TW201212937A

TW201212937A - Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition

Info

Publication number: TW201212937A
Application number: TW100146297A
Authority: TW
Inventors: William P Hausdorff; George Rainer Siber; Peter R Paradiso
Original assignee: Wyeth Corp
Priority date: 2005-04-08
Filing date: 2006-03-31
Publication date: 2012-04-01
Also published as: TWI511739B; KR20220042483A; CA2604363C; US20120237542A1; KR102017842B1; CN113198012A; US20210283247A1; EP2425852A1; IL267125A; CA3165042A1; CN101180079A; CA2604363A1; JP2013006881A; MY145150A; KR20230118200A; SA06270323B1; DK1868645T3; IL186367A0; CN101180079B; TW200719911A

Description

201212937 六、發明說明：【發明所屬之技術領域】本發明概言之係關於醫藥領域，且特定而言係關於微生物學、免疫學、疫苗及藉由免疫對細菌性病原體感染之預防。【先前技術】肺炎鏈球菌係在全世界範圍内嬰兒及年幼兒童中引起腦膜炎、肺炎、及嚴重侵入性疾病的主要原因。多價肺炎球菌多醣疫苗得到許可已有許多年並已證明在預防老年人及高危患者中肺炎球菌疾病方面具有價值。然而，嬰兒及年幼兒童對大部分肺炎球菌多醣反應不佳。7-價肺炎球菌共軛物疫苗（7vPnC，Prevnar®)係首個此類藥物，經證明在嬰兒及年幼兒童中具有高免疫原性且對侵入性疾病及中耳炎非常有效。此疫苗目前已在全世界的許多國家得到批准。Prevnar包含來自血清型4、6B、9V、14、18C、19F及 23F之莢膜多醣，每一多醣皆與一稱作CRM197之載體蛋白質共輛結合。Prevnar在美國、歐洲、及世界其他地區分別覆蓋約80至90%、60至80%、及40至80%之侵入性肺炎球菌疾病（IPD)[ 1,2]。在引入Prevnar後數年間搜集之監視數據已清楚證明，美國嬰兒中侵入性肺炎球菌疾病有如所預期之下降（圖1)[3,4]。引入Prevnar之前於美國嬰兒中實施之IPD監視證明，大部分由血清群6及19引起之疾病係因6A(約1/3)及19A(約 1/4)血清型所致[5,6]。向Prevnar頒發許可證後於美國實施 160374.doc 201212937 之肺炎球菌侵入性疾病監視證明，造成疾病巨大負擔之原因仍係血清型6A及19A(圖1)[3]。此外，由此兩種血清型引起之侵入性疾病病例超過了由血清型1、3、5、及7F總共引起之病例（8.2對3 _3例/100,000個2歲及以下兒童）。此外，血清型6A及19A與抗生素抗性之高發率有關（圖 2)[7,8,9]。儘管隨著更多兒童受到免疫，血清群交叉保護有可能會引起血清型6A及19A疾病的減少，但有證據表明’此種減少很有限且因此等血清型引起之疾病造成的重大負擔仍會繼續存在（參見下文）。考慮到因血清型1、3、5、6A、7F、及19A引起之侵入性肺炎球菌疾病的相對負擔及重要性，向卩^…訂調配物中添加此等血清型會在美國及歐洲使針對侵入性疾病之覆蓋範圍增加至>90%，且在亞洲及拉丁美洲會使之增加至高達70%至80%。此種疫苗會使覆蓋範圍明顯超過prevnari 覆蓋範圍，並提供不依賴於血清群交叉保護限制之6八及 19A的覆蓋範圍。【發明内容】因此，本發明概言之提供一種多價免疫原組合物，包含 13個各不才目同之多醣-蛋白質共軛物，#中各㈣共軛物中白匕3與一载體蛋白質共軛結合的來自不同肺炎鏈球菌血清型的莢膜多_，以及一生理上可接受之媒劑。視情 :’在該調配物令納入—佐劑’諸如基於鋁之佐劑。更特 °本發明提供一種13-價肺炎球菌共軛物（13vPnC) 組合物，該組合物包含7種存於7vPnC疫苗之血清型（4、 160374.doc 201212937 6B、9V、14、18C、19F 及 23F)加 6 種額外血清型（1、3、 5、6A、7F及 19A)。本發明亦提供一種多價免疫原組合物，其中該等莢膜多醣係來自肺炎鏈球菌之ir清型1、3、4、5、6A、6B、 7F、9V、14、18C、19A、19F及23F且該載體蛋白質係 CR^4i97 〇本發明進一步提供一種多價免疫原組合物，其中該等莢膜多醣係來自肺炎鏈球菌之血清型1、3、4、5、6A、 6B、7F、9V、14、18C、19A、19F及 23F，該載體蛋白質係CRM 197 ’且該佐劑係基於銘之佐劑，諸如碌酸銘、硫酸鋁及氫氧化鋁。在一本發明特定實施例中，該佐劑係磷酸銘。本發明亦提供一種多價免疫原組合物，該免疫原組合物包含多醣-蛋白質共輛物以及一生理上可接受之媒劑，其中各該共軛物皆包含一與一載體蛋白質共軛結合之來自不同肺炎鏈球菌血清型的莢膜多醣，且該等莢膜多醣係由血清型3及至少一種額外血清型製備而成。在此種多價免疫原組合物之一實施例中，該額外血清型係選自由血清型 1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、 19A、19F、及23F組成之群。在另一實施例中，該載體蛋白質係CRMm。在又一實施例中，該組合物包含一佐劑，諸如選自磷酸鋁、硫酸鋁及氫氧化鋁之基於鋁之佐劑。在一特定實施例中，該佐劑係磷酸鋁。本發明亦提供一種多價免疫原組合物，包含多醣-蛋白 160374.doc 201212937 質共轆物以及-生理上可接受之媒劑，其中各該共輛物皆合之來自不同肺炎鏈球菌血清型的芙膜多醣’且該等莢膜多畴係由血清型4、6B、 …、㈣……及至少一種額“清型製備而成。在-此種多價免疫原組合物之實施例中，該額外血清型係選自由血清m、3、5、6A、mAWM4 另一實施例中’該載體蛋白質俾Γ'Τβ'Μ' 4- 來《貝你lkm197。在又一實施.例中，該組合物包含一佐劑，法^„，s ώ h 削者如選自磷酸鋁、硫酸鋁及氫氧化鋁之基於鋁之佐劑。在一拄中寄说Λ丨士社特疋實施例中’該佐劑係磷酸紹。本發明亦提供一種用於誘發對肺炎鏈球菌莢膜多醣共軛物之免疫反應的方法，該方法包括施予給人類一免疫有效量之任一剛剛闡述之免疫原組合物。本發明進一步提供：經施予之免疫原組合物中任一種係單一 0.5毫升劑量，經調配含有：2微克之各種醣，但仍係 4微克；約29微克之CRMi97載體蛋白質；0.125毫克之元素鋁（0.5毫克磷酸鋁）佐劑；及作為賦形劑之氯化鈉與琥珀酸鈉緩衝劑。【實施方式】

Prevnar血清型 4、6B、9V、14、18C、19F、23F之納入據來自1995至1998年間IPD監視之數據估計，prevnar中 7種血清型係造成年齡<2歲之兒童中約82%之IPD的原因 [5]。在北加利福尼亞州（功效試驗進行地），嬰兒及年幼兒 160374.doc -6- 201212937 童中所有IPD病例之90〇/。歸因於Prevnar血清型[1〇]。自從 2000年引入Prevnar疫苗以來，整體IpD率已有明顯下降，乃因由疫苗血清型引起之疾病減少之故[3,4]。因此，目前尚無法證明自下一代肺炎球菌共軛物疫苗中去除任一 Prevnar血清型的正確性，故寧可增加血清型以得到更廣泛之覆蓋範圍。 ▲清型1、3、5及7F之納入在美國，年齡小於5歲之兒童中由血清型丨引起之ipD率係<2。/。，約與企清型3A7F中每一種相同π，6]。血清型以 5係造成美國侵入性肺炎球菌疾病高危人群中較高ipD率之原因。特定而言’血清型！在年齡<2歲之阿拉斯加本地兒童中引起3.5%iIPD，且在年齡為2至4歲之兒童中引起 18%[11]。血清型α血清型5二者在世界其他地區及發達國家之本地居民中皆會明顯引起疾病[12，13，14]〇與其他肺炎球菌血清型相比血清型】亦可能與更為嚴重之疾病有關Π5]。此種觀測結論係基於美國與歐洲之間在病例鐘定率上的差異及醫療實踐上的相關差異。總之，歐洲的1PD發病率低於美國。然而，在歐洲由血清型i引起之 IPD百分比不成比例地高於美國（分別係6至7%對丨至？叫。在歐洲，主要從就醫兒童中獲取血液培養物。在美國，在門。夕中自出現239 C之發熱及白細胞數增加之兒童中獲取幻夜培養物係-常規醫療實踐。考慮到醫療實踐方面之差異’人們推定在美國由血清❸引起之疾病的較低百分比可能係由引起較輕疾病之其他血清型的較高比例所沖淡， 160374.doc 201212937 而在歐洲較高百分比則反映更嚴重之疾病。此外，患有複雜肺炎之兒童的血清流行病學研究證明，血清型1以不成比例的形式呈現[16，17，18]。此表明，血清型1之納入可降低嚴重肺炎球菌疾病之數量，同時有助於侵入性肺炎球菌疾病之整體下降。添加血清型3及7F會增加針對ipd之覆蓋範圍，在世界大部分地區可增加約3%至7%，且在亞洲可增加約9%。因此’ 11-價疫苗在亞洲能夠覆蓋5〇%iIpD而在其他地區覆蓋約80%之IPD[1，2]。對於中耳炎覆蓋範圍此等血清型亦很重要[19]。引起中耳炎之肺炎球菌血清型的跨國研究中，Hausdorff等人發現血清型3係全部最常見之中耳液體分離菌中的第8個[20]。血清型3佔與中耳炎有關之肺炎球菌血清型的多達8.7〇/〇。因此，血清型3及汀在中耳炎以及在IPD中的重要性使之有理由被納入肺炎球菌共扼物疫苗中。然而，欲產生對血清型3多醣展現顯著免疫原性之多價肺炎球®共概物疫苗的嘗試未獲得成功。例如，在u_價肺炎球菌蛋白質D共軛物疫苗⑴_Pn_pD)之免疫原性及安全杜研究中’於已接受3劑量疫苗其後又接受相同疫苗或肺炎球菌多醣疫苗強化劑之嬰兒中未觀㈣對血清⑽之激發效應（Nurkka等人，（2004) ped Inf Dis 】，23 1〇〇8_ 1014)。在另一研究中，來自已接受數劑之嬰兒的調理吞噬分析（〇PA)結果在與其他經測試血清型相當之水平下未能表現出針對血清型3之抗體反應（GatchaHl等 160374.doc 201212937 人，17th Annual Meeting of the Eur. Soc. Paed. Inf. Dis. (ESPID)，Poster No. 4，P1A Poster Session 1，Istanbul Turkey， 2001年3月27曰）。在評定11-Pn-PD於急性中耳炎預防中之功效的又一研究中，該疫苗未能提供針對由血清型3引起之事件的保護（Prymula 等人，www.thelancet.com，第 367 卷：740至748 (2006年3月4曰））。因此，包含來自血清型3之莢膜多醣且能夠引發針對血清型3多醣之免疫原性反應的肺炎球菌共軛物疫苗可帶來超越業内現狀之明顯改進。血清型6A及19A之納入 a. 血清型6A及19A之流行病學文獻中監視數據表明，在年齡<2歲之美國兒童中血清型 6A及19A引起之侵入性肺炎球菌疾病超過血清型1、3、 5、及7F引起之疾病數總和（圖1)[1，5]。此外，此等血清型通常與抗生素抗性有關（圖2)並在中耳炎中起到重要作用 [6，19,20]。尚不清楚當前Prevnar疫苗使人們免受因6A及 19A引起之疾病的能力。下文論述在13vPnC疫苗中納入6A 及19A組份之基本原理。 b. 由6B及19F多醣誘發之針對6A及19A的反應獲得許可之非共軛結合之肺炎球菌多醣疫苗（用於年齡至少為2歲之兒童）已含有6A或6B莢膜多醣但未將二者同時納入[21]。在調配23-價肺炎球菌多醣疫苗時產生之免疫原性數據證明，6B單價疫苗誘發出針對6A及6B莢膜二者之抗體。來自在各種群體中以游離多醣及肺炎球菌共軛物疫苗評定IgG及調理呑噬分析（0PA)反應之若干試驗的數據表 160374.doc 201212937 明’對6A之IgG反應由6B抗原誘發，但該等反應水平一般較低’且6A有機體的OPA活性不同於6B有機體 [22,23,24,25]。此外，產生高水平6B抗體反應之受試者會具有很少或沒有針對6A之活性。與其中存在高度相似性之6A及6B莢膜多醣的化學組成形成對比，19A及19F莢膜完全不同，原因在於19A多醣中存在兩條額外側鏈。並不奇怪的是，在用丨9F多醣疫苗免疫之人類志願者中量測之免疫反應表明，在80%之受試者中誘發出對19F之反應，但僅有20%受試者對19A產生反應 [26]。亦已在使用共輊物疫苗之試驗中證明，在用19ρ多釀免疫後對血清型19A存在低水平之交叉反應性IgG及OPA 反應[24,26]。有關對6A及19A之交叉反應性OPA反應的内部數據已在美國嬰兒中實施之7vPnC銜接性臨床試驗（D118_P16)中獲得（圖3)。此等研究與其他研究之實驗結果一致，並證明用 6B多酿免疫後對6A多醣存在交叉反應性功能抗體的誘發，但水平較低，且用19F免疫後產生極少量之針對19A的功能抗體。動物模型中6B及19F免疫對6A及19A之影響曾使用動物模型來評估使用多醣免疫進行交叉保護之潛力。在由Giebink等人研發之中耳炎模型中，用四價多酶外膜蛋白（OMP)共軛物疫苗（包含6B、14、19F、23F酿）或安慰劑免疫栗鼠[27]。在此試驗中，似乎存在一定程度針對6A之交叉保護；然而其並未達到統計學顯著水平且此針 160374.doc -10- 201212937 對中耳炎之保護水平低於6B。在此相同模型中，存在 100%針對19F中耳炎之保護，但僅有17%針對19A中耳炎之保護。

Saeland等人在肺感染模型中使用來自用8_價肺炎球菌破傷風共軛物疫苗（包含6B及19F)免疫之嬰兒的血清被動免疫小鼠’之後用6A有機體進行鼻内攻擊[28]。在59個血清樣品中，有53。/。的小鼠受到針對與6B相關的菌血症之保護且有370/〇受到針對6A之保護。在相同模型中用19A有機體對用來自經4劑11-價肺炎球菌共軛物疫苗（包含與破傷風類毒素共軛之19F)免疫之嬰兒的血清被動免疫之小鼠施以鼻内攻擊[29]。在經被動免疫且隨後經攻擊之1〇〇只小鼠中，有60只小鼠在肺紕織中沒有檢測到19A有機體，而在所有給予鹽水安慰劑之小鼠中皆鑑定出有機體。然而，在此模型中被動免疫未能使之免受19F有機體之攻擊；因此，該模型與血清群19之相關性仍存在疑問。一般而言，此等模型可提供6B免疫對6A有機體產生某種生物學影響之證據’但對異種血清型之影響與同種血清型中觀察到之影響不同。由此等模型不能充分瞭解19F免疫對19A有機體之影響。功效/效力試驗中6B及19F多醣共輛物免疫對6A及19A疾病之影響表1中示出7vPnC及9vPnC (7vPnC +血清型1及5)功效試驗中因6B、6A、19F及19A血清型引起之疾病病例數 [3〇, 10,3 1 ]。侵入性疾病病例數過少，故對於血清型6A及 160374.doc -11 - 201212937 19A無法得出任何結論。然而，芬蘭人中耳炎試驗得到了大量肺炎球菌分離菌[32]。在按方案分析中，7vPnC對對 84% (95% CI 62%、93%)由血清型6B引起之中耳炎有效且對57% (95% CI 24%、76%)由血清型6A引起之中耳炎有效 (表1)。相反，7vPnC對於由19F或19A引起之中耳炎並未展現出血清型特異性功效。表1. 7vPnC及9vPnC疫苗之功效試驗中由血清型6B、6A、 1 9F、及1 9 A引起之肺炎球菌疾病病例 6B 6A 19F 19A PnC Contr. PnC Contr. PnC Contr. PnC Contr. Kaiser功效試驗_ 7vPnC (ITT) 1 7 0 1 2* 13 0 1 Navajo功效試驗-7vPnC (ITT) 0 5 1 0 1 1 1 0 南非人功效試驗-9vPnC HIV(-)(ITT) 1 2 1 0 0 1 3 1 南非人功效試驗-9vPnC HIY(+)(ITT) 1 7 3 10 2 3 2 3 芬蘭人中耳炎試驗-7vPnC (PP) 9* 56 19* 45 43 58 17 26 *經證明之統計學顯著功效來自參考文獻30、10及33以及個人私下交流

Contr=對照 ITT=意向治療分析 ΡΡ=按方案分析上市後IPD監視數據亦可自疾病控制中心（Centers for Disease Control)實施之旨在評估Prevnar效力的病例對照試驗中獲得[33]。在監視實驗室鑑定在3至23個月大兒童中出現之且在年齡及郵編上與3個對照病例相匹配之肺炎球菌 -12· 160374.doc ⑧ 201212937 侵入性疾病病例。得到允許後，自父母及醫療供應者處獲得病例與對照之病史及免疫史（若受試者曾接受至少1劑 Prevnar即認為其受到免疫）。在2003年ICAAC會議上提出了初步結果並在表2中示出有關6B、19F、19A及6A疾病之研究結果之總結。此等數據表明Prevnar能夠預防由6A引起之疾病，但在程度上賴低於血清型6B疾病。此等數據亦表明對由19A引起之侵入性疾病的交叉保護很有限。表2. CDC實施之病例對照試驗的初步結果（在2003年 ICAAC上提出）血清型供給信息之集合，η VE* (95% CI) 疫苗類型，全部 115 94 (87，97) 相關疫苗，全部 36 70 (38 > 86) 非疫苗類型，全部 43 -4 (-106，48) 6B 27 94 (72 ’ 99) 19F 19 73 (16，92) 6A 15 87 (53，97) 19A 16 40 (-87，80) *疫苗效力，對接種疫苗（21劑量）與未接種疫苗加以比較，並根據基本條件加以調整參考文獻40及個人/保密信函使用Prevnar之已發表分析[3]亦表明，血清型6B及19F使由血清型6A及19A在年齡小於2歲之兒童中引起之IPD適當降低（[3]中表1)。由血清型6A、9A、9L、9N、18A、 18B、18F、19A、19B、19C、23A及 23B (「所有疫苗相關 160374.doc -13- 201212937 血清型」）引起之未經免疫之成年人中的發病率稍有降低 ([3]中之表2)。此等數據確定’用Prevnar在年齡小於2歲之兒童中進行群體免疫適合血清型6A及19A，且為將血清型 6A及19A納入本發明13vPnC疫苗中提供依據。有關添加6A及19A之結論示於圖1及表2中使用7 vPnC疫苗進行之上市後監視數據及病例對照研究結果表明，與上述動物模型中有關免疫反應及性能之其他信息相同，會存在一定程度針對6A疾病之交叉保護，但與6B疾病相比程度較低。此外，針對19A之保護似乎很有限。因此，含有血清型6A及19A之13vPnC疫苗可提供不依賴於血清型6B及19F之血清群交叉保護限制的覆蓋範圍。因此，本發明提供一種包含13個各不相同之多醣蛋白質共軛物以及一生理上可接受之媒劑的多價免疫原組合物，其中該等共軛物中每一個皆包含一與一載體蛋白質共軛結合的不同莢膜多醣，且其中該等莢膜多醣係由肺炎鏈球菌之血清型 i、3、4、5、6A、6B、7F、9v、14、加、 19A 191?及23F製備而成。一此種載體蛋白質係稱作 CRM〗9?之白喉類毒素。該免疫原組合物可進一步包含佐劑諸如基於鋁之佐劑，諸如磷酸鋁、硫酸鋁及氫氧化鋁。莢膜夕醣可藉由熟習此項技術者已知之標準技術製備。本發月中’莢膜多醣係由肺炎鏈球菌之血清型1、3、、5、6A、6B ' 7F、9V、14、18C、19Α、19F 及 23F 製備 160374.doc 201212937 而成。此專肺炎球菌共軛物可藓 J错由分開之方法製其調配成單劑量調配物。例如，—_ 備並了將仕—貫施例中，作名_ —姑炎球菌多醣血清型生長於以大尺母 w 穴丑為主的培養基中。，缺後可藉由離心、沉澱、超渡、及管枉層析純化各個多.：對經純化之多醣實施化學活化以㈣Μ㈣Μ發生反應。旦沽化，母凡狀少嗯會分別與—載體蛋白質共軛結合以形成醣共軛物。在一實施例中 J r 母—失膜多醣係與相同載體蛋白質共輕結合。在此营始加士任此貫施例中，該共軛結合作用係藉由還原性胺化作用達成。多醣之化學活化及隨後與載體蛋白f之共輛結合作用可藉由習知方法達成。可參見(例如)美國專利第4,673,574號及第 4,902,506號[34,35]。載體蛋白質較佳係無毒及不具反應原性且可以足夠量及足夠純度獲得之蛋白質。載體蛋白質應能夠經受標準共輛結合作用程序。在本發明-特定實施例中，使紅RMi”作為載體蛋白質。 CRM197 (Wyeth，Sanford , NC)係白喉毒素的無毒變體 (即，類毒素）’其分離自生長於以水解酪蛋白胺基酸及酵母抽提物為主之培養基中的白喉桿菌（c〇rynebactedum diphtheria)菌株C7(pl97)培養物。CRM,”係藉由超濾、硫酸敍沉澱、及離子交換層析法純化。或者，可根據以引用方式併入本文中的美國專利第5,614,382號以重組方式製備 CRM197。其他白喉類毒素亦適於用作載體蛋白質。 160374.doc 201212937 其他適宜載體蛋白質包括經滅活之細菌毒素，諸如破傷風類毒素、百日咳類毒素、霍亂類毒素（例如，國際專利申請案第WO 2004/083251號中所述者[38])、大腸桿菌（E coli)LT、大腸桿菌ST、及來自綠膿桿菌（pseud〇m⑽μ aeruginosa)之外毒素a。亦可使用細菌外膜蛋白質，諸如外膜複合體c(OMPC)、細胞外膜孔道蛋白（ρ〇Ηη)、鐵傳遞蛋白結合蛋白、肺炎球菌溶血素、肺炎球菌表面蛋白 A(PSPA)、肺炎球菌黏附素蛋白（PsaA)、來自a族或B族鏈球菌之C5a肽酶、或流感嗜血桿菌（Haem〇philus丨㈤此虹狀) 蛋白亦可用其他蛋白質，諸如卵清蛋白鑰孔血藍蛋白（KLH)、牛血清白蛋白（BSA)或結核菌素的純化蛋白衍生物（PPD)作為載體蛋白質。莢膜多醣與載體蛋白質進行共軛結合後，可藉由多種技術純化多醣-蛋白質共軛物（相對於多醣_蛋白質共軛物之量進行昌集）。此專技術包括濃縮/透析過渡操作、沉殺/溶洗、管柱層析法及深度過濾。參見下文實例。對逐個醣共軛物實施純化後，將其混合以調配可用作疫苗之本發明免疫原組合物。本發明免疫原組合物之調配可使用業内公認方法達成。例如，可將13種單獨肺炎球菌共軛物與生理上可接受之媒劑調配在一起來製備該組合物。此等媒劑之實例包括但不限於水、經緩衝鹽水、多元醇 (例如，甘油、丙二醇、液體聚乙二醇）及葡萄糖溶液。在某些實施例中’免疫原組合物會包含一或多種佐劑。本文所疋義之佐劑」係可用來增強本發明免疫原組合物 160374.doc -16- 201212937 之免疫原性的物質。因此，佐劑常用來加強免疫反應且為熟習此項技術者所熟知。可增強組合物效力之適宜佐劑包括但不限於： (1) 鋁鹽（明礬），諸如氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鋁，等等； (2) 水包油乳液調配物（含有或不含其他特異性免疫調節劑，諸如胞壁醯肽（如下文定義）或細菌細胞壁組份），例如， (a) MF59 (PCT公開案第WO 90/14837號），其含有5%角鯊烯、0.5%吐溫80、及0.5% Span 85(視情況含有不同量之 MTP-PE (見下文，但並非必需）），使用微射流均質機（諸如型號為110Y之微射流均質機）(MicroHuidics，Newton， ΜΑ)將其調配成亞微米顆粒， (b) SAF，其含有10%角鯊烯、0.4%吐溫80、5%普羅尼克（pluronic)嵌段聚合物L121、及thr-MDP (見下文），可將其微流化成亞微米乳液或進行渦旋以形成較大粒徑之乳液，及 (c) RibiTNMi 劑系統（RAS)(Corixa，Hamilton，MT)，其含有2%角鯊烯、0.2%吐溫80、及一或多種選自由闡述於美國專利第4,912,094號之3-0-去芳基化單磷脂A(MPLtm) (Corixa)、二分枝菌酸海藻糖（TDM)、及細胞壁骨架（CWS)組成之群的細菌細胞壁組份，較佳係MPL+CWS (Detox™); (3) 可使用皂苷佐劑，諸如Quil A或STIMULON™ QS-21 (Antigenics，Framingham，ΜΑ)(美國專利第 5,057,540號） 160374.doc -17- 201212937 或由其形成之顆粒，諸如IS COM (免疫刺激複合體）； (4) 細菌脂多膽’合成之脂質a類似物，諸如胺基烷基葡萄糖胺磷酸化合物（AGP)或其衍生物或類似物，彼等可購自Corixa且闡述於美國專利第6，113,918號中；一種此類 AGP係2-[(R)-3-十四烷醯基氧基十四烷醯基胺基]乙基2去氧-4-0-膦醯基-3-0-[(R)_3-十四烷醯基氧基十四烷醯基]_2_ [(R)-3-十四烷醯基氧基十四烷醯基胺基]·比喃葡萄糖苷’其亦稱作529(先前稱作RC529)，可將其調配成水性形式或穩定乳液；又如合成之多核苷酸，諸如包含一或多個 CpG基序之寡核苷酸（美國專利第6,2〇7,646號）； (5) 細胞因子，諸如介白素（例如，jl]、IL 2、IL 4、 IL-5、IL-6、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18，等等）、干擾素 (例如，γ干擾素）、粒細胞_巨噬細胞集落刺激因子（GM_ CSF)、巨噬細胞集落刺激因子（M_CSF)、腫瘤壞死因子 (TNF)、協同刺激分子B7-1及B7-2，等等； (6) 細菌ADP-核糖化毒素之去毒突變體，諸如呈野生型或突變型（例如’根據公開之國際專利申請案第w〇 00/18434號（亦參見 WO 02/098368 及 WO 02/098369，其中 29位胺基酸麩胺酸由另一胺基酸（較佳為組胺酸）取代）之霍亂毒素（CT)、百曰咳毒素（PT)、或大腸桿菌熱不穩定毒素 (LT)，尤其係LT-K63、LT-R72、CT-S109、PT-K9/G129(參見，例如 WO 93/13302 及 WO 92/19265);及 (7) 可用作免疫調節劑以增強組合物效力之其他物質。胞壁醯肽包括但不限於N-乙醯基·胞壁醯基-L-蘇胺醯基- 160374.doc ⑧ 201212937 D-異麩胺醯胺（thr-MDP)、N-乙醯基-降胞壁醯基-L-丙胺酸-2-(Γ-2'二棕櫚醯基-Sn-甘油-3-羥基磷醯基氧基）-乙胺 (MTP-PE)，等等本發明疫苗調配物可用於藉助經系統或黏膜途徑施予疫苗來保護或治療易受肺炎球菌感染之人類。此等施予可包括經肌内 '腹膜腔内、皮内或皮下途徑注射；或經由黏膜向口腔/食道、呼吸道或泌尿生殖道施予。在一實施例中’使用鼻内施予來治療肺炎或中耳炎（因可更有效地防止肺炎雙球菌的鼻嚥運輸，從而減弱早期階段之感染）。對每一疫苗劑中共軛物的量加以選擇，該量應能夠誘發免疫保護反應，而且無明顯副作用。端視肺炎球菌血清型’該量會有所變化。一般而言，每一劑會含有〇. 1至100 微克之多醣，特定而言含0.1至10微克，且更特定而言含i 至5微克。用於特定疫苗之組份的最佳量可藉由涉及觀察受試者中適當免疫反應之標準研究確定。初次免疫接種後，受試者可接受一或數次經恰當間隔開之加強免疫。在本發明一特定實施例中，13vPnC疫苗係分別與 CRM197共軛結合之血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、 9V、14、18C、19A、19F、及23F肺炎球菌莢膜多醣的無菌液體調配物。每一 0.5毫升劑量經調配含有：2微克之各種膽’僅有6B為4微克；約29微克之CRM197載體蛋白質； 0.125毫克之元素鋁（〇.5毫克磷酸鋁）佐劑；以及作為賦形劑之氯化鈉與琥珀酸鈉缓衝劑。將該液體填裝入不含保存 160374.doc -19- 201212937 劑之單個劑量注射器中。震盪後，疫苗呈均質白色懸浮液狀態，可用於肌内施予。 13乂？11〇：疫苗劑量水平之選擇類似於上市之7乂？11(：疫苗 (Prevnar)。對於所有血清型皆選擇2微克之醣劑量水平，僅6B為每劑4微克。7vPnC疫苗對於血清型4、9V、14、 18C、19F及23F在2微克醣劑量水平下以及對於6B在4微克劑量下已顯示出期望之安全性、免疫原性、及針對IPD之功效。免疫方案可遵循指定用於7 vPnC疫苗之方案。例如，針對因納入13vPnC疫苗中的血清型而由肺炎鏈球菌引起之侵入性疾病的例行方案係用於2、4、6及12至1 5月齡之嬰兒及幼童。本發明組合物亦適用於較大兒童、青少年及成年人0 本發明組合物可進一步包括一或多種針對由其他細菌感染引起之中耳炎的額外抗原。此等細菌包括非典型的流感嗜血桿菌（Haemophilus influenza)、卡他莫拉菌（Moraxella catarrhalis)(先前稱作卡他布蘭漢氏菌（Branhamella catarrhalis))及耳炎差異球菌（A11〇i〇c〇ccus 〇tiUdis)。適於納入之非典型流感嗜血桿菌抗原的實例包括p4蛋白質，亦稱作蛋白質「e」（美國專利第5,601，831號；國際專利申請案第WO03/078453號）、P6蛋白質，亦稱作pal或 PBOMP-1蛋白質（美國專利第511〇 9〇8號；國際專利申請案第W00100790號）、P5蛋白質（美國再公告專利第37 741 號）、嗜血桿菌黏附及透過蛋白（美國專利第6,245,337號及 160374.doc •20· 201212937 第6,676,948號）、LKP tip黏附素蛋白（美國專利第5,643,725 號）及NucA蛋白（美國專利第6,221，365號）。適於納入之卡他莫拉菌抗原之實例包括UspA2蛋白（美國專利第5,552，146號、第6,310，190號）、CD蛋白（美國專利第 5,725,862號）' E蛋白（美國專利第5,948,412號）及74 kD外膜蛋白質（美國專利第6,899,885號）。適於納入之耳炎差異球菌抗原之實例包括彼等在國際專利申請案第WO 03/048304號中得到鑑別者。本發明組合物亦可包括一或多種來自肺炎鍵球菌之蛋白質。適於納入之肺炎鏈球菌蛋白質之實例包括彼等在國際專利申請案第WO 02/083855號中得到鑑別者，以及闡述於國際專利申請案第WO 02/053761號中的肺炎鏈球菌蛋白質。本發明組合物可進一步包括一或多種腦膜炎雙球菌 (Neisseria meningitidis)類型8之蛋白質。適於納入之腦膜炎雙球菌類型B蛋白質之實例包括彼等在國際專利申請案第 WO 03/063766號，第 WO 2004/094596號，第贾〇 01/85772 號第W〇 02/16612號及第WO 01/87939號中得到鑑別者。上文揭示内容概括性地闡述了本發明。參考以下具體實例可獲彳于更為全面之理解。此等實例僅用於舉例說明之目的而非意欲對本發明範圍加以限制。實例實例1 160374.doc •21- 201212937 肺炎鏈球菌莢膜多醣血清型丨之製備主細胞庫及工作細胞庫之製備肺炎鏈球菌之血清型1自美國典型培養物收藏中心 (American Type Culture Collection，ATCC)獲得，菌株 6301。製備若干代菌種儲備物以擴繁菌株並去除動物源組份（FI、F2、及F3代）。製備額外的兩代菌種儲備物。額外的第一代由F3小瓶之菌液製備而成，而隨後的一代由該額外的第一代製備而成。以合成甘油作為低溫保存劑來冷凍 (<-70°C )保存該等菌種小瓶。除冷凍小瓶外，對於F4代亦製備經凍乾小瓶。對於細胞庫製備，使所有培養物生長於以大豆為主的培養基中。冷凍之前，藉由離心濃縮細胞，去除餘下之培養基並將細胞沉澱重懸於含有低溫保存劑 (諸如合成甘油）之新鮮培養基中。發酵及收集使用來自工作細胞庫之培養物接種含有以大豆為主的培養基之接種瓶。將各瓶在36t±2t(無攪拌）下培育直至滿足生長要求為止。使用接種瓶接種含有以大豆為主的培養基之菌種發酵罐。用無菌碳酸鈉溶液維持約7.〇2pH值。達到目標光密度後，使用菌種發酵罐接種含有以大豆為主的培養基之生產發酵罐。用無菌碳酸鈉溶液維持pH。在生長停止後或達到發酵罐工作體積時終止發酵。向培養物中添加適宜量之無菌的12%去氧膽酸鈉以裂解細菌細胞並釋放細胞結合多醣。裂解後，冷卻發酵罐内含物。用乙酸將經裂解培養液之PH調節至約PH 6.6。藉由連續流動離心繼 160374.doc -22- 201212937 而進行深度過濾及0·45微米微孔過濾來澄清裂解物。在—替代方法中，用3 N NaOH維持約7·0之發酵pH。達到目"^光密度後，使用菌種發酵罐接種含有以大豆為主的培養基之生產發酵罐。用3 N NaOH維持pH。在生長停止後或達到發酵罐工作體積時終止發酵。向培養物中添加適且量之無菌的12。/〇去氧膽酸鈉以在培養液中得到〇〖2〇/〇之濃度’從而裂解細菌細胞並釋放細胞結合多醣。裂解後，邊攪拌邊在介於7°C至13°C之間的溫度下使發酵罐内含物保持8至24小時之間的時間間隔，以確保細胞裂解及多醣釋放進行完全。在此保持期間進行攪拌以防止裂解物沉澱沈積於發酵罐壁及pH探頭上，從而使探頭能夠保持完好。接下來，用50%乙酸將裂解培養液之卩^調節至約pH 5 〇。保持^又時間後（無授拌’時間間隔介於12小時至24小時之間，溫度介於15°C至25。(：之間），大部分先前可溶之蛋白質由溶液中析出成為固體沉澱物，其中留在溶液中之多醣幾乎無損失或無降解。藉由連續流動離心繼而進行深度過濾及0.45微米微孔過濾來澄清含有沉澱物之溶液。純化肺炎球菌多醣之純化由若干濃縮/透析過濾操作、沉澱/ 溶洗、管柱層析、及深度過濾步驟構成。除非另有說明，否則’所有程序皆在室溫下實施。將來自肺炎鏈球菌血清型i之發酵罐培養物的澄清培養液濃縮並使用100 kDa MWCO(千道爾頓分子量截流）過濾器進行透析過濾。使用磷酸鈉緩衝液在中性pH下達成透析 160374.doc •23· 201212937 過濾。藉由透析過濾自較高分子量之生物高分子（諸如核酸、蛋白質及多醣）中去除低分子量培養基組份。藉由添加來自儲備溶液之溴化十六碳烷基三曱銨（HB)達 1% HB (w/v)之終濃度來自經濃縮且經透析過濾之溶液中沉澱出多醣。在深度過濾器上收集多醣/HB沉澱物並棄去濾液。藉由使氯化鈉溶液循環通過含有沉澱物之深度過濾器來重新溶解及溶洗多醣沉澱物。然後用額外氣化鈉溶液漂洗過濾器。將來自Nal儲備溶液的蛾化納（Nal)添加至多酿溶液中以達到0.5%之終濃度從而沉澱HB。藉由深度過濾去除沉澱物。濾液包含目標多醣。用NaCl/Nal溶液漂洗沉澱容器及過濾器並將漂洗液與經部分純化之多醣溶液合併。棄去濾液。然後使多醣通過0.2微米之過濾器過濾。在30 kDa MWCO超濾器上濃縮多醣溶液並用氣化鈉溶液透析過濾。藉由通過經活性炭浸潰之深度過濾器過濾來進一步純化經部分純化之多醣溶液。過濾後’用氯化鈉溶液漂洗該炭過濾、器。將漂洗液與多醣溶液合併，然後使之通過0.2微米之過濾器進行過濾。在30 kDa Mwc〇超濾器上濃縮多醣溶液並用1 Μ磷酸鈉緩衝液對其加以調節得到0.025 Μ之磷酸鈉終濃度。檢查 pH並調節至7.〇土〇 2。用含有氯化鈉之磷酸鈉緩衝液平衡陶瓷羥基磷灰石（HA) 官柱以得到適宜電導率（<15 pS) »然後將多醣溶液上樣至 160374.doc -24- 201212937 管柱上。在此等條件下，雜質結合於樹脂上且可自流經管柱的液流中回收多醣。使多醣溶液過濾通過置於管柱之前及之後的0.2微米在線過濾器。使用30 kDa MWCO過濾器濃縮多醣溶液。然後用注射用水（WFI)透析過濾濃縮物。通過0.2微米膜濾器將經透析過濾之多醣溶液過濾至聚丙烯瓶中。取出樣品供測試並將經純化之多醣冷凍保存於-25°C ±5°C 下。定性藉由賦予多醣分子質子之信號的分配可知1h_NMr數據與化學結構相一致。1H-NMR譜顯示出一系列解析度良好的信號（質子來自甲基）從而可用於定量多醣中0_乙醯基官能團。藉由逆流免疫電泳使用特異性抗血清確認一價多醣之身份。使用偶聯有折射率及多角度雷射光散射（MALLS)檢測器之高效凝膠過濾層析並結合樣品濃度來計算分子量。使用尺寸排除層析介質（CL_4B)展示多醣之相對分子大小分佈。實例2 血清型1肺炎球菌醣_CRMi97共軛物之製備活化及共軛使含有經純化多醣之容器解凍且合併於反應容器中。向該反應器中添加〇 2 Μ碳酸鈉（pH 9.0)以在50°C下進行3小 160374.doc -25- 201212937 時的部分脫乙醯基作用（水解）。將反應物冷卻至20«c並藉由0.2 Μ乙酸實施中和。藉由在2至8。(：下培育來實施高碘酸鈉存在下之氧化，並將混合物攪拌15至21小時。將活化反應混合物濃縮並用30K MWCO濾膜以0.9% NaCl過濾透析i〇x。滯留物經ο』微米過濾器過濾。將經活化之_填裝入100毫升玻璃凍乾瓶中，且在_75°CT實施滾動冷凉然後進行冷床乾燥。「滾動冷凍」係用於製備供凍乾（冷凍乾燥）之樣品的方法。在含有醇或任一其他適宜流體之冷束浴中藉由電機驅動滾筒自動旋轉培養瓶。使一薄層產物在培養瓶「外殼」内側各處得到均勻冷凍，從而使更大體積之材料在每次冷凍乾燥運行期間得到安全加工。此等自動化冷凍裝置提供了一種能夠同時預冷凍許多培養瓶、在内側形成期望塗層並為有效冷練乾燥提供足夠表面積之簡便而有效的方法。使含有凍乾材料之瓶升至室溫並以2:1之醣/蛋白質比重懸於CRMw溶液中。向醣/蛋白質混合物中加入1 μ磷酸鈉緩衝液以達0·2 Μ之最終離子強度及7·5之pH值，然後添加氰基硼氫化鈉。將反應物在23。(：下培育18小時，然後再在 37°C下培育72小時。與氰基硼氫化物一起培育之後，用冷鹽水稀釋反應混合物，之後加入1 Μ碳酸鈉以將反應混合物pH調節至9.0。藉由添加硼氫化納在23下培育3至6小時來淬滅未反應之酸。用鹽水將反應混合物稀釋2倍並將其通過0.45至5微米預過濾器轉移到滯留物容器中。將反應混合物用〇15 Μ磷酸 160374.doc -26· 201212937 緩衝液（pH 6)透析過濾3〇x並用鹽水透析過濾2〇x。通過0.2 微米之過濾器過濾滞留物。將共輥物溶液在0.9%鹽水中稀釋成目標濃度為〇·5毫克/ 毫升’且隨後在Class 100通風櫥中將其無菌過濾至最終總體濃縮物（FBC)容器中。將共軛物保存在2至8。〇下。定性使用尺寸排除層析介質（CL-4B)屐示共輕物之相對分子大小分佈。藉由狹縫印跡分析使用特異性抗血清確認共軛物之身份。分別藉由醛糖酸及Lowry分析測定醣與蛋白質濃度，共價結合之共輕複合物中醣與蛋白質之比值可藉由如下計算獲得：微克/毫升醣比值=......-................ 微克/毫升蛋白質藉由Hestdn法量測〇_乙醯基含量（Hestrin等人，；趴〇1

Chem. 1949，180，第249頁）β根據〇_乙酿基濃度與總釀濃度之比得到每毫克醣中〇_乙醯基的微莫耳數。實例3 肺炎鍵球菌笑膜多醣企清型3之製備主細胞庫及工作細胞庫之製備自 Robert Austrian 博士（Univershy 〇f 卜刪^繼^， Philadelphia，Pennsylvania)處獲得肺炎鏈球菌之血清型 3。有關細胞庫系統之製備，參見實例i。 160374.doc -27- 201212937 發酵及收集使用來自卫作細胞庫之培養物接種含有以大豆為主之培養基的接種瓶。將各瓶在36t:±2。。(無攪拌)下培育直至滿足生長要求為^使用接種瓶接種含有以大豆為主的培養基之菌種發酵罐。用無菌碳酸鈉溶液維持約7 ()之邱值。達到目標光密度後’使用菌種發酵罐接種中間菌種發酵罐。達到目標光密度後，使用中間菌種發酵罐接種生產發酵罐。用無菌碳酸鈉溶液維持pH。達到發酵罐工作體積後終止發酵。向培養物中添加適宜量之無菌12%的脫氧膽酸鈉以裂解細菌細胞並釋放細胞結合多醣。裂解後，冷卻發酵罐内含物。用乙酸將經裂解培養液之1)11調節至約pH 6.6。藉由連續流動離心繼而進行深度過濾及〇 45微米微孔過濾來澄清裂解物。純化肺炎球菌多醣之純化由若干濃縮/透析過濾操作 '沉澱/ 溶洗、管柱層析、及深度過濾步驟構成。除非另有說明，否則，所有程序皆在室溫下實施。將來自肺炎鏈球菌血清型3發酵罐培養物的澄清培養液濃縮並使用100 kDa M WCO過濾器進行透析過濾。使用碟酸鈉緩衝液在中性pH下達成透析過濾。藉由透析過濾自較高分子量之生物高分子（諸如核酸、蛋白質及多醣）中去除低分子量培養基組份。在添加溴化十六碳烷基三曱銨（HB)之前，向經濃縮及經透析過濾之多醣溶液中加入經計算體積的NaCl儲備溶液以 -28- 160374.doc rs) 201212937 得到0.25 M NaCl之終濃度。然後藉由添加來自儲備溶液之ΗΒ達1% HB (w/v)之終濃度來沉澱多醣。在深度過濾器上收集多醣/HB沉澱物並棄去濾液。藉由使氣化鈉溶液循環通過含有沉澱物之深度過濾器來重新溶解及溶洗多醣沉澱物。然後用額外氣化鈉溶液漂洗過濾器。將來自Nal儲備溶液的碘化鈉（NaI)添加至多醣溶液中以連到0.5%之終濃度從而沉澱HB。藉由深度過濾去除沉澱物。濾液包含目標多醣。用NaCl/Nal溶液漂洗沉澱容器及過濾器並將漂洗液與經部分純化之多醣溶液合併。棄去滤液。然後使多醣通過0.2微米之過濾器過濾。在30 kDa MWCO超渡器上濃縮多醣溶液並用氣化納溶液透析過濾。藉由通過經活性炭浸潰之深度過濾器過濾來進一步純化經部分純化之多醣溶液。過濾後，用氣化鈉溶液漂洗該炭過渡器。將漂洗液與多醣溶液合併，然後使之通過〇. 2微米之過濾器進行過濾。在30 kDa MWCO超濾器上濃縮多醣溶液並用！ μ磷酸鈉缓衝液對其加以調節得到1025 Μ之磷酸鈉終濃度。檢查 pH並調節至7.0±0,2。用含有氣化鈉之磷酸鈉緩衝液平衡陶瓷羥基磷灰石（HA) 管柱以得到適宜電導率（15 pS)。然後將多醣溶液上樣至管柱上。在此等條件下，雜質結合於樹脂上且可自流經管柱的液流中回收多醣。使多醣流過含有緩衝液之管柱並通過 0.2微米過濾器過濾。 160374.doc •29· 201212937 使用30 kDa MWCO過滤器濃縮多醣溶液。然後用WFI透析過濾濃縮物。通過0.2微米膜濾器將經透析過濾之多醣溶液過濾、至不銹鋼容器中。取出樣品供測試並將經純化之多醣冷束保存於-25°C±5°C 下。定性藉由賦予多醣分子質子之信號的分配可知1H-NMR數據與化學結構相一致。藉由逆流免疫電泳使用特異性抗血清確認一價多醣之身份。使用與折射率及多角度雷射光散射（MALLS)檢測器偶接之高效凝膠過濾層析並結合樣品濃度來計算分子量。使用尺寸排除層析介質（CL-4B)展示多醣之相對分子大小分佈。實例4 血清型3肺炎球菌醣-CRM197共軛物之製備活化及共耗使含ik清型3醣之容器解凍且合併於反應容器中。向該反應器中，加入WFI及2 Μ乙酸以達0.2 Μ及2毫克/毫升醣之終濃度。使溶液溫度升高至85°C保持1小時以水解多醣。將反應物冷卻至;S25°C並添加1 Μ氯化鎂以達〇·1 Μ之終濃度。藉由在23 °C下培育16至24小時實施高碘酸鈉存在下之氧化。將活化反應混合物濃縮並用100K MWCO濾膜以WFI透 160374.doc -30· 201212937 析過濾1〇χ。藉由0.2微米之過濾器過濾滞留物。對於混合，將0.2 Μ磷酸鈉（pH 7.0)添加至經活化醣中以達10 mM之終濃度及6.0至6.5之pH。將CRMl97載體蛋白質與酿溶液混合以得到2克比1克之醣/CRMm比◊將合併之醣/蛋白質溶液填裝至100毫升玻璃凍乾瓶中（目標填裝量為 50毫升）’在-75 °C下實施滾動冷凍，然後進行冷凍乾燥。使含有經一起冷乾之醣/蛋白質材料的瓶升溫至室溫並重懸於0.1 Μ填酸鈉緩衝液（pH 7.0)中以達2〇毫克/毫升之醣終濃度。將pH調節至6.5且隨後添加0.5莫耳當量之氰基侧氫化鈉。將反應物在37°C下培育48小時。與氰基硼氫化物一起培育後，用冷的5 mM琥珀酸鹽/0.9%鹽水緩衝劑稀釋反應混合物。藉由添加爛氫化鈉並在23°C下培育3至6小時來淬滅未反應之醛。使反應混合物通過0·45至5微米前過濾器轉移至滯留物容器中。用0.1 Μ磷酸緩衝液（pH 9)將反應混合物透析過濾3〇χ，用0.15 Μ磷酸鹽缓衝液（pH 6)透析過濾20χ，並用5 mM玻珀酸鹽/0.9%鹽水透析過濾20x。藉由0.2微米之過濾器過渡滯留物。將共軛物溶液稀釋成醣目標濃度為0.5毫克/毫升，並在 Class 100通風櫥中將其無菌過濾至FBC容器中》將共輕物保存在2至8°C下。定性使用尺寸排除層析介質（CL-4B)展示共軛物之相對分子大小分佈。 160374.doc -31- 201212937 藉由狹缝印跡分析使用特異性抗血清確認共輛物之身份。分別藉由Anthrone及Lowry分析測定醣與蛋白質濃度。共價結合之共軛複合物中醣與蛋白質之比值可藉由如下計算獲得：微克/毫升酿比值=.....-................. 微克/毫升蛋白質實例5 肺炎鍵球菌英膜多醣血清型5之製備自紐約州立大學（Brooklyn，New York)之 Gerald Schiffman 博士處獲得肺炎球菌血清型5。有關細胞庫系統之製備，參見實例1。有關多醣之發酵、收穫、純化及定性，參見實例1。替代發酵方法使用來自工作細胞庫之培養物接種含有以大豆為主的培養基及10 mM無菌NaHC〇3溶液之接種瓶。將各瓶在 36°C±2它（無攪拌）下培育直至滿足生長要求為止。使用接種瓶接種含有以大豆為主的培養基及1〇 mM無菌NaHc〇3 =液之菌種發酵罐。用3 N Na〇H維持約7〇之阳。達到目標光密度後，使用菌種發酵罐接種含有以大豆為主的培養基（其中NaHC〇3濃度為1〇 mM)之生產發酵罐。用]n

Na〇H維持PH °在生長停止後或達到發酵罐王作體積時終止發酵。向培養物中添加適宜量之無菌的12%脫氧膽酸鈉以在培養液中得到〇·12%之濃度，從而裂解細菌細胞並釋 160374.doc

-32· 201212937 放細胞結合多醣。裂解後，邊遭搜拌邊在介於7C至13<>C之間的溫度下使發酵罐内含物伴切侏符8至24小時之間的時間間隔’以確保細胞裂解及多聽釋放進行完全。在此保持進行㈣以防止裂解物㈣沈積於發酵罐壁及pH探頭上，從而使探頭能夠保持完好。技令 ^ f接下來，用50%乙酸將裂解培養液之pH調節至約PH 4 5 〇徂姓饥士 ° 間間隔介於12小時至24小時之間，溫度介於丨代至抑之間）’大部分先前可溶之蛋白質由溶液中析出成為固體沉澱物，其中留在溶液中之多酶幾乎無損失或無降解。藉由連續流動離心繼而進行深度過滤及㈣微米微孔過據來澄清含有沉澱物之溶液。實例6 金清型5肺炎球菌醣-CRMw共軛物之製備活化及共軛使含血清型5醣之容器解凍且合併於反應容器中。向該反應器中加入0.1 Μ乙酸鈉（pH 4·7)，之後藉由在23 °c下讲育16至22小時實施高峨酸鈉存在下之氧化。將活化反應混合物濃縮並用100K MWCO濾膜以WFI透析過據10X。通過〇.2微米之過濾器過濾滯留物。將血清型5活化醣與CRMi97以0.8:1之比例混合。將合併之膽/蛋白質溶液填裝至100毫升玻璃凍乾瓶中（目標填裝量為50毫升），在-75°C下實施滾動冷凍，然後一起冷束乾燥。使含有經一起凍乾之材料瓶升溫至室溫並重懸於〇 . 1M/^ 160374.doc -33- 201212937 酸鈉（pH 7.5)中且添加氰基硼氫化鈉。將反應物在3〇〇c下培育72小時’之後再添加一次氰基硼氫化物並在30〇c下培育20至28小時。與氰基硼氫化物一起培育後，用鹽水將反應混合物稀釋 2倍並通過0·45至5微米前過濾器將其轉移至滯留物容器中。用0.01 Μ磷酸緩衝液（ΡΗ 8)將反應混合物透析過濾 30x ’用0.15 Μ磷酸緩衝液（pH 6)透析過濾20x，並用鹽水透析過濾20x *通過〇,2微米之過濾器過濾滯留物。將共軛物溶液稀釋成醣目標濃度為〇·5毫克/毫升，並在 Class 100通風櫥中將其無菌過濾至fBc容器中。將共軛物保存在2至81下。有關共軛物之特性，參見實例2。實例7 肺炎鏈球菌莢膜多醣企清型6A之製備自紐約州立大學（Bro〇klyn，New York)之 Gerald Schiffman 博士處獲得肺炎球菌血清型6A。有關細胞庫系統之製備’ 參見實例1。有關多醣發酵、收穫及純化，參見實例1，但在純化期間，於進行層析步驟之前省略了 30 kDa MWCO濃縮步驟。實例8 血清型6A肺炎球菌醣-CRM197共軛物之製備活化及共輕血清型6A多膽係高分子量聚合物，在氧化前須使之減小。使含血清型6A醣之容器解凍且合併於反應容器中。向 160374.doc •34- 201212937 該反應器中，添加2 Μ乙酸以達0.1 Μ的終濃度，在6〇 °c下水解1.5小時。將反應物冷卻至23°C並藉由用1 M NaOH將反應混合物pH調節至6來實施中和。藉由在23 °C下培育14 至22小時來實施高碘酸鈉存在下之氧化。將活化反應混合物濃縮並用100K MWCO濾膜以WFI透析過濾10X。通過0.2微米之過濾器過濾滯留物。將血清型6A與蔗糠混合並填裝至1〇〇毫升玻璃康乾航中 (目標填裝量為50毫升）並在-75°C下實施滾動冷凍然後進行冷凉·乾燥。使含有凍乾材料之瓶升溫至室溫並以1:丨之醣/蛋白質比重懸於一曱基亞硬（DMSO)中。添加氰基棚氫化納後，將反應混合物在23°C下培育18小時。與氰基硼氫化物一起培月後’用冷的鹽水稀釋反應混合物。藉由添加棚氫化納在 23C下培育3至20小時來淬滅未反應之酸。將經稀釋之反應混合物通過5微米前過濾器轉移至滞留物容器中。用0.9% NaCl將反應混合物透析過濾ι 〇χ並用經號拍酸鹽緩衝之NaCl透析過濾30χ。通過〇.2微米之過遽器過滤滞留物。將共軛物溶液稀釋成醣目標濃度為〇·5毫克/毫升，並在 Class 100通風櫥中將其無菌過濾至fbc容器中。將共軛物保存於2至8°C下。有關共輛物之特性，參見實例2。實例9 肺炎鏈球菌莢膜多II血清型7F之製備 160374.doc -35- 201212937 自纽約州立大學（Brooklyn，New York)之Gerald Sehiffman 博士處獲得肺炎球菌血清型7F。有關細胞庫系統之製備以及有關多醣之發酵及收穫’參見實例3。對於替代之發酵及收穫方法’參見實例1令所述之替代方法。純化肺炎球菌多醣之純化由若干濃縮/透析過濾操作、沉澱/ 溶洗、管柱層析、及深度過濾步驟構成。除非另有說明，否則’所有程序皆在室溫下實施。將來自肺炎鏈球菌血清型7F發酵罐培養物之澄清培養液濃縮並使用100 kDa MWCO過濾器進行透析過濾。使用碟酸鈉緩衝液在中性pH下達成透析過濾《藉由透析過濾自較高分子量之生物高分子（諸如核酸、蛋白質及多醣）中去除低分子量培養基組份。血清型7F不與HB形成沉澱。取而代之，藉由添加來自儲備溶液之HB達1% HB之終濃度來自經濃縮及經透析過遽之溶液中沉澱雜質。在深度過濾器上收集沉澱物並棄去渡液。在濾液中得到多醣。將來自Nal儲備溶液的破化納（Nal)添加至多釀溶液中以達到0.5%之終濃度從而沉澱HB。藉由深度過濾去除沉殿物。遽液包含目標多膽。用NaCl/Nal溶液漂洗沉澱容器及過濾器並將漂洗液與經部分純化之多醣溶液合併。棄去滤液。然後通過0.2微米之過濾器過濾多醣。在30 kDa MWCO超濾'器上濃縮多醣溶液並用氣化鈉溶液透析過濾。 160374.doc -36- 201212937 藉由通過經活性炭浸潰之深度過濾器過濾來進一步純化經部分純化之多醣溶液。過濾後，用氣化鈉溶液漂洗該炭過濾器。將漂洗液與多醣溶液合併，然後使之通過0.2微米之過濾器進行過濾。在30 kDa MWCO超濾器上濃縮多醣溶液並用1 μ磷酸鈉緩衝液對其加以調節得到0.025 Μ之鱗酸納終濃度。檢查 pH並調節至7.0±0.2。用含有氣化鈉之磷酸鈉緩衝液平衡陶瓷羥基磷灰石（HA) 管柱以得到適宜電導率（15 pS)。然後將多醣溶液上樣至管柱上。在此等條件下’雜質結合於樹脂上且可自流經管柱的液流中回收多醣。使多醣流過含有緩衝液之管柱並通過 0.2微米之過濾器過濾。使用30 kDa MWCO過渡器濃縮多醣溶液。然後用wfi透析過渡濃縮物。通過0.2微米膜滤器將經透析過濾之多醣溶液過據至不銹鋼容器中。取出樣品供釋放測試並將經純化之多酿保存於2°C至8°C下。有關多醣之特性，參見實例3。實例10 血清型7F肺炎球菌醣-CRM197共耗物之製備活化及共耗藉由在23C下培育16至24小時實施局破酸納存在下 . 氧

niM 將活化反應混合物濃縮並用100K MWCO濾膜以1〇 160374.doc •37- 201212937

NaOAc (pH 4.5)透析過濾1〇><。通過〇 2微米之過濾器過濾滯留物。 ~ 將血凊型7F填裝至100毫升玻璃凍乾瓶中（目標填裝量為 50毫升）並在-75°C下實施滾動冷凍然後進行冷凍乾燥。使含有凍乾之血清型7F&CRMi97之瓶升溫至室溫並以 1.5:1之醣/蛋白質比重懸於〇1^8〇中。添加氰基硼氫化鈉後，將反應物在23。(：下培育8至1〇小時。藉由添加硼氫化鈉在23 C下培育16小時來淬滅未反應之醛。用冷鹽水將反應混合物稀釋1〇倍並使其通過5微米預過濾器轉移至滞留物容器中。將反應混合物用〇9%鹽水透析過遽1 Ox並用經琥珀酸鹽緩衝之鹽水透析過濾3〇x。通過〇·2微米之過濾器過濾滯留物。將共軛物溶液在0.9%鹽水中稀釋成醣目標濃度為〇.5毫克/毫升’且隨後在Class 100通風櫥中將其無菌過濾至FBC 容器中。將共軛物保存於2至8。(：下。有關共軛物之特性，參見實例4。實例11 肺炎鍵球菌英膜多糖金清型19A之製備自紐約州立大學（Brooklyn，New York)之 Gerald Schiffman 博士處獲得肺炎球菌血清型19A。有關細胞庫系統之製備，參見實例1。有關多醣之發酵、收穫及純化，參見實例7。關於定性，參見實例3。實例12 血清型19A肺炎球菌醣-CRM197共軛物之製備 •38· 160374.doc ⑧ 201212937 活化及共耗使含血清型19A醣之容器解凍且合併於反應容器中。添加乙酸鈉達10 Mm (pH 5.0)並在高碘酸鈉存在下藉由在 23°C下培育16至24小時來實施氧化。

將活化反應混合物濃縮並用1 〇〇κ MWCO濾膜以10 mM 乙酸鹽（pH 5.0)透析過濾1〇x。通過〇2微米之過濾器過濾滯留物。將經活化醣與蔗糖混合’之後添加CrMi97。將血清型 ^八活化醣與匸尺⑷^之混合物彳二者比為^⑴填裝至丨⑽毫升玻璃凍乾航中（目標填裝量為5〇毫升）並在_75〇C下實施滾動冷凍然後進行冷凍乾燥。使含有凍乾材料之瓶升溫至室溫並重懸於DMSO中。向醣/蛋白質混合物中添加氰基硼氫化鈉（1〇〇毫克/毫升）。將反應物在23°C下培育15小時。與氰基硼氫化物一起培育後’藉由添加硼氫化鈉並在23 °C下培育3至20小時來淬滅未反應之酿。用冷鹽水將反應混合物稀釋1〇倍並使其通過5微米預過濾器轉移至滞留物容器中。將反應混合物用〇9%NaC1透析過 /慮1 Ox，經0.45-微米過渡器過據，並用5 mM破ί白酸鹽/0.9% NaCl緩衝液（ΡΗ 6)透析過濾30χ通過〇·2微米之過濾器過遽滯留物。用5 mM玻拍酸鹽/0.9%鹽水將共輛物溶液稀釋成醣目標濃度為0.5毫克/毫升’並在ciass 1〇〇通風櫥中將其無菌過濾至FBC容器中。將共軛物保存於2至fc下。 160374.doc -39- 201212937 有關共軛物之特性，參見實例4。實例13 肺炎鏈球菌莢膜多醣血清型4、66、9¥、14、180、19卩及 23F之製備肺炎鏈球菌菌種培養物之製備自紐:約州立大學（Brooklyn，New York)之 Gerald Schiffman 博士處獲得肺炎球菌血清型4、6B、9V、18C、19F及 23F。肺炎鏈球菌之血清型μ自ATcc獲得，菌株6314。分別使用一小瓶每一期望之肺炎鏈球菌血清型來開始一發酵批次。使用碳酸鈉將含有以大豆為主之培養基及紛紅的兩個瓶的pH調節至7.4±0.2範圍内，且隨後向兩個瓶中添加所需體積之50%葡萄糖/1〇/〇硫酸鎂溶液。用不同量之菌種接種該兩個瓶。在36t： ±2t下培育該兩個瓶直到培養基變為黃色為止。培育之後，自每一瓶中取出樣品並測試光密度（OD)(〇,3至0.9)及PH (4.6至5.5)。選擇兩瓶之一用於接種菌種發酵罐。將以大豆為主的培養基轉移至菌種發酵罐中並滅菌。然後向發酵罐中添加一體積之5〇%葡萄糖/1%硫酸鎂溶液。監測並控制菌種發酵罐之PH及攪拌情況（PH 6.7至7.4)。將 X維持在36C±2C。以無菌方式將菌種接種物（瓶）連接至菌種發酵罐上並轉移接種物❶將發酵罐保持在pH控制下並定期取出樣品進行0D及pH測試。當在6〇〇奈米處達到月望OD時，用來自菌種發酵罐之發酵培養液接種間發酵罐。 160374.doc 201212937 將以大豆為主的培養基轉移至中間發酵罐中並滅菌。然後向發酵罐中添加一體積之50%葡萄糖/1〇/〇硫酸鎂溶液。監測並控制中間發酵罐之pH及攪拌情況（ΡΗ ό·7至7.4)。將 zm度維持在3 6 C ±2 °c。將菌種發酵罐之内含物轉移至中間發酵罐中將發酵罐保持在PH控制下並定期取出樣品進行 OD及pH測试。畲在6〇〇奈米處達到〇 5之期望時用來自中間發酵罐之發酵培養液接種生產發酵罐。將以大豆為主的培養基轉移至生產發酵罐中並滅菌。然後向發酵罐中添加一體積之5〇%葡萄糖/1%硫酸鎂溶液。監測並控制生產發酵罐之pH及攪拌情況（pH 6 7至7 4)。將溫度維持在36t ± 2。(：。將發酵罐保持在？11控制下並定期取出樣品進行〇D&pH測試，直至發酵完成為止。將脫氧膽酸鈉添加至發酵罐中達約〇12% w/v之終濃度》在最低30分鐘内將反應物混合且將溫度設定點降至呢。將培養物培育過夜，且在確認滅活後用鄕乙酸將培養物之PH調節至6.4至6.8之間（必要時）。使發酵罐之溫度升t^2G°C±5°C並將内含物轉移至澄清儲存罐中。使澄清儲存罐之内含物（包括細胞碎片）以介於^至㈣公升/小時之流速（血清型4除外，#中棄去了細胞碎片且流速固定在25至250公升/小時之間）通過離心機加以處理。取出上清液樣品並進行0D測定。離心過程之期望 0.15。 ~ 起初’使上清液再循環通過深度過據器總成，直至達到 0.05±0.03之〇D。然後使上清液诵沾、、哎由貧辰逋過/菜度過濾器總成並通 160374.doc 41 201212937 過〇·45微米膜濾器直至到達濾液儲存罐。隨後’將產物通過閉管轉移至用於加工之純化區。所有上述操作（離心、過濾及轉移）皆在lOt至3〇〇c之間實施。有關血清型4及6B之替代的發酵及收穫方法，參見實例i 中所述之替代方法。純化每一肺炎球菌多醣之純化由若干濃縮/透析過濾操作、沉澱/溶洗、管柱層析、及深度過濾步驟構成。除非另有說明’否則，所有程序皆在室溫下實施^ 將來自期望肺炎鏈球菌血清型之發酵罐培養物的澄清培養液濃縮並用100 kDa MWCO過濾器透析過濾。使用鱗酸鈉緩衝液在pH<9下達成透析過濾。藉由透析過濾自較高分子置·之生物高分子（諸如核酸、蛋白質及多醣）中去除低分子量培養基組份。藉由添加來自儲備溶液之HB達1% HB (w/v)之終濃度（血清型23F除外，其具有2·5%之終濃度）自經濃縮及經透析過渡之溶液中沉激多醣。在深度過濾器上收集多醣/HB沉澱物並棄去濾液。（注意：血清型14不會沉澱；因此需保留濾液。）藉由使氯化鈉溶液循環通過含有沉澱物之深度過渡器來重新溶解及溶洗多酷沉澱物。然後用額外氯化鈉溶液漂洗過濾器。將來自Nal儲備溶液之碘化鈉（Nal)添加至多醣溶液中達 0.5%之終濃度以沉殿HB (血清型όΒ除外，其具有0.25¾之 160374.doc ⑧ •42- 201212937 終濃度）。藉由深度過濾去除沉澱物。濾液包含目標多醣。棄去濾液。然後通過〇·2微米之過濾器過濾多醣。在30 kDa MWCO超濾器上濃縮多醣溶液並用氯化鈉溶液透析過渡。藉由通過經活性炭浸潰之深度過濾器過濾來進一步純化經部分純化之多醣溶液》過濾後，用氣化鈉溶液漂洗該炭過濾器。將漂洗液與多醣溶液合併，然後使之通過0.2微米之過滤器進行過滤。在30 kDa MWCO超濾器上濃縮多醣溶液並用氯化鈉溶液漂洗過濾器。檢查pH並調節至7.0士0.3。用含有氣化鈉之磷酸鈉緩衝液平衡陶瓷羥基磷灰石（HA) 管柱直至pH達7.0±0·3且電導率達26±4 pS為止。然後將多膽溶液上樣至管柱上。在此等條件下，雜質結合於樹脂上且可自流經管柱的液流中回收多醣。然後通過0.2微米之過濾器過濾多醣溶液。使用30 kDa MWCO過濾器濃縮多醣溶液。然後用WFI透析過濾濃縮物直至電導率達<15μ8為止。將經透析過濾之多醣溶液通過〇·2微米膜濾器過濾至主體容器中並保存於2至8°C下。實例14 血清型4、6B、9V、14、18C、19F及23F之肺炎球菌醣-CRM197共輛物的製備活化方法如本實例所述’不同血清型醣遵循不同之活化途徑（活 160374.doc -43· 201212937 化前進行水解或不進行水解）及共輛結合（水性或DMSO反應）。將多醣自主體容器轉移至反應器中。然後將多醣稀釋於 WFI及磷酸鈉中使終濃度介於i_6至2.4毫克/毫升範圍内。步驟1 : 對於血清型6B、9V、14、19F及23F，將pH調節至pH 6·0 ±0.3 〇對於血清型4，添加鹽酸（o.oi μ之酸終濃度）並將溶液在 45°C 土 2°C下培育25至35分鐘。藉由冷卻至21至25。(：並添加1 Μ磷酸鈉達6.7±0.2之目標PH來停止水解《實施加工過程中的測s式來確認去丙嗣酸化之適當水平。對於血清型18C，添加冰乙酸（〇.2 Μ之酸終濃度）並在 94 C ±2 C下將溶液培育205至215分鐘。然後將溫度降至2工至25°C並添加1至2 Μ之磷酸鈉以達6·8±0.2之目標pH。步驟2 :過破酸鹽反應使用總醣含量（除外血清型4)確定肺炎球菌醣活化所需之過蛾酸鈉的莫耳當量。對於血清型4，使用每莫耳醣用 0.8至1.2莫耳過碘酸鈉之比例。充分混合後，對於除19F之外的所有血清型使氧化反應在21至25艽下持續進行16至2〇小時’而對於19F，溫度$15°C。步驟3 :超濾

將經氧化之醣濃縮並用WFI (對於血清型19F為〇〇1 M 磷酸鈉緩衝液pH 6.0)在100 kDa MWCO超濾器（對於18C為 5 kDa超濾器）上透析過濾。棄去透過液並將滯留物通過 160374.doc -44- 201212937 0.22微米過濾器過濾。步驟4 :冷凍乾燥 # & U $ 4' ' m將經濃縮之醣與CRMi97載體蛋白質混合，填裝至玻璃瓶中，經滾動冷凍並保存於仝 65 C下。將經冷凍之濃縮醣冷凍乾燥且隨後保存於-25°C±5°C 下。對於血清型6B、19F、及23F，添加特定量之蔗糖，對該添加量加以計算以在共軛結合反應混合物中達5%±3%之蔗糖濃度》血清型18C不需要添加蔗糖。然後將經濃縮之醣填裝至玻璃瓶中，經滾動冷凍並保存於^_65〇c下。將經冷凍之濃縮醣冷凍乾燥且隨後保存於_25r±5c>c下。共輕結合方法使用兩種共輛結合方法：對於血清型4、9V、14及1 8C 使用水性共輛結合且對於血清型6B、19F及23F使用DMSO 共輛結合。水性共軛結合步驟1 ··溶解對於血清型4、9V及14，使經凍乾之活化醣_CRM197混合物解凍並在室溫平衡。然後於〇. 1 Μ磷酸鈉緩衝液中重構康乾之經活化醣-CRM197，按如下典型比例實施： •對於血清型4及9V，每16至24克醣用1公升緩衝液 •對於血清型14，6至10克醣用1公升緩衝液在37C± 2C下培育反應混合物直至▲清型9 V完全溶解且對於血清型4及14在23°C±2°C下培育。 160374.doc •45· 201212937 對於血清型18C，以每1公升CRMm溶液用0.11公升磷酸納之典型比例將經凍乾之醣重構於Crm197溶於1 Μ磷酸氫二鈉之溶液中。在23。〇±2。(：下培育反應混合物（8至12克/公升之醣濃度）直至完全溶解。在此階段測試pH作為加工過程中的控制β 步驟2:共輕結合反應對於血清型4及9V，藉由添加氰基硼氫化鈉溶液（丨〇〇毫克/毫升）達1.0至1.4莫耳氰基硼氫化鈉/莫耳醣來起始共軛結合反應。將反應混合物在37°C±2°C下培育44至52小時。然後使溫度降至23°C ±2°C並向反應器申添加0.9°/。氯化鈉》添加硼氫化鈉溶液（1〇〇毫克/毫升）以達18至2 2莫耳當量之硕氫化鈉/莫耳醣。將混合物在23°c ±2°c下培育3至6小時。用0.9%氯化鈉稀釋混合物並漂洗反應器。使用1.2微米前過濾器將經稀釋之共軛結合混合物過濾至儲存容器中。對於血清型14及18C ’藉由添加氰基硼氩化物溶液（1 〇〇毫克/毫升）達1.0至1.4莫耳之氰基硼氫化鈉/莫耳醣來起始共軛結合反應。將反應混合物在23。(：士 2。(：下培育12至24小時。使溫度升高至37°C±2eC並將反應物培育72至96小時。然後使溫度降至23°C 土2°C並向反應器中添加0.9%氣化鈉。添加硼氫化鈉溶液（1〇〇毫克/毫升）以達1.8至2.2莫耳當量之硼氫化鈉/莫耳醣。將混合物在23°C ±2°C下培育3至6小時。用0.9%氣化鈉稀釋混合物並漂洗反應器。然後使用 1.2微米前過濾器將經稀釋之共軛結合混合物過濾至儲存 160374.doc • 46· 201212937 容器中。步驟3 :超濾1〇〇 kDa 將經稀釋之共軛結合混合物濃縮並在丨〇〇 kDa MWC〇超滤器上以最小15體積（血清型4)或40體積（血清型9V、14、及18C)之0.9%氣化鈉進行透析過濾。棄去透過液。對於血清型4 ’通過0.45微米過濾器過濾滯留物。在此步實施加工過程中的控制（醣含量）。步驟4 : Η A管柱純化僅對血清型4共輛物實施此步。首先用0·5 Μ磷酸鈉缓衝液（pH 7.0土0.3)中和HA管柱且隨後用0.9%氣化鈉將之平衡。將經過濾滯留物（血清型4)以 1.0公升/分鐘之流速上樣至管柱上。用0.9%氯化鈉以$2 〇公升/分鐘之流速洗滌管柱。然後用〇 5 Μ碟酸鈉緩衝液以 S2.0公升/分鐘之流速溶洗產物。然後將ΗΑ部分濃縮並在1〇〇 kDa MWCO濾膜上以最小20 體積之0.9%氣化納實施透析過遽。棄去透過液。步驟5 :無菌過濾將經100 kDa MWCO透析過濾後之滯留物通過0.22微米過渡器過濾。在經過濾產物上實施加工過程中的控制（醣含量、游離蛋白質、游離醣及氰化物）。對所過濾滯留物實施過程中控制以確定是否需要進行額外的濃縮、透析過渡及/或稀釋來滿足FBC目標。對FBC樣品重複實施此等及額外測試。 1603 74.d〇< • 47- 201212937 如需要，用0.9%氯化鈉稀釋經過濾之共軛物以達低於 0.55克/公升之終濃度。在此階段實施醣含量、蛋白質含量及醣：蛋白質比之釋放測試。最後，將共軛物過濾（0·22微米）並以2 64克/濾毒罐之典型里填裝至10公升不銹鋼濾毒罐中。在此階段，產率、醣含量、蛋白質含量、ρΗ、膽：蛋白質比值及離胺酸含量係作為加工過程中控制加以檢測。在此段 (外觀'游離蛋白f、游離聽、内毒素、分子大小敎式殘留氰化物 '醣身份、CRM197身份）。 DMSO共辆結合步驟I，溶解在室溫平衡經凍乾之活化醣血清型6B、19F、23f及經凍乾之CRM〗97載體蛋白質並重構於DMS〇中溶解濃度通常介於2至3克醣（2至2.5克蛋白質）/公升DMS〇範圍内。步驟II :共軛結合反應在23°C 土2°C下以0.6克至1 .〇克醣/克CRM丨97 (對於血清型 6B及19F)或1.2至1.8克醣/克CRMw (對於血清型23F)之比例範圍將經活化之醣與CRM,97載體蛋白質混合6〇至75分鐘。藉由以0.8至1.2莫耳當量之氰基硼氫化鈉比丨莫耳醣之比例添加氰基硼氫化鈉溶液（1〇〇毫克/毫升）來起始共輕結合反應。將WFI添加至反應混合物中以達1% (v/v)之目標濃度並將混合物在23 C ±2 C下培育40小時以上。將100毫克/毫升之硼氫化鈉溶液（通常為，每莫耳活化醣 160374.doc •48· 201212937 用1.8至2.2莫耳當量之硼氫化鈉）及WFI (目標濃度5%乂~) 添加至反應物中並將混合物在23^±2〇c下培育3至6小時。此程序可還原任何存在於醣上的未反應之醛。然後在 <15°C下將反應混合物轉移至含有0.9%氣化鈉之稀釋罐中。步驟III : 100 kDa超遽將經稀釋之共軛物混合物通過1 2微米過濾器過濾並濃縮且在100 kDa MWCO濾膜上以最大15體積之0.9。/。氣化鈉 (對於血清型23F使用〇.〇i μ磷酸鈉/0.05 M NaCl緩衝液）實施透析過濾。棄去透過液。通過〇 45微米之過濾器過濾滯留物。在此階段採集加工過程中之醣含量樣品。步驟IV : DEAE管柱純化僅對血清型23F實施此步驟。用0·01 Μ磷酸鈉/0.05 Μ氣化鈉緩衝液平衡DEAE管柱。將經過濾之滯留液（血清型23F)上樣至管柱上並用0.01 Μ磷酸鈉/0.05 Μ氯化鈉緩衝液洗滌》然後用〇.〇1 μ磷酸鈉/0.9% NaCl緩衝液洗滌管柱。之後用〇〇1 μ磷酸鈉/0.5 Μ氯化鈉緩衝液洗脫產物。步驟V : 100 kDa超濾將來自6B及19F之滯留液濃縮並用至少30體積之0.9%氯化鈉實施透析過遽。棄去透過液。將來自血清型23F之溶洗液濃縮並用最小2〇體積之0.9% 氯化納實施透析過濾。棄去透過液。步驟VI :無菌過滤 160374.doc .49- 201212937 將經100 kDa MWCO透析過濾後之滯留液通過〇22微米過濾器過濾。對經過濾產物實施加工過程中的控制（醣含量、游離蛋白質、游離醣、剩餘DMSO及剩餘氰化物）。對所過濾滞留物實施過程中控制以確定是否需要進行額外的濃縮、透析過濾及/或稀釋來滿足FBC目標。對FBC樣品重複實施此等及額外測試。如需要’用0.9%氣化鈉稀釋經過濾之共軛物以達低於〇·5 5克/公升之終濃度。在此階段實施有關醣含量、蛋白質含量及醣：蛋白質比之釋放測試。最後’將共軛物過濾（0.22微米）並以2.64克/濾毒罐之量填裝至10公升不銹鋼濾毒罐中。在此階段，產率、醣含量、蛋白質含量、pH、醣：蛋白質比值及離胺酸含量係作為加工過程中控制加以檢測。在此階段實施釋放測試（外觀、游離蛋白質、游離醣、内毒素、分子大小測定、剩餘氰化物、剩餘DMSO、醣身份及CRM197身份）。實例15 多價肺炎球菌共軛物疫苗之調配 13個共輥物之最終主體濃縮物含有0.85%之氯化鈉。血清型3、6A、7F及19A之主體濃縮物亦含有5 mM琥珀酸鈉緩衝液（pH 5.8)。根據批體積及主體醣濃度計算所需之主體濃縮物體積》向預先標記之調配物容器中添加80%之 0.85%氯化鈉（生理鹽水）及所需量琥珀酸鹽緩衝液後，添加主體濃縮物。隨後使用Millipore Durapore膜濾器裝置將該製劑通過0.22微米濾膜無菌過濾至第二個容器中。用剩 -50- 160374.doc ⑧ 201212937 餘的20%之0.85%氯化鈉洗滌第一個容器並使溶液通過相同過濾器且收集至第二個容器中。在添加主體磷酸鋁期間及之後溫和地混合經調配之主體。檢查並調節pH (若需要）。將經調配之主體產物保存於2至8°C。將經調配之主體產物填裝至講自Becton Dickinson的1型硼矽酸注射器中。每隔一定間隔檢測疫苗之混濁度以確保填裝操作之均一性。將經填裝之疫苗（終產物）保存在2至8°C下。實例16 1 3 -價共輛物疫苗之免疫原性迄今為止，已在兔子中實施了有關13vPnC之臨床研究。設計研究#HT01-0021及#ΗΤ01-0036來分別檢查肺炎鏈球菌莢膜多醣（PS)與CRM 197之化學共扼結合及填酸銘 (AlP〇4)佐劑對兔子中因應於13vPnC疫苗之免疫反應的影響。此等影響藉由檢測血清IgG濃度之抗原特異性ELISA 及檢測抗體功能之調理吞噬分析（OPA)來定性。研究 #HT01-0021 研究#HT01-0021檢查含有AlP〇4佐劑之13vPnC疫苗引發疫苗血清型特異性免疫反應之能力。13vPnC疫苗中出現之肺炎球菌血清型包括血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、 9V、14、18C、19A、19F及23F。次要目標包括對抗體反應動力學及持續時間之評估。在第0周及第2周用同A1P04 (1〇〇微克/劑）調配在一起或未調配在一起之每一多聽的計劃之人類臨床劑（每一 PS為2微克，僅有6B為4微克）經肌内免疫新西蘭白兔。在不同時間點採集血清。藉由ELISA量 160374.doc -51 - 201212937 測血清型特異性IgG並藉由OPA評定功能活性。表3顯示在施予兩劑13vPnC疫苗後對採集之樣品求取之幾何平均滴定度（GMT)。使用IgG GMT比值來比較第4周與第〇周之反應。此等數據證明，在13vPnC調配物中納入 Α1Ρ〇4與不含佐劑之相同疫苗比較可誘發出更高水平之抗體。儘管當調配物中納入Α1Ρ〇4時抗體反應會更強，但此等增加在統計學上不顯著。亦在用兩個13 vPnC調配物免疫後於兔子中評定功能抗體反應（表4)。當對含有或不含佐劑之疫苗調配物加以比較時，在13vPnC+AlP〇4疫苗處理組中觀察到更高之〇pA GMT。在兩組所有疫苗血清型之第4周血清池中檢測opA 滴定度。對於大部分血清型，在第4周量測之opa滴定度至少較第0周（基線）之OPA滴定度高4倍。由兩個處理組之血清池評估每一 13 vPnC疫苗血清型之動力學反應。在第0周及第1、2、3、4、8、12、26、及39周進行抽血來評估每一血清型之IgG滴定度且隨後加以比較。除血清型1以外’接受經佐劑化之疫苗的動物中抗體反應優於彼等接受未經佐劑化之疫苗動物中的抗體反應且在免疫方案的第2周達到峰值（數據未顯示）。總而s之’該等數據表明’與攝酸銘調配在一起之 13vPnC疫苗在兔中具有免疫原性，可誘發對納入在疫苗中之肺炎球菌莢膜多醣的實質抗體反應且此等反應與功能活性有關。用13vPnC+AlP04免疫後在7個核心血清型中觀察到之反應與兔子對7價調配物之歷史反應一致。 •52· 160374.doc ⑧ 201212937 (I3%S6) 昵寸城 ddTV+uCJ>n 5ε °°6 寸Is S卜 LIZ 96寸 5 °°9A寸ee 寸ss 寸S τττ

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OS OS s OS 19 § UI IS, H OS OS OS OS 0.1 o.l 0.1 0.1 ·0 寸·ε s •I 5 寸Ό 0.1 0_I 0.1 00I> 00l> 00IV 00I> LLl S66 6卜S 00I> 00I> 00I> 00l> 007 oolv 00IV oolv oolv oolv s 68Z 6--oolv I寸一寸- 00I> oolv oolv s § V61 381 寸I Λ6 AL V9 -s.0"d)^^^^T^4i^^"-"^w々odlv^±^:q 噠雏概肩無韜蛛w屮e隳蛑丨#c"·丨观铵书他鰣鉍蛛擁< IPMO^啦蛛鉍：β 160374.doc -53- 201212937

表4·用兩劑13-價肺炎球菌醣共軛物免疫後NZW兔血清池之肺炎鏈球菌OPAGMT 13vPnCa 丘清型第〇周第4周

Wk4:WkO 比值第0周 13vPnC+ ALP〇4a 第4周

Wk4:WkO 比值

164812864128161626425612864 46212123242828256)241256 61351511,012123251,05125 <8<8<8<8888816<8<8<8<8 16243216648823264328 ?m12812826546s23526256128s <8<8<8<8OC<888168<8<88 13456A6B7F9V1418C19A19F23F A :由來自一處理組(n=12)内早個兔子之等體積血清構成之血清池研究 #ΗΤ01·0036 研究#ΗΤ01-0036比較在用與CRM197蛋白質共軛結合或未與之共軛結合之13vPnC疫苗免疫後兔對納入疫苗之多醣 (PS)的免疫反應。在第〇周及第2周以劑量為2.2微克之每一 PS(僅有6B為4.4微克）經肌内免疫新西蘭白兔。動物接受三種疫苗製劑之一：（a)13vPnC (直接與CRM丨97共軛結合之 PS)，(b)13vPnPS，（游離 PS)或（c) 13vPnPS+CRM197 (與 CRM197混合之游離PS) 〇所有疫苗製劑皆以A1P04作為佐劑，含量係125微克/劑。在IgG ELISA及量測功能抗體之補體介導之OPA中評估針對所有疫苗製劑之血清型特異性免疫反應。比較處理組之間的免疫反應9 表5呈現在抗原特異性IgG ELISA中分析之由第4周抽血 160374.doc -54- 201212937 獲得之GMT數據。額外分析顯示第4周與第〇周之gmt數值的比值。數據表明，共輛物疫苗製劑較游離叫游離Μ + CRM丨97疫苗誘發出更高之血清IgG滴定度。除肺炎鏈球菌血凊里14以外，13 vpnc疫苗能夠在〇pA中誘發對肺炎鏈球菌之代表性菌株之功能抗體（表6)。用13vPnPS或13vPnPS + CRMw疫苗進行兩次免疫後，所量測的13個血清型有…個在第4周不可誘發出較第〇周乏8倍之〇pA滴定度（表6)。總而言之’此等結果表明，13_價肺炎球菌疫苗多醣之共軛結合與單獨游離多醣或與非共軛結合之C RM 1 9 7混合之多膽中所見者相比會產生更高之血清IgG滴定度及整體更強之功能抗體活性。 160374.doc •55- 201212937 (lwo)，w^oboIwsdad^^wf!9i驾 <8113书璁^^^龚墀沭潜涸错^鸯^;1冢嗒阳^^ (131)s ycld3 os-s

ι·9 卜 9 is Z/69 寸寸-0卜寸-0寸 §0-0.H卜 •9SZ I.卜ε寸-•so 卜 •S ε_ Z.9L ~~(680V8,寸 εΓ" §-寸 (ε卜 Γ£'ε3Ι) 8S-6I -5's-l) -寸-z (I 寸9-"-sw/z£) IS5 (83'stl) ΙΠ豸 (lt's9zz寸ε) εε-os (卜寸s_os§ §-ε (日-·寸 ε6-- §-£ (sr8z'sr 卜 91) s 寸 z-s (寸3^0-^9 寸 >- S3 (寸珥SI-II6 stl (9卜9-1-寸 I 寸-) 寸"01 ρ--·0εΓ6ζ) οδε 13 - 101 OS OS OS ins OS OS OSs •s •91 9.1 •II 6.£ 0·ε 寸.1 0-I.z 2 Ι.Π I 0- s m°=sdln (I3%S6)s OS:寸s (Ιϋ%ς6)s

(Ι5,ιιε) °°ε9 (寸 S9--0 卜 ε) 166 (ε9Ι-6ε) ο00 (ςε6--00ε) 19卜(s-έ ^- (06'寸卜) 691 (ΙΙΙέ IL (ο寸寸--寸8£) 的寸Δ ίέ 0101 〇0·卜寸 I) ιζε (S 卜 Γι-ειε) § (8S·寸卜) SI (6-V60S) 6S s 19 OS 99 OS ss OSw 86 OS OS 60°-ε 6_寸is •I /A ·寸 IT ΓΙ 9.II ο.ε ·寸 9.卜 Γ寸 •s (ii8s s§ pl"'6ss)s- (6卜I-寸寸) 60° (889--559) S3 ps--I) 00¾ (s<5I-8 寸) 寸01 ?6ε) 19 (szrl-寸 8e) LZL (8S-9I£) 99寸 (os'nl) (6S6^0S1)s (i49)s (06ζ/·ε寸8) 063- iL 19s 99 0£ OSs 寸SI ε寸e os - s卜ε s V6l u8l 寸一 Λ6 dL m9 V9 160374.doc -56- ⑧ 201212937 表6·用兩劑13-價肺炎球菌疫苗免疫後兔血清池之肺炎鏈球菌 ΟΡΑ滴定度 0ΡΑ_定度處理編號 13vPnPS (游離PS) 13vPnPS + CRM197 (與CRM197混合之游離PS)

13vPnC 血清型第o$s 第4周

Wk4:WkO 比值第4周

Wk4:Wk0 比值第4周

Wk4:Wk0 比值 444488161616484 6 I64 4326464321616168 432 11 11 11 11 61-1+6226266 n 1 3 3 1 3 1 1 ti 11 4 4 4 1 2 11 4 1 44163232163216816832 328646456432168264646432 a :對於所有組皆以此作為第〇周數值應瞭解，上述論述及實例僅給出某些實施例之詳細說明。因此熟習此項技術者應明瞭可使用各種修改及等效内容，此並不偏離本發明之精神及範疇。在本專利申請案中呈現之所有期刊論文、其他參考文獻、專利案及專利申請案之全文皆以引用方式併入本文中〇 [参考文獻] 1. Hausdorff WP, Bryant J, Paradiso PR, Siber GR. Which pneumococcal serogroups cause the most invasive disease: implications for conjugate vaccine formulation and use, part I. Clin Infect Dis 2000; 30:100-21。 2. Hausdorff WP, Bryant J, Kloek C, Paradiso PR, Siber GR. The 160374.doc -57· 201212937 contribution of specific pneumococcal serogroups to different disease manifestations: implications for conjugate vaccine formulation and use, part I. Clin Infect Dis 2000; 30:122-40 〇 3. Whitney CG，Farley MM，Hadler J等人Decline in invasive pneumococcal disease after the introduction of protein-polysaccharide conjugate vaccine. New Engl J Med 2003; 348(18):1737-46。 4. Black S, Shinefield H，Hansen J等人Postlicensure evaluation of the effectiveness of seven valent pneumococcal conjugate vaccine. Pediatr Infect Dis J 2001; 20;1105-7。 5. Robinson KA，Baughman W，Rothrock G等人Epidemiology of invasive Streptococcus pneumoniae infections in the United States, 1995-1998: Opportunities for prevention in the conjugate vaccine era. JAMA 2001; 285:1729-35 o 6. Butler J，Breiman R，Lipman H等人Serotype distribution of Streptococcus pneumoniae infections among preschool children in the United States, 1978-1994. J Infect Dis 1995; 171:885-9 。 7. Whitney CG，Farley MM，Hadler J等人Increasing prevalence of multidrug-resistant Streptococcus pneumoniae in the United States. N Engl J Med 2000; 343:1917-24 〇

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O'Brien KL, Moulton LH, Reid R等人Efficacy and safety of seven-valent conjugate pneumococcal vaccine in American Indian children: group randomised trial. Lancet 2003; 362:355-61。 160374.doc -62- ⑧ 201212937 32. Eskola J，Kilpi T, Palmu A等人Efficacy of a pneumococcal conjugate vaccine against acute otitis media. N Engl J Med 2001: 344:403-9。 33· Pilishvili T，Farley M，Vazquez M，Reingold A, Nyquist A等人 Effectiveness of heptavalent pneumococcal conjugate vaccine in children. Abst G-1079，ICAAC，Chicago, IL， 2003。 34·美國專利第4,673,574號。 35.美國專利第4,9〇2,5〇6號。【圖式簡單說明】圖1繪示在自基線（丨998/1999年）至2001年間年齡<2歲之美國兒童中因血清型產生之IPD率變化。圖2繪示對青黴素（pcN)有抗性之肺炎球菌分離菌在年齡 <5歲之兒童中的分佈（1998)。圖3繪示來自D118-P16 Prevnar試驗之OPA第三劑量後結果的反累積分佈曲線（RCDC)。 160374.doc -63-

Claims

201212937 七、申請專利範圍： 1. 一種多價免疫原組合物，其包含13種不相同之多醣-蛋白質共耗物及生理上可接受之媒劑，其中各共軛物皆包含與載體蛋白共輥結合之來自不同肺炎鏈球菌血清型的莢膜多醣’且該等笑膜多醣係由叙清型1、3、4、5、6A ' 6B、7F、9V、14、18C、19A、19F及 23F 製備而成，並且其中該載體蛋白為CRMm ’其中各〇.5毫升劑量經調配成含有2_2微克之各種醣，但6B係4.4微克；29微克之 CRMm載體蛋白；〇」25毫克之元素鋁（〇5毫克磷酸鋁）佐劑；及作為賦形劑之氣化鈉與琥珀酸鈉緩衝劑。 2. 如凊求項1之免疫原組合物，其中該等多醣-蛋白質共輛物係由13種不相同之多醣-蛋白質共軛物所組成，其中各共輛物皆包含與CRMw載體蛋白共軛結合之來自不同肺炎鏈球菌血清型的莢膜多醣，且該等莢膜多醣係由血清型 1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F 及2：3F製備而成。 3. 如請求項1或2之免疫原組合物，其係用於誘發對肺炎鏈球菌莢膜多醣共軛物之免疫反應。 4. 如請求項1或2之免疫原組合物，其係用於免疫接種，其中初次免疫接種後，個體可接受一或數次經恰當間隔開之加強免疫。 5. 如請求項1或2之免疫原組合物’其係用於嬰兒及幼童之免疫接種，其中免疫接種之時程為2、4、6及12至15月齡。 160374.doc 201212937 6.如請求項1或2之免疫原組合物，其係用於青少年及成年人之免疫接種。 7· —種單劑量注射器，其裝填分別與CRMi97共軛結合之血清型 1、3、4、5、6A、6B、7F ' 9V、14、18C、19A、 19F、及23F肺炎球菌莢膜多醣的無菌液體調配物，其中各0.5毫升劑量經調配成含有：2.2微克之各種醣，但6B 係4.4微克；29微克之CRM197載體蛋白；0.125毫克之元素鋁（0.5毫克磷酸鋁）佐劑；及作為賦形劑之氣化鈉與琥拍酸鈉緩衝劑。 8. 一種單劑量注射器，其裝填分別與CRM197共軛結合之血清型 1、3、4 ' 5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、 19F、及23F肺炎球菌莢膜多醣的無菌液體調配物，其中各0.5毫升劑量經調配成含有：2微克之各種醣，但犯係4 微克；29微克之CRMw載體蛋白；0.125毫克之元素鋁 (〇.5毫克碟酸銘)佐劑；及作為賦形劑之氯化鈉與號拍酸鈉緩衝劑。 9. 如請求項7或8之單劑量注射器，其係用於肌肉注射。 10. —種用於製備包含13種不相同之多醣_蛋白質共軛物及生理上可接受之媒劑的多價免疫原組合物之方法，其中各共耗物皆包含與載體蛋白CRMm共軛結合之不同英膜多醣，其中：莢膜多醣係由肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、 6B、7F、9V、14、18C、19A、19F 及 23F製備而成；各苑膜多醣係經由離心 '沈澱、深度過濾及管柱層析 160374.doc -2- 201212937 而純化；該等經純化之莢膜多醣經化學活化以使該等莢膜多醣能夠與載體蛋白crm197發生反應；每一莢膜多醣在經活化後，分別與載體蛋白CRM197共輛結合以形成聽共扼物；各醣共軛物經活化及混合以調配成免疫原組合物。 11. 如請求項10之方法，其中該共軛結合作用係藉由還原性胺化作用達成。 12. —種用於製備包含丨3種不相同之多醣_蛋白質共軛物及生理上可接受之媒劑的多價免疫原組合物之方法，其中各共耗物皆包含與載體蛋白共軛結合之不同肺炎鏈球菌血清型的英膜多醣，且該等莢膜多醣係由血清型1、3、 4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F及 23F製備而成’其中該載體蛋白為CRM197，其中在各醣共軛物經純化後，將其混合以調配成免疫原組合物。 160374.doc