EA017017B1

EA017017B1 - Окисленный авидин с большим временем удержания в обработанной им ткани

Info

Publication number: EA017017B1
Application number: EA201070216A
Authority: EA
Inventors: Рита Де Сантис; Карло Антонио Нуццоло
Original assignee: Сигма-Тау Индустрие Фармасьютике Риуните С.П.А.
Priority date: 2007-08-02
Filing date: 2008-07-16
Publication date: 2012-09-28
Also published as: EA201070216A1; EP2185203B1; NZ582711A; BRPI0815050A2; CA2694391C; DK2185203T3; HUE032093T2; AU2008281901A1; BRPI0815050B8; AU2008281901B2; KR20100051696A; SI2185203T1; US8562947B2; MX2010001302A; TWI441650B; LT2185203T; CN101772353A; BRPI0815050A8; AR067771A1; KR101544628B1

Abstract

В изобретении приведено описание химически модифицированных авидинов, имеющих большую стабильность в обработанной ими ткани по сравнению с авидином дикого типа. Окисление авидина проводят окислением с периодатом в присутствии низкоаффинного лиганда HABA, который, занимая участки связывания биотина, предупреждает денатурацию белка в ходе стадии окисления. В результате окисления периодатом при разрыве маннозного кольца образуются CHO-группы, которые при инъекции в ткань вступают в реакцию с NH-группами ткани, образуя стабильные Шиффовы основания. Заякоренные авидины сохраняют способность связывать биотинилированные агенты, имеющие терапевтическую активность, такие как радиоактивно меченые биотины, стволовые клетки и соматические клетки, используемые для брахитерапии, подобной радионуклидной терапии с интраоперативным авидинированием для (IART®), или для брахитерапии дегенеративных или генетических болезней.

Description

Область техники

Настоящее изобретение относится к модифицированным авидинам, пригодным для связывания биотинилированных соединений или клеток и удерживания их на участке тела, нуждающегося в терапии.

Предпосылки изобретения

В течение многих лет авидин-биотиновая система была известна в качестве превосходного инструмента для количественных и качественных исследований взаимодействий между низкомолекулярными соединениями и биологическими рецепторами (Айсйек, М., е! а1., 1ттипо1. Тобау, 1984, 6, 39).

Авидин представляет собой гликопротеин с молекулярным весом около 68 кД, присутствующий в яичном белке и имеющий высокое сродство к витамину Н (биотину). Его константа диссоциации (К_б~10^-15 М) является наиболее низкой из известных в природе (Огееп Ν.Μ., е! а1., Вюсйет. 1., 1970, 118, 67; бтееп, Ν.Μ., Α6ν. Рто!ет Сйет., 1975, 29, 85). Авидин состоит из четырех субъединиц с идентичной аминокислотной последовательностью, каждая из которых может потенциально связывать одну молекулу биотина. Остатки сахара составляют примерно 10% от молекулярного веса авидина, причем на одну субъединицу в среднем приходится от 4 до 5 остатков маннозы и 3 Ν-ацетилглюкозаминовых остатка (Вгисй В.С., е! а1., ВюсйетПИу, 1982, 21, 5334).

В 1988 году было опубликовано исследование, посвященное изучению взаимодействия между радиоактивно мечеными производными биотина и авидином (ОатНск В.К., е! а1., 1. Вю1. Сйет., 1988, 263, 210).

В АО 04093916 на имя заявителя описана двухстадийная периоперативная терапия солидных опухолей в качестве нового вида брахитерапии. Первая стадия включала введение в оперируемую область биотинилированного специфического антитела с последующей инъекцией нативного или модифицированного молекулами ПЭГ авидина для создания искусственного рецептора. Затем во второй стадии проводили системное введение подходящего противоракового агента, связанного с биотином. Вторую стадию необходимо провести в интервале от 4 до 72 ч после хирургического удаления опухоли. Однако в этом патенте не предлагалось прямое авидинирование посредством связывания авидина с данной тканью.

Клиническое применение этой двухстадийной брахитерапии с использованием авидина на первой стадии и радиоактивно меченого биотина-ЭОТА (8Т2210) на второй стадии оказалось эффективным для частичного облучения хирургически оперируемой области у пациентов с раком молочной железы (РадаиеШ О., е! а1., Тйе Втеак!, 2007, 16, 17; РадаиеШ О., е! а1., Сйп. Сапе. Век., 2007, 13, 5646). Доза облучения, высвобождаемая в хирургически оперируемый сектор, у 11 пациентов в среднем составляла 20 Гр при вводимой дозе 100 мКи. Это составляет около 1/3 предполагаемой дозы 60 Гр, получаемой такими пациентами при стандартной дистанционной лучевой терапии (ДЛТ).

Недавно были опубликованы результаты применения конструкций стрептавидина с антителами вместе с конъюгатами биотина и радионуклидов при лечении пациентов со злокачественными глиомами и биспецифических антител с гаптен-радионуклидами в терапии опухолей, экспрессирующих карциноэмбриональный антиген (6о1бепЬетд, Ό.Μ., е! а1., 1. СИп. Опсо1., 2006, 24, 823). Однако в довольно большом числе случаев вследствие слишком высокой дозы радиоактивности, проходящей через почки, возникала нефротоксичность.

Одной из главных проблем при лечении с использованием авидина является его быстрое выведение из организма. В последнее время проводимые исследования сосредоточены на поиске модифицированного авидина с более продолжительным временем полужизни. В одном из таких подходов через свободные аминогруппы к белку присоединяют монометоксиполиэтиленгликоль, что дает увеличение времени полужизни модифицированного авидина в плазме, причем при использовании авидина, связанного с ПЭГ-20000, 8% внутривенно введенной дозы все еще присутствует в опухоли через 5 ч, а через 72 ч 6% (Са11се!1 Р., е! а1., 1. Соп!го1. Ве1еаке, 2002, 83, 97).

Фармакокинетическое исследование влияния размера молекулы ПЭГ показало, что при увеличении веса молекулы ПЭГ сокращается время полужизни, в то время как степень аффинности взаимодействия биотина и авидина имеет обратную тенденцию (8а1тако 8., е! а1., ВюсЫт. Рйук. Ас!а, 2005, 1726, 57).

Другое исследование фармакокинетических свойств модифицированного молекулами ПЭГ-авидина и его способности связывать биотин показало, что соотношение семь молекул ПЭГ на молекулу авидина является наилучшим, позволяющим увеличить время полужизни в плазме и снизить иммуногенность авидина. Однако не было приведено никаких данных в отношении накопления биотинилированного лекарственного соединения в опухолях в животной модели (СЫпо1 М., е! а1., Вг. 1. Сапсег, 1998, 78, 2, 189).

Проводили исследования термочувствительных полимеров в качестве альтернативы ПЭГ-авидину. Поли(сополимер Ν-изопропилакриламида и акриламида)авидин обладает большим временем удержания в кровотоке по сравнению с авидином и меньше накапливается в печени (8а1тако 8., е! а1., 1п!. 1. Рйатт., 2007, 340, 20). Однако в этом случае также не было приведено никаких данных относительно накопления биотинилированного лекарственного соединения в опухолях в животной модели.

К сожалению, на сегодняшний момент не существует эффективного и селективного способа специфической локализации терапевтических агентов.

- 1 017017

Поэтому все еще необходимо улучшение противораковой терапии, и на это направлена основная часть исследований, проводимых фармацевтическими компаниями.

Связывание авидина с биотином зависит от белковой части молекулы гликопротеина. В действительности, дегликозилированный авидин сохраняет способность связывать биотин (Н111ег Υ., е! а1., Вюсбет. 1., 1987, 248, 167; ВокеЬгоидб 8.Е., е! а1., 1. Ыис1. Меб., 1996, 37, 8, 1380).

Увеличение накопления и стабильности терапевтического агента в области, которой необходимо воздействие, можно получить посредством авидинирования ткани модифицированным авидином, имеющим более высокую стабильность в ткани по сравнению с авидином дикого типа.

Такая стратегия позволяла бы избежать необходимости системного введения авидина и, следовательно, предупреждала бы любые побочные эффекты, связанные с такой терапией. Дополнительно, повышенное авидинирование целевой ткани давало бы в результате менее токсичный способ лечения вследствие меньшего содержания противоракового агента в нецелевых органах и меньшей дозы противоракового агента для получения такого же эффекта, как при использовании авидина дикого типа.

В настоящем изобретении было найдено, что с помощью окисления гликозилированной части авидина можно получить стабильное авидинирование окружающей опухоль ткани, что обеспечивает лучшее накопление биотинилированного противоракового агента в такой области.

Описание изобретения

Настоящее изобретение включает химически окисленный авидин, способный взаимодействовать с тканями ίη νίνο через обратимую ковалентную химическую связь, что задерживает его диффузию. Такой окисленный авидин вводят на этапе хирургического вмешательства (или с помощью инъекции) в отдельные орган или ткань, которым необходима терапия.

Недавно было раскрыто окисление авидина с помощью 10 мМ периодата натрия (И8 20020137125). В нем авторы присоединяли окисленный авидин к фосфопентаманнозогидразину для получения иминного производного с высокой степенью фосфорилирования, которое затем можно вводить пациенту для модификации лизосомного фермента, что усиливает эффективность ферментзамещающей терапии при лизосомных болезнях. Следует отметить, что образование иминов не происходит ίη νίνο. Также следует отметить, что в этой заявке не была приведена активность такого модифицированного авидина.

В частности, настоящее изобретение относится к окисленному авидину, полученному окислением молекул сахара в гликопротеине, стабильность которого в тканях превышает стабильность авидина дикого типа (авидина-ДТ), в результате чего минимизируются побочные эффекты, возникающие при использовании ранее опубликованных модифицированных авидинов.

Связывание с тканью окисленного авидина является высокогомогенным и не зависит, как, например, в ΙΑΒΤ (радионуклидной терапии с интраоперативным авидинированием) от способности положительно заряженного авидина локализоваться в опухолевых или воспаленных тканях. Поэтому действие окисленного авидина не ограничено специфическим взаимодействием с опухолевыми клетками, что позволяет авидинирование тканей, окружающих удаляемые хирургическим путем опухоли, которые, как известно, содержат дополнительные опухолевые клетки, мечение которых авидином дикого типа затруднено.

Первый вариант осуществления настоящего изобретения относится к химически модифицированному авидину дикого типа, получаемому путем окислительного раскрытия пиранозного кольца сахара, в результате которого образуются альдегидные группы, взаимодействующие с аминогруппами, присутствующими в целевой ткани.

При кислом рН (ниже 6,0) альдегидные группы (СНО) являются, по существу, инертными в отношении белковых ПН₂-групп, поскольку они присутствуют в протонированной форме (ΝΗ₃ ⁺). Однако при рН>7 СНО-группы вступают в реакцию с белковыми NН₂-группами, образуя Шиффовы основания. На схеме 1 приведен пример химического окисления репрезентативного остатка маннозы авидина дикого типа и последующая реакция новообразованных СНО-групп с аминогруппами (Κ.-ΝΠ₂, где В представляет собой белок ткани).

Схема 1

α-β-манноза основание Шиффа

Данное окисление сахара осуществляется с помощью хорошо известного способа, основанного на реакции нативного авидина с периодатом натрия (2аЬогкку, О.В., е! а1., Вюсбет. Вюрб. Век. Сотт., 1974, 61, 1, 210; Огееп, Ν.Μ., Вюсбет. 1., 1963, 89, 599).

- 2 017017

Однако известно, что окисление авидина приводит к повреждению некоторых аминокислотных остатков белка, а именно к окислению триптофана, входящего в участок связывания биотина, что приводит к низкой аффинности к биотину и/или производным биотина (И8 20040191832; Отееп, Ν.Μ., Вюсйет. 1., 1963, 89, 599).

В данном изобретении было найдено, что связывание авидина с низкоаффинным лигандом 4-гидроксиазобензол-2'-карбоновой кислотой (НАВА) перед стадией окисления придает первому конформацию, предупреждающую окисление остатков триптофана, что было показано с помощью УФ спектрального анализа таких производных. Понижение характерных точек перегиба при 282 и 291 нм в УФ-спектре четко связано со степенью окисления триптофановых остатков; в то время как увеличение поглощения в области 250-260 нм характерно для образования замещенного оксиндола.

Сравнение спектров поглощения окисленного авидина (оксавидина) и НАВА-насыщенного окисленного авидина (ОКСавидина_НАВА) со спектром авидина дикого типа (авидина-ДТ) указывает на то, что использование НАВА для защиты сайта связывания биотина в процессе окисления значительно снижает содержание поврежденного триптофана (фиг. 1).

Предпочтительным вариантом осуществления этого изобретения является окисленный авидин с УФ-спектром, в котором поглощение при 282 и 291 нм не представляет прогиба, характерного для окисления остатков триптофана, относительно прогиба, наблюдаемого для авидина-ДТ.

Другим предпочтительным вариантом осуществления этого изобретения является окисленный авидин с УФ-спектром, в котором не увеличивается поглощение при 250-260 нм относительно увеличения, наблюдаемого для авидина-ДТ.

Еще одним предпочтительным вариантом этого изобретения является способ окисления авидина и/или производных авидина в присутствии НАВА-лиганда, который предупреждает окисление триптофановых остатков.

ОКСавидин_НАВА имеет структурные и термодинамические свойства, очень сходные со свойствами авидина-ДТ, что хорошо коррелирует с защитным эффектом НАВА. Термостабильность и конформационные изменения определяли с помощью спектроскопии кругового дихроизма до и после окисления, в присутствии и в отсутствие 4 экв. биотина. Кривые плавления записывали по падению дихроического сигнала при 225 нм в диапазоне температур 25-95°С. Точку перегиба и наклон (р) сигмоидальных кривых вычисляли с помощью аппроксимирующей модели Больцмана программного обеспечения Опщп® 7.0, и они представляли собой точку перехода через денатурированное состояние.

Для каждого конкретного соединения термическая стабильность соответствует температуре, которая совпадает с точкой перегиба соответствующей кривой, полученной для диапазона температур 2595°С.

Данные (табл. 1) указывают на то, что окисление снижает термическую стабильность, определяемую по снижению температуры плавления (Тт) и по наклону (р) сигмоидальной кривой ОКСавидина по сравнению с авидином-ДТ (74,3 относительно 79,0°С и 8,9 относительно 14,7 соответственно).

Неожиданно, но дестабилизирующий эффект был практически незаметен при проведении окисления с НАВА-защищенным авидином, что подтверждалось значениями Тт и р для ОКСавидина_НАВА и авидина: 78,1 относительно 79,0°С и 11,2 относительно 14,7 соответственно.

Таблица 1

	Тт (°С)	р*
Авидин	79,0±0,1	14,7+0,3
Авидин+биотин (4 экв.)	>95	не применимо
ОКСавидин	74,3±0,1	8,9±0,1
ОКСавидин+биотин (4 экв.)	86,3 + 0,2	20,7 + 1,1
ОКСавидиннАвд	78,1+0,3	11,2+0,4
ОКСавидиннАвд+биотин (4 экв.)	>95	не применимо

* Наклон сигмоидальной кривой.

Хотя при нагревании без биотина термическая денатурация является необратимой, как для ОКСавидина_НАВА, так и для оксиавидина, только ОКСавидин_НАВА способен восстанавливать свою вторичную структуру аналогично авидину-ДТ при нагревании/охлаждении в присутствии биотина (данные не показаны). Эти данные подтверждают, что насыщение НАВА представляет собой весьма эффективный способ сохранения конформации авидина при химическом окислении и объясняет впоследствии сохраняемую способность связывать биотин.

Дополнительным предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения является окисленный авидин, имеющий термическую стабильность выше или равную 78°С.

Более предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения является окисленный авидин, имеющий термическую стабильность выше или равную 78°С с наклоном сигмоидальной кривой выше 10.

- 3 017017

Предыдущие данные также подтверждаются способностью окисленного авидина (ОКСавидина_НАВА) связывать биотинилированный аддукт 8Т2210 аналогично авидину-ДТ, как показано в табл. 2.

Таблица 2

	Условия окисления	Молярное соотношение сиогрупп/Авидина	Связывание с биотиномООТА	Стабильность в ткани, % введенной дозы/100 мг+ЗО
13Ц	%±ЗО	24 ч	1 неделя
(Ы)	(Ν)	(Ν)	(И)
	Нет	Ниже уровня	100®	2,4+0,4	0,46 + 0,08
Авидин“ДТ	окисления	чувствительное-		(5)	(4)
		ти метода (5)
	1 мМ	5, 6+0,8	77,2 + 0,9	3, 1+0,7	0, 16±0,03
		(5)	(4)	(1)	(1)
	5 мН ν&ιο₄	7,5 + 0,8	55, 7±2,2	6,3±0,3	0,99±0,25
ОКСавидин	10 мМ	(5) 8,4+1,0	(4} 50,9 + 2,4	(1) 17,4±2,8	(1) 9,713,2
	ΝβΙΟ^	(6)	(6)	(3)	(3)
	20 мМ	11,5±1,5*	49,1+2,1	19,1+2,0	11,4+1,3
	ΝήΙΟ₄	(7)	(6)	(4)	(3)
	4 0 мИ	10,912,6	44,5+0,9	НТ	нт
	ΝάΙΟ^	(5)	(4)
ОКСавидиннлвл	1 мМ ИаЮ₄	4,0±0,8	99,0+0,2	нт	нт
	+1 мМ	(3)	(3)
	НАВА
	5 мМ	7_г 1 + 1,6	95,0+1,7	ΝΤ	нт
	НаТСА + 1 мМ	(4)	(3)
	НАВА
	10 мМ	8,511,3	86,3+1,6**	18,412,2	9,011,2
		(5)	(3 >	(2)	(2)
	1 мН НАВА
	20 мМ	12,9+2,З#	81,411,О#**	18,5+0,5	11,712,3
	1 мН НАВА	(6)	(4)	(4}	(3)
	4 0 мН	9,8 + 1,9	73,0±0,6	НТ	НТ
	1 мМ НАВА	(4)	(3)

N - число независимых экспериментов;

8Б - стандартное отклонение;

НТ - не тестировалось;

^Экспериментальное значение 97,4±0,5, полученное с биотином-ЭОТА (8Т2210) по сравнению с биотином в НАВА-анализе, принимали за 100% в качестве референсного значения для модифицированных авидинов;

*р<0,05 относительно 10 мМ;

#р<0,01 относительно 10 мМ (односторонний Αηονα с последующим тестом СтьюдентаНьюмана-Кейлса);

**р<0,001 относительно той же концентрации периодата без НАВА (двусторонний Αηονα с последующим тестом Бонферони).

Окисленный авидин, полученный по оптимизированному способу (ОКСавидин_НАВА), обладает улучшенными свойствами по сравнению с окисленным авидином, полученным без защиты с помощью НАВА, в отношении связывания с 8Т2210, в то же время обладая высокой стабильностью в ткани (в мышцах конечностей мышей после внутримышечной инъекции). В действительности, при окислении авидина 10 мМ ΝαΙΟ₄ его способность связывать 8Т2210 становится выше при добавлении НАВА перед окислением (86,3% по сравнению с только 50,9% для соответствующего окисленного авидина в отсутствие НАВА). Аналогичный результат возникает при окислении более высокой концентрацией (20 мМ) периодата натрия (81,4 относительно 49,1%).

Дополнительным предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения является окисленный авидин, связывание которого с 8Т2210 составляет 75% или выше относительно 97,4%, полученного для авидина-ДТ.

Более того, стабильность окисленного авидина в тканях задних конечностей мыши (вне зависимости от присутствия НАВА при окислении) была значительно выше, чем для авидина-ДТ. Это хорошо коррелирует с присутствием СНО-групп в гликозилированных боковых цепях авидина.

В более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения после окисления 10 и 20 мМ ΝαΙΟ₄ образуется от примерно 8 до 15 СНО-групп на молекулу авидина (определенных способом с использованием реагента РиграШ®).

- 4 017017

В еще более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения НАВАзащищенные окисленные авидиновые производные (ОКСавидин_НАВА) сохраняют высокую способность к связыванию ЗТ2210 и обладают стабильностью в тканях через 24 ч и через 1 неделю после инъекции, что коррелирует с числом СНО-групп.

Физико-химические исследования с помощью изотермической титрационной калориметрии (ИТК) такого взаимодействия авидина с биотином выявили, что ЗТ2210 связывает авидин-ДТ и ОКСавидин_НАВА аналогичным образом, что демонстрируют константы ассоциации (К_А) и изменение энтальпии (ДН) (3,45 относительно 2,50х10⁶ М^-1 и -1,48 относительно -1,71х10⁴ ккал-моль^-1 соответственно). В отличие от этого взаимодействие ЗТ2210 и ОКСавидина характеризуется более низким значением К_А(6,45х10⁵ М^-1) и более высоким значением ΔΗ (-0,79х10⁴ ккал-моль^-1).

В соответствии с данными по связыванию ЗТ2210 с окисленными авидинами (в пределах ошибки эксперимента) определенная стехиометрия взаимодействия составляет 3,0, 1,7 и 1,2 молекулы ЗТ2210 на молекулы авидина-ДТ, ОКСавидина_НАВА и ОКСавидина соответственно.

Таблица 3

	N	КА, М^-1	ΔΗ, ккал*моль^-1	Δ3, калмоль^-1К¹
Авидин-ДТ	3,0+0,016	3,45Е6±3,07Е5	-1,48Е4±114,0	-19, 6
ОКСавидин, 20 ε/М Ма1О<	1,2+0,012	6,45Е5+5,69Е4	-0,79Е4+117,8	0,16
ОКСавидинндвл, 1 мМ ЦаЮ,	2,5+0,008	4,58Е612,49Е5	-1,29Е4+56,2	-12,7
ОКСавидин_ИАВЯ, 5 мМ МаЮ,	1,9±0,012	5,42Е6±5,90Е5	-1,56Е4±145,0	-21, 6
ОКСавидин_НАВД, 10 мМ ИаЮ₄	1,7+0,008	3,34Е6+2,12Е5	-1,60Е4+109,9	-23,7
ОКСавидиНндвл/ 20 мМ МаЮ,	1,5±0,007	2,50Е6±1,32Е5	-1,71Е4+113,7	-28,0

Окисленный авидин по настоящему изобретению, по существу, сохраняет способность авидина дикого типа связывать биотин, в то же время приобретая способность к обратимому взаимодействию с белками тканей, тем самым представляя собой идеальный кандидат для применения в брахитерапии как, например, в 1АК.Т®.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения окисленный авидин вводят на интраоперационной стадии, в результате чего генерируется искусственный рецептор для вводимого впоследствии противоракового агента.

Более предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения является предоставление химически окисленного авидина для использования в качестве первого агента брахитерапии, имеющего высокую стабильность в обработанных им тканях, в комбинации с вторым агентом, имеющим сродство к указанному первому окисленному авидину.

Еще более предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения является предоставление химически окисленного авидина для использования в качестве первого агента брахитерапии, имеющего высокую стабильность в обработанных им тканях, в комбинации со вторым противораковым агентом, имеющим сродство к указанному первому окисленному авидину.

Другим вариантом осуществления настоящего изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая указанный химически модифицированный авидин в качестве первого ингредиента и биотинилированный терапевтический агент в качестве второго активного ингредиента.

В одном предпочтительном воплощении изобретения вторым активным ингредиентом вышеупомянутой фармацевтической композиции является биотинилированный противораковый агент.

Противораковым агентом называют агент, способный бороться с опухолями. Неполный список противораковых агентов состоит из химиотерапевтических лекарственных соединений, радиоактивно меченых соединений, эффекторных клеток, токсинов, цитокинов и противораковых клеток.

В другом предпочтительном воплощении изобретения терапия представляет собой радиотерапию.

Другой предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения включает в себя получение набора, пригодного для брахитерапии молочной железы, мышц, печени, поджелудочной железы, мочевого пузыря, легких, предстательной железы, яичников, глаз и других органов.

В одной предпочтительной реализации набора два ингредиента находятся в двух отдельных контейнерах.

В одном более предпочтительном варианте осуществления изобретения контейнер химического модифицированного авидина будет содержать достаточное количество продукта, который находится в совместимом кислом растворе или лиофилизирован вместе с подходящими наполнителями, образуя прессованный осадок.

- 5 017017

В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения вышеупомянутый контейнер будет представлять собой специальный шприц, подходящий для последовательного многократного введения точных объемов содержимого в резекционные границы или остатки пораженной ткани, которые вследствие инфильтрации в жизненно важные органы нельзя удалить хирургическим путем.

Также может быть удобным, если контейнер подходит для введения химически модифицированного авидина в виде спрея.

Предпочтительно, чтобы различные контейнеры, уже содержащие дозы отдельных ингредиентов, изготавливались в виде единой упаковки с инструкцией по способам введения.

Еще более предпочтительно, чтобы различные контейнеры представляли собой шприцы.

В другом особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения набор для применения в брахитерапии, например в ΙΆΚΤ®, подходит для последовательного, ограниченного локальной областью, введения первого ингредиента и последующего системного или местного введения второго ингредиента.

Второй ингредиент композиции этого изобретения можно вводить любыми путями, включающими, но не ограниченными, пероральное, внутривенное, внутримышечное, интраартериальное, интрамедуллярное, интратекальное, интравентрикулярное, трансдермальное или чрескожное введение, подкожное, внутрибрюшинное, интраназальное, энтеральное, местное, сублингвальное, интравагинальное, ректальное введение или местное нанесение на пораженную ткань.

В клинической практике существуют случаи, когда брахитерапию проводят, вводя радиоизотоп напрямую в массу опухоли (а именно, в неоперируемые опухоли мозга, как описано в 1и1оте 1., с1 а1., Ргод. №иго1. 8итд., 2007, 20, 303) или в пораженные опухолью органы (а именно, в предстательную железу, как описано в 8айо 8., с1 а1., Ιηΐ. 1. С1ш. Опсо1., 2007, 12, 395). В таком случае идеальным устройством для брахитерапии будет устройство, обеспечивающее гомогенное распределение и стабильность в области участка, подвергаемого воздействию.

На основе экспериментальных данных было найдено, что авидинирование ткани происходит в различных тканях, таких как мышцы, молочная железа (показано в примерах), а также в ткани мозга.

В еще одном особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения будут получать комплекс окисленного авидина и биотинилированного терапевтического агента смешиванием двух ингредиентов и далее вводить пациенту.

Композиция по настоящему изобретению состоит из лекарственного соединения, пригодного для терапии операбельных или неоперабельных (или удаляемых не полностью) солидных опухолей, таких как, например, но не исключительно, раковые заболевания молочных желез, поджелудочной железы, легких, плевры, брюшной полости, лица и шеи, мочевого пузыря, мозга, предстательной железы, яичников, глаз и других органов, как описано в патентной заявке АО 2004/093916, поданной на имя заявителя.

По предпочтительному варианту осуществления изобретения окисленный авидин, полученный с помощью способа по изобретению, можно описать, как химически модифицированный авидин, в котором по меньшей мере один из остатков маннозы замещен на остаток со следующей формулой:

° С* о

Формула I

Дополнительной целью настоящего изобретения являются фармацевтические композиции, описанные ранее, в комбинации с наполнителями и/или фармакологически приемлемыми разбавителями.

Дополнительным вариантом осуществления изобретения является способ получения фармацевтических композиций, отличающийся смешиванием химически модифицированного авидина с подходящими наполнителями, стабилизаторами и/или фармакологически приемлемыми разбавителями.

Наполнитель представляет собой инертное вещество, добавляемое к лекарственному соединению для увеличения массы.

Для введения терапевтического агента фармацевтическая композиция может также содержать фармацевтически приемлемый носитель. Такие носители включают антитела и другие полипептиды, гены и другие терапевтические агенты, такие как липосомы, при условии, что носитель можно вводить без чрезмерной токсичности.

Подходящими носителями могут быть большие, медленно метаболизируемые макромолекулы, такие как белки, полисахариды, полимолочные кислоты, полигликолевые кислоты, полимерные аминокислоты, аминокислотные сополимеры и неактивные вирусные частицы.

Подробное обсуждение фармацевтически приемлемых носителей можно найти в Кетшд1оп'8 Рйаттасеибса1 8с1епсе§ (Маск РиЬ. Со., N. 1. 1991).

Фармацевтически приемлемые носители в терапевтических композициях могут дополнительно содержать жидкости, такие как вода, солевой раствор, глицерин и этиловый спирт.

- 6 017017

Дополнительно в таких композициях могут присутствовать вспомогательные вещества, такие как увлажняющие или эмульгирующие агенты, рН-буферные вещества и т.п. Такие носители позволяют составить фармацевтическую композицию в виде лиофилизированных прессованных осадков, таблеток, пилюль, драже, капсул, жидкостей, гелей, сиропов, взвесей, суспензий и т.п. для приема внутрь пациентами.

Субъектом лечения могут быть животные, в частности субъектом лечения может быть человек.

Схема лечения может включать однократное или многократное введение.

Доза будет определяться опытным специалистом в данной области, так чтобы ввести в целевую ткань количество, которое проявляет эффективное терапевтическое действие.

Общий диапазон дозировок может составлять от 10 до 100 мл раствора окисленного авидина с концентрацией 3-5 мг/мл. Объем дозировки будет зависеть от объема целевой ткани, подвергаемой воздействию, т.е. 30 мл для типичного воздействия на область груди, окружающую участок квандрантектомии (РадаиеШ О., с1 а1., ТНе Втеай, 2007, 16, 17), или до 100 мл для воздействия на брюшную полость.

Биохимическая характеристика окисленного авидина включает оценку СНО-групп колориметрическим методом Ригра1б®, известным опытному специалисту в данной области (Лущаб О., Апа1. Вюсйеш., 1983, 134, 2, 499), с использованием пропионового альдегида в качестве стандарта.

Описание чертежей

Фиг. 1. Представлены УФ-спектры трех различных форм авидина.

Фиг. 2. Кривые А, В и С относятся к профилям элюции авидина-ДТ, ОКСавидинандвл и ОКСавидина соответственно для гель-фильтрации (колонка Вю§ер-8ЕС-83000 (Рйепотепех®, 300x7,8 мм, объем: 14,3 мл) при использовании изократических условий в 100 мМ ацетатном буфере, рН 5,5 и 0,15 мМ ЫаС1 при скорости потока 1 мл/мин и комнатной температуре. Два последних вещества были получены из авидина-ДТ окислением с использованием ЫаЮ₄ (20 мМ). Соотношение 280/260 относится к чистоте авидина в отношении окисления триптофановых остатков и образования оксиндола.

Фиг. 3. Показано биораспределение в организме мыши окисленного авидина после введения с помощью внутримышечной инъекции. В частности, данные на фиг. 3а указывают на то, что через 1 ч после инъекции количество окисленного авидина в получившей инъекцию конечности превышает более чем в два раза количество нативного авидина. Разница возрастает со временем: через 24 и 48 ч нативный авидин практически невозможно детектировать, в то время как количество окисленного авидина соответственно составляет примерно 22 и 15% от введенной с помощью инъекции дозы на 100 мг ткани. Более высокая концентрация окисленного авидина по сравнению с авидином дикого типа в обработанной конечности ассоциирована с более низким содержанием окисленного авидина и более высоким содержанием авидина дикого типа в нецелевых органах, в частности, в течение первого часа, как показано на фиг. 3Ь-3б для крови, почек и печени соответственно. На фиг. 3е показано распределение окисленного авидина и авидина дикого типа в противоположных конечностях.

Фиг. 4. Показана стабильность меченых ¹²⁵1 авидина-ДТ и ОКСавидина_НАВА в обработанных и противоположных конечностях в течение 14 недель. Этот график указывает на то, что относительно уровня, получаемого через 1 ч после введения, время полужизни ОКСавидинаНАВА составляет около 2 недель в отличие от 2 ч для авидина-ДТ.

Фиг. 5. Показана стабильность авидина-ДТ, ПЭГ-авидина и ОКСавидина_НАВА через 24 ч после инъекции 45 мкг (15 мкл) меченых ¹²⁵1 авидина-ДТ, ПЭГ-авидина и ОКСавидина (в 100 мМ ацетатном буфере, рН 5,5) в одну заднюю конечность мышей Ва1Ь/с. Радиоактивность в обработанной конечности измеряли с помощью гамма-счетчика (СатЬегга Раскагб, 8с11\уабогГ АшМа).

Фиг. 6. Показаны срезы мышечной ткани мышей Ва1Ь/с, получивших инъекции авидина-ДТ (вкладка а) или ОКСавидинаНАВА (вкладка Ь), окрашенные антителами к авидину для иммунофлуоресценции (мышиная асцитная жидкость, несущая антитела к авидину, (А5680 Ьа1с11 064К4826, 8фта А1бпсй)), и далее окрашенные вторичными антителами к мышиным иммуноглобулинам, конъюгированными с флуоресцентной меткой А1еха Е1иот 488 (Ьа1сй 99Е2.2, Мо1еси1аг РтоЬек). На панели а наблюдается слабое точечное окрашивание авидина, в то время как в срезах мышц, в которые был введен ОКСавидинНАВА, наблюдается его сильное гомогенное распределение. В обоих случаях авидин локализуется в интерстициальном пространстве.

Фиг. 7. Показана стабильность во времени ^1П1п-8Т2210, введенного внутривенно в заднюю конечность мышей Ва1Ь/с, которым за 48 ч до этого ввели авидин-ДТ или ОКСавидин_НАВА (вкладка а). Вкладки Ь, с и б относятся к захвату ^|||1п-8Т2210 в печени, почках и селезенке соответственно после внутривенной инъекции ^1П1п-8Т2210. На вкладке е показан захват ^Ш1п-8Т2210 через 48 ч после авидинирования ткани. В другом варианте (повторное введение ^Ш1п-8Т2210) животные получали сначала дозу холодного 8Т2210, а 24 ч спустя - вторую дозу ^Ш1п-8Т2210.

Фиг. 8. Показано удерживание в ткани комплексов авидина-ДТ или ОКСавидина_НАВА с 8Т2210 через одну неделю после инъекции в одну заднюю конечность.

Фиг. 9. Показано удерживание в ткани мозга ОКСавидинаНАВА через 24 ч после инъекции с левой стороны черепа.

- 7 017017

Нижеследующие примеры дополнительно иллюстрируют изобретение, не ограничивая его.

Примеры

Пример 1. Синтез и биохимическая характеристика окисленных авидинов.

Способ окисления включает следующие последовательные стадии:

а) инкубация авидина дикого типа (предварительно смешанного с молярным избытком НАВА) с окислителем, таким как 10-20 мМ периодат натрия, в 50-100 мМ ацетатном буфере при рН ниже 6,0 в течение 1-5 ч при 4°С или при комнатной температуре;

б) остановка реакции и очистка продукта путем удаления окислителя и НАВА с помощью хроматографии, ультрафильтрации, диализа или других способов очистки, известных опытному специалисту в данной области; и

в) лиофилизация или введение в состав с кислым рН.

Далее проводили анализ молекулярного веса окисленного авидина с помощью гель-фильтрации на колонке Ью§ер-8ЕС-83000 (Рйепотепех®, 300x7,8 мм, объем: 14,3 мл) с использованием изократических условий в 100 мМ ацетатного буфера, рН 5,5 и 0,15 мМ ЫаС1 при скорости потока 1 мл/мин и при комнатной температуре.

Как показано на фиг. 2, элюция окисленного авидина происходит с небольшой задержкой по сравнению с нативным авидином.

Пример 2. Биораспределение окисленного авидина при введении в мышь.

Проводили оценку стабильности окисленного авидина (ОКСавидина) в обработанной им ткани, его биораспределение в других органах (не обработанных), а также его способность к захвату ¹¹¹1и-8Т2210 в мышиной модели для имитации 1АВТ® в сравнении с авидином дикого типа (авидином-ДТ).

Животную модель 1АВТ® получали, проводя хирургический разрез на одной задней конечности мыши, вводя радиоактивно меченый авидин в границы разреза и прилегающие ткани и измеряя радиоактивность в этой конечности в различных временных точках после введения авидина. В параллельной группе мышей радиоактивный авидин вводили в конечность без хирургического вмешательства.

Количество радиоактивности через 1 и 24 ч после введения было аналогичным у животных с хирургическим вмешательством или без него. Поэтому дальнейшие исследования проводили, используя введение авидина без хирургического вмешательства. Авидин-ДТ метили ¹²⁵1 (Регкш Е1тег, 1!а1у) с использованием реагента 1обо-Сеп (Р1егсе, ВоскГогб, 1Ь). Меченый авидин отделяли от свободного йода с помощью хроматографии на колонке ΡΌ-10 (Атегайат Вюкшепсек, Ирр8а1а, 8\\сбеп) и проводили его окисление, как было описано ранее в примере 1 без какой-либо защиты с помощью НАВА.

8Т2210, описанное в патентной заявке νθ 02/066075 (стр. 18, 1-[2-[6-[5-[(3а8,48,6аВ)-гексагидро-2оксо-1Н-триено [3,4-б]имидазол-4-ил]-1 -пентиламино]-1 -гексиламино]-2-оксоэтил] -1,4,7,10тетраазациклододекан-4,7,10-триуксусной кислоты пентагидрохлорид), метили Чп (Регкш Е1тег, Йа1у) в соответствии с описанным ранее способом (ИгЬаио Ν., е! а1., Еиг. 1. Ыис1. Меб. Мо1. 1тадшд, 2007, 34, 68).

Мышей Ва1Ь/с пи/пи (Наг1ап Ибше, 1!а1у) разделяли на 8 групп по 5 мышей. Меченые ¹²⁵Ι авидин-ДТ или ОКСавидин вводили внутримышечно каждой мыши в одну заднюю конечность (400 мкг/мышь в 40 мкл), и через 1, 24 и 48 ч мышам вводили внутривенно 16 мкг ^1П1п-8Т2210.

Мышей забивали через 1, 24 и 48 ч после введения ^Ш1п-8Т2210, образцы конечностей (обработанных и противоположных), почек, печени и крови собирали и определяли в них уровень радиоактивности с помощью гамма-счетчика (СатЬегга Раскагб, 8сйгаботГ, Аиййа).

Как показано на фиг. 3 а, количество окисленного авидина в обработанной конечности более чем в два раза превышает количество авидина через 1 ч после инъекции. Разница увеличивалась с течением времени: через 24 и 48 ч нативный авидин становился практически недетектируемым, в то время как количество окисленного авидина соответственно составляло примерно 22 и 15% от введенной с помощью инъекции дозы на 100 мг ткани. Как следствие этого, более высокая концентрация окисленного авидина по сравнению с авидином дикого типа в получившей воздействие конечности ассоциирована с более низким содержанием окисленного авидина и более высоким содержанием авидина дикого типа в нецелевых органах, в частности, в течение первого часа, как показано на фиг. 3Ь-3б для крови, почек и печени соответственно. На фиг. 3е показано распределение окисленного авидина и авидина дикого типа в противоположной конечности.

Поскольку 1АВТ®, как, например, описанная в патентной заявке νθ 2004/093916, предусматривает местное введение авидина-ДТ (интраоперативная инъекция) с последующим внутривенным введением противоракового агента через 4-72 ч, очевидно, что использование химически модифицированного авидина (такого как в примере настоящего изобретения) предоставляет большое преимущество.

Пример 3. Продолжительная стабильность в ткани авидина дикого типа и окисленного авидина.

Мышам Ва1Ь/с пи/пи (Сйаг1е§ Вшег, Ьессо 1!а1у) в одну заднюю конечность вводили с помощью инъекции 45 мкг (в 15 мкл 100 мМ ацетатного буфера, рН 5,5) меченых ¹²⁵Ι, или авидина-ДТ, или ОКСавидина; через указанные отрезки времени животных забивали и измеряли радиоактивность в обработанной конечности (а также в других нецелевых органах) с помощью гамма-счетчика (СатЬегга Раскагб, 8сйгаботГ Ашйга).

- 8 017017

Стабильность авидина-ДТ и ОКСавидина_НАВА наблюдали на протяжении 14 недель. Было найдено, что время полужизни ОКСавидина по отношению к содержанию через 1 ч после инъекции составляет примерно 2 недели в отличие от 2 ч для авидина-ДТ (фиг. 4).

Пример 4. Биораспределение окисленного авидина в ткани молочной железы.

Оценивали стабильность ОКСавидинанАвА в ткани молочной железы по сравнению с авидином-ДТ. 50 мкг (в 15 мкл) меченых ¹²⁵1 авидина-ДТ или ОКСавидина_НАВА (полученных стандартным способом, описанным в примере 1) вводили кроликам (Ргапсисс1 Εηζο, Жей, Па1у) в область груди, прилегающей к соску (по 3 области на каждый образец авидина). Животных забивали через 24 ч после инъекции, в области инъекции собирали образцы ткани примерно по 200 мг и измеряли их радиоактивность с помощью гамма-счетчика, как было описано ранее. Данные представлены в виде среднего (+/-8Ό) 3 измерений.

Данные в табл. 4 показывают, что через 24 ч в ткани молочной железы было обнаружено 8,5 и 65,8% от введенной дозы авидина-ДТ и ОКСавидина_НАВА соответственно. Эти данные подтверждают более высокую стабильность ОКСавидина_НАВА по сравнению с авидином-ДТ в ткани молочной железы кролика, ранее наблюдаемую в мышечной ткани мышей.

Таблица 4

Стабильность авидина-ДТ и ОКСавидинанНАВА в ткани молочной железы кролика через 24 ч

% от введенной дозы (+/- 3Ω) через 24 ч
авидин-ДТ	ОКСавидин_НАВА
8,5 (1,13)	65,8 (0,08)

Пример 5. Стабильность в ткани авидина дикого типа, авидина, модифицированного ПЭГ, и окисленного авидина.

Ранее для увеличения времени полужизни авидина в кровотоке другими исследовательскими группами были описаны химически модифицированные авидины (Сайсей Р., с1 а1., 1. Соп(го1. Ке1еа8е, 2002, 83, 97; 8а1та§о 8., е( а1., Ιηΐ. 1. Рйагт., 2007, 340, 20). Стабильность в ткани авидина-ДТ, ПЭГ-авидина (полученного по методике, описанной в статье Сайсей) или ОКСавидина_НАВА (окисленного авидина по настоящему изобретению) оценивали с использованием мышей С57В1/6 (Сйаг1е8 Ктуег, Ьессо Иа1у). Животным вводили в одну заднюю конечность 45 мкг меченых ¹²⁵Ι авидина-ДТ, ПЭГ-авидина и ОКСавидина_НАВА (в 15 мкл 100 мМ ацетатного буфера, рН 5,5). Через 24 ч после инъекции животных забивали и радиоактивность в обработанной конечности измеряли с помощью гамма-счетчика (СатЬегга Раскагб, 8с11\\'абогГ Ашйта).

Конъюгирование с ПЭГ не влияло на стабильность в ткани авидина-ДТ, в то время как увеличение стабильности в ткани было подтверждено для ОКСавидинаНАВА (фиг. 5).

Пример 6. Локализация в ткани авидина-ДТ или ОКСавидина_НАВА.

Проводили сравнение локализации в ткани ОКСавидинаНАВА и авидина-ДТ на замороженных срезах авидинированных тканей после внутримышечной инъекции в одну заднюю конечность голых мышей Ва1Ь/с (Наг1ап, Ибше Йа1у). Через 24 после инъекции вырезали мышцы и приготавливали замороженные срезы для каждого образца. Каждый срез окрашивали гематоксилином/эозином для определения клеточной морфологии или инкубировали с мышиными антителами к авидину (А5680, 8щта А1бпсй, Йа1у) с последующей инкубацией с конъюгированными с флуоресцентным красителем А1еха Г1иог 488 антителами к мышиным иммуноглобулинам (1пуйгодеп, Мйап Иа1у). В конце слайды закрывали покровными стеклами и наблюдали под микроскопом. Как показано на фиг. 6, в срезах мышц, в которые вводили авидин-ДТ (вкладка а), наблюдается слабое точечное окрашивание авидина, в то время как в срезах мышц, в которые был введен ОКСавидинНАВА (вкладка Ь), наблюдается его сильное гомогенное распределение. В обоих случаях авидин локализуется в интерстициальном пространстве. Окрашивание гематоксилином/эозином не выявило никаких гистологических аномалий в мышцах через 24 ч после инъекции ни для авидина-ДТ, ни для ОКСавидинаНАВА (данные не показаны).

Пример 7. Однократный и многократный захват ^Ш1п-8Т2210.

Определяли способность ОКСавидина_НАВА захватывать ¹¹¹1п-8Т2210 в сравнении с авидином-ДТ в мышиной модели, имитирующей ΙΑΚΓ®.

Мышам Ва1Ь/с пи/пи (Наг1ап ибше, Йа1у) в одну заднюю конечность вводили внутримышечно 45 мкг авидина-ДТ или ОКСавидина (в 15 мкл 100 мМ ацетатного буфера, рН 5,5). Через 48 ч после инъекции животным внутривенно вводили 5 мг ^1П1п-8Т2210.

Через указанные промежутки времени забивали группы по 5 животных и измеряли радиоактивность в обработанной конечности, а также в других нецелевых органах с помощью гамма-счетчика (СатЬегга Раскагб, ЗсШгабогГ Ашйта).

- 9 017017

Как показано на фиг. 7а, специфический захват ¹¹¹1и-8Т2210 через 2 ч после внутривенного введение был значительно выше для обработанной ОКСавидиномНАВА ткани, чем для ткани, обработанной авидином-ДТ. Эта разница в уровне радиоактивности впоследствии сохраняется до 24 ч после внутривенного введения ¹¹¹1п-8Т2210, тем самым подтверждая продолжительное авидинирование ткани с использованием ОКСавидинаНАВА. Распределение ¹¹¹1и-8Т2210 в нецелевых органах для авидина-ДТ и ОКСавидина_НАВА было аналогичным (фиг. 7Ь-б).

Одной группе животных вводили первую внутривенную дозу 5 мкг холодного 8Т2210 за 24 ч перед второй дозой 5 мкг ¹¹¹1п-8Т2210. Первую дозу вводили через 24 ч после авидинирования. Животных забивали через 2 ч после внутривенного введения радиоактивно меченого 8Т2210 и измеряли радиоактивность в обработанной конечности с помощью гамма-счетчика, как описано выше.

Как показано на фиг. 7е, вторая доза ¹¹¹1п-8Т2210 захватывалась обработанной ОКСавидином_НАВАконечностью на уровне, сравнимом с уровнем при введении однократной дозы. Этот результат позволяет предположить, что используемая в данном исследовании однократная доза 8Т2210 не насыщает авидинированную ткань и возможно дробление данной предполагаемой дозы.

Пример 8. Захват ¹¹¹1п/⁹⁰¥-8Т2210 и терапевтическая эффективность у трансгенных мышей ЫеиТ.

Трансгенные мыши Ва1Ь/с, несущие активированный крысиный онкоген НЕК-2/пеи (мыши Ва1Ь-ЫеиТ (Όί Саг1о Е., е1 а1., ЬаЬ. 1пуе51.. 1999, 79, 10, 1261), были любезно предоставлены профессором Гвидо Форни из Туринского университета, Италия. Группам животных (по 4 на группу) вводили с помощью внутрисосковой инъекции в четвертую пару (IV) молочных желез по 25 мкл (3,3 мг/мл) либо носителя, либо авидина-ДТ, либо ОКСавидинаНАВА, когда возраст животных достигал 12 недель, что соответствовало периоду, когда у животных развивалась карцинома ίη δίΐιι во всех 10 молочных железах. Через 48 ч животным внутривенно вводили дозу 4,4 мкг радиоактивно меченого 8Т2210. Эта доза соответствовала 800 мкКи ⁹⁰Υ для терапевтических целей с пиком 40 мкКи ¹¹¹1п-8Т2210 для дозиметрических целей. Двух животных на группу забивали через 3 ч после введения и вырезали как и третью (III), так и четвертую пару молочных желез; и измеряли в них радиоактивность с помощью гамма-счетчика, как описано выше. Также собирали другие органы, взвешивали и измеряли радиоактивность. Данные выражали в % от вводимой дозы на 1 г ткани. Эффект этой направленной брахитерапии на опухолевые поражения оценивали путем анализа тотальных препаратов молочной железы, как было описано ранее (Эе Сюташи С., е1 а1., Сапсег Кекеагсй, 2004, 64, 4001).

Данные, приведенные в табл. 5, указывают на то, что у мышей №иТ специфический захват радиоактивно меченого 8Т2210 был явно выражен в обработанных ОКСавидином_НАВА четвертых молочных железах, но не был выражен в обработанных авидином-ДТ или носителем четвертых молочных железах. Результаты измерений для третьих молочных желез во всех группах животных были отрицательными (фоновый уровень крови), указывая на то, что авидинирование ограничивается обработанной молочной железой. Данные в целом согласуются с разницей в стабильности в ткани, ранее описанной для авидинаДТ и ОКСавидина_НАВА. Фоновый уровень радиоактивности в крови и нецелевых органах, включая почки, печень и селезенку, был ниже 0,2% от введенной дозы на 1 г ткани в любом случае, что указывает на отсутствие необходимости проведения стадии вытеснения с биотинилированным альбумином, необходимой для текущей версии IΑΚТ®. Действие данной брахитерапии на основе ОКСавидина_НАВА в результате приводило к существенному уменьшению раковых поражений в обработанных ОКСавидином_НАВА молочных железах, по сравнению с обработанными носителем или авидином-ДТ молочными железами (данные не приведены).

Таблица 5

	Модель ЫеиТ, % от введенной дозы ·⁴⁴Ιη/’ϊ-3Τ2210 на грамм (±3ϋ)
	Кровь	Селезенка	Почки	Печень	Молочная железа IV	Молочная железа III
УеЬ1с1е	0,003(0,001)	0,007 (0,002)	0,143(0,018)	0,023(0,001)	0,007 (0,002)	0,005(0,001)
	0,002(0,001)	0,008(0, 001)	0,161 (0,035)	0,027 (0,006)	0,028 (0,027)	0,007 (0,002)
ΟίΟνίάΐΓίΗΑΒΑ	0,003(0,001)	0,006(0,001)	0,101 (0,008)	0,019(0,003)	1,784 (0,512)	0,008(0,001)

Пример 9. Одностадийная брахитерапия.

Проводили насыщение ίη νίίτο ^ГОКСавидина^эд, используя 8Т2210, очищали от несвязавшегося 8Т2210 с помощью ультрафильтрации и вводили внутримышечно в одну заднюю конечность мышей Ва1Ь/с. Такой же протокол использовали для авидина-ДТ.

Проводили сравнение авидина-ДТ или ОКСавидина_НАВА, насыщенных 8Т2210, в данной конечности со свободным авидином-ДТ или ОКСавидиномНАВА через 1 неделю.

Результаты на фиг. 8 указывают на то, что в то время как ОКСавидин_НАВА (в комплексе с 8Т2210 или нет) все еще присутствует через неделю после инъекции (17% от вводимой дозы на 100 мг), авидин-ДТ практически исчезает (<0,5% от вводимой дозы на 100 мг), таким образом доказывая, что ОКСавидинНАВА, предварительно насыщенный биотинилированным агентом, ведет себя так же, как свободный ОКСавидинНАВА, и его можно использовать для одностадийной брахитерапии.

- 10 017017

Пример 10. Стабильность ОКСавидина_НАВА в мозге в сравнении с авидином-ДТ.

В мозг мышей Ва1Ь/с под общей анестезией вводили с помощью инъекции меченые ¹²⁵1 авидин-ДТ или ОКСавидин_НАВА (доза 16 мкг в 5 мкл). Инъекции в мозг проводили гамильтоновским шприцем с левой стороны черепа на глубину 4-5 мм. Результаты на фиг. 9 указывают на то, что как в мышечной ткани, так и в ткани молочной железы содержание ОКСавидина_НАВА в мозге через 24 ч после инъекции составляет примерно 12,65±6,59% от вводимой дозы на 100 мг ткани. Количество авидина-ДТ (как и в других ранее исследованных тканях) составляет меньше 2,08±1,03% от вводимой дозы на 100 мг ткани. Эти результаты указывают на то, что ОКСавидинНАВА можно использовать для брахитерапии опухолей мозга или для введения в мозг биотинилированных лекарственных средств.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Окисленный авидин, в котором по меньшей мере один остаток маннозы на молекулу авидина замещен остатком следующей формулы:

но.

где указанный окисленный авидин содержит примерно от 8 до 15 альдегидных групп и имеет термическую стабильность, равную или выше 78°С.
2. Комплекс, состоящий из окисленного авидина по п.1 и биотинилированного терапевтического агента.
3. Комплекс по п.2, в котором биотинилированным терапевтическим агентом является противораковый агент.
4. Применение комплекса по п.2 или 3 в качестве лекарственного средства для лечения рака, дегенеративных или генетических болезней.
5. Применение окисленного авидина по п.1, в котором окисленный авидин вводят на первой стадии лечения с последующим введением биотинилированного терапевтического агента.
6. Применение по п.4 или 5 в брахитерапии для лечения пациентов, страдающих от раковых заболеваний.
7. Применение по п.6, в котором раковое заболевание представляет собой рак молочных желез, поджелудочной железы, легких, плевры, брюшной полости, лица и шеи, мочевого пузыря, мозга, предстательной железы, яичников или глаз.
8. Применение по п.6, в котором противораковый агент выбран из группы, состоящей из радиоизотопов, химиотерапевтических агентов, цитокинов, токсинов и противораковых клеток.
9. Применение по п.4 или 5, в котором терапевтический агент представлен биотинилированными стволовыми клетками или соматическими клетками для лечения рака, дегенеративных или генетических болезней.
10. Применение окисленных авидинов, где указанные окисленные авидины необязательно являются частью комплекса по п.2 или 5 для использования в регенерации тканей, пригодной для лечения аутоиммунных/дегенеративных/генетических болезней, включающих диабет, рассеянный склероз, ревматоидный артрит, болезнь Альцгеймера, травму спинного мозга, мышечную дистрофию Дюшенна, инфаркт миокарда и удар.
11. Применение по п.8, в котором указанный радиоизотоп выбран из группы, состоящей из Ее-52, Мп-52т, Со-55, Си-64, Са-67, Са-68, Тс-99т, Ιη-111, 1-123, 1-125, 1-131, Р-32, 8с-47, Си-67, Υ-90, Рб-109, Ад-111, Ι-131, Рт-149, К.е-186, К.е-188, Ά1-211, РЬ-212, В1-212 и Ьи-177.
12. Фармацевтическая композиция, содержащая окисленный авидин или комплекс по любому из пп.1-3 вместе с фармацевтически приемлемым наполнителем для применения в регенерации тканей для лечения аутоиммунных/дегенеративных/генетических болезней, включающих диабет, рассеянный склероз, ревматоидный артрит, болезнь Альцгеймера, травму спинного мозга, мышечную дистрофию Дюшенна, инфаркт миокарда и удар.
13. Набор, включающий фармацевтическую композицию по п.12, содержащую окисленный авидин по любому из пп.1-3 в контейнере и биотинилированный терапевтический агент во втором контейнере.
14. Набор по п.13 для двухстадийной адъювантной интра- и периоперативной, ограниченной локальной областью, и/или системной терапии, в котором два контейнера имеют форму шприцев.

- 11 017017
15. Способ окисления авидина, в котором окисление включает следующие стадии:

а) инкубация авидина дикого типа, предварительно смешанного с молярным избытком 4гидроксиазобензол-2'-карбоновой кислоты (НАВА) с 10-20 мМ периодата натрия в 50-100 мМ ацетатном буфере при рН ниже 6,0 в течение 1-5 ч при 4°С или при комнатной температуре;

б) остановка реакции и очистка продукта путем удаления окислителя и НАВА с помощью хроматографии, ультрафильтрации, диализа или других способов очистки, известных специалисту в данной области; и

в) лиофилизация или введение в состав с кислым рН.
16. Способ лечения пациента, страдающего от ракового заболевания, отличающийся тем, что ткань или орган, подвергаемые лечению, сначала авидинируют окисленным авидином по п.1 и после вводят биотинилированный противораковый агент или напрямую вводят комплекс по п.2.