NL8801484A

NL8801484A - Aminoacylaten van glycerolacetaal.

Info

Publication number: NL8801484A
Application number: NL8801484A
Authority: NL
Original assignee: Scras
Priority date: 1987-06-12
Filing date: 1988-06-09
Publication date: 1989-01-02
Also published as: DK319188A; GR880100363A; CH674516A5; AU1756288A; TNSN88057A1; GR1000889B; BE1000700A4; FR2616326B1; US4921865A; KR960005153B1; OA08879A; NZ224936A; FI90421B; IE881752L; ATA152988A; KR890000471A; DE3819829A1; IN172782B; NO882564D0; FI882705A0

Description

- 1 - £ s.

Aminoacylaten van glycerolacetaal.

ί ... . .

: De uitvinding heeft betrekking op nieuwe aminoacylaten van glycerolacetaal, op een werkwijze voor de bereiding ervan en op therapeutische preparaten die ze bevatten.

5 De uitvinding voorziet in aminoacylaten van glycerol acetaal met de algemene formule 1 van bijgaand formuleblad, waarin Rj een gesubstitueerde fenylgroep of een groep met de formule Sn®2m+1* waarin m een geheel getal van 9 tot 25 is, voorstelt, R-, een waterstofatoom, een fenylgroep of een groep met de formule 10 CnH?n+j, waarin n een geheel getal van 1 tot 10 is, voorstelt, p een geheel getal van 3 tot 10 is, de groep met formule 5 een stikstofbevattende heterocyclische groep voorstelt, zoals pyridinium, 3-thiazolinium, chinolinium, isochinolinium, imidazolium en pyrazinium, en Θ 15 X het anion van een farmaceutisch aanvaardbaar anorganisch of organisch zuur, halogeenion zoals chloor, broom, jood of het anion van benzoezuur, azijnzuur, methaansulfonzuur of wijnsteenzuur voorstelt.

De verbindingen volgens de uitvinding zijn belang-20 wekkend als anti-PAF-middelen (PAF betekent bloedplaatjes aktiverende factor), met overeenkomstige aktiviteit als middelen tegen ana-fylaxie, tegen trombose, tegen aggregatie van bloedplaatjes, tegen vernauwing van bronchi, als middelen voor het verkrijgen van normale bloeddruk en als middelen tegen ischemie, als immunodepres-25 siva; zij zijn ook werkzaam tegen immuunverandering van de nier, tegen verschillende shocks, tegen huidallergieën en ingewands-zweren, bijvoorbeeld veroorzaakt door endotoxine.

De uitvinding voorziet voorts in een werkwijze voor de bereiding van de verbindingen met formule 1 zoals hierboven 30 gedefinieerd, bij welke werkwijze men een geringe stoechiometrische overmaat van een aldehyde of keton met de formule RjCOR^, waarin Rj en de hierboven gedefinieerde betekenis hebben, laat reageren met glycerol in een niet-polair oplosmiddel, in aanwezigheid van p-tolueensulfonzuur en onder refluxomstandigheden, het verkregen 35 4-hydroxymethyl-l,3-dioxolaanderivaat bij kamertemperatuur laat ,8801484 - 2 - reageren met een ω-halogeenalkanoylchloride met de formule ClCO(CHn) X, waarin p en X de hierboven gedefinieerde betekenis L p hebben, in aanwezigheid van een organische base zoals triethyl-amine, en de verkregen verbinding met de formule 3 laat reageren, 5 bij 50-80°C onder stikstofstroom, met een stikstofbevattende heterocyclische verbinding met de formule 4. De verbindingen met formule 1 werden verkregen als een niet-gescheiden mengsel van dia-stereoisomeren, maar deze kunnen met gebruikelijke methoden worden gescheiden.

10 Deze werkwijze wordt toegelicht in reactieschema A.

De uitvinding voorziet tevens in een farmaceutisch preparaat dat een verbinding met de algemene formule 1 zoals hierboven gedefinieerd, gemengd met een farmaceutisch aanvaardbaar verdunningsmiddel of drager, omvat.

15 De uitvinding wordt toegelicht aan de hand van de volgende voorbeelden. Voorbeeld I is volledig uitgewerkt; in de voorbeelden daarna worden slechts de betekenissen van de substi-tuenten en de eigenschappen van de verkregen verbindingen gegeven. (Tenzij anders is aangegeven,wordt TLC op silicagelplaten uitge-20 voerd).

Voorbeeld I.

2-heptadecyl-2-methyl-~4-/ 4'- (N-pyridinium)-butyryloxy-methyl_/-l,3-dioxolaanchloride formule 1 met:

Rj = = CH^, groep met formule 5 = pyridinyl, X= Cl, p = 3, 25 Stap a : Bereiding van 2-heptadecyl-2-methyl-4-hydroxymethyl-l,3- dioxolaan.

In een geschikt reactievat werd gegoten: 11,1 g (40 mmol) 2-nonadecanon, 6 g - een stoechiometrische overmaat - tweemaal gedestilleerde glycerol en 0,6 g p-tolueensulfonzuur, opgelost in 30 120 ml droge tolueen. Het reactiemengsel werd 32 uur onder roeren en onder terugvloeikoeling verhit, en het gevormde water werd met een Dean-Stark-apparaat verwijderd. Na afkoelen werd de organische fase uitgewassen met 30 ml 5 gew.% kaliumhydroxyde-oplossing in water en vervolgens driemaal met de minimale hoeveelheid water. Na 35 drogen over watervrij natriumsulfaat werd het oplosmiddel onder ,.8801484 i *.

- 3 - verminderde druk verwijderd. Het residu werd vervolgens gezuiverd door chromatografie op een silicagelkolom. Achtereenvolgens werd de fractie van het onomgezette keton (petroleumether: diethylether, volumeverhouding 95:5) en daarna de titelverbinding (petroleum-5 ether/diethylether in volumeverhouding 85:15) geëlueerd. Het di-oxolaan is een viskeus produkt, dat gedeeltelijk kristalliseerde.

Opbrengst II g (78%) rf : 0,18 (petroleumether/diethylether in volumeverhouding 70:30) IR 3500 cm_I (OH) 10 1100 - 1060 cm”1 (C-0-).

Stap b: 2-heptadecyl-2-methyl-4-(4,-chloorbutyryloxy-meth.yl)-l >3- dioxolaan.

Een mengsel van 6,4 g (18 mmol) 2-heptadecyl-2-methyl- 4-hydroxymethyl-l,3-dioxolaan, bereid zoals be-15 schreven in stap (a) hierboven, en 6 ml (45 mmol) triethylamine in 15 ml droge chloroform werd bij 0°C toegedruppeld aan een oplossing van 6,25 g (22 mmol) 4-chloorbutyrylchloride in 10 ml droge chloroform. Het mengsel werd 12 uur bij kamertemperatuur geroerd.

Na toevoegen van 20 ml chloroform werd het mengsel uitgewassen met 20 IN natriumhydroxyde-oplossing in water en vervolgens met water tot de pH 7 was. Na verwijdering van het oplosmiddel bleef een residu achter dat werd gechromatografeerd op een silicagelkolom met petroleumether: diethylether als loopvloeistof, in een volumeverhouding van achtereenvolgens 95:5, 90:10 en tenslotte 80:20. Aldus 25 werd 7,6 g (opbrengst 82%) verkregen van een olieachtig produkt dat kristalliseerde; smeltpunt 39-40°C. Dit produkt is een mengsel van de twee eis- en trans-isomeren (scheiding daarvan is niet gemakkelijk) .

rf: 0,45 en 0,37 (petroleumether/diethylether in volumeverhouding 30 80:20) IR 1740 cm”1 (0=0) 1180 - 1160 cm 1 (C-O-C ether en ester) NMR 60 MHz, CDC13> (TMS.) 6: 0,9 (triplet, 3H, CH^ van de keten) 35 1,3 (mult., 35H, 32H + CH3) 2,1 (mult., 2H, CO-CH2-CH2) 2.5 (triplet, 2H, C0-CH2) 3.6 (mult., 4H, CH2-0 en CK2C1) /8801484 * - 4 - 4,2 (mult., 3H, CH2OCO en CH -0).

Stap c; 2-heptadecyl-2-methy1-4-/ 41-(N-pyridinium)-butyryloxy-methy1/-1,3-dioxolaanchloride.

5 g van de in de voorgaande stap (b) verkregen ver-5 binding, opgelost in 30 ml pyridine, werd 24 uur onder stikstof bij 80°C geroerd. De overmaat pyridine werd vervolgens onder verminderde druk verwijderd en het residu werd gezuiverd door chroma-tografie op silicagel. Door elutie met chloroform (voor het verkrijgen van onomgezette uitgangsstof) en vervolgens met chloro-10 form/methanol in een volumeverhouding van 90:10 en daarna 80:20, werd 3,80 g van het titelprodukt verkregen. Dit produkt is een mengsel van de twee cis- en trans-isomeren (scheiding daarvan is niet gemakkelijk), totale opbrengst 40% (65% voor deze stap). Smeltpunt 84-85°C.

15 rf: 0,28 (CHCl^/MeOH in volumeverhouding 70:30) IR (nujol) 1740 cm * 1630 cm * (pyridine) 1200, 1180 cm"1 (C-O-C) NMR, 250 MHz, CDC13 20 δ: 0,9 (triplet, 3H, CH^) 1,2 (sing, groot 30H) -0 1,4 (doublet, 3H, -O^^CH^) (de 2 CH^ van de twee diastereoiso-. meren) 25 -Ον 0Η2- 1,55 (mult., 2H, -0^ ) 2,35 (mult., 2H, CO CH^CH^) 2,6 (triplet, 2H, CO CH2) 3.9 (muit., 1H, CH-0) 30 4 (mult., 2H, CH20 CO) 4,2-3,6 (2 mult., 2H, CH„0) (van de tx^ee diastereoisomeren) 5.10 (mult., 2H, CH2N) (8 (mult., 2H, H ) ( p pyridinium (8,4 (mult, 1H, 35 C9,6 (doub., 2H )

Fassaspectrum: M - Cl m/z : 504 t8801484 « * - 5 - verbinding met formule 6 :166

Voorbeeld II♦ 2-heptadecyl-2-methy1-4-/ 4*(N-chinolinium)-butyryl-oxymethyl /-1,3-dioxolaanchloride.

5 Stap c; 5 g van de in voorbeeld I (stap b) verkregen verbinding werd opgelost in een mengsel van 20 ml chinoline en 20 ml DMSO, en 4 dagen onder stikstof op 80°C verhit. Chinoline en DMSO werden onder verminderde druk gedestilleerd en het residu werd op een silicagelkolom gechromatografeerd (eluens achtereenvolgens CHCl^» daarna CHCl3/MeOH 10 95:5). 2,5 g van het gewenste produkt werd verkregen als een mengsel van de twee diastereoisomeren. rf: 0,58 (CHClg/MeOH, 70:30) IR \> chinoline 1650, 1630 en 1600 cm *

Massaspectrum: 15 M - Cl m/z :554 verbinding met formule 7 :216.

NMR chinolinium in plaats van pyridinium.

6 ppm: 7,90 - 8,10 (4H), 8,70 (1H), 8,90 (1H), 10,90 (1H ).

ot 20 Voorbeeld III.

2-heptadecyl-2-methyl-4-/ 41-(N-thiazolinium)-butyry1-oxymethyl 7-1,3-dioxolaanchloride.

Stap c: 850 mg van het in voorbeeld I (stap b) verkregen produkt 25 in een mengsel van thiazool (4 ml) en DMSO (6 ml) werd 24 uur op 80°C verhit. Het reactiemengsel werd onder vacuum ingedampt en het residu werd op een silicagelkolom gechromatografeerd met CHCl^/MeOH 50:50 als elutiemiddel, waardoor een viskeus produkt werd verkregen, rf: 0,34 (CHCl3/MeOH 70:30) 30 NMR thiazolinium in plaats van pyridinium.

6 ppm : 8,19 (d:lH), 8,4 (d:lH), 10,90 (sing. 1H)

Massaspectrum: M-C1:510 m/z.

„8801484 % % - 6 -

Voorbeeld IV.

2-heptadecy1-4-/ 41-(N-pyridinium)-butyryloxymethyl /- 1.3- dioxolaanchloride.

R1=C]7H35, R2=H, groep met formule 5 = pyridinyl, X=C1, p=3.

5 2 b rf: 0,17 (petroleumether/diethylether in volumeverhouding 30:70) 3 b rf: 0,37 (petroleumether/diethylether in volumeverhouding 70:30) 1^ rf: 0,16 (chloroform/methanol in volumeverhouding 70:30) '° -°v 1^ MR in plaats van CH^ bij 1,4 CH^) -0 .

2 multipletten rond 4,9 ppm (-0,'^H)

Massaspectrum: M - Cl: 490 m/z 15

Voorbeeld V.

2-heptadecyl-4-/ 4t-(N-chinolinium)-butyryloxymethyl /- 1.3- dioxolaanchloride.

20 ®ί= ^17^35 §roeP met formule 5=chinolinium, X = Cl, p=3.

rf: 0,48 (chloroform/methanol in de volumeverhouding 70:30).

Voorbeeld VI.

25 2-heptadecyl-2-(n-propyl)-4-/ 4'-(N-pyridinium)- butyryloxymethyl /-1,3-dioxolaanchloride.

Ri =C17H355 R2=n-propyl, groep met formule 5=pyridinyl, X=C1, p=3.

30 2_ c rf: 0,23 (petroleumether/diethylether in volumeverhouding 70:30) 3 c rf: 0,38 (petroleumether/diethylether in volumeverhouding 80:20) 1 rf: 0,20 (chloroform/methanol in volumeverhouding 70:30) 35 1 NMR in plaats van CH^ bij 1,4 -o -CH2- 1,55 (mult. 4H -O^CH^ ) 1,2 (32H) 0,9 (triplet, 6H, 2CH3) jgr n 8 4 - 7 -

Massaspectrum; Μ - Cl: 532 m/z.

Voorbeeld VII.

2-heptadecyl-2-methyl-4-/ 5 *-(N-pyridinium)-pentanoy1-5 oxymethy1 /-1,3-dioxolaanchloride.

R2=C1^, groep met formule 5=pyridinyl, X=C1, p=4.

rf: 0,23 (chloroform/methanol 70:30).

10

Voorbeeld VIII.

2-(3,4,5-trimethoxyfenyl)-2-methyl-4-/ 4t-(K-pyridi-nium)-butyryloxymethyl 7-1,3-dioxolaanchloride.

15 Rj = groep met de formule 8, R2=CH3, groep met formule 5=pyridxnyl, X = Cl, p = 3.

2d rf: 0,32 (chloroform/methanol in volumeverhouding 98:2) 20 3d rf: 0,61 (chloroform/methanol in volumeverhouding 98:2) ld rf: 0,34 (chloroform/methanol in volumeverhouding 60:40) 25 IR 1735 (C=0) 1610 (pyridine) 1590 (benzeen) 2740 (0CH3) 30 1. XMR in plaats van de keten R.

d ' *

V

1,5 ppm (m, 3H, -0 CH3) voor R^ 3.7 (sing., 9H, 0CH3) 6.8 (2H arom.) 35

Massaspectrum: M - Cl: 432 m/z.

„ 8 8 P 1 4 8 Δ - 8 -

Voorbeeld IX.

2-heptadecyl-2-methy1-4-/ 61-(N-pyridinium)-hexaiioyl-oxymethyl /-1,3-dioxolaanbromide.

Rj = C ] R2=<"H3’ groep met formule 5=pyridinyl, X=Br, p=5 .

5 Stap b: 2-heptadecyl-2-methyl-4-(6t-broomhexanoyloxymethyl)-l,3-dioxolaanbromide .

Volgens de methode zoals beschreven in voorbeeld I en onder toepassing van 6-broomhexanoylchloride werd het gewenste produkt als een viskeus produkt verkregen (opbrengst 82%).

10 rf : 0,57 (petroleumether/ether 80:20).

Stap c: Volgens de in voorbeeld I beschreven methode werd het gewenste produkt als een viskeus produkt verkregen (opbrengst 70%).

rf : 0,36 (CHCl-/MeOH 70:30)

-] J

IR 3450 cm (achtergebleven water) 15 1740, vc_0_£ 1180, vpyridine 1640 cm NMR 500 MHz CDC13, fi(TMS) 0,85 (triplet, 3H, CH^); 1,25 (sing, groot 30H);

-V

1,35 (d 3H, -O^C^, Z + E); 1,45 (muit., 2H, CH^); 2,1 (mult., 2H, COCE^CQ.^; 2,35 (mult., 2H, C0CH2); 3,70 en 20 4,35 (mult., 2H, Ciy), Z + E); 4 (mult. 3H, CH20C0 en H-C-0); © 5.05 (triplet, 2H, CH2N).

pyridinium 8,1 (triplet, 2H, H8); 8,6 (triplet, 1H, Ηγ); 9.5 (d:2H, Ha).

ÏÏ.V. (Ethanol) loge 3,65 λ258,8 nm.

25 Massaspectrum: M - Br m/z : 532

Verbinding met formule 9 : 194.

.88 0 1 484 - 9 -

Voorbeeld X.

2-heptadecyl-2-methy1-4-/ 6'-(N-chinoliniunQ-hexanoyl-oxymethyl)-!,3-dioxolaaribromide.

rf : 0,60 (CHCl~/MeOH 70:30) . J -j 5 IR chinolimum 1650, 1630, 1600 cm U.V. (Ethanol) loge 4,53 7 235,4 nm 2,18 λ 316,5 nm NMR chinolinium in plaats van pyridinium.

Massaspectrum: M - Br m/z : 582

Verbinding met formule 10 : 244;

Voorbeeld XI.

15 2-heptadecyl-2-methy1-4-/ 6'-(N-isochinolinium)- hexanoyloxymethyl)-!,3-dioxolaanbromide.

Stap c: Isochinoline wordt gebruikt in plaats van chinoline.

rf : 0,55 (CHCl./MeOP 70:30) IR isochinoline 1650, 1610, 1590 cm 20 NMR isochinolinium in plaats van chinolinium.

Massaspectrum: M-Br: 582 m/z.

Voorbeeld XII.

25 2-heptadecyl-2-methyl-4-/ 11'-(N-pyridiniumundecanoyl- oxymethyl)-!,3-dioxolaanbromide.

Rj = Ry = 0H^, groep met formule 5=pyridinyl, X=Br, p=10.

Stap b: 2-heptadecyl-2-methyl-4-(l1’-broomundecanoyloxymethyl)- 1,3-dioxolaan.

j e ? 11 p 4 - 10 -

Volgens de in voorbeeld I beschreven methode en onder toepassing van 11-broomundecanoylchloride werd het gewenste produkt verkregen.

Smeltpunt: 52°C (opbrengst 60%) 5 rf; 0,26 (petroleumether/ether 85:15).

Stap c

Smeltpunt: 92°C

rf: 0,45 (CHCl3/MeOH 70:30)

Massaspectrum: M-Br: 602 m/z.

10 Voorbeeld XIII.

2-heptadecyl-2-(n-propyl)-4-/ 6,-(N-pyridinium)-hexa-noylmethyl_/-l,3-dioxolaanbromide.

Rj = Cj 7^5’ R2 = ^P^PY1» S^P formule 5=pyridinyl, X=Br, p=5.

rf: 0,44 (CHC^/MeOH 70:30)

15 Smeltpunt: 76°C

Massaspectrum: M-Br: 560 m/z.

Voorbeeld XIV.

2-nonyl-2-methyl-4-/ 61-(N-pyridinium)-hexanoyloxy-methyl·)-!,3-dioxolaanbromide.

20 Rj - ^9Hi9s R2 = CH3’ SroeP met formule 5=pyridinyl, X=Br, p=5.

Stap b rf: 0,50 (petroleumether/ether 80:20)

Stap c rf: 0,30 (CHCl3/MeOH 70:30) 25 massaspectrum: M-Br: 420 m/z.

Toxicologie.

w δ 6 0 1 4 £ 4

De verbindingen volgens de uitvinding zijn toegediend aan muizen ter bepaling van de acute LD^q. Voor alle verbindingen - II - volgens de uitvinding bedroeg de LD,.q meer dan 300 mg/kg (IP of SC) en 600 mg/kg (PO).

Farmacologie.

Een bewijs van het farmaceutische belang van de ver-5 bindingen volgens de uitvinding is geleverd door de volgende farma ceutische proeven: 1- Remming van de bloedplaatjesaggregatie bij Nieuwzeelandse konijnen.

De proef werd uitgevoerd op bloedplaatjes met plasma van Nieuwzeelandse konijnen. Bloedmonsters werden genomen uit de 10 arteria auricularis en in een citraatbuffer (3,8%; pH 7,4) gebracht; het bloed werd verder 15 minuten bij 1200 omwentelingen per minuut gecentrifugeerd. De proefverbinding werd bereid in DMSO, daarna gedurende 1 minuut op bloedplaatjes-rijk plasma gegoten, waarna een dosis van 2,5 nM PAF werd toegevoegd, De bepaling wordt uitgevoerd 15 op een Cronolog Coultronies apparaat dat het transmissiepercentage bepaalt dat overeenkomt met de maximale hoogte van de piek voor de desaggregatie. Het percentage variatie van de remming met betrekking tot het transmissiepercentage wordt berekend (controle; zuiver DMSO).

20 Deze methode werd in detail beschreven in Laboratory

Investigations, Vol. 41, No. 3, p. 275, 1979, Jean-Pierre Cazenave,

Dr. Med., Jaques Benveniste, Dr. Med., en J. Fraser Mustard, M.D., "Aggregation of Rabbits Platelets by Platelet-Activating Faetor Is Independent of the Release Reaction and the Arachidonate 25 Pathway and Inhibited by Membrane-Active Drugs".

De resultaten laten zien dat de verbindingen de door 2,5 nM PAF teweeggebrachte aggregatie remmen. Vijf proeven die uitgevoerd werden met 5 verschillende konijnen maakten het mogelijk de IC Q van de verschillende verbindingen te berekenen onder toe-30 passing van de lineaire regressietest.

.680141¾ > * - 12 -

Remming van de door PAF teweeggebrachte bloedplaatjesaggregatie in bloedplaatjes-rijk plasma van konijnen.

Voorbeeld nr. ^50 ^

No. I 2,2 , 10”6 5 No. II 1,2 . l(f6

No. III 2,15 . 10”5

No. IV 7 . l(f6

No. V 3,1 . 10-6

No. VI 3,04 . 10“6 10 No. VII 5 10-6

No. VIII 1,13 . 10-5

No. IX 4,04 . 10-7

No. X 3,03 . 10"7

No. XII 3,12 . 10~5 15 No. XIII 1,73 . 10~6

No. XIV 1,46 . 10~6 2- Binding.

Materiaal en Methode.

. -3 -

Het gebruikte synthetische getritieerde / H_/-PAF 20 was aanwezig in ethanoloplossing met een specifieke aktiviteit van 59,5 ci/mmol. Niet gelabeld PAF en lyso-PAF werden gesolubiliseerd in ethanoloplossing en bewaard bij -80°C. De verbindingen werden gesolubiliseerd in DMSO.

Bloedplaatjesmembraan-preparaten.

25 Volledig konijnebloed (6 volumina) werd afgenomen uit de centrale oorslagader en gebracht in 1 volume ACD-oplossing (citroenzuur 1,4 g, natriumcitraat 2,5 g, dextrose 2 g per 100 ml H2O) en 15 minuten gecentrifugeerd bij 150 g. Het bloedplaatjes-rijke plasma (PRP) werd voorzichtig verwijderd en 15 minuten bij 1000 g 30 gecentrifugeerd. De bloedplaatjespellet werd vervolgens driemaal uitgewassen: tweemaal in Tris-HCl-buffer 10 mM, pH 7,4 welke NaCl 150 mM, MgCl2 5 mM, EDTA 2 mM bevatte, en de laatste maal in dezelfde maar natriumvrije buffer.

De bloedplaatjespellet werd opnieuw gesuspendeerd 35 deze laatste buffer, en tenminste driemaal snel bevroren in vloeibare „88014P4 * - 13 - stikstof en langzaam ontdooid bij kamertemperatuur, zoals beschreven door T.Y. Shen c.s.. De gelyseerde bloedplaatjes werden 30 minuten gecentrifugeerd bij 100.000 g in een Beekman model L8.55 ultra-centrifuge (rotor 30,2 Ti). Het bloedplaatjesmembraan-homogenaat 5 werd bij -80°C bewaard en binnen twee weken gebruikt zonder merk bare veranderingen in de PAF-acether bindingseigenschappen.

Het proteïnegehalte werd bepaald met de Lowry-methode met behulp van runderserumalbumine als standaard.

Bindingsproef.

10 60 tot lOQpg memhraanproteïnen werden toegevoegd tot • ♦ · · —3 — een eindvolume van 1 ml in plastic buizen die 1 nM / H /-PAF in

Tris-HCl 10 mM pH 7 buffer met 0,025% runderserumalbumine bevatten, en gexncuheerd met of zonder niet-gelabeld PAF of PAF~antagonisten.

De incubatie werd uitgevoerd bij 0°C gedurende 1 uur en 30 minuten.

15 Het gebonden / H_/-PAF werd gescheiden van het vrije / H_/-PAF door onmiddellijke filtratie via whatman GF/C glasvezelfilters onder vacuum (Brandel-systeem). Het reactiemengsel en de filters werden driemaal gewassen met 5 ml ijskoude boffer. De filters werden vervolgens in polyetheenflesjes gebracht welke gevuld waren met 10 ml 20 scintillatievloeistof, en de radioaktiviteit werd gemeten door een LKB β-teller met een rendement van 45%.

De niet-specifieke binding werd bepaald in aanwezig-heid van 10 M niet-gelabeld PAF. De specifieke binding werd berekend door de niet-specifieke binding af te trekken van de totale binding.

-3 - 25 De remming door verbindingen van de specifieke / H_/-PAF binding werd bepaald als het percentage remming met behulp van de vergelijking: 3 2 ( H-PAF gebonden in aan- ) (totaal gebonden H-PAF) - (wezigheid van verbindingen) % remming = --2-----x 100

30 specifiek gebonden JH-PAF

Voorbeeld No. IC^q

No. I 4,5 . I0~7

No. IX 3,5 . 10~8

No. X 3,5 . 10”8 35 No. XIV 6,1 . 10~7 * v f 1 l r· b

W I V

- 14 - 3- Door PAP in guinese biggetjes teweeggebrachte bronchoconstrictie, leukopenie en trombocytopenie.

Materialen en methoden»

Mannelijke guinese biggetjes (£00-500 g) werden ge-5 anesthetiseerd met urethaan (1,5 g/kg: IP) voordat tracheotomie werd uitgevoerd en ze werden beademd met een ademhalingspomp (Ugo Basile) (70-80 ademhalingen/minuut, 1 ml lucht/100 g/ademhaling). Om een eind te maken aan de spontane ademhaling werd een pneumothorax uitgevoerd. De weerstand tegen uitzetting werd gemeten met 10 een drukoverdrager (Ugo Basile) tegen een begindruk van 10 cm E^O volgens Konzett en Rossier. De dieren werden verdeeld in groepen en al dan niet behandeld met de verbindingen volgens de uitvinding (0,05, 0,1, 0,5, 1 en 5 mg/kg). De produkten werden IV toegediend 1 uur voor de prikkeling met PAF.

15 De dieren werden geprikkeld met verschillende doses PAF (30-100 n/kg) welke intraveneus werden toegediend, en de variaties in de weerstand tegen uitzetting werden genoteerd.

Bloedmonsters werden verzameld voorafgaand aan en 1,5 en 10 minuten na de prikkeling met PAF. 40 yl bloed werd 20 verdund in 10 ml Isoton (Coultronics, Frankrijk); die erythrocyten werden gelyseerd met Zapoglobine (Frankrijk) voordat de leukocyten werden geteld in een coulterteller. Ter bepaling van het aantal bloedplaatjes werd 40 yl bloed verdund in 2 ml Isoton en gecentrifugeerd gedurende 30 seconden met 100 omwentelingen per minuut; 25 100 yl van het supernatant werd verzameld en verder verdund in 10 ml Isoton voordat in een coulterteller werd geteld.

β e * 1 p βί V. v'

Tabel A; Effecten van 2-heptadecyI-2-methyl-4-/ 6 r-(N-pyridinium)-

hexanoyloxymethyl_7-l,3-dioxolaanbromide op door PAF

opgewekte bronchoconstrictie.

- 15 -

Doses n Percentage Percentage 5 __ mg/kg IV___bronchoconstrictie variatie_

Controle - 8 79,8+/-3,22

Verbinding 5 3 3,5 +/- 1,53 -95,6*- van 1 4 19,1 +/- 10,51 -76,1***

Voorbeeld °’5 6 23’6 +/" 7>15 10 0,1 6 43,8 +/- 14,77 -45, Γ*

No. IX 0,05 3 79,0 +/- 9,27 - 1,0 SS

Legenda voor alle tabellen: NS : niet significant * : p < 0,05 15 : p < 0,01 * * * : p < 0,001 .88 P14 p 4

Tabel B: Effecten van 2-heptadecyl-2-methyl-4-/ 6,-(N-pyridinium)- hexanoyloxymethyl_7-l,3-dioxolaaribromide op door PAF opge wekte leukopenie.

- 16 -

Doses n Tijd Procentuele afname Percentage 5 ng/kg IV (mn) van het aantal variatie ______leukocyten__ 8 1 40,8 +/- 7,18

Controle - 8 5 29,2 +/- 10,89 - 8 10 33,5 +/- 5,04__-_ 10 3 1 16,5 +/- 2,42 - 59,6 *

5 35 15,9 +/- 0,99 - 45,5 NS

Verbinding__3_ 10 18,7 +/- 5,08 - 44,2 NS

4 1 3,5 +/- 12,60 - 91,4 ** van ! 45 2,9 +/- 10,51 - 90,1 * 15 ____4 10 1,0 +/- 22,62 - 97,0 **

voorbeeld 6 1 34,6 +/- 6,35 - 15,2 NS

0,5 6 5 19,0 +/- 6,42 - 34,9 NS

No. IX 6 10 14,6 +/- 5,36 - 56,4 NS

6 1 41,8 +/- 6,50 + 2,5 NS

20 0,1 6 5 31,9+/- 4,88 - 9,2 NS

__6__J0 33,5 +/- 4,65 0,0 NS

3 1 45,3 +/- 5,70 + 11,0 NS

0,05 3 5 21,6+/- 3,42 - 26,0 NS

___3 10 114,2 +/- 17,30 - 57,6 NS

A

Tabel C; Effecten van 2-heptadecyl-2-methy1-4-/ 6’-(N-pyridinium)- hexanoyloxymethyl_/-l,3-dioxolaanbromide op door PAF opge wekte trombocytopenie.

- 17 -

Doses n Tijd Procentuele afname van. I Percentage 5 _mg/kg IV___(mn) het aantal leukocyten variatie_ 8 1 68,6 +/- 6,79

Controle - 85 42,4 +/- 2,71 ___8 10 42,5 +/- 3,14__- 3 I 4,2 +/- 2,35 - 93,9*** 10 5 3 5 5,6 +/- 1,84 - 86,8***

Verbinding 3 10 1,1 +/- 1,15 - 97,4*** 4 1 11,5 +/- 6,21 - 83,2*“* van 1 4 5 22,5 +/- 3,27 - 46,9* 4 10 21,0 +/- 3,87_[- 50,6* 15 voorbeeld 6 1 19,3 +/- 10,19 - 71,9*** 0,5 6 5 9,6 +/-12,15 - 77,4“““

No. IX 6 10 10,9 +/- 9,94_ - 74,4*“* "Γ1 Γ” 30,1+/-13,72 - 56,1 “*

0,1 6 5 34,7+/- 3,60 - 18,2 NS

20 ___6 10 42,3 +/- 4,79_ - 0,5 NS

3 1 45,2 +/- 1,20 - 34,1 NS

0,05 3 5 43,0+/- 4,80 + 1,4 NS

___3 10 [36,1 +/- 2,41_15,1 NS

.8801484

Tabel D: Effecten van 2-heptadecyl-2-methyl-4-/ 6'-(N-chinolinium)- hexanoyloxymethyl_/-l,3-dioxolaanbromide op door PAF opgewekte bronchoconstrictie.

- 18 -

Doses n Percentage bronchocon- Percentage _mg/kg IV strictie_____variatie_

Controle - 6 90,8 +/- 0,95__-_

Verbinding 1 5 8,1 +/- 2,91 -91,1*** van 0,5 5 25,1 +/- 6,53 - 72,4* ** voorbeeld No. X 0,1 5__80,4 +/- 13,78__- 11,5 NS_ 10 Tabel E: Effecten van 2-heptadecyl-2-methyl-4-/ 6'-(N-chinolinium)- hexanoyloxymethyl_/-l,3-dioxolaanbromide op door PAF opgewekte leukopenie.

Doses n Tijd Procentuele afname Percentage mg/kg IV (mn) van het aantal leuko- variatie 15 __cyten_ 6 1 41,4 +/- 8,0

Controle - 65 28,7 +/- 6,9 ___ 6 10 26,9 +/-- 10,1__2_

Verbinding 5 j 24,1+/- 6,8 - 41,0 NS

20 van 15 5 9,3 +/- 9,4 - 67,6 ** voorbeeld__5 10 8,9 +/- 13,2_- 66,9 * *

No· X 5 1 17,0 +/- 12,9 - 58,9 * 0,5 5 5 9,0 +/- 11.8 - 68,6**

__5 10 - 7,6 +/- 17,5_+ 128,3 NS

25 5 1 38,8 +/- 6,3 + 6,3 NS

0,1 5 5 38,9 +/- 5,7 + 35,5 NS

__5 10 41,2 +/- 6,5_|+ 53,2 NS

.8801484

Tabel F: Effecten van 2-heptadecyl-2-methyl-4-/ 6'-(N-chinolinium)- hexanoyloxymethyl_/-l,3-dioxolaanbromide op door PAF opge wekte trombocytopenie.

- 19 -

Doses n Tijd Procentuele afname Percentage 5 mg/kg IV (mnj van bet aantal variatie _____I leukocyten___ 6 1 65,3 +/- 8,5

Controle - 65 49,1 +/- 4,8 - ___6 10 48,5 +/- 0,5_ 10 5 1 19,3 +/- 1,4 - 58,3*** 1 5 5 22,1 +/- 2,5 - 55,0**

Verbinding__5 10 19,4 +/- 3,6 - 60,0**

Vatl 5 1 26,2 +/- 6,3 - 59,9** voorbeeld 0j5 5 5 29,8 +/- 1,7 - 39,3* 15 No* X 5 10 32,1+/- 5,8 -33,8*

5 1 51,1 +/- 12,1 - 21,7 NS

0,1 5 5 49,1 +/- 8,8 0 NS

____[5 i 10 45,0 +/- 9,7_- 7,2 NS

Resultaten.

20 2-heptadecyl-2-methyl-4-/ 6*-(N-pyridinium)-hexanoyl- oxymethyl_7-I,3-dioxolaanbromide (0,5, 1 en 5 mg/kg IV) en 2-hepta-decyl-2-methyl-4-/ 6'-(N-chinolinium)-hexanoyloxymethyl_7-l,3-dioxolaanbromide (0,5 en 3 mg/kg IV) remmen de door PAF opgewekte broncho-constrictie en de door PAF opgewekte trombocytopenie bij guinese 25 biggetjes.

4- Door antigeen opgewekte broncboconstrictie, leukopenie en trombocytopenie bij guinese biggetjes welke passief gesensibiliseerd waren met hetero1oog serum.

Intraveneuze injectie van ovalbumine aan guinese 30 biggetjes,welke passief gesensibiliseerd waren met konijne - anti- ovalbumine antiserum, induceert een Broncboconstrictie, verbonden met een leukopenie en een trombocytopenie. Deze anafylactiscbe reactie lijkt veroorzaakt te worden door het vrijkomen van histamine · en de vorming van arachidonzuurmetabolieten (prostaglandines, trom-boxan A2 en leukotriënen). Bij het guinese biggetje wordt het - 20 - vrijkomen van deze autacoiden voornamelijk gemedieerd via immunoglo-bulinen van de IgG-klasse.

Methode.

-Dieren: 5 Hartley mannelijke Guinese biggetjes, Charles River (450-550 g) -Immunisatiemethode:

Intraveneuze injectie 18 uur voor de prikkeling met het antigeen van 0,5 ml/kg van een tweemaal verdund konijne-anti-10 ovalbumine antiserum.

-Prikkeling wordt verkregen door:

Ovalbumine, 0,75 mg/kg, intraveneuze injectie van het antigeen in een eind- volume van 1 ml/kg, 15 drager, 0,15 M NaCl.

-Verbindingen worden toegediend via de orale route in een volume van 2,5 ml/kg, I uur voor de prikkeling met het antigeen. Na anestesie door intraperitoneale injectie van ethylcarbamaat (1,5 g/kg) in een volume van 10 ml/kg. Onderzochte parameters en weergave van de ge- 20 gevens: a - Bronchoconstrictie

Door antigeen opgewekte bronchoconstrictie in mm (A); maximale bronchoconstrictie in mm (Bj Het percentage bronchoconstrictie wordt als volgt be-25 rekend:

A x 100 B

Het aantal neutrofielen en Bloedplaatjes werd geteld 1 minuut voor en 1,5 en 10 minuten na de prikkeling. De veranderingen 30 werden uitgedrukt in percentages, berekend ten opzichte van de waarden welke 1 minuut voor de prikkeling werden verkregen.

De volgende uitrusting werd gebruikt: - Ugo Basile, Cornerio ITALIË, . Knaagdier beademingstoestel ref. 7025 35 . Bronchospam overdrager ref. 7020 . Twee-kanaal recorder "GEMINI" ref. 7070 .8801484 « - 21 - - Coultronics, FRANKRIJK,

. Coulters teller Z B I

Tabel G: Effecten van 2-heptadecyl-2~methy1-4-/^6’-(N-py r idinium)-hexanoyloxyraethyl_/-l,3-dioxolaaiibromide op door antigeen 5 opgewekte bronchoconstrictie.

Dosis n Percentage Percentage mg/kg IV bronchoconstrictie variatie

Controle__-__6_71,9 +/- 14,2__-_

Verbinding

10 van 5 8 51,3 +/- 14,2 - 28,7 NS

voorbeeld

No. IX____

Tabel H: Effecten van 2-heptadecyl-2-methyl-4-/6'-(N-pyridinium)-hexa- noyloxymethyl_/-l,3-dioxolaanbromide op door antigeen opge-15 wekte leukopenie.

Dosis [n j Tijd Procentuele afname Percentage mg/kg (mn) van het aantal remming __IV____leukocyten__ 6 1 - 11,8 +/- 5,1 20 Controle - 6 5 - 39,6 +/- 9,5 - ___6 IQ - 53,9 +/- 7,1___

Verbinding 8 1 - 15,6 +/- 6,6 + 32,0 NS

van 5 8 5 8,7 +/-10,7 - 78,0 * voorbeeld IX _8 10 - 12,3 +/- 14,1 - 77,2 * 25 Tabel I: Effecten van 2-heptadecyl-2-methyl-4-/ 6’-(N-pyridinium)- hexanoyloxymethyl_7-l,3-dioxolaanbromide op door antigeen opgewekte trombocytopenie.

.8801484 - 22 -

Dosis n Tijd Procentuele afname Percentage mg/kg IV (mn) van het aantal remming ____leukocyten__ 6 1-6,8 +/- 2,7 5 Controle - 65 -39,7 +/- 12,5 ____6 10 -26,1 +/- 8,1__

Verbinding 8 1 +0,3 +/- 1,9 - 104,4 NS

van 5 8 5 - 3,5 +/- 3,1 - 91,2«*

voorbeeld 8 IQ —15,7' +/- 6,2 - 39,8 NS

10 No. IX__|___|___

Resultaten.

2-heptadecyl-2-methyl-4-/ 6 *-(N-pyridinium)-hexanoyl-oxymethyl_/-l,3-dioxolaanbromide (5 mg/kg IV) antagoniseert de door antigeen opgewekte leukopenie en trombocytopenie zonder de door 15 antigeen opgewekte bronchoconstrictie in belangrijke mate te verminderen.

5- Werking op de door PAF opgewekte hypotensie bij de geanesthetiseerde rat.

Materialen en methode.

20 Mannelijke Sprague Dawley ratten (Charles River

Breeding Station) (250-300 g) werden geanesthetiseerd met ethylcar-bamaat in een dosis van 1,2 g/kg IP.

, Intraveneuze injectie van PAF veroorzaakt een dcsis-af- hankelijke hypotensie. De effecten van 2-heptadecyl-2-methyl-4-/ 6'-25 (N-pyridinium)-hexanoyloxymethyl_/-l,3-dioxolaanbromide en 2-hepta-decyl-2-methyl-4-/ 6’-(N-chinoliniumhexanoyloxymethyl^/-!,3-dioxo-laanbromide tegen door PAF opgewekte hypotensie werden onderzocht in curatieve behandelingen. De hypotensie werd opgewekt door één enkele dosis PAF (1 yg/kg) in een intraveneuze injectie, direkt in de penis-30 ader, in een volume van 0,1 ml/100 g. Bij de maximale hypotensie, 3 minuten na de injectie met PAF, werden de geneesmiddelen toegediend.

Gemeten parameters en weergave van de resultaten:

De systolische en diastolische arteriële drukken (mmHg) werden gemeten. De waarden werden uitgedrukt als een ge-35 middelde +/- SEM in de bijgaande figuren 1 en 2.

.8801484 ft - 23-

Meet instrument :

Gould P^q overdrager voor het meten van de arteriële druk,

Braun perfusor, 5 Gould 8000 S polygrafische recorder.

6- Antagonisme van de door PAE opgewekte aggregatie van polymorf-kernige leukocyten.

Polymorfkernige leukocyten (PMNs) werden verkregen zoals beschreven door A.W. Ford-Hutchinson c.s. (Br - J. Pharmacol.

10 76, 367-371, 1982). Celsruspensies (^90% PMNs) werden bereid uit peritoneale exudaten welke verkregen waren na een 5 ml IP injectie van natriumcaseinaat 12% (gew/vol) aan mannetjes Wistar-ratten met een lichaamsgewicht van 300 g.

Na centrifugering werden de cellen gewassen met 15 Hanks en opnieuw gesuspendeerd in MEM/Hepes 30 mM medium (PM=7,4) in een concentratie van 10^ cellen/ml. Cytochalasine B (5 pg/ml) werd 10 minuten voor het starten van de aggregatie toegevoegd om de PMNs-aggregatie te versterken. De lichttransmissie door de celsuspen-sie (400 ul) werd gemeten onder magnetisch roeren van 900 opm met 20 een dubhel--straal-aggregometer (Chronolog Corn. Coultronics).

De controlecuvet bevat de celsuspensie, verdund tot 20% van het aantal cellen met MEM, en het verschil vertegenwoordigt 100% transmissie. De verandering in de transmissie, die optreedt wanneer PAF wordt toegevoegd, werd continu opgenomen.

25 De in MEM/Hepes gesolubiliseerde geneesmiddelen (4 pi) werden 2 minuten voor de toevoeging van PAF toegevoegd aan de PMNs-suspensie.

Resultaten.

PAF 10 M veroorzaakte 55 tot 70% aggregatie van 30 deze IMNs-suspensie.

2-heptadecyl-2-methyl-4-/ 6’(N-pyridinium)-hexanoyl-oxymethyl_/~1,3-dioxolaanbromide en 2-heptadecyl-2-methyl-4-/ 6'-(N-chinolinium)-hexanoyloxymethyl_7-1,3-dioxolaanbromide remmen deze aggregatie dosis-afhankelijk met een IC,-q van respectievelijk: 35 2-heptadecyl-2-methyl-4-/ 6T-(N-pyridinium)-hexanoyl-

oxymethvl_/-l,3-dioxolaanbromide: 5 x 1C ^ M

.6801484 » -24- 2-heptadecyl-2-methy1-4-/ 6,-(N-chinolinium)-hexanoyl-“6

oxymethyl)-l,3-dioxolaanbromide: 10 M

7- Remming van de door PAF opgewekte intracytosolische mohilisering van vrij calcium in gewassen bloedplaatjes van konijnen.

5 Bloed werd afgenomen uit de arteria auricularis van het konijn op citroenzuur/natriumcitraat/dextrose en anti-coagulatie-middeljen de gewassen bloedplaatjes werden bereid volgens Ardlie c.s., Brit. J. Pharmacology, 19^ 7-17, 1970. Zij werden geïncubeerd met acetylsalicylzout (100 yM, 30 minuten) ter vermijding van door 10 tromboxaan opgewekte aggregatie. Zij werden vervolgens beladen met de fluorescerende calciumindicator kleurstof chin 2 door incubatie met chin 2 - acetomethylester (15 yM in DMS0, 20 minuten bij kamertemperatuur) welke in de celmembraan doordringt en na hydrolyse in het bloed-plaatje vast zit. De geneesmiddelen werden 15 minuten met de bloed-15 plaatjes gepreincubeerd tegelijk met CP/CPK-mengsel dat uitgescheiden ADP neutraliseert.

De fluorescentiemeting werd vervolgens uitgevoerd (excitatie λ=339 nm, emissie λ=492 nm) na toevoeging van PAF aan de bloedplaatjes-suspensie. De fluorescentieintensiteit is evenredig - 2+ - 20 met het cytosolische vrije calciumgehalte / Ca _/i dat kan worden gekwantificeerd zoals beschreven door Tsien & al;, J. Cell Biol., 94, 325-334, 1982.

Resultaten.

-9

De door 2x10 M PAF opgewekte stimulering van de - 2+ - 25 bloedplaatjes verhoogde het / Ca _/i-gehalte van ongeveer 150 nM in rusttoestand tót 400-600 nM.

2-heptadecyl-2-methyl-4-/ 61-(N-pyridinium)-hexanoy1-oxymethyl /-1,3-dioxolaanbromide en 2-heptadecyl-2-methyl-4-/ 6'-(N- chinolinium)-hexanoyloxymethyl /-1,3-dioxolaanbromide in een concen- -7 ~ _ 2+ - 30 tratie van 5x10 M remmen volledig de door PAF opgewekte / Ca _/£ —8 "** mobilisatie. Bij een concentratie van 5x10 M is de remming van het PAF-effect respectievelijk 44% voor 2-heptadecyl-2-methyl-4-/ 6’-(N-pyridiniumhexanoyloxjnnethyl_/-l,3-dioxolaanbromide en 75% voor 2-heptadecyl-2-methyl-4-/ 6 ,-(N-chinolinium)-hexanoyloxymethyl_/-35 1,3-dioxolaanbromide.

. 8 e e 1 4 8 h * - 25 -

Posologie.

In de humane therapie bedraagt de dagelijkse dosis bij orale toediening 0,1 tot 0,5 mg in tabletten of capsules met een mantelbekleding; de overeenkomstige dagelijkse dosis bij 5 IV-toediening bedraagt0,01 -0,05 mg. De behandeling duurt in het algemeen 2 tot 6 weken.

. ü d f* < ' 0 £

Claims

1. Aminoacylaten van glycerolacetaal met de algemene formule ] van bijgaand formuleblad, waarin Rj een gesubstitueerde fenylgroep of een groep met de formule 5 Sn^2m+1’ waar*-n m een geheel getal van 9 tot 25 is, voorstelt, R2 een waterstofatoom, een fenylgroep of een groep met de formule Si^2n+1’ n een geheel getal van 1 tot 10 is, voorstelt, p een geheel getal van 3 tot 10 is, de groep met formule 5 een stikstofbevattende heterocyclische 10 groep voorstelt, zoals pyridinium, 3-thiazolinium, chinolinium, isochinolinium, imidazolium en pyrazinium, en Θ X het anion van een farmaceutisch aanvaardbaar anorganisch of organisch zuur, halogeenion zoals chloor, broom, jood of het anion van benzoezuur, azijnzuur, methaansulfonzuur of wijnsteenzuur 15 voorstelt, in de vorm van de gescheiden isomeren of van een mengsel daarvan.

2. Werkwijze voor de bereiding van verbindingen volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat men een geringe stoechiometrische overmaat van een aldehyde of keton met de formule R^CC^, waarin

20 Rj en R£ de hierboven gedefinieerde betekenis hebben, laat reageren met glycerol in een niet-polair oplosmiddel, in aanwezigheid van p-tolueensulfonzuur en onder refluxomstandigheden, het verkregen 4-hydroxymethyl-l,3-dioxolaanderivaat bij kamertemperatuur laat reageren met een ω-halogeenalkanoylchloride met de formule 25 CICOiCHg) X, waarin p en X de hierboven gedefinieerde betekenis hebben, in aanwezigheid van een organische base zoals triethyl-amine, en de verkregen verbinding met de formule 3 laat reageren, bij 50-80°C onder stikstofstroom, met een stikstofbevattende heterocyclische verbinding met de formule 4.

3. Therapeutisch preparaat, met het kenmerk, dat het als een werkzaam bestanddeel een doeltreffende hoeveelheid van tenminste één van de verbindingen volgens conclusie 1, in combinatie met een geschikt verdunningsmiddel of drager, bevat. -0-0-0- _ 8 6 P 1 4· 8 4