PT1572946E

PT1572946E - Anticorpo monoclonal terapêutico anti-il-1r1 humano

Info

Publication number: PT1572946E
Application number: PT03752058T
Authority: PT
Inventors: Varnum Brian; Chris Vezina; Alison Witte; Xueming Qian; Frank Martin; Haichun Huang; Gary Elliott
Original assignee: Amgen Inc; Medarex Inc
Priority date: 2002-09-06
Filing date: 2003-09-05
Publication date: 2012-06-21
Also published as: JP2013063973A; IL198420A0; IL167073A; EP1572946B1; IL214262A0; NO337245B1; RS52889B; CN100471871C; IL198420A; ATE549033T1; ES2449578T3; CA2824167A1; KR20050057258A; BRPI0314038B1; BRPI0314038B8; US7438910B2; CA2824167C; NZ581996A; EA200500441A1; NO339345B1

Description

DESCRIÇÃO "ANTICORPO MONOCLONAL TERAPÊUTICO ANTI-IL-lRl HUMANO"

Este pedido está relacionado e reivindica a prioridade do pedido provisório U.S. N° de série 60/408719, apresentado em 6 de Setembro de 2002

CAMPO DA INVENÇÃO A invenção refere-se a anticorpos que se ligam à proteina de tipo 1 do receptor de interleucina-1 (IL-1R1). São também proporcionadas composições, particularmente composições farmacêuticas e métodos para tratar doenças mediadas por IL-1, tais como artrite reumatóide, osteodistrofia e outros estados inflamatórios.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Desenvolvimento de Anticorpos A inflamação é a resposta do corpo a lesões que resultam de lesão mecânica, infecção ou estimulação antigénica. As reacções inflamatórias são frequentemente expressas patologicamente. Tais estados surgem quando a inflamação é expressa de um modo exagerado, é impropriamente estimulada ou persiste após o agente lesante ser removido. 1 inter alia A resposta inflamatória é mediada, inter alia, por citocinas. Uma das citocinas inflamatórias mais potentes já identificada é a interleucina-1 (IL-1) . Um aumento na sinalização de IL-1 provoca inflamação persistente associada a diversas doenças, e pensa-se que a IL-1 seja um mediador chave em muitas doenças e estados patológicos. Esta citocina é sintetizada principalmente (apesar de não exclusivamente) por células da linhagem de macrófagos/monócitos e pode ser produzida em duas formas: IL-1 alfa (IL-lcx) e IL-1 beta (IL-Ιβ). A IL-1 estimula respostas celulares por interacção com um complexo receptor heterodimérico compreendido por duas proteínas transmembranares, a proteína de tipo 1 do receptor de IL-1 (IL-1R1) e a proteína acessória do receptor de IL-1 (IL-lRAcP). A IL-1 liga-se primeiro a IL-1R1; a IL-lRAcP é depois recrutada para este complexo (Greenfeder et ai., 1995, J. Biol. Chem. 270:13757-13765; Yoon e Dinarello, 1998, J. Immunology 160:3170-3179; Cullinan et ai., 1998, J. Immunology 161:5614-5620), seguida por transdução do sinal resultando na indução de uma resposta celular.

Estudos de ligação com base em células sugerem que a IL-lRAcP estabiliza o complexo de sinalização de IL-1R por retardamento da taxa de dissociação do ligando (Wesche et ai., 1998, FEBS Letters 429:303-306). Enquanto a interacção da IL-1 com IL-1R foi exaustivamente caracterizada, a interacção de IL-lRAcP com receptor ligado a ligando permanece pouco definida. Uma vez que a IL-lRAcP não tem qualquer afinidade significativa para IL-1 ou IL-1R1 isoladamente, mas afinidade elevada para o complexo, depreende-se que novos locais de ligação para IL-lRAcP são criados pelo evento de ligação IL-1/IL-1R que pode mesmo incluir contribuições de resíduos de IL-1 (Ettorre et ai., 1997, Eur. Cytokine Netw. 8:161-171). Outra molécula, o antagonista do 2 receptor de IL-1 (IL-lra) compete com IL-Ια e IL-Ιβ para ligação ao receptor, mas não recruta IL-lRAcP, resultando num receptor ocupado mas não de sinalização. A actividade da IL-1 pode ser adicionalmente contrabalançada por IL-1R de tipo II, um receptor chamariz que se liga ao ligando, mas não participa na sinalização devido a um domínio intracelular truncado. A IL-lra e a IL-1R de tipo II actuam para reduzir a gravidade e a duração dos eventos inflamatórios mediados por IL-1 (Wesche et al., 1998, FEBS Letters 429:303-306; Dripps et al., 1991, J. Biol. Chem. 266:10331-10336; Dripps et ai., 1991, J. Biol. Chem. 266:20331-20335) .

Os inibidores de interleucina-1 podem ser produzidos a partir de qualquer proteína capaz de prevenir especificamente a activação de receptores celulares para IL-1, os quais podem resultar de uma variedade de mecanismos. Tais mecanismos incluem a regulação negativa da produção de IL-1, a ligação de IL-1 livre, interferir com a ligação de IL-1 a IL-1R, interferir com a formação do complexo IL-lR-IL-lRAcP ou interferir com a modulação da sinalização de IL-1 após ligação ao seu receptor. As classes de inibidores de IL-1 incluem: • antagonistas do receptor de interleucina-1, tal como IL-lra, como descrito abaixo; • anticorpos monoclonais anti-IL-lR (e. g., como divulgados na publicação do Pedido de Patente Europeia N° EP 623674, cuja divulgação é aqui incorporada por referência); • Proteínas de ligação a IL-1, tal como receptores de IL-1 solúveis (e. g., como divulgados nas Pat. U.S. N° 5492888; 5488032; 5464937; 5319071; e 5180812 • anticorpos monoclonais anti-IL-1 (e. g., como divulgados nas Publicações do Pedido de Patente Internacional 3 N° WO 9501997, WO 9402627, WO 9006371, Pat. U.S. N° 4935343, documentos EP 364778, EP 267611 e EP 220063, • Proteínas acessórias do receptor de IL-1 e anticorpos para as mesmas (e. g., como divulgados nas Publicações do Pedido de Patente Internacional N° WO 96/23067 e WO 99/37773; e • inibidores da enzima conversora de interleucina-1β (ICE) ou da caspase I (e. g., como divulgados nas Publicações do Pedido de Patente Internacional N° WO 99/46248, WO 99/47545 e WO 99/47154, os quais podem ser utilizados para inibir a produção e a secreção de IL-Ιβ; • inibidores da protease de interleucina-1β; e • outros compostos e proteínas que bloqueiam a síntese in vivo ou a libertação extracelular de IL-1.

Inibidores de IL-1 exemplificativos são divulgados nas seguintes referências: Pat. U.S. N° 5747444; 5359032; 5608035; 5843905; 5359032; 5866576; 5869660; 5869315; 5872095; 5955480; e 5965564; Publicações do Pedido de Patente Internacional N° W098/21957, WO96/09323, W091/17184, WO96/40907, W098/32733, W098/42325, WO98/44940, W098/47892, W098/56377, WO99/03837, WO99/06426, WO99/06042, W091/17249, W098/32733, W098/17661, WO97/08174, W095/34326, W099/36426 e W099/36415; Publicações do

Pedido de Patente Europeia N° EP534978 e EP89479; e Pedido de Patente Francesa N° FR 2762514. "Sims J. E. et al. divulga anticorpos conhecidos contra receptores de interleucina 1 (IL-1) de Tipo I e Tipo II e concluem que o receptor de Tipo I (IL-1R1) é responsável pela mediação da transdução de sinal após ligação a IL-1" O antagonista do receptor de interleucina-1 (IL-lra) é uma proteína humana que actua como um inibidor natural da interleucina-1 e é um membro da família IL-1 que inclui IL-lcx e IL-1β. Os antagonistas do receptor (incluindo IL-lra e as suas 4 variantes e derivados) preferidos, assim como métodos para a sua produção e utilização, são descritos na patente U.S. N° 5075222; Publicações do Pedido de Patente Internacional N° WO 91/08285; WO 91/17184; W092/16221; W093/21946; WO 94/06457; WO 94/21275; WO 94/21235 ; documentos DE 4219626, WO 94/20517; WO 96/22793; WO 97/28828; e WO 99/36541, Pedido de Patente Australiana N° AU 9173636; e Pedido de Patente Francesa N° FR2 706 7 72; As proteínas incluem antagonistas do receptor de IL-1 não glicosiladas, assim como formas glicosiladas.

Especificamente, três formas úteis de IL-lra e as suas variantes são divulgadas e descritas na patente U.S. N° 5075222 ("Patente '222"). A IL-lraa é caracterizada por SDS-PAGE como uma molécula de 22-23 kD que tem um ponto isoeléctrico aproximado de 4,8, que elui de uma coluna mono Q de FPLC por volta de 52 mM de NaCl em tampão Tris, pH 7,6. A IL-lra3 é caracterizada como uma proteina de 22-23 kD, que elui de uma coluna mono Q a 48 mM de NaCl. A IL-lraa e a IL-lra3 são glicosiladas. A IL-lrax é caracterizada como uma proteína de 20 kD, que elui de uma coluna mono Q a 48 mM de NaCl e não é glicosilada. A Patente '222 também divulga métodos para isolar os genes responsáveis pela codificação dos inibidores, clonagem do gene em vectores e tipos de células adequados, e a expressão do gene para produzir os inibidores. Embora eficaz, a IL-lra tem uma semi-vida relativamente curta. Na utilização actual, a IL-lra é administrada uma vez por dia. A técnica beneficiaria assim de um antagonista do receptor de IL-1 com uma semi-vida apreciavelmente mais longa. A prevenção da sinalização de IL-1 por inibição da ligação de IL-1 ao receptor de IL-1 é uma abordagem terapêutica atractiva para o tratamento de doenças mediadas por IL-1. Existe uma necessidade na técnica para inibidores clinicamente eficazes 5 da via de sinalização de IL-1 que podem melhorar os efeitos das doenças mediadas por IL-1 e são adequados para distribuição em doentes humanos. Um anticorpo humano que bloqueia a sinalização de IL-1 seria particularmente vantajoso no cumprimento desta necessidade e proporcionaria uma semi-vida mais longa do que a terapia actualmente disponível.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A invenção proporciona anticorpos monoclonais que se ligam ao receptor de interleucina-1 de tipo I (IL-1R1) como definido pelas reivindicações anexas. De um modo preferido, os anticorpos inibem a sinalização de IL-1 por competição com a ligação de IL-Ιβ e IL-Ια a IL-1R1. São também proporcionadas pela invenção linhas celulares de hibridoma que produzem e, de um modo muito preferido, segregam para o meio de cultura celular os anticorpos monoclonais da invenção. Os anticorpos da invenção bloqueiam com sucesso a sinalização de IL-1 em células humanas e são, assim, úteis no tratamento de doentes com doenças mediadas por IL-1. São também proporcionadas proteínas de fusão compreendendo a sequência de uma região Fc de anticorpo e uma ou mais sequências seleccionadas do grupo consistindo de SEQ ID N° : O i—1 SEQ ID N° : 12, SEQ ID N° : 14, SEQ ID N°: 16, SEQ ID N° : 18, SEQ ID N° : 20, SEQ ID N° : 22, SEQ ID N°: 24, SEQ ID N° : 26, SEQ ID N° : 28, SEQ ID N° : 30, SEQ ID N°: 32, SEQ ID N° : 34, SEQ ID N° : 36, SEQ ID N°: 38 e SEQ ID N°: 40. Tais moléculas podem ser preparadas utilizando métodos como descritos, por exemplo, no documento WO 00/24782. Tais moléculas podem ser expressas, por exemplo, em células de mamífero (e. g. , células de ovário de hamster chinês) ou células bacterianas (e. g., células de E. coli). 6

Em determinados aspectos, são também proporcionados anticorpos, de um modo preferido, anticorpos monoclonais, de um modo muito preferido, anticorpos humanos, compreendendo uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos como apresentada em qualquer de SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 6 ou SEQ ID N°: 8 ou um seu fragmento de imunoglobulina de ligação a antigénio ou imunologicamente funcional. São também proporcionados anticorpos, de um modo preferido, anticorpos monoclonais, de um modo muito preferido, anticorpos humanos, compreendendo uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID N°: 4 ou um seu fragmento de imunoglobulina de ligação a antigénio ou imunologicamente funcional.

Em determinados aspectos, os anticorpos compreendem uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a região variável da cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos como apresentada em qualquer de SEQ ID N°: 10, SEQ ID N°: 14 ou SEQ ID N°: 16 ou um seu fragmento de imunoglobulina de ligação a antigénio ou imunologicamente funcional. Noutros aspectos, a região variável da cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos como apresentada em qualquer de SEQ ID N° : 12 ou SEQ ID N°: 18 ou um seu fragmento de imunoglobulina de ligação a antigénio ou imunologicamente funcional. Em aspectos adicionais, a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos como apresentada em qualquer de SEQ ID N°: 20, SEQ ID N°: 22, SEQ ID N°: 24, SEQ ID N°: 26, SEQ ID N°: 28, SEQ ID N°: 30, SEQ ID N°: 32, SEQ ID N°: 34 ou SEQ ID N°: 36 ou um seu fragmento de imunoglobulina de ligaçao a antigénio ou imunologicamente funcional. Ainda em aspectos adicionais, a 7 cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos como apresentada em qualquer de SEQ ID N°: 38 ou SEQ ID N° : 40 ou um seu fragmento de imunoglobulina de ligação a antigénio ou imunologicamente funcional. Tais cadeias de anticorpo são úteis na preparação de anticorpos que se ligam especificamente a IL-1R1 e também na preparação de anticorpos biespecificos em que a molécula resultante se liga a IL-1R1 e/ou a outra molécula alvo (e. g., TNF ou um receptor de TNF). São também proporcionados anticorpos que se ligam especificamente a IL-1R1, em que a cadeia pesada compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID N°: 10 ou um seu fragmento de imunoglobulina de ligação a antigénio ou imunologicamente funcional, e a cadeia leve compreende uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID N°: 12 ou um seu fragmento de imunoglobulina de ligação a antigénio ou imunologicamente funcional.

Em determinados aspectos, são também proporcionados anticorpos compreendendo uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesada compreende uma primeira região variável, e em que a primeira região variável compreende uma sequência que tem uma identidade de, pelo menos, 90%, de um modo mais preferido, pelo menos 95% e, de um modo muito preferido, de cerca de 99% com sequência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID N°: 10 e em que a cadeia leve compreende uma segunda região variável, e em que a segunda região variável compreende uma sequência que tem uma identidade de, pelo menos, 90%, de um modo mais preferido, pelo menos 95% e, de um modo muito preferido, cerca de 99% com a sequência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID N°: 12, em que o anticorpo interage com a IL-1R1. São ainda proporcionados anticorpos que se ligam especificamente a IL-1R1, em que a cadeia pesada compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID N°: 14 ou um seu fragmento de imunoglobulina de ligação a antigénio ou imunologicamente funcional, e a cadeia leve compreende uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID N° : 12 ou um seu fragmento de imunoglobulina de ligação a antigénio ou imunologicamente funcional. São também proporcionados anticorpos, compreendendo uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesada compreende uma primeira região variável, e em que a primeira região variável compreende uma sequência que tem uma identidade de, pelo menos 90%, de um modo mais preferido, pelo menos 95% e, de um modo muito preferido, cerca de 99% com a sequência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID N° : 14 e em que a cadeia leve compreende uma segunda região variável, e em que a segunda região variável compreende uma sequência que tem uma identidade de, pelo menos 90%, de um modo mais preferido, pelo menos 95% e, de um modo muito preferido, cerca de 99% com a sequência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID N°: 12, em que o anticorpo interage com a IL-1R1. A invenção também proporciona anticorpos que se ligam especificamente a IL-1R1, em que a cadeia pesada compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID N°: 16 ou um seu fragmento de imunoglobulina de ligação a antigénio ou 9 imunologicamente funcional, e a cadeia leve compreende uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID N°: 18 ou um seu fragmento de imunoglobulina de ligação a antigénio ou imunologicamente funcional.

Em determinados aspectos, a invenção proporciona anticorpos, compreendendo uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesada compreende uma primeira região variável, e em que a primeira região variável compreende uma sequência que tem uma identidade de, pelo menos 90%, de um modo mais preferido, pelo menos 95% e, de um modo muito preferido, cerca de 99% com a sequência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID N°: 16 e em que a cadeia leve compreende uma segunda região variável, e em que a segunda região variável compreende uma sequência de aminoácidos que tem uma identidade de, pelo menos, 90%, de um modo mais preferido, pelo menos 95% e, de um modo muito preferido, cerca de 99% com a sequência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID N°: 18, em que o anticorpo interaqe com a IL-1R1. São também proporcionados anticorpos que se ligam especificamente a IL-1R1, em que a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID N°: 20, SEQ ID N°: 22, SEQ ID N°: 24, SEQ ID N°: 26, SEQ ID N°: 28 ou SEQ ID N°: 30 ou um seu fragmento de imunoglobulina de ligação a antigénio ou imunologicamente funcional, e a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID N°: 38 ou um seu fragmento de imunoglobulina de ligação a antigénio ou imunologicamente funcional. A invenção proporciona ainda anticorpos que se ligam especificamente a IL-1R1, em que a cadeia pesada compreende uma 10 sequência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID N°: 32, SEQ ID N° : 34 ou SEQ ID N° : 36 ou um seu fragmento de imunoglobulina de ligação a antigénio ou imunologicamente funcional, e a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID N° : 40 ou um seu fragmento de imunoglobulina de ligação a antigénio ou imunologicamente funcional. A invenção também proporciona formas de realização de todos os anteriores que são anticorpos de cadeia simples, anticorpos Fv de cadeia simples, anticorpos Fab, anticorpos Fab' e anticorpos (Fab')2.

Em aspectos particulares, é proporcionada uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos como apresentada em qualquer de SEQ ID N°: 38 ou SEQ ID N°: 40 ou um seu fragmento de imunoglobulina de ligação a antigénio ou imunologicamente funcional.

Além disso, é proporcionada uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos como apresentada em qualquer de SEQ ID N°: 20, SEQ ID N°: 22, SEQ ID N°: 24, SEQ ID N°: 26, SEQ ID N°: 28, SEQ ID N°: 30, SEQ ID N°: 32, SEQ ID N°: 34 ou SEQ ID N° : 36 ou um seu fragmento de imunoglobulina de ligação a antigénio ou imunologicamente funcional. A invenção também se refere a anticorpos humanos isolados que se ligam especificamente a IL-1R1, em que o anticorpo compreende: (a) regiões estruturais de cadeia pesada humana, uma região CDR1 de cadeia pesada humana, uma região CDR2 de cadeia pesada humana e uma região CDR3 de cadeia pesada humana; e (b) regiões estruturais de cadeia leve humana, uma região CDR1 de cadeia leve humana, uma região CDR2 de cadeia leve humana e uma 11 região CDR3 de cadeia leve humana. Em determinados aspectos, a região CDR1 de cadeia pesada humana pode ser a região CDR1 de cadeia pesada de 15C4 como mostrada na Figura 10 e a região CDR1 de cadeia leve humana pode ser a região CDR1 de leve pesada de 15C4 como mostrada na Figura 11. Noutros aspectos, a região CDR2 de cadeia pesada humana pode ser a região CDR2 de cadeia pesada de 15C4 como mostrada na Figura 10 e a região CDR2 de cadeia leve humana pode ser a região CDR2 de cadeia leve de 15C4 como mostrada na Figura 11. Ainda noutros aspectos, a região CDR3 de cadeia pesada humana é a região CDR3 de cadeia pesada de 15C4 como mostrada na Figura 10, e a região CDR3 de cadeia leve humana é a região CDR3 de cadeia leve de 15C4 como mostrada na Figura 11.

Além disso, a invenção proporciona um anticorpo humano isolado como definido nas reivindicações, o qual se liga especificamente ao receptor de interleucina-1 de tipo 1 (IL-1R1), compreendendo: uma região CDR1 de cadeia pesada humana, em que a cadeia pesada CDR1 tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 63; uma região CDR2 de cadeia pesada humana, em que a cadeia pesada CDR2 tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 66; e/ou uma região CDR3 de cadeia pesada humana, em que a cadeia pesada CDR3 tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 69. A invenção também proporciona um anticorpo humano isolado como definido nas reivindicações, o qual se liga especificamente ao receptor de interleucina-1 de tipo 1 (IL-1R1), compreendendo: uma região CDR1 de cadeia leve humana, em que a cadeia leve CDR1 tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 71; uma região CDR2 de cadeia pesada humana, em que a cadeia pesada CDR2 tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 73; e/ou uma região CDR3 12 de cadeia pesada humana, em que a cadeia pesada CDR3 tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 75.

Em determinadas formas de realização, os anticorpos da invenção ligam-se ao terceiro domínio de IL-1R1, o qual é mostrado na Figura 17. De um modo preferido, o epitopo para um anticorpo da invenção consiste na sequência de aminoácidos YSV, a qual é aqui referida como Epitopo 4 e mostrada na Figura 24. São também proporcionadas proteínas de fusão e outras moléculas capazes de ligação ao Epitopo 4 (em conjunto com os anticorpos acima mencionados, colectivamente aqui referidos como "parceiros de ligação específica"), tal como podem ser preparadas utilizando métodos como descritos, por exemplo, no documento WO 00/24782. Tais moléculas podem ser expressas, por exemplo, em células de mamífero (e. g., células de ovário de hamster Chinês) ou em células bacterianas (e. g., células de E. coli).

Além disso, é proporcionado um método para o mapeamento de epitopos de um antigénio seleccionado. Num aspecto, o método compreende os passos de: (a) produzir um conjunto de proteínas de fusão, em que cada proteína de fusão compreende (i) avidina e (ii) um fragmento do antigénio; (b) rastrear o conjunto de proteínas de fusão para ligação a um ou mais parceiros de ligação específica para o antigénio; (c) isolar as proteínas de fusão num meio compreendendo biotina, pelo que a avidina se liga à biotina; e (d) analisar as proteínas de fusão ligadas pelo parceiro ou parceiros de ligação específica para determinar locais de ligação no antigénio para o parceiro ou parceiros de ligação específica. Num aspecto particular, os parceiros de ligação específica são anticorpos.

Em formas de realização adicionais, a invenção proporciona métodos para tratamento de uma doença, estado ou distúrbio 13 mediado por IL-1, como definido nas reivindicações, compreendendo o passo de administrar uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um ou mais anticorpos monoclonais da invenção ou um seu fragmento de imunoglobulina de ligação a antigénio ou imunologicamente funcional a um indivíduo com a sua necessidade. São também proporcionados métodos para detectar o nível de IL-1R1 numa amostra biológica, compreendendo o passo de colocar em contacto a amostra com um anticorpo monoclonal da invenção ou seu fragmento de ligação a antigénio. Os anticorpos anti-IL-lR da invenção podem ser utilizados em qualquer método de ensaio conhecido, tais como ensaios de ligação competitiva, ensaios de sanduíche directos e indirectos, ensaios de imunoprecipitação e imunoensaios de adsorção ligados à enzima (ELISA) (ver, Sola, 1987, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158, CRC Press, Inc.) para a detecção e quantificação de IL-1R. Os anticorpos podem ligar-se a IL-1R com uma afinidade que é apropriada para o método de ensaio a ser utilizado.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

As Figuras 1A-1B descrevem uma sequência de ADNc (Fig. IA) que codifica uma região constante de IgGl de cadeia pesada de anticorpo anti-IL-lRl humano (SEQ ID N°: 1) e a sequência de aminoácidos (Fig. 1B) de uma região constante de IgGl de cadeia pesada de anticorpo anti-IL-lRl humano (SEQ ID N°: 2).

As Figuras 2A-2B descrevem uma sequência de ADNc (Fig. 2A) que codifica uma região constante de cadeia kapa de anticorpo anti-IL-lRl humano (SEQ ID N°: 3) e a sequência de 14 aminoácidos (Fig. 2B) de uma região constante de cadeia kapa de anticorpo anti-IL-lRl humano (SEQ ID N°: 4).

As Figuras 3A-3B descrevem uma sequência de ADNc (Fig. 3A) que codifica uma região constante IgG2 de cadeia pesada de anticorpo anti-IL-lRl humano (SEQ ID N°: 5) e a sequência de aminoácidos (Fig. 3B) de uma região constante IgG2 de cadeia pesada de anticorpo anti-IL-IRl humano (SEQ ID N°: 6).

As Figuras 4A-4B descrevem uma sequência de ADNc (Fig. 4A) que codifica uma região constante IgG4 de cadeia pesada de anticorpo anti-IL-IRl humano (SEQ ID N°: 7) e a sequência de aminoácidos (Fig. 4B) de uma região constante IgG4 de cadeia pesada de anticorpo anti-IL-IRl humano (SEQ ID N°: 8).

As Figuras 5A-5B descrevem uma sequência de ADNc (Fig. 5A) que codifica a região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-IL-IRl 26F5 (SEQ ID N°: 9) e a sequência de aminoácidos (Fig. 5B) da região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-IL-IRl 26F5 (SEQ ID N°: 10).

As Figuras 6A-6B descrevem uma sequência de ADNc (Fig. 6A) que codifica a região variável de cadeia kapa do anticorpo anti-IL-IRl 26F5 (SEQ ID N°: 11) e a sequência de aminoácidos (Fig. 6B) da região variável de cadeia kapa do anticorpo anti-IL-IRl 26F5 (SEQ ID N°: 12).

As Figuras 7A-7B descrevem uma sequência de ADNc (Fig. 7A) que codifica a região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-IL-IRl 27F2 (SEQ ID N°: 13) e a sequência de aminoácidos (Fig. 7B) da região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-IL-IRl 27F2 (SEQ ID N° : 14). 15

As Figuras 8A-8B descrevem uma sequência de ADNc (Fig. 8A) que codifica a região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-IL-lRl 15C4 (SEQ ID N°: 15) e a sequência de aminoácidos (Fig. 8B) da região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-IL-lRl 15C4 (SEQ ID N°: 16).

As Figuras 9A-9B descrevem uma sequência de ADNc (Fig. 9A) que codifica a região variável de cadeia kapa do anticorpo anti-IL-lRl 15C4 (SEQ ID N°: 17) e a sequência de aminoácidos (Fig. 9B) da região variável de cadeia kapa do anticorpo anti-IL-lRl 15C4 (SEQ ID N°: 18). A Figura 10 mostra um alinhamento de sequências de aminoácidos de regiões variáveis de cadeia pesada (sem sequência lider) de anticorpos anti-IL-lRl designados 15C4 (SEQ ID N° : 80, 85), 27F2 (SEQ ID N° : 82, 87) e 26F5 (SEQ ID N° : 84, 89) . As regiões determinantes de complementaridade (CDR) estão sublinhadas. A CDR1 para 26F5 é designada SEQ ID N° : 61; para 27F2 é designada SEQ ID N° : 62; para 15C4 é designada SEQ ID N° : 63. A CDR2 para 26F5 é designada SEQ ID N° : 64; para 27F2 é designada SEQ ID N°: 65; para 15C4 é designada SEQ ID N°: 66. A CDR3 para 26F5 é designada SEQ ID N°: 67; para 27F2 é designada SEQ ID N°: 68; para 15C4 é designada SEQ ID N°: 69. A Figura 11 mostra um alinhamento de sequências de aminoácidos das regiões variáveis e cadeia leve (sem sequência lider) de anticorpos anti-IL-Rl-y designados 15C4 (SEQ ID N° : 81, 86), 27F2 (SEQ ID N° : 83, 88) e 26F5 (SEQ ID N°: 83, 88). A CDR1 para 26F5/27F2 é designada SEQ ID N° : 70; para 15C4 é designada SEQ ID N° : 71. A CDR2 para 26F5/27F2 é designada SEQ ID N°: 72; para 15C4 é 16 designada SEQ ID N°: 73. A CDR3 para 26F5/27F2 é designada SEQ ID N°: 74; para 15C4 é designada SEQ ID N°: 75. A Figura 12 é um gráfico que ilustra o efeito inibidor de anticorpos anti-IL-lRl na formação do complexo IL-lR/IL-ΙβΖIL-lRAcP. A Figura 13 é um gráfico que mostra o efeito inibidor de um anticorpo monoclonal anti-IL-lRl como aqui descrito e 15C4 designado na formação do complexo IL-lR/IL-la/IL-lracP. A Figura 14 é um gráfico que representa a capacidade de anticorpos anti-IL-lRl para bloquear a ligação de IL-Ιβ, embora não interferindo significativamente com a ligação de IL-lra comparativamente com controlo de IgG. A Figura 15A é um gráfico que mostra a inibição da produção de IL-6 em condrócitos humanos primários por anticorpos anti-IL-lRl, aqui identificados e designados 15C4, 26F5 e 27F2 comparativamente com IL-lra. A Figura 15B é um gráfico que mostra a inibição da produção IL-6 em condrócitos humanos primários por IL-lra e anticorpos monoclonais 15C4 e 27F2, comparativamente com a classe de anticorpos monoclonais representados por 10H7 e 24E12. A Figura 16 é um gráfico que mostra a inibição da produção de IL-6 em sangue total humano por anticorpos monoclonais anti-IL-lRl designados 15C4, 26F5 e 27F2, comparativamente com IL-lra. 17 A Figura 17 descreve sequências do 3o domínio de IL-1R1 de aminoácidos (SEQ ID N°: 76) e de nucleótidos (SEQ ID N°: 77) de humano e de nucleótidos (SEQ ID N°: 78) e de aminoácidos (SEQ ID N°: 79) de rato. As barras numeradas acima da sequência humana indicam os 15 locais diferentes mutados para construir as 15 proteínas mutadas diferentes. Os resíduos de rato introduzidos por mutação estão listados abaixo da sequência de ácidos nucleicos de rato. A Figura 18 mostra a análise de transferência de Western que demonstra o reconhecimento de mutantes de IL-1R1 pelo anticorpo monoclonal anti-IL-lRl. A Figura 19 é um desenho que representa a (I) activação da via de sinalização de IL-1 que começa com a ligação de IL-Ιβ a IL-1R1, e recrutamento de IL-lracP e de três classes de anticorpos anti-IL-lRl: (II) bloqueadores de IL-1 do epitopo do 3o domínio, (III) bloqueadores de RAcP do epitopo do 3o domínio e (IV) bloqueadores de IL-1 do epitopo do l°/2° domínio. A Figura 20 descreve a estrutura cristalina de 15C4 e 27F2 com a mutação 10 como aqui descrita. Os resíduos cinzentos indicam os epitopos de 15C4 e 27F2. A Figura 21 descreve os epitopos de 15C4 no terceiro domínio de IL-1R1 extracelular. A Figura 22 descreve os epitopos de 24E12 no terceiro domínio de IL-1R1 extracelular. 18 A Figura 23 descreve a sequência de aminoácidos (SEQ ID N°: 59) da proteína quimérica avidina-IL-lRl humana-FLAG da invenção. A Figura 24 descreve a sequência de aminoácidos (SEQ ID N°: 60) de uma proteína quimérica avidina-IL-lRl de cinomolgos-FLAG. A avidina recombinante de galinha (em itálico) é ligada ao domínio extracelular maduro da IL-1R1 de cinomolgos (sublinhado, com um marcador FLAG C-terminal em negrito) através de um ligante de 6 aminoácidos. Quatro aminoácidos da IL-1R1 humana que foram introduzidos isoladamente e em combinação na sequência de cinomolgos estão em negrito sob a sequência de cinomolgos. 0 epitopo 4 está a negrito, em itálico e sublinhado. A Figura 25A mostra uma análise de transferência de Western da ligação do anticorpo anti-ILl-Rl humana (anti-huILl-Rl) a IL-1R1. 0 * indica que os anticorpos foram utilizados a 5 pg/mL, enquanto nos restantes, os anticorpos foram utilizados a 1 pg/mL. A Figura 25B mostra um sumário da análise densitométrica de um conjunto duplicado de experiências de transferência de Western. A Figura 26 mostra gráficos que representam a ligação de anticorpos anti-huILIRl a proteínas de avidina-IL-lRl-FLAG num ensaio de ligação multiplexado com base em esferas. 19

DESCRIÇÃO DETALHADA DE DETERMINADAS FORMAS DE REALIZAÇÃO PREFERIDAS

Os títulos de secção aqui utilizados são apenas para fins organizativos e não devem ser interpretados como limitativos dos elementos essências descritos.

Definições

Uma doença ou um estado patológico são considerados como sendo uma "doença mediada por interleucina-1 (IL-1)" se a doença ou o estado patológico de ocorrência natural ou induzido experimentalmente estiverem associados com níveis elevados de IL-1 em fluidos ou tecidos corporais ou se as células ou tecidos removidos do corpo produzem níveis elevados de IL-1 em cultura. Níveis elevados de IL-1 podem incluir, por exemplo, níveis que excedem aqueles normalmente encontrados numa célula ou tecido particular ou podem ser qualquer nível detectável de IL-1 numa célula ou tecido que normalmente não expressa IL-1. Em muitos casos, as doenças mediadas por IL-1 são também reconhecidas pelas seguintes duas condições adicionais: (1) as observações patológicas associadas com a doença ou estado patológico podem ser mimetizadas experimentalmente em animais por administração de IL-1 ou regulação positiva da expressão de IL-1; e (2) uma patologia induzida em modelos animais experimentais da doença ou do estado patológico pode ser inibida ou abolida por tratamento com agentes que inibem a acção da IL-1. Na maioria das doenças mediadas por IL-1, pelo menos, duas das três condições estão reunidas e, em muitas doenças mediadas por IL-1, todas as três condições estão reunidas. 20

Uma lista não exclusiva de doenças agudas e crónicas mediadas por IL-1, inclui, mas não está limitada ao seguinte: pancreatite aguda; esclerose lateral amiotrófica (ALS); Doença de Alzheimer; caquexia/anorexia, incluindo caquexia induzida por SIDA; asma e outras doenças pulmonares; aterosclerose; vasculite auto-imune; sindrome de fatiga crónica; doenças associadas a Clostridium, incluindo diarreia associada a Clostridium; estados e indicações coronárias, incluindo insuficiência cardíaca congestiva, restenose coronária, enfarte do miocárdio, disfunção do miocárdio (e. g., relacionada com sepsia) e enxerto de bypass de artéria coronária; cancro, tais como mieloma múltiplo e leucemias mielógenas (e. g., AML ou CML) e outras, assim como metástases tumorais; diabetes (e. g., diabetes dependente de insulina); endometriose; febre; fibromialgia; glomerulonefrite; doença de hospedeiro contra enxerto/rejeição de transplante; choque hemorrágico; hiperalgesia; doença inflamatória intestinal; estados inflamatórios de uma articulação, incluindo osteodistrofia, artrite psoriática e artrite reumatóide; doença inflamatória ocular que pode estar associada com, e. g., transplante da córnea; isquemia, incluindo isquemia cerebral (e. g., lesão cerebral como resultado de traumatismo, epilepsia, hemorragia ou acidente vascular cerebral, cada um dos quais pode conduzir a neurodegeneração); Doença de Kawasaki; dificuldade de aprendizagem; doenças pulmonares (e. g., ARDS); esclerose múltipla; miopatias (e. g., metabolismo da proteína muscular, especialmente em sepsia); neurotoxicidade (e. g., como induzida por HIV); osteoporose; dor, incluindo dor relacionada com cancro; Doença de Parkinson; doença peridental; trabalho de parto prematuro; psoríase; lesão de reperfusão; choque séptico; efeitos secundários de radioterapia; doença da articulação temporo-mandibular; distúrbio de sono; uveíte; ou um estado inflamatório resultante de esforço, entorse, lesão de cartilagem, traumatismo, cirurgia ortopédica, infecção ou outros 21 processos de doença. Os métodos da invenção para tratar estas doenças agudas e crónicas mediadas por IL-1, assim como outros estados e doenças mediadas por IL-1, são descritos abaixo.

Podem ser utilizadas técnicas convencionais para preparar ADN recombinante, realizar síntese de oligonucleótidos e na prática de culturas de tecidos e transformação (e. g., electroporação, transfecção ou lipofecção). Podem ser realizadas reacções enzimáticas e técnicas de purificação de acordo com as especificações do fabricante ou como habitualmente realizadas na técnica ou como aqui descritas. As técnicas e processos anteriores podem ser genericamente realizados de acordo com métodos convencionais bem conhecidos na técnica e como descrito em várias referências gerais e mais específicas que são citadas e discutidas ao longo da presente descrição. Ver, e. g.,

Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.I. Salvo definições específicas proporcionadas, a nomenclatura utilizada, assim como os processos e técnicas laboratoriais, relativamente a química analítica, química orgânica de síntese e química médica e farmacêutica aqui descritas, são aquelas bem conhecidas e utilizadas habitualmente na técnica. Podem ser utilizadas técnicas padrão para sínteses químicas, análises químicas, preparação, formulação e distribuição farmacêutica, e tratamento de doentes.

Como utilizadas de acordo com a presente divulgação, as seguintes expressões, salvo indicação em contrário, devem ser entendidas como tendo os seguintes significados: A expressão "polinucleótido isolado" significa que o polinucleótido em causa, (1) não está associado (covalentemente ou não covalentemente) com a totalidade ou 22 uma porção de outros polinucleótidos com o qual o polinucleótido em causa está associado na natureza, (2) está associado com uma molécula com a qual não está associado na natureza ou (3) não ocorre na natureza associado com quaisquer outros polinucleótidos. Um tal polinucleótido isolado pode ser ADN genómico, ADNc, ARNm ou outro ARN, de origem sintética, ou qualquer sua combinação. A expressão "proteína isolada" aqui referida significa que uma proteína em causa (1) está livre de, pelo menos, algumas outras proteínas com que seria normalmente encontrada, (2) está essencialmente livre de outras proteínas da mesma fonte, e. g. , da mesma espécie, (3) é expressa por uma célula de uma espécie diferente, (4) foi separada de, pelo menos, cerca de 50 por cento de polinucleótidos, lípidos, hidratos de carbono ou outros materiais com que está associada na natureza, (5) não está associada (por interacção covalente ou não covalente) com porções de uma proteína com que a "proteína isolada" está associada na natureza, (6) está operativamente associada (por interacção covalente ou não covalente) com um polipéptido com que não está associada na natureza ou (7) não ocorre na natureza. ADN genómico, ADNc, ARNm ou outro ARN, de origem sintética, ou uma sua qualquer combinação, pode codificar uma tal proteína isolada. De um modo preferido, a proteína isolada está substancialmente livre de proteínas ou polipéptidos ou outros contaminantes que são encontrados no seu ambiente natural que interfeririam com a sua utilização terapêutica, de diagnóstico, profiláctica, em investigação ou outra.

Os termos"polipéptido" ou "proteína" significam uma ou mais cadeias de aminoácidos, em que cada cadeia compreende aminoácidos ligados covalentemente por ligações peptídicas e em que o referido polipéptido ou proteína compreende um pluralidade 23 de cadeias em conjunto ligadas não covalentemente e/ou covalentemente por ligações peptídicas, que tem a sequência de proteínas nativas, isto é, proteínas produzidas por células de ocorrência natural e especificamente não recombinantes, ou manipuladas geneticamente ou células recombinantes, e compreende moléculas que têm a sequência de aminoácidos da proteína nativa, ou moléculas que têm deleções, adições e/ou substituições de um ou mais aminoácidos da sequência nativa. Os termos "polipéptido" e "proteína" abrangem especificamente anticorpos anti-ILl-Rl, ou sequências que têm deleções, adições e/ou substituições de um ou mais aminoácidos de um anticorpo anti-ILR-lRl. Assim, um "polipéptido" ou uma "proteína" pode compreender uma (denominado "um monómero") ou uma pluralidade (denominado "um multímero") de cadeias de aminoácidos. A expressão "fragmento de polipéptido" refere-se a um polipéptido que pode ser monomérico ou multimérico, o qual tem uma deleção amino-terminal, uma deleção carboxi-terminal e/ou uma deleção ou substituição interna de um polipéptido de ocorrência natural ou produzido recombinantemente. Em determinadas formas de realização, um fragmento de polipéptido pode compreender uma cadeia de aminoácidos com, pelo menos, 5 a cerca de 500 aminoácidos de comprimento. Deve ser entendido que em determinadas formas de realização, os fragmentos têm, pelo menos, 5, 6, 8, 10, 14, 20, 50, 70, 100, 110, 150, 200, 250, 300, 350, 400 ou 450 aminoácidos de comprimento. Os fragmentos particularmente úteis do polipéptido incluem domínios funcionais, incluindo domínios de ligação. No caso de um anticorpo anti-ILl-Rl, os fragmentos úteis incluem, mas não estão limitados a: uma região CDR, especialmente uma região CDR3 da cadeia pesada ou leve; um domínio variável de uma cadeia pesada ou leve; uma porção de uma cadeia de anticorpo ou apenas a sua região variável incluindo duas CDR; e semelhantes. A expressão "fragmento de imunoglobulina imunologicamente funcional", como agui utilizada, refere-se a um fragmento de polipéptido gue contém, pelo menos, os domínios variáveis das cadeias pesadas e leves da imunoglobulina. Um fragmento de imunoglobulina imunologicamente funcional da invenção é capaz de ligação a um ligando, prevenir a ligação do ligando ao seu receptor, interromper a resposta biológica que resulta da ligação do ligando ao receptor, ou qualquer sua combinação. De um modo preferido, um fragmento de imunoglobulina imunologicamente funcional da invenção liga-se especificamente a IL-1R1.

As expressões "ocorrência natural" e "nativo" significa que que os materiais biológicos (moléculas, sequências, complexos proteicos, células e semelhantes), aos quais as expressões são aplicadas, podem ser encontrados na natureza e não são manipulados pelo homem. Por exemplo, um polipéptido ou sequência polinucleotídica que está presente num organismo (incluindo vírus) que pode ser isolado de uma fonte na natureza e que não foi intencionalmente modificado pelo homem é de ocorrência natural. Do mesmo modo, as expressões "ocorrência não natural" ou "não nativo" referem-se a um material que não é encontrado na natureza ou que foi estruturalmente modificado ou sintetizado pelo homem. A expressão "ligado operativamente" significa que os componentes aos quais a expressão é aplicada estão numa relação que lhes permite realizar as suas funções inerentes sob condições adequadas. Por exemplo, uma sequência de controlo "ligada operativamente" a uma sequência codificante de proteína está aí ligada, de modo que a expressão da sequência codificante 25 de proteína seja realizada sob condições compatíveis com a actividade transcripcional das sequências de controlo. A expressão "sequência de controlo" significa que a sequência polinucleotídica em causa pode realizar a expressão e o processamento de sequências codificantes às quais está ligada. A Nature de tais sequências de controlo pode depender do organismo hospedeiro. Em formas de realização particulares, as sequências de controlo para procariotas podem incluir um promotor, um local de ligação ribossomal e uma sequência de terminação de transcrição. Noutras formas de realização particulares, as sequências de controlo para eucariotas podem incluir promotores compreendendo um ou mais locais de reconhecimento para factores de transcrição, sequências intensificadoras de transcrição e sequências de terminação de transcrição. Em determinadas formas de realização, as "sequências de controlo" podem incluir sequências líder e/ou sequências de parceiros de fusão. A expressão "polinucleótido" significa polímeros de ácidos nucleicos de cadeia simples ou cadeia dupla de, pelo menos, 10 bases de comprimento. Em determinadas formas de realização, os nucleótidos compreendendo o polinucleótido podem ser ribonucleótidos ou desoxirribonucleótidos ou uma forma modificada de qualquer tipo de nucleótido. As referidas modificações incluem modificações de base, tais como derivados de bromouridina e inosina, modificações de ribose, tais como 2', 3'-didesoxirribose, e modificações de ligação internucleotídica, tais como fosforotioato, fosforoditioato, fosforosselenoato, fosforodisselenoato, fosforoanilotioato, fosforoaniladato e fosforoamidato. A expressão inclui formas de ADN de cadeia simples e dupla. 26 0 termo "oligonucleótido" significa um polinucleótido compreendendo um comprimento de 200 bases ou menos. Em formas de realização preferidas, os oligonucleótidos têm 10 a 60 bases de comprimento. Em formas de realização preferidas adicionais, os oligonucleót idos têm 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 a 40 bases de comprimento. Os oligonucleótidos podem ser de cadeia simples ou de cadeia dupla, e. g., para utilização na construção de um gene mutante. Os oligonucleótidos da invenção podem ser oligonucleótidos de sentido ou anti-sentido. A expressão "nucleótidos de ocorrência natural" inclui desoxirribonucleótidos e ribonucleótidos. A expressão "nucleótidos modificados" inclui nucleótidos com grupos modificados ou substituídos de açúcar ou bases modificadas ou substituídas. A expressão "ligações oligonucleotídicas" inclui ligações, tais como fosforotioato, fosforoditioato, fosforosselenoato, fosforodisselenoato, fosforoanilotioato, fosforoaniladato, fosforoamidato, e semelhantes. Ver, e. g., LaPlanche et al. (1986), Nucl. Acid Res. 14 : 9081; Stec et al. (1984), J. Am. Chem. Soc. 106:6077; Stein et al. (1988), Nucl. Acid Res. 16:3209; Zon et al. (1991), Anti-Cancer Drug Design 6:539; Zon et al. (1991), Oligonucleótides and Analogues: A Practical Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein, ed.), Oxford University Press, Oxford, Inglaterra ; Stec et al., Pat. U.S. N° 5151510; Uhlmann e Peyman (1990), Chemical Reviews 90:543. Um oligonucleótido da invenção pode incluir um marcador, incluindo um marcador radioactivo, um marcador fluorescente, um hapteno ou um marcador antigénico, para ensaios de detecção. O termo "vector" significa qualquer molécula (e. g., ácido nucleico, plasmídeo ou vírus) utilizada para transferir informação de codificação para uma célula hospedeira. 27 A expressão "vector de expressão" ou "construção de expressão" refere-se a um vector que é adequado para transformação de uma célula hospedeira e contém sequências de ácidos nucleicos que direccionam e/ou controlam (em conjunto com a célula hospedeira) a expressão de uma ou mais regiões codificantes heterólogas ai ligadas operativamente. Uma construção de expressão pode incluir, mas não estar limitada a, sequências que afectam ou controlam a transcrição, tradução e splicing de ARN, se estiverem presentes intrões, de uma região codificante ai ligada operativamente. A expressão "célula hospedeira" significa uma célula que foi transformada ou é capaz de ser transformada, com uma sequência de ácidos nucleicos e expressa, assim, um gene seleccionado de interesse. A expressão inclui a progenia da célula parental, sendo ou não a progenia idêntica em morfologia ou em composição genética à célula parental original, desde que o gene seleccionado esteja presente. 0 termo "transdução" significa a transferência de genes de uma bactéria para outra, habitualmente por fagos. "Transdução" também se refere à incorporação e transferência de sequências celulares eucarióticas por retrovirus. 0 termo "transfecção" significa a incorporação de ADN estranho ou exógeno por uma célula, e uma célula foi "transfectada" quando o ADN exógeno foi introduzido dentro da membrana celular. Muitas técnicas de transfecção são bem conhecidas no campo técnico e são aqui divulgadas. Ver, e. g., Graham et ai., 1973, Virology 52:456; Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Id.; Davis et al., 1986, Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier; e Chu et al., 1981, Gene 13:197. Tais técnicas podem ser utilizadas para 28 introduzir uma ou mais unidades de ADN exógeno em células hospedeiras adequadas. 0 termo "transformação" refere-se a uma alteração nas caracteristicas genéticas de uma célula, e uma célula foi transformada quando foi modificada para conter ADN novo. Por exemplo, uma célula é transformada quando é modificada geneticamente do seu estado nativo por transfecção, transdução ou por outras técnicas. Após a transfecção ou transdução, o ADN de transformação pode recombinar com aquele da célula por integração fisica num cromossoma da célula, ou pode ser mantido transientemente como um elemento epissomal sem ser replicado, ou pode replicar independentemente como um plasmideo. Uma célula é considerada como tendo sido "transformada estavelmente" quando o ADN de transformação é replicado com a divisão da célula. 0 termo "antigénio" refere-se a uma molécula ou a uma porção de uma molécula capaz de ser ligada por um agente selectivo de ligação, tal como um anticorpo e, adicionalmente, capaz de ser utilizada num animal para produzir anticorpos capazes de ligação a um epitopo desse antigénio. Um antigénio pode ter um ou mais epitopos. 0 termo "epitopo" inclui qualquer determinante, de um modo preferido, um determinante polipeptídico, capaz de ligação especifica a uma imunoglobulina ou receptor de célula T. Em determinadas formas de realização, os determinantes de epitopo incluem agrupamentos de superfície quimicamente activos de moléculas, tais como aminoácidos, cadeias laterais de açúcar, fosforilo ou sulfonilo e, em determinadas formas de realização, pode ter caracteristicas estruturais tridimensionais específicas e/ou características específicas de carga. Um epitopo é uma região de um antigénio que está ligada por um anticorpo. Em 29 determinadas formas de realização, um anticorpo é referido como se ligar especificamente um antigénio quando reconhecer, de um modo preferido, o seu antigénio alvo numa mistura complexa de proteínas e/ou macromoléculas. Em formas de realização preferidas, um anticorpo é referido como se liga especificamente a um antigénio quando a constante de dissociação for menor ou igual a cerca de 10 nM, de um modo mais preferido, quando a constante de dissociação for menor ou igual a cerca de 100 pM e, de um modo muito preferido, quando a constante de dissociação for menor ou igual a cerca de 10 pM. O termo "identidade" refere-se a uma relação entre as sequências de duas ou mais moléculas polipeptídicas ou duas ou mais moléculas de ácidos nucleicos, como determinado por comparação das suas sequências. Na técnica, "identidade" também significa o grau de parecença de sequência entre moléculas de ácidos nucleicos ou polipéptidos, qualquer que seja o caso, como determinado pelo emparelhamento entre sequências de dois ou mais nucleótidos ou de dois ou mais aminoácidos. A "identidade" mede a percentagem de emparelhamentos idênticos entre as menores de duas ou mais sequências com alinhamentos de lacuna (se algum) definidos por um modelo matemático particular ou um programa de computador (i. e., "algoritmos"). O termo "semelhança" é utilizado na técnica, relativamente a um conceito relacionado; ao contrário da "identidade", contudo, a "semelhança" refere-se a uma medida de parecença que inclui emparelhamentos idênticos e emparelhamentos de substituição conservadora. Se duas sequências polipeptídicas tiverem, por exemplo, 10/20 aminoácidos idênticos e os restantes forem todos substituições não conservadoras, então a percentagem de identidade e de semelhança de ambas seriam 50%. Se no mesmo exemplo, existirem mais cinco posições onde existem 30 substituições conservadoras, então a percentagem de identidade permanece 50%, mas a percentagem de semelhança seria 75% (15/20). Deste modo, nos casos em que existem substituições conservadoras, a percentagem de semelhança entre dois polipéptidos será mais alta do que a percentagem de identidade entre aqueles dois polipéptidos. A identidade e a semelhança de ácidos nucleicos e polipéptidos relacionados podem ser prontamente calculadas por métodos conhecidos. Tais métodos incluem, mas não estão limitados a, aqueles descritos em Computational Molecular Biology, (Lesk, A.M., ed.), 1988, Oxford University Press, Nova Iorque; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, (Smith, D.W., ed.), 1993, Academic Press, Nova Iorque; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, (Grifffin, A.M., e Griffin, H.G., eds.), 1994, Humana Press, New Jersey; von Heinje, G., Sequence Analysis in Molecular Biology, 1987, Academic Press; Sequence Analysis Primer, (Gribskov, M. e Devereux, J., eds.), 1991, M. Stockton Press, Nova Iorque; Carillo et al., 1988, SIAM J. Applied Math. 48:1073; and Durbin et al., 1998, Biological Sequence Analysis, Cambridge University Press.

Os métodos preferidos para determinar a identidade são concebidos para produzir o maior emparelhamento entre as sequências testadas. Os métodos para determinar a identidade são descritos em proqramas de computador publicamente disponíveis. Os métodos de proqramas de computador preferidos para determinar a identidade entre duas sequências incluem, mas não estão limitados ao, pacote de programa GCG, incluindo GAP (Devereux et al., 1984, Nucl. Acid. Res. 12:387; Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI), BLASTP, BLASTN e FASTA (Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410). O programa 31 BLASTX está publicamente disponível pelo National Center for Biotechnology Information (NCBI) e outras fontes (BLAST Manual, Altschul et al. NCB/NLM/NIH Bethesda, MD 20894; Altschul et al., 1990, supra). O algoritmo bem conhecido de Smith Waterman pode também ser utilizado para determinar a identidade.

Determinados esquemas de alinhamento para alinhar duas sequências de aminoácidos podem resultar no emparelhamento de apenas uma curta região das duas sequências, e esta pequena região alinhada pode ter uma identidade de sequência muito elevada, embora não exista uma relação significativa entre as duas sequências de tamanho total. Desta forma, em determinadas formas de realização, o método de alinhamento seleccionado (programa GAP) irá resultar num alinhamento que cobre, pelo menos, 50 aminoácidos contíguos do polipéptido alvo.

Por exemplo, utilizando o algoritmo computorizado GAP (Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI), dois polipéptidos para os quais a percentagem de identidade de sequência é para ser determinada, são alinhados para emparelhamento óptimo dos seus aminoácidos respectivos ("matched span", como determinado pelo algoritmo). Em determinadas formas de realização, uma penalidade da abertura de lacuna (que é calculada como três-vezes a diagonal média; onde a "diagonal média" é a média da diagonal da matriz de comparação utilizada; a "diagonal" é a contagem ou o número atribuído a cada emparelhamento de aminoácido perfeito pela matriz de comparação particular) e uma penalidade de extensão de lacuna (que é habitualmente um décimo da penalidade de abertura de lacuna), assim como uma matriz de comparação, tais como PAM250 ou BLOSUM 62, são utilizados em conjunto com o algoritmo. Em determinadas formas de realização, uma matriz de comparação padrão (ver Dayhoff et al., 1978, Atlas of Protein Sequence and 32

Structure 5:345-352 para a matriz de comparação PAM 250; Henikoff et ai., 1992, Proc. Natl. Acad. Sei USA 89:10915-10919 para a matriz de comparação BLOSUM 62) é também utilizada pelo algoritmo.

Em determinadas formas de realização, os parâmetros para uma comparação de sequências polipeptídicas incluem o seguinte:

Algoritmo: Needleman et al. (1970), J. Mol. Biol. 48 : 443-453;

Matriz de comparação: BLOSUM 62 de Henikoff et al. (1992), supra;

Penalidade de Lacuna: 12

Penalidade de Comprimento de Lacuna: 4

Limite de Semelhança: 0 O programa GAP pode ser útil com os parâmetros acima. Em determinadas formas de realização, os parâmetros acima mencionados são os parâmetros por defeito para comparações de polipéptidos (juntamente com a ausência de penalidade para lacunas finais) que utilizam o algoritmo GAP. A expressão "ocorrência natural" como utilizada com referência a aminoácidos, refere-se aos vinte aminoácidos convencionais. Ver Immunology-A Synthesis, 2a Edição, (E. S. Golub e D. R. Gren, eds.) , Sinauer Associates: Sunderland, MA (1991)

Os análogos peptídicos são utilizados habitualmente na indústria farmacêutica como fármacos não peptídicos com propriedades análogas àquelas do péptido molde. Estes tipos de compostos não peptídicos são denominados "miméticos peptídicos" ou "peptidomiméticos". Ver Fauchere (1986), Adv. Drug Res. 33 15:29; Veber & Freidinger, 1985, TINS p.392; e Evans et al. (1987), J. Med. Chem. 30:1229, os quais são aqui incorporados por referência para qualquer fim. Tais compostos são frequentemente desenvolvidos com a ajuda de modelação molecular computorizada. Os miméticos peptídicos que são estruturalmente semelhantes a péptidos terapeuticamente úteis podem ser utilizados para produzir um efeito terapêutico ou profiláctico semelhante. Geralmente, os peptidomiméticos são estruturalmente semelhantes a um péptido ou polipéptido paradigma (i. e., um péptido ou polipéptido que tem uma propriedade bioquímica ou actividade farmacológica) , tal como um anticorpo humano, mas têm uma ou mais ligações peptídicas opcionalmente substituídas por uma ligação seleccionada de: -CH2-NH-, -CH2-S-, -CH2-CH2-, -CH=CH-(cis e trans), -COCH2-, -CH(OH)CH2- e -CH2SO-, por métodos bem conhecidos na técnica. A substituição sistemática de um ou mais aminoácidos de uma sequência de consenso com um D-aminoácido do mesmo tipo (e. g., D-lisina em vez de L-lisina) pode ser utilizada em determinadas formas de realização para produzir péptidos mais estáveis. Além disso, péptidos constrangidos compreendendo uma sequência de consenso ou uma variação substancialmente idêntica da sequência de consenso, podem ser produzidos por métodos conhecidos na técnica (Rizo & Gierasch, 1992, Ann. Rev. Biochem. 61:387); por exemplo, por adição de resíduos de cisteína internos capazes de formar pontes bissulfureto intramoleculares que ciclizam o péptido. "Anticorpo" ou "péptido(s) de anticorpo" referem-se a um anticorpo intacto ou um seu fragmento de ligação que compete com o anticorpo intacto para ligação específica e inclui anticorpos quiméricos, humanizados, totalmente humanos e biespecíficos. Em determinadas formas de realização, os fragmentos de ligação são produzidos por técnicas de ADN recombinante. Em formas de realização adicionais, os fragmentos de ligação são produzidos 34 por clivagem enzimática ou química de anticorpos intactos. Os fragmentos de ligação incluem, mas não estão limitados a, Fab, Fab', F(ab')2/· Fv e anticorpos de cadeia simples. A expressão "cadeia pesada" inclui uma cadeia pesada de tamanho total e os seus fragmentos que têm sequência de região variável suficiente para conferir especificidade para IL-1R1. Uma cadeia pesada de tamanho total inclui um domínio de região variável, VH, e três domínios de região constante, CH1, CH2 e CH3. 0 domínio VH está no amino-terminal do polipéptido e o domínio Ch3 está no carboxil-terminal. A expressão "cadeia leve" inclui uma cadeia leve de tamanho total e os seus fragmentos que têm sequência de região variável suficiente para conferir especificidade para IL-1R1. Uma cadeia leve de tamanho total inclui um domínio de região variável, VL, e um domínio de região constante, CL. Como a cadeia pesada, o domínio da região variável da cadeia leve está no amino-terminal do polipéptido.

Um "fragmento Fab" é compreendido por uma cadeia leve, e CH1 e regiões variáveis de uma cadeia pesada. A cadeia pesada de uma molécula Fab não pode formar uma ligação bissulfureto com outra molécula de cadeia pesada.

Um "fragmento Fab'" contém uma cadeia leve e uma cadeia pesada que contém mais da região constante, entre os domínios CH1 e Ch2, de modo que uma ligação bissulfureto intercadeia seja formada entre as duas cadeias pesadas para formar uma molécula F(ab')2·

Um "fragmento F(ab')2" contém duas cadeias leves e duas cadeias pesadas contendo uma porção da região constante entre os 35 domínios CH1 e Ch2, de modo que uma ligação bissulfureto intercadeia seja formada entre duas cadeias pesadas. A "região Fv" compreende as regiões variáveis das cadeias pesadas e leves, mas carece das regiões constantes. "Anticorpos de cadeia simples" são moléculas Fv em que as regiões variáveis da cadeia leve e pesada foram ligadas através de um ligante flexível para formar uma única cadeia polipeptídica, a qual forma uma região de ligação a antigénio. Os anticorpos de cadeia simples são discutidos em detalhe na

Publicação do Pedido de Patente Internacional N° WO 88/01649 e nas Patentes U.S. N° 4946778 e 5260203.

Um "anticorpo bivalente", à excepção de um "anticorpo multiespecífico" ou "multifuncional", em determinadas formas de realização, é entendido como compreendendo locais de ligação que têm especificidade antigénica idêntica.

Um anticorpo "biespecífico" ou "bifuncional" é um anticorpo híbrido que tem dois pares diferentes de cadeia pesada/leve e dois locais diferentes de ligação. Os anticorpos biespecíficos podem ser produzidos através de uma variedade de métodos incluindo, mas não limitados a, fusão de hibridomas ou ligação de fragmentos Fab'. Ver, e. g., Songsivilai & Lachmann (1990), Clin. Exp. Immunol. 79:315-321; Kostelny et al. (1992), J.

Immunol. 148:1547-1553.

Na avaliação da ligação e especificidade do anticorpo, de acordo com a invenção, um anticorpo "inibe substancialmente" a adesão de um ligando a um receptor quando um excesso de anticorpo reduz a quantidade de receptor ligado ao contra- 36 receptor por, pelo menos, cerca de 20%, 40%, 60%, 80%, 85% ou mais (como medido num ensaio de ligação competitiva in vitro). O termo "agente" significa um composto químico, uma mistura de compostos químicos, uma macromolécula biológica ou um extracto feito de materiais biológicos.

Os termos "marcador" ou "marcado", referem-se à incorporação de um marcador detectável, e. g., por incorporação de um aminoácido marcado radioactivamente ou ligação a um polipéptido de unidades de biotina que podem ser detectadas por avidina marcada (e. g., estreptavidina, de um modo preferido, compreendendo um marcador detectável, tais como um marcador fluorescente, um marcador quimioluminescente ou uma actividade enzimática que pode ser detectada por métodos ópticos ou colorimétricos). Em determinadas formas de realização, o marcador pode também ser terapêutico. Vários métodos de marcação de polipéptidos e glicoproteínas são conhecidos na técnica e podem ser utilizados vantajosamente nos métodos aqui divulgados. Os exemplos de marcadores para polipéptidos incluem, mas não estão limitados, aos seguintes: radioisótopos ou radionuclidos (e. g., 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99mTc, niIn, 125I, 131I), marcadores fluorescentes (e. g., isotiocianato de fluoresceína (FITC), rodamina ou lantanídeo fosforoso) , marcadores enzimáticos (e. g., peroxidase de rábano, β-galactosidase, luciferase, fosfatase alcalina), marcadores quimioluminescentes, marcadores de hapteno, tal como grupos biotinilo, e epitopos polipeptídicos predeterminados reconhecidos por um repórter secundário (e. g., sequências de par de fecho de leucina, locais de ligação para anticorpos secundários, domínios de ligação a metal, marcadores de epitopo). Em determinadas formas de realização, os marcadores são ligados por braços espaçadores (tal como (CH2)n, em que 37 η < cerca de 20) de vários comprimentos para reduzir o potencial impedimento estérico. A expressão "amostra biológica" inclui, mas não está limitada a, qualquer quantidade de uma substância de um organismo vivo ou anteriormente organismo vivo. Tais organismos vivos incluem, mas não estão limitados a, humanos, murganhos, macacos, ratos, coelhos e outros animais. Tais substâncias incluem, mas não estão limitadas a, sangue, soro, urina, células, órgãos, tecidos, osso, medula óssea, linfa, nódulos linfáticos, tecido sinovial, condrócitos, macrófagos sinoviais, células endoteliais, tecido vascular (particularmente tecido vascular inflamado) e pele. As expressões "agente farmacêutico" e "fármaco" referem-se a um composto químico ou a uma composição capaz de induzir um efeito terapêutico desejado quando administrado correctamente a um doente O termo "doente" inclui indivíduos humanos e animais.

Salvo requerido em contrário pelo contexto, os termos no singular incluem o plural e os termos no plural incluem o singular.

Aminoácidos

Os vinte aminoácidos de ocorrência natural e as suas abreviaturas seguem a utilização convencional. Ver Immunology -A Synthesis, 2a Edição, (E. S. Golub e D. R. Gren, eds.), Sinauer Associates: Sunderland, MA (1991). Os estereoisómeros (e. g., D-aminoácidos) dos vinte aminoácidos convencionais, aminoácidos não naturais, tais como aminoácidos a-,a-dissubstituídos, N-alquil-aminoácidos e outros aminoácidos 38 não convencionais podem também ser componentes adequados para polipéptidos da invenção. Os exemplos de aminoácidos não convencionais incluem: 4-hidroxiprolina, γ-carboxiglutamato, ε-Ν, N, N-trimetil-lisina, ε-Ν-acetil-lisina, 0-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metil-histidina, 5-hidroxilisina, σ-Ν-metilarginina e outros aminoácidos e iminoácidos semelhantes (e. g., 4-hidroxiprolina). Na notação dos polipéptidos aqui utilizada, o sentido para a esquerda é o sentido amino-terminal e o sentido para a direita é o sentido carboxi-terminal, de acordo com a utilização e convenção padrão.

De modo semelhante, salvo indicação em contrário, a extremidade esquerda de sequências polinucleotidicas de cadeia simples é a extremidade 5'; o sentido para a esquerda de sequências polinucleotidicas de cadeia dupla é referido como sentido 5'. 0 sentido da adição 5' para 3' de transcritos nascentes de ARN é referido como o sentido de transcrição; as regiões de sequência na cadeia de ADN que tem a mesma sequência que o transcrito de ARN que são de 5' para a extremidade 5' do transcrito de ARN são referidas como "sequências a montante"; as regiões de sequência na cadeia de ADN que têm a mesma sequência que o transcrito de ARN que são de 3' para a extremidade 3' do transcrito de ARN são referidas como "sequências a jusante".

Os resíduos de aminoácidos de ocorrência natural podem ser divididos em classes com base nas propriedades comuns da cadeia lateral: 1) hidrofóbicos: norleucina (Nor ou Nle) , Met, Ala, Vai, Leu, Ile; 2) 3) 4) hidrofílicos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gin; acídicos: Asp, Glu; básicos: His, Lys, Arg; 39 5) resíduos que influenciam a orientação da cadeia: Gly, Pro; e 6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.

As substituições conservadoras de aminoácidos podem envolver a troca de um membro de uma destas classes com outro membro da mesma classe. As substituições conservadoras de aminoácidos podem abranger os resíduos de aminoácidos de ocorrência não natural, que são tipicamente incorporados por síntese peptídica química em vez de síntese em sistemas biológicos. Estas incluem peptidomiméticos e outras formas reversas ou invertidas de unidades de aminoácidos.

As substituições não conservadoras podem envolver a troca de um membro de uma destas classes para um membro de outra classe. Tais resíduos substituídos podem ser introduzidos, por exemplo, em regiões de um anticorpo humano que são homólogas com anticorpos não humanos ou nas regiões não homólogas da molécula.

Fazendo tais alterações, de acordo com determinadas formas de realização, o índice hidropático de aminoácidos pode ser considerado. A cada aminoácido foi atribuído um índice hidropático com base nas suas características de hidrofobicidade e carga. Estes são: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptofano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); e arginina (-4,5). A importância do índice hidropático de aminoácidos em conferir função biológica interactiva numa proteína é compreendido na técnica (ver, por exemplo, Kyte et al., 1982, J. 40

Mol. Biol. 157:105-131). É conhecido que determinados aminoácidos podem ser substituídos por outros aminoácidos que têm uma pontuação ou índice hidropático semelhante e ainda retêm uma actividade biológica semelhante. Ao fazer alterações com base no índice hidropático, em determinadas formas de realização, está incluída a substituição de aminoácidos cujos índices hidropáticos estão dentro de ±2. Em determinadas formas de realização, estão incluídos aqueles que estão dentro de ±1 e, em determinadas formas de realização, estão incluídos aqueles dentro de ±0,5. É também compreendido na técnica que a substituição de aminoácidos semelhantes pode ser feita eficazmente com base na hidrofilicidade, particularmente nos casos em que o péptido ou proteína biologicamente funcional assim criado, é pretendido para utilização em formas de realização imunológicas, como aqui divulgado. Em determinadas formas de realização, a maior hidrofilicidade média local de uma proteína, como governado pela hidrofilicidade dos seus aminoácidos adjacentes, correlaciona-se com a sua imunogenicidade e antigenicidade, i. e., com uma propriedade biológica da proteína.

Os seguintes valores de hidrofilicidade foram atribuídos a estes resíduos de aminoácidos: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0 ± 1); glutamato (+3,0 ± 1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5 ± 1); alanina (-0,5); histidina (-0,5); cisterna (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5) e triptofano (-3,4). Ao fazer as alterações com base em valores de hidrofilicidade semelhantes, em determinadas formas de realização, está incluída a substituição de aminoácidos cujos valores de hidrofilicidade estão dentro de ±2, em determinadas 41 formas de realização, estão incluídos aqueles que estão dentro de ±1 e, em determinadas formas de realização, estão incluídos aqueles dentro de ±0,5. Pode-se também identificar epitopos de sequências primárias de aminoácidos com base na hidrofilicidade. Estas regiões são também referidas como "regiões de núcleo epitópico".

Substituições de aminoácidos exemplificativas são apresentadas na Tabela 1.

Tabela 1

Substituições de Aminoácidos Resíduos Originais Substituições Exemplificativas Substituições Preferidas Ala Val, Leu, Ile Val Arg Lys, Gin, Asn Lys Asn Gin Gin Asp Glu Glu Cys Ser, Ala Ser Gin Asn Asn Glu Asp Asp Gly Pro, Ala Ala His Asn, Gin, Lys, Arg Arg Ile Leu, Val, Met, Ala, Phe, Norleucina Leu Leu Norleucina, Ile, Val, Met, Ala, Phe Ile Lys Arg, Ácido 1,4-Diamino-butírico, Gin, Asn Arg Met Leu, Phe, Ile Leu Phe Leu, Val, Ile, Ala, Tyr Leu Pro Ala Gly Ser Thr, Ala, Cys Thr 42 (continuação)

Substituições de Aminoácidos

Resíduos Originais Substituições Exemplificativas Substituições Preferidas Thr Ser Ser Trp Tyr, Phe Tyr Tyr Trp, Phe, Thr, Ser Phe Vai Ile, Met, Leu, Phe, Ala, Norleucina Leu

Um especialista será capaz de determinar variantes adequadas de polipéptidos, como aqui apresentados, utilizando técnicas bem conhecidas. Em determinadas formas de realização, um especialista na técnica pode identificar áreas adequadas da molécula que podem ser alteradas sem destruir a actividade, por direccionamento a regiões que não se acredita que sejam importantes para a actividade. Noutras formas de realização, o especialista na técnica pode identificar resíduos e porções das moléculas que são conservadas entre polipéptidos semelhantes. Em formas de realização adicionais, mesmo áreas que podem ser importantes para a actividade biológica ou para a estrutura podem ser submetidas a substituições conservadoras de aminoácidos sem destruir a actividade biológica ou sem afectar de forma adversa a estrutura do polipéptido.

Adicionalmente, um especialista pode rever estudos de estrutura-função que identificam resíduos em polipéptidos semelhantes que são importantes para a actividade ou estrutura. Face a uma tal comparação, o especialista na técnica pode prever a importância de resíduos de aminoácidos numa proteína que corresponde a resíduos de aminoácidos importantes para a actividade ou estrutura em proteínas semelhantes. Um 43 especialista na técnica pode optar por substituições de aminoácidos quimicamente semelhantes para tais resíduos de aminoácidos importantes previstos.

Um especialista na técnica pode também analisar a estrutura tridimensional e a sequência de aminoácidos em relação a essa estrutura em polipéptidos semelhantes. Face a uma tal informação, um especialista na técnica pode prever o alinhamento de resíduos de aminoácidos de um anticorpo relativamente à sua estrutura tridimensional. Em determinadas formas de realização, um especialista na técnica pode escolher não fazer alterações radicais a resíduos de aminoácidos previstos como estando à superfície da proteína, uma vez que tais resíduos podem estar envolvidos em interacções importantes com outras moléculas. Além disso, um especialista na técnica pode preparar variantes de teste contendo uma única substituição de aminoácido em cada resíduo de aminoácido desejado. As variantes podem ser depois rastreadas utilizando ensaios de actividade conhecidos dos especialistas na técnica. Tais variantes podem ser utilizadas para recolher informação acerca de variantes adequadas. Por exemplo, se se verificar que uma alteração a um resíduo de aminoácido particular resultou em actividade destruída, indesejavelmente reduzida ou inadequada, as variantes com tal alteração podem ser evitadas. Por outras palavras, com base na informação recolhida a partir de tais experiências de rotina, um especialista na técnica pode determinar prontamente os aminoácidos onde as substituições adicionais devem ser evitadas, isoladamente ou em combinação com outras mutações.

Muitas publicações científicas foram dedicadas à previsão da estrutura secundária. Ver Moult, 1996, Curr. Op. In Biotech. 7:422-427; Chou et al., 1974, Biochemistry 13:222-245; Chou et al., 1974, Biochemistry 113:211-222; Chou et al., 1978, Adv. 44

Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 47:45-148; Chou et al., 1979,

Ann. Rev. Biochem. 47:251-276; e Chou et al., 1979, Biophys. J. 26:367-384. Além disso, estão actualmente disponíveis programas de computador para ajudar na previsão de estrutura secundária. Um método de prever a estrutura secundária é baseado em modelação de homologia. Por exemplo, dois polipéptidos ou proteínas que têm uma identidade de sequência superior a 30%, ou semelhança superior a 40% têm, frequentemente, topologias estruturais semelhantes. O recente crescimento da base de dados estrutural de proteínas (PDB) tem proporcionado predictabilidade aumentada de estrutura secundária, incluindo o número potencial de enrolamentos dentro de uma estrutura de polipéptido ou proteína. Ver Holm et al., 1999, Nucl. Acid. Res. 27:244-247.

Foi sugerido (Brenner et al., 1997, Curr. Op. Struct. Biol. 7:369-376) existir um número limitado de enrolamentos num dado polipéptido ou proteína e, assim que um número crítico de estruturas tenha sido resolvido, a previsão estrutural tornar-se-ão dramaticamente mais exacto. Métodos adicionais para prever a estrutura secundária incluem "threading" (Jones, 1997, Curr. Opin. Struct. Biol. 7:377-87; Sippl et al., 1996, Struture 4:15-19), "profile analysis" (Bowie et al., 1991, Science 253:164-170; Gribskov et al., 1990, Meth. Enzym. 183:146-159; Gribskov et al., 1987, Proc. Nat. Acad. Sei. 84:4355-4358) e "evolutionary linkage" (ver Holm, 1999, supra; e Brenner, 1997, supra).

Em determinadas formas de realização, as variantes de anticorpos incluem variantes de glicosilação, em que o número e/ou tipo de local de glicosilação foi alterado comparativamente às sequências de aminoácidos do polipéptido parental. Em determinadas formas de realização, as variantes proteicas compreendem um número maior ou menor de locais de glicosilação 45 N-ligados do que a proteína nativa. Um local de glicosilação N-ligado é caracterizado pela sequência: Asn-X-Ser ou Asn-X-Thr, em que o resíduo de aminoácido designado como X pode ser qualquer resíduo de aminoácido, excepto prolina. A substituição de resíduos de aminoácidos para criar esta sequência proporciona um novo local potencial para a adição de uma cadeia de hidrato de carbono N-ligada. Alternativamente, as substituições que eliminam esta sequência irão remover uma cadeia de hidrato de carbono N-ligada existente. É também proporcionado um rearranjo de cadeias de hidrato de carbono N-ligadas em que um ou mais locais de glicosilação N-ligados (tipicamente aqueles que são de ocorrência natural) são eliminados e são criados um ou mais novos locais N-ligados. As variantes de anticorpo preferidas adicionais incluem variantes de cisteína em que um ou mais resíduos da cisteína são suprimidos ou substituídos por outro aminoácido (e. g., serina) comparativamente à sequência de aminoácidos parental. As variantes de cisteína podem ser úteis quando os anticorpos têm que ser re-enrolados numa conformação biologicamente activa, tal como após o isolamento de corpos de inclusão insolúveis. As variantes de cisteína têm habitualmente menos resíduos de cisteína do que a proteína nativa e têm, tipicamente, um número par para minimizar interacções resultantes de cisteínas desemparelhadas.

De acordo com determinadas formas de realização, as substituições de aminoácidos são aquelas que: (1) reduzem a susceptibilidade à proteólise, (2) reduzem a susceptibilidade à oxidação, (3) alteram a afinidade de ligação para formar complexos proteicos, (4) alteram afinidades de ligação e/ou (5) conferem ou modificam outras propriedades físico-químicas ou funcionais em tais polipéptidos. De acordo com determinadas formas de realização, podem ser feitas substituições de aminoácidos simples ou múltiplas (em determinadas formas de 46 realização, substituições de aminoácidos conservadoras) na sequência de ocorrência natural (em determinadas formas de realização, na porção do polipéptido fora do(s) domínio(s) que formam contactos intermoleculares). Em formas de realização preferidas, uma substituição de aminoácido conservadora, tipicamente, não muda substancialmente as características estruturais da sequência parental (e. g., uma substituição de aminoácido não deve tender a quebrar uma hélice que ocorra na sequência parental, ou interromper outros tipos de estrutura secundária que caracterizam a sequência parental). Os exemplos de estruturas secundárias e terciárias polipeptídicas, reconhecidas na técnica são descritos em Proteins, Structures and Molecular Principies, (Creighton, ed.), 1984, W. H. Freeman and Company, Nova Iorque; Introduction to Protein Structure (C. Branden e J. Tooze, eds.), 1991, Garland Publishing, Nova Iorque, N.I.; e Thornton et al. (1991), Nature 354:105.

Preparação de Anticorpos

As unidades estruturais de anticorpos de ocorrência natural compreendem tipicamente um tetrâmero. Cada desses tetrâmeros é tipicamente composto de dois pares idênticos de cadeias polipeptídicas, cada par contendo uma cadeia "leve" de tamanho total (tendo tipicamente um peso molecular de cerca de 25 kDa) e uma cadeia "pesada" de tamanho total (tendo tipicamente um peso molecular de cerca de 50-70 kDa) . A porção amino-terminal de cada cadeia inclui tipicamente uma região variável de cerca de 100 a 110 ou mais aminoácidos que é tipicamente responsável pelo reconhecimento antigénico. A porção carboxi-terminal de cada cadeia define tipicamente uma região constante responsável pela função efectora. As cadeias leves humanas são classificadas tipicamente como cadeias leves kapa e lambda. As cadeias pesadas 47 são classificadas tipicamente como mu, delta, gama, alfa ou épsilon, e definem o isotipo do anticorpo como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente. A IgG tem diversas subclasses, incluindo, mas não limitadas a, IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4. A IgM tem subclasses incluindo, mas não limitadas a, IgMl e IgM2. A IgA está, de modo semelhante, subdividida em subclasses incluindo, mas não limitadas a, IgAl e IgA2. Dentro das cadeias leves e pesadas de tamanho total, tipicamente, uma região "J" de cerca de 12 ou mais aminoácidos liga a região variável e as regiões constantes, com a cadeia pesada a incluir também uma região "D" de cerca de mais 10 aminoácidos. Ver, e. g.,

Fundamental Immunology, Cap. 7, 2a ed., (Paul, W., ed.), 1989, Raven Press, N.I. A combinação das regiões variáveis de cada par de cadeia leve/pesada forma tipicamente o local de ligação a antigénio.

As regiões variáveis de cada uma das cadeias pesadas e das cadeias leves apresentam tipicamente a mesma estrutura geral compreendendo quatro regiões estruturais relativamente conservadas (FR) ligadas por três regiões hiper-variáveis, também denominadas regiões determinantes de complementaridade ou CDR. As CDR das duas cadeias de cada par são tipicamente alinhadas pelas regiões estruturais, cujo alinhamento pode permitir a ligação a um epitopo especifico. Do N-terminal ao C-terminal, ambas as regiões variáveis da cadeia leve e pesada compreendem tipicamente os dominios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4. A atribuição de aminoácidos a cada domínio está tipicamente de acordo com as definições de Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (1987 e 1991, National Institutes of Health, Bethesda, Md.), Chothia & Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196 : 901-917, ou Chothia et al., 1989, Nature 342:878-883). 48

Os anticorpos tornaram-se úteis e de interesse como agentes farmacêuticos com o desenvolvimento dos anticorpos monoclonais. Os anticorpos monoclonais são produzidos utilizando qualquer método que produza moléculas de anticorpo através de linhas celulares continuas em cultura. Os exemplos de métodos adequados para preparar anticorpos monoclonais incluem os métodos de hibridoma de Kohler et al. (1975, Nature 256:495-497) e o método do hibridoma humano de células B (Kozbor, 1984, J. Immunol, 133:3001; e Brodeur et al., 1987, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, (Mareei Dekker, Inc., Nova Iorque), pp. 51-63) .

Os anticorpos monoclonais podem ser modificados para utilização como agentes terapêuticos. Um exemplo é um anticorpo "quimérico" em que uma porção da cadeia pesada e/ou da cadeia leve é idêntica ou homóloga a uma sequência correspondente em anticorpos derivados de uma espécie particular ou pertencente a uma classe ou subclasse particular de anticorpos, enquanto a restante cadeia ou cadeias são idênticas ou homólogas a uma sequência correspondente em anticorpos derivados de outra espécie ou pertencente a uma outra classe ou subclasse de anticorpos. Outros exemplos são fragmentos de tais anticorpos, desde que apresentem a actividade biológica desejada. Ver, Patente U.S. N° 4816567; e Morrison et al. (1985), Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:6851-6855. Um desenvolvimento relacionado é o anticorpo "enxertado a CDR", em que o anticorpo compreende uma ou mais regiões determinantes de complementaridade (CDR) de uma espécie particular ou pertencente a uma classe ou subclasse particular de anticorpo, enquanto a restante cadeia ou cadeias são idênticas ou homólogas a uma sequência correspondente em anticorpos derivados de outra espécie ou pertencente a uma outra classe ou subclasse de anticorpos. 49

Outro desenvolvimento é o anticorpo "humanizado". Os métodos para humanizar anticorpos não humanos são bem conhecidos na técnica (ver Patentes U.S. N° 5585089 e 5693762). Geralmente, um anticorpo humanizado é produzido por um animal não humano, e depois determinados resíduos de aminoácidos, tipicamente de porções não reconhecedoras de antigénio do anticorpo, são modificados para serem homólogos aos referidos resíduos num anticorpo humano de isotipo correspondente. A humanização pode ser realizada, por exemplo, utilizando métodos descritos na técnica (Jones et ai., 1986, Nature 321:522-525; Riechmann et al., 1988, Nature 332:323-327; Verhoeyen et al., 1988,

Science 239:1534-1536), por substituição de, pelo menos, uma porção de uma região variável de roedor para as regiões correspondentes de um anticorpo humano. É mais recente e mais promissor o desenvolvimento de anticorpos humanos sem exposição do antigénio a seres humanos ("anticorpos totalmente humanos"). Utilizando animais transgénicos (e. g., murganhos) que são capazes de produzir um repertório de anticorpos humanos na ausência da produção de imunoglobulinas endógenas de murganho, tais anticorpos são produzidos por imunização com um antigénio (tendo tipicamente, pelo menos, 6 aminoácidos contíguos), opcionalmente conjugado a um veículo. Ver, por exemplo, Jakobovits et al., 1993, Proc.

Natl. Acad. Sei. USA 90:2551-2555; Jakobovits et al., 1993, Nature 362:255-258; e Bruggermann et al., 1993, Year in Immunol. 7:33. Num exemplo destes métodos, os animais transgénicos são produzidos por incapacitação dos loci de imunoglobulina endógena de murganho que codificam as cadeias pesadas e leves de imunoglobulina de murganho, e introdução dos loci que codificam as proteínas da cadeia pesada e leve humanas no seu genoma. Os animais parcialmente modificados que têm menos do que o complemento total de modificações, são depois cruzados para 50 obter um animal que tem todas as modificações desejadas do sistema imune. Quando administrado um imunogénio, estes animais transgénicos produzem anticorpos que são imunoespecificos para estes antigénios que têm sequências de aminoácidos humanas (em vez de murino), incluindo regiões variáveis. Ver as Publicações PCT N° W096/33735 e W094/02602. Métodos adicionais são descritos na Patente U.S. N° 5545807, Publicações PCT N° WO91/10741, W090/04036 e nos documentos EP 546073B1 e EP 546073A1. Os anticorpos humanos podem também ser produzidos através da expressão de ADN recombinante em célula hospedeiras ou através de expressão em células de hibridoma, como aqui descrito.

Os anticorpos totalmente humanos podem também ser produzidos a partir de bibliotecas de apresentação de fagos (como divulgado em Hoogenboom et al., 1991, J. Mol. Biol. 227:381; e Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222:581). Estes processos mimetizam a selecção imune através da apresentação de repertórios de anticorpos na superfície de bacteriófagos filamentosos e subsequente selecção do fago pela sua ligação a um antigénio de escolha. Uma tal técnica é descrita na Publicação PCT N° WO99/10494 que descreve o isolamento de anticorpos agonisticos funcionais e de elevada afinidade para receptores MPL e MSK utilizando uma tal abordagem.

Uma vez determinadas as sequências de nucleótidos que codificam tais anticorpos, também podem ser produzidos anticorpos quiméricos, enxertados a CDR, humanizados e totalmente humanos por métodos recombinantes. Os ácidos nucleicos que codificam os anticorpos são introduzidos em células hospedeiras e expressos utilizando materiais e processos habitualmente conhecidos na técnica. 51 A invenção proporciona um ou mais anticorpos monoclonais totalmente humanos contra a IL-1R1 humana. De um modo preferido, os anticorpos ligam-se ao terceiro domínio de IL-1R1. Em formas de realização preferidas, a invenção proporciona sequências de nucleótidos que codificam, e sequências de aminoácidos compreendendo, moléculas de imunoglobulina de cadeia pesada e leve, particularmente sequências que correspondem às suas regiões variáveis. Em formas de realização preferidas, são proporcionadas sequências que correspondem às regiões determinantes de complementaridade (CDR) , especificamente de CDR1 a CDR3. Em formas de realização preferidas adicionais, a invenção proporciona linhas celulares de hibridoma que expressam tais moléculas de imunoglobulina e anticorpos monoclonais daí produzidos, de um modo muito preferido, anticorpos monoclonais humanos purificados contra a IL-1R1 humana. A capacidade para clonar e reconstruir loci humanos, com tamanho na ordem das megabase, em cromossomas artificiais de levedura (YAC) e para introduzir estes na linha germinal de murganho, proporcionam uma abordagem vantajosa para elucidar os componentes funcionais dos loci muito grandes ou mapeados de forma grosseira, assim como produzir modelos úteis de doença humana. Além disso, a utilização de tal tecnologia para substituição de loci de murganho com os seus equivalentes humanos proporciona conhecimentos únicos na expressão e regulação de produtos génicos humanos durante o desenvolvimento, a sua comunicação com outros sistemas e a sua participação na indução e progressão da doença.

Uma aplicação prática importante de tal estratégia é a "humanização" do sistema imune humoral de murganho. A introdução de loci de imunoglobulina (Ig) humana em murganhos, nos quais os genes de Ig endógenos foram inactivados, oferece a oportunidade 52 para estudar os mecanismos subjacentes à expressão programada e montagem de anticorpos, assim como o seu papel no desenvolvimento de células B. Além disso, tal estratégia proporciona uma fonte para a produção de anticorpos monoclonais (MAb) totalmente humanos, particularmente para utilização como agentes terapêuticos. É esperado que os anticorpos totalmente humanos minimizem as respostas imunogénicas e alérgicas intrínsecas a Mab de murganho ou derivados de murganho, e assim aumentem a eficácia e a segurança de anticorpos administrados em aplicações terapêuticas. Os anticorpos totalmente humanos podem ser utilizados no tratamento de doenças humanas crónicas e recorrentes, tais como osteodistrofia, artrite reumatóide e outros estados inflamatórios, cujo tratamento requer a administração repetida de anticorpos.

Um especialista na técnica pode manipular estirpes de murganho deficientes na produção de anticorpos de murganho, com grandes fragmentos dos loci de Ig humanos, de modo que tais murganhos produzam anticorpos humanos na ausência de anticorpos de murganho. Os grandes fragmentos de Ig humanos podem preservar a grande diversidade génica variável, assim como a regulação apropriada da produção e expressão de anticorpos. Ao explorar o organismo do murganho para a diversificação e selecção de anticorpos e a carência de tolerância imunológica para proteínas humanas, o repertório de anticorpos humanos reproduzido nestas estirpes de murganho produzem anticorpos de elevada afinidade contra qualquer antigénio de interesse, incluindo antigénios humanos. Utilizando a tecnologia de hibridoma, podem ser produzidos e seleccionados MAb humanos específicos de antigénio com a especificidade desejada.

Em determinadas formas de realização, o especialista na técnica pode utilizar regiões constantes de espécies que não a 53 humana, em conjunto com uma ou mais regiões variáveis humanas em tais murganhos para produzir anticorpos guiméricos. Os anticorpos da invenção podem ser produzidos por imunização de tais animais com IL-1R1 de tamanho total, formas solúveis de IL-1R1 ou um seu fragmento. Ver, Por exemplo, a Publicação do Pedido de Patente Internacional WO 93/12227).

As CDR das regiões variáveis da cadeia leve e pesada de anticorpos anti-IL-lRl da invenção, podem ser enxertadas em regiões estruturais (FR) da mesma, ou de outras espécies. Em determinadas formas de realização, as CDR das regiões variáveis da cadeia leve e pesada de anticorpo anti-IL-lRl podem ser enxertadas com FR de consenso. Para criar FR humanas de consenso, as FR de diversas seguências de aminoácidos da cadeia pesada ou da cadeia leve humanas são alinhadas para identificar uma sequência de aminoácidos de consenso. As FR da cadeia pesada ou da cadeia leve do anticorpo anti-IL-lRl são substituídas com as FR de uma cadeia pesada ou cadeia leve diferente. Os aminoácidos raros nas FR das cadeias pesadas e leves do anticorpo anti-IL-lRl são tipicamente não substituídos, enquanto o resto dos aminoácidos da FR podem ser substituídos. Os aminoácidos raros são aminoácidos específicos que estão em posições em que não são habitualmente encontrados em FR. As regiões variáveis enxertadas de anticorpos anti-IL-lRl da invenção, podem ser utilizadas com uma região constante que seja diferente da região constante do anticorpo anti-IL-lRl. Alternativamente, as regiões variáveis enxertadas são parte de um anticorpo Fv de cadeia simples. 0 enxero de CDR é descrito, e. g., nas Patentes U.S. N° 6180370, 5693762, 5693761, 5585089 e 5530101.

Em determinadas formas de realização, a invenção proporciona anticorpos anti-ILl-Rl que compreendem uma região CDR1 de cadeia 54 pesada humana que tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID N° : 63; uma região CDR2 de cadeia pesada humana que tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID N° : 66; e/ou uma região CDR3 de cadeia pesada humana que tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 69.

Noutras formas de realização, a invenção proporciona anticorpos anti-ILl-Rl que compreendem uma região CDR1 de cadeia leve humana que tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 71; uma região CDR2 de cadeia pesada humana que tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID N° : 73; e/ou uma região CDR3 de cadeia pesada humana que tem uma sequência de aminoácidos da SEQ O s Q H 75.

Os anticorpos da invenção são preparados, de um modo preferido, utilizando murganhos transgénicos que têm uma porção substancial do locus humano produtor de anticorpos, introduzido em células produtoras de anticorpos de murganho e que são adicionalmente manipulados para serem deficientes na produção de anticorpos endógenos de murino. Tais murganhos são capazes de produzir anticorpos e moléculas de imunoglobulina humana e não produzir ou produzir quantidades substancialmente reduzidas de anticorpos e moléculas de imunoglobulina de murino. As tecnologias utilizadas para conseguir este resultado são divulgadas em patentes, pedidos e nas referências divulgadas nesta descrição. Em formas de realização preferidas, o especialista pode utilizar os métodos como divulgados na Publicação do Pedido de Patente Internacional N° WO 98/24893. Ver também Mendez et al., 1997, Nature Genetics 15:146-156.

Os anticorpos monoclonais (MAb) da invenção podem ser produzidos através de uma variedade de técnicas, incluindo metodologia convencional de anticorpos monoclonais, e. g., a 55 técnica de hibridação celular somática padrão de Kohler e Milstein, 1975, Nature 256:495. Embora os processos de hibridação celular somática sejam preferidos, em principio, podem ser utilizadas outras técnicas para produzir anticorpos monoclonais, e. g., transformação virai ou oncogénica de linfócitos B.

Numa forma de realização preferida, os anticorpos monoclonais humanos dirigidos contra IL-1R1 podem ser produzidos utilizando murganhos referidos como murganhos "HuMab", os quais contêm um minilocus do gene da imunoglobulina humana que codifica sequências de imunoglobulina humana não rearranjadas da cadeia pesada (μ e γ) e da cadeia leve k, em conjunto com mutações dirigidas que inactivam os loci endógenos da cadeia μ e k. Lonberg et al., 1994, Nature 368:856-859. Desta forma, os murganhos apresentam uma expressão reduzida de IgM ou κ de murganho e, em resposta à imunização, os transgenes da cadeia pesada e leve humanas introduzidos sofrem permuta de classe e mutação somática para produzir anticorpos monoclonais de IgG κ humano de elevada afinidade. Lonberg et al., supra; Lonberg e Huszar, 1995, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93; Harding e Lonberg, 1995, Ann. N.Y. Acad. Sei. 764:536-546. A preparação de murganhos HuMab é descrita em detalhe em Taylor et al., 1992, Nucleic Acids Res. 20:6287-6295; Chen et al., 1993, International Immunology 5:647-656; Tuaillon et al., 1994, J. Immunol. 152:2912-2920; Lonberg et al., 1994, Nature 368:856-859; Lonberg, 1994, Handbook of Exp. Pharmacology 113:49-101; Taylor et al., 1994, International Immunology 6:579-591; Lonberg & Huszar, 1995, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93; Harding & Lonberg, 1995, Ann. N.Y. Acad. Sei 764:536-546; Fishwild et al., 1996, Nature Biotechnology 14:845-851. Ver ainda Patentes U.S. N° 5545806; 5569825; 5625126; 5633425; 5789650; 5877397; 5661016; 5814318; 5874299; e 56 5770429; todas de Lonberg e Kay, assim como a Patente U.S. N° 5545807 de Surani et al.; Publicação do Pedido de Patente Internacional N° WO 93/1227, publicado em 24 de Junho de 1993; WO 92/22646, publicado em 23 de Dezembro de 1992; e WO 92/03918, publicado em 19 de Março de 1992. Alternativamente, as estirpes de murganhos transgénicos HCo7 e HCol2 descritas nos Exemplos abaixo podem ser utilizadas para produzir anticorpos anti-IL-lRl humana.

Vantajosamente, os anticorpos monoclonais totalmente humanos específicos para IL-1R1 são produzidos como se segue. Murganhos transgénicos contendo genes da imunoglobulina humana são imunizados com o antigénio relacionado com a IL-1R1 de interesse. São obtidas células linfáticas (tal como células B) do murganho que expressam anticorpos. Tais células recuperadas são fundidas com uma linha celular de tipo mielóide para preparar linhas celulares de hibridoma imortalizadas e tais linhas celulares de hibridoma são rastreadas e seleccionadas para identificar as linhas celulares de hibridoma que produzem anticorpos específicos para o antigénio de interesse. Em determinadas formas de realização, é proporcionada a produção de uma linha celular de hibridoma que produz os anticorpos específicos para IL-1R1.

Em formas de realização preferidas, os anticorpos da invenção são produzidos por linhas de hibridoma. Nestas formas de realização, os anticorpos da invenção ligam-se a IL-1R1 com uma constante de dissociação (Kd) entre, aproximadamente, 4 pM e 100 pM. Em determinadas formas de realização da invenção, os anticorpos ligam-se a IL-1R1 com uma Kd menor do que cerca de 20 pM. Noutras formas de realização, os anticorpos da invenção ligam-se ao terceiro domínio de IL-1R1. As sequências de 57 aminoácidos e de nucleótidos do terceiro domínio da IL1-R1 de humano e rato são mostradas na Figura 17.

Em formas de realização preferidas, os anticorpos da invenção são do isotipo IgGl, IgG2 ou IgG4, sendo o isotipo IgG2 o mais preferido. Em formas de realização preferidas da invenção, os anticorpos compreendem uma cadeia leve kapa humana e uma cadeia pesada humana de IgGl, IgG2 ou IgG4. Em formas de realização particulares, as regiões variáveis dos anticorpos são ligadas a uma região constante, diferente da região constante para o isotipo IgGl, IgG2 ou IgG4. Em determinadas formas de realização, os anticorpos da invenção foram clonados para expressão em células de mamífero.

Em determinadas formas de realização, as substituições conservadoras de aminoácidos para as cadeias pesadas e leves do anticorpo anti-IL-lRl (e as modificações correspondentes nos nucleótidos codificantes) produzirão anticorpos anti-IL-lRl que têm características funcionais e químicas semelhantes àquelas do anticorpo anti-IL-lRl. Pelo contrário, as modificações substanciais nas características funcionais e/ou químicas do anticorpo anti-IL-lRl podem ser realizadas através da selecção de substituições na sequência de aminoácidos das cadeias pesadas e leves que diferem significativamente no seu efeito em manter (a) a estrutura do esqueleto molecular na área da substituição, por exemplo, como uma conformação em folha ou helicoidal, (b) a carga ou hidrofobicidade da molécula no local alvo, ou (c) o volume da cadeia lateral.

Por exemplo, uma "substituição conservadora de aminoácidos" pode envolver uma substituição de um resíduo de aminoácido nativo com um resíduo não nativo, de modo que exista pouco ou nenhum efeito na polaridade ou carga do resíduo de aminoácido 58 nessa posição. Além disso, qualquer resíduo nativo no polipéptido pode também ser substituído com alanina, como foi previamente descrito para a "mutagénese de varrimento de alanina" (Wells, 1991, Methods Enzymol. 202:390 (ed. J.J. Langone), Academic Press, Londres).

As substituições de aminoácidos desejadas (sejam conservadoras ou não conservadoras) podem ser determinadas pelos especialistas na técnica no momento em que tais substituições são desejadas. Em determinadas formas de realização, as substituições de aminoácidos podem ser utilizadas para identificar resíduos importantes do anticorpo anti-IL-lRl ou para aumentar ou diminuir a afinidade dos anticorpos anti-IL-lRl aqui descritos.

Em formas de realização alternativas, os anticorpos da invenção podem ser expressos em linhas celulares com excepção de linhas celulares de hibridoma. Nestas formas de realização, as sequências que codificam anticorpos particulares podem ser utilizadas para transformação de uma célula hospedeira de mamífero adequada. De acordo com estas formas de realização, a transformação pode ser realizada utilizando qualquer método conhecido para introduzir polinucleótidos numa célula hospedeira, incluindo, por exemplo, o empacotamento do polinucleótido num vírus (ou num vector virai) e a transdução de uma célula hospedeira com o vírus (ou vector) ou por processos de transfecção conhecidos na técnica. Tais processos são exemplificados nas Pat. U.S. N° 4399216, 4912040, 4740461 e 4959455. Geralmente, o processo de transformação utilizado pode depender do hospedeiro a ser transformado. Os métodos para introduzir polinucleótidos heterólogos em células de mamífero são bem conhecidos na técnica e incluem, mas não estão limitados a, transfecção mediada por dextrano, precipitação com fosfato de 59

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de do (s) do ADN cálcio, transfecção mediada por polibreno, protoplastos, electroporação, encapsulação polinucleótido(s) em lipossomas e microinjecção directa em núcleos.

De acordo com determinadas formas de realização dos métodos da invenção, uma molécula de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos de uma região constante de cadeia pesada, de uma região variável de cadeia pesada, de uma região constante de cadeia leve ou de uma região variável de cadeia leve de um anticorpo IL-1R1 da invenção, é introduzida num vector de expressão apropriado utilizando técnicas padrão de ligação. Numa forma de realização preferida, a região constante de cadeia pesada ou leve de IL-1R1 é adicionada ao C-terminal da região variável apropriada e é ligada num vector de expressão. 0 vector é tipicamente seleccionado para ser funcional numa célula hospedeira particular a utilizar (i. e., o vector é compatível com o sistema da célula hospedeira, de modo que possa ocorrer a amplificação do gene e/ou a expressão do gene). Para uma revisão de vectores da expressão, ver, Goeddel (ed.), 1990, Meth. Enzymol. Vol. 185, Academic Press, N.I.

Tipicamente, os vectores da expressão utilizados em qualquer das células hospedeiras conterão sequências para a manutenção do plasmídeo e para a clonagem e expressão de sequência de nucleótidos exógena. Tais sequências, colectivamente referidas como "sequências flanqueadoras" em determinadas formas de realização, incluirão, tipicamente, uma ou mais das seguintes sequências de nucleótidos: um promotor, uma ou mais sequências intensificadoras, uma origem de replicação, uma sequência de terminação transcripcional, uma sequência completa de intrão contendo um local dador e aceitador de splice, uma sequência que codifica uma sequência líder para a secreção de polipéptido, um 60 local de ligação a ribossoma, uma sequência de poliadenilação, uma região poliligante para introduzir o ácido nucleico que codifica o polipéptido a ser expresso e um elemento marcador de selecção. Cada destas sequências é discutida abaixo.

Opcionalmente, o vector pode conter uma sequência que codifica um "marcador", i. e., uma molécula oligonucleotidica localizada na extremidade 5' ou 3' da sequência codificante do polipéptido de IL-1R1; a sequência oligonucleotidica codifica poli-His (tal como hexa-His) ou um outro "marcador", tais como FLAG, HA (hemaglutinina do vírus da gripe) ou myc para o qual existem anticorpos comercialmente disponíveis. Este marcador é tipicamente fundido ao polipéptido após expressão do polipéptido e pode servir como meio para purificação de afinidade ou detecção do anticorpo IL-1R1 a partir da célula hospedeira. A purificação de afinidade pode ser realizada, por exemplo, por cromatografia em coluna utilizando anticorpos contra o marcador como uma matriz de afinidade. Opcionalmente, o marcador pode ser subsequentemente, removido do polipéptido IL-1R1 purificado por vários meios, tal como utilizando determinadas peptidases para clivagem.

As sequências flanqueadoras podem ser homólogas (i. e., da mesma espécie e/ou estirpe que a célula hospedeira), heterólogas (i. e., de uma espécie diferente da espécie ou estirpe da célula hospedeira), híbridas (i. e., uma combinação de sequências flanqueadoras de mais do que uma fonte), sintéticas ou nativas. Como tal, a fonte de uma sequência flanqueadora pode ser qualquer organismo procariótico ou eucariótico, qualquer organismo vertebrado ou invertebrado, ou qualquer planta, desde que a sequência flanqueadora seja funcional no sistema da célula hospedeira e possa ser activada pela mesma. 61

As sequências flanqueadoras úteis nos vectores desta invenção podem ser obtidas por quaisquer de vários métodos bem conhecidos na técnica. Tipicamente, as sequências flanqueadoras úteis aqui, terão sido previamente identificadas por mapeamento e/ou digestão de restrição com endonucleases e podem ser assim isoladas da fonte de tecido apropriada, utilizando as endonucleases de restrição apropriadas. Em alguns casos, a sequência de nucleótidos total de uma sequência flanqueadora pode ser conhecida. Aqui, a sequência flanqueadora pode ser sintetizada utilizando os métodos aqui descritos para a sintese ou clonagem de ácidos nucleicos.

Nos casos em que toda ou apenas uma porção da sequência flanqueadora é conhecida, esta pode ser obtida utilizando a reacção em cadeia da polimerase (PCR) e/ou por rastreamento de uma biblioteca genómica com uma sonda adequada, tais como um oligonucleótido e/ou um fragmento de sequência flanqueadora da mesma ou de outra espécie. Nos casos em que a sequência flanqueadora não é conhecida, um fragmento de ADN contendo uma sequência flanqueadora pode ser isolado de um pedaço de ADN maior que possa conter, por exemplo, uma sequência codificante ou mesmo outro gene ou genes. 0 isolamento pode ser realizado por digestão com endonucleases de restrição para produzir o fragmento de ADN apropriado, seguida por isolamento utilizando purificação em gel de agarose, cromatografia em coluna Qiagen® (Chatsworth, CA) ou outros métodos conhecidos do especialista na técnica. A selecção de enzimas adequadas para realizar este objectivo será prontamente evidente a um técnico com conhecimento geral na matéria.

Uma origem de replicação é tipicamente uma parte daqueles vectores de expressão procarióticos adquiridos comercialmente, e a origem ajuda na amplificação do vector numa célula hospedeira. 62

Se o vector de escolha não contiver um local de origem de replicação, esta pode ser quimicamente sintetizada com base numa sequência conhecida e ligada no vector. Por exemplo, a origem de replicação do plasmídeo pBR322 (New England Biolabs, Beverly, MA) é adequada para a maioria das bactérias Gram-negativas e várias origens virais (e. g. , SV40, polioma, adenovirus, vírus da estomatite vesicular (VSV) ou papilomavírus, tais como HPV ou BPV) são úteis para vectores de clonagem em células de mamífero. Geralmente, o componente de origem de replicação não é necessário para vectores de expressão em mamíferos (por exemplo, a origem SV40 é frequentemente utilizada apenas porque também contém o promotor precoce do vírus).

Uma sequência de terminação de transcrição está tipicamente localizada a 3' da extremidade de uma região codificante de polipéptido e serve para terminar a transcrição. Geralmente, uma sequência de terminação de transcrição em células procarióticas é um fragmento rico em G-C, seguido por uma sequência poli-T. Embora a sequência seja facilmente clonada a partir de uma biblioteca ou mesmo adquirida comercialmente como parte de um vector, esta pode também ser prontamente sintetizada utilizando métodos para a síntese de ácidos nucleicos, tal como aqueles aqui descritos.

Um gene marcador de selecção codifica uma proteína necessária para a sobrevivência e crescimento de uma célula hospedeira, cultivada num meio de cultura selectivo. Os genes marcadores de selecção típicos codificam proteínas que (a) conferem resistência a antibióticos ou outras toxinas, e. g., ampicilina, tetraciclina ou canamicina para células hospedeiras procarióticas; (b) complementem deficiências auxotróficas da célula; ou (c) fornecem nutrientes críticos não disponíveis a partir de meios complexos ou definidos. Os marcadores de 63 selecção preferidos, são o gene de resistência à canamicina, o gene de resistência à ampicilina e o gene de resistência à tetraciclina. Um gene de resistência à neomicina pode também ser utilizado para a selecção em células hospedeiras procarióticas e eucarióticas.

Outros genes de selecção podem ser utilizados para amplificar o gene que será expresso. A amplificação é o processo em que os genes que têm grande procura para a produção de uma proteína crítica para crescimento ou sobrevivência celular, são reiterados habitualmente em tandem dentro dos cromossomas de gerações sucessivas de células recombinantes. Os exemplos de marcadores de selecção adequados para células de mamífero incluem, a di-hidrofolato redutase (DHFR) e a timidina cinase sem promotor. Os transformantes de células de mamífero são colocados sob pressão de selecção em que apenas os transformantes estão excepcionalmente adaptados para sobreviver devido ao gene de selecção presente no vector. A pressão de selecção é imposta através do cultivo das células transformadas sob condições em que a concentração do agente de selecção no meio está sucessivamente aumentada, conduzindo assim à amplificação do gene de selecção e ao ADN que codifica outro gene, tal como o polipéptido IL-1R1 compreendendo o vector. Como resultado, as quantidades aumentadas de um polipéptido, tal como o polipéptido IL-1R1, são sintetizadas a partir do ADN amplificado.

Um local de ligação a ribossoma é habitualmente necessário para a iniciação da tradução do ARNm e é caracterizado por uma sequência de Shine-Dalgarno (procariotas) ou uma sequência de Kozak (eucariotas) . 0 elemento é tipicamente localizado a 3' do promotor e a 5' da sequência codificante do polipéptido a ser expresso. 64

Em alguns casos, tais como quando a glicosilação é desejada num sistema de expressão de célula hospedeira eucariótica, pode-se manipular as várias pré- ou pro-sequências para melhorar a glicosilação ou o rendimento. Por exemplo, pode-se alterar o local de clivagem da peptidase de um péptido sinal particular, ou adicionar pro-sequências que podem também afectar a glicosilação. 0 produto proteico final pode ter, na posição -1 (relativamente ao primeiro aminoácido da proteína madura) um ou mais incidentes de aminoácidos adicionais para a expressão, que podem não ter sido totalmente removidos. Por exemplo, o produto proteico final pode ter um ou dois resíduos de aminoácidos encontrados no local de clivagem da peptidase, ligados ao amino-terminal. Alternativamente, a utilização de alguns locais de clivagem enzimática pode resultar numa forma ligeiramente truncada do polipéptido desejado, se a enzima cortar em tal área no polipéptido maduro.

Os vectores de expressão e clonagem da invenção conterão tipicamente um promotor que é reconhecido pelo organismo hospedeiro e operativamente ligado à molécula que codifica o anticorpo anti-IL-lRl. Os promotores são sequências não transcritas localizadas a montante (i. e., 5') do codão de iniciação de um gene estrutural (habitualmente dentro de cerca de 100 a 1000 pb) que controlam a transcrição do gene estrutural. Os promotores são convencionalmente agrupados em uma de duas classes: promotores indutíveis e promotores constitutivos. Os promotores indutíveis iniciam níveis aumentados de transcrição a partir de ADN sob o seu controlo, em resposta a alguma alteração nas condições de cultura, tais como a presença ou ausência de um nutriente ou uma alteração na temperatura. Os promotores constitutivos, por outro lado, iniciam produção contínua de produto génico; isto é, existe pouco ou nenhum controlo sobre a expressão génica. É bem 65 conhecido um grande número de promotores, reconhecidos por uma variedade de potenciais células hospedeiras. Um promotor adequado está operativamente ligado ao ADN que codifica a cadeia pesada ou a cadeia leve, compreendendo um anticorpo anti-IL-lRl da invenção por remoção do promotor da fonte de ADN por digestão com enzimas de restrição e introdução da sequência promotora desejada no vector.

Os promotores adequados para a utilização com hospedeiros de levedura são também bem conhecidos na técnica. Os intensificadores de levedura são vantajosamente utilizados com promotores de levedura. Os promotores adequados para utilização com células hospedeiras de mamífero são bem conhecidos e incluem, mas não estão limitados àqueles obtidos a partir dos genomas de vírus, tais como vírus polioma, vírus da difteria aviária, adenovírus (tal como adenovírus 2), vírus do papiloma bovino, vírus do sarcoma aviário, citomegalovírus, retrovírus, vírus da hepatite-B e, de um modo muito preferido, Vírus Símio 40 (SV40). Outros promotores adequados de mamífero incluem promotores heterólogos de mamífero, por exemplo, promotores de choque térmico e o promotor de actina.

Promotores adicionais que podem ter interesse incluem, mas não estão limitados a: a região promotora precoce de SV40 (Bernoist e Chambon, 1981, Nature 290:304-10); o promotor CMV; o promotor contido na longa repetição do terminal 3' do vírus do sarcoma de Rous (Yamamoto et al., 1980, Cell 22:787-97); o promotor da timidina cinase de herpes (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad Sei. USA 78:1444-45); as sequências reguladoras do gene da metalotionina (Brinster et al., 1982, Nature 296:39-42); vectores de expressão procarióticos, tal como o promotor da beta-lactamase (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75:3727-31); ou o promotor tac (DeBoer 66 et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80:21-25). Também de interesse são as seguintes regiões de controlo transcripcional de animal, as quais apresentam especificidade de tecido e foram utilizadas em animais transgénicos: a região de controlo do gene I da elastase que está activo em células acinares pancreáticas (Swift et al., 1984, Cell 38:639-46; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409 (1986); MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515); a região de controlo do gene da insulina que está activo em células beta pancreáticas (Hanahan, 1985, Nature 315:115-22); a região de controlo do gene da imunoglobulina que está activo em célula linfóides (Grosschedl et al., 1984, Cell 38:647-58; Adames et al., 1985, Nature 318:533-38; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:1436-44); a região de controlo do vírus do tumor mamário de murganho que está activo em células testiculares, mamárias, linfóides e mastócitos (Leder et al., 1986, Cell 45:485-95); a região de controlo do gene da albumina que está activo no fígado (Pinkert et al., 1987, Genes e Devei. 1:268-76); a região de controlo do gene da alfa-feto-proteína que está activo no fígado (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639-48; Hammer et al., 1987, Science 235:53-58); a região de controlo do gene da alfa 1-antitripsina que está activo no fígado (Kelsey et al., 1987, Genes e Devei. 1:161-71); a região de controlo do gene da beta-globina que está activo em célula mielóides (Mogram et al., 1985, Nature 315:338-40; Kollias et al., 1986, Cell 46:89-94); a região de controlo do gene da proteína básica de mielina que está activo em células oligodendrócitas no cérebro (Readhead et al., 1987, Cell 48:703-12); a região de controlo do gene da cadeia-2 leve da miosina que está activo no músculo-esquelético (Sani, 1985, Nature 314:283-86); e a região de controlo do gene da hormona libertadora de gonadotrofina que está activo no hipotálamo (Mason et al., 1986, Science 234:1372-78). 67

Uma sequência intensificadora pode ser introduzida no vector para aumentar a transcrição do ADN que codifica a cadeia leve ou a cadeia pesada, compreendendo um anticorpo anti-IL-lRl da invenção, por eucariotas superiores. Os intensificadores são elementos de actuação cis de ADN, habitualmente com cerca de 10-300 pb de comprimento que actuam no promotor para aumentar a transcrição. Os intensificadores são relativamente independentes quanto à orientação e posição. Têm sido encontrados a 5' e 3' da unidade de transcrição. São conhecidas diversas sequências intensificadoras disponíveis a partir de genes de mamífero (e. g., globina, elastase, albumina, alfa-feto-proteína e insulina). Tipicamente, contudo, é utilizado um intensificador de um vírus. O intensificador SV40, o intensificador do promotor precoce de citomegalovírus, o intensificador de polioma e intensificadores de adenovírus conhecidos na técnica, são elementos intensificadores exemplificativos para a activação de promotores eucarióticos. Embora um intensificador possa sofrer splice no vector a uma posição 5' ou 3' de uma molécula de ácido nucleico, está tipicamente localizado num local a 5' do promotor.

Os vectores de expressão da invenção podem ser construídos a partir de um vector inicial, tal como um vector comercialmente disponível. Tais vectores podem ou não conter todas as sequências flanqueadoras desejadas. Nos casos em que uma ou mais das sequências flanqueadoras aqui descritas não estão ainda presentes no vector, estas podem ser obtidas individualmente e ligadas no vector. Os métodos utilizados para obter cada das sequências flanqueadoras são bem conhecidos de um especialista na técnica. 68

Depois o vector ter sido construído e uma molécula de ácido nucleico que codifica a cadeia leve ou a cadeia pesada compreendendo um anticorpo anti-IL-lRl ter sido introduzida no local apropriado do vector, o vector completo pode ser introduzido numa célula hospedeira adequada para amplificação e/ou expressão do polipéptido. A transformação de um vector de expressão para um anticorpo anti-IL-lRl numa célula hospedeira seleccionada pode ser realizada por métodos bem conhecidos incluindo transfecção, infecção, co-precipitação com fosfato de cálcio, electroporação, microinjecção, lipofecção, transfecção mediada por DEAE-dextrano ou outras técnicas conhecidas. 0 método seleccionado será em parte uma função do tipo de célula hospedeira a ser utilizada. Estes métodos e outros métodos adequados são bem conhecidos do especialista na técnica, e são apresentados, por exemplo, em Sambrook et al., supra. A célula hospedeira, quando cultivada sob condições apropriadas, sintetiza um anticorpo anti-IL-lRl que pode ser subsequentemente recolhido do meio de cultura (se a célula hospedeira segregar para o meio) ou directamente a partir da célula hospedeira que o produz (se não for segregado). A selecção de uma célula hospedeira apropriada dependerá de vários factores, tais como níveis desejados de expressão, modificações do polipéptido que são desejáveis ou necessárias para a actividade (tais como glicosilação ou fosforilação) e a facilidade de se enrolar numa molécula biologicamente activa.

As linhas celulares de mamífero disponíveis como hospedeiras para a expressão são bem conhecidas na técnica e incluem, mas não estão limitadas a, muitas linhas celulares imortalizadas disponíveis a partir da American Type Culture Collection (A.T.C.C.), incluindo mas não limitadas, às células de ovário de hamster Chinês (CHO), células HeLa, células de rim de cria de 69 hamster (ΒΗΚ), células de rim de macaco (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (e. g. , Hep G2) e uma variedade de outras linhas celulares. Em determinadas formas de realização, pode-se seleccionar linhas celulares por determinação de quais linhas celulares têm níveis elevados de expressão e produzem anticorpos com propriedades de ligação a IL-1R1 constitutivas. Noutra forma de realização, pode-se seleccionar uma linha celular a partir da linhagem de células B que não produz os seus próprios anticorpos, mas tem a capacidade para produzir e segregar um anticorpo heterólogo (e. g., linhas celulares NSO e SP2/0 de mieloma de murganho).

Os anticorpos da invenção são úteis para detectar IL-1R1 em amostras biológicas e na identificação de células ou tecidos que produzem a proteína IL-1R1. Os referidos anticorpos que se ligam a IL-1R1 e bloqueiam a interacção com outros compostos de ligação, têm utilização terapêutica na modulação de doenças mediadas por IL-1. Em formas de realização preferidas, os anticorpos para IL-1R1 podem bloquear a ligação de IL-1R1 a IL-1β ou IL-Ια, o que pode resultar na interrupção da cascata de transdução de sinal de IL-1.

Os anticorpos da invenção que se ligam especificamente a IL-1R1 podem ser úteis no tratamento de doenças mediadas por IL-1, como discutidas abaixo. Os referidos anticorpos podem ser utilizados em ensaios de ligação para detectar a ligação de IL-1R1 e a sua capacidade para inibir IL-1R1 de formar um complexo com IL-Ιβ e com a proteína acessória IL-1R (IL-lRAcP) ou com IL-Ια e IL-lRAcP.

Em determinadas formas de realização, a invenção proporciona métodos para tratar distúrbios médicos associados com reacções inflamatórias mediadas por IL-1 ou reacções imunorreguladoras 70 mediadas por IL-1. Os métodos da invenção incluem a administração de um anticorpo anti-ILIRl da invenção a um indivíduo que sofra de uma doença inflamatória ou imunorreguladora que seja mediada por IL-1. Como aqui utilizadas, os termos "efermidade", "doença", "estado patológico" ou "estado anómalo" são utilizadas indiscriminadamente com a expressão "distúrbio médico".

Numa forma de realização particular, os métodos da invenção envolvem a administração a um doente de um anticorpo anti-IL-lRl da invenção, para prevenir assim a ligação de IL-1 a seu receptor de superfície celular (IL-1R1).

Para tratar um distúrbio médico caracterizado por expressão anómala ou excessiva de IL-1 ou sinalização anómala ou excessiva de IL-1, uma molécula compreendendo um anticorpo para IL-1R de tipo I desta invenção é administrada ao doente numa quantidade e duração suficiente para induzir uma melhoria sustida em, pelo menos, um indicador que reflecte a gravidade do distúrbio. Uma melhoria é considerada "sustida" se o doente apresentar a melhoria em, pelo menos, duas ocasiões separadas por uma a quatro semanas. 0 grau de melhoria é determinado com base em sinais ou sintomas, e pode também utilizar questionários que são colocados ao doente, tal como questionários de qualidade-devida .

Os vários indicadores que reflectem a extensão da doença do doente podem ser avaliados para determinar se a quantidade e duração do tratamento são suficientes. 0 valor de linha de base para o indicador ou indicadores escolhidos é estabelecido por examinação do doente antes da administração da primeira dose do anticorpo. De um modo preferido, a examinação da linha de base é feita no período de cerca de 60 dias da administração da 71 primeira dose. Se o anticorpo de IL-1R for administrado para tratar sintomas agudos, tal como, por exemplo, para tratar lesões traumáticas (lesão traumática do joelho, acidente vascular cerebral, lesão da cabeça, etc.), a primeira dose é administrada assim que praticavelmente possível, após a lesão ou o evento ter ocorrido. A melhoria é induzida por administração repetitiva de uma dose de anticorpo até o doente manifestar uma melhoria face à linha de base, para o indicador ou indicadores escolhidos. No tratamento de estados crónicos, este grau de melhoria é obtido por administração repetitiva deste medicamento durante um período de, pelo menos, um mês ou mais, e. g., durante um, dois, ou três meses ou mais, ou indefinidamente. Um período de uma a seis semanas, ou mesmo uma única dose, são frequentemente suficientes para tratar estados agudos.

Embora o grau de enfermidade do doente após tratamento possa parecer melhorado de acordo com um ou mais indicadores, o tratamento pode ser continuado indefinidamente ao mesmo nível ou numa dose ou frequência reduzida. Uma vez reduzido ou interrompido o tratamento, este pode mais tarde ser recomeçado ao nível original, se os sintomas reaparecerem.

Qualquer via de administração eficaz pode ser utilizada para administrar terapeuticamente o anticorpo. 0 anticorpo pode ser injectado por via intra-articular, intravenosa, intramuscular, intralesão, intraperitoneal, intracraniana, inalação ou injecção subcutânea de bolus ou por infusão contínua. Por exemplo, as doenças pulmonares podem envolver métodos intranasais e de inalação. Outros meios adequados de administração incluem libertação sustida a partir de implantes, inalação de aerossóis, colírios, preparações orais, incluindo pílulas, xaropes, 72 pastilhas ou pastilha elástica, e preparações tópicas, tais como loções, géis, pulverizadores, unguentos ou outras técnicas adequadas. A administração por inalação é particularmente benéfica no tratamento de doenças associadas com distúrbios pulmonares.

Numa forma de realização da invenção, um anticorpo anti-IL-lRl da invenção pode ser administrado uma vez por mês. Noutra forma de realização, o anticorpo é administrado uma vez de duas em duas semanas ou uma vez por semana para tratar os vários distúrbios médicos aqui divulgados. Ainda noutra forma de realização, o anticorpo é administrado, pelo menos, duas vezes por semana e numa outra forma de realização é administrado, pelo menos, uma vez por dia. Um doente adulto é uma pessoa que tem 18 anos de idade ou mais. Se injectada, a quantidade eficaz, por dose de adulto, varia desde 1-200 mg/m2 ou desde 1-40 mg/m2 ou cerca de 5-25 mg/m2. Alternativamente, uma dose fixa pode ser administrada, cuja quantidade possa variar desde 2-400 mg/dose, 2-100 mg/dose ou desde cerca de 10-80 mg/dose. Se a dose for para ser administrada mais do que uma vez por semana, uma gama de dosagem exemplificativa é a mesma como as gamas de dosagem descritas anteriormente ou inferior. Numa forma de realização da invenção, as várias indicações descritas abaixo são tratadas por administração de uma preparação aceitável para injecção contendo anticorpo para o receptor de IL-1 a 80-100 mg/dose ou, alternativamente, contendo 80 mg por dose. A dose é administrada repetidamente. Se for utilizada uma via de administração diferente de injecção, a dose é ajustada, apropriadamente, de acordo com práticas médicas convencionais. Por exemplo, se a via de administração for por inalação, a dosagem pode ser uma a sete vezes por semana a gamas de dose desde 10 mg/dose a 50 mg por dose. 73

Em formas de realização preferidas, a invenção também proporciona composições farmacêuticas compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ou mais anticorpos da invenção em conjunto com um diluente, veiculo, solubilizante, emulsionante, conservante e/ou adjuvante farmaceuticamente aceitáveis. De um modo preferido, os materiais de formulação aceitáveis são não tóxicos para os receptores nas dosagens e concentrações utilizadas. Em formas de realização preferidas, são proporcionadas composições farmacêuticas compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de anticorpos anti-IL-lRl.

Em determinadas formas de realização, a composição farmacêutica pode conter materiais de formulação para modificar, manter ou preservar, por exemplo, o pH, osmolaridade, viscosidade, limpidez, cor, isotonicidade, odor, esterilidade, estabilidade, taxa de dissolução ou libertação, adsorção ou penetração da composição. Em tais formas de realização, os materiais de formulação adequados incluem, mas não estão limitados a, aminoácidos (tais como glicina, glutamina, asparagina, arginina ou lisina); antimicrobianos; antioxidantes (tais como ácido ascórbico, sulfito de sódio ou hidrogenossulfito de sódio); tampões (tais como borato, bicarbonato, Tris-HCl, citratos, fosfatos ou outros ácidos orgânicos) ; agentes de volume (tais como manitol ou glicina); agentes quelantes (tal como ácido etilenodiaminatetraacético (EDTA)); agentes de complexação (tais como cafeína, polivinilpirrolidona, beta-ciclodextrina ou hidroxipropil-beta-ciclodextrina); enchimentos; monossacáridos; dissacáridos; e outros hidratos de carbono (tais como glucose, manose ou dextrinas); proteínas (tais como albumina, gelatina ou imunoglobulinas séricas); corantes, aromatizantes e agentes de diluição; agentes emulsionantes; polímeros hidrofílicos (tal como polivinilpirrolidona); polipéptidos de baixo peso 74 molecular; contra-iões formadores de sal (tal como sódio); conservantes (tais como cloreto de benzalcónio, ácido benzóico, ácido salicilico, timerosal, álcool feniletilico, metilparabeno, propilparabeno, cloro-hexidina, ácido sórbico ou peróxido de hidrogénio); solventes (tais como glicerina, propilenoglicol ou polietilenoglicol) ; álcoois de açúcar (tais como manitol ou sorbitol); agentes de suspensão; agentes tensioactivos ou agentes molhantes (tais como pluronics, PEG, ésteres de sorbitano, polissorbatos, tais como polissorbato 20, polissorbato 80, triton, trimetamina, lecitina, colesterol, tiloxapal); agentes estabilizantes (tais como sacarose ou sorbitol); agentes aumentadores de tonicidade (tais como halogenetos de metal alcalino, de um modo preferido, cloreto de sódio ou potássio, manitol, sorbitol); veiculos de distribuição; diluentes; excipientes e/ou adjuvantes farmacêuticos. Ver, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a edição, (A.R Gennaro, ed.), 1990, Mack Publishing Company.

Em determinadas formas de realização, a composição farmacêutica óptima será determinada por um especialista na técnica dependendo, por exemplo, da via de administração pretendida, formato de distribuição e dosagem desejada. Ver, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, supra. Em determinadas formas de realização, tais composições podem influenciar o estado físico, estabilidade, taxa de libertação in vivo e taxa de eliminação in vivo dos anticorpos da invenção.

Em determinadas formas de realização, o veículo ou transportador primário numa composição farmacêutica pode ser de natureza aquosa ou não aquosa. Por exemplo, um veiculo ou transportador adequado podem ser água para injecção, solução salina fisiológica ou fluido cefalorraquidiano artificial, possivelmente suplementados com outros materiais comuns em 75 composições para administração parentérica. Soro fisiológico tamponado a pH neutro ou soro fisiológico misturado com albumina sérica são veículos exemplificativos adicionais. Em formas de realização preferidas, as composições farmacêuticas compreendem tampão Tris de cerca de pH 7,0-8,5, ou tampão acetato de cerca de pH 4,0-5,5, e podem ainda incluir sorbitol ou um seu substituto adequado. Em determinadas formas de realização da invenção, as composições de anticorpo anti-IL-lRl podem ser preparadas para armazenamento por mistura da composição seleccionada que tem o grau de pureza desejado com agentes de formulação opcionais (Remington's Pharmaceutical Sciences, supra) na forma de um bolo liofilizado ou de uma solução aquosa. Além disso, em determinadas formas de realização, o produto de anticorpo anti-IL-lRl pode ser formulado como um liofilizado utilizando excipientes apropriados, tal como sacarose.

As composições farmacêuticas da invenção podem ser seleccionadas para distribuição parentérica. As composições podem ser seleccionadas para inalação ou para distribuição através do tracto digestivo, tal como oralmente. A preparação de tais composições farmaceuticamente aceitáveis está dentro da especialidade da técnica.

Os componentes de formulação estão presentes, de um modo preferido, em concentrações que são aceitáveis ao local de administração. Em determinadas formas de realização, são utilizados tampões para manter a composição a pH fisiológico ou a um pH ligeiramente mais baixo, tipicamente dentro de uma gama de pH desde cerca de 5 a cerca de 8.

Quando a administração parentérica está contemplada, as composições terapêuticas para utilização nesta invenção podem ser proporcionadas na forma de uma solução aquosa apirógena, 76 parentericamente aceitável, compreendendo o anticorpo anti-IL-lRl desejado num veiculo farmaceuticamente aceitável. Um veiculo particularmente adequado para injecção parentérica é água destilada estéril em que o anticorpo anti-IL-lRl é formulado como uma solução isotónica estéril, correctamente conservada. Em determinadas formas de realização, a formulação pode envolver a preparação da molécula desejada com um agente, tais como microesferas injectáveis, partículas bioerodiveis, compostos poliméricos (tais como ácido poliláctico ou ácido poliglicólico) , esferas ou lipossomas, as quais podem proporcionar libertação controlada ou sustida do produto que pode ser distribuído através de injecção de depot. Em determinadas formas de realização, o ácido hialurónico pode também ser utilizado, o qual tem o efeito de promover a duração sustida na circulação. Em determinadas formas de realização, podem ser utilizados dispositivos implantáveis de distribuição de fármaco para introduzir a molécula de anticorpo desejada.

As composições farmacêuticas da invenção podem ser formuladas para inalação. Nestas formas de realização, os anticorpos anti-IL-lRl são formulados como um pó seco para inalação. Em formas de realização preferidas, podem também ser formuladas soluções de inalação de anticorpo anti-IL-lRl com um propulsor para distribuição do aerossol. Em determinadas formas de realização, as soluções podem ser nebulizadas. A administração pulmonar e os seus métodos de formulação são ainda descritos na Publicação da Patente Internacional N° W094/20069, que descreve a distribuição pulmonar de proteínas quimicamente modificadas.

Está também contemplado que as formulações podem ser administradas oralmente. Os anticorpos Anti-IL-lRl que são administrados desta forma, podem ser formulados com ou sem 77 veículos habitualmente utilizados na preparação de formas de dosagem sólida, tais como comprimidos e cápsulas. Em determinadas formas de realização, uma cápsula pode ser concebida para libertar a parte activa da formulação no tracto gastrointestinal quando a biodisponibilidade é maximizada e a degradação pré-sistémica é minimizada. Podem ser incluídos agentes adicionais para facilitar a absorção do anticorpo anti-IL-lRl. Podem também ser utilizados diluentes, aromatizantes, ceras de baixo ponto de fusão, óleos vegetais, lubrificantes, agentes de suspensão, agentes de desintegração de comprimido e aglutinantes.

Uma composição farmacêutica da invenção é, de um modo preferido, proporcionada de modo a compreender uma quantidade eficaz de uma ou mais anticorpos anti-IL-lRl numa mistura com excipientes não tóxicos que são adequados para o fabrico de comprimidos. Ao dissolver os comprimidos em água estéril, ou noutro veículo apropriado, as soluções podem ser preparadas na forma de dose unitária. Os excipientes adequados incluem, mas não estão limitados a, diluentes inertes, tais como carbonato de cálcio, carbonato ou bicarbonato de sódio, lactose ou fosfato de cálcio; ou agentes de ligação, tais como amido, gelatina ou acácia; ou agentes lubrificantes, tais como estearato de magnésio, ácido esteárico ou talco.

Composições farmacêuticas adicionais serão evidentes aos especialistas na técnica, incluindo formulações que envolvem anticorpos anti-IL-lRl em formulações de distribuição sustida ou controlada. As técnicas para formular uma variedade de outros meios de distribuição sustida ou controlada, tais como transportadores lipossomais, micropartícuias bioerodíveis ou esferas porosas e injecções de depot, são também conhecidas dos especialistas na técnica. Ver, por exemplo, Publicação da 78

Patente Internacional N° W093/15722 que descreve a libertação controlada de microparticulas poliméricas porosas para a distribuição de composições farmacêuticas. As preparações de libertação sustida podem incluir matrizes poliméricas semi-permeáveis na forma de artigos com forma, e. g., películas ou microcápsulas. As matrizes de libertação sustida podem incluir poliésteres, hidrogéis, polilactidas (como divulgadas na Patente U.S. N° 3773919 e na Publicação do Pedido de Patente Europeia N° EP 058481), copolímeros de ácido L-glutâmico e gama-etil-L-glutamato (Sidman et ai., 1983, Biopolymers 22:547-556), poli(2-hidroxietil-metacrilato) (Langer et al., 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277 e Langer, 1982, Chem. Tech. 12:98-105), acetato de viniletileno (Langer et al., supra) ou ácido poli-D(-)-3-hidroxibutírico (Publicação do Pedido de Patente Europeia N° EP 133988). As composições de libertação sustida podem também incluir lipossomas que podem ser preparados por qualquer um de vários métodos conhecidos na técnica. Ver, e. g., Eppstein et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:3688-3692; Publicações do Pedido de Patente Europeia N° EP 036676; EP 088046 e EP 143949.

As composições farmacêuticas utilizadas para administração in vivo são tipicamente proporcionadas como preparações estéreis. A esterilização pode ser realizada por filtração através de membranas de filtração estéreis. Quando a composição é liofilizada, a esterilização utilizando este método pode ser realizada antes ou depois da liofilização e reconstituição. As composições para administração parentérica podem ser armazenadas em forma liofilizada ou numa solução. As composições parentéricas são habitualmente colocadas num recipiente que tem um ponto de acesso estéril, por exemplo, um saco ou frasquinho de solução intravenosa que tem uma tampa perfurável por uma agulha hipodérmica de injecção. 79

Uma vez formulada a composição farmacêutica, esta pode ser armazenada em frasquinhos estéreis como uma solução, suspensão, gel, emulsão, sólido ou como um pó desidratado ou liofilizado. Tais formulações podem ser armazenadas numa forma pronta a utilizar ou numa forma (e. g. , liofilizada) que é reconstituída antes da administração. A invenção também proporciona kits para produzir uma unidade de administração de dose única. Os kits da invenção podem, cada, um conter um primeiro recipiente que tem uma proteína desidratada e um segundo recipiente que tem uma formulação aquosa. Em determinadas formas de realização desta invenção, são proporcionados kits contendo seringas pré-cheias de câmara única a multicâmara (e. g., seringas com líquidos e seringas com liofilizados). A quantidade eficaz de uma composição farmacêutica contendo anticorpo anti-IL-lRl a ser utilizada terapeuticamente depende, por exemplo, do contexto terapêutico e dos objectivos. Um especialista na técnica entenderá que os níveis apropriados de dosagem para o tratamento irão variar dependendo, em parte, da molécula distribuída, da indicação para o qual o anticorpo anti-IL-1R1 está a ser utilizado, da via de administração e do tamanho (peso corporal, superfície corporal ou tamanho do órgão) e/ou estado do doente (idade e saúde geral). Em determinadas formas de realização, o clínico assistente pode titular a dosagem e modificar a via de administração para obter o efeito terapêutico óptimo. Uma dosagem típica pode variar desde cerca de 0,1 pg/kg até cerca de 100 mg/kg ou mais, dependendo dos factores acima mencionados. Em formas de realização preferidas, a dosagem pode variar desde 0,1 pg/kg até cerca de 100 mg/kg; de um modo mais preferido, desde 1 pg/kg até cerca de 100 mg/kg; ou 80 de um modo ainda mais preferido, desde 5 yg/kg até cerca de 100 mg/kg. A frequência de dosagem irá depender dos parâmetros farmacocinéticos do anticorpo anti-IL-lRl particular na formulação utilizada. Tipicamente, um clinico assistente administra a composição até ser alcançada uma dosagem que consiga o efeito desejado. A composição pode assim ser administrada como uma dose única, ou como duas ou mais doses (que pode ou não conter a mesma quantidade da molécula desejada) ao longo do tempo, ou como uma infusão continua através de um dispositivo implantado ou um cateter. Refinamentos adicionais da dosagem apropriada são feitos rotineiramente pelos técnicos com conhecimento geral na matéria e está dentro do âmbito das tarefas realizadas rotineiramente pelos mesmos. As dosagens apropriadas podem ser verificadas através da utilização de dados de resposta à dose apropriados. A via de administração da composição farmacêutica é de acordo com métodos conhecidos, e. g., oralmente, através de injecção por via intravenosa, intraperitoneal, intracerebral (intra-parenquimal), intracerebroventricular, intramuscular, intra-ocular, intra-arterial, intraportal ou intralesão; sistemas de libertação sustida ou através de dispositivos de implantação. Em determinadas formas de realização, as composições podem ser administradas por injecção de bolus ou continuamente por infusão, ou por implantação de dispositivo. A composição pode também ser administrada localmente através de implantação de uma membrana, esponja ou outro material apropriado sobre o qual a molécula desejada foi absorvida ou encapsulada. Em determinadas formas de realização, quando é utilizado um dispositivo de implantação, o dispositivo pode ser 81 implantado em qualquer tecido ou órgão adequado e a distribuição da molécula desejada pode ser através de difusão, bolus de libertação temporizada ou administração continua.

Também pode ser desejável utilizar composições farmacêuticas do anticorpo anti-IL-lRl de acordo com a invenção ex vivo. Em tais casos, as células, tecidos ou órgãos que foram removidos do doente são expostos às composições farmacêuticas de anticorpo anti-IL-lRl após o que as células, tecidos e/ou órgãos são, subsequentemente, implantados de volta ao doente.

Em particular, os anticorpos anti-IL-lRl podem ser distribuídos por implantação de determinadas células que foram manipuladas geneticamente, utilizando métodos como aqueles aqui descritos, para expressar e segregar o polipéptido. Em determinadas formas de realização, tais células podem ser células animais ou humanas, e podem ser autólogas, heterólogas ou xenogénicas. Em determinadas formas de realização, as células podem ser imortalizadas. Noutras formas de realização, de modo a diminuir a possibilidade de uma resposta imunológica, as células podem ser encapsuladas para evitar a infiltração de tecidos circundantes. Em formas de realização adicionais, os materiais de encapsulação são tipicamente membranas ou invólucros poliméricos semi-permeáveis biocompatíveis que permitem a libertação de um ou mais produtos proteicos, mas previnem a destruição das células pelo sistema imune do doente ou por outros factores prejudiciais dos tecidos circundantes.

Em determinadas formas de realização, a invenção abrange ainda a administração de um anticorpo anti-IL-lRl ou de uma composição farmacêutica da invenção simultaneamente com um ou mais outros fármacos que são administrados ao mesmo doente, sendo cada fármaco administrado de acordo com um regime adequado 82 para esse medicamento. Isto abrange pré-tratamento, tratamento simultâneo, tratamento sequencial e regimes alternantes. Os exemplos de tais fármacos incluem, mas não estão limitados a, antivirais, antibióticos, analgésicos, corticosteróides, antagonistas de citocinas inflamatórias, fármacos anti-reumáticos modificadores da doença (DMARD) e anti-inflamatórios não esteróides.

Noutras formas de realização, um anticorpo anti-IL-lRl ou uma composição farmacêutica da invenção pode ser administrado em combinação com outros inibidores de citocinas, incluindo aqueles que antagonizam, por exemplo, RANKL, ΤΘΓβ, IFNy, IL-6 ou IL-8 e TNF, particularmente TNFcx. Em combinação com IL-6, um anticorpo deste invenção pode ser utilizado para tratar e prevenir a recorrência de convulsões, incluindo convulsões induzidas por antagonismo do receptor GABAa, convulsões associadas com episódios ictais de EEG e convulsões limbicas motoras que ocorrem durante o estado epiléptico. Em combinação com um inibidor de IFNy, um anticorpo desta invenção é útil no tratamento de fibrose pulmonar idiopática e fibrose cistica. A combinação de um anticorpo do receptor de IL-1 e de inibidores RANKL, e. g., um anticorpo RANKL é útil para prevenir a destruição óssea em vários cenários incluindo, mas não limitado a, vários distúrbios reumáticos, osteoporose, mieloma múltiplo ou outras malignidades que causam degeneração óssea, ou terapia antitumoral com vista a prevenir metástases ósseas, ou destruição óssea associada com detritos do desgaste de próteses ou com periodontite. Além disso, os anticorpos da invenção podem ser administrados em combinação com inibidores de IL-17, tal como formas solúveis de um receptor de IL-17 (tal como IL-17R:Fc) ou um anticorpo de IL-17 ou um anticorpo de IL-17R, proteína de ligação a IL-18, formas solúveis de receptores de 83 IL-18 e anticorpos de IL-18, anticorpos contra receptores de IL-18 ou anticorpos contra o ligando de CD30 ou contra CD4. A invenção abrange ainda métodos para utilizar um anticorpo anti-ILIRl ou uma composição farmacêutica da invenção no tratamento dos distúrbios médicos aqui divulgados em combinação com um inibidor de TNF, de um modo preferido, TNFR:Fc (ENBREL®) e qualquer combinação de citocinas ou inibidores de citocinas descritos acima que são agentes activos em terapias de combinação. Por exemplo, de acordo com a presente invenção, podem ser utilizados métodos de terapia de combinação para tratar a artrite reumatóide, acidente vascular cerebral, asma, psoriase, etc.

Os estados tratados eficazmente por um anticorpo anti-IL-lRl ou composição farmacêutica aqui descrita, incluem doenças pulmonares, tais como asma, doença pulmonar obstrutiva crónica, proteinose alveolar pulmonar, fibrose e pneumopatia induzida por bleomicina, fibrose pulmonar induzida por radiação, fibrose cística, acumulação de colagénio nos pulmões e ARDS, todas as quais podem ser tratadas com combinações de um anticorpo de IL-1R e um inibidor de IL-4 e/ou um inibidor de IL-13, e. g., anticorpo do IL-4R que inibe a actividade de IL-13 e IL-4. Os anticorpos e as composições farmacêuticas divulgadas da invenção são também úteis para tratar displasia bronco-pulmonar (BPD); doenças pulmonares obstrutivas crónicas (e. g., enfisema e bronquite crónica) e doença pulmonar fibrótica crónica de bebes prematuros. Além disso, os compostos, composições e terapias de combinação da invenção são utilizados para tratar doenças pulmonares ocupacionais, incluindo asbestose, pneumoconiose do mineiro de carvão, silicose ou estados semelhantes associados com a exposição a longo prazo a partículas finas. Noutros aspectos da invenção, os compostos, composições e terapias de 84 combinação divulgados são utilizados para tratar bronquiolite obliterante com pneumonia organizada, fibrose pulmonar incluindo fibrose pulmonar idiopática e fibrose pulmonar induzida por radiação; sarcoidose pulmonar; e alergias, incluindo rinite alérgica, dermatite de contacto, dermatite atópica e asma.

Tais combinações são úteis também para tratar doentes que sofrem de vários distúrbios da pele, incluindo mas não limitados a, dermatite herpetiforme (doença de Duhring), dermatite atópica, dermatite de contacto, urticária (incluindo urticária idiopática crónica) e doenças bolhosas auto-imunes, incluindo pênfigo vulgar e penfigóide bolhoso. Outras doenças tratáveis com a combinação de um anticorpo de IL-1R e IL-4 e/ou um inibidor de IL-13 incluem miastenia grave, sarcoidose, incluindo sarcoidose pulmonar, escleroderma, artrite reactiva, sindrome de IgE hyper, esclerose múltipla e sindrome hipereosinofilica idiopática. A combinação é utilizada também para tratar reacções alérgicas a medicação e como um adjuvante para imunoterapia de alergia.

Os anticorpos do receptor de IL-1 e as composições farmacêuticas aqui descritas são úteis para tratar doenças protozoárias, incluindo malária e esquistossomose e para tratar eritema nodoso leproso; meningite bacteriana ou virai; tuberculose, incluindo tuberculose pulmonar; e pneumonite secundária a uma infecção bacteriana ou virai, incluindo infecção com influenza e mononucleose infecciosa.

Os distúrbios e lesões cardiovasculares são tratáveis e/ou preveniveis com as composições farmacêuticas ou os anticorpos anti-ILl-Rl divulgadas, isoladamente ou em combinação com outros inibidores de citocinas. Os distúrbios cardiovasculares tratáveis incluem aneurismas aórticos; incluindo aneurismas 85 aórticos abdominais, síndrome coronária aguda, arterite; oclusão vascular, incluindo oclusão da artéria cerebral; complicações de cirurgia de bypass coronário; lesão de isquemia/reperfusão; doença cardíaca, incluindo doença cardíaca aterosclerótica, miocardite, incluindo miocardite auto-imune crónica e miocardite virai; insuficiência cardíaca, incluindo insuficiência cardíaca crónica, insuficiência cardíaca congestiva, caquexia de insuficiência cardíaca; enfarte do miocárdio; restenose e/ou aterosclerose após cirurgia cardíaca ou após processos de angioplastia de balão da artéria carótida; isquemia do miocárdio silenciosa; disfunção ventricular esquerda, complicações pós-implantação de dispositivos de assistência ventricular esquerda; Fenómenos de Raynaud; tromboflebite; vasculite, incluindo vasculite de Kawasaki; doença veno-oclusiva, arterite de células gigante, granulomatose de Wegener; confusão mental após cirurgia de bypass cardiopulmonar e púrpura de Schoenlein-Henoch.

Em determinadas formas de realização, os anticorpos anti-IL-lRl e as composições farmacêuticas da invenção podem ser também utilizados para tratar estados crónicos de dor, tal como dor pélvica crónica, incluindo síndrome de dor prostatite/pélvica crónica e dor pós-herpética.

Os distúrbios do sistema endócrino incluindo diabetes com início na juventude (inclui diabetes mellitus auto-imune e tipos de diabetes dependentes de insulina) e diabetes de maturidade (inclui diabetes não dependente de insulina e mediada por obesidade) podem também ser tratados com anticorpos anti-IL-lRl ou composições farmacêuticas da invenção. Tal tratamento a estados secundários associados com diabetes, tais como retinopatia diabética, rejeição de transplante renal em doentes diabéticos, resistência à insulina mediada por obesidade e 86 insuficiência renal, a qual pode estar associada com proteinúria e hipertensão. Outros distúrbios endócrinos são também tratáveis com estes compostos e incluem a doença do ovário policístico, adrenoleucodistrofia ligada ao cromossoma X, hipotiroidismo e tiroidite, incluindo tiroidite de Hashimoto (i. e., tiroidite auto-imune), disfunção da célula tiroideia, incluindo sindrome do doente eutireóideo.

Os estados do sistema gastrointestinal são tratáveis ou preveniveis com anticorpos anti-IL-lRl ou composições farmacêuticas da invenção, isoladamente ou em combinação com outros agentes terapêuticos. Estes estados incluem doença celíaca, doença de Crohn; colite ulcerosa; gastroparesia idiopática; pancreatite, incluindo pancreatite crónica; pancreatite aguda, doença inflamatória intestinal e ulceras, incluindo ulceras gástricas e do duodeno.

Os distúrbios do sistema genito-urinário são também tratáveis ou preveniveis com anticorpos anti-IL-lRl ou composições farmacêuticas aqui descritas. Tais distúrbios incluem glomerulonefrite, incluindo glomerulonefrite auto-imune, glomerulonefrite devido a exposição a toxinas ou glomerulonefrite secundária a infecções com estreptococos hemolíticos ou outros agentes infecciosos. Também tratáveis com os compostos, composições e terapias de combinação da invenção ser a sindrome urémica e as suas complicações clínicas (por exemplo, insuficiência renal, anemia e cardiomiopatia hipertrófica), incluindo sindrome urémica associada com exposição a toxinas, fármacos ou outras causas ambientais. As complicações de inflamação que surgem da parede da bexiga que conduzem à alteração na função de absorção, são tratáveis ou preveniveis com os anticorpos desta invenção. Estão incluídas em tais complicações a colelitíase (cálculo biliar) e a 87 coledocolitíase (pedras do dueto biliar) e a recorrência de colelitiase e coledocolitíase. Estados adicionais tratáveis com os compostos, composições e terapias de combinação da invenção são complicações de hemodiálise; estados da próstata, incluindo hipertrofia benigna da próstata, prostatite não bacteriana e prostatite crónica; e complicações de hemodiálise. São também aqui proporcionados métodos para utilizar anticorpos anti-IL-lRl da invenção, composições e terapias de combinação para tratar vários distúrbios hematológicos e oncológicos. Por exemplo, os anticorpos anti-IL-lRl, isoladamente ou em combinação com outros inibidores de citocinas ou outros agentes activos como acima descritos, podem ser utilizado para tratar várias formas de cancro, incluindo leucemia mielógena aguda, leucemia mielógena crónica, carcinoma nasofaríngeo positivo ao vírus de Epstein-Barr, glioma, cancros do cólon, estômago, próstata, célula renal, do colo do útero e do ovário, cancro do pulmão (SCLC e NSCLC), incluindo caquexia, fatiga, astenia associados ao cancro, síndrome paraneoplásica da caquexia e hipercalcemia. Tumores sólidos, incluindo sarcoma, osteossarcoma e carcinoma, tal como adenocarcinoma (por exemplo, cancro da mama) e carcinoma de células escamosas são também tratáveis. Os cancros tratáveis adicionais incluem cancro do esófago, cancro gástrico, carcinoma da bexiga, leucemia, incluindo leucemia mielógena aguda, leucemia mielógena crónica, leucemia mielóide, leucemia linfoblástica crónica ou aguda e leucemia de células pilosas. Outras malignidades com potencial metastático invasivo, incluindo mieloma múltiplo, podem ser tratadas com os compostos, composições e terapias de combinação em causa.

Além disso, os anticorpos anti-IL-lRl divulgados podem ser utilizados para tratar anemias e distúrbios hematológicos, incluindo neutropenia idiopática crónica, anemia de doença crónica, anemia aplásica, incluindo anemia aplásica de Fanconi; púrpura trombocitopénica idiopática (ITP); púrpura trombocitopénica trombótica, sindromes mielodisplásicas (incluindo anemia refractária, anemia refractária com sideroblastos em anel, anemia refractária com excesso de blastos, anemia refractária com excesso de blastos em transformação); metaplasia de mielofibrose/mielóide; e crise vaso oclusiva de células falciformes. Vários distúrbios linfoproliferativos são também tratáveis com anticorpos anti-IL-lRl da invenção, incluindo síndrome linfoproliferativa auto-imune (ALPS), leucemia linfoblástica crónica, leucemia das células pilosas, leucemia linfática crónica, linfoma de células T periféricas, linfoma linfocitico pequeno, linfoma da célula do manto, linfoma folicular, linfoma de Burkitt, linfoma de células T positivo ao vírus Epstein-Barr, linfoma histiocítico, doença de Hodgkin, linfoma agressivo difuso, leucemias linfáticas agudas, doença linfoproliferativa T gama, linfoma cutâneo de células B, linfoma cutâneo de células T (i. e., micose fungóide) e síndrome de Sézary.

Os estados hereditários, tais como doença de Gaucher, doença de Huntington, doença de IgA linear e distrofia muscular são tratáveis com os anticorpos desta invenção.

Outros estados tratáveis ou preveníveis pelos anticorpos do receptor de IL-1 ou composições farmacêuticas divulgadas, incluem aqueles que resultam de lesões da cabeça ou espinal medula incluindo hematoma subdural devido a traumatismo na cabeça. Em relação a esta terapia, as composições e combinações descritas são adequadas para prevenir lesão neurológica craniana e tratar cefaleia cervicogénica. As composições e combinações 89 descritas são ainda adequadas para tratar efeitos secundários neurológicos associados com irradiação do cérebro.

Os anticorpos anti-IL-lRl e a composição farmacêutica da invenção são também úteis para tratar estados do fígado, tais como hepatite, incluindo hepatite alcoólica aguda, hepatite aguda virai ou induzida por fármaco, hepatite A, B e C, colangite esclerosante, epitélio sinusoidal hepático e inflamação do fígado devido a causas desconhecidas.

Os distúrbios que envolvem a perda de audição e que estão associados com expressão anómala de IL-1 são tratáveis com os anticorpos anti-IL-lRl ou as composições farmacêuticas da invenção. Tais distúrbios incluem perda de audição associada com o nervo coclear que se pensa resultar de um processo auto-imune, i. e., perda de audição auto-imune. Também tratáveis ou preveníveis com os anticorpos anti-IL-lRl ou as composições farmacêuticas da invenção são a síndrome de Ménière e o colesteatoma, um distúrbio do ouvido médio associado frequentemente com a perda de audição.

Os distúrbios não artríticos dos ossos e articulações são também tratáveis com os anticorpos aqui descritos. Isto abrange distúrbios osteoclásticos que conduzem a perda óssea, tal como mas não limitados a, osteoporose, incluindo osteoporose pós-menopáusica, osteodistrofia, periodontite que resulta em dentes a abanar ou a sua perda, e descolamento de próteses após substituição de articulação (habitualmente associada com uma resposta inflamatória aos detritos de desgaste) . Este último estado é também denominado "osteólise de implante ortopédico". Outro estado tratável com os compostos, composições e terapias de combinação da invenção é a disfunção da articulação tempero-mandibular (TMJ). 90

Os anticorpos anti-IL-lRl ou as composições farmacêuticas da invenção podem também ser utilizados para tratar distúrbios reumáticos incluindo artrite reumatóide juvenil e do adulto; escleroderma; lúpus eritematoso sistémico; gota; osteodistrofia; polimialgia reumática; espondiloartropatias soronegativas, incluindo espondilite anguilosante e doença de Reiter, artrite psoriática e artrite de Lyme crónica. Os anticorpos desta invenção são também úteis para tratar inflamação do músculo voluntário e de outros músculos, incluindo dermatomiosite, miosite de corpos de inclusão, polimiosite e linfangioleiomiomatose.

Outra utilização para os anticorpos e as composições farmacêuticas da invenção é o tratamento e/ou a prevenção de amiloidose primária e de amiloidose secundária gue é caracteristica de vários estados incluindo doença de Alzheimer, amiloidose reactiva secundária; Sindrome de Down; e amiloidose associado a diálise. São também tratáveis com os anticorpos ou as composições farmacêuticas da invenção as sindromes herdadas de febre periódica, incluindo febre Mediterrânea familiar, hiperimunoglobulina D e sindrome de febre periódica e sindromes periódicas associadas ao receptor de TNF (TRAPS).

Noutras formas de realização, os anticorpos ou as composições farmacêuticas da invenção podem ser utilizadas para tratar distúrbios que envolvem a pele ou membranas mucosas. Tais distúrbios incluem doenças acantoliticas, incluindo doença de Darier, queratose folicular e pênfigo vulgar. Os distúrbios da pele adicionais que podem ser tratados utilizando anticorpos da invenção incluem acne, acne rosácea, alopécia areata, estomatite aftosa, penfigóide bolhoso, queimaduras, eczema, eritema, incluindo eritema multiforme e eritema multiforme bolhoso (sindrome de Stevens-Johnson), a doença inflamatória da pele, 91 líquen plano, doença bolhosa de IgA linear (dermatose bolhosa crónica da infância), perda de elasticidade da pele, úlceras de superfície mucósica, incluindo úlceras gástricas, dermatite neutrofílica (síndrome de Sweet), dermatomiosite, pitiríase rubra pilaris, psoríase, pioderma gangrenoso, reticulo-histiocitose multicêntrica e necrólise epidérmica tóxica. Outros estados relacionados com a pele tratáveis pelas terapias e terapias de combinação da presente invenção, incluem dermatite herpetiforme.

Os distúrbios adicionais que podem ser tratados com os anticorpos ou as composições farmacêuticas da invenção incluem a doença do enxerto contra o hospedeiro, e complicações que resultam de transplantação de órgãos sólidos, tal como coração, fígado, pele, rim, pulmão (obliteração das vias aéreas do transplante de pulmão) ou outros transplantes, incluindo transplantes de medula óssea.

Os distúrbios oculares são também tratáveis ou preveníveis com os anticorpos anti-IL-lRl ou as composições farmacêuticas divulgadas, incluindo descolamento regmatogénico de retina, e doença inflamatória ocular, incluindo doença inflamatória ocular associada com o fumar e degeneração macular.

Os anticorpos ou as composições farmacêuticas da invenção, como aqui descritas, são úteis para tratar distúrbios que afectam o sistema reprodutivo feminino. Os exemplos incluem, mas não estão limitados a, falha de implantes múltiplos/infertilidade; síndrome de perda fetal ou perde de embrião IV (aborto espontâneo); gravidezes pré-eclampticas ou eclampsia; endometriose, cervicite crónica e trabalho de parto prematuro. 92

Além disso, os anticorpos ou as composições farmacêuticas da invenção são úteis para tratar e/ou prevenir ciática, sintomas de envelhecimento, reacções graves a fármacos (por exemplo, toxicidade de IL-2 ou fibrose e pneumopatia induzida por bleomicina), ou para suprimir a resposta inflamatória antes, durante ou após a transfusão de glóbulos vermelhos alogénicos em cirurgia cardiaca ou outra, ou para tratar uma lesão traumática de um membro ou articulação, tal como lesão traumática do joelho. Vários outros distúrbios médicos tratáveis com os anticorpos anti-IL-lRl ou as composições farmacêuticas divulgadas incluem; esclerose múltipla; Sindrome de Behcet; Sindrome de Sjogren; anemia hemolitica auto-imune; beta talassemia; esclerose lateral amiotrófica (doença de Lou Gehrig); Doença de Parkinson; e tenossinovite de causa desconhecida, assim como vários distúrbios ou doenças auto-imunes associadas com deficiências hereditárias, incluindo atraso mental ligado ao cromossoma X.

Além disso, os anticorpos anti-IL-lRl ou as composições farmacêuticas da invenção são úteis para tratar lesões do sistema nervoso central (SNC), incluindo os efeitos de neurotransmissores neurotóxicos descarregados durante a excitação de inflamação no sistema nervoso central e para inibir ou prevenir o desenvolvimento de cicatrizes gliais em locais de lesão do sistema nervoso central. Em relação à epilepsia e ao tratamento de convulsões, a redução da gravidade e do número de convulsões recorrentes, e redução da gravidade dos efeitos prejudiciais das convulsões, redução da perda neuronal, degeneração neuronal e gliose associada com as convulsões.

As utilizações adicionais para os anticorpos ou as composições farmacêuticas da invenção incluem, mas são limitadas a, tratamento de polineuropatia e miopatia do doente critico 93 (CIPNM), polineuropatia aguda; anorexia nervosa; paralisia de Bell; sindrome de fatiga crónica; demência transmissível, incluindo doença de Creutzfeld-Jacob; neuropatia desmielinizante; Sindrome de Guillain-Barre; doença dos discos vertebrais; Sindrome da guerra do Golfo; polineuropatia desmielinizante inflamatória crónica, miastenia grave; isquemia cerebral silenciosa; distúrbios do sono, incluindo narcolepsia e apneia do sono; degeneração neuronal crónica; e acidente vascular cerebral, incluindo doenças isquémicas cerebrais. Ainda utilizações adicionais para os anticorpos da invenção são a anorexia e/ou estados anoréxicos, peritonite, endotoxemia e choque séptico, formação de granulomas, choque térmico, sindrome de Churg-Strauss, inflamação crónica após infecções agudas, tais como tuberculose e lepra, esclerose sistémica e cicatrização hipertrófica.

Noutras formas de realização, proteínas de fusão de avidina compreendendo uma sequência de aminoácidos de um dos anticorpos de IL-1R1 da invenção podem ser construídas para vários fins. As proteínas de fusão de avidina podem ser produzidas, por exemplo, utilizando um vector de expressão de mamífero contendo uma sequência de ADNc que codifica a avidina recombinante de galinha, adjacente a um local de clonagem múltipla para inserção de um parceiro de fusão específico do gene alvo. 0 vector pode incluir uma sequência de avidina com a sua sequência endógena de sinal para permitir a secreção de parceiros de fusão génica discretos que não contêm naturalmente sequências de sinal. A proteína de fusão expressa pelo vector tem um marcador da proteína avidina na porção N-terminal do parceiro de fusão. A estratégia de fusão como aqui descrita tem a capacidade de segregar proteínas que são normalmente expressas intracelularmente, tais como genes de transdução de sinal ou receptores hormonais nucleares. 94

Alternativamente, pode ser utilizado um vector que codifica a avidina sem a sua sequência endógena de sinal, o que irá resultar em marcação do C-terminal de parceiros da proteína de fusão. Uma fusão de avidina no C-terminal permite também a secreção da proteína com base na sequência endógena de sinal do parceiro de fusão. Tal estratégia pode ser aplicada para permitir um processamento e enrolamento correcto da proteína ou para determinar a validade de uma sequência de sinal proposta. Adicionalmente, o vector pode compreender uma curta sequência de nucleótidos que codifica uma sequência de aminoácidos, que pode actuar como um substrato específico clivável por enzima, entre a avidina e as sequências do parceiro de fusão. Tais sequências cliváveis por enzima permitem a separação do parceiro de fusão a partir da avidina, para fins de purificação ou libertação da proteína.

As proteínas de fusão de avidina da invenção podem ser utilizadas, por exemplo, no rastreio de anticorpos, caracterização funcional (determinação de uma utilidade do anticorpo como um agonista ou antagonista, agente neutralizante, etc.), mapeamento de epitopos ou estratégias de imunização. As fusões de avidina de uma proteína alvo podem ser também utilizadas em farmacocinética, eficácia ou outros formatos de ensaio convencionais, concebidos para testar amostras pré-clínicas ou amostras de doentes clínicos para a presença do anticorpo terapêutico no sangue, urina ou outras amostras de tecido. Os parceiros da proteína de fusão de avidina podem ser preparados como sequências de tamanho total ou truncadas, domínios estruturais especificamente isolados ou como sequências quiméricas com outros homólogos do parceiro de fusão de outras espécies. 95

As proteínas de fusão de avidina podem ser expressas utilizando quaisquer meios convencionais para introduzir genes em células, como aqui descritos e conhecidos na técnica. As proteínas podem ser expressas, por exemplo, em células 293 ou CHO por transfecção das células com uma construção de fusão de avidina numa solução de lípidos, tal como Lipofectamine (Invitrogen, Carlsbad, CA).

Os meios condicionados e/ou os lisados celulares de células que expressam as proteínas de fusão podem ser recolhidos e aplicados num substrato de ensaio, tais como esferas de poliestireno revestidas de biotina ou placas de ELISA revestidas com biotina. A recolha dos meios condicionados e/ou do lisado celular pode ser conduzida num ponto de tempo que permita a expressão óptima da proteína de fusão. 0 ponto de tempo pode ser determinado experimentalmente pelos especialistas na técnica, mas é habitualmente cerca de 48 horas após a transfecção. As proteínas de fusão podem também ser analisadas na membrana celular ou intracelularmente para a expressão e funcionalidade na ligação de ligandos, receptores ou anticorpos conhecidos.

As proteínas de fusão de avidina da invenção podem ser analisadas por qualquer método conhecido ou previamente caracterizado que utiliza interacções de biotina-avidina. Tais métodos incluem, mas não estão limitados a, citometria de fluxo e microscopia/imagiologia fluorescente. Por exemplo, as fusões de avidina expressas em meios ou lisados celulares podem ser aplicadas a esferas revestidas de biotina e coradas com um anticorpo anti-avidina marcado com fluorescência para indicar o nível de expressão. Além disso, os anticorpos fluorescentes podem ser aplicados para reconhecer o parceiro específico da proteína de fusão num formato de ensaio multicolorimétrico. Adicionalmente, anticorpos não marcados específicos para o 96 parceiro da proteína de fusão podem ser aplicados simultaneamente com anticorpos marcados com fluorescência num ensaio competitivo.

Em determinadas formas de realização, a invenção proporciona métodos para o mapeamento de epitopos utilizando proteínas de fusão de avidina. Um exemplo de um método de mapeamento de epitopos da invenção é proporcionado abaixo, relativamente ao mapeamento de epitopos para anticorpos anti-IL-lRl. Contudo, um especialista na técnica reconhecerá que tais métodos podem ser prontamente aplicados ao mapeamento de epitopos para qualquer anticorpo e não estão limitados a anticorpos anti-IL-lRl. Por exemplo, o ADNc codificando avidina de galinha (com sequência endógena de sinal) pode ser ligado com a extremidade 5' a ADNc que codificam uma proteína de interesse (i. e., uma proteína que seja reconhecida por anticorpos para os quais é desejado determinar um epitopo) fundida a uma sequência marcadora FLAG na extremidade 3' . Os genes da fusão marcada com FLAG podem ser montados num vector de expressão utilizando técnicas moleculares convencionais. Um painel de proteínas marcadas com avidina-FLAG mutantes em que determinados aminoácidos foram substituídos (e. g., com resíduos de aminoácidos correspondentes de outra espécie animal) pode ser produzido utilizando técnicas convencionais. As proteínas mutantes e de tipo selvagem podem ser expressas em células hospedeiras e a ligação das proteínas mutantes e de tipo selvagem com um anticorpo de interesse pode ser detectada utilizando, por exemplo, análise de transferência de Western ou ensaios de ligação baseados em esferas, como aqui descritos. Assim, um epitopo pode ser definido por determinação de que substituições nas proteínas mutantes destroem a ligação ao anticorpo de interesse. 97

EXEMPLOS

Os seguintes exemplos, incluindo as experiências conduzidas e os resultados obtidos, são proporcionados para fins apenas ilustrativos e não devem ser interpretados como limitativos da invenção.

Exemplo 1

Produção de anticorpos monoclonais humanos contra o receptor de interleucina-1 de tipo I (IL-1R1)

Murganhos transqénicos HuMab

Os anticorpos monoclonais totalmente humanos para o receptor de IL-1 de tipo I (IL-1R1) foram preparados utilizando a estirpe HCo7 de murganhos transgénicos, a qual expressa genes de anticorpos humanos. Em cada uma destas estirpes de murganho, o gene endógeno da cadeia leve kapa de murganho foi interrompido homozigoticamente como descrito em Chen et al. (1993, EMBO J. 12:811-820), e o gene endógeno da cadeia pesada de murganho foi interrompido homozigoticamente como descrito no Exemplo 1 da Publicação do Pedido de Patente Internacional N° WO 01/09187. Cada destas estirpes de murganho contém um transgene da cadeia leve kapa humana, KCo5, como descrito em Fishwild et al. (1996, Nature Biotechnology 14:845-851). A estirpe HCo7 contém o transgene da cadeia pesada humana HCo7 como descrito nas Patentes U.S. N° 5545806; 5625825; e 5545807. A estirpe HCo7 é aqui referida como murganhos HuMab. 98

Imunizações de HuMab

Para produzir anticorpos monoclonais totalmente humanos para IL-1R1, os murganhos HuMab foram imunizados com IL-1R1 recombinante purificada derivada de células de insecto ou de mamífero (por Exemplo, células CHO) como antigénio. Os esquemas gerais de imunização para murganhos HuMab são descritos em Lonberg et al. (1994, Nature 368:856-859; Fishwild et ai., supra; e Publicação do Pedido de Patente Internacional N° WO 98/24884, cujos ensinamentos de cada são incorporados por referência). Os murganhos tinham 6-16 semanas de idade após a primeira infusão de antigénio. Uma preparação recombinante purificada (25-50 pg) de antigénio IL-1R1 (e. g., purificado a partir de células transfectadas de insecto ou de mamífero que expressam IL-1R1) foi utilizada para imunizar intraperitonealmente (IP) ou subcutaneamente (Sc) os murganhos HuMab.

As imunizações de murganhos transgénicos HuMab foram realizadas utilizando antigénio em adjuvante completo de Freund e duas injecções, seguidas por imunização IP de 2-4 semanas (até um total de 11 imunizações) com o antigénio em adjuvante incompleto de Freund. Várias dúzias de murganhos foram imunizadas para cada antigénio. Um total de 149 murganhos da estirpe HCo7 foi imunizado com IL-1R1. A resposta imune foi monitorizada através de amostras de sangue retro-orbital.

Para seleccionar os murganhos HuMab que produzem anticorpos que se ligam a IL-1R1, os soros de murganhos imunizados foram testados por ELISA como descrito por Fishwild et al., supra. Resumidamente, as placas de microtitulação foram revestidas com IL-1R1 recombinante purificada de células de insecto ou de mamífero a 1-2 pg/mL em PBS e foram incubados 50 pL/poço a 4 °C, 99 de um dia para o outro, depois bloqueadas com 200 pL/poço de 5% de soro de galinha em PBS/Tween (0,05%). Diluições de plasma de murganhos imunizados com IL-1R1 foram adicionadas a cada poço e incubadas durante 1-2 horas à temperatura ambiente. As placas foram lavadas com PBS/Tween e depois incubadas com um reagente policlonal específico de Fc de cabra anti-IgG humana conjugado com peroxidase de rábano (HRP) durante 1 hora à temperatura ambiente. Após lavagem, as placas foram reveladas com substrato ABTS (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, catálogo N° A-1888, 0,22 mg/mL) e analisadas espectrofotometricamente a uma OD de 415-495. Os murganhos com títulos suficientes de imunoglobulina humana anti-IL-lRl foram utilizados para produzir anticorpos monoclonais como descrito abaixo.

Preparação de hibridomas que produzem anticorpos monoclonais humanos para IL-1R1

Os murganhos foram preparados para a produção de anticorpos monoclonais através de injecção intravenosa de reforço com antigénio, 2 dias antes do sacrifício, e os baços foram posteriormente removidos. Os esplenócitos de murganho foram isolados de murganhos HuMab e fundidos com PEG numa linha celular de mieloma de murganho utilizando protocolos convencionais. Tipicamente, foram realizadas 20-30 fusões para cada antigénio.

Resumidamente, suspensões de célula única de linfócitos esplénicos de murganhos imunizados foram fundidas a um quarto do número de células de mieloma de murganho não segregantes P3X63-Ag8.653 (A.T.C.C., N° de Acesso CRL 1580) ou células de mieloma de murganho não segregantes SP2/0 (A.T.C.C., CRL 1581) com PEG a 50% (Sigma) . As células foram plaqueadas a 100 aproximadamente lxl05/poço em placas de microtitulação de fundo plano, seguidas por uma incubação de cerca de duas semanas em meio selectivo contendo 10% de soro bovino fetal, 10% de meio de condicionamento P388D1 (A.T.C.C., N° de Acesso CRL TIB-63), 3-5% de origen (IGEN) em DMEM (Mediatech, N° de Catálogo CRL 10013, com glucose elevada, L-glutamina e piruvato de sódio) mais 5 mM de HEPES, 0,055 mM de 2-mercaptoetanol, 50 mg/mL de gentamicina e lx HAT (Sigma, N° de Catálogo CRL P-7185) . Após 1-2 semanas, as células foram cultivadas em meio em que HAT foi substituído por HT.

Os hibridomas resultantes foram seleccionados para a produção de anticorpos específicos de antigénio. Os poços individuais foram rastreados por ELISA (acima descrito) para anticorpos IgG monoclonais humanos anti-IL-lRl. Uma vez ocorrido crescimento extenso dos hibridomas, o meio foi monitorizado habitualmente após 10-14 dias. Os hibridomas segregantes de anticorpos foram plaqueados novamente, rastreados outra vez e, se ainda positivos para IgG humano, os anticorpos monoclonais anti-IL-lRl foram subclonados, pelo menos, duas vezes por diluição limitante. Os subclones estáveis foram depois cultivados in vitro para produzir quantidades pequenas de anticorpo em meio de cultura de tecidos para caracterização.

Selecção de anticorpos monoclonais humanos que se ligam a IL-1R1

Um ensaio de ELISA como acima descrito foi utilizado para rastrear para hibridomas que mostraram reactividade positiva com o imunogénio IL-1R1. Os hibridomas que segregam um anticorpo monoclonal que se ligou com elevada avidez a IL-1R1 foram subclonados e adicionalmente caracterizados. Um clone de cada 101 hibridoma, que reteve a reactividade das células parentais (como determinado por ELISA), foi escolhido para fazer um banco de células em 5-10 frasquinhos, armazenados em azoto liquido.

Um ELISA especifico de isotipo foi realizado para determinar 0 isotipo dos anticorpos monoclonais produzidos como aqui divulgado. Nestas experiências, os poços de placas de microtitulação foram revestidos com 50 pL/poço de uma solução de 1 pg/mL da cadeia leve kapa de murganho anti-humano em PBS e incubados a 4 °C, de um dia para o outro. Após bloqueamento com 5% de soro de galinha, as placas foram feitas reagir com sobrenadante de cada anticorpo monoclonal testado e um controlo de isotipo purificado. As placas foram incubadas à temperatura ambiente durante 1-2 horas. Os poços foram depois feitos reagir com anti-soros policlonais anti-humano específicos de IgGl, IgG2 ou IgG4 humana, de cabra e conjugados com peroxidase de rábano, e as placas foram reveladas e analisadas como descrito abaixo.

Os anticorpos monoclonais purificados de sobrenadantes de hibridoma que mostraram ligação significativa a IL-1R1, como detectado por ELISA, foram adicionalmente testados para actividade biológica utilizando ensaios de ligação in vitro e ensaios baseados em células de sangue total e condrócitos humanos. Os anticorpos que apresentaram a melhor actividade foram designados 15C4, 26F5, 27F2, 24E12 e 10H7. Os anticorpos foram submetidos a uma experiência preliminar de triagem de epitopo. Placas de ELISA foram revestidas com sIL-lRl humana (domínio 1+2+3), sIL-lRl humana truncada (domínio 1+2), sIL-lRl de rato, sIL-lR humana de tipo II e ovalbumina (controlo negativo). A ligação do anticorpo foi detectada com um anticorpo anti-Fc Humano conjugado com peroxidase de rábano (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) . Os resultados são resumidos na Tabela 2. Um símbolo de verificação (Ό na Tabela 2 representa 102 um resultado positivo para a ligação; "X" representa um resultado negativo. Os anticorpos 15C4, 26F5, 27F2 e 24E12 apenas ligaram a proteína IL-1R1 que tem todos os três domínios extracelulares, indicando que os epitopos para cada estão dentro do terceiro domínio. 0 anticorpo 10H7 liga-se ao domínio extracelular de tamanho total IL-1R1 e também a uma proteína truncada que tem apenas os domínios 1 e 2, demonstrando que o epitopo para este anticorpo se encontra no domínio 1 ou 2. Nenhum dos anticorpos testados tem reactividade cruzada com o receptor de tipo II humano ou IL-1R1 de rato.

Tabela 2

Anticorpo Oa (Controlo Negativo) SIL-1R1 Hu (Domínio 1+2+3) SIL-1R1 Hu (Domínio 1+2) SIL-1RII Hu (Domínio 1+2+3) SIL-1R1 Rato (Domínio 1+2+3) 15C4 X ✓ X X X 26F5 X ✓ X X X 27F2 X ✓ X X X 24E12 X ✓ X X X 10H7 X ✓ ✓ X X 103

Exemplo 2

Inibição in vitro da formação do complexo IL-1 Receptor de Tipo I por anticorpos anti-IL-lRl A capacidade dos anticorpos para inibir os eventos de ligação extracelular requeridos para a sinalização de IL-1 foi avaliada com proteínas recombinantes in vitro num ensaio em que a ligação de IL-1 a IL-1R resulta na formação de um local de ligação de elevada afinidade para IL-lRAcP. A ligação de IL-lRAcP a IL-1 ligado a IL-1R (referido como "complexo de formação") é medida como se segue. As proteínas recombinantes foram incubadas em ensaios de ligação em placas de

microtitulação na ausência (controlo) ou presença de anticorpos. Os valores de IC5o foram derivados de comparações de valores de controlo com valores obtidos na presença de anticorpo a concentrações entre 10 fM e 1 μΜ. Resumidamente, o ensaio foi conduzido como se segue. IL-1R1 biotinilado e esferas revestidas com estreptavidina (Dynal, Dynabeads M-28) foram dispensadas em placas de microtitulação. O anticorpo foi depois adicionado aos poços apropriados numa diluição em série abrangendo uma vasta gama de concentrações. Foi adicionado IL-Ιβ ou IL-Ια a uma concentração de 1 nM, e ILlRAcP marcado com ruténio (preparado com NHS-marcador (IGEN) de acordo com os protocolos da IGEN) foi adicionado numa concentração final de 5 nM. Após incubação durante 1 h à temperatura ambiente, a reacção de ligação foi analisada com um instrumento ORIGEN™ 1,5 ou M8 (IGEN

Internacional Inc.) . A ligação de IL-lRAcP a IL-1 ligado a IL-1R1 foi determinada por detecção do sinal de electroquimioluminescência associada com as esferas de IL-1R1 ligado. A redução do sinal que resulta da competição de anticorpos de ligação a IL-1 ou IL-lRAcP foi calculada como 104 percentagem do sinal de ECL que resulta para ligação máxima (sem competição) . A curva de resposta de inibição para cada anticorpo nestes ensaios de ligação foi estabelecida e as IC50 foram derivadas utilizando o software PRISMA™. Os resultados para a inibição de eventos de ligação induzidos por IL-Ιβ são representados pelo gráfico na Figura 12. Os valores de IC50 para inibição da formação do complexo são mostrados na Tabela 3 abaixo. Os anticorpos 15C4, 26F5, 27F2 e 24E12 inibem fortemente a formação do complexo. Estes anticorpos são todos ligantes do terceiro domínio de IL-1R1, como acima descrito. 0 anticorpo 10H7 pertence a uma classe de anticorpos que se liga a uma construção do IL-1R que carece do terceiro domínio. 0 10H7 é um inibidor menos potente da ligação dirigida por IL-1 de IL-lRAcP do que os ligantes do terceiro domínio. A inibição da formação do complexo pelos anticorpos da invenção foi comparada com a inibição por IL-lra. Os ligantes do terceiro domínio demonstraram uma capacidade semelhante ou ligeiramente superior para inibir a formação de complexo por comparação com IL-lra. A Figura 13 representa a capacidade do anticorpo 15C4 para inibir a formação do complexo IL-1R1/IL-1oí/RAcP. A IC50 para a formação do complexo IL-1R1/IL-la/RAcP foi 43 pM. 105

Tabela 3

Anti- -IL-IRl humano 15C4 26F5 27F2 24E12 10H7 rIL-lra IC50 96 pM 16 0 pM 333 pM 348 pM 5,3 nM 555 pM Limites 71 pM 118 pM 214 pM 223 pM 3, 6 nM 414 pM de a a cL a a a Confiança 12 9 pM 219 pM 517 pM 542 pM 7,5 nM 743 pM de 95%

Exemplo 3

Anticorpos anti-IL-lRl inibem a ligação de IL-Ιβ e IL-lra ao receptor A capacidade dos anticorpos anti-IL-lRl para inibir a ligação de IL-Ιβ ou IL-lra a IL-1R1 foi avaliada num ensaio com proteínas recombinantes. A mistura de reacção continha 0,1 mg/mL de Dynabeads M-280 Streptavidin (Dynal) e 1 nM de IL-1R1 biotinilado. Os anticorpos foram adicionados a concentrações desde 320 nM a 0,3 nM. A adição de IL-Ιβ marcado com ruténio (5 nM) ou IL-lra (1 nM) iniciou a ligação que continuou durante 1 hora à temperatura ambiente. As misturas da reacção foram medidas como acima utilizando um instrumento ORIGEN™ 1,5 ou M8 (IGEN Internacional Inc.). A competição foi calculada como a percentagem do sinal de ECL para ligação máxima (sem competição). Os anticorpos 15C4, 26F5 e 27F2, os anticorpos mais potentes, bloqueiam a ligação do ligando (IL-Ιβ) ao receptor, mas não interferem significativamente com a ligação de IL-lra comparativamente com o controlo de IgG. Pelo contrário, o 106 anticorpo 24E12 liga-se ao receptor mas não bloqueia a ligação de IL-1β ou IL-lra ao receptor. Assim, o anticorpo 24E12 representa uma classe única de ligantes do terceiro domínio distinta da classe representada por 15C4, 26F5 e 27F2. 0 anticorpo 10H7 inibe a ligação de IL-Ιβ e IL-lra ao receptor. Os resultados são resumidos na Figura 14.

Exemplo 4

Ensaios de sangue total humano e condrócitos

Condrócitos humanos primários (Cell Applications Inc., San Diego, CA) foram inoculados em placas de 96 poços a uma densidade de 10000 células/poço em meio DMEM contendo 1% de FBS e 1% de Pen Strep (GIBCO). As células foram deixadas a recuperar de um dia para o outro, antes da adição de anticorpos anti-ILl-RI a concentrações que variam desde 10 nM a 0,1 pM durante 20 minutos. A IL-Ιβ foi adicionada a uma concentração de 1 pM (~EC50) e os sobrenadantes de cultura foram recolhidos após 16 horas de incubação a 37 °C. Os níveis de IL-6 no sobrenadante foram medidos utilizando um ELISA (Pierce-Endogen, Rockford, IL, N° de Cat. EH2IL-65) de acordo com as instruções do fabricante. A curva de resposta de inibição para cada anticorpo da invenção nos ensaios baseados em células foi estabelecida e os valores de IC50 foram derivados utilizando software PRISMA™. Os anticorpos 15C4, 26F5 e 27F2 são inibidores potentes da sinalização de IL-1 comparativamente a IL-lra (Figura 15A) . Os anticorpos 24E12 e 10H7 são acentuadamente menos potentes do que 15C4 e 27F2 (Figura 15B) . Os valores de IC50 para a inibição da produção de IL-6 por condrócitos humanos, induzida por IL-Ιβ, são mostrados 107 nas Tabelas 4A e 4B (correspondendo à Figura 15A e 15B, respectivamente).

Os anticorpos monoclonais anti-IL-lRl 15C4, 26F5 e 27F2 foram pré-incubados 40-60 minutos com sangue total humano recolhido de voluntários normais, em tubos de recolha de sangue com heparina de sódio. Os ensaios foram realizados como se segue: 100 pL de sangue recém-isolado foi fraccionado em poços de uma placa de 96 poços. Foram adicionados 50 pL de anticorpo em meio RPMI contendo 10% de soro AB humano. A IL-Ιβ foi depois adicionada a uma concentração de 30 pM (EC50) . Os sobrenadantes de cultura foram recolhidos após 18 horas e os níveis de IL-6 no sobrenadante foram medidos utilizando ELISA. Como um controlo, IL-lra foi pré-incubado 40-60 minutos com sangue total e a produção de IL-6 foi medida como acima. Os três anticorpos anti-IL-lRl bloquearam a actividade de IL-1 com potência comparável àquela de IL-lra (Figura 16). Os valores de IC50 para a inibição da produção de IL-6 induzida por IL-1 em sangue total humano são mostrados na Tabela 5.

Tabela 4A

Anticorpos anti-IL-lRl Humanos 15C4 27F2 26F5 rIL-lra IC50 16 pM 3 2 pM 2 6 pM 32 pM Limites de 15 pM a 21 pM a 19 pM a 22 pM a Confiança de 95% 18 pM 4 9 pM 3 6 pM 46 pM 108

Tabela 4B

Anticorpos anti -IL-lRl Humanos 15C4 27F2 10H7 24E12 rIL-ra IC50 7 pM 2 8 pM 7,5 pM NA 2 0 pM Limites de 5, 8 pM a 2 2 pM a 5,6 nM a NA 17 pM a Confiança de 95% 7, 9 pM 3 5 pM 10 nM 23 pM

Tabela 5

Dador Parâmetros de Análise 15C4 26F5 27F2 IL-lra 1047 IC50 126 pM 410 pM 2 49 pM 2 41 pM Limites de Confiança de 95% 4 7 pM a 339 pM 213 pM a 79 0 pM 8 8 pM a 7 03 pM 124 pM a 4 71 pM 1319 IC50 111 pM 174 pM 5 79 pM 381 pM Limites de Confiança de 95% 59 pM a 20 8 pM 6 0 pM a 501 pM 249 pM a 1,3 nM 167 pM a 8 75 pM Compósito IC50 126 pM 3 72 pM 3 8 7 pM 26 4 pM (Dados Reunidos) Limites de Confiança de 95% 62 pM a 255 pM 187 pM a 73 9 pM 202 pM a 748 pM 134 pM a 517 pM 109

Exemplo 5

Mutagénese e mapeamento de epitopos

Foi utilizada mutagénese dirigida (Altered Sites® In Vitro Mutagenesis System, Promega, Madison WI) de IL-1R1 para preparar um painel de proteínas mutantes ("muteínas") em que resíduos de aminoácidos de rato foram substituídos com a sequência humana correspondente. Foram construídos quinze plasmídeos mutados diferentes (ver barras numeradas na Figura 17) . Os plasmídeos que codificam estas proteínas substituídas e o IL-1R1 parental foram transientemente transfectados em células CHO. Foram gerados transfectantes simulados como controlos negativos. 0 meio condicionado (CM) destas células foi concentrado ~20 vezes utilizando colunas de concentração Centriprep 10 (Amicon). A expressão das muteínas foi avaliada por SDS-PAGE e transferência de Western. Treze proteínas mutantes foram expressas a níveis que permitiram a avaliação da ligação do anticorpo. As proteínas foram aplicadas num gel, submetidas a electroforese e transferidas para membranas. As membranas foram bloqueadas com 1% de leite em PBS, 0,1% de Tween-20 e depois incubadas durante 1 hora à temperatura ambiente com os anticorpos anti-IL-lR 15C4, 27F2 ou 24E12 a 0,5 ug/mL em PBS, 0,1% de Tween-20. Após lavagem, as membranas foram incubadas com anti-IgG-Fc-HRP de humano produzido em cabra. O sinal foi detectado utilizando substrato quimioluminescente (ECL) (Pierce Chemical Co., Rockford, IL). As sequências específicas humanas críticas para a ligação do anticorpo foram identificadas como aquelas que, quando substituídas com sequências de rato, reduziram ou eliminaram o sinal de ECL. O reconhecimento de 15C4 dos mutantes 1, 2, 4 e 10 foi diminuído quando comparado a 24E12 (Figura 18, painel superior) . De modo semelhante, a ligação de 27F2 aos mutantes 1, 2 e 4 foi diminuída (Figura 18, painel meio) . 24E12 110 nao apresentou ligaçao significativa aos mutantes 12, 13, 14 e 15 (Figura 18, painel inferior). 0 isolamento e caracterização de anticorpos anti-IL-lRl humanos identificaram três classes distintas de anticorpos competitivos (Figura 19). Os inibidores mais fortes da actividade biológica de IL-1, como demonstrado por bioensaios com base em células, são agueles anticorpos que se ligam ao terceiro domínio de IL-1R1 e previnem a associação de IL-1-β. As experiências de mapeamento de epitopos que utilizam um painel de proteínas mutantes no terceiro domínio, demonstraram que esta classe de anticorpos, que inclui 15C4, 27F2 e 26F5, partilha um epitopo conformacional sobreposto mas não idêntico. As Figuras 20 e 21 ilustram a posição dos epitopos de 15C4 no terceiro domínio do receptor de IL-1, num diagrama de fita de IL-1 ligado ao receptor de IL-lra (Schreuder et al., 1997, Nature 386:194-200) . Os resíduos do receptor de IL-1 que definem a ligação da classe mais potente de anticorpos estão ilustrados a cinzento. Estes anticorpos demonstraram potência superior e, desta forma, estes epitopos definem locais de ligação para anticorpos de uma classe superior. Os locais de ligação de 15C4 e 27F2 são sobrepostos mas não idênticos, como determinado pela análise mutacional dos 15 locais diferentes em IL-1R1, descrita acima. Os locais são descritos na Figura 17 como barras numeradas acima da sequência de proteína. Os locais críticos de interacção parecem estar nas mutações nos locais 1 (LSDIA; SEQ ID N°: 41) , 2 (VIDE; SEQ ID N°: 42) , 4 (YSV) e 10 (TCFA; SEQ ID N°: 43) . Os locais de ligação de 15C4 e 27F2 estão compreendidos nos locais 1 e 2, uma vez que a substituição dos resíduos de rato para os resíduos humanos em ambos os locais extingue a ligação. 27F2 difere de 15C4 na medida em que alterações no local 4 extinguem completamente a sua ligação, enquanto a ligação de 15C4 é reduzida mas não completamente 111 eliminada. A mutação 10 reduz também a ligação de 15C4, mas 27F2 não tem interacção óbvia com este local. O exame da estrutura cristalina revela que estes resíduos definem uma face do terceiro domínio que está orientado no sentido do espaço ocupado por ligando ligado (Figuras 20 e 21) (Vigers et al., 1997, Nature 386:190-194). A segunda classe de anticorpos identificados, representada por 10H7, não requer o terceiro domínio para ligação e, ao contrário da classe preferida, inibe a ligação de IL-lra. Esta classe é activa em bioensaios, mas é menos potente do que a classe preferida.

Em contraste com a forte inibição de bioensaios de IL-1 com a classe preferida de anticorpos, 24E12 é um inibidor ineficaz em bioensaios. O anticorpo 24E12 inibe a ligação de IL-lRAcP com IL-1 ligado a IL-1R. O epitopo para esta classe de anticorpos, definida pelos mutantes 12, 13, 14 e 15, está próximo do domínio transmembranar de IL-1R1 e está numa região não envolvida directamente na ligação de IL-1 ou IL-lra (Figura 22).

Exemplo 6

Clonagem das cadeias pesada e leve do anticorpo anti-IL-lRl

Clonagem da cadeia leve do MAb 15C4 anti-IL-lRl

As cadeias leves para três hibridomas que expressam anticorpos monoclonais de ligação a alL-lRl, 15C4, 27F2 e 26F5 foram clonadas no vector de expressão de células de mamífero pDSRal9 {ver Publicação do Pedido Internacional N° WO 90/14363. 112 A construção do plasmídeo que codifica a cadeia leve kapa de 15C4 é explicitamente aqui descrita; a clonagem das outras espécies de cadeia leve foi realizada utilizando processos semelhantes. A região variável da cadeia leve kapa de alL-lRl foi obtida utilizando métodos de amplificação por reacção em cadeia da polimerase (PCR) a partir da primeira cadeia de ADNc preparada a partir de ARN total do hibridoma alL-lRl 15C4, o qual foi preparado utilizando o reagente TRIzol® (Invitrogen). A primeira cadeia de ADNc foi sintetizada utilizando um iniciador aleatório com um adaptador de extensão (5'- GGC CGG ATA GGC CTC CAN NNN NNT -3'; SEQ ID N° : 44) e 5' RACE (amplificação rápida de extremidades de ADNc) foi realizada utilizando o GeneRace™ Kit (Invitrogen) . Para a cadeia leve completa, o iniciador para a frente foi o iniciador interno GeneRacer™ (5'- GAG CAC TGA CAT GGA CTG AAG GGA TA -3'; SEQ ID N°: 45) e o iniciador reverso foi 5'- GGG GTC AGG CTG GAA CTG AGG -3' (SEQ ID N°: 46). Os produtos de RACE foram clonados em pCR4-T0P0 (Invitrogen) e as sequências de ADN foram determinadas. A sequência de ADN de consenso da cadeia kapa 15C4 foi utilizada para conceber iniciadores para amplificação por PCR da cadeia de anticorpo de tamanho total. 0 iniciador de PCR kapa 5' codificado pelo amino-terminal da sequência de sinal, um local da enzima de restrição Xbal, e uma sequência de Kozak optimizada {5'- CAG CAG AAG CTT CTA GAC CAC CAT GTC GCC ATC ACA ACT CAT TGG G -3 ' ; SEQ ID N° : 47). 0 iniciador 3' codificou o carboxi-terminal e o codão de terminação, assim como um local de restrição salI (5'- CTT GTC GAC TCA ACA CTC TCC CCT GTT GAA GCT C -3'; SEQ ID N°: 48). 113

Iniciador kapa 5' 15C4 alL-lRl (SEQ ID N°: 47):

5’- CAG CAG AAG CTT CTA GAC CAC CAT GTC GCC ATC ACA ACT

Xbal Kozak MS P S Q L CATTGGG-3’ I G (SEQ ID N°: 49)

Iniciador kapa 3' 15C4 alL-lRl (SEQ ID N°: 48): 5’- CTT GTC GAC TCA ACA CTC TCC CCT GTT GAA GCT C -3’

Sall * C E G R N F S (SEQ ID N°: 50) 0 clone da cadeia kapa de alL-lRl 15C4 de tamanho total foi obtido utilizando um pCR4: clone kapa 15C4 através de amplificação por PCR com os iniciadores kapa 5' 15C4 alL-lRl e 3'. A reacção de PCR produziu um produto com 733 pares de bases que codifica os 233 resíduos de aminoácidos (incluindo a sequência de sinal da cadeia kapa de 19 aminoácidos) da cadeia kapa de alL-lRl 15C4. 0 produto de PCR foi purificado utilizando um kit de purificação de PCR QIAquick (Qiagen Cat. N° 28104), corte com Xbal e sall, gel isolado e purificado utilizando um kit de extracção de gel QIAquick (Qiagen Cat. N° 28704). Este fragmento de PCR contendo a cadeia kapa de αΕ-lRl 15C4 completa foi depois ligado no vector de expressão de mamífero pDSRal9. O ADN do clone de expressão da cadeia kapa 15C4 foi sequenciado para confirmar que codificava o mesmo péptido que foi identificado no hibridoma 15C4. O vector de expressão final, pDSRcxl9:15C4 kapa tem 5468 pares de bases e contém sete regiões funcionais descritas na Tabela 6. 114

Tabela 6 Número dos Pares de Base do Plasmideo 2 a 881 Um sinal de terminação de transcrição/ poliadenilação da α-subunidade da hormona glicoproteica pituitária bovina (α-FSH) (Goodwin et ai., 1983, Nucleic Acids Res. 11:6873-82; Número de Acesso Genbank X00004) 882 a 2027 Um minigene da di-hidrofolato redutase (DHFR) de murganho contendo o promotor DHFR endógeno de murganho, as sequências codificantes de ADNc e os sinais de terminação de transcrição/poliadenilação de DHFR (Gasser et al., 1982, Proc. Natl. Acad Sei. USA. 79:6522-6; Nunberg et al., 1980, Cell 19:355-64; Setzer et al., 1982, J. Biol. Chem. 257:5143-7; McGrogan et al., 1985, J. Biol. Chem. 260:2307-14) 2031 a 3947 Sequências de pBR322 contendo o gene do marcador de resistência à ampicilina e a origem de replicação do plasmideo em E. coli (Número de Acesso Genbank J01749) 3949 a 4292 Um promotor precoce, intensificador e origem de replicação de SV40 (Takebe et al., 1988, Mol. Cell Biol. 8:466-72, Número de Acesso Genbank J02400) 4299 a 4565 Um elemento intensificador de tradução do domínio LTR de HTLV-1 (Seiki et al., 1983, Proc. Natl. Acad Sei. USA. 80:3618-22, Número de Acesso Genbank J02029) 115 (continuação)

Número dos Pares de Base do Plasmídeo 4574 a 4730 Um intrão dos sinais dadores/aceitadores de splice de 16S, 19S de SV40 (Okayama e Berg, 1983, Mol. Cell Biol. 3:280-9, Número de Acesso Genbank J02400) 4755 a 5468 0 ADNc da cadeia leve kapa 15C4 entre os locais Xbal e sal I

Construção de pDSRl9:hIgGlCH

Um plasmídeo de expressão de MAb pDSRal9:região variável de rato/região constante humana de IgGl (rVh/hChl) foi construído como o resultado de uma ligação de três partes, produto de PCR da região variável de anticorpo de rato terminado com Xbal e BsmBI, a região constante de IgGl humana (CHi, charneira, domínios CH2 e CH3) derivada por clivagem de sall e isolamento do gel do fragmento BsmBI e sall do plasmídeo linear pDSRcxl9:hIgGlCH (extremidades hindiII e BsmBI) e um pDSRal9 linearizado com extremidades Xbal e salI (ver Pedido Provisório de Patente U.S. N° 60/370407, do mesmo titular e co-pendente, apresentado em 5 de Abril de 2002, "Human Anti-OPGL Neutralizing Antibodies As Selective OPGL Pathway Inhibitors". O vector de expressão final, pDSRal9:região variável de rato/região constante humana de IgGl (rVh/hChl), tem 6158 pares de bases e contém 7 regiões funcionais descritas na Tabela 7. 116

Tabela 7 Número dos Pares de Base do Plasmideo 2 a 881 Um sinal de terminação de transcrição/ poliadenilação da α-subunidade da hormona glicoproteica pituitária bovina (α-FSH) (Goodwin et ai., 1983, Nucleic Acids Res. 11:6873-82; Número de Acesso Genbank X00004) 882 a 2027 Um minigene da di-hidrofolato redutase (DHFR) de murganho contendo o promotor DHFR endógeno de murganho, as sequências codificantes de ADNc e os sinais de terminação de transcrição/poliadenilação de DHFR (Gasser et al., 1982, Proc. Natl. Acad Sei. USA. 79:6522-6; Nunberg et al., 1980, Cell 19:355-64; Setzer et al., 1982, J. Biol. Chem. 257:5143-7; McGrogan et al., 1985, J. Biol. Chem. 260:2307-14) 2031 a 3947 Sequências de pBR322 contendo o gene do marcador de resistência à ampicilina e a origem de replicação do plasmideo em E. coli (Número de Acesso Genbank J01749) 3949 a 4292 Um promotor precoce, intensificador e origem de replicação de SV40 (Takebe et al., 1988, Mol. Cell Biol. 8:466-72, Número de Acesso Genbank J02400) 4299 a 4565 Um elemento intensificador de tradução do domínio LTR de HTLV-1 (Seiki et al., 1983, Proc. Natl. Acad Sei. USA. 80:3618-22, Número de Acesso Genbank J02029) 117 (continuação)

Número dos Pares de Base do Plasmideo 4574 a 4730 Um intrão dos sinais dadores/aceitadores de splice de 16S, 19S de SV40 (Okayama e Berg, 1983, Mol. Cell Biol. 3:280-9, Número de Acesso Genbank J02400) 4755 a 6158 0 ADNc da cadeia pesada rVh/hChl entre os locais XbaI e saiI. Esta sequência do fragmento da cadeia pesada é mostrada abaixo (SEQ ID N°:51) com as sequências dos locais de restrição sublinhadas: Xbol TCTAG ACCACCATGG ACATCAGGCT CAGCTTAGTT TTCCTTGTCC TTTTCATAAA AGGTGTCCAG TGTGAGGTAG AACTGGTGGA GTCTGGGGGC GGCTTAGTAC AACCTGGAAG GTCCATGACA CTCTCCTGTG CAGCCTCGGG ATTCACTTTC AGAACCTATG GCATGGCCTO GGTCCGCCAG GCCCCAACGA AGGGTCTGGA GTGGGTCTCA TCAATTACTG CTAGTGGTGG TACCACCTAC TATCGAGACT CCGTGAAGGG CCGCTTCACT ATTTTTAGGG ATAATGCAAA AAGTACCCTA TACCTGCAGA TGGACAGTCC GAGGTCTGAG GACACGGCCA CTTATTTCTG TACATCAATT BsniB 1 TCGGAATACT GGGGCCACGG AGTCATGGTC ACCGTCTCTA GTGCCTCCACCAAGGGCCCA TCGGTCTTCC CCCTGGCACC CTCCTCCAAG AGCACCTCTGGGGGCACAGC GGCCCTGGGC TGCCTGGTCA AGGACTACTT CCCCGAACCG GTGACGGTGT CGTGGAACTC AGGCGCCCTG ACCAGCGGCG TGCACACCTT CCCGGCTGTC CTACAGTCCT CAGGACTCTA CTCCCTCAGC AGCGTGGTGACCGTGCCCTC CAGCAGCTTG GGCACCCAGA CCTACATCTG CAACGTGAATCACAAGCCCA GCAACACCAA GGTGGACAAG AAAGTTGAGC CCAAATCTTG TGACAAAACT CACACATGCC CACCGTGCCC AGCACCTGAA CTCCTGGGGG GACCGTCAGT CTTCCTCTTC CCCCCAAAAC CCAAGGACAC CCTCATGATC TCCCGGACCC CTGAGGTCAC ATGCGTGGTG GTGGACGTGA GCCACGAAGACCCTGAGGTC AAGTTCAACT GGTACGTGGA CGGCGTGGAG GTGCATAATG CCAAGACAAA GCCGCGGGAG GAGCAGTACA ACAGCACGTA CCGTGTGGTC AGCGTCCTCA CCGTCCTGCA CCAGGACTGG CTGAATGGCA AGGAGTACAAGTGCAAGGTC TCCAACAAAG CCCTCCCAGC CCCCATCGAG AAAACCATCTCCAAAGCCAA AGGGCAGCCC CGAGAACCAC AGGTGTACAC CCTGCCCCCA TCCCGGGATG AGCTGACCAA GAACCAGGTC AGCCTGACCT GCCTGGTCAA AGGCTTCTAT CCCAGCGACA TCGCCGTGGA GTGGGAGAGC AATGGGCAGCCGGAGAACAA CTACAAGACC ACGCCTCCCG TGCTGGACTC CGACGGCTCC TTCTTCCTCT ATAGCAAGCT CACCGTGGAC AAGAGCAGGT GGCAGCAGGG GAACGTCTTC TCATGCTCCG TGATGCATGA GGCTCTGCAC AACCACTACA CGCAGAAGAG CCTCTCCCTG TCTCCGGGTA Sal I AATGATAAGT CGAC 118 0 plasmídeo linear pDSRcxl9 :hIgGlCH foi preparado por digestão do plasmídeo pDSR19:região variável de rato/região constante humana de IgGl com as enzimas de restrição XbaI e BsitiBI, para remover a região variável de rato, e purificado utilizando uma kit de extracção de gel QIAquick. 0 plasmídeo linear pDSRal9:hIgGlCH contendo o domínio da região constante humana de IgGl de 1 kpb foi utilizado para aceitar regiões variáveis do anticorpo alL-lR derivadas de hibridoma.

Clonagem da Cadeia Pesada de Anti-ILl-RI 15C4 MAb

As cadeias pesadas para dez hibridomas que expressam anticorpos monoclonais de ligações a alLl-RI, 15C4, 27F2 e 26F5, foram clonados no vector de expressão de célula de mamífero pDSRal9. A construção do plasmídeo que codifica a cadeia pesada de 15C4 é explicitamente descrita; a clonagem das outras espécies de cadeia pesada foi realizada utilizando processos semelhantes. A região variável da cadeia pesada de alL-lRl 15C4 foi obtida utilizando métodos de amplificação por PCR a partir de ADNc da primeira cadeia paraparado a partir de ARN total do

hibridoma alLl-RI 15C4, o qual foi preparado utilizando reagente de TRIzol®. A primeira cadeia de ADNc foi sintetizada utilizando um iniciador aleatório com um adaptador de extensão (5'- GGC CGG ATA GGC CTC CAN NNN NNT -3'; SEQ ID N°: 44) e 5' RACE (amplificação rápida de extremidades de ADNc) foi realizada utilizando o GeneRacer™ Kit. Para a cadeia pesada de comprimento parcial, o iniciador para a frente foi o iniciador interno GeneRacer™ (5'- GGA CAC TGA CAT GGA CTG AAG GAG TA -3’; SEQ ID N°: 45) e o iniciador reverso foi 5'- TGA GGA CGC TGA CCA CAC G -3' (SEQ ID N°: 52). Os produtos de RACE foram clonados em pCR4-T0P0 e as sequências de ADN foram determinadas. A sequência de ADN de consenso da região variável da cadeia pesada 15C4 foi 119 utilizada para conceber iniciadores para amplificação por PCR da região variável da cadeia pesada. 0 iniciador de PCR da cadeia pesada 5' codificado pelo amino-terminal da sequência de sinal, um local da enzima de restrição XbaI, e uma sequência de Kozak optimizada (5'- CAG CAG AAG CTT CTA GAC CAC CAT GGG GTC AAC CGC CAT CCT CG -3'; SEQ ID N°: 53). 0 iniciador 3' codificou a extrermidade carboxilo da região variável, incluindo um local BsmBI da cadeia de sentido de ocorrência natural (5'- GTG GAG GCA CTA GAG ACG GTG ACC AGG GTT CC -3'; SEQ ID N°: 54).

Iniciador da cadeia pesada 5' alL-lRl 15C4 (SEQ ID N° : 53):

5’- CAG CAG AAG CTT CTA GAC CAC C ATG GGG TCA ACC GCC Xbal Kozak M G S TA ATCCTCG—3’ I L (SEQ ID N°: 55)

Iniciador da cadeia pesada 3' alL-lRl 15C4 (SEQ ID N°: 54): 5’- GTG GAG GCA CTA GAG ACG GTG ACC AGG GTT CC-3’ TSASSVTVLT G (SEQ ID N°: 56)

BsmBI

Construção do Clone de Expressão da Cadeia Pesada IgGl Anti-ILI-Rl 0 clone da cadeia pesada de alL-lRl 15C4 de tamanho total foi obtido utilizando um pCR4: clone kapa 15C4 através de amplificação por PCR com os iniciadores da cadeia pesada 5' e 3' alL-lRl 15C4. A reacção de PCR produziu um produto com 442 pares de bases que codifica os 137 resíduos de aminoácidos (incluindo a sequência de sinal da cadeia kapa de 19 aminoácidos) da região 120 variável da cadeia pesada de alL-lRl 15C4. 0 produto de PCR foi purificado utilizando um Kit de Purificação de PCR QIAquick e depois digerido com Xfoat e BsmBI, isolado de gel e purificado com um Kit de Extracção de Gel QIAquick.. Este fragmento contendo a região variável da cadeia pesada de alL-lRl 15C4 completa foi depois ligado no vector de expressão de mamífero pDSRal9:hIgGlCH. 0 ADN do clone de expressão da cadeia pesada de IgGl 15C4 foi sequenciado para confirmar que codificava o mesmo péptido da região variável da cadeia pesada que foi identificado no hibridoma 15C4. 0 vector de expressão final, pDSRal9:15C4 da cadeia pesada IgGl tem 6173 pares de bases e contém sete regiões funcionais descritas na Tabela 8.

Tabela 8 Número dos Pares de Base do Plasmideo 2 a 881 Um sinal de terminação de transcrição/ poliadenilação da α-subunidade da hormona glicoproteica pituitária bovina (α-FSH) (Goodwin et al., 1983, Nucleic Acids Res. 11:6873-82; Número de Acesso Genbank X00004) 121 (continuação)

Número dos Pares de Base do Plasmideo 882 a 2027 Um minigene da di-hidrofolato redutase (DHFR) de murganho contendo o promotor DHFR endógeno de murganho, as sequências codificantes de ADNc e os sinais de terminação de transcrição/ poliadenilação de DHFR (Gasser et ai, 1982, Proc. Natl. Acad Sei. USA. 79:6522-6; Nunberg et al., 1980, Cell 19:355-64; Setzer et al., 1982, J. Biol. Chem. 257:5143-7; McGrogan et ai., 1985, J. Biol. Chem. 260:2307-14) 2031 a 3947 Sequências de pBR322 contendo o gene do marcador de resistência à ampicilina e a origem de replicação do plasmideo em E. coli (Número de Acesso Genbank J01749) 3949 a 4292 Um promotor precoce, intensificador e origem de replicação de SV40 (Takebe et ai., 1988, Mol. Cell Biol. 8:466-72, Número de Acesso Genbank J02400) 4299 a 4565 Um elemento intensificador de tradução do domínio LTR de HTLV-1 (Seiki et ai., 1983, Proc. Natl. Acad Sei. USA. 80:3618-22, Número de Acesso Genbank J02029) 4574 a 4730 Um intrão dos sinais dadores/aceitadores de splice de 16S, 19S de SV40 (Okayama e Berg, 1983, Mol. Cell Biol. 3:280-9, Número de Acesso Genbank J02400) 4755 a 6173 0 ADNc da cadeia pesada IgGl 15C4 entre os locais Xbal e SalI 122

Construção de pDSR19:h!gG2CH

Um plasmídeo de expressão de MAb pDSRlcx9: região variável humana/região constante humana de IgG2 (hVh/hCh2) foi construído como o resultado de uma ligação de três partes, produto de PCR da região variável de anticorpo humano terminado com Xbal e BsmBI, o produto de PCR da região constante de IgG2 humana (CHi, charneira, domínios CH2 e CH3) com extremidades BsmBI e sail e um pDSRal9 linearizado com extremidades Xfoal e SalI. 0 vector de expressão final, pDSRal9:região variável humana/região constante humana de IgG2 (hVh/hCh2) (ver Pedido Provisório de Patente U.S. N° 60/370407, do mesmo titular e co-pendente, apresentado em 5 de Abril de 2002, "Human Anti-OPGL Neutralizing Antibodies As Selective OPGL Pathway Inhibitors"), tem 6164 pares de bases e contém 7 regiões funcionais descritas na Tabela 9.

Tabela 9 Número dos Pares de Base do Plasmideo 2 a 881 Um sinal de terminação de transcrição/ poliadenilação da α-subunidade da hormona glicoproteica pituitária bovina (α-FSH) (Goodwin et al., 1983, Nucleic Acids Res. 11:6873-82; Número de Acesso Genbank X00004) 123 (continuação) Número dos Pares de Base do Plasmideo 882 a 2027 Um minigene da di-hidrofolato redutase (DHFR) de murganho contendo o promotor DHFR endógeno de murganho, as sequências codificantes de ADNc e os sinais de terminação de transcrição/poliadenilação de DHFR (Gasser et al., 1982, Proc. Natl. Acad Sei. USA. 79:6522- 6; Nunberg et al., 1980, Cell 19:355-64; Setzer et al., 1982, J. Biol. Chem. 257:5143-7; McGrogan et al., 1985, J. Biol. Chem. 260:2307-14) 2031 a 3947 Sequências de pBR322 contendo o gene do marcador de resistência à ampicilina e a origem de replicação do plasmideo em E. coli (Número de Acesso Genbank J01749) 3949 a 4292 Um promotor precoce, intensificador e origem de replicação de SV40 (Takebe et al., 1988, Mol. Cell Biol. 8:466-72, Número de Acesso Genbank J02400) 4299 a 4565 Um elemento intensificador de tradução do domínio LTR de HTLV-1 (Seiki et al., 1983, Proc. Natl. Acad Sei. USA. 80:3618-22, Número de Acesso Genbank J02029) 4574 a 4730 Um intrão dos sinais dadores/aceitadores de splice de 16S, 19S de SV40 (Okayama e Berg, 1983, Mol. Cell Biol. 3:280-9, Número de Acesso Genbank J02400) 124 (continuação)

Número dos Pares de Base do Plasmídeo 4755 a 6158 0 ADNc da cadeia pesada hVh/hCh2 entre os locais XbaI e sal I. Esta sequência deste fragmento da cadeia pesada é mostrada abaixo (SEQ ID N°:57) com os locais de restrição sublinhados: Xba 1 TCTAGA CCACCATGGA CATGAGGGTC CCCGCTCAGC TCCTGGGGCT CCTGCTATTG TGGTTGAGAG GTGCCAGATG TGAGGTCCAG CTGGTGCAGTCTGGGGGAGG CTTGGTACAT CCTGGGGGGT CCCTGAGACT CTCCTGTGCAGGCTCTGGAT TCACCTTCAG TGGCCATGCT TTGCACTGGG TTCGCCAGGCTCCAGGAAAA GGTCTGGAGT GGGTATCAGG TATTGGTACT CATGGTGGGACATACTATGC AGACTCCGTG AAGGGCCGAT TCACCATCTC CAGAGACAATGCCAAGAACT CCTTGTTTCT TCAAATGAAC AGCCTGAGCG CCGAGGACATGGCTGTGTAT TACTGTACAA GAAGAAACTG BsmBl GGGACAATTT GACTACTGGGGCCAGGGAAC CCTGGTCACC GTCTCTAGTG CCTCCACCAA GGGCCCATCGGTCTTCCCCC TGGCGCCCTG CTCCAGGAGC ACCTCCGAGA GCACAGCGGCCCTGGGCTGC CTGGTCAAGG ACTACTTCCC CGAACCGGTG ACGGTGTCGTGGAACTCAGG CGCTCTGACC AGCGGCGTGC ACACCTTCCC AGCTGTCCTACAGTCCTCAG GACTCTACTC CCTCAGCAGC GTGGTGACCG TGCCCTCCAGCAACTTCGGC ACCCAGACCT ACACCTGCAA CGTAGATCAC AAGCCCAGCAAGACCAAGGT GGACAAGACA GITGAGCGCA AATGTTGTGT CGAGTGCCCACCGTGCCCAG CACCACCTGT GGCAGGACCG TCAGTCITCC TCTTCCCCCCAAAACCCAAG GACACCCTCA TGATCTCCCG GACCCCTGAG GTCACGTGCGTGGTGGTGGA CGTGAGCCAC GAAGACCCCG AGGTCCAGTT CAACTGGTACGTGGACGGCG TGGAGGTGCA TAATGCCAAG ACAAAGCCAC GGQAGGAGCAGTTCAACAGC ÀCGTTCCGTG TGGTCAGCGT CCTCACCGTT GTGCACCAGGACTGGCTGAA CGGCAAGGAG TACAAGTGCA AGGTCTCCAA CAAAGGCCTCCCAGCCCCCA TCGAGAAAAC CATCTCCAAA ACCAAAGGGC AGCCCCGAGAACCACAGGTG TACACCCTGC CCCCATCCCG GGAGGAGATG ACCAAGAACCAGGTCAGCCT GACCTGCCTG GTCAAAGGCT TCTACCCCAG CGACATCGCCGTGGAGTGGG AGAGCAATGG GCAGCCGGAG AACAACTACA AGACCACACCTCCCATGCTG GACTCCGACG GCTCCTTCTT CCTCTACAGC AAGCTCACCGTGGACAAGAG CAGGTGGCAG CAGGGGAACG TCTTCTCATG CTCCGTGATGCATGAGGCTC TGCACAACCA CTACACGCAG sal I AAGAGCCTCT CCCTGTCTCCGGGTAAATGA TAAGTCGAC 0 plasmídeo linear pDSRal9:hIgG2Cn foi preparado por digestão do plasmídeo pDSRl9:região variável humana/região constante humana de IgG2 com as enzimas de restrição Xbal e 125

BsmBI, para remover a região variável humana, e purificado utilizando uma Kit de Extracção de Gel QIAquick. 0 plasmídeo linear pDSRcxl9 :hIgG2CH contendo o domínio da região constante humana de IgG2 de 1 kpb foi utilizado para aceitar regiões variáveis do anticorpo alL-lR derivadas de hibridoma.

Construção do Clone de Expressão da Cadeia Pesada IgG2 anti-ILl-RI 0 fragmento da região variável da cadeia pesada de alL-lRl 15C4, acima descrito, foi ligado no vector de expressão de mamífero pDSRcxl9:hIgG2Cn. 0 ADN do clone de expressão da cadeia pesada de IgG2 15C4 foi sequenciado para confirmar que codificava o mesmo péptido da região variável da cadeia pesada que foi identificado no hibridoma 15C4. 0 vector de expressão final, pDSRal9:15C4 da cadeia pesada IgG2 tinha 6161 pares de bases e contém sete regiões funcionais descritas na Tabela 10.

Tabela 10 Número dos Pares de Base do Plasmideo 2 a 881 Um sinal de terminação de transcrição/ poliadenilação da α-subunidade da hormona glicoproteica pituitária bovina (α-FSH) (Goodwin et al., 1983, Nucleic Acids Res. 11:6873-82; Número de Acesso Genbank X00004) 126 (continuação)

Número dos Pares de Base do Plasmideo 882 a 2027 Um minigene da di-hidrofolato redutase (DHFR) de murganho contendo o promotor DHFR endógeno de murganho, as sequências codificantes de ADNc e os sinais de terminação de transcrição/ poliadenilação de DHFR (Gasser et ai, 1982, Proc. Natl. Acad Sei. USA. 79:6522-6; Nunberg et al., 1980, Cell 19:355-64; Setzer et al., 1982, J. Biol. Chem. 257:5143-7; McGrogan et ai., 1985, J. Biol. Chem. 260:2307-14) 2031 a 3947 Sequências de pBR322 contendo o gene do marcador de resistência à ampicilina e a origem de replicação do plasmideo em E. coli (Número de Acesso Genbank J01749) 3949 a 4292 Um promotor precoce, intensificador e origem de replicação de SV40 (Takebe et al., 1988, Mol. Cell Biol. 8:466-72, Número de Acesso Genbank J02400) 4299 a 4565 Um elemento intensificador de tradução do domínio LTR de HTLV-1 (Seiki et al., 1983, Proc. Natl. Acad Sei. USA. 80:3618-22, Número de Acesso Genbank J02029) 4574 a 4730 Um intrão dos sinais dadores/aceitadores de spllce de 16S, 19S de SV40 (Okayama e Berg, 1983, Mol. Cell Biol. 3:280-9, Número de Acesso Genbank J02400) 4755 a 6161 0 ADNc da cadeia pesada IgG2 15C4 entre os locais Xbal e SalI 127

Construção de pDSR19:h!gG4CH

Um plasmídeo de expressão de MAb pDSRal9:região variável humana/região constante humana de IgG4 (hVh/hCh4) foi construído como o resultado de uma ligação de três partes do produto de PCR da região variável de anticorpo humano terminado com Xbal e BsmBI, a região constante de IgG4 humana (CHi, charneira, domínios CH2 e CH3) digerida com BsmBI e salI e isolada do gel, e um pDSRal9 linearizado com extremidades Xbal e SalI. 0 vector de expressão final, pDSRcxl9:região variável humana/região constante humana de IgG4 (hVh/hCh4) (ver Pedido Provisório de Patente U.S. N° 60/370407, do mesmo titular e co-pendente, apresentado em 5 de Abril de 2002, "Human Anti-OPGL Neutralizing Antibodies As Selective OPGL Pathway Inhibitors"), tem 6167 pares de bases e contém 7 regiões funcionais descritas na Tabela 11.

Tabela 11 Número dos Pares de Base do Plasmideo 2 a 881 Um sinal de terminação de transcrição/ poliadenilação da α-subunidade da hormona glicoproteica pituitária bovina (α-FSH) (Goodwin et al., 1983, Nucleic Acids Res. 11:6873-82; Número de Acesso Genbank X00004) 128 (continuação) Número dos Pares de Base do Plasmideo 882 a 2027 Um minigene da di-hidrofolato redutase (DHFR) de murganho contendo o promotor DHFR endógeno de murganho, as sequências codificantes de ADNc e os sinais de terminação de transcrição/poliadenilação de DHFR (Gasser et al., 1982, Proc. Natl. Acad Sei. USA. 79:6522- 6; Nunberg et al., 1980, Cell 19:355-64; Setzer et al., 1982, J. Biol. Chem. 257:5143-7; McGrogan et al., 1985, J. Biol. Chem. 260:2307-14) 2031 a 3947 Sequências de pBR322 contendo o gene do marcador de resistência à ampicilina e a origem de replicação do plasmideo em E. coli (Número de Acesso Genbank J01749) 3949 a 4292 Um promotor precoce, intensificador e origem de replicação de SV40 (Takebe et al., 1988, Mol. Cell Biol. 8:466-72, Número de Acesso Genbank J02400) 4299 a 4565 Um elemento intensificador de tradução do domínio LTR de HTLV-1 (Seiki et al., 1983, Proc. Natl. Acad Sei. USA. 80:3618-22, Número de Acesso Genbank J02029) 4574 a 4730 Um intrão dos sinais dadores/aceitadores de splice de 16S, 19S de SV40 (Okayama e Berg, 1983, Mol. Cell Biol. 3:280-9, Número de Acesso Genbank J02400) 129 (continuação)

Número dos Pares de Base do Plasmídeo 4755 a 6167 0 ADNc da cadeia pesada hVh/hCh4 entre os locais XbaI e sal I. Esta sequência deste fragmento da cadeia pesada é mostrada abaixo (SEQ ID N°:58) com os locais de restrição sublinhados: Xbal TCT AGACCACCAT GGACATGAGG GTCCCCGCTC AGCTCCTGGG GCTCCTGCTA TTGTGGTTGA GAGGTGCCAG ATGTGAGGTC CAGCTGGTGCAGTCTGGGGG AGGCTTGGTA CATCCTGGGG GGTCCCTGAG ACTCTCCTGTGCAGGCTCTG GATTCACCTT CAGTGGCCAT GCTTTGCACT GGGTTCGCCAGGCTCCAGGA AAAGGTCTGG AGTGGGTATC AGGTATTGGT ACTCATGGTGGGACATACTA TGCAGACTCC GTGAAGGGCC GATTCACCAT CTCCAGAGACAATGCCAAGA ACTCCTTGTT TCTTCAAATG AACAGCCTGA GCGCCGAGGACATGGCTGTG TATTACTGTA CAAGAAGAAA CTGGGGACAA TTTGACTACTGGGGCCAGGG ZfrmBl AACCCTGGTC ACCGTCTCTA GTGCCAGCAC CAAGGGGCCATCCGTnTTGG CCCIGGCUCC CTUCTCCAGG agcacctccg AGAGCACAGCCGCCCTGGGC TGCCTGGTCA AGGACTACTT CCCCGAACCG GTGACGGTGTCGTGGAACTC AGGCGCCCTG ACCAGCGGCG TGCACACCTT CCCGGCTGTCCTACAGTCCT CAGGACTCTA CTCCCTCAGC AGCGTGGTGA CCGTGCCCTCCAGCAGCTTG GGCACGAAGA CCTACACCTG CAACGTAGAT CACAAGCCCAGCAACACCAA GGTGGACAAG AGAGTTGAGT CCAAATATGG TCCCCCATGCCCATCATGCC CAGCACCTGA GTTCCTGGGG GGACCATCAG TCTTCCTGTTCCCCCCAAAA CCCAAGGACA CTCTCATGAT CTCCCGGACC CCTGAGGTCACGTGCGTGGT GGTGGACGTG AGCCAGGAAG ACCCCGAGGT CCAGTTCAACTGGTACGTGG ATGGCGTGGA GGTGCATAAT GCCAAGACAA AGCCGCGGGAGGAGCAGTTC AACAGCACGT ACCGTGTGGT CAGCGTCCTC ACCGTCCTGCACCAGGACTG GCTGAACGGC AAGGAGTACA AGTGCAAGGT CTCCAACAAAGGCCTCCCGT CCTCCATCGA GAAAACCATC TCCAAAGCCA AAGGGCAGCCCCGAGAGCCA CAGGTGTACA CCCTGCCCCC ATCCCAGGA G GAGATGACCAAGAACCAGGT CAGCCTGACC TGCCTGGTCA AAGGCTTCTA CCCCAGCGACATCGCCGTGG AGTGGGAGAG CAATGGGCAG CCGGAGAACA ACTACAAGACCACGCCTCCC GTGCTGGACT CCGACGGCTC CTTCTTCCTC TACAGCAGGCTAACCGTGGA CAAGAGCAGG TGGCAGGAGG GGAATGTCTT CTCATGCTCCGTGATGCATG AGGCTCTGCA CAACCACTAC Saã ACACAGAAGA GCCTCTCCCTGTCTCTGGGT AAATGATAAG TCGAC 0 plasmídeo linear pDSRal9:hIgG4CH foi preparado por digestão do plasmídeo pDSRl9:região variável humana/região constante humana de IgG4 com as enzimas de restrição XbaI e 130

BsmBI, para remover a região variável humana, e purificado utilizando um Kit de Extracção de Gel QlAquick. 0 plasmídeo linear pDSRal9:hIgG4CH contendo o domínio da região constante humana de IgG4 de 1 kpb foi utilizado para aceitar regiões variáveis do anticorpo alL-lR derivadas de hibridoma.

Construção do Clone de Expressão da Cadeia Pesada IgG4 Anti-ILl-RI 0 fragmento da região variável da cadeia pesada de alL-lRl 15C4, acima descrito, foi ligado no vector de expressão de mamífero pDSRal9:hIgG4CH· 0 ADN do clone de expressão da cadeia pesada de IgG4 15C4 foi sequenciado para confirmar que codificava o mesmo péptido da região variável da cadeia pesada que foi identificado no hibridoma 15C4. o vector de expressão final, pDSRal9:15C4 da cadeia pesada IgG4 tinha 6164 pares de bases e contém sete regiões funcionais descritas na Tabela 12.

Tabela 12 Número dos Pares de Base do Plasmideo 2 a 881 Um sinal de terminação de transcrição/ poliadenilação da α-subunidade da hormona glicoproteica pituitária bovina (α-FSH) (Goodwin et al.f 1983, Nucleic Acids Res. 11:6873-82; Número de Acesso Genbank X00004) 131 (continuação) Número dos Pares de Base do Plasmideo 882 a 2027 Um minigene da di-hidrofolato redutase (DHFR) de murganho contendo o promotor DHFR endógeno de murganho, as sequências codificantes de ADNc e os sinais de terminação de transcrição/ poliadenilação de DHFR (Gasser et ai, 1982, Proc. Natl. Acad Sei. USA. 79:6522-6; Nunberg et al., 1980, Cell 19:355-64; Setzer et al., 1982, J. Biol. Chem. 257:5143-7; McGrogan et ai., 1985, J. Biol. Chem. 260:2307-14) 2031 a 3947 Sequências de pBR322 contendo o gene do marcador de resistência à ampicilina e a origem de replicação do plasmideo em E. coli (Número de Acesso Genbank J01749) 3949 a 4292 Um promotor precoce, intensificador e origem de replicação de SV40 (Takebe et al., 1988, Mol. Cell Biol. 8:466-72, Número de Acesso Genbank J02400) 4299 a 4565 Um elemento intensificador de tradução do domínio LTR de HTLV-1 (Seiki et al., 1983, Proc. Natl. Acad Sei. USA. 80:3618-22, Número de Acesso Genbank J02029) 4574 a 4730 Um intrão dos sinais dadores/aceitadores de spllce de 16S, 19S de SV40 (Okayama e Berg, 1983, Mol. Cell Biol. 3:280-9, Número de Acesso Genbank J02400) 4755 a 6164 0 ADNc da cadeia pesada IgG4 15C4 entre os locais XbaI e sall 132

Exemplo 7

Expressão de anticorpos anti-IL-lRl em células de ovário de hamster Chinês (CHO)

Os anticorpos anti-IL-lRl recombinantes são produzidos em células de ovário de hamster Chinês, especificamente CHO AM-l/D, como divulgado na Patente U.S. N° 6210924. Resumidamente, as sequências de ADN que codificam as cadeias pesadas ou leves completas de cada anticorpo anti-IL-lRl da invenção, são clonadas em vectores de expressão. As células CHO AM-l/D são co-transfectadas com um vector de expressão capaz de expressar uma cadeia pesada completa e um vector de expressão que expressa a cadeia leve completa do anticorpo anti-IL-lRl apropriado. Por exemplo, para produzir o anticorpo 26F5, as células são co-transfectadas com um vector capaz de expressar uma cadeia leve completa compreendendo a sequência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID N°:38 e um vector capaz de expressar uma cadeia pesada completa compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N° : 20, SEQ ID N° : 22 ou SEQ ID N° : 24. Para produzir o anticorpo 27F2, as células são co-transfectadas com um vector capaz de expressar uma cadeia leve completa compreendendo a sequência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID N°: 38 e um vector capaz de expressar uma cadeia pesada completa compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N° : 26, SEQ ID N° : 28 ou SEQ ID N° : 30. Para produzir o anticorpo 15C4, as células são co-transfectadas com um vector capaz de expressar uma cadeia leve completa compreendendo a sequência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID N° : 40 e um vector capaz de expressar uma cadeia pesada completa compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N°: 32, SEQ ID N°: 34 ou SEQ ID N°: 36. A Tabela 13 resume as cadeias leves completas e pesadas completas para os vários 133 anticorpos IL-1R1. A designação ".../IgG=" descreve a sequência da região constante para o anticorpo particular.

Tabela 13

Anticorpo Região Variável da Cadeia Pesada + Região Constante da Cadeia Pesada Cadeia Pesada Completa 26F5/IgGl (nucleótido) SEQ ID N°: 9 + SEQ ID N°: 1 SEQ ID N°: 19 26F5/IgGl (aminoácido) SEQ ID N°: 10 + SEQ ID N°: 2 SEQ ID N°: 20 26F5/IgG2 (nucleótido) SEQ ID N°: 9 + SEQ ID N°: 5 SEQ ID N°: 21 26F5/IgG2 (aminoácido) SEQ ID N°: 10 + SEQ ID N°: 6 SEQ ID N°: 22 26F5/IgG4 (nucleótido) SEQ ID N°: 9 + SEQ ID N°: 7 SEQ ID N°: 23 26F5/IgG4 (aminoácido) SEQ ID N°: 10 + SEQ ID N°: 8 SEQ ID N°: 24 27F2/IgGl (nucleótido) SEQ ID N°: 13 + SEQ ID N°: 1 SEQ ID N°: 25 27F2/IgGl (aminoácido) SEQ ID N°: 14 + SEQ ID N°: 2 SEQ ID N°: 26 27F2/IgG2 (nucleótido) SEQ ID N°: 13 + SEQ ID N°: 5 SEQ ID N°: 27 27F2/IgG2 (aminoácido) SEQ ID N°: 14 + SEQ ID N°: 6 SEQ ID N°: 28 27F2/IgG4 (nucleótido) SEQ ID N°: 13 + SEQ ID N°: 7 SEQ ID N°: 29 134 (continuação)

Anticorpo Região Variável da Cadeia Pesada + Região Constante da Cadeia Pesada Cadeia Pesada Completa 27F2/IgG4 (aminoácido) SEQ ID N°: 14 + SEQ ID N°: 8 SEQ ID N°: 30 15C4/IgGl (nucleótido) SEQ ID N°: 15 + SEQ ID N°: 1 SEQ ID N°: 31 15C4/IgGl (aminoácido) SEQ ID N°: 16 + SEQ ID N°: 2 SEQ ID N°: 32 15C4/IgG2 (nucleótido) SEQ ID N°: 15 + SEQ ID N°: 5 SEQ ID N°: 33 15C4/IgG2 (aminoácido) SEQ ID N°: 16 + SEQ ID N°: 6 SEQ ID N°: 34 15C4/IgG4 (nucleótido) SEQ ID N°:15 + SEQ ID N°: 7 SEQ ID N°: 35 15C4/IgG4 (aminoácido) SEQ ID N°: 16 + SEQ ID N° : 8 SEQ ID N°: 36 Anticorpo Região Variável da Cadeia Leve + Região Constante da Cadeia Leve Cadeia Leve Completa 26F5/27F2 (nucleótido) SEQ ID N°: 11 + SEQ ID N°:3 SEQ ID N°: 37 26F5/27F2 (aminoácido) SEQ ID N°:12 + SEQ ID N°: 4 SEQ ID N°: 38 15C4 (nucleótido) SEQ ID N°:17 + SEQ ID N°: 3 SEQ ID N°: 39 15C4 (aminoácido) SEQ ID N°:18 + SEQ ID N°: 4 SEQ ID N°: 40 135 A expressão estável de anticorpos anti-IL-lRl é realizada por co-transfecção de células CHO AM-l/D deficientes em di-hidrofolato redutase (DHFR), com os vectores de expressão. As transfecções são realizadas utilizando técnicas convencionais (co-precipitação com fosfato de cálcio) e selecção por DHFR. As colónias transfectadas são isoladas e cultivadas até à confluência em placas de 24 poços. Os anticorpos produzidos pelas células transfectadas são examinados quanto ao enrolamento apropriado e actividade neutralizante. Os clones que sobreproduzem anticorpos anti-IL-lRl apropriadamente enrolados dos isotipos IgGl, IgG2 e IgG4 são seleccionados e os anticorpos são purificados como descrito abaixo.

Exemplo 8

Produção de Anticorpo anti-IL-lRl

Os anticorpos anti-IL-lRl são produzidos por expressão numa linha clonal de células CHO. Para cada série produtiva, as células de um único frasquinho são descongeladas em meio de cultura de células sem soro. As células são inicialmente cultivadas num balão em T e são expandidas em série através de uma série de balões com agitação magnética, até ser produzido inoculo suficiente para inocular num biorreactor de 20 L. Após crescimento durante 5-10 dias, a cultura é depois utilizada para inocular um biorreactor de 300 L. Após crescimento durante mais 5-10 dias, a cultura é utilizada para inocular um biorreactor de 2000 L. A produção é realizada num biorreactor de 2000 L utilizando uma cultura em modo descontínuo, em que são alimentados nutrientes contendo componentes concentrados para manter o crescimento celular e a viabilidade da cultura. A 136 produção dura aproximadamente duas semanas, durante as quais o anticorpo anti-ILl-Rl é produzido constitutivamente pelas células e segregado no meio de cultura celular. 0 reactor de produção é controlado por um pH, temperatura e nível de oxigénio dissolvido estabelecidos: o pH é controlado por adição de dióxido de carbono gasoso e carbonato de sódio; o oxigénio dissolvido é controlado pelo fluxo dos gases ar, azoto e oxigénio.

No final da produção, o caldo celular é alimentado numa centrifugadora de discos e o sobrenadante da cultura é separado das células. 0 concentrado é adicionalmente clarificado através de um filtro de profundidade, seguido por um filtro de 0,2 pm. O meio condicionado clarificado é depois concentrado por ultrafiltração de fluxo tangencial. O meio condicionado é concentrado 15 a 30 vezes. O meio condicionado concentrado é depois processado por purificação ou congelado para purificação numa data posterior.

Exemplo 9

Mapeamento de Epitopos Utilizando Proteínas de Fusão com Avidina

Para produzir proteínas de fusão com avidina, o ADNc que codifica a avidina de galinha (com a sequência de sinal endógena) foi ligado com a extremidade 5' de ADNc que codificam os domínios extracelulares maduros de IL-1R1 humano ou de cinomolgos, fundidos com uma sequência marcadora-FLAG na extremidade 3'. Os genes de fusão marcados com FLAG foram 137 montados num vector pALTERMAX utilizando técnicas moleculares convencionais. A sequência de aminoácidos da proteína de fusão IL-1R1 humano-avidina é mostrada na Figura 23 (SEQ ID N°:59). A sequência de aminoácidos da proteína de fusão IL-1R1 cinomolgo-avidina é mostrada na Figura 24 (SEQ ID N°: 60) . Foi gerado um painel de proteínas mutantes avidina-cinoIL-lRI-FLAG, em que aminoácidos humanos foram substituídos por resíduos correspondentes de cinomolgos, utilizando o Altered Sites II Mammalian In Vitro Mutagenesis System (Promega Corp.) . As mutações são ilustradas na Figura 24.

Os plasmídeos que codificam o mutante de avidina-cinoIL-lR e as proteínas de tipo selvagem, assim como que a proteína de avidina-huIL-lRI-FLAG, foram transfectados transientemente em células 293T, utilizando o reagente de transfecção Cytofectine (Bio-Rad Laboratories, Inc.). Transfectantes simulados foram utilizados como controlos negativos. Os anticorpos monoclonais anti-huIL-lRI (MAb) que se ligam a estas proteínas foram avaliados por transferência de Western e ensaios de ligação baseados em esferas que utilizam meio condicionado (CM) recolhido a partir das células transfectadas.

Para a análise de transferência de Western, o CM foi diluído 1:3 em tampão de amostra SDS não redutor, fervido durante 5-10 minutos e aplicado em géis de Tris-glicina a 10%. Após SDS-PAGE e transferência de Western, as membranas foram bloqueadas com 3%de BSA/1% de ovalbumina em PBS/0,1% de Tween-20 (PBST) e coradas com MAb anti-huIL-lRI. Um anticorpo anti-IgG humana-Fc-HRP de cabra (Pierce Chemical Co.) diluído 1:15000 em PBST foi utilizado para a detecção secundária. A detecção anti-FLAG foi utilizada para normalizar o conteúdo proteico. A captura de imagem e densitometria foram realizadas utilizando um sistema digital de imagiologia FluorChem 8000 138 (Alpha Innotech Corp.)· As intensidades do sinal para os MAb anti-huIL-lRI foram normalizadas contra os valores para o anticorpo anti-FLAG, para ter em consideração a variação do conteúdo proteico. A ligação do anticorpo foi expressa como uma percentagem de ligação a avidina-IL-lRl humano-FLAG.

Os resultados da transferência de Western são mostrados na Figura 25A. A Figura 25B mostra a análise densitométrica de um conjunto duplicado de experiências de transferência de Western. Os residuos humanos críticos para ligação do anticorpo são aqueles que restauram o sinal quando substituídos em cinoIL-lRI. Em geral, as mutações 1 e 2 (ilustradas na Figura 24), isoladamente ou em combinação, restauram a ligação a muitos anticorpos (15C4/IgG2, 5B8, 1C2, 24H2, 16E9, 26E4 e 20G1) enquanto as mutações 10,1 e 10,2 não. Nenhum destes anticorpos se ligou a cinoIL-lRI de tipo selvagem. Dois anticorpos (27F2 e 19C8) ligaram-se consistentemente a todas as proteínas mutantes, assim como a cinoIL-lRI de tipo selvagem. Isto sugeriu que o epitopo 4 (resíduos Y279-v281 de cinoIL-lRI), identificado nas proteínas paralog humanas/rato e inalteradas em IL-1R1 de cinomolgos, foi o epitopo dominante para estes anticorpos. O epitopo 4 está a negrito, em itálico e sublinhado na sequência de aminoácidos mostrada na Figura 24.

Nos ensaios de ligação multiplexados baseados em esferas, as proteínas de fusão com avidina foram capturadas por incubação do CM com esferas fluorescentes revestidas de biotina, um conjunto de esferas por proteína de fusão (Beadlyte Multi-Biotin lOplex Bead Kit; Upstate Biotechnologies). As esferas foram lavadas e reunidas em PBST e fraccionadas nos poços de uma placa de fundo de filtro de 96 poços (Millipore Corp.). Os anticorpos (MAb anti-huIL-lRI ou MAb anti-FLAG) foram adicionados a 25 pg/mL e incubados durante 1 hora. As esferas foram lavadas novamente e 139 uma mistura de anticorpo anti-IgG de murganho conjugado com ficoeritrina e (Fab')2 anti-IgG humana, foi utilizada para detectar a ligação do anticorpo. Após uma incubação de 1 hora, as esferas foram lavadas e ressuspensas em PBST. As intensidades médias de fluorescência (MFI) foram medidas utilizando um Luminex 100 (Luminex Corp). Os dados foram normalizados utilizando os valores de MFI para a ligação de MAb anti-FLAG, para ter em consideração a variação do conteúdo proteico. A ligação do anticorpo foi expressa como uma percentagem de ligação a avidina-huIL-lRl-FLAG (Figura 26). 0 perfil de ligação dos anticorpos anti-IL-lRl às proteínas avidina-cinoILIRl-FLAG mutadas com resíduos humanos, assim como às proteínas de cinomolgos de tipo selvagem e IL-1R1 humanas, foi consistente com a análise de imunotransferência mostrada na Figura 25. 140

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Varnum, Brian Witte, Alison Vezina, Chris Wong, Lu Min Qian, Xueming <120> Anticorpo Monoclonal Terapêutico Anti-IL-lRl Humano <130> 01, 1554 <160> 79 <170> Patentln versão 3.0

<210> 1 <211> 990 <212> ADN <213> Homo Sapiens <400> 1 gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct ccbccaagag cacctctggg 60 ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240 tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300 aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360 ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540 141 600 600 660 720 780 840 900 960 990 agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctctat agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa

<210> 2 <211> 330 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 2

Ala 1 Ser Thr Lys Gly 5 Pro Ser Vai Phe Pro 10 Leu Ala Pro Ser Ser 15 Lys Ser Thr Ser Gly 20 Gly Thr Ala Ala Leu 25 Gly Cys Leu Vai Lys 30 Asp Tyr Phe Pro Glu 35 Pro Vai Thr Vai Ser 40 Trp Asn Ser Gly Ala 45 Leu Thr Ser Gly Vai 50 His Thr Phe Pro Ala 55 Vai Leu Gin Ser Ser 60 Gly Leu Tyr Ser Leu 65 Ser Ser Vai Vai Thr 70 Vai Pro Ser Ser Ser 75 Leu Gly Thr Gin Thr 80 Tyr Ile Cys Asn Vai 85 Asn His Lys Pro Ser 90 Asn Thr Lys Vai Asp 95 Lys Lys Vai Glu Pro 100 Lys Ser Cys Asp Lys 105 Thr His Thr Cys Pro 110 Pro Cys Pro Ala Pro 115 Glu Leu Leu Gly Gly 120 Pro Ser Vai Phe Leu 125 Phe Pro Pro Lys Pro 130 Lys Asp Thr Leu Met 135 Ile Ser Arg Thr Pro 140 Glu Vai Thr Cys Vai 145 Vai Vai Asp Vai Ser 150 His Glu Asp Pro Glu 155 Vai Lys Phe Asn Trp 160 142

Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vai His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Vai Vai Ser Vai Leu Thr Vai Leu 180 185 190 His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Vai Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gin Pro Arg Glu Pro Gin Vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu Vai Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Xle Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Vai Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Vai Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn 290 295 300 Vai Phe Ser Cys Ser Vai Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr ' Thr 305 310 315 320 Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330

<210> 3 <211> 321 <212> ADN <213> Homo Sapiens <400> 3 60 120 180 240 300 cgaactgtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag agcttcaaca ggggagagtg t 143 321

<210> 4 <211> 107 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 4

Arg 1 Thr Vai Ala Ala 5 Pro Ser Vai Phe Ile 10 Phe Pro Pro Ser Asp 15 Glu Gin Leu Lys Ser 20 Gly Thr Ala Ser Vai 25 Vai Cys Leu Leu Asn 30 Asn Phe Tyr Pro Arg 35 Glu Ala Lys Vai Gin 40 Trp Lys Vai Asp Asn 45 Ala Leu Gin Ser Gly 50 Asn Ser Gin Glu Ser 55 Vai Thr Glu Gin Asp 60 Ser Lys Asp Ser Thr 65 Tyr Ser Leu Ser Ser 70 Thr Leu Thr Leu Ser 75 Lys Ala Asp Tyr Glu 80 Lys His Lys Vai Tyr B5 Ala Cys Glu Vai Thr 90 His Gin Gly Leu Ser 95 ser Pro Vai Thr Lys 100 Ser Phe Asn Arg Gly 105 Glu Cys

<210> 5 <211> 978 <212> ADN <213> Homo Sapiens <400> 5 gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctccgag 60 agcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120 tggaactcag gcgctctgac cagcggcgtg cacaccttcc cagctgtcct acagtcctca 180 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcaacttcgg cacccagacc 240 tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagac agttgagcgc 300 aaatgttgtg tcgagtgccc accgtgccca gcaccacctg tggcaggacc gtcagtcttc 360 ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacgtgc 420 gtggtggtgg acgtgagcca cgaagacccc gaggtccagt tcaactggta cgtggacggc 480 144 gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagcca gtggtcagcg tcctcaccgt tgtgcaccag aaggtctcca acaaaggcct cccagccccc cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct tccctgtctc cgggtaaa <210> 6 <211> 326 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 6 540 cgggaggagc agttcaacag cacgttccgt gactggctga acggcaagga gtacaagtgc 600 atcgagaaaa ccatctccaa aaccaaaggg 660 cccccatccc gggaggagat gaccaagaac 720 ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg 780 aagaccacac ctcccatgct ggactccgac 840 gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 900 ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 960 978

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Vai Phe 1 5 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu 20 25 Phe Pro Glu Pro Vai Thr Vai Ser Trp 35 40 Gly Vai His Thr Phe Pro Ala Vai Leu 50 55 Leu Ser Ser Vai Vai Thr Vai Pro Ser 65 70 Tyr Thr Cys Asn Vai Asp His Lys Pro 85

Pro 10 Leu Ala Pro Cys Ser 15 Arg Gly Cys Leu Vai Lys 30 Asp Tyr Asn Ser Gly Ala 45 Leu Thr Ser Gin Ser Ser 60 Gly Leu Tyr Ser Ser Asn 75 Phe Gly Thr Gin Thr 80 Ser 90 Asn Thr Lys Vai Asp 95 Lys

Thr Vai Glu Arg Lys Cys Cys Vai Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110

Pro Vai Ala Gly Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 115 120 125

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Vai Thr Cys Vai Vai Vai Asp 130 135 140

Vai Ser His Glu Asp Pro Glu Vai Gin Phe Asn Trp Tyr Vai Asp Gly 145 150 155 160 145

Vai Glu Vai Hls Asn 165 Ala Lys Thr Lys Pro 170 Arg Glu Glu Gin Phe 175 Asn Ser Thr Phe Arg 180 Vai Vai Ser Vai Leu 185 Thr Vai Vai His Gin 190 Asp Trp Leu Asn Gly 195 Lys Glu Tyr Lys Cys 200 Lys Vai Ser Asn Lys 205 Gly Leu Pro Ala Pro 210 lie Glu Lys Thr Ile 215 Ser Lys Thr Lys Gly 220 Gin Pro Arg Glu Pro 225 Gin Vai Tyr Thr Leu 230 Pro Pro Ser Arg Glu 235 Glu Met Thr Lys Asn 240 Gin Vai Ser Leu Thr 245 Cys Leu Vai Lys Gly 250 Phe Tyr Pro Ser Asp 255 Ile Ala Vai Glu Trp 260 Glu Ser Asn Gly Gin 265 Pro Glu Asn Asn Tyr 270 Lys Thr Thr Pro Pro 275 Met Leu Asp Ser Asp Gly 280 Ser Phe Phe Leu 285 Tyr Ser Lys Leu Thr 290 Vai Asp Lys Ser Arg 295 Trp Gin Gin Gly Asn 300 Vai Phe Ser Cys Ser 305 Vai Met His Glu Ala 310 Leu Hls Asn Hls Tyr 315 Thr Gin Lys Ser Leu 320 Ser Leu Ser Pro Gly 325 Lys

<210> 7 <211> 981 <212> ADN <213> Homo Sapiens <400> 7 60 120 180 240 gccagcacca aggggccatc cgtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctccgag agcacagccg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacgaagacc tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagtcc 146 300 360 aaatatggtc ccccatgccc atcatgccca gcacctgagt tcctgggggg accatcagtc ttcctgttcc ccccaaaacc caaggacact ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg 420 tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagac cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggat 480 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagttcaa cagcacgtac 540 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag 600 tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccgtcc tccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 660 gggcagcccc gagagccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccaggagga gatgaccaag 720 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag 780 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 840 gacggctcct tcttcctcta cagcaggcta accgtgraca agagcaggtg gcaggagggg 900 aatgtcttct catgctccgt gakgcatgag gctctgcaca accactacac acagaagagc 960 ctctccctgt ctctgggtaa a 981

<210> 8 <211> 327 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 8

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Vai Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Vai Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Vai Thr Vai Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Vai His Thr Phe Pro Ala Vai Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Vai Vai Thr Vai Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Vai Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Vai Asp Lys 85 90 95 Arg Vai Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Vai Thr Cys vai Vai Vai 130 135 140 147

Asp Vai Ser Gin Glu Asp Pro Glu Vai Gin Phe Asn Trp Tyr Vai Asp 145 150 155 160 Gly Vai Glu Vai HÍS Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Vai Vai Ser Vai Leu Thr Vai Leu His Gin Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Vai Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg 210 215 220 GlU Pro Gin Vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gin Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu Vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 Xle Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 250 265 270 Thr Thr Pro Pro Vai Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 Arg Leu Thr Vai Asp Lys Ser Arg Trp Gin Glu Gly Asn Vai Phe Ser 290 295 300 Cys Ser Vai Met Hls Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser 305 310 315 320 Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325

<210> 9 <211> 417 <212> ADN <213> Homo Sapiens <400> 9 atggagtttg ggctgagctg ggtcttcctc gttgctcttt taagaggtgt ccagtgtcag 60 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcgtg gtccagcctg ggaggtocct gagactctcc 120 tgtgcagcgt ctggattcac cttcagcaac tatggcatgc actgggtccg ccaggctcca 1B0 ggcaaggggc tggagtgggt ggcaggcatt tggaatgatg gaattaataa ataccatgca 240 cactccgtga ggggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatotg 300 caaatgaaca gcccgagagc cgaggacacg gctgtgtatt actgtgcgag agcaoggtct 360 ttcgactggc tattatttga gttctggggc eagggaaccc tggtcaccgt ctctagt 417 148

<210> 10 <211> 139 <212> PRT <213> Homo Sapiens <4 0 0> 10

Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Vai Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg Gly 1 5 10 15 Vai Gin Cys Gin Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin 20 25 30 Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Asn Tyr Gly Met Hie Trp val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Vai Ala Gly Ile Trp Asn Asp Gly Ile Asn Lys Tyr His Ala 65 70 75 80 His Ser Vai Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Pro Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Arg Ser Phe Asp Trp Leu Leu Phe Glu Phe 115 120 125 Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Val Ser Ser 130 135

<210> 11 <211> 384 <212> ADN <213> Homo Sapiens <4 0 0> 11 atggaagccc cagctcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga 60 gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 120 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 180 ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 240 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 300 gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggcctccgct cactttcggc 360 ggagggaeoa aggtggagat caaa 384 149

<210> 12 <211> 128 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 12

Met Glu Ala Pro Ala Gin Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15 Αβρ Thr Thr Gly 20 Glu Ile Val Leu Thr 25 Gin Ser Pro Ala Thr 30 Leu Ser Leu Ser Pro 35 Gly Glu Arg Ala Thr 40 Leu Ser Cys Arg Ala 45 Ser Gin Ser Vai Ser 50 Ser Tyr Leu Ala Trp 55 Tyr Gin Gin Lys Pro 60 Gly Gin Ala Pro Arg Leu 65 Leu Ile Tyr Asp 70 Ala Ser Asn Arg Ala 75 Thr Gly Ile Pro Ala 80 Arg Phe Ser Gly Ser 85 Gly Ser Gly Thr Asp 90 Phe Thr Leu Thr Ile 95 Ser Ser Leu Glu Pro 100 Glu Asp Phe Ala Val 105 Tyr Tyr Cys Gin Gin 110 Arg Ser Asn Trp Pro 115 Pro Leu Thr Phe Gly 120 Gly Gly Thr Lys Val 125 Glu Ile Lys

<210> 13 <211> 417 <212> ADN <213> Homo Sapiens <40 0> 13 atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt taagaggtgt ccagtgtcag 60 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcgtg gtccagcctg ggaggtccct gagactctcc 120 tgtgcagtgt ctggattcac cttcagtaac tatggcatgc actgggtccg ccaggctcca 180 ggcaaggggc tggagtgggt ggcagctata tggaatgatg gagaaaataa acaccatgca 240 ggctccgtga ggggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg 300 caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gctgtgtatt actgtgcgag aggacgatat 360 tttgactggt tattatttga gtattggggc cagggaacce tggtcaccgt ctctagt 417 150

<210> 14 <211> 139 <212> PRT <213> Homo Sapiens <4 0 0> 14

Met Glu Phe 1 Gly Leu 5 Ser Trp val Phe Leu 10 Val Ala Leu Leu Arg 15 Gly Vai Gin Cys Gin 20 Val Gin Leu Val Glu 25 Ser Gly Gly Gly Val 30 val Gin Pro Gly Arg 35 Ser Leu Arg Leu Ser Cys 40 Ala Val Ser Gly Phe 45 Thr Phe Ser Asn Tyr 50 Gly Met His Trp 55 Val Arg Gin Ala Pro 60 Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 65 Ala Ala Ile 70 Trp Asn Asp Gly Glu 75 Asn Lys His His Ala 80 Gly Ser Vai Arg Gly 85 Arg Phe Thr Ile Ser 90 Arg Asp Asn Ser Lys 95 Asn Thr Leu Tyr Leu 100 Gin Met Asn Ser Leu 105 Arg Ala Glu Asp Thr 110 Ala Val Tyr Tyr Cys 115 Ala Arg Gly Arg Tyr 120 Phe Asp Trp Leu Leu 125 Phe Glu Tyr Trp Gly Gin 130 Gly Thr Leu Val 135 Thr Val Ser Ser

<210> 15 <211> 411 < 212 > ADN <213> Homo Sapiens <400> 15 atggggtcaa ccgccatcct cgccctcctc ctggctgttc tccaaggagt ctgtgcegag 60 gtgcagctga tgcagtctgg agcagaggtg aaaaagcccg gggagtctct gaagatctcc 12 0 tgtaagggtt ctggatacag cttttccttc cactggatcg cctgggtgcg ccagatgccc 180 gggaaaggcc tggagtggat ggggatcatc catcctggtg cctctgatac cagatacagc 240 ccgtccttcc aaggccaggt caccatctca gccgacaact ccaacagcgc cacctacctg 300 cagtggagca gcctgaaggc ctcggacacc gccatgtatt tctgtgcgag acaaagggaa 360 ctcgactaet ttgactactg gggccaggga accctggtca ccgtctctag t 411 151

<210> 16 <211> 137 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 16

Met Gly Ser Thr Ala Ile Leu Ala Leu Leu Leu Ala Vai Leu Gin Gly 1 5 10 15 Vai Cys Ala Glu Vai Gin Leu Met Gin Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe 35 40 45 Ser Phe His Trp Ile Ala Trp Vai Arg Gin Met Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Met Gly Ile Ile His Pro Gly Ala Ser Asp Thr Arg Tyr Ser 65 70 75 80 Pro Ser Phe Gin Gly Gin Vai Thr Ile Ser Ala Asp Asn Ser Asn Ser 85 90 95 Ala Thr Tyr Leu Gin Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met 100 105 110 Tyr Phe Cys Ala Arg Gin Arg Glu Leu Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 115 120 125 Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 130 135

<210> 17 <211> 378 <212> ADN <213> Homo Sapiens <400> 17 60 120 180 240 300 360 atgtcgccat cacaactcat tgggtttctg ctgctctggg tfcccagcctc caggggtgaa attgtgctga ctcagtctcc agactttcag tctgtgactc caaaggagaa agtcaccatc acctgccggg ccagtcagag cattggtagt agcttacact ggtaccagca gaaaccagat cagtctccaa agctcctcat caagtatgct tcccagtcct tctcaggggt cccctcgagg ttcagtggca gtggatctgg gacagatbtc accctcacca tcaatagcct ggaagctgaa gatgctgcag cgtattactg tcatcagagt agtagtttae ctctcacttt cggcggaggg accaaggtgg agatcaaa 152 378

<210> 18 <211> 126 <212> PRT <213> Homo Sapiens <4 0 0> 18

Met Ser Pro Ser Gin Leu Ile Gly Phe Leu Leu Leu Trp vai Pro Ala 1 5 10 15 Ser Arg Gly Glu Ile Vai Leu Thr Gin Ser Pro Asp Phe Gin Ser Vai 20 25 30 Thr Pro Lys Glu Lys Vai Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser Ile 35 40 45 Gly Ser Ser Leu His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Asp Gin Ser Pro Lys 50 55 60 Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Gin Ser Phe Ser Gly Vai Pro Ser Arg 65 70 75 80 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser 85 90 95 Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Ala Tyr Tyr Cys His Gin Ser Ser Ser 100 105 110 Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys 115 120 125

<210> 19 <211> 1407 <212> ADN <213> Homo Sapiens <400> 19 60 120 180 240 300 360 atggagtttg ggctgagctg ggtcttcctc gttgctcttt taagaggtgt ccagtgtcag gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcgtg gtccagcctg ggaggtccct gagactctcc tgtgcagcgt ctggattcac cttcagcaac tatggcatgc actgggtccg ccaggctcca ggcaaggggc tggagtgggt ggcaggcatt tggaatgatg gaattaataa ataccatgca cactccgtga ggggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg caaatgaaca gcccgagagc cgaggacacg gctgtgtatt actgtgcgag agcacggtct ttcgactggc tattatttga gttctggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctctagtgcc 153 420 tccaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc 480 acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 540 aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 600 ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac 660 atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaagt tgagcccaaa 720 tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg 780 tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 840 gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 900 gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 960 acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 1020 tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 1080 gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggatgagctg 1140 accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1200 gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 12 60 gactccgacg gctccttctt cctctatagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1320 caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1380 aagagcctct ccctgfcctcc gggtaaa 1407 <210> 20 <211> 469 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 20 Mat Qiti Sly Leu Ser Trp Vai She Leu Vai 1 S 1β Ala Leu Leu teg S ly IS Vai. âX». Cys $ 31« Vai β] M ta Leu Vai ©X» Ser ôly 25 «ly ©Xy VaX 30 Vai m.n Fr» 0£y As? 3S ^ SfiE' L-au Ai fg Leu Ser £ 48 íys Ma Ala ser aiy Vbe 45 itr F&e Ssr Asv Ty: 59 t ©Xy Bi is trp Vai 1 ss irg Sis. Al® Pr» ©ly Ays m ely Leu 154

Glu Trp Vai Ala Gly Ile Trp Asn Asp Gly Ile Asn Lys Tyr His Ala 65 70 75 80 His Ser Vai Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Pro Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Arg Ser Phe Asp Trp Leu Leu Phe Glu Phe 115 120 125 Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 130 135 140 Pro Ser Vai Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly 145 150 155 160 Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Vai Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 165 170 175 Thr Vai Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Vai His Thr Phe 180 185 190 Pro Ala Vai Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Vai Val 195 200 205 Thr Vai Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr Ile Cys Asn Val 210 215 220 Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Vai Asp Lys Lys Vai Glu Pro Lys 225 230 235 240 Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu 245 250 255 Leu Gly Gly Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 260 265 270 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Vai Thr Cys Vai Vai Vai Asp Val 275 280 285 Ser His Glu Asp Pro Glu Vai Lys Phe Asn Trp Tyr Vai Asp Gly Vai 290 295 300 Glu Vai His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser 305 310 315 320 Thr Tyr Arg Vai Vai Ser Vai Leu Thr Vai Leu His Gin Asp Trp Leu 325 330 335 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Vai Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 340 345 350 Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro 355 360 365 Gin Vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin 370 375 380 155

Val 385 Ser Leu Thr Cys Leu 390 Val Lys Gly Phe Tyr 395 Pro Ser Asp Ile Ala 400 Val Glu Trp Glu Ser 405 Asn Gly Gin Pro Glu 410 Asn Asn Tyr Lys Thr 415 Thr Pro Pro Val Leu 420 Asp Ser Asp Gly Ser 425 Phe Phe Leu Tyr Ser 430 Lys Leu Thr Val Asp 435 Lys Ser Arg Trp Gin 440 Gin Gly Asn Val Phe 445 Ser Cys Ser Val Met 450 His Glu Ala Leu His 455 Asn His Tyr Thr Gin 460 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465

<210> 21 <211> 1395 <212> ADN <213> Homo Sapiens <400> 21 atggagtttg ggctgagctg ggtcttcctc gttgctcttt taagaggtgt ccagtgtcag 60 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcgtg gtccagcctg ggaggtccct gagactctcc 120 tgtgcagcgt ctggattcac cttcagcaac tatggcatgc actgggtccg ccaggctcca 180 ggcaaggggc tggagtgggt ggcaggcatt tggaatgatg gaattaataa ataccatgca 240 cactccgtga ggggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg 300 caaatgaaca gcccgagagc cgaggacacg gctgtgtatt actgtgcgag agcacggtct 360 ttcgactggc tattatttga gttctggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctctagtgcc 420 tccaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcgccctgct ccaggagcac ctccgagagc 480 acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 540 aactcaggcg ctctgaccag cggcgtgcac accttcccag ctgtcctaca gtcctcagga 600 ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca acttcggcac ccagacctac 660 acctgcaacg tagatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagacagt tgagcgcaaa 720 tgttgtgtcg agtgcccacc gtgcccagca ccaoctgtgg caggaccgtc agtcttcctc 780 ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacgtgcgtg 840 gtggtggacg tgagccacga agaccccgag gtccagttca actggtacgt ggacggcgtg 900 156 gaggtgcata atgccaagac aaagccacgg gaggagcagt tcaacagcac gttccgtgtg 960 gtcagcgtcc tcaccgttgt gcaccaggac tggctgaacg gcaaggagta caagtgcaag 1020 gtctccaaca aaggcctccc agcccccatc gagaaaacca tctccaaaac caaagggcag 1080 ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg aggagatgac caagaaccag 1140 gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc taccccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1200 agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacacctc ccatgctgga ctccgacggc 1260 tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc 1320 ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc 1380 ctgtctccgg gtaaa 1395

<210> 22 <211> 465 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 22

Met 1 Glu Phe Gly Leu 5 Ser Trp Val Phe Leu 10 Val Ala Leu Leu Arg 15 Gly Vai Gin Cys Gin 20 Val Gin Leu Val Glu 25 Ser Gly Gly Gly Val 30 Val Gin Pro Gly Arg 35 Ser Leu Arg Leu Ser 40 Cys Ala Ala Ser Gly 45 Phe Thr Phe Ser Asn 50 Tyr Gly Met His Trp 55 Val Arg Gin Ala Pro 60 Gly Lys Gly Leu Glu 65 Trp Vai Ala Gly Ile 70 Trp Asn Asp Gly Ile 75 Asn Lys Tyr His Ala 80 His Ser Val Arg Gly 85 Arg Phe Thr Ile Ser 90 Arg Asp Asn Ser Lys 95 Asn Thr Leu Tyr Leu 100 Gin Met Asn Ser Pro 105 Arg Ala Glu Asp Thr 110 Ala Val Tyr Tyr Cys 115 Ala Arg Ala Arg Ser 120 Phe Asp Trp Leu Leu 125 Phe Glu Phe Trp Gly 130 Gin Gly Thr Leu Val 135 Thr Val Ser Ser Ala 140 Ser Thr Lys Gly Pro 145 Ser Val Phe Pro Leu 150 Ala Pro Cys Ser Arg 155 Ser Thr Ser Glu Ser 160 157

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Vai Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Vai 165 170 175 Thr Vai Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Vai His Thr Phe 180 185 190 Pro Ala Vai Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Vai Vai 195 200 205 Thr Vai Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gin Thr Tyr Thr Cys Asn Vai 210 215 220 Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Vai Asp Lys Thr Vai Glu Arg Lys 225 230 235 240 Cys Cys Vai Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Vai Ala Gly Pro 245 250 255 Ser Vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 260 265 270 Arg Thr Pro Glu Vai Thr Cys Vai Vai Vai Asp Vai Ser His Glu Asp 275 280 285 Pro Glu Vai Gin Phe Asn Trp Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vai His Asn 290 295 300 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr Phe Arg Vai 305 310 315 320 Vai Ser Vai Leu Thr Vai Vai His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 325 330 335 Tyr Lys Cys Lys Vai Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 340 345 350 Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Vai Tyr Thr 355 360 365 Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Vai Ser Leu Thr 370 375 380 Cys Leu Vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Vai Glu Trp Glu 385 390 395 400 Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu 405 410 415 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Vai Asp Lys 420 425 430 Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Vai Phe Ser Cys Ser Vai Met His Glu 435 440 445 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 450 455 460

Lys 465 158

<210> 23 <211> 1398 <212> ADN <213> Homo Sapiens <400> 23 atggagtttg ggctgagctg ggtcttcctc gttgctcttt taagaggtgt ccagtgtcag 60 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcgtg gtccagcctg ggaggtccct gagactctcc 120 tgtgcagcgt ctggattcac cttcagcaac tatggcatgc actgggtccg ccaggctcca 180 ggcaaggggc tggagtgggt ggcaggcatt tggaatgatg gaattaataa ataccatgca 240 cactccgtga ggggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg 300 caaatgaaca gcccgagagc cgaggacacg gctgtgtatt actgtgcgag agcacggtct 360 ttcgactggc tattatttga gttctggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctctagtgcc 420 agcaccaagg ggccatccgt cttccccctg gcgccctgct ccaggagcac ctccgagagc 480 acagccgccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 540 aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 600 ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac gaagacctac 660 acctgcaacg tagatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagagagt tgagtccaaa 720 tatggtcccc catgcccatc atgcccagca cctgagttcc tggggggacc atcagtcttc 780 ctgttccccc caaaacccaa ggacactctc atgatctccc ggacccctga ggtcacgtgc 840 gtggtggtgg acgtgagcca ggaagacccc gaggtccagt tcaactggta cgtggatggc 900 gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agttcaacag cacgtaccgt 960 gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga acggcaagga gtacaagtgc 1020 aaggtctcca acaaaggcct cccgtcctcc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 1080 cagccccgag agccacaggt gtacaccctg cccccatccc aggaggagat gaccaagaac 1140 caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1200 gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 1260 ggctccttct tcctctacag caggctaacc gtgracaaga gcaggtggca ggaggggaat 1320 gtcttctcat gctccgtgak gcatgaggct ctgcacaacc actacacaca gaagagcotc 1380 tccctgtctc tgggtaaa 159 <210> 24 <211> 466 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 24

Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Vai Phe Leu Vai Ala Leu Leu Arg Gly 1 5 10 15 Vai Gin Cys Gin Vai Gin Leu vai Glu Ser Gly Gly Gly Vai Vai Gin 20 25 30 Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Asn Tyr Gly Met His Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Vai Ala Gly Ile Trp Asn Asp Gly Ile Asn Lys Tyr His Ala 65 70 75 80 His Ser Vai Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn B5 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Pro Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Arg Ser Phe Asp Trp Leu Leu Phe Glu Phe 115 120 12 5 Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 130 135 140 Pro Ser Vai Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser 145 150 155 160 Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Vai Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Vai 165 170 175 Thr Vai Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Vai His Thr Phe 180 185 190 Pro -Ala Vai Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Vai Vai 195 200 205 Thr Vai Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Vai 210 215 220 Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Vai Asp Lys Arg Vai Glu Ser Lys 225 230 235 240 Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly 245 250 255 Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 260 265 270 160

Ser Arg Thr 275 Pro Asp Pro 290 Glu vai Asn 305 Ala Lys Thr Vai Vai Ser Vai Glu Tyr Lys Cys 340 Lys Thr Ile 355 Ser Thr Leu 370 Pro Pro Thr 385 Cys Leu Vai Glu Ser Asn Gly Leu Asp Ser Asp 420 Lys Ser Arg 435 Trp Glu Ala 450 Leu His Gly 465 Lys

Glu Vai Thr Cys 280 Gin Phe Asn 295 Trp Lys Pro 310 Arg Glu Leu 325 Thr Vai Leu Lys Vai Ser Asn Lys Ala Lys Gly 360 Ser Gin Glu 375 Glu Lys Gly 390 Phe Tyr Gin 405 Pro Glu Asn Gly Ser Phe Phe Gin Glu Gly Asn 440 Asn His Tyr 455 Thr

Vai Vai Vai Asp Tyr Vai Asp Gly 300 Glu Gin Phe 315 Asn His Gin 330 Asp Trp Lys 345 Gly Leu Pro Gin Pro Arg Glu Met Thr Lys Asn 380 Pro Ser Asp 395 Ile Asn Tyr 410 Lys Thr Leu 425 Tyr Ser Arg Vai Phe Ser Cys Gin Lys Ser Leu 460

Vai 285 Ser Gin Glu Vai Glu Vai His Ser Thr Tyr Arg 320 Leu Asn Gly 335 Lys Ser Ser 350 Ile Glu Pro 365 Gin Vai Tyr Gin Vai Ser Leu Ala Vai GlU Trp 400 Thr Pro Pro 415 Vai Leu Thr 430 Vai Asp Ser 445 Vai Met His Ser Leu Ser Leu

<210> 25 <211> 1407 <212> ADN <213> Homo Sapiens <400> 25 60 120 atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt taagaggtgt ccagtgtcag gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcgtg gtccagcctg ggaggtccct gagactctcc tgtgcagtgt ctggattcac cttcagtaac tatggcatgc actgggtccg ccaggctcca 161 180 ggcaaggggc tggagtgggt ggcagctata tggaatgatg gagaaaataa acaccatgca 240 ggctccgtga ggggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg 300 caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gctgtgtatt actgfcgcgag aggacgatat 360 tttgactggt tattatttga gtattggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctctagtgcc 420 tccaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc 480 acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac taottccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 540 aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 600 ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac 660 atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaagt tgagcccaaa 720 tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg 780 tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 840 gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 900 gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 960 acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 1020 tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 1080 gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggatgagctg 1140 accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1200 gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1260 gactccgacg gctccttctt cctctatagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1320 caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1380 aagagcctct ccctgtctcc gggtaaa 1407

<210> 26 <211> 469 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 26

Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Vai Phe Leu Vai Ala Leu Leu Arg Gly 15 10 15

Vai Gin Cys Gin Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Vai Vai Gin 20 25 30 162

Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Vai Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45

Ser Asn Tyr Gly Met His Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60

Glu Trp Vai Ala Ala Ile Trp Asn Asp Gly Glu Asn Lys His His Ala 65 70 75 80

Gly Ser Vai Arg Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95

Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser 100

Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Arg Tyr 115 120

Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr 130 135

Pro Ser Vai Phe Pro Leu Ala Pro 145 150

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Vai 165

Thr Vai Ser Trp Asn Ser Gly Ala 180

Pro Ala Vai Leu Gin Ser Ser Gly 195 200

Thr Vai Pro Ser Ser Ser Leu Gly 210 215

Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 225 230

Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys 245

Leu Gly Gly Pro Ser Vai Phe Leu 260

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 275 280

Ser His Glu Asp Pro Glu Vai Lys 290 295

Glu Vai His Asn Ala Lys Thr Lys 305 310

Thr Tyr Arg Vai Vai Ser Vai Leu 325

Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai 105 110

Phe Asp Trp Leu Leu Phe Glu Tyr 125

Vai Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 140

Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly 155 160

Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Vai 170 175

Leu Thr Ser Gly Vai His Thr Phe 185 190

Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Vai Vai 205

Thr Gin Thr Tyr Ile Cys Asn Vai 220

Vai Asp Lys Lys Vai Glu Pro Lys 235 240

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu 250 255

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 265 270

Vai Thr Cys Vai Vai Vai Asp Vai 285

Phe Asn Trp Tyr Vai Asp Gly Vai 300

Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser 315 320

Thr Vai Leu His Gin Asp Trp Leu 330 335 163

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Vai Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 340 345 350 Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro 355 360 365 Gin Vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin 370 375 380 Vai Ser Leu Thr Cys Leu Vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 385 390 395 400 Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 405 410 415 Pro Pro Vai Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 420 425 430 Thr Vai Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Vai Phe Ser Cys Ser 435 440 445 Vai Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser 450 455 460

Leu Ser Pro Gly Lys 465

<210> 27 <211> 1395 <212> ADN <213> Homo Sapiens <400> 27 atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt taagaggtgt ccagtgtcag 60 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcgtg gtccagcctg ggaggtccct gagactctcc 120 tgtgcagtgt ctggattcac cttcagtaac tatggcatgc actgggtccg ccaggctcca 180 ggcaaggggc tggagtgggt ggcagctata tggaatgatg gagaaaataa acaccatgca 240 ggctccgtga ggggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg 300 caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gctgtgtatt actgtgcgag aggacgatat 360 tttgactggt tattatttga gtattggggc oagggaaecc tggtcaccgt ctctagtgcc 420 tccaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcgccctgct ccaggagcac ctccgagagc 480 acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 540 aactcaggcg ctctgaccag cggcgtgcac accttcccag ctgtcctaca gtcctcagga 600 ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca acttcggcac ccagacctac 660 164 acctgcaacg tagatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagacagt tgagcgcaaa 720 tgttgtgtcg agtgcccacc gtgcccagca ccacctgtgg caggaccgtc agtcttcctc 780 ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacgtgcgtg 840 gtggtggacg tgagccacga agaccccgag gtccagttca actggtacgt ggacggcgtg 900 gaggtgcata atgccaagac aaagccacgg gaggagcagt tcaacagcac gttccgtgtg 960 gtcagcgtcc tcaccgttgt gcaccaggac tggctgaacg gcaaggagta caagtgcaag 1020 gtctccaaca aaggcctccc agcccccatc gagaaaacca tctccaaaac caaagggcag 1080 ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg aggagatgac caagaaccag 1140 gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc taccccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1200 agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacacctc ccatgctgga ctccgacggc 1260 tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc 1320 ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc 1380 ctgtctccgg gtaaa 1395

<210> 28 <211> 465 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 28

Met 1 Glu Phe Gly Leu 5 Ser Trp Vai Phe Leu 10 Vai Ala Leu Leu Arg 15 Gly Vai Gin Cys Gin 20 Vai Gin Leu Vai Glu 25 Ser Gly Gly Gly Vai 30 Vai Gin Pro Gly Arg 35 Ser Leu Arg Leu Ser 40 Cys Ala Vai Ser Gly 45 Phe Thr Phe Ser Asn 50 Tyr Gly Met His Trp 55 Vai Arg Gin Ala Pro 60 Gly Lys Gly Leu Glu Trp 65 Vai Ala Ala Ile 70 Trp Asn Asp Gly Glu 75 Asn Lys His His Ala 80 Gly Ser Vai Arg Gly 85 Arg Phe Thr Ile Ser 90 Arg Asp Asn Ser Lys 95 Asn Thr Leu Tyr Leu 100 Gin Met Αεη Ser Leu 105 Arg Ala Glu Asp Thr 110 Ala Vai 165

Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Arg Tyr Phe Asp Trp Leu Leu Phe Glu Tyr 115 120 125 Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 130 135 140 Pro Ser Vai Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser 145 150 155 160 Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 165 170 175 Thr Vai Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 180 185 190 Pro Ala Vai Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 195 200 205 Thr Vai Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gin Thr Tyr Thr Cys Asn Val 210 215 220 Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys 225 230 235 240 Cys Cys Vai Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro 245 250 255 Ser Vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 260 265 270 Arg Thr Pro Glu Vai Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 275 280 285 Pro Glu Vai Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 290 295 300 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val 305 310 315 320 Vai ser Vai Leu Thr Vai Val His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 325 330 335 Tyr Lys Cys Lys Vai Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 340 345 350 Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr 355 360 365 Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr 370 375 380 Cys Leu Vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 385 390 395 400 166

Ser Asn Gly Gin Pro 405 Glu Asn Asn Tyr Lys 410 Thr Thr Pro Pro Met 415 Leu Asp Ser Asp Gly Ser 420 Phe Phe Leu Tyr 425 Ser Lys Leu Thr Vai 430 Asp Lys Ser Arg Trp 435 Gin Gin Gly Asn Vai 440 Phe Ser Cys Ser Vai 445 Met His Glu Ala Leu 450 His Asn His Tyr Thr 455 Gin Lys Ser Leu Ser 460 Leu Ser Pro Gly

Lys 465

<210> 29 <211> 1398 <212> ADN <213> Homo Sapiens <400> 29 atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt taagaggtgt ccagtgtcag 60 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcgtg gtccagcctg ggaggtccct gagactctcc 120 tgtgcagtgt ctggattcac cttcagtaac tatggcatgc actgggtccg ccaggctcca 180 ggoaaggggc tggagtgggt ggcagctata tggaatgatg gagaaaataa acaccatgca 240 ggctccgtga ggggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg 300 caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gctgtgtatt actgtgcgag aggacgatat 360 tttgactggt tattatttga gtattggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctctagtgcc 420 agcaccaagg ggccatccgt cttccccctg gcgccctgct ccaggagcac ctccgagagc 480 acagccgccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 540 aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 600 ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac gaagacctac 660 acctgcaacg tagatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagagagt tgagtccaaa 720 tatggtcccc catgcccatc atgcccagca cctgagttcc tggggggacc atcagtcttc 780 ctgttccccc caaaacccaa ggacactctc atgatctccc ggacccctga ggtcacgtgc 840 gtggtggtgg acgtgagcca ggaagaccco gaggtccagt tcaactggta cgtggatggc 900 gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agttcaacag cacgtaccgt 960 gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga acggcaagga gtacaagtgc 1020 167 aaggtctcca acaaaggcct cccgtcctcc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 1080 cagccccgag agccacaggt gtacaccctg cccccatccc aggaggagat gaccaagaac 1140 caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1200 gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 1260 ggctccttct tcctctacag caggctaacc gtgracaaga gcaggtggca ggaggggaat 1320 gtcttctcat gctccgtgak gcatgaggct ctgcacaacc actacacaca gaagagcctc 1380 tccctgtctc tgggtaaa 1398

<210> 30 <211> 466 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 30

Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Vai Phe Leu Vai Ala Leu Leu Arg Gly 1 5 10 15 Vai Gin Cys Gin Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Vai Vai Gin 20 25 30 Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Vai Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Asn Tyr Gly Met His Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Vai Ala Ala Ile Trp Asn Asp Gly Glu Asn Lys His His Ala 65 70 75 80 Gly Ser Vai Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Arg Tyr Phe Asp Trp Leu Leu Phe Glu Tyr 115 120 125 Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 130 135 140 Pro Ser Vai Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser 145 150 155 160 Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Vai Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Vai 165 170 175 168

Thr Vai Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Vai His Thr Phe 180 185 190

Pro Ala Vai Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Vai Vai 195 200 205

Thr Vai Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Vai 210 215 220

Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Vai Asp Lys Arg Vai Glu Ser Lys 225 230 235 240

Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly 245 250 255

Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 260 265 270

Ser Arg Thr Pro Glu Vai Thr Cys Vai Vai Vai Asp Vai Ser Gin Glu 275 280 285

Asp Pro Glu Vai Gin Phe Asn Trp Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vai His 290 295 300

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr Tyr Arg 305 310 315 320

Vai Vai Ser Vai Leu Thr Vai Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys 325 330 335

Glu Tyr Lys Cys Lys Vai Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu 340 345 350

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Vai Tyr 355 360 365

Thr Leu Pro Pro Ser Gin Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Vai Ser Leu 370 375 380

Thr Cys Leu Vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Vai Glu Trp 385 390 395 400 Glu Ser Asn Gly Gin 405 Pro Glu Asn Asn Tyr 410 Lys Thr Thr Pro Pro 415 Vai Leu Asp Ser Asp 420 Gly Ser Phe Phe Leu 425 Tyr Ser Arg Leu Thr 430 Vai Asp Lys Ser Arg 435 Trp Gin Glu Gly Asn 440 Vai Phe Ser Cys Ser 445 Vai Met His Glu Ala 450 Leu His Asn His Tyr 455 Thr Gin Lys Ser Leu 460 Ser Leu Ser Leu

Gly Lys 465 169

<210> 31 <211> 1401 <212> ADN <213> Homo Sapiens <400> 31 atggggtcaa ccgccatcct cgccctcctc ctggctgttc tccaaggagt ctgtgccgag 60 gtgcagctga tgcagtctgg agcagaggtg aaaaagcccg gggagtctct gaagatctcc 120 tgtaagggtt ctggatacag cttttccttc cactggatcg cctgggtgcg ccagatgccc 180 gggaaaggcc tggagtggat ggggatcatc catcctggtg cctctgatac cagatacagc 240 ccgtccttcc aaggccaggt caccatctca gccgacaact ccaacagcgc cacctacctg 300 cagtggagca gcctgaaggc ctcggacacc gccatgtatt tctgtgcgag acaaagggaa 360 ctcgactact ttgactactg gggccaggga accctggtca ccgtctctag tgcctccacc 420 aagggeccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 480 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 540 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 600 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 660 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt 720 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 780 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggteaea 840 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 900 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 960 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 1020 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1080 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccafc cccgggatga gctgaccaag 1140 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1200 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1260 gacggctcct tcttcctcta tagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1320 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1380 ctctccctgt ctccgggtaa a 1401 170

<210> 32 <211> 467 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 32

Met 1 Gly Ser Thr Ala 5 Ile Leu Ala Vai Cys Ala Glu 20 Vai Gin Leu Met Pro Gly Glu 35 Ser Leu Lys Ile Ser 40 Ser Phe 50 His Trp Ile Ala Trp 55 Vai Glu 65 Trp Met Gly Ile Ile His 70 Pro Pro Ser Phe Gin Gly 85 Gin Vai Thr Ala Thr Tyr Leu 100 Gin Trp Ser Ser Tyr Phe Cys 115 Ala Arg Gin Arg Glu 120 Gin Gly 130 Thr Leu Vai Thr Vai 135 Ser Vai 145 Phe Pro Leu Ala Pro Ser 150 Ser Ala Leu Gly Cys Leu 165 Vai Lys Asp Ser Trp Asn Ser 180 Gly Ala Leu Thr Vai Leu Gin 195 Ser Ser Gly Leu Tyr 200 Pro Ser 210 Ser Ser Leu Gly Thr 215 Gin

Leu Leu 10 Leu Ala Vai Leu Gin Gly 15 Gin 25 Ser Gly Ala Glu Vai 30 Lys Lys Cys Lys Gly Ser Gly 45 Tyr Ser Phe Arg Gin Met Pro 60 Gly Lys Gly Leu Gly Ala Ser Asp 75 Thr Arg Tyr Ser 80 Ile Ser 90 Ala Asp Asn Ser Asn 95 Ser Leu 105 Lys Ala Ser Asp Thr 110 Ala Met Leu Asp Tyr Phe Asp 125 Tyr Trp Gly Ser Ala Ser Thr 140 Lys Gly Pro Ser Lys Ser Thr 155 Ser Gly Gly Thr Ala 160 Tyr Phe 170 Pro Glu Pro Vai Thr 175 Vai Ser 185 Gly Vai His Thr Phe 190 Pro Ala Ser Leu Ser Ser Vai 205 Vai Thr Vai Thr Tyr Ile Cys Asn Vai Asn His 171 220

Lys 225 Pro Ser Asn Thr Lys 230 Vai Asp Asp Lys Thr His Thr 245 Cys Pro Pro Gly Pro Ser Vai 250 Phe Leu Phe Pro Ile Ser Arg 275 Thr Pro Glu Vai Thr 280 Glu Asp 290 Pro Glu Vai Lys Phe 295 Asn His 305 Asn Ala Lys Thr Lys 310 Pro Arg Arg Vai Vai Ser Vai 325 Leu Thr Vai Lys Glu Tyr Lys 340 Cys Lys Vai Ser Glu Lys Thr 355 Ile Ser Lys Ala Lys 360 Tyr Thr 370 Leu Pro Pro Ser Arg 375 Asp Leu 385 Thr Cys Leu Vai Lys 390 Gly Phe Trp GlU Ser Asn Gly Gin 405 Pro Glu Vai Leu Asp Ser 420 Asp Gly Ser Phe Asp Lys Ser 435 Arg Trp Gin Gin Gly 440 His Glu 450 Ala Leu His Asn His 455 Tyr Pro Gly Lys 465 <210> 33 <211> 1389 <212> ADN <213> Homo Sapiens

Lys Lys Vai 235 Glu Pro Lys Ser Cys 240 Cys Pro 250 Ala Pro Glu Leu Leu 255 Gly Pro 265 Lys Pro Lys Asp Thr 270 Leu Met Cys Vai Vai Vai Asp 285 Vai Ser His Trp Tyr Vai Asp 300 Gly Vai Glu Vai Glu Glu Gin 315 Tyr Asn Ser Thr Tyr 320 Leu His 330 Gin Asp Trp Leu Asn Gly 335 Asn 345 Lys Ala Leu Pro Ala 350 Pro Ile Gly Gin Pro Arg Glu 365 Pro Gin Vai Glu Leu Thr Lys 380 Asn Gin Vai Ser Tyr Pro Ser 395 Asp Ile Ala Vai Glu 400 Asn Asn 410 Tyr Lys Thr Thr Pro 415 Pro Phe 425 Leu Tyr Ser Lys Leu 430 Thr Vai Asn Vai Phe Ser Cys 445 Ser Vai Met Thr Gin Lys Ser 460 Leu Ser Leu Ser 172 <400> 33 atggggtcaa ccgccatcct cgccctcctc ctggctgttc tccaaggagt ctgtgccgag 60 gtgcagctga tgcagtctgg agcagaggtg aaaaagcccg gggagtctct gaagatctcc 120 tgtaagggtt ctggatacag cttttccttc cactggatcg cctgggtgcg ccagatgccc 180 gggaaaggcc tggagtggat ggggatcatc catcctggtg cctctgatac cagatacagc 240 ccgtccttcc aaggccaggt caccatctca gccgacaact ccaacagcgc cacctacctg 300 cagtggagca gcctgaaggc ctcggacacc gccatgtatt tctgtgcgag acaaagggaa 360 ctcgactact ttgactactg gggccaggga accctggtca ccgtctctag tgcctccacc 420 aagggcccat cggtcttccc cctggcgccc tgctccagga gcacctccga gagcacagcg 480 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc occgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 540 ggcgctctga ccagcggcgt gcacaccttc ccagctgtcc tacagtcctc aggactctac 600 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcaacttcg gcacccagac ctacacctgc 660 aacgtagatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga cagttgagcg caaatgttgt 720 gtcgagtgcc caccgtgccc agcaccacct gtggcaggac cgtcagtctt cctcttcccc 780 ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacgtg cgtggtggtg 84 0 gacgtgagcc acgaagaccc cgaggtccag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 900 cataatgcca agacaaagcc acgggaggag cagttcaaca gcacgttccg tgtggtcagc 960 gtcctcaccg ttgtgcacca ggactggctg aacggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 1020 aacaaaggcc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aaaccaaagg gcagccccga 1080 gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc 1140 ctgacctgcc tggtcaaagg cttctacccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 1200 gggcagccgg agaacaacta caagaccaca cctcccatgc tggactccga cggctccttc 1260 ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1320 tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 1380 ccgggtaaa 1389

<210> 34 <211> 463 <212> PRT <213> Homo Sapiens 173 <4Ο0> 34

Met 1 Gly Ser Thr Ala 5 Xle Leu Ala Leu Leu 10 Leu Ala Vai Leu Gin 15 Gly Vai Cys Ala Glu 20 Vai Gin Leu Met Gin 25 Ser Gly Ala Glu Vai 30 Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe 35 40 45 174

Ser Phe His Trp lie Ala Trp Vai 50 55

Glu Trp Met Gly Ile Ile His Pro 65 70

Pro Ser Phe Gin Gly Gin Vai Thr 85

Ala Thr Tyr Leu Gin Trp Ser Ser 100

Tyr Phe Cys Ala Arg Gin Arg Glu 115 120

Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser 130 135

Vai Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser 145 150

Ala Leu Gly Cys Leu Vai Lys Asp 165

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr 180

Vai Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr 195 200

Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gin 210 215

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Vai Asp 225 230

Vai Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala 245

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 260

Pro Glu Vai Thr Cys Vai Vai Vai 275 280

Vai Gin Phe Asn Trp Tyr Vai Asp 290 295

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe 305 310

Vai Leu Thr Vai Vai His Gin Asp 325

Cys Lys Vai Ser Asn Lys Gly Leu 340

Ser Lys Thr Lys Gly Gin Pro Arg 355 360

Arg Gin Met Pro Gly Lys Gly Leu 60

Gly Ala Ser Asp Thr Arg Tyr Ser 75 80

Ile Ser Ala Asp Asn Ser Asn Ser 90 95

Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met 105 lio

Leu Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 125

Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 140

Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala 155 160

Tyr Phe Pro Glu Pro Vai Thr Vai 170 175

Ser Gly Vai His Thr Phe Pro Ala 185 190

Ser Leu Ser Ser Vai Vai Thr vai 205

Thr Tyr Thr Cys Asn Vai Asp His 220

Lys Thr Vai Glu Arg Lys Cys Cys 235 240

Pro Pro Vai Ala Gly Pro Ser Vai 250 255

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 265 270

Asp Vai Ser His Glu Asp Pro Glu 285

Gly Vai Glu Vai His Asn Ala Lys 300

Asn Ser Thr Phe Arg Vai Vai Ser 315 320

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 330 335

Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 345 350

Glu Pro Gin Vai Tyr Thr Leu Pro 365 175

Pro Ser 370 Arg Glu Glu Met Thr 375 Lys Asn Gin Vai Ser 380 Leu Thr Cys Leu Vai 385 Lys Gly Phe Tyr Pro 390 Ser Asp Ile Ala Vai 395 Glu Trp Glu Ser Asn 400 Gly Gin Pro Glu Asn 405 Asn Tyr Lys Thr Thr 410 Pro Pro Met Leu Asp 415 Ser Asp Gly Ser Phe 420 Phe Leu Tyr Ser Lys 425 Leu Thr Vai Asp Lys 430 Ser Arg Trp Gin Gin Gly 435 Asn Vai Phe Ser 440 Cys Ser Vai Met His 445 Glu Ala Leu His Asn 450 His Tyr Thr Gin Lys 455 Ser Leu Ser Leu Ser 460 Pro Gly Lys

<210> 35 <211> 1392 <212> ADN <213> Homo Sapiens <400> 35 atggggtcaa ccgccatcct cgccctcctc ctggctgttc tccaaggagt ctgtgccgag 60 gtgcagctga tgcagtctgg agcagaggtg aaaaagcccg gggagtctct gaagatctcc 120 tgtaagggtt ctggatacag cttttccttc cactggatcg cctgggtgcg ccagatgccc 180 gggaaaggcc tggagtggat ggggatcatc catcctggtg cctctgatac cagatacagc 240 ccgtccttcc aaggccaggt caccatctca gccgacaact ccaacagcgc cacctacctg 300 cagtggagca gcctgaaggc ctcggacacc gccatgtatt tctgtgcgag acaaagggaa 360 ctcgactact ttgactactg gggccaggga accctggtca ccgtctctag tgccagcacc 420 aaggggccat ccgtcttccc cctggcgccc tgctccagga gcacctccga gagcacagcc 480 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgaoggtgtc gtggaactca 540 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 600 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacgaagac ctacacctgc 660 aacgtagatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga gagttgagtc caaatatggt 720 cccccatgcc catcatgccc agcacctgag ttcctggggg gaccatcagt cttcctgttc 780 cccccaaaac ccaaggacac tctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac gtgcgtggtg 840 gtggacgtga gccaggaaga ccccgaggtc cagttcaact ggtacgtgga tggcgtggag 900 176 gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagttca acagcacgta ccgtgtggtc 960 agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaacggca aggagtacaa gtgcaaggtc 1020 tccaacaaag gcctcccgtc ctccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc 1080 cgagagccac aggtgtacac cctgccccca tcccaggagg agatgaccaa gaaccaggtc 1140 agcctgacct gcctggtcaa aggcttctac cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 1200 aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc 1260 ttcttcctct acagcaggct aaccgtgrac aagagcaggt ggcaggaggg gaatgtcttc 1320 tcatgctccg tgakgcatga ggctctgcac aaccactaca cacagaagag cctctccctg 1380 tctctgggta aa 1392 <210> 36 <211> 464

<212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 36

Met Gly Ser Thr Ala Ile Leu Ala Leu Leu Leu Ala Vai Leu Gin Gly 1 5 10 15 Vai Cys Ala Glu Vai Gin Leu Met Gin Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe 35 40 45 Ser Phe Hls Trp Ile Ala Trp Vai Arg Gin Met Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Met Gly Ile Ile His Pro Gly Ala Ser Asp Thr Arg Tyr Ser 65 70 75 80 Pro Ser Phe Gin Gly Gin Vai Thr Ile Ser Ala Asp Asn Ser Asn Ser 85 90 95 Ala Thr Tyr Leu Gin Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met 100 105 110 Tyr Phe Cys Ala Arg Gin Arg Glu Leu Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 115 120 125 Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 130 135 140 Vai Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala 145 150 155 160 177

Ala Leu Gly Cys Ser Trp Asn Ser 180 Vai Leu Gin 195 Ser Pro Ser Ser Ser 210 Lys 225 Pro Ser Asn Pro Pro Cys Pro Vai Phe Leu Phe 260 Thr Pro Glu 275 Vai Glu Vai 290 Gin Phe Lys 305 Thr Lys Pro Ser Vai Leu Thr Lys Cys Lys Vai 340 Ile Ser Lys 355 Ala Pro Pro 370 Ser Gin Leu 385 Vai Lys Gly Asn Gly Gin Pro Ser Asp Gly Ser 420 Arg Trp Gin 435 Glu Leu His Asn His 450

Leu 165 Vai Lys Asp Gly Ala Leu Thr Ser Gly Leu Tyr 200 Leu Gly Thr Lys 215 Thr Lys 230 Vai Asp Ser 245 Cys Pro Ala Pro Pro Lys Pro Thr Cys Vai Vai 280 Asn Trp Tyr 295 Vai Arg Glu 310 Glu Gin Vai 325 Leu His Gin Ser Asn Lys Gly Lys Gly Gin Pro 360 Glu Glu Met 375 Thr Phe Tyr 390 Pro Ser Glu 405 Asn Asn Tyr Phe Phe Leu Tyr Gly Asn Vai Phe 440 Tyr Thr Gin 455 Lys

Tyr Phe 170 Pro Glu Ser 185 Gly Vai His Ser Leu Ser Ser Thr Tyr Thr Cys 220 Lys Arg Vai 235 Glu Pro Glu 250 Phe Glu Lys 265 Asp Thr Leu Vai Asp Vai Ser Asp Gly Vai Glu 300 Phe Asn Ser 315 Thr Asp Trp 330 Leu Asn Leu 345 Pro Ser Ser Arg Glu Pro Gin Lys Asn Gin Vai 380 Asp Ile Ala 395 Vai Lys Thr 410 Thr Pro Ser 425 Arg Leu Thr Ser Cys Ser Vai Ser Leu Ser Leu 460

Pro Vai Thr 175 Vai Thr Phe 190 Pro Ala Vai 205 Vai Thr Vai Asn Vai Asp His Ser Lys Tyr Gly 240 Gly Gly Pro 255 Ser Met Ile 270 Ser Arg Gin 285 Glu Asp Pro Vai His Asn Ala Tyr Arg Vai Vai 320 Gly Lys Glu 335 Tyr Ile Glu 350 Lys Thr Vai 365 Tyr Thr Leu Ser Leu Thr Cys Glu Trp Glu Ser 400 Pro Vai Leu 415 Asp Vai Asp 430 Lys Ser Met 445 His Glu Ala Ser Leu Gly Lys 178

<210> 37 <211> 705 <212> ADN <213> Homo Sapiens <400> 37 atggaagccc cagctcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga 60 gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 120 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 180 ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 240 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 300 gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggcctccgct cactttcggc 360 ggagggacca aggtggagat caaacgaact gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 420 ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 480 tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 540 caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 600 acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 660 ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgt 705

<210> 38 <211> 235 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 38

Met Glu Ala Pro Ala Gin Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 15 10 15

Asp Thr Thr Gly Glu lie Vai Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser 20 25 30

Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser 35 40 45

Vai Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro 50 55 60

Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala 179

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 85 90 95 Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Ser 100 105 110 Asn Trp Pro Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys 115 120 125 Arg Thr Vai Ala Ala Pro Ser Vai Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 130 135 140 Gin Leu Lys ser Gly Thr Ala Ser Vai Vai Cys Leu Leu Asn Asn Phe 145 150 155 160 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Vai Gin Trp Lys Vai Asp Asn Ala Leu Gin 165 170 175 Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Vai Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser 180 185 190 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 195 200 205 Lys His Lys Vai Tyr Ala Cys Glu Vai Thr His Gin Gly Leu Ser Ser 210 215 220 Pro Vai Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235

<210> 39 <211> 699 <212> ADN <213> Homo Sapiens <400> 39 atgtcgccat cacaactcat tgggtttctg ctgctctggg ttccagcctc caggggtgaa 60 attgtgctga ctcagtctcc agactttcag tctgtgactc caaaggagaa agtcaccatc 120 acctgccggg ccagtcagag cattggtagt agcttacact ggtaccagca gaaaccagat 180 cagtctccaa agctcctcat caagtatgct tcccagtcct tctcaggggt cccctcgagg 240 ttcagtggca gtggatctgg gacagatttc accctcacca tcaatagcct ggaagctgaa 300 gatgctgcag cgtattactg tcatcagagt agtagtttac ctctcacttt cggcggaggg 360 accaaggtgg agatcaaacg aactgtggct gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct 420 gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc 480 agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag 540 180 600 agtgtcacag agcaggacag agcaaagcag actacgagaa agctcgcccg tcacaaagag caaggacagc acctacagcc acacaaagtc tacgcctgcg cttcaacagg ggagagtgt tcagcagcac cctgacgctg aagtcaccca tcagggcctg 660 699 <210> 40 <211> 233 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 40

Met Ser Pro Ser Gin Leu Ile Gly Phe Leu Leu Leu Trp Val Pro Ala 1 5 10 15 Ser Arg Gly Glu Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Asp Phe Gin Ser Val 20 25 30 Thr Pro Lys Glu Lys Vai Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser Ile 35 40 45 Gly Ser Ser Leu His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Asp Gin Ser Pro Lys 50 55 60 Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Gin Ser Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg 65 70 75 80 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser 85 90 95 Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Ala Tyr Tyr Cys His Gin Ser Ser Ser 100 105 110 Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 115 12 0 125 Vai Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu 130 135 140 Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 145 150 155 160 Arg Glu Ala Lys Vai Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly 165 170 175 Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 1B0 185 190 Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His 195 200 205 Lys Vai Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val 210 215 220

Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 181 <210> 41 <211> 5 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 41

Leu Ser Asp Ile Ala 1 5 <210> 42 <211> 4 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 42

Vai Ile Asp Glu 1 <210> 43 <211> 4 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 43

Thr Cys Phe Ala 1

<210> 44 <211> 24 <212> ADN <213> artificial <220> <223> iniciador oligonucleotidico para PCR 182 <220> <221> característica_misc <222> (18). (23) <223> n são a, c, t ou g <400> 44 ggccggatag gcctccannn nnnt 24 <210> 45 <211> 26 <212> ADN <213> artificial <220> <223> iniciador oligonucleotidico para PCR <400> 45 ggacactgac atggactgaa ggagta 26 <210> 46 <211> 26 <212> ADN <213> artificial <220> <223> iniciador oligonucleotidico para PCR <400> 46 ggacactgac atggactgaa ggagta 26 183 <210> 47 <211> 46 <212> ADN <213> artificial <220> <223> iniciador oligonucleotidico para PCR <400> 47 cagcagaagc ttctagacca ccatgtcgcc atcacaactc attggg 46 <210> 48 <211> 34 <212> ADN <213> artificial <220> <223> iniciador oligonucleotidico para PCR <400> 48 cttgtcgact caacactctc ccctgttgaa gctc 34 <210> 49 <211> 8 <212> PRT <213> artificial <220> <223> sequência de aminoácidos codificada pelo iniciador 5' anti-IL-lRl 15C4 kapa 184 <400> 49

Met Ser Pro Ser Gin Leu Ile Gly 1 5 <210> 50 <211> 7 <212> PRT <213> artificial <22 0> <223> sequência de aminoácidos codificada pelo iniciador 3' anti-IL-lRl 15C4 kapa <400> 50

Cys Glu Gly Arg Asn Phe Ser 1 5

<210> 51 <211> 1409 <212> ADN <213> Homo Sapiens <400> 51 tctagaccac catggacatc aggctcagct tagttttcct tgtccttttc ataaaaggtg 60 tccagtgtga ggtagaactg gtggagtctg ggggcggctt agtacaacct ggaaggtcca 120 tgacactctc ctgtgcagcc tcgggattca ctttcagaac ctatggcatg gcctgggtcc 180 gccaggcccc aacgaagggt ctggagtggg tctcatcaat tactgctagt ggtggtacca 240 cctactatcg agactcegtg aagggccgct tcactatttt tagggataat gcaaaaagta 300 ccctatacct gcagatggac agtccgaggt ctgaggacac ggccacttat ttctgtacat 360 caatttcgga atactggggc cacggagtca tggtcaccgt ctctagtgcc tccaccaagg 420 gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc acagcggecc 480 tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg aactcaggcg 540 ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga ctctactccc 600 185 tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac atctgcaacg 660 tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaagt tgagcccaaa tcttgtgaca 720 aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg tcagtcttcc 780 tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag gtcacatgcg 840 tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac gtggacggcg 900 tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gsgaggagca gtacaacagc acgtaccgtg 960 tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag tacaagtgca 1020 aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa gccaaagggc 1080 agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggatgagctg accaagaacc 1140 aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc gtggagtggg 1200 agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg gactccgacg 1260 gctccttctt cctctatagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag caggggaacg 1320 tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag aagagcctct 1380 ccctgtctcc gggtaaatga taagtcgac 1409 <210> 52 <211> 19 <212> ADN <213> artificial <22 0> <223> iniciador oligonucleotídico para PCR <400> 52 tgaggacgct gaccacacg 19 <210> 53 <211> 44 <212> ADN <213> artificial 186 <220> <223> iniciador oligonucleotidico para PCR <400> 53 cagcagaagc ttctagacca ccatggggtc aaccgccatc ctcg 44 <210> 54 <211> 32 <212> ADN <213> artificial <220> <223> iniciador oligonucleotidico para PCR <400> 54 gtggaggcac tagagacggt gaccagggtt cc 32 <210> 55 <211> 7 <212> PRT <213> artificial <220> <223> sequência de aminoácidos codificada pelo iniciador da cadeia pesada 5' anti-IL-lRl 15C4 <400> 55

Met Gly Ser Thr Ala Ile Leu 1 5 <210> 56 <211> 11 <212> PRT <213> artificial 187 <220> <223> sequência de aminoácidos codificada pelo iniciador da cadeia pesada 3' anti-IL-lRl 15C4 <400> 56

Thr Ser Ala Ser Ser Vai Thr Vai Leu Thr Gly

<210> 57 <211> 1415 <212> ADN <213> Homo Sapiens <400> 57 tctagaccac catggacatg agggtccccg ctcagctcct ggggctcctg ctattgtggt 60 tgagaggtgc cagatgtgag gtccagctgg tgcagtctgg gggaggcttg gtacatcctg 120 gggggtccct gagactctcc tgtgcaggct ctggattcac cttcagtggc catgctttgc 180 actgggttcg ccaggctcca ggaaaaggtc tggagtgggt atcaggtatt ggtactcatg 240 gtgggacata ctatgcagac tccgtgaagg gccgabtcac catctccaga gacaatgcca 300 agaactcctt gtttcttcaa atgaacagcc tgagcgccga ggacatggct gtgtattact 360 gtacaagaag aaactgggga caatttgact actggggcca gggaaccctg gtcaccgtct 420 ctagtgcctc caccaagggc ccatcggtct tccccctggc gccctgctcc aggagcacct 480 ccgagagcac agcggccctg ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa ccggtgacgg 540 tgtcgtggaa ctcaggcgct ctgaccagcg gcgtgcacac ctCcccagct gtcctacagt 600 cctcaggact ctactccctc agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcaac ttcggcaccc 660 agacctacac ctgcaaegta gatcacaagc ccagcaacac caaggtggac aagacagttg 720 agcgcaaatg ttgtgtcgag tgcccaccgt gcccagcacc acctgtggca ggaccgtcag 780 tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca 840 cgtgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accccgaggt ccagttcaac tggtacgtgg 900 acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccacggga ggagcagttc aacagcacgt 960 188 tccgtgtggt cagcgtcctc accgttgtgc accaggactg gctgaacggc aaggagtaca 1020 agtgcaaggt ctccaacaaa ggcctcccag cccccatcga gaaaaccatc tccaaaacca 1080 aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag gagatgacca 1140 agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta ccccagcgac atcgccgtgg 1200 agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacacctccc atgctggact 1260 ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg tggcagcagg 1320 ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acgcagaaga 1380 gcctctccct gtctccgggt aaatgataag tcgac 1415

<210> 58 <211> 1418 <212> ADN <213> Homo Sapiens <400> 58 tctagaccac catggacatg agggtccccg ctcagctcct ggggctcctg ctattgtggt 60 tgagaggtgc cagatgtgag gtccagctgg tgcagtctgg gggaggcttg gtacatcctg 120 gggggtccct gagactctcc tgtgcaggct ctggattcac cttcagtggc catgctttgc 180 actgggttcg ccaggctcca ggaaaaggtc tggagtgggt atcaggtatt ggtactcatg 240 gtgggacata ctatgcagac tccgtgaagg gccgattcac catctccaga gacaatgcca 300 agaactcctt gtttcttcaa atgaacagcc tgagcgccga ggacatggct gtgtattact 360 gtacaagaag aaactgggga caatttgact actggggcca gggaaccctg gtcaccgtct 420 ctagtgccag caccaagggg ccatccgtct tccccctggc gccctgctcc aggagcacct 480 ccgagagcac agccgccctg ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa ccggtgacgg 540 tgtcgtggaa ctcaggcgcc ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct gtcctacagt 600 cctcaggact ctactccctc agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcagc ttgggcacga 660 agacctacac ctgcaacgta gatcacaagc ccagcaacac caaggtggac aagagagttg 720 agtccaaata tggtccccca tgcccatcat gcccagcacc tgagttcctg gggggaccat 780 cagtcttcct gttcccccca aaacccaagg acactctcat gatctcccgg acccctgagg 84 0 tcacgtgcgt ggtggtggac gtgagccagg aagaccccga ggtccagttc aactggtacg 900 tggatggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag ttcaacagca 960 cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaac ggcaaggagt 1020 189 acaagtgcaa ggtctccaac aaaggcctcc cgtcctccat cgagaaaacc atctccaaag 1080 ccaaagggca gccccgagag ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccag gaggagatga 1140 ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctaccccagc gacatcgccg 1200 tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct cccgtgctgg 1260 actccgacgg ctccttcttc ctctacagca ggctaaccgt ggacaagagc aggtggcagg 1320 aggggaatgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacacaga 1380 agagcctctc cctgtctctg ggtaaatgat aagtcgac 1418

<210> 59 <211> 485 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 59

Met Vai His Ala Thr Ser Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ser Leu 1 5 10 15 Ala Leu Vai Ala Pro Gly Leu Ser Ala Arg Lys Cys Ser Leu Thr Gly 20 25 30 Lys Trp Thr Asn Asp Leu Gly Ser Asn Met Thr Ile Gly Ala Vai Asn 35 40 45 Ser Lys Gly Glu Phe Thr Gly Thr Tyr Thr Thr Ala Vai Thr Ala Thr 50 55 60 Ser Asn Glu Ile Lys Glu Ser Pro Leu His Gly Thr Gin Asn Thr Ile 65 70 75 80 Asn Lys Arg Thr Gin Pro Thr Phe Gly Phe Thr Vai Asn Trp Lys Phe 85 90 95 Ser Glu Ser Thr Thr Vai Phe Thr Gly Gin Cys Phe Ile Asp Arg Asn 100 105 110 Gly Lys Glu Vai Leu Lys Thr Met Trp Leu Leu Arg Ser Ser Vai Asn 115 120 125 Asp Ile Gly Asp Asp Trp Lys Ala Thr Arg Vai Gly Ile Asn Ile Phe 130 135 140 Thr Arg Leu Arg Thr Gin Lys Glu Gin Leu Leu Ala Ser Leu Leu Glu 145 150 155 160 190

Ala Asp Lys Cys Lya Glu Arg Glu Glu Lys Ile Ile Leu Vai Ser Ser 165 170 175

Ala Asn Glu Ile Asp Vai Arg Pro Cys Pro Leu Asn Pro Asn Glu His 180 185 190

Lys Gly Thr Ile Thr Trp Tyr Lys Asp Asp Ser Lys Thr Pro Vai Ser 195 200 205

Thr Glu Gin Ala Ser Arg Ile His Gin His Lys Glu Lys Leu Trp Phe 210 215 220

Vai Pro Ala Met Vai Glu Asp Ser Gly His Tyr Tyr Cys Vai Vai Arg 225 230 235 240

Asn Ser Ser Tyr Cys Leu Arg Ile Lys Ile Ser Ala Lys Phe Vai Glu 245 250 255

Asn Glu Pro Asn Leu Cys Tyr Asn Ala Gin Ala Ile Phe Lys Gin Lys 260 265 270

Leu Pro Vai Ala Gly Asp Gly Gly Leu Vai Cys Pro Tyr Met Glu Phe 275 280 285

Phe Lys Asn Glu Asn Asn Glu Leu Pro Lys Leu Gin Trp Tyr Lys Asp 290 295 300

Cys Lys Pro Leu Leu Leu Asp Asn Ile His Phe Ser Gly Vai Lys Asp 305 310 315 320

Arg Leu Ile Vai Met Asn Vai Ala Glu Lys His Arg Gly Asn Tyr Thr 325 330 335

Cys His Ala Ser Tyr Thr Tyr Leu Gly Lys Gin Tyr Pro Ile Thr Arg 340 345 350

Vai Ile Glu Phe Ile Thr Leu Glu Glu Asn Lys Pro Thr Arg Pro Vai 355 360 365

Ile Vai Ser Pro Ala Asn Glu Thr Met Glu Vai Asp Leu Gly Ser Gin 370 375 380

Ile Gin Leu Ile Cys Asn Vai Thr Gly Gin Leu Ser Asp Ile Ala Tyr 385 390 395 400

Trp Lys Trp Asn Gly Ser Vai Ile Asp Glu Asp Asp Pro Vai Leu Gly 405 410 415

Glu Asp Tyr Tyr Ser Vai Glu Asn Pro Ala Asn Lys Arg Arg Ser Thr 420 425 430

Leu Ile Thr Vai Leu Asn Ile Ser Glu Ile Glu Ser Arg Phe Tyr Lys 435 440 445

His Pro Phe Thr Cys Phe Ala Lys Asn Thr His Gly Ile Asp Ala Ala 450 455 460

Tyr Ile Gin Leu Ile Tyr Pro Vai Thr Asn Phe Gin Lys Asp Tyr Lys 465 470 475 480

Asp Asp Asp Asp Lys 485 191 <210> 60 <211> 485 <212> PRT <213> artificial <220> <223> proteína quimérica de avidina-cinomolgos IL-1R1-FLAG <400> 60

Met Vai His Ala Thr Ser Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ser Leu 1 5 10 15 Ala Leu Vai Ala Pro Gly Leu Ser Ala Arg Lys Cys Ser Leu Thr Gly 20 25 30 Lys Trp Thr Asn Asp Leu Gly Ser Asn Met Thr Ile Gly Ala Vai Asn 35 40 45 Ser Lys Gly Glu Phe Thr Gly Thr Tyr Thr Thr Ala Vai Thr Ala Thr 50 55 60 Ser Asn Glu Ile Lys Glu Ser Pro Leu His Gly Thr Gin Asn Thr Ile 65 70 75 80 Asn Lys Arg Thr Gin Pro Thr Phe Gly Phe Thr Vai Asn Trp Lys Phe 85 90 95 Ser Glu Ser Thr Thr Vai Phe Thr Gly Gin Cys Phe Ile Asp Arg Asn 100 105 110 Gly Lys Glu Vai Leu Lys Thr Met Trp Leu Leu Arg Ser Ser Vai Asn 115 120 125 Asp Xle Gly Asp Asp Trp Lys Ala Thr Arg Vai Gly Ile Asn Ile Phe 13 0 135 140 Thr Arg Leu Arg Thr Gin Lys Glu Gin Leu Leu Ala Ser Leu Leu Glu 145 150 155 160 Ala Asp Lys Cys Asn Glu Arg Glu Glu Lys Ile Ile Leu Vai Ser Ser 165 170 175 Ala Asn Glu Xle Asp Vai Arg Pro Cys Pro Leu Asn Pro Asn Glu Tyr 180 185 190 Lys Gly Thr Ile Thr Trp Tyr Lys Asn Asp Ser Lys Thr Pro Ile Ser 195 200 205 Thr Glu Gin Ala Ser Arg Ile His Gin His Lys Lys Lys Leu Trp Phe 210 215 220 Vai Pro Ala Lys Vai Glu Asp Ser Gly His Tyr Tyr Cys Vai Vai Arg 225 230 235 240 192

Asn Ser Ser Tyr Cys Leu Arg Ile Lys Ile Thr Ala Lys Phe Vai Glu 245 250 255 Asn Glu Pro Asn Leu Cys Tyr Asn Ala Glu Ala Ile Phe Lys Gin Arg 260 265 270 Leu Pro Vai Ala Gly Asp Gly Gly Leu Vai Cys Pro Tyr Met Glu Phe 275 280 285 Phe Lys Asp Glu Asn Asn Glu Leu Pro Lys Leu Leu Trp Tyr Lys Asp 290 295 300 Cys Lys Pro Leu Leu Leu Asp Asn Ile His Phe Ser Gly Vai Lys Asp 305 310 315 320 Arg Leu Ile Vai Met Asn Vai Ala Glu Lys His Arg Gly Asn Tyr Thr 325 330 335 Cys His Ala Ser Tyr Thr Tyr Leu Gly Lys Gin Tyr Pro Ile Thr Arg 340 345 350 Vai Ile Glu Phe Ile Thr Leu Glu Glu Asn Lys Pro Thr Arg Pro Vai 355 360 365 Ile Vai Ser Pro Ala Asn Glu Thr Ile Glu Vai Asp Leu Gly Ser Gin 370 375 380 Ile Gin Leu Ile Cys Asn Vai Thr Gly Gin Leu Ser Asp Thr Ala Tyr 385 390 395 400 Trp Lys Trp Asn Gly Ser Phe Ile Asp Glu Asp Asp Pro Vai Leu Gly 405 410 415 Glu Asp Tyr Tyr Ser Vai Glu Asn Pro Ala Asn Lys Arg Arg Ser Thr 420 425 430 Leu Ile Thr Vai Leu Asn Ile Ser Glu Thr Glu Ser Arg Phe Tyr Lys 435 440 445 His Pro Phe Thr Cys Leu Ala Arg Asn Thr His Gly Met Asp Ala Ala 450 455 460 Tyr Vai Gin Leu Ile Tyr Pro Vai Thr Lys Phe Gin Lys Asp Tyr Lys 465 470 475 480

Asp Asp Asp Asp Lys 485 <210> 61 <211> 5 <212> PRT <213> Homo

Sapiens 193 <4Ο0> 61

Asn Tyr Gly Met His 1 5

<210> 62 <211> 8 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 62

Thr Phe Ser Asn Tyr Gly Met His 1 5

<210> 63 <211> 5 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 63

Phe His Trp Ile Ala 1 5

<210> 64 <211> 17 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 64

Gly Ile Trp Asn Asp Gly Ile Asn Lys Tyr His Ala His Ser Vai Arg 15 10 15

Gly

<210> 65 <211> 17 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 65 194

Ala lie Trp Asn Asp Gly Glu Asn Lys His His Ala Gly Ser Vai Arg 1 Gly 5 10 15 <210> 66 <211> 17 <212> PRT <213> Homo < 4 0 0 > 66 Sapiens

Ile Ile His Pro Gly Ala Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gin 1 Gly 5 10 15 <210> 67 <211> 11 <212> PRT <213> Homo <400> 67 Sapiens

Ala Arg Ser Phe Asp Trp Leu Leu Phe Glu Phe 1 5 10 <210> 68 <211> 11 <212> PRT <213> Homo <400> 68 Sapiens

Gly Arg Tyr Phe Asp Trp Leu Leu Phe Glu Tyr 1 5 10 <210> 69 <211> 9 <212> PRT <213> Homo Sapiens 195 <4 Ο Ο> 6 9

Gin Arg Glu Leu Asp Tyr Phe Asp Tyr 1 5

<210> 70 <211> 11 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 70

Arg Ala Sér Gin Vai 8-êr Sèr Lsan Al«

1 $ IS

<210> 71 <211> 11 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 71

Arg Ala Ser Gin Ser Ile Gly Ser Ser Leu His 15 10

<210> 72 <211> 7 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 72

Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr 1 5

<210> 73 <211> 7 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 73

Tyr Ala Ser Gin Ser Phe Ser 1 5 196

<210> 74 <211> 10 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 74

Gin Gin Arg Ser Asn Trp Pro Pro Leu Thr 15 10

<210> 75 <211> 9 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 75

His Gin Ser ser ser Leu Pro Leu Thr 1 5 <2 10> 76 <2 11> 111 <2 12> PRT <2 13> Homo <4 Λ O O 76

Pro Vai Ile Vai ser Pro Ala Asn Glu Thr Met Glu Vai Asp Leu Gly 1 5 10 15 Ser Gin Ile Gin Leu Ile Cys Asn Vai Thr Gly Gin Leu Ser Asp Ile 20 25 30 Ala Tyr Trp Lys Trp Asn Gly Ser Vai Ile Asp Glu Asp Asp Pro Vai 35 40 45 Leu Gly Glu Asp Tyr Tyr Ser Vai Glu Asn Pro Ala Asn Lys Arg Arg 50 55 60 Ser Thr Leu Ile Thr Vai Leu Asn Ile Ser Glu Ile Glu Ser Arg Phe 65 70 75 80 Tyr Lys His Pro Phe Thr Cys Phe Ala Lys Asn Thr His Gly Ile Asp 85 90 95 Ala Ala Tyr Ile Gin Leu Ile Tyr Pro Vai Thr Asn Phe Gin Lys 100 105 110 197

<210> 77 <211> 350 <212> ADN <213> Homo Sapiens <400> 77 cctgtgattg tgagcccagc taatgagaca atggaagtag acttgggatc ccagatacaa 60 ttgatctgta atgtcaccgg ccagttgagt gacattgctt actggaagtg gaatgggtca 120 gtaattgatg aagatgaccc agtgctaggg gaagactatt acagtgtgga aaatcctgca 180 aacaaaagaa ggagtaccct catcacagtg cttaatatat cggaaattga aagtagattt 240 tataaacatc catttacctg ttttgccaag aatacacatg gtatagatgc agcatatatc 300 cagttaatat atccagtcac taatttccag aagcacatga ttggtatatg 350 <210> 78 <211> 350 <212> ADN <213> Rattus sp. <400> 78 cctgtgatta fcgagcccacg gaatgagacg atggaagctg acccaggatc cacgatacaa 60 ctgatctgca acgtcacggg ccagttcacc gaccttgtct actggaagtg gaatgggtcg 120 gaaattgaat gggacgatcc aatcctagcc gaagactatc agtttttgga acacccttca 180 gccaaaagaa agtacactct cattacaaca cttaacgttt cagaggtcaa aagccagttt 240 tatcgctatc cgttcatctg cttcgttaag aacactcata ttctggagac tgcacacgta 300 cggttagtat acccagttcc tgacttcaag aattacctca tcgggggctt 350 <210> 79 <211> 111 <212> PRT <213> Rattus sp. 198 <4Ο Ο> 79

Pro Vai Ile Met Ser Pro Arg Asn Glu Thr Met Glu Ala Asp Pro Gly 1 5 10 15 Ser Thr lie Gin Leu Ile Cys Asn Vai Thr Gly Gin Phe Thr Asp Leu 20 25 30 Vai Tyr Trp Lys Trp Asn Gly Ser Glu Ile Glu Trp Asp Asp Pro Ile 35 40 45 Leu Ala Glu Asp Tyr Gin Phe Leu Glu His Pro Ser Ala Lys Arg Lys 50 55 60 Tyr Thr Leu Ile Thr Thr Leu Asn Vai Ser Glu Vai Lys Ser Gin Phe 65 70 75 80 Tyr Arg Tyr Pro Phe Ile Cys Phe Vai Lys Asn Thr His Ile Leu Glu 85 90 95 Thr Ala HÍS Vai Arg Leu Vai Tyr Pro Vai Pro Asp Phe Lys Lys 100 105 no

Lisboa, 12 de Junho de 2012 199

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Anticorpo humano isolado que se liga especificamente ao receptor de tipo 1 da interleucina 1 ou seu fragmento de ligação a antigénio, compreendendo: a. regiões estruturais de cadeia pesada humana, uma região CDR1 de cadeia pesada, em que a região CDRl compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID N°: 63, uma região CDR2 de cadeia pesada, em que a região CDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID N°: 66 e uma região CDR3 de cadeia pesada, em que a região CDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID N°: 69; e b. regiões estruturais de cadeia leve humana, uma região CDRl de cadeia leve, em que a região CDRl compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID N°: 71, uma região CDR2 de cadeia leve, em que a região CDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID N°: 73 e uma região CDR3 de cadeia leve, em que a região CDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID N°: 75.
2. Anticorpo ou seu fragmento de ligação a antigénio, da reivindicação 1, em que o anticorpo compreende uma cadeia pesada compreendendo uma região variável de cadeia pesada, compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem uma identidade de sequência de, pelo menos, 90% com a sequência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID N°: 16, e uma cadeia leve compreendendo uma região variável de cadeia leve, compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem uma 1 identidade de sequência de, pelo menos, 90% com a sequência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID N°:18.
3. Anticorpo ou seu fragmento de ligação a antigénio da reivindicação 2, em que a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID N°: 16 e em que a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID N°: 18.
4. Anticorpo ou seu fragmento de ligação a antigénio, da reivindicação 2 compreendendo: a. uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID N°: 40; e b. uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID N°: 32, SEQ ID N°: 34 ou SEQ ID N°: 36, em que o fragmento de ligação a antigénio tem uma deleção no amino-terminal, uma deleção no carboxi-terminal e/ou uma deleção ou substituição interna.
5. Anticorpo da reivindicação 4, em que o fragmento de ligação a antigénio da cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos que tem uma identidade de sequência de, pelo menos, 90% com a sequência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID N° : 32 e o fragmento de ligação a antigénio da cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos que tem uma identidade de sequência de, pelo menos, 90% com a sequência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID N°: 40.
6. Anticorpo da reivindicação 5, em que a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos como apresentada na 2 SEQ ID N°: 32 e em que a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID N°: 40.
7. Anticorpo da reivindicação 4, em que o fragmento de ligação a antigénio da cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos que tem uma identidade de sequência de, pelo menos, 90% com a sequência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID N° : 34 e o fragmento de ligação a antigénio da cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos que tem uma identidade de sequência de, pelo menos, 90% com a sequência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID N°: 40.
8. Anticorpo da reivindicação 7, em que a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID N°: 34 e em que a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID N°: 40.
9. Anticorpo da reivindicação 4, em que o fragmento de ligação a antigénio da cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos que tem uma identidade de sequência de, pelo menos, 90% com a sequência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID N° : 36, e o fragmento de ligação a antigénio da cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos que tem uma identidade de sequência de, pelo menos, 90% com a sequência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID N°: 40.
10. Anticorpo da reivindicação 9, em que a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID N°: 36 e em que a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID N°: 40.
11. Anticorpo ou seu fragmento de ligação a antigénio, da reivindicação 1, em que a cadeia pesada compreende uma 3 região variável, compreendendo a sequência de aminoácidos EVQLMQSGAE VKKPGESLKI SCKGSGYSFS FHWIAWVRQM PGKGLEWMGI IHPGASDTRY SPSFQGQVTI SADNSNSATY LQWSSLKASD TAMYFCARQR ELDYFDYWGQ GTLVTVSS.
12. Anticorpo ou seu fragmento de ligação a antigénio da reivindicação 1, em que a cadeia leve compreende uma região variável, compreendendo a sequência de aminoácidos de EIVLTQSPDF QSVTPKEKVT ITCRASQSIG SSLHWYQQKP DQSPKLLIKY ASQSFSGVPS RFSGSGSGTD FTLTINSLEA EDAAAYYCHQ SSSLPLTFGG GTKVEIK.
13. Anticorpo ou seu fragmento de ligação a antigénio da reivindicação 1, em que a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos EVQLMQSGAE VKKPGESLKI SCKGSGYSFS FHWIAWVRQM PGKGLEWMGI IHPGASDTRY SPSFQGQVTI SADNSNSATY LQWSSLKASD TAMYFCARQR ELDYFDYWGQ GTLVTVSS, e em que a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos EIVLTQSPDF QSVTPKEKVT ITCRASQSIG SSLHWYQQKP DQSPKLLIKY ASQSFSGVPS RFSGSGSGTD FTLTINSLEA EDAAAYYCHQ SSSLPLTFGG GTKVEIK.
14. Molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica que codifica a região variável da cadeia pesada e da cadeia leve dos anticorpos de qualquer uma das reivindicações 1 a 13.
15. Vector de expressão compreendendo o ácido nucleico da reivindicação 14.
16. Célula hospedeira contendo o vector de expressão da reivindicação 15. 4
17. Anticorpo das reivindicações 1 a 13, em que as regiões variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve estão ligadas através de um ligante flexível para formar um anticorpo de cadeia simples.
18. Anticorpo da reivindicação 17, o qual é um anticorpo Fv de cadeia simples.
19. Anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 10, o qual é um anticorpo Fab.
20. Anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 10, o qual é um anticorpo Fab'.
21. Anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 10, o qual é um anticorpo (Fab')2.
22. Anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 13 e 17 a 21, em que o anticorpo é um anticorpo totalmente humano.
23. Anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 13 e 17 a 21, o qual é um anticorpo IgG2.
24. Anticorpo de qualquer uma das reivindicações 2, 3, 4, 6, 8, 10, o qual se liga especificamente ao polipéptido de SEQ ID N°: 76.
25. Anticorpo da reivindicação 24, o qual se liga especificamente à sequência de aminoácidos YSV.
26. Utilização de um anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 25 para a preparação de uma composição farmacêutica para tratar uma doença mediada por IL-1 num 5 doente, em que a doença mediada por IL-1 é seleccionada de doença pulmonar, doença pulmonar obstrutiva crónica ou COPD, proteinose alveolar pulmonar, pneumopatia induzida por bleomicina, fibrose pulmonar, fibrose pulmonar idiopática, fibrose pulmonar induzida por radiação, fibrose cística, acumulação de colagénio nos pulmões, síndrome de dificuldade respiratória aguda ou ARDS, displasia bronco-pulmonar ou BPD, doenças pulmonares obstrutivas crónicas seleccionadas de enfisema e bronquite crónica, doença pulmonar fibrótica crónica, asbestose, pneumoconiose do mineiro de carvão, silicose, bronquiolite obliterante com pneumonia organizada, sarcoidose pulmonar, rinite alérgica, dermatite de contacto, dermatite atópica, diabetes, doença inflamatória intestinal, artrite reumatóide e asma.
27. Composição farmacêutica compreendendo um veículo farmaceuticamente aceitável e uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 25. Lisboa, 12 de Junho de 2012 6