MXPA04008515A - Copulacion de sustancias de bajo peso molecular a un polisacarido modificado. - Google Patents

Abstract

La invencion se refiere a un metodo para acoplar sustancias moleculares inferiores a un polisacarido modificado derivado de almidon. La interaccion de enlace entre el polisacarido modificado y la sustancia molecular inferior se basa en un enlace covalente que es el resultado de una reaccion de acoplamiento entre el grupo aldehido terminal o un grupo funcional de la molecula de polisacarido modificada que procede de este grupo aldehido mediante reaccion quimica y un grupo funcional de la sustancia molecular inferior capaz de reaccionar con este grupo de aldehido o con el grupo funcional de la molecula de polisacarido, siendo que el enlace que resulta directamente durante la reaccion de acoplamiento se puede modificar opcionalmente mediante una reaccion adicional para obtener el enlace covalente precedentemente mencionado. La invencion se refiere ademas a composiciones farmaceuticas las cuales comprenden los conjugados que se forman con el acoplamiento, y el uso de estos conjugados y estas composiciones para el tratamiento profilactico o terapeutico del cuerpo humano o animal.

Description

COPULACION DE SUSTANCIAS DE BAJO PESO MOLECULAR A UN POLISACARIDO MODIFICADO Descripción de la invención Existe un gran número de sustancias de bajo peso molecular de interés comercial, especialmente ingredientes farmacéuticos activos y agentes de protección de cultivos, cuyo uso está limitado o incluso es evitado debido a propiedades de solubilidad insatisfactorias en un medio acuoso y/o a corto tiempo de residencia en el cuerpo. De esta manera, por ejemplo, las moléculas farmacéuticas pequeñas son frecuentemente removidas de la circulación nuevamente en forma demasiado rápida por la filtración glomerular en el riñon (límite de (exclusión de aproximadamente 70 kD) , por lo que un reabastecimiento continuo, lo cual es costoso e inconveniente para el - paciente, con este medicamento es necesario, por ejemplo, por administraciones frecuentemente repetidas o infusión. Para evitar esta desventaja, en algunos casos se administran ingredientes farmacéuticos activos ligeramente solubles como un bolo aceitoso que frecuentemente forma depósitos dolorosos en el sitio de inyección. Además, el uso de estos medicamentos ligeramente solubles está comúnmente asociado con efectos secundarios tóxicos debido a su deposición en órganos tales" como hígado y/o riñon. Esos REF. : 158029 efectos secundarios no deseados a su vez dan como resultado que la escala de concentración que puede emplearse in vivo para el ingrediente activo sea ampliamente restringida. Un enfoque seguido en tiempos recientes para eliminar los problemas descritos consiste en copular estas sustancias problemáticas a polímeros biocompatibles fácilmente solubles tales como, por ejemplo, polietilenglicol y dextrano. Es posible a través de la copulación por un lado incrementar el peso molecular sobre el umbral de 70 kD, de tal manera que el tiempo de residencia en plasma de moléculas más pequeñas pueda incrementarse drásticamente, y por otro lado la solubilidad en el medio acuoso puede ser mejorada por la porción polimérica hidrofílica. La mayoría de las modificaciones hasta la fecha se han llevado a cabo con polietilenglicol o dextrano, prefiriéndose generalmente el PEG debido a que rinde productos más simples. Los conjugados de dextrano comúnmente muestran alta alerginicidad, una baja estabilidad metabólica y, en muchos casos, bajos rendimientos de las reacciones de copulación. Asimismo, han habido reportes de efectos secundarios desagradables o peligrosos tales como prurito, reacciones de hipersensibilidad y pancreatitis en el uso de conjugados de PEG. Además, la actividad biológica de los ingredientes activos es más comúnmente . ampliamente reducida en algunos casos después de la copulación a PEG. Más aún, el metabolismo de los productos de degradación de conjugados de PEG es aún sustancialmente desconocido y representa posiblemente un riesgo para la salud. De esta manera, existe aún la necesidad de alternativas fisiológicamente bien toleradas para dextrano o conjugados de PEG, con los cuales la solubilidad de sustancias de bajo peso molecular deficientemente solubles pueda mejorare y/o el tiempo de residencia de sustancias de bajo peso molecular en el plasma pueda ser incrementado, dando como resultado propiedades farmacodinámicas mejoradas de la molécula activa. Es por lo tanto un objetivo de la invención proporcionar tales alternativas y desarrollar métodos simples y eficientes para preparar estos conjugados alternativos. Se ha encontrado sorprendentemente que este objetivo puede lograrse por conjugados de hidroxialquilalmidon que se caracterizan además porque la interacción de unión entre la molécula de hidroxialquilalmidon y la sustancia de bajo peso molecular se basa en un enlace covalente que es el resultado de una reacción de copulación entre el grupo aldehido terminal, o un grupo funcional derivado de este grupo aldehido mediante reacción química, de la molécula de hidroxialquilalmidon y un grupo funcional, que es capaz de reaccionar con este grupo aldehido o grupo funcional derivado del mismo de la molécula de hidroxialquilalmidon, de la sustancia de bajo peso molecular, en donde el enlace que resulta directamente en la reacción de copulación puede modificarse cuando sea adecuado por una reacción adicional para dar el enlace covalente mencionado arriba. La invención incluye además composiciones farmacéuticas que comprenden estos conjugados, y el uso de estos conjugados y composiciones para el tratamiento profiláctico o terapéutico del cuerpo humano o animal, y métodos para preparar estos conjugados y composiciones. El hidroxialquilalmidón (HAS) empleado de acuerdo con la invención se puede preparar mediante un método conocido, por ejemplo, hidroxialquilación de almidón en la posición C2 y/o Ce de las unidades de anhidroglucosa con óxido de alquileno o 2-cloroalcanol , por ejemplo 2 -cloroetanol (véase, por ejemplo, US 5 218 108 para la hidroxietilación de almidón) , con varias escalas de peso molecular y grados de sustitución deseados. También es posible emplear cualquier preparación que pueda obtenerse comercialmente . La definición del grupo alquilo en "hidroxialquilalmidón" , según se usa en la presente, incluye metilo, etilo, isopropilo y n-propilo, con preferencia particular por etilo. Una ventaja sustancial del hidroxietilalmidón (HES) es que es fácilmente aprobado por las autoridades como expansor de plasma biocompatible y se emplea clínicamente a gran escala. El peso molecular promedio del hidroxialquilalmidón puede estar en la escala de aproximadamente 3 kD a varios millones de daltons, de preferencia alrededor de 10 kD a aproximadamente 200 kD, muy preferiblemente en la escala de alrededor de 70 kD a aproximadamente 1000 kD, en forma particularmente preferible alrededor de 130 kD . Para incrementar el tiempo de residencia de la sustancia de bajo peso molecular en el organismo, el peso molecular promedio del hidroxialquilalmidón se selecciona de preferencia de tal manera que el umbral glomerular de 70 kD sea excedido con los conjugados. El grado de sustitución (relación del número de unidades de anhidroglucosa modificadas al números de unidades de anhidroglucosa en total) puede igualmente variar y frecuentemente estará en la escala de aproximadamente 0.2 a 0.8, de preferencia alrededor de 0.3 a 0.7, muy preferiblemente alrededor de 0.5. (Nota: los números se refieren al "grado de sustitución", el cual es de entre 0 y 1) . La relación de sustitución de C2 a C6 normalmente está en la escala de 4 a 16, de preferencia en la escala de 8 a 12. Estos parámetros pueden ajustarse mediante métodos conocidos. La experiencia con el uso de hidroxietilalmidón como sustituto de sangre ha mostrado que el tiempo de residencia de HES en el plasma depende del peso molecular y el grado de sustitución y tipo de sustitución (sustitución en C2 o sustitución en C6) , con un peso molecular más alto, un grado de sustitución más alto y una mayor proporción de sustitución en C2 incrementando el tiempo de residencia. Estas relaciones también aplican a los conjugados inventivos de hidroxialquilalmidón y sustancias de bajo peso molecular, por lo que el tiempo de residencia de un conjugado particular en el plasma puede ajustarse mediante la proporción de polisacáridos . Como ya se mencionó, el grupo funcional incluido en la reacción de copulación de la molécula de hidroxialquilalmidón es el grupo aldehido terminal o una funcional derivada del mismo mediante reacción química. Un ejemplo de esta reacción química es la oxidación selectiva de este grupo aldehido con un agente oxidante adecuado tal como, por ejemplo, yodo, bromo o algunos iones metálicos, o cualquiera por medio de oxidación electroquímica a un grupo carboxilo o grupo carboxilo activado, por ejemplo, un éster, lactona, amida, con el grupo carboxilo siendo convertido cuando sea adecuado en una segunda reacción en el derivado reactivo. Este grupo carboxilo o grupo carboxilo activado puede ser después copulado a un grupo amino o tiol primario de la sustancia de bajo peso molecular para formar un enlace de amida o enlace de tioéster. Una posibilidad adicional es copular a una función hidroxilo de la sustancia de bajo peso molecular para formar un éster. Sin embargo, un conjugado de la invención puede también obtenerse al hacer reaccionar la sustancia de bajo peso molecular con una molécula enlazadora bifuncional fisiológicamente tolerada y adecuada para introducir un grupo funcional deseado. El grupo reactivo restante de la molécula enlazadora copulada es asimismo con el propósito de la presente invención considerado como un "grupo funcional reactivo de la sustancia de bajo peso molecular" . Las moléculas enlazadoras adecuadas comprenden en un extremo un grupo capaz de entrar en un enlace covalente con un grupo funcional reactivo de la sustancia de bajo peso molecular, por ejemplo, un grupo amino, tiol, carboxilo o hidroxi, y en el otro extremo un grupo igualmente capaz de entrar en un enlace covalente con el grupo aldehido terminal o un grupo funcional derivado del mismo mediante reacción química, por ejemplo, un grupo carboxilo, grupo carboxilo activado, grupo amino o tiol. Entre los dos grupos funcionales de la molécula enlazadora está una molécula de enlace biocompatible de longitud adecuada, por ejemplo, un grupo derivado de un alcano, un (oligo) alquilenglicol u otro grupo de oligómero adecuado. Los grupos que se prefieren y capaces de reaccionar con grupos amino son, por ejemplo, ésteres de N-hidroxisuccinimida, esteres de sulfo-N-hidroxisuccinimida , ésteres imido u otros grupos carboxilo activados; los grupos que se prefieren y capaces de reaccionar con grupos tiol son, por ejemplo, grupos maleimida y carboxilo; los grupos que se prefieren y capaces de reaccionar con grupos aldehido o carboxilo son, por ejemplo, grupos amino o tiol. Ejemplos de moléculas enlazadoras para conectar las funciones SH y NH son: AMAS (éster de N-a (maleimidoacetoxi) succinimida) BMPS (éster de ?-ß (maleimidopropiloxi) succiminida) GMBS (éster de ?-? (maleimidobutiriloxi) succiminida) EMCS (éster de ?-e (maleimidocapropiloxi ) succinimida) MBS (éster de (m- (maleimidobenzoil ) -N-hidroxisuccinimida) SMCC (4- (N-maleimidometil) ciclohexan-1-carboxilato de succinimidilo) SMPB (4- (p-maleimidofenil) butirato de succinimidilo) SPDP (3- (2 -piridilditio) ropionato de succinimidilo) Sulfo-GMBS (éster de N-? (maleimidobutiriloxi) sulfosuccinimida) Sulfo-EMCS (éster de N-e (maleimidocaproiloxi) sulfosuccinimida) . Ejemplos de moléculas enlazadoras para conectar funciones SH y SH son: BMB (1, 4-bis-maleimidobutano) BMDB (1, 4-bis-maleimido-2 , 3-dihidroxibutano) BMH (bis-maleimidohexano) BMOE (bis-maleimidoetano) DT E (ditio-bis-maleimidoetano) HBVS (1, 6-hexan-bis-vinilsulfona) BM (PEO) 3 (1, 8-bis-maleimidotrietilenglicol) BM(PEO)4 (1,11-bis-maleimidotetraetilenglicol ) Ejemplos de moléculas enlazadoras para conectar funciones NH y NH son: BSOCOES (bis- (2-succinimidiloxicarboniloxi) etil) suflona BS3 (suberato de bis- (sulfosuccinimidilo) DFDNB (1 , 5-difluoro-2 , 4 -nitrobenceno) DMA (adipimidato de dimetilo, HCl) ) DSG (glutarato de disuccinimidilo) DSS (suberato de disuccinimidilo) EGS (bis (succinimidilsuccinato de etilenglicol ) . Ejemplos de moléculas enlazadoras para conectar funciones SH y CHO son: BMPH (N- (ácido ß-maleimidopropiónico) hidrazida TFA) EMCA (N- (ácido e-maleimidocaproico) hidrazida) KMUH (N- (ácido ?-maleimidoundecanoico) hidrazida) M2C2H (4- (N-maleimidoraetil) ciclohexan- 1 -carboxil -hidrazida HC1) MPBH (hidrazida de ácido 4-(4-N-maleimidofenil) utírico, HCl) PDPH (3 - (2 -pirridiltio) propionilhidrazida) . Un ejemplo de una molécula enlazadora para conectar funciones SH y OH es: PMI (N- (p-maleimidofenil ) isocianato) . Ejemplos de moléculas enlazadoras para convertir una función SH en una función COOH son B PA (ácido ?-ß-maleimidopropionico) EMCA (ácido ?-ß-maleimidocaproico) K UH (ácido N-K-maleimidoundecanoico) . Ejemplos de moléculas enlazadoras para convertir una función NH en una función COOH son MSA (adipato de metil-N-succinimidilo) u homólogos de cadena más larga del mismo o derivados correspondientes de etilenglicol . Ejemplos de moléculas enlazadoras para convertir una función COOH en una función NH son DAB (1, 4 -diaminobutano) u homólogos de cadena más larga del mismo o derivados correspondientes de etilenglicol. Un ejemplo de una molécula enlazadora que reacciona con un grupo amino de una molécula y proporciona un grupo amino protegido a una distancia más larga de esta molécula para evitar el impedimento estérico es TFCS (éster de N-e (trifluoro-acetilcaproiloxi) succinimida) . Moléculas enlazadoras adecuadas adicionales se conocen por los expertos en la técnica y están disponibles comercialmente o se pueden diseñar según se requiera y dependiendo de los grupos funcionales presentes y deseados en el HAS y la sustancias de peso molecular más bajo que serán copuladas, y ser preparadas mediante métodos conocidos. En un método de preparación que se prefiere particularmente, el grupo aldehido terminal de HAS es oxidado selectivamente con un exceso molar de yodo, de preferencia en una relación molar de yodo a HAS de 2:1 a 20:1, en forma particularmente preferible alrededor de 5:1 a 6:1, en solución básica acuosa. En el método optimizado descrito en el ejemplo 1, inicialmente una cantidad de hidroxialquilalmidón se disuelve en agua destilada caliente, y se añade poco menos de una mol equivalente de solución de yodo acuosa, de preferencia a una concentración de alrededor de 0.05-0.5 N, particularmente preferible de alrededor de 0.1N. Después de esto, una solución acuosa de NaOH a una concentración molar que es aproximadamente 5-15 veces, de preferencia alrededor de 10 veces, la de la solución de yodo se añade lentamente por goteo, a intervalos de varios minutos, a la solución de reacción hasta que la solución comience a volverse transparente nuevamente después de la adición. Poco menos que un equivalente molar de la solución de yodo acuosa anterior se añade de nuevo a la solución de reacción, la adición por goteo de la solución de NaOH se resume, y la adición de yodo y NaOH se repiten hasta que se haya añadido una solución de yodo de aproximadamente 5.5-6 equivalentes molares y una solución de NaOH de 11-12 equivalentes molares, con base en el hidroxialquilalmidón . La reacción se detiene después, la solución de reacción de desalifica, por ejemplo, mediante diálisis o ultrafiltración, se somete a una cromatografía de intercambio catiónico y el producto de reacción se obtiene mediante liofilización. En este método, rendimientos virtualmente cuantitativos se logran sin importar el peso molecular del HAS. En una modalidad particularmente preferida y adicional, la oxidación selectiva tiene lugar con soluciones estabilizadas alcalinas de iones metálicos, por ejemplo Cu++ o Ag+, asimismo en rendimientos aproximadamente cuantitativos (ejemplo 2) . Se prefiere en este caso emplear un exceso molar del agente oxidante de aproximadamente 3-10 veces. El hidroxialquilalmidón selectivamente oxidado que se ha formado es hecho reaccionar posteriormente en un solvente orgánico adecuado con un grupo amino primario de la sustancia de bajo peso molecular deseada para formar un enlace de amida. Los solventes que se prefieren han sido seleccionados del grupo de solventes no próticos polares, y se ha usado en forma particularmente preferible sulfóxido de dimetilo (DMSO) . En contraste con los métodos convencionales descritos en la literatura para reacciones de copulación similares, en este caso se ha encontrado sorprendentemente que el uso de activadores de otra manera obligatorios tales como carbodiimidas y triazoles es innecesario. La copulación de hidroxietilalmidón oxidado selectivamente (ox-HES) a varios compuestos modelo (véase ejemplos) procedió suavemente incluso en ausencia de un activador. Sin embargo, las reacciones de copulación tienen lugar preferiblemente en presencia de una carbodiimida, muy preferiblemente en presencia de DCC (diciclohexildicarbodiimida) , más preferiblemente en presencia de EDC (1- (3-dimetil-aminopropil) -3-etilcarbodiimida) . El grupo reactivo de la molécula de hidroxialquilalmidón también puede ser un grupo amina o tiol producido mediante la reacción química del grupo aldehido terminal. Por ejemplo, una aminación reductora del grupo aldehido puede llevarse a cabo mediante reacción con amoniaco en presencia de hidrógeno y un catalizador o en presencia de cianoborohidruro de sodio. El grupo amina o tiol resultante puede reaccionar después con un grupo carboxilo o grupo aldehido libre de la sustancia de bajo peso molecular. Los resultados iniciales en este caso son enlaces de amida o tioéster o bases de Schiff, los cuales pueden modificarse cuando sea adecuado mediante una reacción adicional . Una posibilidad adicional es que el grupo aldehido terminal de la molécula de hidroxialquilalmidón o un grupo funcional derivado de la misma mediante reacción química también se haga reaccionar con una molécula enlazadora bifuncional fisiológicamente tolerada y adecuada. En este caso, el "grupo funcional derivado del grupo aldehido terminal de la molécula de hidroxialquilalmidón mediante reacción química" para la reacción de copulación es el grupo funcional reactivo restante de la molécula enlazadora bifuncional con el cual el grupo aldehido terminal o el grupo funcional derivado de la misma ha sido hecho reaccionar. Es posible de esta manera convertir igualmente el grupo aldehido terminal en un grupo funcional deseado. Las moléculas enlazadoras adecuadas comprenden en un extremo un grupo capaz de entrar en un enlace covalente con el grupo aldehido terminal o un grupo funcional derivado del mismo mediante reacción química, por ejemplo, un grupo carboxilo, grupo carboxilo activado, grupo amino o tiol, y en el otro extremo un grupo que sea capaz de entrar en un enlace covalente con un grupo funcional reactivo de la sustancia de bajo peso molecular, por ejemplo, un grupo amino, tiol, carboxilo u OH, de preferencia un grupo arilo-OH. Entre los dos grupos funcionales de la molécula enlazadora está una molécula de puenteo biocompatible de longitud adecuada, por ejemplo, un grupo derivado de un alcano, un grupo (oligo) alquilenglicol u otro grupo oligomérico adecuado. Los grupos que se prefieren y capaces de reaccionar con grupos amino son, por ejemplo, ásteres de N-hidroxisuccinimida, esteres de sulfo-N-hidroxisuccinimida , esteres imido u otros grupos carboxilo activados; los grupos preferidos capaces de reaccionar con grupos tiol son, por ejemplo, grupos maleimida y carboxilo; los grupos preferidos capaces de reaccionar con grupos aldehido o carboxilo son, por ejemplo, grupos amino; o tiol . Un número de ejemplos específicos y no restrictivos de moléculas enlazadoras adecuadas ya se han indicado arriba con referencia a la conjugación de moléculas enlazadoras a sustancias de bajo peso molecular. En un método de copulación alternativo de la presente invención, el grupo aldehido terminal del hidroxialquilalmidón (HAS) se hace reaccionar directamente con un grupo amino primario de la sustancia de bajo peso molecular o de una molécula enlazadora copulada a esta sustancia, para formar una base de Shiff. La base de Shiff formada es, posteriormente o en paralelo a lo mismo, reducida a la amina mediante reacción con un agente reductor adecuado, dando como resultado un enlace que es estable en medio acuoso entre la sustancia de bajo pesó molecular y HAS.

Los agentes reductores que se prefieren son borohidruro de sodio, cianoborohidruro de sodio, complejos de boro orgánicos, por ejemplo, un complejo de 4- (dimetilamino) piridina-boro, complejo de N-etil-diisopropilamina-boro, complejo de N-etilmorfolina-boro, complejo de N-metilmorfolina-boro , complejo de N-fenil-morfolina-boro, complejo de lutidina-boro, complejo de trietilamina-boro, complejo de trimetilamina-boro ; los agentes reductores estereoselectivos adecuados son, por ejemplo, borohidruro de triacetato de sodio, trietilborohidruro de sodio, trimetoxiborohidruro de sodio, tri -sec-butilborohidruro de potasio (K-Selectride) , tri-sec-butilborohidruro de sodio (N-Selectride) , tri-sec-butilborohidruro de litio (L-Selectride) , triamilborohidruro de potasio (KS-Selectride) y triamilborohidruro de litio (LS-selectride) . La reacción de copulación de HAS o HAS oxidado a una sustancia de bajo peso molecular es, debido a que se espera que la solubilidad en agua de la sustancia sea deficiente y que la estabilidad de la lactona en medio acuoso sea baja, llevada a cabo de preferencia en un solvente orgánico, muy preferiblemente en un solvente no prótico y polar en el cual el HAS y de preferencia también la sustancia de bajo peso molecular sea soluble. Ejemplos de solventes adecuados para HAS son DMSO, glicol, diglicol, triglicol y N-me ilpirrolidon . También es posible emplear mezclas de DMSO con otros solventes si la sustancia de bajo peso molecular es insoluble en DMSO u otro solvente preferido para HAS. La reacción puede, sin embargo, también llevarse a cabo algunas veces en forma adecuada en una fase heterogénea. La relación molar de HAS a sustancia de bajo peso molecular en la reacción de copulación es normalmente de alrededor de 20:1 a 1:1, de preferencia alrededor de 5:1 a 1:1. Los rendimientos de copulación con base en la sustancia de bajo peso molecular normalmente son de más de 40%, frecuentemente más de 60% y no poco comúnmente más del 80% (véanse ejemplos). La sustancia de bajo peso molecular que será copulada es de preferencia un ingrediente farmacéutico activo cuya solubilidad en medio acuoso y/o cuya biodisponibilidad, estabilidad y tiempo de residencia en el cuerpo van a ser incrementados. El término "sustancia de bajo peso molecular" intenta incluir también péptidos de hasta aproximadamente 50 aminoácidos. El ingrediente farmacéutico activo se selecciona de preferencia del grupo que consiste en antibióticos, antidepresivos, antidiabéticos, antidiuréticos, anticolinérgicos , antiarrítmicos, antieméticos, antitusivos, antipilépticos , antihistamínicos , antimicóticos, antisimpatotónicos , antitrombóticos , andrógenos, an iandrógenos , estrógenos, antiestrógenos , antiosteoporoticos , agentes antitumorales , vasodilatadores, otros agentes antihipertensivos , agentes antipiréticos, analgésicos, agentes antiinflamatorios, ß-bloqueadores , inmunosupresores y vitaminas. Algunos ejemplos no restrictivos de ingredientes farmacéuticos activos que tienen un grupo NH2 como socio en la reacción de copulación con HAS son: albuterol, alendronato, amikazin, ampicilina, amoxicilina, anfotericina B, atenolol, azatioprina, cefaclor, cefadroxilo, cefotaxima, ceftazidima, ceftriaxona, cilastatina, cimetidina, ciprofloxacino, clonidina, colistina, cosintropina, cicloserina, daunorrubicina , doxorrubicina, desmopresina , dihidroergotamina, dobutamina, dopamina, efedrina, epinefrina, ácido e-aminocaproico , ergometrina, esmolol, famotidina, flecainida, ácido fólico, flucitosina, furosemida, ganciclovir, gentamicina, glucagón, hidrazalina, imipenem, isoproterenol , ketamina, liotironina, LHRH, merpatricina, metaraminol, metildopa, metoclopramida , metoprolol, mexiletina, mitomicina, neomicina, netilmicina, nimodipina, nistatina, octreotida, oxitocina, pamidronato, pentamidina, fentolamina, fenilefrina, procainamida, procaína, propranolol, ritodrina, sotalol, teicoplanina, terbutalina, tiamina, tiludronato, tolazolina, trimetoprima, trometamina, vancomicina, vasopresina y vinblastina.

Ejemplos preferidos de ingredientes farmacéuticos activos que tienen un grupo H2 como pareja en la reacción de copulación con HAS son ácido 6-aminopenicílico, 7-aminocefalosporina, ácido 7 -aminocefalosporánico y ácido 7-aminopenicilánico . Ejemplos específicos de los derivados activos que tienen un grupo COOH como socio para la reacción de copulación con HAS son: acetilcisteína , azlocilina, aztreonam, bencilpenicilina, camptotecina, cefamandol, cefazolina, cefepima, cefotaxima, cefotetan, cefoxitina, ceftazidima, ceftriaxona, cefalotina, cilastatina, ciprofloxacino , ácido clavulánico, dicloxacilina, ácido e-aminocaproico, floxacilina, ácido folínico, furosemida, ácido fusídico, imipemem, indometacina, ketorolaco, liotironina, melfalan, metildopa, piperacilina, prostaciclina, prostaglandinas, teicoplanina, ticarcilina y vancomicina. Ejemplos específicos de los ingredientes activos que tienen un grupo arilo-OH como socio en la reacción de copulación con HAS son: albuterol, alopurinol , apomorfina, ceftriaxona, dobutamina, dopamina, doxiciclina, edrofonio, isoproterenol , liotironina, metaraminol, metildopa, minociclina, pentazocina, fenilefrina, fentolamina, propofol, rifamicinas, ritodrina, teicoplanina, terbutalina, tetraciclina y vancomicina. Ejemplos específicos de los ingredientes activos que tienen un grupo OH alifático como socio en la reacción de copulación con HAS son Taxol y palcitaxel. Los productos de reacción de la copulación química descrita arriba pueden investigarse mediante métodos conocidos, y la eficiencia de copulación puede establecerse. Por ejemplo, una gráfica de calibración UV para la sustancia de bajo peso molecular relevante puede construirse y usarse para determinar el contenido de sustancia de bajo peso molecular en la muestra o la proporción de sustancia de bajo peso molecular en el producto de copulación. Si la sustancia de bajo peso molecular no muestra absorción de UV, métodos de detección por colorimetría o electroquímicos adecuados se pueden desarrollar en analogía a métodos conocidos. El contenido de sacáridos en el conjugado puede detectarse por ejemplo mediante tinción específica de glucanas de los productos de reacción fraccionados. La determinación de glucanas cuantitativa también es posible. El rendimiento de copulación de las reacciones que incluyen aminas primarias también puede establecerse mediante la derivación de las aminas no reaccionadas con fluorescamina y la determinación de la fluorescencia. La solubilidad mejorada en agua también puede verificarse fácilmente en el caso de materiales de partida ligeramente solubles mediante pruebas de disolución. En el caso de la copulación con ingredientes farmacéuticos activos parcialmente hidrosolubles , la hidrofilicidad incrementada puede determinarse por medio de un método OECD para medir el valor logP. Éste correlaciona el tiempo de retención de sustancias en RP-HPLC con el coeficiente de división en una mezcla de n-octanol/agua . Todos los conjugados de HES de la invención investigados mediante este método eluyeron en el volumen de contención de una columna C18, y de esta manera no mostraron interacciones con el material de C18. Los conjugados de la presente invención pueden cuando sea adecuado emplearse como tales o en forma de una composición farmacéutica para el tratamiento profiláctico o terapéutico del cuerpo humano o animal . Las composiciones de este tipo incluyen una cantidad farmacéuticamente efectiva de un conjugado de la invención como ingrediente activo, y un vehículo farmacéuticamente adecuado y, cuando sea adecuado, otros ingredientes o excipientes terapéuticos o farmacéuticos. Los excipientes pueden incluir por ejemplo diluyentes, reguladores de pH, saborizantes , aglutinantes, agentes tensioactivos , espesantes, lubricantes, conservadores (incluyendo antioxidantes) y sustancias que sirvan para hacer la formulación isotónica con la sangre del receptor deseado. Una cantidad farmacéuticamente efectiva es la cantidad suficiente para desplegar después de una administración individual o múltiple un efecto benéfico deseado durante un tratamiento para aliviar o curar o prevenir una condición patológica. Un vehículo farmacéuticamente aceptable es un vehículo que es compatible tanto con el ingrediente farmacéutico activo como con el cuerpo del paciente. La forma de la composición variará dependiendo de la ruta de administración deseada o adecuada. Las rutas de administración adecuadas pueden ser por ejemplo oral, parenteral, por ejemplo subcutánea, intramuscular, intravenosa, intraarterial , intraarticular, intratecal, inyección extradural o, cuando sea adecuado, infusión, administración intranasal, intratraqueal , rectal o tópica. Las composiciones farmacéuticas se pueden suministrar benéficamente en forma de una unidad de dosis y se pueden producir mediante cualquier método bien conocido en el sector farmacéutico . Los conjugados de HAS de la presente invención también se pueden emplear en todos los demás sectores en los cuales se hayan usado otros conjugados poliméricos, por ejemplo, conjugados de PEG. Algunos ejemplos específicos y no restrictivos son el uso de un conjugado de HAS como reactivo inmovilizado para una reacción en fase heterogénea o como material de columna para cromatografía de afinidad. Usos posibles y adicionales serán claramente evidentes para el experto en la técnica con el conocimiento de las propiedades descritas en la presente de los conjugados de HAS de la invención . Los siguientes ejemplos están diseñados para explicar la invención a más detalle, sin embargo, restringirla a los mismos. En particular, reacciones análogas también pueden llevarse a cabo con hidroximetilalmidón e hidroxipropilalmidón, y resultados similares pueden lograrse. Ejemplo 1 Oxidación selectiva de hidroxietilalmidon (HES) con yodo Diez gramos de HES-130 kD fueron disueltos en 12 mi de agua desionizada por calentamiento en un matraz de fondo redondo. Se añadieron a esta solución 2 mi de una solución de I2 (0.1 N) . Una pipeta con 2 mi de NaOH 1.0N fue conectada al matraz por medio de un conector de 2 vías, y la solución de NaOH se añadió por goteo a aproximadamente una gota cada cuatro minutos. La solución se decoloró después de la adición de aproximadamente 0.2 mi de la solución de NaOH y, en este tiempo, una segunda porción de 2 mi de solución de yodo 0.1N fue añadida. La reacción se completó después de la adición de un total de 14 mi de solución de yodo y 2.8 mi de solución de NaOH. La mezcla de reacción se dializó después contra agua desionizada . Lactonización: La solución parcialmente desalificada se sometió a una cromatografía en una columna de intercambio catiónico (Amberlite IR-120, forma H+) para convertir así los grupos aldonato en grupos de ácido aldónico. Posteriormente, el agua se removió mediante liofilización, y de esta manera se obtuvo la forma de lactona. Determinación del grado de oxidación: Un mililitro de reactivo de cobre alcalino (3.5 g de Na2P04/ 4.0 g de tartrato de K Na en 50 mi de H20, más 10 mi de NaOH 1N, 8.0 mi de solución de CuS04 al 10% de concentración (peso/volumen) y 0.089 g de yodato de K en 10 mi de H20, después de la adición de 18 g de sulfato de Na, constituyen hasta 100 mi) se pipetean en 1 mi de solución de muestra en cada caso bajo una atmósfera de N2. La mezcla se calienta a 100°C durante 45 minutos. Después de enfriar, se añaden 0.2 mi de solución de KI al 2.5% deconcentración y 0.15 mi de H2S04 2M. Después de cinco minutos se añade una gota de solución indicadora de rojo fenol (1% peso/volumen) , y la titulación se lleva a cabo con solución de Na2SO203 5 mM hasta que el color desaparezca. La concentración de grupos aldehido no reaccionados puede calcularse a partir del consumo de titulador. Se logró un rendimiento aproximadamente cuantitativo (> 98%) . Es posible mediante este procedimiento oxidar hidroxietilalmidones con peso molecular más alto (por ejemplo, 130 kD, 250 kD, 400 kD) al igual que hidroxietilalmidones con peso molecular más bajo (por ejemplo 10 kD, 25 kD, 40 kD) , en rendimientos similarmente altos.

Ejemplo 2 Oxidación selectiva de HES con iones de Cu2* Una solución de 0.24 mmoles de HES- 130 kD se preparó en 10 mi de agua desionizada con calentamiento. Esta solución se calentó en un matraz de fondo redondo de 100 mi hasta una temperatura de 70-80°C, y se añadieron 1.17 mmoles de Cu2+ estabilizado (por ejemplo sal de ochelle como estabilizador u otros estabilizadores) y solución de NaOH acuosa diluida (concentración final de NaOH 0.1N) . La temperatura se elevó después a 100°C y la reacción se dejó, proceder hasta que hubiera aparecido un color rojizo. La reacción se detuvo y la mezcla de reacción se enfrió a 4°C. El precipitado rojizo se removió mediante filtración. El filtrado se dializó contra agua desionizada y después se convirtió en la lactona como en el ejemplo 1. La oxidación tuvo lugar cuantitativamente (rendimiento > 99%) . También fue posible mediante este método oxidar HES de bajo peso molecular (por ejemplo, HES-10 kD, HES-25 kD, HES-40 kD) y especies de HES de peso molecular más alto (por ejemplo 130 kD, 250 kD, 400 kD) . Ejemplo 3 Copulación de hidroxietilalmidón selectivamente oxidado (ox- HES) a alendronato Cinco miligramos de alendronato (un bisfosfonato) y un exceso molar de 3-5 veces de ox-HES lactona (preparada como se describió en el ejemplo 1 ó 2) fueron disueltos en 4-5 mi de DMSO en un matraz de fondo redondo de 100 mi. La suspensión se calentó a 70°C y se dejó durante 24-36 horas con agitación moderada (agitador magnético) . La reacción se detuvo después y la mezcla de reacción se enfrió a la temperatura ambiente. Posteriormente se añadieron 20-30 mi de agua, y esta solución se dializó contra agua destilada. En lugar de la diálisis también es posible emplear una ultrafiltración con un límite de exclusión adecuado de la membrana. Esto hace posible no sólo intercambiar el solvente sino también concentrar la solución, la cual se liofili.za subsecuentemente. El éxito de la copulación es demostrado por medio de métodos analíticos estándares, por ejemplo, cromatografía de permeación en gel y prueba de ninhidrina para grupos amino libres. El rendimiento de producto de copulación fue de aproximadamente 85% para la copulación con ox-HES-130 kD y. alrededor de 80% para la copulación con ox-HES-10 kD. Ej emplo 4 Copulación de HES selectivamente oxidado (ox-HES) a anfotericina B Doce gramos de lactona ox-HES-130 kD seca se disolvieron en 30 mi de DMSO seco en una atmósfera de N2. La solución se calentó a 70°C y se añadieron 52 mg de anfotericina B. La reacción se dejó con exclusión de luz bajo estas condiciones durante 24 horas. Una copulación exitosa se demostró mediante cromatografía de permeación en gel con detección fotométrica a 385 nm ( aa* de anfotericina) . Después de la conclusión de la reacción, ésta fue detenida al añadir 80 mi de agua destilada y dializada intensamente contra agua. La liofilización dio un producto de copulación amarillo pálido. (Rendimiento de alrededor de 87%). Bajo condiciones comparables, se logró un rendimiento de aproximadamente 75% en la copulación de ox-HES-10 kD lactona con anfotericina B. Ejemplo 5 Copulación de ox-HES a ampicilina Uno punto tres gramos de lactona ox-HES- 130 kD seca se disolvieron en 5 mi de DMSO seco en un matraz de fondo redondo de 100 mi. Esta solución se calentó a 45°C y se añadieron 11.0 mg de ampicilina (Aldrich # 27.186-1). La reacción tuvo lugar con agitación moderada durante 20 horas y se detuvo después de este tiempo al añadir 25 mi de agua destilada. La mezcla de reacción se dializó contra agua destilada y luego se liofilizó. El éxito de la copulación fue demostrado al analizar el producto con GPC y determinar los grupos amino libres en la ampicilina usando ninhidrina. Ejemplo 6 Copulación de ox-HES a neomicina Tres x 10~5 moles de lactona ox-HES-25 kD fueron disueltos en 5 mi de N-metilpirrolidona en un recipiente de reacción de 50 mi a 60°C con agitación magnética. La adición de 10 mg de neomicina en 2 mi de DMSO seco fue seguida por ebullición bajo reflujo durante aproximadamente 10 horas. Después de enfriar a la temperatura ambiente, la reacción se detuvo al añadir 35 mi adicionales de agua. Gran parte del solvente se removió mediante diálisis, y el producto de copulación se liofilizó después. Fue posible demostrar el producto de copulación en un rendimiento de aproximadamente 82% mediante GPC con detección UV. Ejemplo 7 Copulación de ox-HES a mepartricina Se requirieron 10 mi de etilenglicol para disolver completamente 2.5 g de ox-HES- 130 kD lactona y 22 mg de mepartricina (obtenible de Societá Prodotti Antibiotici, Milán, Italia) con calentamiento. El solvente se había desgasificado y secado previamente. La solución de reacción se agitó con exclusión de luz bajo una atmósfera de gas inerte durante 36 horas, y la reacción se detuvo finalmente al introducir 40 mi de agua helada. El etilenglicol se removió mediante ultrafiltración (membrana de 10 kD) , y la liofilización posterior produjo 2.1 g de un polvo amarillento claro. Una purificación adicional tuvo lugar mediante RP-HPLC en una columna C18 con detección UV/VIS.

Ejemplo 8 Copulación de ox-HES a nistatina Dos y medio gramos de ox-HES-130 kD lactona seca se disolvieron en 10 mi de DMSO seco en un matraz de fondo redondo de 100 mi. La adición de 9.5 mg de nistatina fue seguida por calentamiento a 60°C y agitación en la oscuridad bajo una atmósfera de gas inerte. La reacción tuvo lugar con agitación moderada durante 48 horas y se detuvo después de este tiempo añadiendo 50 mi de agua destilada. La mezcla de reacción se dializó contra agua destilada y luego se liofilizó. Una copulación exitosa fue demostrable por RP-HLPC (columna C18) y detección a 325 nm. El rendimiento estimado de la absorción del pico de producto fue de aproximadamente 67%. Ejemplo 9 Copulación de ox-HES a mitomicina C Dos y medio gramos de ox-HES-130 kD lactona y 20 g de mitomicina (Fluka # 69824) fueron disueltos en 10 mi de una mezcla 9:1 de DMSO:MeOH a 60°C. La solución de reacción se mantuvo bajo reflujo durante 24 horas y luego se añadieron 40 mi de agua para detener la reacción. Esta solución se dializó contra agua desionizada durante la noche y luego se sometió a secado por congelación. La copulación fue demostrada mediante RP-HPLC y detección a 320 nm. El producto de copulación esperado dio como resultado un rendimiento de 82%.

Ejemplo 10 Copulación, de ox-HES a damiorrubicina Uno punto tres gramos de ox-HES- 130 kD lactona fueron disueltos en 10 mi de N-metilpirrolidona con agitación a 70°C. Se añadieron por goteo a la misma 17 mg de daunorrubicina (Fluka #30450), disueltos en 3 mi de D F. La mezcla de reacción se agitó bajo estas condiciones durante 20 horas, se enfrió a la temperatura ambiente y finalmente se agitó con 40 mi de agua destilada. La mayoría del solvente fue removida mediante diálisis contra agua, seguido por secado por congelación. La daunorrubicina copulada se demostró mediante RP-HPLC y detección UV-VIS. Ejemplo 11 Copulación de ox-HES a 7-aminocefalosporina Tres gramos de ox-HES-130 kD lactona y 20 mg de 7-aminocefalosporina (Fluka #07300) se disolvieron en 5 mi de MDSO seco en un matraz de fondo redondo de 100 mi con agitación magnética. La temperatura se elevó a 50°c y se mantuvo durante 15 minutos. Después de este tiempo, la mezcla de reacción se enfrió a 25°C y se diluyó al añadir 5 mi de agua destilada. DMSO y 7-amino-cefalosporina no reaccionados fueron removidos mediante diálisis contra agua destilada. La solución se lofilizó después y el producto se analizó mediante TLC y GPC.

Ejemplo 12 Copulación de ox-HES a ácido 6-aminopenicílico La reacción descrita en el ejemplo 11 también se llevó a cabo con 16 mg de ácido 6-aminopenicílico en lugar de 7-aminocefalosporina bajo las mismas condiciones, y el producto de reacción se trató y analizó bajo las mismas condiciones. Ejemplo 13 Copulación de ox-HES a LHRH Un gramo de ox-HES-130 kD lactona seca se incubaron con 5 mg de LHRH (hormona liberadora de hormona luteinizante) (Bachem, Suiza) en 10 mi de DMSO seco. La reacción procedió mientras se agitaba a 45°C durante 15 horas y se detuvo al añadir 40 mi de agua. LHRH hesilada fue obtenida mediante liofilización después de que había sido extensamente dializada contra agua para remover así la mayoría del DMSO y péptido no reaccionado. El producto resultante fue analizado mediante GPC (Superóse 12, Amersham- Pharmacia, Suecia) y detección UV a 280 nm. Una estequiometría de alrededor de 1:1 para el producto de copulación emergió de la cuantificación del péptido sobre la base de la absorción de Trp y la cuantificación del contenido de polisacáridos mediante coloración con fenol/ácido sulfúrico. Ejemplo 14 Copulación de ox-HES a camptotecina Veinte miligramos de camptotecina fueron disueltos en 5 mi de DMSO seco a 50°C en un matraz de fondo redondo. A esta solución se le añadieron por goteo 36 mg de 1,4-diaminobutano en 2 mi de DMSO seco. La mezcla de reacción se dejó agitar suavemente bajo estas condiciones durante 24 horas. El producto de conjugación se purificó mediante cromatografía por vaporización. El rendimiento fue de alrededor de 83%. Para la reacción de copulación de la camptotecina modificada con ox-HES-130 kD, la mezcla de reacción completa se disolvió después de la purificación junto con 3.6 g de la lactona polisacárida en 8 mi de DMSO seco mediante agitación y calentamiento a 50°C. El progreso de la reacción fue seguido mediante RP-HPLC de las muestras de la mezcla de reacción. Después de 20 horas a 50°C no fue observable formación de producto adicional, y la reacción se detuvo al añadir 50 mi de agua destilada. Después de la diálisis contra agua, el producto de copulación fue secado por congelación. El análisis tuvo lugar mediante GPC y tinción del grupo amino libre en la camptotecina modificada y no reaccionada con ninhidrina sobre una placa de TLC. Ejemplo 15 Copulación de ox-HES a prostaciclina a) Funcionalización amino Prostaciclina (352 mg) (Sigma-Aldrich) fueron disueltos en 5 mi de DMF seca con cloruro de metileno al 2% (V/V) a 0°C. Se añadieron a la misma 1.3 g de diciclohexilcarbodiimida (DCC) en 5 mi de D F seca. La reacción se dejó tener lugar mientras se agitaba suavemente durante 30 minutos. Después se añadió un exceso molar de 5 veces (con base en la prostaciclina) de éter 1.5-diaminoetílico( y la solución se calentó lentamente a la temperatura ambiente. El producto de copulación amino-funeionalizado se purificó mediante cromatografía por vaporización sobre una fase de sílice. b) Hesilación Doscientos veinte miligramos del producto de copulación purificado de a) fueron disueltos en 8 mi de glicol a temperatura ambiente. Cuatro gramos de ox-HES-130 kD lactona, disueltos en 10 mi de glicol, se mezclaron con agitación y se calentaron a 45°C. Después de un tiempo de reacción de 8 horas, la mezcla se enfrió en un baño de hielo y se dializó intensamente contra agua. La solución transparente se investigó mediante RP-HPLC en una columna C18. Fue posible calcular la eficiencia de copulación a partir de la relación de las áreas en el volumen de retención de la columna (producto de copulación) y la sustancia inicial. El rendimiento fue de 53%. Ejemplo 16 Copulación de HES a alendronato Un exceso molar de diez veces de HES-25 kD se añadió a una solución de 2.25 mg de alendronato en 4 mi de regulador de pH de fosfato (0.1M, pH 7.5) en un matraz de fondo redondo de 100 mi. La mezcla de reacción se agitó para disolver así el polisacárido completamente, y luego se añadió un exceso molar de treinta veces de NaBH3CN. La reacción procedió a temperatura ambiente durante 48 horas, la producción de un producto de copulación siendo detectada en una alícuota mediante reacción con fluorescamina, la cual produce un producto fluorescente con grupos amino libres. Ejemplo 17 Copulación de HES a amoxilina Se introdujeron 4.0 mi de regulador de pH de fosfato de sodio 0.1N (pH 7.5) en un matraz de dos cuellos, y 1.5 g de HES-40 kD fueron disueltos en la misma al calentar a 60°C. Luego de enfriar a 25°C, se añadieron con agitación magnética 7.0 mg de amoxilina (Fluka #10039). Una solución de NaBH3CN que correspondía a un exceso molar de treinta veces se preparó en 2 mi del mismo regulador de pH de fosfato de sodio en un recipiente separado. La solución de cianoborohidruro se añadió lentamente por goteo, usando un embudo de goteo, a la primera solución durante un período de 30 minutos. La mezcla de reacción se agitó durante 24-36 horas adicionales y luego el pH se ajustó a 4 con HCl 0.1N para detener la reacción. La solución se desalificó mediante diálisis y se liofilizó. La demostración del producto de copulación tuvo lugar mediante GPC y fotómetro UV. Ejemplo 18 Copulación de HES a cefaclor Se usaron 4 mi de regulador de pH de fosfato de sodio 0.1N (pH 7.0) para disolver 110 mg de NaBH3CN en un matraz de fondo redondo de 100 mi. Se añadieron mientras se agitaba 6.0 x 10"5 moles de HES-130 kD y 2.0 x 10"5 moles de cefaclor (Fluka #22125) . La temperatura de reacción se mantuvo a 25°C, y la mezcla de reacción se agitó moderadamente durante 24 horas. La solución se acidificó después a pH 4.0 y se agitó durante 30 minutos más. La desalificación y concentración se llevaron a cabo mediante ultrafiltración (membrana de 10 kD) . El producto de copulación fue demostrado mediante HP-GPC a 265 nm. Ejemplo 19 Copulación de HES a doxorrubicina Seis miligramos de doxorrubicina (Fluka #45584) fueron suspendidos en 4 mi de regulador de pH de fosfato de sodio 0.1N (pH 7.5) en presencia de un exceso molar de tres veces HES-130 kD a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se agitó vigorosamente durante 30 minutos, y se añadieron lentamente 3 mi de una solución de NaBH3CN 0.8M. La reacción se mantuvo a temperatura ambiente con agitación durante 48 horas. Después se usó una membrana de 10 kD para la diafiltración para de esta manera remover sales y doxorrubicina no reaccionada. La solución diafiltrada se liofilizó y el producto de copulación se investigó mediante GPC y RP-HPLC. Ejemplo 20 Copulación de HES a vasopresina HES-130 kD (1.25 g) se disolvió en 5 mi de regulador de pH de fosfato de sodio 0.1M, pH 8.0, con calentamiento y agitación suave en un matraz de fondo redondo equipado con un embudo de goteo. Se añadieron a esta solución 5 mg de vasopresina (Bachem, Suiza) . Treinta miligramos de NaBH3CN fueron disueltos en 2 mi de regulador de pH de fosfato 0.1M (pH 7.5) y añadidos lentamente por goteo a través del embudo de goteo a la mezcla de reacción. La reacción se dejó reposar a 25°C durante aproximadamente 24 horas. Para concluir la reacción, el pH se redujo 4.0 al añadir HCl 0.1N. Después de una extensa diálisis contra agua, el producto hesilado fue secado por congelación. El análisis tuvo lugar mediante GPC como se describió arriba y detección UV a 220 nm. Ejemplo 21 Copulación de ox-HES 70 kD a neomicina Neomicina (1.01 mg) (sal sulfato) y 126.21 mg de oxHES 70 kD fueron disueltos en 2 mi de DIVISO en un matraz de dos cuellos bajo una atmósfera de argón y, después de la adición de 0.81 mg de DMAP, calentados a 70 °C durante 24 horas. La reacción se detuvo después al añadir acetona, después de lo cual el producto de copulación se precipitó. El sólido se disolvió en agua y se purificó mediante diálisis contra agua durante 48 horas. El secado por congelación dio como resultado 80 mg de producto de copulación blanco (63%) . Ejemplo 22 Método alternativo para copular ox-HES 70 kD a neomicina La copulación de neomicina a ox-HES 70 kD puede llevarse a cabo igualmente de manera exitosa a temperatura ambiente en DMSO con adición de EDC como activador. Para este propósito, 16.97 mg de neomicina (sal sulfato), 348 mg de ox-HES 70 kD y 2.28 mg de DMAP fueron disueltos en 1 mi de DMSO. Después de la adición de 3.83 mg de DCC (1 equivalente), la solución fue agitada durante dos horas y la adición de un equivalente de DCC fue repetida. Este proceso se repite hasta que 10 equivalentes de DCC hayan sido añadidos a la solución de reacción. El tiempo de reacción totalizó 24 horas. Después de la adición de 20 mi de acetona a la solución, el producto de copulación se precipitó. El sólido se disolvió en agua y se purificó mediante diálisis contra agua durante 48 horas. El secado por congelación dio como resultado 280 mg de producto de copulación blanco (80%) . Ejemplo 23 Copulación de ox-HES 70 kD a daunorrubicina Clorhidrato de daunorrubicina (0.5 mg) , 829.2 mg de ox-HES 70 kD y 0.108 mg de DMAP fueron disueltos en 2 mi de DMSO bajo una atmósfera de argón en un matraz de dos cuellos, y calentados a 70 °C durante 24 horas. Después se les añadió acetona (20 mi) , luego de lo cual el producto de copulación se precipitó. La solución se centrifugó y el precipitado se lavó con acetona y se centrifugó varias veces. Se obtuvo un sólido color rosa claro, se disolvió en agua y se dializó contra agua. El secado por congelación resulta en 656 mg (80%) de un sólido color rosa claro. La pureza de la daunorrubicina copulada se verificó mediante RP-HPLC. Ejemplo 24 Copulación de ox-HES 130 kD a ácido 7 -aminocefalosporánico Trescientos ochenta y tres miligramos de ox-HES-130 kD y 1.22 mg de ácido 7-aminocefalosporánico (Fluka #07300) fueron disueltos en 2 mi de DMSO seco en un matraz de fondo redondo de 100 mi con agitación magnética. La temperatura se elevó a 70°C y se mantuvo durante 24 horas. Después de este tiempo, la mezcla se enfrió a 25°C y el producto de reacción se precipitó al añadir 20 mi de acetona. La solución se lavó con 20 mi de acetona y se disolvió en 20 mi de agua destilada. La purificación adicional del producto de copulación tuvo lugar mediante diálisis contra agua destilada. La solución se liofilizó después y el producto se analizó mediante TLC y GPC . Se obtuvieron 270 mg de producto de copulación (70%) en forma de un sólido blanco.

Ejemplo 25 Copulación de ox-HES 70 kD a ácido 6 -aminopenicilánico La reacción descrita en el ejemplo d también se llevó a cabo con 1.57 mg de ácido 6-aminopenicilánico en lugar de ácido 7-aminocefalosporánico y 135.54 mg de ox-HES 70 kD bajo las mismas condiciones. El producto de reacción se trató y analizó bajo las mismas condiciones. Después de la purificación, 88 mg de producto de copulación (65%) se obtuvieron como sólido blanco. Ejemplo 26 Copulación de HAS 40 kD a amoxicilina Cuatro mililitros de un regulador de pH de fosfato de sodio 0.1N (pH 7.5) se introdujeron en un matraz de dos cuellos, y 1.5 de HES-40 kD fueron disueltos en el mismo al calentar a 60°C. Después de enfriar a 25°C, se añadieron con agitación magnética 0.6 de amoxicilina (Fluka #10039). Una solución de NaBHsN que correspondía a un exceso molar de 30 veces se preparó en 2 mi del mismo regulador de pH de fosfato de sodio en un recipiente separado. La solución de cianoborohidruro se añadió lentamente por goteo con un embudo de goteo a la primera solución durante un periodo de 30 minutos. La mezcla de reacción se agitó durante 46 horas adicionales, y luego el pH se ajustó a 4 con HCl 0.1N para detener la reacción. La solución se desalificó mediante diálisis y se liofilizó. La demostración del producto de copulación tuvo lugar mediante GPC y fotómetro UV. Ejemplo 27 Copulación de ox-HES 70 kD a amoxicilina Ciento setenta y tres miligramos de ox-HES 70 kD y 0.85 g de amoxicilina fueron disueltos en 2 mi de DMSO seco en un matraz de fondo redondo de 100 mi con agitación magnética. La temperatura se elevó a 70°C y se mantuvo durante 24 horas. Después de este tiempo, la mezcla se enfrió a 25°C y el producto de reacción se precipitó al añadir 20 mi de acetona. El sólido se lavó con 20 mi de acetona y se disolvió en 20 mi de agua destilada. La purificación adicional del producto de copulación tuvo lugar mediante diálisis contra agua destilada. La solución se liofilizó después, y el producto se analizó mediante TLC y GPC. Se obtienen 151 mg de producto de copulación (87%) en forma de "un sólido blanco. Ejemplo 28 Copulación de ox-HES 70 kD a cefadroxilo Seiscientos diez miligramos de ox-HES 70 kD y 2.965 mg de cefadroxilo se disolvieron en 2 mi de DMSO seco en un matraz de fondo redondo de 100 mi con agitación magnética. La temperatura se elevó a 70°C y se mantuvo durante 24 horas. Después de este tiempo, la mezcla se enfrió a 25°C y el producto de reacción se precipitó al añadir 20 mi de actona. El sólido se lavó con 20 mi dé acetona y se disolvió en 20 mi de agua destilada. La purificación adicional del producto de copulación tuvo lugar mediante diálisis contra agua destilada. La solución se liofilizó después, y el producto se analizó mediante TLC y GPC. Se obtienen 490 mg de producto de copulación (87%) en forma de un sólido blanco. Ejemplo 29 Copulación de ox-HES 70 kD a glucagón Glucagón (66 x 10~9 moles, 0.23 mg) , oxHES 70 kD (6.6 x 10"6 moles, 123 mg) se disuelven en 1 mi de DMSO en un matraz de fondo redondo. A intervalos de una hora, se añade DDC en ocho porciones a intervalos de una hora hasta que un total de 23.08 mg hayan sido añadidos a la solución de reacción. Luego de un tiempo de reacción de 24 horas, la reacción se detiene al añadir 15 mi de agua. El producto de copulación se purificó mediante diálisis contra agua. El secado por congelación da como resultado 79 mg de producto de copulación blanco (65%) . Se hace constar que con relación a esta fecha el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (36)

1. REIVINDICACIONES
2. Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un conjugado de hidroxialquilalmidón y una sustancia de bajo peso molecular, caracterizado además porque la interacción de unión entre la molécula de hidroxialquilalmidón y la sustancia de bajo peso molecular se basa en un enlace covalente que es el resultado de una reacción de copulación entre (i) el grupo aldehido terminal, o un grupo funcional derivado de este grupo aldehido mediante reacción química, de la molécula de hidroxialquilalmidón y (ii) un grupo funcional, que es capaz de reaccionar con este grupo aldehido o grupo funcional derivado del mismo de la molécula de hidroxialquilalmidón, de la sustancia de bajo peso molecular, en donde el enlace que resulta directamente en la reacción de copulación puede modificarse cuando sea adecuado por una reacción adicional para dar el enlace covalente mencionado arriba. 2. El conjugado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque el grupo funcional derivado del grupo aldehido terminal de la molécula de hidroxialquilalmidón es uno de los grupos funcionales de una molécula enlazadora bifuncional con el cual el grupo aldehido terminal o un grupo funcional derivado de la misma ha sido hecho reaccionar.
3. 3. El conjugado de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado además porque el grupo funcional reactivo de la sustancia de bajo peso molecular es uno de los grupos funcionales de una molécula enlazadora bifuncional que ha sido copulado a la sustancia de bajo peso molecular.
4. 4. El conjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado además porque el enlace covalente es el resultado de una reacción de copulación entre un grupo carboxilo formado por la oxidación selectiva del grupo aldehido terminal de la molécula de hidroxialquilalmidón, o grupo carboxilo activado, y un grupo amino primario o grupo tiol de la sustancia de bajo peso molecular.
5. 5. El conjugado de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque el enlace covalente es un enlace de amida que es el resultado de una reacción de copulación entre una lactona formada por oxidación selectiva del grupo aldehido terminal de la molécula de hidroxialquilalmidón, y un grupo amino primario de la sustancia de bajo peso molecular.
6. 6. El conjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado además porque el enlace covalente es un enlace de amina que es el resultado de una reacción de copulación entre el grupo aldehido terminal de la molécula de. hidroxialquilalmidón, y un grupo amino primario de la sustancia de bajo peso molecular para formar una base de Schiff, y la reducción de la base de Schiff a la amina.
7. 7. El conjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado además porque la molécula de hidroxialquilalmidón tiene un peso molecular en la escala de alrededor de 70 a aproximadamente 1000 kD.
8. 8. El conjugado de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque la molécula de hidroxialquilalmidón tiene un peso molecular de aproximadamente 130 kD.
9. 9. El conjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado además porque la molécula de hidroxialquilalmidón tiene un grado de sustitución de aproximadamente 0.3 a aproximadamente 0.7.
10. 10. El conjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado además porque la molécula de hidroxialquilalmidón tiene una relación de sustitución de C2 a C6 de 8 a 12.
11. 11. El conjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado además porque la molécula de hidroxialquilalmidón es una molécula de hidroxietilalmidón .
12. 12. El conjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado además porque la sustancia de bajo peso molecular es un ingrediente farmacéutico activo.
13. 13. El conjugado de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque el ingrediente farmacéutico activo se selecciona del grupo que consiste en antibióticos, antidepresivos, antidiabéticos, antidiuréticos, anticolinérgicos , antiarrítmicos, antieméticos, antipilépticos , antihistamínicos , antimicóticos , antisimpatotónicos , antitrombóticos, andrógenos, an iandrógenos , estrógenos, antiestrógenos , antiosteoporóticos , agentes antitumorales , vasodilatadores, otros agentes antihipertensivos , agentes antipiréticos, analgésicos, agentes antiinflamatorios, ß-bloqueadores, inmunosupresores y vitaminas.
14. 14. El conjugado de conformidad con la reivindicación 12 ó 13, caracterizado además porque el grupo funcional del ingrediente farmacéutico activo incluido en la reacción de copulación es un grupo amino.
15. 15. El conjugado de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque el ingrediente farmacéutico activo se selecciona del grupo que consiste en albuterol, alendronato, amikazin, aminopenicilina, amoxicilina, atenolol, azatioprina, cefaclor, cefadroxilo, cefotaxima, ceftazidima, ceftriaxona, cilastatina, cimetidina, ciprofloxacino, clonidina, colistina, cosintropina , cicloserina, daunorrubicina, doxorrubicina, desmopresina, dihidroergotamina, dobutamina, dopamina, efedrina, epinefrina, ácido e-aminocaproico, ergometrina, esmolol, famotidina, flecainida, ácido fólico, flucitosina, furosemida, ganciclovir, gentamicina, glucagón, hidrazalina, imipenem, isoproterenol , ketamina, liotironina, LHRH, merpatricina, metaraminol , metildopa, metoclopramida, metoprolol , mexiletina, mitomicina, neomicina, netilmicina, nimodipina, nistatina, octreotida, oxitocina, pamidronato, pentamidina, fentolamina, fenilefrina, procainamida, procaina, propranolol , ritodrina, sotalol, teicoplanina, terbutalina, tiamina, tiludronato, tolazolina, trimetoprima, trometamina, vancomicina, vasopresina y vinblastina.
16. 16. El conjugado de conformidad con la reivindicación 12 ó 13, caracterizado además porque el grupo funcional del ingrediente farmacéutico activo incluido en la reacción de copulación es un grupo carboxilo o grupo carboxilo activado.
17. 17. El conjugado de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque el ingrediente farmacéutico activo se selecciona del grupo que consiste en acetilcisteína, azlocilina, aztreonam, bencilpenicilina, camptotecina, cefamandol, cefazolina, cefepima, cefotaxima, cefotetan, cefoxitina, ceftazidima, ceftriaxona, cefalotina, cilastatina, ciprofloxacino, ácido clavulánico, dicloxacilina, ácido e-aminocaproico, floxacilina, ácido folínico, furosemida, ácido fusídico, imipemem, indometacina, ketorolaco, liotironina, melfalan, metildopa, piperacilina, prostaciclina, prostaglandinas , teicoplanina, ticarcilina y vancomicina .
18. 18. El conjugado de conformidad con la reivindicación 12 ó 13, caracterizado además porque el grupo funcional del ingrediente farmacéutico activo incluido en la reacción de copulación es un grupo alifático o arilo-OH.
19. 19. El conjugado de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque el ingrediente farmacéutico activo se selecciona del grupo que consiste en albuterol, alopurinol, apomorfina, ceftriáxona, dobutamina, dopamina, doxiciclina, edrofonio, isoproterenol , liotironina, metaraminol, metildopa, minociclina, paclitaxel, pentazocina, fenilefrina, fentolamina, propofol, rifamicinas, ritodrina, Taxol, teicoplanina, terbutalina, tetraciclina y vancomicina.
20. 20. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende una cantidad efectiva del conjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 19 y un vehículo farmacéuticamente aceptable y, cuando es adecuado, excipientes e ingredientes activos adicionales.
21. 21. Uso del de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 19 o de la composición de conformidad con la reivindicación 20, en el tratamiento terapéutico o preventivo de humanos o animales.
22. 22. Un método para preparar el conjugado de hidroxialquilalmidón de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, caracterizado además porque se lleva a cabo una reacción de copulación entre el grupo aldehido terminal, o un grupo funcional derivado de este grupo aldehido mediante reacción química, de la molécula de hidroxialquilalmidón y un grupo funcional, capaz de reaccionar con este grupo aldehido o grupo funcional derivado del mismo de la molécula de hidroxialquilalmidón, de la sustancia de bajo peso molecular, y en donde la unión que resulta directamente en la reacción de copulación es modificada cuando es adecuado por una reacción adicional.
23. 23. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque el grupo aldehido terminal de la molécula de hidroxialquilalmidón se convierte mediante oxidación selectiva en el grupo lactona correspondiente, y éste último es hecho reaccionar posteriormente con un grupo amino primario de la sustancia de bajo peso molecular para que la molécula de hidroxialquilalmidón sea enlazada a la sustancia de bajo peso molecular por un enlace de amida.
24. 24. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado además porque la oxidación selectiva del grupo aldehido se lleva a cabo con yodo o iones metálicos en solución acuosa básica.
25. 25. El método de conformidad con la reivindicación 23 ó 24, caracterizado además porque la reacción de copulación se lleva a cabo en presencia de carbodiimida, de preferencia 1- (3-dimetilaminopropil) -3 -etilcarbodiimida (EDC) .
26. 26. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 22 a 25, caracterizado además porque la reacción de copulación se lleva a cabo en fase heterogénea.
27. 27. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 22 a 25, caracterizado además porque la reacción de copulación se lleva a cabo en fase homogénea en DMSO o N-metilpirrolidona o glicol.
28. 28. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23 ó 24, caracterizado además porque la reacción de copulación se lleva a cabo en DMSO o N-metilpirrolidona o glicol en ausencia de un activador.
29. 29. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque el grupo aldehido terminal de la molécula de hidroxialquilalmidon es copulado a un grupo amino primario de la sustancia de bajo peso molecular para formar una base de Schiff, y la base de Schiff que se ha formado se reduce a la amina, para que la molécula de hidroxialquilalmidón sea enlazada por un enlace de amina a la sustancia de bajo peso molecular.
30. 30. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado además porque el agente reductor es borohidruro de sodio, cianoborohidruro de sodio o un complejo de boro orgánico .
31. 31. Un método para preparar hidroxialquilalmidón que es oxidado selectivamente en el grupo aldehido terminal, caracter zado además porque el hidroxialquilalmidón se hace reaccionar en una relación molar de yodo a HAS de 2:1 a 20:1 en solución acuosa básica.
32. 32. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado además porque la relación molar de yodo a HAS es de aproximadamente 5:1 a 6:1.
33. 33. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado además porque a) una cantidad de hidroxialquilalmidón se disuelve en agua destilada caliente, y poco menos que un equivalente molar de solución de yodo acuosa se añade, b) solución de NaOH a una concentración molar que es aproximadamente 5-15 veces la de la solución de yodo se añade lentamente por goteo a intervalos de una pluralidad de minutos a la solución de reacción hasta que la solución empiece a volverse transparente de nuevo después de la adición, c) nuevamente poco menos que un equivalente molar de solución de yodo acuosa se añade a la solución de reacción, d) la adición por goteo de la solución de NaOH se resume , e) se repiten las etapas b) a d) hasta que aproximadamente 5.5-6 equivalentes molares de solución de yodo y 11-12 equivalentes molares de solución de NaOH, con base en el hidroxialquilalmidón, hayan sido añadidos, f) la reacción se detiene después y la solución de reacción es desalificada y sometida a una cromatografía de intercambio catiónico, y el producto de reacción se obtiene mediante liofilización .
34. 34. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado además porque la solución de yodo acuosa es una solución de yodo de aproximadamente 0.05-0.5N.
35. 35. El método de conformidad con la reivindicación 33 ó 34, caracterizado además porque la concentración molar de la solución de NaOH es aproximadamente 10 veces la de la solución de yodo.
36. 36. Un método para preparar hidroxialquilalmidón que es oxidado selectivamente en el grupo aldehido terminal, caracterizado además porque el HAS se oxida en solución alcalina acuosa con un exceso molar de iones metálicos estabilizados seleccionados de iones de Cu2* y Ag+ .