CH674516A5

CH674516A5 -

Info

Publication number: CH674516A5
Application number: CH2183/88A
Authority: CH
Inventors: Colette Broquet; Pierre Braquet
Original assignee: Scras
Priority date: 1987-06-12
Filing date: 1988-06-08
Publication date: 1990-06-15
Also published as: DK319188A; GR880100363A; AU1756288A; NL8801484A; TNSN88057A1; GR1000889B; BE1000700A4; FR2616326B1; US4921865A; KR960005153B1; OA08879A; NZ224936A; FI90421B; IE881752L; ATA152988A; KR890000471A; DE3819829A1; IN172782B; NO882564D0; FI882705A0

Description

DESCRIPTION La présente invention concerne de nouveaux aminoacylates d'acétal du glycérol, un procédé pour leur préparation ainsi que des compositions thérapeutiques en contenant.

La présente invention concerne les aminoacylates d'acétal du glycérol de formule générale I:

ch.— 0 rn

2 V

ch_0 co(ch.)—n^)

2 2 p \y

©

/ \

ch _ 0 r,

I

ch-0 co(ch_)_n^ ) 2 2 p \s

©

x

25

dans laquelle

Ri représente un groupement phényle substitué ou un groupe de formule CmH2m+1, m étant un entier de 9 à 25,

R2 représente un atome d'hydrogène, un groupement phényle ou un groupe de formule C„H2n+i, n étant un entier de 1 à 10, p est un entier de 3 à 10,

-n'

-n o

35

est le pyridinium, le thiazolinium-3, le quinolinium, l'isoquinoli-nium, l'imidozolinium ou le pyrazinium.

3. Composés de formule I selon la revendication 1, dans lesquels X0 est un ion chlore, brome ou iode.

4. Procédé de préparation des composés (I) selon la revendication 1, consistant à faire réagir un léger excès, par rapport aux proportions stoechiométriques, d'un aldéhyde ou d'une cétone de formule R,COR2, dans laquelle R, et R2 sont tels que définis plus haut, sur le glycérol, dans un solvant non polaire, en présence d'acide p-toluènesulfonique et dans des conditions de reflux, puis à faire réagir, à température ambiante, le dérivé hydroxyméthyle-4 dioxolane-1,3 ainsi obtenu sur un chlorure de co-haloalcane de formule ClCO(CH2)pX, dans laquelle p et X sont tels que définis précédemment, en présence d'une base organique et, enfin, à faire réagir, entre 50 et 80 °C, sous circulation d'azote, le composé résultant, de formule

.0 R

40

45

50

X

R,

_oco(ch2)p-x sur un composé hétérocyclique contenant un atome d'azote de formule n'

55

60

N

5. Procédé selon la revendication 4, dans lequel ladite base organique est la triéthylamine. 65

6. Composition thérapeutique comprenant, à titre de principe actif, une quantité efficace d'au moins l'un des composés I selon la revendication 1, associé avec un excipient approprié.

représente un groupement hétérocyclique contenant un atome d'azote tel que le pyridinium, le thiazolinium-3, le quinolinium, l'isoquinolinium, l'imidazolium et le pyrazinium, et

X® représente l'anion pharmaceutiquement acceptable d'un acide minéral ou organique, un ion halogène tel que le chlore, le brome, l'iode ou les anions des acides benzoïque, acétique, méthanesulfonique, ou tartrique,

sous la forme de leurs diastéréoisomères isolés ou de tout mélange de ceux-ci.

Les composés selon l'invention sont intéressants en tant qu'agents anti-PAF (PAF signifie Facteur d'Agrégation Plaquet-taire), avecl'activité correspondante comme anti-anaphylactiques, anti-thrombotiques, anti-coagulants, anti-bronconstric-teurs, anti-ischémiques, normotenseurs, immunodépresseurs et ils agissent contre l'altération des reins, contre différents chocs, contre les allergies de la peau et les ulcères intestinaux provoqués, par exemple, par l'endotoxine.

L'invention concerne, également, un procédé pour la préparation des composés de formule I, tels que définis plus haut, ce procédé consistant à faire réagir un léger excès, par rapport aux proportions stoechiométriques, d'un aldéhyde ou d'une cétone de formule RtCOR2, dans laquelle Rj et R2 sont tels que définis plus haut, sur le glycérol, dans un solvant non polaire, en présence d'acide p-toluènesulfonique et dans des conditions de reflux, puis à faire réagir, à température ambiante, le dérivé hydroxyméthyle-4 dioxolane-1,3 ainsi obtenu sur un chlorure de co-haloalcane de formule ClCO(CH2)pX, dans laquelle p et X sont tels que définis précédemment, en présence d'une base organique telle que la triéthylamine et, enfin, à faire réagir, entre 50 et 80 °C, sous circulation d'azote, le composé résultant, de formule

__0 r_

X 1

uo r2

Loco(ch2)p-x sur un composé hétérocyclique contenant un atome d'azote de formule

3

674 516

<)

V

Les composés selon l'invention sont obtenus sous forme d'un Ce procédé de préparation peut être illustré par la séquence mélange non-séparé de leurs diastéréoisomères, mais ils peuvent s de réactions suivante :

être séparés par les méthodes habituelles.

Etapes

R.-C-R, + CH_OH-CHOH-CH OH

i | ^ 6 6

0

,-0 r,

X 1

0

L_OH

+ Cl C0(CH2)p X

N Et.

chc1.

__0 R.

X 1

0 r2

Loco(ch2)p x

3

+ N

S

-0 r.

X 1

lo r2

©

loco(ch2)p-

©

X

L'invention concerne également une composition thérapeutique comprenant un composé de formule générale I tel que défini plus haut, associé à un excipient pharmaceutiquement acceptable.

L'invention sera mieux comprise grâce à la description des exemples qui suivent. L'exemple I est décrit en détail; dans les exemples suivants, seules sont données les caractéristiques des substituants et des composés obtenus (la Chromatographie en couche mince est réalisée sur plaques au gel de silice, sauf indication contraire).

Exemple 1

Chlorure d'heptadécyle-2 méthyle-2 [(N-pyridinium)-4' butyryl-oxyméthy]e]-4 dioxolane-1,3 Ri = Q7H35, R-2 = CH3, 0

40

-n'

N

= pyridinium, X = Cl, p = 3.

Etape a: Préparation de l'heptadécyle-2 méthyle-2 hydroxyméthyle-4 dioxolane-1,3. a Dans un réacteur approprié, on verse 11,1 g (40 mmole) de nonadécanone-2,6 g de glycérol bidistillé - ce qui représente un léger excès par rapport aux proportions stoechiométriques - et 0,6 g d'acide p-toluènesulfonique dissous dans 120 ml de toluène sec. Le mélange réactionnel est porté au reflux sous agitation pendant 12 h et l'eau obtenue est éliminée au moyen d'un

50

55

60

65

appareil Dean Stark. Après refroidissement, la phase organique est lavée avec 30 ml, à 5% en poids, d'une solution aqueuse de potasse, puis à nouveau trois fois avec la quantité minimale d'eau. Après séchage sur sulfate de soude anhydre, le solvant est éliminé sous pression réduite. Le résidu est ensuite purifié par Chromatographie sur colonne au gel de silice. On sépare la fraction de cétone qui n'a pas réagi (éther de pétrole:éther éthylique, 95:5 en volumes), et enfin le dioxolane a (éther de pétrole : éther éthylique, 85:15 en volumes). Le dioxolane est un produit visqueux, partiellement cristallisé.

Rendement: 11 g (78%)

rf: 0,18 (éther de pétrole:éther éthylique, 70:30 en volumes). IR: 3500 cm"1 (OH)

1100-1060 cm"1 (C-0-).

Etape b: Heptadécyle-2 méthyle-2 (chlorobutyryloxymé-thyle-4')-4 dioxolane-1,3. b Un mélange de 6,4g (18 mmole) d'heptadécyle-2 méthyle-2 hydroxyméthyle-4 dioxolane-1,3, préparé comme décrit à l'étape (a) ci-dessus, et de 6 ml (45 mmole) de triéthylamine dans 15 ml de chloroforme sec est ajouté goutte à goutte à une solution de 6,25 g (22 mmole) de chlorure de chlorobutyryle-4 dans 10 ml de chloroforme sec à 0 °C. Le mélange est agité pendant 12 h à température ambiante. Après avoir ajouté 20 ml de chloroforme, le mélange est lavé avec une solution aqueuse de soude IN. puis avec de l'eau jusqu'à neutralité. L'élimination du solvant donne un résidu que l'on Chromatographie sur colonne de gel de silice avec, comme éluant, des mélanges éther de pétrole:éther éthylique successivement 95:5,90:10 et finalement 80:20 en

674 516

4

volumes. On obtient ainsi 7,6 g (rendement: 82%) d'un produit huileux qui cristallise ; point de fusion: 39-40 °C. Ce produit est un mélange de deux isomères eis et trans, difficilement sépara-bles.

rf: 0,45 et 0,37 (éther de pétrole:éther éthylique, 80:20 en volumes)

IR: 1740 cm"1 (C=0)

1180-1160 cm"1 (C-O-C éther et ester)

RMN: 60 MHZ, CDC13, (TMS)

ô: 0,9 (triplet, 3H, CH3 de la chaîne)

1,3 (mult., 35H, 32H+CH3)

2.1 (mult., 2H, CO-CH.-CTL)

2.5 (triplet, 2H, CO-CH2)

3.6 (mult., 4H, CH2-0 et CH2CI)

4.2 (mult., 3H, CH2OCO et CH-O)

Etape c: Chlorure d'heptadécyle-2 méthyle-2 [(pyridinium-N)-4' butyryloxyméthy!e]-4 dioxolane-1,3.1 5 g du composé obtenu à l'étape (b) précédente sont dissous dans 30 ml de pyridine, le mélange est agité à 80 °C, sous circulation d'azote, pendant 24 h. L'excès de pyridine est ensuite éliminé sous pression réduite et le résidu est purifié par Chromatographie sur gel de silice. On élue avec du chloroforme (pour recueillir le matériau de départ qui n'a pas réagi), puis avec des mélanges chloroforme:méthanol, tout d'abord à 90:10, puis à 80:20 en volumes; on obtient 3,80 g du composé recherché. Ce produit est un mélange des deux isomères eis et trans difficilement séparables.

Rendement: 40% sur l'ensemble de l'exemple (65% pour cette étape).

Point de fusion: 84-85 °C.

rf: 0,28 (CHCl3:MeOH, 70:30 en volumes)

IR (nujol): 1740 cm"1 1630 cm"1 (pyridine)

1200,1180 cm"1 (C-O-C).

RMN: 250 MHZ, CDC13.

ô: 0,9 (triplet, 3H, CH3)

1,2 (sing, large 30H)

Etape c: 5 g du composé obtenu dans l'exemple 1 (étape b) sont dissous dans un mélange de 20 ml de quinoléine et de 20 ml de DMSO, puis chauffé à 80 °C sous circulation d'azote, pendant 4 jours. La quinoléine et le DMSO sont distillés sous pression s réduite et le résidu est chromatographié sur colonne de gel de silice (Eluants successifs: CHC13, puis CHCl-:MeOH, 95:5 en volumes). On obtient 2,5 g du produit recherché sous forme d'un mélange de ses deux diastéréoisomères. rf: 0,58 (CHCl3:MeOH, 70:30 en volumes)

io IR v quinoléine 1650,1630 et 1600 cm"1 Spectre de masse:

1,4 (doublet, 3H.

-°S/

CH3) (les deux CH3 des deux diastéréoisomères)

Spectre de masse:

M - Cl m/z

504

n — (ch2)3

' co2h

Exemple 2

Chlorure d'heptadécyle-2 méthyle-2 [(quinolinium-N)-4' butyryloxyméthyle]-4 dioxo! ane-1,3.

25

30

-O CH2-)

1,55 (mult., 2H, -O-^^

2,35 (mult., 2H, CO CH,-CH,)

2,6 (triplet, 2H, CO CH2)

3.9 (mult., 1H, CH-O)

4 (mult., 2H, CH,0 CO)

4,2-3,6 (2 mult., 2H, CH,0) (des deux diastéréoisorrtères) © "

5.10 (mult., 2H, CH2N)

( 8 (mult., 2H, Hp)

pyridinium: ( 8,4 (mult., 1H, HY)

( 9,6 (doublet, 23Ha)

166.

M - Cl Itl/Z

n — ( ch2 ) 3 — c02h

554'

216.

(CH2)3 - C02H : 216.

RMN: quinolinium au lieu de pyridinium.

ô ppm: 7,90-8,10 (4H),

8,70 (1H),

8,90 (1H),

10,90 (lHa).

Exemple 3

Chlorure d'heptadécyle-2 méthyle-2 [(N-thiazolinium)-4'-buty-ryl oxyméthyle]-4 dioxolane-1,3.

Etape c: 850 g du produit obtenu dans l'exemple 1 (étape b)

35 mélangés avec 4 ml de thiazole et 6 ml de DMSO sont chauffés à 80 °C pendant 24 h. Le mélange réactionnel est évaporé sous vide et le résidu est chromatographié sur colonne de gel de silice, éluant: CHCl3:MeOH, 50:50 en volumes. On obtient un produit visqueux.

40 rf: 0,34 (CHCl3:MeOH, 70:30 en volumes). RMN: thiazolinium au lieu pyridinium.

ô ppm: 8,19 (d:lH),

8,4 (d:lH),

10,90 (sing. IH).

45 Spectre de masse: M - Cl : 510 m/z.

Exemple 4

Chlorure d'heptadécyle-2 [(N-pyridinium)-4' butyryloxymé-thyle]-4 dioxolane-1,3.

50 Ri = Cl7H35,R2 = H, 0

-n'

)

\

= pyridinium, X = Cl, p = 3.

55 2 b rf: 0,17 (éther de pétrole:éther éthylique, 30:70 en volumes)

3 b rf: 0,37 (éther de pétrole:éther éthylique, 70:30 en volumes)

Ib rf: 0,16 (chloroforme:méthanol, 70:30 en volumes) 60 -Ov/

Ib RMN au lieu de CH3 à 1,4 (-O CH3)

°x

65

2 multiplets centrés sur 4,9 ppm (-O N H)

Spectre de masse: M - Cl: 490 m/z.

Exemple 5

Chlorure d'heptadécyle-2 [(N-quinolinium)-4' butyryloxymé-thyle]-4 dioxolane-1,3.

5

674 516

Ri = Q7H35, R2 = H,

~N0

Rj = C17H35, R2 = CH3, ©^ "Tr

-N'

\

= quinolinium, X = Cl, p = 3.

rf: 0,48 (chloroforme:méthanol, 70:30 en volumes). 5

Exemple 6

Chlorure d'heptadécyle-2 (n-propyle)-2 [(N-pyridinium)-4' buty-ryloxyméthyle]-4 dioxolane-1,3.

= pyridinium, X = Br, p = 5.

Ri = C17H35, R2 = n-propyl, ©

-N*

10

15

\

= pyridinium, X = Cl, p = 3.

2 crf: 0,23 (éther de pétrole:éther éthylique, 70:30 en volumes)

3 c rf: 0,38 (éther de pétrole:éther éthylique, 80:20 en volumes)

Ic rf: 0,20 (chloroforme:méthanol, 73:30 en volumes)

Ic RMN au lieu de CH3 à 1,4 20

-OCH,

1,55 (mult. 4H-0 CH2)

1,2 (32H)

0,9 (triplet, 6H, 2CH3)

Spectre de masse: M - Cl: 532 m/z.

25

Exemple 7

Chlorure d'heptadécyle-2 méthyle-2 [(N-pyridinium)-5' penta- 30 noyloxyméthyle]-4 dioxolane-1,3.

Ri = CI7H3S, R2 = CH3, ©^

-N'

\

Etape b: Bromure d'heptadécyle-2 méthyle-2 (bromohexanoyloxyméthyle-6')-4 dioxolane-1,3. En suivant le procédé décrit dans l'exemple 1 et en utilisant du chlorure de bromohexanoyl-6, on obtient le produit recherché sous forme de produit visqueux (rendement: 82%).

rf: 0,57 (éther de pétrole:éther, 80:20).

Etape c: Suivant le procédé décrit dans l'exemple 1, le produit recherché est obtenu sous forme d'un produit visqueux (rendement: 70%).

rf: 0,36 (CHCl3:MeOH), 70:30)

IR: 3450 cm"1 (eau résiduelle)

vCO 1740, vC-O-C 1180, vpyridine 1640 cm"1

RMN 500 MHZ CDC13, ô (TMS)

0,85 (triplet, 3H, CH3); 1,25 (sing, large 30H);

1,35 (d3H, -O •^^•CH3,Z+E);l,45(mult.,2H,CH2ô); 2,1 (mult., 2H, COCH2CH2) ; 2,35 (mult., 2H, COCH2) ; 2,70et4,35 (mult., 2H, CH20, Z+E); 4

(mult. 3H, CH2OCO et H-C-O);

©

5,05 (triplet, 2H, CH2N).

pyridinium8,l (triplet, 2H, Hß); 8,6 (triplet, 1H, H7);9,5 (d: 2H, Ha).

U.V. (Ethanol) loge 3,65 X 258,8 nm.

Spectre de masse:

M - Br Itl/Z

= pyridinium, X = Cl, p = 4. 35

rf: 0,23 (chloroforme:méthanol, 70:30 en volumes).

Exemple 8

Chlorure de (triméthoxyphényle-3,4,5)-2 méthyle-2 [N-pyri-dinium)-4' butyryloxyméthyle]-4 dioxolane-1,3.

OCH

N— (CH2) 3 — C02H

532

194.

40

ri - -<fcrS-och3- r2 - ch3,

5 OCH, Ny

45

= pyridinium, X = Cl, p = 3

2 d rf: 0,32 (chloroforme:méthanol, 98:2 en volumes)

3 d rf: 0,61 (chIoroforme:méthanol, 98:2 en volumes) 50 Id rf: 0,34 (chloroforme:méthanol, 60:40 en volumes)

IR 1735 (C=0)

1610 (pyridine)

1590 (benzène)

2740 (OCH3) 55

Id RMN au lieu de la chaîne Ri -° v/

1,5 ppm (m, 3H, -O x CH3) pour R2

3.7 (sing., 9H, OCH3)

6.8 (2H arom.)

Spectre de masse: M - Cl : 432 m/z.

Exemple 10

Bromure d'heptadécyle-2 méthyle-2 [(N-qumolinium)-6' hexanoyloxyméthyle]-4 dioxolane-1,3. rf: 0,60 (CHCl3:MeOH, 70:30 en volumes) IR Quinolinium 1650,1630,1600 cm'1 U.V. (Ethanol) loge 4,53 X 235,4 nm 2,18 X 316,5 nm

• RMN Quinolinium au lieu de pyridinium.

©

ô: 5,5 (2H, CH2N)),

7,90-8,40 (5H), 9,10 (1H), 10,70 (IH, Ha) Spectre de masse:

M - Br m/z ;

60

N —- (CH2 ) 3 — C02H

58?

244

Exemple 9

Bromure d'heptadécyle-2 méthyle-2 [(N-pyridinium)-6' hexanoyloxyméthyle]-4 dioxolane-1,3.

Exemple 11

Bromure d'heptadécyle-2 méthyle-2 [(N-isoquinolinium)-6' hexanoyloxyméthyle]-4 dioxolane-1,3.

674 516

6

Etape c: On utilise de l'isoquinoléine au lieu delà quinoléine.

rf: 0,55 (CHCl,:MeOH, 70:30 en volumes) IR isoquinoléine 1650,1610,1590 cm'1.

RMN isoquinolinium au lieu de quinolinium.

©

ô: 5,15 (triplet, 2H, CH2N);

7,95-8,40 (4H); 8,80 (2H); 11,05 (1H)

Spectre de masse: M - Br : 582 m/z.

Exemple 12

Bromure d'heptadécyle-2 méthyle-2 [(N-pyridinium)-ll' undécanoyloxyméthylej-4 dioxolane-1,3. ri = ci7h3s, r2 = ch3, ©

10

15

-n'

= pyridinium, X = Br, p = 10.

20

Etape b: Heptadécyle-2 méthyle-2 (bromo-undécanoyloxy-

méthyle-ll')-4 dioxolane-1,3.

En suivant le procédé décrit dans l'exemple 1 et en utilisant du chlorure de bromo-11 undécanoyle, on obtient le produit recherché.

Point de fusion: 52 °C (rendement 60%)

rf: 0,26 (éther de pétrole:éther éthylique, 85:15).

Etape c

Point de fusion: 92 °C

rf: 0,45 (CHCl3:MeOH, 70:30 en volumes)

Spectre de masse: M - Br: 602 m/z.

Exemple 13

Bromure d'heptadécyle-2 (n-propyJe)-2 [(N-pyridinium)-6' hexanoylméthyle]-4 dioxolane-1,3.

25

30

35

Ri = C17H35, R2 = n-propyle, ©

-N^ J

= pyridinium, X = Br, p = 5. \ '

rf: 0,44 (CHCl3:MeOH, 70:30 en volumes)

Point de fusion: 76 °C

Spectre de masse: M - Br: 560 m/z.

Exemple 14

Bromure de nonyle-2 méthyle-2 [(N-pyridinium)-6' hexanoyloxyxméthyle]-4 dioxolane-1,3. R, = C9H19, R2 = CH3, ©

n'

= pyridinium, X = Br, p = 5.

Etape b rf : 0,50 (éther de pétrole:éther éthylique, 80:20 en volumes)

Etape c rf: 0,30 (CHCl3:MeOH, 70:30 en volumes)

Spectre de masse: M - Br: 420 m/z.

Toxicologie

Les composés selon l'invention ont été administrés à la souris pour déterminer la valeur de la DL,,,. Pour tous les composés selon l'invention, la DL5I) a été supérieure à 300 mg/kg (IP ou SC) et à 600 mg/kg (PO).

40

45

50

55

Pharmacologie

L'intérêt pharmaceutique des composés de l'invention a été mis en évidence par l'expérimentation pharmaceutique suivante.

1. Inhibition de l'agrégation plaquettaire sur le lapin de Nouvelle-Zélande

L'expérimentation a été conduite sur des plaquettes, à partir de plasma de lapin de Nouvelle-Zélande. Les échantillons de sang ont été prélevés par l'artère auriculaire et mis dans une solution de tampon citrate (3,8% ; pH7,4) ; le sang a ensuite été centrifugé pendant 15 mn à 1200 t/mn. L'échantil-, Ion testé a été préparé dans le DMSO, puis versé sur des plaquettes riches en plasma avec lesquelles il a été laissé en contact pendant 1 mn, et une dose de 2,5 nM de PAF a été ajoutée.

La détermination est faite sur un appareil Cronolog Coultronics qui détermine le pourcentage de transmission correspondant à la valeur maximale du pic avant la désagrégation. Le pourcentage de variation de l'inhibition, en ce qui concerne le pourcentage de transmission, est calculé (témoin: DMSO pur).

Cette méthode est décrite en détail dans Laboratory Investigations, Vol. 41, No. 3, p. 275,1979, Jean-Pierre Cazenave, Dr. med. Jacques Benveniste, Dr. med., et J. Fraser Mustard, M. D., «Aggregation of Rabbits Platelets by Platelet-Activating Factor is independent of the Release Reaction and the Arachidonate Pathway and inhibited by Membrane-Active drugs».

Les résultats démontrent que les composés inhibent l'agrégation induite par 2,5 nM de PAF. Cinq tests, effectués sur des lots de chacun cinq lapins, ont permis de calculer la CI50 des divers composés en utilisant la méthode de régression linéaire.

Pour les composés des différents exemples, les valeurs suivantes de CIS0 ont été trouvées:

Exemple No.

No. 1 No. 2 No. 3 No. 4 No. 5 No. 6 No. 7 No. 8 No. 9 No. 10 No. 12 No. 13 No. 14

CI50PRP(M)

2,2-1,2-2,15-7-3,1-3,04-5-1,13-4,04-3,03-3,12-1.73 -1,46-

10-e

IO"6 10'5 10'6 10'6 10'6 10'6 10'5 10'7 10'7 10'5 10'6 10'6

60

65

2 - Binding Matériel et methode Le PAF - [3H] synthétique tritié utilisé est une solution éthanolique présentant une activité spécifique de 59,5 ci/mmols. Le PAF non marqué et le PAF-lyso sont en solution dans l'éthanol et stockés à-80 °C. Les composés testés sont en solution dans le DMSO.

Préparations des plaquettes de membrane On prélève du sang complet de lapin (6 volumes) par l'artère principale de l'oreille et on le verse dans 1 volume d'une solution

7

674 516

d'ACD (1,4 g d'acide citrique, 2,5 g citrate de sodium, 2 g de Les valeurs trouvées pour les corps des différents exemples dextrose pour 100 ml de H20) et on le centrifuge à 150 g pendant sont les suivantes :

15 min. Les plaquettes riches en plasma (PRP) sont retirées avec précaution et centrifugées pendant 15 min à 1000 g. L'amas plaquettaire est ensuite lavé 3 fois: deux fois à l'aide de 10 mM 5 Exemple No. IC50 d'un tampon Tris-HCl, pH 7,4 contenant 150 mM NaCl, 5 mM

MgCl2,2mMd'EDTAetunedernièrefoisparlemêmetampon, No. 1 4,5-10"7

mais sans chlorure de sodium. No. 9 3,5-10"8

L'amas plaquettaire est remis en suspension dans ce dernier No. 10 3,5 • 10"8

tampon, congelé rapidement dans l'azote liquide et décongelé io No. 14 6,1 • 10'7 lentement à température ambiante au moins 3 fois comme cela a été décrit par T. Y. Shen et al. Les plaquettes lysées sont centrifugées à 100 000 g pendant 30 min dans une ultra centrifugeuse L8

55 modèle Beckman (Rotor 50,2 Ti). Les plaquettes homogénéi- 3-Bronchoconstriction, leucopenie et thrombocytopenie sées sont stockées à -80 °C et utilisées sous deux semaines dans 15 induites par PAF chez le cochon d'Inde changements notables dans les caractéristiques du binding du PAF acéther.

Le contenu en protéines est déterminé par la méthode Lowry Matériaux et methodes utilisant de la serumalbumine bovine comme étalon. On anesthésie des cochons Inde mâles (400 à 500 g) avec de

20 l'uréthane (1,5 g/kg, IP) avant de leur faire subir une trachéoto-

Dosage du binding mie et d'introduire une pompe respiratoire (Ugo Basile) [70 à 80

On ajoute 60 à 100 (j,g de protéines de la membrane sous un inspirations par min, 1 ml d'air (100 g) inspiration], pour suppri-

volume final d'un ml dans des tubes plastiques contenant 1 nM mer toute respiration spontanée, on effectue un pneumothorax.

PAF- [3H] dans 10 nM d'un tampon de Tris-HCl de pH 7 La résistance à l'insuflation est mesurée avec un transducteur de contenant 0,025% serumalbumine bovine et incubé avec ou sans 25 pression (Ugo Basile) par rapport à une pression initiale de 10 cm

PAF non marqué ou d'antagonistes du PAF. L'incubation s'ef- H20 selon Konzett et Rossler. Les animaux sontrépartis dans fectue pendant 1 h 30 à 0 °C. Le PAF- [3H] lié s'est séparé du PAF plusieurs groupes qui sont traités ou non avec les composés de

- [3H] par filtration immédiate sous vide sur filtres en fibre de l'invention (0,05 ; 0,1 ; 0,5 ; 1 et 5 mg/kg). Les produits sont verre GF/C (système Brandel). Le réacteur et les filtres sont lavés administrés par intra-veineuse 1 h avant le PAF.

3 fois à l'aide d'une solution de 5 ml de tampon glacé. Les filtres 30 Les animaux sont testés avec différentes doses de PAF (30 à

sont ensuite placés dans des flacons en polyethylène remplis de 10 100 n/kg) administrées par intra-veineuse ; on enregistre les ml de fluide de scintillation liquide et on mesure la radioactivité variations de la résistance à l'insuflation.

avec un compteur LKB ß dont le rendement est de 45 %. Des échantillons de sang sont prélévés avant administration

On détermine le binding non spécifique en présence de 10"6 M du PAF puis 1,5 et 10 min après administration. Quarante |il de de PAF non marqué. On calcule le binding spécifique en 35 sang sont dilués dans 10 ml d'isoton (Coultronics, France) ; les soustrayant le binding non spécifique du binding total. On érythrocytes sont dilués dans de la zapoglobine avant de compter détermine l'inhibition provoquée par les composés sur le binding les leucocytes avec un compteur Coulter. Pour déterminer le

PAF-[3H] spécifique en pourcentage d'inhibition par la formule nombre de plaquettes, 40 jxl de sang sont dilués dans 2 ml d'isoton suivante: puis centrifugés à 100 tours/min pendant 30 sec, on prélève 100 ul

1'

% inhibition = X 100

(3H-PAF lié totalement - lié 01

l des composés testés

PAF-3H lié spécifiquement de la couche de surface et on les dilue dans 10 ml d'isoton avant de Legende de tous les tableaux: compter les plaquettes avec un compteur Coulter. NS = Non significatif

* = p < 0,05 50 ** = p < 0,01

p < 0,001

Tableau No 1:

Effets du bromure d'heptadécyle-2 méthyle-2 [(N-pyridinium)-6' hexanoyloxyméthyle]-4 dioxolane-1,3 sur la bronchoconstriction induite par PAF

55

Tableau No 2:

Effets du bromure d'heptadécyle-2 méthyle-2 [(N-pyridinium)-6' hexanoyloxyméthyle]-4 dioxolane-1.3 sur la leucopénie induite par PAF

Doses mg/kg n

Pourcentage de

Pourcentage

IV

Bronchoconstriction de Variation

Témoin

_

8

79,8 +/- 3,22

_

Composé

5

3

3,5 +/-1,53

-95,6***

de

1

4

19,1 +/-10,51

-7,61***

l'exemple

0,5

6

23,6 +/—7,15

-70,4***

No. 9

0,1

6

43,8 +/-14,77

45.1**

0,05

3

79,0 +/- 9,27

-1,0 NS

Doses mg/kg IV

Temps (mn)

Pourcentage de diminution du nombre de leucocytes

65

Témoin

1 5

10 1

40,8+/- 7,18 29,9 +/-10,89 33,5 +/- 5,04 16,5 +/- 2,42

Pourcentage de Variation

-59,6*

674 516

8

Doses n

Temps

Pourcentage

mg/kg

(mn)

de diminution de Variation

IV

du nombre de leucocytes

Composé

5

3

5

15,9+/- 0,99

-45,5 NS

3

10

18,7+/- 5,08

-44,2 NS

4

1

3,5 +/-12,60

-91,4**

de

1

4

5

2,9 +/-10,51

-90,1*

4

10

1,0 +/-22,62

-97,0**

6

1

34,6+/- 6,35

-15,2 NS

l'exemple

0,5

6

5

19,0+/- 6,42

-34,9 NS

6

10

14,6+/- 5,36

-56,4 NS

6

1

41,8+/- 6,50

+2,5 NS

No. 9

0,1

6

5

31,9+/- 4,88

-9,2 NS

6

10

33,5+/- 4,65

0,0 NS

3

1

45,3+/- 5,70

+11,0 NS

0,05

3

5

21,6+/- 3,42

-26,0 NS

3

10

14,2 +/-17,30

-57,6 NS

Tableau No. 5:

Effets du bromure d'heptadécyle-2 méthyle-2 [(N-quinolinium)-6' hexanoyloxyméthyle]-4 dioxolane-1,3 sur la leucopénie induite par PAF

10

20

Doses n

Temps Pourcentage

Pourcentage

mg/kg

(mn)

de diminution de Variation

IV

du nombre de leucocytes

6

1

41,4+/- 8,0

_

Témoin

—

6

5

28,7+/- 6,9

-

6

10

26,9 +/-10,1

-

5

1

24,1+/- 6,8

-^1,0 NS

Composé de 1

5

9,3+/- 9,4

-67,6**

5

10

8,9 +/-13,2

-66,9**

5

1

17,0 +/-12,9

-58,9*

l'exemple

0,5

5

9,0 +/-11,8

-68,6**

5

10

-7,6 +/-17,5

+128,3 NS

5

1

38,8+/- 6,3

+6,3 NS

No. 10

0,1

5

38,9+/- 5,7

+35,5 NS

5

10

41,2+/- 6,5

+53,2 NS

Tableau No. 3: 25

Effets du bromure d'heptadécyle 2 méthyle-2 [(N-pyridinium)-6' hexanoyloxyméthyle]-4 dioxolane-1,3 sur la thrombocytophénie induite par PAF

Tableau No. 6:

Effets du bromure d'heptadécyle-2 méthyle-2 [(N-quinolinium)-6' hexanoyloxyméthyle]-4 dioxolane-1,3 sur la thrombocytopénie induite par PAF

30

Doses n Temps Pourcentage mg/kg (mn) de diminution IV du nombre de leucocytes

Pourcentage de Variation

Doses mg/kg n

Pourcentage de

Pourcentage

IV

Bronchoconstriction de Variation

Témoin

6

90,8+/- 0,95

( 'nnipose de 1

5

8,1 +/- 2,91

-91,1***

l'exemple 0,5

5

25,1 +/- 6,53

-72,4***

No. 10 0,1

5

80,4 +/-13.78

-11,5 NS

Doses n Temps Pourcentage mg/kg (mn) de diminution IV du nombre de leucocytes

Pourcentage de Variation

8

1

68,6 +/-

6,79

Témoin

-

8

5

42,4 +/-

2,71

—

8

10

42,5 +/-

3,14

—

3

1

4,2 +/-

2,35

-93,9***

Composé

5

3

5

5,6 +/-

1,84

-86,8***

3

10

1,1 +/-

1,15

-97,4** 4

4

1

11,5 +/-

6,21

-83,2***

de

1

4

5

22,5 +/-

3,27

-46,9*

4

10

21,0 +/-

3,87

-50,6*

6

1

19,3 +/-

10,19

—71 9***

l'exemple

0,5

6

5

9,6 +/-

12,15

_77|4***

6

10

10,9 +/-

9,94

-74,4***

6

1

30,1 +/-

13,72

-56,1**

No. 9

0,1

6

5

34,7 +/-

3,60

-18,2 NS

6

10

42,3 +/-

4,79

-0,5 NS

3

1

45,2 +/-

1,20

-34,1 NS

0,05

3

5

43,0 +/-

4,80

+1,4 NS

3

10

36,1 +/-

2,41

-15,1 NS

35

40

45

6

1

65,3 +/-

8,5

_

Témoin

6

5

49,1 +/-

4,8

-

6

10

48,5 +/-

0,5

-

5

1

19,3 +/-

1,4

-58,3***

Composé de 1

5

22,1 +/-

2,5

-55,0**

5

10

19,4 +/-

3,6

-60,0**

5

1

26,2 +/-

6,3

-59,9**

l'exemple

0.5

5

29,8 +/-

1,7

-39,3*

5

10

32,1 +/-

5,8

-33,8*

5

1

51,1 +/-

12,1

-21,7 NS

No. 10

0,1

5

49,1 +/-

8,8

0NS

5

10

45,0 +/-

9,7

-7,2 NS

Tableau No. 4:

Effets du bromure d'heptadécyle-2 méthyle-2 [(N-quinolinium)-6' hexanoyloxyméthyle]-4 dioxolane-1,3 sur la bronchoconstriction induite par PAF

Resultats

50 Le bromure d'heptadécyle-2 méthyle-2 [(N-pyridinium)-6' hexanoyloxyméthyle]-4 dioxolane-1,3 (0,5; 1 et 5 mg/kg, IV) et le bromure d'heptadécyle-2 méthyle-2 [(N-quinolinium)-6' hexa-noyloxyméthyle]-4 dioxolane-1,3 (0,5 et 1 mg/kg, IV) inhibent la bronchoconstriction et la thrombocytopénie induites par PAF 55 chez le cochon d'Inde.

4-Bronchoconstriction, leucopénie et thrombocytopénie induites par antigene chez le cochon d'Inde passivement sensibilisé par sérum hétérologue 6° Une injection intra-veineuse d'ovalbumine à des cochons d'Inde passivement sensibilisés avec un sérum anti-ovalbumine de lapin induit une bronchoconstriction associée à une leucopénie et à une thrombocytopénie. Cette réaction anaphylactique semble être dûe à la libération d'histamine et à la génération de 65métabolites d'acide arachidonique (Prostaglandines, throm-boxane A2 et leucotriènes). Chez le cochon d'Inde, la libération d'autacoïdes est en principe déclenchée via les immunoglubulines de la classe IgG.

9

674 516

Methode

- Animaux:

Cochons d'Inde mâles, Charles River (450 à 500 g)

- Procédé d'immunisation:

Injection intra-veineuse, 18 h avant le test avec l'antigène, de 0,5 ml/kg d'une dilution à Yi d'antiséram d'anti-ovalbumine de lapin.

- Le test est composé de:

Ovalbumine, 0,75 g/kg,

Injection intra-veineuse de l'antigène en dosage final de 1 ml/

kg,

Agent vecteur: 0,15 M de NaCl.

-Les composés sont administrés par voie orale, dosés à 1,5 ml/kg, 1 h avant le test avec l'antigène, après anesthésie par injection intrapéritonéale de carbamate d'éthyle (1,5 g/kg) dosé à 10 ml/kg.

Paramètres contrôlés et expression des données: a - Bronchoconstriction:

bronchoconstriction induite par antigène en mm (A), bronchoconstriction maximale en mm (B).

Le pourcentage de bronchoconstriction est calculé comme suit:

a x 100

b

Le comptage des neutrophiles et des plaquettes est réalisé 1 min avant le test puis 1,5 et 10 min après le test. Les écarts sont exprimés en pourcentages calculés par rapport aux valeurs obtenues une minute avant le test.

L'équipement suivant a été utilisé:

- Ugo Basile, Comerio Italie,

Respirateur Rodent réf. 7025 Transducteur Bronchospasme réf. 7020 Enregistreur Deux-Pistes «Gemini» réf. 7070

- Coultronics, France,

Compteur Coulters Z B I

Tableau No. 7:

Effets du bromure d'heptadécyle-2 méthyle-2 [(N-pyridinium)-6' hexanoyloxyméthyle]-4 dioxolane-1,3 sur la bronchoconstriction induite par antigène

Doses mg/kg n

Pourcentage de

Pourcentage

IV

Bronchoconstriction de Variation

Témoin - 6

71,9 +/-14,2

—

Composé de

l'ex. No. 9 5 8

51,3 +/-14,2

-28,7 NS

Tableau No. 8:

Effets du bromure d'heptadécyle-2 méthyle-2 [(N-pyridinium)-6' hexanoyloxyméthyle]-4 dioxolane-1,3 sur la leucopénie induite par antigène

Doses n Temps

Pourcentage

Pourcentage mg/kg

(mn)

de diminution d'Inhibition

IV

du nombre

de leucocytes

6 1

-11,8+/- 5,1

_

Témoin -

6 5

-39,6+/- 9,5

-

6 10

-53,9+/- 7,1

-

Composé de

8 1

-15,6+/- 6,6

+32,0 NS

l'exemple 5

8 5

- 8,7 +/-10,7

-78,0*

No. 9

8 10

-12,3 +/-14,1

-77,2*

Tableau No. 9:

Effets du bromure d'heptadécyle-2 méthyle-2 [(N-pyridinium)-6' hexanoyloxyméthyle]-4 dioxolane-1,3 sur la thrombocytopénie induite par antigène

Doses n Temps

Pourcentage

Pourcentage mg/kg

(mn)

de diminution d'Inhibition

IV

du nombre

de leucocytes

6 1

- 6,8 +/- 2,7

_

Témoin -

6 5

-39,7 +/-12,5

—

6 10

-26,1+/- 8,1

—

Composé de

8 1

+ 0,3 +/- 7,9

-104,4 NS

l'exemple 5

8 5

- 3,5 +/- 3,1

-91,2**

No. 9

8 10

-15,7+/- 6,2

-39,8 NS

Resultats

Le bromure d'heptadécyle-2 méthyle-2 [(N-pyridinium)-6' hexanoyloxyméthyle]-4 dioxolane-1,3 (5 mg/kg, IV) neutralise la leucopénie et la thrombocytopénie induites par l'antigène, sans réduire notablement la bronchoconstriction induite par l'antigène.

5 - Action sur l'hypotension induite par le PAF chez le rat anesthésié Matériaux et methodes:

Des rats Sprague Dawley mâles (Charles River) (250 à 300 g) sont anesthésiés (IP) au carbamate d'éthyle dosé à 1,2 g/kg.

Une injection intra-veineuse de PAF provoque une hypotension dose-dépendante. On recherche les effets du bromure d'heptadécyle-2 méthyle-2 [(N-pyridinium)-6' hexanoyloxymé-thyle]-4 dioxolane-1,3 et du bromure d'heptadécyle-2 méthyle-2 [(N-quinolinium)-6' hexanoyloxyméthyle]-4 dioxolane-1,3 sur l'hypotension induite par le PAF, dans les traitements curatifs. L'hypotension est provoquée par une seule dose de PAF (1 |J,g/ kg) ,0,1 ml/100 g en volume, injectée IV, directement dans la veine du pénis. On administre les composés quand le point d'hypotension maximum est atteint, c'est-à-dire 3 min après l'injection de PAF.

- Paramètres mesurés et expression des résultats:

On mesure les pressions systolique et diastolique (mm Hg). Les valeurs sont exprimées, sous la forme de leur moyenne +/-SEM, sur les courbes des fig. 1 et 2.

- Appareils de mesures:

Transducteur Gould P50 pour mesurer la pression artérielle,

Perfuseur Braun,

Enregistreur polygraphique Gould 8000 S.

6-Antagonisme de l'agrégation de leucocytes polymorpho-nucléaires induite par le PAF

On obtient des leucocytes polymorphonucléaires (PMNs) selon la méthode décrite par A.W. Ford-Hutchinson & al !Dr J. Pharmacol. 76,367-371,1982). Des suspensions cellulaires (< 90% de PMNs) sont préparées à partir d'exsudats péritonéaux obtenus après avoir injecté, IP, 5 ml de caseïnate de sodium à 12% à des rats Wistar mâles, pesant 300 g.

Après centrifugation, les cellules sont lavées à la solution de Hanks et remises en suspension dans du MEM/Hepes à 30 mM en moyenne (PM = 7,4), la concentration étant de 107 cellules par ml. Dix minutes avant le début de l'agrégation, on ajoute de la cytochalasine B (5 u/ml) de façon à augmenter l'agrégation des PMNs. La transmission lumineuse à travers la suspension cellulaire (400 [il) est mesurée sous agitation magnétique à 900 T/mn, à l'aide d'un agrégomètre à double faisceau (Chronolog Corp. Coultronics).

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

674 516 10

Le bac témoin contient la suspension cellulaire diluée à 20% ambiante), le colorant pénètre dans la membrane de la cellule et, du nombre de cellules avec le MEM et la différence représente après hydrolyse, est piégé dans la plaquette. Les composés sont 100% de transmission. La variation de la transmission, lorsqu'on pré-incubés avec les plaquettes pendant 15 min en même temps ajoute du PAF, est enregistrée en continu. qu'un mélange de CP/CPK qui détruit l'ADP sécrétée.

4 ^1 des composés dissous dans le MEM/Hepes sont ajoutés à s Après avoir ajouté le PAF à la suspension plaquettaire, on la suspension de PMNs, avant l'addition de PAF. effectue les mesures de fluorescence (excitation: X = 339 nm,

émission : X = 492 nm). L'intensité de la fluorescence est Resultats proportionnelle au niveau cytosolique libre de calcium [Ca2+]i

Le PAF, dosé à 10 s M, induit une agrégation de 55 à70% dans qui peut être quantifié suivant la méthode de Tsien & al., J. Cell cette suspension de PMNs. 10 Biol., 94, 325-334,1982.

Le bromure d'heptadécyle-2 méthyle-2 [(N-pyridinium)-6'

hexanoyloxyméthyle]-4 dioxolane-1,3 et le bromure d'heptadé- Resultats cyle-2 méthyle-2 [(N-quinolinium)-6' hexanoyloxyméthyle]-4 La stimulation plaquettaire induite par le PAF dosé à 2 x 10"9

dioxolane-1,3 inhibent, en fonction de leur dose, cette agrégation M augmente le niveau de [Ca2+]i qui passe d'environ 150 nM (au avec les valeurs respectives de CI50s suivantes: 15 repos) à 400-600 nM.

bromure d'heptadécyle-2 méthyle-2 [(N-pyridinium)-6' hexa- Le bromure d'heltadécyle-2 méthyle-2 [(N-pyridinium)-6' noyloxyméthyle]-4dioxolane-1,3 : 5 x 10"7M, hexanoyloxyméthyle]-4dioxolane-l,3etlebromured'heptadé-

bromure d'heptadécyle-2 méthyle-2 [(N-quinolinium)-6' cyle-2 méthyle-2 [(N-quinolinium)-6' hexanoyloxyméthyle]-4

hexanoyloxyméthyle]-4 dioxolane-1,3 :10"6 M. dioxolane-1,3 dosés à5 X 10"7 M inhibent totalement la mobilisa-

20 tion de [Ca2+]i induite par le PAF. A 5 X 10"8 M, l'inhibition de l'effet du PAF est, respectivement, de 44% pour le bromure 7-Inhibition de la mobilisation intracytosolique libre de calcium d'heptadécyle-2 méthyle-2 [(N-pyridinium)-6' hexanoyloxymé-induite par le PAF dans des plaquettes de lapin lavées thyle]-4 dioxolane-1,3 et de 75% pour le bromure d'heptadécyle-On prélève du sang dans l'artère auriculaire du lapin, puis on 2 méthyle-2 [(N-quinolinium)- 6' hexanoyloxyméthyle]-4 dioxo-le mélange avec de l'acide citrique, du citrate de sodium, de la 25 lane-1,3.

dextrose et un anti-coagulant; les plaquettes sont préparées selon

Adlie & al., Brit. J. Pharmacology, 19,7-17,1970. Elles sont Posologie incubées avec 100 [xM de sel acétylsalicique pendant 30 min pour Chez l'homme, en administration orale, les doses quoti-éviter une agrégation induite par le thromboxane. Ces plaquettes diennes vont de 0,1 à 0,5 mg en comprimés ou capsules à sont ensuite chargées avec un colorant quin 2, indicateur de 30 enrobage entérique; pour l'administration intra-veineuse, les calcium fluorescent, par incubation avec l'acéto-méthylester de doses quotidiennes correspondantes sont de 0,01 à 0,05 mg. La quin2(15 jxM dans le DMSO pendant 20 min, àtempérature durée du traitement est de 2 à 6 semaines.

M

1 Blatt Zeichnungen

Claims

674 516

2

REVENDICATIONS 1. Aminoacylates d'acétal du glycérol de formule générale I:

ch2-°v vr1 C

/ \

ch — 0 r.

I

®z>-

— ] X p \

dans laquelle

Ri représente un groupement phényle substitué ou un groupe 15 de formule CmH2m+1 m étant un entier de 9 à 25,

R2 représente un atome d'hydrogène, un groupement phényle ou un groupe de formule C„H2n+1, n étant un entier de 1 à 10, p est un entier de 3 à 10,

-N^

\

représente un groupement hétérocyclique contenant un atome d'azote, et

Xe représente l'anion pharmaceutiquement acceptable d'un acide minéral ou organique, un ion halogène, ou les anions des acides benzoïque, acétique, méthanesulfonique, ou tartrique,

sous la forme de leurs diastéréoisomères isolés ou de tout mélange de ceux-ci. 30
2. Composés de formule I selon la revendication 1, dans lesquels le groupement hétérocyclique