JP2016511747A - ナノ粒子表面結合に基づく薬物の組織への送達 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2013年8月27日に出願された米国特許仮出願第61/870,288号、名称「ナノ粒子表面結合に基づく薬物の組織への送達」に対して、米国特許法第119条(e)に基づく優先権の利益を主張し、その全開示を参照により本明細書に組み込むものである。本出願は、2013年1月4日に出願された米国特許仮出願第61/748,809号、名称「ナノ粒子表面結合に基づく薬物の組織への送達」に対して、米国特許法第119条(e)に基づく優先権の利益を主張し、その全開示を参照により本明細書に組み込むものである。
本発明は、粒子を用いた薬物送達システムのための方法および試薬に関する。
連邦政府により資金提供を受けた研究
本発明は、国立衛生研究所(NIH)からの助成金番号第AR060331号により、政府の支援のもとになされたものである。米国政府は本発明に関して一定の権利を有する。
骨関節炎(OA)は、ヒト関節の軟骨を攻撃し、生産性および生活の質に影響を与え、患者の身体に極度の障害をもたらす。世界中で1億5千万人以上が骨関節炎に罹患しているが、有効な治癒法はない。現行の治療は、疼痛および炎症の短期間の軽減をもたらすだけであり、末期OAの特徴である関節軟骨の更なる変性が不可避であるが、それに対する予防とはならない。その結果、(骨および他の柔組織の劣化など)完全な関節機能不全となり、患者は関節置換が必要となる。
マイクロ粒子またはナノ粒子は、従来のマイクロ粒子テクノロジーにおいて使用される如何なる材料から作成することができる。例えば、マイクロ粒子またはナノ粒子は、ポリマー、例えば配列番号1に記載のアミノ酸配列からの5個以上のアミノ酸などのペプチド、またはそれらの組み合わせを含むことができる。
他の実施態様では、第2の活性薬剤は、鎮痛剤、骨関節炎の処置用治療薬剤および/または筋骨格疾患または傷害の処置用治療薬剤であることができる。
いくつかの実施態様では、マイクロ粒子またはナノ粒子は、鎮痛剤および骨関節炎の処置用治療薬剤を含む。他の実施態様では、ナノ粒子は、鎮痛剤および骨関節炎の処置用治療薬剤を含む。
他の側面では、本発明は、骨関節炎などの筋骨格疾患または外傷などの傷害の処置用治療薬剤を含み、結合組織に結合する化合物により官能化されている、平均粒子サイズが10nmより大きいマイクロ粒子である。いくつかの側面では、マイクロ粒子は、第2の活性薬剤を含む、平均粒子サイズが10nm以下のナノ粒子と混合する。
マイクロ粒子またはナノ粒子中の第1の活性薬剤は、骨関節炎の処置用治療薬剤、筋骨格疾患または傷害の処置用治療薬剤、および/または鎮痛剤であることができる。
いくつかの実施態様では、マイクロ粒子は、鎮痛剤および骨関節炎の処置用治療薬剤を含む。他の実施態様では、ナノ粒子は鎮痛剤および骨関節炎の処置用治療薬剤を含む。
いくつかの実施態様では、ポリマーは、ペプチドである。ペプチドは、例えば、配列番号1に記載のアミノ酸配列からの5個以上のアミノ酸または配列番号1に記載のアミノ酸配列からの15個以上のアミノ酸であってもよい。
いくつかの実施態様では、ペプチドは、アビジン、アルブミン、ゼラチン、リゾチームおよび両性トリブロックペプチドからなる群から選択される。
他の実施態様では、治療薬剤はIGFである。
いくつかの実施態様では、アビジンまたはその断片が完全長アビジンである。他の実施態様では、アビジンまたはその断片が、配列番号1に記載の断片である。更に他の実施態様では、アビジンが、エステル結合またはヒドラゾン結合などの共有結合を介して治療薬剤に結合している。他の実施態様では、アビジンが、非共有結合を介して治療薬剤に結合している。
いくつかの実施態様では、アビジンは、1〜4個のビオチン分子と会合している。
本発明によれば、疾患の予防および/または処置のための粒子を用いた薬物送達システムを容易にする方法および試薬が提供される。特に、本明細書に記載される粒子システムは、例えば筋骨格疾患および/または傷害の処置のために薬剤を骨および結合組織へ送達するのに有用である。筋骨格疾患および/または傷害の処置に使用される送達システムが、軟骨および他の結合組織または骨のより深いゾーンまで薬物を透過できることが重要である。本発明の組成物は、より深部の組織ゾーンへの薬物の透過を可能とすること、かつ効果的な処置を確保するために数週間組織内での薬物の保持を容易にすることに効果的である。従来の治療法では、深部への透過および持続する薬物送達を提供することができないため、これらの効果は、当該分野において、多大の進歩をもたらすものである。粒子は、例えば毒性や安定性の問題のために全身へ送達できない薬剤を局部へ送達するためにも有用である。例えば、本発明の粒子は、IGFを骨組織へ送達するために使用可能である。
化合物は、例えばカカオバターまたは他のグリセリドなどの従来の座薬基剤を含有する座薬または保持浣腸剤などの直腸または膣用組成物に処方することもできる。
本明細書に記載される実験は、組織表面に結合可能な粒子が、徐々に分解し、薬物負荷量を放出することにより、持続性送達を提供できることを示すものである。これらの薬物(同化促進+抗異化)は、軟骨全体へ拡散し、最深ゾーンにある標的(細胞および基質)にさえ到達することが可能である。
ポリエチレングリコール由来ポリ‐L‐グルタミン酸(PPA)ナノ粒子を、(i)5〜15nmの間の異なるサイズを有し、(ii)サイズ分布が狭く、(iii)薬物負荷が高く、(iv)制御可能なペグ化を有し、(v)表面電荷が可変であり、(vi)表面が官能化されており、(vii)スケールアップおよび製造に適しており、(viii)様々な薬物との抱合に多用でき、(ix)安全性が高いように設計する。
ナノサイズ量子ドットを使用して、生きたウシ軟骨外植片への粒子の輸送を理解するための研究を行った。薬物は、軟骨の厚さ全体を透過し、有効な処置のために保持されることが好ましい。ウシ外植片を、粒子が軟骨表面ゾーン(図2Aおよび図2Bの右側)に入るようにした特殊な輸送チャンバーにおいて15nmの中性量子ドット中で様々な時間インキュベートした。中性(図2B)および正に帯電した(図2A)量子ドットの右側から左側への24時間中の輸送は、1mm厚の軟骨外植片の表層ゾーンの最上部50ミクロンの中へ透過したことを示した。
サンプル調製:軟骨円板片(6mm直径、1mm厚)は、1〜2週齢仔ウシ膝関節の大腿膝蓋溝からすでに報告された方法で収集した(Patwari et al., Arth. Rheum. 2003)。円板片は、37℃5%CO2インキュベーター中でプロテアーゼ阻害剤(ロシェ製、50mLPBS中コンプリート)を添加したPBS(Ca2+/Mg2+無し)中で予め48時間平衡化した。
図2Aおよび図2Bを作成するために使用した共焦点画像の右縁は、15nmのQDが軟骨表層ゾーンに侵入し、組織の最初の40〜50μmを透過するだけであることを示した。図2Cおよび図2Dは、1XPBS中で24時間インキュベーションした後のQDの同一のサンプルからの脱着を示す。中性QDはサンプルから外へ拡散したが、荷電したQDはしなかった。
結果は、分子量約40kDa(直径約10nm)の溶質が4日間で1mm厚のウシ外植片の主な部分を透過・拡散したが、直径15nmの粒子は6日間で表層ゾーンの最初の40〜50μmを透過することができるだけであったことを示した。これは、15nmの直径は軟骨の複雑な網目構造を透過するには大きすぎることを示している。また、結果は、中性粒子は1XPBS中で脱着したが、正に帯電した粒子はしなかったことを示した。
薬物それ自身が、軟骨基質内で可逆的に結合することを可能とする結合特性を有することができる。このアプローチは、本明細書では「ナノ粒子フリー拡散(FDN)」とも呼ばれる。
材料および方法
緒言:輸送に関する一連の研究において、軟骨円板片を、サイズおよび電荷の異なる蛍光タグを付けた種々の溶質を含有する培地でインキュベートした。その後、組織内での各溶質タイプの透過の深度および空間分布を決定するために、軟骨の断面を共焦点顕微鏡を使用して画像化した。溶質の全取り込み量を得るための別の実験では、軟骨円板片を選択した溶質の溶液中で平衡化後、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)浴中へ脱着した。吸収および脱着浴中での蛍光測定値を使用して、組織内でのこれらの溶質の平衡溶質取り込み比、溶質分配係数、および平衡結合特性を数値化した。軟骨円板片を通過する非平衡輸送の追加の検討により、軟骨内での選択した溶質の有効拡散率の推定が可能となった。
軟骨円板片は、1〜2週齢仔ウシ膝関節(Research87, Hopkinton, MAより入手)の大腿膝蓋溝からすでに報告されている方法で収集した(Patwari et al., Arthritis Rheum, 2003)。簡潔に述べると、円柱状の軟骨円板片(直径3mmまたは6mm)の芯をダーマルパンチを使用して取得し、その後スライスしてインタクトな表層ゾーンを有する軟骨の最上部1mmを得た。すべての処理群で軟骨円板片は、関節表面に沿った深さおよび位置を一致させた。円板片はその後37℃、5%CO2インキュベーター中でプロテアーゼ阻害剤(50mLPBS中コンプリートプロテアーゼカクテル錠剤、Roche Applied Science IN)を添加したPBS(Ca2+/Mg2+無し)中で予め24〜48時間平衡化した。
サイズ排除試験:直径約0.9nm〜15nmの広いサイズ範囲を有する溶質を使用した:(i)フルオレセインイソチオシアネート(FITC、MW389.3Da、直径約0.9nm)、(ii)FITC‐デキストラン(8kDa、水力学的直径4.3nm)、(iii)FITC‐デキストラン(40kDa、直径約10nm(以上、Sigma Aldrich, MO);(iv)FITC‐抱合ニュートラアビジン、pH7で電気的に中性な球状タンパク質(60kDa、直径約7nm;Invitrogen, CA)および(v)直径15nmのCd‐Se量子ドット(MITで合成(Liu et al., J Am Chem Soc, 2010))。
特別なポリメチルメタクリレート(PMMA)輸送チャンバーを、組織の表層ゾーン(SZ)から軟骨に侵入する溶質の一方向の拡散(すなわち、図1のX方向の輸送)を研究するために設計した。チャンバーの壁は、溶質のPMMA表面への非特異的結合を阻止するためにカゼインで処理した。予め平衡化した軟骨円板片(6mm直径、1mm厚)をまず半分に切断し、半円板片試験片をチャンバーに加工した保持スロット内に配置した(図1A)。表層ゾーンに面するチャンバーの上流側に、プロテアーゼ阻害剤(Roche Applied Science, IN)を添加した45μLの濃度既知の溶質の1X‐PBS溶液を充填した;チャンバーの下流側に、プロテアーゼ阻害剤だけを含有する45μLの1X‐PBSを充填した。その後、チャンバーを脱イオン水を含有するペトリ皿に配置し、カバーをし(蒸発を最小とするため)、軟骨表面の滞留層を最小とするためにで37℃のインキュベーター内の低速ロッカー上に配置した。
誘導結合プラズマ測定を使用した量子ドット取り込み量:軟骨半円板片の中へのQDの取り込み全量は、各QD取り込み実験の直後に収集した組織および吸収/脱着浴中に存在するカドミウム(111Cd)の量の定量化により測定した。(CdはQDの芯に存在する)。誘導結合プラズマ質量分析(ICP‐MS)を、ULTIMA2ICP質量分析計(HoribaScientific, NJ)を使用して行い、111Cdの量を既知の方法で定量した(Wongetal., PNAS, 2011)。浴中および軟骨半円板片中のCdの最終合計量は、出発物質であった45μLのQD‐PBS上流溶液中のCdの初期量に対応した。Cd量は、テストした各QDのために作製した較正プロットを使用してQD濃度に変換した。新鮮な無処理軟骨中のCdのバックグラウンド量を測定したところゼロであった。
軟骨基質内での負に帯電したグリコサノミグリカン(GAG)鎖の溶質取り込みおよび結合に対する影響を理解するために、軟骨円板片群(3mm直径、1mm厚)を、コンドロイチナーゼ‐ABC(SigmaAldrich, MO, USA)、またはトリプシン(Invitrogen, CA)のどちらかで処理した。コンドロイチナーゼ‐ABCは、GAG鎖(主に、軟骨中に大変豊富なアグリカンプロテオグリカンのコンドロイチン硫酸GAG鎖)を消化・除去し、一方プロテアーゼのトリプシンは、アグリカンおよび他のGAGを含有するプロテオグリカンおよび糖タンパク質のコアタンパク質を切断する。
若年ウシ軟骨円板片(インタクトな表層ゾーンを有する)を通過するアビジンおよびニュートラアビジンの拡散輸送のリアルタイム測定を、既に報告されているような2区画からなる拡散チャンバーを使用して測定した(Garcia et al., Arch Biochem Biophys, 2003)。3つの軟骨円板片(6mm直径、400μm厚)の群を、上流区画から軟骨円板片中およびそれを横切った溶質輸送が、同時に軟骨の表層ゾーンからのみ可能であるように、拡散チャンバーの2つの区画間にOリングにより固定した(輸送用露出組織全面積0.28cm2/円板片)(図14の挿入図に模式的に示す)。
溶質取り込み量および脱着に関するデータ(例えば、図4A〜Bおよび図12A〜C)は、平均値±SEMとして与えられる。動物での一般化線形混合効果モデルを分析用ランダム変数として使用し、その後複数の処理条件間の比較用にTukey法を使用した。図4のデータは、異なる2匹の動物から得た。各処理条件毎に各動物につき合計でn=3の軟骨サンプルを使用した。平均値とは、処理条件ごとに6つのサンプルの平均値を意味し、動物の影響はなかった。
軟骨中への輸送に対する溶質サイズおよび分子構造の影響:
FITC(389Da、直径約0.9nm)およびFITC‐デキストラン(8kDa、直径約4.3nm)での輸送試験は、水力学的直径が5nm未満の粒子は24時間以内に軟骨外植片の全厚(1mm)を通して透過したが、一方40kDaのFITC‐デキストラン(直径約10nm)の透過勾配は24時間で依然として明白であることを示した(図3A〜C)。
アミン官能化されたQDは1XPBS中で24時間後でも脱着しなかったが、官能基を持たないQDは脱着した。10XPBS中での脱着により、軟骨円板片中に保持されるQDの吸収量は、24時間で64%から0.4%へと有意に低減した(図4B)。トリプシン処理サンプルは、正常な軟骨と比較して(約64%)、保持を有意に低減したが(約40%)、1Xおよび10X脱着で同等の量が保持されており(図4B)、電荷に基づく相互作用を示唆した。トリプシン処理による基質の分解は、予期されたように、両タイプのQDの透過および取り込みを有意に高めた(図4A)。
図12に示す結果から、アビジンが軟骨内のサイトに結合できることがわかった。この仮説をテストするために、直径3mmの軟骨円板片を、固定量の(蛍光標識した)FITC‐アビジン(1μM)および段階的量の未標識アビジン(0、10、76、100、および203μM)を含有する300μL緩衝液中で、3日間平衡化する競合的結合実験を行った。平衡化に要する時間を短縮するために軟骨円板片を半円板片に分割し、平衡化は37℃で96穴プレートで行った。取り込み比RUを測定し、アビジンの全浴中濃度(標識+未標識、図13)に対してプロットした。RUは、平衡化浴中のアビジン濃度(CBath)に対して標準化した、組織内水分重量に対する軟骨内部のアビジン全濃度(結合(CB)+フリー(CF))と定義した:
図14の挿入図に示す輸送セル構造を使用して、軟骨円板片の中へおよびそれを横切るアビジンおよびニュートラアビジンの過渡期輸送を測定した。図14は、平行な3個の軟骨外植片の群を通って拡散するFITC‐アビジンの下流濃度(上流濃度に標準化)のリアルタイムの測定値を示す。
外傷性関節損傷は、多数の軟組織および硬組織に損傷を付与することが可能である。関節軟骨はしばしば損傷されないままであっても、(MRIまたは生検では視認できない)基質へのわずかなミクロな損傷から明白な繊維形成や亀裂までの程度の異なる変化が観察される(Johnson etal., Am J Sports Med, 1998)。外傷は、同時に滑液中の炎症性サイトカインのレベルを増加させ、それらは傷害後の最初の数日/数週間内に、未損傷軟骨さえ急速な軟骨細胞媒介タンパク質分解およびアグリカンや他の基質分子の損失を起こしやすくすることが可能であり(Anderson et al., J Orthop Res, 2011; Lu et al., Arthritis Research & Therapy, 2011; Lotz et al., Arthritis Research & Therapy, 2010; Johnson et al., Am J Sports Med, 1998; Sui et al., Arthritis Rheum, 2009)、最終的にPTOAを引き起こす。組織全体を通って薬物を細胞および基質標的へ持続的に送達するために、軟骨内を迅速に透過することが可能である薬物運搬ナノ粒子を同定する必要があり、様々な粒子サイズおよびタイプについて、迅速で持続的な取り込みが可能かどうかを検討した。
正味電荷は、pH7でイオン化することが可能である塩基性基(リジン、アルギニン)および酸性基(グルタミンおよびアスパラギン酸)を合計して推定した:
PBSおよびアビジンを含有する浴中で平衡にある軟骨外植片を用いて、ドナン平衡分配により、電荷zを有するアビジンの分布が、軟骨組織内のNa+およびCl−濃度と関係していることを予測する:
pH5における脱イオン水の希釈溶液中でのアビジン分子のゼータ電位は、10mVと報告されている(Dougherty et al., Langmuir, 2009)。ゼータ電位を粒子表面電荷密度に関連付ける動電学のGrahame式(Grodzinsky et al., New York: Garland Science, 2011)を使用し、アビジンが球状(直径約7nm)をなすと仮定すると、10mVのゼータ電位は、有効正味分子電荷約+7.3に対応する。
次に、図13におけるアビジン取り込みが結合ではなく静電相互作用(ドナン理論)によるものであることが成り立つとして、アビジン電荷の上限推定値を検討した。
緒言:
骨関節炎の局部処置のための関節内薬物送達に関しては、薬物が脈管構造またはリンパ管から、数時間以内と報告されている半減期で迅速にクリアランスするため、依然不十分である。軟骨のような特定の標的組織の局部治療は、コラーゲンの高密度網目構造および負に帯電したプロテオグリカンのため更に複雑であり、それらはナノサイズの溶質が侵入することさえ阻止することが可能である。
In vivo研究設計
動物試験は、BIDMCの動物保護・利用委員会により承認を得て行った。TexasRed抱合50μMアビジン(pI10.5、66kDa、直径約7nm)またはニュートラアビジン(pH7で中性、60kDa、直径約7nm)(以上、Invitrogen, CA)の関節内(i.a.)注射剤50μLを、健常な18〜20週齢Fischer‐344ラット(Charles River Laboratories)の右膝関節に投与した。注射の後、ラットの膝を曲げ伸ばして注入した溶質を関節内空間全体に分布させた。対側の左膝を対照として使用した。アビジンを注射したラットは4つの異なる時点(6時間、1日、4日、7日)で屠殺し、ニュートラアビジンを注射したラットは1日後に屠殺した。
アビジン‐TexasRed(595nmで励起、615nmで発光)を注射し、6時間後に屠殺したラット関節から抽出した組織サンプルを、Z軸方向のスタックとして10倍の倍率で共焦点顕微鏡(OLYMPUS,FluoViewFV1000)を使用して画像化した。画像は、アビジンが拡散する表面であるX‐Y面で撮影した。3D画像をZ軸方向のスタック(スライス厚さ約4.5μm)を使用して再構築し、これら3D画像のX‐Z面での断面を使用した。対照である対側の膝からの組織試験片の共焦点画像は蛍光を示さなかった。
すべての処理条件での組織サンプルを、37℃のインキュベーターで10xPBS中で48時間脱着して、静電相互作用を阻害し、アビジン/ニュートラアビジンを脱着浴中へ放出させた。48時間以上脱着しても、浴中の蛍光シグナルは増加しなかった。実験の最後に、組織サンプルを浴槽から取り出し、凍結乾燥し、乾燥重量を測定した。脱着浴の蛍光シグナルは、プレートリーダー(Synergy HT, BioTek)を使用して定量化した。検量線の作成の際に、アビジン‐Redおよびニュートラアビジン‐Red両者の蛍光強度および溶質濃度が、浴中濃度と線形であることがわかった。溶質取り込み量は、組織乾燥重量で標準化した組織サンプル中の標識溶質の濃度として算出した。
異なる組織における負に帯電したグリコサノミグリカン(GAG)鎖のアビジン取り込みおよび結合に対する影響を理解するために、硫酸化GAG(sGAG)濃度をジメチルメチレンブルー(DMMB)染料結合アッセイを使用して各組織において測定した(Farndale et al., Biochim. Biophys. Act, 1986)。ナイーブラット関節または切開した関節組織を同時に固定し、組織試験片の骨含有量に拠って24〜72時間Formical‐4(Decal Chemical Corporation)中で脱灰した。脱灰後、試験片を脱水しパラフィンに埋没し、矢状スライスまたは冠状スライス(5μm)のどちらかを、試験片の全体にわたって300μmの間隔で作成した。スライスは、sGAGの量および分布を画像化するためにトルイジンブルーで、試験片間の染色における変動を最小とするためにすべてのスライスを同時に染色した。
アビジンの用量依存性生物学的応答を、ウシ軟骨外植片を使用してテストした。ウシ軟骨円板片は、1〜2週齢仔ウシ膝関節(Hopkinton, MA の Research 87 から入手)の大腿膝蓋溝から収集した。簡潔に述べると、円柱状軟骨円板片(3mm)の芯を、ダーマルパンチを使用して取り出し、その後スライスしてインタクトな表層ゾーンを有する軟骨の最上部1mmを得た。すべての処理群用の軟骨円板片は、関節表面に沿った深さおよび位置を一致させた。
これらの時点で培養を終了し、100〜200μm厚のスライスを各処理条件で得た円板片の中心から切り出した。スライスはすぐにフルオレセイン二酢酸(FDA;PBS中4mg/mL)およびヨウ化プロピジウム(PI;PBS中40mg/mL)(以上、SigmaAldrich, MO)で2〜3分間暗所で染色した。FDAは生細胞を緑色に染色し、一方PIは非生細胞を赤色に染色した。スライスをPBSで洗浄し、Nikon製蛍光顕微鏡を使用し4倍の対物レンズで画像化した。
4日間および10日間の実験の培養が終了する2日前に、培地に5μCi/mL[35S]‐硫酸および10μCi/mL[3H]‐プロリン(共に、Perkin Elmer, Norwalk, CT)を添加した。48時間の放射標識の後、未結合の標識を完全に除去するために円板片を冷PBSで4回80分かけて洗浄した。湿重量を各円板片毎に測定し、その後プロテイナーゼK(Roche, Indianapolis, MN)で一晩消化した。培地および消化した外植片におけるsGAG累積含有量を、DMMBアッセイを使用して測定した。各消化サンプルおよび培地標準の放射標識量(35Sおよび3H)を液体シンチレーションカウンターを使用して測定した。放射標識濃度は、標準値から算出した後、湿重量に標準化した。
図17および図18Aのデータは、平均値±SDとして表され、各処理条件につきそれぞれ6匹および7匹の動物由来であった。一般化線形混合効果モデルで、分析のためのランダム変数として動物を使用し、その後、複数の処理条件間の比較のためにチューキー法を用いた。動物の影響はみられなかった。図20のデータは、2匹の異なる動物由来であり、各処理条件で動物一匹につき合計6個の外植片を使用した;データは、処理条件毎に12個のサンプルの平均値±SEMとして表した(動物の影響はみられなかった)。統計的有意性として、p<0.05を使用した。図18Bにおいて、ダイヤモンドは実験データ(平均値)を示し、実線は線形最小二乗法近似、点線は95%信頼区間である。
ラット関節におけるアビジンの関節内(i.a.)注射:
アビジンのi.a.注射の後、異なる時点(6時間、1日、4日および7日)でラット膝関節に炎症があるかどうかチェックした。膝関節は、関節の腫脹やこわばりのサインは示さなかった。ラットを屠殺した後、関節軟骨、半月板、i.a.靭帯、膝蓋および四頭筋腱を収集し、アビジンの透過深度および保持を調べた。ラット膝関節中のアビジン‐TexasRed(Texasred粉体は裸眼には濃紫である)および抽出組織の紫染色は、6時間および24時間の時点で視認できた。共焦点画像は、i.a.注射後6時間以内にアビジンが組織の全厚を通って拡散することを示した(データ示さず)。対照である対側の膝は蛍光を全く示さなかった。
C(t)=C0e−λt
ラット軟骨(平均濃度18.3μg/mg組織湿重量)、四頭筋腱(5.8μg/mg)、靭帯(4.1μg/mg)、半月板(3.6μg/mg)および膝蓋腱(1.5μg/mg)のsGAG濃度をDMMBアッセイを使用して測定した(図18A);文献で報告されているデータと一貫している(Kamisan., BMC Vet. Res., 2013; Malda et al., PloS One, 2013; Moyer et al., Acta Biomater, 2013; Amiel et al., J. Orthop. Res. Off. Publ. Orthop., 984; Rumian et al., J. Orthop. Res. Off. Publ. Orthop. Res. Soc., 2007)。
アビジン用量の安全限度を推定するために、細胞生存率を、1回用量の0〜100μMアビジンの2、4、および10日間処理後のウシ外植片中の生死蛍光により評価した。10日間の対照における細胞死は最小であり、この期間での異なる処理群間で細胞生存率に有意な差はみられなかった(データ示さず)。軟性の表層ゾーン中の様々な細胞死が、関節表面に沿ったどの位置から収集されたかに依存して無処理外植片でも観察された(圧迫性傷害の受け易さによる)ことに留意されたい。
培地へのsGAG累積損失に関しては、4日目および10日目の測定では、無処理対照、100nMおよび1μMアビジン処理条件の間に有意な差はなかった(図20A)。100μM条件では、4日間(対照7%:100μM14.6%)および10日間(13.6%:20%)で、対照と比較してsGAG損失が多かった。アビジン用量を増加させても、タンパク質およびsGAG合成の速度に有意な変化はなかった(図20Bおよび図20C)。
軟骨の複雑な構造は、ナノサイズの溶質でさえ、その深部ゾーンへ侵入することを防止可能であり、特定の標的組織の中への薬物の局部送達を困難としている(Larsen, J. Pharm. Sci., 2008)。アビジンはその理想的なサイズおよび高い正電荷(+6to+14)のため、速い輸送速度、中性カウンターパートの400倍の取り込み量、ウシ軟骨中で10日間以上の90%を超える保持を示した。これは、アビジンが軟骨の中への薬物局部送達のための担体として理想的な構造を提供できることを示している。
方法
エステル結合を介したデキサメタゾン抱合アビジンの合成:
デキサメタゾンヘミコハク酸(2)の合成
0.030gのデキサメタゾン(1、0.076mmol、1.0等量)を1mLのピリジン(非無水)に完全に溶解し、0.038gのコハク酸無水物(0.382mmol、5.0等量)を得られた透明な溶液へ添加した。その後、1〜2mgのDMAP(7.6μmol、0.1等量)を溶液に添加し、N2気流下で室温で48時間反応させた。48時間後、ピリジンを減圧下で留去した(ロータリーエバポレーター中)。10mLのH2Oを蒸留残滓に添加した。白色の沈殿物ができ、それを10分間撹拌後、遠心分離した。得られた沈殿物を10mLのH2Oで再び洗浄し、洗浄した残滓を凍結乾燥して、目的生成物(2)を得た。
デキサメタゾンヘミコハク酸(2、0.020g、0.0406mmol、1.0等量)を無水DMFに完全に溶解した。0.244g(0.048mmol、1.2等量)のビオチン化PEGアミンを2のDMF溶液に添加した。次に、0.0187g(4.0等量)のNHSを、同一の溶液に添加し、15分間反応させ、その後0.039g(5.0等量)のEDCIを溶液に添加した。反応をN2気流下で48時間行った。48時間後、DMFを蒸発させ、反応混合物を最小量のDMFに再び溶解し、SephadexLH20を充填したサイズ排除クロマトグラフを通過させた。ニンヒドリン試薬でアミンへの陽性を示した溶出分画(ビオチンの二級アミンによる)を収集・貯留した。収集した分画からDMFを留去し、ビオチン化PEG‐デキサメタゾン(3)の粘稠な黄色を帯びた生成物を得た。図23は、デキサメタゾン固定化アビジン(エステル結合)の合成経路スキームを示す。
デキサメタゾン(6‐マレイミドプロピロニル)ヒドラゾン(4)の合成:デキサメタゾン塩酸塩(1)およびN‐β‐マレイミドプロピオン酸ヒドラジドトリフルオロ酢酸塩(BMPH)を5mLのメタノールに溶解した。トリフルオロ酢酸(1.92uL)を添加し、溶液を室温で24時間撹拌した。メタノール溶液を、減圧下31℃で0.96mLの容量に濃縮した。この濃縮溶液に、5mLのPBS(pH7.4)を添加し、得られた懸濁液を、生成物の結晶化のために4℃で48時間放置した。固体状のヒドラゾンを遠心分離で単離し、新鮮なPBSで洗浄し、凍結乾燥し、デキサメタゾン(β‐マレイミドプロピオニル)ヒドラゾン(4)を得た。
イミノチオラン塩酸塩(0.002mg、20μmol、5.0等量)を、1mLのEDTA添加リン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)に溶解した。ビオチン化PEGアミン(0.020g、4.0μmol、1.0等量)を、0.5mLの同一の緩衝液に溶解した。得られたイミノチオラン塩酸塩溶液をPEG溶液に添加し、20分間撹拌しながら反応させた。デキサメタゾン(β‐マレイミドプロピオニル)ヒドラゾンは、最小量のDMSOに溶解し、イミノチオラン活性化ビオチン化PEGアミンを含有する緩衝液溶液に添加した。反応を一晩行った。析出物を遠心分離し、廃棄した。PBS(pH7.4)に対して上澄みを4時間の短期透析しDMSOを除去し、最終産物を得るために溶液を凍結乾燥した。図24は、ヒドラゾン結合の形成を介したデキサメタゾン固定化アビジンの合成スキームを示す。
薬物送達システムは、機械的な傷害の後に疼痛および炎症の即時の軽減を与えるために関節内で薬物を大量に放出し、その後、傷害の異化効果および炎症性サイトカインのレベル上昇を抑制するために数日間少用量の薬物を徐放可能であることが重要である。急性の関節傷害の後、滑液中の炎症性サイトカイン(例えば、IL‐1、IL‐6、TNFα)レベルが即時に上昇し、それらは軟骨の中へ拡散し、タンパク質分解および軟骨基質の損失を急速に開始する。本明細書で示したものは、アビジンを薬物担体として、デキサメタゾンを薬物例として使用して設計した様々な構造物である。
例6に示すようにエステル結合を用いて作成したアビジン‐デキサメタゾン構造体の生物学的活性をin vitro軟骨組織システムにおいてテストした。
in vitroシステムにおいて、軟骨組織を、8日間にわたって対照、IL‐1(1ng/mL)、単一用量のデキサメタゾン(100μm)、単一用量のアビジン‐デキサメタゾン粒子(25〜100μm)、または連続用量のデキサメタゾン(100nM)に暴露した。sGAG累積損失率(図25A)を、2日、4日、6日および8日後に測定した。それぞれのsGAG合成の速度も測定した(図25B)。単一用量のアビジン‐デキサメタゾン粒子は、連続用量のデキサメタゾンと比較しても累積GAG損失を有意に減少させた。
Claims (89)
- 対象における結合組織へ活性薬剤を送達する方法であって、
10nmより大きい平均粒子サイズを有するマイクロ粒子を対象に投与することを含み、マイクロ粒子が、結合組織に結合する化合物により官能化され、第1の活性薬剤を含み、第1の活性薬剤が、マイクロ粒子から放出されるときに結合組織へ送達される、前記方法。 - 筋骨格疾患または傷害を処置する方法であって、
10nmより大きい平均粒子サイズを有するマイクロ粒子を対象に投与することを含み、マイクロ粒子が、結合組織に結合する化合物により官能化され、筋骨格疾患または傷害の処置用治療薬剤を含む、前記方法。 - マイクロ粒子が、ポリマーを含み、ポリマーが任意にペプチドである、請求項1または2に記載の方法。
- 結合組織に結合する化合物がアビジンである、請求項1または2に記載の方法。
- ペプチドが、配列番号1に記載のアミノ酸配列からの5個以上のアミノ酸である、請求項3に記載の方法。
- ペプチドが、配列番号1に記載のアミノ酸配列からの15個以上のアミノ酸である、請求項3に記載の方法。
- 10nm以下の平均粒子サイズを有するナノ粒子を更に含み、ナノ粒子が、第2の活性薬剤を含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 第1の活性薬剤が骨関節炎の処置用治療薬剤である、請求項1に記載の方法。
- 対象が筋骨格疾患または傷害を有し、第1の活性薬剤が、筋骨格疾患または傷害の処置用治療薬剤である、請求項1に記載の方法。
- 第2の活性薬剤が、筋骨格疾患または傷害の処置用治療薬剤である、請求項7に記載の方法。
- 筋骨格傷害が外傷である、請求項2、9、または10のいずれか一項に記載の方法。
- 第2の活性薬剤が鎮痛剤である、請求項7に記載の方法。
- 第2の活性薬剤が骨関節炎の処置用治療薬剤である、請求項7に記載の方法。
- 第1の活性薬剤が鎮痛剤である、請求項1または3〜7のいずれか一項に記載の方法。
- マイクロ粒子が、鎮痛剤および骨関節炎の処置用治療薬剤を含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- ナノ粒子が、鎮痛剤および骨関節炎の処置用治療薬剤を含む、請求項7に記載の方法。
- マイクロ粒子およびナノ粒子が、対象に別々に送達される、請求項7に記載の方法。
- マイクロ粒子およびナノ粒子が、同一の組成物中で対象に送達される、請求項7に記載の方法。
- マイクロ粒子およびナノ粒子が、同時に対象に送達される、請求項7に記載の方法。
- 筋骨格疾患が骨関節炎である、請求項2、9または10のいずれか一項に記載の方法。
- 対象が外傷後骨関節炎を有する、請求項1または2に記載の方法。
- 対象が後期の骨関節炎を有する、請求項1または2に記載の方法。
- 筋骨格傷害が外傷である、請求項2、9、または10のいずれか一項に記載の方法。
- マイクロ粒子が結合組織に結合する化合物により官能化され、第1の活性薬剤を含む、10nmより大きい平均粒子サイズを有するマイクロ粒子と、ナノ粒子が第2の活性薬剤を含む、10nm以下の平均粒子サイズを有するナノ粒子とを含む、組成物。
- マイクロ粒子がポリマーを含む、請求項24に記載の組成物。
- マイクロ粒子がペプチドを含む、請求項24に記載の組成物。
- ペプチドが、配列番号1に記載のアミノ酸配列からの5個以上のアミノ酸である、請求項26に記載の組成物。
- ペプチドが、配列番号1に記載のアミノ酸配列からの15個以上のアミノ酸である、請求項26に記載の組成物。
- 第1の活性薬剤が、骨関節炎の処置用治療薬剤である、請求項24〜28のいずれか一項に記載の組成物。
- 第1の活性薬剤が、筋骨格疾患または傷害の処置用治療薬剤である、請求項24〜28のいずれか一項に記載の組成物。
- 第2の活性薬剤が鎮痛剤である、請求項24〜28のいずれか一項に記載の組成物。
- 第2の活性薬剤が、骨関節炎の処置用治療薬剤である、請求項24〜28のいずれか一項に記載の組成物。
- 第1の活性薬剤が鎮痛剤である、請求項24〜28のいずれか一項に記載の組成物。
- 第2の活性薬剤が、筋骨格疾患または傷害の処置用治療薬剤である、請求項24〜28のいずれか一項に記載の組成物。
- マイクロ粒子が、鎮痛剤および骨関節炎の処置用治療薬剤を含む、請求項24〜28のいずれか一項に記載の組成物。
- ナノ粒子が、鎮痛剤および骨関節炎の処置用治療薬剤を含む、請求項24〜28のいずれか一項に記載の組成物。
- ナノ粒子がペプチドを含む、請求項24に記載の組成物。
- ペプチドが、配列番号1に記載のアミノ酸配列からの5個以上のアミノ酸である、請求項26に記載の組成物。
- ペプチドが、配列番号1に記載のアミノ酸配列からの15個以上のアミノ酸である、請求項26に記載の組成物。
- ペプチドがデキサメタゾン抱合アビジンである、請求項26に記載の組成物。
- マイクロ粒子が、結合組織に結合する化合物により官能化され、骨関節炎の処置用治療薬剤を含む、10nmより大きい平均粒子サイズを有するマイクロ粒子。
- マイクロ粒子がポリマーを含む、請求項41に記載のマイクロ粒子。
- マイクロ粒子がペプチドを含む、請求項41に記載のマイクロ粒子。
- ペプチドが、配列番号1からの5個以上のアミノ酸である、請求項43に記載のマイクロ粒子。
- ペプチドが、配列番号1に記載のアミノ酸配列からの15個以上のアミノ酸である、請求項43に記載のマイクロ粒子。
- 10nm以下の平均粒子サイズを有するナノ粒子を更に含み、ナノ粒子が、第2の活性薬剤を含む、請求項41〜45のいずれか一項に記載のマイクロ粒子。
- 第1の活性薬剤が、骨関節炎の処置用治療薬剤である、請求項41〜45のいずれか一項に記載のマイクロ粒子。
- 第1の活性薬剤が、筋骨格疾患または傷害の処置用治療薬剤である、請求項41〜45のいずれか一項に記載のマイクロ粒子。
- 第2の活性薬剤が鎮痛剤である、請求項46に記載のマイクロ粒子。
- 第2の活性薬剤が、骨関節炎の処置用治療薬剤である、請求項46に記載のマイクロ粒子。
- 第1の活性薬剤が鎮痛剤である、請求項41〜45のいずれか一項に記載のマイクロ粒子。
- 第2の活性薬剤が、筋骨格疾患または傷害の処置用治療薬剤である、請求項46に記載のマイクロ粒子。
- マイクロ粒子が、鎮痛剤および骨関節炎の処置用治療薬剤を含む、請求項41〜45のいずれか一項に記載のマイクロ粒子。
- ナノ粒子が、鎮痛剤および骨関節炎の処置用治療薬剤を含む、請求項46に記載のマイクロ粒子。
- 活性薬剤を対象における結合組織へ送達する方法であって、
10nm以下の平均粒子サイズを有するナノ粒子を、対象に投与することを含み、ナノ粒子が6より大きい正味の正電荷を有するポリマーを含み、ナノ粒子が活性薬剤により官能化されている、前記方法。 - ポリマーが分子量60〜90kdである、請求項55に記載の方法。
- ポリマーが分子量60〜80kdである、請求項55に記載の方法。
- ポリマーが分子量60〜70kdである、請求項55に記載の方法。
- ポリマーがペプチドである、請求項55に記載の方法。
- ペプチドが、配列番号1に記載のアミノ酸配列からの5個以上のアミノ酸である、請求項59に記載の方法。
- ペプチドが、配列番号1に記載のアミノ酸配列からの15個以上のアミノ酸である、請求項59に記載の方法。
- ナノ粒子が、6〜20の正味の正電荷を有するポリマーを含む、請求項55〜61のいずれか一項に記載の方法。
- ナノ粒子が、7〜14の正味の正電荷を有するポリマーを含む、請求項62に記載の方法。
- 活性薬剤が、骨関節炎の処置用治療薬剤である、請求項55〜63のいずれか一項に記載の方法。
- 活性薬剤が、デキサメタゾン、疾患修飾性抗骨関節炎薬(DMOAD)、IGF(インスリン様成長因子)、IGF‐1、FGF‐15およびBMP7などの同化促進成長因子、トリアムシノロンなどのステロイド薬のグルココルチコイドクラスなどの抗異化剤、炎症性サイトカインの遮断薬、TNF、IL‐1、アグリカナーゼおよびマトリックスメタロプロテイナーゼ阻害薬からなる群から選択される、請求項55〜63のいずれか一項に記載の方法。
- 10nm以下の平均粒子サイズを有するナノ粒子を含む組成物であって、ナノ粒子が活性薬剤を含み、活性薬剤が骨または結合組織の疾患状態の処置用治療薬剤であり、ナノ粒子が正味の正電荷が6より大きいポリマーを含む、前記組成物。
- ポリマーが、分子量が90kd未満である、請求項66に記載の組成物。
- ポリマーが、分子量10kd〜90kdである、請求項66に記載の組成物。
- 治療薬剤がIGFである、請求項66に記載の組成物。
- ポリマーが、分子量60〜90kdである、請求項66に記載の組成物。
- ポリマーが、分子量60〜80kdである、請求項66に記載の方法。
- ポリマーが、分子量60〜70kdである、請求項66に記載の方法。
- ポリマーがペプチドである、請求項66に記載の組成物。
- ペプチドが、配列番号1に記載のアミノ酸配列からの5個以上のアミノ酸である、請求項73に記載の組成物。
- ペプチドが、配列番号1に記載のアミノ酸配列からの15個以上のアミノ酸である、請求項73に記載の組成物。
- ナノ粒子が、6〜20の正味の正電荷を有するポリマーを含む、請求項66〜75のいずれか一項に記載の組成物。
- ナノ粒子が、7〜14の正味の正電荷を有するポリマーを含む、請求項76に記載の組成物。
- ペプチドが、アビジン、アルブミン、ゼラチン、リゾチームおよび両性トリブロックペプチドからなる群から選択される、請求項66に記載の組成物。
- アビジンまたはその断片のナノ粒子と、疾患修飾性抗骨関節炎薬(DMOAD)、同化促進成長因子および抗異化剤からなる群から選択される治療薬剤とを含む組成物。
- 治療薬剤がデキサメタゾンである、請求項79に記載の組成物。
- アビジンまたはその断片が完全長アビジンである、請求項79または80に記載の組成物。
- アビジンまたはその断片が、配列番号1に記載の断片である、請求項79または80に記載の組成物。
- アビジンが、共有結合で治療薬剤に結合している、請求項79〜82のいずれか一項に記載の組成物。
- 共有結合が、エステルまたはヒドラゾン結合である、請求項83に記載の組成物。
- アビジンが、非共有結合で治療薬剤に結合している、請求項79〜82のいずれか一項に記載の組成物。
- アビジンが、1〜4個のビオチンと会合している、請求項79〜85のいずれか一項に記載の組成物。
- 筋骨格疾患または傷害の処置に使用する組成物であって、
10nmより大きい平均粒子サイズを有するマイクロ粒子を含み、マイクロ粒子が結合組織に結合する化合物により官能化され、筋骨格疾患または傷害の処置用治療薬剤を含む、前記組成物。 - 活性薬剤を対象における結合組織へ送達するために使用される組成物であって、
10nm以下の平均粒子サイズを有するナノ粒子を含み、ナノ粒子が6より大きい正味の正電荷を有するポリマーを含み、ナノ粒子が活性薬剤により官能化される、前記組成物。 - ナノ粒子と骨または結合組織の疾患状態の処置用治療薬剤とを含む組成物であって、ナノ粒子が、10nm以下の平均粒子サイズを有し、6より大きい正味の正電荷を有するポリマーを含むか、または、アビジンまたはその断片から構成される、前記組成物。
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