PT86343B

PT86343B - Processo para a preparacao de ester morfolinoetilico de acido micofenolico e de seus derivados

Info

Publication number: PT86343B
Application number: PT86343A
Authority: PT
Inventors: Peter H Nelson; Chee-Liang Leo Gu; Anthony C Allison; Elsie M Eugui; William A Lee
Original assignee: Syntex Inc
Priority date: 1987-01-30
Filing date: 1987-12-11
Publication date: 1991-02-08
Also published as: HU201927B; US4753935A; FI85141B; NL960019I1; ES2038190T3; US4952579A; PT86343A; CA1333285C; IL84833A0; EP0281713B1; HU210350A9; PH23819A; US4786637A; JPH0571591B2; US4808592A; AU599728B2; NL960019I2; IE873397L; GEP20094816B; US4948793A

Description

EPÍGRAFE: PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE ÉSTER M0RF0LIN0ETILICO DE ACIDO MICOFEN0LICO E DE SEUS DERIVADOS.

INVENTORES: Peter H. Nelson, Chee-Ling Leo Gu, Anthony C.

Allison, Elsie M. Eugui, William A.Lee.

Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo 4.° da Convenção de Paris de 20 de Março de 1883. EStados UNidos da América do Norte, em de Janeiro de 1987, sob o n² 07/008.717.

INPI. MOD. 113 RF «732

Resumo cesso para

MEMÓRIA DESCRITIVA

A invenção diz respeito a um propreparação de compostos de formula (A)

SYNTEX (U.S.A.)INC.

PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE ESTER MORFOLINOETILICO DE ACI DO MICOFENÓLICO E DE SEUS DERIVADOS

-2na qual

Z é hidrogénio ou -C(O)R, em que R é alquilo inferior ou arilo, e dos seus sais farmaceuticamente aceitáveis, bem como da composições farmacêuticas que os contêm.

Estes compostos e composições .fa_r maceuticas são utilizáveis como agentes imunosupressores, agentes anti-inflamatórios, agentes antitumores, agentes antivíricos, e agentes antipsoriáticos.

O processo de preparação dos referidos compostos consiste, por exemplo, em se fazer reagir un composto de formula

em que

Z tem o significado anterior e X é halogeneo, com morfolinoetanol.

i

Antecedentes da Invenção

Âmbito da Invenção

A presente invenção refere-se ao éter morfolinoetílico de acido micofenólico e a alguns derivados éster simples do grupo hidróxilo fenólico, a composições farmacêuticas que contêm estes compostos, a processos para a preparação destes compostos, e à utilização destes compostos como agentes imunosupressores e anti-inflamatórios. Por exemplo, estes compostos podem ser utilizados para o tratamento de artrite reumatóide, na qual há um processo inflamatório accionado imunologicamente. Devido aos seus efeitos no metabolismo da purina, as composições farmacêuticas da presente invenção também podem ser utilizadas como agentes anti-tumor, antivíricos e antipsoriáticos.

Nota Remissiva sobre Pedidos de

Patente Relacionados

Este pedido de patente está rela cionado com o No. de Serie 803.041, depositado em 27 de Novem bro de 1985, publicado em 11 de Agosto de 1987 como Patente E.U. 4.686.234; e ao No. de Serie 821.633, depositado em 23 de Janeiro de 1986, não concedido.

Informação Antecedente e Descrições Relacionadas

As doenças inflamatórias, em particular a artrite reumatóide, têm sido tratadas com diversos compostos que representam várias classes estruturais e activi dades biológicas, incluindo, por exemplo, agnetes anti-infla_ matórios (corticoesteróides, aspirina, derivados de ácidos arilacético e arilpropiónico e oxicamas), agentes e regimes imunosupressores (metotrexato, ciclofosfamisa, ciclosporina, e irradiação linfóide, total), e medicamentos anti-reumáticos de acção retardada (sais de ouro, e penicilamina e seus derivados). No entanto, nenhuma classe, representativa de gualguer destas classes de compostos é considerada ideal.

ácido micofenólico é um atibiótico com fraca actividade que se encontra no caldo de fermen tação de Penicillium brevicompactum. Alguns compostos rela cionados com acido micofenólico, e as suas utilizações no tratamento de doenças inflamatórias, por exemplo artrite reumatóide, estão descritos nos dois pedidos relacionados anteriores que se seguem.

No. de Serie 803.041, depositado em 27 de Novembro de 1985, agora Patente E.U. 4.686.234, refere-se a compostos que têm a estrutura geral de formula I:

e aos seus sais farmaceuticamente aceitáveis, em que:

é H ou alquilo inferior com 1 a 6 átomos de carbono;

R2 é H, alquilo inferior com 1 a 6 átomos de carbono ou

-f enil^-CC^R^, em que R^ é H, alquilo inferior com 1 a 6 átomos de carbono ou um catião farmaceuticamente aceitável:

R^ e Rç., independentemente um do outro, são H ou alquilo inferior com 1 a 6 átomos de carbono;

e Y^, independentemente um do outro, são 0 ou S; e q é um número inteiro de 1 a 6.

No. de serie 821.633, deposita do em 23 de Janeiro de 1986, agora concedido, diz respeito a compostos que têm a estrutura geral da Formula 2:

(Formula 2) e aos seus sais farmaceuticamente aceitáveis, em que:

A é oxigénio ou enxofre;

R^ é escolhido no grupo constituído por:

^A1	0		Q H
II	II		t 1
H , -CR₂,	-ClCH^CO^	e	-C=C-Q₁, em que

A^ é oxigénio ou enxofre;

q é um numero inteiro de 0 a 6;

R₂ é alquilo, haloalquilo ou -NR^R^, em que:

e são independentemente H, alquilo, haloalquilo, cicloalquilo, fenilo opcionalmente monossubstituído por halogéneo, hidroxi,carboxi, clorocarbonilo, sulfonilamino, nitro, ciano, fenilo, alquilo, acilo, alcoxicarbonilo, acilamino, dialquilamino ou dialquilaminoetoxicarbonilo,fenilo opcionalmente disubstituído por hidroxi, carboxi, nitro ou alquilo, ou benzilo opcionalmente substituído por dialquilami^ no;

R3 é H, alquilo ou um catião farmaceuticamente aceitável;

Q e são independentemente H ou -CC^R^; e 'e escolhido no grupo constituído por:

IH-tetrazolilo, -CH₂OH, -CHO, -CN, -C(O)A₂Rg e -C(O)NR_?R₈em que:

A₂ é oxigénio ou enxofre;

R_c é H, alquilo, alcenilo, cicloalquilo, fenilo opcional6 mente substituído, benzilo opcionalmente substituído ou um catião farmaceuticamente aceitável; e

Ry e Rg são independentemente H, alquilo ou cicloalquilo, ou R? e Rg tomados conjuntamente são -(CH₂)₂0(CH₂)₂~,

ou -(CH₂)₅~; desde que e Rg não sejam ambos H se A e A₂ foram oxigénio.

Compostos um tanto estruturalmente análogos aos compostos que têm as formulas 1 e 2 estão descritos nas Patentes E.U.Nos. 3.705.894; 3.853.319;

3.868.454; e 3.880.995, na Patente Japonesa No. J 57024380, em J.Antibiot.,29 (3), 275-85, 286-91 (1976) e em Câncer

Research, 36(8) 2923-7(1976).

Aos compostos descritos atribuem-se actividades anti-tumor, imunosupressoras, antivíricas,^Λantiartríticas e/ou antipsoriáticas.

Sumario da Invenção

Um aspecto da presente invenção diz respeito ao éster morfolinoetílico de acido micofenólico e alguns derivados de acido micofenólico, isto é, compostos que têm a estrutura da Fórmula A, como segue:

(Formula A)

na qual

Z é hidrogénio ou -C(O)R, em que

R é alquilo ou arilo inferior, e aos seus sais farmacêutica mente aceitáveis.

Noutro aspecto, a invenção refere -sea uma composição farmacêutica que contém uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto com a formula A misturada com pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável .

Noutro aspecto ainda, a invenção refere-se a processos para a preparação de compostos com a formula A.

Em mais outro aspecto, a invenção refere-se a um processo para o tratamento de desordens autoi^ munes, psoríase, doenças inflamatórias, incluindo em particu lar artrite reumatóide, e para o tratamento de tumores e vírus num mamífero por meio da administração a um maaífero que necessite desse tratamento de uma quantidade terapêuticamente eficaz de um composto com a formula A.

Os composto que têm a Formula A apresentam propriedades farmacocinéticas vantajosas, por exemplo solubilidade no ambiente de libertação(por exemplo, o estomago), pico de concentração de plasma, concentração de plasma máxima e actividade melhorada, por exemplo, activ£ dade anti-inflamatória em comparação com ácido micofenólico.

Descrição Pormenorizada da Invenção

Definições e Parâmetros Gerais

Apresentam-se as definições que se seguem para descrever e definir o significado e alcance dos diversos termos usados para descrever aqui a invenção.

A numeração do acido micofenólico é a seguinte:

ch₃

Os compostos de acordo com a invenção serão designados mediante o uso do sistema de numeração indicado acima como os ésteres morfolinoetílicos de acido E-6-(1,3-diidro-4-hidroxi-6-metoxi-7-metil-3-oxo-5-isobenzofuranil)-4-metil-4-hexenóico e seus derivados. Os compostos de acordo com a presente invenção são preparados como o isómero da posição E (ou Entgegen). Alguns compostos representativos são denominados como segue:

o composto com a formula A na qual Z é -C(O)R e, em que R é metilo denomina-se E-6-(l,3-diidro-4-acetoxi-6-metoxi-7-metil-3-oxo-5-isobenzofuranil)-4-metil-4-hexenoato de morfolinoetilo. e

o composto com a formula A na qual Z é -C(O)R e, em que R é fenilo denomina-se E-6-(1,3-diidro-4-benzoiloxi-6-metoxi-7-metil-3-oxo-5-isobenzofuranil)-4-metil-4-hexenoato de morfolinoetilo.

Utilizado na presente, o termo alquilo significa um radical monovalente completamente saturado que contém apenas carbono e hidrogénio, e que pode ser um radical de cadeia cíclica, ramificada ou linear. Este termo é ainda exemplificado por radicais como metilo, etilo, t-butilo, pentilo, heptilo, pivalilo, ciclopentilo e ciloexilo.

O termo alquilo inferior significa um radical alquilo monovalente com um a seis átomos de carbono. Este termo é ainda exemplificado por radicais como metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, t-butilo, i-butilo (ou 2-metilpropil), isoamilo, pentilo e isopentilo.

O termo arilo significa um radical carbocíclico aromático insaturado monovalente substituí, do ou não substituído que tem um só anel (por exemplo, fenilo) ou dois anéis condensados (por exemplo, naftilo).

O termo acilo significa um radical baseado num ácido orgânico, por exemplo, -C(O)r\ em que r! é alquilo ou arilo. Utilizado na presente, halo significa fluoro, bromo, cloro e iodo.

isolamento e a purificação dos compostos e produtos intermédios descritos na presente podem ser efectuados, se se desejar, por meio de qualquer pro cesso de separação ou purificação adequado, por exemplo, fiJL tração, extracção, cristalização, cromatografia de coluna, cromatografia de camada delgada ou cromatografia de camada espessa, ou uma combinação destes processos. Nos exemplos gue se seguem podem encontrar-se descrições especificas de processos de separação e isolamento apropriados. No entanto também se podem empregar, evidentemente, outros processos de separação ou isolamento eguivalentes.

Um sal farmaceuticamente aceitável pode ser qualquer sal derivado de um acido inorgânico ou orgânico. 0 termo anião farmaceuticamente aceitável significa o anião desses sais. 0 sal e o anião são escolhjL dos de maneira gue não sejam indesejáveis biologicamente ou de outro modo gualguer. Estes sais são formados com ácidos inorgânicos, por exemplo, ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido sulfúrico (que dá os sais de sulfato e bis. sulfato), ácido azótico, ácido fosfórico e análogos, e ácidos orgânicos como ácido acético, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido pirúvico, acido oxálico, ácido málico, ácido malónico, ácido succínico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzóico, ácido cinâmico, ácido mandélico, ácido metanossulfónico, ácido etanossulfonico, ácido p-toluenossulfónico, acido salicílico, etc.

Utilizado na presente, o termo tratamento ou tratar significa qualguer tratamento de uma doença de/num mamífero, e incluir:

(i) prevenção da doença, isto é, fazer com que os sintomas clínicos da doença não se desenvolvam;

(ii) inibição da doença, sito é, paragem do desenvolvimento de sintomas clínicos; e/ou (iii) alívio da doença, isto é, provocar uma regressão de sintomas clinicos.

Salvo indicação em contrário, as reacções descritas na presente efectuam-se à pressão atmosfé^ rica numa gama de temperaturas desde cerca de 10°C até cerca de 100°C, mais preferivelmente desde cerca de 10°C até cerca de 50°C, e o mais preferivelmente proximo da temperatura ambiente.

Preparação dos Compostos de Formula A

Os compostos de Formula A podem ser preparados de acordo com diversos percursos sintéticos, conforme a substituição em Z, começando geralmente com acido micofenólico, que existe à venda no mercado. Quando Z é -C(O)R, o oxigénio fenólico de acido micofenólico pode ser acilado antes ou depois da esterificação do acido. Quan do Z é hidrogénio, o material de partida é geralmente acido micofenólico.

Esterificação Morfolinoetílica de Ácidos Micofenólicos Podem empregar-se muitos processos de esterificação correntes, por exemplo descrito em

Synthetic Organic Chemistry, de R.B. Wagner e H.D. Zook (Wiley, Nova York) 1956, cf. páginas 479-532.

Descrevem-se abaixo duas vias sin téticas presentemente preferidas para transformação de acido micofenólico e seus derivados nos compostos éster morfolinoetílico que têm a Formula A. A primeira via compreende a transformação num halogeneto de acido, seguida por conden sação com morfolinoetanol para o produto final. A segunda via compreende a transformação directa no produto final utilizando uma reacção carbodiimida.

Como exemplo, uma terceira via menos preferida implica o começo com um éster de acido micofenólico (que não o éster morfolinoetílico) numa reacção de permuta de éster para transformação no produto final desejado.

A Via Halogeneto de Acido-Condensação

Na primeira via sintética, dissolve-se ou faz-se uma suspensão de acido micofenólico ou de um seu derivado acilado num dissolvente inerte nas condi^ ções da reacção (isto é, um dissolvente inerte como benzeno tolueno, acetonitrilo, tetrahidrofurano, éter dietílico, clorofórmio, ou, preferivelmente, cloreto de metileno) e adiciona-se (aproximadamente 10 equivalentes molares para 1) de um agente de halogenação (por exemplo, cloreto de tionilo), opcionalmente juntamente com uma pequena quantida de de dimetilformamida. Mantém-se a mistura de reacção em agitação durante aproximadamente 1 a 8 horas, preferive_l mente cerca de 4 horas, para dar o halogeneto ácido correspondente .

Dissolve-se o halogeneto ácido num dissolvente inerte, conforme descrito acima, e reage-se por meio de uma reacção de condensação com uma solução arrefecida (por exemplo, mantida a cerca de 4°C) de morfolinoetanol /~tambem denominado 4-(2-hidroxietil)morfolina7, à qual se adicional lentamente durante um período de cerca de 10 minutos a 2 horas, preferivelmente cerca de 90 minutos. O pro duto final com a formula A é isolado e purificado por meio de processos convencionais.

-15Ã Via Carbodiimida

Na segunda via sintética, dissolve-se acido micofenólico ou um seu derivado acilado num dis^ solvente inerte nas condições da reacção / por exemplo tetrj hidrofurano (TIF) seco, diclorometano ou tetracloreto de carbono; preferivelmente TIF7 e faz-se reagir com morfolinoetanol em presença de uma carbodiimida, por exemplo DCC ( diciclo exilcarbodiimida ) ou di-p-tolilcarbodiimida.

A proporção molar de álcool para o acido de partida é de 1:1 aproximadamente. A reacção efectua-se à pressão atmosférica durante um período de cerca de 4 a 8 horas, preferivelmente durante 6 horas. Uma ga ma de temperatura desde cerca de 10°C até cerca da temperatura de refluxo, preferivelmente proximo da temperatura ambiente, pode ser usada nesta reacção. 0 produto final com a formula A é isolado e purificado da maneira usual.

-16Acilação do Oxigénio Fenólico

Os compostos com a formula A na qual Z é -C(O)R são preparados por meio da dissolução de acido micofenólico ou do seu éster morfolinoetílico num di£ solvente orgânico inerte conforme definido acima (por exemplo acetonitrilo ou preferivelmente piridina) e fazendo-o reagir com cerca de 1 a 6 equivalentes molares, preferivelmente cerca de 3 equivalentes molares, do acilo ou halogeneto aroi lo ou anidrido apropriado (por exemplo, anidrido acético cloreto de propionilo, cloreto de benzoilo ou cloreto de piva loilo) em presença de cerca de 1 a 6 equivalentes molares, preferivelmente cerca de 3 equivalentes molares, de uma base inorgânica (por exemplo carbonato de sódio, bicarbonato de potássio, etc), ou uma base orgânica terciária (por exemplo trietilamina, N-metilpiperidina ou preferivelmente piridina). Algumas bases (por exemplo, piridina) também podem servir de dissolvente orgânico inerte.

A reacção efectua-se a uma temperatura de aproximadamente 0°C a aproximadamente 25°C, preferivelmente a cerca de 5°C, durante aproximadamente 1 a aproximadamente 10 horas, preferivelmente cerca de 3 horas. Quando a reacção está essencialmente completa, o produto acilado é isolado por meios convencionais.

Separação do Grupo Acilo do Oxigénio Fenólico

Podem utilizar-se muitos processos correntes, por exemplo hidrólise química ou microbiológica, ou aminólise para preparar compostos coma formula A na qual Z é hidrogénio a partir: de compostos com a formula A na qual Z é -C(O)R. Para hidrólise quimica, um composto com a formula A na qual é Z é -C(O)R é tratado com uma quantidade limitade, preferivelmente um equivalente molar, de uma base orgânica ou inorgânica, preferivelmente um carbonato, bicarbonato ou hidroxi de metal alcalino, preferivelmente hidroxido de lítio. A reacção efectua-se numa mistura de um dissolvente orgânico miscível em água, por exemplo metanol, etanol ou tetrahidrofurano e agua.

Para hidrólise microbiológica, um composto com a formula A na qual Z é -C(O)R é tratado com um fermento, preferivelmente fermento de padeiro, numa mistu rà de um dissolvente orgânico e água. Para a transformação de um composto com a formula A na qual Z é -C(O)R com emprego de aminólise, um composto com a formula A na qual Z é -C(O)R reage com uma amina primária ou secundária, por exemplo propilamina ou dietilamina, num dissolvente orgânico ou orgânico aquoso, até a reacção estar completa ou quase, o que é determinado por observação cromatográfica.

I

Sais de Compostos com a Formula A

Os compostos com a Formula A podem ser transformados nos sais de adição de acido correspondentes. A transformação efectua-se por meio de tratamento com pelo menos uma quantidade estequiométrica de um acido apropriado, por exemplo ácido clorídrico, acido sulfúrico, ácido metanossulfónico, etc. Em geral, a base livre é dissolvida num dissolvente orgânico polar, por exemplo, etanol, metanol ou acetato de etilo e o ácido é adicionado em água, etanol, metanol ou isopropanol. Mantém-se a temperatura de/em 0°C a 50°C. 0 sal resultante precipita espontâneamente ou pode ser retirado de solução com um dissolvente menos polar.

Um ácido dibásico, por exemplo ácido sulfúrico, pode formar dois sais com os compostos de acordo com a presente invenção. Um sal deste género, no qual estão presentes um mole da base e um mole do acido é denominado o sal bisulfato ( ou sulfato hidrogénio). 0 outro, no qual estão presentes dois moles da base e um mole I do acido, é denominado o sulfato.

Os sais de adição de acido dos compostos com a formula A podem ser decompostos nas bases livres correspondentes por meio de tratamento com um excesso de uma base apropriada, por exemplo amoníaco ou bicarbonato de sodio, geralmente em presençade dissolvente aquoso, e a uma temperatura entre 0°C e 50°C. A forma base livre é isolada por meios convencionais, por exemplo extracção com um dissolvente orgânico.

-19Compostos Preferidos

São muitíssimo preferidos os com postos com a formula A na qual Z é hidrogénio, isto é,

E-6-( 1,3-diidro-4-hidroxi-6-metoxi-7-metil-3-oxo-5-isobenzc) furanil)-4-metil-4-hexenoato de morfolinoetilo, e os seus sais farmaceuticamente aceitáveis (preferivelmente os sais cloridrato, sulfato e bissulfato).

Também são preferidos os seguintes compostos e sais farmaceuticamente aceitáveis (preferivelmente os sais cloridrato, sulfato e bissulfato) com a Formula A na qual Z é -C(O)R:

E-6-(l,3-diidro-4-acetoxi-6-metoxi-7-metil-3-oxo-5-isoben zofuranil)-4-metil-4-hexenoato de morfolinoetilo;

E-6-(l,3-diidro-4-propioniloxi-6-metoxi-7-metil-3-oxo-5-isobenzofuranil)-4-metil-hexenoato de morfolinoetilo;

E-6-(1,3-diidro-4-pivaloiloxi-6-metoxi-7-metil-3-oxo-5-isobenzofuranil)-4-metil-4-hexenoato de morfolinoetilo; e

E-6-(l,3-diidro-4-benzoiloxi-6-metoxi-7-metil-3-oxo-5-isobenzofuranilo)-4-metil-4-hexenoato de morfolinoetilo.

Λ.

Processos Preferidos

Os compostos de acordo com a presente invenção podem ser preparados de acordo com as últimas fases seguintes:

um halogeneto de E-6-(1,3-diidro-4-hidroxi-6-metoxi-7-metil -3-oxo-5-isobenzofuranil)-4-metil-4-hexenoilo é condensado com morfolinoetanol para dar um composto de acordo com a Formula A na qual Z é hidrogénio;

um ácido E-6-(l,3-diidro-4-hidroxi-6-metoxi-7-metil-3-oxo-5-isobenzofuranil)-4-metil-4-hexenóico é posto em contac to com morfolinoetanol em presença de uma carbodiimida para dar um composto de acordo com a Formula A na qual Z é hidr£ génio;

um halogeneto de E-6-(l,3-diidro-4-aciloxi-6-metoxi-7-metil-3-oxo-5-isobenzofuranil)-4-metil-4-hexenoilo é condensado com morfolinoetanol para dar um composto de acor do com a Formula A na qual Z é -C(O)R;

um acido E-6-(1,3-diidro-4-aciloxi-6-metoxi-7-metil-3-oxo-5-isobenzofuranil)-4-metil-4-hexenoico é condensado com morfolinoetanol em presença de uma carbodiimida para dar um composto de acordo com a Formula A na qual Z é —C(0)R;

E-6-(l,3-diidro-4-hidroxi-6-metoxi-6-metoxi-7-metil-3-oxo-5-isobenzofuranil)-4-metil-4-hexenoato de morfolinoetilo é condensado com um halogeneto ou anidrido de acilo para dar um composto de acordo com a Formula A na qual é Z é -C(O)R;

um contacto de um acido farmaceuticamente aceitável com

-21um composto com a Formula A para formar o sal de adição de ácido correspondente com a formula A;

substituição de um sal ácido farmaceuticamente aceitável com a Formula A por outro acido farmaceuticamente aceitável; e contacto.de um sal de adição de acido com a Formula A com uma base para formar os compostos bases livre correspondentes com a Formula A.

Os compostos da presente invenção podem ser preparados por um processo para a preparação de compostos com a Formula A

na qual:

Z é hidrogénio ou -C(O)R;

em que

R é alquilo ou arilo inferior;

ou de um seu sal farmaceuticamente aceitável, que compreende:

a) a reacção de um composto com a fórmula

na qual

Z tem a significação anterior e X é halogêneo, com morfo linoetanol para formar um composto com a Formula A; ou

b) a reacção de um composto com a Formula

na qual

Z tem a significação anterior com morfolinoetanol e uma carbodiimida para formar um composto com a Formula A; ou

c) a reacção de um composto com a Formula A na qual Z é hidrogénio com um halogeneto-de acilo ou anidrido de

acilo em presença de uma base para formar um composto com a Formula A na qual Z é C-(O)R; ou

d) a reacção de um composto com a Fórmula A na qual Z é -C(O)R com uma base ou uma amina para formar um composto com a Formula A na qual Z é hidrogénio; ou

e) a transformação de um composto com a Formula A num sal de adição de ácidos farmaceuticamente aceitável de um composto com a Fórmula A; ou

f) a transformação de um sal de adição de ácidos farmaceu ticamente aceitável oude um composto com a Formula A no composto livre correspondente com a Formula A; ou

g) a transformação de um sal de adição de ácidos farmaceu ticamente aceitável de um composto com a Fórmula A noutro sal de adição de ácidos farmaceuticamente aceitável de um com posto com a Formula A; ou

h) a transformação de um composto com a fórmula A na qual Z é -C(O)R noutro composto com a formula A na qual Z é -C(O)R por permuta de éster para éster.

Utilidade e Administração

Utilidade Geral

Os compostos da presente invenção incluindo os seus sais farmaceuticamente aceitáveis, e as composições que os contêm, podem ser utilizados como agentes imunosupressores, agentes anti-inflamatórios, agentes anti-tumor, agentes anti-víricos e agentes antipsoriáticos em mamíferos, que sejam domésticos (gado vacum, suínos, ovinos caprinos, equinos), quer sejam animais de estimação (gatos, caês), ou preferivelmente humanos. Por exemplo, podem utilizar-se compostos com a Formula A para o tratamento de artri te reumatóide, na qual há um processo inflamatório accionado imunologicamente. Estes compostos podem ser utilizados tanto profiláctica (por exemplo, para evitar a rejeição de enxerto), como terapêuticamente.

Experimentação

As experiências de separação inicial de animais para determinar actividade anti-inflamatória potencial incluem a experiencia de artrite adjuvante de acordo com o método de Pearson, Proc. Soc. Exp. Biol.Med. 91: 95-101 (1956).

São também uteis experiencias in vitro, por exemplo, aquelas que empregam explantados sinovi-25-

ais provenientes de pacientes que sofrem de artrite reumatoide, Dayer et al., J.Exp.Med., 145:1399-1404 (1977), para determinar se os compostos apresentam actividade anti-inflamatória.

Determina-se a actividade anti-imu ne utilizando encefalomielite alérgica experimental por meio de uma modificação de um processo inicialmente descrito por Grieg et al., J.Pharmacol. Exp. Ther, 173:85 (1970).

Determina-se a actividade imunosupressora por processos in vivo e in vitro. Determina-se a actividade in vivo utilizando uma modificação da experiên cia de placa hemolítica de Jerne /~Jerne et al., Técnica de placa ágar para reconhecimento de células produtoras de anticorpos, Cell-bound Antibodies,Amos, B. e Kaprowski, H. editores (Wistar Institute Press, Filadélfia) 1963, p.1097.

Determina-se a actividade in vitro por meio de uma adaptação do processo descrito por Greaves et al.,/Activação de linfócitos T e B humanos por mitogéneos policlonais, Nature, 248, 698-701 (1974)J.

Determina-se a actividade antivíri ca pelo processo descrito por Smee et al.,/ Actividade Anti-Virus-herpes do Nucleósido Acíclico 9-(1,3-diidroxi-2-Propoximetil)-Guanina, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 23 (5), 676-682 (1983/7 ou conforme descrito por Planterose / Efeitos antivíricos e citotóxicos de acido micofenólico, Journal of General Virology, 4, 629 (1969/7-26-

Podem efectuar-se experiências deactividades sistémica em psoríase conforme descrito por Spatz et al., /^-Acido micofenólico em psoríase British Journal of Dermatology, 98, 429 (1978^7.

Podem executar-se experiências de actividades anti-tumor conforme descrito por Cárter et al /~Acido micofenólico: um composto anticancro com propriedades invulgares, Nature, 223, 848 (1969).7.

Administração Geral

A administração dos compostos acti^ vos com a formula A, em forma pura ou numa composição farmacêutica apropriada, pode fazer-se por qualquer dos modos de administração geralmente aceites de agentes para utilidades análogas. Assim, a administração pode ser feita por via oral, nasal, parentérica ou tópica, na forma de doses solidas, meio solidas, pós liofilizados ou formas liquidas, por exemplo comprimidos, supositórios, pilulas, cápsulas, pós, soluções, suspnsões, emulsões, cremes, loções, aerossóis, pomadas, geles, etc., preferivelmente em formas de dose unitária apropriadas para administração simples de soses exactas. As composições incluirão um veículo ou excipiente farmacêutico convencional e um composto activo com a Formula A, e, além disso, podem incluir outros agentes medicinais, agentes farmacêuticos, veículos, adjuvantes, etc.

Em geral, conforme o modo de admi_ nistração que se tem em vista, as composições farmacêutica27mente aceitáveis conterão aproximadamente 1% a aproximadamente 99% em peso do composto farmaceuticamente activo da presente invenção e 99% a 1% em peso de excipientes farmacêuticos apropriados. Preferivelmente, a composição será formada por cerca de 5 a 75% em peso de um composto farmaceuticamente activo, sendo o resto constituído por excipientes farmaceuticamente activos.

A maneira de administração preferida, nas condições pormenorizadas acima, é a utilização por via oral de um regime de dose diária conveniente que pode ser ajustada conforme o grau de sofrimento. Para essa administração oral, forma-se uma composição farmaceuticamente aceitável e não tóxica constituída pela incorporação de qualquer dos excipientes normalmente utilizados, por exemplo tipos farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina de sodio, talco, celulose, glucose, gelatina, sacarose, carbonato de magnésio, etc. Essas composições tomam a forma de soluções, suspensões, com primidos, pílulas, cápsulas, pós, preparações de libertação retardada, etc.

Preferivelmente, as composições tomarão a forma de uma pílula ou comprimido, e, assim, a composição conterá, juntamente com o ingrediente activo, um diluente como lactose, sacarose, fosfato dicálcico, etc.; um desintegrante, por exemplo amido ou seus derivados; um lubrificante, por exemplo estearato de magnésio; etc., e um ligante, por exemplo amido, goma acácia, polivinilpirrolidona, gelatina, celulose e seus derivados, etc.

-28Os compostos activos com a Fórmula A podem ser preparados na forma de supositório, empregando, por exemplo, cerca de 0,5% a cerca de 50% de ingrediente activo distribuído num veículo de polietileno glicóis (PEG) /por exemplo, PEG 1000 (96%) e PEG 4000 (4%)7.

Podem preparar-se composições farmaceuticamente administráveis liquidas por meio de, por exemplo, dissolução, dispersão, etc., de um composto activo (cerca de 0,5% a cerca de 20%), conforme descrito acima, e de adjuvantes farmacêuticos opcionais num veículo, por exemplo água,solução, saturada de cloreto de sodio, dextrose aquosa, glicerol, etanol, etc., para formar por este meio uma solução ou suspensão.

Se se desejar, a composição farmacêutica a administrar pode conter também pequenas quanti dades de substancias auxiliares não tóxicas, por exemplo, agentes molhantes ou emulsionantes, agentes de tampão pH, etc por exemplo acetato de sodio, monolaurato de sorbitano, oleato de trietanolamina, etc.

Os métodos presentemente utilizados para a preparação das.referidas formas de dosagem são conhecidos ou evidentes para os técnicos da especialidade ; por exemplo, cf. Remington¹s Pharmaceutical Sciences 16a.Ed.,(Mack Publishing Company, Easton, Pensilvânia,1980) A composição a administrar conterá, em qualquer caso, uma quantidade do(s) composto(s) activo(s) numa quantidade farmaceuticamente eficaz para alívio do estado a tratar quando administrada de acordo com as indicações da presente invenção .

-29Em geral, os compostos da presente invenção são administrados numa quantidade terapeuticamente eficaz, isto é, uma dose suficiente para efectuar tratamento, a qual variará conforme o indivíduo e o estado em tratamento.

Tipicamente, uma dose diária terapeuticamente eficaz varia de 0,02 a 100 mg/kg de peso corporal por dia de um composto activo com a Formula A.

A maior parte das situações respondem a tratamento que compreende um nível de dose da ordem de 0,4 a 30 mg/kg de peso corporal por dia, e o mais preferivelmente cerca de 10 mg/kg/dia. Assim, para administração a uma pessoa com 70 kg, a gama de dose seria de cerca de 1,4 mg e 7 kg por dia, preferivelmente cerca de 28,0 mg, por dia, mais preferivelmente cerca de 700 mg por dia.

-30EXEMPLOS

Os exemplos que se seguem são apresentados para habilitar os técnicos da especialidade a compreender mais claramente e aplicar a presente invenção.Estes exemplos não devem ser considerados uma limitação do âmbito da invenção, mas apenas descritivos e representativos da mesma.

EXEMPLO 1

E-6-(1,3-diidro-4-hidroxi-6-metoxi-7-metil-3-oxo-5-isobenzofuranil)-4-metil-4-hexenoato de morfolinoetilo

K Fórmula Ã na qual Z é Hidrogénio - Acido Clorídrico

Dissolveu-se ácido E-6-(1,3-diidro-4-hidroxi-6-metoxi-7-metil-3-oxo-5-isobenzofuranil)-4-metil-4-hexenóico (ácido microfenólico) (32,Og) em diclorometano (250 ml), seguindo-se a adição de cloreto de tionilo (25,0 ml) e dimetilformamida (0,3 ml). Agitou-se a mistura de reacção à temperatura ambiente durante 3 horas, após o que os componentes voláteis foram separados sob vácuo para se obter cloreto de ácido E-6-(1,3-diidro-4-hidroxi-6-metoxi-7-metil-3-oxo-5-isobenzofuranil)-4-metil-4-hexenóico na forma de óleo (I.V., película líquida, cm’^ para o 5 cm' mais próximo; 3440, 2950, 2860,1795, 1740, 1620, 1465, 1445, 1405, 1360, 1320, 1265, 1230, 1160, 1130, 1060, 1025, 960, 915, 885, 845, 825, 780, 755, 720 e 6 70).

Uma solução de morfolinoetanol (30,5ml) em diclorometano (250 ml) foi arrefecida para 4°C num banho gelado. O óleo cloreto de ácido micofenólico foi dissolvido em diclorometano (50,0ml) e adicionado à solução arrefecida.

Depois de manter em agitação durante 90 minutos (a 4°C), lavou-se a mistura de reacção com água e em seguida com bi-31-

carbonato de sódio aquoso.Secou-se a solução orgânica com sulfato de sódio e evaporou-se para dar E-6-(l,3-diidro-4-hidroxi-6-metoxi-7-metil-3-oxo-5-isobenzofuranil)-4-metil-4-hexenoato de morfolinoetilo (p.f. 93-94°C).

IB. Fórmula A na qual Z é hidrogénio -Carbodiimida

A 1,0 g de ácido (E)-6-(l ,3-diidro-4-hidroxi-6-metoxi-7-metil-3-oxo-5-isobenzofuranil)-4-metil-4-hacenoico (ácido micofenólico) dissolvido em 20 ml de tetrja i drofurano seco adicionaram-se 0,68 g de dicicloexilcarbodiimida e 0,37 g de N-(2-hidroxietil)morfolina.Deixou-se a mistura à temperatura ambiente durante 6 horas e em seguida evaporou-se até secagem. O resíduo foi cromatografado sobre gel de sílica, eluindo com diclorometanozmetanol 50:1, para dar (E)-6-(1,3-diidro-4-hidroxi-6-metoxi-7-metil-3-oxo-5-isobenzofuranil)-4-metil-4-hexenoato de morfolinoetilo (p.f. 93-94°C).

IC. Fórmula A na qual Z é Hidrogénio -Separação de -C(O)R

a. Dissolveu-se E-6-(l,3-diidro-4-acetoxi-6-metoxi-7-metil-3-oxo-5-isobenzofuranil)-4-metil-4-hexenoato de 2-morfolinoetilo (4,75 g) em tetraidrofurano (250 ml) a O°C e adicionou-se uma solução de hidróxido de lítio monoidrato (O,42g) em água (100 ml) a O°C. Manteve-se a mistura de reacção a 0°C durante 3 horas e em seguida juntou-se ácido acético (0,6 g).Em seguida dilui-se a mistura com água(1000 ml) e extrai-se com diclorometano.Seca-se e evapora-se o extracto, e cromatografa-se o resíduo sobre gel de sílica (200 g), eluindo com diclorometano:metanol 20:1, para dar (E)-6-(l,3-diidro-4-hidroxi-6-metoxi-7-metil-3-oxo-5-isobenzofuranil)-4-metil-4-hexenoato de morfolinoetilo (p.f. 93-94°C).

b. Dissolveu-se E-6-(1,3-diidro-4-acetoxi-6-metoxi-7-metil-3-oxo-5-isobenzofuranil)-4-metil-4-hexenoato de

2-morfolinoetil(4,75 g) em isopropanol (100 ml) e à solução junta-se dietilamina (10 ml). Mantém-se a mistura à temperatura ambiente durante 24 horas e em seguida evapora-se até pequeno volume sob vácuo. Dissolve-se o resíduo em diclorometano, e lava-se a solução com água, seca-se e evapora-se. O resíduo é cromatografado sobre gel de sílica (200 g), eluin do com diclorometano:metanol 20:1, a fim de obter (E)-6-(l,3-diidro-4-hidroxi-6-metoxi-7-metil-3-oxo-5-isobenzofuranil)-4-metil-4-hexenoato de morfolinoetilo (p.f. 93-94°C).

EXEMPLO 2

E-6-(1,3-diidro-4-acetoxi-6-metoxi-7-metil-3-oxo-5-isobenzofuranil)-4-metil-4-hexenoato de morfolinoetilo

2A. Fórmula A na qual Z é -CÍOjCH^

Dissolvai-se E-6- (1,3-d iidro-4-hidroxi-6-metoxi-7-metil-3-oxo-5-isobenzofuranil)-4-metil-4-hexenoato de morfolinoetilo (10,0 g) em piridina (50,0 ml) seguindo-se a adição de anidrido acético (10,0 ml). Manteve-se a mistura em agitação à temperatura ambiente durante 90 minutos, em seguida despejou-se em água e extraiu-se com acetato de etilo. Secou-se e evaporou-se a solução orgânica para dar E-6-(1,3-diidro-4-acetoxi-6-metoxi-7-metil-3-oxo-5-isobenzofuranil)-4-metil-4-hexenoato de morfolinoetilo (p.f. 70-73°C).

2B. Fórmula A na qual Z é outro que não -CÍOjCH^

Anàlqpmente, seguindo o processo da parte A acima e substituindo o anidrido acético pelos materiais que seguem:

Cloreto de propionilo, cloreto de 2-metilpropionilo, ι

cloreto de pivaloilo, e brometo de benzoilo;

obtêm-se os compostos respectivos seguintes:

E-6-(1,3-diidro-4-propioniloxi-6-metoxi-7-metil-3-oxo-5-isobenzofuranil)-4-metil-4-hexenoato de morfolinoetilo,

E-6-/1,3-diidro-4-(2-metil-propioniloxi)-6-metoxi-7-metil-3-oxo-5-isobenzofuranil/-4-metil-4-hexenoato de morfolinoetilo,

E-6-(l,3-diidro-4-pivaloiloxi-6-metoxi-7-metil-3-oxo-5-isobenzofuranil)-4-metil-4-hexenoato de morfolinoetilo, e

E-6-(l,3-diidro-4-benzoiloxi-6-metoxi-7-metil-3-oxo-5-isobenzofuranil)-4-metil-4-hexenoato de morfolinoetilo .

EXEMPLO 3

E-6-(1,3-diidro-4-hidroxi-6-metoxi-7-metil-3-oxo-5-isobenzofuranil)-4-metil-4-hexenoato de morfolinoetilo cloridrato

3A. Sal Cloridrato com Formula A na qual Z é Hidrogénio

Dissolveu-se E-6-(1,3-diidro-4-hidroxi-6-metoxi-7-metil-3-oxo-5-isobenzofuranil)-4-metil-4-hexenoato de morfolinoetilo (38,Og) em isopropanol (200 ml) e adicionou-se a solução a uma solução de ácido clorídrico (10,0g) em isopropanol (150 ml).O sal cloridrato foi colhido por filtração e seco sob vácuo (p.f. 154-155°C).

3Β. Sais Cloridratos com Fórmula A na qual Z é Outro que Não -C(O)CH₃

Anàlogamente, seguindo o processo da parte A acima e substituindo E-6-(1,3-diidro-4-hidroxi-6-metoxi-7-metil-3-oxo-5-isobenzofuranil)-4-metil-4-hexenoato de morfolinoetilo pelos seguintes materiais (preparados, por exemplo, como no Exemplo 2B):

E-6-(1,3-diidro-4-propioniloxi-6-metoxi-7-metil-3-oxo-5-isobenzofuranil)-4-metil-4-hexenoato de morfolinoetilo ,

E-6-(1,3-diidro-4-benzoiloxi-6-metoxi-7-metil-3-oxo-5-isobenzofuranil)-4-metil-4-hexenoato de morfolinoetilo; obtêm-se os seguintes compostos respectivos:

E-6-(1,3-diidro-4-propioniloxi-6-metoxi-7-metil-3-oxo-5-isobenzofuranil)-4-metil-4-hexenoato de morfolinoetilo cloridrato (p.f. 140-144°C),

Ε-6-^ί, 3-diidro-4- (2-metil-propioniloxi) -6-metoxi-7-metÍ1-3-OXO-5-isobenzofuranil7-4-metil-4-hexenoato de morfolinoetilo cloridrato,

E-6-(l,3-diidro-4-pivaloiloxi-6-metoxi-7-metil-3-oxo-5-isobenzofuranil)-4-metil-4-hexenoato de morfolinoetilo cloridrato (p.f. 135-139°C), e

E-6-(1,3-diidro-4-benzoiloxi-6-metoxi-7-metil-

-35-3-oxo-5-isobenzofuranil)-4-metil-4-hexenoato de morfolinoetilo cloridrato.

EXEMPLO 4

E-6-(1,3-diidrο-4-hidroxi-6-metoxi-7-metil-3-oxo-5-isobenzofuranil)-4-metil-4-hexenoato de morfolinoetilo bissulfato

4A. Sal Bissulfato com Fórmula A na qual Z é Hidrogénio

Dissolveu-se E-6-(l,3-diidro-4-hidroxi-6-metoxi-7-metil-3-oxo-5-isobenzofuranil)-4-metil-4-hexenoato de morfolinoetilo (4,6 g) em acetato de etilo (50 ml) e adicionou-se a solução a uma solução de ácido sulfúrico (1,25 g) em isopropanol (50 ml) .Colheu-se o sal bissulfato por filtração, lavou-se com acetato de etilo e secou-se sob vácuo a 50°C (p.f. 143-145°C).

4B. Sais Bissulfatos com Fórmula A na qual Z é Outro que

Não -C(O)CH₃

Analogamente, seguindo o processo da parte A acima e substituindo E-6-(1,3-diidro-4-hidroxi-6~ -metoxi-7-metil-3-oxo-5-isobenzofuranil)-4-metil-4-hexenoato de morfolinoetilo pelos materiais preparados no Exemplo 2B, obtêm-se os sais bissulfatos correspondentes.

EXEMPLO 5

Este exemplo descreve a preparação de uma formulação farmacêutica representativa para administração oral que contém um composto activo com a Fórmula A, por exemplo, E-6-(1,3-diidro-4-hidroxi-6-metoxi-7-metil-3-oxo-5-isobenzofuranil)-4-metil-4-hexenoato de morfolinoetilo cloridrato .

Ingredientes

Composto activo

Lactose, seca por aspersão

Estearato de magnésio

Quantidade por

Cápsula, mgs

200

148

Os ingredientes indicados acima são misturados e introduzidos numa cápsula de gelatina dura.

Podem utilizar-se outros compostos com a Fórmula A, por exemplo os preparados de acordo com os Exemplos 2 a 4, como composto activo na preparação das formulações administradas por via oral deste exemplo.

EXEMPLO 6

Este exemplo descreve a preparação de outra formulação farmacêutica representativa para administração oral, que contém um composto activo com a Fórmula A, por exemplo, E-6-(1,3-diidro-4-hidroxi-6-metoxi-7-metil-3-oxo-5-isobenzofuranil)-4-metil-4-hexenoato de morfolinoetilo cloridrato.

Quantidade por comprimido, mgs

Ingredientes

Composto	activo	400
Amido de	milho	50
Lactose		145
EStearato	de magnésio	5

Os ingredientes indicados acima são misturados intimamente e comprimidos em pastilhas separadas e com incisões.

Podem utilizar-se outros compostos com a Fórmula A, por exemplo os preparados de acordo com os Exemplos 2 a 4, como composto activo na preparação das formulações administráveis por via oral deste exemplo.

EXEMPLO 7

Este exemplo descreve a preparação de uma formulação farmacêutica representativa que contém um composto activo com a Fórmula A, por exemplo, E-6-(l,3-diidro-4-hidroxi-6-metoxi-7-metil-3-oxo-5-isobenzofuranil)-4-metil-4-hexenoa to de morfolinoetilo cloridrato.

Prepara-se seguinte composição;

Ingredientes

Cbnposto activo ácido fumárico

Cloreto de sódio

Metil paraben

Açúcar granulado

Sorbitol (solução a 70%) Veegum K (Vanderbilt Co.) Aromatizante

Corantes

Agua destilada uma suspensão oral que tem a

1,0 g

0,5 g

2,0 g

0,1 g

25,5 g

12,85 g

1,0 g

0,035 ml

0,5 mg

q.b. para 100 ml

Podem utilizar-se outros compostos com a fórmula A, por exemplo os preparados de acordo com os Exemplos 2 a 4, como composto activo na preparação das formulações administráveis oralmente deste exemplo.

EXEMPLO 8

Este exemplo descreve a preparação de uma formulação farmacêutica representativa que contêm um composto activo com a Fórmula A, por exemplo, E-6-(l,3-diidro-4-hidroxi-6-metoxi-7-metil-3-oxo-5-isobenzofuranil)-4-metil-4-hexenoato de morfolinoetilo cloridrato.

Prepara-se uma formulação injectável com tampão para um pH de 4, com a seguinte composição:

Ingredientes

Composto activo 0,2 g

Solução Tampão de Acetato de Sódio (0,4 M) 2,0 ml

HCI (IN) q.b. para pH 4

Âgua (destilada, esterilizada) q.b. para 20 ml

Podem empregar-se outros compostos cóm a Fórmual A, por exemplo os preparados de acordo com os Exemplos 2 a 4, como composto activo na preparação das formulações injectáveis deste exemplo.

EXEMPLO 9

Este exemplo descreia preparação de uma formulação farmacêutica representativa para aplicação tópica gue contém um composto activo com a Fórmula A, por exemplo, E-6-(l, 3-di idro-4-hidroxi-6-metoxi-7-metil-3-oxo-5-isobenzofu-39ranilo )-4-metil-4-hexenoato de morfolinoetilo cloridrato.

Ingredientes gramas

Composto activo 0,2-10

Span 602

Tween 602 óleo mineral5

Petrolatum10

Metil paraben0,15

Propil paraben0,05

HAB (hidroxi anisole butilado)0,01 água q.b. para 100

Todos os ingredientes indicados acima, excepto água, são misturados e aquecidos a 60°C com agitação.Em seguida junta-se uma quantidade suficiente de água a 60°C com agitação vigorosa para emulsionar os ingredientes, e, em seguida, junta-se água q.b. para 100 g.

Podem empregar-se outros compostos com a Fórmula A, por exemplo os preparados de acordo com os Exemplos 2 a 4, como composto activo na preparação das formulações tópicas deste exemplo.

EXEMPLO 10

Este exemplo descreve a preparação de uma formulação farmacêutica representativa que contém um composto activo com a Fórmula A, por exemplo, E-6-(l,3-diidro-4-hidroxi-6-metoxi-7-metil-3-oxo-5-isobenzofuranil)-4-metil-4-hexenoato de morfolinoetilo cloridrato.

Prepara-se um supositório com um total de 2,5 gramas com a seguinte composição:

Composto activo

Witepsol H-15*

500 mg restante *

(triglicerídeos de ácido gordo vegetal saturado; produto de Riches-Nelson, Inc., Nova York,N.Y.).

Podem empregar-se outros compostos com a Fórmula A, por exemplo os preparados de acordo com os Exemplos 2 a 4, como composto activo na preparação das formulações supositório deste exemplo.

EXEMPLO 11

Determinação de Actividade Anti-Inflamatória Utilizando Artrite Induzida por Adjuvante no Rato

Protocolo:

Este processo é uma modificação de um processo descrito inicialmente por Pearson, C.M., Proc.Soc.Exp. Biol.Med., 91:95-101 (1956).

Fêmeas de ratos albinos Simonsen com o peso de 160-180 g recebem 0,1 ml de uma suspensão em óleo de parafina de M. Mycobacterium butyribm mortos por calor (10 mg/ml) por meio de uma injecção intradérmica no 1/4 próximo da cauda no dia O. Começando no dia 1, administrou-se o material em experiência por via oral num veículo aquoso (0,5 ml/dose) duas vezes por dia durante 17 dias. No dia 18, determina-se a dilatação nas almofadas das quatro patas e na cauda, utilizando um sistema de classificação no qual a dilatação nas quatro patas foi classificada de 0 a 4 para cada pata e a dilatação da cauda foi classificada de 0 a 3, de maneira que a classificação total máxima é 19.

Os animais são então sacrificados; as patas traseiras de cada animal são separadas e pesadas. A inibição percentual é calculada comparando o aumento de peso das pa tas traseiras dos animais de experiência com os animais de controlo.

quadro que se segue apresenta os dados relativos a um composto com a Fórmula A na qual Z é hidrogénio.

Dose No. de	No. de doses	Peso Médio P a tas Traseiras mg+ SD	Inibição Percentual
mg/kg/d	Ratas
veículo	12	16	k 3,370 + 690
10	11^B	16	2,430 + 599^A	51
20	12	16	2,108 + 492^A	68
30	12	16	1,728 + 371^A	88

A = valor P contra controlo positivo 0,01

B = um animal morreu no dia 14

EXEMPLO 12

Determinação de Actividade Autoimune Utilizando Encefalomielite Alérgica

Experimental

Protocolo:

Este processo é uma modificação de um processo descrito inicialmente por Grieg et al., J. Pharmacol.Exp. Ther. 173:85 (1970).Utilizaram-se fêmeas de ratos Lewis,

LEW/Cre, br de Charles River, com o peso de 125-135 g.

No dia 1, induz-se Encefalomielite Alérgica Experimental por meio da administração de uma injecção subplania? de 0,1 ml no dorso da pata traseira direita de uma emulsão constituída por 15 mg (peso húmido) de tecido de medula espinal singeneico, 0,06 ml de Adjuvante Incompleto de Freund (Difco), 0,04 ml de solução saturada de cloreto de sódio esterilizada a 0,9% e 0,2 mg de Mycobacterium butiricum (Difco) motos por calor e secos. Com inicio no dia 1, o mate-42-

rial de experiência é administrado oralmente em veiculo aquoso 2N (1 ml/dose) uma vez por dia durante 16 dias.Nos dias 12 a 17, obtêm-se avaliações clínicas para cada animal. Os Animais são considerados positivos se houver paralisia de perna traseira flácida em um ou mais dias.

Um composto com a Fórmula A na qual Z é hidrogénio apresentou 70% de inibição de paralisia de perna traseira em comparação com um controlo nesta experiência.

EXEMPLO 13

Determinação de Actividade Imunosupressora Utilizando a Experiência de Formação de Célula em Placa Hemolítica

Este processo é uma modificação da técnica de placa ágar para o reconhecimento de células produtoras de anticorpos, processo descrito inicialmente por Jerne et áL /Cell-bound Antibodies, editores Amos e Kaprowski (Wistar Institute Press, Filadélfia, 1963) p. 109/.

Sensibilizaram-se grupos de 5 a 6 ratinhos machos adultos C57881/6 com 1x10 células de sangue vermelho de ovelas (SRBC) e trataram-se simultaneamente com uma forma de dose oral do material em experiência num veículo aquoso.Os animais de um grupo de controlo recebem o mesmo volume de veiculo.Quatro dias depois da inoculação com SRBC, dispersam-se baços em homogeneizadores Ten Broeck soltos. O número de células nucleadas (WBC) é determinado e a suspensão de células de baço é misturada com SRBC, complemento de cobaia e solução ágar com a concentração de 0,5%.Deixam-se cair Partes alíquotas da mistura acima (0,1 ml) em gotas sobre quatro quadrantes separados de um prato Petri e cobrem-se com folhas de cobertura. Depois de duas horas de incubação a 37°C, contam-se áreas de hemólise em volta de células formadoras de placas (PFC) com um microscópio de

disseogão. Calculam-se para cada baço de ratinho WBC/baço

Z total, PFC/baço e PFC/10° WBC (PPM). Comparam-se depois as médias geométricas de cada grupo de tratamento com o grupo de controlo tratado com veículo.

Experimentou-se neste ensaio um composto com a Fórmula A na qual Z é hidrogénio, tendo-se obtido os resultados abaixo (todas as doses de composto foram administradas oralmente; todos os animais receberam no dia 0, 1 xlO SRBC i.p.; o tratamento efectuou-se desde o dia 0 até ao dia 4).

No. em Grupo	Dose mg/kg/d	PFC/ baço	% de Inib	PPM**	% de Inib	WBC/Baço (XlO⁶)
Controlo
8	—	107,437	—	731.0	—	147
composto
6	10	85,666	20	649.7	11	133
6	20	62,166^a	42	437.9^a	40	141
6	40	20,666^b	81	145.6^b	80	137
6	60	13,416^b	88	90.3^b	88	130

** Os números são médias geométricas a A significância estatística comparada com controlos foi p $ 0,03 b A significância estatística comparada com controlos foi P $0,001

EXEMPLO 14

Determinação de Actividade Imunosupressora Utilizando Respostas de Linfócitos Periféricos a Mitogéneos de células T e B

I

Este processo é uma modificação de um processo descrito inicialmente por Greaves et al., /Activação de linfócitos T e B humanos por mitogéneos policlonais,Nature, 248, 698-701 (1974)/.

I Separam-se células mononucleares humanas (PBL) de sangue completo heparinizado por meio de centrifugação de densidade gradiente em Ficoll-Paque (Pharmacia).Depois de lavagem, cultivam-se 2x10 células/vão em placas de microtitulação com RPMI 1640 completado com soro de vitela fetal a 5%, penicilina e estreptomicina. Para avaliar efeitos diferenciais em linfócitos T e B, empregam-se diversos mitogéneos: PHA (Sigma) a 10 ^g/ml, PWM (Sigma) a 20 /ug/ml e Staphylococcus Proteína A ligado a Sepharose (SPA) (Sigma) 2 mg/ml ou 14 jug/ml de Proteina A. Os materiais em experiên4 8 cia são ensaiados em concentrações entre 10 e 10 M, por adição à cultura no momento 0. As culturas são estabelecidas em quadruplicado e incubadas a 3 7°C numa atmosfera humidifica, da com 7% de CO- durante 72 horas. Adiciona-se uma vibração ^z 3 * de 0,5 /uCi/vão de H-timidina durante os últimas 6 horas. Colhem-se células sobre fiktros de fibra de vidro com um apanhador automático e mede-se radioactiviadde por meio de processos de cintilação correntes. A concentração inibitória de 50% (IC₅₀) para estímulo mitogénico é determinada graficamente .

Compostos com a Formula A na gual Z é conforme indicado abaixo experimentados por este método apresentaram os seguintes resultados.

% Inibição

	^IC50
z	Mitogéneo	10 juM	1 μΜ	.1 juM	. 01 /uM	juM
H	PHA	99	99	98	14	0,031
	PWM	99	99	86	4	0,043
	SPA	99	99	97	19	0,028
coch₃
	PHA	99	99	94	31	0,019
	PWM	99	99	80	2	0,047
	SPA	99	99	95	-27	0,036
co(ch₃:	¹ 3
	PHA	99	71	15	8	0,43
	PWM	98	30	20	13	2,4
	SPA	99	55	1	-9	0,85

EXEMPLO 15

Determinação de Actividade Antivírica Utilizando a Experiência de Redução de Placa em 50%

Este processo é descrito por Smee et al., em Actividade Anti-Herpesvírica do Nucleósido Acíclico 9-(l ,3-Diidroxi-2-Propoximetil)Guanina /Antimicrobial Agents and Chemotherapy, £3(5) , 676-682(1983)J.

Infactaram-se monocamadas confluentes de células Vero em miaoplacas Costar de seis vãos (Bellco Glass, Inc., Vineland, N.J.) com 100 a 200 PFU de HSV ou vírus pseudoarabies.Depois de um período de adsorção de 1,25 horas,o vírus é aspirado e aplicam-se EMEM que contém metilcelulose 0,6%, soro de bovino fetal 2%, NaHCO₃ 0,25%, tampão HEPES 10 mM, 50 pg de gentamicina por ml e o composto em experiência . Incubam-se três vãos por diluição do composto em experiên-46-

cia e seis vãos de controlo sem composto em experiência durante quatro dias a 37°C em CC^ a 5%, após o que se separa a camada de metilcelulose e se fixam as células com metanol durante 10 minutos e se coram com corante Giemsa a 10% (Fisher Scientific Co., Fair Lawn,N.J.) durante 20 minutos. DEpois de as placas serem aspiradas e secas, contam-se as placas com uma ampliação de 13x com um observador de placa Bellco. As concentrações de medicamento que reduzem os números de placa em 50% /a dose inibitória de 50% (Ιϋ^θ)7 são calculadas, por exemplo, com um computador que utiliza um programa de análise probit semilog Zcf. Finney, D.J., Probit Analysis, 3â ed., p. 333 (Cambridge University Press, Londres, 1971)7.

Um composto com a Fórmula A na qual

Z é hidrogénio proporcionou os resultados indicados no quadro que se segue.

Tipo Vírus

Estirpe

Contagem Vírica ic₅₀Çum)

HSV-1	F	0,5	2
HSV-2	G	0,3	2
HSV-2	Lovelace	0,5	2
		EXEMPLO 16

Biodisponibilidade -Níveis de Plasma

Administram-se compostos com a fórmula

A a quatro macacos cynomolgus machos numa forma de dose sólida (aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal) com intervalos de uma semana entre doses. Administra-se ácido micofenólico a um grupo de controlo. Os compostos são pesados dentro de cápsulas de gelatina dura e administrados por via oral. Obtêm-se amostras de plasma a 0,25, 0,5, 1, 3, 5, 7 e horas depois da administração da dose, e analisam-se

-47para determinar concentrações de ácido micofenólico por meio de GLGP.

Comparam-se compostos da presente invenção Z.E-6-(1,3-diidro-4-hidroxi-6-metoxi-7-metil-3-oxo-5-isobenzofuranil)-4-metil-4-hexencato de morfolinoetilo cloridrato e E-6-(l,3-diidro-4-acetoxi-6-metoxi-7-metil-3-oxo-5-isobenzofuranil)-4-metil-4-hexenoato de morfolinoetilo cloridrato/ com ácido micofenólico de acordo com o protocolo acima. Os compostos com a Fórmula A na qual Z e conforme indicado abaixo mostraram absorção mais rápida a níveis de plasma e picos mais altos que o ácido micofenólico conforme indicado no quadro que se segue

No.ID do	C , max	T , max	^AUC0₊24
Z Animal	Qug/ml)	(hr)	jug/ml
ácido micofenólico
A	1,1θ	24,0	16,8
B	4,24	24,0	41,9
C	12,1 '	3,0	116,2
D	9,96	0,5	129,3
Média	6,87	12,9	76,0
+S. D»	+ 5,04	+ 12,9	± 55,2

H	A	66,2	0,5	136,9
	B	18,1	3,0	170,7
	C	20,0	0,5	166,9
	D	29,5	1,0	243,1
	Media	33,5	1,25	179,4
	+S.D.	+ 22,4	+1,19	+ 45,1

coch₃

A	9,75	0,50	107,3
B	7,74	7,0	106,7
C	9,86	1,0	80,1
D	12,5	1,0	162,1
	+ ?;<!§	+ 3;^	+41:8

EXEMPLO 17

Toxicologia

A toxicidade oral aguda de um composto que tem a Fórmula A na qual Z é hidrogénio foi avaliada em ratos e ratinhos.

Aos ratos administraram-se doses orais simples de 0 (veículo de controlo), 125, 250, 500 ou 1000 mg do composto en experiência/kg de peso corporal, seguidas por uma observação durante um período de 2 semanas. Mortes atribuídas aos compostos em experiência ocorreram com todos os animais a 1000 mg/kg, e para todas as fêmeas e 3/6 dos machos a 500 mg/kg.Os indícios clínicos principais incluíram pele áspera, inactividade e coloração urogenital.A dose oral letal mediana aguda do composto em experiência em ratos foi avaliada aproximadamente em 500 mg/kg em machos e entre 250 e 500 mg/kg em fêmeas.

Em ratinhos, doses orais simples de 0 (veículo de controlo), 500, 1000, 2000 e 4000 mg do composto em experiência/kg de peso corporal apenas causaram a morte de 1 fêmea com dose alta. A observação clinica principal foi pele áspera.A dose oral letal mediana aguda do composto em experiência em ratinhos foi avaliada aproximadamente em mais de 4000 mg/kg.

Embora a presente invenção tenha sido descrita com referência às suas formas de realização especificas, deve ser entendido pelos técnicos da especialidade que se podem fazer diversas modificações e que pode haver substituições por equivalentes sem sair do verdadeiro espírito e alcance da invenção. Além disso, podem fazer-se muitas modificações para adaptação de uma situação, material, composição de matéria, processo, fase ou fases de processo particulares, ao objectivo, espirito e alcance da presente invenção.Todas essas modificações são consideradas abrangidas no âmbito das reivindicações anexas.

Μ

Claims

REIVINDICAÇÕES lâ.- Processo para a preparação de um composto representado pela formula A:

na qual

Z é hidrogénio ou -C(O)R, em que R é alquilo inferior ou arilo; ou de um seu sal farmaceuticamente aceitável, caracterizado pelo facto de compreender:

a) a reacção de um composto que tem a formula na qual

Z tem o significado anterior e X é halogênio, com morfolinoe tanol para formar um composto que tem a formula A; ou na qual

Z tem o significado anterior, com morfolinoetanol e uma carbodiimida para formar um composto que tem a formula A;

ou

c) a reacção de um composto que tem a formula A na qual Z é hidrogénio, com um haleto de acilo ou anidrido de acilo em presença de uma base para formar um composto que tem a formula A na qual Z é -C(O)R; ou

d) a reacção de um composto que tem a formula A na qual Z é -C(O)R, com uma base ou uma amina para formar um composto que tem a formula A na qual Z é hidrogénio; ou

e) a transformação de um composto que tem a formula A num ) sal de adição de ácidos farmaceuticamente aceitável de um composto que tem a formula A; ou

f) a transformação de um sal de adição de ácidos farmaceu ticamente aceitável de um composto que tem a formula A no com posto livre correspondente que tem a formula A; ou

g) a transformação de um sal de adição de ácidos farmaceuticamente aceitável de um composto que tem a formula A noutro sal de adição de ácidos farmaceuticamente aceitável de um com posto que tem a formula A; ou

h) a transformação de um composto que tem a formula A na qual Z é -C(O)R noutro composto que tem a formula A na qual Z é -C(O)R por meio de permuta éster para éster.
2ê.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar um composto em que Z é hidrogénio.
3â.~ Processo de acordo com a rei^ vindicação 2, caracterizado por se preparar o sal cloridrato do referido composto.
4B.- Processo de acordo com a rei. vindicação 2, caracterizado por se preparar o sal sulfato ou bissulfato do referido composto.
5§.- Processo de acordo com a rei vindicação 2, caracterizado por se preparar o sal bissulfato do referido composto.
6â.- Processo de acordo com a reÁ vindicação 1, caracterizado por se preparar um composto em que R é alquilo inferior.
7§.- Processo de acordo com a rei vindicação 6, caracterizado por se preparar um composto em que Z é -C(O)CH₃.
8ê.- Processo de acordo com a rei vindicação 7, caracterizado por se preparar o sal cloridrato do referido composto.

91,- Processo de acordo com a rei vindicação 6, caracterizado por se preparar um composto em que Z é -C(O)CH₃CH₃.
10â.~ Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por se preparar um composto em que Z é -C(0)(CH₃)₃.

llâ.- Processo de acordo com a rei. vindicação 1, caracterizado por se preparar um composto em que Z é -C(O)CgH|-.
12i.- Processo para a preparação de uma composição farmacêutica, caracterizado por se incluir na referida composição um excipiente não tóxico farmaceuticamente aceitável e uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto que tem a formula A na qual

Z é hidrogénio ou -C(O)R, em que R é alquilo inferior ou ari lo; ou de um seu sal farmaceuticamente aceitável.
13â.- Processo para o tratamento de doenças auto-imunes, doenças inflamatórias, doenças psoriáticas, tumores, vírus, e artrite reumatóide em mamíferos, caracterizado por compreender a administração a mamíferos que sofrem com essas doenças de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto que tem a formula A na qual

-54Z é hidrogénio ou -C(O)R, em que R é alquilo inferior ou arilo; ou de um seu sal farmaceuticamente aceitável, sendo a gama de dosagem de composto activo de 0,02 a 100 mg/kg de peso corporal por dia.

Lisboa, 11 de Dezembro de 1987