CN112703401A - 用于从使用缀合的分子阱的测定除去生物素干扰的方法和组合物 - Google Patents
用于从使用缀合的分子阱的测定除去生物素干扰的方法和组合物 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及从某些测定除去或减少生物素干扰的方法和组合物。
Description
本申请根据35 USC § 119(e)要求2018年9月25日提交的美国临时申请号62/735,913的权益。上述引用的专利申请的全部内容在此明确通过引入并入本文。
发明领域
本发明涉及用于测定以及用于从此类测定除去干扰、尤其是生物素干扰的方法和组合物。
发明背景
在现代的体外临床诊断中,各种方法被用于检测样品中的分析物。在诊断方法的一种形式(免疫测定法)中,使用一种或多种特异性结合物质。典型的实例是夹心免疫测定法(其中两种特异性结合物质(抗体或抗原)结合目标分析物),和竞争性免疫测定法(其中目标分析物和该分析物的类似物竞争结合特异性结合物质)。在竞争性免疫测定法中,抗原经常也称为半抗原或配体。特异性结合物质之一通常附接至所谓的标记物或标签,其可以是原子(例如,放射性),分子(例如,酶、荧光或发光化合物)或颗粒(磁性或乳胶)。该标记物允许通过对应于利用的标记物的各种检测方法来检测目标分析物。在竞争性测定法中,特异性结合物质或分析物类似物可以携带标记物。其他特异性结合物质通常与固体或可悬浮的基质(“固相”)共价或通过吸附结合。或者,可以将特异性结合物质连接至第二结合对的第一成员(例如,生物素),而将第二结合对的第二成员(例如,链霉抗生物素蛋白)附接至固相。这允许特异性结合物质经由第二结合对相互作用(例如,生物素-链霉抗生物素蛋白)结合至固相。
半抗原、诸如生物素和荧光素经常用于与测定试剂中的抗体或其他小药物分子缀合。它们与包被在固体支持物上的大蛋白分子(例如,链霉抗生物素蛋白与生物素以及抗FITC抗体与荧光素)的紧密结合提供了将半抗原-Ab或半抗原-药物固定在固体表面上的便利方法。由于生物素和链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白之间的结合力展示生物分子的最高常数之一,所以生物素非常经常用作配体,并且链霉抗生物素蛋白非常经常用作其特异性结合配偶体。
对于诊断测定的稳定性和再现性而言重要的是,固相结合的物质对其结合配偶体的结合能力并不随着时间变得受损害。这可能导致可靠性降低和测定灵敏度降低。可能导致这种损害(表现为不稳定性)的一种机制是一部分固相附接的物质流入周围的介质中。游离物质与固相附接的物质竞争结合靶标,并且由于其更快的扩散而通常具有显著的动力学优势。因此,有利的是将与试剂中的固相附接的物质竞争的游离物质的量保持恒定,优选非常接近于零。这将允许以稳定且可再现的方式灵敏地检测分析物。消除游离物质的优选方式是找到将消除解离的结合方法。由于其更大的键强度,与吸附缔合相反,共价键合可能是一种选择方法。然而,在许多情况下,由于各种原因,这可能是不可能的或不切实际的。
生物素已用作补充剂。例如,作为食品补充剂的生物素旨在促进健康的毛发和指甲生长并治疗其他疾病状况。因此,血清中生物素的量可能相当高。因为在许多诊断测定中使用分子、诸如生物素来包被固体支持物、结合抗体或半抗原类似物,所以血液中这些高水平的生物素可能干扰测定信号。因此,如果生物素以游离形式存在于样品溶液中,则其占据结合位点,并且因此可以导致测试结果错误。这在接受高剂量生物素的患者的情况下尤其关键。假定样品中超过30 ng/ml的量的生物素已经导致歪曲的结果。在用生物素治疗的患者的情况下,可能出现最高达180 ng/ml或甚至最高达1500 ng/ml的血清值和约70 ng/ml的持久值。
一种减轻这种干扰的方法涉及使用预制的试剂,即在试剂生产期间与链霉抗生物素蛋白包被的固体支持物预结合的生物素化的测定组分。由于链霉抗生物素蛋白和生物素之间的紧密结合和缓慢的解离速率,用患者样品中的进入生物素从链霉抗生物素蛋白替换已经结合的生物素不是一个主要过程。
第二种方式是增加固相支持物上的链霉抗生物素蛋白结合位点,使得除了生物素化的测定组分外,还有额外的可用于样品生物素分子的结合位点。第三种方式是上述两者的组合。但是,除非我们完全避免使用生物素-链霉抗生物素蛋白作为活性测定组分,否则上述方式均无法真正解决生物素干扰问题。
所有上述解决方案的一个主要问题是测定组分参与干扰预防,其可以容易地影响测定信号本身的幅度。在此类情况下使用的测定组分远离了用于检测意欲分析物的最佳条件。在US 8252605中提供了一些实例。
在美国专利5212063中公开了另一种方法。其公开了使用具有生物素结合核心和蛋白、碳水化合物或共聚物的覆盖层的聚合物颗粒以过滤通过游离生物素,但不过滤通过缀合至大分子的生物素。
这种方法对于一些测定形式可能是有效的,但颗粒的引入可能生成会干扰测定信号的额外吸光度。
因此,本发明的一个目的是提供用于在测定中减轻此类物质、使得检测过程不受干扰的改进方法。因此,需要一种方法来除去生物素,使得不发生对测试的干扰。
与权利要求和/或说明书中的术语“包括”结合使用时,术语“一个/种(a)”或“一个/种(an)”的使用可意味着“一个/种(one)”,但它也与“一个/种或多个/种”、“至少一个/种”和“一个/种或多于一个/种”的含义一致。因此,术语“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“该/所述(the)”包括复数指示物,除非上下文另有明确指示。因此,例如,对“一种化合物”的提及可指一种或多种化合物、2种或更多种化合物、3种或更多种化合物、4种或更多种化合物或更大数目的化合物。术语“多个/种”是指“两个/种或更多个/种”。
术语“至少一个/种”的使用将被理解为包括一个/种以及多于一个/种的任何数量,包括但不限于2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、100个/种等。术语“至少一个/种”可延伸多至100或1000或更多个/种,这取决于它所附接的术语;此外,100/1000的数量不视为限制性的,因为更高的限值也可产生令人满意的结果。此外,术语“X、Y和Z中的至少一个/种”的使用将被理解为包括单独的X,单独的Y和单独的Z,以及X、Y和Z的任何组合。序数术语(即,“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等)的使用仅用于区分两个或更多个事项的目的,并且不意味着暗示例如一个事项相对于另一事项的任何顺序或次序或重要性、或任何添加次序。
在权利要求中使用术语“或”用于意指包括性的“和/或”,除非明确指出仅指替代方案或者除非替代方案是互相排斥的。例如,以下任一种都满足条件“A或B”:A为真(或存在)且B为假(或不存在),A为假(或不存在)且B为真(或存在),并且A和B两者均为真(或存在)。
如本文所用,对“一个实施方案(one embodiment)”、“一个实施方案(anembodiment)”、“一些实施方案”、“一个实例(one example)”、“例如”或“一个实例(anexample)”的任何引用意指结合该实施方案描述的具体要素、特征、结构或特点包括在至少一个实施方案中。例如,说明书中各个地方出现的短语“在一些实施方案中”或“一个实例”不一定全部是指同一实施方案。此外,对一个或多个实施方案或实例的所有引用都应被解释为对权利要求非限定性的。
在整个申请中,术语“约”用于指示,值包括用于测定该值的组合物/仪器/装置、方法的误差的固有变化,或研究受试者间存在的变化。例如,但不限于,当利用术语“约”时,指定值可以与列举值相差正负20%,或15%,或12%,或11%,或10%,或9%,或8%,或7%,或6%,或5%,或4%,或3%,或2%,或1%,因为此类变化适用于执行公开的方法并由本领域普通技术人员所理解。
如在本说明书和一个或多个权利要求中所用,术语“包含(comprising)”(和任何形式的包含,例如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”)、“具有(having)”(和任何形式的具有,例如“具有(have)”和“具有(has)”)、“包括(including)”(和任何形式的包括,例如“包括(includes)”和“包括(include)”)或“含有(containing)”(和任何形式的含有,例如“含有(contains)”和“含有(contain)”)都是包括性的或开放式的,并且不排除另外的未列举的要素或方法步骤。
如本文所用的术语“或其组合”是指所述术语之前列出的事项的所有排列和组合。例如,“A、B、C或其组合”意欲包括以下中的至少一个:A、B、C、AB、AC、BC或ABC,并且如果次序在特定上下文中是重要的,则也包括BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC或CAB。继续该实例,明确包括的是含有一个或多个事项或术语的重复的组合,例如BB、AAA、AAB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、CABABB等等。本领域技术人员将理解,除非从上下文可见,否则通常对任何组合中的事项或术语的数量没有限制。
如本文所用,术语“实质上(substantially)”意味着随后描述的事件或情况完全发生或者随后描述的事件或情况在大范围或程度上发生。例如,当与具体事件或环境相关时,术语“实质上”意味着随后描述的事件或情况发生在至少80%的时间、或至少85%的时间、或至少90%的时间、或至少95%的时间。术语“实质上相邻”可以意指两个事项与彼此100%相邻,或者两个事项与彼此密切接近,但与彼此不是100%相邻,或者两个事项之一的一部分与另一事项不是100%相邻,而是与另一事项密切接近。
如本文所用,短语“与…缔合(associated with)”和“与…偶联(coupled to)”包括两个部分彼此直接缔合/结合以及两个部分彼此间接缔合/结合二者。缔合/偶联的非限制性实例包括例如通过直接的键或通过间隔基团将一个部分与另一个部分共价结合,直接或借助与所述部分结合的特异性结合对成员将一个部分与另一个部分非共价结合,诸如通过将一个部分溶解在另一个部分中或通过合成而将一个部分掺入另一个部分,和将一个部分包被在另一个部分上。
术语“类似物”和“衍生物”在本文中可互换使用,并且是指如下的物质,其在其结构中包含与给定化合物相同的基本碳骨架和碳官能度,但也可以含有对其的一个或多个取代。如本文中所用,术语“取代”将被理解为是指用残基R替换化合物上的至少一个取代基。在某些非限制性实施方案中,R可以包括H,羟基,硫醇,选自氟化物、氯化物、溴化物或碘化物的卤化物,选自下列之一的C1-C4化合物:任选取代的直链、支链或环状烷基,和直链支链或环状烯基,其中任选的取代基选自一种或多种烯基烷基、炔基烷基、环烷基、环烯基烷基、芳基烷基、杂芳基烷基、杂环烷基、任选取代的杂环烯基烷基、芳基环烷基和芳基杂环烷基,其中每个是任选取代的,其中所述任选的取代基选自下列中的一种或多种:烯基烷基、炔基烷基、环烷基、环烯基烷基、芳基烷基、烷基芳基、杂芳基烷基、杂环烷基、任选取代的杂环烯基烷基、芳基环烷基和芳基杂环烷基、苯基、氰基、羟基、烷基、芳基、环烷基、氰基、烷氧基、烷硫基、氨基、-NH(烷基)、-NH(环烷基)2、羧基和-C(O))-烷基。
如本文所用的术语“样品”将被理解为包括可以根据本公开利用的任何类型的生物样品。可利用的流体生物样品的实例包括但不限于:全血或其任何部分(即,血浆或血清)、尿液、唾液、痰、脑脊液(CSF)、皮肤、肠液、腹膜内液、囊液(cystic fluid)、汗液、间质液、细胞外液、泪液、粘液、膀胱洗液(bladder wash)、精液、粪便、胸膜液、鼻咽液、其组合等。
如本文在术语“生物素-特异性结合配偶体”或“靶标分析物-特异性结合配偶体”中具体(但不以限制方式)使用的术语“特异性结合配偶体”或“sbp”应理解为是指能够分别与生物素或靶标分析物特异性缔合的任何分子。例如但非限定地,所述结合配偶体可以是抗体、受体、配体、适体、分子印迹聚合物(即,无机基质)、其组合或衍生物,以及能够分别特异性结合生物素或靶标分析物的任何其他分子。
术语“抗体”在本文中以最广义使用,并且是指例如完整单克隆抗体和多克隆抗体,多特异性抗体(例如,双特异性抗体),其表现出结合分析物的期望生物活性的抗体片段及缀合物(诸如但不限于Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv、Fd、双抗体、单链抗体和其他抗体片段及其缀合物,其保留完整抗体的可变区的至少一部分),抗体替代蛋白或肽(即,工程改造的结合蛋白/肽)及其组合或衍生物。所述抗体可以是任何类型或类别(例如,IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)或亚类(例如,IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。
如本文所用的术语“半抗原”是指能够被靶标分析物-特异性结合配偶体、诸如(但不限于)抗体识别的小的蛋白性或非蛋白抗原决定簇(或“表位”)。如本文所用的术语“多半抗原”应理解为是指含有多个与其附接的表位/抗原决定簇的合成分子。
“分析物”是能够被分析物-特异性结合配偶体、诸如(但不限于)抗体识别的大分子。分析物和半抗原两者均包含至少一个抗原决定簇或“表位”,其为结合分析物-特异性结合配偶体(即抗体)的抗原或半抗原的区域。通常,半抗原上的表位是整个分子。
附图的简要说明
图1示意性描绘各种环糊精阱。
图2示意性描绘抗生物素蛋白和链霉抗生物素蛋白的氨基酸结构。
图3示意性描绘用于可能突变的马来酰亚胺化学法。
详述
在一个实施方案中,在试剂制剂中添加半抗原阱以除去干扰性半抗原,而不涉及生成测定信号的测定组分。
所述半抗原阱可以是可溶的或固体的笼。如果所述阱具有孔,则其应当具有仅允许游离生物素进入孔、但不允许大分子、诸如生物素-抗体进入的孔径。可替代地或另外地,可以使所述阱带电,从而将所述半抗原吸引至该笼。该笼的内部应当能够通过氢键结合、疏水相互作用或分子印迹物(诸如特异性结合配偶体)来捕获干扰性半抗原分子(生物素或荧光素)。
因此,所述分子笼捕获干扰性半抗原分子,但不捕获半抗原-Ab缀合物,以有效地减少半抗原对测定组分中的其结合配偶体的可及性。
分子笼的实例是环糊精。可以将环糊精进行化学修饰以更好地排除半抗原-缀合物。其他实例可以涉及合成的固体(漂浮的)支持物或可溶性复合物,其内表面包被有适体、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白或抗FITC抗体的固体支持物(漂浮的)或可溶性复合物。这种固体支持物或复合物应当具有足够小的分子大小排阻,其仅允许靶标半抗原进入该笼,但不允许大的生物素化抗体进入该笼。参见图1。
因此,本发明是用于减少测定中的游离-半抗原干扰的分子阱,所述分子阱包括:
分子笼,其包括围绕腔的壳,所述腔具有选择性捕获和保留测定溶液中的未缀合或游离的半抗原的特征。所述分子笼的壳可以选自环糊精壳和半抗原的分子-印迹-特异性结合配偶体壳。在一个具体实施方案中,所述壳的特征可以对游离-半抗原具有选择性渗透性,或者是相对较大的测定组分、诸如半抗原的测定缀合物的选择性阻碍物,或者所述壳可以是两种特征的组合。
在一些实施方案中,所述分子笼进一步包括在所述壳上的涂层,所述涂层对于游离-半抗原是选择性可渗透的,并且对于测定溶液中存在的相对较大的测定组分是不可渗透的。所述相对较大的测定组分可以包括半抗原的测定-缀合物、半抗原的测定特异性结合配偶体(sbp)、sbp的测定-缀合物以及大于约1000道尔顿分子量或更优选大于约2000道尔顿分子量的其他测定分子。在一些实施方案中,所述涂层包含牛血清白蛋白、葡聚糖醛、氨基葡聚糖和离子带电部分中的一种或多种。
在一些实施方案中,所述分子笼的腔特征包括以下中的一种或两种:具有与游离-半抗原的选择性相互作用的部分,以及有利于选择性接收和保留游离-半抗原并优先排除测定溶液中存在的大于约1000道尔顿分子量或更优选大于约2000道尔顿分子量的测定分子的腔大小尺寸。所述腔可以包括内部特异性-结合部分以选择性保留接收的游离-半抗原。所述腔特征可以包括以下中的一种或两种:大小受限以选择性接收游离-半抗原并且优先排除测定溶液中存在的大于约1000道尔顿分子量的测定分子的腔开口,以及内腔与游离-半抗原的相互作用,包括氢键键合、范德华力、极性键合、亲水相互作用、疏水相互作用、离子吸引、锁与钥相互作用(lock-and-key interaction)中的一种或多种。
通常,所述测定溶液中的游离-半抗原是所述测定溶液中存在的半抗原的测定-缀合物的分子量的约十分之一,所述分子笼的腔特征包括分子量排除限值大于游离-半抗原的分子量的腔开口,以及具有与游离-半抗原的选择性相互作用的内腔部分。
所述壳可以是环糊精壳,其中所述环糊精选自α-环糊精、β-环糊精和γ-环糊精。
所述游离-半抗原可以选自游离-生物素和游离-荧光素。所述分子-印迹-特异性结合配偶体壳的生物素的特异性结合配偶体可以包含链霉抗生物素蛋白、抗生物素蛋白和traptavidin中的一种或多种。如果所述游离-半抗原是游离-荧光素,则所述分子-印迹-特异性结合配偶体壳的荧光素的特异性结合配偶体包括抗荧光素抗体。
在另一个实施方案中,在试剂制剂中添加半抗原阱,以从其结合配偶体减少干扰性半抗原到最小,而不涉及生成测定信号的测定组分,并且不生成可能干扰真实测定信号的额外吸光度。
该阱可以具有以下特征:
a) 它不是颗粒或固相试剂,而是在水溶液中的可溶性分子结构。
b) 它应只结合游离半抗原,而不结合大分子、诸如半抗原-Ab缀合物。
a)和b)中描述的特征足以构成分子半抗原阱。
或者,对于分子半抗原阱,以下特征也被认为是足够的:
c) 它对于结合具有较慢的解离速率,使得结合的半抗原实际上被锁定在适当的位置。该特征的优点在于,被捕获物(或锁定的生物素)将不易于解离并与缀合的半抗原竞争生成测定信号的半抗原结合配偶体。
d) 它对于结合应当具有较慢的结合速率,使得缀合的半抗原将优先结合生成测定信号的半抗原结合配偶体。
具有单独或组合的特征a)和b)或特征c)和d),分子半抗原阱可以充分地发挥作用。
以生物素-抗生物素蛋白(或链霉抗生物素蛋白)为例,抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白可以经由共价键用dexal或其他间隔分子化学修饰以形成表面层,所述表面层仅对于游离生物素是可渗透的,但对生物素化抗体的生物素部分是不可渗透的。Traptavidin是这样的分子,其对于生物素结合具有1/2结合速率和1/10解离速率,通过与含有生物素的样品预孵育,使其成为良好的生物素阱。对于LOCI PCT测定提出的一种测定实例如下:
1) 将含有生物素的样品与捕获Ab包被的chemibead试剂孵育,所述捕获Ab包被的chemibead试剂含有可溶性分子生物素阱(例如,dexal-修饰的链霉抗生物素蛋白或traptavidin或未修饰的traptavidin)。样品中的游离生物素将结合生物素阱。
2) 添加生物素化抗体,随后添加链霉抗生物素蛋白包被的sensibead。如果在步骤1)中使用天然(未修饰的)traptavidin,则将需要在添加生物素化抗体后不久添加链霉抗生物素蛋白包被的sensibead。这是为了确保生物素化抗体优先结合sensibead上包被的链霉抗生物素蛋白,而不结合对于生物素结合具有比链霉抗生物素蛋白更慢的结合速率的traptavidin。如果使用不结合缀合的生物素的表面-修饰的traptavidin,则来自样品的结合的游离生物素分子将不与生物素化抗体竞争结合链霉抗生物素蛋白-sensibead,因为它们被锁在traptavidin分子中。
医学诊断领域利用许多不同形式的测定技术。商业使用的测定的一个实例是发光氧通道测定(LOCI®)技术。LOCI®先进化学发光测定描述于例如美国专利号5,340,716(Ullman等人),其全部内容明确地通过引用并入本文。当前可用的LOCI®技术具有高灵敏度,并且使用几种试剂。具体而言,LOCI®测定要求这些试剂中的两种(被称为“sensibead”和“chemibead”)通过其他特异性结合配偶体测定试剂以如下的方式保持,其中sensibead和chemibead彼此密切接近以实现信号。在暴露于特定波长的光后,sensibead释放单线态氧,并且如果两个珠粒密切接近,则单线态氧被转移至chemibead;这引起化学反应,其导致所述chemibead发出光,所述光可以在不同波长处测量。
可以根据本公开利用的化学发光化合物和光敏剂的具体、非限制性实例记载于美国专利号5,340,716 (Ullman,等人),其完整内容在此明确地通过引用并入本文。
因此,本发明包括用于减少测定中的游离-半抗原干扰的分子阱,所述分子阱包括:可溶于测定溶液中以选择性结合游离-半抗原的分子结构,所述分子结构包含所述游离-半抗原的修饰的特异性结合配偶体(sbp)。所述修饰的sbp包含以下中的一种或多种:葡聚糖醛组分,结合的空间阻碍聚合物,以及比其他游离-半抗原特异性结合配偶体(sbp)测定试剂更慢的特异性游离-半抗原结合解离速率特性。
这种分子结构可以进一步包含涂层,所述涂层包含以下中的一种或多种:游离-半抗原的选择性可渗透材料;用于以下一种或两种的离子电荷:吸引游离-半抗原和排斥测定溶液中的其他测定分子;以及促进以下一种或两种的极性:游离-半抗原的选择性保留和测定溶液中的其他测定分子的空间排斥。
所述涂层可以包含以下中的一种或多种:蛋白或肽,诸如牛血清白蛋白,聚合物,诸如葡聚糖醛或氨基葡聚糖,化合物,诸如乙二胺,四亚乙基五胺,离子带电的部分,疏水性部分(磺基-N-羟基琥珀酰亚胺乙酸酯)等。修饰的sbp的特异性游离-半抗原结合的解离速率特征比修饰的sbp的特异性游离-半抗原结合的结合速率特征更慢。
在一些实施方案中,所述游离-半抗原是游离-生物素,修饰的sbp是traptavidin,其具有比测定溶液中的其他游离-半抗原sbp更慢的特异性游离-半抗原结合解离速率,所述测定溶液中的其他游离-半抗原sbp选自链霉抗生物素蛋白和抗生物素蛋白。
所述修饰的sbp可以包含以下中的一种或两种:葡聚糖醛组分和空间阻碍聚合物,其选择性阻碍与测定溶液中的测定组分和测定-缀合物的结合,并且比游离-半抗原相对更大。
在一些实施方案中,所述测定溶液中的游离-半抗原选自游离-生物素和游离-荧光素,其中游离-生物素的修饰的sbp是修饰的链霉抗生物素蛋白、修饰的抗生物素蛋白和traptavidin之一,且其中游离-荧光素的修饰的sbp是修饰的抗荧光素。
所述修饰的sbp可以是基因工程改造的sbp,其包含缀合至修饰的sbp的氨基酸的空间阻碍聚合物,所述氨基酸与所述游离-半抗原的特异性结合位点相邻,所述空间阻碍聚合物阻碍对应于游离-半抗原的半抗原-测定缀合物的特异性结合。
所述空间阻碍聚合物选自氨基葡聚糖和牛血清白蛋白。
所述半抗原-测定缀合物选自以下的一种或多种组成的组:半抗原-抗体缀合物、半抗原-抗原缀合物、半抗原-标记酶缀合物、半抗原-所测试的分析物缀合物、半抗原-标记物缀合物和半抗原-受体缀合物。
在分子水平上产生可溶于水性反应混合物中的半抗原阱应当允许比半抗原阱颗粒宽得多的应用。traptavidin-样分子给出的生物素锁定机制大大降低游离生物素从半抗原阱解离并与生物素化抗体竞争sensibead结合的机会。第三,在使用天然(未修饰的)traptavidin的情况下,与traptavidin的较慢结合允许生物素化抗体优先结合sensibead。
在又另一个实施方案中,所述半抗原阱是基因工程改造的半抗原结合蛋白(游离的半抗原阱)。在试剂制剂中添加基因工程改造的半抗原阱,以从其结合配偶体除去干扰性游离半抗原,而不涉及生成测定信号的测定组分,且不生成可能干扰测定信号的额外吸光度。制备半抗原阱涉及以下:
a) 定点诱变改变生物素结合位点附近的氨基酸残基,允许另一种蛋白或聚合物在结合位点附近的缀合,从而提供对大的生物素化抗体的空间阻碍,但没有对于较小的游离半抗原进入结合位点的空间阻碍
b) 其他基因工程改造技术产生与a)类似的突变
c) 基因工程改造的链霉抗生物素蛋白仍以高亲和力结合游离生物素。
d) 将蛋白(例如BSA)或聚合物与工程改造的链霉抗生物素蛋白缀合,以完成游离生物素阱的制备。
e) 通过定点诱变进行基因工程改造,将一个氨基酸残基改变为不在当前序列中的独特氨基酸。例如,将{37- {37、{35- {36或{33- {34 (参见图2)之间的连接部分上的氨基酸残基改变为甲硫氨酸(Met或M)。由于突变在结合位点附近,因此使用SMCC(马来酰亚胺化学法)和/或其他聚合物缀合蛋白将为生物素化抗体试剂提供空间阻碍(参见图3)。
因此,本发明包括用于减少测定中的游离-半抗原干扰的分子阱,所述分子阱包含可溶于测定溶液中的分子复合物,以选择性提供分子复合物中的游离-半抗原竞争性特异性结合。所述分子复合物包含缀合物,其包含半抗原-类似物,比半抗原-类似物相对更大的空间阻碍聚合物以及在半抗原-类似物和空间阻碍聚合物之间提供柔性接头的连接基团;以及,另外,与缀合物互连的抗半抗原特异性结合配偶体(sbp)。所述半抗原-类似物具有比游离-半抗原更弱的与抗半抗原sbp的特异性结合特征,所述柔性接头连接提供半抗原-类似物和抗半抗原sbp上的半抗原的特异性结合位点之间的自由度,所述空间阻碍聚合物防止测定溶液中的半抗原-测定缀合物接近特异性结合位点。
在上述分子阱中,所述半抗原可以是生物素,所述半抗原-类似物选自4'-羟基偶氮苯-2-甲酸(HABA)和2-亚氨基生物素,且所述抗半抗原sbp选自链霉抗生物素蛋白、抗生物素蛋白和traptavidin。
半抗原-类似物相对于游离-半抗原较弱的特异性结合特征可以包括pH-依赖性的特异性结合。所述分子阱的空间阻碍聚合物可以选自蛋白或肽,诸如牛血清白蛋白,聚合物,诸如葡聚糖醛或氨基葡聚糖,化合物,诸如乙二胺、四亚乙基五胺、离子带电的部分,或疏水性部分,诸如磺基-N-羟基琥珀酰亚胺乙酸酯。
本发明包括减少测定中的游离-半抗原的干扰的方法,所述方法包括:
组合测定组分和具有所测试的分析物和过量游离-半抗原的患者样品以形成测定溶液,所述测定组分包含包括半抗原和相对较大的抗半抗原的特异性结合对,半抗原和抗半抗原各自的测定-缀合物,以及对游离-半抗原选择性的分子阱;和
用所述分子阱选择性保留所述测定溶液中的所述游离-半抗原,
其中所述分子阱包含以下中的一种或混合物:具有围绕腔的壳的分子笼、分子复合物和包含修饰的抗半抗原特异性结合配偶体(sbp)的分子结构,所述修饰的抗半抗原sbp包含以下中的一种或多种:葡聚糖醛组分,结合的空间阻碍聚合物以及比其他抗半抗原特异性结合配偶体(sbp)测定组分更慢的特异性游离-半抗原结合解离速率特征。
在这种方法中,所述修饰的抗半抗原sbp的特异性游离-半抗原结合的解离速率特征比所述修饰的抗半抗原sbp的特异性游离-半抗原结合的结合速率特征更慢。
进一步,在这种方法中,所述分子复合物可以是使用柔性接头与空间阻碍聚合物缀合的半抗原-类似物以及与半抗原-类似物缀合物互连的抗半抗原sbp,所述半抗原-类似物具有与所述游离-半抗原相同或更弱的对抗半抗原sbp的特异性结合特征,所述空间阻碍聚合物阻止测定溶液中的半抗原-测定缀合物接近抗半抗原sbp上的特异性半抗原结合位点,且其中测定溶液中的游离-半抗原优选结合抗半抗原sbp特异性结合位点。
在此类方法中,半抗原的测定-缀合物和抗半抗原的测定-缀合物分别选自由以下组成的测定组分的组以及该组中的两种或更多种的组合:抗体、抗原、所测试的分析物、标记物、标记酶、受体。
Claims (8)
1.用于减少测定中的游离-半抗原干扰的分子阱,所述分子阱包括:
可溶于测定溶液中的分子复合物,以选择性提供所述分子复合物中的游离-半抗原竞争性特异性结合,所述分子复合物包括:
缀合物,其包含半抗原-类似物,比所述半抗原-类似物相对更大的空间阻碍聚合物以及在所述半抗原-类似物和所述空间阻碍聚合物之间提供柔性接头的连接基团;和
与所述缀合物互连的抗半抗原特异性结合配偶体(sbp),所述半抗原-类似物具有比所述游离-半抗原更弱的与抗半抗原sbp的特异性结合特征,所述柔性接头连接提供所述半抗原-类似物和抗半抗原sbp上的半抗原的特异性结合位点之间的自由度,所述空间阻碍聚合物防止测定溶液中的半抗原-测定缀合物接近特异性结合位点。
2.权利要求1的分子阱,其中所述半抗原是生物素,所述半抗原-类似物选自4'-羟基偶氮苯-2-甲酸(HABA)和2-亚氨基生物素,所述抗半抗原sbp选自链霉抗生物素蛋白、抗生物素蛋白和traptavidin。
3.权利要求1的分子阱,其中所述半抗原-类似物相对于所述游离-半抗原更弱的特异性结合特征包括pH-依赖性的特异性结合。
4.权利要求1的分子阱,其中所述空间阻碍聚合物选自蛋白或肽,诸如牛血清白蛋白;聚合物,诸如葡聚糖醛或氨基葡聚糖;化合物,诸如乙二胺,四亚乙基五胺,离子带电的部分,或磺基-N-羟基琥珀酰亚胺乙酸酯。
5.减少测定中的游离-半抗原的干扰的方法,所述方法包括:
组合测定组分和具有所测试的分析物和过量游离-半抗原的患者样品以形成测定溶液,所述测定组分包含包括半抗原和相对较大的抗半抗原的特异性结合对,半抗原和抗半抗原各自的测定-缀合物,以及对游离-半抗原选择性的分子阱;和
用所述分子阱选择性保留所述测定溶液中的所述游离-半抗原,
其中所述分子阱包含以下中的一种或混合物:具有围绕腔的壳的分子笼、分子复合物和包含修饰的抗半抗原特异性结合配偶体(sbp)的分子结构,所述修饰的抗半抗原sbp包含以下中的一种或多种:葡聚糖醛组分,结合的空间阻碍聚合物以及比其他抗半抗原特异性结合配偶体(sbp)测定组分更慢的特异性游离-半抗原结合解离速率特征。
6.权利要求5的减少干扰的方法,其中所述修饰的抗半抗原sbp的特异性游离-半抗原结合的解离速率特征比所述修饰的抗半抗原sbp的特异性游离-半抗原结合的结合速率特征更慢。
7.权利要求5的减少干扰的方法,其中所述分子复合物包含使用柔性接头与空间阻碍聚合物缀合的半抗原-类似物以及与半抗原-类似物缀合物互连的抗半抗原sbp,所述半抗原-类似物具有与所述游离-半抗原相同或更弱的对抗半抗原sbp的特异性结合特征,所述空间阻碍聚合物阻止测定溶液中的半抗原-测定缀合物接近抗半抗原sbp上的特异性半抗原结合位点,且其中测定溶液中的游离-半抗原优选结合抗半抗原sbp特异性结合位点。
8.权利要求5的减少干扰的方法,其中所述半抗原的测定-缀合物和所述抗半抗原的测定-缀合物分别选自由以下组成的测定组分的组以及该组中的两种或更多种的组合:抗体、抗原、所测试的分析物、标记物、标记酶、受体。
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