CZ434098A3

CZ434098A3 - Nevodné polární aprotické peptidové formulace

Info

Publication number: CZ434098A3
Application number: CZ984340A
Authority: CZ
Inventors: Cynthia L. Stevenson; Steven J. Prestrelski
Original assignee: Alza Corporation
Priority date: 1996-07-03
Filing date: 1997-07-01
Publication date: 1999-04-14
Also published as: IL127771A0; RU2203084C2; NO986207L; CN102512658A; CZ300378B6; SK283926B6; EP0921808B1; DE69728582D1; NZ333294A; DE69715639T2; CA2259557A1; TW584562B; CY2486B1; MY128850A; DK0921808T3; ES2215967T3; EP1208846B1; ID19718A; PL330927A1; CN101116742A

Description

Oblast techniky

Tento vynález se vztahuje ke stabilním nevodným aprotickým formulacím peptidových sloučenin a zvláště k formulacím peptidových sloučenin při vyšších koncentracích.

Odkazy:

Následující odkazy jsou uváděny čísly v. závorkách ([]) v příslušné částí specifikace.

1. Zoladex (goserelinacetátový implantát), Physician's Desk

Reference,	50.	edice, s. 2858-2861
2 .	Patent	USA	č.	3,	914.412,	vydaný
3.	Patent	USA	č.	4,	547.370,	vydaný
4 .	Patent	USA	č.	4,	661.472,	vydaný
5.	Patent	USA	č.	4,	689.396,	vydaný
6.	Patent	USA	č.	4,	851.385,	vydaný
7 .	Patent	USA	č.	5,	198.533,	vydaný
8 .	Patent	USA	č.	5,	480.868,	vydaný

r. 1996. 21.10.1975 15.10.1985 28.4.1987 . 25.8.1987. 25.7.1989. 30.3.1993. 2.1.1996.

9. WO 92/20711, zveřejněný 26.11.1992.

. WO 95/00168, zveřejněný 5.1. 1995 . '

11. WO 95/04540, zveřejněný 6.2.1995

12. Stabilita gonadorelinu a triptorelinu ve vodném roztoku, V.J.Helm, B.W.Muller, Pharmaceutical Research, 7/12, s. 1253 - 1256, r. 1990.

13. Nový degradační produkt Des-Gly^{* 10}-NH₂-LH-RH-ethylamidu (fertirelinu) ve vodném roztoku, J.Okada, T.Seo,

F.Kasahara, K.Takeda, S.Kondo, J. of Pharmaceutical • 4

Sciences, 80/2, s. 167-170, r. 1991.

14. Charakterizace produktu rozpouštědlové degradace histrelinu, agonisty spouštěcího hormonu luteinizačního hormonu (LHRH), A.R.Oyler, R.E.Naldi, J.R.LLoyd, D.A.Graden, C.J.Shaw, M.L.Cotter, J. of Pharmaceutical Sciences, 80/3, s. 271-275, r. 1991.

15. Parenterální peptidové formulace: chemické a fyzikální vlastnosti nativního spouštěcího hormonu luteinizačního hormonu (LHRH) a hydrofobních analogů ve vodném roztoku, M.F.Powell, L.M.Sanders, A.Rogerson, V.Si, Pharmaceutical Research, 8/10, s. 1258 - 1263, r. 1991.

16. Degradace LHRH analogu nafarelinacetátu ve vodném roztoku, D.M.Johnson, R.A.Pritchard, W. F.Taylor, D.Conley, G.Zuniga, K.G.McGreevy, Intl. J. of Pharmaceutics, 31, s. 125-129, r. 1986.

17. Podpora perkutánní absorpce leuprolidu, M.Y.Fu Lu, D.Lee, G.S.Rao, Pharmaceutical Research, 9/12, s. 1575-1576,

r. 1992.

18. Lutrepulse (IV [intravenózní] injekce gonadorelinacetátu). Physician's Desk Reference, 50. edice,

s. 980-982, r. 1996.

19. Faktrel (gonadorelinhydrochlorid pro subkutánní nebo IV injekci), Physician's Desk Reference, 50. edition, s. 28772878, r. 1996.

20. Lupron (leuprolidacetát pro subkutánní injekci), Physician/s Desk Reference, 50. edition, s. 2555-2556, r. 1996.

21. Depotní lupron (leuprolid acetát pro depotní suspenzi), Physician's Desk Reference, 50. edition, s. 2556-2562, r. 1996.

22. Farmaceutický zásah pro zlepšení klinické účinnosti leuprorelinacetátu, H.Toguchi, J. of Intl. Medical

Research, 18, s. 35-41, r. 1990.

23. Dlouhodobá stabilita vodného roztoku spouštěcího hormonu luteinizačního hormonu hodnocená biotestem in vitro a kapalnou chromatografií, Y.F.Shi, R.J.Sherins,

D.Brightwell, J.F.Gallelli, D.C.Chatterji, J.of

Pharmaceutical Sciences, 73/6, s. 819-821, r. 1984.

24. Peptidové kapalné krystaly: inverzní korelace kinetiky tvorby a thermodynamické stability ve vodném roztoku, M.F.Powell, J.Fleitman, L.M.Sanders, V.C.Si, Pharmaceutical Research, 11/9, s. 1352-1354, r. 1994.

25. Průběh rozpouštění leuprolidacetátu, antagonisty LHRH, stanovený spektroskopií cirkulárního dichroismu , M.E.Powers, A.Adejei, M.Y.Fu Lu, M.C.Manning, Int. J. Pharmaceutics, 108, s. 49-55, r. 1994.

26. Příprava depotních injikovatelných mikrokuliček leuprorelinacetátu pro tříměsíční depozici s použitím biodegradovatelných polymerů, Pharmaceutical Research,

11/8, s. 1143-1147, r. 1994.

Popis obsažený v každé z těchto publikací, patentů nebo patentových přihlášek je zde těmito odkazy celý zahrnut ve stejném rozsahu, jako kdyby znění každé jednotlivé publikace, patentu nebo patentové přihlášky bylo v odkazu specificky a individuálně obsaženo.

Spouštěcí hormon luteinizačního hormonu (LHRH), známý také jako spouštěcí hormon gonadotropinu (GnRH) je dekapeptid se strukturou:.» — ~~- — — ——— ——— pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂.

Je vylučován hypothalamem a váže se na receptory hypofýzy, přičemž uvolňuje luteinizační hormon (LH) a hormon stimulující folikul (FSH). LH a FSH stimulují gonády k syntéze steroidních hormonů. Jsou známy četné analogy LHRH včetně peptidů příbuzných LHRH, které fungují jako agonisty

a takové, které fungují jako antagonisty (1-15). LHRH analogy jsou známy tím, že jsou použitelné při léčbě nemocí na hormonech závislých jako je rakovina prostaty, benigní zbytnění prostaty, endometrióza, hysteromyom, metrofibrom, předčasná puberta, rakovina prsu a jako antikoncepční prostředek^). Podávání léku s dlouhodobým uvolňováním je výhodné jak pro sloučeniny příbuzné agonístům LHRH, které při opakovaném podávání snižují počet dosažitelných receptorů takže produkce steroidních hormonů je potlačena, tak pro sloučniny příbuzné antagonistům LHRH, které je třeba kontinuálně podávat pro trvalou inhibici vzniku endogenního LHRH. (8).

Trvalé parenterální uvolňování léčiv, zvláště léčiv na bázi peptidů, má mnohé výhody. Odborníkům je dobře známé použití implatovatelných zařízení pro dlouhodobé uvoňování velkého množství léčiv nebo jiných příznivě působících činidel. Typické přístroje jsou popsány například v patentech USA č. 5,034.229, 5,057.318 a 5,110.596. Popis každého z těchto patentů je zde nahrazen odkazem.

Všeobecně platí že biologická dostupnost peptidů orální cestou, včetně sloučenin příbuzných LHRH, je nízká (16-17).

Dosavadní stav techniky

V současné době komerčně nabízené formulace LHRH, jejich analogy a příbuzné sloučeniny používané pro parenterální injekce, jsou, .vodné roztoky, které obsahují ^_relativně nízké koncentrace sloučenin příbuzných LHRH (0,05 až 5 mg/ml) a rovněž mohou obsahovat přísady jako mannit nebo laktózu (18-20). Takové formulace sloučenin příbuzných LHRH je třeba skladovat bud zmražené nebo při pokojové teplotě, ale jen krátkou dobu.

Komerčně dosažitelné depotní formulace sloučenin

O - ··· příbuzných LHRH podávané za účelem dlouhodobého uvolňování po dobu 1-3 měsíců sestávají z 15 % sloučeniny příbuzné LHRH dispergované v matrici z kopolymeru D,L-mléčné kyseliny a glýkolové kyseliny v podobě válečku pro subkutánní injektován! (1) a z formulace sestávající z mikročástic obsahujících jádro (střed) ze sloučeniny příbuzné LHRH a želatiny, jež je obklopeno pláštěm z kopolymeru D,L-mléčné kyseliny a glýkolové kyseliny. Tyt^ý^astice jsou suspendovány v rozpouštědle pro subkutánní nebo intramuskulární injektován! (21,26). Tyto výrobky se musí skladovat při pokojové nebo nižší teplotě. 0 vodných formulacích sloučenin příbuzných LHRH je známo, že vykazují chemickou i fyzikální nestabilitu a degradaci po ozáření (12-16, 22-25).

Stabilitu (t₉₀ asi 5 let) prokázaly formulace typu vodných roztoků s velmi nízkou koncentrací (25 μg/ml) obsahující ústoj (10 mM, iontová síla 0,15) a skladované při teplotách do 25 °C (teplota místnosti) (15).

Trvá potřeba stabilních peptidových formulací.

Podstata vynálezu

Tento vynález nabízí stabilní nevodné formulace v podobě roztoků peptidových sloučenin v polárních aprotických rozpouštědlech. Tyto formulace peptidových sloučenin mají koncentrace nejméně ca 10 %. Tyto stabilní formulace lze dlouhodobě skladovat-při zvýšených teplotách (například 37 °C) a jsou zvláště vhodné pro implantované systémy pro dlouhodobé uvolňování léku (například 1-12 měsíců a více).

V jednom ohledu vynález popisuje stabilní nevodné formulace peptidových sloučenin, které obsahují alespoň jednu peptidovou sloučeninu v alespoň jednom polárním aprotickém rozpouštědle. V jednom výhodném provedení ·· ·»

I · · · » · · » ·β· ··· formulace obsahuje nejméně 10 % hmotnostních peptidové sloučeniny.

V jiném ohledu vynález nabízí způsoby přípravy stabilních nevodných formulací peptidových sloučenin, jež zahrnují rozpuštění nejméně jedné peptidové sloučeniny v nejméně jednom polárním aprotickém rozpouštědle. Výhodné formulace obsahují alespoň asi 10 % hmotnostních peptidových sloučenin.

V dalším ohledu vynález poskytuje způsoby léčby pacienta trpícího zhoršeným zdravotním stavem, který může být zlepšen podáním peptidové sloučeniny, přičemž uvedené způsoby zahrnují podávání tomuto pacientovi účinného množství stabilní nevodné formulace obsahující alespoň jednu peptidovou sloučeninu v nejméně jednom polárním aprotickém rozpouštědle.

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1 ukazuje stabilitu 40% (hmot.) roztoku leuprolidacetátu v dimethylsulfoxidu (methylsulfoxid nebo DMSO) po dvou měsících při 80 °C zjišťovanou vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií s převrácenými fázemi (RP-HPLC).

Obrázek 2 ukazuje tentýž vzorek jako v obrázku 1 injektovaný při vylučovací chromatografií (SEC). Z obrázku vyplývá, že k agregaci dochází jen v malé míře a toto nevelké shlukování sestává z dimerních a trimerních produktů a žádná agregace vyššího řádu neexistuje.

Obrázek 3 ukazuje Arrheniův graf úbytku leuprolidu z 40% roztoků leuprolidacetátu v dimethylsulfoxidu (DMSO).

Obrázek 4 ilustruje chemickou a fyzikální stabilitu 40% roztoku leuprolidu v DMSO po 6 měsících při 80 *C.

Obrázek 5 ilustruje ztrátu leuprolidu z 40% roztoku leuprolidacetátu v DMSO po 6 měších při 37 ’C, 50 °C, 65 °C • » »··» nebo 80 °C.

Obrázek 6 ilustruje chemickou stabilitu 40% roztoku leuprolidacetátu v DMSO po 9 měsících při 37 °C.

Obrázek 7 dokazuje, že zvýšení koncentrace roztoku peptidů leuprolidu v DMSO zvýšilo jeho stabilitu při 80 °C.

Obrázek 8 dokazuje, že zvýšení obsahu vlhkosti v 40% formulacích leuprolidu v DMSO mělo za následek sníženou stabilitu při 80 °C.

Obrázek 9 ukazuje, že ve formulacích z obrázku 8 rostlo množství degradačních produktů s rostoucí vlhkostí.

Podrobný popis vynálezu

Tento vynález se vztahuje k nečekanému objevu, že při rozpuštění peptidových sloučenin v nevodných polárních aprotických rozpouštědlech vznikají stabilní formulace. Již známé formulace peptidových sloučenin, což jsou zředěné pufrované vodné roztoky obsahující přísady jako je EDTA nebo askorbová kyselina, které se musí skladovat při nízkých teplotách (4-25 °C), tvoří degradační produkty po degradačních liniích jako je kysele nebo bazicky katalyzovaná hydrolýza, deamidace, racemizace a oxidace. Naproti tomu formulace uvedené v těchto patentových nárocích stabilizují peptidové sloučeniny při zvýšených teplotách (například 37 až 80 *C) a při vysokých koncentracích (tj. nejméně asi 10 %).

Standardní peptidové a proteinové formulace jsou zředěné vodné roztoky. Stability léků se obvykle dociluje změnou jednoho nebo více z následujících parametrů: pH, druhu ústoje, iontové síly, excipientů (EDTA, askorbové kyseliny ap.) V těchto formulacích nelze plně stabilizovat degradační procesy způsobené vodným prostředím (jako je hydrolýza, deamidace, racemizace). Naopak se v tomto vynálezu dokazuje, že peptidy formulované v nevodném prostředí jako je dimethylsulfoxid (DMSO) a dimethylformamid (DMF) jsou chemicky a fyzikálně stabilnější než peptidy formulované ve vodě. DMSO a DMF jsou považovány za polární aprotická rozpouštědla. Od aprotických rozpouštědel by se očekávalo, že zpomalí degradaci, protože nemohou dodávat protony do degradačních pochodů. Naopak by se očekávalo od rozpouštědel, jež jsou polárnější než voda (dipó^fn^Rient vody je 1,85, DMF 3,82 a DMSO 3,96), že urychlí degradaci, protože mohou pomoci stabilizovat stupeň určující tuto rychlost a tím zvýšit rychlost degradace. Nicméně jsme zjistili, že celkový účinek polárních aprotických rozpouštědel všeobecně spočíval ve stabilizaci roztoků peptidů.

Vynález se týká užití nevodných aprotických rozouštědel jako je DMSO nebo DMF pro stabilizaci peptidových formulací proti jak chemické, tak fyzikální degradaci. Tento objev se zakládá na zjištění, že použití DMSO nebo DMF zlepšuje celkovou stabilitu peptidů v širokém rozsahu podmínek formulace, včetně vysokých koncentrací a zvýšených teplot, což umožňuje uvolňování peptidů z dlouhodobě implantovaných systémů, které by jinak nebylo proveditelné.

A. Definice

Zde použité termíny mají tento význam:

Termín chemická stabilita znamená, že po linii ' ” chemických změn jako je oxidace nebo hydrolýza vzniká pouze přijatelné množství degradačních produktů. Konkrétně je formulace považována za stabilní, když po dvou měsících při 37 °C nevznikne víc než asi 20 % degradačních produktů.

Termín fyzikální stabilita znamená, že vzniká pouze přijatelné množství agregátů (například dimerů, trimerů a

ΓΪ!

větších shluků). Specificky je formulace považována za fyzikálně stabilní, když po dvou měsících při 37 °C nevznikne víc než 15 % agregátů.

Termín ’’ stabilní formulace znamená, že po dvou měsících při 37 °C (nebo ekvivalentních podmínkách při zvýšené teplotě) zbude nejméně asi 65 % chemicky a fyzikálně stabilních peptidových sloučenin. Zvláště výhodnými formulacemi jsou takové, které udrží v těchto podmínkách alespoň 80 % chemicky a fyzikálně stabilních peptidů. Speciálně preferovanými stabilními formulacemi jsou takové, u kterých nedochází k degradaci ani po sterilizaci ozářením (například paprsky gama, beta nebo svazkem elektronových paprsků.)

Termín peptid a/nebo peptidové sloučenina znamená polymerní sloučeniny složené z až 50 zbytků aminokyselin spojených amidovými (CONH) vazbami. V těchto termínech jsou zahrnuty i analogy, deriváty, agonisty, antagonisty a jejich farmaceuticky přijatelné soli. Tyto termíny rovněž zahrnují peptidy a/nebo peptidové sloučeniny, které obsahují jako strukturní složku D-aminokyseliny, modifikované, derivatizované nebo v přírodě se nevyskytující aminokyseliny v D- nebo L-konfiguraci a/nebo peptomimetické jednotky.

Termín sloučeniny příbuzné LHRH znamená spouštěcí hormon luteinizačního hormonu (LHRH), jeho analogy a farmaceuticky přijatelné soli. Agonisty a antagonisty LHRH typu okta-, nona- a dekapeptidů jsou obsaženy v termínu sloučeniny příbuzné LHRH stejně jako nativní LHRH. Zvláště preferované sloučeniny příbuzné LHRH zahrnují LHRH, leuprolid, goserelin, nafarelin a ostatní známé aktivní agonisty a antagonisty (1-21).

Termín vysoká koncentrace znamená alespoň 10 % hmotnostních a koncefcraci limitovanou maximální rozpustností toho konkrétního peptidu.

Termín excipient znamená více nebo méně inertní sloučeninu ve formulaci, která je přidána jako ředidlo nebo vehikulum nebo pro vytvoření formy nebo konzistence. Excipienty se odlišují od rozpouštědel jako je ethylalkohol, používaný k rozpouštění léků ve formulacích a od neionogenních povrchově aktivních prostředků jako je Tween 20, používaný k solubilizaci léků ve formulacích a od konzervačních prostředků jako jsou benzylalkoholy nebo methyl- nebo propylparabeny, používané pro prevenci nebo inhibici růstu mikrobů.

Termín polární aprotické rozpouštědlo znamená polární rozpouštědlo, které neobsahuje kyselý vodík a není donorem vodíkové vazby. Příklady polárního aprotického rozpouštědla jsou dimethylsulfoxid (DMSO), dimethylformamid (DMF), hexamethylfosfortriamid (HMPT) a n-methylpyrrolidon.

Termín nevodné protické rozpouštědlo” znamená nepolární rozpouštědlo obsahující vodík vázaný na kyslík nebo dusík, takže je schopen vytvářet vodíkové vazby nebo být donorem protonu. Příklady nepolárních protických rozpouštědel představují polyethylenglykoly (PEG), propylenglykol (PG), polyvinylpyrrolidon (PVP), methoxypropylenglykol (MPEG), glycerin a glykofurol.

Příprava formulací

Tento vynález se vztahuje k nevodnym formulacím peptidových sloučenin v polárním aprotickém rozpouštědle, jež jsou stabilní po dlouhou dobu při zvýšených teplotách. Standardní zředěné vodné peptidové a proteinové formulace vyžadují pro dosažení stability zvláštních podmínek týkajících se ústoje, iontové síly, pH a excipientů (například EDTA a askorbové kyseliny). Naproti tomu patentem nárokované formulace dosahují stability peptidových sloučenin použitím nevodných polárních aprotických rozpouštědel. Především bylo formulacemi podle tohoto vynálezu dosaženo stability v případě vysokých koncentrací (nejméně asi 10 % hmotnostních).

Příklady peptidů a peptidových sloučenin, jež lze formulovat na základě tohoto vynálezu, zahrnují takové peptidy, které mají biologickou aktivitu, nebo které lze použít pro léčbu nemocí nebo jiných patologických stavů. Zahrnují, aniž by se na ně omezovaly, adrenokortíkotropní hormon, angiotensin I a II, atriální natriuretický peptid, bombesin, bradykinin, kalcitonin, cerebellin, dynorfin A, alfa a beta endorfin, endothelin, enkefalin, epidermální růstový faktor, fertirelin, spouštěcí peptid folikulárního gonadotropinu, galanin, glukagon, gonadorelin, gonadotropin, goserelin, spouštěcí peptid růstového hormonu, histrelin, inzulín, leuprolid, LHRH, motilin, nafarelin, neurotensin, oxytocin, somatostatin, substanci P, faktor nekrotického tumoru, triptorelin a vasopresin. Jejich analogy, deriváty, antagonisty, agonisty a farmaceuticky přijatelné soli lze použit rovněž.

Peptidové sloučeniny použitelné v těchto fomulacich a způsoby podle tohoto vynálezu lze použit ve formě soli, nejraději farmaceuticky přijatelné soli. Použitelné soli jsou známy odborníkům a zahrnují soli anorganických kyselin, organických kyselin, anor_gani_ckých_bá.zl nebo organických...........

bází. Výhodnými solemi jsou acetáty.

Peptidy a peptidové sloučeniny dobře rozpustné v nevodných polárních aprotických rozpouštědlech jsou pro použití v tomto vynálezu preferovány. Odborník snadno určí, které sloučeniny jsou použitelné na základě jejich rozpustnosti, což znamená, že sloučenina musí být v daném t fl · *

Φ a fl ® fl* • fl flfl fl· nevodném polárním aprotickém rozpouštědle rozpustná v alespoň přijatelném množství. Přednost se dává rozpustnostem alespoň asi 10 % hmotnostních. Zvláště výhodné peptidové sloučeniny jsou sloučeniny příbuzné LHRH včetně leuprolidu a leuprolid acetátu.

Podíl peptidů může kolísat v závislosti na sloučenině a zdravotním stavu léčeného, rozpustnosti sloučeniny, předpokládané dávce a době podávání. (Viz například Gilman a další, The Pharmacological Basis of Therapeutics, 7. edition, 1985) a Remington, Pharmaceutical Sciences, 18. edition, 1990, jejichž závěry jsou zde zahrnuty odkazy). Koncentrace peptidů ve formulacích s vysokou koncentrací se může pohybovat od asi 10 % hmotnostních do maximální rozpustnosti sloučeniny. Výhodné rozpětí je od asi 20 do asi 60 % hmotnostních. V současné době je více preferován koncentrační rozsah od asi 30 do asi 50 % hmotnostních a nejvhodnější je rozsah od asi 35 do asi 45 % hmotnostních.

Mimo očekávání bylo zjištěno, že při zvyšování koncentrace peptidů rozpuštěného v nevodném polárním aprotickém rozpouštědle se stabilita peptidové formulace může zvyšovat. Například, jak ukazuje obrázek 7, když roztoky 5, 10, 20 a 40 % leuprolidu v DMSO byly 8 měsíců skladovány při 80 °C a periodicky byly odebírány vzorky a analyzovány pro zjištění zbývající koncentrace leuprolidu, formulace s vyššími koncentracemi leuprolidu byly shledány stabilnějšími než formulace s nižšími koncentracemi leuprolidu.

Všeobecně platí, že stabilní formulace podle tohoto vynálezu se mohou připravit jednoduchým rozpuštěním potřebného množství (což může být therapeuticky účinné množství) příslušné peptidové formulace ve zvoleném nevodném polárním aprotickém rozpouštědle. Výhodná polární aprotická rozpouštědla představují DMSO a DMF.

Zvýšení podílu vody obsažené v peptidových formulacích podle tohoto vynálezu zvyšuje stupeň degradace peptidů, jak ukazuje obrázek 8. Tento vzrůst je zřejmě způsoben hlavně růstem produktů chemické degradace, přičemž shlukování (agregace) zůstává poměrně konstantní (obrázek 9).

Bylo též zjištěno, že nevodná protická rozpouštědla jako PEG, PG a PVP lze podle přání přidávat k těmto formulacím podle nároků vynálezu.

C. Metodologie

Zjistili jsme, že se stabilní nevodné formulace peptidových sloučenin mohou připravit rozpuštěním zvolené peptidové sloučeniny v nevodném polárním aprotickém rozpuštědle.

Tyto formulace peptidových sloučenin, specificky formulace sloučeniny příbuzné LHRH leuprolidu, jsme zkoušeli z hlediska stability jejich urychleným stárnutím za zvýšené teploty a měřením jejich chemické a fyzikální stability. Výsledky těchto zkoušek (uvedené například v tabulce II a obrázcích 1,2,4 a 6) ukazují, že tyto formulace byly stabilní za podmínek, jež se blíží nebo překračují skladování po dobu jednoho roku při teplotě 37 °C.

Rovněž jsme testovali stabilitu formulací peptidových sloučenin připravených jak je zde popsáno po gama ozáření (2,5 Megarad). Výs1ed ky u vedené v tabulce III ukazují,________že tyto formulace zůstaly chemicky a fyzikálně stabilní i po takovémto ozáření.

Jak je ukázáno v tabulce I, zkoušeli jsme stabilitu širokého spektra peptidových formulací, zvláště leuprolidu, goserelinu, LHRH, angiotensinu I, bradykininu, kalcitoninu, enkefalinu, inzulínu, neurotensinu, substance P,

trypsinogenu a vasopresinu jejich rozpouštěním (nebo snahou je rozpustit) v nevodném polárním aprotickém rozpouštědle DMSO a pak jejich urychleným stárnutím při zvýšených teplotách. Stabilita formulací se měřila. Výsledky jsou uvedeny v tabulce I jako poločas při 37 °C za předpokladu, že E_a = 22,2 kcal/mol. Značné množství testovaných peptidů bylo v DMSO rozpustných a za zkušebních podmínek zůstaly stálé. Rozpustnost určitého peptidů v určitém nevodném polárním aprotickém rozpouštědle a stabilita výsledného roztoku se snadno stanoví užitím rutinních postupů známých odborníkům.

Tabulka I: Stabilita peptidů formulovaných v DMSO

Formulace	Poločas* (Teplota)
40% leuprolid	29,8 let (37 °C)
40% goserelin	5,0 let (80 °C)
20% LHRH	8,2 roku (65 °C)
20% angiotensin I	4,2 roku (65 °C)
5% angiotensin I	4,1 měsíce (50 °C)
20% bradykinin	2,9 měsíce (65 °C)
40% kalcitonin	nerozpustný (80 ^eC)
20% kaícitonin	2,4 měsíce (80 °C)
5% kalcitonin	100% stabilita 2 měs. (50 ^eC)
10% enkefalin	1,9 měsíce (80 ’C)
5% enkefalin	2,6 měsíce (50 °C)
20% inzulín	nerozpustný gel (65 °C)
5% neurotensin	5,0 měsíce (50 °C)
5% substance P	3,0 měsíce (50 °C)
40% trypsinogen	nerozpustný krystal/gel (65 °C/80 °C)
20% trypsinogen	nerozpustný gel (65 °C)
5% trypsinogen	5,9 měsíců (50 *C)

I Φ •·· • ΦΦΦ · ·

40% vasopresin	degradace (80 °C)
20 % vasopresin	11,8 dní (65 °C)
^Poločas při 37 °C; předpoklad: E_a = 22,2 kcal/mol

Formulace 40% peptidu v DMSO skladované šest měsíců při teplotě 37 °C, 50 °C, 65 °C a 80 °C vykázaly nelineární průběh Arrheniovy kinetické rovnice při měření celkové ztráty peptidu z roztoku, ilustrující stabilitu této formulace při zvýšených teplotách. Rozbor údajů zjištěných při 37 °C ukázal t₉₀ 14,4 měsíců, což dokazuje, že stabilita při 37 °C je velmi dobrá.

Zdá se, že teplota ovlivňuje jak rychlost degradace, tak podíl degradačních produktů formulací podle tohoto vynálezu. Studium formulací leuprolid-DMSO ukázalo, že při 65 °C a 80 °C je zřejmě oxidace hlavní formou chemické degradace. Naopak se zdá, že při 37 ’C a 50 °C je dominantní cestou degradace těchto formulací hydrolýza a isomerace.

Neočekávaně jsme rovněž shledali, že určité peptidové formulace podle tohoto vynálezu jsou bakteriostatické (tj. inhibují růst bakterii), baktericidní (tj. usmrcují bakterie) a sporicidní (tj. usmrcují spory). Zvláště formulace leuprolidu v koncentraci 50-400 mg/ml vykazovaly bakteriostatické, baktericidní a sporicidní účinky.

Stabilitu vzorků neovlivnilo injektování bakterií, což naznačuje, že enzymy uvolňované z usmrcených a lyžovaných bakterií neovlivňovaly záporně stabilitu produktu. Toto ukazuje, že tyto formulace nepodporovaly aktivitu enzymů.

Je známo, že některé peptidy, například kalcitonin a leuprolid, jsou fyzikálně nestabilní, protože u nich dochází k agregaci, gelaci, fibrilaci, formulují-li se ve vodných • · ·4 · fl· '·· • fl · fl · ·· fl 4 · ‘4 · · · · 4 . · · · · • ···«*« · fl fl 4 · fl « ·fl fl fl · fl fl · · fl·· · ·· flflfl ·« ·· roztocích. Zlepšení fyzikální stability může zvýšit biologickou dostupnost, usnadnit senzibilizaci a imunitní odezvu a umožnit snazší parenterální podávání včetně podávání s užitím implantovatelných systémů pro dlouhodobé uvolňování léků.

Mimo očekávání bylo zjištěno, že určité peptidy jako leuprolid, goserelin a kalcitonin formulované v nevodných polárních aprotických rozpouštědlech podle tohoto vynálezu negelují. Ani po 12 měsících při 37 °C nebyla zjištěna žádná gelace. Je to zřejmě proto, že nevodná aprotická polární rozpouštědla nutí peptidy vytvářet prostorová uspořádání (konformace) typu nepravidelná spirála/a-helix, která zpětně nevytvářejí ploché β-struktury skládaného listu a proto nedochází ke geiaci. Proto mají tato rozpouštědla antigelační účinek.

Závažnější aspekt tohoto vynálezu je ten, že nevodné roztoky obsahující peptidové sloučeniny v polárních aprotických rozpouštědlech jsou chemicky a fyzikálně stabilní při vysokých teplotách po dlouhou dobu. Takové formulace jsou stabilní i při vysokých koncentracích. Proto jsou tyto formulace výhodné tím, že mohou být dopravovány nebo skladovány při teplotách místnosti a vyšších po dlouhou dobu. Jsou také vhodné pro použití v implantovatelných systémech pro dlouhodobé uvolňování léku.

Příklady provedení vynálezu

Při realizaci výzkumu následujícími příklady bylo použito těchto způsobů:

1. Příprava roztoků leuprolidacetátu

Leuprolidacetát získaný například od firmy

Mallinckrodt, St. Louis, Missouri, se navážil a ve vhodné • ft • ft • ••ft * · • ft • ft ·· • · ft 'ft • ft · ft ♦ ··♦ ·*!

koncentraci se za míchání nebo centrifugace rozpustil ve vehikulu jako například DMSO, DMF, DMSO/PEG, DMSO/PG nebo DMSO/PVP. Termín bezvodý DMSO se týká formulací s DMSO připravených v bezvodém prostředí, to znamená v suché dusíkové atmosféře.

Pokud není uvedeno jinak, obsah volné báze leuprolidu se vypočítal z proklamovaného chemického složení (čistoty) komerčního výrobku jako 37 % volné báze. Šlo tedy o 40% leuprolidacetát, pokud není uvedeno jinak.

2. Příprava kontejnerů

Kontejnery depotních systémů pro dlouhodobé uvolňování léků (popsané v patentové přihlášce USA č. 08/595.761 a v této přihlášce zahrnuté odkazem) se naplniy vhodnými roztoky leuprolidacetátu. Formulace se plnily do titanových nebo polymérních kontejnerů uzavřených na každém konci polymerní zátkou. Naplněné kontejnery se potom zapečetily do sáčků z vícevrstvé folie a umístily ve vyhřívaném prostoru (zkušební pícce) pro testování stability.

Je třeba poznamenat, že formulace jsou v kontejnerech těchto systémů dokonale izolovány od vnějšího prostředí.

3. Vysokoúčinná kapalinová chromatografie s převrácenými fázemi (RP-HPLC)

Všechny vzorky pro testování stability se analyzovaly na koncentraci leuprolidu a plochy píků v procentech s použitím gradientově eluční vysokoúčinné kapalinové chromatografie s převrácenými fázemi za pomoci chlazeného automatického dávkovače (4 °C) pro snížení degradace vzorků. Podmínky chromatografování jsou uvedeny níže.

• fl·» fl fl

Podmínky chromatografie RP-HPLC • fl· flflfl

Popis	Parametr
Kolona	HaiSil C 18, 4,6 x 250 mm, S/N 5103051
Průtok	0,8 ml x min”¹
Vstřikovaný objem	20 μΐ
Detekce	210 nm
Retenční čas leuprolidu	25 až 30 minut
Mobilní fáze	A = 100 mM fosforečnanu sodného, pH 3,0 B = 90% acetonitril/voda
Gradient	Minuty: 0 5 25 40 41 46 46,1 50 %B: 15 26,5 26,5 65 85 85 15 15

Standardy leuprolidu ve vodě procházely kolonou při 4 až 6 různých koncentracích, typicky v rozmezí 0,1 - 1,2 mg/ml, společně se vzorky testovanými na stabilitu.

Testované vzorky byly obklopeny (ohraničeny) soubory standardů, přičemž mezi soubory standardů nebylo více testovaných vzorků než 40. Všechny píky mezi vnějším objemem a 45 minutami průchodu byly integrovány. Integrované plochy píku standardů leuprolidu byly grafický vynášeny jako funkce koncentrace. Pomocí lineární regrese byly potom vypočítány koncentrace leuprolidu ve vzorcích testovaných na stabilitu. Rovněž byiy zaznamenány %plochy píků leuprolidového píku, ’ sumy všech píků eluovaných před leuprolidem (označena jiné) a sumy všech píků eluovaných za leuprolidem (označena agregáty) a vyneseny do diagramu jako funkce časového průběhu eluce vzorku.

4. Vylučovací chromatografie SEC

Pro vybrané vzorky určené pro zkoušky stability se zjišťovaly plochy píku v procentech a molekulové hmotnosti isokratickou vylučovací chromatografií SEC za použití chlazeného automatického dávkovače (4 °C). Užité chromatografické podmínky jsou uvedeny níže.

Podmínky chromatografie SEC

Popis	Parametr
Kolona	Pharmacia Peptide, HR 10/30, 10 x 300 mm
Průtok	0,5 ml x min ¹
Vstřikovaný objem	20 μΐ
Detekce	210 nm
Retenční čas leuprolidu	asi 25 minut
Mobilní fáze	100 mM fosforečnanu sodného, pH 2,0, 200 mM chloridu sodného, 30ž acetonitril

Znalost vnějšího objemu a celkového objemu kolony SEC byly pro výpočet molekulových vah nezbytné. Pro stanovení vnějšího objemu a celkového objemu se použilo vysokomolekulárního standardu BioRad a 0,1% acetonu. Zaznamenávaly se retenční časy pro první pík standardu BioRad a acetonový pík a konvertovaly se na objemové jednotky níže uvedenými rovnicemi. Protože tyto hodnoty jsou pro určitou kolonu SEC a určitý systém HPLC konstantní, bylo třeba vnější a celkový objem nově určit kdykoliv došlo ke změně na koloně SEC nebo systému HPLC. Potom byly chromatografovány standardy a po nich následovaly vzorky testované na stabilitu. Směs standardů obsahovala přibližně 0,2 mg/ml následujících peptidů: bursin (molekulová hmotnost 449), WLFR. peptid (molekulová hmotnost 619), angiotensin

Β·ΒΒ « Β (molekulová hmotnost 1181), GRE (molekulová hmotnost 5108) a cytochrom C (molekulová hmotnost 12394). Tyto standardy byly zvoleny, protože jejich molekulové hmotnosti ohraničovaly (byly blízké - vyšší i nižší) molekulové hmotnosti leuprolidu a všechny měly bazické pl 9,8 až 11,0 podobně jako leuprolid.

Plochy píků v procentech byly zaznamenány pro všechny píky. Molekulové hmotnosti isolovaných sloučenin byly vypočteny za pomoci níže uvedených rovnic.

V_s

V_o obj emu V_t objemu

= průtok	(ml/min)	X	retenční	čas	píku	vzorku (min)
= průtok	(ml/min)	X	retenční	čas	píku	vnějšího
(min)
= průtok	(ml/min)	X	retenční	čas	píku	celkového
(min)

Kd= V_s - Vo V_t - Vo kde:

V_s = objem standardu nebo vzorku V_o = vnější objem V_t = celkový objem

Pro každý pík peptidového standardu byl vypočítán V_s. S použitím hodnot pro V_t a V_o vypočítaných dříve byl potom pro každý peptidový standard vypočítán Kd. Pro stanovení molekulových hmotnost i každého píku vzorků testovaných na stabilitu se užilo křivky lineární regrese v diagramu log molekulová hmotnost proti Kd^-1. Rovněž byly zaznamenány %plochy píků vzorků testovných na stabilitu.

5. Přístroje a materiály

Pro chromatografické analýzy RP-HPLC a SEC se použilo • · • · • ·

4 4 ·· • · t * • 94 9 4 4 9 • 9 ·

následujících přístrojů a materiálů:

HPLC systém spol. Waters Millennium sestávající z automatického dávkovače 717, čerpadla 626, regulátoru 6000S, detektoru 900 typu fotodiode array” (napojeného na počítač), refraktometrického detektoru 414 od spol. Waters Chromatography, Milford, Ma), trubičky pro HPLC (pozice 48 a 96) spol. Waters Chromatography, Milford, Ma),

HaiSil C 18, 120 A, 5 μια, kolona 4, 6 x 250 mm HPLC od spol. Higgins Analytical, Mountain View, Ca)

Pharmacia Peptide, HR 10/30 SEC kolona od spol. Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)

Následující příklady podáváme pro ilustraci tohoto vynálezu, ale v žádném případě nemají limitovat rozsah jeho platnosti.

Příklad 1

Urychlená zkouška stability formulací leuprolidacetátu

Podle výše uvedeného popisu byly připraveny formulace obsahující 40 % hmotnostních leuprolidacetátu (což je ekvivalent asi 37 % volné báze) ve vehikulu, a potom jimi byly naplněny kontejnery implantovatelných systémů pro dlouhodobé uvolňování léčiv, rovněž výše popsaných. Všechny kontejnery byly z titanu.

Tyto systémy s naplněnými kontejnery byly podrobeny urychlenému stárnutí-inkubací v pícce (spol. Precision Scientific nebo Thelco) při zvýšené teplotě 80 °C po dobu sedmi dnů. To odpovídá skladování při 37 °C během asi 1,5 roku nebo při pokojové teplotě (25 °C) asi čtyři roky.

Tyto vzorky byly analyzovány výše popsanými chromatografickými met ódami RP-HPLC a SEC pro stanovení chemické a fyzikální stability formulací při urychleném ·· » · <

» * ·4·

Φ • · • * *· 4» • · · • »*·· • 4 ··♦ · ·«· stárnutí.

Výsledky uvedené v tabulce II ukazují, že tyto formulace byly schopny zachovat stabilitu LHRH příbuzné sloučeniny leuprolidu. Vždy se zachovalo nejméně 65 % leuprolidu.

Tabulka II

Stabilita formulací leuprolidacetátu v polárním aprotickém rozpouštědle po 7 dnech při 80 °C v titanovém kontejneru

Formulace	% leuprolidu 7. dne
40 % v DMSO	92
40 % v DMSO/PEG (50/50)	90
40 % v DMSO/PG (50/50)	86
40 % v DMSO/PVP (50/50)	93
40 % v DMF	91
40 % v bezvodém DMSO	89

Přiklad 2

Zkouška stability ozářených formulací leuprolidacetátu

Formulace 40% (hmot.) leuprolidacetátu v DMSO byly připraveny jak popsáno výše a plněny do kontejnerů systémů pro dlouhodobé uvolňování léků, rovněž stejně jak popsáno výše. Všechny kontejnery byly vyrobeny z titanu.

Naplněné systémy byly zaslány spol. Sterigenics (Tustin, Kalifornie), kde byly ozářeny paprsky gama (2,5 Megarad) použitím kobaltu 60 v centrální komoře fy Sterigenics (Tustin) k ozáření typu tote box” na 3. stupni. Vzorky označené v tabulce III studené byly dopraveny a ozářeny na suchém ledu. Potom byly vzorky podrobeny urychlenému stárnutí jako v příkladu 1. Vzorky byly odebírány nultý a sedmý den, analyzovány chromatografickými lO

C\l (Ú cn

Ή β

Φ >U| '(0

N

O

Ch β P 'Π3 P 0) υ (0 T) Ή •—( o β Cb 3 Φ

Μ
Ι-(	4-1
Μ	ο
(0	ε Ρ
λ;
ι—1 β	ÓP
Ρ	ο
<0
Ε-ι	Ή υ (0

O

Ρ υ

ω β

<υ β

•η

Φ

Ρ β

Ο λ:

ρ υ

Α >

ο β

(0

Ρ

-Η

Ρ >

4 *·

4 · · • · · · · • ···· 4 4 · • · 4 4

444 · ·· • 44 44 · · · · • · · · · • · ··· ··· • 4 4

444 «4 ··

O

P

X!

υ », λ:

υ

Ή

Ρ = ο β Ο, ίθ

Ρ υ

Ή β

β

Μθ

Ή

Ο

Ob <0 Ρ •Η >—I •Η Ρ (0 Ρ W

Ό (0 β

(0

Cn

fl φ •ο

4Ρ

dimerů/trimerů

Cn <—(

«— r—1

r-l

CM

O

CM CM

τ—I

OO r-l

S'T

Π-

ο W

4Ρ

monomeru

97,7

98,5

98,3

95,3

106,1

«5J« cn cn

«tít· o r-H

O s» rcn

rr—1 cn

cn

α φ Ό ο

04

dimerů/trimerů

0,5

O

CM O

CO o

O

0,6 i .......í

O

0,5

<*Ρ

monomeru

98,1

100

99,1

r-H *. Ch cn

100

cn cn

100

iZ> cn cn

99,5

α φ X»

β ϋ Ή »—1 Ο Μ Ο. α φ Γ—I

(RP-HPLC)

100

o ΟΊ

cn Ch

iT> cn

• o s

o cn

100

co 00

40

Ozáření !|

ano íl

Φ C

studený |

o tí <d

Φ a

ano

ne

0 tí <d

ano

láce i

DMSO

O cn §

O §

DMSO 1 _i

β

>

Κι Ο

<*P O «Φ

4P o

<*P O

<řP O

dP O «4*

ctfi o «4*

dP O

<*> o «SJ*

<*> O «4»

způsoby RP-HPLC a SEC jak popsáno výše pro zjištění chemické a fyzikální stability ozářených formulací.

Výsledky uvedené v tabulce III ukazují, že tyto formulace leuprolidacetátu byly po ozáření stálé. Ve všech případech se zachovalo alespoň 65 % leuprolidu při nízké tvorbě agregátů.

Příklad 3

Urychlené zkoušky dlouhodobé stability formulací leuprolidacetátu.

Byly připraveny roztoky 40% (hmot.) leuprolidacetátu v DMSO, naplněny do kontejnerů, skladovány 2 měsíce při 80 °C a analyzovány jak popsáno výše. Výsledky prezentované v obrázcích 1 (RP-HPLC) a 2 (SEC) ukazují, že se zachovalo

81,1 % leuprolidu, pouze 14,6 % se změnilo chemickou degradací a 5,1 % fyzikální agregací.

Roztoky leuprolidacetátu se připravily, plnily do kontejnerů, skladovaly při 80 °C 6 měsíců a analyzovaly jak popsáno výše. Obrázek 4 ukazuje graf leuprolidu a produktů jeho chemické a fyzikální degradace evidovaných po šesti měsících, z kterého vyplývá, že se dohledal všechen peptidický materiál s nímž se pokus začal a že tyto formulace vykázaly dobrou stabilitu při 80 °C. Suma všech tří těchto složek se zde prezentuje jako ,,ΟθΙΚθΓΠ“,

Obrázek 5 je diagram přirozeného logaritmu těchto údajů a ukazuje, že tyto- formulace vykazovaly v celém testovaném teplotním rozsahu lineární kinetiku.

V obrázku 6 se ukazuje chemická stabilita roztoků 40% leuprolidacetátu připravených a analyzovaných jak popsáno výše. Po devíti měsících při 37 °C se zachovalo více než 90 % (93,5 %) leuprolidu a vzniklo méně než 5 % (2,9 %) produktů chemické degradace (v obrázku označených early) a β · méně než 5 % (2,3 %) produktů fyzikální degradace (označených jako latě”) zjištěných způsobem RP-HPLC ale v dobré shodě s výsledky chromatografie SEC.

Byly připraveny roztoky 40% (hmot.) leuprolidacetátu v

DMSO, umístěny v kontejnerech, skladovány při 37 C, 50 *C, 65 °C a 80 °C a analyzovány s použitím výše popsaného způsobu RP-HPLC. Výsledky byly vypočítány a popsány v: Physical Pharmacy: Physical Chemical Priciples in the Pharmaceutical Sciences, 3. edition, Martin a další, kapitola 14 (1983) a dokázaly, že úbytek leuprolidu z fomulací v DMSO byl nelineární. Údaje jsou uvedeny níže a v obrázku 3 se prezentují jako Arrheniův graf.

Protože Arrheniovy grafy formulací v DMSO skladovaných při 80 °C ukázaly, že úbytek leuprolidu byl nelineární, použilo se pro výpočet t₉₀ těchto formulací pro 14,4 měsíce při 37 ^eC údajů o stabilitě získaných při 37 °C.

DMSO
°C	Kobs (měsíce^-1)	t_1/2 (měsíce)
37	7,29 x 10'^J	95,1
50	9,74 χ 10'³	71,2
65	2,48 χ 10'²	27 , 9
80	0,108	6/4

E_a = nelineární

Příklad 4

Zkouška stability formulací leuprolidacetátu v DMSO/voda Formulace 40% (hmot.) leuprolidacetátu v DMSO,

DMSO/voda (95:5, 90:10, 70:30, 50:50 a 30:70) a ve vodě byly připraveny jak popsáno výše a sedm dní inkubovány při 80 ^eC. V nultém a sedmém dni byla provedena analýza IČ

2@ spektrometrem vybaveným Fourierovou transformací signálu jako detektorem (FTIR).

Výsledky ukázaly, že toto urychlené stárnutí způsobilo u všech zkoušených formulací jen velmi malé změny strukturální konformace leuprolidu. Všeobecně platí, že ve formulacích s DMSO měly peptidové struktury převážně charakter nepravidelné spirály nebo α-helix, zatímco ve vodných formulacích měly převážně ploché β-struktury skládaného listu.

Modifikace výše uvedených způsobů realizace různých provedení tohoto vynálezu budou odborníkům na základě v tomto vynálezu uvedených poučení zřejmé. Výše uvedené příklady nemají omezující charakter, ale pouze představují příklady vynálezu, jehož rozsah je definován následujícími nároky.

2/

Claims

PATENTOVÉNÁROKY (Změněné nároky)

1. Stabilní nevodná formulace peptidové sloučeniny, vyznačující se tím, že obsahuje:

a) nejméně jednu peptidovou sloučeninu; a

b) nejméně jedno polární aprotické rozpouštědlo, přičemž uvedená formulace je stabilní při 37 °C nejméně 3 měsíce.
2. Formulace podle nároku 1, vyznačující se tím, že obsahuje nejméně asi 10 % hmotnostních peptidové sloučeniny.
3. Formulace podle nároku 1, vyznačující se tím, že obsahuje nejméně asi 30 % hmotnostních peptidové sloučeniny.
4. Formulace podle nároku 1, vyznačující se tím, že uvedená peptidová sloučenina je sloučenina příbuzná LHRH.
5. Formulace podle nároku 4, vyznačující se tím, že'uvedená peptidová sloučenina se vybere ze skupiny sestávající z leuprolidu, LHRH, nafarelinu a goserelinu.

ě. Formulace podle nároku 1, vyznačující se tím, že je při 80 °C stabilní nejméně 2 měsíce.
7. Formulace podle nároku 1, vyznačující se tím, že je při 37 °c stabilní nejméně jeden rok.
8. Formulace podle nároku 1, vyznačující se tím, že je přizpůsobena pro aplikaci v implantovatelných
9 · · ’ t · t · · ·· • · · * i J

000··· ·

0 0 0* ·»· · ·· ··* systémech pro dlouhodobé uvolňování léku.

9. Formulace podle nároku 1, vyznačující se tím, že rovněž obsahuje nevodné protické rozpouštědlo.
10. Formulace podle nároku 1, vyznačuj ící se t í m, že uvedené polární aprotické rozpouštědlo se vybere ze skupiny sestávající z DMSO a DMF.
11. Formulace podle nároku 1, vyznačuj ící se t 1 m, že uvedené polární aprotické rozpouštědlo vykazuje antigelační efekt.
12. Formulace podle nároku 1, vyznačuj ící se t 1 m, že sestává hlavně z asi 30 až asi 50 % hmotnostních z leuprolidacetátu, sloučeniny příbuzné LHRH, v DMSO.
13. Formulace podle nároku 1, vyznačuj ící se t í m, že sestává hlavně z leuprolidu a DMSO v množství 370 mg leuprolidu v 1 ml DMSO.
14. Formulace podle nároku 1, vyznačuj ící se t í m, že je po ozáření stabilní.
15. Způsob přípravy st ab i lni nevodné f o.rmu.1 a ce.,. -po dl e. nároku 1,vyznačující se tím, že zahrnuje rozpuštění nejméně jedné peptidové sloučeniny v nejméně jednom polárním aprotickém rozpouštědle.
16. Způsob podle nároku 15, vyznačuj ící setím, že při něm nejméně asi 10 % hmotnostních peptidové sloučeniny přejde do roztoku.

• 0
17. Způsob podle nároku 15, vyznačuj ící se t í m, že při něm nejméně asi 30 % hmotnostních peptidové sloučeniny přejde do roztoku.
18. Způsob podle nároku 15, vyznačuj ící se t í m, že uvedená peptidová sloučenina je sloučenina příbuzná LHRH.
19. Způsob podle nároku 18, vyznačuj ící se t í m, že uvedená peptidová sloučenina se vybere ze skupiny sestávající z leuprolidu, LHRH, nafarelinu a goserelinu.
20. Způsob podle nároku 15, vyznačuj ící se t í m, že rovněž zahrnuje stupeň, v němž se přidá nevodné protické rozpouštědlo.
21. Způsob podle nároku 15, vyznačuj ící se t í in, že asi 30 % až asi 50 % hmotnostních leuprolidacetátu, sloučeniny příbuzné LHRH, je rozpuštěno v DMSO.
22. Způsob podle nároku 15, vyz.načuj ící se t í m, že se při něm 370 mg leuprolidu rozpustí v 1 ml DMSO.
23. Způsob léčby osoby trpící potížemi, vyznačujícím se tím, že jej lze ulehčit podáním peptidové sloučeniny zahrnujícím poskytnutí uvedené osobě účinného množství formulace podle nároku 1.
24. Způsob podle nároku 23, vyznačující se t í m, že toto podávání léku je parenterální podávání.

• ·
25. Způsob podle nároku 23, vyznačuj íci se t í m, že uvedené podávání léku je kontinuální a dlouhodobé.
26. Způsob podle nároku 25, vyznačuj ící se t í m, že uvedené podávání se provádí s použitím implantovatelných systémů pro dlouhodobé uvolňování léku.
27. Způsob podle nároku 23, vyznačuj ící se t í m, že uvedené potíže představuje rakovina prostaty a uvedená peptidová sloučenina je leuprolid.
28. Způsob podle nároku 27, vyznačuj ící se t í m, že se denně podává nejméně asi 80 mikrogramů leuprolidu.
29. Způsob podle nároku 28, vyznačující se t í m, že uvedené denní podávání se děje po dobu vybranou ze skupiny složené ze 3 měsíců, 6 měsíců a 12 měsíců.
30. Způsob podle nároku 29, vyznačující se t í m, že uvedené denní podávání po uvedenou dobu je kontinuální podávání uskutečněné za použití implantovatelného systému pro dlouhodobé uvolňování léku.

.
31. Způsob podle nároku 23, vyznačuj ící se t í m, že uvedené potíže představuje rakovina prostaty a uvedená peptidová sloučenina je antagonista LHRH.
32. Stabilní nevodná formulace peptidové sloučeniny vyznačující se tím, že obsahuje:

a) nejméně jednu peptidovou sloučeninu; a

b) nejméně jedno polární aprotické rozpouštědlo, • · přičemž tato formulace je stabilní při 37 °C nejméně 3 měsíce za předpokladu, že uvedená formulace neobsahuje složky obsahující přidanou vodu.
33. Způsob přípravy stabilní nevodné formulace podle nároku 1, vyznačující se tím, že zahrnuje rozpuštění nejméně jedné peptidové sloučeniny v nejméně jednom polárním aprotickém rozpouštědle za předpokladu, že uvedená formulace neobsahuje složky obsahující přidanou vodu.
34. Způsob podle nároku 33, vyznačující se tím, že se uskutečňuje v atmosféře inertního plynu.
35. Způsob podle nároku 34, vyznačující se tím, že tuto atmosféru představuje suchý dusík.
36. Stabilní nevodná formulace peptidové sloučeniny vyznačující se tím, že obsahuje:

a) nejméně jednu peptidovou sloučeninu; a

b) nejméně jedno polární aprotické rozpouštědlo, přičemž uvedená formulace vykazuje bakteriostatické, baktericidní nebo sporicidní účinky aniž by bylo použito běžných bakteriostatických, baktericidních nebo sporicidních činidel.
37. Způsob přípravy stabilních nevodných formulací podle nároku 36, vyznačující se tím, že zahrnuje rozpuštění nejméně jedné peptidové sloučeniny v nejméně jednom polárním aprotickém rozpouštědle za předpokladu, že do uvedené formulace se nepřidává žádná běžná bakteriostatická, baktericidní nebo sporicidní činidla.

« · * ·

32.

·'· <·'» ·♦* • ·

9 · ·
38. Způsob léčby osoby trpící potížemi, vyznačujícím se tím, že jej lze ulehčit podáním peptidové sloučeniny zahrnujícím poskytnutí uvedené osobě účinného množství formulace podle nároku 36.

1/8