JP6950529B2 - オリゴヌクレオチドの製造方法 - Google Patents
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Description
ホスホロアミダイト法では、代表的なアミダイト化試薬であるクロロ(ジイソプロピルアミノ)亜ホスフィン酸2−シアノエチル又はビス(ジイソプロピルアミノ)亜ホスフィン酸2−シアノエチルなどが用いられる。これらの試薬は非常に高価であり、アミダイト体の単離時にはカラム精製や超低温での再沈殿などの煩雑な操作が必須である。また、アミダイト体はその安定性の低さから−20℃での保存が必要である。
これに対して、H−ホスホネート法では、代表的なH−ホスホネート化試薬である亜リン酸ジフェニル又は亜リン酸などが用いられる。これらは安価であるが、H-ホスホネート体の単離時にはカラム精製などの煩雑な操作は必須である。H−ホスホネート体はその安定性により0℃での保存が必要である(例えば、非特許文献1参照)。
上記のように、オリゴヌクレオチドの化学合成法ではアミダイト体もしくはH−ホスホネート体を用いるが、いずれも単離時の操作性や化合物の安定性に課題を抱えており、大量合成に対応できる新規な、オリゴヌクレオチドの製造方法が望まれていた。
[1] 2’位、3’位、5’位及び核酸塩基部からなる群から選ばれる少なくとも1か所に擬似固相保護基を有し、5’位又は3’位がヒドロキシ基であるヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドの当該5’−ヒドロキシ基又は3’−ヒドロキシ基をH−ホスホネート化する工程を含む、オリゴヌクレオチドの製造方法。
[2] 2’位、3’位、5’位及び核酸塩基部からなる群から選ばれる少なくとも1か所に擬似固相保護基を有し、5’位又は3’位がヒドロキシ基であるヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドの当該5’−ヒドロキシ基又は3’−ヒドロキシ基をH−ホスホネート化する工程を含む伸長反応サイクルを少なくとも1つ含む、[1]に記載の製造方法。
2’位、3’位及び核酸塩基部からなる群から選ばれる少なくとも1か所に擬似固相保護基を有し、3’位に基本保護基又は擬似固相保護基で保護されたヒドロキシ基を有し、5’位に一時保護基で保護されたヒドロキシ基を有する第一ヌクレオシド又は第一オリゴヌクレオチドの一時保護基を除去して5’−ヒドロキシ基を生成することを含む第一工程と、
生成した5’−ヒドロキシ基を、H−ホスホネート化試薬を用いてH−ホスホネート化することを含む第二工程と、
H−ホスホネート化された5’−ヒドロキシ基と、3’位にヒドロキシ基を有し、5’位に一時保護基で保護されたヒドロキシ基を有する第二ヌクレオシド又は第二オリゴヌクレオチドの3’−ヒドロキシ基とから亜リン酸ジエステル結合を形成して、第一ヌクレオシド又は第一オリゴヌクレオチドと、第二ヌクレオシド又は第二オリゴヌクレオチドとの結合体を得る第三工程と、
を含む、[2]に記載の製造方法。
2’位、5’位及び核酸塩基部からなる群から選ばれる少なくとも1か所に擬似固相保護基を有し、5’位に基本保護基又は擬似固相保護基で保護されたヒドロキシ基を有し、3’位に一時保護基で保護されたヒドロキシ基を有する第三ヌクレオシド又は第三オリゴヌクレオチドの一時保護基を除去して3’−ヒドロキシ基を生成することを含む第七工程と、
生成した3’−ヒドロキシ基を、H−ホスホネート化試薬を用いてH−ホスホネート化することを含む第八工程と、
H−ホスホネート化された3’−ヒドロキシ基と、5’位にヒドロキシ基を有し、3’位に一時保護基で保護されたヒドロキシ基を有する第四ヌクレオシド又は第四オリゴヌクレオチドの5’−ヒドロキシ基とから亜リン酸ジエステル結合を形成して、第三ヌクレオシド又は第三オリゴヌクレオチドと、第四ヌクレオシド又は第四オリゴヌクレオチドとの結合体を得る第九工程と、
を含む、[2]に記載の製造方法。
R1は、C1−40アルキル基、C2−40アルケニル基又はC2−40アルキニル基であり、sは、1から5の整数であり、
L1は、単結合、C1−6アルキレン基、C2−6アルケニレン基又はC2−6アルキニレン基であり、
L2は、単結合、−COO−、−CON(R2)−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)、−OCO−、−N(R2)CO−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)、−C(O)−又は−O−であり、
L3は、単結合、C1−6アルキレン基、C2−6アルケニレン基又はC2−6アルキニレン基であり、
L4は、単結合、−COO−、−CON(R2)−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)、−OCO−、−N(R2)CO−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)、−C(O)−又は−O−であり、
L5は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基であり、
L6は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基であり、
mは、0又は1であり、
前記擬似固相保護基を核酸塩基部に有し、その擬似固相保護基のmが0である場合、その擬似固相保護基のL1、L2、L3及びL4のうち、単結合の数は0から3である)で表される、[1]から[18]のいずれか1つに記載の製造方法。
R1は、C1−40アルキル基、C2−40アルケニル基又はC2−40アルキニル基であり、sは、1から5の整数であり、
L1は、単結合、C1−6アルキレン基、C2−6アルケニレン基又はC2−6アルキニレン基であり、
L2は、単結合、−COO−、−CON(R2)−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)、−OCO−、−N(R2)CO−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)又は−O−であり、
L3は、単結合、C1−6アルキレン基、C2−6アルケニレン基又はC2−6アルキニレン基であり、
L4は、単結合、−COO−、−CON(R2)−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)、−OCO−、−N(R2)CO−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)又は−O−であり、
前記擬似固相保護基を核酸塩基部に有する場合、その擬似固相保護基のL1、L2、L3及びL4のうち、単結合の数は0から3である)で表される、[1]から[18]のいずれか1つに記載の製造方法。
BaseZは、それぞれ独立して核酸塩基、基本保護基で保護された核酸塩基又は擬似固相保護基で保護された核酸塩基を示し、
XZは、それぞれ独立して水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、基本保護基で保護されたヒドロキシ基、4位炭素原子に架橋する有機基又は擬似固相保護基で保護されたヒドロキシ基を示し、
Yは、それぞれ独立して水素原子、ヒドロキシ基、基本保護基で保護されたヒドロキシ基、チオール基、基本保護基で保護されたチオール基、水素化ホウ素基、モノC1−6アルキルアミノ基又はジC1−6アルキルアミノ基を示し、
Zは、水素原子、基本保護基、一時保護基又は擬似固相保護基を示し、
;かつBaseZの少なくとも1つが擬似固相保護基で保護された核酸塩基であること、XZの少なくとも1つが擬似固相保護基で保護されたヒドロキシ基であること、及びZが擬似固相保護基であることの少なくとも1つを満たす。)
で示される化合物、又はその塩。
R1は、C1−40アルキル基、C2−40アルケニル基又はC2−40アルキニル基であり、sは、1から5の整数であり、
L1は、単結合、C1−6アルキレン基、C2−6アルケニレン基又はC2−6アルキニレン基であり、
L2は、単結合、−COO−、−CON(R2)−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)、−OCO−、−N(R2)CO−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)又は−O−であり、
L3は、単結合、C1−6アルキレン基、C2−6アルケニレン基又はC2−6アルキニレン基であり、
L4は、単結合、−COO−、−CON(R2)−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)、−OCO−、−N(R2)CO−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)又は−O−であり、
擬似固相保護基を核酸塩基部に有する場合、その擬似固相保護基のL1、L2、L3及びL4のうち、単結合の数は0から3である)で表される、[24]に記載の化合物、又はその塩。
nは、1以上の任意の整数を示し、
BaseZは、独立してそれぞれ核酸塩基、基本保護基で保護された核酸塩基又は擬似固相保護基で保護された核酸塩基を示し、
XZは、独立してそれぞれ水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、基本保護基で保護されたヒドロキシ基、4位炭素原子に架橋する有機基又は擬似固相保護基で保護されたヒドロキシ基を示し、
Yは、独立してそれぞれ水素原子、ヒドロキシ基、基本保護基で保護されたヒドロキシ基、チオール基、基本保護基で保護されたチオール基、水素化ホウ素基、モノC1−6アルキルアミノ基又はジC1−6アルキルアミノ基を示し、
Zは、水素原子、基本保護基、一時保護基又は擬似固相保護基を示し、
;かつBaseZの少なくとも一つが擬似固相保護基で保護された核酸塩基であること、XZの少なくとも一つが擬似固相保護基で保護されたヒドロキシ基であること、及びZが擬似固相保護基であることの少なくとも1つを満たす。)
で示される化合物、又はその塩。
R1は、C1−40アルキル基、C2−40アルケニル基又はC2−40アルキニル基であり、sは、1から5の整数であり、
L1は、単結合、C1−6アルキレン基、C2−6アルケニレン基又はC2−6アルキニレン基であり、
L2は、単結合、−COO−、−CON(R2)−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)、−OCO−、−N(R2)CO−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)又は−O−であり、
L3は、単結合、C1−6アルキレン基、C2−6アルケニレン基又はC2−6アルキニレン基であり、
L4は、単結合、−COO−、−CON(R2)−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)、−OCO−、−N(R2)CO−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)又は−O−であり、
前記擬似固相保護基を核酸塩基部に有する場合、その擬似固相保護基のL1、L2、L3及びL4のうち、単結合の数は0から3である)で表される、[29]に記載の化合物、又はその塩。
BaseZは、それぞれ独立して核酸塩基、基本保護基で保護された核酸塩基又は擬似固相保護基で保護された核酸塩基を示し、
XZは、それぞれ独立して水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、基本保護基で保護されたヒドロキシ基、4位炭素原子に架橋する有機基又は擬似固相保護基で保護されたヒドロキシ基を示し、
Wは、水素原子又は一時保護基を示し、
Yは、それぞれ独立して水素原子、ヒドロキシ基、基本保護基で保護されたヒドロキシ基、チオール基、基本保護基で保護されたチオール基、水素化ホウ素基、モノC1−6アルキルアミノ基又はジC1−6アルキルアミノ基を示し、
Zは、水素原子、基本保護基、一時保護基又は擬似固相保護基を示し、
;かつBaseZの少なくとも1つが擬似固相保護基で保護された核酸塩基であること、XZの少なくとも1つが擬似固相保護基で保護されたヒドロキシ基であること、及びZが擬似固相保護基であることの少なくとも1つを満たし、
前記擬似固相保護基の少なくとも1つが、式(I)
R1は、C1−40アルキル基、C2−40アルケニル基又はC2−40アルキニル基であり、sは、1から5の整数であり、
L1は、単結合、C1−6アルキレン基、C2−6アルケニレン基又はC2−6アルキニレン基であり、
L2は、単結合、−COO−、−CON(R2)−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)、−OCO−、−N(R2)CO−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)、−C(O)−又は−O−であり、
L3は、単結合、C1−6アルキレン基、C2−6アルケニレン基又はC2−6アルキニレン基であり、
L4は、単結合、−COO−、−CON(R2)−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)、−OCO−、−N(R2)CO−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)、−C(O)−又は−O−であり、
L5は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基であり、
L6は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基であり、
mは、0又は1であり、mが0である場合、L4は、単結合ではない。)で表される。]化合物、又はその塩。
nは、1以上の任意の整数を示し、
BaseZは、独立してそれぞれ核酸塩基、基本保護基で保護された核酸塩基又は擬似固相保護基で保護された核酸塩基を示し、
XZは、独立してそれぞれ水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、基本保護基で保護されたヒドロキシ基、4位炭素原子に架橋する有機基又は擬似固相保護基で保護されたヒドロキシ基を示し、
Wは、水素原子又は一時保護基を示し、
Yは、独立してそれぞれ水素原子、ヒドロキシ基、基本保護基で保護されたヒドロキシ基、チオール基、基本保護基で保護されたチオール基、水素化ホウ素基、モノC1−6アルキルアミノ基又はジC1−6アルキルアミノ基を示し、
Zは、水素原子、基本保護基、一時保護基又は擬似固相保護基を示し、
;かつBaseZの少なくとも一つが擬似固相保護基で保護された核酸塩基であること、XZの少なくとも一つが擬似固相保護基で保護されたヒドロキシ基であること、及びZが擬似固相保護基であることの少なくとも1つを満たし、
前記擬似固相保護基の少なくとも1つが、式(I)
R1は、C1−40アルキル基、C2−40アルケニル基又はC2−40アルキニル基であり、sは、1から5の整数であり、
L1は、単結合、C1−6アルキレン基、C2−6アルケニレン基又はC2−6アルキニレン基であり、
L2は、単結合、−COO−、−CON(R2)−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)、−OCO−、−N(R2)CO−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)、−C(O)−又は−O−であり、
L3は、単結合、C1−6アルキレン基、C2−6アルケニレン基又はC2−6アルキニレン基であり、
L4は、単結合、−COO−、−CON(R2)−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)、−OCO−、−N(R2)CO−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)、−C(O)−又は−O−であり、
L5は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基であり、
L6は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基であり、
mは、0又は1であり、mが0である場合、L4は、単結合ではない。)で表される。]
で示される化合物、又はその塩。
R1は、C1−40アルキル基、C2−40アルケニル基又はC2−40アルキニル基であり、sは、1から5の整数であり、
L1は、単結合、C1−6アルキレン基、C2−6アルケニレン基又はC2−6アルキニレン基であり、
L2は、単結合、−COO−、−CON(R2)−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)、−OCO−、−N(R2)CO−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)、−C(O)−又は−O−であり、
L3は、単結合、C1−6アルキレン基、C2−6アルケニレン基又はC2−6アルキニレン基であり、
L4は、単結合、−COO−、−CON(R2)−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)、−OCO−、−N(R2)CO−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)、−C(O)−又は−O−であり、
L5は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基であり、
L6は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基であり、
mは、0又は1であり、mが0である場合、L4は、単結合ではない。)で表される、擬似固相保護基。
2’位、3’位、5’位及び核酸塩基部からなる群から選ばれる少なくとも1か所にヒドロキシ基を有するか、又は2’位及び核酸塩基部の少なくとも1カ所にヒドロキシ基又はアミノ基を有するヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドを、
下記式(X−1)
L1は、単結合、C1−6アルキレン基、C2−6アルケニレン基又はC2−6アルキニレン基であり、
L2は、単結合、−COO−、−CON(R2)−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)、−OCO−、−N(R2)CO−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)、−C(O)−又は−O−であり、
L3は、単結合、C1−6アルキレン基、C2−6アルケニレン基又はC2−6アルキニレン基であり、
L4は、−COO−、−CON(R2)−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)、−OCO−、−N(R2)CO−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)、−C(O)−又は−O−である)で表されるカルボキシ化合物、下記式(X−2)
L4は、単結合、−COO−、−CON(R2)−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)、−OCO−、−N(R2)CO−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)、−C(O)−又は−O−であり、
L5は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基であり、
L6は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基である。)で表されるハロゲン化アルキル化合物と反応させ、
2’位、3’位、5’位及び核酸塩基部からなる群から選ばれる少なくとも1か所に、
下記式(I)
R1は、C1−40アルキル基、C2−40アルケニル基又はC2−40アルキニル基であり、sは、1から5の整数であり、
L1は、単結合、C1−6アルキレン基、C2−6アルケニレン基又はC2−6アルキニレン基であり、
L2は、単結合、−COO−、−CON(R2)−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)、−OCO−、−N(R2)CO−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)、−C(O)−又は−O−であり、
L3は、単結合、C1−6アルキレン基、C2−6アルケニレン基又はC2−6アルキニレン基であり、
L4は、単結合、−COO−、−CON(R2)−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)、−OCO−、−N(R2)CO−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)、−C(O)−又は−O−であり、
L5は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基であり、
L6は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基であり、
mは、0又は1であり、mが0である場合、L4は単結合ではない。)で表される擬似固相保護基を有するヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドの製造方法。
特に記述がない限り、本明細書で用いるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるのと同じ意味をもつ。本明細書に記載されたものと同様又は同等の任意の方法及び材料は、本発明の実施又は試験において使用することができるが、好ましい方法及び材料を以下に記載する。
「工程」との語は、独立した工程だけではなく、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の所期の目的が達成されれば、本用語に含まれる。また「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
「L1」と「L1」は同義であり、「L2」と「L2]は同義であり、「L3」と「L3」は同義であり、「L4」と「L4」は同義であり、「L5」と「L5」は同義であり、「L6」と「L6」は同義である。
ここで、前記リボース及び2’−デオキシリボースは、無置換であるか又は、C1−6アルキル基、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、アミノ基、基本保護基で保護されたヒドロキシ基、保護されたアミノ基からなる群から選択される1つ以上の置換基で置換されている。また、前記C1−6アルキル基は、無置換であるか、ハロゲン原子、C1−6アルコキシカルボニル基、モノC1−6アルキルアミノカルボニル基及びジC1−6アルキルアミノカルボニル基等から独立して選択される1つ以上の置換基で置換されている。前記C1−6アルコキシカルボニル基、モノC1−6アルキルアミノカルボニル基及びジC1−6アルキルアミノカルボニル基等は、無置換であるか又は、C6−10アリール基、5−10員ヘテロアリール基又は3−11員含窒素非芳香族ヘテロ環基より置換されている。
2’位と4’位が架橋したリボースとは、ヌクレオシドの2’位と4’位とが架橋基を介して架橋されている限り限定されないが、例えば、2’位と4’位とが、C2−6アルキレン基(該アルキレン基は無置換であるか、又はC1−6アルキル基で置換されている。また、該アルキレン基の1若しくは2つのメチレン基は、置き換えられていないか、又は−O−、−NR11−(R11は水素原子又はC1−6アルキル基を示す)、−S−、−CO−、−CS−、−COO−、−OCONR12−(R12は水素原子又はC1−6アルキル基を示す)、−CONR13−(R13は水素原子又はC1−6アルキル基を示す)及び−CSNR14−(R14は水素原子又はC1−6アルキル基を示す)から選ばれる基で置き換えられている)で架橋されたリボースが挙げられる。具体例としては、下記式の化合物が挙げられる。ヌクレオシドの糖は、好ましくは、リボース又は2’−デオキシリボースである。
前記核酸塩基における「チオール基の保護基」としては、「ヒドロキシ基の保護基」と同様の保護基に加えて、ジスルフィド結合を形成する保護基を挙げることができる。
本明細書中「伸長反応サイクル」とは、擬似固相保護基を有するヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドをH−ホスホネート化した後、ヒドロキシ基を有するヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドと反応させ、擬似固相保護基を有するヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドと、ヒドロキシ基を有するヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドとがリン含有基を介して結合した結合体を得る反応サイクルを意味する。
本発明に使用される擬似固相保護基とは、該保護基を反応基質が有することにより、反応基質及び反応生成物が低極性溶媒に可溶化し、液相中の反応が可能であると共に、一定以上の極性溶媒の添加により反応生成物又は反応基質が沈殿し、固液分離が可能となる保護基であって、5’位ヒドロキシ基もしくは3’位ヒドロキシ基の下記一時保護基を除去し得る条件では安定な保護基である。擬似固相保護基を有する反応基質を使用することにより、反応性と後処理の簡便性とを両立することができる。
R1は、C1−40アルキル基、C2−40アルケニル基又はC2−40アルキニル基であり、sは、1から5の整数であり、
L1は、単結合、C1−6アルキレン基、C2−6アルケニレン基又はC2−6アルキニレン基であり、
L2は、単結合、−COO−、−CON(R2)−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)、−OCO−、−N(R2)CO−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)、−C(O)−又は−O−であり、
L3は、単結合、C1−6アルキレン基、C2−6アルケニレン基又はC2−6アルキニレン基であり、
L4は、単結合、−COO−、−CON(R2)−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)、−OCO−、−N(R2)CO−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)、−C(O)−又は−O−であり、
L5は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基であり、
L6は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基であり、
mは、0又は1である。
ここで、L2が、−COO−又は−O−であり、L4が、−OCO−又は−O−であるとき、L3は、C1−6アルキレン基、C2−6アルケニレン基又はC2−6アルキニレン基であることが好ましい。
3,4,5−トリス(オクタデシルオキシ)ベンジルオキシスクシニル基(3−{3,4,5−トリス(オクタデシルオキシ)ベンジルオキシカルボニル}プロパノイル基)、
3,4,5−トリス(オクタデシルオキシ)ベンゾイル基、
4−オキソ−4−(2,4,6−トリス(オクタデシルオキシ)フェニル)ブチリル基、
2−(3,4,5−トリス(オクタデシルオキシ)ベンズアミド)エトキシスクシニル基(3−[2−{3,4,5−トリス(オクタデシルオキシ)ベンズアミド}エトキシカルボニル]プロパノイル基)、
2−(N−メチル−3,4,5−トリス(オクタデシルオキシ)ベンズアミド)エトキシスクシニル基(3−[2−{N−メチル−3,4,5−トリス(オクタデシルオキシ)ベンズアミド}エトキシカルボニル]プロパノイル基)、
(N−メチル−3,4,5−トリス(オクタデシルオキシ)ベンズアミド)アセチル基、
((3,4,5−トリス(オクタデシルオキシ)ベンゾイル)オキシ)メチル基、及び
2−(N−メチル−3,4,5−トリス(オクタデシルオキシ)ベンズアミド)エトキシスクシニルオキシメチル基({(3−[2−{N−メチル−3,4,5−トリス(オクタデシルオキシ)ベンズアミド}エトキシカルボニル]プロパノイル)オキシ}メチル基)
などが挙げられる。
擬似固相保護基の具体例としては、国際公開第2014−077292号等に開示された基も挙げられる。
R1は、C1−40アルキル基、C2−40アルケニル基又はC2−40アルキニル基であり、sは、1から5の整数であり、
L1は、単結合、C1−6アルキレン基、C2−6アルケニレン基又はC2−6アルキニレン基であり、
L2は、単結合、−COO−、−CON(R2)−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)、−OCO−、−N(R2)CO−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)又は−O−であり、
L3は、単結合、C1−6アルキレン基、C2−6アルケニレン基又はC2−6アルキニレン基であり、
L4は、単結合、−COO−、−CON(R2)−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)、−OCO−、−N(R2)CO−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)又は−O−である。
ここで、L2が、−COO−又は−O−であり、L4が、−OCO−又は−O−であるとき、L3は、C1−6アルキレン基、C2−6アルケニレン基又はC2−6アルキニレン基であることがより好ましい。
R1は、C1−40アルキル基、C2−40アルケニル基又はC2−40アルキニル基であり、sは、1から5の整数であり、
L1は、C1−6アルキレン基又はC2−6アルケニレン基であり、
L3は、C1−6アルキレン基又はC2−6アルケニレン基であり、
R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基又はC2−6アルケニル基である。
また、擬似固相保護基は、さらに好ましくは、下記式(IV)で表される基である。
R1は、C1−40アルキル基、C2−40アルケニル基又はC2−40アルキニル基であり、sは、1から5の整数であり、
L1は、C1−6アルキレン基又はC2−6アルケニレン基であり、
L3は、C1−6アルキレン基又はC2−6アルケニレン基である。
また、擬似固相保護基は、さらに好ましくは、下記式(IV−2)で表される基である。
R1は、C1−40アルキル基、C2−40アルケニル基又はC2−40アルキニル基であり、sは、1から5の整数であり、
L1は、C1−6アルキレン基又はC2−6アルケニレン基である。
R1は、C1−40アルキル基、C2−40アルケニル基又はC2−40アルキニル基であり、sは、1から5の整数であり、
L1は、C1−6アルキレン基又はC2−6アルケニレン基であり、
R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基又はC2−6アルケニル基である。
式(IV−3)において、L1は、好ましくはC1−6アルキレン基であり、特に好ましくはメチレン基である。
式(II)から式(IV)において、L3は、好ましくはC1−6アルキレン基であり、特に好ましくはメチレン基又はエチレン基である。
式(II)、式(III)及び式(IV−3)において、R2は、好ましくは水素原子又はC1−6アルキル基であり、特に好ましくは水素原子又はメチル基である。
R1は、C1−40アルキル基、C2−40アルケニル基又はC2−40アルキニル基であり、sは、1から5の整数であり、
L1は、単結合、C1−6アルキレン基、C2−6アルケニレン基又はC2−6アルキニレン基であり、
L2は、単結合、−COO−、−CON(R2)−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)、−OCO−、−N(R2)CO−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)、−C(O)−又は−O−であり、
L3は、単結合、C1−6アルキレン基、C2−6アルケニレン基又はC2−6アルキニレン基であり、
L4は、単結合、−COO−、−CON(R2)−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)、−OCO−、−N(R2)CO−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)、−C(O)−又は−O−であり、
L5は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基であり、
L6は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基である。
ここで、L2が、−COO−又は−O−であり、L4が、−OCO−又は−O−であるとき、L3は、C1−6アルキレン基、C2−6アルケニレン基又はC2−6アルキニレン基であることがより好ましい。
R1は、C1−40アルキル基、C2−40アルケニル基又はC2−40アルキニル基であり、sは、1から5の整数であり、
L1は、C1−6アルキレン基又はC2−6アルケニレン基であり、
L3は、C1−6アルキレン基又はC2−6アルケニレン基であり、
L4は、単結合又は−N(R2)CO−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基又はC2−6アルケニル基である)であり、
L5は、水素原子又はC1−6アルキル基であり、
L6は、水素原子又はC1−6アルキル基である)で表される基、又は下記式(VII)
L5は、水素原子又はC1−6アルキル基であり、
L6は、水素原子又はC1−6アルキル基である)で表される基である。
式(I)、式(V)及び(VI)において、L3は、好ましくはC1−6アルキレン基であり、特に好ましくはメチレン基又はエチレン基である。
式(I)から式(VII)で表される擬似固相保護基のsは、好ましくは、2から4の整数であり、より好ましくは3である。
式(I)から式(VII)において、sが2から5であるとき、それぞれのR1は、同一であっても異なっていてもよい。
本発明に使用される一時保護基とは、5’位ヒドロキシ基もしくは3’位ヒドロキシ基を保護する保護基であり、前記「伸長反応サイクル」において脱保護される保護基である。脱保護された5’位ヒドロキシ基もしくは3’位ヒドロキシ基は、伸長反応サイクルにおいて、H−ホスホネート化された後、別のヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドとの結合に利用される。一時保護基は、例えば、以下の文献に記載されるような保護基が挙げられる。
Protective Groups in Organic Synthesis,Greene T.W.and Wuts P.G.M.,published by Wiley Interscience,1999及びProtecting Groups,Kocienski P.J.,1994,Georg Thieme Verlag。
本発明に使用される基本保護基とは、核酸塩基中のアミノ基、カルボニル基、ヒドロキシ基、若しくはチオール基又は、2’位ヒドロキシ基、3’位ヒドロキシ基若しくは5’位ヒドロキシ基、又はリン酸ジエステル結合のヒドロキシ基若しくはチオリン酸ジエステル結合のチオール基を保護する保護基であり、前記「伸長反応サイクル」においては脱保護されず、かつ前記「擬似固相保護基」が有する機能は有さない一般的な保護基である。基本保護基は、例えば、以下の文献に記載される保護基が挙げられる。
Protective Groups in Organic Synthesis,Greene T.W.and Wuts P.G.M.,published by Wiley Interscience,1999及びProtecting Groups,Kocienski P.J.,1994,Georg Thieme Verlag。
次に、本発明にかかるオリゴヌクレオチドの製造方法(以下、「本発明の製造方法」ともいう。)について説明する。具体的には、擬似固相保護基で保護されたヌクレオシド又はオリゴヌクレオチド(以下、「n個重合オリゴヌクレオチド」ともいう)から、ヌクレオシド又はオリゴヌクレオチド(以下、「p個重合オリゴヌクレオチド」ともいう)で伸長され、擬似固相保護基で保護されたオリゴヌクレオチド(以下、「n+p個重合オリゴヌクレオチド」ともいう)を製造する方法について説明する。なお、n個重合オリゴヌクレオチドとは、n個のヌクレオシドがリン含有基を介して結合したオリゴヌクレオチドを意味し、n=1の場合、n個重合オリゴヌクレオチドはヌクレオシドと解され、p個重合オリゴヌクレオチドについても同様である。
p個重合オリゴヌクレオチドについても同様である。
またオリゴヌクレオチドの製造方法は、前記H−ホスホネート化工程を含む伸長反応サイクルを少なくとも1つ含む。
工程aは、伸長末端ではないヒドロキシ基、核酸塩基部及び2’位の中の少なくとも1つに擬似固相保護基を有し、かつ伸長末端のヒドロキシ基が一時保護基で保護されたヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドの一時保護基を除去してヒドロキシ基とすることを含む脱一時保護基工程である。
工程bは、一時保護基が除去されたヒドロキシ基をH−ホスホネート化試薬によりH−ホスホネート化することを含むホスホネート化工程である。
工程cは、工程bでH−ホスホネート化されたヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドに対して、ヒドロキシ基を有するヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドを添加して、そのヒドロキシ基を介して亜リン酸ジエステル結合により縮合させることを含むカップリング工程である。
工程dは、形成された亜リン酸ジエステル結合を、リン酸ジエステル結合、チオリン酸ジエステル結合、アミノリン酸ジエステル結合、ボラノリン酸ジエステル結合、基本保護基で保護されたリン酸ジエステル結合(リン酸トリエステル結合)又は基本保護基で保護されたチオリン酸ジエステル結合(チオリン酸−O,O,S−トリエステル結合)等へと変換することを含む変換工程である。
ここで、前記アミノリン酸ジエステル結合のアミノ基は、無置換であるか、又は1若しくは2個のC1−6アルキル基で置換されている。
基本保護基で保護されたリン酸ジエステル結合は、リン酸ジエステル結合の1つのヒドロキシ基の水素原子が、C1−40アルキル基、C3−6シクロアルキル基、C6−10アリール基、5−10員ヘテロアリール基、アラルキル基又はヘテロアラルキル基等によって置き換えられた結合である。ここで前記C1−6アルキル基は、無置換であるか又は、ハロゲン原子、シアノ基等によって置換されている。C3−6シクロアルキル基、C6−10アリール基、5−10員ヘテロアリール基、アラルキル基及びヘテロアラルキル基は、無置換であるか又は、C1−6アルキル基、ハロゲン原子、シアノ基等によって置換されている。
基本保護基で保護されたチオリン酸ジエステル結合は、チオリン酸ジエステル結合の1つのチオール基の水素原子が、C1−40アルキル基、C3−6シクロアルキル基、C6−10アリール基、5−10員ヘテロアリール基、アラルキル基又はヘテロアラルキル基等によって置き換えられた結合である。ここで前記C1−40アルキル基は、無置換であるか又は、ハロゲン原子、シアノ基等によって置換されている。C3−6シクロアルキル基、C6−10アリール基、5−10員ヘテロアリール基、アラルキル基及びヘテロアラルキル基は、無置換であるか又は、C1−6アルキル基、ハロゲン原子、シアノ基等によって置換されている。
工程cに用いるヒドロキシ基を有するヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドに含まれるヌクレオシド数pは、1以上の任意の整数であれば特に限定されないが、好ましくは、1から50であり、より好ましくは1から30であり、更に好ましくは1から20であり、更に好ましくは1から5であり、更により好ましくは1から3であり、特に好ましくは1、つまりヌクレオシドを用いることが特に好ましい。
なお、工程dで得られた反応混合物を、そのまま工程aに使用することもできる。また、工程d終了後に適宜昇温などを行うことで、同時に工程aを行うこともできる。
(工程e)
工程eは、工程aから工程dのいずれかで得られた反応混合物に極性溶媒を添加して、擬似固相保護基を有するヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドを沈殿させて、固液分離により取得する分離工程である。
なお、工程eは、擬似固相保護基を用いない通常の液相合成法にも、固相合成法にも存在し得ない、擬似固相保護基を用いる液相合成法に特有の工程である。
工程eは、工程aから工程dの各工程の後に、それぞれ独立して例えば0〜5回含まれ、好ましくは0〜3回含まれ、より好ましくは0〜2回含まれ、さらに好ましくは0又は1回含まれる。ここで、工程a〜dの後の少なくとも1つに、1回以上の工程eが含まれる。
伸長反応サイクルには、1から4回の工程eが含まれることが好ましい。工程eは、伸長反応サイクル中に、工程aの後、工程bの後及び工程dの後の少なくとも1つに、それぞれ1回含まれることが、副生物発生を厳格に管理・制御でき、高純度のオリゴヌクレオチドに導けるという観点で好ましい。工程eは、伸長反応サイクル中に、工程bの後に1回含まれるか、工程dの後に1回含まれるか、又は工程b及び工程dの後にそれぞれ1回含まれることが、より好ましい。
その他の態様として、工程eは、伸長反応サイクル中に、工程aの後に1回含まれるか、工程bの後に1回含まれるか、又は工程a及び工程bの後にそれぞれ1回含まれることが、より好ましく、工程a及び工程bの後にそれぞれ1回含まれることが、さらに好ましい。
(工程f)
工程fは、工程aから工程eで得られたオリゴヌクレオチドの基本保護基、一時保護基及び擬似固相保護基を全て除去する脱保護工程である。
2’位、3’位及び核酸塩基部からなる群から選ばれる少なくとも1か所に擬似固相保護基を有し、3’位に基本保護基又は擬似固相保護基で保護されたヒドロキシ基を有し、5’位に一時保護基で保護されたヒドロキシ基を有する第一ヌクレオシド又は第一オリゴヌクレオチドの一時保護基を除去して5’−ヒドロキシ基を生成することを含む第一工程(工程a)と、
生成した5’−ヒドロキシ基を、H−ホスホネート化試薬を用いてH−ホスホネート化することを含む第二工程(工程b)と、
H−ホスホネート化された5’−ヒドロキシ基と、3’位にヒドロキシ基を有し、5’位に一時保護基で保護されたヒドロキシ基を有する第二ヌクレオシド又は第二オリゴヌクレオチドの3’−ヒドロキシ基とから亜リン酸ジエステル結合を形成して、第一ヌクレオシド又は第一オリゴヌクレオチドと、第二ヌクレオシド又は第二オリゴヌクレオチドとの結合体を得る第三工程(工程c)と、
結合体の亜リン酸ジエステル結合を、リン酸ジエステル結合、チオリン酸ジエステル結合、ボラノリン酸ジエステル結合、アミノリン酸ジエステル結合、基本保護基で保護されたリン酸ジエステル結合、又は基本保護基で保護されたチオリン酸ジエステル結合に変換することを含む第四工程(工程d)と、を含むオリゴヌクレオチドの製造方法である。
2’位、5’位及び核酸塩基部からなる群から選ばれる少なくとも1か所に擬似固相保護基を有し、5’位に基本保護基又は擬似固相保護基で保護されたヒドロキシ基を有し、3’位に一時保護基で保護されたヒドロキシ基を有する第三ヌクレオシド又は第三オリゴヌクレオチドの一時保護基を除去して3’−ヒドロキシ基を生成することを含む第七工程(工程a)と、
生成した3’−ヒドロキシ基を、H−ホスホネート化試薬を用いてH−ホスホネート化することを含む第八工程(工程b)と、
H−ホスホネート化された3’−ヒドロキシ基と、5’位にヒドロキシ基を有し、3’位に一時保護基で保護されたヒドロキシ基を有する第四ヌクレオシド又は第四オリゴヌクレオチドの5’−ヒドロキシ基とから亜リン酸ジエステル結合を形成して、第三ヌクレオシド又は第三オリゴヌクレオチドと、第四ヌクレオシド又は第四オリゴヌクレオチドとの結合体を得る第九工程(工程c)と、
結合体の亜リン酸ジエステル結合を、リン酸ジエステル結合、チオリン酸ジエステル結合、ボラノリン酸ジエステル結合、アミノリン酸ジエステル結合、基本保護基で保護されたリン酸ジエステル結合、又は基本保護基で保護されたチオリン酸ジエステル結合に変換することを含む第十工程(工程d)と、を含むオリゴヌクレオチドの製造方法である。
まず、方法A又は方法Bのそれぞれの場合の工程aをスキーム1又は2に示す。
方法Aにおける工程aは、低極性溶媒中において、5’位ヒドロキシ基がフッ素試薬、酸又は塩基で除去可能な一時保護基Rで保護されたn個重合オリゴヌクレオチド(ia)(式中、nは、1以上の任意の整数を示し、n=1の場合は、ヌクレオシドを示す。)の一時保護基Rを、フッ素試薬、酸又は塩基の添加により除去する工程(脱一時保護基工程)である(スキーム1)。
ここで、スキーム1中化合物(ia)又は(iia)が、2以上の核酸塩基部を有する場合、それぞれの核酸塩基部は同一であっても異なっていてもよく、(ia)又は(iia)が、2以上の擬似固相保護基を有する場合、それぞれの擬似固相保護基は同一であっても異なっていてもよく、(ia)又は(iia)が、2以上の基本保護基を有する場合、それぞれの基本保護基は同一であっても異なっていてもよく、n個重合オリゴヌクレオチドが、2以上の4位炭素原子に架橋する有機基を有する場合、それぞれの4位炭素原子に架橋する有機基は同一であっても異なっていてもよい。
Zは、好ましくは、基本保護基又は擬似固相保護基であり、より好ましくは擬似固相保護基である。
Basezに含まれる、式(II)から式(IV)で表される擬似固相保護基のL3は、好ましくはC1−6アルキレン基であり、特に好ましくはメチレン基又はエチレン基である。
Basezに含まれる、式(I)、式(V)又は(VI)で表される擬似固相保護基のL3は、好ましくはC1−6アルキレン基であり、特に好ましくはメチレン基又はエチレン基である。
Basezに含まれる、式(I)から式(VII)で表される擬似固相保護基のsは、好ましくは、2から4の整数であり、より好ましくは3である。
式(I)から式(VII)において、sが2から5であるとき、それぞれのR1は、同一であっても異なっていてもよい。
その他の態様として、Xzはより好ましくは、C2−6アルキレン基(該アルキレン基は無置換であるか、又はメチル基で置換されている。ここで、該アルキレン基の1若しくは2つのメチレン基は、置き換えられていないか、又は−O−、−NR11−(R11は水素原子又はメチル基を示す)、−CO−、−CS−、−COO−、−OCONR12−(R12は水素原子又はメチル基を示す)、−CONR13−(R13は水素原子又はメチル基を示す)及び−CSNR14−(R14は水素原子又はメチル基を示す)から選ばれる基で置き換えられている)で表される4位炭素原子に架橋する有機基である。Xzはより好ましくは、エチレン基(該エチレン基の1若しくは2つのメチレン基は、置き換えられていないか、又は−O−、−CONR13−(R13は水素原子又はメチル基を示す)及び−CSNR14−(R14は水素原子又はメチル基を示す)から選ばれる基で置き換えられている)で表される4位炭素原子に架橋する有機基である。
中でもtert−ブチルジメチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、tert−ブチルジフェニルシリル基、レブリニル基又は3−ベンゾイルプロピオニル基が好ましく、レブリニル基又は3−ベンゾイルプロピオニル基がより好ましく、レブリニル基が更に好ましい。
一時保護基がレブリニル基又は3−ベンゾイルプロピオニル基等である場合、Xz又はZにおける基本保護基は、tert−ブチルジメチルシリル基、トリエチルシリル基等のシリル基、又はトリチル基、ジメトキシトリチル基、モノメトキシトリチル基等のトリアリールメチル基であることが好ましい。特に方法Bの場合に、レブリニル基又は3−ベンゾイルプロピオニル基等を一時保護基として用いてもよい。
Yは、独立してそれぞれ、好ましくは、水素原子、ヒドロキシ基、チオール基又は2−シアノエトキシ基であり、より好ましくは、ヒドロキシ基又はチオール基である。Yを含めたリン官能基は、例えば以下の構造(又は、以下の構造に塩を付した構造)を有する。
フッ素試薬としては、フッ化水素のピリジン塩、テトラブチルアンモニウムフルオリド、フッ化水素のトリエチルアミン塩、フッ化水素酸、フッ化アンモニウム、フッ化アンモニウムのフッ化水素付加体、フッ化カリウム又はフッ化カリウムのフッ化水素付加体が好ましく、中でも、フッ化水素のピリジン塩又はテトラブチルアンモニウムフルオリドがより好ましく、フッ化水素のピリジン塩が特に好ましい。
酸としては、トリフルオロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリクロロ酢酸、メタンスルホン酸、p−トルエンスルホン酸、塩酸、酢酸、硝酸アンモニウムセリウム、ホスホン酸又はリン酸が好ましく、中でも、トリフルオロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリクロロ酢酸、メタンスルホン酸、p−トルエンスルホン酸、塩酸、酢酸又は硝酸アンモニウムセリウムがより好ましく、トリフルオロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリクロロ酢酸、メタンスルホン酸又はp−トルエンスルホン酸がさらに好ましく、ジクロロ酢酸又はホスホン酸が特に好ましい。トリフルオロ酢酸又はp−トルエンスルホン酸も特に好ましい。
塩基としては、ヒドラジン誘導体(ヒドラジン一水和物、ヒドラジン酢酸塩、硫酸ヒドラジニウム、アセトヒドラジド、メチルカルバゼート、フェニルヒドラジン、p−トルエンスルホニルヒドラジン等)、エチレンジアミン誘導体(エチレンジアミン等)及び無機塩基(炭酸カリウム等)等が挙げられる。塩基としては、ヒドラジン誘導体が好ましく、ヒドラジン一水和物がより好ましい。
これらフッ素試薬、酸及び塩基は、上記低極性溶媒で希釈して使用することができる。 また、フッ素試薬、酸及び塩基以外では、Chirazyme L−2、Chirazyme L−5等の酵素により脱保護することも可能である。
た官能基への副反応が進行しなければ、特に限定されないが、ピロール、2−メチルピロ
ール、3−メチルピロール、2,3−ジメチルピロール、2,4−ジメチルピロール等の
ピロール誘導体;インドール、4−メチルインドール、5−メチルインドール、6−メチ
ルインドール、7−メチルインドール、5,6−ジメチルインドール、6,7−ジメチル
インドール等のインドール誘導体を使用することができる。良好なカチオン捕捉効果が得
られるという観点で、ピロール、3−メチルピロール、2,4−ジメチルピロール、イン
ドール、4−メチルインドール、5−メチルインドール、6−メチルインドール、7−メ
チルインドール、5,6−ジメチルインドール、6,7−ジメチルインドールが好ましく
、ピロール、3−メチルピロール、インドールがより好ましく、ピロール、インドールが
更に好ましく、ピロールが特に好ましい。
まず、方法A又は方法Bのそれぞれの場合の工程bをスキーム3又は4に示す。
方法Aにおける工程bは、方法Aにおける前記工程a若しくは後述の工程dで得られたn個重合オリゴヌクレオチドの5’位ヒドロキシ基の脱保護体(iia)の5’位ヒドロキシ基をH−ホスホネート化させる工程(下記スキーム3)である。スキーム3中、各記号は、前記定義と同義である。
まず、方法A又は方法Bのそれぞれの場合の(工程c)をスキーム5又は6に示す。
方法Aにおける(工程c)は、前記方法Aにおける(工程b)で得られたn個重合オリゴヌクレオチドの5’位ヒドロキシ基のH−ホスホネート体(iiia)と、5’位ヒドロキシ基が一時保護基Rにより保護され、かつ3’位ヒドロキシ基を持つp個重合オリゴヌクレオチド(iva)(式中、pは、1以上の任意の整数を示し、p=1の場合は、ヌクレオシドを示す。)と、を縮合させる工程である(スキーム5)。
なお、キャッピング反応とは、カップリング反応、酸化反応後に残存したヒドロキシ基を有する化合物のヒドロキシ基を、ヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドを伸長できない置換基に変換する反応である。
キャッピング反応は、後述する工程dの後に実施してもよい。キャッピング反応は、工程c又は工程dの後に実施することが好ましい。
工程は、工程cで得られたn+p個重合オリゴヌクレオチド(va又はvb)若しくは工程aで得られたn個重合オリゴヌクレオチドにリン原子を修飾する試薬を反応させることにより、該n+p個重合オリゴヌクレオチド(va又はvb)の亜リン酸ジエステル結合をリン酸ジエステル結合、チオリン酸ジエステル結合、アミノリン酸ジエステル結合、ボラノリン酸ジエステル結合、基本保護基で保護されたリン酸ジエステル結合又は基本保護基で保護されたチオリン酸ジエステル結合へと変換する工程である。
工程dで前記酸化剤を使用する場合、工程dの反応溶媒は、前記希釈溶媒と同様である。
工程dで前記硫化剤を使用する場合、工程dの反応溶媒は、前記希釈溶媒と同様である。
キャッピング反応は、前述する工程cの後に実施してもよい。
工程aの後に工程dを行う際には、工程dの後には、前記キャッピング反応を実施しない。
工程eは、工程aから工程dのいずれかで得られた反応溶液に極性溶媒を添加することによりオリゴヌクレオチドを沈殿させて、固液分離により取得する工程である。
オリゴヌクレオチドの製造方法においては、工程eの後に、基本保護基、一時保護基及び擬似固相保護基の種類・性質に応じて、脱保護を行い、オリゴヌクレオチドを単離することができる。脱保護の方法としては、例えば、プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス(PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS)、第3版、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ(JOHN WILLY&SONS)出版(1999年)等に記載されている脱保護方法に従い、オリゴヌクレオチドの全ての保護基を除去する工程を行うことができる。具体的には、擬似固相保護基、ならびに基本保護基であるベンゾイル基、イソブチリル基、フェノキシアセチル基、アセチル基、レブリニル基等、リン酸ジエステル結合又はチオリン酸ジエステル結合を保護している基本保護基である2−シアノエチル基等は、アンモニア水、アンモニア水/エタノール溶液、又はアンモニア水とメチルアミン水溶液の混合液で処理することにより、全て除去することができる。また、5’位又は3’位ヒドロキシ基の一時保護基は、工程aで使用されるフッ素試薬、酸又は塩基、又はそれらを適宜希釈した溶液で処理することにより除去することができる。また、ジャーナルオブザケミカルソサイエティー パーキントランザクション1、2002年、2619頁−2633頁に記載されている脱保護方法に従い、DBU[1,8−ジアザビシクロ[5.4.0]−7−ウンデセン]及びトリメチルシリルクロリドで処理して、リン酸ジエステル結合又はチオリン酸ジエステル結合を保護しているシアノエチル基等を除去した後に、アンモニア水で擬似固相保護基、ならびに基本保護基であるベンゾイル基、イソブチリル基、フェノキシアセチル基、アセチル基、レブリニル基等を除去する方法を用いることもできる。また、無機塩基(炭酸カリウム等)で基本保護基であるベンゾイル基、イソブチリル基、フェノキシアセチル基、アセチル基、レブリニル基等を除去する方法を用いることもできる。
基本保護基で保護されたリン酸ジエステル結合は、例えば、ジャーナルオブザケミカルソサイエティー パーキントランザクション1、1999、1477頁−1486頁に記載されている方法((E)−2−ニトロベンズアルドキシム、ピリジン−2−アルドキシムなどのオキシム化合物及び、1、1、3、3−テトラメチルグアニジン、DBU等の塩基で処理する方法)で脱保護することにより、リン酸ジエステル結合へ変換することができる。2−シアノエチル基等、β脱離によって脱保護可能な基本保護基で保護されたチオリン酸ジエステル結合は、前記塩基性条件下での脱保護により、チオリン酸ジエステル結合へ変換できる。その他の基本保護基で保護されたチオリン酸ジエステル結合は、例えば、ジャーナルオブザケミカルソサイエティー パーキントランザクション1、1999、1477頁−1486頁に記載されている方法(前記オキシム化合物及び前記塩基で処理する方法等)で脱保護することにより、リン酸ジエステル結合へ変換できる。
保護基を有しないオリゴヌクレオチドは、酵素により容易に分解されやすいため、空気清浄度管理下でオリゴヌクレオチドを単離することが好ましい。
例えば、2’位と4’位が−CSNR14−(R14は水素原子又はC1−6アルキル基を示す)で架橋したリボースに、核酸塩基が結合したヌクレオシドは、対応する−CONR13−(R13は水素原子又はC1−6アルキル基を示す)で架橋した構造を有するヌクレオシド等から、チオカルボニル化試薬(例えばローソン試薬等)を用いて、必要に応じて保護反応及び脱保護反応を行って、合成することができる。
また、L1とL2間の結合、L2とL3間の結合、L3とL4間の結合の内、任意の結合を上記縮合法や官能基変換法等を用いて形成させ、段階的に擬似固相保護基を導入することもできる。また、L2が、−COO−、−CON(R2)−、OCO−又は−N(R2)CO−である場合、L2が含むエステル結合又はアミド結合を、上記縮合法や官能基変換法等を用いて形成させ、段階的に擬似固相保護基を導入することもできる。L4が、−COO−、−CON(R2)−、OCO−又は−N(R2)CO−である場合も同様である。ここで、R2は前記定義に同じである。
また、L1とL2の間の結合、L2とL3の間の結合、L3とL4の間の結合の内、任意の結合を上記縮合法や官能基変換法等を用いて形成させ、段階的に擬似固相保護基を導入することもできる。また、L2が、−COO−、−CON(R2)−、OCO−又は−N(R2)CO−である場合、L2が含むエステル結合又はアミド結合を、上記縮合法や官能基変換法等を用いて形成させ、段階的に擬似固相保護基を導入することもできる。L4が、−COO−、−CON(R2)−、OCO−又は−N(R2)CO−である場合も同様である。ここで、R2は前記定義に同じである。
31P−NMRデータが記載されている場合には、JNM−ECX300;日本電子(JEOL)社製)で測定したシグナルの化学シフトδ(単位:ppm)を表す。
条件1:
装置:AB SCIEX TripleTOF 5600
カラム:Kinetex PFP(2.6μm、2.1×75mm)
カラム温度:40℃
溶離液組成:
有機層:テトラヒドロフラン/アセトニトリル=1/1(体積比)
水層:10mM ギ酸アンモニウム水溶液
有機層と水層の混合比を50/50で測定開始後、10分間で90/10に直線的に変えた。その後5分間、有機層と水層の混合比を90/10に固定した。
流速:0.50mL/min、
検出波長:260nm
1H−NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.11(s、3H)、0.12(s、3H)、0.92(s、9H)、1.92(d、3H)、2.02−2.16(m、2H)、2.32−2.39(m、1H)、3.81−3.92(m、2H)、4.01−4.04(m、1H)、4.45−4.49(m、1H)、6.36(q、1H)、7.48(d、1H)、8.27(brs、1H).
窒素雰囲気下、ウリジン(12.03g、49.3mmol)、イミダゾール(6.74g、99.0mmol)のN,N−ジメチルホルムアミド[DMF](120g)溶液に、室温でtert−ブチルジメチルシリルクロリド(7.76g、51.5mmol)を加え、5時間1分撹拌した。この反応混合物を水(240g)に滴下し、析出した固体をろ過した。得られた粗物にトルエンを加えて30分間撹拌し、ろ過して5’−O−(tert−ブチルジメチルシリル)ウリジン(10.49g、収率59%)を白色固体として得た。
1H−NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.11(s、6H)、0.92(s、9H)、3.82−3.87(m、1H)、4.00−4.05(m、1H)、4.14−4.15(m、1H)、4.21−4.26(m、2H)、5.67(d、1H)、5.90(d、1H)、8.06(d、1H).
窒素雰囲気下、5’−O−(tert−ブチルジメチルシリル)ウリジン(5.40g、15.1mmol)、硝酸銀[AgNO3](10.3g、60.6mmol)、ピリジン(6.1mL,75mmol)のTHF(50mL)懸濁液に、室温でトリイソプロピルシリルクロリド(11.65g、60.4mmol)を加え、23時間6分撹拌した。この反応混合物をセライトろ過し、溶媒を減圧下留去して酢酸エチルを加えた。水を加えて分液し、得られた水層に酢酸エチルを加えて分液した。得られた有機層を合わせて6%炭酸水素カリウム水溶液で洗浄し、水で洗浄した。溶媒を減圧下留去し、ヘキサンを加えて固体を析出させ、0℃に冷却後、ろ過し5’−O−(tert−ブチルジメチルシリル)−2’−O−トリイソプロピルシリルウリジン(5.24g、収率68%)を白色固体として得た。
得られたろ液を減圧下留去して、シリカゲルクロマトグラフィー(ヘキサン−酢酸エチル)で精製し、5’−O−(tert−ブチルジメチルシリル)−2’−O−トリイソプロピルシリルウリジン(1.72g、収率22%)を白色固体として得た。
1H−NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.12(s、6H)、0.94(s、9H)、1.04−1.16(m、21H)、2.80(d、1H)、3.81(d、1H)、3.96(d、1H)、4.13−4.20(m、2H)、4.36(t、1H)、5.70(d、1H)、6.07(d、1H)、7.95(dd、1H)、8.17(brs、1H).
窒素雰囲気下、化合物1(8.02g、22.4mmol)、無水コハク酸(3.35g、33.5mmol)の塩化メチレン(80g)溶液に、室温でトリエチルアミン(6.21mL、44.8mmol)を加え、4時間3分撹拌した。反応混合物に2.0M リン酸−トリエチルアミン水溶液を加えて分液した。得られた有機層を、2M リン酸−トリエチルアミン水溶液で2回分液により洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒を減圧下留去し、化合物2を薄紫色固体(11.37g、収率91%)として得た。
1H−NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.13(s、6H)、0.93(s、9H)、1.23(t、9H)、1.92(d、3H)、2.04−2.13(m、1H)、2.39−2.46(m、1H)、2.55−2.66(m、4H)、3.02(q、6H)、3.86−3.95(m、2H)、4.13(d、1H)、5.25(d、1H)、6.35(q、1H)、7.55(d、1H).
窒素雰囲気下、化合物2(2.79g、5.0mmol)、3,4,5−トリス(オクタデシルオキシ)ベンジルアルコール(Tetrahedron、2011、67、6633−6643に記載の方法に準じて合成した)(3.13g、3.4mmol)の塩化メチレン(65g)溶液に、室温で2−(1H−ベンゾトリアゾール−1−イル)−1,1,3,3−テトラメチルウロニウムヘキサフルオホスフェート[HBTU](2.55g、6.7mmol)、ジイソプロピルエチルアミン(1.2mL、7.1mmol)、ジメチルアミノピリジン[DMAP](847mg、6.9mmol)を加え、1時間8分撹拌した。反応混合物にメタノールを加えて析出した固体をろ過し、化合物3(4.53g、収率98%)を白色固体として得た。
1H−NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.130(s、3H)、0.133(s、3H)、0.88(t、9H)、0.94(s、9H)、1.14−1.83(m、96H)、1.93(d、3H)、2.05−2.15(m、1H)、2.37−2.44(m、1H)、2.68(t、4H)、3.89−3.97(m、8H)、4.07(d、1H)、5.02(s、2H)、5.27(d、1H)、6.34(q、1H)、6.53(s、2H)、7.54(d、1H)、8.11(brs、1H).
1H−NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.88(t、9H)、1.09−1.84(m、96H)、1.93(d、3H)、2.30−2.45(m、2H)、2.62−2.73(m、4H)、3.82−4.04(m、9H)、5.02(s、2H)5.25−5.29(m、1H)、6.19(q、1H)、6.53(s、2H)、7.49(d、1H)、8.07(brs、1H).
1H−NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.88(t、9H)、1.16−1.83(m、96H)、1.92(d、3H)、2.31−2.35(m、2H)、2.68(brs、4H)、3.90−3.98(m、6H)、4.17−4.24(m、3H)、5.02(s、2H)、5.39(d、1H)、6.38(q、1H)、6.53(s、2H)、6.94(d、1H)、7.68(d、1H).
31P−NMR:(300MHz;CDCl3)δ6.54.
1H−NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.88(t、9H)、1.20−1.81(m、105H)、1.98(s、3H)、2.32−2.35(m、2H)、2.67(brs、4H)、3.00−3.09(m、6H)、3.90−4.17(m、9H)、5.02(s、2H)、5.41(t、1H)、6.41(t、1H)、6.53(s、2H)、6.90(d、1H)、7.84(s、1H)、7.92(brs、1H)、12.67(brs、1H).
31P−NMR:(300MHz;CDCl3)δ5.11.
1H−NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.091−0.13(m、6H)、0.85−0.95(m、18H)、1.08−1.83(m、96H)、1.90(s、3H)、1.91(s、3H)、2.36(brs、2H)、2.57−2.67(m、6H)、3.81−4.29(m、12H)、4.91(t、1H)、5.01(s、2H)、5.42(s、1H)、6.28−6.37(m、2H)、6.53(s、2H)、7.51(s、1H)、7.72(s、1H).
31P−NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.70.
MS(ESI−):[M−H]− 1654.1197.
窒素雰囲気下、化合物3(1.00g、0.74mmol)の塩化メチレン(5mL)溶液に、40℃でフッ化水素−ピリジン(86.5μL、3.3mmol)を加え、4時間42分撹拌し、ヘキサメチルジシロキサン[TMS2O](0.55mL、2.6mmol)を加えた。この反応混合物のうち、化合物3 0.57mmol分に、ピリジン(8mL)を加え、減圧下濃縮した。再度ピリジン(8mL)を加え、減圧下濃縮し、ピリジン(6mL)を加え、化合物4のピリジン溶液とした。
窒素雰囲気下、亜リン酸(0.50g、6.1mmol)のピリジン(16mL)溶液に、40℃で2,2−ジメチルブチリルクロリド(0.41mL、3.0mmol)を加え、35分間撹拌した。この溶液に化合物4のピリジン溶液を加えてピリジン(1mL)で洗浄した。40℃で6時間35分撹拌し、2,2−ジメチルブチリルクロリド(0.12mL、0.87mmol)を加えてさらに3時間撹拌した。アセトニトリルを加えて固体を析出させ、氷冷した後にろ過し、化合物5a(737mg)を白色固体として得た。
窒素雰囲気下、化合物5a(702mg)と化合物1(279mg、0.78mmol)のピリジン(14mL)溶液に、25℃で2,2−ジメチルブチリルクロリド(0.36mL、2.6mmol)を加え、33分間撹拌した。その後0.1Mのヨウ素を含む、ピリジン、THF及び水の溶液(6.3mL、0.63mmol)を加え、21分間撹拌し、亜リン酸トリメチル(12μL、0.11mmol)を加えた。反応混合物にアセトニトリルを加えて固体を析出させ、減圧下濃縮し、アセトニトリルを加えて氷冷した後にろ過し、化合物6(799mg)を薄い肌色固体として得た。
1H−NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.096(s、3H)、0.11(s、3H)、0.85−0.95(m、18H)、1.10−1.83(m、96H)、1.90(s、3H)、1.91(s、3H)、2.35(brs、2H)、2.57−2.67(m、6H)、3.86−4.28(m、12H)、4.92(t、1H)、5.02(s、2H)、5.35(s、1H)、6.28−6.33(m、2H)、6.53(s、2H)、7.49(s、1H)、7.59(s、1H).
31P−NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.96.
窒素雰囲気下、化合物6(750mg)の塩化メチレン(4mL)溶液に、40℃でフッ化水素−ピリジン(51.9μL、2.0mmol)を加え、3時間23分撹拌し、ヘキサメチルジシロキサン[TMS2O](0.33mL、1.6mmol)を加えた。ピリジン(8mL)を加え、減圧下濃縮した。再度ピリジン(8mL)を加え、減圧下濃縮し、ピリジン(6mL)を加え、化合物7のピリジン溶液とした。
窒素雰囲気下、亜リン酸(0.37g、4.4mmol)のピリジン(12mL)溶液に、40℃で2,2−ジメチルブチリルクロリド(0.37mL、2.7mmol)を加え、39分間撹拌した。この溶液に化合物7のピリジン溶液を加えてピリジン(1mL)で洗浄した。40℃で1時間43分撹拌し、2,2−ジメチルブチリルクロリド(61μL、0.44mmol)を加えてさらに3時間31分撹拌した。アセトニトリルを加えて固体を析出させ、氷冷した後にろ過し、化合物8(611mg)を白色固体として得た。
窒素雰囲気下、化合物8(600mg)と化合物1(194mg、0.54mmol)のピリジン(10mL)溶液に、25℃で2,2−ジメチルブチリルクロリド(0.25mL、1.8mmol)を加え、34分間撹拌した。その後0.1Mのヨウ素を含む、ピリジン、THF及び水の溶液(4.3mL、0.43mmol)を加え、58分間撹拌し、亜リン酸トリメチル(16μL、0.14mmol)を加えた。反応混合物にアセトニトリルを加えて固体を析出させ、減圧下濃縮し、アセトニトリルを加えて氷冷した後にろ過し、化合物9(634mg)を薄い肌色固体として得た。
1H−NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.093(s、3H)、0.10(s、3H)、0.85−0.92(m、18H)、1.09−1.89(m、105H)、2.01−2.52(m、6H)、2.67(brs、4H)、3.85−4.26(m、15H)、4.92(s、1H)、5.01(s、2H)、5.02(s、1H)、5.38(s、1H)、6.13(s、1H)、6.24−6.30(m、2H)、6.53(s、2H)、7.42(s、1H)、7.48(s、1H)、7.60(s、1H).
31P−NMR:(300MHz;CDCl3)δ−1.52、−1.33.
31P−NMR:(300MHz;CDCl3)δ60.46、61.07.
MS(ESI−):[M−H]− 1670.0959.
1H−NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.88(t、9H)、1.09−2.01(m、102H)、2.37−2.69(m、8H)、3.67−4.22(m、18H)、4.91−5.02(m、3H)、5.38(s、1H)、6.09(s、1H)、6.25(s、1H)、6.54(s、2H)、6.81−7.36(m、13H)、7.51(s、1H)、7.56(s、1H).
窒素雰囲気下、3’−O−(tert−ブチルジメチルシリル)チミジン(ベリー社製)(3.07g、8.6mmol)、無水コハク酸(1.29g、12.9mmol)の塩化メチレン(31g)溶液に、室温でトリエチルアミン(2.64g、26.1mmol)を加え、2時間33分撹拌した。反応混合物に2.0M リン酸−トリエチルアミン水溶液を加えて分液した。得られた有機層を2M リン酸−トリエチルアミン水溶液で2回分液により洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒を減圧下留去し、化合物12を白色泡状固体(3.73g)として得た。
1H−NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.10(s、3H)、0.12(s、3H)、0.90(s、9H)、1.23(t、9H)、1.90(s、3H)、2.05−2.14(m、1H)、2.36−2.43(m、1H)、2.51−2.86(m、4H)、3.00(q、6H)、4.10(brs、1H)、4.21−4.26(m、1H)、4.40−4.43(m、1H)、4.59−4.63(m、1H)、5.30(s、1H)、6.08(q、1H)、7.41(d、1H)、9.95(brs、1H).
窒素雰囲気下、化合物12(3.73g、8.2mmol)、3,4,5−トリス(オクタデシルオキシ)ベンジルアルコール(4.96g、5.4mmol)の塩化メチレン(224g)溶液に、室温で2−(1H−ベンゾトリアゾール−1−イル)−1,1,3,3−テトラメチルウロニウムヘキサフルオホスフェート[HBTU](4.13g、10.9mmol)、ジイソプロピルエチルアミン(1.42g、11.0mmol)、ジメチルアミノピリジン(1.37g、11.2mmol)を加え、16時間18分撹拌した。反応混合物にメタノールを加えて析出した固体をろ過し、化合物13(7.18g)を白色固体として得た。
1H−NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.080−0.085(m、6H)、0.86−0.89(m、18H)、1.18−1.84(m、96H)、1.94(d、3H)、2.05−2.14(m、1H)、2.27−2.34(m、1H)、2.64−2.74(m、4H)、3.91−3.98(m、6H)、4.04−4.07(m、1H)、4.20−4.39(m、3H)、5.01(s、2H)、6.25(t、1H)、6.52(s、2H)、7.27(d、1H)、8.01(brs、1H).
窒素雰囲気下、化合物13(6.06g、4.5mmol)のテトラヒドロフラン[THF](60g)溶液に、室温で1.0M テトラブチルアンモニウムフルオリド[TBAF]/THF溶液(4.5mL、4.9mmol)を加え、1時間23分撹拌した。反応混合物にメタノールを加えて析出した固体をろ過し、化合物14(5.45g)を白色固体として得た。
1H−NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.88(t、9H)、1.08−1.84(m、96H)、1.93(d、3H)、2.07−2.16(m、1H)、2.32−2.40(s、1H)、2.62−2.79(m、4H)、3.91−4.00(m、7H)、4.16(dd、1H)、4.27(quint、1H)、4.39(dd、1H)、5.01(q、2H)、6.25(t、1H)、6.53(s、2H)、7.24(d、1H).
窒素雰囲気下、亜リン酸ジフェニル(1.36g、5.8mmol)のピリジン(15mL)溶液に、室温で化合物14(1.05g、0.85mmol)のピリジン(10mL)溶液を加えて、ピリジン(5mL)で洗浄した。40℃で1時間22分撹拌し、水(5.13g)、トリエチルアミン(3.79g)を順に加えて14分間撹拌した。反応混合物にアセトニトリルを加えて析出した固体をろ過し、化合物15(1.09g)を白色固体として得た。
1H−NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.88(t、9H)、1.20−1.83(m、96H)、1.93(d、3H)、2.14−2.23(m、1H)、2.54−2.74(m、5H)、3.90−3.98(m、6H)、4.32−4.39(m、3H)、4.80−4.86(m、1H)、5.00(s、2H)、6.30(t、1H)、6.52(s、2H)、6.89(d、1H)、7.28(d、1H)、8.17(brs、1H)、12.32(brs、1H).
31P−NMR:(300MHz;CDCl3)δ3.86.
窒素雰囲気下、化合物15(250mg)と3’−O−(tert−ブチルジメチルシリル)チミジン(97mg、0.27mmol)のピリジン(5mL)溶液に、25℃で2,2−ジメチルブチリルクロリド(0.12mL、0.90mmol)を加え、29分間撹拌した。その後0.1Mのヨウ素を含む、ピリジン、THF及び水の溶液(2.2mL、0.22mmol)を加え、40分間撹拌し、亜リン酸トリメチル(4.3μL、36μmol)を加えた。反応混合物を減圧下濃縮し、アセトニトリルを加えて固体を析出させ、氷冷した後にろ過し、化合物16(270mg)を淡肌色固体として得た。
1H−NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.076(s、6H)、0.83−0.96(m、18H)、1.06−1.83(m、96H)、1.89(s、3H)、1.92(s、3H)、2.11−2.67(m、8H)、3.90−4.47(m、13H)、4.92(s、1H)、4.99(s、2H)、6.19−6.28(m、2H)、6.52(s、2H)、7.26(s、1H)、7.55(s、1H).
31P−NMR:(300MHz;CDCl3)δ−0.48.
MS(ESI−):[M−H]− 1654.1123.
窒素雰囲気下、化合物17(特開第2011−126993号に記載の方法に準じて合成した)(4.26g、4.8mmol)のニトロベンゼン(43g)溶液に、60℃でコハク酸モノエチルクロリド(1.36mL,9.7mmol)を加え、塩化アルミニウム(1.30g、9.8mmol)を加え、60℃で2時間2分撹拌した。室温まで冷却し、水で2回分液により洗浄した。得られた有機層にメタノールを加えて固体を析出させ、ろ過して淡黄色固体を得た。
この固体のTHF(15g)溶液に、水酸化カリウム(3.17g、48mmol)水溶液を加え、加熱還流下1時間25分撹拌した。水(2g)を加え、濃塩酸で水層のpHを7から8に調整した。塩化メチレン(38g)、水(12g)を加えて分液し、得られた有機層を減圧下濃縮した。得られた残渣をTHFに溶解させ、メタノールを加えて析出した固体をろ過し、化合物18(3.70g)を褐色固体として得た。
1H−NMR:(300MHz;C5D5N)δ0.88(t、9H)、1.11−1.88(m、96H)、3.17(t、2H)、3.62(t、2H)、4.04(t、4H)、4.11(t、2H)、6.53(s、2H).
MS(ESI−):[M−H]− 981.8884.
窒素雰囲気下、化合物18(3.56g、3.6mmol)、化合物1(1.98g、5.6mmol)の塩化メチレン(22g)溶液に、室温で2−(1H−ベンゾトリアゾール−1−イル)−1,1,3,3−テトラメチルウロニウムヘキサフルオホスフェート[HBTU](2.75g、7.3mmol)、ジイソプロピルエチルアミン(1.23mL、7.2mmol)、ジメチルアミノピリジン(0.91g、7.4mmol)を加え、1時間31分撹拌した。反応混合物に水を加えて分液した。得られた水層を塩化メチレンで分液し、得られた有機層を合わせて飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、減圧下濃縮した。ヘキサンを加えて固体を析出させ、ろ過して固体を除去した。得られた粗物をシリカゲルクロマトグラフィー(ヘキサン−酢酸エチル)で精製し、化合物19(2.85g)をオレンジ色油状物として得た。
1H−NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.13(s、6H)、0.88(t、9H)、0.93(s、9H)、1.14−1.87(m、96H)、1.92(d、3H)、2.05−2.14(m、1H)、2.39−2.45(m、1H)、2.67(t、2H)、3.09(t、2H)、3.88−3.94(m、8H)、4.11(d、1H)、5.27(d、1H)、6.05(s、2H)、6.35(q、1H)、7.55(d、1H)、8.01(d、1H).
MS(ESI+):[M+H]+ 1322.0619.
窒素雰囲気下、化合物19(22.5mg)の塩化メチレン(0.3mL)溶液に、フッ化水素−ピリジン(3μL)を加え、7時間3分撹拌し、トリメチルシリルクロリド[TMSCl](10μL)を加えた。ピリジン(0.1mL)を加え、亜リン酸(2.9mg)、2,2−ジメチルブチリルクロリド(20μL)を加え、化合物1(12.9mg)を加えた。2日間撹拌し、2,2−ジメチルブチリルクロリド(10μL)を加えてさらに1時間28分撹拌した。0.1Mのヨウ素を含むピリジン、THF及び水の溶液(1mL)を加え、1日間撹拌し、チオ硫酸ナトリウムが飽和したアセトニトリルと水の混合溶媒(セトニトリル/水=9/1(重量比))を加えてろ過し、化合物20を得た。
MS(ESI−):[M−H]− 1624.1104.
窒素雰囲気下、亜リン酸(329mg、4.0mmol)のピリジン(11mL)溶液に、40℃で2,2−ジメチルブチリルクロリド(0.33mL、2.4mmol)を加え、32分間撹拌した。この溶液に化合物21(国際公開第2014−077292号に記載の方法に準じて合成した)(492mg、0.39mmol)を加え、ピリジン(0.40mL)で洗浄した。40℃で3時間40分撹拌し、アセトニトリルを加えて固体を析出させ、氷冷した後にろ過し、化合物22(495mg)を淡黄色固体として得た。
1H−NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.88(t、9H)、1.17−1.83(m、96H)、1.97(d、3H)、2.18(s、3H)、2.33−2.44(m、2H)、2.54−2.58(m、2H)、2.73−2.79(m、2H)、3.95−4.05(m、6H)、4.20(t、1H)、4.27(d、2H)、5.37(d、1H)、6.38(t、1H)、7.10(s、2H)、6.94(d、1H)、7.76(d、1H).
31P−NMR:(300MHz;CDCl3)δ6.62.
窒素雰囲気下、化合物22(453mg)と化合物1(177mg、0.50mmol)のピリジン(9mL)溶液に、25℃で2,2−ジメチルブチリルクロリド(0.14mL、1.0mmol)を加え、28分間撹拌した。2,2−ジメチルブチリルクロリド(0.14mL、1.0mmol)を加えてさらに44分間撹拌し、その後0.1Mのヨウ素を含む、ピリジン、THF及び水の溶液(4.0mL、0.40mmol)を加え、1時間36分撹拌し、亜リン酸トリメチル(7.8μL、0.066mmol)を加えた。反応混合物にアセトニトリルを加えて固体を析出させ、減圧下濃縮し、アセトニトリルを加えて氷冷した後にろ過し、化合物23(478mg)を薄褐色固体として得た。
1H−NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.095−0.13(m、6H)、0.85−0.97(m、18H)、1.08−1.83(m、96H)、1.89−1.95(m、6H)、2.06−2.39(m、7H)、2.54−2.65(m、2H)、2.75−2.82(m、2H)、3.86−4.30(m、12H)、4.90−5.39(m、2H)、6.12−6.40(m、2H)、7.12(d、2H)、7.45−7.82(m、2H).
31P−NMR:(300MHz;CDCl3)δ−1.27.
窒素雰囲気下、化合物2(89mg、0.16mmol)、N−(2−ヒドロキシエチル)−3,4,5−トリス(オクタデシルオキシ)ベンズアミド(特開第2001−122889号に記載の方法に準じて合成した)(100mg、0.10mmol)の塩化メチレン(1mL)溶液に、40℃で2−(1H−ベンゾトリアゾール−1−イル)−1,1,3,3−テトラメチルウロニウムヘキサフルオホスフェート[HBTU](77mg、0.20mmol)、ジイソプロピルエチルアミン(35μL、0.21mmol)、ジメチルアミノピリジン(25mg、0.20mmol)を加え、1時間21分撹拌した。反応混合物にメタノールを加えて析出した固体をろ過し、化合物24(135mg、収率93%)を白色固体として得た。
1H−NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.096(s、3H)、0.11(s、3H)、0.88(t、9H)、0.91(s、9H)、1.12−1.84(m、96H)、1.92(d、3H)、2.04−2.14(m、1H)、2.34−2.41(m、1H)、2.68(brs、4H)、3.70(q、2H)、3.86(s、2H)、3.96−4.02(m、6H)、4.07(s、1H)、4.32(t、2H)、5.25(d、1H)、6.29−6.34(m、1H)、6.55(t、1H)、6.98(s、2H)、7.52(d、1H)、8.07(brs、1H).
MS(ESI+):[M+H]+ 1409.0956.
窒素雰囲気下、化合物24(99mg、0.070mmol)の塩化メチレン(0.5mL)溶液に、40℃でフッ化水素−ピリジン(8.3μL、0.32mmol)を加え、3時間34分撹拌し、ヘキサメチルジシロキサン[TMS2O](53mL、0.25mmol)を加えた。ピリジン(1mL)を加え、減圧下濃縮した。再度ピリジン(1mL)を加え、減圧下濃縮し、ピリジン(0.8mL)を加え、脱保護された化合物のピリジン溶液とした。
窒素雰囲気下、亜リン酸(57mg、0.693mmol)のピリジン(2mL)溶液に、40℃で2,2−ジメチルブチリルクロリド(59μL、0.43mmol)を加え、31分間撹拌した。この混合物に上記の脱保護された化合物のピリジン溶液を加えてピリジン(0.5mL)で洗浄した。40℃で1時間12分撹拌し、2,2−ジメチルブチリルクロリド(15μL、0.11mmol)を加えてさらに1時間17分撹拌した。反応混合物にアセトニトリルを加えて固体を析出させ、氷冷した後にろ過し、化合物25(78mg)を白色固体として得た。
1H−NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.88(t、9H)、1.18−1.83(m、96H)、1.91(s、3H)、2.19−2.36(m、2H)、2.65(brs、4H)、3.69(brs、2H)、3.95−4.01(m、6H)、4.13(s、1H)、4.17(s、1H)、4.20(s、1H)、4.32(t、2H)、5.28(d、1H)、6.29(q、1H)、6.80(brs、1H)、6.88(d、1H)、7.00(s、2H)、7.53(s、1H).
31P−NMR:(300MHz;CDCl3)δ6.86.
MS(ESI−):[M−H]− 1356.9650.
窒素雰囲気下、化合物25(69mg)と化合物1(28mg、78mmol)のピリジン(1.4mL)溶液に、25℃で2,2−ジメチルブチリルクロリド(35μL、0.25mmol)を加え、48分間撹拌した。その後0.1Mのヨウ素を含む、ピリジン、THF及び水の溶液(0.6mL、0.060mmol)を加え、1時間撹拌し、亜リン酸トリメチル(1.2μL、0.010mmol)を加えた。反応混合物を減圧下濃縮し、アセトニトリルを加えて氷冷した後にろ過し、化合物26(76mg)を淡褐色固体として得た。
1H−NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.087−0.12(m、6H)、0.85−0.95(m、18H)、1.17−1.78(m、96H)、1.86−1.89(m、6H)、2.02−2.65(m、8H)、3.67−4.30(m、16H)、4.92−5.36(m、2H)、6.12−6.32(m、2H)、6.90(brs、1H)、6.99−7.03(m、2H)、7.45−7.60(m、2H).
31P−NMR:(300MHz;CDCl3)δ−1.11.
MS(ESI−):[M−H]− 1755.1612.
1H−NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.88(t、9H)、1.17−1.82(m、96H)、1.86(s、3H)、2.23−2.34(m、4H)、2.64(brs、4H)、3.67−4.31(m、16H)、5.04(brs、1H)、5.41(s、1H)、6.13(t、1H)、6.29(t、1H)、6.97−7.00(m、1H)、7.02(s、2H)、7.26−7.63(m、2H)、9.28(brs、2H).
31P−NMR:(300MHz;CDCl3)δ−0.069.
MS(ESI−):[M−H]− 1711.1424.
1H−NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.87(t、9H)、1.08−1.99(m、102H)、2.23−2.63(m、8H)、3.67(brs、2H)、3.96(t、6H)、4.15−4.27(m、6H)、5.08(brs、1H)、5.35(s、1H)、6.16(s、1H)、6.24(s、1H)、6.83(d、1H)、7.04(s、2H)、7.13(brs、1H)、7.47(s、1H)、7.53(s、1H)、9.86(brs、2H).
31P−NMR:(300MHz;CDCl3)δ−1.59、5.89.
窒素雰囲気下、N−(2−ヒドロキシエチル)−N−メチル−3,4,5−トリス(オクタデシルオキシ)ベンズアミド(特開第2001−253896号に記載の方法に準じて合成した)(5.0g、5.1mmol)と無水コハク酸(1.0g、10mmol)の塩化メチレン(50g)溶液に、室温でトリエチルアミン(2.1mL、15mmol)を加え、1時間57分撹拌した。その後、反応混合物をアセトニトリル(513g)に加えて固体を析出させた後にろ過し、化合物31(5.3g、収率95%)を白色固体として得た。
1H−NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.86−0.90(m、9H)、1.09−1.84(m、96H)、2.65(s、4H)、3.05(s、3H)、3.76(brs、2H)、3.96(t、6H)、4.38(brs、2H)、6.58(s、2H).
MS(ESI):[M−H]− 1082.9343.
窒素雰囲気下、化合物31(1.0g、0.92mmol)と化合物1(0.51g、1.4mmol)の塩化メチレン(25mL)溶液に、室温でHBTU(0.70g、1.8mmol)、ジイソプロピルエチルアミン(0.31mL、1.8mmol)、DMAP(0.23g、1.9mmol)を加え、1時間9分撹拌した。その後、反応混合物をメタノール(102g)に加えて析出した固体をろ過し、化合物32(1.3g、収率99%)を白色固体として得た。
1H−NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.13(s、6H)、0.86−0.94(m、18H)、1.09−1.84(m、96H)、1.92(s、3H)、2.14−2.43(m、2H)、2.66(brs、4H)、3.06(s、3H)、3.68(brs、2H)、3.90−3.98(m、8H)、4.10(s、1H)、4.34(brs、2H)、5.27(d、1H)、6.34(q、1H)、6.57(s、2H)、7.54(s、1H)、8.07(brs、1H).
MS(ESI−):[M−H]− 1421.1060.
窒素雰囲気下、化合物32(1.2g、0.86mmol)のTHF(10mL)溶液に、室温で1.0M TBAF/THF溶液(0.95mL、0.95mmol)を加え、1時間10分撹拌した。その後、反応混合物をメタノール(123g)に加えて析出した固体をろ過し、化合物33(1.2g、定量的)を薄い肌色固体として得た。
1H−NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.88(t、9H)、1.03−1.84(m、96H)、1.92(s、3H)、2.36−2.41(m、2H)、2.65(brs、4H)、3.06(s、3H)、3.75(brs、2H)、3.86(brs、2H)、3.93−3.98(m、6H)、4.07(d、1H)、4.36(brs、2H)、5.30−5.34(m、1H)、6.21(t、1H)、6.59(s、2H)、7.51(s、1H)、8.21(brs、1H).
MS(ESI−):[M−H]− 1307.0241.
窒素雰囲気下、亜リン酸(0.63g、7.6mmol)のピリジン(20mL)溶液に、40℃で2,2−ジメチルブチリルクロリド(0.68mL、5.0mmol)を加え、32分間撹拌した。この溶液に化合物33(1.0g、0.77mmol)を加えて40℃で3時間3分撹拌し、2,2−ジメチルブチリルクロリド(52μL、0.38mmol)を加えてさらに1時間4分撹拌した。その後、反応混合物をアセトニトリル(210g)に加えて析出した固体をろ過し、化合物34(1.0g)を白色固体として得た。
1H−NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.88(t、9H)、1.10−1.81(m、96H)、1.91(s、3H)、2.33−2.37(m、2H)、2.66(brs、4H)、3.06(s、3H)、3.68−3.80(brs、2H)、3.94−4.36(m、11H)、6.36(q、1H)、6.59(s、2H)、6.90(d、1H)、7.60(s、1H).
31P−NMR:(300MHz;CDCl3)δ6.56.
MS(ESI−):[M−H]− 1370.9904.
窒素雰囲気下、化合物34(106mg)と化合物1(43mg、0.12mmol)のピリジン(2.0mL)溶液に、25℃で2,2−ジメチルブチリルクロリド(49μL、0.36mmol)を加え、30分間撹拌した。その後0.05Mのヨウ素を含む、ピリジンと水の溶液(2.0mL、0.10mmol)を加え、38分間撹拌し、さらに0.05Mのヨウ素を含むピリジンと水の溶液(0.13mL、0.0063mmol)を加え、10分間拌した。その後、亜リン酸ジメチル(3.3μL、0.036mmol)を加え、100℃で3時間33分撹拌した。反応混合物を減圧下濃縮し、ピリジン(5.0mL)を加えて、再度減圧下濃縮した後に、ピリジン(1.5mL)を加えた。
窒素雰囲気下、亜リン酸(64mg、0.77mmol)のピリジン(2.0mL)溶液に、40℃で2,2−ジメチルブチリルクロリド(64μL、0.46mmol)を加え、28分間撹拌した。この溶液に上記の脱保護された化合物を含む反応混合物を加えて40℃で1時間5分撹拌し、2,2−ジメチルブチリルクロリド(20μL、0.14mmol)を加えてさらに1時間12分撹拌した。その後、反応混合物をアセトニトリル(51g)に加えて析出した固体を析出ろ過し、化合物35(0.12g)を褐色固体として得た。
1H−NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.88(t、9H)、1.15−1.89(m、102H)、2.23−2.38(m、4H)、2.66(brs、4H)、3.05(s、3H)、3.72(brs、2H)、3.93−4.35(m、14H)、5.11(brs、1H)、5.37(s、1H)、6.17(brs、1H)、6.28(t、1H)、6.58(s、2H)、6.83(d、1H)、7.46(s、1H)、7.54(s、1H)、9.61(brs、2H).
31P−NMR:(300MHz;CDCl3)δ−1.52、6.01.
MS(ESI−):[M−H]− 1675.0476.
MS(ESI−):[M−H]− 1700.0868.
MS(ESI+):[M+H]+ 1726.1283.
MS(ESI−):[M−H]− 1706.1275.
窒素雰囲気下、5’−O−(tert−ブチルジメチルシリル)−2’−デオキシシチジン(ジャーナルオブオーガニックケミストリー、2011年、76巻、105頁−126頁に記載の方法に準じて合成した)(2.5g、7.3mmol)と化合物31(5.3g、4.9mmol)の塩化メチレン(155mL)及びDMF(25mL)の混合溶液に、40℃で1−ヒドロキシベンゾトリアゾール[HOBt](無水)(0.74g、5.5mmol)を加え、続いて1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩[WSC・HCl](1.9g、9.9mmol)を加えて、1時間40分撹拌した。反応混合物を減圧下濃縮した後にメタノール(503g)に加えて固体を析出させた後にろ過し、化合物39(6.8g、収率98%)を黄色固体として得た。
1H−NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.09−0.10(m、6H)、0.84−0.90(m、18H)、1.20−1.81(m、96H)、2.12−2.21(m、1H)、2.28−2.36(m、1H)、2.61−2.77(m、5H)、3.05(s、3H)、3.76(brs、2H)、3.81−3.97(m、8H)、4.07(q、1H)、4.37(brs、2H)、4.40−4.45(m、1H)、6.29(t、1H)、6.57(s、2H)、7.31(d、1H)、8.31(d、1H)、8.88(brs、1H).
MS(ESI−):[M−H]− 1406.1107.
窒素雰囲気下、化合物39(6.7g、4.8mmol)、DMAP(0.062g、0.50mmol)、レブリン酸(0.86g、7.4mmol)のTHF(69g)溶液に、室温でWSC・HCl(1.4g、7.5mmol)を加え、50分間撹拌した。その後、DMAP(0.26g、2.1mmol)を加えて、室温で3日間撹拌した。反応混合物をろ過後に、得られたろ液を減圧下濃縮し、THF(38g)を加えて溶液とした後、アセトニトリル(505g)に加えて析出した固体をろ過し、化合物40(6.7g、収率93%)を淡黄色固体として得た。
1H−NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.09(s、6H)、0.86−0.90(m、18H)、1.26−1.81(m、96H)、2.01−2.13(m、2H)、2.20(s、3H)、2.52−2.80(m、8H)、3.06(s、3H)、3.77(brs、2H)、3.86−3.98(m、8H)、4.20(s、1H)、4.38(brs、2H)、5.26(d、1H)、6.32−6.37(m、1H)、6.57(s、2H)、7.33(d、1H)、8.27(d、1H)、9.17(brs、1H).
MS(ESI−):[M−H]− 1504.1412.
窒素雰囲気下、化合物37(6.5g、4.3mmol)、酢酸(2.9mL、50mmol)のTHF(71g)溶液に、30℃で1.0M TBAF/THF溶液(28mL、28mmol)を加え、4時間53分撹拌した。その後、反応混合物をメタノール(531g)に加えて析出した固体をろ過し、化合物41(6.0g、定量的)を白色固体として得た。
1H−NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.88(t、9H)、1.20−1.80(m、96H)、2.20(s、3H)、2.38−2.80(m、10H)、3.05(s、3H)、3.78(brs、2H)、3.88−3.98(m、8H)、4.18(d、1H)、4.39(brs、2H)、5.36(quint、1H)、6.20(dd、1H)、6.59(s、2H)、7.21−7.31(m、1H)、8.19(d、1H).
MS(ESI−):[M−H]− 1390.0541.
窒素雰囲気下、亜リン酸(1.20g、14.6mmol)のピリジン(40mL)溶液に、40℃で2,2−ジメチルブチリルクロリド(1.28mL、9.3mmol)を加え、30分間撹拌した。この溶液に化合物41(2.0g、1.4mmol)を加えて40℃で1時間23分撹拌した。その後、反応混合物をアセトニトリルに加えて析出した固体をろ過し、化合物42(2.2g)を白色固体として得た。
1H−NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.88(t、9H)、1.26−1.83(m、96H)、2.19(s、3H)、2.38−2.88(m、10H)、3.06(s、3H)、3.75(brs、2H)、3.92−4.35(m、11H)、5.37(d、1H)、6.17(t、1H)、6.58(s、2H)、6.88(d、1H)、7.26−7.28(m、1H)、8.51(d、1H).
31P−NMR:(300MHz;CDCl3)δ5.73.
MS(ESI−):[M−H]− 1454.0237.
窒素雰囲気下、化合物42(96mg)と化合物1(36mg、0.10mmol)のピリジン(2.0mL)溶液に、40℃で2,2−ジメチルブチリルクロリド(45μL、0.33mmol)を加え、23分間撹拌した。その後0.05Mのヨウ素を含む、ピリジンと水の溶液(2.6mL、0.13mmol)を加え、1時間29分撹拌した。その後、亜リン酸ジメチル(3.0μL、0.033mmol)を加え、水(0.26mL,14.4mmol)を加えた後、70℃で15時間55分撹拌した。反応混合物を減圧下濃縮し、化合物43を主生成物として得た。
MS(ESI−):[M−H]− 1694.1110.
窒素雰囲気下、亜リン酸(0.70g、8.5mmol)のピリジン(18mL)溶液に、40℃で2,2−ジメチルブチリルクロリド(0.80mL、5.8mmol)を加え、39分間撹拌した。この溶液に前記濃縮物を加えて40℃で2時間37分撹拌した。その後、反応混合物をアセトニトリル(518g)に加えて析出した固体をろ過し、化合物44(1.0g)をうす肌色固体として得た。
1H−NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.88(t、9H)、1.15−1.83(m、96H)、1.90(s、3H)、2.18(s、3H)、2.46−2.95(m、12H)、3.06(s、3H)、3.68(brs、2H)、3.92−4.34(m、14H)、5.02(s、1H)、5.35(s、1H)、6.16(t、1H)、6.25(t、1H)、6.59(s、2H)、6.82(d、1H)、7.07(d、1H)、7.46(s、1H)、8.65(d、1H).
31P−NMR:(300MHz;CDCl3)δ−2.16、4.97.
MS(ESI−):[M−H]− 1758.0754.
窒素雰囲気下、化合物42(0.94g)と5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)チミジン(東京化成工業社製)(0.49g、0.91mmol)のピリジン(20mL)溶液に、25℃で縮合剤として2,2−ジメチルブチリルクロリド(0.42mL、3.0mmol)を加え、20分間撹拌した(カップリング反応)。その後0.1Mのヨウ素を含む、ピリジン、THF及び水の溶液(9.1mL、0.91mmol)を加え、20分間撹拌した。その後、オルトギ酸トリメチル(1.3mL、12mmol)を加えて25℃で34分間撹拌し、反応混合物を減圧下濃縮した。トルエン(30g)を加えて減圧下濃縮する操作を3回繰り返した後に、塩化メチレン(10mL)を加え、不溶物を吸引ろ過で除去し、塩化メチレン(5mL)で2回抽出した。この溶液に、ピロール(0.13mL、1.8mmol)、ホスホン酸(0.73g、9.1mmol)を室温で加え、29分間撹拌した。ピリジン(2.8mL)を室温で加えた後、2,2−ジメチルブチリルクロリド(0.83mL、6.0mmol)を3分割して10分間おきに加えて1時間16分撹拌し、2,2−ジメチルブチリルクロリド(0.14mL、1.0mmol)を加えてさらに45分間撹拌した。その後、反応混合物をアセトニトリル(396g)に加えて析出した固体をろ過し、化合物44(1.0g)を薄い灰色固体として得た。
MS(ESI−):[M−H]− 1758.0512.
窒素雰囲気下、化合物44(0.98g)と5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)チミジン(東京化成工業社製)(0.45g、0.83mmol)のピリジン(20mL)溶液に、25℃で2,2−ジメチルブチリルクロリド(0.38mL、2.8mmol)を加え、27分間撹拌した。その後0.1Mのヨウ素を含む、ピリジン、THF及び水の溶液(8.3mL、0.83mmol)を加え、44分間撹拌した。その後、オルトギ酸トリメチル(1.2mL、11mmol)を加えて25℃で42分間撹拌し、反応混合物を減圧下濃縮した。トルエン(30g)を加えて減圧下濃縮する操作を3回繰り返した後に、塩化メチレン(10mL)を加え、不溶物を吸引ろ過で除去し、塩化メチレン(5mL)で2回抽出した。この溶液に、ピロール(0.12mL、1.7mmol)、ホスホン酸(0.69g、8.3mmol)を20℃で加え、30分間撹拌した。ピリジン(2.8mL)を25℃で加えた後、2,2−ジメチルブチリルクロリド(0.76mL、5.5mmol)を3分割して10分間おきに加えて39分間撹拌し、2,2−ジメチルブチリルクロリド(0.14mL、1.0mmol)を加えてさらに49分間撹拌した。その後、反応混合物をアセトニトリル(396g)に加えて析出した固体をろ過し、化合物45(1.2g)を薄灰色固体として得た。
MS(ESI+):[M+H]+ 2064.1191.
窒素雰囲気下、化合物45(1.16g)と5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)チミジン(東京化成工業社製)(0.43g、0.81mmol)のピリジン(20mL)溶液に、25℃で2,2−ジメチルブチリルクロリド(0.37mL、2.7mmol)を加え、29分間撹拌した。その後0.1Mのヨウ素を含む、ピリジン、THF及び水の溶液(8.1mL、0.81mmol)を加え、25分間撹拌した。その後、オルトギ酸トリメチル(1.2mL、11mmol)を加えて25℃で21分間撹拌し、反応混合物を減圧下濃縮した。トルエン(30g)を加えて減圧下濃縮する操作を3回繰り返した後に、塩化メチレン(10mL)を加え、不溶物を吸引ろ過で除去し、塩化メチレン(5mL)で2回洗浄した。この溶液に、ピロール(0.11mL、1.6mmol)及びホスホン酸(0.65g、8.1mmol)を27〜30℃で加え、24分間撹拌した。ピリジン(3.0mL)を22〜28℃で加えた後、2,2−ジメチルブチリルクロリド(0.74mL、5.4mmol)を3分割して10分間おきに加えて41分間撹拌し、2,2−ジメチルブチリルクロリド(0.49mL、3.6mmol)を加えてさらに1時間20分撹拌した。その後、反応混合物をアセトニトリル(397g)に加えて析出した固体を析出ろ過し、化合物46(1.33g)を薄い灰色固体として得た。
MS(ESI+):[M+H]+ 2368.1574.
MS(ESI−):[M−H]− 1810.2131.
MS(ESI−):[M−H]− 1774.0443.
MS(ESI−):[M−H]− 1823.1213.
MS(ESI−):[M−H]− 2075.2896.
MS(ESI−):[M−H]− 2316.2547.
MS(ESI−):[M−H]− 1742.1016.
1H−NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.88(t、9H)、1.26−1.83(m、96H)、1.92(s、3H)、2.32−2.36(m、2H)、2.67(s、4H)、3.89−3.98{m、6H+3H(N−メチルイミダゾール)}、4.18−4.21(m、3H)、5.02(s、2H)、5.41(t、1H)、6.38(t、1H)、6.53(s、2H)、6.93(d、1H)、7.04(s、1H、N−メチルイミダゾール)、7.31(s、1H、N−メチルイミダゾール)、7.73(d、1H)、8.84(s、1H、N−メチルイミダゾール).
31P−NMR:(300MHz;CDCl3)δ5.74.
1H−NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.88(t、9H)、1.09−1.84(m、96H)、1.96(s、3H)、2.01(s、3H、N−メチルモルホリン)、2.31−2.36(m、2H)、2.68(s、4H)、2.76(s、4H、N−メチルモルホリン)、3.90−3.98{m、6H+4H(N−メチルモルホリン)}、4.10−4.17(m、3H)、5.02(s、2H)、5.41(t、1H)、6.38(t、1H)、6.53(s、2H)、6.89(d、1H)、7.71(d、1H).
31P−NMR:(300MHz;CDCl3)δ5.88.
1H−NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.88(t、9H)、1.13−1.80(m、96H)、2.17−2.85(m、15H)、3.03(s、3H)、3.68−4.33(m、16H)、5.20−5.35(m、2H)、6.07−6.17(m、2H)、6.43−6.53(m、2H)、6.56(s、2H)、7.24−8.78(m、14H).
31P−NMR:(300MHz;CDCl3)δ6.10、25.20、25.30.
MS(ESI+):[M+H]+ 1965.1202.
MS(ESI+):[M+H]+ 2180.2862.
MS(ESI+):[M+H]+ 2217.2981.
MS(ESI+):[M+H]+ 1788.1262.
MS(ESI+):[M+H]+ 2191.3401.
MS(ESI+):[M+H]+ 1839.1373.
1H−NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.88(t、3H)、1.08−1.64(m、20H)、2.88(t、2H)、7.75−7.80(m、2H)、7.89−7.95(m、2H).
MS(ESI+):[M+H]+ 348.2003.
1H−NMR:(300MHz;CDCl3)δ7.27−7.38(m、1H)、7.40−7.48(m、1H)、7.69−7.77(m、1H)、7.82−7.94(m、3H)、7.99−8.62(m、2H).
MS(ESI+):[M+H]+ 313.0090.
MS(ESI+):[M+H]+ 2295.4570.
MS(ESI+):[M+H]+ 2277.2747.
窒素雰囲気下、N4−ベンゾイル−3’−O−(tert−ブチルジフェニルシリル)−5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−2’−デオキシシチジン(バイオケミストリー、2004年、43巻、6167−6181頁に記載の方法に準じて合成した)(6.5g、6.8mmol)のメタノール(301g)溶液に、室温で40%メチルアミン水溶液(5.8mL、69mmol)を加え、23時間26分撹拌した。反応混合物を減圧下濃縮した後にシリカゲルクロマトグラフィー(クロロホルム−メタノール)で精製し、目的物(5.1g、収率98%)を泡状固体として得た。
1H−NMR:(300MHz;CDCl3)δ1.00(s、9H)、1.95−1.97(m、1H)、2.51−2.59(m、1H)、3.02−3.07(m、1H)、3.25−3.30(m、1H)、3.77(s、6H)、4.44−4.49(m、1H)、5.22(d、1H)、6.35(t、1H)、6.71−6.75(m、4H)、7.08−7.41(m、16H)、7.53−7.59(m、4H)、7.77(d、1H).
MS(ESI+):[M+H]+ 768.3391.
窒素雰囲気下、3’−O−(tert−ブチルジフェニルシリル)−5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−2’−デオキシシチジン(2.5g、3.2mmol)と化合物31(2.2g、2.0mmol)の塩化メチレン(70mL)及びピリジン(14mL)の混合溶液に、40℃でHOBt(無水)(0.35g、2.6mmol)を加え、続いてWSC・HCl(0.92g、4.8mmol)を加えて2時間26分撹拌した。反応混合物中の不溶物をろ過により除去し、減圧下濃縮した後にメタノール(250g)に加えて固体を析出させた後にろ過し、化合物62(3.5g)を白色固体として得た。
1H−NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.88(s、9H)、1.01(s、9H)、1.26−1.81(m、96H)、1.91−1.99(m、1H)、2.68−2.71(m、5H)、3.04−3.08(m、4H)、3.25−3.29(m、1H)、3.77(brs、8H)、3.95(t、6H)、4.13−4.46(m、4H)、6.30(t、1H)、6.56(s、2H)、6.72−6.75(m、4H)、6.91(d、1H)、7.08−7.42(m、15H)、7.53−7.59(m、4H)、8.05(d、1H)、8.92(brs、1H).
MS(ESI+):[M+H]+ 1834.2754.
窒素雰囲気下、化合物62(3.5g、1.9mmol)の塩化メチレン(35g)溶液に室温でピロール(0.39mL、5.7mmol)を加え、10℃でジクロロ酢酸(1.6mL、19mmol)を加え、1時間53分撹拌した。ピリジン(0.77mL、9.5mmol)を加え、反応混合物をメタノール(351g)に加えて析出した固体をろ過し、化合物63(2.8g)を白色固体として得た。
1H−NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.88(s、9H)、1.08(s、9H)、1.26−1.82(m、96H)、2.16−2.25(m、1H)、2.51−2.59(m、1H)、2.69−2.75(m、4H)、3.04(s、3H)、3.19−3.24(m、1H)、3.61−3.65(m、3H)、3.92−4.43(m、10H)、6.21(t、1H)、6.57(s、2H)、7.21(d、1H)、7.35−7.45(m、6H)、7.60−7.66(m、4H)、8.03(d、1H)、9.02(brs、1H).
MS(ESI+):[M+H]+ 1532.1383.
窒素雰囲気下、亜リン酸(0.39g、4.7mmol)のピリジン(14mL)溶液に、40℃で2,2−ジメチルブチリルクロリド(0.41mL、3.0mmol)を加え、30分間撹拌した。この溶液に30℃で化合物63(0.70g、0.46mmol)を加えて30℃で46分間撹拌した。その後、2,2−ジメチルブチリルクロリド(0.38mL、2.7mmol)を加え、58分間撹拌した。反応混合物をアセトニトリル(200g)に加えて析出した固体をろ過し、化合物64(0.70g)を白色固体として得た。
MS(ESI+):[M+H]+ 1596.1098.
窒素雰囲気下、化合物64(0.70g)と5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)チミジン(0.37g、0.68mmol)のピリジン(20mL)溶液に、室温で炭酸ビスペンタフルオロフェニル(0.57g、1.4mmol)を加え、24分間撹拌した。その後N−[(2−シアノエチル)チオ]フタルイミド(0.17g、0.71mmol)を加え、16時間54分間撹拌した。反応混合物をメタノール(200g)に加えて析出した固体をろ過し、化合物65(0.88g)を得た。
1H−NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.88(s、9H)、1.07(s、9H)、1.25−2.01(m、97H)、2.33−2.93(m、10H)、3.04(s、3H)、3.32−4.34(m、24H)、5.08−5.18(m、1H)、6.25−6.36(m、2H)、6.58(s、2H)、6.82−6.85(m、4H)、7.22−7.65(m、21H)、7.79−7.85(m、1H)、8.96(brs、1H)、9.28(brs、1H).
31P−NMR:(300MHz;CDCl3)δ27.08、27.20.
MS(ESI+):[M+H]+ 2207.3152.
MS(ESI+):[M+H]+ 1969.2010.
窒素雰囲気下、化合物42(1.5g)のピリジン(20mL)溶液に5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)チミジン(東京化成工業社製)(0.34g、0.62mmol)、炭酸ビスペンタフルオロフェニル(0.74g、1.9mmol)を加え、22分間撹拌した。その後N−[(2−シアノエチル)チオ]フタルイミド(0.19g、0.81mmol)を加え、15時間29分間撹拌して、化合物82を含む反応溶液を得た。その後、亜リン酸トリエチル(90μL、0.52mmol)、水(0.28mL、16mmol)を加えて25℃で1時間撹拌し、反応混合物を減圧下濃縮した。トルエン(25g)を加えて減圧下濃縮の操作を3回繰り返した後に、塩化メチレン(20mL)を加え、ピロール(0.11mL、1.6mmol)、ホスホン酸(1.0g、13mmol)を10℃で加え、1時間15分間撹拌した。ピリジン(3.0mL)を加えた後、室温で2,2−ジメチルブチリルクロリド(0.96mL、7.0mmol)を4分割して10分間おきに加えて33分間撹拌し、2,2−ジメチルブチリルクロリド(0.48mL、3.5mmol)を加えてさらに35分間撹拌した。その後、反応混合物をアセトニトリル(200g)に加えて析出した固体をろ過し、化合物67(1.9g)を白色固体として得た。
MS(ESI+):[M+H]+ 1829.0819.
工程1と同様の条件で、化合物42の代わりに化合物67を、5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)チミジンの代わりにN4−ベンゾイル−5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−2’−デオキシシチジン(東京化成工業社製)(0.60g)を用いて反応を実施し、化合物68(0.97g)を白色固体として得た。
MS(ESI+):[M+H]+ 2291.1664.
窒素雰囲気下、化合物68(0.96g)とN2−イソブチリル−5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−2’−デオキシグアノシン(東京化成工業社製)(0.51g、0.80mmol)のピリジン(20mL)溶液に、25℃で炭酸ビスペンタフルオロフェニル(0.65g、1.7mmol)を加え、10分間撹拌した。反応混合物を減圧下濃縮して、化合物69を得た。
MS(ESI+):[M+H]+ 2912.4312.
MS(ESI+):[M+H]+ 2817.3753.
MS(ESI+):[M+H]+ 2906.4242.
MS(ESI+):[M+H]+ 2930.4184.
窒素雰囲気下、化合物42(1.2g)のピリジン(20mL)溶液に5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)チミジン(東京化成工業社製)(0.44g、0.80mmol)、炭酸ビスペンタフルオロフェニル(0.67g、1.7mmol)を加え、23分間撹拌した。その後N−[(2−シアノエチル)チオ]フタルイミド(0.19g、0.83mmol)を加え、1時間32分間撹拌した。その後、亜リン酸トリエチル(90μL、0.52mmol)、水(0.28mL、16mmol)を加えて25℃で50分間撹拌し、反応混合物を減圧下濃縮した。トルエン(25g)を加えて減圧下濃縮する操作を3回繰り返した後に、塩化メチレン(20mL)を加え、ピロール(0.11mL、1.6mmol)、ジクロロ酢酸(0.43mL、5.3mmol)を10℃で加え、2時間27分間撹拌した。ピリジン(3.0mL)を加えて室温まで昇温し、反応混合物をアセトニトリル(200g)に加えて析出した固体をろ過し、化合物95(0.72g)を薄い肌色固体として得た。
1H−NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.88(t、9H)、1.25−1.89(m、99H)、2.20(s、3H)、2.21−2.89(m、13H)、3.06−3.20(m、5H)、3.21−3.98(m、11H)、4.19−4.4.44(m、6H)、5.32−5.34(m、2H)、6.10−6.23(m、2H)、6.58(s、2H)、7.41(t、1H)、7.51(d、1H)、7.95−8.08(m、1H)、8.70−9.60(m、2H).
31P−NMR:(300MHz;CDCl3)δ27.55、27.94.
MS(ESI+):[M+H]+ 1765.1162.
窒素雰囲気下、得られた化合物95(0.72g)の塩化メチレン(15mL)とピリジン(2.3mL)の混合溶液に室温でホスホン酸(0.56g、6.8mmol)を加え、2,2−ジメチルブチリルクロリド(0.56mL、4.1mmol)を4分割して10分間おきに加えて31分間撹拌し、2,2−ジメチルブチリルクロリド(0.42mL、3.1mmol)を加えてさらに23分間撹拌した。その後、反応混合物をアセトニトリル(203g)に加えて析出した固体をろ過し、化合物67(0.72g)を白色固体として得た。
窒素雰囲気下、化合物67(0.72g)のピリジン(19mL)溶液にN4−ベンゾイル−5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−2’−デオキシシチジン(東京化成工業社製)(0.49g、0.77mmol)、炭酸ビスペンタフルオロフェニル(0.60g、1.5mmol)を加え、22分間撹拌した。その後、硫化剤としてN−[(2−シアノエチル)チオ]フタルイミド(0.18g、0.76mmol)を加え、1時間10分間撹拌した。その後、反応混合物を2分割し、一方を減圧下濃縮した。トルエン(10g)を加えて減圧下濃縮の操作を3回繰り返した後に、塩化メチレン(10mL)を加え、ピロール(51μL、0.74mmol)、ジクロロ酢酸(0.20mL、2.4mmol)を10℃で加え、2時間10分撹拌した。ピリジン(1.2mL)を加えて室温まで昇温し、反応混合物をさらに2分割し、一方をアセトニトリル(50g)に加えて析出した固体を析出ろ過し、化合物77(0.18g)を薄い肌色固体として得た。
窒素雰囲気下、得られた化合物77(0.18g)の塩化メチレン(3.0mL)とピリジン(0.50mL)の混合溶液に室温でホスホン酸(0.12g、1.5mmol)を加え、2,2−ジメチルブチリルクロリド(0.13mL、0.96mmol)を4分割して10分間おきに加えて57分間撹拌し、2,2−ジメチルブチリルクロリド(33μL、0.24mmol)を加えてさらに40分間撹拌した。その後、反応混合物をアセトニトリル(51g)に加えて析出した固体をろ過し、化合物68(0.15g)を白色固体として得た。
工程2と同様の条件で、化合物67の代わりに化合物68を、N4−ベンゾイル−5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−2’−デオキシシチジンの代わりにN2−イソブチリル−5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−2’−デオキシグアノシン(東京化成工業社製)(86mg)を用いて、反応を実施し、化合物73(0.12g)を白色固体として得た。
MS(ESI+):[M+H]+ 2759.2472.
工程2と同様の条件で、化合物67の代わりに化合物73を、N4−ベンゾイル−5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−2’−デオキシシチジンの代わりにN6−ベンゾイル−5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−2’−デオキシアデノシン(東京化成工業社製)(66mg)を用いて、反応を実施した。硫化後の反応混合物を減圧下濃縮して、化合物74を主生成物として得た。
MS(ESI+):[M+2H]2+ 1742.2655.
MS(ESI+):[M+2H]2+ 1693.2314.
MS(ESI+):[M+H]+ 1969.2134.
MS(ESI+):[M+H]+ 2129.1466.
MS(ESI+):[M+H]+ 1620.1583.
MS(ESI+):[M+H]+ 1636.1879.
1H−NMR:(300MHz;CDCl3)δ2.21(s、3H)、2.58−2.66(m、3H)、2.76−2.81(m、2H)、2.90−3.00(m、1H)、3.42(d、2H)、3.78(s、6H)、4.29(s、1H)、5.51(d、1H)、5.96(s、2H)、6.43−6.48(m、1H)、6.80(d、4H)、7.18−7.44(m、9H)、7.97(s、1H)、8.28(s、1H).
MS(ESI+):[M+H]+ 652.2741.
1H−NMR:(300MHz;CDCl3)δ2.20(s、3H)、2.49−2.94(m、6H)、3.39(s、2H)、3.77(d、6H)、4.24(s、1H)、5.52(d、1H)、6.07(s、2H)、6.19−6.24(m、1H)、6.80(d、4H)、7.19−7.40(m、9H)、7.63(s、1H)、11.97(brs、1H).
MS(ESI+):[M+H]+ 668.2715.
MS(ESI+):[M+H]+ 1734.1983.
1H−NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.88(t、9H)、1.26−1.81(m、96H)、2.19(s、3H)、2.20−2.60(m、7H)、2.75−2.80(m、2H)、2.94−3.06(m、4H)、3.37(d、2H)、3.38−3.79(m、8H)、3.95(t、6H)、3.90−4.50(m、3H)、5.50(d、1H)、6.12−6.20(m、1H)、6.57(s、2H)、6.76−6.80(m、4H)、7.19−7.43(m、9H)、7.79(s、1H)、9.34(brs、1H)、11.89(brs、1H).
MS(ESI+):[M+H]+ 1734.1951.
1H−NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.13(s、6H)、0.93(s、9H)、1.92(d、3H)、2.05−2.15(m、1H)、2.21(s、3H)、2.39−2.45(m、1H)、2.58−2.62(m、2H)、2.76−2.81(m、2H)、3.90−3.91(m、2H)、4.099−4.103(m、1H)、5.26(d、1H)、6.37(q、1H)、7.55(d、1H)、9.34(brs、1H).
窒素雰囲気下、3,4,5−トリス(オクタデシルオキシ)安息香酸(国際公開第2014−077292号に記載の方法に準じて合成した)(3.0g、3.2mmol)、炭酸ナトリウム(1.1g、10mmol)、硫酸水素テトラ−n−ブチルアンモニウム(0.13g、0.38mmol)の塩化メチレン(71g)と水(30g)の混合溶液に、室温でクロロメタンスルホン酸クロリド(0.39mL、3.9mmol)を加え、2時間42分撹拌した。さらにクロロメタンスルホン酸クロリド(60μL、0.60mmol)を加えて18分間撹拌した後に、40℃に昇温して10分間撹拌した。撹拌を停止して分液し、得られた水層に塩化メチレンを加えて抽出した。得られた有機層を合わせて、溶媒を減圧下留去し、アセトニトリル(70g)を加えて析出した固体をろ過し、化合物83を白色固体(3.16g)として得た。
1H−NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.86−0.90(m、9H)、1.26−1.84(m、96H)、3.99−4.05(m、6H)、5.93−6.01(m、2H)、7.27−7.36(m、2H).
窒素雰囲気下、化合物83(1.0g、1.1mmol)、5’−O−(tert−ブチルジメチルシリル)−3’−O−レブリニルチミジン(0.71g、1.6mmol)のDMF(50mL)溶液に、70℃で炭酸カリウム(0.21g、1.5mmol)を加えて2時間5分撹拌し、さらに炭酸カリウム(0.91g、6.mmol)を加えて2時間44分撹拌した。その後、反応混合物をアセトニトリル(201g)に加えて析出した固体をろ過し、化合物84(1.01g)を黄色固体として得た。
1H−NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.14(s、6H)、0.86−0.93(m、18H)、1.26−1.81(m、96H)、2.13−2.43(m、5H)、2.56−2.60(m、2H)、2.74−2.79(m、2H)、3.92−4.12(m、9H)、5.26(d、1H)、6.22(q、2H)、6.42(q、1H)、7.22(s、2H)、7.59(s、1H).
MS(ESI+):[M+H]+ 1394.0827.
窒素雰囲気下、化合物84(0.94g、0.67mmol)、酢酸(0.41mL、7.2mmol)のTHF(10mL)溶液に、30℃で1.0M TBAF/THF溶液(3.5mL、3.5mmol)を加え、4時間2分撹拌した。その後、反応混合物をメタノール(100g)に加えて析出した固体をろ過し、化合物85(0.85g、収率99%(工程3))を黄色固体として得た。
1H−NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.88(t、9H)、1.26−1.81(m、96H)、2.20(s、3H)、2.39−2.44(m、2H)、2.58−2.60(m、2H)、2.76−2.78(m、2H)、3.93(t、3H)、3.96−4.01(m、6H)、4.11(d、1H)、5.34−5.38(m、1H)、6.21(q、2H)、6.32(t、1H)、7.21(s、2H)、7.61(d、1H).
MS(ESI+):[M+H]+ 1279.9950.
1H−NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.88(t、9H)、1.26−1.81(m、96H)、1.97(d、3H)、2.19(s、3H)、2.34−2.41(m、2H)、2.55−2.59(m、2H)、2.74−2.78(m、2H)、3.96−4.01(m、6H)、4.20−4.29(m、3H)、5.39(d、1H)、6.20(q、2H)、6.45−6.50(m、1H)、6.96(d、1H)、7.21(s、2H)、7.76−7.81(m、1H).
31P−NMR:(300MHz;CDCl3)δ6.28.
MS(ESI−):[M−H]− 1341.9722.
窒素雰囲気下、亜リン酸(43mg、0.52mmol)のピリジン(1.5mL)溶液に、40℃で2,2−ジメチルブチリルクロリド(49μL、0.36mmol)を加え、38分間撹拌した。この溶液に上記の脱保護された化合物を含む反応混合物を加えて40℃で2時間14分撹拌した。その後、反応混合物をアセトニトリル(26g)に加えて析出した固体をろ過し、化合物87(52mg)を褐色固体として得た。
1H−NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.88(t、9H)、1.08−1.83(m、96H)、1.89(s、3H)、1.94(s、3H)、2.19(s、3H)、2.23−2.79(m、8H)、3.96−4.00(m、6H)、4.18−4.41(m、6H)、5.18(brs、1H)、5.38(d、1H)、6.14−6.25(m、3H)、6.43−6.48(m、1H)、6.86(d、1H)、7.21(s、2H)、7.46(s、1H)、7.65(s、1H).
31P−NMR:(300MHz;CDCl3)δ−1.10、6.08.
MS(ESI−):[M−H]− 1646.0226.
1H−NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.88(t、9H)、0.98−1.99(m、99H)、2.13−2.34(m、7H)、2.56(brs、2H)、2.75(brs、2H)、3.97−4.21(m、12H)、5.17−5.35(m、2H)、6.14−6.21(m、3H)、6.44(t、1H)、6.93(d、1H)、7.20(s、2H)、7.54−8.34(m、8H).
31P−NMR:(300MHz;CDCl3)δ5.11、59.77、61.38.
MS(ESI−):[M−H]− 1751.0079.
窒素雰囲気下、化合物31(1.0g、0.92mmol)、炭酸ナトリウム(0.36g、3.4mmol)、硫酸水素テトラ−n−ブチルアンモニウム(34mg、0.11mmol)の塩化メチレン(30g)と水(10g)の混合溶液に、室温でクロロメタンスルホン酸クロリド(0.20mL、2.0mmol)を加えて41分間撹拌した。その後、40℃に昇温し、2時間19分撹拌した。撹拌を停止して分液し、得られた水層に塩化メチレンを加えて抽出した。得られた有機層を合わせて、溶媒を減圧下留去し、アセトニトリル(50g)を加えて析出した固体をろ過し、化合物89を淡黄色固体(0.96g)として得た。
1H−NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.88(t、9H)、1.26−1.84(m、96H)、2.70−2.73(m、4H)、3.05(s、3H)、3.74(brs、2H)、3.93−3.98(m、6H)、4.36(brs、2H)、5.69(s、2H)、6.58(s、2H).
MS(ESI+):[M+H]+ 1132.9248.
窒素雰囲気下、化合物89(11mg、9.7μmol)、5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−3’−O−レブリニルチミジン(国際公開第2014−077292号に記載の方法に準じて合成した)(10mg、0.016mmol)のDMF(0.20mL)溶液に、60℃で炭酸カリウム(20mg、0.15mmol)を加えて19時間30分撹拌した。反応混合物を減圧下濃縮し、化合物90を得た。
MS(ESI+):[M+H]+ 1739.1983.
MS(ESI+):[M+H]+ 1551.1540.
MS(ESI−):[M−H]− 2284.3243.
実施例66の工程2と同様の条件で、3’−O−(tert−ブチルジフェニルシリル)−5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−2’−デオキシシチジンの代わりに5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−2’−デオキシシチジン(ケム−インペックス社製)(4.0g)を用いて反応を実施し、化合物93(7.4g)を白色固体として得た。
1H−NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.88(t、9H)、1.19−1.80(m、96H)、2.17−2.28(m、1H)、2.69−2.80(m、5H)、3.05(s、3H)、3.41−3.79(m、10H)、3.92−3.97(m、6H)、4.09−4.46(m、4H)、6.24(t、1H)、6.57(s、2H)、6.84(d、4H)、7.15−7.40(m、10H)、8.20(d、1H)、9.27(brs、1H).
MS(ESI+):[M+H]+ 1596.1595.
窒素雰囲気下、化合物93(7.4g、4.7mmol)、DMAP(0.065g、0.53mmol)、レブリン酸(0.87g、7.5mmol)の塩化メチレン(70mL)溶液に、室温でWSC・HCl(1.4g、7.5mmol)を加え、5時間4分撹拌した。その後、反応混合物をアセトニトリル(504g)に加えて析出した固体をろ過し、化合物94(7.9g)を淡黄色固体として得た。
1H−NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.88(t、9H)、1.20−1.81(m、96H)、2.19(s、3H)、2.23−2.33(m、1H)、2.51−2.60(m、2H)、2.70−2.80(m、7H)、3.06(s、3H)、3.44(d、2H)、3.79(brs、8H)、3.93−3.98(m、6H)、4.03−4.36(m、3H)、5.39(d、2H)、6.27(t、1H)、6.57(s、2H)、6.81−6.85(m、4H)、7.11(d、1H)、7.21−7.36(m、9H)、8.07(d、1H)、9.32(brs、1H).
窒素雰囲気下、化合物94(5.8g、3.4mmol)の塩化メチレン(50g)溶液に、室温でピロール(0.71mL、10mmol)、ジクロロ酢酸(1.4mL、17mmol)を加え、23分間撹拌した。ピリジン(1.4mL、17mmol)を加え、反応混合物をメタノール(502g)に加えて析出した固体をろ過し、化合物41(4.6g)を白色固体として得た。
実施例72の工程4と同様の条件で反応を実施し、硫化後の反応混合物をメタノールに加えて析出した固体をろ過し、化合物74(2.3g、90%)を薄い肌色固体として得た。
窒素雰囲気下、化合物74(0.50g、0.14mmol)のTHF(20mL)溶液を0℃に冷却し、酢酸(3.0mL)を加えた後に、ヒドラジン1水和物(14μL、0.29mmol)を加え、6時間撹拌した。反応混合物にアセチルアセトン(100μL)を加えて室温まで昇温し、減圧下濃縮した後に、メタノール(102g)に加えて析出した固体をろ過し、化合物97(0.45g)を得た。
MS(ESI+):[M+2H]2+ 1693.2456.
窒素雰囲気下、化合物74(0.51g、0.15mmol)の塩化メチレン溶液(10mL)を10℃に冷却し、ピロール(30μL、0.43mmol)を加えて14分間撹拌した。その後、ジクロロ酢酸(82μL、1.0mmol)を加え、4時間3分撹拌した。ピリジン(1.5mL)を加えて室温まで昇温し、反応混合物をアセトニトリル(86g)に加えて析出した固体をろ過し、化合物98(0.46g)を得た。
MS(ESI+):[M+2H]2+ 1591.1922.
窒素雰囲気下、化合物98(0.45g、0.14mmol)の塩化メチレン(5.0mL)とピリジン(1.0mL)の混合溶液に40℃でホスホン酸(0.20g、2.4mmol)を加え、2,2−ジメチルブチリルクロリド(0.19mL、1.4mmol)を4分割して10分間おきに加えて1時間53分撹拌し、2,2−ジメチルブチリルクロリド(0.42mL、0.71mmol)を加えてさらに1時間8分撹拌した。その後、反応混合物をアセトニトリル(84g)に加えて析出した固体をろ過し、化合物99(0.42g)を白色固体として得た。
MS(ESI+):[M+2H]2+ 1623.1824.
MS(ESI+):[M+3H]3+ 2232.9346.
窒素雰囲気下、化合物101(0.15g、23μmol)のTHF(3.0mL)溶液を10℃に冷却し、酢酸(0.90mL)を加えた後に、ヒドラジン1水和物(7.5μL、0.15mmol)を加え、30分間撹拌した。反応混合物をメタノール(57g)に加えて析出した固体をろ過し、化合物101(0.14g)を得た。
MS(ESI+):[M+3H]3+ 2200.2656.
窒素雰囲気下、化合物100(0.39g、58μmol)、インドール(21mg、0.18mmol)の塩化メチレン溶液(8.0mL)を10℃に冷却し、ジクロロ酢酸(33μL、0.40mmol)を加え、2時間撹拌した。更にジクロロ酢酸(14μL、0.17mmol)を加え、2時間32分撹拌した。ピリジン(0.60mL)を加えて室温まで昇温し、反応混合物をメタノール(100g)に加えて析出した固体をろ過し、化合物102(0.35g)を得た。
MS(ESI+):[M+3H]3+ 2132.2235.
窒素雰囲気下、化合物102(0.17g、27μmol)の塩化メチレン(1.0mL)とピリジン(0.20mL)の混合溶液に40℃でホスホン酸(38mg、0.46mmol)を加え、2,2−ジメチルブチリルクロリド(36μL、0.27mmol)を4分割して10分間おきに加えて1時間5分撹拌し、2,2−ジメチルブチリルクロリド(73μL、0.53mmol)を加えてさらに49分間撹拌した。その後、反応混合物をアセトニトリル(51g)に加えて析出した固体をろ過し、化合物103(0.17g)を白色固体として得た。
MS(ESI+):[M+3H]3+ 2153.5570.
MS(ESI+):[M+3H]3+ 2707.5985.
MS(ESI+):[M+3H]3+ 2386.9640.
MS(ESI+):[M+3H]3+ 2221.5833.
MS(ESI+):[M+2H]2+ 1566.1633
MS(ESI+):[M+2H]2+ 1725.2231.
MS(ESI+):[M+4H]4+ 2457.0209.
MS(ESI+):[M+4H]4+ 2478.2707.
MS(ESI+):[M+H]+ 1718.2007.
1H−NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.85(t、9H)、1.25−1.81(m、96H)、2.21(s、3H)、2.59−3.07(m、11H)、3.26−3.78(m、12H)、3.93−4.31(m、9H)、5.53(d、1H)、6.48−6.49(m、1H)、6.59(s、2H)、6.77−6.80(m、4H)、7.20−7.38(m、9H)、8.10(s、1H)、8.61(s、1H)、8.83(brs、1H).
MS(ESI+):[M+H]+ 1718.2015.
窒素雰囲気下、化合物112(0.29g、0.17mmol)の塩化メチレン(1.0mL)溶液を10℃に冷却し、ピロール(35μL、0.51mmol)を加えて5分間撹拌した。その後、ジクロロ酢酸(42μL、0.51mmol)を加え、1時間13分撹拌した。ピリジン(0.14mL)を加えて室温まで昇温し、反応混合物をアセトニトリル(50g)に加えて析出した固体をろ過し、化合物113(0.20g)を得た。
1H−NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.88(t、9H)、1.16−1.83(m、96H)、2.22(s、3H)、2.45−2.51(m、1H)、2.59−2.63(m、2H)、2.79−2.83(m、4H)、3.07−3.20(m、4H)、3.27−4.29(m、15H)、5.56(d、1H)、6.31−6.36(m、1H)、6.58(s、2H)、8.06(d、1H)、8.64(s、1H)、8.93(brs、1H).
MS(ESI+):[M+H]+ 1416.0785.
窒素雰囲気下、ホスホン酸(17mg、0.21mmol)のピリジン(0.30mL)溶液を40℃に昇温し、2,2−ジメチルブチリルクロリド(6.3μL、46μmol)を加えて30分撹拌した。その後、化合物113(11mg、7.8μmol)を加えて2時間15分撹拌し、2,2−ジメチルブチリルクロリド(21μL、0.15mmol)を加えてさらに1時間10分撹拌した。反応混合物をLC−MSにより分析し、化合物114が主生成物であることを確認した。
MS(ESI+):[M+H]+ 1480.0474.
MS(ESI+):[M+H]+ 1620.1626.
窒素雰囲気下、5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−3’−O−レブリニル−2’−デオキシアデノシン(2.0g、3.1mmol)とDMAP(0.78g、6.4mmol)の塩化メチレン(10mL)溶液を40℃に昇温し、N−α−(9−フルオレニルメトキシカルボニル)−N−α−メチルグリシン(2.0g、6.3mmol)、WSC・HCl(1.2g、6.3mmol)の順に加えて、40℃で3時間撹拌した。室温に冷却して、5%炭酸水素ナトリウム水溶液で2回洗浄し、得られた有機層を水で1回洗浄した。有機層を減圧下濃縮した後にシリカゲルクロマトグラフィー(クロロホルム−メタノール)で精製し、化合物116(1.3g)を得た。
1H−NMR:(300MHz;CDCl3)δ2.21(s、3H)、2.42−2.81(m、5H)、3.05−3.14(m、4H)、3.45(brs、2H)、3.77(s、6H)、4.00−4.69(m、6H)、5.55(brs、1H)、6.50(brs、1H)、6.77−6.91(m、4H)、7.19−7.78(m、17H)、8.14(d、1H)、8.52−8.90(m、2H).
MS(ESI+):[M+H]+ 945.3776.
窒素雰囲気下、化合物116(0.10g、0.11mmol)のアセトニトリル(2.1g)溶液に、室温でピペリジン(32μL、0.32mmol)を加えて2時間39分撹拌した。ヘプタンを加えて分液し、アセトニトリル層をヘプタンで3回洗浄した。得られた有機層を減圧下濃縮し、化合物117(61mg)を得た。
MS(ESI+):[M+H]+ 723.3209.
窒素雰囲気下、3,4,5−トリス(オクタデシルオキシ)安息香酸(国際公開第2014−077292号に記載の方法に準じて合成した)(51mg、55μmol)と化合物117(61mg、85μmol)の塩化メチレン(2.5g)溶液に、HOBt(無水)(12mg、90μmol)を加え、続いてWSC・HCl(18mg、92μmol)を加えて、4時間39分撹拌した。反応混合物をメタノール(31g)に加えて固体を析出させた後にろ過し、化合物118(65mg)を白色固体として得た。
1H−NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.88(t、9H)、1.26−1.77(m、96H)、2.21(s、3H)、2.58−2.81(m、5H)、3.01−3.16(m、4H)、3.78(s、6H)、3.96(s、6H)、4.81(s、2H)、5.53(d、1H)、6.48(q、1H)、6.70(s、2H)、6.77−7.39(m、14H)、8.11(s、1H)、8.58(brs、1H).
MS(ESI+):[M+H]+ 1632.1611.
窒素雰囲気下、化合物118(11mg、6.9μmol)及びインドール(2.1mg、18μmol)の塩化メチレン(0.20mL)溶液を10℃に冷却し、ホスホン酸(14mg、0.17mmol)を加え、1時間27分撹拌した。反応混合物をLC−MSにより分析し、化合物119が主生成物であることを確認した。
MS(ESI+):[M+H]+ 1330.0382.
その後、ピリジン(0.050mL)を加えて室温まで昇温し、2,2−ジメチルブチリルクロリド(14μL、0.10mmol)を加えて1時間40分撹拌した。反応混合物をLC−MSにより分析し、化合物120が主生成物であることを確認した。
MS(ESI+):[M+H]+ 1394.0054.
MS(ESI+):[M+H]+ 2155.2871.
MS(ESI+):[M+H]+ 2169.3107.
MS(ESI+):[M+H]+ 2169.2959.
MS(ESI+):[M+H]+ 2183.3273.
MS(ESI+):[M+H]+ 2183.3326.
MS(ESI+):[M+H]+ 2217.3232
3’−O−レブリニルチミジン(バイオオーガニック アンド メディシナル ケミストリー、2013年、21巻、8013頁−8018頁に記載の方法に準じて合成した)(0.75g、2.2mmol)を用いて、特表2003−525305に記載の方法に準じて合成した化合物127を含有する塩化メチレン(26g)溶液にインドール(0.78g、6.6mmol)を加えて10℃に冷却し、ジクロロ酢酸(0.90mL、11mmol)を加え、1時間17分撹拌した。更にジクロロ酢酸(0.90mL、11mmol)を加え、40分間撹拌した。反応混合物を5%炭酸水素ナトリウム水溶液に加えて分液した。得られた水層に塩化メチレンを加えて分液を行う再抽出操作を11回実施し、得られた有機層を合わせて溶媒を減圧下留去し、粗物を得た。粗物をシリカゲルクロマトグラフィー(クロロホルム−メタノール)で精製し、化合物128(0.65g)を得た。
MS(ESI+):[M+H]+ 714.1865.
窒素雰囲気下、化合物128(0.65g、0.91mmol)とN 4 −ベンゾイル−5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−3’−O−ヒドロキシホスフィニル−2’−デオキシシチジントリエチルアミン塩(ケムジーンズ社製)(1.0g、1.3mmol)のピリジン(8mL)溶液に、室温で炭酸ビスペンタフルオロフェニル(1.3g、3.2mmol)を加え、15分間撹拌した。その後、硫化剤としてN−[(2−シアノエチル)チオ]フタルイミド(0.43g、1.9mmol)を加え、1時間57分撹拌した。塩化メチレンと5%炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて分液し、得られた水層を塩化メチレンで2回洗浄した。得られた有機層を合わせて溶媒を減圧下留去し、化合物129を含有する反応混合物(13g)を得た。このうち12gを更に減圧下濃縮し、トルエンを加えて減圧下濃縮の操作を3回繰り返した後に、塩化メチレン(16g)、インドール(0.30g、2.6mmol)を加えて10℃に冷却し、ジクロロ酢酸(0.69mL、8.4mmol)を加え、1時間40分撹拌した。反応混合物を5%炭酸水素ナトリウム水溶液に加えて分液した。得られた水層に塩化メチレンを加えて分液を行う再抽出操作を2回実施し、得られた有機層を合わせて溶媒を減圧下留去し、粗物を得た。粗物をシリカゲルクロマトグラフィー(クロロホルム−メタノール)で精製し、化合物130(0.30g)を得た。
MS(ESI+):[M+H]+ 1176.2650.
窒素雰囲気下、化合物130(0.24g、0.20mmol)とN 2 −イソブチリル−5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−3’−O−ヒドロキシホスフィニル−2’−デオキシグアノシントリエチルアミン塩(ケムジーンズ社製)(0.23g、0.29mmol)のピリジン(6mL)溶液に、室温で炭酸ビスペンタフルオロフェニル(0.43g、1.1mmol)を加え、27分間撹拌した。その後、硫化剤としてN−[(2−シアノエチル)チオ]フタルイミド(0.10g、0.43mmol)を加え、1時間34分撹拌した。塩化メチレンと5%炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて分液し、得られた水層を塩化メチレンで2回洗浄した。得られた有機層を合わせて溶媒を減圧下留去し、化合物131を含有する反応混合物を得た。トルエンを加えて減圧下濃縮の操作を3回繰り返した後に、塩化メチレン(8.0g)及びインドール(77mg、0.66mmol)を加えて10℃に冷却し、ジクロロ酢酸(0.17mL、2.0mmol)を加え、2時間8分撹拌した。反応混合物を5%炭酸水素ナトリウム水溶液に加えて分液した。得られた水層に塩化メチレンを加えて分液を行う再抽出操作を2回実施し、得られた有機層を合わせて溶媒を減圧下留去し、粗物を得た。粗物をシリカゲルクロマトグラフィー(クロロホルム−メタノール)で精製し、化合物132(0.12g)を得た。
MS(ESI+):[M+H]+ 1644.3648.
窒素雰囲気下、化合物132(0.12g、74μmol)とN6−ベンゾイル−5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−3’−O−ヒドロキシホスフィニル−2’−デオキシアデノシントリエチルアミン塩(ケムジーンズ社製)(90mg、0.11mmol)のピリジン(5mL)溶液に、室温で炭酸ビスペンタフルオロフェニル(0.28g、0.71mmol)を加え、1時間2分撹拌した。その後、硫化剤としてN−[(2−シアノエチル)チオ]フタルイミド(37mg、0.16mmol)を加え、2時間8分撹拌した。塩化メチレン、アセトニトリルと5%炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて分液し、得られた水層を塩化メチレンとアセトニトリルの混合溶媒で2回洗浄した。得られた有機層を合わせて溶媒を減圧下留去し、化合物133を含有する反応混合物を得た。この反応混合物に塩化メチレン(3.1g)を加えて0℃に冷却し、酢酸(0.15mL)を加えた後に、ヒドラジン1水和物(36μL、0.74mmol)を加え、1時間26分撹拌した。反応混合物にアセチルアセトン(0.30mL)を加えて室温まで昇温し、5%炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて分液した得られた水層に塩化メチレンを加えて分液を行う再抽出操作を2回実施し、得られた有機層を合わせて溶媒を減圧下留去し、粗物を得た。粗物をシリカゲルクロマトグラフィー(クロロホルム−メタノール)で精製し、化合物134(55mg)を得た。
MS(ESI+):[M+H]+ 2334.5224.
窒素雰囲気下、化合物103(43mg)と化合物134(19mg、8.3μmol)のピリジン(1.4mL)溶液に、室温で炭酸ビスペンタフルオロフェニル(59mg、0.15mmol)を加え、58分間撹拌した。その後、硫化剤としてN−[(2−シアノエチル)チオ]フタルイミド(10mg、44μmol)を加え、40分間撹拌した。その後、反応混合物を減圧下濃縮した。トルエン(2g)を加えて減圧下濃縮の操作を3回繰り返した後に、塩化メチレン(1.2mL)を加え、インドール(2.5mg、21μmol)、ジクロロ酢酸(6.2μL、76μmol)を10℃で加え、1時間51分間撹拌した。その後、ジクロロ酢酸(6.2μL、76μmol)を追加し、2時間41分間撹拌した。さらに、ジクロロ酢酸(6.2μL、76μmol)を追加し、1時間38分間撹拌した。ピリジン(0.20mL)を加えて室温まで昇温し、反応混合物をアセトニトリル(38g)に加えて析出した固体を析出ろ過し、化合物135(51mg)を薄い肌色固体として得た。
MS(ESI+):[M+4H]4+ 2140.0080.
窒素雰囲気下、化合物135(50mg、5.8μmol)の塩化メチレン(2.0mL)とピリジン(0.12mL)の混合溶液に40℃でホスホン酸(19mg、0.23mmol)を加え、2,2−ジメチルブチリルクロリド(25μL、0.18mmol)を5分割して加えて1時間12分間撹拌した。その後、反応混合物をアセトニトリル(39g)に加えて析出した固体をろ過し、化合物136(44mg)を薄い肌色固体として得た。
MS(ESI+):[M+4H]4+ 2155.9794.
MS(ESI+):[M+5H]5+ 2205.1210.
MS(ESI+):[M+3H]3+ 2123.8976.
Claims (37)
- 2’位、3’位、5’位及び核酸塩基部からなる群から選ばれる少なくとも1か所に擬似固相保護基を有し、5’位又は3’位がヒドロキシ基であるヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドの当該5’−ヒドロキシ基又は3’−ヒドロキシ基をH−ホスホネート化する工程を含み、前記擬似固相保護基が、下記式(I)
(式中、*は、前記擬似固相保護基が保護する基との結合位置を示し、
R1は、C10−30アルキル基又はC10−30アルケニル基であり、sは、1から5の整数であり、
L1は、単結合、C1−6アルキレン基、C2−6アルケニレン基又はC2−6アルキニレン基であり、
L2は、単結合、−COO−、−CON(R2)−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)、−OCO−、−N(R2)CO−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)、−C(O)−又は−O−であり、
L3は、単結合、C1−6アルキレン基、C2−6アルケニレン基又はC2−6アルキニレン基であり、
L4は、単結合、−COO−、−CON(R2)−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)、−OCO−、−N(R2)CO−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)、−C(O)−又は−O−であり、
L5は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基であり、
L6は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基であり、
mは、0又は1であり、
前記擬似固相保護基を核酸塩基部に有し、その擬似固相保護基のmが0である場合、その擬似固相保護基のL1、L2、L3及びL4のうち、単結合の数は0から3である)で表される、オリゴヌクレオチドの製造方法。 - 2’位、3’位、5’位及び核酸塩基部からなる群から選ばれる少なくとも1か所に擬似固相保護基を有し、5’位又は3’位がヒドロキシ基であるヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドの当該5’−ヒドロキシ基又は3’−ヒドロキシ基をH−ホスホネート化する工程を含む伸長反応サイクルを少なくとも1つ含む、請求項1に記載の製造方法。
- 前記伸長反応サイクルが、
2’位、3’位及び核酸塩基部からなる群から選ばれる少なくとも1か所に擬似固相保護基を有し、3’位に基本保護基又は擬似固相保護基で保護されたヒドロキシ基を有し、5’位に一時保護基で保護されたヒドロキシ基を有する第一ヌクレオシド又は第一オリゴヌクレオチドの一時保護基を除去して5’−ヒドロキシ基を生成することを含む第一工程と、
生成した5’−ヒドロキシ基を、H−ホスホネート化試薬を用いてH−ホスホネート化することを含む第二工程と、
H−ホスホネート化された5’−ヒドロキシ基と、3’位にヒドロキシ基を有し、5’位に一時保護基で保護されたヒドロキシ基を有する第二ヌクレオシド又は第二オリゴヌクレオチドの3’−ヒドロキシ基とから亜リン酸ジエステル結合を形成して、第一ヌクレオシド又は第一オリゴヌクレオチドと、第二ヌクレオシド又は第二オリゴヌクレオチドとの結合体を得る第三工程と、
を含む請求項2に記載の製造方法。 - 前記結合体の亜リン酸ジエステル結合を、リン酸ジエステル結合、チオリン酸ジエステル結合、ボラノリン酸ジエステル結合、アミノリン酸ジエステル結合、基本保護基で保護されたリン酸ジエステル結合又は基本保護基で保護されたチオリン酸ジエステル結合に変換することを含む第四工程を更に含む、請求項3に記載の製造方法。
- 前記結合体の亜リン酸ジエステル結合を、リン酸ジエステル結合、チオリン酸ジエステル結合、ボラノリン酸ジエステル結合又はアミノリン酸ジエステル結合に変換することを含む第四工程を更に含む、請求項3に記載の製造方法。
- 前記第一工程から第四工程からなる群から選ばれる少なくとも1つの工程で得られる反応混合物に、極性溶媒を添加して沈殿物を生成させることと、生成した沈殿物を固液分離により取得する第五工程を更に含む、請求項4又は5に記載の製造方法。
- 前記極性溶媒が炭素数1から6のアルコール溶媒又は炭素数1から6のニトリル溶媒である、請求項6に記載の製造方法。
- 前記基本保護基、一時保護基及び擬似固相保護基をすべて除去する第六工程を更に含む、請求項3から7のいずれか1項に記載の製造方法。
- 前記第一ヌクレオシド又は第一オリゴヌクレオチドは、3’位に擬似固相保護基で保護されたヒドロキシ基を有する、請求項3から8のいずれか1項に記載の製造方法。
- 前記第三工程は、前記第二ヌクレオシドを用いる、請求項3から9のいずれか1項に記載の製造方法。
- 前記伸長反応サイクルが、
2’位、5’位及び核酸塩基部からなる群から選ばれる少なくとも1か所に擬似固相保護基を有し、5’位に基本保護基又は擬似固相保護基で保護されたヒドロキシ基を有し、3’位に一時保護基で保護されたヒドロキシ基を有する第三ヌクレオシド又は第三オリゴヌクレオチドの一時保護基を除去して3’−ヒドロキシ基を生成することを含む第七工程と、
生成した3’−ヒドロキシ基を、H−ホスホネート化試薬を用いてH−ホスホネート化することを含む第八工程と、
H−ホスホネート化された3’−ヒドロキシ基と、5’位にヒドロキシ基を有し、3’位に一時保護基で保護されたヒドロキシ基を有する第四ヌクレオシド又は第四オリゴヌクレオチドの5’−ヒドロキシ基とから亜リン酸ジエステル結合を形成して、第三ヌクレオシド又は第三オリゴヌクレオチドと、第四ヌクレオシド又は第四オリゴヌクレオチドとの結合体を得る第九工程と、
を含む請求項2に記載の製造方法。 - 前記結合体の亜リン酸ジエステル結合を、リン酸ジエステル結合、チオリン酸ジエステル結合、ボラノリン酸ジエステル結合、アミノリン酸ジエステル結合、基本保護基で保護されたリン酸ジエステル結合又は基本保護基で保護されたチオリン酸ジエステル結合に変換することを含む第十工程を更に含む、請求項11に記載の製造方法。
- 前記結合体の亜リン酸ジエステル結合を、リン酸ジエステル結合、チオリン酸ジエステル結合、ボラノリン酸ジエステル結合又はアミノリン酸ジエステル結合に変換することを含む第十工程を更に含む、請求項11に記載の製造方法。
- 前記第七工程から第十工程のいずれかの工程で得られる反応混合物に、極性溶媒を添加して沈殿物を生成させることと、生成した沈殿物を固液分離により取得する第十一工程を更に含む請求項12又は13に記載の製造方法。
- 前記極性溶媒が炭素数1から6のアルコール溶媒又は炭素数1から6のニトリル溶媒である、請求項14に記載の製造方法。
- 前記基本保護基、一時保護基及び擬似固相保護基をすべて除去する第十二工程を更に含む、請求項11から15のいずれか1項に記載の製造方法。
- 前記第三ヌクレオシド又は第三オリゴヌクレオチドは、5’位に擬似固相保護基で保護されたヒドロキシ基を有する、請求項11から16のいずれか1項に記載の製造方法。
- 前記第九工程は、第四ヌクレオシドを用いる、請求項11から17のいずれか1項に記載の製造方法。
- 前記擬似固相保護基が、下記式(II)
(式中、*は、前記擬似固相保護基が保護する基との結合位置を示し、
R1は、C10−30アルキル基又はC10−30アルケニル基であり、sは、1から5の整数であり、
L1は、単結合、C1−6アルキレン基、C2−6アルケニレン基又はC2−6アルキニレン基であり、
L2は、単結合、−COO−、−CON(R2)−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)、−OCO−、−N(R2)CO−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)又は−O−であり、
L3は、単結合、C1−6アルキレン基、C2−6アルケニレン基又はC2−6アルキニレン基であり、
L4は、単結合、−COO−、−CON(R2)−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)、−OCO−、−N(R2)CO−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)又は−O−であり、
前記擬似固相保護基を核酸塩基部に有する場合、その擬似固相保護基のL1、L2、L3及びL4のうち、単結合の数は0から3である)で表される、請求項1から18のいずれか1項に記載の製造方法。 - 前記一時保護基が、tert-ブチルジメチルシリル基、4、4’−ジメトキシトリチル基、又はレブリニル基である、請求項3から19のいずれか1項に記載の製造方法。
- 前記H-ホスホネート化する工程が、亜リン酸、亜リン酸ジフェニル、フェニル−H−ホスホネートのトリエチルアンモニウム塩、p−トルイル−H−ホスホネートのトリエチルアンモニウム塩、2−クロロ−4H−1,3,2−ベンゾジオキサホスホリン−4−オン、三塩化リンからなる群より選択される少なくとも一種のH-ホスホネート化試薬を用いる、請求項1から20のいずれか1項に記載の製造方法。
- 前記第一から第四ヌクレオシド及び第一から第四オリゴヌクレオチドに含まれる核酸塩基が、それぞれ独立して、6−アミノプリン−9−イル基(アデニン残基)、2−アミノ−6−ヒドロキシプリン−9−イル基(グアニン残基)、2−オキソ−4−アミノ−1,2−ジヒドロピリミジン−1−イル基(シトシン残基)、2−オキソ−4−アミノ−5−メチル−1,2−ジヒドロピリミジン−1−イル基(5−メチルシトシン残基)、2−オキソ−4−ヒドロキシ−1,2−ジヒドロピリミジン−1−イル基(ウラシル残基)及び2−オキソ−4−ヒドロキシ−5−メチル−1,2−ジヒドロピリミジン−1−イル基(チミン残基)からなる群から選択される少なくとも1種である、請求項1から21のいずれか1項に記載の製造方法。
- 2’位、3’位、5’位及び核酸塩基部からなる群から選ばれる少なくとも1か所に擬似固相保護基を有し、5’位又は3’位が、H−ホスホネート化されたヒドロキシ基であり、前記擬似固相保護基が、下記式(I)
(式中、*は、前記擬似固相保護基が保護する基との結合位置を示し、
R1は、C10−30アルキル基又はC10−30アルケニル基であり、sは、1から5の整数であり、
L1は、単結合、C1−6アルキレン基、C2−6アルケニレン基又はC2−6アルキニレン基であり、
L2は、単結合、−COO−、−CON(R2)−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)、−OCO−、−N(R2)CO−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)、−C(O)−又は−O−であり、
L3は、単結合、C1−6アルキレン基、C2−6アルケニレン基又はC2−6アルキニレン基であり、
L4は、単結合、−COO−、−CON(R2)−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)、−OCO−、−N(R2)CO−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)、−C(O)−又は−O−であり、
L5は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基であり、
L6は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基であり、
mは、0又は1であり、
前記擬似固相保護基を核酸塩基部に有し、その擬似固相保護基のmが0である場合、その擬似固相保護基のL1、L2、L3及びL4のうち、単結合の数は0から3である)で表される、ヌクレオシド又はオリゴヌクレオチド。 - 下記式(XI):
[式中、nは、1以上の任意の整数を示し、
BaseZは、それぞれ独立して核酸塩基、基本保護基で保護された核酸塩基又は擬似固相保護基で保護された核酸塩基を示し、
XZは、それぞれ独立して水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、基本保護基で保護されたヒドロキシ基、4位炭素原子に架橋する有機基又は擬似固相保護基で保護されたヒドロキシ基を示し、
Yは、それぞれ独立して水素原子、ヒドロキシ基、基本保護基で保護されたヒドロキシ基、チオール基、基本保護基で保護されたチオール基、水素化ホウ素基、モノC1−6アルキルアミノ基又はジC1−6アルキルアミノ基を示し、
Zは、水素原子、基本保護基、一時保護基又は擬似固相保護基を示し、
;かつBaseZの少なくとも1つが擬似固相保護基で保護された核酸塩基であること、XZの少なくとも1つが擬似固相保護基で保護されたヒドロキシ基であること、及びZが擬似固相保護基であることの少なくとも1つを満たす。]
で示され、ここで、前記擬似固相保護基が、下記式(I)
(式中、*は、前記擬似固相保護基が保護する基との結合位置を示し、
R1は、C10−30アルキル基又はC10−30アルケニル基であり、sは、1から5の整数であり、
L1は、単結合、C1−6アルキレン基、C2−6アルケニレン基又はC2−6アルキニレン基であり、
L2は、単結合、−COO−、−CON(R2)−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)、−OCO−、−N(R2)CO−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)、−C(O)−又は−O−であり、
L3は、単結合、C1−6アルキレン基、C2−6アルケニレン基又はC2−6アルキニレン基であり、
L4は、単結合、−COO−、−CON(R2)−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)、−OCO−、−N(R2)CO−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)、−C(O)−又は−O−であり、
L5は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基であり、
L6は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基であり、
mは、0又は1であり、
前記擬似固相保護基を核酸塩基部に有し、その擬似固相保護基のmが0である場合、その擬似固相保護基のL1、L2、L3及びL4のうち、単結合の数は0から3である)で表される化合物、又はその塩。 - 前記擬似固相保護基が、下記式(II)
(式中、*は、前記擬似固相保護基が保護する基との結合位置を示し、
R1は、C10−30アルキル基又はC10−30アルケニル基であり、sは、1から5の整数であり、
L1は、単結合、C1−6アルキレン基、C2−6アルケニレン基又はC2−6アルキニレン基であり、
L2は、単結合、−COO−、−CON(R2)−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)、−OCO−、−N(R2)CO−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)又は−O−であり、
L3は、単結合、C1−6アルキレン基、C2−6アルケニレン基又はC2−6アルキニレン基であり、
L4は、単結合、−COO−、−CON(R2)−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)、−OCO−、−N(R2)CO−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)又は−O−であり、
前記擬似固相保護基を核酸塩基部に有する場合、その擬似固相保護基のL1、L2、L3及びL4のうち、単結合の数は0から3である)で表される、請求項24に記載の化合物、又はその塩。 - 前記式(XI)におけるBaseZの少なくとも一つが擬似固相保護基で保護された核酸塩基であること、及びZが擬似固相保護基であることの少なくとも一方を満たす、請求項24又は25に記載の化合物、又はその塩。
- 前記式(XI)におけるZが擬似固相保護基である、請求項24から26のいずれか1項に記載の化合物、又はその塩。
- 前記式(XI)におけるnが1から30である、請求項24から27のいずれか1項に記載の化合物、又はその塩。
- 下記式(XII):
[式中、
nは、1以上の任意の整数を示し、
BaseZは、独立してそれぞれ核酸塩基、基本保護基で保護された核酸塩基又は擬似固相保護基で保護された核酸塩基を示し、
XZは、独立してそれぞれ水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、基本保護基で保護されたヒドロキシ基、4位炭素原子に架橋する有機基又は擬似固相保護基で保護されたヒドロキシ基を示し、
Yは、独立してそれぞれ水素原子、ヒドロキシ基、基本保護基で保護されたヒドロキシ基、チオール基、基本保護基で保護されたチオール基、水素化ホウ素基、モノC1−6アルキルアミノ基又はジC1−6アルキルアミノ基を示し、
Zは、水素原子、基本保護基、一時保護基又は擬似固相保護基を示し、
;かつBaseZの少なくとも一つが擬似固相保護基で保護された核酸塩基であること、XZの少なくとも一つが擬似固相保護基で保護されたヒドロキシ基であること、及びZが擬似固相保護基であることの少なくとも1つを満たす。]
で示され、ここで、前記擬似固相保護基が、下記式(I)
(式中、*は、前記擬似固相保護基が保護する基との結合位置を示し、
R1は、C10−30アルキル基又はC10−30アルケニル基であり、sは、1から5の整数であり、
L1は、単結合、C1−6アルキレン基、C2−6アルケニレン基又はC2−6アルキニレン基であり、
L2は、単結合、−COO−、−CON(R2)−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)、−OCO−、−N(R2)CO−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)、−C(O)−又は−O−であり、
L3は、単結合、C1−6アルキレン基、C2−6アルケニレン基又はC2−6アルキニレン基であり、
L4は、単結合、−COO−、−CON(R2)−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)、−OCO−、−N(R2)CO−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)、−C(O)−又は−O−であり、
L5は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基であり、
L6は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基であり、
mは、0又は1であり、
前記擬似固相保護基を核酸塩基部に有し、その擬似固相保護基のmが0である場合、その擬似固相保護基のL1、L2、L3及びL4のうち、単結合の数は0から3である)で表される化合物、又はその塩。 - 前記擬似固相保護基が、下記式(II)
(式中、*は、前記擬似固相保護基が保護する基との結合位置を示し、
R1は、C10−30アルキル基又はC10−30アルケニル基であり、sは、1から5の整数であり、
L1は、単結合、C1−6アルキレン基、C2−6アルケニレン基又はC2−6アルキニレン基であり、
L2は、単結合、−COO−、−CON(R2)−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)、−OCO−、−N(R2)CO−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)又は−O−であり、
L3は、単結合、C1−6アルキレン基、C2−6アルケニレン基又はC2−6アルキニレン基であり、
L4は、単結合、−COO−、−CON(R2)−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)、−OCO−、−N(R2)CO−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)又は−O−であり、
前記擬似固相保護基を核酸塩基部に有する場合、その擬似固相保護基のL1、L2、L3及びL4のうち、単結合の数は0から3である)で表される、請求項29に記載の化合物、又はその塩。 - 前記式(XII)におけるBaseZの少なくとも一つが擬似固相保護基で保護された核酸塩基であること、及びZが擬似固相保護基であることの少なくとも一方を満たす、請求項29又は30に記載の化合物、又はその塩。
- 前記式(XII)におけるZが擬似固相保護基である、請求項29から31のいずれか1項に記載の化合物、又はその塩。
- 前記式(XII)におけるnが1から30である、請求項29から32のいずれか1項に記載の化合物、又はその塩。
- 2’位、3’位、5’位及び核酸塩基部からなる群から選ばれる少なくとも1か所に擬似固相保護基を有し、
5’位又は3’位が、ヒドロキシ基、又は一時保護基で保護されたヒドロキシ基であり、前記擬似固相保護基の少なくとも1つが、式(I)
(式中、*は、前記擬似固相保護基が保護する基との結合位置を示し、
R1は、C10−30アルキル基又はC10−30アルケニル基であり、sは、1から5の整数であり、
L1は、単結合、C1−6アルキレン基、C2−6アルケニレン基又はC2−6アルキニレン基であり、
L2は、単結合、−COO−、−CON(R2)−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)、−OCO−、−N(R2)CO−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)、−C(O)−又は−O−であり、
L3は、単結合、C1−6アルキレン基、C2−6アルケニレン基又はC2−6アルキニレン基であり、
L4は、単結合、−COO−、−CON(R2)−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)、−OCO−、−N(R2)CO−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)、−C(O)−又は−O−であり、
L5は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基であり、
L6は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基であり、
mは、0又は1であり、mが0である場合、L4は、単結合ではない。)で表される、ヌクレオシド又はオリゴヌクレオチド。 - 下記式(XIII):
[式中、nは、1以上の任意の整数を示し、
BaseZは、それぞれ独立して核酸塩基、基本保護基で保護された核酸塩基又は擬似固相保護基で保護された核酸塩基を示し、
XZは、それぞれ独立して水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、基本保護基で保護されたヒドロキシ基、4位炭素原子に架橋する有機基又は擬似固相保護基で保護されたヒドロキシ基を示し、
Wは、水素原子又は一時保護基を示し、
Yは、それぞれ独立して水素原子、ヒドロキシ基、基本保護基で保護されたヒドロキシ基、チオール基、基本保護基で保護されたチオール基、水素化ホウ素基、モノC1−6アルキルアミノ基又はジC1−6アルキルアミノ基を示し、
Zは、水素原子、基本保護基、一時保護基又は擬似固相保護基を示し、
;かつBaseZの少なくとも1つが擬似固相保護基で保護された核酸塩基であること、XZの少なくとも1つが擬似固相保護基で保護されたヒドロキシ基であること、及びZが擬似固相保護基であることの少なくとも1つを満たし、
前記擬似固相保護基の少なくとも1つが、式(I)
(式中、*は、前記擬似固相保護基が保護する基との結合位置を示し、
R1は、C10−30アルキル基又はC10−30アルケニル基であり、sは、1から5の整数であり、
L1は、単結合、C1−6アルキレン基、C2−6アルケニレン基又はC2−6アルキニレン基であり、
L2は、単結合、−COO−、−CON(R2)−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)、−OCO−、−N(R2)CO−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)、−C(O)−又は−O−であり、
L3は、単結合、C1−6アルキレン基、C2−6アルケニレン基又はC2−6アルキニレン基であり、
L4は、単結合、−COO−、−CON(R2)−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)、−OCO−、−N(R2)CO−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)、−C(O)−又は−O−であり、
L5は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基であり、
L6は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基であり、
mは、0又は1であり、mが0である場合、L4は、単結合ではない。)で表される。]化合物、又はその塩。 - 下記式(XIV):
(式中、
nは、1以上の任意の整数を示し、
BaseZは、独立してそれぞれ核酸塩基、基本保護基で保護された核酸塩基又は擬似固相保護基で保護された核酸塩基を示し、
XZは、独立してそれぞれ水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、基本保護基で保護されたヒドロキシ基、4位炭素原子に架橋する有機基又は擬似固相保護基で保護されたヒドロキシ基を示し、
Wは、水素原子又は一時保護基を示し、
Yは、独立してそれぞれ水素原子、ヒドロキシ基、基本保護基で保護されたヒドロキシ基、チオール基、基本保護基で保護されたチオール基、水素化ホウ素基、モノC1−6アルキルアミノ基又はジC1−6アルキルアミノ基を示し、
Zは、水素原子、基本保護基、一時保護基又は擬似固相保護基を示し、
;かつBaseZの少なくとも一つが擬似固相保護基で保護された核酸塩基であること、XZの少なくとも一つが擬似固相保護基で保護されたヒドロキシ基であること、及びZが擬似固相保護基であることの少なくとも1つを満たし、
前記擬似固相保護基の少なくとも1つが、式(I)
(式中、*は、前記擬似固相保護基が保護する基との結合位置を示し、
R1は、C10−30アルキル基又はC10−30アルケニル基であり、sは、1から5の整数であり、
L1は、単結合、C1−6アルキレン基、C2−6アルケニレン基又はC2−6アルキニレン基であり、
L2は、単結合、−COO−、−CON(R2)−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)、−OCO−、−N(R2)CO−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)、−C(O)−又は−O−であり、
L3は、単結合、C1−6アルキレン基、C2−6アルケニレン基又はC2−6アルキニレン基であり、
L4は、単結合、−COO−、−CON(R2)−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)、−OCO−、−N(R2)CO−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)、−C(O)−又は−O−であり、
L5は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基であり、
L6は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基であり、
mは、0又は1であり、mが0である場合、L4は、単結合ではない。)で表される。]で示される化合物、又はその塩。 - 3’位及び5’位に、独立してヒドロキシ基又は保護されたヒドロキシ基を有し、
2’位、3’位、5’位及び核酸塩基部からなる群から選ばれる少なくとも1か所にヒドロキシ基を有するか、又は2’位及び核酸塩基部の少なくとも1カ所にヒドロキシ基又はアミノ基を有するヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドを、
下記式(X−1)
(式中、R1は、C10−30アルキル基又はC10−30アルケニル基であり、sは、1から5の整数であり、
L1は、単結合、C1−6アルキレン基、C2−6アルケニレン基又はC2−6アルキニレン基であり、
L2は、単結合、−COO−、−CON(R2)−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)、−OCO−、−N(R2)CO−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)、−C(O)−又は−O−であり、
L3は、単結合、C1−6アルキレン基、C2−6アルケニレン基又はC2−6アルキニレン基であり、
L4は、−COO−、−CON(R2)−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)、−OCO−、−N(R2)CO−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)、−C(O)−又は−O−である)で表されるカルボキシ化合物、下記式(X−2)
(式中、Xは、ハロゲン原子であり、R1、L1、L2、L3及びL4は、前記式(X−1)における定義と同じである。)で表される酸ハロゲン化物又は、下記式(X−3)
(式中、Xは、ハロゲン原子であり、R1、L1、L2、及びL3は、前記式(X−1)における定義と同じであり、
L4は、単結合、−COO−、−CON(R2)−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)、−OCO−、−N(R2)CO−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)、−C(O)−又は−O−であり、
L5は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基であり、
L6は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基である。)で表されるハロゲン化アルキル化合物と反応させ、
2’位、3’位、5’位及び核酸塩基部からなる群から選ばれる少なくとも1か所に、
下記式(I)
(式中、*は、2’位、3’位、5’位及び核酸塩基部からなる群から選ばれる少なくとも1か所との結合位置を示し、
R1は、C10−30アルキル基又はC10−30アルケニル基であり、sは、1から5の整数であり、
L1は、単結合、C1−6アルキレン基、C2−6アルケニレン基又はC2−6アルキニレン基であり、
L2は、単結合、−COO−、−CON(R2)−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)、−OCO−、−N(R2)CO−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)、−C(O)−又は−O−であり、
L3は、単結合、C1−6アルキレン基、C2−6アルケニレン基又はC2−6アルキニレン基であり、
L4は、単結合、−COO−、−CON(R2)−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)、−OCO−、−N(R2)CO−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)、−C(O)−又は−O−であり、
L5は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基であり、
L6は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基であり、
mは、0又は1であり、mが0である場合、L4は単結合ではない。)で表される擬似固相保護基を有するヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドの製造方法。
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