NUEVAS COMPOSICIONES DE PROTEINA ESTIMULADORA DE ERITROPOYETINA QUÍMICAMENTE MODIFICADAS Y MÉTODOS PARA SU
PREPARACIÓN
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La nueva proteina estimuladora de eritropoyetina
(NPEE) es un análogo de eritropoyetina hiperglucosilado que tiene cinco cambios en la secuencia de aminoácidos de la rHuEPO " (e itropoyetina humana recombinante) , que proporcionan dos cadenas de carbohidrato adicionales. Más específicamente, la NPEE contiene dos cadenas de carbohidrato N-ligadas adicionales en los residuos de aminoácido 30 y 88 (numeración correspondiente a la secuencia de la EPO humana) (véase la Solicitud Internacional de Patente PCT No. US94/02957, la cual se incorpora en la presente en su totalidad como referencia) .
La NPEE es bioquímicamente distinta de la EPO, tiene una vida media sérica más prolongada y una mayor actividad biológica in vivo; Egrie et al . , ASH 97, Blood, 90: 56a
(1997) . Se ha demostrado que la NPEE presenta un incremento de ~3 veces la vida media sérica en ratones, ratas, perros y seres humanos; Id. En ratones, la vida media sérica más prolongada y la actividad in vi vo más alta permiten una dosificación menos frecuente (sólo una vez a la semana o una vez cada tercer semana) , en comparación con la rHuEPO, para obtener la misma respuesta biológica; Id. REF: 142596
Un estudio farmacocinético demostró que, de manera concordante con estudios en animales, la NPEE tiene una vida media sérica significativamente más prolongada que la rHuEPO en pacientes con insuficiencia renal crónica, lo cual sugiere que también se puede emplear una dosificación menos frecuente en seres humanos; MacDougall, et al . , J. American Society of Nephrology, 8: 268A (1997). Un esquema de dosificación menos frecuente seria más conveniente tanto para los médicos como para los pacientes y seria particularmente útil para aquellos pacientes que practican la autoadministración. Otras ventajas de la dosificación menos frecuentes pueden incluir la introducción de una cantidad menor de fármaco en los pacientes, una reducción de la naturaleza o gravedad de los pocos efectos secundarios observados con la administració-n de la rHuEPO y un mayor cumplimiento por el paciente. Aunque la extendida vida media de NPEE ofrece la ventaja de una dosificación menos frecuente con relación a la EPO, todavía hay indicaciones potenciales, tales como la quimioterapia, que podrían requerir una vida media terapéutica incluso más prolongada que lo que la NPEE actualmente demuestra. Un enfoque común utilizado con frecuencia para extender la vida media de proteínas in vi vo, es la conjugación química de un polimero hidrosoluble, tal como
el polietilenglicol (PEG), con la proteina de interés. Generalmente, las moléculas de polietilenglicol se conectan a la proteina a través de un grupo reactivo encontrado en la proteina. Grupos amino, tales como los encontrados en residuos lisina o en el extremo N-terminal, son convenientes para tal unión. Se ha utilizado una variedad de enfoques para unir las moléculas de polietilenglicol con proteínas
(PEGilación) . Por ejemplo, Royer (Patente Norteamericana No. US 4,002,531) establece que la alquilación reductiva se utilizó para unir moléculas de polietilenglicol con una enzima. Davis et al . , (Patente Norteamericana No. US 4,179,337) describe conjugado de PEG:proteina que incluyen, por ejemplo, enzimas e insulina. Shaw (Patente Norteamericana No. US 4,904,584) describe la modificación del número de residuos lisina en las proteínas para la unión de moléculas de polietilenglicol, a través de grupos amino reactivos. Hakimi et al . , (Patente Norteamericana No. US 5,834,594) describe conjugados PEGrproteina hidrosolubles substancialmente no inmunogénicos, que incluyen por ejemplo, las proteínas IL-2, interferón-alfa e IL-lra. Los métodos de Hakimi et al . , incluyen el uso de ligadores únicos para conectar con el PEG los diversos grupos amino libres en la proteina. Kinstler et al . , (Patentes Norteamericanas Nos. US 5,824,784 y 5,985,265)
enseñan métodos que permiten la modificación química selectiva de proteínas modificadas en el extremo N-terminal y análogos de las mismas, incluyendo el G-CSF y el interferón- consensual. De manera importante, estas proteínas modificadas tienen ventajas que se relacionan con la estabilidad de la proteina, asi como proporcionan ventajas en el procesamiento. Los enfoques de PEGilación, tales como los anteriormente descritos, tradicionalmente se aplican a proteínas no glucosiladas derivadas de sistemas de expresión en bacterias, con el fin de mejorar la solubilidad y la vida media en circulación in vivo (tales proteínas típicamente son conferidas a proteínas glucosiladas (glucoproteinas) a través de las porciones carbohidrato agregadas en el transcurso de la expresión en células eucarióticas) . Los efectos de la PEGilación en la vida media in vivo de proteínas no glucosiladas, se piensa que generalmente se deriva de las propiedades fisico quimicas y dinámicas del PEG, que le confieren un volumen hidrodinámico más grande y una mayor masa total al conjugado, reduciendo de esta manera la velocidad de depuración renal. Algunos beneficios adicionales típicamente incluyen una mayor solubilidad y una menor inmunogenicidad del conjugado. Sin embargo, no todas las proteínas responden de igual manera a la PEGilación y no
hay garantía de lograr un mejor rendimiento. La presente invención se basa en el hallazgo sorprendente de que una proteina altamente glucosilada, e.g., la NPEE, puede ser PEGilada para obtener una composición farmacéutica con un perfil de duración incluso más drásticamente sostenido que la NPEE, permitiendo una dosificación de una vez cada 4-6 semanas para elevar el hematocrito y tratar la anemia y, de esta manera, proporciona una enorme ventaja terapéutica. SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a la preparación substancialmente homogénea de NPEE químicamente modificada (o análogos de la misma) y a los métodos relacionados. La presente invención además se refiere a una preparación substancialmente homogénea de NPEE químicamente modificada en el extremo N-terminal (o análogos de la misma) . La presente invención además se refiere a una preparación de NPEE químicamente modificada, representada como una población mixta isoformas posicionales onosubstituidas o formas polisubstituidas . BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 ilustra la estrategia de diseño para la PEGilación de NPEE: (A) el tamaño del polimero PEG varia entre 5 kD, 20 kD y 30 kD; (B) la conformación del
polimero PEG puede ser lineal o ramificada, con pesos moleculares totales de 10 kD, 20 kD ó 40 kD; y (C) se pueden aislar preparaciones de conjugados PEG: NPEE con diferentes grados de substitución, para incluir: NPEE mono-PEG, di-PEG o, en algunos casos, tri-PEG. La Figura 2 ilustra las diversas quimicas de reacción para la PEGilación de la NPEE: (A) alquilación reductiva de' la NPEE con PEG-aldehido; acilación de la NPEE con N-succinimidil éster de PEG; y (C) PEGilación de las cadenas laterales de polisacárido de NPEE mediante una oxidación limitada con peryodato del carbohidrato, en donde el aldehido resultante reacciona con PEG-hidrazida para formar un enlace hidrazona, seguido por una reducción con cianoborohidruro de sodio para estabilizar el enlace. La Figura 3 es una gráfica que ilustra datos de la actividad in vivo de diversos conjugados de 5 kD poli-PEG:NPEE vs . NPEE no modificada (ß) . Las muestras -A-, -?-, -•- y -^- son mezclas de 5 --kD poli-PEG:NPEE con grados progresivamente menores de substitución. El signo % de incorporación de fierro se gráfica vs . los ng/ml administrados . La Figura 4 es una gráfica que ilustra la prolongación de la elevada concentración de hemoglobina
(HGB) en respuesta al tratamiento con diversos conjugados PEG:NPEE, con relación a la NPEE no modificada. Una sola
inyección de bolo de 100 µg/kg de NPEE ( ) , conjugado lineal 20 kD mono-PEG:NPEE derivado de metoxi-PEG activado con NHS-éster (•) , conjugado lineal de 20 kD (~80% mono-PEGrNPEE y 20% di-PEG:NPEE) derivado por alquilación reductiva del PEG activado con aldehido (T) y un control de solución salina (•) . La HGB (g/dl) se gráfica vs . # de dias posteriores al tratamiento. La Figura 5 es una gráfica que ilustra la prolongación de elevados niveles de reticulocitos en respuesta al tratamiento con diversos conjugados PEG:NPEE, con relación a la NPEE no modificada. Inyecciones de un solo bolo de 100 µg/kg de NPEE (O) , conjugados 20 kD mono-PEG:NPEE lineal (•) , 5 kD mono-PEG:NPEE lineal (T) y 5 kD di-PEG:NPEE lineal (^) derivados por alquilación reductiva de metoxi-PEG activado con aldehido, un- conjugado 20 kD mono-PEG:NPEE ramificado (>) de PEG activado con NHS-éster y un control de solución salina (A) . La cuenta absoluta de reticulocitos se gráfica vs. # de dias posteriores al tratamiento. La Figura 6 es una gráfica que ilustra la prolongación de la elevada concentración de hemoglobina en respuesta a un tratamiento con diversos conjugados PEG:NPEE, con relación a la NPEE no modificada.
Inyecciones de un solo bolo de 100 µg/kg de NPEE (O),
conjugados de 20 kD mono-PEG:NPEE lineal (•) , 5 kD monoPEG:NPEE lineal (T) y 5 kD di-PEG:NPEE lineal ( ) derivados de la alquilación reductiva de metoxi-PEG activado con aldehido y un conjugado 20 kD mono-PEG:NPEE ramificado (-i) de PEG activado con NHS-éster. La HGB (g/dl) se gráfica vs . # posteriores al tratamiento. La Figura 7 ilustra un cromatograma en columna HP Q Sefarosa del conjugado 5 kD poli-PEG:NPEE. La columna era una columna HP Q Sepharose HiTrap, en la cual se utilizó un gradiente lineal de NaCl 50 mM a NaCl 200 ir-M para eluir el producto. La Figura 8 ilustra un cromatograma en columna HP Q Sefarosa del conjugado 20 kD mono-PEG:NPEE. La columna era una columna HP Q Sepharose HiTrap, en la cual se utilizó un gradiente lineal de NaCl 50 mM a NaCl 200 mM para eluir el producto. La Figura 9 ilustra un cromatograma en columna HP Q Sefarosa del conjugado 30 kD mono-PEG:NPEE. La columna era una columna HP Q Sepharose HiTrap, en la cual se utilizó un gradiente lineal de NaCl 50 mM a NaCl 200 mM para eluir el producto. La Figura 10 es una gráfica que ilustra la respuesta de reticulocitos de ratones anémicos después de una sola inyección de bolo de 3 µg/kg del conjugado 30 kD mono-PEG:NPEE (D) , 3 µg/kg del conjugado 20 kD mono-
PEG:NPEE (») y 3 µg/kg del conjugado 5 kD poli-PEG:NPEE (•) . La cuenta absoluta de reticulocitos se gráfica vs. # de dias posteriores al tratamiento. La Figura 11 es una gráfica que ilustra la respuesta de reticulocitos de ratones anémicos, después de una sola inyección de bolo de 10 µg/kg del conjugado 30 kD mono-PEG:NPEE (T) , 10 µg/kg del conjugado 20 kD mono-PEG:NPEE (B) y 10 µg/kg del conjugado mixto 5 kD poli-PEG:NPEE (•) . La cuenta absoluta de reticulocitos se gráfica vs. # de dias posteriores al tratamiento. La Figura 12 es una gráfica que ilustra la respuesta de reticulocitos de ratones anémicos, después de una sola inyección en bolo de 30 µg/kg del conjugado 30 kD mono-PEG:NPEE (T) , 30 µg/kg del conjugado 20 kD mono-PEG:NPEE (B) y 30 µg/kg del conjugado mixto 5 kD poli-PEG:NPEE (•) vs . 30 µg/kg de NPEE no modificada (O) . La cuenta absoluta de reticulocitos se gráfica vs . # de dias posteriores al tratamiento. La Figura 13 es una gráfica que ilustra la respuesta de hemoglobina de ratones anémicos, después de una sola inyección de bolo de 3 µg/kg del conjugado 30 kD mono-PEG:NPEE (W) , 3 µg/kg del conjugado 20 kD monoPEG:NPEE (ß) y 3 µg/kg del conjugado mixto 5 kD poli-
PEG:NPEE (•) . La HGB (g/dl) se gráfica vs. # de dias posteriores al tratamiento. La Figura 14 es una gráfica que ilustra la respuesta de hemoglobina de ratones anémicos, después de una sola inyección de bolo de 10 µg/kg del conjugado 30 kD mono-PEG:NPEE (T) , 10 µg/kg del conjugado 20 kD mono-PEG:NPEE (B) y 10 µg/kg del conjugado mixto 5 kD poli-PEG:NPEE (•) . La HGB (g/dl) se gráfica vs . # de dias posteriores al tratamiento. La Figura 15 es una gráfica que ilustra la respuesta de hemoglobina de ratones anémicos, después de una sola inyección de bolo de 30 µg/kg del conjugado 30 kD mono-PEG:NPEE (V) , 30 µg/kg del conjugado 20 kD mono-PEG.-NPEE (B) y 30 µg/kg del conjugado mixto 5 kD poli-PEG:NPEE (•) vs . 30 µg/kg de NPEE no modificada (O) . La HGB (g/dl) se gráfica vs. # de dias posteriores al tratamiento . La Figura 16 es una gráfica que ilustra la respuesta de reticulocitos de ratones normales, después de una sola inyección de bolo de 3 µg/kg del conjugado 30 kD mono-PEG: PEE (T) , 3 µg/kg del conjugado 20 kD mono-PEG:NPEE (B) y 3 µg/kg del conjugado mixto 5 kD poli-PEG:NPEE (•) . La cuenta absoluta de reticulocitos se gráfica vs. # de dias posteriores al tratamiento.
La Figura 17 es una gráfica que ilustra la respuesta de reticulocitos de ratones normales, después de una sola inyección de bolo de 10 µg/kg del conjugado 30 kD mono-PEG:NPEE (T) , 10 µg/kg del conjugado 20 kD mono-PEG:NPEE (B) y 10 µg/kg del conjugado mixto 5 kD poli-PEG:NPEE (•) . La cuenta absoluta de reticulocitos se gráfica, vs. # de dias posteriores al tratamiento. La Figura 18 es una gráfica que ilustra la respuesta de reticulocitos de ratones normales, después de una sola inyección de bolo de 30 µg/kg del conjugado 30 kD mono-PEG:NPEE (T) , 30 µg/kg del conjugado 20 kD monoPEG:NPEE (B) y 30 µg/kg del conjugado mixto 5 kD poli-PEG:NPEE (•) vs. 30 µg/kg de NPEE no modificada (O) . La cuenta absoluta de reticulocitos se gráfica vs . # de dias posteriores al tratamiento. La Figura 19 es una gráfica que ilustra la respuesta de hemoglobina de ratones normales, después de una sola inyección en bolo de 3 µg/kg del conjugado 30 kD ?aono-PEG:NPEE (T) , 3 µg/kg del conjugado 20 kD ono-PEG:NPEE (B) y 3 µg/kg del conjugado mixto 5 kD poli-PEG:NPEE (•) . La HGB (g/dl) se gráfica vs . # de dias posteriores al tratamiento. La Figura 20 es una gráfica que ilustra la respuesta de hemoglobina de ratones normales, después de
una sola inyección de bolo de 10 µg/kg del conjugado 30 kD mono-PEG:NPEE (T) , 10 µg/kg del conjugado 20 kD mono-PEG:NPEE (B) y 10 µg/kg del conjugado mixto 5 kD poli-PEG:NPEE (•) . La HGB (g/dl) se gráfica vs . # de dias posteriores al tratamiento. La Figura 21 es una gráfica que ilustra la respuesta de hemoglobina de ratones normales, después de una sola inyección de bolo de 30 µg/kg del conjugado 30 kD mono-PEG:NPEE (T) , 30 µg/kg del conjugado 20 kD mono-PEG:NPEE (B) y 30 µg/kg del conjugado mixto 5 kD poli- PEG:NPEE (•) vs . 30 µg/kg de NPEE no modificada (O) . La HGB (g/dl) se gráfica vs . # de dias posteriores al tratamiento'. La figura 22 ilustra cromatsgramas de Cromatografia Liquida de Alto Rendimiento (CLAR) de exclusión 'de tamaño del conjugado 5 kD poli-PEG:NPEE (—), el conjugado 20 kD mono-PEG:NPEE (- - -) y el conjugado 30 kD mono-PEG : NPEE ( ) . La columna de CET (Cromatografia de exclusión de tamaño) era una columna Tosohaas TSK 3000 S xl (5 mieras - 7.8 mm X 30 cm) , en la cual se utilizaron NaHPO-; 100 mM, etanol al 10%, NaCl 150 iriM, pH 6.9, para eluir los productos. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Para descubrir si la vida media terapéutica in vivo de una glucoproteina tal como la NPEE se beneficiarla
or la PEGilación, se sintetizó una variedad de diferentes conjugados PEG: PEE y se probaron ín vivo con respecto a la eritropoyesis prolongada. Con el fin de optimizar los efectos potenciales de la PEGilación e identificar los sitios preferidos y la química de la unión del PEG, se empleó una estrategia de diseño en donde se variaron la longitud del polímero, la conformación del mismo y tanto el grado como los sitios de unión (véase la Figura 1) . Los métodos para preparar la NPEE PEGilada de la presente invención, comprenden en general los pasos de (a) hacer reaccionar la NPEE con polietilenglicol (tal como un éster reactivo o un derivado aldehido de PEG) , bajo condiciones por las cuales la NPEE se una a uno o más grupos PEG y (b) obtener eJ producto o los productos de la reacción. Debido a que los sitios específicos de modificación de la NPEE podrían alterar significativamente la actividad intrínseca del conjugado, se exploraron tres diferentes químicas de PEGilación (véase la Figura 2) . El primer enfoque utiliza la alquilación reductiva para conjugar un PEG-aldehído (O- (3-oxopropil) -O' -metilpolietilenglicol) con una amina primaria de la NPEE. Bajo condiciones apropiadas, este enfogue demostró producir conjugados PEG predominantemente modificados a través de la a-amina en el extremo N-terminal de la proteína. Debido a
que el PEG se liga a través de una amina secundaria, por alquilación reductiva, existe el potencial de conservar la carga en el extremo N-terminal de la proteína. La segunda química aplicada a la PEGilación de la NPEE, fue la acilación de las aminas primarias de la NPEE utilizando el NHS-éster de metoxi-PEG (O- [ (N-succinimidiloxicarbonil) -metil] -0' -metilpolietilenglicol) . En contraste con la química previa, la acilación con metoxi-PEG-NHS da como resultado un enlace amida, el cual eliminará la carga de la amina primaria original . La última química de unión evaluada utilizó una oxidación leve de la NPEE, bajo condiciones seleccionadas para hacer 'blanco en el diol pendiente de la penúltima unidad glucosilo de ácido siálico para oxidarse y formar un aldehido. El glucoaldehído resultante, posteriormente, se hizo reaccionar con una etoxi-PEG-hidrazida (0- (hidrazinocarbonilmetil) -O' -metilpolietilenglicol) , para formar una hidrazona semiestable entre el PEG y la NPEE.
La hidrazona subsecuentemente fue reducida con cianoborohidruro de sodio, para producir un conjugado PEG:NPEE estable. Cada uno de los presentes métodos proporciona una mezcla substancialmente homogénea del conjugado polímero :proteína. El término 'substancialmente homogénea" tal como se utiliza en la presente, significa que sólo se
observan moléculas del conjugado polímero:proteína. Tal como se puede comprobar por el mapeo de péptidos y la secuenciación N-terminal, un ejemplo que se presenta más adelante proporciona una preparación que contiene cuando menos 90% del conjugado polímero :proteína y cuando mucho 10% de proteína que no reaccionó. De preferencia, el material PEGilado tiene cuando menos 95% de la preparación (como en el Ejemplo de Trabajo que se presenta más adelante) y más preferiblemente, el material PEGilado tiene 99% de la .preparación o más. El conjugado polímero:proteína tiene actividad biológica y las presentes preparaciones de NPEE PEGilada "substancial ente homogéneas" son aquellas lo suficientemente homogéneas como para mostrar las ventajas de una preparación homogénea, e.g., la facilidad en la aplicación clínica en la predicción' de la farmacocinética de un lote a otro. También se puede elegir preparar una mezcla de moléculas de conjugado polímero:proteína y la ventaja que se obtiene aquí es que se puede seleccionar la proporción de conjugado mono-polímero:proteína a incluir en la mezcla. Así pues, si se desea, se puede preparar una mezcla de varias proteínas con varios números de porciones poliméricas unidas (i.e., di-, tri-, tetra-, etc.) y combinar dichos conjugados con el conjugado mono-polimero:proteína preparado utilizando los presentes
métodos, y tener una mezcla con una proporción predeterminada de conjugado mono-polimero:proteina. Experimentos iniciales diseñados para evaluar y optimizar la estereoquímica de la reacción PEG:proteína, revelaron que la PEGilación por alquilación reductiva, utilizando PEG-aldehído, sorpresivamente fue un tanto ineficiente, requiriendo relaciones molares substancialmente más altas de PEG con respecto a la proteína, que lo típicamente observado en proteínas no glucosiladas. De manera similar, la acilación con esteres de PEG-NHS también fue más lenta y menos eficiente de lo esperado. Por lo tanto, fue evidente que la PEGilación de proteínas no glucosiladas no necesariamente predecía la PEGilación de proteínas glucosiladas y que era necesaria una optimización adicional de las condiciones de reacción. Las moléculas de polímero contempladas para utilizarse en los procedimientos de PEGilación descritos en la presente, se pueden seleccionar del grupo que consiste de polímeros hidrosolubles o una mezcla de los mismos. El polímero hidrosoluble se puede seleccionar del grupo que consiste de, por ejemplo, polietilenglicol, monpmetoxi-polietilenglicol, dextrán, poli- (N-vinilpirrolidona) , homopolímeros de polietilenglicol, un copolimero de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados (e.g., glicerol), dextrán, HPMA, Fleximer™ y alcohol
polivinílico. El polímero seleccionado deberá ser hidrosoluble, para que la proteína a la cual se una no se precipite en un ambiente acuoso, tal como el ambiente fisiológico. Para las reacciones de acilación, el polímero o polímeros seleccionados deberán tener un solo grupo éster reactivo. Para la presente alquilación reductiva, el polímero o polímeros seleccionados deberán tener un solo grupo aldehido reactivo. Un PEG-aldehído reactivo preferido es el propionaldehido de polietilenglicol, el cual es estable en agua, o derivados mono-alcoxi (de 1 a 10 átomos de carbono) o ariloxi del mismo (véase la Patente Norteamericana No. US 5,252,714). El polímero puede estar ramificado o no ramificado. De preferencia, para el uso terapéutico de la preparación del producto final, el polimero será farmacéuticamente aceptable. Un polímero hidrosoluble particularmente preferido para utilizarse en la presente, es el polietilenglicol, abreviado PEG. Tal como se utiliza en la presente, el término 'polietilenglicol" abarca cualquier forma de PEG que haya sido utilizada para derivar otras proteínas, tal como mono-alcoxi- (de 1 a 10 átp os de carbono) -polietilenglicol o ariloxi-polietilenglicol . La proporción de moléculas de polietilenglicol con respecto a las moléculas de proteína variará, al igual que sus concentraciones en la mezcla de reacción. En
1
general, la relación óptima (en términos de eficiencia de la reacción en que no haya un exceso de proteína o polímero que no reaccionaron) estará determinada por el peso molecular del polietilenglicol seleccionado y el número de grupos reactivos disponibles (típicamente 8 ó 3 grupos amino) disponibles. En lo que se refiere al peso molecular, mientras más alto sea el peso molecular del polímero, menor será el número de moléculas de polímero que se unan a la proteína. De manera similar, la ramificación del polímero se deberá tomar en cuenta cuando se optimizan estos parámetros. Generalmente, mientras más alto sea el peso molecular (o mientras más ramificaciones haya) , mayor será la relación polímero:proteína. En la presente invención, se evaluaron polímeros PEG lineales de diferentes longitudes (5 kD, 20 kD y 30 kD) . De manera similar, los conjugados de polímeros de PEG con dos ramificaciones (10 kD, 20 kD y 40 kD) también fueron probados . De cada preparación, se tomaron muestras de conjugados PEG:NPEE monosubstituidos y disubstituidos para investigar los efectos de los sitios secundarios de PEGilación. En general, para las reacciones de PEGilación contempladas en la presente, el peso molecular promedio preferido es de aproximadamente 2 kDa a aproximadame?te 100 kDa (el término 'aproximadamente" indica ± 1 kDa) . De
preferencia, el peso molecular promedio es de aproximadamente 5 kDa a aproximadamente 40 kDa. La relación de polímero hidrosoluble con. respecto a la NPEE, generalmente estará en el rango de 1:1 para monoPEG-, 2:1 para diPEG, etc., y las relaciones de masa para PEG:proteína serían de ~1:7 para 5 kD mono-PEG a ~1:1.3 para 30 kD monoPEG. El método para obtener la preparación de NPEE PEGilada, puede ser por purificación del material PEGilado de una población de moléculas NPEE no PEGiladas . Por ejemplo, más adelante se muestra un ejemplo en donde se separan NPEE mono- y/o di-PEGiladas utilizando una cromatografía de intercambio iónico por tamaño molecular. La cromatografía de exclusión de tamaño se utiliza como herramienta analítica para caracterizar los productos purificados. La presente invención también proporciona un método para obtener selectivamente NPEE químicamente modificada en el extremo N-terminal. El método comprende la alquilación reductiva, la cual explota la reactividad diferencial de los tipos de grupos amino primarios- (lisina versus el extremo N-terminal) disponibles para derivación en una proteína particular. Bajo condiciones de reacción apropiadas, se logra la derivación substancialmente selectiva de la proteína en el extremo N-terminal con un
polímero que contiene grupos carbonilo. La reacción se realiza a un valor de pH que permita aprovechar las diferencias de pKa entre los grupos e-amino de los residuos lisina y del grupo a-amino del residuo N-terminal de la proteína. Mediante tal derivación selectiva, se controla la unión de un polímero hidrosoluble con una proteína: la conjugación con el polímero se lleva a cabo predominantemente en el extremo N-terminal de la proteína y no ocurre ninguna modificación significativa de otros grupos reactivos, tales como los grupos amino de la cadena lateral de lisina. La preparación de preferencia tendrá más del 80% del conjugado monopolímero:proteína y más preferiblemente tendrá más del 95% del conjugado monopolímero :proteína. La NPEE de la presente invención, es un análogo de
EPO hiperglucosilado que comprende dos sitios de glucosilación adicionales, con una cadena de carbohidrato adicional unida en cada sitio. La NPEE fue construida utilizando mutagénesis dirigida a sitio y fue expresada en células huésped de mamífero. Los detalles de la producción de NPEE se proporcionan en la Solicitud Internacional de Patente PCT copropietaria No. US94/02957. Los nuevos sitios de glucosilación N-ligada para la rHuEPO fueron introducidos mediante alteraciones en la secuencia de ADN que codifica para los aminoácidos Asn-X-Ser/Thr en la
cadena polipeptídica. El ADN que codifica para la NPEE fue transfectado en células huésped de ovario de hámster chino (células CHO) y el polipéptido expresado fue analizado con respecto a la presencia de cadenas de carbohidrato adicionales. En una modalidad preferida, la NPEE tendrá dos cadenas de carbohidrato N-ligadas adicionales en los residuos 30 y 88. La numeración de la secuencia de aminoácidos es aquella de la eritropoyetina (EPO) humana. La secuencia de aminoácidos de la NPEE es aquella ilustrada en la SEQ ID No. 1. Debe entenderse que la NPEE tendrá el complemento normal de sitios de glucosilación N-ligada y O-ligada además de los sitios nuevos. La NPEE de la presente invención también puede incluir cambios de aminoácidos conservadores en uno o más residuos de la SEQ ID No. 1. Estos cambios no dan como resultado ' la adición de una cadena de carbohidrato y tendrán poco efecto sobre la actividad biológica del análogo. En general, la presente invención abarca composiciones farmacéuticas que comprenden cantidades efectivas de la proteína o productos derivados de la presente invención, junto con diluyentes, estabilizantes, conservadores, solubilizantes, emulsificantes, adyuvantes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables . Tales composiciones incluyen diluyentes que contienen diversas
soluciones reguladoras (e.g., Tris-HCl, fosfatos), pH y fuerza iónica; aditivos tales como detergentes y agentes solubilizantes (e.g., Polisorbato 20, Polisorbato 80), antioxidantes (e.g., ácido ascórbico, metabisulfito de sodio), conservadores (e.g., Timerosal, alcohol bencílico) y substancias de relleno (e.g., lactosa, manitol); véase e.g., Rémington' s Pharmaceutical Sciences, 18tn Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042), páginas 1435:1712, el cual se incorpora en la presente como referencia. Una cantidad efectiva del ingrediente activo es una cantidad terapéutica, profiláctica o diagnósticamente efectiva, la cual puede ser determinada fácilmente por un técnico en la materia al • tomar en cuenta factores tales como el peso corporal, la edad y la meta terapéutica o profiláctica. Las composiciones PEG:NPEE de la presente invención también pueden incluir un agente amortiguador para mantener el pH de la solución dentro de un rango deseado. Los agentes preferidos incluyen el acetato de sodio, fosfato de sodio y citrato de sodio. También se pueden emplear mezclas de estos agentes amortiguadores . La cantidad de agente amortiguador útil en la composición, depende en gran medida del amortiguador particular utilizado y el pH de la solución. Por ejemplo, el acetato es un amortiguador más eficiente a pH 5 que a pH 6, de modo que se puede usar menos acetato en una solución a pH 5 que
a pH 6. El rango de pH preferido para las composiciones de la presente invención, pH de 3.0 a 7.5. Las composiciones de la presente invención además pueden incluir un agente para ajustar la isotonicidad, para hacer que la solución sea isotónica y más compatible para ser inyectada. El agente más preferido es el cloruro de sodio, én un rango de concentración de 0 a 150 mM. Tal como se utiliza en la presente, y cuando se contemplan conjugados PEG:NPEE, el término 'cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad que proporciona un incremento en el hematocrito que produce un beneficio para un paciente. La cantidad variará de un individuo a otro y dependerá de un número de factores, incluyendo la condición física general del paciente y la causa subyacente de la anemia. Por ejemplo, una cantidad terapéuticamente efectiva de rHuEPO para un paciente que sufre de insuficiencia renal crónica, es de 50 a 150 unidades/kg tres veces a la semana. La cantidad de rHuEPO utilizada para terapia proporciona un índice de incremento del hematocrito aceptable y mantiene el hematocrito en un nivel benéfico (normalmente cuando menos aproximadamente 30% y típicamente en un rango de 30 a 36%) . Una cantidad terapéuticamente efectiva de las presentes composiciones, puede ser determinada fácilmente por un técnico en la materia utilizando los materiales y procedimientos
disponibles al público. La presente invención proporciona conjugados PEG: PEE que se administran con menos frecuencia que la NPEE y/o la EPO. La frecuencia de dosificación variará dependiendo del trastorno que se está tratando, pero en general será de aproximadamente una vez cada 4 a 6 semanas. Debe entenderse que la frecuencia de dosificación realmente utilizada puede variar respecto a las frecuencias descritas en la presente, debido a variaciones en las respuestas por diferentes individuos al conjugado PEG:NPEE; el término 'aproximadamente" pretende reflejar tales variaciones. Así pues, la presente invención se puede utilizar para estimular la producción de eritrocitos y corregir las cuentas disminuidas de eritrocitos. Más comúnmente, las cuentas de eritrocitos disminuyen a causa de la anemia. Entre los 'trastornos que se pueden tratar por la presente invención, se incluye la anemia asociada con una declinación o pérdida de la función renal (insuficiencia renal crónica) , anemia asociada con terapia mielosupresora, tal como fármacos quimioterapéuticos o antivirales (tales como AZT) , anemia asociada con el progreso de cánceres no mieloides y anemia asociada con infecciones virales (tales como VTH) . También se pueden tratar trastornos que pueden causar anemia en un individuo que de cualquier otra manera es sano, tal como una pérdida anticipada de sangre durante
una cirugía. En general, cualquier trastorno que se pueda tratar con la rHuEPO y/o NPEE, también puede ser tratado con los conjugados PEG:NPEE de la presente invención. La presente invención también incluye la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de fierro, con el fin de mantener una incrementada erítropóyesis durante la terapia. La cantidad a ser administrada puede ser determinada fácilmente por un técnico en la materia, basándose en la terapia con rHuEPO. Los conjugados de PEG:NPEE preparados de conformidad con la presente invención, de preferencia se administran por inyección intraperitoneal, subcutánea o intramuscular. Sin embargo, está claro para un técnico en la materia que otras vías de administración también pueden ser efectivas al utilizar las composiciones de la presente invención. Los siguientes Ejemplos se ofrecen para ilustrar de manera más completa la presente invención, pero no se deben -considerar como limitantes de los alcances de la misma. El Ejemplo 1 describe la preparación y pruebas de conjugados PEG:NPEE preparados mediante el acoplamiento de 5 kD ó 20 kD metoxi-PEG-hidrazidas con NPEE, a través de aldehidos generados en las cadenas de carbohidrato de la NPEE mediante una oxidación con peryodato de sodio. El Ejemplo 2 describe la preparación y prueba de conjugados
PEG:NPEE preparados utilizando polímeros 20 kD PEG en forma de esteres NHS-PEG y aldehidos de PEG para producir conjugados PEG-NPEE mediante acilación y alquilación reductiva, respectivamente. El Ejemplo 3 demuestra los efectos sobre la actividad del grado de substitución y variaciones del tamaño del polímero y la conformación para varios conjugados PEG:NPEE. El Ejemplo 4 describe la eficacia de tres conjugados PEG:NPEE: 20 kD mono-PEG:NPEE; la mezcla 5 kD poli-PEG:NPEE; y 30 kD mono-PEG:NPEE, examinados a tres diferentes dosis con relación a una NPEE control, en un modelo de ratón anémico. En el Ejemplo 5, se evaluaron tres diferentes conjugados PEG-NPEE en un bioensayo en ratones normales, para comparar y contrastar su potencial eritropoyético y la duración. EJEMPLO 1 Se produjeron conjugados PEG:NPEE mediante el acoplamiento de 5 kD ó 20 kD metoxi-PEG-hidrazídas con NPEE, a través de aldehidos generados en las cadenas de carbohidrato de la NPEE por oxidación con peryodato de sodio. El grado de modificación se controló al variar la concentración de peryodato de sodio durante la oxidación. Los conjugados se prepararon primero oxidando la NPEE (2-4 mg/ml en acetato de sodio 50 mM) con metaperyodato de sodio 1 mM ó 10 mM (Sigma) durante tres
Minutos a temperatura ambiente, en acetato de sodio 100 mM, pH 5.6. Después el peryodato fue removido por intercambio en una solución reguladora de acetato de sodio 100 mM, pH 5.4. Luego se agregó metoxi-PEG-hidrazida (Shearwater Polymers) a un exceso molar de polímero: proteína de 5 a 100 veces, prefiriéndose un exceso de 10-0 veces. El enlace hidrazona intermediario fue reducido adicionalmente mediante la ' adición de cianoborohidruro de sodio 15 mM (Sigma) y se dejó reaccionar durante una noche a 4°C. Los conjugados resultantes fueron fraccionados por FPLC de exclusión de tamaño, utilizando una columna -Superdex 75, 26 m X 60 cm (Pharmacia) , eluyendo con fosfato de sodio 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7.2. Las preparaciones resultantes variaron en tamaño de ~40 kD a ~200 kD, lo cual fue estimado por Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodeciisulfato de sodio (EGPA-DSS) . Se probaron muestras de PEG: NPEE por unión a receptores en un formato de IEE (Inmunoensayo Enzimético) in vi tro . El ensayo in vi tro es un ensayo de desplazamiento en donde los conjugados PEG: NPEE compiten por unirse al receptor de la EPO contra un conjugado EPO-HRP utilizado como reportero. Los resultados in vi tro sugieren qµe los conjugados PEG: NPEE tuvieron una afinidad aparente más baja por el receptor de la NPEE. La bioactividad de los diversos conjugados
PEG:NPEE1 fue evaluada in vivo monitoreando la incorporación de fierro en roedores después de una sola dosis subcutánea del conjugado. En el ensayo, se acondicionaron ratones en una cámara hiperbárica para suprimir la expresión de eritropoyetina endógena, después se les administró una sola dosis subcutánea, en forma de inyección de boJo, de NPEE o un conjugado PEG:NPEE. Después de cinco días, los ratones recibieron una inyección intravenosa del isótopo 59Fe como rastreador para supervisar la incorporación de fierro en los eritrocitos. Dos días después de la administración del 59Fe, los animales fueron sacrificados y analizados con respecto a la incorporación del fierro como función de la dosis. Inicialmente, se probaron varias mezclas de 5 kD poli-PEG:NPEE con varios grados de PEGilación con respecto a la incorporación de fierro como función de la dosis del conjugado. Los resultados del ensayo in vivo se ilustran en la Figura 3 y demuestran que los conjugados PEG:NPEE preparados mediante el acoplamiento de PEG-hidrazida con NPEE oxidada, tuvieron un rendimiento comparable a la NPEE por sí sola en el bioensayo de incorporación de fierro. EJEMPLO 2 Este Ejemplo describe la preparación y prueba de conjugados PEG:NPEE preparados utilizando esteres de NHS-PEG y PEG-aldehídos producidos a partir de polímeros de PEG
de 20 kD. La estequiometría de la reacción y las condiciones de amortiguamiento del pH fueron optimizadas para cada procedimiento químico, para producir conjugados 20 kD mono-PEG:NPEE con un buen rendimiento. Se preparó un derivado 20 kD mono-PEG:NPEE mediante la acilación de la NPEE con el éster metoxi-PEG-NHS de 20 kD, así como una mezcla "(~80%/20%) de 20 kD mono/di-PEG:NPEE derivada por alquilación reductiva de la NPEE con metoxi-PEG-aldehído de 20 kD. La reacción con metoxi-PEG-aldehído (Shearwater
Polymers) se puede llevar a cabo en un pH de 4 a 6, siendo el pH óptimo 5.2. La concentración de NPEE en la mezcla de reacción fue 4 mg/ml en acetato de sodio 50 mM. El exceso molar del aldehido PEG utilizado fue 5-20 veces y se agregó cianoborohidruro de sodio hasta una concentración final de 15 mM. La mezcla de reacción se agitó durante 1 hora a temperatura ambiente y después durante 18 horas a 5°C. Al concluir la reacción, la mezcla se diluyó hasta una conductividad menor de 5 mS/ cm, elevándose el pH hasta 7.0 y la mezcla se aplicó a una columna Q Sepharose HP
(Pharmacia). Los productos se eluyeron de la- columna utilizando un gradiente lineal de NaCl 50 mM a NaCl 200 mM, amortiguado con Bis-Tris-Propano 10 mM, pH 7.0. Esta purificación permite la separación de especies basándose en el número de moléculas PEG unidas a la NPEE.
La reacción con el éster de PEG activado con NHS, metoxi-SPA-PEG (Shearwater Polymers) , se llevó a cabo a pH 8.0, a una concentración de NPEE de 2-4 mg/ml en solución reguladora Bicine 50 M. Se agregó una solución amortiguada de NPEE a 10-20 equivalentes molares de PEG. La mezcla de reacción se agitó durante 1 hora a temperatura ambienté. Al concluir la reacción, la mezcla se diluyó hasta una conductividad menor de 5 mS/cm, el pH se elevó a 7.0 y la muestra se aplicó a una columna QHP (Pharmacia) . Los productos se eluyeron con un gradiente lineal de NaCl 50 mM a NaCl 200 mM, amortiguado con Bis-Tris-Propano 10 mM, pH 7.0. Los dos conjugados PEG:NPEE aislados, un conjugado 20 kD mono-PEG:NPEE (NHS) y una mezcla (~80%/20%) de 20 kD mono/di-PEG:NPEE (aldehido) fueron probados en un bioensayo en ratones in vivo . El bioensayo murino mide los reticulocitos, que son precursores de los eritrocitos, y la hemoglobina, como monitores de la eritropoyesis en respuesta a una sola dosis de NPEE o PEG:NPEE en ratones normales. Específicamente, el bioensayo mide la intensidad y duración de una incrementada respuesta de hemoglobina y reticulocitos resultante por la inyección subcutánea en bolo de 100 µg/kg en ratones BDF 1 hembras. Los resultados del ensayo se ilustran en la Figura 4 y los resultados del estudio indicaron un incremento significativo y una
1
significativa prolongación de la respuesta de hemoglobina por los conjugados PEG:NPEE en relación a una dosis equivalente de NPEE sola. EJEMPLO 3 Este Ejemplo demuestra los efectos, sobre la actividad, del grado de substitución y variaciones del tamaño del polimero y conformación para conjugados PEG: PEE. Utilizando químicas basadas en metoxi-PEG-aldehido y en metoxi-PEG-NHS, se sintetizó una variedad de conjugados PEG:NPEE desde polímeros lineales de 5 kD, 20 kD y 30 kD, hasta polímeros ramificados de 10 kD, 20 kD y 40 kD. A 'partir de estas reacciones, se aislaron preparaciones de PEG:NPEE monosustituido y disustituido por cromatografía y se probaron con respecto a la prolongación de la eritropoyesis en un bioensayo en ratones. La reacción con" etoxi-PEG-aldehído (Shearwater Polymers) se llevó a cabo con una concentración de NPEE de 4 mg/ml y un exceso molar de 25 veces de PEG en NaOAc, pH 5.0, agregando cianoborohidruro de sodio hasta una concentración final de 20 mM. La mezcla de reacción se agitó durante una noche a 4°C, se diluyó en 4 volúmenes de Tris 20 mM, pH 7.2 y el pH se ajustó a pH 7.4 con NaOH. La mezcla de reacción diluida posteriormente se aplicó a una columna HiTrap Q Sepharose HP (Pharmacia) . Las isoformas
de NPEE PEGiladas se resolvieron eluyendo con un gradiente de NaCl de 0 a 150 mM, en Tris mM, pH 7.2. La reacción con el éster metoxi-PEG-NHS (Shearwater Polymers) se realizó con una concentración de NPEE de 4 mg/ml y un exceso molar de 5 a 7 veces de PEG en solución reguladora Bicine 50 mM, pH 8. La mezcla de reacción se agitó durante una noche a 4°C, después se diluyó con 4 volúmenes de Tris 20 mM, pH 7.2 y el pH se ajustó a pH 7.4 con NaOH. La mezcla de reacción diluida posteriormente se aplicó a una columna HiTrap Q Sepharose HP (Pharmacia) . Las isoformas de NPEE PEGiladas se resolvieron eluyendo con un gradiente de NaCl de 0 a 150 mM, en Tris 20 mM, pH 7.2 (véanse las Figuras 5-7) . Estos esquemas de proceso de emplearon para cada uno de los polímeros lineales de 5 kD, 20 kD y 30 kD, asi como para los esteres de PEG-NHS ramificados de 10 kD, 20 kD y 40 kD. Los diversos conjugados se listan en la Tabla 1 que se presenta a continuación:
Cada isoforma purificada posteriormente se probó un bioensayo in vivo en ratones, con respecto a la
prolongación de la actividad eritropoyética medida por cambios en la cuenta de reticulocitos y la concentración de hemoglobina después de una sola inyección subcutánea en bolo de 100 µg/kg en ratones BDF 1 hembras normales. Cada conjugado PEG:NPEE monosustituido de la serie de polímeros lineales y ramificados, demostró una prolongación significativa y comparable del efecto eritropoyético (véanse las Figuras 8 y 9) . Los conjugados PEG:NPEE disubstituidos de los polímeros de PEG de 20 kD y 30 kD fueron considerablemente menos activos, pero inesperadamente, el conjugado PEG:NPEE ^disustituido de 5 kD demostró una actividad equivalente a su contraparte monosustituida. Todos los conjugados PEG:NPEE monosubstituidos ramificados demostraron una prolongada actividad comparable a los análogos conjugados PEG:NPEE lineales monosubstituidos. Por lo tanto, estos Ejemplos demuestran la mayor duración de la estimulación eritropoyética causada por una variedad de conjugados PEG:NPEE utilizando una sola dosis, inyectada en bolo, en modelos realizados en ratones normales . EJEMPLO 4 Este Ejemplo describe la eficacia de tres conjugados PEG:NPEE: 20 kD mono-PEG:NPEE; la mezcla 5 kD poli-PEG:NPEE; y 30 kD mono-PEG:NPEE, examinada a tres
diferentes dosis con relación a un control de NPEE, en un modelo en ratones anémicos. Para inducir una condición anémica, los ratones fueron tratados previamente con cis-platinina a 1 mg/kg/dia durante 3 dias, seguido por un periodo de 7 días de descanso. Después de 3 ciclos de diez días, los ratones fueron dosificados con una sola inyección en bolo de 20 µg/kg, J O µg/kg ó 3 µg/kg de los conjugados 20 kD monoPEG: NPEE, 30 kD mono-PEG: NPEE ó 5 kD poli-PEG:NPEE y se compararon con un control de NPEE sola a una dosis de 30 µg/kg. Se supervisaron la cuenta de reticulocitos y la concentración de hemoglobina como función del tiempo en respuesta a las dosis de cada fármaco (véanse las Figuras 10-15) . Estos datos demuestran las inesperadas ventajas de una reducción de dosis de ~3 veces y significativos incrementos en la vida media eritropoyética para los conjugados PEG: NPEE con relación a la NPEE sola, en que los resultados demuestran una clara dependencia de la dosis tanto para la magnitud como para la duración de la respuesta de reticulocitos o de hemoglobina a los conjugados PEG:NPEE. En algunos casos, el conjugado.30 kD mono-PEG: NPEE pareció presentar un rendimiento modestamente mejor que el conjugado 5 kD poli-PEG:NPEE, el cual presentó un rendimiento modestamente mejor que el conjugado 20 kD
rendimiento modestamente mejor que el conjugado 20 kD monoPEG:NPEE, lo cual sugiere que el conjugado 30 kD monoPEG:NPEE podría ser una configuración preferida. EJEMPLO 5 En este Ejemplo se evaluaron tres conjugados PEG- NPEE en un bioensayo en ratones normales para comparar y contrastar su potencial eritropoyético y la duración. Los tres compuestos probados fueron: 30 kD mono-PEG:NPEE derivado por acilación con el éster 30 kD PEG-NHS, el conjugado 20 kD mono-PEG:NPEE derivado por alquilación reductiva con el 20 kD PEG-aldehído y la mezcla 5 kD poli-PEG:NPEE derivada por alquilación reductiva con el 5 kD PEG-aldehido. Cada conjugado PEG:NPEE fue probado en una sola dosis subcutánea en forma de bolo a 30 µg/kg, 10 µg/kg ó 3 µg/kg. Se utilizó NPEE no modificada como control a una concentración de 30 µg/kg en una sola inyección en bolo. La respuesta eritropoyética y la duración se supervisaron como función de la cuenta de reticulocitos o la concentración de hemoglobina (véanse las Figuras 16-21) , como función del tiempo. Estos datos demuestran que las tres formas de PEG:NPEE son capaces de inducir una fuerte respuesta eritropoyética con una significativa reducción de la dosis. Además, estos conjugados PEG:NPEE demuestran una prolongada eficacia con relación a la NPEE no modificada.
Materiales y Métodos La presente NPEE puede ser preparada de conformidad con la Solicitud Internacional de Patente PCT No. US94/02957 anteriormente mencionada y que se incorpora como referencia. Los conjugados preparados en la presente también fueron caracterizados por cromatografía de exclusión de tamaño (CET) como herramienta analítica. La columna de CET fue una columna Tosohaas TSK 3000 SWxl (5 mieras - 7.8 mm X 30 cm) , en donde se utilizaron NaHP04 100 mM, etanol al 10%, NaCl 150 nM, pH 6.9, para eluir los productos. Un cromatograma representativo se ilustra en la Figura 22. Toda vez que la presente invención ha sido descrita en términos de ciertas modalidades preferidas, debe entenderse que los técnicos en la materia podrían idear variaciones y modificaciones. Por lo tanto, se pretende que las reivindicaciones anexas cubran todas estas variaciones equivalentes, las cuales están dentro de los alcances de la presente invención tal como está reivindicada . Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.