EA009334B1 - Меченные радиоактивными изотопами производные хинолина и их применение в качестве лигандов метаботропного глутаматного рецептора - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к меченным радиоактивными изотопами производным хинолина проявляющим антагонистическую активность по отношению к метаботропному глутаматному рецептору, в частности, активность по отношению к mGlu1-рецептору; изобретение, кроме того, относится к композициям, содержащим такие производные, а также к их применению для маркировки и идентификации сайтов метаботропного глутаматного рецептора и для визуализации органа. При предпочтительном воплощении X представляет собой О; Rпредставляет собой С-алкил; цикло-С-алкил или (цикло-С-алкил)С-алкил, где один или несколько атомов водорода в С-алкильной группе или в цикло-С-алкильной группе необязательно могут быть заменены на С-алкилокси, арил, галоген или тиенил; Rпредставляет собой водород; галоген; С-алкил или амино; каждый из Rи Rнезависимо представляет собой водород или С-алкил; или Rи Rмогут быть объединены с образованием -R-R, который представляет собой двухвалентный радикал формулы -Z-CH-CH-CH- или -Z-CH-CH, где Zпредставляет собой О или NR, где Rпредставляет собой С-алкил; и где каждый двухвалентный радикал необязательно замещен С-алкилом; или Rи Rмогут быть объединены с образованием двухвалентного радикала формулы -CH-CH-CH-CH-; Rпредставляет собой водород; Y представляет собой О; и арил представляет собой фенил, необязательно замещенный галогеном. Наиболее предпочтительными являются меченные радиоактивными изотопами соединения с радиоактивными изотопами, выбранными из группыH,C иF. Изобретение также относится к применению таких соединений в диагностическом способе, в частности для маркировки и идентификации mGlu1-рецептора в биологическом материале, также как к применению таких соединений для

Description

Настоящее изобретение относится к меченным радиоактивными изотопами производным хинолина, проявляющим антагонистическую активность по отношению к метаботропному глутаматному рецептору, в частности активность по отношению к шС1и1-рецептору, и к получению таких производных; изобретение, кроме того, относится к композициям, содержащим такие производные, а также к их применению для диагностики, в частности для маркировки и идентификации сайтов метаботропного глутаматного рецептора и для визуализации органа.

Введение

Нейромедиатор глутамат считается главным возбуждающим нейромедиатором в центральной нервной системе млекопитающего. Связывание указанного нейромедиатора с метаботропными глутаматными рецепторами (шС1иК), которые представляют собой подсемейство рецепторов, связанных с С-белком, и которые включают 8 отдельных подтипов шС1иК, а именно подтипы от шС1иК1 до шС1иК8, активирует ряд внутриклеточных систем вторичных мессенджеров. Подсемейство шС1и-рецепторов на основе гомологии аминокислотных последовательностей, системы вторичных мессенджеров, используемой рецепторами, и фармакологических характеристик можно разделить на 3 группы. шС1и-рецепторы группы I, которая включает подтипы 1 и 5 шС1иК, связываются с фосфолипазой С, и их активация приводит к внутриклеточной активации ионов кальция. шС1и-рецепторы группы II (шС1иК2 и 3) и шС1и-рецепторы группы III (шС1иК4, 6, 7 и 8) связываются с аденилциклазой, и их активация вызывает снижение (количества) вторичного мессенджера цАМФ, а также торможение нейрональной активности. Как было показано, лечение антагонистами шС1иК группы I переводит в парасинапсисе на сниженное высвобождение нейромедиатора глутамата и снижение опосредованного глутаматом нейронального возбуждения через постсинаптические механизмы. Так как различные патофизиологические процессы и болезненные состояния, затрагивающие центральную нервную систему, считаются следствием возбуждения нервных клеток центральной нервной системы, индуцированного избытком глутамата, антагонисты шС1иК группы I, в частности антагонисты шС1иК1, могли бы быть терапевтически полезны для лечения заболеваний центральной нервной системы, в частности психиатрических и неврологических заболеваний.

Однако вплоть до настоящего времени не было специфических шС1иК1-лигандов, отсутствие которых значительно затрудняет изучение шС1и1-рецепторов, в частности авторадиографические исследования однозначного распределения и распространенности таких рецепторов в отделах мозга. В группе I пока был доступен только [³Н]глутамат, применяемый для крысиных (Тйошзеп и др., Вгаш Ке§. 619: 2228,1993) или человеческих шС1и1а-рецепторов (Κΐπ^δΐοπ и др., Неигорйагшаео1оду 37:277-287, 1998). Для шС1и1а-рецептора и шС1и5-рецептора доступен [³Н]квисквалат, однако указанный рецептор не является специфическим для шС1и1-рецептора (он также связывается с АМРА-рецептором) и является конкурентным, то есть вытесняет глутамат (Ми1е1 и др., ТНеигоейеш. 75: 2590-2601, 2000).

Целью настоящего изобретения является получение подходящих специфических, в частности, неконкурентных лигандов шС1и1-рецепторов.

В настоящее время авторы обнаружили особую группу соединений, которые в виде меченной радиоактивным изотопом формы обеспечивают подходящие, специфические, в частности, неконкурентные лиганды шС1и1-рецептора, а также способ маркировки и идентификации сайтов метаботропного глутаматного рецептора и визуализации органа.

В рамках настоящей заявки термин «специфический» означает, что лиганд избирательно связывается с сайтом шС1и1-рецептора. Термин «неконкурентный» означает, что лиганд не вытесняет или только незначительно вытесняет глутамат, связанный с сайтом шС1и1-рецептора.

Нерадиоактивные соединения согласно настоящему изобретению описаны в заявке ХО 02/28837.

В заявке ХО 99/26927 описаны антагонисты рецепторов шС1иК группы I для лечения неврологических заболеваний и расстройств, основанные - среди прочего - на структуре хинолина.

В заявке ХО 99/03822 описаны бициклические лиганды метаботропного глутаматного рецептора, ни один из которых не основан на структуре хинолина или хинолинона.

В заявке ХО 94/27 605 описаны 1,2,3,4-тетрагидрохинолин-2,3,4-трион-3 или 4-оксимы и их применение для лечения и профилактики нейрональной потери, нейродегенеративных заболеваний, неблагоприятных последствий гиперактивности аминокислот, вызывающих возбуждение и тревогу, а также их меченные радиоактивными изотопами соединения.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к меченному радиоактивными изотопами соединению формулы (е)

Одно из воплощений настоящего изобретения относится к радиоактивной композиции для маркировки и идентификации сайтов метаботропного глутаматного рецептора и для визуализации органа для введения млекопитающим, содержащая терапевтически эффективное количество меченного радиоактив

- 1 009334 ным изотопом соединения и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения оно касается применения меченного радиоактивным изотопом соединения в качестве диагностического средства.

Вариантом предпочтительного воплощения настоящего изобретения является применение радиоактивной композиции в качестве диагностического средства, в частности для маркировки или идентификации тС1и1-рецептора в биологическом материале.

Другим частным воплощением изобретения является способ диагностики, включающий маркировку или идентификацию тС1и1-рецептора в биологическом материале меченным изотопом соединением, причем маркировку осуществляют путем введения меченного изотопом соединения в биологический материал, и идентификацию осуществляют путем обнаружения эмиссии от указанного меченного радиоактивным изотопом соединения.

К одному из предпочтительных воплощений настоящего изобретения является способ диагностики, включающий маркировку или идентификацию тС1и1-рецептора в биологическом материале радиоактивной композицией, причем способ диагностики по любому включает оценку того, способно ли тестируемое соединение располагаться на тС1и1-рецепторе или связываться с тС1и1-рецептором в биологическом материале.

Другой вариант осуществления изобретения заключается в способе диагностики путем визуализации органа, заключающийся в том, что в биологический материал в составе соответствующей композиции вводят меченное радиоактивным изотопом соединение, в количестве, достаточном для связывания указанного меченного радиоактивным изотопом соединения с сайтами тС1и1-рецептора в биологическом материале; и обнаруживают эмиссию от меченного радиоактивным изотопом соединения.

Еще один частный вариант осуществления изобретения относится к способу диагностики, где биологический материал выбран из группы, включающей образцы ткани, жидкости плазмы, жидкости организма, части тела и органов, полученных от теплокровных животных и от теплокровных животных как таковых (рег зе), в частности от человека.

Другое воплощение изобретения относится к применению меченного радиоактивным изотопом соединения для получения диагностического средства для оценки того, обладает ли тестируемое соединение способностью располагаться на тО1и1-рецепторе или связываться с тО1и1-рецептором в биологическом материале.

Особый интерес представляют следующие радиоактивные соединения:

Все соединения согласно изобретению показывают по отношению к тС1иК1 активность от умеренной до сильной. Такая активность, среди прочего, объясняется специфическим связыванием указанного соединения с тС1и1-рецептором, что делает соединения применимыми для диагностики, например для введения меченых атомов и обнаружения сайтов тС1и1-рецепторов. Следовательно, изобретение также относится к меченному радиоактивным изотопом соединению согласно изобретению, применяемому для диагностики.

Первое предпочтительное воплощение (радиоактивные изотопы, испускающие гамма-излучение)

Согласно первому предпочтительному воплощению меченное радиоактивным изотопом соединение содержит, по меньшей мере, один [³Н]-атом или один [¹²⁵1]-атом. [³Н]-атом удобно вводить путем частичного или полного замещения одного или нескольких нерадиоактивных [¹Н]-атомов водорода в молекуле их радиоактивными изотопами. Выбор того, будет ли применяться [³Н]- или [ ¹²⁵1]-меченный лиганд, может зависеть частично от доступности жидкостных сцинтилляционных счетчиков (Т8С), которые довольно дороги. [ ²⁵1]-лиганды можно определить количественно с применением либо γ-счетчика, либо Б8С, в то время как для [³Н]-лигандов требуется применение Б8С.

Меченное радиоактивным изотопом соединение, содержащее по меньшей мере один [³Н]-атом или один [¹²⁵1]-атом, успешно применяют в способах, связанных с мечеными лигандами, в частности, при анализах мембранных рецепторов ΐη νότο для маркировки или идентификации тС1и1-рецептора в биологическом материале.

Меченные радиоактивным изотопом соединения, содержащие, по меньшей мере, один [³Н]-атом или один [¹²⁵1]-атом, также успешно применяют ΐη νΐνο в авторадиографии тС1и1-рецепторов мозга, так как соединения согласно изобретению обладают полезной и неожиданной способностью легко пересекать гематоэнцефалический барьер.

Следовательно, изобретение также относится к меченному радиоактивным изотопом соединению согласно изобретению, применяемому для диагностики, которая заключается в маркировке или идентификации тС1и1-рецептора в биологическом материале, а также к применению соединений согласно изобретению для производства диагностического средства для маркировки или идентификации тС1и1рецептора в биологическом материале либо ΐη νΐνο, либо ΐη νίΐτο.

- 2 009334

В рамках настоящей заявки термин «биологический материал» означает любой материал, имеющий биологическое происхождение. В частности, он относится к образцам тканей, жидкостей плазмы, жидкостей организма, частей тела и органов, получаемых от теплокровных животных и от теплокровных животных как таковых (рег зе), в частности от человека.

Основные эксперименты, которые проводили с применением системы мембранного анализа для маркировки или идентификации шО1и1-рецептора в биологическом материале, представляют собой: эксперименты по изучению насыщения, эксперименты по изучению ингибирования, эксперименты по изучению кинетики ассоциации и эксперименты по изучению кинетики диссоциации. Такие методики применимы для большинства рецепторных систем нейромедиаторов и гормонов, включая шО1иК1-систему (МеШобз Гог ЫеигойапзшЩег Кееер1ог Апа1уз1з, под редакцией Непгу ТУашашига и др., Кауеп Ргезз Μά., Нью-Йорк, 1990). С этой целью меченное радиоактивным изотопом соединение вводят в биологический материал для маркировки шО1и1-рецепторов и регистрируют эмиссии меченного радиоактивным изотопом соединения, чтобы идентифицировать количество или локализацию шО1и1-рецепторов, например, путем авторадиографии рецептора ех νΐνο.

Меченные радиоактивным изотопом соединения согласно изобретению, содержащие по меньшей мере один [³Н]-атом или один [¹²⁵1]-атом, также применяются в качестве агентов для скрининга, обладает ли тестируемое соединение способностью занимать сайт шО1и1-рецептора или связываться с ним. Степень, с которой тестируемое соединение заместит соединение согласно изобретению на сайте шО1и1рецептора, покажет способность тестируемого соединения занимать сайт шО1и1-рецептора или связываться с ним и, следовательно, действовать в качестве либо агониста, антагониста, либо смешанного агониста/ антагониста шО1и1-рецептора.

Меченные радиоактивным изотопом соединения согласно изобретению, содержащие, по меньшей мере, один [³Н]-атом или один [¹²⁵1]- атом преимущественно получают путем замещения атома галогена атомом трития, как описано в экспериментальном разделе.

Второе предпочтительное воплощение (радиоактивный изотоп, испускающий позитрон)

При втором предпочтительном воплощении меченное радиоактивным изотопом соединение содержит, по меньшей мере, один радиоактивный атом углерода или галогена. В принципе, любое соединение формулы (I), содержащее атом углерода или галогена, подходит для введения радиоизотопного ядра путем замены атома углерода или галогена на подходящий радиоактивный изотоп или путем получения соединения формулы (I) с помощью меченных радиоактивными изотопами реагентов. Подходящие для этой цели радиоактивные изотопы галогенов представляют собой радиоактивный углерод, например, [¹¹С]; радиоактивные йодиды, например [¹²²1], [¹²³1], [¹³¹Ι]; радиоактивные бромиды, например [⁷⁵Вг], [⁷⁶Вг], [⁷⁷Вг] и [⁸²Вг]; и радиоактивные фториды, например [¹⁸Т]. Предпочтительные меченные радиоактивными изотопами соединения представляют собой такие соединения формулы (Ι-А)* и (1--В)*, в которых К¹ содержит радиоактивный атом углерода или галогена, в частности [¹¹С], [¹⁸Т], [¹²³Ι], [⁷⁵Вг], [⁷⁶Вг] или [⁷⁷Вг].

Получение радиоактивных соединений

Введение радиоактивного атома галогена можно проводить с помощью подходящей реакции, такой как приведена ниже

в которой все заместители в формуле (Ι-А-а) и (Ι-А-а)* являются такими же, как в формуле (Ι-А)*, а галоген представляет собой атом галогена. Подходящее соединение (Ι-А-а) вступает в реакцию с Н[¹⁸Т] таким образом, что атом галогена, находящийся на хинолиновом кольце, заменяется путем реакции нуклеофильной замены на радиоактивный [¹⁸Т]-атом.

Для получения меченных радиоактивным изотопом соединений согласно формуле (Ι-В)* введение радиоизотопного ядра можно проводить таким же способом, например, согласно схеме взаимодействия, представленной ниже. Очевидно, что соединения формулы (Ι-А)* также можно получать таким способом, то есть с участием меченого заместителя К¹.

(Ι-Β-а) а-В-а)*

Другие способы введения меченых атомов трития описаны, например, в публикациях: Репд и др.

- 3 009334

Гимоп Тесйпо1оду, Атепсап Иис1еаг 8ос1е!у, 21(2):307- 311, 1992 и ВгипбНй и др., 1оигпа1 оГ БаЬе11еб Сотроипбз апб КабюрйагтасеийсаВ 25 (12): 1361-1369 (1988).

Введение радиоактивного [¹¹С]-атома можно проводить согласно схеме взаимодействия, приведенной ниже, по которой подходящее соединение (Ι-А-а) сначала станнилируют (вводят станнильную группу), после чего вводят радиоактивный [¹¹С], применяя, например реакцию конденсации 8И11е-типа, катализируемую палладием с применением [¹¹С]метилйодида (8сой Ж.Р; Спзр О. Т.; 8й11е 1.К., РАт.Сйет. 8ос, 1984, 106, 4630).

В формуле (Ι-А-а), (Ι-А-Ь) и (Ι-А-с)* все заместители имеют такие же значения, как указано для формулы (Ι-А)*, галоген представляет собой атом галогена, и К¹⁷ представляет собой метил или бутил.

Благодаря неожиданной способности легко проникать через гематоэнцефалический барьер меченные радиоактивным изотопом соединения, содержащие радиоактивный атом галогена, в составе соответствующей композиции применяют преимущественно ΐπ у1уо для животного, особенно теплокровного животного, и регистрируют локализацию указанных меченных радиоактивным изотопом соединений с помощью методов визуализации, таких как, например, однофотонная эмиссионная компьютерная томография (81п§1е Рйо!оп Ет188юп СотрШегеб Тотодгарйу) (8РЕСТ) или позитронно-эмиссионная томография (Розйтоп Ет188юп Тотодгарйу) (РЕТ) и т.п. Таким способом можно регистрировать распределение сайтов тО1и1-рецепторов в организме, и с помощью упомянутых выше способов визуализации можно визуализировать органы, содержащие сайты тО1и1-рецепторов, такие как, например, мозг. Такой способ визуализации органа путем введения меченного радиоактивным изотопом соединения формулы (Ι-А)* или (Ι-А)*, которое связывается с сайтами тО1и1-рецепторов, и регистрации эмиссии радиоактивного соединения, также составляет аспект настоящего изобретения.

Применение соединений формулы (Ι-А)* и (Ι-В)* в описанных выше способах составляет еще один аспект настоящего изобретения. Изобретение, в частности, относится к применению соединений согласно изобретению для производства диагностического средства для применения в методе РЕТ. Для применения в методе РЕТ наиболее предпочтительными являются меченные радиоактивным изотопом соединения согласно изобретению, в которые входит ¹⁸Р (патент США 4931270, Нот и др., опубликованный 5 июня 1990).

Получение нерадиоактивных соединений

Нерадиоактивные соединения согласно изобретению могут быть получены с помощью ряда способов.

Чтобы упростить структурное представление некоторых присутствующих соединений и промежуточных соединений, в последующих методиках получения хинолиновая или хинолиноновая группа будут обозначаться далее символом р.

к⁵

Соединения формулы (Ι-А) или (Ι-В), где X представляет собой О, обозначаются формулой (Ι^β-а), указанные соединения могут быть получены окислением промежуточного соединения формулы (ΙΙ) в присутствии подходящего окислителя, такого как перманганат калия, и подходящего катализатора фазового переноса, такого как трис(диокса-3,6-гептил)амин, в подходящем инертном по отношению к реакции растворителе, таком как, например, дихлорметан.

_Р1 X _Λ окисление и

Н —сн-р -----------К¹— (И)

Од/в-а)

Соединения формулы (Т_А/В-а) могут быть также получены при взаимодействии промежуточного соединения формулы (ΙΙΙ) с промежуточным соединением формулы (Ιν), где Ж₁ представляет собой атом галогена, например бром, в присутствии бутиллития и подходящего инертного по отношению к реакции растворителя, такого как, например, тетрагидрофуран.

- 4 009334

С другой стороны, соединения формулы (1д/_В-а) могут быть также получены при взаимодействии промежуточного соединение формулы (V) с промежуточным соединением формулы (IV) в присутствии бутиллития и подходящего инертного по отношению к реакции растворителя, такого как, например, тетрагидрофуран.

Соединения формулы (1д/_В-а) , в которых заместитель К¹ связан с карбонильной группой через атом кислорода [указанный заместитель К¹ обозначается как -О-К^1а, а указанные соединения формулой (1д/_В-а1)], могут быть получены при взаимодействии промежуточного соединения формулы (VI) с промежуточным соединением формулы (VII) в присутствии подходящей кислоты, такой как серная кислота.

О О

-,1а II II р —ОН + НО—с—р--р¹⁹—О—С—С} (VI) (VII) (1д/в-а-1)

Соединения формулы (ГА), где К² представляет собой метилкарбонил [указанные соединения обозначаются формулой (ГА-1)], могут быть получены при взаимодействии промежуточного соединения формулы (VIII) в присутствии подходящей кислоты, такой как соляная кислота, и подходящего инертного по отношению к реакции растворителя, такого как, например, тетрагидрофуран.

Соединения формулы (I) можно также преобразовывать друг в друга посредством известных в данной области преобразований.

Соединения формулы Ц-А), где К² представляет собой атом галогена, такой как хлор, могут быть преобразованы в соединение формулы (ГА), где К² представляет собой другой атом галогена, такой как фтор или иод, путем взаимодействия с подходящим галогенирующим агентом, таким как, например фто рид калия или иодид натрия, в присутствии подходящего инертного по отношению к реакции растворителя, например диметилсульфоксида или ацетонитрила, и, необязательно, в присутствии ацетилхлорида.

Соединения формулы (ГА), где К² представляет собой подходящую удаляемую группу, такую как атом галогена, например хлор, йод [указанная удаляемая группа обозначается как XV², а указанные соединения как (ГА-2)], могут быть преобразованы в соединение формулы (ГА), где К² представляет собой циано [указанное соединение представлено формулой (ГА-3)], путем взаимодействия с подходящим агентом для ввода цианогруппы, таким как, например, триметилсиланкарбонитрил, в присутствии подходящего основания, такого как Ν,Ν-диэтилэтанамин, и подходящего катализатора, такого как, например, тетракис(трифенилфосфин)палладий.

Соединения формулы (ГА-2) могут быть также преобразованы в соединения формулы (ГА-4) при взаимодействии с С_2-6-алкинилтри (С_1-6-алкил)силаном в присутствии СиЕ, соответствующего основания, такого как, например, Ν,Ν-диэтилэтанамин, и соответствующего катализатора, такого как, например, тетракис(трифенилфосфин)палладий. В свою очередь, соединения формулы (ГА-4) могут быть преобразованы в соединения формулы (ГА-5) при взаимодействии с фторидом калия в присутствии подходящей кислоты, такой как уксусная кислота, или при взаимодействии с подходящим основанием, таким как гидроксид калия, в присутствии подходящего инертного по отношению к реакции растворителя, такого как спирт, например метанол и т. п.

Соединения формулы (ГА-2) могут быть также преобразованы в соединения формулы (ГА-6) при взаимодействии с промежуточным соединением формулы (IX) в присутствии Си(, подходящего основания, такого как, например, Ν,Ν-диэтилэтанамин, и подходящего катализатора, такого как тетракис(трифенилфосфин)палладий.

Соединения формулы (ГА-2) могут быть также преобразованы в соединение, где К² представляет собой С_1-6-алкил [указанное соединение представлено формулой (ГА-8)], в присутствии подходящего алкилирующего агента, такого как, например, 8п (С_1-6-алкил)₄, или в соединение, где К² представляет

- 5 009334 собой С_2-6-алкенил [указанное соединение представлено формулой (Ι-Α-9)], в присутствии подходящего алкенилирующего агента, такого как, например, 8η (С_2-6-алкенил) (С1_-6-алкил)₃, оба вступают в реакцию в присутствии подходящего катализатора, такого как, например, тетракис(трифенилфосфин)палладий, и инертного по отношению к реакции растворителя, такого как, например, толуол или диоксан.

Соединения формулы (Ι-Α-2) могут быть также преобразованы в соединение формулы (Ι-Α-7), где Ζ представляет собой О или 8, при взаимодействии с промежуточным соединением формулы (X) необязательно в присутствии подходящего основания, такого как карбонат калия, и инертного по отношению к реакции растворителя, такого как Ν, Ν-диметилформамид.

Соединения формулы (Ι-Α-2) могут быть также преобразованы в соединение формулы (Ι-Α), где К² представляет собой С1-6-алкилоксикарбонил [указанное соединение представлено формулой (Ι-Α-10)], и соединение формулы (Ι-Α), где К² представляет собой водород [указанное соединение представлено формулой (Ι-Α-11)], при взаимодействии с подходящим спиртом формулы С1-6-алкил-ОН и СО в присутствии подходящего катализатора, такого как, например, ацетат палладия (ΙΙ), трифенилфосфин, подходящего основания, такого как карбонат калия, и инертного по отношению к реакции растворителя, такого как Ν, Ν-диметилформамид.

Соединения формулы (Ι-Α-11) могут быть также получены при взаимодействии соединения формулы (Ι-Α-2) с Ζη в присутствии подходящей кислоты, такой как уксусная кислота.

Соединения формулы (Ι-Α-2) могут быть также преобразованы в соединение формулы (Ι-Α), где К² представляет собой аминокарбонил, замещенный С_1-6-алкилоксикарбонил-С_1-6-алкилом [указанное соединение представлено формулой (Ι-Α-12)], при взаимодействии с промежуточным соединением формулы Н^-С_1-6-алкил-С(=О)-О-С_1-6-алкил в присутствии СО, подходящего катализатора, такого как тетракис(трифенилфосфин)палладий, подходящего основания, такого как, например, Ν,Ν-диэтилэтанамин, и подходящего инертного по отношению к реакции растворителя, такого как, например, толуол.

алкил с—О—Србалкил

Ω

Соединения формулы (Ι-Α-2) могут быть также преобразованы в соединение формулы (Ι-Α), где К² представляет собой арил или гетероцикл, выбранный из группы, описанной выше при определении К² [указанный К² обозначается как К^2а, а указанное соединение представлено формулой (Ι-Α-13)], путем взаимодействия с промежуточным соединением формулы (ΧΙ), (ΧΙΙ) или (ΧΙΙΙ) в присутствии подходящего катализатора, такого как, например, тетракис(трифенилфосфин)палладий, и подходящего инертно- 6 009334 го по отношению к реакции растворителя, такого как, например, диоксан.

Соединения формулы (Ι-Α-2) могут быть также преобразованы в соединение формулы (Ι-В), где Υ И К⁵ объединены с образованием радикала формулы (Ь-1) или (Ь-2) [указанное соединение представлено формулой (Ι-Β-1) или (Ι-Β-2)], путем взаимодействия с гидразинкарбоксальдегидом или азидом натрия в подходящем инертном по отношению к реакции растворителе, таком как спирт, например бутанол, или Ν, Ν- диметилформамид.

Соединения формулы (Ι-Α-11) могут быть преобразованы в соответствующий Ν-оксид, представленный формулой (Ι-Α-14), путем взаимодействия с подходящим пероксидом, таким как 3-хлорбензолнадкарбоновая кислота, в подходящем инертном по отношению к реакции растворителе, таком как, например, метиленхлорид. Указанное соединение формулы (Ι-Α-14) может быть далее преобразовано в соединение формулы (Ι-Β), где К⁵ представляет собой водород [указанное соединение представлено формулой (Ι-Β-3)], путем взаимодействия с 4-метилбензолсульфонилхлоридом в присутствии подходящего основания, такого как, например, дикарбонат калия, и подходящего инертного по отношению к реакции растворителя, такого как, например, метиленхлорид.

(Ι-Α-14)

Соединения формулы (Ι-Β-3) могут быть также получены из соединения формулы (Ι-А), где К² представляет собой С_1-6-алкилокси [указанное соединение представлено формулой (Ι-Α-15)], путем взаимодействия с подходящей кислотой, такой как соляная кислота, в присутствии подходящего инертного по отношению к реакции растворителя, такого как, например,тетрагидрофуран.

(Ι-Α-15) (1-13-3)

Соединения формулы (Ι-Β-3) могут быть преобразованы в соединение формулы (Ι-Β), где К⁵ представляет собой С_1-6-алкил [указанное соединение представлено формулой (Ι-Β-4)], путем взаимодействия с соответствующим алкилирующим агентом, таким как, например промежуточное соединение формулы (ΧΙν), где представляет собой подходящую удаляемую группу, такую как атом галогена, например йод, в присутствии трет-бутилата калия и в присутствии подходящего инертного по отношению к реакции растворителя, такого как, например, тетрагидрофуран.

- 7 009334

Соединения формулы (Ι-Β-3) могут быть также преобразованы в соединение формулы (Ι-Β), где К⁵ представляет собой С1-6-алкилоксикарбонил-С1-6-алкил или арил-С1-6-алкил [указанный К⁵ обозначается как К^5а, и указанное соединение представлено формулой (Ι-Β-5)], путем взаимодействия с промежуточным соединением формулы (XV), где Ж4 представляет собой подходящую удаляемую группу, такую как атом галогена, например бром, хлор и т.п., в присутствии подходящего основания, такого как, например, гидрид натрия, и подходящего инертного по отношению к реакции растворителя, такого как, например, Ν,Ν-диметилформамид.

(Ι-Α-15)

Соединения формулы (Ι-Α-2) может быть также преобразовано в соединение формулы (Ι-В), где К⁵ представляет собой водород, и Υ представляет собой 8 [указанное соединение представлено формулой (Ι-Β-6)], путем взаимодействия с Η2Ν^(=8)-ΝΗ2 в присутствии подходящего основания, такого как гидроксид калия, и подходящего инертного по отношению к реакции растворителя, такого как спирт, например этанол, или вода. Соединение формулы (Ι-Β-6) может быть далее преобразовано в соединение формулы (Ι-Α), где К² представляет собой С1-6-алкилтио [указанное соединение представлено формулой (Ι-Α-16)], путем взаимодействия с подходящим С_1-6-алкилгалогенидом, таким как, например, С_1-6алкилиодид, в присутствии подходящего основания, такого как карбонат калия, и подходящего растворителя, такого как, например, ацетон.

Соединения формулы (Ц^-а) могут быть преобразованы в соединения формулы (Ι-Α) или (Ι-Β), где X представляет собой Ν-К⁷ [указанное соединение представлено формулой (Ι^β-Ь)], путем взаимодействия с промежуточным соединением формулы (ΧνΙ) необязательно в присутствии подходящего основания, такого как, например, Ν,Ν-диэтилэтанамин, и в присутствии подходящего инертного по отношению к реакции растворителя, такого как спирт, например этанол.

В⁷—ΝΗ₂

(ΪΑ/в-а) (XVI)

Как уже указывалось в методике получения описанных выше соединений формулы (Ι-Α-13), соединения формулы (Ι) могут быть также преобразованы в соответствующие Ν-оксидные формы посредством известных в данной области процедур преобразования трехвалентного азота в его Ν-оксидную форму. Указанную реакцию Ν-окисления можно в общем случае проводить путем взаимодействия исходного соединения формулы (Ι) с соответствующим органическим или неорганическим пероксидом. Соответствующие неорганические пероксиды включают, например, перекись водорода, пероксиды щелочных металлов или щелочно-земельных металлов, например пероксид натрия, пероксид калия; соответствующие органические пероксиды могут включать надкислоты, такие как, например, бензолнадкарбоновая кислота или галогензамещенная бензолнадкарбоновая кислота, например 3-хлорбензолнадкарбоновая кислота, надалкановые кислоты, например надуксусная кислота, алкилгидропероксиды, например третбутилгидропероксид.

Подходящими растворителями являются, например, вода, низшие спирты, например этанол и т.п., углеводороды, например толуол, кетоны, например 2-бутанон, галогенированные углеводороды, например дихлорметан, и смеси таких растворителей.

Некоторые из промежуточных соединений и исходных продуктов, применяемых в описанных выше методиках, имеются в продаже или могут быть синтезированы согласно методикам, уже описанным в литературе.

Промежуточные соединения формулы (ΙΙ) могут быть получены путем взаимодействия промежуточного соединения формулы (ΧνΙΙ) с промежуточным соединением формулы (ΧνΙΙΙ), где Ж представ

- 8 009334 ляет собой подходящую удаляемую группу, такую как атом галогена, например хлор, бром и т.п., в присутствии магния, простого диэтилового эфира и подходящего инертного по отношению к реакции растворителя, такого как простой диэтиловый эфир.

+ ΐΧ— Ψ₅ (XVII)

(Н) (XVIII)

Промежуточные соединения формулы (XVII) могут быть получены окислением промежуточного соединения формулы (XIX) в присутствии подходящего окислителя, такого как МпО₂, и подходящего инертного по отношению к реакции растворителя, такого как метиленхлорид.

(XIX)

Н (XVII)

Промежуточные соединения формулы (XIX) могут быть получены восстановлением промежуточного соединения формулы (XX) в присутствии подходящего восстановителя, такого как алюмогидрид лития, и подходящего инертного по отношению к реакции растворителя, такого как тетрагидрофуран.

(XX) (XIX)

ОН

Промежуточные соединения формулы (XX), где С) представляет собой хинолиновую группу, необязательно замещенную в положении 3 С1_-6-алкилом, и где карбонильная группа находится в положении 6 [указанные промежуточные соединения представлены формулой (XX-а)], могут быть получены путем взаимодействия промежуточного соединения формулы (XXI) с промежуточным соединением формулы (XXII) в присутствии 3-нитробензолсульфоната натрия, подходящей кислоты, такой как серная кислота, и подходящего спирта, например метанола, этанола, пропанола, бутанола и т.п.

»залкил

Н_; (XXI) (XXII) (ХХ-а)

С другой стороны, промежуточные соединения формулы (II) могут быть также получены путем взаимодействия промежуточного соединения формулы (XXIII) с промежуточным соединением формулы (XXIV), где ^₆ представляет собой подходящую удаляемую группу, такую как атом галогена, например бром, хлор и т.п., в присутствии подходящего агента, такого как бутиллитий, и подходящего инертного по отношению к реакции растворителя, такого как тетрагидрофуран.

(ΧΧΙ11)

(И) (XXIV)

Промежуточные соединения формулы (XXIII) могут быть получены окислением промежуточного соединения формулы (XXV) с помощью окисления Пфицнера-Моффата или Сверна (аддукты диметилсульфоксида с дегидратирующими агентами, например, ОСС, Ас₂О, 8О₃, Р₄О₁₀, СОС1₂ или С1-СО-СОС1) в инертном растворителе, таком как метиленхлорид.

(XXV)

(XXIII)

Промежуточные соединения формулы (XXV) могут быть получены восстановлением промежуточного соединения формулы (XXVI) в присутствии подходящего восстановителя, такого как, например, алюмогидрид лития, и подходящего инертного по отношению к реакции растворителя, такого как бензол.

- 9 009334

(XXVI) (XXV)

Промежуточные соединения формулы (XXVI) могут быть получены из промежуточного соединения формулы (XXVII) этерификацией в присутствии подходящего спирта, такого как метанол, этанол, пропанол, бутанол и т.п., и подходящей кислоты, такой как серная кислота.

Срб алкил—ОН

(XXVII) (XXVI)

Промежуточные соединения формулы (XXVII), где К¹ представляет собой радикал формулы (а-1), где Ζ1 представляет собой О, Ζ2 представляет собой СН2, и η равным 1 [указанные промежуточные соединения представлены формулой (XXVII-а)], могут быть получены восстановлением промежуточного соединения формулы (XXVIII) в присутствии подходящего восстановителя, такого как водород, и подходящего катализатора, такого как палладий на активированном угле, и подходящей кислоты, такой как уксусная кислота. Когда К¹ промежуточного соединения (XXVII) представляет собой необязательно замещенную фенильную группу, ее можно также преобразовывать в необязательно замещенную циклогексильную группу путем восстановления в присутствии подходящего восстановителя, такого как родий на А12О₃, и подходящего инертного по отношению к реакции растворителя, такого как тетрагидрофуран.

(XXVI 1-а) (XXVIII) ' ’

Промежуточные соединения формулы (IV), где О представляет собой хинолиновую группу, замещенную в положении 2 галогеном, например хлором [указанные промежуточные соединения представлены формулой (^-а)], могут быть получены путем взаимодействия промежуточного соединения формулы (IV), где О представляет собой хинолиноновую группу, где К⁵ представляет собой водород [указанное промежуточное соединение представлено формулой (Г^Ь)], в присутствии РОС1₃.

(ΐν-а)

Промежуточные соединения формулы (^-а), где К⁴ представляет собой водород [указанные промежуточные соединения представлены формулой (^-а-1)], могут быть также получены путем взаимодействия промежуточного соединения формулы (XXIX) с РОС1₃ в присутствии Ν, Ν-диметилформамида (формилирование Вильсмайера-Хаака, сопровождаемое циклизацией).

А³

а³

Промежуточные соединения формулы (XXIX) могут быть получены путем взаимодействия промежуточного соединения формулы (XXX) с промежуточным соединением формулы (XXXI), где А представляет собой подходящую удаляемую группу, такую как атом галогена, например хлор, в присутствии подходящего основания, такого как, например, Ν,Ν-диэтилэтанамин, и подходящего инертного по отношению к реакции растворителя, такого как метиленхлорид.

(XXX) (XXXI)

(XXIX)

Промежуточные соединения формулы (^-а) могут быть преобразованы в промежуточное соединение формулы (^-е) путем взаимодействия с промежуточным соединением формулы (XXXII) в присутствии подходящего инертного по отношению к реакции растворителя, такого как спирт, например метанол и т.п.

- 10 009334

к4	К4
Ν α (XXXII)	N О—С ί -<5 ал кил
(ΐν-а)	(1У-с)

Промежуточные соединения формулы (Ιν-а) могут быть также преобразованы в промежуточное соединение формулы (ΐν-ά-1) путем взаимодействия с подходящим амином формулы (ΧΧΧΙΙΙ-а), где каждый из Ζ₃ и Ζ₄ независимо представляет собой водород, С_1-6-алкил, С_1-6-алкилокси-С_1-6-алкил, С_1-6алкилтио- С_1-6-алкил, или в промежуточное соединение формулы (ΐν-ά-2) путем взаимодействия с подходящим амином формулы (ΧΧΧΙΙΙ-Ь), где Ζ₃ и Ζ₄ объединены с образованием гетероцикла, как описано выше в определении К², при условии, что гетероцикл содержит, по меньшей мере, один атом азота, в присутствии подходящего основания, такого как, например, дикарбонат калия, и инертного по отноше-

Промежуточные соединения формулы (Ιν-а), где К³ представляет собой СН2-СН2-СН2-С1 [указанные промежуточные соединения представлены формулой (Ιν-α-2)], могут быть также преобразованы в промежуточное соединение формулы (ГУ), где К² и К³ объединены с образованием двухвалентного радикала формулы -О-СН2-СН₂-СН₂-[указанное промежуточное соединение представлено формулой (Ιν-е1)], путем взаимодействия с подходящей кислотой, такой как соляная кислота и т.п.

Промежуточные соединения формулы (Ιν-α-2) также могут быть преобразованы в промежуточное соединение формулы (Ιν), где К² и К³ объединены с образованием двухвалентного радикала формулы -8СН₂-СН₂-СН₂-[указанное промежуточное соединение представлено формулой (Ιν^-2)], путем взаимодействия с Н₂Ы-С(=8)-ХН₂ в присутствии подходящего инертного по отношению к реакции растворите ля, такого как спирт, например этанол.

(ΐν-3-2) к⁴

(ΐν-β-1)

(ΐν-β-2)

Промежуточные соединения формулы (ν) могут быть получены путем взаимодействия промежуточного соединения формулы (ΧΧνΙΙ) с промежуточным соединением формулы СН₃-ПН-О-СН₃ в присутствии 1,1'-карбонилдиимидазола и подходящего инертного по отношению к реакции растворителя, такого как метиленхлорид.

, 1?	й О-С113
р—с—ОН	+ Н3С—ΝΗ—О—СН3 --►- Ес—С—А (V)

(XXVII)

Промежуточные соединения формулы (νΙΙ), где р представляет собой хинолиновую группу, в частности, хинолиновую группу, где К² представляет собой этил, К³ представляет собой метил и К⁴ представляет собой водород, а карбоксильная группа находится в положении 6 [указанные промежуточные соединения представлены формулой (νΙΙ-а)], могут быть получены путем взаимодействия промежуточ

- 11 009334 ного соединения формулы (XXXIV) в присутствии подходящего альдегида, такого как СН₃-СН₂-СН (=0), (СН₂О)_П, Ζηϋί₂, БеС1₃, и подходящего инертного по отношению к реакции растворителя, такого как спирт, например этанол.

СН3-СН2—СН(=О)
Η,Ν—0	(СН2О)П		он
I 1 п —с—он
(XXXIV)		(νΐΙ-а)

Промежуточные соединения формулы (VIII) могут быть получены путем взаимодействия промежуточного соединения формулы (XXXV) с промежуточным соединением формулы (XXXVI) в присутствии подходящего катализатора, такого как, например, тетракис(трифенилфосфин)палладий и подходящего инертного по отношению к реакции растворителя, такого как диоксан.

(XXXV)

6п-~(С₄н₉)з (XXXVI)

Кроме того, можно разработать некоторые другие способы получения, некоторые из которых описаны далее в примерах настоящей заявки.

С помощью известных в данной области методик могут быть получены стереоизомерно чистые формы соединений и промежуточных соединений настоящего изобретения. Диастереомеры можно разделить с помощью физических способов разделения, таких как селективная кристаллизация, и хроматографических методов, например с помощью жидкостной хроматографии с применением хиральных стационарных фаз. Энантиомеры можно отделить друг от друга путем селективной кристаллизации солей их диастереомеров с оптически активными кислотами. С другой стороны, энантиомеры можно разделить хроматографическими методами с применением хиральных стационарных фаз. Указанные стереоизомерно чистые формы могут быть также получены из соответствующих стереоизомерно чистых форм соответствующих исходных продуктов при условии, что реакция происходит стереоселективно или стереоспецифически. Если требуется определенный стереоизомер, предпочтительно синтезировать указанное соединение с помощью стереоселективных или стереоспецифических способов синтеза. При таких способах применяют преимущественно хирально чистые исходные продукты. Очевидно, что стереоизомерные формы соединений формулы (I) включены в объем изобретения.

Стереоизомер соединения формулы (ЕЛ) или (ЕВ), соответствующий цис-форме, может быть преобразован в другой стереоизомер, соответствующий транс-форме, путем взаимодействия соединения с подходящей кислотой, такой как соляная кислота, в присутствии подходящего инертного по отношению к реакции растворителя, такого как, например тетрагидрофуран.

Антагонистическую активность настоящих соединений по отношению к шО1иК1 можно продемонстрировать при проведении теста по передаче сигнала клонированных крысиных шО1иК1 в СНОклетках, и теста на холодовую аллодению (болевого теста) у крыс с лигатурой Беннетта, как описано в дальнейшем.

Благодаря их антагонистической активности по отношению к шО1иК, более конкретно, их антагонистической активности по отношению к шО1иК группы I, и еще более конкретно, их антагонистической активности по отношению к шО1иК1, соединения формулы (ЕЛ) или (ЕВ), их Ν-оксиды, фармацевтически приемлемые аддитивные соли, четвертичные амины и стереохимически изомерные формы применимы для лечения или профилактики индуцированных глутаматом заболеваний центральной нервной системы. Заболевания, в которых установлена роль глутамата, включают лекарственное привыкание (наркоманию) или абстиненцию (зависимость, толерантность к опиоидам, воздержание от опиоидов), гипоксические, аноксические и ишемические повреждения (ишемический удар, остановку сердечной деятельности), боль (невропатическую боль, боль при воспалении, гипералгезию), гипогликемию, заболевания, связанные с неврональным повреждением, травму мозга, травму головы, повреждение спинного мозга, миелопатию, деменцию, тревогу, шизофрению, депрессию, ослабление когнитивной деятельности, амнезию, биполярные расстройства, расстройства поведения, болезнь Альцгеймера, сосудистую деменцию, смешанную (Альцгеймера и сосудистую) деменцию, заболевание тельца Леви, бредовое состояние или спутанность сознания, болезнь Паркинсона, болезнь Хантингтона, синдром Дауна, эпилепсию, старение, амиотрофический латеральный склероз, рассеянный склероз, СПИД (синдром приобретенного иммунодефицита) и СПИД-ассоциированный комплекс (ЛВС).

Настоящее изобретение также относится к композициям, содержащим терапевтически эффективное количество меченого изотопом соединения формулы (Σ-Ά)* или (ЕВ)* и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель, для введения животным, в частности, человеку, в частности, в связи с диагно

- 12 009334 стикой, более конкретно, для визуализации органа.

Следовательно, соединения по настоящему изобретению или любой их подгруппы для введения можно получать в различных фармацевтических формах. В качестве соответствующих композиций можно упомянуть все композиции, обычно используемые для системного введения лекарственных средств. Для получения фармацевтических композиций согласно настоящему изобретению терапевтически эффективное количество конкретного соединения, в форме основания или аддитивной соли, в виде активного ингредиента объединяют при тщательном перемешивании с фармацевтически приемлемым носителем, который можно выбрать в зависимости от формы препарата, необходимого для введения, из большого разнообразия форм. Желательно, чтобы такие фармацевтические композиции находились в виде стандартной лекарственной формы, предпочтительно для перорального, ректального, местного введения, через кожу или с помощью парентеральной инъекции. Например, в случае жидких препаратов для орального введения, таких как суспензии, сиропы, эмульсии, эликсиры и растворы, для получения композиции в дозированной форме для перорального введения можно использовать любую обычно применяемую фармацевтическую среду, такую как, например, вода, гликоли, масла, спирты и т.п.; или в случае порошков, пилюль, капсул и таблеток можно использовать твердые носители, такие как крахмалы, сахара, каолин, смазки, связующие компоненты, дезинтеграторы и т.п. Благодаря простоте введения таблетки и капсулы представляют собой наиболее выгодную стандартную лекарственную форму для перорального введения, в которой, безусловно, используются твердые фармацевтические носители. Носитель для парентеральной композиции обычно будет содержать стерилизованную воду, по меньшей мере, в значительной степени, хотя могут быть включены и другие ингредиенты, например вспомогательное средство для растворимости. Например, могут быть получены растворы для инъекции, в которых носитель содержит физиологический раствор, раствор глюкозы или смесь раствора глюкозы и физиологического раствора. Можно также получить суспензии для инъекций, в которых можно использовать соответствующие жидкие носители, суспендирующие агенты и т.п. Также включены препараты в твердой форме, которые незадолго перед использованием переводятся в препараты в жидкой форме. В качестве соответствующих композиций для местного нанесения можно упомянуть все композиции, обычно используемые для местного введения лекарственных средств, например кремы, гель, повязки, шампуни, тинктуры, пасты, мази, бальзамы, порошки и т.п. В композициях, подходящих для введения через кожу, носитель необязательно содержит агент, усиливающий проникновение, и/или подходящее смачивающее вещество, необязательно объединенное в незначительных пропорциях с подходящими добавками любой природы, которые не оказывают значительного вредного воздействия на кожу. Указанные добавки могут способствовать введению через кожу и/или могут быть полезны для получения требуемых композиций. Такие композиции можно вводить различными способами, например в виде трансдермального пластыря, в виде точечных мазков, в виде мази.

Для простоты введения и равномерности дозировки особенно удобно получать вышеупомянутые фармацевтические композиции в виде стандартной лекарственной формы. Применяемая здесь в описании и формуле изобретения стандартная лекарственная форма относится к физически дискретным формам, подходящим в качестве стандартных лекарственных форм, каждая единица которых содержит определенное количество активного ингредиента, рассчитанного для получения требуемого терапевтического эффекта, совместно с необходимым фармацевтическим носителем. Примерами таких стандартных лекарственных форм являются таблетки (включая таблетки с шероховатой поверхностью или таблетки, покрытые оболочкой), капсулы, пилюли, суппозитории, упаковки порошков, облатки, растворы или суспензии для инъекции, дозировки в виде чайной ложки лекарства, столовой ложки и т.п. и сегрегированных кратных количеств.

Как известно специалисту в данной области, эффективная диагностическая доза или частота введения зависят от конкретного применяемого соединения формулы (Ι-А)* или (Ι-В)* и конкретного состоя ния животного, которое подвергается лечению.

Следующие примеры предназначены для иллюстрации и не ограничивают объем настоящего изобретения.

Экспериментальная часть

В дальнейшем Ν,Ν-диметилформамид обозначается как ДМФ, простой диизопропиловый эфир обозначается как ΌΙΡΕ, диметилсульфоксид обозначается как ДМСО, 2, 6-бис-(1,1-диметилэтил)-4метилфенол обозначается как ВНТ и тетрагидрофуран обозначается как ТГФ.

Получение промежуточных соединений

Пример А1.

Получение

(промежуточное соединение 1)

Смесь 4-(1-метилэтокси)бензойной кислоты (0,083 моль) и Кй/А1₂О₃ 5% (10 г) в ТГФ(220 мл) подвергают гидрированию при 50°С (при давлении Н₂ 3 бар) в течение 1 ночи. Смесь фильтруют через целит, промывают ТГФ и упаривают. Выход: 16 г промежуточного соединения 1 (100%).

- 13 009334

Пример А2.

Получение 2-этил-3-метил-6-хинолинкарбоновой кислоты (промежуточное соединение 2).

Смесь 4-аминобензойной кислоты (0,299 моль) в этаноле (250 мл) перемешивают при комнатной температуре. Добавляют Ζπϋί₂ (0,0367 моль) и (СН₂О)_П (10 г). По частям добавляют РеС1₃ 6Н₂О (0,5 моль) и повышают температуру до 60-65°С. По каплям в течение более 2 ч добавляют пропаналь (30 мл). Смесь кипятят с обратным холодильником в течение 2 ч и сохраняют при комнатной температуре в течение 12 ч. Смесь выливают в воду и фильтруют через целит. Фильтрат подкисляют до рН=7 с помощью 6н НС1 и смесь упаривают досуха. Остаток применяют без дальнейшей очистки. Выход: 56,1 г 2-этил-3-метил-6хинолинкарбоновой кислоты (промежуточное соединение 2).

Пример А3.

Получение

(промежуточное соединение 3)

К смеси 4-бромбензоламина (0,232 моль) и Ν,Ν-диэтилэтанамина (0,2784 моль) в СН₂С1₂ (400 мл) при 5°С добавляют пентаноилхлорид (0,27 84 моль). Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи, выливают в воду и экстрагируют СН2С12. Органический слой отделяют, промывают концентрированным раствором NН₄ОН и водой, сушат (Мд8О₄) , фильтруют и выпаривают растворитель. Остаток (60 г) кристаллизуют из диэтилового эфира. Осадок отфильтровывают и сушат. Остаток (35 г, 63%) переносят в СН₂С1₂. Органический слой отделяют, промывают 10%-ным раствором К₂СО₃, промывают водой, сушат (Мд8О₄) , фильтруют и выпаривают растворитель. Выход: 30 г промежуточного соединения (3) (54%).

Пример А4.

Получение

(промежуточное соединение 4)

Смесь 6-бром-2(1Н)-хинолинона (0,089 моль) в РОС1₃ (55 мл) перемешивают при 60°С в течение ночи, затем при 100°С в течение 3 ч и выпаривают растворитель. Остаток переносят в СН2С12, выливают в воду со льдом, подщелачивают концентрированным NН₄ОН, фильтруют через целит и экстрагируют СН₂С1₂. Органический слой отделяют, сушат (Мд8О₄), фильтруют и выпаривают растворитель. Выход: 14,5 г промежуточного соединения (4) (67%).

Пример А5.

а) Получение

(промежуточное соединение 5)

К РОС1₃ (108 мл) при 10°С в токе Ν₂ добавляют по каплям ДМФ (37 мл) . После завершения добавления смеси дают нагреться до комнатной температуры. По частям добавляют №(4-бромфенил)бутанамид (0,33 моль). Смесь перемешивают при 85°С в течение ночи, затем дают охладиться до комнатной температуры и выливают на лед (экзотермическая реакция). Осадок отфильтровывают, промывают небольшим количеством воды и сушат (вакуум). Остаток промывают ЕЮАе/диэтиловым эфиром и сушат. Выход: 44,2 г промежуточного соединения (5) (50%).

Ь) Получение

(промежуточное соединение 6)

Смесь промежуточного соединения (5) (0,162 моль) в метаноле (600 мл) и раствора метилата натрия (метанолнатриевой соли) в метаноле при концентрации 35% (154 мл) перемешивают и кипятят с обратным холодильником в течение ночи. Смесь выливают на лед. Осадок отфильтровывают, промывают небольшим количеством воды и переносят в СН2С12. Добавляют 10%-ный К2СО3 и смесь экстрагируют СН₂С1₂. Органический слой отделяют, промывают водой, сушат (Мд8О₄), фильтруют и выпаривают растворитель. Выход: 31,9г промежуточного соединения (6) (74%).

Пример А6.

Получение

(промежуточное соединение 7)

К смеси 4-метоксициклогексанкарбоновой кислоты (0,063 моль) в СН2С12(200 мл) по частям добавляют 1,1'-карбонил-бис-1Н-имидазол (0,07 4 моль). Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 1 ч. Затем добавляют Ν-метоксиметанамин (0,074 моль). Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи, выливают в Н2О и экстрагируют СН2С12. Органический слой отделяют, промывают несколько раз Н₂О, сушат (Мд8О₄), фильтруют и выпаривают растворитель. Выход: 12,6 г промежуточного соединения 7.

- 14 009334

Пример А7.

a) Смесь 6-фтор-4-оксо-4Я-1-бензопиран-2-карбоновой кислоты (0,30 моль) в уксусной кислоте (400 мл) гидрируют в присутствии Рб/С (3 г) в качестве катализатора. После поглощения Н₂ (3 экв.) катализатор отфильтровывают. Фильтрат упаривают. Остаток перемешивают в петролейном эфире. Осадок отфильтровывают и сушат (вакуум; 70°С). После перекристаллизации из СНС1₃/СН₃ОН осадок отфильтровывают и сушат (вакуум; 80°С и высокий вакуум; 85°С).

Выход: 8,8 г 6-фтор-3,4-дигидро-2Н-1-бензопиран-2-карбоновой кислоты (промежуточное соединение 8) (15,0%).

b) Смесь промежуточного соединения (8) (0,255 моль) в этаноле (400 мл) и Н₂8О₄ (5 мл) перемешивают и кипятят с обратным холодильником в течение 8 ч. Выпаривают растворитель досуха. Остаток растворяют (разжижают) в СН₂С1₂. Органический слой отделяют, промывают 10%-ным К₂СО₃, сушат (Мд8О₄), фильтруют и выпаривают растворитель. Выход: 45 г этил-6-фтор-3,4-дигидро-2Н-1бензопиран-2-карбоксилата (промежуточное соединение 9) (79%).

c) Реакция в атмосфере Ν₂. Смесь 70%-ного по массе раствора бис-(2-метоксиэтокси)алюмогидрида натрия в метилбензоле 3,4 М (0,44 моль) и бензола (150 мл) (кипячение с обратным холодильником) добавляют по каплям в течение 1 часа к кипящей с обратным холодильником смеси промежуточного соединения 9 (0,22 моль) и бензола (600 мл). После перемешивания в течение 2,5 ч при температуре флегмы смесь охлаждают до ±15°С. Смесь растворяют (разлагают), добавляя по каплям этанол (30 мл) и воду (10 мл). Полученную смесь выливают в лед/воду и полученную смесь подкисляют концентрированной соляной кислотой. Полученную смесь экстрагируют диэтиловым эфиром (500 мл). Отделенный органический слой промывают водой, сушат, фильтруют и выпаривают растворитель. Остаток очищают колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: СНС13). Отбирают нужную фракцию и выпаривают элюент. Выход: 34 г 6-фтор-3,4-дигидро-2Н-1-бензопиран-2-метанол (промежуточное соединение 10) (85%).

б) Реакция в атмосфере Ν₂. К смеси этандиоилдихлорида (0,1 моль) в СН₂С1₂ (350 мл) при перемешивании и охлаждении (-60°С; на бане 2-пропанон/СО2) в течение 10 мин добавляют сульфинил-бис[метан] (30 мл). После перемешивания в течение 10 мин добавляют смесь промежуточного соединения 10 в СН2С12 (90 мл) в течение 5 мин. После перемешивания в течение 15 мин добавляют Ν,Νдиэтилэтанамин (125 мл). Когда смесь нагреется до комнатной температуры, ее выливают в воду. Продукт экстрагируют СН₂С1₂. Органический слой промывают водой, НС1 (1М), водой, №НСО₃(10%) и водой, сушат и упаривают. Остаток разжижают (растворяют) в диэтиловом эфире, промывают водой, сушат, отфильтруют и упаривают. Остаток очищают колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: СНС13). Нужную фракцию отбирают и элюент выпаривают. Выход: 21,6 г 6-фтор-3,4-дигидро-2Н-1бензопиран-2-карбоксальдегида (промежуточное соединение 11) (67%).

е) Получение

(промежуточное соединение 12)

1,6 М н-бутиллитий (0,056 моль) медленно добавляют при -70°С к раствору промежуточного соединения (5) (0,046 моль) в ТГФ (100 мл). Смесь перемешивают при -70°С в течение 30 мин. Медленно добавляют суспензию промежуточного соединения 11 (0,056 моль) в ТГФ (100 мл). Смесь перемешивают при -70°С в течение 1 ч, затем доводят температуру до комнатной, выливают в Н₂О и экстрагируют ЕЮАс. Органический слой отделяют, сушат (Мд8О₄), фильтруют и выпаривают растворитель. Остаток (21 г) очищают колоночной хроматографией на силикагеле (элюент:циклогексан/ЕЮАс 80/10; 15-35 мкм). Очищенные фракции отбирают и выпаривают растворитель. Выход: 9,5 г промежуточного соединения 12 (55%).

Пример А8

а.)	и		ΌΧ
Получение	п		1
	(промежуточное	И	(промежуточное
	соединение 13)		соединение 14)

Смесь промежуточного соединения (5) (0,1127 моль), 2-метоксиэтанамина (0,2254 моль) и К₂СО₃ (0,2254 моль) в ДМФ (500 мл) перемешивают при 120°С в течение 15 ч и затем охлаждают. Выпаривают растворитель. Остаток переносят в СН₂С1₂ и Н₂О. Органический слой отделяют, сушат (Мд8О₄), фильтруют и досуха выпаривают растворитель. Остаток (33,53 г) очищают колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: СН₂С1₂/СН₃ОН 99,5/0,5; 15-40 мкм). Две фракции отбирают и выпаривают из них растворители. Выход: 5,7 г промежуточного соединения 14 (38%) и промежуточного соединения 13 (34%).

Ь) Получение

(промежуточное соединение 15)

- 15 009334

Смесь промежуточного соединения (5) (0,0751 моль), тиоморфолина (0,0891 моль) и К₂СО₃ (0,15 моль) в ДМФ (200 мл) перемешивают при 120 °С в течение 12 ч. Выпаривают растворитель досуха. Остаток переносят в СН₂С1₂ и Н₂О. Органический слой отделяют, сушат (Мд8О₄) , фильтруют и выпаривают растворитель. Остаток (26 г) очищают колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: циклогексан/ΕΐОΑс 80/20; 20-45 мкм). Две фракции отбирают и выпаривают из них растворители. Две полученные фракции объединяют. Выход: 9,4 г промежуточного соединения 15 (37%); т.пл. 82°С.

Пример А9.

a) 4-аминобензойную кислоту (0,219 моль) добавляют к раствору 3-нитробензолсульфоната натрия (0,118 моль) в 70%-ной Н₂8О₄ (230 мл) и кипятят смесь с обратным холодильником при перемешивании. Добавляют по каплям 2-пропен-1,1-диол-2-метилдиацетат (0,216 моль) и кипятят смесь с обратным холодильником в течение 4 ч. Добавляют этанол (200 мл) и перемешивают смесь при 80°С в течение 48 ч. Смесь упаривают, остаток выливают в воду со льдомМН₄ОН и экстрагируют СН₂С1₂. Органический слой сушат (Мд8О₄) и упаривают. Остаток очищают колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: СН2С12/2-пропанол 99/1). Очищенные фракции отбирают и упаривают. Выход: 21 г этил-3-метил-6хинолинкарбоксилата (промежуточное соединение 16) (45%).

b) Промежуточное соединение 16 (0,098 моль) в ТГФ (270 мл) добавляют при 0°С к раствору ΓΐΑΜ^ (0,098 моль) в ТГФ в атмосфере Ν₂. Когда добавление завершится, добавляют воду (10 мл). Осадок отфильтровывают и промывают СН₂С1₂. Органический слой сушат (Мд8О₄), фильтруют и упаривают. Продукт применяют без дальнейшей очистки. Выход: 16,71 г 3-метил-6-хинолинметанол (промежуточное соединение 17).

c) К раствору промежуточного соединения 17 (0,0 96 моль) в СН₂С1₂ (200 мл) добавляют МпО₂ (0,237 моль) и смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 12 ч. Смесь фильтруют через целит и фильтрат снова перемешивают с МпО2 (20 г) в течение 12 ч. Снова добавляют МпО2 (10 г) . Смесь перемешивают в течение 12 ч. Смесь фильтруют через целит и упаривают. Продукт применяют без дальнейшей очистки. Выход: 11,71 г 3-метил-6-хинолинкарбоксальдегида (71%) (промежуточное соединение 18).

б) Раствор бромциклогексила (0,14 моль) в 1,1'-окси-бис-этане (50 мл) и в присутствии Мд-стружки (50 мл) добавляют при 10°С к смеси ТГФ (0,14 моль) в 1,1'-окси-бис-этане (10 мл). Осторожно добавляют раствор промежуточного соединения 18 (0,07 моль) в присутствии Мд-стружки (100 мл) при 5°С, смесь выливают в воду со льдом и экстрагируют ΕΐΌΑα Выход: 11,34 г (±)-а-циклогексил-3-метил-6хинолинметанола (63%) (промежуточное соединение 19).

Пример Α10.

Получение

(промежуточное соединение 20)

Смесь соединения (5) (0,001507 моль), трибутил-(1-этоксиэтенил)олова (0,00226 моль) и Рб(РРЬ₃)₄ (0,000151 моль) в 1,4-диоксане (5 мл) перемешивают при 80°С в течение 3 ч. Добавляют воду. Смесь экстрагируют ΕΏΑα Органический слой отделяют, сушат (Мд8О₄), фильтруют и выпаривают растворитель. Полученный продукт применяют без дальнейшей очистки. Выход: 1,4 г промежуточного соединения 20.

Пример Α11.

Получение

(промежуточное соединение 21)

Смесь соединения (45) (полученного согласно способу В6) (0,00125 моль) в 3н №О11 (5 мл) и 1РгОН (1,7 мл) перемешивают при комнатной температуре в течение ночи, затем выливают в Н2О, подкисляют 3н. НС1 и экстрагируют ΕΐΌΑα Органический слой отделяют, сушат (Мд8О₄), фильтруют и выпаривают растворитель. Остаток переносят в простой диэтиловый эфир. Осадок отфильтровывают и сушат. Выход: 0,26 г промежуточного соединения 21 (56%). (Т.пл.: 232°С)

Пример Α12.

- 16 009334

Смесь 5-бром-1Н-индол-2,3-диона(0,221 моль) в 3н. КаОН (500 мл) перемешивают при 80°С в течение 30 мин, доводят температуру до комнатной и добавляют 2-пентанон (0,221 моль). Смесь перемешивают и кипятят с обратным холодильником в течение 1 ч 30 мин и подкисляют АсОН до рН=5. Осадок отфильтровывают, промывают водой и сушат. Выход: 52,3 г промежуточного соединения 22 и промежуточного соединения 23. (Общий выход: 80%).

Ь) Получение

(промежуточное соединение 24)

(промежуточное соединение 25)

1,6 М н-ВиЫ (0,0816 моль) добавляют по каплям при -78°С к суспензии промежуточного соединения 22 (0,034 моль) и промежуточного соединения 23 (0,034 моль) в ТГФ (300 мл) в токе Ν₂. Смесь перемешивают при -78°С в течение 30 мин. Добавляют по каплям 1,6 М Н-ВиГ1 (0,0816 моль). Смесь перемешивают в течение 1 ч. Медленно добавляют смесь промежуточного соединения 9 (0,102 моль) в ТГФ (250 мл). Смесь перемешивают в интервале температур от -78 до -20°С, выливают в смесь Н₂О/НС1 (3н) и экстрагируют ЕЮАс. Органический слой отделяют, сушат (Мд8О₄), фильтруют и выпаривают растворитель досуха. Выход: 20,89 г промежуточного соединения 2 4 и промежуточного соединения 25 (86%).

Пример А13.

а) Получение

(промежуточное соединение 26)

К раствору 3-хлор-2-этил-2-бутеналя (0,065 моль) в АсОН (100 мл) при комнатной температуре по частям добавляют 4-амино-3-метоксибензойную кислоту (0,054 моль). Смесь перемешивают, кипятят с обратным холодильником в течение 8 часов и упаривают досуха. Остаток переносят в СН2С12, добавляют воду и подщелачивают раствор с помощью Εΐ₃Ν. Органический слой отделяют, сушат (Мд8О₄), фильтруют и выпаривают растворитель. Остаток кристаллизуют из 2-пропанона. Осадок отфильтровывают и

сушат. Выход: 2,5 г промежуточного соединения 2 6 (18%). о
	(промежуточное
Ь) Получение ' к 1
х	соединение 27)
°х

К раствору промежуточного соединения 26 (0,011 моль) в СН2С12 (30 мл) при комнатной температуре добавляют СТИ (0,012 моль). Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 1 ч. Добавляют метоксиаминометил (0,012 моль) и перемешивают смесь при комнатной температуре в течение 8 ч. Добавляют Н2О. Осадок отфильтровывают. Фильтрат экстрагируют СН2С12.

Органический слой отделяют, сушат (Мд8О₄) , фильтруют и выпаривают растворитель. Остаток перекристаллизовывают из простого диэтилового эфира. Осадок отфильтровывают и сушат. Выход: 0,95 г промежуточного соединения 27 (31%) (т.пл.: 148°С).

Пример А14.

(промежуточное соединение 28)

К раствору 3-хлор-2-этил-2-бутаналя (0,041 моль) в АсОН (60 мл) добавляют при комнатной температуре 4-бромбензоламик (0,034 моль). Смесь перемешивают и кипятят с обратным холодильником в течение 8 ч, доводят до комнатной температуры и упаривают досуха. Продукт кристаллизуют из ЕЮАс. Осадок отфильтровывают, промывают 10%-ным К₂СО₃ и переносят в СН₂С1₂. Органический слой отделяют, сушат (Мд8О₄), фильтруют и выпаривают растворитель. Выход: 4,6 г промежуточного соединения 28 (54%).

Пример А15.

а) Получение

(промежуточное соединение 29)

К раствору 1,3-циклогександиона (0,2 68 моль) в Н₂О (150 мл) медленно добавляют при 5°С раствор КОН (0,326 моль) в Н₂О (150 мл). Температура не должна превышать 12°С. Добавляют ΚΣ (2 г), затем по частям 2-бром-1-(4-нитрофенил)этанон (0,294 моль). Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 48 ч. Осадок отфильтровывают, промывают Н2О, затем простым диэтиловым эфиром и сушат.

- 17 009334

Выход: 63 г (85%). Часть полученной фракции (1 г) кристаллизуют из ЕЮН. Осадок отфильтровывают и сушат. Выход: 0,5 г промежуточного соединения 29 (42%) (т.пл.: 100°С).

Ь) Получение (промежуточное соединение 30)

Смесь промежуточного соединения 29 (0,145 моль) и Н₂8О₄ (40 мл) перемешивают при комнатной температуре в течение 1 ч, выливают на лед, подщелачивают ΝΗ₄ΟΗ и экстрагируют СН₂С1₂. Органический слой отделяют, сушат (Мд8О₄), фильтруют и выпаривают растворитель. Остаток кристаллизуют из ЕЮН. Осадок отфильтровывают и сушат. Выход: 31 г (58%). Часть полученной фракции (1 г) кристаллизуют из ЕЮН. Осадок отфильтровывают и сушат. Выход: 0,7 г промежуточного соединения 30 (58%) (т.пл.: 200°С).

Смесь промежуточного соединения 30 (0,039 моль) и никеля Ренея (10 г) в ЕЮН (100 мл) гидрируют в течение 1 ч при комнатной температуре под давлением 3 бар. Смесь фильтруют через целит и промывают СН₂С1₂. Органический слой отделяют, сушат (Мд8О₄), фильтруют и выпаривают растворитель. Остаток (9,5 г) кристаллизуют из простого диэтилового эфира. Осадок отфильтровывают и сушат. Выход: 4,6 г (52%). Фильтрат упаривают. Остаток (2,7 г) очищают колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: СН₂С1₂/СН₃ОН; 99/1; 15-40 мкм) . Отбирают две фракции и выпаривают растворитель. Выход: 1,6 г Е₁ и 1,2 г Е₂. Е₂ кристаллизуют из ЕЮН. Осадок отфильтровывают и сушат. Выход: 0,24 г промежуточного соединения 31 (2%) (т.пл.: 202°С).

ά) Получение (промежуточное соединение 32)

К раствору 3-хлор-2-этил-2-бутеналя (0,04 моль) в ЛеОН (50 мл) добавляют при комнатной температуре промежуточное соединение 30 (0,02 моль). Смесь перемешивают и кипятят с обратным холодильником в течение 4 ч. Растворитель выпаривают досуха. Остаток кристаллизуют из ЕЮЛс. Осадок отфильтровывают и сушат. Остаток переносят в СН₂С1₂. Смесь подщелачивают 10%-ным К₂СО₃ и экстрагируют СН₂С1₂. Органический слой отделяют, сушат (Мд8О₄), фильтруют и выпаривают растворитель. Остаток кристаллизуют из ЕЮН. Осадок отфильтровывают и сушат. Выход: 2,5 г промежуточного соединения 32 (40%).

Пример Α16.

Получение

(промежуточное соединение 33)

Смесь 2-(4-нитрофенил)-1-фенилэтанона (0,083 моль) и никеля Ренея (20 г) в ЕЮН (200 мл) гидрируют при комнатной температуре в течение 1 ч под давлением 3 бар, затем фильтруют через целит, промывают СН2С12/СН3ОН и сушат. Выход: 17,5 г промежуточного соединения 33 (97%).

Пример Α17.

а) Получение

(промежуточное соединение 34)

К РОС1₃ (0,7536 моль) добавляют по каплям при 5°С ДМФ (12,4 мл). Добавляют 4'-бром-5хлорвалеранилид (0,1032 моль) и перемешивают смесь при 75°С в течение 6 ч, охлаждают до комнатной температуры и выливают в воду со льдом. Нерастворимое вещество отфильтровывают, промывают водой и сушат. Выход: 25,7 г промежуточного соединения 34 (78%).

Ь) Получение

(промежуточное соединение 35)

Смесь промежуточного соединения 34 (0,094 моль) и 6н. НС1 (250 мл) перемешивают и кипятят с обратным холодильником в течение 2 дней, охлаждают, выливают в воду (100 мл) и нейтрализуют

- 18 009334

ΝΗ₄ΟΗ (концентрированный). Нерастворимое вещество фильтруют и промывают водой, затем ЕЮН. Выход: 19 г. Фильтрат упаривают. Остаток (9,4 г) очищают колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: СН₂С1₂/СН₃ОН 99,25/0,75; 15-35 мкм). Отбирают одну фракцию и выпаривают растворитель. Выход: 8 г промежуточного соединения 35 (32%).

Получение нерадиоактивных соединений

Пример В1.

Получение

(соединение ЗЭ6)

К ДМФ (0,024 моль) медленно добавляют РОС1₃ (0,024 моль) при 5°С. Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 30 мин, затем охлаждают до 5°С. Медленно добавляют сложный этиловый эфир 3-оксобутановой кислоты (0,024 моль). Смесь перемешивают при 5°С в течение 30 мин. По частям добавляют 1-(4-аминофенил)-2-фенилэтанон (0,024 моль). Смесь перемешивают при 90°С в течение 3 ч и растворяют в СН₂С1₂. Добавляют воду со льдом. Смесь подщелачивают ЫН₄ОН и экстрагируют СН₂С1₂. Органический слой отделяют, сушат (М§8О₄), фильтруют и выпаривают растворитель. Остаток кристаллизуют из 2-пропанона/диэтилового эфира. Осадок отфильтровывают и сушат. Выход: 0,9 г соединения 306 (11%) (т.пл.: 136°С).

Пример В2

Ь) Получение

(соединение 2)

К раствору (полученному согласно примеру А7.е) (0,022 моль) в трис(диокса-3,6-гептил)амине (1 мл) и СН₂С1₂ (100 мл) при комнатной температуре по частям добавляют КМпО₄ (10 г) . Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 8 ч, фильтруют через целит, промывают СН2С12 и сушат. Остаток (6 г, 100%) кристаллизуют из диэтилового эфира/петролейного эфира. Осадок отфильтровывают и сушат. Выход: 2 г соединения (2) (33%); т.пл. 82°С.

Пример В3

а) Получение

(соединение 3)

1,6 М н-ВиЕ1 (0,07 моль) медленно добавляют при -70°С к раствору промежуточного соединения (5) (0,058 моль) в ТГФ (150 мл). Смесь перемешивают при -70°С в течение 30 мин. Медленно добавляют раствор 2,3-дигидро-1Н-инден-2-карбонитрила (0,07 моль) в ТГФ (100 мл). Смесь перемешивают при -70°С в течение 1 ч, медленно доводят до комнатной температуры, подвергают гидролизу с Н2О и экстрагируют ЕЮАс. Органический слой отделяют, сушат (М§8О₄) , фильтруют и выпаривают растворитель. Остаток (22 г) очищают колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: СН₂С1₂/циклогексан, от 80/20 до 100; 15-35 мкм). Очищенные фракции отбирают и выпаривают растворитель. Вторую фракцию кристаллизуют из 2-пропанона/диэтилового эфира. Осадок отфильтровывают и сушат. Выход: 0,11 г соединения (3). Фильтрат концентрируют. Выход: 0,55 г соединения (3); т.пл. 145°С.

цис- (соединение 4) и транс-(соединение 5)

1,6 М н-ВиЕ1 (0,022 моль) при -70°С медленно добавляют к раствору промежуточного соединения (5) (0,018 моль) в ТГФ (50 мл). Смесь перемешивают при -70°С в течение 1 ч, доводят температуру до 40°С, затем охлаждают до -70°С. Медленно добавляют раствор промежуточного соединения 7 (0,018 моль) в ТГФ (40 мл). Смесь перемешивают при -70°С в течение 1 ч, затем доводят температуру до -20°С, подвергают гидролизу с Н₂О и экстрагируют ЕЮАс. Органический слой отделяют, сушат (М§8О₄), фильтруют и выпаривают растворитель. Остаток (6,5 г) очищают колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: толуол/ЕЮАс 90/10; 15-40 мкм). Отбирают две фракции (Е₁ и Е₂) и выпаривают растворитель. Е₁ (2,4 г) кристаллизуют из простого диэтилового эфира. Осадок отфильтровывают и сушат. Выход: 1,8 г соединения (4) (29%); т.пл. 123°С. Е₂ (0,9 г) кристаллизуют из простого диэтилового эфира. Осадок отфильтровывают и сушат. Выход: 0,2 г соединения (5) (3%); т.пл. 120°С.

- 19 009334

По каплям при -78°С в токе Ν₂ добавляют 1,6 М н-ΒπΕΐ в оксане (ехапе) (0,107 моль) к смеси промежуточного соединения (6) (0,089 моль) в ТГФ. Смесь перемешивают при -78°С в течение 1 ч. При -78°С в токе Ν₂ добавляют смесь промежуточного соединения 7 (150 мл). Смесь перемешивают при 78°С в течение 2 ч, доводят температуру до 0°С, выливают в Н₂О и экстрагируют ΕΐΟΑο. Органический слой отделяют, сушат (Мд8О₄), фильтруют и выпаривают растворитель. Остаток (31 г) очищают колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: циклогексан/ΕΐΟΑс 85/15; 20-45 мкм). Отбирают две очищенные фракции и выпаривают из них растворители. Выход: 11 г соединения (7) (38%) и 8,2 г соединения (8) (28%).

ά) Получение

(соединение 503)

К суспензии Мд (0,0069 моль) в небольшом количестве простого диэтилового эфира медленно добавляют раствор хлорметилбензола (0,0069 моль) в простом диэтиловом эфире (8 мл) . Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 30 мин (распределение Мд), затем охлаждают до 5°С. Медленно добавляют раствор промежуточного соединения 27 (0,0027 моль) в ТГФ (8 мл). Смесь перемешивают при 5°С в течение 15 мин, затем при комнатной температуре в течение 2 ч, выливают в Н₂О и фильтруют через целит. Осадок промывают ΕΐΟΑο. Фильтрат экстрагируют ΕΐΟΑο. Органический слой отделяют, сушат (Мд8О4), фильтруют и выпаривают растворитель. Остаток (1 г) очищают колоночной хроматографией на кромасиле (элюент: от 100 СН₂С1₂ до 99/1 СН₂С1₂/СН₃ОН; 15-40 мкм). Очищенные фракции отбирают и выпаривают растворитель. Остаток (0,5 г, 56%) кристаллизуют из диэтилового эфира. Осадок отфильтровывают и сушат. Выход: 0,14 г соединения 503 (15%).

Пример В4. Примеры модификаций концевых групп

(полученную согласно примеру В3.с) (0,018 моль) в 3н. НС1 (60 мл) и ТГФ (60 мл) перемешивают при 60°С в течение ночи. Смесь подщелачивают 10%-ым раствором К₂СО₃333 и экстрагируют СН₂С1₂. Органический слой отделяют, сушат (Мд8О4) , фильтруют и выпаривают растворитель. Выход: 4,6 г соединения (156) (82%).

(полученную согласно примеру В3.с) (0,0122 моль) 3н. НС1 (40 мл) и ТГФ (40 мл) перемешивают и кипятят с обратным холодильником в течение ночи, выливают в воду, подщелачивают 10%-ным К2СО3 и экстрагируют СН2С12. Органический слой отделяют, сушат (Мд8О4), фильтруют и выпаривают растворитель. Остаток очищают колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: циклогексан/ΕΐΟΑс 40/60; 15-40 мкм). Очищенные фракции отбирают и выпаривают растворитель. Выход: 2 г соединения (9) (52%); т.пл.226°С.

- 20 009334

Смесь соединения (4) (0,0015 моль), 2-метоксиэтанамина (0,003 моль) и К₂СО₃ (0,003 моль) в ДМФ (5 мл) перемешивают при 140°С в течение 48 ч. Добавляют Н₂О. Смесь экстрагируют ЕЮАс. Органический слой отделяют, сушат (Мд8О₄), фильтруют и выпаривают растворитель. Остаток (1 г) очищают колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: циклогексан/ЕЮАс 60/4 0; 15-40 мкм) . Отбирают две фракции и выпаривают растворитель. Обе фракции по отдельности кристаллизуют из пентана. Осадок отфильтровывают и сушат. Выход: 0,05 г соединения (10) (9%; т.пл. 115°С) и 0,057 г соединения (11) (10%; т.пл. 107°С).

Смесь соединения (4) (0,0015 моль) в 2-(метилтио)этанамине (2 мл) перемешивают при 120°С в течение 8 ч. Добавляют 10%-ный К2СО3. Смесь экстрагируют СН2С12. Органический слой отделяют, сушат (Мд8О₄), фильтруют и выпаривают растворитель. Остаток (2,2 г) очищают колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: циклогексан/ЕЮАс 70/30; 15-40 мкм). Отбирают две фракции и выпаривают растворитель. Первую фракцию кристаллизуют из простого диэтилового эфира/петролейного эфира. Осадок отфильтровывают и сушат. Выход: 0,08 г соединения (12) (14%); т.пл.120°С. Вторую фракцию кристаллизуют из простого диэтилового эфира. Осадок отфильтровывают и сушат. Выход: 0,18 г соединения (13) (31%); т.пл. 125°С.

е) Получение

Цис (соединение 14)

Смесь соединения (4) (0,001507 моль), этинилтриметилсилана (0,003013 моль), Си1 (0,000151 моль) и Рб(РРй₃)₄ (0,000151 моль) в Ν,Ν-диэтилэтанамине (5 мл) перемешивают при 100°С в течение 24 ч. Добавляют воду. Смесь фильтруют через целит, промывают ЕЮАс и фильтрат экстрагируют ЕЮАс. Органический слой отделяют, сушат (Мд8О₄), фильтруют и выпаривают растворитель. Остаток (1,3 г) очищают колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: циклогексан/ЕЮАс 85/15; 15-40 м:км). Очищенные фракции отбирают и выпаривают растворитель. Остаток (0,3 г) кристаллизуют из пентана. Осадок отфильтровывают и сушат. Выход: 0,11 г соединения (14) (18%); т.пл. 114°С.

£) Получение

(соединение 15) цис

Смесь соединения (14) (0,013 моль) и КР (0,038 моль) в уксусной кислоте (50 мл) перемешивают при комнатной температуре в течение 2 ч. Добавляют Н₂О и экстрагируют смесь простым диэтиловым эфиром. Органический слой отделяют, сушат (Мд8О₄) , фильтруют и выпаривают растворитель. Остаток (4,4 г) очищают колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: циклогексан/ЕЮАс 70/30; 15-40 мкм). Отбирают одну фракцию и выпаривают растворитель. Полученную фракцию (3 г, 7 3%) кристаллизуют из простого диэтилового эфира. Осадок отфильтровывают и сушат. Выход: 2,45 г соединения (15) (60%); т.пл. 132°С.

- 21 009334 полученное согласно примеру В.7.а) (0,0056 моль) в КОН[1М, Н₂О] (10 мл) и метаноле (30 мл) перемешивают при комнатной температуре в течение 1 ч, выливают в воду и экстрагируют ЕЮАс. Органический слой отделяют, сушат (Мд8О₄), фильтруют и выпаривают растворитель. Остаток (2,2 г) очищают колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: циклогексан/ЕЮАс от 85/15 до 70/30; 15-40 мкм). Отбирают две фракции и выпаривают растворитель.

Первую фракцию кристаллизуют из простого диэтилового эфира.

Осадок отфильтровывают и сушат. Выход: 0,2 г соединения (15) (11%); т.пл. 133°С.

Вторую фракцию кристаллизуют из простого диэтилового эфира.

Осадок отфильтровывают и сушат. Выход: 0,3 г соединения (17) (16%); т.пл. 128°С.

цис

Смесь соединения (4) (0,001205 моль), 2-пропин-1-ола (0,002411 моль), Ρά(ΡΡΕ₃)₄ (0,000121 моль) и СТО (0,000121 моль) в Ν,Ν-диэтилэтанамине (5 мл) перемешивают при 100°С в течение 2 ч. Добавляют воду. Смесь фильтруют через целит, промывают ЕЮАс и экстрагируют ЕЮАс. Органический слой отделяют, сушат (М§8О₄), фильтруют и выпаривают растворитель. Остаток (0,7 г) очищают колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: СН2С12/СН3ОН 98/2; 15-40 мкм). Очищенные фракции отбирают и выпаривают растворитель. Остаток кристаллизуют из петролейного эфира и простого диэтилового эфира. Осадок отфильтровывают и сушат. Выход: 0,1 г соединения (18) (23%); т.пл. 113°С.

(соединение 19)

Смесь соединения (4) (0,006027 моль) и КЕ (0,024108 моль) в ДМСО (20 мл) перемешивают при 140°С. Выпаривают растворитель досуха. Остаток подвергают загустению в воде и простом диэтиловом эфире. Смесь экстрагируют простым диэтиловым эфиром. Органический слой отделяют, промывают простым диэтиловым эфиром, промывают насыщенным раствором КаС1, сушат (Мд8О₄), фильтруют и выпаривают растворитель. Остаток (1,7 г) очищают колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: циклогексан/ЕЮАс 85/15; 15-40 мкм). Отбирают три фракции и выпаривают из них растворители. Первую фракцию кристаллизуют из петролейного эфира. Осадок отфильтровывают и сушат. Выход: 0,21 г соединения (19) (11%); т.пл. 92°С. Вторую фракцию кристаллизуют из петролейного эфира. Осадок отфильтровывают и сушат. Выход: 0,33 г соединения (20) (17%); т.пл. 114°С.

Э) Получение

цис (соединение 21)

Смесь соединения (4) (0,003013 моль), ацетилхлорида (0,003315 моль) и йодида натрия (0,006027 моль) в СНзСN (10 мл) перемешивают и кипятят с обратным холодильником в течение 1 часа. Добавляют 10%-ный К₂СО₃. Смесь экстрагируют СН₂С1₂. Органический слой отделяют, сушат (Мд8О₄), фильтруют и выпаривают растворитель. Остаток (1 г) очищают колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: циклогексан/ЕЮАс 80/20; 15-40 мкм). Отбирают две фракции и выпаривают из них растворители. Первую фракцию кристаллизуют из петролейного эфира. Осадок отфильтровывают и сушат. Выход: 0,12 г соединения (21); т.пл. 110°С.

(соединение 22) цис

Смесь соединения (21) (0,000898 моль), триметилсиланкарбонитрила (0,001347 моль) и Ρά(ΡΡΕ₃)₄ (0,00009 моль) в Ν,Ν-диэтилэтанамине (5 мл) перемешивают при 100°С в течение 2 ч. Добавляют воду. Смесь экстрагируют ЕЮАс. Органический слой отделяют, сушат (Мд8О₄), фильтруют и выпаривают растворитель. Остаток (0,4 г) очищают колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: циклогексан/ЕЮАс 80/20; 15-40 мкм). Очищенные фракции отбирают и выпаривают растворитель. Остаток (0,18 г, 62%) кристаллизуют из петролейного эфира. Осадок отфильтровывают и сушат. Выход: 0,13 г соединения (22) (45%); т.пл. 138°С.

- 22 009334

Смесь соединения (4) (0,00603 моль), Рб(ОАс)₂ (0,000603 моль), РРй₃ (0,00904 моль) и К₂СО₃ (0,012054 моль) в атмосфере СО (газ) и метаноле (40 мл) перемешивают при 90°С в течение 8 ч под давлением СО 5 бар. Добавляют Н₂О. Смесь экстрагируют ЕЮАс. Органический слой отделяют, сушат (Мд8О₄), фильтруют и выпаривают растворитель. Остаток (6 г) очищают колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: СН₂С1₂/СН₃ОН, от 100/0 до 98/2; 15-35 мкм). Отбирают четыре фракции (Р₁-Р₄) и выпаривают растворитель. Выход: 0,13 г (цис) Р₁; 0,02 г Р₂ (цис, соединение 25); 0,055 г Р₃ (транс, 3%) и 0,11 г Р₄ (транс; соединение 26).

Ρι кристаллизуют из петролейного эфира. Осадок отфильтровывают и сушат. Выход: 0,03 г соединения (23) (1%); т.пл. 91 °С.

Р₃ кристаллизуют из петролейного эфира. Осадок отфильтровывают и сушат. Выход: 0,035 г соединения (24) (1%); т.пл. 99°С.

Смесь соединения (4) (0,009 моль) и Ζη (0,027 моль) в уксусной кислоте (30 мл) перемешивают при 60°С в течение 4 ч, фильтруют через целит, промывают СН₂С1₂, упаривают досуха, растворяют в СН₂С1₂ и промывают 10%-ным К₂СО₃. Органический слой отделяют, сушат (Мд8О₄), фильтруют и выпаривают растворитель. Остаток (4 г) очищают колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: циклогексан/ ЕЮАс 75/25; 15-40 мкм). Отбирают одну фракцию и выпаривают растворитель. Полученную фракцию (1 г, 37%) кристаллизуют из петролейного эфира. Осадок отфильтровывают и сушат. Выход: соединение (25); т.пл. 88°С.

Смесь соединения (4) (0,001502 моль), 8η (СН₃)₄ (0,003004 моль) и Рб(РРй₃) ₄ (0,00015 моль) в метилбензоле (5 мл) перемешивают и кипятят с обратным холодильником в течение 3 ч. Добавляют 10%-ный К₂СО₃. Смесь экстрагируют ЕЮАс. Органический слой отделяют, сушат (Мд8О₄), фильтруют и выпаривают растворитель. Остаток (0,7 г) очищают колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: циклогексан/ЕЮАс, 85/15; 15-40 мкм). Отбирают две фракции (Р₁ и Р₂) и выпаривают из них растворители. Выход: 0,27 г (Р1111, исходный продукт) и 0,14 г (Р₂). Р₂ кристаллизуют из пентана и петролейного эфира. Осадок отфильтровывают и сушат. Выход: 0,08 г соединения (27) (17%); т.пл. 110°С.

о) Получение

цис

Смесь соединения (4) (0,001507 моль), трибутилэтенилолова (0,002260 моль) и Рб(РРй₃)₄ (0,000151 моль) в диоксане (5 мл) перемешивают при 80°С в течение 8 ч. Добавляют воду. Смесь фильтруют через целит, промывают ЕЮАс и экстрагируют ЕЮАс. Органический слой отделяют, сушат (Мд8О₄), фильтруют и выпаривают растворитель. Остаток (0,65 г) очищают колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: циклогексан/ЕЮАс, 90/10; 15-40 мкм).

Очищенные фракции отбирают и выпаривают растворитель. Остаток кристаллизуют из петролейного эфира. Осадок отфильтровывают и сушат. Выход: 0,07 г соединения (28) (14%); т.пл. 108°С.

- 23 009334

Смесь соединения (5) (0,001507 моль), трифенил (фенилметил) олова (0,002260 моль) и Рб (РРй₃)₄ (0,000151 моль) в диоксане (5 мл) перемешивают при 80°С в течение 8 ч. Добавляют воду. Смесь экстрагируют ЕЮАс. Органический слой отделяют, сушат (М§80₄), фильтруют и выпаривают растворитель. Остаток (1,4 г) очищают колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: СН₂С1₂/ЕЮАс, 96/4; 15-40 мкм). Очищенные фракции отбирают и выпаривают растворитель. Остаток (0,38 г) кристаллизуют из петролейного эфира. Осадок отфильтровывают и сушат. Выход: 0,16 г соединения (29) (28%); т.пл. 112°С.

Смесь соединения (4) (0,001507 моль), трибутил-2-тиенилолова (0,00226 моль) и Рб(РРй₃)₄ (0,0001507 моль) в диоксане (5 мл) перемешивают при 80°С в течение 8 ч. Добавляют 10%-ный К₂С0₃. Смесь экстрагируют ЕЮАс. Органический слой отделяют, сушат (М§80₄), фильтруют и выпаривают растворитель. Остаток (1,7 г) очищают колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: циклогексан/ЕЮАс, 85/15; 15-40 мкм). Очищенные фракции отбирают и выпаривают растворитель. Остаток (0,65 г) кристаллизуют из простого диэтилового эфира. Осадок отфильтровывают и сушат. Выход: 0,35 г соединения (30) (61%); т.пл. 142°С.

Смесь соединения (4) (0,0015 моль), 3-тиенилбороновой кислоты (0,00226 моль), Рб (РРй₃) ₄ (0,00015 моль) и диоксана перемешивают и кипятят с обратным холодильником в течение 24 ч. Добавляют 10%-ный К₂СО₃. Смесь экстрагируют ЕЮАс. Органический слой отделяют, сушат (М§80₄) , фильтруют и выпаривают растворитель. Остаток (0,8 г) очищают колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: циклогексан/ЕЮАс, 80/20; 15-40 мкм) . Очищенные фракции отбирают и выпаривают растворитель. Остаток (0,4 г, 70%) кристаллизуют из петролейного эфира. Осадок отфильтровывают и сушат. Выход: 0,39 г соединения (31) (68%); т.пл. 113°С.

Смесь соединения (4) (0,003 моль), моногидрохлорид сложного метилового эфира глицина (0,0066 моль) и Рб(РРй)₄ (0,0003 моль) в Ец\ (2 мл) и толуоле (10 мл) перемешивают при 100°С под давлением СО 5 бар в течение 8 ч, фильтруют через целит, промывают СН2С12 и упаривают. Остаток (2 г) очищают колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: циклогексан/ЕЮАс, 80/20; 75-35 мкм). Отбирают одну фракцию и выпаривают растворитель. Полученную фракцию (1 г, 80%) кристаллизуют из простого диэтилового эфира. Осадок отфильтровывают и сушат. Выход: 0,46 г соединения (32) (37%).

Смесь соединения (4) (0,003 моль) и гидразинкарбоксальдегида (0,0045 моль) в 1-бутаноле (15 мл) перемешивают и кипятят с обратным холодильником в течение ночи, выливают в воду и экстрагируют СН₂С1₂. Органический слой отделяют, сушат (М§80₄), фильтруют и выпаривают растворитель. Остаток очищают колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: СН₂С1₂/СН₃0НЖН₄0Н, 95/5/0,1; 15-40 мкм). Отбирают две фракции (Е₁ и Е₂) и выпаривают из них растворители. Выход: 0,3 г Е₁ и 0,3 г Е₂.

- 24 009334

Р₁ кристаллизуют из ΟΗ₃ΟΝ и простого диэтилового эфира. Осадок отфильтровывают и сушат. Выход: 0,102 г соединения (33); т.пл. 224°С.

Р₂ кристаллизуют из ΟΗ₃ΟΝ и простого диэтилового эфира. Осадок отфильтровывают и сушат. Выход: 0,2 г соединения (34); т.пл. 185°С.

Смесь соединения 4 (0,015 моль) и ΝαΝ₃ (0,04 5 моль) в ДМФ (50 мл) перемешивают при 140°С в течение 2 ч. Добавляют 10%-ный К₂СО₃ и смесь экстрагируют ЕЮАс. Органический слой отделяют, сушат (Мд8О₄) , фильтруют и выпаривают растворитель. Остаток (6 г) очищают колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: циклогексан/ЕЮАс, 60/40; 15-40 мкм). Отбирают первую фракцию и выпаривают растворитель. Остаток кристаллизуют из простого диэтилового эфира. Осадок отфильтровывают и сушат. Выход: 1,2 6 г соединения (35) (24%); т.пл. 160°С.

Смесь соединения (4) (0,009 моль) и тиомочевины (0,0099 моль) в этиловом спирте (30 мл) перемешивают и кипятят с обратным холодильником в течение 12 ч, медленно добавляют раствор КОН (0,0149 моль) в Н₂О (5 мл) . Смесь перемешивают и кипятят с обратным холодильником в течение 1 ч, выливают в воду и экстрагируют СН₂С1₂. Органический слой отделяют, сушат (Мд8О₄) , фильтруют и выпаривают растворитель. Остаток очищают колоночной хроматографией на силикагеле (циклогексан/ЕЮАс, 70/30; 15-40 мкм). Очищенные фракции отбирают и выпаривают растворитель. Выход: 1,1 г Р1111 (37%) и 0,4 г Р₂ (13%). Р₁ кристаллизуют из 2-пропанона. Осадок отфильтровывают и сушат. Выход: соединение (36). Р₂ кристаллизуют из 2-пропанона. Осадок отфильтровывают и сушат. Выход: соединение (37).

		о
к) Получение
	цис	транс
	(соединение 38)	(соединение	39)

К раствору соединения (36) (0,0015 моль), соединения (37) (0,0015 моль) и К₂СО₃ (0,0034 моль) в ацетоне (15 мл) при комнатной температуре медленно добавляют СН₃1 (0,0034 моль).

Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 8 ч.

Добавляют воду и смесь экстрагируют СН₂С1₂. Органический слой отделяют, сушат (Мд8О₄), фильтруют и выпаривают растворитель.

Остаток (1,2 г) очищают колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: циклогексан/ЕЮАс, 85/15; 15-40 мкм). Очищенные фракции отбирают и выпаривают растворитель. Выход: 0,6 г Р₁ (57%) и 0,18 г Р2 (17%). Р1 кристаллизуют из простого диэтилового эфира.

Осадок отфильтровывают и сушат. Выход: 0,28 г соединения (38) (27%). Р2 кристаллизуют из простого диэтилового эфира. Осадок отфильтровывают и сушат. Выход: 0,065 г соединения (39) (6%).

х)

(соединение 40)

Смесь соединения (41), полученного согласно примеру В3.Ъ (0,0014 моль), в 3н. НС1 (5 мл) и ТГФ (5 мл) перемешивают и кипятят с обратным холодильником в течение 2-х дней (уикэнда), затем выливают в Н₂О, подщелачивают К₂СО₃ и экстрагируют СН₂С1₂. Органический слой отделяют, сушат (Мд8О₄), фильтруют и выпаривают растворитель. Выход: 0,5 г Р. Полученную фракцию Р кристаллизуют из 2- 25 009334 пропанона. Осадок отфильтровывают и сушат. Выход: 0,35 г соединения (40) (74%).

у) Получение

(соединение 188)

Смесь соединения (5) (0,045 моль), ацетамид (0,90013 моль) и К₂СО₃ (0,225 моль) перемешивают и кипятят с обратным холодильником при 200°С в течение 2 ч, охлаждают до комнатной температуры, выливают в Н₂О/СН₂С1₂ и экстрагируют СН₂С1₂. Органический слой отделяют, сушат (Мд8О₄), фильтруют и досуха выпаривают растворитель. Остаток (14,4 г) кристаллизуют из СН₃ОН. Осадок отфильтровывают и сушат. Фильтрат упаривают. Остаток (11,27 г) очищают колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: СН₂С1₂/СН₃ОНМН₄ОН, 96/4/0,1; 15-35 мкм). Очищенные фракции отбирают и выпаривают растворитель. Выход: 4,2 г соединения (188) (65%).

ζ) Получение

Смесь соединения (188) (0,00032 моль), бензойной кислоты (1,5 эквивалента, 0,00048 моль), 1-этил3-(3'-диметиламинопропил) карбодиимид-НС1 (1:1) (1,5 эквиЕ; алента, 0,00048 моль), Ν-гидроксибензотриазола (1,5 эквивалента, 0,00048 моль) и Εΐ₃Ν (1 эквивалент, 0,00032 моль) в СН₂С1₂ (2мл) перемешивают при комнатной температуре в течение 15 ч. Растворитель выпаривают. Остаток очищают ВЭЖХ, фракции продукта отбирают и выпаривают растворитель. Выход: 0,0 66 г соединения (205) (49,50%).

Смесь промежуточного соединения 20 (0,001507 моль) в 3н. НС1 (10 мл) и ТГФ (10 мл) перемешивают при комнатной температуре в течение 8 ч, подщелачивают 10%-ным К2СО3 и экстрагируют СН2С12. Органический слой отделяют, сушат (Мд8О₄), фильтруют и выпаривают растворитель. Остаток (1,2 г) очищают колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: циклогексан/ЕЮАе, 85/15; 15-40 мкм). Очищенные фракции отбирают и выпаривают растворитель. Остаток (0,4 г) кристаллизуют из петролейного эфира. Осадок отфильтровывают и сушат. Выход: 0,3 г соединения (6) (58%); т.пл. 108°С.

аЬ) Получение

(соединение 419)

Смесь соединения 213 (полученного согласно В4) (0,00305 моль) и С11₃О№ (30% в СН₃ОН) (0,00916 моль) в СН3ОН (25 мл) перемешивают и кипятят с обратным холодильником в течение 15 ч, затем охлаждают до комнатной температуры, выливают в Н₂О и экстрагируют ЕЮАе. Органический слой отделяют, сушат (Мд8О₄) , фильтруют и досуха выпаривают растворитель. Остаток (1,1 г) очищают колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: циклогексан/ЕЮАе; 40/60; 15-40 мкм) . Отбирают две фракции и выпаривают растворитель. Выход: 0,3 г Р₁ и 0,5 г Р₂ (50%). Р₂ кристаллизуют из простого диэтилового эфира/петролейного эфира. Осадок отфильтровывают и сушат. Выход: 0,26 г. Р₁ кристаллизуют из пентана. Осадок отфильтровывают и сушат. Выход: 0,19 г. Данную фракцию очищают колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: СН₂С1₂/СН₃ОН; 98/2; 15-40 мкм). Очищенные фракции отбирают и выпаривают растворитель. Выход: 0,11 г. Данную фракцию очищают колоночной хроматографией на кромасиле (элюент: СН3ОН/Н2О; 70/30). Очищенные фракции отбирают и выпаривают растворитель. Выход: 0,09 г (9%). Полученную фракцию кристаллизуют из простого диэтилового эфира. Осадок отфильтровывают и сушат. Выход: 0,08 г соединения 419 (8%).

- 26 009334

К смеси соединения (9) (0,0019 моль), соединения (8) (0,0019 моль) и т-ВиОК (0,00456 моль) в ТГФ (30 мл) в токе Ν₂ при 5°С добавляют йодметан (0,00456 моль). Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи, выливают в Н₂О и экстрагируют СН₂С1₂. Органический слой отделяют, сушат (М§8О₄), фильтруют и выпаривают растворитель. Остаток очищают колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: циклогексан/ЕЮАс, 65/35; 15-40 мкм). Отбирают две фракции и выпаривают растворитель. Выход: 0,35 г соединения (42) (30%; т.пл. 125°С) и 0,35 г соединения (43) (30%; т.пл. 116°С).

Пример В6.

К смеси соединения (8) и соединения (9) (0,0089 моль) при 0°С в токе Ν₂ добавляют 60% N111 (0,01068 моль). Смесь перемешивают в течение 30 мин. При 0°С добавляют этилбромацетат (0,01068 моль). Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 1 ч, подвергают гидролизу с водой и экстрагируют ЕЮАс. Органический слой отделяют, сушат (М§8О₄), фильтруют и выпаривают растворитель. Остаток очищают колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: циклогексан/ЕЮАс, 60/40; 15-40 мкм). Требуемые фракции (Г_1-Г₄) отбирают и выпаривают растворитель. Выход: 0,11 г Г₁; 0,13 г Г₂; 0,75 г Г₃ и 0,8 г Г₄. Г₃ кристаллизуют из простого диэтилового эфира. Осадок отфильтровывают и сушат. Выход: соединение (44); т.пл.152°С.

Г₄ кристаллизуют из диэтилового эфира. Осадок отфильтровывают и сушат. Выход: соединение (45); т.пл. 147°С.

К раствору соединения (8) и соединения (9) (0,0064 моль) и 60% \а!1 (0,007 моль) в ДМФ (40 мл) добавляют по каплям при 0°С в токе Ν2 бромметилбензол (0,007 моль). Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 1 ч, подвергают гидролизу с водой и экстрагируют ЕЮАс. Органический слой отделяют, промывают водой, сушат (М§8О₄), фильтруют и выпаривают растворитель. Остаток очищают колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: циклогексан/ЕЮАс, 70/30; 15-40 мкм). Требуемые фракции (Г₁-Г₄) отбирают и выпаривают растворитель. Выход: 0,15 г Г₁, 0,1 г Г₂, 0,6 г Г₃(23%) и 0,8 г Г₄.

Г₃ кристаллизуют из простого диэтилового эфира. Осадок отфильтровывают и сушат. Выход: 0,13 г соединения (46); т.пл. 137°С.

Г₄ кристаллизуют из БШЕ и петролейного эфира. Осадок отфильтровывают и сушат. Выход: соединение (47); т.пл. 130°С.

Пример В7.

a) К раствору соединения (48) (полученного согласно примеру В2) (0,044 моль) в СН2С12 (200 мл) при 0°С добавляют 3-хлорбензолнадкарбоновую кислоту (0,088 моль) и смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 12 ч. Смесь промывают 10%-ным К₂СО₃. Органический слой сушат (М§8О₄), фильтруют и упаривают. Остаток перекристаллизовывают из (С₂Н₅)₂О. Выход: 8,2 г циклогексил(3-метил-6-хинолинил)метанон-1-оксида (соединение 49) (69%).

b) К раствору соединения (49) (0,028 моль) в К2СО3 (400 мл) и СН2С12 (400 мл) добавляют 4метилбензолсульфонилхлорид (0,043 моль) и перемешивают смесь при комнатной температуре в течение 1 ч. Смесь экстрагируют СН₂С1₂. Органический слой сушат (М§8О₄) , фильтруют и упаривают. Остаток перекристаллизовывают из (С₂Н₅)₂О. Выход: 6,64 г 6-(циклогексилкарбонил)-3-метил-2(1Н)-хинолинон (соединение 50) (85%); т.пл. 256,1 °С.

Пример В8.

- 27 009334

Смесь соединения (7) (0,0229 моль), гидроксиламина (0,0252 моль) и Ν, Ν-диэтилэтанамина (0,0252 моль) в этаноле (100 мл) перемешивают и кипятят с обратным холодильником в течение 6 ч, выливают в воду и экстрагируют СН₂С1₂. Органический слой отделяют, сушат (Мд8О₄) , фильтруют и выпаривают растворитель. Остаток кристаллизуют из СН₃СК Осадок отфильтровывают и сушат. Остаток очищают колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: СН₂С1₂/ЕЮЛе, 80/20; 15-40 мкм). Отбирают две фракции и выпаривают растворитель. Выход: 2,8 г соединения (51) (36%; т.пл. 133°С) и 3 г соединения (52) (38%; т.пл. 142°С).

[1α(Ζ),4α]

К раствору соединения (7) (0,015 моль) в этаноле (75 мл) добавляют при комнатной температуре гидразин (0,41 моль). Смесь перемешивают и кипятят с обратным холодильником в течение 1 ночи, выливают в воду и экстрагируют СН₂С1₂. Органический слой отделяют, сушат (Мд8О₄), фильтруют и выпаривают растворитель.

Остаток очищают колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: СН₂С1₂/СН₃ОН/№Н₄ОН 98/2/0,1). Очищенные фракции отбирают и выпаривают растворитель. Остаток кристаллизуют из простого диэтилового эфира. Осадок отфильтровывают и сушат. Выход: 0,8 г соединения (53) (15%); т.пл. 110°С.

Пример В9.

Методика для получения соединений 400, 401, 402 403, 404 и 405. Смесь промежуточного соединения 21 (полученного согласно А11) (0,000269 моль), гидрохлорида амантадина (0,000404 моль; 1,5 эквивалента), гидрохлорида №-(этилкарбонимидоил)-№>-диметил-1,3-пропандиамина (0,000404 моль; 1,5 эквивалента), 1-гидрокси-1Н-бензотриазола (0,000404 моль; 1,5 эквивалента) и Εΐ₃Ν (0,000269 моль) в СН2С12 (2 мл) перемешивают при комнатной температуре в течение 12 ч. Выпаривают растворитель. Остаток очищают ВЭЖХ. Фракции продукта отбирают и выпаривают растворитель. Выход: 0,063 г соединения 520 (46.37%).

Пример В10.

Получение

цис (соединение 233)

Смесь промежуточного соединения 27 (0,0026 моль) и промежуточного соединения 26 (0,0026 моль) в ЕЮН (380 мл) и концентр. Н₂8О₄ (19 мл) перемешивают и кипятят с обратным холодильником в течение 15 ч, охлаждают до комнатной температуры, выливают в воду со льдом, подщелачивают К₂СО₃ и экстрагируют ЕЮАе. Органический слой отделяют, сушат (Мд8О₄), фильтруют и выпаривают растворитель. Остаток (17,9 г) очищают колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: циклогексан/ ЕЮАе; 80/20; 15-35 мкм). Очищенные фракции отбирают и выпаривают растворитель. Выход: 0,85 г Е₁, 1,1 г Е₂ и 11,5 г Е₃. Е₁ и Е₂ по отдельности кристаллизуют из петролейного эфира. Осадок отфильтровывают и сушат. Выход: 0,34 г соединения 233.

Пример В11.

Получение

(соединение 511)

Смесь соединения 22 (полученного согласно В4) (0,004 моль) в НС1 (3н.) (20 мл) и ТГФ (20 мл) перемешивают и кипятят с обратным холодильником в течение 8 ч, выливают на лед, подщелачивают NН₄ОН и экстрагируют СН₂С1₂. Органический слой отделяют, сушат (Мд8О₄), фильтруют и выпаривают растворитель. Остаток (1,2 г) очищают колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: СН₂С1₂/СН₃ОН^Н₄ОН; 93/7/0,5; 15-40 мкм). Отбирают две фракции и выпаривают растворитель. Выход: 0,5 г Е₁ (41%) и 0,4 г Е₂. Е₁ кристаллизуют из петролейного эфира. Осадок отфильтровывают и сушат. Выход: 0,17 г соединения 511 (14%).

- 28 009334 (соединение 514)

Пример В12.

Получение

Смесь соединения 524 (полученного согласно В9а) (0,0018 моль) и 85%-ного КОН (0,00 94 моль) в ЕЮН (15 мл) перемешивают и кипятят с обратным холодильником в течение 24 ч, выливают в Н₂О и экстрагируют СН₂С1₂. Органический слой отделяют, сушат (Мд8О₄), фильтруют и выпаривают растворитель. Остаток очищают колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: СН₂С1₂/циклогексан, 80/20; 15-40 мкм). Отбирают две фракции и выпаривают растворитель. Выход: 0,35 г Р₁ (64%) и 0,17 г (8М) Р₁ кристаллизуют из простого диэтилового эфира. Осадок отфильтровывают и сушат. Выход: 0,33 г соединения 514 (60%) (т.пл.:185°С).

Пример В13.

Смесь промежуточного соединения 28 (0,019 моль), 2-бензофуранилбороновой кислоты (0,028 моль), Рб(РРГ₃)₄ (0,001 моль) и ВНТ (небольшое количество) в диоксане (25 мл) и №ъСХ)₃|2| (25 мл) перемешивают, кипятят с обратным холодильником в течение 8 ч и экстрагируют ЕЮАс. Водный слой подщелачивают NН₄ОН и экстрагируют СН₂С1₂. Органический слой отделяют, сушат (Мд8О₄), фильтруют и выпаривают растворитель. Остаток (3,6 г) очищают колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: СН₂С1₂/СН₃ОН, 99/1; 15-40 мкм). Очищенные фракции отбирают и выпаривают растворитель. Выход: 1,8 г (33%). Полученную фракцию кристаллизуют из 2-пропанона/диэтилового эфира. Осадок отфильтровывают и сушат. Выход: 0,39 г соединения 515 (7%) (т.пл.: 134°С).

Пример В14.

Получение

К раствору промежуточного соединения 32 (0,004 моль) в СР₃СООН (5 мл) и АсОН (10 мл) медленно добавляют при комнатной температуре триэтилсилан (0,0012 моль). По частям в токе Ν2 добавляют №-1В11.| (0,0012 моль). Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 8 ч, выливают на лед, подщелачивают К₂СО₃ и экстрагируют СН₂С1₂. Органический слой отделяют, сушат (Мд8О₄), фильтруют и выпаривают растворитель. Остаток (1,2 г) очищают колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: СН₂С1₂/СН₃ОН, 99/1; 15-40 мкм). Отбирают две фракции и выпаривают растворитель. Выход: 0,5 г Р₁ (43%) и 0,4 г Р₂. Р₁ растворяют в 1РгОН. Добавляют НС1/1РЮН (1 экв.). Осадок отфильтровывают и сушат. Выход: 0,32 г соединения 526 (т.пл.: 248°С).

Пример В15

Получение

Смесь промежуточного соединения 33 (0,082 моль) и 3-хлор-2-этил-2-бутеналя (0,098 моль) в АсОН (200 мл) перемешивают и кипятят с обратным холодильником в течение 8 ч. Досуха выпаривают растворитель. Остаток разжижают (растворяют) в СН₂С1₂ и промывают 10%-ным К₂СО₃. Органический слой отделяют, сушат (Мд8О₄), фильтруют и выпаривают растворитель. Остаток (27 г) очищают колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: СН₂С1₂/ЕЮАс; от 95/5 до 92/8; 15-35 мкм). Отбирают две фракции и выпаривают растворитель. Выход: 0,7 г Р1 и 5,3 г Р2. Р1 кристаллизуют из 2-пропанона/диэтилового эфира. Осадок отфильтровывают и сушат. Выход: 0,25 г соединения 471 (2%) (т.пл.: 140°С).

Пример В16.

Получение

К раствору промежуточного соединения 35 (полученного согласно А17.Ь) (0,0379 моль) в ТГФ (200 мл) в токе Ν₂ добавляют по каплям н-ВиЬ1 (0,0417 моль). Смесь перемешивают в течение 30 мин. При 78°С добавляют по каплям раствор 4-бром-№метокси-№метилбензолацетамид (0,0568 моль) в ТГФ (100 мл). Температуру смеси поднимают при перемешивании от -78 до 0°С, смесь выливают в Н2О и экстра

- 29 009334 гируют ΕΐΟΑο. Органический слой отделяют, сушат (Мд8О₄), фильтруют и досуха выпаривают растворитель. Остаток (20,9 г) очищают колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: толуол/ΕΐΟΑс, от 60/40 до 50/50; 15-35 мкм). Отбирают две фракции и выпаривают растворитель. Выход: 4 г фракции 1 и 4 г фракции 2 (28%). Фракцию 2 кристаллизуют из простого диэтилового эфира. Осадок отфильтровывают и сушат. Выход: 1 г соединения 528 (т.пл. 195°С).

В табл. 1-8 перечислены соединения формулы (Ι-Α) и (Ι-Β), которые были получены согласно одному из описанных выше примеров.

Таблица 1

' № соед	' № Пр..	к2	я3	к4	К1	физические . данные ,
54	В2	С1	этил	Н	ХХУ	-
3	ВЗа	С1	этил	н		т.пл.145°С
55	ВЗЬ	С1	этил	н	сг	т.пл.131°С
56	ВЗЬ	С1	этил	н		т.пл. 104°С
57	ВЗЬ	С1	этил	Η	фенил этил	т.пл. 100°С
58	ВЗЬ	С1	этил	Н	са	т.пл. 126°С
59	ВЗЬ	С1	этил	Н	са	т.пл.150‘’С
60	ВЗЬ	С1	этил	Н ‘	са	т.пл.138°С
61	ВЗЪ	ОСНз	этил	Н	а	-
62	ВЗЬ	ОСНз	этил	Н	са	)Т.пл. 130°С
63	ВЗЬ	ОСНз	этил	Н		т.пл. 116°С
64	ВЗЪ	С1	этил	Н	-(СН2)2-О-СНз	т.пл. 82°С
65	ВЗЬ	ОСНз	этил	Н	1 - метилциклогексил	т.пл. 82°С
66	ВЗЪ	ОСНз	этил	Н	3-метоксициклогексил	транс; т.пл. 94°С
67	ВЗЪ	ОСНз	этил	Н	3-метоксициклогексил	цис; т.пл. 108°С

- 30 009334

№ соед	' № ПР-: г	К2	в3	К4' '· .	К1 ; р . '	физические .данные
68	взь	ОСНз	этил	н	4- (метилзтокси)циклогексил	(А), т.пл. 82°С
69	взь	ОСНз	этил	н	4-[С(СН3)з] циклогексил	цис;т.пл.92”С
70	взь	ОСНз	ЭТИЛ	н	4-[С(СН3)з] циклогексил	транс; т.пл. 108°С
71	взь	ОСНз	этил	н	4- метоксициклогексил	(В), т.пл. 92°С
72	взь	ОСНз	этил	н	4- метоксициклогексил	(А), т.пл. 80°С
2	В2	С1	этил	н	СН2-СН(СН3)2	т.пл. 82°С
73	взь	С1	этил	н	-СН2-О-С2Н5	т.пл. 82°С
48	В2	Н	метил	н	циклогексил
74	Β4	I	этил	н	οσ	-
75	В4	I	этил	н	οσ	т.пл.124°С
76	Β4	I	этил	н	οσ	т.пл.138°С
77	Β4	I	этил	н	χσ	т.пл.120°С
78	В4	СИ	этил	Н	οσ	т.пп128°С
79	Β4	ΟΝ	этил	Н	σσ	т.пл.136°С
80	В4	ΟΝ	этил	Н	οσ	т.пл120°С
81	В4	ΟΝ	этил	Н	αχ	т.пл.139°С
82	В4	метил	этил	Н	οσ	т.пл.10б°С
83	В4	метил	этил	Н	οσ	т.пл.149°С
84	В4	метил	этил	Н		г.пл.118°С

- 31 009334

№ соед:	' № Лр. .	к2 ... ·.	Ж .<;·	Ж · /	к1: %<.·/ ' /	физические .данные
85	В4	метил	этил	Н		т.пл. 180°С
86	В4	метил	этил	Н	фенил этил	т.пл. 53°с
87	В4	метил	этил	Н	ίΓ	т.пл. 87°С
88	В4	метил	этил	Н	-СН2-СН(СНз)2	т.пл. 68°С
89	В4	метил	этил	Н	СЖ	т.пл. 120°С
31	В4	3-тиазолил	этил	Н	4- метоксициклогексил	ЦИс;113°С
90	ВЗЬ	ОСН3	Н	Н	4- метоксициклогексил	транс, т.пл. 126°С
91	взъ	ОСНз	Н	Н	4- метоксициклогексил	цис; т.пл. 100°С
92	ВЗЬ	ОСНз	Н	СНз	4- метоксициклогексил	цис; т.пл. 120°С
93	ВЗЬ	ОСНз	Н	СНз	4- метоксицикпогексил	транс; т.пл. 111°С
94	ВЗЬ	ОСНз	метил	Н	4- метоксицикпогексил	цис; т.пл.9б°С
95	ВЗЬ	ОСНз	фенил	Н	4- метоксицикпогексил	цис; НС1 (1:1), т.пл.138°С
96	ВЗЬ	ОСНз	пропил	Н	4- метоксицикпогексил	транс; т.пл. 118°С
97	ВЗЬ	ОСНз	пропил	Н	4- метоксицикпогексил	цис; т.пл. 108°С
98	ВЗЬ	ОСНз	метил	н	4- метоксицикпогексил	цис; т.пл. 104°С
99	В4	Ν(ΰΗ3)2	этил	н		(В); т.пл. 102°С
100	ВЗЬ	С1	этил	н	./Τ'	г.пл.114°С
101	В4	метил	этил	н	4-бутоксициклогексил	дис; т.пл.86°С
102	ВЗЬ	С1	этил	н	Ж	г.лл.78°С

- 32 009334

. № соёд	№ .Пр.	к2 ..<.·	В3. ··	К4	к1 х . (	физические данные
103	взь	С1	этил	н	СУ	:т.пл. 91°С
104	В4	Ν(ΟΗ3)2	этил	н		т.пл. 103 С
105	В4	Ν(ΟΗ3)2	этил	н	ох	т.пл. 170°С
106	ВЗЬ	С1	этил	н	хг	т.пл. 137СС
107	ВЗЬ	С1	этил	н	σ	т.пл.137°С
108	В4	метил	этил	еИгу1	4- метоксициклогексил	цисд.пл. 91°С
109	В4	метал	этап	н	4-этоксициклогексил	транс; т.пл. 150°С
ПО	В4	метил	этил	н	-ХМ	т.пл. 90°С
111	В4	метал	этап	н	-ХМ	т.пл. 94°С
112	В4	метал	этил	н	σ	т.пл. 176°С
113	В4	метил	этил	н	-ХМ	т.пл. 10б°С
114	В4	пропил	Н	н	4- метоксициклогексил	цисгг.пл.74°С
115	В4	метил	этил	н	4-этоксициклогексил	цис; т.пл. 108°С
116	В4	метил	этил	н	σ	т.пл. 110°С
117	ВЗЬ	С1	этил	н	сг	т.пл. 124°С
118	ВЗЬ	С1	этап	н	О—	т.пл. 107°С
119	ВЗЬ	С1	этил	н	сс 1	т.пл. 129”С

- 33 009334

№	№	К2 Г '	К3 : \.·ν	вС·.	к1 : ' V · '	физические данные
йоед.	Пр.
120	В4	метал	этил	н	СГ	т.пл. 106°С
41	ВЗЬ	С1	этил	н		транс; т.пл. 157°С
182	ВЗЬ	метал	этил	н	„а	цис; т.пл. 170°С
183	ВЗЬ	метал	этил	н		транс; т.пл. 144°С
184	ВЗЬ	метил	этил	н	ох	т.пл. 138°С
185	ВЗЬ	С1 ·	этил	н	оса	т.пл. 120°С
186	ВЗЬ	С1	этил	н	1 О
187	ВЗЬ	метил	этил	н	1 О	т.пп.162°С
216	В4	(2ΟΝ	этил	н	а	т.пл. 160°С
217	В4	метил	этил	н	са	.этацциоат (1:1); т.пл. :143°С
218	В4	I	этил	н	С№	т.пл. :102°С
219	В4	ССгИ	этил	Н	Н3С НзСГ^'	т.пл. :115°С
220	В4	С1	этил	Н	У	а	(А); т.пл. :107°С
221	В4	С1	этил	Н	с	а	(В); т.пл. :113°С

- 34 009334

№ соёд	№ пр.	κΥ .	К.3 2 ’ ''	к4 У	К.1 γύ’ / '	физические данные
222	В4	I	этил	н	у	т.пл. :206°С
223	В4	С1	этил	н	УУ	(транс); т.пл..Т17°С
224	В4	метил	этил	Н	А	(А); т.пл.:103°С
225	В2	С1	этил	Н	σ	т.пл. :94°С
226	ВЗЬ	С1	этил	Н	γγ с2н5сг^	(тане); т.пл. :157СС
227	ВЗс	метокси	-ΎΊ	Н	ХУ Нзссг4^	Т.ПЛ. ;204°С
228	В4	С1	этил	Н	гг Н3СО'^У^'	(А); т.пл. :136°с
229	ВЗЬ	н-пропил	Н	Н	ХУ НзССГ4'·'^	(транс);.НС1 (1:1); т.пл. :150°С
230	ВЗЬ	С1	этил	н	да ОСН3	т.пл. :116°С
231	ВЗЬ	С1	этил	н	о/г	т.пл. :120°С
232	ВЗЬ	С1	этил	н	У	т.пл. 112°С
233	В10	изо-пропил	н	3(=0)0- 32Н5	ХУ Н3ССГ	(цис); т.пл. :91°С
234	В4	метил	этил	н	сх^	Т.пл. :122°С

- 35 009334

№ соёд	№ Лр..	:к2 У.	к3 '			физические :данные .
235	В4	метил	ЭТИЛ	н	СТО	т.пл. :106°С
236	В4	метил	этил	н	то.	т.пл. :104°С
237	В4	метил	этил	н	то	т.пл. :90°С
238	В4	метил	н	н	НзСО ^^	(Цис); т.пл. :80°С
239	ВЗЬ	С1	этил	н		(транс); т.пл.:126°С
240	ВЗЪ	С1	этил	н	НзС°х^ТО\^ТО	(Цис); т.пл. :128°С
241	В4	метил	этил	н	( НзСО^^^	ЗН3 ТО	(А); т.пл. :90°С
242	В4	метил	этил	н	С НзСО^^	?Нз то	(В); Т.ПЛ. :110°С
243	ВЗЬ	С1	этил	н	я- О О	т.пл. :134°С
244	ВЗЬ	С1	этил	И	то	т.пл. :127°С
245	В4	ЧНС(=О)ЫН2	этил	Н	.то	(Цис); т.пл. :176°С
246	В4	метил	этил	Н	.то	(В)
247	ВЗЬ	С1	этил	н	σ	т.пл. :92°С
248	В4	метил	этил	н	то	(А); т.пл. :80’С

- 36 009334 физические :данные

- 37 009334

№ соёд	' № пр.;		В3	1к4 :	к1· · .'	1 физические .данные ,
262	ВЗЬ	С1	этал	н		(В); т.пл. :101°С
263	ВЗЬ	метал	этап	н	Ы(СН,)Г^^	Т.ПЛ. :130°С
264	ВЗЬ	С1	этил	н	О	(А); т.пл. :124°С
265	ВЗЬ	С1	этал	н	(Я	(В); т.пл.:126°С
266	В4	Ν(ΟΗ3)2	этал	н	ОСН^х^	(транс); т.пл. :102°С
267	В4	жсн3)2	этал	н	ОСНзх-^х-	[цис);НС1(1:1); т.пл. :170°С
268	В4	метал	этал	н	я	(А);.НС1(1:1); т.пл. :206°С
269	В4	метал	этал	н		т.пл. :104°С
270	ВЗЬ	метал	этал	н		т.пл. :117°С
271	В4	МНС2Н3ОСН3	этал	н	съ	-
272	В4	метал	этил	н	осЙ>ЧЧ	-
273	В4	νη2	этал	н	СС
274	ВЗЬ	С1	этил	н

- 38 009334

№ соед	' № ,ϊιρ..	к2 · '	К3 δ	К4 .· у:	К1	физические .данные
275	взь	С1	этил	н	СГз Ох	т.пл. :99°С
276	взь	С1	этил	н	0х	т.пл. :95°С
277	В4	метил	этил	н	'X	т.пл. :105°С
278	ВЗЬ	С1	этил	н		т.пл.:141°С
279	В4	С1	этил	Н	:ж	т.пл.:168°С
280	В4	С1	этил	Н	„ж	-
281	В4	С1	этил	н	Ж	т.пл.:140°С
282	В4	С1	этил	Н	ж	т.пл.:169°С
283	В4	метил	этил	Н	0х	т.пл. :96°С
284	ВЗЬ	С1	ΖΗ2Ν((2Η3)2	н	ж	т.пл.:115°С
285	В4	метил	этил	н	СНз X	т.пл. :133°С
286	В4	метил	ЗН2ОСН3	н	..ж	(транс); т.пл. :106°С
287	В4	метил	2НЩ(СН3)2	н	.ж	(Цис); т.пл. :11ОСС

- 39 009334

- 40 009334

№ соед	' №: пр.		К3.	к4	кФ ..	физические .данные
304	В4	н-бутил	этил	н	X	-
305	ВЗЬ	С1	н-пропил	н	СГ	т.пл. :125°С
306	В1	метил	С(=О)ОС2Н 5	н	0	т.пл.;136°С
307	В4	метил	н-пропил	н		т.пл. -.81°С
308	В4	метокси	н-пропил	Н	¢0	т.пл. :80°С
309	В4	I	н-пропил	Н	съ	т.пл. :120°С
310	вза	метил	этил	Н		;НС1(1:1); т.пл. :129°С
Ό
311	взь	С1	н	Н	съ	т.пл.:160°С
312	взь	С1	н	Н	ХУ НзСО4^	(транс); Т.ПЛ.:145°С
313	ВЗЬ	С1	н	Н		т.пл.:103°С
314	В4	н-пропил	н-пропил	н	сг	.НС1(1:1); т.пл.:150°С
315	В4	н-пропил	этил	н	¢0	.НС1(1:1)
316	В4	н-пропил	н	н	а	,НС1(1:1); т.пл.:140°С
317	ВЗЬ	С1	н	н	X	т.пл.:168°С
X/
318	В4	метил	н-пропил	н		НС1(1:1); т.пл. :200С
509	ВЗЬ	С1	этил	н	σ

- 41 009334

' № ссёд	' № Пр.» Ί	к2 .· ·;. <	..к3	•К4’.·=·'	^Ρ.:χχ;'··γ4 ..''..Χ	физические :данные
510	В4	метил	этил	н	σ	.Н2О(1:1)
513	В4	метил	этил	н	НзСО'^Д^	-
516	В4	С1	этил	н	ТС	т.пл. :120°С
517	В4	I	этил	н	СН2СН(СН3)2	-
518	В4	С1	этил	н	&	- '
519	В4	С1	этил	н	н3со'хАтс	(А+В)
521	В4	I	этил	Н	сг	-
522	В4	метил	этил	Н	длХУ н	(А)
1	В4	метил	этил	Н	НдССТ4'''''^	(А)
525	В4	С1	этил	н	ХУ НэСС/ТСТ
527	В4	Р	этил	н	сг	т.пл.: 116°С

Таблица 2

X

№	; №	К2 / ' Х/ ; '	х 'у- ‘ ι .	физические данные , .
соёд.	ϊιρ·1
5	ВЗЪ	С1	О	транс; т.пл. ]20°С
121	ВЗЬ	1-пиперидинил	О	цис; НС1(1:1)
122	ВЗЪ	1-пиперидинил	О	транс; НС1 (1:1); т-пл. 128°С

- 42 009334

№ соед	' N° пр. .	К2' У . . . ·. '	X	физические данные
123	взъ	4-тиоморфолинил	0	цис; т.пл. 105°С
124	взь	4-тиоморфолинил	0	транс; т.пл. 115°С
125	взь	4-морфолинил	О	транс; т.пл. 118° С
126	взь	4-тогрйо1ту1	О	цис;т.пл. 118°С
127	взь	-Ы(СН3)2	О	транс; т.пл. 96°С
128	взь	-Ч(СН3)2	О	цис; т.пл. 114°С
4	взь	С1	О	цис;т.пл. 123°С
8	ВЗс	ОСНз	О	транс; т.пл. 68°С
7	ВЗс	ОСНз	О	цис; т.пл. 116°С
6	В4	асе!у1	О	транс; т.пл. 108°С
129	В4	асе!у1 .	О	цис; т.пл. Ю6°С
11	В4	ΝΗ-(ΟΗ2)2-ΟΟΗ3	О	транс; т.пл. 107°С
10	В4	ЫН-(СН2)2-ОСН3	О	цис;т.пп. 115°С
12	В4	НН-(СН2)2-8СНз	О	цис;т.пл. 120°С
13	В4	ΝΗ-(ΌΗ2)2-8ΟΗ3	О	транс; т.пл. 125°С
14	В4	-С=С-81(СНз)3	О	цис; т.пл. 114°С
16	В4	-С=С-81(СН3)з	О	транс; т.пл. 108°С
15	В4	-С=СН	О	цйс;т.пл. 132-133°С
17	В4	-С=СН	О	транс; т.пл. 128°С
18	В4	-ос-сн2он	О	цис;т.пл. 113°С
130	В4	-С^С-СНгОН	О	транс; т.пл. 108°С
19	В4	Р	О	цис;т.пл. 92-99°С
20	В4	Р	О	транс; т.пл. 114°С
21	В4	I	о	цис; т.пл. 110°С
22	В4	ΟΝ	О	цис;т.пл. 137-138°С
26	В4	Н	О	транс
23	В4	-С(=О)-ОСН3	О	цис; т.пл. 91°С
24	В4	-С(=О)-ОСН3	О	транс; т.пл. 99°С
25	В4	Н	О	цис;т.пл. 88°С
27	В4	метил	О	цис; т.пл. 110-112°С
131	В4	метил	О	транс; т.пл. 25 °С
28	В4	этенил	О	цис;т.пл. Ю8°С
132	В4	этенил	О	транс; т.пл. 103°С
29	В4	фенил	О	транс; т.пл. 112°С

- 43 009334

№ соед	' № ηΡ·	К2 ' . /л '	X ·.'·	физические данные .
30	В4	2-тиенил	0	цис;142°С
133	В4	2-тиазолил	О	цис; 108°С
134	В4	2-фуранил	О	цис;т.пл. 105°С
51	В8а	ОСНз	Ν-ΟΗ	[1α(Α),4α]; т.пл. 133°С
52	В8а	ОСНз	Ν-ΟΗ	[1α(Β),4α|; т.пл.142°С
53	В8Ь	ОСНз	ννη2	[Ία(Ζ),4α];τ.ππ. 110°С
135	В4	νη2	0	цис; т.пл. 203°С
136	В4	νη2	0	транс; т.пл. 202°С
137	В4	-С(=0)-0СН(СН3)2	О	цис;т.пл. Ю5°С
138	В4	-С(=О)-ОСН(СН3)2	О	транс; т.пл. 88°С
38	В4	8СН3	О	цис;т.пл. 124°С
39	В4	8СН3	О	транс; т.пл. 116°С
32	В4	О	О	цис; т.пл. 130°С
1 ΟΩ кОУ		сихух	г\	1П1Л--Г1111 1ΟΛΟΠ цпи, ι.ιυι. юи и
188	В4	νη2	О	цис+транс
189	В4	-йуО^сн· о	0	цис; т.пл. 154°С
190	В4	“уО-00’ О	О	транс; т.пл. 156°С
191	В4	л— ΝΗ о	О	цис; т.пл. >260°С
192	В4	О	О	,Н2О (1:1); транс; т.пл. 248°С
193	В4	Аг 0 0	0	цис; т.пл. 224°С
194	В4	О о	О	транс; т.пл. 234°С

- 44 009334

' № соед	' № · Др·	К2.	X	физические данные
195	В4	-χχΝγ^οο2Η5 О	О	цис; т.пл. 108°С
196	В4	χΝγζ^οο2Η5 О	О	транс; т.пл. 127°С
197	В4	н	О	цис; т.пл. 150°С
198	В4	νθΥΟ	О	транс; т.пл. 90°С
199	В4		О	ЬС/М8 [М+Н]+; 475.4
200	В4	О	О	ЬС/М8[М+Н]+; 464.3
201	В4	ν °χ^ι	О	БС/М8 [М+Н]+; 523.3
202	В4		О	ЬС/М8 [М+Н]+; 465.3
203	В4	т^О-°сгн· Ο --	О	ЬС/М8 [М+Н]+; 475.4
204	В4	η λα -Νγ^ν ο	О	ЬС/М8[М+Н]+; 465.3
205	В4	Η О	О	-
319	В4	''Ο	О	(цис);этандиоат (1:1); т.пл. :160°С
320	В4		О	цис; т.пл. :150°С
321	В4	метокси	СНз	цис; .НС1(1:1);т.пл.:118°С
322	В4	н-бутил	О	Цис; .НС1(1:1);Т.пл.:158°С

- 45 009334

№ соёд	' № пр·	К.2 ' : ' 7 ' ;	|' Х . . '	физические данные ., ,
323	В4	д/У О	О	-
324	В4	/Νγ^Ο О	О	-
325	В4	Е-М	О	-
326	В4	χΝ'γχ^·οχΖΑχ0Η3 О	о	-
327	В4	'ГАИ	О	-
328	В4	н А А/ν: о	О	-
329	В4	Λθώ	О	-
330	В4	н /Νγ^Ν(ΟΗ3)2 О	О	-
331	В4	о \ ЛАЖ N Т< ΥΛ н ЕДД	О	-
332	В4		О	-
333	В4	4γΟΛ“ о	О
334	В4	дД О	О
335	В4	γΓ о	О

- 46 009334

№ соёд	' № ηρ·	• к2· . С	х%:	физические данные 4
336	В4	0	0	-
337	В4	о	0	-
338	В4	О	0	-
339	В4	О	О	-
340	В4	усО	О
341	В4	>м\/\/\/ах0СНз О осн3	О	-
342	В4	№ О	О	-
343	В4	ЯГ О	О	-
344	В4	О	О	-
345	В4	II О	О	-
346	В4		0	-
347	В4	О	О	-
348	В4	СН2ОС(=О)СН3	0	(цис); т.пл. :74°С
349	В4	О ’ум\^о^сн3 0	О	-

- 47 009334

№ соед.	№ Πρ·	В2 ·; \ ' .	X	физические данные
350	В4	X___ т о	О	-
351	В4	СНз О γΜ.Ό^, о	О	-
352	В4	н О Ύ г\	О	-
353	В4	СН3	О	(А);.НС1(1:2).Н2О(1:1); т.пл.:166°С
354	В4	Ъа СНз	О	(Цис);
355	В4	Н	О	-
356	В4	О	о	-
357	В4		О
358	В4		О	-
359	В4	О	О	-
360	В4	·Ύη	о	-
361	В4	/му^ОхМ(СНз)2 О	О	•
362	В4	ХЙТ^СН3 О	О	-
363	В4	Η Н χΝΥΝΎ 3 О СНз	О	-

- 48 009334

№ соёд	№ . Ρ·	К2 ; ‘ .	.х '	физические данные
364	В4	о н н 1) /ΝγΝ~Ι 0 ° СНз СН3	0
365	В4	Н Н /-> ри -ΝΥΝΤ^ о °	0	-
366 367 368 369 370 371 372	В4 В4 В4 В4 В4 В4 В4	Η Η ρμ 0 лгОЗ να ^Х(СН3)2 0 Н Н II .ж X ' γ νχ ν-Χ 0 СН3 НН 3 Ύύί	0 0 0 0 0 0 0	-
373	В4	8хн3 Χό	0
374	В4	0 0	0	-
375	В4	ΎΧ	0

- 49 009334

. № соед	' № пр- ,	К2 ·. А/ ' О · '	х<:	физические данные· ' 1
376	В4	° И) Н 0	О	-
377	В4	о II χ ,χίχ N11 3 Н О	О	-
378	В4	О II X ^3. /СН3 Хг их/ 0 14 II Н О	О	-
379	В4	О II н 0 *х^х^	О
380	В4	о сн3 и Т 3 нол-6 СН3	о
381	В4	О ^ηΙΥ4! ЧАу'СНз О	О
382	В4	О /ГП АА\СНз	О
383	В4	° ^-/дЭСНз	О	(цис); т.пл. :148°С
384	В4	0 А/\>сн3	О	(транс); т.пл.:141°С
385	В4	А—ф	О	т.пл. :130°С
386	В4	О	О	(цис); т.пл. :140°С
387	В4	'МО О	О	(транс); т.пл.:155°С

- 50 009334

Таблица 3

0
К-А	Рг	Л	хсн2-сн3
1		А	ч
		А

№ соед.	; № пр.		κδ' δ х к	физические данные . .
140	В4	О	А	т.пл.220°С
141	В4	О	οσ	т.пл.213°С
142	В4	О	4	т.пл. 148°С
143	В4	О	1-метилциклогексил	т.пл. 195-210°С
144	В4	О	3-метоксициклогексил	(цис); т.пл.156°С
145	В4	О	3-метоксициклогексил	’транс); т.пл.156-163°С
146	В4	О	4-(диметилэтил)циклогексил	т.пл. 230°С
147	В4	О	4-(ДИметилэтил)циклогексил	т.пл. 186°С
148	В4	О	4-метилциклогексил	(транс); т.пл. 214°С
36	В4	8	4-метоксициклогексил	(цис); т.пл.224°С
37	В4	8	4-метоксициклогексил	(транс); т.пл. 220°С
149	В4	О	АГ	т.пл. 188°С
40	В4	О	АГ	т.пл. 192°С
150	В4	О	АГ	(цис); т.пл.226°С
151	В4	О	АГ	(транс); т.пл.226°С
152	В4	О	σ	т.пл. 213°С
153	В4	О	см	т.пл. 200°С

- 51 009334

. № соед	' № пр.	Υ.	к.1’ ·' . ' · · . :	. физические. данные .
154	В4	О	сс 1	т.пл 210°С
155	В4	О	4,4-Диметилциклогексил	т.пл.242°С
388	В4	О	СН2СН(СНз)2	т.пл. 189°С
389	В4	О	ссх	т.пл.228иС
390	В4	О	ОД	т.пл. 197°С
391	В4	О	СГ'	т.пл.145°С
392	В4	О		т.пл.192°С
393	В4	О		у	(В); т.пл.:224°С
394	В4	О		у	(А); т.пл.:201°С
395	В4	О	ДУ	(А); т.пл..-207°С
396	В4	О	УТ	т.пл.:212°С
397	В4	О		(В); т.пл.:238°С
398	В4	О		т.пл.:234°С
399	В4	О		(цис); т.пл. :192°С

- 52 009334

Таблица 4

О Я⁴

№ соед	' № ,йр. ‘	. -,3,/. к ‘ . ί	ι£Χ··		'-к5 У	физические данные . '
156	В4	этил	н	И	ОСНз	транс; т.пл. 252°С
157	В4	Н	н	н	ОСНз	(цис+транс); т.пл. 244°С
158	В4	И	метил	н	ОСНз	цис; т.пл. >260°С
159	В4	метил	Н	н	ОСНз	цис; т.пл. 254°С
160	В4	ΐ метил	Н	н	ОСНз	транс; т.пл. >260°С
161	В4	пропил	Н	н	ОСНз	т.пл.208°С
162	В4	пропил	Н	н	ОСНз	транс; т.пл. 232°С
9	В4	этил	Н	н	ОСНз	цис;т.пл. 224-226°С
43	В5	этил	Н	СНз	ОСНз	транс; т.пл. 116° С
42	В5	этил	Н	СНз	ОСНз	цис;т.пл. 125°С
44	В6	этил	Н	СН2-СООС2Н5	ОСНз	цис; т.пл. 152°С
45	В4	этил	Н	0Н2-СООС2Н5	ОСНз	транс; т.пл. 147°С
46	В4	этил	Н	бензил	ОСНз	цис;т.пл. 137°С
47	Й4	этил	Н	бензил	ОСНз	транс; т.пл. 130°С
50	В7	метил	Н	Н	Н	т.пл.256.1°С
163	В4	этил	этил	Н	ОСНз	цис; т.пл. 221 °С
164	В4	этил	этил	Н	ОСНз	цис;т.пп. 221°С
165	В4	этил	этил	Н	ОСНз	транс; т.пл. 215°С
166	В4	этил	н	н Υ^ О	ОСНз	ЬС/МЗ [М+Н]+; 429.4
167	В4	этил	Н	ОАЭ О	ОСНз	ЬС/МЗ [М+Н]+; 451.3
168	В4	н	Н	4	ОСНз	цис; т.пл. Ю6°С
169	В4	этил	Н	о	ОСНз	ЬС/МЗ [М+Н]+; 409.3

- 53 009334

г № соёд	' № • Пр.	в3		В5 ::	в '	физические .· . данные .
400	В9	этил	Н	Ж О	ОСНз	-
401	В9	этил	н	V—9 о о	ОСНз	-
402	В9	этил	н	‘тхш	ОСНз	-
403	В9	этил	н		ОСНз	-
404	В9	этил	н	0 Ν'χΧ	ОСНз	-
405	В9	этил	н		ОСНз
406	В4	этил	н	ΫΌ	ОСНз
407	В4	этил	н		ОСНз	-
408	В4	этил	н	Ϋν	ОСНз	-
409	ВЗЬ	(СН2Ь о	н	Η	ОСНз	т.пл. :168°С
410	34	СН2ОСНз	н	Η	ОСНз	т.пл.:194°С
508	34	этил	н	уй^^ос2н5 ο	ОСНз
520	39	этил	Н	ТЯ	ОСНз	-

- 54 009334

Таблица 5

О К⁴

соёд·.	№ : пр. .		Ж	Ж у	физические данные .. - \
33	В4	н	метоксицикпогексил	сн	цис; т.пл. 224°С
34	В4	н	метоксицикпогексил	сн	транс; т.пл. 185°С
35	В4	н	метоксицикпогексил	N	цис;т.пл. 160-172°С
170	В4	н	метоксицикпогексил	N	транс; т.пл. 146°С
171	В4	н	Ж	N	(В); т.пл. 165°С
172	В4	н	метилциклогексил	N	цис+транс; т.пл.143°С
173	В4	этил	метоксицикпогексил	N	цис;т.пп. 126°С
411	В4	Н		N	т.пл.:109°С
412	В4	Н	οσ	N	Т.ПЛ. .’180°С
413	В4	Н		N	(А)
414	В4	Н		N	т.пл.:156°С

Таблица 6

- 55 009334

О

№ соед.	№ пр.		1 г .. ' . . Г . ; : : · . РбХяХ/АОх'7	физические . данные :
49	В7	н	ί О'	-
174	ВЗЪ	ОСНз		цис; т.пл.115°С
175	ВЗЬ	ОСНз	ГСО	транс; т.пл. Д41°С
176	ВЗЪ	ОСНз		цис;т.пл.149°С
177	ВЗЬ	ОСНз	ό6?	т.пл. 126°С
178	ВЗЬ	ОСНз		транс; т.пл. 160°С
179	ВЗЬ	ОСНз		цис; т.пл. 119°С
180	ВЗЬ	ОСНз	XXX	транс; т.пл. 124°С
181	взь	ОСНз	/ООО	транс; т.пл. 92°С
206	взь	ОСНз	χχο	цис;т.пл. 144°С

- 56 009334

, № соёд.	' № ,ηρ. .	ή.	, у.'·-л0?'	физические. , .· . . данные .;
207	ВЗЬ	ОСНз		ΓΎΎΊ	транс; т.пл. 125°С
				N N
				СНз
208	ВЗЬ	ОСНз		ΤΎΊ	цис;т.пп. 127°С
				СН3
209	ВЗЬ	ОСНз	ΌΟ?	цис;т.пп. 101°С
				τΊ
				и
210	ВЗЬ	ОСНз		ГГГ^	цис; т.пл. 104°С
			н3с
211	ВЗЬ	ОСНз		ΎΓΥ	транс; т.пл. 134°С
			н3с	МА
212	В4	ОСНз			цис; т.пл. 141 °С
			г	Αχ Α Ίτ Ν
				Ι|
213	В4	ОСНз		ΤΎΥ	транс; т.пл. 215°С
			Н3СХ	Η
214	В4	ОСНз		ΥΎΎ^	цис;т.пл. 139°С
			Н3С'
215	ВЗЬ	ОСНз	I	''ЧАЧА' γ\Ασι	транс
415	ВЗЬ	ОСНз	|Г		(цис); т.пл. ,136°С
416	ВЗЬ	ОСНз			(цис)

- 57 009334

№ соед	№ >р.	К. У?·	у + ; у . Ί ’ 'Г ’ ' - ! ...	физические , . данные ;· /-.,
417	В4	ОСНз	ό5..	(цис); т.пл. :149°С
418	ВЗЪ	ОСН3		(транс); т.пл.:132°С
419	В4	ОСНз	ΎΥΥ41*3 Η	(цис);т.пл. :217°С
420	ВЗЪ	ОСНз	ΌΟΟ	(цис); ,НС1(1:1); т.пл.:200°С
421	В4	ОН		(цис); т.пл. :215°С
422	В4	ОН	ΌΧι	(транс); т.пл.:178°С
423	ВЗЪ	ОСНз	УУУу СН3	т.пл. :160°С
424	ВЗЪ	ОСНз		(цис); т.пл.:106°С
425	ВЗЪ	ОСНз		(транс); т.пл.:120°С
426	ВЗЪ	ОСНз	ΌΟΟ	(цис); т.пл. :121°С
427	ВЗЪ	Н		т.пл. :156°С
428	ВЗЪ	ОСНз		(цис); т.пл.:156°С
429	ВЗЪ	ОСНз		(транс); т.пл. :197°С
№ соёд.	’ № пр.	к .	χ Ε ,-1., у. Λ'	физические 4 данные
430	ВЗЪ	СНз	УУууэ	(В)
431	ВЗЪ	СНз		(А)

- 58 009334 .А

Таблица 7

• № соед	№ .пр	ЧСуО:, х' о 'У'··	ь	физические; данные :
432	В16	СА		Т.ПЛ.:128°С
433	В4	УГ	7X0	т.пл.:175°С
434	В4	СХ	'ах	т.пл.:170°С
435	В4	σ	гос	т.пл.:103°С
436	В4	ССГ	7X0	т.пл.:151°С
437	В4	2	7X0	(транс); т.пл.:110°С
438	В4	с&	'000	т.пл.:150°С
439	В4	СО	ТОХ	т.пл.:150°С
440	В4	0 ОСН3	7X0	(ЦИС)
. № соед	' № пр.	в.1 о .: . У. 'У	Ь 0очСОоо:' '	физические. . данные
441	В4	СА	ΌΧ	т.пл. :166°С
442	В4	Ь1(СН3)2 0х	ΌΧ	т.пл. :173°С
443	В4	(X	ТХд 0 0	т.пл. :208°С
444	В4	СН2	ТХР	т.пл. :149°С
445	В4	σ	7X0	т.пл. :133°С
446	ВЗЬ	о	ХОо	т.пл. :150°С
447	ВЗЬ	σ	ТХс?	т.пл. :165°С
448	ВЗЬ	СА^	тхи	т.пл. :147°С
449	ВЗЬ		ΌΧ	т.пл. :154°С
450	ВЗЬ	са	тхх	т.пл. :157°С
451	В4	0х	ΌΧ	т.пл. :190°С
452	В4	о. а2	ΌΧ	Т.пл. :187°С
453	ВЗЬ	ОХ	ΌΧ	т.пл. :200°С
454	ВЗЬ	СА	тхэ	т.пл. :160°С

- 59 009334

№ соёд	№ . пр. · :	' К1: У '	Г С. .	физические :данные
455	взъ			т.пл. :139°С
456	взъ	сг		(А);т.пл.:174°С
457	взь	СГ	Ό»	(В);т.пл.:160°С
458	взъ	сг		т.пл.:184°С
459	В4	.Д»	о ХХХул°хС(СНз)з
460	В4	ХУ н3со о	Ό»	т.пл.:134°С
461	В4	сг		(В); т.пл.:156°С
462	В4	от		т.пл.:153°С
463	ВЗЬ	СГ	Ό»	т.пл.:161°С
464	В4	гпС		т.пл.:135°С
		и	сЛАг
465	В4		Ό»	т.пл.:131°С
466	ВЗЬ	осу	ΌΦΓ	нгю-п- · ' л т.пл.:206°С
467	В34	сг	Ό»Α“	т.пл.:142°С
468	В4	<Х		,гидрат(1:1); т.пл.:104°С
469	ВЗЪ	диметилэтил	ΓΓγΓ-—ϊ	т.пл.:104°С

- 60 009334

№ соёд	№ ,ϊιρ.	К1 <9 0,? /	У; У 7·.· ''У А/ '	физические данные
470	ВЗЬ	σ	XX»	т.пл.:161°С
472	ВЗЬ	СХ	XX»	т.пл.-‘144°С
473	В4	χη		т.пл.:143°С
474	В4	Хг	χχ»	т.пл.:19б°С
475	В4	хх	XI»	т.пл. :162°С
476	В4	СНз с9	XX»	т.пл.:171°С
477	В4	(У	XX»	т.пл.:155°С
478	В2	триметилметил	ХХХр	т.пл.:124°С
479	В4	..х»	хх»	(А); т.пл.:146°С
480	В4	ГХ Н3СО ^^	XX»	(В); т.пл.:162°С
481	В4	СНз О'	XX»	(А); т.пл.:129°С
482	В4	уЬ	XXX)	т.пл.:115°С
483	В2		О»	т.пл.:187°С
484	В2	XX		т.пл.:162°С
485	В4	СНз ..X»		(А); т.пл.:130°С

- 61 009334

№ соед	' № /·. Пр. ;	к? ' <	ь я/ ч ..	физические: ·.··, данные
486	В4	/0 НзСО'^^	ЗН3 -ТС	Ό	ТС \ /	''СТ	(А); т.пл.:124°С
487	В4	η Н3ССТС^	'Н3 -тс	Ό	»4ρ 'к	ХСГ	(В); т.пл.:Ш°С
488	В4	гк Нзссг^	О	'к	\у	т.пл.:85°С
489	В2	Н3СХ-5\ТС ТТ			ч^	т.пл.:150°С
490	В4	н3с		ТСг	ТС		(А); т.пл.:117°С
		Хэ НзСО^^-Я		кА	N	Ч^
491	В2	Ν X		ΎΤ	'ТСр		т.пл.:220°С
		г тс		кА	ν	хсг
492	В4	СН3 σ		Ό	'ТС-	Ч^	т.пл.:13б°С
493	В2	ν(οι^|^Γ^	Ό	\ /		т.пл.:13ГС
494	В4	СН3 σ		ХХО	(А); т.пл.:125°С
495	В4	&		я»	т.пл.:135°С
496	В4	я		Ό:	'Чр Ч1Г	\У	т.пл.:139°С
497	В4	ХГ	ХСО	т.пл.:127°С
498	В16	хг	хсо	т.пл.:195“С
499	В2	Р 1		ΎΎ	ТСу		т.пл.:201°С
		(ТС		кА	'К'

- 62 009334

. № соед	' № ’ пр.	к.1 <·.· '		физические ; ·· .· ·: данные
500	ВЗЬ		4,44ч Υ/ΟχΥ'Γ чч’Чч--1	т.пл.:143°С
501	ВЗЬ			т.пл.:137°С
502	В2	Υ		т.пл. :210°С
503	Β3ά	СХ	ΊΓΤΤ0Η3 ОСНз	т.пл.:134°С
504	В2	сг	3000	т.пл.:163°С
505	В4		ООО	т.пл.:142°С
506	В2	ПГ	ΥΥΥΊ НзС'^^'Ы^З'^	Т.пл.:139°С
507	В4	У	хоо	т.пл.:171°С
512	ВЗЬ	ОСТ	Ό3Ο	-
523	ВЗЬ	&		-

Таблица 8

• № соед.	№ пр. '	Структура , .	физические . ,, :данные ·. -
511	ВИ	А=^чм4\сн
1' № соед.	' № : пр. -	Структура о - :· .	физические данные .
514	В12	0—”Й* ЧУ
515	В13	МчА^Нз
524	В9а	юн р К ооПл	т.пл. ·Ϊ85ΟΓ
471	В15		(Е)
526	В14	Οιλ	.НС1(1:1)

- 63 009334

С. Получение меченных радиоактивными изотопами соединений С.1 Соединения, меченые [³Н]

Соединение 498 Соединение 528

К тщательно взвешенному количеству палладия на углероде (10%, 0,872 мг) добавляют раствор соединения 498 (Ι, 0,919 мг, 2,4 мкмоль) и триэтиламин (0,92 мкл, 6,6 мкмоль) в тетрагидрофуране, обезвоженном натрием (175 мкл). Реакционную колбу присоединяют к коллекторной системе для тритирования и реакционную смесь тщательно дегазируют. Газообразный тритий (19,5 Ки при давлении 1017 мбар) получают из тритида урана и дают возможность реакционой смеси перемешиваться при комнатной температуре. Спустя 30 мин реакционную смесь замораживают жидким азотом и улавливают избыток газообразного трития снова на губчатом уране. Растворитель удаляют из реакционной смеси путем лиофилизации. Вводят метанол (100 мкл) и лиофилизуют для удаления несвязанного трития. Описанную процедуру повторяют еще два раза. Остаток переносят в этанол, фильтруют через 13 мм фильтрующий шприц ОНР Лсгоб15к и промывают общим объемом этанола до 50,0 мл. Полученный продукт содержит [³Н]соединение 528 (ΙΙ) с радиоактивностью 71 мкюри при 67%-ой радиохимической чистоте. Из полученного количества берут фракцию (5,0 мл) и по частям тщательно очищают препаративной ВЭЖХ (Кромасил КК 100-10, размеры колонки 4,6 мм (вн. диаметр) х 300 мм). Спектрофотометрический анализ в УФобласти спектра выполняют при 265 нм. Изократическое элюирование проводят смесью воды-метанолаацетонитрила-диизопропиламина (47:26, 5:26, 5:0,2; об./об.) при скорости потока 2,0 мл/мин. Фракции, содержащие продукт, объединяют и концентрируют в вакууме при 30°С. Остаток растворяют в этаноле (5,0 мл) и вновь концентрируют. Указанную процедуру повторяют еще два раза. Оставшийся остаток в последний раз растворяют в этаноле (20,0 мл) и хранят сам по себе. Полученная партия продукта содержит [³Н] соединение 528 (ΙΙ) с общей радиоактивностью 3,83 мкюри при чистоте> 98% и удельной активности приблизительно 25 кюри/ммоль.

Э. Примеры фармакологического применения.

Ό1. Передача сигнала клонированных крысиных шО1и1-рецепторов в СНО-клетках.

СНО-клетки, экспрессирующие шО1и1-рецептор, высевали в черные 96-луночные планшеты с предварительно нанесенным покрытием. На следующий день с помощью флуоресцентного анализа оценивали влияние соединений настоящего изобретения на повышение внутриклеточного Са²⁺, активированное глутаматом. Клетки нагружали Р1ио-3 ЛМ, планшеты инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре в темноте, клетки промывали и добавляли в клетки на 20 мин соединения настоящего изобретения. После указанного инкубационного периода с помощью флуоресцентного спектрофотометра для считывания планшетов (РЫРК, Мо1еси1аг Эе\'1се5 Ыс) в каждой лунке регистрировали повышение Са²⁺, индуцируемое глутаматом, как функцию времени. Флуоресценцию регистрировали в относительных единицах, а графики получали по усредненным данным четырех лунок. Кривые зависимости ответа от концентрации строили на основе пиков флуоресценции (максимальный сигнал между 1 и 90 с) для каждой концентрации тестируемого соединения. 3начения ρΙΟ₅₀ представляют собой -1од значений концентрации тестируемых соединений, приводящих к 50%-ому ингибированию повышения внутриклеточного Са²⁺, индуцируемого глутаматом.

Соединения согласно настоящему изобретению показывают значение ρΚ.'₅₀, равное по меньшей мере 5. Соединения, включенные в табл. 1-8, показывают значение ρΚ.'₅₀, равное по меньшей мере 6. Специфическая группа соединений показывает значение ρΚ.'₅₀ между 7 и 8. Такие соединения перечислены в табл. 9.

- 64 009334

Таблица 9

№ соед	р1С50		№ соед.	р1С5о		№ соед	р1С50
463	7.98	281	7.63	89	7.25
441	7.95	487	7.63	108	7.25
334	7.95	299	7.63	373	7.25
22	7.94	431	7.61	255	7.23
421	7.94	98	7.57	527	7.23
15	7.93	464	7.57	303	7.22
440	7.93	446	7.56	296	7.22
139	7.93	251	7.55	221	7.21
178	7.92	484	7.54	193	7.21
338	7.91	494	7.53	14	7.20
87	7.90	128	7.52	131	7.19
462	7.90	344	7.52	438	7.19
394	7.90	161	7.49	148	7.18
423	7.89	298	7.48	496	7.18
21	7.87	454	7.45	236	7.17
220	7.87	456	7.45	332	7.17
479	7.86	277	7.44	481	7.16
483	7.86	91	7.43	191	7.16
485	7.84	356	7.42	457	7.14
9	7.84	229	7.41	20	7.14
110	7.84	333	7.41	145	7.13
248	7.84	326	7.41	268	7.13
341	7.83	369	7.40	512	7.13
163	7.81	430	7.39	474	7.13
433	7.79	435	7.38	10	7.11
238	7.79	35	7.36	307	7.11
224	7.78	228	7.36	426	7.11
437	7.78	429	7.36	466 .	7.10
498	7.78	117	7.35	97	7.08
449	7.77	291	7.35	83	7.08
242	7.76	313	7.35	434	7.08
№ соед.	р1С50		№ соед	р1С50		№ соед.	р1С50
346	7.74		280	7.34	300	7.08
182	7.73	460	7.34	199	7.07
486	7.73	482	7.34	290	7.06
447	7.72	343	7.33	112	7.05
7	7.72	425	7.32	348	7.05
175	7.71	473	7.32	286	7.03
475	7.71	287	7.31	442	7.03
480	7.71	448	7.31	422	7.02
213	7.70	243	7.29	283	7.02
239	7.70	323	7.28	318	7.02
241	7.67	159	7.28	36	7.00
461	7.65	289	7.27	396	7.00
115	7.64	184	7.26
445	7.63	436	7.26

Специфическая группа соединений показывает значение р1С₅₀, равное по меньшей мере 8. Такие соединения перечислены в табл. 10.

- 65 009334

Таблица 10

- 66 009334

- 67 009334

Ό2. Эксперименты ΐπ νΐΐΐΌ по изучению связывания с меченным изотопом [³Н] соединением согласно изобретению.

В качестве меченных изотопами [³Н] соединений применяли: соединение 528, далее обозначаемое

- 68 009334 как [³Н] соединение А, которое представляет собой меченное тритием соединение, эквивалентное соединению 432.

В следующих параграфах будет описано исследование, иллюстрирующее применение меченных радиоактивными изотопами соединений согласно изобретению.

Материалы

Все клеточные культуры получены от фирмы Ιηνίΐτο^βη (СайкЬай, υ8Α). Глутамат получен от компании Α1άτίοΗ Сйешюа1 Сотрапу (Мй^аикее, νΙ); [³Н]квисквалат (29 кюри/ммоль), [³Н]Ко 48-8587 (53 кюри/ммоль), мио- [³Н]-инозит (22 Ки/ммоль) и [³⁵8]СТРу 8 (1030 кюри/ммоль) получены от фирмы ΑтегкНат (РаШеу, Великобритания). [³Н]МК-801 (22,5 кюри/ммоль) и [³Н]ССР39653 (20-50 кюри/ммоль) получены от фирмы ΝΞΝ (Ζаνеηΐет, Бельгия). СОР получали от фирмы Воейппдег Мапйе1т (Базель, Швейцария), а глицин получен от фирмы ВюКай (ί.Ά. υ8Α). [³Н]Ь689560 (10-30 кюри/ммоль), [³Н]ЬУ341495 (34,61 Ки/ммоль), [³Н]МРЕР (50,2 кюри/ммоль), (8)-4С3НРС, (18,3К)-ΑСР^, (8)-3,5ОНРС, (8)-4СРС, ΑΙΌΑ, МСРС, МРЕР, СРССОЕ1, Б-8ОР и Ь-квискваловую кислоту приобретали у фирмы Тоспк Сооккоп (Еккех, Великобритания). ΒΑΥ 36-7620, ΝΓ8 2390 и фенциклидин синтезировали самостоятельно. Ε1иο-3-ЛМ и плюрониловую кислоту получали от фирмы Мо1еси1аг РгоЬек (Ье1йеп, Нидерланды). Пробенецид, стрихнин, Ό-серин и Тритон Х-100 приобретали у фирмы 818111:-1^^001 (81ешйе1т, Германия). Все другие реактивы получали от фирмы Мегск (ОагткТай!, Германия).

Трансфецирование и культивирование клеток

Ε929κΑ-κ№τκη, стабильно экспрессирующие человеческий тС1и1а-рецептор, получали так, как описано в публикации Баттсукеп и др., Мо1. Рйагтасо1. 61:1244-1254,2002, и культивировали в среде С1иТатах-Ι с добавлением 10%-ой термоинактивированной, диализированной плодной телячьей сыворотки, 0,1 мг/мл сульфата стрептомицина и 100 единиц/мл пенициллина. СНО-йЫг^--клеткн, стабильно экспрессирующие крысиный тС1и1а-,2-,3-,4-,5- и 6-рецептор, любезно предоставленные 8.№1капй1и (Токийский университет, Япония), выращивали в ЭМЕМ с СкЦатахй с добавлением 10%-ой термоинактивированной, диализированной плодной телячьей сыворотки, 0,4 мМ Ь-пролина, 0,2 мг/мл сульфата стрептомицина и 200 единиц/мл пенициллина. Клеткн хранили при 37°С в атмосфере с 5% СО₂.

Ответ внутриклеточного Са²⁺ в клетках, экспрессирующих крысиный и человеческий шС1и1арецепторы и в клетках, экспрессирующих крысиный шС1и5-рецептор

С помощью флуоресцентного спектрофотометра для считывания планшетов (РПРК, Мо1еси1аг Эеттсек, СΑ, υ8Α) измеряли уровни внутриклеточных ионов кальция ([Са²⁺]₁) в Ь92 98Α-клетках, экспрессирующих человеческий тС1и1а-рецептор, как описано в публикации Батгеукеп и др., Мо1.Рйагтасо1. 61: 1244-1254, 2002.

Такую же методику применяли для СНО-йЫг^--клеток, экспрессирующих крысиный тС1и 13рецептор. Для крысиного тС1и5-рецептора клеткн засевали при 30000 клеток/лунку за 2 дня до экспернмента.

ΙΡ -ответ в СНО-йЫг'-клетках, экспрессирующих крысиный шС1и1а-рецептор

Накопление № измеряли так, как описано в публикации Баттсу кеп и др., Мо1.РНагтасо1. 61:12441254,2002. Коротко, клеткн засевали при 30000 клеток/лунку в 24-луночные планшеты и в течение ночи вводили метку мио- [³Н] инозита (2,5 μ Кн/мл). В день эксперимента клеткн промывали и инкубировали в течение 10 мин с 10 мМ ЫС1. После 30-минутной инкубации с повышенными концентрациями [³Н] соединения А, добавляли 1н. НС1О₄ и устанавливали планшеты при 4°С. Перед применением ионообменной хроматографии добавляли раствор КОН/фосфата и раствор, содержащий 30 мМ №₂В₄О₇-10Н₂О и 3 мМ ЕЭ^.

Получение мембран СНО-йЬГ'-клеток, экспрессирующих крысиный шС1и1а-, 2-, 3-, 4-, 5- и 6рецептор

Конфлюэнтные клеткн промывали охлажденным до 0°С забуференным фосфатом физиологическим раствором и до получения мембран хранили при -20°С. После размораживания клетки суспендировали в 50 мМ растворе Трис-НС1 (рН 7,4) и собирали центрифугированием при 4°С и 23500д в течение 10 мин. Клеткн лизировали в 10 мМ гипотоническом растворе Трис-НС1, рН 7,4. После повторного центрифугирования в течение 10 минут при 4°С и 30000д осадок, полученный после центрифугирования, гомогенизировали на гомогенизаторе иНга Тиггах в 50 мМ Трис-НС1, рН 7,4. Концентрацию белков измеряли с помощью белкового Вю-Кай-анализа с применением в качестве стандарта бычьего сывороточного альбумина.

Связывание [³⁵8]СТРу8 с мембранами СНО-йЫТ' клеток, экспрессирующих крысиные шС1и2-, 3-,

4- и 6-рецепторы

Мембраны размораживали на льду и разбавляли раствором 10 мМ НЕРЕ8-кнслоты, 10 мМ соли НЕРЕ8-кнслоты (рН 7,4), содержащим 100 мМ №С1, 3 мМ МдС1₂, 3 мкМ СОР и 10 мкг/мл сапонина. Тестируемые смеси содержали 10 мкг мембранного белка и предварительно инкубировались в течение 5 мин при 37°С с соединениями или буфером. Затем добавляли глутамат и еще раз инкубировали тестируемые смеси в течение 30 мин при 37°С. В течение следующих 30 мин при 37°С добавляли [³⁵8]СТРу8 до конечной концентрации 0,1 нМ. Реакции прерывали путем ускоренного фильтрования через фильтро

- 69 009334 вальные планшеты ип1П1(сг-9 6 СЕ/В (Раскагб, Мепбеп, СТ) с помощью 96-луночного фильтровального (ТШсгтаЮ) харвестера фирмы Раскагб. Фильтры: промывали 2 раза охлажденным до 0°С фосфатным буфером (10 мМ NаН₂РО₄/10 мМ №ьНРО₄. рН 7,4). Радиоактивность на фильтре определяли на микропланшетах М1сгор1а1е 8сш1Ша1юп и люминесцентном счетчике Ьиттехепсе Соип1ег фирмы Раскагб.

Связывание меченного радиоактивным изотопом лиганда с крысиным шС1и1а-рецептором СНО-йЫТ'мембран

Связывание [³Н] соединения А. После размораживания мембраны гомогенизировали, применяя гомогенизатор И11га Тиггах, и суспендировали в охлажденном до 0°С буфере для связывания, содержащем, если не указано иначе, 50 мМ Трис-НС1 (рН 7,4), 1,2 мМ МдС1₂, 2 мМ СаС1₂. Эксперименты по изучению насыщения лигандами проводили при кажущемся равновесии связывания (инкубация 30 минут) с 20 мкг мембранного белка при 10 концентрациях (0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 1,2, 2,5, 5 и 10 нМ) меченного радиоактивным изотопом лиганда. Неспецифическое связывание оценивали в присутствии 1 мкМ соединения 135. Инкубацию останавливали путем ускоренного фильтрования с отсосом через фильтры из стекловолокна СЕ/С с помощью ручного 40-луночного фильтрационного коллектора. Для измерения кинетики ассоциации мембраны инкубировали при 4°С, 25°С или 37°С в присутствии 2,5 нМ [³Н] соединения А в течение 2, 5, 10, 15, 20, 30, 45, 60, 90 или 120 мин, затем прерывали инкубацию путем ускоренного фильтрования с применением ручного 40-луночного фильтрационного блока. Кинетику диссоциации измеряли путем добавления перед фильтрованием к мембранам, предварительно инкубированным в течение 30 мин при 4 или 25°С в присутствии 2,5 нМ [³Н] соединения А, 1 мкМ соединения 135 через разные интервалы времени. Фильтры переносили во флаконы для подсчета радиоактивности и после добавления иШта-Со1б МV с помощью сцинтилляционного счетчика фирмы Раскагб определяли собранную на фильтрах радиоактивность. В экспериментах по изучению ингибирования тестируемые смеси инкубировали в течение 30 мин при 4°С в 0,5 мл объеме, содержащем 10-20 мкг мембранного белка, соответствующие концентрации тестируемых соединений и 2,5 нМ [³Н] соединения А. Неспецифическое связывание определяли, как описано выше. Фильтрование проводили с помощью фильтровальных планшетов ишШ1ег-96 СЕ/С и 96-луночного фильтровального харвестера фирмы Раскагб. Радиоактивность на фильтрах определяли на микропланшетах Мюгор1а1е 8стй11а1юп и люминесцентном счетчике Ьцт1пехепсе СошИег фирмы Раскагб после добавления микроскинт-О (ткгохсшЕО).

Связывание [³Н] квисквалата. Размороженные мембраны гомогенизировали и суспедировали в охлажденном до 0°С буфере для связывания. В экспериментах по изучению насыщения 30 мкг мембранного белка инкубировали в течение 1 ч при 25°С с 10 различными концентрациями (1, 2, 5, 10, 20, 40, 60, 90, 120 и 150 нМ) [³Н] квисквалата. Неспецифическое связывание определяли в присутствии 1 мМ Ьглутамата. Связанный и свободный меченые лиганды разделяли путем ускоренного фильтрования на фильтрах из стекловолокна СЕ/С с применением ручного 40-луночного фильтрационного коллектора. В экспериментах по ингибированию 30 мкг мембранного белка инкубировали в течение 1 ч при 25°С в объеме 0,5 мл, содержащем соответствующие концентрации тестируемых соединений и конечную концентрацию [³Н] квисквалата, равную 10 нМ. Фильтрование проводили с применением фильтровальных планшетов ипгй11ег-96 СЕ/С и фильтровального харвестера фирмы Раскагб. Радиоактивность, улавливаемую на фильтрах, определяли, как описано выше.

Связывание меченого лиганда с мембранами СНО-йЫг'-клеток, экспрессирующих крысиные шС1и2, 3-, 4-, 5- и 6-рецепторы

После размораживания мембраны гомогенизировали, применяя гомогенизатор Ш1га Тиггах, и суспендировали в охлажденном до 0°С буфере для связывания, содержащем 50 мМ Трис-НС1 (рН 7,4), 1,2 мМ МдС1₂, 2 мМ СаС1₂. Для связывания [³Н] соединения А применяли от 20 до 160 мкг мембранного белка и конечную концентрацию [³Н] соединения А, равную 20 нМ. Как указано в разделе «результаты», для определения неспецифического связывания применяли различные контрольные опыты. Время и температура инкубации, так же как фильтрование, были такими же, как описанные выше для крысиного тС1и1а-рецептора СНО-бЫг-мембран. Экспрессию крысиных тС1и2, 3-, 5- и тС1и6-рецепторов подтверждали с помощью специфического [³Н]ЬУ341495-связывания (тС1и2-, 3- и 6-) или [³Н] МРЕРсвязывания (тС1и5). Для [³Н]ЬУ341495-связывания применяли 1 нМ (тС1и2 и тС1и3) или 10 нМ (тС1и6) [³Н]ЬУ3414 95. Неспецифическое связывание определяли с помощью 1 мМ глутамата. Тестируемые смеси инкубировали в течение 30 мин (тС1и2 и тС1и3) или 60 минут (тС1и6) при 4°С. Инкубацию останавливали фильтрованием на фильтрах из стекловолокна СЕ/В ^йа1тап, Англия), применяя ручной 40-луночный фильтрационный коллектор. Для обнаружения неспецифического связывания крысиных тС1и5-рецепторов СНО-бЫг-мембран применяли 10 нМ [³Н]МРЕР и 10 мкМ МРЕР. Инкубацию проводили при 4°С в течение 30 мин. Связаный и свободный меченые лиганды разделяли на фильтрах из стекловолокна СЕ/С ^йа1тап, Англия) с применением 40-луночного фильтрационного блока.

Связывание [³Н] соединения А с мембранами мозга крысы

Получение тканей. Самца крысы Уистера(~200 г) забивали путем декапитации. Мозг быстро удаляли и незамедлительно иссекали кору головного мозга, гиппокамп, стриатум и мозжечок. Свежую ткань гомогенизировали на гомогенизаторе ИИга Тиггах в 20 объемах 50 мМ Тпх-НС1 (рН 7,4) и центрифугиро

- 70 009334 вали ткань при 23500 д в течение 10 мин. После гомогенизации с применением гомогенизатора ПИЛЬ мембраны дважды промывали путем центрифугирования при 23500 д в течение 10 мин. Осадок, полученный после центрифугирования, суспедировали в 10 объемах 50 мМ Тпз-НС1 (рН 7,4) и замораживали при -80°С.

Анализ связывания ίη νίίτο. После размораживания мембраны, полученные из коры головного мозга, мозжечка, стриатума и гиппокампа крысы, повторно гомогенизировали с применением гомогенизатора 1ЖА1. и суспендировали в охлажденном до 0°С буфере для связывания, содержащем 50 мМ Тпз-НС1, 1,2 мМ МдС1₂, 2 мМ СаС1₂ (рН 7,4). Анализ связывания проводили в общем объеме 0,5 мл, содержащем 2,5 нМ [³Н] соединения А и аликвоту мембран, соответствующую 40 мкг мембран мозжечка, 60 мкг мембран гиппокампа, 80 мкг мембран стриатума или 150 мкг мембран коры головного мозга. Специфическое связывание рассчитывали как разницу между общим связыванием и связыванием, измеренным в присутствии 1 мкМ соединения 135. После инкубации в течение 30 мин при 4°С меченые мембраны промывали и собирали путем ускоренного вакуумного фильтрования на фильтрах из стекловолокна ОЕ/С фирмы \νΐι;·ιΙιη;·ιη с применением 40-луночного фильтрационного коллектора и определяли собранную на фильтрах радиоактивность, как описано выше.

Связывание [³Н]Ко 48-8587, [³Н]Ь689560, [³Н]СОР39653 и [³Н]МК-801 с мембранами мозга крысы. Получение тканей. Самца крысы Вистара (~200 г) забивали путем декапитации. Мозг быстро удаляли и иссекали передний мозг. Ткань гомогенизировали на гомогенизаторе и11га Тиггах в 20 объемах охлажденной до 0°С Н2О и центрифугировали при 48000 д в течение 20 мин. После гомогенизации с применением гомогенизатора ΌϋΑΕ мембраны промывали центрифугированием при 48000 д в течение 10 мин. Затем осадок, полученный после центрифугирования, суспедировали в 20 объемах 50 мМ Ттк-НС1 (рН 7,4), содержащем 0,04% Тритон Х-100, и снова центрифугировали при 48000 д в течение 2 0 мин. Конечный осадок, полученный после центрифугирования, замораживали при -80°С.

Анализ связывания Ιη νίίτο. В день проведения эксперимента осадок, полученный после центрифугирования, размораживали, промывали и повторно гомогенизировали с применением гомогенизатора ΌϋΑΕ в охлажденном до 0° С 50 мМ Трисацетате (рН 7,4). Условия проведения анализа для различных меченых лигандов были следующие. Конечная концентрация мембран при проведении анализа составляла 20 мг/мл (сырая масса) для [³Н]Ко 48-8587 и [³Н]Ь689560 и 10 мг/мл (сырая масса) для [³Н]СОР39653 и [³Н]МК-801. Применяли следующие концентрации меченых лигандов: 2 нМ [³Н]Ко 48-8587, 2 нМ [³Н]Ь689560, 2 нМ [³Н]СОР39653 и 3 нМ [³Н]МК-801. Инкубацию проводили в присутствии 1 мМ К8СИ при связывании [³Н]Ко 48-8587, 100 мкМ стрихнина, при связывании [³Н]Ь689560 и 1 мкМ глицина + 1 мкМ глутамата при связывании [³Н]МК-801. [³Н]Ко 48-8587 и [³Н]СОР39653 неспецифическое связывание определяли в присутствии 1 мМ глутамата. При связывании [³Н]Ь689560 и [³Н]МК-801 для определения неспецифического связывания применяли соответственно 100 мкМ Ό-серина или 10 мкМ фенциклидина. Пробы инкубировали в течение 1 ч при 37°С, 2 ч при 4°С, 30 мин при 25°С и 1 ч при 4°С соответственно при связывании [³Н]Ко 48-8587, [³Н]Ь689560, [³Н]СОР39653 и [³Н]МК-801. После инкубации связанный и свободный меченые лиганды разделяли с помощью 40-луночного фильтрационного коллектора. Собранную на фильтрах радиоактивность определяли, как описано выше.

Связывание [³Н] соединения А и авторадиография срезов мозга крысы.

Получение тканей. Самца крысы Вистара (200 г) забивали путем декапитации. Мозг незамедлительно удаляли из черепа и быстро замораживали в 2-метилбутане при охлаждении сухим льдом (-40°С). Далее до получения срезов мозг хранили при -70°С. С помощью криостатного микротома Ье1са С3050(Ье1са Микросистемы, Vеίζ1а^, Германия) готовили двадцатимикронные сагиттальные срезы и в размороженном состоянии устанавливали их на предметные стекла микроскопа 8ирегЕгой Р1из (Менх1ед1азег, Германия). Далее до применения срезы хранили при -70°С.

Авторадиография рецепторов. Срезы размораживали и сушили в токе холодного воздуха, предварительно инкубировали (3 х 5 минут) в 50 мМ ТИ8-НС1, 1,2 мМ МдС1₂, 2 мМ СаС1₂, 0,1% В8А (рН 7,4) при комнатной температуре. Затем срезы инкубировали в течение 60 минут при комнатной температуре в буфере, содержащем 50 мМ ТИ8-НС1, 1,2 мМ МдС1₂, 2 мМ СаС1₂, 0,1% В8А (рН 7,4) и 1,5 нМ [³Н] соединения А. Неспецифическое связывание определяли путем добавления в инкубационный буфер 1 мкМ соединения 135. После инкубации избыток меченого лиганда вымывали (3 х 5 мин) охлажденным до 0°С буфером, содержащим 50 мМ ТИ8-НС1, 1,2 мМ МдС1₂ и 2 мМ СаС1₂, с последующим быстрым погружением в холодную дистиллированную воду. Срезы сушили в токе холодного воздуха и затем в течение 6 недель при комнатной температуре экспонировали с пленкой [³Н]Нуретй1т (Атегзйат, Великобритания). Пленки проявляли вручную на Кобак Ό1 9 и фиксировали с помощью Кобак Кеабутабс. Некоторые срезы в течение 2 дней при комнатной температуре экспонировали с пластиной Еир Ипадтд Р1а1е и сканировали с помощью Еицх Вазе 2000 рйозрйотадег.

Анализ и статистика данных

Анализ данных проводили с помощью программы ОгарйРаб Рпзт (ОгарйРаб Рпзт 8ой^ате, Шс, 8ап Э1едо, СА). Эксперименты по изучению насыщения связывания анализировали, применяя нелинейный регрессионный анализ. Кривые ингибирования наносили на график по точкам с применением нели

- 71 009334 нейного регрессионного анализа в соответствии с уравнением конкурентного связывания по одному сайту: Υ= нижнее значение + ((верхнее значение - нижнее значение) /1 + 10^х-|'^од|С5°). 3начения К₁ рассчитывали с помощью уравнения Ченга-Прусова (С^епё-Гти^ой} : К₁=1С₅₀/[1 + ( [С]/К_с) ] , где С представляет собой концентрацию меченого лиганда, а К_с представляет собой константу диссоциации меченого лиганда (Сйепд и ГгикоГГ, Β^οсйет.Ρйа^тасο1. 22, 3099-3108, 1973) . Наблюдаемые скорости (к_оЬ) и (к_о££) рассчитывали из кривых ассоциации-диссоциации с помощью программы Ριϊδίη с применением уравнений однофазной экспоненциальной ассоциации и разложения соответственно. Константы к_оп рассчитывали путем вычитания к_о££ из к_оь и деления на концентрацию меченого лиганда. Для статистической оценки данных экспериментов по изучению связывания применяли двухсторонний ΐ-критерий Стьюдента: *р < 0,05, **р < 0,01 и ***р < 0,001. Для анализа данных экспериментов по определению ΙΡ применяли ΐкритерий Даннетта с последующим 2-х факторным дисперсионным анализом (с учетом в качестве показателя концентрации соединения и эксперимента).

Результаты

Селективность и вид антагонизма соединения А по отношению к шС1и1-рецептору. В СН0-б11£г^-клетках, экспрессирующих крысиный шС1и1а-рецептор, соединение А ингибирует увеличение [Са⁺]1, индуцируемое глутаматом, со значением 1С50 21,6 + 5,0 нМ (п=4; фиг. 1А), и как видно, является приблизительно в 8 раз более сильным, чем недавно описанный специфический антагонист шС1и1-рецептора ΒАΥ 36-7620 (1С50 = 161 + 38 нМ, п=3), и в 500 раз более сильным, чем СΡССΟЕΐ(IС50 = 10,3+0,8 мкМ, п=3), протестированный в таком же анализе. Для С1и1а-рецептора человека соединение А имеет значение 1С50 10,4 + 4,7 нМ (п=3). При тестировании вплоть до концентрации 10 мкМ соединение А не ингибирует передачу сигналов Са²⁺, индуцируемую глутаматом, крысиного шС1и5-рецептора, экспрессируемого в СН0-бЫг^--клетках. В рекомбинантных крысиных шС1и2-, 3-, 4- или 6-рецепторах значения 1С50 для ингибирования [³⁵8] ΟΤΡγ 8-активации (30 мкМ), индуцируемой глутаматом, выше 30 мкМ. При проведении анализов с [³⁵8]ΟΤΡγ 8 соединение А вплоть до концентрации 30 мкМ не проявляло агонистической активности по отношению к любому из шС1ц-рецепторов. Кроме того, исследовали, может ли соединение А действовать как положительный аллостерический модулятор на один из указанных типов шС1ирецептора. Для этого строили кривые зависимости ответа от концентрации глутамата путем добавления только одного глутамата или вместе с 10 мкМ соединения А. Анализы, проведенные с [³⁵8]ΟΤΡγ8 на рекомбинантных крысиных шС1и2, 3-, 4- или 6-рецепторах, показали, что после добавления соединения А ЕС₅₀ глутамата не изменялось и что значение Е_маКс глутамата не повышалось. Когда вместе с глутаматом добавляли соединение А (данные не приводятся) , значение ЕС₅₀ и Е_маКс мобилизации внутриклеточного Са²⁺, индуцированной глутаматом, в клетках, экспрессирующих крысиный шС1и5-рецептор, также не изменялись. Вместе указанные данные исключают агонистическую, антагонистическую активность или положительное аллостерическое воздействие на шС1и2-, 3-, 4-, 5- и 6-рецепторы. Исследование радиолигандного связывания на переднем мозге крысы с применением [³Н]Во-488587, [³Н]Ь689560, [³Н]ССΡ39653 и [³Н]МК-801 показало, что соединение А не связывается с АМРА-рецептором, но также не связывается с глициновым, глутаматным рецептором или с участком ΝΜΩΛ-рецептора. образующим мембранный канал (испытано вплоть до концентрации 10 мкМ) соответственно. Для изучения того, как соединение А ингибирует глутаматную активацию шС1и1а-рецэптора, сравнивали мобилизацию Са²⁺ в ответ на глутамат при отсутствии и в присутствии соединения А (фиг. 1В). Присутствие соединения А не только вызывает сдвиг вправо кривой зависимости ответа от концентрации глутамата, но также приводит к резкому уменьшению максимального ответа, вызываемого агонистом, показывая, что антагонизм соединения А является неконкурентным. Полное ингибирование передачи сигналов, опосредуемой шС1и1а-рецептором, наблюдалось в присутствии 100 нМ - 1 мкМ соединения А. Для исследования, может ли соединение А действовать как обратный агонист, измеряли накопление базального ΙΡ в СН0-бЫг -клетках, содержащих крысиный шС1и1а-рецептор, в присутствии соединения А. На фиг. 1С показано, что с увеличением концентрации соединения А происходит явное уменьшение продукции базального ΙΡ. Такое уменьшение статистически значимо (р <0,05), поскольку при удалении 1 мкМ соединения А накопление базального ΙΡ снижается на 24+4%. Максимальное уменьшение 33+3% обнаружено при применении 100 мкМ соединения А. Полученные данные указывают, что соединение А по отношению к шС1и1арецептору действительно действует как обратный агонист.

Описание характера связывания [³Н] соединения А с крысиным шС1и1а-рецептором СН0-бЫг^-мембран. Специфическое связывание 2,5 нМ [³Н] соединения А при 4°С с крысиным шС1и1а-рецептором СН0-б11£г^-- мембран пропорционально количеству мембранного белка и линейно увеличивается между 10 и 50 мкг мембраного белка в расчете на один анализ (фиг. 2). Неспецифическое связывание определяли с помощью 1 мкМ соединения 135 в качестве ингибитора. Соединение 135 идентифицируют как специфический антагонист шС1и1-рецептора с потенциалом реверсиии мобилизации [Са²⁺]₁, индуцируемой глутаматом, 7,2±1,2 нМ (п=3). При применении 20 мкг белка в расчете на один анализ специфическое связывание [³Н] соединения А составляло 92% от общего связывания; при типичных условиях проведения анализа общее и неспецифическое связывание находятся соответственно в диапазоне 3800 и 300 ΌΡΜ.

Добавление 1,2 мМ МдС1₂ и 2 мМ СаС1₂ вызывает небольшое увеличение специфического связыва

- 72 009334 ния (данные не приводятся).

Кроме того, добавление \аС1 (10-100-300 мМ) не давало никакого эффекта. Несмотря на то, что при рН 6 специфическое связывание уменьшается на 22%, увеличение рН вплоть до 10 не давало никакого эффекта (данные не приводятся).

Кинетику ассоциации измеряли, как описано в разделах «Материалы» и «Методы».

Уменьшение температуры инкубации до 4° С резко усиливало специфическое связывание, тогда как при 37°С обнаруживали низкое связывание (фиг. 3). Ассоциация [³Н] соединения А с мембранами была чрезвычайно быстрой. При 4°С уже двухминутная инкубация приводила к специфическому связыванию, соответствующему приблизительно 70% от количества, связанного при равновесии. Максимальное связывание достигалось в пределах 5 мин инкубации для каждой температуры инкубации. Полученные в результате анализа кривых ассоциации константы скорости ассоциации (коЬ) равны 0,6285, 2,571 и 1,523 мин^-1 соответственно при 4, 25 и 37°С. Кинетика диссоциации также была быстрой (фиг. 4). При 25°С меченный радиоактивным изотопом лиганд диссоциировал в пределах до 2 мин после добавления в реакционные пробирки 1 мкМ соединения 135. Быстрая кинетика диссоциации при 25°С не позволила рассчитать точную константу скорости диссоциации (ко1). При температуре инкубации 4°С диссоциация происходила более медленно. После добавления избытка соединения 135 [³Н] соединение А полностью вытеснялось в течение приблизительно 45 мин. Полученная в результате анализа кривой диссоциации при 4°С константа ко11 равна 0,124 9 мин^-1. к_оп (к_оЬ - к_о11/концентрация меченного изотопом лиганда) при 4°С равна 0,1007 нМ^-1 мин^-1.

Эксперименты по изучению насыщения лигандом проводили при кажущемся равновесии связывания (инкубация 30 мин) и с 10 концентрациями меченного радиоактивным изотопом лиганда. На фиг. 5 приведена кривая насыщения и график Скэтчарда, отражающий связывание [³Н] соединения А с крысиным тО1и1а-рецептором СНО-бй£г^--мембран. Графики Скэтчарда линейны, что указывает на присутствие одного насыщаемого связывающего сайта с высокой степенью сродства. С помощью нелинейнорегрессионного анализа равносторонней гиперболы установили значение В_тах 6512 ± 1501 фмоль/мг (фемтомоль/мг) белка и К_о 0,90 + 0,14 нМ (п=3).

Серии агонистов и антагонистов тО1и1-рецептора тестировали на ингибирование связывания [³Н] соединения А с крысиным тО1и1а-рецептором СНО-бМг^--мембран. Кривые ингибирования для некоторых антагонистов приведены на фиг. 6, а значения К; для всех протестированных соединений перечислены табл. 11.

Таблица 11. Потенциальные возможности различных агонистов и антагонистов тО1и1-рецептора при ингибирозании связывания [³Н] соединения А с крысиным тО1и1а-рецептором СНО-бЫт-мембран. 3начения К; и коэффициентов Хилла представляют собой усредненные значения ±8Ώ, полученные в 3-4х независимых экспериментах.________________________ ______

Соединение	Кд. (нМ)	коэффициент Хилла
Соединение А	1,35±0,99	0,94±0,04
ΝΡ3 2390	1,36±0,50	0,97±0,02
ΒΑΥ 36-7620	11,2±0,93	0,95+0,02
СРССОЕС	4,9001170	0,93±0,03
глутамат	> 1000000
квисквалат	> 1000000
13,ЗВ-АСРО	> 1000000
(3)-3,5-ϋΗΡΟ	> 1000000
ЬУ367385	> 1000000
(3)-4СЗНРС	> 1000000
ΑΙΟΑ	> 1000000
(3)-4СРС	> 1000000
МСРС	> 1000000

Примечательно, что все лиганды, которые связываются с глутаматсвязывающим сайтом, то есть глутамат, квисквалат, 18,3К-ΑСР^, (8)-3,5-ЭНРО, δΥ-367385, (8)-4С3НРО, (8)-4СРО, МСРО и ΑΙΏΑ не ингибировали связывание [³Н] соединения А. Напротив, неконкурентные антагонисты тО1и1-рецептора СРССОЕ!, ΒΑΥ 36-7 620, N1’8 2390 и соединение А ингибировали связывание [³Н] соединения А с крысиным тО1и1а-рецептором СНО-бй£г^--мембран с потенциальными возможностями (активностями), в общем случае согласующимися с их потенциальными возможностями по ингибированию функции тО1и1арецептора. Соединение А и \Р8 2390 проявляли самое высокое сродство, соответственно с К; 1,35 ± 0,99 и 1,36 ± 0,50 нМ. ΒΑΥ 36-7 620 ингибировал связывание также при наномолярных концентрациях, тогда как СРССОЕ! вытеснял ( [³Н] соединение А) при микромолярных концентрациях.

- 73 009334

Авторы также исследовали специфичность [³Н] соединения А при связывании с шО1и1 -рецептором в сравнении с шО1и2-, 3-, 4-, 5- и 6-рецепторами. Когда применяли мембраны, полученные из СН0-с111Гг^-клеток, экспрессирующих С1и2, шО1и3 или тС1и6-рецептор, с помощью [³Н]ЬУ341495 обнаружили соответственно 95, 98 и 40%-ое специфическое связывание. [³Н]МРЕР, применяемый в качестве позитивного контроля для тС1и5-рецептора, продуцировал 95%-ое специфическое связывание с мембранами, содержащими крысиный тС1и5-рецептор. Общее связывание 20 нМ [³Н] соединения А с мембранами, полученными из СН0-бЫг^--клеток, экспрессирующих крысиный тС1и2-, 3-, 4-, 5- или 6-рецептор, было не выше, чем связывание с мембранами СН0-бЫг^--клеток дикого типа, но и не выше, чем неспецифическое связывание с крысиным тС1и1а-рецептором на СН0-бМг^--мембранах. Кроме того, исследовали специфическое связывание [³Н] соединения А с указанными мембранами, применяя различные контрольные соединения: 1 мкМ соединения 135, которое, как ожидается, связывается с тем же сайтом, что соединение А, глутамат и Ь-80Р, которые связываются с глутаматсвязывающим «карманом», и МРЕР, который связывается с аллостерическим сайтом на тС1и5-рецепторе (см. таблицу 12). Ни одно из указанных контрольных соединений не вытесняет [³Н] соединение А. В совокупности полученные данные говорят о специфичности [³Н] соединения А по отношению к тС1и1-рецептору по сравнению с подтипами тС1и2, 3-, 4-, 5- и 6-рецептора.

Таблица 12: [³Н] соединение А является специфическим по отношению к тС1и1-рецептору по сравнению с тС1и2-, 3-, 4-, 5-или 6-рецептором. Специфическое связывание 20 нМ [³Н] соединения А с 40 мкг мембран (СН0-бМг^-)-клеток дикого типа или СН0-бМт^--клеток, экспрессирующих крысиный тС1и2-, 3-, 4-, 5- или 6-рецептор, сравнивали со связыванием 10 нМ [³Н] соединения А с 20 мкг СН0бЫг^--мембран, содержащих крысиный тС1и1а-рецептор. Для определения неспецифического связывания применяли различные соединения. Данные по специфическому связыванию (8В) с крысиным тС1и1арецептором СН0-бйГг^--мембран представляют собой усредненное значение ±8Ώ 3-х экспериментов, проводимых дважды.

Другие данные по 8В представляют усредненное значение двух определений из одного эксперимента (ΝΏ означает «не определяли»).

ЗВ (фмоль/мг белка)	шС1и1	дикий тип	тС1и2	тС1иЗ	тС1и4	тС1и5	тС1и6
Соединение 135 в качестве контрольного	6057 ± 1456	65 N0	0 34а	0 0а	82 57ь	О ОО ° со	0 0а
Различные контрольные соединения	Νϋ

^a) для определения неспецифического связывания применяли 1 мМ глутамата;

^b) для определения неспецифического связывания применяли 0,1 мМ Ь-80Р;

^c) для определения неспецифического связывания применяли 10 мкМ МРЕР.

Сравнение со связыванием [³Н] квисквалата. Эксперименты по изучению насыщения связывания проводили с применением 30 мкг белка на инкубат и 10 концентраций (1, 2, 5, 10, 20, 40, 60, 90, 120 и 150 нМ) [³Н]квисквалата, агониста С1и1-рецептора (фиг. 7). При статистической обработке кривых обнаружили один связывающий сайт со значениями Ко и В_тах 22,0 ± 10 нМ и 3912 ± 436 фмоль/мг белка, соответственно (п=3). Очевидно, что [³Н] соединение А связывается с тС1и1а с намного более высоким сродством, чем [³Н]квисквалат. Количество сайтов связывания, меченных [³Н]квисквалатом, составляло ~60% от количества сайтов связывания, меченных [³Н] соединением А.

Проводили оценку ингибиторного действия тех же соединений на связывание [³Н] квисквалата с крысиным тС1и1а-рецептором С Н 0-1.111 Гг^- мембран. Потенциальные возможности для ингибирования протестированных агонистов и антагонистов, а также коэффициенты Хилла приведены в табл. 13. В этом случае соединения, применяемые (известные) для обнаружения конкурентного взаимодействия с глутаматом, ингибировали связывание [³Н]квисквалата, тогда как СРСС0Е!, ВАУ 36-7620 и NР8 2:390 не действовали на связывание [³Н]квисквалата. Соединение А также не вытесняет [³Н]квисквалат при его связывании с крысиным тС1и1а-рецептором. Конкурентные лиганды тС1и1-рецептора вытесняют [³Н]квисквалат при его связывании в следующем порядке их потенциальных возможностей: квисквалат > глутамат > ΚΥ367385 > (8)-3,5-1ОНРС > (8)-4С3НРС > 18,3К-АСРП > (8)-4СРС > АГОА > МСРС.

Таблица 13. Потенциальные возможности различных агонистов и антагонистов тС1и1-рецептора при ингибировании связывания [³Н] квисквалата с крысиным тС1и1а-рецептором СН0-бЫг^--мембран. Значения К; и коэффициенты Хилла представляют собой усредненное значение ±8Ώ 2-х независимых экспериментов.

- 74 009334

Соединение	Κι (мкМ)	коэффициент Хилла
Квисквалат	0,030 ± 0,00	0,98 + 0,01
Глутамат	0,40+0,07	0,99+0,01
ΣΥ367385	1,18+0,47	0,99+0,01
(5)-3,5-ϋΗΡΟ	1,42±0,00	0, 97 + 0,00
(5)-4СЗНРС	1,65+0,06	0,98+0,02
13,ЗК-АСРР	1,92+0,20	0,97+0,01
(3)-4СР6	4,51+0,78	0,98+0,00
АЮА	98,3+15,4	0,98+0,03
МСРС	165+0,47	0,96+0,02
Соединение А	> 1000
ΝΡ3 2390	> 1000
ΒΑΥ 36-7620	> 1000
СРССОЕ+	> 1000

Характер конкуренции между связыванием СРССОЕ1, ВАУ 36-7620, ΝΡ8 2390 и [³Н] соединения А. Тот факт, что все неконкурентные соединения вытесняют [³Н] соединение А при его связывании, не влияя на связывание [³Н]квисквалата, свидетельствует о том, что такие антагонисты связываются с сайтом, отличающимся от глутаматсвязывающего сайта. Чтобы оценить, являются ли описанные в литературе соединения СРССОЕ1, ВАУ 36-7620, ΝΡ8 2390 и соединение А, недавно идентифицированное как антагонист шО1и1-рецептора, конкурентными для одного и того же сайта или взаимоисключающих сайтов, проводили эксперименты по изучению насыщения с концентрациями [³Н] соединения А от 0,2 до 20 нМ при отсутствии и в присутствии СРССОЕ1 (30 мкМ), ВАУ 36-7620 (100 нМ) и ΝΡ8 2390 (10 нМ). Присутствие указанных конкурентов не влияло на значения Втах, однако вызывало значительное увеличение значения Ко [³Н] соединения А (таблица 14). Сказанное проиллюстрировано на фиг. 8, где данные нанесены на график с применением линейной регрессии. На графиках Скэтчарда полученные прямые линии отсекают на оси X фактически одинаковые отрезки (то есть, дают значение Втах).

Таблица 14. 3начения К_о и В_тах, полученные из анализа кривых насыщения связывания [³Н] соединения А в отсутствии и в присутствии антагонистов тО1и1-рецептора СРССОЕ1 (30 мкМ), ВАУ 36-7620 (100 нМ) и \Р8 2390 (10 нМ). 3начения представляют собой усредненные значения ±8Ό, полученные в 3-х отдельных экспериментах. Статистический анализ проводили с применением ΐ-критерия Стьюдента (двухстороннего): **р <0,01 и ***р <0,001._____________________

	контрольное	СРССОЕР	ΒΑΥ 36-7620	ΝΡ3 2390
К0(нМ)	0,73+0,09	3,17+0,90**	5,21+1,2**	2,90+0,20***
Втах (фмоль/мг белка)	7284+970	7009+1231	5872+1018	6887+2804

Связывание [³Н] соединения А в мембранах и срезах мозга крысы. Для изучения связывания рецептора в различных областях мозга крысы применяли [³Н] соединение А, представляющее собой специфический меченый лиганд для тО1и1-рецептора. Мембраны получали из коры головного мозга, стриатума, мозжечка и гиппокампа крысы и измеряли связывание [³Н] соединения А. Неспецифическое связывание в сравнении с общим связыванием составляло 10% в мозжечке, 30% в гиппокампе и 25% в коре головного мозга и стриатуме. 3начения К_о и В_тах определяли для каждой области мозга (таблица 15). Для всех структур значения К_о составляли приблизительно 1 нМ. 3начения В_тах значительно отличаются для разных областей. В мозжечке [³Н] соединением А маркируется удивительно высокое число тО1и1рецепторов. В стриатуме и гиппокампе маркируется приблизительно 16% от количества сайтов, обнаруженных в мозжечке. В коре головного мозга крысы связывалось только 11% от количества связывающих сайтов в мозжечке. Важно, что связывание [³Н] соединения А также максимально ингибируется при инкубации с 10 мкМ структурно неродственного соединения ВАУ 36-7620 (фиг. 9). Селективное по отношению к тО1и5-рецептору соединение МРЕР (тестировали вплоть до 30 мкМ) не действовало на связывание [³Н] соединения А с мембранами мозжечка крысы, еще раз указывая на селективность соединения А по отношению к тО1и1-рецептору.

Методом радиолигандной авторадиографии распределения [³Н] соединения А при связывании в срезах мозга крысы исследовали более подробно (фиг. 10). Авторадиографию [³Н] соединения А исследовали на сагиттальных срезах мозга крысы; неспецифическое связывание определяли с помощью соединения 135 (фиг. 10, рис. А). Очень высокое специфическое связывание наблюдали в молекулярном

- 75 009334 слое мозжечка. Умеренный сигнал наблюдали в САЗ-области и зубчатой извилине гиппокампального образования, таламусе, обонятельном бугорке, мозжечковой миндалине и черном сетчатом веществе. В коре головного мозга, хвостовом путамене, вентральном паллидуме, прилегающем ядре (асситЬепз) маркировка была более низкой. Связывание [³Н] соединения А со срезами мозга крысы также полностью ингибировалось при инкубации с ВАУ 36-7620 (фиг. 10, рис.С).

Таблица 15. Константы равновесного связывания, полученные для связывания [³Н] соединения А с мембранами коры головного мозга, гиппокампа, стриатума и мозжечка крысы. 3начения К и В_тах представляют собой усредненные значения ±8Ό, полученные по результатам 3-х независимых экспериментов.

	кора	гиппокамп	стриатум	мозжечок
Ко (НМ)	1,04±0,40	0,72±0,22	0,84±0,23	0,99±0,36
Впах (Гмоль/мг	471±68	688±125	741±48	4302±2042
белка)

Обсуждение

До настоящего времени для подтипов тО1и1-рецептора обнаружено всего несколько селективных антагонистов. Было показано, что СРССОЕ1 (ЬйзсЫд и др., Мо1.РИагтасо1., 55: 453-461,1999) и ВАУ 367620 с потенциальными возможностями, которые изменяются в диапазоне от микромолярных концентраций для СРССОЕ1 (6,6 мкМ) до высоких наномолярных концентраций для ВАУ 36-7620 (160 нМ), селективно блокируют тО1и1-рецептор. В настоящем исследовании соединение А идентифицировали в качестве нового антагониста тО1и1-рецептора с потенциальной возможностью функциональной антагонистической активности при низкой наномолярной концентрации по отношению к крысиному тО1и1арецептору (21,6 нМ) и человеческому тО1и1а-рецептору (10,4 нМ) . Было установлено, что антагонистическое действие соединения А является неконкурентным, так как максимальная активация тО1и1рецептора, индуцируемая глутаматом, уменьшается в присутствии соединения А. Наблюдаемое в присутствии соединения А увеличение ЕС₅₀ глутамата можно объяснить присутствием свободных рецепторов. В присутствии низких концентраций неконкурентного антагониста кривая зависимости ответа от концентрации будет смещаться вправо, так как для возмещения «несвободных» рецепторов, которые заблокированы антагонистом, необходимо больше агониста. Такие концентрации антагониста еще не будут действовать на максимальный ответ агониста, в то время как более высокие концентрации антагониста, в конечном счете, будут подавлять максимальный ответ (ΖΗπ и др., З.Рйагт.Тох.МеФ., 29: 8591,1993). Такое явление также описано для ВАУ 36-7620 (Сагго11 и др., Мо1.РИагтасо1. 59: 965-973,2001) и СРССОЕ1 (Негтапз и др., \е'игорЬагтасо1оцу, 37: 1645-1647,1998). Полученные данные, кроме того, показывают, что соединение А может действовать как обратный агонист по отношению к тО1и1арецептору, и что по отношению к другим подтипам тО1и-рецептора и ионотропным глутаматным рецепторам соединение А действует на тО1и1-рецептор селективно. Данные по исследованию передачи сигнала показали, что соединение А не оказывает агонистического, антагонистического или положительного аллостерического действия на тО1и2-, 3-, 4-, 5- и 6-рецептор, а исследование радиолигандного связывания показало, что [³Н] соединение А не связывается с тО1и2-, 3-, 4-, 5- и 6-рецептором, более того, исключена возможность, что соединение А действует как нейтральный лиганд по отношению к любому из типов данного рецептора. Отсутствие меченых лигандов, селективных к тОи1-рецептору, вместе с представляющими интерес фармакологическими свойствами соединения А являются неопровержимыми доводами для применения меченного радиоактивными изотопами соединения А для исследования тО1и1-рецепторов при изучении связывания.

[³Н] соединение А при связывании отвечает всем требованиям, предъявляемым к лиганду, очень хорошо подходит для изучения характеристик связывания, фармакологии и распределения тО1и1рецепторов. Первоначально исследование связывания [ Н] соединения А проводили на крысином тО1и1а-рецепторе СНО-йМг^--мембран. Специфическое связывание было очень высоким и линейно увеличивалось с концентрацией белка (фиг. 2). Специфическое связывание умеренно увеличивалось в присутствии МдС1₂ и СаС1₂, тогда как при рН 6 связывание уменьшалось на 22% и не изменялось с увеличением рН. Относительно влияния рН на связывание, стоит заметить, что расчетные физико-химические характеристики соединения А следующие: расчетные рК_а и с1одР равны соответственно 6,2 и 4,5. Таким образом, при рН 7,4 степень ионизации соединения А очень низкая (только 5,9%). При более высоком рН процент ионизации уменьшается еще больше (1,6% при рН 8, 0,2% при рН 9, и при рН 10 протонирование отсутствует). 3начение с1одр остается равным 4,5 при значениях рН от 7,4 до 10. Однако при рН б 61,3% соединения А находится в протонированной форме. Соответственно, с1о§Э уменьшается до 4,1. Более низкое связывание лиганда в ионизированной форме позволяет предположить, что при связывании самым высоким сродством обладает неионизированный лиганд. Это удивительно по сравнению с данными, полученными для лигандов моноаминовых рецепторов, связанных с О-белком (например, допа

- 76 009334 минового рецептора), которые часто являются сильными основаниями и связываются в катионной форме. Для таких соединений при связывании с рецептором движущей силой является электростатическая по характеру сила (Уап бе \Уа1егЬеетб и др., БМеб.Сйет. 29: 600-606,1986). Полученные данные могут указывать на то, что при связывании с рецептором ионные взаимодействия не являются движущей силой и также, что нет вклада ионных поверхностных эффектов. Кроме того, хотя соединение А представляет собой сильно липофильное соединение, очень низкое неспецифическое связывание [³Н] соединения А может быть следствием того, что не происходит никакого электростатического взаимодействия между неионизированной формой соединения А и отрицательно заряженной клеточной мембраной. Связывание зависит от температуры и существенно увеличивается при 4°С (фиг.3). Благодаря быстрой кинетике ассоциации и диссоциации равновесие при связывании достигается быстро. Очевидно, [³Н] соединение А маркирует одну популяцию сайтов с очень высоким сродством (Кс = 0,90±0,14 нМ). Напротив, выбираемый до сих пор [³Н]квисквалат, меченный изотопом лиганд тС1и1-рецептора, показал намного более высокое значение К0 22,0±10 нМ, которое хорошо коррелирует со значением 37 нМ, полученным в публикации Ми1е1 и др., 1.№игос11ет. 75: 2590-2 601,2000. Помимо значительно более высокого сродства [³Н] соединение А маркирует значительно больше (~40%) связывающих сайтов, чем [³Н]квисквалат. 3начения В_тах, найденные для [³Н] соединения А и [³Н] квисквалата, составили соответственно 6512±1501 фмоль/мг белка и 3912± 436 фмоль/мг белка. Такое расхождение можно объяснить, исходя из связывания С-белка рецептора. Агонисты облегчают связывание рецептора с С-белком, что приводит к конформации рецептора с высоким сродством к агонистам. Согласно данной теории, полный агонист, такой как квисквалат, преимущественно будет маркировать рецептор, находящийся в состоянии высокого сродства или связанный с С-белком. Антагонист будет обладать равным сродством к связанным и несвязанным рецепторам, следовательно, как к рецептору, находящемуся в состояниии высокого сродства, так и к рецептору, находящемуся в состояниии низкого сродства.

Полученные данные о том, что В_тах для [³Н] соединения А является значительно более высоким, чем для [³Н] квисквалата, находятся в соответствии с описанной теорией.

Поразительное открытие настоящего исследования заключается в том, что природный агонист глутамат, а также квисквалат, неспособны ингибировать связывание [³Н] соединения А с крысиным тС1и1арецептором СНО-бЫт^--мембран, тогда как СРССОЕ1, 3АУ 36-7620, ΝΡ8 2390 и соединение А, известные в качестве неконкурентных антагонистов, все ингибируют связывание [³Н] соединения А до одинакового максимального уровня (фиг. 6). Ингибирование связывания [³Н] соединения А перечисленными соединениями логически вытекает из сигмоидальных кривых с коэффициентами Хилла, равными приблизительно 1,0 (табл. 11), которые никак не указывают на связывание с множественными сайтами. Важно упомянуть, что хотя для определения неспецифического связывания применяли структурно родственный аналог, со структурно неродственными соединениями, такими как ВАУ 36-7 620, получали такое же низкое неспецифическое связывание, когда их применяли при концентрации 1 мкМ или более для крысиного тС1и1а-рецептора СНО-бЫг^--мембран (фиг. 6). Для [³Н] квисквалата все структуры, подобные аминокислотам, известные как конкурентные лиганды, могут вытеснять [³Н] квисквалат с его связывающего сайта. Потенциальные возможности квисквалата, глутамата, БУ367385, (8)-3,5-ЭНРС, (8)-4С3НРС, 18, 3К.-АСРИ, (8)-4СРС, АША и МСРС (таблица 13) для ингибирования хорошо согласуются со значениями, о которых сообщается в публикации Ми1е1 и др., 1.№игосйет. 75: 2590-2601,2000. Напротив, описанные выше неконкурентные соединения не влияют на его связывание. Относительно СРССОЕ1 сообщалось, что данное соединение не влияет на связывание [³Н]глутамата с мембранами, полученными из клеток, экспрессирующих крысиный тС1и1а-рецептор (ЬйксЫд и др., Мо1.Рйагтасо1. 55: 453-461,1999). Кроме того, считается, что СРССОЕ1 не связывается с глутаматным связывающим сайтом, но взаимодействует с Т11Г815 и А1а818 в трансмембранном домене VII. СРССОЕ1 предлагается в качестве соединения, препятствующего передаче рецепторного сигнала, в результате разрушения внутримолекулярного взаимодействия между глутаматсвязанным внеклеточным доменом и трансмембранным доменом VII. В публикации Саго11. и др. Мо1.Рйагтасо1. 59: 965-973,2001 показано, что ВАУ 36-7620 не вытесняет [³Н] квисквалат из глутаматсвязывающего кармана. Показано, что при связывании ВАУ 36-7620 критическую роль играют от 4 до 7 трансмембранных спиральных участков. Проведенные авторами эксперименты по изучению ингибирования, выполненые с [³Н] соединением А и [³Н]квисквалатом, позволяют считать, что СРССОЕ1, ВАУ 36-7620, ΝΈ8 2390 связываются с тем же сайтом, что соединение А. Эксперименты по изучению насыщения, в которых [³Н] соединение А применяли при отсутствии и в присутствии 30 мкМ СРССОЕ1, 100 нМ ВАУ 36-7620 и 10 нМ ΝΈ8 2390, кроме того, служат доказательством, что данные соединения связываются с одинаковыми или взаимоисключающими сайтами. 3начения К_с значительно увеличивались, тогда как значение В_тах не изменялось (таблица 14). Полученные результаты показывают, что хотя сродство [³Н] соединения А уменьшается, при высоких концентрациях [³Н] соединение А все еще способно вытеснять при связывании другое соединение с его связывающего сайта, что является типичной характеристикой конкурентного взаимодействия. В заключение следует отметить, что полученные данные служат доказательством того, что СРССОЕ1, ВАУ 36-7620, ΝΈ8 2390 и соединение А действуют на сайт, отличающийся от глутаматсвязывающего кармана, возможно они конкурируют за один и тот же трансмембранный сегмент VII.

- 77 009334

Прежние исследования связывания тС1и-рецептора группы I в мозге проводили с применением [³Н]глутамата или [³Н]квисквалата (8сНоерр и Тгие, №иго5с1.БеЦ. 145: 100-104, 1992; \Уп§1 и др.,

1.№игос11ет.. 63: 938-945,1994; Ми!е1 и др., 1.№игос11ет. 75: 2590-2601,2000). Данные меченые лиганды при маркировке более чем одного типа глутаматного рецептора имеют недостатки.

Следовательно, для предотвращения маркировки других подтипов метаботропного или ионотропного глутаматного рецептора селективные ингибиторы следует добавлять к инкубационному буферу. До настоящего времени не существовало меченого лиганда, подходящего для исследования специфического связывания и распределения тС1и1-рецептора. Благодаря специфической маркировке тС1и1-рецептора [³Н] соединением А его можно применять, в частности, для исследования нативных тС1и1-рецепторов в мозге крысы или человека. Эксперименты с применением мембран коры головного мозга, гиппокампа, стриатума и мозжечка крысы показали, что специфическое связывание [³Н] соединения А, определенное в присутствии 1мкМ соединения 135, было высоким, особенно в мозжечке (только 10% неспецифического связывания).

Эксперименты по изучению насыщения вновь показали, что [³Н] соединение А с очень высоким сродством маркирует, очевидно, один связывающий сайт. Для различных областей мозга все найденные значения К_с приблизительно равны 1 нМ (табл.15). Обнаружено поразительное различие значений В_мах: обширная популяция связывающих сайтов маркировалась в мозжечке, тогда как в гиппокампе, стриатуме и коре головного мозга уровни экспрессии рецептора от умеренного до низкого.

Доказано, что благодаря своей специфичности [³Н] соединение А особенно подходит для исследования распределения шС1и1-рецептора в срезах мозга с применением радиолигандной авторадиографии. Авторадиография шС1и1-рецептора показывает, что самый высокий уровень специфического связывания шС1и1 присутствует в молекулярном слое мозжечка. Слой грануллярных клеток (невроцитов) маркировался очень слабо. Такие результаты также обнаружены в публикации Ми!е1. и др., 1.№игосйет. 75: 2590-2601,2000, где исследовалось распределение тС1и-рецептора группы I с помощью [³Н]квисквалата. Обильная маркировка происходила в гиппокампальном образовании, дендритной области СА3 вместе с молекулярным слоем зубчатой извилины. В области СА1 происходило очень слабое связывание [³Н] соединения А, хорошо соответствующее иммуногистохимическим данным, приведенным в публикациях Ьи)аи и др., Еиг. 1.№иго8ст ,8:1488-1500, 1996 и 8Ыдешо1о и др., 1.№иго8с1., 17:7503-7522,1997, где показано, что в дендритных областях СА1 антитело, специфичное по отношению к шС1и5-рецептору в отличие от антитела, специфичного по отношению к шС1и1-рецептору, давало на выходе интенсивное иммунное мечение.

В авторадиографических экспериментах с применением [³Н] квисквалата действительно получали окрашивание как в области СА1, так и в области СА3 гиппокампа, указывающее соответственно на связывание как с шС1и1, так и с шС1и5-рецептором (Ми!е1 и др., 1.№игосйет., 75: 2590-2601,2000). Связывание [³Н] соединения А также весьма высоко в таламусе, обонятельном бугорке, мозжечковой миндалине и черном сетчатом веществе и несколько ниже в коре головного мозга, саиба1е риίатеη, прилегающем ядре (асситЬещ) и вентральном паллидуме. Те же структуры маркировали с помощью [³Н] квисквалата (Ми!е1 и др., ^.Nеи^οсНет.. 75: 2590-2601,2000). Иммуноцитохимические данные по клеточной локализации шС1и1а-рецептора с применением антитела, селективного по отношению к шС1и1а-рецептору, в общем случае также соответствовали полученным в настоящем исследовании данным (Майш и др., №игои., 9:259-270, 1992). Несмотря на то, что [³Н] соединение А, как ожидается, маркирует все известные до настоящего времени варианты сплайсинга шС1и1-рецептора, распределение варианта сплайсинга 1 может однако отличаться от распределения радиоактивной метки, полученного авторами настоящего изобретения. Например, в области СА3 и хвостовом путамене, которые маркировались меченым лигандом, обнаружено наличие иммунореактивности шС1и1Ь-рецептора, но отсутствие иммунореактивности шС1и1а-рецептора или слабая иммунореактивность шС1и1а-рецептора (Майш и др., ΝοιίΓοη, 9:259270,1992; 8Ыдешо1о и др., 1.№иго8ст, 17:7503-7522,1997; Беггадий и др., 1.Сотр.№иг., 400:391-407, 1998). Важно, что при демонстрации идентичности сайтов, маркированных [³Н] соединением А, было обнаружено, что структурно отличающееся соединение ВАУ 36-7620 также полностью вытесняет [³Н] соединение А при связывании с мембранами мозга крысы (фиг. 9), так же как со срезами мозга (фиг. 10), тем самым обеспечивается хорошая гарантия, что ингибируемое связывание является полностью рецептор-специфическим и не относится к структурной группе меченого лиганда.

В настоящей заявке авторы показали, что [³Н] соединение А представляет собой превосходный меченый лиганд для исследования шС1и1- рецепторов в гетерологичной экспрессирующей системе, гомогенатах и срезах крысиного мозга. Можно сделать вывод, что благодаря его минимальному неспецифическому связыванию, его высокому сродству к связыванию и селективности, установленной с помощью маркировки, [³Н] соединение А представляет собой предпочтительный лиганд для дальнейшего исследования шС1и1-рецептора. Применение [³Н] соединения А открывает перспективы для подробного исследования субклеточной и клеточной локализации шС1и1-рецептора и для изучения функциональной роли и регуляции рецептора в различных областях.

- 78 009334

Перечень фигур

Фиг. 1 - антагонистический профиль соединения А. Результаты ингибирования мобилизации Са²⁺ (30 мкМ), индуцируемой глутаматом в СНО-бШг^--клетках, экспрессирующих крысиный тО1и1арецептор, представлены на фиг. 1Α. Данные выражены в процентах от принятого за 100% сигнала, полученного при применении 30 мкМ глутамата, и представляют собой усредненное значение ±8Ό 3-х экспериментов. На фиг. 1В представлена кривая зависимости ответа от концентрации только одного глутамата или вместе с 20 нМ, 30 нМ, 60 нМ, 100 нМ и 1 мкМ соединения А. 3начения представляют собой усредненные значения +8Ό трехкратных определений в пределах 1-го эксперимента. В дополнительном эксперименте получены те же самые результаты. На фиг. 1С представлено накопление базального Ш в присутствии увеличивающихся концентраций соединения А. 3начения выражены в виде процента от продукции базального Ш в присутствии растворителя, принятой за 100%, и представляют собой усредненные значения ±8Ό 3-х экспериментов, проведенных четырехкратно.

Фиг. 2 - специфическое связывание [³Н] соединения А представляет собой линейную зависимость от количества мембранного белка. От 10 до 50 мкг СНО-бШг^--мембран, содержащих крысиный тОи1арецептор, инкубировали в течение 30 минут на льду с 2,5 нМ [³Н] соединением А. Данные получены на основе типичного эксперимента и выражены в виде усредненных значений ±8Ό трехкратных определений.

Фиг.3 - кривая зависимости связывания [³Н] соединения А с крысиным тО1и1а-рецептором СНОбШг^--мембран от времени ассоциации. Кинетику ассоциации измеряли при добавлении 2,5 нМ [³Н] соединения А на разные по продолжительности периоды времени перед фильтрованием и определяли при 3-х разных температурах. Данные представляют собой усредненные значения ±8Ό 3-х независимых экспериментов, проводимых дважды.

Фиг. 4 - временная зависимость диссоциации [³Н] соединения А при связывании с крысиным т61и1а-рецептором СНО-бШг^--мембран при 4°С и 25°С. Образцы инкубировали в течение 30 мин при 4°С или 25°С, затем на период времени, обозначенный для каждой точки на графике, добавляли избыток соединения 135 с последующим ускоренным фильтрованием. 3начения представляют собой усредненные значения ±8Ό 2-х независимых экспериментов, проводимых дважды.

Фиг. 5 - типичная кривая насыщения связывания и график Скэтчарда для связывания [³Н] соединения А с крысиным т61и1а-рецептором СНО-бШг-мембран. Специфическое связывание (8В), измеренное в присутствии 1 мкМ соединения 135, получали при вычислении разности между общим связыванием (ТВ) и неспецифическим связыванием (ВЬ). Точки на графике определяли дважды для каждого эксперимента. Эксперимент повторяли 3 раза.

Фиг.6. - ингибирование связывания 2,5 нМ [³Н] соединения А с крысиным тО1и1а-рецептором СНО-бШг^--мембран различными антагонистами тО1и-рецептора. Точки на графике представляют собой % от общего связывания и являются усредненными значениями ±8Ό 3-4-х отдельных экспериментов.

Фиг. 7 - типичная кривая насыщения связывания и график Скэтчарда для связывания [³Н]квисквалата с крысиным тОи1а-рецептором СНО-бШг^--мембран. Точки на графике определяли дважды для каждого эксперимента. Эксперимент повторяли 2 раза.

Фиг. 8 - кривые насыщения связывания и графики Скэтчарда для связывания [³Н] соединения А с крысиным т61и1а-рецептором СНО-бШг^--мембран в отсутствии и в присутствии СРССОΕί (30 мкМ), ВАУ 36-7620 (100 нМ) и ИР8 2390 (10 нМ) . На графике представлены данные 3-х независимых экспериментов. Данные выражены в нМ специфического связывания. Точки на графике определяли дважды для каждого эксперимента.

Фиг. 9 - ингибирование соединением ВАУ 36-7620 связывания 2,5 нМ [³Н] соединения А с мембранами мозжечка крысы. Точки на графике представляют собой % от общего связывания и являются усредненными значениями ±8Ό 2-х отдельных экспериментов.

Фиг. 10 - связывание [³Н] соединения А с сагиттальными срезами мозга крысы, определенное с применением авторадиографии. На рисунке А представлен типичный срез, на котором показано общее связывание с 1,5 нМ [³Н] соединением А. На рисунке В представлен типичный и непосредственно примыкающий срез, где показано неспецифическое связывание с 1,5 нМ [³Н] соединением А в присутствии 1 мкМ соединения 135. На рисунке С представлен типичный срез, на котором показано неспецифическое связывание с 1,5 нМ [³Н] соединением А в присутствии 10 мкМ ВАУ 36-7620. Срезы, представленные на рисунках А и В, экспонировали с пленкой [³Н]Нурегй1т, тогда как срез на рисунке С экспонировали с пластинкой Еир Ιιηη§ίη§ р1а(е. Т11 означает таламус; 8№ означает черное сетчатое вещество; СА3 означает область гиппокампа СА3; Од означает зубчатую извилину гиппокампа; Сег означает мозжечок; Ср означает хвостовой путамен; Сх означает кору головного мозга, Оί означает обонятельный бугорок, Ат означает мозжечковую миндалину, Ур означает вентральный паллидум, №1 означает прилегающее ядро (асситЬепз).

Claims (16)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Меченное радиоактивным изотопом соединение, представляющее собой соединение (е)
2. 2. Радиоактивная композиция для маркировки и идентификации сайтов метаботропного глутаматного рецептора и для визуализации органа для введения млекопитающим, содержащая терапевтически эффективное количество меченного радиоактивным изотопом соединения по п.1 и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.
3. 3. Применение меченного радиоактивным изотопом соединения по п.1 в качестве диагностического средства.
4. 4. Применение радиоактивной композиции по п.2 в качестве диагностического средства.
5. 5. Применение меченного радиоактивным изотопом соединения по п.1 при получении диагностического средства для маркировки или идентификации тО1и1-рецептора в биологическом материале.
6. 6. Применение радиоактивной композиции по п.2 в качестве активного компонента при получении диагностического средства для маркировки или идентификации тО1и1-рецептора в биологическом материале.
7. 7. Способ диагностики, включающий маркировку или идентификацию тО1и1-рецептора в биологическом материале меченным изотопом соединением по п.1.
8. 8. Способ диагностики по п.7, где маркировку осуществляют путем введения меченного изотопом соединения по п.1 в биологический материал и идентификацию осуществляют путем обнаружения эмиссии от указанного меченного радиоактивным изотопом соединения.
9. 9. Способ диагностики, включающий маркировку или идентификацию тО1и1-рецептора в биологическом материале радиоактивной композицией по п.2.
10. 10. Способ диагностики по п.9, где маркировку осуществляют путем введения радиоактивной композиции по п.2 в биологический материал и идентификацию путем обнаружения эмиссии от указанного меченного радиоактивным изотопом соединения.
11. 11. Способ диагностики по любому из пп.7-10, включающий оценку того, способно ли тестируемое соединение располагаться на тО1и1-рецепторе или связываться с тО1и1-рецептором в биологическом материале.
12. 12. Способ диагностики путем визуализации органа, заключающийся в том, что в биологический материал в составе соответствующей композиции вводят меченное радиоактивным изотопом соединение по п.1, в количестве, достаточном для связывания указанного меченного радиоактивным изотопом соединения с сайтами тО1и1-рецептора в биологическом материале; и обнаруживают эмиссию от меченного радиоактивным изотопом соединения.
13. 13. Способ диагностики путем визуализации органа, заключающийся в том, что в биологический материал в составе соответствующей композиции вводят радиоактивную композицию по п.2, в количестве, достаточном для связывания указанного меченного радиоактивным изотопом соединения с сайтами тО1и1-рецептора в биологическом материале; и обнаруживают эмиссию от меченного радиоактивным изотопом соединения.
14. 14. Способ диагностики по любому из пп.7-13, где биологический материал выбран из группы, включающей образцы ткани, жидкости плазмы, жидкости организма, части тела и органов, полученных от теплокровных животных и от теплокровных животных как таковых (рег зе), в частности от человека.
15. 15. Применение меченного радиоактивным изотопом соединение по п.1 для получения диагностического средства для оценки того, обладает ли тестируемое соединения способностью располагаться на тО1и1-рецепторе или связываться с тО1и1-рецептором в биологическом материале.
16. 16. Применение радиоактивной композиции по п.2 для получения диагностического средства для оценки того, обладает ли тестируемое соединение способностью располагаться на тО1и1-рецепторе или связываться с тО1и1-рецептором в биологическом материале.