TW201032814A - Low-molecular-weight polysulfated hyaluronic acid derivative and pharmaceutical containing the same - Google Patents
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Description
201032814 六、發明說明: 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於一種可用於預防及/或治療過敏性疾病之 低分子量多硫酸化玻尿酸衍生物(haps)。 【先前技術】 作為β-D-N-乙醯葡萄糖胺與β-D-葡萄糖藤酸交替鍵、社而 形成的直鏈狀高分子多糖之玻尿酸,由於在黏多糖類中可 相對容易地獲得,且表現出特異之物理化學性質及生理性 質’故其本身或其各種衍生物被用作醫藥品或化妝品。 例如,作為玻尿酸之衍生物的多硫酸化玻尿酸已知具有 血管舒緩素-激肽系統(kallikrein-kinin system)之抑制活性 (專利文獻1)以及磷脂酶A2之抑制活性(專利文獻2),可用 作過敏性疾病之治療藥(專利文獻3),對作為黏附因子之一 的選擇素介導性之炎症表現出較強之抗炎症作用(專利文 獻4)等。 又’報告有:如黏度平均分子量為10000以下之低分子 量低聚多硫酸化玻尿酸可用作皮膚滲透性優異之化粧料之 有效成分(專利文獻5),並且4〜20糖之多硫酸化玻尿酸寡 糖具有抗凝jk活性以及抗玻尿酸酶活性,存在可用作抗癌 劑之可能性(非專利文獻1)。 [先前技術文獻] [專利文獻] [專利文獻1 ]曰本專利特開平11 _丨47901號公報 [專利文獻2]曰本專利特開平u_269〇77號公報 146140.doc 201032814 [專利文獻3]曰本專利特開平1U35288號公報 [專利文獻4]日本專利特開平8_277224號公報 [專利文獻5]日本專利特開平1 〇_丨95丨〇7號公報 [非專利文獻] [非專利文獻 l]Glycobi〇l〇gy,v〇1 u,No. 1,pp. 57-64, 2001 【發明内容】 I [發明所欲解決之問題] 但目前之實際情況為:如上所述之多硫酸化玻尿酸以及 多硫酸化玻尿酸低聚物,由於其本身具有血管通透性亢進 作用等刺激作用故不適合臨床應用,滿足藥理活性、安全 性等全部性能者較少。 本發明係提供一種不存在上述問題且可用於預防及/或 冶療過敏性疾病之低分子量玻尿酸衍生物。 [解決問題之技術手段] * 本發明者等人為了開發出可用於預防及/或治療過敏性 疾病之化合物而反覆努力研究,結果發現:下述通式(IA) 及(IB)所示之低分子量多硫酸化玻尿酸衍生物具有抗過敏 * 作用及抗炎症作用,且不具有血管通透性亢進作用,可有 * 效地用作醫藥品。 即’本發明係關於以下1)〜15)者。 1)一種預防及/或治療劑,其係選自花粉症、過敏性鼻 炎、過敏性結膜炎、異位性皮膚炎以及哮喘中之過敏性疾 病之預防及/或治療劑,且其係以下述通式(IA): 146140.doc 201032814 [化l]
[式中,η表示0〜15之數,X表示下式(a)或(b): [化2]
Y表示下式(c)、(d)或(e): [化3]
(e) R分別獨立表示氫原子或S03H基(其中,S03H基佔R總數之 80-100%),R1 表示-OH、-OS03H 或-NZJJ 此處,Z!&Z2 獨立表示氫原子、-S03H、可經取代之低級烷基、可經取 代之芳基、可經取代之芳烷基或可經取代之雜芳基,或者 以-NZ!Z2整體表示胺基酸殘基或肽殘基),*表示與氧原子 146140.doc -6- 201032814 之鍵結部位] 或下述通式(IB): [化4]
ow (I B)
[式中,η表示0〜15之數,W表示下式(f)或(g): [化5]
R分別獨立表示氫原子或S03H基(其中,S03H基佔R總數之 80-100%),R1 表示-OH、-0S03H 或-NZAC 此處,Zi 及 Z2 獨立表示氫原子、-S03H、可經取代之低級烷基、可經取 代之芳基、可經取代之芳烷基或可經取代之雜芳基,或者 以-ΝΖΘ2整體表示胺基酸殘基或肽殘基),*表示與氧原子 之鍵結部位] 所表示之低分子量多硫酸化玻尿酸衍生物或其藥學上容許 之鹽作為有效成分。 2) 如上述1)之預防及/或治療劑,其中於通式(IA)中,Y 為式(d)或(e)。 3) 如上述2)之預防及/或治療劑,其中X為式(a)。 4) 如上述3)之預防及/或治療劑,其中η為3、4或5。 146140.doc 201032814 5) 如上述3)之預防及/或治療劑,其中η為4或5。 6) 如上述1)之預防及/或治療劑’其中低分子量多硫酸化 玻尿酸衍生物為通式(ΙΒ)。 7) 如上述6)之預防及/或治療劑,其中η為3、4或5。 8) 如上述6)之預防及/或治療劑,其中η為4或5。 9) 一種如上述1)至8)中任一項之低分子量多硫酸化玻尿 酸衍生物或其藥學上容許之鹽之用途,其係用於製造選自 花粉症、過敏性鼻炎、過敏性結膜炎、異位性皮膚炎以及 哮喘中之過敏性疾病之預防及/或治療劑。 1〇)—種預防及/或治療方法’其係選自花粉症、過敏性 鼻炎、過敏性結膜炎、異位性皮膚炎以及哮喘中之過敏性 疾病之預防及/或治療方法’其特徵在於^對人或動物投 予有效量的上述1)至8)中任一項之低分子量多硫酸化玻尿 酸衍生物或其藥學上容許之鹽。 11) 一種低分子量多硫酸化玻尿酸衍生物或其藥學上容 許之鹽,其係下述通式(ΙΑ’): [化6]
[式中’ η表示〇〜15之數,X表示下式⑷或(b): [化7] 146140.doc 201032814
HOOC
Y'表示下式(d)或(e): [化8]
R分別獨立表示氫原子或S03H基(其中,S03H基佔R總數之 80 〜100%),R1 表示-OH、-OS03H 或-ΝΖβΚ 此處,Z1&Z2 獨立表示氫原子、-so3h、可經取代之低級烷基、可經取 代之芳基、可經取代之芳烷基或可經取代之雜芳基,或者 以-NZ1Z2整體表示胺基酸殘基或肽殘基),*表示與氧原子 之鍵結部位]
或下述通式(IB): [化9]
[式中,η表示0〜15之數,W表示下式⑴或(g): [化 10] 146140.doc -9- 201032814
HOOC
R分別獨立表示氫原子或S〇3h基(其中,s〇3H基佔R總數之 80-100%),Ri表示 _〇h、_〇s〇3H或 _NZiz2(此處,21及22 獨立表示氫原子' _s〇3H、可經取代之低級烷基、可經取 代之芳基、可經取代之芳烷基或可經取代之雜芳基,或者 以-NZ^2整體表示胺基酸殘基或肽殘基),*表示與氧原子 之鍵結部位] 所表示者。 12) 如上述11)之低分子量多硫酸化玻尿酸衍生物或其藥 學上容許之鹽’其中於通式(IA,)中,X為式(a)。 13) 如上述11)之低分子量多硫酸化玻尿酸衍生物或其藥 學上容許之鹽,其為通式(IB)。 14) 如上述12)或13)之低分子量多硫酸化玻尿酸衍生物或 其藥學上容許之鹽,其中η為3、4或5。 15) —種醫藥組合物,其含有如上述11)、12)、13)或14) 之低分子量多硫酸化玻尿酸衍生物或其藥學上容許之鹽、 以及藥學上容許之賦形劑。 [發明之效果] 本發明之低分子量多硫酸化玻尿酸衍生物或其藥學上容 許之鹽具有優異之抗過敏作用及抗炎症作用,並且不具有 血管通透性亢進作用,故而可用作副作用較少、安全性優 異的花粉症、過敏性鼻炎、過敏性結膜炎、異位性皮膚炎 146l40.doc -10- 201032814 以及哮喘等過敏性疾病之預防及/或治療劑。又,本發明 之低分子量多硫酸化玻尿酸衍生物或其藥學上容許之鹽 中’尤其是通式(IA)之Y為(d)或(e)之化合物群以及通式 (IB)之化合物群具有在水溶液中之穩定性較高,容易製成 製劑之優點。 【實施方式】 本發明之低分子量多硫酸化玻尿酸衍生物係玻尿酸低聚 物之全部羥基過度硫酸化所得者,對於硫酸化之程度,可 列舉相對於式(IA)及(IB)之R之總數(低聚物整體),s〇3jj基 所佔之比例(或取代度)為80〜100%者,較好的是9〇〜1〇〇% 者。再者,低聚物中之S〇3H基亦可不均勻分布,但就製 備及使用之觀點而言’通常較好的是S〇3H基均勻地存在 於整個分子中。 本發明之式(IA)所表示之化合物中γ為式(d)或(e)之化合 物(式(IA’))以及式(IB)所表示之化合物,係文獻未記載之 新穎化合物。 於上述式(IA)及(IB)中,Z!&Z2所表示的可經取代之低 級烷基、可經取代之芳基、可經取代之芳烷基、可經取代 之雜芳基中,作為「低級烷基」,可列舉直鏈或分枝狀之 碳數1〜6(以下’簡稱為「Cl·6」)之烷基,例如曱基、乙 基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第二丁基、第三 丁基、正戊基、正己基等。其中,較好的是ci4烷基,更 好的疋曱基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基異丁基、 第二丁基、第三丁基,更好的是甲基、乙基。 146140.doc • 11 · 201032814 作為方基」’可列舉C6 - 1 4之早環至三環式芳香族煙環 基’例如可列舉苯基、萘基、蒽基,較好的是苯基。 作為「雜芳基」,可列舉具有至少1個選自氮原子、硫原 子及氧原子中之雜原子的飽和或不飽和之單環或多環雜環 基。 具體而言’可列舉:含有1〜4個氮原子的3〜6員之不飽和 雜單環基,例如吡咯基、吡咯啉基、咪唑基、吡唑基、啦 咬基、嘧啶基、吡畊基、噠畊基、三唑基、四唑基、四氮 吡啶基等; 含有1〜4個氮原子的3〜7員之飽和雜單環基,例如d比略咬 基、咪唑咬基、派咬基、旅畊基、高β底咬基等; 含有1〜5個氮原子之不飽和縮合雜環基,例如巧丨η朵美、 異吲哚基、異吲哚琳基、苯并咪唾基、喹琳基、異啥琳 基、咪唑并吡啶基、吲唑基、苯并三唑基、四唑并吡啶 基、喹η号琳基、η比咬并四氫》比咬基、四氫異喹琳基、 & 口引口木 淋基、二氫°比洛并"比唆基等; 含有1〜5個氮原子之飽和縮合雜環基,例如吡嘴咬并略 畊基、嗝啶基、吡咯啶并哌啶基等; 含有氧原子之3〜6員之不飽和雜單環基,例如 〜南悬^、 呋喃基等; 含有氧原子之3〜6員之飽和雜單環基,例如 四氧10比〇南 基、四氫呋喃基等; 含有1或2個硫原子的3~6員之不飽和雜單環其 卞辰I,例如噻 吩基等; 146140.doc -12· 201032814 含有1或2個氧原子及1〜3個氮原子的3〜6員之不飽和雜單 環基,例如噚唑基、異呤唑基、呤二唑基、〖,2_氧氮雜環 丙烯(oxazirinyl)等; 3有1或2個氧原子及1〜3個氮原子的3〜6員之飽和雜.單環 基,例如味琳基等; 3有1或2個氧原子及1〜3個HL原子的飽和縮合雜環基, 例如苯并呋吖基、苯并,号唑基、苯并噚二唑基等; . 含有1或2個硫原子及1〜3個氮原子的3〜6員之不飽和雜單 環基’例如噻峻基、嗟二唑基等; 含有1或2個硫原子及1〜3個氮原子的3〜6員之飽和雜單環 基’例如噻唑烷基等; 含有1或2個硫原子及個氮原子的不飽和縮合雜環 基’例如.苯并《«塞。坐基、嗟β坐并四氫吼„定基等; 含有1或2個氧原子之不飽和縮合雜環基,例如笨并呋喃 基本并間一氧雜環戊烯基(benzodioxolyi)、ρ克院美 • (chromanyl)等 〇 作為可取代於上述「低級烷基」上之基,例如可列舉: 鹵素原子、羧基、芳基、低級烷氧基、醯基等,作為可取 代於「芳基」及「雜芳基」上之基,例如可列舉:由素原 * 子、竣基、低級烷基、低級烷氧基、醯基等。 此處,作為芳基,可列舉苯基、萘基等,作為低級烧 基’可列舉上述Cl 6烷基。 又’作為鹵素原子’可列舉氟、氣、溴、蛾等。 又,作為低級烷氧基,可列舉直鏈或分枝狀之Cl 6烷氧 146140.doc -13· 201032814
基,例如:曱氧基、乙4I ^ 氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁 氧基、異丁氧基、第二T备甘 —氣基、第三丁氧基、正戊氧基、 正己氧基等。其中,軔杯 好的疋Cl·4烷氧基,更好的是甲氧 基、乙氧基、正丙氧義、 虱基異丙氧基、正丁氧基、異丁氧 基、第二丁氧基、第二 弟—丁虱基,更好的是甲氧基、乙氧 基0 作為醯基,可列患:· ^ 土夕】舉.CHO、k烷基-羰基、Cw烷氧基_ 幾基、芳基羰基、芳基_c 土 L丨·6伸坑基_幾基、雜芳基幾基、 雜芳基-C!·6伸烷基·羰基等。 此處,Cw烷基、烷氧基、芳基、雜芳基可列舉與 上述者相同之基。X ’作為Ci6伸烧基,可列舉直鍵或分 枝狀之C!-6伸烷基,例如:亞甲基、伸乙基、三亞甲基、 四亞甲基、五亞甲基、六亞甲基、伸丙基、甲基亞甲基、 乙基伸乙基、1,2-二曱基伸乙基、ΐ5ΐ,2,2_四甲基伸乙基 等’較好的是亞甲基、伸乙基、三亞甲基。 又,作為「芳烷基」’例如可列舉芳基_Ci —烷基。此 處’作為芳基、C!.6烧基,可例示與上述相同之基,作為 較好的芳烷基,可列舉:苄基、苯乙基等。 作為可取代於該芳烷基上之基’可列舉上述作為可取代 於芳基、低級烷基上之基而例示者。 作為Z!&Z2所示的「可經取代之低級烷基」,較好的是 二貌甲基,节基,2-、3 -或4-甲基 > 基’ 2-、3 -或4 -甲氧基 苄基’甲氧基曱基,甲氧羰基甲基等; 作為「可經取代之芳基」,較好的是2-、3-或4-▼基笨 146140.doc • 14- 201032814 基,2-、3-或4-甲氧基苯基,2-、3_或4_氟苯基,2…3_或 4-三氟甲基’ 2-、3-或4-叛基苯基等; 作為「可經取代之芳烷基」,較好的是苄基,2_、3或4_ 曱基苄基,2-、3-或4_曱氧基苄基等; 作為「可經取代之雜芳基」,較好的是2_、3 -或4-甲基η比 啶基,2-、3-或4-甲氧基吡啶基’ 2_、3_或4_氟吡啶基,2_ 、3-或4-三氟吡啶基’ 2-、3-或4-羧基吡咬基等。 -NZJ2以整體表示胺基酸殘基或肽殘基之情形時,作為 「胺基酸殘基或肽殘基例如可列舉:丙胺酸、精胺 酸、天冬醯胺、天冬醯胺酸、半胱胺酸、麩醯胺、麩胺 酸、甘胺酸、組胺酸、異白胺酸、白胺酸、離胺酸、甲硫 胺酸、苯基丙胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、 酪胺酸、纈胺酸、β-丙胺酸、肌胺酸、苯基甘胺酸、N—乙 基甘胺酸、Ν-正丙基甘胺酸、Ν-異丙基甘胺酸、Ν-正丁基 甘胺酸、Ν-第三丁基甘胺酸、Ν-正戊基甘胺酸、Ν_正己基 甘胺酸等之胺基酸殘基;肌胺醯基甘胺酸、甘胺醯基甘胺 酸、甘胺酿基肌胺酸、肌胺醯基肌胺酸、丙胺醯基甘胺 酸、β-丙胺醯基苯基丙胺酸、甘胺醯基苯基丙胺酸、苯基 丙胺醯基甘胺酸、苯基丙胺醯基苯基丙胺酸、甘胺醯基甘 胺醯基甘胺酸、Ν-乙基甘胺醯基甘胺酸、Ν-正丙基甘胺酿 基甘胺酸、肌胺醢基甘胺醢基甘胺酸、Ν-乙基甘胺酿基甘 胺醯基甘胺酸、苯基丙胺醯基甘胺醯基甘胺酸等之肽殘 基。再者,該胺基酸殘基或肽殘基末端之幾基可經醯胺 化。 146140.doc -15- 201032814 式(ΙΑ)及(IB)所表示之化合物中,n表示〇〜i5之數較好 的是3〜9,更好的是3、4或5,更好的是4或5。 再者,上述通式(IA)及(IB)所表示之化合物包括各種立 體異構物、光學異構物、水合物等溶劑合物。 又,本發明之低分子量多硫酸化玻尿酸衍生物的較好的 鹽為藥學上谷許之鹽,例如可列舉··鹼金屬鹽(例如鈉 凰鉀鹽荨)、驗土金屬鹽(例如鎂鹽、約鹽等)等金屬鹽, 銨鹽,與鹼金屬(鈉或鉀等)及鹼土金屬(鎂或鈣等)之氫氧 化物、碳酸鹽或碳酸氫鹽等無機鹼之鹽,或者與有機胺❿ (例如二甲胺、二乙胺等)、0比咬、喧琳、旅咬、咪唾、甲 基吡啶、二甲基胺基吡啶、二甲基苯胺、Ν_曱基味啉等有 機驗之鹽等。 本發明之低分子量多硫酸化玻尿酸衍生物或其藥學上容 許之鹽的分子量亦根據鹽之種類不同而不同,其平均分子 量較好的是1500〜13500。 本發明之通式(ΙΑ)或(ΙΒ)所表示之化合物例如可藉由下 述反應式-1所示之方式,將通式(ΙΙΑ)或(ΙΙΒ)所表示之低分 〇 子量玻尿酸衍生物硫酸化而製造。再者,原料化合物及目 標化合物亦可為上述之適合之鹽。 又’下述式中,&及Ζ4所表示之各取代基與心及心對 應,各取代基之含義如上所述。 * [化 11] 146140.doc 16 201032814
[反應-1]
〇γ1硫酸化
或者
[式中’ X1表示以下之(a1)或(b1): [化 12]
HOOC
(b1) Y1表示以下之(c1)、(d1)或(e1): [化 13] 146140.doc 17- 201032814
hoh2c
(d】) CH2R1 NHCOCH3
(e1) w1表示以下之(f1)或(g1): [化 14]
R1’表示-OH或-NZ3Z4(此處,Z3及Z4獨立表示氫原子、可 經取代之低級烷基、可經取代之芳基、可經取代之芳烷基 或可經取代之雜芳基,或者以-NZ3Z4整體表示胺基酸殘基 或肽殘基,η、X、Y、W、R及*表示與上述相同者]。 本反應可藉由已知之硫酸化反應來進行,例如將化合物 (ΙΙΑ)或(ΙΙΒ)及硫酸化劑溶解於適當之溶劑中,於加熱下使 之反應。 作為此處所使用之溶劑,可例示:Ν,Ν-二曱基曱醯胺、 二曱基亞砜、Ν-曱基吡咯啶酮、Ν,Ν-二甲基乙醯胺、 1,1,3,3-四甲基脲、吡啶、Ν,Ν-二甲基丙烯醯胺或1-乙基-3-曱基咪唑啉鑌六氟磷酸鹽、1-丁基-1-曱基吡咯烷鏽四氟 146140.doc •18- 201032814 硼酸鹽、1-丁基氯化吡啶鑌等離子性液體等,或者該等之 混合溶劑等。 作為硫酸化劑並無特別限定,較好的是使用硫酸酐與吼 咬、曱基D比咬、2,6-二曱°比咬、三曱胺、三乙胺、Ν,Ν-二 曱基曱醯胺、二嘮烷等之錯合物,或硫酸-二環己基碳二 亞胺、氯颯等。通常,硫酸化劑較好的是相對於化合物 (IIΑ)或(ΙΙΒ)使用1〜100當量。又,亦可於本反應之體系内 添加三氟乙酸或三氟曱磺酸等酸觸媒。 反應溫度及反應時間並無特別限定,例如可列舉於 0~120°C下反應30分鐘〜20日。 式(IIA)中,Y1為式(d1)或(e1),R1'為-OH之化合物,或者 式(IIB)中R1'為-OH之化合物,可藉由反應-2所示之還原反 應來製造。再者,原料化合物及目標化合物亦可為上述之 適合之鹽。 [化 15]
[反應-2]
還原
或者
[式中,A1表示以下之(h)或⑴:
(Π-2) 146140.doc -19· 201032814 [化 16]
A2表示以下之⑴或(k): [化 17]
η、X1以及*表示與上述相同者]。 即,可藉由例如於適當之溶劑中,於還原劑之存在下使 化合物(ΙΙΙ-1)或(ΠΙ-2)進行還原反應,而製造化合物(Π-1) 或(ΙΙ-2)。 作為用於本反應中之溶劑,例如可例示:水、曱醇、乙 醇、異丙醇、丁醇、第三丁醇、乙二醇等低級醇類’乙 146140.doc -20- 201032814 腈,甲酸、乙酸等脂肪酸,乙醚、四氫呋喃、二呤烷、乙 二醇二曱醚、二乙二醇二甲醚等醚類,苯、甲苯、二甲笨 等芳香族烴類,二氯甲烷、二氣乙烷、氯仿、四氣化碳等 鹵化烴類,N,N-二甲基曱醯胺或該等之混合溶劑等。 作為還原劑,例如可例示:硼氫化鈉、硼氫化鋰、硼氫 化鉀、四丁基硼氫化銨、硼氫化鋅、三第二丁基硼氫化 鋰、硼烷類似物、二異丁基氫化鋁、氫化鋁鋰等。 還原劑通常係相對於化合物(In_i)或(ΠΙ 2)使用〇丨倍莫 耳〜60倍莫耳左右。 、 於本反應之體系内,亦可於吡啶、三曱胺、三乙胺、Ν_ 乙基二異丙胺等胺類,氫氧化鈉等無機鹼或/及二甲基乙 二醛二肟(dimethyl glyoxime)、2 2,_聯吡啶、11〇 啡啉等 配體之存在下,添加氣化鋅、氣化鈷(11)、氣化釤(ΠΙ)、 氣化鈽(in)、氣化鈦(m)、氣化鐵氣化鐵(ΠΙ)、氣化 鎳(II)等。 再者,本還原反應亦可藉由於鈀、鉑等過渡金屬觸媒之 存在下實施催化氫化而進行。 本反應通常可於-80〜l〇(TC左右、較好的是_8〇〜7〇〇c左 右進行,且通常於30分鐘〜60小時左右結束反應。 式(IIA)中Y1為式(d1)或(e1) ’ R丨•為_NZ3z4之化合物,或 者式(IIB)中R1為-NZsZ4之化合物,可藉由以下之反應式_3 所不之還原性胺化反應而製造。再者,原料化合物及目標 化合物亦可為上述之適合之鹽。 [化 18] 146I40.doc -21- 201032814 [反應-3]
HNZ3Z4 (IV) 還原劑 A1
[式中,A1、A2、Z3及Z4表示與上述相同者]。 本反應係所謂還原性胺化反應,即,例如於適當之溶劑 中,於還原劑之存在下,使化合物(III-1)或(III-2)與胺(IV) 反應而形成希夫驗(Schiff base),繼而進行還原。 胺(IV)通常係相對於化合物(III-1)或(III-2)使用1倍莫耳 〜5倍莫耳左右。 作為此處所使用之溶劑,例如可例示:水、曱醇、乙 醇、異丙醇、丁醇、第三丁醇、乙二醇等低級醇類,乙 腈,甲酸、乙酸等脂肪酸,二乙醚、四氫呋喃、二噚烷、 乙二醇二甲醚、二乙二醇二甲醚等醚類,苯、曱苯、二甲 苯等芳香族烴類,二氯甲烷、二氯乙烷、氣仿、四氣化碳 等鹵化烴類,N,N-二甲基曱醯胺或該等之混合溶劑等。 作為此處所使用之還原劑,例如可例示:硼氫化鈉、硼 氫化鋰、硼氫化鉀、四丁基硼氫化銨、氰基硼氫化鈉、三 乙醯氧基硼氫化鈉等。還原劑通常係相對於化合物(III)使 用0.1倍莫耳〜60倍莫耳左右。 146140.doc -22- 201032814 本反應通常可於_80〜10(rc左右,較好的是_8〇〜7〇它左 右進行且通^於30分鐘〜6〇小時左右結束反應。 視需要,亦可於!倍莫耳〜5〇倍莫耳之有機酸類或其鹽之 存在下進行反應。作為有機酸類或其鹽,例如可列舉:匕 酸、二氟乙酸或該等之鹼金屬鹽(例如乙酸鈉等)等。 於本反應之體系内,亦可於吡啶、三甲胺、三乙胺、n_ 乙基二異丙胺等胺類’氫氧化鈉等無機鹼或/及二甲基乙 二搭二將、2,2’|比啶、丨,…啡啉等配體之存在下,添加 氣化辞、氣化鈷(11)、氯化釤_、氣化鈽(ΙΠ)、氯化鈦 (III)、氯化鐵(H)、氯化鐵(m)、氣化鎳(11)等。 又,亦可於該反應之反應體系内添加適量之硼酸。 對於由偶數糖組成之化合物群與由奇數糖組成之化合物 群的轉化,可藉由以下之反應式-4或5,由原料化合物製 造少一個構成糖之化合物。 [化 19] [反應·4]
[式中,Α2表示與上述相同者]。 本反應係藉由弱鹼加熱處理而進行之醯葡萄糖胺之 脫去反應。 146140.doc -23- 201032814 藉由依據Reissig等人之方法(1161331§,】.1^,61&1·,】· Biol· Chem.,217, 959 (1955)),於 pH 值為 9.18 之硼酸鹽緩 衝液中加熱攪拌化合物(V),可製造化合物(VI)。 本反應通常可於50〜120°C左右、較好的是70〜90°C左右 進行,且通常於30分鐘〜60小時左右結束反應。 [化 20] [反應-5]
[式中,D1表示以下之(r)或(s): [化 21]
η及*表示與上述相同者]。 本反應係使用β-尿苷酸酶的葡萄糖醛酸之脫去反應。 146140.doc -24· 201032814 藉由於β-尿苷酸酶之存在下,於適當之緩衝液中攪拌化 合物(VII),可製造化合物(VIIJ)。 本反應通常可於室溫〜6(TC左右、較好的是30〜4(rc左右 進行,且通常於30分鐘〜60小時左右結束反應。 利用上述各反應式而獲得之各目標化合物,可藉由各種 修飾多糖類常用之純化操作而加以純化。具體之純化操作 可列舉:凝膠過濾、、中和、藉由透析之脫鹽、藉由添加有 機溶劑之沈澱操作的回收操作、或藉由冷凍乾燥之回收操 作等。 如下述實施例所示,本發明之化合物具有抗過敏作用及 抗炎症作用,且不顯示血管通透性完進作用,故而可有效 地用作用於預防及/或治療花粉症、過敏性鼻炎、過敏性 結膜炎、異位性皮膚炎以及哮喘等過敏性疾病之醫藥。 該醫樂係將本發明之化合物製成普通之醫療製劑形態而 成者丄可使用通常使用之填充劑、增量劑、黏合劑、賦濕 • 齊1、崩解劑、界面活性劑、潤滑劑等稀釋劑、或賦形劑進 行製備。 . 作為此種醫藥,其劑型可根據治療目的而自各種劑型中 ’ 冑擇’作為其代表㈣丨型’可列舉:錠劑、丸劑、散劑、 - 液劑、懸浮劑、乳劑、顆粒劑、膠囊劑、栓劑、注射劑 (液劑、懸浮劑等)、滴眼劑、軟膏劑、吸入劑等。 作為成形為旋劑形態時所使用之載劑,可廣泛地使用公. 1者例如可列舉:乳糖、白糖、氣化納、葡萄糖、尿 、澱粉、碳酸舞、高嶺土、結晶纖維素等賦形劑;水、 146140.doc -25- 201032814 乙醇、丙醇、單糖漿、葡萄糖液、澱粉液、明膠溶液、羧 甲基纖維素、蟲膠、曱基纖維素、磷睃鉀、聚乙烯D比咯啶 嗣等黏合劑;乾燥澱粉、聚氧乙烯去水山梨醇脂肪酸酯、 十二烧基硫酸納、硬酯酸單甘油酯、澱粉、乳糖等崩解 劑,白糖、硬脂、可可脂、氫化油等崩解抑制劑;四級銨 . 驗、十二烧基硫酸鈉等吸收促進劑;甘油、澱粉等保濕 . 劑’殿粉、乳糖'高嶺土、膨潤土、膠體狀矽酸等吸附 劑,純化滑石、硬酯酸鹽、硼酸粉末、聚乙二醇等潤滑劑 等。 e 進而’視需要旋劑亦可製成通常之加錠衣之錠劑,例 如.糖衣劑、明膠包覆錠、腸溶包衣錠、膜衣錠或者雙層 錠、多層錠。 作為成形為丸劑形態時所使用之載劑,可廣泛地使用公 知者例如可列舉:葡萄糖、乳糖、澱粉、可可脂、氫化 植物油、同嶺土、滑石等賦形劑;阿拉伯膠粉末、黃蓍粉 末月膠、乙醇等黏合劑;昆布糖、瓊脂等崩解劑等。
作為成形為栓劑之形態時所使用之載劑,可廣泛地使用 么头者你]如可列舉:聚乙二醇、可可脂、高級醇、高級 醇之酯、明膠、半合成甘油酯等。 製備成左射劑之情形時,較好的是液劑、乳劑、以及 浮劑經實施殺菌,且與血液為等張。作為成形為該等 劑、乳劑以及懸浮劑之形態時所㈣之稀釋劑,可使用 知廣泛使用者,例如可列舉:水、乙醇、丙二醇乙氧 異硬月曰醇、聚錢異硬脂醇、聚氧乙烤去水山梨醇脂肪 146140.doc •26- 201032814 酯等。再者,此時,可使醫療製劑中含有對於製備等張性 之溶液充分之量之食鹽、葡萄糖或甘油,另外,亦可含有 通常之溶解助劑、緩衝劑、鎮痛劑等,進而亦可視需要含 有著色劑、保存劑、香料、調味劑、甜味劑等或其他醫藥 品。 該醫藥中所含之本發明之化合物之量並無特別限定,可 自較廣範圍内適宜選擇,通常較好的是使醫藥中含有丨〜7〇 重量%的本發明之化合物。 作為本發明之醫藥之投予方法並無特別限制,可採用適 應各種製劑形態、患者之年齡、性別、疾病之狀態以及其 他條件之方法來投予。例如於錠劑、丸劑、液劑、懸浮 劑、乳劑、顆粒劑及膠囊劑之情形時,進行經口投予。 又,於注射劑之情形時,可單獨或者與葡萄糖、胺基酸等 通常之輔液混合後投予至靜脈内,進而可視需要單獨投予 至肌肉内、皮内、皮下或腹腔内。於栓劑之情形時,投予 至直腸内。 上述醫藥之投予量可根據用法、患者之年齡、性別、疾 病之程度以及其他條件而適宜選擇,通常相對於】0體 重,1日分1次〜數次投予0.001〜100mg’較好的是〇 〇〇ι〜5〇 mg。再者,上述投予量會因各種條件而發生變化,故而有 時使用小於述範圍之投予量便可,且有時需要超出上述範 圍之投予量。 [實施例] 以下’揭示實施例來更詳細地說明本發明。 146140.doc -27- 201032814 再者,i-NMR係使用重水(D20)作為溶劑,利用 AVANCEIII 400(BURKER 公司製造)或 AVANCE 500 (BURKER公司製造)進行測定。 製造例1〜5 4原料化合物之製造 藉由以下之製造例1〜54所記載之方法,製造表1〜7中所 示之原料化合物。 再者,質譜分析係利用Voyager DE-PRO(Applied B iosy stems Jap an股份有限公司)來進行。 製造例1 將玻尿酸鈉(資生堂製造,BIO Sodium Hyaluronate HA9)與依據文獻 Glycobiology,vol. 12,No. 7,ρρ· 421-426, 2002從來自牛精巢之玻尿酸酶(calbiochem公司製造, Hyaluronidase Bovine T 100KU)中分離出之玻尿酸募糖4-mer(20 mg)溶解於甲醇(1 ml)及水(0.5 ml)中,於冰浴冷卻 下加入硼氫化鈉(10 mg)並攪拌。恢復至室溫攪拌一夜。 藉由質譜分析確認反應完畢。 於冰浴冷卻下添加10〇/〇乙酸甲醇溶液(0.5 ml)及水(1 ml) 後,於減壓下濃縮。添加10%乙酸曱醇溶液(0.5 ml)並共沸 後,加入曱醇(2 ml)再共沸2次。 將殘渣溶解於水(2 ml)中,用圓盤過濾器(日本Pall公司 製造,0.45 μπι)進行過濾。使其通過短管柱(Aldrich公司製 造,Dowex(註冊商標)50 Wx8氫型)而形成質子化體後,進 行減壓濃縮。使用 AKTA System(GE Healthcare Bio-Science股份有限公司製造)進行凝膠過濾層析(G-10,16 146140.doc -28- 201032814 扣分,獲得目梅 mmx600 mni,水)而脫鹽,冷凍乾燥目標組力 ^ 物。(12 mg,白色粉末) MS[M+Na]+ : 846.21 W-NMR :圖譜示於圖1。 製造例2 除了將原料變更為玻尿酸寡糖6-mer(60 以外以與 製造例1相同之方式進行反應而獲得目標物。(50 mg ’白 色粉末)
MS[M-H]' : 1157.81 W-NMR :圖譜示於圖2。 製造例3 使用玻尿酸寡糖8-mer(60 mg),以與製造例1相门之方式 進行反應而獲得目標物。(51 mg,白色粉末) MS[M-H]' : 1535.57 W-NMR :圖譜示於圖3。 製造例4 使用玻尿酸寡糖l〇-mer(6〇 mg),以與製造例1相门 式進行反應而獲得目標物。(48 mg,白色粉末) MS[M-H]' : 1915.72 W-NMR :圖譜示於圖4。 製造例5 使用玻尿酸募糖12-mer(6〇 mg),以與製、生γ 1 夕1 才目 1**^! ^ - 式進行反應而獲得目標物。(60 mg,白色粉末) 146140.doc •29- 201032814 W-NMR :圖譜示於圖5。 製造例6 除了將原料變更為玻尿酸募糖14-mer(20 mg)以外,以與 製造例1相同之方式獲得目標物。(2〇mg,白色粉末) W-NMR :圖譜示於圖6。 製造例7 將玻尿酸募糖16-mer(10 mg)溶解於甲醇(0_6 ml)及水(0·3 ml)中,於冰浴冷卻下添加硼氫化鈉(5 mg)並攪拌。恢復至 室溫攪拌一夜。藉由質譜分析確認反應完畢。 於冰浴冷卻下添加10%乙酸甲醇溶液(0.1 ml)及水(0.2 ml)後,於減壓下濃縮。 將殘渣溶解於水(1 ml)中,用圓盤過濾器(曰本Pall公司 製造’ 0.45 μιη)進行過濾。使用AKTA System(GE Healthcare Bio-Science股份有限公司製造)進行凝膠過濾層 析(G-10,16 mm><600 mm,水)而脫鹽,冷凍乾燥目標組 分,獲得目標物。(10 mg,白色粉末) W-NMR :圖譜示於圖7 » 製造例8 除了將原料變更為玻尿酸募糖1 8-mer(20 mg)以外,以與 製造例1相同之方式獲得目標物》(20 mg,白色粉末) W-NMR :圖譜示於圖8 » 製造例9 除了將原料變更為玻尿酸募糖20-mer(42 mg)以外,以與 製造例1相同之方式獲得目標物。(40 mg,白色粉末) 146140.doc •30- 201032814 W-NMR :圖譜示於圖9。 製造例10 將玻尿酸寡糖10-mer(20 mg)溶解於水(0.8 ml)中,進行 冰浴冷卻。將鄰胺基苯曱酸(30 mg)、硼酸(40 mg)、乙酸 納(80 mg)以及氰基棚氫化鈉(5 mg)溶解於甲醇(1 ml)及水 (0.2 ml)中’加入該溶液於8〇eC下攪拌5小時。藉由質譜分 析確認反應完畢。 $ 於減壓下濃縮後’將殘渣溶解於甲醇(1 ml)及水(1 ml) 中,用圓盤過濾器(日本Pall公司製造,〇·45 μιη)進行過 濾。進行凝膠過濾層析(LH-20,18 mmx500 mm,水:甲 醇=1 ·· 1)加以純化’冷凍乾燥目標組分,獲得目標物。 (24 mg,白色粉末) W-NMR :圖譜示於圖10。 製造例11 將玻尿酸寡糖l〇-mer(2〇 mg)溶解於水(〇 8 ml)中,進行 • 冰浴冷卻。將苯胺(30 mg)、硼酸(40 mg)、乙酸鈉(80 mg) 以及氰基硼氫化鈉(5 mg)溶解於甲醇(1 ml)及水(〇2如) 中,加入該溶液於80。(:下攪拌5小時。藉由質譜分析確認 _ 反應完畢。 • 於減壓下濃縮後,將殘渣溶解於曱醇(1 ml)及水(1 ml) 中,用圓盤過濾器(日本Pall公司製造,〇45 μιη)進行過 濾。進行凝膠過濾層析(LH_2〇, 18 mmx5〇〇 mm,水:甲 醇1 . 1)加以純化,冷凍乾燥目標組分,獲得目標物。 (17 mg,白色粉末) 146140.doc •31- 201032814 W-NMR :圖譜示於圖11。 製造例12 除了將原料變更為玻尿酸募糖24〜32-mer(10 mg)以外, 以與製造例1相同之方式獲得目標物。(10 mg,白色粉末) 製造例13 除了將原料變更為玻尿酸寡糖34〜46-mer(10 mg)以外, 以與製造例1相同之方式獲得目標物。(10 mg,白色粉末) 製造例1〜13之目標物之結構揭示於下述表1。 [表1]
製造例編號 η R' 製造例編號 η R' 1 1 OH 10 4 H (fOaNa 2 2 OH 3 3 OH 4 4 OH 11 4 H 5 5 OH 6 6 OH 7 7 OH 12 11-15 OH 8 8 OH 13 16-22 OH 9 9 OH 製造例14 將玻尿酸納(資生堂製造,BIO Sodium Hyaluronate HA9)與依據文獻 Glycobiology, vol. 12,No. 7,ρρ· 421-426, 2002從來自牛精巢之玻尿酸酶(calbiochem公司製造, I46140.doc -32- 201032814
Hyaluronidase Bovine T 100KU)分離出之玻尿酸寡糖 4-mer 溶解於硼酸鹽緩衝液(pH值為9.18)(3 ml)中,於80°C下攪 拌1小時。恢復至室溫,加入曱醇(3 ml)後減壓濃縮。將殘 渣溶解於水(2 ml)中,用圓盤過濾器(日本Pall公司製造, 0.45 μπι)進行過滤、後,使用 AKTA System(GE Healthcare Bio-Science股份有限公司製造)進行凝膠過濾層析(G-10, 16 mmX 600 mm,水)而脫鹽,濃縮目標組分,藉此獲得白 色粉末。 繼而,將所獲得之白色粉末(25 mg)溶解於甲醇(1 ml)及 水(0.5 ml)中,於冰浴冷卻下加入氫棚化納(10 mg)並撲 拌。恢復至室溫攪拌一夜。藉由質譜分析確認反應完畢。 於冰浴冷卻下添加10%乙酸甲醇溶液(0.2 ml)後,於減壓下 濃縮。將殘渣溶解於水(2 ml)中,用圓盤過濾器(日本Pall 公司製造,0.45 μιη)進行過濾後,使用AKTA System(GE Healthcare Bio-Science股份有限公司製造)進行凝膠過遽層 析(G-10,16 mm><600 mm,水)而脫鹽,冷柬乾燥目標組 分,獲得目標物。(18 mg,白色粉末) MS[M-H]· : 573.45 W-NMR :圖譜示於圖12。 製造例1 5 除了將原料變更為玻尿酸寡糖6-mer(60 mg)以外,以與 製造例14相同之方式獲得目標物。(34 mg,白色粉末) MS[M-H]' : 953.02 W-NMR :圖譜示於圖13。 146140.doc -33- 201032814 製造例16 除了將原料變更為玻尿酸募糖8-mer(10 mg)以外,以與 製造例14相同之方式獲得目標物。(8 mg,白色粉末) MS[M-H]· : 1331.54 NMR :圖譜示於圖14。 製造例17 除了將原料變更為玻尿酸寡糖10-mer( 10 mg)以外,以與 製造例14相同之方式獲得目標物。(8 mg,白色粉末) MS[M-H]' : 1710.28 ΐΗ·ΝΜΚ·:圖譜示於圖15。 製造例18 除了將原料變更為玻尿酸募糖12_11^1>(2〇 mg)以外,以與 製造例14相同之方式獲得目標物。(16 mg,白色粉末) MS[M-H]' : 2090.01 lH_NMR :圖譜示於圖16。 製造例19 除了將原料變更為玻尿酸寡糖14 mer(18 mg)以外,以與 製造例14相同之方式獲得目標物。⑴叫,白色粉末)、 MS[M-H]' : 2469.52 H-NMR .圖譜示於圖17。 製造例20 于了將原料變更為玻尿酸募糖16-mer(7 mg)以外,以與 製造例14相同之方式蒋專 八後得目標物。(5 mg,白色粉末) MS[M-H]- : 2848.59 146140.doc 201032814 1H-NMR :圖譜示於圖18。 製造例21 除了將原料變更為玻尿酸寡糖1 8-mer( 10 mg)以外,以與 製造例14相同之方式獲得目標物。(9 mg,白色粉末) MS[M-H]' : 3225.70 • 丨H-NMR :圖譜示於圖19。 製造例22 除了將原料變更為玻尿酸寡糖20-mer(l 5 mg)以外,以與 製造例14相同之方式獲得目標物。(13 mg,白色粉末) MS[M-H]' : 3604.16 W-NMR :圖譜示於圖20。 製造例14〜22之目標物之結構揭示於下述表2。 [表2]
❹ 製造例編號 η 製造例編號 η 製造例編號 η 14 0 17 3 2 0 6 15 1 18 4 2 1 7 16 2 19 5 2 2 8 製造例23 將製造例1中所獲得之化合物(17 mg)溶解於緩衝液(將氯 化鈉水溶液(300 mM,1 ml)及乙酸鈉水溶液(200 mM,1 ml)混合,且利用冰乙酸將pH值調整為5.2而成者)(2 ml) 146140.doc -35- 201032814 中,加入Β-l型牛肝β-尿苦酸酶(bovine liver β-glucuronidase Type B-l,Sigma-Aldrich公司製造)(8 mg), 於37°C下培養8小時。對反應液進行超過濾(Millipore公司 製造,Amicon Ultra(4 ml,10 K標稱分子量))而純化後, 使用 AKTA System(GE Healthcare Bio-Science股份有限公 司製造)進行凝膠過滤、層析(G-10,16 mm x600 mm,水)而 脫鹽,冷床乾燥目標組分,獲得目標物。(8 mg,白色粉 末) MS[M-H]' : 601.18 W-NMR :圖譜示於圖21。 製造例24 除了將原料變更為製造例2中所獲得之化合物(11 mg)以 外,以與製造例23相同之方式獲得目標物。(4 mg,白色 粉末) MS[M-H]' : 980.29 W-NMR :圖譜示於圖22。 製造例25 除了將原料變更為製造例3中所獲得之化合物(10 mg)以 外,以與製造例23相同之方式獲得目標物。(8 mg,白色 粉末) MS[M-H]· : 1359.37 W-NMR :圖譜示於圖23。 製造例26 除了將原料變更為製造例4中所獲得之化合物(30 mg)以 146140.doc •36- 201032814 外,以與製造例23相同之方式獲得目標物。(15 mg,白色 粉末) MS[M-H]' : 1738.15 W-NMR :圖譜示於圖24。 製造例27 除了將原料變更為製造例5中所獲得之化合物(14 mg)以 外,以與製造例23相同之方式獲得目標物。(7 mg,白色 粉末) MS[M-H]' : 2117.50 W-NMR :圖譜示於圖25。 製·造例28 除了將原料變更為製造例9中所獲得之化合物(10 mg)以 外,以與製造例23相同之方式獲得目標物。(5 mg,白色 粉末) MS[M-H]' : 3633.84 b-NMR :圖譜示於圖26。 將製造例23〜28之目標物之結構揭示於下述表3。 [表3] HOHzC / Na02c Η0Η2α \ NaOzC H0H2C1 /〇\HO〆^ ηο-Λ^. nhcoch3\ OH NHCOCH3/ OH NHCOCH3 製造例編號 η 製造例編號 η 製造例編號 η 2 3 0 2 5 2 2 7 4 2 4 1 2 6 3 2 8 8 146140.doc -37- 201032814 製造例29 除了將原料變更為製造例15中所獲得之化合物(15 mg) 以外’以與製造例23相同之方式獲得目標物。(9 mg,白 色粉末) MS[M-H]· : 777.28 W-NMR :圖譜示於圖27。 製造例30 除了將原料變更為製造例16中所獲得之化合物(1! mg) 以外,以與製造例23相同之方式獲得目標物。(7 mg,白 色粉末) MS[M-H]' : 1156.41 W-NMR :圖譜示於圖28。 製造例3 1 除了將原料變更為製造例17中所獲得之化合物(23 mg) 以外,以與製造例23相同之方式獲得目標物。(1 5 mg,白 色粉末) MS[M-H]· : 1535.07 W-NMR :圖譜示於圖29。 製造例3 2 除了將原料變更為製造例18中所獲得之化合物(14 mg) 以外’以與製造例23相同之方式獲得目標物。(8 mg,白 色粉末) MS[M-H]· : 1914.60 h-NMR :圖譜示於圖30。 146140.doc -38- 201032814 製造例33 除了將原料變更為製造例22中所獲得之化合物(8 mg)以 外,以與製造例23相同之方式獲得目標物。(5 mg,白色 粉末) MS[M-H]· : 3430.67 ' W-NMR :圖譜示於圖31。 將製造例29~33之目標物之結構揭示於下述表4。 [表4]
製造例編號 η 製造例编號 η 製造例編號 η 2 9 1 3 1 3 3 3 8 3 0 2 3 2 4 製造例34 將玻尿酸鈉(Food Chemifa製造,玻尿酸FCH-SU)與依據 文獻 Glycobiology,vol· 11, No. 1,ρρ· 57-64,2001從來自鏈 黴菌玻尿酸酶(Streptomyces hyalurolyticus)之玻尿酸酶 (Amano Enzyme製造,玻尿酸酶「Amano」1)中分離出之 不飽和玻尿酸寡糖4-mer(8 mg)溶解於甲醇(2 ml)及水(1 ml)中,於冰浴冷卻下加入棚氳化鈉(4 mg)並授拌。恢復至 室溫攪拌一夜。藉由質譜分析確認反應完畢。於冰浴冷卻 下添加10%乙酸曱醇溶液(0.2 ml)後,於減壓下濃縮,然後 使用 AKTA System(GE Healthcare Bio-Science股份有限公 146140.doc -39- 201032814 司製造)進行凝膠過濾層析(G-10,16 mmx600 mm,水)而 脫鹽’冷凍乾燥目標組分,獲得目標物。(3 mg,白色粉 末) MS[M-H]' : 759.61 W-NMR :圖譜示於圖32。 製造例35 除了將原料變更為不飽和玻尿酸募糖6 _mer( 1 0 mg)以 外,以與製造例34相同之方式獲得目標物。(9 mg,白色 粉末) MS[M-H]· : 1139.15 iH-NMR :圖譜示於圖33。 製造例36 除了將原料變更為不飽和玻尿酸寡糖LmerQo mg)以 外,以與製造例34相同之方式獲得目標物。(1〇 mg,白色 粉末) MS[M-H]* : 1518.49 iH-NMR :圖譜示於圖34。 製造例37 除了將原料變更為不飽和玻尿酸募糖1〇mer(1〇 以 外,以與製造例34相同之方式獲得目標物。mg,白色 粉末) MS[M-H]· : 1897.57 W-NMR :圖譜示於圖35。 製造例38 146140.doc 201032814 除了將原料變更為不飽和玻尿酸寡糖12-mer(10 mg)以 外,以與製造例34相同之方式獲得目標物。(8 mg,白色 粉末) MS[M-H]· : 2276.99 W-NMR :圖譜示於圖36。 製造例39 除了將原料變更為不飽和玻尿酸寡糖20-mer( 12 mg)以 外,以與製造例34相同之方式獲得目標物。(10 mg,白色 粉末) MS[M-H]' : 3792.03 W-NMR :圖譜示於圖37。 將製造例34〜39之目標物之結構揭示於下述表5。 [表5] 製造例編號 η 製造例編號 Ώ 製造例編號 η 3 4 1 3 6 3 3 8 5 3 5 2 3 7 4 3 9 9
製造例40 將玻尿酸鈉(Food Chemifa製造,玻尿酸FCH-SU)與依據 文獻 Glycobiology,vol. 11,No· 1, ρρ· 57-64,2001從來自鏈 徽菌玻尿酸酶之玻尿酸酶(Amano Enzyme製造,玻尿酸酶 "Amano" 1)中分離出之不飽和玻尿酸寡糖4-mer(10 mg)溶 146140.doc • 41 - 201032814 解於硼酸鹽緩衝液(pH值為9.18)(1 ml)中,於80°C下攪拌1 小時。恢復至室溫,加入甲醇(3 ml)後減壓濃縮。將殘渣 溶解於水(2 ml)中,用圓盤過濾器(日本Pall公司製造, 0.45 μηι)進行過滤後,使用 AKTA System(GE Healthcare Bio-Science股份有限公司製造)進行凝膠過濾層析(G-10, 16 mmX 600 mm,水)而脫鹽,濃縮目標組分,藉此獲得白 色粉末。 繼而,將所獲得之白色粉末(6 mg)溶解於曱醇(1 ml)及 水(0.5 ml)中,於冰浴冷卻下加入硼氫化鈉(10 mg)並攪 拌。恢復至室溫攪拌一夜。藉由質譜分析確認反應完畢。 於冰浴冷卻下加入1 0%乙酸曱醇溶液(0.2 ml)後,於減壓下 濃縮。將殘渣溶解於水(2 ml)中,用圓盤過濾器(日本Pall 公司製造,0.45 μηι)進行過濾後,使用AKTA System(GE Healthcare Bio-Science股份有限公司製造)進行凝膠過遽層 析(G-10,16 mmx600 mm,水)而脫鹽,冷;東乾燥目標組 分,獲得目標物。(4 mg,白色粉末) MS[M-H]· : 556.77 W-NMR :圖譜示於圖38。 製造例41 除了將原料變更為不飽和玻尿酸募糖6-mer( 10 mg)以 外,以與製造例40相同之方式獲得目標物。(7 mg,白色 粉末) MS[M-H]' : 935.49 b-NMR :圖譜示於圖39。 146140.doc -42- 201032814 製造例42 除了將原料變更為不飽和玻尿酸寡糖8-mer( 10 mg)以 外,以與製造例40相同之方式獲得目標物。(6 mg,白色 粉末) MS[M-H]' : 1314.21 1H-NMR :圖譜示於圖40。 製造例43 除了將原料變更為不飽和玻尿酸寡糖l〇-mer(10 mg)以 胃外,以與製造例40相同之方式獲得目標物。(7 mg,白色 粉末) MS[M-H]' : 1693.58 W-NMR :圖譜示於圖41。 製造例44 除了將原料變更為不飽和玻尿酸寡糖12-mer( 10 mg)以 外,以與製造例40相同之方式獲得目標物。(6 mg,白色 A 粉末) MS[M-H]' : 2073.41 W-NMR :圖譜示於圖42。 * 將製造例40〜44之目標物之結構揭示於下述表6。 . [表 6]
146140.doc 43- 201032814 製造例編號 η 製造例编號 η 製造例編號 η 4 0 0 4 2 2 44 4 4 1 1 4 3 3 製造例45 於玻尿酸寡糖4-mer(l〇 mg)中,加入將苄胺(24 mg)、蝴 酸(20 mg)、乙酸納(40 mg)以及氰基棚氫化納(15 mg)溶解 於甲醇(0.5 ml)及水(0.5 ml)所得之溶液中,於50°C下攪拌 6小時。藉由質譜分析確認反應完畢。 於減壓下濃縮後,溶解於水(2 ml)中,用圓盤過濾器(曰 本Pall公司製造,〇·45 μπι)進行過濾。進行凝膠過濾層析 (G-10 ’ 16 mmX600 mm,水)加以純化,冷;東乾燥目標組 分’獲得目標物。(8mg,白色粉末) W-NMR :圖譜示於圖43。 製造例46 於玻尿酸募糖4-mer( 10 mg)中,加入將苯基丙胺酸(5 mg)、乙酸(10 μΐ)、乙酸鈉(10 mg)以及氰基硼氫化鈉(1〇 mg)溶解於曱醇(0.2 ml)及水(0.2 ml)所得之溶液中,於 60°C下攪拌6小時◊藉由質譜分析確認反應完畢。 於減壓下濃縮後,於殘渣中添加二氯曱烷(5 ml)及水(5 ml)進行萃取。將水相於減壓下濃縮後,溶解於水(2 ml) 中’使用圓盤過濾器(曰本Pall公司製造,0.45 μπι)進行過 濾、。進行凝膠過渡層析(G-10 ’ 16 mmχ600 mm,水)而加 以純化’冷凍乾燥目標組分’獲得目標物。(Π mg,白色 粉末) 146140.doc -44 - 201032814 iH-NMR :圖譜示於圖44。 製造例47 除了將苯基丙胺酸變更為脯胺酸以外,以與製造例46相 同之方式獲得目標物。(8 mg,白色粉末) W-NMR :圖譜示於圖45。 ' 製造例48 除了將苯基丙胺酸變更為色胺酸以外,以與製造例46相 同之方式獲得目標物。(7 rng,白色粉末) 鲁1H-NMR:圖譜示於圖46。 製造例49 除了將苯基丙胺酸變更為甘胺醯基苯基丙胺醯胺以外, 以與製造例46相同之方式獲得目標物。(4 mg,白色粉末) W-NMR :圖譜·示於圖47。 製造例50 除了將苯基丙胺酸變更為苯基丙胺醯基甘胺酸以外,以 φ 與製造例46相同之方式獲得目標物。(14 mg,白色粉末) W-NMR :圖譜示於圖48。 製造例51 • 除了將起始物質由玻尿酸募糖4-mer(l〇 mg)變更為坡尿 • ㉟寡糖1〇'mer(20 mg),且將节胺變更為4_氣苯胺以外,以 與製造例45相同之方式獲得目標物。(1G mg,白色粉末) W-NMR:圖譜示於圖的。 製造例52 除了將破尿酸寡糖4-mer變更為玻尿酸募糖i〇-mer,將 146140.doc •45· 201032814 苄胺變更為2-胺基吡啶以外,以與製造例45相同之方式獲 得目標物。(12 mg,白色粉末) W-NMR :圖譜示於圖50。 製造例53 除了將玻尿酸募糖4-mer變更為玻尿酸寡糖10-mer,將 苯基丙胺酸變更為苯基丙胺醯基甘胺醯基甘胺酸以外,以 與製造例46相同之方式獲得目標物。(5 mg,白色粉末) W-NMR :圖譜示於圖51。 製造例54 除了將玻尿酸募糖4-mer變更為玻尿酸募糖10-mer以 外,以與製造例46相同之方式獲得目標物。(5 mg,白色 粉末) W-NMR :圖譜示於圖52。 將製造例45〜54之目標物之結構揭示於下述表7。 [表7]
146140.doc 46 201032814 製造例編薄 η R' 製造例編號 η R' 4 5 1 5 0 1 4 6 1 5 1 4 4 7 1 COjH 5 2 4 Η ... 4 8 1 5 3 4 〇 4 9 1 54 4
實施例1〜48本發明之化合物之製造 藉由以下之實施例1〜判中所記載之方法,製造表8~14所 示之本發明之化合物。再者’質譜分析係利用QSTAR pulsar i(Applied Biosystems Japan股份有限公司)來進行。 實施例1 將製造例1中所合成之化合物(12 mg)溶解於水(1 mi) 中,添加三丁胺(100 μΐ)並攪拌後,於減壓下濃縮。加入 Ν,Ν-二甲基甲醯胺(2 ml)再共沸2次。將殘渣溶解於Ν,Ν-二 曱基曱醯胺(1 ml)中,添加吡啶·三氧化硫(150 mg),於氮 氣環境下、42°C下攪拌3小時。 於4°C下加入水(1 ml)後,添加飽和乙酸鈉乙醇溶液(30 ml)使之沈殿,使用旋渦混合器(Vortex mixer)加以攪拌 後,進行冷卻離心分離(4°C,3000 rpm ’ 15分鐘),收集沈 澱物。除去上清液,於殘渣中加入水(1 ml)而將其溶解, 146140.doc -47- 201032814 添加飽和乙酸鈉乙醇溶液(20 ml)使之沈澱,使用旋渦混合 器加以攪拌後’進行冷卻離心分離(4°C,3000 rpm,15分 鐘),收集沈澱物。再次除去上清液,於殘渣中加入水(1 ml)而將其溶解,添加飽和乙酸鈉乙醇溶液(20 ml)使之沈 澱,使用旋渦混合器加以攪拌後,進行冷卻離心分離 (4°C,3000 rpm,15分鐘),收集沈澱物。除去上清液,將 殘渣溶解於水(2 ml)中後,減壓濃縮。 將殘渣溶解於水(2 ml)中,用圓盤過濾器(日本Pall公司 製造,0.45 μιη)進行過濾。使用AKTA System(GE Healthcare Bio-Science股份有限公司製造)進行凝膠過濾層 析(G-10,16 mmx600 mm,水)而脫鹽,冷凍乾燥目標組 分’獲得化合物1。(24 mg,白色粉末) [M+2Na]2+ : 994.75 W-NMR :圖譜示於圖53。 實施例2 除了將原料變更為製造例2中所獲得之化合物(47 mg)以 外’以與實施例1相同之方式獲得化合物2。(76 mg,白色 粉末) W-NMR :圖譜示於圖54。 實施例3 除了將原料變更為製造例3中所獲得之化合物(51 mg)以 外,以與實施例1相同之方式獲得化合物3。(1〇8 mg,白 色粉末) [M+3Na]3+ : 1210.10 -48· 146140.doc 201032814 W-NMR:圖譜示於圖55。 實施例4 除了將原料變更為製造例4中所合成之化合物(48叫)以 夕卜’以與實施例1相同之方式獲得化合物4。(92 mg,白色 粉末) [M+3Na]3+ : 1479.73 W-NMR :圖譜示於圖56。 實施例5 β 除了將原料變更為製造例5中所獲得之化合物(6〇 mg)以 外,以與實施例1相同之方式獲得化合物5e(112 mg,白 色粉末) [M+4Na]4+ : 1317.74 iH-NMR :圖譜示於圖57。 實施例6 除了將原料變更為製造例6中所獲得之化合物(2〇 以 φ 外,以與實施例1相同之方式獲得化合物6。(22 mg,白色 粉末) iH-NMR :圖譜示於圖58。 • 實施例7 • 將製造例7中所獲得之化合物(10 mg)溶解於N,N_二甲基 甲醯胺(1 ml)中,添加吡啶·三氧化硫(15〇 mg),於氮氣環 境下、42°C下攪拌3小時。 於4 C下加入水(1 ml)後,添加飽和乙酸鈉乙醇溶液(25 ml)使之沈激’使用旋渦混合器加以攪拌後,進行冷卻離 146140.doc -49- 201032814 心分離(4°C,3 000 rpm,15分鐘),收集沈澱物。除去上清 液,於殘潰中加入水(1 ml)將其溶解,添加飽和乙酸鈉乙 醇溶液(20 ml)使之沈澱,使用旋渦混合器加以攪拌後,進 行冷卻離心分離(4°C,3 000 rpm,15分鐘),收集沈澱物。 再次除去上清液,於殘渣中加入水(1 ml)而將其溶解,添 加飽和乙酸鈉乙醇溶液(20 ml)使之沈澱,使用旋渦混合器 加以攪拌後,進行冷卻離心分離(4°C,3000 rpm,15分 鐘),收集沈澱物。除去上清液,將殘渣溶解於水(2 ml)中 後,減壓濃縮。 將殘渣溶解於水(2 ml)中,用圓盤過濾器(日本Pall公司 製造,0·45 μιη)進行過滤。使用AKTA System(GE Healthcare Bio-Science股份有限公司製造)進行凝膠過渡層 析(G-10,16 mmX600 mm,水)而脫鹽,冷;東乾燥目標組 分,獲得化合物7。(16 mg,白色粉末) W-NMR :圖譜示於圖59。 實施例8 除了將原料變更為製造例8中所獲得之化合物(20 mg)以 外,以與實施例7相同之方式獲得化合物8。(33 mg,白色 粉末) W-NMR :圖譜示於圖60。 實施例9 除了將原料變更為製造例9中所獲得之化合物(39 mg)以 外,以與實施例1相同之方式獲得化合物9。(90 mg,白色 粉末) 146140.doc -50· 201032814 [M+5Na]5+ : 1707.07 W-NMR :圖譜示於圖61。 實施例10 除了將原料變更為製造例1〇中所獲得之化合物(24㈣ ^卜’以與實關i相同之方式獲得化合物心(48呵, 白色粉末) [M+3Na]3+ : 1493.42 1h_NMR :圖譜示於圖62。 實施例11 除了將原料變更為製造例U中所獲得之化合物(i7 mg) 以外,以與實施例1相同之方式獲得化合物n。(34 mg, 白色粉末) [M+3Na]3+ : 1505.11 W-NMR :圖譜示於圖63。 實施例12 • 除了將原料變更為製造例12中所獲得之化合物(1〇 mg) 以外’以與實施例i相同之方式獲得化合物12。(1〇 , 白色粉末) • 實施例13 ' 除了將原料變更為製造例13中所獲得之化合物(1 〇 mg) 以外,以與實施例丨相同之方式獲得化合物13。(21 mg, 白色粉末) 將化合物1〜13之結構揭示於下述表8。 [表8] 146140.doc 51 201032814
Na〇3SO NaQ3SO
NaOaSOHzC, NaOaSO O 化合物編號 η R- 化合物編號 η R, 1 1 OSOsNa 10 4 H严Na 2 2 0S03Na 3 3 OSOaNa kJ 4 4 0S03Na 11 4 SO3H 5 5 〇S〇3Na 6 6 0S03Na 7 7 0S03Na 12 11-15 0S03Na 8 8 〇S〇3Na 13 16-2 2 〇S03Na 9 9 〇SQ3Na 實施例14 將製造例14中所獲得之化合物(18 mg)溶解於N,N-二甲 基甲醯胺(2 ml)中,添加吡啶·三氧化硫(300 mg),於氮氣 環境下、42°C下攪拌3小時。 於4°C下加入水(1 ml)後,添加飽和乙酸鈉乙醇溶液(25 ml)使之沈澱,使用旋渦混合器加以攪拌後,進行冷卻離 心分離(4°C,3000 rpm,15分鐘),收集沈澱物。除去上清 液,於殘渣中加入水(1 ml)將其溶解,添加飽和乙酸鈉乙 醇溶液(20 ml)使之沈澱,使用旋渦混合器加以攪拌後,進 行冷卻離心分離(4°C,3 000 rpm,15分鐘),收集沈澱物。 再次除去上清液,於殘渣中加入水(1 ml)而將其溶解,添 加飽和乙酸納乙醇溶液(25 ml)使之沈澱,使用旋渦混合器 加以攪拌後,進行冷卻離心分離(4°C,3000 rpm,1 5分 146140.doc -52- 201032814 鐘),收集沈澱物。除去上清液,將殘渣溶解於水(2 ml)中 後,用圓盤過濾器(日本Pall公司製造,0.45 μηι)進行過 濾、。使用 AKTA System(GE Healthcare Bio-Science股份有 限公司製造)進行凝膠過濾層析(G-10,16 mmx600 mm, 水)而脫鹽,冷凍乾燥目標組分,獲得化合物14。(30 mg,白色粉末) [M+2Na]2+ : 791.30 H-NMR :圖譜不於圖64。
實施例15 除了將原料變更為製造例15中所獲得之化合物(34 mg) 以外’以與實施例14相同之方式獲得化合物15。(72 mg, 白色粉末) [M+3Na]3+ : 804.83 W-NMR :圖譜示於圖65。 實施例16 除了將原料變更為製造例16中所獲得之化合物(8 mg)以 外’以與實施例14相同之方式獲得化合物16。(u mg,白 色粉末) [M+3Na]3+ : 1074.42 iH-NMR :圖譜示於圖66。 實施例17 除了將原料變更為製造例17中所獲得之化合物(8 mg)以 外,以與實施例14相同之方式獲得化合物17。(14 mg,白 色粉末) 146140.doc -53· 201032814 [M+3Na]3+ : 1344.06 W-NMR :圖譜示於圖67。 實施例18 除了將原料變更為製造例18中所獲得之化合物(16 mg) 以外,以與實施例I4相同之方式獲得化合物18。(23 mg, 白色粉末) [M+4Na]4+ : 1217.00 W-NMR :圖譜示於圖68。 實施例19 除了將原料變更為製造例19中所獲得之化合物(11 mg) 以外,以與實施例14相同之方式獲得化合物19。(9 , 白色粉末) W-NMR :圖譜示於圖69。 實施例20 除了將原料變更為製造例20中所獲得之化合物(5 mg)以 外,以與實施例14相同之方式獲得化合物2〇。(8 mg,白 色粉末) iH-NMR :圖譜示於圖70。 實施例2 1 除了將原料變更為製造例21中所獲得之化合物(8 mg)以 外’以與實施例14相同之方式獲得化合物21 e (u mg,白 色粉末) W-NMR :圖譜示於圖71。 實施例22 146140.doc -54- 201032814 除了將原料變更為製造例22中所獲得之化合物(13 mg) 以外,以與實施例14相同之方式獲得化合物22。(14 mg, 白色粉末) iH-NMR :圖譜示於圖72。 將化合物14〜22之結構揭示於下述表9。 [表9]
化合物编號 η 化合物編號 η 化合物編號 η 14 0 17 3 2 0 6 15 1 18 4 2 1 7 16 2 19 5 2 2 8 實施例23 除了將原料變更為製造例23中所獲得之化合物(8 mg)以 外,以與實施例14相同之方式獲得化合物23。(14 mg,白 色粉末) [M+2Na]2+ : 793.81 W-NMR :圖譜示於圖73。 實施例24 除了將原料變更為製造例24中所獲得之化合物(4 mg)以 外,以與實施例14相同之方式獲得化合物24。(7 mg,白 色粉末) [M+2H]2+ : 1176.25 iH-NMR :圖譜示於圖74。 146140.doc -55- 201032814 實施例25 除了將原料變更為製造例25中所獲得之化合物(8 mg)以 外,以與實施例14相同之方式獲得化合物25。(11 mg,白 色粉末) [M+3Na]3+ : 1076.10 W-NMR :圖譜示於圖75。 實施例26 除了將原料變更為製造例26中所獲得之化合物(15 mg) 以外,以與實施例14相同之方式獲得化合物26。(26 mg, 白色粉末) [M+3Na]3+ : 1345.72 iH-NMR :圖譜示於圖76。 實施例27 除了將原料變更為製造例27中所獲得之化合物(7 mg)以 外,以與實施例14相同之方式獲得化合物27。(1 i mg,白 色粉末) [M+4Na]4+ : 1616.67 W-NMR :圖譜示於圖77。 實施例28 除了將原料變更為製造例28中所獲得之化合物(5 mg)以 外’以與實施例14相同之方式獲得化合物28。(7 mg,白 色粉末) W-NMR :圖譜示於圖78。 將化合物23〜28之結構揭示於下述表1〇。 146140.doc -56 - 201032814 [表 10]
化合物編號 η 化合物編號 η 化合物編號 η 2 3 0 2 5 2 2 7 4 2 4 1 2 6 3 2 8 8 實施例29 除了將原料變更為製造例29中所獲得之化合物(9 mg)以 φ 外,以與實施例14相同之方式獲得化合物29。(16 mg,白 色粉末) [M+2H]2+ : 972.77 iH-NMR :圖譜示於圖79。 實施例3 0 除了將原料變更為製造例30中所獲得之化合物(7 mg)以 外,以與實施例14相同之方式獲得化合物30。(8 mg,白 色粉末) 籲 [M+2H]2+ : 1377.20 iH-NMR :圖譜示於圖80。 實施例3 1 除了將原料變更為製造例3 1中所獲得之化合物(1 5 mg) ' 以外,以與實施例14相同之方式獲得化合物3 1。(2 1 mg, 白色粉末) [M+3Na]3+ : 1210.07 ]H-NMR :圖譜示於圖81。 146140.doc -57- 201032814 實施例32 除了將原料變更為製造例32中所獲得之化合物(8 mg)以 外,以與實施例14相同之方式獲得化合物32。(9 mg,白 色粉末) [M+3H]3+ : 1458.34 1H-NMR :圖譜示於圖82。 實施例33 除了將原料變更為製造例33中所獲得之化合物(5 mg)以 外,以與實施例14相同之方式獲得化合物33。(7 mg,白 色粉末) iH-NMR :圖譜示於圖83。 將化合物29〜33之結構揭示於下述表11。 [表 11]
實施例34 將製造例36中所合成之化合物(7 mg)溶解於Ν,Ν-二曱基 曱醯胺(0.7 ml)中,添加三乙胺·三氧化硫(75 mg)、三氟甲 磺酸(12 μΐ),於氮氣環境下、0°C下攪拌48小時。 於〇°C下加入水(1 ml)後,添加飽和乙酸鈉乙醇溶液(25 ml)使之沈澱,使用旋渦混合器加以攪拌後,進行冷卻離 146140.doc -58- 201032814 心分離(4°C,3000 rpm,15分鐘),收集沈澱物。除去上清 液,於殘潰中加入水(1 ml)而將其溶解,添加飽和乙酸鈉 乙醇溶液(25 ml)使之沈澱,使用旋渦混合器加以攪拌後, 進行冷卻離心分離(4°C,3000 rpm,15分鐘),收集沈澱 物。再次除去上清液,於殘潰中加入水(1 ml)而將其溶 解,添加飽和乙酸鈉乙醇溶液(25 ml)使之沈澱,使用旋渦 混合器加以攪拌後,進行冷卻離心分離(4°C,3000 rpm, 1 5分鐘),收集沈澱物。除去上清液,將殘渣溶解於水(2 ml)中後,用圓盤過濾器(日本Pall公司製造,0.45 μπι)進行 過滤。使用 AKTA System(GE Healthcare Bio-Science股份 有限公司製造)進行凝膠過濾層析(G-10,16 mmx600 mm,水)而脫鹽,冷束乾燥目標組分,獲得化合物34。(9 mg,白色粉末) iH-NMR :圖譜示於圖84。 實施例35 除了將原料變更為製造例37中所獲得之化合物(10 mg) 以外,以與實施例34相同之方式獲得化合物35。(14 mg, 白色粉末) W-NMR :圖譜示於圖85。 實施例36 除了將原料變更為製造例38中所獲得之化合物(10 mg) 以外,以與實施例34相同之方式獲得化合物36。( 1 5 mg, 白色粉末) iH-NMR :圖譜示於圖86。 146140.doc -59· 201032814 將化合物34〜3 6之結構揭示於下述表12。 [表 12]
NaO 化合物编號 η 化合物編號 η 化合物编號 η 3 4 3 3 5 4 3 6 5 實施例37 除了將原料變更為製造例41中所獲得之化合物(9 mg)以 外,以與實施例34相同之方式獲得化合物37。(11 mg,白 色粉末) iH-NMR :圖譜示於圖87。 實施例38 除了將原料變更為製造例44中所獲得之化合物(12 mg) 以外,以與實施例34相同之方式獲得化合物38。(20 mg, 黃色粉末) W-NMR :圖譜示於圖88。 將化合物37〜38之結構揭示於下述表13。 [表 13]
化合物編號 η 3 7 1 3 8 4 實施例39 146140.doc •60- 201032814 除了將原料變更為製造例45中所獲得之化合物(8 mg)以 外,以與實施例U相同之方式獲得化合物%。(12 mg,白 色粉末) W-NMR :圖譜示於圖89。 實施例40 除了將原料變更為製造例46中所獲得之化合物(1〇 mg) 以外,以與實施例I4相同之方式獲得化合物4〇。〇6 mg, 白色粉末) iH-NMR :圖譜示於圖90。 實施例41 除了將原料變更為製造例47中所獲得之化合物(8 mg)以 外’以與實施例14相同之方式獲得化合物41。(14 mg,白 色粉末) W-NMR :圖譜示於圖91。 實施例42 φ 除了將原料變更為製造例48中所獲得之化合物(7 mg)以 外,以與實施例14相同之方式獲得化合物42。(12 mg,白 色粉末) . W-NMR :圖譜示於圖92。 . 實施例43 除了將原料變更為製造例49中所獲得之化合物(4 mg)以 外,以與實施例14相同之方式獲得化合物43。(9 mg,白 色粉末) W-NMR :圖譜示於圖93。 146140.doc -61 · 201032814 實施例44 除了將原料變更為製造例50中所獲得之化合物(10 mg) 以外,以與實施例14相同之方式獲得化合物44。(24 mg, 白色粉末) W-NMR :圖譜示於圖94。 實施例45 除了將原料變更為製造例51中所獲得之化合物(1() mg) 以外,以與實施例14相同之方式獲得化合物45。(2i mg, 白色粉末) W-NMR :圖譜示於圖95。 實施例46 除了將原料變更為製造例52中所獲得之化合物(12 mg) 以外,以與實施例I4相同之方式獲得化合物46 ^ (15 mg, 白色粉末) W-NMR :圖譜示於圖96。 實施例47 除了將原料變更為製造例53中所獲得之化合物(5 mg)以 外,以與實施例14相同之方式獲得化合物47。(9 mg,白 色粉末) W-NMR :圖譜示於圖97。 實施例48 除了將原料變更為製造例54中所獲得之化合物(5 mg)以 外,以與實施例14相同之方式獲得化合物48。(9 mg,白 色粉末) 146I40,doc -62- 201032814 h-NMR :圖譜示於圖98。 將化合物39〜48之結構揭示於下述表14。 [表 14]
化合物編號 η R| 化合物編號 η R' 3 9 1 44 1 X) H 〇 4 0 1 、[/^〇2H H 4 5 4 H 4 1 1 co3h 4 6 4 0 H 4 2 1 a ^N^ScQzH 47 4 0 4 3 1 4 8 4 x° \ν^^Ο〇2Η H 參考例1〜7 依據文獻 Glycobiology,vol. 11,No· 1,ρρ· 57-64, 2001 中 記載之方法,製造表15所示之本發明之化合物(已知化合 物)。 參考例1 以購買獲得之玻尿酸鈉(資生堂製造,BIO Sodium Hyaluronate HA9)與依據文獻 Glycobiology,vol· 12, No. 7, 146140.doc -63- 201032814 pp_ 421-426,2002從來自牛精巢之玻尿酸酶(calbi〇chem& 司製造,Hyaluronidase B0vine τ 100KU)中分離出之玻尿 酸寡糖4-mer(20 mg)為原料,根據上述文獻Glyc〇bi〇1〇gy, vol 11,No_ 1’ pp. 57-64, 2001 獲得化合物 49。(21 mg,白 色粉末) 參考例2 除了將原料變更為玻尿酸募糖1 〇-mer(43 mg)以外,以與 參考例1相同之方式獲得化合物50。(86 mg,白色粉末) 參考例3 除了將原料變更為玻尿酸募糖16-mer(75 mg)以外,以與 參考例1相同之方式獲得化合物5 1。(80 mg,白色粉末) 參考例4 除了將原料變更為玻尿酸寡糖20-mer(23 mg)以外,以與 參考例1相同之方式獲得化合物52。(42 mg,白色粉末) 參考例5 除了將原料變更為玻展酸募糖2 2-mer( 17 mg)以外,以與 參考例1相同之方式獲得化合物53。(25 mg,白色粉末) 參考例6 除了將原料變更為玻尿酸募糖24〜32-mer(20 mg)以外, 以與參考例1相同之方式獲得化合物54。(18 mg,白色粉 末) 參考例7 除了將原料變更為玻尿酸寡糖34〜46-mer(24 mg)以外, 以與參考例1相同之方式獲得化合物5 5。(39 mg,白色粉 146140.doc -64- 201032814 末) 將化合物49〜55之結構揭示於下述表1 5。 [表 15]
化合物编號 η 化合物編號 η 4 9 1 5 3 10 5 0 4 5 4 11-15 5 1 7 5 5 16-2 2 5 2 9 試驗例1 :抗過敏作用,豚鼠過敏性鼻炎模型(鼻塞模型) 實驗係使用Hartley系豚鼠(雄鼠,首次致敏時為6〜7週 齡)。 將購得之動物預備飼養7日以上,以進行檢疫及馴化後 用於實驗。 作為首次致敏,以每隻動物1 ml之量,將1 ml中含有卵 白蛋白(OVA) 1 mg及氫氧化銘凝膠(Alum) 10 mg之生理鹽水 溶液投予至動物之背部皮下。藉由如下方式,於首次致敏 1週後進行1次,或於1週後及2週後進行2次下述局部致 敏,即,使用微量吸管,以每次20 μΐ之量將10 mg/ml之 OVA生理鹽水溶液投予至動物兩側之鼻腔内。 分群係以致敏結束日之體重以及自致敏開始日起至致敏 結束曰為止之體重變化作為指標,利用二維分層隨機抽樣 146140.doc •65- 201032814 法而進行。 最終致敏1週後,以每次10 μΐ之量將20 mg/ml之OVA生 理鹽水溶液投予至兩側之鼻腔内,誘發抗原抗體反應。對 照(Control)群(未誘發群)係以同樣方式投予生理鹽水。 於誘發後30分鐘之前,將被實驗物質以每次10 μΐ之量投 予至兩側之鼻腔内。被實驗物質係溶解於生理鹽水中製成 500 pg/ml之濃度之溶液而用於投予。對照群(未誘發群)及 生理鹽水(Saline)群(溶劑對照群)係以同樣方式投予生理鹽 水。再者,作為對照藥品(化合物〇),係使用「Flunase」 (GlaxoSmithKline股份有限公司製造)。 於誘發當曰之誘發前、誘發10分鐘後、2小時、3小時、 4小時、5小時、6小時及7小時後測定鼻腔阻力。於各測定 時間進行1次測定,各次分別測定1 〇〇次呼吸之鼻腔阻力 (nasal airway resistance,nRaw),將其平均值作為各測定 時間之nRaw,計算出nRaw之增加率作為鼻腔阻力之指 標。 鼻腔阻力(nRaw)之增加率(%)係以下式而求出。 [數1] 各測定時間之nRaw之增加率(%) =(Rx-R〇) X 1 〇 〇 R〇 R〇 :誘發前之nRaw
Rx :各測定時間(X小時後)之nRaw 根據誘發10分鐘後之nRaw之增加率(立即型鼻腔阻力)以 及誘發後3〜7小時之nRaw之增加率之曲線下面積(AUC3-7 hr, 146140.doc •66- 201032814 遲發型鼻腔阻力)來進行評價。 [數2] ah/-' _ (I31U +2xl4hr +2xl5hr +2xl6hr +I7hr) /VUL3_7hr — - ' I3-7 hr :誘發後3-7小時之nRaw之增力口率 . 結果示於圖99及圖100。 由圖99及圖100可知,本發明之化合物顯示出立即型立 即型過敏反應抑制效果,並且顯示出遲發型過敏反應抑制 ❹ 效果。 試驗例 2 : PCA(Passive Cutaneous Anaphylaxis :被動皮 膚過敏反應)抑制效果 實驗係使用Hartley系豚鼠(雄鼠,5週齡以上)。 將使豚鼠對OVA免疫而獲得之抗OVA血清,利用生理鹽 水稀釋至500倍(A液)。 將下述表16中所示之被實驗物質用生理鹽水稀釋為200 pg/ml(B 液)。 W 分別將等量之B液與稀釋至250倍之豚鼠抗OVA血清混 合,使最終濃度達到被實驗物質為100 gg/ml、抗OVA血清 為500倍(C液)。 進行醚麻醉後,以每一點100 μΐ向背部剪毛後之豚鼠的 背部皮内注射生理鹽水、Α液或C液。 約3小時後,以0.8〜1 ml/隻向靜脈内投予含有0.2〜0.4% 之OVA的0.5%伊凡氏藍(Evans blue)生理鹽水溶液。 於30分鐘内放血剝皮,藉由圖像處理定量各點之色素 146140.doc -67- 201032814 量。於圖像處理中,係檢查將僅投予抗OVA血清之點之色 素量設為100%時,由被實驗物質所引起之抑制度。結果 示於表16。(N=3或6) [表 16] 被實驗物質 PCA反應抑制 被實驗物質 PCA反應抑制 僅抗OVA血清 X 化合物13 ◎ 化合物3 〇 化合物50 ◎ 化合物4 ◎ 化合物51 ◎ 化合物5 〇 化合物53 ◎ 化合物7 ◎ 化合物54 ◎ 化合物12 Δ 化合物55 ◎ 於色素滲出量為80%以上之情形,視作無PCA反應抑制 者,以「X」表示,80〜60%(抑制率:20〜40%)之情形表示 為「Δ」,60~30%(抑制率:40〜70%)之情形時表示為 「〇」,未達30%之情形時表示為「©」。 由上述表16可知,本發明之化合物顯示出PCA抑制效 果。 試驗例3 :血管通透性亢進作用試驗 實驗係使用Hartley系豚鼠(雄鼠,5週齡以上)。用生理 鹽水將被實驗物質稀釋為100 pg/ml。 又,使用硫酸化玻尿酸(4糖〜約70糖之混合物,依據曰 本專利特開平11-147901號公報之實施例(製造例1)等而合 成)作為對照。 進行醚麻醉後,以每一點100 μΐ向背部剪毛後的豚鼠之 背部皮内注射生理鹽水、或被實驗物質之生理鹽水溶液。 以1 ml/隻向靜脈内投予0.5%之伊凡氏藍生理鹽水溶 146140.doc -68- 201032814 液。 於30分鐘内放血剝皮,藉由圖像處理定量各點之色素 量° 以將投予聚葡萄糖(硫酸葡聚糖10000)之點的色素量設 為100%時被實驗物質之血管通透率的形式,將結果示於 圖 101~圖 103。 由圖101〜圖103可知,本發明之化合物與公知的高分子 多硫酸化玻尿酸不同,不具有血管通透性亢進用作,不顯 示成為其自身副作用之刺激作用。 試驗例4 :長期穩定性(水溶液中) 將化合物4及化合物5 0製備成1 mg/ml之水溶液,進行 HPLC(high performance liquid chromatography,高效液相 層析法)分析。 將該等溶液於寒冷處(2〜8°C )及室溫下分別保存,經時 地進行HPLC分析直至4個月為止,研究各峰之圖案變化。 HPLC條件: 管柱:Mightysil RP-18 GP(3 μηι,4.6x50 mm)
管柱溫度:40°C 流動相A:含有2 mM之TBAP的20 mM之KH2P04/MeCN (70:30) 流動相B:含有MeCN/2 mM之TBAP的20 mM之KH2P〇4 (80:20) 濃度梯度條件:初始:A 100%、B 0% 於0分鐘~20分鐘,A 100 —95%、B 0 — 5%,線性 146140.doc -69- 201032814 流量:1 ml/min 檢測:UV(210 nm) 注入量:約5 μβ/5 μΐ (ΤΒΑΡ . tetrabutylammonium phosphate ^ . p Pllate,四丁基磷酸銨) 結果示於下述表17。 [表 17] 保存條件及保存時€ 試驗開始 寒冷處,4個月 與試驗開始時相比無變化
-:未實施試驗 * :於室溫下保存7日時,與試驗開始時鉦變 於室溫τ保存ίο日時變剩顯不穩;^,因此於此時結束試驗。 __化合物4_ 可見1個主峰及1個肩峰,其 等之面積比約為5:1 ----化合物50____ 了見主要之3個嶂,第2個峰與 之面積比約為1:4。、 第2個峰與第3個峰之面積比約 為1:卜 身2個峰與第3個峰之面積比^ 為3:2 由上述表17可知,化合物5〇即便於寒冷處保存時,亦可 見所見之3個主峰中第2個峰經時增加及第3個峰經時減 少’於水溶液中不穩定,相對於此,化合物4即便於室溫 下保存時’在4個月期間峰圖案亦未見變化,於水溶液中 較為穩定。 通式(IA)之Y為(d)或(e)之化合物群以及通式(IB)之化合 物群在低分子量多硫酸化玻尿酸衍生物中而言,亦作為水 溶液中之穩定性較高之化合物而特別有用。 [產業上之可利用性] 本發明之低分子量多硫酸化玻尿酸衍生物或其藥學上容 許之鹽的如管通透性亢進作用較小因此可用作炎症性副 146140.doc •70- 201032814 作用較少、安全性優異的過敏性疾病之預防及/或治療 劑。 【圖式簡單說明】 圖1係製造例1中所獲得之化合物之h-NMR圖譜。 圖2係製造例2中所獲得之化合物之W-NMR圖譜。 圖3係製造例3中所獲得之化合物之W-NMR圖譜。 圖4係製造例4中所獲得之化合物之^-NMR圖譜。 圖5係製造例5中所獲得之化合物之W-NMR圖譜。 圖6係製造例6中所獲得之化合物之b-NMR圖譜。 圖7係製造例7中所獲得之化合物之b-NMR圖譜。 圖8係製造例8中所獲得之化合物之W-NMR圖譜。 圖9係製造例9中所獲得之化合物之W-NMR圖譜。 圖10係製造例10中所獲得之化合物之W-NMR圖譜。 圖11係製造例11中所獲得之化合物之^-NMR圖譜。 圖12係製造例14中所獲得之化合物之W-NMR圖譜。 圖13係製造例15中所獲得之化合物之^-NMR圖譜。 圖14係製造例16中所獲得之化合物之^-NMR圖譜。 圖15係製造例17中所獲得之化合物之W-NMR圖譜。 圖16係製造例18中所獲得之化合物之h-NMR圖譜。 圖17係製造例19中所獲得之化合物之W-NMR圖譜。 圖1 8係製造例20中所獲得之化合物之^-NMR圖譜。 圖19係製造例21中所獲得之化合物之^-NMR圖譜。 圖20係製造例22中所獲得之化合物之^-NMR圖譜。 圖21係製造例23中所獲得之化合物之^-NMR圖譜。 146140.doc -71 · 201032814 圖22係製造例24中所獲得之化合物之^-NMR圖譜。 圖23係製造例25中所獲得之化合物之^-NMR圖譜。 圖24係製造例26中所獲得之化合物之^-NMR圖譜。 圖25係製造例27中所獲得之化合物之^-NMR圖譜。 圖26係製造例28中所獲得之化合物之^-NMR圖譜。 圖27係製造例29中所獲得之化合物之iH-NMR圖譜。 圖28係製造例30中所獲得之化合物之^-NMR圖譜。 圖29係製造例3 1中所獲得之化合物之^-NMR圖譜。 圖30係製造例32中所獲得之化合物之^-NMR圖譜。 圖3 1係製造例33中所獲得之化合物之W-NMR圖譜。 圖32係製造例34.中所獲得之化合物之^-NMR圖譜。 圖33係製造例35中所獲得之化合物之^-NMR圖譜。 圖34係製造例36中所獲得之化合物之^-NMR圖譜。 圖35係製造例37中所獲得之化合物之W-NMR圖譜。 圖36係製造例38中所獲得之化合物之W-NMR圖譜。 圖37係製造例39中所獲得之化合物之^-NMR圖譜。 圖38係製造例40中所獲得之化合物之W-NMR圖譜。 圖39係製造例41中所獲得之化合物之^-NMR圖譜。 圖40係製造例42中所獲得之化合物之^-NMR圖譜。 圖41係製造例43中所獲得之化合物之^-NMR圖譜。 圖42係製造例44中所獲得之化合物之iH-NMR圖譜。 圖43係製造例45中所獲得之化合物之^-NMR圖譜。 圖44係製造例46中所獲得之化合物之W-NMR圖譜。 圖45係製造例47中所獲得之化合物之W-NMR圖譜。 146140.doc •72· 201032814 圖46係製造例48中所獲得之化合物之^-NMR圖譜。 圖47係製造例49中所獲得之化合物之^-NMR圖譜。 圖48係製造例50中所獲得之化合物之W-NMR圖譜。 圖49係製造例5 1中所獲得之化合物之W-NMR圖譜。 圖50係製造例52中所獲得之化合物之W-NMR圖譜。 圖51係製造例53中所獲得之化合物之iH-NMR圖譜。 圖52係製造例54中所獲得之化合物之^-NMR圖譜。 圖53係化合物1之1H-NMR圖譜。 圖54係化合物2之1H-NMR圖譜。 圖55係化合物3之1H-NMR圖譜。 圖56係化合物4之1H-NMR圖譜。 圖57係化合物5之1H-NMR圖譜。 圖58係化合物6之1H-NMR圖譜。 圖59係化合物7之1H-NMR圖譜。 圖60係化合物8之1H-NMR圖譜。 圖61係化合物9之1H-NMR圖譜。 圖62係化合物10之1H-NMR圖譜。 圖63係化合物11之1H-NMR圖譜。 圖64係化合物14之1H-NMR圖譜。 圖65係化合物15之1H-NMR圖譜。 圖66係化合物16之1H-NMR圖譜。 圖67係化合物17之1H-NMR圖譜。 圖68係化合物18之1H-NMR圖譜。 圖69係化合物19之1H-NMR圖譜。 146140.doc •73- 201032814 圖70係化合物20之1H-NMR圖譜。 圖71係化合物21之1H-NMR圖譜。 圖72係化合物22之1H-NMR圖譜。 圖73係化合物23之1H-NMR圖譜。 圖74係化合物24之1H-NMR圖譜。 圖75係化合物25之1H-NMR圖譜。 圖76係化合物26之1H-NMR圖譜。 圖77係化合物27之1H-NMR圖譜。 圖78係化合物28之1H-NMR圖譜。 圖79係化合物29之1H-NMR圖譜。 圖80係化合物30之1H-NMR圖譜。 圖81係化合物31之1H-NMR圖譜。 圖82係化合物32之1H-NMR圖譜。 圖83係化合物33之1H-NMR圖譜。 圖84係化合物34之1H-NMR圖譜。 圖85係化合物35之1H-NMR圖譜。 圖86係化合物36之1H-NMR圖譜。 圖87係化合物37之1H-NMR圖譜。 圖88係化合物38之1H-NMR圖譜。 圖89係化合物39之1H-NMR圖譜。 圖90係化合物40之1H-NMR圖譜。 圖91係化合物41之1H-NMR圖譜。 圖92係化合物42之1H-NMR圖譜、 圖93係化合物43之1H-NMR圖譜。 146140.doc • 74· 201032814 圖94係化合物44之1H-NMR圖譜。 圖95係化合物45之1H-NMR圖譜。 圖96係化合物46之1H-NMR圖譜。 圖97係化合物47之1H-NMR圖譜。 圖98係化合物48之1H-NMR圖譜。 圖99係表示立即型立即型過敏反應抑制效果之圖。 : p<0.01,## : p<0.01,卞:ρ<0·05,* : ρ<0·05,** : Ρ<0.01 , Ν=8 ,平均值+/_標準差。 ❿ 圖100係表示遲發型過敏反應抑制效果之圖。### : ρ<0.01,## : ρ<0.01,卞:p<0.05,* : ρ<0.05,** : Ρ<0·01,Ν=8,平均值+/-標準差。 圖101係表示血管通透性亢進用作之圖。dex :投予聚葡 萄糖之點,Control :投予硫酸化玻尿酸之點。 圖102係表示血管通透性亢進用作之圖。dex :投予聚葡 萄糖之點,Control :投予硫酸化玻尿酸之點。 φ 圖103係表示血管通透性亢進用作之圖。dex :投予聚葡 萄糖之點,Control :投予硫酸化玻尿酸之點。 146140.doc 75-
Claims (1)
- 201032814 七、申請專利範圍: 1. 一種過敏性疾病之預防及/或治療劑,該過敏性疾 病係選自花粉症、過敏性鼻炎、過敏性結膜炎、異位性 皮膚炎以及哮喘者,且該預防及/或治療劑係以下述通式 (IA)或下述通式(IB)所表示之低分子量多硫酸化玻尿酸 衍生物或其藥學上容許之鹽作為有效成分: [化1][化2]Y表示下式(c)、(d)或(e): [化3]146140.doc 201032814(e) R分別獨立表示氫原子或S03H基(其中,S03H基佔R總數 之 80 〜100%),R1 表示-OH、-0S03H或-NZJd此處, z2獨立表示氫原子、-so3h、可經取代之低級烷基、可 經取代之芳基、可經取代之芳烷基或可經取代之雜芳 基,或者以-ΝΖΘ2整體表示胺基酸殘基或肽殘基),*表 示與氧原子之鍵結部位]; [化4][式中,η表示0~15之數,W表示下式(f)或(g): [化5]之 80~100%),R1 表示-OH、-0S03H 或-NZiZzC 此處,2!及 Z2獨立表示氫原子、-S03H、可經取代之低級烷基、可 經取代之芳基、可經取代之芳烷基或可經取代之雜芳 基,或者以-ΝΖΘ2整體表示胺基酸殘基或肽殘基]。 -2- 146140.doc 201032814 青长項1之預防及/或治療劑,其中於通式(ΙΑ)中,Y為 式⑷或(e)。 月求項2之預防及/或治療劑,其中X為式(a)。 請求項3之預防及/或治療劑’其中η為3、4或5。 5·如請求項3之預防及/或治療劑,其中η為4或5。 叫求項1之預防及/或治療劑,其中低分子量多硫酸化 玻尿酸衍生物為通式(ΙΒ)» 浚叫求項6之預防及/或治療劑,其中η為3、4或5❶ °青求項6之預防及/或治療劑,其中η為4或5。 9.種如睛求項1至8中任一項之低分子量多硫酸化玻尿酸 何生物或其藥學上容許之鹽之用途,其係用於製造選自 鞑粕症、過敏性鼻炎、過敏性結膜炎、異位性皮膚炎以 及哮喘中之過敏性疾病之預防及/或治療劑者。 1〇_ 一種低分子量多硫酸化玻尿酸衍生物或其藥學上容許之 鹽,其係下述通式(1八,)或下述通式(ΙΒ)所表示者: [化6][式中,η表示0〜15之數,X表示下式(a)或(b): [化7] 146140.doc 201032814Υ|表示下式(d)或(e): [化8]R分別獨立表示氫原子或S03H基(其中,S03H基佔R總數 之 80-100%),R1 表示-OH、-0S03H或-NZAC此處,乙!及 z2獨立表示氫原子、-S03H、可經取代之低級烷基、可 經取代之芳基、可經取代之芳烷基或可經取代之雜芳 基,或者以-ΝΖΘ2整體表示胺基酸殘基或肽殘基),*表 示與氧原子之鍵結部位]; [化9][式中,η表示0〜15之數,W表示下式(f)或(g): [化 10]146140.doc - 4 - 201032814 R分別獨立表示氫原子或s〇3h基(其中,S03H基佔R總數 之 80〜100%),Rl 表示-OH、-0S03H 或-NZiZJ 此處,ZA Z2獨立表示氫原子、_s〇3H、可經取代之低級烧基、可 經取代之芳基、可經取代之芳烷基或可經取代之雜芳 基’或者以-NZiZ2整體表示胺基酸殘基或肽殘基]。 11. 如請求項10之低分子量多硫酸化玻尿酸衍生物或其藥學 上容許之鹽’其中於通式(IA·)中,X為式(a)。 12. 如請求項1〇之低分子量多硫酸化玻尿酸衍生物或其藥學 上容許之鹽,其為通式(IB)。 13. 如請求項1丨或12之低分子量多硫酸化玻尿酸衍生物或其 藥學上容許之鹽,其中η為3、4或5。 14. 一種醫藥組合物,其含有如請求項1〇、12或13之低 分子量多硫酸化玻尿酸衍生物或其藥學上容許之鹽、以 及藥學上容許之賦形劑。 146140.doc
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