PT1933871E

PT1933871E - Anticorpos monoclonais humanos para cinase-1 do tipo receptor de activina

Info

Publication number: PT1933871E
Application number: PT68249150T
Authority: PT
Inventors: Sirid-Aimee Kellermann; Michael Aidan North; Karin Kristina Amundson; Vahe Bedian; Shelley Sims Belouski; Dana Dan Hu-Lowe; Xin Jiang; Shannon Marie Karlicek; James Arthur Thomson; Grant Raymond Wickman; Jingchuan Zhang
Original assignee: Pfizer; Amgen Fremont Inc
Priority date: 2005-09-07
Filing date: 2006-09-06
Publication date: 2013-07-17
Also published as: SI1933871T1; LT2960253T; PE20080035A1; EP1933871A2; TW201431883A; CL2010000096A1; EA201300320A1; JP5161777B2; AP2008004388A0; PL1933871T3; ME00501B; HK1169999A1; US7537762B2; CA2621371C; CA2621371A1; PL2447283T3; PT2960253T; EP2447283A2; UY29783A1; EP2447283A3

Description

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DESCRIÇÃO "ANTICORPOS MONOCLONAIS HUMANOS PARA CINASE-1 DO TIPO RECEPTOR DE ACTIVINA"

Campo da Invenção A presente invenção refere-se aos anticorpos monoclonais humanos e porções de ligação a antigeno dos mesmos que se ligam ao dominio extracelular (DEC), da cinase-1 do tipo receptor de activina (ALK-1). A invenção refere-se igualmente às moléculas de ácido nucleico que codificam tais anticorpos e porções de ligação a antigeno, métodos de produção de anticorpos anti-ALK-1 humanos e porções de ligação a antigeno, composições que compreendem estes anticorpos e porções de ligação a antigeno e métodos de utilização dos anticorpos, porções de ligação a antigeno, e composições.

Antecedentes da Invenção A ALK-1 é um receptor da superfície celular tipo I para transformar o receptor beta do factor de crescimento tipo 1 (TGF-beta-1). A ALK-1 humana é um polipéptido de 503 aminoácidos, que inclui uma sequência de sinal (aminoácidos: 1-21), um dominio de ligação ao ligando TGF-beta-1 extracelular N-terminal ou DEC (aminoácidos: 22-118), um dominio transmembranar único (aminoácidos: 119-141), um dominio regulador rico em glicina/serina (GS) (aminoácidos: 142-202) e um dominio de serina- treonina cinase C-terminal (202-492). A sequência de aminoácidos de ALK-1 humana revelada em Attisano et al. Cell, 1993, vol. 75, pp. 671-680 inclui Ser na posição 172 (registo do

GenBank L17075), enquanto a Patente US N° 6.316.217 reivindica a sequência de aminoácidos de ALK-1 humana com Thr na posição 172 (registo do GenBank NM_000020) . 0 gene ACVRL1 que codifica uma ALK-1 humana de comprimento total revelado em Attisano et al. está disponível comercialmente 2 da Invitrogen Inc., Clone ID IOH21048. Embora a ALK-1 compartilha de 60 a 80 % de homologia global com outros receptores do tipo I (ALK-2 através de ALK-7), a DEC da ALK-1 é notavelmente divergente dos DCE dos outros membros da familia da ALK. Por exemplo, nos seres humanos, apenas o DEC da ALK-2 é significativamente relacionado com o DEC da ALK-1 (partilhando aproximadamente 25 % de identidade de aminoácido) . A Patente US N° 8.318.217; ten Dijke et al. Oncogene, 1993, vol. 8, pp. 2879-2887; Attisano et al. Cell, 1993, vol. 75, pp. 671-680.

Em geral, os ligandos da superfamília de TGF-beta exercem suas actividades biológicas através da ligação aos complexos de receptor heteroméricos de dois tipos (I e II) das serina/treonina cinases. Os receptores do tipo II são constitutivamente cinases activas que fosforilam o receptor tipo I após a ligação de ligando. Por sua vez, as cinases tipo I activadas fosforilam a jusante as moléculas sinalizadoras incluindo os diversos Smads, que se deslocam para o núcleo e levam a uma resposta transcricional. Heldin et al. Nature, 1997, vol. 390, pp. 485-471. No caso da ALK-1, demonstra-se que o Smadl é especificamente fosforilado e desloca-se ao núcleo onde directamente regula a expressão dos genes respondedores Smadl Idl e EphB2. A ALK-1 é expressa alta e selectivamente nas células endoteliais e outros tecidos altamente vascularizados tais como a placenta ou cérebro. Demonstrámos pelo perfil de Affymetrix e a RT-PCR em tempo real em que a expressão da ALK-1 nas células endoteliais altamente excede a expressão dos seus co-receptores de activina do tipo II e endoglina, o seu ligando TGF-beta-1 ou ALK-5. As mutações na ALK-1 estão associadas a telangiectasia hemorrágica na hereditariedade (THH), sugerindo um papel critico para a ALK-1 no controlo do desenvolvimento ou reparação dos vasos sanguíneos. Abdalla et al. J. Med. Genet., 2003, vol. 40, pp. 494-502; Sadick et al. Hematologica/The Hematology J., 3 2005, vol. 90, 818-828 . Além disso, dois estudos independentes de ratinhos nocauteados (knockout) por ALK-1 fornecem a chave in vivo da evidência para a função de ALK-1 durante a angiogénese. Oh et al. Proc Natl Acad Sei USA, 2000, vol. 97, pp. 2626-2631; Urness et al. Nature Genetics, 2000, vol. 26, pp. 328-331. A angiogénese é o processo fisiológico que envolve a formação de novos vasos sanguíneos a partir dos vasos pré-existentes e/ou células estaminais endoteliais circulantes. Este é um processo normal de crescimento e desenvolvimento, assim como na cicatrização de feridas. No entanto, isto é também uma etapa fundamental na transição de tumores de um estado dormente para um estado maligno. Hanahan e Folkman, Hanahan e Folkman, "Patterns and Emerging Mechanisms of the Angiogenic Switch During Tumorigenesis, " Cell, 86(3):353-364, 1996; Carmeliet, "Angiogenesis in Health and Disease," Nature Medicine, 9(6):653-660, 2003; Bergers e Benjamin, "Tumorigenesis and the Angiogenic Switch," Nature Reviews, 3:401-410, 2003. Em doenças como o cancro, o organismo perde a capacidade de manter a angiogénese equilibrada. Novos vasos sanguíneos alimentam-se dos tecidos doentes, destroem os tecidos normais, e no caso de alguns cancros, os novos vasos podem deixar as células tumorais escaparem para dentro da circulação e alojarem-se em outros órgãos (metástases tumorais). Inibidores da angiogénese, incluindo os anticorpos monoclonais (mAbs), são uma classe muito promissora de fármacos direccionados contra este processo anormal para bloquear ou atrasar o crescimento tumoral.

Além de um papel no crescimento de tumor sólido e metástase, outras condições notáveis com uma componente angiogénica são, por exemplo, artrite, psoríase, degeneração macular relacionada à idade neovascular e retinopatia diabética. Bonnet et al. "Osteoarthritis, Angiogenesis and Inflammation, " Rheumatology, 2005, vol. 44, pp. 7-16; Creamer et al. "Angiogenesis in psoriasis," 4

Angiogenesis, 2002, vol. 5, pp. 231-236; Clavel et al. "Recent data on the role for angiogenesis in rheumatoid arthritis," Joint Bone Spine, 2003, vol. 70, pp. 321-326; Anandarajah et ai. "Pathogenesis of psoriatic arthritis," Curr. Opin. Rheumatol., 2004, vol. 16, pp. 338-343; Ng et ai. "Targeting angiogenesis, the underlying disorder in neovascular age-related macular degeneration, " Can. J. Ophthalmol., 2005, vol. 40, pp. 352-368; Witmer et ai. "Vascular endothelial growth factors and angiogenesis in eye disease," Progress in Retinal & Eye Research, 2003, vol. 22, pp. 1-29; Adamis et al. "Angiogenesis e ophthalmic disease," Angiogenesis, 1999, vol. 3, pp. 9-14.

Espera-se que as terapêuticas antiangiogénicas sejam de natureza crónica. Consequentemente, alvos com função endotelial altamente selectiva, tais como a ALK-1, são preferidos para reduzir o atrito resultante dos efeitos colaterais. Além disso, tendo em conta a notável divergência da ALK-1 DEC de DCE dos outros membros da familia ALK, espera-se que mAb produzidos contra o DEC da ALK-1 humana tenham como alvo selectivo a ALK-1. Com base nestas considerações, é altamente desejável um anticorpo monoclonal contra o domínio extracelular de ALK-1 que possa inibir a dimerização com o receptor tipo II e, por isso, bloquear a fosforilação Smadl e a resposta transcricional a jusante. R&D Systems, Inc. produz e vende um anticorpo monoclonal ALK-1 anti- humano (Cat # MAB370) produzido a partir de um hibridoma resultante da fusão do mieloma de ratinho com as células B obtidas de um ratinho imunizado com domínio extracelular de ALK-1 humano recombinante derivado de NSO purificado. Demonstrou-se que este anticorpo nem neutraliza a interacção entre ALK-1 e TGF-beta-1 nem anula a fosforilação de Smadl. Anti-soros de coelho foram gerados contra um péptido sintético correspondente a uma parte da região justamembranar 5 intracelular da ALK-1 (resíduos de aminoácido 145-166), acoplada a hemocianina de Megathura crenulata (KLH) (Patente US N° 6.692.925) e contra o domínio extracelular ALK-1 inteiro excepto para a sequência líder (Lux et al., J. Biol. Chem., 1999, vol. 274, pp. 9984-9992). Abdalla et al (Humano Mol. Gene., 2000, vol. 9, pp. 1227-1237) relata a geração de um anticorpo policlonal para ALK-1 usando uma construção de vírus de vaccínia recombinante. A R&D Systems, Inc. produz e vende um anticorpo ALK-1 anti-humano policlonal (Cat. # AF370) produzido em caprinos imunizados com domínio extracelular ALK-1 humano recombinante derivado de NSO purificado.

Até o momento, nenhum anticorpo monoclonal completamente humano para o DEC da ALK-1 foi relatado, e ninguém demonstrou a eficácia de qualquer anticorpo monoclonal para o DEC da ALK-1 em anular a via de sinalização de ALK-1/TGF-beta-l/Smadl.

Sumário da Invenção A presente invenção é como foi descrito nas reivindicações apensas. A invenção pertence aos anticorpos monoclonais anti-ALK-1 de neutralização isolados ou porções de ligação a antígeno dos mesmos que se ligam à ALK-1 de primata, preferivelmente o DEC da ALK-1 de primata, mais preferivelmente o DEC de ALK-1 humano. Numa forma de realização preferida, os anticorpos de neutralização são anticorpos monoclonais completamente humanos ou porções de ligação a antigeno dos mesmos.

Em outro aspecto, a presente invenção é um anticorpo anti-ALK- 1 ou porção de ligação a antígeno do mesmo que anula a via de sinalização de ALK-1/TGF-beta-l/Smadl. Numa forma de realização preferida, os anticorpos são anticorpos monoclonais completamente humanos ou porções de ligação a antígeno dos mesmos.

Num outro aspecto, a presente invenção é um anticorpo anti- ALK-1 ou porção de ligação a antígeno do mesmo em que 6 o anticorpo ou porção de ligação a antigeno do mesmo é um antagonista da angiogénese estimulada por TGF-beta-1. Numa forma de realização preferida, os anticorpos são anticorpos monoclonais completamente humanos ou porções de ligação a antigeno dos mesmos.

Num outro aspecto, a presente invenção é um anticorpo anti-ALK-1 completamente humano ou porção de ligação a antigeno em gue o anticorpo ou porção de ligação a antigeno do mesmo é um antagonista da angiogénese tumoral estimulada por TGF-beta-1.

Em outro aspecto, a presente invenção é um anticorpo anti-ALK-1 completamente humano injectável ou porção de ligação a antigeno do mesmo, em gue o anticorpo ou porção de ligação a antigeno do mesmo é um antagonista da angiogénese estimulada por TGF-beta-1.

Num outro aspecto, a presente invenção é um anticorpo anti-ALK-1 ou porção de ligação a antigeno do mesmo em que 0 anticorpo ou porção de ligação a antigeno do mesmo inibe a regulação positiva de um gene alvo a jusante especifico da ALK-1, Idl. Numa forma de realização preferida, os anticorpos são anticorpos monoclonais completamente humanos ou porções de ligação a antigeno dos mesmos.

Num outro aspecto, a presente invenção é um anticorpo monoclonal de anti-ALK-1 ou porção de ligação a antigeno do mesmo em que o anticorpo ou porção de ligação a antigeno do mesmo é descrito em termos de pelo menos uma das várias propriedades funcionais conforme descrito a seguir.

Por exemplo, numa forma de realização o anticorpo ou porção de ligação a antigeno do mesmo liga-se ao dominio extracelular da ALK-1 de primata com um valor de avidez de 1 μΜ ou menos como medido pela ressonância de plasmão superficial. Numa outra forma de realização, o anticorpo ou a porção liga-se ao dominio extracelular da ALK-1 de primata com um valor de avidez de menos do que 100 nM, menos do que 5 nM, menos do que 1 nM, menos do que 500 pM, 7 menos do que 100 pM, menos do que 50 pM, menos do que 20 pM, menos do que 10 pM, ou menos do que 1 pM, como medido pela ressonância de plasmão superficial. Em outras formas de realização, o valor de avidez é de 0,1 pM a 1 μΜ. Em outras formas de realização, o valor de avidez é de 1 pM a 100 nM. Em outras formas de realização, o valor de avidez é de 1 pM a 5 nM. Em outras formas de realização, o valor de avidez é de 1 pM a 500 pM. Em outras formas de realização, o valor de avidez é de 1 pM a 100 pM. Em outras formas de realização, a avidez é de 1 pm a 10 pm.

Numa outra forma de realização, o anticorpo ou porção de ligação a antigeno do mesmo liga-se ao domínio extracelular da ALK-1 humana com uma valor de avidez de 100 nM ou menos como medido pela ressonância de plasmão superficial. Numa outra forma de realização, o anticorpo ou porção se liga ao domínio extracelular da ALK-1 humana com um valor de avidez menos do que 10 nM, menos do que 5 nM, menos do que 1 nM, menos do que 50 0 pM, menos do que 100 pM, menos do que 50 pM, menos do que 20 pM, menos do que 10 pM, ou menos do que 1 pM, medido pela ressonância de plasmão superficial. Em certas formas de realização, o valor de avidez é de 1 pM a 100 nM. Em outras formas de realização, o valor de avidez é de 1 pM a 5 nM. Em outras formas de realização, o valor de avidez é de 1 pM a 500 pM. Em outras formas de realização, o valor de avidez é de 1 pM a 100 pM. Em outras formas de realização, a avidez é de 1 pm a 10 pm.

Em outra forma de realização, o anticorpo ou porção do mesmo possui um índice de dissociação (k0ff) para ALK-1 humana de 5 x 10 s ou menor quando medido pela ressonância de plasmão superficial. Por exemplo, em certas formas de realização o anticorpo ou porção possui um koff para ALK-1 humana de menos do que 10”3 s”1 menos do que 5 x 10“4 s"1, menos do que 10"4 s”1, menos do que 5 x IO”5 s”1 menos do que 10“5 s”1, ou menos do que 5 x IO”6 s”1. Em outras formas de realização, o k0ff é de 10 6 s 1 para 10 4 s 1. Em outras formas de realização, o koff é de 10“6 s”1 a 5 x IO-5 s_1.

Numa outra forma de realização, o anticorpo ou porção deste se liga à ALK-1 de primata com um KD de 1000 nM ou menos. Numa outra forma de realização, o anticorpo ou porção liga-se à ALK-1 humana com um KD de menos do que 500 nM, menos do que 100 nM, menos do que 50 nM, menos do que 20 nM, menos do que 10 nM, ou menos do que 1 nM, como medido pela ressonância de plasmão superficial. Em certas formas de realização, o KD é de 1 μΜ a 100 nM. Em outras formas de realização, o KD é de 100 nM a 10 nM. Em outras formas de realização, KD é de 50 nM a 0,1 nM. Tais valores de KD podem ser medidos por qualquer técnica conhecida dos peritos na especialidade, tal como por ELISAs, RIAs, citometria de fluxo, ou ressonância de plasmão superficial, como BIACORE™.

Em outra forma de realização, o anticorpo ou porção do mesmo possui uma maior afinidade de ligação para a ALK-1 de primata (KD (P) ) do que para a ALK-1 de roedores (KD(R)). Numa forma de realização, os anticorpos ou porções de ligação a antigeno dos mesmos da presente invenção têm um Kd(R)/Kd(P), que é maior ou igual a 1,5. Numa outra forma de realização dos antigeno ou porções de ligação a antigeno dos mesmos da presente invenção possuem um Kd(R)/Kd(P), que é maior ou igual a 2, maior ou igual a 3, maior ou igual a 5, maior ou igual a 10, maior ou igual a 20, maior ou igual a 50, maior ou igual a 100, maior ou igual a 200, maior ou igual a 500, ou maior ou igual a 1000. Tais valores de KD tanto para ALK-1 de primata quanto para ALK-1 de roedor podem ser medidos por qualquer técnica conhecida pelos peritos na especialidade, tal como por citometria de fluxo, ELISA, RIA, ou ressonância de plasmão superficial, tal como BIACORE™.

Em outra forma de realização, o anticorpo anti-ALK-1 9 ou porção do mesmo tem uma IC50 de 500 nM ou menos como medido pela sua capacidade de inibir a regulação positiva de um gene alvo a jusante especifico da ALK-1, Idl. Numa outra forma de realização, a dita IC50 é menor do que 300 nM, menor do que 200 nM, menor do que 150 nM, menor do que 100 nM, menor do que 50 nM, menor do que 20 nM, menor do que 10 nM òu menor do que 1 nM. Em certas formas de realização, a IC50 é de 1 nM e 500 nM. Em outras formas de realização, 0 IC50 é de 5 nM e 250 nM. Em outras formas de realização, 0 IC50 é de 10 nM e 100 nM.

Em outra forma de realização, o anticorpo anti-ALK-1 ou porção do mesmo possui uma IC5o de 250 nM ou menos como medido pela sua capacidade de inibir a fosforilação Smadl determinada pelo Western Blotting utilizando Odyssey Infrared Imaging System. Numa outra forma de realização, a dita IC50 é menor do que 200 nM, menor do que 150 nM, menor do que 100 nM, merior do que 5 0 nM, menor do que 2 0 nM, menor do que 10 nM, ou menor do que 1 nM. Em certas formas de realização, a IC50 é de 1 nM a 250 nM. Em outras formas de realização, a IC50 é de 5 nM a 200 nM. Em outras formas de realização, a IC50 é de 10 nM a 100 nM.

Numa outra forma de realização, o anticorpo anti-ALK-1 ou porção do mesmo inibe angiogénese dos vasos humanos num ratinho SCID enxertado com tecido do prepúcio humano, em que células tumorais de melanoma humano M24met são intradermicamente implantadas como determinado pela análise IHC do ensaio de sinal CD-31 humano em pelo menos 40 % em comparação com uma amostra de controlo. Numa outra forma de realização, o anticorpo anti-ALK-1 ou porção do mesmo inibe a angiogénese dos vasos humanos num ratinho SCID enxertado com tecido do prepúcio humano, em que as células tumorais do melanoma humano M24met são intradermicamente implantadas em pelo menos 30 %, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, ou pelo menos 60 % quando comparado com uma amostra de controlo. 10

Em outra forma de realização, o anticorpo anti-ALK-1 ou porção do mesmo possui uma EC5o de 500 nM ou menos como medido pela sua capacidade de inibir a angiogénese dos vasos humanos num ratinho SCID enxertado com tecido do prepúcio humano, em que células tumorais do melanoma humano M24met são intradermicamente implantadas. Numa outra forma de realização, a dita EC50 é menor do que 400 nM, menor do que 300 nM, menor do que 200 nM, menor do que 150 nM, menor do que 100 nM, menor do que 50 nM, menor do que 2 5 nM, ou menor do que 5 nM. Em certas formas de realização, a EC50 é de 5 nM a 500 nM. Em outras formas de realização, a IC50 é de 25 nM a 300 nM. Em outras formas de realização, a IC50 é de 50 nM a 150 nM.

Numa outra forma de realização, o anticorpo anti-ALK-1 ou porção do mesmo inibe angiogénese dos vasos humanos num ratinho SCID enxertado com tecido do prepúcio humano, em que uma mistura de colagénio acrescido de células endoteliais humanas macrovasculares é intradermicamente implantada como determinado pela análise IHC do ensaio de sinal CD-31 humano em pelo menos 25 % em comparação com uma amostra de controlo. Numa outra forma de realização, o anticorpo anti-ALK-1 ou porção do mesmo inibe angiogénese dos vasos humanos num ratinho SCID enxertado com tecido do prepúcio humano, no qual colagénio é intradermicamente implantado em pelo menos 50 % quando comparado com uma amostra de controlo. Numa outra forma de realização, o anticorpo anti-ALK-1 ou porção do mesmo inibe em pelo menos 75 %, em pelo menos 80 %, em pelo menos 85 %, em pelo menos 90 % ou pelo menos 95 % em comparação com o controlo.

Em outra forma de realização, o anticorpo anti-ALK-1 ou porção do mesmo concorre para a ligação com a ALK-1 com um anticorpo seleccionado a partir do grupo consistindo em 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1 (rWT); 1.12.1 (M29I/D19A); 1.12.1 (M29I); 1.12.1 (D19A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1, 11 4.24.1, 4.38.1, 4.58.1, 4.62.1, 4.68.1, 4.72.1, 5.13.1, 5.34.1, 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1 e 5.59.1.

Em outra forma de realização, o anticorpo anti-ALK-1 ou porção do mesmo concorre para a ligação com a ALK-1 com um anticorpo seleccionado a partir do grupo consistindo em 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1 (rWT); 1.12.1 (M29I/D19A); 1.12.1 (M29I); 1.12.1 (D19A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1, 4.24.1, 4.38.1, 4.58.1, 4.62.1, 4.68.1, 4.72.1, 5.13.1, 5.34.1, 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1 e 5.59.1.

Numa outra forma de realização, o anticorpo anti-ALK-1 ou porção do mesmo liga-se ao mesmo epítopo da ALK-1 como um anticorpo seleccionado a partir do grupo consistindo em 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1 (rWT); 1.12.1 (M29I/D19A); 1.12.1 (M29I); 1.12.1 (D19A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1,31. 1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1, 4.24.1, 4.38.1, 4.58.1, 4.62.1, 4.68.1, 4.72.1, 5.13.1, 5.34.1, 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1 e 5.59.1.

Em outra forma de realização, o anticorpo anti-ALK-1 ou porção do mesmo liga-se à ALK-1 com substancialmente o mesmo KD como um anticorpo seleccionado a partir do grupo consistindo em 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1 (rWT); 1,12. 1 (M29I/D19A); 1.12.1 (M29I); 1.12.1 (D19A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1, 4.24.1, 4.38.1, 4.58.1, 4.62.1, 4.68.1, 4.72.1, 5.13.1, 5.34.1, 5.53.1; 5.56.1, 5.57.1 e 5.59.1. Numa outra forma de realização, o anticorpo anti-ALK-1 ou porção do mesmo liga-se à ALK-1 com substancialmente o mesmo kott como um anticorpo seleccionado a partir do grupo consistindo em 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1 (rWT); 1.12.1 (M29I/D19A); 1.12.1 (M29I); 1.12.1 (D19A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1, 4.24.1, 4.38.1, 4.58.1, 4.62.1, 4.68.1, 4.72.1, 5.13.1, 5.34.1, 5.53.1; 5.56.1, 5.57.1 e 5.59.1.

Um aspecto adicional da presente invenção é um 12 anticorpo ou porção de ligação a antigénio do mesmo conforme reivindicado com pelo menos uma das propriedades funcionais descritas anteriormente, e compreende um dominio VH que é pelo menos 90 % idêntico em sequência de aminoácidos a qualquer uma das SEQ ID NOs: 6; 14; 18; 26; 30; 38; 46; 50; 54; 58; 62; 66; 70; ou 104. Numa forma de realização, o dito dominio VH é pelo menos 91 %, pelo menos 93 %, pelo menos 95 %, pelo menos 97 %, pelo menos 99 %, ou 100 % idêntico em sequência de aminoácidos a qualquer uma das SEQ ID NOs: 6; 14; 18; 26; 30; 38; 46; 50; 54; 58; 62; 66; 70; ou 104.

Numa forma de realização adicional, o anticorpo ou porção do mesmo conforme reivindicado tem pelo menos uma das propriedades funcionais descritas anteriormente, e compreende um dominio VH que é qualquer das SEQ ID NOs: 6; 14; 18; 26; 30; 38; 46; 50; 54; 58; 62; 66; 70; ou 104, ou difere de qualquer uma das SEQ ID NOs: 6; 10; 14; 18; 26; 30; 38; 46; 50; 54; 58; 62; 66; 70; ou 104 por ter pelo menos uma substituição de aminoácidos conservadora. Por exemplo, o dominio VH pode diferir em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 substituições de aminoácidos conservadoras de qualquer uma das SEQ ID NOs: 6; 14; 18; 2 6; 30; 38; 46; 50; 54; 58; 62; 66; 70; ou 104. Numa forma de realização adicional, qualquer destas substituições de aminoácidos conservadoras pode ocorrer nas regiões CDR1, CDR2, e/ou CDR3.

Um aspecto adicional da presente invenção é um anticorpo ou porção de ligação a antigénio do mesmo conforme reivindicado com pelo menos uma das propriedades funcionais descritas anteriormente, e compreende um dominio VL que é pelo menos 90 % idêntico em sequência de aminoácidos a qualquer uma das SEQ ID NOs: 8; 16; 20; 28; 32; 40; 48; 52; 56; 60; 64; 68; 72; ou 127. Numa forma de realização, o dito dominio VL é pelo menos 91 %, pelo menos 93 %, pelo menos 95 %, pelo menos 97 %, pelo menos 99 %, ou 13 100 % idêntico em sequência de aminoácidos a qualquer uma das SEQ ID NOs: 8; 16; 20; 28; 32; 40; 48; 52; 56; 60; 64; 68; 72; ou 127.

Numa forma de realização adicional, o anticorpo ou porção do mesmo conforme reivindicado tem pelo menos uma das propriedades funcionais descritas anteriormente, e compreende um domínio VL que é qualquer uma das SEQ ID NOs: 8; 16; 20; 28; 32; 40; 48; 52; 56; 60; 64; 68; 72; ou 127, ou difere de qualquer uma das SEQ ID NOs: 8; 16; 20; 28; 32; 40; 48; 52; 56; 60; 64; 68; 72; ou 127 por ter pelo menos uma substituição de aminoácidos conservadora. Por exemplo, o domínio VL pode diferir em 1, 2, 3, 4, 5, 8, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 substituições de aminoácidos conservadoras de qualquer uma das SEQ ID NOs: 8; 16; 20; 28; 32; 40; 44; 48; 52; 56; 60; 64; 68; 72; ou 127. Numa forma de realização adicional, qualquer destas substituições de aminoácidos conservadoras pode ocorrer nas regiões CDR1, CDR2, e/ou CDR3.

Outro aspecto da presente invenção é um anticorpo ou porção de ligação a antigénio do mesmo conforme reivindicado com pelo menos uma das propriedades funcionais descritas anteriormente em que os domínios VL e VH são, cada um, pelo menos 90 % idênticos em sequência de aminoácidos aos domínios VL e VH, respectivamente, de qualquer um dos anticorpos monoclonais 1.12.1; 1.12.1 (rWT) ; 1.12.1 (M29I/D19A); 1.12.1 (M29I); 1.12.1 (D19A); 1.13.1; 1.14.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.9.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1, 4.68.1, 4.72.1; e 5.13.1. Por exemplo, os domínios VL e VH são cada um pelo menos 91 %, 93 %, 95 %, 97 %, 99 % ou 100 % idênticos nas sequências de aminoácidos para os domínios VL e VH, respectivamente, de qualquer um dos anticorpos monoclonais 1.12.1; 1.12.1 (rWT); 1.12.1 (M29I/D19A); 1.12.1 (M29I); 1.12.1 (D19A); 1.13.1; 1.14.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.9.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1, 14 4.68.1, 4.72.1; e 5.13.1.

Em outro aspecto da presente invenção está um anticorpo monoclonal ou porção de ligação a antigénio do mesmo conforme reivindicado que é seleccionado a partir do grupo consistindo em: a) um anticorpo ou porção do mesmo que compreende um domínio VH como foi apresentado na SEQ ID NO: 6, e um domínio VL como foi apresentado na SEQ ID NO: 8; c) um anticorpo ou porção do mesmo que compreende um domínio VH como foi apresentado na SEQ ID NO: 14 e um domínio VL como foi apresentado na SEQ ID NO: 16; d) um anticorpo ou porção do mesmo que compreende um dominio VH como foi apresentado na SEQ ID NO: 18, e um domínio VL como foi apresentado na SEQ ID NO: 20; f) um anticorpo ou porção do mesmo que compreende um domínio VH como foi apresentado na SEQ ID NO: 2 6 e um domínio VL como foi apresentado na SEQ ID NO: 28; g) um anticorpo ou porção do mesmo que compreende um domínio VH como foi apresentado na SEQ ID NO: 30 e um domínio VL como foi apresentado na SEQ ID NO: 32; i) um anticorpo ou porção do mesmo que compreende um domínio VH como foi apresentado na SEQ ID NO: 38 e um domínio VL como foi apresentado na SEQ ID NO: 40; k) um anticorpo ou porção do mesmo que compreende um domínio VH como foi apresentado na SEQ ID NO: 46 e um domínio VL como foi apresentado na SEQ ID NO: 48; 1) um anticorpo ou porção do mesmo que compreende um domínio VH como foi apresentado na SEQ ID NO: 50 e um domínio VL como foi apresentado na SEQ ID NO: 52; m) um anticorpo ou porção do mesmo que compreende um domínio VH como foi apresentado na SEQ ID NO: 54 e um domínio VL como foi apresentado na SEQ ID NO: 56; n) um anticorpo ou porção do mesmo que compreende um domínio VH como foi apresentado na SEQ ID NO: 58 e um domínio VL como foi apresentado na SEQ ID NO: 60; o) um anticorpo ou porção do mesmo que compreende um domínio VH como foi apresentado na SEQ ID NO: 62 e um domínio VL como foi apresentado na SEQ ID NO: 64; p) um anticorpo ou porção 15 do mesmo que compreende um domínio VH como foi apresentado na SEQ ID NO: 66 e um domínio VL como foi apresentado na SEQ ID NO: 68 ; q) um anticorpo ou porção de ligação a antigénio do mesmo que compreende um domínio VH como foi apresentado na SEQ ID NO: 70 e um domínio VL como foi apresentado na SEQ ID NO: 72; w) um anticorpo ou porção do mesmo que compreende um domínio VH como foi apresentado na SEQ ID NO: 104 e um domínio VL como foi apresentado na SEQ ID NO: 127; x) um anticorpo ou porção do mesmo que compreende um domínio VH como foi apresentado na SEQ ID NO: 6 e um domínio VL como foi apresentado na SEQ ID NO: 127; e y) um anticorpo ou porção do mesmo que compreende um domínio VH como foi apresentado na SEQ ID NO: 104 e um domínio VL como foi apresentado na SEQ ID NO: 8.

Numa outra forma de realização, para qualquer um dos anticorpos ou de porções dos mesmos, como descrito acima, em grupos de a) a v) dos domínios VH e/ou VL podem diferir das SEQ ID NOs específicas aqui recitadas em pelo menos uma substituição de aminoácido conservadora. Por exemplo, os domínios VH e/ou VL podem diferir da SEQ ID NO recitada em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 substituições de aminoácido conservadoras. Numa outra forma de realização, qualquer uma destas substituições de aminoácido conservadoras podem ocorrer nas regiões CDRl, CDR2, e/ou CDR3.

Em outra forma de realização, a presente invenção proporciona um anticorpo monoclonal ou porção de ligação a antigénio do mesmo conforme reivindicado com pelo menos uma das propriedades funcionais descritas anteriormente, em que o domínio VH é independentemente seleccionado a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 6; 14; 18; 26; 30; 38; 46; 50; 54; 58; 62; 66; 70; ou 104, ou uma sequência que difere de qualquer uma das SEQ ID NOs: 6; 14; 18; 26; 30; 38; 46; 50; 54; 58; 62; 66; 70; ou 104, em pelo menos uma substituição de aminoácidos conservadora, e o domínio VL é 16 independentemente seleccionado a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 8; 16; 20; 28; 32; 40; 48; 52; 56; 60; 64; 68; 72; ou 127, ou uma sequência que difere de qualquer uma das SEQ ID NOs: 8; 16; 20; 28; 32; 40; 48; 52; 56; 60; 64; 68; 72; ou 127, em pelo menos uma substituição de aminoácidos conservadora. Por exemplo, os dominios VH e VL podem, cada um, diferir das SEQ ID NOs: 6; 14; 18; 26; 30; 38; 46; O LO 54; 58; 62; 66; 70; ou 104, e 8; 16; 20; 28; 32; 40; 48; 52; 56; 60; 64; 68; 72; ou 127, respectivamente, em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 substituições de aminoácidos conservadoras.

Numa forma de realização adicional, a presente invenção proporciona um anticorpo monoclonal ou porção de ligação a antigénio do mesmo conforme reivindicado com pelo menos uma das propriedades funcionais descritas anteriormente, em que o dito anticorpo ou porção compreende sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 de VH independentemente seleccionadas a partir das sequências de CDR1, CDR2 ou CDR3 de cadeia pesada, respectivamente, encontradas em qualquer uma das SEQ ID NOs: 6; 14; 18; 26; 30; 38; 46; 50; 54; 58; 62; 66; 70; ou 104, ou uma sequência que difere de qualquer uma das SEQ ID NOs: 6; 14; 18; 26; 30; 38; 46; 50; 54; 58; 62; 66; 70; ou 104, em pelo menos uma substituição de aminoácidos conservadora. Por exemplo, a CDR1, CDR2 e CDR3 de VH pode diferir da CDRl, CDR2 e CDR3, respectivamente, de qualquer das SEQ ID NOs: 6; 14; 18; 26; 30; 38; 46; 50; 54; 58; 62; 66; 70; ou 104, em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 substituições de aminoácidos conservadoras.

Numa forma de realização adicional, a presente invenção proporciona um anticorpo monoclonal ou porção de ligação a antigénio do mesmo conforme reivindicado com pelo menos uma das propriedades funcionais descritas anteriormente, em que o dito anticorpo ou porção compreende sequências de CDRl, CDR2 e CDR3 de VL independentemente 17 seleccionado a partir das sequências de CDR1, CDR2 ou CDR3 de cadeia leve, respectivamente, encontradas em qualquer uma das SEQ ID NOs: 8; 16; 20; 28; 32; 40; 48; 52; 56; 60; 64; 68; 72; ou 127, ou uma sequência que difere de qualquer uma das SEQ ID NOs: 8; 16; 20; 28; 32; 40; 48; 52; 56; 60; 64; 68; 72; ou 127, em pelo menos uma substituição de aminoácidos conservadora. Por exemplo, as CDR1, CDR2 e CDR3 de VL podem diferir das CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente, de qualquer das SEQ ID NOs: 8; 16; 20; 28; 32; 40; 44; 48; 52; 56; 60; 64; 68; 72; ou 127 em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 substituições de aminoácidos conservadoras. A presente invenção proporciona ainda um anticorpo monoclonal ou porção de ligação a antigénio do mesmo conforme reivindicado com pelo menos uma das propriedades funcionais descritas anteriormente, em que o dito anticorpo ou porção de ligação a antigénio compreende a CDR1 de VH e VL, a CDR2 de VH e VL e a CDR3 de VH e VL como observadas em qualquer um dos anticorpos monoclonais 1.12.1; 1.12.1 (rWT); 1.12.1 (M29I/D19A); 1.12.1 (M29I); 1.12.1 (D19A); 1.13.1; 1.14.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.9.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1, 4.68.1, 4.72.1; e 5.13.1. A presente invenção proporciona ainda um anticorpo monoclonal ou porção de ligação a antigénio do mesmo conforme reivindicado com pelo menos uma das propriedades funcionais descritas anteriormente, em que o dito anticorpo ou porção de ligação a antigénio compreende uma cadeia pesada que utiliza um gene VH 4-31, VH 3-11, VH 4-61 ou VH 4-59 humano. Em algumas formas de realização, a cadeia pesada utiliza um gene VH 3-33 humano, gene D 6-19 humano e um gene JH 3B humano; um gene VH 4-31 humano, gene D 6-19 humano e um gene Jh 4B humano; um gene Vh 4-61 humano, gene D 6-19 humano e um gene JH 4B humano; um gene VH 4-31 humano, um gene D 3- 3 humano e um gene JH 3B humano; um 18 gene VH 4-31 humano e um gene JH 3B humano; um gene VH 4-59 humano, um gene D 6-19 humano e um gene Jh 4B humano; um gene VH 3-11 humano, um gene D 3-22 humano e um gene JH 6B humano; um gene VH 3-15 humano, um gene D 3-22 humano e um gene Jh 4B humano; um gene VH 4-31 humano, um gene D 5-12 humano e um gene JH 6B humano; um gene VH 4-31 humano, um gene D 4-23 humano e um gene JH 4B humano; um gene VH 4-31 humano, um gene D 2- 2 humano e um gene Jh 5B humano; um gene VH 4-31 humano e um gene JH 6B humano; gene VH 3-15 humano, um gene D 1-1 humano e um gene Jh 4B humano; um gene VH 3-11 humano, um gene D 6-19 humano e um gene Jh 6B humano; um gene VH 3-11 humano, um gene D 3-10 humano e um gene JH 6B humano; ou um gene VH 3-11 humano, um gene D 6-6 humano e um gene JH 6B humano. A presente invenção proporciona ainda um anticorpo monoclonal ou porção de ligação a antigeno do mesmo com pelo menos uma das propriedades funcionais descritas anteriormente, em que o dito anticorpo ou porção de ligação a antigeno compreende uma cadeia leve que utiliza um gene VK A27, VK A2, VK Al, VK A3, VK B3, VK B2, VK LI ou VK L2 humano. Em algumas formas de realização, a cadeia leve utiliza um gene VK LI humano e um gene JK 4 humano; um gene VK A27 humano e um gene JK 5 humano ou um gene JK 4 humano; um gene VK B3 humano e um gene JK 1 humano; um gene VK L2 humano e um gene Jk 3 humano; um gene VK A2 humano e um gene JK 1 humano; um gene VK A3 humano e um gene JK 4 humano; um gene VK Al humano e um gene JK 1 humano; um gene VK B2 humano e um gene JK 4 humano; ou um gene VK A2 humano e um gene JK 1 humano. A presente invenção proporciona ainda um anticorpo monoclonal ou porção de ligação a antigeno do mesmo com pelo menos uma das propriedades funcionais descritas anteriormente, em que o dito anticorpo ou porção de ligação a antigeno compreende uma ou mais de uma cadeia pesada e/ou cadeia leve da sequência de aminoácido FR1, FR2, FR3 ou FR4 19 como observado em qualquer um dos anticorpos monoclonais 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1 (rWT); 1.12.1 (M29I/D19A); 1.12.1 (M29I); 1.12.1 (D19A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1; e 5.59.1. A presente invenção proporciona ainda um anticorpo monoclonal que compreende as sequências de aminoácidos apresentadas nas: a) SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 4; e d) SEQ ID NO: 100 e SEQ ID NO: 102.

Numa outra forma de realização da presente invenção existe qualquer um dos anticorpos reivindicados que é uma molécula de IgG, IgM, IgE, IgA ou IgD, ou derivada das mesmas. Por exemplo, o anticorpo pode ser uma IgGl ou IgG2.

Outra forma de realização da invenção proporciona qualquer um dos anticorpos ou porções de ligação a antigeno acima descritos, que é um fragmento Fab, um fragmento F(ab')2/ um fragmento Fv, um fragmento Fv de cadeia única, um fragmento VH de cadeia única, um fragmento VL de cadeia única, um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico ou um anticorpo biespecifico.

Numa outra forma de realização existe um anticorpo derivado ou porção de ligação a antigeno que compreende qualquer um dos anticorpos ou porções dos mesmos, como descrito anteriormente e pelo menos uma entidade molecular adicional. Por exemplo, a pelo menos uma entidade molecular adicional pode ser um outro anticorpo (por exemplo, um anticorpo biespecifico ou um diacorpo), um agente de detecção, uma etiqueta, um agente citotóxico, um agente farmacêutico, e/ou uma proteína ou péptido que possa mediar a associação do anticorpo ou porção de anticorpo com outra molécula (tal como uma região de núcleo de estreptavidina ou uma cauda de polihistidina) . Por exemplo, os agentes de detecção úteis com os quais um anticorpo ou porção de ligação a antigeno da invenção pode ser derivado incluem 20 compostos fluorescentes, incluindo fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, cloreto de 5-dimetilamina-1-naftalenossulfonilo, ficoeritrina, lantanídeos fósforos, e similares. Um anticorpo também pode ser etiquetado com enzimas que são úteis para a detecção, tais como peroxidase de rábano silvestre, β-galactosidase, luciferase, fosfatase alcalina, glicose oxidase, e similares. Numa outra forma de realização os anticorpos ou porções dos mesmos da presente invenção também podem ser marcados com biotina, ou com um epítopo de polipéptido predeterminado reconhecido por um repórter secundário (por exemplo, sequências do par do zipper de leucina, locais de ligação para anticorpos secundários, domínios de ligação ao metal, etiquetas de epítopo) . Em mais uma outra forma de realização da presente invenção, qualquer um dos anticorpos ou porções dos mesmos pode igualmente ser derivado com um grupo químico tal como polietilenoglicol (PEG), um grupo metilo ou etilo, ou um grupo de hidrato de carbono.

Em algumas formas de realização, os anticorpos anti-ALK-1 ou porções de ligação a antígeno revelados no presente documento são anexados a um suporte sólido.

Em algumas formas de realização, a lisina C-terminal da cadeia pesada de acordo com qualquer um dos anticorpos anti-ALK-1 da invenção é clivada. Em várias formas de realização da invenção, as cadeias pesadas e leves dos anticorpos anti-ALK-1 podem opcionalmente incluir uma sequência de sinal. A presente invenção também proporciona uma composição farmacêutica que compreende qualquer um dos anticorpos ou porções de ligação a antígeno dos mesmos conforme descrito acima e um veículo farmaceuticamente aceitável.

Em outra forma de realização, a invenção refere-se a uma molécula de ácido nucleico isolada que compreende uma sequência de nucleótidos que codifica qualquer um dos anticorpos ou porções de ligação a antígeno dos mesmos 21 conforme descrito no presente documento. Numa forma de realização particular, uma molécula de ácido nucleico isolada compreende a sequência de nucleótidos apresentada na SEQ ID NO: 1, cuja sequência codifica uma cadeia pesada. Em outra forma de realização particular, uma molécula de ácido nucleico isolada compreende a sequência de nucleótidos apresentada na SEQ ID NO: 3, cuja sequência codifica uma cadeia leve.

Numa outra forma de realização uma molécula de ácido nucleico isolada compreende um polinucleótido que compreende uma grelha de leitura aberta da sequência de ADNc de um clone depositado sob um número de acesso de ATCC PTA-6864. Em outra forma de realização particular uma molécula de ácido nucleico isolada compreende um polinucleótido que compreende uma grelha de leitura aberta da sequência de ADNc de um clone depositado sob o número de acesso de ATCC PTA-6865.

Numa outra forma de realização particular, uma molécula de ácido nucleico isolada compreende a sequência de nucleótidos apresentada na SEQ ID NO: 95 ou 128, cada uma das sequências codifica uma cadeia pesada. Em outra forma de realização particular, uma molécula de ácido nucleico isolada compreende a sequência de nucleótidos apresentada na SEQ ID NO: 101, cuja sequência codifica uma cadeia leve. A invenção refere-se ainda a um vector que compreende qualquer uma das moléculas de ácido nucleico descritas no presente documento, em que o vector compreende uma sequência de controlo da expressão operativamente ligada à molécula de ácido nucleico.

Uma outra forma de realização proporciona uma célula hospedeira que compreende qualquer um dos vectores descritos neste documento ou que compreende qualquer uma das moléculas de ácido nucleico descritas no presente documento. A presente invenção também proporciona uma linha 22 celular isolada, que produz qualquer um dos anticorpos ou porções de ligação a antígeno como foi descrito no presente documento ou que produz a cadeia pesada ou cadeia leve de qualquer um dos ditos anticorpos ou as ditas porções de ligação a antigeno.

Numa outra forma de realização, a presente invenção refere-se a um método para a produção de um anticorpo anti-ALK-1 ou porção de ligação a antigeno do mesmo, que compreende o cultivo de qualquer uma das células hospedeiras ou linhas celulares descritas no presente documento sob condições adequadas e recuperação do dito anticorpo ou porção de ligação a antigeno. A presente invenção também se refere a um animal transgénico não humano ou planta transgénica que compreende qualquer um dos ácidos nucleicos descritos no presente documento, em que o animal transgénico não humano ou a planta transgénica expressa o dito ácido nucleico. A presente invenção proporciona ainda um método para isolar um anticorpo ou porção de ligação a antigeno do mesmo que se liga à ALK-1, que compreende a etapa de isolar o anticorpo do animal transgénico não humano ou planta transgénica como foi descrito no presente documento.

Numa outra forma de realização, a invenção refere-se a um hibridoma depositado sob um número de acesso de ATCC de PTA-Q808. A presente invenção também proporciona um método para determinar se uma substância inibe a regulação positiva de um gene alvo a jusante especifico da ALK-1, Idl, o método que compreende o contacto de uma primeira amostra de células que expressam Idl com a substância e determinar se a expressão Idl é inibida, em que um nível reduzido de expressão Idl na primeira amostra de células colocada em contacto com a substância em comparação a uma amostra de controlo de células é indicativo da referida substância que inibe a expressão Idl. A presente invenção proporciona 23 ainda o método, em que a substância é um anticorpo que se liga ao dominio extracelular da ALK-1. A presente invenção proporciona também um método para tratar o crescimento celular anormal num mamífero em necessidade do mesmo, que compreende a etapa de administrar ao dito mamífero qualquer um dos anticorpos ou porções de ligação a antígeno dos mesmos, ou qualquer uma das composições farmacêuticas, como foi descrito no presente documento. A presente invenção proporciona ainda um método para o tratamento do crescimento anormal de células num mamífero em necessidade do mesmo com um anticorpo ou porção de ligação a antígeno do mesmo que se liga à ALK-1 que compreende as etapas de administrar ao dito mamífero uma quantidade eficaz de qualquer uma das moléculas de ácido nucleico descritas no presente documento sob condições adequadas que permitem a expressão das ditas moléculas de ácido nucleico. Numa outra forma de realização, o método de tratamento do crescimento anormal de células compreende administrar uma quantidade de uma ou mais substâncias seleccionadas dos agentes anti-tumorais, agentes anti-angiogéneses, inibidores da transdução de sinal e agentes anti-proliferativos, em que as quantidades são juntas eficazes no tratamento do dito crescimento celular anormal. Nas formas de realização particulares, o dito crescimento celular anormal é canceroso. A presente invenção também proporciona uma proteína ALK-1 de macaco Cynomolgus isolada que tem uma sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 93. A presente invenção proporciona ainda uma molécula de ácido nucleico isolada que codifica uma proteína que tem uma sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 93. A presente invenção proporciona ainda uma molécula de ácido nucleico isolada da SEQ ID NO: 94.

Breve Descrição dos Desenhos A figura 1 mostra um exemplo dos dados de ligação ao 24 epítopo. 0 anticorpo 1.12.1 (M29I/D19A) foi injectado durante 10 minutos seguido por uma segunda injecção de 10 minutos do anticorpo 1.12.1 (M29I/D19A). Isto define a resposta máxima para uma injecção de 20 minutos destes anticorpos. A resposta máxima da injecção de 20 minutos foi similarmente determinada para o anticorpo 1.27.1. O anticorpo 1.12.1 (M29I/D19A) foi injectado durante 10 minutos seguido por uma injecção de 10 minutos do anticorpo 1.27.1. Se a resposta total diminui entre as respostas máximas definidas, então os dois anticorpos devem se ligar ao mesmo epitopo. Se a resposta total exceder a resposta máxima mais elevada, então os anticorpos devem ligar-se a diferentes epítopos. A experiência foi repetida com a ordem das injecções invertida conforme descrito no Exemplo 9. A figura 2 mostra o alinhamento da sequência de proteínas humana e Cyno ALK-1. A figura 3 mostra a determinação KD do anticorpo recombinante 1.12.1 que se liga à superfície celular ALK-1. (a) Humano, (b) Cyno. 1.12.1 (rWT) refere-se à variante mAb 1.12.1 que era mAb recombinante expressa. 1.12.1 (M29I/D19A) refere-se à variante mAb 1.12.1 que era mAb recombinante expressa contendo duas mutações específicas de aminoácido (metionina na posição 29 na cadeia pesada substituída com isoleucina e ácido aspártico na posição 19, na cadeia leve substituída com alanina). 1.12.1 (M29I) refere-se à variante mAb 1.12.1 que era mAb recombinante expressa contendo uma mutação de aminoácido única específica onde a metionina na posição 29 na cadeia pesada foi substituída com isoleucina. 1.12.1 (D19A) refere-se à variante mAb 1.12.1 que era mAb recombinante expressa contendo uma mutação de aminoácido única específica onde o ácido aspártico na posição 19 na cadeia leve foi substituído por alanina. 25 A figura 4 mostra exemplos de titulações ID1 usando o Ensaio Taqman ID1 para as variantes de anticorpo 1.12.1. 1.12.1 refere-se à variante mAb 1.12.1 que foi isolada da hibridoma. 1.12.1 (rWT) refere-se à variante mAb 1.12.1 que era mAb recombinante expressa. 1.12.1 (M29I/D19A) refere-se à variante mAb 1.12.1 que era mAb recombinante expressa contendo duas mutações especificas de aminoácido (metionina na posição 29 na cadeia pesada substituída com isoleucina e ácido aspártico na posição 19, na cadeia leve substituída com alanina). 1.12.1 (M29I) refere-se à variante mAb 1.12.1 que era mAb recombinante expressa contendo uma mutação de aminoácido única específica onde a metionina na posição 29 na cadeia pesada foi substituída com isoleucina. 1.12.1 (D19A) refere-se à variante mAb 1.12.1 que era mAb recombinante expressa contendo um mutação de aminoácido única específica onde o ácido aspártico na posição 19 na cadeia leve foi substituído por alanina. A figura 5 mostra exemplos de titulações ID1 usando o Ensaio Taqman ID1 para as variantes da sequência de anticorpo 1.12.1 e os derivados Fab. 1.12.1 refere-se à variante mAb 1.12.1 que foi isolada do hibridoma. 1.12.1 (rWT) refere-se à variante mAb 1.12.1 que era mAb recombinante expressa. 1.12.1 (M29I) refere-se à variante mAb 1.12.1 que era mAb recombinante expressa contendo um mutação de aminoácido única específica onde a metionina na posição 29 na cadeia pesada foi substituída com isoleucina. 1.12.1 (D19A) refere-se à variante mAb 1.12.1 que era mAb recombinante expressa contendo uma mutação de aminoácido única específica onde o ácido aspártico na posição 19 na cadeia leve foi substituído por alanina. 26 1.12.1 (M29I/D19A) refere-se à variante mAb 1.12.1 que era mAb recombinante expressa contendo duas mutações específicas de aminoácido (metionina na posição 29 na cadeia pesada substituída com isoleucina e ácido aspártico na posição 19 na cadeia leve substituído com alanina).

Fab 1.12.1 (M29I/D19A) refere-se ao fragmento Fab da mAb 1.12.1 (M29I/D19A) preparado pela digestão de 1.12.1 (M29I/D19A) IgGl utilizando papaína. A figura 6 mostra a incorporação de ALK-1. (a) Monitorizar o anticorpo de neutralização que permanece na superfície celular, (b) Monitorizar o receptor de superfície celular ALK-1 remanescente. A figura 7A mostra o alinhamento das sequências de domínio variável para anticorpos anti-ALK-1 da invenção, nas sequências de linha germinal. As mutações comparadas com a linha germinal são claras. As sequências de CDR são sublinhadas. A figura 7B revela o alinhamento das sequências de aminoácidos previstas dos domínios variáveis de cadeia leve para anticorpos anti-ALK-1 1.12.1, 1.14.1, 1.162.1, 1.31.1, 4.62.1 e 4.72.1 na sequência A27 VK da linha germinal humana. As figuras 7C e 7D mostram o alinhamento das sequências de aminoácidos previstas de domínios variáveis de cadeia pesada leve para anticorpos anti-ALK-1 1.12.1, 1.151.1, 1.162.1, 1.8.1, 4.24.1, 4.38.1, 4.58.1, 4.62.1, 4.68.1, 4.72.1, 5.13.1 e 5.34.1 da sequência 4-31 VH da linha germinal humana. A figura 8 mostra um exemplo da análise histológica (Coloração de Η & E) de uma secção de pele humana enxertada pós-cirúrgica. A figura 9 (A) mostra a coloração de tricromo de colagénio num ratinho quimérico de pele humana. A figura 9 (B) mostra a detecção de vasos humanos no gel de colagénio implantado num ratinho quimérico do prepúcio humano. Tex-red: vasos humanos. FITC: vasos de 27 ratinho. Amarelo: co-coloração. A figura 10 mostra uma imagem imunofluorescente de vasos humanos (vermelho) e de ratinhos (verde) do tumor M24met no ratinho quimérico do prepúcio humano SCID. A figura 11 mostra a imagem IHC de vasos humanos (castanho) do tumor M24met no ratinho quimérico de prepúcio humano SCID. A figura 12 mostra as imagens imunofluorescentes representativas de vasos humanos (vermelho) e de ratinho (verde) do controlo e os tumores M24met tratados com anticorpo 1.12.1 (M29I/D19A) (10 mg/kg) no ratinho quimérico do prepúcio humano SCID. A figura 13 mostra a inibição dependente da dose do crescimento de vaso de tumor humano pelo anticorpo 1.12.1 (M29I/D19A) no modelo de ratinho quimérico do prepúcio humano SCID. A figura 14 mostra a concentração plasmática do ratinho SCID do anticorpo 1.12.1 (M29I/D19A). A figura 15 mostra a EC5o estimada para o anticorpo 1.12.1 (M29I/D19A) no modelo quimérico de M24met prepúcio SCID. O valor de controlo de 100 % foi dado uma concentração de soro artificial de 0,1 nM para fins gráficos. Isso não altera a EC5o aparente.

Descrição Pormenorizada da Invenção Definições e Técnicas Gerais A não ser que de outro modo definido no presente documento, os termos científicos e técnicos utilizados em conexão com a presente invenção devem ter os significados que são comummente entendidos pelos peritos ordinários na especialidade. Além disso, a não ser que de outro modo requerido pelo contexto, os termos singulares devem incluir pluralidades e os termos no plural devem incluir os singulares. Geralmente, a nomenclatura utilizada em conexão com, e técnicas de, cultura celular e de tecidos, biologia molecular, imunologia, microbiologia, genética e de 28 proteínas e química de ácido nucleico e hibridação descrita no presente documento é aquela bem conhecida e comuinmente utilizada na técnica.

Os métodos e técnicas da presente invenção geralmente são realizados de acordo com os métodos convencionais bem conhecidos na técnica e como descrito em diversas referências gerais e mais específicas que são citadas e debatidas em todo o presente memória descritiva, a não ser que de outro modo indicado. Veja-se, por exemplo, Sambrook J. & Russell D.. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.I. (2000); Ausubel et al, Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, John & Sons, Inc. (2002); Harlow and Lane Using Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.I. (1998); e Coligan et al, Short Protocols in Protein Science, Wiley, John & Sons, Inc. (2003). As reacções enzimáticas e técnicas de purificação são realizadas de acordo com as especificações do fabricante, como comummente executado na técnica ou como foi descrito no presente documento. A nomenclatura utilizada em conexão com, e os procedimentos e técnicas de laboratório, química analítica, química orgânica sintética, e química medicinal e farmacêutica descrita no presente documento são aqueles bem conhecidos e comummente usados na técnica. Fernandez-L et al. (Cardiovascular Research, vol. 68, N° 2, 5 de Julho de 2005, páginas 235-248) ensina que células endoteliais de desenvolvimento no sangue de pacientes com telangiectasia hemorrágica hereditária revelam anormalidades compatível com lesões vasculares.

Os seguintes termos, a não ser que de outro modo indicado, devem ser entendidos como tendo os seguintes significados:

Como é utilizado no presente documento, o termo "ALK- 29 1" refere-se à cinase-1 do tipo receptor de activina de mamífero. 0 termo ALK-1 destina-se a incluir ALK-1 recombinante e formas quiméricas recombinantes de ALK-1, que podem ser preparadas por métodos de expressão recombinantes padrão.

Como é utilizado no presente documento, o acrónimo "mAb" refere-se a um anticorpo monoclonal.

Como é utilizado no presente documento, um anticorpo que é referido por número é um anticorpo monoclonal (mAb), que é obtido a partir do hibridoma do mesmo número. Por exemplo, anticorpo monoclonal 1.12.1 é obtido do hibridoma 1.12.1. 1.12.1 refere-se à variante mAb 1.12.1 que foi isolada do hibridoma. 1.12.1 (rWT) refere-se à variante mAb 1.12.1 que era mAb recombinante expressa. 1.12.1 (M29I/D19A) refere-se à variante mAb 1.12.1 que era mAb recombinante expressa contendo duas mutações específicas de aminoácidos (metionina na posição 29 na cadeia pesada substituída com isoleucina e ácido aspártico na posição 19 na cadeia leve substituídos com alanina). 1.12.1 (M29I) refere-se à variante mAb 1.12.1 que era mAb recombinante expressa contendo uma mutação de aminoácido única específica onde a metionina na posição 29 na cadeia pesada foi substituída com isoleucina. 1.12.1 (D19A) refere-se à variante mAb 1.12.1 que era mAb recombinante expressa contendo uma mutação de aminoácido única específica onde o ácido aspártico na posição 19 na cadeia leve foi substituído por alanina.

Como é utilizado no presente documento, o "crescimento anormal de células", salvo indicação em contrário, refere-se ao crescimento celular que é independente dos mecanismos reguladores normais (por exemplo, a perda inibição de contacto). 30

Como é utilizado no presente documento, o termo "adjacente" é usado para referir-se às sequências de nucleótido que são directamente ligadas uma a outra, não tendo nenhum nucleótido. Por meio de exemplo, o pentanucleótido 5'- AAAAA-3' é adjacente ao trinucleótido 5i-TTT-3' quando os dois são conectados desta maneira: 5'-AAAAATTT-3 'ou 5'-TTTAAAAA-3', mas não quando os dois são ligados desta maneira: 5'-AAAAAC"nT-3'. O termo "agente" é aqui usado para significar um composto químico, uma mistura de compostos químicos, uma macromolécula biológica, ou um extracto produzido a partir de materiais biológicos.

Como é utilizado no presente documento, "aliviar" uma doença, distúrbio ou condição significa reduzir a gravidade dos sintomas da doença, distúrbio ou condição. Isto inclui, mas não é limitado a, afectar o tamanho, crescimento e/ou massa de um tumor, a extensão ou progresso da metástase, e similares, num paciente em comparação com estes mesmos parâmetros no paciente antes ou na ausência do método de tratamento.

Como é utilizado no presente documentos, a sigla "Idl" refere-se a um gene alvo específico a jusante de ALK-1, o gene Idl, que é importante para a angiogénese. O gene Idl foi relatado para controlar o percurso da angiogénese em certos cancros mediante o desligamento da produção de uma proteína, trombospondina-1 (TSP-1), um supressor da angiogénese de ocorrência natural. Por exemplo, relatou-se que o gene Idl, que é altamente expresso nos cancros melanoma, da mama, da cabeça e pescoço, cerebral, cervical, próstata, pancreático e testicular, resulta da expressão diminuída de TSP-1 e formação aumentada dos vasos sanguíneos tumorais. Volpert, Olga V. et al, "Idl regulates angiogenesis through transcriptional repression of thrombospondin-1," Câncer Cell, Dez. 2002, Vol. 2, pp. 473-483. 31

Como é utilizado no presente documento, o termo "Smad" refere-se às proteínas de dominio Smad observadas numo intervalo de espécies de nematoides em seres humanos. Estas proteínas altamente conservadas contêm um dominio N-terminal MH1 que faz contacto com o ADN, e é separado por uma região articuladora curta do dominio C-terminal MH2, este mostrando uma impressionante semelhança com os dominios associados bifurcados (FHA). Os dominios FHA e Smad (MH2) partilham uma estrutura comum consistindo num sanduíche de onze filamentos beta, em duas folhas com topologia Gree key. As proteínas Smad mediam a sinalização pelas citocinas TGF-beta/activina/BMP-2/4 dos receptores Ser/Thr proteina cinases na superfície celular até o núcleo. As proteínas Smad dividem-se em três classes funcionais: os Smads regulados pelo receptor (R-Smads), incluindo Smadl, -2, -3, -5 e -8, cada um dos quais está envolvido numa via de sinalização específica do ligando; os Smads co-mediadores (co-Smads), incluindo Smad4, que interagem com os R-Smads para participar na sinalização; e os Smads inibidores (1-Smads), incluindo Smad-β e -7, que bloqueiam a activação dos R-Smads e Co-Smads, assim negativamente regulando os percursos de sinalização.

Como é utilizado no presente documento, o termo "TGF-beta" refere-se aos factores do crescimento-beta transformantes, que constitui uma família de citocinas multi-funcionais (TGF-beta 1 -5) que regulam o crescimento e diferenciação celular. 0 factor de crescimento transformante (TGF) é um dos muitos factores do crescimento caracterizados que existem na natureza. Ele desempenha papéis fundamentais em ratinhos "SCID" com imunodeficiência combinada grave. Muitas células sintetizam o TGF-beta, e essencialmente todas possuem receptores específicos para este péptido. 0 TGF-beta regula as acções de muitos outros factores do crescimento peptídicos e determina uma direcção positiva ou negativa dos seus efeitos. 0 TGF-beta é uma 32 citocina supressora de tumor com efeitos inibidores do crescimento em células epiteliais. 0 TGF-β pode também funcionar como um promotor de tumor mediante a extracção de uma transição de epitelial a mesenquimal. 0 TGF-β inactiva várias proteínas envolvidas na progressão do ciclo celular e, desse modo, exerce seus efeitos inibidores do crescimento sobre as células epiteliais por causar-lhes a detenção na fase G1 do ciclo celular. A proteina funciona como um homodimero ligado a dissulfeto. Sua sequência caracteriza-se pela presença de vários resíduos de cisteína C-terminais, que formam o interbloqueamento das ligações de dissulfeto organizadas numa topologia semelhante a nó. Uma disposição de "cistina-nó" similar foi observada nas estruturas de alguns inibidores da enzima e neurotoxinas que se ligam aos canais Ca2+ activados por voltagem, embora a topologia precisa seja diferente. Os genes TGF-beta são expressos diferencialmente, sugerindo que as várias espécies de TGF-beta possam ter funções fisiológicas distintas in vivo.

Como é utilizado no presente documento, o termo "TGF-beta 1" refere-se ao receptor do factor beta de crescimento transformante tipo 1, que é um péptido de 112 resíduos de aminoácido mediante a clivagem proteolítica do C-terminal de uma proteína precursora. Exame dos níveis de ARNm o TGF-beta 1 em tecidos adultos murinos indica que a expressão é predominante no baço, pulmão e placenta. 0 TGF-beta 1 é suposto de desempenhar papéis importantes nos processos patológicos.

Como é utilizado no presente documento, o termo "SCID" refere-se aos ratinhos com imunodeficiência combinada grave.

Como é utilizado no presente documento, o termo "HUVEC" refere-se às células endoteliais da veia umbilical humana.

Como é utilizado no presente documento, os 33 "aminoácidos" são representados pelo seu nome completo, pelo código de três letras correspondente, ou pelo código de uma letra correspondente, conforme indicado no seguinte quadro:

Nome Completo Código de Três Código de Um Letra

Letras Ácido Aspártico Asp D Ácido Glutámico Glu E Lisina Lys K Arginina Arg R Histidina His H Tirosina Tyr Y Cisterna Cys C Asparagina Asn N Glutamina Gin Q Serina Ser S Treonina Thr T Glicina Gly G Alanina Ala A Valina Vai V Leucina Leu L Isoleucina Ile I Metionina Met M Prolina Pro P Fenilalanina Phe F Triptofano Trp W Como é utilizado no presente documento, aminoácidos convencionais e respectivas abreviaturas seguem a utilização convencional. Veja-se Immunology-A Synthesis (2a Edição, E. S. Golub e D. R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)).

Uma "substituição conservadora de aminoácidos" é 34 aquela em que um resíduo de aminoácido é substituído por outro resíduo de aminoácido que tem um grupo R de cadeia lateral com propriedades químicas semelhantes (por exemplo, carga ou hidrofobicidade). Em geral, uma substituição de aminoácido conservadora não irá alterar substancialmente as propriedades funcionais de uma proteína. Nos casos em que duas ou mais sequências de aminoácidos diferem uma da outra por substituições conservadoras, a identidade de sequência percentual ou grau de semelhança pode ser ajustado para cima para corrigir a natureza conservadora da substituição. Meios para fazer esse ajuste são bem conhecidos pelos peritos na especialidade. Veja-se, por exemplo, Pearson, Methods Mol. Biol. 243:307-31 (1994).

Exemplos de grupos de aminoácidos que possuem cadeias laterais com propriedades químicas semelhantes incluem 1) cadeias laterais alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina e; 2) cadeias laterais de hidroxilo alifáticas: serina e treonina; 3) cadeias laterais contendo amida: asparagina e glutamina; 4) cadeias laterais aromáticas: fenilalanina, tirosina e triptofano; 5) cadeias laterais básicas: lisina, arginina, histidina; 6) cadeias laterais acídicas: ácido aspártico e ácido glutâmico; e 7), cadeias laterais contendo enxofre: cisteína e metionina. Os grupos de substituição conservadora de aminoácidos são: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato, e asparagina-glutamina.

Alternativamente, uma substituição conservadora é qualquer mudança que tem um valor positivo na matriz de probabilidade log PAM250 divulgada em Gonnet et al., Science 256:1443-45 (1992). A substituição "moderadamente conservadora" é qualquer mudança que tem um valor não negativo na matriz de probabilidade log PAM250.

Em certas formas de realização, as substituições de aminoácido num anticorpo anti-ALK-1 ou porção de ligação a 35 antígeno do mesmo são aquelas que: (1) reduzem a susceptibilidade à proteólise, (2) reduzem a susceptibilidade à oxidação, (3) alteram a afinidade vinculativa para formar complexos de proteína, e (4) conferem ou modificam outras propriedades físico-químicas ou funcionais de tais análogos, mas ainda retêm a ligação específica para ALK-1. Os análogos podem incluir várias substituições na sequência de péptido de ocorrência normal. Por exemplo, uma ou múltiplas substituições de aminoácido, de preferência substituições de aminoácido conservadoras, podem ser preparadas na sequência de ocorrência normal, por exemplo, na parte do polipéptido fora do(s) domínio(s) que formam os contactos intermoleculares. As substituições de aminoácido também podem ser feitas no(s) domínio(s) que forma(m) os contactos intermoleculares que podem melhorar a actividade do polipéptido. Uma substituição de aminoácido conservadora não deve alterar substancialmente as características estruturais da sequência de origem; por exemplo, um aminoácido de substituição de não alterar a lâmina 3 antiparalela que confecciona o domínio de ligação da imunoglobulina que ocorre na sequência de origem, ou romper outros tipos de estrutura secundária que caracteriza a sequência de origem. Em geral, a glicina e a prolina não devem ser usadas numa lâmina (3 antiparalela. Exemplos de estruturas secundárias e terciárias de polipéptido reconhecidos na técnica são descritos em Proteins, Structures and Molecular Principies (Creighton, Ed., W. H. Freeman e Company, Nova Iorque (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden e J. Tooze, eds., Garland Publishing, Nova Iorque, N.I. (1991)); e Thornton et al., Nature 354:105 (1991). A similaridade de sequência para os polipéptidos, que também é referida como a identidade de sequência, é tipicamente medida utilizando software de análise de sequência. O software de análise de proteína compara as 36 sequências similares utilizando medidas de similaridade atribuída às várias substituições, supressões e outras modificações, incluindo as substituições de aminoácido conservadoras. Por exemplo, GCG contém programas como "Gap" e "Bestfit" que podem ser usados com parâmetros de valor padrão para determinar a homologia de sequência ou identidade de sequência entre os polipéptidos estritamente relacionados, tais como polipéptidos homólogos de diferentes espécies de organismos ou entre uma proteína tipo silvestre e uma muteína desta. Veja-se, por exemplo, GCG Versão 6.1. As sequências de polipéptidos também podem ser comparadas usando FASTA utilizando parâmetros padrão ou recomendados, um programa em GCG Versão 6.1. FASTA (por exemplo, FASTA2 e FASTA3) proporciona alinhamentos e identidade de sequência percentual das regiões da melhor sobreposição entre as sequências de consulta e pesquisa (Pearson, Methods Enzymol. 183:63-98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol. 132: 185-219 (2000)). Outro algoritmo preferido quando se compara uma sequência da invenção com um banco de dados contendo um grande número de sequências de diferentes organismos é o programa de computador BLAST, especialmente blastp ou tblastn, usando parâmetros padrão. Veja-se, por exemplo, Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990); Altschul et al. , Nucleic Acids Res. 25:3389- 402 (1997) . O comprimento das sequências de polipéptido comparado para homologia será geralmente pelo menos cerca de 16 resíduos de aminoácido, geralmente pelo menos cerca de 20 resíduos, mais geralmente pelo menos cerca de 24 resíduos, tipicamente pelo menos cerca de 28 resíduos, e preferivelmente mais do que cerca de 35 resíduos. Ao pesquisar uma base de dados contendo sequências de um grande número de diferentes organismos, é preferível comparar as sequências de aminoácido. O termo "análogo" conforme usado neste documento refere-se aos polipéptidos 37 que são compreendidos de um segmento de pelo menos 25 aminoácidos que possui identidade substancial com uma parte de uma sequência de aminoácido de ocorrência natural deduzida e que possui pelo menos uma das propriedades do polipéptido de ocorrência natural. Tipicamente, os análogos de polipéptido compreendem uma substituição de aminoácido conservadora (ou adição ou supressão) com relação à sequência de ocorrência natural. Os análogos tipicamente são pelo menos 20 aminoácidos de extensão, preferivelmente pelo menos 50 aminoácidos de extensão ou mais longos, e podem muitas vezes ser tão longos quanto um polipéptido de ocorrência natural de comprimento total.

Os análogos de péptido são comummente utilizados na indústria farmacêutica como fármacos não péptidos com propriedades análogas àquelas do péptido padrão. Estes tipos de composto não péptido são denominados "miméticos de péptido" ou "peptidomiméticos". Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29 (1986); Veber e Freidinger TINS p. 392 (1985); e Evans et al., J. Med. Chem. 30:1229 (1987). Tais compostos são frequentemente desenvolvidos com o auxilio da modelagem molecular computadorizada.

Os miméticos de péptido que são estruturalmente similares aos péptidos terapeuticamente úteis podem ser utilizados para produzir um efeito terapêutico ou profiláctico equivalente. Geralmente, os peptidomiméticos são estruturalmente similares a um polipéptido paradigma (isto é, um polipéptido que possui uma propriedade bioquímica ou actividade farmacológica) , tais como anticorpos humanos, mas têm uma ou mais ligações peptídícas opcionalmente substituídas por uma ligação seleccionada a partir do grupo consistindo em: — CH2NH—, —CH2S—, — CH2—CH2—, —CH=CH— (cis e trans) , — COCH2—, — CH(OH)CH2—, e CH2SO—, por métodos bem conhecidos na técnica. A substituição sistemática de um ou mais aminoácidos de uma sequência de consenso com um D-aminoácido do mesmo tipo (por exemplo, D- 38 lisina no lugar de L-lisina) pode ser usada para gerar péptidos mais estáveis. Além disso, os péptidos restritos gue compreendem uma sequência de consenso ou uma variação de sequência de consenso substancialmente idêntica podem ser gerados por métodos conhecido na técnica (Rizo e Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992)), por exemplo, mediante a adição de resíduos de cisteína internos capazes de formar pontes de dissulfeto intramoleculares que ciclizam o péptido.

Um "anticorpo" ou "imunoglobulina" (Ig) intacta compreende pelo menos duas cadeias pesadas (H) (cerca de 50 a 70 kDa) e duas cadeias leves (L) (cerca de 25 kDa) interligadas por ligações de dissulfeto. Existem apenas dois tipos de cadeia leve: λ e k. Nos seres humanos elas são semelhantes, mas apenas um tipo está presente em cada anticorpo. As cadeias pesadas são classificadas como mu, delta, gama, alfa, ou épsilon, e definem o isotipo de anticorpo como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente. Veja-se de uma forma geral, Fundamental Immunology Cap. 7 (Paul, W., ed., 2a ed. Raven Press, N.I. (1989)). Numa forma de realização preferida, o anticorpo é uma IgG e é um subtipo IgGl, IgG2, IgG3 ou IgG4. Numa forma de realização mais preferida, o anticorpo anti-ALK-1 é a subclasse IgG2.

Cada cadeia pesada está compreendida de um domínio variável de cadeia pesada (VH) e uma região constante de cadeia pesada (CH) . A região constante de cadeia pesada está compreendida de três domínios, CHI, CH2 e CH3. Cada cadeia leve é composta de um domínio variável de cadeia leve (VL) e uma região constante de cadeia leve. A região constante de cadeia leve está compreendida de um domínio, CL. Dentro das cadeias leves e pesadas, as regiões variáveis e constantes são unidas por um região "J" de cerca de 12 ou mais aminoácidos, com a cadeia pesada incluindo também uma região "D" de cerca de 3 ou mais aminoácidos. As regiões VH e VL podem ser ainda 39 subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominadas "regiões determinantes complementares" (CDR), intercaladas com regiões que são mais conservadas, denominadas "regiões estruturais" (FR) . Cada VH e VL é composta de três CDRs e quatro RFs, dispostas de amino-terminal a carboxil-terminal na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. A atribuição dos aminoácidos para cada dominio está de acordo com as definições de Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD (1987 e 1991)), ou Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196:901 -917 (1987); Chothia et al. , Nature 342:878-883 (1989) .

Os domínios variáveis de cada par de cadeia pesada/leve (VH e VL) formam o local de ligação de anticorpos que interage com um antígeno. Assim, um anticorpo IgG intacto, por exemplo, possui dois locais de ligação. Excepto nos anticorpos bifuncionais ou biespecíficos, os dois locais de ligação são os mesmos. As regiões constantes dos anticorpos podem mediar a ligação da imunoglobulina para hospedar os tecidos ou factores, incluindo várias células do sistema imune (por exemplo, células efectoras), e a primeira porção (Clq) do sistema complementar clássico.

Os anticorpos devem ter bastante diversidade de ligação a antígeno para reconhecer todos os possíveis agentes patogénicos (muitas regiões V) , enquanto mantém a eficácia biológica das suas regiões C (algumas regiões C). Os genes Ig são aleatoriamente cortados juntos dos segmentos genéticos que permitem muitas regiões V serem utilizadas com algumas regiões C. Os segmentos genéticos que codificam as cadeias Ig H, capa e lambda são observados em três diferentes cromossomas. Durante o desenvolvimento das células B, as enzimas recombinase removem os intrões e alguns exões do ADN e ligam os segmentos em genes funcionais Ig. 40

Os segmentos genéticos Ig em mamíferos são dispostos em grupos de exões "variáveis" (V) , "diversidade" (D) , "união" (J) , e "constante" (C) . Os segmentos capa V (VK) , cada um, codificam os dois primeiros CDR e três FR da região V de cadeia capa, acrescido de alguns resíduos de CDR3. Os segmentos J capa (Jk) , cada um, codificam o restante da CDR3 e os quatro FR. C capa (Ck) codifica a região C completar da cadeia leve capa. O ADN que codifica a cadeia capa humana inclui aproximadamente 40 segmentos V capa (VK) funcionais, cinco segmentos J capa (Jk) e um segmento genético C capa (Ck), assim como alguns segmentos genéticos que contêm codões de interrupção ("pseudogenes") . O ADN de cadeia lambda (λ) humano contém aproximadamente 30 segmentos V lambda (νλ) funcionais e quatro séries funcionais de segmentos J lambda (JX) e C lambda (Ολ). Um J lambda (JX) particular sempre emparelha com seu C lambda (Ολ) correspondente, ao contrário do J capa (Jk) em que todos emparelham com o mesmo C capa (Ck). O ADN para cadeia H de ser humano inclui aproximadamente 50 segmentos Vh funcionais, 30 segmentos DH, e seis segmentos Jh. Os dois primeiros CDR e três FR do dominio variável de cadeia pesada são codificados por VH. O CDR3 é codificado por alguns nucleótidos de VH, todos de DH, e parte de JH, enquanto o FR4 é codificado pelo restante do segmento genético JH. Há também segmentos genéticos individuais no ADN para cada dominio de cadeia pesada e região de membrana de cada isotipo, dispostos na ordem em que eles são expressos pelas células B. O termo "polipéptido" abrange as proteínas nativas ou artificiais, fragmentos de proteína e análogos de polipéptido de uma sequência de proteína. Um polipéptido pode ser monomérico ou polimérico. O termo "proteína isolada", "polipéptido isolado" ou "anticorpo isolado" é uma proteína, polipéptido ou anticorpo que, em virtude da sua origem ou fonte de 41 derivação (1), não é associado com as porções naturalmente associadas que o acompanham em seu estado nativo, (2) é livre de outras proteínas da mesma espécie, (3) é expresso por uma célula de uma espécie diferente, ou (4) não ocorre na natureza. Desta forma, um polipéptido que é quimicamente sintetizado ou sintetizado num sistema celular diferente da célula da qual naturalmente se oriqina será "isolado" de suas porções naturalmente associadas. Uma proteina também pode ser apresentada substancialmente isenta de porções naturalmente associados por isolamento, utilizando técnicas de purificação de proteina bem conhecidas na especialidade.

Exemplos de anticorpos isolados incluem, mas não limitado a eles, um anticorpo anti-ALK-1 que foi purificado por afinidade usando ALK-1, e um anticorpo anti-ALK-1 que foi sintetizado por uma linha celular in vitro.

Uma proteina ou polipéptido é "substancialmente pura", "substancialmente homogénea", ou "substancialmente purificada" quando pelo menos cerca de 60 a 75 % de uma amostra apresenta uma única espécie de polipéptido. O polipéptido ou proteina pode ser monomérico ou multimérico. Um polipéptido ou proteina substancialmente pura pode tipicamente compreender cerca de 50 %, 60 %, 70 %, 80 % ou 90 % p/p de uma amostra da proteina, mais geralmente cerca de 95 %, e de preferência pode ser mais de 99 % pura. A pureza ou homogeneidade de proteina pode ser indicada por vários meios bem conhecidos na técnica, tais como a electroforese em gel de poliacrilamida de uma amostra de proteina, seguido pela visualização de umo intervalo de polipéptido único após a coloração do gel com uma mancha bem conhecido na técnica. Para certos propósitos, resolução mais elevada pode ser fornecida por HPLC ou utilizando outros meios bem conhecidos na técnica de purificação. O termo "fragmento de polipéptido", como é utilizado no presente documento refere-se a um polipéptido que possui uma anulação amino-terminal e/ou carboxi terminal, mas onde 42 a sequência de aminoácido remanescente é idêntica às posições correspondentes na sequência de ocorrência natural. Em algumas formas de realização, os fragmentos são pelo menos 5, 6, 8 ou 10 aminoácidos de comprimento. Em outras formas de realização, os fragmentos são pelo menos 14, pelo menos 20, pelo menos 50, ou pelo menos, 70, 80, 90, 100, 150 ou 200 aminoácidos de comprimento. O termo "análogo" ou "análogo de polipéptido", conforme usado neste documento refere-se a um polipéptido que compreende um segmento que possui identidade substancial a alguma sequência de aminoácido de referência e possui substancialmente a mesma função ou actividade como a sequência de aminoácido de referência. Tipicamente, os análogos de polipéptido compreendem uma substituição de aminoácido conservadora (ou inserção ou supressão) com relação à sequência de referência. Os análogos podem ser pelo menos 20 ou 25 aminoácidos de comprimento, ou podem ser pelo menos 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 ou 200 aminoácidos de comprimento ou mais longo, e podem muitas vezes ser tão longos quanto o polipéptido de comprimento total. Algumas formas de realização da invenção incluem fragmentos de polipéptido ou anticorpos análogos de polipéptido com 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 ou 17 substituições da sequência de aminoácido da linha germinal. Fragmentos ou análogos de anticorpos ou moléculas de imunoglobulina podem ser facilmente preparados pelos peritos ordinários na especialidade seguindo os ensinamentos deste memória descritiva. O termo "porção de ligação a antigeno", de um anticorpo (ou simplesmente "porção de anticorpo"), tal como é utilizado neste documento, refere-se a um ou mais fragmentos de um anticorpo que retém a capacidade de especificamente se ligar a um antigeno (por exemplo, ALK-1 ou DEC de ALK-1) . Foi mostrado que a função de ligação a antigeno de um anticorpo pode ser realizada por fragmentos 43 de um anticorpo de comprimento total. Exemplos de fragmentos de ligação incluídos dentro do termo "porção de ligação a antigeno" de um anticorpo incluem: (i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente consistindo dos dominios VL, VH, CL e Chi; (") um Fragmento F (ab')2/ um fragmento bivalente que compreende dois fragmentos Fab ligados por uma ponte de dissulfeto na região de articulação; (iii) um fragmento Fd consistindo dos dominios VH e CH1; (iv) um fragmento Fv consistindo dos dominios VI e Vh de uma subdivisão única de um anticorpo, (v) um fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), que consiste de um dominio VH; e (vi) uma complementaridade isolada que determina a região (CDR). Além disso, embora os dois dominios do fragmento Fv, VL e Vh, sejam codificados por genes distintos, eles podem ser unidos, utilizando métodos recombinantes, por um articulador sintético que lhe permite ser produzidos como uma cadeia de proteína única em que o par das regiões VL e Vh formam moléculas monovalentes (conhecidas como Fv de cadeia única (scFv)); veja-se, por exemplo, Bird e outros Science 242:423-426 (1988) e Huston e outros Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 85:5879-5883 (1988)). Tais anticorpos de cadeia única também se destinam a serem englobados dentro do termo "porção de ligação a antigeno", de um anticorpo. Outras formas de anticorpos de cadeia única, tais como diacorpos também são incluídas. Os diacorpos são anticorpos bivalentes biespecíficos no qual os domínios VH e VL são expressos numa única cadeia de polipéptido, mas usando um articulador que é demasiado curto para permitir o emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia, forçando, assim, os domínios emparelharem com os domínios complementares de outra cadeia e criar dois locais de ligação a antigeno (veja-se, por exemplo, Holliger e outros Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 90:6444-6448 (1993); Poljak et ai., Structure 2:1121-1123 (1994)).

Ainda mais, um anticorpo ou porção de ligação a 44 antígeno do mesmo pode ser parte de moléculas imunoaderentes maiores, formadas pela associação covalente ou não covalente do anticorpo ou porção de anticorpos com uma ou mais de outras proteínas ou péptidos. Exemplos de tais moléculas imunoaderentes incluem a utilização da região de núcleo de estreptavidina para produzir uma molécula scFv tetramérica (Kipriyanov e outros Humano Antibodies and Hybridomas 6: 93-101 (1995)) e a utilização de um resíduo de cisteína, um péptido marcador e uma cauda de polihistidina C-terminal para produzir moléculas scFv bivalentes e submetidas a biotina (Kipriyanov et al., Mol. Immunol. 31:1047-1058 (1994)). Outros exemplos incluem onde um ou mais CDRs de um anticorpo forem incorporados numa molécula ou covalente ou não covalentemente para torná-la Uma imunoaderente que se liga especificamente a um antígeno de interesse, tal como a ALK-1 ou DEC de ALK-1. Em tais formas de realização, o(s) CDR (s) podem ser incorporados como parte de uma grande cadeia de polipéptido, podem ser covalentemente ligados a uma outra cadeia de polipéptido, ou podem ser incorporados não covalentemente.

As porções de anticorpo, tais como fragmentos Fab e F(ab')2/ podem ser preparadas a partir de anticorpos inteiros utilizando técnicas convencionais, tais como digestão de papaína ou pepsina, respectivamente, de anticorpos inteiros. Além disso, os anticorpos, porções de anticorpos e moléculas imunoaderentes podem ser obtidos usando técnicas de ADN recombinante padrão, como foi descrito no presente documento.

Como é utilizado no presente documento, o termo "anticorpos humanos" significa qualquer anticorpo em que as sequências de domínio variáveis e constantes são sequências humanas. O termo abrange anticorpos com sequências derivadas de genes humanos, mas que tenham sido alterados, por exemplo, para diminuir possível imunogenicidade, aumentar a afinidade, eliminar cisternas que possam causar 45 dobraduras indesejáveis, etc. 0 termo também abrange tais anticorpos produzidos recombinantemente em células não humanas, o que poderia conceder glicosilação não típica das células humanas. Estes anticorpos podem ser preparados de diversas maneiras, como será descrito a seguir.

Como é utilizado no presente documento, o termo "anticorpo de neutralização", "um anticorpo inibidor" ou anticorpo antagonista, significa um anticorpo que inibe a via de sinalização ALK-1/TGF-beta-l/Smadl. Numa forma de realização preferida, o anticorpo inibe a via de sinalização ALK-1 /TGF-beta-1/Smadl em pelo menos cerca de 20 %, de preferência 40 %, mais preferivelmente 60 %, ainda mais preferivelmente 80 %, ou ainda mais preferivelmente 85 %. A neutralização ou inibição do potencial dos anticorpos anti-ALK-1 humanos pode ser determinada, por exemplo, pela sua capacidade de inibir a regulação positiva de um gene alvo a jusante específico de ALK-1, Idl, como apresentado no Exemplo 12; inibir a fosforilação Smadl determinada pela Western Blotting utilizando Odyssey Infrared Imaging Sistema da LI-COR Biosciences como apresentado no Exemplo 13. O termo "anticorpo quimérico", como é utilizado no presente documento significa um anticorpo que compreende regiões de dois ou mais anticorpos diferentes. Por exemplo, um ou mais dos CDRs de um anticorpo quimérico podem ser derivados de um anticorpo anti-ALK-1 humano. Em outro exemplo, todos os CDRs podem ser derivados de anticorpos anti-ALK-1 humanos. Num outro exemplo, os CDRs de mais de um anticorpo anti-ALK-1 humano podem ser combinados num anticorpo quimérico. Por exemplo, um anticorpo quimérico pode compreender um CDR1 da cadeia leve de um primeiro anticorpo anti-ALK-1 humano, um CDR2 da cadeia leve de um segundo anticorpo anti- ALK-1 humano e um CDR3 da cadeia leve de um terceiro anticorpo anti- ALK-1 humano, e os CDRs da cadeia pesada podem ser derivados de um ou mais outros 46 anticorpos anti-ALK-1. Além disso, as regiões estruturais podem ser derivadas de um dos anticorpos anti-ALK-1 a partir do qual um ou mais dos CDRs são tomadas, ou a partir de uma ou mais diferentes anticorpos humanos. Além disso, como debatido anteriormente neste documento, o anticorpo quimérico inclui um anticorpo que compreende uma porção derivado das sequências da linha germinal de mais do que uma espécie.

Em algumas formas de realização, um anticorpo quimérico da invenção é um anticorpo anti-ALK-1 humanizado. Um anticorpo anti-ALK-1 humanizado da invenção compreende a sequência de aminoácido de uma ou mais regiões estruturais e/ou a sequência de aminoácido de pelo menos uma parte da região constante de um ou mais anticorpos anti-ALK-1 humanos da invenção e ainda compreende sequências derivadas de um anticorpo anti- ALK-1 não humano, por exemplo, sequências de CDR.

Como é utilizado no presente documento, o termo "ELISA" refere-se a um ensaio imunossorvente ligado a enzima. Este ensaio é bem conhecido dos peritos na especialidade. Exemplos deste ensaio podem ser observados em Vaughan, T.J. et al., Nature Biotech. 14:309-314 (1996), assim como no Exemplo 2 do presente pedido. O termo "ressonância de plasmão superficial", tal como é utilizado no presente documento, refere-se a um fenómeno óptico que leva em conta a análise das interacções bioespecificas em tempo real mediante a detecção das alterações nas concentrações de proteína dentro de uma matriz biossensora, por exemplo, utilizando o sistema BIACORE™ (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden e Piscataway, NJ) . Para mais descrições, veja-se Jonsson et al., Ann. Biol. Clin. 51:19 26 (1993); Jonsson et al., Biotechniques 11: 620 627 (1991); Jonsson et al. , J. Mol. Recognit. 8:125 131 (1995); e Johnsson et al. r Anal.

Biochem. 198:268 277 (1991). 47 0 termo "afinidade" refere-se a uma medida da atracção entre um antigeno e um anticorpo. A atractividade intrinseca do anticorpo para o antigénio é tipicamente expressa como a constante de equilibrio da afinidade de ligação (KD) de uma interacção anticorpo-antígeno particular. Diz-se que um anticorpo se liga especificamente a um antigeno quando a KD for < 1 mM, de preferência ^ 100 nM. Uma constante da afinidade de ligação KD pode ser medida pela ressonância de plasmão superficial, por exemplo, utilizando o sistema BIACORE™ como debatido nos Exemplos 7 e 8. 0 termo "koff" refere-se à constante da taxa de dissociação de uma interacção anticorpo-antigeno particular. A constante da taxa de dissociação koff pode ser medida pela ressonância de plasmão superficial, por exemplo, utilizando o sistema BIAcore como debatido nos Exemplos 7 e 8. 0 termo "avidez" refere-se à intensidade de combinação funcional de um anticorpo com seu antigeno, que se baseia tanto na afinidade quanto nas valências do anticorpo. Como é utilizado no presente documento, este termo descreve a afinidade aumentada que ocorre como resultado de múltiplos locais de ligação a antigeno numa imunoglobulina.

Como é utilizado no presente documento, o termo "selectividade molecular" refere-se à afinidade de ligação de um anticorpo num antigeno especifico sendo maior do que em outros antigenos. Por exemplo, os anticorpos da presente invenção podem ser selectivos com relação a ALK-1 sobre a ALK-2 através da ALK-7, significando que a afinidade de ligação do anticorpo para ALK-1 é pelo menos 2 vezes maior, por exemplo, 4 vezes, ou 10 vezes, ou 50 vezes, ou 100 vezes ou mais, do que para a ALK-2 através da ALK-7. Tais afinidades de ligação podem ser medidas usando técnicas padronizadas conhecidas dos peritos na especialidade. O termo "epitopo" inclui qualquer determinante de 48 proteína capaz da ligação específica a uma imunoglobulina ou receptor da célula T ou de outra maneira gue interage com uma molécula. Os determinantes epitópicos geralmente consistem de agrupamentos superficiais quimicamente activos de moléculas tais como aminoácidos ou hidratos de carbono ou cadeias laterais de açúcar e possuem geralmente três características estruturais tridimensionais específicas, assim como características de carga específicas. Um epítopo pode ser "linear" ou "conformacional". Num epítopo linear, todos os pontos de interacção entre a proteína e a molécula de interacção (tal como um anticorpo) ocorrem linearmente ao longo da sequência primária de aminoácido da proteína. Num epítopo conformacional, os pontos de interacção ocorrem através dos resíduos de aminoácido na proteína que são separados um do outro. Assim que um epítopo desejado num antígeno for determinado, é possível gerar anticorpos neste epítopo, por exemplo, utilizando as técnicas descritas na presente invenção. Alternativamente, durante o processo de descobrimento, a geração e caracterização de anticorpos podem elucidar a informação sobre os epítopos desejáveis. A partir desta informação, é possível então competitivamente fazer o rastreio dos anticorpos para a ligação ao mesmo epítopo. Uma abordagem para alcançar este objectivo é conduzir os estudos de inter-concorrência para encontrar os anticorpos que competitivamente se ligam uns com os outros, isto é, os anticorpos competem para ligação a antígeno. Um processo de produção elevada para anticorpos "de armazenagem" baseado em sua inter-concorrência é descrito no Pedido de Patente Internacional N° WO 03/48731.

Como é utilizado no presente documento, o termo "armazenagem" refere-se a um método para agrupar anticorpos baseado nas suas características de ligação a antígeno. A atribuição de depósitos é um pouco arbitrária, dependendo da forma como são diferentes os padrões de ligação observados para todos os anticorpos testados. Portanto, os 49 depósitos nem sempre se correlacionam com os epítopos determinados por outros meios e não devem ser utilizados para definir os epitopos. 0 termo "competir", como é utilizado no presente documento no que refere-se a um anticorpo, significa que um primeiro anticorpo, ou uma porção de ligação a antigeno do mesmo, concorre para á ligação a antigeno com um segundo anticorpo, ou uma porção de ligação a antigeno do mesmo, onde a ligação do primeiro anticorpo com seu epitopo é detectavelmente diminuída na presença do segundo anticorpo em comparação com a ligação do primeiro anticorpo na ausência do segundo anticorpo. A alternativa, onde a ligação do segundo anticorpo ao seu epitopo é também detectavelmente diminuída na presença do primeiro anticorpo, pode, mas não necessariamente, ser o caso. Isto é, um primeiro anticorpo pode inibir a ligação de um segundo anticorpo ao seu epitopo sem que o segundo anticorpo iniba a ligação do primeiro anticorpo ao seu respectivo epitopo. No entanto, onde cada anticorpo detectavelmente inibe a ligação do outro anticorpo com o seu epitopo cognato ou ligando, quer para a mesma, maior ou menor extensão, os anticorpos são ditos "de inter-concorrência" uns com os outros para a ligação de seus respectivos epítopos. Os anticorpos tanto de competição quanto de inter-competição são contemplados pela presente invenção. Independentemente do mecanismo pelo qual tal concorrência ou inter-concorrência ocorre (por exemplo, impedimento estérico, mudança conformacional, ou ligação a um epitopo comum, ou porção do mesmo, e similares) , o artífice versado deve observar, com base nos ensinamentos proporcionado no presente documentos, que tais anticorpos concorrentes e/ou inter-concorrentes estão envolvidos e podem ser úteis para os métodos revelados no presente documento. 0 termo "polinucleótido" como aqui referido significa 50 uma forma polimérica de nucleótidos de pelo menos 10 bases de comprimento, ou ribonucleótidos ou deoxinucleótidos ou uma forma modificada de qualquer tipo de nucleótido. O termo inclui as formas de filamento único ou duplo. O termo "polinucleótido isolado" aqui usado significa um polinucleótido de origem genómico, ADNc ou sintética ou alguma combinação destes, que em virtude da sua origem o "polinucleótido isolado" (1) não é associado com todos ou uma parte dos polinucleótidos com que o "polinucleótido isolado" é encontrado na natureza, (2) é operativamente ligado a um polinucleótido que não é ligado na natureza, ou (3) não ocorre na natureza como parte de uma sequência maior. O termo "nucleótidos de ocorrência natural" como é utilizado no presente documento inclui desoxirribonucleótidos e ribonucleótidos. O termo "nucleótidos modificados", conforme usado neste documento inclui nucleótidos com grupos de açúcar modificados ou substituídos e similares. O termo "ligações de oligonucleótido" mencionados neste documento inclui as ligações de oligonucleótido tais como fosforotioato, fosforoditioato, fosforosselenoato, fosforodisselenoato, fosforoanilotioato, fosforaniladato, fosforoamidato, e similares. Veja-se por exemplo, LaPlanche et al., Nucl. Acids Res. 14:9081 (1986); Stec et al., J. Am. Chem. Soe. 106:6077 (1984); Stein et al., Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988); Zon et al., Anti-Cancer Drug Design 6:539 (1991); Zon et al., Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991)); Patente US N° 5.151.510; Uhlmann e Peyman, Chemical Reviews 90:543 (1990). Um oligonucleótido pode incluir uma etiqueta para detecção, se for desejado.

As sequências "operativamente ligadas" incluem tanto as sequências de controlo da expressão que são contíguas 51 com o gene de interesse quanto as sequências de controlo da expressão que atuam em trans ou numa distância para controlar o gene de interesse. 0 termo "sequência de controlo da expressão", como é utilizado no presente documento significa as sequências de polinucleótido que são necessárias para efectuar a expressão e processamento das sequências de codificação a qual elas estão ligadas. As sequências de controlo da expressão incluem as sequências de inicio, término, promotoras e intensificadoras da transcrição apropriadas; sinais de processamento de ARN eficientes tais como os sinais de junção e poliadenilação; sequências que estabilizam o ARNm citoplasmático; sequências que intensificam a eficiência de translação (ou seja, sequência de consenso Kozak); sequências que aumentam a estabilidade da proteína; e quando for desejado, sequências que intensificam a secreção de proteína. A natureza destas sequências de controlo difere dependendo do organismo hospedeiro; em procariotas, tais sequências de controlo geralmente incluem promotor, local de ligação ribossómico, e sequência de término da transcrição; em eucariotas, geralmente, tais sequências de controlo incluem promotores e sequência de término da transcrição. 0 termo "sequências de controlo" destina-se a incluir, no mínimo, todas as porções cuja presença é essencial para a expressão e processamento, e podem também incluir porções adicionais cuja presença é vantajosa, por exemplo, sequências líderes e sequências associadas de fusão. 0 termo "vector", como é utilizado no presente documento, significa uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar um outro ácido nucleico a qual foi ligado. Em algumas formas de realização, o vector é um plasmídeo, ou seja, uma parte de filamento duplo do ADN em que os segmentos de ADN adicionais podem ser ligados. Em algumas formas de realização, o vector é um vector virai, em que os 52 segmentos de ADN adicionais podem ser ligados no genoma virai. Em algumas formas de realização, os vectores são capazes de replicação autónoma numa célula hospedeira em que eles são introduzidos (por exemplo, vectores bacterianos que tem uma origem bacteriana de replicação e vectores de mamífero epissómicos). Em outras formas de realização, os vectores (por exemplo, vectores de mamíferos não epissómicos) podem ser integrados no genoma de uma célula hospedeira após a introdução na célula hospedeira, e desse modo são replicados, juntamente com o genoma hospedeiro. Além disso, certos vectores são capazes de orientar a expressão dos genes para que eles sejam operativamente ligados. Tais vectores são referidos neste documento como "vectores de expressão recombinantes" (ou simplesmente, "vectores de expressão"). 0 termo "célula hospedeira recombinante" (ou simplesmente "célula hospedeira"), como é utilizado no presente documento, significa uma célula em que um vector de expressão recombinante foi introduzido. É necessário compreender que "célula hospedeira recombinante" e "célula hospedeira" significam não apenas a célula objecto particular, mas também os descendentes de uma tal célula. Porque certas modificações podem ocorrer nas gerações que se sucedem devido à mutação ou influências ambientais, tais descendentes não podem, de fato, ser idênticos à célula de origem, mas são ainda incluídos dentro do âmbito do termo "célula hospedeira", como é utilizado no presente documento.

Como é utilizado no presente documento, o termo "linha germinal" refere-se às sequências de nucleótido e sequências de aminoácidos dos genes de anticorpo e segmentos genéticos em que eles são transmitidos de pais para filhos através das células germinativas. Esta sequência da linha germinal é distinguida das sequências de nucleótido que codificam os anticorpos nas células B 53 maduras, que foram alteradas por eventos de recombinação e hipermutação durante o curso de maturação da célula B. Um anticorpo que "utiliza" uma linha germinal particular possui uma sequência de nucleótidos ou aminoácido que se alinha mais estritamente com esta sequência de nucleótidos da linha germinal ou com a sequência de aminoácido que especifica. Tais anticorpos frequentemente são transformados em comparação com a sequência da linha germinal. 0 termo "identidade de sequência percentual" no contexto das sequências de ácido nucleico significa os resíduos em duas sequências que são as mesmas quando alinhadas com relação à correspondência máxima. 0 nucleótidos, nucleótidos, nucleótidos, nucleótidos, nucleótidos, comprimento da comparação de identidade de sequência pode ser mais de uma extensão de pelo menos cerca de nove geralmente, pelo menos cerca de 18 mais geralmente pelo menos cerca de 24 tipicamente pelo menos cerca de 28 mais tipicamente pelo menos cerca de 32 e preferivelmente pelo menos cerca de 36, 48 ou mais nucleótidos. Existem vários algoritmos diferentes conhecidos na técnica que podem ser usados para medir a identidade da sequência de nucleótido. Por exemplo, as sequências de polinucleótido podem ser comparadas usando FASTA, Gap ou Bestfit, que são programas em Wisconsin Package Versão 10.0; Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisconsin. FASTA, que inclui, por exemplo, os programas FASTA2 e FASTA3, proporciona alinhamentos e identidade de sequência percentual das regiões da melhor sobreposição entre as sequências de consulta e pesquisa (Pearson, Methods Methods Mol. Biol. Enzymol. 266:227-276:71-84 (1998))

Enzymol. 183:63-98 (1990); Pearson, 132:185-219 (2000); Pearson, Methods 258 (1996); Pearson, J. Mol. Biol. A não ser que de outro modo especificado, os parâmetros padrão de um programa ou 54 algoritmo particular são utilizados. Por exemplo, a identidade de sequência percentual entre as sequências de ácidos nucleico pode ser determinada utilizando FASTA com os seus parâmetros padrão (um tamanho de palavra 6 e o factor NOPAM para a matriz de pontuação) ou usando Gap com os seus parâmetros padrão como previsto na GCG Versão 6.1.

Uma referência a uma sequência de nucleótidos abrange o seu complemento a não ser que de outro modo especificado. Assim, uma referência a um ácido nucleico que tem uma sequência particular deve ser entendida de abranger seu filamento complementar, com a sua sequência complementar. 0 termo "similaridade substancial" ou "similaridade de sequência substancial", quando refere-se a um ácido nucleico ou seu fragmento, significa que quando idealmente alinhado com as inserções ou deleções de nucleótido apropriadas com outro ácido nucleico (ou a seu filamento complementar) , existe identidade sequência de nucleótidos em pelo menos cerca de 85 %, de preferência pelo menos cerca de 90 % e mais preferivelmente pelo menos cerca de 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % das bases de nucleótido, como medido por qualquer algoritmo bem conhecido da identidade de sequência, tal como FASTA, BLAST ou Gap, como debatido acima. A expressão "identidade de sequência percentual" no contexto das sequências de aminoácidos significa os residuos em duas sequências que são os mesmos quando alinhados com relação a correspondência máxima. O comprimento da comparação de identidade de sequência pode ser acrescido de uma extensão de pelo menos cerca de cinco aminoácidos, geralmente pelo menos cerca de 20 aminoácidos, mais geralmente pelo menos cerca de 30 aminoácidos, tipicamente pelo menos cerca de 50 aminoácidos, mais tipicamente pelo menos cerca de 100 aminoácidos, e ainda mais tipicamente cerca de 150, 200 ou mais aminoácidos. Existem vários algoritmos diferentes conhecidos na técnica 55 que podem ser usados para medir a identidade de sequência de aminoácido. Por exemplo, as sequências de aminoácidos podem ser comparadas usando FASTA, Gap ou Bestfit, que são programas em Wisconsin Package Versão 10.0; Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisconsin.

Como aplicar aos polipéptidos, o termo "identidade substancial" ou "similaridade substancial" significa que duas sequências de aminoácido, quando idealmente alinhadas, tais como pelos programas GAP ou BESTFIT utilizando pesos de abertura padrão como fornecidos com os programas, compartilham pelo menos 70 %, 75 % ou 80 % de identidade de sequência, preferivelmente pelo menos 90 % ou 95 % de identidade de sequência, e mais preferivelmente pelo menos 97 %, 98 % ou 99 % de identidade de sequência. Em certas formas de realização, as posições residuais que não são idênticas diferem pelas substituições de aminoácido conservadoras. O termo "sequência de sinal", também chamado de péptido sinal, péptido lider, refere-se a um segmento de cerca de 15 a 30 aminoácidos no N terminal de uma proteína que permite a proteína ser segregada (passar através de uma membrana celular). A sequência de sinal é removida quando a proteína é segregada.

Como é utilizado no presente documento, o termo "etiqueta" ou "etiquetado" refere-se à incorporação de uma outra molécula no anticorpo. Numa forma de realização, a etiqueta é um marcador detectável, por exemplo, a incorporação de um aminoácido radioretiquetado ou ligação a um polipéptido de porções de biotinilo que pode ser detectado pela avidina etiquetada (por exemplo, estreptavidina contendo um marcador fluorescente ou actividade enzimática que pode ser detectada pelos métodos ópticos ou colorimétricos). Em outra forma de realização, o etiqueta ou marcador pode ser terapêutico, por exemplo, um conjugado de medicamento ou toxina. Vários métodos de 56 etiquetagem de polipéptidos e glicoproteínas são conhecidos na técnica e podem ser usados. Exemplos de etiquetas para polipéptidos incluem, mas não são limitados a, os seguintes: radioisótopos ou radionuclideos (por exemplo, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, "Tc, 111In, 125I, 131I), etiquetas fluorescentes (por exemplo, FITC, rodamina, fósforos lantanideos), etiquetas enzimáticos (por exemplo, peroxidase de rábano silvestre, (3-galactosidase, luciferase, fosfatase alcalina), marcadores quimioluminescentes, grupos de biotinilo, epítopos de polipéptido predeterminados reconhecidos por um repórter secundário (por exemplo, sequências de par de zipper de leucina, locais de ligação para anticorpos secundários, domínios de ligação de metal, etiquetas de epítopo), agentes magnéticos, tais como quelatos de gadolínio, toxinas tais como a toxina da coqueluche, taxoi, citocalasina B, gramicidina D, brometo de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colquicina, doxorrubicina, daunorrubicina, Diidroxi antracina diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deidrotestosterona, glicocorticoides, procaina, tetracaina, lidocaina, propranolol, e puromicina e análogos ou homólogos destes. Em algumas formas de realização, os etiquetas são ligados por subdivisões espaçadores de vários comprimentos para reduzir o impedimento estérico potencial. 0 termo "primata" refere-se a um mamifero da ordem primatas, que inclui os antropoides e prosimianos, caracterizados pelo desenvolvimento refinado das mãos e pés, um focinho encurtado, e um grande cérebro. Os mamíferos da ordem Primatas incluem os seres humanos, macacos, e prosimianos, ou primatas menores. "Quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se àquela quantidade do agente terapêutico sendo administrado que irá aliviar de certa forma um ou mais dos sintomas do distúrbio 57 a ser tratado. Em referência ao tratamento do cancro, uma quantidade terapeuticamente eficaz refere-se àquela quantidade que possui pelo menos um dos seguintes efeitos: reduzir o tamanho do tumor; inibir (isto é, retardar em certa medida, preferivelmente interromper) a metástase tumoral; inibir em certa medida (isto é, retardar até certo ponto, preferivelmente interromper) o crescimento tumoral, e aliviar até certo ponto (ou, preferivelmente, eliminar) um ou mais sintomas associados com o cancro. "Tratar", "tratando" e "tratamento" referem-se a um método de aliviar ou anular um distúrbio biológico e/ou seus sintomas subordinados. No que refere-se ao cancro, estes termos simplesmente significam que a expectativa de vida de uma pessoa afectada com um cancro será aumentada ou que um ou mais dos sintomas da doença, serão reduzidos. "Contacto" refere-se levar um anticorpo ou porção do mesmo de ligação a antigeno da presente invenção e uma ALK-1 alvo, ou epitopo deste, conjuntamente de uma tal maneira que o anticorpo possa afectar a actividade biológica da ALK-1. Tal "contacto" pode ser realizado ”in vitro", isto é, num tubo de ensaio, uma placa de Petri, ou coisa parecida. Num tubo de ensaio, o contacto pode envolver apenas um anticorpo ou porção do mesmo de ligação a antigeno e ALK-1 ou epitopo deste ou pode envolver todas as células. As células também podem ser mantidas ou cultivadas em placas de cultura celular e colocadas em contacto com anticorpos ou porções dos mesmos de ligação a antigeno neste ambiente. Neste contexto, a capacidade de um anticorpo particular ou porção do mesmo de ligação a antigeno de afectar um distúrbio relacionado com a ALK-1, isto é, a IC5o dos anticorpos, pode ser determinado antes da utilização do anticorpo in vivo com organismos vivos mais complexos ser obtida. Para as células fora do organismo, existem vários métodos, e são bem conhecidos por aqueles versados na técnica, para colocar em contacto ALK-1 58 com os anticorpos ou componentes de ligação a antigeno. 0 acrónimo "FACS" refere-se à Classificação Celular activada por Fluorescência. 0 acrónimo FACS e citometria de fluxo são utilizados de modo trocável. A etiquetagem fluorescente permite a investigação da estrutura e função celular. A imunofluorescência, a aplicação mais amplamente utilizada, envolve a coloração das células com anticorpos conjugados com corantes fluorescentes tais como a fluoresceina e ficoeritrina. Este método é muitas vezes usado para rotular as moléculas na superfície celular, mas os anticorpos podem ser direccionados em alvos no citoplasma. Na imunofluorescência directa um anticorpo numa molécula é directamente conjugado a um corante fluorescente, e as células são manchadas numa etapa. Na imunofluorescência indirecta o anticorpo primário não é etiquetado, e um segundo anticorpo fluorescentemente conjugado é adicionado que é especifico para o primeiro anticorpo.

Anticorpos Anti-ALK-1

Esta invenção pertence aos anticorpos monoclonais anti-ALK-1 de neutralização isolada ou porções de ligação a antigeno dos mesmos que se ligam à ALK 1 de primata, preferivelmente o DEC de ALK 1 de primata, mais preferivelmente o DEC de ALK 1 humana. Numa forma de realização preferida, a invenção pertence aos anticorpos de neutralização isolada que são anticorpos monoclonais completamente humanos ou porções de ligação a antigeno dos mesmos. De preferência, os anticorpos humanos são anticorpos anti-ALK-1 recombinantes humanos que possuem maior afinidade para ALK-1 do que para ALK-2 através de ALK-7. Em algumas formas de realização, os anticorpos anti-ALK-1 humanos são produzidos pela imunização de um animal transgénico não humano, por exemplo, um roedor, cujo genoma compreende genes da imunoglobulina humana de modo que o animal transgénico produz anticorpos humanos. Vários 59 aspectos da invenção referem-se a tais anticorpos e porções de ligação a antigeno, e composições farmacêuticas destes, bem como ácidos nucleicos, vectores de expressão recombinantes e células hospedeiras para produzir tais anticorpos e porções de ligação a antigeno. Os métodos de utilização dos anticorpos e porções de ligação a antigeno da presente invenção para anular a via de sinalização ALK-1/TGF-beta-l/Smadl ou para detectar a ALK-1, quer in vitro ou in vivo, são também contemplados pela invenção.

Um anticorpo anti-ALK-1 da invenção pode compreender uma cadeia capa humana ou lambda humana ou uma sequência de aminoácido derivada deste. Em algumas formas de realização que compreendem uma cadeia leve capa, o dominio variável de cadeia leve (VL) utiliza um gene A27, A2, Al, A3, B3, B2, Ll e L2 VK humano. Em algumas formas de realização, a cadeia leve utiliza um gene humano VK Ll e um gene humano Jk 4; um gene humano VK A27 e um gene humano Jk 5 ou um gene humano Jk 4; um gene humano VK B3 e um gene humano Jk 1; um gene humano VK L2 e um gene humano Jk 3, um gene humano VK A2 e um gene humano JK 1; um gene humano VK A3 e um gene humano Jk 4; um gene humano VK Al e um gene humano Jk 1; um gene humano VK B2 e um gene humano JK 4; ou um gene humano VK A2 e um gene humano Jk 1.

Em algumas formas de realização, o VL do anticorpo anti-ALK-1 compreende uma ou mais substituições, supressões ou inserções (adições) de aminoácido em relação à sequência de aminoácido da linha germinal VK. Em algumas formas de realização, o VL do anticorpo anti-ALK-1 compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 substituições de aminoácido em relação à sequência de aminoácido da linha germinal VK. Em algumas formas de realização, uma ou mais das substituições da linha germinal é nas regiões CDR da cadeia leve. Em algumas formas de realização, as substituições de aminoácido VK em relação à linha germinal estão numa ou mais das mesmas posições como as 60 substituições em relação à linha germinal observada em qualquer um ou mais do VL dos anticorpos proporcionado no presente documentos como mostrado, por exemplo, na figura 7. Em algumas formas de realização, as mudanças de aminoácido estão numa ou mais das mesmas posições, mas envolvem uma substituição diferente do que no anticorpo de referência.

Em algumas formas de realização, as substituições de aminoácido em relação à linha germinal ocorrem numa ou mais das mesmas posições como substituições da linha germinal em qualquer um do VL de anticorpos 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1 (rWT); 1.13.1; 1,14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24,1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1, 4.68.1, 4.72.1, 5.13.1, 5.34.1, 5.53.1, 5.56.1, 5.57.1 e 5.59.1, mas as substituições podem representar substituições de aminoácido conservadoras em tal posição em relação ao aminoácido no anticorpo de referência. Por exemplo, se uma posição particular num destes anticorpos for alterada em relação à linha germinal e for glutamato, pode-se substituir aspartato nesta posição. Similarmente, se uma substituição de aminoácido comparada com a linha germinal num anticorpo exemplificado for serina, pode-se conservadoramente substituir treonina por serina nesta posição. As substituições de aminoácido conservadoras são debatidas supra.

Em algumas formas de realização, o anticorpo anti-ALK-1 compreende uma sequência de aminoácido de cadeia leve de SEQ ID NO: 4. Em outras formas de realização, a cadeia leve compreende a sequência de aminoácido de cadeia leve de anticorpos 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1 (rWT); 1.12.1 (M29I/D19A); 1.12.1 (M29I); 1.12.1 (D19A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4,24. 1; 4.38.1, 4.58.1, 4.62.1, 4.68.1, 4.72.1, 5.13.1, 5.34.1, 5.53.1, 5.56.1, 5.57.1 ou 5.59.1.

Em algumas formas de realização, a cadeia leve do 61 anticorpo anti-ALK-1 humano compreende a sequência de aminoácido VL de anticorpos 1.12.1 (SEQ ID NO: 8); 1.11.1 (SEQ ID NO: 12); 1.13.1 (SEQ ID NO: 16); 1.14.1 (SEQ ID NO: 20); 1.151.1 (SEQ ID NO: 24); 1.162.1 (SEQ ID NO: 28);

1.183.1 (SEQ ID NO: 32); 1.8.1 (SEQ ID NO: 36); 1.9.1 (SEQ ID NO: 40); 4.10.1 (SEQ ID NO: 44); 4.24.1 (SEQ ID NO: 48);

4.38.1 (SEQ ID NO: 52); 4.58.1 (SEQ IDNO: 56); 4.62.1 (SEQ ID NO: 60); 4.68.1 (SEQ ID NO: 64); 4.72.1 (SEQ ID NO: 68);

5.13.1 (SEQ IDNO: 72); 5.34.1 (SEQ IDNO: 76); 5.53.1 (SEQ ID NO: 80); 5.56.1 (SEQ ID NO: 84); 5.57.1 (SEQ ID NO: 88); ou 5.59.1 (SEQ ID NO: 92); ou dita sequência de aminoácido tendo até 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 substituições de aminoácido conservadoras e/ou um total de até 3 substituições de aminoácido não conservadoras. Em outras formas de realização a cadeia leve do anticorpo anti-ALK-1 humano compreende a sequência de aminoácido VL de anticorpos 1.27.1; 1.29.1 ou 1.31.1. Em algumas formas de realização, a cadeia leve compreende a sequência de aminoácido a partir do inicio do CDR1 até o final do CDR3 de qualquer um dos anticorpos precedentes.

Em algumas formas de realização, a cadeia leve pode compreender as sequências de aminoácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 seleccionadas independentemente das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve, respectivamente, de dois ou mais anticorpos monoclonais seleccionados de 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1 (rWT); 1.12.1 (M29I/D19A); 1.12.1 (M29I); 1.12.1 (D19A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5,13.1; 5.34.1, 5.53.1, 5.56.1, 5.57.1 ou 5.59.1, ou ditas regiões de CDR cada uma tendo menos do que 3 ou menos do que 2 substituições de aminoácido conservadoras e/ou um total de três ou menos substituições de aminoácido não conservadoras.

Em certas formas de realização, à cadeia leve do 62 anticorpo anti-ALK-1 compreende as sequências de aminoácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve de um anticorpo seleccionado de 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1 (rWT) r 1.12.1 (M29I/D19A); 1.12.1 (M29I); : 1.12.1 ( D19A); 1.13. 1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1 .183.1; 1.27.1; 1 .29.1; 1.31. 1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1, 4. 24.1, 4.38.1, 4 .58.1, 4.62. 1, 4.68.1, 4.72.1, 5.13.1, 5 .34.1; 5.53.1; 5 .56.1, 5.57.1 ou 5.59.1, ou ditas regiões de CDR cada uma tendo menos do que 3 ou menos do que 2 substituições de aminoácido conservadoras e/ou um total de três ou menos substituições de aminoácido não conservadoras.

Com referência à cadeia pesada, em algumas formas de realização, o domínio variável (VH) utiliza um gene VH 4-31, VH 3-11, VH 3-15, VH 3-33, VH 4-61 ou VH 4-59 humano. Em algumas formas de realização, a sequência VH do anticorpo anti-ALK-1 contém uma ou mais substituições, supressões ou inserções (adições) de aminoácido, colectivamente "mutações", em relação à sequência de aminoácido VH da linha germinal. Em algumas formas de realização, o domínio variável da cadeia pesada compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10 ou 11 mutações da sequência de aminoácido VH da linha germinal. Em algumas formas de realização, a(s) mutação(ões) é/são substituições não conservadoras em comparação com a sequência de aminoácidos da linha germinal. Em algumas formas de realização, as mutações estão nas regiões de CDR da cadeia pesada. Em algumas formas de realização, a cadeia pesada utiliza um gene humano VH 3-33, um gene humano D 6-19 e um gene humano JH 3B; um gene humano VH 4-31, um gene humano D 6-19 e um gene humano Jh 4B, um gene humano VH 4-61, um gene humano D 6-19 e um gene humano Jh 4B; um gene humano VH 4-31, um gene humano D 3-3 e um gene humano Jh 3B; um gene humano VH 4-31 e um gene humano Jh 3B, um gene humano Vh 4- 5 9, um gene humano D 6-19 e um gene humano Jh 4B, um gene humano VH 3-11, um gene humano D 3-22 e um gene humano Jh 6B, um gene 63 humano Vh 3-15, um gene humano D 3-22 e um gene humano Jh 4B, um gene humano VH 4-31, um gene humano D 5-12 e um gene humano JH 6B; um gene humano VH 4-31, um gene humano D 4-23 e um gene humano Jh 4B, um gene humano VH 4-31, um gene humano D 2-2 e um gene humano Jh 5B; um gene humano VH 4-31 e um gene humano Jh 6B; gene humano VH 3-15, um gene humano D 1-1 e um gene humano Jh 4B, um gene humano VH 3- 11, um gene humano D 6-19 e um gene humano JH 6B, um gene humano VH 3-11, um gene humano D 3-10 e um gene humano Jh 6B; ou um gene humano VH 3-11, um gene humano D 6-6 e um gene humano Jh 6B.

Em algumas formas de realização, as substituições de aminoácido estão numa ou mais das mesmas posições como as substituições da linha germinal em qualquer um ou mais dos VH de anticorpos 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1 (rWT); 1.12.1 (M29I/D19A); 1.12. 1 (M2 91 Κ 1.12.1 (D19A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; Ι. 183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1, 4.24.1, 4.38.1, 4.58.1, 4.62.1, 4.68.1, 4.72.1, 5.13.1, 5.34.1, 5.53.1; 5,56 .1; 5.57.1 ou 5.59.1. Em outras formas de realização, as mudanças de aminoácido estão numa ou mais das mesmas posições, mas envolvem uma substituição diferente do que no anticorpo de referência.

Em algumas formas de realização, a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácido SEQ ID NO: 2. Em outras formas de realização, a cadeia pesada compreende a sequência de aminoácido de cadeia pesada de anticorpos 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1 (rWT); 1.12.1 (M29I/D19A); 1.12.1 (M29I); 1.12.1 (D19A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1, 4.58.1, 4.62.1, 4.68.1, 4.72.1, 5.13.1, 5.34.1, 5.53.1, 5.56.1, 5.57.1 ou 5.59.1. Em algumas formas de realização, a cadeia pesada compreende sequência de aminoácido VH de anticorpos 1.12.1 (SEQ ID NOS: 6); 1.11.1 (SEQ ID NO: 10); 1.13.1 (SEQ ID NO: 14); 1,14. 1 (SEQ ID NO: 18); 1.151.1 (SEQ ID NO: 22); 1.162.1 (SEQ ID NO: 26); 64 1.183.1 (SEQ ID NO: 30); 1.8.1 (SEQ NO ID: 34); 1.9.1 (SEQ ID NO: 38); 4.10.1 (SEQ ID NO: 42); 4.24.1 (SEQ ID NO: 46); 4.38.1 (SEQ ID NO: 50); 4.58.1 (SEQ ID NO: 54); 4.62.1 (SEQ ID NO: 58); 4.68.1 (SEQ ID NO: 62); 4.72.1 (SEQ ID NO: 66); 5.13.1 (SEQ ID NO: 70); 5.34.1 (SEQ ID NO: 74); 5.53.1 (SEQ ID NO: 78); 5.56.1 (SEQ ID NO: 82); 5.57.1 (SEQ ID NO: 86); ou 5.59.1 (SEQ ID NO: 90); ou dita sequência de aminoácido VH tendo até 1, 2, 3, 4, 6, 8, 9, 10 ou 11 substituições de aminoácido conservadoras e/ou um total de até 3 substituições de aminoácido não conservadoras. Em outras formas de realização, a cadeia pesada compreende a sequência de aminoácido VH de anticorpo 1.27.1, 1.29.1 ou 1.31.1. Em algumas formas de realização, a cadeia pesada compreende a sequência de aminoácido a partir do inicio do CDR1 até final do CDR3 de qualquer um dos anticorpos precedentes.

Em algumas formas de realização, a cadeia pesada compreende as regiões de cadeia pesada CDR1, CDR2 e CDR3 de anticorpos 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1 (rWT); 1.12.1 (M29I/D19A); 1.12.1 (M29I); 1.12.1 (D19A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1, 4.38.1, 4.58.1, 4.62.1, 4.68.1, 4.72.1, 5.13.1, 5.34.1, 5.53.1, 5.56.1, 5.57.1 ou 5.59.1, ou ditas regiões de CDR cada uma tendo menos do que 8, menos do que 6, menos do que 4, ou menos do que 3 substituições de aminoácido conservadoras e/ou um total de três ou menos substituições de aminoácido não conservadoras.

Em algumas formas de realização, as regiões de CDR de cadeia pesada são independentemente seleccionadas das regiões de CDR de dois ou mais anticorpos seleccionados dos anticorpos 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1 (rWT); 1.12.1 (M29I/D19A); 1.12.1 (M29I); 1.12.1 (D19A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1, 4.24.1, 4.38.1, 4.58.1, 4.62.1, 4.68.1, 65 4.72.1, 5.13.1, 5.34.1, 5.53.1, 5.56.1, 5.57.1; ou 5.59.1. Em outra forma de realização, o anticorpo compreende uma cadeia leve como divulgado acima e uma cadeia pesada como divulgado acima. Numa outra forma de realização, os CDRs de cadeia leve e os CDRs de cadeia pesada são provenientes do mesmo anticorpo.

Em várias formas de realização, os anticorpos anti-ALK-1 possuem a(s) sequência(s) de aminoácido de cadeia pesada de comprimento total e cadeia leve de comprimento total, as sequências de aminoácidos VH e VL, as sequências de aminoácidos de cadeia pesada CDR1, CDR2 e CDR3 e cadeia leve CDR1, CDR2 e CDR3 ou a sequência de aminoácido de cadeia pesada a partir do inicio do CDR1 até o final do CDR3 e a sequência de aminoácido de cadeia leve a partir do inicio do CDR1 até o final do CDR3 de um anticorpo anti-ALK-1 proporcionado no presente documento.

Um tipo de substituição de aminoácido que pode ser produzido é alterar uma ou mais cisteinas no anticorpo, que pode ser quimicamente reactiva, com um outro resíduo, tal como, sem limitação, alanina ou serina. Numa forma de realização, existe uma substituição de uma cisteína não canónica. A substituição pode ser feita num CDR ou região estrutural de um domínio variável ou no domínio constante de um anticorpo. Em algumas formas de realização, a cisteína é canónica.

Um outro tipo de substituição de aminoácido que pode ser feita é remover os locais proteolíticos potenciais no anticorpo. Estes locais podem ocorrer num CDR ou região estrutural de um domínio variável ou no domínio constante de um anticorpo. A substituição de resíduos de cisteína e a remoção dos locais proteolíticos podem reduzir o risco de heterogeneidade no produto de anticorpo e assim aumentar a sua homogeneidade. Outro tipo de substituição de aminoácido é eliminar os pares de asparagina-glicina, que formam os locais de desamidação potenciais, mediante a alteração de 66 um ou de ambos os resíduos.

Em algumas formas de realização, a lisina C-terminal da cadeia pesada do anticorpo anti ALK-1 da invenção é clivada. Em várias formas de realização da invenção, as cadeias pesadas e leves dos anticorpos anti-ALK-1 podem opcionalmente incluir uma sequência de sinal.

Num aspecto, a invenção proporciona vinte cinco anticorpos monoclonais anti-ALK-1 humanos inibidores e as linhas celulares do hibridoma que os produzem. Em certas formas de realização, os anticorpos da presente invenção são IgGs designados como: 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1 (rWT); 1.12.1 (M29I/D19A); 1.12.1 (M29I); 1.12.1 (D19A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1, 4.62.1, 4.68.1, 4.72.1, 5.13.1, 5.34.1, 5.53.1, 5.56.1, 5.57.1 e 5.59.1, Nas formas de realização preferidas, o anticorpo anti-ALK-1 humano é anticorpo 1.12.1, 1.12.1 (M29I/D19A), 1.12.1 (M29I), 1.12.1 (D19A), 1.27.1, 1.14.1, 1.162.1, 1.31.1, 4.62.1 ou 4.72.1.

Os anticorpos reconhecem os epítopos expostos na superfície sobre antígenos como regiões de sequência linear (primária) ou sequência estrutural (secundária). BIAcore foi utilizado para definir a paisagem do epítopo funcional e determinar a exclusividade do epítopo aos anticorpos anti- ALK-1 exemplificados por esta invenção. O Quadro 1 lista os identificadores de sequência (SEQ ID NO) dos ácidos nucleicos que codificam as cadeias leves e pesadas de comprimento total de variantes de anticorpo 1.12.1 e porções contendo o domínio variável de anticorpos anti-ALK-1 da invenção, e as sequências de aminoácidos deduzidas correspondentes. 67_Quadro 1_ IDENTIFICADORES DE SEQUENCIA (SEQ ID NO)

Anticorpo COMPRIMENTO TOTAL PORÇÃO CONTENDO 0 DOMÍNIO V Pesada Leve Pesada Leve ADN Proteína ADN Proteína ADN Proteína ADN Proteína 1.11.1 9 10 11 12 1.12.1(M29I/D1 9A) 1 2 3 4 5 6 7 8 1.12.1 95 100 101 102 103 104 126 127 1.12.1(rWT) 128 100 101 102 129 104 126 127 1.13.1 13 14 15 16 1.14.1 17 18 19 20 1.151.1 21 22 23 24 1.162.1 25 26 27 28 1.183.1 29 30 31 32 1.8.1 33 34 35 36 1.9.1 37 38 39 40 4.10.1 41 42 43 44 4.24.1 45 46 47 48 4.38.1 49 50 51 52 4.58.1 53 54 55 56 4.62.1 57 58 59 60 4.68.1 61 62 63 64 4.72.1 65 66 67 68 5.13.1 69 70 71 72 5.34.1 73 74 75 76 5.53.1 77 78 79 80 5.56.1 81 82 83 84 5.57.1 85 86 87 88 5.59.1 89 90 91 92 1.12.1 (M29I/D19A) refere-se ao anticorpo anti-ALK-1 contendo uma mutação de aminoácido única especifica na cadeia pesada onde a metionina na posição 29 foi substituída com isoleucina e uma mutação de aminoácido única específica na cadeia leve onde o ácido aspártico na posição 19 foi substituído com alanina conforme descrito no Exemplo 4. 1.12.1 refere-se à variante mAb 1.12.1, que foi isolada dos hibridomas. 1.12.1 (rWT) refere-se à variante mAb 1.12.1 que foi expressa como um mAb recombinante descrito no Exemplo 3. 68 A invenção proporciona ainda variantes de cadeia pesada e/ou leve de certos anticorpos anti-ALK-1 humanos listados acima, que compreendem uma ou mais modificações de aminoácido. Para designar as variantes, a primeira letra é o simbolo da letra um para o aminoácido da cadeia de anticorpo de ocorrência natural, o número refere-se à posição do aminoácido (em que a posição um é o aminoácido N-terminal do FR1), e a segunda letra é o simbolo de uma letra para o aminoácido variante.

Em mais outras formas de realização, a invenção inclui anticorpos que compreendem sequências de aminoácidos de dominio variável com mais do que 80 %, mais do que 85 %, mais do que 90 %, mais do que 95 %, mais do que 96 %, mais do que 97 %, mais do que 98 % ou mais do que 99 % de identidade de sequência para uma sequência de aminoácido de dominio variável de qualquer um dos anticorpos anti-ALK-1 humanos listados acima.

Classe e Subclasse de Anticorpos Anti-ALK-1 A classe e subclasse de anticorpos anti-ALK-1 podem ser determinadas por qualquer método conhecido na técnica. Em geral, a classe e a subclasse de um anticorpo podem ser determinadas utilizando anticorpos que são específicos de uma classe e subclasse particulares de anticorpos. Esses anticorpos estão disponíveis comercialmente. A classe e a subclasse podem ser determinadas por ELISA, Western Blot, assim como outras técnicas. Alternativamente, a classe e a subclasse podem ser determinadas pelo sequenciamento total ou uma parte dos domínios constante das cadeias pesadas e/ou leves dos anticorpos, comparando suas sequências de aminoácidos com as sequências de aminoácidos conhecidas de várias classes e subclasses de imunoglobulinas, e determinando a classe e subclasse dos anticorpos.

A classe de um anticorpo anti-ALK-1 obtido como descrito acima pode ser permutada com a outra. Num aspecto da invenção, uma molécula de ácido nucleico que codifica VL 69 ou VH é isolada usando métodos bem conhecidos na técnica tal que não inclui sequências de ácido nucleico que codificam CL ou Ch. "Antibody Enqineering" (Kontermann & Dubel, Eds., Springer-Verlag, Berlin (2001)). As moléculas de ácido nucleico que codificam VL ou Vh são depois operativamente ligadas a uma sequência de ácido nucleico que codifica um CL ou Ch, respectivamente, a partir de uma classe diferente de molécula de imunoglobulina. Isto pode ser obtido usando um vector ou molécula de ácido nucleico que compreende uma cadeia Cl ou Ch, como descrito acima. Por exemplo, um anticorpo anti-ALK-1 que foi originalmente IgM pode ser conectado a uma IgG. Além disso, a comutação de classe pode ser utilizada para converter uma subclasse IgG em outra, por exemplo, a partir de IgGl para IgG2. Um método preferido para a produção de um anticorpo da invenção que compreende um isotipo desejado compreende as etapas de isolamento de uma molécula de ácido nucleico que codifica a cadeia pesada de um anticorpo anti-ALK-1 e uma molécula de ácido nucleico que codifica a cadeia leve de um anticorpo anti-ALK-1, obtenção do dominio variável da cadeia pesada, que liga o dominio variável da cadeia pesada com o dominio constante de uma cadeia pesada do isotipo desejado, expressão da cadeia leve e cadeia pesada ligada numa célula, e colheita do anticorpo anti-ALK-1 com o isotipo desejado.

Em algumas formas de realização, o anticorpo anti-ALK-1 é um anticorpo monoclonal. O anticorpo anti-ALK-1 pode ser uma molécula de IgG, uma molécula de IgM, uma molécula de IgE, uma molécula de IgA ou uma molécula de IgD. Numa forma de realização preferida, o anticorpo anti-ALK-1 é uma IgG e é uma subclasse IgGl, IgG2, IgG3, IgG4. Em outra forma de realização preferida, o anticorpo é a subclasse IgG2 .

Identificação de Epítopos ALK-1 Reconhecidos pelos Anticorpos Anti-ALK-1 70 A invenção proporciona um anticorpo monoclonal anti-ALK-1 humano que se liga à ALK-1 e concorre ou inter-concorre com e/ou liga o mesmo epitopo como: (a) um anticorpo seleccionados de 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1 (rWT); 1.12.1 (M29I/D19A); 1.12.1 (M29I); 1.12.1 (D19A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1, 4.24.1, 4.38.1, 4.58.1, 4.62.1, 4.68.1, 4.72.1, 5.13.1; 5.34.1, 5.53.1, 5.56.1, 5.57.1 e 5.59.1; (b) um anticorpo que compreende um domínio variável de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácido do dominio VH em qualquer uma das SEQ ID NOS: 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 50, 54, 58, 62, 66, 70, 74, 78, 82, 86, 90 ou 104, (c) Um anticorpo que compreende um dominio variável de cadeia leve tendo a sequência de aminoácido do dominio VL em qualquer uma das SEQ ID NOS: e 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88 e 92 ou 127, (d) um anticorpo que compreende tanto um dominio variável de cadeia pesada como definido em (b) quanto um dominio variável de cadeia leve como definido em (c) .

Pode-se determinar se um anticorpo liga-se ao mesmo epitopo ou inter-concorre para a ligação com um anticorpo anti-ALK-1 usando métodos conhecidos na técnica. Numa forma de realização, permite-se que o anticorpo anti-ALK-1 da invenção se ligue à ALK-1 sob condições de saturação e depois se mede a capacidade do anticorpo de teste em se ligar à ALK-1. Se o anticorpo de teste for capaz de se ligar à ALK-1 ao mesmo tempo que o anticorpo anti-ALK-1 de referência, então o anticorpo de teste se liga a um epitopo diferente do que o anticorpo anti-ALK-1 de referência. No entanto, se o anticorpo de teste não for capaz de se ligar à ALK-1 ao mesmo tempo, então o anticorpo de teste se liga ao mesmo epitopo, um epitopo de sobreposição, ou um epitopo que está nas proximidades do epitopo ligado pelo anticorpo anti-ALK-1 da invenção. Esta experiência pode ser realizada 71 utilizando ELISA, RIA, BIACORE™, ou citometria de fluxo. Para testar se um anticorpo anti- ALK-1 inter-concorre com outro anticorpo anti-ALK-1, pode-se utilizar o método de concorrência descrito acima em duas direcções, isto é, determinar se o anticorpo conhecido bloqueia o anticorpo de teste e vice-versa. Numa forma de realização preferida, a experiência é executada utilizando BIACORE™.

Afinidade de Ligação dos Anticorpos Anti-ALK-1 na ALK-1 A afinidade de ligação (KD) e taxa de dissociação (k0ff) de um anticorpo anti-ALK-1 ou porção do mesmo de ligação a antigeno na ALK-1 podem ser determinadas por métodos conhecidos na técnica. A afinidade de ligação pode ser medida por ELISA, RIAs, citometria de fluxo, ou ressonância de plasmão superficial, tal como BIACORE™. A taxa de dissociação pode ser medida pela ressonância de plasmão superficial. Preferivelmente, a afinidade de ligação e taxa de dissociação é medida pela ressonância de plasmão superficial. Mais preferivelmente, a afinidade de ligação e taxa de dissociação são medidas utilizando BIACORE™. Pode-se determinar se um anticorpo possui substancialmente a mesma KD como um anticorpo anti-ALK-1 mediante a utilização de métodos conhecidos na técnica. Tais métodos de determinação da KD e koff podem ser utilizados durante o estágio de rastreio inicial, assim como durante os estágios de optimização subsequentes. Inibição da Actividade ALK-1 pelo Anticorpo Anti-ALK-1

Os anticorpos monoclonais anti-ALK-1 que inibem a ligação de ALK-1 podem ser identificados usando vários ensaios. Por exemplo, os anticorpos anti-ALK-1 de neutralização podem ser identificados por sua inibição da regulação positiva de um gene alvo a jusante especifico de ALK-1, Idl, conforme descrito no Exemplo 12. Os anticorpos anti-ALK-1 preferidos possuem uma IC50 de não mais de 500 nM, 300 nM, 200 nM, 150 nM, 100 nM, 50 nM, 20 nM, 10 nM ou 1 nM. 72

Pode-se também determinar a capacidade de um anticorpo anti- ALK-1 em inibir a fosforilação Smadl determinada pela Western Blotting utilizando Odyssey Infrared Imaging System, conforme descrito no Exemplo 13. Em vários formas de realização, o anticorpo anti-ALK-1 possui um IC50 neste ensaio de não mais do que 250 nM, 200 nM, 150 nM, 100 nM, 50 nM, 20 nM, 10 nM ou 1 nM.

Inibição da Angiogénese por Anticorpo Anti:ALK-l

Em outra forma de realização, o anticorpo anti-ALK-1 ou porção do mesmo inibe angiogénese humana dos vasos como demonstrado num ratinho SCID enxertado com tecido do prepúcio humano, em que as células tumorais M24met do melanoma humano são intradermicamente implantadas como determinado pela análise IHC do ensaio de sinal CD-31 humano por um factor de pelo menos 40 % em comparação com uma amostra de controlo tal como descrito no Exemplo 17 e apresentado no Quadro 13.

Em outra forma de realização, o anticorpo anti-ALK-1 ou porção do mesmo inibe a angiogénese humana dos vasos como demonstrado num ratinho SCID enxertado com tecido do prepúcio humano, em que o colagénio é intradérmica implantado conforme determinado pela análise IHC do ensaio de sinal CD-31 humano por um factor de pelo menos 50 % quando comparado com uma amostra de controlo como descrito no Exemplo 16 e apresentado no Quadro 12.

Selectividade Molecular e de Espécies

Num outro aspecto da invenção, os anticorpos anti-ALK-1 demonstram selectividade tanto da espécie quanto molecular. Seguindo os ensinamentos da memória descritiva, pode-se determinar a selectividade da espécie ou molecular para o anticorpo anti-ALK usando métodos bem conhecidos na técnica. Por exemplo, pode-se determinar a selectividade da espécie usando Western Blot, ressonância de plasmão superficial, por exemplo, BIAcore, ELISA, imunoprecipitação ou RIA. 73

Em algumas formas de realização, o anticorpo anti-ALK-1 se liga à ALK- 1 primata com uma KD que é pelo menos duas vezes menor do que a sua KD para ALK-1 de roedores. Numa outra forma de realização, a KD para ALK-1 primata é pelo menos 3 vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 50 vezes, pelo menos 100 vezes, pelo menos 200 vezes, pelo menos 500 vezes, ou pelo menos 1000 vezes menor do que a sua KD para ALK-1 de roedores como medido por citometria de fluxo.

Em outras formas de realização, o anticorpo anti-ALK-1 possui uma selectividade para ALK-1 sobre ALK-2 através da ALK-7. Em algumas formas de realização, o anticorpo anti-ALK-1 não apresenta qualquer ligação especifica apreciável para qualquer outra proteina diferente de ALK-1. Preferivelmente, o anticorpo anti-ALK-1 liga-se ao DEC da ALK-1 humana. Métodos de Produção de Anticorpos e Linhas Celulares que Produzem Anticorpos Imunogénio de ALK-1

Em algumas formas de realização, o imunogénio ou antigeno de ALK-1 é ALK-1 isolada e/ou purificada. Em algumas formas de realização, o imunogénio de ALK-1 é ALK-1 humana. Nas formas de realização preferidas, o imunogénio de ALK-1 é o DEC de ALK-1 humana. ALK-1 humana, ou porções antigénicas da mesma, pode ser preparada de acordo com os métodos bem conhecidos pelos peritos na especialidade, ou pode ser adquirida a partir de vendedores comerciais. As sequências de aminoácidos e nucleótido de ALK-1 humana são conhecidas (veja-se, por exemplo, N° de Acesso de registo do Genbank L17075). O gene ACVRL1 que codifica uma ALK-1 de comprimento total é comercialmente disponível da Invitrogen Inc., Clone ID IOH21048. Por exemplo, R & D Systems, Inc. vende a quimera de ALK-1/Fc humana recombinante (Número de Catálogo 370-AL) preparada pela expressão, de uma sequência de ADN que codifica os resíduos de aminoácido DEC 1-118 da ALK-1, cuja sequência de ADN foi fundida a uma sequência de 74 ADN que codifica a região Fc de IgG humano através de uma sequência de ADN que codifica um ligador de polipéptido numa linha celular de mieloma de rato. A quimera ALK-l/Fc humana madura recombinante é uma proteina homodimérica ligada a dissulfeto tendo Asp 22 no amino-terminal. Além disso, o Exemplo 1 descreve a preparação da proteina de cauda de His DEC ALK-1 que foi utilizada para a geração de hibridomas que produzem um anticorpo anti-ALK-1 de acordo com a presente invenção.

Em outras formas de realização, o antigeno de ALK-1 é uma célula que expressa ou sobre-expressa a ALK-1. Em outras formas de realização, o antigeno de ALK-1 é uma proteina recombinante expressa de levedura, células de insectos, bactérias tais como E. coli, ou outros recursos por tecnologia recombinante.

Imunização

Em algumas formas de realização, os anticorpos humanos são produzidos pela imunização de um animal transgénico não humano que compreende dentro de seu genoma alguns ou todos os locais de cadeia pesada e cadeia leve da imunoglobulina humana com um antigeno ALK-1. Numa forma de realização preferida, o animal não humano é um animal XENOMOUSE®. (Abgenix, Inc., Fremont, CA).

Os ratinhos XENOMOUSE® são estirpes de ratinho planejadas que compreendem grandes fragmentos de locais de cadeia pesada e cadeia leve da imunoglobulina humana e são deficientes na produção de anticorpos de ratinho. Veja-se, por exemplo, Green et al., Nature Genetics 7:13-21 (1994) e Patentes US 5.916.771, 5.939.598, 5.985.615, 5.998.209, 6.075.181, 6.091.001, 6.114.598, 6.130.364, 6.162.963, 6.150.584. Veja-se também documentos WO 91/10741, documento WO 94/02602, documento WO 96/34096, documento WO 96/33735, documento WO 98/16654, documento WO 98/24893, documento WO 98/50433, documento WO 99/45031, documento WO 99/53049, documento WO 00/09560 e WO 00/037504. 75

Em outro aspecto, a invenção proporciona um método para produzir anticorpos anti-ALK-1 a partir de anticorpos de animais não-humanos, não ratinhos mediante a imunização de animais transgénicos não humanos que compreendem locais de imunoglobulina humana com um antigeno de ALK-1. Pode-se produzir tais animais utilizando os métodos descritos nos documentos acima citados. Os métodos divulgados nestes documentos podem ser modificados como descrito na Patente US 5.994.619, que é por meio desta incorporada por referência. A Patente US 5.994.619 descreve métodos para a produção de novas células e linhas celulares de massa celular interna cultivada (CICM), derivadas de suinos e bovinos, e células CICM transgénicas em que o ADN heterólogo foi inserido. As células transgénicas de CICM podem ser usadas para produzir embriões, fetos e descendentes transgénicos clonados. A patente '619 também descreve métodos de produzir animais transgénicos que são capazes de transmitir o ADN heterólogo aos seus descendentes. Nas formas de realização preferidas da invenção corrente, os animais não humanos são mamíferos, particularmente ratos, ovinos, suinos, caprinos, bovinos, equinos e galinhas.

Os ratinhos XENOMOUSE® produzem um repertório humano semelhante a adulto de anticorpos completamente humanos e geram anticorpos humanos específicos do antigeno. Em algumas formas de realização, os ratinhos XENOMOUSE® contêm aproximadamente 80 % do repertório de gene V de anticorpo humano através da introdução da megabase feita sob medida, fragmentos de configuração da linha germinal dos locais de cadeia pesada humana e locais de cadeia leve capa no cromossoma artificial de levedura (YAC). Em outras formas de realização, os ratinhos XENOMOUSE® ainda contêm aproximadamente todo o local de cadeia leve lambda humano. Veja-se Mendez et al., Nature Genetics 15:146-156 (1997), Green e Jakobovits, J. Exp. Med. 188:483-495 (1998), e 76 documento WO 98/24893.

Em algumas formas de realização, os animais não humanos que compreendem os genes da imunoglobulina humana são animais que possuem uma imunoglobulina humana "minilocus". No método minilocus, um local Ig exógeno é imitado através da inclusão de genes individuais do local Ig. Assim, um ou mais genes VH, um ou mais genes DH, um ou mais genes Jh, um domínio constante mu, e um segundo domínio constante (preferivelmente um domínio constante gama) são formados numa construção para inserção num animal. Este método é descrito, entre outros, nas Patentes US N° 5.545.807, 5.545.806, 5.569.825, 5.625.126, 5.633.425, 5.661.016, 5.770.429, 5.789.650, 5.814.318, 5.591.669, 5.612.205, 5.721.367, 5.789.215, 5.643.763.

Em outro aspecto, a invenção proporciona um método para produzir anticorpos anti-ALK-1 humanizados. Em algumas formas de realização, os animais não humanos são imunizados com um antígeno ALK-1 conforme descrito a seguir sob condições que permitem a produção de anticorpos. As células produtoras de anticorpos são isoladas dos animais e ácidos nucleicos que codificam as cadeias pesadas e leves de um anticorpo anti-ALK-1 de interesse, são isoladas das células produtoras de anticorpos isoladas ou de uma linha celular imortalizada produzida a partir de tais células. Estes ácidos nucleicos são subsequentemente planejadas utilizando as técnicas conhecidas pelos peritos na especialidade e como descrito mais a seguir para reduzir a quantidade de sequência não humana, isto é, humanizar o anticorpo para reduzir a resposta imunológica em seres humanos. A imunização dos animais pode ser feita por qualquer método conhecido na técnica. Veja-se, por exemplo, Harlow e Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Nova Iorque: Cold Spring Harbor Press, 1990. Métodos para a imunização de animais não humanos como ratinhos, ratos, ovinos, caprinos, suínos, bovinos e cavalos são bem conhecidos na técnica. 77

Veja-se, por exemplo, Harlow e Lane, supra, e Patente US 5.994.619. Numa forma de realização preferida, o antígeno de ALK-1 é administrado com um adjuvante para estimular a resposta imune. Os adjuvantes exemplares incluem adjuvante de Freund completo ou incompleto, RIBI (dipéptidos de muramilo) ou ISCOM (complexos imunoestimuladores). Tais adjuvantes podem proteger o polipéptido da dispersão rápida mediante o sequestro num depósito local, ou eles podem conter substâncias que estimulam o hospedeiro a segregar factores que são quimiotácticas para os macrófagos e outras porções do sistema imune. Preferivelmente, se um polipéptido estiver sendo administrado, o plano de imunização envolverá duas ou mais administrações do polipéptido, espalhadas ao longo de várias semanas. 0 Exemplo 2 exemplifica um método para a produção de anticorpos monoclonais anti-ALK-1 em ratinhos XENOMOUSE®. Produção de Anticorpos e Linhas Celulares de Produção de Anticorpos

Após a imunização de um animal com um antigeno de ALK-1, os anticorpos e/ou células produtoras de anticorpos podem ser obtidos a partir do animal. Em algumas formas de realização, o soro contendo anticorpo anti-ALK-1 é obtido a partir do animal por hemorragia ou sacrifício do animal. 0 soro pode ser utilizado como é obtido do animal, uma fracção de imunoglobulina pode ser obtida do soro, ou os anticorpos anti-ALK-1 podem ser purificados a partir do soro.

Em algumas formas de realização, as linhas celulares produtoras de anticorpo são preparadas de células isoladas do animal imunizado. Após imunização, o animal é sacrificado e o nódulo linfático e/ou as células B esplénicas são imortalizadas por qualquer meio conhecido na técnica. Métodos de imortalizar as células incluem, mas não são limitados a, transfecção das mesmas com oncogenes, infecção das mesmas com um vírus oncogénico e cultivo das 78 mesmas sob condições que seleccionam as células imortalizadas, submissão das mesmas aos compostos carcinogénicos ou mutantes, fusão das mesmas com uma célula imortalizada, por exemplo, uma célula de mieloma, e inactivação das mesmas com um gene supressor tumoral. Veja-se, por exemplo, Harlow e Lane, supra. Se a fusão com células de mieloma for utilizada, as células de mieloma preferivelmente não segregam polipéptidos de imunoglobulina (uma linha celular não secretora).

As células imortalizadas são submetidas a rastreio usando ALK-1, ou uma porção desta. Numa forma de realização preferida, o rastreio inicial é realizado usando um imunoensaio (ELISA) ou um radioimunoensaio ligado a enzima. Um exemplo do rastreio ELISA é fornecido no documento WO 00/37504 .

As células produtoras de anticorpos anti-ALK-1, por exemplo, hibridomas, são seleccionadas, clonadas e ainda submetidas ao rastreio com relação as caracteristicas desejáveis, incluindo crescimento robusto, alta produção de anticorpos e caracteristicas de anticorpo desejáveis, como debatido mais a seguir. Os hibridomas podem ser expandidos in vivo em animais singeneicos, em animais que carecem de um sistema imune, por exemplo, ratinhos nus, ou em cultura celular in vitro. Métodos de selecção, clonagem e expansão de hibridomas são bem conhecidos daqueles de habilidade usual na técnica.

Numa forma de realização preferida, o animal imunizado é um animal não humano que expressa os genes da imunoglobulina humana e as células B esplénicas são fundidas à uma linha celular de mieloma da mesma espécie como o animal não humano. Numa forma de realização mais preferida, o animal imunizado é um ratinho XENOMOUSE® e a linha celular de mieloma é um mieloma de ratinho não secretor. Em mais uma forma de realização mais preferida, a linha celular de mieloma é P3-X63-Ag8.653 (Colecção 79

Americana de Culturas Celulares). Veja-se, por exemplo, o Exemplo 2.

Assim, numa forma de realização, a invenção proporciona métodos para produzir uma linha celular que produz um anticorpo monoclonal humano ou um fragmento deste direccionado à ALK-1 que compreende (a) imunizar um animal transgénico não humano descrito no presente documento com ALK-1, uma porção de ALK-1 ou uma célula ou tecido que expressa a ALK-1; (b) deixar o animal transgénico aumentar uma resposta imune à ALK-1; (c) isolar as células produtoras de anticorpos de animais transgénicos; (d) imortalizar as células produtoras de anticorpos; (e) criar as populações monoclonais individuais das células produtoras de anticorpos imortalizados; e (f) submeter o rastreio as células produtoras de anticorpos imortalizadas para identificar um anticorpo direccionado à ALK-1.

Em outro aspecto, a invenção proporciona uma linha celular que produz um anticorpo anti-ALK-1 humano. Em algumas formas de realização a linha celular é uma linha celular de hibridoma. Em algumas formas de realização, o hibridoma são hibridomas de ratinho, como descrito acima. Em outras formas de realização, os hibridomas são produzidos numa espécie não humana, não ratinho tal como ratos, ovinos, suinos, caprinos, bovinos e equinos. Em outra forma de realização, os hibridomas são hibridomas humanos.

Numa outra forma de realização, um animal transgénico é imunizado com um antigeno de ALK-1, as células primárias, por exemplo, células sanguíneas B do baço ou periféricas, são isoladas de um animal transgénico imunizado e as células individuais que produzem anticorpos específicos para o antigeno desejado são identificadas. 0 ARNm poliadenilado de cada célula individual é isolada e a reacção de cadeia polimerase de transcrição reversa (RT-PCR) é realizada utilizando iniciadores de sentido que 80 fortalecem as sequências de domínio variáveis, por exemplo, degeneram os iniciadores que reconhecem a maior parte ou todas as regiões FR1 dos genes de domínio variáveis de cadeia pesada e leve humanos e iniciadores antisenses que fortalecem as sequências de região constante ou de união. Os ADNc dos domínios variáveis de cadeia pesada e leve são depois clonados e expressos em qualquer célula hospedeira adequada, por exemplo, uma célula de mieloma, como anticorpos quiméricos com as respectivas regiões constantes de imunoglobulina, tais como os domínios de cadeia pesada e constantes κ ou λ. Veja-se Babcook, J.S. et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 93:7843-48, 1996. Os anticorpos anti-ALK-1 podem então ser identificados e isolados como foi descrito no presente documento.

Em outra forma de realização, técnicas de apresentação em fagos podem ser utilizadas para fornecer bibliotecas contendo um repertório de anticorpos com afinidades variáveis para ALK-1. Para a produção de tais repertórios, é desnecessário imortalizar a células B do animal imunizado. Pelo contrário, as células B primárias podem ser usadas directamente como uma fonte de ADN. A mistura de ADNc obtida a partir da célula B, por exemplo, derivada do baço, é utilizada para preparar uma biblioteca de expressão, por exemplo, uma biblioteca de apresentação em fagos transfectada em E. coli. As células resultantes são testadas com relação a imunorreactividade para ALK-1. Técnicas para a identificação de anticorpos humanos de alta afinidade de tais bibliotecas são descritas em Griffiths et al., EMBO J., 13:3245-3260 (1994); Nissim et al., Ibid, pp. 692-698 e em Griffiths et al., Ibid, 12:725-734.

Em última análise, os clones da biblioteca são identificados os quais produzem afinidades de ligação de uma magnitude desejada para o antígeno e para o ADN que codifica o produto responsável por esta ligação é recuperado e manipulado com relação à expressão 81 recombinante padrão. As bibliotecas de apresentação em fagos também podem ser construídas utilizando sequências de nucleótido anteriormente manipuladas e rastreio de forma semelhante. Em geral, os ADNc que codificam as cadeias pesadas e leves são independentemente fornecidos ou unidos para formar análogos Fv para produção na biblioteca de f ago. A biblioteca de fago é depois submetida o rastreio com relação aos anticorpos com as afinidades mais elevadas para ALK-1 e o material genético recuperado do clone adequado. Outros ciclos de rastreio podem aumentar a afinidade do anticorpo original isolado. Ácidos Nucleicos, Vectores, Células Hospedeiras e Métodos Recombinantes de Produção de Anticorpos Ácidos Nucleicos A presente invenção também abrange moléculas de ácido nucleico que codificam anticorpos anti-ALK-1 ou um fragmento de ligação a antigeno dos mesmos. Em algumas formas de realização, diferentes moléculas de ácido nucleico codificam uma cadeia pesada e uma cadeia leve de uma imunoglobulina anti-ALK-1. Em outras formas de realização, a mesma molécula de ácido nucleico codifica uma cadeia pesada e uma cadeia leve de uma imunoglobulina anti-ALK-1 .

Em algumas formas de realização, a molécula de ácido nucleico que codifica o domínio variável da cadeia leve (VL) utiliza um gene A27, A2, Al, A3, B3, B2, Ll e L2 VK humano, e um gene Jk5, Jkl, Jk3 ou Jk4 humano. Em algumas formas de realização a molécula de ácido nucleico utiliza um gene A27 VK humano e um gene Jk5 humano. Em outras formas de realização, a molécula de ácido nucleico utiliza um gene humano A2 e um gene humano Jkl. Em algumas formas de realização, a molécula de ácido nucleico que codifica a cadeia leve codifica uma sequência de aminoácido que compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 82 15 substituições da(s) sequência(s) de aminoácido da linha germinal. Em algumas formas de realização, a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de nucleótidos que codifica uma sequência de aminoácido VL que compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 substituições de aminoácido conservadoras e/ou 1, 2 ou 3 substituições não conservadora em comparação com as sequências VK e Jk da linha germinal. As substituições podem ser nas regiões do CDR, nas regiões estruturais, ou no domínio constante.

Em algumas formas de realização, a molécula de ácido nucleico codifica uma sequência de aminoácidos VL que compreende uma ou mais mutações em comparação com a sequência da linha germinal que são idênticas às mutações da linha germinal observadas no VL de qualquer um dos anticorpos 1.12.1; 1.12.1 (rWT); 1.12.1 (M29I/D19A); 1.12.1 (M29I); 1.12.1 (D19A); 1.13.1; 1.14.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13;

Em algumas formas de realização, a molécula de ácido nucleico codifica pelo menos três substituições de aminoácido em comparação com a sequência da linha germinal que são idênticas às mutações da linha germinal observadas no VL de qualquer um dos anticorpos 1.12.1; 1.12.1 (rWT); 1.12.1 (M29I/D19A); 1.12.1 (M29I); 1.12.1 (D19A); 1.13.1; 1.14.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.9.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1.

Em algumas formas de realização, a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de nucleótidos seleccionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 7, 15, 19, 27, 31, 39, 43, 47, 51, 55, 59, 63, 67, 71 ou 126, que codifica a sequência de aminoácidos VL de anticorpo monoclonal 1.12.1 (M29I/D19A); 1.13.1; 1.14.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.9.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; ou 1.12.1. 83

Em algumas formas de realização, a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de nucleótidos que codifica a sequência de aminoácido de uma das SEQ ID NOs: 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56; 60; 64; 68; 72, 76, 80, 84, 88 e 92 ou 127. Em algumas formas de realização, a molécula de ácido nucleico compreende a sequência do nucleótido da SEQ ID NO: 3 ou uma parte desta. Em algumas formas de realização, o ácido nucleico codifica a sequência de aminoácido da cadeia luz de um, dois ou três CDRs do dito anticorpo. Em algumas formas de realização, o dito porção codifica uma região contigua de CDR1-CDR3 da cadeia leve de um anticorpo anti-ALK-1.

Em algumas formas de realização, a molécula de ácido nucleico codifica uma sequência de aminoácido VI que é pelo menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % ou 99 % idêntica à sequência de aminoácido VL de qualquer um dos anticorpos 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1 (rWT); 1.12.1 (M29I/D19A); 1.12.1 (M29I) ; 1.12.1 (D19A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1 ou 5.59.1, ou com a sequência de aminoácido da região VI da SEQ ID NO: 4. As moléculas de ácido nucleico da invenção incluem ácidos nucleicos que hibridam sob condições muito restringentes, tais como aquelas acima descritas, ou que são pelo menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % ou 99 % idênticas a um ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácido da região VL da SEQ ID NOs: 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88 e 92 ou 126 ou a um ácido nucleico que compreende a sequência de nucleótidos da região VL da SEQ ID NO: 4.

Em outras formas de realização preferidas, a molécula de ácido nucleico codifica o dominio variável de uma cadeia pesada (VH) que utiliza uma sequência genética VH 4-31, VH 84 3-11, Vh 4-61 ou VH 4-59 humana ou uma sequência derivada desta. Em algumas formas de realização, a molécula de ácido nucleico utiliza um gene humano Vh 4-31, um gene DH6-19 e um gene humano JH4B.

Em algumas formas de realização, a molécula de ácido nucleico codifica uma sequência de aminoácido que compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11 mutações comparadas com a sequência de aminoácido da linha germinal dos genes V, D ou J humanos. Em algumas formas de realização, as ditas mutações estão na região VH. Em algumas formas de realização, ditas mutações estão nas regiões de CDR.

Em algumas formas de realização, a molécula de ácido nucleico codifica uma sequência VH que compreende uma ou mais mutações de aminoácido em comparação com a sequência Vh da linha germinal que são idênticas às mutações de aminoácido observadas no VH de qualquer um dos anticorpos monoclonais 1.12.1; 1.12.1 (rWT); 1.12.1 (M29I/D19A); 1.12.1 (M29I); 1.12.1 (D19A); 1.13.1; 1.14.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.9.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; ou 5.13.1. Em algumas formas de realização, o ácido nucleico codifica pelo menos três mutações de aminoácido comparadas com as sequências da linha germinal que são idênticas a pelo menos três mutações de aminoácido observadas num dos anticorpos monoclonais listados acima.

Em algumas formas de realização, a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de nucleótidos seleccionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 5, 13, 17, 25, 29, 37, 41, 45, 49, 53, 57, 61, 65, 69, 73, ou 103, que codifica a sequência de aminoácidos Vh do anticorpo monoclonal 1.12.1 (M29I/D19A); 1.13.1; 1.14.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; ou 1.12.1.

Em algumas formas de realização, a molécula de ácido 85 nucleico compreende uma sequência de nucleótidos que codifica a sequência de aminoácido de uma das SEQ ID NOs: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 50, 54, 58, 62, 66, 70, 74, 78, 82, 86, 90 ou 104. Em várias formas de realização preferidas, a molécula de ácido nucleico compreende pelo menos uma parte da sequência de nucleótidos de SEQ ID NOS: 1 ou 95. Em algumas formas de realização, a dita parte codifica a região VH, uma região CDR3, todas as três regiões CDR, ou uma região contigua incluindo CDR1-CDR3.

Em algumas formas de realização, a molécula de ácido nucleico codifica uma sequência de aminoácido VH que é pelo menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % ou 99 % idêntica à sequência de aminoácido VH em qualquer uma das SEQ ID NOS: 2, 6, 10 , 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 50, 54, 58, 62, 66, 70, 74, 78, 82, 86, 90 ou 104. As moléculas de ácido nucleico da invenção incluem ácidos nucleicos que hibridam sob condições muito restringentes, tais como aquelas acima descritas, ou que são pelo menos 70 %, 75 %, 80 % , 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 ! % ou 99 % idênticas a um ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácido das SEQ ID NOs: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 50, 54, 58, 62, 66, 70, 74, 78, 82, 86, 90, 100 ou 104, ou a uma região VH desta, ou a um ácido

nucleico que compreende a sequência de nucleótidos das SEQ ID NOs: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 49, 53, 57, 61, 65, 69, 73, 77, 81, 85, 89, 95, 103, 128 ou 129, ou a sequência de nucleótidos que codifica uma região VH desta.

Em outra forma de realização, o ácido nucleico codifica uma cadeia pesada de comprimento total de um anticorpo seleccionado a partir do grupo consistindo em 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1 (rWT); 1.12.1 (M29I/D19A); 1.12.1 (M29I); 1.12.1 (D19A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 86 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1 e 5.59.1, ou uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2. Além disso, o ácido nucleico pode compreender a sequência de nucleótidos das SEQ ID NOs: 1 ou 95.

Uma molécula de ácido nucleico que codifica a cadeia pesada ou leve de um anticorpo anti-ALK-1 ou suas porções conforme foi reivindicado pode ser isolada de qualquer fonte que produza tal anticorpo. Em várias formas de realização, as moléculas de ácido nucleico são isoladas de uma célula B que expressa um anticorpo anti- ALK-1 isolado de um animal imunizado com ALK-1 ou de uma célula imortalizado derivada de uma tal célula B. Métodos de isolar ácidos nucleicos que codificam um anticorpo são bem conhecidos na técnica. Veja-se, por exemplo, Sambrook J. & Russell D.. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed.,

Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.I. (2000) . O ARNm pode ser isolado e utilizado para produzir ADNc para utilização na reacção de cadeia polimerase (PCR) ou clonagem de ADNc de genes de anticorpo. Numa forma de realização preferida, a molécula de ácido nucleico é isolada de um hibridoma que possui como um de seus pares de fusão uma célula de um animal transgénico não humano, a dita célula produzindo uma imunoglobulina humana. Numa forma de realização ainda mais preferida, a célula produtora de imunoglobulina humana é isolada de um animal XENOMOUSE®. Em outra forma de realização, a célula produtora da imunoglobulina humana é isolada de um animal transgénico não humano, não ratinho, como descrito acima. Em outra forma de realização, o ácido nucleico é isolado de um animal não humano, não transgénico. As moléculas de ácido nucleico isoladas de um animal não-humano, não transgénico podem ser usadas, por exemplo, para anticorpos humanizados que compreendem uma ou mais sequências de 87 aminoácidos de um anticorpo anti-ALK-1 humano da presente invenção.

Em algumas formas de realização, um ácido nucleico que codifica uma cadeia pesada de um anticorpo anti-ALK-1 da invenção pode compreender uma sequência de nucleótidos que codifica um domínio VH da invenção unida estruturalmente a uma sequência de nucleótidos que codifica um domínio constante de cadeia pesada de qualquer fonte. Do mesmo modo, uma molécula ácido nucleico que codifica uma cadeia leve de um anticorpo anti-ALK-1 da invenção pode compreender uma sequência de nucleótidos que codifica um domínio VL da invenção unida estruturalmente a uma sequência de nucleótidos que codifica um domínio constante de cadeia leve de qualquer fonte.

Num outro aspecto da invenção, as moléculas de ácido nucleico que codificam o domínio variável das cadeias pesadas (VH) e/ou leves (VI) são "convertidas" em genes de anticorpo de comprimento total. Numa forma de realização, as moléculas de ácido nucleico que codificam os domínios VH ou VL são convertidas em genes de anticorpo de comprimento total mediante a inserção numa expressão vector que codifica anteriormente os domínios constantes de cadeia pesada (CH) ou constantes de cadeia leve (Cl), respectivamente, de tal forma que o segmento Vh está operativamente ligado ao(s) segmento(s) CH dentro do vector, e/ou o segmento VL está operativamente ligado ao segmento Cl dentro do vector. Em outra forma de realização, as moléculas de ácido nucleico que codificam os domínios Vh e/ou VL são convertidas em genes de anticorpo de comprimento total através da união, por exemplo, ligação, de uma molécula de ácido nucleico que codifica um domínio VH e/ou VL a uma molécula de ácido nucleico que codifica um domínio CHe/ou CL usando técnicas biomoleculares padrão. As sequências de ácido nucleico de genes de domínio constante da imunoglobulina de cadeia pesada e leve são conhecidas na 88 técnica. Kabat et al.r Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed., NIH Publ. N° 91-3242, 1991. As moléculas de ácido nucleico que codificam as cadeias pesadas e/ou leves de comprimento total podem, então, ser expressas a partir de uma célula em que elas foram introduzidas e o anticorpo anti-ALK-1 isolado.

As moléculas de ácido nucleico podem ser usadas para recombinantemente expressar grandes quantidades de anticorpos anti-ALK-1. As moléculas de ácido nucleico também podem ser utilizadas para produzir anticorpos quiméricos, anticorpos biespecificos, anticorpos de cadeia única, imunoadesinas, diacorpos, anticorpos transformados e derivados de anticorpo, como descrito mais a seguir. Se as moléculas de ácido nucleico forem derivadas de um animal não humano, não transgénico, as moléculas de ácido nucleico podem ser utilizadas para a humanização de anticorpos, também como será descrito a seguir.

Em outra forma de realização, uma molécula de ácido nucleico da invenção é usada como uma sonda ou iniciador de PCR para uma sequência de anticorpo especifica. Por exemplo, o ácido nucleico pode ser usado como uma sonda em métodos de diagnóstico ou como um iniciador de PCR para amplificar as regiões de ADN que podem ser utilizadas, entre outros, para isolar as moléculas de ácido nucleico adicionais que codificam os domínios variáveis de anticorpos anti-ALK-1. Em algumas formas de realização, as moléculas de ácido nucleico são oligonucleótidos. Em algumas formas de realização, os oligonucleótidos são domínios altamente variáveis das cadeias leves e pesadas do anticorpo de interesse. Em algumas formas de realização, os oligonucleótidos codificam toda ou uma parte de um ou mais dos CDRs de anticorpos 1.12.1; 1.12.1 (rWT); 1.12.1 (M29I/D19A); 1.12.1 (M29I); 1.12.1 (D19A); 1.13.1; 1.14.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.9.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; ou 5.13.1 ou suas 89 variantes como foi descrito no presente documento.

Vectores A invenção proporciona vectores que compreendem moléculas de ácido nucleico que codificam a cadeia pesada de um anticorpo anti-ALK-1 da invenção ou uma porção de ligação a antigeno do mesmo. A invenção proporciona também vectores que compreendem moléculas de ácido nucleico que codificam a cadeia leve de tais anticorpos ou porção de ligação a antigeno dos mesmos. A invenção proporciona ainda vectores que compreendem moléculas de ácido nucleico que codificam as proteínas de fusão, anticorpos modificados, fragmentos de anticorpo, e sondas destas.

Em algumas formas de realização, os anticorpos anti-ALK-1 da invenção ou porções de ligação a antigeno são expressos através da inserção de ADN que codificam as cadeias leves e pesadas de comprimento parcial ou total, obtidas como descrito acima, em vectores de expressão tais que os genes são operativamente ligados às necessárias sequências de controlo de expressão tais como as sequências de controlo transcricionais e traducionais. Os vectores de expressão incluem plasmideos, retrovirus, adenovirus, virus associados com adeno (AAV), virus de planta tais como o virus mosaico da couve-flor, virus do mosaico do tabaco, cosmideos, YACs, epissomas derivados de EBV, e similares. 0 gene de anticorpo é ligado num vector tal que as sequências de controlo transcricionais e traducionais dentro do vector servem à sua função destinada de regulação da transcrição e translação do gene de anticorpo. 0 vector de expressão e as sequências de controlo da expressão são escolhidos para serem compatíveis com a célula hospedeira de expressão usada. 0 gene de cadeia leve de anticorpo e o gene de cadeia pesada de anticorpo podem ser inseridos em vectores separados. Numa forma de realização preferida, ambos os genes são inseridos no mesmo vector de expressão. Os genes de anticorpo são inseridos no vector de expressão por 90 métodos padrão (por exemplo, ligação dos locais de restrição complementares sobre o fragmento genético de anticorpo e vectores, ou ligação final abrupta se nenhum local de restrição estiver presente).

Um vector conveniente é aquele que codifica uma sequência de imunoglobulina CH ou CL humana funcionalmente completa, com os locais de restrição apropriados planejados de modo que qualquer sequência de VH ou VL possa facilmente ser inserida e expressa, como descrito acima. Em tais vectores, junção geralmente ocorre entre o local doador da junção na região J inserida e o local aceitante da junção precedendo o dominio C humano, e também nas regiões de junção que ocorrem dentro dos exões Ch humanos. O término da poliadenilação e transcrição ocorre nos locais cromossómicos nativos a jusante das regiões de codificação. 0 vector de expressão recombinante também pode codificar um péptido de sinal que facilita a secreção da cadeia de anticorpo de uma célula hospedeira. O gene da cadeia de anticorpo pode ser clonado no vector tal que o péptido de sinal esteja ligado estruturalmente ao amino terminal da cadeia de imunoglobulina. O péptido de sinal pode ser um péptido de sinal da imunoglobulina ou um péptido de sinal heterólogo (isto é, um péptido de sinal de uma proteina não imunoglobulina).

Além dos genes de cadeia de anticorpo, os vectores de expressão recombinantes da invenção transportam sequências reguladoras que controlam a expressão dos genes da cadeia de anticorpo numa célula hospedeira. Será observado por aqueles versados na técnica que a concepção do vector de expressão, incluindo a selecção das sequências reguladoras pode depender de tais factores como a escolha da célula hospedeira a ser transformada, o nivel de expressão da proteina desejada, etc. As sequências reguladoras preferidas para a expressão da célula hospedeira de mamíferos incluem elementos virais que direccionam os 91 niveis elevados de expressão de proteína em células de mamífero, tais como promotores e/ou intensificadores derivados de LTRs retrovirais, citomegalovírus (CMV) (tais como o promotor/intensificador CMV), Simian Virus 40 (SV40) (tais como o promotor/intensificador SV40), adenovírus, (por exemplo, o promotor tardio principal de adenovírus (AdMLP)), polioma e promotores de mamífero fortes tais como a imunoglobulina nativa e promotores de actina. Para outra descrição de elementos reguladores virais, e suas sequências, veja-se, por exemplo, a Patente US N° 5.168.062, Patente US N° 4.510.245 e Patente US N° 4.968.615. Métodos para expressar anticorpos em plantas, incluindo uma descrição dos promotores e vectores, assim como a transformação de plantas, são conhecidos na técnica. Veja-se, por exemplo, a Patente US N° 6.517.529. Métodos de expressar polipéptidos em células bacterianas ou células fúngicas, por exemplo, células de levedura, também são bem conhecidos na técnica.

Além dos genes de cadeia de anticorpos e sequências reguladoras, os vectores de expressão recombinante da invenção podem carregar sequências adicionais, tais como sequências que regulam a replicação do vector nas células hospedeiras (por exemplo, origens de replicação) e genes marcadores seleccionáveis. O gene marcador seleccionável facilita a selecção de células hospedeiras em que o vector foi introduzido (veja-se, por exemplo, as Patentes US N° 4.399.216, 4.634.665, 5.179.017). Por exemplo, tipicamente o gene marcador seleccionável confere resistência aos medicamentos, tais como G418, higromicina ou metotrexato, numa célula hospedeira em que o vector foi introduzido. Por exemplo, os genes marcadores seleccionáveis incluem o gene diidrofolato reductase (DHFR) (para utilização em células hospedeiras do dhfr com selecção/amplificação de metotrexato), o neo gene (para selecção G418), e o gene glutamato sintetase. 92 Células Hospedeiras de não Hibridomas e Métodos de Produzir Recombinantemente Proteína

As moléculas de ácido nucleico que codificam anticorpos anti- ALK-1 e vectores que compreendem estas moléculas de ácido nucleico podem ser usadas para a transfecção de uma célula hospedeira adequada de mamífero, planta, bacteriana ou levedura. A transformação pode ser feita por qualquer método conhecido para a introdução de polinucleótidos numa célula hospedeira. Métodos para a introdução de polinucleótidos heterólogos em células de mamífero são bem conhecidos na técnica e incluem a transfecção mediada por dextrano, precipitação de fosfato de cálcio, transfecção mediada por polibreno, a fusão protoplástica, electroporação, encapsulamento do(s) polinucleótido(s) em lipossomas, e microinjecção directa do ADN em núcleos. Além disso, as moléculas de ácido nucleico podem ser introduzidas nas células de mamífero por vectores virais. Métodos de transformar células são bem conhecidos na técnica. Veja-se, por exemplo, as Patentes US N° 4.399.216, 4.912.040, 4.740.461 e 4.959.455). Métodos de transformar células vegetais são bem conhecidos na técnica, incluindo, por exemplo, a transformação mediada por Agrobacterium, transformação biolística, injecção directa, electroporação e transformação virai. Os métodos de transformar células bacterianas e de levedura também são bem conhecidos na técnica. carcinoma

As linhas celulares de mamífero disponíveis como hospedeiros para expressão são bem conhecidas na técnica e incluem muitas linhas celulares imortalizadas disponíveis da Colecção Americana de Culturas Celulares (ATCC). Estas incluem, entre outros, células do ovário de hamster chinês (CHO), células NSO, células SP2, células HEK-293T, células 293 Freestyle (Invitrogen), células NIH-3T3, células HeLa, células renais de hamster bebé (BHK), células renais do macaco verde africano (COS), células do 93 hepatocelular humanas (por exemplo, Hep G2), células A549, e várias outras linhas celulares. As linhas celulares de preferência particular são seleccionadas através da determinação de quais linhas celulares possuem niveis de expressão elevados. Outras linhas celulares que podem ser utilizadas são linhas celulares de insecto, tais como células Sf9 ou Sf21. Quando os vectores de expressão recombinantes que codificam os genes de anticorpo forem introduzidos em células hospedeiras de mamífero, os anticorpos são produzidos pelo cultivo das células hospedeiras por um período de tempo suficiente para levar em conta a expressão do anticorpo nas células hospedeiras ou, mais preferivelmente, secreção do anticorpo no meio de cultura em que as células hospedeiras são cultivadas. Os anticorpos podem ser recuperados a partir do meio de cultura, utilizando métodos de purificação de proteína padrão. As células hospedeiras de planta incluem, por exemplo, Nicotiana, Arabidopsis, lentilha d'água, milho, trigo, batata, etc. As células hospedeiras bacterianas incluem espécies E. coli e Streptomyces. As células hospedeiras de levedura incluem Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae e Pichia pastoris.

Além disso, a expressão de anticorpos da invenção a partir da produção de linhas celulares pode ser reforçada usando várias técnicas conhecidas. Por exemplo, o sistema de expressão genética de sintetase de glutamina (o sistema GS) é uma abordagem comum para reforçar a expressão sob certas condições. 0 sistema GS é debatido no todo ou em parte em conexão com as Patentes Europeias N° 0 216 846, 0 256 055, 0 323 997, 0 338 841. É provável que os anticorpos expressos por diferentes linhas celulares ou em animais transgénicos terão diferentes glicosilação uns com os outros. No entanto, todos os anticorpos codificados pelas moléculas de ácido nucleico aqui fornecidas, ou que compreende as sequências 94 de aminoácidos aqui fornecidas são parte da presente invenção, independente da glicosilação dos anticorpos. Animais e Plantas Transgénicas

Os anticorpos anti-ALK-1 da invenção também podem ser produzidos transgenicamente através da geração de um mamífero ou planta que é transgénica com relação as sequências de cadeia pesada e leve da imunoglobulina de interesse e produção do anticorpo numa forma recuperável. Em conexão com a produção transgénica em mamíferos, os anticorpos anti- ALK-1 podem ser produzidos, e recuperados, no leite de cabras, vacas, ou de outros mamíferos. Veja-se, por exemplo, as Patentes US N° 5.827.690, 5.756.687, 5.750.172, 5.741.957. Em algumas formas de realização, os animais transgénicos não humanos que compreendem locais de imunoglobulina humana são imunizados com ALK-1 ou uma porção imunogénico desta, como descrito acima. Os métodos para a produção de anticorpos em plantas são descritos, por exemplo, nas Patentes US N° 6.046.037 e 5.959.177.

Em algumas formas de realização, os animais transgénicos não humanos ou plantas são produzidos através da introdução de uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam um anticorpo anti-ALK-1 da invenção nos animais ou plantas mediante técnicas transgénicas padrão. Veja-se Hogan e Patente US N° 6.417.429, supra. As células transgénicas utilizadas para a produção de animais transgénicos podem ser células estaminais embriónicas ou células somáticas ou um óvulo fecundado. Os organismos não humanos transgénicos podem ser quiméricos, heterozigotos não quiméricos e homozigotos não quiméricos. Veja-se, por exemplo, Hogan et ai., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual 2a ed., Cold Spring Harbor Press (1999); Jacksori et ai., Mouse Genetics e Transqenics: A Practical Approach, Oxford University Press (2000); e Pinkert, Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook.

Academic Press (1999) . Em algumas formas de realização, os 95 animais transgénicos não humanos possuem uma ruptura direccionada e substituição por um construção direccionado que codifica uma cadeia pesada e/ou uma cadeia leve de interesse. Numa forma de realização preferida, os animais transgénicos compreendem e expressam as moléculas de ácido nucleico que codificam as cadeias pesadas e leves que se ligam especificamente à ALK-1, de preferência ALK- 1 humana. Em algumas formas de realização, os animais transgénicos compreendem moléculas de ácido nucleico que codificam um anticorpo modificado tal como um anticorpo de cadeia única, um anticorpo quimérico ou um anticorpo humanizado. Os anticorpos anti-ALK-1 podem ser produzidos em qualquer animal transgénico. Numa forma de realização preferida, os animais não humanos são ratinhos, ratos, ovinos, suinos, caprinos, bovinos e equinos. 0 animal transgénico não humano expressa ditos polipéptidos codificados no sangue, leite, urina, saliva, lágrima, muco e outros fluidos corporais.

Bibliotecas de Visualização em Faqos A invenção proporciona um método para produzir um anticorpo anti- ALK-1 ou porção de ligação a antigeno do mesmo que compreende as etapas de sintetizar uma biblioteca de anticorpos humanos em fago, fazer o rastreio da biblioteca com ALK-1 ou uma porção de ligação ao anticorpo destes, isolar o fago que se liga à ALK-1, e obter o anticorpo do fago. Por meio de exemplo, um método para preparar da biblioteca de anticorpos para utilização nas técnicas de apresentação em fagos (phage display) compreende as etapas de imunizar um animal não humano que compreende locais de imunoglobulina humana com ALK-1 ou uma porção antigénico deste para criar uma resposta imunológica, extraindo as células produtoras de anticorpo do animal imunizado; isolar o ARN que codifica as cadeias leves e pesadas de anticorpos da invenção da células extraídas, inverter transcrevendo o ARN para produzir ADNc, 96 amplificar o ADNc utilizando iniciadores, e inserir o ADNc num vector de apresentação em fagos tal que os anticorpos sejam expressos no fago. Os anticorpos anti-ALK- 1 recombinantes da invenção podem ser obtidos desta forma.

Os anticorpos anti-ALK-1 humanos recombinantes da invenção podem ser isolados mediante o rastreio de uma biblioteca de anticorpo combinatória recombinante. Preferivelmente a biblioteca é uma biblioteca de apresentação em fagos scFv, gerada usando ADNc humanos VL e VH preparados a partir do ARNm isolado das células B. Métodos para a preparação e rastreio de tais bibliotecas são conhecidos na técnica. Kits para gerar bibliotecas de apresentação em fagos estão comercialmente disponíveis (por exemplo, the Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, N° de catálogo 27-9400-01; e o kit de apresentação em fagos Stratagene SurfZAP™, N° de catálogo 240612). Há também outros métodos e reagentes que podem ser utilizados na geração e rastreio das bibliotecas de visualização de anticorpos (veja-se, por exemplo, a Patente US N° 5.223.409; Publicações PCT N° WO 92/18619, documento WO 91/17271, documento WO 92/20791, documento WO 92/15679, documento WO 93/01288, documento WO 92/01047, documento WO 92/09690; Fuchs et al. , Bio/Technology 9:1370-1372 (1991); Hay et al., Hum. Antibod. Hybridomas 3:81 85 (1992); Huse et al., Science 246:1275 1281 (1989); McCafferty et al., Nature 348:552 554 (1990); Griffiths et al., EMBO J. 12:725 734 (1993); Hawkins et al. , J. Mol. Biol. 226:889 896 (1992); Clackson et al., Nature 352:624 628 (1991); Gram et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:3576 3580 (1992); Garrad et al., Bio/Technology 9:1373 1377 (1991); Hoogenboom et al., Nuc. Acid Res. 19:4133 4137 (1991); e Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 88:7978 7982 (1991).

Numa forma de realização, para isolar e produzir anticorpos anti-ALK-1 humanos com as caracteristicas desejadas, um anticorpo anti-ALK-1 humano como foi descrito 97 no presente documento é primeiro usado para seleccionar as sequências de cadeia pesada e leve humanas tendo actividade de ligação similar em direcção a ALK-1, usando os métodos de impressão de epítopo descritos na Publicação PCT N° WO 93/06213. As bibliotecas de anticorpo utilizadas neste método são preferivelmente bibliotecas scFv preparadas e submetidas ao rastreio conforme descrito na Publicação PCT N° WO 92/01047, McCafferty et al. , Nature 348:552 554 (1990); e Griffiths et al., EMBO J. 12 : 725.734 (1993). As bibliotecas de anticorpo scFv preferivelmente são submetidas ao rastreio usando ALK-1 humana como o antigeno.

Assim que os dominios VL e VH humanos são seleccionados, as experiências de "mistura e comparação" são realizadas, em que diferentes pares dos segmentos VL e Vh inicialmente seleccionados são submetidos o rastreio com relação a ligação de ALK-1 para seleccionar as combinações de pares VL/VH preferida. Adicionalmente, para ainda melhorar a qualidade do anticorpo, os segmentos VL e VH do(s) par(es) VL/VH preferido(s) podem ser aleatoriamente transformados, de preferência dentro da região CDR3 de VH e/ou VL, num processo análogo ao processo de mutação somática in vivo responsável pela maturação por afinidade de anticorpos durante uma resposta imune natural. Esta maturação por afinidade in vitro pode ser executada pela amplificação dos dominios VH e VL usando iniciadores da PCR complementares ao Vh CDR3 ou VL CDR3, respectivamente, cujos iniciadores foram "bloqueados" com uma mistura aleatória das quatro bases de nucleótido em certas posições tal que os produtos da PCR resultantes codificam os segmentos VH e VL em que as mutações aleatórias foram introduzidas nas regiões CDR3 VH e/ou VL. Estes segmentos VH e VL aleatoriamente transformados podem ser reexaminados com relação a ligação à ALK-1.

Após o rastreio e isolamento de um anticorpo anti-ALK-1 da invenção de uma biblioteca de apresentação de 98 imunoglobulina recombinante, os ácidos nucleicos que codificam o anticorpo seleccionado podem ser recuperados da "pacote de apresentação" (por exemplo, a partir do genoma fago) e subclonados em outros vectores de expressão por técnicas de ADN recombinantes padrão. Se desejado, o ácido nucleico pode ainda ser manipulado para criar outras formas de anticorpo da invenção, como será descrito a seguir. Para expressar um anticorpo humano recombinante isolado pelo rastreio de uma biblioteca combinatória, o ADN que codifica o anticorpo é clonado num vector de expressão recombinante e introduzido numa célula hospedeira de mamifero, como descrito acima.

Anticorpos Desimunizados

Num outro aspecto da invenção, o anticorpo pode ser desimunizado para reduzir a sua imunogenicidade usando as técnicas descritas nas, por exemplo, Publicações PCT N° WO 98/52976 e WO 00/34317.

Anticorpos Mutados

Numa outra forma de realização, as moléculas de ácido nucleico, vectores e células hospedeiras podem ser utilizadas para produzir anticorpos anti- ALK-1 mutados. Os anticorpos podem ser transformados nos dominios variáveis das cadeias pesadas e/ou leves, por exemplo, para alterar uma propriedade de ligação do anticorpo. Por exemplo, uma mutação pode ser feita numa ou mais das regiões de CDR para aumentar ou diminuir a KD do anticorpo com relação a ALK-1, para aumento ou diminuir a k0ff, ou alterar a especificidade de ligação do anticorpo. As técnicas na mutagénese direccionada ao local são bem conhecidas na técnica. Veja-se, por exemplo, Sambrook et al e Ausubel et ai, supra. Em outra forma de realização, uma ou mais mutações são feitas num residuo de aminoácido que é conhecido por ser alterado, em comparação com a linha germinal no anticorpo monoclonal 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1 (rWT); 1.12.1 (M29I/D19A); 1.12.1 (M29I); 1.12.1 (D19A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 99 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1 ou 5.59.1. As mutações podem ser feitas numa região de CDR ou região estrutural de um dominio variável, ou num dominio constante. Numa forma de realização preferida, as mutações são feitas num dominio variável. Em algumas formas de realização, uma ou mais mutações são feitas num residuo de aminoácido que é conhecido por ser alterado em comparação com a linha germinal numa região de CDR ou região estrutural de um dominio variável de uma sequência de aminoácido SEQ ID NO: 2, 4,6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 , 80 , 82 , 84, 86 , 88 , 90 92 ou 127, ou cuja sequência de ácido nucleico é apresentada na SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, li, : 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 95, 102 ou 126. Em outra forma de realização, a região estrutural é transformada de modo que a(s) região(ões) estruturais resultantes possui(em) a sequência de aminoácido do gene da linha germinal correspondente. Uma mutação pode ser feita numa região estrutural ou dominio constante para aumentar a meia-vida do anticorpo anti-ALK-1. Veja-se, por exemplo, a Publicação PCT N° WO 00/09560. Uma mutação numa região estrutural ou dominio constante também pode ser feita para alterar a imunogenicidade do anticorpo, para fornecer um local para a ligação covalente ou não covalente numa outra molécula, ou para alterar tais propriedades como fixação complementar, ligação de FcR e citotoxicidade mediada pela célula dependente de anticorpo (ADCC). De acordo com a invenção, um único anticorpo pode ter mutações em qualquer um ou mais dos CDRs ou regiões estruturais do dominio variável ou no dominio constante. 100

Em algumas formas de realização, existem de 1 a 13, incluindo qualquer número no intervalo, as mutações de aminoácido nos domínios VH ou VL do anticorpo anti-ALK-1 mutado em comparação com o anticorpo anti- ALK-1 antes da mutação. Em qualquer um do acima, as mutações podem ocorrer numa ou mais regiões de CDR. Além disso, qualquer uma das mutações podem ser substituições de aminoácido conservadoras. Em algumas formas de realização, não há mais do que 5, 4, 3, 2, ou 1 mudança de aminoácido nos domínios constante.

Anticorpos Modificados

Em outra forma de realização, um anticorpo de fusão ou imunoadesina podem ser produzidos o que compreende todo ou uma parte de um anticorpo anti-ALK-1 da invenção ligada a outro polipéptido. Numa forma de realização preferida, apenas os domínios variáveis do anticorpo anti-ALK-1 são ligados ao polipéptido. Numa outra forma de realização preferida, o domínio Vh de um anticorpo anti-ALK-1 é ligado a um primeiro polipéptido, enquanto o domínio VI de um anticorpo anti-ALK-1 é ligada a um segundo polipéptido que se associa com o primeiro polipéptido de uma maneira tal que os domínios Vh e VI podem interagir um com o outro para formar um local de ligação a antígeno. Em outra forma de realização preferida, o domínio VH é separado do domínio VL por um articulador tal que os domínios VH e VL podem interagir um com o outro (veja-se a seguir sob Anticorpos de Cadeia Única). 0 anticorpo Vh-ligante-VL é depois ligado ao polipéptido de interesse. Além disso, os anticorpos de fusão podem ser criados em que dois (ou mais) anticorpos de cadeia única são ligados um ao outro. Isto é útil se alguém quiser criar um anticorpo divalente ou polivalente numa cadeia de polipéptido única, ou se alguém quiser criar um anticorpo biespecífico.

Para criar um anticorpo de cadeia única, (scFv), os fragmentos de ADN codificadores de VH e VL são 101 operativamente ligados a outro fragmento que codifica um articulador flexível, por exemplo, que codifica a sequência de aminoácidos (Gly4-Ser)3, tal que as sequências de Vh e VL podem ser expressas como uma proteína de cadeia única contígua, com os domínios VL e VH unidos pelo articulador flexível. Veja-se, por exemplo, Bird et al., Science 242:423 426 (1988); Hustori et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:5879 5883 (1988); McCafferty et al., Nature 348:552 554 (1990). Os anticorpos de cadeia única podem ser monovalentes, se apenas um Vh e VL isolados for utilizado, bivalente, se dois VH e VL forem utilizados, ou polivalente, se mais do que dois VH e VL forem utilizados. Os anticorpos biespecíficos ou polivalentes podem ser gerados os quais se ligam especificamente à ALK-1 e a uma outra molécula.

Em outras formas de realização, outros anticorpos modificados podem ser preparados utilizando anticorpo anti-ALK-1 que codifica as moléculas de ácido nucleico. Por exemplo, "Kappa bodies" (III et al., Protein Eng. 10: 949-57 (1997)), "Minibodies" (Martin et al., EMBO J. 13: 5303-9 (1994)), "Diabodies " (Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 6444-6448 (1993)), ou "Janusins" (Traunecker et al., EMBO J. 10:3655-3659 (1991) e Traunecker et al., Int. J. Câncer (Supl.) 7:51-52 (1992)) podem ser preparados usando técnicas biomoleculares padrão seguindo os ensinamentos da memória descritiva.

Os anticorpos biespecíficos ou fragmentos de ligação a antígeno podem ser produzidos por uma variedade de métodos incluindo a fusão de hibridomas ou ligação de fragmentos Fab' . Veja-se, por exemplo, Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321 (1990), Kostelny et al., J. Immunol. 148:1547-1553 (1992). Além disso, os anticorpos biespecíficos podem ser formados como "diacorpos" ou "Janusins". Em algumas formas de realização, o anticorpo biespecífico se liga a dois epítopos diferentes da ALK-1. 102

Em algumas formas de realização, o anticorpo biespecífico possui uma primeira cadeia pesada e uma primeira cadeia leve de anticorpo monoclonal 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1 (rWT); 1.12.1 (M29I/D19A); 1.12.1 (M29I); 1.12.1 (D19A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1,9.1; 4,10. 1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1 ou 5.59.1 e uma cadeia pesada e cadeia leve de anticorpo adicional. Em algumas formas de realização, a cadeia leve e cadeia pesada adicionais também são de um dos anticorpos monoclonais identificados acima, mas são diferentes das primeiras cadeias pesadas e leves.

Em algumas formas de realização, os anticorpos modificados acima descritos são preparados usando um ou mais dos domínios variáveis ou regiões de CDR de um anticorpo monoclonal anti-ALK-1 humano proporcionado no presente documento.

Anticorpos Derivatizados e Etiquetados

Um anticorpo anti-ALK-1 ou porção de ligação a antígeno da invenção pode ser derivatizado ou vinculado à outra molécula (por exemplo, um outro péptido ou proteína). Em geral, os anticorpos ou porção do mesmo são derivatizados tais que a ligação de ALK-1 não é afectada adversamente pela derivatização ou etiquetagem. Consequentemente, os anticorpos e porções de anticorpo da invenção destinam-se a incluir as formas tanto intactas quanto modificadas dos anticorpos anti ALK-1 humanos descritos no presente documento. Por exemplo, um anticorpo ou porção de anticorpo da invenção pode ser funcionalmente ligado (pelo acoplamento químico, fusão genética, associação não covalente ou de outra maneira) a uma ou mais outras entidades moleculares, tais como um outro anticorpo (por exemplo, um anticorpo biespecífico ou um diacorpo), um agente de detecção, um agente farmacêutico, e/ou uma proteína ou péptido que pode mediar a associação do 103 anticorpo ou porção de anticorpo com outra molécula (tal como uma região de núcleo de estreptavidina ou cauda de polihistidina).

Um tipo de anticorpo derivatizado é produzido pela reticulação de dois ou mais anticorpos (do mesmo tipo ou de tipos diferentes, por exemplo, para criar anticorpos biespecificos). Os reticuladores adequados incluem aqueles que são heterobifuncionais, tendo dois grupos distintamente reactivos separados por um espaçador adequado (por exemplo, éster maleimidobenzoil-N-hidroxissuccinimida) ou homobifuncionais (por exemplo, suberato de dissuccinimidilo). Tais ligantes estão disponíveis da Pierce Chemical Company, Rockford, II.

Outro tipo de anticorpo derivatizado é um anticorpo etiquetado. Os agentes de detecção úteis com os quais um anticorpo ou porção de ligação a antigeno da invenção pode ser derivatizado incluem compostos fluorescentes, incluindo fluoresceina, isotiocianato de fluoresceina, rodamina, cloreto de 5-dimetilamina-l-naftalenossulfonilo, ficoeritrina, lantanideos fosforoso e similares. Um anticorpo também pode ser etiquetado com enzimas que são úteis para a detecção, tais como peroxidase de rábano silvestre, β- galactosidase, luciferase, fosfatase alcalina, glicose oxidase e similares. Quando um anticorpo for etiquetado com uma enzima detectável, é detectado mediante a adição de reagentes adicionais que a enzima usa para produzir um produto de reacção que pode ser diferenciado. Por exemplo, quando o agente peroxidase de rábano silvestre estiver presente, a adição de peróxido de hidrogénio e diaminobenzidina leva a um produto de reacção colorido, que é detectável. Um anticorpo também pode ser etiquetado com biotina, e detectado através da medição indirecta da ligação de avidina ou estreptavidina. Um anticorpo também pode ser etiquetado com um epitopo de polipéptido predeterminado por um repórter secundário (por 104 exemplo, sequências de par de zipper de leucina, locais de ligação para anticorpos secundários, dominios de ligação de metal, etiquetas de epitopo). Em algumas formas de realização, as etiquetas são ligadas por subdivisões de espaçador de vários comprimentos para reduzir impedimento estérico potencial.

Um anticorpo anti-ALK-1 também pode ser derivatizado com um grupo quimico tal como polietileno glicol (PEG), um grupo metilo ou etilo, ou um grupo de hidrato de carbono. Estes grupos são úteis para melhorar as caracteristicas biológicas do anticorpo, por exemplo, para aumentar a meia-vida no soro.

Composições Farmacêuticas e Administração

Esta invenção também se refere a uma composição farmacêutica para o tratamento das condições associadas com a angiogénese aumentada indesejável num mamifero, incluindo um ser humano, que compreende uma quantidade de um anticorpo anti-ALK-1 ou porção do mesmo de ligação a antigeno, como foi descrito no presente documento, que é eficaz no tratamento de tais condições, e um veiculo farmaceuticamente aceitável.

Os anticorpos e porções de ligação a antigeno da presente invenção podem ser incorporados nas composições farmacêuticas adequadas para administração a um indivíduo. Tipicamente, a composição farmacêutica compreende um anticorpo ou porção de ligação a antigeno da invenção e um veiculo farmaceuticamente aceitável. Como é utilizado no presente documento "veiculo farmaceuticamente aceitável" significa qualquer um e todos os solventes, meio de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes de retardo isotónicos e de absorção, e similares que são fisiologicamente compatíveis. Alguns exemplos de veículos farmaceuticamente aceitáveis são água, salina, salina tamponada de fosfato, dextrose, glicerol, etanol e similares, assim como suas combinações. Em muitos 105 casos, será preferível incluir agentes isotónicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois tais como manitol, sorbitol ou cloreto de sódio na composição. Exemplos adicionais de substâncias farmaceuticamente aceitáveis são agentes molhantes ou quantidades menores de substâncias auxiliares, tais como agentes molhantes ou emulsificantes, conservantes ou tampões, que reforçam a validade ou eficácia do anticorpo.

As composições desta invenção podem estar numa variedade de formas, por exemplo, formas de dosagem líquidas, semi-sólidas e sólidas, tais como soluções líquidas (por exemplo, soluções injectáveis e infusíveis), dispersões ou suspensões, comprimidos, pílulas, pós, lipossomas e supositórios. A forma preferida depende do modo planejado de administração e aplicação terapêutica. As composições preferidas típicas estão na forma de soluções injectáveis ou infusíveis, tais como composições semelhantes àquelas utilizadas para a imunização passiva dos seres humanos. O modo preferido de administração é parentérico (por exemplo, intravenosa, subcutânea, intraperitoneal, intramuscular). Numa forma de realização preferida, o anticorpo é administrado por infusão intravenosa ou injecção. Em outra forma de realização preferida, o anticorpo é administrado por injecção intramuscular ou subcutânea. As formulações injectáveis podem ser apresentadas na forma de dosagem unitária, por exemplo, em ampolas ou em recipientes de múltiplas doses, com ou sem um conservante adicionado. As composições podem assumir tais formas como suspensões, soluções ou emulsões em veículos oleosos ou aquosos, e podem conter agentes formuladores tais como agentes de suspensão, estabilizantes e/ou dispersantes. Alternativamente, o ingrediente activo pode estar na forma de pó para constituição com um veículo adequado, por exemplo, água livre de pirogénio estéril, antes da sua utilização. 106

As composições terapêuticas tipicamente devem ser estéreis e estáveis sob as condições de fabricação e armazenagem. A composição pode ser formulada como uma solução, microemulsão, dispersão, lipossoma, ou outra estrutura ordenada adequada para concentração elevada de medicamento. As soluções estéreis injectáveis podem ser preparadas mediante a incorporação do anticorpo anti-ALK-1 na quantidade requerida num solvente adequado com uma ou uma combinação de ingredientes enumerados acima, se requerido, seguidos pela esterilização filtrada. Geralmente, as dispersões são preparadas pela incorporação do composto activo num veiculo estéril que contém um meio de dispersão básica e os outros ingredientes requeridos daqueles enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação das soluções injectáveis estéreis, os métodos preferidos de preparação são secagem a vácuo e secagem por congelamento que produz um pó do ingrediente activo a-crescido de qualquer ingrediente desejado de uma solução anteriormente filtrada estéril deste. A própria fluidez de uma solução pode ser mantida, por exemplo, mediante a utilização de um revestimento tal como a lecitina, pela manutenção do tamanho de particula requerido no caso de dispersão e pela utilização de tensioactivos. A absorção prolongada de composições injectáveis pode ser realizada mediante a inclusão na composição de um agente que atrasa a absorção, por exemplo, sais de monoestearato e gelatina.

Os anticorpos ou porções de anticorpo da presente invenção podem ser administrados por uma variedade de métodos conhecidos na técnica, embora para muitas aplicações terapêuticas, a via/modo preferida de administração é subcutânea, intramuscular ou infusão intravenosa. Como será observado pelo artifice versado, a via e/ou modo de administração irá variar dependendo dos resultados desejados. as composições de

Em certas formas de realização, 107 anticorpo da presente invenção podem ser preparadas com um veiculo que protegerá o anticorpo contra a liberação rápida, tal como uma formulação de liberação controlada, incluindo implantes, emplastros transdérmicos, e sistemas de liberação microencapsulados. Os polímeros biocompativeis biodegradáveis podem ser utilizados, tais como acetato de etileno vinilo, polianidridos, ácido poliglicólico, colagénio, poliortoésteres, e ácido poliláctico. Muitos métodos para a preparação de tais formulações são geralmente conhecidos dos peritos na especialidade. Veja-se, por exemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems J. R. Robinson, ed., Mareei Dekker, Inc., Nova Iorque, 1978.

Os compostos activos adicionais também podem ser incorporados nas composições. Em certas formas de realização, um anticorpo anti-ALK-1 inibidor da invenção é co-formulado com e/ou co-administrado com um ou mais agentes terapêuticos adicionais. Estes agentes incluem, sem limitação, os anticorpos que se ligam a outros alvos, agentes anti-tumorais, agentes anti-angiogéneses, inibidores da transdução de sinal, agentes anti-proliferativos, agentes quimioterápicos, ou análogos de péptido que inibem a anti-ALK- 1. Tais terapêuticas de combinação podem exigir dosagens mais baixas do anticorpo anti-ALK-1 inibidor assim como os agentes co-administrados, evitando assim possíveis efeitos tóxicos ou complicações associadas com as várias monoterapêuticas.

Como observado acima, as composições da presente invenção opcionalmente podem ainda compreender um antioxidante farmaceuticamente aceitável além de um agente quelante. Os antioxidantes adequados incluem, mas não são limitados a eles, metionina, tiossulfato de sódio, catalase, e platina.

Por exemplo, a composição pode conter metionina numa concentração que varia de 1 mM a cerca de 100 mM, e em 108 particular, é cerca de 27 mM. Por exemplo, uma formulação aquosa pode ser: 10 mg/ml de anticorpo anti-ALK-1, 20 mM de histidina, pH 5,5, 84 mg/ml de dihidratado de trealose, 0,2 mg/ml de Polisorbato 80, 0,05 mg/ml de EDTA dissódico, 0,1 mg/ml de L-Metionina.

As composições da invenção podem incluir uma "quantidade terapeuticamente eficaz" ou uma "quantidade profilacticamente eficaz" de um anticorpo ou porção de ligação a antigeno da invenção. Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se a uma quantidade efectiva, em dosagens e por periodos de tempo necessários, para alcançar o resultado terapêutico desejado. Uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo ou porção de ligação a antigeno pode variar de acordo com factores tais como o estado doentio, idade, sexo e peso do indivíduo, e a capacidade do anticorpo ou porção de anticorpo em extrair uma resposta desejada no indivíduo. Uma quantidade terapeuticamente eficaz é também aquela em que quaisquer efeitos tóxicos ou prejudiciais do anticorpo ou porção de ligação a antigeno são anulados pelos efeitos terapeuticamente benéficos. Uma "quantidade profilacticamente eficaz" refere-se a uma quantidade eficaz, em dosagens e por períodos de tempo necessários, para alcançar o resultado profiláctico desejado. Tipicamente, visto que uma dose profiláctica é utilizada em indivíduos antes de ou num estágio mais precoce da doença, a quantidade profilacticamente eficaz pode ser menos do que a quantidade terapeuticamente eficaz.

Os regimes de dosagem podem ser ajustados para fornecer a melhor resposta desejada (por exemplo, uma resposta terapêutica ou profiláctica). Por exemplo, um único bolo pode ser administrado, várias doses divididas podem ser administradas ao longo do tempo ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada conforme indicado pelas exigências da situação terapêutica. É 109 especialmente vantajoso formular as composições parentéricas na forma unitária de dosagem para a facilidade de administração e uniformidade de dosagem. A forma farmacêutica unitária como é utilizado no presente documento refere-se às unidades fisicamente discretas, adequadas como dosagens unitárias para os indivíduos mamíferos serem tratados; cada unidade contendo uma quantidade predeterminada de composto activo calculado para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o veiculo farmacêutico requerido. A especificação para as formas farmacêutcas unitárias da invenção é ditada pelas e directamente dependente das caracteristicas únicas do anticorpo anti-ALK-1 ou porção do mesmo e do efeito terapêutico ou profiláctico particular a ser alcançado, e (b) as limitações inerentes na técnica de compor um tal anticorpo para o tratamento de sensibilidade nos indivíduos.

Um intervalo não limitativo exemplar para uma quantidade terapêutica ou profilacticamente eficaz de um anticorpo ou porção de anticorpo da invenção é de 0,025 a 50 mg/kg, mais preferivelmente de 0,1 a 50 mg/kg, mais preferivelmente de 0,1 a 25, 0, 1 a 10 ou 0, 1 a 3 mg/kg. Em algumas formas de realização, uma formulação contém 5 mg/ml de anticorpo num tampão de 2 0 mM de citrato de sódio, pH 5,5, 140 mM de NaCl, e 0,2 mg/ml de polisorbato 80. Deve ser observado que os valores de dosagem podem variar com o tipo e gravidade da condição a ser atenuada. Deve ser ainda compreendido que para qualquer indivíduo particular, os regimes de dosagem específicos devem ser ajustados ao longo do tempo de acordo com a necessidade individual e o julgamento profissional da pessoa que administra ou supervisiona a administração das composições, e que os intervalos de dosagem apresentados no presente documento são exemplares apenas e não são destinados a limitar o âmbito ou prática da composição reivindicada. 110

Um outro aspecto da presente invenção proporciona kits que compreendem um anticorpo anti-ALK-1 ou porção de ligação a antigeno da invenção ou uma composição que compreende um tal anticorpo ou porção. Um kit pode incluir, além do anticorpo ou composição, agentes de diagnóstico ou terapêuticos. Um kit pode também incluir instruções para utilização num método de diagnóstico ou terapêutico. Numa forma de realização preferida, o kit inclui o anticorpo ou uma composição que compreende-o e um agente de diagnóstico que pode ser usado num método descrito a seguir. Em outra forma de realização preferida, o kit inclui o anticorpo ou uma composição que o compreende e um ou mais agentes terapêuticos que podem ser usados num método descrito a seguir. Métodos Diagnósticos de Utilização

Os anticorpos anti-ALK-1 ou porções de ligação a antigeno dos mesmos podem ser utilizados nos métodos de diagnóstico para detectar ALK- 1 numa amostra biológica in vitro e in vivo. Por exemplo, os anticorpos anti-ALK-1 podem ser usados num imunoensaio convencional, incluindo, sem limitação, um ELISA, um RIA, citometria de fluxo, imunoistoquimica do tecido, Western Blot ou imunoprecipitação. Os anticorpos anti-ALK-1 da invenção podem ser usados para detectar ALK-1 de seres humanos. Os anticorpos anti-ALK-1 também podem ser usados para detectar ALK-1 de outros primatas, por exemplo, macacos cinomolgos. A invenção proporciona um método para detecção de ALK-1 numa amostra biológica que compreende o contacto da amostra biológica com um anticorpo anti-ALK-1 da invenção e detecção do anticorpo ligado. Numa forma de realização, o anticorpo anti-ALK-1 é directamente etiquetado com uma etiqueta detectável. Em outra forma de realização, o anticorpo anti-ALK-1 (o primeiro anticorpo) é não etiquetado e um segundo anticorpo ou outra molécula que possa se ligar ao anticorpo anti-ALK-1 é etiquetado. Como é 111 bem conhecido de uma pessoa de habilidade na técnica, um segundo anticorpo é escolhido o qual é capaz de especificamente se ligar nas espécies e classes particulares do primeiro anticorpo. Por exemplo, se o anticorpo anti-ALK-1 for uma IgG humano, então o anticorpo secundário pode ser uma IgG anti-humano. Outras moléculas que podem se ligar aos anticorpos incluem, sem limitação, Proteina A e Proteina G, ambas das quais são disponíveis comercialmente, por exemplo, da Pierce Chemical Co.

Etiquetas adequados para o anticorpo-ou anticorpo secundário foram debatidos anteriormente, e incluem várias enzimas, grupos protéticos, materiais fluorescentes, materiais luminescentes e materiais radioactivos. Exemplos de enzimas adequadas incluem peroxidase de rábano silvestre, fosfatase alcalina, β-galactosidase, ou acetilcolinaesterase; exemplos de complexos de grupo protético adequados incluem estreptavidina/biotina e avidina/biotina; exemplos de materiais fluorescentes adequados incluem umbeliferona, fluoresceina, isotiocianato de fluoresceina, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceina, cloreto de dansilo ou ficoeritrina; um exemplo de um material luminescente inclui luminol; e exemplos de material radioactivo adequado incluem 125I, 131I, 35S ou 3H.

Em outras formas de realização, a ALK-1 pode ser analisada numa amostra biológica por um imunoensaio de concorrência utilizando padrões de ALK-1 etiquetados com uma substância detectável e um anticorpo anti- ALK-1 não etiquetado. Neste ensaio, a amostra biológica, os padrões de ALK-1 etiquetados e o anticorpo anti-ALK-1 são combinados e a quantidade de padrão de ALK-1 etiquetado ligada ao anticorpo não etiquetado é determinada. A quantidade de ALK-1 na amostra biológica é inversamente proporcional à quantidade de padrão de ALK-1 etiquetado ligado ao anticorpo anti-ALK-1. 112

Pode-se usar os imunoensaios divulgados acima para vários propósitos. Por exemplo, os anticorpos anti-ALK-1 podem ser utilizados para detectar ALK-1 nas células cultivadas. Numa forma de realização preferida, os anticorpos anti-ALK-1 são utilizados para determinar a quantidade de ALK-1 produzida por células que foram tratadas com diversos compostos. Este método pode ser utilizado para identificar compostos que modulam os niveis de proteína ALK-1. De acordo com este método, uma amostra de células é tratada com um composto de teste por um período de tempo enquanto uma outra amostra é deixada sem tratamento. Se o nível total de ALK-1 tiver que ser medido, as células são submetidas a lise e o nível de ALK-1 total é medido através de um dos imunoensaios descritos acima. 0 nível total de ALK- 1 nas células tratadas versus não tratadas é comparado para determinar o efeito do composto de teste.

Um imunoensaio preferido para medir os níveis de ALK-1 totais é a citometria de fluxo ou imunoistoquímica. Métodos tais como ELISA, RIA, citometria de fluxo, Western Blot, imunoistoquímica, etiquetagem da superfície celular das proteínas dá membrana integrais e imunoprecipitação são bem conhecidos na técnica. Veja-se, por exemplo, Harlow e Lane, supra. Além disso, os imunoensaios podem ser graduados para cima para o rastreio de produção elevada de modo a testar um grande número de compostos para activação ou inibição da expressão de ALK-1.

Os anticorpos anti-ALK-1 da invenção também podem ser usados para determinar os níveis de ALK-1 num tecido ou em células derivadas do tecido. Em algumas formas de realização, o tecido é um tecido doente. Em algumas formas de realização do método, um tecido ou uma biópsia deste é extirpado de um paciente. 0 tecido ou biópsia é depois usado num imunoensaio para determinar, por exemplo, os níveis de ALK-1 totais ou localização de ALK-1 pelos 113 métodos debatidos acima.

Os anticorpos da presente invenção também podem ser usados in vivo para identificar os tecidos e órgãos que expressam ALK-1. Uma vantagem de utilizar os anticorpos anti-ALK-1 humanos da presente invenção é que eles podem ser usados com segurança in vivo sem obter uma resposta imune substancial para o anticorpo após a administração, ao contrário dos anticorpos de origem não humana ou com anticorpos humanizados ou quiméricos. 0 método compreende as etapas de administração de um anticorpo anti-ALK-1 detectavelmente etiquetado ou uma composição que o compreende a um paciente com necessidade de um tal teste de diagnóstico e submetendo o paciente à análise de imagem para determinar a localização dos tecidos que expressam a ALK-1. A análise da formação de imagem é bem conhecida na técnica médica, e inclui, sem limitação, análise de raio-x, formação de imagem por ressonância magnética (MRI) ou tomografia computadorizada (CT). 0 anticorpo pode ser etiquetado com qualquer agente adequado para a formação de imagem in vivo, por exemplo, um agente de contraste, tal como o bário, que pode ser utilizado para análise de raio-x, ou um agente de contraste magnético, tal como um quelato gadolinio, que pode ser usado para a MRI ou CT. Outros agentes de etiquetagem incluem, sem limitação, radioisótopos, tais como 99Tc. Em outra forma de realização, o anticorpo anti- ALK-1 será não etiquetado e será digitalizado pela administração de um segundo anticorpo ou outra molécula que seja detectável e que possa se ligar ao anticorpo anti-ALK-1. Numa forma de realização, uma biópsia é obtido do paciente para determinar se o tecido de interesse expressa ALK-1. Métodos Terapêuticos de Utilização

Em outra forma de realização, a invenção proporciona um método para inibir a actividade de ALK-1 mediante a administração de um anticorpo anti-ALK-1 a ura paciente em 114 necessidade do mesmo. Qualquer um dos anticorpos ou porções de ligação a antigeno dos mesmos descritos no presente documento pode ser utilizado terapeuticamente. Numa forma de realização preferida, o anticorpo anti-ALK-1 é um anticorpo quimérico ou humanizado de ser humano. Em outra forma de realização preferida, o anticorpo anti-ALK-1 é anticorpo humano, e o paciente é um paciente humano. Alternativamente, o paciente pode ser um mamífero que exprime ALK-1 em que o anticorpo anti-ALK-1 inter-reage com ele. 0 anticorpo pode ser administrado a um mamífero não-humano que expressa a ALK-1 com o qual o anticorpo inter-reage (por exemplo, um macaco cinomolgo) para fins veterinários ou como um modelo animal de doenças humanas. Tais modelos animais podem ser úteis para a avaliação da eficácia terapêutica de anticorpos desta invenção.

Numa outra forma de realização, um anticorpo anti-ALK-1 ou porção do mesmo de anticorpo pode ser administrado a um paciente que expressa indevidamente níveis elevados de ALK-1. 0 anticorpo pode ser administrado uma vez, mas mais preferivelmente é administrado várias vezes. 0 anticorpo pode ser administrado a partir de três vezes ao dia a uma vez a cada seis meses ou mais. A administração pode ser num plano tal como três vezes ao dia, duas vezes ao dia, uma vez ao dia, uma vez a cada dois dias, uma vez a cada três dias, uma vez por semana, uma vez a cada duas semanas, uma vez a cada mês, uma vez a cada dois meses, uma vez a cada três meses e uma vez a cada seis meses. 0 anticorpo também pode ser administrado continuamente através de uma minibomba. 0 anticorpo pode ser administrado através de uma via mucosal, bucal, intranasal, inalável, intravenosa, subcutânea, intramuscular, parentérica, ou intratumoral. 0 anticorpo pode ser administrado uma vez, pelo menos duas vezes ou durante pelo menos o período de tempo até que a condição esteja tratada, mitigada ou curada. 0 anticorpo geralmente será administrado durante tanto tempo quanto a 115 condição estiver presente. 0 anticorpo será geralmente administrado como parte de uma composição farmacêutica como descrito supra. A dosagem de anticorpo geralmente será no intervalo de 0,1 a 100 mg/kg, mais preferivelmente de 0,5 a 50 mg/kg, mais preferivelmente de 1 a 20 mg/kg, e ainda mais preferivelmente de 1 a 10 mg/kg. A concentração de soro do anticorpo pode ser medida por gualguer método conhecido na técnica.

Numa forma de realização, o anticorpo é administrado numa formulação como uma solução aguosa estéril que tem um pH que varia de cerca de 5,0 a cerca de 6,5 e que compreende de cerca de 1 mg/ml a cerca de 200 mg/ml de anticorpos, de cerca de 1 a cerca de 100 milimolares de tampão de histidina, de cerca de 0,01 mg/ml a cerca de 10 mg/ml de polisorbato 80, de cerca de 100 milimolar a cerca de 400 milimolar de trealose, e de cerca de 0,01 milimolar a cerca de 1,0 milimolar de dihidrato de EDTA dissódico.

Além disso, é contemplado pela presente invenção que qualquer uma das composições aqui pode ser administrada a um paciente susceptivel ou sofrendo de uma condição associada com o aumento da angiogénese ("uma condição angiogénica").

Exemplos de condições angiogénicas que podem ser tratadas/prevenidas pelas composições/métodos da presente invenção incluem, mas não são limitados a eles, cancro (tanto sólido quanto hematológico) , degeneração macular relacionada à idade (AMD), anomalias de desenvolvimento (organogénese), cegueira diabética, endometriose, neovascularização ocular, psoriase, artrite reumatoide (RA) e descolorações da pele (por exemplo, hemangioma, nevo flâmeo ou nevo simples).

Por exemplo, a presente invenção refere-se aos métodos para o tratamento ou prevenção das condições associadas com a neovascularização ocular utilizando qualquer uma das composições/métodos aqui contidas. As condições associadas 116 com a neovascularização ocular incluem, mas não estão limitadas a elas, retinopatia diabética, degeneração macular relacionada com a idade ("ARMD"), glaucoma rubeótica, queratite intersticial, retinopatia da prematuridade, retinopatia isquémica (por exemplo, célula falciforme), miopia patológica, histoplasmose ocular, pterigia, coroidopatia interna puniciada, e similares. Tratamento do Crescimento Celular Anormal

Esta invenção também se refere a um método para o tratamento de crescimento celular anormal num mamífero, incluindo um ser humano, que compreende a administração a dito mamífero uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-ALK-1 ou porção de ligação a antígeno do mesmo, como foi descrito no presente documento, que é eficaz no tratamento do crescimento celular anormal.

Numa forma de realização deste método, o crescimento celular anormal é cancro, incluindo, mas não limitado a eles, mesotelioma, hepatobiliar (dueto hepático e biliar), um tumor do CNS primário ou secundário, um tumor cerebral primário ou secundário, cancro do pulmão (NSCLC e SCLC), cancro dos ossos, cancro pancreático, cancro da pele, cancro da cabeça ou pescoço, melanoma cutâneo ou ocular, cancro do ovário, cancro do cólon, cancro rectal, cancro da região anal, cancro do estômago, gastrointestinal (estômago, colo-rectal e duodenal), cancro da mama, cancro do útero, carcinoma das trompas de Falópio, carcinoma do endométrio, carcinoma do colo do útero, carcinoma da vagina, carcinoma da vulva, Doença de Hodgkin, cancro do esófago, cancro do intestino delgado, cancro do sistema endócrino, cancro da tiroide, cancro da glândula paratiroide, cancro da glândula adrenal, sarcoma do tecido macio, cancro da uretra, cancro do pénis, cancro da próstata, cancro testicular, leucemia aguda ou crónica, leucemia mieloide crónica, linfomas linfocíticos, cancro da bexiga, o cancro do rim ou ureter, carcinoma de células 117 renais, carcinoma da pélvis renal, neoplasias do sistema nervoso central (CNS), linfoma primário CNS, linfoma de não Hodgkin, tumores do eixo espinhal, glioma do tronco cerebral, adenoma pituitário, cancro adrenocortical, cancro da vesicula biliar, mieloma múltiplo, colangiocarcinoma, fibrossarcoma, neuroblastoma, retinoblastoma, ou uma combinação de um ou mais dos cancros precedentes.

Numa forma de realização preferida da presente invenção o cancro é seleccionado do cancro de pulmão (NSCLC e SCLC), cancro da cabeça ou pescoço, cancro do ovário, cancro do cólon, cancro rectal, cancro da região anal, cancro do estômago, cancro da mama, cancro do rim ou ureter, carcinoma das células renais, carcinoma da pélvis renal, neoplasias do sistema nervoso central (CNS), linfoma primário do CNS, linfoma de não Hodgkin, tumores do eixo espinhal, ou uma combinação de um ou mais dos cancros precedentes.

Numa outra forma de realização preferida da presente invenção o cancro é seleccionado de cancro de pulmão (NSCLC e SCLC), cancro do ovário, cancro do cólon, cancro rectal, cancro da região anal, ou uma combinação de um ou mais dos cancros precedentes.

Em outra forma de realização do dito método, o dito crescimento celular anormal é uma doença proliferativa benigna, incluindo, mas não limitado a eles, psoriase, hipertrofia benigna da próstata ou restinose.

Esta invenção também se refere a um método para o tratamento de crescimento celular anormal num mamífero que compreende a administração a dito mamífero de uma quantidade de um anticorpo anti-ALK-1 ou porção do mesmo de ligação a antígeno, como foi descrito no presente documento, que é eficaz no tratamento dó crescimento celular anormal em combinação com um agente anti-tumoral seleccionado a partir do grupo consistindo em inibidores da mitose, agentes alquilantes, anti-metabólitos, antibióticos 118 de intercalação, inibidores do factor de crescimento, inibidores do ciclo celular, enzimas, inibidores da topoisomerase, modificadores da resposta biológica, anticorpos, citotóxicos, anti-hormonas e anti-androgénio. A invenção também se refere a uma composição farmacêutica para o tratamento do crescimento celular anormal num mamifero, incluindo um ser humano, que compreende uma quantidade de um anticorpo anti- ALK-1 ou porção do mesmo de ligação a antigeno, como foi descrito no presente documento, que é eficaz no tratamento do crescimento celular anormal em combinação com um veiculo farmaceuticamente aceitável e um agente anti-tumoral seleccionado a partir do grupo consistindo em inibidores da mitose, agentes alquilantes, anti- metabólitos, antibióticos de intercalação, inibidores do factor de crescimento, inibidores do ciclo celular, enzimas, inibidores da topoisomerase, modificadores da resposta biológica, anti-hormonas e anti-androgénio. A invenção também se refere a um método para o tratamento de um distúrbio hiperproliferativo num mamifero que compreende a administração em dito mamifero de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-ALK-1 ou porção do mesmo de ligação a antigeno, como foi descrito no presente documento, em combinação com um agente anti-tumoral seleccionado a partir do grupo consistindo em agentes anti-proliferativos, inibidores da cinase, inibidores da angiogénese, inibidores do factor de crescimento, inibidores de cox-1, II inibidores de cox-11, inibidores da mitose, agentes alquilantes, anti-metabólitos, antibióticos de intercalação, inibidores do factor de crescimento, radiação, inibidores do ciclo celular, enzimas, inibidores da topoisomerase, modificadores da resposta biológica, anticorpos, citotóxicos, anti-hormonas, estatinas e anti-androgénio.

Numa forma de realização da presente invenção o agente 119 anti-tumoral utilizado em conjunto com um anticorpo anti-ALK-1 ou porção do mesmo de ligação a antigeno, e composições farmacêuticas descritas no presente documento, é um agente anti-angiogénese, inibidor da mistura cinase ou inibidor do factor de crescimento. Os inibidores da mistura cinase preferidos incluem Sutent (Pfizer Inc., SU-11248), descrito na Patente US N° 6.573.293 (Pfizer, Inc, NY, EUA).

Os agentes anti-angiogéneses incluem, mas não estão limitados a eles, os seguintes agentes, tais como inibidor da EGF, inibidores da EGFR, inibidores do VEGF, inibidores do VEGFR, inibidores de TIE2, inibidores de IGF1R, inibidores da COX-II (ciclooxigenase II), inibidores de MMP-2 (matriz-metaloproteinase 2) e inibidores de MMP-9 (matriz-metaloproteinase 9). Os inibidores do VEGF preferidos incluem, por exemplo, Avastin (bevacizumab), um anticorpo monoclonal anti-VEGF da Genentech, Inc. of South San Francisco, Califórnia.

Os inibidores do VEGF adicionais incluem CP-547.632 (Pfizer Inc., NY, EUA), Axitinib (Pfizer Inc.; AG-013736), ZD-6474 (AstraZeneca), AEE788 (Novartis), AZD-2171), VEGF Trap (Regeneron/Aventis), Vatalanib (também conhecido como PTK-787, ZK-222584: Novartis & Schering AG), Macugen (pegaptanib octassódio, NX-1838, EYE-001, Pfizer Inc./Gilead/Eyetech), IM862 (Cytran Inc, of kirkland, Washington, EUA); e angiozima, uma ribozima sintética da Ribozyme (Boulder, Colorado) e Chiron (Emeryville, Califórnia) e combinações dos mesmos. Os inibidores do VEGF úteis na prática da presente invenção são divulgados nas Patentes US N° 6.534.524 e 6.235.764, ambas das quais são incorporadas na integra para todos os propósitos. Os inibidores do VEGF particularmente preferido incluem CP-547632, AG 13736, Vatalanib, Macugen e combinações dos mesmos.

Os inibidores do VEGF adicionais são descritos, por exemplo, no documento WO 99/24440 (publicado em 20 de Maio 120 de 1999), documento WO 1999/062890 (publicado em 9 de Dezembro de 1999), no documento WO 95/21813 (publicado em 17 de agosto de 1995), documento WO 99/61422 (publicado em 2 de Dezembro de 1999), Patente dos Estados Unidos 6.534.524 (divulga AG 13736), Patente dos Estados Unidos 5.834.504 (concedida em 10 de Novembro de 1998), documento WO 98/50358 (publicado em 12 de Novembro de 1998), Patente dos Estados Unidos 5.883.113 (concedida em 16 de marco de 1999), Patente dos Estados Unidos 5.886.020 (concedida em 23 de marco de 1999), Patente dos Estados Unidos 5.792.783 (concedida em 11 de Agosto de 1998), Patente US N° 6.653.308 (concedida em 25 de Novembro de 2003), documento WO 99/10349 (publicado em 4 de Março de 1999), documento WO 97/32856 (publicado em 12 de Setembro de 1997) , documento WO 97/22596 (publicado em 26 de Junho de 1997), documento WO 98/54093 (publicado em 3 de Dezembro de 1998), documento WO 98/02438 (Publicado em 22 de Janeiro de 1998), documento WO 99/16755 (publicado em 8 de Abril de 1999) e documento WO 98/02437 (publicado em 22 de Janeiro de 1998).

Outros agentes anti-proliferativos que podem ser usados com os anticorpos, ou suas porções de ligação a antigeno, da presente invenção incluem inibidores da enzima famesil proteína transferase e inibidores do receptor tirosina cinases PDGFr, incluindo os compostos divulgados e reivindicados nas seguintes Patentes dos Estados Unidos N° 6.080.769; 6.194.438; 6.495.564; 6.586.447; 6.074.935; 6.495.564; e 6.150.477.

Para os inibidores de PDGRr adicionais, veja-se o documento W001/40217, publicado em 7 de Julho de 2001 e documento WO 2004/020431, publicado em 11 de Março de 2004. Os inibidores de PDGFr preferidos incluem CP-868,596 da Pfizer e seus sais farmaceuticamente aceitáveis.

Os inibidores GARF preferidos incluem AG-2037 da Pfizer (pelitrexol e seus sais farmaceuticamente aceitáveis). Os inibidores GARF úteis na prática da 121 presente invenção são divulgadas na Patente US N° 5.608.082.

Exemplos de inibidores da COX-II úteis, que podem ser usados em conjunto com um anticorpo anti-ALK-1 ou porção do mesmo de ligação a antigeno, como foi descrito no presente documento, e as composições farmacêuticas descritas no presente documento incluem CELEBREX™ (celecoxib), parecoxib, deracoxib, ABT-963, MK-663 (etoricoxib), COX-189 (lumiracoxib), BMS 347070, RS 57067, NS-398, Bex- tra (valdecoxib), paracoxib, Vioxx (rofecoxib), SD-8381, 4-metil-2-(3,4- Dimetilfenil)-1 -(4-sulfamoil-fenil)-1 H-pirrol, 2-(4-Etoxifenil)-4-metil-l -(4-sulfa- moilfenil)-ΙΗ-pirrol, T-614, JTE-522, S-2474, SVT-2016, CT-3, SC-58125 e Arcoxia (etoricoxib). Para os inibidores da COX-II adicionais, veja-se Publicações de Pedido de Patente US N° 2005-0148627 e 2005-0148777.

agente anti-5.466.823. A

Numa tumoral é estrutura

Numa tumoral é estrutura forma de realização preferida o celecoxib, veja-se Patente US N° para Celecoxib é mostrada a seguir:

forma de realização preferida do agente anti-valecoxib, veja-se Patente US N° 5.633.272. A para o valdecoxib é mostrada a seguir:

valdecoxib CAS MO. 181695--72-7 5,633,272 C-2B65 SC-65872

agente anti-5.932.598. A

Numa forma de realização preferida do tumoral é parecoxib, veja-se Patente US N° estrutura para paracoxib é mostrada a seguir:

parecoxib CAS lio. 198470-84-7 5,932.598 C-2931 122

122 agente anti-5.521.207. A

Numa forma de realização preferida do tumoral é deracoxib, veja-se Patente US N° estrutura para deracoxib é mostrada a seguir:

agente anti-6.034.256. A

Numa forma de realização preferida do tumoral é SD- 8381, veja-se Patente US N° estrutura para o DS-8381 é mostrada a seguir:

ONa 3 SD-B181 . 6,031,256 Ex. 175

Numa forma de realização preferida do agente anti-tumoral é ABT- 963, veja-se Publicação Internacional Número WO 2002/24719. A estrutura para ABT-963 é mostrada a seguir:

Numa forma de realização preferida do agente anti-tumoral é rofecoxib como mostrado a seguir:

0 rof ecoxLb CAS No. 162011-90-7 b

Numa forma de realização preferida do agente anti- tumoral é MK-663 (etoricoxib), veja-se Publicação

Internacional Número WO 1998/03484. A estrutura para o etoricoxib é mostrada a seguir:

KK-663 etoricoxib CAS Uú. WO 93/01484 SC-06218 jd

Numa forma de realização preferida do agente anti-tumoral é COX- 189 (lumiracoxib) , veja-se Publicação Internacional Número WO 1999/11605. A estrutura para o 123 lumiracoxib é mostrada a seguir 123

COr.-ia, Lumiracoxiii CAS No. 220991-20-8 Novartis WO 99/11605

Numa forma de realização preferida do agente anti-tumoral é BMS- 347070, veja-se Patente dos Estados Unidos N° 6.180.651. A estrutura de BMS-347070 é mostrada a seguir:

Cl

CA5 No. 19?438-Ag.5 6.180,651

Numa forma de realização preferida do agente anti-tumoral é NS-398 (CAS 123653-11-2) . A estrutura para NS-398 (CAS 123653-11-2) é mostrada a seguir:

O NS-398 CAS NO. 123653-11-2

Numa forma de realização preferida do agente anti-tumoral é RS 57067 (CAS 17932-91-3) . A estrutura para RS-57067 (CAS 17932-91-3) é mostrada a seguir:

Numa forma de realização preferida do agente anti-tumoral é de 4- metil-2-(3,4-dimetilfenil)-1-(4-sulfamoil-fenil)-ΙΗ-pirrol. A estrutura de 4- metil-2-(3,4-dimetilfenil)-1-(4-sulfamoil-fenil)-ΙΗ-pirrol é mostrada a seguir: 124

Numa forma de realização preferida do agente anti-tumoral é 2-(4- Etoxifenil)-4-metil-l-(4-sulfamoilfenil)-ΙΗ-pirrol. A estrutura para 2-(4- Etoxifenil)-4-metil-l -(4-sulfamoilfenil)-1 H-pirrol é mostrada a seguir: C2H50'

i so2nh2

Numa forma de realização preferida do agente anti-tumoral é meloxicam. A estrutura de meloxicam é mostrada a seguir:

Outros inibidores úteis como agentes anti-tumorais utilizados em conjunto com os anticorpos da presente invenção e composições farmacêuticas descritas no presente documento incluem aspirina, e medicamentos anti-inflamatórios não esteroides (ΑΙΝΕ), que inibem a enzima que produz prostaglandinas (ciclooxigenase I e II), resultando em niveis mais baixos de prostaglandinas, incluem, mas não são limitados aos seguintes, Salsalato (Amigesic), Cetoprofeno (Feldene), (Voltaren), Tolmetina

Diflunisal (Orudis), Naproxen (Dolobid) , Ibuprofeno (Motrin) , Nabumetona (Relafen) , Piroxicam (Aleve, Naprosyn), Diclofenac

Indometacina (Indocin), Sulindac (Clinoril), (Tolectin), Etodolac (Lodine), Ketorolac (Toradol) , Oxaprozin (Daypro) e combinações dos mesmos. Os inibidores da COX-I preferidos incluem ibuprofeno (Motrin), nuprina, naproxeno (Aleve), indometacina (Indocin), nabumetona (Relafen) e combinações dos mesmos. 125

Os agentes direccionados usados em conjunto com um anticorpo anti-ALK-1 ou porção do mesmo de ligação a antigeno, como foi descrito no presente documento, e composições farmacêuticas destes como foi descrito no presente documento, incluem inibidores de EGFr tais como Iressa (gefitinib, AstraZeneca), Tarceva (erlotinib ou OSI-774, OSI Pharmaceuticals Inc.), Erbitux (cetuximab, Imclone Pharmaceuticals, Inc.) , EMD-7200 (Merck AG), ABX-EGF (Amgen Inc. e Abgenix Inc.), HR3 (Governo cubano), anticorpos IgA (University of Erlangen-Nuremberg), TP-38 (IVAX), proteína de fusão EGFR, vacina EGF, imunolipossomas anti- EGFr (Hermes Biosciences Inc.) e combinações dos mesmos.

Os inibidores de EGFr preferidos incluem Iressa, Erbitux, Tarceva e combinações dos mesmos. A presente invenção também tem a ver com agentes anti-tumorais seleccionados entre os inibidores do receptor de mistura erb ou inibidores do receptor de ErbB2, tais como CP-724.714 (Pfizer, Inc.), CI-1033 (canertinib, Pfizer, Inc.), Herceptina (trastuzumab, Genentech Inc.), Omitarg (204, pertuzumab, Genentech Inc.), TAK-165 (Takeda), GW-572016 (lonafarnib, GlaxoSmithKline), GW-282974 (GlaxoSmithKline), EKB-569 (Wyeth), PKI-166 (Novartis), dHER2 (HER2 Vaccine, Corixa e GlaxoSmithKline) , APC8024 (HER2 Vaccine, Dendreon), anticorpo biespecífico anti-HER2/neu (Decof Câncer Center), B7.her2.IgG3 (Agensys), AS HER2 (Research Institute for Rad Biology & Medicine), anticorpos biespecíficos trifuncionais (University of Munich) e mAB AR-209 (Aronex Pharmaceuticals Inc) e mAB 2B-1 (Chiron) e combinações dos mesmos. Os agentes anti-tumorais selectivos erb preferidos incluem Herceptina, TAK-165, CP-724714, ABX-EGF, HER3 e combinações dos mesmos. Os inibidores receptor da mistura erbb preferidos incluem GW572016, Cl-1033, EKB-569 e Omitarg e combinações dos mesmos.

Os inibidores erbB2 adicionais incluem agueles no 126 documento WO 98/02434 (publicado em 22 de Janeiro de 1998), documento WO 99/35146 (publicado em 15 de Julho de 1999), documento WO 99/35132 (publicado em 15 de Julho de 1999), documento WO 98/02437 (publicado em 22 de Janeiro de 1998), documento WO 97/13760 (publicado em 17 de Abril de 1997), documento WO 95/19970 (publicado em 27 de Julho de 1995), Patente dos Estados Unidos 5.587.458 (concedida em 24 de Dezembro de 1996), e Patente dos Estados Unidos 5.877.305 (concedida em 2 de Março de 1999), cada uma das quais é aqui incorporada por referência na sua totalidade. Para inibidores do receptor de ErbB2 adicionais úteis na presente invenção, veja-se Patente dos Estados Unidos N° 6.465.449, 6.284.764, e Pedido Internacional N° WO 2001/98277.

Adicionalmente, outros agentes anti-tumorais podem ser seleccionados dos seguintes agentes, Sorafenib (Onyx Pharmaceuticals Inc.; BAY-43- 9006), Genasense (augmerosen, Genta), Panitumumab (Abgenix/Amgen) , Zevalin (Schering), Bexxar (Corixa/GlaxoSmithKline) , Abarelix, Alimta, EPO 906 (Novartis), discodermolide (XAA-296), ABT-510 (Abbott), Neovastat (Aeterna), enzastaurino (Eli Lilly), Combrestatin A4P (Oxigene), ZD-6126 (AstraZeneca), flavopiridol (Aventis), CYC-202 (Cyclacel), AVE-8062 (Aventis), DMXAA (Roche/Antisoma), Thymitaq (Eximias), Temodar (temozolomida, Schering Plough) e Revilimd (Celegene) e combinações dos mesmos.

Outros agentes anti-tumorais podem ser seleccionados dos seguintes agentes, CyPat (acetato de ciproterona), Histerelina (acetato de histrelina), Plenaixis (depósito abarelix), Atrasentan (ABT-627), Satraplatin (JM- 216), talomide (talidomida), Theratope, Temilifene (DPPE), ABI-007 (paclitaxel), Evista (raloxifeno), Atamestano (Biomed-777), Xyotax (poliglutamato paclitaxel), Targetin (bexarotina) e combinações dos mesmos.

Adicionalmente, outros agentes anti-tumorais podem ser 127 seleccionados dos seguintes agentes, Trizaona (tirapazamina), Aposyn (exisulind), Nevastat (AE-941), Ceplene (dicloridrato de histamina), Orathecin (rubitecan), Virulizin, Gastrimmune (G17DT), DX-8951f (mesilato de exatecan), Onconase (rampirnase), BEC2 (mitumoab), Xcytrin (motexafin gadolínio) e combinações dos mesmos.

Outros agentes anti-tumorais podem ser seleccionados dos seguintes agentes, CeaVac (CEA), NeuTrexin (glucuronato de trimetresato) e combinações dos mesmos. Os agentes anti-tumorais adicionais podem ser seleccionados a partir dos seguintes agentes, OvaRex (oregovomab), Osidem (IDM-1), e combinações dos mesmos. Os agentes anti-tumorais adicionais podem ser seleccionados dos seguintes agentes, Advexin (ING 201), Tirazona (tirapazamina), e combinações dos mesmos. Os agentes anti-tumorais adicionais podem ser seleccionados dos seguintes agentes, RSR13 (efaproxiral), Cotara (1311 chTNT 1/b), NBI-3001 (IL-4) e suas combinações. Os a-gentes anti-tumorais adicionais podem ser seleccionados do seguintes agentes, Canvaxin, vacina GMK, PEG Interon A, Taxoprexin (DHA/paciltaxel) e combinações dos mesmos. Outros agentes anti-tumorais preferidos incluem inibidor MEK1/2 da Pfizer PD325901, inibidor MEK da Array Biopharm ARRY-142886, inibidor CDK2 da Bristol Myers BMS-387032, inibidor CDK da Pfizer PD0332991 e AXD-5438 da AstraZeneca e combinações dos mesmos. Adicionalmente, os inibidores mTOR também podem ser utilizados tais como CCI-779 (Wyeth) e derivados de rapamicina RAD001 (Novartis) e AP- 23573 (Ariad), inibidores HDAC SAHA (Merck Inc./Aton Pharmaceuticals) e suas combinações. Os agentes anti-tumorais adicionais incluem inibidor aurora 2 VX-680 (Vertex), inibidor Chkl/2 XL844 (Exilixis).

Os seguintes agentes citotóxicos, por exemplo, um ou mais seleccionados do grupo consistindo em epirubicina (Ellence), docetaxel (Taxotere), paclitaxel, Zinecard (dexrazoxane), rituximab (Rituxan), mesilato de imatinib 128 (Gleevec), e combinações dos mesmos, podem ser utilizados em conjunto com um anticorpo anti-ALK-1 ou porção do mesmo de ligação a antigeno, como foi descrito no presente documento, e composições farmacêuticas, como foi descrito no presente documento. A invenção também contempla a utilização dos anticorpos e suas porções de ligação a antigeno da presente invenção juntamente com terapêutica hormonal, incluindo, mas não limitado a eles, exemestano (Aromasin, Pfizer Inc.), leuprorelina (Lupron ou Leuplin, TAP/Abbott/Takeda), anastrozol (Arimidex, Astrazeneca), gosrelina (Zoladex, AstraZeneca), doxercalciferol, fadrozol, formestano, citrato de tamoxifeno (tamoxifeno, Nolvadex, AstraZeneca) , Casodex (AstraZeneca), Abarelix (Praecis), Trelstar, e combinações dos mesmos. A invenção também refere-se aos agentes de terapêutica hormonal tais como anti-estrogénios incluindo, mas não limitado a fulvestrant, toremifeno, raloxifeno, lasofoxifeno, letrozol (Femara, Novartis), anti-androgénio, como bicalutamida, flutamida, mifepristona, nilutamida, Casodex® (4'-ciano- 3-(4-fluorofenilsulfonil)-2-hidroxi-2-metil-3'-(trifluorometil) propionanilida, bicalutamida) e combinações dos mesmos.

Além disso, a invenção proporciona anticorpos da presente invenção isoladamente ou em combinação com um ou mais produtos de cuidados de suporte, por exemplo, um produto seleccionado a partir do grupo consistindo em Filgrastim (Neupogen), ondansetron (Zofran), Fragmin, Procrit, Aloxi, Emend, ou suas combinações.

Os agentes citotóxicos particularmente preferidos incluem Camptosar, Erbitux, Iressa, Gleevec, Taxotere e combinações dos mesmos.

Os seguintes inibidores da topoisomerase I podem ser utilizados como agentes anti-tumorais camptotecina, irinotecan HCI (Camptosar), edotecarin, oratecina 129 (Supergen), exatecan (Daiichi), BN-80915 (Roche) e combinações dos mesmos. Os inibidores da toposimerase II particularmente preferidos incluem epirubicina (Ellence).

Os anticorpos da invenção podem ser utilizados com agentes antitumorais, agentes alquilantes, antimetabólitos, antibióticos, agentes anti- tumor derivados de plantas, derivados de camptotecina, inibidores da tirosina cinase, outros anticorpos, interferões, e/ou modificadores da resposta biológica.

Agentes alquilantes incluem, mas não são limitados a, N-óxido de nitrogénio mostarda, ciclofosfamida, ifosfamida, melfalano, busulfan, mitobronitol, carboquone, tiotepa, ranimustina, nimustina, temozolomida, AMD-473, altretamina, AP-5280, apaziquona, brostalicina, Bendamustina, carmustina, estramustina, fotemustina, glufosfamida, ifosfamida, KW-2170, mafosfamida e mitolactol; compostos alquilantes coordenados com platina incluem, mas não são limitados a, cisplatina, Paraplatin (carboplatina), eptaplatina, lobaplatina, nedaplatina, Eloxatin (oxaliplatina, Sanofi) ou satrplatina e combinações dos mesmos. Os agentes alquilantes particularmente preferidos incluem Eloxatin (oxaliplatina).

Os antimetabólitos incluem, mas não são limitados a, metotrexato, ribósido de β-mercaptopurina, mercaptopurina, 5-fluorouracilo (5-FU) isoladamente ou em combinação com leucovorina, tegafur, UFT, doxifluridina, carmofur, citarabina, ocfosfato de citarabina, enocitabina, S-l, Alimta (premetrexed dissódio, LY231514, MTA), Gemzar (gencitabina, Eli Lilly), fludarabina, 5-azacitidina, capecitabina, cladribina, clofarabina, decitabina, eflornitina, etinilcitidina, citosina arabinósido, hidroxiuréia, ST-1, melfalano, nelarabina, nolatrexed, ocfosfato, premetrexed dissódio, pentostatina, pelitrexol, raltitrexed, triapina, trimetrexato, vidarabina, vincristina, vinorelbina; ou, por exemplo, uma dos anti- 130 metabólitos preferidos divulgados no Pedido de Patente Europeu N° 239362 tal como ácido N-(5-[N-(3,4-diidro-2-metil-4-oxoquinazolin-6- ilmetil)-N-metilamino]-2-tenoil)-L-glutâmico e suas combinações.

Antibióticos incluem antibióticos de intercalação, mas não estão limitados a eles: aclarrubicina, actinomicina D, anrubicina, anamicina, adriamicina, bleomicina, daunorrubicina, doxorrubicina, elsamitrucina, epirrubicina, galarrubicina, idarrubicina, mitomicina C, nemorrubicina, neocarziriostatina, peplomicina, pirarrubicina, rebecamicina, stimalamer, estreptozocina, valrubicina, zinostatina e combinações dos mesmos.

Substâncias anti-tumorais derivadas de planta, por exemplo, aquelas seleccionadas de inibidores da mitose, por exemplo, vinblastina, docetaxel (Taxotere), paclitaxel e suas combinações.

Agentes inibidores da topoisomerase citotóxica incluem um ou mais agentes seleccionados do grupo consistindo em aclarubicn, amonafide, belotecan, camptotecina, 10-hidroxicamptotecina, 9-aminocamptotecina, diflomotecan, irinotecan HCI (Camptosar), edotecarin, epirrubicina (Ellence), etopósido, exatecan, gimatecan, lurtotecan, mitoxantrona, pirarrubicina, pixantrona, rubitecan, sobuzoxano, SN-38, taflupósido, topotecan, e combinações dos mesmos.

Os agentes inibidores da topoisomerase citotóxica incluem um ou mais agentes seleccionados do grupo consistindo em camptotecina, 10- hidroxicamptotecina, 9-aminocamptotecina, irinotecan HCI (Camptosar), edotecarin, epirrubicina (Ellence), etopósido, SN-38, topotecan, e combinações dos mesmos.

Os agentes imunológicos incluem interferões e numerosos outros agentes de reforço imunológicos. Os Interferões incluem interferão alfa, interferão alfa-2a, interferão, alfa-2b, interferão beta, o interferão gama-la, 131 o interferão gama-lb (Actimmune), ou interferão gama-nl e combinações dos mesmos. Outros agentes incluem filgrastim, lentinan, sizofilan, TheraCys, ubenimex, WF-10, aldesleucina, alemtuzumab, BAM-002, dacarbazine, daclizumab, denileucina, gemtuzumab ozogamicina, ibritumomab, imiquimod, lenograstim, lentinan, vacina de melanoma (Corixa), molgramostim, OncoVAX-CL, sargramostim, tasonermin, tecleucina, timalasin, tositumomab, Virulizin, Z- 100, epratuzumab, mitumomab, oregovomab, pentumomab (Y-muHMFGl), Provenge (Dendreon) e combinações dos mesmos.

Os modificadores da resposta biológica são agentes que modificam os mecanismos de defesa dos organismos vivos ou respostas biológicas, tais como a sobrevivência, crescimento e diferenciação das células dos tecidos "para direccioná-los para terem actividade anti-tumoral. Tais agentes incluem crestin, lentinan, sizofiran, picibanil, ubenimex e combinações dos mesmos.

Outros agentes anticancerigenos incluem alitretinoina, ampligen, atrasentan bexaroteno, bortezomib, Bosentano, calcitriol, exisulind, finasterida, fotemustina, ácido ibandrónico, miltefosina, mitoxantrona, I- asparaginase, procarbazina, dacarbazina, hidroxicarbamida, pegaspargase, pentostatin, tazarotne, Telcyta (TLK-286, Telik Inc.), Velcade (bortemazib, Millennium), tretinoina, e combinações dos mesmos.

Outros compostos antiangiogénicos incluem acitretin, fenretinide, talidomida, ácido zoledrónico, angiostatina, aplidine, cilengtide, combretastatina A-4, endostatina, halofuginona, rebimastat, removab, Revlimid, esqualamina, ukrain, Vitaxin e combinações dos mesmos.

Os compostos coordenados com platina incluem, mas não são limitados a eles, cisplatina, carboplatina, nedaplatina, oxaliplatina, e combinações dos mesmos.

Derivados de camptotecina incluem, mas não são limitados a eles, camptotecina, 1O-hidroxicamptotecina, 9- 132 aminocamptotecina, irinotecan, SN-38, edotecarin, topotecano e combinações dos mesmos.

Outros agentes anti-tumorais incluem mitoxantrona, 1-asparaginase, procarbazina, dacarbazina, hidroxycarbamida, pentostatina, tretinoina e suas combinações.

Os agentes anti-tumorais capazes de aumentar as respostas imunes anti-tumorais, tais como anticorpos CTLA-4 (antigeno linfocitário cito- tóxico 4) , e outros agentes capazes de bloquear CTLA-4 também podem ser utilizados, tais como a MDX-010 (Medarex) e compostos CTLA 4 divulgados na Patente dos Estados Unidos N° 6.682.736; e agentes anti-proliferativos tais como outros inibidores farnesil proteina transferase, por exemplo, os inibidores da farnesil proteina transferase. Para anticorpos CTLA-4 específicos adicionais que podem ser usados na presente invenção veja-se Pedido Provisório dos Estados Unidos 60/113.647 (depositado em 23 de Dezembro de 1998), Patente dos Estados Unidos N° 6.682.736. Por exemplo, um outro anticorpo anti-CTLA-4 que pode ser utilizado em conformidade com a presente invenção é ticilimumab, que tem a sequência de anticorpo monoclonal 11.2.1 na Patente US N° 6.682.736.

Para os anticorpos IGF1R específicos que podem ser usados na presente invenção, veja-se Pedido de Patente Internacional N° WO 2002/053596.

Para os anticorpos CD40 específicos que podem ser usados na presente invenção, veja-se Pedido de Patente Internacional N° WO 2003/040170.

Os agentes de terapêutica genética também podem ser utilizados como agentes anti-tumorais tais como TNFerade (GeneVec), que expressam TNFalfa em resposta à radioterapia.

Numa forma de realização do presente invenção, as estatinas podem ser usadas em conjunto com um anticorpo anti-ALK-1 ou porção do mesmo de ligação a antigeno, como 133 foi descrito no presente documento, e composições farmacêuticas. As estatinas (inibidores da HMG-CoA reducatase) podem ser seleccionadas do grupo consistindo em Atorvastatina (Lipitor, Pfizer Inc.), Provastatina (Pravachol, Bristol-Myers Squibb), Lovastatina (Mevacor, Merck Inc.), Sinvastatina (Zo- cor, Merck Inc.),

Fluvastatina (Lescol, Novartis), Cerivastatina (Baycol, Bayer), Rosuvastatina (Crestor, AstraZeneca), Lovostatina e Niacina (Advicor, Kos Pharmaceuticals), derivados e combinações dos mesmos.

Numa forma de realização preferida a estatina é seleccionada a partir do grupo consistindo em Atovorstatina e Lovastatina, derivados e combinações dos mesmos.

Outros agentes úteis como agentes anti-tumorais incluem Caduet.

Para qualquer um dos métodos de tratamento de um distúrbio hiperproliferativo ou crescimento celular anormal como foi descrito no presente documento usando uma combinação de um anticorpo anti-ALK-1 ou porção de ligação a antigeno com pelo menos um agente terapêutico adicional, o anticorpo anti-ALK- 1 pode ser conjugado, ou derivatizado, com o agente terapêutico adicional. 0 pelo menos um agente terapêutico adicional também pode ser administrado separadamente, ou numa maneira não derivatizada ou não conjugada. Quando o pelo menos um agente terapêutico adicional não for derivatizado ou conjugado ao anticorpo, pode ser administrado dentro da mesma formulação farmacêutica como o anticorpo, ou pode ser administrado numa formulação separada.

Tratamento da Perda de Visão

Os compostos da invenção e composições farmacêuticas que os contém, são úteis para o tratamento da perda de visão grave da degeneração macular relacionada à idade e outras doenças que afectam o segmento posterior do olho, tais como a neovascularização coroidal, retinopatia 134 diabética, glaucoma, retinite pigmentosa, e similares.

Por exemplo, as composições da invenção podem ser utilizadas para formar um depósito de medicamento por trás do olho e podem incluir uma ou mais agentes farmaceuticamente activos, além de um ou mais excipientes não activos como foi descrito no presente documento. Exemplos de agentes farmaceuticamente activos úteis nas composições da invenção incluem anti-infecciosos, incluindo, sem limitação, os antibióticos, antivirais e antifúngicos; agentes antialergénicos e estabilizantes de mastócitos; agentes anti-inflamatórios esteroidais e não esterodais (como nepafenac); inibidores da ciclooxigenase, incluindo, sem limitação, inibidores da Cox I e Cox II; combinações de agentes anti-infecciosos e anti-inf lamatórios ; descongestionantes; agentes anti-glaucoma, incluindo, sem limitação, adrenérgicos, agentes bloqueadores de beta-adrenérgico, agonistas de alfa-adrenérgico, agentes parassipatomiméticos, inibidores da colinesterase, inibidores da anidrase carbónica e prostaglandinas; combinações de agentes anti-glaucoma; antioxidantes, suplementos nutricionais; medicamentos para o tratamento de edema macular cistoide incluindo, sem limitação, agentes anti- inflamatórios não esteroides; medicamentos para o tratamento de degeneração macular relacionada com a idade (AMD) incluindo AMD não exsudativa (seca) e exsudativa (húmida), incluindo, sem limitação, inibidores da angiogénese, incluindo inibidores da angiogénese que inibem os receptores da proteína cinase, incluindo receptores da proteína cinase que são receptores do VEGF; e suplementos nutricionais; medicamentos para o tratamento de infecções herpéticas e infecções oculares CMV; medicamento para o tratamento da vitreorretinopatia proliferativa incluindo, sem limitação, antimetabólitos e fibrinolíticos; agentes de modulação da ferida, incluindo, sem limitação, os factores de crescimento; anti- 135 metabólitos; medicamentos neuroprotetores, incluindo, sem limitação, eliprodil; e esteroides angiostáticos para o tratamento de doenças ou condições de segmento posterior 26, incluindo, sem limitação, a degeneração macular relacionada com a idade (AMD), incluindo AMD não exsudativa (seca) e exsudativa (húmida), neovascularização coroidal, retinopatias, retinite, uveite, edema macular e glaucoma. Para informação adicional a cerca de tais esteroides angiostáticos veja-se Patentes US N° 5.679.666 e 5.770.592. Um anti-inflamatório não esteroide para o tratamento de edema macular cistoide é nepafenac.

Para administração nos olhos, um composto da presente invenção é liberado num veiculo oftalmológico farmaceuticamente aceitável tal que o composto é mantido em contacto com a superfície ocular por um período de tempo suficiente para deixar o composto penetrar na córnea e/ou esclerótica e regiões internas do olho, incluindo, por exemplo, a câmara anterior, câmara posterior, corpo vítreo, humor aquoso, humor vítreo, córnea, íris/ciliar, lente, coroide/retina e a esclerótica. 0 veículo oftalmológico farmaceuticamente aceitável pode ser uma pomada, óleo vegetal, ou um material encapsulado. Um composto da invenção pode também ser injectado directamente no humor vítreo ou humor aquoso.

Além disso, um composto pode ser também administrado por métodos aceitáveis bem conhecidos, tais como a sub-Tenon e/ou injecções subconjuntivais. Como é bem sabido na técnica oftálmica, a mácula está compreendida principalmente de cones da retina e é a região de máxima acuidade visual na retina. Uma cápsula de Tenon ou membrana de Tenon é disposta na esclerótica. Uma conjuntiva abrange uma pequena área do globo do olho posterior até o limbo (a conjuntiva bulbar) e se dobra para cima (o fundo de saco superior) ou para baixo (o fundo de saco inferior) , para cobrir as áreas internas da pálpebra superior e pálpebra 136 inferior, respectivamente. A conjuntiva é disposta na parte de cima da cápsula de Tenon. A esclerótica e a cápsula de Tenon definem a superfície exterior do globo do olho. Para o tratamento de doenças oculares tais como a degeneração macular relacionada com a idade (AMD), incluindo AMD não exsudativa (seca) e exsudativa (húmida) , neovascularização coroidal, retinopatias (tais como a retinopatia diabética, retinopatia da prematuridade) , edema macular diabético, retinite, uveíte, edema macular cistoide (CME), glaucoma e outras doenças ou condições do segmento posterior dos olhos, é preferível dispor um depósito de uma quantidade específica de um agente oftalmicamente aceitável farmaceuticamente activo directamente sobre a superfície externa da esclerótica e a seguir da cápsula de Tenon. Além disso, nos casos de degeneração macular relacionada com a idade (AMD) incluindo a AMD não exsudativa (seca) e exsudativa (húmida) AMD e CME é mais preferível dispor o depósito directamente sobre a superfície externa da esclerótica, a seguir da cápsula de Tenon, e geralmente acima da mácula.

Os compostos podem ser formulados como uma preparação de depósito. Tais formulações de acção prolongada podem ser administradas pela implantação (por exemplo, por via subcutânea ou intramuscular), injecção intramuscular ou pela injecção sub-Tenon ou intravítrea mencionada acima. Alternativamente, o ingrediente activo pode estar na forma de pó para constituição com um „veículo adequado, por exemplo, água livre de pirogénio estéril, antes da sua utilização.

Dentro das formas de realização particularmente preferidas da invenção, os compostos podem ser preparados para a administração tópica em solução salina (combinados com qualquer um dos conservantes e agentes anti-microbianos comummente utilizados nas preparações oculares), e administrada na forma de colírio. A solução ou 137 suspensão pode ser preparada na sua forma pura e administrada várias vezes ao dia. Alternativamente, as presentes composições, preparadas como descrito acima, podem também ser administradas directamente na córnea.

Dentro das formas de realização preferidas, a composição é preparada com um polimero muco-adesivo que se liga na córnea. Assim, por exemplo, os compostos podem ser formulados com materiais poliméricos ou hidrofóbicos adequados (por exemplo, como uma emulsão num óleo aceitável) ou resinas de permuta de ion, ou como derivados moderadamente solúveis, por exemplo, como um sal moderadamente solúvel.

Um veiculo farmacêutico para compostos hidrofóbicos é um sistema co-solvente que compreende álcool benzilico, um tensioactivo não polar, um polimero orgânico miscivel em água, e uma fase aquosa. 0 sistema co- solvente pode ser um sistema co-solvente VPD. VPD é uma solução de 3 % p/v de álcool benzilico, 8 % p/v do tensioactivo não polar polisorbato 80, e 65 % p/v de polietilenoglicol 300, preparado em volume de etanol absoluto. O sistema co-solvente VPD (VPD:5W) contém VPD diluído 1:1 com dextrose a 5 % em solução aquosa. Este sistema de co-solvente dissolve compostos hidrofóbicos, e produz por si mesmo baixa toxicidade após administração sistémica. Naturalmente, as proporções de um sistema co-solvente podem variar consideravelmente sem destruir suas características de solubilidade e toxicidade. Além disso, a identidade das porções co-solventes pode ser variada: por exemplo, outros tensioactivos não polares de baixa toxicidade podem ser utilizados em vez de polissorbato 80, o tamanho de fracção do polietileno glicol pode ser variado; outros polímeros biocompatíveis podem substituir o polietileno glicol, por exemplo, polivinil pirrolidona; e outros açúcares ou polissacáridos podem ser substituídos por dextrose.

Alternativamente, outros sistemas de liberação para os 138 compostos farmacêuticos hidrofóbicos podem ser utilizados. Lipossomas e emulsões são exemplos conhecidos de veiculos ou veiculos de liberação para medicamentos hidrofóbicos. Certos solventes orgânicos tais como dimetilsulfóxido também podem ser utilizados, embora geralmente à custa de uma maior toxicidade. Adicionalmente, os compostos podem ser liberados usando um sistema de liberação sustentada, tal como matrizes semipermeáveis de polimeros hidrofóbicos sólidos contendo o agente terapêutico. Vários materiais de liberação sustentada foram estabelecidos e são conhecidos por aqueles versados na técnica. As cápsulas de liberação sustentada podem, em função da sua natureza quimica, liberar os compostos durante algumas semanas até mais de 100 dias. Dependendo da natureza quimica e da estabilidade biológica do reagente terapêutico, estratégias adicionais para a estabilização de proteina podem ser utilizadas.

As composições farmacêuticas também podem compreender veiculos ou excipientes de fase sólida ou gel adequados. Exemplos de tais veiculos ou excipientes incluem carbonato de cálcio, fosfato de cálcio, açúcares, amidos, derivados de celulose, gelatina, e polimeros tais como o polietileno glicol.

Qualquer uma das composições pode ser formulada para administração a um indivíduo. Um indivíduo da presente invenção é preferivelmente um mamífero, ou mais preferivelmente um ser humano.

As formulações farmacêuticas aqui podem ainda incluir um agente terapêutico seleccionado a partir do grupo consistindo em: um agente antineoplásico, um agente anti-inflamatório, um agente antibacteriano, um agente antiviral, um agente angiogénico, e um agente antiangiogénico. Exemplos de tais agentes são revelados no presente documento.

Por exemplo, um agente antineoplástico pode ser seleccionado a partir do grupo consistindo em Cloridrato de 139

Acodazol; Acronina; Adozelesin; Aldesleucina; Altretamina; Ambomicina; Acetato de Ametantrona; Aminoglutetimida; Ansacrina; Anastrozol; Antramicina; Asparaginase; Asperlin; Azacitidina; Azetepa; Azotomicina; batimastat; Benzodepa; Bicalutamida; Cloridrato de Bisantreno; Dimesilato de Bisnafide; Bizelesin; Sulfato de Bleomicina; Brequinar de sódio; Bropirimina; busulfan; Cactinomicina; Calusterona; Caracemida; Carbetimer; Carboplatina; Carmustina; Cloridrato de Carubicina; Carzelesin; Cedefingol; Clorambucil; Cirolemicina; Cisplatina; cladribina; Mesilato de Crisnatol; Ciclofosfamida; Citarabina; Dacarbazina; Dactinomicina; Cloridrato de Daunorrubicina; Decitabina; Dexormaplatina; Dezaguanina; Mesilato de Dezaguanina; Diaziquona; Docetaxel; doxorrubicina; Cloridrato de doxorrubicina; Droloxifeno; citrato de Droloxifeno; Propionato de Dromostanolona; Duazomicina; Edatrexato; Cloridrato de Eflornitina; Elsamitrucina; Enloplatina; Enpromato; Epipropidina; Cloridrato de Epirrubicina; Erbulozol; Cloridrato de Esorrubicina; Estramustina; Estramustina Fosfato de sódio; Etanidazol; Ethiodized Oil I 131; Etopósido; Fosfato de Etopósido; Etopri- na; Cloridrato de Fadrozol; Fazarabina; Fenretinida; Floxuridina; Fosfato de Fludarabina; Fluorouracilo; Flurocitabina; Fosquidona; Fostriecina de sódio; Gencitabina; Cloridrato de Gencitabina; Gold Au 198; Hidroxiuréia; Cloridrato de Idarrubicina; Ifosfamida; Imofosina; Interferão Alfa-2A; Interferão Alfa-2b; Interferão Alfa-nl; Interferão Alfa-n3; Interferão beta-la; Interferão Gama-lb; Iproplatina; Cloridrato de Irinotecan; Acetato de Lanreotide; Letrozol; Cloridrato de Liarozol Acetato de Leuprolide; Lometrexol de sódio; Lomustina; Cloridrato de Losoxantrona; Masoprocol; Maitansina; Cloridrato de Mecloretamina; Acetato de Megestrol; Acetato de Melengestrol; Melfalan; Menogaril; Mercaptopurina; metotrexato; métotrexato de sódio; Metoprina; Meturedepa; 140

Mitindomida; Mitocarcina; Mitocromina; Mitogilina; Mitomalcina; Mitomicina; Mitosper; Mitotano; Cloridrato de Mitoxantrona; Ácido Micofenólico; Nocodazol; Nogalamicina; Ormaplatina; Oxissurano; Paclitaxel; Pegaspargase; Peliomicina; Pentamustina; Sulfato de Peplomicina; Perfosfamida; Pipobroman; Piposulfan; Cloridrato de Piroxantrona; Plicamicina; Plomestano; Porfimero sódico; Porfiromicina; Prednimustina; Cloridrato de Procarbazina; Puromicina; Cloridrato de Puromicina; Pirazofurina; Riboprina; Rogletimida; Safingol; Cloridrato de Safingol; Semustina; Sintrazeno; Esparfosato de sódio; Esparsomicinl, Cloridrato de Espirogermânio; Espiromustina; Espiroplatina; Estreptonigrina; Estreptozocina; Cloreto de Estrôncio Sr 89; Sulofenur; Talisomicina; Taxano; Taxoide; Tecogalan de sódio; Tegafur; Cloridrato de Teloxantrona; Temoporfin; Teniposideo; Teroxirona; Testolactona; Tiamiprina; Tioguanina; Tiotepa; Tiazofurin; Tirapazamina; Cloridrato de Topotecano; citrato de Toremifeno; Acetato de Trestolona; Fosfato de Triciribina; Trimetrexato; Trimetrexato Glucuronato; Triptorelina; Cloridrato de Tubulozol; Mostarda de Uracilo; Uredepa; Vapreotide; Vertepprfín; Sulfato de Vinblastina; Sulfato de Vincristina; Vindesina; Sulfato de Vindesina; Sulfato de Vinepidina; Sulfato de Vinglicinato; Sulfato de Vinleurosina; Tartrato de Vinorelbina; Sulfato de Vinrosidina; Sulfato de Vinzolidina; Vorozol; Zeniplatina; Zinostatina; Cloridrato de Zorrubicina.

Agentes antiangiogénicos são quaisquer agentes que inibem a angiogénese, quer revelados aqui ou conhecidos na técnica. Nas formas de realização preferidas, um agente antiangiogénico é um agente anti-VEGF, tal como Macugen™ (Eyetech, Nova Iorque, NY), ou anticorpos anti-VEGF.

As composições farmacêuticas podem ser formuladas por técnicas padrão usando um ou mais veiculos, excipientes e diluentes adequados. Veja-se, por exemplo, Remington's 141

Pharmaceutical Sciences, (19a Ed. Williams & Wilkins, 1995).

As formulações adequadas para a administração parentérica incluem formulações isotónicas aquosas e não aquosas com o sangue do destinatário; e as suspensões estéreis aquosas e não aquosas que podem incluir os sistemas de suspensão designados para direccionar o composto para as porções do sangue ou um ou mais órgãos. As formulações podem ser apresentadas em recipientes lacrados de dose unitária ou múltiplas doses, por exemplo, ampolas ou frascos. Para as formulações infraoculares, as dosagens unitárias são preferidas porque nenhum conservante está na formulação. Para outras formulações parentéricas, conservante pode ser utilizado, o que levaria em conta os recipientes de múltiplas doses.

As soluções e suspensões de injecção extemporâneas podem ser preparadas, por exemplo, a partir de pós estéreis. As formas parentéricas e intravenosas podem também incluir minerais e outros materiais para torná-las compatíveis com o tipo de injecção ou o sistema de liberação escolhido.

As administrações parentéricas particulares contempladas pela presente invenção incluem administrações infraoculares e intravitreas ao olho. As formulações farmacêuticas para administrações infraoculares e intravitreas incluem salina tamponada de fosfato (PBS) e solução salina isotónica equilibrada (BSS) com ou sem excipientes tais como manitol ou sorbitol como estabilizadores d proteina.

Em geral, água, óleo adequado, salina, dextrose aquosa (glicose), ou soluções de açúcar relacionadas e glicóis tais como propileno glicol ou polietileno glicol são veiculos adequados para soluções parentéricas. As soluções para a administração parentérica preferivelmente contêm um sal hidrossolúvel do ingrediente activo, agentes 142 estabilizantes adequados e, se necessário, substâncias tamponantes. Os agentes antioxidantes, tais como bissulfito de sódio, sulfito de sódio ou ácido ascórbico, isoladamente ou combinados, são agentes estabilizantes adequados. Também são utilizados sais de ácido citrico destes, ou EDTA de sódio. Além disso, as soluções parentéricas podem conter conservantes, tais como cloreto de benzalcónio, metil- ou propil-parabeno, ou clorobutanol. Os veículos farmacêuticos adequados são descritos em Remington, citados supra.

Em qualquer uma das formas de realização aqui, uma composição ou formulação farmacêutica neste documento pode ser liofilizada.

Em qualquer das formas de realização, as formulações farmacêuticas preferíveis possuem menos do que cerca de 10, mais preferivelmente menos do que cerca de 5, mais preferivelmente menos do que cerca de 3, ou mais preferivelmente menos do que cerca de 1 unidade de endotoxina por miligrama de agentes terapêuticos.

Em algumas formas de realização, os métodos de tratamento revelados no presente documento ainda incluem a administração a um indivíduo que sofre de uma condição angiogénica de um ou mais agentes terapêuticos seleccionados do grupo consistindo em agentes antineoplásticos, agentes antivirais, agentes anti-inflamatórios, agentes antibacterianos, agentes antiangiogénicos ou agentes antiangiogénicos.

Tais tratamentos de combinação podem ser obtidos mediante a administração num indivíduo de uma co-formulação das composições aqui contidas com o(s) agente(s) terapêutico(s) adicional(is) ou mediante a administração das composições aqui contidas e o(s) agente(s) terapêutico(s) como duas formulações farmacêuticas separadas. Nas formas de realização em que mais do que uma composição/agente terapêutico é administrada a um indivíduo, dosagens mais baixas das composições e/ou 143 agente(s) terapêutico(s) podem ser utilizadas como um resultado do efeito sinergistico de ambos os ingredientes activos.

Os agentes antineoplásticos que podem ser administrados a um indivíduo incluem, mas não são limitados a, Aclarrubicina; Cloridrato de Acodazol; Acronina; Adozelesina; Aldesleucina; Altretamina; Ambomicina; Acetato de Ametantrona; Aminoglutetimida; Ansacrina; Anastrozol; Antramicina; Asparaginase; Asperlin; Azacitidina; Azetepa; Azotomicina; batimastat; Benzodepa; Bicalutamida; Cloridrato de Bisantreno; Dimesilato de Bisnafide;

Bizelesina; Bropirimina; Caracemida; Cloridrato Clorambucilo;

Cedefingol; cladribina; Citarabina;

Sulfato de Bleomicina; Brequinar de sódio; busulfan; Cactinomicina; Calusterona; Carbetimer; Carboplatina; Carmustina; de Carubicina; Carzelesina;

Cirolemicina; Cisplatina;

Mesilato de Crisnatol; Ciclofosfamida;

Gama-lb;

Dacarbazina; Dactinomicina; Cloridrato de Daunorrubicina; Decitabina; Dexormaplatina; Dezaguanina; Mesilato de Dezaguanina; Diaziquona; Docetaxel; doxorrubicina; Cloridrato de doxorrubicina; Droloxifeno; citrato de Droloxifeno; Propionato de Dromostanolona; Duazomicina; Edatrexato; Cioridreto de Eflornitina; Elsamitrucina; Enloplatina; Enpromato; Epipropidina; Cloridrato de Epirrubicina; Erbulozol; Cloridrato de Esorrubicina; Estramustina; Estramustina Fosfato de sódio; Etanidazol; Ethiodized Oil I 131; Etopósido; Fosfato de Etopósido; Etoprina; Cloridrato de Fadrozol; Fazarabina; Fenretinida; Floxurridina; Fosfato de Fludarabina; Fluorouracilo; Flurocitabina; Fosquidona; Fostriecina de sódio; Gencitabina; Cloridrato de Gencitabina; Gold Au 198; Hidroxiuréia; Cloridrato de Idarrubicina; Ifosfamida; Imofosina; Interferão Alfa-2A; Interferão Alfa-2b; Interferão Alfa-nl; Interferão Alfa- n3; Interferão beta-la; Interferão Gama-lb; Iproplatina; Cloridrato de 144

Irinotecan; Acetato de Lanreótido; Letrozol; Cloridrato de Liarozol Acetato de Leuprolide; Lometrexol de sódio; Lomustina; Cloridrato de Losoxantrona; Masoprocol; Maitansina; Cloridrato de Mecloretamina; Acetato de Megestrol; Acetato de Melengestrol; Melfalano; Menogaril; Mercaptopurina; metotrexato; Metotrexato de sódio; Metoprina; Meturedepa; Mitindomida; Mitocarcin;

Mitocromina; Mitogilin; Mitomalcina; Mitomicina; Mitosper; Mitotano; Cloridrato de Mitoxantrona; Ácido Micofenólico; Nocodazol; Nogalamicina; Ormaplatina; Oxisuran; Paclitaxel; Pegaspargase; Peliomicina; Pentamustina; Sulfato de Peplomicina; Perfosfamida; Pipobroman; Piposulfan; Cloridrato de Piroxantrona; Plicamicina; Plomestano; Porfimero sódico; Porfiromicina; Prednimustina; Cloridrato de Procarbazina; Puromicina; Cloridrato de Puromicina; Pirazofurina; Riboprina; Rogletimida; Safingol; Cloridrato de Safingol; Semustina; Sintrazeno; Esparfosato de sódio; Esparsomicinl, Cloridrato de espirogermánio; Espiromustina; Espiroplatina; Estreptonigrina; Estreptozocina; Cloreto de Estrôncio Sr 89; Sulofenur; Talisomicina; Taxano; Taxoide; Tecogalan de sódio; Tegafur; Cloridrato de Teloxantrona; Temoporfin; Tenipósido; Teroxirona; Testolactona;

Tiamiprina; Tioguanina; Tiotepa; Tiazofurin; Tirapazamina; Cloridrato de Topotecano; Citrato de Toremifeno; Acetato de Trestolona; Fosfato de Triciribina; Trimetrexato; Trimetrexato Glucuronato; Triptorelina; Cloridrato de Tubulozol; Mostarda de Uracilo; Uredepa; Vapreótido; Verteporfina; Sulfato de d Vinblastina; Sulfato de Vincristina; Vindesina; Sulfato de Vindesina; Sulfato de Vinepidina; Sulfato de Vinglicinato; Sulfato de Vinleurosina; Tartrato de Vinorelbina; Sulfato de Vinrosidina; Sulfato de Vinzoiidina; Vorozol; Zeniplatina; Zinostatina; Cloridrato de Zorrubicina.

Os agentes antibacterianos que podem ser administrados a um indivíduo incluem, mas não estão limitados a eles, 145 145 lincomicina, fosfomicina, Capreomicina, minociclina, novobiocina, polimixina, gramicidina, bacitracina, penicilinas, aminoglicósidos, macrólidos, monobactâmicos, rifamicinas, tetraciclinas, cloranfenicol, clindamicina, imipenem, ácido fusidico, fusidato sódio, neomicina, colistimetato, colistina, doxiciclina, vancomicina, canamicina, gentamicina, eritromicina e cefalosporinas.

Os agentes anti-inflamatórios que podem ser administrados a um indivíduo incluem, mas não são limitados a, ΑΙΝΕ (por exemplo, aspirina (salicilamida), salicilamida de sódio, indoprofen, indometacina, indometacina de sódio trihidratado, Bayer™, Bufferin™, Celebrex™, diclofenac, Ecotrin™, diflunisal, fenoprofen, naproxeno, sulindac, Vioxx™), corticosteroides ou corticotropina (ACTH), colquicina e acetato de anecortave.

Os agentes antivirais que podem ser administrados a um indivíduo incluem, mas não são limitados a eles, a-metil-P-adamantano metilamina, 1,-D-ribofuranosil-1,2,4-triazóis-3 carboxamida, 9-[2-hidroxi-etoxi]metilguanina, adamantanamina, 5-iodo-2'-deoxiuridina, trifluorotimidina, interferão, arabinósido de adenina, CD4, 3'-azido-3'-deoxitimidina (AZT), 9-(2- hidroxietoximetil)-guanina (aciclovir), ácido fosfonofórmico, 1-adamantanamina, péptido T, e 2',3'dideoxicitidina. A administração de uma composição da presente invenção a uma célula alvo in vivo pode ser realizada utilizando qualquer uma de uma variedade de técnicas bem conhecidas dos peritos na especialidade.

Por exemplo, as composições da presente invenção podem ser administradas sistémica ou localmente por qualquer meio conhecido na técnica (por exemplo, por via oral, intraocular, intravascular (i.v.), intradérmica, intramuscular, transdérmica, transmucosal, entérica, parental, por inalação pulverização, rectal, ou topicamente), em formulações de dosagem unitária e contendo 146 veículos, adjuvantes e veículos farmaceuticamente aceitáveis convencionais.

Como é utilizado no presente documento o termo intraocularmente inclui intravitreal, sub-retiniana, e similares.

Como é utilizado no presente documento o termo parentérica como usado inclui, subcutânea, endovenosa, intramuscular, intraesternal, técnicas de infusão ou intraperitoneal. Supositórios para administração rectal do medicamento podem ser preparados mediante a mistura do medicamento com um excipiente não irritante adequado tal como manteiga de cacau e polietileno glicóis que são sólidos em temperaturas normais, mas líquidos na temperatura rectal e, por isso, derreterá no recto e liberará o medicamento. 0 regime de dosagem para o tratamento de um distúrbio ou uma doença com as composições desta invenção se baseia numa variedade de factores, incluindo o tipo de doença, a idade, peso, sexo e estado clínico do paciente, a gravidade da patologia, a via de administração, e o composto particular utilizado. Assim, o regime posológico pode variar amplamente, mas pode ser determinado rotineiramente utilizando métodos padrão.

Para a administração sistémica, o anticorpo anti-ALK-1 ou porção do mesmo de ligação a antígeno da presente invenção e/ou um ou mais agentes terapêuticos adicionais são preferivelmente administrados numa dose de pelo menos 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 2,0, 3, 0, 4,0, 5, 0, 6, 0, 7,0, 8,0, 9, 0, 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100 ou 150 mg/kg de peso corporal. Em outras formas de realização, os polipéptidos (de preferência dímeros ou homodímeros) e/ou de moléculas pequenas são aqui sistemicamente administrados numa dose de 0,1 a 100 mg/kg, mais preferivelmente de 0,5 a 50 mg/kg, mais preferivelmente de 1 a 30 mg/kg de peso corporal, ou mais 147 preferivelmente de 5 a 20 mg/kg.

Para a administração localizada, o anticorpo anti-ALK-1 ou porção do mesmo de ligação a antigeno da presente invenção e/ou um ou mais agentes terapêuticos adicionais são preferivelmente administrados numa dose de pelo menos 50 yg, 100 yg, 150 yg, 200 yg, 250 yg, 300 yg, 350 yg, 400 yg, 450 yg, 500 yg, 550 yg, 600 yg, 650 yg ou 700 yg. Em outras formas de realização, os polipéptidos (preferivelmente dimeros ou homodímeros) e/ou moléculas pequenas aqui são administrados localmente numa dose de 50 a 1000 yg, mais preferivelmente de 100 a 800 yg, mais preferivelmente de 200 a 500 yg, ou mais preferivelmente de 300 a 400 yg por local.

Por exemplo, para a administração dérmica o anticorpo anti- ALK-1 ou porção do mesmo de ligação a antigeno da presente invenção e/ou peptidomiméticos e/ou um ou mais agentes terapêuticos são administrados numa dose de 50 a 1000 yg/cm2, mais preferivelmente de 100 a 800 yg/cm2, ou mais preferivelmente de 200 a 500 yg/cm2. Em outro exemplo, para administração ocular, os polipéptidos e/ou peptidomiméticos e/ou moléculas pequenas da presente invenção são administrados numa dose de 50 a 1000 yg/olho, mais preferivelmente de 100 a 800 yg/olho, ou mais preferivelmente de 200 a 500 yg/olho.

As composições farmacêuticas preferivelmente incluem o ingrediente activo (por exemplo, um anticorpo anti-ALK-1), numa quantidade eficaz, isto é, numa quantidade eficaz para alcançar o beneficio terapêutico ou profiláctico. A quantidade real eficaz para uma aplicação particular vai depender da condição a ser tratada e da via de administração. A determinação de uma quantidade eficaz está bem dentro da capacidade dos peritos na especialidade, especialmente à luz da divulgação aqui apresentada.

Preferivelmente, a quantidade eficaz do ingrediente activo, por exemplo, um anticorpo anti-ALK-1, é de cerca de 148 0,0001 mg a cerca de 500 mg de agente activo por quilograma de peso corporal de um paciente, mais preferivelmente de cerca de 0,001 a cerca de 250 mg de agente activo por quilograma de peso corporal do paciente, ainda mais preferivelmente de cerca de 0,01 mg a cerca de 100 mg de agente activo por quilograma de peso corporal do paciente, ainda mais preferivelmente de cerca de 0,5 mg a cerca de 50 mg de agente activo por quilograma de peso corporal do paciente, e o mais preferível de cerca de 1 mg a cerca de 15 mg de agente activo por quilograma de peso corporal do paciente.

Em termos de percentagem em peso, as formulações da presente invenção preferivelmente compreenderão o agente activo, por exemplo, um anticorpo anti-ALK-1, numa quantidade de cerca de 0,0001 a cerca de 10 % em peso, mais preferivelmente de cerca de 0,001 a cerca de 1 % em peso, mais preferivelmente de cerca de 0,05 a cerca de 1 % em peso, ou mais preferivelmente cerca de 0,1 a cerca de 0,5 % em peso.

Terapêutica Genética

As moléculas de ácido nucleico que codificam os anticorpos e porções de anticorpos da presente invenção podem ser administradas a um paciente com necessidade através da terapêutica genética. A terapêutica pode ser in vivo ou ex vivo. Numa forma de realização preferida, as moléculas de ácido nucleico que codificam tanto uma cadeia pesada quanto uma cadeia leve são administradas a um paciente. Numa forma de realização mais preferida, as moléculas de ácido nucleico são administradas tais que elas são estavelmente integradas em cromossomas de células B, porque estas células são especializadas para a produção de anticorpos. Numa forma de realização preferida, as células precursoras B são transfectadas ou infectadas ex vivo e re-transplantadas num paciente em necessidade do mesmo. Numa outra forma de realização, as células precursoras B ou 149 outras células são infectadas in vivo usando um vírus conhecido de infectar o tipo de célula de interesse. Os vectores típicos utilizados para a terapêutica genética incluem lipossomas, plasmídeos e vectores virais. Os vectores virais exemplares são retrovírus, adenovírus e vírus adeno-associados. Após a infecção, quer in vivo ou ex vivo, os níveis de expressão de anticorpos podem ser monitorizados por tomar uma amostra do paciente tratado e usar qualquer imunoensaio conhecido na técnica ou debatido no presente documento.

Numa forma de realização preferida, o método de terapêutica genética compreende as etapas de administrar uma molécula de ácido nucleico isolada que codifica a cadeia pesada ou uma porção de ligação a antígeno desta de um anticorpo anti-ALK-1 e que expressa a molécula do ácido nucleico. Em outra forma de realização, o método de terapêutica genética compreende as etapas de administrar uma molécula de ácido nucleico isolada que codifica a cadeia leve ou uma porção de ligação a antígeno desta de um anticorpo anti-ALK-1 e que expressa a molécula de ácido nucleico. Num método mais preferido, o método de terapêutica genética compreende as etapas de administrar uma molécula de ácido nucleico isolada que codifica a cadeia pesada ou uma porção de ligação a antígeno desta e uma molécula de ácido nucleico isolada que codifica a cadeia leve ou o porção de ligação a antígeno desta de um anticorpo anti-ALK-1 da invenção e que expressa as moléculas de ácido nucleico. 0 método de terapêutica genética pode também compreender a etapa de administrar um outro agente terapêutico, tal como qualquer um dos agentes debatidos anteriormente em conexão com a terapêutica de combinação. Método para o rastreio de Antagonistas ou Agonistas de ALK-1

Numa forma de realização, a presente invenção 150 proporciona um método para determinar se uma substância inibe a regulação positiva de um gene alvo jusante especifico da ALK-1, Idl, tal como, por exemplo, o Ensaio Taqman para Idl descrito no Exemplo 12. O método compreende colocar em contacto uma amostra de células que expressam Idl com a substância e determinar se a expressão de Idl foi inibida, em que um nivel reduzido de expressão de Idl na amostra das células colocadas em contacto com a substância quando comparado com uma amostra de controlo de células é indicativo de dita substância que inibe a expressão de Idl. Numa forma de realização especifica, a substância é um anticorpo que se liga ao dominio extracelular da ALK-1. Em outra forma de realização, a substância é uma molécula pequena. De acordo com a invenção, as células podem expressar inerentemente tanto ALK-1 quanto Idl, tais como HUVECs descritas no Exemplo 12, ou que foram transformados ou transfectadas com ADN que codifica uma ou ambas destas. Pode-se determinar a expressão de Idl através da, por exemplo, utilização de Ensaio Taqman para Idl descrito no Exemplo 12.

Inversamente, os activadores ou agonistas também podem ser testados, ou utilizados, seguindo os mesmos tipos de procedimentos.

De modo que esta invenção possa ser melhor compreendida, os seguintes exemplos são apresentados. Estes exemplos são para propósitos de ilustração e não devem ser interpretados como limitativos do âmbito da invenção de qualquer maneira.

Exemplos

Nos seguintes exemplos e preparações, "MW" significa peso molecular; "Cauda de His" significa a cauda de poli-histidina C-terminal (6xHis) para a rápida purificação com a resina de quelação do niquel e detecção com um anticorpo anti-His (C-terminal) ; "BSA" significa albumina de soro bovino; 151 "EDTA" significa ácido etilenodiaminatetraacético; "DMSO" significa sulfóxido de dimetilo; "MOPS" significa o ácido 3-(N-morfolino)-propanossulfónico; "MES" significa o ácido 2-(N-morfolino)-etanossulfónico; "PBS" significa solução salina tamponada com fosfato; "dPBS" significa solução salina tampo- nada com fosfato da Dulbecco; "HEMA" significa metacrilato de 2-hidroxietilo; "DMEM" significa meio de eagle modificado da Dulbecco; "FBS" significa soro bovino fetal; "NEAA" significa aminoácidos não essenciais; "HEPES" significa ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-etanossulfónico; e "DMF" significa dimetil-formamida. Exemplo 1, Preparação do Imunogénio ALK-1 0 DEC do ALK foi clonado do clone ORF de ALK-1 humano de comprimento completo (Invitrogen, Clone ID IOH21048) por PCR com a utilização dos iniciadores dianteiros 5'-ACGGCCCAGCCGGCCGACCCTGT GAAGCCGTCT (SEQ ID NO: 96) e 5'-ACTA4GC77TTAATGATGA TGATGATGATGCTGGCCATCTGTTCCCG (SEQ ID NO: 97) reverso. 0 produto da PCR foi purificado, tratado com as enzimas de restrição Sfil e Hindlll, e clonado no local Sfil/Hindlll de um vector de expressão de mamíferos pSecTag2/Hygro (Invitrogen Inc., N° de Catálogo V910-20). 0 clone foi usado para transientemente transfectar as células 293T com o reagente de transfecção Fugene 6 (Roche Applied Science, N° de Catálogo 1814443), seguindo-se as instruções do fabricante. 0 sobrenadante da cultura celular contendo a proteína alvo segregada foi colhido 72 horas após a transfecção e deixado ligar-se à resina Ni-NTA (QIAGEN, N° de Catálogo 30430) em 4 °C durante a noite. A resina foi então lavada com tampão contendo Tris 20 mM, pH 8,0, imidazol 25 mM e cloreto de sódio 300 mM. A proteína Cauda de His foi removida por eluição da resina com a utilização do tampão contendo Tris 20 mM, pH 8,0, imidazol 300 mM e cloreto de sódio 300 mM. Uma resina de permuta de catiões CM Sepharose foi usada para ainda purificar a proteína em 152 fosfato de sódio 20 mM (pH 7,0), e a fracção não ligada contendo a proteína alvo foi colhida. A proteína foi permutada no tampão por PBS ou HEPES 10 mM, pH 7,4, mais cloreto de sódio por diálise, e concentrada a 0,2 a 1 mg/ml com uma pureza final de > 90 %, avaliada por gel de SDS PAGE corado com azul de Coomassie. A proteína DEC ALK-1 com cauda de His foi intensamente glicosilada com um MW aparente de 2 6 KDa, em comparação com um MW teórico de 11 KDa para a proteína. A proteína com cauda de His DEC ALK-1 (SEQ ID NO: 98) foi usada para a geração do anticorpo anti-ALK-1 produtor dos hibridomas, como descrito no Exemplo 2. ProteínaDEC ALK-1 com cauda de His humana: sequência de genes: a parte de letras minúsculas é o sinal de secreção):

etggagacagacacactcctgctatgggiacIgctgcteígggtíccaggttccaeíggtgacgcggcccagcí^sccGACCCTGTGAAGC

COTÇTCGGGGCCCGCTGSTGACCTâCACGTGTGAGAGCÇCACAttBCAÀÍâaGâCCtACCTGCCGG ggggcctggtgcacagtagtgctggtgcgggaggaggggaggcacccccaggaacatcggggçt gcgggaacttgcacagggagctctgçagggggcgccccaçcgagttçgtcaaccactactgctgc GAaAGCCACCTCTGCAACCAOAACGTGTCCCTGGTGCTGGAGGCCACCCAACCTCCTTCGGAGCAG CCGGGMCAGATGGCCAGCATCATCATCATCATCAT {SÊQ IDNO; 98) sequência de proteínas: DPVKPSRG P LVTCTCESPHCKG PTC R GAWCTVVLVHEEGRHPQEH RGCGNLH R£ LCRGRPTEFVN HY CCDSHLCNHNVaLVLEATQPPSEQPGTDGQHHHHHH (SEQ ID NO: 38)

Exemplo 2. Geração de Anticorpo anti-ALK-1 Produtor de Hibridomas

Ratinhos XENOMOUSE® de oito a dez semanas de idade foram imunizados em suas patas traseiras com 10 yg/ratinho ou de quimera ALK-l/Fc recombinante humano (R&D Systems, Inc., Número de Catálogo 370-AL) ou com a proteína de cauda de His DEC ALK-1 descrita no Exemplo 1. Esta dose foi repetida cinco a sete vezes durante um período de três a cinco semanas. Três ou quatro dias antes da fusão, os ratinhos receberam uma injecção final do imunogénio em PBS. Os linfócitos dos nódulos linfáticos dos ratinhos imunizados foram fundidos com a linha de células P3- X63 Ag8.653 através da electrofusão das células [N° de Cat. de 153 ATCC CRL 1580), e estas células fundidas foram submetidas à selecção de HA-DMEM como anteriormente descrito (DMEM/15 % de FBS/1 % de L-glutamina 200 mM /1 % aminoácido não essencial 100X/1 % Pen 100X/Strep/10 U/ml de IL-6/1 frasco/litro de suplemento de meio OPI mais 0,5x HA (Azasserina-Hipoxantina, Sigma, N° de Cat. A9666)]. Um painel de hibridomas foi recuperado, todos os quais segregam os anticorpos de IgG2 humano especifico de ALK-1. 0 ensaio ELISA foi usado para detectar a ligação do anticorpo. O imunogénio foi aplicado à placa de microtitulação Immulon de 96 poços (superfície MaxiSorp™ da placa NUNC-Immuno™, Nalge Nunc International, N° de Cat. 439454) a 4 yg/ml em tampão de bicarbonato de sódio 50 mM durante a noite, a 4 °C. As placas foram lavadas e depois bloqueadas com PBS com a adição de 0,1 % de Tween-20 e 0,5 % de albumina de soro bovino. Os anticorpos foram acrescentados às placas de ELISA bloqueadas, incubados por 1 hora, e lavados com PBS com Tween-20. A ligação foi detectada por IgG humana-peroxidase de rábano silvestre (Pierce, N° de Catálogo 31420) seguido pela adição de ABTS (Pierce, N° de Catálogo 37615). As medições colorimétricas foram realizadas em 405 nm numa leitora de micro-placas (SpectraMax Plus 384, Molecular Devices).

Vinte e cinco hibridomas foram seleccionados para estudo adicional. Estes eram células isoladas clonadas por diluição limitativa e foram designados 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1(rWT); 1.12.1(M29I/D19A); 1.12.1(M291); 1.12.1(Dl9A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1; e 5.59.1.

A linha LN 15916 de Células de Hibridoma de Ratinho (o hibridoma 1.12.1) foi depositada sob termos de acordo com o Tratado de Budapeste na Colecção Americana de Culturas Celulares (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, VA 154 20110-2209 em 21 de Junho de 2005. Ao hibridoma 1.12.1 foi atribuído o seguinte número de acesso: PTA-6808.

Exemplo 3. Sequências de Anticorpos Anti-ALK-1

Para analisar a estrutura de anticorpos produzida de acordo com a invenção, foram clonados ácidos nucleicos que codificam os fragmentos de cadeia pesada e leve dos anticorpos monoclonais anti-ALK-1 produtores dos hibridomas. A clonagem e a sequenciação foi realizada por meios padrão. O ARNm poli (A)+ foi isolado com a utilização de um kit Fast-Track™ (Invitrogen) de aproximadamente 2 X 105 células de hibridoma para cada um dos anticorpos de ALK-1. O ADNc foi sintetizado do ARNm mediante a utilização de iniciadores aleatórios. O ADNc iniciado aleatoriamente foi amplificado por PCR com a utilização de iniciadores de domínio variável específicos da família de Vh humano ou de VK humano, em combinação com iniciadores específicos para a região constante C72 humana, ou uma região constante Ck para amplificar a região variável de anticorpos incluindo todas as regiões da estrutura (FRs) e regiões determinadoras da complementaridade (CDRs). Foram obtidas as sequências de ácido nucleico que codificam os transcritos humanos de cadeia pesada e de cadeia leve capa dos hibridomas produtores de anti- ALK-1 por sequenciação directa de ambas as cadeias dos produtos da PCR. As sequências foram analisadas com a utilização do programa registrado da Abgenix e a informação publicamente disponível quanto aos genes humanos VH e VK, o "registo de sequências V BASE), Tomlinson et al., MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, Reino Unido). Resultados idênticos podem ser obtidos com a utilização do programa de alinhamento de sequências publicamente disponível, por qualquer pessoa de experiência normal, com a utilização dos programas de software MacVector e Geneworks.

Especificamente, o anticorpo 1.12.1 ALK-1 de 155 comprimento completo foi clonado nos vectores de expressão como se segue: o ARNm poli(A)+ foi isolado com a utilização de um Kit RNeasy Mini (Qiagen) e o ADNc sintetizado do ARNm com o kit Advantage RT-para-PCR (BD Biosciences) com a utilização de iniciação de oligo(dT). 0 ADNc iniciado por oligo(dT) para clonar 1.12.1 foi amplificado com a utilização dos iniciadores listados no Quadro 2. A amplificação foi obtida com a utilização da polimerase Pfu Ultra (Stratagene) e um PTC-200 ADN Engine (MJ Research) com ciclagem como se segue: 3'095 °C; 25x (20" 0 95 °C, 3O"052 °C, 1'2O"072 °C) ; 1θ’072 °C. Os clones tiveram as sequências verificadas com a utilização da Grills 16a BDTv3.1/quimica dGTP (Applied Biosystems Inc.) e um Analisador de ADN 3730x1 (Applied Biosystems Inc.). No processo de clonar 1.12.1 VH, uma mutação silenciosa foi introduzida no 8° codão, transformando "GGC" num "GGT". Todas as sequências foram analisadas por alinhamentos ao 'registo de sequências V BASE' [Tomlinson et al., J. Mol. Biol., 227, 776- 798 (1992); Hum. Mol. Genet, 3, 853-860 (1994); EMBO J., 14, 4628-4638 (1995)].

Quadro 2

Iniciadores de Amplificação de Cadeia Pesada e Leve Usados para Clonar 1.12.1 de Comprimento Completo Nome do Iniciador Sequência do Iniciador SEQ ID NO 4-61 5' tcttcaagcttgatatctctagaagccgccaccATGAAACACCTGTGGTTCTTCCTCC 3' 105 Gl/2 FL R 5' ttctctgatcagaattcctaCTATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGC 3' 106 Al 1 5' tcttcaagcttcccgggagccgccaccATGGAAACCCCAGCGCAGCTT 3' 107 K FL R 5' ttctttgatcagaattctcaCTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTTTG 3' 108 Bases não hibridantes em letras minúsculas

Exemplo 4. Análise de Utilização de Genes e Análise de CDR 156 A partir da sequência de ácido nucleico e da sequência de aminoácidos prevista dos anticorpos, a utilização dos genes foi identificada para cada cadeia de anticorpos. 0 Quadro 3 apresenta a utilização de genes de clones de hibridomas seleccionados dos anticorpos de acordo com a invenção.

Quadro 3

Utilização de Genes de Cadeia Pesada e Leve Clone Linha Germinal de Cadeia Pesada Linha Germinal de Cadeia Leve Capa SEQ ID NO: VH Dh Jh SEQ ID NO: VK Jk 1.11.1 9 3-33 6-19 JH3B 11 LI JK4 1.12.1 103 4-31 6-19 JH4B 126 A27 JK5 1.13.1 13 4-61 6-19 JH4B 15 Α2Ί JK5 1.14.1 17 4-61 6-19 JH4B 19 Α2Ί JK5 1.151.1 21 4-31 3-3 JH3B 23 B3 JK1 1.162.1 25 4-31 JH3B 27 Α2Ί JK5 1.183.1 29 4-59 6-19 JH4B 31 L2 JK3 1.31.1 4-31 6-19 JH4B Α2Ί JK5 1.8.1 33 4-31 3-3 JH3B 35 B3 JK1 1.9.1 37 3-11 3-22 JH6B 39 A2 JK1 4.10.1 41 3-15 3-22 JH4B 43 A3 JK4 4.24.1 45 4-31 5-12 JH6B 47 Α2Ί JK5 4.38.1 49 4-31 4-23 JH4B 51 B3 JK1 4.58.1 53 4-31 4-23 JH4B 55 Α2Ί JK5 4.62.1 57 4-31 5-12 JH6B 59 Α2Ί JK5 4.68.1 61 4-31 2-2 JH5B 63 A21 JK5 4.72.1 65 4-31 5-12 JH6B 67 Α2Ί JK5 5.13.1 69 4-31 JH3B 71 Α2Ί JK4 5,34.1 73 4-31 JH6B 75 AI JK1 5.53.1 77 3-15 1-1 JH4B 79 B2 JK4 5.56.1 81 3-11 6-19 JH6B 83 A2 JK1 157 5.57.1 85 3-11 3-10 JH6B 87 A.2 JK1 5.59.1 89 3-11 6-6 JH6B 91 A2 JK1 A mutagénese, nas regiões Vh (M29I) e VK (D19A) do clone 1.12.1, foi conduzida com os iniciadores listados no Quadro 4 e o kit QuickChange (Stratagene) de acordo com as instruções do fabricante. As variantes mutadas foram verificadas por sequência e clonadas nos vectores de expressão por procedimentos padrão. 158

Quadro 4

Oligonucleótidos Mutagénicos (sequências 5' a 3') Iniciador Sense Antisense 1.12.1 (D19A) CTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGTAGG (SEQID NO: 109) CCTACAGGAGAGGGTGGCTCTTTCCCCTGGAG (SEQ ID NO: 110) 1.12.1 (M29I) GGTGGCTCCATCAGCAGTGGTGAATACTAC (SEQ ID NO: 111) GTAGTATTCACCACTGCTGATGGAGCCACC (SEQ ID NO: 112) As mutações acham-se indicadas em negrito e sublinhadas. 159

As moléculas de ácido nucleico codificando o dominio variável de cadeia pesada (SEQ ID NO: 5) e o dominio variável de cadeia leve (SEQ ID NO: 7) do anticorpo 1.12.1 (M29I/D19A) foram depositadas sob termos de acordo com o Tratado de Budapeste, na Colecção Americana de Culturas Celulares (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209 em 14 de Julho de 2005. Aos depósitos foram atribuídos os seguintes números de acesso: N° de ATCC PTA-6864 para DH5a de E. coli contendo o plasmídeo pCR2.1 TOPO 1.12.1 VH (M29I): UC 25502; e N° de ATCC PTA-6865 para o DH5a de E. coli contendo o plasmídeo pCR2.1 TOPO 1.12.1 VK (D19A): UC 25503. Vários anticorpos humanos específicos anti-ALK-1 apresentaram um padrão comum em CDRl do domínio variável de cadeia pesada. Estes levam as moléculas a utilizarem os segmentos de genes V de cadeia pesada 4- 31 ou 4-61. As sequências FR1 e CDRl correspondentes a estas cadeias pesadas de anticorpos são apresentadas no Quadro 4A, alinhadas em relação às sequências da linha germinal. Um traço (-) no alinhamento indica um resíduo idêntico à linha germinal. Em todos os casos, o padrão GYYWS (SEQ ID NO: 136) no final do CDRl sofreu mutações somáticas para produzir um novo padrão de sequências, por meio do que o resíduo G é permutado num resíduo acídico (D ou E) , e o resíduo S final é permutado num N em 9 fora dos 12 exemplos. A diversidade de sequências em outras regiões do VH indica que estas devem provavelmente ser eventos de mutação somática independentes que levam ao mesmo padrão de sequência no final do CDRl de VH. 160 Clone 5.34.1 4.58.1 4.38.1 5.13.1 1.162.1 4.72.1 4.24.1 4.62.1 1.31.1 1.12.1

Quadro 4A Padrões de Sequências de Cadeia Pesada de Anticorpos ALK1 V-gene D-gene J-gene ER1 QVQLQESGFGLVKPSQTLSLTCTVS CDR1 QGSISSGGYYWS 1.13.1 1.14.1

Linha germinal VH4-31 - NA - JH6B VH4-31 D4-23 JH4B VH4-31 D4-23 JH4B VH4-31 - NA - JH3B VH4-31 - NA - JH3B VH4-31 D5-12 JH6B VH4-31 D5-12 JH6B VH4-31 D5-12 JH6B VH4-31 D6-19 JH4B VH4-31 D6-19 JH4B Linha germinal VH4-61 D6-19 JH4B VH4-61 D6-19 JH4B (SEQ ID NO: 122) QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVS (SEQ ID NO: 124) —H----------------------

(SEQ ID NO: 123) -------D---N -------D---N -------D---- -------D---N ------ND---N -------D---N -------D---N ---M---E---N GGSVSSGGYYWS (SEQ ID NO: 125) -------D---N -------D---N

Exemplo 5. Preparação das Moléculas Fab 1.12.1 O fragmento Fab de 1.12.1 (M29I/D19A) foi preparado pela digestão de IgGl 1.12.1 (M29I/D19A) com a utilização de papaina. O IgGl de 1 12.1 (M29I/D19A) de comprimento completo purificado pela Proteína A foi incubado com papaina (VWR) na relação de 1:50 (papainarproteína) em tampão contendo fosfato de sódio 30 mM (pH 7,0), EDTA 2 mM e cisteína 2 mM em 37 °C por 2 a 3 horas. A mistura de digestão foi então aplicada a uma minicoluna de proteína A para remover a proteína de comprimento completo não digerida e o fragmento Fc. Fab não ligado foi colhido no fluxo passante. Uma coluna de exclusão de tamanho (Superdex 200, Amersham Pharmacia Biotech) foi então usada para ainda purificar a proteína Fab e para trocar o tampão em PBS. A endotoxina foi removida pela aplicação da solução proteica através do gel Detoxi (PIERCE) e da coluna de permuta de 161 iões Vivapure Mini Q (VivaScience) subsequentemente. A proteína foi filtrada com o filtro de seringa de 0,2 ym e o nível de endotoxina foi testado com um kit de pirogénio LAL (Cambrex). A proteína purificada final tinha uma concentração de 2 a 3 mg/ml, com o nível de endotoxina de < 0,1 EU/mg e pureza de > 95 %. O fragmento Fab 1.12.1 (M29I/D19A) tinha um peso molecular de 47.347, sob condição não reduzida, como mostrado pela espectrometria de massa de pulverização de electrões. A análise de sequenciação N-terminal de Edman confirmou a sequência de términos N de cadeia leve de EIVLTQSPG (SEQ ID NO: 113) e a sequência de cadeia pesada de QVQLQESG (SEQ ID NO: 114), respectivamente.

Exemplo 6. Determinação dos Valores da Avidez dos Anticorpos Monoclonais anti-ALK-1 Completamente Humanos por Ressonância de Plasmão Superficial (SPR) Usando BIACORE™

As medidas da avidez dos anticorpos anti-ALK-1 purificados mediante a ressonância de plasmão superficial com a utilização do instrumento BIACORE™ 3000 foram realizadas como segue, com a utilização dos protocolos do fabricante.

Para realizar as análises cinéticas, a proteína de fusão ALK- 1/Fc humana recombinante (hALK-l/Fc) e a proteína de fusão ALK-l/Fc de cinomolgos (cALK-l/Fc) foram imobilizadas em células de fluxo separadas de um chip sensorial BIAcore CM5 usando-se o acoplamento de amina de rotina. As superfícies foram preparadas com a utilização de tampão de acetato 10 mM, pH 5,0, quando o tampão de imobilização e as densidades proteicas de 300 e 150 RU foram obtidas para as proteínas de fusão hALK-l/Fc e cALK-1/Fc, respectivamente. A desactivação dos ésteres de N-hidroxissuccinimida não reagidos foi realizada com a utilização de cloridrato de etanolamina não reagido, pH 8,5. As amostras de anticorpos no tampão em desenvolvimento foram preparadas em concentrações variando de 0,125 a 2 nM 162 (uma solução de 0 nM que compreende tampão em desenvolvimento sozinho foi incluída como uma referência zero) . As amostras foram aleatorizadas e injectadas em duplicado por 10 minutos cada através de todas as células de 4 fluxos usando-se HBS-EP (HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, 0,005 % de Tensioactivo P20) como tampão de desenvolvimento. Associações foram observadas como sendo independentes dos índices de fluxo de 1 a 100 μΐ/minuto, indicando nenhuma limitação de transporte de massa. Um índice de fluxo de 25 μΐ/minuto foi usado para determinar os valores da avidez. A dissociação do anticorpo foi monitorizada por 10 minutos, a superfície foi regenerada por uma injecção de 12 segundos de H3P04 100 mM (25 μΐ/minuto). Os dados brutos foram processados com a utilização do pacote de programas Scrubber (©Biologic Software) e analisados com a utilização do pacote de programas CLAMP (©Biologic Software). Os conjuntos múltiplos de dados de uma superfície única, seis conjuntos de dados de uma vez, foram simultaneamente ajustados globalmente a um modelo de ligação simples Langmuir 1:1 utilizando-se um valor de Rmáx de variável comum. O Quadro 5 relaciona os valores da avidez para os anticorpos anti-ALK-1 representativos da presente invenção. Os dados representados indicam que os anticorpos preparados de acordo com a invenção possuem altas afinidades e fortes constantes de ligação quanto a ALK-1 humano.

Quadro 5

Determinação do Valor da Avidez por Ressonância de Plasmão Superficial (BIAcore) Clone hALK-l/Fc Avidez hALK-l/Fc koff cALK-l/Fc Avidez (pM) (pM) (1/s) 1.12.1 27 (M29I/D19A) <6, 8 <5, 0 x 10“6 1.14.2 76 5,6 x 10“5 280 1.27.3 2,9 1,9 x 10“5 60 163 163 1.31.1 <13 <5,0 x IO'6 150 1.162.1 18 1,1 x 10“5 62 1.183.2 220 3,1 x 10~5 1800 4.24.2 70 4,4 x IO'5 430 4.38.1 100 4,0 x IO'5 150 4.58.2 40 1,6 x IO'5 130 4.62.1 9, 6 7,6 x IO'6 19 4.68.2 86 3,8 x IO'5 320 4.72.2 73 3,4 x IO'5 280 5.13.3 91 6,3 x IO'5 190 1.12.1(M29I/D19A) refere-se à variante de mAb 1.12.1 que foi expressa mAb recombinante contendo duas mutações de aminoácidos especificas (metionina na posição 29 na cadeia pesada substituída por isoleucina e ácido aspártico na posição 19 na cadeia leve substituída pela alanina).

Exemplo 7. Determinação das Constantes de Afinidade (KD) das Variantes de Anticorpo Monoclonal 1.12.1 Anti-ALK-1 Completamente Humano Mediante Ressonância de Plasmão

Superficial (SPR) com a Utilização de BIACORE™

As medidas de afinidade dos anticorpos anti-ALK-1 purificados por ressonância de plasmão superficial com a utilização do instrumento BIACORE™ 3000 foram realizadas como segue, com a utilização dos protocolos do fabricante.

Para realizar as análises cinéticas, as variantes do anticorpo monoclonal 1.12.1 anti-ALK-1 completamente humano foram imobilizadas sobre a camada de dextrano de um chip biossensor CM5 usando o acoplamento de amina. As superfícies foram preparadas com a utilização do tampão de acetato 10 mM, pH 5,0, como o tampão de imobilização, e as densidades proteicas de 3500 a 4800 RU foram obtidas. A desactivação dos ésteres de N-hidroxissuccinimida não reagidos foi realizada com a utilização de cloridrato de etanolamina 1 M, pH 8,5. As amostras de ALK-DEC monomérico 164 no tampão em desenvolvimento foram preparadas em concentrações que variaram de 2,63 a 640 mM (uma solução de 0 nM que compreende o tampão em desenvolvimento isoladamente foi incluída como uma referência zero).

As amostras foram aleatorizadas e injectadas por 2 minutos cada através de todas as 4 células de fluxo usando HBS-EP (HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, 0,005 % de Tensioactivo P20) como tampão de desenvolvimento. Um índice de fluxo de 25 μΐ/minuto foi usado para se determinar as constantes de afinidade. A dissociação do ALK-DEC monomérico foi monitorada por 10 minutos, a superfície foi regenerada por uma injecção de 12 segundos de H3PO4 100 mM (25 μΐ/minuto) . Os dados brutos foram processados com a utilização do pacote de programas Scrubber (©BioLogic Software) e analisados com a utilização do pacote de programas CLAMP (©BioLogic Software). Os dados foram ajustados globalmente a um simples modelo de ligação Langmuir 1:1. O Quadro 6 proporciona uma lista das medições da afinidade quanto às variantes do anticorpo monoclonal 1.12.1 anti-ALK-1 humano da presente invenção.

Quadro 6

Determinação da Constante de Afinidade da Variante 1.12.1 de mAb, KD, por Ressonância de Plasmão Superficial (BIAcore) Anticorpo Associação (M 1 s d Dissociação (s x) KD (nM) 1.12.1 1,9 X 103 7,4 x 10“5 39 1.12.1 (rWT) 2,2 x 103 O \—1 X co LO 26 1.12.1 (D19A) 2,6 x 103 0 \—1 X 17 1.12.1 (M29I) 2,4 x 103 9,1 x 10“5 38 1.12.1 (M29I/D19A) (D * 2,2 x 103 O \—1 X LO σ\ 43 1.12.1 (M29I/D19A) (2) * 2,3 x 103 o \—1 X co 37 165 *As duas constantes de afinidade para 1.12.1 (M291/Dl9A) (1) e (2) foram obtidas com a utilização de duas superfícies separadas. 1.12.1 refere-se à variante de 1.12.1 de mAb que foi isolada do hibridoma. 1.12;l(rWT) refere-se à variante 1.12.1 de mAb que foi expressa mAb recombinante. 1.12.1 (M29I) refere-se à variante 1.12.1 de mAb que foi expressa mAb recombinante contendo uma mutação de aminoácido única específica, em que a metionina na posição 29 na cadeia pesada foi substituída por isoleucina. 1.12.1(D19A) refere-se à variante 1.12.1 de mAb que foi expressa mAb recombinante contendo uma mutação de aminoácido única específica, em que o ácido aspártico na posição 19 na cadeia leve foi substituído por alanina. 1.12.1(M291/Dl9A) refere-se à variante 1.12.1 de mAb que foi expressa mAb recombinante contendo duas mutações de aminoácido específicas (a metionina na posição 29 na cadeia pesada substituída por isoleucina e ácido aspártico na posição 19 na cadeia leve substituída por alanina).

Exemplo 8. Determinação das Constantes de Afinidade (KD) dos Anticorpos Monoclonais Anti-ALK-1 Completamente Humanos pela Ressonância de Plasmão Superficial (SPR) com a

Utilização de BIACORE™

As medidas de afinidade (KD e k0ff) dos anticorpos anti-ALK-1 purificados por ressonância de plasmão superficial com a utilização do instrumento BIACORE™ 3000 foram realizadas como segue, com a utilização dos protocolos do fabricante.

Para realizar as análises cinéticas, mAbs purificados por afinidade foram imobilizados sobre camada de dextrano de um chip biossensor CM5 com a utilização do acoplamento de amina. As superfícies foram preparadas com a utilização do tampão de acetato 10 mM, pH 5,0, como o tampão de imobilização, e as densidades proteicas de 200 a 400 RU foram obtidas. A desactivação dos ésteres de N- hidroxissuccinimida não reagidos foi realizada usando-se cloridrato de etanolamina 1 M, pH 8,5. As amostras de ALK-DEC monoméricas em tampão de desenvolvimento foram preparadas nas concentrações variando de 3,125 a 400 nM (uma solução de 0 nM que compreende apenas tampão de desenvolvimento foi incluída como uma referência zero). As amostras foram aleatorizadas e injectadas em duplicata por 2 minutos cada através de todas as 4 células de fluxo 166 usando-se HBS-EP (HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, 0,005 % de Tensioactivo P20) como tampão de desenvolvimento. As associações foram observadas como sendo independentes dos indices de fluxo de 1 a 100 μΐ/minuto, indicando nenhuma limitação de transporte de massa. Um indice de fluxo de 25 μΐ/minuto foi usado para determinar as constantes de afinidade. A dissociação do ALK- DEC monomérico foi monitorada por 10 minutos, a superfície foi regenerada por uma injecção de 12 segundos de H3PO4 100 mM (25 μΐ/minuto). Os dados brutos foram processados com a utilização do pacote de programas Scrubber (©BioLogic Software) e analisados com a utilização do pacote de programas CLAMP (©BioLogic Software).

Os dados foram ajustados globalmente a um simples modelo de ligação Langmuir a 1:1. O Quadro 7 proporciona uma lista das medições de afinidade quanto aos anticorpos anti-ALK-1 representativos da presente invenção:

Quadro 7

Determinação da Constante de Afinidade, Kn, para os Anticorpos Monoclonais Representativos mediante a Ressonância de Plasmão Superficial (BIAcore) Anticorpo Associação (M 1 s ') Dissociação (s 4) KD (nM) 1.12.1 (M29I/D19A) 3,3 x 104 8,2 x IO'4 25 1.31.1 3,2 x 104 1,9 x IO'4 6, 0 4.72.1 3,2 x 104 2,5 x IO'5 0, 8 Fab 1.12.1 3,8 x 104 8,2 x IO'4 22 (M29I/D19A) 0 ALK-DEC monomérico usado para gerar os dados no Exemplo 8 foi uma preparação diferente daquela usada para gerar os dados do Exemplo 7. 1.12.1 (M29I/D19A) refere-se à variante de 1.12.1 de mAb que foi expressa como mAb recombinante contendo duas mutações de aminoácidos especificas mencionadas acima (ácido aspártico na posição 19 na cadeia leve substituída por alanina e metionina na posição 29 na cadeia pesada substituída por isoleucina). Fab 1.12.1 (M29I/D19A) refere-se ao fragmento de Fab de 1.12.1 (M29I/D19A) de mAb preparado por digestão de 1.12.1 (M29I/D19A) IgGl com a utilização de papaína. 167

Exemplo 9. Identificação da Selectividade dos Epitopos dos Anticorpos Anti-ALK-1

As experiências de competição cruzada foram realizadas com a utilização do instrumento BIACORE™ 3000 (Biacore International AB, Uppsala, Suécia e Piscataway, N.J.), seguindo-se os protocolos do fabricante. A quimera de ALK-l/FC humana recombinante foi imobilizada sobre a camada de dextrano de um chip biossensor CM5 usando o acoplamento de amina. Os chips foram preparados com a utilização de tampão de acetato 10 mM, pH 5,0, como o tampão de imobilização, e uma densidade proteica de 940 RU foi obtida. A desactivação dos ésteres de N-hidroxissucinimida foi realizada com a utilização de cloridrato de etanolamina 1 M, pH 8,5.

Os mAbs purificados foram diluídos a uma concentração de 50 nM em tampão de desenvolvimento HBS-EP (HEPES 0,01 M, pH 7,4, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, 0,005 % de Polissorbato 20). Um anticorpo primário foi escolhido e depois injectado através da célula de fluxo por 600 segundos numa velocidade de 10 μΐ/minuto. Após a injecção ter sido completada, um anticorpo secundário foi escolhido e injectado através da mesma célula de fluxo por 600 segundos numa velocidade de 10 ml/minuto. A superfície do sensor foi regenerada por uma injecção de 12 segundos de H3PO4 (25 μΐ/minuto).

Após a regeneração, o anticorpo primário foi novamente injectado através da célula de fluxo por 600 segundos, numa velocidade de 10 μΐ/minuto. Após a injecção estar completa, um diferente anticorpo secundário foi escolhido e injectado através da mesma célula de fluxo por 600 segundos numa velocidade de 10 μΐ/minuto. Uma vez o painel inteiro de 14 anticorpos ter sido usado como o anticorpo secundário, um novo anticorpo primário foi escolhido e o procedimento foi repetido com o novo anticorpo primário. Estes procedimentos foram realizados até que todas as combinações possíveis dos anticorpos primários e secundários tivessem sido injectados 168 através da célula de fluxo. A ligação do anticorpo secundário foi considerada como tendo ocorrido se a resposta total observada após a injecção de ambos os anticorpos excedesse aquela observada para ambos os valores limites possíveis. Os valores de limite foram determinados pela utilização do mesmo anticorpo, tanto o anticorpo primário quanto o anticorpo secundário. Apresentada no Quadro 8, uma matriz de resposta foi criada com base em se a ligação foi observada: - indica nenhuma ligação do anticorpo secundário, x indica que a ligação foi observada (a resposta foi maior do que os valores limites para os anticorpos individuais). 0 agrupamento dos clones que apresentam o mesmo padrão de reactividade dá origem a duas caixas de epítopos diferentes com 1.11.1 numa caixa e todos os outros anticorpos na outra caixa. 169

Quadro 8. Matriz de Resposta de Armazenamento de Epítopo BIAcore.

mAb Primário mAb Secundário 1.9.1 1.11.1 1.12.1 (M29I/D19A) 1.27.3 1.31.1 1.162.1 1.183.2 4.24.2 4.38.1 4.58.2 4.62.1 4.68.2 4.72 5.13 1.9.1 - X - - - - - - - - - - - - 1.11.1 X - X X X X X X X X X X X X 1.12.1 (M29I/D19A)" X 1.27.3 X 1.31.1 X 1.162.1 X 1.183.2 X 4.24.2 X 4.38.1 X 4.58.2 X 4.62.1 X 4.68.2 X 4.72 X 5.13 X 170

Exemplo 10. Isolamento do Gene ALK-1 do Macacos Cinomolgos O gene ALK-1 do Macacos Cinomolgos ("Cino") foi extraído do tecido dos pulmões do Cino. Com base na sequência de genes publicado em para o ALK-1 humano (registo do Genebank L17075), os iniciadores foram projectados para amplificar por PCR o ALK-1 de Cinomolgos de comprimento completo. O ARNm foi preparado do tecido do pulmão do cinomolgo extraído congelado (cerca de 1 g) , com a utilização do kit de purificação de ARNm (Ambion, N° de Catálogo 1915) de acordo com as instruções do fabricante. 200 ng do ARNm foi submetido a transcrição reversa e amplificado por PCR com a utilização do kit OneStep RT-PCR (Qiagen, N° de Catálogo 210210), utilizando os oligos específicos do gene: 5'-AGCGGGCCCAGAGGGACCATG (SEQ ID NO: 115) (dianteira) e 5'-CAGAAAGGAATCAGGTGCTCCTGGGÇTA (SEQ ID NO: 116) (reversa) numa temperatura de revenimento de 61° C. Um produto da RT-PCR do tamanho apropriado (-1,5 Kb) foi extraído e purificado de um gel de agarose a 0,9 % após a electroforese, depois TOPO-TA foi clonado no vector pCR4-TOPO (Invitrogen, N° de Catálogo K4575-01). O inserto foi sequenciado para se obter a sequência de nucleótidos ORF do ALK-1 do Cinomolgo. As sequências de nucleótidos e de aminoácidos transladados previstos são apresentadas nas SEQ ID NOs: 93 e 94, respectivamente. Embora a porção citoplasmática do gene codifique as sequências proteicas idênticas entre o Cino e o ser humano, existem cinco diferenças de aminoácidos no domínio extracelular (DEC, que inclui as posições 22 a 118) e 1 diferença de aminoácidos no domínio da transmembrana da proteína. A identidade da sequência do DEC entre seres humanos e Cino, é de 94,8 %. Um alinhamento do DEC humano e dos primatas é apresentado na figura 2.

Um par de iniciadores (directo: 5'- GATTATGGCCTTGGGCTCCCCCAGGAAA (SEQ ID NO: 117) e indirecto: 5'- GGGCTATTGAATCACTTTAGGCTTCTCTGGACTGTTG) (SEQ ID NO: 118) 171 foi usado para amplificar em PCR o gene ALK-1 de Cinomolgos de comprimento completo.

Exemplo 11. Determinação das Características de Ligação da Superfície Celular e Hibridação Cruzada de Primatas Mediante Citometria de Fluxo (FACS)

Para gerar as linhas celulares que sobre-expressam ALK-1, as quais podem ser usadas para testar a afinidade de ligação anti-ALK-1 usando a citometria de fluxo (FACS), genes ALK-1 de comprimento completo humanos, de Cinos e de ratos foram clonados no vector pcDNA5/FRT/To TOPO da Invitrogen (N° de Catálogo K6510-20) e transfectados em 293 células hospedeiras Flp-ln T-Rex (Invitrogen, N° de Catálogo R780-07), respectivamente. As selecções foram realizadas usando-se higromicina para se obter as linhas celulares finais estáveis. As sobre-expressões das proteínas de ALK-1 de comprimento completo respectivas foram obtidas por indução de tetraciclina (2 yg/ml) em 37 °C/5 % de CO2 por 24 horas.

Os mAbs anti-ALK-1 foram testados quanto às suas afinidades de ligação ao ALK-1 da superfície celular usando o ensaio FACS, usando-se 293 células estáveis que sobre-expressam as proteínas ALK-1. As células foram separadas com a utilização de tripsina-EDTA e lavadas com PBS-AS frio. Após terem sido separadas em alíquotas nas placas de 96 poços, as células foram bloqueadas por soro e incubadas com diferentes concentrações de mAb específico por 1 hora a 4 °C. Subsequentemente, as células foram lavadas e

incubadas com um anticorpo secundário k anti- humano conj ugado com 0 fluoróforo R-PE antes analisado com a utilização de um citómetro de fluxo FACSCalibur (BD

Biosciences). 10.000 eventos foram colhidos para cada amostra sem se aplicar qualquer obstrução. Como mostrado no Quadro 9, a média geométrica de cada histograma de amostra foi representada graficamente como uma função da concentração de mAb, e KD foi calculado para cada mAb após 172 ajuste a um modelo de equilíbrio de duas situações. Exemplos das experiências de FACS equivalentes de seres humanos e de primatas são apresentados na figura 3.

Quadro 9

Resultados de Afinidade de Ligação Média (KD) dos Anticorpos Monoclonais Anti-ALK-1 ao ALK-1 da Superfície Celular Humano ou de Cino Medida por FACS Anticorpo KD (nM) Humano Cino 1.12.1 6,7 2,0 1.27.1 3,7 2,2 1.162.1 5, 6 3, 0 4.38.1 9,3 3,4 4.58.1 14,0 6,7 4.72.1 6,4 3, 8 5.13.1 3,2 1,6 1.31.1 3,2 1,7 4.24.1 7,6 3,1 4.62.1 2,3 0,78 4.68.1 8,4 9,0

Além disso, 1.12.1 foi apresentado pelo ensaio de FACS como tendo cruzamento muito limitado a rato (KD > 100 nM) e é prognosticado como tendo cruzamento muito baixo a ratinhos, em vista da identidade de sequência de DEC de 74 % e 68 % entre o ALK-1 de rato/humano e de ratinho/humano, respectivamente. O ensaio de FACS foi também usado para se determinar KD das variantes de mAb 1.12.1 recombinante. No Quadro 10, os resultados indicam afinidade de ligação semelhante do anticorpo recombinante. 173

Quadro 10

Resultados da Afinidade de Ligação Média das Variantes ao ALK-1 Humano ou de Cino da Superfície Celular Medidos por FACS Anticorpo KD (nM) Humano Cino 1.12.1 6,7 2,0 1.12.1 (rWT) 5,9 6, 0 1.12.1 (M29I) 6, 0 3,3 1.12.1 (D19A) 5,7 3, 8 1.12.1 (M29I/D19A) 7,2 3,4 Fab 1.12.1 (M29I/D19A) 0,77 ND 1.12.1 refere-se à variante de 1.12.1 de mAb que foi isolada do hibridoma. 1.12.1 (rWT) refere-se à variante 1.12.1 de mAb que foi expresso mAb recombinante. 1.12.1 (M29I) refere-se à variante 1.12.1 de mAb que foi expressa mAb recombinante contendo uma mutação única específica de aminoácido em que a metionina na posição 29 na cadeia pesada foi substituída por isoleucina. 1.12.1 (D19A) refere-se à variante 1.12.1 de mAb que foi expressa mAb recombinante contendo uma mutação única especifica de aminoácido em que o ácido aspártico na posição 19 na cadeia leve foi substituído por alanina. 1.12.1 (M29I/D19A) refere-se à variante 1.12.1 de mAb que foi expressa mAb recombinante contendo duas mutações de aminoácido específicas (metionina na posição 29 na cadeia pesada substituída por isoleucina, e ácido aspártico na posição 19 na cadeia leve substituída por alanina). Fab 1.12.1 (M29I/D19A) refere-se ao fragmento Fab de 1.12.1 (M29I/D19A) de mAb preparado por digestão de IgGl de 1.12.1 (M29I/D19A) com a utilização de papaína.

Exemplo 12. Ensaio de Tagman para Idl

HUVECs (Biowhittaker, N° de Cat. CC-2519) foram semeados sobre placas de 24 poços, 12000 células/poço em 600 μΐ de meio HUVEC completo (kit EGM-2 Bullet, Biowhittaker, N° de Cat. CC-3162), e deixados semear durante a noite. No dia seguinte, as células foram tipicamente 50 % confluentes. O Meio Completo foi removido e 200 μΐ de Meio de Inanição (EBM-2 com 0,2 % de FBS apenas) foram adicionados. As células foram incubadas por 2 horas. Depois, as células foram tratadas com 40 μΐ da solução de anticorpo em PBS. Ab liofilizado foi reconstituído com PBS estéril. Finalmente, as células foram 174 tratadas com 1 % de FBS/meio Basal (concentrações finais) por 30 minutos, o meio foi removido e as células foram lisadas em 400 μΐ de Tampão de RTL (kit Rneasy 96, Qiagen, N° de Cat. 74182), de acordo com os protocolos do fabricante. Subsequentemente, o ARN foi preparado com a utilização do kit RNeasy (de acordo com instruções do fabricante) . O ARN foi eluido e quantificado com o Kit de Quantificação de ARN RiboGreen® (Molecular probes, N° de Cat. R-11490). Quantidade igual do ARN total foi usada para a análise de PCR de tempo real para detectar a expressão de ARN de Idl (instrumento ABI 7900). A PCR foi conduzida com a utilização do Kit Taqman One Step PCR Master Mix (ABI, N° de Cat. 4309169) e as sequências de iniciador de IDl/Sonda listadas a seguir. A PCR foi conduzida com a utilização de 40 ciclos do revenimento a seguir e condições de amplificação: 95 °C, 15 segundos; 60 °C, 1 minuto.

Sonda TaqMan: 5'-6-FAM conjugado a CPG, e 3'-TAMRA. Nome: Sonda ID1

Sequência: 5' CCAGCACGTCATCGACTACATCAGGGA 3' (SEQ ID NO: 119)

Iniciadores de PCR Taqman:

Nome: ID1-F

Sequência: 5' AAGGTGAGCAAGGTGGAGATTC 3' (SEQ ID NO: 120) Nome: ID1-R

Sequência: 5' TTCCGAGTTCAGCTCCAACTG 3' (SEQ ID NO: 121) OS exemplos das titulações de Idl para a molécula condutora de 1.12.1(M29I/D19A) (incluindo as variantes das sequências de 1.12.1) e o derivado de Fab são mostrados nas figuras 4 e 5.

Um sumário dos valores médios de IC50 para este ensaio é apresentado no Quadro 11. Todas as determinações de IC50 foram desenvolvidas em triplicata.

Exemplo 13. Fosforilação de Smadl Detectada pelo Sistema de Formação de Imagem de Infravermelho Odyssey da Biosciences LI-COR (placa de 24 poços) 175 HUVECs (Biowhittaker, N° de Cat. CC-2519) foram semeados sobre placas de 24 poços, 18000 células/poço em 600 μΐ de meio HUVEC completo (kit EGM-2 Bullet, Biowhittaker, N° de Cat. CC-3162), e deixados em cultivo durante a noite. No dia seguinte, as células estavam tipicamente 50 % confluentes. Õ Meio Completo foi removido e 200 μΐ de Meio de Inanição (Meio de Inanição: EBM-2 com 0,2 % de FBS apenas) foram adicionados. As células foram incubadas por 2 horas. Depois, as células foram tratadas com 40 μΐ da solução de anticorpo em PBS por 3 horas. Finalmente, as células foram tratadas com 0,3X de Meio

Completo (concentração final) por 35 minutos. O meio foi removido, e as células foram lisadas em 80 μΐ de 1,1X

Tampão de Amostra (Invitrogen, N° de Cat. NP0007). Smadl fosforilado foi determinado por Western Blotting usando-se X Cell Surelock Mini-Cell & Blot Module (Invitrogen, N° de Cat. EI0002). 0 Smadl fosforilado foi detectado com a utilização do anticorpo anti-fosfor-Smadl de coelho (Sinalização Celular, N° de Cat. 9511), que é então detectado por IgG AntiCoelho Conjugado IRDye® 800 (Rockland Immunochemicals, N° de Cat. 611-732-127). A quantidade de Smadl fosforilado foi quantificada com a utilização do Imageador Infravermelho Odyssey (Li-Cor) . Actina (Santa Cruz, N° sc-8432) foi usada para a normalização (anti-ratinho Alex 680, Molecular Probe, N° de Cat. A-21058). Um resumo dos valores médios de IC50 para este ensaio é mostrado no Quadro 11. Todas as determinações de IC50 foram desenvolvidas em triplicata. 176

Quadro 11

Clone ID1 Taqman IC50 nM pSmadl Western IC50 nM 1.11.1 nd nd 1.12.1(M29I/D19A) 16 18 1.13.1 100 87 1.27.1 82 70 1.29.1 94 82 1.31.1 24 21 1.162.1 75 15 1.183.1 58 17 4.24.1 100 82 4.38.1 87 52 4.58.1 14 15 4.62.1 24 34 4.68.1 141 110 4.72.1 21 35 5.13.1 30 68

Exemplo 14. Caracterlsticas de Internalização dos Anticorpos Monoclonais Anti-ALK-1 FACS foi usado para monitorizar o decurso de tempo do ALK-1 receptor da superfície das células remanescente, bem como o anticorpo neutralizante. 0 ALK-1 remanescente da superfície celular é monitorado por um anticorpo marcador que é capaz de ligar-se ao ALK-1 da superfície celular reconhecendo ainda um epítopo diferente do anticorpo neutralizante. Um mAb de DEC ALK anti-humano de ratinho (R&D sytems, N° de Cat. AF310) foi identificado e usado no estudo como o anticorpo marcador. 0 decurso de tempo da internalização foi estudado com a utilização das linhas de células endoteliais HUVEC e HUAEC.

As células foram cultivadas em 37 °C com 5 % de CO2 em placas de 24 poços contendo 200 μΐ de meio de cultura 177 completo por poço. Em cada 11 pontos do tempo no decurso de 48 horas, 2 μΐ de uma solução de 1 mg/ml de anticorpo foram adicionados a um poço e misturados (a concentração final do anticorpo neutralizante é de 10 yg/ml) . A placa foi então colocada de volta na incubadora em 37 °C até o ponto do tempo de 0 hora, quando a placa foi colocada sobre gelo para interromper o processo de internalização. O anticorpo marcador foi adicionado aos poços neste ponto (concentração final de 10 yg/ml) e incubado sobre gelo por 1 hora. As células foram então lavadas com PBS separado por tripsinação e transferidas para uma placa de 96 poços. As células foram então lavadas, bloqueadas e tratadas com anticorpos secundários carregando diferentes fluoróforos a fim de monitorizar tanto o anticorpo neutralizante quanto o ALK-1 receptor remanescente sobre a superfície celular. As amostras foram ensaiadas num instrumento de citometria de fluxo FACSCalibur, contando-se 3.000 a 5.000 eventos/amostra. A Média Geométrica de cada amostra no canal de fluorescência específico foi calculada e representada em gráfico como uma função do tempo. Os dados foram ajustados a uma equação de radio-desintegração modificada para se obter o meio-tempo (ti/2) da internalização, bem como o percentual do anticorpo neutralizante ou ALK-1 receptor remanescente sobre a superfície celular quando a internalização alcançasse o estado de equilíbrio. Como mostrado na figura 6, 1.12.1 (M29I/D19A) de mAb internaliza na mesma velocidade e na mesma extensão do ALK-1 receptor da superfície celular. A meia-vida da internalização de 1.12.1(M29I/D19A) é de -2 horas. Um equilíbrio foi alcançado quando 50 % do anticorpo foi internalizado. Um anticorpo policlonal comprado da R&D Systems (N° de Cat. AF370) internaliza num ti/2 de 1 hora e alcança o estado de equilíbrio com -70 % do receptor sendo internalizado (figura 6). Características de internalização similares foram observadas com outros mAbs anti-ALK-1 178 humanos da invenção (não mostrados).

Exemplo 15. Estabelecimento do Prepúcio Humano - Ratinhos Quiméricos SCID

Modificação significativa do procedimento de cirurgia foi feita a um procedimento anteriormente publicado por H-C Yan et al "Human/Severe Combined Immunodeficient Mouse Chimeras, An Experimental In vivo Model System to Study the Regulation of Human Endothelial Cell- Leukocyte Adhesion Molecules", J. Clin. Invest. 91: 986, 1993; J. Varner "Regulation of Angiogenesis in vivo by Ligation of Integrin a5bl with the Central Cell-Binding Domain of Fibronectin" Amer. J. Path. 156 (4): 1345, 2000; K. Tahtis et al "Expression and Targeting of Human Fibroblast Activation Protein in a Human Skin/Severe Combined Immunodeficient Mouse Breast Câncer Xenograft Model" Mol. Câncer. Ther. 2(8): 729, 2003. Após a chegada do National Disease

Research Institute and Cooperative Human Tissue Network, peças do prepúcio humano foram preparadas de regiões doentes e transferidas para meio de RPMI (Cellgro/Mediatech, N° de Cat. MT-15- 040-CV suplementado com Penicilina e Estreptomicina (Gibco/Life Tech, N° de Cat. 15070-063) (adição de 5 ml da solução do estoque de pen/strep em 500 ml de RPMI) . Com a utilização de um escalpelo e cortanto-se em placa de petri estéril, as peles foram preparadas numa forma oval de aproximadamente 8x13 mm limpando-se quaisquer extremidades desiguais e tecidos conectivos, e armazenadas sobre gelo húmido antes da cirurgia. O volume apropriado (4 μΐ/grama do animal) de solução de 100 mg/ml de Cetamina (KetasetTR, Fort Dodge Animal Health)/1 mg/ml de medetomidina (Pfizer Animal Health - Dormitor) foi injectado por via intraperitoneal no abdómen de ratinhos scid (isto é, num ângulo de 45°, sob a pele, porém não muito profundo internamente). Uma vez anestesiados, os ratinhos receberam com lubrificante ocular, uma injecção subcutânea de Cetoprofeno (10 mg/kg, 179

Fort Dodge Animal Health) e o pelo foi raspado sobre o local da cirurgia. A região cirúrgica foi cirurgicamente esfregada por três vezes com a utilização de Clorahe-xiderm (Butler, Chclo-Scrub 40, N° de cat. WAB20109) e depois álcool num movimento, circular que se iniciou do centro do local cirúrgico para fora, e evitou-se ir de uma área suja de volta para uma área limpa. Os ratinhos foram transferidos para a cobertura cirúrgica preparada e colocados sobre uma almofada de água aquecida (Gaymar Industries, N° de Cat. TP500 T/Pump) que foi mantida em 37 °C. Os ratinhos foram então colocados sob anestesia de isofluorina durante a duração da cirurgia. O lado dorsal de um ratinho foi coberto com um campo cirúrgico cortado para expor o local de cirurgia. A pele do ratinho foi levantada com fórcipes e um tecido de pele de conformação oval foi cortado com tesouras curvas com um movimento. Um prepúcio humano de dimensão apropriada foi colocado sobre o ratinho. A pele humana e a do ratinho foram suturadas entre si com a utilização da sutura Ethilon (Ethicon N° de Cat. 697H), iniciando-se em cima do oval, depois no fundo, depois do lado direito mais distante e depois do lado esquerdo mais distante. Mais suturas foram feitas no meio para ainda segurar os tecidos entre si. Aproximadamente 8 suturas foram feitas a igual distância ao redor da pele. Durante a cirurgia, usou-se uma seringa com solução salina estéril para irrigar o ferimento cirúrgico da pele/ratinho quando ela se tornava seca. Um Bandaid (atadura) foi colocado sobre o ferimento. Um curativo transparente (3M Tegaderm™) foi então usado para livremente ser enrolado ao redor da bandagem. O curativo foi cortado no tamanho para cobrir uma área levemente mais ampla do que o Bandaid. Foi dado ao ratinho então Atipamezole (50 a 100 μΐ, Pfizer Animal Health - Antisedan), e o ratinho foi restabelecido numa gaiola aquecida em 5 a 10 minutos. O curativo e as bandagens foram removidos em 7 a 10 dias e pelo 15a dia a 180 maioria das peles pareciam crostas. A cura completa ocorreu entre 21 a 28 dias, após cujo tempo as peles estavam prontas para serem inoculadas com as células tumorais. É mostrado na figura 8 um exemplo da análise histológica (Coloração de Η & E) de uma secção da pele enxertada após a cirurgia. A histologia da pele enxertada imita exactamente as caracteristicas da pele humana implantada nos ratinhos descritos por Tahtis et al., "Expression and Targeting of Humano Fibroblast Activation Protein in a Human Skin/Severe Combined Immunodeficient Mouse Breast Câncer Xenograft Model" Mol. Câncer. Ther. 2(8): 729, 2003. h.e.: camada epidérmica humana; h.d.: camada dérmica humana.

Exemplo 16. Modelo de Colagénio no Prepúcio Humano Ratinhos Quimera SCID

Solução de estoque Colagénio I (N° de Cat. 354236, Becten- Dickinson) foi diluida a 4 mg/ml com ácido acético 0,02 N e foi mantida sobre gelo antes da implantação. A solução de colagénio ácida (8 partes) foi misturada com 10X M199 (Sigma, N° de Cat. M9163) (1 parte) e fibronectina (Fn) plasmática humana (N° de Cat. 354008, Becten-Dickinson) para se alcançar uma concentração final Fn de 90 μΐ/ml; NaOH (1,0 N) foi adicionado para ajustar o pH em ~ 7,2. A mistura de colagénio/Fn foi mantida sobre gelo até a utilização. A mistura de implante foi preparada com a utilização da mistura acima de Colagénio/Fn mais o inibidor angiogénico de interesse com ou sem células endoteliais macrovasculares humanas (HMVEC) (Cascade Biologics, N° de Cat. C- 010-5C) . As HMVECs foram preparadas como 6 x 106 células/ml em PBS. 50 a 100 μΐ da mistura de implante foram injectados intradermicamente dentro do prepúcio no ratinho quimera scid. 7 a 14 dias mais tarde, os tampões de colagénios foram colhidos, implantados no composto OCT (N° de Cat. 4583, Sajura Finetek, CA) e o encaixe congelado para análise imunohistoquimica. O tampão de colagénio no prepúcio foi identificado com o Kit Trichrome (N° de Cat. 181 KC1641, Mater Tech, CA) como coloração azul, como mostrado na figura 9 (AX.,Qs vasos humanos foram identificados por coloração por P-CAM humano usando-se o anticorpo CD-31 anti-humano (Clone 13.3, Vector Laboratories) (Figure 9 (B) . 0 Quadro 12 proporciona um resumo do coloração dos vasos humanos e da quantificação no modelo de colagénio no prepúcio - ratinhos quimera SCID.

Quadro 12. Resumo dos Resultados do Modelo de Colagénio

Matriz HMVEC na Matriz Tratamento (Rx) Dias de Rx Ponto Final do Estudo Classificação dos vasos de ser humano (1 x 103) % de Controlo (vasos humanos) 1,6 mg/ml de Colagénio Nenhum Nenhum tratamento 4 Coloração de CD-31 humano 0,036 ± 0,001 40 1,6 mg/ml de Colagénio 7 x 103 Nenhum tratamento 4 0,071 ± 0,022 78 1,6 mg/ml de Colagénio 1,4xl04 nenhum tratamento 4 0,063 ± 0,016 69 2,4 mg/ml de Colagénio Nenhum nenhum tratamento 4 0,091 ± 0,056 100 2,4 mg/ml de Colagénio 7 x 10" nenhum tratamento 4 0,067 ± 0,049 74 2,4 mg/ml de Colagénio 1,4 xlO4 nenhum tratamento 4 0,062 ± 0,047 68 3,0 mg/ml de Colagénio 8,8x10^ Nenhum tratamento 4 Coloração de CD-31 humano 54 ± 9 100 3,0 mg/ml de Colagénio 8,8xl03 Anticorpo de controlo do isotipo 100 pg/ml misturado em gel 4 52 ± 13 96 3,0 mg/ml de Colagénio 8,8x10a 1.12.1(M29 1/ D19A) anticorpo 100 pg/ml misturado em gel 4 15 ± 3 28 182

Matriz HMVEC na Matriz Tratamento (Rx) Dias de Rx Ponto Final do Estudo Classificação dos vasos de ser humano (1 x 103) % de Controlo (vasos humanos) 3,0 mg/ml de Colagénio nenhum nenhum tratamento 4 Coloração de CD-31 humano 0,112 + 0,026 100 5,0 mg/ml de Colagénio nenhum nenhum tratamento 4 0,031 + 0,012 28 3, 0 mg/ml de Colagénio nenhum Anticorpo de controlo do isotipo 100 pg/ml, Inj ecção id. 4 Coloração de CD-31 humano 75 ± 15 100 3,0 mg/ml de Colagénio nenhum 1.12.1(M29 1/ D19A) anti-corpolOO pg/ml, injecção id. 4 39 ± 11 52 3,0 mg/ml de Colagénio nenhum 1.14.1 anticorpo 100 pg/ml, inj ecção id 4 44 ± 28 59

Exemplo 17. Modelo de Tumor M24MET no Prepúcio Humano -Ratinhos Quimera SCID

Tipicamente, os enxertos de idade entre 5 a 10 semanas após a cirurgia foram usados nestes estudos. A linha de células M24met foi descrita por Mueller e colaboradores, em "Tissue factor-initiated thrombin generation activates the signaling thrombin receptor on malignant melanoma cells", Câncer Research, 55(8): 1629-1632, 1995. A suspensão de células M24met foi preparada como se segue: 80 % de células M24met confluentes foram lavados, tripsinizados com a utilização de Tripsina/EDTA (Gibco, N° de Cat. 25200-056) e colhidos no meio PRMI (Cellgro/Mediatech, N° de Cat. MT-15-040-CV) suplementado com 10 % de FBS (Cellgro/Mediatech, N° de Cat. AKD- 11775) e L-glutamina 2 mM (Cellgro/Mediatech, N° de Cat. 25-005-CI). As células foram centrifugadas em 600 rpm por 5 minutos, recolocadas em suspensão em PBS 183 estéril. As contagens celulares foram estimadas com a utilização do Contador Coulter (Beckman Coulter, Modelo Z2) . As células foram centrifugadas em 600 rpm por 5 minutos e foram recolocadas em suspensão em mistura de

Colagénio e Fn (3 mg/ml) para se obter uma suspensão de 4 x 107 células/ml de suspensão celular para implantação.

Para inocular, 2 x 106 das células acima foram injectadas (50 μΐ de 4 x 107 células/ml) intradermicamente na pele humana enxertada no ratinho. Nos dias 5 a 7 após o implante, os tumores estavam palpáveis e os ratinhos foram aleatorizados dentro dos grupos de Controlo e de Tratamento antes que a dosagem iniciasse. O grupo de Controlo é definido como aquele em que os animais devem receber ou nenhuma dose, a dose do Veiculo em que o anticorpo anti-ALK-1 foi constituído, ou a dose do isótopo combinado com o anticorpo anti-KLH monoclonal humano IgG2 (Pfizer Inc) . O grupo de Tratamento é definido como aquele em que os animais devam receber uma dose do anticorpo 1.12.1(M29I/D19A) anti-ALK-1.

Exemplo 18. Coloração Dual de Imunofluorescência (IF) de CD-31 Humano e de Ratinho

As secções de tecido congelado foram secas ao ar e fixadas em -20 °C em acetona (Fisher, N° de Cat. A16S-4), ou 10 minutos. As amostras foram secas ao ar novamente e lavadas em PBS três vezes em 5 minutos cada. As amostras foram bloqueadas em 5 % de soro de coelho (Vector Laboratories, N° de Cat. S-5000) em PBS por 30 minutos na temperatura ambiente. A mistura de anticorpo primária foi preparada em 5 % de soro de coelho com o anticorpo CD-31 anti-humano (Santa Cruz, N° de Cat SC1505) e o anti-ratinho CD-31 (Pharmingen, Clone Mecl 3.3, N° de Cat 01951 A) em diluições de 1:100 e 1:150, respectivamente. A mistura de anticorpos acima foi adicionada às amostras de tecido por 1 hora em TA. Os blocos foram lavados em PBS por três vezes a 5 min cada antes de incubados com a mistura de 184 anticorpo secundária por 1 hora em TA. A mistura de anticorpo secundária foi preparada em PBS/0,05 % Tween-20 (Sigma, N° de Cat P1379), anticorpo anti-cabra de coelho Vermelho do Texas (Jackson Labs, N° de Cat 305-075- 003) e anticorpo anti-rato de coelho FITC (Jackson Labs, N° de Cat 312-095- 003) . Os anticorpos eram diluidos a 1 : 50 se anticorpos fossem usados ou a 1: 100 se os anticorpos frescos fossem usados. As lâminas foram lavadas novamente em PBS por três vezes a 5 min cada, antes de fixadas em Vectashield (Hard Set, meio de Montagem com DAPI, Vector Lab, CA, N° de Cat H- 1500) . As lâminas foram mantidas no escuro e 4 °C até análise da imagem. A análise da imagem foi realizada usando-se um microscópio fluorescente BX60 Olympus e as fotografias foram tiradas usando-se uma máquina fotográfica colorida digital microfire Olympus. As fotografias de 3-5 pontos/lâmina quentes, uma lâmina/animal, 4-7 animais/grupo foram tiradas e as áreas do vaso como indicado por coloração positiva de CD-31 anti-humano, foram quantificadas por três indivíduos usando-se Image Pro Plus v4.5 (MediaCybernetics). O ponto extremo farmacodinâmico (média de grupo) foi expresso como a percentagem de inibição CD-31 humana, em comparação com o grupo de Controlo ou como área de vaso humano total. A significância estatística foi determinada por ANOVA. É mostrada na figura 10 uma imagem imunofluorescente de vasos humanos (vermelho) e de ratinho (verde) do tumor M24met do recipientes de ratinho (vermelho) e vasos (verdes) do tumor M24met do ratinho quimérico SCID do prepúcio humano.

Exemplo 19. Coloração Imunohistoquímico (IHC) de CD-31 Humanos

As secções de tecido congelado foram secas ao ar e fixadas a -20 °C em acetona por 10 min. As amostras foram secas ao ar novamente e levadas em PBS duas vezes a 5 min cada. As amostras foram incubadas em 0,075 % H2O2/ metanol (Fisher N° de Cat A433-4) por 15 min e lavadas em PBS três 185 vezes a 5 min cada. As amostras foram bloqueadas em soro de coelho/PBS por 30 min e aplicadas com anticorpo CD-31 anti-humano 1:100 (Santa Cruz, N° de Cat SC1505) em 5 % de soro de coelho por 1 hora em TA. As amostras foram lavadas em PBS duas vezes a 5 min cada e aplicadas com anti-cabra de coelho a 1:200 (Vector Labs, N° de Cat BA-5000) em 5 % de soro de coelho por 35 min em TA. As lâminas foram então lavadas em PBS duas vezes a 5 min cada e estreptavidina recentemente produzida (Vector Labs, ABC Elite kit, N° de Cat PK-6100) foi adicionada. As lâminas foram lavadas novamente em PBS duas vezes a 5 min cada e então reveladas em diaminobenzidina (DAB) (Vector Labs, N° de Cat SK-4100). As lâminas foram lavadas em PBS duas vezes a 5 min cada, seguido por hematoxilina de Mayers (Sigma, N° de Cat HHS-32) por 5 segundos. As amostras foram bem enxaguadas em diH20 e imersas duas vezes brevemente na solução de hidróxido de amónio (estoque 5 ml em 1L de diH20) (Sigma, N° de Cat A-6899) e enxaguadas em diH20 novamente. As amostras foram então desidratadas em álcool de 70 %, 90 % e então 100 % (Harleco, N° de Cat 65347/85) 1 minuto cada e finalmente em xileno (JT Baker; N° de Cat 51.6,09). As lâminas foram fixadas com Cytoseal 60 (Stephens Scientific, Cat #8310-4,) e cobertas com lamelas cobre-objectos para análise de imagem. É mostrada na figura 11 a imagem IHC de vasos humanos (castanho) do tumor M24met do ratinho quimérico SCID-prepúcio humano.

Exemplo 20. Tratamento Terapêutico com o Anticorpo Anti-ALK-1 1.12.1 (M29I/D19A)

Para o tratamento, a dosagem foi realizada subcutaneamente (sc) ou intravenosamente (iv). Tipicamente, uma dose do anticorpo 1.12.1 (M29ID19A) foi dada para cada estudo. A segunda dose do anticorpo ALK-1, se necessário, foi administrada no dia 9 ou 10. Algumas vezes múltiplos niveis de dose, isto é, 1,5, 10, 50 mg/kg, foram administrados para investigar a inibição dependente de dose 186 do crescimento de vaso humano. Os animais foram monitorados diariamente e os tumores foram medidos três vezes/semana por calibres. Pelo dia 14 - 17 os tumores estavam entre 250 - 350 mm3 e foram removidos dos ratinhos, embebidos em OCT e congelados para análise IF ou IHC. São mostradas nas figura 12 imagens imunofluorescentes representativas de vasos humanos (vermelho) e de ratinho (verde) dos tumores M24met de Controlo e 1.12.1(M29I/D19A) tratados (10 mg/kg) no ratinho quimérico de SCID de prepúcio humano. Inibição dependente da dose de vasos tumorais humanos por 1.12.1 (M29I/D19A) em modelo de ratinho quimérico SCID de prepúcio humano é mostrada na figura 13 e um resumo dos estudos relacionados é apresentado no Quadro 13.

Quadro 13

Resumo de caracterização de modelo in vivo e da inibição de crescimento de vaso humano dos tumores M24met no modelo quimérico-SCID Parâmetros de Protocolo Pontos Finais Tumor Fármaco Dose Vi a Program a CD31 (% inibição em comparação com controlo) Dia do Estud o Notas Gerais MCF-7 nenhum na na Na não quantificad 19 Tumores implantados intradermicamente . Testados com e sem estradiol e implante de o colagénio. Os tumores cresceram lentamente e expressaram pouco CD31 humano 187

Resumo de caracterização de modelo ín vivo e da inibição de crescimento de vaso humano dos tumores M24met no modelo quimérico-SCID Parâmetros de Protocolo Pontos Finais Notas Gerais Tumor Fármaco Dose Vi a Program a CD31 (% inibição em comparação com controlo) Dia do Estud 0 M24met nenhum na na na não quantificad 0 19 Tumores implantados intradermicamente . Testados com e sem matriz de colagénio/FN. Com matriz constatado crescimento de tumor superior, todos os futuros estudos conterão suplementos de matriz. Os tumores mostraram bom fingimento de CD31 humano. M24met (pequeno ) nenhum na na na não quantificad 0 9 Tamanho do Tumor < 100 mm3. Pouco CD31 humano M24met (médio) nenhum na na na não quantificad o 12 Tamanho de tumor < 100-200 mm3. Algum CD31 humano) M24met (grande) nenhum na na na não quantificad o 12 Tamanho tumor < 200 mm3. Tumores M24met grandes têm números superiores de fingimento de vaso humano, os estudos futuros serão conduzidos com tumores maiores M24met IgG humano não especific o 10 mg/k g IV 2 doses (dia 5 & 9) 0 15 Primeiro estudo de avaliação. 1.12.1(M29I/D19A) mostrou redução significativa de coloração de CD31 humano. Nenhuma inibição de crescimento de tumor. 1.12.1 (M 29I/D19A) 10 mg/k g IV 42 188

Resumo de caracterização de modelo in vivo e da inibição de crescimento de vaso humano dos tumores M24met no modelo guimérico-SCID Parâmetros de Protocolo Pontos Finais Tumor Fármaco Dose Vi a Program a CD31 (% inibição em comparação com controlo) Dia do Estud o Notas Gerais I M24met IgG humano não especific o 10 mg/k g IV 2 doses (dia 5 & 10) 0 14 Segundo estudo de avaliação. Resultados confirmados de GW-366. Nenhuma 1.12.1 (M 29I/D19A) 10 mg/k g IV 40 inibição de crescimento de tumor observada. IgG humano não especific o 10 mg/k g SC 0 Primeiro teste de actividade dependente da dose de 1.12.1 (M 29I/D19A) 10 mg/k g SC 43 1.12.1(M29I/D19A) contra CD31 humano. Algum 1.12.1 (M 29I/D19A) 1 mg/k g SC 2 doses (dia 5 & 50 14 efeito dependente da dose observado contra CD31 M24met .1.12.1 (M 29I/D19A) 0.1 mg/k g SC 10) 20 humano. Algum efeito dependente da dose observado. Resultados PK que dose única será suficiente para redução significativa de CD31. Nenhuma inibição de crescimento de tumor observada. 189

Resumo de caracterização de modelo in vivo e da inibição de crescimento de vaso humano dos tumores M24met no modelo quimérico-SCID Parâmetros de Protocolo Pontos Finais Tumor Fármaco Dose 7ia Programa CD31 (% inibição em comparação com controlo) Dia do Estudo Notas Gerais Nenhuma dose 0 mg /kg na na ND Isotipo igual ou IgG 10 mg /kg SC 0 Segundo teste de dose dependente IgG humano não especifico 10 mg/kg SC ND da actividade de 1.12.1(M29I/D19A) contra CD31 M24met 1.12.1 (M 29I/D19A) 1 mg /kg SC uma dose (dia 5) 24 16 humano. Dose de depuração dependente do efeito anti-CD31 observada. Nenhuma 1.12.1 (M 29I/D19A) 5 mg /kg SC 59 inibição de crescimento de tumor observada. 1.12.1 (M 29I/D19A ) 10 mg/kg SC 72 Isotipo igualou IgG 10 mg/kg SC 0 1.12.1 (M 29I/D19A) 1 mg/kg SC 33 Teste de Faixa de Dose ampla final 1.12.1 (M 29I/D19A) 3 mg/kg SC 41 para 1.12.1(M29I/D19A) I M24met 1.12.1 (M 29I/D19A) 5 mg/kg SC uma dose (dia 5) 60 14 Estudo mostrou bons efeitos dependentes da 1.12.1 (M 29I/D19A) 7,5 mg /kg SC 60 dose. Dados de ajuste a uma dose 1.12.1 (M 29I/D19A) 10 mg/kg SC 73 de curva de resposta de dose sigmoidal produz um IC5o de 93 nM. Nenhuma inibição de crescimento de tumor observada 1.12.1 (M 29I/D19A) 50 mg/kg SC 70

Exemplo 21. Determinação EC50 In Vivo

Ratinhos quiméricos SCID de prepúcio humano foram intradermicamente implantados com células M24met e foram 190 tratados (sc) com anticorpo anti-ALK-1 1.12.1(M29I/D19A) a 1, 3, 5, 7,5, 10 e 50 mg/kg ou com anticorpo KLH anti-humano de igualação de isotipo (10 mg/kg). Na conclusão das experiências, a área de vaso humano em cada tumor foi quantificada como descrito acima. Concentrações de plasma de ratinho de anticorpo anti-ALK-1 1.12.1(M29I/D19A) foram medidas usando-se o método descrito a seguir: as amostras de soro dos ratinhos foram analisadas quanto à concentração de anticorpo anti-ALK-1 1.12.1(M29I/D19A) por um ELISA (Ensaio imunoabsorvente ligado por enzima). Placas de ELISA foram revestidas com 10 ng/ml de anticorpo especifico IgG Fc anti-humano de cabra (Pierce, N° de Cat 31123) em PBS, incubadas durante a noite a 4 °C e então bloqueadas com tampão de bloqueio StartBlock (Pierce, N° de Cat 37542) em temperatura ambiente por 1 hora. Amostras de soro foram diluídas antes da análise 100 e 1000-vezes em tampão de bloqueio StarBlock. Dois conjuntos de padrões foram preparados no soro em branco diluído 100 e 100- vezes. Os padrões e amostras de soro diluídas foram incubados na placa por 1 h. Anticorpo anti-ALK-1 ligado 1.12.1 (M29I/D19A) foi detectado usando-se IgG de anticorpo anti-humano de cabra etiquetado com peroxidase de rábano silvestre (HRP) (específico-Fab) (Sigma, N° de Cat A0293). O substrato usado foi 3, 3', 5, 5'-tetrametil benzidina (Sigma, N° de Cat T8665) . A absorvência foi lida a 450 nm numa leitora de placa Vmax (Molecular Devices, Menlo Park, CA) . Uma curva padrão foi ajustada utilizando-se regressão não-linear. O limite de detecção deste ensaio foi de 10 ng/ml de anticorpo anti-ALK-1 1.12.1(M29I/D19A). Concentração de plasma de ratinho SCID de anticorpo anti-ALK-1 1.12.1 (M29I/D19A) é mostrada na figura 15. A figura 15 representa a EC5o estimada para 1.12.1 (M29I/D19A) no modelo de quimera-SCID de prepúcio M24met. A área de vaso humano foi colocada em gráfico contra PK de plasma médio através do período de estudo (14 dias) para 191 cada grupo de tratamento. Uma curva ajustada foi produzida pelo programa Sigmoidal Dose Dependent de Graphpad (Prizm). A EC50 de 93 ng/ml (EC50 é definida como a concentração de plasma reguerida para uma redução de 50 % de área de vaso humano do no Grupo de Controlo) foi derivada do ajuste de curva. 192

LISTA DE SEQUÊNCIAS <110> Pfizer Inc Amgen Fremont Inc.

<120> ANTICORPOS MONOCLONAIS HUMANOS PARA CINASE-1 DO TIPO RECEPTOR DE ACTIVINA

<130> ABX-PF9 PROV <140> 60/715.292 <141> 2005-09-07 <160> 136 <170> Patentln versão 3.3 <210> 1 <211> 1332 <212> ADN <213> Humano <4 0 0> 1 193 caggtgcagc tgcaggagtc gggtccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc 60 acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agtggtgaat actactggaa ctggatccgc 120 cagcacccag ggaagggcct ggagtggatt gggtacatct attacagtgg gagtacctac 180 tacaacccgt ccctcaagag tcgagttacc atatcagtag acacgtctaa gaaccagttc 240 tccctgaagc tgagctctgt gactgccgcg gacacggccg tgtattactg tgcgagagag 300 tcagtggctg ggtttgacta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctcagcctcc 360 accaagggcc catcggtctt ccccctggcg ccctgctcca ggagcacctc cgagagcaca 420 gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 480 tcaggcgctc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 540 tactccctca gcagcgtagt gaccgtgccc tccagcaact tcggcaccca gacctacacc 600 tgcaacgtag atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agacagttga gcgcaaatgt 660 tgtgtcgagt gcccaccgtg cccagcacca cctgtggcag gaccgtcagt cttcctcttc 720 cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac gtgcgtggtg 780 gtggacgtga gccacgaaga ccccgaggtc cagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag 840 gtgcataatg ccaagacaaa gccacgggag gagcagttca acagcacgtt ccgtgtggtc 900 agcgtcctca ccgtcgtgca ccaggactgg ctgaacggca aggagtacaa gtgcaaggtc 960 tccaacaaag gcctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaaaccaa agggcagccc 1020 cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggagg agatgaccaa gaaccaggtc 1080 agcctgacct gcctggtcaa aggcttctac cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 1140 aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acacctccca tgctggactc cgacggctcc 1200 ttcttcctct acagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc 1260 tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cacagaagag cctctccctg 1320 tctccgggta aa 1332 <210> 2 <211> 444 <212> PRT <213> Humano <400> 2 194

Gin Val 1 Gin Leu Gin 5 Glu Ser Gly Thr Leu Ser Leu 20 Thr Cys Thr Val Glu Tyr 1Γ Trp Asn Trp ile Arg 40 Trp Ile 50 Gly Tyr ile Tyr W Ser Leu 65 Lys Ser Arg Val Thr 70 ile ser ser Leu Lys Leu Ser 85 ser val Thr Cys Ala Arg Glu 100 ser val Ala Gly Leu Val Thr 115 val ser Ser Ala Ser 120 Leu Ala 130 pro cys Ser Arg ser 135 Thr cys 145 Leu Val Lys ASp SS Phe Pro ser Gly Ala Leu Thr 165 Ser Gly val ser ser Gly Leu 180 TVr Ser Leu ser Asn phe Gly 195 Thr Gin Thr Tyr Thr 200 Asn Thr 210 Lys Val Asp Lys Thr 215 val Pro 225 pro cys Pro Ala Pro 230 pro val Pro pro Lys Pro Lys 245 Asp Thr Leu

Pro Gly Leu val Lys Pro ser Gin 10 15 Ser ciy Gly Ser Ile Ser ser Gly 25 30 Gin His Pro Gly Lys 45 Gly Leu Glu Gly ser Thr Tyr 60 Tyr Asn pro ser Val ASp Thr Ser Lys Asn Gin phe 75 80 Ala Ala 90 Asp Thr Ala val ST Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 105 110 Thr Lys Gly pro Ser 125 Val Phe pro ser Glu ser Thr 140 Ala Ala Leu Gly Glu Pro Val Thr val Ser Trp Asn 155 160 His Thr Phe pro Ala val Leu Gin 170 175 Ser Val Val Thr val Pro Ser ser 185 190 cys Asn val Asp HIS 205 Lys pro ser Glu Arg Lys cys 220 cys val Glu cys Ala Gly pro 235 ser Val Phe Leu Phe 240 Met ile ser Arg Thr pro Glu Val 250 255 195

Thr Cys vai vai vai Asp vai ser His Glu ASp pro Glu vai Gin Phe 260 265 270 Asn Trp 3? Vai ASp Gly vai Glu 280 Vai HlS Asn Ala $ Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn ser Thr Phe Arg vai vai Ser vai Leu Thr 290 295 300 vai Vai HlS Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys cys Lys vai 305 310 315 320 ser Asn Lys Gly Leu 325 Pro Ala pro lie Glu 330 Lys Thr He Ser 3?! Thr Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin vai Tyr Thr Leu Pro pro ser Arg 340 345 3S0 Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin vai ser Leu Thr Cys Leu Vai Lys Gly 355 360 365 phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin pro 370 375 380 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr pro pro Met Leu ASp ser ASp Gly ser 385 390 395 400 Phe Phe Leu Tyr Ser 405 Lys Leu Thr vai ASp 410 Lys Ser Arg Trp Gin 415 Gin Gly Asn Vai Phe Ser cys ser vai Met HiS Glu Ala Leu His A$n His 420 425 430 Tyr Thr Gin Lys ser Leu ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 <210> 3 <211> 645 <212> ADN <213> Humano <400> 3 196 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgta gggccagtca gagtgtcagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120 cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtacatcca gcagggccac tggcatccca 180 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcaccc tcaccatcag cagactggag 240 cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcgccgat caccttcggc 300 caagggacac gactggagat taaacgaact gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 360 ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 420 tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 480 caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 540 acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 600 ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgt 645 <210> 4 <211> 215 <212> PRT <213> Humano <400> 4 197 HCI _1 C He vai Leu Thr 5 Gin ser Pro Gly Thr Leu 10 Ser Leu ser Pro Gly 15 Glu Arg Ala Thr 20 Leu Ser cys Arg Ala 25 Ser Gin ser val ser 30 ser Ser Tyr Leu Ala 35 Trp Tyr Gin Gin Lys 40 pro Gly Gin Ala pro 45 Arg Leu Leu lie Tyr 50 Gly Thr Ser ser Arg 55 Ala Thr Gly Ile Pro 60 ASp Arg Phe ser Gly 65 ser Gly ser Gly Thr 70 Asp phe Thr Leu Thr 75 He ser Arg Leu Glu 80 pro Glu Asp Phe Ala 85 val Tyr Tyr cys Gin Gin 90 Tyr Gly ser ser 95 pro Ile Thr Phe Gly 100 Gin Gly Thr Arg Leu 105 Glu lie Lys Arg Thr 110 val Ala Ala pro ser 115 Vai Phe ile phe pro 120 Pro Ser Asp Glu Gin 125 Leu Lys ser Gly Thr 130 Ala ser Vai val cys 135 Leu Leu Asn Asn phe 140 Tyr Pro Arg Glu Ala 145 Lys vai Gin Trp Lys 150 val Asp Asn Ala Leu 155 Gin ser Gly Asn Ser 160 Gin Glu Ser vai Thr 165 Glu Gin ASp ser ΪΚ Asp ser Thr Tyr ser 175 Leu ser ser Thr Leu 180 Thr Leu Ser Lys Ala 185 Asp Tyr Glu Lys HiS 190 Lys Val Tyr Ala Cys 195 Glu Vai Thr His Gin 200 Gly Leu Ser ser Pro 205 val Thr Lys

Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 5 <211> 355 <212> ADN <213> Humano <400> 5 198 caggtgcagc tgcaggagtc gggtccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc 60 acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agtggtgaat actactggaa ctggatccgc 120 cagcaccqag ggaagggcct ggagtggatt gggtacatct attacagtgg gagtacctac 180 tacaacccgt cccccaagag tcgagttacc atatcagtag acacgtctaa gaaccagttc 240 tccctgaagc tgagctctgt gactgccgcg gacacggccg tgtattactg tgcgagagag 300

tcagtggctg ggtttgacta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctcag 35S <210> 6 <211> 118 <212> PRT <213> Humano <400> 6

Gin 1 Vai Gin Leu Gin 5 Glu Ser Gly Pro Gly Leu 10 Vai Lys Pro Ser 15 Gin Thr Leu ser Leu 20 Thr cys Thr vai Ser 25 Gly Gly ser lie ser ser 30 Gly Glu Tyr Tyr 35 Trp Asn Trp 11 e Arg 40 Gin His Pro Gly L^s Gly Leu Glu Trp He 50 Gly Tyr lie Tyr W Ser Gly ser Thr ar Tyr Asn Pro ser Leu 65 Lys Ser Arg vai Thr 70 ile ser Vai Asp Thr 75 Ser Lys Asn Gin Phe 80 ser Leu Lys Leu Ser 8S ser vai Thr Ala Ala Asp 90 Thr Ala vai T^r Tyr cys Ala Arg Glu 100 Ser vai Ala Gly Phe 105 Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 110 Thr Leu vai Thr 115 Vai Ser ser <210> 7 <211> 325 <212> ADN <213> Humano <400> 7 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 199 199 120 180 240 300 325 tagcctggta ccagcagaaa gcagggccac tggcatccca tcaccatcag cagactggag gctcgccgat caccttcggc ctctcctgta gggccagtca gagtgtcagc agcagctact cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtacatcca gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcaccc cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta caagggacac gactggagat taaac <210> 8 <211> 108 <212> PRT <213> Humano <400> 8

Glu 1 Π e vai Leu Thr 5 Gin Ser Pro Gly Thr 10 Leu Ser Leu Ser pro 15 Gly Glu Arg Ala Thr 20 Leu Ser cys Arg Ala 25 ser Gin Ser val ser 30 Ser ser Tyr Leu Ala 35 Trp Tyr Gin Gin a* pro Gly Gin Ala pro 45 Arg Leu Leu ile Tyr 50 Gly Thr Ser ser Arg 55 Ala Thr Gly Ile pro 60 ASp Arg Phe ser Gly 65 Ser Gly ser Gly Thr 70 Asp phe Thr Leu Thr 75 Ile ser Arg Leu Glu 80 ΡΓΟ Glu ASp Phe Ala 85 val Tyr Tyr cys Gin 90 Gin Tyr Gly ser ser 95 Pro Ile Thr Phe Gly Gin Gly Thr Arg Leu Glu lie Lys 100 105 <210> 9 <211> 361 <212> ADN <213> Humano <400> 9 200 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt agtcatggca tgtactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagct atatggtatg atggaagtaa taaatactat 180 gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga atagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagatcag 300 gagcagtggc ccgatgtttt tgatatctgg ggccaaggga caatggtcac cgtctcttca 360 g 361 <210> 10 <211> 120 <212> PRT <213> Humano <4 0 0> 10

Gin val Gin Leu Val Glu ser Gly Gly Gly Val val Gin Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe ser ser His 20 25 30 Gly Met 5T Trp val Arg Gin Ala 40 pro Gly Lys Gly Leu 45 Glu Trp Val Ala Ala 50 lie Trp Tyr Asp Gly S5 Ser Asn Lys Tyr Sr Ala Asp Ser val Lys 65 Gly Arg Phe Thr zle 70 ser Arg Asp Asn ser 75 Lys Asn Thr Leu Br Leu Gin Met Asn ser 85 Leu Arg Ala Glu Asp 90 Thr Ala Val Tyr Br cys Ala Arg Asp Gin 100 Glu Gin Trp Pro Asp 105 Val Phe A$P lie ll8 Gly Gin

Gly Thr Met val Thr vai ser ser 115 120 <210> 11 <211> 322 <212> ADN <213> Humano <4 0 0> 11 201 201 ctgtaggaga cagagtcacc 60 cctggtttca gcagaaacca 120 tgcaaagtgg ggtcccatca 180 ccatcagcag cctgcagcct 240 acccgctcac tttcggcgga 300 322 gacatccaga tgacccagtc tccatcctca ctgtctgcat atcacttgtc gggcgagtca gggcattaga aattatttag gggaaagccc ctaagtccct gatctatggt gcatccagtt aagttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca gaagattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt gggaccaagg tggagatcaa ac <210> 12 <211> 107 <212> PRT <213> Humano <400> 12

Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu ser Ala ser Vai Gly 1 5 10 15 Asp Arg vai Thr Ile Thr cys Arg Ala Ser Gin Gly Ile Arg Asn Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro ser Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gin ser Gly vai pro Ser Lys Phe Ser Gly 50 5S 60 Ser 65 Gly ser Gly Thr Asp 70 phe Thr Leu Thr Ile 75 Ser ser Leu Gin pro 80 Glu Asp Phe Ala Thr 85 Tyr Tyr Cys Gin Gin 90 Tyr Asn Ser Tyr Pro 95 Leu Thr Phe Gly Gly 100 Gly Thr Lys vai Glu 105 Ile Lys <2 10> 13 <2 11> 355 <2 12> ADN <2 13> Humano <4 00> 13 202 caggtgcacc tgcaggagtc acctgcactg tctctggtgg cagccccccg ggaagggact tacaacccct ccctcaagag tccctgaagc tgaactctgt tcagtggccg cctttgacta <210> 14 <211> 118 <212> PRT <213> Humano gggcccagga ctggtgaagc ctccgtcagc agtggtgatt ggagtggatt gggtatatct tcgaatcacc atatcaatag gaccgctgcg gacacggcct ctggggccag ggaaccctgg cttcggagac cctgtccctc actactggaa ctggatccgg attacagtgg gagcaccaac acacgtccaa gaaccagttc tgtattactg tgcgagagaa tcaccgtctc ctcag 60 120 180 240 300 355 <400> 14 Gin vai Hls Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu val Lys Pro Ser GlU 1 5 10 15 Thr Leu ser Leu Thr cys Thr Vai ser Gly Gly ser Vai Ser Ser Gly 20 25 30 ASP Tyr ar Trp Asn Trp He Arg 40 Gin Pro pro Gly «Γ Gly Leu Glu Trp He 50 Gly Tyr il e Tyr W Ser Gly Ser Thr Asn 60 Tyr Asn Pro Ser Leu 65 Lys Ser Arg ile Thr 70 Ile Ser He ASp Thr 75 ser Lys Asn Gin Phe 80 Ser Leu Lys Leu Asn 85 Ser Vai Thr Ala Ala 90 ASp Thr Ala Leu ST Tyr cys Ala Arg Glu 100 ser Vai Ala Ala phe 105 ASP Tyr Trp Gly Gin 110 ciy Thr Leu vai Thr Vai Ser Ser 115 <210> 15 <211> 325 <212> ADN <213> Humano <4 0 0> 15 203 gaaattgtgt tgacgcagtc ctctcctgca gggccagtca cctggccagg ctcccaggct gacaggttca gtggcagtgg cctgaagatt ttgcagtgta caagggacac gactggagat <210> 16 <211> 108 <212> PRT <213> Humano tccaggcacc ctgtctttgt gagtattagc agtaggtact cctcatctat ggtgcatcca gtctgggaca gacttcactc ttactgtcaa cactatggta taaac ctccagggga aagagccacc 60 tagcctggta ccagcaggaa 120 gcagggccac tggcatccca 180 tcaccatcag cagactggag 240 gctcaccgat caccttcggc 300 325 <4 0 0> 16 <51U ile Vai Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr 20 Leu ser Cys Arg Ala 25 Ser Gin Ser ile Ser 30 ser Arg Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Glu pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 lie IV Gly Ala Ser Ser Arg 55 Ala Thr Gly li e pro 60 Asp Arg phe ser Gly 65 ser Gly ser Gly Thr 70 Asp Phe Thr Leu Thr 75 ile ser Arg Leu Glu 80 Pro GlU Asp phe Ala 85 vai Tyr Tyr cys Gin 90 His Tyr Gly ser Ser 95 Pro He Thr Phe Gly Gin Gly Thr Arg Leu Glu lie Lys 100 105 <210> 17 <211> 355 <212> ADN <213> Humano <4 0 0> 17 204 204 60 120 180 240 300 355 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc acctgcactg tctctggtgg ctccgtcagc agtggtgatt actactggaa ctggatccgg cagcccccag ggaagggact ggagtggatt gggtatatct attacagtgg gagcaccaac tacaacccct ccctcaagag tcgagtcacc atatcagtag acacgtccaa gaaccagttc tccctgaagc tgagctctgt gaccgctgcg gacacggccg tgtattactg tgcgagagaa gcagtgtccg cctttgacta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctcag <210> 18 <211> 118 <212> PRT <213> Humano <4 0 0> 18

Gin Vai Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu vai Lys pro Ser Glu 1 5 10 15

Thr Leu ser Leu Thr cys Thr vai ser Gly Gly Ser vai Ser Ser Gly 20 25 30

Asp Tyr Tyr Trp Asn Trp ile Arg Gin Pro Pro Gly. Lys Gly Leu Glu 35 40 45

Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser 50 55 60

Leu Lys Ser Arg Vai Thr ile ser vai Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe 65 70 75 80

Ser Leu Lys Leu Ser Ser Vai Thr Ala Ala Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr 85 90 95

Cys Ala Arg Glu Ala vai ser Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 HO

Leu val Thr vai ser ser 115 <210> 19 <211> 325 <212> ADN <213> Humano <400> 19 205 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agtacctact tagcctggca ccagcagaaa 120

cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgtatcca gcagggccag tggcgtccca ISO gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240 cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gttcaccgat caccttcggc 300

caagggacac gactggagat taaac 32S <210> 20 <211> 108 <212> PRT <213> Humano <400> 20

Glu ile vai Leu Thr Gin ser Pro Gly Thr Leu ser Leu ser Pro Gly 15 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu ser cys Arg Ala ser Gin ser vai ser ser Thr 20 25 30

Tyr Leu Ala Trp His Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala pro Arg Leu Leu 35 40 45

He Tyr Gly vai ser Ser Arg Ala ser Gly Vai Pro Asp Arg Phe ser 50 55 60

Gly ser Gly ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie ser Arg Leu Glu 65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala vai Tyr Tyr cys Gin Gin Tyr Gly Ser Ser Pro

Ile Thr Phe Gly Gin Gly Thr Arg Leu Glu ile Lys 100 105 <210> 21 <211> 370 <212> ADN <213> Humano <400> 21 206 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc 60 acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agtggtggtc actactggag ctggatccgc 120 cagcacccag ggaagggcct ggagtggatt gggtacatct attacagtgg gagcacctac 180 tacaacccgt ccctcaagag tcgagttacc atatcagtag acacgtctaa gaaccagttc 240 tccctgaagc tgagttctgt gactgccgcg gacacggccg tatattactg tgcgagagcg 300 gggcgatttt tggagtggtc tgatgttttt gatatctggg gccaagggac aatggtcacc 360 gtctcctcag 370 <210> 22 <211> 123 <212> PRT <213> Humano <400> 22Gin vai Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu vai Lys Pro ser Gin 1 5 10 IS Thr Leu Ser Leu Thr cys Thr val Ser Gly Gly Ser Xle Ser Ser Gly 20 25 30 Gly His Tyr 35 Trp Ser Trp ile Arg 40 Gin His Pro Gly ar Gly Leu Glu Trp lie SO Gly Tyr xle Tyr W Ser Gly Ser Thr Tyr 60 Tyr Asn pro ser Leu 65 Lys ser Arg vai Thr 70 Ile ser val ASP Thr 75 Ser Lys Asn Gin Phe 80 ser Leu Lys Leu ser 85 ser Vai Thr Ala Ala 90 Asp Thr Ala val ΪΤ Tyr cys Ala Arg Ala 100 Gly Arg Phe Leu Glu 105 Trp ser ASp val Phe 110 Asp Xle Trp Gly Gin 115 Gly Thr Met vai Thr 120 val ser ser <210> 23 <211> 340 <212> ADN <213> Humano <400> 23 207 gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60 atcaactgca agtccagcca gagtgtttta tacagctcca acaataagaa ctacttagct 120 tggtaccagc agaaaccagg gcagcctcct aagctgctca tttactgggc atctacccgg 180 gaatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagcc tgcaggctga agatgtggca gtttattact gtcagcaata ttatgatact 300 cctccgacgt tcggccaagg gaccaaggtg gaaatcaaac 340 <210> 24 <211> 113 <212> PRT <213> Humano <400> 24

Asp ile vai Met Thr Gin ser Pro Asp Ser Leu Ala Vai Ser Leu Gly 1 S 10 15

Glu Arg Ala Thr ile Asn cys Lys ser ser Gin Ser vai Leu Tyr Ser 20 25 30

Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin 35 40 45

Pro Pro 50 Lys Leu Leu lie 5Γ Trp Ala ser Thr Arg 60 Glu ser Gly vai ΡΓΟ Asp Arg Phe ser Gly ser Gly ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 lie Ser ser Leu Gin Ala Glu ASP vai Ala vai Tyr Tyr cys Gin Gin 85 90 95 Tyr Tyr ASp Thr Pro pro Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys vai Glu He 100 105 110

Lys <210> 25 <211> 355 <212> ADN <213> Humano <400> 25 208 208 60 120 180 240 300 355 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cctcacagac cctgtccctc atctgtactg tttctggtgg ctccatcagc agtggtgaat actactggag ctggatccgc cagcacccag ggaagggcct ggagtggatt gggtacatct attacagtgg gagcacctac tacaacccgt ccctcaagag tcgacttacc atatcagtag acacgtctaa gaaccagttc tccctgaagc tgagctctgt gactgccgcg gacacggccg tgtattactg tgcgagagag gggatcggtg cttttgatat ctggggccaa gggacaatgg tcaccgtctc ttcag <210> 26 <211> 118 <212> PRT <213> Humano <400> 26

Gin vai Gin Leu Gin Glu Ι ΟΙ <Λ Gly ΡΓΟ Gly Leu val Lys Pro ser Gin 1 5 10 IS Thr Leu ser Leu Ile cys Thr Val Ser Gly Gly Ser ile ser ser Gly 20 25 30 Glu Tyr ST Trp Ser Trp ile Arg 40 Gin HiS pro Gly Lys 45 Gly Leu Glu Trp ile 50 Gly Tyr Ile Tyr 3r Ser Gly Ser Thr Tyr 60 Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile ser val Asp Thr ser Lys Asn Gin Phe 65 70 75 80 Ser Leu Lys Leu ser ser val Thr Ala Ala ASp Thr Ala val Tyr Tyr 85 90 95 cys Ala Arg GlU Gly ile Gly Ala phe Asp ile Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110 Met Vai Thr vai Ser Ser 115 <210> 27 <211> 325 <212> ADN <213> Humano <400> 27 209 gaaattgtgt tgacgcagtc gccaggcacc ctgtctttgt ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact cctggccagg ctcctaggct cctcatctat ggagcatcca gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cggtatggta caagggacac gactggagat taaac <210> 28 <211> 108 <212> PRT <213> Humano 209 ctccagggga aagagccacc 60 tagcctggta ccagcagaaa 120 gcagggccac tggcatccca 180 tcaccatcat cagactggac 240 gctcaccgat caccttcggc 300 325 <400> 28

Glu He vai Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu ser Leu ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu ser cys Arg Ala ser Gin ser vai ser ser ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 ojy ser Gly ser Gly Thr Asp phe Thr Leu Thr Ile ile Arg Leu ASp 65 70 75 80 ΡΓΟ Glu ASp phe Ala vai Tyr Tyr cys Gin Arg Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95 ile Thr phe Gly 100 Gin Gly Thr Arg Leu 105 Glu ile Lys <210> 29 <211> 361 <212> ADN <213> Humano <400> 29 210 caggtgcagc tgcaggagtc acctgcactg·tctctggtgg ccagggaagg gactggagtg ccctccctca agagtcgagt aagctgagct ctgtgaccgc agcagtggct gcccctactt 9 <210> 30 <211> 120 <212> PRT <213> Humano gggcccagga ctggtgaagc ctccatcagt agttactact gattgggtat atctattaca caccatatca gtagacacgt tgcggacacg gccgtgtatt tgactactgg ggccagggaa cttcggagac cctgtccctc 60 ggagctggat ccggcagccc 120 gtgggagcac caactacaac 180 ccaagaacca gttctccctg - 240 actgtgcgag agaggacgat 300 ccctggtcac cgcttcctca 360 361 <400> 30

Gin vai Gin Leu Gin Glu ser Gly pro Gly Leu Val Lys Pro ser Glu 1 5 10 15 * Thr Leu ser Leu Thr cys Thr vai Ser Gly Gly Ser lie Ser Ser Tyr 20 25 30 Tyr Trp ser Trp 11 e Arg Gin pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp ile 35 40 45 Gly sT lie Tyr Tyr ser Gly 55 ser Thr Asn Tyr Asn 60 Pro Ser Leu Lys ser 65 Arg val Thr 11 e ser 70 vai ASp Thr ser Asn Gin Phe ser Leu 80 Lys Leu ser Ser Vai 85 Thr Ala Ala Asp Thr 90 Ala val Tyr Tyr 8* Ala Arg Glu ASp ASp 100 Ser Ser Gly Cys pro 105 Tyr Phe Asp Tyr Trp 110 Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Ala ser Ser 115 120 <210> 31 <211> 322 <212> ADN <213> Humano <400> 31 211 gaaatagtga tgacgcagtc tccagccacc ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc ggccaggctc ccagggtcct catctatggt aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagag gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag gggaccaaag tggatatcaa ac ctgtctgtgt agcaacttag gcatccacca ttcactctca tataataact ctccagggga cctggtacca gggccactgg ccatcagcag ggccattcac aagagccacc gcagaaacct tatcccagtc cctgcagtct tttcggccct 60 120 180 240 300 322 <210> 32 <211> 107 <212> PRT <213> Humano <400> 32 Glu Ile val Met Thr Gin ser Pro Ala Thr Leu ser val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu 5er Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Asn 20 25 30 Leu Ala Trp 35 Tyr Gin Gin Lys Pro 40 Gly Gin Ala Pro Arg 45 Val Leu Ile Tyr Gly 50 Ala Ser Thr Arg Ala 55 Thr Gly Ile Pro Val 60 Arg Phe Ser Gly ser 6S Gly ser Gly Thr Glu 70 Phe Thr Leu Thr He 75 Ser Ser Leu Gin ser 80 Glu Asp Phe Ala Vai 85 Tyr Tyr Cys Gin Gin 90 Tyr Asn Asn Trp Pro 95 Phe Thr Phe Gly pro 100 Gly Thr Lys Val Asp 105 Ile Lys <2 10> 33 <2 11> 370 <2 12> ADN <2 13> Humano <400> 33 212 cagatgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcgcagac cctgtccctc 60 acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agtggtggtc actactggag ctggatccgc 120 cagcaccccg ggaagggcct ggagtggatt gggtacatct attacagtgg gagcgcctac 180 tacaacccgt ccctcaagag tcgagttacc atatcagtag acacgtctaa gaaccagttc 240 tccctgaagc tgagctctgt gactgccgcg gacacggccg tgtattactg tgcgagagcg 300 gggcgatttt tggagtggtc tgatgttttt gatatctggg gccaagggac aatggtcacc 360 gtctctttag 370 <210> 34 <211> 123

<212> PRT <213> Humano <400> 34

Gin Met Gin Leu Gin Glu ser Gly Pro Gly Leu vai Lys Pro ser Gin 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr cys Thr Vai Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly 20 25 30 Gly His Tyr Trp ser Trp 11 e Arg Gin His pro Gly Lys Gly Leu GlU 35 40 45 Trp il e 50 Gly Tyr ile Tyr W Ser Gly Ser Ala Tyr 60 Tyr Asn pro ser Leu Lys ser Arg vai Thr ile ser Vai Asp Thr ser Lys Asn Gin Phe 65 70 75 80 Ser Leu Lys Leu Ser 85 ser vai Thr Ala Ala Asp 90 Thr Ala vai ar Tyr cys Ala Arg Ala Gly Arg phe Leu Glu Trp ser Asp Val Phe ASp Ile XOO 105 110 Trp Gly Gin Gly 115 Thr Met vai Thr 120 Vai Ser Leu <210> 35 <211> 340 <212> ADN <213> Humano <400> 35 213 gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggecacc 60 atcaactgca agtccagcca gagtgtttta tacagctcca acaataagaa ctacttaact 120 tggtaccagc agaaaccagg acggcctcct aagctgctca tttactgggc atctacccgg 180 gaatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagcc tgcaggctga agatgtggca gtttattact gtcaacaata ttataatact 300 cctccgacgt tcggccaagg gaccaaggtg gaaatcaagc 340 <210> 36 <211> 113 <212> PRT <213> Humano <400> 36

Asp lie vai Met Thr Gin ser Pro Asp Ser Leu Ala val ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn cys Lys ser ser Gin Ser vai Leu Tyr Ser 20 25 30 Ser Asn Asn 35 Lys Asn Tyr Leu Thr 40 Trp Tyr Gin Gin Lys 45 Pro Gly Arg pro pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu ser Gly val 50 '55* 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 lie Ser ser Leu Gin 85 Ala Glu ASp Vai Ala 90 val Tyr Tyr cys Gin 95 Gin Tyr Tyr Asn Thr 100 Pro Pro Thr Phe Gly 105 Gin Gly Thr Lys val 110 Glu Ile Lys <210> 37 <211> 379 <212> ADN <213> Humano <400> 37 214 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtcaagc ctggagggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt gactactaca tgagctggat ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtttcatac attagtagta gtggtaatac catatactac 180 gcagactctg tgaagggccg attcaccatc tccagggaca aegccaggaa ctcactgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagggaagcc 300 tatgatagta gtggttacta ctactactac tacggtatgg acgtctgggg ccaagggacc 360 acggtcaccg tctcctcag 379 <210> 38 <211> 126 <212> PRT <213> Humano <400> 38

Gin vai Gin Leu vai Glu ser Gly Gly Gly Leu vai Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 ser Leu Arg Leu ser cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met ser Trp lie Arg Gin Ala pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp vai 35 40 45 Ser Tyr 50 lie ser Ser ser Gly 55 Asn Thr lie Tyr 3r Ala ASP ser vai Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ser Leu Tyr 65 70 7S 80 3 _J Gin Met Asn Ser 85 Leu Arg Ala Glu Asp 90 Thr Ala Vai Tyr Tyr 95 cys Ala Arg Glu Ala 100 Tyr Asp Ser Ser Gly 105 Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr 110 Tyr Gly Met Asp Vai Trp Gly Gin Gly Thr Thr vai Thr vai ser Ser 115 120 125 <210> 39 <211> 337 <212> ADN <213> Humano <400> 39 215 215 60 120 180 240 300 337 gatattgtga tgacccagac tccactctct ctgtccgtca cccctggaca gccggcctcc atctcctgca agtctagtca gagcctcctg catagtgatg gaaagaccta cttgtattgg tacctgcaga agccaggcca gcctccacag ctcctgatct atgaagtttc caaccggttc tctggagtgc cagataggtt cagtggcagc gggtcaggga cagatttcac actgacaatc agccgggtgg aggctgacga tgttggggtt tattactgca tgcaaagtac acaccttcct tggacgttcg gccaagggac caaggtggaa atcaaac <210> 40 <211> 112 <212> PRT <213> Humano <400> 40 ASp lie Vai Met Thr Gin Thr Pro Leu ser Leu ser vai Thr Pro Gly 1 5 10 15 Gin pro Ala ser ile Ser cys Lys Ser ser Gin Ser Leu Leu HiS Ser 20 25 30 ASp Gly ST Thr Tyr Leu Tyr Trp 40 Tyr Leu Gin Lys Pro 45 Gly Gin pro Pro Gin Leu Leu lie Tyr Glu Vai ser Asn Arg Phe Ser Gly vai Pro 50 55 60 Asp 65 Arg Phe Ser Gly Ser 70 Gly ser Gly Thr Asp 75 Phe Thr Leu Thr lie 80 ser Arg Val Glu Ala 85 Asp Asp vai Gly vai 90 Tyr Tyr Cys Met Gin 95 ser Thr Mis Leu pro Trp Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys vai Glu Ile Lys XOO 105 110 <210> 41 <211> 376 <212> ADN <213> Humano <400> 41 216 gaggtgcagc tggtggagtc tcctgtgcag cctctggatt ccagggaagg ggctggagtg gactacgctg cacccgtgaa ctgtatctgc aaatgaacag gggaattact atgatggtag gtcaccgtct cctcag <210> 42 <211> 125 <212> PRT <213> Humano tgggggaggc ttggtaaagc cactttcagt aacgcctgga ggttggccgt attaaaagca aggcagattc accatctcaa cctgaaaacc gaggacacag tggttattac tcttttgact ctggggggtc ccttagactc tgagctgggt ccgccaggct aaagtgatgg tgggacaaca gagatgattc aaaaaacacg ccgtgtatta ctgtaccaca actggggcca gggaaccctg 60 120 180 240 300 360 376 <400> 42

Glu 1 Vai Gin Leu val 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Leu val Lys pro Gly 15 Gly Ser Leu Arg Leu ser cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr phe ser Asn Ala 20 25 30 Trp Met Ser Trp val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Arg 50 ile Lys Ser Lys Ser 55 ASp Gly Gly Thr Thr 60 ASP Tyr Ala Ala pro val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg ASP ASP Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu ASP Thr Ala val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Thr 100 Gly Asn Tyr Tyr xòf Gly Ser Gly Tyr Tyr 110 Ser Phe Asp Tyr Trp 115 Gly Gin Gly Thr Leu 120 Val Thr val ser ser 125 <2 10> 43 <2 11> 337 <2 12> ADN <2 13> Humano <400> 43 217 gatãttgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 60 atctcctgca ggtctagtca gagcctcctg catagtaatg gatacaacta tttggattgg 120 tacctgcaga agccagggca gtctccacag ctcctgatct atttgggttc taatcgggcc 180 tccggggtcc ctgacaggtt cagtggcagt ggatcaggca cagattttac actgaaaatc 240 agcagagtgg aggctgagga tgttggggtt tattactgca tgcaagctct acaaactcct 300 cccactttcg gcggagggac caaggtggag atcaaac 337 <210> 44 <211> 112 <212> PRT <213> Humano <400> 44 ASp Ile Val Met Thr 5 Gin Ser pro Leu ser 10 Leu Pro Val Thr Pro 15 Gly Glu Pro Ala ser Ile ser cys Arg Ser ser Gin Ser Leu Leu Hls Ser 20 25 30 Asn Gly Tyr 35 Asn Tyr Leu ASp Trp 40 Tyr Leu Gin Lys Pro 45 Gly Gin Ser ΡΓΟ Gin 50 Leu Leu Ile Tyr Leu 55 Gly ser Asn Arg Ala 60 Ser Gly val Pro ASp 65 Arg Phe Ser Gly ser 70 Gly ser Gly Thr ASP 75 Phe Thr Leu Lys ile 80 Ser Arg val Glu Ala 85 Glu Asp val Gly val 90 Tyr Tyr Cys Met Gin 95 Ala Leu Gin Thr Pro 100 Pro Thr Phe Gly Gly 105 Gly Thr Lys val Glu 110 lie Lys <210> 45 <211> 355 <212> ADN <213> Humano <400> 45 218 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc cagcacccag ggaagggcct ggagtggatt tacaacccgt ccctcaagag tcgagttacc tccctgaagc tgagctctgt gactgccgcg tccacggacg gtatggacgt ctggggccaa <210> 46 <211> 118 <212> PRT <213> Humano ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc 60 agtaatgatt actactggaa ctggatccgc 120 gggtacatct attacagtgg gagcacctac 180 atatcagtag acacgtctaa gaaccagttc 240 gacacggccg tgtattactg tgcgagagaa 300 gggaccacgg tcaccgtctc ctcag 355 <400> 46

Gl π Vál Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Vai Lys pro Ser Gin 1 5 10 15 Thr Leu ser Leu Thr cys Thr vai ser Gly Gly Ser ile Ser Ser Asn 20 25 30 ASp Tyr 3r Trp Asn Trp ile Arg 40 Gin His Pro Gly ST Gly Leu GlU Trp lie 50 Gly Tyr ile Tyr JT Ser Gly ser Thr Tyr 60 Tyr Asn pro Ser Leu Lys ser Arg vai Thr ile ser vai Asp Thr ser Lys Asn Gin Phe 65 70 75 80 Ser Leu Lys Leu Ser Ser vai Thr Ala Ala Asp Thr Ala vai Tyr Tyr 85 90 95 cys Ala Arg GlU ser Thr Asp Gly Met Asp vai Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110 Thr vai Thr vai Ser ser • 115 <210> 47 <211> 325 <212> ADN <213> Humano <400> 47 219 gaaaatgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcaactact tagcctggta ccagcagaaa 120 cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcttcca gcggggccac tggcatccca 160 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240 cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cattatggta gctcaccgat caccttcggc 300 caagggacac gactggagat taaac 325 <210> 48 <211> 108 <212> PRT <213> Humano <400> 48

Glu Asn Vai Leu Thr Gin Ser o Ι Ο. Gly Thr Leu Ser Leu ser pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu ser cys Arg Ala ser Gin Ser vai ser ser Asn 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala pro Arg Leu Leu 35 40 45 He S!r Gly Ala Ser Ser Gly 55 Ala Thr Gly lie Pro 60 Asp Arg Phe Ser Gly 65 Ser Gly ser Gly Thr 70 ASp Phe Thr Leu Thr 75 lie ser Arg Leu Glu 80 Pro Glu Asp Phe Ala 85 Vai Tyr tyr cys Gin 90 His Tyr Gly ser Ser 95 Pro Ile Thr Phe Gly Gin Gly Thr Arg Leu Glu 11 e Lys 100 105 <2 10> 49 <2 11> 361 <2 12> ADN <2 13> Humano <400> 49 220 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc 60 acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agtggtgatt actactggag ctggatccgc 120 cagcacccag ggaagggcct ggagtggatt gggtacatct attacagtgg gagcacctac 180 tacaacccgt ccctcaagag tcgagttacc atatcaatag acacgtctaa gaaccagttc 240 tccctgaagc tgagctctgt gactgccgcg gacacggccg tgtattactg tgcgagagaa 300 cgtgactacg gtggtggctt tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 360 g 361 <210> 50 <211> 120 <212> PRT <213> Humano <400> 50

Gin vai Gin Leu Gin Glu ser Gly 1 5 Thr Leu ser Leu 20 Thr cys Thr vai Asp Tyr Tyr 35 Trp ser Trp xle Arg 40 Trp lie 50 Gly Tyr lie Tyr W ser Leu Lys Ser Arg vai Thr Xle ser 65 70 ser Leu Lys Leu Ser Ser vai Thr 85 cys Ala Arg Glu Arg Asp Tyr Gly 100 Thr Leu vai Gly 115 pro Gly Leu vai Lys Pro Ser Gin 10 15 Ser Gly Gly Ser ile ser Ser Gly 25 30 Gin His Pro Gly SP Gly Leu Glu Gly Ser Thr Sr Tyr Asn pro Ser xle ASp Thr ser Lys Asn Gin Phe 75 80 Ala Ala 90 Asp Thr Ala vai ΪΡ Tyr Gly 105 Gly Phe Asp Tyr Trp 110 Gly Gin Thr vai ser ser 120 <210> 51 <211> 340 <212> ADN <213> Humano <400> 51 221 gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60 atcaactgca agtccagcca gagtgtttta tacagctcca tcaataagat ctacttagct 120 tggtaccagc agaaaccagg acagcctcct aagctgctca tttactgggc atctacccgg 180 gaatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagcc tgcaggctga agatgtggca gtttattact gtcaccaata ttatagtact 300 ccgtggacgt tcggccaagg gaccaaggtg gaaatcaaac 340 <210> 52 <211> 113 <212> PRT <213> Humano <400> 52

Asp ile vai Met Thr Gin ser pro Asp ser Leu Ala vai ser Leu Gly 15 10 15

Glu Arg Ala Thr ile Asn cys Lys ser ser Gin Ser vai Leu Tyr ser 20 25 30 ser rle Asn Lys ile Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin 35 40 45 pro Pro Lys Leu Leu ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu ser Gly Vai 50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly ser Gly ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 ile ser ser Leu Gin Ala Glu Asp vai Ala vai Tyr Tyr Cys His Gin 85 K 90 95

Tyr Tyr ser Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys vai Glu lie 100 105 110

Lys <210> 53 <211> 355 <212> ADN <213> Humano <400> 53 222 222 caggtgcagc tgcaggagtc acctgcactg tctctggtgg cagcacccag ggaagggcct tacaacccgt ccctcaagag tccctgaagc tgagctctgt gctacggagg ggtttgacta

gggcccagga ctggtgaage cttcacagac cctgtccctc 60 ctccatcagc agtggtgatt actactggaa ctggatccgc 120 ggagtggatt gggtacatct attacagtgg gagcacctac 180 tcgagttacc atttcagtag ccacgtctaa gaaccagttc 240 gactgccgcg gacacggccg tgtattactg tgcgagagag 300 ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctcag 35S <210> 54 <211> 118 <212> PRT <213> Humano <400> 54

Gin vai Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu val Lys Pro Ser Gin 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu 20 Thr Cys Thr val ser 25 Gly Gly Ser lie ser 30 Ser Gly ASp ryr sr Trp Asn Trp lie Arg 40 Gin Hls pro Gly 8* Gly Leu Glu Trp ile 50 Gly Tyr ile Tyr Tyr 55 Ser Gly Ser Thr Sr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg val Thr lie Ser val Ala Thr Ser Lys Asn Gin Phe 65 70 75 80 ser Leu Lys Leu ser Ser val Thr Ala Ala Asp Thr Ala val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Glu Ala Thr Glu Gly Phe ASP Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr val ser ser 115 <210> 55 <211> 325 <212> ADN <213> Humano <400> 55 223 223 60 120 180 240 300 325 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagggccacc ctctcctgea gggccagtca gagtgttagc accacctact tagcctggta ccagcagaaa cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag cctgaagatt ttgcactgta ttactgtcag cactatggta cctcatcgat caccttcggc caagggacac gactggagat taaac <210> 56 <211> 108 <212> PRT <213> Humano <400> 56

GlU Πβ vai Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu ser cys Arg Ala ser Gin ser vai ser Thr Thr 20 25 30 Tyr Leu Ala 35 Trp Tyr Gin Gin as Pro Gly Gin Ala Pro 45 Arg Leu Leu lie Gly Ala ser Ser Arg 55 Ala Thr Gly xle Pro 60 Asp Arg phe ser Gly ser Gly ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu ASP phe Ala Leu Tyr Tyr cys Gin His Tyr Gly Thr ser ser 85 90 95 Ile Thr Phe Gly 100 Gin Gly Thr Arg Leu 105 Glu lie Lys <210> 57 <211> 355 <212> ADN <213> Humano <400> 57 224 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc 60 acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agtggtgatt actactggaa ctggatccgc 120 cagcacccag ggaagggcct ggagtggatt gggtacatct attacagtgg gagcacctac 180 tacaacccgt ccctcaagag tcgagctacc atatcagtag acacgtctaa gaaccagttc 240 tccctgaagc tgagctctgt gactgccgcg gacacggccg tgtattactg tgcgagagaa 300 tccacggacg gtatggacgt ctggggccaa gggaccacgg tcaccgtctc ctcag 355 <210> 58 <211> 118 <212> PRT <213> Humano <400> 58 <3l n Vai <51 n Leu Gin Glu 1 5 Thr Leu ser Leu Thr cys 20 Asp Tyr Tyr Trp 35 Asn Trp Trp 11 e 50 Gly Tyr Ile Tyr Leu Lys ser Arg val Thr 65 70 Ser Leu Lys Leu ser 85 Ser Cys Ala Arg Glu 100 Ser Thr Thr vai Thr vai Ser ser 115 <210> 59 <211> 325 <212> ADN <213> Humano

Ser Gly Pro Gly 10 Leu val Lys Pro Ser 15 Gin Thr val Ser Gly Gly Ser Ile Ser 30 Ser Gly He Arg 40 £ 5 Gin His ΡΓΟ Gly ΪΫ Gly Leu Glu W Ser Gly Ser Thr Tyr 60 Tyr Asn Pro Ser lie ser val Asp Thr ser Lys Asn Gin Phe 75 80 val Thr Ala Ala 90 Asp Thr Ala val Tyr 95 Tyr Asp Gly Met 105 ASP val Trp Gly Gin 110 Gly Thr <400> 59 225 gaaagtgtgt tgacgcagtc ctctcctgca gggccagtca cctggccagg ctcccaggct gacaggttca gtggcagtgg cctgaagatt ttgcagtgta caagggacac gactggagat <210> 60 <211> 108 <212> PRT <213> Humano tcctggcacc ctgtctttgt gagtgttagc agcagctact cctcatatat ggtgtttcca gtctgggaca gacttcactc ttactgtcag cagtatggta taaac ctccagggga aagagccacc tagcctggta ccagcagaaa gcagggccac tggcatccca tcaccatcag cagactggag gctcaccgat caccttcggc 60 120 180 240 300 325 - <400> 60 Glu Ser Vai Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu ser Leu ser Pro 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu ser cys Arg Ala ser Gin ser val ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin LVS Pro Gly Gin Ala pro Arg Leu 35 40 45 He Tyr Gly Vai Ser ser Arg Ala Thr Gly ile Pro ASp Arg Phe 50 55 60 Gly ser Gly ser Gly Thr Asp phe Thr Leu Thr ile ser Arg Leu 65 70 75 Pro Glu ASP Phe Ala val Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Gly Ser ser 85 90 95 li e Thr Phe Gly Gin Gly Thr Arg Leu Glu xle Lys 100 105 <210> 61 <2 11> 355 <2 12> ADN <2 13> Humano

Gly ser Leu ser Glu 80 pro <400> 61 226 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc 60 acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agtggtgatt actactggaa ctggatccgc 120 cagcacccag ggaagggcct ggagtggatt gggtacatct attacagtgg gagcacctac 180 tacaacccgt ccctcaagag tcgagttacc atatcagtag acacgtctaa gaaccagttc 240 tccctgaagc tgagctctgt gactgccgcg gacacggccg tgtattactg tgcgagagag 300 gatattgcag gattcgaccc ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctcag 355 <210> 62 <211> 118 <212> PRT <213> Humano <400> 62 Gin Vai Gin Leu Gin Glu Ser Gly pro Gly Leu val Lys pro ser Gin 1 5 10 15 Thr Leu ser Leu Thr cys Thr val Ser Gly Gly Ser ile ser Ser Gly 20 25 30 Asp Tyr ir Trp Asn Trp Ile Arg 40 Gin Hls pro Gly 8· Gly Leu GlU Trp ile 50 Gly Tyr lie Tyr W Ser Gly Ser Thr Tyr 60 Tyr Asn Pro ser Leu Lys ser Arg Val Thr He ser val Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe 65 70 75 80 ser Leu Lys Leu ser Ser val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 cys Ala Arg Glu ASp ile Ala Gly Phe Asp Pro Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110 Leu vai Thr val ser Ser 115 <210> 63 <211> 325 <212> ADN <213> Humano <400> 63 227 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120 cctggccagg ctcccaggct cctcatctac ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gactccactc tcaccatcag cagactggag 240 cctgaagatt ttgcagtata ttactgtcag cagtatggta gctcacctat caccttcggc 300 caagggacac gactggagat taaac 325 <210> 64 <211> 108 <212> PRT <213> Humano <400> 64

GlU Ile Vai Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu ser Leu Ser pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu ser Cys Arg Ala ser Gin Ser Vai Ser ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin 4ís Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 He IXr Gly Ala ser Ser Arg 55 Ala Thr Gly lie Pro 60 Asp Arg Phe ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Ser Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 pro GlU ASP phe Ala 85 Vai Tyr Tyr Cys Gin 90 Gin Tyr Gly ser ser 95 Pro ile Thr phe Gly 100 Gin Gly Thr Arg Leu 105 Glu Ile uys <2 10> 65 <2 11> 355 <2 12> ADN <2 13> Humano <400> 65 228 caggtgcagc tgcaggagtc gggcceagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtecctc 60 acctgeactg tctctggtgg ctccatcagç agtggtgaat actactggag ctggatccgc 120 cagcacccag ggaagggcct ggagtggatt gggtãtatct tttâcagtgg gagcacctac 180 tacaacecgt ccctcaagag tcgagttacc atatcactag acacgtctaa gaaecagttc 240 tccctgaagc tgagctctgt gactgccgcg gacacggccg tgtattactg tgegagagaa 300

tccacogacg gtatggacgt ctggggccaa gggaccacgg teaccgtctc ctcag 3SS <210> 66 <211> 118 <212> PRT <213> Humano <400> 66 Gin 1 vai Gin Leu Gin 5 GlU ser Gly pro Gly 10 Leu Vai Lys Pro Ser 15 Gin Thr Leu Ser Leu 20 Thr cys Thr vai ser 25 Gly Gly Ser Ile Ser 30 Ser Gly Glu Tyr Tyr 35 Trp Ser Trp He Arg 40 Gin His pro Gly Gly Leu Glu Trp Ile 50 Gly Tyr ile Phe Tyr 55 Ser Gly ser Thr Tyr 60 Tyr Asn pro ser Leu 65 Lys Ser Arg vai Thr 70 lie ser Leu Asp Thr 75 Ser Lys Asn Gin Phe 80 ser Leu Lys Leu ser 85 ser vai Thr Ala Ala 90 ASp Thr Ala vai ar Tyr cys Ala Arg Glu 100 ser Thr ASp Gly Met 105 Asp vai Trp Gly Gin 110 Gly Thr Thr vai Thr vai ser ser 115 <210> 67 <211> 325 <212> ADN <213> Humano <400> 67 229 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcggaaa 120 cctggccagg ctcccaggct cctcatatat ggtgtatcca gtagggccac tggcatccca 180 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240 cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag caatatggta gctcaatgat caccttcggc 300 caagggacac gactggágat taaac 325 <210> 68 <211> 108 <212> PRT <213> Humano <400> 68

Glu lie Vai Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu ser Leu ser pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr 20 Leu ser cys Arg Ala 25 ser Gin Ser vai ser 30 ser Ser Tyr Leu Ala 35 Trp Tyr Gin Arg »* Pro Gly Gin Ala pro 45 Arg Leu Leu 11 e Gly Vai ser ser Arg 55 Ala Thr Gly lie pro 60 Asp Arg Phe ser Gly 65 Ser Gly ser Gly Thr 70 Asp Phe Thr Leu Thr 75 lie Ser Arg Leu Glu 80 ΡΓΟ Glu Asp phe Ala 85 Vai Tyr Tyr cys Gin 90 Gin Tyr Gly ser Ser 95 Met lie Thr phe Gly 100 Gin Gly Thr Arg Leu 10S Glu lie Lys <210> 69 <211> 355 <212> ADN <213> Humano <400> 69 230 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc 60 acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agtggtgatt actactggaa ctggatccgc 120 cagcacccag ggaagggcct ggagtggatt gggtacatct attacagtgg gagcacctac 180 tacaacccgt ccctcaagag tcgagttacc atatcagtag acacgtctaa gaaccagttc , 240 tccctgaagc tgagctctgt gactgccgcg gacacggccg tgtattactg tgcgagagag 300 ggcctcgagg cttttgatat ctggggtcaa gggacaatgg tcaccgactc ttcag 355 <210> 70 <211> 118 <212> PRT <213> Humano <400> 70 Gin vai Gin Leu Gin Glu Ser Gly pro Gly Leu vai Lys Pro ser Gin 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr cys Thr Vai ser Gly Gly Ser He ser Ser Gly 20 25 30 Asp Tyr Tyr Trp Asn Trp lie Arg Gin H1S Pro Gly aXs Gly Leu Glu 35 40 45 Trp lie 50 Gly Tyr lie Tyr ΪΓ ser Gly ser Thr Tyr 60 Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg vai Thr lie Ser Vai ASP Thr Ser Lys Asn Gin Phe 65 70 75 80 ser Leu Lys Leu Ser 85 Ser vai Thr Ala Ala 90 Asp Thr Ala val ar Tyr cys Ala Arg Glu Gly Leu Glu Ala Phe ASP lie Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110 Het val Thr ASp Ser Ser 115 <210> 71 <211> 325 <212> ADN <213> Humano <400> 71 231 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120 cctggccagg ctcccaggct cctcatctat gatgcatcca gcagggccac tggcatccca 180 gacaggttca gtggcagtgg ctctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240 cccgaagatt ttgcagtgta ctactgtcag cattatggta gctcacttct cactttcggc 300

ggagggacca aggtggagat caaac 32S <210> 72 <211> 108 <212> PRT <213> Humano <400> 72

Glu ile vai Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin ser vai Ser Ser ser 20 25 30 Tyr Leu Ala 35 Trp Tyr Gin Gin 8* pro Gly Gin Ala pro 45 Arg Leu Leu Π e Tyr ASp Ala Ser ser Arg Ala Thr Gly ile Pro ASp Arg Phe ser 50 55 60 Gly 65 Ser Gly Ser Gly Thr 70 Asp Phe Thr Leu Thr 75 ile ser Arg Leu Glu 80 o L. O. Glu Asp phe Ala 8S vai Tyr Tyr cys Gin 90 HÍS Tyr Gly ser ser 95 Leu Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys vai Glu He Lys 100 105

<210> 73 <211> 355 <212> ADN <213> Humano <400> 73 232 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc 60 acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agtggtgatt actactggaa ctggatccgc 120 cagcacccag ggaagggcct ggagtggatt gggtacatct attacagtgg gagcacctac 180 tacaactcgt ccctcaagag tcgagttacc atatcagtag acacgtctaa gaaccagttc 240 tccctgaagc tgagctctgt gactgccgcg gacacggccg tgtattactg tgcgagagag 300 ggccagaacg gtatggacgt ctggggccaa gggaccacgg tcaccgtctc ctcag 355 <210> 74 <211> 118 <212> PRT <213> Humano <400> 74

Gin vai Gin Leu Gin Glu Ser Gly 1 5

Thr Leu ser Leu Thr Cys Thr Vai 20

Asp Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg 35 40

Trp lie Gly Tyr Ile Tyr T^r Ser

Leu Lys ser Arg vai Thr lie ser 65 70 ser Leu Lys Leu Ser ser vai Thr 85

Cys Ala Arg Glu Gly Gin Asn Gly 100

Thr vai Thr vai ser ser 115 <210> 75 <211> 340 <212> ADN <213> Humano pro Gly Leu Vai Lys Pro ser Gin 10 15 ser Gly Gly ser lie ser Ser Gly 25 30 Gin His Pro Gly iP Gly Leu GlU Gly Ser Thr ar Tyr Asn ser Ser vai Asp Thr 75 ser Lys Asn Gin Phe 80 Ala Ala 90 Asp Thr Ala vai Sr Tyr Met Asp vai Trp Gly Gin Gly Thr 105 110 <400> 75 233 gatgttgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccttggaca gccggcctcc atctcctgca ggtctagtca aagcctcgta tacagtgatg gaaacaccta cttgaattgg 60 120 tttcagcaga ggccaggcca tctggggtcc cagacagatt agcagggtgg aggctgagga ccgtggacgt tcggccaagg <210> 76 <211> 113 <212> PRT <213> Humano atctccaagg cgcctaattt cagcggcagt gggtcaggca tgttggggtt tattactgca gaccaaggtg gaaatcaaac ataaggtttc taactgggac ctgatttcac actgaaaatc tgcaaggtac acactggcct 180 240 300 340 <400> 76 ASp vai Vai Met Thr Gin ser Pro Leu Ser Leu Pro Vai Thr Leu Giy 1 5 10 15 Gin Pro Ala ser ile Ser cys Arg ser Ser Gin Ser Leu vai Tyr ser 20 25 30 ASp Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gin Gin Arg Pro Gly Gin Ser 35 40 45 Pro Arg 50 Arg Leu 11 e Tyr 8* vai ser Asn Trp Asp 60 Ser Gly Val Pro ASp Arg Phe ser Gly Ser Gly ser Gly Thr AfP Phe Thr Leu Lys Xle 65 70 75 80 ser Arg vai Glu Ala 85 Glu Asp vai Gly vai 90 Tyr Tyr Cys Met Gin 95 Gly Thr His Trp pro ΡΓΟ Trp Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys val Glu lie 100 105 110 Lys <210> 77 <211> 358 <212> ADN <213> Humano <400> 77 234 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt ccagggaagg ggctggagtg ggttggccgt gactacgctg cacccgtgaa aggcagattc ctgtatctgc aaatgaacag cctgaaaacc ggggatggaa cgcactttga ctactggggc <211> 119 <212> PRT <213> Humano ttggtaaagc aacgcctgga attaaaagca accatctcaa gaggacacag cagggaaccc ctggggggtc tgagctgggt aaactgatgg gagatgattc ccgtgtatta tggtcaccgt ccttagactc ccgccaggct tgggacaaca aaaaaacacg ctgtaccaca ctcctcag 60 120 180 240 300 358 <400> 78 Glu val Gin Leu vai Glu ser Gly 1 5 ser Leu Arg Leu ser Cys Ala Ala 20 Trp Met Ser Trp Val Arg Gin Ala 3S 40 Gly Arg lie Lys Ser Lys Thr Asp

Pro val Lys Gly Arg Phe Thr lie 65 70

Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu 85 Tyr cys Thr Thr Gly Asp Gly Thr 100 Thr Leu val Thr val Ser ser 115 <2 Λ O \—1 79 <2 11> 322 <2 12> ADN <2 13> Humano <4 A o o 79

Gly Gly 10 Leu Val Lys pro Gly 15 Gly Ser Gly phe Thr Phe ser Asn Ala 25 30 pro Gly Lys Gly Leu 45 Glu Trp val Gly Gly Thr Thr 60 ASp Tyr Ala Ala ser Arg ASp 75 Asp Ser Lys Asn Thr 80 Lys Thr Glu ASp Thr Ala val Tyr 90 95 HÍS 105 phe ASp Tyr Trp Gly 110 Gin Gly 235 gaaacgacac tcacgcagtc tccagcattc atgtcagcga ctccaggaga caaagtcaac 60 atctcctgca aagccagcca agacattgat gatgatatga actggtacca acagaaacca 120 ggagaagctg ctattttcat tattcaagaa gctactactc tcgttcctgg aatcccacct 180 cgattcagtg gcagcgggta tggaacagat tttaccctca caattaataa catagaatct 240 gaggatgctg catattactt ctgtctacaa catgataatt tcccgctcac tttcggcgga 300 gggaccaagg tggagatcaa ac 322 <210> 80 <211> 107 <212> PRT <213> Humano <400> 80

Glu Thr Thr Leu Thr Gin ser pro Ala Phe Met ser Ala Thr pro Gly 15 10 15

Asp tys Vai Asn ile ser cys Lys Ala ser Gin ASp ile Asp Asp Asp 20 25 30 Met Asn Trp 35 Tyr Gin Gin Lys Pro 40 Gly Glu Ala Ala 11 e 45 Phe Ile Ile Gin Glu Ala Thr Thr Leu vai Pro Gly He pro Pro Arg phe Ser Gly 50 55 60 ser 65 Gly tyr Gly Thr Asp 70 Phe Thr Leu Thr ile 7S Asn Asn Ile Glu ser 80 Glu ASp Ala Ala Tyr 85 Tyr Phe cys Leu Gin 90 HÍS Asp Asn Phe Pro 95 Leu Thr Phe Gly Gly 100 Gly Thr Lys vai Glu 105 ile Lys <2 10> 81 <211> 379 <2 12> ADN <2 13> Humano <400> 81 236 caggtgcagc tggtggagtc tcctgtgcag cctctggatt ccagggaagg ggctggagtg gcagactctg tgaagggccg ctgcaaatga acagcctgag tatagcagtg gctggtacga acggtcaccg tctcctcag tgggggaggc ttggtcaagc caccttcagt gactactaca ggtttcatac attagtagta attcaccatc tccagggaca agccgaggac acggccgtgt ggactactac tacggtatgg ctggagggtc cctgagactc tgagctggat ccgccaggct gtggtagtac cacatactac acgccaagaa gtcactgtat attactgtgc gagagagggg acgtctgggg ccaagggacc 60 120 180 240 3 00 360 379 <210> 82 <211> 126 <212> PRT <213> Humano 82 vai Gin Leu Vai 5 GlU ser Gly Leu Arg Leu 20 ser cys Ala Ala Met ser 35 Trp ile Arg Gin Ala 40 W lie ser ser Ser Gly 55 ser dy Arg phe Thr He 70 Ser Arg Gin Met Asn ser 85 Leu Arg Ala Arg Glu Gly 100 Tyr ser ser Gly ASp Vai 115 Trp Gly Gin Gly Thr 120 83 337 ADN Humano

Gly Giy Leu Vai Lys pro Gly Giy 10 15 ser Gly Phe Thr Phe ser Asp Tyr 25 30 Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp vai 45 Thr Thr Tyr Tyr 60 Ala Asp ser Val ASP Asn Ala 75 Lys Lys ser Leu JF GlU ASp 90 Thr Ala val Tyr ΪΓ Cys Trp 105 Tyr Glu Asp Tyr Tyr 110 Tyr Gly Thr vai Thr Vai ser Ser 125 <4 0 0> Gin 1

Ser

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<210> 84 <211> 112 <212> PRT <213> Humano <400> 84 ASP lie Vai Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Ser vai Thr pro Gly 1 5 10 15 Gin pro Ala Ser He ser cys Lys Phe ser Gin Ser Leu Leu His ser 20 25 30 Asp Gly ss Thr Tyr Leu Tyr Trp 40 Tyr Leu Gin Lys Pro 45 Gly Gin pro ΡΓΟ Gin Leu Leu lie Tyr Glu vai Ser Asn Arg Phe Ser Gly Vai pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly ser Gly ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys ile 65 70 75 80 Ser Arg Vai Glu Ala 85 Glu Asp Vai Gly Vai 90 Tyr Tyr cys Met Gin 95 ser ile Gin Leu pro Arg Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys vai Glu lie Lys 100 105 110 <210> 85 <211> 388 <212> ADN <213> Humano <400> 85 238 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtcaagc ctggagggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt gacttctaca tgagctggat ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggaatg gatttcatac attagtagta gtggtagtac catttactac 180 gcagactctg tgaagggccg attcaccatg tccagggaca acgccaagaa ctcactgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attattgtgc gagagaagga 300 tactatgatt cggggagtta ttataaggac tacgactact acggtatgga cgtctggggc 360 caagggacca cggtcaccgt ctcctcag 388 <210> 86 <211> 129 <212> PRT <213> Humano 86 <400>

Gin 1 ser

Tyr ser

Lys 65

Leu

Ala

Tyr

Vai Gin Leu vai 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Leu vai Lys o t. 0. Gly IS Gly Leu Arg Leu Ser cys Ala Ala Ser Gly phe Thr phe ser ASp Phe 20 25 30 Met ser Trp lie Arg Gin Ala pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 11 e 35 40 45 Tyr He ser Ser ser Gly ser Thr lie Tyr Tyr Ala ASp Ser vai SO 55 60 Gly Arg Phe Thr Met 70 ser Arg ASp Asn Ala 75 Lys Asn Ser Leu Tyr 80 Gin Met Asn Ser 85 Leu Arg Ala Glu Asp 90 Thr Ala vai Tyr W cys Arg Glu Gly 100 Tyr Tyr ASp ser Gly 105 ser Tyr Tyr Lys ASp 110 Tyr ASp Tyr Gly 115 Met ASp vai Trp Gly 120 Gin Gly Thr Thr vai 125 Thr vai ser

Ser <210> 87 <211> 337 <212> ADN <213> Humano 239 <4Ο0> 87 r gatattgtga tgacccagac tccactctct ctgtccgtca cccctggaca gccggcctcc 60 atctcctgca agtctagtca gagcctcctg catagtgatg gaaagaccta tttgtattgg 120 tacctgcaga agccaggcca gcctccacag ctcctgatct atgaagtttc caaccggttc 180 tctggagtgc cagataggtt cagtggcagc gggtcaggga cagatttcac actgaaaatc 240 agccgggtgg aggctgagga tgttggggtt tattactgca tgcaaagtat acagcttcct 300 cggacgttcg gccaagggac caaggtggaa atcaaac 337 <210> 88 <211> 112 <212> PRT <213> Humano <400> 88 ASP ile Vai Met Thr Gin Thr Pro Leu ser Leu ser vai Thr pro Gly 1 5 10 15 Gin pro Ala ser Ile ser Cys Lys ser Ser Gin Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asp Gly 8* Thr Tyr Leu Tyr Trp 40 Tyr Leu Gin Lys Pro 45 Gly Gin Pro Pro Gin Leu Leu ile Tyr Glu Vai ser Asn Arg Phe ser Gly vai Pro 50 55 60 Asp 65 Arg phe ser Gly ser 70 Gly Ser Gly Thr Asp 75 Phe Thr Leu Lys Ile 80 ser Arg vai Glu Ala 85 GlU Asp vai Gly vai 90 Tyr Tyr cys Met Gin 95 ser lie Gin Leu Pro Arg Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 89 <211> 379 <212> ADN <213> Humano <400> 89 240 caggtgcggc tggtggagtc tcctgtgcag cctctggatt ccagggaagg ggctggagtg gcagactctg tgaagggccg ctgcaaatga acagcctgag tatagcagct cgtcacatta acggtcaccg tctcctcag tgggggaggc ttggtcaagc caccttcagt gactactaca ggtttcatac attagtagta attcaccatc tccagggaca agccgaggac acggccgtgt ctacgactac tacggtatgg ctggagggtc cctgagactc tgagctggat ccgccaggct gtggtatttc catatactac acgccaagaa ctcactgtat attactgtge gagagaagga acgtctgggg ccaagggacc 60 120 180 240 300 360 379 <210> 90 <211> 126 <212> PRT <213> Humano <400> 90

Gin vai Arg Leu vai Glu ser Gly Gly Gly Leu Vai Lys Pro Gly Giy 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser ASp Tyr 20 25 30 Tyr Met ser Trp ile Arg Gin Ala pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp val 35 40 45 ser Tyr 50 ile Ser ser ser Gly 55 xle Ser ile Tyr Sr Ala ASP ser val Lys Gly Arg Phe Thr ile ser Arg Asp Asn Ala Lys A$n Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gin Met Asn Ser 85 Leu Arg Ala Glu ASp 90 Thr Ala val Tyr Cys Ala Arg Glu Gly 100 Tyr ser ser ser Ser 105 HÍS Tyr Tyr Asp Tyr 110 Tyr Gly Met ASp Vai Trp Gly Gin Gly Thr Thr Vai Thr Val Ser ser 115 120 125 <210> 91 <211> 337 <212> ADN <213> Humano <400> 91 241 241 gatattgtga tgacccagac atctcctgca agtctagtca tacctgcaga agceaggeca tctggagtgc cagataggtt agccgggtgg aggctgagga cggacgttcg gccaagggac tccactctct ctgtccgtca cccctggaca gccggcctcc 60 gagcctcctg catagtgatg gaaagaccta tttgtattgg 120 gcctccacag gtccttatct atgaagtttc caaccggttc 180 cagtggcagc gggtcaggga cagatttcac actgaaaatc 240 tgttggggtt tattactgca tgcaaagtac acagcttcct 300 caaggtggaa atcaaac 337 <210> 92 <211> 112 <212> PRT <213> Humano <400> 92

Asp 1 lie vai Met Thr 5 Gin Thr Pro Leu Ser 10 Leu Ser Vai Thr pro 15 Gly Gin prõ Àlã ser ile ser cys Lys Ser ser Gin Ser Leu Leu HÍS Ser 20 25 30 Asp Gly W Thr Tyr Leu Tyr Trp 40 Tyr Leu Gin Lys pro 45 Gly Gin pro Pro Gin 50 vai Leu ile Tyr Glu S5 Vai ser Asn Arg phe 60 ser Gly vai pro ASp 65 Arg Phe ser Gly Ser 70 Gly ser Gly Thr Asp 75 phe Thr Leu Lys l1e 80 ser Arg vai Glu Ala 85 Glu ASp vai dy vai 90 Tyr Tyr cys Met Gin 95 Ser Thr Gin Leu pro 100 Arg Thr Phe Gly Gin 105 Gly Thr Lys vai Glu 110 He Lys

<210> 93 <211> 503 <212> PRT <213> Macaco Cinomolgo <400> 93 242

Met Thr Leu Gly ser pro Arg Arg Gly Leu Leu Met Leu Leu Met Ala 15 10 15

Leu vai Thr Gin Gly Asp Pro vai Lys Pro ser Arg Gly Pro Leu vai 20 25 30

Thr cys Thr Cys Glu ser Pro His Cys Arg Gly Pro Thr cys Gin Gly 35 40 45

Ala Trp Cys Thr Vai vai Leu vai Arg Glu Glu Gly Arg His Pro Gin 50 55 60

Glu His Arg Gly cys Gly Asn Leu His Arg Glu Leu cys Arg Gly Arg 65 70 75 80

Pro Thr Glu phe vai Asn His Tyr cys Cys Asp ser His Leu cys Asn 85 90 95

Arg Asn vai ser Leu vai Leu Glu Ala Thr Gin Thr Pro ser Glu Gin 100 105 HO

Pro Gly Thr Asp Ser Gin Leu Ala Leu lie Leu Gly Pro vai Leu Ala 115 120 125

Leu Leu Ala Leu Vai Ala Leu Gly Vai vai Gly Leu Trp His vai Arg 130 135 1«0

243

Ser Leu He Leu Lys 165 Ala ser Glu Gin Gly 170 Asp Ser Met Leu Gly 175 Asp Leu Leu ASp ser 180 ASp Cys Thr Thr Gly 185 ser Gly Ser Gly Leu 190 pro Phe Leu vai Gin Arg Thr Vai Ala Arg Gin val Ala Leu val Glu cys val 195 200 205 Gly Lys 210 Gly Arg Tyr Gly Glu 215 val Trp Arg Gly Leu 220 Trp HÍS Gly Glu Ser Vai Ala Vai Lys 11 e Phe ser Ser Arg ASp Glu Gin ser Trp Phe 225 230 235 240 Arg Glu Thr Glu He Tyr Asn Thr val Leu Leu Arg His Asp Asn Ile 245 250 255 Leu Gly Phe lie Ala ser Asp Met Thr Ser Arg Asn ser ser Thr Gin 260 265 270 Leu Trp Leu ile Thr Hls Tyr HÍS Glu His Gly Ser Leu Tyr ASp Phe 275 280 285 Leu Gin Arg Gin Thr Leu Glu pro Hls Leu Ala Leu Arg Leu Ala val 290 295 300 ser 505 Ala Ala cys Gly Leu 310 Ala HÍS Leu HIS val 315 Glu ile phe Gly Thr 320 Gin Gly Lys pro Ala 325 xle Ala HlS Arg ASP 330 phe Lys Ser Arg Asn 335 val Leu Vai Lys ser 340 Asn Leu Gin Cys Cys 345 Ile Ala Asp Leu í\l Leu Ala Vai Met HÍS 355 ser Gin Gly Ser Asp 360 Tyr Leu ASP Ile 1¾ Asn Asn pro Arg Vai 370 Gly Thr Lys Arg Tyr 375 Met Ala pro Glu val 380 Leu Asp Glu Gin He 385 Arg Thr ASp Cys Phe 390 Glu Ser Tyr Lys Trp 395 Thr Asp Ile Trp Ala 400 Phe Gly Leu Vai Leu 405 Trp Glu Ile Ala Arg 410 Arg Thr ile Val Asn 415 Gly lie vai Glu ASp 420 Tyr Arg Pro Pro Phe 425 Tyr ASp Val Val pro 430 Asn ASp 244 ΡΓΟ Ser Phe Glu ASp Met VI >t _l Lys vai vai cys vai Asp Gin Gin Thr 435 440 445 ΡΓΟ Thr lie Pro Asn Arg Leu Ala Ala Asp Pro vai Leu ser Gly Leu 450 455 460 Ala 465 Gin Met Met Arg Glu 470 cys Trp Tyr Pro Asn 475 Pro ser Ala Arg Leu 480 Thr Ala Leu Arg Ile 485 Lys «-ys Thr Leu Gin 490 Lys Ile ser Asn ser 495 Pro Glu Lys pro $ vai ne Gin

<210> 94 <211> 1512 <212> ADN <213> Macaco Cinomolg0 <400> 94 245 atgaccttgg gctccccgag gagaggcctt ctgatgctgc tgatggcctt ggtgacccag 60 ggtgaccccg tgaagccctc tcggggcccg ctggtgacct gcacatgtga gagcccacat 120 tgcagggggc ctacctgcca gggggcctgg tgcacagtag tgctggtgcg ggaggagggg 180 aggcaccccc aggaacatcg gggctgcggg aacttgcaca gggagctctg cagggggcgc 240 cccaccgagt tcgtcaacca ctactgctgt gacagccacc tctgcaaccg caacgtgtcc 800 ctggtgctgg aggccaccca aactccttcg gagcagccgg gaacagacag ccagctggcc 360 ctgatcctgg gccccgtgct ggccttgctg gccctggtgg ccctgggtgt cgtgggcctg 420 tggcatgtcc gacggaggca ggagaagcag cggggcctgc acagcgagct gggagagtcc 480 agtctcatcc tgaaagcatc tgagcagggc gacagcatgt tgggggacct cctggacagt 540 gactgcacca cagggagtgg ctcggggctc cccttcctgg tgcagaggac agtggcacgg 600 caggttgcct tggtggagtg tgtgggaaaa ggccgctatg gcgaagtgtg gcggggcttg 660 tggcacggtg agagtgtggc cgtcaagatc ttctcctcga gggacgaaca gtcctggttc 720 cgggagactg agatctacaa cacagtgttg ctcagacacg acaacatcct aggcttcatc 780 gcctcagaca tgacctcccg caactcgagc acgcagctgt ggctcatcac gcattaccac 840 gagcacggct ccctctacga ctttctgcag agacagacgc tggagccgca tttggctctg 900 aggctagctg tgtccgcagc ctgtggcctg gcacacctgc acgtggagat cttcggtaca 960 cagggcaaac cggccattgc ccaccgtgac ttcaagagcc gcaacgtgct ggtcaagagc 1020 aacctgcagt gttgcattgc tgacctgggc ctggctgtga tgcactcaca gggcagcgat 1080 tacctggaca tcggcaacaa cccgagagta ggcaccaaga ggtacatggc acccgaggtg 1140 ctggatgagc agatccgcac ggactgcttt gagtcctata agtggactga catctgggcc 1200 tttggcctgg tgctgtggga gatcgcccgc cggaccatcg tgaacggcat cgtggaggac 1260 tatagaccac ccttctatga tgtggtgccc aatgacccca gctttgagga catgaagaag 1320 gtggtgtgtg tggatcagca gacccccacc atccctaacc ggctggctgc agacccggtc 1380 ctctcaggcc tagctcagat gatgcgggag tgctggtacc caaacccetc tgcccgactc 1440 actgcgctgc ggatcaagaa gacactacag aaaattagca acagtccaga gaagcccaaa 1500 gtgattcagt ag 1512 <210> 95 <211> 1332 <212> ADN <213> Humano <400> 95 246 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc €0 acctgcactg tctctggtgg ctccatgagc agtggtgaat actactggaa ctggatccgc 120 cagcacccag ggaagggcct ggagtggatt gggtacatct attacagtgg gagtacctac 180 tacaacccgt ccctcaagag tcgagttacc atatcagtag acacgtctaa gaaccagttc 240 tccctgaagc tgagctctgt gactgccgcg gacacggccg tgtattactg tgcgagagag 300 tcagtggctg ggtttgacta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctcagcctec 360 accaagggcc catcggtctt ccccctggcg ccctgctcca ggagcacctc cgagagcaca 420 gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 480 tcaggcgctc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccagctg tcctacagtc ctcaggactc 540 tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcaact tcggcaccca gacctacacc 600 tgcaacgtag atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agacagttga gcgcaaatgt 660 tgtgtcgagt gcccaccgtg cccagcacca cctgtggcag gaccgtcagt cttcctcttc 720 cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac gtgcgtggtg 780 gtggacgtga gccacgaaga ccccgaggtc cagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag 840 gtgcataatg ccaagacaaa gccacgggag gagcagttca acagcacgtt ccgtgtggtc 900 agcgtcctca ccgttgtgca ccaggactgg ctgaacggca aggagtacaa gtgcaaggtc 960 tccaacaaag gcctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaaaccaa agggcagccc 1020 cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggagg agatgaccaa gaaccaggtc 1080 agcctgacct gcctggtcaa aggcttctac cccagcgaca tcgcegtgga gtgggagagc 1140 aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acacctccca tgctggactc cgacggctcc 1200 ttcttcctct acagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc 1260 tcatgctccg tgatgcatga ggctetgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg 1320 tctccgggta aa 1332 <210> 96 <211> 33 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> O iniciador directo usado para clonar ECD de ALK-1 <400> 96 aoggcccagc cggccgaccc tgtgaagccg tct 33 <210> 97 247 <211> 47

<212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Ο iniciador indirecto usado para clonar ECD de ALK-1 <400> 97 actaagcttt taatgatgat gatgatgatg ctggccatct gttcccg 47 <210> 98 <211> 103 <212> PRT <213> Humano

Asp Pro vai Lys Pro ser Arg Gly pr° va^ cys

Ser Pro His cys Lys <3ly Pro Thr çys Arg Gly Ala Trp Qjs Thr vai 20 25

Vai Leu Vai Arg Glu Glu Gly Arg His Pro Gin Glu His Arg Gly cys 35 40 45

Gly asm Leu His Arg Glu Leu Cys Arg Gly Arg Pro Thr Glu phe vai 50 55 60

Asn His Tyr cys cys Asp ser His Leu cys Asn His Asn vai ser Leu 65 70 val Leu Glu Ala Thr Gin Pro Pro ser 85

Glu Gin pro Gly Thr Asp Gly 90 95

Gin His His His His HÍS HÍ5 100 <210> 99 <211> 387 <212> ADN <213> Humano 248 <4Ο0> 99 atggagacag acacactcct getatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt €0 gacgcggccc agccggccga ccctgtgaag ccgtctcggg gcccgctggt gacctgcacg 120

tgtgagagec cacattgcaa ggggcctacc tgctgggggg cctggtgcac agtagtgctg ISO gtgççggagg aggggaggca cccccaggaa catcggggct gcgggaactt gcacagggag 240 ctctgcaggg ggcgccccac cgagttcgtc aaccactact gçtgcgaeag ccacetçtgc 300 aaccacaacg tgtccctggt gctggaggcc acccaacctc cttcggagea gccgggaaca 360 gatggccagc atcatcatca teatcat 387 <210> 100 <211> 444 <212> PRT <213> Humano <4 0 0> 100 249

Gin vai Gin Leu Gin GlU ser Gly Pro Gly Leu val Lys Pro Ser Gin 1 5 10 15 Thr Leu ser Leu Thr cys Thr Vai Ser Gly Gly Ser Met ser Ser Gly 20 25 30 Glu Tyr 5T Trp Asn Trp He Arg 40 Gin HÍS pro Gly Lys 45 Gly Leu Glu Trp ile 50 Gly Tyr He Tyr Tyr 55 Ser Gly Ser Thr Sr Tyr Asn Pro ser Leu Lys ser Arg vai Thr lie Ser vai Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe 65 70 75 80 ser Leu Lys Leu ser 85 ser vai Thr Ala Ala 90 Asp Thr Ala val ΙΓ Tyr cys Ala Arg Glu Ser vai Ala Gly Phe ASp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110 Leu vai Thr vai ser ser Ala ser Thr Lys Gly pro Ser val Phe pro 115 120 125 Leu Ala pro cys ser Arg Ser Thr ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu vai Lys Asp Tyr Phe Pro GlU pro val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr ser Gly vai HÍS Thr phe Pro Ala Val Leu Gin 165 170 175 ser ser Gly Leu Tyr ser Leu ser Ser val val Thr val Pro Ser ser 180 185 190 Asn phe Gly Thr Gin Thr Tyr Thr cys Asn Val Asp m1s Lys Pro Ser 195 200 205

Asn Thr Lys vai Asp Lys Thr vai Glu Arg Lys cys cys vai Glu Cys 210 21S 220 250

Pro Pro Cys pro Ala Pro pro vai Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 225 230 235 240 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile ser Arg Thr Pro Glu Val 245 250 255 Thr cys Vai vai Vai ASp vai Ser HÍS Glu Asp pro Glu Val Gin Phe 260 265 270 ASn Trp 3Ϊ Vai ASp Gly vai Glu 280 val His Asn Ala Lys 285 Thr Lys pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn ser Thr phe Arg val val Ser val Leu Thr 290 295 300 vai Vai His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys cys Lys val 305 310 315 320 Ser Asn Lys Gly Leu 325 pro Ala Pro lie Glu 330 Lys Thr Ile ser ΪΪ1 Thr Lys Gly Gin pro Arg Glu pro Gin val Tyr Thr Leu pro Pro ser Arg 340 345 350 Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin vai Ser Leu Thr cys Leu val Lys Gly 355 360 365 Phe Tyr 370 Pro Ser ASP lie Ala 375 Vai Glu Trp Glu Ser 380 Asn Gly Gin pro Glu 385 A$n Asn Tyr Lys Thr 390 Thr pro Pro Met Leu 395 Asp ser Asp Gly ser 400 Phe Phe Leu Tyr ser Lys Leu Thr val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin 405 410 415 Gly Asn vai phe Ser cys ser vai Met His Glu Ala Leu His Asn His 420 425 430 Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 <210> 101 <211> 645 <212> ADN <213> Humano <4 0 0> 101 251 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagacacc 60 ctctcctgta gggccagtca gagtgtcagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120 cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtacatcca gcagggccac tggcatccca 180 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcaccc tcaccatcag cagactggag 240 cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcgccgat caccttcggc 300 caagggacac gactggagat taaacgaact gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 360 ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 420 tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 480 caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 540 acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 600 ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgt 645 <210> 102 <211> 215

<212> PRT <213> Humano <4 0 0> 102 252 •51U He Vai Leu Thr Gin Ser pro Gly Thr Leu ser Leu Ser pro Gly 1 5 10 15 <ãiu Arg Asp Thr Leu ser Cys Arg Ala Ser Gin ser vai ser Ser ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp 35 Tyr Gin Gin Lys 40 Pro Gly Gin Ala pro 45 Arg Leu Leu xle ar Gly Thr Ser ser Arg 55 Ala Thr Gly ile pro 60 ASp Arg Phe ser Gly ser Gly ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 pro Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr cys Gin Gin Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95 Ile Thr Phe Gly 100 Gin Gly Thr Arg Leu 105 Glu Ile Lys Arg Thr 110 vai Ala Ala Pro Ser Vai Phe ile Phe Pro pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser 115 120 125 Gly Thr 130 Ala ser Vai vai Si Leu Leu Asn Asn Phe 140 Tyr Pro Arg Glu Ala 145 Lys vai Gin Trp Lys 150 Vai ASp Asn Ala Leu 155 Gin ser Gly Asn ser 160 Gin Glu Ser vai Thr Glu Gin ASP ser Lys Asp ser Thr Tyr Ser Leu 165 170 175 Ser ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala ASp Tyr Glu Lys His Lys vai 180 185 190 Tyr Ala Cys Glu vai Thr His Gin Gly Leu ser ser pro Vai Thr Lys 195 200 205 ser Phe Asn Arg Gly Glu cys 210 215 <210> 103 <211> 355 <212> ADN <213> Humano < 4 0 0 > 103 253 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc €0 acctgcactg tctctggtgg ctccatgagc agtggtgaat actactggaa ctggatccgc 120 cagcacccag ggaagggcct ggagtggatt gggtacatct attacagtgg gagtacctac 180 tacaacccgt ccctcaagag tcgagttacc atatcagtag acacgtctaa gaaccagttc 240 tccctgaagc tgagctctgt gactgccgcg gacacggccg tgtattactg tgcgagagag 300 tcagtggctg ggtttgacta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctcag 355 <210> 104 <211> 118 <212> PRT <213> Humano <4 0 0> 104

Gin val Gin Leu Gin Glu ser Gly Pro Gly Leu vai Lys ργο ser Gin 15 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr cys Thr val ser Gly Gly Ser Met Ser ser Gly 20 25 30

Glu Tyr Tyr Trp Asn Trp ile Arg Gin His Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45

Trp ile Gly Tyr lie Tyr Tyr ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro ser 50 55 60

Leu Lys Ser Arg Val Thr lie Ser val Asp Thr ser Lys Asn Gin Phe 65 70 75 80

Ser Leu Lys Leu ser ser val Thr Ala Ala Asp Thr Ala val Tyr Tyr 85 90 95 cys Ala Arg Glu ser Val Ala Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110

Leu val Thr val ser Ser 115 <210> 105 <211> 58 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Iniciador de Amplificação Usado para clonar 1.12.1 de 254

Comprimento Completo < 4 0 0> 105 tcttcaagct tgatatctct agaagccgcc accatgaaac acctgtggtt cttcctcc 58 <210> 106 <211> 46 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Iniciador de Amplificação Usado para clonar 1.12.1 de Comprimento Completo <4 0 0> 106 ttctctgatc agaattccta ctatttaccc ggagacaggg agaggc 46 <210> 107 <211> 48 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Iniciador de Amplificação usado para clonar 1.12.1 de Comprimento Completo <400> 107 tcttcaagct tcccgggagc cgccaccatg gaaaccccag cgcagctt 48 <210> 108 <211> 49 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Iniciador de Amplificação Usado para clonar 1.12.1 de 255

Comprimento Completo <4 0 0> 108 ttctttgatc agaattctca ctaacactct cccctgttga agctctttg 49 <210> 109 <211> 32 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido mutagénico <4 0 0> 109 ctccagggga aagagccacc ctctcctgta gg 32 <210> 110 <211> 32 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido mutagénico <4 0 0> 110 cctacaggag agggtggctc tttcccctgg ag 32 <210> 111 <211> 30 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido mutagénico 256 <4 Ο 0> 111 ggtggctcca tcagcagtgg tgaatactac 30 <210> 112 <211> 30 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido mutagénico <4 0 0> 112 gtagtattca ccactgctga tggagccacc 30 <210> 113 <211> 9 <212> PRT <213> Humano

Gly

Glu lie vai Leu Thr Gin Ser Pro 1 5 <4 0 0> 113 <210> 114 <211> 8 <212> PRT <213> Humano <4 0 0> 114

Gin Vai Gin Leu Gin Glu ser Gly 1 5 <210> 115 <211> 21 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Iniciador directo 257 <4 Ο 0> 115 agcgggccca gagggaccat g 21 <210> 116 <211> 28 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Iniciador indirecto <4 0 0> 116 cagaaaggaa tcaggtgctc ctgggcta 28 <210> 117 <211> 28 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Iniciador directo <4 0 0> 117 gattatggcc ttgggctccc ccaggaaa 28 <210> 118 <211> 37 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Iniciador indirecto <4 0 0> 118 gggctattga atcactttag gcttctctgg actgttg 37 258 <210> 119 <211> 27 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Sonda TaqMan (IDl-Sonda) <4 0 0> 119 ccagcacgtc atcgactaca tcaggga 27 <210> 120 <211> 22 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Iniciador de PCR Taqman (ID1 <4 0 0> 120 aaggtgagca aggtggagat tc 22 <210> 121 <211> 21 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Iniciador de PCR Taqman (ID1-R) <4 0 0> 121 ttccgagttc agctccaact g 21 <210> 122 <211> 25

259 <212> PRT <213> Humano <4 0 0> 122 Gin val Gin 1 Thr Leu ser <210> 123 <211> 12 <212> PRT <213> Humano <4 0 0> 123 Gly 1 <210> 124 <211> 25 <212> PRT <213> Humano <4 0 0> 124 Gin Val Gin 1 Thr Leu Ser <210> 125 <211> 12 <212> PRT <213> Humano <4 0 0> 125 Gly 1 <210> 126 <211> 325 <212> ADN

Leu Gin Glu ser Gly Pro Gly Leu vai Lys pro ser Gin 5 10 15.

Leu Thr cys Thr vai ser 20 25

Gly ser ile |er ser Gly Gly Tyr T^r Trp ser

Leu Gin Glu Ser Gly pro Gly Leu vai Lys pro ser Glu 5 10 15

Leu Thr cys Thr vai ser 20 25

Gly ser vai |er Ser Gly Gly Tyr Tgr Trp Ser 260 <213> Humano <4 0 0> 126 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagacacc 60 ctctcctgta gggccagtca gagtgtcagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120 cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtacatcca gcagggccac tggcatccca 180 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcaccc tcaccatcag cagactggag 240 cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcgccgat caccttcggc 300 caagggacac gactggagat taaac 325 <210> 127 <211> 108 <212> PRT <213> Humano <400> 127

Glu lie val Leu Thr Gin Ser pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Asp Thr Leu Ser cys Arg Ala Ser Gin ser val Ser ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala 35 Trp Tyr Gin Gin Lys 40 Pro Gly Gin Ala pro 45 Arg Leu Leu lie Tyr Gly Thr ser Ser Arg Ala Thr Gly lie Pro ASp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly ser Gly Thr ASp phe Thr Leu Thr lie ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu ASp phe Ala 85 val Tyr Tyr cys Gin 90 Gin Tyr Gly Ser ser 95 Pro n e Thr phe Gly Gin Gly Thr Arg Leu Glu lie Lys 100 105 <2 10> 128 <2 11> 1332 <2 12> ADN <2 13> Humano 261 <4 Ο 0> 128 caggtgcagc tgcaggagtc gggtccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc 60 acctgcactg tctctggtgg ctccatgagc agtggtgaat actactggaa ctggatccgc 120

cagcacccag ggaagggcct ggagtggatt gggtacatct attacagtgg gagtacctac ISO tacaacccgt ccctcaagag tcgagttacc atatcagtag acacgtctaa gaaccagttc 240 tccctgaagc tgagctctgt gactgccgcg gacacggccg tgtattactg tgcgagagag 300 tcagtggctg ggtttgacta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctcagcctcc 360 accaagggcc catcggtctt ccccctggcg ccctgctcca ggagcacctc cgagagcaca 420 geggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 480 tcaggcgctc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccagctg tcctacagtc ctcaggactc 540 tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcaact tcggcaccca gacctacacc 600 tgcaacgtag atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agacagttga gcgcaaatgt 660 tgtgtcgagt gcccaccgtg cccagcacca cctgtggcag gaccgtcagt cttcctcttc 720 cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac gtgcgtggtg 780 gtggacgtga gccacgaaga ccccgaggtc cagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag 840 gtgcataatg ccaagacaaa gccacgggag gagcagttca acagcacgtt ccgtgtggtc 900 agcgtcctca ccgttgtgca ccaggactgg ctgaacggca aggagtacaa gtgcaaggtc 960 tccaacaaag gcctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaaaccaa agggcagccc 1020 cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggagg agatgaccaa gaaccaggtc 1080 agcctgacct gcctggtcaa aggcttctac cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 1140 aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acacctccca tgctggactc cgacggctcc 1200 ttcttcctct acagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc 1260 tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg 1320 tctccgggta aa 1332 <210> 129 <211> 355 <212> ADN <213> Humano <400> 129 262 caggtgcagc tgcaggagtc gggtccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc 60 acctgcactg tctctggtgg ctccatgagc agtggtgaat actactggaa ctggatccgc 120 cagcacccag ggaagggcct ggagtggatt gggtacatct attacagtgg gagtacctac 180 tacaacccgt ccctcaagag tcgagttacc atatcagtag acacgtctaa gaaccagttc 240 tccctgaagc tgagctctgt gactgccgcg gacacggccg tgtattactg tgcgagagag 300 tcagtggctg ggtttgacta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctcag 355 <210> 130 <211> 503 <212> PRT <213> Humano <400> 130

Met Thr Leu Gly Ser ΡΓΟ Arg Lys Gly Leu Leu Met Leu Leu Met Ala 1 S 10 15 Leu Vai Thr Gin 20 Gly Asp pro Vai íf pro ser Arg Gly pro 30 Leu val Thr cys Thr cys Glu ser pro His cys Lys Gly Pro Thr cys Arg Gly 35 40 45 Ala Trp cys Thr vai vai Leu val Arg Glu Glu Gly Arg HiS pro Gin 50 55 60 Glu His Arg Gly Cys Gly Asn Leu His Arg Glu Leu Cys Arg Gly Arg 65 70 75 80 pro Thr Glu phe vai 85 Asn HÍS Tyr cys %s ASp ser His Leu 8* Asn HIS Asn vai ser Leu vai Leu Glu Ala Thr Gin pro pro ser Glu Gin 100 105 110 263 ΡΓΟ Gly Thr Asp Gly GTo Leu Ala Leu He Leu Gly pro val Leu Ala 115 120 125 Leu Leu Ala Leu val Ala Leu Gly Val Leu Gly Leu Trp His val Arg 130 135 140 Arg Arg Gin GlU Lys Gin Arg Gly Leu His ser Glu Leu Gly Glu ser 145 150 155 160 ser Leu Ile Leu Lys Ala ser Glu Gin Gly Asp Thr Met Leu 5½ ASp 165 170 175 Leu Leu ASp ser 180 Asp Cys Thr Thr ser Gly Ser Gly Leu 190 pro Phe Leu Val Gin Arg Thr val Ala Arg Gin val Ala Leu val Glu Cys Val 195 200 205 Gly Lys Gly Arg Tyr Gly Glu Val Trp Arg Gly Leu Trp His Gly Glu 210 215 220 ser val Ala val Lys ile Phe ser ser Arg Asp Glu Gin ser Trp phe 225 230 235 240 Arg Glu Thr Glu ile Tyr Asn Thr val Leu Leu Arg HlS Asp Asn ile 245 250 255 Leu Gly phe ile Ala ser ASp Met Thr ser Arg Asn ser ser Thr Gin 260 265 270 Leu Trp Leu Ile Thr HlS Tyr His Glu His Gly ser Leu Tyr Asp phe 275 280 285 Leu Gin Arg Gin Thr Leu Glu Pro HlS Leu Ala Leu Arg Leu Ala val 290 295 300 Ser Ala Ala Cys Gly Leu Ala His Leu His Val Glu ile Phe Gly Thr 305 310 315 320 Gin Gly Lys Pro Ala 325 Ile Ala HlS Arg Asp 330 Phe Lys Ser Arg Asn 335 Val Leu val Lys Ser 340 Asn Leu Gin cys cys 345 Ile Ala ASp Leu 35¾ Leu Ala vai Met His 3SS ser Gin Gly ser Asp 360 Tyr Leu ASp Ile Gly 365 Asn Asn pro Arg Val 370 Giy Thr Lys Arg 95 Met Ala Pro Glu val 380 Leu Asp Glu Gin ile Arg Thr Asp cys Phe Glu ser Tyr Lys Trp Thr Asp ile Trp Ala 264 385 39Ó 395 400 phe Gly Leu vai Leu Trp Glu ile Ala Arg Aro Thr lie vai Asn Gly 405 410 415 lie vai Glu Asp Tyr Arg pro Pro Phe Tyr Asp vai vai Pro Asn Asp 420 425 430 pro Ser Phe Glu Asp Met Lys Lys vai vai cys vai Asp Gin Gin Thr 435 440 445

Pro Thr ile Pro Asn Arg Leu Ala Ala Asp Pro vai Leu ser Gly Leu 450 455 460

Ala Gin Met Met Arg Glu cys Trp Tyr Pro Asn pro Ser Ala Arg Leu 465 470 475 480

Thr Ala Leu Arg lie Lys Lys Thr Leu Gin Lys lie Ser Asn ser Pro 485 490 495

Glu Lys Pro Lys vai rle Gin 500 <210> 131 <211> 120 <212> PRT <213> Humano <4 0 0> 131 265

Gin vai Gin Leu Gin Glu ser Gly Pro Gly Leu Val Lys pro Ser Glo 1 5 10 15 Thr Leu ser Leu Thr cys Thr Vai Ser Gly Gly ser ile Ser Ser Giy 20 25 30 Gly Tyr Sr Trp Ser Trp ile Arg 40 Gin HÍS pro Gly ΪΫ Gly Leu Glu Trp ile 50 Gly Tyr Ile Tyr ΪΓ Ser Gly Ser Thr ar Tyr Asn Pro Ser Leu Lys ser Arg vai Thr ile ser vai Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe 65 70 75 80 Ser Leu Lys Leu Ser 85 ser Vai Thr Ala Ala 90 Asp Thr Ala val ar Tyr Cys Ala Arg Gly 100 Ile Ala Vai Ala Gly 105 Tyr Phe ASp Tyr Trp 110 Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr vai Ser Ser 115 120 <210> 132 <211> 108 <212> PRT <213> Humano <4 0 0> 132 2 66 βία ile vai Leu Thr Gin ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu ser Pro Gly ~ j 10 15 ísIu Arg Ala Thr Leu ser Cys Arg Ala Ser Gin ser vai ser Ser Ser w 20 25 30 rvr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys pro Gly Gin Ala pro Arg Leu Leu 17 35 40 45

Xle Tyr Gly Ala ser ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 filv Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 90 85 pro Glu Asp Phe Ala vai Tyr Tyr cys Gin Gin Tyr Gly ser Ser Pro ile Thr Phe Gly Gin Gly Thr Arg Leu Glu ile Lys 100 105 <210> 133 <211> 96 <212> PRT <213> Humano <400> 133 Glu ile 1 10 20 25 35 40 60 Leu ser Pro Gly 15 vai ser ser Ser 30 pro Arg Leu Leu 45 Asp Arg Phe Ser ser Arg Leu Glu 80 Gly ser Ser pro 95 ile T^r Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly ile Pro Asp Arg Phe Ser 55

Gly ser Gly ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr ile ser Arg Leu Glu 65 7 70 75 ftn 85 90

<210> 134 <211> 99 <212> PRT 267 <213> Humano <400> 134

Gin Vai Gin Leu Gin Glu Ser Gly pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gin 1 5 10 15 Thr Leu ser Leu Thr Cys Thr val Ser Gly Gly Ser 11 e Ser Ser Gly 20 25 30 Gly Tyr ar Trp ser Trp ile Arg 40 Gin His pro Gly Lys 45 Gly Leu Glu Trp lie 50 Gly Tyr ile Tyr Tyr 55 Ser Gly ser Thr ar Tyr Asn pro Ser Leu Lys ser Arg vai Thr ile Ser Val ASp Thr Ser Lys Asn Gin Phe 65 70 75 80 ser Leu Lys Leu ser 85 Ser val Thr Ala Ala 90 ASp Thr Ala val W Tyr cys Ala Arg <2 10> 135 <2 11> 108 <2 12> PRT <2 13> Humano <4 0 0> 135 268

Glu 1 He vai Leu Thr 5 Gin ser pro Gly Thr 10 Leu Ser Leu ser Pro 15 Gly Glu Arg Ala Thr 20 Leu Ser Cys Arg Ala 25 Ser Gin Ser vai Ser 30 Ser Ser Tyr Leu Ala 35 Trp Tyr Gin Gin Lys 40 Pro Gly Gin Ala Pro 45 Arg Leu Leu lie ÍT Gly Ala ser Ser Arg 55 Ala Thr Gly lie pro 60 Asp Arg Phe ser Gly 65 ser Gly ser Gly Thr 70 ASp phe Thr Leu Thr 75 ile Ser Arg Leu Glu 80 Pro Glu A5p Phe Ala 85 val Tyr Tyr Cys Gin 90 His Phe Gly ser ser 95 pro Xle Thr Phe Gly Gin Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 136 <211> 5 <212> PRT <213> Humano <4 0 0 > 136

Gly Tyr Tyr Trp ser 1 5 269

REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de referências citadas pelo requerente é apenas para a conveniência do leitor. A mesma não faz parte do documento de Patente Europeia. Embora tenha sido tomado muito cuidado na compilação das referências, não se poderão excluir erros e omissões e o IEP nao assume qualquer responsabilidade neste sentido.

Documentos de Patente citados na descrição us 6074935 A [0281] us 6150477 A [0281] wo 0140217 A [0282] wo 2004020431 A [0282] us 5608082 A [0283] us 20050148627 A [0284] us 20050148777 A [0284] us 5466823 A [0285] us 5633272 A [0286] us 5932598 A [0287] us 5521207 A [0288] us 6034256 A [0289] wo 200224719 A [0290] wo 199803484 A [0292] wo 199911605 A [0293] us 6180651 B [0294] wo 9802434 A [0304] wo 9935146 A [0304] wo 9935132 A [0304] wo 9713760 A [0304] wo 9519970 A [0304] us 5587458 A [0304] us 5877305 A [0304] us 6465449 B [0304] us 8284764 B [0304] wo 200198277 A [0304] 270 • ΕΡ 239362 A [0317] • US 6682736 B [0329] • US 601113647 B [0329] • WO 2002053596 A [0330] • WO 2003040170 A [0331] • US 5679666 A [0338] • US 5770592 A [0338] • US 60715292 B [0428]

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Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um anticorpo monoclonal anti-ALK-1 de neutralização, ou uma porção de ligação a antigénio do mesmo, em que o dito anticorpo ou porção de ligação a antigénio do mesmo compreende as sequências de aminoácidos de CDR1, CDR2, e CDR3 dos domínios variáveis da cadeia leve e pesada, respectivamente, das SEQ ID NOs: 6 e 8 ; SEQ ID NOs: 14 e 16; SEQ ID NOs: 18 e 20; SEQ ID NOs: 26 e 28; SEQ ID NOs: 30 e 32; SEQ ID NOs: 38 e 40; SEQ ID NOs: 46 e 48; SEQ ID NOs : 50 e 52; SEQ ID NOs : 54 e QO LO SEQ ID NOs : 58 e 60; SEQ ID NOs : 62 e 64; SEQ ID NOs: 66 e 68; SEQ ID NOs: 70 e 72; ou SEQ ID NOs: 104 Θ 127 .

2. 0 anticorpo, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, em que os domínios VH e VL do anticorpo ou porção de ligação a antigénio do mesmo compreendem as seguintes sequências, respectivamente: SEQ ID NOs: 6 e 8; SEQ ID NOs: 14 e 16; SEQ ID NOs: 18 e 20; SEQ ID NOs: 26 e 28; SEQ ID NOs: 30 e 32; SEQ ID NOs: 38 e 40; SEQ ID NOs: 46 e 48; SEQ ID NOs: 50 e 52; 2 2 SEQ ID NOs SEQ ID NOs SEQ ID NOs SEQ ID NOs SEQ ID NOs SEQ ID NOs 54 e 56; 58 e 60; 62 e 64; 66 e 68; 70 e 72; 104 e 127; ou a sequência de aminoácidos de VH codificada pela sequência de nucleótidos do inserto encontrado no clone depositado sob número de acesso de ATCC PTA-6864 e a sequência de aminoácidos de VL codificada pela sequência de nucleótidos do inserto encontrado no clone depositado sob número de acesso de ATCC PTA-6865.

3. Um anticorpo monoclonal anti-ALK-1 que compreende uma sequência de aminoácidos de cadeia pesada da SEQ ID NO: 2 e uma sequência de aminoácidos de cadeia leve da SEQ ID NO: 4 .

4. Um anticorpo monoclonal anti-ALK-1 que compreende uma sequência de aminoácidos de cadeia pesada da SEQ ID NO: 100 e uma sequência de aminoácidos de cadeia leve da SEQ ID NO: 102 .

5. O anticorpo ou porção de ligação a antigénio de acordo com a reivindicação 2, que compreende um domínio variável da cadeia pesada da SEQ ID NO: 6 e um domínio variável da cadeia leve da SEQ ID NO: 8.

6. O anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 1 ou 2, o anticorpo monoclonal sendo uma molécula de IgGl ou IgG2.

7. O anticorpo ou porção de ligação a antigénio de acordo com a reivindicação 1, que compreende um domínio VH que é pelo menos 90 % idêntico em sequência de aminoácidos a 3 qualquer uma das SEQ ID NOs: 6; 14; 18; 26; 30; 38; 46; 50; 54; 58; 62; 66; 70 e 104.

8. O anticorpo ou porção de ligação a antigénio de acordo com a reivindicação 1, que compreende um dominio VL que é pelo menos 90 % idêntico em sequência de aminoácidos a qualquer uma das SEQ ID NOs: 8; 16; 20; 28; 32; 40; 48; 52; 56; 60; 64; 68; 72 e 127.

9. O anticorpo ou porção de ligação a antigénio de acordo com a reivindicação 1, em que o anticorpo compreende as sequências de aminoácidos de CDR1, CDR2, e CDR3 dos domínios variáveis da cadeia leve e pesada, respectivamente, das SEQ ID NOs: 6 e 8.

10. O anticorpo ou porção de ligação a antigénio de acordo com a reivindicação 1, seleccionado a partir do grupo consistindo em: a) um anticorpo ou porção do mesmo que compreende um domínio VH como foi apresentado na SEQ ID NO: 6, ou difere da SEQ ID NO: 6 em pelo menos uma substituição de aminoácidos conservadora, em que a dita sequência com a pelo menos uma substituição de aminoácidos conservadora é pelo menos 90 % idêntica em sequência de aminoácidos à sequência não substituída, e um domínio VL como foi apresentado na SEQ ID NO: 8, ou difere da SEQ ID NO: 8 em pelo menos uma substituição de aminoácidos conservadora, em que a dita sequência com a pelo menos uma substituição de aminoácidos conservadora é pelo menos 90 % idêntica em sequência de aminoácidos à sequência não substituída; b) um anticorpo ou porção do mesmo que compreende um domínio VH como foi apresentado na SEQ ID NO: 14, ou difere da SEQ ID NO: 14 em pelo menos uma substituição de aminoácidos conservadora, em que a dita sequência com a pelo menos uma substituição de aminoácidos conservadora é 4 pelo menos 90 % idêntica em sequência de aminoácidos à sequência não substituída, e um domínio VL como foi apresentado na SEQ ID NO: 16, ou difere da SEQ ID NO: 16 em pelo menos uma substituição de aminoácidos conservadora, em que a dita sequência com a pelo menos uma substituição de aminoácidos conservadora é pelo menos 90 % idêntica em sequência de aminoácidos à sequência não substituída; c) um anticorpo ou porção do mesmo que compreende um domínio VH como foi apresentado na SEQ ID NO: 18, ou difere da SEQ ID NO: 18 em pelo menos uma substituição de aminoácidos conservadora, em que a dita sequência com a pelo menos uma substituição de aminoácidos conservadora é pelo menos 90 % idêntica em sequência de aminoácidos à sequência não substituída, e um domínio VL como foi apresentado na SEQ ID NO: 20, ou difere da SEQ ID NO: 20 em pelo menos uma substituição de aminoácidos conservadora, em que a dita sequência com a pelo menos uma substituição de aminoácidos conservadora é pelo menos 90 % idêntica em sequência de aminoácidos à sequência não substituída; d) um anticorpo ou porção do mesmo que compreende um domínio VH como foi apresentado na SEQ ID NO: 26, ou difere da SEQ ID NO: 26 em pelo menos uma substituição de aminoácidos conservadora, em que a dita sequência com a pelo menos uma substituição de aminoácidos conservadora é pelo menos 90 % idêntica em sequência de aminoácidos à sequência não substituída, e um domínio VL como foi apresentado na SEQ ID NO: 28, ou difere da SEQ ID NO: 28 em pelo menos uma substituição de aminoácidos conservadora, em que a dita sequência com a pelo menos uma substituição de aminoácidos conservadora é pelo menos 90 % idêntica em sequência de aminoácidos à sequência não substituída; e) um anticorpo ou porção do mesmo que compreende um 5 domínio VH como foi apresentado na SEQ ID NO: 30, ou difere da SEQ ID NO: 30 em pelo menos uma substituição de aminoácidos conservadora, em que a dita sequência com a pelo menos uma substituição de aminoácidos conservadora é pelo menos 90 % idêntica em sequência de aminoácidos à sequência não substituída, e um domínio VL como foi apresentado na SEQ ID NO: 32, ou difere da SEQ ID NO: 32 em pelo menos uma substituição de aminoácidos conservadora, em que a dita sequência com a pelo menos uma substituição de aminoácidos conservadora é pelo menos 90 % idêntica em sequência de aminoácidos à sequência não substituída; f) um anticorpo ou porção do mesmo que compreende um domínio VH como foi apresentado na SEQ ID NO: 38, ou difere da SEQ ID NO: 38 em pelo menos uma substituição de aminoácidos conservadora, em que a dita sequência com a pelo menos uma substituição de aminoácidos conservadora é pelo menos 90 % idêntica em sequência de aminoácidos à sequência não substituída, e um domínio VL como foi apresentado na SEQ ID NO: 40, ou difere da SEQ ID NO: 40 em pelo menos uma substituição de aminoácidos conservadora, em que a dita sequência com a pelo menos uma substituição de aminoácidos conservadora é pelo menos 90 % idêntica em sequência de aminoácidos à sequência não substituída; g) um anticorpo ou porção do mesmo que compreende um domínio VH como foi apresentado na SEQ ID NO: 4 6, ou difere da SEQ ID NO: 46 em pelo menos uma substituição de aminoácidos conservadora, em que a dita sequência com a pelo menos uma substituição de aminoácidos conservadora é pelo menos 90 % idêntica em sequência de aminoácidos à sequência não substituída, e um domínio VL como foi apresentado na SEQ ID NO: 48, ou difere da SEQ ID NO: 48 em pelo menos uma substituição de aminoácidos conservadora, em que a dita sequência com a pelo menos 6 uma substituição de aminoácidos conservadora é pelo menos 90 % idêntica em sequência de aminoácidos à sequência não substituída; h) um anticorpo ou porção do mesmo que compreende um domínio VH como foi apresentado na SEQ ID NO: 50, ou difere da SEQ ID NO: 50 em pelo menos uma substituição de aminoácidos conservadora, em que a dita sequência com a pelo menos uma substituição de aminoácidos conservadora é pelo menos 90 % idêntica em sequência de aminoácidos à sequência não substituída, e um domínio VL como foi apresentado na SEQ ID NO: 52, ou difere da SEQ ID NO: 52 em pelo menos uma substituição de aminoácidos conservadora, em que a dita sequência com a pelo menos uma substituição de aminoácidos conservadora é pelo menos 90 % idêntica em sequência de aminoácidos à sequência não substituída; i) um anticorpo ou porção do mesmo que compreende um domínio VH como foi apresentado na SEQ ID NO: 54, ou difere da SEQ ID NO: 54 em pelo menos uma substituição de aminoácidos conservadora, em que a dita sequência com a pelo menos uma substituição de aminoácidos conservadora é pelo menos 90 % idêntica em sequência de aminoácidos à sequência não substituída, e um domínio VL como foi apresentado na SEQ ID NO: 56, ou difere da SEQ ID NO: 56 em pelo menos uma substituição de aminoácidos conservadora, em que a dita sequência com a pelo menos uma substituição de aminoácidos conservadora é pelo menos 90 % idêntica em sequência de aminoácidos à sequência não substituída; j) um anticorpo ou porção do mesmo que compreende um domínio VH como foi apresentado na SEQ ID NO: 58, ou difere da SEQ ID NO: 58 em pelo menos uma substituição de aminoácidos conservadora, em que a dita sequência com a pelo menos uma substituição de aminoácidos conservadora é pelo menos 90 % idêntica em sequência de aminoácidos à 7 sequência não substituída, e um domínio VL como foi apresentado na SEQ ID NO: 60, ou difere da SEQ ID NO: 60 em pelo menos uma substituição de aminoácidos conservadora, em que a dita sequência com a pelo menos uma substituição de aminoácidos conservadora é pelo menos 90 % idêntica em sequência de aminoácidos à sequência não substituída; k) um anticorpo ou porção do mesmo que compreende um domínio VH como foi apresentado na SEQ ID NO: 62, ou difere da SEQ ID NO: 62 em pelo menos uma substituição de aminoácidos conservadora, em que a dita sequência com a pelo menos uma substituição de aminoácidos conservadora é pelo menos 90 % idêntica em sequência de aminoácidos à sequência não substituída, e um domínio VL como foi apresentado na SEQ ID NO: 64, ou difere da SEQ ID NO: 64 em pelo menos uma substituição de aminoácidos conservadora, em que a dita sequência com a pelo menos uma substituição de aminoácidos conservadora é pelo menos 90 % idêntica em sequência de aminoácidos à sequência não substituída; l) um anticorpo ou porção do mesmo que compreende um domínio VH como foi apresentado na SEQ ID NO: 66, ou difere da SEQ ID NO: 66 em pelo menos uma substituição de aminoácidos conservadora, em que a dita sequência com a pelo menos uma substituição de aminoácidos conservadora é pelo menos 90 % idêntica em sequência de aminoácidos à sequência não substituída, e um domínio VL como foi apresentado na SEQ ID NO: 68, ou difere da SEQ ID NO: 68 em pelo menos uma substituição de aminoácidos conservadora, em que a dita sequência com a pelo menos uma substituição de aminoácidos conservadora é pelo menos 90 % idêntica em sequência de aminoácidos à sequência não substituída; m) um anticorpo ou porção de ligação a antigénio do mesmo que compreende um domínio VH como foi apresentado na SEQ 8 ID NO: 70, ou difere da SEQ ID NO: 7 0 em pelo menos uma substituição de aminoácidos conservadora, em que a dita sequência com a pelo menos uma substituição de aminoácidos conservadora é pelo menos 90 % idêntica em sequência de aminoácidos à sequência não substituída, e um domínio VL como foi apresentado na SEQ ID NO: 72, ou difere da SEQ ID NO: 72 em pelo menos uma substituição de aminoácidos conservadora, em que a dita sequência com a pelo menos uma substituição de aminoácidos conservadora é pelo menos 90 % idêntica em sequência de aminoácidos à sequência não substituída; n) um anticorpo ou porção do mesmo que compreende um domínio VH como foi apresentado na SEQ ID NO: 104, ou difere da SEQ ID NO: 104 em pelo menos uma substituição de aminoácidos conservadora, em que a dita sequência com a pelo menos uma substituição de aminoácidos conservadora é pelo menos 90 % idêntica em sequência de aminoácidos à sequência não substituída, e um domínio VL como foi apresentado na SEQ ID NO: 127, ou difere da SEQ ID NO: 127 em pelo menos uma substituição de aminoácidos conservadora, em que a dita sequência com a pelo menos uma substituição de aminoácidos conservadora é pelo menos 90 % idêntica em sequência de aminoácidos à sequência não substituída; o) um anticorpo ou porção do mesmo que compreende um domínio VH como foi apresentado na SEQ ID NO: 6, ou difere da SEQ ID NO: 6 em pelo menos uma substituição de aminoácidos conservadora, em que a dita sequência com a pelo menos uma substituição de aminoácidos conservadora é pelo menos 90 % idêntica em sequência de aminoácidos à sequência não substituída, e um domínio VL como foi apresentado na SEQ ID NO: 127, ou difere da SEQ ID NO: 127 em pelo menos uma substituição de aminoácidos conservadora, em que a dita sequência com a pelo menos uma substituição de aminoácidos conservadora é pelo menos 9 90 % idêntica em sequência de aminoácidos à sequência não substituída; e p) um anticorpo ou porção do mesmo que compreende um domínio VH como foi apresentado na SEQ ID NO: 104, ou difere da SEQ ID NO: 104 em pelo menos uma substituição de aminoácidos conservadora, em que a dita sequência com a pelo menos uma substituição de aminoácidos conservadora é pelo menos 90 % idêntica em sequência de aminoácidos à sequência não substituída, e um domínio VL como foi apresentado na SEQ ID NO: 8, ou difere da SEQ ID NO: 8 em pelo menos uma substituição de aminoácidos conservadora, em que a dita sequência com a pelo menos uma substituição de aminoácidos conservadora é pelo menos 90 % idêntica em sequência de aminoácidos à sequência não substituída.

11. 0 anticorpo ou porção de liqação a antiqénio de acordo com a reivindicação 1, em que o dito anticorpo ou porção de ligação a antigénio compreende uma cadeia pesada que utiliza uma sequência de linha germinal VH 4-31, VH 3-11, VH 4-61 ou VH 4-59 humana, ou em que pelo menos uma substituição de aminoácidos conservadora ocorre na sequência de linha germinal VH 4-31, VH 3-11, VH 4-61 ou VH 4-59 humana, em que a dita sequência com a pelo menos uma substituição de aminoácidos conservadora é pelo menos 90 % idêntica em sequência de aminoácidos à sequência não substituída.

12. 0 anticorpo ou porção de ligação a antigénio de acordo com a reivindicação 1, em que o dito anticorpo ou porção de ligação a antigénio compreende uma cadeia leve que utiliza uma sequência de linha germinal VK A27, VK A2, VK B3 ou VK L2 humana, ou em que pelo menos uma substituição de aminoácidos conservadora ocorre na sequência de linha germinal VK A27, VK A2, VK B3 ou VK L2 humana, em que a dita sequência com a pelo menos uma substituição de aminoácidos 10 conservadora é pelo menos 90 % idêntica em sequência de aminoácidos à sequência não substituída.

13. O anticorpo de acordo com a reivindicação 1 ou 2 que é uma molécula de IgG, uma molécula de IgM, uma molécula de IgE, uma molécula de IgA, ou uma molécula de IgD, ou é derivado a partir da mesma.

14. O anticorpo ou porção de ligação a antigénio de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, em que o dito anticorpo ou porção de ligação a antigénio é derivatizado ou ligado a outra molécula.

15. O anticorpo ou porção de ligação a antigénio de acordo com a reivindicação 14, em que a dita molécula é um péptido ou uma proteína.

16. Uma molécula de ácido nucleico isolada que compreende as sequências de nucleótidos das SEQ ID NOs: 5 e 7 r SEQ ID NOs: 1 e 3 r SEQ ID NOs: 95 e 101; SEQ ID NOs: 128 e 101; SEQ ID NOs: 103 e 12 6; SEQ ID NOs: 129 e 12 6; SEQ ID NOs: 13 e 15; SEQ ID NOs: 17 e 19; SEQ ID NOs: 25 e 27; SEQ ID NOs: 29 e 31; SEQ ID NOs: 37 e 39; SEQ ID NOs: 45 e 47; SEQ ID NOs: 49 e 51; SEQ ID NOs: 53 e 55; SEQ ID NOs: 57 e 59; SEQ ID NOs: 61 e 63; 11 SEQ ID NOs: 65 e 67; ou SEQ ID NOs: 69 e 71.

17. Um vector que compreende a molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 16, em que o vector compreende uma sequência de controlo de expressão operativamente ligada à molécula de ácido nucleico.

18. Uma célula hospedeira que compreende a) uma sequência de nucleótidos que codifica a cadeia pesada e uma sequência de nucleótidos que codifica a cadeia leve de um anticorpo ou porção de ligação a antigénio de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15; b) uma sequência de nucleótidos que codifica ambas as cadeias leve e pesada do anticorpo ou porção de ligação a antigénio de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15; ou c) o vector de acordo com a reivindicação 17.

19. Um hibridoma depositado sob um número de acesso de ATCC de PTA-6808.

20. O anticorpo produzido pelo hibridoma de acordo com a reivindicação 19, ou uma porção de ligação a antigénio do mesmo.

21. Uma composição farmacêutica que compreende o anticorpo ou porção de ligação a antigénio de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15 e um veiculo fisiologicamente aceitável. a

22. Utilização do anticorpo ou porção de ligação a antigénio de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15 ou a composição farmacêutica de acordo com 12 reivindicação 21 para o fabrico de um medicamento.

23. Utilização do anticorpo ou porção de ligação a antigénio de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15 ou a composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 21 para o fabrico de um medicamento para o tratamento de melanoma ou cancro de mama, cabeça e pescoço, cerebral, do colo do útero, da próstata, pancreático ou testicular num mamífero em necessidade do mesmo.

24. 0 anticorpo ou porção de ligação a antigénio de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15 ou a composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 21 para utilização no tratamento de melanoma ou cancro de mama, cabeça e pescoço, cerebral, do colo do útero, da próstata, pancreático ou testicular num mamífero em necessidade do mesmo.