SK722589A3 - Fungi strain tolypocladium varium and microbial process for the production of cyclosporine complex - Google Patents
Fungi strain tolypocladium varium and microbial process for the production of cyclosporine complex Download PDFInfo
- Publication number
- SK722589A3 SK722589A3 SK7225-89A SK722589A SK722589A3 SK 722589 A3 SK722589 A3 SK 722589A3 SK 722589 A SK722589 A SK 722589A SK 722589 A3 SK722589 A3 SK 722589A3
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- cyclosporin
- complex
- varium
- antibiotic
- fermentation
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
- C12N1/145—Fungal isolates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/64—Cyclic peptides containing only normal peptide links
- C07K7/645—Cyclosporins; Related peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/911—Microorganisms using fungi
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Virology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Botany (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Transplantation (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Crystals, And After-Treatments Of Crystals (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Description
Oblasť techniky
Vynález sa týka nového plesňového kmeňa Tolypocladium varium a jeho použitia pri mikrobiálnej príprave cyklosporínového komplexu alebo jeho zložiek, cyklosporínu A, cyklosporínu B a cyklosporínu C, aeróbnou fermentáciou.
Doterajší stav techniky é
Cyklosporíny sú cyklické, neutrálne, nepoláme jedenásťčlenné oligopeptidy, v ktorých niektoré zo skupín aminokyselín sú rozdielne. Cyklosporín A a cyklosporín B izoloval najprv A. Rueger et al. (Helv. Chim. Acta 59, 1075 (1976)), zatiaľčo cyklosporíny B, D, E a G izoloval R. Traber et al. (Helv. Chim. Acta 60, 1568 (1977)) z kultúry plesní (NRRL 8044), identifikovanej najprv ako Trichoderma polysporum (Ling. ex. Pers.) Rifai. Neskôr sa uskutočnila taxonómiou revízia uvedeného kmeňa a potom bol popísaný v literatúre ako Tolypocladium inflatum Gams.
V súčasnosti je známych 25 rôznych cyklosporínových antibiotík uvedených ako cyklosporíny A až Z (Helv. Chim. Acta 70, 13 (1987)). Z týchto zložiek je najcennejší cyklo- sporín A, ktorý má selektívny imunosupresivny účinok.
Cyklosporín A bol najskôr známy ako mierne antifungicídne antibiotikum, jeho význačný imunosupresivny účinok sa potvrdil až neskôr (J. F. Borel et al: Immunology 32, 1017 (1977)).
V sériách skúšok in vitro a in vivo sa potvrdilo, že cyklosporíny A, C a G sú veľmi špecifické imunosupresívne látky.
Cyklosporín A inhibuje očakávanú humorálnu a tkanivovú imunitnú odpoveď. Pri štúdiu jeho spôsobu účinku sa zistilo, že inhibuje T bunkovú proliferáciu a aj syntézu interleukínu 2.
Terapeutické použitie cyklosporínu A pri transplantácii ľudských orgánov bolo uverejnené v r. 1978. Najprv bol aplikovaný pri transplantácii obličiek (R. J. Calne et al.: Lancet 1978/2, 1323) a kostnej drene (R. L. Powles et al.: Lancet 1978/2, 1327) transplantations.
V priebehu transplantácie orgánov (obličiek, podžalúdkovej žľazy, pečene, srdca, pľúc) a kostnej drene bola negatívna reakcia orgánov potlačená aplikáciou cyklosporínu A.
Ďalej bol cyklosporín A úspešne aplikovaný pri liečení niektorých autoimunitných ochorení (uveitidy, reumatickej artritídy, psoriázy a ťažkej myasténie).
V patentovej literatúre sa na produkciu cyklosporínového komplexu použili nasledujúce mikroorganizmy: Cylindrocarpon lucidum Booth, NRRL 5760 (švajčiarsky patent č. 589,716); Tolypocladium inflatum Gams, NRRL 8044 (podľa predošlej taxonómie: Trichoderma polysporum (Link ex Pers.) Rifai (švajčiarsky patent č. 603,790 podľa Bisetta (1983): Tol. inflatum w. Gams, 1971 je synonymný s Tol. niveum (rostrup) Bisett com.mov. a Fusarium solani, MCI-1549, MCI1550 (publikovaná japonská patentová prihláška č. 82
63093)). V priebehu fermentačného procesu uskutočňovaného s vyššie uvedenými mikroorganizmami sa dosiahla po dlhom čase fermentácie nízka úroveň produkcie cyklosporínu a výťažok izolácie bol tiež nízky.
Výskum sa ukutočnil za účelom nájdenia kmeňov mikroorganizmov, ktoré by produkovali cyklosporínový antibiotikový. komplex alebo jeho zložky s vyššou koncentráciou a pri výhodnejších podmienkach ako u predošlých kmeňov. Pri skriningu veľkého počtu vláknitých plesňových kmeňov izolovaných z pôdy sa našiel kmeň mikroorganizmu Tolypocladium genus, ktorý je schopný biosyntézy cyklosporínového antibiotikového komplexu.
Podstata vynálezu
Predmetom vynálezu je jednak tento mikroorganizmus označený CY/93, ktorý nemohol byť identifikovaný pri taxonomickej štúdii žiadnym druhom plesní produkujúcim cyklosporínový komplex. Tolypocladium species nová CY 93 je nový taxón kmeňa Tolypocladium genus, ktorý sa môže diferencovať na úrovni druhu.
Predmetom vynálezu je ďalej aj spôsob mikrobiálnej prípravy cyklosporínového komplexu alebo jeho zložiek, cyklosporínu A, cyklosporínu B a cyklosporínu C, aeróbnou fermentáciou vláknitého plesňového kmeňa vedúcou k biosyntéze vyššie uvedeného antibiotika (antibiotík) v živnom prostredí obsahujúcom využiteľné zdroje uhlíka a dusíka a minerálne soli a izoláciou vytvorených produktov, ktorý sa vyznačuje tým, že sa kmeň vyššie uvedeného druhu plesne Tolypocladium varium, produkujúci cyklosporínový antibiotikový komplex, kultivuje v živnom prostredí obsahujúcom zdroje uhlíka, organické a anorganické zdroje dusíka a minerálne látky, za aeróbnych podmienok pri 25 až 30 °C a prípadne sa vyrobený cyklosporínový antibiotikový komplex alebo jeho zložky izolujú a čistia.
Fermentácia sa uskutočňuje v prostredí obsahujúcom ako zdroj dusíka peptón, síran amónny a tryptón a ako zdroj uhlíka glukózu, maltózu a sorbit.
Taxonomické znaky nového druhu plesne sa porovnali s hlavnými diagnostickými vlastnosťami druhu Tolypocladium nasledujúcim spôsobom.
Tolypocladium genus bol najskôr popísaný Gamsom v r. 1971 ako nový rod Moniliales. Jeho charakteristické vlastnosti sú: pomalý rast, poduškovité biele kolónie, koncové a bočné fialidy rozvinuté čiastočne na krátkom bočnom vetvení, so silno napučanou bázou a vláknitým, často skloneným hrdlom, končiacim v jednobunkovom konídiu. V tomto rode rozlíšil Gams nasledujúce tri nové druhy:
T. qeodes, T. cylindrosporum a T. inflatum.
T. geodes sa vyznačoval pôdnou vôňou typu Actinomycetes, zatiaľ čo novému T. varium sp. nov. CY/93 táto vlastnosť' úplne chýba. Ďalej sú nosičové bunky T. qeodes značne užšie ako bunky T. varium sp. nov. CY/93. Konídiá T, cylindrosporum sú charakteristicky dlhé a predĺžené, zatiaľ čo konídiá T. varium sp. nov. CY/93 sú sférické a len nepatrne predĺžené. Konídiá T. inflatum sú vajcovité a dlhšie ako pozorované v kultúre T. varium sp. nov. CY/93. Fialidy T. inflatum sú charakteristicky produkované vo verticiloch buď priamo na hýfach, alebo na 2 až 3 um dlhých nosičových bunkách. T.
varium sp. nov. CY/93 zvyčajne nepreukazuje žiadne podobné verticilátové usporiadanie, také usporiadanie je detegovateľné len z času na čas ojedinelo. V dôsledku bieleho páperistého vzdušného mycélia sú kolónie všetkých známych druhov Tolypocladium biele, zatiaľ čo rub kolónii je žltkavosivý, bezfarebný alebo žltý. Nie sú produkované žiadne typicky rozpustné pigmenty. T. varium sp. nov. CY/93 sa môže odlíšiť aj v tomto ohľade: v prostredí obsahujúcom glukózu a peptón a sladový a kvasnicový výťažok je produkovaný tmavý, tmavosivý (a čierny) s časovou premenlivosťou.
Taxonomické hodnotenie nových druhov v porovnaní s inými známymi druhmi Tab/pocladium sa uskutočnilo na základe nasledujúcich publikácií: W. Gams: Perseonia, 6, 185-191, (1971); G. L. Barron: Can. J. Bot. 5R, 439-442 (1980) a Bisett J., Can. J. Bot. 61, 1311-1329 (1983).
Diagnostické vzory Tolypocladium varium sp. nov. CY/93 sú zhromaždené v nasledujúcom:
10-dňové kolónie majú priemer 10 až 25 mm, ich povrch je pokrytý bielym, páperistým, bohato sporulujúcim vzdušným mycéliom. Rub kolónií je žltavo až špinavo sivý. V niektorých prostrediach sa produkuje tmavosivý, rozpustný pigment. Na hýfach vzdušného mycélia sa pozoruje koncová a bočná sporulácia. Fialidy sú umiestnené buď osamelo, alebo sporadicky, náhodne vo verticiloch, priamo na hýfach alebo na krátkych (2 až 3 μπι) nosičových bunkách. Fialidy sú vytvorené z napučanej bázy (2 až 4 x 2 až 3 μπι) a dlhého, vláknitého hrdla (2 až 4 x 0,5 až 0,6 μπι) . Konídiá hlavičiek sú malé (2 až 3 . 1,3 až 2,2 μπι), zvyčajne sférické a hladké. Špecifický epiteton varium sa týka variability fialíd. Tol. varium ukazuje vo svojom životnom cykle určitú podobnosť s rodom
Harptsporium, o ktorom sa bude zmieňovať inde. Kmeň označený CY/93 nemôže využívať rafinózu, ale rastie dobre na nasledujúcich zdrojoch uhlíka: manite, inozite, sacharóze, fruktóze, ramnóze, galaktóze, dextróze, arabinóze a xylóze v povrchových kultúrach. Tieto kultúry sa nevyvíjajú dobre na živnej pôde a agare so sladovým výťažkom, dobre sa vyvíjajú na agare so sójovou múkou, Czapekovom agare a agare so zemiakovou dextrózou. Na uskladnenie nie je vhodný agar s ovsenou múkou a agar s dextrózou a kvasnicovým výťažkom.
Tol. varium sa ostro odlišuje od Tol. trigonosporum, ktoré produkuje konídiá trojhranné na povrchu so slabo vydutými okrajmi.. Tol. varium sa odlišuje aj od Tol. balanoides. Posledné produkuje fľašovité bočné fialidy.
Okrem toho sa kmeň (CY/93) Tolypocladium varium n.sp. odlišuje od autentického typu kmeňa Tolypocladium inflatum (CBS 714.70) s ohľadom na to, že posledný uvedený kmeň vyvíja bohaté biele vzdušné mycélium pri kultivácii na živnej pôde maltóza-agar, zatiaľ čo Tolypocladium varium sp.nov. CY/93 neprodukuje toto vzdušné mycélium. Typ kmeňa Tolypocladium inflatum produkuje v mycéliu v živnej pôde železopeptón červenkastohnedý konečný pigment, zatiaľ čo mycélium Tolypocladium varium sp.nov. CY/93 zostáva svetložlté. Kmeň Tolypocladium varium sp.nov. CY/93 nevyužíva arabinózu, zatiaľ čo Tolypocladium inflatum využíva. Pri použití dusitanu sodného vyvíja posledný menovaný kmeň bohaté mycélium, zatiaľ čo Tolypocladium varium sp.nov. CY/93 rastie ťažko.
Porovnanie Tolypocladium varium sp.nov. CY/93 s autentickými kmeňmi iných Tolypocladium species_, Trichoderma polysporum ATCC 16,641 a Cylindrocarpon lucium NRRL 5760 je uvedené v tabuľke 1.
i
Tabuľka I
O ΓΟΟ
CO i σν j £ ' U '
E ‘C
CTÍ >
O
E *5 cO
Q O £ o H
O r<N Γ(Z)
CQ O cn <u Ό
O <υ 00
E .3 5
CTÍ O o cx >> ô H o C— <4 <N r—
C/3 ffl o \O VO ω o H
C
E o
J3
O & «3 Q O u.
Ό C
O o
VO t—Rozklad celulózy
Vzdušné mycélium: zelené alebo modravozelené Červený rozpustný pigment produkcie na Ringovom agare Hnedý pigment produkcie na_agare so železom Tmavohnedý pigment produkcie na agare so syntetickým glycerolom
Využitie sacharózy
Využitie inulínu
Rast pri 5 °C
Rast pri 37 °C
Odolnosť proti zohrievaniu pri 50 °C počas 60 minút Produkcia kyseliny z glukózy Využitie salicylátu sodného Využitie malonátu sodného Využitie vínanu sodného Fialový rozpustný pigment produkcie na agare s tyrozíno a leucínom +4 + +-4- +
I ί
+ + + ŕ +-+-4+-++ +++
| — | +++ | |||
| +-+ + | H- + + | — | + +- + | |
| — | - | + +-4 | ||
| + +- + | [4 4-4- | - | — | |
| — | 4“ | + 4 4- | ||
| i | 4-4- + | 4 + 4- |
+-+4- + + +
| 4- | ! + | I 4—h 4- j |
| i ' | — i | |
| .............. | ------------4 | |
| 4 4- | i I | — |
| 4- 4- | 1 i 1 J i “ 1 | — |
| i i | ||
| — | i i ; 4 4+' | + 44 |
Kmeň podľa vynálezu je veľmi výhodný vzhľadom na rýchly rast. Priaznivým znakom je to, že kmeň môže využiť sacharózu, glukózu, sorbózu, maltózu, fruktózu, škrob, glycerol a tiež tuky a oleje ako zdroje uhlíka a rôzne organické a anorganické zdroje dusíka, ako kukuričný výluh, peptón, kvasnicový výťažok, mäsový výťažok, dusičnan sodný, dusičnan amónny, síran amónny a rôzne aminokyseliny. Okrem vyššie uvedených zdrojov uhlíka a dusíka môžu živné prostredia použité na produkciu cyklosporínového antibiotikového komplexu obsahovať aj minerálne soli (chlorid draselný, síran horečnatý alebo dihydrogenfosforečnan draselný), stopové prvky (soli medi, mangánu, železa), ďalej vitamíny a odpeňovacie látky.
Podľa výhodnej metódy podía vynálezu sa kvapalné prostredie naočkuje suspenziou konídia a mycélia pripraveného z kultúry Tolypocladium varium sp.nov. CY/93 na šikmom agare. Po trojdňovej kultivácii sa získaná predkultúra použije na naočkovanie prostredia použitého na výrobu antibiotika, ktoré sa potom inkubuje pri 25 až 30 °C, s výhodou pri 25 ’C, 5 až 7 dní. Počas fermentácie sa pH udržiava v rozmedzí 6,0 až 2,5, s výhodou pri 5,2. Fermentácia sa uskutočňuje za aeróbnych podmienok za intenzívneho miešania (750 až 1000 otáčok za minútu) a za prevzdušňovania 300 1/h.
Počas fermentácie sa obsah cyklosporínu v živnej pôde monitoruje mikrobiálnou skúškou a vysokotlakovou kvapalinovou chromatografiou. Len čo sa vyrobia maximálne množstvá antibiotika, získajú sa tieto z kultúry známym spôsobom extrakčnou a/alebo absorpčnou metódou.
Cyklosporinová koncentrácia živnej pôdy sa meria na základe antifungicídnej účinnosti cyklosporinov doskovým difúznym testom. Ako skúšané organizmy sa môžu s výhodou použiť Aspergillus niger, Aspergillus japonicus a Curvularia . lunata (M. Dreyfuss et al.: European J. Appl. Microbiol. 3, 125-133 (1976)). Vysokotlaková kvapalinová chromatografia cyklosporinovej koncentrácie živnej pôdy sa uskutočňuje na vzorke pôdy desaťnásobným zriedením metanolom podlá F. Kreuziga (J. Chromat. 290, 181 (1284)). Podľa týchto pokusov sa vyrobí cyklosporínový antibiotikový komplex obsahujúci cyklosporín A ako hlavný produkt a cyklosporín B a cyklosporín C ako menšie zložky s vysokým výťažkom (950 mcg/ml) za použitia nového kmeňa Tolypocladium varium sp.nov. CY/93.
Na izoláciu cyklosporínového komplexu z fermentačnej živnej pôdy sa s výhodou môže použiť extrakčná metóda. Pred extrakciou sa mycélium oddelí buď filtráciou, alebo odstredením. Antibiotiká vyrobené počas fermentácie sa môžu výhodne vymyť z buniek mikroorganizmu nižšími alkanolmi, s výhodou metanolom, alebo organickými ketónmi, s výhodou acetónom, zatiaľ čo cyklosporíny vo filtráte sa môžu extrahovať organickými rozpúšťadlami miešateľnými s vodou, ako je etylacetát, n-butylacetát, dichlórmetán, 1,2-dichlóretán alebo chloroform, s výhodou n-butylacetát. Surový produkt získaný extrakciou je znečistený červenými a fialovými pigmentami produkovanými plesňou, ktoré sa môžu odstrániť adsorpciou na aktívnom uhlí alebo silikagéle. Prípadné lipidové nečistoty (t.j. odpeňovacia látka) sa môžu oddeliť distribúciou do systému petroléteru a metanolu obsahujúceho 10 % vody, kde sa nečistoty prevedú do petroléterovej fázy.
Vodná metanolová fáza sa koncentruje za zníženého tlaku, potom sa vodný zvyšok extrahuje dichlórmetánom, ktorý sa odparí a získa sa vyčistený cyklosporín. Cyklosporín A sa môže oddeliť od menších cyklosporínových zložiek stĺpcovou chromatografiou a prekryštalizovaním.
Štruktúra izolovaných produktov sa objasnila ultrafialovou, infračervenou, XH nukleárnou magnetickou rezonančnou, 13C nukleárnou magnetickou rezonančnou a hmotnostnou spektroskopiou a analýzou aminokyselín.
Vynález bude objasnený v nasledujúcich príkladoch bez toho, aby bol obmedzený jeho rozsah.
Príklady uskutočnenia vynálezu * *
Príklad 1
Suspenzia konídia a mycélia sa pripraví s 5 ml 0,9% roztoku chloridu sodného, získaného z kultúry Tolypocladium varium sp.nov. CY/93 na šikmom agare so sladovým výťažkom a kvasnicovým výťažkom. 1 ml tejto suspenzie sa použije na naočkovanie 100 ml sterilného inokulačného prostredia IC v 500-mililitrovej Erlenmeyerovej banke.
Zloženie prostredia IC:
glukóza kazeín-peptón dusičnan sodný dihydrogenfosforečnan draselný chlorid draselný
0, 5 síran horečnatý x 7 H20 0,5 g síran železnatý x 7 H2O 0,01 g v 1000 ml vodovodnej vody.
pH živného prostredia sa upraví pred sterilizáciou na
5,2 a zmes sa sterilizuje 25 minút pri 121 ’C. Kultúra sa inkubuje pri 25 ’C na rotačnej trepačke (340 otáčok za minútu) , potom sa použije 5 ml tohto inokulačného prostredia na naočkovanie 15 500-mililitrových Erlenmeyerových baniek obsahujúcich 100 ml sterilného prostredia FCi.
Zloženie prostredia FCi;
| glukóza | 80 | g |
| tryptón | 40 | g |
| močovina | 2 | g |
| síran amónny | 12 | g |
| dusičnan amónny | 3 | g |
| dihydrogénfosforečnan draselný | 2 | g |
| chlorid draselný | 0, 5 | g |
| síran horečnatý x 7 H2O | 0, 5 | g |
| síran železnatý x 7 H20 | 0, 01 | g |
| v 1000 ml vodovodnej vody. | ||
| pH živného prostredia sa | upraví | pred sterilizáciou na |
5,2 a zmes sa sterilizuje 25 minút pri 121 ’C.
Banky sa inkubujú pri 25 ’C na rotačnej trepačke (340 otáčok za minútu). Počas fermentácie sa monitoruje antibiotiková koncentrácia živnej pôdy doskovým difúznym testom.
Ako skúšaný organizmus sa použije Aspergillus niger.
Koncentrácia cyklosporinového antibiotikového komplexu v živnej pôde sa stanoví za použitia cyklosporínu A ako štandardu.
Fermentácia prebieha 168 hodín, kedy živná pôda obsahuje 400 pg/ml cyklosporinového antibiotikového komplexu. Cyklosporínový komplex sa izoluje podía nasledujúcej metódy.
Bunky jedného litra živnej pôdy sa filtrujú a antibiotiká sa premyjú dvakrát 200 ml metanolu. Vodný metanolový roztok sa koncentruje za zníženého tlaku, potom sa antibiotikový komplex extrahuje z vodného koncentrátu 2 x 50 ml nbutylacetátu. Cyklosporínový obsah filtrátu sa extrahuje 200 ml n-butylacetátu. n-butylacetátové extrakty sa zhromaždia, sušia bezvodým síranom sodným, potom sa odparia za zníženého tlaku pri 40 ’C. 3,7 g získaného surového produktu sa rozpustí v 10 ml metanolu a privedie sa na vrchol gélovej kolóny Sephadex LH-20 (dĺžka kolóny 40 cm, priemer 2,5 cm), pripravenej s metanolom. Lipidové nečistoty sa potom oddelia elúciou metanolom. Frakcie obsahujúce cyklosporínový komplex sa odparia za zníženého tlaku pri 40 °C. Oddelenie zložiek získaného cyklosporinového komplexu (1,05 g) sa uskutočňuje chromatografiou na silikagélovej kolóne pripravenej z 20 g silikagélu 40 (Reanal, Budapešť) elúciou zmesou chloroformmetanol, obsahujúcou postupne sa zvyšujúci objem metanolu. Elúcia začína so 100 ml chloroformu, potom pokračuje zmesou chloroform-metanol, kde obsah metanolu každej 100-mililitrovej časti sa zvýši o 0,5 %. Cyklosporínový obsah frakcií sa monitoruje chromatografiou na tenkej vrstve (doska: silikagél 60 F254, DC Alufoil (Merck), elučné činidlo: etylacetát izopropylalkohol 95 : 5, detekcia: jódové pary). Cyklosporíny A, B a C sa eluujú z kolóny zmesou metanol-chloroform obsahujúcou 2,0 %, 2,5 % a 3,0 % metanolu. Frakcia obsahujúca čisté zložky sa odparí za zníženého tlaku a získa sa 225 mg cyklosporínu A (t.t.: 137-140 ’C, [a]D: -189 ° (metanol)), 25 mg cyklosporínu B (t.t.: 149-151 ’C) a 52 mg cyklosporínu C (t.t.: 150-152 ’C).
Príklad 2
1 inokulačného prostredia IC, sterilizovaného 45 minút pri 121 °C v 10-litrovom laboratórnom ferment0r£/ sa naočkuje 200 ml inokulačnej kultúry pripravenej tak, ako sa popisuje v príklade 1, potom sa inkubuje pri 25 °C, mieša sa pri 750 otáčkach za minútu a prevzdušňuje sa 300 1/h vzduchu .
Fermentácia sa ďalej uskutočňuje 72 hodín, potom sa použije 500 ml tohto inokulačného prostredia na naočkovanie 5 1 prostredia FC2, sterilizuje sa 45 minút pri 121 °C v 10litrovom laboratórnom f ermentôr£>.
Zloženie prostredia FC2.’ glukóza tryptón g
g močovina síran amónny 12 g dusičnan sodný 3 g dihydrogenfosforečnan draselný 2 g chlorid draselný 0,5 g síran horečnatý x 7 H2O 0,5 g
| síran | meďnatý x | 5H2O | 0, 01 | g |
| síran | mangánatý | x 7 H2O | 0, 01 | g |
| síran | železnatý | x 7 H2O | 0,01 | g |
v 1000 ml vodovodnej vody.
pH prostredia sa upraví pred sterilizáciou na 5,2. Naočkovaná kultúra sa inkubuje pri 25 °C, mieša sa pri 750 otáčkach za minútu a prevzdušňuje sa 300 1/h.
Fermentácia sa uskutočňuje za vyššie uvedených podmienok 144 hodín až po dosiahnutie vrcholu cyklosporínového titra, potom je živná pôda bohatá a môže sa spracovať.
Cyklosporín A sa izoluje zo 4,8 1 fermentačnej živnej pôdy obsahujúcej 500 μς/ιηΐ cyklosporínového komplexu nasledujúcim spôsobom.
Bunky mikroorganizmu sa odstredia a cyklosporínový komplex sa vymyje z buniek 2x1 litrom metanolu. Vodný metanolový roztok sa koncentruje za zníženého tlaku, potom sa antibiotikový komplex extrahuje z vodného koncentrátu 2 x 250 ml n-butylacetátu.
Cyklosporínový komplex sa extrahuje z filtrátu fermentačnej živnej pôdy 2 x 500 ml n-butylacetátu. Všetky n-butylacetátové extrakty sa zhromaždia, vysušia bezvodým síranom sodným, potom sa roztok odparí za zníženého tlaku pri 40 ’C. Predbežné čistenie získaného surového produktu (19,2 g) sa uskutočňuje chromatografiou na kolóne pripravenej zo 100 g silikagélu 60 (velkosť častíc 0,063 až 0,2 mm), so zmesou chloroform-metanol-acetón (92 : 4 : 4) ako elučným činidlom. Frakcie obsahujúce cyklosporínový komplex (chromatografia na tenkej vrstve: doska: silikagél 60 F254, DC Alufoil (Merck), elučné činidlo: hexán-acetón 2 : 1; detekcia: chlór/tolidin) sa odparia do sucha. Odparok (5,28 g) sa podrobí stĺpcovej chromatografii a získa sa cyklosporín A. Kolóna sa pripraví zo 115 g silikagélu 60 (veľkosť častíc 0,063 až 0,2 mm) a eluuje sa zmesou hexán-acetón obsahujúcou postupne sa zvyšujúci objem acetónu. Cyklosporín A sa eluuje z kolóny zmesou obsahujúcou 23 % acetónu. Odparením frakcií obsahujúcich cyklosporín A sa získa 1,46 g cyklosporínu A.
Príklad 3
Suspenzia konídia a mycélia sa pripraví s 5 ml 0,9% roztoku chloridu sodného, získaného z kultúry Tolypocladium varium nov.sp. CY/93 na šikmom agare so sladovým výťažkom a kvasnicovým výťažkom a použije na naočkovanie 800 ml inokulačného prostredia IC popísaného v príklade 1 a sterilizuje sa v 3-litrovej Erlenmeyerovej banke. Banka sa inkubuje pri 25 °C na rotačnej trepačke (340 otáčok za minútu) 2,5 dňa, potom sa týmto prostredím naočkuje 5 1 prostredia FC3, sterilizovaného v 10-litrovom laboratórnom fermentér^, pri 121 °C 45 minút.
Zloženie prostredia FC3:
| sorbóza | 60 | g |
| tryptón | 40 | g |
| močovina | 2 | g |
| síran amónny | 12 | g |
| dusičnan sodný | 3 | g |
| dihydrogenfosforečnan draselný | 2 | g |
| chlorid draselný | 0, 5 | g |
| síran horečnatý x 7 H2O | 0, 5 | g |
| síran mangánatý x 7 H2O | 0, 01 | g |
| síran železnatý x 7 H2O | 0, 01 | g |
v 1000 ml vodovodnej vody.
pH prostredia sa upraví pred sterilizáciou na 5,2. Naočkovaná kultúra sa inkubuje pri 25 °C za miešania pri 1000 otáčkach za minútu a prevzdušňuje 300 1/h.
Fermentácia sa ďalej uskutočňuje 168 hodín, kedy obsahuje fermentačná živná pôda podľa mikrobiálnej skúšky 600 mcg/ml cyklosporínového komplexu.
Izoláciou podľa príkladu 2 sa získa z jedného litra živnej pôdy 310 mg cyklosporínu A.
Príklad 4
Suspenzia konídia a mycélia sa pripraví s 5 ml 0,9% roztoku chloridu sodného získaného, z päť- až sedemdňovej kultúry Tolypocladium varium nov.sp.CY/93 (NCAIM(P)F 001005) na šikmom agare so sladovým výťažkom a kvasnicovým výťažkom a použije na naočkovanie 500 ml inokulačného prostredia IC popísaného v príklade 1 a sterilizuje sa v 3-litrovej Erlenmeyerovej banke. Banka sa inkubuje pri 25 °C na rotačnej trepačke (340 otáčok za minútu) 3 dni, potom sa týmto prostredím naočkuje 5 1 prostredia FC4, sterilizovaného v 10litrovom laboratórnom fermentôrf/ pri 121 °C 45 minút.
Zloženie prostredia FC4:
| maltóza | 80 | g |
| tryptón | 40 | g |
| močovina | 2 | g |
| síran amónny | 12 | g |
| dusičnan sodný | 3 | g |
| dihydrogenfosforečnan draselný | 2 | g |
| chlorid draselný | 0,5 | g |
| síran horečnatý x 7 H2O | 0, 5 | g |
| síran mangánatý x 7 H2O | . 0, 01 | g |
| síran meďnatý x 5 H20 | 0,01 | g |
| síran železnatý x 7 H2O | 0, 01 | g |
| v 1000 ml vodovodnej vody. |
pH prostredia sa upraví pred sterilizáciou na 5,2. Po naočkovaní sa fermentačná živná pôda inkubuje pri 25 °C za miešania pri 1000 otáčkach za minútu a prevzdušňuje 300 1/h.
Fermentácia sa ďalej uskutočňuje 144 hodín, kedy obsahuje fermentačná živná pôda podlá mikrobiálnej skúšky 620 mcg/ml cyklosporínového komplexu.
Izolácia sa uskutočňuje metódou popísanou v príklade
1. Z jedného litra živnej pôdy sa získa 305 mg cyklosporínu
A.
Príklad 5
Suspenzia konídia a mycélia sa pripraví s 5 ml 0,9% roztoku chloridu sodného z päť- až sedemdňovej kultúry Tolypocladium varium nov.sp. CY/93 (NCAIM(P)F 001005) na šikmom agare so sladovým výťažkom a kvasnicovým výťažkom a • použije na naočkovanie 500 ml inokulačného prostredia IC popísaného v príklade 1 a sterilizuje sa v 3-litrovej Erlenmeyerovej banke. Banka sa inkubuje pri 25 °C na rotačnej trepačke (340 otáčok za minútu) 2 dni, potom sa týmto prostredím naočkuje 5 1 prostredia FCi, sterilizovaného v 10litrovom laboratórnom fermentfir£/pri 121 ’C 45 minút. Po naočkovaní sa fermentačná živná pôda mieša pri 25 ’C pri 750 otáčkach za minútu a prevzdušňuje 300 1/h. Po 96-hodinovej kultivácii sa pridá sterilizovaný vodný roztok 100 g maltózy a fermentácia pokračuje 144 hodín, kedy živná pôda obsahuje podlá mikrobiálnej skúšky 950 mcg/ml cyklosporínového komplexu. Získa sa celkom 4,8 1 živnej pôdy. Izolácia sa uskutočňuje podlá metódy popísanej v príklade 2 a získa sa 2,75 g cyklosporínu A.
Claims (3)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Plesňový kmeň Tolypocladium varium sp. nov.. CY/93 uložený v NCAIM(P)F pod číslom 001005, produkujúci cyklosporinový antibiotikový komplex.
- 2. Spôsob mikrobiálnej prípravy cyklosporínového komplexu alebo jeho zložiek, cyklosporínu 1, cyklosporínu B a cyklosporínu C, aeróbnou fermentáciou vláknitého plesňového kmeňa vedúcou k biosyntéze vyššie uvedeného antibiotika alebo antibiotík v živnom prostredí obsahujúcom využiteľné zdroje uhlíka a dusíka a minerálne soli a izoláciou vytvorených produktov, vyznačujúci sa tým, že sa plesňový kmeň Tolypocladium varium podľa nároku 1, produkujúci cyklosporínový antibiotikový komplex, kultivuje v živnom prostredí obsahujúcom zdroje uhlíka, organické a anorganické zdroje dusíka a minerálne soli za aeróbnych podmienok pri 25 až 30 °C a prípadne sa vyrobený cyklosporínový antibiotikový komplex alebo jeho zložky izolujú a čistia.
- 3. Spôsob podľa nároku 2, vyznačujúci sa tým, že sa fermentácia uskutočňuje v prostredí obsahujúcom ako zdroj dusíka peptón, síran amónny a tryptón a ako zdroj uhlíka glukózu, maltózu a sorbit.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| HU886497A HU201577B (en) | 1988-12-20 | 1988-12-20 | Process for producing cyclosporin antibiotics |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SK722589A3 true SK722589A3 (en) | 1999-03-10 |
| SK279768B6 SK279768B6 (sk) | 1999-03-12 |
Family
ID=10971727
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SK7225-89A SK279768B6 (sk) | 1988-12-20 | 1989-12-20 | Plesňový kmeň tolypocladium varium a spôsob mikrob |
Country Status (23)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5156960A (sk) |
| EP (1) | EP0379708B1 (sk) |
| JP (1) | JPH0763356B2 (sk) |
| AT (1) | AT393135B (sk) |
| BG (1) | BG60274B2 (sk) |
| CA (1) | CA2006144C (sk) |
| CZ (1) | CZ283557B6 (sk) |
| DD (1) | DD290356A5 (sk) |
| DE (1) | DE58908740D1 (sk) |
| DK (1) | DK174719B1 (sk) |
| FI (1) | FI92603C (sk) |
| FR (1) | FR2640641B1 (sk) |
| GB (1) | GB2227489B (sk) |
| HU (1) | HU201577B (sk) |
| IT (1) | IT1237799B (sk) |
| LV (2) | LV10102B (sk) |
| NO (1) | NO175873C (sk) |
| PL (1) | PL162959B1 (sk) |
| RU (1) | RU1836425C (sk) |
| SE (1) | SE505442C2 (sk) |
| SK (1) | SK279768B6 (sk) |
| UA (1) | UA13320A (sk) |
| YU (1) | YU47100B (sk) |
Families Citing this family (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE69222150T2 (de) * | 1991-01-25 | 1998-01-15 | Fujisawa Pharmaceutical Co | Prozess zur produktion von cyclosporin-a und/oder c |
| EP0507968B1 (de) * | 1991-04-06 | 1995-09-06 | Arzneimittelwerk Dresden Gmbh | Verfahren zur fermentativen Herstellung und Isolierung von Cyclosporin A sowie neue Cyclosporin- bildende Stämme |
| FI92334C (fi) * | 1992-12-30 | 1994-10-25 | Leiras Oy | Menetelmä syklosporiinien tuottamiseksi ja menetelmässä käytettävä uusi Tolypocladium-kanta |
| SI9300303A (en) * | 1993-06-08 | 1994-12-31 | Krka Tovarna Zdravil | Process for isolation of hypolipemic effective substance |
| KR100304324B1 (ko) * | 1994-10-13 | 2001-11-22 | 김용규 | 사이클로스포린a의제조방법 |
| KR100341355B1 (ko) * | 1994-10-14 | 2002-10-25 | 주식회사종근당 | 사이클로스포린a의제조방법 |
| KR0126610B1 (ko) * | 1994-10-18 | 1997-12-29 | 김충환 | 고생산 세포융합변이균주에 의한 사이클로스포린 a의 제조방법 |
| EP0725076B1 (en) * | 1995-02-01 | 2001-06-06 | National Research Development Corporation of India | A process for the preparation of cyclosporin A from tolypocladium species |
| US5854276A (en) * | 1995-06-29 | 1998-12-29 | Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. | Substance WF16616, process for production thereof, and use thereof |
| DE19611094C2 (de) | 1996-03-21 | 1999-06-17 | Dresden Arzneimittel | Verfahren zur Reinigung von Cyclosporin A und/oder verwandten Cyclosporinen aus einem Cyclosporin-haltigen Rohextrakt unter Anwendung chromatographischer Verfahren mit Kieselgel als Adsorbens |
| US5747330A (en) * | 1996-06-05 | 1998-05-05 | Poli Industria Chimica | Antibiotic producing microbe |
| US5709797A (en) * | 1996-06-05 | 1998-01-20 | Poli Industria Chimica S.P.A. | Method of isolating cyclosporins |
| JP2002534370A (ja) | 1998-12-30 | 2002-10-15 | デクセル リミテッド | サイクロスポリンを送達するための分散可能な濃縮物 |
| US7732404B2 (en) | 1999-12-30 | 2010-06-08 | Dexcel Ltd | Pro-nanodispersion for the delivery of cyclosporin |
| DE60023189D1 (de) | 2000-02-29 | 2006-02-23 | Biocon Ltd | Herstellung und reinigung von cyclosporin-a |
| US7696166B2 (en) | 2006-03-28 | 2010-04-13 | Albany Molecular Research, Inc. | Use of cyclosporin alkyne/alkene analogues for preventing or treating viral-induced disorders |
| US7696165B2 (en) | 2006-03-28 | 2010-04-13 | Albany Molecular Research, Inc. | Use of cyclosporin alkyne analogues for preventing or treating viral-induced disorders |
| EP2151450A1 (de) * | 2008-07-29 | 2010-02-10 | Sandoz AG | Verfahren zur Aufarbeitung von mikrobiologisch hergestellten zyklischen Oligopeptiden |
| CN103635188B (zh) * | 2011-04-28 | 2017-03-22 | 细胞基因公司 | 使用pde4抑制剂用于治疗和控制自身免疫性疾病和炎性疾病的方法和组合物 |
| GB201319791D0 (en) * | 2013-11-08 | 2013-12-25 | Sigmoid Pharma Ltd | Formulations |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4117118A (en) * | 1976-04-09 | 1978-09-26 | Sandoz Ltd. | Organic compounds |
| DE2819094A1 (de) * | 1977-05-10 | 1978-11-23 | Sandoz Ag | Cyclosporin-derivate, ihre verwendung und herstellung |
| US4215199A (en) * | 1978-06-05 | 1980-07-29 | Sandoz Ltd. | Antibiotic production |
| SE448386B (sv) * | 1978-10-18 | 1987-02-16 | Sandoz Ag | Nya cyklosporinderivat, forfarande for framstellning av dem samt farmaceutisk komposition innehallande dem |
| US4764503A (en) * | 1986-11-19 | 1988-08-16 | Sandoz Ltd. | Novel cyclosporins |
-
1988
- 1988-12-20 HU HU886497A patent/HU201577B/hu unknown
-
1989
- 1989-12-18 DK DK198906409A patent/DK174719B1/da not_active IP Right Cessation
- 1989-12-19 UA UA4742791A patent/UA13320A/uk unknown
- 1989-12-19 SE SE8904262A patent/SE505442C2/sv unknown
- 1989-12-19 RU SU4742791A patent/RU1836425C/ru active
- 1989-12-20 CZ CS897225A patent/CZ283557B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1989-12-20 GB GB8928715A patent/GB2227489B/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-12-20 CA CA002006144A patent/CA2006144C/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-12-20 US US07/454,005 patent/US5156960A/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-12-20 NO NO895160A patent/NO175873C/no not_active IP Right Cessation
- 1989-12-20 EP EP89123535A patent/EP0379708B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1989-12-20 YU YU241589A patent/YU47100B/sh unknown
- 1989-12-20 JP JP1328529A patent/JPH0763356B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1989-12-20 BG BG90701A patent/BG60274B2/xx unknown
- 1989-12-20 FI FI896157A patent/FI92603C/fi active IP Right Grant
- 1989-12-20 SK SK7225-89A patent/SK279768B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1989-12-20 IT IT22765A patent/IT1237799B/it active IP Right Grant
- 1989-12-20 FR FR898916878A patent/FR2640641B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1989-12-20 DD DD89335977A patent/DD290356A5/de not_active IP Right Cessation
- 1989-12-20 AT AT2891/89A patent/AT393135B/de not_active IP Right Cessation
- 1989-12-20 DE DE58908740T patent/DE58908740D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1989-12-20 PL PL28287689A patent/PL162959B1/pl unknown
-
1992
- 1992-05-04 LV LVP-92-10A patent/LV10102B/en unknown
-
1993
- 1993-06-28 LV LVP-93-708A patent/LV10500B/lv unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| SK722589A3 (en) | Fungi strain tolypocladium varium and microbial process for the production of cyclosporine complex | |
| RU2330069C2 (ru) | Способ получения макролидного соединения и штаммы streptomyces sp., mortierella sp. и micromonosporaceae | |
| RU2112807C1 (ru) | Способ получения иммунодепрессанта циклоспорина а и штамм tolypocladium species свs630.92, продуцирующий циклоспорин а | |
| WO1994016091A9 (en) | A process for producing immunosuppressives and a novel microbial species to be employed therein | |
| US5747330A (en) | Antibiotic producing microbe | |
| KR960016874B1 (ko) | 미생물에 의한 트랜스-4-히드록시-l-프롤린의 제조방법 | |
| JP2003509508A (ja) | ミコフェノール酸およびその誘導体の製造方法 | |
| US4973552A (en) | Staurosporine fermentation process | |
| EP0846699A1 (en) | Substance wf16616, process for production thereof, and use thereof | |
| US5516686A (en) | Fungicidal antibiotic producing Streptomyces sp. NCIMB 40212 | |
| US6521600B1 (en) | Compound, WF002, production thereof and use thereof | |
| KR0143769B1 (ko) | 항균성 폴리펩티드 화합물과 그 제조방법 및 이를 함유하는 약학 조성물 | |
| RU2066687C1 (ru) | Способ получения циклоспорина а, штаммы гриба sesquicilliopsis rosariensis g.arnold - продуценты циклоспорина а, штамм гриба tolypocladium inflatum - продуцент циклоспорина а | |
| RU2120997C1 (ru) | Способ получения 2-амино-4(гидроксиметил)-3а,5,6,6а-тетрагидро-4h-циклопент-[d]-оксазол-4, 5,6-триола и продуцирующие его штаммы актиномицета micromonospora и актиномицета amycolatopsis | |
| EP0525846A1 (en) | Sporomiella intermedia and processes therefrom | |
| SI8912415A (sl) | Mikrobni postopek za proizvodnjo imunosupresivnih antibiotikov |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MK4A | Expiry of patent |
Expiry date: 20091220 |