KR101544628B1

KR101544628B1 - 처리 조직에서의 체류 시간이 긴 산화 아비딘

Info

Publication number: KR101544628B1
Application number: KR1020107004513A
Authority: KR
Inventors: 산티스 리타 데; 카를로 안토니오 누졸로
Original assignee: 시구마-토우인더스트리에파아마슈우티히리유니트에스.피이.에이.
Priority date: 2007-08-02
Filing date: 2008-07-16
Publication date: 2015-08-17
Also published as: AU2008281901B2; CN101772353B; AU2008281901A1; MY155347A; BRPI0815050B1; ES2625815T3; IL203321A; SG183076A1; EA201070216A1; JP2010535166A; EP2185203B1; US20100239497A1; NZ582711A; US8562947B2; HK1145290A1; TW200920403A; EP2185203A1; CA2694391A1; HRP20170735T1; KR20100051696A

Abstract

본 발명은 야생형 아비딘과 비교하여 처리 조직에서 보다 높은 영속성을 갖는 화학 개질 아비딘에 관한 것이다. 아비딘 산화는 비오틴 결합 부위를 차지하여 산화 단계 동안 단백질 변성을 방지하는 저친화성 리간드 HABA 존재하에서 페리오데이트 항온반응을 통해 수행한다. 페리오데이트 산화로 아비딘 만노스 고리 개방에 의한 CHO기가 생성되고, 주입시, 조직 NH₂ 잔기와 반응하여 안정한 쉬프 베이스를 형성한다. 앵커된 아비딘은 IART^®(Intraoperative Avidination Radionuclide Therapy) 등과 같은 근접요법, 또는 퇴행성 또는 유전 질환에 유용한, 방사성표지된 비오틴 등 치료 활성이 부여된 비오틴화된 제제, 줄기 세포 및 체세포에 결합하는 능력을 유지한다.

Description

처리 조직에서의 체류 시간이 긴 산화 아비딘{OXIDIZED AVIDIN WITH HIGH RESIDENCY TIME IN THE TREATED TISSUES}

본 명세서에서 기술하는 발명은 비오틴화된 화합물 또는 세포에 결합하는데 유용하고, 이들을 치료가 요구되는 부위에 유지시키는데 유용한 개질 아비딘에 관한 것이다.

아비딘-비오틴 시스템은 수년간 소형 분자와 생물학적 수용체간 상호작용에 대한 정성 및 정량 실험을 위해 사용된 뛰어난 수단이다(Wilchek, M., et al., Immunol. Today, 1984, 6, 39).

아비딘은 달걀 흰자위에 존재하는 약 68 kDa의 당단백질이고 비타민 H 비오틴에 높은 친화성을 보인다. 이의 해리 상수(K_d∼1O^-15M)는 자연계에서 최소치인 것으로 알려져 있다(Green N.M., et al., Biochem. J., 1970, 118, 67; Green, N.M., Adv. Protein Chem., 1975, 29, 85). 아비딘은 아미노산 서열이 동일한 4 서브유닛으로 구성되는데, 각 서브유닛은 비오틴 1 분자에 잠재적으로 결합할 수 있다. 당화는 이 분자량의 약 10%를 차지하고, 서브유닛 당 평균 4∼5 만노스 및 3 N-아세틸글루코사민 잔기를 갖는다(Bruch R. C., et al., Biochemistry, 1982, 21, 5334).

1988년, 방사성표지된 비오틴 유도체 및 아비딘간 상호작용에 대한 연구가 보고되었다(Garlick R.K., et al., J. Biol. Chem., 1988, 263, 210). 본 출원인의 WO04093916에서, 신규 근접요법 형태로서 고형 종양의 2 단계 수술기 주위 기간(perioperative) 요법을 기술하고 있다. 제1 단계는 비오틴화된 특정 항체의 수술 부위 내 투여후, "인공 수용체" 구축을 위한 천연 또는 PEG화된 아비딘의 후속 주입이 포함된다. 이후, 제2 단계에서, 비오틴에 커플링된 적절한 항암제를 전신 투여하였다. 제2 단계는 종양의 수술적 제거로부터 4∼72시간 내에 수행될 것이 요구된다. 그러나, 목적하는 조직에 아비딘을 공유 결합시켜 직접 아비딘화하는 것은 제안되어 있지 않다.

제1 단계 아비딘 및 제2 단계 방사성표지된 비오틴-DOTA(ST2210)를 사용하는 2 단계 근접요법의 임상 용도는 유방암 환자의 외과적 수술 영역에 부분적으로 조사량을 전달하는데 효과적인 것으로 증명되었다(Paganelli G., et al., The Breast, 2007, 16, 17; Paganelli G., et al., Clin. Cane. Res., 2007, 13, 5646). 11명의 환자에서, 외과적으로 수술된 지수 사분면에 조사된 조사량은 100 mCi의 투여량에 대해 평균 20 Gy였다. 이러한 증가는 현행 표준 외부빔 방사선 치료법(EBR)에 의해 이러한 유형의 환자에게 전달되는 예측치 60 Gy의 약 1/3을 의미한다.

악성 신경교종 환자의 치료에서 비오틴-방사성핵종과 스트렙타비딘 항체 구축물의 사용, 및 암배아 항원을 발현하는 종양의 치료에서 햅텐-방사성핵종과 이중특이적 항체의 사용이 최근 보고되었다(Goldenberg, D. M., et al., J. Clin. Oncol., 2006, 24, 823). 그러나, 드문 사례에서, 신장을 통과하는 용량이 너무 높기 때문에 신장 독성이 나타났다.

아비딘을 사용한 치료시 주요 문제점 중 하나는 체내에서 아비딘이 빠르게 제거된다는 것이다. 최근, 연구들은 반감기가 늘어난 "개질 아비딘"을 찾는데 주력하고 있다. 유리 아미노 기를 통해서 단백질을 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜에 연결시키는 것으로 구성된 이러한 접근법은 아비딘을 PEG-20 kDa에 커플링시킨 경우 i.v. 주입 용량의 8%가 종양에서 5시간 후에도 존재하였고 72시간 후에는 6%가 존재하여, 이러한 개질 아비딘의 혈장 반감기가 증가됨을 알 수 있다(Caliceti P., et al., J. Control. Release, 2002, 83, 97).

PEG 부분의 크기 영향을 검증한 약동력학 실험은 PEG 단위가 무거울수록, 반감기가 짧아진 반면, 비오틴-아비딘 친화도는 이와 반대되는 경향을 나타낸 점에서 흥미롭다(Salmaso S., et al, Biochim. Phys. Acta, 2005, 1726, 57).

상이한 PEG화 아비딘에 대한 다른 약동력학적 및 비오틴 결합 특성 실험은 아비딘 단백질 당 7 PEG 부분이 최고 비율이며, 이를 통해 혈장 반감기가 증가하고 아비딘의 면역원성이 감소한다는 것을 보여주었다. 그러나, 종양 내 비오틴화된 약물 축적과 관련된 동물 모델에서의 구체적인 설명은 제공되지 않았다(Chinol M., et al., Br. J. Cancer, 1998, 78, 2, 189).

PEG-아비딘의 대안물로서, 감열 중합체가 연구되었다. 폴리(N-이소프로필아크릴아미드-코-아크릴아미드)-아비딘은 아비딘에 비하여 혈류에서 체류 시간이 보다 길었고 간에서의 축적률은 낮았다(Salmaso S., et al., Int. J. Pharm., 2007, 340, 20). 그러나, 이 경우도 종양 내 비오틴화 약물 축적과 관련된 동물 모델의 어떠한 설명도 보고되지 않았다.

불행하게도, 지금까지, 치료제를 특이적으로 국재화하기 위한 효과적이고 선택적인 방법이 존재하지 않았다. 따라서, 항암 요법의 개선이 여전히 요구되고 있으며 이는 제약 회사들의 주력 부문이기도 하다. 아비딘-비오틴 결합 상호작용은 단백질 부분에 따라 좌우된다. 사실, 탈당화 아비딘은 비오틴 결합능을 보존한다(Hiller Y., et al, Biochem. J., 1987, 248,167; Rosebrough S.F., et al., J. Nucl. Med., 1996, 37, 8, 1380).

치료하려는 영역 내에서 치료제의 영속성 및 축적률 증가는, 야생형 아비딘에 비하여 높은 조직 영속성이 부여된 개질 아비딘으로 조직을 아비딘화시키는 것을 통해 이룰 수 있다.

이러한 전략은 아비딘의 전신 투여가 필요없으며 동시에 이러한 요법과 관련된 임의의 부작용이 방지된다. 또한, 관련 조직의 아비딘화 증가는 비관련 장기에서는 낮은 항암제 분포도에 기인하여 치료 독성이 덜하게 되고, 낮은 항암제 용량으로 야생형 아비딘과 동일한 효과를 얻을 수 있게 된다.

이제, 아비딘의 당화 부분을 산화시켜서, 주변 종양 조직의 안정한 아비딘화를 이룰 수 있고, 이러한 영역에 비오틴화 항암제가 양호하게 농축가능하다는 것이 확인되었다.

도 1: 상이한 3종의 아비딘 형태에 대한 UV 스펙트럼을 도시한 도면이다.
도 2: 곡선 A, B 및 C는 각각, 실온에서 1 mL/분의 유속으로, 100 mM 아세트산나트륨 완충액 pH 5.5 및 0.15 M NaCl을 사용하는 등용매 조건을 이용하는 크기 배제 크로마토그래피(Biosep-SEC-S3000 컬럼(Phenomenex^®, 300x7.8 mm, 부피: 14.3 ml)) 상에서의 WT아비딘, OX아비딘_HABA 및 OX아비딘의 용리 프로파일이다. 뒤의 2종은 NaIO₄(20 mM)를 사용한 산화를 통해 WT아비딘으로부터 얻었다. 280/260 비율은 트립토판 잔기의 산화 및 옥시인돌 형성과 관련된 아비딘의 통합성(integrity)을 나타낸다.
도 3: 근육내 투여 후 처리 마우스에서 산화 아비딘의 생체분포도를 도시한 도면이다. 구체적으로, 도 3a는 처리한 사지에서 산화 아비딘의 양이 주입 1 시간 후 천연 아비딘 보다 2배 이상이었다. 편차는 시간 경과에 따라 증가하였고, 천연 아비딘은 24시간 및 48시간 후에 거의 검출되지 않은 반면, 산화 아비딘은 각각 조직 100 mg 당 주입 용량의 약 22% 및 15%를 나타내었다. 처리한 사지에서 야생형 아비딘에 비하여 높은 산화 아비딘의 농도는 결과적으로, 각각 도 3b, 3c 및 3d의 혈액, 신장 및 간에 도시한 바와 같이, 특히 초기 시간에, 비표적 장기에서 야생형 아비딘의 분포가 보다 높고 산화 아비딘의 분포도는 낮은 것과 관련이 있다. 도 3e는 대측 사지에서 야생형 아비딘 및 산화 아비딘의 분포도를 도시한 도면이다.
도 4: 최대 14주 동안 처리 및 대측 사지에서 ¹²⁵I-방사성표지된 WT아비딘 및 OX아비딘_HABA의 조직 영속성을 도시한 그래프이다. 이 그래프는, 1시간 수준을 참조하여, OX아비딘_HABA의 조직 반감기가 약 2주였고 이에 반해 WT아비딘은 2시간으로 나타났다.
도 5: 100 mM 아세테이트 완충액 pH 5.5에 제형화된 ¹²⁵I-표지된 WT아비딘, PEG아비딘 또는 OX아비딘 45 ㎍(15 ㎕ 중)을 Balb/c 마우스의 한쪽 뒷다리에 주입한 후 24시간 경과후 WT아비딘, PEG아비딘 및 OX아비딘_HABA의 조직 영속성을 도시한 그래프이다. 처리된 사지에서 방사능은 감마 계측기(Camberra Packard, Schwadorf Austria)로 측정하였다.
도 6: 면역형광분석을 위해서, WT아비딘(패널 a) 또는 OX아비딘_HABA(패널 b)을 주입한 Balb/c 마우스 근육을 수득하여 항아비딘 항체로 염색한 절개부를 도시한 도면이다: 마우스 항아비딘 복수액(A5680 뱃치 064K4826, Sigma Aldrich)이후, 항 마우스 Alexa Fluor 488(뱃치 99E2.2, 분자 프로브). 패널 a는 약한 점으로 국재화가 나타낸 반면, OX아비딘_HABA을 주입한 근육 절개부는 강한 균질 분포를 나타냈다. 양쪽 경우에서, 아비딘은 간질에 국재하였다.
도 7: 48시간 전에 WT아비딘 또는 OX아비딘_HABA 처리한 Balb/c 마우스 뒷다리에 i.v. 주입된 ¹¹¹In-ST2210의 다양한 시점에서의 영속성을 도시한 것이다(패널 a). 패널 b, c 및 d는 ¹¹¹In-ST2210의 i.v. 주입 이후, 각각, 간, 신장 및 비장에서 ¹¹¹In-ST2210 캡테이션(captation)을 나타낸 것이다. 패널 e는 조직 아비딘화로부터 48시간 후 ¹¹¹In-ST2210 캡테이션을 도시한 것이다. 2차 실험(¹¹¹In-ST2210 반복)에서, 동물들은 콜드 ST2210 용량을 먼저 투여받고 24시간 후에 ¹¹¹In-ST2210의 제2 용량을 투여받았다.
도 8: 한쪽 뒷다리에 주입 후 1주경에 ST2210과 WT아비딘 또는 OX아비딘_HABA 복합체의 조직 체류성을 나타낸 도면이다.
도 9: 좌측 두개골을 통해서 주입한 후 24시간 경 OX아비딘_HABA의 뇌조직 체류성을 도시한 도면이다.

본 발명은 분산을 지연시키는 방식으로, 가역적 공유 화학 결합을 통해, 생체 내에서 조직과 상호작용할 수 있는 화학적으로 산화된 아비딘을 포함한다. 이러한 산화 아비딘은 수술 단계 동안 또는 치료를 요하는 선택 장기 또는 조직에 주입하여 투여된다.

10 mM의 과요오드산나트륨을 사용한 아비딘의 산화가 최근에 보고되었다(US20020137125). 여기서, 저자는 산화 아비딘을 포스포펜타만노스-히드라진과 커플링하여 고도로 인산화된 이민 유도체를 얻고, 이를 리소좀 효소를 변형시키기 위해 환자에게 투여하여, 리소좀 질환의 효소 교체 요법의 효능을 증강시켰다. 상기 이민 형성이 생체 내에서 개재되지 않는다는 점이 주목할만하다. 또한 이러한 개질 아비딘의 활성이 상기 출원서에 보고되지 않았다는 점을 주의해야 한다.

구체적으로, 본 발명은 야생형 아비딘(WT아비딘)에 비하여 조직 내 영속성이 높은 한편 이전에 보고된 개질 아비딘 단백질을 사용한 경우 일어날 수 있는 부작용이 최소화된, 당단백질의 당 부분을 산화시켜 얻은 산화 아비딘에 관한 것이다.

산화 아비딘의 조직 결합은 고도로 균질하고, IART에서처럼 종양 및 염증성 조직에 국재화되기 위해 양전하 아비딘의 능력에 의존적이지 않다. 따라서, 산화 아비딘 작용은 종양 세포와의 특이적 상호작용에 제한되지 않으며, 그에 따라 야생형 아비딘에 의한 직접 표적화가 용이하지 않은 여분의 종양 세포를 함유하는 것으로 알려진 수술적으로 제거된 종양 주변 조직의 아비딘화가 가능하다.

본 발명의 제1 구체예는 피라노시드 당의 산화적 고리 개방으로, 목적 조직에 존재하는 아미노 잔기와 상호작용하는 알데히드 부분이 생성된, 화학 개질된 야생형 아비딘에 관한 것이다.

산성 pH(6.0 이하)에서 CHO 기는, 양자화된 NH₃ ⁺ 형태가 존재하기 때문에, 단백질 NH₂에 대해 실질적으로 불활성이다. 그러나, pH ≥ 7에서, CHO 기는 단백질 NH₂ 잔기와 반응하여 쉬프 베이스를 형성한다. 야생형 아비딘의 대표적인 만노스 잔기의 화학적 산화반응 및 새로 형성된 CHO기와 아미노 기(R-NH₂, 여기서 R은 조직 단백질 잔기임)의 후속 반응의 예는 하기 반응식 1에 나타내었다.

[반응식 1]

이러한 당 산화반응은 과요오드산나트륨과 천연 아비딘의 반응을 기초로 하는 공지 방법에 따라 수행한다(Zaborsky, O. R., et al., Biochem. Bioph. Res. Comm., 1974, 61, 1, 210; Green, N.M., Biochem. J., 1963, 89, 599).

그러나, 아비딘 산화는 일부 단백질 아미노-산성 잔기에 손상을 주는 것으로 알려져 있는데, 즉, 비오틴 결합 부위에 포함되는 트립토판의 산화는 비오틴 및/또는 비오틴 유도체에 대한 친화성을 저하시키는 것으로 알려져 있다 (US20040191832; Green, N.M., Biochem. J., 1963, 89, 599).

산화 단계 전에 저 친화성 리간드 4-히드록시아조벤젠-2'-카르복실산(HABA)과 아비딘의 결합은 아비딘에, 이러한 유도체의 UV 스펙트럼 분석을 통해 밝혀진 바에 따르면 트립토판 잔기의 산화를 방지하는 구조를 부여하는 것으로 확인되었다. UV 스펙트럼에서, 282 및 291 nm에서의 특징적인 변곡점 감소가 트립토판 산화 정도와 상당히 관련이 있으며, 반면 250-260 nm 영역에서 흡광도 증가는 치환된 옥시인돌 형성의 특징이다.

야생형 아비딘(WT아비딘)과 비교하여, 산화 아비딘(OX아비딘) 및 HABA-포화된 산화 아비딘(OX아비딘_HABA)의 흡광 스펙트럼은 산화 동안 비오틴 결합 부위를 보호하기 위한 HBAB 사용이 트립토판 손상률을 크게 감소시킨다는 것을 보여준다(도 1).

본 발명의 바람직한 구체예는 282 및 291 nm에서 흡광도가 WT아비딘에서 관찰되는 흡광도와 비교하여 트립토판 잔기 산화의 특징적인 변곡점이 존재하지 않는, UV 스펙트럼을 나타내는 산화 아비딘이다.

본 발명의 다른 바람직한 구체예는 250-260 nm에서 흡광도가 WT아비딘에서 관찰되는 것과 비교하여 어떠한 증가도 존재하지 않는 UV 스펙트럼을 나타내는 산화 아비딘이다.

또 다른 본 발명의 바람직한 구체예는 트립토판 잔기의 산화를 방지하는 리간드 HABA 존재 하에서 아비딘 및/또는 아비딘 유도체를 산화하는 방법이다.

HABA의 보호 효과와 일관되게, OX아비딘_HABA은 WT아비딘과 매우 유사한 구조적 특성 및 열역학적 특성을 보인다. 열 안정성 및 구조 변화는 4당량의 비오틴 존재 및 부재하에서, 산화 전후에 원형 편광이색 분광분석법으로 측정하였다. 용융 곡선은 25∼95℃의 온도 범위에 225 nm에서 이색성 신호 감소에 따라서 기록하였다. 변곡점 및 S 자형 곡선의 기울기(p)는 Origin^® 7.0 소프트웨어의 Botzman 적합 모델을 통해 계산하였고 변성 조건을 통해 전이점을 나타내었다. 각각의 특정 화합물에 대해, 열 안정성은 25∼95℃의 온도 범위에서 기록된 상응 곡선의 변곡점과 일치되는 온도에 해당된다.

데이타(표 1)는 WT아비딘과 비교하여 용융점(T_m)의 감소 및 OX아비딘의 S자형 곡선의 기울기(p)(각각, 74.3 대 79.0℃, 및 8.9 대 14.7)를 통해 평가한 바에 따르면, 산화는 열안정성을 감소시키는 것으로 나타났다.

놀랍게도, 탈안정화 효과는, 산화 반응을 HABA-보호된 아비딘에 대해 수행한 경우에, OX아비딘_HABA 및 아비딘의 T_m 및 p 값이 각각, 78.1 대 79.0℃, 및 11.2 대 14.7로 확인된 바와 같이, 거의 무시가능한 정도였다.

	Tm(℃)	p*
아비딘	79.0 ± 0.1	14.7 ± 0.3
아비딘 + 4eq 비오틴	> 95	n.a.
OX아비딘	74.3 ± 0.1	8.9 ± 0.1
OX아비딘 + 4eq 비오틴	86.3 ± 0.2	20.7 ± 1.1
OX아비딘_HABA	78.1 ± 0.3	11.2 ± 0.4
OX아비딘_HABA + 4eq 비오틴	> 95	n.a.
* S자형 곡선의 기울기; n.a. = 적용불가

열변성이 비오틴없이 가열시 OX아비딘_HABA 및 OX아비딘 둘 모두에 대해 비가역적이지만, OX아비딘_HABA만이 비오틴 존재하에 가열/냉각시 WT아비딘과 유사하게, 이의 2차 구조를 회복하였다(결과는 도시하지 않음). 이러한 발견은 HABA 포화가 화학적 산화가 수행되는 아비딘의 구조를 보호하는데 매우 유효하고 결과적으로 비오틴 결합능이 유지되는 것이 설명된다.

본 발명의 더욱 바람직한 구체예는 78℃ 이상의 열 안정성을 나타내는 산화 아비딘이다.
본 발명의 보다 바람직한 구체예는 S자형 곡선 기울기가 10보다 크고 열 안정성이 78℃ 이상인 산화 아비딘이다.

전술한 발견은 또한 하기 표 2에 나타낸 바와 같이, WT아비딘과 유사하게 비오틴화된 부가물 ST2210에 대한 산화 아비딘(OX아비딘_HABA)의 결합능으로 확증되었다.

	산화 조건	CHO/아비딘 몰비율±SD(N)	비오틴DOTA 결합%±SD(N)	조직 영속성% ID/100 mg±SD
	산화 조건	CHO/아비딘 몰비율±SD(N)	비오틴DOTA 결합%±SD(N)	24h(N)	1주(N)
WT아비딘	비 산화반응	<LoQ(5)	100^@	2.4±0.4(5)	0.46±0.08(4)
OX아비딘	1 mM NaIO₄	5.6±0.8(5)	77.2±0.9(4)	3.1±0.7(1)	0.16±0.03(1)
	5 mM NaIO₄	7.5±0.8(5)	55.7±2.2(4)	6.3±0.3(1)	0.99±0.25(1)
	10 mM NaIO₄	8.4±1.0(6)	50.9±2.4(6)	17.4±2.8(3)	9.7±3.2(3)
	20 mM NaIO₄	11.5±1.5^*(7)	49.1±2.1(6)	19.1±2.0(4)	11.4±1.3(3)
	40 mM NaIO₄	10.9±2.6(5)	44.5±0.9(4)	NT	NT
OX아비딘_HABA	1 mM NaIO₄ + 1 mM HABA	4.0±0.8(3)	99.0±0.2(3)	NT	NT
	5 mM NaIO₄ + 1 mM HABA	7.1±1.6(4)	95.0±1.7(3)	NT	NT
	10 mM NaIO₄ + 1 mM HABA	8.5±1.3(5)	86.3±1.6^(3)**	18.4±2.2(2)	9.0±1.2(2)
	20 mM NaIO₄ + 1 mM HABA	12.9±2.3^#(6)	81.4±1.0^#(4)**	18.5±0.5(4)	11.7±2.3(3)
	40 mM NaIO₄ + 1 mM HABA	9.8±1.9(4)	73.0±0.6(3)	NT	NT
N = 독립 실험 회수; SD = 표준 편차; NT = 실험안함; @ HABA 분석을 통해 자유 비오틴과 비교한 비오틴DOTA (ST2210)으로 얻은 97.4 ± 0.5의 실험값을 개질 아비딘에 대한 기준값으로 100%로서 가정함; p<O.O5 vs 1OmM; #p<0.01 vs 1OmM (단측 Anova 후 Student-Newman-Keuls); *p< 0.001 vs HABA 부재외에는 동일 조건(양측 Anova 후 Bonferroni)

최적 방법(OX아비딘_HABA)에 따라 얻은 산화 아비딘은 ST2210 결합 관점에서 HABA 보호없이 제조된 산화 아비딘과 비교하여 개선된 특성을 나타내는 한편, 처리 조직(i.m.주입 후 마우스 사지 근육)에서 높은 영속성을 유지하였다. 또한, 아비딘을 10 mM의 NaIO₄로 산화하는 경우, ST2210에 대한 이의 결합능은 산화 전에 HABA를 부가하면 보다 높아졌다(HABA 부재시 해당 산화 아비딘에 대해 50.9%인 것에 비해 86.3%). 보다 높은 과요오드산나트륨 농도(20 mM) 존재 하에 산화시킨 경우 유사한 결과를 얻었다(81.4% 대 49.1%).

본 발명의 추가의 바람직한 구체예는 WT아비딘에 대해 얻은 97.4%에 비해 75% 이상의 ST2210 결합을 나타내는 산화 아비딘에 관한 것이다.

더 나아가 HABA 존재 또는 부재하에서 산화시켰는가와 무관하게, 마우스의 뒷다리에서 산화 아비딘이 조직 영속성은 WT아비딘보다 상당히 높았다. 이러한 양태는 아비딘의 당화 측쇄 내 CHO 기의 존재와 엄격하게 상호관련이 있다.

본 발명의 보다 바람직한 구체예에서, 아비딘 당 약 8∼15 CHO 잔기(Purpald 방법으로 측정시)가 10 및 20 mM NaIO₄를 사용한 산화 이후 생성되었다.

보다 더욱 바람직한 본 발명의 구체예에서, "HABA-보호된" 산화 아비딘 유도체(OX아비딘_HABA)는 높은 ST ST2210 결합능을 유지하였고 주입 후 24시간 및 1주에서 조직 영속성을 나타냈으며, 이러한 결과는 CHO 기의 수와 상호관련이 있다.

등온 적정 열측정법(ITC)에 따른 아비딘/비오틴 상호작용의 물리-화학적 특징규명 결과, 회합 상수(K_A) 및 엔탈피 변화율(ΔH)(각각 3.45 대 2.50 x 10⁶ M^-1, 및 -1.48 대 -1.71 x 10⁴ kcal mol^-1)로 확인한 것과 유사하게, ST2210은 각각 WT아비딘 및 OX아비딘_HABA에 결합할 수 있는 것으로 확인되었다. 대조적으로, ST2210/OX아비딘 상호작용은 보다 낮은 K_A(6.45 x 10⁵ M^-1) 및 보다 높은 ΔH(-0.79 x 10⁴ kcal mol^-1)를 보였다.

시험 오차 내에서, 산화 아비딘에 대한 ST2210 결합 데이타에 따르면, 측정된 상호작용의 화학양론은 WT아비딘, OX아비딘_HABA 및 OX아비딘 분자 당 각각 ST2210 3.0, 1.7 및 1.2 분자이다.

	N	KA(M^-1)	ΔH(kcal mol^-1)	ΔS(cal mol^-1K^-1)
WT아비딘	3.0±0.016	3.45E6±3.07E5	-1.48E4±114.0	-19.6
OX아비딘 20 mM NaIO₄	1.2±0.012	6.45E5±5.69E4	-0.79E4±117.8	0.16
OX아비딘_HABA 1 mM NaIO₄	2.5±0.008	4.58E6±2.49E5	-1.29E4±56.2	-12.7
OX아비딘_HABA 5 mM NaIO₄	1.9±0.012	5.42E6±5.90E5	-1.56E4±145.0	-21.6
OX아비딘_HABA 10 mM NaIO₄	1.7±0.008	3.34 E6 ±2.12 E5	-1.60 E4 ±109.9	-23.7
OX아비딘_HABA 20 mM NaIO₄	1.5±0.007	2.50E6±1.32E5	-1.71E4±113.7	-28.0

본 발명에 따르면, 산화 아비딘은 실질적으로 야생형 아비딘의 비오틴 결합능을 유지하면서 조직 단백질과 가역적으로 상호작용하는 특성을 획득하여, IART^®과 같은 근접요법에 사용하기 위한 이상적인 후보물이 되었다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 산화 아비딘은 수술중(intraoperative) 단계에 투여되어, 후속 항암제에 대한 "인공 수용체"를 생성한다.

본 발명의 보다 바람직한 구체예는 처리 조직 내에서의 높은 영속성이 부여된 제1 근접요법 제제로서, 제1 산화 아비딘에 대한 친화성이 부여된 제2 제제와 조합되어 사용되는, 화학적으로 산화된 아비딘을 제공하는 것이다.

보다 더욱 바람직한 본 발명의 구체예는 처리 조직 내의 높은 영속성이 부여된 제1 근접요법 제제로서, 제1 산화 아비딘에 대한 친화성이 부여된 제2 항암제와 조합하여 사용되는, 화학적으로 산화된 아비딘을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 구체예는 제1 성분으로서 상기 화학 개질 아비딘, 및 제2 활성 성분으로서 비오틴화된 치료제를 함유하는 약학 조성물이다.

본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, 상기 약학 조성물의 제2 활성 성분은 비오틴화된 항암제이다. 항암제는 종양과 싸울 수 있는 제제를 의미한다. 비제한적인 항암제의 예로는 화학치료 약물, 방사선표지된 화합물, 이펙터 세포, 독소, 사이토카인 및 항암 세포가 포함된다. 본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, 상기 요법은 방사선 요법 형태로 수행된다.

본 발명이 다른 바람직한 구체예는, 유방, 근육, 간, 췌장, 방광, 뇌, 폐, 전립선, 난소, 눈 및 기타 장기의 근접요법에 유용한 키트의 제조로 구성된다.
상기 키트의 바람직한 구체예에서, 2 성분은 2개의 개별 용기에 존재한다.

보다 바람직한 구체예에서, 화학 개질 아비딘 용기는 케익을 형성하도록 적절한 부형제와 함께 동결건조되거나 또는 융화성 산성 용액 중에 제형화된 적절한 양의 생성물로 구성된다.

특히 바람직한 구체예에서, 상기 언급한 용기는 중추 장기의 침윤때문에 수술적으로 제거할 수 없는 질환 장기의 절개 가장자리 또는 잔류 부분으로 다수회의 정확한 용량을 연속 투여하는데 적합한 특수 시린지 형태일 수 있다. 용이하게, 상기 용기는 또한, 분무로서 화학 개질 아비딘을 투여하는데 적합한 형태일 수 있다.

바람직하게, 이미 개별 성분의 용량을 함유하는 다양한 용기를 투여 방식에 대한 지시서를 포함하는 단일 팩으로 제조할 수 있다.

보다 더 바람직하게, 다양한 용기는 시린지 형태를 가질 수 있다.

다른 특히 바람직한 구체예에서, IART^® 등과 같은 근접요법에 사용하기 위한 키트는 제1 성분의 연속 국소영역 투여 및 후속하는 제2 성분의 전신 또는 국소 투여에 적합하다.

본 발명의 조성물의 제2 성분은 이에 제한되는 것은 아니고, 경구, 정맥 내, 근육내, 동맥내, 수질내, 수강내, 뇌실내, 경피 또는 경피성 외용, 피하, 복막내, 비내, 장, 국소, 설하, 질내, 직장 또는 질환 조직 상에 국소 경로를 포함하는 임의 수의 경로를 통해 투여될 수 있다.

종양 덩어리(즉, 문헌 [Julow J., et al., Prog. Neurol. Surg., 2007, 20, 303]에 기술된 바와 같이, 수술불가 뇌종양) 또는 종양이 있는 장기(즉, 문헌 [Saito S, et al., Int. J. Clin. Oncol., 2007, 12, 395]에 기술된 바와 같은 전립선)에 직접 방사성 동위 원소를 투여하여 근접요법을 수행하는 임상 사례가 존재한다. 이러한 사례에서, 이상적인 근접요법 디바이스는 처리 부위 내에서 균질한 분포 및 안정성을 보여주는 것이다.

실험 데이타를 기준으로, 조직 아비딘화는 상이한 조직, 예컨대 근육, 유방(본 발명의 실시예에 나타냄)을 비롯하여 뇌 조직 내에서 일어날 수 있다는 것을 확인하였다.

보다 더욱 특히 바람직한 구체예에서, 산화 아비딘-비오틴화된 치료제의 복합체를 상기 2 성분을 혼합하여 얻고 이후 환자에게 투여한다.

본 발명의 조성물은 수술가능하거나 또는 그렇지 않거나, 또는 완전하게 제거불가한 고형 종양, 예컨대 이에 제한되는 것은 아니고, 유방암, 췌장암, 폐암, 흉막암, 복막암, 얼굴 및 목의 암, 방광암, 뇌암, 전립선암, 난소암, 안암 및 본 출원인이 출원한 국제 공개 특허 WO2004/093916에 기재된 다른 장기의 암에 대한 치료에 유용한 약물을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 본 발명의 방법으로 얻은 산화 아비딘은 화학 개질 아비딘으로 정의될 수 있으며, 여기서 만노스 잔기 중 하나 이상이 하기 화학식 I의 잔기로 치환된다:

[화학식 I]

본 발명의 추가 목적은 부형제 및/또는 약학적으로 허용되는 희석제와 조합된, 앞서 기술한 약학 조성물이다.

본 발명의 추가 구체예는 적절한 부형제, 안정화제 및/또는 약학적으로 허용되는 희석제와 화학 개질 아비딘을 혼합하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물의 제조 방법이다. 부형제는 대량 제공을 위해 약물에 부가되는 불활성 약물이다.

상기 약학 조성물은, 치료제의 투여를 위해서, 약학적으로 허용되는 담체를 함유할 수 있다. 이러한 담체는 항체 및 다른 폴리펩티드, 유전자 및 다른 치료제 예컨대 리포솜을 포함하고, 단, 담체는 과도한 독성없이 투여될 수 있는 것을 조건으로 한다.

적절한 담체는 거대한, 서서히 대사되는 거대분자, 예컨대 단백질, 다당류, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 중합성 아미노산, 아미노산 공중합체 및 불활성 바이러스 입자일 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체에 대한 상세 설명은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Pub. Co., N. J.1991)]을 참조한다. 치료 조성물 중 약학적으로 허용되는 담체는 부가적으로, 액체 예컨대 물, 염수, 글리세롤 및 에탄올을 함유할 수 있다.

추가적으로, 보조물, 예컨대 습윤제 또는 유화제, pH 완충 물질 등이 이러한 조성물 중에 존재할 수 있다. 이러한 담체는, 환자가 섭취하도록, 동결건조 케이크, 정제, 알약, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁액 등으로 상기 약학 조성물을 제형화할 수 있게 한다.

치료되는 피험체는 동물일 수 있고, 구체적으로는, 인간 피험체를 치료할 수 있다.

치료 용량은 단일 용량 스케쥴이거나 또는 다수 용량 스케쥴일 수 있다. 용량은 유효한 치료 작용을 발휘하는 양을 표적 조직에 전달하도록 당분야의 숙련가가 결정할 수 있다. 일반적으로 용량 범위는 3∼5 mg/mL의 농도로 산화 아비딘 용액 10∼100 mL일 수 있다. 이러한 용량 부피는 치료하려는 표적 조직의 용적에 의존적인데, 즉, 사분절제술 부위 주변의 유방 영역을 치료하는데 대체로 30 mL(Paganelli G., et al., The Breast, 2007, 16,17) 또는 복강 치료를 위해 최대 100 mL 정도일 수 있다.

상기 산화 아비딘의 생화학적 특징규명에는 표준물로서 프로피온알데히드를 사용하는, 당분야의 숙련가에게 공지된 색채계 Purpald^® 방법에 의한 CHO기 측정이 포함된다(Avigad G., Anal. Biochem., 1983,134, 2, 499).

이하 실시예를 통해 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 이에 한정되는 것이 아니다.

실시예

실시예 1: 산화 아비딘의 합성 및 생화학적 특징규명

산화 방법은 하기의 연속 단계를 포함한다:

a) 과몰량의 HABA와 사전 혼합된 야생형 아비딘을 산화제 예컨대 50∼100 mM 아세테이트 완충액(pH 6.0 이하) 중 10∼20 mM 과요오드산나트륨과, 1∼5시간 동안 4℃ 또는 실온에서 항온반응시키는 단계;

b) 반응을 차단하고 크로마토그래피, 한외여과, 투석 및 당분야의 숙련가에게 공지된 다른 정제 방법을 통해 산화제 및 HABA를 제거하여 정제하는 단계; 및

c) 산성 pH에서 제형화 또는 동결건조하는 단계.

산화 아비딘은 100 mM 아세트산나트륨 완충액 pH 5.5 및 0.15 M NaCl의 등용매 조건을 사용하여 1 mL/분의 유속으로 실온에서 biosep-SEC-S3000 컬럼(Phenomenex^®, 300x7.8 mm, 부피: 14.3 ml) 상에서의 크기 배제 크로마토그래피를 통해 분자 크기를 더 분석하였다.

도 2에 도시한 바와 같이, 산화 아비딘의 용리는 천연 아비딘에 비해 약간 지연되는 것으로 나타났다.

실시예 2: 처리한 마우스에서 산화 아비딘의 생체분포도

산화 아비딘(OX아비딘)에 대해, 야생형(WT아비딘)과 비교하여 마우스 모델 모의 IART^®에서 ¹¹¹In-ST2210을 포획하는 능력을 비롯하여, 처리 조직에서의 영속성, 미처리 장기에서의 생체분포도를 평가하였다.

IART^®의 동물 모델은 마우스의 한쪽 뒷다리에 수술적 절개를 수행하고, 수술 가장자리 및 주변 조직에 방사성표지된 아비딘을 침윤시킨 후 투여 이후 상이한 시점에서 처리된 사지에서 방사능을 측정하여 설정하였다. 유사 마우스 그룹에서, 방사능 아비딘은 수술없이 사지에 침윤되었다.

투여로부터 1 및 24 시간 후, 방사능 양은 수술 처리한 동물 및 수술 미처리 동물에서 유사하였다. 따라서, 추가 실험은 수술없이 아비딘 침윤을 통해 수행하였다. IodoGen 방법(Pierce, Rockford, IL)에 따라서, WT아비딘을 ¹²⁵I(Perkin Elmer, Italy)로 표지하였다. 표지된 아비딘을 PD-10 컬럼(Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden) 상에서 크로마토그래피하여 자유 요오도로부터 분리하고 임의의 사전 HABA 보호없이 실시예 1에 기술한 바와 같이 산화시켰다.

WO 02/066075(18 페이지, 1-[2-[6-[5- [(3aS,4S,6aR)-헥사히드로-2-옥소-1H-티에노[3,4-d]이미다졸-4-일]-1-펜틸아미노]-1-헥실아미노]-2-옥소에틸]-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-4,7,10-트리아세트산 펜타히드로클로라이드)에 기술된 ST2210을 [Urbano N., et al., Eur. J Nucl. Med. MoI. Imaging, 2007, 34, 68]에 기술된 방법에 따라서 ¹¹¹In(Perkin Elmer, Italy)로 표지하였다.

Balb/c nu/nu 마우스(Harlan Udine, Italy)를 각 5마리의 8 그룹으로 분류하였다. ¹²⁵I-표지된 WT아비딘 또는 OX아비딘을 각 마우스의 한쪽 뒷다리에 근육내(i.m.) 투여(40 ㎕ 중 400 ㎍/마우스)하고 1, 24 또는 48시간 후 마우스에게 16 ㎍ ¹¹¹In-ST2210을 정맥내(i.v.) 투여하였다.

¹¹¹In-ST2210 투여하고 1, 24 또는 48시간 경에 마우스를 희생시키고 처리 및 대측 사지, 신장, 간 및 혈액 샘플을 회수하고 감마 계측기(Camberra Packard, Schwadorf, Austria)로 계측하였다.

도 3a에 도시한 바와 같이, 처리 사지 내 산화 아비딘의 양은 주입 1시간 후 아비딘의 2배 이상이었다. 편차는 시간에 따라 증가하였다: WT아비딘은 24시간 및 48시간 이후에 거의 검출되지 않은 반면, OX아비딘은 각각 조직 100 mg 당 주입된 용량의 약 22% 및 15%였다. 처리 사지에서 야생형 아비딘에 비하여 높은 산화 아비딘의 농도는 결과로서, 각각 도 3b, 3c 및 3d의 혈액, 신장 및 간에 도시한 바와 같이, 특히 처음 시간에, 비표적 장기에서 야생형 아비딘의 보다 높은 분포도 및 산화 아비딘의 낮은 분포와 연관이 있다. 도 3e는 대측 사지에서 OX아비딘 및 WT아비딘의 분포도를 도시한 것이다.

국제 공개 특허 WO2004/093916에 기술한 바와 같이, IART^®은 WT아비딘(수술중 주사)을 국소 투여하고, 이후에 4 내지 72시간 후 항암제의 정맥내 주사가 후속된다는 것이 예상되므로, 본 발명의 실시예에서처럼, 화학 개질 아비딘의 사용이 상당한 장점을 제공한다는 것이 분명하다.

실시예 3: 야생형 및 산화 아비딘의 장기 조직 영속성

Balb/c nu/nu 마우스(Charles River, Lecco Italy)의 한쪽 뒷다리에 15 ㎕ 중 45 ㎍의, 100 mM 아세테이트 완충액(pH 5.5)에 제형화된 ¹²⁵I-표지된 WT아비딘 또는 ¹²⁵I-표지된 XO아비딘을 투여하고 표시된 시점에 동물을 희생시키고 처리한 사지를 비롯하여 다른 비표적 장기에서 감마 계측기(Camberra Packard, Schwadorf Austria)를 사용하여 방사능을 측정하였다.

WT아비딘 및 OX아비딘_HABA의 조직 영속성은 최대 14주까지 모니터링하였다. 1시간 수준을 참조시, OX아비딘의 조직 반감기는 WT아비딘이 2시간인 것과 대조적으로 약 2주로 확인되었다(도 4).

실시예 4: 유방 조직에서 산화 아비딘의 생체분포도

WT아비딘과 비교하여 유방 조직에서 OX아비딘_HABA의 영속성을 평가하였다. 실시예 1에 기술한 일반 방법에 따라 제조된 ¹²⁵I-표지된 WT아비딘 또는 OX아비딘_HABA 50 ㎍(15 ㎕ 중)을 토끼(Francucci Enzo, Rieti, Italy)의 유도 아래 유방 부분에 투여하였다(각 아비딘에 대해 3 유방 영역). 이 동물을 주사 24시간 후에 희생시키고 약 200 mg의 주사 영역의 조직 샘플을 회수하고 앞서 기술한 바와 같이 감마 계측기로 계측하였다. 데이타는 3 측정치의 평균(+/- SD)값이다.

표 4의 데이타는 유방 조직에서 24시간 후에 각각, WT아비딘 및 OX아비딘_HABA은 ID 8.5% 및 65.8%로 나타났다. 이 데이타는 WT아비딘과 비교하여, 앞서 마우스 근육 조직에서 관찰된, OX아비딘_HABA의 높은 영속성을 토끼 유방 조직에서 검증해 주는 것이다.

토끼 유방 조직에서 WT아비딘 및 OX아비딘_HABA의 24시경 영속성
24h에서 %ID/유방(+/- SD)
WT아비딘	OX아비딘_HABA
8.5(1.13)	65.8(0.008)

실시예 5: 야생형, PEG 화 또는 산화 아비딘의 조직 영속성

화학 개질 아비딘은 순환계에서 아비딘 반감기를 개선시키고자 다른 그룹에서 이전에 기술한 적이 있다(Caliceti P., et al., J. Control. Release, 2002, 83, 97; Salmaso S., et al, Int. J. Pharm., 2007, 340, 20). Caliceti에 따라 제조된 PEG아비딘, WT아비딘, 또는 OX아비딘_HABA(본 발명에 따른 산화 아비딘)의 조직 영속성을 C57B1/6 마우스(Charles River, Lecco Italy)에서 평가하였다. 동물의 한쪽 뒷다리에 100 mM 아세테이트 완충액(pH 5.5)에 제형화된 ¹²⁵I-표지된 WT아비딘, PEG-아비딘 또는 OX아비딘_HABA를 15 ㎕ 중 45 ㎍으로 i.m. 주입하였다. 주입 24시간 후, 동물을 희생하고 처리 사지에서 방사능을 감마 계측기(Camberra Packard, Schwadorf Austria)로 측정하였다.

PEG-접합은 WT아비딘의 조직 영속성에 영향을 주지 않은 반면, OX아비딘_HABA의 조직 영속성은 증가된 것으로 확인되었다(도 5).

실시예 6: WT아비딘 또는 OX아비딘 _HABA 의 조직 국재화

Balb/c 누드 마우스(Harlan, Udine Italy)의 한쪽 뒷다리에 근육내 주입한 후 아비딘화된 조직의 냉동절편에서 조직 국재화에 대해 WT아비딘과 비교하여 OX아비딘_HABA를 평가하였다. 처리 후 24시간 경 근육을 절개하고 일련의 냉동절편을 각 샘플로부터 준비하였다. 각 슬라이드를 해마톡실린/에오신으로 염색하여 조직 형태를 분석하거나 또는 마우스 항아비딘 항체(A5680, Sigma Aldrich, Italy)와 항온반응 후 항마우스 Alexa fluor 488(Invitrogen, Milan Italy)과 항온반응시켰다. 마지막으로, 슬라이드에 커버슬립을 고정시키고 현미경 하에서 관찰하였다. 도 6에 도시한 바와 같이, WT아비딘을 주입한 근육에서 얻은 절개부(패널 a)는 약한 점의 국재화가 나타난 반면 OX아비딘_HABA을 주입한 근육의 절개부(패널 b)는 강하고 균질한 분포를 나타내었다. 두 경우에서 아비딘은 간질에 국재하였다. 해마톡실린/에오신 염색은 WT아비딘 또는 OX아비딘_HABA의 주입 24시간 후 근육의 조직학적 이상성을 보이지 않았다(결과 도시하지 않음).

실시예 7: ¹¹¹ In - ST2210 단독 및 반복 캡테이션( captation )

OX아비딘HABA을 WT아비딘과 비교하여 마우스 모델 모의 IART®에서 이의 ¹¹¹In-ST2210를 포획하는 능력에 대해 평가하였다.

Balb/c nu/nu 마우스(Harlan Udine, Italy)의 한쪽 뒷다리에 100 mM 아세테이트 완충액(pH 5.5)에 제형화된 WT아비딘 또는 OX아비딘_HABA 15 ㎕ 중 45 ㎍을 주입하였다(i.m.). 주입 48시간 후, 동물에게 5 ㎍의 ¹¹¹In-ST2210을 정맥내(i.v.) 주입하였다.

5마리 동물 그룹을 지정한 시점에서 희생시키고 처리한 사지를 비롯하여 다른 비표적 장기에서의 방사능을 감마 계측기(Camberra Packard, Schwadorf Austria)를 사용하여 측정하였다.

도 7a에 도시한 바와 같이, i.v. 주입 2시간 후 ¹¹¹In-ST2210의 특이적 캡테이션이 WT아비딘 처리한 것보다 OX아비딘^HABA 처리한 조직에서 훨씬 높았다. 이러한 방사능 영속성의 편차는 ¹¹¹In-ST2210 i.v. 투여하고 최대 24시간의 후속 시점에서 지속되었으며, 따라서 OX아비딘_HABA를 사용하여 장기 지속성 조직 아비딘화가 얻어진다는 것이 확인되었다. 비 표적 장기에서 ¹¹¹In-ST2210의 분포도는 WT아비딘 및 OX아비딘_HABA에 대한 것과 유사하였다(도 7b,7c,7d).

한 그룹의 동물에게 5 ㎍ ¹¹¹In-ST2210의 제2 용량 투여 24시 전에 콜드 ST2210 5㎍의 제1 정맥 내 용량을 투여하였다. 제1 투여는 아비딘화 24시간 전에 일어났다. 이 동물들을 방사성표지된-ST2210의 i.v. 주입 후 2시간경에 희생시키고 처리된 사지의 방사능을 상기 기술한 바와 같이 감마 계측기로 측정하였다.

도 7e에 도시한 바와 같이, ¹¹¹In-ST2210의 제2 용량은 단일 용량으로 얻은 것과 필적하는 수준으로 OX아비딘_HABA-처리 사지에 의해 포획되었다. 이러한 결과는 아비딘화된 조직이 이 실험에서 사용된 ST2210의 단일 용량에 의해 포화되지 않았으며 주어진 목적 용량의 분할이 용이하다는 것을 시사한다.

실시예 8: NeuT 형질전환 마우스에서 ¹¹¹ In / ⁹⁰ Y- ST2210 캡테이션 및 치료 효능

활성화된 래트 HER-2/neu 발암유전자를 보유한 Balb/c 형질전환 마우스(Balb-NeuT 마우스(Di Carlo E., et al., Lab. Invest., 1999, 79, 10, 1261))는 유니버시티 오브 튜린 이태리의 Guido Forni 교수로부터 제공받았다. 4마리 동물/그룹에게, 이 동물이 모두 10 유방에서 정소 부위 암종이 발현된 시기에 상응하는 12주령에 비히클, WT아비딘 또는 OX아비딘_HABA 25 ㎕(3.3 mg/ml)를 양 IV°유방의 유두내에 주입하였다. 48시간 후, 동물에게 방사성표지된 ST2210 4.4 ㎍ 용량을 i.v. 투여하였다. 이 용량은 선량측정을 위한 40 μCi의 ¹¹¹In-ST2210의 스파이크와 치료 목적용 800 μCi의 ⁹⁰Y에 상응하는 것이다. 2마리 동물/그룹을 투여 후 3시간 경에 희생시켰고 두 유방 IV 및 III를 절개하고 상기 기술한 바와 같이 감마 계측기로 계측하였다. 비표적 장기도 회수하고 측량하고 계측하였다. 데이타는 조직의 %ID/g으로 나타내었다. 종양 병변에 대한 이러한 사전 표적화 근접요법의 효과는 이전에 기술한 바와 같이 유선의 온조직 분석을 통해 평가하였다(De Giovanni C, et al., Cancer Research, 2004, 64, 4001).

표 5에 나타낸 데이타는 방사성표지된 ST2210의 특이적 캡테이션이 IV 유방 OX아비딘_HABA-처리된 경우에서는 명백하게 나타난 반면, WT아비딘 처리된 IV 유방 또는 비히클 처리된 NeuT 마우스의 유방에서는 그렇지 않다는 것을 보여준다. 모든 동물 그룹에서 얻은 유방 III은 음성(혈액 배경값 수준)이었는데 이는 아비딘화가 처리된 유방에 한정된다는 것을 의미한다. 종합적인 데이타는 WT아비딘 및 OX아비딘_H _A _BA에 대해 이전에 기술한 조직 영속성에서의 편차와 일치한다. 신장, 간 및 비장을 포함하는 비표적 장기 및 혈액에서의 배경값 방사능은 임의 경우에서 0.2%ID/조직 g 이하였으며, 따라서 IART^®의 현재 버젼에서 필요한 바와 같은 비오틴화된 알부민을 사용한 추적 단계 수행이 필요하지 않다는 것을 의미한다. NeuT 마우스의 유선에 대한 본 발명의 OX아비딘_HABA 기반 근접요법의 효과는 비히클 pr WT아비딘-처리된 유방에 비하여 OX아비딘_HABA-처리된 유방에서 암 병변의 유의한 감소를 일으켰다(결과를 도시하지 않음).

NeuT 모델 ¹¹¹In/⁹⁰Y-ST2210의 %ID/g(±SD)
	혈액	비장	신장	간	유방IV	유방III
비히클	0.003 (0.001)	0.007 (0.002)	0.143 (0.018)	0.023 (0.001)	0.007 (0.002)	0.005 (0.001)
WT아비딘	0.002 (0.001)	0.008 (0.001)	0.161 (0.035)	0.027 (0.006)	0.028 (0.027)	0.007 (0.002)
OX아비딘_HABA	0.003 (0.001)	0.006 (0.001)	0.101 (0.008)	0.019 (0.003)	1.784 (0.512)	0.008 (0.001)

실시예 9: 1단계 근접요법

¹²⁵I-OX아비딘_HABA를 시험관 내에서 ST2210로 포화시키고, 미결합된 ST2210을 한외여과를 통해 정제하고 Balb/c 마우스의 한쪽 뒷다리에 근육내 주입하였다. 동일한 프로토콜을 WT아비딘에 대해 수행하였다. 처리된 사지에서 ST2210 포화된 WT아비딘 또는 OX아비딘_HABA의 양은 1 주 후 자유 WT아비딘 또는 OX아비딘_HABA에 대해 비교하였다.

도 8의 결과는 ST2210과 복합체를 형성하거나 또는 형성하지 않은 OX아비딘_HABA은 주입 1주 후에도 여전히 존재하지만(17% ID/100 mg), WT아비딘은 거의 완전하게 사라졌고(<0.5% ID/100mg), 따라서 이는 비오틴화된 제제로 사전 포화된 OX아비딘_H _A _BA가 자유 OX아비딘_HABA과 동일하게 작용한다는 증거를 제공하는 것이며, 1 단계 근접요법에 사용할 수 있다는 것을 의미한다.

실시예 10: WT아비딘과 비교한 OX아비딘 _HABA 의 뇌 영속성

앞서 기술한 바와 같이 준비한 ¹²⁵I-WT아비딘 또는 OX아비딘_HABA를 5 ㎕ 부피(16 ㎍ 용량)로 전신 마취된 Balb/c 마우스의 뇌에 주입하였다. 뇌 주입은 깊이 4∼5 mm에서 해밀톤 시린지를 사용하여, 두개골의 좌측을 통해 수행하였다. 도 9의 결과는 근육 및 유방과 유사하게, 주입 24시간 후, 뇌에서 OX아비딘_HABA의 체류가 약 12.65 ± 6.59 %ID/조직 100 mg인 것으로 나타났다. 이전에 평가한 다른 조직에서처럼 WT아비딘의 양은 2.08 ± 1.03 %ID/조직 100 mg 이하였다. 이 결과는 OX아비딘_HABA이 뇌종양의 근접요법 또는 뇌 비오틴화 치료제를 표적화하는데 유용할 수 있다는 것을 의미한다.

Claims

아비딘 분자 당 1 이상의 만노스 잔기가 하기 화학식의 잔기로 치환된 산화 아비딘으로서, 약 8∼15개의 알데히드 부분을 함유하고 열 안정성이 78℃ 이상인 산화 아비딘:
제1항에 따른 산화 아비딘 및 비오틴화된 치료제로 이루어진 복합체.
제2항에 있어서, 비오틴화 치료제는 항암제인 복합체.
제2항 또는 제3항에 있어서, 약제로 사용하는 것인 복합체.
제1항에 있어서, 암, 퇴행성 또는 유전 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된 질병을 치료하기 위한 약제의 제조에서의 산화 아비딘으로서, 상기 약제의 투여 후 비오틴화된 치료제가 후속 투여되는 것인 산화 아비딘.
제3항에 있어서, 암 질환을 앓고 있는 환자를 치료하기 위한 근접요법용 복합체.
제6항에 있어서, 암 질환은 유방, 췌장, 폐, 흉막, 복막, 얼굴 및 목, 방광, 뇌, 전립선, 난소 또는 눈의 암인 복합체.
제6항에 있어서, 비오틴화된 치료제는 방사성 동위 원소, 화학치료 제제, 사이토카인, 독소 및 항암 세포로 이루어진 군에서 선택된 것인 복합체.
제2항에 있어서, 치료제는 암, 퇴행성 또는 유전 질환을 치료하기 위한 비오틴화된 줄기 세포 또는 체세포인 복합체.
제2항에 있어서, 당뇨병, 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 알츠하이머, 척추 손상, 뒤센형 근이영양증, 심근경색 및 뇌졸중을 포함하는 자가면역/퇴행성/유전 질환의 치료에 유용한 조직 재생에 적용하기 위한 것인 복합체.
제8항에 있어서, 상기 방사성 동위 원소는 Fe-52, Mn-52m, Co-55, Cu-64, Ga-67, Ga-68, Tc-99m, In-111, I-123, I-125, I-131, P-32, Sc-47, Cu-67, Y-90, Pd-109, Ag-111, I-131, Pm-149, Re-186, Re-188, At-211, Pb-212, Bi-212 및 Lu-177로 이루어진 군에서 선택되는 것인 복합체.
제1항에 따른 산화 아비딘과 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학 조성물.
제1 용기 중 산화 아비딘 및 제2 용기 중 비오틴화된 치료제를 함유하는 제12항에 따른 약학 조성물을 포함하는 키트.
제2항 또는 제3항에 따른 복합체와 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학 조성물.
제14항에 따른 약학 조성물을 함유하는 용기를 포함하는 키트.
제13항에 있어서, 2 단계 보조제 수술기 중(intraoperative) 및 수술기 주위 기간(perioperative) 국소영역 및/또는 전신 요법을 위한 것이고, 상기 2개의 용기는 시린지 형태를 갖는 것인 키트.
a) 과몰량의 (HABA)와 사전 혼합된 야생형 아비딘을, 산화제 예컨대 pH 6.0 이하의 50∼100 mM 아세테이트 완충액 중 10∼20 mM의 과요오드산나트륨과 1∼5시간 동안 4℃ 또는 실온에서 항온반응시키는 단계;
b) 반응을 차단하고 크로마토그래프, 한외여과, 투석 또는 당분야의 숙련가에게 공지된 다른 정제 방법으로 산화제 및 HABA를 제거하여 정제하는 단계; 및
c) 산성 pH에서 제형화 또는 동결건조하는 단계
를 포함하는 아비딘의 산화 방법.
제1항에 따른 산화 아비딘 및 비오틴화된 항암제, 또는 제2항에 따른 복합체를 포함하는, 암 질환을 앓고 있는 환자를 치료하기 위한 약제.
삭제
제5항에 있어서, 암 질환을 앓고 있는 환자를 치료하기 위한 근접요법용 산화 아비딘.
제20항에 있어서, 암 질환은 유방, 췌장, 폐, 흉막, 복막, 얼굴 및 목, 방광, 뇌, 전립선, 난소 또는 눈의 암인 산화 아비딘.
제20항에 있어서, 비오틴화된 치료제는 방사성 동위 원소, 화학치료 제제, 사이토카인, 독소 및 항암 세포로 이루어진 군에서 선택된 것인 산화 아비딘.
제5항에 있어서, 치료제는 암, 퇴행성 또는 유전 질환을 치료하기 위한 비오틴화된 줄기 세포 또는 체세포인 산화 아비딘.
제1항에 있어서, 당뇨병, 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 알츠하이머, 척추 손상, 뒤센형 근이영양증, 심근경색 및 뇌졸중을 포함하는 자가면역/퇴행성/유전 질환의 치료에 유용한 조직 재생에서 적용하기 위한 것인 산화 아비딘.
제22항에 있어서, 상기 방사성 동위 원소는 Fe-52, Mn-52m, Co-55, Cu-64, Ga-67, Ga-68, Tc-99m, In-111, I-123, I-125, I-131, P-32, Sc-47, Cu-67, Y-90, Pd-109, Ag-111, I-131, Pm-149, Re-186, Re-188, At-211, Pb-212, Bi-212 및 Lu-177로 이루어진 군에서 선택되는 것인 산화 아비딘.