JP6253591B2 - 抗がん剤、及び併用抗がん剤 - Google Patents

Description

本発明は、抗がん剤、及び併用抗がん剤に関する。

がん患者に対する治療としては、様々な治療が行われているが、中でも化学療法剤による治療が広く行われている。がん細胞は、正常細胞と比べて細胞増殖が頻繁に行われていることから、従来から、抗がん剤として細胞の増殖を抑制し停止させる薬剤が臨床で多く用いられてきた。しかしながら、十分な抗腫瘍作用とはいえなかったり、副作用が生じる場合があったりするなどの問題がある。
このような状況下、より有用な新たな抗がん剤の探索が行われており、その速やかな提供が強く求められている。

エラジタンニンは、植物界に広く存在することが知られている化合物である。これまでに、前記エラジタンニンを含有する、抗Ｂ型肝炎ウイルス剤（例えば、特許文献１参照）、骨疾患の予防・治療剤（例えば、特許文献２参照）、育毛剤（例えば、特許文献３参照）が提案されている。しかしながら、前記エラジタンニンが抗腫瘍作用を有することは、知られていない。

特開平４−３６２３９号公報 特開平６−１８３９５８号公報 特開２００４−９１３９０号公報

本発明は、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、優れた抗がん作用を有する抗がん剤、及び併用抗がん剤を提供することを目的とする。

前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞ エラジタンニンを含有することを特徴とする抗がん剤である。
＜２＞ 前記＜１＞に記載の抗がん剤と、アントラサイクリン類を含有する抗がん剤とを併用することを特徴とする併用抗がん剤である。
＜３＞ がんを予防又は治療するための方法であって、個体に、前記＜１＞に記載の抗がん剤、及び前記＜２＞に記載の併用抗がん剤の少なくともいずれかを投与することを特徴とする方法である。

本発明によれば、前記目的を達成することができ、優れた抗がん作用を有する抗がん剤、及び併用抗がん剤を提供することができる。

図１は、試験例２−１のヒト骨肉腫 ＳＪＳＡ−１細胞を移植したマウスにおける腫瘍体積の変化を示すグラフである。 図２は、試験例２−１のヒト肺がん ＮＣＩ−Ｈ４６０細胞を移植したマウスにおける腫瘍体積の変化を示すグラフである。 図３は、試験例２−２のヒト骨肉腫 ＳＪＳＡ−１細胞を移植したマウスにおける腫瘍体積の変化を示すグラフである。 図４は、試験例２−３のヒト骨肉腫 ＳＪＳＡ−１細胞を移植したマウスにおける腫瘍体積の変化を示すグラフである。 図５は、試験例３のヒト骨肉腫 ＳＪＳＡ−１細胞を移植したマウスにおける腫瘍体積の変化を示す図である。

（抗がん剤）
本発明の抗がん剤（以下、「エラジタンニン含有抗がん剤」と称することがある）は、エラジタンニンを少なくとも含み、必要に応じて、更にその他の成分を含有する。

＜エラジタンニン＞
前記エラジタンニンは、植物界に広く存在し、強い抗酸化作用を有することが知られている物質である。
前記エラジタンニンとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、少なくとも分子内に１つのヘキサヒドロキシジフェノイル基（下記「式Ｉ」参照）を有することが好ましい。前記少なくとも分子内に１つのヘキサヒドロキシジフェノイル基を有するエラジタンニンは、加水分解されるとエラグ酸が生成される。

前記エラジタンニンの具体例としては、ゲラニイン（Ｇｅｒａｎｉｉｎ）、カスアリクチン（Ｃａｓｕａｒｉｃｔｉｎ）、オイゲニイン（Ｅｕｇｅｎｉｉｎ）、テリマグランジンＩ（Ｔｅｌｌｉｍａｇｒａｎｄｉｎ Ｉ）、１，３−ジ−Ｏ−ガロイル−４，６−Ｏ−ヘキサヒドロキシジフェノイルグルコース、ストリクチニン（Ｓｔｒｉｃｔｉｎｉｎ）、サングイイン（Ｓａｎｇｕｉｉｎ）Ｈ−１、サングイインＨ−４、２，３−ヘキサヒドロキシジフェノイルグルコース、ケブラグ酸（Ｃｈｅｂｕｌａｇｉｃ ａｃｉｄ）、ペデュンクラギン、イソターケビン、グラナチンＡ、グラナチンＢ、ケブリン酸、カジュアリニン、ヌファリンＣ、ヌファリンＤ、ヌファリンＦ、サングイインＨ−１１などが挙げられる。
これらの中でも、ゲラニイン、カスアリクチン、オイゲニイン、テリマグランジンＩ、１，３−ジ−Ｏ−ガロイル−４，６−Ｏ−ヘキサヒドロキシジフェノイルグルコース、ストリクチニンが好ましく、ゲラニイン、オイゲニインがより好ましい。

前記ゲラニインは、分子式はＣ_４１Ｈ_２８Ｏ_２７で表され、分子量は９５２．６４であり、構造式は以下で表される。

前記カスアリクチンは、分子式はＣ_４１Ｈ_２８Ｏ_２６で表され、分子量は９３６．６５であり、構造式は以下で表される。

前記オイゲニインは、分子式はＣ_４１Ｈ_３０Ｏ_２６で表され、分子量は９３８．６６であり、構造式は以下で表される。

前記テリマグランジンＩは、分子式はＣ_３４Ｈ_２６Ｏ_２２で表され、分子量は７８６．５６であり、構造式は以下で表される。

前記１，３−ジ−Ｏ−ガロイル−４，６−Ｏ−ヘキサヒドロキシジフェノイルグルコースは、分子式はＣ_３４Ｈ_２６Ｏ_２２で表され、分子量は７８６．５６であり、構造式は以下で表される。

前記ストリクチニンは、分子式はＣ_２７Ｈ_２２Ｏ_１８で表され、分子量は６３４．４５であり、構造式は以下で表される。

前記エラジタンニンの構造を確認する方法としては、特に制限はなく、適宜選択した各種の分析方法を用いることができ、例えば、質量分析法、紫外分光法、赤外分光法、プロトン核磁気共鳴分光法、炭素１３核磁気共鳴分光法などが挙げられる。

前記エラジタンニンは、塩であってもよい。
前記塩としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、酸付加塩、金属塩、アンモニウム塩、有機アミン付加塩、アミノ酸付加塩などが挙げられる。
前記酸付加塩の具体例としては、塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩などの無機酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、乳酸塩などの有機酸塩が挙げられる。
前記金属塩の具体例としては、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩などのアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、亜鉛塩などが挙げられる。
前記アンモニウム塩の具体例としては、アンモニウム塩、テトラメチルアンモニウム塩などが挙げられる。
前記有機アミン付加塩の具体例としては、モルホリン付加塩、ピペリジン付加塩などが挙げられる。
前記アミノ酸付加塩の具体例としては、グリシン付加塩、フェニルアラニン付加塩、アスパラギン酸付加塩、グルタミン酸付加塩、リジン付加塩などが挙げられる。

前記エラジタンニンは、１種単独で用いてもよいし、２種以上を併用してもよい。

前記エラジタンニンは、化学合成により得られたものであってもよいし、エラジタンニンを含む植物抽出物から精製したものであってもよいし、植物抽出物に含まれる態様であってもよい。

前記植物抽出物の植物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、チャ属に属する植物、キブシ属に属する植物、モクマオウ属に属する植物、フウロソウ属に属する植物、アカメガシワ属に属する植物、モモタマナ属に属する植物、ワレモコウ属に属する植物、コウホネ属に属する植物、アジサイ属に属する植物、アデク属に属する植物、コナラ属に属する植物、カエデ属に属する植物、ミズキ属に属する植物、ザクロ属に属する植物、バラ属に属する植物、キイチゴ属に属する植物、フトモモ属に属する植物などが挙げられる。
前記植物の一部は、民間薬や香辛料として利用されているので、これらから抽出することもできる。前記民間薬や香辛料として利用されている植物としては、例えば、フウロソウ属に属するゲンノショウコ、アカメガシワ属に属するアカメガシワ、フトモモ属に属するチョウジなどが挙げられる。これらの中でも、ゲンノショウコが好ましい。

前記植物抽出物の製造方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができる。
例えば、前記植物抽出物の抽出原料は、原料である植物の果実、種子、葉、茎、根、根茎などを、適当な時期に採取した後、そのまま、又は空気乾燥などの乾燥に付すことにより、調製することができる。
前記抽出原料からエラジタンニンを抽出する方法としては、例えば、前記抽出原料を粉砕若しくは細切した後、抽出溶媒を用いて抽出する方法が挙げられる。
前記抽出溶媒としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水、アルコール類、ケトン類、エステル類、酸を添加した水などが挙げられる。
前記アルコール類の具体例としては、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコールなどが挙げられる。
前記ケトン類の具体例としては、アセトン、メチルエチルケトンなどが挙げられる。
前記エステル類の具体例としては、酢酸メチル、酢酸エチルなどが挙げられる。
前記酸を添加した水の具体例としては、クエン酸水、酢酸水、酒石酸水などが挙げられる。
前記抽出溶媒は、１種単独で用いてもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記抽出の温度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、０℃〜１００℃が挙げられる。
前記抽出の時間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、１時間〜１０日間程度が挙げられる。
前記抽出溶媒の使用量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、乾燥原料あたり、１倍質量〜３０倍質量とすることが挙げられる。
前記抽出操作としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、攪拌、浸漬放置などが挙げられる。
前記抽出操作の回数は、１回であってもよいし、複数回繰り返してもよい。

前記エラジタンニンを精製する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、二相溶媒分配法、カラムクロマトグラフィー法、分取高速液体クロマトグラフィー法などが挙げられる。これらは、１種単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
前記エラジタンニンを精製する原料としては、例えば、上記抽出操作で得られた粗抽出液から不溶性残渣を濾過若しくは遠心分離により取り除いた抽出液、植物の搾汁液や樹液などが挙げられる。
前記二相溶媒分配法の具体例としては、前記エラジタンニンを精製する原料から油溶性成分や色素をクロロホルム、エチルエーテル、ｎ−ヘキサン、石油エーテル等により抽出除去する方法、前記エラジタンニンを精製する原料から酢酸エチル、ｎ−ブタノール、メチルエチルケトン等の溶媒と水との分配により、溶媒相へエラジタンニンを回収する方法などが挙げられる。
前記カラムクロマトグラフィー法の具体例としては、担体として順相系シリカゲル、逆相系シリカゲル、ダイヤイオンＨＰ−２０、セパビーズＳＰ−２０７などを用いる吸着カラムクロマトグラフィー法、担体としてセファデックスＬＨ−２０などを用いるゲル濾過法などが挙げられる。
前記分取高速液体クロマトグラフィー法の具体例としては、オクタデシルシリカなどを用いる逆相系のカラムを用いる方法、シリカゲルなどを用いる順相系のカラムを用いる方法などがあげられる。
上記精製方法により、塩類等水溶性のイオン性物質、糖類、多糖類等の非イオン性物質、油分、色素等が前記エラジタンニンを精製する原料から除去され、精製されたエラジタンニンを得ることができる。

前記エラジタンニン含有抗がん剤における前記エラジタンニンの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。前記エラジタンニン含有抗がん剤は、エラジタンニンそのものであってもよい。

＜その他の成分＞
前記エラジタンニン含有抗がん剤における前記その他の成分としては、特に制限はなく、例えば、薬理学的に許容され得る担体の中から目的に応じて適宜選択することができ、例えば、添加剤、補助剤、水などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。

前記添加剤、又は前記補助剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、殺菌剤、保存剤、粘結剤、増粘剤、固着剤、結合剤、着色剤、安定化剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、等張化剤、溶剤、酸化防止剤、紫外線防止剤、結晶析出防止剤、消泡剤、物性向上剤、防腐剤などが挙げられる。

前記殺菌剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、塩化セチルピリジニウム等のカチオン性界面活性剤などが挙げられる。

前記保存剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、クレゾールなどが挙げられる。

前記粘結剤、前記増粘剤、又は前記固着剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、デンプン、デキストリン、セルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルデンプン、プルラン、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸アンモニウム、アルギン酸プロピレングリコールエステル、グアーガム、ローカストビーンガム、アラビアゴム、キサンタンガム、ゼラチン、カゼイン、ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキサイド、ポリエチレングリコール、エチレン・プロピレンブロックポリマー、ポリアクリル酸ナトリウム、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。

前記結合剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。

前記着色剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、酸化チタン、酸化鉄などが挙げられる。

前記安定化剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、トラガント、アラビアゴム、ゼラチン、ピロ亜硫酸ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、チオグリコール酸、チオ乳酸などが挙げられる。

前記ｐＨ調整剤、又は前記緩衝剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。

前記等張化剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、塩化ナトリウム、ブドウ糖などが挙げられる。

前記エラジタンニン含有抗がん剤における前記その他の成分の含有量としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。

前記エラジタンニン含有抗がん剤は、１種単独で使用してもよいし、他の成分を有効成分とする医薬や薬剤と併せて使用してもよい。また、前記エラジタンニン含有抗がん剤は、他の成分を有効成分とする医薬や薬剤中に配合された状態で使用してもよい。

前記エラジタンニンが抗がん作用を有するか否かを調べる方法としては、特に制限はなく、公知の方法の中から目的に応じて適宜選択することができ、例えば、後述する試験例２に記載の方法などが挙げられる。

＜剤型＞
前記エラジタンニン含有抗がん剤の剤型としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、固形剤、半固形剤、液剤などが挙げられる。

−固形剤−
前記固形剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、内用剤として用いられる場合、例えば、錠剤、チュアブル錠、発泡錠、口腔内崩壊錠、トローチ剤、ドロップ剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、ドライシロップ剤、浸剤などが挙げられる。
前記固形剤が、外用剤として用いられる場合、例えば、坐剤、パップ剤、プラスター剤などが挙げられる。

−半固形剤−
前記半固形剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、内用剤として用いられる場合、例えば、舐剤、チューインガム剤、ホイップ剤、ゼリー剤などが挙げられる。
前記半固形剤が、外用剤として用いられる場合、例えば、軟膏剤、クリーム剤、ムース剤、インヘラー剤、ナザールジェル剤などが挙げられる。

−液剤−
前記液剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、内用剤として用いられる場合、例えば、シロップ剤、ドリンク剤、懸濁剤、酒精剤などが挙げられる。
前記液剤が、外用剤として用いられる場合、例えば、液剤、点眼剤、エアゾール剤、噴霧剤などが挙げられる。

＜投与＞
前記エラジタンニン含有抗がん剤の投与方法、投与量、投与時期、及び投与対象としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記投与方法としては、例えば、局所投与法、経腸投与法、非経口投与法などが挙げられる。
前記投与量としては、例えば、投与対象個体の年齢、体重、体質、症状、他の成分を有効成分とする医薬や薬剤の投与の有無など、様々な要因を考慮して適宜選択することができる。
前記投与対象となる動物種としては、例えば、ヒト、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、トリなどが挙げられるが、これらの中でもヒトに好適に用いることができる。

前記エラジタンニン含有抗がん剤は、優れた抗がん作用を有するため、がんの予防剤又は治療剤として好適に利用可能である。前記抗がん剤は、がんの中でも、骨肉腫、及び肺がんの予防剤又は治療剤として好適に利用可能である。

（併用抗がん剤）
本発明の併用抗がん剤は、前記エラジタンニン含有抗がん剤と、アントラサイクリン類を含有する抗がん剤（以下、「アントラサイクリン類含有抗がん剤」と称することがある）とを少なくとも含み、必要に応じて、更にその他の成分を含有する。

＜エラジタンニン含有抗がん剤＞
前記エラジタンニン含有抗がん剤の詳細としては、前記した本発明の抗がん剤の項目に記載したとおりである。

＜アントラサイクリン類含有抗がん剤＞
前記アントラサイクリン類含有抗がん剤は、アントラサイクリン類を少なくとも含み、必要に応じて、更にその他の成分を含有する。

−アントラサイクリン類−
前記アントラサイクリン類は、７，８，９，１０−テトラヒドロ−５，１２−テトラセンキノン（７，８，９，１０−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−５，１２−ｔｅｔｒａｃｅｎｅｑｕｉｎｏｎｅ）を母核とする配糖体であり、様々ながんに対して抗腫瘍効果を示すことが知られている物質が含まれる。
前記アントラサイクリン類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、バルルビシン、ミトキサントロンが好ましく、ドキソルビシンがより好ましい。前記アントラサイクリン類は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記アントラサイクリン類は、塩であってもよい。
前記塩としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、塩酸塩などが挙げられる。
前記アントラサイクリン類は、化学合成により得られたものであってもよいし、微生物の培養液から精製したものであってもよい。また、前記アントラサイクリン類は、市販品を用いることもできる。
前記アントラサイクリン類含有抗がん剤における前記アントラサイクリン類の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。前記アントラサイクリン類含有抗がん剤は、アントラサイクリン類そのものであってもよい。

−その他の成分−
前記アントラサイクリン類含有抗がん剤における前記その他の成分としては、特に制限はなく、例えば、薬理学的に許容され得る担体の中から目的に応じて適宜選択することができ、例えば、添加剤、補助剤、水などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
前記添加剤、補助剤としては、前記したエラジタンニン含有抗がん剤のその他の成分の項目に記載したものと同様のものが挙げられる。
前記アントラサイクリン類含有抗がん剤における前記その他の成分の含有量としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。

前記併用抗がん剤は、前記エラジタンニン含有抗がん剤、及びアントラサイクリン類含有抗がん剤のみを併せて使用してもよいし、他の成分を有効成分とする医薬と併せて使用してもよい。また、前記併用抗がん剤は、他の成分を有効成分とする医薬や薬剤中に配合された状態で使用してもよい。

＜剤型＞
前記併用抗がん剤の剤型としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記したエラジタンニン含有抗がん剤の剤型の項目に記載したものと同様のものが挙げられる。
前記エラジタンニン含有抗がん剤と、前記アントラサイクリン類含有抗がん剤とは、同一の剤型であってもよいし、異なる剤型であってもよい。

＜投与＞
前記併用抗がん剤の投与方法、投与量、投与時期、及び投与対象としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記したエラジタンニン含有抗がん剤の剤型の項目に記載したものと同様のものが挙げられる。
前記併用抗がん剤では、前記エラジタンニン含有抗がん剤と、前記アントラサイクリン類含有抗がん剤とを別々の剤型として投与してもよいし、両者を１つの製剤中に含む単剤として投与してもよい。
前記エラジタンニン含有抗がん剤と、前記アントラサイクリン類含有抗がん剤とを別々の剤型とする場合、両者は同時に投与してもよいし、時間を置いて別々に投与してもよい。
前記エラジタンニン含有抗がん剤と、前記アントラサイクリン類含有抗がん剤とを時間を置いて別々に投与する場合の投与順序としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記エラジタンニン含有抗がん剤、及び前記アントラサイクリン類含有抗がん剤の投与経路としては、同一であってもよいし、異なっていてもよい。

前記併用抗がん剤は、優れた抗がん作用を有するため、がんの予防剤又は治療剤として好適に利用可能である。前記併用抗がん剤は、がんの中でも、骨肉腫、及び肺がんの予防剤又は治療剤として好適に利用可能である。

（がんを予防又は治療するための方法）
前記エラジタンニン含有抗がん剤、及び前記併用抗がん剤は、がんを患う個体に投与することにより、がん細胞の増殖を効果的に抑制し、がんを予防又は治療することができる。したがって、本発明は、個体に、前記エラジタンニン含有抗がん剤、及び前記併用抗がん剤の少なくともいずれかを投与することを特徴とする、がんの予防又は治療方法にも関する。
対象とする前記がんとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、骨肉腫、肺がんに好適に利用可能である。

以下に試験例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの試験例に何ら限定されるものではない。

（試験例１：ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞増殖抑制活性）
エラジタンニンによる各種がん細胞株の増殖抑制活性を以下のようにして測定した。
下記がん細胞株を、１０液量％ＦＢＳ（シグマアルドリッチ社製）を含むＤＭＥＭ培地（日水製薬株式会社製）を用いて、１ウェルに５×１０^３細胞／１００μＬで９６ウェルプレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ_２の雰囲気下で２４時間培養して細胞を完全にプレートに接着させた。
ここに、下記エラジタンニンを、終濃度が、１００μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬ、１２．５μｇ／ｍＬ、６．２５μｇ／ｍＬ、３．１３μｇ／ｍＬ、１．５６μｇ／ｍＬ、０．７８μｇ／ｍＬとなるように添加し、３日間、３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気下で培養した。
また、比較対照として、がん細胞を接着させた９６ウェルプレートにおいて、エラジタンニンを添加せずに３日間、３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気下で培養した。
３日間培養後、ＭＴＴ法を用いて細胞増殖を測定した。前記ＭＴＴ法は、ＭＴＴ溶液（ＭＴＴ（３−（４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）を５ｍｇ／ｍＬの濃度で含有するＰＢＳ溶液）１０μＬを各ウェルに加え４時間培養し、産生されたフォルマザン産物を、２０％ＳＤＳ溶液１００μＬを各ウェルに添加して溶解し、５７０ｎｍの吸光度をラボシステムズ マルチスキャンＭＳ（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社製）で測定することにより行った。
前記エラジタンニンを添加した系の吸光度を「Ａ」とし、前記比較対照の系の吸光度を「Ｂ」として、下記式（１）により、細胞増殖阻害率（％）を算出した。
細胞増殖阻害率（％）＝｛（Ｂ−Ａ）／Ｂ｝×１００ ・・・ 式（１）
次に、前記細胞増殖阻害率より、細胞の増殖を５０％抑制する濃度（ＩＣ_５０値）を判定した。結果を表１に示す。
＜がん細胞株＞
・ ヒト骨肉腫 ＳＪＳＡ−１細胞（ＡＴＣＣより入手）
・ ヒト肺がん ＮＣＩ−Ｈ４６０細胞（ＡＴＣＣより入手）
＜エラジタンニン＞
・ ゲラニイン（Ｃｈｅｎｇｄｕ Ｂｉｏｐｕｒｉｆｙ Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）
・ カスアリクチン（長良サイエンス株式会社製）
・ オイゲニイン（長良サイエンス株式会社製）
・ テリマグランジンＩ（長良サイエンス株式会社製）
・ １，３−ジ−Ｏ−ガロイル−４，６−Ｏ−ヘキサヒドロキシジフェノイルグルコース（長良サイエンス株式会社製）
・ ストリクチニン（長良サイエンス株式会社製）

表１の結果から、エラジタンニンは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、各種がん細胞の増殖を抑制する活性を有することが判明した。

（試験例２−１：がん細胞移植マウスにおける抗腫瘍活性−１）
エラジタンニンとしてゲラニイン（Ｃｈｅｎｇｄｕ Ｂｉｏｐｕｒｉｆｙ Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）を用い、以下のようにして抗腫瘍活性を調べた。
下記がん細胞株を１×１０^７個／１００μＬになるようにＤＭＥＭ培地を含む５０体積％のマトリゲル（ベックトン・ディッキンソン社製）で調製し、この１００μＬを体重約１８ｇの雌のＢＡＬＢ／ｃ／ｎｕ／ｎｕマウス（ヌードマウス）の皮下に移植した。
前記移植後１週間後から、ゲラニインを週に２回（３日又は４日おき）、マウスの尾静脈に投与した。ゲラニインは、５％ＤＭＳＯ及び０．５％Ｔｗｅｅｎ８０が入った生理食塩水に溶解させ、投与液量として、ゲラニインが、１２．５ｍｇ／ｋｇとなるように調製した。
また、比較対照として、前記移植後１週間後から、５％ＤＭＳＯ及び０．５％Ｔｗｅｅｎ８０が入った生理食塩水（Ｓａｌｉｎｅ）を週に２回（３日又は４日おき）、マウスの尾静脈に投与した。
なお、試験に用いたマウスの数は、がん細胞株として、ヒト骨肉腫 ＳＪＳＡ−１細胞を用いた試験では一群１０匹とし、ヒト肺がん ＮＣＩ−Ｈ４６０細胞を用いた試験では一群５匹とした。
前記ゲラニインによる抗腫瘍効果の評価は、細胞移植後の腫瘍の増殖状況を観察して行った。即ち、腫瘍の長径と短径をノギスで計測し、下記式（２）から腫瘍体積を測定し、その平均及び標準誤差を求め、比較対照群に対するゲラニイン投与群の効果を判定した。結果を図１及び図２に示す。
腫瘍体積＝長径×(短径)^２÷２ ・・・ 式（２）
＜がん細胞株＞
・ ヒト骨肉腫 ＳＪＳＡ−１細胞（ＡＴＣＣより入手）
・ ヒト肺がん ＮＣＩ−Ｈ４６０細胞（ＡＴＣＣより入手）

図１は、ヒト骨肉腫 ＳＪＳＡ−１細胞を移植したマウスにおける腫瘍体積の変化を示し、図２は、ヒト肺がん ＮＣＩ−Ｈ４６０細胞を移植したマウスにおける腫瘍体積の変化を示す。
図１及び図２中、「＊」は有意差０．０５％以下を示し、「＊＊」は有意差０．０１％以下を示し、「＊＊＊」は有意差０．００１％以下を示し、「●」は生理食塩水（Ｓａｌｉｎｅ）を投与した群の結果を示し、「○」はゲラニイン投与群の結果を示す。
図１及び図２の結果から、ヒト骨肉腫 ＳＪＳＡ−１細胞を移植したマウスにおける腫瘍体積、及びヒト肺がん ＮＣＩ−Ｈ４６０細胞を移植したマウスにおける腫瘍体積は、ゲラニイン投与群では、比較対照群に対して有意に小さく、エラジタンニンであるゲラニインが、抗がん作用を有することが判明した。

（試験例２−２：がん細胞移植マウスにおける抗腫瘍活性−２）
エラジタンニンとしてオイゲニイン（長良サイエンス株式会社製）を用い、以下のようにして抗腫瘍活性を調べた。
がん細胞株であるヒト骨肉腫 ＳＪＳＡ−１細胞（ＡＴＣＣより入手）を１×１０^７個／１００μＬになるようにＤＭＥＭ培地を含む５０体積％のマトリゲル（ベックトン・ディッキンソン社製）で調製し、この１００μＬを体重約１８ｇの雌のＢＡＬＢ／ｃ／ｎｕ／ｎｕマウス（ヌードマウス）の皮下に移植した。
前記移植後１週間後から、オイゲニインを週に２回（３日又は４日おき）、マウスの尾静脈に投与した。オイゲニインは、５％ＤＭＳＯ及び０．５％Ｔｗｅｅｎ８０が入った生理食塩水に溶解させ、投与液量として、オイゲニインが、１２．５ｍｇ／ｋｇ、６．２５ｍｇ／ｋｇ、又は３．１３ｍｇ／ｋｇとなるように調製した。
また、比較対照として、前記移植後１週間後から、５％ＤＭＳＯ及び０．５％Ｔｗｅｅｎ８０が入った生理食塩水（Ｓａｌｉｎｅ）を週に２回（３日又は４日おき）、マウスの尾静脈に投与した。
なお、試験に用いたマウスの数は、一群７匹とした。
前記オイゲニインによる抗腫瘍効果の評価は、前記試験例２−１と同様にして行った。結果を図３に示す。

図３は、ヒト骨肉腫 ＳＪＳＡ−１細胞を移植したマウスにおける腫瘍体積の変化を示す。
図３中、「＊」は有意差０．０５％以下を示し、「＊＊」は有意差０．０１％以下を示し、「●」は生理食塩水（Ｓａｌｉｎｅ）を投与した群の結果を示し、「○」はオイゲニインの投与量を１２．５ｍｇ／ｋｇとした群の結果を示し、「△」はオイゲニインの投与量を６．２５ｍｇ／ｋｇとした群の結果を示し、「□」はオイゲニインの投与量を３．１３ｍｇ／ｋｇとした群の結果を示す。
図３の結果から、ヒト骨肉腫 ＳＪＳＡ−１細胞を移植したマウスにおける腫瘍体積は、オイゲニイン投与群では、比較対照群に対して有意に小さく、エラジタンニンであるオイゲニインが、抗がん作用を有することが判明した。

（試験例２−３：がん細胞移植マウスにおける抗腫瘍活性−３）
エラジタンニンとして、以下のようにして調製したゲラニインを含有するゲンノショウコ抽出物を用い、以下のようにして抗腫瘍活性を調べた。

＜ゲンノショウコ抽出物の調製＞
ゲンノショウコ（株式会社栃本天海堂製）５００ｇに対して、３Ｌのエタノールを加えて２４時間静置後、ろ過し、ろ液を乾固させたものをゲンノショウコ抽出物とした。
−ゲンノショウコ抽出物中のゲラニイン含量の測定−
前記ゲンノショウコ抽出物をＨＰＬＣで分析した。
カラム ： Ｎｕｃｒｏｓｉｌ Ｃ１８（直径４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）（ジーエルサイエンス株式会社製）
検出波長 ： ２２０ｎｍ
流速 ： ０．５ｍＬ／分間
移動相 Ａ液 ： ０．０５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）
移動相 Ｂ液 ： １００％アセトニトリル
グラジエント条件 ： （Ａ液１００％、Ｂ液０％、０分間）→（Ａ液７０％、Ｂ液３０％、５０分間）→（Ａ液０％、Ｂ液１００％、７０分間）で行った。
前記ＨＰＬＣで分析したゲラニインのピーク面積を「Ａ」とし、すべてのピーク面積を合計した値を「Ｂ」として、下記式（３）により、ゲラニインの含有量（質量％）を算出した。その結果、前記ゲンノショウコ抽出物中に、ゲラニインは８．５質量％含まれていた。
ゲラニイン含有量（質量％）＝Ａ／Ｂ×１００ ・・・ 式（３）

＜抗腫瘍活性の測定＞
がん細胞株であるヒト骨肉腫 ＳＪＳＡ−１細胞（ＡＴＣＣより入手）を５×１０^６個／１００μＬになるようにＤＭＥＭ培地を含む５０体積％のマトリゲル（ベックトン・ディッキンソン社製）で調製し、この１００μＬを体重約１８ｇの雌のＢＡＬＢ／ｃ／ｎｕ／ｎｕマウス（ヌードマウス）の皮下に移植した。
前記移植後１週間後から、ゲンノショウコ抽出物を週に２回（３日又は４日おき）、マウスの尾静脈に投与した。ゲンノショウコ抽出物は、５％ＤＭＳＯ及び０．５％Ｔｗｅｅｎ８０が入った生理食塩水に溶解させ、投与液量として、ゲンノショウコ抽出物が、１２５ｍｇ／ｋｇ（ゲラニインは、１０．６ｍｇ／ｋｇ）、６２．５ｍｇ／ｋｇ（ゲラニインは、５．３ｍｇ／ｋｇ）、又は３１．３ｍｇ／ｋｇ（ゲラニインは、２．７ｍｇ／ｋｇ）となるように調製した。
また、比較対照として、前記移植後１週間後から、５％ＤＭＳＯ及び０．５％Ｔｗｅｅｎ８０が入った生理食塩水（Ｓａｌｉｎｅ）を週に２回（３日又は４日おき）、マウスの尾静脈に投与した。
なお、試験に用いたマウスの数は、一群７匹とした。
前記ゲンノショウコ抽出物による抗腫瘍効果の評価は、前記試験例２−１と同様にして行った。結果を図４に示す。

図４は、ヒト骨肉腫 ＳＪＳＡ−１細胞を移植したマウスにおける腫瘍体積の変化を示す。
図４中、「＊＊」は有意差０．０１％以下を示し、「＊＊＊」は有意差０．００１％以下を示し、「●」は生理食塩水（Ｓａｌｉｎｅ）を投与した群の結果を示し、「○」はゲンノショウコ抽出物の投与量を１２５ｍｇ／ｋｇとした群の結果を示し、「△」はゲンノショウコ抽出物の投与量を６２．５ｍｇ／ｋｇとした群の結果を示し、「□」はゲンノショウコ抽出物の投与量を３１．３ｍｇ／ｋｇとした群の結果を示す。
図４の結果から、ヒト骨肉腫 ＳＪＳＡ−１細胞を移植したマウスにおける腫瘍体積は、ゲンノショウコ抽出物投与群では、比較対照群に対して有意に小さく、エラジタンニンであるゲラニインを含有するゲンノショウコ抽出物が、抗がん作用を有することが判明した。

上記試験例２−１から２−３の結果から、エラジタンニンが、抗がん剤に用いることができることが示された。

（試験例３：がん細胞移植マウスにおける抗腫瘍活性−４）
エラジタンニンと、既存の抗がん剤であるアントラサイクリン類含有抗がん剤とを併用した場合の抗腫瘍活性を以下のようにして調べた。
前記エラジタンニンは、ゲラニイン（Ｃｈｅｎｇｄｕ Ｂｉｏｐｕｒｉｆｙ Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）を用いた。前記アントラサイクリン類含有抗がん剤は、ドキソルビシン塩酸塩溶液（協和発酵キリン株式会社製）を用いた。
がん細胞株であるヒト骨髄腫ＳＪＳＡ−１細胞（ＡＴＣＣより入手）を５×１０⁶個／１００μＬになるようにＤＭＥＭ培地を含む５０体積％のマトリゲル（ベックトン・ディッキンソン社製）で調製し、この１００μＬを体重約１８ｇの雌のＢＡＬＢ／ｃ／ｎｕ／ｎｕマウス（ヌードマウス）の皮下に移植した。
前記移植の翌日から、（１）ゲラニイン、（２）ドキソルビシン塩酸塩溶液、又は（３）ゲラニイン及びドキソルビシン塩酸塩の混合溶液を週に２回（３日又は４日おき）、マウスの尾静脈に投与した。
（１）ゲラニインは、５％ＤＭＳＯ及び０.５％Ｔｗｅｅｎ８０が入った生理食塩水にゲラニインを溶解させ、投与液量として、ゲラニインが、１２．５ｍｇ／ｋｇとなるように調製した。（２）ドキソルビシン塩酸塩溶液は、生理食塩水にドキソルビシン塩酸塩を溶解させ、投与液量として、ドキソルビシン塩酸塩が、２．５ｍｇ／ｋｇとなるように調製した。（３）ゲラニイン及びドキソルビシン塩酸塩の混合溶液は、それぞれ溶液を、投与液量として、ゲラニインが１２．５ｍｇ／ｋｇ、ドキソルビシン塩酸塩が２．５ｍｇ／ｋｇとなるように調製した。
また、比較対照として、前記移植後１週間後から、５％ＤＭＳＯ及び０.５％Ｔｗｅｅｎ８０が入った生理食塩水（Ｓａｌｉｎｅ）を週に２回（３日又は４日おき）マウスの尾静脈に投与した。
なお、試験に用いたマウスの数は、一群５匹とした。
前記（１）ゲラニイン、（２）ドキソルビシン塩酸塩溶液、又は（３）ゲラニイン及びドキソルビシン塩酸塩の混合溶液による抗腫瘍効果の評価は、前記試験例２−１と同様にして行った。結果を図５に示す。

図５は、ヒト骨肉腫 ＳＪＳＡ−１細胞を移植したマウスにおける腫瘍体積の変化を示す。
図５中、「＊」は有意差０．０５％以下を示し、「＊＊」は有意差０．０１％以下を示し、「＊＊＊」は有意差０．００１％以下を示し、「●」は生理食塩水（Ｓａｌｉｎｅ）を投与した群の結果を示し、「□」は（１）ゲラニイン（Ｇｅｒａｎｉｉｎ １２．５ｍｇ／ｋｇ）を投与した群の結果を示し、「△」は（２）ドキソルビシン塩酸塩溶液（Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ ２．５ｍｇ／ｋｇ）を投与した群の結果を示し、「◇」は（３）ゲラニイン及びドキソルビシン塩酸塩の混合溶液（Ｇｅｒａｎｉｉｎ １２．５ｍｇ／ｋｇ＋Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ ２．５ｍｇ／ｋｇ）を投与した群の結果を示す。
図５の結果から、ヒト骨肉腫 ＳＪＳＡ−１細胞を移植したマウスにおける腫瘍体積は、（３）ゲラニイン及びドキソルビシン塩酸塩の混合溶液を投与した群では、（１）ゲラニインを投与した群、及び（２）ドキソルビシン塩酸塩溶液を投与した群に対して有意に小さく、エラジタンニンであるゲラニインと、アントラサイクリン類含有抗がん剤であるドキソルビシン塩酸塩とを併用することにより、顕著な抗腫瘍活性を示すことが判明した。

本発明の態様としては、例えば、以下のものなどが挙げられる。
＜１＞ エラジタンニンを含有することを特徴とする抗がん剤である。
＜２＞ エラジタンニンが、ゲラニイン、カスアリクチン、オイゲニイン、テリマグランジンＩ、１，３−ジ−Ｏ−ガロイル−４，６−Ｏ−ヘキサヒドロキシジフェノイルグルコース、及びストリクチニンから選択される少なくとも１種である前記＜１＞に記載の抗がん剤である。
＜３＞ エラジタンニンが、ゲラニイン、及びオイゲニインの少なくともいずれかである前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の抗がん剤である。
＜４＞ エラジタンニンが、ゲンノショウコ抽出物に含まれる前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の抗がん剤である。
＜５＞ がんが、骨肉腫、及び肺がんのいずれかである前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の抗がん剤である。
＜６＞ 前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載の抗がん剤と、アントラサイクリン類を含有する抗がん剤とを併用することを特徴とする併用抗がん剤である。
＜７＞ アントラサイクリン類が、ドキソルビシンである前記＜６＞に記載の併用抗がん剤である。
＜８＞ がんが、骨肉腫、及び肺がんのいずれかである前記＜６＞から＜７＞のいずれかに記載の併用抗がん剤である。
＜９＞ がんを予防又は治療するための方法であって、個体に、前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載の抗がん剤、及び前記＜６＞から＜８＞のいずれかに記載の併用抗がん剤の少なくともいずれかを投与することを特徴とする方法である。

本発明の抗がん剤、及び併用抗がん剤は、優れた抗がん作用を有するため、がんの予防剤又は治療剤、好ましくは、骨肉腫、及び肺がんの予防剤又は治療剤として好適に利用可能である。

Claims (3)

1. 骨肉腫の腫瘍体積を減少させるために用いられる抗がん剤であって、
   ゲラニインを含有することを特徴とする抗がん剤。
2. ゲラニインを含有する抗がん剤と、ドキソルビシンを含有する抗がん剤とを含むことを特徴とする併用抗がん剤組成物。
3. ゲラニインを含有する抗がん剤と、ドキソルビシンを含有する抗がん剤とを併用することを特徴とする併用抗がん剤であって、前記併用抗がん剤が多剤である併用抗がん剤。