ES2625815T3 - Avidina oxidada con alto tiempo de residencia en los tejidos tratados - Google Patents

Abstract

Una avidina oxidada en que al menos un residuo de manosa por molécula de avidina se sustituye por un residuo de la siguiente fórmula **Fórmula** En donde dicha avidina oxidada contiene aproximadamente de 8 a 15 restos aldehído y tiene una estabilidad térmica igual o mayor que 78ºC.

Description

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DESCRIPCION

Avidina oxidada con alto tiempo de residencia en los tejidos tratados Campo de la invencion

La invencion descrita en esta memoria se refiere a avidinas modificadas utiles para unir compuestos biotinilados o celulas y mantenerlas en un sitio que necesita terapia.

Fundamento de la invencion

El sistema de avidina-biotina se ha conocido durante muchos anos como una herramienta excepcional para estudios cualitativos y cuantitativos en interacciones entre pequenas moleculas y receptores biologicos (Wilchek, M., et al., Immunol. Today, 1984, 6, 39).

La avidina es una glicoprotefna de aproximadamente 68 kDa presente en la clara de huevo y que muestra alta afinidad por la vitamina H biotina. Su constante de disociacion (Kd ~ 10-15 M) es la mas baja conocida en la naturaleza (Green N.M., et al., Biochem., J., 1970, 118, 67; Green, N.M., Adv. Protein Chem., 1975, 29, 85). Esta compuesta por cuatro subunidades de identica secuencia de aminoacidos, cada una de las cuales puede unirse potencialmente a una molecula de biotina. La glicosilacion representa aproximadamente el 10% de su peso molecular con un promedio de cuatro a cinco residuos de manosa y tres residuos de N-acetilglucosamina por subunidad (Bruch R.C., et al., Biochemistry, 1982, 21, 5334).

En 1988, se presento un estudio respecto a la interaccion entre derivados de biotina radiomarcados y avidina (Garlick R.K., et al., J. Biol. Chem., 1988, 263, 210).

En el documento WO04093916 en el nombre del Solicitante, se describio una terapia perioperativa de dos etapas de tumores solidos como una nueva forma de braquiterapia. La primera etapa implicaba la administracion en el area operada de un anticuerpo especffico biotinilado seguido por la inyeccion de avidina nativa o PEG-ilada para construir un “receptor artificial”. Despues, en la segunda etapa, el agente anticancengeno apropiado acoplado a la biotina se administraba sistemicamente. La segunda etapa necesitaba realizarse en las 4 a 72 horas desde la eliminacion quirurgica del tumor. Sin embargo, no se proporcionaban sugerencias de avidinacion directa a traves de enlace covalente de avidina al tejido considerado.

Las aplicaciones clfnicas de esta braquiterapia de dos etapas que usa avidina en la primera etapa y biotina-DOTA radiomarcada (ST2210) en la segunda etapa, probaron que es efectiva en el reparto de irradiacion parcial al area operada quirurgicamente en pacientes de cancer de mama (Paganelli G., et al., The Breast, 2007, 16, 17; Paganelli G., et al., Clin. Canc. Res., 2007, 13, 5646). La dosis de radiacion liberada al cuadrante operado quirurgicamente, en 11 pacientes, fue un promedio de 20 Gy para una dosis administrada de 100 mCi. Este aumento representa aproximadamente 1/3 de los 60 Gy esperados repartidos a este tipo de pacientes por la Radioterapia de Haz Externo (EBR) estandar actual.

Los usos de construcciones de anticuerpo de estreptavidina con conjugados de radionuclidos de biotina en el tratamiento de pacientes con gliomas malignos, y de anticuerpos biespecfficos con radionuclidos de hapteno en la terapia de tumores que expresan el antfgeno carcinoembrionario se presentaron recientemente (Goldenberg, D.M., et al., J. Clin. Oncol., 2006, 24, 823). Sin embargo, en bastantes casos la toxicidad renal aparecio debido a la dosis demasiado elevada que paso al rinon.

Uno de los principales problemas cuando se trata con la avidina, reside en su rapido aclaramiento del cuerpo. Ultimamente, los esfuerzos de la investigacion se enfocaron en descubrir “avidina modificada” con una mayor vida media. Una de dichas aproximaciones que consiste en unir la protefna por medio de grupos amino libres a monometoxipolietilenglicol, dio por resultado una vida media en plasma prolongada de la avidina modificada con el 8% de la dosis inyectada i.v. aun presente en el tumor despues de 5 horas y el 6% despues de 72 horas cuando la avidina estaba acoplada a PEG-20 kDa (Caliceti P., et al., J. Control. Release, 2002, 83, 97).

Un estudio farmacocinetico que demuestra la influencia del tamano del resto PEG resalto el hecho de que cuanto mas pesada es la unidad pEg mas corta es la vida media, mientras que el grado de afinidad de biotina-avidina estaba siguiendo una tendencia contraria (Salmaso S., et al., Biochim. Phys. Acta, 2005, 1726, 57).

Otro estudio de propiedades farmacocineticas y de union a biotina en una avidina PEG-ilada diferente mostro que 7 restos PEG por protefna avidina era la mejor relacion, permitiendo el aumento de la vida media en plasma y reduciendo la inmunogenicidad de la avidina. Sin embargo, no se dieron detalles en el modelo animal con respecto a la acumulacion de farmaco biotinilado en los tumores (Chinol M., et al., Br. J. Cancer, 1998, 78, 2, 189).

Como una alternativa a la PEG-avidina, se han investigado los polfmeros termosensibles. La poli(W- isopropilacrilamida-co-acrilamida)-avidina mostro un mayor tiempo de residencia en la corriente sangufnea en comparacion con la avidina y menor acumulacion en el hfgado (Salmaso S., et al., Int. J. Pharm., 2007, 340, 20). Sin embargo, tampoco en este caso se presentaron detalles en el modelo animal con respecto a la acumulacion de

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farmaco biotinilado en los tumores.

Desafortunadamente, hasta ahora, no esta disponible ningun metodo eficiente y selectivo para localizar de forma especffica agentes terapeuticos.

Por lo tanto, la mejora de la terapia anticancerfgena tiene aun una gran necesidad y es un area principal de esfuerzos para las companfas farmaceuticas.

La interaccion de union de avidina-biotina es dependiente de la parte de protefna. De hecho, la avidina desglicosilada conserva la capacidad de union de la biotina (Hiller Y., et al, Biochem. J., 1987, 248, 167; Rosebrough S.F., et al., J. Nucl. Med., 1996, 37, 8, 1380).

La acumulacion aumentada y la permanencia de un agente terapeutico en el area a tratar podrfan conseguirse a traves de la avidinacion del tejido con una avidina modificada dotada de una mayor permanencia en el tejido en comparacion con la avidina de tipo salvaje.

Dicha estrategia evitarfa la necesidad de administracion sistemica de avidina y en consecuencia prevendrfa cualquier efecto secundario relacionado con dicha terapia. Ademas, una avidinacion aumentada del tejido relevante darfa por resultado un tratamiento menos toxico debido a la menor distribucion del agente anticancerfgeno en organos no relevantes y dosis reducida de agente anticancerfgeno para obtener el mismo efecto que con la avidina de tipo salvaje.

Se ha encontrado actualmente que oxidando la parte glicosilada de la avidina, puede obtenerse la avidinacion estable del tejido tumoral circundante, permitiendo que un agente anticancerfgeno biotinilado se concentre mejor en dicha region.

Descripcion de la invencion

La presente invencion implica una avidina oxidada qufmicamente capaz de interactuar con tejidos in vivo, a traves de un enlace qufmico covalente reversible, de una forma que retrasa su difusion. Dicha avidina oxidada se administra durante la etapa quirurgica o inyectando un organo o tejido seleccionado que necesita la terapia.

La oxidacion de la avidina por medio de 10 mM de peryodato sodico se presento recientemente (documento US20020137125). En el ultimo, los autores acoplaron la avidina oxidada con fosfopentamanosa-hidrazina para obtener un derivado de imina altamente fosforilado que podrfa administrarse entonces al paciente para modificar la enzima lisosomal, mejorando esto la eficacia de la terapia de sustitucion de enzimas de las enfermedades lisosomales. Es digno de mencion que la formacion de imina no interviene in vivo. Tambien tiene que notarse que no se presenta actividad de dicha avidina modificada es esa solicitud.

En particular, la presente invencion se refiere a una avidina oxidada, obtenida por oxidacion de los restos de azucar de la glicoprotefna, que muestra mayor permanencia en los tejidos en comparacion con la avidina de tipo salvaje (WTavidina) mientras que minimiza los efectos secundarios encontrados cuando se usan las protefnas de avidina modificada presentadas anteriormente.

La union al tejido de la avidina oxidada es altamente homogenea y no depende cono en IART de la capacidad de la avidina cargada de forma positiva para localizar el tumor y los tejidos inflamatorios. Por lo tanto, la accion de la avidina oxidada no esta limitada a la interaccion especffica con celulas tumorales permitiendo asf la avidinacion de los tejidos que rodean los tumores eliminados quirurgicamente que se sabe que contienen celulas tumorales libres no facilmente accesibles para dirigirse al objetivo con la avidina de tipo salvaje.

Una primera realizacion de la presente invencion se refiere a una avidina de tipo salvaje modificada qufmicamente por medio de la apertura anular oxidativa del azucar piranosfdico, generando asf restos aldehfdo que interactuan con residuos amino presentes en el tejido de interes.

Los grupos CHO, a pH acido (por debajo de 6,0), son esencialmente inertes frente a las protefnas NH2 porque esta presente la forma NH3+ protonada. Sin embargo a pH>7, los grupos CHO reaccionan con los residuos NH2 de la protefna para formar bases de Schiff. Un ejemplo de la oxidacion qufmica de un residuo de manosa representativo de la avidina de tipo salvaje y la siguiente reaccion de los grupos cHo de nueva formacion con los grupos amino (R- NH2, donde R es un residuo de protefna del tejido) se da en el Esquema 1.

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Esta oxidacion del azucar se alcanza segun el metodo bien conocido basado en la reaccion de la avidina nativa con peryodato sodico (Zaborsky, O.R., et al., Biochem. Bioph. Res. Comm., 1974, 61, 1, 210; Green, N.M. Biochem. J., 1963, 89, 599).

La oxidacion de avidina sin embargo, se sabe que da por resultado el dano de algunos residuos de aminoacidos de la protefna, es decir, la oxidacion de triptofano que esta implicada en el sitio de union a la biotina, provocando una menor afinidad hacia la biotina y/o derivados de biotina (documento US20040191832; Green, N.M., Biochem. J., 1963, 89, 599).

Se ha encontrado actualmente que la union de avidina al ligando de baja afinidad acido 4-hidroxiazobenceno-2'- carboxflico (HABA), antes de la etapa de oxidacion, confiere a la primera una conformacion que evita la oxidacion de los residuos de triptofano como se revelo por el analisis de los espectros UV de dichos derivados. La disminucion de las inflexiones caracterfsticas a 282 y 291 nm, en los espectros UV se relaciona estrictamente con el grado de oxidacion del triptofano; mientras que un aumento de absorbancia en la region de 250-260 nm es caracterfstico de la formacion de un oxindol sustituido.

Los espectros de absorcion de la avidina oxidada (OXavidina) y avidina oxidada saturada con HABA (OXavidinaHABA), en comparacion con el de la avidina de tipo salvaje (WTavidina) indican que el uso de HABA para proteger los sitios de union de la biotina durante la oxidacion disminuye en gran medida la tasa de dano del triptofano (figura 1). La avidina oxidada presenta un espectro UV en donde la absorbancia a 282 y 291 nm no presenta la inflexion caracterfstica de la oxidacion de residuos de triptofano con respecto a la observada para la WTavidina.

La avidina oxidada presenta un espectro UV en donde la absorbancia a 250-260 nm no presenta ningun aumento con respecto al observado para la WTavidina.

Otra realizacion aun preferida de esta invencion es la de un metodo de oxidacion de avidina y/o derivados de avidina en presencia del ligando HABA que evita la oxidacion de los residuos de triptofano.

En estricto acuerdo con el efecto protector de HABA, la OXavidinaHABA muestra propiedades estructurales y termodinamicas muy similares a la WTavidina. La estabilidad termica y los cambios conformacionales se determinaron por espectroscopia de dicrofsmo circular antes y despues de la oxidacion, con y sin 4 equivalentes de biotina. Las curvas de fusion se grabaron siguiendo la disminucion de la senal dicroica a 225 nm en el intervalo de temperatura de 25-95°C. El punto de inflexion y la pendiente (p) de las curvas sigmoideas se calcularon por medio del modelo de ajuste de Boltzman del software Origin® 7.0 y representan el punto de transicion a traves de la condicion desnaturalizada.

Para cada compuesto especffico, la estabilidad termica corresponde a la temperatura que marca el punto de inflexion de la correspondiente curva registrada en el intervalo de temperatura de 25-95°C.

Los datos (tabla 1) indican que la oxidacion disminuye la estabilidad termica, como se determina por la disminucion en la temperatura de fusion (Tm) y por la pendiente (p) de la curva sigmoidea de la OXavidina en comparacion con la WTavidina (74,3 frente a 79,0°C, y 8,9 frente a 14,7, respectivamente).

De forma sorprendente, el efecto de desestabilizacion es casi insignificante cuando la oxidacion se realiza en avidina protegida con HABA como se confirma por los valores de Tm y p de la OXavidinaHABA y la avidina, 78,1 frente a 79,0°C, y 11,2 frente a 14,7, respectivamente.

Tabla 1

Tm (°C) P*

Avidina

79,0 ± 0,1 14,7 ± 0,3

Avidina + 4 eq de biotina

>95 n.a.

OXavidina

74,3 ± 0,1 8,9 ± 0,1

OXavidina + 4 eq de biotina

86,3 ± 0,2 20,7 ± 1,1

OXavidinaHABA

78,1 ± 0,3 11,2 ± 0,4

OXavidinaHABA + 4 eq de biotina

>95 n.a.

*Pendiente de la curva sigmoidea; n.a. = no aplicable

Aunque la desnaturalizacion termica es irreversible tanto para la OXavidinaHABA como para la OXavidina cuando se calienta sin biotina, solo la OXavidinaHABA recupera su estructura secundaria, de forma similar a la WTavidina, 5 cuando se calienta/enfrfa en presencia de biotina (datos no mostrados). Estos descubrimientos confirman que la saturacion HABA es una forma muy efectiva para conservar la conformacion de avidina sometida a oxidacion qufmica y para explicar la capacidad de union a la biotina consiguientemente retenida.

La avidina oxidada presenta una estabilidad termica mayor o igual a 78°C.

Preferiblemente la avidina oxidada presenta una estabilidad termica mayor o igual a 78°C con una pendiente de la 10 curva sigmoidea mayor que 10.

El descubrimiento anterior se corrobora tambien por la capacidad de union de la avidina oxidada (OXavidinaHABA) al aducto biotinilado ST2210 que es similar a la de la WTavidina como se muestra en la tabla 2.

Tabla 2

Condiciones de oxidacion Relacion molar de CHO/avidina ± DE (N) % de union de biotinaDOTA ± DE (N) Permanencia en el tejido % de ID/100 mg ± DE 24 h 1 semana (N) (N)

WTavidina

Sin oxidacion <LoQ (5) 100@ 2,4 ± 0,4 (5) 0,46 ± 0,08 (4)

NaIO4 1 mM 5,6 ± 0,8 (5) 77,2 ± 0,9 (4) 3,1 ± 0,7 (1) 0,16 ± 0,03 (1)

OXavidina

NaIO4 5 mM 7,5 ± 0,8 (5) 55,7 ± 2,2 (4) 6,3 ± 0,3 (1) 0,99 ± 0,25 (1)

NaIO4 10 mM

8,4 ± 1,0 (6) 50,9 ± 2,4 (6) 17,4 ± 2,8 (3) 9,7 ± 3,2 (3)

NaIO4 20 mM

11,5 ± 1,5* (7) 49,1 ± 2,1 (6) 19,1 ± 2,0 (4) 11,4 ± 1,3 (3)

NaIO4 40 mM 10,9 ± 2,6 (5) 44,5 ± 0,9 (4) NE NE

NaIO4 1 mM + HABA 1 mM 4,0 ± 0,8 (3) 99,0 ± 0,2 (3) NE NE

< CO < 1 TO C ~o > TO X o

NaIO4 5 mM + HABA 1 mM 7,1 ± 1,6 (4) 95,0 ± 1,7 (3) NE NE

NaIO4 10 mM + HABA 1 mM NaIO4 20 mM + HABA 1 mM

8,5 ± 1,3 (5) 12,9 ± 2,3 # (6) 86.3 ± 1,6** (3) 81.4 ± 1,0#** (4) 18.4 ± 2,2 (2) 18.5 ± 0,5 (4) 9,0 ± 1,2 (2) 11,7 ± 2,3 (3)

NaIO4 40 mM + HABA 1 mM 9,8 ± 1,9 (4) 73,0 ± 0,6 (3) NE NE

N = numero de experimentos independientes; DE = Desviacion Estandar; NE = No Ensayado

15 @El valor experimental de 97,4 ± 0,5 obtenido con biotinaDOTA (ST2210) en comparacion con la biotina libre

mediante el ensayo de HABA se asume como el 100% del valor de referencia para avidinas modificadas; *p<0,05 frente a 10 mM; #p<0,01 frente a 10 mM (Anova de una direccion seguido por Student-Newman-Keuls); **p<0,001

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frente a lo mismo sin HABA (Anova de dos direcciones seguido por Bonferroni).

La avidina oxidada obtenida segun el metodo optimizado (OXavidinaHABA) muestra propiedades mejoradas en comparacion con la avidina oxidada preparada sin proteccion HABA con respecto a la union de ST2210 mientras mantiene alta permanencia en el tejido tratado (musculo de la pata de ratones despues de inyeccion i.m.). De hecho, cuando la avidina se oxida con 10 mM de NaIO4, su capacidad de union con respecto a ST2210, es mayor si HABA se anade antes de la oxidacion (86,3% en comparacion a solo 50,9% para la avidina oxidada correspondiente en ausencia de HABA). Un resultado similar se obtiene cuando la oxidacion se da en presencia de una mayor concentracion de peryodato sodico (20 mM) (81,4% frente a 49,1%).

La avidina oxidada presenta una union con ST2210 mayor o igual que 75% con respecto al 97,4% obtenido para WTavidina.

Ademas, la permanencia en el tejido de la avidina oxidada en la pata trasera de los ratones, a pesar del hecho de que dicha oxidacion se de en presencia o no de HABA, es mucho mayor que para la WTavidina. Este comportamiento esta estrictamente correlacionado con la presencia de grupos CHO en las cadenas laterales glicosiladas de la avidina.

En la avidina oxidada segun la presente invencion, aproximadamente de 8 a 15 residuos de CHO por avidina (como se estima por el metodo de Purpald) se producen despues de la oxidacion con NaIO4 10 y 20 mM.

Preferiblemente los derivados de avidina oxidada “protegidos con HABA” (OXavidinaHABA) mantienen una alta capacidad de union a ST2210 y muestran permanencia en el tejido, a las 24 horas y a la semana despues de la inyeccion, que correlacionan con el numero de grupos CHO.

La caracterizacion ffsico-qufmica, por medio de la Calorimetrfa de Valoracion Isotermica (ITC), de dicha interaccion de avidina/biotina revelo que ST2210 es capaz de unirse a WTavidina y OXavidinaHABA de una manera comparable como se demuestra por las constantes de asociacion (Ka) y el cambio de entalpfa (AH) (3,45 frente a 2,50 x 106 M-1, y -1,48 frente a -1,71 x 104 kcal mol-1, respectivamente). Por el contrario, la interaccion ST2210/OXavidina muestra menor Ka (6,45 x 105 M"1) y mayor AH (-0,79 x 104 kcal mol-1).

Segun los datos de union de ST2210 a avidinas oxidadas, en el error experimental, la estequiometria determinada de interaccion es de 3,0, 1,7 y 1,2 moleculas de ST2210 por molecula de WTavidina, OXavidinaHABA y OXavidina, respectivamente.

Tabla 3

N Ka M-1 AH kcal mol-1 AS cal mol-1 K-1

WTavidina

3,0 ± 0,016 3,45E6 ± 3,07E5 -1,48E4 ± 114,0 -19,6

OXavidina NaIO4 20 mM

1,2 ± 0,012 6,45E5 ± 5,69E4 -0,79E4 ± 117,8 0,16

OXavidinaHABA NaIO4 1 mM

2,5 ± 0,008 4,58E6 ± 2,49E5 -1,29E4 ± 56,2 -12,7

OXavidinaHABA NaIO4 5 mM

1,9 ± 0,012 5,42E6 ± 5,90E5 -1,56E4 ± 145,0 -21,6

OXavidinaHABA NaIO4 10 mM

1,7 ± 0,008 3,34E6 ± 2,12E5 -1,60E4 ± 109,9 -23,7

OXavidinaHABA NaIO4 20 mM

1,5 ± 0,007 2,50E6 ± 1,32E5 -1,71E4 ± 113,7 -28,0

La avidina oxidada, segun la presente invencion, mantiene esencialmente la capacidad de union a la biotina de la avidina de tipo salvaje mientras adquiere la propiedad de interactuar de forma reversible con las protefnas del tejido, dando por resultado asf un candidato ideal para el uso en braquiterapia como en el IART®.

La avidina oxidada segun la presente invencion puede administrarse en la etapa intraoperativa, generando asf un “receptor artificial” para el posterior agente anticancengeno.

Una realizacion mas preferida de la presente invencion es proporcionar una avidina oxidada qufmicamente para usarse como un primer agente de braquiterapia, dotada de alta permanencia en los tejidos tratados, en combinacion con un segundo agente dotado con afinidad por dicha primera avidina oxidada.

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Una realizacion incluso mas preferida de la presente invencion es proporcionar una avidina oxidada qufmicamente para usarse como un primer agente de braquiterapia, dotada de alta permanencia en los tejidos tratados, en combinacion con un segundo agente anticancerfgeno dotado de afinidad por dicha primera avidina oxidada.

Otra realizacion de la presente invencion es una composicion farmaceutica que contiene dicha avidina qufmicamente modificada como el primer ingrediente y un agente terapeutico biotinilado como el segundo ingrediente activo.

En una realizacion preferida de la invencion, el segundo ingrediente activo de la composicion farmaceutica anterior es un agente anticancerfgeno biotinilado.

Agente anticancerfgeno significa un agente capaz de luchar contra los tumores. Una lista no exhaustiva de agentes anticancerfgenos consiste en farmacos quimioterapeuticos, compuestos radiomarcados, celulas efectoras, toxinas, citoquinas y celulas anticancerfgenas.

En otra realizacion preferida de la invencion, la terapia tendra la forma de radioterapia.

Otra realizacion preferida de la presente invencion consiste en la preparacion de un kit util para la braquiterapia de mama, musculo, hfgado, pancreas, vejiga, cerebro, pulmon, prostata, ovarios, ojos y otros organos.

En una realizacion preferida del kit, los dos ingredientes estan en dos recipientes separados.

El recipiente de avidina modificada qufmicamente consistirfa en una cantidad adecuada de producto, formulado en una disolucion acida compatible o liofilizado con excipientes adecuados para formar una torta.

Preferiblemente, el recipiente mencionado anteriormente tendra la forma de una jeringa especial adecuada para administraciones sucesivas de multiples volumenes precisos en los margenes de la reseccion o residuos de tejido enfermo que no pueden eliminarse quirurgicamente por la infiltracion de organos vitales. De forma conveniente, el recipiente puede estar ademas en la forma adecuada para la administracion de avidina modificada qufmicamente como un pulverizado.

Preferiblemente, los diversos recipientes, conteniendo ya las dosis de los ingredientes individuales, se fabricaran como un paquete unico que lleva las instrucciones para los modos de administracion.

Incluso mas preferiblemente, los diversos recipientes tienen la forma de una jeringa.

En otra realizacion particularmente preferida, el kit para usar en braquiterapia, que, como en IART®, es adecuado para la administracion locoregional secuencial del primer ingrediente y posterior administracion sistemica o local del segundo ingrediente.

El segundo ingrediente de la composicion de esta invencion puede administrarse mediante cualquier numero de rutas que incluyen, aunque no estan limitadas a, medios oral, intravenoso, intramuscular, intra-arterial, intramedular, intratecal, intraventricular, aplicaciones transdermica o transcutanea, subcutaneo, intraperitoneal, intranasal, enteral, topico, sublingual, intravaginal, rectal o localmente en el tejido enfermo.

Hay casos clfnicos donde la braquiterapia se realiza administrando radioisotopo directamente en la masa tumoral (es decir, tumores cerebrales inoperables como se describe en Julow J., et al., Prog. Neurol. Surg., 2007, 20, 303) u organos afectados por tumor (es decir, prostata como se describe en Saito S, et al., Int. J. Clin. Oncol., 2007, 12, 395). En tal caso un dispositivo de braquiterapia ideal serfa uno que muestre distribucion homogenea y estabilidad en el sitio tratado.

En base a datos experimentales, se ha encontrado que la avidinacion del tejido se da en diferentes tejidos como musculo, mamario (mostrado en los actuales ejemplos) ademas de en tejido cerebral.

En aun otra realizacion particularmente preferida, el agente terapeutico biotinilado de avidina oxidada complejo se obtendra mezclando los dos ingredientes y posteriormente se administrara al paciente.

La composicion de la presente invencion constituye una medicina util para la terapia de tumores solidos operables o no, o no completamente eliminables, tales como, por ejemplo aunque no de forma exclusiva, canceres de mama, pancreas, pulmon, pleura, peritoneo, cara y cuello, vejiga, cerebro, prostata, ovarios, ojos y otros organos como se describe en la solicitud de patente WO2004/093916 presentada en el nombre del Solicitante.

Segun una realizacion preferida de la invencion la avidina oxidada obtenida por el procedimiento de la invencion puede definirse como una avidina modificada qufmicamente, en que al menos uno de los residuos de manosa se ha sustituido por un residuo de la siguiente formula (I)

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Un objeto adicional de la presente invencion es composiciones farmaceuticas descritas anteriormente, en combinacion con excipientes y/o diluyentes farmacologicamente aceptables.

El procedimiento para la preparacion de la composicion farmaceutica se caracteriza por mezclar la avidina modificada qufmicamente con excipientes adecuados, estabilizadores y/o diluyentes farmaceuticamente aceptables.

Un excipiente es una sustancia inerte que se anade a un farmaco para proporcionar masa.

La composicion farmaceutica puede contener tambien un vehfculo farmaceuticamente aceptable, para la administracion de un agente terapeutico. Dichos vehfculos incluyen anticuerpos y otros polipeptidos, genes y otros agentes terapeuticos tales como liposomas, con tal que el vehfculo pueda administrarse sin toxicidad indebida.

Los vehfculos adecuados pueden ser grandes macromoleculas metabolizadas lentamente tales como protefnas, polisacaridos, poli(acidos lacticos), poli(acidos glicolicos), aminoacidos polimericos, copolfmeros de aminoacido y partfculas de virus inactivas.

Una discusion minuciosa de los vetnculos farmaceuticamente aceptables esta disponible en Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., N.J. 1991).

Los vehfculos farmaceuticamente aceptables en las composiciones terapeuticas pueden contener adicionalmente lfquidos tales como agua, solucion salina, glicerol y etanol.

Adicionalmente, sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulgentes, sustancias tamponantes de pH, y similares, pueden estar presentes en dichas composiciones. Dichos vehfculos permiten que las composiciones farmaceuticas se formulen como tortas de liofilizacion, comprimidos, pfldoras, grageas, capsulas, lfquidos, geles, jarabes, lechadas, suspensiones y similares, para la ingestion por el paciente.

Los sujetos a tratar pueden ser animales; en particular, pueden tratarse sujetos humanos.

El tratamiento de dosificacion puede ser un programa de dosis unicas o un programa de dosis multiples.

La dosis se determinara por un experto en el campo para asf repartir al tejido diana una cantidad que ejerza una accion terapeutica efectiva.

Un intervalo de dosis general podrfa estar entre 10-100 ml de disolucion de avidina oxidada a una concentracion de 3-5 mg/ml. El volumen de dosis dependera del volumen del tejido diana a tratar, es decir, 30 ml para un tratamiento tfpico de una region de la mama alrededor del sitio de una cuadrantectomfa (Paganelli G., et al., The Breast, 2007, 16, 17) o hasta 100 ml para el tratamiento de una cavidad peritoneal.

La caracterizacion bioqufmica de la avidina oxidada incluye la estimacion de grupos CHO mediante el metodo calorimetrico Purpald® conocido por el experto en el campo (Avigad G., Anal. Biochem., 1983, 134, 2, 499), usando propionaldehfdo como un patron.

Descripcion de los dibujos

Figura 1:

Muestra los espectros UV de tres formas diferentes de avidina.

Figura 2:

Las curvas A, B y C se refieren a los perfiles de elucion de WTavidina, OXavidinaHABA y OXavidina respectivamente en cromatograffa de exclusion de tamano (columna Biosep-SEC-S3000 (Phenomenex®, 300x7,8 mm, volumen: 14,3 ml) usando una condicion isocratica con un tampon de acetato sodico 100 mM pH 5,5 y NaCl 0,15 M a un caudal de 1 ml/min a temperatura ambiente. Los dos ultimos se obtuvieron a partir de WTavidina mediante oxidacion usando NaIO4 (20 mM). La relacion 280/260 se refiere a la integridad de la avidina con respecto a la oxidacion de residuos de triptofano y formacion de oxindol.

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Figura 3:

Muestra la biodistribucion de avidina oxidada en ratones tratados despues de la administracion intramuscular. En particular la Figura 3a indica que la cantidad de avidina oxidada en la pata tratada es mas del doble de la avidina nativa despues de 1 hora desde la inyeccion. La diferencia aumenta con el tiempo: la avidina nativa es casi indetectable despues de 24 y 48 horas, mientras la avidina oxidada representa aproximadamente el 22% y 15% de la dosis inyectada/100 mg de tejido, respectivamente. La concentracion mayor de avidina oxidada en comparacion con avidina de tipo salvaje en la pata tratada se asocia, como consecuencia, a una menor distribucion de avidina oxidada y una mayor distribucion de avidina de tipo salvaje en los organos que no son diana, particularmente en la primera hora, como se muestra para la sangre, rinon e hfgado en la Figura 3b, c y d, respectivamente. La Figura 3e muestra la distribucion de avidina oxidada y la avidina de tipo salvaje en las patas controlaterales.

Figura 4:

Muestra la permanencia en el tejido de WTavidina y OXavidinaHABA radiomarcadas con 125I en las patas tratadas y controlaterales hasta 14 semanas. Dicho grafico indica que, en referencia al nivel de la hora 1, la vida media en el tejido de la OXavidinaHABA es aproximadamente 2 semanas en oposicion a las 2 horas para la WTavidina.

Figura 5:

Muestra la permanencia en el tejido de WTavidina, PEGavidina y OXavidinaHABA despues de 24 horas desde la inyeccion en una pata trasera de ratones Balb/c con 45 pg (en 15 pl) de WTavidina, PEGavidina u OXavidina marcadas con 125I formuladas en tampon de acetato 100 mM pH 5,5. La radioactividad en la pata tratada se midio por contador gamma (Camberra Packard, Schwadorf Austria).

Figura 6:

Muestra las secciones obtenidas a partir de musculos de ratones Balb/c inyectados con WTavidina (panel a) u OXavidinaHABA (panel b) y tenidos con anticuerpo anti avidina para la inmunofluorescencia: fluido ascftico anti avidina de raton (A5680 carga 064K4826, Sigma Aldrich), seguido por Alexa Fluor 488 anti raton (carga 99E2,2, Molecular Probes). El panel a muestra una localizacion punteada debil mientras las secciones de los musculos inyectados con OXavidinaHABA muestran una distribucion homogenea fuerte. En ambos casos la avidina se localizo en el intersticio.

Figura 7:

Muestra la permanencia en varios puntos temporales de 111In-ST2210 inyectado i.v. en la pata trasera de ratones Balb/c que se trataron 48 horas antes con WTavidina u OXavidinaHABA (panel a). Los paneles b, c y d se refieren a la captacion de 111In-ST2210 en el hfgado, rinon y bazo, respectivamente, despues de la inyeccion i.v. de 111In-ST2210.

El panel e muestra la captacion de 111In-ST2210 despues de 48 horas desde la avidinacion del tejido. En el segundo escenario del caso (111In-ST2210 repetido) los animales recibieron en primer lugar una dosis de ST2210 frfo y 24 horas despues una segunda dosis de 111In-ST2210.

Figura 8:

Muestra la residencia en el tejido de los complejos de WTavidina u OXavidinaHABA con ST2210 una semana despues de la inyeccion en una pata trasera.

Figura 9:

Muestra la residencia en el tejido cerebral de la OXavidinaHABA 24 horas despues de la inyeccion a traves del lado izquierdo del craneo.

Los siguientes ejemplos ilustran adicionalmente la invencion, sin limitarla.

Ejemplos

Ejemplo 1: Sfntesis y caracterizacion bioqufmica de avidinas oxidadas

El metodo del procedimiento de oxidacion comprende las siguientes etapas sucesivas:

a) incubado de avidina de tipo salvaje pre-mezclada con un exceso molar de HABA, con un agente oxidante tal como peryodato sodico 10-20 mM en tampon de acetato 50-100 mM a pH por debajo de 6,0 durante 1-5 horas a 4°C o a temperatura ambiente;

b) bloqueo de la reaccion y purificacion por eliminacion del agente oxidante y HABA por cromatograffa, ultrafi ltracion, dialisis u otros metodos de purificacion conocidos por el experto en el campo; y

c) liofilizado o formulacion a un pH acido.

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La avidina oxidada se analizo adicionalmente por el tamano molecular mediante cromatograffa de exclusion por tamano en una columna biosep-SEC-S3000 (Phenomenex®, 300x7,8 mm, volumen: 14,3 ml) usando una condicion isocratica con un tampon de acetato sodico 100 mM pH 5,5 y NaCl 0,15 M a un caudal de 1 ml/min a temperatura ambiente.

Como se muestra en la Figura 2 la elucion de una avidina oxidada aparece ligeramente retrasada en comparacion con la avidina nativa.

Ejemplo 2: Biodistribucion de avidina oxidada en ratones tratados

La avidina oxidada (OXavidina) se evaluo para la permanencia en el tejido tratado, para su biodistribucion en organos no tratados, ademas de para su capacidad para capturar 111In-ST2210 en un modelo de raton que simula IART® en comparacion con la avidina de tipo salvaje (WTavidina).

El modelo animal de IART® se establecio realizando un corte quirurgico en una pata trasera de un raton, infiltrando avidina radiomarcada en los margenes quirurgicos y tejidos circundantes y midiendo la radioactividad en la pata tratada en puntos temporales diferentes despues de la administracion. En un grupo paralelo de ratones, la avidina radioactiva se infiltro en la pata sin cirugfa.

La cantidad de radioactividad, despues de 1 y 24 horas desde la administracion fue similar en los animales tratados quirurgicamente y no tratados quirurgicamente. Por lo tanto, se realizaron estudios adicionales infiltrando avidina sin cirugfa. La WTavidina se marco con 125I (Perkin Elmer, Italia) segun el metodo Yodo-Gen (Pierce, Rockford, IL). La avidina marcada se separo del yodo libre por cromatograffa en una columna PD-10 (Amershan Biosciences, Uppsala, Suecia) y se oxido como se describe anteriormente en el Ejemplo 1 sin ninguna proteccion HABA previa.

El ST2210 descrito en la solicitud de patente WO 02/066075 (pagina 18, pentahidrocloruro de acido 1-[2-[6-[5- [(3aS,4S,6aR)-hexahidro-2-oxo-1H-tieno[3,4-d]imidazol-4-il]-1-pentilamino]-1-hexilamino]-2-oxoetil]-1,4,7,10- tetraazaciclododecano-4,7,10-triacetico) se marco con f11In (Perkin Elmer, Italia) segun un metodo descrito anteriormente (Urbano N., et al., Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging, 2007, 34, 68).

Los ratones Balb/c nu/nu (Harlan Udine, Italia) se dividieron en 8 grupos de 5 ratones. Se administraron WTavidina u OXavidina marcadas con 125I de forma intramuscular (i.m.) en una pata trasera de cada raton (400 pg/raton en 40 pl) y despues de 1, 24 o 48 horas los ratones recibieron de forma intravenosa (i.v.) 16 pg de 111In-ST2210.

Los ratones se sacrificaron 1, 24 o 48 horas despues de la administracion de 111In-ST2210 y se recogieron muestras de las patas tratadas y controlaterales, rinon, hfgado y sangre y se contaron en un contador gamma (Camberra Packard, Schwadorf, Austria).

Como se muestra en la Figura 3a la cantidad de avidina oxidada en la pata trasera es mas del doble que la avidina despues de 1 hora desde la inyeccion. La diferencia aumenta con el tiempo: la WTavidina es casi indetectable despues de 24 y 48 horas mientras que la OXavidina era aproximadamente del 22% y 15% de la dosis inyectada/100 mg de tejido, respectivamente. La mayor concentracion de avidina oxidada en comparacion con la avidina de tipo salvaje en la pata trasera estaba asociada, como consecuencia, a una menor distribucion de avidina oxidada y una mayor distribucion de avidina de tipo salvaje en los organos que no son diana, particularmente en la primera hora, como se muestra para la sangre, rinon e hfgado en la Figura 3b, c y d, respectivamente. La Figura 3e muestra la distribucion de OXavidina y WTavidina en la pata controlateral.

Ya que IART®, como se describe en la solicitud de patente WO2004/093916, preve la administracion local de WTavidina (inyeccion intraoperativa) seguida por la inyeccion intravenosa del agente anticancerfgeno despues de 472 horas, es evidente que el uso de una avidina modificada qufmicamente, como la del ejemplo de la presente invencion, ofrece grandes ventajas.

Ejemplo 3: Permanencia en el tejido a largo plazo de las avidinas de tipo salvaje y oxidada

Los ratones Balb/c nu/nu (Charles River, Lecco Italia) se inyectaron en una pata trasera con 45 pg en 15 pl o bien de WTavidina marcada con 125I o de OXavidina marcada con 125I formuladas en tampon acetato 100 mM pH 5,5 y a los puntos temporales indicados los animales se sacrificaron y la radioactividad en la pata tratada ademas de en otros organos que no son diana se midio por contador gamma (Camberra Packard, Schwadorf Austria).

La permanencia en el tejido de la WTavidina y la OXavidinaHABA se monitorizo hasta 14 semanas. La vida media en el tejido de la OXavidina, cuando se refiere al nivel de hora 1, se encontro que era aproximadamente 2 semanas al contrario que las 2 horas para la WTavidina (figura 4).

Ejemplo 4: Biodistribucion de avidina oxidada en el tejido mamario

La OXavidinaHABA se evaluo para su permanencia en el tejido mamario en comparacion con la WTavidina. Se administraron 50 pg (en 15 pl) de WTavidina u OXavidinaHABA marcadas con 125I, preparadas segun el metodo general descrito en el ejemplo 1, en la region de la mama por debajo del pezon (3 mamas por cada avidina) de conejos (Francucci Enzo, Rieti, Italia). Los animales se sacrificaron despues de 24 h desde la inyeccion y las

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muestras de tejido del area inyectada de aproximadamente 200 mg se recogieron y se contaron en un contador gamma como se describe anteriormente. Los datos son el promedio (+/- DE) de 3 determinaciones.

Los datos en la Tabla 4 muestran que el 8,5 y 65,8% de ID de WTavidina y OXavidinaHABA, respectivamente se encuentran despues de 24 horas en el tejido mamario. Estos datos confirman la permanencia mas alta de la OXavidinaHABA, en comparacion con la WTavidina, observada anteriormente en el tejido muscular del raton, en el tejido mamario de conejo.

Tabla 4: Permanencia a las 24 horas de la WTavidina y la OXavidinaHABA en el tejido mamario de conejo.

% de ID/mama (+/- DE) a las 24 h

WTavidina

OXavidinaHABA

8,5 (1,13)

65,8 (0,08)

Ejemplo 5: Permanencia en el tejido de las avidinas de tipo salvaje, pegilada u oxidada

Las avidinas modificadas qufmicamente se describieron anteriormente por otros grupos con la intencion de mejorar la vida media de la avidina en la circulacion (Caliceti P., et al., J. Control. Release, 2002, 83, 97; Salmaso S., et al., Int. J. Pharm., 2007, 340, 20). La permanencia en el tejido de la WTavidina, PEGavidina preparada segun Caliceti, u OXavidinaHABA (avidina oxidada segun la presente invencion) se evaluo en ratones C57Bl/6 (Charles River, Lecco Italia). Los animales se inyectaron (i.m.) en una pata trasera con 45 pg en 15 pl de WTavidina, PEG-avidina u OXavidinaHABA marcadas con 125I formuladas en tampon acetato 100 mM pH 5,5. Despues de 24 horas desde la inyeccion, los animales se sacrificaron y la radioactividad en la pata tratada se midio por contador gamma (Camberra Packard, Schwadorf Austria).

La conjugacion PEG no afecto a la permanencia en el tejido de la WTavidina mientras que un aumento en la permanencia en el tejido se confirmo para la OXavidinaHABA (Figura 5).

Ejemplo 6: Localizacion en el tejido de la WTavidina o la OXavidinaHABA

La OXavidinaHABA se evaluo para la localizacion en el tejido en comparacion con la WTavidina en criosecciones de tejidos avidinados despues de la inyeccion intramuscular en una pata trasera de ratones desnudos Balb/c (Harlan, Udine Italia). Los musculos se escindieron 24 h despues del tratamiento y se prepararon criosecciones en serie de cada muestra. Cada loncha se tino con hematoxilina/eosina para evaluar la morfologfa del tejido o se incubo con un anticuerpo anti avidina de raton (A5680, Sigma Aldrich, Italia) seguido por Alexa fluor 488 anti raton (Invitrogen, Milan Italia). Finalmente, las lonchas se montaron con laminas cubreobjetos y se observaron bajo el microscopio.

Como se muestra en la Figura 6, las secciones obtenidas de los musculos inyectados con WTavidina (panel a) muestran una localizacion punteada debil mientras que las secciones de los musculos inyectados con OXavidinaHABA (panel b) muestran una distribucion homogenea fuerte. En ambos casos la avidina se localizo en el intersticio. La tincion de hematoxilina/eosina no mostro anormalidades histologicas del musculo despues de 24 h desde la inyeccion tanto con WTavidina como con OXavidinaHABA (datos no mostrados).

Ejemplo 7: Captacion sencilla y repetida de 111In-ST2210

La OXavidinaHABA se evaluo por su capacidad para capturar 111In-ST2210 en un modelo de raton que simula IART® en comparacion con la WTavidina.

Los ratones Balb/c nu/nu (Harlan Udine, Italia) se inyectaron (i.m.) en una pata trasera con 45 pg en 15 pl tanto de WTavidina como de OXavidinaHABA formuladas en tampon acetato 100 mM pH 5,5. Despues de 48 horas desde la inyeccion, los animales recibieron de forma intravenosa (i.v.) 5 pg de 111In-ST2210.

Los grupos de 5 animales se sacrificaron en los puntos temporales indicados y la radioactividad en la pata tratada ademas de en otros organos que no son diana se midio por el contador gamma (Camberra Packard, Schwadorf Austria).

Como se muestra en la Figura 7a la captacion especffica de 111In-ST2210 despues de 2 horas desde la inyeccion i.v. es mucho mayor para el tejido tratado con OXavidinaHABA que para el tratado con WTavidina. Estas diferencias en la permanencia de radioactividad persisten en los puntos temporales posteriores hasta 24 horas desde la administracion i.v. de 111In-ST2210, confirmando asf la avidinacion del tejido de larga duracion obtenida con OXavidinaHABA. La distribucion de 111In-ST2210 en organos que no son objetivo es similar para la WTavidina y la OXavidinaHABA (Figura 7 b, c, d).

Un grupo de animales recibio una primera dosis intravenosa de 5 pg de ST2210 frfo 24 horas antes de una segunda de 5 pg de 111In-ST2210. La primera se dio 24 horas despues de la avidinacion. Los animales se sacrificaron 2 horas

despues de la inyeccion i.v. de ST2210 radiomarcado y la radioactividad en la pata tratada se midio mediante el contador gamma como anteriormente.

Como se muestra en la Figura 7e la segunda dosis de 111In-ST2210 se capturo por la pata tratada con OXavidinaHABA a un nivel comparable con la obtenida con la dosis sencilla. Este resultado sugiere que el tejido 5 avidinado no estaba saturado por la dosis sencilla de ST2210 usada en este estudio y que el fraccionamiento de una dosis prevista dada es viable.

111 90

Ejemplo 8: Captacion de In/ Y-ST2210 y eficacia terapeutica en ratones transgenicos NeuT

Los ratones transgenicos Balb/c que portan el oncogen HER-2/neu de rata activado (ratones Balb-NeuT (Di Carlo E., et al., Lab. Invest., 1999, 79, 10, 1261) se proporcionaron amablemente por el Prof. Guido Forni, Universidad de 10 Turin, Italia. Cuatro animales/grupo se inyectaron dentro del pezon en ambas mamas IV° con 25 pl (3,3 mg/ml) o bien de vehiculo, WTavidina u OXavidinaHABA en la semana 12 de vida que corresponde al periodo en que los animales desarrollan carcinoma in situ en todas las 10 mamas. Despues de 48 horas los animales recibieron una dosis (i.v.) de 4,4 pg de ST2210 radiomarcado. Esta dosis corresponde a 800 pCi de 90Y para propositos terapeuticos con una punta de 40 pCi de 111In-ST2210 para propositos dosimetricos. Dos animales/grupo se 15 sacrificaron 3 horas despues de la administracion y ambas mamas IV y III se escindieron y se contaron en un contador gamma como anteriormente. Tambien se recogieron organos que no eran objetivos, se pesaron y se contaron. Los datos se expresan como el % de ID/g de tejido. El efecto de esta braquiterapia pre-dirigida en las lesiones tumorales se evaluo mediante analisis de preparacion completa de la glandula mamaria como se describe anteriormente (De Giovanni C., et al., Cancer Research, 2004, 64, 4001).

20 Los datos mostrados en la Tabla 5 indican que la captacion especffica de ST2210 radiomarcado es evidente en las mamas IV tratadas con OXavidinaHABA pero ni en la mama IV de WTavidina ni en las mamas tratadas con vehiculo de los ratones NeuT. Las mamas III de todos los grupos de animales son negativas (nivel de fondo en sangre) que indica que la avidinacion esta confinada a las mamas tratadas. Los datos del total estan de acuerdo con la diferencia en la permanencia en el tejido descrita anteriormente para la WTavidina y la OXavidinaHABA. La radioactividad de 25 fondo en sangre y los organos que no son objetivo que incluyen rinon, hfgado y bazo estaba por debajo de 0,2% de ID/g de tejido en cualquier caso indicando que no hay necesidad de realizar una etapa de seguimiento con albumina biotinilada como se necesita en la actual version de IART®. El efecto de la actual braquiterapia basada en OXavidinaHABA en la glandula mamaria de los ratones NeuT dio por resultado una reduccion significativa de las lesiones cancerfgenas en las mamas tratadas con OXavidinaHABA en comparacion con las mamas tratadas con 30 vehiculo o WTavidina (datos no mostrados).

Tabla 5

Modelo NeuT % de ID de 1riIn/9UY-ST2210/g (± DE)

Sangre

Bazo Rinon Hfgado Mama IV Mama IIII

Vehiculo

0,003 (0,001) 0,007 (0,002) 0,143 (0,018) 0,023 (0,001) 0,007 (0,002) 0,005 (0,001)

WTavidina

0,002 (0,001) 0,008 (0,001) 0,161 (0,035) 0,027 (0,006) 0,028 (0,027) 0,007 (0,002)

OXavidinaHABA

0,003 (0,001) 0,006 (0,001) 0,101 (0,008) 0,019 (0,003) 1,784 (0,512) 0,008 (0,001)

Ejemplo 9: Braquiterapia de una etapa

La 125I-OXavidinaHABA se saturo in vitro con ST2210, se purifico de ST2210 no unido por ultrafiltracion y se inyecto de 35 forma intramuscular en una pata trasera de ratones Balb/c. El mismo protocolo se siguio con respecto a la WTavidina.

La cantidad de WTavidina u OXavidinaHABA saturada con ST2210 en la pata tratada, se comparo con la WTavidina u OXavidinaHABA libre despues de 1 semana.

Los resultado en la figura 8 indican que mientras la OXavidinaHABA o bien complejada o no con ST2210 estaba aun 40 presente una semana despues de la inyeccion (17% de ID/100 mg), la WTavidina habfa desaparecido casi completamente (<0,5% de ID/100 mg) proporcionando asf evidencia de que la OXavidinaHABA pre-saturada con un agente biotinilado se comporta igual que la OXavidinaHABA libre y podrfa usarse para la braquiterapia en una etapa.

Ejemplo 10: Permanencia en el cerebro de OXavidinaHABA en comparacion con WTavidina

La 125I-WTavidina u OXavidinaHABA, preparadas como se describe anteriormente, se inyectaron en un volumen de 5 45 pl (dosis de 16 pl) en el cerebro de ratones Balb/c bajo anestesia general. La inyeccion en el cerebro se realizo a traves del lado izquierdo del craneo, usando una jeringa de Hamilton, a una profundidad de 4-5 mm. Los resultados en la figura 9 indican que de forma similar al musculo y la mama, la residencia de la OXavidinaHABA en el cerebro,

despues de 24 horas desde la inyeccion, es aproximadamente 12,65 ± 6,59% de ID/100 mg de tejido. La cantidad de WTavidina como en otros tejidos previamente evaluados, es menor que 2,08 ± 1,03% de ID/100 mg de tejido. Este resultado indica que la OXavidinaHABA podrfa ser util para la braquiterapia de tumores cerebrales o para la direccion al cerebro de compuestos terapeuticos biotinilados.

Claims (16)

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   REIVINDICACIONES

   1. Una avidina oxidada en que al menos un residuo de manosa por molecula de avidina se sustituye por un residuo de la siguiente formula

   imagen1

   En donde dicha avidina oxidada contiene aproximadamente de 8 a 15 restos aldehfdo y tiene una estabilidad termica igual o mayor que 78°C.
2. 2. Un complejo que consiste en una avidina oxidada segun la reivindicacion 1 y un agente terapeutico biotinilado.
3. 3. Un complejo segun la reivindicacion 2, en donde el agente terapeutico biotinilado es un agente anticancerfgeno.
4. 4. El complejo segun las reivindicaciones 2 o 3 para usar como un medicamento.
5. 5. La avidina oxidada segun la reivindicacion 1 para usar en un tratamiento terapeutico en donde la avidina oxidada se administra a un paciente en una primera etapa del tratamiento, seguido por la administracion de un agente terapeutico biotinilado.
6. 6. El complejo segun la reivindicacion 3 o la avidina oxidada segun la reivindicacion 5 para usar en braquiterapia para tratar a un paciente afectado por una enfermedad cancerfgena.
7. 7. El complejo o la avidina oxidada segun la reivindicacion 6, en donde la enfermedad cancerfgena es un cancer de las mamas, pancreas, pulmon, pleura, peritoneo, cara y cuello, vejiga, cerebro, prostata, ovarios u ojos.
8. 8. El complejo o la avidina oxidada segun la reivindicacion 7 en donde el agente terapeutico biotinilado se selecciona del grupo que consiste en radioisotopos, agentes quimioterapeuticos, citoquinas, toxinas y celulas anticancerfgenas.
9. 9. El complejo segun la reivindicacion 4 o la avidina oxidada segun la reivindicacion 5 en donde el agente terapeutico esta representado por celulas madre o celulas somaticas biotiniladas para el tratamiento de cancer, enfermedades degenerativas o geneticas.
10. 10. La avidina oxidada segun la reivindicacion 1 o el complejo segun la reivindicacion 4, para aplicaciones en la regeneracion tisular utiles para el tratamiento de enfermedades autoinmunes/degenerativas/geneticas que incluyen, diabetes, esclerosis multiple, artritis reumatoide, Alzheimer, lesion vertebral, distrofia muscular de Duchenne, infarto de miocardio e ictus.
11. 11. El complejo o la avidina oxidada segun la reivindicacion 8 en que dicho radioisotopo se selecciona del grupo que consiste en Fe-52, Mn-52m, Co-55, Cu-64, Ga-67, Ga-68, Tc-99m, In-111, I-123, I-125, I-131, P-32, Sc-47, Cu-67, Y- 90, Pd-109, Ag-111, I-131, Pm-149, Re-186, Re-188, At-211, Pb-212, Bi-212 y Lu-177.
12. 12. Una composicion farmaceutica que comprende una avidina oxidada o un complejo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 junto con un excipiente farmaceuticamente aceptable.
13. 13. Un kit que comprende una composicion farmaceutica segun la reivindicacion 12 que contiene una avidina oxidada segun cualquiera de las reivindicaciones 1-3 en un recipiente y un agente terapeutico biotinilado en un segundo recipiente.
14. 14. Un kit segun la reivindicacion 13 para una terapia locoregional y/o sistemica intra y perioperativa adyuvante en dos etapas, en donde los dos recipientes tienen la forma de una jeringa.
15. 15. Un procedimiento de oxidacion de avidina en donde la oxidacion comprende las siguientes etapas:

    a) incubado de avidina de tipo salvaje premezclada con un exceso molar de (HABA), con peryodato sodico 10-20 mM en tampon acetato 50-100 mM a pH por debajo de 6,0 durante 1-5 horas a 4°C o a temperatura ambiente;

    b) bloqueo de la reaccion y purificacion por eliminacion del agente oxidante y HABA por cromatograffa, ultrafiltracion o dialisis; y

    c) liofilizado o formulacion a un pH acido.
16. 16. Una avidina oxidada obtenible mediante el procedimiento segun la reivindicacion 15.