KR20140004261A - 액티빈 수용체 유사 키나제-1에 대한 인간 모노클로날 항체 - Google Patents

액티빈 수용체 유사 키나제-1에 대한 인간 모노클로날 항체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 액티빈 수용체 유사 키나제-1(ALK-1)의 세포 외 도메인(ECD)과 결합하고, ALK-1/TGF-베타-1/Smad1 신호 전달 경로를 억제하는 기능을 하는 인간 항체 및 이의 항원 결합부를 포함하는 항체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 인간 항-ALK-1 항체로부터 유래하는 중쇄 및 경쇄 면역 글로불린 및 이러한 면역 글로불린을 암호화하는 핵산 분자에 관한 것이기도 하다. 본 발명은 또한 인류 즉, 인간의 항-ALK-1 항체의 제조 방법, 이러한 항체를 포함하는 조성물, 그리고 이 항체와 조성물을 이용하는 방법에 관한 것이기도 하다. 본 발명은 또한 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 트랜스제닉 동물 또는 식물에 관한 것이기도 하다.

Description

액티빈 수용체 유사 키나제-1에 대한 인간 모노클로날 항체{HUMAN MONOCLONAL ANTIBODIES TO ACTIVIN RECEPTOR-LIKE KINASE-1}
본 출원은 35 U.S.C.§119(e) 하에서, 본원에 그 자체로서 참고용으로 인용되어 있는 미국 가 명세서 특허 출원 제60/715,292호(2005년 9월 7일 출원)의 우선권을 주장한다.
발명의 분야
본 발명은 액티빈 수용체 유사 키나제-1(ALK-1)의 세포 외 도메인(ECD)과 결합하는 인간의 모노클로날 항체 및 이의 항원 결합부에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 항체 및 항원 결합부를 암호화하는 핵산 분자, 인간 항-ALK-1 항체 및 항원 결합부를 제조하는 방법, 이와 같은 항체와 항원 결합부를 포함하는 조성물 및 상기 항체, 항원 결합부 및 조성물을 사용하는 방법에 관한 것이기도 하다.
ALK-1은 형질 전환 성장 인자 베타 수용체 제1형(TGF-베타-1)에 대한 제I형 세포 표면 수용체이다. 인간 ALK-1은 503개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드로서, 신호 서열(1∼21번 아미노산), N-말단 세포 외 TGF-베타-1 리간드 결합 도메인 또는 ECD(22∼118번 아미노산), 단일 경막 도메인(119∼141번 아미노산), 조절 글리신/세린 풍부(GS) 도메인(142∼202번 아미노산) 및 C-말단 세린-트레오닌 키나제 도메인(202∼492번 아미노산)을 포함한다. 문헌[Attisano외 다수 Cell, 1993, vol. 75, pp. 671-680]에 개시되어 있는 인간 ALK-1의 아미노산 서열은 172번 위치에 Ser(Genbank 번호: L17075)을 포함하지만, 미국 특허 제6,316,217호에는 172번 위치에 Thr(Genbank 번호: NM_000020)을 포함하는 인간 ALK-1의 아미노산 서열이 개시되어 있다. 상기 아티사노(Attisano)외 다수의 문헌에 개시되어 있는 전장 인간 ALK-1을 암호화하는 ACVRL1 유전자는 인비트로겐 인코포레이션(Invitrogen Inc.)로부터 클론 ID IOH21048로서 시판되고 있다. 비록 ALK-1은 기타 제I형 수용체(ALK-2∼ALK-7)와의 상동성이 전체적으로 60∼80% 정도이지만, ALK-1의 ECD는 기타 ALK 군의 일원의 ECD와는 상당히 다르다. 예를 들어, 인간의 경우, ALK-2의 ECD만이 ALK-1의 ECD와 상당 수준 관련되어 있다(아미노산 동일성이 약 25%에 해당함)[미국 특허 제6,316,217호; ten Dijke외 다수 Oncogene, 1993, vol. 8, pp. 2879-2887; Attisano외 다수 Cell, 1993, vol. 75, pp. 671-680].
일반적으로, TGF-베타 상과 리간드는 세린/트레오닌 카니제로 이루어진 2가지 유형(I형 및 II형)의 헤테로머(heteromer) 수용체의 복합체와 결합함으로써 생물학적 기능을 수행한다. 제II형 수용체는 구성적으로 활성인 키나제로서, 리간드와 결합시 제I형 수용체를 인산화시킨다. 뿐만 아니라, 활성화된 제I형 키나제는 다양한 Smad를 비롯한 하류 신호 전달 분자를 인산화하여, 이 분자를 핵으로 이동시키고 전사 반응을 유도한다[Heldin외 다수 Nature, 1997, vol. 390, pp. 465-471]. ALK-1의 경우, Smad1이 특히 인산화되어 핵으로 이동하고, 여기에서 이것은 Smad1 반응성 유전자인 Id1과 EphB2의 발현을 직접적으로 조절한다.
ALK-1은 내피 세포와 기타 고도로 맥관화된 조직 예를 들어, 태반 또는 뇌에서 다량으로 그리고 선택적으로 발현된다. 어피메트릭스(Affymetrix) 프로파일링 및 실시간 RT-PCR을 통하여, 내피 세포에서 ALK-1이 발현되면 이것의 보조 수용체(co-receptor)인 제II형 액티빈과 엔도글린(endoglin), 그리고 이의 리간드인 TGF-베타-1 또는 ALK-5도 높은 수준으로 발현됨을 알 수 있다. ALK-1이 돌연 변이되면, 유전성 출혈성 모세혈관 확장증(HHT)이 유발되는데, 이는 곧, 혈관의 발달 또는 수선의 제어에 있어서 ALK-1이 중요한 역할을 한다는 사실을 말해주는 것이다[Abdalla외 다수 J. Med. Genet, 2003, vol. 40, pp. 494-502; Sadick외 다수 Hematologica/The Hematology J., 2005, vol. 90, 818-828]. 뿐만 아니라, ALK-1 결핍 마우스를 이용한 2회의 독립적인 실험을 통하여, 신생 혈관 형성에서의 ALK-1의 기능에 관한 생체 내 중요한 증거가 규명되었다[Oh외 다수 Proc Natl Acad Sci U S A, 2000, vol. 97, pp. 2626-2631; Urness외 다수 Nature Genetics, 2000, vol. 26, pp. 328-331].
신생 혈관 형성은 기존의 혈관 및/또는 순환하는 내피 줄기 세포로부터 새로운 혈관을 형성하는 과정을 포함하는 생리적인 경로이다. 이 과정은 성장과 발달에 있어서 뿐만 아니라, 상처의 치료에 있어서도 일반적으로 진행되는 경로이다. 그러나, 이 과정은 또한 종양을 잠재 상태에서 악성 상태로 변이시키는데 있어 필수 단계이기도 하다[Hanahan 및 Folkman, "Patterns and Emerging Mechanisms of the Angiogenic Switch During TumoriGenesis," Cell, 86(3):353-364, 1996; Carmeliet, "Angiogenesis in Health and Disease," Nature Medicine, 9(6):653-660, 2003; Bergers 및 Benjamin, "TumoreiGenesis and the Angiogenic Switch," Nature Reviews, 3:401-410, 2003]. 암과 같은 질병에 있어서, 신체는 신생 혈관 형성시 균형을 유지하는 능력을 잃어버리게 된다. 신생 혈관은 발병 조직에 영양분을 공급하고, 정상적인 조직을 파괴할 뿐만 아니라, 몇몇 암의 경우에는 신생 혈관으로 말미암아 종양 세포가 혈류를 타고 발병 조직을 이탈하여 다른 기관에 머무르게 만들기도 한다(종양의 전이). 모노클로날 항체(mAb)를 비롯한 신생 혈관 형성 억제제는 이와 같은 비정상적인 과정을 표적화하여 종양의 성장을 억제하거나 늦출 수 있는 매우 유용한 약물 군이다.
고형 종양 성장 및 전이에서의 역할 이외에도, 신생 혈관 형성 성분과 관련하여 잘 알려진 기타 증상으로서는, 예를 들어, 관절염, 건선, 신생 혈관 노인성 황반 변성증 및 당뇨병성 망막증이 있다[Bonnet외 다수 Osteoarthritis, Angiogenesis and Inflammation," Rheumatology, 2005, vol. 44, pp. 7-16; Creamer외 다수 "Angiogenesis in psoriasis," Angiogenesis, 2002, vol. 5, pp. 231-236; Clavel외 다수 "Recent data on the role for Angiogenesis in rheumatoid arthritis," Joint Bone Spine, 2003, vol. 70, pp. 321-326; Anandarajah외 다수 "Pathogenesis of psoriatic arthritis," Curr. Opin. Rheumatol., 2004, vol. 16, pp. 338-343; Ng외 다수 "Targeting Angiogenesis, the underlying disorder in neovascular age-related macular degeneration," Can. J. Ophthalmol., 2005, vol. 40, pp. 352-368; Witmer외 다수 "Vascular endothelial growth factors and Angiogenesis in eye disease," Progress in Retinal & Eye Research, 2003, vol. 22, pp. 1-29; Adamis외 다수 "Angiogenesis and ophthalmic disease," Angiogenesis, 1999, vol. 3, pp. 9-14].
항 신생 혈관 치료법은 본래 장기간에 걸쳐 행해지는 것으로 생각된다. 그러므로, 고도로 선택적인 내피 기능을 가지는 표적 예를 들어, ALK-1은 부작용으로 인한 소모를 줄이는 것이 바람직하다. 또한, 기타 ALK 군의 일원의 ECD와 ALK-1 ECD가 상당히 다를 경우, 인간 ALK-1 ECD에 대해 생성된 mAb은 ALK-1을 선택적으로 표적화하는 것으로 생각된다. 이러한 사항들을 바탕으로 하였을 때, 제II형 수용체와의 이량체화를 억제할 수 있고, 이에 따라서 Smad1 인산화 및 하류 전사 반응을 차단할 수 있는 ALK-1 세포 외 도메인에 대한 모노클로날 항체가 매우 바람직하다.
R&D 시스템스 인코포레이션(R&D Systems, Inc.)에서는 정제 NS0-유래 재조합 인간 ALK-1 세포외 도메인으로 면역화된 마우스로부터 얻어진 B 세포dhk 마우스 골수종을 융합하여 생성된 하이브리도마로부터 생산된, 모노클로날 항-인간 ALK-1 항체(Cat. # MAB370)를 제조 및 시판하고 있다. 이 항체는 ALK-1과 TGF-베타-1 간의 상호 작용을 중화하지 않을 뿐만 아니라, Smad1 인산화도 억제하지 않는 것으로 파악된다. 토끼의 항혈청은, 키홀 림펫(key-hole limpet) 헤모시아닌(KLH)과 커플을 형성하는, ALK-1의 세포 내 막 근접 부위의 일부에 상응하는 합성 펩티드(145∼166번 아미노산 잔기)(미국 특허 제6,692,925호)와, 선두 서열을 제외한 전체 ALK-1 세포 외 도메인[Lux외 다수, J. Biol. Chem., 1999, vol. 274, pp. 9984-9992]에 대해서 생산되어 왔다. 앱댈러(Abdalla)외 다수의 문헌[Human Mol. Gen., 2000, vol. 9, pp.1227-1237]에는, 재조합 백시니아 바이러스 구조물을 이용하여 ALK-1에 대한 폴리클로날 항체를 생산하는 방법에 관하여 개시되어 있다. R&D 시스템스 인코포레이션에서는 정제 NS0-유래 재조합 인간 ALK-1 세포외 도메인으로 면역화된 염소에서 생산된 폴리클로날 항-인간 ALK-1 항체(Cat. # AF370)를 제조 및 시판하고 있다.
현재, ALK-1의 ECD에 대한 완전 인간 모노클로날 항체에 관하여 보고된 바는 없으며, 어느 누구도 ALK-1/TGF-베타-1/Smad1 신호 전달 경로를 억제하는데 있어서 ALK-1의 ECD에 대한 임의의 모노클로날 항체의 효능에 대해 밝혀내지 못하였다.
본 발명은 영장류의 ALK-1, 바람직하게는 영장류 ALK-1의 ECD, 더욱 바람직하게는 인간 ALK-1의 ECD와 결합하는 분리된 중화 항-ALK-1 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합부에 관한 것이다. 바람직한 구체예에서, 중화 항체는 완전히 인간의 것인 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합부이다.
다른 측면에서, 본 발명은 항-ALK-1 항체 또는 이의 항원 결합부에 관한 것으로서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합부는 ALK-1/TGF-베타-1/Smad1 신호 전달 경로를 억제한다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 항체는 완전히 인간의 것인 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합부이다.
다른 측면에서, 본 발명은 항-ALK-1 항체 또는 이의 항원 결합부에 관한 것으로서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합부는 TGF-베타-1 촉진 신생 혈관 형성의 길항제이다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 항체는 완전히 인간의 것인 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합부이다.
다른 측면에서, 본 발명은 완전히 인간의 것인 항-ALK-1 항체 또는 이의 항원 결합부에 관한 것으로서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합부는 TGF-베타-1 촉진 종양 신생 혈관 형성의 길항제이다.
다른 측면에서, 본 발명은 널리-허용되며(well-tolerated), 주사 가능하고, 완전히 인간의 것인 항-ALK-1 항체 또는 이의 항원 결합부에 관한 것으로서, 상기 항체 및 이의 항원 결합부는 TGF-베타-1 촉진 신생 혈관 형성의 길항제이다.
다른 측면에서, 본 발명은 항-ALK-1 항체 또는 이의 항원 결합부에 관한 것으로서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합부는 ALK-1의 특이적 하류 표적 유전자인 Id1의 상향 조절을 억제한다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 항체는 완전히 인간의 것인 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합부이다.
다른 측면에서, 본 발명은 항-ALK-1 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합부에 관한 것으로서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합부는 이하에 기술된 바와 같이 몇몇 기능상의 특성 중 하나 이상의 관점에서 기술된다.
예를 들어, 하나의 구체예에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합부는 영장류 ALK-1의 세포 외 도메인과 결합력 값(avidity value)(표면 플라스몬 공명법에 의해 측정함) 1μM 이하로 결합한다. 추가의 구체예에서, 본 발명의 항체 또는 이의 일부는 영장류 ALK-1의 세포 외 도메인과 결합력 값(표면 플라스몬 공명법에 의해 측정함) 100nM 미만, 5nM 미만, 1nM 미만, 500pM 미만, 100pM 미만, 50pM 미만, 20pM 미만, 10pM 미만, 또는 1pM 미만으로 결합한다. 임의의 구체예에서, 상기 결합력 값은 0.1pM∼1μM이다. 기타 구체예에서, 상기 결합력 값은 1pM∼5nM이다. 다른 구체예에서, 상기 결합력 값은 1∼500pM이다. 다른 구체예에서, 상기 결합력 값은 1∼100pM이다. 기타 구체예에서, 상기 결합력 값은 1∼10pM이다.
다른 구체예에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합부는 인간 ALK-1의 세포 외 도메인과 결합력 값(표면 플라스몬 공명법에 의해 측정함) 100nM 이하로 결합한다. 추가의 구체예에서, 본 발명의 항체 또는 이의 일부는 인간 ALK-1의 세포 외 도메인과 결합력 값(표면 플라스몬 공명법에 의해 측정함) 10nM 미만, 5nM 미만, 1nM 미만, 500pM 미만, 100pM 미만, 50pM 미만, 20pM 미만, 10pM 미만, 또는 1pM 미만으로 결합한다. 임의의 구체예에서, 상기 결합력 값은 1pM∼100nM이다. 기타 구체예에서, 상기 결합력 값은 1pM∼5nM이다. 다른 구체예에서, 상기 결합력 값은 1∼500pM이다. 다른 구체예에서, 상기 결합력 값은 1∼100pM이다. 다른 구체예에서, 상기 결합력 값은 1∼10pM이다.
다른 구체예에서, 본 발명의 항체 또는 이의 일부의 인간 ALK-1에 대한 해리 속도(off-rate)(Koff)(표면 플라스몬 공명법에 의해 측정함)는 5×10-3s-1 이하이다. 예를 들어, 임의의 구체예에서, 본 발명의 항체 또는 이의 일부의 인간 ALK-1에 대한 Koff는 10-3s-1 미만, 5×10-4s-1 미만, 10-4s-1 미만, 5×10-5s-1 미만, 10-5s-1 미만 또는 5×10-6s-1 미만이다. 다른 구체예에서, 상기 Koff는 10-6∼10-4s-1이다. 다른 구체예에서, 상기 Koff는 10-6∼5×10-5s-1이다.
다른 구체예에서, 본 발명의 항체 또는 이의 일부는 영장류 ALK-1과 KD 1000nM 이하로 결합한다. 추가의 구체예에서, 본 발명의 항체 또는 이의 일부는 인간 ALK-1과 KD(표면 플라스몬 공명법에 의해 측정함) 500nM 미만, 100nM 미만, 50nM 미만, 20nM 미만, 10nM 미만 또는 1nM 미만으로 결합한다. 임의의 구체예에서, 상기 KD는 1μM∼100nM이다. 기타 구체예에서, 상기 KD는 100∼10nM이다. 다른 구체예에서, 상기 KD는 50∼0.1nM이다. 이와 같은 KD 값은 당 업자에게 공지된 임의의 기술 예를 들어, ELISA, RIA, 유세포 분석법 또는 표면 플라스몬 공명법 예를 들어, 바이어코어(BIACORE)™에 의해 측정될 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명의 항체 또는 이의 일부는 설치류의 ALK-1(KD(R))에 대한 결합 친화도보다 영장류의 ALK-1(KD(P))에 대한 결합 친화도가 더욱 크다. 하나의 구체예에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합부의 KD(R)/KD(P)는 1.5 이상이다. 추가의 구체예에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합부의 KD(R)/KD(P)는 2 이상, 3 이상, 5 이상, 10 이상, 20 이상, 50 이상, 100 이상, 200 이상, 500 이상, 또는 1000 이상이다. 이와 같이 영장류 ALK-1와 설치류 ALK-1에 대한 KD 값은 당 업자에게 공지된 임의의 기술 예를 들어, 유세포 분석법, ELISA, RIA 또는 표면 플라스몬 공명법 예를 들어, 바이어코어™에 의해 측정될 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명의 항-ALK-1 항체 또는 이의 일부의 IC50은 500nM 이하이며, 이때 상기 IC50은 상기 항체 또는 이의 일부가 ALK-1의 특이적 하류 표적 유전자인 Id1의 상향 조절을 억제하는 능력에 의해 측정된다. 추가의 구체예에서, 상기 IC50은 300nM 미만, 200nM 미만, 150nM 미만, 100nM 미만, 50nM 미만, 20nM 미만, 10nM 미만, 또는 1nM 미만이다. 임의의 구체예에서, 상기 IC50은 1∼500nM 이다. 다른 구체예에서, 상기 IC50은 5∼250nM 이다. 다른 구체예에서, 상기 IC50은 10∼100nM이다.
다른 구체예에서, 본 발명의 항-ALK-1 항체 또는 이의 일부의 IC50은 250nM 이하로서, 이 IC50은 오디세이 적외선 영상화 시스템(Odyssey Infrared Imaging System)을 사용하여 웨스턴 블로팅에 의해 측정된, 상기 항체 또는 이의 일부가 Smad1 인산화를 억제하는 능력에 의해 측정된다. 추가의 구체예에서, 상기 IC50은 200nM 미만, 150nM 미만, 100nM 미만, 50nM 미만, 20nM 미만, 10nM 미만, 또는 1nM 미만이다. 임의의 구체예에서, 상기 IC50은 1∼250nM이다. 기타 구체예에서, 상기 IC50은 5∼200nM이다. 다른 구체예에서, 상기 IC50은 10∼100nM이다.
다른 구체예에서, 본 발명의 항-ALK-1 항체 또는 이의 일부는 인간의 포피 조직이 이식된(인간의 흑색종 M24met 종양 세포가 피내 이식된) SCID 마우스에 있어서 인간의 신생 혈관 형성을, 대조군 시료에 비하여, 40% 이상 억제하는데, 이는, 인간의 CD-31 신호 검정법의 IHC 분석에 의해 측정된다. 추가의 구체예에서, 상기 항-ALK-1 항체 또는 이의 일부는 인간의 포피 조직이 이식된(인간의 흑색종 M24met 종양 세포가 피내 이식된) SCID 마우스에 있어서 인간의 신생 혈관 형성을, 대조군 시료에 비하여, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 또는 60% 이상 억제한다.
다른 구체예에서, 본 발명의 항-ALK-1 항체 또는 이의 일부의 EC50은 500nM 이하로서, 상기 EC50은 상기 항체 또는 이의 일부가 인간 포피 조직이 이식된(인간 흑색종 M24met 종양 세포가 피내 이식된) SCID 마우스에 있어서, 인간의 신생 혈관 형성을 억제하는 능력에 의해서 측정된다. 추가의 구체예에서, 상기 EC50은 400nM 미만, 300nM 미만, 200nM 미만, 150nM 미만, 100nM 미만, 50nM 미만, 25nM 미만, 또는 5nM 미만이다. 임의의 구체예에서, 상기 EC50은 5∼500nM이다. 다른 구체예에서, 상기 EC50은 25∼300nM 이다. 다른 구체예에서, 상기 EC50은 50∼150nM이다.
다른 구체예에서, 본 발명의 항-ALK-1 항체 또는 이의 일부는 인간의 포피 조직이 이식된(콜라겐과 인간 대혈관 내피 세포가 함께 피내 이식된) SCID 마우스에 있어서, 인간의 신생 혈관 형성을, 대조군 시료에 비하여 25% 이상 억제하는데, 이는 인간의 CD-31 신호 검정법의 IHC 분석에 의해 측정된다. 추가의 구체예에서, 본 발명의 항-ALK-1 항체 또는 이의 일부는 인간의 포피 조직이 이식된(콜라겐이 피내 이식된) SCID 마우스에 있어서 인간의 신생 혈관 형성을, 대조군 시료에 비하여 50% 이상 억제한다. 추가의 구체예에서, 본 발명의 항-ALK-1 항체 또는 이의 일부는 대조군에 비하여, 혈관의 신생을 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상 억제한다.
다른 구체예에서, 본 발명의 항-ALK-1 항체 또는 이의 일부는, 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1(rWT); 1.12.1(M29I/D19A); 1.12.1(M29I); 1.12.1(D19A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1; 및 5.59.1로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체와, ALK-1과의 결합에 대해 경쟁한다.
다른 구체예에서, 본 발명의 항-ALK-1 항체 또는 이의 일부는, 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1(rWT); 1.12.1(M29I/D19A); 1.12.1(M29I); 1.12.1(D19A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1; 및 5.59.1로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체와, ALK-1과의 결합에 대해 교차 경쟁한다.
다른 구체예에서, 본 발명의 항-ALK-1 항체 또는 이의 일부는, 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1(rWT); 1.12.1(M29I/D19A); 1.12.1(M29I); 1.12.1(D19A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1; 및 5.59.1로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 ALK-1 에피토프와 결합한다.
다른 구체예에서, 본 발명의 항-ALK-1 항체 또는 이의 일부는, 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1(rWT); 1.12.1(M29I/D19A); 1.12.1(M29I); 1.12.1(D19A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1; 및 5.59.1로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체의 KD와 실질적으로 동일한 KD로 ALK-1과 결합한다.
다른 구체예에서, 본 발명의 항-ALK-1 항체 또는 이의 일부는, 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1(rWT); 1.12.1(M29I/D19A); 1.12.1(M29I); 1.12.1(D19A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1; 및 5.59.1로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체의 Koff와 실질적으로 동일한 Koff로 ALK-1과 결합한다.
본 발명의 추가의 측면은 전술한 기능상의 특성 중 하나 이상을 가지는 항체 또는 이의 항원 결합부에 관한 것으로서, 이는 서열 번호 6; 10; 14; 18; 22; 26; 30; 34; 38; 42; 46; 50; 54; 58; 62; 66; 70; 74; 78; 82; 86; 90; 또는 104 중 어느 하나와 아미노산 서열이 90% 이상 동일한 VH 도메인을 포함한다. 하나의 구체예에서, 상기 VH 도메인은 서열 번호 6; 10; 14; 18; 22; 26; 30; 34; 38; 42; 46; 50; 54; 58; 62; 66; 70; 74; 78; 82; 86; 90; 또는 104 중 어느 하나와 아미노산 서열이 91% 이상, 93% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 99% 이상 또는 100% 동일하다.
추가의 구체예에서, 본 발명의 항체 또는 이의 일부는 전술한 기능상의 특성 중 하나 이상을 가지며, 또한 서열 번호 6; 10; 14; 18; 22; 26; 30; 34; 38; 42; 46; 50; 54; 58; 62; 66; 70; 74; 78; 82; 86; 90; 또는 104 중 어느 하나이거나, 또는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 가진다는 점에서 서열 번호 6; 10; 14; 18; 22; 26; 30; 34; 38; 42; 46; 50; 54; 58; 62; 66; 70; 74; 78; 82; 86; 90; 또는 104 중 어느 하나와 상이한 VH 도메인을 포함한다. 예를 들어, 상기 VH 도메인은 서열 번호 6; 10; 14; 18; 22; 26; 30; 34; 38; 42; 46; 50; 54; 58; 62; 66; 70; 74; 78; 82; 86; 90; 또는 104 중 어느 하나와, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 보존적 아미노산 치환을 가진다는 점에서 상이할 수 있다. 추가의 구체예에서, 상기 보존적 아미노산 치환 중 어느 것은 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 부위에서 일어날 수 있다.
본 발명의 추가의 측면은 전술한 바와 같은 기능상의 특성 중 하나 이상을 가지는 항체 또는 이의 항원 결합부에 관한 것으로서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합부는 서열 번호 8; 12; 16; 20; 24; 28; 32; 36; 40; 44; 48; 52; 56; 60; 64; 68; 72; 76; 80; 84; 88; 92; 또는 127 중 어느 하나와 아미노산 서열이 90% 이상 동일한 VL 도메인을 포함한다. 하나의 구체예에서, 상기 VL 도메인은 서열 번호 8; 12; 16; 20; 24; 28; 32; 36; 40; 44; 48; 52; 56; 60; 64; 68; 72; 76; 80; 84; 88; 92; 또는 127 중 어느 하나와 아미노산 서열이 91% 이상, 93% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 99% 이상, 또는 100% 동일하다.
추가의 구체예에서, 본 발명의 항체 또는 이의 일부는 전술한 바와 같은 기능상의 특성을 하나 이상 가지며, 서열 번호 8; 12; 16; 20; 24; 28; 32; 36; 40; 44; 48; 52; 56; 60; 64; 68; 72; 76; 80; 84; 88; 92; 또는 127 중 어느 하나이거나, 또는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 가진다는 점에서 서열 번호 8; 12; 16; 20; 24; 28; 32; 36; 40; 44; 48; 52; 56; 60; 64; 68; 72; 76; 80; 84; 88; 92; 또는 127 중 어느 하나와 상이하다. 예를 들어, 상기 VL 도메인은 서열 번호 8; 12; 16; 20; 24; 28; 32; 36; 40; 44; 48; 52; 56; 60; 64; 68; 72; 76; 80; 84; 88; 92; 또는 127 중 어느 하나와, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 보존적 아미노산 치환을 가진다는 점에서 상이할 수 있다. 추가의 구체예에서, 상기 보존적 아미노산 치환 중 어느 것은 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 부위에서 이루어질 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 전술한 바와 같은 기능상 특성들 중 하나 이상을 가지는 항체 또는 이의 항원 결합부에 관한 것으로서, 상기 VL 및 VH 도메인은 각각 모노클로날 항체 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1(rWT); 1.12.1(M29I/D19A); 1.12.1(M29I); 1.12.1(D19A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1; 및 5.59.1 중 어느 하나의 VL 및 VH 도메인과 아미노산 서열이 90% 이상 동일하다. 예를 들어, 상기 VL 및 VH 도메인은 각각 모노클로날 항체 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1(rWT); 1.12.1(M29I/D19A); 1.12.1(M29I); 1.12.1(D19A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1; 및 5.59.1 중 어느 하나의 VL 및 VH 도메인과 아미노산 서열이 91%, 93%, 95%, 97%, 99% 이상 또는 100% 동일하다.
본 발명의 다른 측면에서, 본 발명은 a) 서열 번호 6에 제시된 VH 도메인, 및 서열 번호 8에 제시된 VL 도메인을 포함하는 항체 또는 이의 일부; b) 서열 번호 10에 제시된 VH 도메인, 및 서열 번호 12에 제시된 VL 도메인을 포함하는 항체 또는 이의 일부; c) 서열 번호 14에 제시된 VH 도메인, 및 서열 번호 16에 제시된 VL 도메인을 포함하는 항체 또는 이의 일부; d) 서열 번호 18에 제시된 VH 도메인, 및 서열 번호 20에 제시된 VL 도메인을 포함하는 항체 또는 이의 일부; e) 서열 번호 22에 제시된 VH 도메인, 및 서열 번호 24에 제시된 VL 도메인을 포함하는 항체 또는 이의 일부; f) 서열 번호 26에 제시된 VH 도메인, 및 서열 번호 28에 제시된 VL 도메인을 포함하는 항체 또는 이의 일부; g) 서열 번호 30에 제시된 VH 도메인, 및 서열 번호 32에 제시된 VL 도메인을 포함하는 항체 또는 이의 일부; h) 서열 번호 34에 제시된 VH 도메인, 및 서열 번호 36에 제시된 VL 도메인을 포함하는 항체 또는 이의 일부; i) 서열 번호 38에 제시된 VH 도메인, 및 서열 번호 40에 제시된 VL 도메인을 포함하는 항체 또는 이의 일부; j) 서열 번호 42에 제시된 VH 도메인, 및 서열 번호 44에 제시된 VL 도메인을 포함하는 항체 또는 이의 일부; k) 서열 번호 46에 제시된 VH 도메인, 및 서열 번호 48에 제시된 VL 도메인을 포함하는 항체 또는 이의 일부; l) 서열 번호 50에 제시된 VH 도메인, 및 서열 번호 52에 제시된 VL 도메인을 포함하는 항체 또는 이의 일부; m) 서열 번호 54에 제시된 VH 도메인, 및 서열 번호 56에 제시된 VL 도메인을 포함하는 항체 또는 이의 일부; n) 서열 번호 58에 제시된 VH 도메인, 및 서열 번호 60에 제시된 VL 도메인을 포함하는 항체 또는 이의 일부; o) 서열 번호 62에 제시된 VH 도메인, 및 서열 번호 64에 제시된 VL 도메인을 포함하는 항체 또는 이의 일부; p) 서열 번호 66에 제시된 VH 도메인, 및 서열 번호 68에 제시된 VL 도메인을 포함하는 항체 또는 이의 일부; q) 서열 번호 70에 제시된 VH 도메인, 및 서열 번호 72에 제시된 VL 도메인을 포함하는 항체 또는 이의 일부; r) 서열 번호 74에 제시된 VH 도메인, 및 서열 번호 76에 제시된 VL 도메인을 포함하는 항체 또는 이의 일부; s) 서열 번호 78에 제시된 VH 도메인, 및 서열 번호 80에 제시된 VL 도메인을 포함하는 항체 또는 이의 일부; t) 서열 번호 82에 제시된 VH 도메인, 및 서열 번호 84에 제시된 VL 도메인을 포함하는 항체 또는 이의 일부; u) 서열 번호 86에 제시된 VH 도메인, 및 서열 번호 88에 제시된 VL 도메인을 포함하는 항체 또는 이의 일부; v) 서열 번호 90에 제시된 VH 도메인, 및 서열 번호 92에 제시된 VL 도메인을 포함하는 항체 또는 이의 일부; w) 서열 번호 104에 제시된 VH 도메인, 및 서열 번호 127에 제시된 VL 도메인을 포함하는 항체 또는 이의 일부; x) 서열 번호 6에 제시된 VH 도메인, 및 서열 번호 127에 제시된 VL 도메인을 포함하는 항체 또는 이의 일부; 및 y) 서열 번호 104에 제시된 VH 도메인, 및 서열 번호 8에 제시된 VL 도메인을 포함하는 항체 또는 이의 일부로 이루어진 군으로부터 선택되는 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합부에 관한 것이다.
추가의 구체예에서, 상기 a)∼v) 군에 속하는 항체 또는 이의 일부 중 임의의 것에 있어서, 상기 VH 및/또는 VL 도메인은 하나 이상의 보존적 아미노산 치환이 발생함으로 인하여 상기 나열된 특정 서열 번호의 서열과 상이할 수 있다. 예를 들어, 상기 VH 및/또는 VL 도메인은 상기 나열된 서열 번호의 서열과 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 보존적 아미노산 치환을 가진다는 점에서 상이할 수 있다. 추가의 구체예에서, 이와 같은 보존적 아미노산 치환 중 임의의 것은 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 부위에서 발생할 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명은 전술한 기능상의 특성들 중 하나 이상을 가지는 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합부를 제공하는 것으로서, 여기서, 상기 VH 도메인은 서열 번호 6; 10; 14; 18; 22; 26; 30; 34; 38; 42; 46; 50; 54; 58; 62; 66; 70; 74; 78; 82; 86; 90; 또는 104의 서열, 또는 서열 번호 6; 10; 14; 18; 22; 26; 30; 34; 38; 42; 46; 50; 54; 58; 62; 66; 70; 74; 78; 82; 86; 90; 또는 104 중 어느 하나와 상이한(하나 이상의 보존적 아미노산 치환이 발생함으로 인하여 상이한) 서열 중 어느 하나로부터 독립적으로 선택되며, 상기 VL 도메인은 서열 번호 8; 12; 16; 20; 24; 28; 32; 36; 40; 44; 48; 52; 56; 60; 64; 68; 72; 76; 80; 84; 88; 92; 또는 127의 서열, 또는 서열 번호 8; 12; 16; 20; 24; 28; 32; 36; 40; 44; 48; 52; 56; 60; 64; 68; 72; 76; 80; 84; 88; 92; 또는 127 중 어느 하나와 상이한(하나 이상의 보존적 아미노산 치환이 발생함으로 인하여 상이한) 서열 중 어느 하나로부터 독립적으로 선택된다. 예를 들어, 상기 VH 및 VL 도메인은 각각 서열 번호 6; 10; 14; 18; 22; 26; 30; 34; 38; 42; 46; 50; 54; 58; 62; 66; 70; 74; 78; 82; 86; 90; 또는 104, 및 서열 번호 8; 12; 16; 20; 24; 28; 32; 36; 40; 44; 48; 52; 56; 60; 64; 68; 72; 76; 80; 84; 88; 92; 또는 127의 서열과, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 보존적 아미노산 치환을 포함한다는 점에서 상이할 수 있다.
추가의 구체예에서, 본 발명은 전술한 기능상의 특성들 중 하나 이상을 가지는 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합부를 제공하는데, 여기서, 상기 항체 또는 이의 일부는 각각 중쇄 CDR1, CDR2 또는 CDR3 서열로부터 독립적으로 선택되는 VH CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하며, 이때 상기 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열들은 서열 번호 6; 10; 14; 18; 22; 26; 30; 34; 38; 42; 46; 50; 54; 58; 62; 66; 70; 74; 78; 82; 86; 90; 또는 104의 서열, 또는 서열 번호 6; 10; 14; 18; 22; 26; 30; 34; 38; 42; 46; 50; 54; 58; 62; 66; 70; 74; 78; 82; 86; 90; 또는 104 중 어느 하나의 서열과, 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 포함한다는 점에서 상이한 서열 중 어느 하나에서 확인할 수 있다. 예를 들어, 상기 VH CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 서열 번호 6; 10; 14; 18; 22; 26; 30; 34; 38; 42; 46; 50; 54; 58; 62; 66; 70; 74; 78; 82; 86; 90; 또는 104 중 임의의 서열의 CDR1, CDR2 및 CDR3과, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 보존적 아미노산 치환을 포함한다는 점에서 상이할 수 있다.
추가의 구체예에서, 본 발명은 전술한 기능상의 특성들 중 하나 이상을 가지는 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합부를 제공하는데, 여기서, 상기 항체 또는 이의 일부는 서열 번호 8; 12; 16; 20; 24; 28; 32; 36; 40; 44; 48; 52; 56; 60; 64; 68; 72; 76; 80; 84; 88; 92; 또는 127의 서열 중 어느 하나, 또는 서열 번호 8; 12; 16; 20; 24; 28; 32; 36; 40; 44; 48; 52; 56; 60; 64; 68; 72; 76; 80; 84; 88; 92; 또는 127 중 어느 하나의 서열과, 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 포함한다는 점에서 상이할 수 있다. 예를 들어, 상기 VL CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 서열 번호 8; 12; 16; 20; 24; 28; 32; 36; 40; 44; 48; 52; 56; 60; 64; 68; 72; 76; 80; 84; 88; 92; 또는 127의 서열 중 임의의 서열의 CDR1, CDR2 및 CDR3과, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 보존적 아미노산 치환을 포함한다는 점에서 상이할 수 있다.
본 발명은 또한 전술한 기능상의 특성들 중 하나 이상을 가지는 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합부를 제공하는데, 여기서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합부는 VH 및 VL CDR1, VH 및 VL CDR2와, VH 및 VL CDR3를 포함하며, 이들은 모노클로날 항체 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1(rWT); 1.12.1(M29I/D19A); 1.12.1(M29I); 1.12.1(D19A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1; 및 5.59.1 중 어느 하나에서 살펴볼 수 있다.
본 발명은 또한 전술한 기능상의 특성들 중 하나 이상을 가지는 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합부를 제공하는데, 여기서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합부는 인간 VH 4-31, VH 3-11, VH 3-15, VH 3-33, VH 4-61 또는 VH 4-59 유전자를 이용하는 중쇄를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 상기 중쇄는 인간 VH 3-33 유전자, 인간 D 6-19 유전자 및 인간 JH 3B 유전자; 인간 VH 4-31 유전자, 인간 D 6-19 유전자 및 인간 JH 4B 유전자; 인간 VH 4-61 유전자, 인간 D 6-19 유전자 및 인간 JH 4B 유전자; 인간 VH 4-31 유전자, 인간 D 3-3 유전자 및 인간 JH 3B 유전자; 인간 VH 4-31 유전자 및 인간 JH 3B 유전자; 인간 VH 4-59 유전자, 인간 D 6-19 유전자 및 인간 JH 4B 유전자; 인간 VH 3-11 유전자, 인간 D 3-22 유전자 및 인간 JH 6B 유전자; 인간 VH 3-15 유전자, 인간 D 3-22 유전자 및 인간 JH 4B 유전자; 인간 VH 4-31 유전자, 인간 D 5-12 유전자 및 인간 JH 6B 유전자; 인간 VH 4-31 유전자, 인간 D 4-23 유전자 및 인간 JH 4B 유전자; 인간 VH 4-31 유전자, 인간 D 2-2 유전자 및 인간 JH 5B 유전자; 인간 VH 4-31 유전자 및 인간 JH 6B 유전자; 인간 VH 3-15 유전자, 인간 D 1-1 유전자 및 인간 JH 4B 유전자; 인간 VH 3-11 유전자, 인간 D 6-19 유전자 및 인간 JH 6B 유전자; 인간 VH 3-11 유전자, 인간 D 3-10 유전자 및 인간 JH 6B 유전자; 또는 인간 VH 3-11 유전자, 인간 D 6-6 유전자 및 인간 JH 6B 유전자를 이용한다.
본 발명은 또한 전술한 기능상의 특성들 중 하나 이상을 가지는 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합부를 제공하는데, 여기서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합부는 인간 Vκ A27, Vκ A2, Vκ A1, Vκ A3, Vκ B3, Vκ B2, Vκ L1 또는 Vκ L2 유전자를 이용하는 경쇄를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 상기 경쇄는 인간 Vκ L1 유전자 및 인간 Jκ 4 유전자; 인간 Vκ A27 유전자 및 인간 Jκ 5 유전자 또는 인간 Jκ 4 유전자; 인간 Vκ B3 유전자 및 인간 Jκ 1 유전자; 인간 Vκ L2 유전자 및 인간 Jκ 3 유전자; 인간 Vκ A2 유전자 및 인간 Jκ 1 유전자; 인간 Vκ A3 유전자 및 인간 Jκ 4 유전자; 인간 Vκ A1 유전자 및 인간 Jκ 1 유전자; 인간 Vκ B2 유전자 및 인간 Jκ 4 유전자; 또는 인간 Vκ A2 유전자 및 인간 Jκ 1 유전자를 이용한다.
본 발명은 또한 전술한 기능상의 특성들 중 하나 이상을 가지는 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합부를 제공하는데, 여기서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합부는 모노클로날 항체 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1(rWT); 1.12.1(M29I/D19A); 1.12.1(M29I); 1.12.1(D19A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1; 및 5.59.1 중 어느 하나에서 살펴볼 수 있는 중쇄 및/또는 경쇄 FR1, FR2, FR3 또는 FR4 아미노산 서열 중 하나 이상을 포함한다.
본 발명은 또한 a) 서열 번호 2 및 서열 번호 4; b) 서열 번호 2 및 서열 번호 102; c) 서열 번호 100 및 서열 번호 4; 그리고 d) 서열 번호 100 및 서열 번호 102에 제시된 아미노산 서열들을 포함하는 모노클로날 항체를 제공한다.
본 발명의 추가의 구체예에서, 본 발명은 IgG, IgM, IgE, IgA, 또는 IgD 분자이거나 이들로부터 유래하는 것인, 전술한 항체들 중 임의의 항체에 관한 것이다. 예를 들어, 상기 항체는 IgG1 또는 IgG2일 수 있다.
다른 구체예는 전술한 바와 같은 항체 또는 이의 항원 결합부 중 임의의 것 예를 들어, Fab 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편, 단일 사슬 Fv 단편, 단일 사슬 VH 단편, 단일 사슬 VL 단편, 인간화된 항체, 키메라 항체 또는 이중 특이적 항체를 제공한다.
추가의 구체예에서, 본 발명은 전술한 바와 같은 항체 또는 이의 일부 중 임의의 것과 하나 이상의 부가 분자 실체를 포함하는 유도체화된 항체 또는 이의 항원 결합부에 관한 것이다. 예를 들어, 상기 하나 이상의 부가 분자 실체는 다른 항체(예를 들어, 이중 특이적 항체 또는 다이아바디(diabody)), 검출 제제, 표지, 세포 독성 제제, 약학 제제, 및/또는 항체나 항체의 일부와 다른 분자(예를 들어, 스트렙타비딘 중심 부위 또는 폴리히스티딘 태그)의 결합을 매개할 수 있는 단백질 또는 펩티드일 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합부와 유도체화될 수 있는 유용한 검출 제제로서는 형광성 화합물 예를 들어, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 염화 5-디메틸아민-1-나프탈렌설포닐, 피코에리트린 및 란탄계 원소인 인 등을 포함한다. 항체는 또한 검출에 유용한 효소 예를 들어, 호오스래디쉬 퍼옥시다제, β-갈락토시다제, 루시퍼라제, 알칼리성 포스파타제 및 글루코스 산화 효소 등으로 표지화될 수도 있다. 추가의 구체예에서, 본 발명의 항체 또는 이의 일부는 또한 바이오틴이나, 2차 리포터에 의하여 인지되는 소정의 폴리펩티드 에피토프(예를 들어, 루신 지퍼 쌍 서열, 2차 항체에 대한 결합 위치, 금속 결합 도메인 및 에피토프 태그)로 표지화될 수도 있다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 항체 또는 이의 일부 중 임의의 것은 화학 기 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 메틸 또는 에틸 기, 또는 탄수화물 기에 의하여 유도체화될 수도 있다.
몇몇 구체예에서, 본원에 개시된 항-ALK-1 항체 또는 이의 항원 결합부는 고형 지지체에 부착된다.
몇몇 구체예에서, 본 발명의 항-ALK-1 항체 중 임의의 것의 중쇄에 존재하는 C-말단 리신은 절단된다. 본 발명의 다양한 구체예에서, 항-ALK-1 항체의 중쇄 및 경쇄는 임의로 신호 서열을 포함할 수도 있다.
본 발명은 또한 전술한 바와 같은 항체 또는 이의 항원 결합부 중 임의의 것과 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공하기도 한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 본원에 개시된 바와 같은 항체 또는 이의 항원 결합부 중 임의의 것을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자에 관한 것이다. 하나의 특정 구체예에서, 분리된 핵산 분자는 중쇄를 암호화하는 서열인 서열 번호 1에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 다른 특정 구체예에서, 분리된 핵산 분자는 경쇄를 암호화하는 서열 번호 3에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
다른 특정 구체예에서, 분리된 핵산 분자는 ATCC 수탁 번호 PTA-6864로서 기탁된 클론의 cDNA 서열의 개방 해독 틀을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 다른 특정 구체예에서, 분리된 핵산 분자는 ATCC 수탁 번호 PTA-6865로서 기탁된 클론의 cDNA 서열의 개방 해독 틀을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
다른 특정 구체예에서, 분리된 핵산 분자는 서열 번호 95 또는 서열 번호 128에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서, 상기 서열들은 각각 중쇄를 암호화하는 것이다. 다른 특정 구체예에서, 분리된 핵산 분자는 경쇄를 암호화하는 서열인 서열 번호 101에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 본원에 개시된 핵산 분자 중 임의의 것을 포함하는 벡터에 관한 것으로서, 여기서, 상기 벡터는 임의로는 핵산 분자에 작동 가능하도록 결합되어 있는 발현 제어 서열을 포함한다.
다른 구체예는 본원에 개시된 벡터 중 임의의 것 또는 본원에 개시된 핵산 분자 중 임의의 것을 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 본 발명은 또한 본원에 개시된 바와 같은 항체 또는 항원 결합부 중 임의의 것을 생산하거나, 또는 상기 항체 또는 이의 항원 결합부 중 임의의 것의 중쇄 또는 경쇄를 생산하는 분리된 세포주를 제공하기도 한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 항-ALK-1 항체 또는 이의 항원 결합부를 생산하는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 본원에 개시된 숙주 세포 또는 숙주 세포주 중 임의의 것을 적당한 조건 하에서 배양하는 단계 및 상기 항체 또는 이의 항원 결합부를 회수하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 본원에 개시된 핵산 중 임의의 것을 포함하는 비-인간 트랜스제닉(transgenic) 동물 또는 트랜스제닉 식물에 관한 것으로서, 상기 비-인간 트랜스제닉 동물 또는 트랜스제닉 식물은 상기 핵산을 발현한다.
본 발명은 또한 ALK-1에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합부를 분리하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 본원에 개시된 바와 같은 비-인간 트랜스제닉 동물 또는 트랜스제닉 식물로부터 항체를 분리하는 단계를 포함한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 ATCC 수탁 번호 PTA-6808로서 기탁된 하이브리도마에 관한 것이다.
본 발명은 또한 임의의 물질이 ALK-1의 특이적 하류 표적 유전자인 Id1의 상향 조절을 억제하는지 여부를 측정하는 방법을 제공하기도 하는데, 이 방법은 Id1을 발현하는 세포의 제1 시료와 임의의 물질을 접촉시키는 단계 및 Id1 발현이 억제되는지 여부를 측정하는 단계를 포함하며, 여기서, 상기 물질과 접촉한 세포의 제1 시료 내에서의 Id1 발현 수준이 세포의 대조군 시료 내에서의 Id1 발현 수준에 비하여 감소하였음은 곧, 상기 물질이 Id1 발현을 억제하는 것임을 말해주는 것이다. 본 발명은 또한 상기 물질이 ALK-1의 세포 외 도메인과 결합하는 항체인 것인 방법을 추가로 제공한다.
본 발명은 또한 치료를 필요로 하는 포유동물에서 세포의 이상 성장을 치료하는 방법을 제공하는 것으로서, 이 방법은 본원에 개시된 항체 또는 이의 항원 결합부 중 임의의 것, 또는 본원에 개시된 약학 조성물 중 임의의 것을 상기 포유동물에 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명은 또한 ALK-1과 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합부를 사용하여 치료를 필요로 하는 포유동물에서 세포의 이상 성장을 치료하는 방법을 제공하는데, 이 방법은, 상기 핵산 분자를 발현시키기에 적당한 조건 하에서 상기 포유동물에게 본원에 개시된 핵산 분자 중 임의의 것을 유효량 투여하는 단계를 포함한다. 다른 구체예에서, 세포의 이상 성장을 치료하는 방법은 또한 항 종양 제제, 항 신생 혈관 형성 제제, 신호 전달 억제제 및 항 증식 제제로부터 선택되는 하나 이상의 물질을 일정량 투여하는 단계를 추가로 포함하며, 이때의 투여량은 모두 상기 세포의 이상 성장을 억제하는데 효과적인 양이다. 특정 구체예에서, 상기 세포의 이상 성장은 암 세포 성장이다.
본 발명은 또한 서열 번호 93에 제시된 아미노산 서열을 가지는 분리된 사이노몰거스(cynomolgus) 원숭이의 ALK-1 단백질을 제공한다. 본 발명은 또한 서열 번호 93의 아미노산 서열을 가지는 단백질을 암호화하는 분리된 핵산 분자를 제공한다. 본 발명은 또한 서열 번호 94의 분리된 핵산 분자를 제공한다.
도 1은 에피토프 결합 데이터의 예를 보여주는 것이다. 1.21.1(M29I/D19A) 항체를 10분 동안 주사한 후, 다시 2차적으로 1.21.1(M29I/D19A) 항체를 10분 더 주사하였다. 이로써 상기 항체를 20분 동안 주사하였을 경우의 최대 반응성을 한정할 수 있다. 1.27.1 항체의 20분 주사시 최대 반응성에 대해서도 유사한 방식으로 측정하였다. 1.12.1(M29I/D19A) 항체를 10분 동안 주사한 후, 다시 1.27.1 항체를 10분 더 주사하였다. 만일 총 반응성이 한정된 최대 반응성 범위에 속하게 되면, 상기 2개의 항체는 동일한 에피토프와 결합하는 것임에 틀림없다. 만일 총 반응성이 최고의 최대 반응성을 넘으면, 상기 항체들은 상이한 에피토프와 결합하는 것임에 틀림없다. 본 실험은 실시예 9에 기술된 주사 순서와 반대로 반복 수행하였다.
도 2는 인간 및 사이노 ALK-1 단백질 서열의 배열을 나타내는 것이다.
도 3a 및 3b는 세포 표면 ALK-1에 결합하는 재조합 1.12.1 항체의 KD 측정 결과를 나타내는 것이다. 도 3a: 인간, 도 3b: 사이노.
1.12.1(rWT)은 재조합 mAb로서 발현된 mAb 1.12.1 변이체이다.
1.12.1(M29I/D19A)은 2개의 특정 아미노산 돌연 변이를 함유하는 재조합 mAb로서 발현된 mAb 1.12.1 변이체이다[중쇄의 29번 위치의 메티오닌은 이소루신으로 치환되며, 경쇄의 19번 위치의 아스파르트산은 알라닌으로 치환됨].
1.12.1(M29I)은 특정 아미노산 돌연 변이를 1개 함유하는 재조합 mAb로서 발현된 mAb 1.12.1 변이체로서, 여기서, 중쇄의 29번 위치의 메티오닌은 이소루신으로 치환되었다.
1.12.1(D19A)은 특정 아미노산 돌연 변이를 1개 함유하는 재조합 mAb로서 발현된 mAb 1.12.1 변이체로서, 여기서, 경쇄의 19번 위치의 아스파르트산은 알라닌으로 치환되었다.
도 4는 ID1 택맨 검정법(ID1 Taqman Assay)을 이용하는, 1.12.1 항체 변이체에 대한 ID1 적정 결과의 일례를 나타내는 것이다.
1.12.1은 하이브리도마로부터 분리된 mAb1.12.1 변이체이다.
1.12.1(rWT)은 재조합 mAb로서 발현된 mAb 1.12.1 변이체이다.
1.12.1(M29I/D19A)은 2개의 특정 아미노산 돌연 변이를 함유하는 재조합 mAb로서 발현된 mAb 1.12.1 변이체이다[중쇄의 29번 위치의 메티오닌은 이소루신으로 치환되며, 경쇄의 19번 위치의 아스파르트산은 알라닌으로 치환됨].
1.12.1(M29I)은 특정 아미노산 돌연 변이를 1개 함유하는 재조합 mAb로서 발현된 mAb 1.12.1 변이체로서, 여기서, 중쇄의 29번 위치의 메티오닌은 이소루신으로 치환되었다.
1.21.1(D19A)은 특정 아미노산 돌연 변이를 1개 함유하는 재조합 mAb인 mAb 1.12.1 변이체로서, 여기서, 경쇄의 19번 위치의 아스파르트산은 알라닌으로 치환되었다.
도 5는 ID1 택맨 검정법을 이용하는, 1.12.1 항체 서열 변이체 및 Fab 유도체에 대한 ID1 적정 결과의 일례를 나타내는 것이다.
1.12.1은 하이브리도마로부터 분리된 mAb 1.12.1 변이체이다.
1.12.1(rWT)은 재조합 mAb로서 발현된 mAb 1.12.1 변이체이다.
1.12.1(M29I)은 특정 아미노산 돌연 변이를 1개 함유하는 재조합 mAb로서 발현된 mAb 1.12.1 변이체로서, 여기서, 중쇄의 29번 위치의 메티오닌은 이소루신으로 치환되었다.
1.12.1(D19A)은 특정 아미노산 돌연 변이를 1개 함유하는 재조합 mAb로서 발현된 mAb 1.12.1 변이체로서, 여기서, 경쇄의 19번 위치의 아스파르트산은 알라닌으로 치환되었다.
1.12.1(M29I/D19A)은 2개의 특정 아미노산 돌연 변이를 함유하는 재조합 mAb로서 발현된 mAb 1.12.1 변이체이다[중쇄의 29번 위치의 메티오닌은 이소루신으로 치환되며, 경쇄의 19번 위치의 아스파르트산은 알라닌으로 치환됨].
Fab 1.12.1(M29I/D19A)은 파페인을 사용하여 1.12.1(M29I/D19A) IgG1을 분해함으로써 생성된 mAb 1.12.1(M29I/D19A)의 Fab 단편이다.
도 6a 및 도 6b는 ALK-1 내부화의 결과를 나타내는 것이다. 도 6a: 세포 표면상에 잔류하고 있던 항체가 중화되었는지 여부를 모니터한 결과. 도 6b: 세포 표면 수용체 ALK-1이 잔류하는지 여부를 모니터한 결과.
도 7a는 본 발명의 항-ALK-1 항체에 대한 가변 도메인 서열을 생식 계열 서열에 정렬한 결과를 나타내는 것이다. 생식 계열과 비교된 돌연 변이는 굵은 글씨로 나타내었다. CDR 서열에는 밑줄을 그어 표시하였다. 도 7b는 항-ALK-1 항체 1.12.1, 1.14.1, 1.162.1, 1.31.1, 4.62.1 및 4.72.1에 대한 경쇄 가변 도메인의 예측 아미노산 서열을 인간 생식 계열 A27 Vκ 서열에 정렬한 결과를 나타내는 것이다. 도 7c 및 도 7d는 항-ALK-1 항체 1.12.1, 1.151.1, 1.162.1, 1.8.1, 4.24.1, 4.38.1, 4.58.1, 4.62.1, 4.68.1, 4.72.1, 5.13.1 및 5.34.1에 대한 중쇄 가변 도메인의 예측 아미노산 서열을 인간 생식 계열 4-31VH 서열에 정렬한 결과를 나타내는 것이다.
도 8은 수술 후 이식된 인간의 피부 절편을 조직학적으로 분석한 결과(H & E 염색법)의 일례를 나타내는 것이다.
도 9a는 인간 피부 키메라 마우스에 있어서 콜라겐의 3색 염색법의 결과를 나타내는 것이다.
도 9b는 인간 포피 키메라 마우스에 있어서 이식된 콜라겐 겔 내 인간의 혈관을 검출한 결과를 나타내는 것이다. 텍스-레드(Tex-red): 인간의 혈관, FITC: 마우스 혈관, 황색: 공동 염색.
도 10은 인간 포피 SCID 키메라 마우스에 있어서 M24met 종양의 인간 혈관(적색) 및 마우스 혈관(녹색)의 면역 형광 이미지를 나타내는 것이다.
도 11은 인간 포피 SCID 키메라 마우스에 있어서 M24met 종양의 인간 혈관(갈색)의 IHC 이미지를 나타내는 것이다.
도 12는 인간 포피 SCID 키메라 마우스에 있어서, 대조군 및 1.12.1(M29I/D19A) 항체 처리된(10㎎/㎏) M24met 종양의 인간 혈관(적색) 및 마우스 혈관(녹색)의 대표적인 면역 형광 이미지를 나타내는 것이다.
도 13은 인간 포피 SCID 키메라 마우스 모델에 있어서, 1.12.1(M29I/D19A) 항체에 의하여 인간 종양 혈관의 성장이 투여량-의존적으로 억제됨을 타내는 것이다.
도 14는 1.12.1(M29I/D19A) 항체의 SCID 마우스 혈장 농도를 나타내는 것이다.
도 15는 M24met 포피 SCID-키메라 모델에 있어서 1.12.1(M29I/D19A) 항체에 대한 EC50의 측정치를 나타내는 것이다. 그래프를 작성하기 위하여, 100%에서의 대조 수치를 인공 혈청 농도 0.1nM로서 설정하였다. 이는 겉보기 EC50을 바꾸지 못한다.
정의 및 일반적인 기술
본원에서 달리 정의하지 않는한, 본 발명과 관련하여 사용된 과학 용어 및 기술 용어들은 당 업자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 뿐만 아니라, 문맥상 특별히 지정하지 않는 한, 단수 형태의 용어는 그것의 복수 형태도 포함하는 것이며, 복수 형태의 용어는 그것의 단수 형태도 포함할 것이다. 일반적으로, 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학 및 단백질과 핵산 화학, 그리고 혼성화와 관련되어 사용되는 명명법과, 이와 관련된 기술들은 당 업자에게 널리 공지되어 있는 것이며, 또한 당 업계에서 일반적으로 사용되고 있는 것이다.
본 발명의 방법 및 기술은 일반적으로 달리 특정하지 않는 한, 본 명세서 전체를 통하여 인용 및 기술되어 있는 다양한 일반적인 참고 문헌과 더욱 자세한 참고 문헌에 기술된 바와 같이 수행되며, 또한 당 업계에 널리 공지된 통상의 방법에 따라서 수행된다. 예를 들어, 본원에 참고용으로 인용되어 있는 문헌[Sambrook J. & Russell D.. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (2000); Ausubel외 다수, Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, John & Sons, Inc. (2002); Harlow and Lane Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1998); 및 Coligan외 다수, Short Protocols in Protein Science, Wiley, John & Sons, Inc. (2003)]을 참조하시오. 효소 반응과 정제 기술은 일반적으로 당 업계에서 행해지는 바와 같거나, 또는 본원에 개시되어 있는 바와 같이, 제조자의 지침서에 따라서 수행된다. 본원에 개시된 분석 화학, 유기 합성 화학 및 약품 화학 및 약물 화학과 관련하여 사용된 명명법과 이와 관련된 실험 방법 그리고 이의 기술은 당 업자에게 널리 공지되어 있으며, 또한 당 업계에서 일반적으로 사용되고 있는 기술이다.
달리 특정하지 않는 한, 이하의 용어들은 다음과 같은 의미들을 가지는 것으로 이해될 것이다.
본원에 사용된 "ALK-1"이란 용어는, 포유동물 액티빈 수용체 유사 키나제-1을 의미한다. 상기 ALK-1이란 용어는 표준적인 재조합 발현 방법에 의해 제조될 수 있는 재조합 ALK-1과 이 ALK-1의 재조합 키메라 형을 포함하는 것이다.
본원에 사용된 두문자어 "mAb"이란, 모노클로날 항체를 의미하는 것이다.
본원에 번호로서 나타낸 항체는 동일한 번호의 하이브리도마로부터 생산된 모노클로날 항체(mAb)를 의미하는 것이다. 예를 들어, 모노클로날 항체 1.12.1은 하이브리도마 1.12.1로부터 생산된 항체이다.
1.12.1이란, 하이브리도마로부터 분리된 mAb 1.12.1 변이체를 의미하는 것이다.
1.12.1(rWT)이란, 재조합 mAb으로서 발현된 mAb 1.12.1 변이체를 의미하는 것이다.
1.12.1(M29I/D19A)이란, 2개의 특정 아미노산 돌연 변이를 함유하는 재조합 mAb으로서 발현된 mAb 1.12.1 변이체를 의미하는 것이다[여기서, 중쇄의 29번 위치의 메티오닌은 이소루신으로 치환되며, 경쇄의 19번 위치의 아스파르트산은 알라닌으로 치환됨].
1.12.1(M29I)이란, 특정 아미노산 돌연 변이를 1개 함유하는 재조합 mAb으로서 발현된 mAb1.12.1 변이체를 의미하는 것으로서, 이 변이체는 중쇄의 29번 위치의 메티오닌이 이소루신으로 치환된 것이다.
1.12.1(D19A)이란, 특정 아미노산 돌연 변이를 1개 함유하는 재조합 mAb으로서 발현된 mAb1.12.1 변이체를 의미하는 것으로서, 이 변이체는 경쇄의 19번 위치의 아스파라긴산이 알라닌으로 치환된 것이다.
본원에 사용된 "세포의 이상 성장"이란 용어는, 달리 특정하지 않는 한, 정상적인 조절 기작과 독립적인(예를 들어, 접촉에 의해 억제되지 않는) 세포 성장을 의미하는 것이다.
본원에 사용된 "인접한"이란 용어는, 뉴클레오티드 서열이 서로 직접적으로 부착되어 있으며, 삽입 뉴클레오티드(intervening nucleotide)를 가지지 않는 경우를 의미하는 것이다. 예를 들어, 5원 뉴클레오티드(pentanucleotide)인 5'-AAAAA-3'와 3원 뉴클레오티드(trinucleotide)인 5'-TTT-3'가 5'-AAAAATTT-3' 또는 5'-TTTAAAAA-3'의 형태로 연결될 경우, 상기 5원 뉴클레오티드는 상기 3원 뉴클레오티드에 인접하여 존재하는 것이지만, 이 두 뉴클레오티드들이 5'-AAAAACTTT-3'의 형태로 연결될 경우에는 인접하여 존재하는 것이 아니다.
본원에 사용된 "제제"란 용어는, 화학적 화합물이나, 이 화학적 화합물, 생물학적 거대 분자 또는 생물학적 물질로부터 유래하는 추출물의 혼합물을 의미하는 것이다.
본원에 사용된 질병, 질환 또는 병상을 "경감시키다"란 용어는, 이 질병, 질환 또는 병상에 있어서 이것의 증상의 심각성을 감소시키는 것을 의미한다. 여기에는 치료 방법을 실시하기 전이나 실시하지 않았을 때 환자의 종양의 크기, 성장 및/또는 질량, 전이 정도 또는 진행 과정 등과 비교하였을 때, 치료 방법을 실시한 환자의 종양의 크기, 성장 및/또는 질량, 전이 정도 또는 진행 과정 등에 영향을 주는 것을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본원에 사용된 두문자어 "Id1"은, 신생 혈관 형성에 중요한 역할을 하는 ALK-1의 특이적 하류 표적 유전자인 Id1 유전자를 의미하는 것이다. 상기 Id1 유전자는 단백질 즉, 천연 생성 신생 혈관 형성 억제 인자인 트롬보스폰딘-1(TSP-1)의 생산을 중지시킴으로써, 임의의 암에서 신생 혈관 형성 경로를 억제하는 것이라고 보고된 바 있다. 예를 들어, 상기 Id1 유전자는 흑색종, 유방암, 두부 및 경부 암, 뇌종양, 자궁 경부암, 전립선암, 췌장암 및 고환 암에서 다량 발현되어, TSP-1의 발현량을 감소시키고, 또한 종양 혈관 형성을 촉진하는 것으로 보고된바 있다[Volpert, Olga V.외 다수, "Id1 regulates angiogenesis through transcriptional repression of thrombospondin- 1," Cancer Cell, Dec. 2002, Vol. 2, pp. 473-483].
본원에 사용된 "Smad"란 용어는, 선충에서 인간에 이르기까지의 종에서 발견되는 Smad 도메인 단백질을 의미하는 것이다. 이와 같이 고도로 보존된 단백질은 DNA와 접촉하는 N-말단 MH1 도메인을 함유하며, 포크헤드-결합(ForkHead-associated; FHA) 도메인과 상당히 유사한 C-말단 MH2 도메인과는 짧은 링커 부위에 의해 격리되어 있다. FHA 및 Smad(MH2) 도메인은 2개의 시트에 11개의 베타 사슬이 그리스 열쇠 형상으로 존재하는 샌드위치로 이루어진 공통 구조를 갖는다. Smad 단백질은, 세포 표면에 있는 수용체 Ser/Thr 단백질 키나제로부터 핵으로의 TGF-베타/액티빈/BMP-2/4 시토킨에 의한 신호 전달을 매개한다. Smad 단백질은 3개의 기능 군으로 분류된다: 즉, 리포터-조절 Smad(R-Smad) 예를 들어, Smad1, Smad2, Smad3, Smad5 및 Smad8[상기 일원들은 각각 리간드-특이적 신호 전달 경로에 관여함]; 보조 매개 인자 Smad(co-Smad) 예를 들어, Smad4[이는 신호 전달에 관여하는 R-Smad와 상호 작용을 함]; 그리고, 억제 Smad(I-Smad) 예를 들어, Smad6 및 Smad7[이는 R-Smad 와 Co-Smad의 활성화를 차단하여, 신호 전달 경로를 하향 조절함].
본원에 사용된 "TGF-베타"란 용어는, 세포 성장과 분화를 조절하는 다 기능성 시토킨 군을 구성하는 형질 전환 성장 인자(TGF-베타-1∼5)를 의미하는 것이다. 형질 전환 성장 인자(TGF)는 천연에 존재하는 다수의 특성 규명된 성장 인자 중 하나이다. 이는 중증 합병성 면역 결핍증이 발생한 "SCID" 마우스에서 중요한 역할을 담당한다. 다수의 세포들이 TGF-베타를 합성하며, 본질적으로 모든 세포들이 이 펩티드에 대한 특이적 수용체를 가진다. TGF-베타는 다수의 기타 펩티드 성장 인자의 작용을 조절하며, 이 성장 인자의 영향력을 양으로나 음으로 유도시킨다. TGF-베타는 상피 세포 내에서 성장 억제 효과를 나타내는 종양 억제 시토킨이다. TGF-β는 또한 상피-대-간엽 전이를 유도함으로써 종양 프로모터로서의 역할을 할 수도 있다. TGF-β는 세포 주기 진행 과정에 관여하는 몇몇 단백질들을 불활성화하므로, 상피 세포를 세포 주기 중 G1 기에 머무르게 만들어, 이 상피 세포에서 성장 억제 효과를 나타낸다. 상기 단백질은 이황화-결합 동종 이량체의 형태로서 작용을 한다. 이 단백질 서열의 C-말단에는 여러 개의 시스테인 잔기가 존재하며, 이 시스테인 잔기는 나사와 유사한 형태로 배열되어 있는, 맞물린 형태의 이황화 결합을 형성한다. 유사한 "시스틴-나사" 배열은 이것의 정밀한 부분의 형태가 상이하지만, 전압-게이팅 Ca2+ 통로에 결합하는 신경 독소와 몇몇 효소 억제 인자의 구조에서 발견되었다. TGF-베타 유전자는 차등적으로 발현되는데, 이는 곧, 다양한 TGF-베타 류가 생체 내에서의 생리학적 역할이 구별될 수 있음을 말해주는 것이다.
본원에 사용된 "TGF-베타-1"이란 용어는, 형질 전환 성장 인자 베타 수용체 제1형을 의미하는 것으로서, 전구체 단백질의 C-말단에서 단백 분해에 의해 전달되어 유도된 112개의 아미노산 잔기들로 이루어진 펩티드이다. 성체인 쥣과 동물의 조직 내 TGF-베타-1 mRNA 수준을 관찰하면, 비장, 폐 및 태반 내에서 다량으로 발현됨을 알 수 있다. TGF-베타-1은 병리학적 과정에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 생각된다.
본원에 사용된 "SCID"란 용어는, 중증 합병성 면역 결핍증이 발생한 마우스를 의미하는 것이다.
본원에 사용된 "HUVEC"란 용어는, 인간의 제대 정맥 내피 세포를 의미하는 것이다.
본원에 사용된 "아미노산"은, 이하 표에 제시된 바와 같이, 아미노산의 생략하지 않은 이름, 아미노산에 해당하는 3 문자 암호, 또는 아미노산에 해당하는 1 문자 암호로 표시한다.
Figure pat00001
본원에 사용된, 20개의 통상적인 아미노산들 및 이들의 약어는 통상의 사용법에 따른 것이다. 본원에 참고용으로 인용되어 있는 문헌[Immunology-A Synthesis (2nd Edition, E. S. Golub and D. R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)]을 참조하시오.
"보존적 아미노산 치환"은 어떤 아미노산 잔기가 화학적 특성(예를 들어, 전하 또는 소수성)이 유사한 측쇄 R기를 가지는 다른 아미노산으로 치환되는 경우를 의미한다. 일반적으로, 보존적 아미노산 치환은 실질적으로 단백질의 기능상 특성을 바꾸지는 않을 것이다. 2개 이상의 아미노산 서열이 보존적 치환에 의해 서로 달라진 경우, 서열 동일성 % 또는 유사성 정도는 치환의 보존적 특성에 맞추어서 바로 상향 조정될 수 있다. 이와 같이 조정하기 위한 수단은 당 업자에게 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Pearson, Methods Mol. Biol. 243:307-31 (1994)]을 참조하시오.
유사한 화학적 특성을 보유하는 측쇄를 가지는 아미노산 군의 예로서는, 1) 지방족 측쇄: 글리신, 알라닌, 발린, 루신 및 이소루신; 2) 지방족-하이드록실 측쇄: 세린 및 트레오닌; 3) 아미드-함유 측쇄: 아스파라긴 및 글루타민; 4) 방향족 측쇄: 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판; 5) 염기성 측쇄: 리신, 아르기닌 및 히스티딘; 6) 산성 측쇄: 아스파르트산 및 글루탐산; 및 7) 황-함유 측쇄:시스테인 및 메티오닌을 포함한다. 바람직한 보존적 아미노산 치환 군으로서는 발린-루신-이소루신, 페닐알라닌-티로신, 리신-아르기닌, 알라닌-발린, 글루타메이트-아스파르테이트 및 아스파라긴-글루타민이 있다.
대안적으로, 보존적 치환은, 본원에 참고용으로 인용되어 있는 문헌[Gonnet외 다수, Science 256:1443-45 (1992)]에 개시된 바와 같은, PAM250 로그-유사성 매트릭스(PAM250 log-likelihood matrix)에 있어서 양의 값을 가지는 임의의 변이이다. "중간 정도로 보존적인" 치환은 상기 PAM250 로그-유사성 매트릭스에 있어서 음이 아닌(nonnegative) 값을 가지는 임의의 변이이다.
임의의 구체예에서, 항-ALK-1 항체 또는 이의 항원 결합부에 대한 아미노산 치환으로서는 다음과 같은 것들이 있다: (1) 단백 분해에 대한 민감성을 감소시키는 것, (2) 산화에 대한 민감성을 감소시키는 것, (3) 단백질 복합체를 형성하는 결합 친화성을 바꾸는 것, 그리고 (4) 이러한 유사체의 기타 물리 화학적 특성 또는 기능상의 특성을 부여하거나 변형시키되, ALK-1에 대한 특이 결합성은 유지시키는 것. 유사체는 정상적으로 생성되는 펩티드 서열에 대한 다수의 치환을 포함한다. 예를 들어, 단일 또는 다수 회의 아미노산 치환, 바람직하게는 보존적 아미노산 치환은 정상적으로 생성되는 서열 예를 들어, 분자들을 상호 접촉시키는 도메인(들)의 외부에 존재하는 폴리펩티드의 일부에서 이루어질 수 있다. 아미노산 치환은 또한 폴리펩티드의 활성을 개선할 수 있도록 분자들을 상호 접촉시키는 도메인(들) 내에서 이루어질 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 실질적으로 모 서열의 구조적 특성을 변이시키지 않는데; 예를 들어, 아미노산 치환은 모 서열에 존재하는 면역 글로불린 결합 도메인을 구성하는 역-평형 β-시트를 변형시키지 않아야 하며, 또는 모 서열의 특징을 이루는 2차 구조의 다른 형태를 파괴하지 않아야 한다. 일반적으로, 글리신과 프롤린은 역-평형 β-시트에 사용되지 않을 것이다. 업계에서 인식되고 있는 폴리펩티드 2차 및 3차 구조에 관하여는 본원에 참고용으로 인용되어 있는, 문헌[Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N. Y. (1991)); 및 Thornton외 다수, Nature 354:105 (1991)]에 개시되어 있다.
펩티드에 대한 서열 유사성(이를 서열 동일성이라고도 칭함)은 통상적으로 서열 분석 소프트웨어를 사용하여 측정된다. 단백질 분석용 소프트웨어는 다양한 치환, 결실 및 기타 변형 예를 들어, 보존적 아미노산 치환에 부여된 유사성의 측정치를 이용하여, 유사한 서열을 매치시킨다. 예를 들어, GCG는 밀접하게 관련되어 있는 폴리펩티드 예를 들어, 상이한 유기체 종으로부터 유래하는 상동성 폴리펩티드 사이, 또는 야생형 단백질과 이의 돌연 변이 단백질 사이의 서열 상동성 또는 서열 동일성을 측정하기 위한 디폴트 매개 변수와 함게 사용될 수 있는 프로그램 예를 들어, "Gap" 및 "Bestfit"을 포함한다. 예를 들어, GCG 버젼 6.1을 참조하시오. 폴리펩티드 서열은 또한 디폴트값 또는 추천 매개 변수를 이용하는, GCG 버젼 6.1의 프로그램을 사용하여 비교될 수 있다. FASTA(예를 들어, FASTA2 및 FASTA3)는 의문 서열 및 검색 서열 사이에 가장 많이 겹쳐지는 부위의 서열 동일성 %와 이 부위의 서열 배열을 제공한다[Pearson, Methods Enzymol. 183:63-98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol. 132:185-219 (2000)]. 본 발명의 서열을 상이한 유기체로부터 유래하는 다수의 서열을 함유하는 데이터베이스와 비교할 때 사용되는 기타 바람직한 알고리즘으로서는 컴퓨터 프로그램 BLAST, 구체적으로 blastp 또는 tblastn(디폴트 매개변수를 이용함)이 있다. 예를 들어, 본원에 참고용으로 인용되어 있는 문헌[Altschul외 다수, J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990); Altschul외 다수, Nucleic Acids Res. 25:3389-402 (1997)]을 참조하시오.
상동성이 비교된 폴리펩티드 서열의 길이는 일반적으로 약 16개 이상의 아미노산 잔기, 일반적으로는 약 20개 이상의 잔기, 더욱 일반적으로는 약 24개 이상의 잔기, 통상적으로는 약 28개 이상의 잔기, 그리고 바람직하게는 약 35개 이상의 잔기일 것이다. 다수의 상이한 유기체로부터 유래하는 서열을 포함하는 데이터베이스를 검색할 때, 아미노산 서열을 비교하는 것이 바람직하다. 본원에 사용된 "유사체"란 용어는, 추론된 천연-생성 아미노산 서열의 일부와 실질적으로 동일한 25개 이상의 아미노산의 분절을 포함하며, 이 천연-생성 폴리펩티드의 특성들 중 하나 이상을 가지는 폴리펩티드를 의미하는 것이다. 통상적으로, 폴리펩티드 유사체는 천연-생성 서열과 관련하여 보존적 아미노산 치환(또는 부가 또는 결실)을 포함한다. 유사체는 통상적으로 그 길이가 20개 이상의 아미노산, 바람직하게는 50개 이상의 아미노산 또는 그 이상이며, 종종 전장의 천연-생성 폴리펩티드만큼 길 수도 있다.
펩티드 유사체는 일반적으로 제약 산업 분야에서 주형 펩티드의 특성과 유사한 특성을 갖는 비-펩티드 약물로서 사용된다. 이와 같은 비-펩티드 화합물류를 "펩티드 모의체(peptide mimetics)" 또는 "펩티도모의체(peptidomimetics)"라고 부른다[Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29 (1986); Veber and Freidinger TINS p.392 (1985); 및 Evans외 다수 J. Med. Chem. 30:1229 (1987); 상기 문헌들은 본원에 참고용으로 인용되어 있음]. 이와 같은 화합물은 종종 컴퓨터화된 분자 모델링의 도움을 받아 개발된다.
치료학적으로 유용한 펩티드와 구조적으로 유사한 펩티드 모의체는 균등한 치료 효과 또는 예방 효과를 나타내는데 사용될 수 있다. 일반적으로, 펩티도모의체는 패러다임 폴리펩티드[즉, 생화학적 특성 또는 약리학적 활성을 가지는 폴리펩티드] 예를 들어, 인간의 항체와 구조적으로 유사하지만, -CH2NH-, -CH2S-, -CH2- CH2-, -CH=CH-(시스 및 트랜스), -COCH2-, -CH(OH)CH2- 및 CH2SO-로 이루어진 군으로부터 선택되는 결합에 의하여 임의로 치환되는(당 업계에 널리 공지된 방식에 의함) 하나 이상의 펩티드 결합을 가진다. 공통 서열 중 하나 이상의 아미노산을 동일한 종류의 D-아미노산으로 체계적으로 치환하는 것(예를 들어, L-리신 대신 D-리신으로 치환하는 것)은 더욱 안정한 펩티드를 생산하는데 사용될 수 있다. 뿐만 아니라, 공통 서열 또는 실질적으로 동일한 공통 서열 변이체를 포함하는 구속 펩티드(constrained peptide)는 당 업계에 공지된 방법 예를 들어, 펩티드를 고리화시키는 분자 내 이황화 결합을 형성할 수 있는 내부 시스테인 잔기를 첨가하는 방법에 의하여 생산될 수 있다[Rizo and Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992); 본원에 참고용으로 인용됨].
원 상태의 "항체" 또는 "면역 글로불린(Ig)"은 2개 이상의 중쇄(H)(약 50∼70kDa) 및 2개의 경쇄(L)(약 25kDa)가 이황화 결합에 의해 서로 연결되어 있다. 경쇄에는 2가지 유형만이 존재한다: 즉 λ 및 κ. 인간에 있어서, 상기 경쇄는 유사하지만, 각각의 항체에는 한 가지 유형만이 존재한다. 중쇄는 뮤, 델타, 감마, 알파 또는 엡실론으로서 분류되며, 이것들은 항체의 동 기준 표본형을 각각 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE로서 정의해준다. 일반적으로, 문헌[Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)); 본원에 그 자체로서 참고용으로 인용됨]을 참조하시오. 바람직한 구체예에서, 상기 항체로서는 IgG, 즉, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 아형이 있다. 더욱 바람직한 구체예에서, 상기 항-ALK-1 항체로서는 하위 군인 IgG2이 있다.
각각의 중쇄는 중쇄 가변 도메인(VH) 및 중쇄 불변부(CH)로 구성되어 있다. 중쇄 불변부는 3개의 도메인 즉, CH1, CH2 및 CH3으로 구성되어 있다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 도메인(VL)과 경쇄 불변부로 구성되어 있다. 경쇄 불변부는 하나의 도메인 즉, CL로 구성되어 있다. 경쇄 및 중쇄 내에서, 가변부 및 불변부는 약 12개 이상의 아미노산으로 이루어진 "J" 부위에 의해 연결되어 있는데, 여기서, 상기 중쇄는 또한 약 3개 이상의 아미노산으로 이루어진 "D" 부위를 포함하기도 한다. 상기 VH 및 VL 부위는 또한 더욱 보존적인 부위("틀 부위(FR)"라 칭함)가 중간에 삽입된 변이 부위("상보성 결정 부위(CDR)"라 칭함)로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 3개의 CDR과 4개의 FR을 다음과 같은 순서로 아미노 말단에서 카복실 말단으로 정렬하여 포함하고 있다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 각각의 도메인에 대한 아미노산의 번호 메김은 캐벗(Kabat) 정의에 따라서 이루어진다[Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD (1987 and 1991)), 또는 Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Chothia외 다수, Nature 342:878-883 (1989)].
각각의 중쇄/경쇄 쌍(VH 및 VL)의 가변 도메인은 항원과 상호 작용을 하는 항체 결합 위치를 형성한다. 그러므로, 예를 들어, 원 상태의 IgG 항체는 2개의 결합 위치를 가진다. 이 작용성 또는 이중 특이적 항체의 경우를 제외하고, 상기 2개의 결합 위치는 동일하다. 항체의 불변부는 숙주 조직 또는 인자 예를 들어, 다양한 면역계 세포(예를 들어, 효과기 세포)와 전통적인 보체 시스템의 제1 성분(C1q) 및 면역 글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
항체는 이들 자신의 C 부위(소수의 C 부위)의 생물학적 효능을 유지하면서, 가능한 모든 병원체(다수의 V 부위)를 인지하는데 충분한 항원-결합 다양성을 가져야 한다. Ig 유전자는 소수의 C 부위와 함께 사용될 수 있도록 만드는 다수의 V 부위인 유전자 분절로부터 무작위로 함께 스플라이싱(splicing)된다. IgH, 카파 및 람다 사슬을 암호화하는 유전자 분절은 3개의 상이한 염색체상에서 발견된다. B 세포 발달 과정이 진행되는 동안, 재조합 효소는 인트론과 몇몇 엑손을 DNA로부터 제거하며, 이 분절들을 기능성 Ig 유전자로 스플라이싱한다.
포유 동물에 있어서 Ig 유전자 분절은 "가변성"(V), "다양성"(D), "접합"(J) 및 "불변성"(C) 엑손 군으로 정렬된다. V 카파(Vκ) 분절은 각각 카파 사슬 V 부위의 처음 2개의 CDR과 3개의 FR, 그리고 소수의 CDR3 잔기들을 암호화한다. J 카파(Jκ) 분절은 각각 나머지 CDR3 및 4번째 FR을 암호화한다. C 카파(Cκ)는 카파 경쇄의 완전한 C 부위를 암호화한다. 인간의 카파 사슬을 암호화하는 DNA는 약 40개의 기능성 V 카파(Vκ) 분절, 5개의 J 카파(Jκ) 분절 및 1개의 C 카파(Cκ) 유전자 분절, 그리고 종결 코돈을 함유하는 몇몇 유전자 분절("의사 유전자")을 포함한다. 인간의 람다(λ) 사슬 DNA는 약 30개의 기능성 V 람다(Vλ) 분절과, J 람다(Jλ) 및 C 람다(Cλ) 분절의 4개의 기능성 세트를 포함한다. 동일한 C 카파(Cκ)와 모두 짝을 이루는 J 카파(Jκ)와 달리, 특정 J 람다(Jλ)는 항상 이것과 상응하는 C 람다(Cλ)와 짝을 이룬다. 인간 H 사슬에 대한 DNA는 약 50개의 기능성 VH 분절, 30개의 DH 분절 그리고 6개의 JH 분절을 포함한다. 중쇄 가변 도메인에 있어서 처음 2개의 CDR 및 3개의 FR은 VH에 의해 암호화된다. CDR3은 VH의 몇몇 뉴클레오티드, DH의 전부 그리고 JH의 일부에 의해 암호화되지만, FR4는 JH 유전자 분절의 나머지 부분에 의해 암호화된다. 뿐만 아니라, 각각의 중쇄 도메인과 각각의 동 기준 표본형의 막 부위에 대한 DNA에는, 개별 유전자 분절들이 B 세포에 의해 발현되는 순서로 정렬되어 있다.
"폴리펩티드"라는 용어는, 천연의 또는 인공의 단백질, 단백질 단편 및 단백질 서열의 폴리펩티드 유사체를 포함하는 의미이다. 폴리펩티드는 단량체 또는 다량체일 수 있다.
"분리된 단백질", "분리된 폴리펩티드" 또는 "분리된 항체"라는 용어는, 그것이 유래된 기원이나 공급원에 따라서, (1) 천연 상태에서 함께 존재하는 성분들(천연의 상태에서 항체와 함께 존재하는 성분들)과 결합되어 있지 않거나, (2) 동일한 종으로부터 유래된 다른 단백질들이 제거되었거나, (3) 상이한 종으로부터 유래된 세포에 의하여 발현되었거나, 또는 (4) 천연에서 생성되지 않는 단백질, 폴리펩티드 또는 항체를 의미하는 것이다. 그러므로, 화학적으로 합성되었거나 또는 폴리펩티드가 본래 유래된 세포와는 상이한 세포 시스템 내에서 합성된 폴리펩티드는 그것의 천연 결합 성분으로부터 "분리"될 것이다. 단백질은 또한 당 업계에 널리 공지된 단백질 정제 기술을 이용하여 분리함으로써, 천연의 상태에서 결합되어 있던 성분이 실질적으로 제거될 수도 있다.
분리된 항체의 예로서는 ALK-1을 이용하여 친화도 정제된 항-ALK-1 항체와, 시험관 내에서 세포에 의해 합성된 항-ALK-1 항체를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
단백질 또는 폴리펩티드는, 시료의 약 60∼75% 이상이 한 가지 종류의 폴리펩티드일 때, "실질적으로 순수한", "실질적으로 균질한" 또는 "실질적으로 정제된" 것이다. 폴리펩티드 또는 단백질은 단량체 또는 다량체일 수 있다. 실질적으로 순수한 폴리펩티드 또는 단백질은 통상적으로 단백질 시료를 약 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% w/w, 더욱 일반적으로는 약 95% w/w를 포함할 수 있으며, 바람직하게는 99% 이상 순수할 수 있다. 단백질의 순도 또는 균질도는 당 업계에 널리 공지된 다수의 방법 예를 들어, 단백질 시료의 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동을 수행한 후, 상기 겔을 당 업계에 널리 알려진 염색 시약으로 염색하여 하나의 폴리펩티드 밴드를 가시화하는 방법에 의해 표현될 수 있다. 임의의 목적을 위하여, HPLC 또는 기타 정제 업계에 널리 공지된 수단에 의하여 고 해상도의 결과가 제공될 수 있다.
본원에 사용된 "폴리펩티드 단편"이란 용어는, 아미노-말단 및/또는 카복시-말단이 결실되되, 나머지 아미노산 서열은 천연-생성 서열 내 상응하는 위치와 동일한 폴리펩티드를 의미하는 것이다. 몇몇 구체예에서, 단편의 길이는 5, 6, 8 또는 10개 이상의 아미노산이다. 다른 구체예에서, 상기 단편의 길이는 14개 이상, 20개 이상, 50개 이상, 또는 70, 80, 90, 100, 150 또는 200개 이상의 아미노산이다.
본원에 사용된 "유사체" 또는 "폴리펩티드 유사체"란 용어는, 몇몇 참조 아미노산 서열과 실질적으로 동일하고, 참조 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 기능 또는 활성을 가지는 분절을 포함하는 폴리펩티드를 의미하는 것이다. 통상적으로, 폴리펩티드 유사체는 참조 서열에 대한 보존적 아미노산 치환(또는 삽입 또는 결실)을 포함한다. 유사체는 그 길이가 20 또는 25개 이상의 아미노산이거나, 또는 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 또는 200개 이상의 아미노산일 수 있으며, 전장 폴리펩티드 정도로 길 수도 있다. 본 발명의 몇몇 구체예는 생식 계열 아미노산 서열로부터 유래하며, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 또는 17개의 치환 부를 가지는 폴리펩티드 유사체 항체 또는 폴리펩티드 단편을 포함한다. 항체 또는 면역 글로불린 분자의 단편 또는 유사체는 본 명세서에 개시되어 있는 바에 따라서, 당 업자에 의해 용이하게 제조될 수 있다.
본원에 사용된 항체의 "항원 결합부"(또는 간단히 "항체의 일부")라는 용어는, 항원(예를 들어, ALK-1 또는 ALK-1의 ECD)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 의미하는 것이다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 실행될 수 있음이 알려져 있다. 항체의 "항원 결합부"라는 용어에 포함된 결합 단편의 예로서는 (i) Fab 단편 즉, VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편; (ii) F(ab')2 단편 즉, 2개의 Fab 단편이 힌지부에서 이황화 결합에 의해 결합되어 있는 2가 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (v) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편(Ward외 다수, (1989) Nature 341 :544-546); 그리고 (vi) 분리된 상보성 결정 부위(CDR)를 포함한다. 뿐만 아니라, Fv 단편의 2개의 도메인인 VL 및 VH는 별도의 유전자에 의해 암호화되지만, 이들 도메인은, 상기 별도 유전자들이 단일 단백질 사슬로 형성될 수 있도록 만들어 주어, VL 및 VH 부위가 짝을 이루어 1가의 분자(단일 사슬 Fv(scFv)라고도 알려짐)가 형성되도록 만들 수 있는, 합성 링커에 의한 재조합 방법을 이용하여 서로 결합될 수 있다[예를 들어, Bird외 다수 Science 242:423-426 (1988) 및 Huston외 다수 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988) 참조]. 이러한 단일 사슬 항체는 또한 항체의 "항원 결합부"라는 용어에 포함되기도 한다. 단일 사슬 항체의 다른 형태의 것 예를 들어, 다이아바디도 포함된다. 다이아바디는 2가이며, 이중 특이적인 항체로서, 이것의 VH 및 VL 도메인은 단일 폴리펩티드 사슬에서 발현되되, 동일한 사슬 상에 존재하는 2개의 도메인들 간에 짝을 형성하기에는 너무 짧은 링커를 사용하므로, 이 도메인들이 다른 사슬의 상보성 도메인과 강제로 짝을 형성하도록 하여, 2개의 항원 결합 위치를 생성하는 것이다[예를 들어, Holliger외 다수 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993); Poljak외 다수 Structure 2:1121-1123 (1994) 참조].
또한, 항체 및 이의 항원 결합부는 보다 큰 면역 접합체(immunoadhesin) 분자 즉, 항체 또는 항체의 일부와 하나 이상의 기타 단백질 또는 펩티드를 공유 결합 또는 비공유 결합시켜 형성된 면역 접합체 분자의 일부일 수 있다. 이러한 면역 접합체 분자를 제조하는 방법의 예로서는 스트렙타비딘 중심 부위를 사용하여 4 량체인 scFv 분자를 형성하는 것[Kipriyanov외 다수 Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101 (1995)]과, 시스테인 잔기, 마커 펩티드 및 C-만단 폴리히스티딘 태그를 사용하여 2가 및 바이오틴화된 scFv 분자를 형성하는 것[Kipriyanov외 다수 Mol. Immunol. 31 :1047-1058 (1994)]을 포함한다. 기타 예로서는, 항체로부터 유래하는 하나 이상의 CDR이 공유적으로 또는 비 공유적으로 분자에 통합되어, 목적으로 하는 항원 예를 들어, ALK-1 또는 ALK-1의 ECD에 특이적으로 결합하는 면역 접합체로 만드는 것을 포함한다. 이러한 구체예에서, CDR은 더욱 큰 폴리펩티드 사슬의 일부로서 통합될 수 있거나, 다른 폴리펩티드 사슬에 공유 결합될 수 있거나, 또는 비 공유적으로 통합될 수 있다.
항체의 일부 예를 들어, Fab 및 F(ab')2 단편은, 전체 항체를 종래의 기술 예를 들어, 파페인 또는 펩신 분해법을 이용하여 분해하여, 이 전체 항체로부터 제조될 수 있다. 뿐만 아니라, 항체, 항체의 일부 및 면역 접합체 분자는 본원에 기술된 바와 같은 표준적인 재조합 DNA 기술을 이용하여 생산될 수 있다.
본원에 사용된 "인간 항체"라는 용어는, 가변 도메인 서열 및 불변 도메인 서열이 인간의 서열인 임의의 항체를 의미하는 것이다. 상기 용어에는 인간의 유전자로부터 유래하는 서열을 가지되, 예를 들어, 발생할 수 있는 면역원성이 감소하고, 친화성이 증가하며, 바람직하지 않게 폴딩(folding)시킬 수 있는 시스테인이 제거되도록 변이된 항체를 포함한다. 상기 용어에는 또한 인간 세포에 통상적으로 발생하지 않는 글리코실화가 발생한, 비-인간 세포 내에서 재조합적으로 생산되는 항체를 포함한다. 이러한 항체는 이하에 기술된 바와 같은 다양한 방법으로 제조될 수 있다.
본원에 사용된 "중화 항체", "억제 인자 항체" 또는 길항 항체란 용어는, ALK-1/TGF-베타-1/Smad1 신호 전달 경로를 억제하는 항체를 의미하는 것이다. 바람직한 구체예에서, 상기 항체는 상기 ALK-1/TGF-베타-1/Smad1 신호 전달 경로를 약 20% 이상, 바람직하게는 40%, 더욱 바람직하에는 60%, 더더욱 바람직하게는 80%, 또는 가장 바람직하게는 85%까지 억제한다. 인간 항-ALK-1 항체의 중화 또는 억제 잠재력은 예를 들어, 실시예 12에 기술된 바와 같이, 이 항체가 ALK-1의 특이적 하류 표적 유전자인 Id1의 상승 조절을 억제하는 능력; 실시예 13에 기술된 바와 같이, 이 항체가 Smad1 인산화를 억제하는 능력[이는 LI-COR 바이오사이언시스(LI-COR Biosciences)로부터 시판되고 있는 오디세이 적외선 영상화 시스템을 이용하는 웨스턴 블로팅에 의해 측정됨]으로써 측정될 수 있다.
본원에 사용된 "키메라 항체"란 용어는, 2개 이상의 상이한 항체로부터 유래하는 부위들을 포함하는 항체를 의미하는 것이다. 예를 들어, 키메라 항체의 CDR 중 1개 이상은 인간 항-ALK-1 항체로부터 유래될 수 있다. 다른 예에서, CDR 전부는 인간의 항-ALK-1 항체로부터 유래될 수 있다. 다른 예에서, 상기 하나 이상의 인간 항-ALK-1 항체로부터 유래한 CDR은 키메라 항체에 합쳐질 수 있다. 예를 들어, 키메라 항체는 제1 인간 항-ALK-1 항체의 경쇄로부터 유래하는 CDR1, 제2 인간 항-ALK-1 항체의 경쇄로부터 유래하는 CDR2, 제3 인간 항-ALK-1 항체의 경쇄로부터 유래하는 CDR3을 포함할 수 있으며, 중쇄로부터 유래하는 CDR들은 하나 이상의 기타 항-ALK-1 항체로부터 유래할 수 있다. 뿐만 아니라, 틀 부위는 CDR 중 하나 이상이 유래된 항-ALK-1 항체 중 하나, 또는 하나 이상의 상이한 인간 항체로부터 유래될 수 있다. 뿐만 아니라, 본원에서 전술한 바와 같이, 키메라 항체는 하나 이상의 종의 생식 계열 서열로부터 유래하는 부분을 포함하는 항체를 포함한다.
몇몇 구체예에서, 본 발명의 키메라 항체는 인간화된 항-ALK-1 항체이다. 본 발명의 인간화된 항-ALK-1 항체는 하나 이상의 틀 부위의 아미노산 서열 및/또는 본 발명의 하나 이상의 인간 항-ALK-1 항체의 불변부의 최소한의 부분으로부터 유래하는 아미노산 서열을 포함하며, 추가로 비-인간 항-ALK-1 항체로부터 유래하는 서열 예를 들어, CDR 서열을 포함한다.
본원에 사용된 "ELISA"란 용어는, 효소-결합 면역 흡착 검정법을 의미하는 것이다. 이 검정법은 당 업자에게 널리 공지되어 있다. 이 검정법의 예로서는 문헌[Vaughan, T.J.외 다수, Nature Biotech. 14:309-314 (1996)]과, 본 출원의 실시예 2에서 살펴볼 수 있다.
본원에 사용된 "표면 플라스몬 공명법"이란 용어는, 예를 들어, 바이어코어™ 시스템[Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, N. J.]을 사용하는 바이오센서 매트릭스 내에서 단백질 농도 변화를 검출함으로써, 실시간으로 이중 특이적 상호 작용을 분석할 수 있는 광학 현상을 의미한다. 이에 관한 보다 자세한 설명에 관하여는 문헌[Jonsson외 다수, Ann. Biol. Clin. 51:19-26(1993); Jonsson외 다수, Biotechniques 11:620-627; Jonsson외 다수, J. Mol. Recognit. 8:125-131 (1995); 및 Johnsson외 다수, Anal. Biochem. 198:268-277 (1991)]을 참고하시오.
"친화도"란 용어는, 항원과 항체 간 서로 끌리는 성질을 나타내는 척도를 의미하는 것이다. 항원에 대한 항체의 고유의 끌리는 성질을 통상적으로 특정 항체-항원 상호 작용의 결합 친화도 평형 상수(KD)로서 나타낸다. 항체는 KD가 1mM 이하, 바람직하게는 100nM 이하일 때 항원과 특이적으로 결합한다고 볼 수 있다. KD 결합 친화도 상수는 예를 들어, 실시예 7 및 실시예 8에 기술된 바와 같이, 바이어코어™ 시스템을 이용하는 표면 플라스몬 공명법에 의해 측정될 수 있다.
"Koff"란 용어는, 특정의 항체-항원 상호 작용의 해리 속도의 상수를 의미하는 것이다. Koff 해리 속도 상수는 예를 들어, 실시예 7 및 실시예 8에 기술된 바와 같이, 바이어코어™ 시스템을 이용하는 표면 플라스몬 공명법에 의해 측정될 수 있다.
"결합성(avidity)"이란 용어는, 항체의 친화도와 원자가 둘 다를 바탕으로 하는, 항체와 항원의 기능상 결합력을 의미하는 것이다. 본원에서 상기 용어는, 면역 글로불린상에 존재하는 다수 개의 항원 결합 위치에서 일어나는 친화도가 증가된 경우를 의미한다.
본원에 사용된 "분자 선택도"란 용어는, 특이 항원에 대한 항체의 결합 친화도가 다른 항원에 대한 항체의 결합 친화도보다 큰 경우의 결합 친화도를 의미하는 것이다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 ALK-2∼ALK-7에 비하여 ALK-1에 대해 선택적일 수 있는데, 이는 곧, ALK-1에 대한 항체의 결합 친화도가 ALK-2∼ALK-7에 대한 항체의 결합 친화도보다 2배 이상 예를 들어, 4배, 10배, 50배 또는 100배 이상 크다는 것을 의미한다. 이와 같은 결합 친화도는 당 업자에게 공지된 표준적인 기술을 이용하여 측정될 수 있다.
"에피토프"란 용어는, 면역 글로불린 또는 T-세포 수용체와 특이적으로 결합할 수 있거나, 아니면 임의의 분자와 상호 작용할 수 있는 임의의 단백질 결정기를 포함한다. 에피토프 결정기는 일반적으로 분자의 화학적으로 활성인 표면기들 예를 들어, 아미노산 또는 탄수화물 또는 당의 측쇄를 포함하며, 일반적으로는 특이적인 3차원 구조 특성과 특이적인 하전 특성을 가진다. 에피토프는 "선형"이거나 "입체형"일 수 있다. 선형인 에피토프에 있어서, 단백질과 상호 작용성인 분자(예를 들어, 항체) 간 상호 작용 위치는 전부 단백질의 1차 아미노산 서열을 따라서 일렬로 존재한다. 입체형인 에피토프에 있어서, 상호 작용 위치는 단백질 상에 산재되어 있는 아미노산 잔기들을 횡단하면서 존재한다. 일단, 항원 상에 존재하는 바람직한 에피토프가 확인되면, 예를 들어, 본 발명에 개시된 기술을 이용하여, 상기 확인된 에피토프에 대한 항체를 생산할 수 있다. 대안적으로, 발견 과정에 있어서, 항체의 생산 및 특성 규명을 통하여, 바람직한 에피토프에 대한 정보를 유추할 수 있다. 이 정보로부터, 동일한 에피토프와의 결합 여부에 대해 항체를 경쟁적으로 스크리닝할 수 있는 것이다. 이를 위한 방법으로서는 교차 경쟁 연구를 수행하여, 서로 경쟁적으로 결합하는 항체 즉, 항원과의 결합에 대해 경쟁하는 항체를 발견하는 것이 있다. 항체의 교차 경쟁성을 바탕으로 하여 항체를 "묶는(binning)" 고 처리량 방법에 관하여는 국제 특허 출원 공보 WO 03/48731에 개시되어 있다.
본원에 사용된 "묶음(binning)"이란 용어는, 항원 결합 특성을 바탕으로 하여 항체를 군으로 묶는 것을 의미하는 것이다. 이와 같이 묶는 것은 테스트된 항체 전부에 대하여 관찰되는 결합 패턴이 얼마나 상이한지에 따라서, 어느 정도 임의적이기도 하다. 그러므로, 묶는 것은 기타 수단에 의하여 확인된 에피토프와 항상 상관되어 있는 것은 아니며, 에피토프를 한정하는데 사용되어서도 안 될 것이다.
본원에서 항체와 관련하여 사용된 "경쟁하다"라는 용어는, 제1 항체 또는 이의 항원 결합부가 항원과의 결합에 대해 제2의 항체 또는 이의 항원 결합부와 경쟁하는 경우를 의미하는 것으로서, 여기서, 제2 항체의 존재 하에서의 상기 제1 항체와 이것의 동 기원 에피토프와의 결합은, 제2 항체의 부재 하에서의 상기 제1 항체와 이것의 동 기원 에피토프와의 결합에 비하여 상당 수준 감소한다. 대안적으로, 제2 항체와 이것의 에피토프와의 결합은 제1 항체의 존재 하에서 상당 수준 감소할 수도 있다. 즉, 제1 항체는, 제1 항체와 이것의 각각의 에피토프와의 결합을 억제하는 제2 항체 없이도, 제2 항체가 이것의 에피토프와 결합하는 것을 억제할 수 있다는 것이다. 그러나, 각각의 항체가 다른 항체와 이것의 동 기원 에피토프 또는 리간드의 결합을 상당 수준 억제하는 경우, 그 정도가 동일하거나, 더욱 크거나 또는 더욱 작음에 따라서, 항체는 그것의 각 에피토프(들)와의 결합에 대해 서로 "교차 경쟁하는 것"으로서 간주된다. 항체와 경쟁하는 것과 교차 경쟁하는 것은 둘 다 본 발명에 포함된다. 본원에 교시된 바를 바탕으로 하여, 이와 같은 경쟁 또는 교차 경쟁이 발생하는 기작(예를 들어, 입체 장애, 형태 변화, 또는 공통 에피토프 또는 이의 일부와의 결합 등)에 상관없이, 이와 같은 경쟁 항체 및/또는 교차 경쟁 항체도 본 발명에 포함되며, 또한 본원에 개시된 방법에 유용할 수 있음을 당 업자는 알 수 있을 것이다.
본원에 있어서 "폴리뉴클레오티드"란 용어는, 길이가 10 염기 이상인 뉴클레오티드의 다량체 형태의 것 즉, 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드, 또는 상기 두 가지 유형 중 어느 하나의 변형된 형태의 뉴클레오티드를 의미하는 것이다. 상기 용어는 단일 및 이중 사슬 형태의 것을 포함한다.
본원에 사용된 "분리된 폴리뉴클레오티드"란 용어는, 게놈 DNA, cDNA 또는 이것의 합성 기원 또는 몇몇 혼합물을 의미하는 것으로서, 그 기원에 따라서, 상기 "분리된 폴리뉴클레오티드"는 (1) 천연 상태에서 함께 발견되는 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부와 결합되어 있지 않거나, (2) 그것이 천연의 상태에서는 결합되어 있지 않은 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하도록 결합되어 있거나, 또는 (3) 천연의 상태에서 더욱 큰 서열의 일부로서 존재하지 않는 폴리뉴클레오티드이다.
본원에 사용된 "천연 생성 뉴클레오티드"란 용어는, 데옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드를 포함한다. 본원에 사용된 "변형된 뉴클레오티드"란 용어는, 당 기 등이 변형 또는 치환된 뉴클레오티드를 포함한다. 본원에 있어서 "올리고뉴클레오티드 결합"이란 용어에는, 올리고뉴클레오티드 결합 예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로디셀레노에이트, 포스포로어닐로티오에이트, 포스포라닐라데이트 및 포스포로아미데이트 등을 포함한다. 예를 들어, 본원에 참고용으로 인용되어 있는 문헌[LaPlanche외 다수, Nucl. Acids Res. 14:9081 (1986); Stec외 다수, J. Am. Chem. Soc. 106:6077 (1984); Stein외 다수, Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988); Zon외 다수, Anti-Cancer Drug Design 6:539 (1991); Zon외 다수, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991)); 미국 특허 제5,151,510호; Uhlmann and Peyman, Chemical Reviews 90:543 (1990)]을 참조하시오. 원한다면, 올리고뉴클레오티드는 검출용 표지를 포함할 수 있다.
"작동 가능하도록 결합된" 서열은 목적 유전자와 인접하여 존재하는 발현 제어 서열과, 가로 질러 작용하거나 또는 멀리 떨어져서 작용하여 목적 유전자를 제어하는 발현 제어 서열 둘 다를 포함한다.
본원에 사용된 "발현 제어 서열"이란 용어는, 암호화 서열이 결찰되어 이 암호화 서열을 발현 및 가공시키는데 필요한 폴리뉴클레오티드 서열을 의미하는 것이다. 발현 제어 서열은 적당한 전사 개시, 종결, 프로모터 및 인핸서 서열; 효율적인 RNA 가공 신호 예를 들어, 스플라이싱 및 폴리아데닐화 신호; 세포질 mRNA를 안정화시키는 서열; 번역 효율을 증가시키는 서열(즉, 코작(Kozak) 공통 서열); 단백질의 안정성을 증강시키는 서열을 포함하며; 원하는 경우에는, 단백질 분비를 촉진하는 서열도 포함한다. 이와 같은 제어 서열의 성질은 숙주 유기체에 따라서 상이한데; 원핵 생물의 경우, 이러한 제어 서열로서는 일반적으로 프로모터, 리보좀 결합 위치, 그리고 전사 종결 서열을 포함하고; 진핵 생물의 경우, 이러한 제어 서열로서는 프로모터 및 전사 종결 서열을 포함한다. "제어 서열"이라는 용어는, 최소한 그 존재가 발현 및 가공 과정에 필수적인 모든 성분들을 포함하는 것이며, 그 존재가 유리한 부가 성분 예를 들어, 리더 서열 및 융합 파트너 서열을 포함할 수도 있다.
본원에 사용된 "벡터"란 용어는, 그것이 결합되어 있는 다른 핵산을 운반할 수 있는 핵산 분자를 의미하는 것이다. 몇몇 구체예에서, 상기 벡터로서는 플라스미드 즉, 부가 DNA 분절이 결찰될 수 있는 DNA의 환형 이중 사슬 조각이 있다. 몇몇 구체예에서, 상기 벡터로서는 바이러스 벡터 즉, 부가의 DNA 분절이 바이러스 게놈 내에 결찰될 수 있는 벡터가 있다. 몇몇 구체예에서, 상기 벡터는 이 벡터가 도입된 숙주 세포 내에서 자율적으로 복제할 수 있다[예를 들어, 박테리아 복제 기원을 가지는 박테리아 벡터 및 에피좀 포유동물 벡터]. 다른 구체예에서, 상기 벡터(예를 들어, 비-에피좀 포유동물 벡터)는 숙주 세포에 도입됨에 따라서 이 숙주 세포의 게놈에 통합될 수 있으며, 이로써, 숙주 세놈과 함께 복제된다. 뿐만 아니라, 임의의 벡터는 이 벡터에 작동 가능하도록 결합되어 있는 유전자를 발현시킬 수 있다. 이러한 백터를 본원에서 "재조합 발현 벡터"(또는 간단히 "발현 벡터")라고 칭한다.
본원에 사용된 "재조합 숙주 세포"(또는 간단히 "숙주 세포")라는 용어는, 재조합 발현 벡터가 도입된 세포를 의미하는 것이다. "재조합 숙주 세포" 및 "숙주 세포"는 특정의 목적 세포뿐만 아니라, 그러한 세포의 자손까지도 의미하는 것임을 이해해야 할 것이다. 돌연 변이나 환경에 의한 영향으로 인하여 후속 세대들에 변형이 일어날 수 있기 때문에, 실제로 이러한 자손들은 모 세포와 동일할 수는 없지만, 본원에 사용된 "숙주 세포"라는 용어의 범위에는 포함된다.
본원에 사용된 "생식 계열"이란 용어는, 항체 유전자 및 유전자 분절의 아미노산 서열 및 뉴클레오티드 서열이 생식 세포에 의해서 부모로부터 자손까지 전달될 때의 상기 항체 유전자 및 유전자 분절의 아미노산 서열 및 뉴클레오티드 서열을 나타내는 의미이다. 이 생식 계열 서열은 B 세포 성숙 과정에서 재조합 및 과변이 과정에 의해 변형된 성숙 B 세포 내에 존재하는 항체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열과는 구별된다. 특정 생식 계열을 "이용하는" 항체는 생식 계열 뉴클레오티드 서열 또는 이 뉴클레오티드 서열이 특정하는 아미노산 서열과 가장 밀접하게 정렬되는 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열을 가진다. 이러한 항체는 종종 생식 계열 서열에 비하여 돌연 변이된다.
핵산 서열과 관련된 내용 중에서 "서열 동일성 %"란 용어는, 최대로 상응하도록 정렬하였을 때, 2개의 서열 내에 존재하는 동일한 잔기들의 비율을 의미하는 것이다. 서열 동일성 비교 길이는 약 9개 이상의 뉴클레오티드, 일반적으로는 약 18개 이상의 뉴클레오티드, 더욱 일반적으로는 약 24개 이상의 뉴클레오티드, 통상적으로 약 28개 이상의 뉴클레오티드, 더욱 통상적으로 약 32개 이상의 뉴클레오티드, 그리고 바람직하게, 약 36개 또는 48개 이상의 뉴클레오티드로 이루어진 영역에 해당할 수 있다. 뉴클레오티드 서열 동일성을 측정하는데 사용될 수 있는 다수의 상이한 알고리즘들이 당 업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 서열은 FASTA, Gap 또는 Bestfit[이 알고리즘은 위스콘신 팩키지 버젼 10.1(Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisconsin)의 프로그램임]을 이용하여 비교할 수 있다. 예를 들어, 프로그램 FASTA2 및 FASTA3을 포함하는 FASTA는 의문 서열과 검색 서열 간 가장 많이 중첩되는 부위의 서열 동일성 %와 이 서열의 배열을 제공한다[Pearson, Methods Enzymol. 183:63-98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol. 132:185-219 (2000); Pearson, Methods Enzymol. 266:227-258 (1996); Pearson, J. Mol. Biol. 276:71-84 (1998); 본원에 참고용으로 인용됨]. 달리 특정하지 않는 한, 특정 프로그램 또는 알고리즘에 대한 디폴트 매개 변수가 사용된다. 예를 들어, 핵산 서열 간 서열 동일성 %는, 디폴트 매개 변수(문자 길이 6 및 스코어링 매트릭스에 대한 NOPAM 인자)를 이용하는 FASTA, 또는 본원에 참고용으로 인용되어 있는 GCG 버젼 6.1에 제공된 디폴트 매개 변수를 이용하는 Gap을 사용하여 측정될 수 있다.
뉴클레오티드 서열에 대한 참조 기준으로서는 달리 특정하지 않는 한, 그것의 상보체를 포함한다. 그러므로, 특정 서열을 가지는 핵산에 대한 참조 기준은 그것의 상보성 서열을 가지는 상보성 사슬을 포함하는 것으로 이해하여야 할 것이다.
핵산 또는 이의 단편을 칭할 때, "실질적 유사성" 또는 "실질적 서열 유사성"이란 용어는, 적당한 뉴클레오티드 삽입 또는 결실을 포함하는 다른 핵산(또는 이의 상보성 사슬)과 최적으로 정렬될 때, 뉴클레오티드 서열 동일성[전술한 바와 같이, 임의의 널리 알려진 서열 동일성 알고리즘인 FASTA, BLAST 또는 Gap에 의해 측정됨]이 뉴클레오티드 염기의 약 85% 이상, 바람직하게는 약 90% 이상, 및 더욱 바람직하게는 약 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상인 경우를 의미하는 것이다.
아미노산 서열에 관한 내용에 있어서 "서열 동일성 %"란 용어는, 최대로 상응하도록 정렬하였을 때, 2개의 서열 내에 존재하는 동일한 잔기들의 비율을 의미하는 것이다. 서열 동일성 비교 길이는 약 5개 이상의 아미노산, 일반적으로는 약 20개 이상의 아미노산, 더욱 일반적으로는 약 30개 이상의 아미노산, 통상적으로 약 50개 이상의 아미노산, 더욱 통상적으로 약 100개 이상의 아미노산, 그리고 바람직하게, 약 150개 또는 200개 이상의 아미노산으로 이루어진 영역에 해당할 수 있다. 아미노산 서열 동일성을 측정하는데 사용될 수 있는 다수의 상이한 알고리즘들이 당 업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 아미노산 서열은 FASTA, Gap 또는 Bestfit[이 알고리즘은 위스콘신 팩키지 버젼 10.1(Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisconsin)의 프로그램들임]을 사용하여 비교될 수 있다.
"실질적 동일성" 또는 "실질적 유사성"이란 용어가 폴리펩티드에 적용될 때, 이 용어들은, 예를 들어, 프로그램 GAP 또는 BESTFIT[이 프로그램에 의해 제공되는 디폴트 갭 가중치 사용]에 의하여 2개의 아미노산 서열들이 최적으로 정렬되었을 때, 이 서열들의 서열 동일성이 70%, 75% 또는 80% 이상, 바람직하게는 90% 또는 95% 이상, 그리고 더욱 바람직하게는 97%, 98% 또는 99% 이상인 경우를 의미한다. 임의의 구체예에서, 동일하지 않은 잔기의 위치들은 보존적 아미노산 치환에 의하여 상이하다.
신호 펩티드 또는 리더 펩티드라고도 칭하여지는 "신호 서열"이란 용어는 또한, 단백질의 N-말단부에 존재하는 약 15∼30개의 아미노산으로 이루어진 분절로서, 이 단백질을 분비되도록(세포막을 통과하도록) 만들어주는 분절을 의미하는 것이다. 신호 서열은 단백질이 분비됨에 따라서 제거된다.
본원에 사용된 "표지" 또는 "표지화된"이란 용어는, 항체 내에 다른 분자가 통합되는 것을 의미하는 것이다. 하나의 구체예에서, 상기 표지화는 검출 가능한 마커, 예를 들어, 방사성 표지화된 아미노산을 통합하는 것이거나, 표지화된 아비딘[예를 들어, 광학적 방법 또는 비색계 방법에 의해 검출될 수 있는 형광성 마커를 함유하거나 또는 효소 활성을 나타내는 스트렙타비딘]에 의해 검출될 수 있는 바이오티닐 부분의 폴리펩티드에 부착하는 것이다. 다른 구체예에서, 상기 표지 또는 마커는 치료제 예를 들어, 약물 컨쥬게이트 또는 독소일 수 있다. 폴리펩티드 및 당단백질을 표지화하는 다양한 방법이 당 업계에 공지되어 있으며, 이 방법을 사용할 수 있다. 폴리펩티드용 표지의 예로서는 방사성 동위 원소 또는 방사성 핵종(예를 들어, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I), 형광 표지(예를 들어, FITC, 로다민, 란탄계 원소인 인), 효소 표지(예를 들어, 호오스래디쉬 퍼옥시다제, β-갈락토시다제, 루시퍼라제, 알칼리성 포스파타제), 화학 발광 마커, 바이오티닐 기, 2차 리포터(예를 들어, 루신 지퍼 쌍 서열, 2차 항체에 대한 결합 위치, 금속 결합 도메인, 에피토프 태그)에 의해 인지되는 소정의 폴리펩티드 에피토프, 자화제 예를 들어, 가돌리늄 킬레이트, 독소 예를 들어, 페르투시스 독소, 탁솔, 사이토칼래신 B, 그래미시딘 D, 브롬화에티듐, 에머틴, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 독소루비신, 도노루비신, 디하이드록시 안트라신 디온, 미토잔트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-디하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도마인, 프로프라놀롤 및 퓨로마이신 및 이의 유사체나 상동체를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 몇몇 구체예에서, 표지는 다양한 길이를 가지는 스페이서 암(spacer arm)에 의해 부착되어, 그 결과 잠재적인 입체 장해를 감소시킬 수 있다.
"영장류"란 용어는, 영장류 목에 속하는 포유동물을 의미하는 것으로서, 그 예로서는, 손과 발이 섬세하게 발달되어 있으며, 코가 짧고, 뇌가 큰 것을 특징으로 하는 유인원 및 원원류(prosimian)를 포함한다. 영장류 목에 속하는 포유동물로서는 인간, 유인원, 원숭이 및 원원류 또는 하등 영장류를 포함한다.
"치료학적 유효량"이란, 치료될 질환의 증상 중 하나 이상을 어느 정도 경감시킬, 투여될 치료제의 양을 의미하는 것이다. 암의 치료에 있어서, 치료학적 유효량이란, 다음과 같은 효과 중 하나 이상을 나타내는 양을 의미한다: 종양의 크기를 감소시킴; 종양의 전이를 억제함(즉, 어느 정도 늦추거나 바람직하게는 중지시킴); 종양의 성장을 어느 정도 억제함(즉, 어느 정도 늦추거나 바람직하게는 중지시킴); 그리고 암과 관련된 하나 이상의 증상들을 어느 정도 경감시킴(또는 바람직하게는 없앰).
"치료하다", "치료" 및 "처치"란 용어는, 생물학적 질환 및/또는 이에 동반되는 증상들을 경감시키거나 또는 없애주는 방법을 의미하는 것이다. 암과 관련하였을 때, 상기 용어들은 단순히 암이 발병한 개체의 기대 수명을 증가시키게 되거나 또는 암과 관련된 하나 이상의 증상들을 감소시키게 될 방법을 의미하는 것이다.
"접촉"이란 용어는, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합부와, 표적 ALK-1 또는 이의 에피토프를, 이 항체가 ALK-1의 생물 활성에 영향을 미칠 수 있는 방식으로 접합시키는 것을 의미한다. 이러한 "접촉"은 "시험관 내" 즉, 시험관이나 페트리 접시 등에서 이루어질 수 있다. 시험관 내에서, 접촉은 항체 또는 이의 항원 결합부와, ALK-1 또는 이의 에피토프 사이에서만 이루어질 수 있거나, 또는 전체 세포가 관여할 수도 있다. 세포는 또한 세포 배양 접시 내에서 유지 또는 성장할 수 있으며, 또한 이러한 환경에서 항체 또는 이의 항원 결합부와 접촉할 수도 있다. 여기서, 특정 항체 또는 이의 항원 결합부가 ALK-1-관련 질환을 억제하는 능력 즉, 항체의 IC50은 항체를 생체 내에서 복잡한 유기체와 함께 사용하기 이전에 측정될 수 있다. 유기체 외부에 있는 세포에 적용되는 방법 즉, 항체 또는 이의 항원 결합부와 ALK-1을 접촉시키는 방법도 다수 존재하며, 이러한 방법들은 당 업자에게 널리 알려져 있다.
두 문자 어 "FACS"란, 형광도 활성화 세포 분류법(Fluorescence Activated Cell Sorting)을 의미한다. 두문자어 FACS 및 유세포 분석법은 호환되어 사용된다. 형광성 표지화를 통하여, 세포 구조와 기능을 관찰할 수 있다. 가장 널리 사용되는 방법인 면역 형광도 측정법은, 형광 염료 예를 들어, 플루오레세인 및 피코에리트린에 컨쥬게이트화된 항체로 세포를 염색하는 단계를 포함한다. 이 방법은 종종 세포 표면상에 존재하는 분자를 표지화하는데 사용될 수 있으나, 항체는 세포질 내 표적에서 생성될 수 있다. 직접 면역 형광도 측정법에 있어서, 특정 분자에 대한 항체는 직접적으로 형광 염료와 컨쥬게이트화되며, 세포는 한 단계에 머물러 있게 된다. 간접 면역 형광도 측정법에 있어서는, 1차 항체는 표지화되지 않으며, 제1 항체에 특이적인, 2차 형광 컨쥬게이트화 항체가 첨가된다.
항-ALK-1 항체
본 발명은 영장류 ALK-1, 바람직하게는 영장류 ALK-1의 ECD, 더욱 바람직하게는 인간 ALK-1의 ECD에 결합하는, 분리된 중화 항-ALK-1 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합부에 관한 것이다. 바람직한 구체예에서, 본 발명은 완전히 인간의 것인 모노클로날 항체인, 분리된 중화 항체 또는 이의 항원 결합부에 관한 것이다. 바람직하게, 인간 항체는 ALK-1에 대한 친화도가 ALK-2∼ALK-7에 대한 친화도보다 큰 재조합 인간 항-ALK-1 항체이다. 몇몇 구체예에서, 인간 항-ALK-1 항체는 비-인간 트랜스제닉 동물(즉, 게놈에 인간의 면역 글로불린 유전자를 포함하여, 이것을 포함하는 동물이 인간의 항체를 생산하는 트랜스제닉 동물) 예를 들어, 설치류를 면역화하여 생산된다. 본 발명의 다양한 측면은, 이와 같은 항체와 이의 항원 결합부, 그리고 이것을 포함하는 약학 조성물과, 이러한 항체 및 이의 항원 결합부를 생산하기 위한 핵산, 재조합 발현 벡터 및 숙주 세포에 관한 것이다. ALK-1/TGF-베타-1/Smad1 신호 전달 경로를 억제하거나, 시험관 내 또는 생체 내에서 ALK-1을 검출하기 위하여 본 발명의 항체 및 이의 항원 결합부를 사용하는 방법도 본 발명에 포함된다.
본 발명의 항-ALK-1 항체는 인간 카파 또는 인간 람다 경쇄 또는 이로부터 유래하는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 카파 경쇄를 포함하는 몇몇 구체예에서, 경쇄 가변 도메인(VL)은 인간의 A27, A2, A1, A3, B3, B2, L1 또는 L2 Vκ 유전자를 이용한다. 몇몇 구체예에서, 경쇄는 인간의 Vκ L1 유전자 및 인간의 Jκ4 유전자; 인간의 Vκ A27 유전자 및 인간의 Jκ 5 유전자 또는 인간의 Jκ 4 유전자; 인간의 Vκ B3 유전자 및 인간의 Jκ 1 유전자; 인간의 Vκ L2 유전자 및 인간의 Jκ 3 유전자; 인간의 Vκ A2 유전자 및 인간의 Jκ 1 유전자; 인간의 Vκ A3 유전자 및 인간의 Jκ 4 유전자; 인간의 Vκ A1 유전자 및 인간의 Jκ 1 유전자; 인간의 Vκ B2 유전자 및 인간의 Jκ 4 유전자; 또는 인간의 Vκ A2 유전자 및 인간의 Jκ 1 유전자를 이용한다.
몇몇 구체예에서, 본 발명의 항-ALK-1 항체의 VL은 생식 계열 Vκ 아미노산 서열과 관련된 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입(부가)을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 본 발명의 항-ALK-1 항체의 VL은 생식 계열 Vκ 아미노산 서열과 관련된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 아미노산 치환을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 생식 계열로부터 유래하는 치환 부 중 하나 이상은 경쇄의 CDR 부위에 존재한다. 몇몇 구체예에서, 생식 계열과 관련된 Vκ 아미노산 치환은, 예를 들어, 도 7에 나타낸 바와 같이, 본원에 제공된 항체의 VL 중 임의의 하나 이상에서 살펴볼 수 있는 생식 계열과 관련된 치환 부와 동일한 위치들 중 하나 이상의 위치에 존재한다. 몇몇 구체예에서, 이와 같은 아미노산 변이는 동일한 위치들 중 하나 이상의 위치에서 일어나지만, 참조 항체와는 상이한 치환 부를 만든다.
몇몇 구체예에서, 생식 계열과 관련된 아미노산 치환은 항체 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1(rWT); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1; 및 5.59.1의 VL 중 임의의 것에 존재하는 생식 계열로부터 유래하는 치환 부와 동일한 위치 중 하나 이상의 위치에서 발생하지만, 이 치환은 참조 항체의 아미노산과 관련된 위치(들)에서 일어나는 보존적 아미노산 치환을 대표할 수 있다. 예를 들어, 이들 항체 중 하나에 존재하는 특정 위치가 생식 계열과 관련하여 변이되며, 이것이 글루타메이트이면, 이는 상기 위치에서 아스파르테이트로 치환될 수 있다. 이와 유사하게, 만일 예시된 항체의 생식 계열과 비교되는 아미노산 치환 부가 세린이면, 그 위치의 세린 대신 트레오닌으로 보존적으로 치환될 수 있다. 보존적 아미노산 치환에 관하여는 전술하였다.
몇몇 구체예에서, 본 발명의 항-ALK-1 항체는 서열 번호 4의 경쇄 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구체예에서, 경쇄는 항체 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1(rWT); 1.12.1(M29I/D19A); 1.12.1(M29I); 1.12.1 (D19A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1; 또는 5.59.1의 경쇄 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇 구체예에서, 인간 항-ALK-1 항체의 경쇄는 항체 1.12.1(서열 번호 8); 1.11.1(서열 번호 12); 1.13.1(서열 번호 16); 1.14.1(서열 번호 20); 1.151.1(서열 번호 24); 1.162.1(서열 번호 28); 1.183.1(서열 번호 32); 1.8.1(서열 번호 36); 1.9.1(서열 번호 40); 4.10.1(서열 번호 44); 4.24.1(서열 번호 48); 4.38.1(서열 번호 52); 4.58.1(서열 번호 56); 4.62.1(서열 번호 60); 4.68.1(서열 번호 64); 4.72.1(서열 번호 68); 5.13.1(서열 번호 72); 5.34.1(서열 번호 76); 5.53.1(서열 번호 80); 5.56.1(서열 번호 84); 5.57.1(서열 번호 88); 또는 5.59.1(서열 번호 92)의 VL 아미노산 서열; 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 보존적 아미노산 치환을 가지고/가지거나 최대 3개의 비-보존적 아미노산 치환을 가지는 상기 아미노산 서열들을 포함한다. 다른 구체예에서, 인간 항-ALK-1 항체의 경쇄는 항체 1.27.1; 1.29.1 또는 1.31.1의 VL 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 경쇄는 상기 항체들 중 어느 하나의 CDR1의 시작부로부터 CDR3의 말단부까지의 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇 구체예에서, 경쇄는 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1(rWT); 1.12.1 (M29I/D19A); 1.12.1(M29I); 1.12.1(D19A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1; 5.59.1으로부터 선택되는 2개 이상의 모노클로날 항체의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 부위로부터 독립적으로 선택되는 CDR1, CDR2 및 CDR3 부위; 또는 각각 3개 미만 또는 2개 미만의 보존적 치환을 가지고/가지거나 총 3개 이하의 비-보존적 아미노산 치환을 가지는 상기 CDR 부위의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
임의의 구체예에서, 항-ALK-1 항체의 경쇄는 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1(rWT); 1.12.1(M29I/D19A); 1.12.1(M29I); 1.12.1(D19A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1; 5.59.1로부터 선택되는 항체의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 부위; 또는 각각 3개 미만 또는 2개 미만의 보존적 아미노산 치환을 가지고/가지거나 총 3개 이하의 비-보존적 아미노산 치환을 가지는 상기 CDR 부위들의 아미노산 서열을 포함한다.
중쇄와 관련하여, 몇몇 구체예에서, 가변 도메인(VH)은 인간의 VH 4-31, VH 3-11, VH 3-15, VH 3-33, VH 4-61 또는 VH 4-59 유전자를 이용한다. 몇몇 구체예에서, 본 발명의 항-ALK-1 항체의 VH 서열은 생식 계열 VH 아미노산 서열과 관련하여 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입(부가)(총칭 "돌연 변이")을 함유한다. 몇몇 구체예에서, 상기 중쇄의 가변 도메인은 생식 계열 VH 아미노산 서열로부터 유래하는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11개의 돌연 변이를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 상기 돌연 변이(들)는 생식 계열 아미노산 서열에 비하여 비-보존적 치환이다. 몇몇 구체예에서, 상기 돌연 변이는 중쇄의 CDR 부위 내에 존재한다. 몇몇 구체예에서, 중쇄는 인간의 VH 3-33 유전자, 인간의 D 6-19 유전자 및 인간의 JH 3B 유전자; 인간의 VH 4-31 유전자, 인간의 D 6-19 유전자 및 인간의 JH 4B 유전자; 인간의 VH 4-61 유전자, 인간의 D 6-19 유전자 및 인간의 JH 4B 유전자; 인간의 VH 4-31 유전자, 인간의 D 3-3 유전자 및 인간의 JH 3B 유전자; 인간의 VH 4-31 유전자 및 인간의 JH 3B 유전자; 인간의 VH 4-59 유전자, 인간의 D 6-19 유전자 및 인간의 JH 4B 유전자; 인간의 VH 3-11 유전자, 인간의 D 3-22 유전자 및 인간의 JH 6B 유전자; 인간의 VH 3-15 유전자, 인간의 D 3-22 유전자 및 인간의 JH 4B 유전자; 인간의 VH 4-31 유전자, 인간의 D 5-12 유전자 및 인간의 JH 6B 유전자; 인간의 VH 4-31 유전자, 인간의 D 4-23 유전자 및 인간의 JH 4B 유전자; 인간의 VH 4-31 유전자, 인간의 D 2-2 유전자 및 인간의 JH 5B 유전자; 인간의 VH 4-31 유전자 및 인간의 JH 6B 유전자; 인간의 VH 3-15 유전자, 인간의 D 1-1 유전자 및 인간의 JH 4B 유전자; 인간의 VH 3-11 유전자, 인간의 D 6-19 유전자 및 인간의 JH 6B 유전자; 인간의 VH 3-11 유전자, 인간의 D 3-10 유전자 및 인간의 JH 6B 유전자; 또는 인간의 VH 3-11 유전자, 인간의 D 6-6 유전자 및 인간의 JH 6B 유전자를 이용한다.
몇몇 구체예에서, 아미노산 치환은 항체 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1(rWT); 1.12.1(M29I/D19A); 1.12.1(M29I); 1.12.1(D19A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1; 또는 5.59.1의 VH 중 임의의 하나 이상에 있어서 생식 계열로부터 유래하는 치환 부와 동일한 위치 중 하나 이상의 위치에 존재한다. 기타 구체예에서, 아미노산 변이는 동일한 위치들 중 하나 이상의 위치에서 일어나지만, 참조 항체와는 상이한 치환 부를 만든다.
몇몇 구체예에서, 중쇄는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구체예에서, 중쇄는 항체 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1(rWT); 1.12.1(M29I/D19A); 1.12.1(M29I); 1.12.1(D19A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1; 또는 5.59.1의 중쇄 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 중쇄는 항체 1.12.1(서열 번호 6); 1.11.1(서열 번호 10); 1.13.1(서열 번호 14); 1.14.1(서열 번호 18); 1.151.1(서열 번호 22); 1.162.1(서열 번호 26); 1.183.1(서열 번호 30); 1.8.1(서열 번호 34); 1.9.1(서열 번호 38); 4.10.1(서열 번호 42); 4.24.1(서열 번호 46); 4.38.1(서열 번호 50); 4.58.1(서열 번호 54); 4.62.1(서열 번호 58); 4.68.1(서열 번호 62); 4.72.1(서열 번호 66); 5.13.1(서열 번호 70); 5.34.1(서열 번호 74); 5.53.1(서열 번호 78); 5.56.1(서열 번호 82); 5.57.1(서열 번호 86); 또는 5.59.1(서열 번호 90)의 VH 아미노산 서열; 또는 최대 1, 2, 3, 4, 6, 8, 9, 10 또는 11개의 보존적 아미노산 치환을 가지고/가지거나 전부 합해서 최대 3개의 비-보존적 아미노산 치환을 가지는 상기 VH 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구체예에서, 중쇄는 항체 1.27.1; 1.29.1 또는 1.31.1의 VH 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 중쇄는 상기 항체들의 CDR1의 시작부로부터 CDR3의 말단부에 이르는 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇 구체예에서, 중쇄는 항체 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1(rWT); 1.12.1(M29I/D19A); 1.12.1(M29I); 1.12.1(D19A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1; 또는 5.59.1의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 부위; 또는 8개 미만, 6개 미만, 4개 미만 또는 3개 미만의 보존적 아미노산 치환을 가지고/가지거나 총 3개 이하의 비-보존적 아미노산 치환을 가지는 상기 CDR 부위들을 포함한다.
몇몇 구체예에서, 중쇄 CDR 부위는 항체 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1(rWT); 1.12.1(M29I/D19A); 1.12.1(M29I); 1.12.1(D19A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1; 또는 5.59.1로부터 선택되는 2개 이상의 항체의 CDR 부위로부터 독립적으로 선택된다. 다른 구체예에서, 본 발명의 항체는 상기 나열한 바와 같은 경쇄와 상기 나열한 바와 같은 중쇄를 포함한다. 추가의 구체예에서, 경쇄 CDR 및 중쇄 CDR은 동일한 항체로부터 유래하는 것이다.
다양한 구체예에서, 본 발명의 항-ALK-1 항체는, 본원에 제공된 항-ALK-1 항체의 전장 중쇄 아미노산 서열(들) 및 전장 경쇄 아미노산 서열(들), VH 및 VL 아미노산 서열, 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열, 또는 CDR1의 시작부로부터 CDR3의 말단부에 이르는 중쇄 아미노산 서열, 및 CDR1의 시작부로부터 CDR3의 말단부에 이르는 경쇄 아미노산 서열을 가진다.
발생할 수 있는 아미노산 치환의 한 가지 유형은 항체 내에 존재하는 하나 이상의 시스테인들을 변이시키는 것으로서, 여기서, 상기 시스테인은 다른 잔기 예를 들어, 알라닌이나 세린과 화학적으로 반응할 수 있는 것이다. 하나의 구체예에서, 비-표준형 시스테인의 치환도 발생한다. 상기 치환은 항체의 가변 도메인의 CDR 또는 틀 부위, 또는 항체의 불변 도메인에서 일어날 수 있다. 몇몇 구체예에서, 시스테인은 표준형이다.
발생할 수 있는 아미노산 치환의 다른 유형은 항체 내 잠재적인 단백 분해 위치를 제거하는 것이다. 이러한 위치들은 항체의 가변 도메인의 CDR 또는 틀 부위, 또는 항체의 불변 도메인에 존재할 수 있다. 시스테인 잔기의 치환 및 단백 분해 위치의 제거로 인하여 항체 생성물의 이질성 발생 위험을 줄일 수 있으므로, 이에 따라서 항체의 동질성이 증가할 수 있게 된다. 아미노산 치환의 다른 유형으로서는 상기 잔기들 중 하나 또는 2개를 변형시켜, 잠재적인 탈아민화 위치를 형성하는 아스파라긴-글리신 쌍을 제거하는 것이다.
몇몇 구체예에서, 본 발명의 항-ALK-1 항체의 중쇄의 C-말단 리신은 절단된다. 본 발명의 다양한 구체예에서, 항-ALK-1 항체의 중쇄 및 경쇄는 신호 서열을 포함할 수도 있다.
하나의 측면에서, 본 발명은 25개의 억제 인간 항-ALK-1 모노클로날 항체와 이를 생산하는 하이브리도마 세포주를 제공한다. 임의의 구체예에서, 본 발명의 항체는 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1(rWT); 1.12.1(M29I/D19A); 1.12.1(M29I); 1.12.1 (D19A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1; 및 5.59.1로서 표시되는 IgG이다. 바람직한 구체예에서, 인간의 항-ALK-1 항체는 항체 1.12.1, 1.12.1(M29I/D19A), 1.12.1(M29I), 1.12.1(D19A), 1.27.1, 1.14.1, 1.162.1, 1.31.1, 4.62.1 또는 4.72.1이다.
항체는 항원의 표면에 노출된 에피토프를 선형(1차) 서열 또는 구조적(2차) 서열 부위로서 인지한다. 바이어코어를 사용하여 기능상 에피토프의 분포를 확인하고, 또한 본 발명에 의해 구체화된 항-ALK-1 항체만이 가지는 에피토프를 확인하였다.
표 1은 1.12.1 항체 변이체의 전장 중쇄 및 경쇄와, 본 발명의 항-ALK-1 항체의 가변 도메인 함유 부분, 그리고 이와 상응하는 추론 아미노산 서열을 암호화하는 핵산의 서열 식별 표시(서열 번호)를 나열한 것이다.
Figure pat00002
1.12.1(M29I/D19A)은, 실시예 4에 기술된 바와 같이, 중쇄에 특정 아미노산 돌연 변이(즉, 29번 위치의 메티오닌이 이소루신으로 치환됨)가 1회 발생하였고, 또한 경쇄에 특이적 아미노산돌연 변이(즉, 19번 위치의 아스파르트산이 알라닌으로 치환됨)가 1회 발생한 항-ALK-1 항체이다.
1.12.1은, 하이브리도마로부터 분리된 mAb 1.12.1 변이체이다.
1.12.1(rWT)은, 실시예 3에 기술된 바와 같이, 재조합 mAb으로서 표현된 mAb 1.12.1 변이체이다.
본 발명은 또한 상기 나열한 인간 항-ALK-1 항체 중 임의의 것의 중쇄 및/또는 경쇄 변이체(하나 이상의 아미노산이 변형된 변이체)를 제공하는 것이다. 이 변이체를 지정하기 위하여, 첫 번째 문자는 천연-생성 항체 사슬의 아미노산에 대한 1 문자 암호이며, 여기서 번호는 아미노산의 위치를 나타내는 것이고(1번 위치는 FR1의 N-말단 아미노산임), 두 번째 문자는 아미노산 변이체에 대한 1 문자 암호이다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 상기 나열한 인간의 항-ALK-1 항체 중 임의의 것의 가변 도메인 아미노산 서열에 대한 서열 동일성이 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상인 가변 도메인 아미노산 서열을 포함하는 항체를 포함한다.
항-ALK-1 항체의 군 및 하위 군
항-ALK-1 항체의 군 및 하위 군은 당 업계에 공지된 임의의 방법에 의하여 동정될 수 있다. 일반적으로, 항체의 군 및 하위 군은 항체의 특정 군과 하위 군에 특이적인 항체들을 이용하여 동정될 수 있다. 이러한 항체는 시판되고 있다. 상기 군 및 하위 군은 ELISA, 웨스턴 블로팅 및 기타 기술에 의해 동정될 수 있다. 대안적으로, 상기 군 및 하위 군은 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 불변 도메인의 전부 또는 일부를 서열 결정함으로써 동정될 수 있는데, 즉, 면역 글로불린의 다양한 군과 하위 군의 공지 아미노산 서열과 상기 항체의 아미노산 서열을 비교함으로써, 이 항체들의 군과 하위 군을 동정할 수 있다.
전술한 바와 같이 얻어진 항-ALK-1 항체 군은 상호 전환(switching)될 수 있다. 본 발명의 하나의 측면에서, VL 또는 VH를 암호화하는 핵산 분자는 당 업계에 널리 공지된 방법을 이용하여 분리되며, 또한 이 핵산 분자는 CL 또는 CH를 암호화하는 핵산 서열을 포함하지 않는다["Antibody Engineering" (Kontermann & Dubel, Eds., Springer-Verlag, Berlin (2001)]. VL 또는 VH를 암호화하는 핵산 분자는 이후 각각 면역 글로불린 분자의 상이한 군으로부터 유래하는 CL 또는 CH를 암호화하는 핵산 서열에 작동 가능하도록 결합된다. 이 과정은 전술한 바와 같이, CL 또는 CH 사슬을 포함하는 벡터 또는 핵산 분자를 이용하여 이루어질 수 있다. 예를 들어, 원래 IgM이었던 항-ALK-1 항체는 IgG로 군 간 전환(class switching)될 수 있다. 뿐만 아니라, 이러한 군 간 전환은 하나의 IgG 하위 군을 다른 하위 군으로 바꾸는데 사용될 수 있다[예를 들어, IgG1→IgG2]. 원하는 동 기준 표본형을 포함하는 본 발명의 항체를 제조하는 바람직한 방법은, 항-ALK-1 항체의 중쇄를 암호화하는 핵산 분자와, 항-ALK-1 항체의 경쇄를 암호화하는 핵산 분자를 분리하는 단계, 상기 중쇄의 가변 도메인을 얻어내는 단계, 원하는 동 기준 표본형의 중쇄의 불변 도메인과 중쇄의 가변 도메인을 결찰시키는 단계, 세포 내에서 경쇄와 결찰된 중쇄를 발현시키는 단계, 및 원하는 동 기준 표본형을 발현하는 항-ALK-1 항체를 수집하는 단계를 포함한다.
몇몇 구체예에서, 본 발명의 항-ALK-1 항체는 모노클로날 항체이다. 상기 항-ALK-1 항체는 IgG, IgM, IgE, IgA 또는 IgD 분자일 수 있다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 항-ALK-1 항체는 IgG이고, 또한 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 하위 군이다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 상기 항체는 하위 군 IgG2이다.
항-ALK-1 항체에 의하여 인지된 ALK-1 에피토프의 동정
본 발명은 ALK-1에 결합하고, (a) 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1(rWT); 1.12.1(M29I/D19A); 1.12.1(M29I); 1.12.1(D19A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1; 및 5.59.1로부터 선택되는 항체, (b) 서열 번호 6; 10; 14; 18; 22; 26; 30; 34; 38; 42; 46; 50; 54; 58; 62; 66; 70; 74; 78; 82; 86; 90 또는 104의 서열 중 어느 하나에 존재하는 VH 도메인의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항체, (c) 서열 번호 8; 12; 16; 20; 24; 28; 32; 36; 40; 44; 48; 52; 56; 60; 64; 68; 72; 76; 80; 84; 88; 92 또는 127의 서열 중 어느 하나에 존재하는 VL 도메인의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체, 및 (d) 상기 (b)에서 정의한 중쇄 가변 도메인과 상기 (c)에서 정의한 경쇄 가변 도메인 둘 다를 포함하는 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프와 경쟁 또는 교차 경쟁 및/또는 결합하는 인간의 항-ALK-1 모노클로날 항체를 제공한다.
항체가 동일한 에피토프와 결합하거나, 항-ALK-1 항체와의 결합에 대해 교차 경쟁하는지 여부는 당 업계에 공지된 방법에 의해 확인될 수 있다. 하나의 구체예에서, 포화 조건하에 본 발명의 항-ALK-1 항체는 ALK-1과 결합할 수 있으며, 이는 테스트 항체가 ALK-1과 결합하는 능력을 측정함으로써 확인할 수 있다. 만일 테스트 항체가 참조 항-ALK-1 항체와 동시에 ALK-1과 결합할 수 있으면, 이 테스트 항체는 참조 항-ALK-1 항체가 결합하는 에피토프와는 상이한 에피토프에 결합한다. 그러나, 만일 테스트 항체가 ALK-1과 동시에 결합할 수 없으면, 이 테스트 항체는 동일한 에피토프, 중첩 에피토프, 또는 본 발명의 항-ALK-1 항체가 결합하는 에피토프에 매우 인접하여 존재하는 에피토프와 결합한다. 이 실험은 ELISA, RIA, 바이어코어™ 또는 유세포 분석법을 이용하여 수행될 수 있다. 항-ALK-1 항체가 다른 항-ALK-1 항체와 교차 경쟁하는지 여부를 테스트하기 위해서는, 전술한 경쟁 방법을 2 방향으로 실시할 수 있는데, 즉, 공지의 항체가 테스트 항체를 차단하는지 여부와 테스트 항체가 공지의 항체를 차단하는지 여부를 측정함으로써 테스트할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 상기 실험은 바이어코어™를 사용하여 수행된다.
ALK-1에 대한 항-ALK-1 항체의 결합 친화도
ALK-1에 대한 항-ALK-1 항체 또는 이의 항원 결합부의 결합 친화도(KD)와 해리 속도(Koff)는 당 업계에 공지된 방법에 의하여 측정될 수 있다. 결합 친화도는 ELISA, RIA, 유세포 분석법 또는 표면 플라스몬 공명법 예를 들어, 바이어코어™에 의하여 측정될 수 있다. 해리 속도는 표면 플라스몬 공명법에 의해 측정될 수 있다. 바람직하게, 결합 친화도 및 해리 속도는 표면 플라스몬 공명법에 의하여 측정된다. 더욱 바람직하게, 결합 친화도 및 해리 속도는 바이어코어™를 사용하여 측정된다. 당 업계에 공지된 방법을 사용하여 항체가 실질적으로 항-ALK-1 항체와 동일한 KD를 가지는지 여부를 측정할 수 있다. KD 및 Koff는 초기 스크리닝 단계와, 후속 최적화 단계에서 측정될 수 있다.
항-ALK-1 항체에 의한 ALK-1 활성의 억제
ALK-1 결합을 억제하는 항-ALK-1 모노클로날 항체는 다수의 검정법을 사용하여 동정될 수 있다. 예를 들어, 중화 항-ALK-1 항체는, 실시예 12에 기술된 바와 같이, 이들 항체가 ALK-1의 특이적 하류 표적 유전자인 Id1의 상향 조절을 억제하는 능력으로써 동정될 수 있다. 바람직한 항-ALK-1 항체의 IC50은 500nM, 300nM, 200nM, 150nM, 100nM, 50nM, 20nM, 1OnM 또는 1nM 미만이다.
뿐만 아니라, 오디세이 적외선 영상화 시스템(실시예 13 참조)을 이용하는 웨스턴 블로팅에 의하여, 항-ALK-1 항체가 Smad1의 인산화를 억제하는 능력을 측정할 수도 있다. 다양한 구체예에서, 상기 항-ALK-1 항체의 상기 검정법에서의 IC50은 250nM, 200nM, 150nM, 100nM, 50nM, 20nM, 10nM 또는 1nM 미만이다.
항-ALK-1 항체에 의한 신생 혈관 형성의 억제
다른 구체예에서, 인간의 포피 조직이 이식된, 즉 인간 흑색종 M24met 종양 세포가 피내 이식된 SCID 마우스를 통하여 입증되는 바와 같이, 본 발명의 항-ALK-1 항체 또는 이의 일부는 인간 혈관의 신생 형성을 대조군 시료에 비하여 40% 이상의 팩터(factor)로 억제하는데, 이는 실시예 17과 표 13에 나타낸 바와 같이, 인간 CD-31 신호 검정법에 의한 IHC 분석 결과로 측정된다.
다른 구체예에서, 인간의 포피 조직이 이식된, 즉 콜라겐이 피내 이식된 SCID 마우스를 통하여 입증되는 바와 같이, 본 발명의 항-ALK-1 항체 또는 이의 일부는 인간 혈관의 신생 형성을 대조군 시료에 비하여 50% 이상의 팩터로 억제하는데, 이는 실시예 16과 표 12에 나타낸 바와 같이, 인간 CD-31 신호 검정법에 의한 IHC 분석 결과로 측정된다.
종 선택성 및 분자 선택성
본 발명의 다른 측면에서, 본 발명의 항-ALK-1 항체는 종 선택성과 분자 선택성 둘 다 나타낸다. 본 발명의 명세서에 따르면, 당 업계에 널리 공지된 방법을 사용하여 항-ALK-1 항체에 대한 종 선택성 또는 분자 선택성을 측정할 수 있다. 예를 들어, 종 선택성은 웨스턴 블로팅, 표면 플라스몬 공명법 예를 들어, 바이어코어, ELISA, 면역 침전법 또는 RIA를 이용하여 측정될 수 있다.
몇몇 구체예에서, 본 발명의 항-ALK-1 항체는, 설치류 ALK-1에 대한 KD보다 2배 이상 작은 KD로 영장류의 ALK-1과 결합한다.추가의 구체예에서, 영장류 ALK-1에 대한 KD는, 설치류 ALK-1에 대한 KD보다 3배 이상, 10배 이상, 50배 이상, 100배 이상, 200배 이상, 500배 이상, 또는 1000배 이상 작다[유세포 분석법에 의해 측정됨].
다른 구체예에서, 본 발명의 항-ALK-1 항체의 ALK-1에 대한 선택성은 ALK-2∼ALK-7에 대한 선택성과 비교된다. 몇몇 구체예에서, 본 발명의 항-ALK-1 항체는 ALK-1을 제외한 임의의 기타 단백질에 적당하게 특이적으로 결합하지 않는다. 바람직하게, 본 발명의 항-ALK-1 항체는 인간 ALK-1의 ECD와 결합한다.
항체 및 항체 생산 세포주를 생산하는 방법
ALK-1 면역원
몇몇 구체예에서, 본 발명의 ALK-1 면역원 또는 항원은 분리 및/또는 정제된 ALK-1이다. 몇몇 구체예에서, 상기 ALK-1 면역원은 인간의 ALK-1이다. 바람직한 구체예에서, 상기 ALK-1 면역원은 인간 ALK-1의 ECD이다. 인간의 ALK-1 또는 이의 항원성 부분은 당 업계에 널리 공지된 방법에 따라서 제조될 수 있거나, 또는 제조사로부터 구입할 수 있다. 인간의 ALK-1 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 공지되어 있다[예를 들어, Genbank 등록 수탁 번호: L17075]. 전장 ALK-1을 암호화하는 ACVRL1 유전자는 인비트론겐 인코포레이션으로부터 클론 ID IOH21048로 시판되고 있다. 예를 들어, R&D 시스템즈 인코포레이션은 ALK-1의 1∼118번 ECD 아미노산 잔기를 암호화하는 DNA 서열을 발현함으로써 제조되는 재조합 인간 ALK-1/Fc 키메라(카탈로그 번호: 370-AL)를 시판하고 있으며, 이때 상기 DNA 서열은 마우스 골수종 세포주 내에서 폴리펩티드 링커를 암호화하는 DNA 서열을 통하여, 인간의 IgG의 Fc 부위를 암호화하는 DNA 서열과 융합된 것이다. 상기 재조합 성숙 인간 ALK-1/Fc 키메라는 아미노-말단부 22번 위치에 Asp를 가지는 이황화 결합된 동종 이량체 단백질이다. 뿐만 아니라, 실시예 1에는 본 발명에 의한 항-ALK-1 항체를 생산하는 하이브리도마를 생산하기 위하여 사용되는 방법인 ALK-1 ECD His-태그 단백질의 제조 방법에 관하여 기술되어 있다.
다른 구체예에서, ALK-1 항원은 ALK-1을 발현하거나 또는 과다 발현하는 세포이다. 다른 구체예에서, ALK-1 항원은 효모, 곤충 세포, 박테리아 예를 들어, 이. 콜라이(E.coli), 또는 기타 재조합 기술에 의하여 얻어지는 공급원으로부터 발현된 재조합 단백질이다.
면역화
몇몇 구체예에서, 인간의 항체는 게놈 내에 인간 면역 글로불린의 중쇄 및 경쇄 위치 중 일부 또는 전부를 포함하는 비-인간 트랜스제닉 동물을 ALK-1 항원으로 면역화함으로써 생산된다. 바람직한 구체예에서, 상기 비-인간 동물은 제노마우스(XENOMOUSE)® 동물(Abgenix, Inc., Fremont, CA)이다.
제노마우스® 마우스는 인간 면역 글로불린의 중쇄 및 경쇄 위치의 대형 단편을 포함하고, 마우스 항체 생산능이 결여된 조작 마우스 변종이다. 예를 들어, 문헌[Green외 다수, Nature Genetics 7:13-21 (1994) 및 미국 특허 제5,916,771호, 동 제5,939,598호, 동 제5,985,615호, 동 제5,998,209호, 동 제6,075,181호, 동 제6,091,001호, 동 제6,114,598호, 동 제6,130,364호, 동 제6,162,963호 및 동 제6,150,584호]을 참조하시오. 또한 WO 91/10741, WO 94/02602, WO 96/34096, WO 96/33735, WO 98/16654, WO 98/24893, WO 98/50433, WO 99/45031, WO 99/53049, WO 00/09560 및 WO 00/037504을 참조하시오.
다른 측면에서, 본 발명은 비-인간, 비-마우스 동물로부터 항-ALK-1 항체를 생산하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 인간 면역 글로불린 위치를 포함하는 비-인간 트랜스제닉 동물을 ALK-1 항원으로 면역화하는 단계를 포함한다. 이와 같은 동물은 전술한 문헌들에 개시된 방법들을 이용하여 생산될 수 있다. 상기 문헌들에 개시된 방법은 본원에 참고용으로 인용되어 있는 미국 특허 제5,994,619호에 개시된 바와 같이 변형될 수 있다. 미국 특허 제5,994,619호에는 돼지와 소로부터 유래하는, 신규의 배양 내부 세포량(CICM) 세포 및 세포주와, 이종 DNA가 삽입된 트랜스제닉 CICM 세포를 생산하는 방법에 관하여 개시되어 있다. CICM 트랜스제닉 세포는 클로닝된 트랜스제닉 배, 태아 및 자손을 생산하는데 사용될 수 있다. 상기 미국 특허 제5,994,619호에는 또한 이종 DNA를 자손에게 전달할 수 있는 트랜스제닉 동물을 생산하는 방법에 관하여도 개시되어 있다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 비-인간인 동물로서는 포유동물, 구체적으로는 래트, 양, 돼지, 염소, 소, 말 또는 닭이 있다.
제노마우스® 마우스는 완전히 인간의 것인 항체의 성체-유사 인간 레퍼토리(repertoire)를 생산하며, 또한 항원-특이적 인간 항체도 생산한다. 몇몇 구체예에서, 상기 제노마우스® 마우스는, 효모 인공 염색체(YAC) 내에 인간 중쇄 위치 및 카파 경쇄 위치의 100만 개의 염기로 이루어진 크기의 생식 계열 구성 단편을 도입함으로써, 약 80%의 인간 항체 V 유전자 레퍼토리를 포함하게 된다. 다른 구체예에서, 제노마우스® 마우스는 추가로 인간 람다 경쇄 위치를 거의 전부 포함한다. 문헌[Mendez외 다수, Nature Genetics 15:146-156 (1997), Green and Jakobovits, J. Exp. Med. 188:483-495 (1998) 및 WO 98/24893; 본원에 참고용으로 인용됨]을 참조하시오.
몇몇 구체예에서, 인간의 면역 글로불린 유전자를 포함하는 비-인간인 동물은 인간의 면역 글로불린 "미니 유전자좌(minilocus)"를 가지는 동물이다. 미니 유전자좌 연구법에 있어서, 외인성 Ig 위치는 Ig 위치로부터 유래하는 각각의 유전자를 포함시킴으로써 모의된다. 그러므로, 하나 이상의 VH 유전자, 하나 이상의 DH 유전자, 하나 이상의 JH 유전자, 뮤 불변 도메인, 그리고 제2의 불변 도메인(바람직하게는 감마 불변 도메인)은 동물에 삽입하기 위한 구조물로서 형성된다. 이 연구 방법에 관하여는 본원에 참고용으로 인용되어 있는 미국 특허 제5,545,807호, 동 제5,545,806호, 동 제5,569,825호, 동 제5,625,126호, 동 제5,633,425호, 동 제5,661,016호, 동 제5,770,429호, 동 제5,789,650호, 동 제5,814,318호, 동 제5,591,669호, 동 제5,612,205호, 동 제5,721,367호, 동 제5,789,215호, 및 동 제5,643,763호에 개시되어 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 인간화된 항-ALK-1 항체를 제조하는 방법을 제공한다. 몇몇 구체예에서, 비-인간 동물은 이하에 기술된 바와 같이 항체 생산을 허용하는 조건 하에서 ALK-1 항원으로 면역화된다. 항체-생산 세포는 동물로부터 분리되고, 목적으로 하는 항-ALK-1 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 핵산은 분리된 항체-생산 세포 또는 이러한 세포로부터 생산된 무한 증식성 세포주로부터 분리된다. 이와 같은 핵산들은 추후 당 업자에게 공지된 기술 및 이하 상세히 기술된 방법을 사용하여 조작되며, 그 결과 비-인간 서열의 양은 감소하게 된다[즉, 항체가 인간화되어 인간 체내에서의 면역 반응이 감소함].
동물의 면역화는 당 업계에 공지된 임의의 방법에 의하여 이루어질 수 있다. 예를 들어, 문헌[Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1990]을 참조하시오. 비-인간 동물 예를 들어, 마우스, 래트, 양, 염소, 돼지, 소 및 말을 면역화하는 방법에 대하여는 당 업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Harlow and Lane(상동) 및 미국 특허 제5,994,619호]을 참조하시오. 바람직한 구체예에서, ALK-1 항원은 면역 반응을 촉진시키기 위해 애쥬반트와 함께 투여된다. 대표적인 애쥬반트로서는 완전 또는 불완전 프룬트 애쥬반트(Freund's adjuvant), RIBI(뮤라밀 디펩티드) 또는 ISCOM(면역 촉진 복합체)을 포함한다. 이러한 애쥬반트는, 폴리펩티드가 국소적으로 축적되도록 격리시킴으로써, 이 폴리펩티드가 급속하게 분산되는 것을 막을 수 있거나, 또는 상기 애쥬반트는 숙주가 대식 세포 및 면역계의 기타 성분에 대해 주화성을 나타내는 인자를 분비하도록 촉진하는 물질을 함유할 수 있다. 바람직하게, 만일 폴리펩티드가 투여되면, 면역화 스케쥴에는 폴리펩티드를 2회 이상 투여하여 수 주에 걸쳐 분산시키는 것이 포함될 것이다. 실시예 2에는 제노마우스® 마우스 내에서 항-ALK-1 모노클로날 항체를 생산하는 방법에 관하여 예시되어 있다.
항체 및 항체-생산 세포주의 생산
동물을 ALK-1 항원으로 면역화한 후, 항체 및/또는 항체-생산 세포를 이 동물로부터 얻을 수 있다. 몇몇 구체예에서, 항-ALK-1 항체-함유 혈청은 이 동물로부터 채혈하거나 또는 이 동물을 안락사시켜 얻을 수 있다. 상기 혈청은 이 동물로부터 구하여 사용할 수 있으며, 면역 글로불린 분획은 상기 혈청으로부터 얻을 수 있고, 상기 항-ALK-1 항체는 상기 혈청으로부터 정제될 수 있다.
몇몇 구체예에서, 항체-생산 세포주는 면역화된 동물로부터 분리된 세포로 제조된다. 면역화 이후, 상기 동물을 안락사시켜, 이것의 림프 소절 및/또는 비장의 B 세포를 당 업계에 공지되어 있는 임의의 방법을 사용하여 무한 증식시킨다. 세포를 무한 증식시키는 방법으로서는, 세포에 발암 유전자를 형질 감염시키는 방법, 세포를 발암 유전자 바이러스로 감염시키고 무한 증식된 세포를 선별할 수 있는 조건하에서 이 세포를 배양한 다음, 이 세포에 발암성 화합물 또는 돌연 변이 유발 화합물을 처리하여, 이 세포를 무한 증식성 세포 예를 들어, 골수종 세포와 융합한 후, 종양 억제 유전자를 불활성화시키는 방법을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 문헌[Harlow and Lane(상동)]을 참조하시오. 만일 골수종 세포와의 융합 방법을 사용한다면, 이 골수종 세포는 면역 글로불린 폴리펩티드를 분비하지 않는 것이 바람직하다(비-분비형 세포주). 무한 증식성 세포는 ALK-1 또는 이의 일부를 이용하여 스크리닝된다. 바람직한 구체예에서, 초기의 스크리닝은 효소-결합 면역 검정법(ELISA) 또는 방사능 면역 검정법을 이용하여 수행된다. ELISA 스크리닝의 예는 본원에 참고용으로 인용되어 있는 WO 00/37504에 제공되어 있다.
항-ALK-1 항체-생산 세포 예를 들어, 하이브리도마는 선별 및 클로닝되며, 또한 이하에 더욱 상세히 기술되어 있는 바와 같이 원하는 특성들을 가지는지 여부 예를 들어, 꾸준히 성장하는지 여부, 항체 생산량이 증가하였는지 여부, 그리고 바람직한 항체의 특성들을 가지는지 여부에 대해 추가로 스크리닝된다. 하이브리도마는 동계 동물, 면역계가 결여된 동물 예를 들어, 누드 마우스에서 생체 내 증식될 수 있거나, 또는 세포 배양액 중에서 시험관 내 증식될 수 있다. 하이브리도마를 선별, 클로닝 및 증식하는 방법에 관하여는 당 업자에게 널리 공지되어 있다.
바람직한 구체예에서, 면역화된 동물은 인간의 면역 글로불린 유전자를 발현하고, 비장 B 세포가 비-인간 동물과 동일한 종으로부터 유래한 골수종 세포주에 융합된, 비-인간인 동물이다. 더욱 바람직한 구체예에서, 면역화된 동물은 제노마우스® 마우스이고, 골수종 세포주는 비-분비형 마우스 골수종이다. 더욱 바람직한 구체예에서, 골수종 세포주는 P3-X63-Ag8.653(미국 표준 균주 보존 기관)이다. 예를 들어, 실시예 2를 참조하시오.
그러므로, 하나의 구체예에서, 본 발명은 ALK-1에 대해서 생성된 인간의 모노클로날 항체 또는 이의 단편을 생산하는 세포주를 생산하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 (a) 본원에 개시된 비-인간 트랜스제닉 동물을 ALK-1, ALK-1의 일부 또는 ALK-1을 발현하는 세포나 조직으로 면역화하는 단계; (b) 이 트랜스제닉 동물의 ALK-1에 대한 면역 반응이 증가하도록 만드는 단계; (c) 이 트랜스제닉 동물로부터 항체-생산 세포를 분리하는 단계; (d) 항체-생산 세포를 무한 증식 처리하는 단계; (e) 무한 증식성 항체-생산 세포의 각 모노클로날 군집을 생산하는 단계; 및 (f) 무한 증식성 항체-생산 세포를 스크리닝하여, ALK-1에 대해 생성된 항체를 동정하는 단계를 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은 인간 항-ALK-1 항체를 생산하는 세포주를 제공한다. 몇몇 구체예에서, 세포주는 하이브리도마 세포주이다. 몇몇 구체예에서, 상기 하이브리도마는 전술한 바와 같은 마우스 하이브리도마이다. 다른 구체예에서, 상기 하리브리도마는 비-인간, 비-마우스 종 예를 들어, 래트, 양, 돼지, 염소, 소 또는 말에서 생산된다. 다른 구체예에서, 하이브리도마는 인간 하이브리도마이다.
다른 구체예에서, 트랜스제닉 동물은 ALK-1 항원으로 면역화되며, 1차 세포 예를 들어, 비장 또는 말초 혈액 B 세포는 면역화된 트랜스제닉 동물로부터 분리되고, 원하는 항원에 특이적인 항체를 생산하는 각각의 세포가 동정된다. 각각의 세포로부터 유래하는 폴리아데닐화 mRNA가 분리되며, 역 전사 중합 효소 연쇄 반응(RT-PCR)은 가변 도메인 서열에 어닐링되는 센스 프라이머 예를 들어, 인간 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 유전자의 FR1 부위의 대부분 또는 전부를 인지하는 축퇴성 프라이머와, 불변부 서열 또는 접합부 서열에 어닐링되는 안티 센스 프라이머를 사용하여 수행된다. 이후, 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 cDNA는 클로닝되어, 임의의 적당한 숙주 세포 예를 들어, 골수종 세포에서, 각각의 면역 글로불린 불변부 예를 들어, 중쇄 및 κ 또는 λ 불변 도메인을 보유하는 키메라 항체로서 발현된다. 본원에 참고용으로 인용되어 있는 문헌[Babcook, J. S.외 다수, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7843-48, 1996]을 참조하시오. 이후 항-ALK-1 항체는 본원에 개시된 바와 같이 동정 및 분리될 수 있다.
다른 구체예에서, 파지 디스플레이 기술(phage display technique)을 사용하면 ALK-1에 대한 친화도가 다양한 항체의 레퍼토리를 함유하는 라이브러리를 생산할 수 있다. 이러한 레퍼토리의 생산을 위하여 면역화된 동물로부터 유래하는 B 세포를 무한 증식 처리할 필요는 없다. 오히려, 1차 B 세포를 DNA 공급원으로서 직접 사용할 수 있다. 예를 들어, 비장으로부터 유래하는 B 세포로부터 얻어진 cDNA의 혼합물을 사용하여, 발현 라이브러리 예를 들어, 이. 콜라이에 형질 감염된 파지 디스플레이 라이브러리를 생산한다. 결과로 생성된 세포를 ALK-1에 대한 면역 반응성에 대해 테스트한다. 이러한 라이브러리로부터 유래하는 고 친화성 인간 항체의 동정 기술에 관하여는 본원에 참고용으로 인용되어 있는 문헌[Griffiths외 다수, EMBO J., 13:3245-3260 (1994); Nissim외 다수, 상동, pp. 692-698 및 Griffiths외 다수, 상동, 12:725-734]에 개시되어 있다. 궁극적으로, 이 라이브러리로부터 유래하는 클론들(즉, 항원에 대한 결합 친화도가 원하는 수준인 클론)이 동정되며, 이러한 결합에 관여하는 생산물을 암호화하는 DNA는 회수되어 표준적인 재조합체 발현용으로서 조작된다. 파지 디스플레이 라이브러리는 또한 이미 조작된 뉴클레오티드 서열을 이용하여 구성될 수 있으며, 유사한 방식으로 스크리닝될 수도 있다. 일반적으로, 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 cDNA는 독립적으로 공급 또는 결합하여, 파지 라이브러리 내에서 생산되는 Fv 유사체를 형성한다.
이후 파지 라이브러리는 ALK-1 및 적당한 클론으로부터 회수된 유전 물질에 대한 친화도가 가장 큰 항체에 대해 스크리닝된다. 스크리닝 횟수를 늘리면 분리된 원래 항체의 친화도도 증가할 수 있다.
핵산, 벡터, 숙주 세포 및 재조합체를 사용하는 항체 생산 방법
핵산
본 발명은 또한 항-ALK-1 항체 또는 이의 항원 결합부를 암호화하는 핵산 분자를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 상이한 핵산 분자는 항-ALK-1 면역 글로불린의 중쇄 및 경쇄를 암호화한다. 다른 구체예에서, 동일한 핵산 분자는 항-ALK-1 면역 글로불린의 중쇄 및 경쇄를 암호화한다.
몇몇 구체예에서, 경쇄의 가변 도메인(VL)을 암호화하는 핵산 분자는 인간 A27, A2, A1, A3, B3, B2, L1 또는 L2 Vκ 유전자, 그리고 인간 Jκ5, Jκ1, Jκ3 또는 Jκ4 유전자를 이용한다. 몇몇 구체예에서, 핵산 분자는 인간 A27 Vκ 유전자 및 인간 Jκ5 유전자를 이용한다. 다른 구체예에서, 핵산 분자는 인간 A2 유전자 및 인간 Jκ1 유전자를 이용한다. 몇몇 구체예에서, 경쇄를 암호화하는 핵산 분자는 생식 계열 아미노산 서열(들)로부터 유래하며, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 치환 부를 포함하는 아미노산 서열을 암호화한다. 몇몇 구체예에서, 핵산 분자는 생식 계열 Vκ 및 Jκ 서열에 비하여, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 보존적 아미노산 치환 부 및/또는 1, 2 또는 3개의 비-보존적 치환 부를 포함하는 VL 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 치환은 CDR 부위, 틀 부위 또는 불변 도메인에서 일어날 수 있다.
몇몇 구체예에서, 핵산 분자는 생식 계열 서열과 비교하였을 때, 1개 이상의 돌연 변이[즉, 항체 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1(rWT); 1.12.1(M29I/D19A); 1.12.1(M29I); 1.12.1(D19A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1; 또는 5.59.1중 어느 하나의 VL에서 살펴볼 수 있는, 생식 계열에 발생하는 돌연 변이와 동일한 돌연 변이]를 포함하는 VL 아미노산 서열을 암호화한다.
몇몇 구체예에서, 핵산 분자는 생식 계열 서열과 비교하였을 때, 3개 이상의 아미노산 치환부[즉, 항체 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1(rWT); 1.12.1(M29I/D19A); 1.12.1(M29I); 1.12.1(D19A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1; 또는 5.59.1 중 어느 하나의 VL에서 살펴볼 수 있는, 생식 계열에 발생하는 돌연 변이와 동일한 아미노산 치환부]를 암호화한다.
몇몇 구체예에서, 핵산 분자는 서열 번호 7, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 47, 51, 55, 59, 63, 67, 71, 75, 79, 83, 87, 91 또는 126으로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 상기 뉴클레오티드 서열은 모노클로날 항체 1.12.1(M29I/D19A); 1.11.1, 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1; 5.59.1 또는 1.12.1의 VL 아미노산 서열을 암호화한다.
몇몇 구체예에서, 핵산 분자는 서열 번호 8; 12; 16; 20; 24; 28; 32; 36; 40; 44; 48; 52; 56; 60; 64; 68; 72; 76; 80; 84; 88; 92 또는 127의 서열 중 하나의 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 핵산 분자는 서열 번호 3의 뉴클레오티드 서열 또는 이의 일부를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 핵산은 상기 항체의 CDR 중 1개, 2개 또는 3개 모두의 경쇄의 아미노산 서열을 암호화한다. 몇몇 구체예에서, 상기 일부는 항-ALK-1 항체의 경쇄의 CDR1∼CDR3으로부터 유래하는 인접 부위를 암호화한다.
몇몇 구체예에서, 핵산 분자는 항체 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1(rWT); 1.12.1(M29I/D19A); 1.12.1(M29I); 1.12.1(D19A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1 ; 1.27.1 ; 1.29.1 ; 1.31.1 ; 1.8.1; 1.9.1 ; 4.10.1 ; 4.24.1 ; 4.38.1 ; 4.58.1 ; 4.62.1 ; 4.68.1; 4.72.1 ; 5.13.1; 5.34.1 ; 5.53.1 ; 5.56.1 ; 5.57.1 ; 또는 5.59.1 중 어느 하나의 VL 아미노산 서열, 또는 서열 번호 4의 VL 부위의 아미노산 서열과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한 VL 아미노산 서열을 암호화한다. 본 발명의 핵산 분자는 고도로 엄중한 조건 하에서 혼성화하는 핵산 예를 들어, 전술한 바와 같은 핵산, 또는 서열 번호 8; 12; 16; 20; 24; 28; 32; 36; 40; 44; 48; 52; 56; 60; 64; 68; 72; 76; 80; 84; 88; 92 또는 126의 VL 부위의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산, 또는 서열 번호 4의 VL 부위의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한 핵산을 포함한다.
다른 바람직한 구체예에서, 핵산 분자는 인간의 VH 4-31, VH 3-11, VH 3-15, VH 3-33, VH 4-61 또는 VH 4-59 유전자 서열 또는 이로부터 유래하는 서열을 이용하는 중쇄의 가변 도메인(VH)을 암호화한다. 몇몇 구체예에서, 핵산 분자는 인간의 VH 4-31 유전자, DH6-19 유전자 및 인간의 JH4B 유전자를 이용한다.
몇몇 구체예에서, 핵산 분자는 인간의 V, D 또는 J 유전자의 생식 계열 아미노산 서열과 비교하였을 때, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11개의 돌연 변이를 포함하는 아미노산 서열을 암호화한다. 몇몇 구체예에서, 상기 돌연 변이는 VH 부위 내에 존재한다. 몇몇 구체예에서, 상기 돌연 변이는 CDR 부위 내에 존재한다.
몇몇 구체예에서, 핵산 분자는 생식 계열 VH 서열과 비교하였을 때, 모노클로날 항체 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1(rWT); 1.12.1(M29I/D19A); 1.12.1(M29I); 1.12.1(D19A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1; 또는 5.59.1 중 어느 하나의 VH에서 살펴볼 수 있는 아미노산 돌연 변이와 동일한 하나 이상의 아미노산 돌연 변이를 포함하는 VH 서열을 암호화한다. 몇몇 구체예에서, 핵산은 생식 계열 서열과 비교하였을 때, 상기 나열된 모노클로날 항체 중 하나에서 살펴볼 수 있는 3개 이상의 아미노산 돌연 변이와 동일한 3개 이상의 아미노산 돌연 변이를 암호화한다.
몇몇 구체예에서, 핵산 분자는 서열 번호 5, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 49, 53, 57, 61, 65, 69, 73, 77, 81, 85, 89 또는 103의 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열 즉, 모노클로날 항체 1.12.1(M29I/D19A); 1.11.1; 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1; 5.59.1 또는 1.12.1의 VH 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
몇몇 구체예에서, 핵산 분자는 서열 번호 2; 6; 10; 14; 18; 22; 26; 30; 34; 38; 42; 46; 50; 54; 58; 62; 66; 70; 74; 78; 82; 86; 90 또는 104 중 어느 하나의 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 다수의 바람직한 구체예에서, 핵산 분자는 서열 번호 1 또는 서열 번호 95의 뉴클레오티드 서열의 최소한의 일부를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 상기 일부는 VH 부위, CDR3 부위, CDR 부위 3개 모두, 또는 CDR1∼CDR3을 포함하는 인접 부위를 암호화한다.
몇몇 구체예에서, 핵산 분자는 서열 번호 2; 6; 10; 14; 18; 22; 26; 30; 34; 38; 42; 46; 50; 54; 58; 62; 66; 70; 74; 78; 82; 86; 90 또는 104 중 어느 하나에 있어서의 VH 아미노산 서열과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한 VH 아미노산 서열을 암호화한다. 본 발명의 핵산 분자는 고도로 엄중한 조건 하에서 혼성화하는 핵산 예를 들어, 전술한 바와 같은 핵산, 또는 서열 번호 2; 6; 10; 14; 18; 22; 26; 30; 34; 38; 42; 46; 50; 54; 58; 62; 66; 70; 74; 78; 82; 86; 90; 100 또는 104의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 또는 이의 VH 부위, 또는 서열 번호 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 49, 53, 57, 61, 65, 69, 73, 77, 81, 85, 89, 95, 103, 128 또는 129의 뉴클레오티드 서열 또는 이의 VH 부위를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한 핵산을 포함한다.
다른 구체예에서, 핵산은 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1(rWT); 1.12.1(M29I/D19A); 1.12.1(M29I); 1.12.1(D19A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1; 5.59.1로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체의 전장 중쇄, 또는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 암호화한다. 뿐만 아니라, 핵산은 서열 번호 1 또는 서열 번호 95의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
항-ALK-1 항체 또는 이의 일부의 중쇄 또는 경쇄를 암호화하는 핵산 분자는 이러한 항체를 생산하는 임의의 공급원으로부터 분리될 수 있다. 다양한 구체예에서, 핵산 분자는 ALK-1으로 면역화된 동물로부터 분리되는 항-ALK-1 항체를 발현하는 B 세포나 이러한 B 세포로부터 유래되는 무한 증식성 세포로부터 분리된다. 항체를 암호화하는 핵산을 분리하는 방법은 당 업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Sambrook J. & Russell D., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (2000)]을 참조하시오. mRNA는 분리되어, 중합 효소 연쇄 반응(PCR)에 사용될 cDNA를 생산하거나 또는 항체 유전자를 cDNA 클로닝 하는데 사용될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 핵산 분자는 융합 파트너 중 하나로서 비-인간 트랜스제닉 동물 유래의 세포를 취하는 하이브리도마로부터 분리되는데, 여기서, 상기 세포는 인간의 면역 글로불린을 생산하는 것이다. 더욱 바람직한 구체예에서, 인간 면역 글로불린을 생산하는 세포는 제노마우스® 동물로부터 분리된다. 다른 구체예에서, 인간 면역 글로불린을 생산하는 세포는 전술한 바와 같이, 비-인간, 비-마우스 트랜스제닉 동물로부터 분리된다. 다른 구체예에서, 핵산은 비-인간, 비-트랜스제닉 동물로부터 분리된다. 비-인간, 비-트랜스제닉 동물로부터 분리된 핵산 분자는 예를 들어, 본 발명의 인간 항-ALK-1 항체로부터 유래하는 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 인간화된 항체 생산용으로서 사용될 수 있다.
몇몇 구체예에서, 본 발명의 항-ALK-1 항체의 중쇄를 암호화하는 핵산은, 임의의 공급원으로부터 유래하는 중쇄 불변 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 인-프레임(in-frame) 상태로 결합된 본 발명의 VH 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 이와 유사하게, 본 발명의 항-ALK-1 항체의 경쇄를 암호화하는 핵산 분자는 임의의 공급원으로부터 유래하는 경쇄 불변 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 인-프레임 상태로 결합된 본 발명의 VL 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 측면에서, 중쇄 가변 도메인(VH) 및/또는 경쇄 가변 도메인(VL)을 암호화하는 핵산 분자는 전장 항체 유전자로 "전환"된다. 하나의 구체예에서, VH 또는 VL 도메인을 암호화하는 핵산 분자는, 이미 중쇄 불변 도메인(CH) 또는 경쇄 불변 도메인(CL)을 각각 암호화하고 있는 발현 벡터에 삽입되어, 상기 VH 분절이 벡터 내에 존재하던 CH 분절(들)과 작동 가능하도록 결합하고/결합하거나, 상기 VL 분절이 벡터 내에 존재하던 CL 분절과 작동 가능하도록 결합함으로써, 전장 항체 유전자로 전환된다. 다른 구체예에서, VH 및/또는 VL 도메인을 암호화하는 핵산 분자는 표준적인 분자 생물학적 기술을 이용하여, VH 및/또는 VL 도메인을 암호화하는 핵산 분자를 CH 및/또는 CL 도메인을 암호화하는 핵산 분자에 결합 예를 들어, 결찰시킴로써, 전장 항체 유전자로 전환된다. 인간 중쇄 및 경쇄 면역 글로불린 불변 도메인 유전자의 핵산 서열에 관하여는 당 업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Kabat외 다수, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., NIH Publ. No. 91-3242, 1991]을 참조하시오. 이후, 전장 중쇄 및/또는 경쇄를 암호화하는 핵산 분자는 이 핵산 분자가 도입된 세포에서 발현되며, 이로써 항-ALK-1 항체가 분리된다.
핵산 분자는 다량의 항-ALK-1 항체를 재조합적으로 발현시키기 위해 사용될 수 있다. 핵산 분자는 또한 이하에 기술된 바와 같이, 키메라 항체, 이중 특이적 항체, 단일 사슬 항체, 면역 접합체, 다이아바디, 돌연 변이 항체 및 항체의 유도체를 생산하는데 사용될 수도 있다. 만일 핵산 분자가 비-인간, 비-트랜스제닉 동물로부터 유래되면, 핵산 분자는 이하에도 기술되어 있는 바와 같이, 항체의 인간화에도 사용될 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명의 핵산 분자는 특이적 항체 서열에 대한 프로브 또는 PCR 프라이머로서 사용된다. 예를 들어, 핵산은 진단 방법에서 프로브로서 사용될 수 있거나, 항-ALK-1 항체의 가변 도메인을 암호화하는 부가의 핵산 분자를 분리하는데 사용될 수 있는 DNA 부위를 증폭시키기 위한 PCR 프라이머로서 사용될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 핵산 분자는 올리고뉴클레오티드이다. 몇몇 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 목적 항체의 중쇄 및 경쇄의 고도로 가변성인 도메인으로부터 유래한다. 몇몇 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 항체 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1(rWT); 1.12.1(M29I/D19A); 1.12.1(M29I); 1.12.1 (D19A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1; 또는 5.59.1, 또는 본원에 개시된 이것의 변이체의 CDR 중 하나 이상의 일부 또는 전부를 암호화한다.
벡터
본 발명은 본 발명의 항-ALK-1 항체 또는 이의 항원 결합부의 중쇄를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다. 본 발명은 또한 이러한 항체 또는 이의 항원 결합부의 경쇄를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다. 본 발명은 또한 융합 단백질, 변형 항체, 항체 단편 및 이의 프로브를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다.
몇몇 구체예에서, 본 발명의 항-ALK-1 항체 또는 이의 항원 결합부는 전술한 바와 같이 얻어진 부분 또는 전장 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 DNA를 발현 벡터에 삽입하여, 이 유전자를 필수 발현 제어 서열 예를 들어, 전사 및 번역 제어 서열에 작동 가능하도록 결합시킴으로써 발현된다. 발현 벡터로서는 플라스미드, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스(AAV), 식물 바이러스 예를 들어, 꽃 양배추 모자이크 바이러스, 담배 모자이크 바이러스, 코스미드, YAC 및 EBV 유래 에피좀 등을 포함한다. 항체 유전자는 벡터에 결찰되며, 이 벡터 내에 존재하던 전사 및 번역 제어 서열은 항체 유전자의 전사 및 번역을 조절하는 기능을 발휘하게 된다. 발현 벡터 및 발현 제어 서열은 사용되는 발현 숙주 세포와 융합 가능한 것으로서 선택된다. 항체 경쇄 유전자 및 항체 중쇄 유전자는 별도의 벡터에 삽입될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 상기 두 유전자는 동일한 발현 벡터에 삽입된다. 항체 유전자는 표준적인 방법[예를 들어, 항체 유전자 단편 상의 상보적인 제한 위치와 벡터의 결찰, 또는 제한 위치가 존재하지 않을 경우에는 평활 말단 결찰]에 의해 발현 벡터에 삽입된다.
편리한 벡터는, 전술한 바와 같이, 임의의 VH 또는 VL 서열이 용이하게 삽입 및 발현될 수 있도록 조작된 적당한 제한 위치를 가지는, 기능상 완전한 인간 CH 또는 CL 면역 글로불린 서열을 암호화하는 것이다. 이러한 벡터에 있어서, 스플라이싱은 일반적으로 삽입된 J 부위 내 스플라이싱 공여 위치와, 인간 C 도메인의 앞에 존재하는 스플라이싱 수용 위치 사이에서 일어나며, 또한 인간 CH 엑손 내에 존재하는 스플라이싱 부위에서도 일어난다. 폴리아데닐화 및 전사 종결은 암호화 부위의 하류에 존재하는 본래 염색체 위치에서 일어난다. 재조합 발현 벡터는 또한 숙주 세포로부터 항체 사슬이 분비되는 것을 촉진하는 신호 펩티드를 암호화할 수도 있다. 항체 사슬 유전자는 벡터에 클로닝될 수 있으며, 이로써, 신호 펩티드는 면역 글로불린 사슬의 아미노 말단에 인-프레임 상태로 결합된다. 신호 펩티드는 면역 글로불린 신호 펩티드 또는 이종 신호 펩티드(즉, 비-면역 글로불린 단백질로부터 유래하는 신호 펩티드)일 수 있다.
항체 사슬 유전자 이외에, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 숙주 세포 내에서 항체 사슬 유전자의 발현을 제어하는 조절 서열을 운반한다. 당 업자들은 발현 벡터를 디자인하는 것 예를 들어, 조절 서열을 선택하는 것은 예를 들어, 형질 전환될 숙주 세포의 선택, 및 원하는 단백질의 발현 수준과 같은 요인에 따라 달라질 수 있음을 알 것이다. 포유동물 숙주 세포 발현용으로서 바람직한 조절 서열로서는 포유동물 세포 내에서 단백질 발현의 수준을 높이는 바이러스 요소 예를 들어, 레트로바이러스 LTR로부터 유래하는 프로모터 및/또는 인핸서, 사이토메갈로바이러스(CMV)(예를 들어, CMV 프로모터/인핸서), 원숭이 바이러스 40(SV40)(예를 들어, SV40 프로모터/인핸서), 아데노바이러스(예를 들어, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터(AdMLP)), 폴리오마 및 강력 포유동물 프로모터 예를 들어, 천연 면역 글로불린 및 액틴 프로모터를 포함한다. 바이러스 조절 요소 및 이의 서열에 관한 보다 상세한 설명에 관하여는 예를 들어, 미국 특허 제5,168,062호, 미국 특허 제4,510,245호 및 미국 특허 제4,968,615호를 참조하시오. 식물 내에서 항체를 발현시키는 방법, 프로모터와 벡터에 관한 설명, 그리고 식물의 형질 전환법에 관하여는 당 업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 본원에 참고용으로 인용되어 있는 미국 특허 제6,517,529호를 참조하시오, 박테리아 세포 또는 진균 세포 예를 들어, 효모 세포 내에서 폴리펩티드를 발현하는 방법에 관하여도 당 업계에 널리 공지되어 있다.
항체 사슬 유전자 및 조절 서열에 더하여, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 부가의 서열 예를 들어, 숙주 세포 내에서 벡터의 복제를 조절하는 서열(예를 들어, 복제 기원) 및 선별 마커 유전자를 보유할 수 있다. 상기 선별 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포의 선별을 촉진한다[예를 들어, 본원에 참고용으로 인용되어 있는 미국 특허 제4,399,216호, 동 제4,634,665호 및 동 제5,179,017호를 참조하시오]. 예를 들어, 선별 마커 유전자는 통상 벡터가 도입된 숙주 세포에 약물 예를 들어, G418, 하이그로마이신 또는 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여한다. 예를 들어, 선별 마커 유전자로서는 디하이드로폴레이트 환원 효소(DHFR) 유전자[메토트렉세이트 선별/증폭시 dhfr- 숙주 세포에 사용함], neo 유전자(G418 선별용) 및 글루타메이트 합성 효소 유전자를 포함한다.
단백질을 재조합 생산하는 비-하이브리도마 숙주 세포 및 방법
항-ALK-1 항체를 암호화하는 핵산 분자와 이러한 핵산 분자를 포함하는 벡터는 적당한 포유동물, 식물, 박테리아 또는 효모 숙주 세포를 형질 감염하는데 사용될 수 있다. 형질 전환은 숙주 세포에 폴리뉴클레오티드를 도입하는 임의의 공지된 방법에 의하여 이루어질 수 있다. 이종 폴리뉴클레오티드를 포유동물 세포에 도입하는 방법은 당 업계에 널리 공지되어 있으며, 그 예로서는 덱스트란-매개 형질 감염법, 인산칼슘 침전법, 폴리브렌-매개 형질 감염법, 원형질체 융합법, 전기 천공법, 폴리뉴클레오티드(들)의 리포좀 내 캡슐 형성법, 그리고 DNA를 핵에 직접 미세 주입하는 방법을 포함한다. 뿐만 아니라, 핵산 분자는 바이러스 벡터에 의하여 포유동물 세포에 도입될 수 있다. 세포를 형질 전환하는 방법에 관하여는 당 업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 본원에 참고용으로 인용되어 있는 미국 특허 제4,399,216호, 동 제4,912,040호, 동 제4,740,461호 및 동 제4,959,455호를 참조하시오. 식물 세포를 형질 전환하는 방법은 당 업계에 널리 공지되어 있으며, 그 예로서는 아그로박테리움(Agrobacterium)-매개 형질 전환법, 바이오리스틱 형질 전환법(biolistic transformation), 직접 주입법, 전기 천공법 및 바이러스 형질 전환법을 포함한다. 박테리아 및 효모 세포를 형질 전환하는 방법도 당 업계에 널리 공지되어 있다.
발현용 숙주로서 이용 가능한 포유동물 세포주에 관하여는 당 업계에 널리 공지되어 있으며, 그 예로서는 미국 표준 균주 보존 기관(ATCC)으로부터 얻을 수 있는 다수의 무한 증식성 세포주를 포함한다. 그 예로서는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, NS0 세포, SP2 세포, HEK-293T 세포, 293 프리스타일(Freestyle) 세포(Invitrogen), NIH-3T3 세포, HeLa 세포, 새끼 햄스터 신장(BHK) 세포, 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(COS), 인간 간 세포 암종 세포(예를 들어, Hep G2), A549 세포 및 기타 다수의 세포주를 포함한다. 특히 바람직한 세포주는 어느 세포주의 발현 수준이 높은지를 측정함으로써 선택된다. 사용될 수 있는 기타 세포주로서는 곤충 세포주 예를 들어, Sf9 또는 Sf21 세포가 있다. 항체 유전자를 암호화하는 재조합 발현 벡터가 포유동물 숙주 세포에 도입될 때, 항체는, 숙주 세포 내에서 항체를 발현시키기에 충분한 시간 동안, 또는 더욱 바람직하게는 숙주 세포가 생장한 배양 배지로 항체를 분비하는데 충분한 시간 동안, 숙주 세포를 배양함으로써 생산된다. 항체는 표준적인 단백질 정제 방법을 사용하여 배양 배지로부터 회수될 수 있다. 식물 숙주 세포로서는 예를 들어, 니코티아나(Nicotiana), 아라비돕시스(Arabidopsis), 개구리밥, 옥수수, 밀 및 감자 등을 포함한다. 박테리아 숙주 세포로서는 이. 콜라이와 스트렙토마이세스(Streptomyces) 종을 포함한다. 효모 숙주 세포로서는 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) 및 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)를 포함한다.
뿐만 아니라, 본 발명의 항체를 생산 세포로부터 발현시키는 것은 다수의 공지된 기술을 사용함으로써 촉진될 수 있다. 예를 들어, 글루타민 합성 효소 유전자 발현 시스템(GS 시스템)은 일정한 조건 하에서 발현을 강화하기 위한 일반적인 수단이다. GS 시스템은 유럽 특허 0 216 846, 0 256 055, 0 323 997 및 0 338 841에 전체적으로 또는 부분적으로 기술되어 있다.
상이한 세포주에 의하거나 또는 트랜스제닉 동물에서 발현되는 항체는 서로 상이한 방식으로 글리코실화되는 것으로 추정된다. 그러나, 본원에 제공된 핵산 분자에 의해 암호화된 모든 항체, 또는 본원에 제공된 아미노산 서열을 포함하는 모든 항체는, 항체의 글리코실화에 상관 없이, 본 발명의 일부에 해당한다.
트랜스제닉 동물 및 식물
본 발명의 항-ALK-1 항체는 또한 목적 면역 글로불린 중쇄 및 경쇄 서열에 대하여 트랜스제닉인 포유동물 또는 식물을 제조하여, 회수 가능한 형태인 항체를 생산해 냄으로써, 트랜스제닉 방식으로 생산될 수 있다. 포유동물에서의 트랜스제닉 방식의 생산과 관련하여, 항-ALK-1 항체는 염소, 소 또는 기타 포유동물의 모유 내에서 생산될 수 있고, 또한 이로부터 회수될 수 있다. 예를 들어, 본원에 참고용으로 인용되어 있는 미국 특허 제5,827,690호, 동 제5,756,687호, 동 제5,750,172호 및 동 제5,741,957호를 참조하시오, 몇몇 구체예에서, 인간의 면역 글로불린 위치를 포함하는 비-인간 트랜스제닉 동물은, 전술한 바와 같이, ALK-1 또는 이의 면역원성 일부로써 면역화된다. 식물 내에서 항체를 생산하는 방법에 관하여는 본원에 참고용으로 인용되어 있는 미국 특허 제6,046,037호 및 동 제5,959,177호에 기술되어 있다.
몇몇 구체예에서, 비-인간 트랜스제닉 동물 또는 식물은 표준적인 트랜스제닉 방식의 기술에 의해 본 발명의 항-ALK-1 항체를 암호화하는 하나 이상의 핵산 분자를 동물 또는 식물에 도입시킴으로써 생산된다. 문헌[Hogan, 미국 특허 제6,417,429호(상동)]을 참조하시오. 트랜스제닉 동물을 제조하는데 사용된 트랜스제닉 세포는 배아 줄기 세포 또는 체세포 또는 수정난일 수 있다. 트랜스제닉 비-인간 유기체는 키메라, 비 키메라 이형 접합체와, 비 키메라 동형 접합체일 수 있다. 예를 들어, 본원에 참고용으로 인용되어 있는 문헌[Hogan외 다수, Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Press (1999); Jackson외 다수, Mouse Genetics and Transgenics: A Practical Approach, Oxford University Press (2000); 및 Pinkert, Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook, Academic Press (1999)]을 참조하시오. 몇몇 구체예에서, 트랜스제닉 비-인간 동물은 목적 중쇄 및/또는 경쇄를 암호화하는 구조물을 표적화함으로써, 표적화된 파괴 및 치환이 진행된다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 트랜스제닉 동물은 ALK-1, 바람직하게는 인간 ALK-1에 특이적으로 결합하는 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 핵산 분자를 포함 및 발현한다. 몇몇 구체예에서, 트랜스제닉 동물은 변형된 항체 예를 들어, 단일 사슬 항체, 키메라 항체 또는 인간화된 항체를 암호화하는 핵산 분자를 포함한다. 상기 항-ALK-1 항체는 임의의 트랜스제닉 동물에서 제조될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 비-인간 동물로서는 마우스, 래트, 양, 돼지, 염소, 소 또는 말이 있다. 바-인간 트랜스제닉 동물은 암호화된 상기 폴리펩티드를 혈액, 모유, 소변, 타액, 눈물, 점액 및 기타 체액 내에 발현한다.
파지 디스플레이 라이브러리
본 발명은 항-ALK-1 항체 또는 이의 항원 결합부를 생산하는 방법에 관한 것으로서, 파지 상에서 인간 항체의 라이브러리를 합성하는 단계, ALK-1 또는 이의 항원 결합부를 가지는 라이브러리를 스크리닝하는 단계, ALK-1과 결합하는 파지를 분리하는 단계, 및 이 파지로부터 항체를 얻는 단계를 포함한다. 예를 들어, 파지 디스플레이 기술에 사용되는 항체 라이브러리를 제조하는 한 가지 방법은, 인간 면역 글로불린 위치를 포함하는 비-인간 동물을 ALK-1 또는 이의 항원 결합부로 면역화하여, 면역 반응을 유도한 후, 이 면역화된 동물로부터 항체-생산 세포를 추출하는 단계; 추출된 세포로부터 본 발명의 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 RNA를 분리하고, 이 RNA를 역전사시켜 cDNA를 생산한 후, 프라이머를 사용하여 이 cDNA를 증폭시키는 단계; 및 상기 cDNA를 파지 디스플레이 벡터에 삽입하여, 파지 상에 항체가 발현되도록 만드는 단계를 포함한다. 본 발명의 재조합 항-ALK-1 항체는 이러한 방식으로 생산될 수 있다.
본 발명의 재조합 인간 항-ALK-1 항체는 재조합 조합형 항체 라이브러리를 스크리닝함으로써 분리될 수 있다. 바람직하게, 상기 라이브러리는 scFv 파지 디스플레이 라이브러리 즉, B 세포로부터 분리된 mRNA로부터 제조된 인간 VL 및 VH cDNA를 사용하여 생산된 라이브러리이다. 이러한 라이브러리를 제조 및 스크리닝하는 방법은 당 업계에 공지되어 있다. 파지 디스플레이 라이브러리용 키트는 시판되고 있다[예를 들어, 파마시아 리컴비난트 파지 안티바디 시스템(Pharmacia Recombinant Phage Antibody System), 카탈로그 번호 27-9400-01; 및 스트라타젠(Stratagene)의 SurfZAP™ 파지 디스플레이 키트, 카탈로그 번호 240612]. 항체 디스플레이 라이브러리를 생산 및 스크리닝하는데 사용될 수 있는 기타 방법과 시약들도 존재한다[예를 들어, 미국 특허 제5,223,409호; PCT 공보 WO 92/18619, WO 91/17271, WO 92/20791, WO 92/15679, WO 93/01288, WO 92/01047, WO 92/09690; Fuchs외 다수, Bio/Technology 9:1370-1372 (1991); Hay외 다수, Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85 (1992); Huse외 다수, Science 246:1275-1281 (1989); McCafferty외 다수, Nature 348:552-554 (1990); Griffiths외 다수, EMBO J. 12:725-734 (1993); Hawkins외 다수, J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992); Clackson외 다수, Nature 352:624-628 (1991); Gram외 다수, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3576-3580 (1992); Garrad외 다수, Bio/Technology 9:1373-1377 (1991); Hoogenboom외 다수, Nuc. Acid Res. 19:4133-4137 (1991); 및 Barbas외 다수, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7978-7982 (1991); 상기 문헌 들은 모두 본원에 참고용으로 인용됨].
하나의 구체예에서, 원하는 특성을 가지는 인간 항-ALK-1 항체를 분리 및 생산하기 위해서는, 본원에 기술된 바와 같이, 본원에 참고용으로 인용되어 있는 PCT 공보 WO 93/06213에 개시된 에피토프 각인 방법(epitope imprinting method)을 통해, 우선 인간 항-ALK-1 항체를 사용하여, ALK-1에 대한 결합 활성이 유사한 인간 중쇄 및 경쇄 서열을 선별한다. 이 방법에 사용된 항체 라이브러리는 본원에 참고용으로 인용되어 있는 문헌[PCT 공보 WO 92/01047, McCafferty외 다수, Nature 348:552-554 (1990); 및 Griffiths외 다수, EMBO J. 12:725-734 (1993)]에 개시된 바와 같이 제조 및 스크리닝된 scFv 라이브러리인 것이 바람직하다. 상기 scFv 항체 라이브러리는 인간 ALK-1을 항원으로 사용하여 스크리닝된다.
일단 처음에 인간의 VL 및 VH 도메인이 선별되면, "혼합 및 매칭" 실험("mix and match" experiment)을 수행하는데, 여기서는, 처음에 선별된 VL 및 VH 분절의 상이한 쌍들이 ALK-1과의 결합 여부에 대해 스크리닝되며, 그 결과 바람직한 VL/VH 쌍의 조합체가 선별된다. 뿐만 아니라, 항체의 품질을 더욱 개선하기 위해서, 바람직한 VL/VH 쌍(들)의 VL 및 VH 분절들을, 바람직하게는, 천연 상태의 면역 반응시 항체의 친화도 성숙에 관여하는 생체 내 체세포 돌연 변이 과정에 유사한 방식으로, 상기 VH 및/또는 VL의 CDR3 부위 내에서 무작위적으로 돌연 변이시킨다. 이와 같은 시험관 내 친화도 성숙은 각각 VH CDR3 또는 VL CDR3에 상보성인 PCR 프라이머를 사용하여 VH 및 VL 도메인을 증폭시킴으로써 이루어질 수 있는데, 이때 사용되는 프라이머는 임의의 위치에서 4개의 뉴클레오티드 염기의 무작위적 혼합물로 "스파이킹(spiking)"되며, 그 결과, PCR 생산물은 무작위 돌연 변이가 VH 및/또는 VL CDR3 부위에 도입되어 있는 VH 및 VL 분절을 암호화하게 된다. 이와 같이 무작위적으로 돌연 변이된 VH 및 VL 분절을, 이 분절이 ALK-1과 결합하는지 여부에 대해 다시 스크리닝할 수 있다.
본 발명의 항-ALK-1 항체를 재조합 면역 글로불린 디스플레이 라이브러리로부터 스크리닝 및 분리한 다음, 선별된 항체를 암호화하는 핵산을 표준적인 재조합 DNA 기술에 의해 디스플레이 팩키지(예를 들어, 파지 게놈)로부터 회수할 수 있으며, 또한 기타 발현 벡터에 서브클로닝할 수 있다. 원한다면, 이하에 기술된 바와 같이, 핵산을 추가로 조작하여, 본 발명의 기타 항체형을 생산할 수 있다. 조합형 라이브러리의 스크리닝에 의해 분리된 재조합 인간 항체를 발현시키기 위해서는, 이하에 기술된 바와 같이, 이 항체를 암호화하는 DNA를 재조합 발현 벡터에 클로닝하여 포유동물 숙주 세포에 도입한다.
탈 면역화된 항체(deimmunized antibody)
본 발명의 다른 측면에서, 항체는 탈 면역화되어 예를 들어, 문헌[PCT 공보 WO 98/52976 및 WO 00/34317; 본원에 참고용으로 인용됨]에 개시된 기술을 이용하여 이 항체의 면역원성을 줄일 수 있다.
돌연 변이된 항체
다른 구체예에서, 핵산 분자, 벡터 및 숙주 세포를 돌연 변이된 항-ALK-1 항체를 생산하는데 사용할 수 있다. 예를 들어, 항체의 결합 특성을 변질시키기 위하여 상기 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 도메인을 돌연 변이시킬 수 있다. 예를 들어, 돌연 변이는 CDR 부위 중 하나 이상의 부위에서 일어나, 항체의 ALK-1에 대한 KD를 증가 또는 감소시키거나, Koff를 증가 또는 감소시키거나, 또는 항체의 결합 특이성을 변질시킬 수 있다. 위치-배향 돌연 변이 유발 기술에 관하여는 당 업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Sambrook외 다수 및 Ausubel외 다수, 상동]을 참조하시오. 다른 구체예에서, 하나 이상의 돌연 변이는 생식 계열과 비교하였을 때, 모노클로날 항체 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1(rWT); 1.12.1(M29I/D19A); 1.12.1(M29I); 1.12.1 (D19A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1; 또는 5.59.1 중 변이된 것으로 알려진 아미노산 잔기에서 일어난다. 돌연 변이는 가변 도메인의 CDR 부위 또는 틀 부위, 또는 불변 도메인 내에서 일어날 수 있다. 바람직한 구체예에서, 돌연 변이는 가변 도메인에서 일어난다. 몇몇 구체예에서, 하나 이상의 돌연 변이는 생식 계열과 비교하였을 때, 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92 또는 127의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 95, 102 또는 126에 제시된 이것의 핵산 서열의 가변 도메인의 틀 부위 또는 CDR 부위 중 변이된 것으로 알려진 아미노산 잔기에서 일어난다.
다른 구체예에서, 틀 부위는 돌연 변이되며, 그 결과로 생성되는 틀 부위(들)가 상응하는 생식 계열 유전자의 아미노산 서열을 가지게 된다. 돌연 변이는 틀 부위 또는 불변 도메인 중에서 발생하여, 그 결과, 항-ALK-1 항체의 반감기를 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 본원에 참고용으로 인용되어 있는 PCT 공보 WO 00/09560을 참조하시오. 틀 부위 또는 불변 도메인의 돌연 변이는 또한, 항체의 면역원성을 변질시키거나, 다른 분자와의 공유 결합 또는 비 공유 결합을 위한 위치를 제공하거나, 또는 보체 고정, FcR 결합 및 항체-의존성 세포-매개 세포 독성(ADCC)과 같은 특성들을 변질시키기 위해 가하여질 수 있다. 본 발명에 따르면, 단일 항체는 CDR 중 어느 하나 이상 또는 가변 도메인의 틀 부위 또는 불변 도메인 내에 돌연 변이가 발생할 수 있다.
몇몇 구체예에서, 돌연 변이된 항-ALK-1 항체의 VH 또는 VL 도메인 내에는, 돌연 변이 이전의 항-ALK-1 항체와 비교하였을 때, 1∼13(또는 이 사이의 임의의 정수)개의 아미노산 돌연 변이가 존재한다. 전술한 바 중 임의의 경우에 있어서, 돌연 변이는 하나 이상의 CDR 부위내에서 발생할 수 있다. 뿐만 아니라, 돌연 변이 중 어느 것은 보존적 아미노산 치환일 수 있다. 몇몇 구체예에서, 불변 도메인에는 5, 4, 3, 2 또는 1개 미만의 아미노산 변이가 발생할 수 있다.
변형된 항체
다른 구체예에서, 다른 폴리펩티드에 결합되어 있는 본 발명의 항-ALK-1 항체의 전부 또는 일부를 포함하는 융합 항체 또는 면역 접합체가 제조될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 항-ALK-1 항체의 가변 도메인만이 폴리펩티드에 결합되어 있다. 다른 바람직한 구체예에서, 항-ALK-1 항체의 VH 도메인은 제1 폴리펩티드에 결합되는 반면에, 항-ALK-1 항체의 VL 도메인은 제2 폴리펩티드에 결합되는데, 이때, 상기 제2 폴리펩티드는 VH 및 VL 도메인이 서로 상호 작용하여 항원 결합 위치를 형성할 수 있는 방식으로 제1 폴리펩티드와 결합한다. 기타 바람직한 구체예에서, 상기 VH 도메인은 링커에 의해 VL 도메인과 분리되며, 이때 상기 VH 및 VL 도메인들은 서로 상호 작용할 수 있다[이하, "단일 사슬 항체" 확인]. 이후, VH-링커-VL 항체는 목적 폴리펩티드와 결합된다. 또한, 2개(또는 그 이상)의 단일 사슬 항체가 서로 결합되어 있는 융합 항체도 생산될 수 있다. 이것은, 단일 폴리펩티드 사슬 상에서 2가 또는 다가의 항체를 만들고자 할 때나, 또는 이중 특이적 항체를 만들고자 할 때에 유용하다.
단일 사슬 항체 즉, (scFv)를 생산하기 위해서는, VH 및 VL 암호화 DNA 단편들을 가요성 링커를 암호화하는 다른 단편 예를 들어, 아미노산 서열 (Gly4-Ser)3을 암호화하는 다른 단편에 작동 가능하도록 결합시켜, 이 VH 및 VL 서열들을 가요성 링커에 의해 결합된 VL 및 VH 도메인을 가지는 연속 단일 사슬 단백질로서 발현시킬 수 있다. 예를 들어, 문헌[Bird외 다수, Science 242:423-426 (1988); Huston외 다수, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988); McCafferty외 다수, Nature 348:552-554 (1990)]을 참조하시오. 만일 하나의 VH와 VL만이 사용되면, 상기 단일 사슬 항체는 1가일 수 있으며, 만일 2개의 VH와 VL이 사용되면, 상기 단일 사슬 항체는 2가일 수 있고, 만일 2개 이상의 VH와 VL이 사용되면, 상기 단일 사슬 항체는 다가일 수 있다. ALK-1 및 다른 분자와 특이적으로 결합하는 이중 특이적 또는 다가의 항체가 생산될 수 있다.
다른 구체예에서, 기타 변형된 항체는 항-ALK-1 항체를 암호화하는 핵산 분자를 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, "카파 바디(Kappa body)"[Ill외 다수, Protein Eng. 10: 949-57 (1997)], "미니바디(Minibody)"[Martin외 다수, EMBO J. 13: 5303-9 (1994)], "다이아바디(Diabody)"[Holliger외 다수, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)] 또는 "재누신(Janusin)"[Traunecker외 다수, EMBO J. 10:3655-3659 (1991) 및 Traunecker외 다수, Int. J. Cancer (Suppl.) 7:51-52 (1992)]은 본원의 명세서에서 교시하는 바에 따라서 표준적인 분자 생물학적 기술로 제조될 수 있다.
이중 특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 다양한 방법 예를 들어, 하이브리도마의 융합법 또는 Fab 단편의 결합법에 의하여 생산될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321 (1990), Kostelny외 다수, J. Immunol. 148:1547-1553 (1992)]을 참조하시오. 뿐만 아니라, 이중 특이적 항체는 "다이아바디" 또는 "재누신"으로서 형성될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 이중 특이적 항체는 ALK-1의 상이한 에피토프 2개와 결합한다. 몇몇 구체예에서, 이중 특이적 항체는 모노클로날 항체 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1(rWT); 1.12.1 (M29I/D19A); 1.12.1(M29I); 1.12.1(D19A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1; 또는 5.59.1로부터 유래하는 제1 중쇄 및 제1 경쇄, 및 부가의 항체 중쇄 및 경쇄를 가진다. 몇몇 구체예에서, 상기 부가의 경쇄 및 중쇄는 또한 전술한 모노클로날 항체 중 하나로부터 유래하지만, 상기 제1 중쇄 및 경쇄와는 상이한 것이다.
몇몇 구체예에서, 전술한 변형 항체는 본원에 제공된 인간 항-ALK-1 모노클로날 항체로부터 유래하는 가변 도메인 또는 CDR 부위 중 하나 이상을 사용하여 제조된다.
유도체 및 표지화된 항체
본 발명의 항-ALK-1 항체 또는 이의 항원 결합부는 다른 분자(예를 들어, 다른 펩티드 또는 단백질)로 유도체화되거나 결합할 수 있다. 일반적으로, 항체 또는 이의 일부는 유도체화되어, 이 ALK-1 결합이 유도체화 또는 표지화에 의하여 악영향을 받지 않도록 될 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체 및 항체의 일부는 본원에 개시된 인간 항-ALK-1 항체의 원 상태의 것 및 변형된 형태의 것 둘 다를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 항체 또는 항체의 일부는, 항체 또는 항체의 일부와 다른 분자(예를 들어, 스트렙타비딘 중심 부위 또는 폴리히스티딘 태그)의 결합을 매개할 수 있는 하나 이상의 기타 분자적 실체 예를 들어, 다른 항체(예를 들어, 이중 특이적 항체 또는 다이아바디), 검출 제제, 약학 제제 및/또는 단백질 또는 펩티드에 (화학 커플링, 유전자 융합, 비 공유 결합 등에 의해) 기능상 결합될 수 있다.
유도체화된 항체의 한 가지 유형은 (이중 특이적 항체를 생산하기 위해 동일하거나 상이한 유형의) 항체들을 2개 이상 가교시킴으로써 생산된다. 적당한 가교제로서는 적당한 스페이서에 의해 2개의 분명한 반응기가 구분되어 있는 이종의 2작용성인 가교제(예를 들어, m-말레이미도벤조일-N-하이드록시숙신이미드 에스테르), 또는 동종의 2 작용성인 가교제(예를 들어, 수베르산디숙신이미딜)를 포함한다. 이러한 링커들은 피어스 케미칼 컴퍼니(Pierce Chemical Company; Rockford, Il)에서 시판되고 있다.
유도체화된 항체의 다른 유형으로서는 표지화된 항체가 있다. 본 발명의 항체 또는 항원 결합부를 유도체화할 수 있는 유용한 검출 제제로서는 형광 화합물 예를 들어, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 염화 5-디메틸아민-1-나프탈렌설포닐, 피코에리트린 및 란탄계 원소인 인 등을 포함한다. 항체는 또한 검출에 유용한 효소 예를 들어, 호오스 래디쉬 퍼옥시다제, β-갈락토시다제, 루시퍼라제, 알칼리성 포스파타제 및 글루코스 산화 효소 등으로 표지화될 수도 있다. 항체가 검출 가능한 효소로 표지화될 때, 이 항체는 상기 효소가 이용하는 부가의 시약을 첨가하여, 분별될 수 있는 반응 생산물을 생산하게 함으로써 검출된다. 예를 들어, 상기 제제가 호오스 래디쉬 퍼옥시다제이면, 과산화수소를 첨가하여야 할 것이고, 디아미노벤지딘은 검출 가능한 발색 반응 생산물을 생성한다. 항체는 또한 바이오틴으로 표지화되어, 아비딘 또는 스트렙타비딘 결합 여부를 간접적으로 측정으로써 검출될 수도 있다. 항체는 또한 2차 리포터(예를 들어, 루신 지퍼 쌍 서열, 2차 항체에 대한 결합 위치, 금속 결합 도메인 및 에피토프 태그)에 의해 인지되는 소정의 폴리펩티드 에피토프로 표지화될 수도 있다. 몇몇 구체예에서, 표지는 잠재적인 입체 장해를 줄이기 위해 다양한 길이를 가지는 스페이서 암(spacer arm)에 의해 부착된다.
항-ALK-1 항체는 또한 화학기 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 메틸기 또는 에틸기, 또는 탄수화물기로 유도체화될 수도 있다. 이러한 기들은 항체의 생물학적 특성들을 개선하는데(예를 들어, 혈청 반감기를 증가시키는데) 유용하다.
약학 조성물 및 투여 방법
본 발명은 또한 포유동물 예를 들어, 인간에 있어서 바람직하지 못한 신생 혈관 형성 수준의 증가와 관련된 병상의 치료를 위한 약학 조성물로서, 본원에 기술된 바와 같이, 상기와 같은 병상의 치료에 효과적인 양의 항-ALK-1 항체 또는 이의 항원 결합부와, 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이기도 하다.
본 발명의 항체 및 이의 항원 결합부는 개체에 투여하기 적당한 약학 조성물에 통합될 수 있다. 통상적으로, 본 발명의 약학 조성물은 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합부와 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 본원에 사용된 "약학적으로 허용 가능한 담체"란 용어는, 생리적으로 혼화 가능한 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅물, 항 박테리아 제제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 의미하는 것이다. 약학적으로 허용 가능한 담체의 몇몇 예로서는 물, 염수, 인산염 완충 염수, 덱스트로즈, 글리세롤 및 에탄올 등과, 이들의 혼합물이 있다. 다수의 경우, 등장제 예를 들어, 당, 다가 알콜 예를 들어, 만니톨, 소르비톨 또는 염화나트륨을 조성물 중에 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 약학적으로 허용 가능한 물질의 부가 예로서는, 항체의 유통 기한 또는 효능을 연장 및 증강시키는 습윤제 또는 최소량의 보조 물질 예를 들어, 습윤제 또는 유화제, 보존제 또는 완충액이 있다.
본 발명의 조성물은 다양한 형태 예를 들어, 액체, 반고체 및 고체 투여형 예를 들어, 액체 용액(예를 들어, 주사 가능하고, 주입 가능한 용액), 분산액 또는 현탁액, 정제, 환약, 분말, 리포좀 및 좌제의 형태를 가질 수 있다. 바람직한 형태는 의도로 하는 투여 방식과 치료 방법에 따라서 달라진다. 통상 바람직한 조성물로서는 주사 가능한 용액 또는 주입 가능한 용액 예를 들어, 인간의 수동 면역화에 사용되는 것과 유사한 형태를 가지는 조성물이 있다. 바람직한 투여 방식으로서는 비 경구(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복막 내 및 근육 내) 투여 방식이 있다. 바람직한 구체예에서, 항체는 정맥 내 주입 또는 주사에 의해 투여된다. 기타 바람직한 구체예에서, 항체는 근육 내 또는 피하 주사에 의해 투여된다. 주사용 제형은 (보존제를 함유하거나 함유하지 않는) 단위 투여형 예를 들어, 앰플이나, 복수 회 투여용 용기로서 제공될 수 있다. 본 발명의 조성물은 현탁액, 용액 또는 유질 또는 수성 비이클 중 유액의 형태를 취할 수 있으며, 제형화 제제 예를 들어, 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 활성 성분은 사용 전, 적당한 비이클 예를 들어, 멸균 무 발열원 물과 함께 사용될 분말형으로 존재할 수 있다.
치료용 조성물은 통상적으로 제조 및 보관시 멸균 및 안정하여야 한다. 이러한 조성물은 용액, 미세 유액, 분산액, 리포좀 또는 기타 고 농도 약물에 적당한 구조물로서 제형화될 수 있다. 멸균 주사 용액은 필요에 따라서, 상기 나열한 성분들 중 하나 이상과 적당한 용매 중에 상기 항-ALK-1 항체를 필요량만큼 혼합한 후, 멸균 여과함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 상기 나열한 성분들 중 기저 분산 매질과 기타 필요한 성분들을 함유하는 멸균 비이클에 활성 화합물을 혼합함으로써 제조된다. 멸균 주사 용액 제조용인 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법으로서는, 이미 멸균 여과한 용액으로부터 활성 성분과 바람직한 임의의 부가 성분의 분말을 생성하는 동결-건조법 및 진공 건조법이 있다. 용액의 유동성은 예를 들어, 코팅물 예를 들어, 레시틴을 사용하고, 분산액의 경우에는 필요한 입도를 유지하며, 계면 활성제를 사용함으로써, 적당히 유지될 수 있다. 조성물 중에 흡수를 지연시키는 제제 예를 들어, 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 포함시킴으로써 주사 가능한 조성물의 흡수를 지연시킬 수 있다.
다수의 치료 분야에 있어서, 투여 경로/방식으로서는 피하, 근육 내 또는 정맥 내 주입이 바람직하지만, 본 발명의 항체 또는 항체의 일부는 당 업계에 공지된 다양한 방법에 의하여 투여될 수 있다. 당 업자에 의하여 이해될 바와 같이, 투여 경로 및/또는 투여 방식은 원하는 결과에 따라서 달라질 것이다.
임의의 구체예에서, 본 발명의 항체 조성물은 항체가 급속하게 방출되는 것을 막아줄 담체와 함께, 예를 들어, 조절 방출형 제형 예를 들어, 임플란트, 경피 패치 및 미세 캡슐화 전달 시스템으로서 제조될 수 있다. 생체 분해 가능하고 생체 혼화성인 중합체 예를 들어, 아세트산에틸렌비닐, 다가 무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산을 사용할 수 있다. 이러한 제형을 제조하는 다수의 방법이 일반적으로 당 업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 본원에 참고용으로 인용되어 있는 문헌[Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978]을 참조하시오.
부가 활성 화합물도 본 발명의 조성물에 혼합될 수 있다. 임의의 구체예에서, 본 발명의 억제 항-ALK-1 항체는 하나 이상의 부가 치료제와 함께 제형화되고/제형화되거나 함께 투여된다. 이러한 제제로서는 다른 표적에 결합하는 항체, 항 종양 제제, 항 신생 혈관 형성 제제, 신호 전달 억제제, 항 증식 제제, 화학 요법 제제 또는 항-ALK-1을 억제하는 펩티드 유사체를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 병행 요법에는 억제성 항-ALK-1 항체와 공동 투여되는 제제의 투여량을 줄일 수 있으므로, 다수의 단일 요법에서 일어날 수 있는 합병증과 초래될 수 있는 독성을 피할 수 있게 된다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 조성물은 킬레이트화제 이외에도 약학적으로 허용 가능한 항산화제를 추가로 포함할 수도 있다. 적당한 항산화제로서는 메티오닌, 티오황산나트륨, 카탈라제 및 백금을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 농도 1∼약 100mM, 구체적으로, 약 27mM의 메티오닌을 함유할 수 있다. 예를 들어, 수성 제형은 10㎎/㎖의 항-ALK-1 항체, 20mM 히스티딘, pH5.5, 84㎎/㎖ 트레할로스 이수화물, 0.2㎎/㎖ 폴리소르베이트 80, 0.05㎎/㎖의 디소듐 EDTA, 0.1㎎/㎖의 L-메티오닌일 수 있다.
본 발명의 조성물은 본 발명의 항체 또는 항원 결합부를 "치료학적 유효량" 또는 "예방학적 유효량"만큼 포함할 수 있다. "치료학적 유효량"이란, 원하는 치료 효과를 얻는데 필요한 시간 동안에 이러한 효과를 얻기 위한 투여량을 의미하는 것이다. 항체 또는 항원 결합부의 치료학적 유효량은 여러 가지 인자들 예를 들어, 질병의 상태, 개체의 연령, 성별 및 체중, 그리고 항체 또는 항체의 일부가 개체 내에서 원하는 반응을 유도해내는 능력에 따라서 달라질 수 있다. 치료학적 유효량은 또한 항체 또는 항원 결합부의 임의의 독성 효과 또는 유해 효과가 치료학적으로 유리한 효과에 의해 상쇄되는 양이다. "예방학적 유효량"이란, 원하는 예방 효과를 얻는데 필요한 시간 동안 이러한 효과를 얻기 위한 투여량을 의미하는 것이다. 통상적으로, 예방학적 투여량은 발병 전 또는 질병의 초기 단계에 개체에 사용되는 양이므로, 예방학적 유효량은 치료학적 유효량보다 적을 수 있다.
투여 방식은 최적의 원하는 반응(예를 들어, 치료 반응 또는 예방 반응)을 제공하도록 조정할 수 있다. 예를 들어, 단일 볼루스(bolus)가 투여될 수 있거나, 일정 시간에 걸쳐서 수 회 나누어 투여될 수도 있거나, 또는 치료 상황의 응급도가 나타내는 바에 따라서 투여량을 감량 또는 증량시킬 수도 있다. 투여의 용이성과 투여량의 균일성을 위하여, 단위 투여형의 비 경구 투여용 조성물을 제형화하는 것이 특히 유리하다. 본원에 사용된 단위 투여형이란, 치료될 포유동물 개체에 대한 단위 투여형으로서 맞추어진 물리적으로 별개인 단위를 의미하는 것으로서; 각각의 단위는 필요로 하는 약학 담체와 함께 원하는 치료 효과를 나타내도록 계량된 소정 량의 활성 화합물을 함유한다. 본 발명의 단위 투여형에 대한 상세한 설명은 (a) 항-ALK-1 항체 또는 이의 일부의 독특한 특성과, 얻어질 구체적인 치료 효과 또는 예방 효과 및 (b) 개체 내 치료에 대한 민감도에 대한 항체 합성 분야의 고질적인 한계점에 의해서 결정되며 또한 이것들과 직접적으로 관련되어 있다.
본 발명의 항체 또는 항체의 일부의 치료학적 또는 예방학적 유효량의 비 제한적이고 예시적인 범위는 0.025∼50㎎/㎏, 더욱 바람직하게는 0.1∼50㎎/㎏, 더욱 바람직하게는 0.1∼25, 0.1∼10 또는 0.1∼3㎎/㎏이다. 몇몇 구체예에서, 제형은 20mM 시트르산나트륨(pH5.5), 140mM NaCl 및 0.2㎎/㎏의 폴리소르베이트 80의 완충액 중에 항체 5㎎/㎖를 함유한다. 투여량 수치는 경감될 병상의 유형과 중증도에 따라서 달라질 수 있음에 주목하여야 할 것이다. 또한, 임의의 특정 개체에 있어서, 구체적인 투여 방식은 개체의 요구와 본 발명의 조성물을 투여하는 사람 또는 이를 감독하는 사람의 전문적인 판단에 따라서, 시간이 경과함에 따라서 조정해야 할 것이며, 본원에 제시된 투여량 범위는 오로지 예시적인 것일 뿐, 본 발명의 조성물의 범위 또는 실시를 한정하고자 하는 것은 아님을 이해해야 할 것이다.
본 발명의 다른 측면은 본 발명의 항-ALK-1 항체 또는 항원 결합부, 또는 이러한 항체나 항체의 일부를 포함하는 조성물을 포함하는 키트를 제공하는 것이다. 키트는 항체 또는 조성물 이외에도, 진단제 또는 치료제를 포함할 수 있다. 키트는 또한 진단 방법 또는 치료 방법에 사용하기 위한 지침을 포함할 수도 있다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 키트는 이하에 기술된 방법에 사용될 수 있는 항체 또는 이 항체를 포함하는 조성물과 진단제를 포함한다. 기타 바람직한 구체예에서, 본 발명의 키트는 이하에 기술된 방법에 사용될 수 있는 본 발명의 항체 또는 이 항체를 포함하는 조성물과, 하나 이상의 치료제를 포함한다.
진단학적 사용 방법
본 발명의 항-ALK-1 항체 또는 이의 항원 결합부는 시험관 내 또는 생체 내에서 생물학적 시료 중 ALK-1을 검출하기 위한 진단 방법에 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항-ALK-1 항체는 종래의 면역 검정법 예를 들어, ELISA, RIA, 유세포 분석법, 면역 조직 화학적 방법, 웨스턴 블로팅 또는 면역 침전법에서 사용될 수 있다. 본 발명의 항-ALK-1 항체는 인간으로부터 ALK-1을 검출하는데 사용될 수 있다. 항-ALK-1 항체는 또한 다른 영장류 예를 들어, 사이노몰거스 원숭이로부터 ALK-1을 검출하는데에도 사용될 수 있다.
본 발명은 생물시료 중에서 ALK-1을 검출하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 생물 시료를 본 발명의 항-ALK-1 항체와 접촉시키는 단계 및 결합된 항체를 검출하는 단계를 포함한다. 하나의 구체예에서, 본 발명의 항-ALK-1 항체는 검출 가능한 표지로써 직접 표지화된다. 다른 구체예에서, 본 발명의 항-ALK-1 항체(제1 항체)는 표지화되지 않고, 본 발명의 항-ALK-1 항체와 결합할 수 있는 제2 항체나 기타 분자가 표지화된다. 당 업자에게 널리 공지되어 있는 바와 같이, 제2 항체는 제1 항체의 특정 종류와 군에 특이적으로 결합할 수 있는 것으로서 선택된다. 예를 들어, 만일 항-ALK-1 항체가 인간의 IgG이면, 제2 항체는 항-인간 IgG일 수 있다. 항체와 결합할 수 있는 기타 분자로서는 예를 들어, 단백질 A 및 단백질 G를 포함하는데, 이 두 단백질은 예를 들어, 피어스 케미칼 컴퍼니로부터 시판되고 있다.
항체 또는 제2 항체용으로서 적당한 표지에 관하여는 이미 기술한 바 있는데, 그 예로서는 다양한 효소, 보결 분자단, 형광 물질, 발광 물질 및 방사성 물질을 포함한다. 적당한 효소의 예로서는 호오스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제 또는 아세틸콜린에스터라제를 포함하며; 적당한 보결 분자단 복합체의 예로서는 스트렙타비딘/바이오틴 및 아비딘/바이오틴을 포함하고; 적당한 형광 물질의 예로서는 움베리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 염화 댄실 또는 피코에리트린을 포함하며; 발광 물질의 예로서는 루미놀을 포함하고; 적당한 방사성 물질의 예로서는 125I, 131I, 35S 또는 3H를 포함한다.
기타 구체예에서, ALK-1은 검출 가능한 물질로 표지화되되, 항-ALK-1 항체로는 표지화되지 않은 ALK-1 표준 물질을 이용하는 경쟁 면역 검정법에 의하여 생물 시료 중에서 검정될 수 있다. 이 검정법에서, 생물학적 시료, 표지화된 ALK-1 표준 물질 및 항-ALK-1 항체는 혼합되며, 표지화되지 않은 항체에 결합된 표지화 ALK-1 표준 물질의 양이 측정된다. 생물 시료 중 ALK-1의 양은 항-ALK-1 항체에 결합된 표지화 ALK-1 표준 물질의 양에 반비례한다.
다수의 목적으로 전술한 바와 같은 면역 검정법을 실시할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항-ALK-1 항체는 배양 세포 중에서 ALK-1을 검출하는데 사용될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 ALK-1 항체는 다양한 화합물로 처리된 세포에 의해 생산되는 ALK-1의 양을 측정하는데 사용된다. 이 방법은 ALK-1 단백질의 수준을 조절하는 화합물을 동정하는데 사용될 수 있다. 이 방법에 따르면, 하나의 세포 시료는 일정 기간 동안 테스트 화합물로 처리되는 반면에, 다른 시료는 처리되지 않은 채로 놔둔다. 만일 ALK-1의 총 수준을 측정하면 세포를 용해하고, 총 ALK-1 수준은 전술한 면역 검정법 중 하나를 이용하여 측정된다. 처리 세포 대 미처리 세포에 있어서 ALK-1의 총 수준을 비교하여 테스트 화합물의 효과를 확인한다.
총 ALK-1 수준을 측정하기 위한 바람직한 면역 검정법으로서는 유세포 분석법 또는 면역 조직 화학적 방법이 있다. 방법 예를 들어, ELISA, RIA, 유세포 분석법, 웨스턴 블로팅, 면역 조직 화학적 방법, 완전 막 단백질의 세포 표면 표지화 및 면역 침전법에 관하여는 당 업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Harlow and Lane, 상동]을 참조하시오. 더욱이, 면역 검정법은 ALK-1 발현의 활성화 또는 억제 여부에 대하여 다수의 화합물을 테스트하기 위해서, 고 처리량 스크리닝 방법으로 그 규모를 확대할 수 있다.
본 발명의 항-ALK-1 항체는 또한 조직이나 조직으로부터 유래하는 세포 내 ALK-1의 수준을 측정하는데 사용될 수도 있다. 몇몇 구체예에서, 조직은 발병된 조직이다. 상기 방법에 관한 몇몇 구체예에서, 조직 또는 이의 생검편은 환자로부터 절개된 것이다. 이후, 조직 또는 생검편은 면역 검정법에서 사용되어, 전술한 방법에 따라서, 예를 들어, 총 ALK-1 수준 또는 ALK-1의 국소화 여부를 측정하는데 이용된다.
본 발명의 항체는 또한 생체 내에서 ALK-1을 발현하는 조직 및 기관을 동정하는데 사용될 수도 있다. 본 발명의 인간 항-ALK-1 항체를 사용하는데 있어서 한 가지 이점은, 이 항체는 비-인간 기원의 항체와는 달리, 인간화되거나 키메라인 항체와 함께 투여되었을 때 상기 항체들이 항체의 실질적인 면역 반응을 일으키지 않고 생체 내에서 안전하게 사용될 수 있다는 점이다.
본 발명의 방법은 진단 테스트를 필요로 하는 환자에게 검출 가능하도록 표지화된 항-ALK-1 항체 또는 이 항체를 포함하는 조성물을 투여하는 단계 및 이 환자를 영상 분석하여, ALK-1-발현 조직의 위치를 파악하는 단계를 포함한다. 영상 분석은 의료 업계에 널리 공지되어 있으며, 그 예로서는 X-선 분석법, 자기 공명 영상화(MRI) 또는 컴퓨터 단층 촬영(CT)을 포함한다. 본 발명의 항체는 생체 내 영상화에 적당한 임의의 제제 예를 들어, X-선 분석법에 사용될 수 있는 조영제 예를 들어, 바륨, 또는 MRI나 CT에 사용될 수 있는 자기 조영제 예를 들어, 가돌리늄 킬레이트로 표지화될 수 있다. 기타 표지화 제제로서는 예를 들어, 방사성 동위 원소 예를 들어, 99Tc를 포함한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 항-ALK-1 항체는 표지화되지 않을 것이며, 또한 검출 가능하고 항-ALK-1 항체와 결합할 수 있는 기타 분자 또는 제2 항체를 투여함으로써 영상화될 것이다. 하나의 구체예에서, 생검편은 목적 조직이 ALK-1을 발현하는지 여부를 측정하기 위해 환자로부터 얻어낸다.
치료학적 사용 방법
다른 구체예에서, 본 발명은 항체의 투여를 필요로 하는 환자에게 항-ALK-1 항체를 투여함으로써, ALK-1 활성을 억제하는 방법을 제공한다. 본원에 개시된 항체 또는 이의 항원 결합부 중 임의의 것은 치료학적으로 사용될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 항-ALK-1 항체는 인간의 항체, 키메라 항체 또는 인간화된 항체이다. 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 항-ALK-1 항체는 인간의 항체이고, 환자는 인간인 환자이다. 대안적으로, 환자는 항-ALK-1 항체와 교차 반응하는 ALK-1을 발현하는 포유동물일 수 있다. 항체는 수의학적 용도로서(예를 들어, 사이노몰거스 원숭이), 또는 인간의 질병에 관한 동물 모델로서, 항체와 교차 반응을 하는 ALK-1을 발현하는 비-인간 포유동물에게 투여될 수 있다. 이러한 동물 모델은 본 발명의 항체의 치료 효능을 평가하는데 유용할 수 있다.
다른 구체예에서, 항-ALK-1 항체 또는 이 항체의 일부는 ALK-1을 부적당하게 높은 수준으로 발현하는 환자에게 투여될 수 있다. 본 발명의 항체는 1회 투여될 수 있지만, 다수 회 투여되는 것이 더욱 바람직하다. 본 발명의 항체는 매일 3회∼6개월 또는 그 이상의 기간마다 1회씩 투여될 수 있다. 투여는 일정한 스케쥴 예를 들어, 매일 3회씩, 매일 2회씩, 매일 1회씩, 2일에 1회씩, 3일에 1회씩, 1주일에 1회씩, 2주일에 1회씩, 1개월에 1회씩, 2개월에 1회씩, 3개월에 1회씩 그리고 6개월에 1회씩 실시될 수 있다. 본 발명의 항체는 또한 미니 펌프를 통하여 연속적으로 투여될 수도 있다. 본 발명의 항체는 점막, 협측, 비강 내, 흡입, 정맥 내, 피하, 근육 내, 비 경구 또는 종양 내 경로로 투여될 수 있다. 본 발명의 항체는 1회, 2회 이상, 또는 병상이 치료, 완화 또는 치유될 때까지의 최소한의 기간 동안 투여될 수 있다. 본 발명의 항체는 일반적으로 병상이 존재하는 한 투여될 것이다. 본 발명의 항체는 일반적으로 전술한 바와 같이 약학 조성물의 일부로서 투여될 것이다. 항체의 투여량은 일반적으로 0.1∼100㎎/㎏, 더욱 바람직하게는 0.5∼50㎎/㎏, 더욱 바람직하게는 1∼20㎎/㎏, 및 더더욱 바람직하게는 1∼10㎎/㎏의 범위 내일 것이다. 본 발명의 항체의 혈청 중 농도는 당 업계에 공지된 임의의 방법에 의하여 측정될 수 있다.
하나의 구체예에서, 본 발명의 항체는 pH가 약 5.0∼약 6.5이고, 항체를 약 1∼약 200㎎/㎖, 히스티딘 완충액을 약 1∼약 100mM, 폴리소르베이트 80을 약 0.01∼약 10㎎/㎖, 트레할로스를 약 100∼약 400mM, 그리고 디소듐 EDTA 이수화물을 약 0.01∼약 1.0mM 포함하는 멸균 수용액인 제형에 포함되어 투여된다.
본 발명에 의하면, 본원의 조성물 중 임의의 것은 신생 혈관 형성 수준이 증가되는 것과 관련된 병상("신생 혈관 형성 병상")에 민감하거나 또는 이러한 병상이 발병한 환자에 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물/방법에 의하여 치료/예방될 수 있는 신생 혈관 형성 병상의 예로서는 암(고형 암 및 혈액 암), 노인성 황반 변성증(AMD), 발달 이상(기관 형성), 당뇨병성 실명, 자궁 내막증, 안구 신생 혈관 형성증, 건선, 류머티즘성 관절염(RA) 및 피부 변색(예를 들어, 혈관종, 화염성 모반 또는 단순 모반(nevus simplex))을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
예를 들어, 본 발명은 본원에 개시된 조성물/방법 중 임의의 것을 이용하여, 안구 신생 혈관 형성과 관련된 병상을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다. 이 안구 신생 혈관 형성과 관련된 병상의 예로서는 당뇨병성 망막증, 노인성 황반 변성증("ARMD"), 녹내장(rubeotic glaucoma), 간질 각막염, 미성숙에 따른 망막증, 허혈성 망막증(예를 들어, 겸상 세포), 병리학적 근시, 안구의 히스토플라스마증, 프테리지아(pterygia) 및 점상 내부 맥락막 병증(punitiate inner choroidopathy) 등을 포함한다.
이상 세포 성장의 치료법
본 발명은 또한 포유동물 예를 들어, 인간 내 이상 세포 성장의 치료 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 본원에 개시된 바와 같이 이상 세포 성장을 치료하는데 유효한 양인 치료학적 유효량만큼의 항-ALK-1 항체 또는 이의 항원 결합부를 상기 포유동물에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 하나의 구체예에서, 이상 세포 성장으로서는 암 예를 들어, 중피종, 간 담도(간 및 담관) 암, 1차 또는 2차 CNS 종양, 1차 또는 2차 뇌 종양, 폐암(NSCLC 및 SCLC), 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부 암, 피부 또는 안구 내 흑색종, 난소암, 결장암, 직장암, 항문부 암, 위암, 위장관 암(위, 결장 직장 및 십이지장 암), 유방암, 자궁암, 나팔관 암종, 자궁 내막 암종, 자궁 경부 암종, 질 암종, 외음부 암종, 호지킨병, 식도암, 소장 암, 내분비계 암, 갑상선 암, 부갑상선 암, 부신 암, 연 조직 육종, 요도 암, 남성 성기 암, 전립선암, 고환 암, 만성 또는 급성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 림프구성 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관 암, 신세포 암종, 신우 암종, 중추 신경계(CNS)의 신생물, 1차 CNS 림프종, 비 호지킨 림프종, 척추 종양, 뇌간 교 세포종, 뇌하수체선종, 부신 피질 암, 담낭암, 다발성 골수종, 담관암, 섬유육종, 신경아세포종, 망막아세포종 또는 상기 암 중 하나 이상의 암이 함께 발병한 경우가 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 암은 폐암(NSCLC 및 SCLC), 두부 또는 경부 암, 난소암, 결장암, 직장암, 항문부 암, 위암, 유방암, 신장 또는 수뇨관 암, 신 세포 암종, 신우 암종, 중추 신경계(CNS)의 신생물, 1차 CNS 림프종, 비 호지킨 림프종, 척추 종양 또는 상기 암 중 하나 이상의 암이 함께 발병한 경우로부터 선택된다.
본 발명의 기타 바람직한 구체예에서, 암은 폐암(NSCLC 및 SCLC), 난소암, 결장암, 직장암, 항문부 암 또는 상기 암 중 하나 이상의 암이 함께 발병한 경우로부터 선택된다.
본 발명의 방법에 관한 다른 구체예에서, 상기 이상 세포 성장으로서는 양성 증식성 질병 예를 들어, 건선, 양성 전립선 비대증 또는 레스티노시스(restinosis)가 있다.
본 발명은 또한 포유동물의 이상 세포 성장을 치료하는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 본원에 개시된 바와 같은 항-ALK-1 항체 또는 이의 항원 결합부를 일정량만큼 상기 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는데, 여기서, 상기 양은 유사 분열 억제제, 알킬화제, 대사 길항 물질, 삽입성 항생제, 성장 인자 억제제, 세포 주기 억제제, 효소, 토포이소머라제 억제제, 생물 반응 개질제, 항체, 세포 독소, 항 호르몬 및 항 안드로겐으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항 종양 제제와 함께 이상 세포 성장을 치료하기에 효과적인 양이다.
본 발명은 또한 포유동물 예를 들어, 인간의 이상 세포 성장을 치료하기 위한 약학 조성물에 관한 것으로서, 이 조성물은 본원에 개시된 바와 같은 항-ALK-1 항체 또는 이의 항원 결합부를 일정량만큼 포함하는데, 여기서, 상기 양은 유사 분열 억제제, 알킬화제, 대사 길항 물질, 삽입성 항생제, 성장 인자 억제제, 세포 주기 억제제, 효소, 토포이소머라제 억제제, 생물 반응 개질제, 항 호르몬 및 항 안드로겐으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항 종양 제제 및 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께, 이상 세포 성장을 치료하기에 효과적인 양이다.
본 발명은 또한 포유동물에 있어서 과다 증식성 질환을 치료하는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 본원에 개시된 바와 같은 항-ALK-1 항체 또는 이의 항원 결합부를 항 증식 제제, 키나제 억제제, 신생 혈관 형성 억제제, 성장 인자 억제제, COX-I 억제제, COX-II 억제제, 유사 분열 억제제, 알킬화제, 대사 길항 물질, 삽입성 항생제, 성장 인자 억제제, 방사선, 세포 주기 억제제, 효소, 토포이소머라제 억제제, 생물 반응 개질제, 항체, 세포 독소, 항 호르몬, 스타틴 및 항 안드로겐으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항 종양 제제와 함께, 치료학적 유료량으로 상기 포유동물에 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 하나의 구체예에서, 본 발명의 항-ALK-1 항체 또는 이의 항원 결합부, 및 본원에 개시된 바와 같은 약학 조성물과 함께 사용되는 항 종양 제제로서는 항 신생 혈관 형성 제제, 키나제 억제제, 판 키나제(pan kinase) 억제제 또는 성장 인자 억제제가 있다. 바람직한 판 키나제 억제제로서는 미국 특허 제6,573,293호(Pfizer, Inc, NY, USA)에 개시된 수턴트(Sutent; Pfizer Inc., SU-11248)를 포함한다.
항 신생 혈관 형성 제제로서는 예를 들어, EGF 억제제, EGFR 억제제, VEGF 억제제, VEGFR 억제제, TIE2 억제제, IGF1R 억제제, COX-II(사이클로옥시게나제 II) 억제제, MMP-2(기질-메탈로프로티나제 2) 억제제, 및 MMP-9(매트릭스-메탈로프로티나제 9) 억제제와 같은 제제들을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직한 VEGF 억제제로서는 예를 들어, 아바스틴(Avastin; 베바시주맵), 항-VEGF 모노클로날 항체(Genentech, Inc.; South San Francisco, California)를 포함한다.
추가의 VEGF 억제제로서는 CP-547,632(Pfizer Inc., NY, USA), 액시티닙(Axitinib)(Pfizer Inc.; AG-013736), ZD-6474(AstraZeneca), AEE788(Novartis), AZD-2171), VEGF 트랩(Trap)(Regeneron/Aventis), 바탈라닙(Vatalanib)(PTK-787, ZK-222584라고도 알려짐: Novartis & Schering AG), 마큐젠(Macugen)(페갑타닙 8 나트륨, NX-1838, EYE-001, Pfizer Inc./Gilead/Eyetech), IM862(Cytran Inc.: Kirkland, Washington, USA); 및 앤지오자임, 리보자임으로부터 유래하는 합성 리보자임(Boulder, Colorado) 및 카이론(Chiron)(Emeryville, California) 및 이들의 혼합물을 포함한다. 본 발명의 실시에 유용한 VEGF 억제제에 관하여는 미국 특허 제6,534,524호 및 동 제6,235,764호(상기 문헌은 둘 다 본원에 그 자체로서 참고용으로 인용됨)에 개시되어 있다. 특히 바람직한 VEGF 억제제로서는 CP-547,632, AG13736, 바탈리닙, 마큐젠 및 이들의 혼합물을 포함한다.
추가의 VEGF 억제제에 관하여는 예를 들어, WO 99/24440(1999년 5월 20일 발행), PCT 국제 특허 출원 PCT/IB99/00797(1999년 5월 3일 출원), WO 95/21613(1995년 8월 17일 발행), WO 99/61422(1999년 12월 2일 발행), 미국 특허 제6,534,524호(AG13736 개시), 미국 특허 제5,834,504호(1998년 11월 10일 발행), WO 98/50356(1998년 11월 12일 발행), 미국 특허 제5,883,113호(1999년 3월 16일 발행), 미국 특허 제5,886,020호(1999년 3월 23일 발행), 미국 특허 제5,792,783호(1998년 8월 11일 발행), 미국 특허 제6,653,308호(2003년 11월 25일 발행), WO 99/10349(1999년 3월 4일 발행), WO 97/32856(1997년 9월 12일 발행), WO 97/22596(1997년 6월 26일 발행), WO 98/54093(1998년 12월 3일 발행), WO 98/02438(1998년 1월 22일 발행), WO 99/16755(1999년 4월 8일 발행), 및 WO 98/02437(1998년 1월 22일 발행)[상기 문헌들은 모두 본원에 그 자체로서 참고용으로 인용됨]에 개시되어 있다.
본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합부와 함께 사용될 수 있는 기타 항 증식 제제로서는 효소 파네실 단백질 전이 효소 억제제 및 수용체 티로신 키나제 PDGFr의 억제제 예를 들어, 다음과 같은 미국 특허 출원 즉, 09/221946(1998년 12월 28일 출원); 09/454058(1999년 12월 2일 출원); 09/501163(2000년 2월 9일 출원); 09/539930(2000년 3월 31일 출원); 09/202796(1997년 5월 22일 출원); 09/384339(1999년 8월 26일 출원); 및 09/383755(1999년 8월 26일 출원); 그리고 다음과 같은 미국 가 명세서 출원 즉, 60/168207(1999년 11월 30일 출원); 60/170119(1999년 12월 10일 출원); 60/177718(2000년 1월 21일 출원); 60/168217(1999년 11월 30일 출원), 및 60/200834(2000년 5월 1일 출원)에 개시되어 청구된 화합물들을 포함한다. 상기 특허 출원 및 가 명세서 특허 출원은 각각 본원에 그 자체로서 참고용으로 인용되어 있다.
추가의 PDGRr 억제제에 관하여는 WO 01/40217(2001년 7월 7일 발행) 및 WO 2004/020431(2004년 3월 11일 발행)[상기 문헌의 내용은 본원에 모든 목적을 위하여 그 자체로서 참고용으로 인용됨]을 참조하시오. 바람직한 PDGFr 억제제로서는 화이자(Pfizer)의 CP-868,596과 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다.
바람직한 GARF 억제제로서는 화이자의 AG-2037(펠리트렉솔 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염)을 포함한다. 본 발명의 실시에 유용한 GARF 억제제에 관하여는 본원에 모든 목적을 위하여 그 자체로서 인용되어 있는 미국 특허 제5,608,082호에 개시되어 있다.
본원에 개시된 바와 같은 항-ALK-1 항체 또는 이의 항원 결합부, 및 본원에 개시된 바와 같은 약학 조성물과 함께 사용될 수 있는 유용한 COX-II 억제제의 예로서는 셀레브렉스(CELEBREX)™(셀레콕시브), 패러콕시브, 데라콕시브, ABT-963, MK-663(에토리콕시브), COX-189(루미라콕시브), BMS 347070, RS 57067, NS-398, 벡스트라(Bextra)(발데콕시브), 파라콕시브, 비옥스(Vioxx)(로페콕시브), SD-8381, 4-메틸-2-(3,4-디메틸페닐)-1-(4-설파모일-페닐)-1H-피롤, 2-(4-에톡시페닐)-4-메틸-1-(4-설파모일페닐)-1H-피롤, T-614, JTE-522, S-2474, SVT-2016, CT-3, SC-58125 및 아르콕시아(Arcoxia)(에토리콕시브)를 포함한다. 추가의 COX-II 억제제에 관하여는, 그 내용이 그 자체로서 모든 목적으로 인용되어 있는 미국 특허 출원 제10/801,446호 및 동 제10/801,429호를 참조하시오.
하나의 바람직한 구체예에서, 항 종양 제제는 셀레콕시브인데, 이에 관하여는 그 내용이 모든 목적을 위하여 그 자체로서 참고용으로 인용되어 있는 미국 특허 제5,466,823호를 참조하시오. 셀레콕시브의 구조는 다음과 같다:
Figure pat00003
하나의 바람직한 구체예에서, 항 종양 제제는 발데콕시브인데, 이에 관하여는 그 내용이 모든 목적을 위하여 그 자체로서 참고용으로 인용되어 있는 미국 특허 제5,633,272호를 참조하시오. 발데콕시브의 구조는 다음과 같다:
Figure pat00004
하나의 바람직한 구체예에서, 항 종양 제제는 패러콕시브인데, 이에 관하여는 그 내용이 모든 목적을 위하여 그 자체로서 참고용으로 인용되어 있는 미국 특허 제5,932,598호를 참조하시오. 패러콕시브의 구조는 다음과 같다:
Figure pat00005
하나의 바람직한 구체예에서, 항 종양 제제는 데라콕시브인데, 이에 관하여는 그 내용이 모든 목적을 위하여 그 자체로서 참고용으로 인용되어 있는 미국 특허 제5,521,207호를 참조하시오. 데라콕시브의 구조는 다음과 같다:
Figure pat00006
하나의 바람직한 구체예에서, 항 종양 제제는 SD-8381인데, 이에 관하여는 그 내용이 모든 목적을 위하여 그 자체로서 참고용으로 인용되어 있는 미국 특허 제6,034,256호를 참조하시오. SD-8381의 구조는 다음과 같다:
Figure pat00007
하나의 바람직한 구체예에서, 항 종양 제제는 ABT-963인데, 이에 관하여는 그 내용이 모든 목적을 위하여 그 자체로서 참고용으로 인용되어 있는 국제 출원 공보 WO 2002/24719를 참조하시오. ABT-963의 구조는 다음과 같다:
Figure pat00008
하나의 바람직한 구체예에서, 항 종양 제제는 다음과 같은 로페콕시브이다:
Figure pat00009
하나의 바람직한 구체예에서, 항 종양 제제는 MK-663(에토리콕시브)인데, 이에 관하여는 그 내용이 모든 목적을 위하여 그 자체로서 참고용으로 인용되어 있는 국제 출원 공보 WO 1998/03484를 참조하시오. 에토리콕시브의 구조는 다음과 같다:
Figure pat00010
하나의 바람직한 구체예에서, 항 종양 제제는 COX-189(루미라콕시브)인데, 이에 관하여는 그 내용이 모든 목적을 위하여 그 자체로서 참고용으로 인용되어 있는 국제 출원 공보 WO 1999/11605를 참조하시오. 루미라콕시브의 구조는 다음과 같다:
Figure pat00011
하나의 바람직한 구체예에서, 항 종양 제제는 BMS-347070인데, 이에 관하여는 그 내용이 모든 목적을 위하여 그 자체로서 참고용으로 인용되어 있는 미국 특허 제6,180,651호를 참조하시오. BMS-347070의 구조는 다음과 같다:
Figure pat00012
하나의 바람직한 구체예에서, 항 종양 제제는 NS-398(CAS 123653-11-2)이다. 이 NS-398(CAS 123653-11-2)의 구조는 다음과 같다:
Figure pat00013
하나의 바람직한 구체예에서, 항 종양 제제는 RS 57067(CAS 17932-91-3)이다. 이 RS 57067(CAS 17932-91-3)의 구조는 다음과 같다:
Figure pat00014
하나의 바람직한 구체예에서, 항 종양 제제는 4-메틸-2-(3,4-디메틸페닐)-1-(4-설파모일-페닐)-1H-피롤이다. 이 4-메틸-2-(3,4-디메틸페닐)-1-(4-설파모일-페닐)-1H-피롤의 구조는 다음과 같다:
Figure pat00015
하나의 바람직한 구체예에서, 항 종양 제제는 2-(4-에톡시페닐)-4-메틸-1-(4-설파모일페닐)-1H-피롤이다. 이 2-(4-에톡시페닐)-4-메틸-1-(4-설파모일페닐)-1H-피롤의 구조는 다음과 같다:
Figure pat00016
하나의 바람직한 구체예에서, 항 종양 제제는 멜록시캠이다. 이 멜록시캠의 구조는 다음과 같다:
Figure pat00017
본 발명의 항체와 본원에 개시된 약학 조성물과 함께 사용하기에 유용한 기타 억제제 즉, 항 종양 제제로서는 아스피린을 포함하고, 프로스타글란딘(사이클로옥시게나제 I 및 II)을 생성하는 효소를 억제하여 프로스타글란딘의 수준을 낮추는 비-스테로이드성 소염 약물(NSAID)로서는 다음과 같은 것들을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다: 살살레이트(Salsalate)(아미제식(Amigesic)), 디플루니살(Diflunisal)(돌로비드(Dolobid)), 이부프로펜(Ibuprofen)(모트린(Motrin)), 케토프로펜(Ketoprofen)(오루디스(Orudis)), 나부메톤(Nabumetone)(레라펜(Relafen)), 피록시캠(Piroxicam)(펠덴(Feldene)), 나프록센(Naproxen)(알레브(Aleve), 나프로신(Naprosyn)), 디클로페낙(Diclofenac)(볼타렌(Voltaren)), 인도메타신(Indomethacin)(인도신(Indocin)), 설린닥(Sulindac)(클리노릴(Clinoril)), 톨메틴(Tolmetin)(톨렉틴(Tolectin)), 에토돌락(Etodolac)(로딘(Lodin)), 케토롤락(Ketorolac)(토라돌(Toradol)), 옥사프로진(Oxaprozin)(다이프로(Daypro)) 및 이의 혼합물. 바람직한 COX-I 억제제로서는 이부프로펜(모트린), 뉴프린(nuprin), 나프록센(알레브), 인도메타신(인도신), 나부메톤(렐라팬(Relafen)) 및 이의 혼합물을 포함한다.
본원에 개시된 바와 같은 본 발명의 항-ALK-1 항체 또는 이의 항원 결합부와, 이의 약학 조성물과 함께 사용되는 표적화된 제제로서는 EGFr 억제제 예를 들어, 이레사(Iressa)(제피티닙; AstraZeneca), 타세바(Tarceva)(어로티닙 또는 OSI-774; OSI Pharmaceuticals Inc.), 어비툭스(Erbitux)(세툭시맵; Imclone Pharmaceuticals, Inc.), EMD-7200(Merck AG), ABX-EGF (Amgen Inc. 및 Abgenix Inc), HR3(쿠바 정부), IgA 항체(University of Erlangen-Nuremberg), TP-38(IVAX), EGFR 융합 단백질, EGF-백신, 항 EGFr 면역리포좀(Hermes Biosciences Inc.) 및 이의 혼합물을 포함한다.
바람직한 EGFr 억제제로서는 이레사, 어비툭스, 타세바 및 이의 혼합물을 포함한다.
본 발명은 또한 판 어브(pan erb) 수용체 억제제 또는 ErbB2 수용체 억제제로부터 선택된 항 종양 제제 예를 들어, CP-724,714(Pfizer, Inc.), CI-1033(카너티닙; Pfizer, Inc.), 허셉틴(Herceptin)(트라스투주맵; Genentech Inc.), 오미타그(Omitarg)(2C4, 퍼투주맵; Genentech Inc.), TAK-165(Takeda), GW-572016(로나파르닙;GlaxoSmithKline), GW-282974(GlaxoSmithKline), EKB-569(Wyeth), PKI-1 66(Novartis), dHER2(HER2 백신; Corixa 및 GlaxoSmithKline), APC8024(HER2 백신; Dendreon), 항-HER2/neu 이중 특이적 항체(Decof Cancer Center), B7.her2.lgG3(Agensys), AS HER2(Research Institute for Rad Biology & Medicine), 3 작용성 이중 특이적 항체(University of Munich) 및 mAB AR-209(Aronex Pharmaceuticals Inc) 및 mAB 2B-1(Chiron) 및 이의 혼합물에 관한 것이다. 바람직한 어브 선택적 항 종양 제제로서는 허셉틴, TAK-165, CP-724,714, ABX-EGF, HER3 및 이의 혼합물을 포함한다. 바람직한 판 어브 수용체 억제제로서는 GW572016, CI-1033, EKB-569 및 오미타그와, 이들의 혼합물을 포함한다.
추가의 erbB2 억제제로서는, 각각 그 자체로서 참고용으로 본원에 인용되어 있는, WO 98/02434(1998년 1월 22일 발행), WO 99/35146(1999년 7월 15일 발행), WO 99/35132(1999년 7월 15일 발행), WO 98/02437(1998년 1월 22일 발행), WO 97/13760(1997년 4월 17일 발행), WO 95/19970(1995년 7월 27일 발행), 미국 특허 제5,587,458호(1996년 12월 24일 발행), 및 미국 특허 제5,877,305호(1999년 3월 2일 발행)에 개시되어 있는 것들을 포함한다. 본 발명에 유용한 추가의 ErbB2 수용체 억제제에 관하여는 그 자체로서 본원에 참고용으로 인용되어 있는, 미국 특허 제6,465,449호 및 동 제6,284,764호와, 국제 출원 WO 2001/98277를 참조하시오.
뿐만 아니라, 기타 항 종양 제제는 다음과 같은 제제들로부터 선택될 수 있다: 소라페닙(Sorafenib)(Onyx Pharmaceuticals Inc.; BAY-43-9006), 제나센스(Genasense)(오그머로센; Genta), 파니투무맵(Panitumumab)(Abgenix/Amgen), 제발린(Zevalin)(Schering), 벡사(Bexxar)(Corixa/GlaxoSmithKline), 아바렐릭스(Abarelix), 얼림타(Alimta), EPO 906(Novartis), 디스코더몰라이드(XAA-296), ABT-510(Abbott), 네오바스타트(Neovastat)(Aeterna), 엔자스토린(Eli Lilly), 컴브레스타틴(Combrestatin) A4P(Oxigene), ZD-6126(AstraZeneca), 플라보피리돌(Aventis), CYC-202(Cyclacel), AVE-8062(Aventis), DMXAA(Roche/Antisoma), 티미타크(Thymitaq)(Eximias), 테모다(Temodar)(테모졸로미드; Schering Plough) 및 레빌림드(Revilimd)(Celegene) 및 이의 혼합물.
기타 항 종양 제제는 다음과 같은 제제들로부터 선택될 수 있다: CyPat(아세트산사이프로테론), 히스테렐린(Histerelin)(아세트산히스트렐린), 플레나익시스(Plenaixis)(애버렐릭스 데포), 아트라센탄(Atrasentan)(ABT-627), 사트라플라틴(Satraplatin)(JM-216), 탈로미드(탈리도미드(Thalidomide)), 테라토프(Theratope), 테밀리펜(Temilifene)(DPPE), ABI-007(파클리탁셀), 에비스타(Evista)(랄록시펜), 아타메스탄(Atamestane)(바이오메드-777), 자이오탁스(Xyotax)(폴리글루타메이트 파클리탁셀), 타게틴(Targetin)(벡사로틴) 및 이의 혼합물.
뿐만 아니라, 기타 항 종양 제제는 다음과 같은 제제들로부터 선택될 수 있다: 트리자온(Trizaone)(티라파자민), 아포신(Aposyn)(엑시설린), 네바스타트(Nevastat)(AE-941), 세플렌(Ceplene)(히스타민 디하이드로클로라이드), 오라테신(Orathecin)(루비테칸), 비룰리진(Virulizin), 가스트리뮨(Gastrimmune)(G17DT), DX-8951f(엑사테칸 메실레이트), 온코나제(Onconase)(란피르나제), BEC2(미투모앱), 엑사이트린(Xcytrin)(모텍사핀 가돌리늄) 및 이의 혼합물.
추가의 항 종양 제제는 다음과 같은 제제들로부터 선택될 수 있다: 시아백(CeaVac)(CEA), 뉴트렉신(NeuTrexin)(트리메트레세이트 글루큐로네이트) 및 이의 혼합물. 추가의 항 종양 제제는 다음과 같은 제제로부터 선택될 수 있다: 오바렉스(OvaRex)(오레고보맵), 오시뎀(Osidem)(IDM-1) 및 이의 혼합물. 추가의 항 종양 제제는 다음과 같은 제제로부터 선택될 수 있다: 어드벡신(Advexin)(ING 201), 티라존(Tirazone)(티라파자민) 및 이의 혼합물. 추가의 항 종양 제제는 다음과 같은 제제로부터 선택될 수 있다: RSR13(에파프록시랄), 코타라(Cotara)(131I chTNT 1/b), NBI-3001(IL-4) 및 이의 혼합물. 추가의 항 종양 제제는 다음과 같은 제제로부터 선택될 수 있다: 캔백신(Canvaxin), GMK 백신, PEG 인터론 A, 탁소프렉신(Taxoprexin)(DHA/파클리탁셀) 및 이의 혼합물. 기타 항 종양 제제로서는 화이자의 MEK1/2 억제제 PD325901, 어레이 바이오팜(Array Biopharm)의 MEK 억제제 ARRY-142886, 브리스톨 마이어스(Bristol Myers)의 CDK2 억제제 BMS-387,032, 화이자의 CDK 억제제 PD0332991 및 아스트라제네카(AstraZeneca)의 AXD-5438 및 이의 혼합물을 포함한다. 뿐만 아니라, mTOR 억제제로서는 예를 들어, CCI-779(Wyeth) 및 라파마이신 유도체 RAD001(Novartis) 및 AP-23573(Ariad), HDAC 억제제 SAHA(Merck Inc./Aton Pharmaceuticals) 및 이의 혼합물이 사용될 수 있다. 추가의 항 종양 제제로서는 오로라 2 억제제 VX-680(Vertex), Chk1/2 억제제 XL844(Exilixis)를 포함한다.
다음과 같은 세포 독성 제제 예를 들어, 에피루시맵(엘렌스(Ellence)), 도세탁셀(탁소텔(Taxotere)), 파클리탁셀, 자인카드(Zinecard)(덱스라족산), 리툭시맵(리툭산(Rituxan)), 이마티닙 메실레이트(글리벡(Gleevec)) 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 세포 독성 제제는 본원에 개시된 바와 같은 항-ALK-1 항체 또는 이의 항원 결합부, 및 본원에 개시된 바와 같은 이의 약학 조성물과 함께 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 호르몬 요법 제제 예를 들어, 엑세메스탄(아로마신(Aromasin); Pfizer Inc.), 루프로렐린(루프론(Lupron) 또는 루프린(Leuplin); TAP/Abbott/Takeda), 아나스트로졸(아리미덱스(Arimidex); Astrazeneca), 고세렐린(졸라덱스(Zoladex); AstraZeneca), 독셀칼시페롤, 파드로졸, 포메스탄, 시트르산타목시펜(타목시펜, 놀바덱스(Nolvadex), AstraZeneca), 카소덱스(Casodex)(AstraZeneca), 아바렐릭스(Abarelix)(Praecis), 트렐스타(Trelstar) 및 이의 혼합물과 함께 본 발명의 항체 및 이의 항원 결합부를 사용하는 것에 관한 것이기도 하다.
본 발명은 또한 호르몬 요법 제제 예를 들어, 항 에스트로겐 예를 들어, 펄베스트란트, 토레미펜, 랄록시펜, 라소폭시펜, 레트로졸(페마라(Femara); Novartis), 항 안드로겐 예를 들어, 비칼루타미드, 플루타미드, 미페프리스톤, 닐루타미드, 카소덱스(Casodex)® (4'-시아노-3-(4-플루오로페닐설포닐)-2-하이드록시-2-메틸-3'-(트리플루오로메틸) 프로피온아닐리드, 비칼루타미드) 및 이의 혼합물에 관한 것이기도 하다.
또한, 본 발명은 본 발명의 항체를 단독으로 투여하거나, 또는 하나 이상의 지지적 보호 제품 예를 들어, 필그라스팀(Filgrastim)(뉴포젠(Neupogen)), 온단세트론(조프란(Zofran)), 프래그민(Fragmin), 프로크릿(Procrit), 알록시(Aloxi), 에멘드(Emend) 또는 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 제품과 함께 투여한다.
특히 바람직한 세포 독성 제제로서는 캠프토사(Camptosar), 어비툭스(Erbitux), 이레사, 글리백, 탁소텔 및 이의 혼합물을 포함한다.
다음과 같은 토포이소머라제 I 억제제 예를 들어, 이리노테칸 HCl(캠프토사), 엔도테카린, 오라테신(Supergen), 엑사테칸(Daiichi), BN-80915(Roche) 및 이의 혼합물은 항 종양 제제 캠프토테신 대신 사용될 수 있다. 특히 바람직한 토포이소머라제 II 억제제로서는 에피루비신(Ellence)을 포함한다.
본 발명의 항체는 항 종양 제제, 알킬화제, 대사 길항 물질, 항생제, 식물 유래 항 종양 제제, 캠프토테신 유도체, 티로신 키나제 억제제, 기타 항체, 인터페론 및/또는 생물 반응 개질제와 함께 사용될 수 있다.
알킬화제로서는 질소 머스타드 N-산화물, 사이클로포스파미드, 이포스파미드, 멜파란, 부설판, 미토브로니톨, 카보쿠온, 티오테파, 라니머스틴, 니머스틴, 테모졸로미드, MAD-473, 알트레타민, AP-5280, 아파지쿠온, 브로스탈리신, 벤다머스틴, 카머스틴, 에스트라머스틴, 포테머스틴, 글루포스파미드, 이포스파미드, KW-2170, 마포스파미드 및 미토락톨을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니며; 백금-배위 알킬화 화합물로서는 시스플라틴, 파라플라틴(Paraplatin)(카보플라틴), 엡타플라틴, 로바플라틴, 네다플라틴, 엘록사틴(Eloxatin)(옥살리플라틴; Sanofi) 또는 사트리플라틴 및 이의 혼합물을 포함한다. 특히 바람직한 알킬화제로서는 엘록사틴(Eloxatin)(옥살리플라틴)을 포함한다.
대사 길항 물질로서는 메토트렉세이트, 6-머캡토퓨린, 리보시드, 머캡토퓨린, 5-플루오로우라실(5-FU)를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니며, 이들 물질을 단독으로 사용하거나, 또는 루코보린, 테가퍼, UFT, 독시플루리딘, 카모퍼, 시타라빈, 시타라빈 옥포스페이트, 에노시타빈, S-1, 알림타(프리메트렉시드 디소듐, LY231514, MTA), 젬자(Gemzar)(젬시타빈, Eli Lilly), 플루다라빈, 5-아자시티딘, 카페시타빈, 클라드리빈, 클로파라빈, 데시타빈, 에플로르니틴, 에티닐시티딘, 시토신 아라비노시드, 하이드록시우레아, TS-1, 맬파란, 넬라라빈, 놀라트렉시드, 옥포스페이트, 디소듐 프리메트렉시드, 펜토스타틴, 펠리트렉솔, 랠리트렉시드, 트리아핀, 트리메트렉세이트, 비다라빈, 빈크리스틴, 비노렐빈; 또는 유럽 특허 출원 239362에 개시된 바람직한 대사 길항 물질 중 하나 예를 들어, N-(5-[N-3,4-디하이드로-2-메틸-4-옥소퀴나졸린-6-일메틸)-N-메틸아미노]-2-테노일)-L-글루탐산 및 이의 혼합물과 함께 사용된다.
항생제로서는 삽입성 항생제 예를 들어, 아클라루비신, 악티노마이신 D, 암루비신, 아나마이신, 아드리아마이신, 블레오마이신, 도노루비신, 독소루비신, 엘사미트루신, 에피루비신, 갈라루비신, 이다루비신, 미토마이신 C, 네모루비신, 네오카지노스타틴, 페플로마이신, 피라루비신, 레베카마이신, 스티말라머, 스트렙토조신, 발루비신, 지노스타틴 및 이의 혼합물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
식물 유래 항 종양 물질로서는 예를 들어, 유사 분열 억제제 예를 들어, 빈블라스틴, 독세탁셀(탁소텔), 파클리탁셀 및 이의 혼합물로부터 선택되는 것들을 포함한다.
세포 독성 토포이소머라제 억제제로서는 아클라루비신, 아모나피드, 벨로테칸, 캠프토테신, 10-하이드록시캠프토테신, 9-아미노캠프토테신, 디플로모테칸, 이리노테칸 HCl(캠프토사), 에도테카린, 에피루비신(엘렌스), 에토포시드, 엑사테칸, 지마테칸, 루토테칸, 미토잔트론, 피라루비신, 픽산트론, 루비테칸, 소부족산, SN-38, 타플루포시드, 토포테칸 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 제제를 포함한다.
바람직한 세포 독성 토포이소머라제 억제제로서는 캠프토테신, 10-하이드록시캠프토테신, 9-아미노캠프토테신, 이리노테칸 HCl(캠프토사), 엔도테카린, 에피루비신(엘렌스), 에토포시드, SN-38, 토포테칸 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 제제를 포함한다.
면역 물질로서는 인터페론과 다수의 기타 면역 강화 제제를 포함한다. 인터페론으로서는 인터페론 알파, 인터페론 알파-2a, 인터페론 알파-2b, 인터페론 베타, 인터페론 감마-1a, 인터페론 감마-1b(악티뮨) 또는 인터페론 감마-n1 및 이의 혼합물을 포함한다. 기타 제제로서는 필그라스팀, 렌티난, 시조필란, 테라시스(TheraCys), 유베니멕스, WF-10, 알데스루킨, 알렘투주맵, BAM-002, 다카바진, 다클리주맵, 데니루킨, 젬투주맵, 오조가미신, 이브리투모맵, 이미퀴몹, 레노그라스팀, 렌티난, 흑색종 백신(Corixa), 몰그래모스팀, 온코백스(OncoVax)-CL, 사그래모스팀, 타소너민, 테클루킨, 티말라신, 토시투모맵, 비룰리진(Virulizin), Z-100, 에프라투주맵, 미투모맵, 오레고보맵, 펨투모맵(Y-muHMFG1), 프로벤지(Provenge)(Dendreon) 및 이의 혼합물을 포함한다.
생물 반응 개질제로서는 살아있는 유기체의 방어 기작 또는 생물 반응 예를 들어, 생존, 성장 또는 조직 세포의 분화를 개질시켜 유기체가 항 종양 활성을 가지도록 만들어주는 제제가 있다. 이러한 제제로서는 크레스틴, 렌티난, 시조피란, 피시바닐, 유베니멕스 및 이의 혼합물을 포함한다.
기타 항암제로서는 알리트레티노인, 암플리젠, 아트라센탄, 벡사로텐, 보르테조미브, 보센탄, 칼시트롤, 엑시설린드, 피나스테리드, 포테머스틴, 이반드론산, 밀테포신, 미토잔트론, I-아스파라기나제, 프로카바진, 다카바진, 하이드록시카바미드, 페가스파가제, 펜토스타틴, 타자로튼, 텔시타(Telcyta)(TLK-286; Telik Inc.), 벨케이드(Velcade)(보르테마지브; Millenium), 트레티노인 및 이의 혼합물을 포함한다.
기타 항 신생 혈관 형성 화합물로서는 아시트레틴, 펜레티니드, 탈리도미드, 졸레드론산, 안지오스타틴, 아플리딘, 실렝티드, 컴브레타스타틴 A-4, 엔도스타틴, 할로푸기논, 레비마스타트, 레모뱁, 레블리미드, 스쿠알라민, 유크레인, 비탁신(Vitaxin) 및 이의 혼합물을 포함한다.
백금-배위 화합물로서는 시스플라틴, 카보플라틴, 네다플라틴, 옥살리플라틴 및 이의 혼합물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
캡프토테신 유도체로서는 캡프토테신, 10-하이드록시캠프토테신, 9-아미노캠프토테신, 이리노테칸, SN-38, 엔도테카린, 토포테칸 및 이의 혼합물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
기타 항 종양 제제로서는 미토잔트론, I-아스파라기나제, 프로카바진, 다카바진, 하이드록시카바미드, 펜토스타틴, 트레티노인 및 이의 혼합물을 포함한다.
항 종양 면역 반응을 강화할 수 있는 항 종양 제제 예를 들어, CTLA-4(세포 독성 림프구 항원 4) 항체 및 CTLA-4를 차단할 수 있는 기타 제제 예를 들어, MDX-010(Medarex) 및 CTLA-4 화합물[미국 특허 제6,682,736호]; 및 항 증식 제제 예를 들어, 기타 파네실 단백질 전이 효소 억제제 예를 들어, 파네실 단백질 전이 효소 억제제도 사용될 수 있다. 뿐만 아니라, 본 발명에 사용될 수 있는 특이적 CTLA-4 항체에 관하여는, 그 자체로서 본원에 참고용으로 인용되어 있는, 미국 가 명세서 특허 출원 60/113,647(1998년 12월 23일 출원), 미국 특허 제6,682,736호를 참조하시오. 예를 들어, 본 발명에 사용될 수 있는 기타 항-CTLA-4 항체로서는, 미국 특허 제6,682,736호에 개시되어 있는 모노클로날 항체 11.2.1의 서열을 가지는 티실리무맵이 있다.
본 발명에 사용될 수 있는 특이적 IGF1R 항체에 관하여는 본원에 그 자체로서 참고용으로 인용되어 있는 국제 특허 출원 WO 2002/053596을 참조하시오.
본 발명에 사용될 수 있는 특이적 CD40 항체에 관하여는 본원에 그 자체로서 참고용으로 인용되어 있는 국제 특허 출원 WO 2003/040170을 참조하시오.
유전자 요법 제제로서는 또한, 방사선 요법에 반응하여 TNF 알파를 발현하는 항 종양 제제 예를 들어, TNFerade(GeneVec)를 사용할 수 있다.
본 발명의 하나의 구체예에서, 스타틴은 본원에 개시된 바와 같은 항-ALK-1 항체 또는 이의 항원 결합부, 및 이의 약학 조성물과 함께 사용될 수 있다. 스타틴(HMG-CoA 환원 효소 억제제)은 아토르바스타틴(Atorvastatin)(리피토(Lipitor); Pfizer Inc.), 프로바스타틴(Provastatin)(프라바콜(Pravachol); Bristol-Myers Squibb), 로바스타틴(Lovastatin)(메바코(Mevacor); Merck Inc.), 심바스타틴(Simvastatin)(조코(Zocor); Merck Inc.), 플루바스타틴(Fluvastatin)(레스콜(Lescol); Novartis), 세리바스타틴(Cerivastatin)(베이콜(Baycol); Bayer), 로수바스타틴(Rosuvastatin)(크레스토(Crestor); AstraZeneca), 로보스타틴(Lovostatin) 및 니아신(Niacin)(어드비코(Advicor); Kos Pharmaceuticals), 이의 유도체 및 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
바람직한 구체예에서, 스타틴은 아토보르스타틴 및 로바스타틴, 이의 유도체 및 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.
항 종양 제제로 유용한 기타 제제로서는 카듀잇(Caduet)을 포함한다.
본원에 개시된 바와 같이, 하나 이상의 부가 치료제와 함께 항-ALK-1 항체 또는 이의 항원 결합부를 혼합 사용하여 과다 증식성 질환 또는 이상 세포 성장을 치료하는 방법 중 임의의 방법에 있어서, 항-ALK-1 항체는 부가 치료제와 컨쥬게이트화될 수 있거나 또는 이것으로써 유도체화될 수 있다. 하나 이상의 부가 치료제는 또한 별도로 투여될 수 있거나, 또는 비-유도체화 또는 비-컨쥬게이트화 방식으로 투여될 수 있다. 하나 이상의 부가 치료제가 유도체화되지 않거나 또는 항체와 컨쥬게이트화되지 않는 경우, 상기 부가 치료제는 항체를 포함하는 약학 제형과 동일한 약학 제형 내에 포함되어 투여될 수 있거나, 또는 별도의 제형으로서 투여될 수 있다.
실명의 치료
본 발명의 화합물 및 이를 포함하는 약학 조성물은 노인성 황반 변성증으로 인한 중증 실명 및 기타 눈의 후 안부에 발병하는 질병 예를 들어, 맥락막 신생 혈관 형성증, 당뇨병성 망막증, 녹내장 및 망막 색소 변성증 등의 치료에 유용하다.
예를 들어, 본 발명의 조성물은 안구의 뒷 부분에 약물 데포를 형성하는데 사용될 수 있으며, 또한 본 발명의 조성물은 본원에 개시된 바와 같은 하나 이상의 비-활성 부형제 이외에도, 하나 이상의 약학적으로 활성인 제제를 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물에 유용한 약학적 활성 제제의 예로서는 항감염제 예를 들어, 항생제, 항 바이러스 제제 및 항진균제; 항알레르기 제제 및 비만 세포 안정화제; 스테로이드 및 비-스테로이드 소염제(예를 들어, 네파페낙); 사이클로옥시게나제 억제제 예를 들어, Cox I 및 Cox II 억제제; 항감염제와 소염제의 혼합물; 충혈 완화제; 녹내장 억제제 예를 들어, 아드레날린 억제제, 베타-아드레날린 억제제, 알파-아드레날린 작동제, 부교감 신경 작동제, 콜린에스터라제 억제제, 탄산 탈수소효소 억제제 및 프로스타글란딘; 녹내장 억제제의 혼합물; 항산화제; 영양 보충제; 낭포성 황반 부종 치료 약물 예를 들어, 비-스테로이드 소염제; 노인성 황반 변성증(AMD) 예를 들어, 비 삼출성(건조형) 및 삼출성(습윤형) AMD 치료 약물 예를 들어, 신생 혈관 형성 억제제 예를 들어, 단백질 키나제 수용체 예를 들어, VEGF 수용체와 같은 단백질 키나제 수용체를 억제하는 신생 혈관 형성 억제제; 및 영양 보충제; 헤르페스성 감염 및 CMV 안구 감염 치료용 약물; 증식성 유리체 망막 병증 치료 약물 예를 들어, 대사 길항 물질 및 섬유소 용해제; 상처 조절제(wound modulating agent) 예를 들어, 성장 인자; 대사 길항 물질; 신경 보호 약물(neuroprotective drugs) 예를 들어, 엘리프로딜; 및 후 안부 26의 질병 또는 병상 예를 들어, 노인성 황반 변성증(AMD) 예를 들어, 비 삼출성(건조형) 및 삼출성(습윤형) AMD, 맥락막 신생 혈관증, 망막 변성증, 망막염, 포도막염, 황반 부종 및 녹내장을 치료하기 위한 안지오스타틴성 스테로이드를 포함한다. 이러한 안지오스타틴 스테로이드에 관한 추가 정보에 관하여는 미국 특허 제5,679,666호 및 동 제5,770,592호를 참조하시오. 낭포성 황반 부종 치료용 비-스테로이드 소염제로서는 네파페낙이 있다.
눈에 투여함에 있어서, 본 발명의 화합물은 약학적으로 허용 가능한 안과용 비이클 내에 포함되어 전달되며, 그 결과, 상기 화합물은 이 화합물이 각막 및/또는 공막 그리고 안구의 내부 예를 들어, 전 안부, 후 안부, 유리체, 안방 수, 유리액, 각막, 홍체/모양체, 수정체, 맥락막/망막 및 공막에 침투하기에 충분한 시간 동안 안구 표면과 접촉한 상태로 유지될 수 있게 된다. 약학적으로 허용 가능한 안과용 비이클은 연고, 식물성 오일 또는 캡슐 형성용 물질일 수 있다. 본 발명의 화합물은 또한 유리액 또는 안방 수에 직접 주사될 수도 있다.
또한, 본 발명의 화합물은 널리 공지되어 실시되고 있는 방법 예를 들어, 테논(Tenon) 낭하 및/또는 결막 하 주사법에 의해 투여될 수도 있다. 안과 업계에 널리 공지되어 있는 바와 같이, 황반은 주로 망막 원추 세포로 이루어져 있으며, 이 황반은 망막 내에서 시각 형성시 정확도를 최대로 만드는 부위이다. 테논 캡슐 또는 테논 막은 공막에 존재하는 막이다. 결막은 안구의 가장 자리 부분(구결막)에 대하여 후방에 존재하는 짧은 영역을 덮고 있으며, 상부 눈꺼풀과 하부 눈꺼풀의 내부 영역을 덮도록 상부(상부 주머니) 또는 하부(하부 주머니)에 포개져 있다. 결막은 테논 캡슐의 상부에 존재하는 것이다. 공막 및 테논 캡슐은 안구 외표면의 경계를 한정하고 있다. 안 질환 예를 들어, 노인성 황반 변성증(AMD) 예를 들어, 비 삼출성(건조형) 및 삼출성(습윤형) AMD, 맥락막 신생 혈관 형성증, 망막증(예를 들어, 당뇨병성 망막 병증, 미성숙으로 인한 망막 병증), 당뇨병성 황반 부종, 망막염, 포도막염, 낭포성 황반 부종(CME), 녹내장, 및 안구 후방 부에 발생하는 기타 질병 또는 질환의 치료에 있어서, 안과학적으로 허용 가능한 약학적 활성 제제를 특정 량만큼 함유하고 있는 데포를 직접 공막의 외 표면에 넣거나 테논 캡슐 아래에 넣는 것이 바람직하다. 또한, 노인성 황반 변성증(AMD) 예를 들어, 비 삼출성(건조형) 및 삼출성(습윤형) AMD 및 CME의 경우에는, 상기 데포를 공막의 외표면, 테논 캡슐의 아래, 그리고 일반적으로는 황반의 상부에 넣는 것이 가장 바람직하다.
본 발명의 화합물은 데포 제제로서 제형화될 수 있다. 이와 같은 장기 작용 제형은 이식(예를 들어, 피하 또는 근육 내 이식)에 의하거나, 근육 내 주사에 의하거나, 또는 전술한 바와 같이 테논 낭하 또는 망막 내 주사에 의하여 투여될 수 있다. 대안적으로, 활성 성분은 사용 전에 적당한 비이클 예를 들어, 멸균 무 발열원 물로 구성되는 분말의 형태일 수 있다.
본 발명의 특히 바람직한 구체예에 있어서, 본 발명의 화합물은 국소 투여용으로서, 염수(안과용 제제에 일반적으로 사용되는 보존제 및 항 미생물 제제 중 임의의 것과 혼합) 중에 포함되어 제조되어, 안약의 형태로서 투여될 수 있다. 순수한 형태의 용액 또는 현탁액으로서 제조되어, 매일 수시로 투여할 수 있다. 대안적으로, 전술한 바와 같이 제조된 본 발명의 조성물은 또한 각막에 직접 투여될 수도 있다.
바람직한 구체예에 있어서, 본 발명의 조성물은 각막에 결합하는 점막 점착성 중합체를 포함하여 제조된다. 그러므로, 예를 들어, 본 발명의 화합물은 적당한 중합체 또는 소수성 물질(예를 들어, 허용 가능한 오일 중 유액) 또는 이온-교환 수지와 함께 제형화될 수 있거나, 또는 난용해성인 유도체 예를 들어, 난용해성 염으로서 제형화될 수 있다.
소수성 화합물과 함께 사용되는 약학 담체로서는 벤질 알콜, 비극성 계면 활성제, 수혼화성 유기 중합체 및 수성 상을 포함하는 공용매 시스템이 있다. 상기 공용매 시스템은 VPD 공용매 시스템일 수 있다. VPD는 무수 에탄올 중 부피를 이루는, 3% w/v 벤질 알콜, 8% w/v 비 극성 계면 활성제 폴리소르베이트 80, 및 65% w/v 폴리에틸렌 글리콜 300의 용액이다. 상기 VPD 공용매 시스템(VPD:5W)은 수중 5% 덱스트로즈 용액으로 희석된(1:1) VPD를 함유한다. 상기 공용매 시스템은 소수성 화합물을 잘 용해시키고, 이 시스템 자체가 전신 투여될 때 나타나는 독성은 작다. 자연적으로, 이 공용매 시스템의 비율은 용해도를 망쳐놓지 않고 독성을 나타내지 않는 수준에서 상당 수준 변동될 수 있다. 뿐만 아니라, 상기 공용매 성분의 종류도 변할 수 있는데; 예를 들어, 기타 낮은 독성을 가지는 비극성 계면 활성제가 폴리소르메이트 80 대신에 사용될 수 있으며; 폴리에틸렌 글리콜의 비율도 바뀔 수 있고; 기타 생물 혼화성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜 예를 들어, 폴리비닐 피롤리돈으로 대체할 수 있으며; 또한 기타 당이나 다당류는 덱스트로즈를 대체할 수 있다.
대안적으로, 기타 소수성 약학 화합물용 전달 시스템이 사용될 수 있디. 리포좀 및 유액은 소수성 약물 전달용 비이클 또는 담체로서 알려져 있다. 비록 일반적으로 독성이 더욱 크기는 하지만, 임의의 유기 용매 예를 들어, 디메틸설폭시드도 사용될 수 있다. 더욱이, 본 발명의 화합물은 치료제를 함유하는 지연-방출형 시스템 예를 들어, 소수성 고형 중합체의 반투과성 기질을 사용하여 전달될 수 있다. 다양한 지연-방출형 물질이 확립되어 있으며, 또한 당업자에게 공지되어 있다. 지연-방출형 캡슐은 이것의 화학적 성질에 따라서, 수주에서 최대 100일 동안 화합물을 방출할 수 있다. 치료용 시약의 화학적 성질과 생물학적 안정성에 따라서, 단백질 안정화를 위한 부가의 기술을 적용시킬 수도 있다.
본 발명의 약학 조성물은 적당한 고형 또는 겔 형태의 담체 또는 부형제를 포함할 수 있다. 이러한 담체나 부형제의 예로서는 탄산칼슘, 인산칼슘, 당, 전분, 셀룰로즈 유도체, 젤라틴 및 중합체 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다.
본 발명의 조성물 중 임의의 것은 개체 투여용으로서 제형화될 수 있다. 본 발명의 개체는 바람직하게는 포유동물, 또는 더욱 바람직하게는 인간이다.
본원에 개시된 약학 제형은 또한 항 신생 물질 제제, 소염제, 항 박테리아 제제, 항바이러스 제제, 신생 혈관 형성 제제 및 항 신생 혈관 형성 제제로 이루어진 군으로부터 선택되는 치료제를 포함할 수도 있다. 이러한 제제의 예는 본원에 개시되어 있다.
예를 들어, 항 신생 물질 제제는 염산아코다졸; 아크로닌; 아도젤레신; 알데스루킨; 알트레타민; 암보마이신; 아세트산아메탄트론; 아미노글루테티미드; 암사크린; 아나스트로졸; 안트라마이신; 아스파라기나제; 아스퍼린; 아자시티딘; 아제테파; 아조토마이신; 바티마스타트; 벤조데파; 바이칼루타미드; 염산비잔트렌; 비스나피드 디메실레이트; 비젤레신; 황산블레오마이신; 브레퀴나 소듐; 브로피리민; 부설판; 칵티노마이신; 칼루스테론; 카라세미드; 카베티머; 카보플라틴; 카머스틴; 염산카루비신; 카젤레신; 세데핀골; 클로람부실; 사이로레마이신; 시스플라틴; 클래드리빈; 크리스네이톨 메실레이트; 사이클로포스파미드; 시타라빈; 다카바진; 닥티노마이신; 염산도노루비신; 데시타빈; 덱소마플라틴; 데자구아닌; 데자구아닌 메실레이트; 디아지쿠온; 도세탁셀; 독소루비신; 염산독소루비신; 드롤록시펜; 시트르산드롤록시펜; 프로피온산드로모스타놀론; 두아조마이신; 에다트렉세이트; 염산에플로니틴; 엘사미트루신; 엔로플라틴; 엔프로메이트; 에피프로피딘; 염산에피루비신; 어불로졸; 염산에소루비신; 에스트라머스틴; 에스트라머스틴 포스페이트 소듐; 에타니다졸; 에티오디제드유(ethiodized oil) I 131; 에토포시드; 인산에토포시드; 에토프린; 염산파드로졸; 파자라빈; 펜레티나이드; 플록수리딘; 인산플루다라빈; 플루오로우라실; 플루로시타빈; 포스퀴돈; 포스트리에신 소듐; 젬시타빈; 염산젬시타빈; 금 Au198; 하이드록시우레아; 염산이다루비신; 이포스파미드; 이모포신; 인터페론 알파-2a; 인터페론 알파-2b; 인터페론 알파-n1; 인터페론 알파-n3; 인터페론 베타-1a; 인터페론 감마-1b; 이프로플라틴; 염산이리노테칸; 아세트산란레오티드; 레트로졸; 아세트산루프롤리드; 염산리아로졸; 로메트렉솔 소듐; 로머스틴; 염산로소잔트론; 마소프로콜; 메이탄신; 염산메클로레타민; 아세트산메게스트롤; 아세트산멜렌게스트롤; 멜파란; 메노가릴; 머캡토퓨린; 메토트렉세이트; 메토트렉세이트 소듐; 메토프린; 메튜레데파; 미틴도미드; 미토카신; 미토크로민; 미토질린; 미토말신; 미토마이신; 미토스퍼; 미토탄; 염산미토잔트론; 마이코페놀산; 노코다졸; 노갈라마이신; 오르마플라틴; 옥시수란; 파클리탁셀; 페가스파르가제; 펠리오마이신; 펜타머스틴; 황산페플로마이신; 퍼포스파미드; 피포브로만; 피포설판; 염산피로잔트론; 플리카마이신; 플로메스탄; 포르피머 소듐; 포르피로마이신; 프레드니머스틴; 염산프로카바진; 퓨로마이신; 염산퓨로마이신; 피라조푸린; 리보프린; 로글레티미드; 사핀골; 염산사핀골; 세머스틴; 심트라젠; 스파포세이트 소듐; 스파소마이신 I; 염산스피로게르마늄; 스피로머스틴; 스피로플라틴; 스트렙토니그린; 스트렙토조신; 염화 스트론튬 Sr89; 술로페너; 탈리소마이신; 탁산; 탁소이드; 테코갈란 소듐; 테가퍼; 염산텔로잔트론; 테모포르핀; 테니포시드; 테록시론; 테스토락톤; 티아미프린; 티오구아닌; 티오테파; 티아조푸린; 티라파자민; 염산토포테칸; 시트르산토레미펜; 아세트산트레스톨론; 인산트리시리빈; 트리메트렉세이트; 트리메트렉세이트 글루큐로네이트; 트립토렐린; 염산투불로졸; 우라실 머스타드; 우레데파; 바프레오티드; 버테포르핀; 황산빈블라스틴; 황산빈크리스틴; 빈데신; 황산빈데신; 황산빈피딘; 황산빈글리시네이트; 황산빈루로신; 타르타르산 비노렐빈; 황산빈로시딘; 황산빈졸리딘; 보로졸; 제니플라틴; 지노스타틴; 염산조루비신으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
항 신생 혈관 형성 제제는 신생 혈관 형성을 억제하는 임의의 제제로서, 이에 관하여는 본원에 개시되어 있거나 또는 당 업계에 공지되어 있다. 바람직한 구체예에서, 항 신생 혈관 형성 제제로서는 항-VEGF 제제 예를 들어, 마큐젠™ (Eyetech, New York, NY); 또는 항-VEGF 항체가 있다.
약학 조성물은 하나 이상의 적당한 담체, 부형제 및 희석제를 사용하여 표준적인 기술에 따라 제형화될 수 있다. 예를 들어, 본원에 모든 목적을 위하여 참고용으로 인용되어 있는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, (19th Ed.) Williams & Wilkins, 1995]을 참조하시오.
비 경구 투여용으로서 적당한 제형으로서는, 대상으로 하는 수용체의 혈액과 등장성인 수성 및 비 수성 제형; 및 혈액 성분 또는 하나 이상의 기관에 화합물을 표적화하도록 디자인된 현탁 시스템을 포함할 수 있는 수성 및 비 수성 멸균 현탁액을 포함한다. 이 제형은 단위 투여형 또는 다수 회 투여용으로서 밀봉된 용기 예를 들어, 앰플이나 바이알 중에 담겨 제공될 수 있다. 안구 내 제형에 있어서는 제형 중에 보존제가 포함되지 않으므로 단위 투여형이 바람직하다. 다수 회 투여용 용기를 사용할 수 있는 기타 비 경구 제형에 있어서는, 보존제를 사용할 수 있다.
즉석 제조용 주사 용액 및 현탁액은 예를 들어, 멸균 분말로부터 제조될 수 있다. 비 경구 및 정맥 내 투여형은 또한 선택된 주사 또는 전달 시스템의 종류에 따라서 허용 가능한 무기물 및 기타 물질을 포함할 수도 있다.
본 발명에 따른 특정 비 경구 투여 방법으로서는 눈의 안구 내 투여하는 방법과 유리체 내에 투여하는 방법을 포함한다. 안구 내 및 유리체 내 투여될 약학 제형은 인산염 완충 염수(PBS)와 밸런스를 맞춘 등장 염 용액(BSS)을 포함하며, 이때 부형제 예를 들어, 만니톨이나 소르비톨(단백질 안정화제)도 함께 포함하거나 또는 포함하지 않는다.
일반적으로, 물, 적당한 오일, 염수, 수성 덱스트로스(글루코스) 또는 관련된 당 용액과 글리콜 예를 들어, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜은 비 경구 투여용 용액의 담체로서 적당하다. 비 경구 투여용 용액은 바람직하게는 활성 성분의 수용성 염, 적당한 안정화제를 함유하며, 또한 필요에 따라서, 완충 물질도 함유한다. 항산화제 예를 들어, 중아황산나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산은 단독으로 또는 혼합하여 사용하였을 때, 적당한 안정화제가 된다. 뿐만 아니라, 시트르산염 또는 나트륨 EDTA도 사용될 수 있다. 게다가, 비 경구 투여용 용액은 보존제 예를 들어, 염화벤잘코늄, 메틸파라벤 또는 프로필파라벤 또는 클로로부탄올을 함유할 수 있다. 적당한 약학 담체에 관하여는 상기 언급된 레밍턴의 문헌에 기술되어 있다.
본원의 임의의 구체예에 있어서, 본원의 조성물 또는 약학 제형은 동결될 수 있다.
본원의 임의의 구체예에 있어서, 약학 제형은 치료제 1㎎당 약 10 유닛 미만, 더욱 바람직하게는 약 5 유닛 미만, 더욱 바람직하게는 약 3 유닛 미만, 또는 더욱 바람직하게는 약 1 유닛 미만의 내독소를 포함하는 것이 바람직하다.
몇몇 구체예에서, 본원에 개시된 치료 방법은 신생 혈관 형성 관련 병상이 발병한 개체에, 항 신생 물질 제제, 항바이러스 제제, 소염제, 항 박테리아 제제, 항 신생 혈관 형성 제제 또는 항 신생 혈관 형성 제제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
이러한 병용 치료법은 본원에 개시된 조성물과 부가의 치료제(들)를 함께 제형화한 제형을 개체에 투여하거나, 또는 본원에 개시된 조성물과 치료제(들)를 2개의 별도 약학 제형으로서 투여함으로써 행하여질 수 있다. 하나 이상의 조성물/치료제가 개체에 투여되는 구체예에 있어서는, 두 개의 활성 성분의 상승 효과로 인하여 조성물 및/또는 치료제를 소량씩 투여할 수 있다.
개체에 투여될 수 있는 항신생물 제제로서는 아클라루비신; 염산아코다졸; 아크로닌; 아도젤레신; 알데스루킨; 알트레타민; 앰보마이신; 아세트산아메탄트론; 아미노글루테티미드; 암사크린; 아나스트로졸; 안트라마이신; 아스파라기나제; 아스퍼린; 아자시티딘; 아제테파; 아조토마이신; 바티마스타트; 벤조데파; 비칼루타미드; 염산비잔트렌; 비스나피드 디메실레이트; 비젤레신; 황산블레오마이신; 브레퀴나 소듐; 브로피리민; 부설판; 캑티노마이신; 칼루스테론; 카라세미드; 카베티머; 카보플라틴; 카머스틴; 염산카루비신; 카젤레신; 세데핀골; 클로람부실; 사이롤레마이신; 시스플라틴; 클래드리빈; 크리스네이톨 메실레이트; 사이클로포스파미드; 시타라빈; 다카바진; 닥티노마이신; 염산도노루비신; 데시타빈; 덱소마플라틴; 데자구아닌; 데자구아닌 메실레이트; 디아지쿠논; 도세탁셀; 독소루비신; 염산독소루비신; 드롤록시펜; 시트르산드롤록시펜; 프로피온산드로모스타놀론; 두아조마이신; 에다트렉세이트; 염산에플로니틴; 엘사미트루신; 엔로플라틴; 엔프로메이트; 에피프로프딘; 염산에피루비신; 에르불로졸; 염산에소루비신; 에스트라머스틴; 에스트라머스틴 포스페이트 소듐; 에타니다졸; 에티오디제드유 I 131; 에토포시드; 인산에토포시드; 에토프린; 염산파드로졸; 파자라빈; 펜레티나이드; 플록수리딘; 인산플루다라빈; 플루오로우라실; 플루로시타빈; 포스퀴돈; 포스트리에신 소듐; 젬시타빈; 염산젬시타빈; 금 Au198; 하이드록시우레아; 염산이다루비신; 이포스파미드; 이모포신; 인터페론 알파-2a; 인터페론 알파-2b; 인터페론 알파-n1; 인터페론 알파-n3; 인터페론 베타-1a; 인터페론 감마-1b; 이프로플라틴; 염산이리노테칸; 아세트산란레오티드; 레트로졸; 아세트산루프롤리드; 염산리아로졸; 로메트렉솔 소듐; 로머스틴; 염산로소잔트론; 마소프로콜; 메이탄신; 염산메클로레타민; 아세트산메게스트롤; 아세트산멜렌게스트롤; 멜파란; 메노가릴; 머캡토퓨린; 메토트렉세이트; 메토트렉세이트 소듐; 메토프린; 메튜레데파; 미틴도미드; 미토카신; 미토크로민; 미토질린; 미토말신; 미토마이신; 미토스퍼; 미토탄; 염산미토잔트론; 마이코페놀산; 노코다졸; 노갈라마이신; 오르마플라틴; 옥시수란; 파클리탁셀; 페가스파르가제; 펠리오마이신; 펜타머스틴; 황산페플로마이신; 퍼포스파미드; 피포브로만; 피포설판; 염산피로잔트론; 플리카마이신; 플로메스탄; 포르피머 소듐; 포르피로마이신; 프레드니머스틴; 염산프로카바진; 퓨로마이신; 염산퓨로마이신; 피라조푸린; 리보프린; 로글레티미드; 사핀골; 염산사핀골; 세머스틴; 심트라젠; 스파포세이트 소듐; 스파소마이신 I; 염산스피로게르마늄; 스피로머스틴; 스피로플라틴; 스트렙토니그린; 스트렙토조신; 염화 스트론튬 Sr89; 술로페너; 탈리소마이신; 탁산; 탁소이드; 테코갈란 소듐; 테가퍼; 염산텔로잔트론; 테모포르핀; 테니포시드; 테록시론; 테스토락톤; 티아미프린; 티오구아닌; 티오테파; 티아조푸린; 티라파자민; 염산토포테칸; 시트르산트레스톨론; 인산트리시리빈; 트리메트렉세이트; 트리메트렉세이트 글루큐로네이트; 트립토렐린; 염산투불로졸; 우라실 머스타드; 우레데파; 바프레오티드; 버테포르핀; 황산빈블라스틴; 황산빈크리스틴; 빈데신; 황산빈데신; 황산빈피딘; 황산빈글리시네이트; 황산빈루로신; 타르타르산 비노렐빈; 황산빈로시딘; 황산빈졸리딘; 보로졸; 제니플라틴; 지노스타틴; 염산조루비신을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
개체에 투여될 수 있는 항 박테리아 제제로서는 페니실린, 아미노글리코시드, 매크롤리드, 모노박탐, 리파마이신, 테트라사이클린, 클로람페니콜, 클린다마이신, 린코마이신, 이미페넴, 후시딘산, 노보바이오신, 포스포마이신, 후시단산 나트륨, 네오마이신, 폴리믹신, 카프레오마이신, 콜리스티메테이트, 콜리스틴, 그래미시딘, 미노사이클린, 독시사이클린, 바노마이신, 바시트라신, 카나마이신, 젠타마이신, 에리트로마이신 및 세팔로스포린을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
개체에 투여될 수 있는 소염제로서는 NSAID(예를 들어, 아스피린(살리실아미드), 소듐 살리실아미드, 인도프로펜, 인도메타신, 소듐 인도메타신 3수화물, 바이어(Bayer)™, 부페린(Bufferin)™, 셀레브렉스(Celebrex)™, 디클로페낙, 에코트린(Ecotrin)™, 디플루니살, 페노프로펜, 나프록센, 술린닥, 비옥스(Vioxx)™), 코르티코스테로이드 또는 코르티코트로핀(ACTH), 콜히친 및 아세트산아네코르타브를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
개체에 투여될 수 있는 항 바이러스 제제로서는 α-메틸-P-아다만탄 메틸아민, 1-D-리보푸라노실-1,2,4-트리아졸-3 카복사미드, 9-[2-하이드록시-에톡시]메틸구아닌, 아다만탄아민, 5-요도-2'-데옥시우리딘, 트리플루오로티미딘, 인터페론, 아데닌 아라비노시드, CD4, 3'-아지도-3'-데옥시티미딘(AZT), 9-(2-하이드록시에톡시메틸)-구아닌(아시클로비어), 포스포노포름산, 1-아다만탄아민, 펩티드 T 및 2',3' 디데옥시시티딘을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물을 표적 세포에 생체 내 투여하는 것은 당 업자에게 널리 공지된 다양한 기술 중 임의의 기술을 이용하여 이루어질 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 조성물은 당 업계에 공지된 임의의 방법[예를 들어, 경구, 안내, 혈관내(정맥내), 피내, 근육내, 경피, 경점막, 장관내, 비경구(흡입 스프레이, 항문 또는 국소) 투여 방법]에 의하여, 통상의 약학적으로 허용 가능한 담체, 애쥬반트 및 비이클을 함유하는 단위 투여 제형의 형태로서 전신 또는 국소 투여될 수 있다.
본원에 사용된 "안구 내" 투여란 용어에는, 유리체 내 및 망막 하 투여등이 포함된다.
본원에 사용된 "비 경구" 투여란 용어에는, 피하, 정맥 내, 근육 내, 흉골 내, 주입 기술 또는 복막 내 투여가 포함된다. 약물의 직장 투여용 좌제는 적당한 비 자극성 부형제 예를 들어, 상온에서는 고체이되 직장 내에서는 액체이어서, 직장 내에서 용해되어 약물을 방출시킬 코코아 버터 및 폴리에틸렌 글리콜을 약물과 혼합하여 제조될 수 있다.
본 발명의 조성물을 사용하여 질환 또는 질병을 치료하기 위한 투여 방식은 다수의 인자 예를 들어, 질병의 유형, 환자의 연령, 체중, 성별, 의학적 상태, 병상의 중증도, 투여 경로 및 사용된 특정 화합물을 바탕으로 한다. 그러므로, 투여 방식은 매우 다양할 수 있으나, 통상적으로는 표준적인 방법을 사용하여 측정될 수 있다.
전신 투여에 있어서, 본 발명의 항-ALK-1 항체 또는 이의 항원 결합부 및/또는 하나 이상의 부가 치료제는 체중 1㎏ 당 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100 또는 150㎎ 이상의 투여량으로 투여되는 것이 바람직하다. 다른 구체예에 있어서, 본원의 폴리펩티드(바람직하게는 이량체 또는 동종 이량체) 및/또는 소 분자는 체중 1㎏ 당 0.1∼100㎎, 더욱 바람직하게는 0.5∼50㎎, 더욱 바람직하게는 1∼30㎎, 또는 더욱 바람직하게는 5∼20㎎의 투여량으로 전신 투여된다.
국소 투여에 있어서, 본 발명의 항-ALK-1 항체 또는 이의 항원 결합부 및/또는 하나 이상의 부가 치료제는 바람직하게는 50㎍, 100㎍, 150㎍, 200㎍, 250㎍, 300㎍, 350㎍, 400㎍, 450㎍, 500㎍, 550㎍, 600㎍, 650㎍ 또는 700㎍ 이상의 투여량으로 투여된다. 다른 구체예에서, 본원의 폴리펩티드(바람직하게는 이량체 또는 동종 이량체) 및/또는 소 분자는 투여 부위당 50∼1000㎍, 더욱 바람직하게는 100∼800㎍, 더욱 바람직하게는 200∼500㎍, 또는 더욱 바람직하게는 300∼400㎍의 투여량으로 국소 투여된다.
예를 들어, 진피 투여에 있어서, 본 발명의 항-ALK-1 항체 또는 이의 항원 결합부 및/또는 펩티도 모의체 및/또는 하나 이상의 부가 치료제는 50∼1000㎍/㎠, 더욱 바람직하게 100∼800㎍/㎠, 또는 더욱 바람직하게 200∼500㎍/㎠의 투여량으로 투여된다. 다른 예에서, 안구 내 투여의 경우, 본 발명의 폴리펩티드 및/또는 펩티도모의체 및/또는 소 분자는 50∼1000㎍/눈, 더욱 바람직하게는 100∼800㎍/눈, 또는 더욱 바람직하게는 200∼500㎍/눈의 투여량으로 투여된다.
본 발명의 약학 조성물은 바람직하게는 활성 성분(예를 들어, 항-ALK-1 항체)을 유효량 즉, 치료적 또는 예방학적 효능을 나타내는데 유용한 양으로 포함한다. 특정 용도로서 유용한 실제 양은 치료될 병상 및 투여 경로에 따라서 달라질 것이다. 유효량은 당 업자의 능력 범위 내에서 적당히 측정될 수 있으며, 특히, 본원에 개시된 바에 따라 측정된다.
바람직하게, 활성 성분 예를 들어, 항-ALK-1 항체의 유효량은 환자 체중 1㎏당 활성 성분 약 0.0001∼약 500㎎, 더욱 바람직하게는 환자 체중 1㎏당 활성 성분 약 0.001∼약 250㎎, 더욱 바람직하게는 환자 체중 1㎏당 활성 성분 약 0.01∼약 100㎎, 더더욱 바람직하게는 환자 체중 1㎏당 활성 성분 약 0.5∼약 50㎎, 그리고 가장 바람직하게는 환자 체중 1㎏당 활성 성분 약 1∼약 15㎎이다.
중량%의 관점에 있어서, 본 발명의 제형은 바람직하게는 활성 성분 예를 들어, 항-ALK-1 항체를 약 0.0001∼약 10중량%, 더욱 바람직하게는 약 0.001∼약 1 중량%, 더욱 바람직하게는 약 0.05∼약 1 중량%, 또는 더욱 바람직하게는 약 0.1∼약 0.5 중량% 포함할 것이다.
유전자 요법
본 발명의 항체 및 항체의 일부를 암호화하는 핵산 분자는 유전자 요법을 통하여 이의 투여를 필요로 하는 환자에게 투여될 수 있다. 본 치료법은 생체 내 또는 생체 외에서 이루어질 수 있다. 바람직한 구체예에서, 중쇄 및 경쇄 둘 다를 암호화하는 핵산 분자가 환자에게 투여된다. 더욱 바람직한 구체예에서, 핵산 분자는 B 세포의 염색체에 안정하게 통합되도록 투여되는데, 그 이유는 이들 세포가 항체를 생산하는 특징을 보유하기 때문이다. 바람직한 구체예에서, 전구체 B 세포는 생체 외에서 형질 감염 또는 감염되어, 투여를 필요로 하는 환자에게 재이식된다. 다른 구체예에서, 전구체 B 세포 또는 기타 세포는 목적으로 하는 세포 유형을 감염시키는 것으로 공지된 바이러스를 이용하여 생체 내에서 감염된다. 유전자 요법에 사용되는 통상의 벡터로서는 리포좀, 플라스미드 및 바이러스 벡터를 포함한다. 대표적인 바이러스 벡터로서는 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스가 있다. 생체 내 또는 생체 외 감염 이후, 항체의 발현 수준은 처리된 환자로부터 시료를 채취하여, 당 업계에 공지되어 있거나 본원에 기술되어 있는 면역 검정법에 따라서 모니터될 수 있다.
바람직한 구체예에서, 유전자 치료 방법은 항-ALK-1 항체의 중쇄 또는 이 항체의 항원 결합부를 암호화하는 분리된 핵산 분자를 투여하는 단계 및 이 핵산 분자를 발현시키는 단계를 포함한다. 다른 구체예에서, 유전자 치료 방법은 항-ALK-1 항체의 경쇄 또는 이 항체의 항원 결합부를 암호화하는 분리된 핵산 분자를 투여하는 단계 및 이 핵산 분자를 발현시키는 단계를 포함한다. 더욱 바람직한 방법에 있어서, 유전자 치료 방법은 본 발명의 항-ALK-1 항체의 중쇄 또는 이 항체의 항원 결합부를 암호화하는 분리된 핵산 분자 및 본 발명의 항-ALK-1 항체의 경쇄 또는 이 항체의 항원 결합부를 암호화하는 분리된 핵산 분자를 투여하는 단계 및 이 핵산 분자를 발현하는 단계를 포함한다. 유전자 치료 방법은 또한 다른 치료제 예를 들어, 병행 요법과 관련하여 상기 언급한 제제 중 임의의 제제를 투여하는 단계를 포함할 수도 있다.
ALK-1 길항제 또는 작동제를 스크리닝하는 방법
하나의 구체예에서, 본 발명은 어떤 물질이 ALK-1의 특이적 하류 표적 유전자 예를 들어, Id1을 상향 조절하는 것을 억제하는지 여부를 측정하는 방법을 제공한다[예를 들어, 실시예 12에 기술된 바와 같은 Id1에 대한 택맨 검정법]. 본 방법은 Id1을 발현하는 세포의 시료와 특정 물질을 접촉시키는 단계와, Id1 발현이 억제되는지 여부를 측정하는 단계를 포함하는데, 여기서, 이 물질과 접촉한 세포의 시료 중 Id1의 발현 수준이 세포의 대조군 시료 중 Id1의 발현 수준에 비하여 감소하였음은 곧, 상기 물질이 Id1 발현을 억제하는 것임을 나타내는 것이다. 하나의 특정 구체예에서, 상기 물질은 ALK-1의 세포 외 도메인과 결합하는 항체이다. 다른 구체예에서, 상기 물질은 소 분자이다. 본 발명에 따르면, 세포 예를 들어, 실시예 12에 기술된 바와 같은 HUVEC, 또는 상기 ALK-1 및 Id1 중 어느 하나 또는 둘 다를 암호화하는 DNA로 형질 전환 또는 형질 감염된 세포는 본래 ALK-1과 Id1을 둘 다 발현할 수 있다. 예를 들어, 실시예 12에 기술된 바와 같이, 택맨 검정법을 Id1에 대하여 실시하면, Id1의 발현 수준을 측정할 수 있다.
반대로 말하면, 활성제 또는 작동제도 동일한 유형의 절차에 따라서 테스트 또는 이용될 수 있는 것이다.
본 발명의 이해를 돕기 위하여, 이하에 실시예들을 기술하였다. 하기 실시예는 오로지 예시를 위한 목적으로 기술한 것으로서, 본 발명의 범위를 어떠한 방식으로든 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
[실시예]
이하 실시예 및 제조 방법에 있어서, "MW"는 분자량을 의미하고; "His-Tag"는 니텔-킬레이트화 수지를 사용하는 급속 정제 방법 및 항-His(C-말단) 항체를 사용하는 검출 방법에 사용되는 C-말단 폴리히스티딘(6×His) 태그를 의미하는 것이며; "BSA"는 소 혈청 알부민을 의미하는 것이고; "EDTA"는 에틸렌디아민테트라아세트산을 의미하는 것이며; "DMSO"는 디메틸설폭시드를 의미하는 것이고; "MOPS"는 3-(N-모폴리노)프로판설폰산을 의미하는 것이며; "MES"는 2-(N-모폴리노)에탄설폰산을 의미하는 것이고; "PBS"는 인산염 완충 염수를 의미하는 것이며; "dPBS"는 둘베코 인산염 완충 염수를 의미하는 것이고; "HEMA"는 2-하이드록시-에틸 메타크릴레이트를 의미하는 것이며; "DMEM"은 둘베코 개질 이글 배지를 의미하는 것이고; "FBS"는 소 태아 혈청을 의미하는 것이며; "NEAA"는 비 필수 아미노산을 의미하는 것이고; "HEPES"는 N-2-하이드록시에틸피페라진-N'-2-에탄설폰산을 의미하는 것이며; "DMF"는 디메틸 포름아미드를 의미하는 것이다.
실시예 1: ALK-1 면역원 제조
ALK-1의 ECD는 전방향 프라이머인 5'-ACGGCCCAGCCGGCCGACCCTGTGAAGCCGTCT-3'(서열 번호 96)와 역방향 프라이머인 5'-ACTAAGCTTTTAATGATGATGATGATGATGCTGGCCATCTGTTCCCG-3'(서열 번호 97)을 이용하는 PCR에 의하여, 전장 인간 ALK-1 ORF 클론(Invitrogen, 클론명 IOH21048)로부터 클로닝하였다. PCR 생성물을 정제하고, SfiI 및 HindIII 제한 효소로 처리한 다음, 이를 포유 동물 발현 벡터인 pSecTag2/Hygro(Invitrogen Inc., Catalog No. V910-20)의 SfiI/HindIII 위치에 클로닝하였다. 제조자의 지침에 따라서, 이 클론을 퓨젠(Fugene) 6 형질 감염 시약(Roche Applied Science, Catalog No.1814443)을 사용하여 293T 세포를 일시적으로 형질 감염시키는데 사용하였다. 형질 감염후 72시간 경과시 분비된 표적 단백질을 함유하는 세포 배양액으로부터 상청액을 수집하여, 이를 4℃에서 밤새도록 Ni-NTA 수지(QIAGEN, Catalog No.30430)와 결합시켰다. 이후, 상기 수지를 20mM Tris pH 8.0, 25mM 이미다졸 및 300mM 염화나트륨을 함유하는 완충액으로 세척하였다. 20mM Tris pH 8.0, 300mM 이미다졸 및 300mM 염화나트륨을 함유하는 완충액을 이용하여 수지로부터 이 His-Tag 단백질을 용리해냈다. CM 세파로스 양이온 교환 수지를 사용하여 상기 단백질을 20mM 인산나트륨(pH 7.0)중에서 추가로 정제하고, 표적 단백질을 함유하는 미결합 분획을 수집하였다. 단백질을 담고있던 완충액을 투석에 의해 PBS 또는 10mM HEPES, pH 7.4 및 150mM 염화나트륨으로 바꾸고, 이를 최종 순도 >90%이 되도록(쿠마시 블루 염색에 의한 SDS PAGE 겔로 판단함) 0.2∼1㎎/㎖로 농축하였다. ALK-1 ECD His-Tag 단백질을 겉보기 MW이 26kDa인 글리코실 기를 사용하여 고분자량으로 글리코실화하여, 단백질에 대한 이론적 MW인 11kDa과 비교하였다. 상기 ALK-1 ECD His-Tag 단백질(서열 번호 98)을 사용하여, 실시예 2에 기술한 바와 같은 항-ALK-1 항체를 생산하는 하이브리도마를 제조하였다.
인간 ALK-1 ECD His-Tag 단백질: 유전자 서열(소문자 부분은 분비 신호를 나타냄)
atggagacagacacactcctgctatgggtactgctgctctgggttccaggttccactggtgacgcggcccagccggccGACCCTGTGAAGCCGTCTCGGGGCCCGCTGGTGACCTGCACGTGTGAGAGCCCACATTGCAAGGGGCCTACCTGCCGGGGGGCCTGGTGCACAGTAGTGCTGGTGCGGGAGGAGGGGAGGCACCCCCAGGAACATCGGGGCTGCGGGAACTTGCACAGGGAGCTCTGCAGGGGGCGCCCCACCGAGTTCGTCAACCACTACTGCTGCGACAGCCACCTCTGCAACCACAACGTGTCCCTGGTGCTGGAGGCCACCCAACCTCCTTCGGAGCAGCCGGGAACAGATGGCCAGCATCATCATCATCATCAT (서열 번호 99)
단백질 서열:
DPVKPSRGPLVTCTCESPHCKGPTCRGAWCTVVLVREEGRHPQEHRGCGNLHRELCRGRPTEFVNHYCCDSHLCNHNVSLVLEATQPPSEQPGTDGQHHHHHH (서열 번호 98)
실시예 2: 항-ALK-1 항체를 생산하는 하이브리도마의 제조
8∼10주령의 제노마우스® 마우스의 뒷다리에 10㎍/마우스의 재조합 인간 ALK-1/Fc 키메라(R&D Systems, Inc., Catalog Number 370-AL) 또는 ALK-1 ECD His-Tag 단백질(실시예 1)을 투여하여 상기 마우스를 면역화하였다. 이와 같이 하여 3∼5주 동안 5∼7회 반복 수행하였다. 융합시키기 3일 또는 4일 전 즈음에, 상기 마우스에 PBS 중 면역원을 최종적으로 주사하였다. 전기 세포 융합법을 통하여 면역화된 마우스로부터 유래한 림프 소절 림프구를 비-분비형 골수종 P3-X63-Ag8.653 세포WN(ATCC 카탈로그 번호 CRL 1580)와 융합시키고, 상기 융합된 세포들을 전술한 바와 같이 HA-DMEM 선별시켰다[DMEM/15% FBS/1% 200mM L-글루타민/1% 100X 비-필수 아미노산/1% 100× Pen/Strep/10U/㎖ IL-6/1 바이알/리터 OPI 배지 보충물 + 0.5× HA(아자세린-하이포잔틴; Sigma, Cat. # A9666)]. 모두 ALK-1 특이 인간 IgG2 항체를 분비하는 하이브리도마 패널을 회수하였다.
ELISA 검정법은 항체의 결합 여부를 검출하는데 사용되었다. 96-웰 이뮬론(Immulon) 미세 역가 평판 표면(NUNC-이뮤노(Immuno)™ 평판 맥시솝(MaxiSorp)™ 표면; Nalge Nunc International, Cat. No.439454)에 50mM 중탄산나트륨 완충액 중 4㎍/㎖의 농도로 40℃에서 밤새도록 면역원을 코팅하였다. 평판을 세척한 후, 여기에 0.1% Tween-20 및 0.5% 소 혈청 알부민을 PBS와 함께 첨가하여 블로킹시켰다. 상기 블로킹된 ELISA 평판에 항체를 가하고, 이를 1시간 동안 항온 처리한 다음, Tween-20과 PBS로 세척하였다. 결합 여부는 항-인간 IgG 호오스래디쉬 퍼옥시다제((Pierce, Catalog No. 31420) → ABTS(Pierce, Catalog No. 37615)를 첨가하여 검출하였다. 미세 평판 판독기(SpectraMax Plus 384, Molecular Devices) 내 405㎚에서 비색 측정을 실시하였다.
추가의 연구를 위하여 25개의 하이브리도마를 선별하였다. 이 하이브리도마는 희석율을 제한함으로써 클로닝되었으며, 또한 상기 하이브리도마를 각각 다음과 같이 명명하였다: 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1(rWT); 1.12.1(M29I/D19A); 1.12.1(M29I); 1.12.1(D19A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1; 및 5.59.1.
마우스 하이브리도마 세포주 LN 15916(하이브리도마 1.12.1)를 부다페스트 조약에 따라서 미국 표준 균주 보존 기관(ATCC)(미국 20110-2209 버지니아주 매너사스 유니버시티 불러바드 10801)에 2005년 6월 21일자로 기탁하였다. 상기 하이브리도마 1.12.1은 수탁 번호 PTA-6808를 부여받았다.
실시예 3: 항-ALK-1 항체의 서열
본 발명에 따라서 생산된 항체의 구조를 분석하기 위하여, 항-ALK-1 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마로부터 중쇄 및 경쇄 단편을 암호화하는 핵산을 클로닝하였다. 클로닝 및 서열 결정을 표준적인 방법에 따라서 수행하였다.
패스트-트랙(Fast-Track)™ 키트(Invitrogen)를 사용하여, ALK-1 항체 각각에 대하여 약 2×105개의 하이브리도마 세포로부터 폴리(A)+ mRNA를 분리하였다. 무작위 프라이머를 사용하여 cDNA를 mRNA로부터 합성하였다. 인간 VH 또는 인간 Vκ군 특이 가변 도메인 프라이머를, 모든 틀 부위(FR)와 상보성 결정 부위(CDR)를 포함하는 항체 가변부 증폭용인 인간 Cγ2 불변부 또는 Cκ 불변부에 특이적인 프라이머와 함께 사용하여, 무작위적으로 프라이밍된 cDNA를 PCR 증폭하였다. PCR 생성물의 양 사슬을 직접 서열 결정함으로써 항-ALK-1 생산 하이브리도마로부터 인간 중쇄 및 카파 경쇄 전사체를 암호화하는 핵산 서열을 얻었다. 애비제닉스(Abigenix)사 제품인 소프트웨어와 공중이 이용 가능한 서열 정보(인간 VH 및 Vκ 유전자에 대한 서열 정보)("V BASE 서열 디렉토리", Tomlinson외 다수, MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, UK)를 사용하여 서열을 분석하였다. 당 업자는 맥벡터(MacVector) 및 진워크(Genework) 소프트웨어 프로그램을 통해 입수 가능한 서열 정렬 소프트웨어를 사용하여 동일한 결과를 얻을 수 있었다.
구체적으로, 전장 ALK-1 항체 1.12.1을 다음과 같이 발현 벡터에 클로닝하였다: RNeasy 미니 키트(Qiagen)를 사용하여 폴리(A)+ mRNA를 분리하고, 올리고(dT) 프라이밍을 이용하는 어드밴티지(Advantage) RT-대-PCR 키트(BD Biosciences)를 사용하여 mRNA로부터 cDNA를 합성하였다. 표 2에 나열한 프라이머를 사용하여 클론 1.12.1에 대하여 이 올리고(dT) 프라이밍된 cDNA를 증폭시켰다. Pfu 울트라 중합 효소(Stratagene) 및 PTC-200 DNA 엔진(MJ Research)을 사용하여, 다음과 같이 순환시켜 증폭 반응을 수행하였다: 95℃에서 3분; 95℃에서 20초, 52℃에서 30초, 72℃에서 1분 20초(25회 반복); 72℃에서 10분. 그릴스 16th BDTv3.1/dGTP 화학(Applied Biosystems Inc) 및 373OxI DNA 분석기(Applied Biosystems Inc)를 사용하여, 클론의 서열을 확인하였다. 1.12.1 VH를 클로닝하는 과정에 있어서, 8번째 코돈에 침묵 돌연 변이를 도입시켜, "GGC"를 "GGT"로 전환시켰다. 모든 서열을 'V BASE 서열 디렉토리'(Tomlinson외 다수, J. Mol. Biol., 227, 776-798 (1992); Hum. Mol. Genet, 3, 853-860 (1994); EMBO J., 14, 4628-4638 (1995))에 정렬시켜 분석하였다.
Figure pat00018
[▲ 표 2: 전장 1.12.1을 클로닝하는데 사용된 중쇄 및 경쇄 증폭용 프라이머; 비-혼성화 염기는 소문자로 나타냄]
실시예 4: 유전자를 이용한 분석법 및 CDR 분석법
항체의 핵산 서열과 예측 아미노산 서열로부터, 각 항체 사슬에 대한 유전자의 유전자 선호도를 확인하였다. 표 3에는 본 발명에 따른 항체의 선택된 하이브리도마 클론의 유전자 이용 현황이 제시되어 있다.
Figure pat00019
Figure pat00020
[▲ 표 3: 중쇄 및 경쇄의 유전자 이용 현황]
제조자의 지침에 따라서, 클론 1.12.1의 VH(M29I) 및 Vκ(D19A) 부위에서, 표 4에 나열된 프라이머 및 퀵체인지(QuickChange) 키트(Stratagene)를 사용하여 돌연 변이 유발법을 실시하였다. 돌연 변이된 변이체의 서열을 확인한 후, 이를 표준적인 방법에 따라서 발현 벡터에 클로닝하였다.
Figure pat00021
[▲ 표 4: 돌연 변이 유발된 올리고뉴클레오티드(5'→3' 서열); 돌연 변이는 굵은 글씨에 밑줄을 쳐서 나타냄]
1.12.1(M29I/D19A) 항체의 중쇄 가변 도메인(서열 번호 5) 및 경쇄 가변 도메인(서열 번호 7)을 암호화하는 핵산을 부다페스트 조약에 따라서 미국 표준 균주 보존 기관(ATCC)(미국 20110-2209 버지니아주 매너사스 유니버시티 불러바드 10801)에 2005년 7월 14일자로 기탁하였다. 상기 기탁물에는 다음과 같은 수탁 번호가 부여되었다: ATCC 번호 PTA-6864[플라스미드 pCR2.1 TOPO 1.12.1 VH(M29I) 함유 이. 콜라이 DH5α: UC 25502]; 및 ATCC 번호 PTA-6865[플라스미드 pCR2.1 TOPO 1.12.1 Vκ(D19A) 함유 이. 콜라이 DH5α: UC 25503].
다수의 항-ALK-1 특이 인간 항체는 중쇄 가변 도메인의 CDR1과 공통된 패턴을 갖고 있다. 이 항체 분자는 4-31 또는 4-61 중쇄 V-유전자 분절을 이용한다. 이 항체의 중쇄에 상응하는 FR1 및 CDR1 서열을 생식 계열 서열에 대해 정렬하여 이하 표 4a에 나타내었다. 이 배열에 있어서 대쉬(-)는 생식 계열과 동일한 잔기를 나타내는 것이다. 모든 경우에 있어서, CDR1의 말단부에 존재하는 GYYWS(서열 번호 136) 패턴에서는 체세포 돌연 변이가 진행되어, 그 결과, 새로운 서열 패턴이 형성되며, 이로써, G 잔기는 산성 잔기(D 또는 E)로 변이되고, 마지막 S 잔기는 12가지의 예들 중 9개에서 N으로 변이된다. VH의 다른 부분에서의 서열 다양성을 통하여, 이러한 변이는 VH의 CDR1 말단부에 존재하던 동일한 서열 패턴을 형성하는 독립적인 체세포 돌연 변이인 것으로서 파악됨을 알 수 있다.
[표 4a]
Figure pat00022
[▲ 표 4a: ALK-1 항체의 중쇄 서열 패턴]
실시예 5: 1.12.1 Fab 분자의 제조
파페인을 사용하여 1.12.1(M29I/D19A) IgG1을 분해함으로써 1.12.1(M29I/D19A)의 Fab 단편을 제조하였다. 단백질 A 정제 전장 1.12.1(M29I/D19A) IgG1을 파페인(VWR)과 함께, 30mM 인산나트륨(pH 7.0), 2mM EDTA 및 2mM 시스테인을 함유하는 완충액 중에 1:50의 비율(파페인:단백질)로 항온 처리하였으며, 이때의 온도는 37℃로, 그리고 시간은 2∼3시간 동안 실시하였다. 이후, 분해 혼합물을 단백질 A 미니-컬럼에 가하여, 분해되지 않은 전장 단백질과 Fc 단편을 제거하였다. 컬럼 소통액으로부터 미결합 Fab을 수집하였다. 이후, 크기별 배제 컬럼 크로마토그래피(size exclusion column; 수퍼덱스(Superdex) 200; Amersham Pharmacia Biotech)를 수행하여, Fab 단백질을 추가로 정제하고, 이때 완충액은 PBS로 바꾸었다. 디톡시 겔(Detoxi gel; PIERCE)과 비바퓨어 미니 Q(Vivapure Mini Q) 이온 교환 컬럼(VivaScience)에 차례로 단백질 용액을 통과시켜 내독소를 제거하였다. 단백질을 0.2㎛의 시린지형 필터로 여과하고, 내독소 수준을 LAL 발열원 키트(Cambrex)로 테스트하였다. 정제된 단백질의 최종 농도는 2∼3㎎/㎖였는데, 이때의 내독소 수준은 < 0.1 EU/㎎이었고, 순도는 > 95%였다. 1.12.1(M29I/D19A) Fab 단편의 분자량은 비-환원 조건 하에서 47,347이었다[전자-스프레이 질량 분광 분석법에 의하여 확인됨]. 에드만(Edman) N-말단 서열 결정 분석법을 수행한 결과, EIVLTQSPG(서열 번호 113)의 경쇄 N-말단 서열과 QVQLQESG(서열 번호 114)의 중쇄 서열을 각각 확인할 수 있었다.
실시예 6: 바이어코어™를 사용하는 표면 플라스몬 공명법(SPR)을 통하여, 전체가 인간의 것인 항-ALK-1 모노클로날 항체의 결합력 값을 측정하는 방법
이하에 기술한 바와 같이, 바이어코어™ 3000 장치를 사용하는 표면 플라스몬 공명법에 의하여, 정제된 항-ALK-1 항체의 결합력 값을 제조자의 지침에 따라서 측정하였다.
동력학적 분석을 수행하기 위하여, 재조합 인간 ALK-1/Fc 융합 단백질(hALK-1/Fc) 및 사이노몰거스 ALK-1/Fc 융합 단백질(cALK-1/Fc)을, 통상의 아민 커플링법을 이용하여 CM5 바이어코어 센서 칩의 개별 유동성 세포에 고정하였다. 고정 완충액으로서 10mM 아세트산염 완충액(pH 5.0)을 사용하여 표면을 만들고, hALK-1/Fc 및 cALK-1/Fc 융합 단백질 각각에 대해 단백질 밀도가 300RU 및 150RU이 되도록 만들었다. 1M 염산에탄올아민(pH 8.5)을 사용하여 미반응 N-하이드록시숙신이미드 에스테르를 불활성화시켰다. 전개 완충액 중 항체 시료의 농도를 0.125nM에서 2nM로 만들었다[전개 완충액만을 포함하는 0nM 용액만이 0 참고 물질로서 포함됨]. 시료를 무작위로 골라내고, 전개 완충액으로서 HBS-EP(10mM HEPES pH 7.4, 150mM NaCl, 3mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20)를 사용하여, 전부 4개의 유동성 세포 중 2개에 상기 시료들 각각을 10분에 걸쳐서 주입하였다. 결합 속도(on-rate)가 유속 1∼100㎕/분, 즉 물질 이동에 제한이 없음을 나타내는 유속에 대해 독립적인지 여부를 관찰하였다. 유속 25㎕/분을 적용시켜 결합력 값을 측정하였다. 항체의 해리 여부를 10분 동안 모니터하였으며, 이때, 12초 동안 100mM H3PO4(25㎕/분)를 주입하여 표면을 재생시켰다. 스크러버(Scrubber; ⓒBioLogic Software) 소프트웨어 패키지를 사용하여 미가공 데이터를 처리하고, 클램프(CLAMP; ⓒBioLogic Software) 소프트웨어 패키지를 사용하여 분석하였다. 하나의 표면에서 얻어진 다수 개의 데이터 세트(1회당 6개의 데이터 세트)를, 간단한 1:1 랭뮤어(Langmuir) 결합 모델(공통 변수로서 Rmax값을 이용함)에 대해 동시에 전체적으로 맞추었다. 표 5에는 본 발명의 각 항-ALK-1 항체에 대한 결합력 값이 나열되어 있다. 이 표에 나타낸 데이터를 통하여, 본 발명에 따라서 제조된 항체는 인간 ALK-1에 대하여 고 친화성이며, 또한 결합 상수도 크다는 사실을 알 수 있다.
Figure pat00023
[▲ 표 5: 표면 플라스몬 공명법(바이어코어)에 의한 결합력 값의 측정 결과]
1.12.1(M29I/D19A)이란, 특정 아미노산 돌연 변이가 2회 발생한[즉, 중쇄의 29번 위치의 메티오닌이 이소루신으로 치환되었고, 경쇄의 19번 위치의 아스파르트산이 알라닌으로 치환된], 재조합 mAb로서 발현된 mAb 1.12.1 변이체이다.
실시예 7: 바이어코어™를 이용하는 표면 플라스몬 공명법(SPR)에 의해, 전체가 인간의 것인 항-ALK-1 모노클로날 항체 1.12.1의 변이체의 친화도 상수(K D )를 측정하는 방법
이하에 기술한 바와 같이, 바이어코어™ 3000 장치를 사용하는 표면 플라스몬 공명법에 의하여, 정제된 항-ALK-1 항체의 친화도를 제조자의 지침에 따라서 수행하였다.
동력학적 분석을 수행하기 위하여, 전체가 인간의 것인 인간 항-ALK-1 모노클로날 항체 1.12.1의 변이체를, 통상의 아민 커플링법을 이용하여 CM5 바이오 센서 칩의 덱스트란 층에 고정하였다. 고정 완충액으로서 10mM 아세트산염 완충액(pH 5.0)을 사용하여 표면을 만들고, 단백질 밀도가 3500∼4800RU가 되도록 만들었다. 1M 염산에탄올아민(pH 8.5)을 사용하여 미반응 N-하이드록시숙신이미드 에스테르를 불활성화시켰다. 전개 완충액 중 단량체 ALK-ECD 시료의 농도를 2.63nM에서 640nM로 만들었다[전개 완충액만을 포함하는 0nM 용액만이 0 참고 물질로서 포함됨]. 시료를 무작위로 골라내고, 전개 완충액으로서 HBS-EP(10mM HEPES pH 7.4, 150mM NaCl, 3mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20)를 사용하여, 전부 4개의 유동성 세포에 상기 시료들 각각을 2분에 걸쳐서 주입하였다. 유속 25㎕/분을 적용시켜 친화도 상수를 측정하였다. 단량체 ALK-ECD의 해리 여부를 10분 동안 모니터하였으며, 이때, 12초 동안 100mM H3PO4(25㎕/분)를 주입하여 표면을 재생시켰다. 스크러버(ⓒBioLogic Software) 소프트웨어 패키지를 사용하여 미가공 데이터를 처리하고, 클램프(ⓒBioLogic Software) 소프트웨어 패키지를 사용하여 분석하였다. 이 데이터를 간단한 1:1 랭뮤어(Langmuir) 결합 모델에 대해 전체적으로 맞추었다. 표 6에는 본 발명의 인간 항-ALK-1 모노클로날 항체 1.12.1에 대한 친화도 수치가 나열되어 있다.
Figure pat00024
[▲ 표 6: 표면 플라스몬 공명법(바이어코어)에 의해 mAb 1.12.1 변이체의 친화도 상수인 KD를 측정한 결과]
상기 표 6에 있어서, 1.12.1(M29I/D19A) (1) 및 (2)에 대한 2개의 친화도 상수는 2개의 개별 표면으로부터 얻어짐.
1.12.1은, 하이브리도마로부터 분리된 mAb 1.12.1 변이체임.
1.12.1(rWT)은, 재조합 mAb으로서 발현된 mAb 1.12.1 변이체임.
1.12.1(M29I)은, 특정 아미노산 돌연 변이가 1회 발생한[중쇄의 29번 위치의 메티오닌이 이소루신으로 치환된] 재조합 mAb으로서 발현된 mAb 1.12.1 변이체임.
1.12.1(D19A)은, 특정 아미노산 돌연 변이가 1회 발생한[경쇄의 19번 위치의 아스파르트산이 알라닌으로 치환된] 재조합 mAb으로서 발현된 mAb 1.12.1 변이체임.
1.12.1(M29I/D19A)은, 특정 아미노산 돌연 변이가 2회 발생한[중쇄의 29번 위치의 메티오닌이 이소루신으로 치환되고, 경쇄의 19번 위치의 아스파르트산이 알라닌으로 치환된] 재조합 mAb으로서 발현된 mAb 1.12.1 변이체임.
실시예 8: 바이어코어™를 사용하는 표면 플라스몬 공명법(SPR)에 의해, 전체가 인간의 것인 항-ALK-1 모노클로날 항체 각각의 친화도 상수(K D )의 측정 방법
이하에 기술한 바와 같이, 바이어코어™ 3000 장치를 사용하는 표면 플라스몬 공명법에 의하여, 정제된 항-ALK-1 항체의 친화도(KD 및 Koff)를 제조자의 지침에 따라서 측정하였다.
동력학적 분석을 수행하기 위하여, 친화도-정제된 mAb을, 통상의 아민 커플링법을 이용하여 CM5 바이오 센서 칩의 덱스트란 층에 고정하였다. 고정 완충액으로서 10mM 아세트산염 완충액(pH 5.0)을 사용하여 표면을 만들고, 단백질 밀도가 200∼400RU가 되도록 만들었다. 1M 염산에탄올아민(pH 8.5)을 사용하여 미반응 N-하이드록시숙신이미드 에스테르를 불활성화시켰다. 전개 완충액 중 단량체 ALK-ECD 시료의 농도를 3.125nM에서 400nM로 만들었다[전개 완충액만을 포함하는 0nM 용액만이 0 참고 물질로서 포함됨]. 시료를 무작위로 골라내고, 전개 완충액으로서 HBS-EP(10mM HEPES pH 7.4, 150mM NaCl, 3mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20)를 사용하여, 전부 4개의 유동성 세포에 2개의 시료들을 각각 2분에 걸쳐서 주입하였다. 결합 속도가 유속 1∼100㎕/분, 즉 물질 이동에 제한이 없음을 나타내는 유속에 대해 독립적인지 여부를 관찰하였다. 유속 25㎕/분을 적용시켜 친화도 상수를 측정하였다. 단량체 ALK-ECD의 해리 여부를 10분 동안 모니터하였으며, 이때, 12초 동안 100mM H3PO4(25㎕/분)를 주입하여 표면을 재생시켰다. 스크러버(ⓒBioLogic Software) 소프트웨어 패키지를 사용하여 미가공 데이터를 처리하고, 클램프(ⓒBioLogic Software) 소프트웨어 패키지를 사용하여 분석하였다. 이 데이터를 간단한 1:1 랭뮤어 결합 모델에 대해 전체적으로 맞추었다. 표 7에는 본 발명의 항-ALK-1 항체 각각에 대한 친화도 측정 결과가 나열되어 있다.
Figure pat00025
[▲ 표 7: 표면 플라스몬 공명법(바이어코어)에 의해, 모노클로날 항체 각각의 친화도 상수(KD)를 측정한 결과]
실시예 8의 데이터를 얻는데 사용된 단량체 ALK-ECD는 실시예 7의 데이터를 얻는데 사용된 단량체 ALK-ECD와 상이한 제제이다.
1.12.1(M29I/D19A)는, 전술한 바와 같이 특정 아미노산 돌연 변이가 2회 발생한[경쇄의 19번 위치의 아스파르트산이 알라닌으로 치환되고, 중쇄의 29번 위치의 메티오닌이 이소루신으로 치환된] 재조합 mAb로서 발현된 mAb 1.12.1 변이체이다.
Fab 1.12.1(M29I/D19A)은, 파페인을 사용하여 1.12.1(M29I/D19A) IgG1을 분해함으로써 제조된 mAb 1.12.1(M29I/D19A)의 Fab 단편이다.
실시예 9: 항-ALK-1 항체의 에피토프 선택성의 확인
제조자의 프로토콜에 따라서, 바이어코어™ 3000 장치(Biacore International AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, NJ)를 사용하여 교차 경쟁 실험을 수행하였다.
재조합 인간 ALK-1/FC 키메라를 아민 커플링 반응을 이용하여 CM5 바이오센서 칩의 덱스트란 층에 고정시켰다. 10mM 아세트산염 완충액(pH5.0)을 고정 완충액으로 사용하여 칩을 제조하였는데, 이때의 단백질 밀도는 940 RU였다. 1M 염산에탄올아민(pH 8.5)을 사용하여 미반응 N-하이드록시숙신이미드 에스테르를 불활성화시켰다.
정제된 mAb을 HBS-EP 전개 완충액(0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3mM EDTA, 0.005% 폴리소르베이트 20) 중에 희석시켜 농도가 50nM이 되도록 만들었다. 1차 항체를 골라낸 후, 10㎕/분의 속도로 600초 동안 유동성 세포에 주입하였다. 주입을 마친 후, 2차 항체를 선택하여, 이를 상기와 동일하게 10㎕/분의 속도로 600초 동안 유동성 세포에 주입하였다. 여기에 12초 동안 100mM H3PO4(25㎕/분)를 주입하여 센서 표면을 재생시켰다.
재생시킨 후, 1차 항체를 다시 10㎕/분의 속도로 600초 동안 유동성 세포에 주입하였다. 주입을 마친 후, 상이한 2차 항체를 선택하여, 상기와 동일하게 10㎕/분의 속도로 600초 동안 유동성 세포에 주입하였다. 14개의 항체 패널 전부가 2차 항체로 사용되면, 새로운 1차 항체를 골라내어, 이 새로운 1차 항체로 상기 과정을 반복 수행하였다. 1차 및 2차 항체를 조합 투여하여 유동성 세포에 모두 주입될 때까지 상기 과정을 수행하였다. 상기 2가지 항체를 주입한 후 전체 반응성이, 이 2가지 항체 주입시 얻어질 수 있는 역치 값을 초과할 경우를 2차 항체가 결합한 경우로 간주하였다. 1차 항체 및 2차 항체 둘 다와 동일한 항체를 사용하여 역치 값을 측정하였다. 이를 표 8에 나타내었는데, 여기서, 결합이 관찰되는지 여부를 바탕으로 하여 반응 매트릭스를 작성하였다: 여기서, -는 2차 항체가 결합하지 않은 경우를 나타내고, x는 결합이 관찰되는 경우를 나타냄[반응성은 각각의 항체에 대한 역치 값보다 컸음]. 동일한 반응성 패턴을 나타내는 클론을 2개의 상이한 에피토프 묶음[1.11.1과 기타 모든 항체]으로 분류하였다.
Figure pat00026
[▲ 표 8: 바이어코어 에피토프 묶음 반응 매트릭스 ]
실시예 10: 사이노몰거스 원숭이 ALK-1 유전자의 분리
사이노몰거스 원숭이("사이노(Cyno)") ALK-1 유전자를 사이노몰거스 원숭이의 폐 조직으로부터 추출하였다. 인간 ALK-1(Genebank 등록 번호: L17075)에 대하여 공개된 유전자 서열을 바탕으로 프라이머를 디자인하여, 전장 사이노몰거스 ALK-1을 PCR 증폭하였다. 제조자의 지침에 따라서, mRNA 정제 키트(Ambion, Catalog No. 1915)를 사용하여 동결 절개 사이노몰거스 폐 조직(약 1g)으로부터 mRNA를 제조하였다. 200ng의 mRNA를 역전사시키고, 유전자-특이 올리고머 즉, 5'-AGCGGGCCCAGAGGGACC ATG (서열 번호 115)(전방향) 및 5'-CAGAAAGGAATCAGGTGCTCCTGGG CTA (서열 번호 116)(역방향)를 이용하는 원스텝 RT-PCR 키트(OneStep RT-PCR kit; Qiagen, Catalog No. 210210)로 PCR 증폭시켰다(온도 = 61℃). 적당한 크기(약 1.5 Kb)의 RT-PCR 생산물을 잘라서, 전기 영동 시킨 다음, 이를 0.9% 아가로스 겔로부터 정제한 후, TOPO-TA를 pCR4-TOPO 벡터(Invitrogen, Catalog No. K4575-01)에 클로닝하였다. 삽입물을 서열 결정하여, 사이노몰거스 ALK-1의 ORF 뉴클레오티드 서열을 얻었다. 뉴클레오티드 및 번역된 예측 아미노산 서열을 각각 서열 번호 93 및 서열 번호 94에 나타내었다. 유전자의 세포질 부분은 사이노와 인간의 공통된 단백질 서열을 암호화하였으나, 이들의 세포 외 도메인에는 5개의 아미노산[22∼118번 위치를 포함하는 ECD]과 1개의 아미노산[단백질의 경막 도메인에 존재하는 아미노산]에 있어서 차이가 있었다. 인간과 사이노 간 ECD 서열의 동일성은 94.8%이다. 인간과 영장류 ECD의 배열을 도 2에 나타내었다.
한 쌍의 프라이머[전방향: 5'-GATT ATG GCCTTGGGCTCCCCCAGGAAA(서열 번호 117) 및 역방향: 5'-GGG CTA TTGAATCACTTTAGGCTTCTCTGGACTGTTG(서열 번호 118)]를 사용하여, 전장 사이노몰거스 ALK-1 유전자를 PCR 증폭시켰다.
실시예 11: 유세포 분석법(FACS)에 의한 영장류 가교 혼성화 여부 및 세포 표면 결합 특성의 측정
유동성 형구 계측법(FACS)를 이용하여 항-ALK-1 결합 친화도를 테스트하는데 사용될 수 있는 ALK-1-과발현 세포주를 생산하기 위하여, 전장인 인간, 사이노몰거스 및 래트의 ALK-1 유전자를 인비트로겐(Invitrogen)의 pcDNA5/FRT/To TOPO 벡터(Catalog No. K6510-20)에 클로닝하고, 이를 293 FIp-In T-Rex 숙주 세포(Invitrogen, Catalog No. R780-07)에 각각 형질 감염시켰다. 하이그로마이신을 사용하여 선별한 결과, 안정한 최종 세포주를 얻었다. 37℃/5% CO2에서 24시간 동안 테트라사이클린(2㎍/㎖) 유도시켜 각각의 전장 ALK-1 단백질을 과발현시켰다.
ALK-1 단백질을 과발현하는 293개의 안정한 세포를 이용하는 FACS 검정법을 이용하여, 항-ALK-1 mAb가 세포 표면 ALK-1에 대해 결합 친화도를 가지는지 여부에 대해 테스트하였다. 트립신-EDTA를 사용하여 세포를 탈리시키고, 이를 냉각 PBS-SA로 세척하였다. 이를 96-웰 평판에 분취하여 넣은 후, 세포에 혈청을 첨가하여 이 세포를 블로킹시킨 다음, 40℃에서 1 시간 동안 상이한 농도의 특이 mAb와 함게 세포를 항온 처리하였다. 이후, 상기 세포를 세척하고, 이를 R-PE 형광단과 컨쥬게이트화된 항-인간 κ 2차 항체와 함께 항온 처리한 다음, FACSCalibur 유세포 분석기(BD Biosciences)를 사용하여 분석하였다. 게이팅(gating)시키지 않고서 각각의 시료에 대해 10,000개의 데이터를 수집하였다. 그 결과를 표 9에 나타내었는데, 각 시료의 막대 그래프의 기하 평균은 mAb 농도에 대한 함수로 나타내었으며, KD는 2-상태 평형 모델(two-state equilibrium model)에 맞춘 후 각각의 mAb에 대해 측정하였다. 균등한 인간 및 영장류 FACS 실험의 예를 도 3에 나타내었다.
Figure pat00027
[▲ 표 9: FACS에 의해 측정된 세포 표면 인간 또는 사이노 ALK-1에 대한, 항-ALK-1 모노클로날 항체의 평균 결합 친화도(KD) 측정 결과]
뿐만 아니라, 1.12.1은 FACS 검정법에 따르면, 래트/인간 및 마우스/인간 ALK-1 사이의 ECD 서열 동일성이 각각 74% 및 68%인 것으로 보았을 때, 래트와 극도로 제한된 정도로 교차하는 것으로 파악되며(KD > 100nM), 또한 마우스와는 극도로 낮은 정도로 교차하는 것으로 예측된다.
FACS 검정법은 또한 재조합 1.12.1 mAb 변이체의 KD를 측정하는데에도 사용되었다. 표 10을 통하여, 재조합 항체의 경우에도 결합 친화도가 유사함을 알 수 있다.
Figure pat00028
[▲ 표 10: FACS에 의해 측정된 세포 표면 인간 또는 사이노 ALK-1에 대한, 1.12.1(M29I/D19A) 변이체의 평균 결합 친화도(KD) 측정 결과]
1.12.1은, 하이브리도마로부터 분리된 mAb 1.12.1 변이체임.
1.12.1(rWT)은, 재조합 mAb로서 발현된 mAb 1.12.1 변이체임.
1.12.1(M29I)은, 특정 아미노산 돌연 변이가 1회 발생한[중쇄의 29번 위치의 메티오닌이 이소루신으로 치환된] 재조합 mAb로서 발현된 mAb 1.12.1 변이체임.
1.12.1(D19A)은, 특정 아미노산 돌연 변이가 1회 발생한[경쇄의 19번 위치의 아스파르트산이 알라닌으로 치환된] 재조합 mAb로서 발현된 mAb 1.12.1 변이체임.
1.12.1(M29I/D19A)는, 전술한 바와 같이 특정 아미노산 돌연 변이가 2회 발생한[중쇄의 29번 위치의 메티오닌이 이소루신으로 치환되고, 경쇄의 19번 위치의 아스파르트산이 알라닌으로 치환된] 재조합 mAb로서 발현된 mAb 1.12.1 변이체이다.
Fab 1.12.1(M29I/D19A)은, 파페인을 사용하여 1.12.1(M29I/D19A) IgG1을 분해함으로써 제조된 mAb 1.12.1(M29I/D19A)의 Fab 단편이다.
실시예 12: Id1에 대한 택맨 검정법
HUVEC(Biowhittaker, Cat. # CC-2519)를 24-웰 평판에, 600㎕ 완전 HUVEC 배지(EGM-2 뷸렛 키트(Bullet kit); Biowhittaker, Cat. # CC-3162) 중 12000 세포/웰로 접종하고, 이를 밤새도록 성장시켰다. 그 다음날, 이 세포는 통상적으로 50%의 합류 상태가 되었다. 완전 배지를 제거하고, 여기에 200㎕의 결핍 배지(Starvation Medium; 0.2% FBS만을 함유하는 EBM-2를 주성분으로 함)를 첨가하였다. 세포를 2시간 동안 항온 처리하였다. 이후, 세포를 PBS중 40㎕의 항체 용액으로 처리하였다. 동결 Ab를 멸균 PBS로 재구성하였다. 마지막으로, 세포를 1% FBS/기저 배지(최종 농도)로 30분 동안 처리하고 나서 배지를 제거하고, 제조자의 프로토콜에 따라서, 세포를 400㎕의 RTL 완충액(Rneasy 96 키트; Qiagen, Cat. # 74182) 중에서 용해시켰다. 이후, 제조자의 지침에 따라서 RNeasy 키트를 사용하여 RNA를 제조하였다. RNA를 용리시키고, 리보그린(RiboGreen)® RNA 정량 키트(분자 프로브, Cat. # R-11490)를 사용하여 정량하였다. 동량의 총 RNA를 실시간 PCR 분석용으로서 사용하여, Id1 RNA 발현 여부를 검출하였다(ABI 7900 장치 사용). 택맨 원스텝 PCR 마스터 믹스 키트(Taqman One Step PCR Master Mix Kit; ABI, Cat. # 4309169)를 사용하여 PCR을 수행하고, ID1 프라이머/프로브 서열을 이하에 나열하였다. 다음과 같은 어닐링 및 증폭 조건 하에서 40 순환의 PCR을 수행하였다: 95℃, 15초; 60℃, 1분.
택맨 프로브: CPG-컨쥬게이트화 5'-6-FAM, 및 3'-TAMRA.
명칭: ID1-프로브
서열: 5' CCAGCACGTCATCGACTACATCAGGGA 3'(서열 번호 119)
택맨 PCR 프라이머:
명칭: ID1-F
서열: 5' AAGGTGAGCAAGGTGGAGATTC 3'(서열 번호 120)
명칭: ID1-R
서열: 5' TTCCGAGTTCAGCTCCAACTG 3'(서열 번호 121)
1.12.1(M29I/D19A) 인도 분자(1.12.1 서열 변이체 포함) 및 Fab 유도체에 대한 Id1 역가의 예를 도 4 및 도 5에 나타내었다.
본 검정법에 대한 평균 IC50값을 표 11에 요약하였다. 모든 IC50은 3회 측정하였다.
실시예 13: LI-COR 바이오사이언시스(LI-COR Biosciences)사의 오디세이 적외선 영상화 시스템에 의해 검출된 Smad1 인산화(24-웰 평판)
HUVEC(Biowhittaker, Cat. # CC-2519)를 24-웰 평판에, 600㎕ 완전 HUVEC 배지(EGM-2 뷸렛 키트, Biowhittaker, Cat. # CC-3162) 중 18000 세포/웰로 접종하고, 이를 밤새도록 성장시켰다. 그 다음날, 이 세포는 통상적으로 50%의 합류 상태가 되었다. 완전 배지를 제거하고, 여기에 200㎕의 결핍 배지(Starvation Medium; 0.2% FBS만을 함유하는 EBM-2를 주성분으로 함)를 첨가하였다. 세포를 2시간 동안 항온 처리하였다. 이후, 세포를 PBS중 40㎕의 항체 용액으로 3시간 동안 처리하였다. 마지막으로, 세포를 35분 동안 0.3×의 완전 배지(최종 농도)로 처리하였다. 이 배지를 제거하고, 세포를 80㎕의 1.1× 시료 완충액(Invitrogen, Cat. No. NP0007)에서 용해시켰다. X 세포 슈어락 미니-셀 & 블럿 모듈(X Cell Surelock Mini-Cell & Blot Module; Invitrogen, Cat.# EI0002)를 사용하여 인산화된 Smad1을 측정하였다. 토끼 항-포스포-Smad1 항체(Cell Signaling, Cat. No. 9511)를 사용하여 인산화된 Smad1을 검출한 후, 이를 IRDye™ 800 컨쥬게이트화 항-토끼 IgG(Rockland Immunochemicals, Cat. No.611-732-127)로 검출하였다. 인산화된 Smad1의 양을 오디세이 적외선 영상화기(Li-Cor)로 정량하였다. 액틴(Santa Cruz, # sc-8432)을 정규화하는데 사용하였다[항-마우스 알렉스 680; Molecular Probe, Cat. No. A-21058]. 본 검정법에 대한 평균 IC50 값을 표 11에 나타내었다. 이때, 모든 IC50 수치는 3회 측정하였다.
Figure pat00029
실시예 14: 항-ALK-1 모노클로날 항체의 내재화 특성
FACS를 이용하여 잔류하고 있던 세포 표면 수용체 ALK-1과 중화 항체를 경시적으로 모니터하였다. 잔류하고 있는 세포 표면 ALK-1은 중화 항체가 결합하는 에피토프와는 상이한 에피토프를 인지하는 세포 표면 ALK-1과 결합할 수 있는 마커 항체에 의해 모니터된다. 마우스 항-인간 ALK-1 ECD mAb(R&D sytems, Cat. No # AF310)를 동정하여 이를 마커 항체로서 연구에 사용하였다.
내피 세포주인 HUVEC 및 HUAEC을 이용하여 내재화를 경시적으로 연구하였다. 이 세포를 웰당 200㎕의 완전 배양 배지를 함유하는 24-웰 평판 내에서 5% CO2와 함께 37℃의 온도에서 생육하였다. 48시간 동안 11회 시점에서, 1㎎/㎖ 항체 용액 2㎕를 하나의 웰에 첨가하고, 이를 혼합하였다(중화 항체의 최종 농도 = 10㎍/㎖). 이후, 0시간 시점 즉, 평판을 얼음에 넣어서 내재화 과정을 중지시킨 시점과 같은 상태로 될 때까지, 평판을 다시 37℃의 항온 처리기에 넣었다. 이 시점(최종 농도가 10㎍/㎖가 되는 시점)에서 마커 항체를 웰에 첨가하여, 이를 1시간 동안 얼음으로 항온 처리하였다. 이후, 상기 세포를 트립신처리하여 탈리된 PBS로 세척하고, 이를 96-웰 평판으로 옮겼다. 이후, 세포를 상이한 형광 단을 보유하는 2차 항체로 세척, 블로킹 및 처리하여, 세포 표면에 잔류하던 중화 항체와 수용체 ALK-1을 모니터하였다. 시료를 FACSCalibur 유세포 분석기(계수: 3000∼5000회/시료)로 검정하였다. 특이 형광 통로에 있어서의 각 시료의 기하 평균을 측정하여, 이를 시간에 대한 함수로 나타내었다. 데이터를 변형된 방사성-붕괴 등식에 적용시켜, 내재화가 정상-상태에 도달하였을 때의 내재화 반감기(t1/2)와 세포 표면에 잔류하는 중화 항체 또는 수용체 ALK-1의 비율을 구하였다. 도 6에 나타낸 바와 같이, mAb 1.12.1(M29I/D19A)은 세포 표면 수용체 ALK-1과 동일한 속도와 동일한 정도로 내재화한다. 1.12.1(M29I/D19A) 내재화 반감기는 약 2시간이다. 항체의 50%가 내재화되었을 때 평형에 도달하였다. R&D 시스템스(Cat. No # AF370)로부터 구입한 폴리클로날 항체는 t1/2 1시간으로 내재화하며, 또한 약 70%의 수용체가 내재화될 때 정상-상태에 도달한다(도 6). 본 발명의 기타 인간 항-ALK-1 mAb에서도 유사한 내재화 특성이 관찰되었다(결과 생략).
실시예 15: 인간 포피-SCID 키메라 마우스의 확립
문헌[H-C Yan외 다수 "Human/Severe Combined Immunodeficient Mouse Chimeras, An Experimental In Vivo Model System to Study the Regulation of Human Endothelial Cell-Leukocyte Adhesion Molecules", J. Clin. Invest 91 :986, 1993; J. Varner "Regulation of Angiogenesis in Vivo by Ligation of Integrin a5b1 with the Central Cell-Binding Domain of Fibronectin" Amer. J. Path. 156 (4):1345, 2000; K. Tahtis외 다수 "Expression and Targeting of Human Fibroblast Activation Protein in a Human Skin/Severe Combined Immunodeficient Mouse Breast Cancer Xenograft Model" Mol. Cancer. Ther. 2(8):729, 2003]에 개시된 방법을 상당 수준 변형한 변법을 수술 방법에 적용하였다. 국립 질병 연구 센터(National Disease Research Institute) 및 이와 연계된 인간 조직 네트워크(Cooperative Human Tissue Network)로부터 인간 포피 세포를 입수하여, 이 인간 포피 세포를 건강하지 못한 부위로부터 잘라낸 다음, 이 세포 조각들을 페니실린과 스트렙토마이신(Gibco/Life Tech, Cat# 15070-063)이 보강된 RPMI 배지(Cellgro/Mediatech, Cat# MT-15-040-CV)에 넣었다[이때, 페니실린/스트렙토마이신 스톡 용액 5㎖를 RPMI 500㎖에 첨가함]. 멸균 페트리 접시 내에서 외과용 메스를 사용하여, 피부를 말단부가 깔끔한 타원형(약 8×13㎜)으로 잘라내었는데, 이때 결합 조직도 제거하였으며, 수술 전 이 피부를 얼음에 습윤 상태로 보관하였다. 100㎎/㎖ 케타민(케타셋TR(KetasetTR), Fort Dodge Animal Health)/1㎎/㎖ 메데토미딘 (Pfizer Animal Health - Dormitor) 용액을 적당한 부피(동물당 4㎕/g)로 SCID 마우스의 복부에 복강 내 주사하였다[즉, 45°각도로, 피부 아래에 주사하되 너무 깊이 내부로 찔러넣지는 않음]. 마취시킨 후, 마우스에 안구 윤활제를 투여하고, 케토프로펜(10㎎/㎏, Fort Dodge Animal Health)을 피하 주사한 다음, 수술 부위의 털을 깎았다. 수술 부위를 클로라헥시덤(Clorahexiderm; Butler, Chclo-Scrub 40, cat # WAB20109)으로 3회 문지른 후, 수술 위치의 중심으로부터 바깥쪽으로 원을 그리면서 알콜로 닦아내어, 더러운 부위로부터 깨끗한 부위로 다시 닦는 일이 없도록 하였다. 이 마우스를 미리 준비된 수술용 후드로 옮겨 놓고, 37℃로 유지되는 온수 패드(Gaymar Industries, cat# TP500 T/Pump) 위에 놓았다. 이후, 상기 마우스를 수술하는 동안 내내 이소플루오린으로 마취시켰다. 마우스의 등 쪽을, 수술 부위가 노출되도록 잘라진 수술용 드레이프로 덮었다. 마우스 피부를 핀셋으로 집어 올리고, 곡선형의 가위를 사용하여 피부 조직을 타원형으로 한번에 잘라내었다. 적당한 크기로 잘라진 인간의 포피를 마우스에 이식하였다. 인간 및 마우스 피부를 에틸론(Ethilon) 봉합사(Ethicon cat# 697H)를 사용하여, 타원형 조직의 상부에서부터 하부의 방향으로, 그리고 오른쪽 가장 긴 축으로부터 왼쪽 가장 긴 축의 방향으로 봉합하였다. 그 사이의 부위들도 더 봉합하여, 조직을 단단히 봉합하였다. 피부 주위를 동일한 간격으로 대략 8바늘 봉합하였다. 수술하는 동안에는, 상처 부위가 마르지 않도록 멸균 염수가 담긴 시린지를 사용하여 피부/마우스 수술 부위 상처에 계속 물을 공급하였다. 상처 부위에 반창고를 붙였다. 이후, 투명한 드레싱(3M 테가덤(Tegaderm)™)을 대어 상기 반창고 주위를 헐렁하게 감싸주었다. 이 드레싱을 반창고가 붙어있는 부위보다 약간 넓게 감싸도록 잘랐다. 이후, 마우스에 아티파메졸(Atipamezole)(50∼100㎕, Pfizer Animal Health - Antisedan)을 가하고, 마우스를 5∼10분 동안 따뜻하게 데운 우리에서 회복시켰다. 수술 후 7∼10일 경과시 드레싱과 반창고를 제거하였으며, 그 후로 15일 경과시에는 피부의 대부분에 딱지가 앉았다. 피부에 종양 세포를 이식할 수 있는 상태가 되는 시기인 약 21∼28일 경과시에 완전한 치유가 이루어졌다. 도 8은 수술 후 이식된 피부 절편을 조직학적으로 분석한 결과(H & E 염색)를 나타내는 것이다. 이식된 피부의 조직학적 결과는 문헌[Tahtis외 다수 "Expression and Targeting of Human Fibroblast Activation Protein in a Human Skin/Severe Combined Immunodeficient Mouse Breast Cancer Xenograft Model" Mol. Cancer. Ther. 2(8):729, 2003]에 개시된 바와 같이, 마우스에 인간 피부를 이식하였을 때 관찰되는 결과와 유사한 특징을 나타내었다. h.e. = 인간 상피층; h.d. = 인간 진피층.
실시예 16: 인간 포피에 있어서의 콜라겐 모델 - SCID 키메라 마우스
0.02 N 아세트산을 사용하여 콜라겐 I 스톡 용액(cat# 354236, Becten-Dickinson)을 4㎎/㎖의 농도로 희석한 후, 이를 이식하기 전 얼음에 넣어 두었다. 산성 콜라겐 용액(8부)을 10× M199(Sigma, Cat# M9163)(1부)와 인간 혈장 피브로넥틴(Fn)(cat# 354008, Becten-Dickinson)과 혼합하여, 최종 Fn 농도가 90㎕/㎖가 되도록 만들고; 여기에 NaOH(1.0N)를 첨가하여 pH를 약 7.2로 맞추었다. 콜라겐/Fn 혼합물을 사용할 때까지 얼음에 넣어 두었다. 콜라겐/Fn 혼합물과 목적으로 하는 신생 혈관 형성 억제제를 사용하여 이식용 혼합물을 만들었다[인간 대혈관 내피 세포(HMVEC)(Cascade Biologies, Cat# C-010-5C)를 포함하거나 포함하지 않음]. HMVEC를 PBS 중에 6×106개의 세포/㎖의 농도로 제조하였다. 50∼100㎕의 이식 혼합물을 SCID 키메라 마우스의 포피에 피내 주사하였다. 7∼14일 경과 후, 콜라겐 전을 수집하여, 이를 OCT 화합물(cat# 4583, Sajura Finetek, CA) 내에 매립하여, 스냅 동결시켜 면역 조직 화학 분석을 실시하였다. 포피 내 콜라겐 전을 트리크롬 키트(cat# KC1641, Mater Tech, CA)로 동정한 결과, 도 9a에 나타낸 바와 같이 청색으로 염색되었다. 항-인간 CD-31 항체(클론 13.3, Vector Laboratories)(도 9b)를 사용하여 인간 P-CAM에 대하여 염색함으로써, 인간의 혈관을 확인하였다. 표 12에는 포피-SCID 키메라 마우스의 콜라겐 모델에 있어서 인간의 혈관을 염색 및 정량한 결과가 요약되어 있다.
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[▲ 표 12: 콜라겐 모델 결과 요약]
실시예 17: 인간 포피-SCID 키메라 마우스에 있어서 M24met 종양 모델
본 연구에서는 통상적으로 이식령(graft age)이 수술 후 5∼10주인 마우스를 사용하였다. M24met 세포주에 관하여는 문헌[뮐러외 다수; "Tissue factor-initiated thrombin generation activates the signaling thrombin receptor on malignant melanoma cells", Cancer Research, 55(8): 1629-32, 1995]에 개시되어 있다. M24met 세포 현탁액은 다음과 같이 제조하였다: 합류 상태가 80%인 M24met 세포를 세척하고, 트립신/EDTA(Gibco, Cat# 25200-056)를 사용하여 트립신 처리한 다음, 이를 10% FBS(Cellgro/Mediatech, Cat# AKD-11775) 및 2mM L-글루타민이 보강된 PRMI(Cellgro/Mediatech, cat# MT-15-040-CV) 배지 중에 수집하였다. 이 세포를 5분 동안 600rpm에서 원심 분리하고, 멸균 PBS 중에 재현탁하였다. 쿨터 카운터(Coulter Counter; Beckman Coulter, Model Z2)를 사용하여 세포의 갯 수를 측정하였다. 세포를 600 rpm에서 5분 동안 원심 분리하고, 이를 콜라겐/ Fn(3㎎/㎖) 혼합물에 재현탁하여, 이식용 세포 현탁액 1㎖당 4×107개의 세포를 얻었다.
접종을 위하여, 상기 2×106개의 세포를 마우스에 이식된 인간의 피부로 피내 주입하였다[4×107개 세포/㎖, 50㎕]. 이식 후 5∼7일 경과시, 종양이 손으로 만져졌으며, 투여를 시작하기에 앞서서, 마우스를 대조군과 처리 군으로 무작위로 나누었다. 대조군은 아무것도 투여하지 않았거나, 항-ALK-1 항체로 구성된 비이클이 투여되었거나, 또는 동 기준 표본형의 매칭된 IgG2 인간 모노클로날 항체 항-KLH(Pfizer Inc)를 투여한 동물군으로서 정의된다. 처리 군은 항-ALK-1 항체 1.12.1(M29I/D19A)가 투여된 동물군으로서 정의된다.
실시예 18: 인간 및 마우스 CD-31 면역 형광도(IF) 이중 염색
동결된 조직 절편을 공기 건조시키고, 이를 -20℃의 아세톤(Fisher, Cat#A16S-4) 중에서 10분 동안 고정시켰다. 이 시료를 다시 공기 건조시키고, PBS 중에서 3회(각각 5분씩) 세척하였다. 이 시료를 실온의 PBS 중 5% 토끼 혈청(Vector Laboratories, Cat# S-5000)에서 3분 동안 블로킹하였다. 1차 항체 혼합물을 항-인간 CD-31 항체(Santa Cruz, Cat# SC1505)와 항-마우스 CD-31(Pharmingen, Clone Med 3.3, Cat# 01951A)와 함께(각각 1:100 및 1:150 희석) 5% 토끼 혈청 중에서 제조하였다. 실온에서 상기 항체 혼합물을 조직 시료에 1시간 동안 첨가하였다. 형성된 블록을 PBS중에서 각각 5분씩 3회 세척하고, 이를 실온에서 1시간 동안 2차 항체 혼합물과 함께 항온 처리하였다. 2차 항체 혼합물을 PBS/0.05% Tween-20(Sigma, Cat.No. P1379), 텍사스 레드(Texas Red) 토끼 항-염소 항체(Jackson Labs, Cat# 305-075-003) 그리고 FITC 토끼 항-Rat 항체(Jackson Labs, Cat# 312-095-003) 중에 제조하였다. 만일 동결된 항체를 사용할 경우에는 이 항체들을 1:50의 비율로 희석하여 사용하였으며, 만일 신선한 항체를 사용할 경우에는 이 항체들을 1:100의 비율로 희석하여 사용하였다. 슬라이드를 PBS 중에서 각각 5분씩 3회 세척하고, 이를 벡타실드(Vectashield; DAPI와 배지를 함께 적재한 경질의 세트; Vector Lab, CA, Cat# H-1500)에 쌓아놓았다. 이 슬라이드를 영상 분석을 수행할 때까지 4℃의 암실에 놓아두었다. 올림푸스 BX60 형광 현미경으로 영상 분석을 수행하고, 이때 올림푸스 마이크로파이어 디지털 칼라 카메라로 사진을 촬영하였다. 3∼5 열점/슬라이드, 1 슬라이드/동물, 4∼7 마리 동물/군으로부터 사진을 촬영하고, 이미지 프로 플러스 v4.5(MediaCybernetics)를 사용하여 항-인간 CD-31로 염색된 혈관 부위를 각각 3회씩 정량하였다. 약력학적 종말점(군 평균)을, 대조군과 비교하였을 때의 인간 CD-31 억제율 또는 인간 혈관의 총 표면적으로 나타내었다. ANOVA로 통계학적 유의성을 측정하였다. 도 10에는 인간 포피 SCID 키메라 마우스의 M24met 종양에 있어서 인간 혈관(적색) 및 마우스 혈관(녹색)의 면역 형광 이미지를 나타내고 있다.
실시예 19: 인간 CD-31의 면역 조직 화학(IHC)적 염색
동결된 조직 절편을 공기 건조시키고, 이를 -20℃의 아세톤 중에서 10분 동안 고정시켰다. 이 시료를 다시 공기 건조시키고, PBS 중에서 2회(각각 5분씩) 세척하였다. 이 시료를 0.075% H2O2/메탄올(Fisher, Cat.# A433-4) 중에서 15분 동안 항온 처리하고, PBS 중에서 3회(각각 5분씩) 세척하였다. 이 시료를 5% 토끼 혈청/PBS 중에서 30분 동안 블로킹하고, 실온의 5% 토끼 혈청 중에서 1시간 동안 항-인간 CD-31 항체(Santa Cruz, Cat# SC1505)로 1:100 희석시켰다. 이 시료를 PBS중에서 2회(각각 5분씩) 세척하고, 여기에 5% 토끼 혈청 중 토끼 항-염소(1:200)(Vector Laboratories, Cat# BA-5000)를 실온에서 35분 동안 가하였다. 이후, 슬라이드를 PBS 중에서 각각 5분씩 2회 세척하고, 여기에 새로이 제조한 스트렙타비딘(Vector Labs, ABC Elite kit, Cat# PK-6100)을 첨가하였다. 이후, 이 슬라이드를 PBS 중에서 다시 2회(각각 5분씩) 세척하고, 디아미노벤지딘(DAB)(Vector Labs, Cat#SK-4100) 중에서 전개시켰다. 이후, 슬라이드를 PBS 중에서 2회 세척하고(각각 5분씩), 마이어스(Mayers) 헤마톡실린(Sigma, Cat# HHS-32)으로 5초 동안 세척하였다. 이 시료를 diH20로 잘 헹군 다음, 희석된(1ℓ diH20 중 5㎖ 스톡) 수산화암모늄 용액(Sigma, Cat# A-6899) 중에 간단히 2회 찍고, 다시 diH20 중에서 헹구었다. 이후 상기 시료를 70%, 90% 및 100%의 알콜(Harleco, Cat# 65347/85)(각각 1분씩) → 자일렌(JT Baker, Cat# 516,09)으로 차례로 탈수시켰다. 슬라이드에 사이토실(Cytoseal) 60(Stephens Scientific, Cat #8310-4)을 얹어 놓은 후 커버 글라스로 덮어서 이미지 분석을 실시하였다. 도 11에는 인간 포피-SCID 키메라 마우스 내 M24met 종양의 인간 혈관(갈색)의 IHC 이미지를 나타낸 것이다.
실시예 20: 항-ALK-1 항체 1.12.1(M29I/D19A)를 사용하는 치료적 처치
처리를 위하여, 피하(sc) 또는 정맥 내(iv) 투여를 수행하였다. 통상적으로, 각각의 연구 당 1.12.1(M29I/D19A) 항체를 1회씩 투여하였다. 필요하다면, 제9일 및 제10일 경과시에 ALK-1 항체를 2차적으로 투여하였다. 가끔은 1, 5, 10, 50㎎/㎏씩 다수 회 투여하여, 인간 혈관 성장이 투여량에 의존적인 방식으로 억제되는지 여부를 관찰하였다. 매일 동물을 모니터하고, 캘리퍼를 사용하여 종양 크기를 1주일에 3회씩 측정하였다. 14∼17일 경과시 종양 크기가 250∼350㎣일 때, 마우스로부터 종양을 분리해내어, 이를 OCT에 매립하여, IF 또는 IHC 분석용으로 동결시켰다. 도 12는 인간 포피 SCID 키메라 마우스 내 대조군 및 1.12.1(M29I/D19A) 처리(10㎎/㎏) M24met 종양의 인간 혈관(적색) 및 마우스 혈관(녹색)의 면역 형광 이미지를 나타내는 것이다. 인간 포피 SCID 키메라 마우스 모델 내 1.12.1(M29I/D19A)에 의한 인간 종양 혈관의 투여량-의존적 억제 결과를 도 13에 나타내었으며, 이와 관련된 연구 결과를 표 13에 요약하였다.
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Figure pat00032
[▲ 표 13: SCID 키메라 모델에 있어서, M24met 종양에서의 인간 혈관 성장 억제 결과 및 생체 내 모델의 특성 규명 결과에 관한 요약]
실시예 21: 생체 내 EC 50 측정
인간 포피 SCID 키메라 마우스에 M24met 세포를 피내 이식하고, 여기에 항-ALK-1 항체 1.12.1(M29I/D19A)를 1, 3, 5, 7.5, 10 및 50 ㎎/㎏씩 피하 처리하거나, 또는 동 기준 표본형 매칭 항-인간 KLH 항체(10㎎/㎏)를 처리하였다. 실험 결과에 따라서, 각 종양에 있어서 인간 혈관의 표면적을 전술한 바와 같이 정량하였다. 항-ALK-1 항체 1.12.1(M29I/D19A)의 마우스 혈장 농도는 다음과 같은 방법으로 측정하였다: 마우스로부터 얻은 혈청 시료를 ELISA(효소 결합 면역 흡착 검정법)에 의해서 항-ALK-1 항체 1.12.1(M29I/D19A) 농도에 대해 분석하였다. ELISA 평판을 PBS 중 10 ug/㎖ 염소 항-인간 IgG Fc 특이 항체(Pierce, cat# 31123)로 코팅하고, 이를 4℃에서 밤새도록 항온 처리한 다음, 다시 실온에서 1시간 동안 스타트블록(StartBlock) 블로킹 완충액(Pierce, cat# 37542)으로 블로킹하였다. 혈청 시료를 희석한 다음, 이 스타트블록 블로킹 완충액(100배 및 1000배) 중에서 분석을 실시하였다. 표준 물질 2세트를 100배 및 1000배 희석된 블랭크 혈청 중에서 제조하였다. 표준 물질 및 희석된 시료를 1시간 동안 평판 상에서 항온 처리하였다. 호오스 래디쉬 퍼옥시다제(HRP)-표지화 염소 항-인간 IgG(Fab-특이) 항체(Sigma, cat# A0293)를 사용하여 결합된 항-ALK-1 항체 1.12.1(M29I/D19A)을 검출하였다. 기질로서는 3,3',5,5'-테트라메틸 벤지딘(Sigma, cat# T8665)을 사용하였다. Vmax 평판 판독기(Molecular Devices, Menlo Park, CA)에서 450㎚에서의 흡광도를 측정하였다. 비선형 회귀법을 적용하여 표준 곡선을 보정하였다. 본 검정법의 측정 한도는 항-ALK-1 항체 1.12.1(M29I/D19A) 10 ng/㎖였다.
항-ALK-1 항체 1.12.1(M29I/D19A)의 SCID 마우스 혈장 농도를 도 15에 나타내었다.
도 15는 M24met 포피 SCID-키메라 모델에 있어서 1.12.1(M29I/D19A)에 대하여 측정된 EC50을 나타내는 것이다. 전체 연구 기간(14일)에 걸친 평균 혈장 PK에 대하여 인간 혈관 표면적을 그래프로 나타내었다. 그래프패드(Graphpad; Prizm)의 S자형의 투여량 의존 프로그램에 따라서 보정된 곡선을 작성하였다. 보정 곡선으로부터 93 ng/㎖의 EC50을 도출해냈다[여기서, EC50은 대조군에 있어서 인간 혈관 표면적이 50% 감소할 때에 필요한 혈장 농도로서 정의됨].
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ATCC PTA-6808 20050621 ATCC PTA-6864 20050714 ATCC PTA-6865 20050714
SEQUENCE LISTING <110> Pfizer Inc Amgen Fremont Inc. <120> HUMAN MONOCLONAL ANTIBODIES TO ACTIVIN RECEPTOR-LIKE KINASE-1 <130> ABX-PF9 PROV <140> 60/715,292 <141> 2005-09-07 <160> 136 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 1332 <212> DNA <213> Human <400> 1 caggtgcagc tgcaggagtc gggtccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc 60 acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agtggtgaat actactggaa ctggatccgc 120 cagcacccag ggaagggcct ggagtggatt gggtacatct attacagtgg gagtacctac 180 tacaacccgt ccctcaagag tcgagttacc atatcagtag acacgtctaa gaaccagttc 240 tccctgaagc tgagctctgt gactgccgcg gacacggccg tgtattactg tgcgagagag 300 tcagtggctg ggtttgacta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctcagcctcc 360 accaagggcc catcggtctt ccccctggcg ccctgctcca ggagcacctc cgagagcaca 420 gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 480 tcaggcgctc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 540 tactccctca gcagcgtagt gaccgtgccc tccagcaact tcggcaccca gacctacacc 600 tgcaacgtag atcacaagcc cagcaacacc 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ctcccaggct cctcatctat ggtacatcca gcagggccac tggcatccca 180 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcaccc tcaccatcag cagactggag 240 cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcgccgat caccttcggc 300 caagggacac gactggagat taaac 325 <210> 127 <211> 108 <212> PRT <213> Human <400> 127 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Asp Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Thr Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95 Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 128 <211> 1332 <212> DNA <213> Human <400> 128 caggtgcagc tgcaggagtc gggtccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc 60 acctgcactg tctctggtgg ctccatgagc agtggtgaat actactggaa ctggatccgc 120 cagcacccag ggaagggcct ggagtggatt gggtacatct attacagtgg gagtacctac 180 tacaacccgt ccctcaagag tcgagttacc atatcagtag acacgtctaa gaaccagttc 240 tccctgaagc tgagctctgt gactgccgcg gacacggccg tgtattactg tgcgagagag 300 tcagtggctg ggtttgacta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctcagcctcc 360 accaagggcc catcggtctt ccccctggcg ccctgctcca ggagcacctc cgagagcaca 420 gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 480 tcaggcgctc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccagctg tcctacagtc ctcaggactc 540 tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcaact tcggcaccca gacctacacc 600 tgcaacgtag atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agacagttga gcgcaaatgt 660 tgtgtcgagt gcccaccgtg cccagcacca cctgtggcag gaccgtcagt cttcctcttc 720 cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac gtgcgtggtg 780 gtggacgtga gccacgaaga ccccgaggtc cagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag 840 gtgcataatg ccaagacaaa gccacgggag gagcagttca acagcacgtt ccgtgtggtc 900 agcgtcctca ccgttgtgca ccaggactgg ctgaacggca aggagtacaa gtgcaaggtc 960 tccaacaaag gcctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaaaccaa agggcagccc 1020 cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggagg agatgaccaa gaaccaggtc 1080 agcctgacct gcctggtcaa aggcttctac cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 1140 aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acacctccca tgctggactc cgacggctcc 1200 ttcttcctct acagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc 1260 tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg 1320 tctccgggta aa 1332 <210> 129 <211> 355 <212> DNA <213> Human <400> 129 caggtgcagc tgcaggagtc gggtccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc 60 acctgcactg tctctggtgg ctccatgagc agtggtgaat actactggaa ctggatccgc 120 cagcacccag ggaagggcct ggagtggatt gggtacatct attacagtgg gagtacctac 180 tacaacccgt ccctcaagag tcgagttacc atatcagtag acacgtctaa gaaccagttc 240 tccctgaagc tgagctctgt gactgccgcg gacacggccg tgtattactg tgcgagagag 300 tcagtggctg ggtttgacta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctcag 355 <210> 130 <211> 503 <212> PRT <213> Human <400> 130 Met Thr Leu Gly Ser Pro Arg Lys Gly Leu Leu Met Leu Leu Met Ala 1 5 10 15 Leu Val Thr Gln Gly Asp Pro Val Lys Pro Ser Arg Gly Pro Leu Val 20 25 30 Thr Cys Thr Cys Glu Ser Pro His Cys Lys Gly Pro Thr Cys Arg Gly 35 40 45 Ala Trp Cys Thr Val Val Leu Val Arg Glu Glu Gly Arg His Pro Gln 50 55 60 Glu His Arg Gly Cys Gly Asn Leu His Arg Glu Leu Cys Arg Gly Arg 65 70 75 80 Pro Thr Glu Phe Val Asn His Tyr Cys Cys Asp Ser His Leu Cys Asn 85 90 95 His Asn Val Ser Leu Val Leu Glu Ala Thr Gln Pro Pro Ser Glu Gln 100 105 110 Pro Gly Thr Asp Gly Gln Leu Ala Leu Ile Leu Gly Pro Val Leu Ala 115 120 125 Leu Leu Ala Leu Val Ala Leu Gly Val Leu Gly Leu Trp His Val Arg 130 135 140 Arg Arg Gln Glu Lys Gln Arg Gly Leu His Ser Glu Leu Gly Glu Ser 145 150 155 160 Ser Leu Ile Leu Lys Ala Ser Glu Gln Gly Asp Thr Met Leu Gly Asp 165 170 175 Leu Leu Asp Ser Asp Cys Thr Thr Gly Ser Gly Ser Gly Leu Pro Phe 180 185 190 Leu Val Gln Arg Thr Val Ala Arg Gln Val Ala Leu Val Glu Cys Val 195 200 205 Gly Lys Gly Arg Tyr Gly Glu Val Trp Arg Gly Leu Trp His Gly Glu 210 215 220 Ser Val Ala Val Lys Ile Phe Ser Ser Arg Asp Glu Gln Ser Trp Phe 225 230 235 240 Arg Glu Thr Glu Ile Tyr Asn Thr Val Leu Leu Arg His Asp Asn Ile 245 250 255 Leu Gly Phe Ile Ala Ser Asp Met Thr Ser Arg Asn Ser Ser Thr Gln 260 265 270 Leu Trp Leu Ile Thr His Tyr His Glu His Gly Ser Leu Tyr Asp Phe 275 280 285 Leu Gln Arg Gln Thr Leu Glu Pro His Leu Ala Leu Arg Leu Ala Val 290 295 300 Ser Ala Ala Cys Gly Leu Ala His Leu His Val Glu Ile Phe Gly Thr 305 310 315 320 Gln Gly Lys Pro Ala Ile Ala His Arg Asp Phe Lys Ser Arg Asn Val 325 330 335 Leu Val Lys Ser Asn Leu Gln Cys Cys Ile Ala Asp Leu Gly Leu Ala 340 345 350 Val Met His Ser Gln Gly Ser Asp Tyr Leu Asp Ile Gly Asn Asn Pro 355 360 365 Arg Val Gly Thr Lys Arg Tyr Met Ala Pro Glu Val Leu Asp Glu Gln 370 375 380 Ile Arg Thr Asp Cys Phe Glu Ser Tyr Lys Trp Thr Asp Ile Trp Ala 385 390 395 400 Phe Gly Leu Val Leu Trp Glu Ile Ala Arg Arg Thr Ile Val Asn Gly 405 410 415 Ile Val Glu Asp Tyr Arg Pro Pro Phe Tyr Asp Val Val Pro Asn Asp 420 425 430 Pro Ser Phe Glu Asp Met Lys Lys Val Val Cys Val Asp Gln Gln Thr 435 440 445 Pro Thr Ile Pro Asn Arg Leu Ala Ala Asp Pro Val Leu Ser Gly Leu 450 455 460 Ala Gln Met Met Arg Glu Cys Trp Tyr Pro Asn Pro Ser Ala Arg Leu 465 470 475 480 Thr Ala Leu Arg Ile Lys Lys Thr Leu Gln Lys Ile Ser Asn Ser Pro 485 490 495 Glu Lys Pro Lys Val Ile Gln 500 <210> 131 <211> 120 <212> PRT <213> Human <400> 131 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly 20 25 30 Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Gly Ile Ala Val Ala Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 132 <211> 108 <212> PRT <213> Human <400> 132 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95 Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 133 <211> 96 <212> PRT <213> Human <400> 133 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95 <210> 134 <211> 99 <212> PRT <213> Human <400> 134 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly 20 25 30 Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg <210> 135 <211> 108 <212> PRT <213> Human <400> 135 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Phe Gly Ser Ser Pro 85 90 95 Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 136 <211> 5 <212> PRT <213> Human <400> 136 Gly Tyr Tyr Trp Ser 1 5

Claims (25)

  1. 각각 서열 번호 10 및 12;
    각각 서열 번호 22 및 24;
    각각 서열 번호 34 및 36;
    각각 서열 번호 42 및 44;
    각각 서열 번호 74 및 76;
    각각 서열 번호 78 및 80;
    각각 서열 번호 82 및 84;
    각각 서열 번호 86 및 88; 또는
    각각 서열 번호 90 및 92
    의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는, ALK-1에 결합하는 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합부.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인이 하기 서열:
    각각 서열 번호 10 및 12;
    각각 서열 번호 22 및 24;
    각각 서열 번호 34 및 36;
    각각 서열 번호 42 및 44;
    각각 서열 번호 74 및 76;
    각각 서열 번호 78 및 80;
    각각 서열 번호 82 및 84;
    각각 서열 번호 86 및 88; 또는
    각각 서열 번호 90 및 92
    를 포함하는 것인 항체 또는 이의 항원 결합부.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 모노클로날 항체가 IgG1 또는 IgG2 분자인 모노클로날 항체.
  4. 제1항에 있어서, 서열 번호 10, 22, 34, 42, 74, 78, 82, 86 및 90 중 어느 하나와 아미노산 서열이 90% 이상 동일한 VH 도메인을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합부.
  5. 제1항에 있어서, 서열 번호 12, 24, 36, 44, 76, 80, 84, 88 및 92 중 어느 하나와 아미노산 서열이 90% 이상 동일한 VL 도메인을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합부.
  6. 제1항에 있어서,
    a) 서열 번호 10에 제시된 VH 도메인, 또는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환에 의해 서열 번호 10과는 다른 VH 도메인으로서, 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열이 비치환 서열과 아미노산 서열이 90% 이상 동일한 것인 VH 도메인과, 서열 번호 12에 제시된 VL 도메인, 또는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환에 의해 서열 번호 12와는 다른 VL 도메인으로서, 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열이 비치환 서열과 아미노산 서열이 90% 이상 동일한 것인 VL 도메인을 포함하는 항체 또는 이의 일부;
    b) 서열 번호 22에 제시된 VH 도메인, 또는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환에 의해 서열 번호 22와는 다른 VH 도메인으로서, 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열이 비치환 서열과 아미노산 서열이 90% 이상 동일한 것인 VH 도메인과, 서열 번호 24에 제시된 VL 도메인, 또는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환에 의해 서열 번호 24와는 다른 VL 도메인으로서, 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열이 비치환 서열과 아미노산 서열이 90% 이상 동일한 것인 VL 도메인을 포함하는 항체 또는 이의 일부;
    c) 서열 번호 34에 제시된 VH 도메인, 또는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환에 의해 서열 번호 34와는 다른 VH 도메인으로서, 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열이 비치환 서열과 아미노산 서열이 90% 이상 동일한 것인 VH 도메인과, 서열 번호 36에 제시된 VL 도메인, 또는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환에 의해 서열 번호 36과는 다른 VL 도메인으로서, 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열이 비치환 서열과 아미노산 서열이 90% 이상 동일한 것인 VL 도메인을 포함하는 항체 또는 이의 일부;
    d) 서열 번호 42에 제시된 VH 도메인, 또는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환에 의해 서열 번호 42와는 다른 VH 도메인으로서, 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열이 비치환 서열과 아미노산 서열이 90% 이상 동일한 것인 VH 도메인과, 서열 번호 44에 제시된 VL 도메인, 또는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환에 의해 서열 번호 44와는 다른 VL 도메인으로서, 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열이 비치환 서열과 아미노산 서열이 90% 이상 동일한 것인 VL 도메인을 포함하는 항체 또는 이의 일부;
    e) 서열 번호 74에 제시된 VH 도메인, 또는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환에 의해 서열 번호 74와는 다른 VH 도메인으로서, 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열이 비치환 서열과 아미노산 서열이 90% 이상 동일한 것인 VH 도메인과, 서열 번호 76에 제시된 VL 도메인, 또는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환에 의해 서열 번호 76과는 다른 VL 도메인으로서, 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열이 비치환 서열과 아미노산 서열이 90% 이상 동일한 것인 VL 도메인을 포함하는 항체 또는 이의 일부;
    f) 서열 번호 78에 제시된 VH 도메인, 또는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환에 의해 서열 번호 78과는 다른 VH 도메인으로서, 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열이 비치환 서열과 아미노산 서열이 90% 이상 동일한 것인 VH 도메인과, 서열 번호 80에 제시된 VL 도메인, 또는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환에 의해 서열 번호 80과는 다른 VL 도메인으로서, 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열이 비치환 서열과 아미노산 서열이 90% 이상 동일한 것인 VL 도메인을 포함하는 항체 또는 이의 일부;
    g) 서열 번호 82에 제시된 VH 도메인, 또는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환에 의해 서열 번호 82와는 다른 VH 도메인으로서, 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열이 비치환 서열과 아미노산 서열이 90% 이상 동일한 것인 VH 도메인과, 서열 번호 84에 제시된 VL 도메인, 또는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환에 의해 서열 번호 84와는 다른 VL 도메인으로서, 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열이 비치환 서열과 아미노산 서열이 90% 이상 동일한 것인 VL 도메인을 포함하는 항체 또는 이의 일부;
    h) 서열 번호 86에 제시된 VH 도메인, 또는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환에 의해 서열 번호 86과는 다른 VH 도메인으로서, 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열이 비치환 서열과 아미노산 서열이 90% 이상 동일한 것인 VH 도메인과, 서열 번호 88에 제시된 VL 도메인, 또는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환에 의해 서열 번호 88과는 다른 VL 도메인으로서, 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열이 비치환 서열과 아미노산 서열이 90% 이상 동일한 것인 VL 도메인을 포함하는 항체 또는 이의 일부; 및
    i) 서열 번호 90에 제시된 VH 도메인, 또는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환에 의해 서열 번호 90과는 다른 VH 도메인으로서, 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열이 비치환 서열과 아미노산 서열이 90% 이상 동일한 것인 VH 도메인과, 서열 번호 92에 제시된 VL 도메인, 또는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환에 의해 서열 번호 92와는 다른 VL 도메인으로서, 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열이 비치환 서열과 아미노산 서열이 90% 이상 동일한 것인 VL 도메인을 포함하는 항체 또는 이의 일부
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체 또는 이의 항원 결합부.
  7. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합부가 인간 VH 4-31, VH 3-11, VH 3-15 또는 VH 3-33 유전자, 또는 인간 VH 4-31, VH 3-11, VH 3-15 또는 VH 3-33 유전자에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환이 발생한 유전자로서, 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열이 비치환 서열과 아미노산 서열이 90% 이상 동일한 것인 유전자를 이용하는 중쇄를 포함하는 것인 항체 또는 이의 항원 결합부.
  8. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합부가 인간 Vκ A1, Vκ A2, Vκ A3, Vκ B3, Vκ B2 또는 Vκ L1 유전자, 또는 인간 Vκ A1, Vκ A2, Vκ A3, Vκ B3, Vκ B2 또는 Vκ L1 유전자에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환이 발생한 유전자로서, 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열이 비치환 서열과 아미노산 서열이 90% 이상 동일한 것인 유전자를 이용하는 경쇄를 포함하는 것인 항체 또는 이의 항원 결합부.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, IgG, IgM, IgE, IgA, 또는 IgD 분자이거나 이로부터 유래하는 항체.
  10. 제1항, 제2항 및 제4항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합부가 유도체화되거나 다른 분자에 연결되는 것인 항체 또는 이의 항원 결합부.
  11. 제10항에 있어서, 상기 분자가 펩티드, 단백질, 세포 독성 제제, 또는 약학 제제인 항체 또는 이의 항원 결합부.
  12. 제1항, 제2항 및 제4항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 모노클로날 항체의 중쇄 또는 이의 항원 결합부, 또는 경쇄 또는 이의 항원 결합부, 또는 둘 다를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자.
  13. 제12항에 있어서, 서열 번호 9, 11, 21, 23, 33, 35, 41, 43, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89 또는 91의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자.
  14. 제9항에 따른 모노클로날 항체의 중쇄 또는 이의 항원 결합부, 또는 경쇄 또는 이의 항원 결합부, 또는 둘 다를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자.
  15. 제12항의 핵산 분자를 포함하는 벡터로서, 상기 핵산 분자에 작동 가능하게 연결된 발현 조절 서열을 포함하는 벡터.
  16. 제14항의 핵산 분자를 포함하는 벡터로서, 상기 핵산 분자에 작동 가능하게 연결된 발현 조절 서열을 포함하는 벡터.
  17. (a) 제1항, 제2항 및 제4항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합부의 중쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 경쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열; 또는
    (b) 제1항, 제2항 및 제4항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합부의 중쇄와 경쇄를 둘 다 암호화하는 뉴클레오티드 서열
    을 포함하는 숙주 세포.
  18. 제15항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  19. 제16항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  20. 신생 혈관 형성의 억제를 필요로 하는 포유동물에서 신생 혈관 형성을 억제하기 위한, 제1항, 제2항 및 제4항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합부를 포함하는 약학 조성물.
  21. 신생 혈관 형성의 억제를 필요로 하는 포유동물에서 신생 혈관 형성을 억제하기 위한, 제9항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합부를 포함하는 약학 조성물.
  22. 암, 노인성 황반 변성증, 당뇨병성 실명, 자궁내막증, 안구 신생 혈관 형성증, 또는 류머티즘성 관절염의 치료를 필요로 하는 포유동물에서 암, 노인성 황반 변성증, 당뇨병성 실명, 자궁내막증, 안구 신생 혈관 형성증, 또는 류머티즘성 관절염을 치료하기 위한, 제1항, 제2항 및 제4항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합부를 포함하는 약학 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 상기 암이 흑색종, 중피종, 신세포 암종, 유방암, 두경부암, 뇌종양, 자궁경부암, 전립선암, 췌장암, 고환암, 간담도암, 간관암, 담관암, 대장암, 방광암, 난소암, 폐암, 비소세포폐암, 소세포폐암, 결장암, 직장암, 또는 항문부암인 약학 조성물.
  24. 암, 노인성 황반 변성증, 당뇨병성 실명, 자궁내막증, 안구 신생 혈관 형성증, 또는 류머티즘성 관절염의 치료를 필요로 하는 포유동물에서 암, 노인성 황반 변성증, 당뇨병성 실명, 자궁내막증, 안구 신생 혈관 형성증, 또는 류머티즘성 관절염을 치료하기 위한, 제9항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합부를 포함하는 약학 조성물.
  25. 제24항에 있어서, 상기 암이 흑색종, 중피종, 신세포 암종, 유방암, 두경부암, 뇌종양, 자궁경부암, 전립선암, 췌장암, 고환암, 간담도암, 간관암, 담관암, 대장암, 방광암, 난소암, 폐암, 비소세포폐암, 소세포폐암, 결장암, 직장암, 또는 항문부암인 약학 조성물.
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