BRPI0815050B1 - avidina oxidada com tempo de permanência elevado em tecidos tratados, complexo compreendendo a referida avidina e uso dos mesmos, composição farmacêutica, kit, bem como processo de oxidação de avidina - Google Patents

Abstract

avidina oxidada com tempo de permanência elevado nos tecidos tratados a presente invenção descreve avidinas quimicamente modifica-das que possuem maior permanência nos tecidos tratados em comparação com a avidina tipo silvestre. a oxidação de avidina é executada pela incubação de periodato na presença do ligando de baixa afinidade haba que, ocupando os sítios de ligação da biatina, impede a desnaturação da proteína durante a etapa de oxidação. a oxidação de periodato gera grupos de cho de abertura do anel de manose de avidina que, uma vez injetados, reagem com os resíduos de nh2 do tecido para formar bases de schiff estáveis. as avidinas ancoradas mantêm a capacidade de ligar os agentes biotinilados dotado de atividade terapêutica, como biatinas marcadas radioativamente, células tronco e células somáticas, úteis para braquiterapias como lntraoperative avidination radionuclide therapy (iart®) ou doenças degenerativas ou genéticas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para AVIDINA OXIDADA COM TEMPO DE PERMANÊNCIA ELEVADO EM TECIDOS TRATADOS, COMPLEXO COMPREENDENDO A REFERIDA AVIDINA E USO DOS MESMOS, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, KIT, BEM COMO PROCESSO DE OXIDAÇÃO DE AVIDINA.

CAMPO DA INVENÇÃO

A invenção aqui descrita refere-se a avidinas modificadas úteis para ligar compostos ou células biotiniladas e mantê-las em um sítio que necessita de terapia.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

O sistema avidina-biotina foi conhecido durante muitos anos como uma ferramenta excepcional para os estudos qualitativos e quantitativos nas interações entre pequenas moléculas e receptores biológicos (Wilchek,

M., etal., Immunol. Today, 1984, 6, 39).

A avidina é uma glicoproteína de cerca de 68 kDa presente na clara do ovo e que apresenta alta afinidade com a biotina de vitamina H. Sua constante de dissociação (Kd~10’¹⁵M) é a mais conhecida na natureza (Green N.M., etal., Biochem. J., 1970, 118, 67; Green, N.M., Adv. Protein Chem., 1975, 29, 85). Ela é composta de quatro subunidades da sequência de aminoácido idêntica, cada uma das quais pode potencialmente se ligar a uma molécula de biotina. A glicosilação é responsável por cerca de 10 % de seu peso molecular, com uma média de quatro a cinco manoses e três resíduos de N-acetilglicosamina por subunidade (Bruch R. C., et a!., Biochemistry, 1982, 21, 5334).

Em 1988, um estudo sobre a interação entre os derivados de biotina marcados radioativamente e avidina foi relatado (Garlick R.K., et al., J. Biol. Chem., 1988, 263, 210).

Na WO 04093916 no nome da Requerente, a terapia perioperatória de duas etapas de tumores sólidos foi descrita como uma nova forma de braquiterapia. A primeira etapa envolveu a administração dentro da área operada de um anticorpo específico biotinilado seguido pela injeção de avidina nativa ou submetida a PEG de modo a construir um receptor artificial.

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Então, dentro da segunda etapa, o agente anticancerígeno apropriado acoplado à biotina foi administrado sistemicamente. A segunda etapa necessita ser executada dentro de 4 a 72 horas a partir da remoção cirúrgica do tumor.

No entanto, nenhuma sugestão de avidinação direta através da ligação covalente de avidina ao tecido considerado foi fornecida.

As aplicações clínicas desta braquiterapia de duas etapas usando avidina na primeira etapa e biotina-DOTA (ST2210) marcada radioativamente na segunda etapa, mostraram-se eficazes na liberação de irradiação parcial na área cirurgicamente operada em pacientes com câncer de mama (Paganelli G., etal., The Breast, 2007, 16, 17; Paganelli G., etal., Clin. Canc. Res., 2007, 13, 5646). A dose de radiação liberada ao quadrante índice cirurgicamente operado, em 11 pacientes, foi uma média de 20 Gy para uma dose administrada de 100 mCi. Este aumento representa cerca de 1/3 dos 60 Gy esperado para este tipo de paciente pela External Beam Radiotherapy (EBR) padrão corrente.

O uso de construtos de anticorpo de estreptavidina com conjugados de radionuclídeos de biotina no tratamento de pacientes com gliomas malignos, e de anticorpos biespecíficos com radionuclídeos de hapteno na terapia de tumores expressando antígeno carcinoembrionário foi relatado recentemente (Goldenberg, D.M., et a!., J. Clin. Oncol. 2006, 24, 823). No entanto, em muitos poucos casos a toxicidade renal apareceu devido à dose demasiada elevada que passou no rim.

Um dos principais problemas quando se trata com avidina, reside em sua rápida liberação do organismo. Ultimamente, os esforços de pesquisa focalizaram em encontrar avidina modificada com uma meia-vida mais longa. Uma tal abordagem que consiste na ligação da proteína através de grupos amino livres ao monometoxipolietileno glicol, resultou em meiavida plasmática prolongada da avidina modificada com 8 % da dose injetada

i.v. ainda presente no tumor após 5 horas e 6 % após 72 horas quando a avidina foi acoplada ao PEG-20 kDa (Caliceti P., et a!., J. Control. Release, 2002, 83, 97).

Um estudo de farmacocinética que demonstra a influência do

3/25 tamanho do componente de PEG destacou o fato de que quanto mais pesada a unidade de PEG tanto mais curta a meia-vida, entretanto, o grau de afinidade de biotina-avidina seguiu uma tendência oposta (Salmaso S., et al., Biochim. Phys. Acta, 2005, 1726, 57).

Um outro estudo das propriedades farmacocinéticas e de ligação à biotina sobre a avidina submetida a PEG diferente mostrou que 7 porções de PEG por proteína avidina foi a melhor relação, permitindo aumentar a meia-vida plasmática e reduzir a imunogenicidade da avidina. No entanto, nenhum detalhe foi dado em modelo animal no que diz respeito ao acúmulo de fármaco biotinilado dentro dos tumores (Chinol M., etal., Br. J. Cancer, 1998, 78, 2, 189).

Como uma alternativa a PEG-avidina, polímeros temnorresponsivos foram investigados. A poli(N-isopropilacrilamida-co-acrilamida)-avidina apresentou maior tempo de permanência na corrente sanguínea em comparação com a avidina e menor acúmulo dentro do fígado (Salmaso S., et al., Int. J. Pharm., 2007, 340, 20). No entanto, também neste caso nenhum detalhe em modelo animal no que diz respeito ao acúmulo de fármaco biotinilado dentro dos tumores foi relatado.

Infelizmente, até agora, nenhum método eficiente e seletivo para especificamente localizar os agentes terapêuticos está disponível.

Portanto, a melhora da terapia anticâncer é ainda uma grande necessidade e uma principal área de esforços para as empresas farmacêuticas.

A interação de ligação de avidina-biotina é dependente da porção de proteína. De fato, a avidina desglicosilada conserva a capacidade de ligação da biotina (Hiller Y., et al, Biochem. J., 1987, 248,167; Rosebrough

S.F., etal., J. Nucl. Med., 1996, 37, 8, 1380).

Acúmulo e permanência aumentados de um agente terapêutico dentro da área a ser tratada podem ser alcançados através da avidinação do tecido com uma avidina modificada dotada de uma permanência mais elevada no tecido em comparação com a avidina tipo silvestre.

Uma tal estratégia evitaria a necessidade da administração sistêmica de avidina e, consequentemente, impediría os efeitos colaterais relacionados à terapia. Além disso, uma avidinação aumentada do tecido relevante

4/25 resultaria em um tratamento menos tóxico devido à menor distribuição do agente anticâncer em órgãos não relevantes e reduziría a dose de agente anticâncer para obter o mesmo efeito que aquele com a avidina tipo silvestre.

Foi agora observado que mediante a oxidação da parte glicosilada de avidina, a avidinação estável em torno do tecido tumoral pode ser obtida, permitindo que um agente anticâncer biotinilado se concentre de maneira superior em tal região.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

A presente invenção envolve uma avidina quimicamente oxidada capaz de interagir com os tecidos in vivo, através de uma ligação química covalente reversível, de certo modo que atrase a sua difusão. Tal avidina oxidada é administrada durante a etapa cirúrgica ou mediante a injeção em um órgão ou tecido selecionado que necessita de terapia.

A oxidação de avidina por meio de 10 mM de periodato de sódio foi relatada recentemente (US20020137125). Nesta, os autores acoplaram a avidina oxidada com fosfopentamanose-hidrazina para obter um derivado de imina altamente fosforilado que pode depois ser administrado ao paciente para a modificação da enzima lisossomal, isto intensifica a eficácia da terapia de reposição enzimática de doenças lisossômicas. É digno de nota que a formação de imina não interfere in vivo. Também deve ser observado que nenhuma atividade de tal avidina modificada é relatada neste pedido.

Em particular, a presente invenção refere-se a uma avidina oxidada, obtida pela oxidação das porções de açúcar da glicoproteína, que apresenta maior permanência nos tecidos em comparação com a avidina tipo silvestre (WTavidin), enquanto minimiza os efeitos colaterais encontrados quando se usa as proteínas de avidina modificada anteriormente relatadas.

A ligação do tecido de avidina oxidada é altamente homogênea e não depende como em IART da capacidade da avidina positivamente carregada de se localizar nos tecidos tumorais e inflamatórios. Portanto, a ação de avidina oxidada não se limita à interação específica com células tumorais, permitindo assim a avidinação dos tecidos que circundam os tumores cirurgicamente removidos que são conhecidos por conter células tumorais de reposição não

5/25 facilmente acessíveis ao direcionamento direto com a avidina tipo silvestre.

Uma primeira modalidade da presente invenção se refere a uma avidina tipo silvestre quimicamente modificada por meio da abertura do anel oxidativo do açúcar piranosídico, gerando assim porções de aldeído que interagem com resíduos de aminoácido presentes no tecido de interesse.

Grupos de CHO, com pH acídico (abaixo de 6,0), são substancialmente inertes contra as proteínas NH₂ porque a forma NH₃ ⁺ protonada está presente. No entanto, em pH > 7, grupos de CHO reagem com resíduos de proteína NH₂ para formar bases de Schiff. Um exemplo da oxidação química de um resíduo de manose representativo de avidina tipo silvestre e da seguinte reação de grupos de CHO recém-formados com os grupos de amino (R-NH₂, onde R é um resíduo de proteína tecidual) é dado no Esquema 1. Esquema 1

a-D-manose base de Schiff.

Esta oxidação de açúcar é obtida de acordo com o método bemconhecido baseado na reação da avidina nativa com periodato de sódio (Zaborsky, O.R., et al. Biochem. Bioph. Res. Comm., 1974, 61, 1, 210; Green

N.M., Biochem. J., 1963, 89, 599).

A oxidação de avidina, no entanto, é conhecida por resultar em danos a alguns resíduos de aminoácido da proteína, isto é, oxidação de triptofano que está envolvida no sítio de ligação da biotina, causando uma menor afinidade para a biotina e/ou derivados de biotina (US20040191832; Green, N.M., Biochem. J., 1963, 89, 599).

Foi agora observado que a ligação de avidina ao ligante ácido 4hidroxiazobenzeno-2’-carboxílico de baixa afinidade (HABA), antes da etapa de oxidação, confere ao primeiro uma conformação que impede a oxidação dos resíduos de triptofano como revelado pela análise de espectro de UV de tais derivados. A diminuição das inflexões características em 282 e 291 nm,

6/25 no espectro de UV está estritamente relacionada com o grau de oxidação do triptofano; entretanto, um aumento de absorvância na região de 250 a 260 nm é característico da formação de um oxindol substituído.

Os espectros de absorção da avidina oxidada (OXavidin) e da avidina oxidada saturada por HABA (OXavidin_HABA) comparados com aqueles da avidina tipo silvestre (WTavidin), indicam que o uso de HABA para proteger os sítios de ligação da biotina durante a oxidação diminui grandemente a taxa de dano do triptofano (figura 1).

Uma modalidade preferida desta invenção é aquela da avidina oxidada que apresenta um espectro de UV em que a absorvância em 282 e 291 nm não apresenta a característica de inflexão da oxidação dos resíduos de triptofano com relação àquela observada para WTavidin.

Uma outra modalidade preferida desta invenção é aquela da avidina oxidada apresentando um espectro de UV em que a absorvância em 250 a 260 nm não apresenta qualquer aumento em relação àquela observada para WTavidin.

Outra modalidade ainda preferida desta invenção é aquela de um método de oxidação da avidina e/ou derivados de avidina na presença do ligante de HABA que previne os resíduos de triptofano da oxidação.

Exatamente de acordo com o efeito protetor do HABA, OXavidiDhaba apresenta propriedades estruturais e termodinâmicas muito semelhantes ao WTavidin. A estabilidade térmica e as mudanças conformacionais foram determinadas por espectroscopia de dicroísmo circular antes e após a oxidação, com e sem 4 equivalentes de biotina. As curvas de fusão foram registradas seguindo a diminuição do sinal dicroico em 225 nm na faixa de temperatura de 25 a 95 °C. O ponto de inflexão e inclinação (p) das curvas sigmoides foi calculado por meio do modelo de ajuste Boltzman do software Origin® 7.0 e representa o ponto de transição através da condição desnaturada.

Para cada composto específico, a estabilidade térmica corresponde à temperatura que se iguala ao ponto de inflexão da curva correspondente registrado na faixa de temperatura de 25 a 95 °C.

Os dados (tabela 1) indicam que a oxidação diminui a estabilida

7/25 de térmica, como determinado pela diminuição da temperatura de fusão (T_m) e pela inclinação (p) da curva sigmoide de OXavidin em comparação com WTavidin (74,3 versus 79,0 °C e 8,9 versus 14,7, respectivamente).

Surpreendentemente, o efeito de desestabilização é quase insignificante quando a oxidação é executada em avidina protegida por HABA como confirmado pelos valores T_m e p de OXavidinHABA θ avidina, 78,1 versus 79,0 °C, e 11,2 versus 14,7, respectivamente.

Tabela 1

	Tm (°C)	P*
Avidina	79,0 ±0,1	14,7 ±0,3
Avidina + 4 eq de biotina	> 95	n.a.
OXavidin	74,3 ±0,1	8,9 ±0,1
OXavidin + 4 eq de biotina	86,3 ± 0,2	20,7 ± 1,1
OXavidinHABA	78,1 ±0,3	11,2 ±0,4
OXavidinHABA + 4 eq de biotina	>95	n.a.

* Inclinação da curva sigmoide; n.d. = não aplicável

Embora a desnaturação térmica seja irreversível tanto para 0XavidinHABA quanto para OXavidin quando aquecidos sem biotina, apenas OXavidinHABA recupera sua estrutura secundária, similarmente ao WTavidin, quando aquecido/Resfriado na presença de biotina (dados não mostrados). Estas descobertas confirmam que a saturação de HABA é uma maneira muito eficaz de preservar a conformação da avidina submetida à oxidação química e explicar a capacidade de ligação da biotina consequentemente retida.

Uma outra modalidade preferida da presente invenção é aquela de uma avidina oxidada que apresenta uma estabilidade térmica maior ou igual a 78°C.

Uma modalidade mais preferida da presente invenção é aquela de uma avidina oxidada apresentando uma estabilidade térmica maior ou igual a 78 °C, com uma inclinação da curva sigmoide maior do que 10.

A descoberta anterior também é corroborada pela capacidade de ligação da avidina oxidada (OXavidin_HABA) com o aduto biotinilado ST2210 que é similar àquele com WTavidin como mostrado na tabela 2.

8/25

Tabela 2

% de permanência no tecido ID/100 mg ± SD 24 h (N) 1 semana (N)	0,46 ± 0,08 (4)	0,16 ±0,03 (D	0,99 ± 0,25 (D	9,7 ±3,2 (3)	11,4 ± 1,3 (3)	H Z
2,4 ±0,4 (5)	3,1 ±0,7 (1)	6,3 ±0,3 (1)	00 CM +1 C*7	19,1 ±2,0 (4)	z
% de ligação de biotinDOTA ± SD (N)	100@	77,2 ± 0,9 (4)	55,7 ± 2,2 ________________(4)_______________	50,9 ±2,4 _________________(θ)_________________	49,1 ±2,1 (6)	03 o' +1 iq ·—·
Relação molar de CHO/avidina ± SD (N)	O Q uo v	CO o +i ín CD IO	CO o +1 ÍD LO	o_ X +i co	* IO 7 ε LO r— V	10,9 ±2,6 _____________(5)_____________
Condições de oxidação	Sem oxidação	O ro Z E	d ro z E iD	d 05 z E o T“	d 05 z E o CM	d 05 z E o
	WTavidin	UipiABXQ

9/25

Tabela 2

o 0 Ό (D o Q

z 05 c 05 E

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VaVHuipiABXQ

N = número de experiências independentes; SD = desvio padrão; NT = não testado.

@0 valor experimental de 97,4 ± 0,5 obtido com biotinDOTA (ST2210) em comparação com a biotina livre pelo ensaio de HABA assume-se como 100 % como o valor de referência para avidinas modificadas; *p < 0,05 vs 10 mM; # p < 0,01 vs 10 mM (Anova one-way seguido por Student-Newman-Keuls), **p < 0,001 vs mesmo sem HABA (Anova two way seguido por Bonferroni).

10/25

A avidina oxidada obtida de acordo com o método otimizado (OXavidiriHABA) apresenta propriedades melhoradas em comparação com avidina oxidada preparada sem proteção HABA com referência à ligação de ST2210 enquanto mantém a permanência elevada no tecido tratado (membros musculares de camundongos após a injeção i.m.). Na verdade, quando avidina for oxidada com 10 mM de NalO₄, sua capacidade de ligação com relação ao ST2210 é maior se HABA for adicionado antes da oxidação (86,3 % em comparação com apenas 50,9 % com relação à avidina oxidada correspondente na ausência de HABA). Um resultado semelhante é obtido quando a oxidação ocorre na presença de uma concentração de periodato de sódio mais elevada (20 mM) (81,4 % versus 49,1 %).

Uma outra modalidade preferida da presente invenção é aquela de uma avidina oxidada que apresenta uma ligação com ST2210 maior ou igual a 75 % em relação aos 97,4 % obtidos para WTavidin.

Além do mais, a permanência tecidual de avidina oxidada no membro traseiro de camundongos, não obstante o fato de que tal oxidação ocorreu na presença ou não de HABA, é muito superior do que para a WTavidin. Este comportamento é estritamente correlacionado com a presença de grupos de CHO dentro das cadeias laterais glicosiladas de avidina.

Em uma modalidade mais preferida da presente invenção, cerca de 8 a 15 resíduos de CHO por avidina (como estimado pelo método de Purpald) são produzidos após a oxidação com NalO₄a 10 e 20 mM.

Em uma modalidade ainda mais preferida da presente invenção, os derivados de avidina oxidada protegidos por HABA (OXavidin_HABA) mantêm uma capacidade de ligação ao ST2210 elevada e apresentam permanência no tecido, em 24 horas e 1 semana após a injeção, que se correlaciona com o número de grupos de CHO.

A caracterização físico-química, por meio de Calorimetria de Titulação Isotérmica (ITC), de tal interação de avidina/biotina revelou que ST2210 é capaz de se ligar ao WTavidin e OXavidin_HABA de uma maneira comparável como demonstrado pelas constantes de associação (K_A) e variação de entalpia (ΔΗ) (3,45 versus 2,50 x 10⁶ M'¹, e -1,48 versus -1,71 x 10⁴

11/25 kcal mol·¹, respectivamente). Ao contrário, a interação de ST2210/OXavidin apresenta K_A mais baixa (6,45 x 10⁵ M'¹) e mais elevada ΔΗ (-0,79 x 10⁴ kcal mol'¹).

De acordo com os dados da ligação de ST2210 às avidinas oxidadas, dentro do erro experimental, a estequiometria determinada de interação é de 3,0, 1,7 e 1,2 moléculas de ST2210 por molécula de WTavidin, OXavidin_HABA θ OXavidin, respectivamente.

Tabela 3

	N	Ka M-1	ΔΗ kcal mol·1	AS cal mol·1 K1
WTavidin	3.0 + 0.016	3.45E6 ± 3.07E5	-1.48E4 ± 114.0	-19.6
OXavidin 20 mM NaIÜ4	1.2 + 0.012	6.45E5 ± 5.69E4	-0.79E4+ 117.8	0.16
OXavidinHABA 1 mM NaIÜ4	2.5 ± 0.008	4.58E6 ± 2.49E5	-1.29E4 + 56.2	-12.7
OXavidinHABA 5 mM NaIOá	1.9 ±0.012	5.42E6 ± 5.90E5	-1.56E4 ± 145.0	-21.6
OXavidinHABA 10 mMNalOí	1.7 ± 0.008	3.34E6 ± 2.12E5	-1.60E4 ± 109.9	-23.7
OXavidinHABA 20 mM NaI04	1.5 + 0.007	2.50E6 + 1.32E5	-1.71E4 + 113.7	-28.0

A avidina oxidada, de acordo com a presente invenção, substancialmente mantém a capacidade de ligação à biotina da avidina tipo silvestre enquanto obtém a propriedade de interagir reversivelmente com as proteínas do tecido, resultando assim em um candidato ideal para a utilização em braquiterapia como na IART®.

Em uma modalidade preferida da presente invenção, a avidina oxidada é administrada no estágio intraoperatória, gerando assim um receptor artificial para o agente anticancerígeno subsequente.

Uma modalidade mais preferida da presente invenção é fornecer uma avidina quimicamente oxidada para ser utilizada como um primeiro agente de braquiterapia, dotado com alta permanência nos tecidos tratados, em combinação com um segundo agente dotado com afinidade para dita primeira avidina oxidada.

Uma modalidade ainda mais preferida da presente invenção é

12/25 fornecer uma avidina quimicamente oxidada para ser utilizada como um primeiro agente de braquiterapia, dotado de alta permanência nos tecidos tratados, em combinação com um segundo agente anticancerígeno dotado de afinidade para dita primeira avidina oxidada.

Outra modalidade da presente invenção é uma composição farmacêutica contendo a dita avidina quimicamente modificada como o primeiro ingrediente e um agente terapêutico biotinilado como o segundo ingrediente ativo.

Em uma realização preferida da invenção, o segundo ingrediente ativo da composição farmacêutica acima é um agente anticâncer biotinilado. Agente anticâncer significa um agente capaz de combater tumores. Uma lista não exaustiva de agentes anticancerígenos consiste em fármacos quimioterápicos, compostos marcados radioativamente, células efetoras, toxinas, citocinas e células anticancerígenas.

Em outra modalidade preferida da invenção, a terapia adotará a forma de radioterapia.

Uma outra modalidade preferida da presente invenção consiste na preparação de um kit útil para braquiterapia da mama, músculo, fígado, pâncreas, bexiga, cérebro, pulmão, próstata, ovários, olhos e outros órgãos.

Em uma realização preferida do kit, os dois ingredientes estão em dois recipientes separados.

Em uma modalidade mais preferida, o recipiente de avidina quimicamente modificada consistirá em uma quantidade adequada de produto, formulada em uma solução acídica compatível ou liofilizada com excipientes adequados para formar um bolo.

Em uma modalidade particularmente preferida, o recipiente acima mencionado tomará a forma de uma seringa especial adequada para administrações sucessivas de múltiplos volumes precisos nas margens de ressecção ou resíduos de tecido doente que não pode ser removido cirurgicamente por causa da infiltração de órgãos vitais. Convenientemente, o recipiente também pode estar em uma forma adequada para a administração de avidina quimicamente modificada como um pulverizador.

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Preferivelmente, os vários recipientes, já contendo as doses dos ingredientes individuais, serão produzidos como um pacote único que carrega as instruções para os modos de administração.

Ainda mais preferivelmente, os vários recipientes possuem a forma de uma seringa.

Em outra modalidade particularmente preferida, o kit para uso em braquiterapia que, como em IART®, é adequado para a administração locorregional sequencial do primeiro ingrediente e administração sistêmica ou local subsequente do segundo ingrediente.

O segundo ingrediente da composição desta invenção pode ser administrado por qualquer número de vias incluindo, mas não limitado a, aplicações orais, intravenosas, intramusculares, intra-arteriais, intramedulares, intratecais, intraventriculares, transdérmicas ou transcutâneas, meios subcutâneos, intraperitoneais, intranasais, enterais, tópicos, sublinguais, intravaginais, retais ou localmente no tecido doente.

Há casos clínicos onde a braquiterapia é executada mediante a administração de radioisótopos diretamente na massa tumoral (isto é, tumores cerebrais inoperáveis como descrito em Julow J., et al. Prog. Neurol. Surg. 2007, 20, 303) ou órgãos afetados pelo tumor (isto é, próstata como descrito em Saito S, etal., Int. J. Clin. Oncol. 2007, 12, 395). Em um tal caso um dispositivo de braquiterapia ideal seria um que mostra a distribuição homogênea e a estabilidade dentro do local tratado.

Com base nos dados experimentais, observou-se que a avidinação do tecido ocorre em diferentes tecidos tais como músculo, mamário (mostrado nos exemplos presentes) assim como dentro do tecido cerebral.

Em outra modalidade ainda particularmente preferida, o complexo de agente terapêutico biotinilado por avidina oxidada será obtido pela mistura dos dois ingredientes e subsequentemente administrado ao paciente.

A composição da presente invenção constitui um medicamento útil para a terapia de tumores sólidos operáveis ou não, ou não completamente removíveis, tais como, por exemplo, mas não exclusivamente, os

14/25 cânceres da mama, pâncreas, pulmão, pleura, peritônio, rosto e pescoço, bexiga, cérebro, próstata, ovários, olhos e outros órgãos como descrito no pedido de patente WO 2004/093916 depositado em nome da Requerente.

De acordo com uma modalidade preferida da invenção, a avidina oxidada obtida pelo processo da invenção pode ser definida como uma avidina quimicamente modificada, na qual pelo menos um dos resíduos de manose foi substituído por um resíduo da seguinte fórmula (I)

Fórmula I

Um outro objeto da presente invenção são as composições farmacêuticas descritas mais no início, em combinação com excipientes e/ou diluentes farmacologicamente aceitáveis.

Uma outra modalidade da invenção é um processo para a preparação de composições farmacêuticas caracterizadas pela mistura da avidina quimicamente modificada com excipientes, estabilizantes e/ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis adequados.

Um excipiente é uma substância inerte que é adicionada a um fármaco para fornecer volume. A composição farmacêutica também pode conter um veículo farmaceuticamente aceitável, para a administração de um agente terapêutico. Tais veículos incluem anticorpos e outros polipeptídeos, genes e outros agentes terapêuticos, tais como lipossomas, contanto que o veículo possa ser administrado sem toxicidade indevida.

Os veículos adequados podem ser macromoléculas grandes lentamente metabolizadas tais como proteínas, polissacarídeos, ácidos poliláticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácido e partículas de vírus inativo.

Um debate completo de veículos farmaceuticamente aceitáveis

15/25 está disponível em Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., N. J.1991).

Os veículos farmaceuticamente aceitáveis nas composições terapêuticas podem adicionalmente conter líquidos tais como água, solução salina, glicerol e etanol.

Adicionalmente, substâncias auxiliares, tais como agentes umectantes e emulsificantes, substâncias tamponantes do pH, e outras mais, podem estar presentes em tais composições. Tais veículos permitem que as composições farmacêuticas sejam formuladas como bolos de liofilização, comprimidos, pílulas, drágeas, cápsulas, líquidos, géis, xaropes, pastas fluidas, suspensões e os similares, para ingestão pelo paciente.

Os indivíduos a serem tratados podem ser animais; em particular, os seres humanos podem ser tratados.

A dosagem do tratamento pode ser um esquema de dose única ou um esquema de múltiplas doses.

A dose será determinada pelo versado na técnica tal como para liberar no tecido alvo uma quantidade que exerça uma ação terapêutica eficaz.

Uma faixa de dose geral pode estar entre 10 a 100 ml de solução de avidina oxidada em uma concentração de 3 a 5 mg/ml. O volume da dose dependerá do volume do tecido alvo a ser tratado, isto é, 30 ml para um tratamento típico de uma região da mama que circunda o local de uma quadrantectomia (Paganelli G., etal. The Breast, 2007, 16,17 ) ou até 100 ml para o tratamento de uma cavidade peritoneal.

A caracterização bioquímica de avidina oxidada inclui a estimativa dos grupos de CHO pelo método colorimétrico Purpald® conhecido do versado na técnica (Avigad G., Anal. Biochem., 1983.134, 2, 499), utilizando propionaldeído como um padrão.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1:

Mostra os espectros de UV de três formas diferentes de avidina.

16/25

Figura 2:

As curvas A, B e C referem-se aos perfis de eluição de WTavidin, OXavidin_HABA θ OXavidin, respectivamente, na cromatografia de exclusão por tamanho (coluna Biosep-SEC-S3000 (Phenomenex®, 300 x 7,8 mm, volume: 14,3 ml) utilizando uma condição isocrática com um tampão de acetato de sódio 100 mM pH 5,5 e NaCl 0,15 M em uma taxa de fluxo de 1 ml/min em temperatura ambiente. Os dois últimos foram obtidos de WTavidin mediante a oxidação usando NalO4 (20 mM). A relação 280/260 refere-se à integridade da avidina com relação à oxidação de resíduos de triptofano e formação de oxindol.

Figura 3:

Mostra a biodistribuição de avidina oxidada em camundongos tratados após a administração intramuscular. Em particular a Figura 3a indica que a quantidade de avidina oxidada no membro tratado é mais do que o dobro de avidina nativa após 1 hora de injeção. A diferença aumenta com o tempo: avidina nativa é quase indetectável após 24 e 48 horas, enquanto a avidina oxidada representa cerca de 22 % e 15 % da dose injetada/100 mg de tecido, respectivamente. A concentração mais elevada de avidina oxidada em comparação com a avidina tipo silvestre no membro tratado é, como uma consequência, associada a uma distribuição inferior de avidina oxidada e uma distribuição superior de avidina tipo silvestre nos órgãos não alvo, particularmente na primeira hora, como mostrado para o sangue, rins e fígado na Figura 3b, c e d, respectivamente. A Figura 3e mostra a distribuição de avidina oxidada e avidina tipo silvestre nos membros controlaterais.

Figura 4:

Mostra a permanência no tecido de WTavidin e OXavidin_HABA marcado radioativamente por ¹²⁵l em membros tratados e controlaterais de até 14 semanas. Tal gráfico indica que, referido ao nível de 1 hora, a meiavida do tecido de OXavidin_HABA é de cerca de 2 semanas quando oposto a 2 horas para WTavidin.

Figura 5:

Mostra a permanência no tecido de WTavidin, PEGavidin e O

17/25

XavidiriHABA após 24 horas da injeção em um membro traseiro dos camundongos Balb/c com 45 pg (em 15 pl) de WTavidin, PEGavidin ou OXavidin marcados por ¹²⁵l formulados em tampão de acetato 100 mM pH 5,5. A radioatividade no membro tratado foi medida pelo contador gama (Camberra Packard, Schwadorf Áustria).

Figura 6:

Mostra as seções obtidas de músculos de camundongos Balb/c injetados com WTavidin (painel a) ou OXavidinHABA (painel b) e manchados com anticorpo antiavidina quanto à imunofluorescência: fluido ascítico de antiavidina de camundongo (064K4826 batelada A5680, Sigma Aldrich), seguido por anticamundongo Flúor Alexa 488 (batelada 99E2.2, Molecular Probes). O painel a mostra uma localização pontilhada fraca enquanto as seções dos músculos injetados com OXavidinHABA mostram uma forte distribuição homogênea. Em ambos os casos, a avidina foi localizada no interstício.

Figura 7:

Mostra a permanência em vários pontos do tempo de ¹¹¹lnST2210 injetado i.v. no membro traseiro de camundongos Balb/c que foram tratados 48 horas antes com WTavidin ou OXavidin_HABA (painel a). Os painéis b, c e d se referem à captação de ¹¹¹ln-ST2210 no fígado, rim e baço, respectivamente, após a injeção i.v. de ¹¹¹ln-ST2210.

O painel e mostra a captação de ¹¹¹ln-ST2210 após 48 horas de avidinação do tecido. No cenário do segundo caso (¹¹¹ln-ST2210 repetido) os animais receberam em primeiro lugar uma dose de ST2210 gelado e 24 horas mais tarde uma segunda dose de ¹¹¹ln-ST2210.

Figura 8:

Mostra a permanência no tecido dos complexos de WTavidin ou OXavidin_HABA com ST2210 uma semana após a injeção em um membro traseiro.

Figura 9:

Mostra a permanência no tecido cerebral de OXavidin_HABA 24 horas após a injeção através do lado esquerdo do crânio.

18/25

Os seguintes exemplos ilustram ainda mais a invenção, sem limitá-la.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Síntese e caracterização bioquímica de avidinas oxidadas

O método do procedimento de oxidação compreende as seguintes etapas sucessivas:

a) incubar a avidina tipo silvestre pré-misturada com um excesso molar de HABA, com um agente oxidante tal como periodato de sódio 10-20 mM em tampão de acetato 50-100 mM em pH abaixo de 6,0 durante 1 a 5 horas a 4 °C ou em temperatura ambiente;

b) bloquear a reação e purificação mediante a remoção do agente oxidante e HABA por cromatografia, ultrafiltração, diálise ou outros métodos de purificação conhecidos do versado na técnica; e

c) liofilizar ou formular em um pH acídico.

A avidina oxidada foi ainda analisada com relação ao tamanho molecular por cromatografia de exclusão de tamanho em uma coluna biosep-SEC-S3000 (Phenomenex®, 300 x 7,8 mm, volume: 14,3 ml), utilizando uma condição isocrática com um tampão de acetato de sódio 100 mM pH 5,5 e NaCI 0,15 M a uma taxa de fluxo de 1 ml/min em temperatura ambiente.

Como mostrado na Figura 2, a eluição de uma avidina oxidada aparece ligeiramente retardada em comparação com a avidina nativa. Exemplo 2: Biodistribuição de avidina oxidada em camundongos tratados

A avidina oxidada (OXavidin) foi avaliada com relação à permanência no tecido tratado, com relação a sua biodistribuição em órgãos não tratados, assim como com relação a sua capacidade de capturar ¹¹¹ InST2210 em um modelo de camundongo que simula IART® em comparação com a avidina tipo silvestre (WTavidin).

O modelo animal de IART® foi instituído mediante a execução de um corte cirúrgico em um membro traseiro de um camundongo, infiltração de avidina marcada radioativamente nas margens cirúrgicas e tecidos circundantes e medição da radioatividade no membro tratado em diferentes momentos após a administração. Em um grupo paralelo de camundongos, a

19/25 avidina radioativa foi infiltrada no membro sem cirurgia.

A quantidade de radioatividade após 1 e 24 horas de administração foi similar nos animais cirurgicamente tratados e não cirurgicamente tratados. Portanto, outros estudos foram executados mediante a infiltração de avidina sem cirurgia. WTavidin foi marcado com ¹²⁵l (Perkin Elmer, Italy), de acordo com o método lodo-Gen (Pierce, Rockford, IL). A avidina marcada foi separada de iodo livre por cromatografia em uma coluna PD-10 (Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden) e oxidada como descrito anteriormente no Exemplo 1, sem qualquer proteção de HABA anterior.

O ST2210 descrito no pedido de patente WO 02/066075 (página 18, pentacloridrato de ácido 1-[2-[6-[5-[(3aS,4S,6aR)-hexa-hidro-2-oxo-1H-tieno [3,4-d]imidazol-4-il]-1 -pentilamino]-1 -hexilamino]-2-oxoetil]-1,4,7,10-tetra -azaciclododecano-4,7,10-triacético) foi marcado com ¹¹¹ In (Perkin Elmer, Italy), de acordo com um método anteriormente descrito (Urbano N., et al., Eur. J Nucl. Med. Mol. Imaging, 2007, 34, 68).

Camundongos Balb/c nu/nu (Harlan Udine, Italy) foram divididos em 8 grupos de 5 camundongos. WTavidin ou OXavidin marcado por ¹²⁵l foi administrado por via intramuscular (i.m.) em um membro traseiro de cada camundongo (400 mg/camundongo em 40 pl) e após 1, 24 ou 48 horas os camundongos receberam por via intravenosa (i.v.) 16 pg de ¹¹¹ln-ST2210.

Os camundongos foram sacrificados 1, 24 ou 48 horas após a administração de ¹¹¹ln-ST2210 e os membros tratados e controlaterais, amostras de rim, fígado e sangue foram coletados e contados em um contador gama (Camberra Packard, Schwadorf, Austria).

Como mostrado na Figura 3a, a quantidade de avidina oxidada no membro tratado é mais do que o dobro da avidina após 1 hora da injeção. A diferença aumenta com o tempo: WTavidin é quase indetectável após 24 e 48 horas, enquanto OXavidin foi de cerca de 22 % e 15 % da dose injetada/100 mg de tecido, respectivamente. A concentração mais elevada de avidina oxidada em comparação com a avidina tipo silvestre no membro tratado foi, como uma consequência, associada a uma menor distribuição de avidina oxidada e uma maior distribuição de avidina tipo silvestre nos órgãos não

20/25 alvo, particularmente na primeira hora, como mostrado para o sangue, rins e fígado na Figura 3b, c e d, respectivamente. A Figura 3e mostra a distribuição de OXavidin e WTavidin no membro controlateral.

Visto que a IART®, conforme descrito no pedido de patente WO 2004/093916, prevê a administração local de WTavidin (injeção intraoperatória) seguido pela injeção intravenosa do agente anticancerígeno após 4 a 72 horas, fica evidente que o uso de uma avidina quimicamente modificada, como aquela do exemplo da presente invenção, oferece grandes vantagens. Exemplo 3: Permanência no tecido a longo prazo de avidinas tipo silvestre e oxidadas

Camundongos Balb/c nu/nu (Charles River, Lecco Italy) foram injetados em um membro traseiro com 45 pg em 15 μΙ de WTavidin marcado com ¹²⁵l ou Oxavidin marcado com ¹²⁵l formulados em tampão de acetato 100 mM pH 5,5 e, nos pontos de tempo indicados, os animais foram sacrificados, e a radioatividade no membro tratado assim como em outros órgãos não alvo medida pelo contador gama (Camberra Packard, Schwadorf Austria).

A permanência no tecido WTavidin e OXavidin_HABA foi monitorada até 14 semanas. A meia-vida do tecido de OXavidin, quando se refere ao nível de 1 hora, foi observada ser de cerca de 2 semanas ao contrário de 2 horas para WTavidin (Figura 4).

Exemplo 4: Biodistribuição de avidina oxidada em tecido mamário

OXavidinHABA foi avaliado quanto à sua permanência no tecido mamário em comparação com WTavidin. 50 pg (em 15 μΙ) de WTavidin ou OXavidin_HABA marcado por ¹²⁵l, preparados de acordo com o método geral descrito no exemplo 1, foram administrados na região da mama subjacente ao mamilo (3 mamas para cada avidina) de coelhos (Francucci Enzo, Rieti, Italy). Os animais foram sacrificados após 24 h da injeção e amostras de tecido da área injetada de cerca de 200 mg foram coletadas e contadas em um contador gama como descrito anteriormente. Os dados são a média (+/SD) de 3 determinações.

Os dados na Tabela 4 mostram que 8,5 e 65,8 % ID de WTavidin e OXavidinHABA, respectivamente, são observados após 24 horas no teci

21/25 do mamário. Estes dados confirmam a permanência superior de OXavidinHABA, em comparação com WTavidin, anteriormente observado no tecido muscular de camundongo, no tecido mamário de coelho.

Tabela 4: Permanência em 24 horas de WTavidin e OXavidinHABA no tecido mamário de coelho.

% de ID/mama	± SD) em 24 h
WTavidin	OXavidinHABA
8,5 (1,13)	65,8 (0,08)

Exemplo 5: Permanência no tecido de avidinas peguiladas ou oxidadas do tipo silvestre

As avidinas quimicamente modificadas foram descritas anteriormente por outros grupos com a intenção de melhorar a meia-vida da avidina em circulação (Caliceti P., etal., J. Control. Release, 2002,83, 97; Salmaso S., et al., int. J. Pharm., 2007, 340, 20). A permanência no tecido de WTavidin, PEGavidin preparado de acordo com Caliceti, ou OXavidin_HABA (avidina oxidada de acordo com a presente invenção) foi avaliada em camundongos C57B1/6 (Charles River, Lecco Italy). Os animais foram injetados (i.m.) em um membro traseiro com 45 pg em 15 pl de WTavidin, PEGavidin ou OXavidinHABA marcados com ¹²⁵l formulados em tampão de acetato 100 mM pH 5,5. Após 24 horas da injeção, os animais foram sacrificados e a radioatividade no membro tratado foi medida pelo contador gama (Camberra Packard, Schwadorf Austria).

A conjugação de PEG não afetou a permanência no tecido de WTavidin enquanto um aumento de permanência no tecido foi confirmado para o OXavidin_HABA (Figura 5).

Exemplo 6: Localização do tecido de WTavidin ou OXavidinHABA

OXavidin_HABA foi avaliado com relação à localização do tecido em comparação com WTavidin em criossecções de tecidos submetidos à avidina após a injeção intramuscular em um membro traseiro de camundongos nudes Balb/c (Harlan, Udine Italy). Os músculos foram cortados 24 horas após o tratamento e criossecções em série foram preparadas a partir de cada amostra. Cada lâmina foi manchada com hematoxilina/eosina para

22/25 avaliar a morfologia do tecido ou incubada com um anticorpo antiavidina de camundongo (A5680, Sigma Aldrich, Italy), seguido Alexa Fluor 488 anticamundongo (Invitrogen, Milan Italy). Finalmente, as lâminas foram montadas com lamínulas e observadas sob microscópio. Como mostrado na Figura 6, as secções obtidas dos músculos injetados com WTavidin (painel a) mostram uma localização pontilhada fraca, enquanto as secções dos músculos injetados com OXavidinHABA (painel b) mostram uma forte distribuição homogênea. Em ambos os casos, a avidina foi localizada no interstício. O manchamento de hematoxilina/eosina não apresentou nenhuma anormalidade histológica do músculo após 24 horas da injeção com WTavidin ou OXavidinHABA (dados não mostrados).

Exemplo 7: Captação única e repetida de ¹¹¹ln-ST2210

Oxavidin_HABA foi avaliado com relação a sua capacidade em capturar ¹¹¹ln-ST2210 em um modelo de camundongo que simula IART® em comparação com WTavidin.

Camundongos Balb/c nu/nu (Harlan Udine, Italy) foram injetados (i.m.) em um membro traseiro com 45 pg em 15 pl de WTavidin ou OxavidinHABA formulados em tampão de acetato 100 mM pH 5,5. Após 48 horas da injeção, os animais receberam por via intravenosa (i.v.) 5 pg de ¹¹¹lnST2210.

Grupos de 5 animais foram sacrificados nos momentos indicados e a radioatividade no membro tratado assim como em outros órgãos alvos foi medida pelo contador gama (Camberra Packard, Schwadorf Austria).

Como mostrado na Figura 7^a, a captação específica de ¹¹¹ InST2210 após 2 horas da injeção i.v. é muito mais elevada para o tecido tratado com OXavidinHABA do que para o tecido tratado com WTavidin. Estas diferenças na permanência de radioatividade persistem nos pontos de tempo subsequentes até 24 horas da administração i.v. de ¹¹¹ln-ST2210, confirmando assim a avidinação de tecido de longa duração obtida com OXavidiΠηαβα· A distribuição de ¹¹¹ln-ST2210 nos órgãos não alvo é similar para WTavidin e OXavidin_HABA (Figura 7 b, c, d).

Um grupo de animais recebeu a primeira dose intravenosa de 5

23/25 pg de ST2210 gelado 24 horas antes de uma segunda de 5 pg de ¹¹¹lnST2210. A primeira ocorreu 24 horas após a avidinação. Os animais foram sacrificados 2 horas após a injeção i.v. de ST2210 marcado radioativamente e a radioatividade no membro tratado foi medida pelo contador gama como acima.

Como mostrado na Figura 7e, a segunda dose de ¹¹¹ln-ST2210 foi capturada pelo membro tratado com OxavidinHABA em um nível comparável àquele obtido com a dose única. Este resultado sugere que o tecido submetido à avidina não foi saturado pela dose única de ST2210 utilizado neste estudo e que o fracionamento de uma dada dose planejada é viável. Exemplo 8: captação de ¹¹¹ ln/⁹°Y-ST2210 e a eficácia terapêutica em camundongos transgênicos NeuT

Camundongos transgênicos Balb/c que carregam o oncogene HER-2/neu de rato ativado (camundongos Balb-NeuT (Di Carlo E., et al., Lab. Invest., 1999, 79, 10, 1261) foram gentilmente fornecidos pelo Prof Guido Forni, University of Turim, Italy). Quatro animais/grupo foram injetados intramamilos em ambas as mamas IV^o com 25 pl (3,3 mg/ml) de veículo, WTavidin ou OXavidinHABA na 12- semana de vida que corresponde ao período em que os animais desenvolveram carcinoma in situ em toda as 10 mamas. Após 48 horas os animais receberam uma dose (i.v.) de 4,4 pg de ST2210 marcado radioativamente. Esta dose correspondeu a 800 pCi de ⁹⁰Y para propósitos terapêuticos, com um reforço de 40 pCi de ¹¹¹ln-ST2210 para propósitos dosimétricos. Dois animais/grupo foram sacrificados 3 horas após a administração e ambas as mamas IV e III extirpadas e contadas em um contador gama como acima. Os órgãos não alvo também foram coletados e contados. Os dados são expressos como a % de ID/g de tecido. O efeito desta braquiterapia pré-direcionada sobre as lesões tumorais foi avaliado por toda a análise de montagem da glândula mamária como descrito anteriormente (De Giovanni C., etal., Cancer Research, 2004, 64, 4001).

Os dados apresentados na Tabela 5 indicam que a captação específica de ST2210 marcado radioativamente é evidente nas mamas IV tratadas com OXavidin_HABA, mas nem na mama IV de WTavidin nem nas

24/25 mamas tratadas com veículo de camundongos NeuT. As mamas III de todos os grupos de animais são negativas (nível de segundo plano sanguíneo), indicando que avidinação se limita às mamas tratadas. Os dados sobre o total estão de acordo com a diferença de permanência no tecido descrito anteriormente para WTavidin e OXavidin_HABA· A radioatividade de fundo no sangue e de órgãos não alvo incluindo rins, fígado e baço estava abaixo de 0,2 % de ID/g de tecido em qualquer caso, assim indicando que não há necessidade de executar uma etapa de perseguição com albumina submetida à biotina como necessário na versão atual de IART®. O efeito da presente braquiterapia com base em OXavidin_HABA na glândula mamária de camundongos NeuT, resultou em uma redução significativa das lesões de câncer nas mamas tratadas com OXavidinHABA em relação às mamas tratadas com veículo pr WTavidin (dados não mostrados).

Tabela 5

	modelo NeuT % de ID c	e111ln/90Y-ST2210/g (± SD)
	Sangue	Baço	Rim	Fígado	Mama IV	Mama III
Veículo	0,003 (0,001)	0,007 (0,002)	0,143 (0,018)	0,023 (0,001)	0,007 (0,002)	0,005 (0,001)
WTavidin	0,002 (0,001)	0,008 (0,001)	0,161 (0,035)	0,027 (0,006)	0,028 (0,027)	0,007 (0,002)
OXavidinHABA	0,003 (0,001)	0,006 (0,001)	0,101 (0,008)	0,019 (0,003)	1,784 (0,512)	0,008 (0,001)

Exemplo 9: Braquiterapia de uma etapa ¹²⁵l-OXavidinHABA foi saturado in vitro com ST2210, purificado a partir de ST2210 não ligado mediante a ultrafiltração e injetado por via intramuscular em um membro traseiro de camundongos Balb/c. O mesmo protocolo foi seguido no que diz respeito ao WTavidin.

A quantidade de WTavidin ou OXavidinHABA saturado com ST2210 no membro tratado, foi comparada para liberar WTavidin ou OXavidinHABA após 1 semana.

Os resultados na Figura 8 indicam que por enquanto OXavidinHABA complexo ou não com ST2210 ainda estava presente uma semana

25/25 após a injeção (17 % de ID/100 m), WTavidin quase completamente desapareceu (<0,5 % de ID/100 mg), assim evidenciando que OXavidin_HABA présaturado com um agente biotinilado se comporta da mesma maneira como OXavidin_HABA livre e pode ser usado para braquiterapia de uma etapa.

Exemplo 10: Permanência no cérebro de OXavidin_HABA comparado com WTavidin ¹²⁵l-WTavidin ou OXavidinHABA preparado como descrito anteriormente foi injetado em um volume de 5 μΙ (dose de 16 pg) no cérebro de camundongos Balb/c sob anestesia geral. A injeção no cérebro foi executada 10 através da lateral esquerda do crânio, mediante o uso de uma seringa Hamilton, em uma profundidade de 4 a 5 mm. Os resultados na figura 9 indicam que similarmente ao músculo e mama, a permanência de OXavidin_HABA no cérebro, após 24 horas da injeção, é de cerca de 12,65 ± 6,59 % de ID/100 mg de tecido. A quantidade de WTavidin como em outros tecidos anterior15 mente avaliados, é menor do que 2,08 ± 1,03 % de ID/100 mg de tecido. Este resultado indica que OXavidin_HABA pode ser útil para a braquiterapia de tumores cerebrais ou para o direcionamento ao cérebro de produtos terapêuticos biotinilados.

Claims (16)

1. Avidina oxidada, caracterizada pelo fato de que pelo menos um resíduo de manose por molécula de avidina é substituído por um resíduo da seguinte fórmula:

em que a referida avidina oxidada contém cerca de 8 a 15 porções de aldeído e apresenta uma estabilidade térmica igual ou superior a 78°C.

2. Complexo, caracterizado pelo fato de que consiste em uma avidina oxidada, como definida na reivindicação 1, e um agente terapêutico biotinilado.

3. Complexo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o agente terapêutico biotinilado é um agente anticâncer.

4. Uso de um complexo como definido na reivindicação 2 ou 3, caracterizado pelo fato de ser como um medicamento.

5. Uso de uma avidina oxidada como definida na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de um medicamento para o tratamento de uma doença selecionada a partir do grupo consistindo em câncer, doença genética ou degenerativa, e em que a administração do referido medicamento é seguida pela administração de um agente terapêutico biotinilado.

6. Uso de acordo com a reivindicação 4 ou 5, caracterizado pelo fato de ser em braquiterapia para tratar um paciente acometido por uma doença de câncer.

7. Uso de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a doença de câncer é um câncer de mama, pâncreas, pulmão, pleura, peritônio, rosto e pescoço, bexiga, cérebro, próstata, ovários ou olhos.

Petição 870180146588, de 31/10/2018, pág. 7/13

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8. Uso de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o agente terapêutico biotinilado é selecionado a partir do grupo consistindo em radioisótopos, agentes quimioterápicos, citocinas, toxinas e células anticancerígenas.

9. Uso de acordo com a reivindicação 4 ou 5, caracterizado pelo fato de que o agente terapêutico é representado por células-tronco biotiniladas ou células somáticas para o tratamento de câncer, doenças degenerativas e genéticas.

10. Uso da avidina oxidada como definida na reivindicação 1 ou do complexo como definido na reivindicação 2 ou 3, caracterizado pelo fato de ser para aplicações na regeneração de tecidos útil para o tratamento de doenças autoimunes/degenerativas/genéticas, incluindo diabetes, esclerose múltipla, artrite reumatoide, doença de Alzheimer, lesão medular, distrofia muscular Duchenne, infarto do miocárdio e acidente vascular cerebral.

11. Uso de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o referido radioisótopo é selecionado a partir do grupo consistindo em Fe-52, Mn-52m, Co-55, Cu-64, Ga-67, Ga-68, Tc-99m, In-111, I-123, I125, I-131, P-32, Sc-47, Cu-67, Y-90, Pd-109, Ag-111, I-131, Pm-149, Re186, Re-188, At-211, Pb-212, Bi-212 e Lu-177.

12. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende uma avidina oxidada ou um complexo como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, juntamente com um excipiente farmaceuticamente aceitável.

13. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende uma composição farmacêutica como definida na reivindicação 12 contendo uma avidina oxidada ou um complexo como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 3 em um recipiente e um agente terapêutico biotinilado em um segundo recipiente.

14. Kit de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de ser para a terapia locorregional e/ou sistêmica de duas etapas adjuvante intra e perioperativa, em que os dois recipientes possuem a forma de uma seringa.

Petição 870180146588, de 31/10/2018, pág. 8/13

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15. Processo de oxidação de avidina, caracterizado pelo fato de que a oxidação compreende as seguintes etapas:

a) incubar a avidina do tipo selvagem pré-misturada com um excesso molar de (HABA), com um agente oxidante tal como periodato de só-

5 dio 10-20 mM em tampão de acetato 50-100 mM, em pH abaixo de 6,0 durante 1 a 5 horas a 4^oC ou em temperatura ambiente;

b) bloquear a reação e purificação mediante a remoção do agente oxidante e HABA por cromatografia, ultrafiltração, diálise ou outros métodos de purificação conhecidos por um versado na técnica; e

10 c) liofilizar ou formular em um pH acídico.

16. Avidina oxidada, caracterizada pelo fato de ser obtida pelo processo como definido na reivindicação 15.