PL189015B1

PL189015B1 - Niewodny preparat peptydowy, sposób wytwarzania niewodnego preparatu peptydowego i zastosowanie tego preparatu

Info

Publication number: PL189015B1
Application number: PL97330927A
Authority: PL
Inventors: Cynthia L. Stevenson; Steven J. Prestrelski
Original assignee: Alza Corp
Priority date: 1996-07-03
Filing date: 1997-07-01
Publication date: 2005-06-30
Also published as: HUP9904270A2; MY128850A; NO322514B1; HUP9904270A3; CZ300378B6; IL170958A; IL178824A; TW584562B; PT1208846E; ATE224199T1; NO986207D0; EP1208846A2; SK283926B6; BR9710132A; NO20063870L; DE69728582D1; AU739169B2; NZ333294A; US6235712B1; DE69715639D1

Abstract

1. Niewodny preparat peptydowy, który zawiera, co najmniej jeden zwiazek po- krewny hormonu uwalniajacego hormon luteinizujacy (LHRH), oraz co najmniej jeden polarny rozpuszczalnik aprotonowy, znamienny tym, ze jako polarny rozpuszczalnik apro- tonowy zawiera rozpuszczalnik wybrany z grupy obejmujacej dimetylosulfotlenek, dimety- loformamid, heksametylofosfotriamid lub n-metylopirolidon i jest stabilny w temperaturze 37°C przez przynajmniej 3 miesiace. 13. Sposób wytwarzania trwalego niewodnego preparatu peptydowego okreslonego w zastrz. 1, znamienny tym, ze zwiazek pokrewny LHRH rozpuszcza sie, w co naj- mniej jednym polarnym rozpuszczalniku nie protonowym wybranym z grupy obejmujacej dimetylosulfotlenek, dimetyloformamid, heksametylofosfotriamid lub n-metylopirolidon. 22. Zastosowanie preparatu okreslonego w zastrz. 1 do wytwarzania srodka leczni- czego do leczenia raka prostaty i schorzen zwiazanych z hormonami przez podawanie tego preparatu leczonemu osobnikowi. 31. Zastosowanie preparatu okreslonego w zastrz. 1 do wytwarzania srodka bakterio- statycznego, bakteriobójczego lub zarodnikobójczego. PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest niewodny polarny nie protonowy preparat peptydowy, zwłaszcza o wysokich stężeniach, sposób wytwarzania niewodnego preparatu peptydowego i zastosowanie tego preparatu do wytwarzania środka do leczenia schorzeń, które mogą być łagodzone podaniem związku peptydowego.

Na ogół dostępność biologiczna peptydów, w tym związków pokrewnych hormonowi uwalniającemu hormon luteinizujący (LHRH), podawanych w roztworach wodnych jest niska.

Hormon uwalniający hormon luteinizujący (LHRH) znany również pod nazwą hormon uwalniający gonadotropinę (GnRH) jest dekapetydem o budowie:

pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2.

Jest on wydzielany w podwzgórzu i wiąże się z receptorami w przysadce mózgowej uwalniając hormon luteinizujący (LH) [lutropinę] i hormon folikulostymulujący (FSH) [folitropinę], LH i FSH pobudzają gonady (gruczoły płciowe) do syntezy hormonów steroidowych. Znanych jest szereg analogów LHRH, w tym peptydów pokrewnych LHRH, które działają jako agoniści LHRH oraz takich, które działają jako antagoniści LHRH ([1-15] patrz pozycje literaturowe na końcu opisu). Analogi LHRH znane sąjako związki przydatne w leczeniu zaleznych od hormonów chorób takich jak rak prostaty, łagodny przerost prostaty, endometrioza, mięśniak macicy, włókniak macicy, przedwczesne dojrzewanie lub rak piersi oraz jako środki antykoncepcyjne [8]. Korzystne jest podawanie o przedłużonym uwalnianiu zarówno związków będących agonistami LHRH, gdyż zmniejsza to liczbę dostępnych receptorów po powtarzanym podawaniu i w rezultacie obniża wytwarzanie hormonów sterydowych oraz związków będących antagonistami LHRH, które muszą być podawane w sposób ciągły dla trwałego blokowania endogennego LHRH [8].

Przedłużone, ciągłe pozajelitowe dostarczanie leków, zwłaszcza leków peptydowych wykazuje wiele zalet. Stosowanie implantowanych materiałów (urządzeń) umożliwiających przedłuzone, ciągłe dostarczanie rozmaitych leków lub innych korzystnych czynników jest juz dobrze znane. Typowe materiały opisano np. w opisach patentowych US 5.034.229; US 5.057.318 i US 5.110.596.

189 015

Generalnie dostępność biologiczna podawanych doustnie peptydów, w tym związków pokrewnych LHRH, jęst niska [16-17],

Dostępne aktualnie na rynku preparaty LHRH, jego analogów i związków pokrewnych stosowane do iniekcji pozajelitowych, stanowią roztwory wodne o stosunkowo niskich stężeniach związków pokrewnych LHRH (0,05 do 5 mg/ml); mogą one zawierać również takie zarobki jak mannitol lub laktozę [18-20]. Takie preparaty związków pokrewnych LHRH muszą być przechowywane w lodówce lub w temperaturze pokojowej przez krótki okres czasu.

Dostępne preparaty „depot” związków pokrewnych LHRH, których podanie zapewnia przedłuzone ciągłe uwalnianie leku w okresie 1-3 miesięcy obejmują preparaty zawierające 15% związku pokrewnego LHRH zdyspergowanego w osnowie będącej kopolimerem kwasów D,L-mlekowego i glikolowego o kształcie cylindrycznym dostosowanym do iniekcji podskórnych [1] i preparaty zawierające mikrocząsteczki z rdzeniem związku pokrewnego LHRH i żelatyną otoczone warstewką kopolimeru kwasów D,L-mlekowego i glikolowego. Takie mikrocząsteczki zawiesza się w rozcieńczalniku odpowiednim do iniekcji podskórnych lub domięśniowych [21, 26]. Produkty takie należy przechowywać w temperaturze pokojowej lub niższej. Wodne preparaty związków pokrewnych LHRH są znane z chemicznej i fizycznej nietrwałości oraz z tego, że ulegają rozpadowi pod wpływem napromieniowania [12-16, 22-25],

Znane z trwałości preparaty (t» około pięciu lat) są bardzo rozcieńczonymi (25 pg/ml) buforowanymi (10 mmol, moc jonowa 0,15) roztworami wodnymi do przechowywania w temperaturach nie wyzszych niż temperatura pokojowa (25°C) [15].

Istnieje zatem potrzeba opracowania trwałych preparatów peptydowych.

Wynalazek obejmuje niewodny preparat peptydowy, który zawiera, co najmniej jeden związek pokrewny hormonu uwalniającego hormon luteinizujący (LHRH) oraz, co najmniej jeden polarny rozpuszczalnik nie protonowy, który jako polarny rozpuszczalnik nie protonowy związku pokrewnego LHRH zawiera rozpuszczalnik wybrany z grupy obejmującej dimetylosulfotlenek, dimetyloformamid, heksametylofosfotriamid lub n-metylopirolidon w ilości, co najmniej 10% wagowo i jest stabilny w temperaturze 37°C przez przynajmniej 3 miesiące.

Preparat ten zawiera związek pokrewny LHRH korzystnie w ilości, co najmniej 10% wagowych do, co najmniej 30% wagowych przy czym jako związek pokrewny LHRH zawiera leuprorelinę, LHRH, nafarelinę i goserelinę.

Preparat według wynalazku jest trwały w temperaturze 80°C, przez co najmniej 2 miesiące, a w temperaturze 37°C jest trwały, przez co najmniej jeden rok, nadaje się zatem do stosowania w implantowanym urządzeniu do dostarczania leków.

Preparat według wynalazku może dodatkowo zawierać niewodny rozpuszczalnik protonowy oraz polarny rozpuszczalnik protonowy zapobiegający żelowaniu.

Korzystny preparat jako związek pokrewny LHRH zawiera od 30% do 50% wagowych octanu leuproreliny w dimetylosulfotlenku.

Zasadniczo leuprorelina i dimetylosulfotlenek zawarte są w proporcji 307 mg leuproreliny na 1 ml dimetylosulfotlenku. Preparat jest stabilny po napromieniowaniu.

Wynalazek obejmuje również sposób wytwarzania trwałego niewodnego preparatu peptydowego, przez rozpuszczenie, co najmniej jednego związku pokrewnego LHRH, w co najmniej jednym polarnym rozpuszczalniku nie protonowym. Według wynalazku związek pokrewny LHRH rozpuszcza się, w co najmniej jednym polarnym rozpuszczalniku nie protonowym wybranym z grupy obejmującej dimetylosulfotlenek, dimetyloformamid, heksametylofosfotriamid lub n-metylopirolidon w ilości, co najmniej 10% wagowo.

W sposobie według wynalazku korzystnie rozpuszcza się, co najmniej 10% do co najmniej 30% wagowych, związku pokrewnego LHRH, przy czym związek pokrewny LHRH dobiera się z grupy obejmującej leuprorelinę, LHRH, nafarelinę i goserelinę. Dodatkowo można dodawać niewodny rozpuszczalnik protonowy.

Związek pokrewny LHRH jakim jest octan leuproreliny rozpuszcza się w dimetylosulfotlenku w ilości od 30% do 50% wagowych lub 370 mg leuporeliny w 1 ml dimetylosulfotlenku. Rozpuszczanie przeprowadza się w atmosferze gazu obojętnego, takiego jak suchy azot.

189 015

Preparat według wynalazku znajduje zastosowanie do wytwarzania środka leczniczego do leczenia raka prostaty i schorzeń związanych z hormonami, takich jak wymienione powyżej, przez podawanie tego preparatu leczonemu osobnikowi.

Zwykle wytwarzany środek leczniczy jest podawany pozajelitowo, korzystnie podawany jest długoterminowo w sposób ciągły, na przykład za pomocą wszczepionego implantu.

Gdy leczonym schorzeniem jest rak prostaty, podawanym związkiem pokrewnym LHRH jest leuprorelina. Korzystnie, wytwarzany środek leczniczy jest podawany w postaci 80 pg leuprolidu dziennie. W przypadku, gdy jest podawany w postaci implantu, podawany jest w wybranym okresie 3 miesięcy lub 6 miesięcy lub 12 miesięcy.

Przy leczeniu raka prostaty, jako związek pokrewny LHRH zastosowany może być antagonista LHRH.

Preparat według wynalazku może być zastosowany do wytwarzania środka bakteriostatycznego, bakteriobójczego i zarodnikobójczego.

Wynalazek zapewnia trwałe niewodne preparaty będące roztworami związków peptydowych w polarnych rozpuszczalnikach nie protonowych. W szczególności stężenie związków peptydowych w preparatach wynosi, co najmniej około 10%. Takie trwałe preparaty można przechowywać w podwyższonych temperaturach (np. 37°C) przez długie okresy czasu i są one szczególnie przydatne do stosowania w materiałach implantowanych umożliwiających długie (np. przez 1-12 miesięcy) dostarczanie leku.

Tak więc, w jednym aspekcie, wynalazek zapewnia trwałe niewodne preparaty związków peptydowych, które zawierają, co najmniej jeden związek peptydowy, w co najmniej jednym polarnym rozpuszczalniku nie protonowym, o zawartości związku, co najmniej około 10%o wagowo związku.

W innym aspekcie, wynalazek podaje sposób wytwarzania trwałego niewodnego preparatu związku peptydowego, który obejmuje rozpuszczenie, co najmniej jednego związku peptydowego, w co najmniej jednym polarnym rozpuszczalniku nie protonowym. Korzystne preparaty zawierają, co najmniej około 10^o% wagowo związku peptydowego.

W jeszcze dalszym aspekcie, wynalazek wskazuje na zastosowanie preparatu do wytwarzania leków do leczenia osobników cierpiących na schorzenie, które może być łagodzone podaniem skutecznej ilości związku peptydowego w trwałym niewodnym preparacie zawierającym, co najmniej jeden związek peptydowy, w co najmniej jednym polarnym rozpuszczalniku nie protonowym.

Na załączonych rysunkach:

figura 1 ilustruje trwałość 40% wagowo roztworu octanu leuprolidu w dimetylosulfotlenku (DMSO) po dwóch miesiącach przechowywania w temperaturze 80°C oznaczoną metodą chromatografii HPLC na fazie odwróconej (RP-HPLC);

figura 2 przedstawia tę samą próbkę co na fig. 1 poddaną chromatografii ekskluzyjnej (wykluczania, zelowo-permeacyjnej). Wykres wskazuje, iż występuje bardzo niewielka agregacja cząsteczek i udział w niej ma powstawanie dimeru i trimeru, natomiast nie tworzą się agregaty wyższego rzędu;

figura 3 przedstawia wykres Arrheniusa wskazujący na ubytek leuprolidu w 40% roztworach octanu leuprolidu w dimetylosulfotlenku (DMSO);

figura 4 ilustruje chemiczną i fizyczną trwałość 40% roztworu octanu leuprolidu w DMSO po sześciu miesiącach przechowywania w temperaturze 80°C;

figura 5 ilustruje ubytek leuprolidu w 40% roztworze octanu leuprolidu w DMSO w trakcie przechowywania przez sześć miesięcy w temperaturach 37°C, 50°C, 65°C lub 80°C; figura 6 ilustruje trwałość chemiczną 40% roztworu octanu leuprolidu w DMSO w trakcie przechowywania przez dziewięć miesięcy w temperaturze 37°C;

figura 7 ilustruje, że wzrost stężenia peptydu - leuprolidu w DMSO podwyzsza jego trwałość w temperaturze 80°C;

figura 8 ilustruje, że wzrost zawartości wilgoci w 40% preparatach leuprolid-DMSO jest wynikiem zmniejszonej trwałości w temperaturze 80°C;

figura 9 ilustruje, że w preparatach pokazanych na fig. 8 zawartość produktów rozpadu wzrasta wraz ze wzrostem zawartości wilgoci.

189 015

Niniejszy wynalazek bazuje na nieoczekiwanym odkryciu, że rozpuszczenie związków peptydowych w niewodnych rozpuszczalnikach nie protonowych prowadzi do uzyskania trwałych preparatów. Znane poprzednio preparaty związków peptydowych będące rozcieńczonymi buforowanymi roztworami wodnymi zawierającymi takie zarobki jak EDTA lub kwas askorbinowy, które należało przechowywać w niskich temperaturach (4-25°C) ulegały degradacji do produktów rozpadu na drodze takiej jak katalizowana kwasami/zasadami hydroliza, deaminacja, racemizacja i utlenianie. W przeciwieństwie do tego preparaty według wynalazku stabilizują związki peptydowe w podwyższonych temperaturach (np. od 37°C do 80°C) i w wysokich stężeniach (np. co najmniej około 10%).

Standardowe preparaty peptydowe i białkowe są rozcieńczonymi roztworami wodnymi. Stabilność leku osiąga się poprzez zmianę jednego lub więcej z poniższych parametrów: pH, rodzaj buforu, moc jonowa, zarobki (EDTA, kwas askorbinowy itd.). Dla standardowych preparatów nie można uzyskać pełnej stabilizacji, ponieważ drogi degradacji wymagają obecności wody (hydroliza, deaminacja, racemizacja). Natomiast, jak wykazano, peptydy w roztworach niewodnych takich jak roztwór w dimetylosulfotlenku (DMSO) i dimetyloformamidzie (DMF) są chemicznie i fizycznie bardziej stabilne niż w roztworach wodnych. DMSO i DMF traktowane są jako polarne rozpuszczalniki nie protonowe. Można by oczekiwać, że rozpuszczalniki nie protonowe obniżą szybkość degradacji, ponieważ nie są zdolne dostarczać protony do reakcji degradacji. Natomiast, rozpuszczalniki bardziej polarne niż woda (przykładowo, momenty dipolowe wynoszą dla wody 1,85, dla DMF 3,82 i dla DMSO 3,96) mogłyby zwiększać szybkość degradacji gdyż mogą uczestniczyć w stabilizowaniu etapu określającego szybkość degradacji i ją zwiększać. Tym niemniej podczas prac nad wynalazkiem odkryto, że całkowity końcowy efekt polarnych rozpuszczalników nie protonowych generalnie jest efektem stabilizującym roztwory peptydów.

Zastosowanie niewodnych rozpuszczalników nie protonowych takich jak DMSO i DMF stabilizuje preparaty peptydowe i zapobiega ich fizycznej i chemicznej degradacji. Odkrycie to pozwala na zastosowania DMSO i DMF do poprawy całkowitej stabilności peptydów w szerokim przedziale warunków w tym wysokich stężeń i podwyższonych temperatur, umożliwiając w ten sposób dostarczanie peptydów za pomocą długo działających implantowanych materiałów (urządzeń), co inaczej nie byłoby możliwe.

A. Definicje: Stosowane tutaj terminy mają następujące znaczenia:

Termin „trwałość (stabilność) chemiczna” oznacza, że na drodze chemicznej takiej jak utlenianie lub hydroliza w preparacie powstają dopuszczalne ilości produktów degradacji. W szczególności, preparat uznawany jest za chemicznie trwały, gdy nie więcej niż około 20% produktów rozpadu powstaje w ciągu dwóch miesięcy w temperaturze 37°C.

Termin „trwałość (stabilność) fizyczna” oznacza, że powstają dopuszczalne ilości agregatów (np. dimerów, trimerów i większych form). W szczególności, preparat uznawany jest za fizycznie trwały, gdy nie więcej niż około 15% agregatów powstaje w ciągu dwóch miesięcy w temperaturze 37°C.

Termin „preparat trwały” oznacza, że w preparacie pozostaje przynajmniej 65% trwałego chemicznie i fizycznie związku peptydowego po dwóch miesiącach w temperaturze 37°C (lub w równoważnych warunkach w podwyższonej temperaturze). Szczególnie korzystnymi preparatami są takie, w których pozostaje, co najmniej 80% trwałego chemicznie i fizycznie peptydu w tych warunkach. Wyjątkowo korzystnymi są takie preparaty, które nie ulegają degradacji w warunkach wyjaławiania przez naświetlania (promieniowaniem gamma, beta lub strumieniem elektronów).

Terminy „peptyd” i/lub „związek peptydowy” oznaczają polimer zbudowany z około 50 reszt aminokwasowych połączonych poprzez wiązania amidowe (CONH). W zakres tego określenia wchodzą analogi, pochodne, agoniści, antagoniści i ich farmaceutycznie dopuszczalne sole. 'Termin ten obejmuje również peptydy i/lub związki peptydowe zawierające D-aminokwasy, modyfikowane, podstawione lub nie występujące naturalnie aminokwasy o konfiguracji D- lub L, i/lub jednostki peptydomimetów w strukturach tych peptydów-.

Termin „związek pokrewny LHRH” oznacza hormon uwalniający hormon luteinizujacy (LHRH) i jego analogi oraz ich farmaceutycznie dopuszczalne sole. Termin „związek pokrewny

189 015

LHRH” obejmuje agonistów i antagonistów LHRH (okta-, nona-i dekapeptydowych) i natywny LHRH. Szczególnie preferowanymi „związkami pokrewnymi LHRH” są LHRH, leuprolid, goserelina, nafarelina i inni znani agoniści i antagoniści [1-21].

Termin „wysokie stężenie” oznacza stężenia, co najmniej od około 10% wagowo do maksymalnej rozpuszczalności konkretnego peptydu.

Termin „zaróbka” oznacza mniej lub bardziej obojętną substancję w preparacie, którą dodaje się jako rozpuszczalnik lub podłoże dla uzyskania odpowiedniej konsystencji. Zarobki odróżnia się od rozpuszczalników takich jak EtOH, które dodaje się aby rozpuścić leki w preparacie i od niejonowych środków powierzchniowo czynnych takich jak Tween 20, które stosuje się do roztwarzania leków w preparacie i od środków konserwujących takich jak alkohole benzylowe lub parabeny metylowy i propylowy, które stosuje się celem zapobiegania lub zahamowania wzrostu bakterii.

Termin „polarny rozpuszczalnik nie protonowy” oznacza rozpuszczalnik polarny, który nie zawiera kwasowego wodoru i nie jest donorem w wiązaniu wodorowym. Przykładami polarnych rozpuszczalników nie protonowych są dimetylosulfotlenek (DMSO), dimetyloformamid (DMF), heksametylofosforotriamid (HMPT) i N-metylopirolidon.

Termin „niewodny rozpuszczalnik protonowy” oznacza nie polarny rozpuszczalnik, który zawiera wodór przyłączony do tlenu lub azotu i jest zdolny wytwarzać wiązania wodorowe lub być donorem protonu. Przykładami niewodnych rozpuszczalników protonowych są glikole polietylenowe (PEG), glikol propylenowy (PG), poliwinylopirolidon (PVP), glikol metoksypropylenowy (MPEG), gliceryna i glikofurol.

B. Wytwarzanie preparatów:

Niniejszy wynalazek obejmuje niewodne preparaty związków peptydowychw polarnych rozpuszczalnikach nie protonowych, które są trwałe przez długi okres czasu w podwyższonych temperaturach. Standardowe rozcieńczone wodne preparaty peptydów i białek, dla uzyskania ich trwałości, wymagają manipulowania rodzajem buforu, mocą jonową, wartościami pH i rozczynnikami (np. EDTA i kwas askorbinowy). W przeciwieństwie do tego, preparaty według wynalazku nadają stabilność związkom peptydowym dzięki użyciu niewodnych polarnych rozpuszczalników nie protonowych. W szczególności, preparaty według wynalazku zapewniają stabilność związków w wysokich stężeniach, (co najmniej 10% wagowo).

Przykładami peptydów i związków peptydowych, z których można przygotowywać preparaty według wynalazku są te peptydy. które wykazują aktywność biologiczną lub, które mogą być zastosowane w leczeniu innych stanów patologicznych. Obejmują one, chociaż nie są do nich ograniczone, hormon adrenokortykotropowy, angiotensynę I i II, atrialny peptyd natriuret^yc^zn^y^, bombezynę, bradykininę, kalcytoninę, cerebelinę, dynorfinę A, alfai beta ebdorfinę, endotelinę, enkefalinę, naskórkowy hormon wzrostu, fertirelinę, hormon uwalniający folikulogonadotropinę, galaninę, glukagon, gonadorelinę, gonadotropinę, goserelinę, hormon uwalniający hormon wzrostu, histerelinę, insulinę, leuprolid, LHRH, molitynę, nafarelinę, neurotensynę, oksytocynę, somatostatynę, substancję P, czynnik martwicy nowotworu, tryptorelinę i wazopresynę.

Związki peptydowe przydatne w preparatach i sposobie według wynalazku stosować można w postaci soli, korzystnie farmaceutycznie dopuszczalnych soli. Przydatnymi solami są sole kwasów nieorganicznych, kwasów nieorganicznych, zasad nieorganicznych lub zasad organicznych. Korzystnymi solami są octany. '

Do zastosowania według wynalazku korzystnymi są te peptydy i związki peptydowe, które łatwo rozpuszczają się w niewodnych polarnych rozpuszczalnikach nie protonowych. Znawca łatwo określi, które związki będą przydatne na podstawie ich rozpuszczalności, np. związek musi być rozpuszczalny w konkretnym niewodnym polarnym rozpuszczalniku nie protonowym w co najmniej dopuszczalnej ilości. Korzystne są związki o rozpuszczalności, co najmniej około 10% wagowo. Szczególnie korzystnymi związkami peptydowymi są związki pokrewne LHRH w tym leuprolid i octan leuprolidu.

Proporcje peptydu mogą być różne w zależności od związku, warunków jakim jest on poddany, rozpuszczalności związku, oczekiwanej dawki i czasu podawania (patrz The Pharmacological Basis of Therapeutics, Gilman i in., VII wyd. (1985), i Pharmaceutical Sciences,

189 015

Remington, wyd. XVIII, (1990)). Stężenie peptydu w preparatach o wysokim stężeniu wynosi, od co najmniej około 10% wagowo do maksymalnej, rozpuszczalności związku. Korzystny przedział stężeń wynosi od 20 do 60% wagowo. Aktualnie bardziej korzystny przedział stężeń wynosi od 30 do 50% wagowo, a najkorzystniejszy przedział stężeń wynosi od około 35 do około 45% wagowo.

Również nieoczekiwanie stwierdzono, że wzrost stężenia peptydu rozpuszczonego w niewodnym polarnym rozpuszczalniku protonowym zwiększa trwałość preparatu peptydowego. Na przykład fig. 7 pokazuje, że gdy przechowywano 5, 10, 20 i 40% roztwory leuprolidu w DMSO przez 8 tygodni w temperaturze 80°C i co pewien czas pobierano i analizowano próbki celem oznaczenia pozostałego leuprolidu to stwierdzono, ze preparaty o wyższym stężeniu leuprolidu są trwalsze niż preparaty mniej stężone.

Generalnie, trwałe preparaty według wynalazku sporządza się rozpuszczając po prostu żądaną ilość, która może być ilością terapeutycznie efektywną, żądanego związku peptydowego w wybranym niewodnym polarnym rozpuszczalniku nie protonowym. Korzystnymi polarnymi rozpuszczalnikami nie protonowymi są DMSO i DMF.

Wzrost zawartości wody w preparatach peptydowych według wynalazku zwiększa degradację peptydu jak to przedstawiono na fig. 8. Wydaje się, że to zwiększenie rozpadu związane jest głównie ze zwiększeniem się ilości produktów degradacji chemicznej, gdyż agregacja jest względnie stała (fig. 9).

Stwierdzono również, że do preparatów według wynalazku można ewentualnie dodawać mewodne rozpuszczalniki protonowe takie jak PEG, PG i PVP.

C. Metodologia: Stwierdzono, że trwałe niewodne preparary awiązków peptydowych można otrzymać rozpuszczając związek peptądową w diewoanym pslerdąm rozpuszczalniku nie protonowym.

Testowano preparaty związków peptąaowych, zwłaszcza preparaty leuprolidu - związku pokrewnego LHRH, pod kątem trwałości poddając je przyśpieszonemu starzeniu w podwyższonej temperaturze i mierząc chemiczną i fizyczną trwałość preparatu. Wyniki tych badań (podane na przykład, w tabeli II i zilustrowane na fig. 1, 2, 4 i 6) pokazują, że preparaty te są trwałe w warunkach odpowiadających (lub ostrzejszych) w przybliżeniu przechowywaniu przez 1 rok w temperaturze 37°C.

Testowano również preparaty związków peptyaswąch na trwałość po naświetlaniu promieniowaniem gamma o dawce 2,5 megarada. Wyniki, przedstawione w tabeli DI, pokazują, że preparaty te pozostają chemicznie i fizycznie trwałe po takim napromieniowaniu.

Jak to podano w tabeli I przetestowano na trwałość szeroką grupę preparatów peptydowych, zawierających leuprolid, goserelinę, LHRH, adgistedsąnę I, bradąkididę, kalcytoninę, enkofalinę, insulinę, neurotedsydę, substancję P, trąpsądoged i wazopresydę rozpuszczając je (lub próbując rozpuszczać) w niewodnym polarnym rozpuszczalniku nie protonowym dMsO, a następnie poddając przyśpieszonemu starzeniu w podwyższonych temperaturach. Mierzono trwałość (stabilność) preparatów. Wyniki przedstawiono w tabeli I jako półokres życia (półokres rozpadu) w temperaturze 37°Ć zakładając Ea = 22,2 kcal/mol. Szeroka grupa testowanych peptydów rozpuszczała się w DMSO i pozostawała trwała w warunkach testu. Rozpuszczalność określonego pewtyau w konkretnym niewodnym polarnym rozpuszczalniku nie protonowym i trwałość otrzymanego roztworu wyznacza się łatwo.

Tabela I

Stabilność wowtąaów w preparatach w DMSO

Preparat	Półokres rozpadu (Temperatura)
1	2
40% Louwrslia	29,8 lat (37°C)
40% GssoIolma	5,0 lat (80°C)

189 015

c.d. tabeli I

1	2
20% LHRH	8,2 lat (65°C)
20% Angiotensyna I	4,2 lat (65°C)
5% Angiotensyna I	4,1 miesiąca (50°C)
20% Bradykinma	2,9 miesiąca (65°C)
40% Kalcytonina	nierozpuszczalna (80°C)
20% Kalcytonina	2,4 miesiąca 80°C)
5% Kalcytonina	100% trwałości w ciągu 2 miesięcy (50°C)
10% Enkefalma	1,9 miesiąca (80°C)
5% Enkefalma	2, 6 miesiąca (50°C)
20% Insulina	nierozpuszczalny żel (65 °C)
5% Neurotensyna	5,0 miesiąca (50°C)
5% Substancja P	3,0 miesiąca (50°C)
40% Trypsynogen	nierozpuszczalny kryształ/żel (65/80°C)
20% Trypsynogen	nierozpuszczalny żel (65 °C)
5% Trypsynogen	5,9 miesiąca (50°C)
40% Wazopresyna	zdegradowana (80°C)
20% Wazopresyna	11,8 dni (65°C)
* półokres rozpadu w temperaturze 37°C przy załozeniu Ea = 22,2 kcal/mol

Pomiar całkowitego ubytku peptydu w roztworze dla 40% preparatów peptydu w DMSO przechowywanych przez 6 miesięcy w temperaturze 37°C, 50°C, 65°C i 80°C wykazuje nieliniową kinetykę Arrheniusa co wskazuje na trwałość tych preparatów w podwyższonych temperaturach. Analiza danych zebranych dla temperatury 37°C daje wartość t90 14,4 miesięcy wskazując, ze trwałość w temperaturze 37°C jest jeszcze całkiem dobra.

Temperatura wpływa zarówno na szybkość degradacji jak i na skład produktów degradacji w preparatach według wynalazku. Badania preparatów leuprolid-DMSO wskazuje, że w temperaturach 65°C i 80°C główną drogą degradacji chemicznej jest utlenianie. Natomiast w temperaturach 37°C i 50°C dominującymi procesami degradacji są hydroliza i izomeryzacja.

Nieoczekiwanie stwierdzono również, że pewne preparaty peptydowe według wynalazku są bakteriostatyczne (hamują wzrost bakterii), bakteriobójcze (uśmiercają bakterie) i zarodnikobójcze (zabijają zarodniki). W szczególności preparaty leuprolidu o stężeniu 50-400 mg/ml wykazują aktywność bakteriostatyczną, bakteriobójczą i zarodnikobójczą. Stabilność próbek nie zmieniała się po podaniu zabitych bakterii wskazując, ze enzymy uwalniane z zabitych i rozpuszczonych (po lizie) bakterii nie odwracają efektu trwałości produktu. Wskazuje to, iz preparaty te nie wpływają na aktywność enzymatyczną.

189 015

Pewne peptydy, na przykład kalcytonina i leuprolid znane są z nietrwałości fizycznej, ulegają one agregacji, żelowaniu i fibrylacji (tworzeniu włókien) w roztworach wodnych. Poprawienie trwałości fizycznej może poprawiać dostępność biologiczną, podwyzszać czułość i wielkość odpowiedzi immunologicznej i ułatwiać podawanie pozajelitowe w tym podawanie za pomocą implantowanych układów dostarczania leków.

Nieoczekiwanie stwierdzono, że pewne peptydy, takie jak leuprolid, goserelina i kalcytonina, nie ulegają żelowaniu w niewodnych polarnych rozpuszczalnikach nie protonowych według wynalazku. Nie zaobserwowano żelowania nawet po okresie 12 miesięcy w temperaturze 37°C. Wynika to widocznie z faktu iż, niewodne polarne rozpuszczalniki nie protonowe powodują przyjmowanie przez peptydy konformacji kłębka swobodnego/alfa helisy, która nie ulega rozfałdowaniu do struktury beta harmonijkowej i dlatego nie powstaje żel. Tak więc rozpuszczalniki te wykazują efekt antyż.elujący.

Głównym aspektem wynalazku są niewodne roztwory zawierające związki peptydowe w polarnych rozpuszczalnikach nie protonowych, które są trwałe w wysokich temperaturach przez długi okres czasu. Preparaty takie są trwałe nawet przy wysokich stężeniach roztworu. Tak więc zaletami tych preparatów jest możliwość transportowania ich i przechowywania w temperaturach wyższych od temperatury pokojowej przez długie okresy czasu. Są one również odpowiednie do zastosowania w implantowanych materiałach (urządzeniach) dostarczania leków.

Poniżej przedstawiono przykłady z przeprowadzonych badań, w których zastosowano następujące metody.

1. Przygotowanie roztworów octanu leuprolidu

Octan leuprolidu (na przykład, z firmy Mallincrodt, St.Louis, Missouri) odważono i rozpuszczono przez mieszanie bądź wirowanie w obojętnym nośniku (DMSO, DMF, DmSo/PEG, DMSP/PG lub DMSO/PVP) do odpowiedniego stężenia. Określenie suchy DMSO dotyczy preparatów w DMSO przygotowanych w warunkach niskiej wilgotności (np. w atmosferze suchego N2). O ile nie zaznaczono inaczej, zawartość wolnej zasady leuprolidu obliczano na podstawie mocy według certyfikatu analitycznego otrzymanego dla roztworu wzorcowego przeliczonego na wolną zasadę w temperaturze 37°C. Był to 40% roztwór octanu leuprolidu, o ile nie zaznaczono inaczej.

2. Przygotowanie pojemników. Pojemniki (rurki) implantowanych urządzeń dostarczania leku (ujawnione w amerykańskim zgłoszeniu patentowym nr 08/595,761) napełniono odpowiednim roztworem octanu leuprolidu. Preparatami napełniono rurki tytanowe lub z polimeru z polimeryczną zatyczką zamykającą każdy z końców. Następnie napełnioną rurkę zamykano szczelnie w torbie polifoliowej i umieszczano w piecu do testowania trwałości.

Należy zaznaczyć, że preparaty w rurkach były całkowicie odizolowane od otoczenia.

3. Chromatografia HPLC na fazie odwróconej (RP-HPLC)

Wszystkie próbki na badania stabilności analizowano na stężenie leuprolidu i % powierzchni piku eluując gradientem stężeń na fazie odwróconej techniką HPLC wykorzystując chłodzony (4°C) autosampler (urządzenie do automatycznego pobierania próbki) aby zminimalizować rozkład próbki. Zastosowane warunki chromatograficzne podano poniżej.

Warunki chromatografu RP-HPLC

Opis	Parametr
1	2
Kolumna	HaiSil C18, 4,6x250 mm, S/N5103051
Szybkość przepływu	0, 8 niL min'¹
Objętość nastrzyku	20 (łL
Detekcja	210 nm

189 015

c.d tabeli

1	2
Czas retencji Leuprolidu	pomiędzy 25-30 minutami
Faza ruchoma	A = 100 mM fosforan sodu, pH 3,0
	B = 90% acetonitryl/woda
	Mm 0 5,0 25,0 40 41 46 46,1 50
	%B 15 26,5 26,5 65 85 85 15,0 15

Standardowe roztwory leuprolidu (w wodzie) o 4 do 6 różnych stężeniach, zwykle pomiędzy 0,1-1,2 mg/ml, nastrzykiwano równolegle z próbkami testowanymi na stabilność. Próbki testowane na stabilność przedzielano próbkami standardowymi z ilością nie większą niż 40 próbek testowanych pomiędzy standardowymi. Integrowano wszystkie piki pomiędzy objętością pustą kolumny a 45 minutą przebiegu chromatografii. Zintegrowane powierzchnie pików dla standardów leuprolidu wykreślano w funkcji stężenia. Stężenia leuprolidu w próbkach testujących trwałość obliczano metodą regresji liniowej. Powierzchnie procentowe pików od leuprolidu, sumy wszystkich pików eluujących przed leuprolidem (oznaczanych jako „inne”) i sumy wszystkich pików eluujących po leuprolidzie (oznaczanych jako „agregaty”) również zapisywano i wykreślano jako finkcję punktów czasowych.

4. Chromatoorafn cksi luzyjna (jykluc;ymia, żelowo-permeaeyjna), SI/C. Wybrany próbki na badanie stabilności analizowano na % powierzchni piku i ciężary cząsteczkowe stosując do badań SEC roztwór izokratyczny (4°C) z chłodzonym autosamplerem. Zastosowano następujące warunki chromatograficzne.

Warunki chromatografu SEC

Opis	Parametr
Kolumna	Pharmacia Peptide, HR 10/30, 10x300 mm
Szybkość przepływu	0,5 mL mm'¹
Objętość nastrzyku	20 pL
Detekcja	210 nm
Faza ruchoma	100 mM fosforan amonu, pH 2,0, 200 mM chlorek sodu, 30% acetonitryl

Aby wyliczyć ciężary cząsteczkowe należy znać objętość pustą („martwą”) i całkowitą kolumny do chromatografii ekskluzyjnej. Aby wyznaczyć odpowiednio objętość pustą i objętość całkowitą zastosowano standard o wysokim ciężarze cząsteczkowym firmy BioRad i 0,1% aceton. Zanotowano czasy retencji pierwszego piku dla standardu BioRad i piku od acetonu i przeliczono je na jednostki objętości według poniższych równań. Ponieważ wartości te są stałe dla określonej SEC kolumny i systemu HPLC to wartości objętości pustej i całkowitej wyznaczano na nowo podczas każdej zmiany SEC kolumny lub systemu HPLC. Następnie przeprowadzano eksperyment standardowy, a następnie dla próbek badanych na stabilność. Mieszanina standardowa zawierała w przybliżeniu 0,2 mg/ml następujących peptydów: Bursyna (c.cz. = 449), WLRF peptyd (c.cz. = 619), Angiotensyna (c.cz. = 1181), GRF (c.cz. = 5108) i Cytochrom C (c.cz. = 12394). Standardy takie wybrano gdyż obejmują one zakresem ciężarów cząsteczkowych leuprolid i wszystkie wykazują zasadowy punkt izoelektryczny pl (9,8-11,0).

189 015

Dla wszystkich pików wyznaczano % powierzchni piku.

Ciężary cząsteczkowe wszystkich wydzielonych związków obliczano według poniższych równań.

V_s = szybkość przepływu (ml/min) x czas retencji piku próbki (min)

V_o = szybkość przepływu (ml/min) x czas retencji objętości pustej (min)

Vt = szybkość przepływu (ml/min) x czas retencji objętości całkowitej (min)

V -V τλ S O gdzie: V_s = objętość standardu lub próbki V₀ = objętość pusta Vt = objętość całkowita

V_s obliczano dla każdego piku peptydu standardowego. Następnie obliczan_o K_d dla każdego standardowego peptydu korzystając z wyznaczonych wcześniej wartoś_ci V_t i V_o. N_astępnie wykorzystywano linię regresji liniowej dla zależności log ciężar cząsteczkowy względem K/’ aby wyznaczyć ciężary cząsteczkowe dla każdego piku w próbce badanej na stabilność. Zapisywano również % powierzchni pików dla próbek badanych na stabilność.

5. .Aparatura i materiały, ria yadaniach technikami RP-HPLC i SEC zastosowano nastę pujące aparaty i materiały: System HPLC Waters Millenium składający się z autoscmplerc 717, pompy 626, kontrolera 6000S, detektora fotodiodowego 900, detektora 414 na współczynnik załamania (Waters Cnręmatography, Milford, MA);

Probówki HPLC do podestów z 48- i 96-pozyhjami (Waters Cnręmatograpny, Milford, MA);

HaiailC18, 120A, 5 pm 4,6 x 250 mm kolumna HPLC (Higgins „Analytical, Mountain View, CA);

Pharmacia Peptide HR 10,/30 SEC kolumna (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).

Poniższe przykłady przedstawiono celem zilustrowania wynalazku, a nie ograniczenia jego zakresu.

Przykład 1. Przyśpieszone badania trwałości preparatów octanu leuprolidu

Przygotowano preparaty (40% wagowo) octanu leuprolidu (co odpowiada około 37% leuprolidu - wolnej zasady) w obojętnym nośniku tak jak to opisano powyżej i napełniono nimi rurki implantowanych urządzeń dostarczania leków, również w opisany powyżej sposób. Rurki wykonane były z tytanu.

Napełnione urządzenia poddano procesowi przyśpieszonego starzenia przez przetrzymywanie ich w podwyższonych temperaturach (80°C) przez siedem dni w piecu (Precision acientific of Thelco). Odpowiada to około 1,5-rocznemu starzeniu w temperaturze 37°C lub około pięcioletniemu starzeniu w temperaturze pokojowej (25°C).

Próbki analizowano metodami RP-HPLC i SEC tak jak opisano powyżej w celu wyznaczenia chemicznej i fizycznej trwałości poddawanych starzeniu preparatów.

Przedstawione w tabeli II wyniki, wskazują, że preparaty te utrzymują stabilność pokrewnego LHRH związku - leuprolidu. W każdym przypadku pozostawało przynajmniej 65% niezmienionego leuprolidu.

Tabela II

Trwałość polarnych nie protonowych preparatów octanu leuprolidu po 7 dniach w temperaturze 80°C w pojemnikach tytanowych

Preparat	% leuprolidu w dniu 7
1	2
40% w DMSO	92
40% w DMSO/PEG (50/50)	90
40% w DMSO/PG (50/50)	86

189 015 c d. tabeli II

1	2
40% w DMSO/PVP (50/50)	93
40% w DMF	91
40% w suchym DMSO	89

Przykład 2. Badania trwałości napromieniowanych preparatów octanu leuprolidu

Przygotowano (40%, wagowo) preparaty octanu leuprolidu w DMSO tak jak opisano powyżej i napełniono nimi pojemniki urządzeń dostarczania leków również w opisany powyżej sposób. Wszystkie rurki wykonane były z tytanu.

Napełnione urządzenia wysłano do Sterigenics (Tustin, Kalifornia) gdzie poddano je naświetlaniom promieniowaniem gamma o dawce 2,5 megarada stosując bombę kobaltową Cobalt 60 (3 level ,/tote box” irridation, w Sterigenics' Tustin Main Celi). Próbki, oznaczone w tabeli LIjako „zimne” przesłano i naświetlano na suchym lodzie. Próbki poddano następnie procesowi przyśpieszonego starzenia tak jak w przykładzie 1. Próbki pobierano w dniu 0 i dniu 7, i analizowano metodami RP-HPLC i SEC tak jak opisano przy określaniu chemicznej i fizycznej trwałości naświetlanych preparatów.

Przytoczone w tabeli III wyniki pokazują, że preparaty octanu leuprolidu były trwałe po napromieniowaniu. W każdym przypadku pozostawało przynajmniej 65% niezmienionego leuprolidu; obserwowano niski poziom powstawania agregatów.

Tabela III

Trwałość polarnych aprotonowych preparatów octanu leuprolidu (40%, wagowo) po naświetlaniu promieniami gamma o dawce 2,5 megarada w zbiornikach tytanowych

Preparat	Napromie- niowanie	% leuprolidu w dniu 7 (RP-HPLC)	SEC
			dzień 0	dzień 7
			% monomeru	% dimer/ trimer	% monomeru	% dimer/trimer
40% DMSO	Tak	100	98,1	0,5	97,7	1,9
40% DMSO	Nie	90	100,0	0	98,5	1,1
40% DMSO	Zimne	99	99,1	0,2	98,3	1,4
40% DMSO	Tak	96	99,1	0,8	95,3	2,0
40% DMSO	Nie	nie ozn.	100,0	0	106,1	0
40% DMSO	Tak	90	99,4	0,6	99,4	2,2
40% DMSO	Nie	100	100,0	0	104,0	1,0
40% DMSO	Tak	88	99,5	0,5	97,7	1,8
40% DMSO	Tak	83	99,5	0,5	91,7	1,5

189 015

Przykład 3. Przyśpieszone długotrwałe badania trwałości preparatów octanu leuprolidu

Przygotowano 40% wagowo preparaty octanu leuprolidu w DMSO, napełniono nimi pojemniki urządzeń dostarczania leków, przechowywano je przez 2 miesiące w temperaturze 80°C i analizowano tak jak opisano powyżej. Przedstawione na fig. 1 (RP-HPLC) i fig. 2 (SEC) wyniki wskazują, że odzyskuje się 81,1% leuprolidu i tylko 14,6% ulega degradacji chemicznej oraz 5,1% fizycznej agregacji.

Roztwory octanu leuprolidu przygotowano, napełniano je i przechowywano przez 6 miesięcy w temperaturze 80°C i analizowano tak jak opisano powyżej. Fig. 4 przedstawia zawartość leuprolidu i produktów jego chemicznej i fizycznej degradacji odzyskanych w ciągu okresu sześciu miesięcy wskazując, że rozpatrywano cały materiał peptydowy, z którego wychodzono i że preparaty te wykazują dobrą stabilność w temperaturze 80°C. Suma wszystkich trzech składowych elementów pokazana jest również jako bilans masy. Fig. 5 przedstawia wykres logarytmu naturalnego dla tych danych wskazując, że preparaty te wykazują liniowe kinetyki w całym zakresie testowanych temperatur.

Na fig. 6 przedstawiono trwałość chemiczną 40% roztworów octanu leuprolidu sporządzonych i analizowanych tak jak opisano poprzednio. Po dziewięciu miesiącach w temperaturze 37°C było obecne więcej niż 90% (93,5%) leuprolidu z mniejszą niż 5% (2,9%) zawartością produktów degradacji chemicznej (oznaczonych jako „wczesne”) i mniejszą niż 5% (2,3%) zawartością produktów fizycznej degradacji (oznaczonych „późniejsze”. w oparciu 0 wygląd krzywych RP-HPLC i w zgodności z wynikami z SEC).

Przygotowano 40% wagowo roztwory octanu leuprolidu, napełniano nimi pojemniki i przechowywano je w temperaturach 37°C, 50°C, 65°C lub 80°C i analizowano tak jak opisano powyżej.

Wyniki obliczano metodą opisaną w Physical Pharmacy: Physical Chemical Pronciples in the Pharmaceutical Sciencec, wyd. El, Martin i in., Rozdział 14 (1983) i pokazano, że ubytek leuprolidu z preparatów w DMSO jest nieliniowy. Dane przytoczone są poniżej i na wykresie Arrhemusa na fig. 3.

Ponieważ wykresy Arrheniusa dla preparatów w DMSO przechowywanych w temperaturze 80°C wskazały na nieliniowy ubytek leuprolidu to do obliczenia wartości t% dla tych preparatów w czasie 14,4 miesiąca w temperaturze 37°C wzięto dane o stabilności uzyskane dla temperatury 37°C.

DMSO
°C	Kobs (miesiące _)	T1/2 (miesiące)
37	7,29 x 10‘³	95,1
50	9,74 x 10’³	71,2
65	2,48 x W²	27,9
80	0,108	6,4

Ea = nieliniowa

Przykład 4. Badania trwałości preparatów octanu leuprolidu w mieszaninach DMS O/woda

Przygotowano 40% wagowo preparaty octanu leuprolidu w DMSO, mieszaninach DMSO/woda (95:5, 90:10, 50:50 i 30:70) i w wodzie tak jak opisano powyżej i inkubowano je przez 7 dni w temperaturze 80°C. Przeprowadzono analizę metodą spektroskopii w podczerwieni z Transformaccą Fouriera (FTIR) w dniu 0 i w dniu 7.

189' 015

Uzyskane wyniki wskazują, że podczas przyśpieszonego starzenia konformacja leuprolidu we wszystkich testowanych próbkach zmienia się bardzo niewiele. Zasadniczo, struktura peptydu w preparatach w DMSO jest głównie strukturą kłębka swobodnego lub a-helisą podczas, gdy dominującą struktura w preparatach w wodzie jest struktura β-harminijkowa (β-sheet).

Poniżej przedstawiono dane literaturowe ze stanu techniki:

Odnośniki literaturowe podano w nawiasach kwadratowych ([]) w odpowiednim miejscu w opisie wynalazku.

1. Zoladex (goserelin acetate implant), Physician's Desk Reference, L wyd., str. 2856-2861 (1966).

2. Patent Stanów Zjednoczonych Nr 3.914.412 udzielony 21 października 1975.

3. Patent Stanów Zjednoczonych Nr 4.547.370 udzielony 15 października 1985.

4. Patent Stanów Zjednoczonych Nr 4.661.472 udzielony 28 kwietnia 1987.

5. Patent Stanów Zjednoczonych Nr 4.689.398 udzielony 25 sierpnia 1987.

6. Patent Stanów Zjednoczonych Nr 4.851.385 udzielony 25 lipca 1989.

7. Patent Stanów Zjednoczonych Nr 5.198.533 udzielony 30 marca 1993.

8. Patent Stanów Zjednoczonych Nr 5.480.868 udzielony 2 stycznia 1996.

9. W092/20711 opublikowany 26 listopada 1992.

10. W095/00168 opublikowany 5 stycznia 1995.

11. W095/04540 opublikowany 66 lutego 1995.

12. „Stability of Gonadorelin and Triptorelin in Aqueous Solution”, V.J. Helm, B.W. Muller, Pharmaceutical Research, 7/12, str*. 1253-1256 (1990).

13. „New Degradation Product of Des-Gly¹⁰-NH2-LH-RH-Ethylamide (Fertirelin) in Aqueous Solution”, J. Okada, T. Seo, F. Kasahara, K. Takeda, S. Kondo, J. of Pharmaceutical Scieces, 80/2, str. 167-170(1991).

14. „Characterization of the Solution Degradation Product of Histerelin, a Gonadotropin Releasing Hormone (LHRH) Agonist”, A.R. Oyler, R.E. Naldi, J.R. Lloyd, D.A. Graden, C.J. Shaw, M.L. Cotter, J. of Pharmaceutical Scieces, 80/3, str. 271-275(1991).

15. „Parenteral Peptide Formulations: Chemical and Physical Properties of Native Luteinizing Hormone-Releasing Hormone (LHRH) and Hydrophobic Analogues in Aqueous Solution”, M.F. Powell, L.M. Sanders, A. Rogerson, V. Si, Pharmaceutical Research, 8/10, str. 1258-1263(1991).

16. „Degradation of the LHRH Analog Nafarelin Acetate in Aqueous Solution”, D.M. Johnson, R.A. Pritchard, W.F. Taylor, D. Conley, G Zuniga, K.G. McGreevy, Intl. J. of Pharmaceutics, 31, str. 125-129(1986).

17. „Percutaneous Absorption Enhancement of Leuprolide”, M.Y. Fu Lu, D. Lee, GS. Rao, Pharmaceutical Research, 9/12, str. 1575-1576 (1992).

18. Lutrepulse (gonadorelin acetate for IV injection), Physician's Desk Reference, Lwyd., str. 980-982(1996).

19. Fectrel (gonadorelin HC1 for subcutaneous or IV injection), Physician's Desk Reference, Lwyd., str. 2877-2878(1996).

20. Lupron (leuprolide acetate for subcutaneous injection), Physician's Desk Reference, 50th Edition, str. 2555-2556(1996).

21. Lupron depot (leuprolide acetate for depot suspension), Physician's Desk Reference, Lwyd., str. 2555-2556(1996).

22. „Pharmaceutical Manipulation of Leuprorelin Acetate to Improve Clinical Pei for niańce”, J. of Intl. Medical Research, 18, str. 34-41(1990).

23. „Long-term Stability of Aqueous Solutions of Luteinizing Hormone-Releasing Hormone Assessed by an In-Vitro Bioassay and Liquid Chromatography”, Y.F. Shi, R.J. Sherins, D. Bnghtwell, J.F. Gallelli, D.C. Chatteiji, J. of Pharmaceutical Scieces, 73/6, r. 819-821 (1984).

189 015

24. „Peptide Liquid Crystals: Inverse Correlation of Kinetic Formation and Thermodynamical Stability in Aqueous Solution”, M.F. Powell, J. Fleitman, L.M. Sanders, V.C. Si, Pharmaceutical Reasearch, 11/9, str. 1352-1354(1994).

25. „Solution Behavior of Leuprolide Acetate, an LHRH Agonist, as determined by Circular Dichroism Spectroscopy”, M.E. Powers, A. Adejei, M.Y. Fu Lu, M.C. Manning, Intl. J. of Pharmaceutics, 108, str. 49-55(1994).

26. „Preparation of Thre-Month Depot Injectable Microspheres of Leuprorelin Acetate Using Biodegradable Polymers”, Pharmaceutical Research, 11/8, -str. 1143-1147(1994).

189 015

W Kobs DMSO

FIG. 3 /T

189 015

FIG. 4

189 015

FIG. 5

189 015

.ϊ t 3

X # * *

-► Β Ί χ ο

ιη ο

«η pi(ojdneq%

CJ

CSI

CD

110 αν

189 015

c

O

Ν

U pijojdnsi % d

LL

100.0

189 Ols

189 015

FIG. 1

[	Monomer
Dimer )	Λ
FJ	v Λ

0.0

10.0

20.0 30.0

Czas (min)

40.0

FIG. 2

Departament Wydawnictw UP RP Nakład 50 egz.

Cena 4,00 zł

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Niewodny preparat peptydowy, który zawiera, co najmniej jeden związek pokrewny hormonu uwalniającego hormon luteinizujący (LHRH) oraz co najmniej jeden polarny rozpuszczalnik aprotonowy, znamienny tym, że jako polarny rozpuszczalnik aprotonowy zawiera rozpuszczalnik wybrany z grupy obejmującej dimetylosulfotlenek, dimetyloformamid, heksametylofosfotriamid lub n-metylopirolidon i jest stabilny w temperaturze 37°C przez przynajmniej 3 miesiące.
2. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera związek pokrewny LHRH w ilości co najmniej 10% wagowych.
3. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera związek pokrewny LHRH w ilości, co najmniej 30% wagowych.
4. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera związek pokrewny LHRH wybrany spośród grupy obejmującej leuprorelinę, LHRH, nafarelinęi goserelinę.
5. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że jest trwały w temperaturze 80°C przez, co najmniej 2 miesiące.
6. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że jest trwały w temperaturze 37°C przez, co najmniej jeden rok.
7. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że nadaje się do stosowania w implantowanym urządzeniu do dostarczania leków.
8. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, ze dodatkowo zawiera niewodny rozpuszczalnik protonowy.
9. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera polarny rozpuszczalnik nie protonowy zapobiegający żelowaniu.
10. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że jako związek pokrewny LHRH zawiera od 30% do 50% wagowych octanu leuproreliny w dimetylosulfotlenku.
11. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera zasadniczo leuprorelinę i dimetylosulfotlenek w proporcji 307 mg leuproreliny na 1 ml dimetylosulfotlenku.
12. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że jest stabilny po napromieniowaniu.
13. Sposób wytwarzania trwałego niewodnego preparatu peptydowego określonego w zastrz. 1, znamienny tym, że związek pokrewny LHRH rozpuszcza się, w co najmniej jednym polarnym rozpuszczalniku nie protonowym wybranym z grupy obejmującej dimetylosulfotlenek, dimetyloformamid, heksametylofosfotriamid lub n-metylopirolidon.
14. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że rozpuszcza się, co najmniej 10% wagowych związku pokrewnego LHRH.
15. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że rozpuszcza się, co najmniej 30% wagowych związku pokrewnego LHRH.
16. Sposób według zastrz. 13 albo 14, albo 15, znamienny tym, że rozpuszcza się związek pokrewny LHRH wybrany spośród grupy obejmującej leuprorelinę, LHRH, nafarelinę i goserelinę.
17. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że dodatkowo dodaje się niewodny rozpuszczalnik protonowy.
18. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że jako związek pokrewny LHRH rozpuszcza się od 30% do 50% wagowych octanu leuproreliny w dimetylosulfotlenku.
19. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że rozpuszcza się 370 mg leuporeliny w 1 ml dimetylosulfotlenku.
20. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że rozpuszczanie przeprowadza się w atmosferze gazu obojętnego.
21. Sposób według zastrz. 20, znamienny tym, że jako gaz obojętny stosuje się suchy azot.

189 015
22. Zastosowanie preparatu określonego w zastrz. 1 do wytwarzania środka leczniczego do leczenia raka prostaty i schorzeń związanych z hormonami przez podawanie tego preparatu leczonemu osobnikowi.
23. Zastosowanie według zastrz. 22, znamienne tym, że wytwarzany środek leczniczy jest podawany pozajelitowo.
24. Zastosowanie według zastrz. 22, znamienne tym, że wytwarzany środek leczniczy jest podawany długoterminowo w sposób ciągły.
25. Zastosowanie według zastrz. 22, znamienne tym, że wytwarzany środek leczniczy jest podawany za pomocą implantowanego urządzenia.
26. Zastosowanie według zastrz. 22, znamienne tym, że leczonym schorzeniem związanym z hormonami jest rak prostaty, zaś związkiem pokrewnym LHRH jest leuproelina.
27. Zastosowanie według zastrz. 22 albo 23, albo 24, albo 25, albo 26, znamienne tym, że wytwarzany środek leczniczy jest podawany w postaci 80 pg leuprolidu dziennie.
28. Zastosowanie według zastrz. 27, znamienne tym, że wytwarzany środek leczniczy jest podawany w wybranym okresie 3 miesięcy lub 6 miesięcy lub 12 miesięcy
29. Zastosowanie według zastrz. 28, znamienne tym, że wytwarzany środek leczniczy jest podawany przez urządzenie implantowane.
30. Zastosowanie według zastrz. 22, znamienne tym, że leczonym schorzeniem jest rak prostaty, zaś związkiem pokrewnym LHRH jest antagonista LHRH.
31. Zastosowanie preparatu określonego w zastrz. 1 do wytwarzania środka bakteriostatycznego, bakteriobójczego lub zarodnikobójczego.