ME00501B

ME00501B - Humana monoklonska antitijela na kinazu 1 sličnu aktivnom receptoru

Info

Publication number: ME00501B
Application number: MEP-2008-812A
Authority: ME
Inventors: Michael Aidan North; Karin Kristina Amundson; Vahe Bedian; Shelley Sims Belouski; Dana Dan Hu-Lowe; Xin Jiang; Shannon Marie Karlicek; Sirid-Aimee Kellermann; James Arthur Thomson; Grant Raymond Wickman; Jingehuan Zhang; Jianying Wang
Original assignee: Pfizer; Amgen Fremont Inc
Priority date: 2005-09-07
Filing date: 2006-09-06
Publication date: 2011-10-10
Also published as: PL1933871T3; EP2447283B1; HUE038941T2; EA201300320A1; CY1120794T1; HN2006031275A; TW201431883A; HK1169999A1; EP2960253B1; JP2012228251A; PL2447283T3; CR9819A; NL1032452A1; ES2681656T3; MA29843B1; CR20130351A; US20070065444A1; WO2007040912A3; HK1219488A1; US7537762B2

Abstract

Ovaj pronalazak se odnosi na humana antitela i njihove delove za vezivanje antigena koji se vezuju za vanćelijski domen (ECD) kinaze-1 slične aktivinskom receptoru (ALK-1) i koji funkcionišu tako da ukinu signalni put ALK-1 / TGF-beta-1 /Smad l . Pronalazak se takođe odnosi na imunoglobuline teškog i lakog lanca izvedene iz humanih antitela na ALK-1 i molekule nukleinske kiseline koji kodiraju takve imunoglobuline. Ovaj pronalazak se takođe odnosi na postupke prav lj enja humanih anti tela na ALK- I, kompozicija koji sadrže ova antitela i metode za upotrebu antitela i kompozicija. Pronalazak se odnosi i na transgene životinje ili biljke koje sadrže molekule nukleinske kiseline iz ovog pronalaska.

Description

Oblast pronalaska

Ovaj pronalazak se odnosi na humana monoklonska antitela i njihove delove za vezivanje antigena koji se vezuju za vanćelijski domen (ECD) kinaze-1 slične aktivinskom receptom (ALK-1, od engl. activin receptor-like kinase-1). Pronalazak se takođe odnosi na molekule nukleinske kiseline koji kodiraju takva antitela i delove za vezivanje antigena, postupke pravljenja humanih antitela na ALK-1 i delove za vezivanje antigena, kompozicije koje sadrže ova antitela i delove za vezivanje antigena i postupke upotrebe antitela, delova za vezivanje antigena i kompozicija.

Stanje u struci

ALK-1 je receptor tipa I sa površine ćelije, za transformisanje beta receptora tipa 1 za faktor rasta (TGF-beta-1). Humani ALK-1 je polipeptid sa 503 aminokiseline, koji uključuje signalnu sekvencu (aminokiseline: 1-21), domen za vezivanje liganda na N-kraju vanćelijskog TGF-beta-1 ili ECD (aminokiseline: 22-118), jedan jedini transmembranski domen (aminokiseline: 119-141), regulatorni domen bogat glicinom/serinom (GS) (aminokiseline: 142-202) i serin-treonin kinazni domen na C-kraju (202-492). Aminokiselinska sekvenca humanog ALK-1 opisana u Attisano et al. Cell, 1993, vol. 75, pp. 671-680 uključuje Ser na poziciji 172 (Genbank zapis L17075), dok U.S. Patent 6,316,217 štiti aminokiselinsku sekvencu humanog ALK-1 sa Thr na poziciji 172 (Genbank zapis NM_000020). ACVRL1 gen koji kodira ćelu dužinu humanog ALK-1, opisan u Attisano et al., je komercijalno dostupan od Invitrogen Ine., Clone ID IOH21048. Mada ALK-1 deli 60-80% ukupne

homologije sa ostalim receptorima tipa I (od ALK-2 do ALK-7), ECD iz ALK-1 je znatno različit od od ECD-ova ostalih članova familije ALK. Na primer, u čoveku, samo je ECD iz ALK-2 značajno povezan sa ECD iz ALK-1 (sa kojim deli oko 25 % aminokiselinske identiteta). U.S. Patent 6,316,217; ten Dijke et al. Oncogene, 1993, vol. 8, pp. 2879-2887; Attisano et al. Cell 1993, vol. 75, pp. 671-680.

U opštem slučaju, ligandi TGF-beta superfamilije ispoljavaju svoja biološka dejstva vezivanjem za heteromerne receptorske komplekse dva tipa (I i II) serin/treonin kinaza. Receptori tipa II su konstitutivno aktivne kinaze koje fosforilišu receptor tipa I posle vezivanja za ligand. Sa svoje strane, aktivirane kinaze tipa I "nizvodno" fosforilišu signalne molekule uključujući različite Smad-ove, koji se premeštaju u jedro i dovode do transkripcionog odgovora. Heldin et al. Nature, 1997, vol. 390, pp. 465-471. U slučaju ALK-1, pokazali smo da je Smadl specifično fosforilisan i translocira se u jedro, gde direktno reguliše ekspresiju gena responsivnih na Smadl, Idi i EphB2.

ALK-1 se eksprimira intenzivno i selektivno u endotelnim ćelijama i drugim jako vaskularizovanim tkivima kao što je placenta ili mozak. Pokazali smo Affymetrix profliranjem i RT-PCR-om (PCR u realnom vremenu) da ekspresija ALK-1 u endotelnim ćelijama jako prevazilazi ekspresiju svojih ko-receptora akti vina tipa II i endoglina, svog liganda TGF-beta-1 ili ALK-5. Mutacije u ALK-1 su vezane za hereditarnu hemoragičnu telangiektaziju (FIHT), ukazujući na kritičnu ulogu ALK-1 u kontroli razvoja i li popravke krvnih sudova. Abdalla et al. J. Med. Genet., 2003, vol. 40, pp. 494-502; Sadick et al. Hematologica/The Hematology J, 2005, vol. 90, 818-828. Povrh toga, dve nezavisne studije sa ALK-1 nokaut miševima pružaju ključan in vivo dokaz za funkciju ALK-1 tokom angiogeneze. Oh et al. Proc Natl AcadSci USA, 2000, vol. 97, pp. 2626-2631; Urness et al. Nature Genetics , 2000, vol. 26, pp. 328-331.

Angiogeneza je fiziološki proces koji uključuje formiranje novih krvnih sudova iz prethodnih sudova i/ili cirkulaciju endotelnih matičnih ćelija. Ovo je normalan proces u rastu i razviću, kao i u zaceljivanju rana. Međutim, ovo je i fundamentalan korak u prelazu tumora iz latentnog stanja u maligno stanje. Hanahan i Folkman, "Patterns and Emerging Mechanisms of the Angiogenic Svvitch During Tumorigenesis," Cell, 86(3):353-364, 1996; Carmeliet, “Angiogenesis in Health and Disease,” Nature Medicine, 9(6):653-660, 2003; Bergers i Benjamin, “Tumoreigenesis and the Angiogenic Svvitch,” Nature Reviews, 3:401-410, 2003. U oboljenjima kao što je kancer, telo gubi sposobnost da održava uravnoteženu angiogenezu. Novi krvni sudovi hrane obolela tkiva, uništavaju normalna tkiva i, u slučaju nekih kancera, novi sudovi mogu da dopuste ćelijama tumora da pobegnu u cirkulaciju i smeste se u drugim organima (metastaze tumora). Inhibitori angiogeneze, uključujući monoklonska antitela (mAbs), su vrlo obećavaj uća klasa lekova usmerenih protiv ovog abnormalog procesa, da blokiraju ili uspore rast tumora.

Kao dodatak ulozi u rastu čvrstih tumora i metastaza, druga značajna stanja sa angiogenetskom komponentom su, na primer, artritis, psorijaza, neovaskularna staračka degeneracija makule i diabetička retinopatija. Bonnet et al. “Osteoarthritis, Angiogenesis and Inflammation,” Rheumatology, 2005, vol. 44, pp. 7-16; Creamer et al. “Angiogenesis in psoriasis,” Angiogenesis, 2002, vol. 5, pp. 231-236; Clavel et al. “Recent data on the role for angiogenesis in rheumatoid arthritis,” Joint Bone Spine, 2003, vol. 70, pp. 321-326; Anandarajah et al. “Pathogenesis of psoriatic arthritis,” Curr. Opin. Rheumatol., 2004, vol. 16, pp. 338-343; Ng et al. “Targeting angiogenesis, the underlying disorder in neovascular age-related macular degeneration,” Can. J. Ophthalmoi, 2005, vol. 40, pp. 352-368; Witmer et al. “Vascular endothelial growth factors and angiogenesis in eye disease,” Progress in Retinal & Eye Research, 2003, vol. 22, pp. 1-29; Adamis et al. “Angiogenesis and ophthalmic disease,” Angiogenesis, 1999, vol. 3, pp. 9-14.

Očekuje se da su anti-angiogenetske terapije hronične po prirodi. U skladu s tim, mete sa visoko selektivnom endotelnom funkcijom, kao stoje ALK-1, su poželjne da bi se smanjilo iscrpljivanje koje je rezultat bočnih efekata. Štaviše, imajući u vidu izuzetna odstupanja ECD ALK-1 od ECD-ova ostalih članova ALK familije, očekuje se da mAb, proizvedeno na humani ECD ALK-1, selektivno cilja na ALK-1. Na osnovu ovih razmatranja, monoklonsko antitelo na vanćelijski domen ALK-1, koje može da inhibira dimerizaciju sa receptorom tipa II i time blokira fosforilaciju Smadl i "nizvodni" (downstream) transkripcioni odgovor, je jako poželjno.

R&D Systems, Ine. pravi i prodaje monoklonsko antitelo na humani ALK-1 (Cat. # MAB370), proizvedeno iz hibridoma dobijenog spajanjem mišjeg mijeloma sa B ćelijama dobijenim iz miša imunizovanog prečišćenim rekombinantnim humanim vanćelijskim domenom ALK-1 izvedenim iz NS0. Pokazali smo da ovo antitelo niti neutrališe interakciju između ALK-1 i TGF-beta-1, niti poništava fosforilaciju Smadl. Napravljeni su zečji antiserumi na sintetički peptid koji odgovara delu regiona ALK-1 unutarćelijske juxtamembrane (aminokiselinski ostaci 145-166), spojen sa hemocijaninom Fissurellidae (KLH) (U.S. Patent 6,692,925) i protiv celog vanćelijskog domena ALK-1 osim vodeće sekvence (Lux et al., J Biol. Chem., 1999, vol. 274, pp. 9984-9992). Abdalla et al (Human

Mol. Gen., 2000, vol. 9, pp. 1227-1237) objavljuju stvaranje poliklonskog antitela na ALK-1 upotrebom rekombinantnog konstrukta virusa vaccinia. R&D Systems, Ine. pravi i prodaje poliklonsko humano antitelo na ALK-1 (Cat. # AF370) proizvedeno u kozama imunizovanim prečišćenim rekombinantnim humanim vanćelijskim domenom ALK-1 izvedenim izNSO

Do danas, nisu objavljena potpuno humana monoklonska antitela na ECD ALK-1 i niko nije pokazao efikasnost bilo kog monoklonskog antitela na ECD ALK-1 u ukidanju signalnog puta ALK-1/ TGF-beta-1 /Smadl.

Pregled pronalaska

Pronalazak se odnosi na izolovana neutrališuća monoklonska antitela na ALK-1 ili njihove delove za vezivanje antigena koji se vezuju za ALK-1 primata, poželjno ECD ALK-1 primata, još poželjnije ECD humanog ALK-1. U jednom poželjnom izvođenju, neutrališuća antitela su potpuno humana monoklonska antitela ili njihovi delovi za vezivanje antigena.

U jednom drugom aspektu, ovaj pronalazak je antitelo na ALK-1 ili njegov deo za vezivanje antigena, gde antitelo ili njegov deo za vezivanje antigena ukida signalni put ALK-1/TGF-beta-l/Smadl. U jednom poželjnom izvođenju, antitela su potpuno humana monoklonska antitela ili njihovi delovi za vezivanje antigena.

U jednom drugom aspektu, ovaj pronalazak je antitelo na ALK-1 ili njegov deo za vezivanje antigena, gde je antitelo ili njegov deo za vezivanje antigena antagonist angiogeneze stimulisane TGF-om-beta-1. U jednom poželjnom izvođenju, antitela su potpuno humana monoklonska antitela ili njihovi delovi za vezivanje antigena.

U jednom drugom aspektu, ovaj pronalazak je potpuno humano antitelo na ALK-1 ili njegov deo za vezivanje antigena, gde je antitelo ili njegov deo za vezivanje antigena antagonist tumorske angiogeneze stimulisane TGF-om-beta-1.

U jednom drugom aspektu, ovaj pronalazak je dobro podnošljivo injektabilno potpuno humano antitelo na ALK-1 ili njegov deo za vezivanje antigena, gde je antitelo ili njegov deo za vezivanje antigena antagonist angiogeneze stimulisane TGF-om-beta-1.

U jednom drugom aspektu, ovaj pronalazak je antitelo na ALK-1 ili njegov deo za vezivanje antigena, gde antitelo ili njegov deo za vezivanje antigena inhibira ushodnu regulaciju (up-regulation) specifičnog nizvodnog ciljnog gena od strane ALK-1, Idi. U jednom poželjnom izvođenju u, antitela su potpuno humana monoklonska antitela ili njihovi delovi za vezivanje antigena.

U jednom drugom aspektu, ovaj pronalazak je monoklonsko antitelo na ALK-1 ili njegov deo za vezivanje antigena, gde je antitelo ili njegov deo za vezivanje antigena opisan u terminima bar jedne od nekoliko funkcionalnih osobina kao stoje opisano niže.

Na primer, u jednom izvođenju, antitelo ili njegov deo za vezivanje antigena se vezuje za vanćelijski domen ALK-1 primata sa aviditetom od 1 pM ili manjim, kao što je izmereno površinskom plazmonskom rezonancom. A u još jednom izvođenju, antitelo ili njegov deo se vezuje za vanćelijski domen ALK-1 primata sa aviditetom manjim od 100 nM, manjim od 5 nM, manjim od 1 nM, manjim od 500 pM, manjim od 100 pM, manjim od 50 pM, manjim od 20 pM, manjim od 10 pM, ili manjim od 1 pM, kao što je izmereno površinskom plazmonskom rezonancom. U određenim izvođenjima, aviditet je od 0,1 pM do 1 pM. U nekim drugim izvođenjima, aviditet je od 1 pM do 100 nM. U nekim drugim izvođenjima, aviditet je od 1 pM do 5 nM. U nekim drugim izvođenjima, aviditet je od 1 pM do 500 pM. U nekim drugim izvođenjima, aviditet je od 1 pM do 100 pM. U nekim drugim izvođenjima, aviditet je od 1 pM do 10 pM.

U jednom drugom izvođenju, antitelo ili njegov deo za vezivanje antigena se vezuje za vanćelijski domen humanog ALK-1 sa aviditetom od 100 nM ili manjom kao stoje izmereno površinskom plazmonskom rezonancom. A u još jednom izvođenju, antitelo ili njegov deo se vezuje za vanćelijski domen humanog ALK-1 sa vrednošću aviditeta manjom od 10 nM, manjom od 5 nM, manjom od 1 nM, manjom od 500 pM, manjom od 100 pM, manjom od 50 pM, manjom od 20 pM, manjom od 10 pM, ili manjom od 1 pM, kao što je izmereno površinskom plazmonskom rezonancom. U određenim izvođenjima, aviditet je od 1 pM do 100 nM. U nekim drugim izvođenjima, aviditet je od 1 pM do 5 nM. U nekim drugim izvođenjima, aviditet je od 1 pM do 500 pM. U nekim drugim izvođenjima, aviditet je od 1 pM do 100 pM. U nekim drugim izvođenjima, aviditet je od 1 pM do 10 pM.

U jednom drugom izvođenju, antitelo ili njegov deo ima konstantu brzine disocijacije (k0ftj za humani ALK-1 5 x 10'3 s'1 ili manju, kao što je izmereno površinskom plazmonskom rezonancom. Na primer, u određenim izvođenjima antitelo ili njegov deo ima k0ff za humani ALK-1 manju od 10'3 s'1, manju od 5 x IO'4 s'1, manju od IO'4 s'1, manju od 5 x IO'5 s'1, manju od IO'5 s'1, ili manju od 5 x IO'6 s'1. U nekim drugim izvođenjima, kotrje od IO'6 s'1 do IO'4 s'1. U nekim drugim izvođenjima, k0frje od IO'6 s'1 do 5 x IO'5 s'1.

U jednom drugom izvođenju, antitelo ili njegov deo se vezuje za primatski ALK-1 sa Kd od 1000 nM ili manjom. A u još jednom izvođenju, antitelo ili njegov deo se vezuje za humani ALK-1 sa Kn manjom od 500 nM, manjom od 100 nM, manjom od 50 nM, manjom od 20 nM, manjom od 10 nM, ili manjom od 1 nM, kao što je izmereno površinskom plazmonskom rezonancom. U određenim izvođenjima, Koje od 1 p.M do 100 nM. U nekim drugim izvođenjima, Koje od 100 nM do 10 nM. U nekim drugim izvođenjima, KD je od 50 nM do 0,1 nM. Takve vrednosti Kd se mogu izmeriti bilo kojom tehnikom poznatom u struci, kao što su ELISA-e, RIA-e, protočna citometrija, ili površinska plazmonska rezonanca, kao što je BIACORE™.

U jednom drugom izvođenju, antitelo ili njegov deo ima veći afinitet vezivanja za primatski ALK-1 (KD(P)) neog za glodarski ALK-1 (KD(R)). U jednom izvođenju, antitela ili njihovi delovi za vezivanje antigena iz ovog pronalaska imaju Kd(R)/Kd(P) veći ili jednak 1,5. A u još jednom izvođenju, antitela ili njihovi delovi za vezivanje antigena iz ovog pronalaska imaju Kd(R)/Kd(P) veći ili jednak 2, veći ili jednak 3, veći ili jednak 5, veći ili jednak 10, veći ili jednak 20, veći ili jednak 50, veći ili jednak 100, veći ili jednak 200, veći ili jednak 500, ili veći ili jednak 1000. Takve vrednosti Kd za primatski ALK-1 i za glodarski ALK-1 se mogu izmeriti bilo kojom tehnikom poznatom u struci, kao što je protočna citometrija, ELISA, RIA, ili površinska plazmonska rezonanca, kao što je BIACORE,M.

U jednom drugom izvođenju, antitelo na ALK-1 ili njegov deo ima IC50 od 500 nM ili manji, kao što je izmereno njegovom sposobnošću da inhibira ushodnu regulaciju specifičnog nizvodnog ciljnog gena od strane ALK-1, Idi. A u još jednom izvođenju, navedeni IC50 je manji od 300 nM, manji od 200 nM, manji od 150 nM, manji od 100 nM, manji od 50 nM, manji od 20 nM, manji od 10 nM, ili manji od 1 nM. U određenim izvođenjima, IC50 je od 1 nM do 500 nM. U nekim drugim izvođenjima, IC50 je od 5 nM do 250 nM. U nekim drugim izvođenjima, IC50 je od 10 nM do 100 nM.

U jednom drugom izvođenju, antitelo na ALK-1 ili njegov deo ima IC50 od 250 nM ili manji, što je izmereno njegovom sposobnošću da inhibira fosforilaciju Smadl korišćenjem Western blot tehnike pomoću Odyssey Infrared Imaging System-a. A u još jednom izvođenju, pomenjuti IC50 je manji od 200 nM, manji od 150 nM, manji od 100 nM, manji od 50 nM, manji od 20 nM, manji od 10 nM, ili manji od 1 nM. U određenim izvođenjima, IC50 je od 1 nM do 250 nM. U nekim drugim izvođenjima, IC50 je od 5 nM do 200 nM. U nekim drugim izvođenjima, IC50 je od 10 nM do 100 nM.

U jednom drugom izvođenju, antitelo na ALK-1 ili njegov deo inhibira angiogenezu humanih krvnih sudova u SCID mišu kome je transplantirano tkivo sa humanog obreska, u koje su intradermalno implantirane M24met tumorske ćelije humanog melanoma, što je određeno IHC analizom probe humanog CD-31, čiji je signal najmanje 40% u odnosu na kontrolni uzorak. A u još jednom izvođenju, antitelo na ALK-1 ili njegov deo inhibira angiogenezu humanih sudova u SCID mišu kome je transplantirano tkivo sa humanog obreska, u koje su intradermalno implantirane M24met tumorske ćelije humanog melanoma, sa bar 30%, bar 40%, bar 50% ili bar 60% u odnosu na kontrolni uzorak.

U jednom drugom izvođenju, antitelo na ALK-1 ili njegov deo ima EC50 od 500 nM ili manji, što je izmereno njegovom sposobnošću da inhibira angiogenezu humanih sudova u SCID mišu kome je transplantirano tkivo sa humanog obreska, u koje su intradermalno implantirane M24met tumorske ćelije humanog melanoma. A u još jednom izvođenju, navedeni EC50 je manji od 400 nM, manji od 300 nM, manji od 200 nM, manji od 150 nM, manji od 100 nM, manji od 50 nM, manji od 25 nM, ili manji od 5 nM. U određenim izvođenjima, EC50 je od 5 nM do 500 nM. U nekim drugim izvođenjima, IC50 je od 25 nM do 300 nM. U nekim drugim izvođenjima, IC50 je od 50 nM do 150 nM.

U jednom drugom izvođenju, antitelo na ALK-1 ili njegov deo inhibira angiogenezu humanih sudova u SCID mišu kome je transplantirano tkivo sa humanog obreska, u koje je intradermalno implantirana smesa kolagena i humanih makrovaskularnih endotelnih ćelija, što je određeno IHC analizom signala probe humanog CD-31, koji je bar 25% u odnosu na kontrolni uzorak. A u još jednom izvođenju, antitelo na ALK-1 ili njegov deo inhibira angiogenezu humanih sudova u SCID mišu kome je transplantirano tkivo sa humanog obreska, u koje je intradermalno implantiran kolagen, sa najmanje 50% u odnosu na kontrolni uzorak. A u još jednom izvođenju, antitelo na ALK-1 ili njegov deo inhibira bar 75%, bar 80%, bar 85%, bar 90% ili bar 95% u odnosu na kontrolni uzorak.

U jednom drugom izvođenju, antitelo na ALK-1 ili njegov deo je u kompeticiji za vezivanje za ALK-1 sa antitelom odabranim iz grupe koju čine 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1(rWT); 1.12.1(M29I/D19A); 1.12.1(M29I); 1.12.1 (Dl 9A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1; i 5.59.1.

U jednom drugom izvođenju, antitelo na ALK-1 ili njegov deo je u unakrsnoj kompeticiji za vezivanje za ALK-1 sa antitelom odabranim iz grupe koju čine 1.11.1; 1.12.1; 1.12. l(rWT); 1.12.1 (M29I/D19A); 1.12.1 (M29I); 1.12.1 (Dl 9A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1; i 5.59.1.

U jednom drugom izvođenju, antitelo na ALK-1 ili njegov deo se vezuje za isti epitop ALK-1 kao i antitelo odabrano iz grupe koju čine 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1(rWT);

1.12.1 (M29I/D19A); 1.12.1 (M29I); 1.12.1 (Dl 9A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1; i 5.59.1.

U jednom drugom izvođenju, antitelo na ALK-1 ili njegov deo se vezuje za ALK-1 sa suštinski istom Kd kao i antitelo odabrano iz grupe koju čine 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1(rWT);

1.12.1 (M29I/D19A); 1.12.1 (M29I); 1.12.1(D19A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1; i 5.59.1.

U jednom drugom izvođenju, antitelo na ALK-1 ili njegov deo se vezuje za ALK-1 sa suštinski istom k0ff kao i antitelo odabrano iz grupe koju čine 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1(rWT);

1.12.1 (M29I/D19A); 1.12.1(M29I); 1.12.1 (D19A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1; i 5.59.1.

Još jedno izvođenje ovog pronalaska je antitelo ili njegov deo za vezivanje antigena sa bar jednom od ranije opisanih funkcionalnih osobina i sadrži Vh domen koji je najmanje 90% identičan po aminokiselinskoj sekvenci sa bilo kojom od SEQ ID NOs: 6; 10; 14; 18; 22; 26; 30; 34; 38; 42; 46; 50; 54; 58; 62; 66; 70; 74; 78; 82; 86; 90; ili 104. U jednom izvođenju, navedeni Vh domen je najmanje 91%, najmanje 93%, najmanje 95%, najmanje 97%, najmanje 99%, ili 100% identičan po aminokiselinskoj sekvenci sa bilo kojom od SEQ ID NOs: 6; 10; 14; 18; 22; 26; 30; 34; 38; 42; 46; 50; 54; 58; 62; 66; 70; 74; 78; 82; 86; 90; ili 104.

A u još jednom izvođenju, antitelo ili njegov deo ima bar jednu od ranije opisanih funkcionalnih osobina i sadrži VH domen koji je bilo koja od SEQ ID NOs: 6; 10; 14; 18; 22; 26; 30; 34; 38; 42; 46; 50; 54; 58; 62; 66; 70; 74; 78; 82; 86; 90; ili 104, ili se razlikuje od bilo koje od SEQ ID NOs: 6; 10; 14; 18; 22; 26; 30; 34; 38; 42; 46; 50; 54; 58; 62; 66; 70; 74; 78; 82; 86; 90; ili 104 time što ima bar jednu konzervativnu supstituciju aminokiseline. Na primer, Vh domen može da se razlikuje po 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ili 15 konzervativnih supstitucija aminokiseline od bilo koje od SEQ ID NOs: 6; 10; 14; 18; 22; 26; 30; 34; 38; 42; 46; 50; 54; 58; 62; 66; 70; 74; 78; 82; 86; 90; ili 104. A u još jednom izvođenju, bilo koja od ovih konzervativnih supstitucija aminokiseline može da se javi u CDR1, CDR2, i/ili CDR3 regionima.

Još jedan aspekt ovog pronalaska je antitelo ili njegov deo za vezivanje antigena sa bar jednom od ranije opisanih funkcionalnih osobina i sadrži Vl domen čija je aminokiselinska sekvenca najmanje 90% identična sa bilo kojom od SEQ ID NOs: 8; 12; 16; 20; 24; 28; 32; 36; 40; 44; 48; 52; 56; 60; 64; 68; 72; 76; 80; 84; 88; 92; ili 127. U jednom izvođenju, navedeni VL domen je najmanje 91%, najmanje 93%, najmanje 95%, najmanje 97%, najmanje 99%, ili 100% identičan po aminokiselinskoj sekvenci sa bilo kojom od SEQ ID NOs: 8; 12; 16; 20; 24; 28; 32; 36; 40; 44; 48; 52; 56; 60; 64; 68; 72; 76; 80; 84; 88; 92; ili 127.

A u još jednom izvođenju, antitelo ili njegov deo ima bar jednu od ranije opisanih funkcionalnih osobina i sadrži VL domen koji je bilo koja od SEQ ID NOs: 8; 12; 16; 20; 24; 28; 32; 36; 40; 44; 48; 52; 56; 60; 64; 68; 72; 76; 80; 84; 88; 92; ili 127, ili se razlikuje od bilo koje od SEQ ID Nos: 8; 12; 16; 20; 24; 28; 32; 36; 40; 44; 48; 52; 56; 60; 64; 68; 72; 76; 80; 84; 88; 92; ili 127 po tome što ima bar jednu konzervativnu supstituciju aminokiseline. Na primer, Vl domen može da se razlikuje po 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ili 15 konzervativnih supstitucija aminokiseline od bilo koje od SEQ ID NOs: 8; 12; 16; 20; 24; 28; 32; 36; 40; 44; 48; 52; 56; 60; 64; 68; 72; 76; 80; 84; 88; 92; ili 127. A u još jednom izvođenju, bilo koja od ovih konzervativnih supstitucija aminokiseline može da se javi u CDR1, CDR2, i/ili CDR3 regionima.

Još jedan aspekt ovog pronalaska je antitelo ili njegov deo za vezivanje antigena sa bar jednom od ranije opisanih funkcionalnih osobina, gde je svaki od VL i VH domena bar 90% identičan po aminokiselinskoj sekvenci svakom od Vl, odnosno Vh, domena bilo kog od monoklonskih antitela 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1(rWT); 1.12.1(M29I/D19A); 1.12.1 (M29I);

1.12.1 (D19 A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1; i

5.59.1. Na primer, svaki od VL, tj. Vh, domena je bar 91%, 93%, 95%, 97%, 99% ili 100% identičan po aminokiselinskoj sekvenci svakom od VL, odnosno Vh, domena bilo kog od monoklonskih antitela 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1(rWT); 1.12.1 (M29I/D19A); 1.12.1 (M29I);

1.12.1 (Dl 9A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1; i

5.59.1.

U još jednom aspektu ovog pronalaska je monoklonsko antitelo ili njegov deo za vezivanje antigena koje je odabrano iz grupe koja sadrži: a) an ili njegov deo koji sadrži Vr domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 6 i Vl domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 8;

b) antitelo ili njegov deo koji sadrži Vh domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 10 i VL domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 12; c) antitelo ili njegov deo koji sadrži Vh domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 14 i Vl domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 16; d) antitelo ili njegov deo koji sadrži Vh domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 18 i VL domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 20; e) antitelo ili njegov deo koji sadrži Vh domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 22 i VL domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 24; f) antitelo ili njegov deo koji sadrži VH domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 26 i Vl domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 28; g) antitelo ili njegov deo koji sadrži VH domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 30 i Vl domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 32; h) antitelo ili njegov deo koji sadrži Vh domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 34 i Vl domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 36; i) antitelo ili njegov deo koji sadrži VH domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 38 i Vl domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 40; j) antitelo ili njegov deo koji sadrži VH domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 42 i Vl domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 44; k) antitelo ili njegov deo koji sadrži Vh domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 46 i Vl domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 48; 1) antitelo ili njegov deo koji sadrži VH domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 50 i VL domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 52; m) antitelo ili njegov deo koji sadrži Vh domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 54 i Vl domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 56; n) antitelo ili njegov deo koji sadrži Vh domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 58 i Vl domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 60; o) antitelo ili njegov deo koji sadrži Vh domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 62 i VL domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 64; p) antitelo ili njegov deo koji sadrži Vh domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 66 i Vl domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 68; q) antitelo ili njegov deo za vezivanje antigena koji sadrži VH domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 70 i Vl domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 72; r) antitelo ili njegov deo koji sadrži Vh domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 74 i Vl domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 76; s) antitelo ili njegov deo koji sadrži Vh domen kao stoje prikazan u SEQ ID NO: 78 i Vl domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 80; t) antitelo ili njegov deo koji sadrži VH domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 82 i VL domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 84; u) antitelo ili njegov deo koji sadrži VH domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 86 i VL domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 88; v) antitelo ili njegov deo koji sadrži Vh domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 90 i Vl domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 92; w) antitelo ili njegov deo koji sadrži VH domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 104 i VL domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 127; x) antitelo ili njegov deo koji sadrži VH domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 6 i Vl domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 127; i y) antitelo ili njegov deo koji sadrži Vh domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 104 i VL domen kao stoje prikazan u SEQ ID NO: 8.

A u još jednom izvođenju, za sva antitela ili njihove delove kao što su opisani gore u grupama a) do v), VH i/ili Vl domeni mogu da se razlikuju od specifičnih SEQ ID NOs navedenih ovde po bar jednoj konzervativnoj supstituciji aminokiseline. Na primer, VH i/ili Vl domeni mogu da se razlikuju od navedenih SEQ ID NO po 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ili 15 konzervativnih supstitucija aminokiseline. A u još jednom izvođenju, bilo koja od ovih konzervativnih supstitucija aminokiseline može da se javi u CDR1, CDR2, i/ili CDR3 regionima.

U jednom drugom izvođenju, ovaj pronalazak obezbeđuje monoklonsko antitelo ili njegov deo za vezivanje antigena sa bar jednom od ranije opisanih funkcionalnih osobina, gde je Vh domen nezavisno odabran iz bilo koje SEQ ID NOs: 6; 10; 14; 18; 22; 26; 30; 34; 38; 42; 46; 50; 54; 58; 62; 66; 70; 74; 78; 82; 86; 90; ili 104, ili je sekvenca koja se razlikuje od bilo koje od SEQ ID NOs: 6; 10; 14; 18; 22; 26; 30; 34; 38; 42; 46; 50; 54; 58; 62; 66; 70; 74; 78; 82; 86; 90; ili 104, po najmanje jednoj konzervativnoj supstituciji aminokiseline i Vl domen je nezavisno odabran iz bilo koje od SEQ ID NOs: 8; 12; 16; 20; 24; 28; 32; 36; 40; 44; 48; 52; 56; 60; 64; 68; 72; 76; 80; 84; 88; 92; ili 127, ili je sekvenca koja se razlikuje od bilo koje od SEQ ID NOs: 8; 12; 16; 20; 24; 28; 32; 36; 40; 44; 48; 52; 56; 60; 64; 68; 72; 76; 80; 84; 88; 92; ili 127, po najmanje jednoj konzervativnoj supstituciji aminokiseline. Na primer, svaki od Vh i Vl domena može da se razlikuje od SEQ ID NOs: 6; 10; 14; 18; 22; 26; 30; 34; 38; 42; 46; 50; 54; 58; 62; 66; 70; 74; 78; 82; 86; 90; ili 104, odnosno, od 8; 12; 16; 20; 24; 28; 32; 36; 40; 44; 48; 52; 56; 60; 64; 68; 72; 76; 80; 84; 88; 92; ili 127, po 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ili 15 konzervativnih supstitucija aminokiseline.

A u još jednom izvođenju, ovaj pronalazak obezbeđuje monoklonsko antitelo ili njegov deo za vezivanje antigena sa bar jednom od prethodno opisanih funkcionalnih osobina, gde navedeno antitelo ili njegov deo sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence Vh nezavisno odabrane od odgovarajućih CDR1, CDR2, ili CDR3 sekvenci teških lanaca, nađenih u bilo kojoj od SEQ ID NOs: 6; 10; 14; 18; 22; 26; 30; 34; 38; 42; 46; 50; 54; 58; 62; 66; 70; 74; 78; 82; 86; 90; ili 104, ili sekvencu koja se razlikuje od bilo koje od SEQ ID NOs: 6; 10; 14; 18; 22; 26; 30; 34; 38; 42; 46; 50; 54; 58; 62; 66; 70; 74; 78; 82; 86; 90; ili 104, po bar jednoj konzervativnoj supstituciji aminokiseline. Na primer, CDR1, CDR2 i CDR3 VH mogu da se razlikuju od odgovarajućih CDR1, CDR2 i CDR3 bilo koje od SEQ ID NOs: 6; 10; 14; 18;

22; 26; 30; 34; 38; 42; 46; 50; 54; 58; 62; 66; 70; 74; 78; 82; 86; 90; ili 104, po 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ili 15 konzervativnih supstitucija aminokiseline.

A u još jednom izvođenju, ovaj pronalazak obezbeđuje monoklonsko antitelo ili njegov deo za vezivanje antigena sa bar jednom od ranije opisanih funkcionalnih osobina, gde rečeno antitelo ili njegov deo sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence Vl nezavisno odabrane od odgovarajućih CDR1, CDR2, ili CDR3 sekvenci lakih lanaca, nađenih u bilo kojoj od SEQ ID NOs: 8; 12; 16; 20; 24; 28; 32; 36; 40; 44; 48; 52; 56; 60; 64; 68; 72; 76; 80; 84; 88; 92; ili 127, ili sekvencu koja se razlikuje od bilo koje od SEQ ID NOs: 8; 12; 16; 20; 24; 28; 32; 36; 40; 44; 48; 52; 56; 60; 64; 68; 72; 76; 80; 84; 88; 92; ili 127, po bar jednoj konzervativnoj supstituciji aminokiseline. Na primer, CDR1, CDR2 i CDR3 Vl mogu da se razlikuju od odgovarajućih CDR1, CDR2 i CDR3 bilo koje od SEQ ID NOs: 8; 12; 16; 20; 24; 28; 32; 36; 40; 44; 48; 52; 56; 60; 64; 68; 72; 76; 80; 84; 88; 92; ili 127 po 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ili 15 konzervativnih supstitucija aminokiseline.

Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje monoklonsko antitelo ili njegov deo za vezivanje antigena sa bar jednom od prethodno opisanih funkcionalnih osobina, gde pomenuto antitelo ili njegov deo za vezivanje antigena sadrži CDR1 Vh i Vl, CDR2 Vh i Vl, i CDR3 Vh i Vl, kao što je nađeno u bilo kom od monoklonskih antitela 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1 (rWT); 1.12.1(M29I/D19A); 1.12.1 (M29I); 1.12.1 (D19A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1; i 5.59.1.

Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje monoklonsko antitelo ili njegov deo za vezivanje antigena sa bar jednom od ranije opisanih funkcionalnih osobina, gde pomenuto antitelo ili njegov deo za vezivanje antigena sadrži težak lanac koji koristi humani VH 4-31, VH 3-11, Vh 3-15, VH 3-33, VH 4-61 ili VH 4-59 gen. U nekim izvođenjima, težak lanac koristi humani VH

3- 33 gen, humani D 6-19 gen i humani Jh 3B gen; humani Vh 4-31 gen, humani D 6-19 gen i humani Jh 4B gen; humani Vh 4-61 gen, humani D 6-19 gen i humani JH 4B gen; humani VH

4- 31 gen, humani D 3-3 gen i humani JH 3B gen; humani VH 4-31 gen i humani JH 3B gen; humani Vh 4-59 gen, humani D 6-19 gen i humani JH 4B gen; humani Vh 3-11 gen, humani D

3- 22 gen i humani Jh 6B gen; humani VH 3-15 gen, humani D 3-22 gen i humani JH 4B gen; humani VH 4-31 gen, humani D 5-12 gen i humani Jh 6B gen; humani VH 4-31 gen, humani D

4- 23 gen i humani Jh 4B gen; humani VH 4-31 gen, humani D 2-2 gen i humani JH 5B gen; humani VH 4-31 gen i humani Jh 6B gen; human VH 3-15 gen, humani D 1-1 gen i humani JH 4B gen; humani VH 3-11 gen, humani D 6-19 gen i humani JH 6B gen; humani VH 3-11 gen,

humani D 3-10 gen i humani Jh 6B gen; ili humani Vh 3-11 gen, humani D 6-6 gen i humani Jh 6B gen.

Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje monoklonsko antitelo ili njegov deo za vezivanje antigena sa bar jednom od prethodno opisanih funkcionalnih osobina, gde pomenuto antitelo ili njegov deo za vezivanje antigena sadrži lak lanac koji koristi humani VK A27, VK A2, VK Al, VK A3, VK B3, VK B2, VK LI ili VK L2 gen. U nekim izvođenjima, lak lanac koristi humani VK LI gen i humani JK 4 gen; humani Vk A27 gen i humani Jk 5 gen ili humani JK 4 gen; humani Vk B3 gen i humani Jk 1 gen; humani Vk L2 gen i humani Jk 3 gen; humani Vk A2 gen i humani Jk 1 gen; humani Vk A3 gen i humani Jk 4 gen; humani Vk Al gen i humani Jk 1 gen; humani VK B2 gen i humani Jk 4 gen; ili humani VK A2 gen i humani Jk 1 gen.

Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje monoklonsko antitelo ili njegov deo za vezivanje antigena sa bar jednom od prethodno opisanih funkcionalnih osobina, gde pomenuto antitelo ili njegov deo za vezivanje antigena sadrži jedan ili više FR1, FR2, FR3 ili FR4 aminokiselinskih sekvenci teških lanaca i/ili lakih lanaca kao što je nađeno u bilo kom od monoklonskih antitela 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1(rWT); 1.12.1(M29I/D19A); L12.1(M29I);

1.12.1 (D19A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1; i

5.59.1.

Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje monoklonsko antitelo koje sadrži aminokiselinske sekvence predstavljene u: a) SEQ ID NO: 2 i SEQ ID NO: 4; b) SEQ ID NO: 2 i SEQ ID NO: 102; c) SEQ ID NO: 100 i SEQ ID NO: 4 i d) SEQ ID NO: 100iSEQ ID NO: 102.

A u još jednom izvođenju ovog pronalaska je bilo koje od prethodno opisanih antitela koje je molekul IgG, IgM, IgE, IgA, ili IgD, ili je izveden iz njega. Na primer, antitelo može biti IgG i ili IgG2.

Jedno drugo izvođenje obezbeđuje bilo koje od antitela ili delova za vezivanje antigena opisanih gore, koje je fragment Fab, fragment F(ab’)2, fragment Fy, jednolančani fragment Fv, jednolančani fragment VH, jednolančani fragment Vl, humanizovano antitelo, himerno antitelo ili bispecifično antitelo.

A u još jednom izvođenju je izvedeno antitelo ili deo za vezivanje antigena koji sadrži bilo koje od antitela ili njegovih delova opisanih gore i najmanje jedan dodatni molekulski entitet. Na primer, taj najmanje jedan dodatni molekulski entitet može biti drugo antitelo (npr., bispecifično antitelo ili dijatelo), sredstvo za detekciju, obeleživač, citotoksično sredstvo, farmaceutisko sredstvo i/ili protein ili peptid koji može da posreduje u spajanju antitela ili dela antitela sa nekim drugim molekulom (kao što je jezgarni region streptavidina ili polihistidinski marker). Na primer, korisna sredstva za detekciju sa kojima se antitelo ili njegov deo za vezivanje antigena iz pronalaska može izvesti uključuju fluorescentna jedinjenja, uključujući fluorescein, fluorescein izotiocijanat, rodamin, 5-dimetilamin-l-naftalensulfonil hlorid, fikoeritrin, fosfolantanide i slično. Antitelo se može obeležavati i enzimima koji su korisni za detekciju, kao što je peroksidaza, (3-galaktozidaza, luciferaza, alkalna fosfataza, oksidaza glukoze i slično. A u još jednom izvođenju, antitela ili njihovi delovi iz ovog pronalaska se mogu obeležavati i biotinom ili prethodno određenim polipeptidnim epitopom koji prepoznaje sekundarni reporter (npr., par sekvenci leucinskog rajsferšlusa, mesta vezivanja za sekundarna antitela, domeni za vezivanje metala, markeri epitopa). U još jednom izvođenju ovog pronalaska, bilo koje od antitela ili njegovih delova se može obeležavati i hemijskom grupom kao što je polietilen glikol (PEG), metil ili etil grupa, ili ugljovodonična grupa.

U nekim izvođenjima, antitela na ALK-1 ili njihovi delovi za vezivanje antigena, opisani ovde, su pričvršćeni za čvrstu podlogu.

U nekim izvođenjima, lizin sa C-kraja teškog lanca bilo kog antitela na ALK-1 iz pronalaska se razgrađuje. U različitim izvođenjima pronalaska, teški i laki lanci antitela na ALK-1 mogu po želji da uključe i signalnu sekvencu.

Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži bilo koje od antitela ili njegovih delova za vezivanje antigena kao što je opisano gore i farmaceutski prihvatljiv nosač.

U jednom drugom izvođenju, pronalazak se odnosi na izolovan molekul nukleinske kiseline koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira bilo koje od antitela ili njegov deo za vezivanje antigena kao što je ovde opisano. U jednom određenom izvođenju, izolovan molekul nukleinske kiseline sadrži nukleotidnu sekvencu datu u SEQ ID NO: 1, gde sekvenca kodira težak lanac.. U jednom drugom određenom izvođenju, izolovan molekul nukleinske kiseline sadrži nukleotidnu sekvencu datu u SEQ ID NO: 3, gde sekvenca kodira lak lanac.

U jednom drugom određenom izvođenju, izolovan molekul nukleinske kiseline sadrži polinukleotid koji ima otvoren okvir čitanja sekvence cDNK klona deponovanog pod pristupnim brojem ATCC PTA-6864. U jednom drugom određenom izvođenju, izolovan molekul nukleinske kiseline sadrži polinukleotid koji ima otvoren okvir čitanja sekvence cDNK klona deponovanog pod pristupnim brojem PTA-6865.

U jednom drugom određenom izvođenju, izolovan molekul nukleinske kiseline sadrži nukleotidnu sekvencu datu u SEQ ID NO: 95 ili 128, gde svaka od ovih sekvenci kodira težak lanac. U jednom drugom određenom izvođenju, izolovan molekul nukleinske kiseline sadrži nukleotidnu sekvencu datu u SEQ ID NO: 101, gde ova sekvenca kodira lak lanac.

Pronalazak se dalje odnosi na vektor koji sadrži bilo koje molekule nukleinske kiseline opisane ovde, gde vektor opciono sadrži ekspresionu kontrolnu sekvencu operativno vezanu za molekul nukleinske kiseline.

Jedan drugi izvođenju ćeliju domaćina koja sadrži bilo koji od vektora opisanih ovde ili koji sadrži bilo koje molekule nukleinske kiseline opisane ovde. Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje izolovanu ćelijsku liniju koja proizvodi bilo koje od antitela ili njegovih delova za vezivanje antigena kao što je opisano ovde ili koja proizvodi težak ili lak lanac bilo kog od navedenih antitela ili navedenih delova za vezivanje antigena.

U jednom drugom izvođenju, ovaj pronalazak se odnosi na postupak za proizvodnju antitela na ALK-1 ili njihovih delova za vezivanje antigena, koji se sastoji od gajenja bilo kojih od ćelija domaćina ili ćelijskih linija, opisanih ovde, pod pogodnim uslovima i sakupljanja navedenih antitela ili njihovih delova za vezivanje antigena.

Ovaj pronalazak se takođe odnosi na ne-humane transgenske životinje ili transgenske biljke koje sadrže bilo koje od nukleinskih kiselina opisanih ovde, gde ne-humana transgenska životinja ili transgenska biljka eksprimira navedenu nukleinsku kiselinu.

Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje postupak za izolovanje antitela ili njegovog dela za vezivanje antigena koji se vezuje za ALK-1, koji sadrži stupanj izolovanja antitela iz nehumane transgenske životinje ili transgenske biljke kao što je opisano ovde.

U jednom drugom izvođenju, pronalazak se odnosi na hibridome deponovane pod pristupnim brojem ATCC PTA-6808.

Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje postupak kojim se određuje da li supstanca inhibira ushodnu regulaciju specifičnog nizvodnog ciljanog gena od strane ALK-1, Idi, gde se postupak sastoji od spajanja prvog uzorka ćelija koje eksprimiraju Idi sa supstancom i određivanja da li je ekspresija Idi inhibirana, gde snižen nivo ekspresije Idi u prvom uzorku ćelija koje su dovedene u kontakt sa supstancom u poređenju sa kontrolnim uzorkom ćelija ukazuje na to da navedena supstanca inhibira ekspresiju Idi. Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje postupak, gde je supstanca antitelo koje se vezuje za vanćelijski domen ALK-1.

Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje postupak za tretiranje abnormalnog ćelijskog rasta u sisaru kome je to potrebno, koji sadrži stupanj davanja pomenutom sisaru bilo kog od

antitela ili njiegovih delova za vezivanje antigena, ili bilo koje farmaceutske kompozicije, kao što je opisano ovde. Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje postupak za tretiranje abnormalnog ćelijskog rasta u sisaru kome je to potrebno, pomoću antitela ili njegovog dela za vezivanje antigena koji se vezuje za ALK-1, koji sadrži korake davanja pomenutom sisaru efektivne količine bilo kog od molekula nukleinske kiseline opisanih ovde pod pogodnim uslovima koji dozvoljavaju ekspresiju navedenog molekula nukleinske kiseline. U jednom drugom izvođenju, postupak tretiranja abnormalnog ćelijskog rasta se dalje sastoji od davanja količine jedne ili više supstanci odabranih među anti-tumorskim agensima, anti-angiogenetskim agensima, inhibitorima prenosa signala i antiproliferativnim agensima, gde su te količine zajedno efektivne u tretiranju pomenutog abnormalnog ćelijskog rasta. U posebnim izvođenjima, navedeni abnormalni ćelijski rast je kancerozan.

Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje izolovan protein ALK-1 iz Cynomolgus majmuna koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 93. Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje izolovan molekul nukleinske kiseline koji kodira protein sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 93. Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje izolovan molekul nukleinske kiseline sekvence SEQ ID NO: 94.

Kratak opis crteža

Slika 1 prikazuje primer podataka o vezivanju epitopa. Antitelo 1.12.1 (M29I/D19A) je ubrizgavano 10 minuta, a sledećih 10 minuta je ubrizgavano antitelo 1.12.1 (M29I/D19A). Ovo defmiše maksimalan odgovor za ubrizgavanje od 20 minuta tog antitela. Maksimalan odgovor za ubrizgavanje od 20 minuta je slično određen i za antitelo 1.27.1. Antitelo 1.12.1 (M29I/D19A) je ubrizgavano 10 minuta, a sledećih 10 minuta je ubrizgavano antitelo 1.27.1. Ako ukupan odgovor upadne između defmisanih maksimalnih odgovora, onda ova dva antitela moraju da se vezuju za isti epitop. Ako ukupan odgovor pređe najviši maksimalan odgovor, onda ova dva antitela moraju da se vezuju za različite epitope. Eksperiment je ponovljen sa obrnutim redom ubrizgavanja, kao što je opisano u Primeru 9.

Slika 2 prikazuje redosled sekvenci humanih i Cynomolgus-nih proteina ALK-1.

Slika 3 prikazuje određivanje KD vezivanja rekombinantnog antitela 1.12.1 za ALK-1 na površini ćelije, (a) Elumano. (b) Cynomolgus.

1.12.1(rWT) se odnosi na varijantu mAb 1.12.1 koja je eksprimiran rekombinantni

mAb.

1.12.1(M29I/D19A) se odnosi na varijantu mAb 1.12.1 koja je eksprimiran rekombinantni mAb koja sadrži dve specifične mutacije aminokiselina (metionin na poziciji 29 na teškom lancu je zamenjen izoleucinom i asparaginska kiselina na poziciji 19 na lakom lancu je zamenjena alaninom).

1.12.1 (M29I) se odnosi na varijantu mAb 1.12.1 koja je eksprimiran rekombinantni mAb koja sadrži jednu specifičnu mutaciju aminokiseline, gde je metionin na poziciji 29 na teškom lancu zamenjen izoleucinom.

1.12.1 (D19A) se odnosi na varijantu 1.12.1 koja je eksprimiran rekombinantni mAb koja sadrži jednu specifičnu mutaciju aminokiseline, gde je asparaginska kiselina na poziciji 19 na lakom lancu zamenjena alaninom.

Slika 4 prikazuje primere IDI titracija korišćenjem IDI Taqman testa za varijante antitela 1.12.1.

1.12.1 se odnosi na varijantu mAb 1.12.1 koja je izolovana iz hibridoma.

1.12.1(rWT) se odnosi na varijantu mAb 1.12.1 koja je eksprimiran rekombinantni

mAb.

1.12.1 (D19A) se odnosi na varijantu mAb 1.12.1 koja je eksprimiran rekombinantni mAb koja sadrži jednu specifičnu mutaciju aminokiseline, gde je asparaginska kiselina na poziciji 19 na lakom lancu zamenjena alaninom.

Slika 5 prikazuje primere titracija IDI korišćenjem IDI Taqman testa za varijante sekvenci antitela 1.12.1 i derivat Fab.

1.12.1 se odnosi na varijantu mAb 1.12.1 koja je izolovana iz hibridoma.

1.12.1(rWT) se odnosi na varijantu mAb 1.12.1 koja je eksprimiran rekombinantni

mAb.

Fab 1.12.1(M29I/D19A) se odnosi na fragment Fab mAb 1.12.1 (M29I/D19A) dobijen digestijom 1.12.1(M29I/D19A) IgGl pomoću papaina.

Slika 6 pokazuje internalizaciju ALK-1. (a) Praćenje neutrališućeg antitela koje ostaje na ćelijskoj površini, (b) Praćenje receptora ALK-1 koji ostaje na ćelijskoj površini.

Slika 7A pokazuje poređenje sekvenci varijabilnog domena za antitela na ALK-1 iz pronalaska, sa embrionskim sekvencama. Mutacije upoređene sa embrionskim su date masnim slovima. Sekvence CDR su podvučene. Slika 7B pokazuje poređenje predviđenih aminokiselinskih sekvenci varijabilnih domena lakog lanca za antitela na ALK-1 1.12.1,

1.14.1, 1.162.1, 1.31.1, 4.62.1 i 4.72.1 sa humanim embrionskim sekvencama Vk A27. Slike 7C i 7D pokazuju poređenje predviđenih aminokiselinskih sekvenci varijabilnih domena teškog i lakog lanca za antitela na ALK-1 1.12.1, 1.151.1, 1.162.1, 1.8.1, 4.24.1, 4.38.1,

4.58.1.4.62.1, 4.68.1,4.72.1, 5.13.1 i 5.34.1 sa humanim embrionskim sekvencama VH 4-31. Slika 8 prikazuje primer histološke (F1 & E Staining) analize dela transplantirane

humane kože posle hirurgije.

Slika 9 (A) prikazuje trohromatsko bojenje kolagena u himernom mišu sa humanom

kožom.

Slika 9 (B) prikazuje određivanje humanih sudova u kolagenskom gelu implantiranom u humani obrezak himernog miša. Texas crveno: humani sudovi. FITC: mišji sudovi. Žuto: paralelno bojenje.

Slika 10 prikazuje imunofluorescentnu sliku humanih (crveno) i mišjih (zeleno) sudova M24met tumora u SCID himernom mišu sa humanim obreskom.

Slika 11 prikazuje IHC snimak humanih sudova (braon) M24met tumora u SCID himernom mišu sa humanim obreskom.

Slika 12 prikazuje reprezentativne imunofluorescentne snimke humanih (crveno) i mišjih (zeleno) sudova kontrole i M24met tumora tretiranih (10 mg/kg) antitelom 1.12.1(M29I/D19A) u SCID himernom mišu sa humanim obreskom.

Slika 13 prikazuje inhibiciju zavisnu od doze rasta humanog tumorskog suda koju vrši antitelo 1.12.1(M29I/D19A) u modelu SCID himerni miš sa humanim obreskom.

Slika 14 prikazuje koncentraciju antitela 1.12.1(M29I/D19A) u plazmi SCID miša.

Slika 15 prikazuje procenjen EC50 za antitelo 1.12.1(M29I/D19A) u modelu M24met SCID himera sa obreskom. Pri grafičkom prikazivanju, koncentracija veštačkog seruma od 0,1 nM je uzeta za kontrolnu vrednost od 100%. Ovo ne menja prividni EC50 .

Detaljan opis pronalaska Definicije i opšte tehnike

Osim ako je ovde drukčije defmisano, naučni i tehnički termini korišćeni u vezi sa ovim pronalaskom imaju značenja koja se obično podrazumevaju među stručnjacima uobičajenog nivoa. Dalje, osim ako kontekst zahteva drukčije, termini u jednini uključuju množine i termini u množini uključuju jedninu. Uopšteno, korišćena nomenklatura i opisane ovde tehnike kultura ćelija i tkiva, molekularne biologije, imunologije, mikrobiologije, genetike, hernije proteina i nukleinskih kiselina i hibridizacije su one dobro poznate i uobičajeno korišćene u struci.

Postupak i i tehnike iz ovog pronalaska se uopšteno izvode prema konvencionalnim postupcima dobro poznatim u struci i kao što su opisani u različitim opštim i specifičnijim referencama koje su citirane i diskutovane kroz ćelu ovu prijavu, osim ako je drukčije naznačeno. Videti, npr., Sambrook J. & Russell D.. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2000); Ausubel et ah, Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, John & Sons, Ine. (2002); Harlow i Lane Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1998) i Coligan et ah, Short Protocols in Protein Science, Wiley, John & Sons, Ine. (2003), koje su ovde ugrađene referencom. Enzimske reakcije i tehnike prečišćavanja su izvođene prema specifikacijama proizvođača, kao što se obišno radi u struci ili kao što su opisane ovde. Korišćena nomenklatura used i laboratorijske procedure i tehnike analitičke hernije, sintetičke organske hernije i medicinske i farmaceutske hernije opisane ovde su one dobro poznate i uobičajeno korišćene u struci.

Podrazumevaće se da sledeći termini, osim ako je drukčije ukazano, imaju sledeća značenja:

Kao što je ovde korišćen, termin “ALK-1” se odnosi na sisarsku kinazu-1 sličnu aktivinskom receptom. Predviđeno je da termin ALK-1 uključi rekombinantni ALK-1 i rekombinantne himerne oblike ALK-1, koji se mogu dobiti standardnim postupcima rekombinantne ekspresije.

Kao stoje ovde korišćen, akronim “mAb” se odnosi na monoklonsko antitelo (od engl. monoclonal antibody).

Kao što je ovde korišćeno, antitelo koje se označava brojem je monoklonsko antitelo (mAb) koje je dobijeno iz hibridoma pod istim brojem. Na primer, monoklonsko antitelo

1.12.1 je dobijeno iz hibridoma 1.12.1.

1.12.1 se odnosi na varijantu mAb 1.12.1 koja je izolovana iz hibridoma.

1.12.1(rWT) se odnosi na varijantu mAb 1.12.1 koja je eksprimiran rekombinantni

mAb.

1.12.1 (M29I/ D19A) se odnosi na varijantu mAb 1.12.1 koja je eksprimiran rekombinantni mAb koja sadrži dve specifične mutacije aminokiselina (metionin na poziciji 29 na teškom lancu je zamenjen izoleucinom i asparaginska kiselina na poziciji 19 na lakom lancu je zamenjena alaninom).

Kao što je ovde korišćeno, "abnormalan rast ćelija", osim ako je drukčije naznačeno, se odnosi na rast ćelija koji je nezavisan od normalnih regulatornih mehanizama (npr., gubitak kontaktne inhibicije).

. Kao što je ovde korišćen, termin "susedan" se koristi za nukleotidne sekvence koje su direktno spojene među sobom, bez nukleotida između. Na primer, pentanukleotid 5'-AAAAA-3' je susedan trinukleotidu 5'-TTT-3' kad su ta dva spojena na ovaj način: 5'-AAAAATTT-3' ili 5'-TTTAAAAA-3', ali nije susedan kad su ta dva spojena ovako: 5'-AAAAACTTT-3'.

Termin "sredstvo" (agens) se ovde koristi da označi hemijsko jedinjenje, smesu hcmijskih jedinjenja, biološki makromolekul, ili ekstrakt napravljen iz bioloških materijala.

Kao što je ovde korišćeno, "olakšati” oboljenje, poremećaj ili stanje znači smanjiti jačinu simptoma oboljenja, poremećaja ili stanja. Ovo uključuje, ali nije ograničeno na, uticaj na veličinu, rast i/ili masu tumora, stepen ili napredovanje metastaze i slično, u pacijentu u poređenju sa istim parametrima u pacijentu pred ili u odsustvu postupka lečenja.

Kao što je ovde korišćen, akronim “Idi” se odnosi na specifičan nizvodni ciljni gen ALK-1, Idi gen, koji je važan za angiogenezu. Nađeno je da Idi gen kontroliše angiogenetsku putanju u nekim kancerima tako što isključi proizvodnju proteina trombospondina-1 (TSP-1), prirodnog suppresora angiogeneze. Na primer, nađeno je da Idi gen, koji se intenzivno eksprimira u melanomu, u raku dojke, glave i vrata, mozga, grlića materice, prostate, pankreasa i testisa, dovodi do smanjene ekspresije TSP-1 i povećanog formiranja krvnih sudova tumora. Volpert, Olga V. et al, "Idi regulates angiogenesis through transcriptional repression of thrombospondin-1," Cancer Cell, Dec. 2002, Vol. 2, pp. 473-483.

Kao što je ovde korišćen, termin “Smad” se odnosi na proteine Smad domena nađene u nizu vrsta od nematoda do čoveka. Ovi jako konzervisani proteini sadrže N-terminalni MH1 domen koji se vezuje za DNK i odvojen je kratkim linker regionom od C-terminalnog MH2 domena, koji pokazuje zapanjujuću sličnost sa (FHA, od engl. forkhead-associated) domenima povezanim sa mestom račvanja. FHA i Smad (MH2) domeni dele zajedničku strukturu koja ima sendvič od jedanaest beta lanaca u dva sloja sa topologijom grčkog motiva. Smad proteini posreduju u signaliziranju koje vrše TGF-beta/aktivin/BMP-2/4 citokini od receptora Ser/Thr protein-kinaza na ćelijskoj površini do jedra. Smad proteini spadaju u tri funkcionalne klase: receptorski regulisani Smad-ovi (R-Smad-ovi), uključujući Smadl, -2, -3, -5, i -8, od kojih je svaki uključen u ligand-specifičnu signalnu putanju; ko-medijatorski Smad-ovi (ko-Smad-ovi), uključujući Smad4, koji interaguju sa R-Smad-ovima da bi učestvovali u signaliziranju i inhibitorni Smad-ovi (I-Smad-ovi), uključujući Smad-6 i -7, koji blokiraju aktivaciju R-Smad-ova i ko-Smad-ova, čime negativno regulišu signalne putanje.

Kao što je ovde korišćen, termin “TGF-beta” se odnosi na transformišuće faktore rasta beta, koji čine familiju multi-funkcionalnih citokina (TGF-beta 1-5) koja reguliše rast i diferencijaciju ćelija. Transformišući faktor rasta (TGF) je jedan od mnogih okarakterisanih faktora rasta koji postoje u prirodi. On igra suštinske uloge u “SCID” miševima sa teškom kombinovanom imunodeficijencijom. Mnoge ćelije sintetišu TGF-beta i u suštini sve imaju specifične receptore za ovaj peptid. TGF-beta reguliše dejstva of mnogih drugih peptidnih faktora rasta i određuje pozitivan ili negativan smer njihovih efekata. TGF-beta je citokin koji suprimira tumor sa efektima inhibicije rasta u epitelnim ćelijama. TGF-p može da deluje i kao promoter tumora tako što izaziva prelaz iz epitela u mezenhim. TGF-3 inaktivira nekoliko proteina uključenih u odvijanje ćelijskog ciklusa i time ispoljava svoje efekte inhibitora rasta na epitelne ćelije izazivajući njihovo zaustavljanje u G1 fazi ćelijskog ciklusa. Ovaj protein funkcioniše kao homodimer sa disulfidnim vezama. Njegova sekvenca se odlikuje prisustvom nekoliko C-terminalnih cisteinskih ostataka, koji formiraju disulfidne veze uređene u topologiju nalik na čvor. Slično uređenje "cisteinskog čvora" je primećeno u strukturama nekih enzimskih inhibitora i neurotoksina koji se vezuju za Ca2+ kanale zavisne od napona, mada im se detalji topologije razlikuju. TGF-beta geni se eksprimiraju diferencijalno, sugerišući da različite vrste TGF- beta mogu da imaju različite fiziološke uloge in vivo.

Kao što je ovde korišćen, termin “TGF-beta 1” se odnosi na receptor tipa 1 transformišućeg faktora rasta beta, koji je peptid od 112 aminokiselina, izveden proteolitičkim cepanjem sa C-kraja prekursorskog proteina. Ispitivanje mRNA nivoa TGF-beta 1 u tkivima odraslog miša ukazuje na to da je ekspresija predominantna u slezini, plućima i placenti. Veruje se da TGF-beta 1 igra važne uloge u patološkim procesima.

Kao što je ovde korišćen, termin “SCID” se odnosi na miševe sa teškom kombinovanom imunodeficijencijom.

Kao što je ovde korišćen, termin “HUVEC” se odnosi na humane endotelne ćelije pupčane vene.

Kao što je ovde korišćeno, “aminokiseline” su prikazane svojim punim imenom, svojim odgovarajućim šiframa od tri slova, ili svojim odgovarajućim šiframa od jednog slova, kao što je prikazano u sledećoj tabeli:

Puno ime Šifra od tri slova Šifra od jednog slova

Kao što je ovde korišćeno, dvadeset konvencionalnih aminokiselina i njihove skraćenice su u skladu sa konvencionalnom upotrebom. Videti Immunology—A Synthesis (2nd Edition, E. S. Golub and D. R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)), koji je ovde inkorporisan referencom.

"Konzervativna supstitucija aminokiseline" je ona u kojoj je aminokiselinski ostatak supstituisan drugim aminokiselinskim ostatkom (koji ima R grupu kao bočni lanac) sa sličnim hemijskim osobinama (npr., naelektrisanje ili hidrofobnost). U opštem slučaju, konzervativna supstitucija aminokiseline neće suštinski promeniti funkcionalne osobine proteina. U slučajevima gde se dve ili više aminokiselinskih sekvenci razlikuju među sobom po konzervativnim supstitucijama, procentualna identičnost sekvenci ili stepen sličnosti može da se poveća da bi se uzela u obzir konzervativna priroda supstitucije. Sredstva kojima se radi ovakvo podešavanje su dobro poznata stručnjacima. Videti, npr., Pearson, Methods Mol. Biol. 243:307-31 (1994).

Primeri grupa aminokiselina koje imaju bočne lance sa sličnim hemijskim osobinama uključuju 1) alifatične bočne lance: glicin, alanin, valin, leucin i izoleucin; 2) alifatično-hidroksilne bočne lance: serin i treonin; 3) bočne lance sa amidom: asparagin i glutamin; 4) aromatične bočne lance: fenilalanin, tirozin i triptofan; 5) bazne bočne lance: lizin, arginin i histidin; 6) kisele bočne lance: asparaginska kiselina i glutaminska kiselina i 7) bočne lance sa sumporom: cistein i metionin. Poželjne grupe za konzervativne supstitucije aminokiselina su: valin-leucin-izoleucin, fenilalanin-tirozin, lizin-arginin, alanin-valin, glutamat-aspartat i asparagin-glutamin.

Alternativno, konzervativna zamena je bilo koja promena koja ima pozitivnu vrednost u PAM250 "log-likelihood" matrici, opisanoj u Gonnet et ah, Science 256:1443-45 (1992), koji je ovde ugrađen referencom. "Umereno konzervativna" zamena je bilo koja promena koja ima ne-negativnu vrednost u PAM250 "log-likelihood" matrici.

U određenim izvođenjima, supstitucije aminokiselina u antitelu na ALK-1 ili njegovom delu za vezivanje antigena su one koje: (1) smanjuju susceptibilnost prema proteolizi, (2) smanjuju susceptibilnost prema oksidaciji, (3) menjaju afinitet vezivanja u formiranju proteinskih kompleksa i (4) daju ili modifikuju druge fiziko-hemijske ili funkcionalne osobine takvih analoga, ali ipak zadržavaju specifično vezivanje za ALK-1. Analozi mogu da uključe različite supstitucije u normalnim peptidnim sekvencama. Na primer, jednostruke ili višestrukemultiple supstitucije aminokiselina, poželjno konzervativne supstitucije aminokiselina, mogu da se rade u sekvencama koje se normalno javljaju, na primer, u delu polipeptida van domena koji formiraju međumolekulske kontakte. Supstitucije aminokiselina mogu da se rade i u domenima koji formiraju međumolekulske kontakte tako da poboljšaju aktivnost polipeptida. Konzervativna supstitucija aminokiseline ne bi trebalo da suštinski promeni strukturne karakteristike roditeljske sekvence; npr., zamena aminokiseline ne bi trebalo da promeni anti-paralelan (3-sloj koji čini imunoglobulinski domen vezivanja koji se javlja u roditeljskoj sekvenci ili da naruši druge tipove sekundarne strukture koja karakteriše roditeljsku sekvencu. U opštem slučaju, glicin i prolin se ne bi koristili za anti-paralelan P-sloj. Primeri sekundarnih i tercijarnih struktura polipeptida koji se koriste u struci su opisani u Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)); i Thornton et al., Nature 354:105 (1991), koji su ovde ugrađeni referencama.

Sličnost sekvenci za polipeptide, o kojoj se takođe govori kao o identičnosti sekvenci, se tipično meri pomoću softvera za analizu sekvenci. Softver za analizu proteina sparuje slične sekvence koristeći mere sličnosti dodeljene različitim supstitucijama, delecijama i ostalim modifikacijama, uključujući konzervativne supstitucije aminokiselina. Na primer, GCG sadrži programe kao što su "Gap" i "Bestfit", koji se mogu koristiti sa datim (default) parametrima za određivanje sekvencne homologije ili sekvencne identičnosti između srodnih polipeptida, kao što su homologi polipeptidi iz različitih vrsta organizama ili između prirodnog proteina i njegovog muteina. Videti, npr., GCG verziju 6.1. Polipeptidne sekvence se mogu porediti i pomoću FASTA korišćenjem datih ili preporučenih parametara, program u GCG verziji 6.1. FASTA (npr., FASTA2 i FASTA3) obezbeđuje poređenja i procentualnu identičnost sekvenci regiona najboljeg preklapanja između ispitivane i tražene sekvence (Pearson, Metods Enzymol. 183:63-98 (1990); Pearson, Metods Mol. Biol. 132:185-219 (2000)). Još jedan poželjan algoritam za poređenje sekvence iz pronalaska sa bazom podataka koja sadrži veliki broj sekvenci iz različitih organizama je kompjuterski program BLAST, naročito blastp ili tblastn, korišćenjem datih parametara. Videti, npr., Altschul et ak, J. Mol. Biol 215:403-410 (1990); Altschul et al., Nucleic Acid Res. 25:3389-402 (1997); koji su ovde ugrađeni referencama.

Dužina polipeptidnih sekvenci koje se porede na homologiju će generalno imati najmanje oko 16 aminokiselina, obično bar oko 20, još češće bar oko 24, tipično bar oko 28 i poželjno više od oko 35. Kad se pretražuju baze podataka koje sadrže sekvence iz velikog broja različitih organizama, poželjno je da se porede aminokiselinske sekvence. Termin "analog", kao što se ovde koristi, odnosi se na polipeptide koji se sastoje od segmenta od bar 25 aminokiselina koji ima suštinsku identičnost sa delom izvedene aminokiselinske sekvence koja se javlja u prirodi i koji ima bar jednu od osobina prirodnog polipeptida. Tipično, polipeptidni analozi imaju konzervativnu supstituciju aminokiselina (ili adiciju ili deleciju) u odnosu na sekvencu koja se javlja u prirodi. Analozi su tipično dugi bar 20 aminokiselina, poželjno bar 50 aminokiselina ili više, a često mogu biti dugi i koliko ceo polipeptid koji se javlja u prirodi.

Peptidni analozi se obično koriste u farmaceutskoj industriji kao ne-peptidni lekovi sa osobinama analognim onima peptida-obrasca. Ovi tipovi ne-peptidnih jedinjenja se zovu "mimetici peptida" ili "peptidomimetici". Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29 (1986); Veber and Freidinger TINS p.392 (1985) i Evans et al. J. Med. Chem. 30:1229 (1987), koji su ovde ugrađeni referencama. Takva jedinjenja su često razvijena uz pomoć kompjuterizovanog molekulskog modelovanja.

Mimetici peptida koji su strukturno slični terapijski korisnim peptidima mogu se koristiti da proizvedu ekvivalentan terapijski ili profilaktički efekat. Generalno, peptidomimetici su strukturno slični paradigmatskom polipeptidu (tjpolipeptidu koji ima biohemijsku osobinu ili farmakološko dejstvo), kao što je humano antitelo, ali imaju jednu ili više peptidnih veza koje su po želji zamenjene vezom odabranom iz grupe koju čine: — CH2NH—, —CH2S—, —CH2—CH2—, —CH=CH— (cis i trans), —COCH2—, -CH(OFI)CH2— i CH2 SO—, postupcima dobro poznatim u struci. Sistematska supstitucija jedne ili više aminokiseline iz konsenzus sekvence D-amino kiselinom istog tipa (npr., D-lizin umesto L-lizina) može se koristiti za pravljenje stabilnijih peptida. Pored toga, (konformaciono) napregnuti peptidi koji sadrže konsenzus sekvencu ili suštinski identičnu varijaciju konsenzus sekvence mogu se praviti postupcima poznatim u struci (Rizo and Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992), ovde ugrađen referencom); na primer, dodavanjem internih cisteinskih ostataka sposobnih da obrazuju intramolekulske disulfidne mostove koji ciklizuju peptid.

Intaktno "antitelo" ili “imunoglobulin” (Ig) sadrži najmanje dva teška (H, od "heavy", engl.) lanca (oko 50-70 kDa) i dva laka (L) lanca (oko 25 kDa), međusobno povezana disulfidnim vezama. Postoje samo dva tipa lakog lanca: X i k. Kod ljudi su oni slični, ali je samo jedan tip prisutan u svakom antitelu. Teški lance su klasifikovani kao mi, delta, gama, alfa, ili epsilon i odgovarajuće defmišu izotip antitela kao IgM, IgD, IgG, IgA i IgE. Videti uopšteno, Fundamental Immunologv Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)) (ovde ugrađen referencom u svojoj celokupnosti u sve svrhe). U jednom poželjnom izvođenju, antitelo je IgG i podtip IgGl, IgG2, IgG3 ili IgG4. U jednom poželjnijem izvođenju, antitelo na ALK-1 je potklasa IgG2.

Svaki težak lanac se sastoji od varijabilnog domena teškog lanca (Vh) i konstantnog regiona teškog lanca (Ch). Konstantni region teškog lanca se sastoji od tri domena, CH1, CH2 i CH3. Svaki lak lanac se sastoji od varijabilnog domena lakog lanca (Vl) i konstantnog regiona lakog lanca. Konstantni region lakog lanca se sastoji od jednog domena, Cl. Unutar lakih i teških lanaca, varijabilni i konstantni regioni su spojeni "J" regionom od oko 12 ili više aminokiselina, sa teškim lancem koji takođe uključuje "D" region od oko 3 ili više aminokiselina. VH i VL regioni se mogu dalje podeliti na regione hipervarijabilnosti, koji se nazivaju “regioni koji određuju komplementarnost” (CDR), umetnuti među regione koji su najviše očuvani, nazvani “okvirni regioni” (FR). Svaki VH i VL se sastoji od tri CDR-a i četiri FR-a, poredanih od amino-kraja do karboksil-kraja sledećim redom: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Dodeljivanje aminokiseline svakom domenu je u skladu sa definicijama Kabata, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD (1987 i 1991)), ili Chothia & Leslc, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Chothia et al., Nature 342:878-883 (1989).

Varijabilni domeni svakog para težak/lak lanac (Vh i Vl) formiraju mesto vezivanja antitela koje interaguje sa antigenom. Dakle, intaktno IgG antitelo, na primer, ima dva mesta vezivanja. Osim u bifunkcionalnim ili bispecifičnim antitelima, dva mesta vezivanja su ista. Konstantni regioni antitela mogu da posreduju u vezivanju imunoglobulina za tkiva ili faktore domaćina, uključujući različite ćelije imunog sistema (npr., efektorske ćelije) i prvu komponentu (Clq) klasičnog sistema komplementa.

Antitela moraju da imaju dovoljno veliki diverzitet vezivanja antigena da bi prepoznala svaki mogući patogen (mnogi V regioni), a da istovremeno održavaju biološku efektivnost svojih C regiona (malo C regiona). Ig geni su nasumice spojeni iz segmenata gena koji dozvoljavaju da se koriste mnogi V regioni sa samo nekoliko C regiona. Segmenti gena koji kodiraju Ig H, kapa i lambda lance, su nađeni na tri različita hromozoma. Tokom razvića B ćelija, enzimi rekombinaze uklanjaju introne i neke egzone iz DNK i spajaju segmente u funkcionalne Ig gene.

Segmenti Ig gena u sisarima su uređeni u grupe “varijabilnih” (V), “raznovrsnih” (D, od diversity, engl.), “spajajućih” (J, od joining, engl.) i “konstantnih” (C) egzona. Svaki od V kapa (Vk) segmenata kodira prva dva CDR i tri FR iz kapa V regiona lanca, plus nekoliko aminokiselina CDR3. Svaki od J kapa (Jk) segmenata kodira ostatak CDR3 i četvrti FR. C kapa (Ck) kodira kompletan C region kapa lakog lanca. DNK koja kodira humani kapa lanac uključuje približno 40 funkcionalnih V kapa (Vk) segmenata, pet J kapa (Jk) segmenata i jedan C kapa (Ck) genski segment, kao i neke segmente gena koji sadrže stop kodone (“pseudogeni”). DNK humanog lambda (k) lanca sadrži približno 30 funkcionalnih V lambda (Vk) segmenata i četiri funkcionalnih skupova J lambda (Jk) i C lambda (Ck) segmenata. Određeni J lambda (Jk) se uvek sparuje sa svojim odgovarajućim C lambda (Ck), za razliku od J kapa (Jk), koji se svi sparuju sa istim C kapa (Ck). DNK za humani H lanac uključuje približno 50 funkcionalnih VH segmenata, 30 Dh segmenata i šest Jh segmenata. Prva dva CDR i tri FR varijabilna domena teškog lanca kodira Vh- CDR3 kodira nekoliko nukleotida Vh, svi iz Dh, i deo Jh, dok je FR4 kodiran ostatkom Jh segmenta gena. Postoje i pojedinačni segmenti gena u DNK za svaki domen teškog lanca i membranski region svakog izotipa, poredanih po redu po kom se eksprimiraju u B ćelijama.

Termin “polipeptid” obuhvata nativne ili veštačke proteine, proteinske fragmente i polipeptidne analoge proteinske sekvence. Polipeptid može biti monomeran ili polimeran.

Termin “izolovan protein”, “izolovan polipeptid” ili “izolovano antitelo” je protein, polipeptid ili antitelo koje, po svom poreklu ili izvoru derivacije, (1) nije povezano sa prirodno pridruženim komponentama koje ga prate u njegovom nativnom stanju, (2) je slobodno od drugih proteina iste vrste, (3) je eksprimirano u ćeliji iz različite vrste, ili (4) se ne javlja u prirodi. Prema tome, polipeptid koji je hemijski sintetisan ili je sintetisan u ćelijskom sistemu različitom od ćelije u kojoj prirodno nastaje, će biti “izolovan” od svojih prirodno pridruženih komponenata. Protein se takođe može dobiti suštinski oslobođen od svojih prirodno pridruženih komponenata izolovanjem, upotrebom tehnika prečišćavanja proteina dobro poznatih u struci.

Primeri izolovanog antitela uključuju, ali nisu ograničeni na, antitelo na ALK-1 koje je afmitivno prečišćeno pomoću ALK-1 i antitelo na ALK-1 koje je sintetisano u ćelijskoj liniji in vi tro.

Protein ili polipeptid je “suštinski čist”, “suštinski homogen,” ili “suštinski prečišćen” kad najmanje oko 60 do 75% uzorka ispoljava jednu jedinu vrstu polipeptida. Polipeptid ili protein može biti monomeran ili multimeran. Suštinski čist polipeptid ili protein može tipično da sadrži oko 50, 60, 70, 80 ili 90 težinskih % proteinskog uzorka, češće oko 95% i poželjno može da bude preko 99% čist. Čistoća ili homogenost proteina se može odrediti brojnim sredstvima dobro poznatim u struci, kao što je elektroforeza proteinskog uzorka na poliakrilamidnom gelu, gde se vizuelno određuje poedinačna traka polipeptida posle bojenja gela bojom dobro poznatom u struci. U određene svrhe, može se obezbediti viša rezolucija upotrebom HPLC ili nekih drugih načina dobro poznatih u struci prečišćavanja.

Termin “polipeptidni fragment”, kao što je ovde korišćen, odnosi se na polipeptid koji ima deleciju na amino-kraju i/ili karboksi-kraju, ali gde je preostala aminokiselinska sekvenca identična odgovarajućim pozicijama u sekvenci koja se javlja prirodno. U nekim izvođenjima, fragmenti su najmanje 5, 6, 8 ili 10 aminokiselina dugi. U nekim drugim izvođenjima, fragmenti su najmanje 14, najmanje 20, najmanje 50, ili najmanje 70, 80, 90, 100, 150 ili 200 aminokiselina dugi.

Termin “analog” ili “polipeptidni analog”, kao što se ovde koristi, odnosi se na polipeptid koji sadrži segment koji ima suštinsku identičnost sa nekom referentnom aminokiselinskom sekvencom i ima suštinski istu funkciju ili aktivnost kao referentna aminokiselinska sekvenca. Tipično, polipeptidni analozi sadrže konzervativnu supstituciju aminokiselina (ili inserciju ili deleciju) u odnosu na referentnu sekvencu. Analozi mogu biti bar 20 ili 25 aminokiselina dugi, ili mogu biti bar 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 ili 200 aminokiselina dugi ili duži i često mogu imati ćelu dužinu polipeptida. Neka izvođenja iz pronalaska uključuju polipeptidne fragmente ili polipeptidne analoge antitela sa 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 ili 17 supstitucija u embrionskoj aminokiselinskoj sekvenci. Fragmente ili analoge antitela ili imunoglobulinskih molekula može lako pripremiti stručnjak uobičajenog nivoa prateći uputstva iz ove specifikacije.

Termin "deo za vezivanje antigena" antitela (ili jednostavno "deo antitela"), kao što je ovde korišćen, odnosi se na jedan ili više fragmenata antitela koji zadržavaju sposobnost da se specifično vezuju za antigen (npr., ALK-1 ili ECD iz ALK-1). Pokazano je da funkciju antitela da vezuje antigen mogu da obavljaju fragmenti celog antitela. Primeri fragmenata za vezivanje koji su obuhvaćeni u okviru termina "deo za vezivanje antigena" antitela uključuju (i) Fab fragment, monovalentan fragment koji se sastoji od Vl, Vh, Cl i CH1 domena; (ii) F(ab')2 fragment, bivalentan fragment koji sadrži dva Fab fragmenta spojena disulfidnim mostom na regionu šarke; (iii) Fd fragment koji se sastoji od VH i ChI domena; (iv) Fv fragment koji se sastoji od Vl i Vh domena jednog kraka antitela, (v) dAb fragment (Ward et ak, (1989) Nature 341:544-546), koji se sastoji od VH domena i (vi) izolovan region koji određuje komplementarnost (CDR). Štaviše, iako su dva domena Fv fragmenta, VL i Vh, kodirana odvojenim genima, oni mogu biti spojeni, pomoću rekombinantnih postupaka, sintetičkom spojnicom (linkerom) koja im omogućava da budu napravljeni kao jedan jedini proteinski lanac, u kome se Vl i Vh regioni sparuju da bi formirali jednovalentne molekule (poznate kao jednolančani Fv (scFv)); videti, npr., Bird et al. Science 242:423-426 (1988) i Huston et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988)). Takva jednolančana antitela su takođe obuhvaćena terminom "deo za vezivanje antigena" antitela. Drugi obići jednolančanih antitela, kao što su dijatela, su takođe obuhvaćeni. Dijatela su dvovalentna, bispecifična antitela, u kojima su Vh i Vl domeni eksprimirani na jednom jedinom polipeptidnom lancu, ali pomoću linkera koji je suviše kratak da bi im dozvolio sparivanje između dva domena na istom lancu, time prisiljavajući domene da se spare sa komplementarnim domenima drugog lanca čime se prave dva mesta za vezivanje antigena (videti, npr., Holliger et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993); Poljak et al. Structure 2:1121-1123 (1994)).

Dalje, antitelo ili njegov deo za vezivanje antigena može biti deo većih imunoadhezionih molekula, formiranih kovalentnom ili nekovalentnom asocijacijom antitela ili dela antitela sa jednim ili više drugih proteina ili peptida. Primeri takvih imunoadhezionih molekula uključuju upotrebu streptavidinskog jezgarnog regiona za pravljenje tetramernih scFv molekula (Kipriyanov et al. Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101 (1995)) i upotrebu cisteinskog ostatka, peptidnog markera i polihistidinske “repiće“ sa C-kraja za pravljenje dvovalentnih i biotinilovanih scFv molekula (Kipriyanov et al. Mol. Immunol. 31:1047-1058 (1994)). Drugi primeri uključuju one gde je jedan ili više CDR-ova iz antitela ugrađeno u molekul, bilo kovalentno bilo nekovalentno, da bi se napravio imunoadhezin koji specifično vezuje antigen od interesa, kao što je ALK-1 ili ECD iz ALK-1. U takvim izvođenjima, CDR(-ovi) mogu biti ugrađeni kao deo većeg polipeptidnog lanca, mogu biti kovalentno vezani za drugi polipeptidni lanac ili mogu biti ugrađeni nekovalentno.

Delovi antitela, kao što su Fab i F(ab')2 fragmenti, mogu se dobijati iz celih antitela konvencionalnim tehnikama, kao što je digestija celih antitela papainom, odnosno, pepsinom. Štaviše, antitela, delovi antitela i imunoadhezioni molekuli mogu se dobijati standardnim tehnikama pomoću rekombinantne DNK, kao što je opisano ovde.

Kao što je ovde korišćen, termin “humano antitelo” označava bilo koje antitelo u kome su sekvence varijabilnog i konstantnog domena humane sekvence. Termin obuhvata antitela sa sekvencama izvedenim iz humanih gena, ali koje su promenjen, npr. da bi se smanjila moguća imunogenost, povećao afinitet, eliminisali cisteini koji bi mogli da izazovu nepoželjno savijanje, itd. Termin talcođe obuhvata takva antitela koja su proizvedena rekombinantno u ne-humanim ćelijama, koja bi mogla da dovedu do glikozilacije, netipične za humane ćelije. Ova antitela se mogu dobijati na mnogo načina, kao stoje opisano niže.

Kao što je ovde korišćen, termin “neutrališuće antitelo,” “inhibitorno antitelo” ili antagonističko antitelo označava antitelo koje inhibira signalnu putanju ALK-1/TGF-beta-1/Smadl. U jednom poželjnom izvođenju, antitelo inhibira signalnu putanju ALK-l/TGF-beta-l/Smadl za najmanje oko 20%, poželjno 40%, poželjnije 60%, još poželjnije 80%, ili čak još poželjnije 85%. Neutrališući ili inhibitorni potencijal humanih antitela na ALK-1 može se odrediti, na primer, preko njihove sposobnosti da inhibiraju ushodnu regulaciju specifičnog nizvodnog ciljnog gena ALK-1, Idi, kao što je prikazano u Primeru 12; da inhibiraju fosforilaciju Smadl, što se određuje Western Blot tehnikom upotrebom Odyssey Infrared Imaging System-a od LI-COR Biosciences, kao što je prikazano u Primeru 13.

Termin “himerno antitelo” kao što je ovde korišćen, označava antitelo koje sadrži regione iz dva ili više različitih antitela. Na primer, jedan ili više CDR-ova himernog antitela može se izvesti iz humanog antitela na ALK-1. U jednom drugom primeru, svi CDR-ovi se mogu izvesti iz humanog antitela na ALK-1. A u još jednom primeru, CDR-ovi iz više od jednog humanog antitela na ALK-1 mogu se kombinovati u himerno antitelo. Na primer, himerno antitelo može da sadrži CDR1 iz lakog lanca prvog humanog antitela na ALK-1, CDR2 iz lakog lanca drugog humanog antitela na ALK-1 i CDR3 iz lakog lanca trećeg humanog na ALK-1, a CDR-ovi iz teškog lanca mogu biti izvedeni iz jednog ili više drugih antitela na ALK-1. Dalje, okvirni regioni mogu biti izvedeni iz jednog od antitela na ALK-1, iz kog je uzet jedan ili više CDR-ova ili iz jednog ili više različitih humanih antitela. Štaviše,

kao stoje ovde ranije diskutovano, himerno antitelo uključuje antitelo koje sadrži deo izveden iz embrionskih sekvenci više od jedne vrste.

U nekim izvođenjima, himerno antitelo iz pronalaska je humanizovano antitelo na ALK-1. Humanizovano antitelo na ALK-1 iz pronalaska sadrži aminokiselinsku sekvencu jednog ili više okvirnih regiona i/ili aminokiselinsku sekvencu bar iz dela konstantnog regiona jednog ili više humanih antitela na ALK-1 iz pronalaska i dalje sadrži sekvence izvedene iz ne-humanog antitela na ALK-1, na primer CDR sekvence.

Kao što je ovde korišćen, termin “ELISA” se odnosi na imunosorpciju vezanu za neki enzim (od engl. enzyme-linked imunosorbent assay). Ovaj test je dobro poznat stručnjacima. Primeri ovog testa mogu se naći u Vaughan, T.J. et ah, Nature Biotech. 14:309-314 (1996), kao i u Primeru 2 ove aplikacije.

Termin “površinska plazmonska rezonanca”, kao što je ovde korišćen, odnosi se na optički fenomen koji omogućava analizu biospecifičnih interakcija u realnom vremenu detekcijom promena u proteinskim koncentracijama unutar biosenzornog matriksa, na primer, pomoću BIACORE1M sistema (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden i Piscataway, N.J.). Za dalje opise, videti Jonsson et ah, Ann. Biol. Clin. 51:19-26 (1993); Jonsson et ah, Biotehniques 11:620-627 (1991); Jonsson et ah, J. Mol. Recognit. 8:125-131 (1995) i Johnsson et ah, Anal. Biochem. 198:268-277 (1991).

Termin “afinitet” se odnosi na meru privlačenja između antigena i antitela. Intrinsična privlačnost antitela za antigen se tipično izražava kao ravnotežna konstanta afiniteta za vezivanje (Kd) određene interakcije antitela i antigena. Za antitelo se kaže da specifično vezuje antigen kad je Kd < 1 mM, poželjno < 100 nM. Konstanta afiniteta za vezivanje Kd može se meriti površinskom plazmonskom rezonancom, na primer, pomoću BIACOREIM sistema, kao što je diskutovano u Primerima 7 i 8.

Termin “k0ff” se odnosi na konstantu brzine disocijacije određene interakcije antitela i antigena. Konstanta brzine disocijacije k0ff može da se meri površinskom plazmonskom rezonancom, na primer, pomoću BIACOREIM sistema, kao stoje diskutovano u Primerima 7 i 8.

Termin “aviditet” se odnosi na snagu funkcionalnog kombinovanja antitela sa njegovim antigenom, koja se zasniva i na afinitetu i na valencama antitela. Kao što je ovde korišćen, ovaj termin opisuje povećan afinitet koji se javlja kao rezultat višestrukih antigenskih mesta vezivanja na imunoglobulinu.

Kao što je ovde korišćen, termin “molekulska selektivnost” se odnosi na afinitet za vezivanje antitela za specifičan antigen koji je veći nego za druge antigene. Na primer, antitela iz ovog pronalaska mogu da budu selektivna za ALK-1 u odnosu na ALK-2 do ALK-7, što znači daje afinitet za vezivanje antitela za ALK-1 bar 2 puta veći, na primer 4 puta, ili 10 puta, ili 50 puta, ili 100 puta ili više, nego za ALK-2 do ALK-7. Takvi afiniteti za vezivanje mogu da se mere standardnim tehnikama koje su poznate stručnjacima.

Termin “epitop” uključuje bilo koju determinantu proteina, sposobnu za specifično vezivanje za imunoglobulin ili receptor T-ćelije ili za neko drugo interagovanje sa molekulom. Epitopske determinante se uglavnom sastoje od hemijski aktivnih površinskih grupacija molekula kao što su aminokiseline ili ugljovodonični bočni lanci ili bočni lanci šećera i uglavnom imaju specifične trodimenzione strukturne karakteristike, kao i specifične karakteristike naelektrisanja. Epitop može biti “linearan” ili “konformacioni.” U linearnom epitopu, sve tačke interakcija između proteina i interagujućeg molekula (kao što je antitelo) se javljaju linearno duž primarne aminokiselinske sekvence proteina. U konformacionom epitopu, tačke interakcije se javljaju na aminokiselinskim ostacima na proteinu koji su razdvojeni jedan od drugog. Jednom kad se odredi željeni epitop na antigenu, moguće je praviti antitela za taj epitop, npr., upotrebom tehnika opisanih u ovom pronalasku. Alternativno, tokom procesa otkrivanja, pravljenje i karakterizacija antitela mogu da pojasne informaciju o željenim epitopima. Iz ove informacije je zatim moguće pretražiti antitela kompeticijom za vezivanje za isti epitop. Jedan pristup da se ovo postigne je da se izvedu unakrsno-kompetitivne studije za nalaženje antitela koja se kompetitivno vezuju među sobom, tj. antitela su u kompeticiji u vezivanju za antigen. Proces određivanja korisnog dejstva (throughput process) za “grupisanje” antitela baziran na njihovoj unakrsnoj kompeticiji je opisan u International Patent Application No. WO 03/48731.

Kao što je ovde korišćen, termin “grupisanje” (binning) se odnosi na postupak za grupisanje antitela, koji se zasniva na njihovim karakteristikama vezivanja za antigen. Dodela “grupe” (bin) je donekle arbitrarna, u zavisnosti od toga koliko su različiti uočeni obrasci vezivanja kod svih testiranih antitela. Prema tome, grupe ne koreliraju uvek sa epitopima određenim na druge načine i ne bi trebalo da se koriste za defmisanje epitopa.

Termin “u kompeticiji”, kao stoje ovde korišćen u odnosu na antitelo, znači daje prvo antitelo ili njegov deo za vezivanje antigena, u kompeticiji za vezivanje antigena sa drugim antitelom ili njegovim delom za vezivanje antigena, kad se vezivanje prvog antitela sa njemu srodnim epitopom primetno smanjuje u prisustvu drugog antitela, u poređenju sa vezivanjem prvog antitela u odsustvu drugog antitela. Alternativno, kad je vezivanje drugog antitela za njegov epitop takođe primetno smanjeno u prisustvu prvog antitela, može, ali ne mora da bude slučaj. To jest, prvo antitelo može da inhibira vezivanje drugog antitela za njegov epitop, a da to drugo antitelo ne inhibira vezivanje prvog za njegov odgovarajući epitop. Međutim, kad svako antitelo primetno inhibira vezivanje onog drugog antitela sa njemu srodnim epitopom ili ligandom, bilo u istoj, većoj, ili manjoj meri, za antitela se kaže da su “u unakrsnoj kompeticiji” jedan sa drugim za vezivanje za njihov(e) odgovarajuć(e) epitop(e). Antitela i u kompeticiji i u unakrsnoj kompeticiji su obuhvaćena ovim pronalaskom. Bez obzira na mehanizam kojim se takva kompeticija ili unakrsna kompeticija odvija (npr., sterička smetnja, konformaciona promena ili vezivanje za zajednički epitop ili njegov deo i slično), upućen stručnjak će prepoznati, na osnovu uputstava datih ovde, da je takva kompeticija i/ili unakrsna kompeticija antitela obuhvaćena i može biti korisna za postupke koji su ovde opisani.

Termin “polinukleotid”, kao što je ovde korišćen, označava polimeran oblik nukleotida dužine od najmanje 10 baza, bilo da su ribonukleotidi, bilo dezoksinukleotidi, bilo modifikovan oblik bilo kog tipa nukleotida. Termin uključuje jedno- i dvolančane forme.

Termin “izolovan polinukleotid”, kao što je ovde korišćen, označava polinukleotid genomskog, cDNK ili sintetičkog porekla ili neku njihovu kombinaciju, koji, po poreklu (1) nije povezan sa svim ili delom polinukleotida sa kojima se “izolovan polinukleotid” nalazi u prirodi, (2) je operativno spojen sa polinukleotidom sa kojim nije spojen u prirodi ili (3) se ne javlja u prirodi kao deo veće sekvence.

Termin “nukleotidi koji se javljaju u prirodi”, kao što je ovde korišćen, uključuje dezoksiribonulcleotide i ribonukleotide. Termin “modifikovani nukleotidi”, kao što je ovde korišćen, uključuje nukleotide sa modifikovanim ili supstituisanim grupama šećera i slično. Termin “oligonukleotidni spojevi”, koji se ovde koristi, uključuje oligonukleotidne spojeve kao što su fosforotioat, fosforoditioat, fosforoselenoat, fosforodiselenoat, fosforoanilotioat, fosforaniladat, fosforoamidat i slično. Videti, npr., LaPlanche et al., Nucl. Acids Res. 14:9081 (1986); Stec et al., J. Am. Chem. Soc. 106:6077 (1984); Stein et al., Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988); Zon et al., Anti-Kancer Drug Design 6:539 (1991); Zon et al., Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991)); U.S. Patent No. 5,151,510; Uhlmann and Peyman, Chemical Reviews 90:543 (1990), čiji su opisi ovde ugrađeni referencom. Oligonukleotid može po želji da uključi obeleživač za detekciju.

“Operativno spojene” sekvence uključuju i sekvence za kontrolu ekspresije koje su u susedstvu sa genom od interesa i sekvence za kontrolu ekspresije koje deluju u trans ili na rastojanju da kontrolišu gen od interesa.

Termin “sekvenca za kontrolu ekspresije”, kao što je ovde korišćen, označava polinukleotidne sekvence koje su neophodne da deluju na ekspresiju i obradu kodirajućih sekvenci za koje su vezane. Sekvence za kontrolu ekspresije uključuju odgovarajuće sekvence za početak i kraj transkripcije, promotorske i stimulatorske ("enhanser") sekvence; signale za efikasnu obradu RNK, kao što su signali za iskrajanje i poliadenilaciju; sekvence koje stabilišu citoplazmatsku iRNK; sekvence koje pojačavaju efikasnost translacije (tj., Kozak konsenzus sekvenca); sekvence koje pojačavaju stabilnost proteina i kad je poželjno, sekvence koje pojačavaju sekreciju proteina. Priroda takvih kontrolnih sekvenci se razlikuje u zavisnosti od organizma domaćina; u prokariotama, takve kontrolne sekvence uglavnom uključuju promoter, mesto za vezivanje ribozoma i sekvencu za završetak transkripcije; u eukariotama, uopšteno, takve kontrolne sekvence uključuju promotere i sekvencu za kraj transkripcije. Namera je da termin “kontrolne sekvence” uključi, kao minimum, sve komponente čije je prisustvo esencijalno za ekspresiju i obradu, a može da uključi i dodatne komponente čije je prisustvo povoljno, na primer, čeone sekvence i fuzione partnerske sekvence.

Termin “vektor”, kao što je ovde korišćen, označava molekul nukleinske kiseline sposoban da transportuje drugu nukleinsku kiselinu sa kojom je vezan. U nekim izvođenjima, vektor je plazmid, tj., kružan dvolančani komad DNK u koji se mogu ligirati dodatni segmenti DNK. U nekim izvođenjima, vektor je virusni vektor, gde se dodatni segmenti DNK mogu ligirati u virusni genom. U nekim izvođenjima, vektori su sposobni za autonomnu replikaciju u ćeliji domaćinu u koju su uvedeni (npr., bakterijski vektori koji imaju bakterijsko poreklo replikacije i epizomski sisarski vektori). U nekim drugim izvođenjima, vektori (npr., ne-epizomski sisarski vektori) mogu biti integrisani u genom ćelije domaćina po uvođenju u ćeliju domaćina i time replicirani zajedno sa domaćinovim genomom. Štaviše, određeni vektori su sposobni da usmeravaju ekspresiju gena za koje su operativno vezani. Takvi vektori se ovde pominju pod nazivom “rekombinantni vektori ekspresije” (ili jednostavno, “ekspresioni vektori”).

Termin “rekombinantna ćelija domaćin” (ili jednostavno “ćelija domaćin”), kao što je ovde korišćen, označava ćeliju u koju je uveden rekombinantni ekspresioni vektor. Podrazumeva se da “rekombinantna ćelija domaćin” i “ćelija domaćin” označavaju ne samo određenu ćeliju, nego i potomstvo takve ćelije. Pošto mogu da se jave određene modifikacije u sledećim generacijama bilo zbog mutacija, bilo zbog uticaja sredine, takvo potomstvo ne mora, u stvari, da bude identično roditeljskoj ćeliji, ali je ipak uključeno u opseg termina “ćelija domaćin”, kao što se ovde koristi.

Kao što je ovde korišćen, termin “embrionski” se odnosi nukleotidne sekvence i aminokiselinske sekvence gena antitela i genskih segmenata, kako se one prenose sa roditelja na potomstvo preko embrionskih ćelija. Ova embrionska sekvenca se razlikuje od nukleotidnih sekvenci koje kodiraju antitela u zrelim B ćelijama koje su izmenjene rekombinantnim i hipermutacionim događajima tokom maturacije B ćelija. Antitelo koje “koristi” određenu embrionsku liniju ima nukleotidnu ili aminokiselinsku sekvencu koja je najbliža sa onom embrionskom nukleotidnom sekvencom ili sa aminokiselinskom sekvencom koju ona određuje. Takva antitela su često mutirana u poređenju sa embrionskom sekvencom.

Termin “procentualna identičnost sekvenci” u kontekstu sekvenci nukleinskih kiselina označava ostatke u dve sekvence koji su isti kad se one postave po redosledu maksimalne korespondencije. Dužina sekvenci za poređenje pri određivanju identičnosti može biti najmanje oko devet nukleotida, obično najmanje oko 18 nukleotida, još češće najmanje oko 24 nukleotida, tipično najmanje oko 28 nukleotida, još tipičnije najmanje oko 32 nukleotida i poželjno najmanje oko 36, 48 ili više nukleotida. Postoji niz različitih algoritama poznatih u struci koji se mogu koristiti za merenje identičnosti nukleotidnih sekvenci. Na primer, polinukleotidne sekvence se mogu porediti pomoću FASTA, Gap ili Bestfit, programa u Wisconsin Package Version 10.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisconsin. FASTA, koji uključuje, npr., programe FASTA2 i FASTA3, obezbeđuje poređenje i procentualnu identičnost sekvenci regiona najboljeg preklapanja ispitivanih i željenih sekvenci (Pearson, Methods Enzymol. 183:63-98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol. 132:185-219 (2000); Pearson, Mehtods Enzymol. 266:227-258 (1996); Pearson, J. Mol. Biol. 276:71-84 (1998); ugrađeni ovde referencom). Ako nije drukčije specifikovano, koriste se parametri koji su dati u obrascu (default) za određeni program ili algoritam. Na primer, procentualna identičnost sekvenci između sekvenci nukleinskih kiselina može se odrediti pomoću FASTA sa njegovim parametrima u obrascu (reč od 6 slova i NOPAM faktor za ocenjivanje) ili pomoću Gap sa njegovim parametrima u obrascu, kakvi su u GCG Version 6.1, ugrađenom ovde referencom.

Pozivanje na nulcleotidnu sekvencu obuhvata njen komplement ako nije drukčije specifikovano. Dakle, pozivanje na nukleinsku kiselinu koja ima određenu sekvencu treba da podrazumeva i njen komplementaran lanac, sa komplementarnom sekvencom.

Termin “suštinska sličnost” ili “suštinska sličnost sekvenci”, kad se odnosi na nukleinsku kiselinu ili njen fragment, znači da kad se optimalno postavi sa odgovarajućim nukleotidnim insercijama ili delecijama sa drugom nukleinskom kiselinom (ili njenim komplementarnim lancem), postoji identičnost nukleotidnih sekvenci u bar oko 85%, poželjno bar oko 90% i još poželjnije bar oko 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% nukleotidnih baza, što se meri bilo kojim od dobro poznatih algoritama za identičnost sekvenci, kao što je FASTA, BLAST ili Gap, kao što je gore diskutovano.

Termin “procentualna identičnost sekvenci” u kontekstu aminokiselinskih sekvenci označava ostatke u dve sekvence koje su iste kad se postave za maksimalno odgovaranje. Dužina sekvenci za poređenje pri određivanju identičnosti može biti najmanje oko pet aminokiselina, obično bar oko 20 aminokiselina, češće bar oko 30 aminokiselina, tipično bar oko 50 aminokiselina, još tipičnije bar oko 100 aminokiselina i čak još tipičnije oko 150, 200 ili više aminokiselina. Postoji niz različitih algoritama poznatih u struci koji se mogu koristiti za merenje identičnosti aminokiselinskih sekvenci Na primer, aminokiselinske sekvence se mogu porediti pomoću FASTA, Gap ili Bestfit, programa u Wisconsin Package Version 10.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisconsin.

Kad se primenjuje na polipeptide, termin “suštinska identičnost” ili “suštinska sličnost” označava da dve aminokiselinske sekvence, kad se optimalno postave, što se radi programima GAP ili BESTFIT uz vrednosti gap težina u obrascu programa, dele najmanje 70%, 75% ili 80% identičnosti sekvenci, poželjno najmanje 90% ili 95% identičnosti sekvenci i još poželjnije najmanje 97%, 98% ili 99% identičnosti sekvenci. U određenim izvođenjima, pozicije ostataka koji nisu identični se razlikuju po konzervativnim supstitucijama aminokiselina.

Termin "signalna sekvenca," takođe nazivan signalni peptid, čeoni peptid, odnosi se na segment od oko 15 do 30 aminokiselina na N-kraju proteina koji omogućava proteinu da bude sekretovan (da prođe kroz ćelijsku membranu). Signalna sekvenca se uklanja kako se protein sekretuje.

Kao što su ovde korišćeni, termini “obeleživač” ili “obeležen” se odnose na ugrađivanje drugog molekul u antitelo. U jednom izvođenju, obeleživač je detektabilni marker, npr., ugrađivanje radioaktivno obeležene aminokiseline ili kačenje biotinil grupa za polipeptid koje se mogu detektovati markiranim avidinom (npr., streptavidin koji sadrži fluorescentni marker ili enzimsku aktivnost koja se može detektovati optičkim ili kolorimetrijskim postupcima). U jednom drugom izvođenju, obeleživač ili marker može biti terapijski, npr., konjugovan sa lekom ili toksin. Različiti postupci obeležavanja polipeptida i glikoproteina su poznati u struci i mogu se koristiti. Primeri obeleživača za polipeptide uključuju, ali nisu ograničeni na, sledeće: radioizotopi ili radionuklidi (npr., 3H, l4C, l5N, 35S, 90Y, 99Tc, 111ln, l25I, l3lI), fluorescentni obeleživači (npr., FITC, rodamin, fosfolantanidi), enzimski obeleživači (npr., peroksidaza rena, P-galaktozidaza, luciferaza, alkalna fosfataza), hemiluminescentni obeleživači, biotinil grupe, prethodno određeni polipeptidni epitopi koje prepoznaje sekundarni reporter (npr., par sekvenci leucinskog rajsferšlusa, mesta za vezivanje sekundarnog antitela, domeni za vezivanje metala, epitopni markeri), magnetna sredstva, kakva su gadolinijum helati, toksini kakav je pertusis toksin, taksol, citohalazin B, gramicidin D, etidijum bromid, emetin, mitomicin, etopozid, tenopozid, vinkristin, vinblastin, koihicin, doksorubicin, daunorubicin, dihidroksi antracin dion, mitoksantron, mitramicin, aktinomicin D, 1-dehidrotestosteron, glukocorticoidi, prokain, tetrakain, lidokain, propranolol i puromicin i njihovi analozi ili homolozi. U nekim izvođenjima, obeleživači su zakačeni preko lanaca-nosača različitih dužina da bi se smanjila potencijalna sterička smetnja.

Termin “primat” se odnosi na sisara iz reda primata, što uključuje antropoide i polumajmune, koje karakteriše fini razvoj šaka i stopala, skraćena gubica i veliki mozak. Sisarski red Primata uključuje ljude, čovekolike majmune, majmune i polumajmune ili niže primate.

"Terapijski efektivna količina" se odnosi na onu količinu terapijskog sredstva koja se daje, a koja će do neke mere ublažiti jedan ili više simptoma poremećaja koji se tretira. Kad je reč o tretmanu kancera, terapijski efektivna količina se odnosi na onu količinu koja ima bar jedan od sledećih efekata: smanjenje veličine tumora; inhibiranje (odnosno, usporavanje do neke mere, poželjno zaustavljanje) metastaze tumora; inhibiranje do neke mere (odnosno, usporavanje do neke mere, poželjno zaustavljanje) rasta tumora i ublažavanje do neke mere (ili, poželjno, eliminisanje) jedan ili više simptoma vezanih za kancer.

"Tretirati", "tretiranje" i "tretman" ("lečenje") se odnose na postupak ublažavanja ili ukidanja biološkog poremećaja i/ili njemu pridruženih simptoma. U slučaju kancera, ovi termini jednostavno znače da će se povećati očekivana dužina života osobe pogođene kancerom ili da će se smanjiti jedan ili više simptoma bolesti.

"Kontaktiranje" se odnosi na dovođenje u dodir antitela ili njegovog dela za vezivanje antigena iz ovog pronalaska i ciljanog ALK-1, ili njegovog epitiopa na takav način da antitelo može da utiče na biološku aktivnost ALK-1. Takvo "kontaktiranje" se može postići "in vitro," tju epruveti, petri šolji ili slično. U epruveti, kontaktiranje može da uključi samo antitelo ili njegov deo za vezivanje antigena i ALK-1 ili njegov epitop ili može da uključi ćele ćelije. Ćelije se takođe mogu održavati ili rasti u posudama za ćelijsku kulturu i dovoditi u kontakt sa antitelima ili njihovim delovima za vezivanje antigena u toj sredini. U ovom kontekstu, sposobnost određenog antitela ili njegovog dela za vezivanje antigena da utiče na poremećaj vezan za ALK-1, tj., IC50 antitela, može se odrediti pre pokušaja upotrebe antitela in vivo sa složenijim živim organizmima. Za ćelije izvan organizma, postoje mnogi postupci za kontaktiranje ALK-1 sa antitelima ili njihovim delovima za vezivanje antigena i oni su dobro poznati stručnjacima.

Akronim “FACS” se odnosi na sortiranje fluorescencijom aktiviranih ćelija (Fluorescence Activated Cell Sorting). Akronim FACS i protočna citometrija se koriste ravnopravno. Fluorescentno obeležavanje dopušta ispitivanje strukture i funkcije ćelija. Imunofluorescencija, najšire korišćen postupak, uključuje bojenje ćelija antitelima konjugovanim sa fluorescentnim bojama kakve su fluorescein i fikoertrin. Ovaj postupak se često koristi za obeležavanje molekula na ćelijskoj površini, ali antitela se mogu usmeriti na mete u citoplazmi. U direktnoj imunofluorescenciji, antitelo na molekul je direktno konjugovano sa fluorescentnom bojom i ćelije se boje u jednom koraku. U indirektnoj imunofluorescenciji, primarno antitelo nije obeleženo, nego se dodaje drugo fluorescentno konjugovano antitelo koje je specifično za prvo antitelo.

Antitela na ALK-1

Ovaj pronalazak se odnosi na izolovana neutrališuća monoklonska antitela na ALK-1 ili njihove delove za vezivanje antigena koji se vezuju za ALK-1 primata, poželjno ECD ALK-1 primata, još poželjnije ECD humanog ALK-1. U jednom poželjnom izvođenju, pronalazak se odnosi na izolovana neutrališuća antitela koja so potpuno humana monoklonska antitela ili njihovi delovi za vezivanje antigena. Poželjno, humana antitela su rekombinantna humana antitela na ALK-1 koja imaju veći afinitet prema ALK-1 nego prema ALK-2 do ALK-7. U nekim izvođenjima, humana antitela na ALK-1 se proizvode imunizovanjem nehumane transgene životinja, npr., glodara, čiji genom sadrži humane gene za imunoglobulin, tako da transgena životinja proizvodi humana antitela. Različiti aspekti pronalaska se odnose na takva antitela i njihove delove za vezivanje antigena i farmaceutske kompozicije koje ih sadrže, kao i na nukleinske kiseline, rekombinantne ekspresione vektore i ćelije domaćine za pravljenje takvih antitela i njihovih delova za vezivanje antigena. Postupala za upotrebu antitela i njihovih delova za vezivanje antigena iz ovog pronalaska za prekidanje signalne putanje ALK-1/ TGF-beta-1 /Smadl ili za detekciju ALK-1, bilo in vitro, bilo in vivo, su takođe obuhvaćeni ovim pronalaskom.

Antitelo na ALK-1 iz pronalaska može da sadrži humani kapa ili humani lambda lak lanac ili aminokiselinsku sekvencu izvedenu iz njega. U nekim izvođenjima koji sadrže kapa lak lanac, varijabilni domen (Vl) lakog lanca koristi humani A27, A2, Al, A3, B3, B2, LI ili L2 VK gen. U nekim izvođenjima, lak lanac koristi humani Vk LI gen i humani Jk 4 gen; humani Vk A27 gen i humani Jk 5 gen ili humani Jk 4 gen; humani Vk B3 gen i humani Jk 1 gen; humani Vk L2 gen i humani Jk 3 gen; humani VK A2 gen i humani JK 1 gen; humani VK A3 gen i humani JK 4 gen; humani VK Al gen i humani JK 1 gen; humani Vk B2 gen i humani Jk 4 gen; ili humani VK A2 gen i humani JK 1 gen.

U nekim izvođenjima, Vl antitela na ALK-1 sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija, delecija ili insercija (adicija) u odnosu na embrionsku aminokiselinsku sekvencu VK. U nekim izvođenjima, VL antitela na ALK-1 sadrži 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ili 15 aminokiselinskih supstitucija u odnosu na embrionsku aminokiselinsku sekvencu VK. U nekim izvođenjima, jedna ili više supstitucija iz embrionske linije je u CDR regionima lakog lanca. U nekim izvođenjima, VK aminokiselinske supstitucije u odnosu na embrionsku liniju su na jednoj ili više istih pozicija kao supstitucije u odnosu na embrionsku nađene u bilo kom jednom ili više Vl antitela obezbeđenih ovdc, kao stoje prikazano, na primer, na Slici 7. U nekim izvođenjima, aminokiselinske promene na jednoj ili više istih pozicija, ali uključuju različite supstitucije od onih u referentnom antitelu.

U nekim izvođenjima, aminokiselinske supstitucije u odnosu na embrionsku liniju se javljaju na jednoj ili više istih pozicija kao supstitucije iz embrionske linije u bilo kom Vl antitela 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1(rWT); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1; i 5.59.1, ali supstitucije mogu da reprezentuju konzervativne supstitucije aminokiselina na takvim pozicijama u odnosu na aminokiseline u referentnom antitelu. Na primer, ako je određena pozicija u jednom od ovih antitela promenjena u odnosu na embrionsku i ako je glutamat, može se supstituisati aspartatom na toj poziciji. Slično, ako je aminokiselinska supstitucija u odnosu na embrionsku u antitelu iz primera serin, on se može konservativno supstituisati treoninom na toj poziciji. Konzervativne aminokiselinske supstitucije su diskutovane gore.

U nekim izvođenjima, antitelo na ALK-1 sadrži aminokiselinsku sekvencu lakog lanca iz SEQ ID NO: 4. U nekim drugim izvođenjima, lak lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu lakog lanca antitela 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1(rWT); 1.12.1 (M29I/D19A); 1.12.1 (M29I);

1.12.1 (D19A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1; ili 5.59.1.

U nekim izvođenjima, lak lanac humanog antitela na ALK-1 sadrži aminokiselinsku sekvencu VL antitela 1.12.1 (SEQ ID NO: 8); 1.11.1 (SEQ ID NO: 12); 1.13.1 (SEQ ID NO: 16); 1.14.1 (SEQ ID NO: 20); 1.151.1 (SEQ ID NO: 24); 1.162.1 (SEQ ID NO: 28); 1.183.1 (SEQ ID NO: 32); 1.8.1(SEQ ID NO: 36); 1.9.1(SEQ ID NO: 40); 4.10.1 (SEQ ID NO: 44);

4.24.1 (SEQ ID NO: 48); 4.38.1(SEQ ID NO: 52); 4.58.1 (SEQ ID NO: 56); 4.62.1 (SEQ ID NO: 60); 4.68.1 (SEQ ID NO: 64); 4.72.1 (SEQ ID NO: 68); 5.13.1 (SEQ ID NO: 72); 5.34.1 (SEQ ID NO: 76); 5.53.1 (SEQ ID NO: 80); 5.56.1 (SEQ ID NO: 84); 5.57.1 (SEQ ID NO: 88); ili 5.59.1 (SEQ ID NO: 92); ili navedena aminokiselinska sekvenca ima do 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ili 15 konzervativnih supstitucija aminokiseline i/ili ukupno do 3 nekonzervativne supstitucije aminokiselina. U nekim drugim izvođenjima, lak lanac humanog antitela na ALK-1 sadrži aminokiselinsku sekvencu VL antitela 1.27.1; 1.29.1 ili 1.31.1. U nekim izvođenjima, lak lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu od početka CDR1 do kraja CDR3 bilo kog od prethodno pomenutih antitela.

U nekim izvođenjima, lak lanac može da sadrži aminokiselinske sekvence CDR1, CDR2 i CDR3 regiona nezavisno odabrane iz odgovarajućih CDR1, CDR2 i CDR3 regiona lakog lanca iz dva ili više monoklonskih antitela odabranih među 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1(rWT); 1.12.1 (M29I/D19 A); 1.12.1 (M29I); 1.12.1 (Dl 9A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1; ili 5.59.1, ili svaki od navedenih CDR regiona ima manje od 3 ili manje od 2 konzervativne supstitucije aminokiselina i/ili ukupno tri ili manje nekonzervativnih supstitucija aminokiselina.

U određenim izvođenjima, lak lanac antitela na ALK-1 sadrži aminokiselinske sekvence CDR1, CDR2 i CDR3 regiona lakog lanca antitela odabranih među 1.11.1; 1.12.1;

1.12.1 (rWT); 1.12.1 (M29I/D19A); 1.12.1 (M29I); 1.12.1 (Dl 9A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1;

4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1; ili 5.59.1, ili svaki od navedenih CDR regiona ima manje od 3 ili manje od 2 konzervativne supstitucije aminokiselina i/ili ukupno tri ili manje nekonzervativnih supstitucija aminokiselina.

Što se tiče teškog lanca, u nekim izvođenjima, varijabilni domen (Vh) koristi humani Vh 4-31, Vh 3-11, Vh 3-15, Vh 3-33, Vh 4-61 ili Vh 4-59 gen. U nekim izvođenjima, sekvenca VH antitela na ALK-1 sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija, delecija ili insercija (adicija), zajednički “mutacija”, u odnosu na embrionsku aminokiselinsku sekvencu VH. U nekim izvođenjima, varijabilni domen teškog lanca sadrži 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili 11 mutacija embrionske aminokiselinske sekvence Vh- U nekim izvođenjima, mutacije su nekonzervativne supstitucije u odnosu na embrionsku aminokiselinsku sekvencu. U nekim izvođenjima, mutacije su u CDR regionima teškog lanca. U nekim izvođenjima, težak lanac koristi humani Vh 3-33 gen, humani D 6-19 gen i humani Jh 3B gen; humani Vh 4-31 gen, humani D 6-19 gen i humani Jh 4B gen; humani Vh 4-61 gen, humani D 6-19 gen i humani Jh 4B gen; humani Vh 4-31 gen, humani D 3-3 gen i humani Jh 3B gen; humani Vh 4-31 gen i humani Jh 3B gen; humani Vh 4-59 gen, humani D 6-19 gen i humani JH 4B gen; humani VH

3- 11 gen, humani D 3-22 gen i humani Jh 6B gen; humani Vh 3-15 gen, humani D 3-22 gen i humani Jh 4B gen; humani VH 4-31 gen, humani D 5-12 gen i humani Jh 6B gen; humani VH

4- 31 gen, humani D 4-23 gen i humani Jh 4B gen; humani Vh 4-31 gen, humani D 2-2 gen i humani JH 5B gen; humani VH 4-31 gen i humani Jh 6B gen; humani VH 3-15 gen, humani D 1-1 gen i humani JH 4B gen; humani VH 3-11 gen, humani D 6-19 gen i humani JH 6B gen; humani VH 3-11 gen, humani D 3-10 gen i humani JH 6B gen; ili humani Vh 3-11 gen, humani D 6-6 gen i humani Jh 6B gen.

U nekim izvođenjima, aminokiselinske supstitucije su na jednoj ili više istih pozicija kao supstitucije iz embrionske linije u bilo kom jednom ili više Vh antitela 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1(rWT); 1.12.1(M291/D19A); 1.12.1 (M29I); 1.12.1 (D19A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1; ili 5.59.1. U nekim drugim izvođenjima, aminokiselinske promene su na jednoj ili više istih pozicija, ali uključuju različite supstitucije od onih u referentnom antitelu

U nekim izvođenjima, težak lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 2. U nekim drugim izvođenjima, težak lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu teškog lanca antitela 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1(rWT); 1.12.1 (M29I/D19A); 1.12.1 (M29I); 1.12.1 (Dl 9A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1;

4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1; ili 5.59.1. U nekim izvođenjima, težak lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu Vh antitela 1.12.1 (SEQ ID NOS: 6); 1.11.1 (SEQ ID NO: 10); 1.13.1 (SEQ ID NO: 14); 1.14.1 (SEQ ID NO: 18);

1.151.1 (SEQ ID NO: 22); 1.162.1 (SEQ ID NO: 26); 1.183.1 (SEQ ID NO: 30); 1.8.1(SEQ ID NO: 34); 1.9.1(SEQ ID NO: 38); 4.10.1 (SEQ ID NO: 42); 4.24.1 (SEQ ID NO: 46); 4.38.1(SEQ ID NO: 50); 4.58.1 (SEQ ID NO: 54); 4.62.1 (SEQ ID NO: 58); 4.68.1 (SEQ ID NO: 62); 4.72.1 (SEQ ID NO: 66); 5.13.1 (SEQ ID NO: 70); 5.34.1 (SEQ ID NO: 74); 5.53.1 (SEQ ID NO: 78); 5.56.1 (SEQ ID NO: 82); 5.57.1 (SEQ ID NO: 86); ili 5.59.1 (SEQ ID NO: 90); ili navedena aminokiselinska sekvenca Vh ima do 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili 11 konzervativnih supstitucija aminokiseline i/ili ukupno do 3 nekonzervativne supstitucije aminokiselina. U nekim drugim izvođenjima, težak lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu VH antitela 1.27.1; 1.29.1 ili 1.31.1. U nekim izvođenjima, težak lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu od početka CDR1 do kraja CDR3 bilo kog od prethodno pomenutih antitela.

U nekim izvođenjima, težak lanac sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 regione teškog lanca antitela 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1(rWT); 1.12.1(M29I/D19A); 1.12.1 (M29I); 1.12.1 (D19A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1; ili 5.59.1, ili svaki od navedenih CDR regiona ima manje od 8, manje od 6, manje od 4, ili manje od 3 konzervativne supstitucije aminokiselina i/ili ukupno 3 ili manje nekonzervativnih supstitucija aminokiselina.

U nekim izvođenjima, CDR regioni teškog lanca su nezavisno odabrani među CDR regionima dva ili više antitela odabranih među antitelima 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1(rWT); 1.12.1(M29I/D19A); 1.12.1(M29I); 1.12.1 (D19A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1; ili 5.59.1. U jednom drugom izvođenju, antitelo sadrži lak lanac kao što je opisan gore i težak lanac kao što je opisan gore. A u još jednom izvođenju, CDR-ovi lakog lanca i CDR-ovi teškog lanca su iz istog antitela.

U nizu izvođenja, antitela na ALK-1 imaju aminokiselinske sekvence ćele dužine teškog lanca i ćele dužine lakog lanca, aminokiselinske sekvence Vh i V L, aminokiselinske sekvence CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca i CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca ili aminokiselinsku sekvencu teškog lanca od početka CDR1 do kraja CDR3 i aminokiselinsku sekvencu lakog lanca od početka CDR1 do kraja CDR3 antitela na ALK-1 koje je ovde obezbeđeno.

Jedan tip aminokiselinske supstitucije koji se može uraditi je da se promeni jedan ili više cisteina u antitelu, koji mogu biti hemijski reakivni, nekim drugim ostatkom, kao što je, bez ograničenja, alanin ili serin. U jednom izvođenju, postoji supstitucija nekanonskog cisteina. Supstitucija se može uraditi u CDR ili okvirnom regionu varijabilnog domena ili u konstantnom domenu antitela. U nekim izvođenjima, cistein je kanonski.

Jedan drugi tip aminokiselinske supstitucije koji se može uraditi je da se uklone potencijalna proteolitička mesta u antitelu. Takva mesta se mogu javiti u CDR ili okvirnom regionu varijabilnog domena ili u konstantnom domenu antitela. Supstitucija cisteinskog ostatka i uklanjanje proteolitičkih mesta može da smanji rizik od heterogenosti u dobijenom antitelu i time poveća njegovu homogenost. Jedan drugi tip aminokiselinske supstitucije je da se eliminišu parovi asparagin-glicin, koji formiraju potencijalna mesta dezamidacije, menjanjem jednog ili oba ostatka.

U nekim izvođenjima, lizin sa C-kraja teškog lanca antitela na ALK-1 iz pronalaska se odseca. U različitim izvođenjima pronalaska, težak i lak lanac antitela na ALK-1 mogu po želji da uključe signalnu sekvencu.

U jednom izvođenju, pronalazak obezbeđuje dvadeset pet inhibitornih humanih monoklonskih antitela na ALK-1 i ćelijske linije hibridoma koje ih proizvode. U određenim izvođenjima, antitela iz ovog pronalaska su IgG-ovi, označeni kao: 1.11.1; 1.12.1;

1.12.1 (rWT); 1.12.1 (M29I/D19 A); 1.12.1 (M29I); 1.12.1 (D19A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1; i 5.59.1. U poželjnim izvođenjima, humano antitelo na ALK-1 je antitelo 1.12.1, 1.12.1(M29I/D19A), 1.12.1 (M29I),

1.12.1 (D19A), 1.27.1, 1.14.1, 1.162.1, 1.31.1,4.62.1 ili 4.72.1.

Antitela prepoznaju epitope izložene na površini antigena kao regione linearnih (primarnih) sekvenci ili strukturnih (sekundarnih) sekvenci. Korišćen je BIAcore da bi se definisao funkcionalni epitopski "pejzaž" i odredila epitopska ekskluzivitnost antitela na ALK-1 datih ovim pronalaskom.

Tabela 1 prikazuje listu iđentifikatora sekvenci (SEQ ID NO) nukleinskih kiselina koje kodiraju ćele dužine teških i lakih lanaca varianti antitela 1.12.1 i delove antitela na ALK-1 iz pronalaska koji sadrže varijabilne domene i odgovarajuće izvedene aminokiselinske sekvence.

Tabela 1

IDENTIFIKATORI SEKVENCI (SEQ ID NO)

1.12.1 (M29I/D19A) se odnosi na antitelo na ALK-1 koje sadrži specifičnu tačkastu aminokiselinsku mutaciju u teškom lancu, gde je metionin na poziciji 29 zamenjen izoleucinom i specifičnu tačkastu aminokiselinsku mutaciju u lakom lancu, gde je asparaginska kiselina na poziciji 19 zamenjena alaninom, kao stoje opisano u Primeru 4.

1.12.1 se odnosi na varijantu mAb 1.12.1 koja je izolovana iz hibridoma.

1.12.1(rWT) se odnosi na varijantu mAb 1.12.1 koja je eksprimirana kao

rekombinantni mAb opisan u Primeru 3.

Pronalazak dalje obezbeđuje varijante teškog i/ili lakog lanca određenih gore nabrojanih humanih antitela na ALK-1, koje sadrže jednu ili više aminokiselinskih modifikacija. Da bi se označile varijante, prvo slovo je jednoslovni simbol aminokiseline iz lanca antitela koje se javlja u prirodi, broj se odnosi na poziciju aminokiseline (gde je pozicija jedan N-kraj aminokiseline iz FR1), a drugo slovo je jednoslovni simbol varijante aminokiseline.

A u još nekim izvođenjima, pronalazak uključuje antitela koja sadrže varijabilni domen aminokiselinske sekvence sa više od 80%, više od 85%, više od 90%, više od 95%, više od 96%, više od 97%, više od 98% ili više od 99% identičnosti sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom varijabilnog domena bilo kog od gore nabrojanih humanih antitela na ALK-1.

Klasa i potklasa antitela na ALK-1

Klasa i potklasa antitela na ALK-1 mogu se odrediti bilo kojim postupkom poznatim u struci. Uopšteno, klasa i potklasa antitela mogu se odrediti pomoću antitela koja su specifična za određenu klasu i podklasu antitela. Takva antitela su komercijalno dostupna. Klasa i potklasa se mogu odrediti tehnikama ELISA, Western Blot, kao i drugim. Alternativno, klasa i potklasa se mogu odrediti sekvenciranjem celih ili delova konstantnih domena teških i/ili lakih lanaca antitela, poređenjem njihovih aminokiselinskih sekvenci sa poznatim aminokiselinskim sekvencama različitih klasa i potklasa imunoglobulina, čime se određuju klasa i potklasa antitela.

Klasa antitela na ALK-1 dobijena kao što je opisano gore može se preobratiti u drugu. U jednom izvođenju pronalaska, molekul nukleinske kiseline koji kodira Vl ili Vh je izolovan pomoću postupaka dobro poznatih u struci, takvih da on ne uključuje sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju Cl ili Ch, “Antibodv Engineering” (Kontermann & Dubel, Eds.,

Springer-Verlag, Berlin (2001)). Molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju Vl ili Vh se zatim operativno vezuju za sekvencu nukleinske kiseline koja kodira Cl, odnosno, Ch, iz različite klase imunoglobulinskih molekula. Ovo se može postići pomoću vektora ili molekula nukleinske kiseline koji sadrži Cl ili Ch lanac, kao što je opisano gore. Na primer, antitelo na ALK-1 koje je izvorno bilo IgM može preći u klasu IgG. Dalje, promena klase se može koristiti za konvertovanje iz jedne podklase IgG u drugu, npr., iz IgGl u IgG2. Poželjan postupak za proizvodnju antitela iz pronalaska koja sadrže željene izotipove se sastoji iz koraka izolovanja molekula nukleinske kiseline koji kodira težak lanac antitela na ALK-1 i molekula nukleinske kiseline koji kodira lak lanac antitela na ALK-1, dobijanja varijabilnog domena teškog lanca, vezivanja varijabilnog domena teškog lanca sa konstantnim domenom teškog lanca željenog izotipa, eksprimiranja lakog lanca i vezanog teškog lanca u ćeliji i sakupljanja antitela na ALK-1 sa željenim izotipom.

U nekim izvođenjima, antitelo na ALK-1 je monoklonsko antitelo. Antitelo na ALK-1 može biti IgG, IgM, IgE, IgA, ili IgD molekul. U jednom poželjnom izvođenju, antitelo na ALK-1 je IgG i IgGl, IgG2, IgG3, IgG4 potklasa. U jednom drugom poželjnom izvođenju, antitelo je potklasa IgG2.

Identifikacija epitopa ALK-1 koje prepoznaju antitela na ALK-1

Pronalazak obezbeđuje humano monoklonsko antitelo na ALK-1 koje se vezuje za ALK-1 i ulazi u kompeticiju ili unakrsnu kompeticiju sa i/ili se vezuje za isti epitop kao: (a) antitelo odabrano među 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1(rWT); 1.12.1(M29I/D19A); 1.12.1 (M29I);

1.12.1 (D19 A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1; i 5.59.1; (b) antitelo koji sadrži varijabilni domen teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom VH domena u bilo kojoj od SEQ ID NOS: 6; 10; 14; 18; 22; 26; 30; 34; 38; 42; 46; 50; 54; 58; 62; 66; 70; 74; 78; 82; 86; 90 ili 104, (c) antitelo koji sadrži varijabilni domen lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom VL domena u bilo kojoj od SEQ ID NOS: i 8; 12; 16; 20; 24; 28; 32; 36; 40; 44; 48; 52; 56; 60; 64; 68; 72; 76; 80; 84; 88; 92 ili 127, (d) antitelo koje sadrži i varijabilni domen teškog lanca kao što je defmisan u (b) i varijabilni domen lakog lanca kao stoje defmisan u (c).

Pomoću postupaka poznatih u struci, može se odrediti da li se antitelo vezuje za isti epitop ili je u unakrsnoj kompeticiji za vezivanje sa antitelom na ALK-1. U jednom izvođenju, omogućuje se antitelu na ALK-1 iz pronalaska da se veže za ALK-1 u uslovima saturacije, a zatim se meri sposobnost ispitivanog antitela da se veže za ALK-1. Ako je ispitivano antitelo sposobno da se veže za ALK-1 u isto vreme kad i referentno antitelo na ALK-1, onda se ispitivano antitelo vezuje za različit epitop nego referentno antitelo na ALK-1. Međutim, ako ispitivano antitelo nije sposobno da se veže za ALK-1 u isto vreme, onda se ispitivano antitelo vezuje za isti epitop, preklapajući epitop ili epitop koji je u bliskom susedstvu sa epitopom vezanim za antitelo na ALK-1 iz pronalaska. Ovaj eksperiment se može izvoditi tehnikama ELISA, RIA, BIACORE™, ili protočnom citometrijom. Da bi se ispitalo da li je antitelo na ALK-1 u unakrsnoj kompeticiji sa drugim antitelom na ALK-1, može se koristiti postupak kompeticije (opisan gore) u dva smera, tj. odrediti da li poznato antitelo blokira ispitivano antitelo i obrnuto. U jednom poželjnom izvođenju, eksperiment se izvodi pomoću BIACORE™.

Afinitet antitela na ALK-1 da se veže za ALK-1

Afinitet vezivanja (Kd) i brzina disocijacije (k0ff) antitela na ALK-1 ili njegovog dela za vezivanje antigena za ALK-1 može se odrediti pomoću postupaka poznatih u struci. Afinitet vezivanja se može meriti ELISA-ma, RIA-ma, protočnom citometrijom ili površinskom plazmonskom rezonancom, kao stoje BIACORE™. Brzina disocijacije se može meriti površinskom plazmonskom rezonancom. Poželjno, afinitet vezivanja i brzina disocijacije se mere površinskom plazmonskom rezonancom. Još poželjnije, afinitet vezivanja i brzina disocijacije se mere pomoću BIACOREIM. Može se odrediti da li antitelo ima suštinski istu Kd kao antitelo na ALK-1 upotrebom postupaka poznatih u struci. Takvi postupci određivanja Kd i k0trmogu se koristiti tokom početnog stadijuma pretraživanja, kao i tokom sledećih stupnjeva optimizacije.

Inhibicija ALK-1 aktivnosti pomoću antitela na ALK-1

Monoklonska antitela na ALK-1 koja inhibiraju vezivanje ALK-1 mogu se iđentiLikovati upotrebom niza testova. Na primer, neutrališuća antitela na ALK-1 mogu se iđentifikovati preko njihove inhibicije ushodne regulacije specifičnog nizvodnog ciljnog gena ALK-1, Idi, kao što je opisano u Primeru 12. Poželjna antitela na ALK-1 imaju IC50 ne veći od 500 nM, 300 nM, 200 nM, 150 nM, 100 nM, 50 nM, 20 nM, 10 nM, ili 1 nM.

Može se takođe odrediti sposobnost antitela na ALK-1 da inhibira fosforilaciju Smadl, tehnikom Western Blotting pomoću Odyssey Infrared Imaging System-a, kao što je opisano u Primeru 13. U različitim izvođenjima, antitelo na ALK-1 ima IC50U ovom testu ne veći od 250 nM, 200 nM, 150 nM, 100 nM, 50 nM, 20 nM, 10 nM, ili lnM.

Inhibicija angiogeneze pomoću antitela na ALK-1

U jednom drugom izvođenju, antitelo na ALK-1 ili njegov deo inhibira angiogenezu humanih sudova, kao što je pokazano u SCID mišu kome je transplantirano tkivo humanog obreska, gde su M24met tumorske ćelije humanog melanoma intradermalno implantirane, što je određeno IHC analizom signala humanog CD-31 sa faktorom od najmanje 40% u poređenju sa kontrolnim uzorkom, kao što je opisano u Primeru 17 i pokazano u Tabeli 13.

U jednom drugom izvođenju, antitelo na ALK-1 ili njegov deo inhibira angiogenezu humanih sudova kao što je pokazano u SCID mišu kome je transplantirano tkivo humanog obreska, gde je kolagen intradermalno implantiran, što je određeno IHC analizom signala humanog CD-31 sa faktorom od najmanje 50% u poređenju sa kontrolnim uzorkom, kao što je opisano u Primeru 16 i pokazano u Tabeli 12.

Vrste i molekulska selektivnost

U jednom drugom aspektu pronalaska, antitela na ALK-1 ispoljavaju selektivnost i prema vrsti i prema molekulu. Prateći uputstva iz ove specifikacije, može se odrediti selektivnost prema vrsti i prema molekulu za antitelo na ALK-1 upotrebom postupaka dobro poznatih u struci. Na primer, može se odrediti selektivnost prema vrsti pomoću Western blot, površinske plazmonske rezonance, npr., BIAcore, ELISA, imunoprecipitacije ili RIA.

U nekim izvođenjima, antitelo na ALK-1 se vezuje za ALK-1 primata sa Kd koja je najmanje dva puta manja nego njegova KD za glodarski ALK-1. A u još jednom izvođenju, Kd za ALK-1 primata je bar 3 puta, bar 10 puta, bar 50 puta, bar 100 puta, bar 200 puta, bar 500 puta, ili bar 1000 puta manja nego njegova Kd za glodarski ALK-1, kao što je izmereno protočnom citometrijom.

U nekim drugim izvođenjima, antitelo na ALK-1 ima selektivnost za ALK-1 u odnosu na ALK-2 do ALK-7. U nekim izvođenjima, antitelo na ALK-1 ne pokazuje nikakvo primetno specifično vezivanje za bilo koji drugi protein osim za ALK-1. Poželjno je da se antitelo na ALK-1 vezuje za ECD humanog ALK-1.

Postupak proizvodnje antitela i ćelijske linije za proizvodnju antitela

ALK-1 Imunogen

U nekim izvođenjima, ALK-1 imunogen ili antigen je izolovan i/ili prečišćen je ALK-1. U nekim izvođenjima, ALK-1 imunogen je humani ALK-1. U poželjnim izvođenjima, ALK-1 imunogen je ECD humanog ALK-1. Humani ALK-1, ili njegovi antigenski delovi, može se dobiti prema postupcima dobro poznatim u struci, ili se može kupiti komercijalno. Aminokiselinske i nukleotidne sekvence humanog ALK-1 su poznate (videti, npr. Genbank zapis, pristupni broj LI 7075). ACVRL1 gen koji kodira ćelu dužinu ALK-1 je komercijalno dostupan od Invitrogen Ine., Clone ID IOH21048. Na primer, R&D Systems, Ine. prodaje rekombinantnu humanu ALK-l/Fc himeru (kataloški broj 370-AL), dobijenu ekspresijom sekvence DNK koja kodira aminokiseline 1-118 ECD-a ALK-1, gde je sekvenca DNK bila fuzionisana sa sekvencom DNK koja kodira Fc region humanog IgG preko sekvence DNK koja kodira polipeptidni linker u ćelijskoj liniji mijeloma miša. Krajnja rekombinantna zrela humana ALK-l/Fc himera je homodimeran protein sa disulfidnom vezom, koji ima Asp 22 na amino kraju. Pored toga, Primer 1 opisuje dobijanje His-Tag proteina iz ECD ALK-1, koji je korišćen za generisanje hibridoma koji prave antitelo na ALK-1 prema ovom pronalasku.

U nekim drugim izvođenjima, ALK-1 antigen je ćelija koja eksprimira ili eksprimira ALK-1 u višku. U nekim drugim izvođenjima, ALK-1 antigen je rekombinantni protein eksprimiran iz kvasca, ćelija insekata, bakterija kao što je E. coli ili iz drugih izvora rekombinantnom tehnologijom.

Imunizacija

U nekim izvođenjima, humana antitela se prave imunizovanjem ALK-1 antigenom nehumane, transgene životinje, koja unutar svog genoma sadrži neke ili sve lokuse teškog i lakog lanca humanog imunoglobulina. U jednom poželjnom izvođenju, ne-humana životinja je XENOMOUSE® životinja. (Abgenix, Ine., Fremont, CA).

XENOMOUSE® miševi su mišji sojevi dobijeni inženjeringom koji sadrže lokuse velikih fragmenata teškog i lakog lanca humanog imunoglobulina i deficijentni su u proizvodnji mišjih antitela. Videti, npr., Green et al., Nature Genetics 7:13-21 (1994) i U.S. Patents 5,916,771, 5,939,598, 5,985,615, 5,998,209, 6,075,181, 6,091,001, 6,114,598, 6,130,364, 6,162,963 i 6,150,584. Videti i WO 91/10741, WO 94/02602, WO 96/34096, WO 96/33735, W0 98/16654, W0 98/24893, W0 98/50433, WO 99/45031, WO 99/53049, WO 00/09560 i WO 00/037504.

U jednom drugom izvođenju, pronalazak obezbeđuje postupak za pravljenje antitela na ALK-1 iz ne-humanih, ne-mišjih životinja imunizovanjem ne-humanih transgenih životinja koje sadrže mesta humanog imunoglobulina sa ALK-1 antigenom. Takve životinje se mogu proizvoditi upotrebom postupaka opisanih u gorenavedenim dokumentima. Postupci opisani u ovim dokumentima mogu se modifikovati kao stoje opisano u U.S. Patent 5,994,619, koji je ovde ugrađen referencom. U.S. Patent 5,994,619 opisuje postupke za proizvodnju novih ćelija i ćelijskih linija gajene unutarćelijske mase (CICM, od engl. cultured inner cell mass), tj. embrioblasta, izvedenih iz svinja i krava i transgenih CICM ćelija u koje je ubačena heterologna DNK. CICM transgene ćelije se mogu koristiti za proizvodnju kloniranih transgenih embriona, fetusa i potomstva. Patent 5,994,619 opisuje i postupke za proizvodnju transgenih životinja koje su sposobne za prenos heterologne DNK svom potomstvu. U poželjnim izvođenjima ovog pronalaska, ne-humane životinje su sisari, posebno pacovi, ovce, svinje, koze, goveda, konji ili živina.

XENOMOUSE® miševi proizvode repertoar potpuno humanih antitela sličan onom odraslog čoveka i generišu antigen-specifična humana antitela. U nekim izvođenjima, XENOMOUSE® miševi sadrže približno 80% repertoara V gena humanih antitela uvođenjem fragmenata (veličine megabaza) embrionske konfiguracije humanih lokusa teškog lanca i lokusa kapa lakog lanca pomoću veštačkog hromozoma kvasca (YAC, od engl. yeast artificial chromosome). U nekim drugim izvođenjima, XENOMOUSE® miševi dalje sadrže približno ceo lokus humanog lambda lakog lanca. Videti Mendez et al., Nature Genetics 15:146-156 (1997), Green and Jakobovits, J. Exp. Med. 188:483-495 (1998) i WO 98/24893, čiji su opisi ovde ugrađeni referencom.

U nekim izvođenjima, ne-humana životinja koja sadrži gene humanog imunoglobulina je životinja koja ima “minilokus” humanog imunoglobulina. U pristupu sa minilokusom, egzogeni Ig lokus je podražavan inkluzijom pojedinačnih gena iz Ig lokusa. Dakle, jedan ili više VH gena, jedan ili više DH gena, jedan ili više Jh gena, mi konstantan domen i drugi konstantan domen (poželjno gama konstantan domen) se formiraju u konstrukt za inserciju u životinju. Ovaj pristup je opisan, između ostalog, u U.S. Patent-ima Nos. 5,545,807, 5,545,806, 5,569,825, 5,625,126, 5,633,425, 5,661,016, 5,770,429, 5,789,650, 5,814,318, 5,591,669, 5,612,205, 5,721,367, 5,789,215, i 5,643,763, ovde ugrađenim referencom.

U još jednom izvođenju, pronalazak obezbeđuje postupak za pravljenje humaniizovanih antitela na ALK-1. U nekim izvođenjima, ne-humane životinje se imunizuju ALK-1 antigenom, kao stoje opisano niže, u uslovima koji omogućuju proizvodnju antitela. Ćelije koje proizvode antitelo se izoluju iz životinja i nukleinske kiseline koje kodiraju teške i lake lance antitela na ALK-1 od interesa izoluju se iz izolovanih ćelija koje proizvode antitelo ili iz imortalizovane ćelijske linije dobijene iz takvih ćelija. Ove nukleinske kiseline se zatim menjaju inženjeringom upotrebom tehnika poznatih stručnjacima i, kao što je opisano još niže, da bi se smanjila količina ne-humanih sekvenci, tj., da bi se humaniizovalo antitelo, da bi se smanjio imuni odgovor u čoveku.

Imunizacija životinja se može raditi bilo kojim postupkom poznatim u struci. Videti, npr., Harlovv and Lane, Antibodies: A Laboratorv Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1990. Postupci za imunizovanje ne-humanih životinja kao što su miševi, pacovi, ovce, koze, svinje, goveda i konji su dobro poznati u struci. Videti, npr., Harlovv and Lane, supra i U.S. Patent 5,994,619. U jednom poželjnom izvođenju, ALK-1 antigen se daje sa adjuvantom da bi se stimulisao imuni odgovor. Tipični adjuvanti uključuju kompletan ili nekompletan Freund-ov adjuvant, RIBI (muramil dipeptidi) ili ISCOM (imunostimulišući kompleksi). Takvi adjuvanti mogu da zaštite polipeptid od brzog dispergovanja tako što ga zadrže u lokalnom depozitu, ili mogu da sadrže supstance koje stimulišu domaćina da luči faktore koji su hemotaktički za makrofage i ostale komponente imunog sistema. Poželjno je da, ako se daje polipeptid, raspored imunizacije uključi dva ili više davanja polipeptida u toku nekoliko nedelja. Primer 2 ilustruje postupak za proizvodnju monoklonskih antitela na ALK-1 u XENOMOUSE® miševima.

Proizvodnja antitela i ćelijske linije za proizvodnju antitela

Posle imunizacije životinje ALK-1 antigenom, antitela i/ili ćelije koje proizvode antitela mogu se dobiti iz životinje. U nekim izvođenjima, serum koji sadrži antitela na ALK-1 se dobija iz životinje iskrvavljivanjem ili žrtvovanjem životinje. Serum se može koristiti onakav kakav je dobijen iz životinje, može se dobiti imunoglobulinska frakcija iz seruma ili antitela na ALK-1 mogu biti prečišćena iz seruma.

U nekim izvođenjima, ćelijske linije koje proizvode antitela se dobijaju iz ćelija izolovanih iz imunizovane životinje. Posle imunizacije, životinja se žrtvuje i limfni čvor i/ili B ćelije slezine se imortalizuju na bilo koji način poznat u struci. Postupci imortalizovanja ćelija uključuju, ali nisu ograničeni na, transfektovanje ćelija onkogenima, inficiranje ćelija onkogenim virusom i njihovo kultivisanje u uslovima koji selektuju imortalizovane ćelije, njihovo podvrgavanje karcinogenim jedinjenjima ili onim koja izazivaju mutacije, njihovo fuzionisanje sa imortalizovanim ćelijama, npr., ćelijama mijeloma i inaktiviranje gena za supresiju tumora. Videti, npr., Harlow and Lane, supra. Ako se koristi fuzionisanje sa ćelijama mijeloma, poželjno je da ćelije mijeloma ne sekretuju imunoglobulinske polipeptide (ne-sekretorna ćelijska linija). Imortalizovane ćelije se pretražuju pomoću ALK-1 ili njegovog dela. U jednom poželjnom izvođenju, početno pretraživanje se izvodi pomoću imunoeseja sa vezanim enzimom (ELISA) ili pomoću radioimunoeseja. Primer pretraživanja pomoću ELISA je dato u WO 00/37504, koji je ovde ugrađen referencom.

Ćelije koje proizvode antitela na ALK-1, npr., hibridomi, se selektuju, kloniraju i dalje pretražuju na željene karakteristike, uključujući robustan rast, visoku produkciju antitela i željene karakteristike antitela, kao stoje diskutovano još niže. Hibridomi se mogu proširiti in vivo u singenim životinjama, u životinjama kojima nedostaje imuni sistem, npr., golim miševima, ili u ćelijskoj kulturi in vitro. Postupci odabiranja, kloniranja i širenja hibridoma su dobro poznati stručnjacima uobičajenog nivoa.

U jednom poželjnom izvođenju, imunizovana životinja je ne-humana životinja koja eksprimira humane imunoglobulinske gene i B ćelije slezine se fuzionišu sa ćelijskom linijom mijeloma iz iste vrste kao što je ne-humana životinja. U jednom poželjnijem izvođenju, imunizovana životinja je XENOMOUSE® miš, a ćelijska linija mijeloma je ne-sekretorni mišji mijelom. U jednom još poželjnijem izvođenju, ćelijska linija mijeloma je P3-X63-Ag8.653 (American Type Culture Collection). Videti, npr., Primer 2.

Dakle, u jednom izvođenju, pronalazak obezbeđuje postupke za proizvodnju ćelijske linije koja proizvodi humano monoklonsko antitelo ili njegov fragment usmeren na ALK-1 koji se sastoje od (a) imunizovanja ne-humane transgene životinje opisane ovde pomoću ALK-1, dela ALK-1 ili ćelijom ili tkivom koje eksprimira ALK-1; (b) dopuštanja transgenoj životinji da podigne imuni odgovor na ALK-1; (c) izolovanja ćelija iz transgene životinje; (d) imortalizovanja ćelija koje proizvode antitela; (e) kreairanja individualnih monoklonskih populacija imortalizovanih ćelija koje proizvode antitela i (f) pretraživanja imortalizovanih ćelija koje proizvode antitela da bi se identifikovalo antitelo usmereno na ALK-1.

U jednom drugom izvođenju, pronalazak obezbeđuje ćelijsku liniju koja proizvodi humano antitelo na ALK-1. U nekim izvođenjima, ćelijska linija je ćelijska linija hibridoma. U nekim izvođenjima, hibridomi su mišji hibridomi, kao stoje opisano gore. U nekim drugim izvođenjima, hibridomi su proizvedeni u ne-humanoj, ne-mišjoj vrsti kao što su pacovi, ovce, svinje, koze, goveda ili konji. U jednom drugom izvođenju, hibridomi su humani hibridomi.

U jednom drugom izvođenju, transgena životinja je imunizovana ALK-1 antigenom; primarne ćelije, npr., B ćelije iz slezine ili periferne krvi, se izoluju iz imunizovane transgene životinje i identifikuju se pojedinačne ćelije koje proizvode antitela specifična za dati antigen. Poliadenilovana iRNK iz svake pojedinačne ćelije se izoluje i uradi se polimerazna lančana reakcija sa reverznom transkripcijom (RT-PCR, od engl. reverse transcription polymerase chain reaction) pomoću sens prajmera koji hibridizuju sa sekvencama varijabilnog domena, npr., izrođenih prajmera koji prepoznaju većinu ili sve FR1 regione humanih gena varijabilnih domena teškog i lakog lanca i anti-sens prajmera koji hibridizuju sa sekvencama konstantnog ili spajajućeg regiona. cDNK varijabilnih domena teškog i lakog lanca se zatim kloniraju i eksprimiraju u nekoj pogodnoj ćeliji domaćinu, npr., ćeliji mijeloma, kao himerna antitela sa odgovarajućim imunoglobulinskim konstantnim regionima, kao što su k i A, konstantni domeni teškog lanca. Videti Babcook, J.S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7843-48, 1996, ovde ugrađen referencom. Antitela na ALK-1 se zatim mogu identifikovati i izolovati kao što je opisano ovde.

U jednom drugom izvođenju, tehnike ispoljavanja na fagu se mogu koristit da bi se obezbedile biblioteke koje sadrže repertoar antitela sa različitim afinitetima prema ALK-1. Za pravljenje takvih repertoara, nije neophodno da se imortalizuju B ćelije iz imunizovanih životinja. Radije se primarne B ćelije mogu koristiti direktno kao izvor DNK. Smesa cDNK, dobijena iz B ćelija, npr., izvedenih iz slezina, se koristi za dobijanje ekspresione biblioteke, na primer, biblioteke na fagu transfektovane u E. coli. Dobijene ćelije se testiraju na imunoreaktivnost prema ALK-1. Tehnike za identifikaciju humanih antitela visokog afiniteta iz takvih biblioteka su opisali Griffiths et al., EMBO J., 13:3245-3260 (1994); Nissim et al., ibid, pp. 692-698 i Griffiths et al., ibid, 12:725-734, koji su ugrađeni referencom. Na kraju se identifikuju klonovi iz biblioteke koji proizvode afinitete vezivanja za antigen željene veličine i DNK koja kodira proizvod odgovoran za takvo vezivanje se povraća i obrađuje za standardnu rekombinantnu ekspresiju. Biblioteke na fagu se mogu konstruisati i korišćenjem prethodno obrađenih nukleotidnih sekvenci i pretraženih na sličan način. U opštem slučaju, cDNK koje kodiraju težak i lak lanac se nezavisno dodaju ili vezuju da bi formirale Fv analogone za proizvodnju u biblioteci na fagu.

Biblioteka na fagu se zatim pretražuje na antitela sa najvećim afinititetima prema ALK-1 i genetski materijal se povraća iz odgovarajućeg klona. Sledeće runde pretraživanja mogu da povećaju afmititet originalnog izolovanog antitela.

Nukleinske kiseline, vektori, ćelije domaćini i rekombinantni postupci za pravljenje antitela Nukleinske kiseline

Ovaj pronalazak takođe obuhvata molekule nukleinske kiseline koji kodiraju antitela na ALK-1 ili njegove fragmente za vezivanje antigena. U nekim izvođenjima, različiti molekuli nukleinske kiseline kodiraju težak lanac i lak lanac anti-ALK-1 imunoglobulina. U nekim drugim izvođenjima, isti molekul nukleinske kiseline kodira težak lanac i lak lanac anti-ALK-1 imunoglobulina.

U nekim izvođenjima, molekul nukleinske kiseline koji kodira varijabilni domen lakog lanca (Vl) koristi humani A27, A2, Al, A3, B3, B2, LI ili L2 VK gen i humani Jk5, JkI, Jk3 ili Jk4 gen. U nekim izvođenjima, molekul nukleinske kiseline koristi humani A27 Vk gen i humani Jk5 gen. U nekim drugim izvođenjima, molekul nukleinske kiseline koristi humani A2 gen i humani JkI gen. U nekim izvođenjima, molekul nukleinske kiseline koji kodira lanac, kodira aminokiselinsku sekvencu koja sadrži 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ili 15 supstitucija u odnosu na embrionsku/e aminokiselinsku sekvencu (ili više njih). U nekim izvođenjima, molekul nukleinske kiseline sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira aminokiselinsku sekvencu Vl koja sadrži 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ili 15 konzervativnih supstitucija aminokiseline i/ili 1, 2, ili 3 ne-konzervativne supstitucije u odnosu na embrionske sekvence Vk i Jk- Supstitucije mogu biti u CDR regionima, okvirnim regionima, ili u konstantnom domenu.

U nekim izvođenjima, molekul nukleinske kiseline kodira aminokiselinsku sekvencu VL koja sadrži jednu ili više mutacija u odnosu na embrionsku sekvencu koje su identične mutacijama iz embrionske nađenim u VL bilo kog od antitela 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1(rWT); 1.12.1(M29I/D19A); 1.12.1 (M29I); 1.12.1(D19A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1; ili 5.59.1.

U nekim izvođenjima, molekul nukleinske kiseline kodira bar tri aminokiseline supstitucije u odnosu na embrionsku sekvencu koje su identične mutacijama iz embrionske nađenim u Vl nekog od antitela 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1(rWT); 1.12.1(M29I/D19A);

1.12.1 (M29I); 1.12.1 (D19A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1; ili 5.59.1.

U nekim izvođenjima, molekul nukleinske kiseline sadrži nukleotidnu sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 7, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 47, 51, 55, 59, 63, 67, 71, 75, 79, 83, 87, 91 ili 126, koja kodira aminokiselinsku sekvencu VL monoklonskog antitela 1,12.1(M29I/D19A), 1.11.1, 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1; 5.59.1 ili 1.12.1.

U nekim izvođenjima, molekul nukleinske kiseline sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira aminokiselinsku sekvencu jedne od SEQ ID NOs: 8; 12; 16; 20; 24; 28; 32; 36; 40; 44; 48; 52; 56; 60; 64; 68; 72; 76; 80; 84; 88; 92 ili 127. U nekim izvođenjima, molekul nukleinske kiseline sadrži nukleotidnu sekvencu iz SEQ ID NO: 3 ili njen deo. U nekim izvođenjima, nukleinska kiselina kodira aminokiselinsku sekvencu jednog, dva ili sva tri CDR-a lakog lanca navedenog antitela. U nekim izvođenjima, navedeni deo kodira neprekidan region iz CDR1-CDR3 lakog lanca antitela na ALK-1.

U nekim izvođenjima, molekul nukleinske kiseline kodira aminokiselinsku sekvencu VL koja je bar 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% ili 99% identična aminokiselinskoj sekvenci Vl bilo kog od antitela 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1(rWT);

1.12.1 (M29I/D19A); 1.12.1 (M29I); 1.12.1 (Dl 9A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1; ili 5.59.1, ili aminokiselinskoj sekvenci Vl regiona iz SEQ ID NO: 4. Molekuli nukleinske kiseline iz pronalaska uključuju nukleinske kiseline koje hibridizuju pod jako strogim uslovima, kao što su oni opisani gore ili koje su bar 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% ili 99% identične nukleinskoj kiselini koja kodira aminokiselinsku sekvencu Vl regiona SEQ ID NOs: 8; 12; 16; 20; 24; 28; 32; 36; 40; 44; 48; 52; 56; 60; 64; 68; 72; 76; 80; 84; 88; 92 ili 126 ili nukleinskoj kiselini koji sadrži nukleotidnu sekvencu Vl regiona iz SEQ ID NO: 4.

U drugim poželjnim izvođenjima, molekul nukleinske kiseline kodira varijabilni domen teškog lanca (Vh) koji koristi humanu sekvencu Vh 4-31, Vh 3-11, Vh 3-15, VH 3-33, Vh 4-61 ili Vh 4-59 gena ili sekvencu izvedenu iz nje. U nekim izvođenjima, molekul nukleinske kiseline koristi humani Vh 4-31 gen, DH6-19 gen i humani JH4B gen.

U nekim izvođenjima, molekul nukleinske kiseline kodira aminokiselinsku sekvencu koji sadrži 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili 11 mutacija u odnosu na embrionsku aminokiselinsku sekvencu humanih V, D ili J gena. U nekim izvođenjima, navedene mutacije su u VH regionu. U nekim izvođenjima, navedene mutacije su u CDR regionima.

U nekim izvođenjima, molekul nukleinske kiseline kodira sekvencu Vh koja sadrži jednu ili više aminokiselinskih mutacija u odnosu na embrionsku VH sekvencu koje su identične aminokiselinskim mutacijama nađenim u Vh bilo kog od monoklonskih antitela 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1(rWT); 1,12.1(M29I/D19A); 1.12.1 (M29I); 1.12.1 (D19 A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1; ili 5.59.1. U nekim izvođenjima, nukleinska kiselina kodira bar tri aminokiselinske mutacije u odnosu na embrionske sekvence koje su identične sa bar tri aminokiseline mutacije nađene u jednom od gore nabrojanih monoklonskih antitela.

U nekim izvođenjima, molekul nukleinske kiseline sadrži nukleotidnu sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 5, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 49, 53, 57, 61, 65, 69, 73, 77, 81, 85, 89, ili 103, koja kodira aminokiselinsku sekvencu VH monoklonskog antitela 1.12.1(M29I/D19A), 1.11.1, 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1; 5.59.1 ili 1.12.1.

U nekim izvođenjima, molekul nukleinske kiseline sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira aminokiselinsku sekvencu jedne od SEQ ID NOs: SEQ ID NOs: 2; 6; 10; 14; 18; 22; 26; 30; 34; 38; 42; 46; 50; 54; 58; 62; 66; 70; 74; 78; 82; 86; 90 ili 104. U različitim poželjnim izvođenjima, molekul nukleinske kiseline sadrži bar deo nukleotidne sekvence iz SEQ ID NOS: 1 ili 95. U nekim izvođenjima, navedeni deo kodira Vh region, CDR3 region, sva tri CDR regiona ili neprekidan region uključujući CDR1-CDR3.

U nekim izvođenjima, molekul nukleinske kiseline kodira aminokiselinsku sekvencu VH koja je bar 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% ili 99% identična aminokiselinskoj sekvenci VH u bilo kojoj od SEQ ID NOs: 2; 6; 10; 14; 18; 22; 26; 30; 34; 38; 42; 46; 50; 54; 58; 62; 66; 70; 74; 78; 82; 86; 90 ili 104. Molekuli nukleinske kiseline iz pronalaska uključuju nukleinske kiseline koje hibridizuju pod jako strogim uslovima, kao što su oni opisani gore ili koje su bar 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% ili 99% identične nukleinskoj kiselini koja kodira aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NOs: 2; 6; 10; 14; 18; 22; 26; 30; 34; 38; 42; 46; 50; 54; 58; 62; 66; 70; 74; 78; 82; 86; 90, 100 ili 104, ili njenom Vh regionu ili nukleinskoj kiselini koji sadrži nukleotidnu sekvencu iz SEQ 1D NOs: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 49, 53, 57, 61, 65, 69, 73, 77, 81, 85, 89, 95, 103, 128, ili 129 ili nukleotidnu sekvencu koja kodira dati Vh region.

U jednom drugom izvođenju, nukleinska kiselina kodira ćelu dužinu teškog lanca antitela odabranog iz grupe koja se sastoji od 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1(rWT);

1.12.1(M29I/D19A); 1.12.1 (M29I); 1.12.1 (Dl 9A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1;

5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1; i 5.59.1, ili težak lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 2. Dalje, nukleinska kiselina može da sadrži nukleotidnu sekvencu iz SEQ ID NOs: 1 ili 95.

Molekul nukleinske kiseline koji kodira težakili lak lanac antitela na ALK-1 ili njiegvih delova može se izolovati iz bilo kog izvora koji proizvodi takvo antitelo. U različitim izvođenjima, molekuli nukleinske kiseline se izoluju iz B ćelije koja eksprimira antitelo na ALK-1 izolovane iz životinje imunizovane pomoću ALK-1 ili iz imortalizovane ćelije izvedene iz takve B ćelije. Postupci izolovanja nukleinskih kiselina koje kodiraju antitelo su dobro poznati u struci. Videti, npr., Sambrook J. & Russell D.. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2000). iRNK mogu biti izolovane i korišćene za proizvodnju cDNK za upotrebu u lančanoj reakciji polimeraze (PCR) ili cDNK za kloniranje gena za antitela. U jednom poželjnom izvođenju, molekul nukleinske kiseline je izolovan iz hibridoma koji za jednog od fuzionih partnera ima ćeliju iz ne-humane transgene životinje, gde ta ćelija proizvodi humani imunoglobulin. U jednom još poželjnijem izvođenju, ćelija koja proizvodi humani imunoglobulin je izolovana iz XENOMOUSE® životinje. U jednom drugom izvođenju, ćelija koja proizvodi humani imunoglobulin je izolovana iz ne-humane, ne-mišje transgene životinje, kao što je opisano gore. U jednom drugom izvođenju, nukleinska kiselina je izolovana iz ne-humane, ne-transgene životinje. Molekuli nukleinske kiseline izolovani iz nehumane, ne-transgene životinje mogu da se koriste, npr., za humaniizovana antitela koja sadrže jednu ili više aminokiselinskih sekvenci iz humanog antitela na ALK-1 iz ovog pronalaska.

U nekim izvođenjima, nukleinska kiselina koja kodira težak lanac antitela na ALK-1 iz pronalaska može da sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira Vh domen iz pronalaska spojen u odgovarajućem okviru čitanja sa nukleotidnom sekvencom koja kodira konstantan domen teškog lanca iz bilo kog izvora. Slično, molekul nukleinske kiseline koji kodira lak lanac antitela na ALK-1 iz pronalaska može da sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira VL domen iz pronalaska spojen u odgovarajućem okviru čitanja sa nukleotidnom sekvencom koja kodira konstantan domen lakog lanca iz bilo kog izvora.

U jednom daljem izvođenju pronalaska, molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju varijabilni domen teškog(VH) i/ili lakog (Vl) lanca su “konvertovani” u ćele gene antitela. U jednom izvođenju, molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju Vh ili VL domene su konvertovani u ćele gene antitela insercijom u ekspresioni vektor koji već kodira konstantan domen teškog lanca (CH) odnosno, konstantan domen lakog lanca (Cl), takav da je VH segment operativno spojen sa Ch segmentom(-ima) unutar vektora, i/ili je Vl segment is operativno spojen sa Cl segmentom unutar vektora. U jednom drugom izvođenju, molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju Vh i/ili Vl domen su konvertovani u ćele gene antitela vezivanjem, npr., ligiranjem molekula nukleinske kiseline koji kodira Vh i/ili VL domen za molekul nukleinske kiseline koji kodira Ch i/ili Cl domen pomoću standardih molekularno bioloških tehnika. Sekvence nukleinske kiseline gena za konstantne domene teškog i lakog lanca humanog imunoglobulina su poznate u struci. Videti, npr., Kabat et al., Sequences of Proteins of lmmunological Interest, 5th Ed., NIH Publ. No. 91-3242, 1991. Molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju ćelu dužinu teškog i/ili lakog lanca mogu se zatim eksprimirati iz ćelije u koju su uvedeni i izolovati antitelo na ALK-1.

Molekuli nukleinske kiseline mogu se upotrebljavati za rekombinantnu ekspresiju velikih količina antitela na ALK-1. Molekuli nukleinske kiseline se takođe mogu upotrebljavati za proizvodnju himernih antitela, bispecifičnih antitela, jednolančanih antitela, imunoadhezina, dijatela, mutiranih antitela i derivata antitela, kao što je opisano još niže. Ako su molekuli nukleinske kiseline izvedeni iz ne-humane, ne-transgene životinje, molekuli nukleinske kiseline se mogu upotrebljavati za humaniizaciju antitela, što je takođe opisano niže.

U jednom drugom izvođenju, molekul nukleinske kiseline iz pronalaska se koristi kao proba ili PCR prajmer za specifičnu sekvencu antitela. Na primer, nukleinska kiselina se može upotrebljavati kao proba u dijagnostičkim postupcima ili kao PCR prajmer da se umnože regioni DNK koji se mogu koristiti, između ostalog, za izolovanje dodatnih molekula nukleinske kiseline koja kodira varijabilne domene antitela na ALK-1. U nekim izvođenjima, molekuli nukleinske kiseline su oligonukleotidi. U nekim izvođenjima, oligonukleotidi su iz jako varijabilnih domena teškog i lakog lanca antitela od interesa. U nekim izvođenjima, oligonukleotidi kodiraju ćele ili delove jednog ili više CDR-ova antitela 1.11.1; 1.12.1;

1.12.1 (rWT); 1.12.1 (M29I/D19 A); 1.12.1 (M29I); 1.12.1 (Dl 9A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1; ili 5.59.1 ili njegovih varijanti kao stoje opisano ovde.

Vektori

Pronalazak obezbeđuje vektore koji sadrže molekule nukleinske kiseline koji kodiraju težak lanac antitela na ALK-1 iz pronalaska ili njegovog dela za vezivanje antigena. Pronalazak takođe obezbeđuje vektore koji sadrže molekule nukleinske kiseline koji kodiraju lak lanac takvih antitela ili njegovih delova za vezivanje antigena. Pronalazak dalje obezbeđuje vektore koji sadrži molekule nukleinske kiseline koji kodiraju fuzione proteine, modifikovana antitela, fragmente antitela i njihove probe.

U nekim izvođenjima, antitela na ALK-1 iz pronalaska ili njihovi delovi za vezivanje antigena su eksprimirani insercijama DNK koje kodiraju delove ili ćele dužine lakog i teškog lanca, dobijenih kao što je opisano gore, u ekspresione vektore tako da su geni operativno vezani za neophodne sekvence za kontrolu ekspresije, kao što su sekvence za kontrolu transkripcije i translacije. Ekspresioni vektori uključuju plazmide, retroviruse, adenoviruse, adeno-asocirane viruse (AAV), biljne viruse kakvi su mozaički virus karfiola, mozaički virus duvana, kozmidi, YAC-ovi, epizomi izvedeni iz EBV i slični. Gen antitela je ligiran u vektor tako da sekvence za kontrolu transkripcije i translacije unutar vektora služe svojim predviđenim funkcijama regulacije transkripcije i translacije gena antitela. Ekspresioni vektor i sekvence za kontrolu ekspresije se biraju tako da budu kompatibilne sa ekspresionom ćelijom domaćinom koja se koristi. Gen za lak lanac i gen za težak lanac antitela mogu se ubaciti u odvojene vektore. U jednom poželjnom izvođenju, oba gena su insertovana u isti ekspresioni vektor. Geni antitela su insertovani u ekspresioni vektor standardnim postupcima (npr., ligacijom komplementarnih restrikcionih mesta na fragment gena antitela i vektor, ili ligacijom ravnih krajeva ako restrikciona mesta nisu prisutna).

Pogodan vektor je onaj koji kodira funkcionalno kompletnu humanu imunoglobulinsku sekvencu Ch ili Cl, sa odgovarajućim restrikcionim mestima, konstruisan tako da bilo koja VH ili VL sekvenca može lako da se insertuje i eksprimira, kao stoje opisano gore. U takvim vektorima, iskrajanje (splajsing) se obično javlja između donorskog mesta iskrajanja u insertovanom J regionu i akceptorskog mesta iskrajanja koje prethodi humanom C domenu, a takođe u regionima iskrajanja koji se javljaju unutar humanih Ch egzona.

Poliadenilacija i terminacija transkripcije se javljaju na nativnim hromozomskim mestima nizvodno od kodirajućih regiona. Rekombinantni ekspresioni vektor može da kodira i signalni peptid koji olakšava sekreciju lanca antitela iz ćelije domaćina. Gen za lanac antitela može da se klonira u vektor tako da signalni peptid bude u istom okviru čitanja kao amino kraj imunoglobulinskog lanca. Signalni peptid može biti imunoglobulinski signalni peptid ili heterologan signalni peptid (tj., signalni peptid iz ne-imunoglobulinskog proteina).

Kao dodatak na gene za lance antitela, rekombinantni ekspresioni vektori iz pronalaska nose regulatorne sekvence koje kontrolišu ekspresiju gena za lance antitela u ćeliji domaćinu. Stručnjaci podrazumevaju da dizajn ekspresionog vektora, uključujući odabir regulatornih sekvenci može da zavisi od takvih faktora kao što su izbor ćelije domaćina koja treba da se transformiše, nivo ekspresije željenog proteina, itd. Poželjne regulatorne sekvence za ekspresiju sisarskih ćelija domaćina uključuju virusne elemente koji određuju visoke nivoe ekspresije proteina u sisarskim ćelijama, kao što su promotori i/ili enhanseri izvedeni iz retrovirusnih LTR-ova, citomegalovirus (CMV) (kao stoje CMV promotor/enhanser), Simian Virus 40 (SV40) (kao stoje SV40 promotor/enhancer), adenovirus, (npr., adenovirusni glavni kasni promotor (AdMLP)), poliom i jaki sisarski promotori kao što su nativni imunoglobulinski i aktinski promotori. Za dalji opis virusnih regulatornih elemenata i njihovih sekvenci, videti npr., U. S. Patent No. 5,168,062, U. S. Patent No. 4,510,245 i U. S. Patent No. 4,968,615. Postupci za eksprimiranje antitela u biljkama, uključujući opis promotora i vektora, kao i transformaciju biljaka su poznati u struci. Videti, npr., United States Patents 6,517, 529, ovde ugrađen referencom. Postupci eksprimiranja polipeptida u bakterijskim ćelijama ili gljivičnim ćelijama, npr., ćelijama kvasca, su takođe dobro poznati u struci.

Kao dodatak na gene za lance i regulatorne sekvence antitela, rekombinantni ekspresioni vektori iz pronalaska mogu da nose dodatne sekvence, kao što su sekvence koje regulišu replikaciju vektora u ćelijama domaćinima (npr., počeci replikacije) i selektabilne marker gene. Selektabilan marker gen olakšava selekciju ćelija domaćina u koje je uveden vektor (videti npr., U. S. Patent Nos. 4,399,216, 4,634,665 i 5,179,017, ovde ugrađeni referencom). Na primer, tipično, selektabilan marker gen daje otpornost na lekove, kao što su G418, higromicin ili metotreksat, u ćeliji domaćinu u koju je vektor uveden. Na primer, selektabilni marker geni uključuju gen za dihidrofolat reduktazu (DHFR) (za upotrebu u ćelijama domaćinima sa DHFR sa selekcijom/amplifikacijom metotreksata), gen za otpornost na neomicin (za selekciju G418) i gen za glutamat sintetazu.

Ne-hibridomske ćelije domaćini i postupci rekombinantne proizvodnje proteina

Molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju antitela na ALK-1 i vektori koji sadrže ove molekule nukleinske kiseline mogu da se koriste za transfekciju pogodnog sisara, biljke, bakterijske ili kvaščeve ćelije domaćina. Transformisanje se može izvršitibilo kojim poznatim postupkom uvođenja polinukleotida ćeliju domaćina. Postupci za uvođenje heterolognih polinukleotida u sisarske ćelije su dobro poznati u struci i uključuju transfekciju posredovanu dekstranom, precipitaciju kalcijum fosfatom, transfekciju posredovanu polibrenom, fuziju protoplasta, elektroporaciju, inkapsulaciju polinukleotida u lipozomima i direktno mikroinjektiranje DNK u jedra. Pored toga, molekuli nukleinske kiseline se mogu uvesti u sisarske ćelije virusnim vektorima. Postupci transformisanja ćelija su dobro poznati u struci. Videti, npr., U. S. Patent Nos. 4,399,216, 4,912,040, 4,740,461, i 4,959,455 (koji su ovde inkorporisani referencom) Postupci transformisanja biljnih ćelija su dobro poznati u struci, uključujući, npr., transformaciju posredovanu Agrobacterium-om, biolističku transformaciju, direktno injektiranje, elektroporaciju i virusnu transformaciju. Postupci transformisanja bakterijskih i kvaščevih ćelija su takođe dobro poznati u struci.

Sisarske ćelijske linije dostupne kao domaćini za ekspresiju su dobro poznate u struci i uključuju mnoge imortalizovane ćelijske linije dostupne iz American Type Culture Collection (ATCC). Ove uključuju, inter alia, jajne ćelije kineskog hrčka (CHO), NSO ćelije, SP2 ćelije, HEK-293T ćelije, 293 Freestyle ćelije (Invitrogen), NIH-3T3 ćelije, HeLa ćelije, ćelije bubrega mladunca hrčka (BHK), bubrežne ćelije afričkog zelenog majmuna (COS), ćelije humanog hepatoćelijskog karcinoma (npr., Hep G2), A549 ćelije i brojne druge ćelijske linije. Posebno poželjne ćelijske linije su odabrane određivanjem koje ćelijske linije imaju visok nivo ekspresije. Ostale ćelijske linije koje se mogu koristiti su ćelijske linije insckata, kao što su Sf9 ili Sf21 ćelije. Kad se vektori za rekombinantnu ekspresiju koji kodiraju gene antitela uvedu u sisarske ćelije domaćine, antitela se proizvode gajenjem ćelija domaćina tokom vremenskog perioda dovoljno dugog da dozvoli ekspresiju antitela u ćelijama domaćinima ili, još poželjnije, sekreciju antitela u medijum za kulturu u kome se gaje ćelije domaćini Antitela se mogu povratiti iz medijuma za kulturu pomoću standardnih postupaka za prečišćavanje proteina. Biljne ćelije domaćini uključuju, npr., Nicotiana, Arabidopsis, Lemnaceae, kukuruz, pšenicu, krompir, itd. Bakterijske ćelije domaćini uključuju vrste E. coli i Streptomyces. Ćelije domaćini kvasca uključuju Schizosaccharomycespombe, Saccharomycescerevisiae i Pichia pastoris.

Dalje, ekspresija antitela iz pronalaska iz proizvodnih ćelijskih linija može se povećati upotrebom brojnih poznatih tehnika. Na primer, sistem za gensku ekspresiju glutamin sintetaze (GS sistem) je čest pristup za pojačanje ekspresije pod određenim uslovima. GS sistem je diskutovan u celini ili delimično u vezi sa European Patent Nos. 0 216 846, 0 256 055,0 323 997 i 0 338 841.

Verovatno je da će antitela eksprimirana u različitim ćelijskim linijama ili u transgenim životinjama imati različite glikozilacije. Međutim, sva antitela koja kodiraju molekuli nukleinskih kiselina obezbeđeni ovom prijavom, ili koja sadrže aminokiselinske sekvence obezbeđene ovom prijavom su deo ovog pronalaska, bez obzira na glikozilaciju antitela.

Transgene životinje i biljke

Antitela na ALK-1 iz pronalaska se mogu proizvoditi i transgeno kroz dobijanje sisara ili biljke koja je transgena za sekvence imunoglobulinskog teškog i lakog lanca od interesa i proizvodnju antitela u takvom izvođenju koji se odatle može povratiti. U vezi sa transgenom proizvodnjom u sisarima, antitela na ALK-1 se mogu proizvoditi u, i povratiti iz, mleka koza, krava ili drugih sisara. Videti, npr., U. S. Patent Nos. 5,827,690, 5,756,687, 5,750,172, i 5,741,957, koji su ovde inkorporisani referencom. U nekim izvođenjima, ne-humane transgene životinje, koje sadrže lokuse za humani imunoglobulin, se imunizuju pomoću ALK-1 ili njegovim imunogenim delom, kao što je opisano gore. Postupci za pravljenje antitela u biljkama su opisani u, npr., US patentima 6,046,037 i US 5,959, 177, koji su ovde inkorporisani referencom.

U nekim izvođenjima, ne-humane transgene životinje ili biljke se proizvode uvođenjem jednog ili više molekula nukleinske kiseline koja kodira antitelo na ALK-1 iz pronalaska u životinju ili biljku standardnim transgenim tehnikama. Videti Hogan i United States Patent 6,417,429, supra. Transgene ćelije koje se koriste za pravljenje transgenih životinja mogu biti embrionske matične ćelije ili somatske ćelije ili oplođeno jaje. Transgeni ne-humani organizmi mogu biti himerni, nehimerni heterozigoti i nehimerni homozigoti. Videti, npr., Hogan et al., Manipulating the Mouse Embrvo: A Laboratorv Manual 2 ed., Cold Spring Harbor Press (1999); Jackson et al., Mouse Genetics and Transgenics: A Practical Approach, Oksford University Press (2000); Pinkert, Transgenic Animal Technologv: A Laboratorv Handbook, Academic Press (1999), gde su svi ovde inkorporisani referencom. U nekim izvođenjima, transgene ne-humane životinje imaju ciljanu disrupciju i zamenu željenim konstruktom koji kodira težak lanac i/ili lak lanac od interesa. U jednom poželjnom izvođenju, transgene životinje sadrže i eksprimiraju molekule nukleinske kiseline koji kodiraju težak i lak lanac koji se specifično vezuju za ALK-1, poželjno humani ALK-1. U nekim izvođenjima, transgene životinje sadrže molekule nukleinske kiseline koja kodira modifikovano antitelo kao što je jednolančano antitelo, himerno antitelo ili humanizovano antitelo. Antitela na ALK-1 mogu da se prave u bilo kojoj transgenoj životinji. U jednom poželjnom izvođenju, ne-humane životinje su miševi, pacovi, ovce, svinje, koze, goveda ili konji. Ne-humana transgena životinja eksprimira navedene kodirane polipeptide u krvi, mleku, urinu, pljuvačci, suzama, mukusu i ostalim telesnim tečnostima.

Biblioteke na fagu

Pronalazak obezbeđuje postupak za proizvodnju antitela na ALK-1 ili njegovog dela za vezivanje antigena koji sadrži korake sintetisanja biblioteke humanih antitela na fagu, pretraživanja biblioteke pomoću ALK-1 ili njegovog dela za vezivanje antigena, izolovanja faga koji vezuje ALK-1 i dobijanja antitela iz faga. Kao primer, jedan postupak za dobijanje biblioteke antitela za upotrebu u tehnikama ispoljavanja na fagu (phage display techniques) sadrži korake imunizovanja pomoću ALK-1 ili njegovog antigenskog dela ne-humane životinje koja sadrži lokuse za humani imunoglobulin da bi se stvorio imuni odgovor, ekstrahovanja ćelija koje proizvode antitelo iz imunizovane životinje; izolovanja RNK koja kodira težak i lak lanac antitela iz pronalaska iz ekstrahovanih ćelija, reverzne transkripcije RNK da bi se dobila cDNK, amplifikovanja cDNK upotrebom prajmera i insercije cDNK u vektor ispoljavanja na fagu tako da se antitela eksprimiraju na fagu. Rekombinantna antitela na ALK-1 iz pronalaska mogu se dobiti na ovaj način.

Rekombinantna humana antitela na ALK-1 iz pronalaska mogu se izolovati pretraživanjem biblioteke rekombinantnih kombinatorijskih antitela. Poželjna biblioteka je biblioteka ispoljavanja scFv na fagu, napravljena upotrebom humanih cDNK VL i Vh dobijenih iz iRNK izolovanih iz B ćelija. Metodologije za dobijanje i pretraživanje takvih biblioteka su poznate u struci. Postoje komercijalno dostupni kompleti ("kitovi") za pravljenje biblioteka ispoljavanja na fagu (npr., Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, kataloški br. 27-9400-01 i Stratagene SurfZAP komplet za ispoljavanje na fagu, kataloški br. 240612). Postoje i drugi postupci i reagensi koji se mogu koristiti u pravljenju i pretraživanju biblioteka za ispoljavanje antitela (videti, npr., U. S. Patent No. 5,223,409; PCT Publication

Nos. W092/18619, W091/17271, WO 92/20791, WO 92/15679, WO93/01288, WO 92/01047, WO 92/09690; Fuchs et al., Bio/Technology 9: 1370-1372 (1991); Hay et al., Hum. Antibod. Hybridomas 3: 81-85 (1992); Huse et ai, Science 246: 1275-1281 (1989); McCafferty et al., Nature 348: 552-554 (1990); Griffiths et al., EMBOJ. 12: 725-734 (1993); Havvkins et al., J. Mol. Biol. 226: 889-896 (1992); Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Gram et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 3576-3580 (1992); Garrad et al., Bio/Technology 9: 1373-1377 (1991); Hoogenboom et al., Nuc. Acid Res. 19: 4133-4137 (1991) i Barbas et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7978-7982 (1991), svi ovde uključeni referencom.

U jednom izvođenju, da bi se izolovala i proizvela humana antitela na ALK-1 sa željenim karakteristikama, prvo se koristi humano antitelo na ALK-1 kakvo je ovde opisano da bi se odabrale sekvence humanog teškog i lakog lanca koje imaju sličnu aktivnost vezivanja za ALK-1 pomoću postupka utiskivanja (imprinting) epitopa opisanih u PCT Publication No. WO 93/06213, koja je ovde uključena referencom. Poželjno je da biblioteke antitela koje se koriste u ovom postupku budu scFv biblioteke, dobijene i pretražene kao stoje opisano u PCT Publication No. WO 92/01047, McCafferty et al., Nature 348: 552-554 (1990) i Griffiths et al., EMBO J. 12: 725-734 (1993), sve ovde uključene referencom. Biblioteke scFv antitela poželjno se pretražuju pomoću humanog ALK-1 kao antigena.

Jednom kad su odabrani početni humani Vl i Vh domeni, rade se eksperimenti "pomešaj i spari", u kojima se različiti parovi početno odabranih segmenata Vl i Vh pretražuju na vezivanje za ALK-1 da bi se odabrale poželjne kombinacije parova NJ Vh-Pored toga, da bi se dalje popravio kvalitet antitela, segmenti VL i VH poželjnih parova NJ VH se mogu nasumice mutirati, poželjno unutar CDR3 regiona VL i/ili VH, u procesu analognom in vivo procesu somatske mutacije, odgovornom za sazrevanje afiniteta antitela tokom prirodnog imunog odgovora. Ovo in vitro sazrevanje afiniteta može se postići amplifikovanjem domena Vh i VL pomoću PCR prajmera, komplementarnih CDR3 VH odnosno, CDR3 Vl, gde su prajmeri "špikovani" nasumičnom smesom četiri nukleotidne baze u određenim pozicijama tako da dobijeni PCR proizvodi kodiraju segmente VH i VL u kojima su randomizirane mutacije uvedene u CDR3 regione VH i/ili VL. Ovi nasumično mutirani VH i VL segmenti mogu se ponovo pretražiti na vezivanje za ALK-1.

Posle pretraživanja i izolovanja antitela na ALK-1 iz pronalaska iz biblioteke za ispoljavanje rekombinantnog imunoglobulina, nukleinske kiseline koje kodiraju odabrano antitelo mogu se dobiti iz tog paketa (npr, iz genoma faga) i podklonirati u druge ekspresione vektore standardnim tehnikama rekombinantne DNK. Po želji, nukleinskom kiselinom se može dalje manipulisati da bi se stvorili druga izvođenja antitela iz pronalaska, kao što je opisano dole. Da bi se eksprimiralo rekombinantno humano antitelo izolovano pretraživanjem kombinatorijske biblioteke, DNK koja kodira antitelo se klonira u rekombinantni ekspresioni vektor i uvodi u sisarske ćelije domaćine, kao stoje opisano gore.

Deimunizovana antitela

U jednom drugom izvođenju pronalaska, antitelo se može deimunizovati da bi se redukovala njegova imunogenost tehnikama opisanim u, npr., PCT Publication Nos. W098/52976 i WOOO/34317 (ovde ugrađenih referencom).

Mutirana antitela

U jednom drugom izvođenju, molekuli nukleinske kiseline, vektori i ćelije domaćini mogu da se koriste za pravljenje mutiranih antitela na ALK-1. Antitela se mogu mutirati u varijabilnim domenima teškog i/ili lakog lanca, npr., da bi se promenila osobina vezivanja antitela. Na primer, mutacija može da se napravi u jednom ili više CDR regiona da bi se povećala ili smanjila Kd antitela za ALK-1, da bi se povećala ili smanjila k0ff ili da bi se promenila specifičnost vezivanja antitela. Tehnike u specifičnoj (site-directed) mutagenezi su dobro poznate u struci. Videti, npr., Sambrook et al. i Ausubel et al., supra. U jednom drugom izvođenju, jedna ili više mutacija se pravi na aminokiselinskom ostatku za koji se zna da je promenjen u odnosu na embrionski u monoklonskom antitelu 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1(rWT); 1.12.1 (M29I/D19A); 1.12.1 (M29I); 1.12.1 (Dl 9A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1 ili 5.59.1. Mutacije se mogu praviti u CDR regionu ili u okvirnom regionu varijabilnog domena ili u konstantnom domenu. U jednom poželjnom izvođenju, mutacije se prave u varijabilnom domenu. U nekim izvođenjima, jedna ili više mutacija se pravi na aminokiselinskom ostatku za koji se zna daje promenjen u odnosu na embrionski u CDR regionu ili okvirnom regionu varijabilnog domena aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90 92 ili 127, ili čija je sekvenca nukleinske kiseline predstavljena u SEQ ID NO: 1,3, 5, 7, 9, 1 1, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61,63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 95, 102 ili 126.

U jednom drugom izvođenju, okviran region je mutiran tako da dobijeni okvirni region(i) ima(ju) aminokiselinsku sekvencu koja odgovara embrionskom genu. Mutacija može da bude napravljena u okvirnom regionu ili konstantnom domenu da bi se povećao poluživot antitela na ALK-1. Videti, npr., PCT Publication No. WO 00/09560, ovde ugrađenu referencom. Mutacija u okvirnom regionu ili konstantnom domenu može se napraviti i da bi se promenila imunogenost antitela, da bi se obezbedilo mesto za kovalentno ili nekovalentno vezivanje za drugi molekul ili da bi se promenile takve osobine kao što su fiksacija komplementa, vezivanje FcR i ćelijski posredovana citotoksičnost zavisna od antitela (ADCC, od antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity). U skladu sa pronalaskom, jedno antitelo može da ima mutacije u bilo kom jednom ili više CDR-ova ili okvirnih regiona varijabilnog domena ili u konstantnom domenu.

U nekim izvođenjima, ima od 1 do 13, uključujući sve brojeve između, aminokiselinskih mutacija u bilo kom od VH ili Vl domena mutiranog antitela na ALK-1 u odnosu na antitelo na ALK-1 pre mutacije. U bilo kom od gornjih, mutacije mogu da se jave u jednom ili više CDR regiona. Dalje, bilo koja od mutacija može da bude konzervativna aminokiselinska supstitucija. U nekim izvođenjima, nema više od 5, 4, 3, 2, ili 1 aminokiselinske promene u konstantnim domenima.

Modifikovana antitela

U jednom drugom izvođenju, fuziono antitelo ili imunoadhezin može da se napravi da sadrži ćelo ili deo antitela na ALK-1 iz pronalaska vezan za drugi polipeptid. U jednom poželjnom izvođenju, samo varijabilni domeni antitela na ALK-1 su vezani za polipeptid. U jednom drugom poželjnom izvođenju, Vh domen antitela na ALK-1 je vezan za prvi polipeptid, dok je Vl domen antitela na ALK-1 vezan za drugi polipeptid koji se pridružuje prvom polipeptidu na način takav da VH i VL domeni mogu da interaguju jedan s drugim da bi formirali vezivno mesto antitela. A u još jednom poželjnom izvođenju, VH domen je odvojen od Vl domena linkerom takvim da Vr i Vl domeni mogu da interaguju jedan s drugim (videti niže pod Jednolančana antitela). VR-linker-VL antitelo se zatim vezuje za polipeptid od interesa. Pored toga, fuziona antitela mogu da budu kreirana tako da dva (ili više) jednolančana antitela budu vezana jedno za drugo. Ovo je korisno ako se želi kreirati dvovalentno ili polivalentno antitelo na jednom polipeptidnom lancu ili ako se želi kreirati bispecifično antitelo.

Da bi se kreiralo jednolančano antitelo (scFv), fragmenti DNK koji kodiraju Vh- i Vl-se operativno vežu za drugi fragment koji kodira fleksibilan linker, npr., koji kodira aminokiselinsku sekvencu (Gly4 -Ser)3, tako da sekvence VH i Vl mogu da budu eksprimirane kao neprekidan jednolančani protein, sa Vl i Vh domenima spojenim fleksibilnim linkerom. Videti, npr., Bird et al, Science 242: 423-426 (1988); Huston et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883 (1988); McCafferty et al., Nature 348: 552-554 (1990). Jednolančano antitelo može da bude jednovalentno, ako su korišćeni samo pojedinačni VH i VL, dvovalentno, ako su korišćena dva Vh i Vl, ili polivalentno, ako je korišćeno više od dva Vh i VL. Mogu se praviti bispeciffična ili polivalentna antitela koja se vezuju speciffično za ALK-1 i za neki drugi molekul.

U nekim drugim izvođenjima, ostala modifikovana antitela mogu da se dobiju pomoću molekula nukleinske kiseline koji kodiraju antitela na ALK-1. Na primer, "Kappa bodies" (111 et al., Protein Eng. 10: 949-57 (1997)),"Minibodies" (Martin et al., EMBO J. 13: 5303-9 (1994)), "Diabodies" (Holliger et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)), ili "Janusins" (Traunecker et al, EMBO J. 10: 3655- 3659 (1991) i Traunecker et al, Int. J. Kancer (Suppl.) 7: 51-52 (1992)) mogu da se dobijaju standardnim tehnikama molekularne biologije, sledeći uputstva iz ove specifikacije.

Bispecifična antitela ili njihovi fragmenti koji vezuju antigene mogu da se proizvode raznim postupcima uključujući fuziju hibridoma ili vezivanje Fab' fragmenata. Videti, npr., Songsivilai & Lachmann, Cliva. Exp. Immimol. 79: 315-321 (1990), Kostelny et al, J. Immunol. 148: 1547-1553 (1992). Pored toga, bispeciffična antitela mogu da se formiraju kao "dijatela" ili "janusini". U nekim izvođenjima, bispeciffično antitelo se vezuje za dva različita epitopa ALK-1. U nekim izvođenjima, bispeciffično antitelo ima prvi težak lanac i prvi lak lanac iz monoklonskog antitela 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1(rWT); 1.12.1(M29I/D19A);

1.12.1 (M29I); 1.12.1 (D19A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1; ili 5.59.1 i dodatni težak lanac i lak lanac antitela. U nekim izvođenjima, dodatni težak lanac i lak lanac su takođe iz jednog od gore identifikovanih monoklonskih antitela, ali su različiti od prvog teškog i lakog lanca.

U nekim izvođenjima, modifikovana antitela opisana gore se dobijaju korišćenjem jednog ili više varijabilnih domena ili CDR regiona iz humanog monoklonskog antitela na ALK-1 obezbeđenog ovde.

Izvedena i obeležena antitela

Antitelo na ALK-1 ili njegov deo koji vezuje antigen iz pronalaska može da bude derivatizovano ili vezano za drugi molekul (npr., drugi peptid ili protein). U opštem slučaju, antitela ili njihovi delovi su derivatizovani tako da derivatizacija ili obeležavanje nema negativan uticaj na vezivanje ALK-1. Prema tome, antitela i delovi antitela iz pronalaska su predviđeni da uključe i intaktne i modifikovane forme humanih antitela na ALK-1, opisane ovde. Na primer, antitelo ili deo antitela iz pronalaska može da bude funkcionalno vezano (hemijskim kuplovanjem, genskom fuzijom, nekovalentnim asociranjem ili na drugi način) za jedan ili više drugih molekulskih entiteta, kao što su drugo antitelo (npr., bispecifično antitelo ili dijatelo), sredstvo za detekciju, farmaceutsko sredstvo i/ili protein ili peptid koji može da posreduje u udruživanju antitela ili dela antitela sa drugim molekulom (kao što je region streptavidinskog jezgra ili polihistidinski obeleživač).

Jedan tip izvedenog antitela se pravi unakrsnim vezivanjem dva ili više antitela (istog tipa ili različitih tipova, npr., da bi se kreirala bispecifična antitela). Pogodni kroslinkeri uključuju one koji su heterobifunkcionalni, sa dve različite reaktivne grupe, razdvojene odgovarajućom marginom (spacer) (npr., m-maleimidobenzoil-N-hidroksisukcinimidni estar) ili homobifunkcionalni (npr., disukcinimidil suberat). Takvi linkeri su dostupni od Pierce Hemijski Company, Rockford, II.

Drugi tip izvedenog antitela je obeleženo antitelo. Korisna sredstva za detekciju sa kojima antitelo ili njegov deo za vezivanje antigena iz pronalaska može da se derivatizuje uključuju fluorescentna jedinjenja, uključujući fluorescein, fluorescein izotiocijanat, rodamin,

5-dimetilamin-l-naftalensulfonil hlorid, fikoeritrin, fosfolantanide i slične. Antitelo može da bude obeleženo i enzimima koji su korisni za detekciju, kao što su peroksidaza rena, (3-galaktozidaza, luciferaza, bazna fosfataza, glukozna oksidaza i slični. Kad se antitelo obeleži detektabilnim enzimom, ono se detektuje dodavanjem dodatnih reagenasa koje enzim koristi da napravi reakcioni proizvod koji se može uočiti. Na primer, kad je prisutan agens peroksidaza rena, dodavanje vodonik peroksida i diaminobenzidina dovodi do obojenog reakcionog proizvoda, koji je detektabilan. Antitelo se može obeležiti i biotinom i detektovati indirektnim merenjem vezivanja avidina ili streptavidina. Antitelo se može obeležiti i prethodno određenim polipeptidnim epitopom koji prepoznaje sekundarni reporter (npr., par sekvenci leucinskog rajsferšlusa, vezivna mesta za sekundarna antitela, domeni za vezivanje metala, epitopni obeleživači). U nekim izvođenjima, obeleživači su spojeni kracima različitih dužina da bi se smanjila potencijalna sterička smetnja.

Antitelo na ALK-1 se može derivatizovati i hemijskom grupom kao što je polietilen glikol (PEG), metil ili etil grupom ili ugljovodoničnom grupom. Ove grupe su korisne za poboljšanje bioloških osobina antitela, npr., za povećanje poluživota seruma.

Farmaceutske kompozicije i davanje

Pronalazak se odnosi i na farmaceutsku kompoziciju za lečenje stanja vezanih za nepoželjnu povećanu angiogenezu u sisaru, uključujući čoveka, koja sadrži količinu antitela na ALK-1 ili njegovog dela za vezivanje antigena , kao što je opisano ovde, koja je efektivna u lečenju takvih stanja , i farmaceutski prihvatljiv nosač.

Antitela i njihovi delovi za vezivanje antigena iz ovog pronalaska mogu se ugraditi u farmaceutske kompozicije pogodne za davanje subjektu. Tipično, farmaceutska kompozicija sadrži antitelo ili njegov deo za vezivanje antigena iz pronalaska i farmaceutski prihvatljiv nosač. Kao što je ovde korišćen, “farmaceutski prihvatljiv nosač” označava bilo koji i sve rastvarače, disperzione medijume, prevlake, antibakterijska i antifungalna sredstva, izotonična sredstva i sredstva za odlaganje apsorpcije i slično, koji su fiziološki kompatibilni. Neki primeri farmaceutski prihvatljivih nosača su voda, slani rastvor, fosfatno puferisan slani rastvor, dekstroza, glicerol, etanol i slično, kao i njihove kombinacije. U mnogim slučajevima, biće poželjno da se u kompoziciju uključe izotonična sredstva, na primer, šećeri, polialkoholi kao što je manitol, sorbitol, ili natrijum hlorid. Dodatni primeri farmaceutski prihvatljivih supstanci su sredstva za kvašenje ili manje količine pomoćnih supstanci kao što su sredstva za kvašenje ili emulzifikatori, konzervansi ili puferi, koji povećavaju trajnost ili efektivnost antitela.

Kompozicije iz ovog pronalaska mogu postojati u raznim formama, na primer, tečnoj, polučvrstoj i čvrstoj formi doze, kao što su tečni rastvori (npr., rastvori za injekcije i infuzije), disperzije ili suspenzije, tablete, pilule, prahovi, lipozomi i supozitorije. Poželjna forma zavisi od predviđenog načina davanja i terapijske primene. Tipičnie poželjne kompozicije su u formi rastvora za injekcije i infuzije, kao što su kompozicije slične onima koje se koriste za pasivnu imunizaciju ljudi. Poželjan način davanja je parenteralan (npr., intravenski, subkutani, intraperitonealni, intramuskularni). U jednom poželjnom izvođenju, antitelo se daje intravenskom infuzijom ili injekcijom. U drugom poželjnom izvođenju, antitelo se daje intramuskularnom ili subkutanom injekcijom. Formulacije za injekcije mogu da budu date u vidu jedinične doze, npr., u ampulama ili kao kontejneri sa višestrukom dozom, sa ili bez dodatog konzervansa. Kompozicije mogu da budu u obliku suspenzija, rastvora ili emulzija u uljnim ili viđenim nosačima i mogu da sadrže agense za formulacije kao što su agensi za suspendovanje, stabilizaciju i/ili dispergovanje. Alternativno, aktivni sastojak može biti u formi praha za konstitusanje sa pogodnim nosačem, npr., sterilnom vodom bez pirogena, pre upotrebe.

Terapijske kompozicije tipično moraju da budu sterilne i stabilne u uslvima proizvodnje i skladištenja. Kompozicija može biti formulisana kao rastvor, mikroemulzija, disperzija, lipozom ili neka druga uređena struktura pogodna za visoku koncentraciju leka. Sterilni injektabilni rastvori se mogu dobijati ubacivanjem antitela na ALK-1 u potrebnoj količini u odgovarajući rastvarač sa jednim ili kombinacijom sastojaka nabrojanih gore, po potrebi, a zatim filtriranom sterilizacijom. Uopšteno, disperzije se dobijaju ugrađivanjem aktivnog jedinjenja u sterilan nosač koji sadrži osnovni disperzioni medijum i potrebne ostale sastojke od onih nabrojanih gore. U slučaju sterilnih prahova za dobijanje sterilnih injektabilnih rastvora, poželjni postupci dobijanja su sušenje na vakuumu i sušenje uz zamrzavanje koje daje prah aktivnog sastojka plus bilo koji dodatni željeni sastojak iz njihovog prethodno sterilno profiltriranog rastvora. Pravilna fluidnost rastvora se može održati, na primer, upotrebom prevlake kao što je lecitin, održavanjem zahtevane veličine čestica u slučaju disperzije i upotrebom surfaktanata. Produžena apsorpcija injektabilnih kompozicija se može postići uključivanjem u kompoziciju sredstva koje odlaže apsorpciju, na primer, monostearatnih soli i želatina.

Antitela ili delovi antitela iz ovog pronalaska mogu se davati nizom postupaka poznatih u struci, mada je za mnoge terapijske primene, poželjan put/način davanja subkutano, intramuslcularno ili intravenozna infuzija. Kao što će vešt stručnjak podrazumevati, put i/ili način davanja će varirati u zavisnosti od željenih rezultata.

U određenim izvođenjima, kompozicije sa antitelom iz ovog pronalaska mogu se praviti sa nosačem koji će štititi antitelo od brzog otpuštanja, kao što je formulacija sa kontrolisanim otpuštanjem, uključujući implante, transdermalne flastere i transportne sisteme sa mikroenkapsulacijom. Mogu se koristiti biodegradabilni, biokompatibilini polimeri, kao što su etilen vinil acetat, polianhidridi, poliglikolina kiselina, kolagen, poliortoestri i polimer mlečne kiseline. Mnogi postupci za dobijanje takvih formulacija su opšte poznati stručnjacima. Videti, npr., Sustained and Controlled Release Drug Deliverv Svstems J. R. Robinson, ed., MarcelDekker, Ine., New York,1978, ovde ugrađen referencom.

Dodatna aktivna jedinjenja se takođe mogu staviti u kompozicije. U određenim izvođenjima, inhibitorno antitelo na ALK-1 iz pronalaska se formuliše zajedno sa i/ili se daje zajedno sa jednim ili više dodatnih terapijskih sredstava. Ova sredstva uključuju, bez ograničenja, antitela koja vezuju druge mete, antitumorska sredstva, antiangiogenetska sredstva, inhibitore prenosa signala, antiproliferativna sredstva, hemoterapijska sredstva ili peptidne analoge koji inhibiraju anti-ALK-1. Takve kombinovane terapije mogu da zahtevaju niže doze inhibitornog antitela na ALK-1, kao i agenasa koji se daju zajedno sa njima, čime se izbegavaju moguće toksičnosti ili komplikacije vezane za razne monoterapije.

Kao što je gore primećeno, kompozicije iz ovog pronalaska opciono mogu dalje da sadrže farmaceutski prihvatljiv antioksidant kao dodatak helirajućem sredstvu. Pogodni antioksidanti uključuju, ali nisu ograničeni na, metionin, natrijum tiosulfat, katalazu i platinu. Na primer, kompozicija može da sadrži metionin u koncentraciji iz opsega od 1 mM do oko 100 mM, a naročito je oko 27 mM. Na primer, vodena formulacija može biti: 10 mg/mL antitela na ALK-1; 20 mM histidina, pH 5,5; 84 mg/mL trehaloza dihidrata; 0,2 mg/mL polisorbata 80; 0,05 mg/mL dinatrijum EDTA; 0,1 mg/mL L-metionina.

Kompozicije iz pronalaska mogu da uključe "terapijski efektivnu količinu" ili "profilaktički efektivnu količinu" antitela ili njegovog dela za vezivanje antigena iz pronalaska. "Terapijski efektivna količina" se odnosi na količinu efektivnu, u dozama i vremenskim periodima neophodnim da bi se postigao željeni terapijski rezultat. Terapijski efektivna količina antitela ili dela antitela za vezivanje antigena može da varira u skladu sa faktorima kao što su stanje bolesti, starost, pol i težina osobe i sposobnost antitela ili dela antitela da podigne željeni odgovor u osobi. Terapijski efektivna količina je takođe ona u kojoj terapijski povoljni efekti premašuju bilo koje toksičke ili štetne efekte antitela ili dela antitela za vezivanje antigena. "Profilaktički efektivna količina" se odnosi na količinu efektivnu, u dozama i vremenskim periodima neophodnim da bi se postigao željeni profilaktički rezultat. Tipično, pošto se profilaktička doza daje subjektima pre ili na ranijem stupnju bolesti, profilaktički efektivna količina će biti manja nego terapijski efektivna količina.

Režimi doziranja se mogu podesiti da obezbede optimalan željeni odgovor (npr., terapijski ili profilaktički odgovor). Na primer, može se dati jedan jedini bolus, može se dati nekoliko doza podeljenih tokom vremena ili doza može biti proporcionalno smanjena ili povećana prema pokazateljima potreba terapijske situacije. Posebno je pogodno formulisati parenteralne kompozicije u jediničnim oblicima doze za olakšavanje davanja i uniformnost doza. Jedinični oblici doze, kao što se ovde koristi, odnosi se na fizički diskretne jedinice podešene kao jedinične doze za sisarske subjekte koji se tretiraju; svaka jedinica sadrži unapred određenu količinu aktivnog jedinjenja, sračunatu da proizvede željen terapijski efekat, zajedno sa potrebnim farmaceutskim nosačem. Specifikacija jediničnih oblika doza iz pronalaska je diktirana i direktno zavisna od (a) jedinstvenih karakteristika antitela ili dela antitela na ALK-1 i konkretnog terapijskog ili profilaktičkog efekta koji treba postići i (b) ograničenja inherentnih struci pravljenja takvog antitela za tretiranje senzitivnosti pojedinaca.

Tipičan, neograničavajući opseg terapijskih ili profilaktičkih efektivnih količina antitela ili njegovog dela iz pronalaska je 0,025 do 50 mg/kg, poželjnije 0,1 do 50 mg/kg, još poželjnije 0,1 - 25; 0,1 do 10 ili 0,1 to 3 mg/kg. U nekim izvođenjima, formulacija sadrži 5 mg/mL antitela u puferu od 20 mM natrijum citrata, pH 5,5, 140 mM NaCl i 0,2mg/mL polisorbata 80. Treba napomenuti da vrednosti doza mogu da variraju sa tipom i jačinom stanja koje treba ublažiti. Dalje treba podrazumevati da za bilo kog konkretnog subjekta, specifičan režim doziranja treba da se podešava tokom vremena u skladu sa individualnim potrebama i profesionalnom procenom osobe koja daje ili nadgleda davanje kompozicija i da su opsezi doza izloženi ovde samo primeri i nisu predviđeni da ograniče obim ili praksu kompozicije koja je predmet zaštite.

Jedan drugi aspekt ovog pronalaska obezbeđuje komplete koji sadrže antitelo na ALK-1 ili njegov deo koji vezuje antigen iz pronalaska ili kompozicije koja sadrži takvo antitelo ili njegov deo. Komplet može da uključi, pored antitela ili kompozicija, dijagnostičke ili terapijske agense. Kao dodatak antitelu ili kompoziciji, komplet može da uključi dijagnostička ili terapijska sredstva. Komplet takođe može da uključi uputstva za upotrebu u dijagnostičkom ili terapijskom postupku. U jednom poželjnom izvođenju, komplet uključuje antitelo ili kompoziciju koja ga sadrži i dijagnostički agens koji se može koristiti u postupku opisanom niže. U jednom drugom poželjnom izvođenju, komplet uključuje antitelo ili kompoziciju koja ga sadrži i jedan ili više terapijskih agenasa that koji se mogu koristiti u postupku opisanom niže.

Dijagnostički postupci upotrebe

Antitela na ALK-1 ili njihovi delovi za vezivanje antigena mogu se koristiti u dijagnostičkim postupcima za detekciju ALK-1 u biološkom uzorku in vitro ili in vivo. Na primer, antitela na ALK-1 se mogu koristiti u uobičajenom imunoeseju, uključujući, bez ograničenja, ELISA, RIA, protočnu citometriju, imunohistohemiju tkiva, Western blot ili imunoprecipilaciju. Antitela na ALK-1 iz pronalaska se mogu koristiti za detekciju ALK-1 iz ljudi. Antitela na ALK-1 se takođe mogu koristiti za detekciju ALK-1 iz drugih primata, npr. majmuna cinomologus.

Pronalazak obezbeđuje postupak za detekciju ALK-1 u biološkom uzorku koji se sastoji od kontaktiranja biološkog uzorka sa antitelom na ALK-1 iz pronalaska i detekcije vezanog antitela. U jednom izvođenju, antitelo na ALK-1 je direktno obeleženo detektabilnim obeleživačem. U jednom drugom izvođenju, antitelo na ALK-1 (prvo antitelo) je neobeleženo, a drugo antitelo ili neki drugi molekul koji može da veže antitelo na ALK-1 je obeležen. Kao što je dobro poznato stručnjaku, drugo antitelo je odabrano tako što je sposobno da specifično veže određenu vrstu i klasu prvog antitela. Na primer, ako je antitelo na ALK-1 humani IgG, onda sekundarno antitelo može biti anti-humani-IgG. Drugi molekuli koji mogu da se vežu za antitela uključuju, bez ograničenja, protein A i protein G, gde su oba komercijalno dostupna, npr., od Pierce Chemical Co.

Pogodni obeleživači za antitela ili sekundarna antitela su već diskutovani i uključuju razne enzime, prostetičke grupe, fluorescentne materijale, luminescentne materijale i radioaktivne materijale. Primeri pogodnih enzima uključuju peroksidazu rena, baznu fosfatazu, |3-galaktozidazu, ili acetilholinesterazu; primeri pogodnih kompleksa prostetičkih grupa uključuju streptavidin/biotin i avidin/biotin; primeri pogodnih fluorescentnih materijala uključuju umbeliferon, fluorescein, fluorescein izotiocijanat, rodamin, dihlorotriazinilamin fluorescein, dansil hlorid ili fikoeritrin; primer luminescentnog materijala uključuje luminol i primeri pogodnih radioaktivnih materijala uključuju I, I, S ili H.

U drugim izvođenjima, ALK-1 se može testirati u biološkom uzorku kompeticionim imunoesejem, koristeći ALK-1 standarde obeležene detektabilnom supstancom i neobeleženo antitelo na ALK-1. U ovom eseju, biološki uzorak, obeleženi ALK-1 standardi i antitelo na ALK-1 se lcombinuju i određuje se količina obeleženog ALK-1 standarda vezanog za neobeleženo antitelo. Količina ALK-1 u biološkom uzorku je obrnuto proporcionalna količini obeleženog ALK-1 standarda vezanog za antitelo na ALK-1.

Imunoeseji, izloženi gore, mogu se koristiti za niz svrha. Na primer, antitela na ALK-1 se mogu koristiti za detekciju ALK-1 u gajenim ćelijama. U jednom poželjnom izvođenju, antitela na ALK-1 se koriste za određivanje količine ALK-1 koji su proizvele ćelije tretirane različitim jedinjenjima. Ovaj postupak se može koristiti za identifikaciju jedinjenja koja modulišu nivoe ALK-1 proteina. Prema ovom postupku, jedan uzorak ćelija se tretira testiranim jedinjenjem u jednom periodu, dok se drugi uzorak ostavi netretiran. Ako se meri ukupan nivo ALK 1, ćelije se liziraju i meri se ukupan nivo ALK 1 pomoću jednog od imunoeseja opisanih gore. Ukupan nivo ALK-1 u tretiranim prema netretiranim ćelijama se poredi da bi se odredio efekat testiranog jedinjenja.

Poželjan imunoesej za merenje ukupnih nivoa ALK-1 je protočna citometrija ili imunohistohemija. Postupci kao što su ELISA, RIA, protočna citometrija, Western blot, imunohistohemija, obeležavanje integralnih membranskih proteina na površini ćelije i imunoprecipitacija su dobro poznati u struci. Videti, npr., Harlovv and Lane, supra. Pored toga, imunoeseji se mogu napraviti na velikoj skali za efikasno pretraživanje da bi se testirao veliki broj jedinjenja bilo na aktivaciju ili na inhibiciju ekspresije ALK-1.

Antitela na ALK-1 iz pronalaska se mogu takođe upotrebljavati za određivanje nivoa ALK-1 u tkivu ili u ćelijama izvedenim iz tkiva. U nekim izvođenjima, tkivo je obolelo tkivo. U nekim izvođenjima postupka, tkivo ili njegova biopsija je isečena iz pacijenta. U nekim izvođenjima postupka, tkivo ili njegov uzorak mogu biti eksizirani iz pacijenta. Tkivo ili njegov uzorak se zatim mogu koristiti u imunoeseju da bi se odredili, npr., ukupni nivoi ALK-1 ili lokalizacija ALK-1 postupcima diskutovanim gore.

Antitela iz ovog pronalaska se mogu takođe upotrebljavati in vivo za identifikaciju tkiva i organa koji eksprimiraju ALK-1. Jedna prednost upotrebe humanih antitela na ALK-1 iz ovog pronalaska je da se ona mogu bezbedno koristiti in vivo bez podizanja bitnog imunog odgovora na antitelo po davanju, za razliku od antitela ne-humanog porekla ili humaniizovanih ili himernih antitela.

Postupak sadrži korake davanja detektabilno obeleženog antitela na ALK-1 ili kompozicije koja ga sadrži pacijentu kome je potreban takav diagnostički test i podvrgavanja pacijenta analizi snimanja (imaging) da bi se odredila lokacija tkiva koja eksprimiraju ALK-1. "Imidžing" analiza je dobro poznata u medicinskoj struci i uključuje, bez ograničenja, analizu x-zracima, snimanje magnetnom rezonancom (MRI) ili kompjuterizovanom tomografijom (CT). Antitelo može biti obeleženo bilo kojim sredstvom pogodnim za in vivo snimanje, na primer, kontrastnim agensom, kao što je barijum, koji se može koristiti za analizu x-zracima, ili magnetni kontrastni agens, kao što je gadolinijum helat, koji se može koristiti za MRI ili CT. Druga sredstva za obeležavanje uključuju, bez ograničenja, radioizotope, kao što je 99Tc. U jednom drugom izvođenju, antitelo na ALK-1 će biti neobeleženo i snimano davanjem drugog antitela ili drugog molekula koji je detektabilan i koji može da veže antitelo na ALK-1. U jednom izvođenju, pacijentu se radi biopsija da bi se odredilo da li tkivo od interesa eksprimira ALK-1

Terapijski postupci upotrebe

U jednom drugom izvođenju, pronalazak obezbeđuje postupak za inhibiranje aktivnosti ALK-1 davanjem antitela na ALK-1 pacijentu kome je to potrebno. Bilo koja od antitela ili njihovih delova za vezivanje antigena opisanih ovde mogu se koristiti terapijski. U jednom poželjnom izvođenju, antitelo na ALK-1 je humano, himerno ili humanizovano antitelo. U jednom drugom poželjnom izvođenju, antitelo na ALK-1 je humano antitelo i pacijent je humani pacijent. Alternativno, pacijent može biti sisar koji eksprimira ALK-1 sa kojim antitelo na ALK-1 unakrsno reaguje. Antitelo može da se daje ne-humanom sisaru koji eksprimira ALK-1 sa kojim antitelo unakrsno reaguje (npr. majmun cynomolgus) u veterinarske svrhe ili kao životinjskom modelu ljudskog oboljenja. Takvi životinjski modeli mogu biti korisni za procenjivanje terapijske efikasnosti antitela iz ovog pronalaska.

U jednom drugom izvođenju, antitelo na ALK-1 ili njegov može se davati pacijentu koji eksprimira neadekvatno visoke nivoe ALK-1. Antitelo se može dati jednom, ali je poželjnije da se da više puta. Antitelo se može davati od tri puta dnevno do jednom na svakih šest meseci ili duže. Raspored davanja može biti tri puta dnevno, dvaput dnevno, jednom dnevno, jednom u dva dana, jednom u tri dana, jednom nedeljno, jednom u dve nedelje, jednom mesečno, jednom na svaka dva meseca, jednom na svaka tri meseca i jednom na svakih šest meseci. Antitelo se može davati kontinualno minipumpom. Antitelo se može davati mukoznim, bukalnim, intranazalnim, inhalabilnim, intravenskim, subkutanim, intramuskularnim, parenteralnim ili intratumorskim putem. Antitelo se može dati jednom, najmanje dvaput ili bar u vremenskom periodu dok se stanje tretira, dok se ne ublaži ili ne izleći. Antitelo će se uopšteno davati dok god je stanje prisutno. Antitelo će se uopšteno davati kao deo farmaceutske kompozicije koja je opisana supra. Doza antitela će se uopšteno kretati u opsegu 0,1-100 mg/kg, poželjnije 0,5-50 mg/kg, još poželjnije 1-20 mg/kg, a čak još poželjnije 1-lOmg/kg. Koncentracija antitela u serumu može se meriti bilo kojim postupkom poznatim u struci.

U jednom izvođenju, antitelo se daje u formulaciji kao sterilan vodeni rastvor koji ima pH u opsegu od oko 5,0 do oko 6,5 i koji sadrži od oko 1 mg/ml do oko 200 mg/ml antitela, od oko 1 millimolarnog do oko 100 millimolarnog histidinskog pufera, od oko 0,01 mg/ml do oko 10 mg/ml polisorbata 80, od oko 100 millimolarne do oko 400 millimolarne trehaloze i od oko 0,01 millimolarnog do oko 1,0 millimolarnog dinatrijum EDTA dihidrata.

Ovim pronalaskom je dalje predviđeno da se bilo koja od kompozicija odavde može davati pacijentu podložnom ili koji pati od stanja vezanog za povećanu angiogenezu (“angiogenetsko stanje”).

Primeri angiogenetskog stanja koja se mogu tretirati/sprečiti kompozicijama/ postupcima iz ovog pronalaska uključuju, ali nisu ograničeni na, kancer (i čvrst i hematološki), staračku degeneraciju makule (AMD), razvojne abnormalnosti (organogeneza), diabetičko slepilo, endometrioza, okularna neovaskularizacija, psorijaza, reumatoidni artritis (RA) i promene boje kože (npr., hemangiomi, nevus flammeus, ili nevus simplex).

Na primer, ovaj pronalazak se odnosi na postupke za lečenje ili sprečavanje stanja povezanih sa okularnom neovaskularizacijom pomoću kompozicija/postupaka datih ovde. Stanja povezana sa okularnom neovaskularizacijom uključuju, ali nisu ograničena na, dijabetičku retinopatiju, staračku degeneraciju makule (“ARMD”), rubeotični glaukom, intersticijski keratitis, retinopatiju preranog rođenja, ishemičnu retinopatiju (npr., srpaste ćelije), patološku miopiju, očnu histoplazmozu, pterigium, tačkastu unutrašnju horoidopatiju i slično.

Tretiranje abnormalnog rasta ćelija

Ovaj pronalazak se takođe odnosi na postupak za tretiranje abnormalnog rasta ćelija u sisaru, uključujući čoveka, koji se sastoji od davanja navedenom sisaru terapijski efektivne količine antitela na ALK-1 ili njihovog dela za vezivanje antigena, kao što je opisano ovde, koja je efektivna u tretiranju abnormalnog rasta ćelija.

U jednom izvođenju ovog postupka, abnormalan ćelijski rast je kancer, uključujući, ali bez ograničenja, mezoteliome, hepatobilliarne (hepatičke i billiarne kanale), primarni ili sekundarni tumor CNS-a, primarni ili sekundarni tumor CNS-a, kancer pluća (NSCLC i SCLC), kancer kostiju, kancer pankreasa, kancer kože, kancer glave ili vrata, kutani ili intraokularni melanom, kancer jajnika, kancer debelog creva, rektalni kancer, kancer analnog regiona, kancer stomaka, gastrointestinalni (gastrični, kolorektalni i duodenalni), kancer dojke, kancer materice, karcinom jajovoda, karcinom endometrijuma, karcinom grlića materice, karcinom vagine, karcinom vulve, Hodžkinsovu bolest, kancer ezofagusa, kancer tankog creva, kancer endokrinog sistema, kancer tiroidne žlezde, kancer paratiroidne žlezde, kancer adrenalne žlezde, sarkom mekog tkiva, kancer uretre, kancer penisa, kancer prostate, kancer testisa, hroničnu ili akutnu leukemiju, hroničnu mijeloidnu leukemiju, limfocitne limfome, kancer bešike, kancer bubrega ili uretre, karcinom renalnih ćelija, karcinom renalnog pelvisa, neoplazme centralnog ncrvnog sistema (CNS), primarni limfom CNS-a, ne-

Hodžkinsov limfom, tumore kičmenog stuba, gliom moždanog stabla, adenom hipofize, adrenokortikalni kancer, kancer žučne kese, multiple mijelome, holangiokarcinom, fibrosarkom, neuroblastom, retinoblastom, ili kombinaciju jednog ili više gore navedenih kancera.

U jednom poželjnom izvođenju ovog pronalaska, kancer je odabran iz grupe: kancer pluća (NSCLC i SCLC), kancer glave ili vrata, kancer jajnika, kancer debelog creva, rektalni kancer, kancer analnog regiona, kancer stomaka, kancer dojke, kancer bubrega ili uretre, karcinom renalnih ćelija, karcinom renalnog pelvisa, neoplazme centralnog nervnog sistema (CNS), primarni limfom CNS-a, ne-Hodžkinsov limfom, tumori kičmenog stuba, ili kombinacija jednog ili više gore navedenih kancera.

U jednom drugom poželjnom izvođenju ovog pronalaska, kancer je odabran iz grupe: kancer jajnika, kancer debelog creva, rektalni kancer, kancer analnog regiona ili kombinacija jednog ili više gore navedenih kancera.

U jednom drugom izvođenju pomenutog postupka, pomenuti abnormalan ćelijski rast je benigno proliferativno oboljenje, uključujući, ali bez ograničenja, psorijazu, benignu hipertrofiju prostate ili restinozu.

Ovaj pronalazak se odnosi i na postupak tretiranja abnormalnog rasta ćelija u sisaru, koji se saszoji od davanja navedenom sisaru količine antitela na ALK-1 ili njegovog dela za vezivanje antigena, kao što je opisano ovde, koja je efektivna u tretiranja abnormalnog rasta ćelija u kombinaciji sa anti-tumorskim agensom odabranim iz grupe koju čine mitotički inhibitori, agensi za alkilovanje, anti-metaboliti, antibiotici koji se umeću, inhibitori faktora rasta, inhibitori ćelijskog ciklusa, enzimi, inhibitori topoizomeraze, modifikatori biološkog odgovora, antitela, citotoksini, anti-hormoni i anti-androgeni.

Pronalazak se odnosi i na farmaceutsku kompoziciju za tretiranje abnormalnog rasta ćelija u sisaru, uključujući čoveka, koja sadrži količinu antitela na ALK-1 ili njegovog dela za vezivanje antigena, kao što je opisano ovde, koja je efektivna u tretiranja abnormalnog rasta ćelija u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim nosačem i anti-tumorskim agensom odabranim iz grupe koju čine mitotički inhibitori, agensi za alkilovanje, anti-metaboliti, antibiotici koji se umeću, inhibitori faktora rasta, inhibitori ćelijskog ciklusa, enzimi, inhibitori topoizomeraze, modifikatori biološkog odgovora, anti-hormoni i anti-androgeni.

Ovaj pronalazak se odnosi i na postupak za tretiranje hiperproliferativnog poremećaja disorder u sisaru, koji se saszoji od davanja navedenom sisaru količine antitela na ALK-1 ili njegovog dela za vezivanje antigena, kao što je opisano ovde, koja je efektivna u tretiranja abnormalnog rasta ćelija u kombinaciji sa anti-tumorskim agensom odabranim iz grupe koju čine antiproliferativni agensi, inhibitori kinaze, inliibitori angiogeneze, inhibitori faktora rasta, inhibitori koks-I, inhibitori koks-II, mitotički inhibitori, agensi za alkilovanje, anti-metaboliti, antibiotici koji se umeću (intercalating), radijacija, inhibitori ćelijskog ciklusa, enzimi, inhibitori topoizomeraze, modifikatori biološkog odgovora, antitela, citotoksini, anti-hormoni, statini i anti-androgeni.

U jednom izvođenju ovog pronalaska, anti-tumorski agens korišćen u sprezi sa antitelom na ALK-1 ili njegovim delom za vezivanje antigena i farmaceutskim kompozicijama opisanim ovde, je anti-angiogenetski agens, inhibitor kinaze, inhibitor pan kinaze ili inhibitor faktora rasta. Poželjni inhibitori pan kinaze uključuju Sutent (Pfizer Ine., SU-11248), opisan u U.S. Patent No. 6,573,293 (Pfizer, Ine, NY, USA).

Anti-angiogenetski agensi, uključuju, ali nisu ograničeni na, sledeće agense, kao stoje inhibitor EGF, inhibitor EGFR, inhibitor VEGF, inhibitor VEGFR, inhibitor TIE2, inhibitor IGF1R, inhibitor COX-II (ciklooksigenaza II), inhibitori MMP-2 (matriks-metaloprotienaza 2) i inhibitori MMP-9 (matriks-metaloprotienaza 9). Poželjni inhibitori VEGF, uključuju, na primer, Avastin (bevacizumab), monoklonsko antitelo na VEGF od Genentech, Ine. South San Francisco, California.

Dodatni inhibitori VEGF uključuju CP-547,632 (Pfizer Ine., NY, USA), Axitinib (Pfizer Ine.; AG-013736), ZD-6474 (AstraZeneca), AEE788 (Novartis), AZD-2171), VEGF Trap (Regeneron/Aventis), Vatalanib (poznat i kao PTK-787, ZK-222584: Novartis & Schering AG), Macugen (pegaptanib oktanatrijum, NX-1838, EYE-001, Pfizer Inc./Gilead/Eyetech), IM862 (Cytran Ine. of Kirkland, Washington, USA) i angiozim, sintetički ribozim iz Ribozyme (Boulder, Colorado) i Chiron (Emeryville, California) i njihove kombinacije. Inhibitori VEGF koji su u praksi iz ovog pronalaska su opisani u US Patent No. 6,534,524 i 6,235,764, oba su ugrađena u svojoj celosti u sve svrhe. Naročito poželjni inhibitori VEGF uključuju CP-547,632, AG13736, Vatalanib, Macugen i njihove kombinacije.

Dodatni inhibitori VEGF su opisani u, na primer, WO 99/24440 (objavljen 20. maja, 1999.), PCT međunarodna prijava (International Application) PCT/IB99/00797 (zavedena 3. maja, 1999.), WO 95/21613 (objavljen 17. avgusta, 1995.), WO 99/61422 (objavljen 2. decembra, 1999.), United States Patent 6, 534,524 (opisuje AGI3736), United States Patent 5,834,504 (izdat 10. novembra, 1998.), WO 98/50356 (objavljen 12. novembra, 1998.), United States Patent 5,883,1 13 (izdat 16. marta, 1999.), United States Patent 5,886,020 (izdat 23.

marta, 1999), United States Patent 5,792,783 (izdat 11. avgusta, 1998.), U.S. Patent No. US 6,653,308 (izdat 25. novembra, 2003.), WO 99/10349 (objavljen 4. marta, 1999.), WO 97/32856 (objavljen 12. septembra, 1997.), WO 97/22596 (objavljen 26. juna, 1997.), WO 98/54093 (objavljen 3. decembra, 1998.), WO 98/02438 (objavljen 22. januara, 1998.), WO 99/16755 (objavljen 8. aprila, 1999.) i WO 98/02437 (objavljen 22. januara, 1998.), koji su ovde ugrađeni referencama u svojoj celosti.

Druga antiproliferativa sredstva, koja se mogu koristiti sa antitelima ili njihovim delovima za vezivanje antigena iz ovog pronalaska, uključuju inhibitore enzima farnesil protein transferaze i inhibitore receptora tirozin kinaze PDGFr, uključujući jedi nj enj a koja su opisana i koja su predmet zaštite u sledećim patentnim prijavama Sjedinjenih Država: 09/221946 (zavedena 28. decembra, 1998.); 09/454058 (zavedena 2. decembra, 1999.);

09/501163 (zavedena 9. februara, 2000); 09/539930 (zavedena 31. marta, 2000); 09/202796 (zavedena 22. maja, 1997.); 09/384339 (zavedena 26. avgusta, 1999.) i 09/383755 (zavedena 26. avgusta, 1999.) i jedinjenja koja su opisana i koja su predmet zaštite u sledećim Privremenim patentnim prijavama Sjedinjenih Država (United States Provisional Applications): 60/168207 (zavedena 30. novembra, 1999.); 60/170119 (zavedena 10. decembra, 1999); 60/177718 (zavedena 21. januara, 2000); 60/168217 (zavedena 30. novembra, 1999.) i 60/200834 (zavedena 1. maja, 2000). Svaka od prethodnih patentnih prijava i privremenih patentnih prijava je ovde ugrađena referencama u svojoj celosti.

Za dodatne inhibitore PDGRr, videti W001/40217, objavljen 7. jula, 2001. i W02004/020431, objavljen 11. marta, 2004., čiji je sadržaj ugrađen u svojoj celosti u sve svrhe. Poželjni inhibitori PDGFr uključuju Pfizerov CP-868,596 i njegove farmaceutski prihvatljive soli.

Poželjni inhibitori GARF uključuju Pfizerov AG-2037 (pelitreksol i njegove farmaceutski prihvatljive soli). Inhibitori GARF korisni u praksi iz ovog pronalaska su opisani u US Patent No. 5,608,082 koji je ugrađen u svojoj celosti u sve svrhe.

Primeri korisnih inhibitora COX-II which can be used u sprezi sa antitelom na ALK.-1 ili njegovim delom za vezivanje antigena, kao što je opisano ovde, i farmaceutskim kompozicijama opisanim ovde, uključuju CELEBREX™ (celekoksib) parekoksib, derakoksib, ABT-963, MK-663 (etorikoksib), COX-189 (Lumiracoksib), BMS 347070, RS 57067, NS-398, Bextra (valdekoksib), parakoksib, Vioxx (rofekoksib), SD-8381, 4-metil-2-(3,4-dimetilfenil)-1 -(4-sulfamoil-fenil)-1 H-pirol, 2-(4-etoksifenil)-4-metil-1 -(4-

sulfamoilfenil)-1 H-pirol, T-614, JTE-522, S-2474, SVT-2016, CT-3, SC-58125 i Arcoxia (etorikoksib). Za dodatne inhibitore COX-II, videti U.S. Patent Application Nos. 10/801,446 i 10/801,429, čiji je sadržaj ugrađen referencom u svojoj celosti u sve svrhe.

U jednom poželjnom izvođenju, anti-tumorski agens je celekoksib, videti U.S. Patent No. 5,466,823, čiji je sadržaj ugrađen referencom u svojoj celosti u sve svrhe. Struktura Celekoksiba je prikazana niže:

U jednom poželjnom izvođenju anti-tumorski agens je valekoksib, videti U.S. Patent No. 5,633,272, čiji je sadržaj ugrađen referencom u svojoj celosti u sve svrhe. Struktura valdekoksib je prikazana niže:

U jednom poželjnom izvođenju, anti-tumorski agens je parekolcsib, videti U.S. Patent No. 5,932,598, čiji je sadržaj ugrađen referencom u svojoj celosti u sve svrhe. Struktura parakoksiba je prikazana niže:

U jednom poželjnom izvođenju anti-tumorski agens je derakoksib, videti U.S. Patent No. 5,521,207, čiji je sadržaj ugrađen referencom u svojoj celosti u sve svrhe. Struktura derakoksiba je prikazana niže:

U jednom poželjnom izvođenju, anti-tumorski agens je SD-8381, videti U.S. Patent No. 6,034,256, čiji je sadržaj ugrađen referencom u svojoj celosti u sve svrhe. Struktura SD-8381 je prikazana niže:

U jednom poželjnom izvođenju anti-tumorski agens je ABT-963, videti International

Publication Number WO 2002/24719, čiji je sadržaj ugrađen referencom u svojoj celosti u sve svrhe. Struktura ABT-963 je prikazana niže:

U jednom poželjnom izvođenju, anti-tumorski agens je rofekoksib, kao što je prikazano niže:

U jednom poželjnom izvođenju, anti-tumorski agens je MK-663 (etorikoksib), videti International Publication Number WO 1998/03484, čiji je sadržaj ugrađen referencom u svojoj celosti u sve svrhe. Struktura etorilcoksiba je prikazana niže:

U jednom poželjnom izvođenju, anti-tumorski agens je COX-189 (Lumirakoksib), videti International Publication Number WO 1999/11605, čiji je sadržaj ugrađen referencom u svojoj celosti u sve svrhe. Struktura Lumirakoksiba je prikazana niže:

U jednom poželjnom izvođenju, anti-tumorski agens je BMS-347070, videti United States Patent No. 6,180,651, čiji je sadržaj ugrađen referencom u svojoj celosti u sve svrhe. Struktura BMS-347070 je prikazana niže:

BMS 347070

CAS No. 197438-48-5

6,180,651

U jednom poželjnom izvođenju, anti-tumorski agens je NS-398 (CAS 123653-1 1-2).

Struktura NS-398 (CAS 123653-11-2) je prikazana niže:

NS-398

CAS No. 123653-11-2

U jednom poželjnom izvođenju, anti-tumorski agens je RS 57067 (CAS 17932-91-3). Struktura RS-57067 (CAS 17932-91-3) je prikazana niže:

i

RS 57067

CAS No. 17932-91-3

U jednom poželjnom izvođenju, anti-tumorski agens je 4-metil-2-(3,4-dimetilfenil)-l-(4-sulfamoil-fenil)-lH-pirol. Struktura 4-metil-2-(3,4-dimetilfenil)-l-(4-sulfamoil-fenil)-lH-pirola je prikazana niže:

U jednom poželjnom izvođenju, anti-tumorski agens je 2-(4-etoksifenil)-4-metil-l-(4-sulfamoilfenil)-1 H-pirol. Struktura 2-(4-etoksifenil)-4-metil-1 -(4-sulfamoilfenil)-1 H-pirola je prikazana niže:

U jednom poželjnom izvođenju anti-tumorski agens je meloksikam. Struktura meloksikama je prikazana niže:

Drugi korisni inhibitori kao anti-tumorski agensi korišćeni u sprezi sa antitelima iz ovog pronalaska i farmaceutskim kompozicijama opisanim ovde uključuju aspirin i nesteroidne anti-inflamatorne lekove (NSAIDs) koji inhibiraju enzim koji pravi prostaglandine (ciklooksigenaza I i II), što dovodi do nižih nivoa prostaglandina, uključuju ali nisu ograničeni na sledeće: Salsalate (Amigesic), Diflunisal (Dolobid), Ibuprofen (Motrin), Ketoprofen (Orudis), Nabumetone (Relafen), Piroxicam (Feldene), Naproxen (Aleve, Naprosyn), Diclofenac (Voltaren), Indomethacin (Indocin), Sulindac (Clinoril), Tolmetin (Tolectin), Etodolac (Lodine), Ketorolac (Toradol), Oxaprozin (Daypro) i njihove kombinacije. Poželjni inhibitori COX-I uključuju ibuprofen (Motrin), nuprin, naproksen (Aleve), indometacin (Indocin), nabumeton (Relafen) i njihove kombinacije.

Ciljani agensi korišćeni u u sprezi sa antitelom na ALK-1 ili njegovim delom za vezivanje antigena i farmaceutskim kompozicijama opisanim ovde, uključuju inhibitore EGFr kao što su Iressa (gefitinib, AstraZeneca), Tarceva (erlotinib ili OSI-774, OSI Pharmaceuticals Ine.), Erbitux (cetuksimab, Imclone Pharmaceuticals, Ine.), EMD-7200 (Merck AG), ABX-EGF (Amgen Ine. i Abgenix Ine.), HR3 (Cuban Government), IgA antitela (University of Erlangen-Nuremberg), TP-38 (IVAX), EGFR fuzioni proteini, EGF-vakcina, anti-EGFr imunolipozomi (Flermes Biosciences Ine.) i njihove kombinacije.

Poželjni EGFr inhibitori uključuju Iressa, Erbitux, Tarceva i njihove kombinacije.

Ovaj pronalazak se takođe odnosi na anti-tumorske agense odabrane među pan erb receptorskim inhibitorima ili ErbB2 receptorskim inhibitorima, kakvi su CP-724,714 (Pfizer, Ine.), Cl-1033 (canertinib, Pfizer, Ine.), Herceptin (trastuzumab, Genentech Ine.), Omitarg (2C4, pertuzumab, Genentech Ine.), TAK-165 (Takeda), GW-572016 (lonafarnib, GlaxoSmithKline), GW-282974 (GlaxoSmithKline), EKB-569 (Wyeth), PKI-166 (Novartis), dHER2 (HER2 Vaccine, Corixa i GlaxoSmithKline), APC8024 (HER2 Vaccine, Dendreon), anti-HER2/neu bispecifično antitelo (Decof Kancer Center), B7.her2.IgG3 (Agensys), AS EIER2 (Research Institute for Rad Biology & Medicine), trifunkcionalna bispecifična antitela (University of Munich) i mAB AR-209 (Aronex Pharmaceuticals Ine) i mAB 2B-1 (Chiron) i njihove kombinacije. Poželjni erb selektivni anti-tumorski agensi uključuju Herceptin, TAK-165, CP-724,714, ABX-EGF, HER3 i njihove kombinacije. Poželjni pan erbb receptorski inhibitori uključuju GW572016, Cl-1033, EKB-569, Omitarg i njihove kombinacije.

Dodatni erbB2 inhibitori uključuju one iz WO 98/02434 (objavljen 22. januara,

1998.), WO 99/35146 (objavljen 15. jula, 1999.), WO 99/35132 (objavljen 15. jula, 1999.), WO 98/02437 (objavljen 22. januara, 1998.), WO 97/13760 (objavljen 17. aprila, 1997.), WO 95/19970 (objavljen 27. jula, 1995.), United States Patent 5,587,458 (izdat 24. decembra, 1996.), i United States Patent 5,877,305 (izdat 2. marta, 1999.), od kojih je svaki ovde ugrađen referencom u svojoj celosti. Za dodatne ErbB2 receptorske inhibitore korisne u ovom pronalasku, videti United States Patent Nos. 6,465,449, i 6,284,764 i International Application No. WO 2001/98277, od kojih je svaki ovde ugrađen referencom u svojoj celosti.

Pored toga, druga anti-tumorska sredstva mogu biti odabrana od sledećih: Sorafenib (Onyx Pharmaceuticals Ine.; BAY-43-9006), Genasense (augmerosen, Genta), Panitumumab (Abgenix/Amgen), Zevalin (Schering), Bexxar (Corixa/GlaxoSmithKline), Abarelix, Alimta, EPO 906 (Novartis), diseodermolide (XAA-296), ABT-510 (Abbott), Neovastat (Aeterna), enzastaurin (Eli Lilly), Combrestatin A4P (Oxigene), ZD-6126 (AstraZeneca), flavopiridol (Aventis), CYC-202 (Cyclacel), AVE-8062 (Aventis), DMXAA (Roche/Antisoma), Thymitaq (Eximias), Temodar (temozolomide, Schering Plough) i Revilimd (Celegene) i njihove kombinacije.

Druga anti-tumorska sredstva mogu biti odabrana od sledećih: CyPat (ciproteron acetat), Histerelin (histrelin acetat), Plenaixis (abareliks depo), Atrasentan (ABT-627), Satraplatin (JM-216), talomid (Talidomid), Teratop, Temilifen (DPPE), ABI-007 (paclitaksel), Evista (raloksifen), Atamestan (Biomed-777), Xyotax (poliglutamat paklitaksel), Targetin (beksarotin) i njihove kombinacije.

Dodatno, druga anti-tumorska sredstva mogu biti odabrana od sledećih: Trizaone (tirapazamin), Aposyn (eksisulind), Nevastat (AE-941), Ceplene (histamin dihidrohlorid), Orathecin (rubitekan), Virulizin, Gastrimmune (G17DT), DX-8951f (eksatekan mezilat), Onconase (ranpirnaza), BEC2 (mitumoab), Xcytrin (moteksafm gadolinijum) i njihove kombinacije.

Dalje, druga anti-tumorska sredstva mogu biti odabrana od sledećih: CeaVac (CEA), NeuTrexin (trimetresat glukuronat) i njihove kombinacije. Dodatna anti-tumorska sredstva mogu biti odabrana od sledećih: OvaRex (oregovomab), Osidem (IDM-1) i njihove kombinacije. Dodatna anti-tumorska sredstva mogu biti odabrana od sledećih: Advexin (ING 201), Tirazone (tirapazamin) i njihove kombinacije. Dodatna anti-tumorska sredstva mogu biti odabrana od sledećih: RSR13 (efaproksiral), Cotara (1311 chTNT 1/b), NBI-3001 (IL-4) i njihove kombinacije. Dodatna anti-tumorska sredstva mogu biti odabrana od sledećih: Canvaxin, GMK vakcina, PEG Interon A, Taxoprexin (DHA/paciltaksel) i njihove kombinacije. Drugi poželjni anti-tumorski agensi uključuju Pfizerov MEK 1/2 inhibitor PD325901, Array Biophann-ov MEK inhibitor ARRY-142886, Bristol Myers-ov CDK2 inhibitor BMS-387,032, Pfizerov CDK inhibitor PD0332991 i AstraZeneca-in AXD-5438 i njihove kombinacije. Dodatno, mogu se takođe koristiti mTOR inhibitori kao što su CCI-779 (Wyeth) i derivati rapamicina RAD001 (Novartis) i AP-23573 (Ariad), HDAC inhibitori ŠAHA (Merck Inc./Aton Pharmaceuticals) i njihove kombinacije. Dodatna anti-tumorska sredstva uključuju aurora 2 inhibitor VX-680 (Vertex) i Chkl/2 inhibitor XL844 (Exilixis).

Sledeći citotoksični agensi, npr., jedan ili više odabranih iz grupe koja sadrži epirubicin (Ellence), docetaksel (Taxotere), paclitaksel, Zinecard (deksrazoksane), rituksimab (Rituxan) imatinib mezilat (Gleevec) i njihove kombinacije, mogu se koristiti u sprezi sa antitelom na ALK-1 ili njegovim delom za vezivanje antigena, kao što je opisano ovde i njihovim farmaceutskim kompozicijama, kao što je opisano ovde.

Pronalazak takođe predviđa upotrebu antitela i njihovih delova za vezivanje antigena iz ovog pronalaska zajedno sa hormonskom terapijom, uključujući bez ograničenja, eksemestan (Aromasin, Pfizer Ine.), leuprorelin (Lupron ili Leuplin, TAP/Abbott/Takeda), anastrozol (Arimidex, Astrazeneca), gosrelin (Zoladex, AstraZeneca), dolcserkalciferol, fadrozol, formestan, tamoksifen citrat (tamoksifen, Nolvadex, AstraZeneca), Casodex (AstraZeneca), Abarelix (Praecis), Trelstar i njihove kombinacije.

Pronalazak se takođe odnosi na sredstva za hormonsku terapiju kao što su anti-estrogeni uključujući, ali bez ograničenja, fulvestrant, toremifen, raloksifen, lasofoksifen, letrozol (Femara, Novartis), anti-androgene kao što su bikalutamid, flutamid, mifepriston, nilutamid, Casodex®(4'-cijano-3-(4-fluorofenilsulfonil)-2-hidroksi-2-metil-3'-(trifluorometil) propionanilid, bikalutamid) i njihove kombinacije.

Dalje, pronalazak obezbeđuje antitela iz ovog pronalaska sama ili u kombinaciji sa jednim ili više produkata za dodatnu negu, npr., proizvod odabran iz grupe koja sadrži

Filgrastim (Neupogen), ondansetron (Zofran), Fragmin, Procrit, Aloxi, Emend ili njihove kombinacije.

Naročito poželjni citotoksični agensi uključuju Camptosar, Erbitux, Iressa, Gleevec, Taxotere i njihove kombinacije.

Sledeći inhibitori topoizomeraze I mogu se koristiti kao anti-tumorski agensi: kamptotecin, irinotekan HC1 (Camptosar), edotekarin, oratecin (Supergen), eksatekan (Daiichi), BN-80915 (Roche) i njihove kombinacije. Naročito poželjni inhibitori topoizomeraze II uključuju epirubicin (Ellence).

Antitela iz pronalaska mogu se koristiti sa antitumorskim agensima, agensima za alkilovanje, antimetabolitima, antibioticima, antitumorskim agensima izvedenim iz biljaka, derivatima kamptotecina, inhibitorima tirozin kinaze, drugim antitelima, interferonima i/ili modifikatorima biološkog odgovora.

Agensi za alkilovanje uključuju, ali nisu ograničeni na, azot mustard N-oksid, ciklofosfamid, ifosfamid, melfalan, busulfan, mitobronitol, karbokon, tiotepu, ranimustin, nimustin, temozolomid, AMD-473, altretamin, AP-5280, apazikon, brostalicin, bendamustin, karmustin, estramustin, fotemustin, glufosfamid, ifosfamid, KW-2170, mafosfamid i mitolaktol; koordinativna jedinjenja s platinom za alkilovanje uključuju, ali nisu ograničena na, cisplatin, Paraplatin (karboplatin), eptaplatin, lobaplatin, nedaplatin, Eloxatin (oksaliplatin, Sanofi) ili satrplatin i njihove kombinacije. Naročito poželjni agensi za alkilovanje uključuju Eloxatin (oksaliplatin).

Antimetaboliti uključuju, ali nisu ograničeni na, metotreksat, 6-merkaptopurin ribozid, merkaptopurin, 5-fluorouracil (5-FU) sam ili u kombinaciji sa leukovorinom, tegafurom, UFT, doksifluridinom, karmofurom, citarabinom, citarabin okfosfatom, enocitabinom, S-l, Alimta (premetreksed dinatrijum, LY231514, MTA), Gemzar-om (gemcitabin, Eli Lilly), fludarabinom, 5-azacitidinom, kapecitabinom, kladribinom, klofarabinom, decitabinom, eflornitinom, etinilcitidinom, citozin arabinozidom, hidroksiureom, TS-1, melfalanom, nelarabinom, nolatreksedom, okfosfatom, dinatrijum premetreksedom, pentostatinom, pelitreksolom, raltitreksedom, triapinom, trimetreksatom, vidarabinom, vinkristinom, vinorelbinom; ili na primer, jedan od poželjnih anti-metabolita opisanih u European Patent Application No. 239362, kao što je N-(5-[N-(3,4-dihidro-2-metil-4-oksokinazolin-6-ilmetil)-N-metilamino]-2-tenoil)-L-glutaminska kiselina i njihove kombinacije.

Antibiotici uključuju antibiotike koji se umeću ali nisu ograničeni na: aklarubicin, aklinoinicin D, amrubicin, anamicin, adriamicin, bleomicin, daunorubicin, doksorubicin, elsamitrucin, epirubicin, galarubicin, idarubicin, mitomicin C, nemorubicin, neokarcinostatin, peplomicin, pirarubicin, rebekamicin, stimalamer, streptozocin, valrubicin, zinostatin i njihove kombinacije.

Anti-tumorske supstance izvedene iz biljaka uključuju, na primer, one odabrane među mitotičkim inhibitorima, na primer, vinblastin, docetaksel (Taxotere), paklitaksel i njihove kombinacije.

Citotoksični inhibirajući agensi topoizomerazu uključuju jedan ili više agenasa odabranih iz grupe koja sadrži aklarubicin, amonafid, belotekan, kamptotecin, 10-hidroksikamptotecin, 9-aminokamptotecin, diflomotekan, irinotekan HC1 (Camptosar), edotekarin, epirubicin (Ellence), etopozid, eksatekan, gimatekan, lurtotekan, mitoksantron, pirarubicin, piksantron, rubitekan, sobuzoksan, SN-38, taflupozid, topotekan i njihove kombinacije.

Poželjni citotoksični agensi koji inhibiraju topoizomerazu uključuju jedan ili više agenasa odabranih iz grupe koja sadrži kamptotecin, 10-hidroksikamptotecin, 9-aminokamptotecin, irinotekan HC1 (Camptosar), edotekarin, epirubicin (Ellence), etopozid, SN-38, topotekan i njihove kombinacije.

Imunološki agensi uključuju interferone i brojne druge agense koji pojačavaju imunitet. Interferoni uključuju interferon alfa, interferon alfa-2a, interferon, alfa-2b, interferon beta, interferon gama-1 a, interferon gama-lb (Actimmune), ili interferon gama-nl i njihove kombinacije. Drugi agensi uključuju filgrastim, lentinan, sizofilan, TheraCys, ubenimeks, WF-10, aldesleukin, alemtuzumab, BAM-002, dakarbazin, daklizumab, denileukin, gemtuzumab ozogamicin, ibritumomab, imikimod, lenograstim, lentinan, vakcina za melanom (Corixa), molgramostim, OncoVAX-CL, sargramostim, tasonermin, tekleukin, timalazin, tositumomab, Virulizin, Z-100, epratuzumab, mitumomab, oregovomab, pemtumomab (Y-muHMFGl), Provenge (Dendreon) i njihove kombinacije.

Modifikatori biološkog odgovora su agensi koji modifikuju odbrambene mehanizme živih organizama ili biološke odgovore, kao što je preživljavanje, rast ili diferencijacija ćelija u tkivima, da ih usmere da imaju anti-tumorsku aktivnost. Takvi agensi uključuju krestin, lentinan, sizofiran, picibanil, ubenimeks i njihove kombinacije.

Drugi antikancerozni agensi uključuju alitretinoin, ampligen, atrasentan beksaroten, bortezomib. Bosentan, kalcitriol, eksisulind, fmasterid, fotemustin, ibandronsku kiselinu, miltefosin, mitoksantron, 1-asparaginaza, prokarbazin, dakarbazin, hidroksikarbamid, pegaspargaza, pentostatin, tazarotin, Telcyta (TLK-286, Telik Ine.), Velcade (bortemazib, Millenium), tretinoin i njihove kombinacije.

Druga anti-angiogenetska jedinjenja uključuju acitretin, fenretinid, talidomid, zoledronsku kiselinu, angiostatin, aplidin, cilengtid, kombretastatin A-4, endostatin, halofuginon, rebimastat, removab, Revlimid, skalamin, ukrain, Vitaxin i njihove kombinacije.

Koordinativna jedinjenja sa platinom uključuju, ali nisu ograničena na, cisplatin, karboplatin, nedaplatin, oksaliplatin i njihove kombinacije.

Derivati kamptotecina uključuju, ali nisu ograničeni na, kamptotecin, 10-hidroksikamptotecin, 9-aminokamptotecin, irinotekan, SN-38, edotekarin, topotekan i njihove kombinacije.

Drugi antitumorski agensi uključuju mitoksantron, 1-asparaginazu, prokarbazin, dakarbazin, hidroksikarbamid, pentostatin, tretinoin i njihove kombinacije.

Anti-tumorski agensi sposobni da pojačaju antitumorski imuni odgovor, kao što su CTLA-4 (citotoksični limfocitni antigen 4) antitela, a mogu se takođe koristiti drugi agensi sposobni da blokiraju CTLA-4, kao što su MDX-010 (Medarex) i CTLA-4 jedinjenja, opisana u United States Patent No. 6,682,736; i anti-proliferativni agensi, kao što su drugi inhibitori farnezil protein transferaze, na primer inhibitori farnezil protein transferaze. Za dodatna specifična antitela na CTLA-4 koja se mogu koristiti u ovom pronalasku, videti United States Provisional Application 60/113,647 (zavedena 23. decembra, 1998.), United States Patent No. 6, 682,736, koji je ovde ugrađen referencom u svojoj celosti. Na primer, još jedno antitelo na CTLA-4 koje se može koristiti u skladu sa ovim pronalaskom je ticilimumab, koji ima sekvencu monoklonskog antitela 11.2.1 u US Patentu 6,682,736.

Za specifična IGF1R antitela koja se mogu koristiti u ovom pronalasku, videti International Patent Application No. WO 2002/053596, koji je ovde ugrađen referencom u svojoj celosti.

Za specifična CD40 antitela koja se mogu koristiti u ovom pronalasku, videti International Patent Application No. WO 2003/040170, koji je ovde ugrađen referencom u svojoj celosti.

Agensi za gensku terapiju mogu se takođe upotrebljavati kao anti-tumorski agensi, kao što je TNFerade (GeneVec), koji eksprimira TNF alfa kao odgovor na radioterapiju.

U jednom izvođenju ovog pronalaska, statini se mogu koristiti u sprezi sa antitelom na ALK-1 ili njegovim delom za vezivanje antigena, kao što je opisano ovde i njihovim farmaceutskim kompozicijama, kao što je opisano ovde. Statini (inhibitori HMG-CoA

reduktaze) mogu biti odabrani iz grupe koja sadrži Atorvastatin (Lipitor, Pfizer Ine.), Provastatin (Pravachol, Bristol-Myers Squibb), Lovastatin (Mevacor, Merck Ine.), Simvastatin (Zocor, Merck Ine.), Fluvastatin (Lescol, Novartis), Cerivastatin (Baycol, Bayer), Rosuvastatin (Crestor, AstraZeneca), Lovostatin i Niacin (Advicor, Kos Pharmaceuticals) i njihove derivate i kombinacije.

U jednom poželjnom izvođenju, statin je odabran iz grupe koja sadrži Atovorstatin i Lovastatin, njihove derivate i kombinacije.

Drugi agensi korisni kao anti-tumorski agensi uključuju Caduet.

Za sve postupke tretiranja hiperproliferativnog poremećaja ili abnormalnog rasta ćelija, kao što su opisani ovde, upotreba kombinacije antitela na ALK-1 ili i njegovog dela za vezivanje antigena sa bar jednim dodatnim terapijskim agensom, antitelo na ALK-1 se može konjugovati ili derivatizovati, sa dodatnim terapijskim agensom. Bar jedan dodatni terapijski agens se može dati i odvojeno, ili na način bez derivatizovanja ili konjugovanja. Kad bar jedan dodatni terapijski agens nije konjugovan ili derivatizovan sa antitelom, on se može davati u okviru iste farmaceutske formulacije sa antitelom, ili se može davati u odvojenoj formulaciji.

Tretiranje gubitka vida

Jedinjenja iz pronalaska i farmaceutske kompozicije koje ih sadrže, su korisni za lečenje teškog gubitka vida zbog staračke degeneracije makule i drugih oboljenja koja pogađaju posteriorni segment oka, kao što je horoidna neovaskularizacija, diabetička retinopatija, glaukom, pigmentna retinopatija i slično.

Na primer, kompozicije iz pronalaska se mogu koristiti za formiranje depoa leka iza oka i mogu uključiti jedan ili više farmaceutski aktivnih agenasa, kao dodatak na jedan ili više neaktivnih ekscipijenata, kao što je opisano ovde. Primeri farmaceutski aktivnih agenasa korisnih u kompozicijama iz pronalaska uključuju agense protiv infekcija, uključujući, bez ograničenja, antibiotike, antivirusna i antifungalna sredstva; antialergijske agense i stabilizatore mast ćelija; steroidne i nesteroidne anti-inflamatorne agense (kao što je nepafenak); inhibitore ciklooksigenaze, uključujući, bez ograničenja, inhibitore Cox I i Cox II; kombinacije anti-infektivnih i anti-inflamatornih agenasa; dekongestante; anti-glaukomne agense, uključujući, bez ograničenja, adrenergičke, beta-adrenergičke blokiirajuće agense, alfa-adrenergičke agoniste, parasimpatomimetičke agense, inhibitore holinesteraze, inhibitore karboanhidraze i prostaglandine; kombinacije anti-glaukomnih agenasa; antioksidante;

dopune ishrani; lekove za lečenje cistoidnog edema makule uključujući, bez ograničenja, nesteroidne anti-inflamatorne agense; lekove za lečenje staračke degeneracije makule (AMD) uključujući ne-eksudativni (suv) i eksudativni (vlažan) AMD, uključujući, bez ograničenja, inhibitore angiogeneze, uključujući inhibitore angiogeneze koji inhibiraju protein kinazne receptore, uključujući protein kinazne receptore koji su VEGF receptori i dopune ishrani; lekove za lečenje herpesnih infekcija i CMV očnih infekcija; lekove za lečenje proliferativne vitreoretinopatije uključujući, bez ograničenja, antimetabolite i fibrinolitike; agense za modulaciju rana, uključujući, bez ograničenja, faktore rasta; antimetabolite; neuroprotektivne lekove, uključujući, bez ograničenja, eliprodil; i angiostatičke steroide za lečenje oboljenja ili stanja posteriornog segmenta 26, uključujući, bez ograničenja, staračku degeneraciju makule (AMD) uključujući ne-eksudativni (suv) i eksudativni (vlažan) AMD, horoidnu neovaskularizaciju, retinopatije, retinitis, uvejitis, edem makule i glaukom. Za dodatne informacije o takvim angiostatičkim steroidima, videti U.S. Patent Nos. 5,679,666 i 5,770,592. Nesteroidan anti-inflamatoran agens za lečenje cistoidnog edema makule je nepafenak.

Za administraciju u oko, jedinjenje iz ovog pronalaska se isporučuje u farmaceutski prihvatljivom oftalmološkom nosaču takvom da jedinjenje ostaje u kontaktu sa površinom oka dovoljno dug period da dozvoli jedinjenju da penetrira rožnjaču i/ili beonjaču i unutrašnje regione oka, uključujući, na primer, prednju komoru, zadnju komoru, staklasto telo, očnu vodicu, rožnjaču, dužicu/cilijarno telo, sočivo, sudovnjaču/mrežnjaču i beonjaču. Farmaceutski prihvatljiv oftalmološki nosač može biti mast, biljno ulje ili inkapsulirajući materijal. Jedinjenje iz pronalaska se takođe može injektirati direktno u staklasto telo ili očnu vodicu.

Dalje, jedinjenje se takođe može administrirati pomoću dobro poznatih, prihvatljivih postupaka, kao što su sub-Tenon i/ili subkonjunktivalne injekcije. Kao što je dobro poznato u oftalmološkoj struci, makula se sastoji prvenstveno od čepića i to je oblast maksimalne oštrine vida u retini. Tenonova kapsula ili Tenonova membrana obavija beonjaču. Vežnjača (konjunktiva) pokriva kratku površinu očne jabučice iza limbusa (bulbarna konjunktiva) i savija se nagore (gornja prelazna bora) ili nadole (donja prelazna bora) da pokrije unutrašnje oblasti gornjeg, odnosno, donjeg kapka. Konjunktiva se nalazi povrh Tenonove membrane. Beonjača i Tenonova kapsula defmišu spoljnu površinu očne jabučice. Za lečenje očnih oboljenja kakva su staračka degeneracija makule (AMD) uključujući ne-eksudativni (suv) i eksudativni (vlažan) AMD, horoidna neovaskularizacija, retinopatije (kakve su dijabetička retinopatija, retinopatija preranog rođenja), dijabetički edem makule, retinitis, uvejitis, cistoidni edem makule (CME), glaukom i druga oboljenja ili stanja posteriornog segmenta oka, poželjno je ostaviti depo specifične količine oftalmološki prihvatljivog farmaceutski aktivnog agensa direktno na spoljnu površinu beonjače i ispod Tenonove kapsule. Kao dodatak, u slučajevima staračke degeneracije makule (AMD) uključujući ne-eksudativni (suv) i eksudativni (vlažan) AMD i CME, najpoželjnije je ostaviti depo direktno na spoljnu površinu beonjače, ispod Tenonove kapsule i generalno iznad makule.

Jedinjenja se mogu formulisati kao depo preparati. Takve formulacije sa dugim dejstvom se mogu administrirati implantiranjem (na primer, subkutano ili intramuskularno), intramuskulamom injekcijom ili gore pomenutom sub-Tenon ili intravitrealnom injekcijom. Alternativno, aktivan sastojak može biti u vidu praha za spajanje sa pogodnim nosačem, npr., sterilnom vodom bez pirogena, pre upotrebe.

U okviru posebno poželjnih izvođenja pronalaska, jedinjenja se mogu pripremati za topičko davanje u slanom rastvoru (kombinovana sa bilo kojim konzervansima i antimikrobnim agensima koji se obično koriste u očnim preparatima) i davati u vidu kapi za oči. Rastvor ili suspenzija se mogu pripremati u svom čistom obliku i davati nekoliko puta dnevno. Alternativno, sadašnje kompozicije, dobijene kao što je opisano gore, mogu se takođe davati direktno u korneu.

U okviru poželjnih izvođenja, kompozicija se priprema sa muko-adhezivnim polimerom koji se vezuje za korneu. Prema tome, na primer, jedinjenja se mogu formulisati sa pogodnim polimernim ili hidrofobnim materijalima (na primer, kao emulzija u prihvatljivom ulju) ili jonoizmenjivačkim gumama, ili kao slabo rastvorljivi derivati, na primer, kao slabo rastvorljiva so.

Farmaceutski nosač za hidrofobna jedinjenja je sistem od dva rastvarača koji sadrži benzil alkohol, nepolarni surfaktant, organski polimer mešljiv sa vodom i vodenu fazu. Sistem sa dva rastvarača može biti VPD sistem sa dva rastvarača. VPD je rastvor 3% w/v (w/v = težina/zapremina) benzil alkohola, 8% w/v nepolarnog surfaktantnog polisorbata 80 i 65% w/v polietilen glikola 300, dopunjenih do date zapremine apsolutnim etanolom. VPD sistem sa dva rastvarača (VPD:5 w) sadrži VPD razblažen 1:1 5%-nim rastvorom dekstroze u vodi. Ovaj kosolventni sistem rastvara i hidrofobna jedinjenja i sam pravi nisku toksičnost sistemskim unošenjem. Prirodno, proporcije sistema sa dva rastvarača mogu prilično varirati bez narušavanja njegovih karakteristika rastvorljivosti i toksičnosti. Štaviše, identitet kosolventnih komponenata se može varirati: na primer, neki drugi nisko toksični nepolarni surfaktanti se mogu koristiti umesto polisorbata 80; veličina frakcije polietilen glikola se može varirati; neki drugi biokompatibilni polimeri mogu da zamene polietilen glikol, npr. polivinil pirolidon i drugi šećeri ili polisaharidi mogu da zamene dekstrozu.

Alternativno, mogu da se koriste drugi sistemi za transport hidrofobnih farmaceutskih jedinjenja. Lipozomi i emulzije su poznati primeri nosača za davanje ili nosača za hidrofobne lekove. Određeni organski rastvarači kakav je dimetilsulfoksid se takođe mogu upotrebljavati, mada obično po cenu veće toksičnosti. Dodatno, jedinjenja se mogu davati upotrebom sistema sa zadržanim otpuštanjem, kakvi su polupropustljivi matriksi oo čvrstih hidrofobnih polimera koji sadrže terapijsko sredstvo. Napravljeni su različiti materijali sa sporim otpuštanjem i oni su poznati stručnjacima. Kapsule sa sporim otpuštanjem mogu, u zavisnosti od njihove hemijske prirode, da otpuštaju jedinjenja nekoliko nedelja, pa i do preko 100 dana. U zavisnosti od hemijske prirode i biološke stabilnosti terapijskog reagensa, mogu se primeniti dodatne strategije za stabilizaciju proteina.

Farmaceutske kompozicije mogu da sadrže i pogodne čvrste ili želatinozne nosače ili ekscipijente. Primeri takvih nosača ili ekscipijenata uključuju kalcijum karbonat, kalcijum fosfat, šećere, škrob, derivate celuloze, želatin i polimere kakvi su polietilen glikoli.

Svaka kompozicija se može formulisati za davanje pojedincu. Pojedinac iz ovog pronalaska je poželjno sisar ili, još poželjnije, čovek.

Farmaceutske formulacije odavde mogu dalje da uključuju terapijsko sredstvo odabrano iz grupe koju čine: antineoplastički agens, anti-inflamatoran agens, antibakterijski agens, antivirusni agens, angiogenetski agens i anti-angiogenetski agens. Primeri takvih agenasa su opisani ovde.

Na primer, antineoplastički agens može da bude odabran iz grupe koju čine akodazol hidrohlorid; akronin; adozelesin; aldesleukin; altretamin; ambomicin; ametantron acetat; aminoglutetimid; amsakrin; anastrozol; antramicin; asparaginaza; asperlin; azacitidin; azetepa; azotomicin; batimastat; benzodepa; bikalutamid; bizantren hidrohlorid; bisnafid dimezilat; bizelesin; bleomicin sulfat; brekinar natrijum; bropirimin; busulfan; kaktinomicin; kalusteron; karacemid; karbetimer; karboplatin; karmustin; karubicin hidrohlorid; karcelesin; cedefmgol; hlorambucil; kirolemicin; cisplatin; kladribin; krisnatol mezilat; ciklofosfamid; citarabin; dakarbazin; daktinomicin; daunorubicin hidrochlorid; decitabin; deksormaplatin; dezaguanin; dezaguanin mezilat; diazikon; docetaksel; doksorubicin; doksorubicin hidrohlorid; droloksifen; droloksifen citrat; dromostanolon propionat; duazomicin; edatreksat; eflornitin hidrohlorid; elsamitrucin; enloplatin; enpromat; epipropidin; epirubicin hidrohlorid;

erbulozol; ezorubicin hidrohlorid; estramustin; estramustin fosfat natrijum; etanidazol; etijodirano ulje i 131; etopozid; etopozid fosfat; etoprin; fadrozol hidrohlorid; fazarabin; fenretinid; floksuridin; fludarabin fosfat; fluorouracil; flurocitabin; foskidon; fostriecin natrijum; gemcitabin; gemcitabin hidrohlorid; zlato Au 198; hidroksiurea; idarubicin hidrohlorid; ifosfamide; imofosin; interferon alfa-2a; interferon alfa-2b; interferon alfa-nl; interferon alfa-n3; interferon beta-Ia; interferon gama-Ib; iproplatin; irinotekan hidrohlorid; lanreotid acetat; letrozol; leuprolid acetat liarozol hidrohlorid; lometreksol natrijum; lomustin; losoksantron hidrohlorid; mazoprokol; maitanzin; mehloretamin hidrohlorid; megestrol acetat; melengestrol acetat; melfalan; menogaril; merkaptopurin; metotreksat; metotreksat natrijum; metoprin; meturedepa; mitindomid; mitokarcin; mitokromin; mitogilin; mitomalcin; mitomicin; mitosper; mitotan; mitoksantron hidrohlorid; mikofenolna kiselina; nokodazol; nogalamicin; ormaplatin; oksisuran; paclitaksel; pegaspargaza; peliomicin; pentamustin; peplomicin sulfat; perfosfamid; pipobroman; piposulfan; piroksantron hidrohlorid; plikamicin; plomestan; porfimer natrijum; porfiromicin; prednimustin; prokarbazin hidrohlorid; puromicin; puromicin hidrohlorid; pirazofurin; riboprin; rogletimid; safmgol; safmgol hidrohlorid; semustin; simtrazen; sparfosat natrijum; sparsomicin, spirogermanijum hidrohlorid; spiromustin; spiroplatin; streptonigrin; streptozocin; stroncijum hlorid Sr 89; sulofenur; talisomicin; taksan; taksoid; tekogalan natrijum; tegafur; teloksantron hidrohlorid; temoporfm; tenipozid; teroksiron; testolakton; tiamiprin; tioguanin; tiotepa; tiazofurin; tirapazamin; topotekan hidrohlorid; toremifen citrat; trestolon acetat; trikiribin fosfat; trimetreksat; trimetreksat glukuronat; triptorelin; tubulozol hidrohlorid; uracil mustard; uredepa; vapreotid; verteporfm; vinblastin sulfat; vinkristin sulfat; vindesin; vindesin sulfat; vinepidin sulfat; vinglicinat sulfat; vinleurosin sulfat; vinorelbin tartrat; vinrosidin sulfat; vinzolidin sulfat; vorozol; zeniplatin; zinostatin; zorubicin hidrohlorid.

Anti-angiogenetski agensi su svi agensi koji inhibiraju angiogenezu, bilo da su opisani ovde, bilo da su poznati u struci. U poželjnim izvođenjima, anti-angiogenetski agens je anti-VEGF agens, kakav je Macugen™ (Eyetech, New York, NY); ili anti-VEGF antitelo.

Farmaceutske kompozicije mogu biti formulisane standardnim tehnikama uz upotrebu jednog ili više pogodnih nosača, ekscipijenata i razblaživača. Videti, npr., Remington’s Pharmaceutical Sciences, (19th Ed. Williams & Wilkins, 1995) (ugrađen ovde referencom u sve svrhe).

Formulacije pogodne za parenteralno davanje uključuju vodene i nevodene formulacije, izotonične sa krvlju predviđenog recipijenta i vodene i nevodene sterilne suspenzije, koje mogu da uključe suspenzione sisteme dizajnirane da usmere jedinjenje ka komponentama krvi ili ka jednom ili više organa. Formulacije mogu biti date u vidu jedinične doze ili u vidu zapečaćenih kontejnera sa višestrukom dozom, na primer, ampule ili bočice. Za intraokularne formulacije, poželjne su jedinične doze zato što u formulaciji nema konzervansa. Za druge parenteralne formulacije, konzervans se može koristiti, što omogućuje kontejnere sa više doza.

Mogu se praviti rastvori i suspenzije za injekcije, na primer, iz sterilnih prahova. Parenteralna i intravenozna izvođenja mogu uključiti i minerale i druge materijale koji će ih učiniti kompatiblim sa izabranim tipom injektiranja ili sistema davanja.

Određena parenteralna davanja predviđena u ovom pronalasku uključuju intraokularne i intravitriozne administracije u oko. Farmaceutske formulacije za intraokularne i intravitriozne administracije uključuju fosfatno puferisan slani rastvor (PBS) i uravnotežen izotoničan slani rastvor (BSS) sa ili bez ekscipijenta, kakav je manitol ili sorbitol, za stabilizaciju proteina.

Uopšteno, voda, pogodno ulje, slani rastvor, vodeni rastvor dekstroze (glukoze) ili rastvori srodnih šećera i glikola kao što je propilen glikol ili polietilen glikoli su pogodni nosači za parenteralne rastvore. Rastvori za parenteralno davanje poželjno sadrže so aktivnog sastojka rastvorljivu u vodi, pogodne stabilizijuće agense i, po potrebi, puferske supstance. Antioksidujući agensi, kao što je natrijum bisulfit, natrijum sulfit ili askorbinska kiselina, bilo sami, bilo kombinovani, su pogodni stabilizijući agensi. Koriste se i njihove soli limunske kiseline ili natrijum EDTA. Pored toga, parenteralni rastvori mogu da sadrže konzervanse, kao što je benzalkonijum hlorid, metil- ili propil-paraben, ili hlorobutanol. Pogodni farmaceutski nosači su opisani u Remington-u, citiranim supra.

U bilo kom od izvođenja opisanih ovde, kompozicija ili farmaceutska formulacija može biti lipolizovana.

U bilo kom od izvođenja opisanih ovde, poželjno je da farmaceutske formulacije imaju manje od oko 10, poželjnije manje od oko 5, još poželjnije manje od oko 3, ili još poželjnije manje od oko 1 endotoksinske jedinice po miligramu terapijskih agenasa.

U nekim izvođenjima, postupci lečenja opisani ovde dalje uključuju davanje pojedincu koji pati od angiogenetskog stanja jedan ili više terapijskih agenasa odabranih iz grupe koja sadrži antineoplastične agense, antivirusne agense, anti-inflamatorne agense, antibakterijske agense, angiogenetske agense ili anti-angiogenetske agense.

Takvi kombinovani tretmani se mogu postići bilo davanjem pojedincu ko-formulisane kompozicije odavde sa dodatnim terapijskim agensima, bilo davanjem kompozicija odavde i terapijskih agenasa kao dve odvojene farmaceutske formulacije. U izvođenjima gde se pojedincu daje više od jedne kompozicije/terapijskog agensa, mogu se koristit manje doze kompozicija i/ili terapijskih agenasa zbog sinergijskog efekta ova dva aktivna sastojka.

Antineoplastični agensi koji se mogu davati pojedincu uključuju, ali nisu ograničeni na, aklarubicin; akodazol hidrohlorid; akronin; adozelesin; aldesleukin; altretamin; ambomicin; ametantron acetat; aminoglutetimid; amsakrin; anastrozol; antramicin; asparaginazu; asperlin; azacitidin; azetepu; azotomicin; batimastat; benzodepu; bikalutamid; bizantren hidrohlorid; bisnafid dimezilat; bizelesin; bleomicin sulfat; brekinar natrijum; bropirimin; busulfan; kactinomicin; kalusteron; karacemide; karbetimer; karboplatin; karmustin; karubicin hidrohlorid; karzelesin; cedefmgol; hlorambucil; kirolemicin; cisplatin; kladribin; krisnatol mezilat; ciklofosfamid; citarabin; dakarbazin; daktinomicin; daunorubicin hidrohlorid; decitabin; deksormaplatin; dezaguanin; dezaguanin mezilat; diazikon; docetaksel; doksorubicin; doksorubicin hidrohlorid; droloksifen; droloksifen citrat; dromostanolon propionat; duazomicin; edatreksat; eflornitin hidrohlorid; elzamitrucin; enloplatin; enpromat; epipropidin; epirubicin hidrohlorid; erbulozol; ezorubicin hidrohlorid; estramustin; estramustin fosfat natrijum; etanidazol; etijodirano ulje i 131; etopozid; etopozid fosfat; etoprin; fadrozol hidrohlorid; fazarabin; fenretinid; floksuridin; fludarabin fosfat; fluorouracil; flurocitabin; foskidon; fostriecin natrijum; gemcitabin; gemcitabin hidrohlorid; zlato Au 198; hidroksiurea; idarubicin hidrohlorid; ifosfamid; imofosin; interferon alfa-2a; interferon alfa-2b; Interferon alfa-nl; interferon alfa-n3; interferon beta-Ia; interferon gama-Ib; iproplatin; irinotekan hidrohlorid; lanreotid acetat; letrozol; leuprolid acetat liarozol hidrohlorid; lometreksol natrijum; lomustin; losoksantron hidrohlorid; mazoprokol; maitanzin; mehloretamin hidrohlorid; megestrol acetat; mclcngcstrol acetat; mclfalan; menogaril; merkaptopiirin; inetutreksal; melotreksat natrijum; rneloprin; meturedepu; mitindomid; mitokarcin; mitokromin; mitogilin; mitomalcin; mitomicin; mitosper; mitotan; mitoksantron hidrohlorid; mikofenolnu kiselinu; nokodazol; nogalamicin; ormaplatin; oksisuran; paklitaksel; pegaspargazu; peliomicin; pentamustin; peplomicin sulfat; perfosfamid; pipobroman; piposulfan; piroksantron hidrohlorid; plikamicin; plomestan; porfimer natrijum; porfiromicin; prednimustin; prokarbazin hidrohlorid; puromicin; puromicin hidrohlorid; pirazofurin; riboprin; roglclimid; safingol; sa liri gol hidrohlorid; semuslin; sirntraz.cn; sparfosal. natrijum; sparsomicin, spirogermanijum hidrohlorid; spiromustin; spiroplatin; streptonigrin;

streptozocin; stroncijum hlorid Sr 89; sulofenur; talisomicin; taksan; taksoid; tekogalan natrijum; tegafur; teloksantron hidrohlorid; temoporfm; tenipozid; teroksiron; testolakton; tiamiprin; tioguanin; tiotepu; tiazofurin; tirapazamin; topotekan hidrohlorid; toremifen citrat; trestolon acetat; triciribin fosfat; trimetreksat; trimetreksat glukuronat; triptorelin; tubulozol hidrohlorid; uracil mustard; uredepu; vapreotid; verteporfm; vinblastin sulfat; vinkristin sulfat; vindesin; vindesin sulfat; vinepidin sulfat; vinglicinat sulfat; vinleurozin sulfat; vinorelbin tartrat; vinrosidin sulfat; vinzolidin sulfat; vorozol; zeniplatin; zinostatin; zorubicin hidrohlorid.

Antibakterijski agensi koji se mogu davati pojedincu uključuju, ali nisu ograničeni na, penicilline, aminoglikozide, makrolide, monobaktame, rifamicine, tetracikline, hloramfenikol, klindamicin, linkomicin, imipenem, fusidinsku kiselinu, novobiocin, fosfomicin, fusidat natrijum, neomicin, polimiksin, kapreomicin, kolistimetat, kolistin, gramicidin, minociklin, doksiciklin, vanomicin, bacitracin, kanamicin, gentamicin, eritromicin i cefalosporine.

Anti-inflamatorni agensi koji se mogu davati pojedincu uključuju, ali nisu ograničeni na, NSAIDS (npr., aspirin (salicilamid), natrijum salicilamid, indoprofen, indometacin, natrijum indometacin trihidrat, Bayer™, Bufferin™, Celebrex™, diclofenac, Ecotrin™, diflunisal, fenoprofen, naproksen, sulindak, Vioxx™), korticosteroide ili korticotropin (ACTH), kolhicin i anekortav acetat.

Antivirusni agensi koji se mogu davati pojedincu uključuju, ali nisu ograničeni na, a-metil-P-adamantan metilamin, l,-D-ribofuranozil-l,2,4-triazol-3 karboksamid, 9-[2-hidroksi-etoksijmetilguanin, adamantanamin, 5-jodo-2’-deoksiuridin, trifluorotimidin, interferon, adenin arabinozid, CD4, 3’-azido-3’-dezoksitimidin (AZT), 9-(2-hidroksietoksimetil)-guanin (aciklovir), fosfonomravlju kiselinu (CH3O5P), 1-adamantanamin, peptid T i

2’,3'dideoksieilidin.

Davanje kompozicija iz ovog pronalaska ciljnim ćelijama in vivo se može postići upotrebom bilo koje iz niza tehnika dobro poznatih stručnjacima.

Na primer, kompozicije iz ovog pronalaska se mogu davati sistemski ili lokalno na bilo koji od načina poznatih u struci (npr., oralno, intraokularno, intravaskularno (i.v.), intradermalno, intramuskularno, transdermalno, transmukozalno, enterično, parentalno, sprejem za inhalaciju, rektalno, ili topično) u jediničnim dozama formulacija i sa konvencionim farmaceutski prihvatljivim nosačima i adjuvantima.

Kao što je ovde korišćen, termin intraokularno uključuje intravitrealno, subretinalno i slično.

Kao što je ovde korišćen, termin parenteralan uključuje, subkutane, intravenozne, intramuskularne, intrasternalne, infuzione tehnike ili intraperitonealno. Supozitorije za rektalno unošenje leka mogu se pripremati mešanjem leka sa pogodnim neiritirajućim ekscipijentom kao što je kakao puter i polietilen glikoli koji su čvrsti na uobičajenim temperaturama, ali tečni na rektalnoj temperaturi i zato će se istopiti u rektumu i otpustiti lek.

Režim doziranja za lečenje poremećaja ili oboljenja kompozicijama iz ovog pronalaska se zasniva na nizu faktora, uključujući tip oboljenja, sarost, težinu, pol, zdravstveno stanje pacijenta, težinu stanja, način davanja i konkretno jedinjenje koje se koristi. Dakle, režim doziranja može jako da varira, ali se može odrediti rutinski standardnim postupcima.

Za sistemsko davanje, antitelo na ALK-1 ili njegov deo za vezivanje antigena iz ovog pronalaska i/ili jedan ili više dodatnih terapijskih agenasa se poželjno daju u dozi od bar 0,05; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0; 9,0; 10; 20; 30;

40; 50; 75; 100 ili 150 mg/kg telesne težine. U nekim drugim izvođenjima, polipeptidi (poželjno dimeri ili homodimeri) i/ili mali molekuli odavde se daju sistemski u dozi od 0,1100 mg/kg, poželjnije 0,5-50 mg/kg, još poželjnije 1-30 mg/kg telesne težine ili još poželjnije

5-20 mg/kg.

Za lokalizovano davanje, antitelo na ALK-1 ili njegov deo za vezivanje antigena iz ovog pronalaska i/ili jedan ili više dodatnih terapijskih agenasa se poželjno daju u dozi od bar 50 pg, 100 pg, 150 pg, 200 pg, 250 pg, 300 pg, 350 pg, 400 pg, 450 pg, 500 pg, 550 pg, 600 pg, 650 pg, ili 700 pg. U nekim drugim izvođenjima, polipeptidi (poželjno dimeri ili homodimeri) i/ili mali molekuli odavde se daju lokalno u dozi od 50-1000 pg, poželjnije 100800 pg, još poželjnije 200-500 pg ili još poželjnije 300-400 pg po mestu.

Na primer, za dermalno davanje, antitelo na ALK-1 ili njegov deo za vezivanje antigena iz ovog pronalaska i/ili peptidomimetici i/ili jedan ili dodatnih terapijskih agenasa se daju u dozi od 50-1000 pg/cm2, poželjnije 100-800 pg/cm2 ili još poželjnije 200-500 pg/cm2. LI jednom drugom primeru, za očno davanje, polipeptidi i/ili peptidomimetici i/ili mali molekuli iz ovog pronalaska se daju u dozi od 50-1000 pg/oko, poželjnije 100-800 pg/oko ili još poželjnije 200-500 pg/oko.

Farmaceutske kompozicije poželjno uključuju aktivan sastojak (npr., antitelo na ALK-1) u efektivnoj količini, tj., u količini efektivnoj da se postigne terapijska ili profilaktička dobrobit. Prava efektivna količina za određenu primenu će zavisiti od stanja koje se tretira i načina davanja. Određivanje efektivne količine je sasvim u okviru sposobnosti stručnjaka, naročito u svetlu ovog opisa.

Poželjno je da efektivna količina aktivnog sastojka, npr., antitela na ALK-1, bude od oko 0,0001 mg do oko 500 mg aktivnog agensa po kilogramu telesne težine pacijenta, poželjnije od oko 0,001 do oko 250 mg aktivnog agensa po kilogramu telesne težine pacijenta, još poželjnije od oko 0,01 mg do oko 100 mg aktivnog agensa po kilogramu telesne težine pacijenta, a još poželjnije od oko 0,5 mg do oko 50 mg aktivnog agensa po kilogramu telesne težine pacijenta i najpoželjnije od oko 1 mg do oko 15 mg aktivnog agensa po kilogramu telesne težine pacijenta.

Što se tiče težinskog procenta, formulacije iz ovog pronalaska će poželjno sadržati aktivni agens, npr., antitelo na ALK-1, u količini od oko 0,0001 do oko 10 tt. %, još poželjnije od oko 0,001 do oko 1 tt. %, još poželjnije od oko 0,05 do oko 1 tt. % ili još poželjnije about 0,1 tt. do oko 0.5 tt. %.

Genska terapija

Molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju antitela i delove antitela iz ovog pronalaska mogu se davati pacijentu kome je to potrebno putem genske terapije. Terapija može biti bilo in vivo, bilo ex vivo. U jednom poželjnom izvođenju, molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju i težak i lak lanac se daju pacijentu. U jednom poželjnijem izvođenju, molekuli nukleinske kiseline se daju tako da su oni stabilno integrisani u hromozome B ćelija, zato što su ove ćelije specijalizovane za proizvodnju antitela. U jednom poželjnom izvođenju, prekursorske B ćelije su transfektovane ili inficirane ex vivo i ponovo transplantirane u pacijenta kome je to potrebno. U jednom drugom izvođenju, prekursorske B ćelije ili druge ćelije su inficirane in vivo pomoću virusa za koji se zna da inficira ćelijski tip od interesa. Tipični vektori koji se koriste za gensku terapiju uključuju lipozome, plazmide i virusne vektore. Primeri i virusnih vektora su retrovirusi, adenovirusi i adeno-asocirani virusi. Posle inficiranja bilo in vivo, bilo ex vivo, nivoi ekspresije antitela se mogu pratiti uzimanjem uzorka iz tretiranog pacijenta i upotrebom bilo kog imunoeseja poznatog u struci ili diskutovanog ovde.

U jednom poželjnom izvođenju, postupak genske terapije sadrži korake administracije izolovanog molekula nukleinske kiseline koji kodira težak lanac ili njegov deo za vezivanje antigena antitela na ALK-1 i eksprimiranja molekula nukleinske kiseline. U jednom drugom izvođenju, postupe genske terapije sadrži korake administracije izolovanog molekula nukleinske kiseline koji kodira lak lanac ili njegov deo za vezivanje antigena antitela na ALK-1 i eksprimiranja molekula nukleinske kiseline. U poželjnijem postupku, postupak genske terapije sadrži korake administracije izolovanog molekula nukleinske kiseline koji kodira težak lanac ili njegov deo za vezivanje antigena i izolovanog molekula nukleinske kiseline koji kodira lak lanac ili njegov deo za vezivanje antigena antitela na ALK-1 iz pronalaska i eksprimiranja molekula nukleinske kiseline. Postupak genske terapije može da sadrži i korake administracije nekog drugog terapijskog agensa, kao stoje bilo koji od agenasa diskutovanih prethodno u vezi sa kombinovanom terapijom.

Postupak za pretraživanje antagonista ili agonista ALK-1

U jednom izvođenju, ovaj pronalazak obezbeđuje postupak za određivanje da li supstanca inhibira ushodnu regulaciju specifičnog nizvodnog ciljnog gena ALK-1, Idi, kao stoje, na primer, Taqman-ov esej za Idi opisan u Primeru 12. Postupak sadrži kontaktiranje uzorka ćelija koje eksprimiraju Idi sa supstancom i određivanje da li je ekspresija Idi inhibirana, gde snižen nivo ekspresije Idi u uzorku ćelija kontaktiranih sa supstancom u odnosu na kontrolni uzorak ćelija ukazuje da data supstanca inhibira ekspresiju Idi. U jednom specifičnom izvođenju, supstanca je antitelo koje se vezuje za vanćelijski domen ALK-1. U jednom drugom izvođenju, supstanca je mali molekul. Prema pronalasku, ćelije mogu inherentno da eksprimiraju i ALK-1 i Idi, kao stoje HUVECs opisan u Primeru 12, ili koje su transformisane ili transfektovane sa DNK koja kodira jedan ili oba ova. Može se odrediti ekspresija Idi, npr., upotrebom Taqman-ovog eseja za Idi, opisanog u Primeru 12.

Obrnuto, aktivatori ili agonisti se mogu testirati, ili koristiti, sledeći isti tip procedura.

Da bi se bolje razumeo ovaj pronalazak, dati su sledeći primeri. Ovi primeri služe samo kao ilustracija i ni na koji način ih ne treba shvatiti kao ograničenja opsega pronalaska.

Primeri

U sledećim primerima i preparatima, “MW” označava molekulsku težinu; “His-Tag” označava C-kraj polihistidinskog (6xHis) markera za brzo prečišćavanje nikl-helirajućom smolom i detekciju anti-His (C-kraj) antitelom; “BSA" označava albumin iz goveđeg seruma; “EDTA” označava etilendiamintetraacetatnu kiselinu; “DMSO” označava dimetil sulfoksid; “MOPS” označava 3-(N-morfolino) propansulfonsku kiselinu; “MES” označava 2-(N-morfolinojetansulfonsku kiselinu; “PBS” označava fosfatno puferisan slani rastvor; “dPBS” označava Dulbecco-ov fosfatno puferisan slani rastvor; “HEMA” označava 2-hidroksi-etil metakrilat; “DMEM” označava Dulbecco-ov modifikovan Eagle medijum; “FBS” označava fetalni goveđi serum; “NEAA” označava ne-essencijalne aminokiseline; “HEPES” označava N-2-hidroksietilpiperazin-N'-2-etansulfonsku kiselinu i “DMF” označava dimetil formamid.

Primer 1. Pobijanje imunogena ALK-1

ECD ALK-1 je kloniran iz ćele dužine humanog ALK-1 ORF klona (Invitrogen, Gone ID IOH21048) pomoću PCR korišćenjem prajmera za reakciju unapred 5’-ACGGCCCTGCCGGCCGACCCTGTGAAGCCGTCT (SEQ ID NO: 96) i za reakciju unazad 5 ’ - ACTAA GC77TT AAT GAT GAT GATGAT GAT GCTGGCC ATCT GTTCCCG

(SEQ ID NO: 97). Proizvod PCR je prečišćen, tretiran Sfil i Hindlll restrikcionim enzimima i kloniran u Sfil/Hindlll mesto sisarskog ekspresionig vektora pSecTag2/Hygro (Invitrogen Ine., Catalog No.V910-20). Klon je korišćen za prolaznu transfekciju 293T ćelija Fugene 6 transfekcionim reagensom (Roche Applied Science, Catalog No.1814443) sledeći uputstva proizvođača. Supernatant iz ćelijske kulture koji sadrži sekretovan ciljni protein je sakupljen 72 sata posle transfekcije i ostavljen je da se veže za Ni-NTA smolu (QIAGEN, Catalog No.30430) na 4°C preko noći. Smola je zatim oprana puferom koji sadrži 20 mM Tris pH 8, 0, 25 mM imidazol i 300 mM natrijum hlorid. Flis-Tag protein je eluiran sa smole puferom koji sadrži 20 mM Tris pH 8,0, 300 mM imidazol i 300 mM natrijum hlorid. CM Sepharose katjono-izmenjivačka smola je korišćena za dalje prečišćavanje proteina u 20 mM-nom natrijum fosfatu (pH 7,0) i sakupljena je nevezana frakcija koja sadrži ciljni protein. Proteinu je zamenjen pufer za PBS ili 10 mM HEPES, pH 7,4, plus 150 mM natrijum hlorid dijalizom i koncentrovan je do 0,2-1 mg/mL sa konačnom čistoćom od >90%, što je procenjeno pomoću SDS PAGE gela bojenog Coomassie plavim. His-Tag protein iz ECD ALK-1 je jako glikozilovan sa prividnom MW od 26 KDa, u poređenju sa teorijskom MW od 11 KDa

proteina. His-Tag protein ECD ALK-1 (SEQ ID NO: 98) je korišćen za pravljenje hibridoma koji proizvode antitelo na ALK-1 kao što je opisano u Primeru 2.

Humani His-Tag protein ECD ALK-1:

genska sekvenca (deo sa malim slovima je signal za sekreciju):

atggagacagacacactcctgctatgggtactgctgctctgggttccaggttccactggtgacgcggcccagccggccGACCCT

GTGAAGCCGTCTCGGGGCCCGCTGGTGACCTGCACGTGTGAGAGCCCACATTGCA

AGGGGCCTACCTGCCGGGGGGCCTGGTGCACAGTAGTGCTGGTGCGGGAGGAGG

GGAGGCACCCCCAGGAACATCGGGGCTGCGGGAACTTGCACAGGGAGCTCTGCA

GGGGGCGCCCCACCGAGTTCGTCAACCACTACTGCTGCGACAGCCACCTCTGCAA

CCACAACGTGTCCCTGGTGCTGGAGGCCACCCAACCTCCTTCGGAGCAGCCGGGA

ACAGATGGCCAGCATCATCATCATCATCAT (SEQ ID NO: 99)

proteinska sekvenca:

DPVKPSRGPLVTCTCESPHCKGPTCRGAWCTVVLVREEGRHPQEHRGCGNLHRELC RGRPTEFVNHYCCDSHLCNHNVSLVLEATQPPSEQPGTDGQHHHHHH (SEQ ID NO: 98)

Primer 2, Pravljenje hibridoma koji proizvode antitela na ALK-1

Osam do deset nedelja stari XENOMOUSE® miševi su imunizovani preko jastučića na zadnjim šapama pomoću 10 pg/miš rekombinantnih humanih ALK-l/Fc himera (R&D Sistems, Ine., Catalog Number 370-AL) ili pomoću His-Tag proteina iz ECD ALK-1, opisanog u Primeru 1. Ova doza je ponovljena pet do sedam puta tokom perioda od tri do pet nedelja. Tri ili četiri dana pre fuzije, miševima je data konačna injekcija imunogena u PBS. Limfociti iz limfnih čvorova imunizovanih miševa su fuzionisani sa P3-X63-Ag8.653 ćelijskom linijom ne-sekretornog mijeloma elektro ćelijskom fuzijom (ATCC Cat. No. CRL 1580) i ove fuzionisane ćelije su podvrgnute HA-DMEM selekciji, kao što je prethodno opisano (DMEM/15%FBS/1% 200 mM L-glutamin/1% 100X ne-esencijalna

aminolciselina/1% 100X Pen/Strep/10 U/ml IL-6/1 bočical/litar OPI dodatak medijumu plus 0,5 x HA (azaserin-hipoksantin, Sigma, Cat. # A9666)). Ostaje panel hibridoma koji svi sekretuju specifična humana IgG2 antitela na ALK-1.

ELISA esej je korišćen za detekciju vezivanja antitela. Površina Immulon mikrotitarske ploče sa 96 ležišta (NUNC-ImmunoIM plate MaxiSorp1M surface, Nalge Nunc International, Cat. No.439454) je prevučena imunogenom, pri 4pg/mL u 50 mM-om natrijum bikarbonatnom puferu preko noći na 4°C. Ploče su oprane, a zatim blokirane PBS-om uz dodatak 0,1%-nog Tween-20 i 0,5%-nog albumina iz goveđeg seruma. Antitela su dodata u blokirane ELISA ploče, inkubirana 1 sat i oprana PBS-pm sa Tween-20. Vezivanje je detektovano pomoću peroksidaze rena na antitelima na humani IgG (Pierce, Catalog No. 31420), zatim je dodat ABTS (Pierce, Catalog No. 37615). Kolorimetrijska merenja su izvršena na 405 nm u čitaču mikro ploča (SpectraMax Plus 384, Molecular Devices).

Dvadeset pet hibridoma je odabrano za nastavak studije. Klonirane su pojedinačne ćelije ograničavanjem razblaženja i označene su kao 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1(rWT); 1.12.1(M29I/D19A); 1.12.1 (M29I); 1.12.1(D19A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1 i 5.59.1.

Ćelijska linija mišjeg hibridoma LN 15916 (hbridom 1.12.1) je deponovana, pod uslovima u saglasnosti sa Budimpeštanskim sporazumom, u American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209 21. juna, 2005. Hibridomu 1.12.1 je dodeljen sledeći pristupni broj: PTA-6808.

Primer 3. Sekvence antitela na ALK-1

Da bi se analizirala struktura antitela proizvedenih u skladu sa pronalaskom, klonirane su nukleinske kiseline koje kodiraju fragmente teškog i lakog lanca iz hibridoma koje proizvode monoklonska antitela na ALK-1. Kloniranje i sekvenciranje je postignuto standardnim načinima.

Poli(A)+ iRNK je izolovana pomoću kompleta Fast-TrackIM (Invitrogen) iz približno 2 X 105 ćelija hibridoma za svako od ALK-1 antitela. cDNK je sintetisana od iRNK pomoću nasumičnih prajmera. cDNK hibridizovana sa nasumičnim prajmerima je umnožena PCR-om pomoću specifičnih prajmera za familiju varijabilnih domena za humane VH ili humane Vk u sprezi sa prajmerima specifičnim za humani Cy2 konstantan region ili Ck konstantan region da bi se umnožio varijabilni region antitela, uključujući sve okvirne regione (FR) i regione koji određuju komplementarnost (CDR). Dobijene su sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju transkripte za humani težak i kapa lak lanac iz hibridoma koji proizvode antitela na ALK-1 direktnim sekvenciranjem oba lanca proizvoda PCR. Sekvence su analizirane pomoću softvera u vlasništvu Abgenix-a i javno dostupnih informacija o sekvencama za humane VH i Vk gene, “V BASE sekvenca directory”, Tomlinson et ah, MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, UK). Identične rezultate bi mogao da dobije stručnjak uobičajenog

nivoa korišćenjem javno dostupnog softvera za poređenje sekvenci upotrebom MacVector i Geneworks softverskih programa.

Specifično, ćela dužina antitela na ALK-1 1.12.1 je klonirana u ekspresione vektore na sledeći način: Poli(A)+ iRNK je izolovana pomoću kompleta RNeasy Mini Kit (Qiagen) i cDNK sintetisane iz iRNK pomoću kompleta Advantage RT-for-PCR kit (BD Biosciences) uz upotrebu oligo(dT) kao prajmera. 01igo(dT)-cDNK za klon 1.12.1 je umnožena upotrebom prajmera nabrojanih u Tabeli 2. Amplifikacija je postignuta upotrebom Pfu Ultra polimeraze (Stratagene) i PTC-200 DNK Engine (MJ Research) sa sledećim ciklusima: 3’ na 95DC; 25x (20” na 95DC, 30” na 52DC, 1’20” na 72DC); 10’ na 72DC. Sekvence klonova su proverene pomoću Grills 16th BDTv3.1/dGTP Chemistry (Applied Biosistems Ine) i 3730x1 DNK Analyzer (Applied Biosistems Ine). U procesu kloniranja Vh 1.12.1, ćutljiva mutacija je uvedena u osmi kodon, transformišući “GGC” u “GGT.” Sve sekvence analizirane poređenjem u ‘V BASE sequence directory’ (Tomlinson, et al, J. Mol. Biol, 227, 776-798 (1992); Hum. Mol. Genet., 3, 853-860 (1994); EMBOJ., 14, 4628-4638 (1995).)

Tabela 2

Prajmeri za umnožavanje teškog i lakog lanca koji se koriste za kloniranje ćele dužine 1.12.1

Malim slovima su date baze koje ne hibridizuju

Primer 4, Analiza upotrebe gena i analiza CDR

Iz sekvence nukleinske kiseline i predviđene aminokiselinske sekvence antitela, identifikovana je upotreba gena za svaki lanac antitela. Tabela 3 prikazuje koji su geni za antitela iz odabranih klonova hibridoma korišćeni u skladu sa pronalaskom.

Tabela 3

Upotreba gena za teške i lake lance

Mutageneza u Vh (M29I) i Vn (D19A) regionima klona 1.12.1, je izvedena pomoću prajmera nabrojanih u Tabeli 4 i kompleta QuickChange (Stratagene) prema uputstvima proizvođača. Sekvence mutiranih varijanti su proverene i klonirane u ekspresione vektore standardnim procedurama.

Tabela 4

Mutageni oligonukleotidi (sekvence 5’ do 3’):

Mutacije su označene masnim slovima i podvučene

Molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju varijabilni domen teškog lanca (SEQ ID NO: 5) i varijabilni domen lakog lanca (SEQ ID: 7) antitela 1.12.1 (M29I/D19A) su deponovani pod uslovima u saglasnosti sa Budimpeštanskim sporazumom, u American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209 14. jula, 2005. Deponovanim su dodeljeni sledeći pristupni brojevi: ATCC No. PTA-6864 za E. coli DH5a koja sadrži plazmid pCR2.1 TOPO 1.12.1 VH (M29I):UC 25502; i ATCC No. PTA-6865 za E. coli DH5a koja sadrži plazmid pCR2.1 TOPO 1.12.1 V (D19A):UC 25503.

Brojna specifična humana antitela na ALK-1 su ispoljila zajednički motiv (pattern) u CDR1 varijabilnog domena teškog lanca. Ovi vodeći molekuli koriste 4-31 ili 4-61 segment V-gena za težak lanac. Sekvence FR1 i CDR1 koje odgovaraju ovim teškim lancima antitela su prikazane u Tabeli 4A, poredane nasuprot embrionskih sekvenci. Crtica (-) u redu označava aminokiselinu identičnu sa embrionskom. U svim slučajevima, motiv GYYWS (SEQ ID NO: 136) na kraju CDR1 je bio podvrgnut somatskim mutacijama da bi dao profil nove sekvence, gde je G ostatak promenjen u kiselinski ostatak (D ili E), a krajnji S ostatak je promenjen u N u 9 od 12 primera. Raznovrsnost sekvenci u drugim Vh regionima ukazuje na to da su, izgleda, nezavisne somatske mutacije dovele do istog profila sekvence na kraju CDR1 VH.

Tabela 4A

Sekvence teškog lanca antitela na ALK-1

Primer 5. Pobijanje molekula Fab 1.12.1

Fab fragment 1.12.1(M29I/D19A) je dobijen digestijom 1.12.1 (M29I/D19A) IgGl uz upotrebu papaina. Prečišćena ćela dužina IgGl 1.12.1(M29I/D19A) proteinom A je inkubirana sa papainom (VWR) u odnosu 1:50 (papain: protein) u puferu koji sadrži 30 mM natrijum fosfat (pH 7,0), 2 mM EDTA i 2 mM cistein, na 37 °C 2-3 sata. Digestiona smesa je zatim propuštena kroz mini-kolonu proteina A da bi se uklonili nedigestirani ćeli proteini i Fc fragmenti. Nevezani Fab je sakupljen u proboju. Kolona od molekulskog sita (Superdex 200, Amersham Pharmacia Biotech) je zatim korišćena za dalje prečišćavanje Fab proteina i za izmenu pufera u PBS. Endotoksin je uklonjen propuštanjem proteinskog rastvora kroz Detoxi gel (PIERCE) i Vivapure Mini Q jonoizmenjivačku kolonu (VivaScience), jedno za drugim. Protein je profiltriran kroz špric sa filtrom od 0,2 pm i testiran je nivo endotoksina pomoću kompleta LAL pyrogent (Cambrex). Konačno prečišćen protein je bio u koncentraciji 2-3 mg/mL, sa nivoom endotoksina <0,1 EU/mg i čistoće >95%. Fab fragment 1,12.1(M29I/D19A) ima molekulsku težinu 47,347 u neredukovanim uslovima, što je pokazano elektron-sprej masenom spektrometrijom. Edman-ova analiza sekvenci N-kraja je

potvrdila sekvencu EIVLTQSPG (SEQ ID NO: 113) na N-kraju lakog lanca, odnosno, sekvencu QVQLQESG (SEQ ID NO: 114) na N-kraju teškog lanca.

Primer 6. Određivanje vrednosti aviditeta celih humanih monoklonskih antitela na ALK-1 površinskom plazmonskom rezonancom (SPR) pomoću BIACORE1M

Mere aviditeta prečišćenih antitela na ALK-1 dobijene su površinskom plazmonskom rezonancom pomoću BIACORE1M 3000 instrumenta na sledeći način, prateći protokole proizvođača.

Da bi se uradile kinetičke analize, rekombinantni humani ALK-l/Fc fuzioni protein (hALK-l/Fc) i ALK-1/Fc fuzioni protein (cALK-l/Fc) cynomolgus-a su imobilisani na odvojenim protočnim ćelijama CM5 BIAcore senzornog čipa rutinskim kuplovanjem amina. Površine su pripremljene pomoću 10 mM acetatnog pufera, pH 5,0 kao pufera za imobilizaciju i postignute su gustine proteina od 300 za fuzioni protein hALK-l/Fc i 150 RU za i fuzioni protein cALK-l/Fc. Deaktivacija neizreagovanih N-hidroksisukcinimidnih estara je urađena uz pomoć 1 M etanolamin hidrohlorida, pH 8,5. Uzorci antitela u puferu za eluiranje (running buffer) su pripremljeni u koncentracijama u opsegu od 0,125 do 2 nM (0 nM rastvor koji sadrži čist pufer za eluiranje je uključen kao nulta tačka). Uzorci su randomizirani i ubrizgavani u duplikatu, 10 minuta svaki, u sve 4 protočne ćelije uz upotrebu HBS-EP (10 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0,005% Surfactant P20) kao pufera za eluiranje. Uočeno je da su početne brzine nezavisne od brzina protoka od 1 do 100 pL/min, što ukazuje na to da nema ograničenja na transport mase. Brzina protoka od 25 pL/min je korišćena za određivanje vrednosti aviditeta. Disocijacija antitela je praćena 10 minuta, površina je obnovljena injektiranjem 100 mM H3PO4 (25 pL/min) tokom 12 sekundi. Sirovi podaci su obrađeni upotrebom softverskog paketa Scrubber (©BioLogic Softvvare) i analizirani uz pomoć softverskog paketa CLAMP (©BioLogic Software). Skupovi višestrukih podataka sa jedne površine, šest skupova podataka odjednom, simultano su fitovani globalno na jednostavan 1:1 Langmirov model vezivanja korišćenjem zajedničke varijabilne vrednosti Rmax. Tabela 5 pokazuje vrednosti aviditeta za reprezentativna antitela na ALK-1 iz ovog pronalaska. Predstavljeni podaci ukazuju na to da antitela napravljena u skladu sa pronalaskom imaju visoke afinitete i visoke konstante vezivanja za humani ALK-1.

Tabela 5

Određivanje vrednosti aviditeta površinskom plazmonskom rezonancom (BIAcore)

1.12.1(M29I/D19A) se odnosi na varijantu mAb 1.12.1 koja predstavlja eksprimiran rekombinantni mAb sa dve specifične aminokiselinske mutacije (metionin na poziciji 29 u teškom lancu je zamenjen izoleucinom i asparaginska kiselina na poziciji 19 u lakom lancu je zamenjena alaninom).

Primer 7. Određivanje konstanti afiniteta (Kn) varijanti potpuno humanih monoklonskih antitela na ALK-1 1.12.1 površinskom plazmonskom rezonancom (SPR) pomoću BIACORE™

Mere afiniteta prečišćenih antitela na ALK-1 dobijene su površinskom plazmonskom rezonancom pomoću BIACORE™ 3000 instrumenta na sledeći način, prateći protokole proizvođača.

Da bi se uradile kinetičke analize, varijante potpuno humanih monoklonskih antitela na ALK-1 1.12.1 su imobilisani na dekstranskom sloju biosenzornog čipa CM5 kuplovanjem

amina. Površine su pripremljene pomoću 10 mM acetatnog pufera, pH 5,0 kao pufera za imobilizaciju i postignute su gustine proteina od 3500-4800 RU. Deaktivacija neizreagovanih N-hidroksisukcinimidnih estara je urađena uz pomoć 1 M etanolamin hidrohlorida, pH 8,5. Uzorci monomernih ALK-ECD u puferu za eluiranje su pripremljeni u koncentracijama u opsegu od 2,63 do 640 nM (0 nM rastvor koji sadrži čist pufer za eluiranje je uključen kao nulta tačka). Uzorci su randomizirani i injektirani po 2 minuta svaki, u sve 4 protočne ćelije uz upotrebu HBS-EP (10 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0,005% surfaktant P20) kao pufera za eluiranje. Brzina protoka od 25 pL/min je korišćena za određivanje konstanti afiniteta. Disocijacija monomernih ALK-ECD je praćena 10 minuta, površina je obnovljena injektiranjem 100 mM H3PO4 (25 pL/min) tokom 12 sekundi. Sirovi podaci su obrađeni upotrebom softverskog paketa Scrubber (©BioLogic Software) i analizirani uz pomoć softverskog paketa CLAMP (©BioLogic Softvvare). Podaci su fitovani globalno na jednostavan 1:1 Langmirov model vezivanja. Tabela 6 pokazuje mere afiniteta za varijante humanog monoklonskog antitela na ALK-1 1.12.1 iz ovog pronalaska.

Tabela 6

Određivanje konstanti afiniteta Kn varijanti mAb 1.12.1 površinskom plazmonskom

rezonancom (BIAcore)

Dve konstante afiniteta 1.12.1(M29I/D19A) (1) i (2) su dobijene korišćenjem dve odvojene površine.

1.12.1 se odnosi na varijantu mAb 1.12.1 koja je izolovana iz hibridoma.

1.12.1(rWT) se odnosi na varijantu mAb 1.12.1 koja predstavlja eksprimiran

rekombinantni mAb.

1.12.1 (M29I) se odnosi na varijantu mAb 1.12.1 koja predstavlja eksprimiran rekombinantni mAb sa jednom specifičnom aminokiselinskom mutacijom, gde je metionin na poziciji 29 u teškom lancu zamenjen izoleucinom.

1.12.1 (D19A) se odnosi na varijantu mAb 1.12.1 koja predstavlja eksprimiran rekombinantni mAb i koja sadrži jednu specifičnu aminokiselinsku mutaciju, gde je asparaginska kiselina na poziciji 19 u lakom lancu zamenjena alaninom.

1.12.1(M29I/D19A) se odnosi na varijantu mAb 1.12.1 koja predstavlja eksprimiran rekombinantni mAb sa dve specifične aminokiselinske mutacije (metionin na poziciji 29 u teškom lancu zamenjen izoleucinom a asparaginska kiselina na poziciji 19 u lakom lancu zamenjena alaninom).

Primer 8. Određivanje konstanti afiniteta (Kn) reprezentativnih potpuno humanih monoklonskih antitela na ALK-1 površinskom plazmonskom rezonancom (SPR) pomoću BIACORE™

Mere afiniteta (Kd i k0ff) prečišćenih antitela na ALK-1 dobijene su površinskom plazmonskom rezonancom pomoću BIACORE™ 3000 instrumenta na sledeći način, prateći protokole proizvođača.

Da bi se uradile kinetičke analize, mAb-ovi prečišćeni po afinitetu su imobilisani na dekstranskom sloju biosenzornog čipa CM5 kuplovanjem amina. Površine su pripremljene pomoću 10 mM acetatnog pufera, pH 5,0, kao pufera za imobilizaciju i postignute su gustine proteina od 200-400 RU. Deaktivacija neizreagovanih N-hidroksisukcinimidnih estara je urađena uz pomoć 1 M etanolamin hidrohlorida, pH 8,5. Uzorci monomernih ALK-ECD u puferu za eluiranje su pripremljeni u koncentracijama u opsegu od 3,125-400 nM (0 nM rastvor koji sadrži čist pufer za eluiranje je uključen kao nulta tačka). Uzorci su randomizirani i ubrizgavani u duplikatu, po 2 minuta svaki, u sve 4 protočne ćelije uz upotrebu HBS-EP (10 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0,005% surfaktant P20) kao pufera za eluiranje. Uočeno je da su početne brzine nezavisne od brzina protoka od 1 do 100 pL/min, što ukazuje na to da nema ograničenja na trasport mase. Brzina protoka od 25 pL/min je korišćena za određivanje konstanti afiniteta. Disocijacija monomernih ALK-ECD je praćena 10 minuta, površina je obnovljena injektiranjem 100 mM H3PO4 (25 pL/min) tokom 12 sekundi. Sirovi podaci su obrađeni upotrebom softverskog paketa Scrubber (©BioLogic Softvvare) i analizirani uz pomoć softverskog paketa CLAMP (©BioLogic Software). Podaci su fitovani globalno na jednostavan 1:1 Langmirov model vezivanja.

Tabela 7 pokazuje mere afiniteta za representativna antitela na ALK-1 1.12.1 iz ovog pronalaska.

Tabela 7

Određivanje konstanti afiniteta (Kn) reprezentativnih monoklonskih antitela površinskom plazmonskom rezonancom (BIAcore)

Monomeran ALK-ECD korišćen za dobijanje podataka u Primeru 8 je bio različit preparat nego onaj korišćen za dobij anje podataka u Primeru 7.

1.12.1(M29I/D19A) se odnosi na varijantu mAb 1.12.1 koja predstavlja eksprimiran rekombinantni mAb i koja sadrži dve specifične aminokiselinske mutacije pomenute gore (asparaginska kiselina na poziciji 19 u lakom lancu je zamenjena alaninom i metionin na poziciji 29 u teškom lancu je zamenjen izoleucinom).

Fab 1,12.1(M29I/D19A) se odnosi na Fab fragment mAb 1.12.1 (M29I/D19A) dobijen digestijom 1.12.1(M29I/D19A) IgGl uz upotrebu papaina.

Primer 9. Identifikacija epitopske selektivitnosti antitela na ALK-1

Eksperimenti sa unakrsnom kompeticijom su izvođeni pomoću instrumenta BIACOREim 3000 (Biacore International AB, Uppsala, Sweden i Piscataway, N.J), sledeći protokole proizvođača.

Rekombinantna humana ALK-1 /FC himera je imobilisana na dekstranskom sloju biosenzornog čipa CM5 kuplovanjem amina. Čipovi su pripremljeni pomoću 10 mM acetatnog pufera, pH 5,0, kao pufera za imobilizaciju i postignuta je gustina proteina od 940 RU. Deaktivacija neizreagovanih N-hidroksisukcinimidnih estara je urađena uz pomoć 1 M etanolamin hidrohlorida, pH 8,5.

Prečišćeni mAb-ovi su razblaženi do koncentracije od 50 nM u puferu za eluiranje HBS-EP (0,01 M HEPES pH 7,4, 0,15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0,005% polisorbat 20). Primarno antitelo je Izabrano, a zatim injektirano u protočne ćelije tokom 600 sekundi brzinom od 10 pL/min. Pošto je injektiranje završeno, sekundarno antitelo je Izabrano, a zatim injektirano u iste protočne ćelije tokom 600 sekundi brzinom od 10 pL/min. Površina senzora je obnovljena injektiranjem 100 mM H3PO4 (25 pL/min) tokom 12 sekundi.

Posle regeneracije, primarno antitelo je ponovo injektirano u protočne ćelije tokom 600 sekundi brzinom od 10 pL/min. Pošto je injektiranje završeno, Izabrano je drugo sekundarno antitelo, a zatim injektirano u iste protočne ćelije tokom 600 sekundi brzinom od 10 pL/min. Kad je ceo panel od 14 antitela iskorišćen za sekundarna antitela, Izabrano je novo primarno antitelo i procedura je ponovljena sa novim primarnim antitelom. Ove procedure su sprovođene sve dok sve moguće kombinacije primarnih i sekundarnih antitela nisu injektirane u protočne ćelije. Smatra se da se vezivanje sekundarnog antitela desilo ako je ukupan odgovor nađen posle injektiranja oba antitela bio veći od obe moguće pražne vrednosti. Pražne vrednosti su određene upotrebom istog antitela i kao primarnog i kao sekundarnog antitela. Kao što je prikazano u Tabeli 8, napravljena je matrica odgovora na osnovu toga da li je nađeno vezivanje: - označava da nema vezivanja sekundarnog antitela, x označava da je nađeno vezivanje (odgovor je bio veći od pražnih vrednosti za pojedinačna antitela). Grupisanje klonova koji pokazuju isti profil reaktivnosti daje dva različita grupisanja epitopa, gde je 1.11.1 u jednoj grupi, a sva ostala antitela u drugoj grupi.

Tabela 8. Matrica odgovora grupisanih epitopa pomoću BIAcore

Primer 10. Izolovanje ALK-1 gena Cvnomolsus majmuna

ALK-1 gen Cynomolgus majmuna je ekstrahovan iz plućnog tkiva Cynomolgusa. Na osnovu objavljen genske sekvence za humani ALK-1 (Genebank record L17075), dizajnirani su prajmeri za umnožavanje celog ALK-1 Cynomolgusa PCR-om. iRNK je pripremljena iz zamrznutog isečenog plućnog tkiva Cynomolgusa (ca. 1 g) upotrebom kompleta za prečišćavanje iRNK (Ambion, Catalog No. 1915) prema uputstvima proizvođača. 200 ng iRNK je reverzno transkribovano i umnoženo PCR-om pomoću kompleta OneStep RT-PCR (Qiagen, Catalog No. 210210) uz korišćenje gen-specifičnih oligonukleotida: 5’-AGCGGGCCCAGAGGGACG4 TG (Seq ID NO: 115) (unapred) i 5’-

CAGAAAGGAATCAGGTGCTCCTGGGC714 (Seq ID NO: 116) (unazad) na temperaturi hibridizacije od 61°C. Proizvod RT-PCR-a odgovarajuće veličine (~1,5 Kb) je isečen i prečišćen iz 0,9 % agaroznog gela posle elektroforeze, zatim je TOPO-TA kloniran u pCR4-TOPO vektor (Invitrogen, Catalog No. K4575-01). Insert je sekvenciran da bi se dobila ORF nukleotidna sekvenca ALK-1 Cynomolgusa. Nukleotid i predviđene translirane aminokiselinske sekvence su pokazane u SEQ ID NOs: 93 i 94, respektivno. Dok gen za citoplazmatičan deo kodira identične proteinske sekvence u Cynomolgusu i čoveku, u vanćelijskom domenu (ECD, koji uključuje pozicije 22-118) postoji 5 aminokiselinskih razlika i 1 aminokiselinska razlika u transmembranskom domenu proteina. Identičnost sekvenci u ECD između čoveka i Cynomolgusa je 94,8%. Redosled humanog i primatskog ECD je prikazan na Slici 2.

Par prajmera (unapred: 5’- GATTA7GGCCTTGGGCTCCCCCAGGAAA (Seq ID NO: 117) i unazad: 5’- GGGC7NTTGAATCACTTTAGGCTTCTCTGGACTGTTG) (Seq ID NO: 118) je korišćen za umnožavanje celog ALK-1 gena Cynomolgusa PCR-om.

Primer 11. Određivanje karakteristika vezivanja ćelijske površine i unakrsne hibridizacije primata protočnom citometriiom (FACS)

Da bi se dobile ćelijske linije koje eksprimiraju ALK-1 u višku, koje se mogu koristiti za testiranje afiniteta vezivanja za antitelo na ALK-1 protočnom citometrijom (FACS), klonirana je ćela dužina humanih, Cynomolgus-ovih i pacovskih ALK-1 gena u Invitrogen (Catalog No. K6510-20) pcDNA5/FRT/To TOPO vektor i transfektovana je u 293 Flp-In T-Rex ćeliju domaćina (Invitrogen, Catalog No. R780-07), respektivno. Selekcije su pravljene upotrebom higromicina da bi se dobile konačne stabilne ćelijske linije. Eksprimiranje u višku odgovarajućih celih ALK-1 proteina je postignuto indukcijom tetraciklinom (2 pg/mL) na 37°C/5%C02 24 sata.

Anti-ALK-1 mAbs su testirani na afinitete vezivanja za ALK-1 na ćelijskoj površini pomoću FACS eseja, uz upotrebu stabilnih ćelija 293, koje eksprimiraju ALK-1 proteine u višku. Ćelije su odlepljene pomoću tripsin-EDTA i oprane hladnim PBS-SA. Posle alikvotiranja u ploče sa 96 ležišta, ćelije su blokirane serumom i inkubirane sa različitim koncentracijama specifičnog mAb 1 sat na 4°C. Posle toga, ćelije su oprane i inkubirane sa anti-humanim k sekundarnim antitelom konjugovanim sa R-PE fluoroforom pre analiziranja, pomoću FACSCalibur protočnog citometra (BD Biosciences). 10000 događaja je sakupljeno za svaki uzorak bez primene bilo kakvog gejtinga. Kao što je prikazano u Tabeli 9, histogram geometrijskih sredina svih uzoraka je nacrtan kao funkcija koncentracije mAb i KD je izračunata za svaki mAb posle fitovanja na model sa dvoetapnom ravnotežom. Primeri ekvivalentnih eksperimenata na humanom i primatskom materijalu sa FACS su prikazani na Slici 3.

Tabela 9

Srednji afiniteti vezivanja (Kn) monoklonskih antitela na ALK-1 za ćelijsku površinu humanog ili Cvnomolsus-ovog ALK-1 mereni pomoću FACS

Dodatno, FACS esejem je pokazano da 1.12.1 ima vrlo ograničeno unakrsno vezivanje sa pacovom (Kd>100 nM) i predviđeno je da ima vrlo nisko unakrsno vezivanje sa misom u svetlu 74% sekvencijalne identičnosti u ALK-1 iz ECD između pacova i čoveka i 68% između miša i čoveka).

FACS esej je takođe korišćen za određivanje Kd rekombinantnih varijanti mAb 1.12.1. Kao što je prikazano u Tabeli 10, rezultati pokazuju sličan afinitet vezivanja rekombinantnog antitela.

Tabela 10

Srednji afiniteti vezivanja (Kn) varijanti 1.12.HM29I/D19A) za ćelijsku površinu humanog ili Cvnomolsus-ovog ALK-1 mereni pomoću FACS

1.12.1 se odnosi na varijantu mAb 1.12.1 koja je izolovana izhibridoma.

1.12.1(rWT) se odnosi na varijantu mAb 1.12.1 koja predstavlja eksprimiran

rekombinantni mAb.

1.12.1 (M29I) se odnosi na varijantu mAb 1.12.1 koja predstavlja eksprimiran rekombinantni mAb i koja sadrži jednu specifičnu aminokiselinsku mutaciju, gde je metionin na poziciji 29 u teškom lancu zamenjen izoleucinom.

1.12.1(M29I/D19A) se odnosi na varijantu mAb 1.12.1 koja predstavlja eksprimiran rekombinantni mAb i koja sadrži dve specifične aminokiselinske mutacije (metionin na poziciji 29 u teškom lancu je zamenjen izoleucinom i asparaginska kiselina na poziciji 19 u lakom lancu je zamenjena alaninom).

Fab 1.12.1(M29I/D19A) se odnosi na Fab fragment mAb 1.12.1 (M29I/D19A) dobijen digestijom 1.12.1 (M29I/D19A) IgGl uz upotrebu papaina.

Primer 12. Tagman esej za Idi

HUVEC (Biovvhittaker, Cat. # CC-2519) su zasejane na ploče sa 24 ležišta, 12000 ćelija/ležište u 600 pL kompletnog HUVEC medijuma (EGM-2 Bullet kit, Biovvhittaker, Cat. # CC-3162) i ostavljene da rastu preko noći. Sledećeg dana, ćelije su tipično bile 50% konfluentne. Kompletan medijum je sklonjen i dodato je 200 pL siromašnog medijuma (EBM-2 sa 0,2% FBS samo). Ćelije su inkubirane 2 sata. Zatim su ćelije tretirane sa 40 pL rastvora antitela u PBS. Liofilizovan Ab je rekonstituisan sterilnim PBS. Konačno, ćelije su tretirane 1% FBS/Basal medijumom (konačne koncentracije) 30 minuta, medijum je sklonjen i ćelije su lizirane u 400 pL RTL pufera (Rneasy 96 kit, Qiagen, Cat. # 74182), prema protokolima proizvođača. Posle toga, RNK je pripremljena pomoću kompleta RNeasy (prema instrukcijama proizvođača). RNK je eluirana i kvantifikovana pomoću RiboGreen® RNK Quantitation Kit (Molecular probes, Cat. # R-11490). Jednaka količina ukupne RNK je korišćena za PCR analizu u realnom vremenu za detekciju ekspresije RNK Idi (AB1 7900 instrument). PCR je rađen pomoću Taqman One Šlep PCR Masler Mix Kil (ABI, Cal. U

4309169) i sekvence IDI prajmer/ proba su date niže. PCR je rađen sa 40 ciklusa uz sledeće uslove hibridizacije i amplifikacije: 95 °C, 15 sekundi; 60 °C, 1 min.

TaqMan proba: CPG-konjugovan 5’-6-FAM i 3’-TAMRA Naziv: IDI-proba

Sekvenca: 5’ CCAGCACGTCATCGACTACATCAGGGA 3’ (Seq ID NO: 119) Taqman PCR prajmeri:

Naziv: ID1-F

Sekvenca: 5’ AAGGTGAGCAAGGTGGAGATTC 3’ (Seq IDNO: 120)

Naziv: ID1-R

Sekvenca: 5’ TTCCGAGTTCAGCTCCAACTG 3’ (Seq ID NO: 121)

Primeri titracija Idi za vodeći molekul 1.12.1(M29I/D19A) (uključujući varijante sekvenci 1.12.1) i derivat Fab su prikazani na Slikama 4 i 5.

Rezime srednjih vrednosti IC50 za ovaj esej je prikazan u Tabeli 11. Sva određivanja IC50 su vršena u triplikatu.

Primer 13. Fosforilacija Smadl detektovana pomoću Odvssev Infrared Imaging Svstem LI-COR Biosciences (ploča sa 24 ležišta)

HUVEC (Biowhittaker, Cat. # CC-2519) su zasejane na ploče sa 24 ležišta, 18000 ćelija/ležište u 600 pL kompletnog HUVEC medijuma (EGM-2 Bullet kit, Biowhittaker, Cat. # CC-3162) i ostavljene da rastu preko noći. Sledećeg dana, ćelije su tipično bile 50% konfluentne. Kompletan medijum je sklonjen i dodato je 200 pL siromašnog medijuma (EBM-2 sa samo 0,2% FBS). Ćelije su inkubirane 2 sata. Zatim su ćelije tretirane sa 40 pL rastvora antitela u PBS 3 sata. Konačno, ćelije su tretirane 0.3 X kompletnim medijumom (konačne koncentracije) 35 minula. Medijum je uklonjen i ćelije su lizirane u 80 pL 1,1 X Sample Buffer (Invitrogen, Cat. No. NP0007). Fosforilisan Smadl je određen Western Blot analizom korišćenjem X Cell Surelock Mini-Cell & Blot Module (Invitrogen, Cat. # EI0002). Fosforilisan Smadl je detektovan pomoću zečjeg antitela na fosfo-Smadl (Cell Sigiialing, Cat. No. 9511), koje je zatim detektovano pomoću IRDye™ 800 Conjugated Anti-RABBIT IgG (Rockland Immunochemicals, Cat. No.611-732-127). Količina fosforilisanog Smadl je kvantifikovana pomoću Odyssey Infrared Imager (Li-Cor). Alctin (Santa Cruz, # sc-8432) je korišćen za normalizaciju (anti-miš Alex 680, Molecular Probe, Cat. No. A-21058). Rezime srednjih vrednosti IC^ za ovaj esej je prikazan u Tabeli 11. Sva određivanja IC™ su vršena u triplikatu.

Primer 14. Karakteristike internalizacije monoklonskih antitela na ALK-1

FACS je korišćen za praćenje toka preostalog receptorskog ALK-1 na ćelijskoj površini, kao i neutrališućeg antitela. Preostali ALK-1 na ćelijskoj površini je praćen preko antitela-markera, koje je sposobno da veže ALK-1 na ćelijskoj površini, pri tome prepoznajući različit epitop iz neutrališućeg antitela. Mišji anti-humani mAb na ALK-1 iz ECD (R&D sytems, Cat. No # AF310) je identifikovano i korišćeno u ispitivanju kao antitelo marker.

Tok internalizacije je proučavan uz pomoć endotelnih ćelijskih linija HUVEC i FIUAEC. Ćelije su gajene na 37°C sa 5% CO2 u pločama sa 24 ležišta, koje su sadržale 200 |_iL kompletnog medij uma za kulturu po ležištu. U svakoj od 11 vremenskih tačaka tokom 48 sata, 2 pL rastvora antitela, koncentracije 1 mg/mL, je dodato u jedno ležište i mešano

(konačna koncentracija neutrališućeg antitela je 10 pg/mL). Ploča je zatim vraćena u inkubator sa 37°C do vremenske tačke 0 sati, kad je ploča stavljena na led da bi se zaustavio proces internalizacije. Na toj tački, antitelo-marker je dodato u ležišta (konačna koncentracija 10 pg/mL) i ploča je inkubirana na ledu 1 sat. Ćelije su zatim oprane PBS-om, tripsinizovane i prebačene na ploču sa 96 ležišta. Ćelije su zatim oprane, blokirane i tretirane sekundarnim antitelima sa različitim fluroforima da bi se pratili i neutrališuće antitelo i receptorski ALK-1 koji je ostao na površini ćelije. Uzorci su testirani instrumentom FACSCalibur za protočnu citometriju, koji broji 3,000-5,000 događaja/uzorak. Geometrijska sredina svakog uzorka u specifičnom kanalu za fluorescenciju je izračunata i nacrtana kao funkcija vremena. Podaci su fitovani na modifikovanu jednačinu radioaktivnog raspada da bi se dobilo poluvreme (p/2) internalizacije, kao i procent neutrališućeg antitela ili receptorskog ALK-1 koji je ostao na površini ćelije kad je internalizacija dostigla stacionarno stanje. Kao što je pokazano na Slici 6, mAb 1.12.1(M291/D19A) se internalizuje istom brzinom i u istoj meri kao receptorski ALK-1 na površini ćelije. Poluživot internalizacije 1.12.1(M29I/D19A) je ~2 sata. Ravnoteža je dostignuta kad je 50% antitela internalizovano. Poliklonsko antitelo, kupljeno od R&D systems (Cat. No # AF370) internalizuje sa ti/2 od 1 sat i dostiže stacionarno stanje sa -70% internalizovanog receptora (Slika 6). Slične karakteristike internalizacije su nađene kod ostalih humanih mAb na ALK-1 iz pronalaska (nije pokazano).

Primer 15. Uspostavljanje SCID himernih miševa sa humanim obreskom

Značajna modifikacija hirurške procedure je napravljena u odnosu na proceduru objavljenu ranije u H-C Yan, et al “Human/Severe Combined Immunodeficient Mouse Chimeras, An Experimental In Vivo Model System to Study the Regulation of Human Endothelial Cell-Leukocyte Adhesion Molecules”, J. Clin. Invest. 91:986, 1993; J. Varner “Regulation of Angiogenesys in Vivo by Ligation of Integrin a5bl with the Central Cell-Binding Domain of Fibronectin” Amer. J. Path. 156 (4): 1345, 2000; K. Tahtis, et al “Expression and Targeting of Human Fibroblast Activation Protein in Human Skin/Severe Combined Immunodeficient Mouse Breast Cancer Xenograft Model” Mol. Cancer. Ther. 2(8):729, 2003. Po dolasku iz National Disease Research Institute i Cooperative Human Tissue Netvvork, komadima humanog obreska su odsečeni nezdravi delovi i prebačeni su u RPMI medijume (Cellgro/Mediatech, Cat# MT-15-040-CV obogaćene penicilinom i streptamicinom (Gibco/Life Tech, Cat# 15070-063) (dodato 5 mLs matičnog rastvora pen./strep. u 500mLs RPMT). Upotrebom skalpela i sečenjem u sterilnoj petri šolji, kože su

"ošišane" u ovalan oblik od približno 8x13 mm, očišćene od iskrzanih krajeva i vezivnog tkiva i ostavljene na mokrom ledu do operacije. Odgovarajuća zapremina (4 pL/gram životinje) rastvora 100 mg/mL ketamina (Ketaset"\ Fort Dodge Animal Health)/1 mg/mL medetomidina (Pfizer Animal Health - Dormitor) je intraperitonealno ubrizgana u abdomen scid miša (tjpod uglom od 45°, pod kožu, ali ne suviše duboko unutra). Kad su anestezirani, miševima je dat očni lubrikant, subkutana injekcija ketoprofena (10 mg/kg, Fort Dodge Animal Health) i dlaka je ibrujana na mestu zahvata. Hirurški region je hirurški istrljan tri puta pomoću Clorahexiderm-a (Butler, Chclo-Scrub 40, cat # WAB20109), a zatim alkoholom, kružnim pokretom iz centra mesta zahvata ka spolja i izbegavano je vraćanje iz prljave oblasti u čistu. Miševi su prebačeni u pripremljenu hiruršku komoru i postavljeni na jastuče sa grejanom vodom (Gaymar Industries, cat# TP500 T/Pump) koja je održvana na 37°C. Miševima su zatim držani u izofluornoj anesteziji za vreme trajanja operacije. Leđna strana miša je bila pokrivena hirurškim platnom sa otvorom koji izlaže mesto zahvata. Koža miša je uhvaćena forcepsom i kožno tkivo ovalnog oblika je isečeno krivim makazama jednim pokretom. Humani obrezak odgovarajuće veličine je stavljena na miša. Humana i mišja koža su zašivene pomoću Ethilon šava (Ethicon cat# 697H.), počev od vrha ovala, zatim dno, zatim desni kraj i onda levi kraj. Više kopči je napravljeno između da bi dodatno pričvrstila tkiva zajedno. Približno 8 kopči je napravljeno ekvidistantno oko kože. Tokom operacije, korišćen je špric sa sterilnim slanim rastvorom za kvašenje hirurške rane kad bi se osušila. Bandaid (flaster sa postavom od gaze) je stavljen preko rane. Providni pokrov (3M TegadermIM) je zatim korišćen i labavo obmotan oko zavoja. Pokrov je iskrojen tako da pokrije površinu malo veću od Bandaid-a. Mišu je onda dat atipamezol (50-100 pL, Pfizer Animal Health -Antisedan) i on se oporavljao u zagrejanom kavezu 5-10 min. Pokrov i zavoji su skinuti posle 7-10 dana i do 15-og dana veći deo kože se pojavio kao krasta. Do potpunog zaceljenja je došlo u roku od 21-28 dana, posle kog vremena su kože bile spremne za inokulaciju tumorskim ćelijama. Na Slici 8 je pokazan primer histološke (H & E Staining) analize dela nakalemljene kože posle kirurškog zahvata. Histologija nakalemljene kože blisko podražava karakteristike humane kože implantirane u miševe, kao što je opisano u Tahtis, et al. “Expression and Targeting of Human Fibroblast Activation Protein in Human Skin/Severe Combined Immunodeficient Mouse Breast Cancer Xenograft Model” Mol. Cancer. Ther. 2(8):729, 2003. h.e.: humani epidermalni sloj; h.d.: humani dermalni sloj.

Primer 16. Kolagcnski model u SCID himernim miševima sa humanim obreskom

Matični rastvor kolagena I (cat# 354236, Becten-Dickinson) je razblažen do 4 mg/mL 0,02 N-nom sirćetnom kiselinom i čuvan na ledu pre implantacije. Kiseli kolagenski rastvor (8 delova) je mešan sa 10 X Ml99 (Sigma, Cat# M9163) (1 deo) i humanim fibronektinom iz plazme (Fn) (cat# 354008, Becten-Dickinson) da bi se dostigla finalna koncentracija Fn od 90 pL/mL; dodat je NaOFI (1,0 N) da bi se podesio pH to ~ 7,2. Smesa kolagen/Fn je čuvana na ledu do upotrebe. Mešavina za implant je pripremljena upotrebom gornje smese kolagen/Fn plus angiogenetski inhibitor od interesa sa ili bez humanih makrovaskularnih endotelnih ćelija (HMVEC), (Cascade Biologics, Cat# C-010-5C). HMVEC su pripremljeni kao 6 x 10° ćelija/mL u PBS. 50 - 100 pL smese za implant je injektirano intradermalno u humani obrezak u scid himernom mišu. 7-14 dana posle, kolagenski zapušači su pokupljeni, potopljeni u OCT jedinjenje (cat# 4583, Sajura Finetek, CA) i trenutno zamrznuti za imunohistohemijsku analizu. Kolagenski zapušač u humanom obresku je identifikovan pomoću kompleta Trichrome (cat# KC1641, Mater Tech, CA) kao plave mrlje, kao što je prikazano na Slici 9 (A). Flumani krvni sudovi su identifikovani bojenjem na humani P-CAM uz upotrebu antitela na humani CD-31 (klon 13.3, Vector Laboratories) (Slika 9 (B)). Tabela 12 sumira bojenje humanih krvnih sudova i kvantifikaciju u kolagenskom modelu u SCID himernim miševima sa humanim obreskom.

Primer 17. M24met tumorski model u SCID himernim miševima sa humanim obreskom

Tipično, transplantati stari između 5 i 10 nedelja posle hirurškog zahvata su korišćeni u ovim ispitivanjima. M24met ćelijsku liniju su opisali Mueller i saradnici u “Tissue factor-initiated thrombin generation activates the signaling thrombin receptor on malignant melanoma cells”, Cancer Research, 55(8): 1629-32, 1995. Suspenzija M24met ćelija je dobijena na sledeć načini: 80% konfluentnih M24met ćelija je oprano, tripsinizovano pomoću Trpsin/EDTA (Gibco, Cat# 25200-056) i sakupljeno u PRMI (Cellgro/Mediatech, cat# MT-15-040-CV) medijum obogaćen 10%-nim FBS (Cellgro/Mediatech, Cat# AKD-11775) i 2 mM L-glutaminom (Cellgro/Mediatech, Cat# 25-005-C1). Ćelije su centrifugirane na 600 rpm 5 min, ponovo suspendovane u sterilnom PBS. Brojevi ćelija su procenjeni pomoću Coulter Counter (Beckman Coulter, Model Z2). Ćelije su centrifugirane na 600 rpm 5 min i ponovo suspendovane u smesi kolagen/ Fn (3 mg/ml) da bi se dobila suspenzija sa 4xl07 ćelija /ml za implantaciju.

Za inokulaciju, 2xl06 gornjih ćelija je ubrizgano (50 Dl 4xl07 ćelija/ml) intradermalno u nakalemljenu humanu kožu na mišu. 5-7 dana posle implantacije, tumori bi bili opipljivi i miševi su nasumice podeljeni na kontrolnu grupu i grupu za tretman pre početka doziranja. Kontrolna grupa je defmisana tako da životinje ili ne dobiju nikakvu dozu, ili da dobiju dozu nosača u kome je antitelo na ALK-1 bilo konstituisano, ili dozu IgG2 humanog monoklonskog antitela na KLH (Pfizer Ine) sparenog po izotipu. Grupa za tretman je defmisana tako da životinje dobiju dozu antitela na ALK-1 1.12.1 (M29I/D19A).

Primer 18. Dvostruko bojenje imunofluorescencijom (IF) humanog i mišjeg CD-31

Isečci zamrznutog tkiva su osušeni na vazduhu i fiksirani na -20°C u acetonu (Fisher, Cat#A16S-4) ili 10 min. Uzorci su ponovo osušeni na vazduhu i prani u PBS tri puta, svaki put po 5 min. Uzorci su blokirani u 5%-nom zečjem serumu (Vector Laboratories, Cat# S-5000) u PBS 30 min na sobnoj temperaturi (s. t.). Smesa primarnih antitela je napravljena u 5%-nom zečjem serumu sa antitelima na humani CD-31 (Santa Cruz, Cat# SCI505) u razblaženju 1:100 i na mišji CD-31 (Pharmingen, Gone Meci 3.3, Cat# 01951 A) u razblaženju 1:150. Gornja smesa antitela je dodavana uzorcima tkiva 1 sat na s. t. Blokovi su prani u PBS tri puta, svaki put po 5 min pre inkubiranja sa smesom sekundarnih antitela 1 sat na s. t. Smesa sekundarnih antitela je napravljena u PBS/0,05% Tween-20 (Sigma, Cat# P1379), zečjih anti-kozjih antitela obojenih Texas crvenim (Jackson Labs, Cat# 305-075-003)

i zečjih anti-pacovskih antitela obeleženih FITC-om (Jackson Labs, Cat# 312-095-003). Antitela su razblažena u odnosu 1:50 ako su korišćena zamrznuta, ili u odnosu 1:100, ako su korišćena sveža. Pločice su prane ponovo u PBS tri puta, svaki put po 5 min pre stavljanja u Vectashield (Hard Set, Mounting medium sa DAPI, Vector Lab, CA, Cat# H-1500). Pločice su držane u mraku na 4°C do analize snimaka. Analiza snimaka je vršena pomoću 01ympus BX60 fluorescentnog mikroskopa, a fotografije su snimljene 01ympus microfire digitalnim fotoaparatom u boji. Napravljeni su snimci iz 3-5 vrućih tačaka/pločica, jedna pločica/životinja, 4-7 životinja/grupa i površine sa krvnim sudovima, naznačene pozitivnim bojenjem anti-humanih CD-31, su kvantifikovale tri osobe pomoću Image Pro Plus v4.5 (MediaCybernetics). Krajnja tačka farmakodinamike (srednja vrednost grupe) je izražena kao procenat inhibicije humanih CD-31 u poređenju sa kontrolnom grupom ili kao ukupna površina humanih krvnih sudova. Statistička značajnost je određena pomoću ANOVA. Na Slici 10 je pokazana imunofluorescentna slika humanih (crveno) i mišjih (zeleno) sudova M24met tumora u SCID himernim miševima sa humanim obreskom.

Primer 19. Imunohistohemiisko (IHC) bojenje humanih CD-31

Preseci zamrznutog tkiva su osušeni na vazduhu i fiksirani na -20°C u acetonu 10 min. Uzorci su ponovo osušeni na vazduhu i prani u PBS dva puta, svaki put po 5 min. Uzorci su inkubirani u 0,075% H2O2/ metanolu (Fisher Cat# A433-4) 15 min i prani u PBS tri puta, svaki put po 5 min. Uzorci su blokirani u 5%-nom zečjem serumu/PBS 30 min i dodavano im je antitelo na humani CD-31, 1:100 (Santa Cruz, Cat# SCI505) u 5%-nom zečjem serumu 1 sat na s. t. Uzorci su prani u PBS dva puta, svaki put po 5 min i dodavana su im zečja anti-kozja antitela u 1:200 (Vector Labs, Cat# BA-5000) u 5%-nom zečjem serumu 35 min na s. t. Pločice su zatim prane u PBS dva puta, svaki put po 5 min i dodat je sveže napravljen streptavidin (Vector Labs, ABC Elite kit, Cat# PK-6100). Pločice su opet prane u PBS dva puta, svaki put po 5 min, a zatim razvijeni u diaminobenzidinu (DAB) (Vector Labs, Cat#SK-4100). Pločice su prane u PBS dva puta, svaki put po 5 min, a zatim Mayers-ovim hematoksilinom (Sigma, Cat# HFIS-32) 5 sekundi. Uzorci su dobro isprani u diFLO i dvaput kratko umočeni u razblažen rastvor (5ml matičnog rastvora u 1L diFLO) amonijum hidroksida (Sigma, Cat# A-6899) i ponovo isprane u diFLO. Uzorci su zatim dehidriram u 70%, 90%, a zatim 100% alkoholu (Harleco, Cat# 65347/85), po 1 minut u svakom i konačno u ksilenu (JT

Baker, Cat# 516,09). Za analizu snimaka, na pločice je stavljen Cytoseal 60 (Stephens Scientific, Cat #8310-4) i pokrivene su pokrovnim staklima. Na Slici 11 je pokazan IHC snimak humanih krvnih sudova (braon) M24met tumora u SCID himernim miševima sa humanim obreskom.

Primer 20. Terapijski tretman antitelom na ALK-1 1.12.KM29I/D19A)

Za tretman, doziranje je vršeno ili subkutano (sc) ili intravenski (iv). Tipično, jedna doza antitela 1.12.1(M29I/D19A) je data za svako ispitivanje. Druga doza antitela na ALK-1 je, ako je neophodno, bila data 9. ili 10. dana. Nekad su dati nivoi višestrukih doza, tj., 1, 5, 10, 50 mg/kg je dato da bi se isptiala zavisnost inhibicije rasta humanih krvnih sudova od odze. Životinje su praćene svaki dan i tumori su mereni tri puta nedeljno nonijusom. Do 14 -17. dana, tumori su bili između 250-350 mm3 i uklonjeni su sa miševa, uronjeni u OCT i zamrznuti za IF ili IHC analizu. Na Slici 12 su pokazani reprezentativni imunofluorescentni snimci humanih (crveno) i mišjih (zeleno) sudova kontrolnih i tretiranih (10 mg/kg) M24met tumora u SCID himernim miševima sa humanim obreskom. Inhibicija zavisna od doze humanih sudova tumora pomoću 1.12.1(M29I/D19A) u modelu humani obrezak-SCID himerni mišje prikazana na Slici 13 i sumacija srodnih studija je data u Tabeli 13.

Tabela 13.

Rezime karakterizaciie in vivo modela i inhibicije rasta humanih krvnih sudova M24met

tumora u SCID-himernom modelu

Primer 21. Određivanje EC50 In vivo

SCID himernim miševima sa humanim obreskom su intradermalno implantirane M24met ćelije i tretirani susc) antitelom na ALK-1 1.12.1(M29I/D19A) po 1, 3, 5, 7,5, 10 i 50 mg/kg ili humanim antitelom na KLH (10 mg/kg) sparenim po izotipu. Posle zaključivanja eksperimenta, površina humanih krvnih sudova u svakom tumoru je bila kvantifikovana kao stoje opisano gore. Koncentracije antitela na ALK-1 1.12.1(M29I/D19A) u mišjoj plazmi su merene sledećim postupkom: analizirane su koncentracije antitela na ALK-1

1.12.1 (M29I/D19A) u uzorcima seruma iz miševa ELISA testom (test imunosorpcije vezan sa enzimom). ELISA ploče su prevučene sa 10 pg/ml kozjeg specifičnog antitela na humani IgG Fc (Pierce, cat# 31123) u PBS, inkubirane preko noći na 4°C, a zatim blokirane StartBlock blokirajućim puferom (Pierce, cat# 37542) na sobnoj temperaturi 1 sat. Uzorci seruma su razblaženi pred analizu 100 i 1000 puta u StartBlock blokirajućem puferu. Dva skupa standarda su napravljena u praznom serumu razblaženom 100 i 100 puta. Standardi i uzorci razblaženog seruma su inkubirani na ploči 1 sat. Vezano antitelo na ALK-1 1.12.1(M29I/D19A) je detektovano pomoću kozjeg (Fab-specifičnog) antitela na humani IgG, obeleženog peroksidazom rena (HRP) (Sigma, cat# A0293). Korišćen je supstrat 3, 3’, 5, 5’-tetrametil benzidin (Sigma, cat# T8665). Apsorbanca je čitana na 450nm na čitaču ploče (Molecular Devices, Menlo Park, CA). Standardna kriva je fitovana nenlinearnom regresijom. Granica detekcije ovog testa je bila 10 ng/ml antitela na ALK-1 1.12.1(M29I/D19A).

Koncentracija antitela na ALK-1 1,12.1(M29I/D19A) u plazmi SCID miša je prikazana na Slici 15.

Slika 15 predstavlja procenjene EC50 za 1.12.1 (M29I/D19A) u modelu M24met obrezak-SCID himera. Površina humanih krvnih sudova je nacrtana u funkciji prosečnog PK plazme tokom perioda studije (14 dana) za svaku tretiranu grupu. Fitovana kriva je konstruisana u programu Sigmoidal Dose Dependent program u Graphpad (Prizm). EC50 od 93 ng/ml (EC50 je defmisana kao koncentracija u plazmi potrebna za smanjenje površine humanih krvnih sudova za 50% u kontrolnoj grupi) je izvedena iz fitovane krive.

Sve publikacije, patenti i patentne prijave citirane u ovoj specifikaciji su ovde ugrađene referencama, kao daje svaka pojedinačna publikacija ili patentna prijava specifično i pojedinačno navedena da je ugrađena referencom. Mada je gornji pronalazak opisan do nekih detalja ilustracijama i primerima u cilju jasnoće razumevanja, stručnjacima uobičajenog

nivoa će odmah biti jasno, u svetlu uputstava iz ovog pronalaska, da određene promene modifikacije mogu biti učinjene bez odstupanja od duha ili opsega pridodatih zahteva.

Claims

1. Monoklonsko antitelo, ili njegov deo za vezivanje antigena, koje vezuje ALK-1, koje sadrži prvi varijabilni domen koji sadrži SEQ ID NO: 6 i drugi varijabilni domen koji sadrži SEQ ID NO: 8.

2. Monoklonsko antitelo prema zahtevu 1, koje sadrži aminokiselinsku sekvencu teškog lanca iz SEQ ID NO: 2 i aminokiselinsku sekvencu lakog lanca iz SEQ ID NO: 4.

3. Monoklonsko antitelo prema zahtevu 1, koje sadrži težak lanac koji sadrži SEQ ID NO: 6 i laki lanac koji sadrži SEQ ID NO: 8.

4. Monoklonsko antitelo, ili njegov deo za vezivanje antigena, koje vezuje ALK-1, s tim što monoklonsko antitelo sadrži aminokiselinsku sekvencu teškog lanca iz SEQ ID NO: 100 i aminokiselinsku sekvencu lakog lanca iz SEQ IDNO: 102.

5. Monoklonsko antitelo prema zahtevu 1 ili 3, gde je monoklonsko antitelo molekul IgGl ili IgG2.

6. Humano monoklonsko antitelo, ili njegov deo za vezivanje antigena, koje vezuje ALK-1 i koje ima bar jednu dodatnu osobinu odabranu iz grupe koja: a) se vezuje za vanćelijski domen ALK-1 primata, sa vrednošću aviditeta od 5 nM ili manjim, merenom površinskom plazmonskom rezonancom; b) se vezuje za vanćelijski domen humanog ALK-1 sa vrednošću aviditeta od 250 pM ili manje, merenom površinskom plazmonskom rezonancom; c) ima konstantu brzine disocijacije (koff) za humani ALK-I od 5 x 10-3 s-1 ili manju, merenu površinskom plazmonskom rezonancom; d) se vezuje za ALK-1 primata sa KD od 50 nM ili manje, merenom protočnom citometrijom; e) ima KD(gIodara)/KD(primata) koji je veći od 1, 5; f) ima IC50 od 150 nM ili manje, mereno preko inhibiranja ushodne regulacije specifičnog nizvodnog ciljnog gena za ALK-1, Idi; g) ima IC50 od 150 nM ili manje, mereno preko inhibiranja fosforilacije Smad l, određene tehnikom Western Blot; h) inhibira angiogenezu humanih krvnih sudova u SCID mišu, kome je nakalemljeno tkivo humanog obreska, u koju su intradermalno implantirane M24met tumorske ćelije humanog melanoma, stoje određeno IHC analizom humanog CD-31, čiji je signal najmanje 40% u odnosu na kontrolni uzorak; i) inhibira angiogenezu humanih krvnih sudova u SCID mišu, kome je nakalemljeno tkivo humanog obreska, u koju je intradermalno implantiran kolagen, što je određeno IHC analizom humanog CD-31, čiji je signal najmanje 50% u odnosu na kontrolni uzorak; j) ulazi u kompeticiju za vezivanje za ALK-1 sa antitelom odabranim iz grupe koja se sastoji od 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1 (M29I/D19A); 1.12.1 (M29I); 1.12.1(D19A); 1.12.1 (rWT); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1; i 5.59.1; k) ulazi u unakrsnu kompeticiju za vezivanje za ALK-1 sa antitelom odabranim iz grupe koja se sastoji od 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1 (M29I/D19A); 1.12.1 (M29I); 1.12.1 (D19A); 1.12.1 (rWT); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1; i 5.59.1; l) se vezuje za isti epitop ALK-1 kao i antitelo odabrano iz grupe koja se sastoji od 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1 (M29I/D19A); 1.12.1(M29I); 1.12.1 (D19A); 1.12.1 (rWT); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1; i 5.59.1; m) se vezuje za ALK-1 sa suštinski istom KD kao i antitelo odabrano iz grupe koja se sastoji od 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1 (M29I/D19A); 1.12.1 (M29I); 1.12.1(D19A); 1.12.1 (rWT); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1; i 5.59.1; and n) se vezuje za ALK-1 sa suštinski istom koff kao i antitelo odabrano iz grupe koja se sastoji od 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1 (M291/D19A); 1.12.1 (M291); 1.12.1 (D19A); 1.12.1 (rWT); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1; i 5.59.1.

7. Antitelo ili njegov deo za vezivanje antigena prema zahtevu 6, koje sadrži VH domen koji je bar 90% identičan po aminokiselinskoj sekvenci sa bilo kojom od SEQ ID NO: 6; 10; 14; 18; 22; 26; 30; 34; 38; 42; 46; 50; 54; 58; 62; 66; 70; 74; 78; 82; 86; 90; ili 104.

8. Antitelo ili njegov deo za vezivanje antigena prema zahtevu 6, koje sadrži VL domen koji je bar 90% identičan po aminokiselinskoj sekvenci sa bilo kojom od SEQ ID NO: 8; 12; 16; 20; 24; 28; 32; 36; 40; 44; 48; 52; 56; 60; 64; 68; 72; 76; 80; 84; 88; 92; ili 127.

9. Antitelo ili njegov deo za vezivanje antigena prema zahtevu 6, gde je VH domen odabran među SEQ ID NOs: 6; 10; 14; 18; 22; 26; 30; 34; 38; 42; 46; 50; 54; 58; 62; 66; 70; 74; 78; 82; 86; 90; ili 104, ili sekvenca koja se razlikuje od svih SEQ ID NOs: 6; 10; 14; 18; 22; 26; 30; 34; 38; 42; 46; 50; 54; 58; 62; 66; 70; 74; 78; 82; 86; 90; ili 104 bar po jednoj konzervativnoj supstituciji aminokiseline, gde je navedena sekvenca, sa bar jednom konzervativnom supstitucijom aminokiseline, bar 90% identična po aminokiselinskoj sekvenci sa nesupstituisanom sekvencom, a VL domen je nezavisno odabran među SEQ ID NOs: 8; 12; 16; 20; 24; 28; 32; 36; 40; 44; 48; 52; 56; 60; 64; 68; 72; 76; 80; 84; 88; 92; ili 127, ili sekvenca koja se razlikuje od svih SEQ ID NOs: 8; 12; 16; 20; 24; 28; 32; 36; 40; 44; 48; 52; 56; 60; 64; 68; 72; 76; 80; 84; 88; 92; ili 127 po bar jednoj konzervativnoj supstituciji aminokiseline, gde je navedena sekvenca, sa bar jednom konzervativnom supstitucijom aminokiseline, bar 90% identična po aminokiselinskoj sekvenci sa nesupstituisanom sekvencom.

10. Antitelo ili njegov deo za vezivanje antigena prema zahtevu 6, gde je navedeno antitelo ili njegov deo odabran iz grupe koja sadrži: (a) antitelo ili njegov deo koji sadrži sekvence CDR1 , CDR2 i CDR3 Vh nezavisno odabrane iz odgovarajućih sekvenci CDR1, CDR2, ili CDR3 teškog lanca, nađene u bilo kojoj od SEQ ID NOs: 6; 10; 14; 18; 22; 26; 30; 34; 38; 42; 46; 50; 54; 58; 62; 66; 70; 74; 78; 82; 86; 90; ili 104, ili sekvencu koja se razlikuje od bilo koje od SEQ ID NOs: 6; 10; 14; 18; 22; 26; 30; 34; 38; 42; 46; 50; 54; 58; 62; 66; 70; 74; 78; 82; 86; 90; ili 104 po bar jednoj konzervativnoj supstituciji aminokiseline, gde je navedena sekvenca, sa bar jednom konzervativnom supstitucijom aminokiseline, bar 90% identična po aminokiselinskoj sekvenci sa nesupstituisanom sekvencom; i (b) antitelo ili njegov deo koji sadrži sekvence CDR1, CDR2 i CDR3 VL nezavisno odabrane iz odgovarajućih sekvenci CDR1, CDR2, ili CDR3 lakog lanca, nađene u bilo kojoj od SEQ ID NOs: 8; 12; 16; 20; 24; 28; 32; 36; 40; 44; 48; 52; 56; 60; 64; 68; 72; 76; 80; 84; 88; 92; ili 127, ili sekvencu koja se razlikuje od bilo koje od SEQ ID NOs: 8; 12; 16; 20; 24; 28; 32; 36; 40; 44; 48; 52; 56; 60; 64; 68; 72; 76; 80; 84; 88; 92; ili 127 po bar jednoj konzervativnoj supstituciji aminokiseline, gde je navedena sekvenca, sa bar jednom konzervativnom supstitucijom aminokiseline, bar 90% identična po aminokiselinskoj sekvenci sa nesupstituisanom sekvencom.

11. Antitelo ili njegov deo za vezivanje antigena prema zahtevu 10, gde je navedeno antitelo ili njegov deo odabran iz grupe koja sadrži: (a) antitelo ili njegov deo koji sadrži sekvence CDR1, CDR2 i CDR3 VH nađene u bilo kojoj od SEQ ID NOs: 6; 10; 14; 18; 22; 26; 30; 34; 38; 42; 46; 50; 54; 58; 62; 66; 70; 74; 78; 82; 86; 90; ili 104, ili sekvencu koja se razlikuje od bilo koje od SEQ ID NOs' 6; 10; 14; 18; 22; 26; 30; 34; 38; 42; 46; 50; 54; 58; 62; 66; 70; 74; 78; 82; 86; 90; ili 104 po bar jednoj konzervativnoj supstituciji aminokiseline, gde je navedena sekvenca, sa bar jednom konzervativnom supstitucijom aminokiseline, bar 90% identična po aminokiselinskoj sekvenci sa nesupstituisanom sekvencom; i (b) antitelo ili njegov deo koji sadrži sekvence CDR1, CDR2 i CDR3 VL nađene u bilo kojoj od SEQ ID NOs: 8; 12; 16; 20; 24; 28; 32; 36; 40; 44; 48; 52; 56; 60; 64; 68; 72; 76; 80; 84; 88; 92; ili 127, ili sekvencu koja se razlikuje od bilo koje od SEQ ID NOs: 8; 12; 16; 20; 24; 28; 32; 36; 40; 44; 48; 52; 56; 60; 64; 68; 72; 76; 80; 84; 88; 92; ili 127 po bar jednoj konzervativnoj supstituciji aminokiseline, gde je navedena sekvenca, sa bar jednom konzervativnom supstitucijom aminokiseline, bar 90% identična po aminokiselinskoj sekvenci sa nesupstituisanom sekvencom.

12. Antitelo ili njegov deo za vezivanje antigena prema zahtevu 10 ili 11, odabrano iz grupe koja sadrži: a) antitelo ili njegov deo koji sadrži VH domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 6, ili se razlikuje od SEQ ID NO: 6 po bar jednoj konzervativnoj supstituciji aminokiseline, gde je navedena sekvenca, sa bar jednom konzervativnom supstitucijom aminokiseline, bar 90% identična po aminokiselinskoj sekvenci sa nesupstituisanom sekvencom, i VL domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 8, ili se razlikuje od SEQ ID NO: 8 po bar jednoj konzervativnoj supstituciji aminokiseline, gde je navedena sekvenca, sa bar jednom konzervativnom supstitucijom aminokiseline, bar 90% identična po aminokiselinskoj sekvenci sa nesupstituisanom sekvencom; ' b) antitelo ili njegov deo koji sadrži VH domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 10, ili se razlikuje od SEQ ID NO: 10 po bar jednoj konzervativnoj supstituciji aminokiseline, gde je navedena sekvenca, sa bar jednom konzervativnom supstitucijom aminokiseline, bar 90% identična po aminokiselinskoj sekvenci sa nesupstituisanom sekvencom, i VL domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 12, ili se razlikuje od SEQ ID NO: 12 po bar jednoj konzervativnoj supstituciji aminokiseline, gde je navedena sekvenca, sa bar jednom konzervativnom supstitucijom aminokiseline, bar 90% identična po aminokiselinskoj sekvenci sa nesupstituisanom sekvencom; c) antitelo ili njegov deo koji sadrži VH domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 14, ili se razlikuje od SEQ ID NO: 14 po bar jednoj konzervativnoj supstituciji aminokiseline, gde je navedena sekvenca, sa bar jednom konzervativnom supstitucijom aminokiseline, bar 90% identična po aminokiselinskoj sekvenci sa nesupstituisanom sekvencom, i VL domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 16, ili se razlikuje od SEQ ID NO: 16 po bar jednoj konzervativnoj supstituciji aminokiseline, gde je navedena sekvenca, sa bar jednom konzervativnom supstitucijom aminokiseline, bar 90% identična po aminokiselinskoj sekvenci sa nesupstituisanom sekvencom; d) antitelo ili njegov deo koji sadrži VH domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 18, ili se razlikuje od SEQ ID NO: 18 po bar jednoj konzervativnoj supstituciji aminokiseline, gde je navedena sekvenca, sa bar jednom konzervativnom supstitucijom aminokiseline, bar 90% identična po aminokiselinskoj sekvenci sa nesupstituisanom sekvencom, i VL domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 20, ili se razlikuje od SEQ ID NO: 20 po bar jednoj konzervativnoj supstituciji aminokiseline, gde je navedena sekvenca, sa bar jednom konzervativnom supstitucijom aminokiseline, bar 90% identična po aminokiselinskoj sekvenci sa nesupstituisanom sekvencom; e) antitelo ili njegov deo koji sadrži VH domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 22, ili se razlikuje od SEQ ID NO: 22 po bar jednoj konzervativnoj supstituciji aminokiseline, gde je navedena sekvenca, sa bar jednom konzervativnom supstitucijom aminokiseline, bar 90% identična po aminokiselinskoj sekvenci sa nesupstituisanom sekvencom, i VL domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 24, ili se razlikuje od SEQ ID NO: 24 po bar jednoj konzervativnoj supstituciji aminokiseline, gde je navedena sekvenca, sa bar jednom konzervativnom supstitucijom aminokiseline, bar 90% identična po aminokiselinskoj sekvenci sa nesupstituisanom sekvencom; f) antitelo ili njegov deo koji sadrži VH domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 26, ili se razlikuje od SEQ ID NO: 26 po bar jednoj konzervativnoj supstituciji aminokiseline, gde je navedena sekvenca, sa bar jednom konzervativnom supstitucijom aminokiseline, bar 90% identična po aminokiselinskoj sekvenci sa nesupstituisanom sekvencom, i VL domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 28, ili se razlikuje od SEQ ID NO: 28 po bar jednoj konzervativnoj supstituciji aminokiseline, gde je navedena sekvenca, sa bar jednom konzervativnom supstitucijom aminokiseline, bar 90% identična po aminokiselinskoj sekvenci sa nesupstituisanom sekvencom; g) antitelo ili njegov deo koji sadrži VH domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 30, ili se razlikuje od SEQ ID NO: 30 po bar jednoj konzervativnoj supstituciji aminokiseline, gde je navedena sekvenca, sa bar jednom konzervativnom supstitucijom aminokiseline, bar 90% identična po aminokiselinskoj sekvenci sa nesupstituisanom sekvencom, i VL domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 32, ili se razlikuje od SEQ ID NO: 32 po bar jednoj konzervativnoj supstituciji aminokiseline, gde je navedena sekvenca, sa bar jednom konzervativnom supstitucijom aminokiseline, bar 90% identična po aminokiselinskoj sekvenci sa nesupstituisanom sekvencom; h) antitelo ili njegov deo koji sadrži VH domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 34, ili se razlikuje od SEQ ID NO: 34 po bar jednoj konzervativnoj supstituciji aminokiseline, gde je navedena sekvenca, sa bar jednom konzervativnom supstitucijom aminokiseline, bar 90% identična po aminokiselinskoj sekvenci sa nesupstituisanom sekvencom, i VL domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 36, ili se razlikuje od SEQ ID NO: 36 po bar jednoj konzervativnoj supstituciji aminokiseline, gde jc navedena sekvenca, sa bar jednom konzervativnom supstitucijom aminokiseline, bar 90% identična po aminokiselinskoj sekvenci sa nesupstituisanom sekvencom; i) antitelo ili njegov deo koji sadrži VH domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 38, ili se razlikuje od SEQ ID NO: 38 po bar jednoj konzervativnoj supstituciji aminokiseline, gde je navedena sekvenca, sa bar jednom konzervativnom supstitucijom aminokiseline, bar 90% identična po aminokiselinskoj sekvenci sa nesupstituisanom sekvencom, i VL domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 40, ili se razlikuje od SEQ ID NO: 40 po bar jednoj konzervativnoj supstituciji aminokiseline, gde je navedena sekvenca, sa bar jednom konzervativnom supstitucijom aminokiseline, bar 90% identična po aminokiselinskoj sekvenci sa nesupstituisanom sekvencom; j) antitelo ili njegov deo koji sadrži VH domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 42, ili se razlikuje od SEQ ID NO: 42 po bar jednoj konzervativnoj supstituciji aminokiseline, gde je navedena sekvenca, sa bar jednom konzervativnom supstitucijom aminokiseline, bar 90% identična po aminokiselinskoj sekvenci sa nesupstituisanom sekvencom, i VL domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 44, ili se razlikuje od SEQ ID NO: 44 po bar jednoj konzervativnoj supstituciji aminokiseline, gde je navedena sekvenca, sa bar jednom konzervativnom supstitucijom aminokiseline, bar 90% identična po aminokiselinskoj sekvenci sa nesupstituisanom sekvencom; k) antitelo ili njegov deo koji sadrži VH domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 46, ili se razlikuje od SEQ ID NO: 46 po bar jednoj konzervativnoj supstituciji aminokiseline, gde je navedena sekvenca, sa bar jednom konzervativnom supstitucijom aminokiseline, bar 90% identična po aminokiselinskoj sekvenci sa nesupstituisanom sekvencom, i VL domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 48, ili se razlikuje od SEQ ID NO: 48 po bar jednoj konzervativnoj supstituciji aminokiseline, gde je navedena sekvenca, sa bar jednom konzervativnom supstitucijom aminokiseline, bar 90% identična po aminokiselinskoj sekvenci sa nesupstituisanom sekvencom; l) antitelo ili njegov deo koji sadrži VH domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 50, ili se razlikuje od SEQ ID NO: 50 po bar jednoj konzervativnoj supstituciji aminokiseline, gde je navedena sekvenca, sa bar jednom konzervativnom supstitucijom aminokiseline, bar 90% identična po aminokiselinskoj sekvenci sa nesupstituisanom sekvencom, i VL domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 52, ili se razlikuje od SEQ ID NO: 52 po bar jednoj konzervativnoj supstituciji aminokiseline, gde je navedena sekvenca, sa bar jednom konzervativnom supstitucijom aminokiseline, bar 90% identična po aminokiselinskoj sekvenci sa nesupstituisanom sekvencom; m) antitelo ili njegov deo koji sadrži VH domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 54, ili se razlikuje od SEQ ID NO: 54 po bar jednoj konzervativnoj supstituciji aminokiseline, gde je navedena sekvenca, sa bar jednom konzervativnom supstitucijom aminokiseline, bar 90% identična po aminokiselinskoj sekvenci sa nesupstituisanom sekvencom, i VL domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 56, ili se razlikuje od SEQ ID NO: 56 po bar jednoj konzervativnoj supstituciji aminokiseline, gde je navedena sekvenca, sa bar jednom konzervativnom supstitucijom aminokiseline, bar 90% identična po aminokiselinskoj sekvenci sa nesupstituisanom sekvencom,; n) antitelo ili njegov deo koji sadrži VH domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 58, ili se razlikuje od SEQ ID NO: 58 po bar jednoj konzervativnoj supstituciji aminokiseline, gde je navedena sekvenca, sa bar jednom konzervativnom supstitucijom aminokiseline, bar 90% identična po aminokiselinskoj sekvenci sa nesupstituisanom sekvencom, i VL domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 60, ili se razlikuje od SEQ ID NO: 60 po bar jednoj konzervativnoj supstituciji aminokiseline, gde je navedena sekvenca, sa bar jednom konzervativnom supstitucijom aminokiseline, bar 90% identična po aminokiselinskoj sekvenci sa nesupstituisanom sekvencom; o) antitelo ili njegov deo koji sadrži VH domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 62, ili se razlikuje od SEQ ID NO: 62 po bar jednoj konzervativnoj supstituciji aminokiseline, gde je navedena sekvenca, sa bar jednom konzervativnom supstitucijom aminokiseline, bar 90% identična po aminokiselinskoj sekvenci sa nesupstituisanom sekvencom, i VL domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 64, ili se razlikuje od SEQ ID NO: 64 po bar jednoj konzervativnoj supstituciji aminokiseline, gde je navedena sekvenca, sa bar jednom konzervativnom supstitucijom aminokiseline, bar 90% identična po aminokiselinskoj sekvenci sa nesupstituisanom sekvencom; p) antitelo ili njegov deo koji sadrži VH domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 66, ili se razlikuje od SEQ ID NO: 66 po bar jednoj konzervativnoj supstituciji aminokiseline, gde je navedena sekvenca, sa bijednom konzervativnom supstitucijom aminokiseline, bar 90% identična po aminokiselinskoj sekvenci sa nesupstituisanom sekvencom, i VL domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 68, ili se razlikuje od SEQ ID NO: 68 po bar jednoj konzervativnoj supstituciji aminokiseline, gde je navedena sekvenca, sa bar jednom konzervativnom supstitucijom aminokiseline, bar 90% identična po aminokiselinskoj sekvenci sa nesupstituisanom sekvencom; q) antitelo ili njegov deo za vezivanje antigena koji sadrži VH domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 70, ili se razlikuje od SEQ ID NO: 70 po bar jednoj konzervativnoj supstituciji aminokiseline, gde je navedena sekvenca, sa bar jednom konzervativnom supstitucijom aminokiseline, bar 90% identična po aminokiselinskoj sekvenci sa nesupstituisanom sekvencom, i VL domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 72, ili se razlikuje od SEQ ID NO: 72 po bar jednoj konzervativnoj supstituciji aminokiseline, gde je navedena sekvenca, sa bar jednom konzervativnom supstitucijom aminokiseline, bar 90% identična po aminokiselinskoj sekvenci sa nesupstituisanom sekvencom; r) antitelo ili njegov deo koji sadrži VH domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 74, ili se razlikuje od SEQ ID NO: 74 po bar jednoj konzervativnoj supstituciji aminokiseline, gde je navedena sekvenca, sa bar jednom konzervativnom supstitucijom aminokiseline, bar 90% identična po aminokiselinskoj sekvenci sa nesupstituisanom sekvencom, i VL domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 76, ili se razlikuje od SEQ ID NO: 76 po bar jednoj konzervativnoj supstituciji aminokiseline, gde je navedena sekvenca, sa bar jednom konzervativnom supstitucijom aminokiseline, bar 90% identična po aminokiselinskoj sekvenci sa nesupstituisanom sekvencom; s) antitelo ili njegov deo koji sadrži Vh domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 78, ili se razlikuje od SEQ ID NO: 78 po bar jednoj konzervativnoj supstituciji aminokiseline, gde je navedena sekvenca, sa bar jednom konzervativnom supstitucijom aminokiseline, bar 90% identična po aminokiselinskoj sekvenci sa nesupstituisanom sekvencom, i VL domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 80, ili se razlikuje od SEQ ID NO: 80 po bar jednoj konzervativnoj supstituciji aminokiseline, gde je navedena sekvenca, sa bar jednom konzervativnom supstitucijom aminokiseline, bar 90% identična po aminokiselinskoj sekvenci sa nesupstituisanom sekvencom; t) antitelo ili njegov deo koji sadrži VH domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 82, ili se razlikuje od SEQ ID NO: 82 po bar jednoj konzervativnoj supstituciji aminokiseline, gde je navedena sekvenca, sa bar jednom konzervativnom supstitucijom aminokiseline, bar 90% identična po aminokiselinskoj sekvenci sa nesupstituisanom sekvencom, i VL domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 84, ili se razlikuje od SEQ ID NO: 84 po bar jednoj konzervativnoj supstituciji aminokiseline, gde je navedena sekvenca, sa bar jednom konzervativnom supstitucijom aminokiseline, bar 90% identična po aminokiselinskoj sekvenci sa nesupstituisanom sekvencom; u) antitelo ili njegov deo koji sadrži Vh domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 86, ili se razlikuje od SEQ ID NO: 86 po bar jednoj konzervativnoj supstituciji aminokiseline, gde je navedena sekvenca, sa bar jednom konzervativnom supstitucijom aminokiseline, bar 90% identična po aminokiselinskoj sekvenci sa nesupstituisanom sekvencom, i VL domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 88, ili se razlikuje od SEQ ID NO: 88 po bar jednoj konzervativnoj supstituciji aminokiseline, gde je navedena sekvenca, sa bar jednom konzervativnom supstitucijom aminokiseline, bar 90% identična po aminokiselinskoj sekvenci sa nesupstituisanom sekvencom; v) antitelo ili njegov deo koji sadrži VH domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 90, ili se razlikuje od SEQ ID NO: 90 po bar jednoj konzervativnoj supstituciji aminokiseline, gde je navedena sekvenca, sa bar jednom konzervativnom supstitucijom aminokiseline, bar 90% identična po aminokiselinskoj sekvenci sa nesupstituisanom sekvencom, i VL domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 92, ili se razlikuje od SEQ ID NO: 92 po bar jednoj konzervativnoj supstituciji aminokiseline, gde je navedena sekvenca, sa bar jednom konzervativnom supstitucijom aminokiseline, bar 90% identična po aminokiselinskoj sekvenci sa nesupstituisanom sekvencom; w) antitelo ili njegov deo koji sadrži VH domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 104, ili se razlikuje od SEQ ID NO: 104 po bar jednoj konzervativnoj supstituciji aminokiseline, gde je navedena sekvenca, sa bar jednom konzervativnom supstitucijom aminokiseline, bar 90% identična po aminokiselinskoj sekvenci sa nesupstituisanom sekvencom, i VL domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 127, ili se razlikuje od SEQ ID NO: 127 po bar jednoj konzervativnoj supstituciji aminokiseline, gde je navedena sekvenca, sa bar jednom konzervativnom supstitucijom aminokiseline, bar 90% identična po aminokiselinskoj sekvenci sa nesupstituisanom sekvencom; x) antitelo ili njegov deo koji sadrži VH domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 6, ili se razlikuje od SEQ ID NO: 6 po bar jednoj konzervativnoj supstituciji aminokiseline, gde je navedena sekvenca, sa bar jednom konzervativnom supstitucijom aminokiseline, bar 90% identična po aminokiselinskoj sekvenci sa nesupstituisanom sekvencom, i VL domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 127, ili se razlikuje od SEQ ID NO: 127 po bar jednoj konzervativnoj supstituciji aminokiseline, gde je navedena sekvenca, sa bar jednom konzervativnom supstitucijom aminokiseline, bar 90% identična po aminokiselinskoj sekvenci sa nesupstituisanom sekvencom; and y) antitelo ili njegov deo koji sadrži VH domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 104, ili se razlikuje od SEQ ID NO: 104 po bar jednoj konzervativnoj supstituciji aminokiseline, gde je navedena sekvenca, sa bar jednom konzervativnom supstitucijom aminokiseline, bar 90% identična po aminokiselinskoj sekvenci sa nesupstituisanom sekvencom, i VL domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 8, ili se razlikuje od SEQ ID NO: 8 po bar jednoj konzervativnoj supstituciji aminokiseline, gde je navedena sekvenca, sa bar jednom konzervativnom supstitucijom aminokiseline, bar 90% identična po aminokiselinskoj sekvenci sa nesupstituisanom sekvencom.

13. Antitelo ili njegov deo za vezivanje antigena prema zahtevu 6, gde navedeno antitelo ili njegov deo za vezivanje antigena sadrži težak lanac koji koristi humani VH 4-31, VH 3-1 1, VH 3-15, VH 3-33, VH 4-61 ili VH 4-59 gen, ili gde se javlja bar jedna supstitucija konzervativne aminokiseline u humanom VH 4-31, VH 3-11, VH 3-15, VH 3-33, VH 4-61 ili VH 4-59 genu, gde je navedena sekvenca, sa bar jednom konzervativnom supstitucijom aminokiseline, bar 90% identična po aminokiselinskoj sekvenci sa nesupstituisanom sekvencom.

14. Antitelo ili njegov deo za vezivanje antigena prema zahtevu 6, gde navedeno antitelo ili njegov deo za vezivanje antigena sadrži laki lanac koji koristi humani VK A27, VK A2, VK Al, VK A3, VK B3, VK B2, Vk- LI ili VK L2 gen, ili gde se javlja bar jedna supstitucija konzervativne aminokiseline u humanom VK A27, VK A2, VK Al, VK. A3, VK B3, VK B2, VK LI ili Vk L2 genu, gde je navedena sekvenca, sa bar jednom konzervativnom supstitucijom aminokiseline, bar 90% identična po aminokiselinskoj sekvenci sa nesupstituisanom sekvencom.

15. Antitelo, prema bilo kojem od zahteva 6-14, koje je molekul IgG, IgM, IgE, IgA, ili IgD, ili je izveden iz njih.

16. Izolovan molekul nukleinske kiseline koji sadrži nukleotidnu sekvencu kao što je data u bilo kojoj od SEQ IDNO: 1, 3, 5, 7, 95, 101, 103, 126, 128 ili 129.