NO330688B1

NO330688B1 - Radiomerkede kinolin- og kinolinonderivater og deres anvendelse som metabotropiske glutamatreseptorligander

Info

Publication number: NO330688B1
Application number: NO20044635A
Authority: NO
Inventors: Francois Paul Bischoff; Anne Simone Josephine Lesage; Cornelus Gerardus Maria Janssen; Hilde Lavreysen
Original assignee: Janssen Pharmaceutica Nv
Priority date: 2002-03-29
Filing date: 2004-10-27
Publication date: 2011-06-06
Also published as: CN1642580A; IL164299A; AU2003226737A1; NO20044635L; CN1642580B; US7517517B2; EA009334B1; HRP20040870A2; HK1079700A1; CA2479109C; JP4573533B2; US20060083676A1; UA78548C2; MXPA04009435A; PL371607A1; BR0308945A; WO2003082350A2; WO2003082350A3; EP1492571A2; JP2005524679A

Abstract

Legemiddel

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører radiomerkede kinolin- og kinolinonderivater som viser metabotropisk glutamatreseptorantagonistisk aktivitet, spesielt mGlul-reseptoraktivitet, og deres fremstilling; den vedrører videre sammensetninger omfattende dem, samt deres anvendelse i en diagnostisk fremgangsmåte, spesielt for å merke og identifisere metabotropiske glutamatreseptorseter og for avbilding av et organ.

Introduksjon

Nevrotransmitteren glutamat anses å være den viktigste eksitatoriske nevrotransmitter i sentralnervesystemet til pattedyr. Bindingen av denne nevrotransmitter til metabotropiske glutamatreseptorer (mGluRer), som er en underfamilie av de G-protein-koblede reseptorer og som omfatter 8 distinkte undertyper av mGluRer, nemlig mGluRl til mGluR8, aktiverer mange forskjellige intracellulære second messenger-systemer. mGluRene kan deles i 3 grupper basert på aminosyresekvenshomologi, second messenger-systemet benyttet av reseptorene og de farmakologiske karakteristika. Gruppe I mGluRer, som omfatter mGluR-undertype 1 og 5, kobler til fosfolipase C og deres aktivering fører til intracellulær kalsiumion-mobilisering. Gruppe II mGluRer (mGluR2 og 3) og gruppe III mGluRer (mGluR4, 6, 7 og 8) kobler til adenyl cyklase og deres aktivering forårsaker en reduksjon i second messenger cAMP og som sådan en dempning av den nevronale aktivitet. Behandling med

Gruppe I mGluR-antagonister har blitt vist i parasynapsen å gi en redusert frigivelse av nevrotransmitter glutamat og minske den glutamat-medierte nevronale eksitasjon via postsynaptiske mekanismer. Fordi mange forskjellige patofysiologiske prosesser og sykdomstilstander som påvirker sentralnervesystemet er antatt å skyldes usedvanlig stor glutamatindusert eksitasjon av nevronene i sentralnervesystemet, kunne Gruppe I mGluR-antagonister, spesielt mGluRl-antagonister være terapeutisk fordelaktige i behandlingen av sentralnervesystemsykdommer, spesielt i psykiatriske og nevrologiske lidelser.

Imidlertid har, frem til nå, ingen spesifike mGluRl-ligander vært tilgjengelige, en mangel som kraftig hemmet studien av mGlul-reseptorene, spesielt de radio-autografiske undersøkelser av den entydig fordeling og tallrikhet av disse reseptorer i hjernedeler. For gruppe I var bare [<3>H]glutamat tilgjengelig så langt, som ble anvendt på rotte (Thomsen et al., Brain Res. 619:22-28, 1993) eller humane (Kingston et al., Neuropharmacoloqy 37:277-287, 1998) mGlula- reseptorer. For mGlula-reseptoren og mGlu5-reseptoren er [<3>H]quisqualat tilgjengelig, imidlertid er reseptoren ikke spesifikk for mGlul-reseptoren (den binder også til AMPA-reseptoren) og den er konkurrerende, dvs. den erstatter glutamat (Mutel at al., J. Neurochem. 75:2590-2601, 2000).

Det har vært målet for denne oppfinnelse å tilveiebringe passende spesifikke, spesielt ikke-konkurrerende mGlul-reseptorligander.

Oppfinnerne har nå funnet en spesiell gruppe med forbindelser som - i en radiomerket form - sørger for passende spesifikke, spesielt ikke-konkurrerende mGlul-reseptorligander samt en fremgangsmåte for merking og identifisering av metabotropiske glutamatreseptorsteder og for avbilding av et organ.

Innenfor rammen av denne søknad betyr begrepet "spesifikk" at liganden fortrinnsvis binder til mGlul-reseptorsetet. Begrepet "ikke-konkurrerende" betyr at liganden ikke eller bare marginalt erstatter glutamat bundet til mGlul-reseptorstedet.

WO 02/28837 bringer for dagen de ikke-radioaktive forbindelser i henhold til den foreliggende oppfinnelse.

WO 99/26927 bringer for dagen antagonister av Gruppe I mGluRer for behandling av nevrologiske lidelser og forstyrrelser, basert - blant annet - på en kinolinstruktur.

WO 99/03822 bringer for dagen bicykliske metabotropiske

glutamatreseptorligander, ingen av dem basert på en kinolin- eller kinolinonstruktur.

WO 94/27605 bringer for dagen l,2,3,4-tetrahydrokinolin-2,3,4-trion-3- eller 4-oksimer og anvendelse derav for behandling og forebygging av nevronalt tap, nevrodegenerative sykdommer, ugunstige konsekvenser av hyperaktiviteten av de eksitatoriske aminosyrer og angst, samt radiomerkede forbindelser derav.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Den foreliggende oppfinnelse vedrører forbindelsene med formel (a), (b), (c), (d) og (e):

et farmasøytisk akseptabelt addisjonssalt, og en stereokjemisk isomer form derav.

For in vivo bruk er salter av forbindelsene med formel (a), (b), (c), (d) og (e) de hvori motionet er farmasøytisk akseptabelt. Imidlertid kan salter av syrer og baser som er ikke-farmasøytisk akseptable finne anvendelse, for eksempel, i fremstillingen eller rensingen av en farmasøytisk akseptabel forbindelse. Alle salter, ente farmasøytisk akseptable eller ikke er inkludert innenfor omfanget av den foreliggende oppfinnelse. Med begrepet "in vivo" menes anhver anvendelse av forbindelsene i henhold til oppfinnelsen hvorved forbindelsene administreres til levende dyr.

De farmasøytisk akseptable addisjonssalter som nevnt i det foregående er ment å omfatte de terapeutisk aktive ikke-toksiske syreaddisjonssaltformer som forbindelsene med formel (a), (b), (c), (d) og (e) er i stand til å danne. Den sistnevnte kan beleilig oppnås ved behandling av baseformen med slike passende syrer som uorganiske syrer, for eksempel, hydrohalosyrer, f.eks. saltsyre, hydrobromsyre og lignende; svovelsyre; salpetersyre; fosforsyre og lignende; eller organiske syrer, for eksempel, eddiksyre, propansyre, hydroksyeddiksyre, 2-hydroksypropansyre, 2-oksopropansyre, oksalsyre, malonsyre, ravsyre, maleinsyre, fumarsyre, eplesyre, vinsyre, 2-hydroksy-l,2,3-propantrikarboksylsyre, metansulfonsyre, etansulfonsyre, benzensulfonsyre, 4-metylbenzensulfonsyre, cykloheksansulfaminsyre, 2-hydroksybenzosyre, 4-amino-2-hydroksybenzosyre og lignende syrer. Omvendt kan saltformen omdannes ved behandling med alkali til den frie baseform.

Forbindelsene med formel (a), (b), (c), (d) og (e) inneholdende sure protoner kan omdannes til sine terapeutisk aktive ikke-toksiske metall- eller aminaddisjonssaltformer ved behandling med passende organiske og uorganiske baser. Passende basesaltformer omfatter, for eksempel, ammoniumsaltene, alkali-og jordalkalimetallsaltene, f.eks. litium-, natrium-, kalium-, magnesium-, kalsiumsaltene og lignende, salter med organiske baser, f.eks. primære, sekundære og tertiære alifatiske og aromatiske aminer slik som metylamin, etylamin, propylamin, isopropylamin, de fire butylaminisomerer, dimetylamin, dietylamin, dietanolamin, dipropylamin, diisopropylamin, di-n-butylamin, pyrrolidin, piperidin, morfolin, trimetylamin, trietylamin, tripropylamin, kinuklidin, pyridin, kinolin og isokinolin, benzatin-, /V-metyl-D-glukamin-, 2-amino-2-(hydroksymetyl)-l,3-propandiol-, hydrabaminsaltene, og salter med aminosyrer slik som, for eksempel, arginin, lysin og lignende. Omvendt kan saltformen omdannes ved behandling med syre til den frie syreform.

Begrepet "addisjonssalt" omfatter også hydratene og løsningsmiddeladdisjons-formene som forbindelsene med formel (a), (b), (c), (d) og (e) er i stand til å danne. Eksempler på slike former er f.eks. hydrater, alkoholater og lignende.

Begrepet "kvaternært amin" som anvendt i det foregående definerer de kvaternære ammoniumsalter som forbindelsene med formel (a), (b), (c), (d) og (e) er i stand til å danne ved reaksjon mellom et basisk nitrogen i en forbindelse med formel (a), (b)/(c), (d) eller (e) og et passende kvaterniseringsmiddel, slik som, for eksempel, et eventuelt substituert alkylhalid, arylhalid eller arylalkylhalid, f.eks. metyljodid eller benzyljodid. Andre reaktanter med gode utgående grupper kan også anvendes, slik som alkyl-trifluormetansulfonater, alkyl-metansulfonater og alkyl-p- toluensulfonater. Et kvaternært amin har et positivt ladet nitrogen. Farmasøytisk akseptable motioner inkluderer klor, brom, jod, trifluoracetat og acetat. Det valgte motion kan introduseres ved å anvende ionebytteresiner.

Det vil bli verdsatt at noen av forbindelsene i henhold til oppfinnelsen kan inneholde ett eller flere kirale sentere og forekomme som stereokjemisk isomere former.

Begrepet "stereokjemisk isomere former" som anvendt i det foregående definerer alle de mulige stereoisomere former som forbindelsene i henhold til oppfinnelsen eller de fysiologisk funksjonelle derivater kan inneha. Med mindre annet er nevnt eller indikert, betegner den kjemiske angivelse av forbindelser blandingen av alle mulige stereoisomere former, nevnte blandinger inneholdende alle diastereomerer og enantiomerer med basismolekylstrukturen samt hver av de individuelle isomere former av forbindelsene i henhold til oppfinnelsen, hovedsakelig fri, dvs. assosiert med mindre enn 10 %, fortrinnsvis mindre enn 5 %, spesielt mindre enn 2 % og mest foretrukket mindre enn 1 % av de andre isomerer. Stereokjemisk isomere former av forbindelsene i henhold til oppfinnelsen er åpenbart ment å bli omfattet innenfor rammen av den foreliggende oppfinnelse. Det samme gjelder for intermediatene som beskrevet heri, anvendt for å fremstille sluttprodukter av forbindelsene i henhold til oppfinnelsen.

Begrepene c/s og trans anvendes heri i overensstemmelse med Chemical Abstracts-nomenklatur.

For noen forbindelser i henhold til oppfinnelsen og i intermediatene anvendt i deres fremstilling, har den absolutte stereo kjem i ske konfigurasjon ikke blitt bestemt. I disse tilfeller betegnes den stereoisomere form som først ble isolert som "A" og den andre som "B", uten ytterligere referanse til den faktiske stereokjemiske konfigurasjon. Imidlertid kan nevnte "A"- og "B"-stereoisomere former karakteriseres entydig ved fysikokjemiske karakteristika slik som deres optiske rotasjon i tilfelle "A" og "B" har et enantiomert forhold. Fagmannen er i stand til å bestemme den absolutte konfigurasjon til slike forbindelser ved å anvende kjente metoder i faget slik som, for eksempel, røntgendiffraksjon. I tilfelle "A" og "B" er stereoisomere blandinger kan de separeres ytterligere hvorved de respektive først isolerte fraksjoner betegnes "Al" og "Bl"og de andre som "A2" og "B2", uten ytterligere referanse til den faktiske stereokjemiske konfigurasjon.

/V-oksidformene av de foreliggende forbindelser er ment å omfatte forbindelsene med formel (a), (b), (c), (d) og (e) hvori ett eller flere nitrogenatomer er oksidert til det såkalte /V-oksid.

Noen av forbindelsene i henhold til oppfinnelsen kan også eksistere i sin tautomere form. Slike former er, selv om de ikke er eksplisitt indikert i formlene over, ment å være inkludert innenfor rammen av den foreliggende oppfinnelse. Av spesiell interesse er de forbindelser med formel (a), (b), (c), (d) og (e) som er stereokjemisk rene.

Spesielt interessante er de følgende radioaktive forbindelser:

Alle forbindelser i henhold til oppfinnelsen viser en moderat til sterk mGluRl-aktivitet. Slik aktivitet er blant annet tilskrevet den spesifikke binding av forbindelsen til mGlul-reseptoren, som gjør forbindelsene nyttige i en diagnostisk fremgangsmåte, f.eks. for å merke og detektere mGlul-reseptorseter. Oppfinnelsen vedrører derfor også en radiomerket forbindelse i henhold til oppfinnelsen for anvendelse i en diagnostisk fremgangsmåte.

Første foretrukne utførelse ( qamma- emitterende radionuklid)

I henhold til en første foretrukne utførelse omfatter den radiomerkede forbindelse minst ett [<3>H]-atom eller ett [<125>1]-atom. Et[<3>H]-atom introduseres beleilig ved delvis eller fullstendig substituering av ett eller flere ikke-radioaktive CH]-hydrogenatomer i molekylet med deres radioaktive isotoper. Valget av om en [<3>H]-eller [<125>I]-radioligand vil bli anvendt kan avhenge delvis av tilgjengeligheten av væskescintillatorer (LSC), som er relativt dyre. [<125>1]-ligander kan kvantifiseres ved å anvende enten en y-teller eller en LSC, mens derimot [<3>H]-ligander nødvendiggjør anvendelsen av en LSC.

Den radiomerkede forbindelse omfattende minst ett[3H]-atom eller ett [<125>1]-atom anvendes fordelaktig i radioligandbindingsteknikker, spesielt i in wfro-membran-reseptorassayer for å merke eller identifisere en mGlul-reseptor i biologisk materiale.

De radiomerkede forbindelser omfattende minst ett [<3>H]-atom eller ett [<125>1]-atom anvendes også fordelaktig i in vivo mGlul-reseptorautoradiografi av hjernen siden forbindelsene i henhold til oppfinnelsen har den fordelaktige og uventede evne til lett å krysse blod-hjerne-barribarrieren.

Oppfinnelsen vedrører derfor også en radiomerket forbindelse i henhold til oppfinnelsen anvendt i en diagnostisk fremgangsmåte som består i å merke eller identifisere en mGlul-reseptor i biologisk materiale, samt anvendelsen av forbindelsene i henhold til oppfinnelsen for fremstillingen av et diagnostisk verktøy for å merke eller identifisere en mGlul-reseptor i biologisk materiale, enten in vivo eller in vi tro.

Innenfor rammen av denne søknad menes med begrepet "biologisk materiale" å inkludere ethvert materiale som har en biologisk opprinnelse. Spesielt vedrører dette vevsprøver, plasmafluid, kroppsvæsker, kroppsdeler og organer som stammer fra varmblodige dyr og varmblodige dyr per se, spesielt mennesker.

Basiseksperimenter som utføres ved å anvende membranassaysystemet for å merke eller identifisere en mGlul-reseptor i biologisk materiale er: metningseksperimenter, hem mi ngseksperi menter, assosiasjonskinetiske eksperimenter og dissosiasjonskinetiske eksperimenter. Disse metoder er anvendelig på de fleste nevrotransmitter- og hormonreseptorsystemer, inklusive mGluRl-systemet (Methods for Neurotransmitter Receptor Analysis, red. av Henry I. Yamamura et al., Raven Press Ltd., New York, 1990). Med dette som formål administreres den radiomerkede forbindelse til det biologiske materiale for å merke mGlul-reseptorene og emisjonene fra den radiomerkede forbindelse detekteres for å identifisere mengden eller beliggenheten til mGlul-reseptorene, for eksempel for ex wVo-reseptorautoradiografi.

De radiomerkede forbindelser i henhold til oppfinnelsen omfattende minst ett [<3>H]-atom er også nyttige som midler for å undersøke om en testforbindelse har evnen til å okkupere eller binde til et mGlul-reseptorsete. Graden med hvilken en testforbindelse vil erstatte en forbindelse i henhold til oppfinnelsen fra mGlul-reseptorsetet vil vise testforbindelsens evne til å okkupere eller binde til en mGlul-reseptor og derfor virke som enten en agonist, en antagonist eller en blandet agonist/antagonist av en mGlul-reseptor.

De radiomerkede forbindelser i henhold til oppfinnelsen omfattende minst ett [<3>H]-atom fremstilles fordelaktig ved å substituere et halogenatom med et tritiumatom, som er dokumentert i den eksperimentelle del under.

Andre foretrukne utførelse ( positronsemitterende radionuklid)

I en andre foretrukket utførelse omfatter den radiomerkede forbindelse minst ett radioaktivt karbon- eller halogenatom.

Fremstilling av de radioaktive forbindelser

Introduksjonen av et radioaktivt halogenatom kan utføres ved en passende reaksjon slik som beskrevet under hvor alle substituenter i formel (I-A-a) og (I-A-a)<*>er definert som i formel (I-A)<*>og halo er et halogenatom. En passende forbindelse (I-A-a) reageres med H[<18>F] slik at halogenatomet nærværende på kinolinringen erstattes ved en nukleofil erstatningsreaksjon med det radioaktive [<18>F]-atom.

For å oppnå radiomerkede forbindelser i henhold til formel (a), (b), (c), (d) og (e) kan radiomerking utføres på en ekvivalent måte, for eksempel via et reaksjonsskjema som beskrevet under. Åpenbart kan også forbindelser i henhold til formel (a), (b), (c), (d) og (e) oppnås på en ekvivalent måte, dvs. via merking av en P^-substituent.

Andre metoder for tritium-merking er beskrevet f.eks. av Peng et al. Fusion Technology. American Nuclear Society, 21(2):307-311, 1992 og av Brundish et al. Journal of Labelled Compounds and Radiopharmaceuticals 25(12):1361-1369

(1988).

Introduksjonen av et radioaktivt [<U>C] kan utføres ved å anvende reaksjonsskjemaet under hvor en passende forbindelse (I-A-a) først stanylleres hvoretter det radioaktive [<n>C] introduseres ved å anvende f.eks. en palladiumkatalysert "Stille-type"-koblingsreaksjon ved å anvende [<n>C]metyljodid (Scott, W.J.; Crisp, G.T.; Stille, J.K. J. Am. Chem. Soc, 1984, 106, 4630).

I formel (I-A-a), (I-A-b) og (I-A-c)<*>har alle substituenter den samme betydning som definert i formel (I-A)<*>, halo er et halogenatom og R<17>er metyl eller butyl.

Pa grunn av deres uventede egenskap til å lett penetrere blod-hjerne-barribarrieren, administreres de radiomerkede forbindelser omfattende et radioaktivt halogenatom fordelaktig in vivo, i en passende sammensetning til et dyr, spesielt et varmblodig dyr, og lokaliseringen av de radiomerkede forbindelser detekteres ved å anvende avbildningsteknikker, slik som, for eksempel, enfotontomografi (SPECT) eller positronsemissjonstomografl (PET) og lignende. Pa denne måte kan fordelingen av mGlul-reseptorseter gjennom hele kroppen detekteres og organer inneholdende mGlul-reseptorseter slik som, for eksempel, hjernen, kan visualiseres ved avbildingsteknikkene nevnt over. Denne prosess for å avbilde et organ ved å administrere en radiomerket forbindelse med formel (I-A)<*>eller (I-A)<*>, som binder til mGlul-reseptorsetene og detektering av emissjonene fra den radioaktive forbindelse utgjør også et aspekt av den foreliggende oppfinnelse.

Anvendelsen av forbindelsene med formel (a), (b), (c), (d) og (e) i de over beskrevne teknikker utgjør et ytterligere aspekt av den foreliggende oppfinnelse. Oppfinnelsen vedrører spesielt anvendelsen av forbindelsene i henhold til oppfinnelsen for fremstillingen av et diagnostisk verktøy for anvendelse i PET. For anvendelse i PET er mest foretrukket radiomerkede forbindelser i henhold til oppfinnelsen, hvor en<18>F er innlemmet (US 4 931 270 fra Horn et al., publisert 5. juni 1990).

Fremstilling av de ikke- radioaktive forbindelser

De ikke-radioaktive forbindelser i henhold til oppfinnelsen kan fremstilles på mange forskjellige måter.

For å forenkle den strukturelle fremstilling av noen av de foreliggende forbindelser og intermediater i de følgende fremstillingsprosedyrer, vil kinolin- eller kinolinonenheten heretter bli representert ved symbolet Q.

Forbindelsene med formel (a), (b), (c), (d) eller (e), hvori X representerer 0, forbindelsene er representert ved formel (Ia/b-s)/kan fremstilles ved å oksidere et intermediat med formel (II) i nærvær av et passende oksidasjonsmiddel, slik som kaliumpermanganat, og en passende faseoverføringskatalysator, slik som tris(dioksa-3,6-heptyl)amin, i et passende reaksjonsinert løsningsmiddel, slik som for eksempel diklormetan.

Forbindelser med formel (U/B-a) kan også fremstilles ved å reagere et intermediat med formel (III) med et intermediat med formel (IV), hvori Wi representerer et haloatom, f.eks. brom, i nærvær av butyllitium og et passende reaksjonsinert løsningsmiddel, slik som for eksempel tetrahydrofuran.

Alternativt kan forbindelser med formel (U/B-a) også fremstilles ved å reagere et intermediat med formel (V) med et intermediat med formel (IV) i nærvær av butyllitium og et passende reaksjonsinert løsningsmiddel, slik som for eksempel tetra hyd rof uran.

Forbindelser med formel (U/B-a), hvori R^substituenten er bundet til ka rbony len heten via et oksygenatom, P^-substituent er representert ved 0-R<la>og forbindelsene med formel (IA/B-a-l), kan fremstilles ved å reagere et intermediat med formel (VI) med et intermediat med formel (VII) i nærvær av en passende syre, slik som svovelsyre.

Forbindelser med formel (I-A), hvori R<2>representerer metylkarbonyl, forbindelsene er representert ved formel (I-A-l), kan fremstilles ved å reagere et intermediat med formel (VIII) i nærvær av en passende syre, slik som saltsyre, og et passende reaksjonsinert løsningsmiddel, slik som for eksempel tetra hyd rof uran.

Forbindelsene med formel (I) kan også omdannes til hverandre ved å følge kjente transformasjoner i faget.

Forbindelser med formel (I-A) hvori R<2>er et haloatom, slik som klor, kan omdannes til en forbindelse med formel (I-A), hvori R2 er et annet haloatom, slik som fluor eller jod, ved reaksjon med et passende halogeneringsmiddel, slik som for eksempel kaliumfluorid eller natriumjodid, i nærvær av et passende reaksjonsinert løsningsmiddel, f.eks. dimetylsulfoksid eller acetonitril og eventuelt i nærvær av acetyl klorid.

Forbindelser med formel (I-A), hvori R2 er en passende utgående gruppe, slik som et haloatom, f.eks. klor, jod, den utgående gruppe er representert ved W<2>og forbindelsene ved (I-A-2), kan omdannes til en forbindelse med formel (I-A) hvori R<2>er cyano, forbindelsen er representert ved formel (I-A-3), ved reaksjon med et passende cyano-introduserende middel, slik som for eksempel trimetylsilankarbonitril, i nærvær av en passende base slik som /V,/V-dietyletanamin og en passende katalysator, slik som for eksempel tetrakis(trifenylfosfin)palladium.

Forbindelser med formel (I-A-2) kan også omdannes til en forbindelse med formel (I-A-4) ved reaksjon med C2-6alkynyltri(Ci.6alkyl)silan i nærvær av Cul, en passende base, slik som for eksempel /V,/V-dietyletanamin, og en passende katalysator, slik som for eksempel tetrakis(trifenylfosfin)palladium. Forbindelser med formel (I-A-4) kan i sin tur omdannes til en forbindelse med formel (I-A-5) ved reaksjon med kaliumfluorid i nærvær av en passende syre slik som eddiksyre, eller ved reaksjon med en passende base, slik som kaliumhydroksid, i nærvær av et passende reaksjonsinert løsningsmiddel, slik som en alkohol, f.eks. metanol og lignende.

Forbindelser med formel (I-A-2) kan også omdannes til en forbindelse med formel (I-A-6) ved reaksjon med et intermediat med formel (IX) i nærvær av Cul, en passende base, slik som for eksempel /V,/V-dietyletanamin, og en passende katalysator slik som tetrakis(trifenylfosfin)palladium.

Forbindelser med formel (I-A-2) kan også omdannes til en forbindelse hvori R<2>er Ci-6alkyl, forbindelsen er representert ved formel (I-A-8) i nærvær av et passende alkyleringsmiddel, slik som for eksempel Sn(Ci.6alkyl)4, eller til en forbindelse hvori R<2>er C2-6alkenyl, forbindelsen er representert ved formel (I-A-9) i nærvær av et passende alkenyleringsmiddel, slik som for eksempel Sn(C2-6alkenyl)

(Ci-6alkyl)3, begge reaksjoner i nærvær av en passende katalysator, slik som for eksempel tetrakis(trifenylfosfin)palladium og et reaksjonsinert løsningsmiddel, slik som for eksempel toluen eller dioksan.

Forbindelser med formel (I-A-2) kan også omdannes til en forbindelse med formel (I-A-7) hvori Z representerer O eller S, ved reaksjon med et intermediat med formel (X) eventuelt i nærvær av en passende base slik som dikaliumkarbonat og et reaksjonsinert løsningsmiddel, slik som /V,/V-dimetylformamid.

Forbindelser med formel (I-A-2) kan også omdannes til en forbindelse med formel (I-A), hvori R<2>er Ci-6alkyloksykarbonyl, forbindelsen er representert ved formel (I-A-10) og en forbindelse med formel (I-A), hvori R2 er hydrogen, forbindelsen er representert ved formel (I-A-ll), ved reaksjon med en passende alkohol med formel Ci-6alkylOH og CO i nærvær av en passende katalysator, slik som for eksempel palladium(II)acetat, trifenylfosfin, en passende base slik som dikaliumkarbonat og et reaksjonsinert løsningsmiddel, slik som N, N-dimetylformamid.

Forbindelser med formel (I-A-ll) kan også fremstilles ved å reagere en forbindelse med formel (I-A-2) med Zn i nærvær av en passende syre slik som eddiksyre.

Forbindelser med formel (I-A-2) kan også omdannes til en forbindelse med formel (I-A), hvori R<2>er aminokarbonyl substituert med Ci-6alkyloksykarbonylCi-6alkyl, forbindelsen er representert ved formel (I-A-12), ved reaksjon med et intermediat med formel H2N-Ci-6alkyl-C(=0)-0-Ci-6alkyl i nærvær av CO, en passende katalysator slik som tetrakis(trifenylfosfin)palladium, en passende base, slik som for eksempel /V,/V-dietyletanamin, og et passende reaksjonsinert løsningsmiddel, slik som for eksempel toluen. Forbindelser med formel (I-A-2) kan også omdannes til en forbindelse med formel (I-A) hvori R2 er aryl eller en heterocykel valgt fra gruppen beskrevet i definisjonen av R2 over, nevnte R<2>er representert ved R<2a>og forbindelsen ved formel (I-A-13) ved reaksjon med et intermediat med formel (XI), (XII) eller (XIII) i nærvær av en passende katalysator slik som for eksempel tetrakis(trifenylfosfin)palladium og et passende reaksjonsinert løsningsmiddel, slik som for eksempel dioksan.

Forbindelser med formel (I-A-2) kan også omdannes til en forbindelse med formel (I-B), hvori Y og R<5>er tatt sammen for å danne et radikal med formel (b-1) eller (b-2), forbindelsen er representert ved formel (I-B-l) eller (I-B-2), ved reaksjon med hydrazinkarboksaldehyd eller natriumazid i et passende reaksjonsinert løsningsmiddel, slik som en alkohol, f.eks. butanol, eller /V,/v-dimetylformamid.

Forbindelser med formel (I-A-ll) kan omdannes til det tilsvarende /V-oksid, representert ved formel (I-A-14), ved reaksjon med et passende peroksid, slik som 3-klor-benzenkarboperoksosyre, i et passende reaksjonsinert løsningsmiddel, slik som for eksempel metylenklorid. Forbindelsen med formel (I-A-14) kan videre omdannes til en forbindelse med formel (I-B), hvori R<5>er hydrogen, forbindelsen er representert ved formel (I-B-3), ved reaksjon med 4-metyl-benzensulfonylklorid i nærvær av en passende base, slik som for eksempel dikaliumkarbonat og et passende reaksjonsinert løsningsmiddel, slik som for eksempel metylenklorid.

Forbindelser med formel (I-B-3) kan også fremstilles fra en forbindelse med formel (I-A), hvori R2 er Ci-6alkyloksy, forbindelsen er representert ved formel (I-A-15), ved reaksjon med en passende syre, slik som saltsyre, i nærvær av et passende reaksjonsinert løsningsmiddel, slik som for eksempel tetra hyd rof uran.

Forbindelser med formel (I-B-3) kan omdannes til en forbindelse med formel (I-B), hvori R<5>representerer d.6alkyl, forbindelsen er representert ved formel (I-B-4), ved reaksjon med et passende alkyleringsmiddel, slik som for eksempel et intermediat med formel (XIV), hvori W3representerer en passende utgående gruppe slik som et haloatom f.eks. jod, i nærvær av kalium-tert.-butoksid og i nærvær av et passende reaksjonsinert løsningsmiddel, slik som for eksempel tetra hyd rof uran.

Forbindelser med formel (I-B-3) kan også omdannes til en forbindelse med formel (I-B), hvori R<5>er Ci-6alkyloksykarbonylCi-6alkyl eller arylCi-6alkyl, nevnte R<5>er representert ved R<5a>og forbindelsen er representert ved formel (I-B-5), ved reaksjon med et intermediat med formel (XV), hvori W4representerer en passende utgående gruppe, slik som et haloatom, f.eks. brom, klor og lignende, i nærvær av en passende base, slik som for eksempel natriumhydrid og et passende reaksjonsinert løsningsmiddel, slik som for eksempel /V,/V-dimetylformamid.

Forbindelser med formel (I-A-2) kan også omdannes til en forbindelse med formel (I-B), hvori R<5>er hydrogen og Y er S, forbindelsen er representert ved formel (I-B-

6), ved reaksjon med H2N-C(=S)-NH2i nærvær av en passende base, slik som kaliumhydroksid, og et passende reaksjonsinert løsningsmiddel, slik som en alkohol, for eksempel etanol, eller vann. Forbindelser med formel (I-B-6) kan videre omdannes til en forbindelse med formel (I-A), hvori R2 er Ci-6alkyltio, forbindelsen er representert ved formel (I-A-16), ved reaksjon med et passende Ci.6alkylhalid, slik som for eksempel Ci.6alkyljodid, i nærvær av en passende base, slik som dikaliumkarbonat, og et passende løsningsmiddel, slik som for eksempel aceton. Forbindelser med formel (U/B-a) kan omdannes til forbindelser med formel (I-A) eller (I-B), hvori X er N-R<7>, forbindelsen er representert ved formel (IA/B-b), ved reaksjon med et intermediat med formel (XVI), eventuelt i nærvær av en passende base, slik som for eksempel /V,/V-dietyletanamin, og i nærvær av et passende reaksjonsinert løsningsmiddel, slik som en alkohol, f.eks. etanol.

Som allerede indikert i fremstllingsprosedyren for forbindelser med formel (I-A-13) beskrevet over, kan forbindelsene med formel (I) også omdannes til de tilsvarende /V-oksidformer ved å følge kjente prosedyrer i faget for å konvertere et trivalent nitrogen til dets /V-oksidform. /V-oksidasjonsreaksjonen kan generelt utføres ved å reagere utgangsmaterialet med formel (I) med et passende organisk eller uorganisk peroksid. Passende uorganiske peroksider omfatter, for eksempel, hydrogenperoksid, alkalimetall- eller jordalkalimetallperoksider, f.eks. natriumperoksid, kaliumperoksid; passende organiske peroksider kan omfatte peroksysyrer slik som, for eksempel, benzenkarboperoksosyre eller halosubstituert benzen ka rboperoksosyre, f.eks. 3-klorbenzenkarboperoksosyre, peroksoalkansyrer, f.eks. peroksoeddiksyre, alkylhydroperoksider, f.eks. tert-butylhydroperoksid. Passende løsningsmidler er, for eksempel, vann, lavere alkanoler, f.eks. etanol og lignende, hydrokarboner, f.eks. toluen, ketoner, f.eks. 2-butanon, halogenerte hydrokarboner, f.eks. diklormetan, og blandinger av slike løsningsmidler.

Noen av intermediatene og utgangsmaterialene anvendt i reaksjonsprosedyrene over er kommersielt tilgjengelige, eller kan syntetiseres i henhold til prosedyrer allerede beskrevet i litteraturen.

Intermediater med formel (II) kan fremstilles ved å reagere et intermediat med formel (XVII) med et intermediat med formel (XVIII), hvori W5representerer en passende utgående gruppe slik som et haloatom, f.eks. klor, brom og lignende, i nærvær av magnesium, dietyleter og et passende reaksjonsinert løsningsmiddel, slik som dietyleter.

Intermediater med formel (XVII) kan fremstilles ved å oksidere et intermediat med formel (XIX) i nærvær av et passende oksidasjonsmiddel, slik som Mn02, og et passende reaksjonsinert løsningsmiddel, slik som metylenklorid.

Intermediater med formel (XIX) kan fremstilles ved å redusere et intermediat med formel (XX) i nærvær av et passende reduksjonsmiddel slik som litiumaluminiumhydrid, og et passende reaksjonsinert løsningsmiddel, slik som tetra hyd rof uran. Intermediater med formel (XX), hvori Q representerer en kinolinenhet eventuelt substituert i stilling 3 med Ci-6alkyl og hvori karbonylenheten er plassert i stilling 6, intermediatene er representert ved formel (XX-a), kan fremstilles ved å reagere et intermediat med formel (XXI) med et intermediat med formel (XXII) i nærvær av natrium 3-nitro-benzensulfonat, en passende syre, slik som svovelsyre, og en passende alkohol, f.eks. metanol, etanol, propanol, butanol og lignende.

Alternativt kan intermediater med formel (II) også fremstilles ved å reagere et intermediat med formel (XXIII) med et intermediat med formel (XXIV), hvori W6er en passende utgående gruppe, slik som et haloatom, f.eks. brom, klor og lignende, i nærvær av et passende middel, slik som butyllitium og et passende reaksjonsinert løsningsmiddel, slik som tetra hyd rof uran.

Intermediater med formel (XXIII) kan fremstilles ved å oksidere et intermediat med formel (XXV) ved å anvende Moffatt Pfitzner- eller Swern-oksidasjonen (dimetylsulfoksidaddukter med tørkemidler f.eks. DCC, Ac20, S03, P4Oi0, COCI2eller CI-CO-COCI) i et inert løsningsmiddel slik som metylenklorid.

Intermediater med formel (XXV) kan fremstilles ved å redusere et intermediat med formel (XXVI) i nærvær av et passende reduksjonsmiddel, slik som for eksempel litiumaluminiumhydrid og et passende reaksjonsinert løsningsmiddel, slik som benzen.

Intermediater med formel (XXVI) kan fremstilles fra et intermediat med formel (XXVII) ved forestering i nærvær av en passende alkohol, slik som metanol, etanol, propanol, butanol og lignende, og en passende syre, slik som svovelsyre.

Intermediater med formel (XXVII), hvori R<1>representerer et radikal med formel (a-1) med Zi som er O, Z2er CH2og n er 1, intermediatene er representert ved formel (XXVII-a), kan fremstilles ved å redusere et intermediat med formel (XXVIII) i nærvær av et passende reduksjonsmiddel slik som hydrogen, og en passende katalysator, slik som palladium på trekull, og en passende syre slik som eddiksyre. Når R<1>i intermediat (XXVII) representerer en eventuelt substituert fenylenhet, kan den også omdannes til en eventuelt substituert cykloheksylenhet ved reduksjon i nærvær av et passende reduksjonsmiddel slik som rodium på Al203, og et passende reaksjonsinert løsningsmiddel, slik som tetra hyd rof uran.

Intermediater med formel (IV), hvori Q representerer en kinolinenhet substituert i stilling 2 med halo, f.eks. klor, intermediatene er representert ved formel (IV-a), kan fremstilles ved å reagere et intermediat med formel (IV), hvori Q representerer en kinolinonenhet med R<5>som er hydrogen, intermediatet er representert ved formel (IV-b), i nærvær av POCI3.

Intermediater med formel (IV-a), hvori R<4>er hydrogen, intermediatene er representert ved formel (IV-a-1), kan også fremstilles ved å reagere et intermediat med formel (XXIX) med POCI3i nærvær av /V,/V-dimetylformamid (Vilsmeier-Haack-formylering etterfulgt av cyklisering).

Intermediater med formel (XXIX) kan fremstilles ved å reagere et intermediat med formel (XXX) med et intermediat med formel (XXXI), hvori W7representerer en passende utgående gruppe, slik som et haloatom, f.eks. klor, i nærvær av en passende base, slik som for eksempel /V,/V-dietyletanamin, og et passende reaksjonsinert løsningsmiddel, slik som metylenklorid.

Intermediater med formel (IV-a) kan omdannes til et intermediat med formel (IV-c) ved reaksjon med et intermediat med formel (XXXII) i nærvær av et passende reaksjonsinert løsningsmiddel, slik som en alkohol, f.eks. metanol og lignende. Intermediater med formel (IV-a) kan også omdannes til et intermediat med formel (IV-d-1) ved reaksjon med et passende amin med formel (XXXIII-a), hvori Z3og Z4hver uavhengig representerer hydrogen, Ci-6alkyl, Ci-6alkyloksyCi-6alkyl, Ci-6alkyltioCi.6alkyl eller til et intermediat med formel (IV-d-2) ved reaksjon med et passende amin med formel (XXXIII-b), hvori Z3og Z4er tatt sammen for å danne en heterocykel som definert i det overnevnte i definisjonen av R2 forutsatt at heterocykelen omfatter minst ett nitrogenatom, i nærvær av en passende base, slik som for eksempel dikaliumkarbonat, og et reaksjonsinert løsningsmiddel, slik som /V,/V-dimetylformamid.

Intermediater med formel (IV-a), hvori R<3>representerer CH2-CH2-CH2-CI, intermediatene er representert ved formel (IV-a-2), kan også omdannes til et intermediat med formel (IV), hvori R2 og R<3>er tatt sammen for å danne et bivalent radikal med formel -0-CH2-CH2-CH2-, intermediatet er representert ved formel (IV-e-1), ved reaksjon med en passende syre, slik som saltsyre og lignende. Intermediater med formel (IV-a-2) kan også omdannes til et intermediat med formel (IV), hvori R2 og R<3>er tatt sammen for å danne et bivalent radikal med formel -S-CH2-CH2-CH2-, intermediatet er representert ved formel (IV-e-2), ved reaksjon med H2N-C(=S)-NH2i nærvær av et passende reaksjonsinert løsningsmiddel, slik som en alkohol, f.eks. etanol.

Intermediater med formel (V) kan fremstilles ved å reagere et intermediat med formel (XXVII) med et intermediat med formel CH3-NH-0-CH3i nærvær av l,l'-karbonyldiimidazol og et passende reaksjonsinert løsningsmiddel, slik som metylenklorid.

Intermediater med formel (VII), hvori Q representerer en kinolinenhet, spesielt en kinolinenhet hvori R2 er etyl, R<3>er metyl og R<4>er hydrogen, og karboksylenheten er plassert i stilling 6, intermediatene er representert ved formel (VII-a), kan fremstilles ved reaksjon et intermediat med formel (XXXIV) i nærvær av et passende aldehyd, slik som CH3-CH2-CH(=0), (CH20)n, ZnCI2, FeCI3og et passende reaksjonsinert løsningsmiddel, slik som en alkohol, for eksempel etanol. Intermediater med formel (VIII) kan fremstilles ved å reagere et intermediat med formel (XXXV) med et intermediat med formel (XXXVI) i nærvær av en passende katalysator, slik som for eksempel tetrakis(trifenylfosfin)palladium og et passende reaksjonsinert løsningsmiddel, slik som for eksempel dioksan.

Enda noen andre fremstillinger kan tenkes ut, noen av dem er beskrevet ytterligere i denne søknad med eksemplene.

Rene stereoisomere former av forbindelsene og intermediatene av denne oppfinnelse kan oppnås ved anvendelsen av kjente prosedyrer i faget. Diastereomerer kan separeres ved fysiske separasjonsmetoder slik som selektiv krystallisasjon og kromatografiske teknikker, f.eks. væskekromatografi ved å anvende kirale stasjonærfaser. Enantiomerer kan separeres fra hverandre ved den selektive krystallisasjon av deres diastereomere salter med optisk aktive syrer. Alternativt kan enantiomerer separeres ved kromatografiske teknikker ved å anvende kirale stasjonærfaser. De rene stereoisomere former kan også avledes fra de tilsvarende rene stereoisomere former av de passende utgangsmaterialer, forutsatt at reaksjonen skjer stereoselektivt eller stereospesifikt. Fortrinnsvis, hvis en spesifikk stereoisomer er ønsket, vil forbindelsen bli syntetisert ved stereoselektive eller stereospesifikke fremstillingsmetoder. Disse metoder vil fordelaktig anvende kiralt rene utgangsmaterialer. Stereoisomere former av forbindelsene med formel (I) er åpenbart ment å bli inkludert innenfor rammen av oppfinnelsen.

En stereoisomer av en forbindelse med formel (a), (b), (c), (d) eller (e) slik som en c/s-form, kan omdannes til en annen stereoisomer slik som den tilsvarende trans-form ved å reagere forbindelsen med en passende syre, slik som saltsyre, i nærvær av et passende reaksjonsinert løsningsmiddel, slik som for eksempel tetra hyd rof uran.

Den mGluRl-antagonistiske aktivitet av de foreliggende forbindelser kan demonstreres i testen signal-transduksjonsklonede rotte mGluRl i CHO-celler og den kalde allodynia-test i rotter med en Bennett-ligasjon, som beskrevet heretter.

Pa grunn av deres mGluR-antagonistiske aktivitet, mer spesielt deres Gruppe I mGluR-antagonistiske aktivitet og enda mer spesielt, deres mGluRl-antagonistiske aktivitet, er forbindelsene med formel (a), (b), (c), (d) eller (e), deres /V-oksider, farmasøytisk akseptable addisjonssalter, kvaternære aminer og stereokjemisk isomere former nyttige i behandlingen eller forebyggingen av glutamat-induserte sykdommer i sentralnervesystemet. Sykdommer hvor en rolle for glutamat har blitt demonstrert inkluderer legemiddelavhengighet eller abstinens (avhengighet, opioidtoleranse, opioidavvenning), hypoksiske, anoksiske og iskemiske skader (iskemisk slag, hjertestans), smerte (nevropatisk smerte, inflammatorisk smerte, hyperalgesi), hypoglykemi, sykdommer relatert til nevronal skade, hjernetraume, hodetraume, ryggmargsskade, myelopati, demens, angst, schizofreni, depresjon, svekket kognisjon, amnesi, bipolare forstyrrelser, atferdsforstyrrelser, Alzheimers sykdom, vaskulær demens, blandet (Alzheimers og vaskulær) demens, Lewy Body sykdom, delirium eller forvirring, Parkinsons sykdom, Huntingtons sykdom, Downs syndrom, epilepsi, aldring, amyotrofisk lateral sklerose, multippel sklerose, AIDS (ervervet immunsviktsyndrom) og AIDS-relatert kompleks (ARC).

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også sammensetninger for administrasjonen til pattedyr, spesielt mennesker, spesielt for diagnostisk formål, mer spesielt for avbilding av et organ omfattende en terapeutisk effektiv mengde av en radiomerket forbindelse med formel (a), (b), (c), (d) eller (e) og en farmasøytisk akseptabel bærer eller fortynningsmiddel.

Derfor kan forbindelsene av den foreliggende oppfinnelse eller enhver undergruppe derav formuleres til forskjellige farmasøytiske former for administrasjonsformål. Som passende sammensetninger kan det nevnes alle sammensetninger vanligvis anvendt for systemisk administering av legemidler. For å fremstille de farmasøytiske sammensetninger av denne oppfinnelse kombineres en terapeutisk effektiv mengde av en spesiell forbindelse, i base- eller addisjonssaltform, som den aktive ingrediens i tett blanding med en farmasøytisk akseptabel bærer, hvilken bærer kan ha en vid variasjon av former avhengig av preparatformen ønsket for administrasjon. Disse farmasøytiske sammensetninger er ønskelig i enhetsdoseringsform passende, fortrinnsvis, for administrasjon oralt, rektalt, topisk, perkutant eller ved parenteral injeksjon. For eksempel, i fremstilling av sammensetningene i oral doseringsform, kan enhver av de vanlige farmasøytiske medier anvendes, slik som, for eksempel, vann, glykoler, oljer, alkoholer og lignende i tilfellet av orale flytende preparater slik som suspensjoner, siruper, emulsjoner, eliksirer og løsninger: eller faste bærere slik som stivelser, sukkere, kaolin, smøremidler, bindemidler, desintegrerende midler og lignende i tilfellet av pulvere, piller, kapsler og tabletter. Pa grunn av deres letthet ved administrasjon, representerer tabletter og kapsler den mest fordelaktige orale doseringsenhetsform, i hvilket tilfelle faste farmasøytiske bærere åpenbart anvendes. For parenterale sammensetninger vil bæreren vanligvis omfatte sterilt vann, i det minste for en stor del, selv om andre ingredienser, for eksempel, for å hjelpe på løselighet, kan inkluderes. Injiserbare løsninger kan, for eksempel, fremstilles hvor bæreren omfatter salineløsning, glukoseløsning eller en blanding av saline- og glukoseløsning. Injiserbare suspensjoner kan også fremstilles i hvilket tilfelle passende flytende bærere, suspensjonsmidler og lignende kan anvendes. Også inkludert er fastform preparater som er ment å bli omdannet, kort før bruk, til preparater med flytende form. Som passende sammensetninger for topisk applikasjon kan det nevnes alle sammensetninger vanligvis anvendt for topisk administrasjon av legemidler f.eks. kremer, gel, forbindinger, sjampoer, tinkturer, pastaer, salver, balsamer, pulvere og lignende. I sammensetningene passende for perkutan administrasjon omfatter bæreren eventuelt et penetrasjonsforbedrende middel og/eller et passende fuktemiddel, eventuelt kombinert med passende additiver av enhver natur i mindre proporsjoner, hvilke additiver ikke forårsaker en signifikant skadelig effekt på huden. Additivene kan lette administrasjonen til huden og/eller kan være nyttig for å fremstille de ønskede sammensetninger. Disse sammensetninger kan administreres på forskjellige måter, f.eks., som et transdermalt plaster, som en "spot-on", som en salve.

Det er spesielt fordelaktige å formulere de ovennevnte farmasøytiske sammensetninger i enhetsdoseringsform for å lette administrasjon og uniformitet av dosering. Enhetsdoseringsform som anvendt i beskrivelsen og kravene heri refererer til fysisk diskrete enheter passende som enhetsdoseringer, hver enhet inneholdende en forbestemt kvantitet av aktiv ingrediens beregnet for å frembringe den ønskede terapeutiske effect sammen med den nødvendige farmasøytisk bærer. Eksempler på slike enhetsdoseringsformer er tabletter (inklusive skårne eller belagte tabletter), kapsler, piller, suppositorier, pulverpakker, kjeks, injiserbare løsninger eller suspensjoner, teskjefuller, spiseskjefuller og lignende, og segregerte multipler derav.

Den diagnostisk effektive dose eller administrasjonsfrekvens avhenger av den spesielle forbindelse med formel (a), (b), (c), (d) eller (e) anvendt og den spesielle tilstand til pattedyret som behandles, hvilket er velkjent for fagmannen.

De følgende eksempler er ment å illustrere og ikke begrense omfanget av den foreliggende oppfinnelse.

Eksperimentell del

Heretter er "DMF" definert som /V,/V-dimetylformamid, "DIPE" er definert som diisopropyleter, "DMSO" er definert som dimetylsulfoksid, "BHT" er definert som 2,6-bis(l,l-dimetyletyl)-4-metylfenol og "THF" er definert som tetra hyd rof uran.

A. Fremstilling av intermediatene

Eksempel Al

En blanding av 4-(l-metyletoksy)benzosyre (0,083 mol) og Rh/Al2035 % (10 g) i TH F (220 ml) ble hydrogenen ved 50 °C (under 3 bar H2-trykk) i 1 natt. Blandingen ble filtrert over celite, vasket med THF og dampet inn. Utbytte: 16 g av intermediat 1 (100 %).

Eksempel A2

Fremstilling av 2-etyl-3-metyl-6-kinolinkarboksylsyre (interm. 2)

En blanding av 4-aminobenzosyre (0,299 mol) i etanol (250 ml) ble omrørt ved romtemperatur. ZnCI2(0,0367 mol) og (CH20)n(10 g) ble tilsatt. FeCI3.6H20 (0,5 mol) ble tilsatt porsjonsvis og temperaturen steg til 60-65 °C. Propanal (30 ml) ble tilsatt dråpevis over en periode på 2 timer. Blandingen ble refluksert i 2 timer og holdt ved romtemperatur i 12 timer. Blandingen ble helt i vann og filtrert gjennom celite. Filtratet ble surgjort til pH=7med HCI 6 N og blandingen ble dampet inn til tørrhet. Residuet ble anvendt uten ytterligere rensing. Utbytte: 56,1 g 2-etyl-3-metyl-6-kinolinkarboksylsyre (interm. 2).

Eksempel A3

Pentanoylklorid (0,2784 mol) ble tilsatt ved 5 °C til en blanding av 4-brombenzenamin (0,232 mol) og /V,/V-dietyletanamin (0,2784 mol) i CH2CI2(400 ml). Blandingen ble omrørt ved romtemperatur natten over, helt ut i vann og ekstrahert med CH2CI2. Den organiske fase ble separert, vasket med en konsentrert NH4OH-løsning og vann, tørket (MgS04), filtrert og løsningsmidlet ble dampet inn. Residuet (60 g) ble krystallisert fra dietyleter. Presipitatet ble filtrert fra og tørket. Residuet (35 g, 63 %) ble tatt opp i CH2CI2. Den organiske fase ble separert, vasket med en 10 % K2C03-løsning, vasket med vann, tørket (MgS04), filtrert og løsningsmidlet ble dampet inn. Utbytte: 30 g av intermediat (3) (54 %).

Eksempel A4

En blanding av 6-brom-2(lH)-kinolinon (0,089 mol) i POCI3(55 ml) ble omrørt ved 60 °C natten over, deretter ved 100 °C i 3 timer og løsningsmidlet ble dampet inn. Residuet ble tatt opp i CH2CI2, helt ut i isvann, gjort basisk med NH4OH kons., filtrert over celite og ekstrahert med CH2CI2. Den organiske fase ble separert, tørket (MgS04), filtrert og løsningsmidlet ble dampet inn. Utbytte: 14,5 g av intermediat (4) (67 %).

Eksempel A5

DMF (37ml) ble tilsatt dråpevis ved 10 °C under N2-strøm til POCI3(108 ml). Etter fullstendig tilsetning ble blandingen tillatt å varme til romtemperatur. /V-(4-brom-fenyl)butanamid (0,33 mol) ble tilsatt porsjonsvis. Blandingen ble omrørt ved 85 °C natten over, deretter tillatt å avkjøle til romtemperatur og helt ut på er (eksoterm reaksjon). Presipitatet ble filtrert fra, vasket med en liten mengde vann og tørket (vakuum). Residuet ble vasket med EtOAc/dietyleter og tørket. Utbytte: 44,2 g av intermediat (5) (50 %).

En blanding av intermediat (5) (0,162 mol) i metanol (600 ml), og en løsning av metanolnatriumsalt i metanol ved 35 % (154 ml) ble omrørt og refluksert natten over. Blandingen ble helt ut på is. Presipitatet ble filtrert fra, vasket med en liten mengde vann og tatt opp i CH2CI2. K2C0310 % ble tilsatt og blandingen ble ekstrahert med CH2CI2. Den organiske fase ble separert, vasket med vann, tørket

(MgS04), filtrert og løsningsmidlet ble dampet inn. Utbytte: 31,9 g av intermediat (6) (74 %).

Eksempel A6

l,l'-karbonylbis-lW-imidazol (0,074 mol) ble tilsatt porsjonsvis til en blanding av 4-metoksycykloheksankarboksylsyre (0,063 mol) i CH2CI2(200 ml). Blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 1 time. Deretter ble /V-metoksymetanamin (0,074 mol) tilsatt. Blandingen ble omrørt ved romtemperatur natten over, helt ut i H20 og ekstrahert med CH2CI2. Den organiske fase ble separert, vasket flere ganger med H20, tørket (MgS04), filtrert og løsningsmidlet ble dampet inn. Utbytte: 12,6 g av interm. 7.

Eksempel A7

a) En blanding av 6-fluor-4-okso-4H-l-benzopyran-2-karboksylsyre (0,30 mol) i eddiksyre (400 ml) ble hydrogenert med Pd/C (3 g) som en katalysator. Etter

opptak av H2(3 ekv) ble katalysatoren filtrert fra. Filtratet ble dampet inn. Residuet ble omrørt i petroleumseter. Presipitatet ble filtrert fra og tørket (vakuum; 70 °C). Etter omkrystallisasjon fra CHCI3/CH3OH ble presipitatet filtrert fra og tørket (vakuum; 80 °C og høyvakuum; 85 °C). Utbytte: 8,8 g 6-fluor-3,4-dihydro-2A/-l-benzopyran-2-karboksylsyre (interm. 8) (15,0 %). b) En blanding av intermediat (8) (0,255 mol) i etanol (400 ml) og H2S04(5 ml) ble omrørt og refluksert i 8 timer. Løsningsmidlet ble dampet inn til tørrhet. Residuet

ble løst i CH2CI2. Den organiske fase ble separert, vasket med K2C0310 %, tørket (MgS04), filtrert og løsningsmidlet ble dampet inn. Utbytte: 45 g av etyl 6-fluor-3,4-dihydro-2W-l-benzopyran-2-karboksylat (interm. 9) (79 %).

c) Reaksjon under N2. En blanding av natrium-bis(2-metoksyetoksy)aluminum-hydrid, 70 vekt % løsning i metylbenzen 3,4 M (0,44 mol) i benzen (150 ml)

(refluks) ble tilsatt dråpevis i løpet av 1 time til en refluksert blanding av interm. 9 (0,22 mol) og benzen (600 ml). Etter omrøring i 2,5 timer ved reflukstemperatur ble blandingen avkjølt til ±15 °C. Blandingen ble dekomponert ved dråpevis tilsetning av etanol (30 ml) og vann (10 ml). Denne blanding ble helt ut på is/vann og denne blanding ble surgjort med konsentrert saltsyre. Denne blanding ble ekstrahert med dietyleter (500 ml). Den separert organiske fase ble vasket med vann, tørket, filtrert og løsningsmidlet ble dampet inn. Residuet ble renset vd kolonnekromatografi over silikagel (eluent: CHCI3). Den ønskede fraksjon ble

samlet og eluenten ble dampet inn. Utbytte: 34 g 6-fluor-3,4-dihydro-2H-l-benzopyran-2-metanol (interm. 10) (85 %).

d) Reaksjon under N2. Til en omrørt og avkjølt (-60 °C; 2-propanon/C02-bad) blanding av etandioyldiklorid (0,1 mol) i CH2CI2(350 ml) ble sulflnylbis[metan]

(30 ml) tilsatt i løpet av 10 minutter. Etter omrøring i 10 minutter ble en blanding av interm. 10 i CH2CI2(90 ml) tilsatt i løpet av 5 minutter. Etter omrøring i 15 minutter ble /V,/V-dietyletanamin (125 ml) tilsatt. Da blandingen var varmet opp til romtemperatur, ble den helt ut i vann. Produktet ble ekstrahert med CH2CI2. Den organiske fase ble vasket med vann, HCI (1 M), vann, NaHC03(10 %) og vann, tørket og dampet inn. Residuet ble løst i dietyleter, vasket med vann, tørket, filtrert og dampet inn. Residuet ble renset ved kolonnekromatografi over silikagel (eluent: CHCI3). Den ønskede fraksjon ble samlet og eluenten ble dampet inn. Utbytte: 21,6 g 6-fluor-3,4-dihydro-2H-l-benzopyran-2-karboksaldehyd (interm.

11) (67 %).

n-butyllitium 1,6 M (0,056 mol) ble tilsatt langsomt ved -70 °C til en løsning av intermediat (5) (0,046 mol) i TH F (100 ml). Blandingen ble omrørt ved -70 °C i 30 minutter. En suspensjon av interm. 11 (0,056 mol) i THF (100 ml) ble tilsatt langsomt. Blandingen ble omrørt ved -70 °C i 1 time, deretter brakt til romtemperatur, helt ut i H20 og ekstrahert med EtOAc. Den organiske fase ble separert, tørket (MgS04), filtrert og løsningsmidlet ble dampet inn. Residuet (21 g) ble renset ved kolonnekromatografi over silikagel (eluent: cykloheksan/EtOAc 80/10; 15-35 pm). De rene fraksjoner ble samlet og løsningsmidlet ble dampet inn. Utbytte: 9,5 g av interm. 12 (55 %).

Eksempel A8

En blanding av intermediat (5) (0,1127 mol), 2-metoksyetanamin (0,2254 mol) og K2C03(0,2254 mol) i DMF (500 ml) ble omrørt ved 120 °C i 15 timer og deretter avkjølt. Løsningsmidlet ble dampet inn. Residuet ble tatt opp i CH2CI2og H20. Den organiske fase ble separert, tørket (MgS04), filtrert og løsningsmidlet ble dampet inn til tørrhet. Residuet (33,53 g) ble renset ved kolonnekromatografi over silikagel (eluent: CH2CI2/CH3OH 99,5/0,5; 15-40 um). To fraksjoner ble samlet og deres løsningsmidler ble dampet inn. Utbytte: 5,7 g av interm. 14 (38 %) og interm. 13 (34 %).

En blanding av intermediat (5) (0,0751 mol), tiomorfolin (0,0891 mol) og K2C03(0,15 mol) i DMF (200 ml) ble omrørt ved 120 °C i 12 timer. Løsningsmidlet ble dampet inn til tørrhet. Residuet ble tatt opp i CH2CI2og H20. Den organiske fase ble separert, tørket (MgS04), filtrert og løsningsmidlet ble dampet inn. Residuet (26 g) ble renset ved kolonnekromatografi over silikagel (eluent: cykloheksan/EtOAc 80/20; 20-45 pm). To fraksjoner ble samlet og deres løsningsmidler ble dampet inn. De to fraksjoner ble kombinert. Utbytte: 9,4 g av interm. 15 (37 %); smp. 82 °C.

Eksempel A9

a) 4-aminobenzosyre (0,219 mol) ble tilsatt til en løsning av natrium 3-nitrobenzensulfonat (0,118 mol) i H2S0470 % (230 ml) og blandingen ble omrørt

og refluksert. 2-propen-l,l-diol, 2-metyl-, diacetat (0,216 mol) ble tilsatt dråpevis og blandingen ble refluksert i 4 timer. Etanol (200 ml) ble tilsatt og blandingen ble omrørt ved 80 °C i 48 timer. Blandingen ble dampet inn, residuet ble helt i isvann/NH4OH og ekstrahert med CH2CI2. Den organiske fase ble tørket (MgS04) og dampet inn. Residuet ble renset ved kolonnekromatografi over silikagel (eluent: CH2CI2/2-propanol 99/1). De rene fraksjoner ble samlet og dampet inn. Utbytte: 21 g etyl 3-metyl-6-kinolinkarboksylat (interm. 16) (45 %).

b) Interm. 16 (0,098 mol) i TH F (270 ml) ble tilsatt ved 0 °C til en løsning av LiAIH4(0,098 mol) i THF under N2. Da tilsetningen var fullstendig, ble vann (10 ml)

tilsatt. Presipitatet ble filtrert fra og vasket med CH2CI2. Den organiske fase ble tørket (MgS04), filtrert fra og dampet inn. Produktet ble anvendt uten ytterligere rensing. Utbytte: 16,71 g 3-metyl-6-kinolinmetanol (interm. 17).

c) Mn02(0,237 mol) ble tilsatt til en løsning av interm. 17 (0,096 mol) i CH2CI2(200 ml) og blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 12 timer. Blandingen ble

filtrert gjennom celite og filtratet ble omrørt igjen med Mn02(20 g) i 12 timer. Mn02(10 g) ble tilsatt igjen. Blandingen ble omrørt i 12 timer. Blandingen ble filtrert gjennom celite og dampet inn. Produktet ble anvendt uten ytterligere rensing. Utbytte: 11,71 g 3-metyl-6-kinolinkarboksaldehyd (71 %) (interm. 18).

d) En løsning av bromcykloheksyl (0,14 mol) i l,l'-oksybisetan (50 ml) og Mg-spon (50 ml) ble tilsatt ved 10 °C til en blanding av THF (0,14 mol) i l,l'-oksybisetan

(10 ml). En løsning av interm. 18 (0,07 mol) i Mg-spon (100 ml) ble tilsatt forsiktig

ved 5 °C, blandingen ble helt i isvann og ekstrahert med EtOAc. Utbytte: 11,34 g (±)-a-cykloheksyl-3-metyl-6-kinolinmetanol (63 %) (interm. 19).

Eksempel A10

En blanding av forbindelse (5) (0,001507 mol), tributyl(l-etoksyetenyl)stannan (0,00226 mol) og Pd(PPh3)4(0,000151 mol) i 1,4-dioksan (5 ml) ble omrørt ved 80 °C i 3 timer. Vann ble tilsatt. Blandingen ble ekstrahert med EtOAc. Den organiske fase ble separert, tørket (MgS04), filtrert og løsningsmidlet ble dampet inn. Dette produkt ble anvendt uten ytterligere rensing. Utbytte: 1,4 g av interm. 20.

Eksempel All

En blanding av forbindelse (45) (fremstilt i henhold til B6) (0,00125 mol) i NaOH 3 N (5 ml) og iPrOH (1,7 ml) ble omrørt ved romtemperatur natten over, deretter helt ut i H20, surgjort med HCI 3 N og ekstrahert med EtOAc. Den organiske fase ble separert, tørket (MgS04), filtrert og løsningsmidlet ble dampet inn. Residuet ble tatt opp i dietyleter. Presipitatet ble filtrert fra og tørket. Utbytte: 0,26 g av intermediat 21 (56 %). (smp.: 232 °C)

Eksempel A12

En blanding av 5-brom-lH-indol-2,3-dion (0,221 mol) i NaOH 3 N (500 ml) ble omrørt ved 80 °C i 30 minutter, brakt til romtemperatur og 2-pentanon (0,221 mol) ble tilsatt. Blandingen ble omrørt og refluksert i 1 time og 30 minutter og surgjort med AcOH inntil pH=5. Presipitatet ble filtrert, vasket med vann og tørket. Utbytte: 52,3 g av intermediat 22 og intermediat 23. (Totalt utbytte: 80 %).

nBuLi 1,6 M (0,0816 mol) ble tilsatt dråpevis ved -78 °C til en suspensjon av intermediat 22 (0,034 mol) og intermediat 23 (0,034 mol) i THF (300 ml) under N2-strøm. Blandingen ble omrørt ved -78 °C i 30 minutter. nBuLi 1,6M (0,0816 mol) ble tilsatt dråpevis. Blandingen ble omrørt i 1 time. En blanding av intermediat 9 (0,102 mol) i THF (250 ml) ble tilsatt langsomt. Blandingen ble omrørt ved -78 °C til -20 °C, helt ut i H20/HCI 3 N og ekstrahert med EtOAc. Den organiske fase ble separert, tørket (MgS04), filtrert og løsningsmidlet ble dampet inn til tørrhet. Utbytte: 20,89 g av forbindelsesintermediat 24 og intermediat 25 (86 %).

Eksempel A13

4-amino-3-metoksybenzosyre (0,054 mol) ble tilsatt porsjonsvis ved romtemperatur til en løsning av 3-klor-2-etyl-2-butenal (0,065 mol) i AcOH (100 ml). Blandingen ble omrørt og refluksert i 8 timer og dampet inn til tørrhet. Residuet ble tatt opp i CH2CI2, vann ble tilsatt og løsningen ble gjort basisk med Et3N. Den organiske fase ble separert, tørket (MgS04), filtrert og løsningsmidlet ble dampet inn. Residuet ble krystallisert fra 2-propanon. Presipitatet ble filtrert fra og tørket. Utbytte: 2,5 g av interm. 26 (18 %).

CDI (0,012 mol) ble tilsatt ved romtemperatur til en løsning av interm. 26 (0,011 mol) i CH2CI2(30 ml). Blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 1 time. Metoksy-aminometyl (0,012 mol) ble tilsatt og blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 8 timer. H20 ble tilsatt. Et presipitat ble filtrert fra. Filtratet ble ekstrahert med CH2CI2. Den organiske fase ble separert, tørket (MgS04), filtrert og løsningsmidlet ble dampet inn. Residuet ble krystallisert fra dietyleter. Presipitatet ble filtrert fra og tørket. Utbytte: 0,95 g av interm. 27 (31 %) (smp.:148 °C).

Eksempel A14

4-brombenzenamin (0,034 mol) ble tilsatt ved romtemperatur til en løsning av 3-klorid-2-etyl-2-butanal (0,041 mol) i AcOH (60 ml). Blandingen ble omrørt og refluksert i 8 timer, brakt til romtemperatur og dampet inn til tørrhet. Produktet ble krystallisert fra EtOAc. Presipitatet ble filtrert, vasket med K2C0310 % og tatt opp i CH2CI2. Den organiske fase ble separert, tørket (MgS04), filtrert og løsningsmidlet ble dampet inn. Utbytte: 4,6 g av interm. 28 (54 %).

Eksempel Al5

En løsning av KOH (0,326 mol) i H20 (150 ml) ble tilsatt langsomt ved 5 °C til en løsning av 1,3-cykloheksandion (0,268 mol) i H20 (150 ml). Temperaturen må ikke nå 12 °C. Kl (2 g) deretter 2-brom-l-(4-nitrofenyl)etanon (0,294 mol) ble tilsatt porsjonsvis. Blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 48 timer. Presipitatet ble filtrert, vasket med H20 deretter med dietyleter og tørket. Utbytte: 63 g (85 %). En del av denne fraksjon (1 g) ble krystallisert fra EtOH. Presipitatet ble filtrert fra og tørket. Utbytte: 0,5 g av interm. 29 (42 %) (smp.: 100 °C).

En blanding av interm. 29 (0,145 mol) i H2S04(40 ml) ble omrørt ved romtemperatur i 1 time, helt ut i is, gjort basisk med NH4OH og ekstrahert med CH2CI2. Den organiske fase ble separert, tørket (MgS04), filtrert og løsningsmidlet ble dampet inn. Residuet ble krystallisert fra EtOH. Presipitatet ble filtrert fra og tørket. Utbytte: 31 g (58 %). En del av denne fraksjon (1 g) ble krystallisert fra

EtOH. Presipitatet ble filtrert fra og tørket. Utbytte: 0,7 g av interm. 30 (58 %)

(smp.: 200 °C).

En blanding av interm. 30 (0,039 mol), Raney-Ni (10 g) i EtOH (100 ml) ble hydrogenert ved romtemperatur under et trykk på 3 bar i 1 time. Blandingen ble filtrert over celite og vasket med CH2CI2. Den organiske fase ble separert, tørket (MgS04), filtrert og løsningsmidlet ble dampet inn. Residuet (9,5 g) ble krystallisert fra dietyleter. Presipitatet ble filtrert fra og tørket. Utbytte: 4,6 g (52 %). Filtratet ble dampet inn. Residuet (2,7 g) ble renset ved kolonnekromatografi over silikagel (eluent: CH2CI2/CH3OH; 99/1; 15-40 pm). To fraksjoner ble samlet og løsningsmidlet ble dampet inn. Utbytte: 1,6 g Fl og 1,2 g F2. F2 ble krystallisert fra EtOH. Presipitatet ble filtrert fra og tørket. Utbytte: 0,24 g av interm. 31 (2 %)

(smp.: 202 °C).

Interm. 30 (0,02 mol) ble tilsatt ved romtemperatur til en løsning av 3-klor-2-etyl-2-butenal (0,04 mol) i AcOH (50 ml). Blandingen ble omrørt og refluksert i 4 timer. Løsningsmidlet ble dampet inn til tørrhet. Residuet ble krystallisert fra EtOAc. Presipitatet ble filtrert fra og tørket. Residuet ble tatt opp i CH2CI2. Blandingen ble gjort basisk med K2C0310 % og ekstrahert med CH2CI2. Den organiske fase ble separert, tørket (MgS04), filtrert og løsningsmidlet ble dampet inn. Residuet ble krystallisert fra EtOH. Presipitatet ble filtrert fra og tørket. Utbytte: 2,5 g av interm. 32 (40 %).

Eksempel A16

En blanding av 2-(4-nitrofenyl)-l-fenyletanon (0,083 mol) og Raney-Ni (20 g) i EtOH (200 ml) ble hydrogenert ved romtemperatur i 1 time under et trykk på 3 bar, deretter filtrert over celite, vasket med CHzCVCHaOH og tørket. Utbytte: 17,5 g av interm. 33 (97 %).

Eksempel A17

DMF (12,4 ml) ble tilsatt dråpevis ved 5 °C til POCI3( 0,7536 mol). 4'-brom-5-klor-valeranilid (0,1032 mol) ble tilsatt og blandingen ble omrørt ved 75 °C i 6 timer, avkjølt ved romtemperatur og helt ut i isvann. Det uløselige ble filtrert, vasket med vann og tørket. Utbytte: 25,7 g av intermediat 34 (78 %).

En blanding av intermediat 34 (0,094 mol) i HCI 6 N (250 ml) ble omrørt og refluksert i 2 dager, avkjølt, helt ut på vann (100 ml) og nøytralisert med NH4OH (konsentrert). Det uløselige ble filtrert og vasket med vann deretter med EtOH. Utbytte: 19 g. Filtratet ble dampet inn. Residuet (9,4 g) ble renset ved kolonnekromatografi over silikagel (eluent: CH2CI2/CH3OH 99,25/0,75; 15-35 pm). En fraksjon ble samlet og løsningsmidlet ble dampet inn. Utbytte: 8 g av intermediat 35 (32 %).

B. Fremstilling av de ikke- radioaktive forbindelser

Eksempel Bl

POCI3(0,024 mol) ble tilsatt langsomt ved 5 °C til DMF (0,024 mol). Blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 30 minutter, deretter avkjølt til 5 °C. 3-okso-butansyre-etylester (0,024 mol) ble tilsatt langsomt. Blandingen ble omrørt ved 5 °C i 30 minutter. l-(4-aminofenyl)-2-fenyletanon (0,024 mol) ble tilsatt porsjonsvis. Blandingen ble omrørt ved 90 °C i 3 timer og løst i CH2CI2. Isvann ble tilsatt. Blandingen ble gjort basisk med NH4OH og ekstrahert med CH2CI2. Den organiske fase ble separert, tørket (MgS04), filtrert og løsningsmidlet ble dampet inn. Residuet ble krystallisert fra 2-propanon/dietyleter. Presipitatet ble filtrert fra og tørket. Utbytte: 0,9 g av forbindelse 306 (11 %) (smp.: 136 °C).

Eksempel B2

KMn04(10 g) ble tilsatt porsjonsvis ved romtemperatur til en løsning av

(fremstilt i henhold til eksempel A7.e) (0,022

mol)

i tris(dioksa-3,6-heptyl)amin (1 ml) og CH2CI2(100 ml). Blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 8 timer, filtrert over celite, vasket med CH2CI2og tørket. Residuet (6 g, 100 %) ble krystallisert fra dietyleter/petroleumseter. Presipitatet ble filtrert fra og tørket. Utbytte: 2 g av forbindelse (2) (33 %); smp. 82 °C.

Eksempel B3

nBuLi 1,6 M (0,07 mol) ble tilsatt langsomt ved -70 °C til en løsning av intermediat (5) (0,058 mol) i THF (150 ml). Blandingen ble omrørt ved -70 °C i 30 minutter. En løsning av 2,3-dihydro-lH-inden-2-karbonitril (0,07 mol) i THF (100 ml) ble tilsatt langsomt. Blandingen ble omrørt ved -70 °C i 1 time, brakt langsomt til romtemperatur, hydrolisert med H20 og ekstrahert med EtOAc. Den organiske fase ble separert, tørket (MgS04), filtrert og løsningsmidlet ble dampet inn. Residuet (22 g) ble renset ved kolonnekromatografi over silikagel (eluent: CH^I^ cykloheksan 80/20 til 100; 15-35 pm). De rene fraksjoner ble samlet og løsningsmidlet ble dampet inn. Den andre fraksjon ble krystallisert fra 2-propanon/dietyleter. Presipitatet ble filtrert fra og tørket. Utbytte: 0,11 g av forbindelse (3). Filtratet ble konsentrert. Utbytte: 0,55 g av forbindelse (3); smp. 145 °C.

nBuLi 1,6 M (0,022 mol) ble tilsatt langsomt ved -70 °C til en løsning av intermediat (5) (0,018 mol) i THF (50 ml). Blandingen ble omrørt ved -70 °C i 1 time, brakt til -40 °C, deretter avkjølt til -70 °C. En løsning av interm. 7 (0,018 mol) i THF (40 ml) ble tilsatt langsomt. Blandingen ble omrørt ved -70 °C i 1 time, deretter brakt til -20 °C, hydrolysen med H20 og ekstrahert med EtOAc. Den organiske fase ble separert, tørket (MgS04), filtrert og løsningsmidlet ble dampet inn. Residuet (6,5 g) ble renset ved kolonnekromatografi over silikagel (eluent: toluen/EtOAc 90/10; 15-40 pM). To fraksjoner (Fl og F2) ble samlet og løsningsmidlet ble dampet inn. Fl (2,4 g) ble krystallisert fra dietyleter. Presipitatet

ble filtrert fra og tørket. Utbytte: 1,8 g av forbindelse (4) (29 %); smp. 123 °C. F2 (0,9 g) ble krystallisert fra dietyleter. Presipitatet ble filtrert fra og tørket. Utbytte: 0,2 g av forbindelse (5) (3 %); smp. 120 °C. nBuLi 1,6M i heksan (0,107 mol) ble tilsatt dråpevis ved -78 °C under N2-strøm til en blanding av intermediat (6) (0,089 mol) i THF. Blandingen ble omrørt ved -78 °C i 1 time. En blanding av interm. 7 (150 ml) ble tilsatt ved -78 °C under N2-strøm. Blandingen ble omrørt ved -78 °C i 2 timer, brakt til 0 °C, helt ut i H20 og ekstrahert med EtOAc. Den organiske fase ble separert, tørket (MgS04), filtrert og løsningsmidlet ble dampet inn. Residuet (31 g) ble renset ved kolonnekromatografi over silikagel (eluent: cykloheksan/EtOAc 85/15; 20-45 pm). To rene fraksjoner ble samlet og deres løsningsmidler ble dampet inn. Utbytte: 11 g av forbindelse (7) (38 %) og 8,2 g av forbindelse (8) (28 %).

En løsning av klormetylbenzen (0,0069 mol) i dietyleter (8 ml) ble tilsatt langsomt til en suspensjon av Mg (0,0069 mol) i en liten mengde dietyleter. Blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 30 minutter (forsvinning av Mg), deretter avkjølt til 5 °C. En løsning av interm. 27 (0,0027 mol) i THF (8 ml) ble tilsatt langsomt. Blandingen ble omrørt ved 5 °C i 15 minutter, deretter ved romtemperatur i 2 timer, helt ut i H20 og filtrert over celite. Presipitatet ble vasket med EtOAc. Filtratet ble ekstrahert med EtOAc. Den organiske fase ble separert, tørket (MgS04), filtrert og løsningsmidlet ble dampet inn. Residuet (1 g) ble renset ved kolonnekromatografi over kromasil (eluent: CH2CI2100 til CH2CI2/CH3OH 99/1; 15-40 pm). De rene fraksjoner ble samlet og løsningsmidlet ble dampet inn. Residuet (0,5 g, 56 %) ble krystallisert fra dietyleter. Presipitatet ble filtrert fra og tørket. Utbytte: 0,14 g av forbindelse 503 (15 %).

Eksempel B4: eksempler på endeqruppemodifikasioner

(fremstilt i henhold til eksempel B3.c) (0,018 mol) i HCI 3 N (60 ml) og THF (60 ml) ble omrørt ved 60 °C natten over. Blandingen ble gjort basisk med en 10 % K2C03

-løsning og ekstrahert med CH2CI2. Den organiske fase ble separert, tørket (MgS04), filtrert og løsningsmidlet ble dampet inn. Utbytte: 4,6 g av forbindelse

(156) (82 %). (fremstilt i henhold til eksempel B3.c) (0,0122 mol) i HCI 3 N (40 ml) og THF (40 ml) ble omrørt og refluksert natten over, helt ut i vann, gjort basisk med K2C0310 % og ekstrahert med CH2CI2. Den organiske fase ble separert, tørket (MgS04), filtrert og løsningsmidlet ble dampet inn. Residuet ble renset ved kolonnekromatografi over silikagel (eluent: cykloheksan/EtOAc 40/60; 15-40 pm). De rene fraksjoner ble samlet og løsningsmidlet ble dampet inn. Utbytte: 2 g av forbindelse (9) (52 %); smp. 226 °C. En blanding av forbindelse (4) (0,0015 mol), 2-metoksyetanamin (0,003 mol) og K2C03(0,003 mol) i DMF (5 ml) ble omrørt ved 140 °C i 48 timer. H20 ble tilsatt. Blandingen ble ekstrahert med EtOAc. Den organiske fase ble separert, tørket (MgS04), filtrert og løsningsmidlet ble dampet inn. Residuet (1 g) ble renset ved kolonnekromatografi over silikagel (eluent: cykloheksan/EtOAc 60/40; 15-40 pm). To fraksjoner ble samlet og løsningsmidlet ble dampet av. Begge fraksjoner ble krystallisert separat fra pentan. Presipitatet ble filtrert fra og tørket. Utbytte: 0,05 g av forbindelse (10) (9 %; smp. 115 °C) og 0,057 g av forbindelse (11) (10 %; smp. 107 °C). En blanding av forbindelse (4) (0,0015 mol) i 2-(metyltio)etanamin (2ml) ble omrørt ved 120 °C i 8 timer. K2C0310 % ble tilsatt. Blandingen ble ekstrahert med CH2CI2. Den organiske fase ble separert, tørket (MgS04), filtrert og løsningsmidlet ble dampet inn. Residuet (2,2 g) ble renset ved kolonnekromatografi over silikagel (eluent: cykloheksan/EtOAc 70/30; 15-40 pm). To fraksjoner ble samlet og løsningsmidlet ble dampet inn. Den første fraksjon ble krystallisert fra dietyleter/petroleumseter. Presipitatet ble filtrert fra og tørket. Utbytte: 0,08 g av forbindelse (12) (14 %); smp. 120 °C. Den andre fraksjon ble krystallisert fra dietyleter. Presipitatet ble filtrert fra og tørket. Utbytte: 0,18 g av forbindelse (13) (31 %); smp. 125 °C. En blanding av forbindelse (4) (0,001507 mol), etynyltrimetylsilan (0,003013 mol), Cul (0,000151 mol) og Pd(PPh3)4(0,000151 mol) i /V,/V-dietyletanamin (5 ml) ble omrørt ved 100 °C i 24 timer. Vann ble tilsatt. Blandingen ble filtrert over celite, vasket med EtOAc og filtratet ble ekstrahert med EtOAc. Den organiske fase ble separert, tørket (MgS04), filtrert og løsningsmidlet ble dampet inn. Residuet (1,3 g) ble renset ved kolonnekromatografi over silikagel (eluent: cykloheksan/EtOAc 85/15; 15-40 pm). De rene fraksjoner ble samlet og løsningsmidlet ble dampet inn. Residuet (0,3 g) ble krystallisert fra pentan. Presipitatet ble filtrert fra og tørket. Utbytte: 0,11 g av forbindelse (14) (18 %); smp. 114 °C. En blanding av forbindelse (14) (0,013 mol) og KF (0,038 mol) i eddiksyre (50 ml) ble omrørt ved romtemperatur i 2 timer. H20 ble tilsatt og blandingen ble ekstrahert med dietyleter. Den organiske fase ble separert, tørket (MgS04), filtrert og løsningsmidlet ble dampet inn. Residuet (4,4 g) ble renset ved kolonnekromatografi over silikagel (eluent: cykloheksan/EtOAc 70/30; 15-40 pm). En fraksjon ble samlet og løsningsmidlet ble dampet inn. Denne fraksjon (3 g, 73 %) ble krystallisert fra dietyleter. Presipitatet ble filtrert fra og tørket. Utbytte: 2,45 g av forbindelse (15) (60 %); smp. 132 °C.

fremstilt i henhold til eksempel B.7.a) (0,0056 mol) i KOH [1 M, H20] (10 ml) og metanol (30 ml) ble omrørt ved romtemperatur i 1 time, helt ut i vann og ekstrahert med EtOAc. Den organiske fase ble separert, tørket (MgS04), filtrert og løsningsmidlet ble dampet inn. Residuet (2,2 g) ble renset ved kolonnekromatografi over silikagel (eluent: cykloheksan/EtOAc 85/15 til 70/30; 15-40 pm). To fraksjoner ble samlet og løsningsmidlet ble dampet inn.

Den første fraksjon ble krystallisert fra dietyleter. Presipitatet ble filtrert fra og tørket. Utbytte: 0,2 g av forbindelse (15) (11 %); smp. 133 °C.

Den andre fraksjon ble krystallisert fra dietyleter. Presipitatet ble filtrert fra og tørket. Utbytte: 0,3 g av forbindelse (17) (16 %); smp. 128 °C. rQ\ rrv\ 3) 4 ^u,uuu±z± moi; og l-ui moi; i/v,/v-aietyieianamin (o mi; Die omrørt ved 100 °C i 2 timer. Vann ble tilsatt. Blandingen ble filtrert over celite, vasket med EtOAc og ekstrahert med EtOAc. Den organiske fase ble separert, tørket (MgS04), filtrert og løsningsmidlet ble dampet inn. Residuet (0,7 g) ble renset ved kolonnekromatografi over silikagel (eluent: CH2CI2/CH3OH 98/2; 15-40 pm). De rene fraksjoner ble samlet og løsningsmidlet ble dampet inn. Residuet ble krystallisert fra petroleumseter og dietyleter. Presipitatet ble filtrert fra og tørket. Utbytte: 0,1 g av forbindelse (18) (23 %); smp. 113 °C.

En blanding av forbindelse (4) (0,006027 mol) og KF (0,024108 mol) i DMSO (20 ml) ble omrørt ved 140 °C. Løsningsmidlet ble dampet inn til tørrhet. Residuet ble gjort fast i vann og dietyleter. Blandingen ble ekstrahert med dietyleter. Den organiske fase ble separert, vasket med dietyleter, vasket med en mettet løsning av NaCI, tørket (MgS04), filtrert og løsningsmidlet ble dampet inn. Residuet (1,7 g) ble renset ved kolonnekromatografi over silikagel (eluent: cykloheksan/EtOAc 85/15; 15-40 pm). Tre fraksjoner ble samlet og deres løsningsmidler ble dampet inn.

Den første fraksjon ble krystallisert fra petroleumseter. Presipitatet ble filtrert fra og tørket. Utbytte: 0,21 g av forbindelse (19) (11 %); smp. 92 °C. Den andre fraksjon ble krystallisert fra petroleumseter. Presipitatet ble filtrert fra og tørket. Utbytte: 0,33 g av forbindelse (20) (17 %); smp. 114 °C.

En blanding av forbindelse (4) (0,003013 mol), acetylklorid (0,003315 mol) og natriumjodid (0,006027 mol) i CH3CN (10 ml) ble omrørt og refluksert i 1 time. K2C0310 % ble tilsatt. Blandingen ble ekstrahert med CH2CI2. Den organiske fase ble separert, tørket (MgS04), filtrert og løsningsmidlet ble dampet inn. Residuet (1 g) ble renset ved kolonnekromatografi over silikagel (eluent: cykloheksan/EtOAc 80/20; 15-40 pm). To fraksjoner ble samlet og deres løsningsmidler ble dampet inn. Den første fraksjon ble krystallisert fra petroleumseter. Presipitatet ble filtrert fra og tørket. Utbytte: 0,12 g av forbindelse (21); smp. 110 °C.

En blanding av forbindelse (21) (0,000898 mol), trimetylsilankarbonitril (0,001347 mol) og Pd(PPh3)4(0,00009 mol) i /V,/V-dietyletanamin (5 ml) ble omrørt ved 100 °C i 2 timer. Vann ble tilsatt. Blandingen ble ekstrahert med EtOAc. Den organiske fase ble separert, tørket (MgS04), filtrert og løsningsmidlet ble dampet inn. Residuet (0,4 g) ble renset ved kolonnekromatografi over silikagel (eluent: cykloheksan/EtOAc 80/20; 15-40 pm). De rene fraksjoner ble samlet og løsningsmidlet ble dampet inn. Residuet (0,18 g, 62 %) ble krystallisert fra petroleumseter. Presipitatet ble filtrert fra og tørket. Utbytte: 0,13 g av forbindelse (22) (45 %); smp. 138 °C.

En blanding av forbindelse (4) (0,00603 mol), Pd(OAc)2(0,000603 mol), PPh3(0,00904 mol) og K2C03(0,012054 mol) i CO (gass) og metanol (40 ml) ble omrørt ved 90 °C i 8 timer under et CO-trykk på 5 bar. H20 ble tilsatt. Blandingen ble ekstrahert med EtOAc. Den organiske fase ble separert, tørket (MgS04), filtrert og løsningsmidlet ble dampet inn. Residuet (6 g) ble renset ved kolonnekromatografi over silikagel (eluent: CH2CI2/CH3OH 100/0 til 98/2; 15-35 pm). Fire fraksjoner (F1-F4) ble samlet og løsningsmidlet ble dampet inn. Utbytte: 0,13 g (cis) Fl; 0,02 g F2 (cis, forbindelse 25); 0,055 g F3 (trans, 3 %) og 0,11 g F4 (trans; forbindelse 26).

Fl ble krystallisert fra petroleumseter. Presipitatet ble filtrert fra og tørket. Utbytte: 0,03 g av forbindelse (23) (1 %); smp. 91 °C.

F3 ble krystallisert fra petroleumseter. Presipitatet ble filtrert fra og tørket. Utbytte: 0,035 g av forbindelse (24) (1 %); smp. 99 °C.

En blanding av forbindelse (4) (0,009 mol) og Zn (0,027 mol) i eddiksyre (30 ml) ble omrørt ved 60 °C i 4 timer, filtrert over celite, vasket med CH2CI2, dampet inn til tørrhet, løst i CH2CI2og vasket med K2C0310 %. Den organiske fase ble separert, tørket (MgS04), filtrert og løsningsmidlet ble dampet inn. Residuet (4 g) ble renset ved kolonnekromatografi over silikagel (eluent: cykloheksan/EtOAc 75/25; 15-40 pm). En fraksjon ble samlet og løsningsmidlet ble dampet inn. Denne fraksjon (1 g 37 %) ble krystallisert fra petroleumseter. Presipitatet ble filtrert fra oa tørket. Utbvtte: forbindelse (251: smp. 88 °C.

En blanding av forbindelse (4) (0,001502 mol), Sn(CH3)4(0,003004 mol) og Pd(PPh3)4(0,00015 mol) i metylbenzen (5 ml) ble omrørt og refluksert i 3 timer. K2C0310 % ble tilsatt. Blandingen ble ekstrahert med EtOAc. Den organiske fase ble separert, tørket (MgS04), filtrert og løsningsmidlet ble dampet inn. Residuet (0,7 g) ble renset ved kolonnekromatografi over silikagel (eluent: cykloheksan/EtOAc 85/15; 15-40 pm). To fraksjoner (Fl og F2) ble samlet og deres løsningsmidler ble dampet inn. Utbytte: 0,27 g (Fl, utgangsmateriale) og 0,14 g (F2). F2 ble krystallisert fra pentan og petroleumseter. Presipitatet ble filtrert fra og tørket. Utbytte: 0,08 g av forbindelse (27) (17 %); smp. 110 °C.

En blanding av forbindelse (4) (0,001507 mol), tributyletenylstannan (0,002260 mol) og Pd(PPh3)4(0,000151 mol) i dioksan (5 ml) ble omrørt ved 80 °C i 8 timer. Vann ble tilsatt. Blandingen ble filtrert over celite, vasket med EtOAc og ekstrahert med EtOAc. Den organiske fase ble separert, tørket (MgS04), filtrert og løsningsmidlet ble dampet inn. Residuet (0,65 g) ble renset ved kolonnekromatografi over silikagel (eluent: cykloheksan/EtOAc 90/10; 15-40 pm). De rene fraksjoner ble samlet og løsningsmidlet ble dampet inn. Residuet ble krystallisert fra petroleumseter. Presipitatet ble filtrert fra og tørket. Utbytte: 0,07 g av forbindelse (28) (14 %); smp. 108 °C.

En blanding av forbindelse (5) (0,001507 mol), trifenyl(fenylmetyl)stannan (0,002260 mol) og Pd(PPh3)4(0,000151 mol) i dioksan (5 ml) ble omrørt ved 80 °C i 8 timer. Vann ble tilsatt. Blandingen ble ekstrahert med EtOAc. Den organiske fase ble separert, tørket (MgS04), filtrert og løsningsmidlet ble dampet inn. Residuet (1,4 g) ble renset ved kolonnekromatografi over silikagel (eluent: CH2Cl2/EtOAc 96/4; 15-40 pm). De rene fraksjoner ble samlet og løsningsmidlet ble dampet inn. Residuet (0,38 g) ble krystallisert fra petroleumseter. Presipitatet ble filtrert fra og tørket. Utbytte: 0,16 g av forbindelse (29) (28 %); smp. 112 °C.

En blanding av forbindelse (4) (0,001507 mol), tributyl-2-tienylstannan (0,00226 mol) og Pd(PPh3)4(0,0001507 mol) i dioksan (5 ml) ble omrørt ved 80 °C i 8 timer. K2C0310 % ble tilsatt. Blandingen ble ekstrahert med EtOAc. Den organiske fase ble separert, tørket (MgS04), filtrert og løsningsmidlet ble dampet inn. Residuet (1,7 g) ble renset ved kolonnekromatografi over silikagel (eluent:

cykloheksan/EtOAc 85/15; 15-40Mm). De rene fraksjoner ble samlet og løsningsmidlet ble dampet inn. Residuet (0,65 g) ble krystallisert fra dietyleter. Presipitatet ble filtrert fra og tørket. Utbytte: 0,35 g av forbindelse (30) (61 %); smp. 142 °C. En blanding av forbindelse (4) (0,0015 mol), 3-tienylborsyre (0,00226 mol), Pd(PPh3)4(0,00015 mol) og dioksan ble omrørt og refluksert i 24 timer. K2C03 10 % ble tilsatt. Blandingen ble ekstrahert med EtOAc. Den organiske fase ble separert, tørket (MgS04), filtrert og løsningsmidlet ble dampet inn. Residuet (0,8 g) ble renset ved kolonnekromatografi over silikagel (eluent: cykloheksan/EtOAc 80/20; 15-40 pm). De rene fraksjoner ble samlet og løsningsmidlet ble dampet inn. Residuet (0,4 g, 70 %) ble krystallisert fra petroleumseter. Presipitatet ble filtrert fra og tørket. Utbytte: 0,39 g av forbindelse (31) (68 %); smp. 113 °C. En blanding av forbindelse (4) (0,003 mol), glysinmetylester-monohydroklorid (0,0066 mol) og Pd(PPh)4(0,0003 mol) i Et3N (2 ml) og toluen (10 ml) ble omrørt ved 100 °C under 5 bar CO-trykk i 8 timer, filtrert over celite, vasket med CH2CI2og dampet inn. Residuet (2 g) ble renset ved kolonnekromatografi over silikagel (eluent: cykloheksan/EtOAc 80/20; 75-35 pm). En fraksjon ble samlet og løsningsmidlet ble dampet inn. Denne fraksjon (1 g 80 %) ble krystallisert fra dietyleter. Presipitatet ble filtrert fra og tørket. Utbytte: 0,46 g av forbindelse (32) (37 %).

En blanding av forbindelse (4) (0,003 mol) og hydrazinkarboksaldehyd (0,0045 mol) i 1-butanol (15 ml) ble omrørt og refluksert natten over, helt ut i vann og ekstrahert med CH2CI2. Den organiske fase ble separert, tørket (MgS04), filtrert og løsningsmidlet ble dampet inn. Residuet ble renset ved kolonnekromatografi over silikagel (eluent: CH2CI2/CH3OH/NH4OH 95/5/0,1; 15-40 pm). To fraksjoner (Fl og F2) ble samlet og deres løsningsmidler ble dampet inn. Utbytte: 0,3 g Fl og 0,3 g F2.

Fl ble krystallisert fra CH3CN og dietyleter. Presipitatet ble filtrert fra og tørket. Utbytte: 0,102 g av forbindelse (33); smp. 224 °C.

F2 ble krystallisert fra CH3CN og dietyleter. Presipitatet ble filtrert fra og tørket. Utbytte: 0,2 g av forbindelse (34); smp. 185 °C.

En blanding av forbindelse 4 (0,015 mol) og NaN3(0,045 mol) i DMF (50 ml) ble omrørt ved 140 °C i 2 timer. K2C0310 % ble tilsatt og blandingen ble ekstrahert med EtOAc. Den organiske fase ble separert, tørket (MgS04), filtrert og løsningsmidlet ble dampet inn. Residuet (6 g) ble renset ved kolonnekromatografi over silikagel (eluent: cykloheksan/EtOAc 60/40; 15-40 pm). Den første fraksjon ble samlet og løsningsmidlet ble dampet inn. Residuet ble krystallisert fra dietyleter. Presipitatet ble filtrert fra og tørket. Utbytte: 1,26 g av forbindelse (35) (24 %); smp. 160 °C.

En blanding av forbindelse (4) (0,009 mol) og tiourea (0,0099 mol) i etylalkohol (30 ml) ble omrørt og refluksert i 12 timer og en løsning av KOH (0,0149 mol) i H20 (5 ml) ble tilsatt langsomt. Blandingen ble omrørt og refluksert i 1 time, helt ut i vann og ekstrahert med CH2CI2. Den organiske fase ble separert, tørket (MgS04), filtrert og løsningsmidlet ble dampet inn. Residuet ble renset ved kolonnekromatografi over silikagel (cykloheksan/EtOAc 70/30; 15-40 pm). De rene fraksjoner ble samlet og løsningsmidlet ble dampet inn. Utbytte: 1,1 g av Fl (37 %) og 0,4 g av F2 (13 %). Fl ble krystallisert fra 2-propanon. Presipitatet ble filtrert fra og tørket. Utbytte: forbindelse (36). F2 ble krystallisert fra 2-propanon. Presipitatet ble filtrert fra og tørket. Utbytte: forbindelse (37).

CH3I (0,0034 mol) ble tilsatt langsomt ved romtemperatur til en løsning av forbindelse (36) (0,0015 mol), forbindelse (37) (0,0015 mol) og K2C03(0,0034 mol) i aceton (15 ml). Blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 8 timer. Vann ble tilsatt og blandingen ble ekstrahert med CH2CI2. Den organiske fase ble separert, tørket (MgS04), filtrert og løsningsmidlet ble dampet inn. Residuet (1,2 g) ble renset ved kolonnekromatografi over silikagel (eluent: cykloheksan/EtOAc 85/15; 15-40 pm). De rene fraksjoner ble samlet og løsningsmidlet ble dampet inn. Utbytte: 0,6 g Fl (57 %) og 0,18 g F2 (17 %). Fl ble krystallisert fra dietyleter. Presipitatet ble filtrert fra og tørket. Utbytte: 0,28 g forbindelse (38) (27 %). F2 ble krystallisert fra dietyleter. Presipitatet ble filtrert fra og tørket. Utbytte: 0,065 g av forbindelse (39) (6 %). i henhold til eksempel B3.b (0,0014 mol) i HCI 3 N (5 ml) og THF (5 ml) ble omrørt og refluksert i en helg, deretter helt ut i H20, gjort basisk med K2C03og ekstrahert med CH2CI2. Den organiske fase ble separert, tørket (MgS04), filtrert og løsningsmidlet ble dampet inn. Utbytte: 0,5 g av F. Denne fraksjon F ble krystallisert fra 2-propanon. Presipitatet ble filtrert fra og tørket. Utbytte: 0,35 g av forbindelse (40) (74 %).

En blanding av forbindelse (5) (0,045 mol), acetamid (0,90013 mol) og K2C03(0,225 mol) ble omrørt og refluksert ved 200 °C i 2 timer, avkjølt ved romtemperatur, helt ut i H20/CH2CI2; og ekstrahert med CH2CI2. Den organiske fase ble separert, tørket (MgS04), filtrert og løsningsmidlet ble dampet inn til tørrhet. Residuet (14,4 g) ble krystallisert fra CH3OH. Presipitatet ble filtrert fra og tørket. Filtratet ble dampet inn. Residuet (11,27 g) ble renset ved kolonnekromatografi over silikagel (eluent: CH2CI2/CH3OH/NH4OH 96/4/0,1; 15-35 jim). De rene fraksjoner ble samlet og løsningsmidlet ble dampet inn. Utbytte: 4,2 g av forbindelse (188) (65 %).

En blanding av forbindelse (188) (0,00032 mol), benzosyre (1,5 ekv., 0,00048 mol), l-etyl-3-(3'-dimetylaminopropyl)karbodiimid.HCI (1:1) (1,5 ekv., 0,00048 mol), /V-hydroksybenzotriazol (1,5 ekv., 0,00048 mol) og Et3N (1 ekv., 0,00032 mol) i CH2CI2(2 ml) ble omrørt ved romtemperatur i 15 timer. Løsningsmidlet ble dampet inn. Residuet ble renset ved HPLC og produktfraksjonene ble samlet og løsningsmidlet ble dampet inn. Utbytte: 0,066 g av forbindelse (205) (49,50 %).

En blanding av interm. 20 (0,001507 mol) i HCI 3 N (10 ml) og THF (10 ml) ble omrørt ved romtemperatur i 8 timer, gjort basisk med K2C0310 % og ekstrahert med CH2CI2. Den organiske fase ble separert, tørket (MgS04), filtrert og løsningsmidlet ble dampet inn. Residuet (1,2 g) ble renset ved kolonnekromatografi over silikagel (eluent: cykloheksan/EtOAc 85/15; 15-40 pm). De rene fraksjoner ble samlet og løsningsmidlet ble dampet inn. Residuet (0,4 g) ble krystallisert fra petroleumseter. Presipitatet ble filtrert fra og tørket. Utbytte: 0,3 g av forbindelse (6) (58 %); smp. 108 °C.

En blanding av forbindelse 213 (fremstilt i henhold til B4) (0,00305 mol) og CH3ONa (30 % i CH3OH) (0,00916 mol) i CH3OH (25 ml) ble omrørt og refluksert i 15 timer deretter avkjølt til romtemperatur, helt ut i H20 og ekstrahert med EtOAc. Den organiske fase ble separert, tørket (MgS04), filtrert og løsningsmidlet ble dampet inn til tørrhet. Residuet (1,1 g) ble renset ved kolonnekromatografi over silikagel (eluent: cykloheksan/EtOAc; 40/60; 15-40 pm). To fraksjoner ble samlet og løsningsmidlet ble dampet inn. Utbytte: 0,3 g Fl og 0,5 g F2 (50 %) F2 ble krystallisert fra dietyleter/petroleumseter. Presipitatet ble filtrert fra og tørket. Utbytte: 0,26 g Fl ble krystallisert fra pentan. Presipitatet ble filtrert fra og tørket. Utbytte: 0,19 g. Denne fraksjon ble renset ved kolonnekromatografi over silikagel (eluent: CH2CI2/CH3OH; 98/2; 15-40 pm). De rene fraksjoner ble samlet og løsningsmidlet ble dampet inn. Utbytte: 0,11 g. Denne fraksjon ble renset ved kolonnekromatografi over kromasil (eluent:CH3OH/H20; 70/30). De rene fraksjoner ble samlet og løsningsmidlet ble dampet inn. Utbytte: 0,09 g (9 %). Denne fraksjon ble krystallisert fra dietyleter. Presipitatet ble filtrert fra og tørket. Utbytte: 0,08 g av forbindelse 419 (8 %).

Eksempel B5

Jodmetan (0,00456 mol) ble tilsatt ved 5 °C til en blanding av forbindelse (9) (0,0019 mol), forbindelse (8) (0,0019 mol) og tBuOK (0,00456 mol) i THF (30 ml) under N2-strøm. Blandingen ble omrørt ved romtemperatur natten over, helt ut i H20 og ekstrahert med CH2CI2. Den organiske fase ble separert, tørket (MgS04), filtrert og løsningsmidlet ble dampet inn. Residuet ble renset ved kolonnekromatografi over silikagel (eluent: cykloheksan/EtOAc 65/35; 15-40 pm). To fraksjoner ble samlet og løsningsmidlet ble dampet inn. Utbytte: 0,35 g av forbindelse (42) (30 %; smp. 125 °C) og 0,35 g av forbindelse (43) (30 %; smp. 116 °C). Eksempel B6

NaH 60 % (0,01068 mol) ble tilsatt ved 0 °C under N2-strøm til en blanding av forbindelse (8) og forbindelse (9) (0,0089 mol). Blandingen ble omrørt i 30 minutter.

Etylbromacetat (0,01068 mol) ble tilsatt ved 0 °C. Blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 1 time, hydrolisert med vann og ekstrahert med EtOAc. Den organiske fase ble separert, tørket (MgS04), filtrert og løsningsmidlet ble dampet inn. Residuet ble renset ved kolonnekromatografi over silikagel (eluent: cykloheksan/EtOAc 60/40; 15-40 pm). De ønskede fraksjoner (F1-F4) ble samlet og løsningsmidlet ble dampet inn. Utbytte: 0,11 g Fl; 0,13 g F2; 0,75 g F3 og 0,8 g F4.

F3 ble krystallisert fra dietyleter. Presipitatet ble filtrert fra og tørket. Utbytte: forbindelse (44); smp. 152 °C.

F4 ble krystallisert fra dietyleter. Presipitatet ble filtrert fra og tørket. Utbytte: forbindelse (45); smp. 147 °C.

Brom metyl benzen (0,007 mol) ble tilsatt dråpevis ved 0 °C under N2-strøm til en løsning av forbindelse (8) og forbindelse (9) (0,0064 mol) og NaH 60 % (0,007 mol) i DMF (40 ml). Blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 1 time, hydrolisert med vann og ekstrahert med EtOAc. Den organiske fase ble separert, vasket med vann, tørket (MgS04), filtrert og løsningsmidlet ble dampet inn. Residuet ble renset ved kolonnekromatografi over silikagel (eluent: cykloheksan/EtOAc 70/30; 15-40 pm). De ønskede fraksjoner (F1-F4) ble samlet og løsningsmidlet ble dampet inn. Utbytte: 0,15 g Fl, 0,1 g F2, 0,6 g F3 (23 %) og 0,8 g F4.

F3 ble krystallisert fra dietyleter. Presipitatet ble filtrert fra og tørket. Utbytte: 0,13 g av forbindelse (46); smp. 137 °C.

F4 ble krystallisert fra DIPE og petroleumseter. Presipitatet ble filtrert fra og tørket. Utbytte: forbindelse (47); smp. 130 °C.

Eksempel B7

a) 3-klorbenzenkarboperoksosyre (0,088 mol) ble tilsatt ved 0 °C til en løsning av forbindelse (48) (fremstilt i henhold til eksempel B2) (0,044 mol) i CH2CI2(200 ml)

og blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 12 timer. Blandingen ble vasket med K2C0310 %. Den organiske fase ble tørket (MgS04), filtrert fra og dampet inn. Residuet ble omkrystallisert fra (C2H5)20. Utbytte: 8,2 g cykloheksyl(3-metyl-6-kinolinyl)metanon,l-oksid (forbindelse 49) (69 %).

b) 4-metyl-benzensulfonylklorid (0,043 mol) ble tilsatt til en løsning av forbindelse (49) (0,028 mol) i K2C03(400 ml) og CH2CI2(400 ml) og blandingen ble omrørt ved

romtemperatur i 1 time. Blandingen ble ekstrahert med CH2CI2. Den organiske fase ble tørket (MgS04), filtrert fra og dampet inn. Residuet ble omkrystallisert fra (C2H5)20. Utbytte: 6,64 g 6-(cykloheksylkarbonyl)-3-metyl-2(lH)-kinolinon (forbindelse 50) (85 %); smp. 256,1 °C.

Eksempel B8

En blanding av forbindelse (7) (0,0229 mol), hydroksylamin (0,0252 mol) og /V,/V-dietyletanamin (0,0252 mol) i etanol (100 ml) ble omrørt og refluksert i 6 timer, helt ut i vann og ekstrahert med CH2CI2. Den organiske fase ble separert, tørket (MgS04), filtrert og løsningsmidlet ble dampet inn. Residuet ble krystallisert fra CH3CN. Presipitatet ble filtrert fra og tørket. Residuet ble renset ved kolonnekromatografi over silikagel (eluent: CH2CI2/EtOAc 80/20; 15-40 pm). To fraksjoner ble samlet og løsningsmidlet ble dampet inn. Utbytte: 2,8 g av forbindelse (51) (36 %; smp. 133 °C) og 3 g av forbindelse (52) (38 %; smp. 142 °C).

b) Fremstilling

Hydrazin (0,41 mol) ble tilsatt ved romtemperatur til en løsning av forbindelse (7)

(0,015 mol) i etanol (75 ml). Blandingen ble omrørt og refluksert i 1 natt, helt ut i

vann og ekstrahert med CH2CI2. Den organiske fase ble separert, tørket (MgS04), filtrert og løsningsmidlet ble dampet inn. Residuet ble renset ved kolonnekromatografi over silikagel (eluent: CH2CI2/CH3OH/NH4OH 98/2/0,1). De rene fraksjoner ble samlet og løsningsmidlet ble dampet inn. Residuet ble krystallisert fra dietyleter. Presipitatet ble filtrert fra og tørket. Utbytte: 0,8 g av forbindelse (53) (15 %); smp. 110 °C.

Eksempel B9

Prosedyre for forbindelse 400, 401, 402, 403, 404 og 405. En blanding av interm. 21 (fremstilt i henhold til All) (0,000269 mol), amantadin-hydroklorid (0,000404 mol; 1,5 ekv.), W-(etylkarbonimidoyl)-W,A/-dimetyl-l,3-propandiamin-hydroklorid (0,000404 mol; 1,5 ekv.), 1-hydroksy-l/V-benzotriazol (0,000404 mol; 1,5 ekv.) og Et3N (0,000269 mol) i CH2CI3(2 ml) ble omrørt ved romtemperatur i 12 timer. Løsningsmidlet ble dampet inn. Residuet ble renset med HPLC. Produktfraksjonene ble samlet og løsningsmidlet ble dampet inn. Utbytte: 0,063 g av forbindelse 520 (46,37 %).

Eksempel B10

En blanding av intermediat 27 (0,0026 mol) og intermediat 26 (0,0026 mol) i EtOH (380 ml) og H2S04kons. (19 ml) ble omrørt og refluksert i 15 timer, deretter avkjølt til romtemperatur, helt ut i isvann, gjort basisk med K2C03og ekstrahert med EtOAc. Den organiske fase ble separert, tørket (MgS04), filtrert og løsningsmidlet ble dampet inn. Residuet (17,9 g) ble renset ved kolonnekromatografi over silikagel (eluent: cykloheksan/EtOAc; 80/20; 15-35 Dm). De rene fraksjoner ble samlet og løsningsmidlet ble dampet inn. Utbytte: 0,85 g av Fl, 1,1 g F2 og 11,5 g av F3. Fl og F2 ble krystallisert separat fra petroleumseter. Presipitatet ble filtrert fra og tørket. Utbytte: 0,34 g av forbindelse 233. Eksempel Bil

En blanding av forbindelse 22 (fremstilt i henhold til B4) (0,004 mol) i HCI (3 N) (20 ml) og THF (20 ml) ble omrørt og refluksert i 8 timer, helt ut på is, gjort basisk med NH4OH og ekstrahert med CH2CI2. Den organiske fase ble separert, tørket (MgS04), filtrert og løsningsmidlet ble dampet inn. Residuet (1,2 g) ble renset ved kolonnekromatografi over silikagel (eluent: CH2CI2/CH3OH/NH4OH; 93/7/0,5; 15-40 pm). To fraksjoner ble samlet og løsningsmidlet ble dampet inn. Utbytte: 0,5 g Fl (41 %) og 0,4 g av F2. Fl ble krystallisert fra petroleumseter. Presipitatet ble filtrert fra og tørket. Utbytte: 0,17 g av forbindelse 511 (14 %).

Eksempel B12

En blanding av forbindelse 524 (fremstilt i henhold til B9a) (0,0018 mol) og KOH 85 % (0,0094 mol) i EtOH (15 ml) ble omrørt og refluksert i 24 timer, helt ut i H20 og ekstrahert med CH2CI2. Den organiske fase ble separert, tørket (MgS04), filtrert og løsningsmidlet ble dampet inn. Residuet ble renset ved kolonnekromatografi over silikagel (eluent: CH2CI2/cykloheksan 80/20; 15-40 pm). To fraksjoner ble samlet og løsningsmidlet ble dampet inn. Utbytte: 0,35 g Fl (64 %) og 0,17 g (SM) Fl ble krystallisert fra dietyleter. Presipitatet ble filtrert fra og tørket. Utbytte: 0,33 g av forbindelse 514 (60 %) (smp.: 185 °C).

Eksempel B13

En blanding av interm. 28 (0,019 mol), 2-benzofuranylborsyre (0,028 mol), Pd(PPh3)4(0,001 mol) og BHT (en liten kvantitet) i dioksan (25 ml) og Na2C03[2] (25 ml) ble omrørt og refluksert i 8 timer og ekstrahert med EtOAc. Den vandige fase ble gjort basisk med NH4OH og ekstrahert med CH2CI2. Den organiske fase ble separert, tørket (MgS04), filtrert og løsningsmidlet ble dampet inn. Residuet (3,6 g) ble renset ved kolonnekromatografi over silikagel (eluent: CH2CI2/CH3OH 99/1; 15-40 pm). De rene fraksjoner ble samlet og løsningsmidlet ble dampet inn. Utbytte: 1,8 g (33 %). Denne fraksjon ble krystallisert fra 2-propanon/dietyleter. Presipitatet ble filtrert fra og tørket. Utbytte: 0,39 g av forbindelse 515 (7 %)

(smp.: 134 °C).

Eksempel B14

Trietylsilan (0,0012 mol) ble tilsatt langsomt ved romtemperatur til en løsning av interm. 32 (0,004 mol) i CF3COOH (5 ml) og AcOH (10 ml). NaBH4(0,0012 mol) ble tilsatt porsjonsvis under N2-strøm. Blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 8 timer, helt ut på is, gjort basisk med K2C03og ekstrahert med CH2CI2. Den organiske fase ble separert, tørket (MgS04), filtrert og løsningsmidlet ble dampet inn. Residuet (1,2 g) ble renset ved kolonnekromatografi over silikagel (eluent: CHzCI^CHaOH 99/1; 15-40 pm). To fraksjoner ble samlet og løsningsmidlet ble dampet inn. Utbytte: 0,5 g Fl (43 %) og 0,4 g F2. Fl ble løst i iPrOH. HCI/iPrOH (1 ekv) ble tilsatt. Presipitatet ble filtrert fra og tørket; Utbytte: 0,32 g av forbindelse 526 (smp.: 248 °C).

Eksempel Bl5

En blanding av interm. 33 (0,082 mol) og 3-klor-2-etyl-2-butenal (0,098 mol) i AcOH (200 ml) ble omrørt og refluksert i 8 timer. Løsningsmidlet ble dampet inn til tørrhet. Residuet ble løst i CH2CI2og vasket med K2C0310 %. Den organiske fase ble separert, tørket (MgS04), filtrert og løsningsmidlet ble dampet inn. Residuet (27 g) ble renset ved kolonnekromatografi over silikagel (eluent: CH2CI2/EtOAc 95/5 til 92/8; 15-35 pm). To fraksjoner ble samlet og løsningsmidlet ble dampet inn.

Utbytte: 0,7 g Fl og 5,3 g F2. Fl ble krystallisert fra 2-propanon/dietyleter. Presipitatet ble filtrert fra og tørket. Utbytte: 0,25 g av forbindelse 471 (2 %)

(smp.: 140 °C).

Eksempel B16

nBuLi (0,0417 mol) ble tilsatt dråpevis ved -78 °C til en løsning av interm. 35 (fremstilt i henhold til A17.b) (0,0379 mol) i THF (200 ml) under N2-strøm. Blandingen ble omrørt i 30 minutter. En løsning av 4-brom-/V-metoksy-/V-metylbenzenacetamid (0,0568 mol) i THF (100 ml) ble tilsatt dråpevis ved -78 °C. Blandingen ble omrørt fra -78 °C til 0 °C, helt ut i H20 og ekstrahert med EtOAc. Den organiske fase ble separert, tørket (MgS04), filtrert og løsningsmidlet ble dampet inn til tørrhet. Residuet (20,9 g) ble renset ved kolonnekromatografi over silikagel (eluent: toluen/EtOAc 60/40 til 50/50; 15-35 pm). To fraksjoner ble samlet og løsningsmidlet ble dampet inn. Utbytte: 4 g av fraksjon 1 og 4 g av fraksjon 2 (28 %). Fraksjon 2 ble krystallisert fra dietyleter. Presipitatet ble filtrert fra og tørket. Utbytte: 1 g av forbindelse 528 (smp. 195 °C).

Tabell 1 til 8 lister forbindelsene med formel (I-A) og (I-B) som ble fremstilt i henhold til ett av eksemplene over.

C. Fremstilling av radioaktivt merkede forbindelser

Cl r3Hl- merkede forbindelser

Til en nøyaktig målt mengde av palladium på karbon (10 %, 0,872 mg) ble en løsning av forbindelse 498 (I, 0,919 mg, 2,4 pmol) og trietylamin (0,92 pl, 6,6 pmol) i natrium-tørket tetra hyd rof uran (175 pl) tilsatt. Reaksjonskolben ble forbundet med et tritieringsmanifoldsystem og reaksjonsblandingen ble forsiktig degasset. Tritiumgass (19,5 Ci ved et trykk på 1017 mbar) ble generert fra urantritid og ble tillatt til den ved romtemperatur omrørte reaksjonsblanding. Etter 30 min ble reaksjonsblandingen frosset med flytende nitrogen og overskuddet av tritiumgass ble gjennvunnet på uransvamp. Løsningsmidlet ble lyofilisert fra reaksjonsblandingen. Metanol (100 pl) ble introdusert og lyofilisert for å fjerne ustabil tritium. Denne prosedyre ble gjentatt to ganger til. Residuet ble tatt opp i etanol, filtrert over et GHP Acrodisk 13 mm sprøytefilter og utarmet med etanol til et totalt volum på 50,0 ml. Den inneholdt 71 mCi radioaktivitet med [<3>H]-forbindelse 528 (II) ved en 67 % radiokjemisk renhet. Fra denne mengde ble en fraksjon (5,0 ml) tatt og grundig renset i porsjoner via preparativ HPLC (Kromasil KR 100-10, kolonnedimensjoner 4,6 mm ID x 300 mm). UV-deteksjon skjedde ved 265 nm. Eluering ble utført isokratisk med vann-metanol-acetonitril-diisopropylamin (47:26,5:26,5:0,2; vol/vol/vol/vol) ved en strømningshastighet på 2,0 ml/min. Produktet inneholdende fraksjoner ble kombinert og konsentrert under vakuum ved 30 °C. Residuet ble løst i etanol (5,0 ml) og konsentrert igjen. Denne prosedyre ble gjentatt to ganger til. Det gjenværende residu ble til sist løst i etanol (20,0 ml) og lagret som sådan. Batchen inneholdt [<3>H]-forbindelse 528 (II) med en total radioaktivitet på 3,83 mCi ved en renhet > 98 % og ved en spesifikk aktivitet på ca 25 Ci/mmol.

D. Farmakologiske eksempler

Dl. Signaltransdukslon ved den klonede rotte mGlul- reseptor i CHO- celler

CHO-celler som uttrykker mGlul-reseptoren ble plettert i forbelagte svarte 96-brønns plater. Den neste dag ble effekten av de foreliggende forbindelser på glutamat-aktivert intracellulær Ca<2+->økning evaluert i et fluorescensbasert assay. Cellene ble lastet med Fluo-3 AM, plater ble inkubert i 1 time ved romtemperatur i mørket, celler ble vasket og de foreliggende forbindelser ble tilsatt til cellene i 20 minutter. Etter denne inkubasjonstid ble den glutamat-induserte Ca<2+->stigning registrert for hver brønn i funksjon av tid ved å anvende den fluorescensbildeplateleser (FLIPR, Molecular Devices Inc.). Relative fluorescensenheter ble registrert og gjennomsnittlige datagrafer av firedobbelte brønner ble oppnådd. Konsentrasjon-responskurver ble konstruert basert på toppfluorescens (maksimum signal mellom 1 og 90 sekunder) for hver konsentrasjon av testet forbindelse. pIC50-verdier er -log-verdiene av konsentrasjonen av de testede forbindelser som resulterer i 50 % hemming av den glutamat-induserte intracellulære Ca<2+->stigning.

Forbindelsene i henhold til den foreliggende oppfinnelse foreviste en pIC50-verdi på minst 5.

Forbindelsene som er inkludert i tabellene 1-8 foreviste en pIC50-verdi på minst 6.

En spesiell gruppe forbindelser foreviste en pIC50-verdi mellom 7 og 8. Det gjelder forbindelsene listet i tabell 9.

En spesiell gruppe forbindelser foreviste en pIC50-verdi på minst 8. Den vedrører forbindelsene listet i tabell 10.

D2. In wtro- bindinqeksperimenter med en r3Hl- radiomerket forbindelse i henhold til oppfinnelsen

Som [<3>H]-radiomerkede forbindelser anvendes: forbindelse 528. heretter kalt [<3>H]Forbindelse A, som er den tritium-radiomerkede ekvivalent av forbindelse 432.

I de neste paragrafer vil en studie bli vist som illustrerer anvendelsen av radiomerkede forbindelser i henhold til oppfinnelsen.

Materialer

Alle cellekulturreagenser ble skaffet fra Invitrogen (Carlsbad, USA). Glutamat ble skaffet fra Aldrich Chemical Company (Milwaukee, WI); [<3>H]quisqualat (29 Ci/mmol), [<3>H]Ro 48-8587 (53 Ci/mmol), m/o-[<3>H]-inositol (22 Ci/mmol) og [<35>S]GTPyS (1030 Ci/mmol) ble skaffet fra Amersham (Paisley, UK). [<3>H]MK-801 (22,5 Ci/mmol) og [<3>H]CGP39653 (20-50 Ci/mmol) ble skaffet fra NEN (Zaventem, Belgium). GDP ble skaffet fra Boehringer Manheim (Basel, Sveits) og glysin fra BioRad (CA, USA). [<3>H]L689560 (10-30 Ci/mmol), [<3>H]LY341495 (34,61 Ci/mmol), [<3>H]MPEP (50,2 Ci/mmol), (S)-4C3HPG, (1S,3R)-ACPD, (S)-3,5-DHPG, (S)-4CPG, AIDA, MCPG, MPEP, CPCCOEt, L-SOP og L-quisqualsyre ble kjøpt fra Tocris Cookson (Essex, UK). BAY 36-7620, NPS 2390 og fencyklidin ble syntetisert internt. Fluo-3-AM og pluronsyre ble skaffet fra Molecular Probes (Leiden, Nederland). Probenecid, stryknin, D-serin og Triton X-100 ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany). Alle andre reagenser var fra Merck (Darmstadt, Tyskland).

Celletransfeksion og dyrking

L929sA-celler som stabilt uttrykker den humane mGlula-reseptor ble erholdt som beskrevet i Lavreysen et al., Mol. Pharmacol. 61:1244-1254, 2002 og ble dyrket i Glutamax-I-medium supplert med 10 % varmeinaktivert dialysert føtalt kalveserum, 0,1 mg/ml streptomycinsulfat og 100 enheter/ml penicillin. CHO-dhfr"-celler som stabilt uttrykker rotte mGlula-, -2-, -3-, -4-, -5- og -6-reseptoren var en velvillig gave fra S. Nakanishi (Tokyo University, Japan) og ble dyrket i DMEM med Glutamax-I med 10 % varmeinaktivert dialysert føtalt kalveserum, 0,4 mM L-prolin, 0,2 mg/ml streptomycinsulfat og 200 enheter/ml penicillin. Celler ble holdt i en atmosfære på 37 °C og 5 % C02.

Intracellulær Caz+- respons i rotte og human mGlula- reseptoruttrvkkende celler og i rotte mGlu5- reseptoruttrvkkende celler.

Intracellulære kalsiumionenivåer ([Ca<2+>]i) i human mGlula-reseptoruttrykkende L929sA-celler ble målt ved å anvende den fluormetriske bildeplateleser (FLIPR, Molecular Devices, CA, USA), som beskrevet i Lavreysen et al., Mol. Pharmacol. 61:1244-1254, 2002. Den samme prosedyre ble fulgt for CHO-dhfr"-celler som uttrykker rotte mGlula-reseptoren. For rotte mGlu5-reseptoren ble celler sådd ved 30.000 celler/brønn 2 dager før eksperimentet.

IP- response i rotte mGlula- reseptor som uttrykker CHO- dhfr"- celler

IP-akkumulasjon ble målt som beskrevet i Lavreysen et al., Mol. Pharmacol. 61:1244-1254, 2002. Kort fortalt ble celler sådd ved 30.000 celler/brønn i 24-brønns plater og ble merket med 2,5 jiCi/ml myo-[<3>H]inositol natten over. På eksperimentdagen ble celler vasket og inkubert i 10 min med 10 mM LiCI. Etter 30 min inkubasjon med økende konsentrasjoner av [<3>H]Forbindelse A ble 1 N HCI04tilsatt og plater ble satt ved 4 °C. KOH/fosfatløsning og en løsning inneholdende 30 mM Na2B4O7.10H2O og 3 mM EDTA ble tilsatt før applikasjon til ionebytterkromatografi.

Membranpreparerinq fra CHO- dhfr"- celler som uttrykker rotte mGlula-, - 2-, - 3-, - 4-. - 5- oa - 6- reseptoren

Konfluente celler ble vasket i iskald fosfat-bufferet saline og lagret ved -20 °C til membranpreparering. Etter tining ble celler suspendert i 50 mM Tris-HCI, pH 7,4 og samlet gjennom sentrifugenng i 10 min ved 23.500 g ved 4 °C. Cellene ble lysert i 10 mM hypotonisk Tris-HCI, pH 7,4. Etter sentrifugen ng igjen i 20 min ved 30.000 g ved 4 °C ble pelleten homogenisert med en Ultra Turrax-homogenisator i 50 mM Tris-HCI, pH 7,4. Proteinkonsentrasjoner ble målt med Bio-Rad proteinassayet ved å anvende bovint serumalbumin som standard. r35SlGTPvS- bindinq til membraner fra CHO- dhfr"- celler som uttrykker rotte mGlu2-,

- 3-, - 4- og - 6- reseptoren

Membraner ble tint på er og fortynnet i 10 mM HEPES-syre, 10 mM HEPES-salt, pH 7,4, inneholdende 100 mM NaCI, 3 mM MgCI2, 3 jiM GDP og 10 jig/ml saponin. Assayblandinger inneholdt 10jag membranprotein og ble preinkubert med forbindelser eller buffer i 5 min ved 37 °C. Deretter ble glutamat tilsatt og assayblandingene ble inkubert videre i 30 min ved 37 °C. [<35>S]GTPyS ble tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 0,1 nM i ytterligere 30 min ved 37 °C. Reaksjoner ble terminert ved rask filtrering gjennom Unifilter-96 GF/B filterplater (Packard, Meriden, CT) ved å anvende en 96-brønns Packard filtermate høster. Filtere ble vasket 2 ganger med iskald 10 mM NaH2PO4/10 mM Na2HP04-buffer, pH 7,4. Filterbundet radioaktivitet ble talt i en mikroplate scintillasjons- og luminesensteller fra Packard.

Radioliqandbindinq til rotte mGlula- reseptor- CHO- dhfr"- membraner

[<3>H]Forbindelse A-binding. Etter tining ble membranene homogenisert ved å anvende en Ultra Turrax-homogenisator og suspendert i iskald bindingsbuffer inneholdende 50 mM Tris-HCI (pH 7,4), 1,2 mM MgCI2, 2 mM CaCI2, med mindre annet er indikert. Ligandmetningseksperimenter ble utført ved tilsynelatende bindingslikevekt (30 min inkubasjon) med 20 jig membranprotein og 10 konsentrasjoner (0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 1, 2, 2,5, 5 og 10 nM) radioligand. Ikke-spesifikk binding ble estimert i nærvær av 1 jiM forbindelse 135. Inkubasjonen ble stoppet ved rask filtrering under sug over GF/C glassfiberfiltere ved å anvende en manuell 40-brønns filtreringsmanifold. For å måle assosiasjonskinetikk ble membraner inkubert ved 4 °C, 25 °C eller 37 °C i nærvær av 2,5 nM [<3>H]Forbindelse A i 2, 5, 10, 15, 20, 30, 45, 60, 90 eller 120 min, deretter

terminert ved hurtig filtrering ved å anvende en manuell 40-brønns filtreringsenhet. Dissosiasjonskinetikk ble målt ved å tilsette, ved forskjellige tider før filtrering 1 jiM forbindelse 135 til membraner preinkubert i 30 min ved 4 °C eller 25 °C i nærvær av 2,5 nM [<3>H]Forbindelse A. Filterne ble overført til scintillasjonsflasker og, etter tilsetningen av Ultima-Gold MV, ble radioaktiviteten samlet på filterne talt i en Packard scintillator. For hemmingseksperimenter ble assayblandinger inkubert i 30 min ved 4 °C i et volum på 0,5 ml inneholdende 10-20 jag membranprotein, passende konsentrasjoner av testforbindelser og 2,5 nM [<3>H]Forbindelse A. Ikke-spesifikk binding ble definert som over. Filtrering ble utført ved å anvende Unifilter-96 GF/C filterplater og en 96-brønns Packard filtermate høster. Etter tilsetningen av microscint-0 ble radioaktivitet på filterne talt i en mikroplate scintillasjons- og luminesensteller fra Packard.

[<3>H]quisqualatbinding. Tinte membraner ble homogenisert og suspendert i iskald bindingsbuffer. For metningseksperimenter ble 30 jag membranprotein inkubert i 1 time ved 25 °C med 10 konsentrasjoner (1, 2, 5, 10, 20, 40, 60, 90, 120 og 150 nM) [<3>H]quisqualat. Ikke-spesifikk binding ble bestemt i nærvær av 1 mM L-glutamat. Bundet og fri radioligand ble separert ved hurtig filtrering over GF/C glassfiberfiltere ved å anvende en manuell 40-brønns filtreringsmanifold. For hemmingseksperimenter ble 30jig membranprotein inkubert i 1 time ved 25 °C i et volum på 0,5 ml inneholdende passende konsentrasjoner av testforbindelser og en sluttkonsentrasjon på 10 nM [<3>H]quisqualat. Filtrering ble utført ved å anvende Unifilter-96 GF/C filterplater og en Packard filtermate høster. Radioaktivitet fanget på filterne ble talt som over.

Radioliqandbindinq til membraner fra CHO- dhfr- celler som uttrykker rotte mGlu2-,

- 3-, - 4-, - 5- og - 6- reseptoren

Etter tining ble membranene homogenisert ved å anvende en Ultra Turrax-homogenisator og suspendert i iskald bindingsbuffer inneholdende 50 mM Tris-HCI (pH 7,4), 1,2 mM MgCI2, 2 mM CaCI2. For [<3>H]Forbindelse A-binding ble 20 til 160 jig membranprotein og en sluttkonsentrasjon på 20 nM [<3>H]Forbindelse A anvendt. Som indikert i resultatdelen ble forskjellige blindprøver anvendt for å definere ikke-spesifikk binding. Inkubasjonstid og temperatur samt filtrering var som beskrevet for rotte mGlula-reseptor-CHO-dhfr"-membraner. Ekspresjon av rotte mGlu2-, -3-,

-5- og mGlu6-reseptorer ble bekreftet ved spesifikk binding av [<3>H]LY341495 (mGlu2, -3 og -6) eller [<3>H]MPEP (mGlu5). For [<3>H]LY341495-binding ble 1 nM (mGlu2 og mGlu3) eller 10 nM (mGlu6) [<3>H]LY341495 anvendt. Ikke-spesifikk

binding ble bestemt ved å anvende 1 mM glutamat. Assayblandinger ble inkubert i 30 min (mGlu2 og mGlu3) eller 60 min (mGlu6) ved 4 °C. Inkubasjon ble stoppet ved filtrering over GF/B glassfiberfiltere (Whatman, England) ved å anvende en manuell 40-brønns filtreringsmanifold. For rotte mGlu5-reseptor-CHO-dhfr"-membraner ble 10 nM [<3>H]MPEP og 10 jiM MPEP anvendt for å vise ikke-spesifikk binding. Inkubasjon ble utført ved 4 °C i 30 min. Bundet og fri radioligand ble separert over GF/C glassfiberfiltere (Whatman, England) ved å anvende en 40-brønns filtreringsenhet.

r<3>HlForbindelse A- bindinq til rottehiernemembraner.

Vevspreparering. Hann Wistar-rotter (-200 g) ble avlivet ved dekapitasjon. Hjernene ble hurtig fjernet og cortex, hippocampus, striatum og cerebellum ble øyeblikkelig dissekert. De ferske vev ble homogenisert med en Ultra Turrax i 20 volumer med 50 mM Tris-HCI, pH 7,4 og vev ble sentrifugert ved 23.500 g i 10 min. Etter homogenisering ved å anvende en DUAL-homogenisator ble membraner vasket to ganger ved sentrifugen ng ved 23.500 g i 10 min. Sluttpelleten ble suspendert i 10 volumer med 50 mM Tris-HCI, pH 7,4 og frosset ved -80 °C.

In vitro bindingsassay. Etter tining ble membraner fra rotte cortex, cerebellum, striatum og hippocampus rehomogenisert ved å anvende en DUAL og suspendert i iskald bindingsbuffer inneholdende 50 mM Tris-HCI, 1,2 mM MgCI2, 2 mM CaCI2, pH 7,4. Bindingsassayet ble utført i et totalvolum på 0,5 ml inneholdende 2,5 nM [<3>H]Forbindelse A og en membranalikvot tilsvarende 40 jag for cerebellarmembraner, 60 jig for hippocampalmembraner, 80jig for striatalmembraner eller 150 ug for kortikalmembraner. Spesifikk binding ble beregnet som differansen mellom den totale binding og bindingen målt i nærvær av 1 jiM forbindelse 135. Etter inkubasjon i 30 min ved 4 °C ble de merkede membraner vasket og høstet ved hurtig vakuumfiltrering over Whatman GF/C glassfiberfiltere ved å anvende en 40-brønns filtreringsmanifold og radioaktivitet samlet på filterne ble talt som over.

r3H! Ro 48- 8587-. r<3>HlL689560-, I" 3H1CGP39653- oa r3HlMK- 801- bindina til rottehiernemembraner.

Vevspreparering. Hann Wistar-rotter (-200 g) ble avlivet ved dekapitasjon. Hjernene ble rakst fjernet og forhjernen dissekert. Vevet ble homogenisert med en Ultra Turrax i 20 volumer iskaldt H20 og ble sentrifugert ved 48.000 g i 20 min. Etter homogenisering ved å anvende en DUAL-homogenisator ble membraner vasket ved sentrifugen ng ved 48.000 g i 10 min. Pelleten ble deretter suspendert i 20 volumer 50 mM Tris-HCI, pH 7,4 inneholdende 0,04 % Triton X-100 og igjen sentrifugert ved 48.000 g i 20 min. Sluttpelleten ble frosset ved -80 °C.

In vitro bindingsassay. Pa eksperimentdagen ble pelleten tint, vasket og rehomogenisert ved å anvende en DUAL i iskald 50 mM Tris-acetat, pH 7,4. Assaybetingelser for de forskjellige radioligander var som følger. Sluttkonsentrasjonen av membran i assayet var 20 mg/ml (våtvekt) for [<3>H]Ro 48-8587 og [<3>H]L689560 og var 10 mg/ml (våtvekt) for [<3>H]CGP39653 og [<3>H]MK-801. Radioligandkonsentrasjoner på 2 nM [<3>H]Ro 48-8587, 2 nM [<3>H]L689560, 2 nM [<3>H]CGP39653 og 3 nM [<3>H]MK-801 ble anvendt. Inkubasjon ble utført i nærvær av 1 mM KSCN for [<3>H]Ro 48-8587, 100 jiM stryknin for [<3>H]L689560 og 1 jiM glysin + 1 jiM glutamat for [<3>H]MK-801 binding. Ikke-spesifikk binding ble bestemt i nærvær av 1 mM glutamat for [<3>H]Ro 48-8587- og [<3>H]CGP39653-binding. For [<3>H]L689560- og [<3>H]MK-801-binding ble henholdsvis 100^M D-serin eller 10^M fencyklidin anvendt for å definere ikke-spesifikk binding. Assayer ble inkubert i 1 time ved 37 °C, 2 timer ved 4 °C, 30 min ved 25 °C og 1 time ved 4 °C for henholdsvis [<3>H]Ro 48-8587-, [<3>H]L689560-, [3H]CGP39653- og[<3>H]MK-801-binding. Etter inkubasjon ble bundet og fri radioligand separert ved å anvende en 40-brønns filtreringsmanifold. Radioaktivitet samlet på filterne ble talt som over.

r3H! Forbindelse A- bindinq og autoradiografi på rottehiernesnitt.

Vevspreparering. Hann Wistar-rotter (200 g) ble avlivet ved dekapitasjon. Hjerner ble øyeblikkelig fjernet fra skallen og ble hurtig frosset i tørris-avkjølt 2-metylbutan (-40 °C). Hjerner ble deretter lagret ved -70 °C inntil snitting. Tjue mikrometer tykke sagittal-snitt ble kuttet ved å anvende en Leica C3050 kryostat mikrotom (Leica Microsystems, Wetzlar, Tyskland) og tine-montert på SuperFrost Plus objektglass (Menzle-glaser, Tyskland). Snittene ble deretter holdt ved -70 °C inntil bruk.

Reseptor-autoradiografi. Snitt ble tinet og tørket under en strøm av kald luft, preinkubert (3x5 min) i 50 mM Tris-HCI, 1,2 mM MgCI2, 2 mM CaCI2, 0,1 % BSA pH 7,4 ved romtemperatur. Snitt ble deretter inkubert i 60 min ved romtemperatur, i buffer inneholdende 50 mM Tris-HCI, 1,2 mM MgCI2, 2 mM CaCI2, 0,1 % BSA (pH 7,4) og 1,5 nM [<3>H]Forbindelse A. Ikke-spesifikk binding ble bestemt ved tilsetning av 1 jiM forbindelse 135 i inkubasjonsbufferen. Etter inkubasjonen ble overskuddet av radioligand vasket av (3 x 5 min) i iskald buffer inneholdende 50 mM Tris-HCI, 1,2 mM MgCI2og 2 mM CaCI2, etterfulgt av en rask dypp i kaldt destillert vann. Snittene ble tørket under en strøm av kald luft og deretter eksponert for [<3>H]Hyperfilm (Amersham, UK) i 6 uker ved romtemperatur. Filmene ble fremkalt manuelt i Kodak D19 og fiksert med Kodak Readymatic. Noen snitt ble eksponert for en Fuji avbildingsplate i 2 dager ved romtemperatur og skannet ved å anvende en Fujix Bass 2000 phosphoimager.

Dataanalyse og statistikk

Dataanalyse ble utført ved å anvende GraphPad Prism-programmet (GraphPad Prism Software, Inc., San Diego, CA). Metningsbindingseksperimenter ble analysert ved å anvende en ikke-lineær regresjonsanalyse. Hemmingskurver ble tilpasset ved å anvende ikke-lineær regresjonanalyse tilpasset stedskonkurranseligningen: Y= Bunn + ((Topp - Bunn)/1 + iox-L°s'IC50). Krverdier ble beregnet ved å anvende Cheng-Prusoff-ligningen: Ki=IC50/[l + ([C]/KD)] hvor C er konsentrasjonen av radioligand og KDer dissosiasjonskonstanten til radioliganden (Cheng og Prusoff, Biochem. Pharmacol. 22, 3099-3108, 1973). Den observerte on (k0t>) og off (koff) hastighet ble beregnet fra assosiasjon-dissosiasjonskurver ved å anvende henholdsvis de en-fase- eksponentiell assosiasjons- og nedbrytingsligninger i Prism-programmet. kon ble beregnet ved å subtrahere kofffra kobog dele med radioligandkonsentrasjonen. Den to-halede Studenfs t-test ble anvendt for statistisk evaluering av bindingsdataene:<*>p<0,05,

<**>p<0,01 og p<0,001.

Dunnetfs t-testen som følger en 2-veis analyse av varians (med som faktorer forbindelsekonsentrasjon og eksperiment) ble anvendt for å analysere dataene fra IP-eksperi mentene.

Resultater

Selektivitet og antagonistisk virkemåte av Forbindelse A for mGlul-reseptoren. I CHO-dhfr"-celler som uttrykker rotte mGlula-reseptoren hemmet forbindelse A den glutamat-induserte økning i [Ca<2+>]imed en IC50-verdi på 21,6 ± 5,0 nM (n=4; figur IA) og syntes å være ca 8 ganger mer potent enn den nylig beskrevne spesifikk mGlul-reseptorantagonist BAY 36-7620 (IC50= 161 ± 38 nM, n=3) og 500 ganger mer potent enn CPCCOEt (IC50= 10,3 ± 0,8 jiM, n=3), testet i det samme assay. For den humane mGlula-reseptor hadde forbindelse A en IC50-verdi på 10,4 ± 4,7 nM (n=3). Forbindelse A hemmet ikke glutamat-indusert Ca<2+->signalisering til rotte mGlu5-reseptoren uttrykket i CHO-dhfr-celler, testet opp til en konsentrasjon på 10 (iM. IC50-verdier for hemming av glutamat (30 (iM)-indusert [<35>S]GTPyS-aktivering var over 30 (iM ved rekombinante rotte mGlu2-, -3-, -4- eller -6-reseptorer. I [<35>S]GTPyS-assayer foreviste forbindelse A ikke agonistaktivitet mot noen av mGlu-reseptorene opp til en konsentrasjon på 30 jiM. I tillegg ble det undersøkt om forbindelse A kunne virke som en positiv allosterisk modulator på en av disse mGlu-reseptortyper. For dette utførte vi glutamatkonsentrasjon-responsekurver ved å tilsette glutamat alene eller sammen med 10 jiM forbindelse A. [<35>S]GTPvS-assayer på rekombinant rotte mGlu2-, -3-, -4- eller -6-reseptorer viste at glutamat EC50ikke ble endret og at glutamat Emax-verdien ikke ble økt ved tilsetning av forbindelse A. EC50- og Emax-verdien for glutamat-indusert intracellulær Ca<2+->mobilisering endret seg heller ikke i celler som uttrykker rotte mGlu5-reseptoren når forbindelse A ble tilsatt sammen med glutamat (data ikke vist). Sammen ekskluderer disse data agonist, antagonist eller positiv allosterisk virkning på mGlu2-, -3-, -4-, -5- og -6-reseptorer. Radioligandbindingsstudier på rotteforhjerne ved å anvende [<3>H]Ro-488587, [<3>H]L689560, [<3>H]CGP39653 og [<3>H]MK-801 viste at forbindelse A ikke bandt til AMPA-reseptoren, heller ikke bandt den til henholdsvis glysin-, glutamat- eller kanalporestedet av NMDA-reseptoren (testet opp til en konsentrasjon på 10 jiM). For å analysere hvordan forbindelse A-hemmer glutamataktivering av mGlula-reseptoren ble mobilisering av Ca<2+>i respons på glutamat sammenlignet i fravær og nærvær av forbindelse A (figur IB). Nærværet av forbindelse A forårsaket ikke bare en høyre forskyvning i konsentrasjon-responskurven til glutamat, men resulterte også i en dramatisk reduksjon i den maksimale respons fremkalt av agonisten, som viser at antagonisme av forbindelse A var ikke-konkurrerende. Fullstendig hemming av mGlula-reseptor-mediert signalisering ble observert i nærvær av 100 nM-1 jiM forbindelse A. For å undersøke hvorvidt forbindelse A kunne virke som en invers agonist, målte vi basal IP- akkumulasjon i rotte mGlula-reseptor inneholdende CHO-dhfr"-celler i nærvær av forbindelse A. Figur 1C viser at det er en klar reduksjon i basal IP-produksjon med økende konsentrasjon av forbindelse A. Denne reduksjon var statistisk signifikant (p<0,05) som "off" 1 jiM forbindelse A, hvor basal IP-akkumulasjon avtok med 24 ±4 %. En maksimal minskning på 33 3 % ble funnet da 100 jiM forbindelse A ble anvendt. Disse data indikerer at forbindelse A faktisk kan virke som en invers agonist mot mGlula-reseptoren.

Karakterisering av [<3>H]Forbindelse A-binding til rotte mGlula-reseptor-CHO-dhfr"-membraner. Den spesifikk binding av 2,5 nM [<3>H]Forbindelse A ved 4 °C til rotte mGlula-reseptor-CHO-dhfr-membraner var proporsjonal med mengden av membranprotein og økte lineært mellom 10 og 50 yg membranprotein per assay (figur 2). Ikke-spesifikk binding ble definert ved å anvende 1 jiM forbindelse 135 som inhibitor. Forbindelse 135 ble identifisert som en spesifikk mGlul-reseptorantagonist med en potens på 7,2 ± 1,2 nM (n=3) for reversering av glutamat-indusert [Ca<2+>]imobilisering. Ved anvendelse av 20 jig protein per assay var spesifikk binding av [<3>H]Forbindelse A~92 % av den totale binding; under typiske assaybetingelser, var total og ikke-spesifikk binding i området på henholdsvis 3.800 og 300 DPM.

Tilsetning av 1,2 mM MgCI2og 2 mM CaCI2forårsaket en svak økning i spesifikk binding (data ikke vist). Ytterligere tilsetning av NaCI (10-100-300 mM) hadde ingen effekt. Selv om spesifikk binding avtok med 22 % ved pH 6, hadde økning av pH opp til 10 ingen effekt (data ikke vist).

Assosiasjonskinetikk ble målt som beskrevet i materialer og metoder. Senkning av inkubasjonstemperaturen til 4 °C, økte dramatisk spesifikk binding, mens derimot en lav binding ble funnet ved 37 °C (figur 3). Assosiasjonen av [<3>H]Forbindelse A til membraner var ekstremt rask. Ved 4 °C, resulterte 2 min inkubasjon allerede i en spesifikk binding tilsvarende ca 70 % av kvantiteten bundet ved likevekt. Maksimal binding ble nådd innen 5 min inkubasjon for hver inkubasjonstemperatur. Analyse av assosiasjonskurvene resulterte i observerte assosiasjonshastighetskonstanter (kob) på 0,6285, 2,571 og 1,523 min"<1>ved henholdsvis 4 °C, 25 °C og 37 °C. Dissosiasjonskinetikken var også hurtig (figur 4). Ved 25 °C dissosierte radioliganden innen så lite som 2 min etter 1 jiM forbindelse 135 var tilsatt til reaksjonsrørene. Den hurtige dissosiasjonskinetikk ved 25 °C tillot oss ikke å beregne en nøyaktig dissosiasjonshastighetskonstant (k0ff). Dissosiasjon forekom mer gradvis når inkubert ved 4 °C. [<3>H]Forbindelse A ble erstattet fullstendig innen omtrent 45 min etter tilsetningen av et overskudd av forbindelse 135. Analyse av dissosiasjonskurven ved 4 °C resulterte i en kofTpå 0,1249 min"<1,>kon (kob-koff/radioligandkonsentrasjon) ved 4 °C var 0,1007 nM"<1>min" i

Ligandmetningseksperimenter ble utført ved tilsynelatende bindingslikevekt (30 min inkubasjon) og med 10 konsentrasjoner av radioligand. Figur 5 viser metningskurven og Scatchard-plott av [<3>H]Forbindelse A-binding til rotte mGlula-reseptor-CHO-dhfr"-membraner. Scatchard-plott var lineære, hvilket indikerer nærværet et enkelt, mettbart, bindingssete med høy affinitet. Ikke-lineær regresjonsanalyse av den rektangulære hyperbel viste et Bmaxpå 6512 ± 1501 fmol/mg protein og en KDpå 0,90 ± 0,14 nM (n = 3).

En serie med mGlul-reseptoragonister og -antagonister ble testet for hemming av [<3>H]Forbindelse A-binding til rotte mGlula-reseptor-CHO-dhfr"-membraner. Hemmingskurver for noen antagonister er vist i figur 6, og Kj-verdiene til alle testede forbindelser er listet i tabell 11.

Forunderlig nok hemmet ikke alle ligander som binder til glutamatbindingssetet, dvs. glutamat, quisqualat, 1S,3R-ACPD, (S)-3,5-DHPG, LY-367385, (S)-4C3HPG, (S)-4CPG, MCPG og AIDA [<3>H]Forbindelse A-binding. Derimot hemmet de ikke-konkurrerende mGlul-reseptorantagonister CPCCOEt, BAY 36-7620, NPS 2390 og forbindelse A [3H]Forbindelse A-binding til rotte mGlula-reseptor-CHO-dhfr"-membraner med potenser, generelt overensstemmende med deres potenser til å hemme mGlula-reseptorfunksjon. Forbindelse A og NPS 2390 viste den høyeste affinitet, med en K, på henholdsvis 1,35 ± 0,99 og 1,36 ± 0,50 nM. BAY 36-7620 hemmet også bindingen ved nanomolare konsentrasjoner, mens derimot CPCCOEt erstattet ved mikromolare konsentrasjoner.

Vi undersøkte også spesifisiteten av [<3>H]Forbindelse A-binding mot mGIul versus mGlu2-, -3-, -4-, -5-, og -6-reseptorer. Ved å anvende [<3>H]LY341495 ble 95, 98 og 40 % spesifikk binding funnet da membraner fremstilt fra CHO-dhfr"-celler som uttrykker henoldsvis mGlu2-, mGlu3- eller mGlu6-reseptoren ble anvendt.

[<3>H]MPEP ble anvendt som en positiv kontroll for mGlu5-reseptoren og forårsaket 95 % spesifikk binding til rotte mGlu5-reseptor-inneholdende membraner. Total binding av 20 nM [<3>H]Forbindelse A til membraner fremstilt fra CHO-dhfr"-celler som uttrykker rotte mGlu2-, -3-, -4-, -5- eller -6-reseptoren var ikke høyere enn bindingen til membraner fra vill-type CHO-dhfr"-celler, heller ikke var den høyere enn den ikke-spesifikke binding til rotte mGlula-reseptor-CHO-dhfr"-membraner. Videre ble spesifikk binding av [<3>H]Forbindelse A til disse membraner undersøkt ved å anvende forskjellige blindprøver: 1 jiM forbindelse 135, som er forventet å binde til det samme sete som forbindelse A, glutamat og L-SOP, som binder til glutamatbindingslommen og MPEP som binder til et allosterisk sted på mGlu5-reseptoren (se tabell 12). Ingen av disse blindprøver fortrengte [<3>H]Forbindelse A. Sammen demonstrerer disse data spesifisiteten av [<3>H]Forbindelse A for mGlul-reseptoren relativt til mGlu2-, -3-, -4-, -5- og -6-reseptorsubtypene.

Tabell 12: [<3>H]Forbindelse A er spesifikk for mGlul-reseptoren relativt til mGlu2-, - 3-, -4-, -5- eller -6-reseptoren. Den spesifikk binding av 20 nM [<3>H]Forbindelse A til 40 jig membraner fra vill-type (CHO-dhfr)-celler eller fra CHO-dhfr"-celler som

uttrykker rotte mGlu2-, -3-, -4-, -5- eller -6-reseptorer sammenlignes med binding av 10 nM [<3>H]Forbindelse A til 20ug rotte mGlula-reseptor-CHO-dhfr"-membraner. Forskjellige forbindelser ble anvendt for å definere ikke-spesifikk binding. Spesifikk bindingsdata (SB) fra rotte mGlula-reseptor-CHO-dhfr"-membraner er gjennomsnittet ± SD av 3 eksperimenter utført i duplikat. Andre SB-data er gjennomsnittet av duplikate bestemmelser fra ett eksperiment (ND= ikke bestemt).

Sammenligning med [<3>H]quisqualatbinding. Metningsbindingseksperimenter ble utført ved å anvende 30ug protein per inkubasjon og 10 konsentrasjoner (1, 2, 5, 10, 20, 40, 60, 90, 120 og 150 nM) av mGlul-reseptoragonisten [<3>H]quisqualat (figur 7). Tilpasning av kurvene viste et enklt bindingssete med KD- og Bmax-verdier på henholdsvis 22,0 ± 10 nM og 3912 ±436 fmol/mg protein (n=3). Tydeligvis binder [<3>H]Forbindelse A til mGlula med en mye høyere affinitet enn [<3>H]quisqualat. Antall bindingsseter merket med [<3>H]quisqualat var -60 % av antall bindingssteder merket med [<3>H]Forbindelse A.

De samme forbindelser ble evaluert for deres hemmende virkning på [<3>H]quisqualat binding til rotte mGlula-reseptor-CHO-dhfr"-membraner. Hemmende potenser av de testede agonister og antagonister samt Hill-koeffisienter er summert i tabell 13. I dette tilfelle hemmet forbindelsene kjent for å utøve en konkurrerende interaksjon med glutamat [<3>H]quisqualatbinding, mens derimot CPCCOEt, BAY 36-7620 og NPS 2390 ikke påvirket [<3>H]quisqualatbinding. I tillegg erstattet ikke forbindelse A binding av [<3>H]quisqualat til rotte mGlula-reseptoren. De konkurrerende mGlul-reseptorligander erstattet [<3>H]quisqualatbinding med den følgende rekkefølge av potensgrad: quisqualat > glutamat > LY367385 > (S)-3,5-DHPG > (S)-4C3HPG >

1S,3R-ACPD > (S)-4CPG > AIDA > MCPG.

Natur av konkurranse mellom CPCCOEt, BAY 36-7620, NPS 2390 og [<3>H]Forbindelse A-binding. Det faktum at de ikke-konkurrerende forbindelser alle erstatter [<3>H]Forbindelse A-binding uten å påvirke bindingen av [<3>H]quisqualat antyder at disse antagonister binder et annet sted enn glutamatbindingssetet. For å vurdere om referanseforbindelsene CPCCOEt, BAY 36-7620, NPS 2390 og den nylig identifiserte mGlul-reseptorantagonist forbindelse A konkurrerer om det samme setet eller gjensidig eksklusiv seter ble metningseksperimenter med [<3>H]Forbindelse A konsentrasjoner fra 0,2 til 20 nM i fravær og nærvær av CPCCOEt (30 iiM), BAY 36-7620 (100 nM) og NPS 2390 (10 nM) utført. Nærværet av disse konkurrenter påvirket ikke Bmax-verdiene, men forårsaket en signifikant økning i KD-verdien av [<3>H]Forbindelse A (tabell 14). Dette er anskueliggjort i figur 8, hvor dataene er plottet ved å anvende lineær regresjon. I Scatchard-plott flyter de oppnådde lineære linjer faktisk sammen til den samme avskjæring på X-aksen (dvs. Bmax-verdien).

[<3>H]Forbindelse A-binding i rottehjernemembraner og snitt. Vi anvendte den spesifikke mGlul-reseptorradioligand [<3>H]Forbindelse A for å undersøke reseptor-binding i forskjellige områder av rottehjernen. Membraner fra rottecortex, - striatum, -cerebellum og -hippocampus ble fremstilt og [<3>H]Forbindelse A-binding ble målt. Ikke-spesifikk binding sammenlignet med total binding var 10 % i cerebellum, 30 % i hippocampus og 25 % i cortex og striatum. KD- og Bmax-verdier ble bestemt for hvert hjerneområde (tabell 15). KD-verdier var ca 1 nM for alle strukturer. Bmax-verdiene var signifikant forskjellige blant de forskjellige områder.

[<3>H]Forbindelse A merket et påfallende høyt antall mGlul-reseptorer i cerebellum.

I striatum og hippocampus ble ca 16 % av antallet seter funnet i cerebellum merket. Bare 11 % av antallet bindingsseter i cerebellum ble bundet i rottecortexen. Viktig, også inkubasjon med 10 jiM av den strukturelt ikke relatert forbindelse BAY 36-7620 hemmet maksimalt [<3>H]Forbindelse A-binding (figur 9). Den mGlu5-reseptorselektive forbindelse MPEP (testet opp til 30 jiM) påvirket ikke [<3>H]Forbindelse A-binding til rotte cerebel la membraner, som igjen viser Forbindelse As mGlul-reseptorselektivitet.

Ved å anvende radioligand-autoradiografi undersøkte vi [<3>H]Forbindelse A-bindingsfordeling i rottehjernesnitt i ytterligere detalj (figur 10). [<3>H]Forbindelse A-autoradiografi ble undersøkt i sagittal rottehjernesnitt; ikke-spesifikk binding ble bestemt ved å anvende forbindelse 135 (figur 10, panel A). Veldig høy spesifikk binding ble observert i det molekylære lag av cerebellum. Et moderat signal ble observert i CA3-feltet og dentate gyrus av den hippocampale formasjon, talamus, olfaktoriske tuberkel, amygdala og substantia nigra reticulata. Den cerebrale cortex, caudate putamen, ventral pallidum, nucleus accumbens viste lavere merking. Inkubasjon med BAY 36-7620 hemmet også fullstendig [<3>H]Forbindelse A-binding til rottehjernesnitt (figur 10, panel C).

Diskusjon

Hittil har bare noen få mGlul-reseptor-subtype selektive antagonister blitt funnet. mGIul-reseptoren har blitt vist å være selektivt blokkert av CPCCOEt (Litschig et al., Mol. Pharmacol. 55:453-461, 1999) og BAY 36-7620 med potenser som varierer fra mikromolar for CPCCOEt (6,6 jiM) til høye nanomolare konsentrasjoner for BAY 36-7620 (160 nM). I den foreliggende studie er forbindelse A identifisert som en ny mGlul-reseptorantagonist med lav nanomolar funksjonell antagonistisk potens på rotte mGlula-reseptoren (21,6 nM) og den humane mGlula-reseptor (10,4 nM). Antagonistvirkningen til forbindelse A ble funnet å være ikke-konkurrerende, siden den maksimale glutamat-indusert mGlul-reseptoraktivering ble minsket i nærvær av forbindelse A. Den observerte økning i glutamat EC50i nærvær av forbindelse A kan forklares ved nærværet av ledige reseptorer. I nærvær av lave konsentrasjoner av en ikke-konkurrerende antagonist, vil konsentrasjons-responskurven bli flyttet mot høyre fordi mer agonist trengs for å kompensere for de "ikke-ledige" reseptorer som blokkeres av antagonisten. Disse antagonistkonsentrasjoner vil likevel ikke påvirke den maksimale agonistrespons, selv om høyere antagonistkonsentrasjoner til slutt vil undertrykke maksimumsresponsen (Zhu et al., J. Pharm. Tox. Meth. 29:85-91, 1993). Dette fenomen har også blitt rapportert for BAY 36-7620 (Carroll et al., Mol. Pharmacol. 59:965-973, 2001) og CPCCOEt (Hermans et al., Neuropharmacoloqy 37:1645-1647, 1998). våre data viser videre at forbindelse A kan virke som en invers agonist mot mGlula-reseptoren og at forbindelse A virker selektivt på mGlul-reseptoren med hensyn på andre mGlu-reseptorsubtyper og ionotropiske glutamatreseptorer. Signaltransduksjonsdata viste at forbindelse A ikke viser agonist, antagonist eller positiv allosterisk virkning på mGlu2-, -3-, -4-, -5- og -6-reseptoren og radioligandbindingsstudier viste at [<3>H]Forbindelse A ikke binder til mGlu2-, -3-, -4-, -5- og -6-reseptoren, som videre utelukker muligheten for at forbindelse A virker som en nøytral ligand ved noen av disse reseptortyper. Mangelen på selektive mGlul-reseptorradioligander sammen med de interessante farmakologiske egenskaper til forbindelse A var overbevisende grunner til å merke forbindelse A for undersøkelsen av mGIul-reseptorer i bindingsstudier.

[<3>H]Forbindelse A-binding møter alle kravene til en ligand svært godt egnet til å studere bindingsegenskaper, farmakologi og fordeling av mGIul-reseptorer. Først ble [<3>H]Forbindelse A-bindingsstudier utført i rotte mGlula-reseptor-CHO-dhfr"-membraner. Spesifikk binding var svært høy og økte lineært med

proteinkonsentrasjon (figur 2). Spesifikk binding viste en beskjeden økning i nærvær av MgCI2og CaCI2/mens binding avtok med 22 % ved pH 6 og var upåvirket ved en økning i pH. Med hensyn til effektene av pH på binding, er det verdt å bemerke de beregnede fysikokjemiske egenskaper til forbindelse A: beregnet pKaog clogP er henholdsvis 6,2 og 4,5. Ved pH 7,4 er ionisasjonsgraden av forbindelse A således svært lav (bare 5,9 %). Prosenten av ionisasjon reduseres ytterligere ved høyere pH (1,6 % ved pH 8, 0,2 % ved pH 9 og ingen protonasjon ved pH 10). clogD-verdien forblir 4,5 fra pH 7,4 til pH 10. Ved pH 6 er imidlertid 61,3 % av forbindelse A i den protonerte form. Følgelig avtar clogD til 4,1. Den lavere binding av liganden i ionisert form antyder at den ikke-ioniserte ligand har den høyeste bindingsaffinitet. Dette er bemerkelsesverdig, og er i motsetning til funn for ligander for mono-amin G protein-koblede reseptorer (f.eks. dopaminreseptoren), som ofte er sterke baser og binder i en kationisk form. For slike forbindelser er drivkraften for bindingen til reseptoren elektrostatisk i natur (Van de Waterbeemd et al., J. Med. Chem. 29:600-606, 1986). Våre data kan indikere at ioniske interaksjoner ikke er en drivkraft i bindingen til reseptoren, og at det heller ikke er et bidrag av ioniske overflateeffekter. Følgelig, selv om forbindelse A er en sterkt lipofil forbindelse, kan den svært lave ikke-spesifikk [<3>H]Forbindelse A-binding skyldes det faktum at ingen elektrostatisk interaksjon kan skje mellom den ikke-ioniserte form av forbindelse A og den negativt ladde

cellemembrane. Binding var temperaturavhengig, og økte betydelig ved 4 °C (figur 3). I kraft av dens raske assosiasjons- og dissosiasjonskinetikk ble bindingslikevekt hurtig nådd. [<3>H]Forbindelse A merket tilsynelatende en enkelt populasjon av seter med en svært høy affinity (KD= 0,90 ± 0,14 nM). Derimot foreviser [<3>H]quisqualat, den hittil valgte mGlul-reseptorradioligand, en mye høyere KD-verdi på 22,0 ± 10 nM, som korrelserer godt med verdien på 37 nM oppnådd av Mutel et al., ^ Neurochem, 75:2590-2601, 2000. Ved siden av den vesentlig høyere affinitet merket [<3>H]Forbindelse A signifikant flere (-40 %) bindingssteder enn [<3>H]quisqualat. Bmax-verdier på 6512 ± 1501 fmol/mg protein og 3912 ± 436 fmol/mg protein ble funnet for henholdsvis [<3>H]Forbindelse A og [<3>H]quisqualat. Denne diskrepans kan forklares på grunnlag av G protein-koblingen av reseptoren. Agonister fremmer koblingen av reseptoren til G proteinet, som resulterer i en reseptorkonformasjon med høy affinitet for agonistser. I henhold til denne teori ville en fullstendig agonist slik som quisqualat overveiende merke den høye affinitet eller G protein-koblet reseptortilstand. En antagonist ville ha lik affinitet for koblede og ukoblede reseptorer, og således for både høy- og lav-affinitetstilstandenen av reseptoren, vårt funn at Bmaxfor [<3>H]Forbindelse A er betydelig høyere enn for [<3>H]quisqualat er på linje med denne teori.

Et slående funn i denne studie var at den naturlige agonist glutamat og også quisqualat var ute av stand til å hemme [<3>H]Forbindelse A-binding til rotte mGlula-reseptor-CHO-dhfr-membraner, mens CPCCOEt, BAY 36-7620, NPS 2390 og forbindelse A, kjent som ikke-konkurrerende antagonister, alle hemmet [<3>H]Forbindelse A-binding til det samme maksimale nivå (figur 6). Hemming av [<3>H]Forbindelse A-binding av de sistnevnte forbindelser fulgte sigmoidale kurver med Hill-koeffisienter på ca 1,0 (tabell 11), som ikke ga indikasjon for binding til multiple seter. Det er viktig å nevne at selv om en strukturelt beslektet analog ble anvendt for å definere ikke-spesifikk binding, ble en lignende lav ikke-spesifikk binding oppnådd med strukturelt ikke beslektede forbindelser slik som BAY 36-7620 når anvendt ved 1 jiM eller mer i rotte mGlula-reseptor-CHO-dhfr"-membraner (figur 6). For [<3>H]quisqualat kunne alle de aminosyrelignende strukturer, kjent som konkurrerende ligander, erstatte [<3>H]quisqualat fra dens bindingssete. Hemmende potenser av quisqualat, glutamat, LY367385, (S)-3,5-DHPG, (S)-4C3HPG, IS, 3R-ACPD, (S)-4CPG, AIDA og MCPG (tabell 13) var i god overensstemmelse med verdiene rapportert av Mutel et al. J. Neurochem. 75:2590-2601, 2000. Derimot påvirket ikke de over ikke-konkurrerende forbindelser dens binding. For CPCCOEt har det blitt rapportert at den ikke påvirker [<3>H]glutamatbinding til membraner fremstilt fra rotte mGlula-reseptoruttrykkende celler (Litschig et al., Mol. Pharmacol. 55:453-461. 19991. Videre har det blitt antydet at CPCCOEt ikke binder til glutamatbindingssetet, men interagerer med Thr815 og Ala818 i transmembrandomene VII. CPCCOEt er foreslått å interferere med reseptorsignalering ved å avbryte en intramolekylær interaksjon mellom det glutamat-bundede ekstracellulære domene og transmembrandomenet VII. Caroll et al. i Mol. Pharmacol. 59:965-973, 2001 demonstrerte at BAY 36-7620 ikker erstattet [<3>H]quisqualat fra glutamatbindingslommen. Transmembrane spiraler 4 til 7 ble vist å spille en sentral rolle for binding av BAY 36-7620. Våre hemmingseksperimenter utført med [<3>H]Forbindelse A og [<3>H]quisqualat antyder at CPCCOEt, BAY 36-7620, NPS 2390 binder til det samme sted som forbindelse A. Metningseksperimenter ved å anvende [<3>H]Forbindelse A i fravær og nærvær av 30 nM CPCCOEt, 100 nM BAY 36-7620 og 10 nM NPS 2390 støtter videre at disse forbindelser binder til de samme eller gjensidig utelukkende seter. KD-verdier økte signifikant, mens Bmax-verdien var uendret (tabell 14). Disse resultater indikerer at selv om affiniteten til [<3>H]Forbindelse A avtar, er fremdeles høye konsentrasjoner av [<3>H]Forbindelse A i stand til å erstatte binding av den andre forbindelse fra dens bindingssete, som er en typisk egenskap ved en konkurrerende interaksjon. Til slutt støtter våre data oppfatningen at CPCCOEt, BAY 36-7620, NPS 2390 og forbindelse A virker på et sete forskjellig fra glutamatbindingslommen, formodentlig konkurrerer de om det samme transmembransegment VII.

Tidligere gruppe I mGlu-reseptorbindingsstudier i hjerne ble utført ved å anvende [<3>H]glutamat eller [<3>H]quisqualat (Schoepp og True, Neurosci. Lett 145:100-104, 1992; Wright et al., J. Neurochem. 63:938-945, 1994; Mutel et al., J. Neurochem. 75:2590-2601, 2000). Disse radioligander har ulempen at de merker mer enn en type glutamatreseptor. Derfor måtte selektive inhibitorer bli tilsatt til inkubasjonsbufferen for å forhindre merking på andre metabotropiske eller ionotropiske glutamatreseptor-subtyper. Hittil er det ingen radioligand tilgjengelig for å spesifikt studere bindingen og fordelingen av mGlul-reseptoren. Den spesifikke mGlul-reseptormerking av [<3>H]Forbindelse A gjør den spesielt nyttig for undersøkelsen av naturlig forekommende mGIul-reseptorer i rotte eller human hjerne. Eksperimenter ved å anvende rottecortex-, hippocampus-, striatum- og cerebellum membraner viste at [3H] Forbindelse A spesifikk binding, definert i nærvær av 1 jiM forbindelse 135, var høy, spesielt i cerebellum (bare 10 % ikke-spesifikk binding). Metningeksperimenter viste at [<3>H]Forbindelse A igjen merket tilsynelatende et enkelt bindingssete med svært høy affinitet. KD-verdier på ca 1 nM ble funnet for alle de forskjellige hjerneområder (tabell 15). En slående forskjell i Bmax-verdier ble funnet: en stor populasjon av bindingsseter ble merket i cerebellum, mens i hippocampus, striatum og cortex ble moderate til lave nivåer av reseptorekspresjon detektert.

På grunn av dens spesifisitet viste [<3>H]Forbindelse A seg å være spesielt passende for undersøkelse av mGlul-reseptorfordeling i hjernesnitt ved å anvende radioligand-autoradiografi. mGlul-reseptor-autoradiografi viste at det høyeste nivå av mGIul spesifikk binding var til stede i det molekylære lag av cerebellum. Det granule cellelag ble svært svakt merket. Disse resultater ble også funnet av Mutel et al. i J. Neurochem. 75:2590-2601, 2000 som undersøkte gruppe I mGlu-reseptorfordeling ved å anvende [<3>H]quisqualat. I den hippocampale formasjon viste det CA3-dendritiske felt sammen med det molekylære lag av den dentate gyrus rikelig merking. CAl-arealet viste svært svak [<3>H]Forbindelse A-binding, som stemmer godt overens med immunohistokjemiske data fra Lujan et al., Eur. J. Neurosci. 8:1488-1500. 1996 og Shigemoto et al., J. Neurosci. 17:7503-7522, 1997, som viste at i CAl-dendritiske felt ga et antistoff spesifikt for mGlu5-reseptoren, men ikke et spesifikt mGIul-reseptorantistoff intens immunomerking. Autoradiografieksperimenter ved å anvende [<3>H]quisqualat viste virkelig farging i både CA1- og CA3-området av hippocampus, som indikerer binding til henholdsvis både mGIul- og mGlu5-reseptoren (Mutel et al., J. Neurochem. 75:2590-2601, 2000). [<3>H]Forbindelse A-binding var også ganske høy i talamus, den olfaktoriske tuberkel, amygdala og substantia nigra reticulata og var noe lavere i den cerebrale cortex, caudate putamen, nucleus accumbens og ventral pallidum. De samme strukturer ble merket ved å anvende [<3>H]quisqualat (Mutel et al., J. Neurochem. 75:2590-2601, 2000). Også immunocytokjemiske funn på den cellulære lokalisering av mGlula-reseptoren, ved å anvende et antistoff selektivt for mGlula.-reseptoren, var generelt overensstemmende med våre data (Martin et al., Neuron. 9:259-270, 1992). Siden [<3>H]Forbindelse A er forventet å merke alle mGlul-reseptor-spleisevarianter kjent til dags dato, kan imidlertid fordelingen av 1 spleisevariant skille seg fra den til vårt radiomerke. For eksempel, i CA3-området og den caudate putamen, som er merket av radioliganden, ble mGlulb-reseptor, men ingen eller lite mGlula-reseptorimmunoreaktivitet funnet (Martin et al., Neuron. 9:259-270, 1992; Shigemoto et al., J. Neurosci. 17:7503-7522, 1997; Ferraguti et al., J. Cosm<p>. Neur. 400:391-407, 1998). Et viktig poeng i demonstrasjonen av identiteten til de [<3>H]Forbindelse A-merkede steder var funnet at den strukturelt forskjellige forbindelse BAY 36-7620 også fullstendig erstatter [<3>H]Forbindelse A-binding til rottehjernemembraner (figur 9) samt til hjernesnitt (figur 10), som gir en god garanti for at den hemmede binding utelukkende er reseptorspesifikk og ikke relatert til en strukturell enhet i radioliganden.

I denne søknad har vi vist at [<3>H]Forbindelse A er en utmerket radioligand for å studere mGlul-reseptorer i et heterologt ekspresjonssystem, rottehjernehomogenater og hjernesnitt. Vi kan konkludere med at på grunn av dens minimale ikke-spesifikk binding, dens høye bindingsaffinitet og markerte selektivitet, er [<3>H]Forbindelse A-liganden som man foretrekker for videre utforsking av mGlul-reseptoren. [<3>H]Forbindelse A åpener perspektiver for en detaljert undersøkelse av subcellulær og cellulær lokalisering av mGlul-reseptoren og for studien av den funksjonelle rolle og regulering av reseptoren i forskjellige områder.

Figurliste

Fig. 1: Antagonistprofile av Forbindelse A. Hemming av glutamat (30 (iM)-indusert Ca<2+->mobilisering i CHO-dhfr"-celler som uttrykker rotte mGlula-reseptoren er vist i Fig. IA. Data uttrykkes som prosent av signalet oppnådd ved å anvende 30 jiM glutamat, som ble satt ved 100 % og er gjennomsnitt ± SD av 3 eksperimenter. Fig. IB viser en konsentrasjon-responskurve for glutamat alene eller sammen med 20 nM, 30 nM, 60 nM, 100 nM og 1 jiM Forbindelse A. Verdier er gjennomsnitt ± SD av triplikatbestemmelser innenfor 1 eksperiment. Et ytterligere eksperiment viste de samme resultater. Fig. 1C viser basal IP-akkumulasjon i nærvær av økende konsentrasjoner av Forbindelse A. Verdier uttrykkes som prosent av basal IP-produksjon i nærvær av løsningsmiddel, som ble satt som 100 % og er gjennomsnitt ± SD av 3 eksperimenter utført i kvadruplikat. Fig. 2: Spesifikk [<3>H]Forbindelse A-binding er lineær med mengde membranprotein. 10 til 50jig rotte mGlula-reseptor-CHO-dhfr"-membraner ble inkubert i 30 min på er med 2,5 nM [<3>H]Forbindelse A. Data uttrykkes som gjennomsnitt ± SD av triplikatbestemmelser og er fra et representativt eksperiment. Fig. 3: Assosiasjon-tidsforløpscurve for [<3>H]Forbindelse A-binding til rotte mGlula-reseptor CHO-dhfr"-membraner. Assosiasjonskinetikk ble målt ved å tilsette 2,5 nM [<3>H]Forbindelse A ved forskjellige tider før filtrering og ble bestemt ved 3 forskjellige temperaturer. Data er gjennomsnitt ± SD av 3 uavhengige eksperimenter utført i duplikat. Fig. 4: Tisforløp for dissosiasjon av [<3>H]Forbindelse A til rotte mGlula-reseptor CHO-dhfr"-membraner ved 4 °C og 25 °C. Prøver ble inkubert i 30 min ved 4 °C eller 25 °C, deretter ble et overskudd av forbindelse 135 tilsatt, etterfulgt av hurtig filtrering ved tiden indikert for hvert datapunkt. Verdier er gjennomsnitt ± SD av 2 uavhengige eksperimenter utført i duplikat. Fig. 5: Representativ metningsbindingskurve og Scatchard-plott av [<3>H]Forbindelse A-binding til rotte mGlula-reseptor-CHO-dhfr"-membraner. Spesifikk binding (SB) ble oppnådd ved å beregne forskjellen mellom total binding (TB) og ikke-spesifikk binding (BL), målt i nærvær av 1 jiM forbindelse 135. For hvert eksperiment ble datapunkter bestemt i duplikat. Eksperimentet ble gjenntatt 3 ganger. Fig. 6: Hemming av 2,5 nM [<3>H]Forbindelse A-binding til rotte mGlula-reseptor-CHO-dhfr"-membraner av forskjellige mGlu-reseptorantagonister. Datapunkter representerer % av total binding og er gjennomsnitt ± SD av 3-4 individuelle eksperimenter. Fig. 7: Representativ metningsbindingskurve og Scatchard-plott av [<3>H]quisqualat-binding til rotte mGlula-reseptor-CHO-dhfr"-membraner. For hvert eksperiment ble datapunkter bestemt i duplikat. Eksperimentet ble gjentatt 2 ganger. Fig. 8: Metningsbindingskurver og Scatchard-plott av [3H]Forbindelse A-binding til rotte mGlula-reseptor-CHO-dhfr -membraner i fravær og nærvær av CPCCOEt (30 ytA), BAY 36-7620 (100 nM) og NPS 2390 (10 nM). Den viste graf er en representativ for 3 uavhengige eksperimenter. Data uttrykkes i nM spesifikt bundet. For hvert eksperiment ble datapunkter bestemt i duplikat. Fig. 9: Hemming av 2,5 nM [<3>H]Forbindelse A-binding til rotte cerebellarmembraner av BAY 36-7620. Datapunkter representerer % av total binding og er gjennomsnitt ± SD av 2 individuelle eksperimenter. Fig. 10: [<3>H]Forbindelse A-binding til sagittalt rottehjernesnitt ved å anvende autoradiografi. Panel A er et representativt snitt som viser total binding med 1,5 nM [<3>H]Forbindelse A. Panel B er et representativt og nærliggende snitt som viser ikke-spesifikk binding med 1,5 nM [<3>H]Forbindelse A i nærvær av 1 jiM forbindelse 135. Panel C er et representativt snitt som viser ikke-spesifikk binding med 1,5 nM [<3>H]Forbindelse A i nærvær av 10 jiM BAY 36-7620. Snitt fra panel A og B ble eksponert for [<3>H]Hyperfilm, mens snittet fra panel C ble eksponert for en Fuji avbildingsplate. Th, talamus; SNr, substantia nigra reticulata; CA3, CA3-områd av hippocampus; Dg; dentate gyrus av hippocampus; Cer; cerebellum; Cp, caudate putamen; Cx, cerebral cortex, Ot, olfaktorisk tuberkel, Am, amygdala, Vp, ventral pallidum, Na, nucleus accumbens.

Claims

1. Forbindelse, hvori forbindelsen er en hvilken som helst av forbindelsene (a), (b), (c), (d) og (e):

2. Forbindelse ifølge krav 1, hvori forbindelsen er forbindelse (a).

3. Anvendelse av en forbindelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1-2 i en diagnostisk fremgangsmåte.

4. Anvendelse av en forbindelse ifølge krav 3, hvori den diagnostiske fremgangsmåte består av å merke eller identifisere en mGlul-reseptor i biologisk materiale.

5. Anvendelse av en forbindelse ifølge krav 4, hvori merkingen består av å administrere forbindelsen til biologisk materiale og identifiseringen består av å detektere emisjonene fra forbindelsen.

6. Anvendelse av en forbindelse ifølge krav 3, hvori den diagnostiske fremgangsmåte består av å screene om en testforbindelse har evnen til å okkupere eller binde til en mGlul-reseptor i biologisk materiale.

7. Anvendelse av en forbindelse ifølge et hvilket som helst av kravene 4-6, hvori det biologiske materiale er valgt fra gruppen av vevsprøver, plasmafluid, kroppsvæsker, kroppsdeler og organer som stammer fra varmblodige dyr og varmblodige dyr perse.

8. Anvendelse av en forbindelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1-2 for fremstillingen av et diagnostisk verktøy for å merke eller identifisere en mGlul-reseptor i biologisk materiale.

9. Anvendelse av en forbindelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1-2 for fremstillingen av et diagnostisk verktøy for å screene om en testforbindelse har evnen til å okkupere eller binde til en mGlul-reseptor i biologisk materiale.

10. Anvendelse av en forbindelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1-2 for fremstillingen av et diagnostisk verktøy for å avbilde et organ ved å administrere en tilstrekkelig mengde av en forbindelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1-2 i en passende sammensetning til biologisk materiale, hvorved nevnte forbindelse binder til et mGIul-reseptorsete i det biologiske materiale; og detektering av emisjonene fra forbindelsen.

11. Anvendelse av en forbindelse eller sammensetning ifølge krav 10 for fremstillingen av et diagnostisk verktøy for avbilding av et organ, hvor avbildingen utføres ved å anvende positronemisjonstomografi (PET).