NO322514B1 - Stabile, ikke-vandige formuleringer av en LHRH-beslektet peptidforbindelse og fremgangsmater for fremstilling av disse. - Google Patents

Description

OPPFINNELSENS OMRADE

Denne oppfinnelse angår stabile ikke-vandige polare aprotiske formuleringer av peptidforbindelser. I særdeleshet frembringes formuleringer med høye konsentrasjoner av peptidforbindelser.

OPPFINNELSENS BAKGRUNN

Referanser:

De følgende referanser refereres til ved numrene i parentes ([]) i de relevante deler av beskrivelsen.

1. Zoladex (goserelinacetatimplantat), Physician's Desk

Reference, 50. utg. s. 2858-2861 (1996).

2. US patent nr. 3914412, utgitt 21. oktober 19975.

3. US patent nr. 4547370, utgitt 15. Oktober 1985.

4. US patent nr. 4661472, utgitt 28. april 1987.

5. US patent nr. 4689396, utgitt 25. august 1987.

6. US patent nr. 4851385, utgitt 25. juli 1989.

7. US patent nr. 5198533, utgitt 30. mars 1993.

8. US patent nr. 5480868, utgitt 2. januar 1996.

9. WO92/20711, publisert 26. november 1992.

10. WO/95/00168, publisert 5. januar 1995.

11. WO95/04540, publisert 16. februar 1995.

12. "Stability of Gonadorelin and Triptorelin in Aqueous Solution", V.J. Helm, B.W. Muller, Pharmaceutical Research, 7/12, s. 1253-1256 (1990). 13. "New Degradation Product of Des-Gly10-NH2-LH-RH-Ethylamide (Fertirelin) in Aqueous Solution", J. Okada, T. Seo, F. Kasahara, K. Takeda, S. Kondo, J. of Pharmaceutical Sciences, 80/2, s. 167-170 (1991). 14. "Characterization of the Solution Degradation Product of Histrelin, a Gonadotropin Releasing Hormone (LHRH) Agonist", A.R. Oyler, R.E. Naldi, J.R. Lloyd, D.A. Graden, C.J. Shaw, M.L. Cotter, J". of Pharmaceutical Sciences, 80/3, s. 271-275 (1991). 15. "Parenteral Peptide Formulations: Chemical and Physical Properties of Native Luteinizing Hormone-Releasing Hormone (LHRH) and Hydrophobic Analogues in Aqueous Solution", M.F. Powell, L.M. Sanders, A.

Rogerson, V. Si, Pharmaceutical Research, 8/10,

s. 1258-1263 (1991). 16. "Degradation of the LHRH Analog Nafarelin Acetate in Aqueous Solution", D.M. Johnson, R.A. Pritchard,

W.F. Taylor, D. Conley, G. Zuniga, K.G. McGreevy, Jntl. J. of Pharmaceutics, 31, s. 125-129 (1986). 17. "Percutaneous Absorption Enhancement of Leuprolide", M.Y. FuLu, D.Lee, G.S. Rao, Pharmaceutical Research, 9/ 12,

s. 1575-1576 (1992).

18. Lutrepulse (gonadorelinacetat for IV-injeksjon), Physician's Desk Reference, 50. utg., s. 980-982

(1996). 19. Factrel (gonadorelin HC1 for subkutan eller IV-injeksjon), Physician'3 Desk Referencé, 50. utg. s. 2877-2878 (1996). 20. Lupron (leuprolidacetat for subkutan injeksjon), Physician's Desk Reference, 50. utg. s. 2555-2556

(1996).

21. Lupron-depot (leuprolidacetat for depotsuspensjon), Physician's Desk Reference, 50. utg. s. 2556-2562

(1996).

22. "Pharmaceutical Manipulation of Leuprorelin Acetate to Improve Clinical Performance", H. Toguchi, J. of

Intl. Medical Research, 18, s. 35-41 (1990). 23. "Long-Term Stability of Aqueous Solutions of Luteinizing Hormone-Releasing Hormone Assessed by an In-Vitro Bioassay and Liquid Chromatography", Y.F. Shi, R.J. Sherins, D. Brightwell, J.F. Gallelli, D.C. Chatterji, J". of Pharmaceutical Sciences, 73/6, s. 819-821 (1984) . 24. "Peptide Liquid Crystals: Inverse Correlation of Kinetic Formation and Thermodynamic Stability in Aqueous Solution", M.F. Powell, J. Fleitman, L.M. Sanders, V.C. Si, Pharmaceutical Research, 11/9, s. 1352-1354 (1994). 25. "Solution Behavior of Leuprolide Acetate, an LHRH Agonist, as Determined by Circular Dichroism Spectroscopy", M.E. Powers, A. Adejei, M.Y. Fu Lu, M.C. Manning,

Intl. J". of Pharmaceutics, 108, s. 49-55 (1994). 26."Preparation of Three-Month Depot Injectable Microspheres of Leuprorelin Acetate Using Biodegradable Polymers", Pharmaceutical Research, 11/8, s. 1143-1147 (1994) .

Beskrivelsen av hver av de ovennevnte publikasjoner, patenter eller patentsøknader er herved inkorporert ved referanse i sin helhet til det samme omfang som dersom språket i hver individuell publikasjon, patent og patentsøknad ble spesifikt og individuelt inkorporert ved referanse.

Frigjøringshormon for luteiniserende hormon (LHRH), også kjent som gonadotropinfrigjøringshormon (GnRH) er et dekapeptid med strukturen:

pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Léu-Arg-Pro-Gly-NH2.

Det utskilles fra hypotalamus og bindes til reseptorer i hypofysen, frigjør luteiniserende hormon (LH) og follikkelstimulerende hormon (FSH). LH og FSH stimulerer gonadene til å syntetisere steroidhormoner. Flere analoger av LHRH er kjente, inkludert peptider beslektet med LHRH som virker som agonister og de som virker som antagonister. [1-15] LHRH-analoger er kjent for å være nyttig i behandling av hormonavhengige sykdommer som prostatacancer, benign prostatomegaly, endometriose, hysteromyomer, metrofibromer, tidlig utviklet pubertet, eller brystcancer, og som prevensjonsmidler. [8] Administrering med langsom frigjøring foretrekkes for både LHRH-beslektede agonistforbindelser, som reduserer antallet av tilgjengelige reseptorer etter gjentatt administrering slik at produksjonen av steroidhormoner hemmes, og LHRH-beslektede antagonistforbindelser, som må administreres kontinuerlig for å opprettholde inhibering av endogen LHRH. [8]

Den langsomme parenterale avlevering av medikamenter, i særdeleshet peptidmedikamenter, frembringer mange fordeler. Anvendelsen av implanterbare anordninger for langsom avlevering av et vidt spekter av medikamenter eller andre gunstige midler er vel kjent innen teknikken. Typiske anordninger beskrives for eksempel i US patent nr. 5034229; 5057318 og 5110596. Beskrivelsen av hver av disse patenter er

inkorporert i dette dokument ved referanse.

Generelt er den orale biotilgjengelighet av peptider, inkludert LHRH-beslektede forbindelser lav. [16-17]

Dagens markedsførte formuleringer av LHRH, dens analoger og beslektede forbindelser som anvendes ved parenteral injeksjon er vandige løsninger som inneholder relativt lave konsentrasjoner av LHRH-beslektede forbindelser (0,05 til 5 mg/ml) og kan også inneholde eksipienser som mannitol eller laktose. [18-20] Slike formuleringer av LHRH-beslektede forbindelser må enten lagres nedkjølt eller de kan lagres ved romtemperatur i korte perioder.

Tilgjengelige depotformuleringer av LHRH-beslektede forbindelser administrert for langsom frigjøring over en periode på 1-3 måneder inkluderer eri formulering omfattende 15 % LHRH-beslektet forbindelse dispergert i en matriks av D,L-melke- og glykolsyrekopolymerer til stede som en sylinder som injiseres subkutant [1] og en formulering omfattende mikropartikler bestående av en kjerne av LHRH-beslektet forbindelse og gelatin omgitt av et skall av D,L-melke- og glykolsyrekopolymer. Disse mikropartikler suspenderes i et fortynningsmiddel for injeksjon enten subkutant eller intramuskulært. [21,26] Disse produkter må lagres ved romtemperatur eller lavere. Vandige formuleringer av LHRH-beslektede forbindelser er kjent for å fremvise både kjemisk og fysisk ustabilitet, så vel som degradering etter bestråling. [12-16, 22-25]

Formuleringer som har vist seg å' være stabile (t90 omtrent fire år) har vært veldig lavkonsentrerte (25 ug/ml) vandige, bufrede (10 mM, ionestyrke 0,15) løsninger lagret ved temperaturer ikke høyere enn romtemperatur (25 °C) . [15]

Det er et behov for stabile formuleringer av peptider.

OPPSUMMERING AV OPPFINNELSEN

Foreliggende oppfinnelse angår stabile ikke-vandige formuleringer som er løsninger av peptidforbindelser i polare aprotiske løsningsmidler. I særdeleshet formuleres peptidforbindelsene ved konsentrasjoner på minst ca. 10 %. Disse stabile formuleringer kan lagres ved forhøyede temperaturer (f.eks. 37 °C) i lange perioder og er spesielt nyttige ved implanterbare avleveringsanordninger for vedvarende avlevering (f.eks. 1 til 12 måneder eller lenger) av medikamentet.

I et aspekt frembringer oppfinnelsen stabile ikke-vandige formuleringer av peptidforbindelser, der formuleringene omfatter minst én peptidforbindelse i minst ett polart aprotisk løsningsmiddel. I en foretrukket utførelsesform omfatter formuleringen minst ca. 10 vekt% peptidforbindelse.

I et annet aspekt frembringer oppfinnelsen fremgangsmåter for fremstilling av en stabil ikke-vandig formulering av en peptidforbindelse; der fremgangsmåtene omfatter oppløsning av minst en peptidforbindelse i minst ett polart aprotisk løsningsmiddel. Foretrukne formuleringer omfatter minst ca. 10 vekt% peptidforbindelse.

KORT BESKRIVELSE AV FIGURENE

Figur 1 illustrerer stabiliteten av 40 vekt% leuprolidacetatløsning i dimetylsulfoksid (metylsulfoksid eller DMSO) etter to måneder ved 80 °C, analysert ved revers fase-HPLC (RP-HPLC). Figur 2 viser den samme prøve .som figur 1 injisert på størrelseseksklusjonskromatografi (SEC). Figuren viser at det er svært liten aggregering, og den aggregeringen som er består av dimer- og trimerprodukter, uten høyereordensaggregater. Figur 3 er et Arrhenius-plot som viser tap av leuprolid fra 40 % løsninger av leuprolidacetat i dimetylsulfoksid (DMSO). Figur 4 illustrerer den kjemiske og fysiske stabilitet av en 40 % leuprolidløsning i DMSO etter seks måneder ved 80 °C. Figur 5 illustrerer tap av leuprolid fra en 40 % leuprolidacetatløsning i DMSO over en periode på seks måneder ved 37, 50, 65 og 80 °C. Figur 6 illustrerer den kjemiske stabilitet av en 40 % leuprolidacetatløsning i DMSO over en periode på 9 måneder

ved 37 °C.

Figur 7 illustrerer at økende konsentrasjon av peptidet leuprolid i DMSO-løsning øker stabiliteten ved 80 °C.

Figur 8 illustrerer at økende fuktighetsinnhold i 40

% leuprolid-DMSO-formuleringer medfører redusert stabilitet ved 80 °C.

Figur 9 illustrerer at, i formuleringene vist i figur

8 øker kjemiske degraderingsprodukter med økende fuktighet.

DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

Foreliggende oppfinnelse angår det uventede funn at oppløsning av peptidforbindelser i ikke-vandige polare aprotiske løsningsmidler resulterer i stabile formuleringer. Tidligere kjente formuleringer av peptidforbindelser som er fortynnede vandige bufferløsninger inneholdende eksipienser som EDTA eller askorbinsyre som må lagres ved lave temperaturer (4-25 °C) , danner degraderingsprodukter ved hjelp av degraderingsreaksjonsveier som syre/basekatalysert hydrolyse, deamidering, racemisering og oksidering. I motsetning stabiliserer formuleringene ifølge oppfinnelsen peptidforbindelser ved forhøyede temperaturer (f.eks. 37 °C

til 80 °C), og ved høye konsentrasjoner (dvs. minst ca 10 %).

Standard peptid- og proteinformuleringer består av fortynnede vandige løsninger. Medikamentstabilitet oppnås vanligvis ved å variere en eller flere av de følgende: pH, buffertype, ionestyrke, eksipienser (EDTA, askorbinsyre etc.). For disse formuleringer kan degraderingreaksjonsveier som krever vann (hydrolyse, deamidering, racemisering) ikke fullstendig stabiliseres. I motsetning, i foreliggende oppfinnelse, ble det vist at peptider formulert i ikke-vandige løsninger, slik som dimetylsulfoksid (DMSO) og dimetylformamid (DMF), var kjemisk og fysisk mer stabile enn disse formuleringer i vann. DMSO og DMF er å betrakte som polare aprotiske løsningsmidler. Aprotiske løsningsmidler ville forventes å øke degraderingshastigheten siden de mangler evnen til å bidra med protoner i degraderingsreaksjoner. I motsetning, løsningsmidler som er mer polare enn vann (f.eks. dipolmomentet til vann er 1,85, for DMF 3,82 og for DMSO 3,96) ville forventes å øke degraderingshastigheten siden de kan hjelpe til å stabilisere det hastighetsbestemmende trinn og øke degraderingshastigheten. Imidlertid, har vi funnet at den totale effekt av polare aprotiske løsningsmidler generelt var å stabilisere løsninger av peptider.

Oppfinnelsen omfatter anvendelse av ikke-vandige, aprotiske løsningsmidler som DMSO eller DMF for å stabilisere peptidformuleringer mot både kjemisk og fysisk degradering. Oppfinnelsen består i realiseringen av at anvendelsen av DMSO og DMF forbedrer den totale stabilitet av peptider for et bredt spekter av formuleringsbetingelser, inkludert høye konsentrasjoner og forhøyede temperaturer, følgelig gjør de det mulig å avlevere peptider i implanterbare avleveringsanordninger for langtids;bruk som ellers ikke ville være hensiktsmessig.

Oppfinnelsen angår således en stabil ikke-vandig formulering av en peptidforbindelse som er utvalgt fra gruppen som bestående av leuprolid, LHRH, og goserelin, og salter av disse, som er kjennetegnet ved at den omfatter: a) minst én peptidforbindelse fra gruppen som er angitt ovenfor og b) minst ett polart aprotisk løsningsmiddel.

Oppfinnelsen gjelder også en fremgangsmåte for

fremstilling av stabil ikke-vandig formulering ifølge oppfinnelsen, som er kjennetegnet ved at den omfatter oppløsning av minst én peptidforbindelse ifølge oppfinnelsen i minst ett polart aprotisk løsningsmiddel.

A. Definisjoner:

Anvendt i beskrivelsen har de følgende betegnelser følgende betydning: Betegnelsen "kjemisk stabilitet" betyr at en akseptabel prosent av degraderingsprodukter fremstilt ved kjemiske reaksjonsveier slik som oksidering eller hydrolyse dannes. I særdeleshet anses en formulering kjemisk stabil dersom ikke mer enn 20 % nedbrytningsprodukter dannes etter to måneder ved 37 °C.

Betegnelsen "fysisk stabilitet" betyr at en akseptabel prosent aggregater (f.eks. dimerer, trimerer eller større former) dannes. I særdeleshet anses en formulering å være fysisk stabil dersom ikke mer enn 15 % aggregater dannes etter to måneder ved 37 °C.

Betegnelsen "stabil formulering" betyr at minst ca. 65 % fysisk og kjemisk stabil peptidforbindelse er igjen etter to måneder ved 37 °C (eller ekvivalente betingelser ved en forhøyet temperatur). Særlig foretrukne formuleringer er formuleringer som bibeholder minst ca. 80 % kjemisk og fysisk stabil forbindelse under visse betingelser. Særlig foretrukne stabile formuleringer er formuleringer som ikke viser degradering etter steriliserende bestråling (f.eks. gamma-, beta- eller elektronstråler).

Betegnelsen "peptid" og/eller "peptidforbindelse" betyr polymere av opp til 50 aminosyrerester bundet sammen ved amid(CONH)-bindinger. Analoger, derivater, agonister, antagonister og farmasøytisk akseptable salter av«disse er inkludert i betegnelsene. Betegnelsene inkluderer også peptider og/eller peptidforbindelser som har D-aminosyrer, modifiserte, derivatiserte eller ikke-naturlig forekommende aminosyrer i D- eller L-konfigurasjon og/eller peptidetteriignende enheter som deler av deres struktur.

Betegnelsen "LHRH-beslektet forbindelse" betyr frigjøringshormon for luteiniserende hormon (LHRH) og dets analoger og farmasøytisk akseptable salter. Okta-, nona- og dekapeptid-LHRH-agonister og -antagonister inkluderes i betegnelsen LHRH-beslektede forbindelser, så også nativt LHRH. Særlig foretrukne LHRH-beslektede forbindelser omfatter LHRH, leuprolid, goserelin, nafarelin og andre kjente aktive agonister og antagonister. [1-21]

Betegnelsen "høy konsentrasjon" betyr fra minst 10 %

(vekt/vekt) og opp til maksimal løselighet av den særskilte forbindelse.

Betegnelsen "eksipiens" betyr en mer eller mindre inert substans i en formulering som er tilsatt som et

fortynningsmiddel eller vehikkel, eller for å danne form eller konsistens. Eksipienser holdes atskilt fra løsningsmidler som EtOH, som anvendes for å oppløse medikamenter i formuleringer,

fra ikke-ioniske surfaktanter som Tween 20 , som anvendes for å oppløseliggjøre medikamenter i formuleringer, og fra konserveringsmidler som benzylalkoholer og metyl- eller propylparabener, som anvendes for å forebygge eller inhibere mikrobiell vekst.

Betegnelsen "polart aprotisk løsningsmiddel" betyr et polart løsningsmiddel som ikke inneholder sure hydrogen og ikke virker som en hydrogenbindingsdonor. Eksempler på polare aprotiske løsningsmidler er dimetylsulfoksid (DMSO), dimetylformamid (DMF), heksametylfosfortriamid (HMPT) og n-metylpyrrolidon.

Betegnelsen "ikke-vandig protisk løsningsmiddel" betyr et ikke-vandig løsningsmiddel som inneholder hydrogen bundet til oksygen eller nitrogen slik at det er i stand til å danne hydrogenbindinger eller donere et proton. Eksempler på ikke-vandige protiske løsningsmidler er polyetylenglykoler (PEG), propylenglykol (PG), polyvinylpyrrolidon (PVP) metoksypropylenglykol (MPEG), glyserol og glykofuroi.

B. Fremstilling av formuleringer:

Foreliggende oppfinnelse angår ikke-vandige formuleringer av peptidforbindelser i polart aprotisk løsningsmiddel som er stabile over lang tid ved forhøyede temperaturer. Standard fortynning av vandige peptid- og proteinformuleringer krever manipulering av buffertype, ionestyrke, pH og eksipienser (f.eks. EDTA og askorbinsyre) for å oppnå stabilitet. I motsetning oppnår formuleringene ifølge oppfinnelsen stabilisering av peptidforbindelser ved anvendelse av ikke-vandige protiske løsningsmidler. I særdeleshet er stabilitet ved høye konsentrasjoner (minst ca. 10 vekt %) av forbindelsen frembragt ved formuleringen ifølge oppfinnelsen.

Eksempler på peptider og peptidforbindelser som kan formuleres ifølge foreliggende oppfinnelse inkluderer peptider som har biologisk aktivitet, eller som kan anvendes for å behandle en sykdom eller andre patologiske tilstander. De omfatter, men er ikke begrenset til adrenokortikotropiske hormon, angiotensin I og II, atrialt natriuretisk peptid, bombesin, bradykinin, kalsitonin, cerebellin, dynorfin A, alfa- og beta-endorfin, endotelin, enkefalin, epidermal vekstfaktor, fertirelin, follikulært gonadotropinfrigjørende peptid, galanin, glukagon, gonadorelin, gonadotropin, goserelin, veksthormonfrigjørende peptid, histrelin, insulin, leuprolid, LHRH, motilin, nafarelin, neurotensin, oksytocin, somatostatin, substans P, tumornekrosefaktor, triptorelin og vasopressin. Analoger, derivater, antagonister, agonister og farmasøytisk akseptable salter av de ovenfor nevnte kan også anvendes.

Peptidforbindelsene nyttige i formuleringene og fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse kan anvendes i form av et salt, fortrinnsvis et farmasøytisk akseptabelt salt. Nyttige salter er kjente for fagpersoner innen teknikken og inkluderer salter med uorganiske syrer, organiske syrer, uorganiske baser og organiske baser. Foretrukne salter er acetatsalter.

Peptider og peptidforbindelser som er lett løselige i ikke-vandige protiske løsningsmidler foretrekkes ved anvendelse ifølge oppfinnelsen. En fagperson innen teknikken kan enkelt bestemme hvilke forbindelser som vil være nyttige på bakgrunn av deres løselighet. Dvs. forbindelsen må minst være løselig i det spesielle ikke-vandige protiske løsningsmiddel til en akseptabel mengde, som kan være en farmasøytisk effektiv mengde. Foretrukne løseligheter er minst ca. 10 vekt %. Særskilt foretrukne peptidforbindelser er LHRH-beslektede forbindelser, inkludert leuprolid og leuprolidacetat.

Andelen peptid kan variere avhengig av forbindelsen, tilstanden som skal behandles, løseligheten av forbindelsen, den forventede dose og varigheten av administrering. (Se f.eks. The Pharmacological Basis of Therapeutics, Gilman et al., 7. utgave (1985) og Pharmaceutical Sciences, Remington, 18. utgave (1990), beskrivelsen av disse er inkorporert ved referanse). Konsentrasjonen av peptid i høykonsentrerte formuleringer kan variere fra minst ca. 10 vekt % til maksimal løselighet av forbindelsen. Et foretrukket område er fra ca.

20 til ca. 60 vekt %. Det for tiden mer foretrukne område er fra ca. 30 til ca. 50 vekt %, og det mest foretrukne område er ca. 35 til ca. 45 vekt %.

Det har uventet blitt funnet at å øke konsentrasjonen av peptid oppløst i ikke-vandig polart aprotisk løsningsmiddel kan øke stabiliteten av peptidformuleringen. F.eks., som vist i figur 7, når løsninger av 5, 10, 20 og 40 % leuprolid i DMSO ble lagret i 8 uker ved 80 °C og prøver ble tatt jevnlig og analysert for å bestemme prosent gjenværende leuprolid, var formuleringer inneholdende høyere konsentrasjoner av leuprolid mer stabile enn formuleringer med lavere konsentrasjoner av leuprolid.

Generelt kan de stabile formuleringer ifølge foreliggende oppfinnelse fremstilles ved bare å løse den ønskede mengde, som kan være en terapeutisk effektiv mengde av den ønskede peptidforbindelse i det utvalgte ikke-vandige polare aprotiske løsningsmiddel. Foretrukne polare aprotiske løsningsmidler omfatter DMSO og DMF.

Å øke vanninnholdet i peptidformuleringene ifølge oppfinnelsen øker peptiddegraderingen som vist i figur 8. Det synes som denne økning kan skyldes i hovedsak økende kjemiske degraderingsprodukter, med en aggregering som er relativt konstant (figur 9).

Det er også blitt funnet at ikke-vandige protiske løsningsmidler som PEG, PG og PVP eventuelt kan tilsettes formuleringene ifølge oppfinnelsen.

C. Metodikk:

Det er blitt funnet at stabile ikke-vandige formuleringer av peptidforbindelser kan fremstilles ved å oppløse peptidforbindelsen som skal formuleres i ikke-vandig polar aprotiske løsningsmidler.

Disse formuleringer av peptidforbindelser, i særdeleshet formuleringer av det LHRH-beslektede leuprolid, er blitt undersøkt for stabilitet ved å utsette dem for akselererende aldring ved forhøyet temperatur, og å måle kjemisk og fysisk stabilitet av formuleringene. Resultatene av disse studier (vist f.eks. i tabell II og figurene 1, 2, 4 og 6) viser at disse formuleringer var stabile ved betingelsene

som tilsvarte eller overskred lagring i et år ved 37 °C.

Det er også blitt undersøkt formuleringer av peptidforbindelser fremstilt som beskrevet i dokumentet for stabilitet etter 2,5 megarad gammabestråling. Resultatene i tabell III, viser at disse formuleringer fortsatt er kjemisk og fysisk stabile etter slik bestråling. Formuleringer utsatt for elektronstrålebestråling ble også funnet å være stabile.

Som vist i tabell I, ble en stor variasjon av peptidformuleringer, spesielt leuprolid, goserelin, LHRH, angiotensin 1, bradykinin, kalsitonin, enkefalin, insulin, neurotensin, substans P, trypsinogen og vasopressin undersøkt for stabilitet ved å løse (eller prøve å løse) dem i det ikke-vandige polare aprotiske løsningsmiddel DMSO, deretter utsette dem for akselererende aldring ved forhøyede temperaturer. Stabiliteten av formuleringene ble analysert. Resultatene presenteres i tabell I som halveringstid ved 37 °C med en antatt Ea = 22,2 kcal/mol. Et vidt spekter av testede peptider ble løst i DMSO og forble stabile under forsøksbetingelsene. , Løseligheten av et spesielt peptid i et spesielt ikke-vandig polart aprotisk løsningsmiddel og stabiliteten av den resulterende løsning bestemmes enkelt ved hjelp av rutineprosedyrer kjent for fagpersoner innen teknikken.

Formuleringer av 40 % peptid i DMSO lagret i seks måneder ved 37, 50, 65, og 80 °C viste en ikke-lineær Arrhenius-kinetikk målt ved totalt tap av peptid fra løsningen, som viser stabilitet av disse formuleringer ved forhøyede temperaturer. Analyser av data innsamlet ved5 37 °C ga en t90 på 14,4 måneder, som antyder at stabiliteten ved 37 °C fortsatt er veldig god.

Temperatur synes å påvirke både

degraderingshastigheten og andelen degraderingsprodukter i

formuleringen ifølge oppfinnelsen. Studier av leuprolid-DMSO-formuleringer har vist at ved 65 og 80 °C er oksidering tilsynelatende den hovedsakelige kjemiske degraderingvei. I motsetning, ved 37 og 50 °C er hydrolyse og isomerisering tilsynelatende den dominerende degraderingsvei for disse formuleringer.

Det er også uventet blitt funnet at spesielle peptidformuleringer ifølge oppfinnelsen er bakteriostatiske (dvs. inhiberer bakterievekst), baktericidale (dvs. medfører død av bakterier) og sporicidale (dvs. dreper sporer). I særdeleshet viste leuprolidformuleringer av 50-400 mg/ml bakteriostatisk, baktericidal og sporicidal aktivitet. Stabiliteten av prøvene var upåvirket ved tilsetting av bakterier, hvilket antyder at enzymene frigjort fra de døde og lyserte bakterier ikke påvirker stabiliteten av produktet på en ugunstig måte. Dette viser at disse formuleringer ikke bidro til enzymatisk aktivitet.

Noen peptider, f.eks. kalsitonin og leuprolid er kjent for å være fysisk ustabile, vise aggregering, geldannelse og fibrillering når de formuleres i vandige løsninger. Å forbedre fysisk stabilitet kan øke biotilgjengeligheten, dempe sensitivisering og immunrespons, og legge til rette for enklere parenteral administrering, inkludert administrering ved hjelp av implanterbare medikamentavleveringssystemer.

Det er uventet blitt funnet at særskilte peptider, slik som leuprolid, goserelin og kalsitonin, formulert i ikke-vandige polare aprotiske løsningsmidler ifølge oppfinnelsen ikke danner gel. Mangel på geldannelse ble funnet selv etter 12 måneder ved 37 °C. Dette skyldes tilsynelatende at ikke-vandige polare aprotiske løsningsmidler medfører at peptider danner en tilfeldig spole/alfa-helixkonformasjon som ikke åpnes til en "beta-sheet"-struktur, og derfor ikke danner gel. Derfor har disse løsningsmidler en gelhindrende effekt.

Et viktig aspekt ifølge oppfinnelsen er at ikke-vandige løsninger inneholdende peptidforbindelser i polare aprotiske løsningsmidler er kjemisk og fysisk stabile ved høye temperaturer i lange perioder. Slike formuleringer er stabile selv når det anvendes høye konsentrasjoner. Følgelig er disse formuleringer fordelaktige ved at de kan transporteres og lagres ved temperaturer tilsvarende romtemperatur og høyere i lange perioder. De er også egnet for anvendelse i implanterbare avleveringssystemer.

BESKRIVELSE AV EKSEMPLER IFØLGE OPPFINNELSEN

De følgende fremgangsmåter ble anvendt for å utføre studiene i eksemplene som følger.

1. Fremstilling av leuprolidacetatløsninger

Leuprolidacetat (f.eks. levert fra Mallinckrodt, St. Louis, Missouri) ble innveid og løst ved røring eller sentrifugering i vehikkel (DMSO, DMF, DMSO/PEG, DMSO/PG eller DMSO/PVP) ved passende konsentrasjon. Betegnelsen tørr DMSO betyr DMSO-formuleringer tillaget i omgivelser med lav fuktighet (dvs. tørr N2-atmosfære).

Dersom ikke annet er anvist ble innhold av fri leuprolidbase beregnet fra analysesertifikatets styrkeverdier til å være 37 % fri base. Dette var 40 % leuprolidacetat, bortsett fra som bemerket.

2. Fremstilling av reservoarer

Reservoarene av implanterbare medikamentavleveringssystemer (som beskrevet i US patentsøknad nr. 08/595 761, inkorporert i beskrivelsen ved referanse) ble fylt med passende leuprolidacetatløsning. De fylte anordninger gjennomgikk deretter stabilitetstesting. Formuleringen ble fylt på titan- eller polymerreservoarer med en polymerplugg som tilstopper hver ende. Det fylte reservoar ble deretter pakket i en polyfoliebag og plassert i en

stabilitetstestingsovn.

Det bør bemerkes at formuleringene inne i reservoarene til disse anordninger er fullstendig isolert fra det omgivende miljø.

3. Reversfase- HPLC ( RP- HPLC)

Alle stabilitetsprøver ble analysert for leuprolidkonsentrasjon og % maksimalareal ved hjelp av en gradientelueringsreversfase-HPLC-analyse med en avkjølt automatisk prøvepåsetter (4 °C) for å minimalisere prøvedegradering. De anvendte kromatografiske betingelser er listet nedenfor.

Leuprolidstandarder (i vann) ved 4 til 6 ulike konsentrasjonsnivåer, typisk mellom 0,1 - 1,2 mg/ml, ble analysert sammen med stabilitetsprøvene. Stabilitetsprøvene ble oppstilt sammen med standardsettene, men aldri flere enn 40 prøver mellom standardsettene. Alle topper mellom "void"-volumene og 45 minutter av analysen ble integrert. De integrerte maksimalarealer for leuprolidstandardene ble plottet som en funksjon av konsentrasjonen. Leuprolidkonsentrasjonene for stabilitetsprøvene ble deretter beregnet ved hjelp av lineær regresjon. % maksimalarealene for leuprolidtoppen, summen av alle elueringstoppene før leuprolid (merket "andre"), og summen av alle elueringstoppene etter leuprolid (merket "aggregater") ble<;>også registrert og plottet som en funksjon av prøvetidspunktene.

4. Størrelseseksklusjonskromatografi ( SEC)

Utvalgte stabilitetsprøver ble analysert for % maksimalareal og molekylvekter ved hjelp av en isokratisk løsning SEC-analyse med en nedkjølt automatisk prøvepåsetter (4 °C). De anvendte kromatografiske betingelser er listet nedenfor.

Voidvolumet og totalvolumet for

størrelseseklusjonskolonnen var nødvendig for beregningen av molekylvektene. Bio-Rads høy-molekylvektstandard og 0,1 %

aceton ble anvendt for å bestemme henholdsvis voidvolumet og totalvolumet. Retensjonstidene for første topp i Bio-Rad standarden og acetontoppen ble registrert og konvertert til volumenheter ved hjelp av ligningene nedenfor. Siden disse verdier er konstant for en spesiell SEC-kolonne og HPLC-system, ble voidvolumet og totalvolumet bestemt om igjen når endringer i SEC-kolonnen eller HPLC-systemet ble foretatt. En standardanalyse ble deretter utført etterfulgt av stabilitetsprøvene. Standardblandingen inneholdt ca. 0,2 mg/ml av de følgende peptider: Bursin (MW=449), WLFR-peptid (MW=619), angiotensin (MW=1181), GRF (MW=5108), og cytokrom C (MW=12394). Disse standarder ble valgt fordi de tilsvarer leuprolidmolekylvekten og har et basisk pH (9,8 - 11,0), tilsvarende leuprolid.

% Toppareal ble registrert for alle toppene. Molekylvektene for de separerte forbindelsene ble beregnet ved hjelp av likevektene nedenfor.

Der:

Vs = standard- eller prøvevolum

V0 = voidvolum

Vt = totalvolum

Vs ble beregnet for hver peptidstandardtopp. Kd for hver peptidstandard ble deretter beregnet ved hjelp av verdiene for Vt og V0 bestemt tidligere. Den lineære regresjonslinje fra plottet av logMW versus Kd"<1> ble anvendt for å bestemme molekylvektene for hver topp i stabilitetsprøven. De prosentvise topparealer for stabilitetsprøvene ble også registrert.

5. Instrumentering og materialer

Instrumentering og materialene anvendt ved RP-HPLC og SEC var som følger: Waters Millennium HPLC-system bestående av den automatiske prøvepåsetter 717, pumpe 626, kontrollenhet 6000S, fotodiodeseriedetektor 900 og refraktiv indeksdetektor 414

(Waters Chromatography, Milford, MA)

HPLC-ampuller for 48-posisjoner og 96-posisjoner (Waters

Chromatography, Milford, MA)

HaiSil C18, 120 A, 5 um 4,6 x 250 mm HPLC-kolonne (Higgins Analytical, Mountain View, CA)

Pharmacia-Peptide, HR 10/30 SEC-kolonne (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)

Følgende eksempler gis for å illustrere oppfinnelsen og er ikke ment å være konstruert på en slik måte at det begrenser rammen av oppfinnelsen.

EKSEMPEL 1

Akselererte stabilitetsstudier av leuprolidacetatformuleringer Formuleringer av 40 vekt % leuprolidacetat (ekvivalent med 37 % fri leuprolidbase) i vehikkel ble fremstilt som beskrevet ovenfor og anvendt til å fylle reservoarene av implanterbare medikamentavleveringssystemer, også som beskrevet ovenfor. Noen reservoarer var laget av polymermaterialer, mens andre var titan.

De fylte anordninger ble utsatt for akselerert aldring ved å lagre dem ved forhøyede temperaturer (80 °C) i syv dager i en inkubator (Precision Scientific eller Thelco). Dette er ekvivalent med ca. 1,5 år ved 37 °C eller ca. fire år ved romtemperatur(25 °C) .

Prøvene ble analysert ved hjelp av RP-HPLC og SEC som beskrevet ovenfor for å bestemme den kjemiske og fysiske stabilitet av de lagrede formuleringer.

Resultatene presentert i tabell III viser at disse formuleringer var i stand til å beholde stabiliteten av den

LHRH-beslektede forbindelse leuprolid. I hvert tilfelle var minst 65 % leuprolid bevart.

EKSEMPEL 2

Stabilitetsstudier av bestrålte leuprolidacetatformuleringer

Formuleringer av 40 vekt% leuprolidacetat i DMSO ble tillaget som beskrevet ovenfor og anvendt for å fylle reservoarene av medikamentavleveringssystemer, også som beskrevet ovenfor. Alle reservoarer var laget av titan.

De fylte anordninger ble sendt til Sterigenics (Tustin, Carlifornia) der de ble utsatt for 2,5 megarad gammabestråling ved hjelp av Kobolt 60, 3-nivå "tote box"-bestråling i Sterigenics Tustin Main Cell. I tabell III, ble prøvene merket "kalde" transportert og bestrålt på tørris. Prøvene ble deretter utsatt for akselerert aldring som i eksempel 1. Prøver ble tatt ved dag 0 og dag 7, og analysert ved hjelp av RP-HPLC og SEC som beskrevet ovenfor for å bestemme kjemisk og fysisk stabilitet av de bestrålte formuleringer.

Resultatene presentert i tabell III, viser at disse leuprolidacetatformuleringer var stabile etter bestråling. I hvert tilfelle var minst 65 % leuprolid bevart, med lave nivåer av aggregatdannelse.

EKSEMPEL 3

Akselererte langtidsstabilitetsstudier av

leuprolidacetatformuleringer

Løsninger av 40 vekt% leuprolidacetat i DMSO ble tillaget, fyllt på reservoarer, lagret i to måneder ved 80 °C og analysert som beskrevet ovenfor. Resultatene vist i fig. 1 (RP-HPLC) og 2 (SEC) viser at 81,1 % leuprolid ble gjenvunnet, med bare 14,6 % kjemisk degradering og 5,1 % fysisk aggregering.

Leuprolidacetatløsninger ble tillaget, påsatt, lagret ved 80 °C i seks måneder og analysert som beskrevet ovenfor.

Figur 4 er et plot av leuprolid og dets kjemiske og fysiske degraderingsprodukter gjenvunnet i løpet av seksmåneders tidsperioden, og viser at det kan gjøres opp for alt peptidmateriale som de startet med og at disse formuleringer viste svært god stabilitet ved 80 °C. Summen av disse tre elementer presenteres også som massebalanse. Figur 5 er et plot av den naturlige logaritmen til disse data, som viser at disse formuleringer har en lineær kinetikk over hele det testede temperaturområde.

Den kjemiske stabilitet av 40 %

leuprolidacetatløsninger tillaget og analysert som beskrevet ovenfor presenteres i figur 6. Etter ni måneder ved 37 °C var mer enn 90 % (93,5 %) leuprolid til stede, og at mindre enn 5 % (2,9 %) kjemiske degraderingsprodukter (vist som "tidlig") og mindre enn 5 % (2,3 %) fysiske degraderingsprodukter (vist som "sen" og basert på RP-HPLC-profilen, men i godt samsvar med SEC) er dannet.

Løsninger av 40 vekt% leuprolidacetat i DMSO ble tillaget, påsatt reservoarer, lagret ved 37, 50, 65 eller 80 °C og analysert ved hjelp av RP-HPLC som beskrevet ovenfor. Resultatene ble beregnet som beskrevet i Physical Pharmacy: Physical Chemical Principles in the Pharmaceutical Sciences, 3. utgave, Martin et al., kapittel 14 (1983) og viser at tapet av leuprolid fra DMSO-formuleringer var ikke-lineært. Dataene vises nedenfor og et Arrhenius-plot av dataene presenteres i figur 3.

Siden Arrhenius-plottene av DMSO-formuleringer lagret ved 80 °C viste at tapet av leuprolid var ikke-lineært, ble stabilitetsdataene samlet ved 37 °C anvendt for å beregne en t9o for disse formuleringer på 14,4 måneder ved 37 °C.

EKSEMPEL 4

Stabilitetsstudier av leuprolidacetatformuleringer i DMSO/ vann

Formuleringer av 40 vekt% leuprolidacetat i DMSO, DMSO/vann (95:5, 90:10, 70:30, 50:50 og 30:70) og vann ble tillaget som beskrevet ovenfor og inkubert i syv dager ved 80 °C. Fourier-transformert infrarød spektroskopi (FTIR)-analyser ble utført ved dag 0 og ved dag 7.

Resultatene viser at den strukturelle konformasjon av leuprolid ble svært lite forandret etter denne akselererte aldring for alle de undersøkte formuleringer. Vanligvis var den dominerende peptidstruktur tilfeldig spole eller a-helix i DMSO-formuleringer, mens den dominerende peptidstruktur i vannformuleringer var "p-sheet".

Modifisering av de ovenfor beskrevne metoder for å utføre ulike utførelsesformer av denne oppfinnelse vil være tydelige for fagpersoner innen teknikken etterfulgt av opplæringene ifølge oppfinnelsen som beskrevet i dokumentet. Eksemplene beskrevet ovenfor er ikke begrensende, men er heller eksempler på denne oppfinnelse, der rammen defineres ved de følgende krav.

Claims (21)

1. Stabil ikke-vandig formulering av en peptidforbindelse som er utvalgt fra gruppen som bestående av leuprolid, LHRH, og goserelin, og salter av disse, karakterisert ved at den omfatter: a) minst én peptidforbindelse fra gruppen som er angitt ovenfor og b) minst ett polart aprotisk løsningsmiddel.

2. Formulering ifølge krav 1, karakterisert ved at den omfatter minst ca.

10 vekt % peptidforbindelse.

3. Formulering ifølge krav 1, karakterisert ved at den omfatter minst 30 vekt % peptidforbindelse.

4. Formulering ifølge krav 1, karakterisert ved at den er stabil ved 80°C i minst 2 måneder.

5. Formulering ifølge krav 1, karakterisert ved at den er stabil ved 37°C i minst 3 måneder.

6. Formulering ifølge krav 1, karakterisert ved at den er stabil ved 37°C i minst ett år.

7. Formulering ifølge krav 1, karakterisert ved at den er tilpasset anvendelse i et implanterbart medikamentavleveringssystem.

8. Formulering ifølge krav 1, karakterisert ved at den ytterligere omfatter et ikke-vandig protisk løsningsmiddel.

9. Formulering ifølge krav 1, karakterisert ved at det polare aprotiske løsningsmiddel utvelges fra gruppen bestående av DMSO eller DMF.

10. Formulering ifølge krav 1, karakterisert ved at det polare aprotiske løsningsmiddel frembringer en antigeldannende effekt.

11. Formulering ifølge krav 1, karakterisert ved at den omfatter ca. 30 til ca. 50 vekt% av den LHRH-beslektede forbindelsen leuprolidacetat i DMSO.

12. Formulering ifølge krav 1, karakterisert ved at den består av leuprolid og DMSO i forholdet 370 mg leuprolid i 1 ml DMSO.

13. Formulering ifølge krav 1, karakterisert ved at den er stabil etter bestråling.

14. Fremgangsmåte for fremstilling av stabil ikke-vandig formulering ifølge krav 1, karakterisert ved at den omfatter oppløsning av minst én peptidforbindelse ifølge krav 1 i minst ett polart aprotisk løsningsmiddel.

15. Fremgangsmåte ifølge krav 14, karakterisert ved at minst ca. 10 vekt % peptidforbindelse oppløses.

16. Fremgangsmåte ifølge krav 14, karakterisert ved at minst 30 vekt % peptidforbindelse oppløses.

17. Fremgangsmåte ifølge krav 14, karakterisert ved at peptidforbindelsen er den LHRH-beslektede forbindelsen leuprolidacetat ifølge krav 1.

18. Fremgangsmåte ifølge krav 17, karakterisert ved at peptidforbindelsen er utvalgt fra gruppen bestående av leuprolid, LHRH, og goserelin.

19. Fremgangsmåte ifølge krav 14, karakterisert ved at den ytterligere omfatter trinnet med å tilsette minst ett ikke-vandig protisk løsningsmiddel.

20. Fremgangsmåte ifølge krav 14, karakterisert ved at ca. 30 til ca. 50 vekt% av den LHRH-beslektede forbindelsen leuprolidacetat oppløses i DMSO.

21. Fremgangsmåte ifølge krav 14, karakterisert ved at 370 mg leuprolid oppløses i 1 ml DMSO.