PL218788B1 - Znakowane radioaktywnie pochodne chinoliny i jej zastosowanie - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku są znakowane radioaktywnie pochodne chinoliny i jej zastosowanie.

Pochodne chinoliny wykazują aktywność antagonistów metabotropowego receptora glutaminianu, w szczególności aktywność receptora mGlu1. Ze względu na swą aktywność pochodne te znajdują zastosowanie w diagnostyce, w szczególności w oznaczaniu i identyfikacji in vitro lub ex vivo umiejscowienia metabotropowych receptorów glutaminianu i w obrazowaniu organu.

Neurotransmiter glutaminowy uważa się za główny neurotransmiter pobudzający w ośrodkowym układzie nerwowym ssaków. Wiązanie się tego neurotransmitera z metabotropowymi receptorami glutaminianu (mGluR), które są podrodziną receptorów sprzężonych z białkiem G obejmujących 8 różnych podtypów mGluR, mianowicie mGluR1 do mGluR8, aktywuje rozmaite wewnątrzkomórkowe układy wtórnych przekaźników. Receptory mGluR można podzielić na 3 grupy w zależności od homologii sekwencji aminokwasów, układu wtórnych przekaźników wykorzystywanego przez receptory i właściwości farmakologicznych. Receptory z grupy I mGluR, która obejmuje podtypy 1 i 5 mGluR, łączą się z fosfolipazą C i ich aktywacja prowadzi do wewnątrzkomórkowej mobilizacji jonów wapnia. Receptory z grupy II mGluR (mGluR2 i 3) i receptory z grupy III mGluR (mGluR4, 6, 7 i 8) łączą się z cyklazą adenylową i ich aktywacja powoduje zmniejszenie stężenia wtórnego przekaźnika cAMP, a w konsekwencji stłumienie aktywności neuronalnej. Wykazano, że leczenie antagonistami receptorów mGluR grupy I przekłada się w przestrzeni okołosynaptycznej na zmniejszenie uwalniania glutaminianu i na zmniejszenie postsynaptycznego pobudzenia neuronalnego wywoływanego przez glutaminian. Ponieważ uważa się, że rozmaite procesy patofizjologiczne i stany chorobowe ośrodkowego układu nerwowego powstają na skutek nadmiernego pobudzenia neuronów ośrodkowego układu nerwowego wywołanego glutaminianem, antagoniści grupy I mGluR, w szczególności antagoniści mGluR1 mogliby okazać się terapeutycznie korzystni w leczeniu chorób ośrodkowego układu nerwowego, w szczególności chorób psychiatrycznych i neurologicznych.

Jednakże, aż do chwili obecnej, nie były dostępne żadne specyficzne ligandy mGluR1, co znacznie utrudniało badanie receptorów mGlu1, w szczególności radioautograficzne badania dokładnego rozmieszczenia i ilości tych receptorów w częściach mózgu. Dla grupy I dotychczas dostępny był tylko ₃

[³H]glutaminian, stosowany na receptorach mGlu1a szczura (Thomsen i in.; Brain Res. 619: 22-28,

1993) lub człowieka (Kingston i in., Neuropharmacology 37: 277-287, 1998). Dla receptora mGlu1a ₃ i receptora mGlu5 dostępny jest [³H]kwiskwalan, jednakże receptor ten nie jest specyficzny dla receptora mGlu1 (łączy także się z receptorem AMPA) i jest konkurencyjny, tj. wypiera glutaminian (Mutel i in., J. Neurochem. 75: 2590-2601, 2000).

Celem tego wynalazku było wytworzenie odpowiednich specyficznych, w szczególności niekonkurencyjnych ligandów receptora mGlu1.

Twórcy wynalazku opracowali poszczególne grupy związków, które - w postaci znakowanej izotopem - stanowią odpowiednie swoiste, w szczególności niekompetycyjne, ligandy receptora mGlu1 oraz sposób znakowania i identyfikacji miejsc występowania metabotropowych receptorów glutaminianu i obrazowania narządu.

Stosowany w tym zgłoszeniu termin „specyficzny” oznacza, że ligand łączy się preferencyjnie z receptorem mGlu1. Termin „niekompetycyjny” oznacza, że ligand nie wypiera lub tylko nieznacznie wypiera, glutaminian związany z receptorem mGlu1.

WO nr 02/28 837 ujawnia nieradioaktywne związki według wynalazku.

WO nr 99/26 927 ujawnia antagonistów mGluR grupy I do leczenia zaburzeń i chorób neurologicznych, których budowa opiera się, między innymi, na strukturze chinoliny.

WO nr 99/03 822 ujawnia bicykliczne ligandy metabotropowych receptorów glutaminianu, z których żaden nie opiera się na strukturze chinoliny lub chinolinonu.

WO nr 94/27 605 ujawnia 1,2,3,4-tetrahydrochinolino-2,3,4-trion-3 lub 4-oksymy i ich zastosowanie do leczenia i zapobiegania utracie neuronów, chorobom neurodegeneracyjnym, szkodliwym skutkom nadmiernej aktywności aminokwasów pobudzających i stanom lękowym, jak również ich radioaktywnie znakowane związki.

JP nr 2000 169 450 ujawnia pochodne kwasu 6-arylochinolinokarboksylowego, które wykazują antagonizm wobec receptora kwasu glutaminowego, zwłaszcza mających wysokie powinowactwo i selektywność wobec receptora AMPA.

Publikacja „Trends in Pharmacological Sciences”, Elsevier Trends Journal, Cambridge, GB, vol.

21, nr 4, kwiecień 2000, str. 149-154) jest przeglądem ujawniającym pochodne kwasu kinurenowego,

PL 218 788 B1 które są użyteczne w neuroprotekcji jako antagoniści receptorów glutaminowych. Związki według tej publikacji różnią się od związków według wynalazku podstawieniem rdzenia chinolinowego.

Publikacja S. Sing-Yuen i wsp., „Hydroxy-quinolin-2-ones: inhibitors of [H]-glycine binding to the site associated with the NMDA receptor”, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, Oxford, GB, vol. 6, ₃ nr 5, 5 marca 1996 (1996-03-05), str. 499-504 ujawnia 3-hydroksychinolin-2-ony jako inhibitory [³H]₃

-glicyny i [³H]-AMPA związane z korowymi membranami szczurów. Związki te różnią się pod względem budowy od związków według wynalazku wzorem podstawienia rdzenia chinolinowego.

₃

Publikacja Vincent Mutel i wsp. „Characterization of (³H)quisqualate binding to recombinant rat metabotropic glutamate 1a i 5a receptors and to rat and human brain sections”, Journal of Neurochemistry, vol. 75, nr 6, grudzień 2000 (2000-12), str. 2590-2601, ujawnia, że [³H]-kwiskwalan jest nieselektywnym kompetycyjnym agonistą, który oddziaływuje wzajemnie z receptorami mGlu1 i mGlu5, a także z receptorami jonotropowymi (wiąże się on także z receptorem AMPA). Jest to w sprzeczności z niniejszym wynalazkiem, w którym poszukuje się selektywności.

Publikacja C. T. Peng i wsp., „An evaluation of diffrent methods for tritrium labelling fusion technology”, American Nuclear Society, Lagrande Park Illinois, US, vol. 21, nr 2, PT 2, 1 marzec 1992, str. 307-311, ujawnia i ocenia różne metody znakowania trytem.

Publikacja Brundish i wsp., „Tritium labelling by selective denomination”, Journal of Labelled Compounds and Radiopharmaceuticals, Sussex, GB, vol. 12, 1988, str. 1361-1369 ujawnia metodę znakowania trytem i selektywne odbromowanie związków zawierających zarówno chlor lub podwójne wiązanie i brom.

Niniejszy wynalazek dotyczy znakowanej radioaktywnie pochodnej chinoliny, będącej jednym ze związków (a), (b), (c), (d) i (e):

jej farmaceutycznie dopuszczalnej soli addycyjnej i stereochemicznej postaci izomerycznej.

PL 218 788 B1

Korzystną pochodną według wynalazku jest związek (a).

Dalszym aspektem wynalazku jest zastosowanie wyżej określonej znakowanej radioaktywnie pochodnej chinoliny w metodzie diagnostycznej, przy czym ta metoda diagnostyczna obejmuje znakowanie lub identyfikację in vitro lub ex vivo receptora mGlu1 w materiale biologicznym.

Zastosowanie znakowanej radioaktywnie pochodnej chinoliny polega według wynalazku na tym, że znakowanie obejmuje traktowanie materiału biologicznego pochodną, a identyfikacja polega na wykrywaniu emisji pochodzącej z tej pochodnej.

Zastosowanie znakowanej radioaktywnie pochodnej chinoliny polega według wynalazku na tym, że metoda diagnostyczna obejmuje badanie przesiewowe czy związek testowy wykazuje zdolność do zajęcia lub wiązania się z receptorem mGlu1 w materiale biologicznym.

Zastosowanie znakowanej radioaktywnie pochodnej chinoliny polega według wynalazku na tym, że materiał biologiczny wybiera się z grupy obejmującej próbki tkanki, osocza, płyny fizjologiczne, części ciała i narządy pochodzące od zwierząt ciepłokrwistych.

Termin „znakowany radioaktywnie związek” oznacza dowolny związek o wzorze (a), (b), (c), (d) i (e), jego farmaceutycznie dopuszczalną sól addycyjną lub stereochemiczną formę izomeryczną, który zawiera co najmniej jeden radioaktywny atom. Zgodnie z niniejszym zgłoszeniem, związki, które nie zawierają radioaktywnego atomu nie są oznaczone gwiazdką przy numerze związku, związki które zawierają radioaktywny atom są oznaczone gwiazdką przy numerze związku. Związki można znakować, z zastosowaniem radionuklidów emitujących promieniowanie pozytronowe lub gamma. W technikach wiązania radioligandów (test przeponowego receptora) stosowanym radioaktywnym atomem jest ₃ atom [³H]. Do celów obrazowania, najpowszechniej stosowanymi radionuklidami (PET) emitującymi

-1 -1 -1 Q 4C 40 1 1 1ft promieniowanie pozytronowe są ¹¹C, ¹⁸F, ¹⁵O i ¹³N, przy czym według wynalazku stosuje ¹¹C i ¹⁸F, wszystkie powstają w akceleratorze i mają odpowiednio czasy półtrwania 20, 100, 2 i 10 minut. Z uwagi na tak krótkie czasy półtrwania tych radionuklidów stosowanie ich jest rozsądne w przypadkach dostępności do akceleratora, w którym są wytwarzane, co zatem ogranicza ich zastosowanie. Najszerzej stosowane są ¹⁸F, ^99mTc, ²⁰¹Tl i ¹²³I.

W szczególności, radioaktywny atom jest wybrany spośród takich jak atom wodoru, węgla i atom fluoru.

11 18 122 123 125

W szczególności, radioaktywny atom jest wybrany spośród takich jak ³H, ¹¹C, ¹⁸F, ¹²²I,¹²³I, ¹²⁵I, ¹³¹I,⁷⁵Br, ⁷⁶Br, ⁷⁷Br i ⁸²Br.

Korzystnie, według wynalazku, radioaktywny atom jest wybrany spośród takich jak ³H, ¹¹C i ¹⁸F.

W celu szerszego zilustrowania wynalazku, dalszą ilustrację przedstawiono w odniesieniu do wzoru ogólnego (I-A) i (I-A)*, przy czym wzór oznaczony gwiazdką (*) odnosi się do związków znakowanych radioaktywnie:

w którym to wzorze:

R¹ oznacza 4-³H-benzyl, 4-metoksycykloheksyl i 1-F-4-metoksycykloheksyl lub 1-F-4-metoksycykloheksyl;

R² oznacza ¹⁸F lub ¹¹CH₃;

₃

R³ oznacza etyl;

lub R² razem z R³ oznaczają dwuwartościową grupę o wzorze -CH2CH2CH2-O-;

R⁴ oznacza atom wodoru;

ich farmaceutycznie dopuszczalnych soli addycyjnych i stereochemicznych form izomerycznych. Solami związków o wzorze (I-A)* są te, w których przeciwjon jest farmaceutycznie dopuszczalny. Jednakże, sole kwasowe i zasadowe, które nie są farmaceutycznie dopuszczalne mogą także

PL 218 788 B1 znaleźć zastosowanie, np. do wytwarzania lub oczyszczania farmaceutycznie dopuszczalnego związku. Wszystkie te sole są objęte zakresem wynalazku.

Wymienione powyżej farmaceutycznie dopuszczalne sole addycyjne są terapeutycznie aktywnymi, nietoksycznymi formami soli addycyjnej z kwasem, które związki o wzorze (I-A)* mogą tworzyć. Można je dogodnie otrzymać, traktując zasadę odpowiednimi kwasami, takimi jak kwasy nieorganiczne, np. kwasy fluorowcowodorowe, np. chlorowodorowy, bromowodorowy itp.; kwas siarkowy; azotowy; fosforowy itp.; lub kwasy organiczne, np. octowy, propanowy, hydroksyloctowy, 2- hydroksypropanowy, 2-oksopropanowy, szczawiowy, malonowy, bursztynowy, maleinowy, fumarowy, jabłkowy, winowy, 2-hydroksy-1,2,3-propanotrikarboksylowy, metanosulfonowy, etanosulfonowy, benzenosulfonowy, 4-metylobenzenosulfonowy, cykloheksanoamidosulfonowy, 2-hydroksybenzoesowy, 4-amino-2-hydroksybenzoesowy, itp. kwasy. W przeciwieństwie do tego formę soli można przekształcić działając ługiem w postaci wolnej zasady.

Związki o wzorze (I-A)* zawierające kwasowe protony można przekształcić w ich terapeutycznie aktywną nietoksyczną sól addycyjną z metalem lub aminą, działając odpowiednimi organicznymi i nieorganicznymi zasadami. Odpowiednie sole zasadowe obejmują np. sole amoniowe, sole metali alkalicznych i ziem alkalicznych, np. sole litu, sodu, potasu, magnezu, wapnia itp., sole z organicznymi zasadami, takimi jak np. pierwszorzędowe, drugorzędowe i trzeciorzędowe alifatyczne i aromatyczne aminy, takie jak metyloamina, etyloamina, propyloamina, izopropyloamina, cztery izomery butyloaminy, dimetyloamina, dietyloamina, dietanoloamina, dipropyloamina, diizopropyloamina, di-n-butyloamina, pirolidyna, piperydyna, morfolina, trimetyloamina, trietyloamina, tripropyloamina, chinuklidyna, pirydyna, chinolina i izochinolina, benzatyna, N-metylo-D-glukamina, 2-amino-2-(hydroksymetylo)-1,3-propanodiol, sole hydrabaminy i sole z aminokwasami, takimi jak np. arginina, lizyna itp. W przeciwieństwie do tego formę soli można przekształcić działając kwasem w jego wolnej formie.

Termin „sól addycyjna” obejmuje także hydraty i solwatowane formy addycyjne, które mogą być wytworzone przez związki o wzorze (I-A)*.

Przykładami takich form są np. hydraty, alkoholany, itp.

Należy rozumieć, że pewne związki według wynalazku mogą zawierać jedno lub więcej centrów chiralnych i mogą występować w stereochemicznej formie izomerycznej.

Stosowany tu wcześniej termin „stereochemiczne formy izomeryczne” określa wszystkie możliwe formy stereoizomeryczne, które związki według wynalazku lub fizjologicznie funkcyjne pochodne mogą posiadać. W przeciwnym razie wymienione lub wskazane, chemiczne oznaczenie związków wskazuje mieszaninę wszystkich możliwych form stereoizomerycznych, wymienione mieszaniny zawierają wszystkie diastereomery i enancjomery o podstawowej budowie cząsteczkowej, jak również wszystkie z poszczególnych form izomerycznych związków według wynalazku, zasadniczo w wolnej postaci, np. wraz z poniżej 10%, korzystnie, poniżej 5%, w szczególności poniżej 2% i najkorzystniej poniżej 1% innych izomerów.

Stereochemiczne formy izomeryczne związków według wynalazku, zgodnie z zamierzeniem, są objęte zakresem wynalazku. To samo dotyczy opisanych tu związków pośrednich, użytych w celu przygotowania związków końcowych według wynalazku.

Terminy cis i trans stosuje się tu zgodnie z nomenklaturą Chemical Abstracts.

Dla niektórych związków według wynalazku i związków pośrednich użytych do ich wytwarzania, nie określono bezwzględnej konfiguracji stereochemicznej. W tych przypadkach, forma stereoizomeryczna, którą wydzielono jako pierwszą jest wskazana jako „A”, a druga jako „B”, bez późniejszego odniesienia do faktycznej konfiguracji stereochemicznej. Jednakże, wymienione formy stereoizomeryczne „A” i „B” można jednoznacznie scharakteryzować poprzez właściwości fizykochemiczne takie jak ich skręcalność optyczna, w przypadku „A” i „B”, określająca stosunek enancjomeryczny. Fachowiec w dziedzinie jest w stanie określić bezwzględną konfigurację takich związków, stosując metody znane w dziedzinie takie jak np. dyfrakcja promienia rentgenowskiego. W przypadku, gdy „A” i „B” są mieszaninami stereoizomerycznymi, można je następnie rozdzielić, uzyskując odpowiednio pierwsze frakcje oznaczone jako „A1” i „B1” oraz drugie frakcje oznaczone jako „A2” i „B2”, bez dalszego odniesienia do faktycznej konfiguracji stereochemicznej.

Niektóre ze związków według wynalazku mogą także występować w ich formach tautomerycznych. Takie formy, chociaż nie są wyraźnie wskazane w powyższym wzorze, zgodnie z zamierzeniem są objęte zakresem wynalazku. Szczególnie interesujące są te związki o wzorze (I-A)* i (I-B)*, które są stereochemicznie czyste.

PL 218 788 B1

Tak więc, związkami według wynalazku są następujące związki radioaktywne:

Wszystkie związki według wynalazku przejawiają średnią lub dużą aktywność mGluR1. Aktywność tę przypisuje się między innymi swoistemu wiązaniu się tego związku z receptorem mGlu1, co powoduje przydatność związków w diagnostyce, np. do znakowania i wykrywania miejsc występowania receptora mGlu1.

Wynalazek dotyczy zatem także związku znakowanego radioaktywnie według wynalazku do zastosowania w diagnostyce in vitro lub ex vivo.

Pierwsze korzystne rozwiązanie (radionuklid emitujący promieniowanie gamma)

Według pierwszego korzystnego rozwiązania, radioznakowany związek zawiera co najmniej jeden atom [³H] lub jeden atom [¹⁸F]. Atom [³H] dogodnie jest wprowadzony przez częściowe lub całko₁ wite zastąpienie jednego lub więcej nieradioaktywnych atomów [¹H] wodoru w cząsteczce przez ich ₃ radioaktywne izotopy. Ligandy [³H] oznacza się ilościowo z zastosowaniem metody LSC (cieczowych liczników scyntylacyjnych).

W technikach polegających na wiązaniu liganda znakowanego radioaktywnie, w testach in vitro receptorów błonowych do znakowania lub identyfikacji receptora mGlu1 w materiale biologicznym, ₃ korzystnie stosuje się związek znakowany radioaktywnie, zawierający co najmniej jeden atom [³H].

Ponieważ związki według wynalazku mają korzystną i nieoczekiwaną zdolność łatwego przeni₃ kania bariery krew-mózg, związki znakowane radioaktywnie, zawierające co najmniej jeden atom [³H], można stosować do autoradiografii in vivo receptora mGlu1 w mózgu.

Wynalazek dotyczy zatem także znakowanego radioaktywnie związku według wynalazku używanego w metodzie diagnostycznej in vitro lub ex vivo, polegającej na wyznakowaniu lub identyfikacji receptora mGlu1 w materiale biologicznym, jak również zastosowania związków według wynalazku do wytworzenia narzędzia diagnostycznego do znakowania lub identyfikacji receptora mGlu1 w materiale biologicznym. Stosowany w tym zgłoszeniu termin „materiał biologiczny” oznacza jakąkolwiek subPL 218 788 B1 stancję pochodzenia biologicznego. W szczególności dotyczy to próbek tkanki, próbek płynów osocza, próbek płynów fizjologicznych, pochodzących od zwierząt ciepłokrwistych, w szczególności człowieka.

Podstawowymi doświadczeniami przeprowadzanymi z zastosowaniem układu testowego z wykorzystaniem błon do znakowania lub identyfikacji receptora mGlu1 w materiale biologicznym są: badania wysycania, badanie hamowania, badanie kinetyki asocjacji i badanie kinetyki dysocjacji. Metody te można stosować w większości układów receptorowych neurotransmiterów i hormonów, obejmujących układ mGluR1 (Methods for Neurotransmitter Receptor Analysis, wyd., Henry I. Yamamura i in., Raven Press Ltd., New York, 1990). W tym celu, na przykład do autoradiografii receptorów ex vivo, aby uwidocznić receptory mGlu1, do materiału biologicznego podaje się znakowany radioaktywnie związek i wykrywa się emisję radioaktywnie znakowanego związku w celu określenia ilości lub umiejscowienia receptorów mGlu1.

₃

Znakowane radioaktywnie związki według wynalazku zawierające co najmniej jeden atom [³H] lub jeden atom [¹⁸F] znajdują także zastosowanie jako środki przesiewowe określające czy dany związek testowy ma zdolność zajęcia lub połączenia się z receptorem mGlu1. Stopień, w jakim związek testowy wypiera związek według wynalazku z miejsca wiązania z receptorem mGlu1 pokazuje zdolność związku testowego do zajmowania lub łączenia się z receptorem mGlu1, a więc do zachowywania się albo jak agonista, albo jak antagonista lub jako mieszany agonista/antagonista receptora ₃ mGlu1. Radioznakowane związki według wynalazku zawierające co najmniej jeden atom [³H], korzystnie, wytworzono przez zastąpienie atomu fluorowca atomem trytu, jak udokumentowano w sekcji doświadczalnej poniżej.

Drugie korzystne rozwiązanie (radionuklid emitujący promieniowanie pozytronowe)

W drugim korzystnym rozwiązaniu, radioznakowany związek zawiera co najmniej jeden radioaktywny węgiel lub atom fluorowca. W zasadzie, dowolny związek o wzorze (I) zawierający atom węgla lub atom fluorowca nadaje się do znakowania przez zastąpienie atomu węgla lub atomu fluorowca odpowiednim radioaktywnym izotopem lub przez wytworzenie związków o wzorze (I) z zastosowaniem reagentów radioaktywnie znakowanych. Do tego celu odpowiednimi radioizotopami fluorowca są radioaktywny węgiel, np. [¹¹C]; radioaktywne radioaktywne fluorki, np. [¹⁸F].

Wytwarzanie związków radioaktywnych

Radioaktywny atom fluorowca można wprowadzić przeprowadzając odpowiednią reakcję, jak to przedstawiono poniżej:

przy czym wszystkie podstawniki we wzorze (I-A-a) i (I-A-a)* są określone jak we wzorze (I-A)* i halo oznacza atom fluorowca. Odpowiedni związek o wzorze (I-A-a) poddaje się reakcji z H[¹⁸F] tak, aby obecny w pierścieniu chinoliny atom fluorowca został w reakcji podstawienia nukleofilowego zastąpiony przez radioaktywny atom [¹⁸F].

Inne metody znakowania trytu ujawniono np. w publikacjach Peng'a i in., Fusion Technology. American Nuclear Society, 21 (2): 307-311, 1992 i Brundish'a i in. Journal of Labelled Compounds and Radiopharmaceuticals 25 (12): 1361-1369 (1988). Wprowadzenie radioaktywnego [¹¹C] można przeprowadzić stosując poniższy schemat reakcji, na którym odpowiedni związek o wzorze (I-A-a) przeprowadza się najpierw w pochodną cynową, następnie wprowadza się radioaktywny, stosując np. katalizowane palladem sprzęganie typu Stille'ego z zastosowaniem jodku [¹¹C] metylu (Scott, W. J.; Crisp, G. T.; Stille, J. K. J. Am. Chem. Soc., 1984, 106, 4630).

PL 218 788 B1

We wzorze (I-A-a), (I-A-b) i (I-A-c)*, wszystkie podstawniki mają takie samo znaczenie jak zdefiniowano dla wzoru (I-A)*, halo oznacza atom fluorowca i R¹⁷ oznacza metyl lub butyl.

Ze względu na swoją nieoczekiwaną właściwość łatwego przenikania przez barierę krew-mózg, znakowane radioaktywnie związki zawierające radioaktywny atom fluorowca można podawać in vivo zwierzęciu, w odpowiedniej kompozycji, szczególnie zwierzęciu stałocieplnemu, oraz wykrywa się położenie tych znakowanych radioaktywnie związków stosując techniki obrazowania, takie jak na przykład tomografia komputerowa emisji JBB pojedynczego fotonu (SPECT) lub tomografia pozytronowa emisyjna (PET), itp. Tym sposobem można wykryć rozmieszczenie receptorów mGlu1 w organizmie i uwidocznić, za pomocą wymienionych powyżej technik obrazowania, narządy zawierające receptory mGlu1, takie jak np. mózg. Tak więc, związki według wynalazku o wzorach (a), (b), (c), (d) i (e) można stosować w wyżej opisanych technikach, w szczególności do wytworzenia narzędzia diagnostycznego do zastosowania w PET. Do zastosowania w PET, najbardziej korzystne są znakowane radioaktywnie związki według wynalazku zawierające (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 931 270 Horn i in., opublikowany 5 czerwca 1990).

Wytwarzanie związków nieradioaktywnych

Nieradioaktywne związki według wynalazku można wytwarzać wieloma metodami.

W celu uproszczenia strukturalnej reprezentacji niektórych z obecnych związków oraz związków pośrednich w następujących sposobach wytwarzania, grupę chinolinową lub chinolinonową oznaczono symbolem Q.

R⁴

Związki o wzorze (I-A), w których X oznacza O, o wzorze (IA/B-a), można wytworzyć przez utlenienie związku pośredniego o wzorze (II) w obecności odpowiedniego środka utleniającego, takiego jak nadmanganian potasu oraz odpowiedniego katalizatora przeniesienia fazowego, takiego jak tris(dioksa-3,6-heptylo)amina, w odpowiednim obojętnym rozpuszczalniku takim jak np. dichlorometan.

Związki o wzorze (IA/B-a) można także wytworzyć przez poddanie związku pośredniego o wzorze (III) reakcji ze związkiem pośrednim o wzorze (IV), w którym W1 oznacza atom fluorowca, np. bromu, w obecności butylolitu i odpowiedniego obojętnego rozpuszczalnika, takiego jak np. tetrahydrofuran.

O

1 II

R¹—C=N + W,-Q -► R— C—Q (III) (IV) (Ift-b-a)

Alternatywnie, związki o wzorze (IA/B-a) można także wytworzyć przez poddanie związku pośredniego o wzorze (V) reakcji ze związkiem pośrednim o wzorze (IV) w obecności butylolitu i odpowiedniego obojętnego rozpuszczalnika, takiego jak np. tetrahydrofuran.

_zO-CH_{3 1} f?

R¹—_C—N _{+ Wr}Q -> R— C—Q

Yh₃ (V) (IV) ilA/B-a) ₁

Związki o wzorze (IA/B-a), którym podstawnik R¹ jest poprzez atom tlenu związany przy grupie

1a karbonylowej, wymieniony podstawnik R¹ o wzorze O-R^1a i o wzorze (IA/B-a-1) można wytworzyć przez poddanie związku pośredniego o wzorze (VI) reakcji ze związkiem pośrednim o wzorze (VII) w obecności odpowiedniego kwasu, takiego jak kwas siarkowy.

PL 218 788 B1 ο ο

R¹ — oh + HO—C—Q -► R¹ — O—C—Q (VI) (VII) (I_A/_B-a-l) ₂

Związki o wzorze (I-A), w którym R² oznacza metylokarbonyl, o wzorze (I-A-1), można wytworzyć, poddając reakcji związek pośredni o wzorze (VIII) w obecności odpowiedniego kwasu takiego jak kwas chlorowodorowy oraz odpowiedniego obojętnego rozpuszczalnika, takiego jak np. tetrahydrofuran.

Związki o wzorze (I) można także poddać wzajemnej konwersji, stosując znane w dziedzinie przekształcenia.

₂

Związki o wzorze (I-A), w którym R² oznacza atom fluorowca taki jak atom chloru, można na drodze reakcji z odpowiednim środkiem fluorowcującym, takim jak np. fluorek potasu lub jodek sodu, w obecności odpowiedniego obojętnego rozpuszczalnika, np. sulfotlenku dimetylu lub acetonitrylu ₂ i ewentualnie w obecności chlorku acetylu przekształcić w związek o wzorze (I-A), w którym R² oznacza inny atom fluorowca, taki jak atom fluoru lub jodu.

₂

Związki o wzorze (I-A), w którym R² oznacza odpowiednią grupę opuszczającą, taką jak atom ₂ fluorowca, np. atom chloru, jodu, oznaczoną symbolem W², o wzorze (I-A-2) można na drodze reakcji z odpowiednim środkiem wprowadzającym grupę cyjano, takim jak np. trimetylosilanokarbonitryl, w obecności odpowiedniej zasady takiej jak N,N-dietyloetanoamina i odpowiedniego katalizatora, ta₂ kiego jak np. tetrakis(trifenylofosfino)pallad, przekształcić w związek o wzorze (I-A), w którym R² oznacza cyjano, reprezentowany wzorem (I-A-3).

Związki o wzorze (I-A-2) można także na drodze reakcji z C2-6alkinylotri(C1-6alkilo)silanem w obecności Cul, odpowiedniej zasady takiej jak np. N,N-dietyloetanoamina oraz odpowiedniego katalizatora, takiego jak np. tetrakis(trifenylofosfino)pallad, poddać konwersji do związku o wzorze (I-A-4). Związki o wzorze (I-A-4) można następnie na drodze reakcji z fluorkiem potasu, w obecności odpowiedniego kwasu takiego jak kwas octowy, lub na drodze reakcji z odpowiednią zasadą, taką jak wodorotlenek potasu, w obecności odpowiedniego obojętnego rozpuszczalnika takiego jak alkohol, np. metanol itp., poddać konwersji do związku o wzorze (I-A-5).

Związki o wzorze (I-A-2) można także na drodze reakcji ze związkiem pośrednim o wzorze (IX) w obecności Cul, odpowiedniej zasady, takiej jak np. N,N-dietyloetanoamina oraz odpowiedniego katalizatora, takiego jak tetrakis(trifenylofosfino)pallad, poddać konwersji do związku o wzorze (I-A-6).

₂

Związki o wzorze (I-A-2) można także poddać konwersji do związku, w którym R² oznacza C1-6alkil, reprezentowanego wzorem (I-A-8) w obecności odpowiedniego czynnika alkilującego, takiego jak ₂ np. Sn(C2-6alkil)4 lub do związku, w którym R² oznacza C2-6alkenyl, reprezentowanego wzorem (I-A-9) w obecności odpowiedniego czynnika alkenylującego, takiego jak np. Sn(C2-6alkenylo)(C1-6alkil)3, obie reakcje prowadzi się w obecności odpowiedniego katalizatora, takiego jak np. tetrakis(trifenylofosfino)pallad oraz obojętnego rozpuszczalnika, takiego jak np. toluen lub dioksan.

Związki o wzorze (I-A-2) można także na drodze reakcji ze związkiem pośrednim o wzorze (X), ewentualnie w obecności odpowiedniej zasady, takiej jak diwęglan potasu oraz obojętnego rozpuszczalnika, takiego jak N,N-dimetyloformamid, poddać konwersji do związku o wzorze (I-A-7), w którym Z oznacza O lub S.

Związki o wzorze (I-A-2) można także, poddać konwersji do związku o wzorze (I-A), w którym ₂

R² oznacza C1-6alkilooksykarbonyl, reprezentowanego wzorem (I-A-10) i związku o wzorze (I-A), ₂ w którym R² oznacza atom wodoru, reprezentowanego wzorem (I-A-11), na drodze reakcji z odpowiednim alkoholem o wzorze C1-6alkil-OH i CO w obecności odpowiedniego katalizatora, takiego jak

PL 218 788 B1 np. octan palladu (II), trifenylofosfina, odpowiedniej zasady, takiej jak diwęglan potasu oraz obojętnego rozpuszczalnika, takiego jak N,N-dimetyloformamid.

Związki o wzorze (I-A-ll) można także wytworzyć przez poddanie związku o wzorze (I-A-2) reakcji z cynkiem w obecności odpowiedniego kwasu, takiego jak kwas octowy.

Związki o wzorze (I-A-2) można także na drodze reakcji ze związkiem pośrednim o wzorze H2N-C1-galkilo-C(=O)-O-C1-6alkil w obecności CO, odpowiedniego katalizatora, takiego jak tetrakis(trifenylofosfino)pallad, odpowiedniej zasady, takiej jak np. N,N-dietyloetanoamina oraz odpowiedniego obojętnego rozpuszczalnika, takiego jak np. toluen, poddać konwersji do związku o wzorze (I-A), ₂ w którym R² oznacza aminokarbonyl podstawiony przez C1-6alkilooksykarbonylo-C1-6alkil, reprezentowanego wzorem (I-A-12).

C_v6alkil

Ć~0—C_t-₆aikil

II o

PL 218 788 B1

Związki o wzorze (I-A-2) można także na drodze reakcji ze związkiem pośrednim o wzorze (XI), (XII) lub (XIII) w obecności odpowiedniego katalizatora, takiego jak np. tetrakis(trifenylofosfino)pallad oraz odpowiedniego obojętnego rozpuszczalnika, takiego jak np. dioksan, poddać konwersji do związ22 ku o wzorze (I-A), w którym R² oznacza aryl lub heterocykl wybrany z grupy opisanej w definicji R² 2 2a powyżej, wymieniony R² jest określony przez R^2a, reprezentowanego wzorem (I-A-13).

Związki o wzorze (I-A-2) można także na drodze reakcji z hydrazynokarboaldehydem lub azydkiem sodu w odpowiednim rozpuszczalniku obojętnym, takim jak N,N-dimetyloformamid lub alkohol, ₅ np. butanol, poddać konwersji do związku o wzorze (I-B), w którym Y i R⁵ razem tworzą rodnik o wzorze (b-1) lub (b-2), reprezentowanego wzorem (I-B-1) lub (I-B-2).

Związki o wzorze (I-A-11) można na drodze reakcji z odpowiednim nadtlenkiem, takim jak kwas

3-chloronadbenzoesowy, w odpowiednim rozpuszczalniku obojętnym, takim jak na przykład chlorek metylenu przekształcić do odpowiedniego N-tlenku, reprezentowanego wzorem (I-A-14), który można następnie na drodze reakcji z chlorkiem 4-metylobenzenosulfonylu w obecności odpowiedniej zasady, takiej jak np. diwęglan potasu i odpowiedniego obojętnego rozpuszczalnika, takiego jak np. chlorek ₅ metylenu, poddać konwersji do związku o wzorze (I-B), w którym R⁵ oznacza atom wodoru, reprezentowanego wzorem (I-B-3).

PL 218 788 B1

Związki o wzorze (I-B-3) można także na drodze reakcji z odpowiednim kwasem takim jak kwas chlorowodorowy, w obecności odpowiedniego obojętnego rozpuszczalnika takiego jak np. tetrahydro₂ furan wytworzyć ze związku o wzorze (I-A), w którym R² oznacza C1-6alkilooksy, reprezentowanego wzorem (I-A-15).

Związki o wzorze (I-B-3) można na drodze reakcji z odpowiednim czynnikiem alkilującym, takim jak np. związek pośredni o wzorze (XIV), w którym W3 oznacza odpowiednią grupę opuszczającą, taką jak atom fluorowca np. atom jodu, w obecności tertbutanolanu potasu oraz w obecności odpowiedniego obojętnego rozpuszczalnika, takiego jak np. tetrahydrofuran, przekształcić w związek o wzorze (I-B), w którym oznacza C1-6alkil, reprezentowany wzorem (I-B-4).

Związki o wzorze (I-B-3) można także na drodze reakcji ze związkiem pośrednim o wzorze (XV), w którym W4 oznacza odpowiednią grupę opuszczającą, taką jak atom fluorowca, np. atom bromu, chloru itp., w obecności odpowiedniej zasady, takiej jak np. wodorek sodu oraz odpowiedniego obojętnego rozpuszczalnika, takiego jak np. N,N-dimetyloformamid, poddać konwersji do związku o wzorze (I-B), w którym R⁵ oznacza C1-6alkilooksykarbonyloC1-6alkil lub aryloC1-6alkil, wymieniony R⁵

5a jest określony przez R^5a, reprezentowanego wzorem (I-B-5).

PL 218 788 B1

Związki o wzorze (I-A-2) można także na drodze reakcji z H2N-C(=S)-NH2 w obecności odpowiedniej zasady, takiej jak wodorotlenek potasu i odpowiedniego obojętnego rozpuszczalnika, takiego ₅ jak alkohol, np. etanol, lub woda, poddać konwersji do związku o wzorze (I-B), w którym R⁵ oznacza atom wodoru i Y oznacza S, reprezentowanego wzorem (I-B-6). Związki o wzorze (I-B-6) można następnie na drodze reakcji z odpowiednim C1-6fluorowcoalkilem, takim jak np. jodek C1-6alkilu, w obecności odpowiedniej zasady, takiej jak diwęglan potasu oraz odpowiedniego rozpuszczalnika, takiego ₂ jak np. aceton, poddać konwersji do związku o wzorze (I-A), w którym R² oznacza C1-6alkilotio, reprezentowanego wzorem (I-A-16).

Związki o wzorze (IA/B-a) można na drodze reakcji ze związkiem pośrednim o wzorze (XVI), ewentualnie w obecności odpowiedniej zasady, takiej jak np. N,N-diemyletanoamina oraz w obecności odpowiedniego obojętnego rozpuszczalnika, takiego jak alkohol, np. etanol, przekształcić w związki o wzorze (I-A) lub (I-B), w którym X oznacza N-R⁷, o wzorze (IA/B-b).

Ο Ν—R⁷

R¹—C—Q + R⁷^NH₂ -► R¹—C—Q (*A/B’^a) <^XVI> dA/B-^b>

Jak już wskazano w opisanej powyżej procedurze wytwarzania związków o wzorze (I-A-13), związki o wzorze (I) można także poddać konwersji do odpowiedniej formy N-tlenkowej sposobami znanymi w dziedzinie, przekształcając trójwartościowy azot w jego formę N-tlenkową. Wspomnianą reakcję N-utleniania można na ogół prowadzić, poddając substancję wyjściową o wzorze (I) reakcji z odpowiednim organicznym lub nieorganicznym nadtlenkiem. Odpowiednie nieorganiczne nadtlenki obejmują np. nadtlenek wodoru, nadtlenki metali alkalicznych lub ziem alkalicznych, np. nadtlenek sodu, potasu; odpowiednie organiczne nadtlenki mogą obejmować nadtlenokwasy, takie jak np. kwas nadbenzoesowy lub fluorowcopodstawiony kwas nadbenzoesowy, jak np. kwas 3-chloronadbenzoesowy, nadtlenokwasy alkanokarboksylowe, np. nadtlenokwas octowy, nadtlenki alkilu, np. nadtlenek tert-butylu. Odpowiednie rozpuszczalniki stanowią np. woda, niższe alkanole, np. etanol itp., węglowodory, np. toluen, ketony, np. 2-butanon, fluorowcowane węglowodory, np. dichlorometan oraz mieszaniny tych rozpuszczalników.

Pewne związki pośrednie i substancje wyjściowe użyte w powyższych metodach są dostępne w handlu lub mogą być zsyntetyzowane metodami już opisanymi w literaturze.

Związki pośrednie o wzorze (II) można wytworzyć przez poddanie związku pośredniego o wzo₅ rze (XVII) reakcji ze związkiem pośrednim o wzorze (XVIII), w którym W⁵ oznacza odpowiednią grupę opuszczającą, taką jak atom fluorowca, np. atom chloru, bromu itp., w obecności magnezu, eteru dietylowego i odpowiedniego obojętnego rozpuszczalnika, takiego jak eter dietylowy.

O OH

Q—C—H + R¹—Wg -► R¹—CH-Q (XVII) (XVIII) (II)

Związki pośrednie o wzorze (XVII) można wytworzyć, utleniając związek pośredni o wzorze (XIX) w obecności odpowiedniego środka utleniającego takiego jak MnO2 i odpowiedniego obojętnego rozpuszczalnika, takiego jak chlorek metylenu.

PL 218 788 B1

Związki pośrednie o wzorze (XIX) można wytworzyć, redukując związek pośredni o wzorze (XX) w obecności odpowiedniego czynnika redukującego, takiego jak wodorek litowoglinowy i odpowiedniego obojętnego rozpuszczalnika, takiego jak tetrahydrofuran.

Związki pośrednie o wzorze (XX), w których Q oznacza grupę chinolinową, ewentualnie podstawioną w pozycji 3 C1-6alkilem oraz w których grupę karbonylową umieszcza się w pozycji 6, o wzorze (XX-a), można wytworzyć, poddając związek pośredni o wzorze (XXI) reakcji ze związkiem pośrednim o wzorze (XXII) w obecności 3-nitrobenzenosulfonianu sodu, odpowiedniego kwasu, takiego jak kwas siarkowy oraz odpowiedniego alkoholu, np. metanolu, etanolu, propanolu, butanolu, itp.

Alternatywnie, związki pośrednie o wzorze (II) można także wytworzyć, poddając związek pośredni o wzorze (XXIII) reakcji ze związkiem pośrednim o wzorze (XXIV), w którym W6 oznacza odpowiednią grupę opuszczającą, taką jak atom fluorowca, np. atom bromu, chloru itp., w obecności odpowiedniego odczynnika, takiego jak butylolit oraz odpowiedniego obojętnego rozpuszczalnika, takiego jak tetrahydrofuran.

O OH _R ¹_^_H + Q—Wg -► R¹—CH—G (XXIII) (XXIV) (II!

Związki pośrednie o wzorze (XXIII) można wytworzyć, utleniając związek pośredni o wzorze (XXV) z zastosowaniem reakcji utleniania Moffatt'a Pfitzner'a lub Swern'a (związki addycyjne dimemylosulfotlenku ze środkami odwadniającymi, np. DCC, AC2O, SO3, P4O10, COCI2 lub Cl-CO-COCl) w obojętnym rozpuszczalniku, takim jak chlorek metylenu.

Związki pośrednie o wzorze (XXV) można wytworzyć, redukując związek pośredni o wzorze (XXVI) w obecności odpowiedniego czynnika redukującego, takiego jak np. wodorek litowoglinowy oraz odpowiedniego obojętnego rozpuszczalnika, takiego jak benzen.

O

R¹-C-O-CV6alkil -► R¹-CH2~OH (XXVI) (XXV)

PL 218 788 B1

Związki pośrednie o wzorze (XXVI) można wytworzyć ze związku pośredniego o wzorze (XXVII) przeprowadzając estryfikację w obecności odpowiedniego alkoholu, takiego jak metanol, etanol, propanol, butanol i itp. oraz odpowiedniego kwasu, takiego jak kwas siarkowy.

₁

Związki pośrednie o wzorze (XXVII), w którym R¹ oznacza rodnik o wzorze (a-1), w którym Z1 oznacza O, Z2 oznacza CH2 oraz n oznacza 1, o wzorze (XXVII-a) można wytworzyć, redukując związek pośredni o wzorze (XXVIII) w obecności odpowiedniego czynnika redukującego, takiego jak wodór, odpowiedniego katalizatora, takiego jak pallad na węglu drzewnym oraz odpowiedniego kwasu, ₁ takiego jak kwas octowy. Gdy R¹ we wzorze związku pośredniego (XXVII) oznacza ewentualnie podstawioną grupę fenylową, związek można także poddać konwersji do ewentualnie podstawionego cykloheksylu, przeprowadzając redukcję w obecności odpowiedniego czynnika redukującego, takiego jak rod na AI2O3 oraz odpowiedniego obojętnego rozpuszczalnika, takiego jak tetrahydrofuran.

Związki pośrednie o wzorze (IV), w którym Q oznacza grupę chinolinową podstawioną w pozycji 2 atomem fluorowca, np. atomem chloru, o wzorze (IV-a) można wytworzyć, poddając reakcji, w obec₅ ności POCI3, związek pośredni o wzorze (IV), w którym Q oznacza grupę chinolinonową, w której R⁵ oznacza atom wodoru, reprezentowany wzorem (IV-b).

Związki pośrednie o wzorze (IV-a), w którym R⁴ oznacza atom wodoru, o wzorze (IV-a-1), można także wytworzyć, poddając związek pośredni o wzorze (XXIX) reakcji z POCI3 w obecności N,N-dimetyloformamidu (formylowanie Vilsmeier'a-Haack'a, następnie cyklizacja).

Związki pośrednie o wzorze (XXIX) można wytworzyć, poddając związek pośredni o wzorze (XXX) reakcji ze związkiem pośrednim o wzorze (XXXI), w którym W⁷ oznacza odpowiednią grupę

PL 218 788 B1 opuszczającą, taką jak atom fluorowca, np. atom chloru, w obecności odpowiedniej zasady, takiej jak np. N,N-dietyloetanoamina oraz odpowiedniego obojętnego rozpuszczalnika, takiego jak chlorek metylenu.

Związki pośrednie o wzorze (IV-a) można na drodze reakcji ze związkiem pośrednim o wzorze (XXXII) w obecności odpowiedniego obojętnego rozpuszczalnika takiego jak alkohol, np. metanol itp. przekształcić w związek pośredni o wzorze (IV-c).

Związki pośrednie o wzorze (IV-a) można także na drodze reakcji z odpowiednią aminą o wzorze (XXXIII-a), w którym każdy Z3 i Z4 niezależnie oznacza atom wodoru, C1-6alkil, C1-6alkilooksyC1-6alkil, C1-6alkilotioC1-6alkil, poddać konwersji do związku pośredniego o wzorze (IV-d-1) lub na drodze reakcji z odpowiednią aminą o wzorze (XXXIII-b), w którym Z3 i Z4 razem tworzą heterocykl według definicji ₂

R² powyżej, pod warunkiem, że heterocykl zawiera co najmniej jeden atom azotu, w obecności odpowiedniej zasady, takiej jak np. diwęglan potasu oraz obojętnego rozpuszczalnika, takiego jak N,N-dimetyloformamid do związku pośredniego o wzorze (IV-d-2).

₃

Związki pośrednie o wzorze (IV-a), w którym R³ oznacza CH2-CH2-CH2-CI, o wzorze (IV-a-2), można także na drodze reakcji z odpowiednim kwasem, takim jak kwas chlorowodorowy itp., poddać 23 konwersji do związku pośredniego o wzorze (IV), w którym R² i R³ razem tworzą dwuwartościowy rodnik o wzorze -O-CH2-CH2-CH2-, reprezentowanego wzorem (IV-e-1). Związki pośrednie o wzorze (IV-a-2) można także na drodze reakcji z H2N-C(=S)-NH2 w obecności odpowiedniego obojętnego rozpuszczalnika, takiego jak alkohol, np. etanol, poddać konwersji do związku pośredniego o wzorze

PL 218 788 B1 (IV), w którym R² i R³ razem tworzą dwuwartościowy rodnik o wzorze -S-CH2-CH2-CH2-, reprezentowanego wzorem (IV-e-2).

Związki pośrednie o wzorze (V) można wytworzyć, poddając związek pośredni o wzorze (XXVII) reakcji ze związkiem pośrednim o wzorze CH3-NH-O-CH3 w obecności 1,1'-karbonylodiimidazolu oraz odpowiedniego obojętnego rozpuszczalnika, takiego jak chlorek metylenu.

ο ο i II + _> 1 Η ^Ο—CK₃

R-C-OH H₃C~-NH-O-CH₃ R-C-N

CH₃ (XXVII) (V)

Związki pośrednie o wzorze (VII), w którym Q oznacza grupę chinolinową, w szczególności gru2 3 4 pę chinolinową, w której R² oznacza etyl, R³ oznacza metyl i R⁴ oznacza atom wodoru oraz grupę karboksylową umieszcza się w pozycji 6, o wzorze (VII-a), można wytworzyć na drodze reakcji związku pośredniego o wzorze (XXXIV) w obecności odpowiedniego aldehydu, takiego jak CH3-CH2-CH(=O), (CH2O)n, ZnCl2, FeCl3 oraz odpowiedniego obojętnego rozpuszczalnika, takiego jak alkohol, np. etanol.

Związki pośrednie o wzorze (VIII) można wytworzyć, poddając związek pośredni o wzorze (XXXV) reakcji ze związkiem pośrednim o wzorze (XXXVI) w obecności odpowiedniego katalizatora, takiego jak np. tetrakis(trifenylofosfino)pallad oraz odpowiedniego obojętnego rozpuszczalnika, takiego jak np. dioksan.

Można opracować jeszcze inne preparaty, a niektóre z nich ujawniono w tym zgłoszeniu w przykładach.

PL 218 788 B1

Czyste stereoizomeryczne formy związków oraz związków pośrednich według wynalazku można otrzymać stosując metody znane w dziedzinie. Diastereomery można rozdzielać fizycznymi metodami rozdzielania, takimi jak selektywna krystalizacja oraz technikami chromatograficznymi, jak np. chromatografia cieczowa z zastosowaniem chiralnych faz stacjonarnych. Enancjomery można rozdzielać metodą selektywnej krystalizacji ich diastereomerycznych soli z optycznie czynnymi kwasami. Alternatywnie, enancjomery można rozdzielać stosując techniki chromatograficzne z zastosowaniem chiralnych faz stacjonarnych. Powyższe czyste formy stereoizomeryczne mogą także pochodzić od stosownych czystych form stereoizomerycznych odpowiednich substancji wyjściowych, pod warunkiem, że reakcja przebiega stereoselektywnie lub stereospecyficznie.

Korzystnie, jeśli pożądany jest specyficzny stereoizomer, powyższy związek syntetyzuje się metodami stereoselektywnymi lub stereospecyficznymi. W tych metodach korzystnie stosuje się chiralnie czyste substancje wyjściowe. Stereoizomeryczne formy związków o wzorze (I) są objęte zakresem wynalazku.

Stereoizomer związku o wzorze (I-A) w formie cis, można przekształcić w inny stereoizomer taki jak odpowiadający izomer trans, poprzez poddanie związku reakcji z odpowiednim kwasem, takim jak kwas chlorowodorowy, w obecności odpowiedniego obojętnego rozpuszczalnika, takiego jak np. tetrahydrofuran.

Antagonistyczną aktywność danych związków względem mGluR1 można wykazać w teście transdukcji sygnału na sklonowanych komórkach CHO zawierających szczurzy mGluR1 i teście allodynii wywołanej niską temperaturą u szczurów z ligacją Bennett'a, jak opisano poniżej.

Z uwagi na swoją aktywność antagonistyczną względem mGluR, szczególnie aktywność antagonistyczną względem grupy I mGluR, a w szczególności aktywność antagonistyczną względem mGluR1, związki o wzorze (I-A), ich farmaceutycznie dopuszczalne sole addycyjne i stereochemiczne formy izomeryczne są przydatne w leczeniu lub zapobieganiu chorób ośrodkowego układu nerwowego wywołanych glutaminianem.

Choroby, w których wykazano rolę glutaminianu obejmują takie, jak uzależnienie od narkotyków lub zespół odstawienny (uzależnienie, tolerancja opioidów, odstawienie opioidów), uszkodzenia spowodowane hypoksją, anoksją i niedokrwieniem (udar niedokrwienny, zatrzymanie akcji serca), ból (ból neuropatyczny, ból zapalny, przeczulica bólowa), hipoglikemia, choroby związane z uszkodzeniem neuronów, uraz mózgu, uraz głowy, uszkodzenie rdzenia kręgowego, mielopatia, otępienie, stany lękowe, schizofrenia, depresja, upośledzona percepcja, amnezja, zaburzenia dwubiegunowe, zaburzenia zachowania, choroba Alzheimera, otępienie pochodzenia naczyniowego, mieszane (Alzheimera i naczyniowe) otępienie, demencja z ciałami Lewy'ego, stany majaczeniowe lub splątanie, choroba Parkinsona, choroba Huntingtona, zespół Downa, padaczka, starzenie się, stwardnienie zanikowe boczne, stwardnienie rozsiane, AIDS (zespół nabytego niedoboru odporności) i zespół zaburzeń związanych z AIDS (ARC).

Tak więc, związki o wzorze (I-A) można sporządzać w postaci kompozycji do podawania ssakom, w szczególności ludziom, w szczególności w celach diagnostycznych in vitro lub ex vivo, a w szczególności do obrazowania narządu zawierającego terapeutyczną ilość związku znakowanego radioaktywnie o wzorze (I-A)* i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik lub rozcieńczalnik.

Zatem, związki według wynalazku lub ich dowolne podgrupy można komponować w różne postacie farmaceutyczne do podawania. Za odpowiednie można uznać wszystkie kompozycje zazwyczaj stosowane do systematycznego podawania leków. W celu przygotowania kompozycji farmaceutycznych według wynalazku, łączy się terapeutyczną ilość danego związku, w postaci zasady lub soli addycyjnej, jako substancji czynnej w jednorodnej mieszance z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem, który może przyjąć rozmaite formy zależnie od pożądanej postaci preparatu do podawania. Te kompozycje farmaceutyczne nadają się, najlepiej w jednostkowej postaci dawkowania, do podawania doustnego, doodbytniczego, zewnętrznego, przezskórnego lub pozajelitowego przez wstrzyknięcie. Przykładowo, do przygotowania kompozycji w doustnej postaci dawkowania można stosować dowolny z zazwyczaj stosowanych środków farmaceutycznych, takich jak np. woda, glikole, oleje, alkohole itp. jak ma to miejsce w przypadku płynnych preparatów do podawania doustnego, takich jak zawiesiny, syropy, emulsje, eliksiry i roztwory: lub stałe nośniki, takie jak skrobie, cukry, kaolin, lubrykanty, lepiszcza, środki rozsadzające itp. jak ma to miejsce w przypadku proszków, pigułek, kapsułek, tabletek. Ze względu na łatwość podawania, tabletki i kapsułki stanowią najkorzystniejsze doustne jednostkowe postacie dawkowania, w przypadku których stosuje się oczywiście stałe nośniki farmaceutyczne. W kompozycjach pozajelitowych, nośnikiem jest zazwyczaj jałowa woda, co najmniej w znacznej częPL 218 788 B1 ści, choć można również włączyć inne składniki, np. w celu zwiększenia rozpuszczalności. Przykładowo, można wytworzyć roztwory do wstrzykiwania, w których nośnik stanowi roztwór soli fizjologicznej, roztwór glukozy lub roztwór będący mieszaniną soli fizjologicznej i glukozy. Można także wytworzyć zawiesiny do wstrzykiwania, w przypadku których można stosować odpowiednie ciekłe nośniki, emulgatory itp. Włącza się również preparaty w postaci stałej, które zamierza się zamienić, na krótko przed użyciem, w preparaty w postaci płynnej.

Za odpowiednie do stosowania zewnętrznego uznaje się wszystkie kompozycje zazwyczaj stosowane do zewnętrznego podawania leków np. kremy, żel, opatrunki, szampony, nalewki, pasty, maści, balsamy, proszki itp. W kompozycjach odpowiednich do podawania przezskórnego, nośnik ewentualnie zawiera promotor sorpcji i/lub odpowiedni środek zwilżający, ewentualnie połączony z odpowiednimi dodatkami o dowolnych własnościach w małych ilościach, które nie mają znaczących działań niepożądanych na skórę. Dodatki te mogą ułatwić podawanie naskórne i/lub mogą być pomocne w wytwarzaniu 10 pożądanych kompozycji. Te kompozycje można podawać na różne sposoby, np. jako plaster przezskórny, jako preparat do nakraplania, jako maść.

Szczególnie korzystne jest wytworzenie wymienionych wyżej kompozycji farmaceutycznych w jednostkowej postaci dawkowania, aby zapewnić łatwość podawania i jednorodność dawkowania. W opisie i zastrzeżeniach patentowych termin jednostkowa postać dawkowania oznacza fizycznie oddzielne, odpowiednie do zastosowania w pojedynczych dawkach jednostki, z których każda zawiera z góry określoną ilość substancji czynnej obliczoną w celu wytworzenia pożądanego efektu terapeutycznego w połączeniu z wymaganym nośnikiem farmaceutycznym. Przykładami takich jednostkowych postaci dawkowania są tabletki (obejmujące tabletki z rowkiem lub powleczone), kapsułki, pigułki, czopki, saszetki z proszkiem, opłatki, roztwory lub zawiesiny do wstrzykiwania, preparaty w porcji łyżeczki do herbaty, preparaty w porcji łyżeczki do łyżki stołowej itp. i ich oddzielne wielokrotności.

Skuteczna diagnostycznie dawka lub częstość podawania zależy od użycia poszczególnego związku o wzorze (I-A)* oraz danego stanu leczonego ssaka, co jest dobrze znane fachowcom w dziedzinie.

Poniższe przykłady przedstawiono dla ilustracji bez ograniczania zakresu wynalazku.

Część doświadczalna

Stosowany poniżej termin „DMF” oznacza N,N-dimetyloformamid, „DIPE” oznacza diizopropyloeter, „DMSO” oznacza dimetylosulfotlenek, „BHT” oznacza 2,6-bis(1(1,dimetyloetylo)-4-metylofenol oraz „THF” oznacza tetrahydrofuran.

A. Otrzymywanie związków pośrednich

P r z y k ł a d A1

Wytwarzanie

Mieszaninę kwasu 4-(1-metyloetoksy)benzoesowego (0,083 mola) i 5% Rh/Al2O3 (10 g) w THF (220 ml) uwodorniano w temperaturze 50°C (pod ciśnieniem 3 barów H2) przez 1 noc. Mieszaninę przesączono przez celit, przemyto THF i odparowano. Wydajność: 16 g związku pośredniego 1 (100%).

P r z y k ł a d A2

Wytwarzanie kwasu 2-etylo-3-metylo-6-chinolinokarboksylowego (związek pośredni 2)

Mieszaninę kwasu 4-aminobenzoesowego (0,299 mola) w etanolu (250 ml) mieszano w temperaturze pokojowej, dodano ZnCl2 (0,0367 mola) oraz (CH2O)n (10 g) oraz porcjami FeCl3 · 6H2O (0,5 mola) i podgrzano do temperatury 60-65°C. Następnie, przez 2 godziny dodawano propanal (30 ml). Mieszaninę ogrzewano w temperaturze refluksu przez 2 godziny, po czym utrzymywano w temperaturze pokojowej przez 12 godzin. Mieszaninę wylano do wody i przesączono przez celit. Przesącz zakwaszono do pH = 7, stosując 6N HCl i mieszaninę odparowano do sucha. Pozostałość użyto bez dalszego oczyszczania. Wydajność: 56,1 g kwasu 2-etylo-3-metylo-6-chinolinokarboksylowego (związek pośredni 2).

PL 218 788 B1

P r z y k ł a d A3 Wytwarzanie

Do mieszaniny 4-bromobenzenoaminy (0,232 mola) i N,N-dietyloetanoaminy (0,2784 mola) w CH2CI2 (400 ml), w temperaturze 5°C, dodano chlorek pentanoilu (0,2784 mola). Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez noc, wylano do wody i ekstrahowano CH2CI2. Warstwę organiczną oddzielono, przemyto stężonym roztworem NH4OH i wodą, osuszono (MgSO4), przesączono i rozpuszczalnik odparowano. Pozostałość (60 g) krystalizowano z eteru dietylowego. Osad odsączono i osuszono. Pozostałość (35 g, 63%) rozpuszczono w CH2CI2. Warstwę organiczną oddzielono, przemyto 10% roztworem K2CO3 oraz wodą, osuszono (MgSO4), przesączono i rozpuszczalnik odparowano. Wydajność: 30 g związku pośredniego (3) (54%).

P r z y k ł a d A4

Wytwarzanie

Mieszaninę 6-bromo-2(1H)-chinolinonu (0,089 mola) w POCI3 (55 ml) mieszano w temperaturze 60°C przez noc, następnie w temperaturze 100°C przez 3 godziny i rozpuszczalnik odparowano. Pozostałość rozpuszczono w CH2CI2, wylano do wody z lodem, zalkalizowano stężonym roztworem NH4OH, przesączono przez celit i ekstrahowano CH2CI2. Warstwę organiczną oddzielono, osuszono (MgSO4), przesączono i rozpuszczalnik odparowano. Wydajność: 14,5 g związku pośredniego (4) (67%).

P r z y k ł a d A5

a) Wytwarzanie

Do POCI3 (108 ml), w temperaturze 10°C, utrzymując przepływ azotu kroplami dodano DMF (37 ml), mieszaninę pozostawiono do ogrzania do temperatury pokojowej, po czym porcjami dodano N-(4-bromofenylo)butanamid (0,33 mola). Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze 85°C przez noc, następnie pozostawiono do ochłodzenia do temperatury pokojowej i wylano na lód (reakcja egzotermiczna). Osad odsączono, przemyto małą ilością wody i osuszono (próżnia). Pozostałość przemyto układem EtOAc/eter dietylowy i osuszono. Wydajność: 44,2 g związku pośredniego (5) (50%).

b) Wytwarzanie

PL 218 788 B1

Mieszaninę związku pośredniego (5) (0,162 mola) w metanolu (600 ml) i 35% roztwór soli sodowej w metanolu (154 ml) mieszano i ogrzewano w temperaturze refluksu przez noc. Mieszaninę wylano na lód. Osad odsączono, przemyto małą ilością wody i rozpuszczono w CH2CI2, a następnie dodano 10% K2CO3 i mieszaninę ekstrahowano CH2CI2. Warstwę organiczną oddzielono, przemyto wodą, osuszono (MgSO4), przesączono i rozpuszczalnik odparowano. Wydajność: 31,9 g związku pośredniego (6) (74%).

P r z y k ł a d A6

Wytwarzanie

O' {związek pośredni 7)

Do mieszaniny kwasu 4-metoksycykloheksanokarboksylowego (0,063 mola) w CH2CI2 (200 ml) porcjami dodano 1,1'-karbonylobis-1H-imidazol (0,074 mola). Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, po czym dodano N-metoksymetanoaminę (0,074 mola). Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez noc, wylano do H2O i ekstrahowano CH2CI2. Warstwę organiczną oddzielono, przemyto kilka razy H2O, osuszono (MgSO4), przesączono i rozpuszczalnik odparowano. Wydajność: 12,6 g związku pośredniego 7.

P r z y k ł a d A7

a) Mieszaninę kwasu 6-fluoro-4-okso-4H-1-benzopirano-2-karboksylowego (0,30 mola) w kwasie octowym (400 ml) uwodorniano, stosując Pd/C (3 g) jako katalizator. Po zużyciu H2 (3 równoważniki), katalizator odsączono, przesącz odparowano, a pozostałość mieszano w eterze naftowym. Osad odsączono i osuszono (próżnia; 70°C). Po krystalizacji z układu CHCI3/CH3OH, osad odsączono i osuszono (próżnia; 80°C i silnie zmniejszone ciśnienie; 85°C). Wydajność: 8,8 g kwasu 6-fluoro-3,4-dihydro-2H-1-benzopirano-2-karboksylowego (związek pośredni 8) (15,0%).

b) Mieszaninę związku pośredniego (8) (0,255 mola) w etanolu (400 ml) i H2SO4 (5 ml) mieszano i ogrzewano w temperaturze refluksu przez 8 godzin. Rozpuszczalnik odparowano do sucha. Pozostałość rozpuszczono w CH2CI2. Warstwę organiczną oddzielono, przemyto 10% K2CO3, osuszono (MgSO4), przesączono i rozpuszczalnik odparowano. Wydajność: 45 g 6-fluoro-3,4-dihydro-2H-1-benzopirano-2-karboksylanu etylu (związek pośredni 9) (79%).

c) Reakcja w atmosferze azotu. Do ogrzewanej w temperaturze refluksu mieszaniny związku pośredniego 9 (0,22 mola) i benzenu (600 ml), w czasie 1 godziny, kroplami dodawano mieszaninę bis(2-metoksyetoksy)glinowodorku sodu, 70% wagowo roztworu w metylobenzenie 3,4M (0,44 mola) w benzenie (150 ml) (refluks). Mieszaninę reakcyjną mieszano jeszcze 2,5 godziny w temperaturze wrzenia, ochłodzono do temperatury ± 15°C, po czym rozłożono wkraplając etanol (30 ml) i wodę (10 ml). Tę mieszaninę wylano do wody z lodem, zakwaszono stężonym kwasem chlorowodorowym i ekstrahowano eterem dietylowym (500 ml). Oddzieloną warstwę organiczną przemyto wodą, osuszono, przesączono i rozpuszczalnik odparowano. Pozostałość oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (eluent: CHCI3). Pożądaną frakcję zebrano i eluent odparowano. Wydajność: 34 g 6-fluoro-3,4-dihydro-2H-1-benzopirano-2-metanolu (związek pośredni 10) (85%).

d) Reakcja w atmosferze azotu. Do wymieszanej i ochłodzonej (-60°C; łaźnia 2-propanon/CO2) mieszaniny dichlorku etanodioilu (0,1 mola) w CH2CI2 (350 ml) dodawano w czasie 10 minut sulfinylobis[metan] (30 ml). Po wymieszaniu przez 10 minut, przez 5 minut dodawano mieszaninę związku pośredniego 10 w CH2CI2 (90 ml). Po wymieszaniu przez 15 minut, dodano N,N-dietyloetanoaminę (125 ml). Po ogrzaniu do temperatury pokojowej, mieszaninę wylano do wody. Produkt ekstrahowano CH2CI2. Warstwę organiczną przemyto wodą, HCl (1M), wodą, NaHCO3 (10%) i wodą, osuszono i odparowano. Pozostałość rozpuszczono w eterze dietylowym, przemyto wodą, osuszono, przesączono i odparowano. Pozostałość oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (eluent: CHCI3). Pożądaną frakcję zebrano i eluent odparowano. Wydajność: 21,6 g 6-fluoro-3,4-dihydro-2H-1-benzopirano-2-karboaldehydu (związek pośredni 11) (67%).

PL 218 788 B1

e) Wytwarzanie

Do roztworu związku pośredniego (5) (0,046 mola) w THF (100 ml), w temperaturze -70°C, powoli dodano n-butylolit 1,6M (0,056 mola). Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze -70°C przez 30 minut, po czym powoli dodano zawiesinę związku pośredniego 11 (0,056 mola) w THF (100 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze -70°C przez 1 godzinę, następnie pozostawiono w temperaturze pokojowej, wylano do H2O i ekstrahowano EtOAc, warstwę organiczną oddzielono, osuszono (MgSO4), przesączono i rozpuszczalnik odparowano. Pozostałość (21 g) oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (eluent: cykloheksan/EtOAc 80/10; 15-35 μm). Czyste frakcje zebrano i rozpuszczalnik odparowano. Wydajność: 9,5 g związku pośredniego 12 (55%).

P r z y k ł a d A8 a) Wytwarzanie

Mieszaninę związku pośredniego (5) (0,1127 mola), 2-metoksyetanoaminy (0,2254 mola) i K2CO3 (0,2254 mola) w DMF (500 ml) mieszano w temperaturze 120°C przez 15 godzin i następnie ochłodzono. Rozpuszczalnik odparowano. Pozostałość rozpuszczono w CH2CI2 i H2O. Warstwę organiczną oddzielono, osuszono (MgSO4), przesączono i rozpuszczalnik odparowano do sucha. Pozostałość (33,53 g) oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (eluent: CH2CI2/-CH₃OH 99,5/0,5; 15-40 μm). Zebrano dwie frakcje i odparowano z nich rozpuszczalniki. Wydajność: 5,7 g związku pośredniego 14 (38%) i związku pośredniego 13 (34%).

b) Wytwarzanie

Mieszaninę związku pośredniego (5) (0,0751 mola), tiomorfoliny (0,0891 mola) i K2CO3 (0,15 mola) w DMF (200 ml) mieszano w temperaturze 120°C przez 12 godzin. Rozpuszczalnik odparowano do sucha. Pozostałość rozpuszczono w CH2CI2 i H2O. Warstwę organiczną oddzielono, osuszono (MgSO4), przesączono i rozpuszczalnik odparowano. Pozostałość (26 g) oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (eluent: cykloheksan/EtOAc 80/20; 20-45 μm). Zebrano dwie frakcje i odparowano z nich rozpuszczalniki i połączono. Wydajność: 9,4 g związku pośredniego 15 (37%); temperatura topnienia 82°C.

P r z y k ł a d A9

a) Do roztworu 3-nitrobenzenosulfonianu sodu (0,118 mola) w 70% H2SO4 (230 ml) dodano kwas 4-aminobenzoesowy (0,219 mola), po czym mieszaninę reakcyjną mieszano i ogrzewano w temPL 218 788 B1 peraturze refluksu. Następnie, kroplami dodano dioctan 2-metylo-2-propeno-1,1-diolu (0,216 mola) i mieszaninę ogrzewano w temperaturze refluksu przez 4 godziny. Dodano etanol (200 ml) i mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze 80°C przez 48 godzin. Mieszaninę odparowano, pozostałość wylano do wody z lodem/NH4OH i ekstrahowano CH2CI2. Warstwę organiczną osuszono (MgSO4) i odparowano. Pozostałość oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (eluent: CH2CI2/2-propanol 99/1). Czyste frakcje zebrano i odparowano. Wydajność: 21 g 3-metylo-6-chinolinokarboksylanu etylu (związek pośredni 16) (45%).

b) Do roztworu LiAlH4 (0,098 mola) w THF, w temperaturze 0°C, w atmosferze azotu dodano związek pośredni 16 (0,098 mola) w THF (270 ml). Następnie dodano wodę (10 ml). Osad odsączono i przemyto CH2CI2. Warstwę organiczną osuszono (MgSO4), odsączono i odparowano. Produkt użyto bez dalszego oczyszczania. Wydajność: 16,71 g 3-metylo-6-chinolinometanolu (związek pośredni 17).

c) Do roztworu związku pośredniego 17 (0,096 mola) w CH2CI2 (200 ml) dodano MnO2 (0,237 mola) i mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 12 godzin. Mieszaninę przesączono przez celit i przesącz mieszano ponownie z MnO2 (20 g) przez 12 godzin. Ponownie dodano MnO2 (10 g). Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 12 godzin, po czym przesączono przez celit i odparowano. Produkt użyto bez dalszego oczyszczania. Wydajność: 11,71 g 3-metylo-6-chinolinokarboaldehydu (71%) (związek pośredni 18).

d) Do mieszaniny THF (0,14 mola) w 1,1'-oksybisetanie (10 ml), w temperaturze 10°C, dodano roztwór bromocykloheksylu (0,14 mola) w 1,1'-oksybisetanie (50 ml) i wiórki magnezu (50 ml), po czym, w temperaturze 5°C, ostrożnie dodano mieszaninę związku pośredniego 18 (0,07 mola) i wiórki magnezu (100 ml), mieszaninę wylano do wody z lodem i ekstrahowano EtOAc. Wydajność: 11,34 g (±)-a-cykloheksylo-3-metylo-6-chinolinometanolu (63%) (związek pośredni 19).

P r z y k ł a d A10

Wytwarzanie

Mieszaninę związku (5) (0,001507 mola), tributylo-(1-etoksyetenylo)wodorku cyny (0,00226 mola) i Pd(PPH3)4 (0,000151 mola) w 1,4-dioksanie (5 ml) mieszano w temperaturze 80°C przez 3 godziny, po czym dodano wodę i mieszaninę ekstrahowano EtOAc, warstwę organiczną oddzielono, osuszono (MgSO4), przesączono i rozpuszczalnik odparowano. Ten produkt użyto bez dalszego oczyszczania. Wydajność: 1,4 g związku pośredniego 20.

P r z y k ł a d A11

Wytwarzanie

Mieszaninę związku (45) (wytworzono według przykładu B6) (0,00125 mola) w 3N Na OH (5 ml) i iPrOH (1,7 ml) mieszano w temperaturze pokojowej przez noc, następnie wylano do H2O, zakwaszono 3N HCl i ekstrahowano EtOAc, warstwę organiczną oddzielono, osuszono (MgSO4), przesączono

PL 218 788 B1 i rozpuszczalnik odparowano. Pozostałość rozpuszczono w eterze dietylowym. Osad odsączono i osuszono. Wydajność: 0,26 g związku pośredniego 21 (56%) (temperatura topnienia: 232°C)

P r z y k ł a d A12

a. Wytwarzanie

Mieszaninę 5-bromo-1H-indolo-2,3-dionu (0,221 mola) w 3N NaOH (500 ml) mieszano w temperaturze 80°C przez 30 minut, pozostawiono w temperaturze pokojowej i dodano 2-pentanon (0,221 mola). Mieszaninę reakcyjną mieszano i ogrzewano w temperaturze refluksu przez 1 godzinę i 30 minut, po czym zakwaszono AcOH do pH = 5. Osad odsączono, przemyto wodą i osuszono. Wydajność:

52,3 g związku pośredniego 22 i związku pośredniego 23. (Wydajność całkowita: 80%).

b. Wytwarzanie

Do zawiesiny związku pośredniego 22 (0,034 mola) i związku pośredniego 23 (0,034 mola) w THF (300 ml), w temperaturze -78°C, utrzymując przepływ azotu, kroplami dodano nBuLi 1,6M (0,0816 mola). Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze -78°C przez 30 minut, po czym kroplami dodano 1,6M nBuLi (0,0816 mola). Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 1 godzinę, a następnie powoli dodano mieszaninę związku pośredniego 9 (0,102 mola) w THF (250 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze -78°C do -20°C, wylano do H2O/HCI 3N i ekstrahowano EtOAc, warstwę organiczną oddzielono, osuszono (MgSO4), przesączono i rozpuszczalnik odparowano do sucha.

Wydajność: 20,89 g związku pośredniego 24 i związku pośredniego 25 (86%).

P r z y k ł a d A13

a. Wytwarzanie

Do roztworu 3-chloro-2-etylo-2-butenalu (0,065 mola) w AcOH (100 ml), w temperaturze pokojowej, porcjami dodano kwas 4-amino-3-metoksybenzoesowy (0,054 mola). Mieszaninę reakcyjną mieszano i ogrzewano w temperaturze refluksu przez 8 godzin, po czym odparowano do suchej masy.

Pozostałość rozpuszczono w CH2CI2, dodano wodę i roztwór zalkalizowano Et3N. Warstwę organiczną oddzielono, osuszono (MgSO4), przesączono i rozpuszczalnik odparowano. Pozostałość krystalizowano z 2-propanonu. Osad odsączono i osuszono. Wydajność: 2,5 g związku pośredniego 26 (18%).

PL 218 788 B1

b. Wytwarzanie

Do roztworu związku pośredniego 26 (0,011 mola) w CH2CI2 (30 ml), w temperaturze pokojowej, dodano CDI (0,012 mola). Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, dodano metoksyaminometyl (0,012 mola) i mieszano w temperaturze pokojowej przez 8 godzin. Następnie dodano H2O. Osad odsączono, przesącz ekstrahowano CH2CI2, warstwę organiczną oddzielono, osuszono (MgSO4), przesączono, i rozpuszczalnik odparowano. Pozostałość krystalizowano z eteru dietylowego. Osad odsączono i osuszono. Wydajność: 0,95 g związku pośredniego 27 (31%) (temperatura topnienia: 148°C).

P r z y k ł a d A14

Wytwarzanie

Do roztworu 3-chloro-2-etylo-2-butanalu (0,041 mola) w AcOH (60 ml), w temperaturze pokojowej, dodano 4-bromobenzenoaminę (0,034 mola). Mieszaninę reakcyjną mieszano i ogrzewano w temperaturze refluksu przez 8 godzin, po czym pozostawiono w temperaturze pokojowej i odparowano do suchej masy. Produkt krystalizowano z EtOAc, osad odsączono, przemyto 10% K2CO3 i rozpuszczono w CH2CI2. Warstwę organiczną oddzielono, osuszono (MgSO4), przesączono i rozpuszczalnik odparowano. Wydajność: 4,6 g związku pośredniego 28 (54%).

P r z y k ł a d A15 a. Wytwarzanie

Do roztworu 1,3-cykloheksanodionu (0,268 mola) w H2O (150 ml), w temperaturze 5°C, powoli dodano roztwór KOH (0,326 mola) w H2O (150 ml). Temperatura nie wzrosła do 12°C. Następnie, porcjami dodano K1 (2 g) oraz 2-bromo-1-(4-nitrofenylo)etanon (0,294 mola). Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 48 godzin. Osad odsączono, przemyto H2O, następnie eterem dietylowym i osuszono. Wydajność: 63 g (85%). Część tej frakcji (1 g) krystalizowano z EtOH.

Osad odsączono i osuszono. Wydajność: 0,5 g związku pośredniego 29 (42%) (temperatura topnienia: 100°C).

PL 218 788 B1

b. Wytwarzanie

Mieszaninę związku pośredniego 29 (0,145 mola) w H2SO4 (40 ml) mieszano w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, wylano na lód, zalkalizowano NH4OH i ekstrahowano CH2CI2. Warstwę organiczną oddzielono, osuszono (MgSO4), przesączono i rozpuszczalnik odparowano. Pozostałość krystalizowano z EtOH. Osad odsączono i osuszono. Wydajność: 31 g (58%). Część tej frakcji (1 g) krystalizowano z EtOH. Osad odsączono i osuszono. Wydajność: 0,7 g związku pośredniego 30 (58%) (temperatura topnienia: 200°C).

c. Wytwarzanie

Mieszaninę związku pośredniego 30 (0,039 mola), niklu Raney'a (10 g) w EtOH (100 ml) uwodorniano w temperaturze pokojowej pod ciśnieniem 3 barów przez 1 godzinę. Mieszaninę przesączono przez celit i przemyto CH2CI2. Warstwę organiczną oddzielono, osuszono (MgSO4), przesączono i rozpuszczalnik odparowano. Pozostałość (9,5 g) krystalizowano z eteru dietylowego. Osad odsączono i osuszono. Wydajność: 4,6 g (52%). Przesącz odparowano. Pozostałość (2,7 g) oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (eluent: CH₂CI₂/CH₃OH; 99/1; 15-40 μm). Zebrano dwie frakcje i rozpuszczalnik odparowano. Wydajność: 1,6 g F1 i 1,2 g F2. F2 krystalizowano z EtOH. Osad odsączono i osuszono. Wydajność: 0,24 g związku pośredniego 31 (2%) (temperatura topnienia: 202°C).

d. Wytwarzanie

Do roztworu 3-chloro-2-etylo-2-butenalu (0,04 mola) w AcOH (50 ml), w temperaturze pokojowej, dodano związek pośredni 30 (0,02 mola). Mieszaninę reakcyjną mieszano i ogrzewano w temperaturze refluksu przez 4 godziny. Rozpuszczalnik odparowano do sucha. Pozostałość krystalizowano z EtOAc. Osad odsączono i osuszono. Pozostałość rozpuszczono w CH2CI2. Mieszaninę zalkalizowano 10% K2CO3 i ekstrahowano CH2CI2. Warstwę organiczną oddzielono, osuszono (MgSO4), przesączono i rozpuszczalnik odparowano. Pozostałość krystalizowano z EtOH. Osad odsączono i osuszono. Wydajność: 2,5 g związku pośredniego 32 (40%).

PL 218 788 B1

P r z y k ł a d A16

Wytwarzanie

Mieszaninę 2-(4-nitrofenylo)-1-fenyloetanonu (0,083 mola) i niklu Raney'a (20 g) w EtOH (200 ml) uwodorniano w temperaturze pokojowej, pod ciśnieniem 3 barów przez 1 godzinę, następnie przesączono przez celit, przemyto CH2CI2/CH3OH i osuszono. Wydajność: 17,5 g związku pośredniego 33, (97%).

P r z y k ł a d A17

a. Wytwarzanie

Do POCI3 (0,7536 mola), w temperaturze 5°C, kroplami dodano DMF (12,4 ml) oraz 4'-bromo-5-chlorowaleranilid (0,1032 mola) i mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze 75°C przez 6 godzin, po czym ochłodzono w temperaturze pokojowej i wylano do wody z lodem. Nierozpuszczone części stałe odsączono, przemyto wodą i osuszono. Wydajność: 25,7 g związku pośredniego 34 (78%).

b. Wytwarzanie

Mieszaninę związku pośredniego 34 (0,094 mola) w 6N HCl (250 ml) mieszano i ogrzewano w temperaturze refluksu przez 2 dni, ochłodzono, wylano do wody (100 ml) i zobojętniono NH4OH (stężony). Nierozpuszczone części stałe odsączono, przemyto wodą, a następnie EtOH. Wydajność: 19 g. Przesącz odparowano. Pozostałość (9,4 g) oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (eluent: CH₂CI₂/CH₃OH 99,25/0, 75; 15-35 μm). Zebrano jedną frakcję i rozpuszczalnik odparowano. Wydajność: 8 g związku pośredniego 35 (32%).

B. Wytwarzanie związków nieradioaktywnych

P r z y k ł a d B1

Wytwarzanie

Do DMF (0,024 mola), w temperaturze 5°C, powoli dodano POCI3 (0,024 mola). Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 30 minut, następnie ochłodzono do temperatury

5°C i powoli dodano ester etylowy kwasu 3-oksomasłowego (0,024 mola). Mieszaninę reakcyjną mie28

PL 218 788 B1 szano w temperaturze 5°C przez 30 minut i porcjami dodano 1-(4-aminofenylo)-2-fenyloetanon (0,024 mola). Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze 90°C przez 3 godziny i rozpuszczono w CH2CI2. Dodano wodę z lodem. Mieszaninę zalkalizowano NH4OH i ekstrahowano CH2CI2. Warstwę organiczną oddzielono, osuszono (MgSO4), przesączono i rozpuszczalnik odparowano. Pozostałość krystalizowano z układu 2-propanon/eter dietylowy. Osad odsączono i osuszono. Wydajność: 0,9 g związku 306 (11%) (temperatura topnienia: 136°C).

P r z y k ł a d B2 Wytwarzanie

Do roztworu związku

(wytworzonego według przykładu A7e) (0,022 mola) w tris(dioksa-3,6-heptylo)aminie (1 ml) i CH2CI2 (100 ml), w temperaturze pokojowej, porcjami dodano KMnO4 (10 g). Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 8 godzin, przesączono przez celit, przemyto CH2CI2i osuszono. Pozostałość (6 g, 100%) krystalizowano z układu eter dietylowy/eter naftowy. Osad odsączono i osuszono. Wydajność: 2 g związku (2) (33%) ; temperatura topnienia 82°C.

P r z y k ł a d B3

a) Wytwarzanie

Do roztworu związku pośredniego (5) (0,058 mola) w THF (150 ml), w temperaturze -70°C, powoli dodano 1,6M nBuLi (0,07 mola). Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze -70°C przez 30 minut, po czym powoli dodano roztwór 2,3-dihydro-1H-indeno-2-karbonitrylu (0,07 mola) w THF (100 ml).

Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze -70°C przez 1 godzinę, pozostawiono w temperaturze pokojowej, hydrolizowano H2O i ekstrahowano EtOAc, warstwę organiczną oddzielono, osuszono (MgSO4), przesączono i rozpuszczalnik odparowano. Pozostałość (22 g) oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (eluent: CH₂Cl₂/cykloheksan 80/20 do 100; 15-35 μm). Czyste frakcje zebrano i rozpuszczalnik odparowano. Drugą frakcję krystalizowano z układu 2-propanon/eter dietylowy. Osad odsączono i osuszono. Wydajność: 0,11 g związku (3). Przesącz zatężono. Wydajność: 0,55 g związku (3); temperatura topnienia 145°C.

PL 218 788 B1

Do roztworu związku pośredniego (5) (0,018 mola) w THF (50 ml), w temperaturze -70°C, powoli dodano 1,6M nBuLi (0,022 mola). Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze -70°C przez 1 godzinę, ochłodzono do temperatury -40°C, następnie do temperatury -70°C. Powoli dodano roztwór związku pośredniego 7 (0,018 mola) w THF (40 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze -70°C przez 1 godzinę, następnie ogrzano do temperatury -20°C, zhydrolizowano H2O i ekstrahowano EtOAc, warstwę organiczną oddzielono, osuszono (MgSO4), przesączono i rozpuszczalnik odparowano. Pozostałość (6,5 g) oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (eluent: toluen/EtOAc 90/10; 15-40 pm). Zebrano dwie frakcje (F1 i F2) i rozpuszczalnik odparowano. F1 (2,4 g) krystalizowano z eteru dietylowego. Osad odsączono i osuszono. Wydajność: 1,8 g związku (4) (29%); temperatura topnienia 123°C. F2 (0,9 g) krystalizowano z eteru dietylowego. Osad odsączono i osuszono. Wydajność: 0,2 g związku (5) (3%); temperatura topnienia 120°C.

c) Wytwarzanie

Do mieszaniny związku pośredniego (6) (0,089 mola) w THF, w temperaturze -78°C, utrzymując przepływ azotu, kroplami dodano 1,6M nBuLi w heksanie (0,107 mola). Mieszaninę mieszano w temperaturze -78°C przez 1 godzinę, po czym, w temperaturze -78°C, utrzymując przepływ azotu, dodano mieszaninę związku pośredniego 7 (150 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze -78°C przez 2 godziny, ogrzano do temperatury 0°C, wylano do H2O i ekstrahowano EtOAc, warstwę organiczną oddzielono, osuszono (MgSO4), przesączono i rozpuszczalnik odparowano. Pozostałość (31 g) oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (eluent: cykloheksan/EtOAc 85/15; 20-45 pm). Dwie czyste frakcje zebrano i odparowano z nich rozpuszczalniki. Wydajność: 11 g związku (7) (38%) i 8,2 g związku (8) (28%).

d) Wytwarzanie

Do zawiesiny Mg (0,0069 mola) w małej ilości eteru dietylowego powoli dodano roztwór chlorometylobenzenu (0,0069 mola) w eterze dietylowym (8 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 30 minut (nad Mg), następnie ochłodzono do temperatury 5°C, po czym powoli dodano roztwór związku pośredniego 27 (0,0027 mola) w THF (8 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze 5°C przez 15 minut, następnie w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, wylano do H2O i przesączono przez celit. Osad przemyto EtOAc. Przesącz ekstrahowano EtOAc, warstwę organiczną oddzielono, osuszono (MgSO4), przesączono i rozpuszczalnik odparowano. Pozostałość (1 g) oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na kromasilu (eluent: CH2CI2 100 do CH2CI2/CH3OH 99/1; 15-40 pm). Czyste frakcje zebrano i rozpuszczalnik odparowano. Pozostałość (0,5 g, 56%) krystalizowano z eteru dietylowego. Osad odsączono i osuszono. Wydajność: 0,14 g związku 503 (15%).

P r z y k ł a d B4: przykłady modyfikacji grup końcowych a) Wytwarzanie

PL 218 788 B1

Mieszaninę związku

(wytworzonego według przykładu B3.c) (0,018 mola) w 3N HCl (60 ml) i THF (60 ml) mieszano w temperaturze 60°C przez noc. Mieszaninę zalkalizowano 10% roztworem K2CO3 i ekstrahowano CH2CI2.

Warstwę organiczną oddzielono, osuszono (MgSO4), przesączono i rozpuszczalnik odparowano. Wydajność: 4,6 g związku (156) (82%).

b) Wytwarzanie

Mieszaninę związku

(wytworzonego według przykładu B3.c) (0,0122 mola) w 3N HCl (40 ml) i THF (40 ml) mieszano i ogrzewano w temperaturze refluksu przez noc, wylano do wody, zalkalizowano 10% K2CO3 i ekstrahowano CH2CI2. Warstwę organiczną oddzielono, osuszono (MgSO4), przesączono i rozpuszczalnik odparowano. Pozostałość oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (eluent: cykloheksan/EtOAc 40/60; 15-40 μm). Czyste frakcje zebrano i rozpuszczalnik odparowano.

Wydajność: 2 g związku (9) (52%); temperatura topnienia 226°C.

c) Wytwarzanie

Mieszaninę związku (4) (0,0015 mola), 2-metoksyetanoaminy (0,003 mola) i K2CO3 (0,003 mola) w DMF (5 ml) mieszano w temperaturze 140°C przez 48 godzin, po czym dodano H2O. Mieszaninę ekstrahowano EtOAc, warstwę organiczną oddzielono, osuszono (MgSO4), przesączono i rozpuszczalnik odparowano. Pozostałość (1 g) oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (eluent: cykloheksan/EtOAc 60/40; 15-40 μm). Zebrano dwie frakcje i rozpuszczalnik odparowano. Obie frakcje krystalizowano oddzielnie z pentanu. Osad odsączono i osuszono. Wydajność: 0,05 g związku (10) (9%; temperatura topnienia 115°C) i 0,057 g związku (11) (10%; temperatura topnienia 107°C).

PL 218 788 B1

Mieszaninę związku (4) (0,0015 mola) w 2-(metylotio)etanoaminie (2 ml) mieszano w temperaturze 120°C przez 8 godzin, po czym dodano 10% K2CO3. Mieszaninę ekstrahowano CH2CI2. Warstwę organiczną oddzielono, osuszono (MgSO4), przesączono i rozpuszczalnik odparowano. Pozostałość (2,2 g) oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (eluent: cykloheksan/EtOAc 70/30; 15-40 μπ). Zebrano dwie frakcje i rozpuszczalnik odparowano. Pierwszą frakcję krystalizowano z układu eter dietylowy/eter naftowy. Osad odsączono i osuszono. Wydajność: 0,05 g związku (12) (14%); temperatura topnienia 120°C. Drugą frakcję krystalizowano z eteru dietylowego. Osad odsączono i osuszono. Wydajność: 0,18 g związku (13) (31%); temperatura topnienia 125°C.

e) Wytwarzanie

Mieszaninę związku (4) (0,001507 mola), etynylotrimetylosilanu (0,003013 mola), Cul (0,000151 mola) i Pd(PPH3)4 (0,000151 mola) w N,N-dietyloetanoaminie (5 ml) mieszano w temperaturze 100°C przez 24 godziny, po czym dodano wodę. Mieszaninę przesączono przez celit, przemyto EtOAc i przesącz ekstrahowano EtOAc, warstwę organiczną oddzielono, osuszono (MgSO4), przesączono i rozpuszczalnik odparowano. Pozostałość (1,3 g) oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (eluent: cykloheksan/EtOAc 85/15; 15-40 μπ). Czyste frakcje zebrano i rozpuszczalnik odparowano. Pozostałość (0,3 g) krystalizowano z pentanu. Osad odsączono i osuszono. Wydajność: 0,11 g związku (14) (18%); temperatura topnienia 114°C.

f) Wytwarzanie

Mieszaninę związku (14) (0,013 mola) i KF (0,038 mola) w kwasie octowym (50 ml) mieszano w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, po czym dodano H2O i mieszaninę ekstrahowano eterem dietylowym. Warstwę organiczną oddzielono, osuszono (MgSO4), przesączono i rozpuszczalnik odparowano. Pozostałość (4,4 g) oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (eluent: cykloheksan/EtOAc 70/30; 15-40 μπ). Zebrano jedną frakcję i rozpuszczalnik odparowano. Tę frakcję (3 g, 73%) krystalizowano z eteru dietylowego. Osad odsączono i osuszono. Wydajność: 2,45 g związku (15) (60%); temperatura topnienia 132°C.

PL 218 788 B1

g) Wytwarzanie

Mieszaninę związku

(wytworzonego według przykładu B7a) (0,0056 mola) w KOH [1M, H2O] (10 ml) i metanolu (30 ml) mieszano w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, wylano do wody i ekstrahowano EtOAc, warstwę organiczną oddzielono, osuszono (MgSO4), przesączono i rozpuszczalnik odparowano. Pozostałość (2,2 g) oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (eluent: cykloheksan/EtOAc 85/15 do 70/30; 15-40 μm). Zebrano dwie frakcje i rozpuszczalnik odparowano. Pierwszą frakcję krystalizowano z eteru dietylowego. Osad odsączono i osuszono. Wydajność: 0,2 g związku (15) (11%); temperatura topnienia 133°C. Drugą frakcję krystalizowano z eteru dietylowego. Osad odsączono i osuszono. Wydajność: 0,3 g związku (17) (16%); temperatura topnienia 128°C.

h) Wytwarzanie

Mieszaninę związku (4) (0,001205 mola), 2-propyn-1-olu (0,002411 mola), Pd(PPH3)4 (0,000121 mola) i Cul (0,000121 mola) w N,N-dietyloetanoaminie (5 ml) mieszano w temperaturze 100°C przez 2 godziny, po czym dodano wodę. Mieszaninę przesączono przez celit, przemyto EtOAc i ekstrahowano EtOAc, warstwę organiczną oddzielono, osuszono (MgSO4), przesączono i rozpuszczalnik odparowano. Pozostałość (0,7 g) oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (eluent: CH₂CI₂/CH₃OH 98/2; 15-40 μm). Czyste frakcje zebrano i rozpuszczalnik odparowano. Pozostałość krystalizowano z eteru naftowego i eteru dietylowego. Osad odsączono i osuszono. Wydajność: 0,1 g związku (18) (23%); temperatura topnienia 113°C.

i) Wytwarzanie

PL 218 788 B1

Mieszaninę związku (4) (0,006027 mola) i KF (0,024108 mola) w DMSO (20 ml) mieszano w temperaturze 140°C, po czym rozpuszczalnik odparowano do sucha. Pozostałość zestalono w wodzie i eterze dietylowym. Mieszaninę ekstrahowano eterem dietylowym. Warstwę organiczną oddzielono, przemyto eterem dietylowym, a następnie nasyconym roztworem NaCl, osuszono (MgSO4), przesączono i rozpuszczalnik odparowano. Pozostałość (1,7 g) oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (eluent: cykloheksan/EtOAc 85/15; 15-40 μm). Zebrano trzy frakcje i odparowano z nich rozpuszczalniki. Pierwszą frakcję krystalizowano z eteru naftowego. Osad odsączono i osuszono. Wydajność: 0,21 g związku (19) (11%); temperatura topnienia 92°C. Drugą frakcję krystalizowano z eteru naftowego. Osad odsączono i osuszono. Wydajność: 0,33 g związku (20) (17%); temperatura topnienia 114°C.

j) Wytwarzanie

Mieszaninę związku (4) (0,003013 mola), chlorku acetylu (0,003315 mola) i jodku sodu (0,006027 mola) w CH3CN (10 ml) mieszano i ogrzewano w temperaturze refluksu przez 1 godzinę, po czym dodano 10% K2CO3. Mieszaninę ekstrahowano CH2CI2, warstwę organiczną oddzielono, osuszono (MgSO4), przesączono i rozpuszczalnik odparowano. Pozostałość (1 g) oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (eluent: cykloheksan/EtOAc 80/20; 15-40 μm). Zebrano dwie frakcje i odparowano z nich rozpuszczalniki. Pierwszą frakcję krystalizowano z eteru naftowego. Osad odsączono i osuszono. Wydajność: 0,12 g związku (21); temperatura topnienia 110°C.

k) Wytwarzanie

Mieszaninę związku (21) (0,000898 mola), trimetylosilanokarbonitrylu (0,001347 mola) i Pd(PPH3)4 (0,00009 mola) w N,N-dietyloetanoaminie (5 ml) mieszano w temperaturze 100°C przez 2 godziny, po czym dodano wodę. Mieszaninę ekstrahowano EtOAc, warstwę organiczną oddzielono, osuszono (MgSO4). przesączono i rozpuszczalnik odparowano. Pozostałość (0,4 g) oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (eluent: cykloheksan/EtOAc 80/20; 15-40 μm). Czyste frakcje zebrano i rozpuszczalnik odparowano. Pozostałość (0,18 g, 62%) krystalizowano z eteru naftowego. Osad odsączono i osuszono. Wydajność: 0,13 g związku (22) (45%); temperatura topnienia 138°C.

l) Wytwarzanie

PL 218 788 B1

Mieszaninę związku (4) (0,00603 mola), Pd(OAc)2 (0,000603 mola), PPH3 (0,00904 mola) i K2CO3 (0,012054 mola) w CO (gaz) i metanolu (40 ml) mieszano w temperaturze 90°C przez 8 godzin pod ciśnieniem 5 barów CO, po czym dodano H2O. Mieszaninę ekstrahowano EtOAc, warstwę organiczną oddzielono, osuszono (MgSO4), przesączono i rozpuszczalnik odparowano. Pozostałość (6 g) oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (eluent: CH2CI2/CH3OH 100/0 do 98/2; 15-35 μm). Zebrano cztery frakcje (F1-F4) i rozpuszczalnik odparowano. Wydajność: 0,13 g (cis) F1; 0,02 g F2 (cis, związek 25); 0,055 g F3 (trans, 3%) i 0,11 g F4 (trans; związek 26). F1 krystalizowano z eteru naftowego. Osad odsączono i osuszono. Wydajność: 0,03 g związku (23) (1%); temperatura topnienia 91°C. F3 krystalizowano z eteru naftowego. Osad odsączono i osuszono. Wydajność: 0,035 g związku (24) (1%); temperatura topnienia 99°C.

m) Wytwarzanie

Mieszaninę związku (4) (0,009 mola) i Zn (0,027 mola) w kwasie octowym (30 ml) mieszano w temperaturze 60°C przez 4 godziny, przesączono przez celit, przemyto CH2CI2, odparowano do sucha, rozpuszczono w CH2CI2 i przemyto 10% K2CO3. Warstwę organiczną oddzielono, osuszono (MgSO4), przesączono i rozpuszczalnik odparowano. Pozostałość (4 g) oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (eluent: cykloheksan/EtOAc 75/25; 15-40 μm). Zebrano jedną frakcję i rozpuszczalnik odparowano. Tę frakcję (1 g, 37%) krystalizowano z eteru naftowego. Osad odsączono i osuszono. Wydajność: związek (25); temperatura topnienia 88°C.

n) Wytwarzanie

Mieszaninę związku (4) (0,001502 mola), Sn(CH3)4 (0,003004 mola) i Pd(PPH3)4 (0,00015 mola) w metylobenzenie (5 ml) mieszano i ogrzewano w temperaturze refluksu przez 3 godziny, po czym dodano 10% K2CO3. Mieszaninę ekstrahowano EtOAc, warstwę organiczną oddzielono, osuszono (MgSO4), przesączono i rozpuszczalnik odparowano. Pozostałość (0,7 g) oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (eluent: cykloheksan/EtOAc 85/15; 15-40 μm). Zebrano dwie frakcje (F1 i F2) i odparowano z nich rozpuszczalniki. Wydajność: 0,27 g (F1, substancja wyjściowa) i 0,14 g (F2). F2 krystalizowano z pentanu i eteru naftowego. Osad odsączono i osuszono. Wydajność: 0,08 g związku (27) (17%); temperatura topnienia 110°C.

o) Wytwarzanie

PL 218 788 B1

Mieszaninę związku (4) (0,001507 mola), tributyloetenylwodorku cyny (0,002260 mola) i Pd(PPH3)4 (0,000151 mola) w dioksanie (5 ml) mieszano w temperaturze 80°C przez 8 godzin, po czym dodano wodę. Mieszaninę przesączono przez celit, przemyto EtOAc i ekstrahowano EtOAc, warstwę organiczną oddzielono, osuszono (MgSO4), przesączono i rozpuszczalnik odparowano. Pozostałość (0,65 g) oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (eluent: cykloheksan/EtOAc 90/10; 15-40 μm). Czyste frakcje zebrano i rozpuszczalnik odparowano. Pozostałość krystalizowano z eteru naftowego. Osad odsączono i osuszono. Wydajność: 0,07 g związku (28) (14%); temperatura topnienia 108°C.

p) Wytwarzanie

Mieszaninę związku (5) (0,001507 mola), trifenylo(fenylometylo)wodorku cyny (0,002260 mola) i Pd(PPH3)4 (0,000151 mola) w dioksanie (5 ml) mieszano w temperaturze 80°C przez 8 godzin, po czym dodano wodę. Mieszaninę ekstrahowano EtOAc, warstwę organiczną oddzielono, osuszono (MgSO4), przesączono i rozpuszczalnik odparowano. Pozostałość (1,4 g) oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (eluent: CH₂CI₂/EtOAc 96/4; 15-40 μm). Czyste frakcje zebrano i rozpuszczalnik odparowano. Pozostałość (0,38 g) krystalizowano z eteru naftowego. Osad odsączono i osuszono. Wydajność: 0,16 g związku (29) (28%); temperatura topnienia 112°C.

q) Wytwarzanie

Mieszaninę związku (4) (0,001507 mola), tributylo-2-tienylwodorku cyny (0,00226 mola) i Pd(PPH3)4 (0,0001507 mola) w dioksanie (5 ml) mieszano w temperaturze 80°C przez 8 godzin, po czym dodano 10% K2CO3. Mieszaninę ekstrahowano EtOAc, warstwę organiczną oddzielono, osuszono (MgSO4), przesączono i rozpuszczalnik odparowano. Pozostałość (1,7 g) oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (eluent: cykloheksan/EtOAc 85/15; 15-40 μm). Czyste frakcje zebrano i rozpuszczalnik odparowano. Pozostałość (0,65 g) krystalizowano z eteru dietylowego. Osad odsączono i osuszono. Wydajność: 0,35 g związku (30) (61%); temperatura topnienia 142°C.

r) Wytwarzanie

PL 218 788 B1

Mieszaninę związku (4) (0,0015 mola), kwasu 3-tienyloboronowego (0,00226 mola), Pd(PPh3)4 (0,00015 mola) i dioksanu mieszano i ogrzewano w temperaturze refluksu przez 24 godziny, po czym dodano 10% K2CO3. Mieszaninę ekstrahowano EtOAc, warstwę organiczną oddzielono, osuszono (MgSO4), przesączono i rozpuszczalnik odparowano. Pozostałość (0,8 g) oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (eluent: cykloheksan/EtOAc 80/20; 15-40 μm). Czyste frakcje zebrano i rozpuszczalnik odparowano. Pozostałość (0,4 g, 70%) krystalizowano z eteru naftowego. Osad odsączono i osuszono. Wydajność: 0,39 g związku (31) (68%); temperatura topnienia 113°C.

s) Wytwarzanie

Mieszaninę związku (4) (0,003 mola), estru metylowego monochlorowodorku glicyny (0,0066 mola) i Pd(PPh)4 (0, 0003 mola) w Et3N (2 ml) i toluenie (10 ml) mieszano w temperaturze 100°C pod ciśnieniem 5 barów CO przez 8 godzin, przesączono przez celit, przemyto CH2CI2 i odparowano. Pozostałość (2 g) oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (eluent: cykloheksan/EtOAc 80/20; 75-35 μm). Zebrano jedną frakcję i rozpuszczalnik odparowano. Tę frakcję (1 g 80%) krystalizowano z eteru dietylowego. Osad odsączono i osuszono. Wydajność: 0,46 g związku (32) (37%).

t) Wytwarzanie

Mieszaninę związku (4) (0,003 mola) i hydrazynokarboaldehydu (0,0045 mola) w 1-butanolu (15 ml) mieszano i ogrzewano w temperaturze refluksu przez noc, po czym wylano do wody i ekstrahowano CH2CI2. Warstwę organiczną oddzielono, osuszono (MgSO4), przesączono i rozpuszczalnik odparowano. Pozostałość oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (eluent: CH₂CI₂/CH₃OH/NH₄OH 95/5/0,1; 15-40 μm). Zebrano dwie frakcje (F1 i F2) i odparowano z nich rozpuszczalniki. Wydajność: 0,3 g F1 i 0,3 g F2. F1 krystalizowano z CH3CN i eteru dietylowego. Osad odsączono i osuszono. Wydajność: 0,102 g związku (33); temperatura topnienia 224°C. F2 krystalizowano z CH3CN i eteru dietylowego. Osad odsączono i osuszono. Wydajność: 0,2 g związku (34);

PL 218 788 B1

Mieszaninę związku 4 (0,015 mola) i NaN3 (0,045 mola) w DMF (50 ml) mieszano w temperaturze 140°C przez 2 godziny, po czym dodano 10% K2CO3, mieszaninę ekstrahowano EtOAc, warstwę organiczną oddzielono, osuszono (MgSO4), przesączono i rozpuszczalnik odparowano. Pozostałość (6 g) oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (eluent: cykloheksan/EtOAc 60/40; 15-40 μm). Pierwszą frakcję zebrano i rozpuszczalnik odparowano. Pozostałość krystalizowano z eteru dietylowego. Osad odsączono i osuszono. Wydajność: 1,26 g związku (35) (24%); temperatura topnienia 160°C.

v) Wytwarzanie

Mieszaninę związku (4) (0,009 mola) i tiomocznika (0,0099 mola) w alkoholu etylowym (30 ml) mieszano i ogrzewano w temperaturze refluksu przez 12 godzin, po czym powoli dodano roztwór KOH (0,0149 mola) w H2O (5 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano i ogrzewano w temperaturze refluksu przez 1 godzinę, wylano do wody i ekstrahowano CH2CI2. Warstwę organiczną oddzielono, osuszono (MgSO4), przesączono i rozpuszczalnik odparowano. Pozostałość oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (cykloheksan/EtOAc 70/30; 15-40 μm). Czyste frakcje zebrano i rozpuszczalnik odparowano. Wydajność: 1,1 g F1 (37%) i 0,4 g F2 (13%). F1 krystalizowano z 2-propanonu. Osad odsączono i osuszono. Wydajność: związek (36). F2 krystalizowano z 2-propanonu. Osad odsączono i osuszono. Wydajność: związek (37).

w) Wytwarzanie

Do roztworu związku (36) (0,0015 mola), związku (37) (0,0015 mola) i K2CO3 (0,0034 mola) w acetonie (15 ml), w temperaturze pokojowej, powoli dodano CH3I (0,0034 mola). Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 8 godzin, po czym dodano wodę i mieszaninę ekstrahowano CH2CI2. Warstwę organiczną oddzielono, osuszono (MgSO4), przesączono i rozpuszczalnik odparowano. Pozostałość (1,2 g) oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (eluent: cykloheksan/EtOAc 85/15; 15-40 μm). Czyste frakcje zebrano i rozpuszczalnik odparowano. Wydajność: 0,6 g F1 (57%) i 0,18 g F2 (17%). Frakcję F1 krystalizowano z eteru dietylowego. Osad odsączono i osuszono. Wydajność: 0,28 g związek (38) (27%). Frakcję F2 krystalizowano z eteru dietylowego. Osad odsączono i osuszono. Wydajność: 0,065 g związku (39) (6%).

x) Wytwarzanie

PL 218 788 B1

Mieszaninę związku (41)

wytworzonego według przykładu B3b (0,0014 mola) w 3N HCl (5 ml) i THF (5 ml) mieszano i ogrzewano w temperaturze refluksu w czasie weekendu, następnie wylano do H2O, zalkalizowano K2CO3 i ekstrahowano CH2CI2. Warstwę organiczną oddzielono, osuszono (MgSO4), przesączono i rozpuszczalnik odparowano. Wydajność: 0,5 g frakcji F. Frakcję F krystalizowano z 2-propanonu. Osad odsączono i osuszono. Wydajność: 0,35 g związku (40) (74%).

y) Wytwarzanie

Mieszaninę związku (5) (0,045 mola), acetamidu (0,90013 mola) i K2CO3 (0,225 mola) mieszano i ogrzewano w temperaturze refluksu w temperaturze 200°C przez 2 godziny, ochłodzono w temperaturze pokojowej, wylano do H2O/CH2CI2 i ekstrahowano CH2CI2. Warstwę organiczną oddzielono, osuszono (MgSO4), przesączono i rozpuszczalnik odparowano do sucha. Pozostałość (14,4 g) krystalizowano z CH3OH. Osad odsączono i osuszono. Przesącz odparowano. Pozostałość (11,27 g) oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (eluent: CH2CI2/CH3OH/NH4OH 96/4/0,1; 15-35 μm). Czyste frakcje zebrano i rozpuszczalnik odparowano. Wydajność: 4,2 g związku (188) (65%).

z) Wytwarzanie

Mieszaninę związku (188) (0,00032 mola), kwasu benzoesowego (1,5 równoważnika, 0,00048 mola), chlorowodoru 1-etylo-3-(3'-dimetyloaminopropylo)karbodiimidu (1:1) (1,5 równoważnika, 0,00048 mola), N-hydroksybenzotriazolu (1,5 równoważnika, 0,00048 mola) i Et3N (1 równoważnik, 0,00032 mola) w CH2CI2 (2 ml) mieszano w temperaturze pokojowej przez 15 godzin, po czym rozpuszczalnik odparowano. Pozostałość oczyszczono metodą HPLC, frakcje zebrano i rozpuszczalnik odparowano. Wydajność: 0,066 g związku (205) (49,50%).

aa) Wytwarzanie

PL 218 788 B1

Mieszaninę związku pośredniego 20 (0,001507 mola) w 3N HCl (10 ml) i THF (10 ml) mieszano w temperaturze pokojowej przez 8 godzin, po czym zalkalizowano 10% K2CO3 i ekstrahowano CH2CI2. Warstwę organiczną oddzielono, osuszono (MgSO4), przesączono i rozpuszczalnik odparowano. Pozostałość (1,2 g) oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (eluent: cykloheksan/EtOAc 85/15; 15-40 μπ). Czyste frakcje zebrano i rozpuszczalnik odparowano. Pozostałość (0,4 g) krystalizowano z eteru naftowego. Osad odsączono i osuszono. Wydajność: 0,3 g związku (6) (58%); temperatura topnienia 108°C.

ab) Wytwarzanie

Mieszaninę związku 213 (wytworzono według przykładu B4) (0,00305 mola) i CH3ONa (30% w CH₃OH) (0,00916 mola) w CH₃OH (25 ml) mieszano i ogrzewano w temperaturze refluksu przez 15 godzin, a następnie ochłodzono do temperatury pokojowej, wylano do H2O i ekstrahowano EtOAc, warstwę organiczną oddzielono, osuszono (MgSO4), przesączono i rozpuszczalnik odparowano do sucha. Pozostałość (1,1 g) oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (eluent: cykloheksan/EtOAc; 40/60; 15-40 μm). Zebrano dwie frakcje i rozpuszczalnik odparowano. Wydajność: 0,3 g F1 i 0,5 g F2 (50%) F2 krystalizowano z układu eter dietylowy/eter naftowy. Osad odsączono i osuszono. Wydajność: 0,26 g F1, krystalizowano z pentanu. Osad odsączono i osuszono. Wydajność: 0,19 g. Tę frakcję oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (eluent: CH₂CI₂/CH₃OH; 98/2; 15-40 μm). Czyste frakcje zebrano i rozpuszczalnik odparowano. Wydajność: 0,11 g. Tę frakcję oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na kromasilu (eluent:CH3OH/H2O; 70/30). Czyste frakcje zebrano i rozpuszczalnik odparowano. Wydajność: 0,09 g (9%). Tę frakcję krystalizowano z eteru dietylowego. Osad odsączono i osuszono. Wydajność: 0,08 g związku 419 (8%).

P r z y k ł a d B5

Wytwarzanie

Do mieszaniny związku (9) (0,0019 mola), związku (8) (0,0019 mola) i tBuOK (0,00456 mola) w THF (30 ml) w temperaturze 5°C, utrzymując przepływ azotu, dodano jodometan (0,00456 mola). Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez noc, wylano do H2O i ekstrahowano CH2CI2. Warstwę organiczną oddzielono, osuszono (MgSO4), przesączono i rozpuszczalnik odparowano. Pozostałość oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (eluent: cykloheksan/EtOAc 65/35; 15-40 μm). Zebrano dwie frakcje i rozpuszczalnik odparowano. Wydajność: 0,35 g związku (42) (30%; temperatura topnienia 125°C) i 0,35 g związku (43) (30%; temperatura topnienia 116°C).

PL 218 788 B1

P r z y k ł a d B6 a) Wytwarzanie

Do mieszaniny związku (8) i związku (9) (0,0089 mola), w temperaturze 0°C, utrzymując przepływ azotu, dodano 60% NaH (0,01068 mola). Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 30 minut, po czym, w temperaturze 0°C, dodano bromooctan etylu (0,01068 mola). Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, hydrolizowano wodą i ekstrahowano EtOAc, warstwę organiczną oddzielono, osuszono (MgSO4), przesączono i rozpuszczalnik odparowano. Pozostałość oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (eluent: cykloheksan/EtOAc 60/40; 15-40 μm). Pożądane frakcje (F1-F4) zebrano i rozpuszczalnik odparowano. Wydajność: 0,11 g F1; 0,13 g F2; 0,75 g F3 i 0,8 g F4. Frakcję F3 krystalizowano z eteru dietylowego. Osad odsączono i osuszono. Wydajność: związek (44); temperatura topnienia 152°C. F4 krystalizowano z eteru dietylowego. Osad odsączono i osuszono. Wydajność: związek (45); temperatura topnienia 147°C.

b) Wytwarzanie

Do roztworu związku (8) i związku (9) (0,0064 mola) i 60% NaH (0, 007 mola) w DMF (40 ml), w temperaturze 0°C, utrzymując przepływ azotu, kroplami dodano bromometylobenzen (0,007 mola). Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, hydrolizowano wodą i ekstrahowano EtOAc, warstwę organiczną oddzielono, przemyto wodą, osuszono (MgSO4), przesączono i rozpuszczalnik odparowano. Pozostałość oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (eluent: cykloheksan/EtOAc 70/30; 15-40 μm). Pożądane frakcje (F1-F4) zebrano i rozpuszczalnik odparowano. Wydajność: 0,15 g F1, 0,1 g F2,0,6 g F3 (23%) i 0,8 g F4. Frakcję F3 krystalizowano z eteru dietylowego. Osad odsączono i osuszono. Wydajność: 0,13 g związku (46); temperatura topnienia 137°C. Frakcję F4 krystalizowano z DIPE i eteru naftowego. Osad odsączono i osuszono. Wydajność: związek (47); temperatura topnienia 130°C.

P r z y k ł a d B7

a) Do roztworu związku (48) (wytworzono według przykładu B2) (0, 044 mola) w CH2CI2 (200 ml), w temperaturze 0°C, dodano kwas 3-chloronadbenzoesowy (0,088 mola) i mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 12 godzin. Mieszaninę przemyto 10% K2CO3. Warstwę organiczną osuszono (MgSO4), odsączono i odparowano. Pozostałość krystalizowano z (C2H5)2O. Wydajność: 8,2 g 1-tlenku cykloheksylo(3-metylo-6-chinolinylo)metanonu (związek 49) (69%).

b) Do roztworu związku (49) (0,028 mola) w K2CO3 (400 ml) i CH2CI2 (400 ml) dodano chlorek 4-metylobenzenosulfonylu (0,043 mola) i mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, po czym ekstrahowano CH2CI2. Warstwę organiczną osuszono (MgSO4), odsączono i odparowano. Pozostałość krystalizowano z (C2H5)2O. Wydajność: 6,64 g 6-(cykloheksylokarbonylo)-3-metylo-2(1H)-chinolinony (związek 50) (85%); temperatura topnienia 256,1°C.

PL 218 788 B1

P r z y k ł a d B8 a) Wytwarzanie

Mieszaninę związku (7) (0,0229 mola), hydroksyloaminy (0,0252 mola) i N,N-dietyloetanoaminy (0,0252 mola) w etanolu (100 ml) mieszano i ogrzewano w temperaturze refluksu przez 6 godzin, po czym wylano do wody i ekstrahowano CH2CI2. Warstwę organiczną oddzielono, osuszono (MgSO4), przesączono i rozpuszczalnik odparowano. Pozostałość krystalizowano z CH3CN. Osad odsączono i osuszono. Pozostałość oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (eluent: CH2Cl2/EtOAc 80/20; 15-40 pm). Zebrano dwie frakcje i rozpuszczalnik odparowano. Wydajność: 2,8 g związku (51) (36%; temperatura topnienia 133°C) i 3 g związku (52) (38%; temperatura topnienia 142°C).

b) Wytwarzanie

Do roztworu związku (7) (0,015 mola) w etanolu (75 ml), w temperaturze pokojowej, dodano hydrazynę (0,41 mola). Mieszaninę reakcyjną mieszano i ogrzewano w temperaturze refluksu przez 1 noc, wylano do wody i ekstrahowano CH2CI2. Warstwę organiczną oddzielono, osuszono (MgSO4), przesączono i rozpuszczalnik odparowano. Pozostałość oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (eluent: CH2CI2CH3OH/NH4OH 98/2/0,1). Czyste frakcje zebrano i rozpuszczalnik odparowano. Pozostałość krystalizowano z eteru dietylowego. Osad odsączono i osuszono. Wydajność: 0,8 g związku (53) (15%); temperatura topnienia 110°C.

P r z y k ł a d B9

Wytwarzanie

Procedura dla związków 400, 401, 402, 403, 404 i 405. Mieszaninę związku pośredniego 21 (wytworzono według przykładu A11) (0,000269 mola), chlorowodorku amantadyny (0,000404 mola;

1,5 równoważnika), chlorowodorku N'-(etylokarbonimidoilo)-N,N-dimetylo-1,3-propanediaminy (0,000404

PL 218 788 B1 mola; 1,5 równoważnika), 1-hydroksy-1H-benzotriazolu (0,000404 mola; 1,5 równoważnika) i Et3N (0,000269 mola) w CH2CI2 (2 ml) mieszano w temperaturze pokojowej przez 12 godzin, po czym rozpuszczalnik odparowano. Pozostałość oczyszczono metodą HPLC. Frakcje zebrano i rozpuszczalnik odparowano. Wydajność: 0,063 g związku 520 (46, 37%).

P r z y k ł a d B10 Wytwarzanie

Mieszaninę związku pośredniego 27 (0,0026 mola) i związku pośredniego 26 (0,0026 mola) w EtOH (380 ml) i stężony H2SO4 (19 ml) mieszano i ogrzewano w temperaturze refluksu przez 15 godzin, po czym ochłodzono do temperatury pokojowej, wylano do wody z lodem, zalkalizowano K2CO3 i ekstrahowano EtOAc, warstwę organiczną oddzielono, osuszono (MgSO4), przesączono i rozpuszczalnik odparowano. Pozostałość (17,9 g) oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (eluent: cykloheksan/EtOAc; 80/20; 15-35 pμ). Czyste frakcje zebrano i rozpuszczalnik odparowano. Wydajność: 0,85 g F1, 1,1 g F2 i 11,5 g F3. Frakcje F1 i F2 krystalizowano oddzielnie od eteru naftowego. Osad odsączono i osuszono. Wydajność: 0,34 g związku 233.

P r z y k ł a d B11

Wytwarzanie

Mieszaninę związku 22 (wytworzono według przykładu B4) (0,004 mola) w HCl (3N) (20 ml) i THF (20 ml) mieszano i ogrzewano w temperaturze refluksu przez 8 godzin, po czym wylano na lód, zalkalizowano NH4OH i ekstrahowano CH2CI2. Warstwę organiczną oddzielono, osuszono (MgSO4), przesączono i rozpuszczalnik odparowano. Pozostałość (1,2 g) oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (eluent: CH₂CI₂/CH₃OH/NH₄OH; 93/7/0,5; 15-40 μm). Zebrano dwie frakcje i rozpuszczalnik odparowano. Wydajność: 0,5 g F1 (41%) i 0,4 g F2. Frakcję F1 krystalizowano z eteru naftowego. Osad odsączono i osuszono. Wydajność: 0,17 g związku 511 (14%).

P r z y k ł a d B12

Wytwarzanie

Mieszaninę związku 524 (wytworzono według przykładu B9a) (0,0018 mola) i 85% KOH (0,0094 mola) w EtOH (15 ml) mieszano i ogrzewano w temperaturze refluksu przez 24 godziny, po czym wylano do H2O i ekstrahowano CH2CI2. Warstwę organiczną oddzielono, osuszono (MgSO4), przesączoPL 218 788 B1 no i rozpuszczalnik odparowano. Pozostałość oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (eluent: CH₂CI₂/cykloheksan 80/20; 15-40 μm). Zebrano dwie frakcje i rozpuszczalnik odparowano. Wydajność: 0,35 g F1 (64%) i 0,17 g (SM), frakcję F1 krystalizowano z eteru dietylowego. Osad odsączono i osuszono. Wydajność: 0,33 g związku 514 (60%) (temperatura topnienia: 185°C).

P r z y k ł a d B13 Wytwarzanie

Mieszaninę związku pośredniego 28 (0,019 mola), kwasu 2-benzofuranyloboronowego (0,028 mola), Pd(PPH3)4 (0,001 mola) i BHT (w małej ilości) w dioksanie (25 ml) i Na2CO3 [2] (25 ml) mieszano i ogrzewano w temperaturze refluksu przez 8 godzin, po czym ekstrahowano EtOAc, warstwę wodną zalkalizowano NH4OH i ekstrahowano CH2CI2. Warstwę organiczną oddzielono, osuszono (MgSO4), przesączono i rozpuszczalnik odparowano. Pozostałość (3,6 g) oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (eluent: CH₂CI₂/CH₃OH 99/1; 15-40 μm). Czyste frakcje zebrano i rozpuszczalnik odparowano. Wydajność: 1,8 g (33%). Tę frakcję krystalizowano z układu 2-propanon/eter dietylowy. Osad odsączono i osuszono. Wydajność: 0,39 g związku 515 (7%) (temperatura topnienia: 134°C).

P r z y k ł a d B14

Wytwarzanie

Do roztworu związku pośredniego 32 (0,004 mola) w CF3COOH (5 ml) i AcOH (10 ml), w temperaturze pokojowej, powoli dodano trietylosilan (0,0012 mola). Następnie, utrzymując przepływ azotu, porcjami dodano NaBH4 (0,0012 mola). Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 8 godzin, wylano na lód, zalkalizowano K2CO3 i ekstrahowano CH2CI2. Warstwę organiczną oddzielono, osuszono (MgSO4), przesączono i rozpuszczalnik odparowano. Pozostałość (1,2 g) oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (eluent: CH2CI2/CH3OH 99/1; 15-40 μm). Zebrano dwie frakcje i rozpuszczalnik odparowano. Wydajność: 0,5 g F1 (43%) i 0,4 g F2. Frakcję F1 rozpuszczono w iPrOH, po czym dodano HCl/iPrOH (1 równoważnik). Osad odsączono i osuszono; Wydajność: 0,32 g związku 526 (temperatura topnienia: 248°C).

P r z y k ł a d B15

Wytwarzanie

PL 218 788 B1

Mieszaninę związku pośredniego 33 (0,082 mola) i 3-chloro-2-etylo-2-butenalu (0,098 mola) w AcOH (200 ml) mieszano i ogrzewano w temperaturze refluksu przez 8 godzin, po czym rozpuszczalnik odparowano do sucha. Pozostałość rozpuszczono w CH2CI2 i przemyto 10% K2CO3. Warstwę organiczną oddzielono, osuszono (MgSO4), przesączono i rozpuszczalnik odparowano. Pozostałość (27 g) oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (eluent: CH2CI2/Et-OAc 95/5 do 92/8; 15-35 μm). Zebrano dwie frakcje i rozpuszczalnik odparowano. Wydajność: 0,7 g F1 i 5,3 g F2. F1 krystalizowano z układu 2-propanon/eter dietylowy. Osad odsączono i osuszono. Wydajność: 0,25 g związku 471 (2%) (temperatura topnienia: 140°C).

P r z y k ł a d B16

Wytwarzanie

Do roztworu związku pośredniego 35 (wytworzono według przykładu A17b) (0,0379 mola) w THF (200 ml), w temperaturze -78°C, utrzymując przepływ azotu, kroplami dodano nBuLi (0,0417 mola), po czym mieszaninę reakcyjną mieszano przez 30 minut, a następnie, w temperaturze -78°C, kroplami dodano roztwór 4-bromo-N-metoksy-N-metylobenzenacetamidu (0,0568 mola) w THF (100 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze -78°C do 0°C, wylano do H2O i ekstrahowano EtOAc, warstwę organiczną oddzielono, osuszono (MgSO4), przesączono i rozpuszczalnik odparowano do sucha. Pozostałość (20,9 g) oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (eluent: toluen/EtOAc 60/40 do 50/50; 15-35 μm). Zebrano dwie frakcje i rozpuszczalnik odparowano. Wydajność: 4 g frakcji 1 i 4 g frakcji 2 (28%). Frakcję 2 krystalizowano z eteru dietylowego. Osad odsączono i osuszono. Wydajność: 1 g związku 528 (temperatura topnienia 195°C).

Tablice 1 do 8 zawierają związki o wzorze (I-A) i (I-B), które wytworzono według jednego z powyższych przykładów.

Tablica 1

O R⁴

Związek	Przykład		r3	R4	R1		Właśc.
nr	nr						f iz.
54	B2	Cl	etyl	H		ca	-
3	B3o	Cl	etyl	H	f	ΎΎ	t. t.
						145°C
55	B3b	Cl	etyl	H		2	t„ t.
							131°C

PL 218 788 B1

56	E3b	Cl	etyl	H		t.t. 104’C
57	B3b	Cl	etyl	H	fenyloetyl	t.t.
							10Q°C
5 δ	B3b	Cl	etyl	H	c	a	t.t.
							126’C
59	B3b	Cl	etyl	H	c	a	t.t.
							ISO^C
60	B3b	Cl	etyl	H	ca	t.t. 138°C
61	B3b	och3	etyl	H	a	-
62	B3b	och3	etyl	H	c	a	t.t.
							13G°C
63	33b	och3	etyl	H	r		t.t.
						7	116°C
64	33b	Cl	etyl	H	-(CH2)2-O-CH3	t. t..
							82°C
65	33b	OCH3	etyl	H	1-met ylocyklo-	t.t.
					heksyl	82°C
66	33b	OCH 3	etyl	H	3-metcksycyklo-	trans;
					heksyl	t. t.
							94°C
67	33b	GCHcj	etyl	H	3-metoksycyklo-	cis;
					^heksyl	t.t.
							108°C
6θ	B3b	och3	etyl	H	4-imetyloeto-	(A) ,
					|ksy)cykloheksyl	t,t.82°C

PL 218 788 B1

69	B3b	och3	etyl	H	4-[C(CH3>3J- cykloheksyl	cis; 92aC
70	B3b	och3	etyl	H	4-[CiCH3J3]- cykloheksyl	trans; t.t. 103°C
71	B3b	OCH 3	etyl	H	4-metylocyklo- heksyl	t.t. 92°C
72	33b	OCH 2	etyl	H	4-metylocyklo- heksyl	(A) , t.t. 80°C
2	B2	Cl	etyl	H	CH2-CH(CH3)2	t.t. 82°C
73	B3b	Cl	et yl	H	-CH2-O-C2H5	t.t. 82°C
48	B2	H	metyl	H	cykloheksyl
74	B4	I	etyl	H	ca	-
75	B4	I	etyl	H	ca	t.t. 124°C
76	B4	I	etyl	H		t - Ł . 138°C
77	B4	I	etyl	H	,ασ	t.t. 120°C
73	B4	CN	etyl	H	-	t.t. i2e°c
79	B4	CN	etyl	H	TFT	t.t.

PL 218 788 B1

			1 :ftO
80	84	CN	etyl	H	ao	t.t.
						120°C
81	Β4	CN	etyl	H	ca	t, t,
						139°C
82	S4	metyl	etyl	H	ca	t.t-»
						106°C
83	B4	metyl	etyl	H	ca	t.t. 2400
84	B4	metyl	etyl	H		t.t, iiaa
85'	B4	metyl	etyl	H	a	t.t.
						180°C
86	B4	metyl	etyl	H	fenyloetyl	t
						53°C
87	B4	metyl	etyl	H	a	t.t.
						87°C
88	B4	metyl	etyl	H	-CH2-CH(CH3)2	t.t.
						68°C
89	34	metyl	etyl	H	CCf	t.t.
						120°C
31	B4	3-tiazolil	etyl	E	4-metoksyc.yklo-	cis;113°
					heksyl	C
90	B3b	och3	H	H	4-metoksycykło-	trans,
					heksyl	t.t.
	1					1.26°C

PL 218 788 B1

91	B3b	och3	H	H	4-metoksycyklo- heksyl	cis t t.t. 100°C
92	B3b	och3	H		4-metoksycyklo-	cis;
					heksyl	t .t.
						120°C
93	B3b	och3	H	ch3	4-metoksycyklo-	trans;
					heksyl	t.t.
						111°C
94	B3b	OCH 3	metyl	H	4-metoksycyklo-	c is f
					heksyl	t.t.
						96°C
95	B3b	och3	fenyl	H	4-metoksycyklo-	Cis; HC1
					heksyl	(1:1),
						t.t.
						138°C
96	B3b	och3	propyl	H	4-metoksycyklo-	trans;
					heksyl.	t.t.
						118°C
97	B3b	OCH 3	propyl	H	4-metoksycyklo-	cis;
					heksyl	t.t.
						108°C
98	B3b	och3	metyl	H	4-metoksycyklo-	cis;
					heksyl	t.t.
						104°C
99	B4	N(CH3)2	etyl	H		(B) ;
						t.t.
						102°C

PL 218 788 B1

100	B3b	Cl	etyl	H	XX	t.t. 114°C
101	B4	metyl	etyl	H	4-buteksyeyklo- heksyl	cis; t.t. 86°C
102	33b	Cl	etyl	H	ZT	t.t. 78°C
103	B3b	Cl	etyl	H	cr	t.t.91°C
104	B4	N (CH3) 2	et yl	H		t.t, 103°C
105	B4	N(CH3)2	etyl	H	ox	t.t. 170°C
106	B3b	Cl	etyl	H	-fr	t.t. 137ńC
107	B3b	Cl	etyl	H	σ	t.t. 137°C
10Θ	B4	metyl	etyl	etyl	4~metoksycyklo- heksyl	cis; t.t. 9ł°C
109	B4	metyl	etyl	H	4-etoksycyklo- heksyl	trans; t.t. 150’C
110	B4	metyl	etyl	H		t.t. 90°C
111	B4	metyl	etyl	H		t.t. 94°C
112	B4	metyl	etyl	H		t.t, 176°C

PL 218 788 B1

113	Β4	metyl	etyl	H		t. t. 106°C
114	Β4	propyl	H	H	4-iaetoksycyklo- heksyl	c i s; 74°C
115	Β4	metyl	etyl	H	4-etoksycyklo- heksyl	ci 3 ; t.t. 10B°C
116	Β4	metyl	a t y 1	H	σ	t.t. 110°C
117	B3b	Cl	etyl	H		t.t. 124°C
118	B3b	Cl	etyl	H		t.t. 107°C
119	B3b	Cl	etyl	H	a? I	t.t. 129°C
120	B4	metyl	etyl	H	O	t.t. 106yC
41	B3b	Cl	etyl	H	Τν	trans; t.t. 15t°C
182	B3b	metyl	etyl	H		t.t. 170°C
183	B3b	metyl	etyl	H		trans; t.t. 144°C

PL 218 788 B1

184	B3b	metyl	etyl	H	22	t.t. 138’C
185	B3b	Cl	etyl	H	OuC	t.t. 120eC
186	B3b	Cl	etyl	H
187	B3b	metyl	etyl	H		t.t. 162*C
216	B4	CCsN	etyl	H	α	t,t. 160°C
217	B4	metyl	etyl	H	cęr	etano- diesan {1:1}; t.t. 143°C
218	B4	T	etyl	B	7	t.t. 102°C
219	B4	CC=N	etyl	li	HsC HsCr^-^	t.t. 115’C
220	B4	Cl	etyl	H.	ot	(A) ; 107°C
221	B4	Cl	etyl	H	ot	(B) ; t.t. 113’C

PL 218 788 B1

222	Β4	I	etyl	H	a	t.t·. 206°C
223	Β4	Cl	etyl.	H	JO	(trans); t.t. 117 °C.
224	Β4	metyl	etyl	H	.aó	(A) ; t, t. 'r Λ ° r Ib J
225	Β2	Cl	etyl	H	a	t.t. 34°C
226	B3b	Cl	etyl	H	„jo	(trans); t.t. 157 C
227	B3c	metoksy	Ot i	H	oJ	t.t. 204°C
228	B4	Cl	etyl	H	H3CO''^^	(A) ; t.t. 13ScC i
229	B3b	n-propyl	H	H	nr	(trans); HC1 (1:1; t.t. 150“C
230	B3b	Cl	etyl	H	ęcr OCH3	t.t. 11€°C
231	B3b	Ci	etyl	H	cęr	t.t. 120°C

PL 218 788 B1

232	B3b I	Cl	etyl	H	Y	t.t, 2. >4. £^t l—i*
233	ΒΙΟ	i-propyl	H	c;-e )O-		(cis); t.t, 91°C
234	B4	metyl	styl	H		t.t. 122Ά
235	B4	metyl	etyl	H	Ol!/	t.t,
236	B4	metyl	etyl	H		rnp.;104 °c
237	B4	metyl	etyl ;	H	Cr	t.t. 90°C
233	84	metyl	H	H	AT	(cis); t.t. 80eC
239	B3b		etyl	H		(trans); t.t. i2e°c
240	B3b	Cl	etyl	fi		(cis); t.t. 123SC
241	84	metyl	etyl	H	i X	:h3 X	(A); t.t. 90°C
242	34	metyl	etyl	H	i HsCO^^	?H3 A	(B)i t.t.

PL 218 788 B1

				110°C
243	B3b	Cl	etyl	H		t.t. 134’C
244	B3b	Cl	etyl	H		t.t. 127ϋΕ
245	B4	NHC(=O)NH2	etyl	H		(cis); t. t. 176°C
246	B4	metyl	etyl	H		(B)
247	B3b	Cl	etyl	H	σ	t.t. 92 °C
248	B4	metyl	etyl	H		(A); t.t. 80“C
249	B3b	Cl	etyl	H		(B); t.t. 138’C
25C	B4	metyl	etyl	H	p O-npropyl	(trans) t.t. 118°C
251	B4	metyl	etyl	H	a	(B); HC1 (1:1)
252	B3b	Cl	etyl	H		<A)
253	B3b	Cl	etyl	H	p /propyl	i B)

PL 218 788 B1

254	B3b	metyl	etyl	H	σ	t -rt . ?rc
255	Β4	metyl	etyl	H	&	(cis 5;
					O-npropyl	t.t.
						68 °C
256	Β4	metyl	etyl	H	χσ	t.t. żitrc
257	Β4	metyl	etyl	H	ca	t.t.
					T och3	113°C
258	Β4	metyl	etyl	H		t.t. 92°C
259	E3b	metyl	etyl	H	jX	t.t. 115aC
260	B3b	metyl	etyl	H		t.t.
					1 och3	60°C
261	33b	Cl	etyl	fi	YY	(A) ; t.t.
						86“C
262	B3b	Cx	etyl	H		SB) ; t.t. 101Χ
263	B3b	metyl	etyl	H	np	t.t, ISiTC
264	B3b	Cl	etyl	fi	a	ift!;
						t.t.
						124°C

PL 218 788 B1

265	B3to	Cl	etyl	H	Cr	(B) i t.t. 126’C
266	34	H(CH352	etyl	B		(trans); t.t. 102“C
267	B4	n(CH3)2	etyl	K		(cis); HC1 (1:1); t.t. 170°C
263	04	metyl	etyl	H	ττ	(A); HC1 (1:1) ; t.t, 206°C
269	B4	metyl	etyl	H		t.t, 104’C
270	B3b	metyl	etyl	B		t.t. 117°C
271	04	nhc2hsoch3	etyl	H	7	-
272	B4	isetyl	etyl	H		-
273	B4	nh2	etyl	H		-
274	B3b	Cl	etyl	H	A.

PL 218 788 B1

275	B3b	Cl	etyl	H		t.t. 99°C
276	B3b	Cl	etyl	H	d	t.t. 95°C
277	B4	metyl	etyl	H	d	t.t, 105°C
278	B3b	Cl	etyl	H	06	t.t. 141°C
279	B4	Cl	etyl	H	22	t.t. 168°C
280	B4	Cl	etyl	H	22	-
281	B4	Cl	etyl	U		t.t. 140°C
232	B4	Cl	etyl	H	<Γ6	t.t. 169°C
283	34	metyl	etyl	H	d	t.t. 96°C
284	B3b	Cl	CH2N(CH3)2	H	Ob	t.t. 115°C
285	B4	metyl	etyl	H	u	t.t. 133aC
286	B4	metyl	ch2och3	H	.22	(trails) ; t.t. 106°C
2S7	B4	metyl	CH2N(CH3)2	H	.22	(cis); t.t.

PL 218 788 B1

						110°C
288	B3b	Cl	rt-propyl	H	tx	t.t.; 1109C
289	B4	1¾	etyl	H	OL·	t.t, 218 C
290	B4	metyl	n-propyl	H		t.t. 90*Χ
291	B3b	Cl	n-propyl	H	„θ'	{cis 1; t.t, las^c.....
292	B3b	Cl	n-propyl	H		(trans); t.t. 1049C
293	B3b	Cl	etyl	H	&	t, t. 106’C
294	B4	metyl	n-propyl	H	,θθ	(cis); t.t. i 94 X i
295	B4	metyl	CHjjN (CH3) 2	H	Cc	t.t. 83®C
296	B3b	Cl	etyl	H	Π	t.t, 99aC
297	B3b	ci	styl	H	UL·	t.t, noec
298	B4	metyl.	etyl	H	UL·	t.t. 93 °C

PL 218 788 B1

299	34	metyl	etyl	H	..........»'........................ .............	;. t, 105°C
300	Bl	metyl	etyl	H	&	t.t, 114*C
301	B3b	metyl	etyl	H	<r	t.t. 143°C
302	B4	metoksy	etyl	H	cer	t. Ł. 93ttC
303	34	metyl	etyl	H		t.t, 82°C
304	B4	n-buty.l	etyl	H	cer	-
305	B3b	Cl	n-propyl	H	ctr^	t.t. 125’C
306	BI	metyl	C(=O)OC2H5	H	ćr	t.t. 136=C
307	B4	metyl	n-propyl	H	cer	t.t. 81°C
308	B4	met o kusy	n-propyl	H		t.t. eoa
309	34	I	n-propyl	H	On	t.t. 120°C
310	B3d	metyl	etyl	H		-HC1 (1:1); t.t. 129nC
311	B3b	ri 7 V-i_	H	H	cr	1SO*C

PL 218 788 B1

312	B3b	Cl	a	H	.X	(trans); t.t. nsa
313	B3b	Cl	H	H	iir	t .fc* 1G3°C
314	B4	n-propyl	n-propyl	K	sr	HCl ( ,l c 1) 7 t.t. 150Χ
315	B4	n-propyl	etyl	H	Cr	HCl (1:1!
316	B4	n-propyl	H	H	σ	1 (1:1) : t.t. 140°C
317	B3b	Cl	H	H	Q .	t.t. 1SB°C
318	B4	metyl	n-propyl	H	O	HCl j (1:1); t.t. 200“C
509	B3b	Cl	etyl	H	σ	-
510	B4	metyl	etyl	H	σ	h2o (1:1)
513	B4	metyl	etyl	H	η	-
516	B4	Cl	etyl	H		t.t. 120°C

PL 218 788 B1

517	11	I	etyl	a	CH2CH{CH352	-
SIS	B4	Cl	etyl	a	&	-
519	B4	Cl	etyl	H	Γ^Ύ^ηϊ	(A+B)
521	B4	I	etyl	H	dr	-
522	31	metyl	etyl	H	ΑΛ.-Ο H	!Λ3
J,	B4	metyl	etyl	H		(AS
525	B4	Cl	etyl	H
527	B4	F	etyl		cr	t.t. 1167

Tablica 2

Związek nr	Przykład XIΓ	r2	X	Właściwości fizyczne
5	B3b	Cl	o	trans; t.t. 1207
121	B3b	1-piperydyny!	o	cis; HC1 (lii)
122	B3b	1-piperydyny!	o	trans; HC1 (1:1}; t.t. 128°C
123	B3b	4-tiamorfolinyl	0	cia; t.t, 1C5°C
124	B3b	4-tiomorfoIinyl	o	trans; t.t. 115°C
125	B3b	4-morfolinyl	0	trans; t.t. 118’C
126	B3b	4-morfolinyl	0	cis; t.t, 118°C

PL 218 788 B1

127	B3b	-N(CHS)?	0	trans; t.t. 96°C
128	B3b	-n(ch3)?	0	cis; t.t. 114°C
4	B3b	Cl	0	cis; t.t. 123°C
8	B3c	och3	0	trans; t.t. 68’C
7	B3c	och3	0	cis; t.t. 116°C
6	B4	acetyl	0	trans; t.t. 10B°C
129	B4	acetyl	0	cis; t.t. 106°C
11	34	Nil- (CHj) ?-OCH3	0	trans; t.t. 107°c
10	B4	NH-<CH?}7-OCEs	o	cis; t.t. 115°C
12	B4	KH-(CH?}?-SCH3	0	cis; t.t. 120°C
13	B4	KH-(CH?)7~SCH3	0	trans; t.t. 125 °C
14	B4	-C=C-Si(CH3)3	0	cis; t.t. 114°C
16	B4	07-31 i CH-.; -i	0	trans; t.t, 108°C
15	B4	-OCH	0	cis; t.t. 132-133“C
17	B4	-C-CK	0	trans; t.t. 128“C
18	B4	-C=C-CH?OH	0	cis; t.t. 113OC
130	B4	-OC-CH7GH	0	trans; t.t. 108°C
19	B4	ΪΓ	0	cis; t.t. 92-99°C
20	B4	π·	0	trans; t.t. 114°C
21	B4	I	0	cis; t.t. 110°C
22	B4	CN	0	cis; t.t. 137-138°C
26	34	H	0	trans
23	B4	-Co-G; -0C1H	0	cis; t.t. 91°C
24	B4	-C(O}-QCH-5	0	trans; t.t. 99°C
25	B4	H	0	cis; t.t. 88°C
27	B4	metyl	0	cis; t.t. 110-112°C
131	£54	metyl	o	trans; t.t. 25 °C

PL 218 788 B1

28	Β4	etenyl	0	cis; t.t. 108 °C
132	34	etenyl	0	trans; t.t. 103°C
29	34	fenyl	0	trans; t.t. 112°C
30	Β4	2-tienyl	0	cis; 142 C
133	Β4	2-tiazolil	0	cis; 108°C
134	Β4	2-furanyl	0	cis; t.t. 105°C
51	B8a	octa	N-OH	[1α(Α),4α]; t.t. 133°C
52	B8a	och3	N-OH	[1α(Β),4α]; t.t. 142°C
53	B8b	och3	NN9?	[lot (Z) , 4a] ; t.t. 110oC
135	B4	rh9	0	cis; t.t. 203 °C
136	B4	KH?	0	trans; t.t. 202°C
137	B4	-C(—OJ-OCH(CH3)2	0	cis; t.t. 105°C
138	34	-C(=0)-OCH(CH3)7	0	trans; t.t. 88°C
38	34	sch3	0	cis; t.t, 124°C
39	34	sch3	0	trans; t.t. 1I6°C
32	34	Η Ϊ .χ,Α/ 0	0	cis; t.t, 130 °C
139	B4	etyl	0	cis; t.t. 180°C
188	B4	NH?	0	cis + trans
189	B4	jyO-ocH, 0	0	cis; t.t. 154 ”C
190	B4	-A/CO”5 0	0	trans; t.t. 156°C
191	B4	-'kfCp 0	0	cis; t.t. >260”C
192	B4	0	0	Η2Ο (1:1); trans; t.t. 248°C

PL 218 788 B1

193	Β4	W 0 o	0	cis; t.t. 224°C
194	Β4	w 0 0	0	trans; t.t. 234°C
195	Β4	/^Y>)C2hs o	0	cis; t.t. 108 °C
196	Β4	X^Y>3C2H6 0	0	trans; t.t. 127°C
197	Β4	~H /Νγ^'δ'^θ	0	cis; t.t. 150“C
198	Β4	VX3	0	trans; t.t. 90°C
199	Β4	'!T0j	0	LC/MS [M+H]+; 475.4
200	Β4	Αγ>τ-Ο	0	LC/MS [M+H]+; 464.3
201	Β4	•*rcro	0	LC/MS [M.+H]+; 523.3
202	Β4		0	LC/MS [M+H]+; 465,3
203	Β4	Υθ	0	LC/MS (M+H)+; 475.4
204	Β4	o	0	LC/MS [M+H]+; 465.3
205	Β4	;	0	-
319	Β4		0	(cis); etanodiesan(1:1); t.t. 160°C
320	Β4	''Ό	0	(cis); t.t, 150°C

PL 218 788 B1

321	Β4	metoksy	CK2	(Cis); HCl (1:1); t.t. 118°C
322	Β4	n-butyl·	0	(cis); HCl (1:1) ; t.t. 158°C
323	34	0	0
324	Β4	A^JO o	0	-
325	Β4	ϊ VHs H 11 11 1	0	-
326	Β4	H χΝ'γχχο'χχοΗ3 o	0	-
327	Β4		0	-
328	Β4	/Νγθ> 0	0	-
329	Β4	Onó	0	-
330	Β4	H x'N'sJxxn(ch3)2	0	-
331	Β4	sVo	0	-
332	Β4	Άό	0	-
333	Β4	a//” 0	0	-
334	Β4	H a// o	0	-

PL 218 788 B1

335	Β4	Β ίΤ' ο	0
336	Β4	HyAM 0	0	-
337	Β4	0	0	-
338	Β4	ο	0	-
339	Β4	αΧ 0	0	-
340	Β4	Χυο 0	0	-
341	Β4		ο	-
342	Β4	Ο	0	-
343	Β4		0	-
344	Β4	α°	0	-
345	Β4	0	0	-
346	Β4	ΎΧ	0	-
347	Β4	/Ny-X^XCF3 0	0	-
348	Β4	CHjOC(=0)CH3	0	(cis); t.t. 74°C
349	Β4	0	0	-

PL 218 788 B1

350	Β4		0	-
351	Β4		0	-
352	34	γΧ	0	-
353	Η4		0	(A); HC1(1:2) H2O(1:1); t.t. 166°C
354	Β4	Χ%η3	o	(cis)
355	Β4	Η	o
356	Β4	Α/Χ	0	-
357	Β4		0
358	Β4	Ύο	0	-
359	34		0	- :
360	34	X	o	-
361	Β4	0	0	-
362	Β4	^γ-'Τ.Η,. O	0	-
363	34	_ ΎΧ	o	-
364	Β4	“cHJCHa	0

PL 218 788 B1

365	Β4	Η Η η Ρμ. ΤΙ	0	-
366	Β4	Η Fi 7 Τη	0	-
367	Β4	0	0	-
368	Β4	Η Η Π 0	0	-
369	Β4	ΛΛη ° <aN(C^	0	-
370	Β4	AAzOw, ο	0	-
371	Β4	Α/ΧΟ ο ν	0	_
372	Β4	°'’Y'Ox'Ch3 Ύύ	0	_
373	Β4	χΟΗ3 X	0	-
374	Β4	/NyXx'^<K/CH3	0	-
375	Β4		0	-
376	Β4	Α°	0	-
377	Β4	ο χ<Ρ°Ρ, Η 0	0	-
373	Β4		0	-

PL 218 788 B1

37 9	B4		0	-
3S0	B4	cii	0	-
381	B4		o	-
382	BI	''ffTfi <^kCH3	o
383	B4	0 ^\5CH3	0	(cis); t.t, 148ttC
384	B4	° C^OCH,	0	(trans); t.t. 14FC
365	B4	Λ-θ	0	t.t. 130°C
38 6	B4	0	0	(cis); t.t. 140sC
387	B4	aXJ	0	(trans); t.t. 155°C

Tablica 3

Związek nr	Przykład nr	Y1	R1	Właściwości fizyczne
140	B4	0	ca	t.t. 220°C
141	B4	0	ca	t.t. 213°C

PL 218 788 B1

142	Β4	0	4 1
143	Β4	0	l-m@tylocyklohek.syl	t.t. 195-2107
144	Β4	0	3-metoksycykloheksyl	cis; t.t. 1567
145	Β4	0	3-metoksycykloheksyl	trans; t.t. 156-1637
146	Β4	0	4-(dimetyloetylo)-	t.t. 2307
			cykloheksyl
147	Β4	0	4-(metyloetoksy) -	t.t. 1867
			cykloheksyl
148	Β4	0	4-metylocykloheksyl	trans; t.t. 214°C
36	Β4	s	4-metoksycykloheksyl	cis; t.t. 2247
37	Β4	s	4-metoksycykloheksyl	trans; t.t. 2207
149	Β4	o	X	t.t. 1887
40	334	0	X	t.t. 1927
150	Β4	0	AT	cis; t.t. 2267
151	Β4	0	aT	trans; t.t. 2267
152	Β4	0	σ	t.t. 2137
153	Β4	0	C7	t.t. 2007
154	Β4	0	a 1	t.t. 210 7
155	Β4	0	4,4-dimetylocykloheksyl	t.t. 2427
338	Β4	0	CH7CH(CH3)7	t.t. 1897
389	Β4	0	ca	t.t. 2287

PL 218 788 B1

390	B4	0		t.t. 197°C
391	B4	0		t.t. 145°C
392	B4	0	yXr	t.t. 192°C
393	B4	0		(B); t.t. 224°C
394	B4	0		JA); t.t. 201°C
395	B4	0		(A)- t.t. 207°C
396	B4	0	11'	t.t. 212°C
397	B4	0	ar	(B); t.t. 238°C
398	B4	0	OT	t.t. 234°C
399	B4	0		(cis); t.t. 192°C

Tablica 4

O R⁴

Związek	Przykład	R3	R4	RS	R	Właściwości
nr	nr					fi zyczne
156	B4	etyl	E	H	och3	trans; t.t.
						252“C
157	B4	H	H	H	och3	(cis + trans);
						t.t. 244 °C

PL 218 788 B1

158	Β4	Η	metyl	H	och3	ci s; t.t.
						>260°C
159	Β4	metyl	H	H	och3	cis; t,t. 254°C
160	Β4	metyl	H	K	OCH 3	trans; t.t. >260°C
161	Β4	propyl	H	H	OCK3	t.t. 208°C
162	Β4	propyl	H	H	och3	trans; t.t. 232°ε
9	Β4	etyl	H	H	och3	cis; t.t. 224- 226C
43	Β5	etyl	H	ch3	och3	trans; t.t, 116°C
42	BS	etyl	H	ch3	OCH3	cis; t.t. 125°C
44	B6	etyl	H	CH2-COOC2H5	och3	cis; t.t. 152°C
45	B4	etyl	H	CH2-COOC2H5	och3	trans;t.t. 147°C
46	B4	etyl	H	benzyl	och3	cis; t.t. 137“C
47	B4	etyl	H	benzyl	och3	trans; t.t. 130°C
50	B7	metyl	H	H	H	t.t.256.l’C
163	B4	etyl	etyl	H	och3	cis; t.t. 221°C
164	B4	etyl	etyl	H	och3	cis; t.t. 221 °C

PL 218 788 B1

165	Β4	etyl	etyl	H	OCH 3	trans; t.t. 215°C
166	Β4	etyl		ydV O	OCH 3	LC/MS [M+H]+; 429.4
167	34	etyl		0	och3	LC/MS [M+H]+; 451.3
168	84	H	H	H	OCH 3	106°C
169	Β4	etyl	H	1 H	OCH3	LC/MS [M+H]+; 409.3
400	Β9	etyl	H	1 0 0	OCH3	-
401	Β9	etyl	H		och3	-
402	Β9	etyl	H	?OjO	OCH3	-
403	39	etyl	H		OCH3	-
404	Β9	etyl	H	Sr	OCH3	-
405	JB9	etyl	H	1 H fH3	OCH3	*
406	Β4	etyl	H	?O	cch3
407	Β4	etyl	H	d	OCH3	-
408	Β4	etyl	H	d	och3	-

PL 218 788 B1

409	B3b	O	I-I	H	och3	t.t. 168°C
410	B4	ch7och3	H	H	och3	t.t. 194°C
508	B4	etyl	H	Ιγ.ίθ-^00*Η5 o	och3	-
520	JB9	etyl	H	O)	OCH 3	-

Tablica 5

Związek nr	Przykład nr	r4	R1	X	Właściwości fizyczne
33	B4	H	metoksycykloheksyl	CH	cis; t.t. 224°C
34	B4	H	metoksycykloheksyl	CH	trans; t.t. 185°C
35	B4	H	metoksycykloheksyl	N	cis; t.t. 160-172“C
170	B4	H	metoksycykloheksyl	N	trans; t.t. 146°C
171	B4	H	a	N	(3!; t.t. 165°C
172	B4	H	metylocykloheksyl	N	cis + trans; t.t. 143ο0
173	B4	etyl	metoksycykloheksyl	N	cis; t.t. 126°C
411	34	H	LY	N	t.t. 109°C
412	34	H	ca	N	t.t. 180°C
413	B4	H		N	(A)
414	B4	H		N	t.t. 156°C

PL 218 788 B1

Tablica 6

Związek nr	Przykład	R	L	Właściwości fizyczne
49	B7	H	0*	-
174	B3b	och3	X-	cis; t.t. 115°C
175	B3b	OCH 3	O»	trans; t.t. 141 °C
176	B3b	och3		cis; t.t.l49sC
177	B3b	GCH3	X	t.t, 126°C
178	33b	OCH3	ΧΟΟ	trans; t.t.i60°C
179	B3b	OCH 3	ęcc	cis; t.t.H9BC
180	B3b	OCH 3		trans; t.t. 124 °C
181	B3b	och3	3X0	trans; t.t. 92Χ
206	B3b	OCH 3	ΤΧΟ MD	cis; m.p. 144°C

PL 218 788 B1

207	B3b	OCK3	7X0 CHj	trans; t.t. 1257
208	S3b	och3	xoo ch3	cis; t.t. 127°C
209	B3b	och3		cis; t.t. 1017
210	B3b	och3		cis; t.t. 1047
211	B3b	och3		trans; t.t. 1347
212	B4	OCH3		cis; t.t. 1417
213	B4	OCH 3	XYC H	trans; t.t. 21 57
214	B4	°ch3	YYY	cis; t.t, 1397
215	B3b	OCH 3	M>Ac«	trans
415	B3b	OCH 3	yyV	(cis); t.t. 1367
41fi	B3b	OCH 3	TOu	(cis)
417	B4	OCH 3	Y,	(cis); t.t. 1497

PL 218 788 B1

418	B3b	OCH3	XX	(trans); t.t. 132°C
419	B4	OCH 3	2XXX?CH3 H	(cis); t.t. 217°C
420	B3b	OCH 3	XX	(cis); HC1 (1:1); t.t. 20G°C
421	B4	OH	W	(cis); t.t. 215°C
422	B4	OH	XX	(trans); t.t. 178°C
423	B3b	OCH 3	XX ch3	t.t. 160°C
424	B3b	OCH 3	XX	(cis); t.t. 106°C
425	B3b	OCH 3	XX	(trans); t.t. 120°C
426	B3b	OCH 3	XX)	(cis); t.t. 121°C
427	B3b	H	XX	t.t. 156°C
428	B3b	OCH 3		(cis); t.t, 156°C
429	B3b	OCH3	XX	(trans); t.t, 197°C
430	B3b	CH3	XX	(B)
431	B3b	ch3	XX	(A)

PL 218 788 B1

Tablica Ί

PL 218 788 B1

446	B3b	cr		t.t. 1SO°C
447	B3b	a	ΤΧΧΧ	t.t. 165°C
4 48	B3b	x	7X	t.t, 147QC
449	B3b	a	IW	t.t. 154°C
450	B3b	ca	UW	t.t. 157°C
4 51	B4	ck	UW	t.t. 190°C
452	B4	a^	OQu	t.t. 187°C
453	B3b	ΧΓ	X	t.t. 200°C
454	B3b	CL·	ΌΧ>	t.t. 160°C
455	B3b	cr	wS—i	t,t, 139°C
456	B3b	a	’X	(A); t.t. 174aC
457	B3b			(B); t.t. 160°C
458	B3b	OL·	X	t.t. 184°C
459	B4	,xr	tocA

PL 218 788 B1

PL 218 788 B1

477	Β4	ĆO	X00	t.t. 155eC
478	Β2	trimetylometyl	ΌΧ	t.t. 124*0
479	Β4		Χ00	{A); t.t. 146’C
480	Β4		O»	(B); t.t. :162eC
481	Β4	d		XX	fft); t.t. 129eC
482	Β4	d		1X0	t.t. 11S°C
483	Β2	,.tX	1X0	t.t. 187°C
484	Β2		1X0	t.t. 162°C
485	Β4	CHa „xx	XX	(A); t.t. 130°C
486	84	CHa rX Hjccr^^	ΌΟΟ	(A); t.t. 124°C
487	84	CH- JT	1X0	(3); t.t. 128°C
486	84	X	XX	t.t. 85°C
489	82		1X0	t.t. 150'C
490	Β4	HA p Hsccr'1''·-^	W	(A); t.t. 117*C
491	82	θ'	1X0	t.t. 220°G

PL 218 788 B1

4 92	Β4			W	t.t. 136°C
493	Β2		w	t.t. 131°C
494	Β4	(0		3X0	(A); t.t. 125°C
495	Β4		r	t.t. 135°C
496	Β4		ew	t.t. 139°C
497	84	er	3X0	t.t. 127°C
493	Β16	xr	W	t.t. 195°C
499	Β2	ćr	3X0	t.t. 201°C
500	B3b		3X0'	t.t. 143°C
501	B3b	J	3X0	t.t. 137°C
502	B2	o1	3X0	t.t. 210°C
503	B3d	er	YYY^Y^ch3 OCHg	t.t. 134°C
504	B2	er	«3X0	t.t. 163°C
605	B4	er	3X0	t.t. 142°C
506	B2	er	0X0	t.t. 139°C
507	B4		3X0	t.t. 171°C

PL 218 788 B1

512	B3b	ca	W	-
523	B3b	Ó7	i:	-

Tablica 8

Związek	Przykład	Budowa				Właściwości
nr	nr					fizyczne
511	Bil	Ol	τΓΎΎ	^ch3		-
			LA. ^Nx	ch3
514	B12	γΎ	Lfddd		i	-
		U	Ld α	A
515	B13		^Sty	oz	xch3	-
			La	A	;h3
524	B9a	F	~735H-'			t.t. 185°C
		Lx^	UL. xN^	O5X
		Ol
471	B15	Ux	OTV		Uh3	(E)
			LA	Ν'Χ'·	ch3
		OO-
526	B14	u		da		HCł (1:1)
			LA		OH,

D. Wytwarzanie radioaktywnie znakowanych związków ₃

C.1. Znakowane związki [³H]

PL 218 788 B1

Do palladu na węglu w zmierzonej ilości (10%, 0,872 mg) ostrożnie dodano roztwór związku

498 (I, 0,919 mg, 2,4 ^mola) i trietyloaminy (0,92 μ|, 6,6 mmola) w wysuszonym nad sodem tetrahydrofuranie (175 μ!).

Do kolby przyłączono układ wielokrotnego miareczkowania i mieszaninę reakcyjną ostrożnie odgazowano.

₃

Gazowy tryt (19,5 Ci pod ciśnieniem 1017 mbarów) wytwarzano z wodorku [³H] uranu, po czym mieszaninę reakcyjną, mieszając, pozostawiono w temperaturze pokojowej.

Po upływie 30 minut, mieszaninę reakcyjną zamrożono stosując ciekły azot i nadmiar gazowego trytu odzyskano znad warstwy uranu.

Rozpuszczalnik liofilizowano z mieszaniny reakcyjnej.

Wprowadzono metanol (100 μΐ) i liofilizowano w celu usunięcia nietrwałego trytu. Procedurę powtórzono jeszcze dwa razy.

Pozostałość rozpuszczono w etanolu, przesączono przez filtr strzykawkowy GHP Acrodisk 13 mm i etanol usunięto do końcowej objętości 50,0 ml.

₃

Mieszanina wykazała dla [³H]-związku 528 (II) w 67% radiochemicznej czystości radioaktywność 71 mCi.

Z tej ilości wydzielono frakcję (5,0 ml), którą porcjami starannie oczyszczono metodą preparatywnej HPLC (Kromasil KR 100-10, kolumna 4,6 mm ID x 300 mm).

Wykrywanie UV przeprowadzano przy 265 nm.

Eluowanie przeprowadzono izokratycznie, stosując układ woda-metanol-acetonitryl-diizopropyloamina (47:26,5:26,5:0,2; objętościowo/objętościowo/objętościowo/objętościowo) z szybkością przepływu 2,0 ml/minutę.

Frakcje produktu połączono i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze 30°C. Pozostałość rozpuszczono w etanolu (5,0 ml) i ponownie zatężono.

Procedurę powtórzono jeszcze dwa razy.

Pozostałość rozpuszczono w etanolu (20,0 ml) i tak przechowywano.

₃

Łaźnia zawierała [³H]-związek 528 (II) o ogólnej radioaktywności 3,83 mCi i o czystości powyżej 98% oraz o specyficznej aktywności wynoszącej około 25 Ci/mmol.

D. Przykłady farmakologiczne

D1. Transdukcja sygnału na poziomie sklonowanego szczurzego receptora mGlu1 w komórkach CHO

Komórki CHO, w których dochodzi do ekspresji receptora mGlu1 wysiano na wstępnie powleczonych czarnych 96-studzienkowych płytkach.

Następnego dnia, określono wpływ związków według wynalazku na aktywowany glutaminianem wewnątrzkomórkowy wzrost stężenia Ca²⁺ stosując test fluorescencyjny.

Do zawiesiny komórkowej dodano Fluo-3 AM, płytki inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności, komórki przemyto i na 20 minut dodano związki według wynalazku.

Po tym okresie inkubacji, dla każdej studzienki rejestrowano wywołany glutaminianem wzrost stężenia Ca²⁺ w funkcji czasu stosując czytnik Fluorescent Image Plate Reader (FLIPR, Molecular Devices Inc.).

Rejestrowano jednostki fluorescencji względnej i otrzymano wykresy średnich z danych dla czterech studzienek.

Dla każdego stężenia badanego związku wykreślono krzywe odpowiedzi w zależności od stężenia w oparciu o najsilniejszy poziom fluorescencji (sygnał maksymalny pomiędzy 1 i 90 sekundą). Wartości PIC50 stanowią wartości -log stężenia badanych związków powodującego 50% hamowanie wywołanego glutaminianem wzrostu poziomu wewnątrzkomórkowego Ca²⁺.

Związki według wynalazku wykazują wartość PIC50 co najmniej 5.

Związki przedstawione w tablicach 1-8 wykazują wartość PIC50 co najmniej 6.

Konkretna grupa związków wykazuje wartość PIC50 pomiędzy 7 i 8.

Dotyczy to związków wyszczególnionych w tablicy 9.

PL 218 788 B1

Tablica 9

Związek nr	PIC50
463	7, 98
441	7,95
334	7,95
22	7,94
421	7,94
15	7,93
440	7,93
139	7,93
178	7,92
338	7,91
87	7,90
4 62	7,90
394	7,90
423	7,89
21	7,87
220	7,87
479	7,86
483	7,86
485	7,84
9	7,84
110	7,84
248	7,84
341	7,83
163	7,81
433	7,79
238	7,79
224	7,78
437	7,78
498	7,78
449	7,77
242	7,76

Związek nr	PIC50
281	7,63
487	7,63
299	7,63
431	7,61
98	7,57
464	7,57
446	7,56
251	7,55
484	7,54
494	7,53
128	7,52
344	7,52
161	7,49
298	7,48
454	7,45
456	7,45
277	7,44
91	7,43
356	7,42
229	7,41
333	7,41
326	7,41
369	7,40
430	7,39
435	7,38
35	7,36
228	7,36
429	7,36
117	7,35
291	7,35
313	7,35

PL 218 788 B1

Szczególna grupa związków wykazuje wartość PIC50 co najmniej 8. Są to związki wymienione w tablicy 10.

Tablica 10 :

Związek nr	Budowa	pIC50
416		0			8,587
			i 1Γ	........-,
				1
	(CIS)
27		0 a	τΧτ		8,527
	^oX	X		^Χ
	(CIS)
174	c	o a	ϊΧ	Ύί	8,49
	^ox
	(CIS)

PL 218 788 B1

506		8,48
25	..χ/σχ (CIS)	8, 45
4	-,χ/οχ (CIS)	8,4
19	.,χΎχχ {CIS)	8, 38
429	0 χο JO^X^CfX0 J {CIS)	8,38
424	0 ,oDx'0Co (CIS)	8,355
176	.xŻxXO (CIS)	Θ, 33

PL 218 788 B1

210	0	8,315
	-tt^ei
{CIS)	A
		o
114		YtAC	Ύ	8,28
		J AA	αΆ >·%.
	(CIS)
488	i	0 i |t HY*		8,27
		AA^*	'ΎΓ
504	cc	3 A'A		8,27
		_^x^sAk -sX.	'O^
477	ęc	0 «AA		8,2S
	F	MA	^cr
432		□ jYA		8,237
214	r	0 AHpi		8,233
	nA	A AA	''ipA
	(CIS)

PL 218 788 B1

465	0	8,145
135	.Ραχ (CIS)	8,14
4 20	-..Poco (CIS) chlorowodorek (1:1)	8,135
292	,xpr (CIS)	8,13
427	o	8,115
208	,opo i (CIS)	8,095
419	xóox H {Cisi	8, 065

PL 218 788 B1

455	α	0	8,055
Αγ-	Ογ Μ 0
		0
418		JL		8,045
		Γτ	χγνα
		ΑΑ	άυ s
	(TRANS)
497		0		8,025
		ΥαΑ	ΎΎΊ
		χ	''ττ'ττ
	ΥΥι	ο
439	1			8,023
	ΥΛ,	^ΥΥΥΊ
		αανχ>
	(ίΎ	0
237	I			8,01
		γ	JL >ί Α
	ΑΑ	□
499	Γ Η			8
	αΛ	(ί	αα’ΑΑ~Α
	F	(ί	ζα

₃

D2. Doświadczenia z wiązaniem in vitro związku znakowanego radioaktywnym [³H] według wynalazku ₃

Stosowane tu związki znakowane radioaktywnym [³H] to: związek 528, poniżej nazywany ₃

[³H]związkiem A, który jest odpowiednikiem znakowanego radioaktywnym trytem związku 432.

W następnych akapitach, przedstawiono badanie ilustrujące zastosowanie znakowanych radioaktywnie związków według wynalazku.

PL 218 788 B1

Materiały

Wszystkie odczynniki do hodowli komórkowych otrzymano z firmy Invitrogen (Carlsbad, USA). ₃

Glutaminian otrzymano z firmy Aldrich Chemical Company (Milwaukee, WI); [³H]kwiskwalan (29 Ci/mmol), [³H]Ro 48-8587 (53 Ci/mmol), mio-[³H]inozytol (22 Ci/mmol) i [35S]GTPyS (1030 Ci/mmol) otrzymano z firmy Amersham (Paisley, UK). [³H]MK-801 (22,5 Ci/mmol) i [³H]CGP39653 (20-50 Ci/mmol) otrzymano z firmy NEN (Zaventem, Belgium). GDP otrzymano z firmy Boehringer Manheim (Basel, Switzerland), a glicynę z firmy BioRad (CA, USA). [³H]L689560 (10-30 Ci/mmol), [³H]LY341495 (34,61 Ci/mmol), [³H]MPEP (50,2 Ci/mmol), (S)-4C3HPG, (1S,3R) ACPD, (S)-3,5-DHPG, (S)-4CPG, AIDA, MCPG, MPEP, CPCCOEt, L-SOP i L-kwas kwiskwalenowy zakupiono w firmie Tocris Cookson (Essex, UK). BAY 36-7620, NPS 2390 i fencyklidynę zsyntetyzowano na miejscu. Fluo-3-AM i kwas pluronowy (pluronic) otrzymano z firmy Molecular Probes (Leiden, The Netherlands). Probenecid, strychninę, D-serynę i Triton X-100 zakupiono w firmnie Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany). Wszystkie pozostałe odczynniki pochodziły z firmy Merck (Darmstadt, Germany).

Transfekcja i hodowla komórek

Komórki L929sA o stałej ekspresji ludzkiego receptora mGlu1a otrzymano według opisu Lavreysen i in., Mol. Pharmacol. 61: 1244-1254, 2002 i hodowano na podłożu Glutamax-I uzupełnionym 10% inaktywowaną termicznie, dializowaną płodową surowicą cielęcą, 0,1 mg/ml siarczanem streptomycyny i 100 jednostkami/ml penicyliny. Komórki CHO-dhfr^- o stałej ekspresji szczurzego receptora mGlu1a, -2, -3, -4, -5 i -6 otrzymane w prezencie od S. Nakanishi (Uniwersytet Tokyo, Japonia) hodowano w DMEM z zastosowaniem Glutamax-I oraz 10% inaktywowaną termicznie, dializowaną płodową surowicą cielęcą, 0,4 mM L-proliną, 0,2 mg/ml siarczanem streptomycyny i 200 jednostkami/ml penicyliny. Komórki utrzymywano w atmosferze 5% CO2 do temperaturze 37°C.

Odpowiedź wewnątrzkomórkowego Ca²⁺ w szczurzych i ludzkich komórkach wykazujących ekspresję receptora mGlu1 i w szczurzych komórkach wykazujących ekspresję receptora mGlu5.

Poziom jonów wapnia wewnątrzkomórkowego ([Ca²⁺]i) w ludzkich komórkach L929sA wykazujących ekspresję receptora mGlu1 zmierzono stosując czytnik płytkowy dla obrazowania fluorometrycznego (FLIPR, Molecular Devices, CA, USA), jak opisano w Lavreysen i in., Mol. Pharmacol. 61: 1244-1254, 2002. Tę samą procedurę stosowano w odniesieniu do komórek CHO-dhfr^- wykazujących ekspresję szczurzego receptora mGlu1. Dla szczurzego receptora mGlu5, komórki posiano po 30000 komórek/studzienkę 2 dni przed doświadczeniem.

Odpowiedź IP w szczurzych komórkach CHO-dhfr^- wykazujących ekspresję receptora mGlu1

Nagromadzenie IP zmierzono jak opisano w Lavreysen i in., Mol. Pharmacol. 61: 1244-1254,

2002. Krótko, komórki posiano po 30000 komórek/studzienkę na 24-studzienkowej płytce hodowlanej ₃ i znakowano 2,5 pCi/ml mio[³H]inozytolem przez noc. W dniu doświadczenia, komórki przemyto i inkubowano przez 10 minut 10 mM LiCl.

₃

Po 30 minutach inkubacji we wzrastających stężeniach [³H]związku A, dodano 1N HCIO4 i płytki trzymano w temperaturze 4°C. Przed zastosowaniem jonowymiennej chromatografii dodano roztwór KOH/fosforan i roztwór zawierający 30 mM Na2B4O7 · 10H2O i 3 mM EDTA.

Preparat błonowy komórek CHO-dhfr^- wykazujących ekspresję szczurzego receptora mGlu1a, -2, -3, -4, -5 i -6

Konfluentne komórki przemyto lodowatą solą fizjologiczną buforowaną fosforanem i przechowywano w temperaturze -20°C aż do momentu wytwarzania preparatu błonowego. Po rozmrożeniu, komórki zawieszono w 50 mM Tris-HCl, pH 7,4 i zebrano poprzez odwirowanie przez 10 minut przy 23500 g w temperaturze 4°C. Komórki poddano lizie w 10 mM hipotonicznym Tris-HCl, pH 7,4. Po ponownym odwirowaniu przez 20 minut przy 30000 g w temperaturze 4°C, osad homogenizowano przy użyciu homogenizatora Ultra Turrax w 50 mM Tris-HCl, pH 7,4. Zmierzono stężenia białka stosując test białkowy Bio-Rad jako wzorca używając albuminy surowicy bydlęcej.

Wiązanie się [³⁵S]GTPyS z błonami komórek CHO-dhfr^- wykazujących ekspresję szczurzego receptora mGlu2, -3, -4 i -6

Błony rozmrożono na lodzie i rozcieńczono w 10 mM kwasie HEPES, 10 mM soli HEPES, pH

7,4, zawierających 100 mM NaCl, 3 mM MgCl₂, 3 μΜ GDP i 10 μg/ml saponiny. Mieszaniny testowe zawierające 10 μg białka błonowego i inkubowano wstępnie ze związkami lub buforem przez 5 minut w temperaturze 37°C. Następnie, dodano glutaminian i dodatkowo inkubowano mieszaniny testowe przez 30 minut w temperaturze 37°C. Przez kolejne 30 minut w temperaturze 37°C dodawano

[³⁵S]GTPyS do osiągnięcia końcowego stężenia 0,1 nM. Reakcje zakończono szybką filtracją przez

PL 218 788 B1 bibuły filtracyjne Unifilter-96 GF/B (Packard, Meriden, CT) stosując 96-studzienkowy harwester Packard Filtermate. Filtry przemyto 2 razy lodowatym buforem 10 mM NaH2PO4/10 mM Na2HPO4, pH 7,4. Promieniotwórczość filtra zliczono w liczniku Microplate Scintillation and Luminescence Counter firmy Packard.

Wiązanie ligandów znakowanych radioaktywnie z błoną CHO-dhfr^- szczurzego receptora mGlu1 ₃

Wiązanie [³H]związku A. Po rozmrożeniu, błony homogenizowano stosując homogenizator Ultra Turrax i zawieszono w oziębionym lodem buforze wiążącym, zawierającym 50 mM Tris-HCl (pH 7,4), 1,2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, o ile nie wskazano tego inaczej. Doświadczenia wysycania ligandem przeprowadzono przy widocznej równowadze wiązania (inkubacja 30 minut) z 20 μg białka błonowego i 10 stężeniami (0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 1, 2, 2,5, 5 i 10 nM) liganda znakowanego radioaktywnie. Stopień wiązania nieswoistego oszacowano w obecności 1 μM związku 135. Inkubację zatrzymano przez szybką filtrację pod zwiększonym ciśnieniem przez filtry GF/C z włókien szklanych stosując wielokrotnie ręczny 40-studzienkowy ssący kolektor filtracyjny. Do pomiaru kinetyki asocjacji, inkubowano błony w temperaturze 4°C, 25°C lub 37°C w obecności 2,5 nM [³H]związku A przez 2, 5, 10, 15, 20, 30, 45, 60, 90 lub 120 minut, następnie zakończono inkubację przez szybką filtrację stosując ręczną 40-studzienkową jednostkę filtracyjną. Kinetykę dysocjacji zmierzono przez dodawanie 1 μM związku

135 do błony inkubowanej wstępnie przez 30 minut w temperaturze 4°C lub 25°C w obecności 2,5 nM ₃

[³H]związku A w różnych momentach czasu poprzedzających filtrację. Filtry przeniesiono do fiolek scyntylacyjnych i, po dodaniu Ultima-Gold MV, zliczono promieniotwórczość osadzoną na filtrach w liczniku scyntylacyjnym Packard. W celu przeprowadzenia badań nad hamowaniem, mieszaniny testowe inkubowano przez 30 minut w temperaturze 4°C w objętości 0,5 ml zawierającej 10-20 μg ₃ białka błonowego, odpowiednie stężenia związków testowych i 2,5 nM [³H]związku A. Nieswoiste wiązanie zdefiniowano jak powyżej. Filtrację przeprowadzono stosując płytki filtrujące Unifilter-96 GF/C i 96-studzienkowy harwester Packard Filtermate. Po dodaniu odczynnika microscint-O, promieniotwórczość na filtrach zliczono w liczniku Microplate Scintillation and Luminescence Counter firmy Packard.

₃

Wiązanie [³H]kwiskwalanu. Rozmrożone błony homogenizowano i zawieszono w oziębionym lodem buforze do reakcji wiązania. W celu przeprowadzenia badań nad wysycaniem, 30 μq białka błonowego inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze 25°C w 10 stężeniach (1, 2, 5, 10, 20, 40, 60, ₃

90, 120 i 150 nM) [³H] kwiskwalanu. Stopień wiązania nieswoistego określono w obecności 1 mM 1-glutaminianu. Związane i wolne ligandy znakowane radioaktywnie oddzielono szybką filtracją przez filtry z włókien szklanych GF/C stosując ręczny 40-studzienkowy ssący kolektor filtracyjny. W celu przeprowadzenia badań nad hamowaniem, 30 μg białka błonowego inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze 25°C w objętości 0,5 ml zawierającej odpowiednie stężenia związków testowych ₃ i stężenie końcowe 10 nM [³H]kwiskwalanu. Filtrację przeprowadzono stosując płytki filtrujące Unifilter96 GF/C i harwester Packard Filtermate. Promieniotwórczość osadzonej na filtrach substancji zliczono powyższą metodą.

Ligand znakowany radioaktywnie wiążący się z błonami komórek CHO-dhfr^- wykazujących ekspresję szczurzego receptora mGlu2, -3, -4, -5 i -6

Po rozmrożeniu, błony homogenizowano stosując homogenizator Ultra Turrax i zawieszono w oziębionym lodem buforze do reakcji wiązania zawierającym 50 mM Tris-HCl (pH 7,4), 1,2 mM ₃

MgCl₂, 2 mM CaCl₂. Do wiązania [ H]związku A użyto 20 do 160 μg białka błonowego i stężenia koń₃ cowego 20 nM [³H]związku A. Jak wskazano w rozdziale dotyczącym wyników, do określenia stopnia wiązania nieswoistego zastosowano różne ślepe próby. Zastosowano czas inkubacji i temperaturę, jak również sposób filtracji taki, jak opisano dla błon CHO-dhfr^- szczurzego receptora mGlu1a. Ekspresję ₃ szczurzych receptorów mGlu2, -3, -5 i mGlu6 potwierdzono specyficznym wiązaniem [³H]LY341495 (mGlu2, -3 i -6) lub [³H]MPEP (mGlu5). Do wiązania [³H]LY341495 użyto 1 nM (mGlu2 i mGlu3) lub ₃ nM (mGlu6) [³H]LY341495. Stopień wiązania nieswoistego określono stosując 1 mM glutaminian. Mieszaniny testowe inkubowano przez 30 minut (mGlu2 i mGlu3) lub 60 minut (mGlu6) w temperaturze 4°C. Inkubację zatrzymano przez filtrację przez filtry GF/B z włókien szklanych (Whatman, England) stosując ręczny 40-studzienkowy ssący kolektor filtracyjny. Dla błon CHO-dhfr^- szczurzego ₃ receptora mGlu5 użyto 10 nM [³H]MPEP i 10 pM MPEP w celu ujawnienia stopnia wiązania nieswoistego. Inkubację przeprowadzono w temperaturze 4°C przez 30 minut. Związane i wolne ligandy znakowane radioaktywnie oddzielono przy użyciu filtrów GF/C z włókien szklanych (Whatman, Anglia) stosując 40-studzienkową jednostkę filtracyjną.

PL 218 788 B1 ₃

Wiązanie [^{1 * 3}h]związku A z błonami szczurzego mózgu

Preparat tkankowy

Samce szczura linii Wistar (około 200 g) uśmiercono przez dekapitację. Usunięto szybko mózgi i natychmiast wypreparowano korę, hipokamp, ciało prążkowane i móżdżek. Świeżą tkankę homogenizowano Ultra Turrax w 20 objętościach 50 mM Tris-HCl, pH 7,4 i odwirowywano przy 23500 g przez 10 minut. Po homogenizacji przy użyciu homogenizatora DUAL, błony dwukrotnie przemyto przez odwirowanie przy 23500 g przez 10 minut. Uzyskany ostatecznie osad zawieszono w 10 objętościach 50 mM Tris-HCl, pH 7,4 i zamrożono w temperaturze -80°C.

Test wiązania in vitro. Po rozmrożeniu, błony ze szczurzej kory, móżdżka, ciała prążkowanego i hipokampu homogenizowano ponownie przy użyciu DUAL i, w celu przeprowadzenia reakcji wiązania, zawieszono w oziębionym lodem buforze zawierającym 50 mM Tris-HCl, 1,2 mM MgCl2, 2 mM ₃

CaCl2, pH 7,4. Test wiązania przeprowadzono w całkowitej objętości 0,5 ml przy stężeniu 2,5 nM [³h] związku A i próbkę błony odpowiadającą 40 μg dla błon móżdżkowych, 60 μg dla błon hipokampu, 80 μg dla błon ciała prążkowanego lub 150 μg dla błon korowych. Stopień swoistego wiązania obliczono jako różnicę pomiędzy całkowitym wiązaniem i wiązaniem zmierzonym w obecności 1 μM związku 135. Po inkubacji przez 30 minut w temperaturze 4°C, wyznakowane błony przemyto i zebrano przez szybką filtrację próżniową przy użyciu filtrów GF/C Whatman z włókien szklanych stosując 40-studzienkowy ssący kolektor filtracyjny i promieniotwórczość substancji zebranej na filtrach zliczono powyższą metodą.

Wiązanie [³H]Ro 48-8587, [³H]L689560, [³H]CGP39653 i [3H]MK-801 z błonami szczurzego mózgu

Preparat tkankowy. Samce szczurów linii Wistar (około 200 g) uśmiercono przez dekapitację, po czym szybko usunięto mózgi i wypreparowano przodomózgowie. Tkankę homogenizowano przy użyciu Ultra Turrax w 20 objętościach oziębionej lodem wody i wirowano przy 48000 g przez 20 minut. Po homogenizacji przy użyciu homogenizatora DUAL, błony przemyto przez wirowanie przy 48000 g przez 10 minut. Następnie, osad zawieszono w 20 objętościach 50 mM Tris-HCl, pH 7,4 zawierającego 0,04% Triton X-100 i ponownie wirowano przy 48000 g przez 20 minut. Ostatecznie uzyskany osad zamrożono w temperaturze -80°C.

Test wiązania in vitro. W dniu doświadczenia osad rozmrożono, przemyto i poddano ponownej homogenizacji przy użyciu DUAL w oziębionym lodem 50 mM Tris-octanie, pH 7,4. Warunki testowe dla poszczególnych ligandów znakowanych radioaktywnie w następujący sposób. Końcowe stężenie błon w próbce dla [³H]Ro 48-8587 i [³H]L689560 wynosiło 20 mg/ml (mokra masa), a dla

[³H]CGP39653 i [³H]MK-801 wynosiło 10 mg/ml (mokra masa). Użyto następujących stężeń ligandów znakowanych radioaktywnie: 2 nM [³H]Ro 48-8587, 2 nM [³H]L689560, 2 nM [³H]CGP39653 i 3 nM [³H]MK-801. Inkubację przeprowadzono w obecności 1 mM KSCN dla wiązania [³H]Ro 48-8587, 100 o o μM strychniny dla wiązania [ H]L689560 i 1 μM glicyny + 1 μM glutaminianu dla wiązania [ H]MK-801.

Stopień wiązania nieswoistego dla wiązania [³H]Ro 48-8587 i [³H]CGP39653 określono w obecności ₃ mM glutaminianu. W celu określenia stopnia wiązania nieswoistego dla wiązania [³H]L689560 ₃ i [ H]MK-801, użyto, odpowiednio, 100 μM D-seryny lub 10 μM fencyklidyny. Próbki inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze 37°C, 2 godziny w temperaturze 4°C, 30 minut w temperaturze 25°C i 1 godzinę w temperaturze 4°C dla wiązania, odpowiednio, [³H]Ro 48-8587, [³H]L689560, [³H]CGP39653 ₃ i [³H]MK-801. Po inkubacji, związane i wolne ligandy znakowane radioaktywnie oddzielono stosując 40-studzienkowy ssący kolektor filtracyjny. Promieniotwórczość substancji zebranej na filtrach zliczono powyższą metodą.

₃

Wiązanie [³H]związku A i autoradiografia na fragmentach szczurzego mózgu

Preparat tkankowy. Samce szczurów linii Wistar (200 g) uśmiercono przez dekapitację. Mózgi natychmiast usunięto z czaszek i szybko zamrożono w oziębionym suchym lodem 2-metylobutanie (-40°C). Mózgi następnie przechowywano w temperaturze -70°C i pokrojono na skrawki. Przy użyciu mikrotomu kriostatowego Leica C3050 wykonano dwudziestomikrometrowe skrawki w płaszczyźnie strzałkowej (Leica Mikrosystems, Wetzlar, Germany) i rozmrażając nałożono na szkiełka mikroskopowe SuperFrost Plus (Menzle-glaser, Germany). Skrawki następnie trzymano w temperaturze -70°C, aż do wykorzystania.

Autoradiografia receptorów. Skrawki rozmrożono i osuszono w strumieniu zimnego powietrza, wstępnie inkubowano (3x5 minut) w 50 mM Tris-HCl, 1,2 mM MgCl2,2 mM CaCl2, 0,1% BSA pH 7,4 w temperaturze pokojowej. Następnie, skrawki inkubowano przez 60 minut w temperaturze pokojowej,

PL 218 788 B1 w buforze zawierającym 50 mM Tris-HCl, 1,2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 0,1% BSA (pH 7,4) i 1,5 nM ₃

[ H] związek A. Stopień wiązania nieswoistego określono poprzez dodanie do buforu do inkubacji 1 μΜ związku 135. Po inkubacji, nadmiar liganda znakowanego radioaktywnie wypłukano (3 x 5 min) w oziębionym lodem buforze zawierającym 50 mM Tris-HCl, 1,2 mM MgCl2 i 2 mM CaCl2, a następnie ₃ szybko zanurzono w zimnej wodzie destylowanej. [³H]Hyperfilm poddano ekspozycji na skrawki osuszone w strumieniu zimnego powietrza, a następnie (Amersham, UK) przez 6 tygodni w temperaturze pokojowej. Film wywołano ręcznie w odczynniku Kodak D19 i utrwalono odczynnikiem Kodak Readymatic. Część skrawków poddano ekspozycji na płytkę Fuji Imaging Platę przez 2 dni w temperaturze pokojowej i skanowane przy użyciu fosfoimager Fujix Bass 2000.

Analiza danych i statystyka

Analizę danych przeprowadzono stosując program GraphPad Prism (GraphPad Prism Software, Inc., San Diego, CA). Eksperymenty dotyczące wiązania wysycającego analizowano stosując analizę regresji nieliniowej. Krzywe hamowania dopasowano metodą regresji nieliniowej dopasowując równanie według jednostronnego testu kompetetywnego:

Y = wartości minimalne + ((wartości maksymalne - wartości minimalne)/1 + 10X-LogIC50)

Wartości Ki obliczono stosując równanie Cheng'a-Prusoff'a: Ki = IC50/[1 + ([C]/KD)], gdzie C oznacza stężenie liganda znakowanego radioaktywnie, a KD oznacza stałą dysocjacji liganda znakowanego radioaktywnie (Cheng i Prusoff, Biochem. Pharmacol. 22, 3099-3108, 1973). Obserwowane stałe szybkości asocjacji (kob) i dysocjacji (koff) obliczono z krzywych asocjacji i dysocjacji, stosując odpowiednio równania wykładnicze asocjacji jednofazowej i zanikającej według programu Prism. Stałą kon obliczono odejmując koff od kob i dzieląc wynik przez stężenie liganda znakowanego radioaktywnie. W celu statystycznego oszacowania danych wiązania użyto dwustronnego testu t Student'a: * p < 0,05, ** p < 0,01 i *** p < 0,001.

Do analizy danych z doświadczeń IP użyto test t Dunnett'a, a następnie 2-dwustronną analizę wariancji (ze stężeniem związku i doświadczeniem jako współczynnikami).

Wyniki

Selektywność i tryb antagonizmu związku A w stosunku do receptora mGlu1 w komórkach CHO-dhfr^- wykazujących ekspresję szczurzego receptora mGlu1, związek A hamował wywołane glutaminianem zwiększenie [Ca²⁺] j przy IC50 wynoszącym 21,6 ± 5,0 nM (n = 4; fig. 1A) i wydawał się około 8 razy silniejszy niż ostatnio opisany specyficzny antagonista receptora mGlu1 BAY 36-7620 (IC₅₀ = 161 ± 38 nM, n = 3) i 500 razy silniejszy niż CPCCOEt (IC₅₀ = 10,3 ± 0,8 μΜ, n = 3), badane w tym samym teście. Dla ludzkiego receptora mGlu1a, wartość IC50 związku A wynosiła 10,4 ± 4,7 nM (n = 3). Związek A nie hamował wywołanego glutaminianem przekaźnictwa Ca⁺ za pośrednictwem szczurzego receptora mGlu5 eksprymowanego w komórkach CHO-dhfr^-, badanego aż do stężenia μM. Wartości IC₅₀ dla hamowania wywołanej glutaminianem (30 μΜ) aktywacji [ S]QTPyS wynosiły powyżej 30 μΜ przy rekombinowanych szczurzych receptorach mGlu2, -3, -4 lub -6. W próbkach

[³⁵S]GTPyS, związek A nie wykazywał aktywności agonistycznej względem żadnego z receptorów mGlu, aż do stężenia 30 μM. Ponadto, badano czy związek A może pełnić rolę dodatniego modulatora alosterycznego względem jednego spośród tych typów receptorów mGlu. W tym celu, wyznaczono krzywe odpowiedzi w zależności od stężenia glutaminianu przez dodanie samego glutaminianu lub razem z 10 μM związku A. Testy [ S]GTPyS na rekombinowanych szczurzych receptorach mGlu2, -3, -4 lub -6 wykazały, że EC50 glutaminianu nie uległo zmianie, a wartość Emax glutaminianu nie zwiększyła się po dodaniu związku A.

Wartość EC50 i Emax wywołanej glutaminianem mobilizacji wewnątrzkomórkowego Ca²⁺ także nie uległa zmianie w komórkach zawierających szczurzy receptor mGlu5, gdy związek A dodano razem z glutaminianem (dane tu nie przedstawione).

Te dane łącznie wykluczają agonistyczne, antagonistyczne i pozytywne alosteryczne działanie na receptory mGlu2, -3, -4, -5 i -6. Badania wiązania ligandów znakowanych radioaktywnie z użyciem szczurzego przodomózgowia i z zastosowaniem [³H]Ro-488587, [³H]L689560, [³H]CGP39653 ₃ i [ H]MK-801 wykazały, że związek A nie wiąże się z receptorem AMPA, ani nie wiąże się, odpowiednio, z miejscem wiążącym glicynę, glutaminian lub szczeliną kanału receptora NMDA (badano do stężenia 10 μm). W celu analizy sposobu, w jaki związek A hamuje aktywację glutaminianem receptora mGlu1a, porównano mobilizację Ca²⁺ w odpowiedzi na glutaminian przy braku i w obecności związku A (fig. 1B).

PL 218 788 B1

Obecność związku A nie tylko spowodowała przesunięcie w prawo w krzywej odpowiedzi w zależności od stężenia glutaminianu, lecz także dała w wyniku znaczne zmniejszenie maksymalnej odpowiedzi wywołanej przez agonistę, wskazując na niekompetycyjny charakter antagonizmu związku A.

W obecności 100 nM-1 μΜ związku A obserwowano całkowite hamowanie przekaźnictwa za pośrednictwem receptora mGlu1a.

W celu stwierdzenia czy związek A może pełnić rolę odwrotnego agonisty, zmierzono podstawowe nagromadzenie IP w obecności związku A w szczurzych komórkach CHO-dhfr^- zawierających receptor mGlu1a. Fig. 1C pokazuje, że wraz z wzrastającymi stężeniami związku A występuje wyraźne zmniejszenie podstawowej produkcji IP. To zmniejszenie było znaczące statystycznie (p < 0,05), jako że szybkość dysocjacji 1 μM związku A, przy którym podstawowe nagromadzenie IP zmniejszyło się o 24 ± 4%. Maksymalne zmniejszenie o 33 ± 3% wykryto w przypadku stosowania 100 μM związku A. Te dane wskazują, że związek A rzeczywiście może pełnić rolę odwrotnego agonisty względem receptora mGlu1a.

3Charakterystyka wiązania [³H]związku A ze szczurzym receptorem mGlu1a błon CHO-dhfr^-.

₃

Swoiste wiązanie 2,5 nM [³H]związku A w temperaturze 4°C ze szczurzym receptorem mGlu1a błon CHO-dhfr^- było proporcjonalne do ilości białka błonowego i zwiększało się liniowo między 10 a 50 μg białka błonowego na próbkę (fig. 2). Stopień wiązania nieswoistego określono stosując 1 μM związku

135 jako inhibitor.

Związek 135 określono jako swoistego antagonistę receptora mGlu1 o sile odwrócenia wywołanej glutaminianem mobilizacji [Ca²+],, 7,2 ± 1,2 nM (n = 3). Przy użyciu 20 μg białka na próbkę, swoiste ₃ wiązanie [³H]związku A stanowiło około 92% całkowitego wiązania; w typowych warunkach testowych, całkowite i nieswoiste wiązanie wynosiło odpowiednio 3800 i 300 DPM.

Dodanie 1,2 mM MgCl2 i 2 mM CaCl2 spowodowało nieznaczne zwiększenie wiązania swoistego (dane nie przedstawione). Dodatkowe dodanie NaCl (10-100-300 mM) nie wywarło efektu. Podczas gdy, przy pH 6 stopień swoistego wiązania zmniejszył się o 22%, zwiększenie pH do 10 nie wywarło efektu (dane nie przedstawione).

Kinetykę asocjacji określono jak opisano w materiałach i metodach. Obniżenie temperatury inkubacji do 4°C, znacznie zwiększyło stopień wiązania swoistego, podczas gdy w temperaturze 37°C ₃ występował niski stopień wiązania (fig. 3). Wiązanie [³H]związku A z błonami zachodziło bardzo szybko. Już 2-minutowa inkubacja w temperaturze 4°C spowodowała swoiste wiązanie odpowiadające około 70% ilości związku związanej w stanie równowagi.

Maksymalne wiązanie osiągnięto przy 5-minutowej inkubacji w każdej z temperatur.

Analiza krzywych asocjacji dała w wyniku obserwowane stałe szybkości asocjacji (k0k) wynoszące odpowiednio 0,6285, 2,571 i 1,523 minuty^-1 w temperaturze 4°C, 25°C i 37°C.

Kinetyka dysocjacji także wskazywała na gwałtowny przebieg (fig. 4). W temperaturze 25°C, ligand znakowany radioaktywnie zdysocjował w ciągu zaledwie 2 minut po dodaniu 1 μM związku 135 do probówek reakcyjnych. Gwałtowny przebieg dysocjacji w temperaturze 25°C uniemożliwiał dokładne obliczenie stałej szybkości dysocjacji (koff) .

₃

Dysocjacja przebiegała bardziej stopniowo przy inkubacji w temperaturze 4°C. [³H]związek A został całkowicie wyparty w ciągu około 45 minut po dodaniu nadmiaru związku 135. Analiza krzywej dysocjacji w temperaturze 4°C dała w wyniku koff wynoszącą 0,1249 minuty^-1 Kon (kob-koff/stężenie li-1 -1 ganda znakowanego radioaktywnie) w temperaturze 4°C wynosiła 0,1007 nM^-1 minuty^-1.

Doświadczenia nad wysycaniem ligandem przeprowadzono przy pozornej równowadze wiązania (30 minut inkubacji) i z zastosowaniem 10 stężeń liganda znakowanego radioaktywnie. Fig. 5

3przedstawia krzywą nasycenia i wykres typu Scatchard'a wiązania [³H]związku A z błonami CHO-dhfr zawierającymi szczurze receptory mGlu1a.

Wykresy Scatchard'a były liniowe, wskazując na obecność pojedynczego, dającego się wysycić, miejsca wiążącego o wysokim powinowactwie.

Analiza regresji nieliniowej równoosiowej hiperboli wykazała Bmax wynoszące 6512 ± 1501 fmoli/mg białka i KD wynoszącą 0,90 + 0,14 nM (n = 3).

Badano szereg agonistów i antagonistów receptora mGlu1 pod względem hamowania wiązania

3[³H]związku A z błonami CHO-dhfr^- zawierającymi szczurze receptory mGlu1a. Krzywe hamowania dla niektórych antagonistów przedstawiono na fig. 6, a wartości Ki wszystkich badanych związków wymieniono w tablicy 11.

PL 218 788 B1

T a b l i c a 11

Moc różnych agonistów i antagonistów receptora mGlu1 hamowania wiązania [³H]związku A z błonami CHO-dhfr^- zawierającymi szczurzy receptor mGlu1a.

Wartości K1 i współczynniki Hill przedstawiono za pomocą średniej ± SD z 3-4 niezależnych doświadczeń.

Związek	Ki (nM)	Współczynnik Hill
Związek A	1,35 ± 0,99	0,94 ± 0,04
NPS 2390	1,36 ± 0,50	0,97 ± 0,02
BAY 36-7620	11,2 ± 0,93	0,95 ± 0, 02
CPCCOEt	4900± 170	0,93 ± 0,03
Glutaminian	>1000000
Kwiskwalan	>1000000
1S,3R-ACPD	>1000000
(S)-3,5-DHPG	>1000000
LY367 385	>1000000
(S)-4C3HPG	>1000000
AIDA	>1000000
(S)-4CPG	>1000000
MCPG	>1000000

Istotne jest, że żaden z ligandów łączących się z miejscem wiążącym glutaminian, tj. glutaminian, kwiskwalan, 1S,3R-ACPD, (S)-3,5-DHPG, LY-367385, (S)-4C3HPG, (S)-4CPG, MCPG i AIDA ₃ nie hamował wiązania [³H] związku A.

Dla odróżnienia, niekompetycyjni antagoniści receptora mGlu1 CPCCOEt, BAY 36-7620, NPS

32390 i związek A hamowali wiązanie [³H]związku A z błonami CHO-dhfr^- zawierającymi szczurze receptory mGlu1a z siłą, na ogół odpowiadającą ich zdolności do hamowania funkcji receptora mGlu1a.

Związek A i NPS 2390 wykazały najwyższe powinowactwo, z Ki wynoszącą odpowiednio 1,35 ± 0,99 i 1,36 ± 0,50 nM. BAY 36-7620 hamował wiązanie także w stężeniach nanomolarnych, podczas gdy CPCCOEt ulegał wyparciu w stężeniach mikromolowych.

₃

Zbadano także swoistość wiązania [³H]związku A względem receptora mGlu1 w porównaniu do ₃ receptorów mGlu2, -3, -4, -5 i -6. Stosując [³H] LY341495, stwierdzono 95, 98 i 40% swoistych wiązań w przypadku stosowania błon wytworzonych z komórki CHO-dhfr^- zawierających odpowiednio receptor mGlu2, mGlu3 lub mGlu6.

₃

Dla receptora mGlu5 jako kontrolę pozytywną zastosowano [³H]MPEP, który w 95% związał się swoiście z błonami zawierającymi szczurzy receptor mGlu5.

3Całkowite wiązanie 20 nM [³H]związku A z błonami pochodzącymi z komórek CHO-dhfr^- zawierającymi szczurzy receptor mGlu2, -3, -4, -5 lub -6 nie było większe niż wiązanie z błonami z komórkami CHO-dhfr^- typu dzikiego, ani nie było większe niż wiązanie nieswoiste z błonami CHO-dhfr^- zawierającymi szczurzy receptor mGlu1a.

₃

Ponadto, badano swoiste wiązanie [ H] związku A z błonami stosując różne ślepe próby: 1 μΜ związek 135, który ma łączyć się z tym samym miejscem wiązania co związek A, glutaminian i L-SOP, które łączą się z miejscem wiążącym glutaminian i MPEP, który łączy się z miejscem allosterycznym na receptorze mGlu5 (patrz tablica 12).

₃

W żadnych z tych ślepych prób nie obserwowano wypierania [³H]związku A. Łącznie, te dane ₃ wykazują swoistość [³H]związku A względem receptora mGlu1 w porównaniu do receptorów podtypów mGlu2, -3, -4, -5 i -6.

PL 218 788 B1

T a b l i c a 12

[³H]związek A jest swoisty względem receptora mGlu1 w porównaniu do receptorów mGlu2, -3, -4, -5 czy -6.

Porównano swoiste wiązanie 20 nM [³H]związku A z 40 pg błon z komórek typu dzikiego (CHO-dhfr) lub z komórek CHO-dhfr^- zawierających szczurze receptory mGlu2, -3, -4, -5, lub -6 z wiązaniem 10 nM [³H]związku A z 20 μg błon CHO-dhfr^- zawierających szczurzy receptor mGlu1a. W celu określenia stopnia wiązania nieswoistego użyto różnych związków. Dane dotyczące swoistego wiązania (SB) z błonami CHO-dhfr^- zawierającymi szczurzy receptor mGlu1a przedstawiono jako średnią ± SD z 3 doświadczeń przeprowadzonych w dwóch powtórzeniach. Pozostałe dane SB przedstawiono jako średnią z dwóch powtórzeń oznaczeń z jednego doświadczenia (ND = nie określono)

SB (fmole/mg białka)	mGlu1	Typ dziki	mGlu2	mGlu3	mGlu4	mGlu5	mGlu6
Związek 135 jako ślepa próba	6057±1456	65	0	0	82	38	0
Różne ślepe próby	ND	ND	34a	0a	57b	0c	0a

^a w celu określenia wiązania nieswoistego użyto 1 mM glutaminianu ^b w celu określenia wiązania nieswoistego użyto 0,1 mM L-SOP ^c w celu określenia wiązania nieswoistego użyto 10 pM MPEP ₃

Porównanie z wiązaniem [ H]kwiskwalanu. Stosując 30 pg białka na inkubat i 10 stężeń (1,2, 5, ₃

10, 20, 40, 60, 90, 120 i 150 nM) [³H] kwiskwalanu - agonisty receptora mGlu1 przeprowadzono doświadczenia nad wysycaniem wiązania (fig. 7). Dopasowanie krzywych wykazało pojedyncze miejsce wiążące o wartościach KD i Bmax wynoszących odpowiednio 22,0 ± 10 nM i 3912 ± 436 fmoli/mg białka ₃ (n = 3). Jasne jest, że [³H] związek A wiąże się z mGlu1a z dużo większym powinowactwem niż

[³H]kwiskwalan. Liczba miejsc wiążących wyznakowanych [³H]kwiskwalanem stanowiła około 60% ₃ liczby miejsc wiążących wyznakowanych przez [³H]związek A.

₃

Te same związki oszacowano pod względem ich hamującego działania na wiązanie [³H]kwiskwalanu z błonami CHO-dhfr^- zawierającymi szczurzy receptor mGlu1a. Działanie hamujące badanych agonistów i antagonistów, jak również współczynniki Hill podsumowano w tablicy 13. W tym przypadku, związki o znanym działaniu kompetycyjnym względem glutaminianu, hamowały wiązanie ₃

[³H]kwiskwalanu, podczas gdy CPCCOEt, BAY 36-7620 i NFS 2390 nie wywierały wpływu na wiąza33 nie [³H]kwiskwalanu. Także związek A nie wypierał [³H]kwiskwalanu z wiązania ze szczurzym recepto₃ rem mGlu1a. Kompetycyjne ligandy receptora mGlu1 wypierały [³H]kwiskwalan z wiązania z siłą według następującego porządku: kwiskwalan > glutaminian > LY367385 > (S)-3,5-DHPG > (S)-4C3HPG > 1S,3R-ACPD > (S)-4CPG > AIDA > MCPG.

T a b l i c a 13

Siła różnych agonistów i antagonistów receptora mGlu1 względem hamowania wiązania [³H]kwiskwalanu z błonami CHO-dhfr^- zawierającymi szczurzy receptor mGlu1. Wartości Ki i współczynniki Hill rzedstawiono jako średnią ± SD z 2 niezależnych doświadczeń.

Związek	K1 (pM)	Współczynnik Hill
Kwiskwalan	0,030 ± 0,00	0,98 ± 0,01
Glutaminian	0,40 ± 0,07	0,99 ± 0,01
LY367385	1,18 ± 0,47	0,99 ± 0,01
(S)-3,5-DHPG	1,42 ± 0, 00	0,97 ± 0,00
(S)-4C3HPG	1,65 ± 0,06	0,98 ± 0,02
1S,3R-ACPD	1,92 ± 0,20	0,97 ± 0,01
(S)-4CPG	4,51 ± 0,78	0,98 ± 0,00
AIDA	98,3 ± 15,4	0,98 ± 0,03
MCPG	165 ± 0,47	0,96 ± 0,02
związek A	> 1000
NFS 2390	> 1000
BAY 36-7620	> 1000
CPCCOEt	> 1000

PL 218 788 B1

Własności działań kompetycyjnych dotyczące wiązań CPCCOEt, BAY 36-7620, NFS 2390 i [³H]związku A. Fakt, że wszystkie niekompetycyjne związki wypierały z wiązania [³H]związek A jed₃ nocześnie nie wpływając na wiązanie [³H]kwiskwalanu sugeruje, że ci antagoniści wiązali się z innym miejscem niż miejsce wiążące glutaminian. W celu stwierdzenia czy wzorcowe związki CPCCOEt, BAY 36-7620, NFS 2390 i odkryty ostatnio związek A - antagonista receptora mGlu1 - współzawodniczą o to samo miejsce wiążące czy o zupełnie różne miejsca, przeprowadzono doświadczenia wysy₃ cania przy zastosowaniu stężeń [³H]związku A od 0,2 do 20 nM przy braku, oraz w obecności CPCCOEt (30 μm), BAY 36-7620 (100 nM) i NPS 2390 (10 nM). Obecność tych związków nie wpłynęła na ₃ wartości Bmax, ale spowodowała znaczne zwiększenie wartości KD [³H]związku A (tablica 14). Przedstawiono to na fig. 8, nanosząc dane z zastosowaniem regresji liniowej. W wykresach typu Scatchard, otrzymane wykresy liniowe rzeczywiście zbiegają się w tym samym punkcie przecięcia z osią X (tj. wartość Bmax).

T a b l i c a 14

Wartości KD i Bmax otrzymane za pomocą analizy krzywych wysycającego wiązania [³H]związku A przy braku i w obecności antagonistów receptora mGlu1 - CPCCOEt (30 μΜ), BAY 36-7620 (100 nM) i NFS 2390 (10 nM).

Wartości przedstawiono jako średnią ± SD z 3 poszczególnych doświadczeń. Analizę statystyczną przeprowadzono stosując test t Student'a (dwustronny): ** p < 0,01 i *** p < 0,001

	Kontrola	CPCCOEt	BAY 36- 7620	NPS 2390
Kd (nM)	0,73 ± 0,09	3,17 ± 0,90**	5,21 ± 1,2**	2,90 ± 0,20***
Bmax (fmol/mg białka)	7284 ± 970	7009±1231	5872±1018	6887 ± 2804

₃

Wiązanie [³H]związku A w skrawkach i błonach komórkowych szczurzego mózgu

W celu zbadania wiązania z receptorem w różnych 10 obszarach szczurzego mózgu użyto ₃

[³H]związku A - swoistego znakowanego radioaktywnie liganda receptora mGlu1. Wypreparowano błony pochodzące ze szczurzej kory, ciała prążkowanego, móżdżku oraz hipokampa i zmierzono wią₃ zanie [³H]związku A. Stopień wiązania nieswoistego w porównaniu z całkowitym wiązaniem wynosił 10% w móżdżku, 30% w hipokampie i 25% w korze i ciele prążkowanym. Dla każdego regionu mózgu określono wartości KD i Bmax (tablica 15). Dla wszystkich struktur wartość KD wynosiła około 1 nM.

₃

Wartości Bmax dla poszczególnych obszarów mózgu były znacznie zróżnicowane. [³H]związek A wyznakował niezwykle dużą ilość receptorów mGlu1 w móżdżku.

W ciele prążkowanym i hipokampie wyznakowało się około 16% liczby miejsc wyznakowanych w móżdżku.

W korze mózgowej szczura ligand związało zaledwie 11% liczby miejsc wyznakowanych w móżdżku. Istotne jest, że także inkubacja z 10 μM związku BAY 36-7 620 o odmiennej strukturze ₃ maksymalnie hamowała wiązanie [³H]związku A (fig. 9). Selektywny względem receptora mGlu5 zwią₃ zek MPEP (badany aż do 30 μm) nie wpłynął na wiązanie [ H]związku A z błonami szczurzego móżdżku, jeszcze raz wykazując selektywność związku A względem receptora mGlu1.

Stosując autoradiografię ligandów znakowanych radioaktywnie, bardziej szczegółowo zbadano ₃ rozmieszczenie wiązania [³H]związku A w skrawkach szczurzego mózgu (fig. 10). Autoradiografię ₃

[³H]związku A przeprowadzono na skrawkach szczurzego mózgu wykonanych w płaszczyźnie strzałkowej; określono stopień wiązania nieswoistego stosując związek 135 (fig. 10, część A). Bardzo wysoki stopień swoistego wiązania zaobserwowano w warstwie drobinowej móżdżku. Umiarkowany sygnał obserwowano w polu CA3 i zakręcie zębatym hipokampa, wzgórzu, guzku węchowym, ciałach migdałowatych i części siatkowatej istoty czarnej.

Kora mózgowa, część ogoniasta skorupy, brzuszna część gałki bladej, jądro półleżące wykazywały mniejszy stopień znakowania. Również inkubacja z BAY 36-7620 całkowicie hamowała wiązanie ₃

[³H]związku A ze skrawkami szczurzego mózgu (fig. 10, część C).

T a b l i c a 15

Stałe równowagowe wiązania [³H]związku A z błonami ze szczurzej kory, hipokampa, ciała prążkowanego i móżdżku. Wartości KD i Bmax przedstawiono jako średnią ± SD z 3 niezależnych doświadczeń

	Kora	Hipokamp	Ciało prążkowane	Móżdżek
Kd (nM)	1,04 ± 0,40	0,72 ± 0,22	0,84 ± 0,23	0,99 ± 0,36
Bmax (fmol/mg białka)	471 ± 68	688±125	741 ± 48	4302 ± 2042

PL 218 788 B1

Omówienie

Do chwili obecnej, odkryto jedynie kilku selektywnych antagonistów podtypu 1 receptora mGlu. Wykazano, że CPCCOEt (Litschig i in., Mol. Pharmacol. 55: 453-461, 1999) i BAY 36-7620 selektywnie blokują receptor mGlu1 ze zróżnicowaną siłą - od mikromolowego stężenia dla CPCCOEt (6,6 μm) do wysokiego nanomolarnego stężenia dla BAY 36-7620 (160 nM). Badanie to przedstawia związek A jako nowy, działający przy niskich nanomolarnych stężeniach, antagonista receptora mGlu1 o działaniu antagonisticznym względem szczurzego receptora mGlu1a (21,6 nM) i ludzkiego receptora mGlu1a (10,4 nM). Wykazano, że antagonistyczne działanie związku A ma charakter n iekompetetywny, ponieważ maksymalna wywołana glutaminianem (00 aktywacja receptora mGlu1 była obniżona w obecności związku A. Obecność dodatkowych receptorów może wyjaśnić obserwowane zwiększenie EC50 glutaminianu w obecności związku A. W obecności niekompetetywny antagonisty w niskim stężeniu krzywa odpowiedzi na stężenie będzie przesunięta w prawo, ponieważ potrzeba więcej agonisty, aby skompensować brak dodatkowych receptorów zablokowanych przez antagonistę. Takie stężenia antagonisty nie wpłyną jeszcze na maksymalną odpowiedź na agonistę, podczas gdy większe stężenia antagonisty w końcu stłumią maksymalną odpowiedź (Zhu i in., J. Pharm. Tox. Meth. 29: 85-91, 1993). O tym zjawisku doniesiono również dla BAY 36-7620 (Carroll i in., Mol. Pharmacol. 59: 965-973, 2001) i CPCCOEt (Hermans i in., Neuropharmacology 37: 1645-1647, 1998). Dodatkowo, dane wykazują, że związek A może wykazywać działanie odwrotnie agonistyczne względem receptora mGlu1a oraz, że związek A działa selektywnie względem receptora mGlu1 w porównaniu do innych podtypów receptora mGlu i jonotropowych receptorów glutaminianu. Dane dotyczące transdukcji sygnału wykazały, że związek A nie wykazuje agonistycznego, antagonistycznego ani dodatniego alosterycznego działania względem receptora mGlu2, -3, -4, -5 i -6, a badania dotyczące wiązania ligan₃ da j|0 znakowanego radioaktywnie wykazały, że [³H] związek A nie wiąże się z receptorem mGlu2, -3, -4, -5 ani -6, jeszcze raz wykluczając możliwość, że związek A działa jako ligand obojętny wobec któregokolwiek spośród tych typów receptora. Brak selektywnych znakowanych radioaktywnie ligandów receptora mGlu1 oraz interesujące właściwości farmakologiczne związku A stanowią nieodparte powody, aby przeznaczyć związek A do badania receptorów mGlu1 w badaniach wiązania.

₃

Wiązanie [³H]związku A spełniło wszystkie wymagania dotyczące liganda bardzo dobrze nadającego się do badania właściwości wiązania, farmakologii i rozmieszczenia receptorów mGlu1. Po3czątkowo, badania wiązania [³H]związku A przeprowadzono przy użyciu błon CHO-dhfr^- zawierających szczurzy receptor mGlu1. Stopień swoistego wiązania był bardzo wysoki i zwiększał się liniowo wraz ze stężeniem białka (fig. 2). Stopień swoistego wiązania nieznacznie zwiększył się w obecności MgCl2 i CaCl2, podczas gdy przy pH 6 obniżył się o 22%, a zwiększenie pH nie miało wpływu na swoiste wiązanie. Jeśli chodzi o wpływ pH na wiązanie, warto zwrócić uwagę na obliczone fizyko-chemiczne właściwości związku A: obliczone wartości pKa i clogP wynoszą odpowiednio 6,2 i 4,5. Zatem, przy pH 7,4 stopień jonizacji związku A jest bardzo niski (zaledwie 5,9%). Procent jonizacji zmniejsza się jeszcze bardziej przy wyższym pH (1,6% przy pH 8, 0,2% przy pH 9 i brak jonizacji przy pH 10). Wartość clogD pozostaje 4,5 w zakresie od pH 7,4 do pH 10. Przy pH 6, jednakże, 61,3% związku A występuje w postaci zjonizowanej. Odpowiednio, clogD zmniejsza się do 4,1. Mniejsze wiązanie liganda w postaci zjonizowanej sugeruje, że niezjonizowany ligand charakteryzuje się największym powinowactwem. Jest to nieoczekiwane i nie zgadza się z wynikami badań nad Ugandami receptorów sprzężonych z monoaminowym białkiem G (np. receptor dopaminy), które często są silnymi zasadami i wiążą się w postaci kationowej. Dla takich związków, siła powodująca wiązanie z receptorem ma charakter elektrostatyczny (Van de Waterbeemd i in., J. Med. Chem. 29: 600-606, 1986). Dane mogą wskazywać na to, że oddziaływania jonowe nie są siłą powodującą wiązanie z receptorem oraz, że nie przyczyniają się do jonowych efektów powierzchniowych. Ponadto, chociaż związek A jest związkiem sil₃ nie lipofilowym, bardzo słabe nieswoiste wiązanie [³H]związku może wywoływane być faktem, że pomiędzy nie zjonizowaną formą związku A a naładowaną ujemnie błoną komórką nie może dojść do oddziaływania elektrostatycznego. Wiązanie zależało od temperatury i rosło znacznie w temperaturze

4°C (fig. 3). Dzięki tej szybkiej kinetyce asocjacji i dysocjacji szybko osiągnięta zostaje równowaga ₃ wiązania. Najwidoczniej [³H]związek A znakował jedną populację miejsc o bardzo wysokim powino₃ wactwie (KD = 0,90 + 0,14 nM). Odwrotnie, [³H]kwiskwalan, wybrany tu znakowany radioaktywnie ligand receptora mGlu1, wykazywał znacznie większą wartość KD rzędu 22,0 ±10 nM, dobrze skorelowaną z wartością 37 nM otrzymaną przez Mutel'a i in., J. Neurochem, 75: 2590-2601, 2000. Oprócz ₃ znacznie większego powinowactwa, [³H]związek A znakował znacznie wiecej (około 40%) miejsc wią3 3 3 żących niż [³H]kwiskwalan. Dla [³H]związku A i [³H]kwiskwalanu stwierdzono wartości Bmax odpowied100

PL 218 788 B1 nio 6512 + 1501 fmoli/mg białka i 3912 ± 436 fmoli/mg białka. Tę rozbieżność można wyjaśnić sprzężeniem białka G z receptorem. Agoniści ułatwiają sprzęganie receptora z białkiem G, w wyniku czego powstaje konformacja receptora o wysokim powinowactwie do agonistów. Zgodnie z tą teorią, kompletny agonista taki jak kwiskwalan w przeważającej mierze znakowałby receptor w stanie wysokiego powinowactwa lub sprzężonego z białkiem G. Antagonista miałby takie same powinowactwo do sprzężonych, jak i nie sprzężonych receptorów i zatem względem receptora zarówno w stanie o du₃ żym, jak i małym powinowactwie. Nasze stwierdzenie, że Bmax [^{i * 3}H]związku A ma wartość znacznie ₃ większą niż dla [³H]kwiskwalanu zgadza się z tą teorią.

Nieoczekiwanym stwierdzeniem w tym badaniu było to, że naturalny agonista glutaminian, jak ₃ również kwiskwalan nie były zdolne do hamowania wiązania [³H]związku z błonami zawierającymi szczurzy receptor mGlu1a CHO-dhfr^-, podczas gdy wszystkie spośród związków, takich jak CPCCOEt, BAY 36-7620, KI NFS 2390 i związek A, znane jako niekompetycyjni antagoniści, hamowały wiązanie

[³H]związku do tego samego maksymalnego poziomu (fig. 6). Hamowanie wiązania [³H]związku przez inne związki przyjmowało kształt krzywych sigmoidalnych z współczynnikami Hill około 1,0 (tablica 11), bez wskazania na wiązania z wieloma miejscami.

Istotne jest, aby wspomnieć, że chociaż w celu określenia stopnia nieswoistego wiązania zastosowano strukturalnie pokrewny analog, podobny niski stopień wiązania nieswoistego z błonami zawierającymi szczurzy receptor mGlu1a CHO-dhfr^- otrzymano przy zastosowaniu nie pokrewnych strukturalnie związków takich jak BAY 36-7620 w ilości 1 μΜ lub większej (fig. 6).

₃

W przypadku [³H]kwiskwalanu, wszystkie struktury podobne do aminokwasów, znane jako li₃ gandy kompetycyjne, mogą wyprzeć [³H]kwiskwalan z jego miejsca wiążącego. Siła hamująca kwiskwalanu, glutaminianu, LY367385, (S)-3,5-DHPG, (S)-4C3HPG, IS, 3R-ACPD, (S)-4CPG, AIDA i MCPG (tablica 13) zgadzała się z wartościami opisanymi przez Mutel'a i in. J. Neurochem. 75: 2590-2601, 2000. Przeciwnie, powyższe związki niekompetetywne nie miały wpływu na to wiązanie.

₃

W przypadku CPCCOEt doniesiono, że nie wpływa na on na wiązanie [³H]glutaminianu z błonami uzyskanymi ze szczurzych komórek, w których dochodzi do ekspresji receptora mGlu1a (Litschig i in., Mol. Pharmacol. 55: 453-461,1999).

Ponadto, sugerowano że CPCCOEt nie wiąże się z miejscem wiążącym glutaminian, lecz oddziaływuje z Thr815 i Ala818 na przezbłonowej domenie VII. Zaproponowano, że CPCCOEt upośledza sygnalizację receptorową zakłócając międzycząsteczkowe oddziaływanie pomiędzy związaną z glutaminianem domeną pozakomórkową a przezbłonową domeną VII.

Caroll i in. w Mol. Pharmacol. 59: 965-973, 2001 wykazali, że BAY 36-7620 nie wypiera ₃

[³H]kwiskwalanu z zagłębienia wiążącego glutaminian. Wykazano, że decydującą rolę w wiązaniu BAY 36-7620 odgrywają helisy przezbłonowe 4 do 7.

₃

Nasze doświadczenia nad hamowaniem przeprowadzone z zastosowaniem [³H]związku A ₃ i [³H]kwiskwalanu sugerują, że CPCCOEt, BAY 36-7620, NFS 2390 wiążą się z tym samym miejscem, ₃ co związek A. Doświadczenia nad wysycaniem z zastosowaniem [ H] związku A bez i z 30 μM CPCCOEt; 100 nM BAY 36-7620 i 10 nM NFS 2390 stanowią dalsze potwierdzenie, że związki te wiążą się z tymi samymi lub wzajemnie wykluczającymi się miejscami.

Wartości KD znacznie wzrosły, podczas gdy wartość Bmax nie zmieniła się (tablica 14). Wyniki te wskazują, że chociaż powinowactwo [³H]związku A zmniejsza się, [³H]związek A przy dużych stężeniach nadal był w stanie wyprzeć drugi związek z jego miejsca wiążącego, co jest typową cechą oddziaływania kompetetywnego.

Na zakończenie, nasze dane potwierdzają opinię, że CPC-COEt, BAY 36-7620, NFS 2390 i związek A działają na miejsce inne niż zagłębienie wiążące glutaminian, przypuszczalnie współzawodniczą o taki sam przezbłonowy segment VII.

Poprzednie badania nad wiązaniem receptora mGlu grupy I w mózgu przeprowadzono stosując [³H]glutaminian lub [³H]kwiskwalan (Schoepp i True, Neurosci. Lett 145: 100-104, 1992; Wright i in., J. Neurochem. 63: 938-945, 1994; Mutel i in., J. Neurochem. 75: 2590-2601, 2000).

Te znakowane radioaktywnie ligandy posiadały tę wadę, że znakowały więcej niż jeden typ receptora glutaminianu. Dlatego też, w celu zapobiegnięcia znakowania innymi metabotropowymi lub jonotropowymi podtypami receptora glutaminianu, do bufora do inkubacji musiano dodać selektywne inhibitory.

Do chwili obecnej nie ma dostępnego znakowanego radioaktywnie liganda nadającego się specyficznie do badania wiązania i rozmieszczenia receptora mGlu1.

PL 218 788 B1

101 ₃

Swoiste znakowanie przez [³H]związek receptora mGlu1 A sprawia, że jest on szczególnie przydatny do badania natywnych receptorów mGlu1 w mózgu szczura lub człowieka. Doświadczenia z zastosowaniem błon ffp szczurzej kory, hipokampu, ciała prążkowanego i móżdżku wykazały, że ₃ swoiste wiązanie [ H]związku A, określone w obecności 1 μΙ^ związku 135 było duże, szczególnie w móżdżku (tylko 10% wiązania nieswoistego). Doświadczenia nad wysycaniem wykazały, że ₃

[³H]związek A ponownie znakował najwidoczniej jedno miejsce wiążące z bardzo dużym powinowactwem. W przypadku wszystkich różnych powierzchni mózgu stwierdzone wartości KD wynosiły około 1 nM (tablica 15).

Stwierdzono zadziwiającą różnicę w wartościach Bmax: w móżdżku znakowaniu uległa duża część miejsc wiążących, podczas gdy w hipokampie, ciele prążkowanym i korze wykryto umiarkowany do niskiego poziom ekspresji receptora.

₃

Dzięki swojej swoistości, [³H]związek A potwierdził swoją szczególną przydatność dla badań nad rozmieszczeniem receptora mGlu1 w skrawkach mózgu przy zastosowaniu autoradiografii wykorzystującej znakowany radioaktywnie ligand. Autoradiografia z zastosowaniem receptora mGlu1 wykazała, że najwyższy poziom swoistego wiązania z mGlu1 występował w drobinowej warstwie móżdżku. Warstwa komórek granularnych była bardzo słabo wyznakowana. Takie wyniki uzyskał także Mutel i in. w J. Neurochem. 75: 2590-2 601, 2000 którzy zbadali rozmieszczenie receptora mGlu grupy I ₃ stosując [³H]kwiskwalan.

W obszarze hipokampu, silne znakowanie obserwowano w polu dendrytycznym CA3 wraz z warstwą drobinową zakrętu zębatego. W obszarze CA1 obserwowano bardzo słabe wiązanie ₃

[³H]związku, co dobrze korespondowało z danymi immunohistochemicznymi Lujan'a i in., Eur. J. Neurosci. 8: 1488-1500, 1996 i Shigemoto i in., J. Neurosci. 17: 7503-7522, 1997, którzy wykazali, że w polach dendrytycznych CA1, intensywne znakowanie immunologiczne uzyskiwano stosując przeciwciało swoiste względem receptora mGlu5, a nie przy zastosowaniu przeciwciała swoistego względem receptora mGlu1.

₃

Doświadczenia autoradiograficzne z zastosowaniem [³h]kwiskwalanu rzeczywiście ujawniły barwienie zarówno w obszarze CA1 jak i CA3 hipokampa, wskazując na wiązanie zarówno z odpowiednio receptorem mGlu1 jak i mGlu5 (Mutel i in., J. Neurochem. 75: 2590-2601, 2000). Wiązanie ₃

[³H]związku było także całkiem silne we wzgórzu wzrokowym, guzku węchowym, jądrze migdałowatym i siatkowatej części istoty czarnej i nieco niższe w korze mózgowej, części ogoniastej skorupy, jądrze półleżącym i brzusznej części gałki bladej.

₃

Takie same struktury ulegały wyznakowaniu przy zastosowaniu [³H]kwiskwalanu (Mutel i in., J. Neurochem. 75: 2590-2601, 2000). Także wyniki badań immunocytochemicznych nad lokalizacją komórkową receptora mGlu1, z zastosowaniem przeciwciała selektywnego względem receptora mGlu1, były na ogół zgodne z naszymi danymi (Martin i in., Neuron. 9: 259-270, 1992). Ponieważ ₃ oczekuje się, że [³H]związek A będzie wyznakowywał wszystkie znane do tej pory warianty potranslacyjne receptora mGlu1, rozmieszczenie 1 wariantu potranslacyjnego może jednakże różnić się od tego, jaki uzyskano dla naszego radioaktywnego znacznika.

Przykładowo, w obszarze CA3 i części ogoniastej skorupy, stwierdzono immunoreaktywność znakowaną ligandem radioaktywnym receptora mGlu1b, lecz nie małego receptora mGlu1a (Martin i in., Neuron. 9: 259-270,1992; Shigemoto i in., J. Neurosci. 17: 7503-7522, 1997; Ferraguti i in., J. Comp. Neur. 400: 391-407, 1998).

₃

Istotnym punktem w wykazaniu identyczności miejsc znakowanych przez [³H]związek A było stwierdzenie, że strukturalnie różny związek BAY 36-7-620 również całkowicie wypierał wiązanie ₃

[³H]związku w błonach szczurzego mózgu (fig. 9), jak również w skrawkach mózgu (fig. 10), stanowiąc gwarancję, że hamowane wiązania jest swoiste wyłącznie dla receptora, a nie związane jest z grupą strukturalną znakowanego radioaktywnie liganda.

₃

W tym zgłoszeniu wykazano, że [³H]związek A jest znakowanym radioaktywnie ligandem doskonałym do badania receptorów mGlu1 w heterologicznym układzie ekspresyjnym, homogenatach mózgu szczurzego oraz skrawkach mózgu.

Na koniec można stwierdzić, że ze względu na swój minimalny stopień wiązania nieswoistego, ₃ wysokie powinowactwo wiązania oraz wyraźną selektywność, [³H]związek A jest ligandem z wyboru ₃ dla dalszego badania receptora mGlu1. [³H]związek A otwiera perspektywy dla szczegółowego badania subkomórkowej i komórkowej lokalizacji receptora mGlu1 i badania roli i regulacji receptora w różnych obszarach.

102

PL 218 788 B1

Lista rysunków

Figura 1: profil antagonizmu związku A. Fig. 1A przedstawia hamowanie wywołanego glutami2- nianem (30 μm) uruchamiania Ca ^- w komórkach CHO-dhfr^- zawierających szczurzy receptor mGlula. Dane wyrażono jako procent sygnału otrzymanego przy zastosowaniu 30 μΜ glutaminianu, który uznano jako 100% i przedstawiono jako średnią ± SD z 3 doświadczeń. Fig. 1B przedstawia krzywą odpowiedzi na stężenie glutaminianu, samego lub razem z 20 nM, 30 nM, 60 nM, 100 nM i 1 μΜ związku A. Wartości przedstawiono jako średnią ± SD z trzykrotnych oznaczeń w czasie 1 doświadczenia. Dodatkowe doświadczenie dało takie same wyniki. Fig. 1C przedstawia podstawowe nagromadzenie IP w obecności wzrastających stężeń związku A. Wartości wyrażono jako procent podstawowej produkcji IP w obecności rozpuszczalnika, który uznano jako 100% i przedstawiono w postaci średniej ± SD z 3 doświadczeń przeprowadzonych w czterech powtórzeniach.

₃

Figura 2: swoiste wiązanie [³H]związku A pozostaje w zależności liniowej z ilością białka błonowego. 10 do 50 μg błon CHO-dhfr^- zawierających szczurzy receptor mGlula inkubowano przez ₃ minut na lodzie z 2,5 nM [³H]związku A. Dane wyrażono jako średnią ± SD z trzykrotnych oznaczeń pochodzą one z reprezentatywnego doświadczenia.

3Figura 3: krzywa przebiegu asocjacji w czasie dla wiązania [³H]związku A z błonami CHO-dhfr^- zawierającymi szczurzy receptor mGlu1a. Kinetykę asocjacji zmierzono przez dodanie 2,5 nM ₃

[³H]związku A w różnym czasie poprzedzającym filtrację i określono w 3 różnych temperaturach. Dane przedstawiono jako średnią + SD z 3 niezależnych doświadczeń przeprowadzonych w dwóch powtórzeniach.

3Figura 4: przebieg w czasie dysocjacji [³H]związku A od błon CHO-dhfr^- zawierających szczurzy receptor mGlu1a w temperaturze 4°C i 25°C. Próbki inkubowano przez 30 minut w temperaturze 4°C lub 25°C, następnie dodano w nadmiarze związek 135, z następującą szybką filtracją w momencie wyznaczonym dla każdego punktu danych. Wartości przedstawiono jako średnią ± SD z 2 niezależnych doświadczeń przeprowadzonych w dwóch powtórzeniach.

Figura 5: reprezentatywna krzywa wysycania wiązania i wykres typu Scatchard wiązania

3[³H]związku A z błonami CHO-dhfr^- zawierającymi szczurzy receptor mGlu1a. Stopień swoistego wiązania (SB) otrzymano obliczając różnicę pomiędzy całkowitym wiązaniem (TB) i stopniem wiązania nieswoistego (BL), zmierzonym w obecności 1 μM związku 135. W każdym doświadczeniu, punkty na wykresie określono w dwóch powtórzeniach. Doświadczenie przeprowadzono 3 razy.

3Figura 6: hamowanie wiązania 2,5 nM [³H]związku A z błonami CHO-dhfr^- zawierającymi szczurzy receptor mGlu1a przez różnych antagonistów receptora mGlu. Punkty na wykresie oznaczają % całkowitego wiązania i przedstawiono je jako średnią + SD z 3-4 osobnych doświadczeń.

Figura 7: reprezentatywna krzywa wysycenia wiązania i wykres typu Scatchard wiązania

3[³H]kwiskwalanu z błonami CHO-dhfr^- zawierającymi szczurzy receptor mGlu1a. W każdym doświadczeniu, punkty na wykresie wyznaczano w dwóch powtórzeniach. Doświadczenie przeprowadzono razy.

₃

Figura 8: krzywe wysycenia wiązania i wykresy typu Scatchard wiązania [³H]związku A z błonami CHO-dhfr^- zawierającymi szczurzy receptor mGlu1a przy braku i w obecności CPCCOEt (30 μm), BAY 36-7620 (100 nM) i NFS 2390 (10 nM). Przedstawiony wykres jest reprezentatywny dla 3 niezależnych doświadczeń. Dane wyrażono w nM związanych swoiście. W każdym doświadczeniu, punkty na wykresie wyznaczano w dwóch powtórzeniach.

₃

Figura 9: hamowanie przez BAY 36-7620 wiązania 2,5 nM [³H]związku A z błonami szczurzego móżdżku. Punkty na wykresie oznaczają % całkowitego wiązania i przedstawiono je jako średnią ± SD z 2 osobnych doświadczeń.

₃

Figura 10: wiązanie [³H]związku A ze skrawkami szczurzego mózgu wykonanymi w płaszczyźnie strzałkowej przy zastosowaniu autoradiografii. Część A przedstawia reprezentatywny skrawek ₃ przedstawiający całkowite wiązanie z 1,5 nM [³H]związku A. Część B przedstawia kolejny skrawek ₃ reprezentatywny dla wiązania nieswoistego z 1,5 nM [ H] związku A w obecności 1 μM związku 135.

₃

Część C przedstawia skrawek reprezentatywny dla wiązania nieswoistego z 1,5 nM [³H]związku A ₃ w obecności 10 μM BAY 36-7620. Na działanie skrawków z części A i B wystawiono [ H]Hyperfilm, podczas gdy na działanie skrawka z części C wystawiono płytkę Fuji Imaging Plate. Th, wzgórze; SNr, istota czarna siateczkowata; CA3, obszar CA3 hipokampa; Dg; zakręt zębaty hipokampa; Cer; móżdżek; Cp, część ogoniasta skorupy; Cx, kora mózgowa, Ot, guzek węchowy, Am, jądro migdałowate,

Vp, część brzuszna gałki bladej, Na, jądro półleżące.

Claims (6)

1. Znakowana radioaktywnie pochodna chinoliny, będąca jednym ze związków (a), (b), (c), (d) i (e):

jej farmaceutycznie dopuszczalna sól addycyjna i stereochemiczna postać izomeryczna.

2. Pochodna według zastrz. 1, będąca związkiem (a).

3. Zastosowanie znakowanej radioaktywnie pochodnej chinoliny, jak określono w zastrz. 1 albo 2, w metodzie diagnostycznej, przy czym ta metoda diagnostyczna obejmuje znakowanie lub identyfikację in vitro lub ex vivo receptora mGlu1 w materiale biologicznym.

4. Zastosowanie znakowanej radioaktywnie pochodnej chinoliny według zastrz. 3, znamienne tym, że znakowanie obejmuje traktowanie materiału biologicznego pochodną, a identyfikacja polega na wykrywaniu emisji pochodzącej z tej pochodnej.

5. Zastosowanie znakowanej radioaktywnie pochodnej chinoliny według zastrz. 3, znamienne tym, że metoda diagnostyczna obejmuje badanie przesiewowe czy związek testowy wykazuje zdolność do zajęcia lub wiązania się z receptorem mGlu1 w materiale biologicznym.

6. Zastosowanie znakowanej radioaktywnie pochodnej chinoliny według zastrz. 3-5, znamienne tym, że materiał biologiczny wybiera się z grupy obejmującej próbki tkanki, osocza, płyny fizjologiczne, części ciała i narządy pochodzące od zwierząt ciepłokrwistych.