PT87689B

PT87689B - Processo para a preparacao de novos aminoacilatos de glicerol acetal

Info

Publication number: PT87689B
Application number: PT87689A
Authority: PT
Inventors: Pierre Braquet; Colette Broquet
Original assignee: Scras
Priority date: 1987-06-12
Filing date: 1988-06-09
Publication date: 1992-09-30
Also published as: HK77191A; FR2616326B1; DZ1215A1; AU621298B2; FI882705A; IN172782B; SE8802162D0; DK319188A; ES2009283A6; NZ224936A; FI90421B; GR1000889B; KR960005153B1; KR890000471A; SG73191G; NL192521B; CH674516A5; FR2616432B1; DK319188D0; DE3819829A1

Description

PROCESSO PARA. A PREPARAÇÃO DE

NOVOS AMINOACILATOS DS GLICEROL·

ACETAL

Descrição

A presente invenção refere-se a um processo para a preparação de novos aminoacilatos de glicerol acetal. Os compostos preparados de acordo com o processo da presente invenção são os aminocilatos de glicerol acetal com a fórmula geral I

CH í₂0

- 0 R, \ / ¹c / \

- c

P ^v2

na qual

R representa um grupo fenilo substituido ou um grupo com a fórmula C sendo m um número inteiro de 9 m 2m + 1 a 25,

R₂ representa um átomo de hidrogénio, um grupo fenilo ou um grupo com a fórmula C , ,, sendo n um número n Ali τ x inteiro de 1 a 10, p é um número inteiro de 3 a 10,

representa um grupo heterocíclico que contém azoto, por exemplo piridinio, 3-tiazolínio, quinolínio, isoquinolínio, imidazólio e pirazínio, e significa o anião de um sal inorgânico ou orgânico farmaceuticamente aceitável, ião halogêneo como cloro, bromo, iodo ou aniões de ácido benzoico, ácido acético, ácido metanosulfónico, ácido tartárico.

Os compostos obtidos de acordo com a invenção tem interesse como agentes anti-PAF (PAF significa Factor de Activação de Plaquetas) (Platelets Activating Factor), com actividade correspondente como agentes antianafiláticos, antitrombôticos, agregante antiplaquetes, antibronco constritor, normo-tensivo e anti-isquémico, imunodeprsssores, e activos também contra alteração imune de rim, contra vários choques, contra alergias da pele e úlceras intestinais induzidas por endotoxina, por exemplo.

processo de acordo com a invenção compreende a reacção de um pequeno excesso astequiométrico de um aldeído ou cetona com a fórmula RjC0R2, na gual R-j_ e R₂ têm as significações anteriores, com glicerol num dissolvente não polar, na presença de ácido p-toluenosulfónico e em condi. ções <ae refluxo, a reacção, à temperatura ambiente, do derivado 4-hidroximetil 1,3-dioxolano resultante com um cloreto de

(0 -haloalcanóilo com a fórmula GIGO(CH^) X, na qual p e X têm a significação anterior, na presença de uma base orgânica como trietilamina, e a reacção, à temperatura de 50-80°C, sob circulação de azoto, do composto resultante com a fórmula

R,

R, ,^0C0(CH₉) -X 2 p com um composto heterociclico que contém azoto com a fórmula

0Foram obtidos na forma de uma mistura não separada de diastereoisómeros, mas podem ser separados pelos processos correntes.

S_ste processo é descrito pelo esquema de reacção seguinte.

R -C-R. + CH 0H-CH0H-GH_0H JL ζ! ώ 2*

N Et, + Cl C0(CH„) X p CHC10 R

X

-0 R,

R.

|-o' fases

Looo(ch ) x ζ p

R, ⁺O ><

0.0

2'p ^NV

OCO (CH0 - N^X

processo dé acordo com a invenção é descrito pelos exemplos que se seguem. 0 exemplo 1 está descrito de maneira completa; nos exemplos subsequentes, indicam-se apenas as características dos substituintes e dos compostos resultantes (Salvo indicação em contrário, CCD (TLC) efectua-se sobre placas de gel de sílica).

EXEMPLO 1

Cloreto de 2-heptadecil 2-metil 4-/~~4(N-piridínio) butiriloximet.il7-l, 3-dioxolano ^R1 - ^c17^H35 * ^R2 * ^3'

piridinilo, X - Cl, p=3.

Fase a; Preparação de 2-heptadecil. 2-metil 4-hidroximetil 1, 3-d.ioxolano. ã

Num reactor apropriado despejaram-se 11,1 g (40 mmoles) de 2-nonadecanona, 6 g - o que representa um excesso em comparação com as proporções estequeomátricas de glicerol destilado duas vezes e 0, 6 g de ácido p-toluenosulfónico dissolvidos em 120 ml de tolueno seco. A mistura de reacção foi levada a refluxo com agitação durante 12 horas e a água resultante foi eliminada com o emprego de um aparelho de Dean Stark. Depois de arrefecimento, lavou-se a fase orgânica com 30 ml de solução aquosa a 5% em peso de hidróxido de potássio, e, em seguida, três vezes com a quantidade mínima de água. Depois de secagem sobre sulfato de sódio anidro, separou-se o dissolvente sob pressão reduzida. P_urificou-se depois o resíduo por meio de cromatografia sobre uma coluna de gel de sílica. Eluiram-se sucessivamente a fracção da cetona gue não entrou na reacção (éter de petróleo t éter dietílico 95:5 em volume), e, em seguida, o dioxolano a (éter de petróleo / éter dietílico 85:15 em volume). O dioxolano é um produto viscoso, parcialmente cristalizado. Rendimento 11 g (78%).

rf; 0,18 (éter de petróleo / éter dietílico 70:30 em volume)

IV 3500 cm”¹ (OH)

1100 - 1060 cm”¹ (C-0-).

Fase b: 2-heptadecil 2-mstil 4-(4'-clorobutilriloximetil)

1,3-dioxolano. b

Uma mistura de 6,4 g (18 mmoles)de

2-heptadecil 2-metil 4-hidroximetil 1,3-dioxolano, preparada honforme descrito na fase (a) acima, e 6 ml (45 mmoles) de trietilamina em 15 ml de clorofórmio seco foi adicionado gota a gota a uma solução de 6,25 g (22 mmoles) de cloreto de 4-clorobutirilo em 10 ml de clorofórmio seco a 0°C. H_anteve-se a mistura em agitação durante 12 horas à temperatura ambiente. D_epois da adição de 20 ml de clorofórmio, a mistura foi lavada com solução aquosa IN de hidróxido de sódio, e, em seguida, com água até o pH ser 7. A eliminação do dissolvente deixou um resíduo gue foi cromatografado sobre uma coluna de gel de sílica com éter de petróleo t éter dietilico como eluente, sucessivamente 95:5, em seguida 90:10 e finalmente 80:20 em volume. Obtiveram-se assim 7, 6 g (rendimento 82%) de um produto oleoso gue cristalizou; ponto de fusão 39-40°C. E₃te produto é uma mistura dos dois isómeros cis e trans (a separação destes não é fácil).

rf: 0,45 e 0,37 (éter de petróleo / éter dietilico 80:20 em volume)

IV 1740 cm¹ (OO)

1180 - 116o cm”¹ (C-O-C éter e éster)

RMN 60 MH_Z, CDG1₃, (TMS) í 0.9 (tripleto, 3H, CH₃ de cadeia

1.3 (mult., 35H, 32H + CH^

2.1 (mult., 2H, GO-CH₂-GH₂)

2.5 (tripleto, 2ti, CO-ÇH^)

3.6 (mult., 4H, CH -0 e CH₂C1)

4.2 (mult., 3H, CH/CO e CH-θ).

l

Fase cí Cloreto de 2-heptadecil 2-metil 4-/Ç4‘- (N-piridínio) butlriloximetil? 1,3-dioxolano. ,1 g do composto obtido na fase (b) acima, dissolvidos em 30 ml de piridina, foram mantidos em agitação a 80°C durante 24 horas, numa atmosfera de azoto. Em seguida eliminou-se o excesso de piridina sob pressão reduzida, e purificou-se o resíduo por cromatografia sobre gel de sílica. Eluição com clorofórmio (para recuperação de material de partida que não entrou em reacção), e, em seguida, com clorofórmio / metanol, primeiramente a 90:10, em seguida a 80 : 20 em volume deu 3,8 g do produto em título. Este produto e uma mistura dos dois isómeros cis e trans (a separação destes não ê fácil), rendimento : 40% ao todo (65% para esta fase). P₀nto de fusão 84 - 85°C.

rf : 0,28 (CHCI- / MeOH 70:30, por volume) ^J -1

IV (nujol) 1740 cm

1630 cm¹ (piridina)

-^_1 (C-O-C)

RMN, b : 0.9 1.2

250 MH , z

1200, 1180 cm CDC1.

(tripleto, 3H, CH-j) (singleto largo 30H)

-o

1.4 (doubleto, 3H, -0

CH.) os 2 CH_ dos 3 3 dois diastereosómeros)

1.55	(multipleto,	2H,	-0 >< -0
2.35	(muitipleto,	2H,	CO CH,
2.6	(tripleto, 21	i, CO CH₂)
3.9	(multipleto.	IH,	CH-0)
4	(multipleto,	2H,	ch₂o c
4. 2-3	.6 (2 mult.,	2H,	ch₂o)

^Oil2meros)

5.10 (mult. 2H, CH₂N) - 6 t i piridínio ( 8 (mult., 2H, H_o) ( , h ί 8.4 (mult., IH, H ( Ύ ( 9.6 (doub., 2H )

V*

Espectro de massa:

M - Cl m/z

504 st)

N — (<^2)3 - ⁰⁰2^{H : 166}

EXEMPLO 2

Cloreto de 2-heptadecil 2-metil 4-/~4*-(N-guinolínio) butiril oximetil7 1,3-dioxolano.

Fase ,c: Dissolvem-se 5 g do composto obtido no exemplo 1 (fase b) numa mistura de 20 ml de guinolina e 20 ml de DMSO e aquecem-se a 80°C numa atmosfera de azoto durante 4 dias.

Destilam-se quinolina e DMSO sob pressão reduzida e cromatografa-se o resíduo sobre uma coluna de gel de sílica, (eluente sucessivamente CHC1_, seguidamente CHC1_ / MeOH □ o

95:5). Obtiveram-se 2,5 g do produto desejado na forma de uma mistura dos dois diastereoisómeros. rf: 0,58 (CHC1₃ / MeOH, 70:30)

IV / quinolina

E_spectro de massa:

: 554 : 216.

.d

RMN quinolínio em vez de piridínio.

ã ppm : 7.90 - 8.10 (4H), 8.70 (IH), 8.90 (1K), 10.90 (lH_fí).

EXEMPLO 3

Cloreto de 2-heptadecil 2-nietil 4-/^4/-(N-tiazolínio) butiril ^ximetil/ 1,3-dioxolano.

Fase c: Aqueceram-se 850 mg do produto obtido no exemplo 1 (fase b) numa mistura de tiazole (4 ml) e DMSO (5 ml) à tempera tura de 80°C durante 24 horas. Evaporou-se a mistura de reacçSo em vácuo e cromatografaou-se o resíduo sobre uma coluna de gel de sílica, eluente CKClg / MeOH 50:50 que da um produto viscoso.

rf: 0.34 (CHClg /MeOH 70:30)

RMN tiazolínio em vez de piridínio.

ppm : 8.19 (d : IH), 8.4 (d : IH), 10.90 (sing. IH)

Espectro de massa : M - Cl : 510 m/z.

EXEMPLO 4

Cloreto de 2-heptadecil 4-/~4(N-piridínio) butoriloximetll/

1, ,3-dioxo.lano.

^R1 ~ £17^35' ^R2 ⁼ ) =pirrdinilo, X = Cl, p =* 3.

b rf : 0.17 (éter de petróleo / éter dietílico 30:70 em volume)

3. b rf : 0.37 (éter de petróleo / éter dietílico 70:30 em volume)

I. rf : 0.16 (clorofórmio / metanol 70:30 por volume)

-ο

I. RMN em vez de CH» a 1,4 (-0 b 3 multipletos centrados sobre 4,9 ppm (-0

H)

E_gpectro de massa: M - Cl : 490 m/z.

EXEMPLO 5

Cloreto de 2-heptadecil 4-/ 4(N-guinolínio) butiril oxi metil? 1,3-dioxolano ^R1 ^{= G}17^35^z R^ ^a Η, —N= guinolínio, rf : 0.48 (clorofórmio / metanol 70:30 em volume).

EXEMPLO 6

Cloreto de 2-heptadecil 2-(n-propil) . 4-/~4(N-piridínio) butiril oxi metil?!,3-dioxolano.

r_x β C_l7H₃₅, R₂ = n-propilo, -N « piridinilo, X » Cl, p = 3.

c rf : 0.23 (éter de petróleo / éter dietílico 70:30 em volume) c rf : 0.38 (éter de petróleo / éter dietílico 80:20 em volume)

I rf : 0.20 (clorofórmio / metanol 70:30 em volume) c

I RMN em vez de CEL em 1.4 C 3

-o m₂-

ca₂-)

1.55 (mult. 4H

1.2 (3 2íi)

0.9 (tripleto, 6H, 2Cíí/

Espectro de massa : M - Cl : 532 m/z.

EXEMPW 7

Cloreto de 2-heptadecil 2-metil 4-/~5¹-(N-piridínio) pentanoil oximetil? 1,3-dioxolano.

R_x = C₁₇H₃₅, R₂ » CH₃ , -N = piridinilo, X = Cl, p =* 4.

rf í 0,23 (clorofórmio / metanol 70:30).

EXEMPLO 8

Cloreto de 2-(3,4,5-trimetoxi fenil) 2-metil. 4-/~4(H-piridínio-butiriloximetil/ 1,3-dioxolano.

= piridinilo, X p = 3.

Cl>

d rf : 0,32 (clorofórmio / metanol 98:2 em volume)

3. d rf s 0, 61 (clorofórmio / metanol 98:2 em volume)

I_n rf : P, 34 (clorofórmio / metanol 60:40 em volume) d

IV 1735 (C=O)

1610 (piridina)

1590 (benzeno)

2740 (OCK₃) * 1

I, RMN em vez da cadeia R, d 1

1.5 ppm (m, 3K, -C^x GH^ para R,,

3.7 (sing, 911, OGH^)

6.8 (2H. arom.)

E_spectro de massa : M - Cl : 432 m/z.

EXEMPLO 9

Brometo de 2-heptadecil 2-metil 4-/~6'-(H-piridínio.) hexanoiloxlmetil? 1,3-dioxolano

= piridinilo, X - Br, p « 5.

Fase b : Brometo de 2-heptadecil 2-metil 4-(6'-bromo hexanolloximetilj 1,3-dioxolano.

Seguindo o procedimento descrito no exemplo 1, com o emprego de cloreto de 6-bromo-hexanoilo, obteve-se o produto desejado foi obtido na forma de um pro duto viscoso (rendimento 82%) rf : 0,57 (éter de petróleo / éter 80:20).

fase c : seguindo o procedimento descrito no exemplo 1, ob- | i

teve-se o produto desejado, sob a forma de um pro-} duto viscoso (rendimento 70%). !

i rf : 0,36 (CHC1₃ /MeOH 70:30) \

IV 3450 cm^-1 (água residual)

00 1740, 9 C-O-C 1180, 9 piridina 1640 cm^-1 í

I

RMN 500 MH CDCl_q, £)

Z 3

0.85 (tripleto, 3H, CH ) ; 1.25 (sing. largo 30H) : i í

-ο.

1.35 (d, 3H,

CH2.1 (mult., 4.35 (mult.,

Ϊ, +

COCH^) ; 2 2H, GH₂O, Z + E)

E) ; 1.45 (mult., 2H, GH₂ & ) i 35 (mult., 2H, OOGH₂) ,· 3.70 e ; 4 (mult. 3H, CI^OGO e H-C-0) ;

Θ

5.05 (tripleto, 2H, Cí-^N).

piridínio 8.1 (tripleto, 2H, Ηβ) ; 8.6 (tripleto, IH, Hf) ,·

9.5 (d : 2H, H_a).

U. V. (Etanol) log£ 3.65 λ 258.8 nm. Espectro de massa :

M - Br ιη/ζ

532

194.

EXEMPLO, 10

Brometo de 2-heptadecil 2-metil 4-/~6^l-(N-quinolínio.)_ hexanoi-j loxlmetil).....1,3-dioxolanp !

rf : 0,60 (CHC1₃ / MeOK 70:30)

IV Quinolínio 1650, 1630, 1600 cm^-1

U. V. (Etanol) logfc 4.53 X 235.4 nm

2.18 λ 316.5 nm

RMN quinolínio em vez de piridínio.

10.70 (IH, Hcx).

Espectro de massa :

M - 3r m/z í 582

Brometo de 2-heptadecil 2-metil 4-/ 6(N-isoquinolinio) hexanoiloximetil).. 1, 3-dioxolano.

fase c : Emprego de . isoquinolina em vez de guinolina.

rf : 0,55 (CHC1₃ / MeOH 73:30)

IV isoquinolina 1650, 1610, 1590 cm \

RMN isoquinoliíno em vez de quinolínio.

: 5.15 (tripleto, 2H, GH N) ; 7.95 - 8.40 (4H) ; 8.80 (2H); 11.05 (1H).

E_spectro de massa í 11 - Br : 582 m/z.

EXEMPLO 12

Brometo de 2-heptadecil 2-mefil 4-/ 11/-.(N-piridínio nndecanoiloximetil) 1,3-dioxolano.

^R1 ~ ^C17^H35' ^R2 = ^GH3 « piridinilo, X = Br, p = 10.

fase b : 2-heptadecil 2-metil 4-(11'-bromo undecanoiloximetil) 1,3-dioxolano.

Seguindo o procedimento descrito no exemplo 1, empregando cloreto de 11-bromo undecanoilo, obteve13

-se o produto desejado.

Ponto de fusão : 52°C (rendimento 60%) rf : 0,26 (éter de petróleo / éter 85:15).

fase c ponto de fusão : 92°G rf : 0,45 (CHC1₃ / MeOH 70:30) Espectro de massa: M - Br : 602 m/z.

EXEMPLO 13

Brometo de 2-heptadecil 2-(n-propil) 4-A6¹-(H-piridínio) hexanoilmetil 7 1,3-dioxolano.

-N.

^R1 ^{= C}17^K35' ^R2 “ = piridinilo. X = Br, P = 5.

rf : 0.44 (CHC1₃ / MeOH 70:30)

Ponto de fusão : 76°C

E_spectro de massa : M - Br : 560 m/z.

EXEMPLO 14

Brometo de 2-nonil 2-metil 4-/ 6 ^/N-piridínio.) hexanoiloximetil) 1,3-dloxolano.

^R1 = ^O9^H19- ^R2 “ ^3piridinilo. X = Br, p = 5.

fase b rf : 0,50 (éter de petróleo / éter 80:20) fase c rf ϊ 0.30 (CHC1₃ / MeOH 70:30)

Espectro de massa : ll - Br : 4 20 m/z,

TOXICO LO GIA

Os compostos da presente invenção foram administrados a radinhos para a determinação da LD^ aguda. Para todos os compostos da invenção, a foi superior a

300 mg/kg (IP ou SC) e 600 mg/kg (PO).

FARMACOLOGIA

Pr-ovou-se o interesse farmacêutico dos compostos da invenção com as seguintes experiências farmacêuticas:

§) - Inibição da agregação de plaquetas em coelho da nova

Zelândia.

A experiência efectuou-se sobre plaquetas com plasma de coelhos da Nova Zelandia.

Tiraram-se amostras de sangue da artéria auricular e colocaram-se num tampão citado (3,8%; pH 7,4); o sangue foi centrifugado ulteriormente durante 15 minutos a 1200 RPM. A amastra experimentada foi preparada em DMSO, em seguida despejada sobre plasms rico em plaquetas durante 1 minuto, e, em seguida, adicionou-se uma dose de 2, 5 nM de PAF.

A determinação efectua-se num aparelho Cronolog Coultronics, que determina a percentagem de transmissão correspondente à altura máxima do pico antes da desagregação.

A percentagem de variação da inibição relativamente à percentagem de transmissão é calculada (controlo: DMSO puro). Este método foi descrito pormenorizadamente em LABORAIORY Ii?L TIGATIONS, Vol. 41, N2 3, p. 275,

1979, J2AN-PIERRE CAZENAVS, Dr. MED., JACQUES LENVENISI Dr. MED., e J. PRASER MUSTARD, M. D., A agregação de Plaquetas de Coelhos por Factor de Activação de Plaquetas é Independente da Reacção de Libertação e do Percur·

so Araquidonato e é Inibida por Medicamentos Membrana-Activos .

Os resultados demonstram que os compostos inibem a agregação induzida por 2,5 nM de PAF. Cinco experiências efectuadas em cinco coelhos di -nos calcular a IC_r_ dos diversos compostos test de regressão linear.

zida

Inibição de agregação por PAF em plasma rico em plaquetas de 'ersntes permitira; empregando o de plaquetas indu· coelhos

Exemplo N²	1¾ PRP ............. 2.2 .	(M) io⁶
NS	1 ..........
NS	2 ..........	............. 1.2 .	IO^-6
Ns	3 ..........	............. 2.15 .	io-⁵
NS	4 ..........	............. 7	10 ~ -6
NS	5 ..........	............. 3.1 .	10 -6
NS	6 ..........		10
NS	7 ..........	............ 5	io^-6 -5
NS	8 ..........	1.13 .	10
N²	9 ..........	............. 4.04 .	io-7
NS	10 ..........	............ 3.03 .	10“ ⁷
NS	12 ..........	............ 3.12 .	io-⁵— 6
NS	13 ..........	............ 1.73 .	10
Ns	14 ..........	............ 1.46 .	10 ⁶

- LIGAÇÃO

MATERIAL E MÉTODO —

AZ H__/-PAF triciada sintética utiliza-4 da estava em solução em etanol com uma actividade específica de 59,5 ci/mmoles. PAF e liso-PAF não marcados foram solubilizadas em solução de etanol e armazenadas a -80°C. Os compostos foram solubilizados em DMSO.

Preparações de membranas de plaquetas

Extraiu-se sangue completo de coelho (6 volumes) da artéria auricular central em 1 volume de solução ACD (ácido cítrico 1,4 g, citrato de sódio 2,5 g, Dextrose 2 g por 100 ml de K^O) e centrifugou-se a 150 g durante 15 minutos. 0 plasma rico em plaquetas (PRP) foi separada cuidado·· samente e centrifugado durante 15 minutos a 1000 g. A película de plaquetas foi depois lavada três vezes: duas vezes em tampão Tris-HCl 10 mM, pH 7,4 gue continha NaCl 150 mM,

MgCl^ 5 mM, EDTA 2 mM e a última vez no mesmo tampão mas isento de sódio,

A pílula de plaquetas foi suspensa de novo neste último tampão, con gelada rapidamente em azoto líquido e liquefeita le ntamente à temperatura ambiente pelo menos três vezes, conforme descrito por T.V. Shen et al.,.

As plaquetas lisadas foram centrifugadas a 100 000 g durante 30 minutos numa BECKMAN modelo L8.55 ultra centrífugo (rotor 50.2 Ti). 0 homogenato de membrana de plaquetas foi armazenado a -80°C e utilizado dentro de duas semanas sem alterações observáveis nas características ligantes aéter-PAF.

conteúdo de proteína foi determinado pelo método de Lowry, utilizando albumina de soro de bovino como padrão.

Experiência de ligação

Açjicionaram-se 60 a 100 _zug de proteínas membrana até um volume final de 1 ml em tubos de plástico gue continham 1 nM / H_/-PAF em tampão Tris-HCl 10 mM pH 7 que continham albumina de soro de bovino a 0,025% e incubaram-se com ou sem PAF nSo marcado ou antagonistas-PAF. A incubação efectuou-se durante 1 h 30 m a 0°C. 3eparou-se a ligação / H_/-PAF do / 3_T. -, -PAF livre por meio de filtração imediata através de filtros de fibra de vidro GF/C whatman sob vácuo (sistema Brandel). A reacção e os filtros foram lavados três vezes com 5 ml de tampão gelado. Os filtros foram depois colocados em frasquinhos de polietileno cheios com 10 ml de fluído de cintilação líquida e mediu-se a radioactividade por meio de um contador IKB β com eficiência de 45%.

A ligação não específica foi determi— fi nada na presença de 10 M do PAF não marcado. A ligação específica foi calculada por meio da substracção de ligação não específica da ligação total. A inibição por compostos na —3 — ligação / HJZ-PAF específica foi determinada em inibição percentual pela equação:

³H-PAF ligação (ligação total 3H-PAF)- na presença de compostos inibição %= -——---- χ 100

H-PAF ligado especificamente

Exemplo
N2.	1
N2	9
N^e	10
N2	14

IC

4.5 .	10
3.5 .	10-⁸
3.5 .	IO^-8
6,1 .	10“ ⁷

³ - BRONOOOONSTRUÇÃO, hSUCOPSNIA E TROMBOCITOPENIA INDUZIDAS

POR PAF NA 00BAIA

MATERIAIS E MÉTODOS

Anestesiaram-se cooaias machos (400-500 g) com uretano (1, 5 g/kg : IP) antes de serem tragueotomizadas e ventiladas com uma bomba respiratória (^TJGO BASILE) (70-80 exalações/minuto, 1 ml de ar / 100 g / oxalação) para abolir a respiração espontânea efectua-se um pneumotórax. A resistência à dilatação foi medida com um transmissor de pressão (UGO BASILE) contra uma pressão inicial de 10 cm de acordo com Konzat e Rossler. Os animais foram repartidos em grupos e foram tratados ou não com os compostos da invenção (0,05, 0,1, 0,5, 1 e 5 mg/kg). Os produtos foram administrados IV 1 hora antes de desafio com PAF.

Os animais foram ensaiados com várias doses de PAF (30-100 n/kg) administradas intravenosamente, e registaram-se as variações da resistência à dilatação.

Colheram-se amostras de sangue antes e 1, 5 e 10 minutos depois do desafio com PAF. Diluiram-se 40 μΐ de sangue em 10 ml de isoton (Coultronics, Franca); lisaram-se eritrócitos com Zapoglobin (França) antes de se contarem leucócitos num contador coulter. Para determinar o numero de plaquetas diluiram-se 40 _xul de sangue em 2 ml de isoton e centrifugou-se a 100 rotações por minuto dutrante 30 segundos, colheram-se 100 μΐ do sobrenadante e diluiram-se de novo em 10 ml de isoton antes da contagem num contador coulter.

Quadro Ns 1 : Efeitos do brometo de 2-hêptadecil 2-metil

4-/“6'-(N-piridínio) hexanoiloximetil/ 1,3-dioxolano sobre broncoconstrição PAF-induzida

	Doeses mg/kg IV	n	percentagem de Broncoconstrição	Variação Percentual
Controlo	-	8	79.8 +/- 3.22	-
Composto	5	3	3.5 +/- 1.53	- 95.5
do
exemplo	1	4	19.1 +/- 10.51	- 76.1 ífcfc*
0.5	6	23.5 +/- 7.15	- 70.4
n2
	0.1	6	43.S +/- 14.77	- 45.1
9
	0.05	3	79.0 +/- 9.27	- 1.0 NS

LEGENDA DE TODOS OS . -UADROSí

NS : Não Significativo >lí : p <’ 0.05 >fc>fe : p < 0.01 *** í p 0.001

Quadro 2;

Efeitos de brometo de 2-heptadecil 2-metil-4/_ 6 ’-(N-piridínio) hexanoiloximetil7 1,3-dioxola sobre leucopenia PAP-induzida no

	Doses mg/kg IV	n	Tempo (mn)	Percentagem de diminuição de número de· leucócitos	Variação percentual
Controlo		8	1	40.8 +/“ 7.18	-
8	5	29.2 +/- 10.89	-
8	10	33.5 +/“ 5.04	-
Compostc do exemplo Ns g	5	3	1	16.5 +/ 2.42	- 59.6 *
3	5	15.9 +/“ 0-99	- 45.5 NS
3	10	18.7 +/“ 5.08	- 44.2 NS
1	4	1	3.5 +/- 12.60	- 91.4 **
4	5	2.'9 +/ 10.51	- 90.1 *
4	10	1.σ +/“ 22.62	- 97.0 **
0.5	6	1	34.6 +/- 6.35	- 15.2 NS
6	5	19.0 +/“ 6.42	- 34.9 NS
6	10	14.6 +/- 5.36	- 56.4 NS
	0.1	6	1	41.8 +/- 6.50	+ 2.5 NS
6	5	31.9 +/“ 4.88	- 9.2 NS
6	10	33.5 +/- 4.65	0.0 NS
		3	1	45.3 +/“ 5.70	+ 11.0 NS
0.05	3	5	21.6 +/“ 3-42	- 26.0 NS
	3	10	14.2 +/“ 17.30	- 57.6 NS

Quadro NS 5: Efeitos de brometo de 2-heptadecil 2-metil-4/“6'(N-piridínio) hexaoiloximeti/7 1,3-dioxolano sobre trombocitopenia PAP-induzida

	Doses mg/kg IV	n	Tempo (mn)	Percentagem de diminuição de números de leucócitos	Variação percentual
Controlo		8	1	40.8 +/- 7.18	-
8	5	29.2 +/- 10.89	-
8	10	33.5 +/ 5.04	-
Composto do exemplo	5	3	1	16.5 +/- 2.42	- 59.6 *
3	5	15.9 +/“ 0.99	- 45.5 NS
3	10	18.7 +/“ 5.08	- 44.2 NS
1	4	1	3-5 +/- 12.60	- 91.4 **
4	5	2.9 +/“ 10-51	- 90.1 *
4	10	1.·σ +/- 22.62	- 97.0 **
0.5	6	1	34.6 +/“ 6.35	- 15.2 NS
6	5	19.0 +/~ 6.42	- 34.9 NS
6	10	14.6 +/“ 5.36	- 56.4 NS
NS 9	0.1	6	1	41.8 +/- 6.50	+ 2.5 NS
6	5	31.9 +/- 4.88	- 9.2 NS
6	10	33.5 +/“ 4.65	0.0 NS
		3	1	45.3 +/~ ⁵·70	+ 11.0 NS
0.05	3	5	21.6 +/- 3.42	- 26.0 NS
	3	10	14.2 +/“ 17.30	- 57.6 NS
- 22 -

Quadro N2 4: Efeitos de brometo de 2-heptadecil 2-metil 4-2Γ6¹ -(N-quinolínio) hexanoiloximetil/

1,3-dioxolano sobre broncoconstrição PAF-indozida

	Doses mg/kg IV	n	Percentagem de Broncoconstrição	Variação Percentual
Controlo	-	6	90.8 +/- 0.95	-
Composto	1	5	8.1 +/- 2.91	- 91.1 Xafefc
d exemplo	0.5	5	25.1 +/- 6.53	- 72.4
NS 10	0.1	5	-30.4 +/- 13.78	- 11.5 NS

Quadro N9 5: Efeitos de brometo de 2-heotadecil 2-metil 4-/6'-(N-quinolínio) hexanoiloximetil_/

1,3-dioxolano sobre leucopenia PAP-induzida

	Doses mg/kg/lV	n	Tempo (mn)	Percentagem ' de diminuição de número de leucócitos‘	Variação Percentual
Controlo	-	6	1	41.4 +/ θ·0
6	5	28.7 +/ 6.9
6	10	26.9 +/“ 10-1
Composto do Exemplo 10	1	5	1	24.1 +/“ 6.8	- 41.0 NS
5	5	9.3 +/” 9-4	- 67.6 **
5	10	8.9 +/“ 13-2	66.9 **
Q.5	5	1	17.0 +/- 12.9	- 58.9 *
5	5	9.0 +/ 11-8	- 68.6 **
5	10	- 7.6 +/- 17.5	+ 128.3 NS
0.1	5	1	38.8 +/“ 6.3	+ 6.3 NS
5	5	38.9 +/“ 5.7	+ 35.5 NS
5	10	41.2 +/“ 6.5	+ 53.2 NS

ti.

Quadro NS 6; Efeitos de brometo de 2-heptadecil 2-metil 4-/~6’-(N-quinolínio) hexanoiloximetij/

1,5-dioxolano sobre trombocitopenia PAP-induzida

	Doses mg/kg/lV	n	Tempo (mn)	Percentagem de diminuição de número de leucócitos	Variação Percentual
Controlo	-	6	1	65.3 +/ 3.5	-
6	5	49.1 +/- 4.8
6	10	48.5 +/“ θ·5
Composto do exemplo N2 10	1	5	1	19.3 +/- 1-4	- 58.3 ***
5	5	22.1 +/“ 2.5	- 55.0 **
5	10	19.4 +/ 3-6	- 60.0 **
0.5	5	1	26.2 +/- 6-3	- 59.9 **
5	5	29.8 +/ 1-7	- 39.3 *
5	10	32.1 +/“ 5.8	- 33.8 *
0,1	5	1	51.1 +/ 12.1	- 21.7 NS
5	5	49.1 +/“ θ·®	0 NS
5	10	45.0 +/“ 9·7	- 7.2 NS

- 24A -

RESULTADOS

Brometo de 2-heptadecil 2-metil 4-/ 6'-(N-piridínio) hexanoiloximetil/ 1,3-dioxolano (0,5, 1 e 5 mg/kg IV) e brometo de 2-heptadecil 2-metil 4-/ 6'-(N-quinolínio) hexanoiloximetil/ 1,3-dioxolano (0,5 e 1 mg/xg IV) inibem a broncoconstrição PAF-induzida e a trombocitopenia PAF-induzida na cobaia.

4- BRONGOGONS TRIÇÃO,. LEUOOPSNIA E TROMBOCITOPENIA INDUZIDAS

POR ANT1GÉNIQ EM.....COBAIAS. SENSIBILIZADAS.. PASSIVAx^iENTE GOM

SORO HETERÓLOGO

A injecção intravenosa de ovalbumina a cobaias sensibilizadas passivamente com anti-soro antiovalbumina de coelho induz uma broncoconstrição associada com uma leucopenia e uma trombocitopenia. Esta reacção anabilácti ca afigura-se devido à libertação de histamina e à geração de metabólicos ácidos araquidónico (prostaglandina, tromboxano A„ e leucotrienos). No cobaia, a libertação destes autocóides é medida principalmente via imunoglobinas da classe IvC.

MÉTODO

A_nimais:

. Cobaias machos Hertley, Charles Rivcr (450-550 g)

Procedimento de imunização:

. Injecção intravenosa 18 h antes do desafio com o antigéneo de 0,5 ml/kg de 1/2 diluição de anti-soro antiovaJ bumina de coelho.

Desafio é obtido por;

. Ovalbumina, 0,75 mg/kg . Injecção intravenosa do antigéneo num volume final de 1 ml/xg, . Veículo, NaCl 0,15 M.

- Os compostos são administrados por via oral num volume de 2,5 ml/kg, 1 h antes de desafio com o antigéneo. D_epois de anestesia por meio de injecção intraperitoneal de carbamato de etilo (1,5 g/kg) num volume de 10 ml/kg. Parâmetros verificados e expressão dos dadosí a - Broncoconstrição . Broncoconstrição induzida por antigéneo em mm (A), . Broncoconstrição máxima em mm (3)

A A percentagem de broncoconstrição é calculada como segue:

A x 100

B

Sfectuaram-se contagens de neutrófilos e plaquetas 1 minuto antes e 1, 5 e 10 minutos depois do desafio. As variações foram expressas em percentagens calculadas sobre os valores obtidos um minuto antes do desafio.

Utilizou-se o seguinte equipamento: ugo Basile, Comerio ITALIA, . Ventilador de roedores ref. 7025 . Transmissor de broncospasmo ref. 7020 . Registador de Dois Ganais GBMINI ref. 7070

Coultronics, FRANCA.

. C_ontador Coulters Z 3 I

Quadro N^a 7* Efeitos de brometo de 2-heptadecil 2-metil 4/6· -(N-piridinio) hexanoiloximetil)

1,3-dioxolano sobre broncoconstrição induzida por antigéneo

	Dose mg/kg IV	n	Percentagem de bronco- constrição	Variação Percentual
Controlo	-	6	71.9 +/- 14.2	-
Composto do Exemplo N2 9	5	8	51.3 +/- 14.2	-28.7 NS

- 27 Quadro NQ 8;

Efeitos de brometo de 2-heptadecil 2-metil 4-/ 6'-(N-piridínio) hexanoiloximetil/

1,3-dioxolano sobre leucopenia induzida por antigéneo

	Dose mg/kg/IV	n	Tempo (mn)	Percentagem de diminuição no número de leucócitos	Inibição Percentual
Controlo	-	6	1	- 11.8 +/- 5.1	-
6	5	- 39.6 +/- 9.5
6	10	- 53.9 +/- ⁷-l
Composto do exemplo —N.£....9........	5	8	1	- 15.6 +/~ 6.6	+ 32.0 NS
8	5	- 8.7 +/ IO·⁷	- 78.0 *
8	10	- 12.3 +/“ 14.1	- 77.2 *

Quadro N2 9·’ Efeitos de brometo de 2-heptadecil 2-metil 4-/”6'-(N-piridínio) hexanoiloximetil/ 1,3-dioxolano sobre trombocitopenia induzida por antigéneo

	Dose mg/kg/lV	n	Tempo (mn)	Percentagem de diminuição no número de leucócitos	Inibição Percentual
Controlo	-	6	1	- 6.8 +/- 2.7	-
6	5	- 39.7 +/“ 12.5
6	10	- 26.1 +/- 8-1
Composto do exemplo N° 9	5	8	i '	f · 0.3 +/ 7.9	- 104.4 NS
8	5	- 3.5 +/~ 3.1	- 91.2 **
8	10	- 15.7 +/“ 6.2	- 3 9.8 NS
- 28 -

RESULTADOS

O brometo de 2-heptadecil 4-/^-6*-(N-piridínio)hexanoiloximetil7 1,3-dioxolano (5 mg/kg IV) antagoniza leucopenia e trombocitopenia induzidas por antigéneo sem diminuir significativamente broncoconstrição induzida por antigéneo.

⁵ “ ACÇÃO SOBRE HIPOTENSÃO FAF-IUDUZIDA HO RATO AíIESTESIADO

MATERIAIS E MÉTODO:

Ratos Spragua Dawley machos (Estação de criação Charles River) (250-300 g) foram anestesiados com carbamato de etilo com a dose de 1, 2 g/kg IP.

A injecção intravenosa de PAF provoca uma hipotensão dependente de dose. Os efeitos de brometo de 2-heptadecil 2-metil 4-/ 6'-(N-piridínio) hexanoiloximetil/

1,3-dioxolano e brometo de 2-heptadecil 2-metil 4-/ 6'-(U-quinolínio) hexanoiloximetil/ 1,3-dioxolano foram procurados contra hipotensão PAF-induzida, em tratamentos curativos. A hipotensão foi provocada por uma só dose de PAF (1 jug/kg) numa injecção intravenosa, directamente na veia pénis, num volume de 0,1 ml/100 g. Administraram-se medicamentos na hipotensão máxima, isto é, 3 minutos .depois da injecção de PAF.

Parâmetros medidos e expressão dos resultados:

Mediram-se as tensões arteriais sistólica e diastólica (mmHg). Os valores foram expressos numa média +/- SEM nas curvas que se seguem.

Aparelho de medida:

. Transmissor Gould Ρ^θ para medir tensão arterial, . Per fusor Braun, . Registador poligráfico Gould 8000 S.

- ANTAGONISip DA AGREGAÇÃO DE, LEUCÓCITOS POLIMORFONUCIEAR

INDUZIDA POR PAF

Obtiveram-se leucócitos polimorfonucleares (PMNs) conforme descritos por A. C. Ford-Hutchinson et al. (Br - J. Pharmacol. 76, 367-371, 1982). P^epararam-se suspensões de células ( < 90% PMNs) a partir de exudatos peritoneais obtidos depois de uma injecção de 5 ml IP de caseinato de sódio a 12% (p/v) a ratos Wistar machos, peso corporal 300 g.

Depois de centrifugação, lavaram-se as células com Hanks e voltaram a ser postas em suspensão em meio MEM/Hepes 30 mM (PM = 7,4) com uma concentração de 10 células/ml. Juntou-se citocalasina 3 (5 ug/ml) 10 minutos an de iniciar a agregação para amplificar a agregação PMNs. Mediu-se a transmitância de luz através da suspensão de células (400 _zul) mantendo em agitação magnética a 900 r.p.m. com um agregómetro de feixe duplo (Chronolog Corp. Coultronics).

produto de controle é a suspensão de células diluída a 20% da contagem de células com MEM e a diferença representa 100% de transmitância. Registou-se continuamente a variação da transmitância, gue ocorra guando sa junta PAF.

A^icionaram-se medicam ntos solubilizados em MEM/H_epes (4 _zul) à suspensão PMNs 2 minutos antes da adição de PAF.

RESU3T APOS

PAF 10 ° induziu 55 a 70% de agregação desta suspensão PMNs.

B_rometo de 2-heptadecil 2-metil 4-/ 6‘-(N-piridínio) hexanoiloximetil__/ 1,3-dioxQlano e brometo de

II ΙΙ··μΧ de 2-heptadecil 2-metil 4-/-6- -(N-quinolínio) hexanoiloximetil

1,3-dioxolano inibem dependentemente de dose esta agregação com !^5_θ3 respectivas:

. brometo de 2-heptadecil 2-metil 4~/6'-(n_

- . -7

-piridínio) hexanoiloximetil/ 1,3-dioxolano: 5 x 10 M . brometo de 2-heptadecil 2-metil 4-/6'-(N-quinolínio) hexanoiloximetil) 1,3-dioxolano: 10^ ^w

- INIBIÇÃO, DB MOBILIZAÇÃO DS CÁLCIO LIVRE INTRACIIOSÓLICO

INDUZIDA POR PAF SM PLAQUETAS DE COELHO LAVADAS

Extraiu-se sangue da artéria auricular do coelho sobre ácido cítrico/citrato de sódio/dextrose e anticoagulante e prepararam-se as plaquetas lavadas de acordo com Ardlie et al., Brit. J. Pharmacolpgy, 1,9, 7-17, 1970, Foram incubadas com sal acetilsalicílico (100 _zUíí, 30 mintos) para impedir a agregação induzida por tromboxano. Foram depois carregadas com o indicador de cálcio fluorescente corante quin 2 por meio de incubação com aceto-metiléster guin 2 (15 ,uM em DMSO, 20 minutos à temperatura ambiente) gue penetra na membrana de célula e depois de hidrolisada fica apanhada dentro da plaqueta. Incubaram-se previamente msdi camentos com plaquetas durante 15 minutos simultaneamente com mistura CP/CPK que destrói ADP segregado.

Efectuou-se depois a medição fluorescente (excitação A - 339 nm, emissão/l - 492 nm) depois de adição de PAF àsuspensão. A intensidade de fluorescência é proporcional ao nível de cálcio livre citosólico /“Ga^J/ i que pode ser quantificado conforme descrito por Tsien et al. J. Cpll. Bjol., 94, 325-334, 1982.

RESULTADOS por PAF 2 x 10

A estimulação de plaquetas induzida

-9 t - 2+ —

M aumentou o nível / Ca _/i de cerca de - 32 150 mM no estado de repouso para 400-600 nM.

Brometo de 2-heptadecil 2-metil 4-/~6‘-(N-piridínio) hexeaoiloximetil/ 1,3-dioxolano e brometo de

2-heptadecil 2-metil 4-/^6'-(N-guinolínio) hexanoiloximeti±7 —7

1, 3-dioxolano a 5 x 10 M inibem totalmente a jnobilisação — 2*4“ —.

/ Ca _/i induzida por PAF. A 5 x 10 M, a inibição do efei to de PAF q respetivamente 44% para brometo de 2-heptadecil 2-metil 4-/ 6'-(N-piridínioJhexanoiloximetil/l,3-dioxolano e 75% para brometo de 2-heptadecil 2-metil 4-/ 6'-(N-quinolí nio) hexanoiloximetil/l,3-dioxolano.

POSOLOGIA

Em terapêutica humana, por administração oral, as doses diárias são de 0,1 a 0,5 mg em comprimidos ou cápsulas com um revestimento enterico; por via IV, as doses diárias correspondentes são de 0,01 a 0,05 mg. 0 tratamento dura em geral de 2 a 6 semanas.

Claims

REIVINDICAÇÕES _ lâ P_rocesso para a preparação dos novos aminoacilatos de glicerol acetal com a fórmula geral I

CH„— 0 R ² \ /¹c / \

CH — 0

CH₂O co(ch₂) na qual

Rj- representa um grupo fenilo substituido ou um grupo com a fórmula C_mH2m + 1' sendo m um numero inteiro desde 9 até 25,

R2 representa um átomo de hidrogénio, um grupo fenilo ou um grupo com a fórmula C_n ^K2n + 1 ^sen<3° ^{n um} numero inteiro desde 1 até 10, p é um numero inteiro d esde 3 até 10, ©^

-NL ) representa um grupo heterocíclico gue contém azoto, por exemplo pdridínio, 3-ttiazolinio, quinolínio, isoquinolinio, imidazólio e pirazínio, e

X significa o anião de um ácido inorgânico ou orgânico farmaceuticamente aceitável, um ião halogéneo como por exemplo cloro, bromo, iodo ou aniôes de ácido benzóico, ácido acético, ácido metanosulfónico, ácido tartárico, sob a forma dos eeus isómeros separados ou de qualquer mistura dos mesmos, caracterizado por compreender a reacção de um pequeno excesso estequiométrico de um aldeído ou cetona com a fórmula R^OORg, qual R^ e R₂ tem as significações anteriores, com glicerol num dissolvente não polar, na presença de ácido p-tolueno sul fónico e em condições de refluxo, a reacção , à temperatura ambiente, do derivado 4-hidroximetil 1., 3 -dioxolano resultante com um cloreto de -haloalcanoilo com a fórmula C1C0 (GH₂) X, na qual p e X tem as significações anteriores, na fjressnça de uma base org*nica como, por exemplo, trietilamina, e a reacção, a 50 - SO°C, numa atmosfera de a ,oto em circulação, do composto resultante com a fórmula t

R

L-ooo(chJ -X z p com um composto heterociclico gue contém azoto com a formula