MX2014007687A - Derivados de dihidro-benzo-oxazina y dihidro-pirido-oxazina. - Google Patents

Derivados de dihidro-benzo-oxazina y dihidro-pirido-oxazina.

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Abstract

La invención se refiere a los compuestos de dihidro-benzooxazina y dihidro-pirido-oxazina de la fórmula (I) y/o a las sales farmacéuticamente aceptables y/o solvatos de los mismos: (ver Fórmula) en donde Y, V, W, U, Q, R1, R5, R7 y R30 son como se definen en la descripción. Estos compuestos son adecuados para el tratamiento de un trastorno o de una enfermedad que sea mediada por la actividad de las enzimas de PI3K.

Description

DERIVADOS DE DIHI DRO-BENZQ-OXAZI N A Y DIHIDRO-PIRIDQ-OXAZINA CAM PO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a la preparación y uso de nuevos derivados de dihidro-benzo-oxazina y dihidro-pirido-oxazina como fármacos candidatos en forma libre o en forma de sal farmacéuticamente aceptable con valiosas propiedades de tipo fármaco, tales como, por ejemplo, una forma con estabilidad metabólica y farmacocinética adecuada , para la modulación , notoriamente la i nhibición de la actividad o función de la familia de cinasa de fosfoinositida-3'-OH (posteriormente en la presente P I3K).
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los miembros de la familia de cinasa de fosfoinositida-3 (PI3K) están involucrados en el crecimiento, diferenciación , y sobrevivencia celular, en la remodelación citoesquelética, y en el tráfico de los organelos intracelulares en muchos tipos diferentes de células (Okkenhaug y Wymann , Natu re Rev. I mmunol . , 3: 31 7 (2003) .
Hasta la fecha , se han identificado ocho PI3Ks de mam ífero, divididas en tres clases principales (I , I I y II I ) con base en su secuencia genética, estructu ra, moléculas adaptadoras, expresión , modo de activación, y sustrato preferido.
PI3K5 es u na cinasa de l ípido que pertenece a la familia de PI3K clase I (PI3K a, ß, ? y d) que genera señales de segundo mensajero corriente abajo de los receptores enlazados a la cinasa de tirosina. ??3?d es un heterodímero compuesto de una proteína adaptadora y una subunidad catalítica ?110d que convierte el fosfatidil-inositol-4,5-bis-fosfato (PtdlnsP2) hasta el fosfatidil-inositol-3,4,5-tri-fosfato (PtdlnsP3). Las proteínas efectoras interactúan con el PtdlnsP3 y desencadenan sendas de señalización específicas involucradas en la activación, diferenciación, migración, y sobrevivencia celular.
La expresión de las subunidades catalíticas ?110d y ?110? es preferencial para los leucocitos. La expresión también se observa en las células de músculo liso, en los miocitos, y en las células endoteliales. En contraste, p110a y ?110ß son expresadas por todos los tipos de células (Marone y colaboradores, Biochimica et Biophysica Acta 1784: 159 (2008)). ??3?d está asociada con el desarrollo y la función de las células-B (Okkenhaug y colaboradores, Science 297: 1031 (2002)).
Las células-B también tienen una función crítica en la patogénesis de un número de enfermedades autoinmunes y alérgicas, así como en el proceso de rechazo de trasplante (Martin y Chan, Annu. Rev. Immunol. 24: 467 (2006)).
La quimiotaxis está involucrada en muchas enfermedades autoinmunes o inflamatorias, en la angiogénesis, invasión/ metástasis, neurodegeneración, o en el sanado de heridas (Gerard y colaboradores, Nat. Immunol. 2: 108 (2001)). Los sucesos temporalmente distintos en la migración de los leucocitos en respuesta a las quimiocinas dependen completamente de ??3?d y ??3?? (Liu y colaboradores, Blood 110: 1191 (2007)).
PI3Ka y PI3KR tienen una función esencial en el mantenimiento de la homeostasia, y la inhibición farmacológica de estos objetivos moleculares se ha asociado con la terapia de cáncer (Maira y colaboradores, Expert Opin. Ther. Targets 12: 223 (2008)).
PI3Ka está involucrada en las sendas de señalización de insulina y de crecimiento celular (Foukas y colaboradores, Nature 441: 366 (2006)). Se espera que la inhibición selectiva de la isoforma PI3K5 evite los efectos secundarios potenciales, tales como hiperglicemia, y mala regulación metabólica o del crecimiento.
Las infecciones parasitarias todavía representan una de las causas más importantes de patología y mortalidad en todo el mundo. Entre los parásitos que provocan patología humana y animal el filo apicomplexa comprende un grupo de parásitos que surgen del vector que es responsable de una amplia variedad de enfermedades serias incluyendo, pero no limitándose a, malaria, Leishmaniasis y tripanosomiasis. Solamente la malaria infecta al 5-10 por ciento de la humanidad y provoca alrededor de dos millones de muertes por año. [Schofield y colaboradores, "Immunological processes in malaria pathogenesis", Nat Rev Imm 2005], [Schofield L, "Intravascular infiltrates and organ-specific inflammation in malaria pathogenesis], [Mishra y colaboradores, "TLRs in CNS Parasitic infections", Curr Top Micro Imm 2009], [Bottieau y colaboradores, "Therapy of vector-borne protozoan infections in nonendemic settings", Expert Rev. Anti infecí. Ther. , 201 1].
Los receptores tipo Toll (TLRs) son moléculas filogenéticamente antig uas codificadas por la l ínea germinal que reconocen moléculas estructuralmente relevantes evolutivamente conservadas (conocidas como patrones moleculares asociados con patógenos (PAM Ps)) dentro de los patógenos microbianos. Varios tipos diferentes de células, incluyendo células, incluyendo las células del sistema inmunológico, expresan los receptores tipo Toll (TLRs) y, de esta manera, son capaces de detectar la presencia de los patrones moleculares asociados con patógenos (PAM Ps) . Hasta ahora se han descrito 1 0 miembros funcionales de la familia TLR (TLR 1 -1 0) en los seres humanos, todos los cuales reconocen moléculas PAM P específicas. En seguida del reconocimiento de estos PAM Ps específicos, los receptores tipo Toll (TLRs) inducen y orquestan la respuesta inmu nitaria del huésped a las infecciones con bacterias, virus, hongos y parásitos. [Hedíaat y colaboradores, "Targeting of TLRs: a decade of progress in combating infectious disease", reseña, Lancet infectious disease 201 1], [Kwai y colaboradores, "TLRs and their crosstalk with other innate receptors in infection and immunity", reseña, Immunity Mayo-201 1].
El sistema inmunológico del huésped infectado responde a la infección con la producción inducida por TLR de citoq uinas pro-inflamatorias principalmente del tipo auxiliar-T 1 (Th 1 ) . Aunque son benéficas las cantidades adecuadas de estas citoqu inas y se req uieren para eli m inar la infección , u na sobreprod ucción de estos mediadores es dañ ina para el h uésped , y está asociada con un a patolog ía inm unológicamente mediada , incluyendo neu ropatolog ía y daño al tejido con consecuencias graves y con frecuencia fatales . U n ejem plo prom inente y altamente relevante de esta patolog ía inm u nológicamente mediada es la malaria aguda y cerebra l (CM ) que provoca s íntomas cl ínicos graves y con frecuencia es fatal. [Schofield y colaboradores, "Immunological processes in malaria pathogenesis", Nat Rev Imm 2005], [Schofield L, "Intravascular infiltrates and organ-specific inflammation in malaria pathogenesis], [Mishra y colaboradores, "TLRs in CNS Parasitic infections", Curr Top Micro Imm 2009], [Bottieau y colaboradores, "Therapy of vector-borne protozoan infections in nonendemic settings", Expert Rev. Anti infecí. Ther., 201 1] [Hedíaat y colaboradores, "Targeting of TLRs: a decade of progress in combating infectious disease", reseña, Lancet Infectious Disease 201 1]. A pesar del progreso hecho en el tratamiento y la erradicación de la malaria, la tasa de mortalidad q ue está asociada con una malaria grave, incluyendo la malaria cerebral (CM) , sigue siendo inaceptablemente alta. Las estrategias dirigidas exclusivamente a la erradicación del parásito en el huésped , por consiguiente, podrían no ser suficientes para prevenir las complicaciones neurológicas y la muerte en todos los casos de malaria cerebral (CM). El desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas complementarias innovadoras para reducir de una manera eficiente la mortalidad y patología asociada con la malaria cerebral (CM) que es causada, en parte, por la inmunopatología mediada por el huésped, por consiguiente, sigue siendo una necesidad médica urgente. [Higgins y colaboradores, "Immunopathogenesis of falciparum malaria: implications for adjunctive therapy in the management of severe and cerebral malaria", Expert Rev. Anti Infect. Ther. 2011].
Recientemente se ha proporcionado evidencia adicional de que el TLR9 tiene una función clave en el reconocimiento y la respuesta a los parásitos, incluyendo, pero no limitándose a, Plasmodium, Leishmania, Tripanosoma y Toxoplasma [Gowda y colaboradores, "The Nucleosome is the TLR9-specific Immunostimulatory component plasmodium falciparum that activates DCs", PLoS ONE, Junio 2011], [Peixoto-Rangel y colaboradores, "Candidate gene analysis of ocular toxoplasmosis in Brazil: evidence for a role for TLR9", Mem Inst Oswaldo Cruz 2009], [Pellegrini y colaboradores, "The role of TLRs and adoptive immunity in the development of protective or pathological immune response triggered by the Tripanosoma cruzi protozoan", Future Microbio! 2011], y de que la interferencia con la activación de TLRs, incluyendo el TLR9, representa una estrategia prometedora para prevenir las respuestas inflamatorias perjudiciales en la malaria grave y cerebral [Franklin y colaboradores, "Therapeutical targeting of nucleic acid-sensing TLRs prevents experimental cerebral malaria", PNAS 2011].
La malaria es una enfermedad infecciosa causada por cuatro parásitos protozoarios : Plasmodium falciparum; Plasmodium vivax; Plasmodium ovale; y Plasmodium malaria. Estos cuatro parásitos típicamente son transmitidos por la mordida de un mosquito Anopheles hembra infectado. La malaria es un problema en muchas partes del mu ndo y durante las últimas décadas, el problema de la malaria ha aumentado continuamente. Se estima que cada año mueren de 1 a 3 millones de personas de malaria - en su mayor parte niños de menos de 5 años de edad . Este aumento en la mortalidad por malaria se debe en parte al hecho de que el Plasmodium falciparum, el parásito de malaria más letal, ha adquirido resistencia contra casi todos los fármacos contra la malaria disponibles, con la excepción de los derivados de artemisinina.
La Leishmaniasis es causada por una o más de 20 variedades de protozoarios parasitarios que pertenecen al género Leishmania , y es transmitida por la mordida de moscas de arena hembras. La Leishmaniasis es endémica en aproximadamente 88 países, incluyendo muchas áreas tropicales y sub-tropicales. Existen cuatro formas principales de Leishmaniasis. Leishman iasis visceral, también denominada como kala-azar, es la forma más grave y es causada por el parásito Leishmania donovani. Los pacientes q ue desarrollan Leishmaniasis visceral pueden morir en meses a menos que reciban tratamiento. Las dos terapias principales para Leishmaniasis visceral son los derivados de antimonio de estibogluconato de sodio (Pentostam®), y antimoniato de meglumina (Glucantim®). El estibogluconato de sodio se ha utilizado du rante aproximadamente 70 añ os, y la resistencia a este fárm aco es u n problem a creciente . En ad ición , el tratam iento es relativam ente largo y doloroso, y puede provoca r efectos secundarios indeseables.
La Tri panosom iasis Africa na H um ana , tam bién conocida com o enfermedad del sueño , es una enfermedad parasitaria que surge del vector. Los parásitos concernidos son protozoarios pertenecientes al Género Tripanosoma. Son transmitidos a los seres humanos por las mordidas de la mosca tse-tsé (Género Glossina) que ha adquirido su infección a partir de seres humanos o a partir de animales que alojan a los parásitos patogénicos humanos.
La enfermedad de Chagas (también denominada como Tripanosomiasis Americana) es otra enfermedad parasitaria humana que es endémica entre las poblaciones pobres del Continente Americano. La enfermedad es causada por el protozoario parásito Tripanosoma cruzi, el cual es transmitido a los seres h umanos por los insectos succionadores de sangre. La enfermedad humana se presenta en dos etapas: La etapa aguda , que se presenta poco tiempo después de la infección , y la etapa crón ica , la cual puede desarrollarse durante muchos años. Las infecciones crónicas dan como resultado diferentes trastornos neurológicos , incluyendo demencia, daño al músculo card íaco , y algunas veces dilatación del tracto digestivo, así como pérdida de peso. La enfermedad crónica no tratada con frecuencia es fatal . Los fármacos actualmente disponibles para el tratamiento de la enfermedad de Chagas son nifu rtimox y benzonidazol . Sin embargo, los problemas con estas terapias actuales incluyen sus diversos efectos secundarios, la duración del tratamiento, y el requerimiento de supervisión médica durante el tratamiento. Adicionalmente, el tratamiento es en realidad solamente efectivo cuando se da durante la etapa aguda de la enfermedad. Ya se ha presentado resistencia a los dos fármacos de la línea frontal. Se ha propuesto el agente antifúngico de anfotericina b como un fármaco de segunda línea, pero este fármaco es costoso y relativamente tóxico.
La toxoplasmosis es endémica a través de la mayor parte del mundo, la cual puede infectar a una gran proporción de la población adulta. Sin embargo, su prevalencia difiere en diferentes países. Se estima que infecta a cuando menos el 10 por ciento de los adultos en los países templados del norte, y a más de la mitad de los adultos en los países del Mediterráneo y tropicales. Toxoplasma gondii es un protozoario intracelular obligado ubicuito y se considera que es la causa más común de retinitis infecciosa en los seres humanos, la cual depende de una variedad de factores, incluyendo el clima, la higiene, y los hábitos dietéticos. El curso de la enfermedad en los adultos inmunocompetentes es usualmente asintomático y auto-limitante. Tan pronto como se ha presentado la infección, el parásito forma quistes latentes en la retina y en otros órganos del cuerpo, los cuales pueden reactivarse años después de la infección inicial, dando lugar a una retinocoroiditis aguda y a la formación de nuevas lesiones retinocoroidales. [Arevalo y colaboradores, "Ocular Toxoplasmosis in the developing world", Internat. Oftal. Clin 2010].
La neurocisticercosis es la enfermedad pa rasitaria más com ún del sistema nervioso central (C N S) (incidencia de aproximadamente 2.5 m illones en todo el m u ndo) causada por las larvas de Taenia solium. La enfermedad tiene una larga fase asintomática en los seres humanos caracterizada por la ausencia de una respuesta inflamatoria detectable alrededor del parásito. La respuesta inmu nitaria global durante la fase asintomática es del fenotipo Th2. Sin embargo, la destrucción de las larvas mediante el tratamiento terapéutico o por el desgaste normal del parásito provoca u na fuerte respuesta inflamatoria, que consiste con frecuencia en una reacción granulomatosa crón ica y la manifestación de los síntomas típicos de la enfermedad. La respuesta inmunitaria en el sistema nervioso central (CNS) de los pacientes sintomáticos consiste en un fenotipo Th 1 evidente o una respuesta mixta de Th 1 , Th2, y Th3, dependiendo de la ausencia o presencia de granulomas. La respuesta h íper-inflamatoria prevaleciente d urante la fase sintomática en el sistema nervioso central (CNS) es responsable de la severa neu ropatología y mortalidad asociada con la neurocisticercosis. [Mishra y colaboradores, "TLRs in CNS Parasitic Infections", Curr Top Micro Imm 2009].
Existe una necesidad de proporcionar nuevos inhibidores de PI3K q ue sean buenos fármacos candidatos. En particular, los compuestos de la invención deben enlazarse potentemente a P I3K mientras q ue muestren poca afinidad por otros receptores y muestren la actividad funcional como inhibidores. Deben ser bien absorbidos desde el tracto gastrointestinal, deben ser metabólicamente estables, y deben poseer propiedades farmacocinéticas favorables. Cuando se dirijan contra los receptores del sistema nervioso central, deben cruzar la barrera hematoencefálica libremente, y cuando se dirijan selectivamente contra los receptores del sistema nervioso periférico, no deben cruzar la barrera hematoencefálica. No deben ser tóxicos, y deben demostrar pocos efectos secundarios. Adicionalmente, el fármaco candidato ideal existirá en una forma física que sea estable, no higroscópica y fácilmente formulada.
Los compuestos de la invención muestran cierto nivel de selectividad contra los diferentes parálogos de PI3K a, Q>, ?, y d. En particular, muestran cierto nivel de selectividad para la isoforma PI3K5.
Los compuestos de la presente invención, por consiguiente, son potencialmente útiles en el tratamiento de una amplia gama de trastornos, en particular los trastornos que incluyen, pero no se limitan a, trastornos autoinmunitarios, enfermedades inflamatorias, enfermedades alérgicas, inmunopatologías asociadas con enfermedades o infecciones, enfermedades de las vías respiratorias, tales como asma y enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), rechazo de trasplante, cánceres, por ejemplo, de origen hematopoiético, o tumores sólidos.
La invención también se refiere al tratamiento, ya sea solo o bien en combinación, con uno o más compuestos farmacológicamente activos diferentes, incluyendo los métodos para el tratamiento de condiciones, enfermedades o trastornos en donde una o más de las funciones de las células-B, tales como la producción de anticuerpos, la presentación de antígeno, la producción de citoquinas o la organogénesis linfoide, sean anormales o sean indeseables, incluyendo artritis reumatoide, pénfigo vulgar y las enfermedades relacionadas, púrpura trombocitopénica idiopática, lupus eritematoso sistémico, esclerosis múltiple, miastenia grave, síndrome de Sjógren, anemia hemolítica autoinmune, vasculitidas asociadas con ANCA, crioglobulinemia, púrpura trombocitopénica trombótica, urticaria autoinmune crónica, alergia (dermatitis atópica, dermatitis por contacto, rinitis alérgica), síndrome de Goodpasture, AMR (rechazo de trasplante mediado por anticuerpos), rechazo de trasplante híper-agudo, agudo y crónico mediado por células-B, y cánceres de origen hematopoiético, incluyendo, pero no limitándose a, mieloma múltiple; leucemia mielógena aguda; leucemia mielógena crónica; leucemia linfocítica; leucemia mieloide; linfoma no de Hodgkin; linfomas; policitemia vera; trombocitemia esencial; mielofibrosis con metaplasia mieloide; y enfermedad de Walden Stróem, así como en la inmunopatología asociada con enfermedades o infecciones.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a los compuestos de dihidro-benzo-oxazina y dihidro-pirido-oxazina de la fórmula (I) y/o a las sales farmacéuticamente aceptables y/o solvatos de los mismos: en donde: Y se selecciona a partir de O o N H ; V se selecciona a partir de CR5 ó N ; W se selecciona a partir de CH2, u O ; U se selecciona a partir de N o CH ; Q se selecciona a partir de N o CR6; en donde U y Q no son ambos N ; R1 se selecciona a partir de fenilo, piridilo, pirimidinilo, pirazinilo, piridazinilo, 1 ,2,3-triazinilo, 1 ,2 ,4-triazin ilo, 1 , 3,5-triazinilo, o -X-R4 en donde X se selecciona a partir de C(O) , S(0)2 ó CH2 y R4 se selecciona a partir de alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, halo-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, hidroxi-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, alcoxilo de 1 a 8 átomos de carbono-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, ciano-alq uilo de 1 a 8 átomos de carbono, N , N-di-alq uilo de 1 a 4 átomos de carbono-amino-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono-sulfonil-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, fenilo, heterociclilo, heterociclil-oxilo, heterociclil-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, cicloalquilo de 3 a 12 átomos de carbono, cicloalquiloxilo de 3 a 12 átomos de carbono, cicloalquilo de 3 a 12 átomos de carbono-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, heteroarilo, heteroaril-oxilo, heteroaril-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, hidroxilo, alcoxilo de 1 a 8 átomos de carbono, amino, N-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-amino, o N,N-di-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-amino, en donde el alquilo de 1 a 8 átomos de carbono en N-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-amino y en N,N-di-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-amino puede estar insustituido o sustituido por halógeno, hidroxilo, o alcoxilo de 1 a 4 átomos de carbono, en donde el cicloalquilo de 3 a 12 átomos de carbono en cicloalquilo de 3 a 12 átomos de carbono y en cicloalquilo de 3 a 12 átomos de carbono-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono puede estar insustituido o sustituido por 1 a 5 sustituyentes seleccionados a partir de halógeno, hidroxilo, o alcoxilo de 1 a 4 átomos de carbono; en donde el 'heterociclilo' es un sistema de anillo monocíclico de 3 a 7 miembros saturado o parcialmente insaturado que contiene de 1 a 3 heteroátomos seleccionados a partir de N, O o S, cada uno de los cuales está insustituido o sustituido por 1 a 5 sustituyentes seleccionados a partir de oxo, halógeno, alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, halo-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, hidroxi-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, hidroxilo, alcoxilo de 1 a 8 átomos de carbono, alcoxilo de 1 a 8 átomos de carbono-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, amino, N-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-amino, N,N-di-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-amino, alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-carbonilo, halo-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-carbonilo, hidroxi-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-carbonilo o alcoxilo de 1 a 8 átomos de carbono-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-carbonilo; en donde el 'heterociclilo' se puede unir en un heteroátomo o en un átomo de carbono, y en donde los heteroátomos de N y/o S también se pueden oxidar opcionalmente hasta diferentes estados de oxidación, en donde el 'heteroarilo' es un sistema de anillo monocíclico de 3 a 7 miembros completamente insaturado que contiene de 1 a 3 heteroátomos seleccionados a partir de N, O o S, o pirazolo-[1 ,5-a]-pirimidina o imidazo-[2, 1 -b]-tiazol, cada uno de los cuales está insustituido o sustituido por 1 a 5 sustituyentes seleccionados a partir de halógeno, alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, halo-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, hidroxi-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, hidroxilo, alcoxilo de 1 a 8 átomos de carbono, alcoxilo de 1 a 8 átomos de carbono-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, amino, N-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-amino, N, N-di-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-amino, alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-carbonilo, halo-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-carbonilo, hidroxi-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-carbonilo o alcoxilo de 1 a 8 átomos de carbono-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-carbonilo; en donde el 'heteroarilo' se puede unir en un heteroátomo o en un átom o de carbono , y en donde los heteroátomos de N y/o S también se pueden oxidar opcionalmente hasta d iferentes estados de oxidación ; R6 se selecciona a partir de hidrógeno , halógeno, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, halo-alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, alcoxilo de 1 a 4 átomos de carbono, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono-sulfonilo, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono-sulfinilo, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono-sulfanilo, halo-alcoxilo de 1 a 4 átomos de carbono, alcoxilo de 1 a 4 átomos de carbono-alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, amino, N-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-amino, ? ,?-di-alq uilo de 1 a 8 átomos de carbono-amino; R7 se selecciona a partir de hid rógeno, halógeno, ciano, nitro, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, halo-alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, alcoxilo de 1 a 4 átomos de carbono, N (R8)2-sulfonilo, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono-sulfonilo, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono-sulfonil-amino, alcoxilo de 1 a 8 átomos de carbono-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, amino, N-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-amino, o N , N-di-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-amino; o R6 y R7, son juntos CH = CH-CH = C H , en donde Rs se selecciona independientemente a partir de hidrógeno, alq uilo de 1 a 4 átomos de carbono, alcoxilo de 1 a 4 átomos de carbono, o dos R8 junto con el nitrógeno con el que están unidos , forman un anillo heterocíclico de 4 a 7 miembros que contiene de 1 a 2 heteroátomos seleccionados a partir de N , O, S, que está insustitu ido o sustitu ido por 1 a 3 sustituyentes seleccionados a partir de alquilo de 1 a 4 átom os de ca rbono ; R5 se selecciona independientemente a partir de H , D, F o alquilo de 1 a 2 átomos de carbono; R30 se selecciona independientemente a partir de H , D o F.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 es el patrón de difracción en polvo de rayos-X del Ejemplo F 1 , forma cristalina anhidra.
La Figu ra 2 es la g ráfica de calorimetría de exploración diferencial del Ejemplo F 1 , forma cristalina anhidra .
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA I NVENCIÓN A menos q ue se especifique de otra manera, el término "compuestos de la presente invención" se refiere a los compuestos de la fórmula (I) , y de las sub-fórmulas de la misma , a las sales del compuesto, a los hidratos o solvatos de los compuestos y/o sales, así como a todos los estereoisómeros (incluyendo diaestereoisómeros y enantiómeros) , tautómeros y compuestos isotópicamente marcados (incluyendo las sustituciones con deuterio) . Los compuestos de la presente invención comprenden además los polimorfos de los compuestos de la fórmula (I) (o de las subfórmulas de la misma), y las sales de los mismos. Cuando se mencionan los compuestos de la fórmula (I) , esto pretende incluir también los tautómeros y N-óxidos de los compuestos de la fórmula (I ) .
La invención se puede apreciar más completamente haciendo referencia a la sigu iente descripción , incluyendo el sigu iente glosario de términos y los ejemplos concluyentes. Como se utilizan en la presente, los términos "incluyendo", "conteniendo" y "comprendiendo" se utilizan en la presente en su sentido abierto, no limitante.
Los tautómeros, tales como los tautómeros entre la forma de ceto- y enol, la forma de lactama y lactima, la forma de amida y la forma de ácido imídico o la forma de enamina y la forma de imina, pueden estar presentes, por ejemplo, en la porción R1 de los compuestos de la fórmula (I). Los residuos de heterociclilo y heteroarilo que contienen nitrógeno pueden formar N-óxidos.
Cuando se utiliza la forma plural para los compuestos, sales, y similares, esto también significa un solo compuesto, sal, o similar.
Los términos generales utilizados anteriormente en la presente y más adelante en la presente, de preferencia tienen, dentro del contexto de esta divulgación, los siguientes significados, a menos que se indique de otra manera: Como se utiliza en la presente, el término "alquilo" se refiere a una fracción de hidrocarburo ramificado, incluyendo una sola o múltiples ramificaciones, o no ramificado, completamente saturado, que tiene hasta 20 átomos de carbono. A menos que se disponga de otra manera, alquilo se refiere a fracciones de hidrocarburo que tienen 1 a 16 átomos de carbono, de 1 a 10 átomos de carbono, de 1 a 7 átomos de carbono, o de 1 a 4 átomos de carbono. Los ejemplos representativos de alquilo incluyen, pero no se limitan a, metilo, etilo, propilo normal, isopropilo, butilo normal, butilo secundario, isobutilo, butilo terciario, pentilo normal, isopentilo, neopentilo, hexilo normal, 3-metil-hexilo, 2,2- dimetil-pentilo, 2,3-dimetil-pentilo, heptilo normal, octilo normal, nonilo normal, decilo normal, y similares. Típicamente, los grupos alquilo tienen de 1 a 7, más preferiblemente de 1 a 4 átomos de carbono.
Como se utiliza en la presente, el término "halo-alquilo" se refiere a un alquilo como se define en la presente, que está sustituido por uno o más grupos halógeno como se definen en la presente. El halo-alquilo puede ser mono-halo-alquilo, di-halo-alquilo o poli-halo-alquilo incluyendo per-halo-alquilo. Un mono-halo-alquilo puede tener un átomo de yodo, bromo, cloro o flúor dentro del grupo alquilo. Los grupos di-halo-alquilo y poli-halo-alquilo pueden tener dos o más de los mismos átomos de halógeno o una combinación de diferentes grupos halógeno dentro del alquilo. Típicamente, el poli-halo-alquilo contiene hasta 12, o 10, u 8, o 6, o 4, o 3, o 2 grupos halógeno. Los ejemplos no limitantes de halo-alquilo incluyen fluoro-metilo, di-fluoro-metilo, tri-fluoro-metilo, cloro-metilo, di-cloro-metilo, tri-cloro-metilo, penta-fluoro-etilo, hepta-fluoro-propilo, di-fluoro-cloro-metilo, di-cloro-fluoro-metilo, di-fluoro-etilo, di-fluoro-propilo, di-cloro-etilo y dicloro-propilo. Un per-halo-alquilo se refiere a un alquilo que tiene todos los átomos de hidrógeno reemplazados con átomos de halógeno.
Como se utiliza en la presente, el término "heterociclilo" o "heterocíclico" se refiere a un anillo o sistema de anillos monocíclico de 3 a 7 miembros o de 7 a 10 miembros, saturado o parcialmente saturado, que contiene cuando menos un heteroátomo seleccionado a partir de N, O, y S, en donde los átomos de N y S también se pueden oxidar opcionalmente hasta diferentes estados de oxidación. 'Heterociclilo' se puede unir en un heteroátomo o en un átomo de carbono. 'Heterociclilo' puede incluir anillos fusionados o puenteados, así como anillos espirocíclicos.
En el contexto de R4, los ejemplos de los heterociclos incluyen oxiranilo, aziridinilo, oxetanilo, tietanilo, acetitinilo, pirrolidinilo, tetrahidro-furanilo, tetrahidro-tiofenilo, 2,3-dihidro-furanilo, 2,5-dihidro-furanilo, 2,3-dihidro-tiofenilo, 1-pirrolinilo, 2-pirrolinilo, 3-pirrolinilo, tetrahidro-piranilo, piperidinilo, tetrahidro-tiopiranilo, morfolinilo, tiomorfolinilo, oxatianilo, dioxanilo, piperazinilo, dihidro-piranilo, tetrahidro-piridinilo, dihidro-tiopiranilo, azepanilo, tiepanilo y oxepanilo.
En el contexto de R8, los ejemplos de los heterociclos incluyen pirrolinilo, piperidinilo, morfolinilo, tiomorfolinilo, piperazinilo, tetrahidro-piridinilo y azepanilo.
Como se utiliza en la presente, el término "heteroarilo" o "heteroarílico" se refiere a un anillo o sistema de anillos insaturado monocíclico de 4, 5, 6, ó 7 miembros, bicíclico de 7, 8, 9, 10, 11, ó 12 miembros, o tricíclico de 10, 11, 12, 13, 14, ó 15 miembros - que lleva el número más alto posible de dobles enlaces conjugados en el(los) anillo(s), que contiene cuando menos un heteroátomo seleccionado a partir de N, O, y S, en donde los átomos de N y S también se pueden oxidar opcionalmente hasta diferentes estados de oxidación. 'Heteroarilo' se puede unir en un heteroátomo o en un átomo de carbono. 'Heteroarilo' pueden incluir anillos fusionados o puenteados, así como anillos espirocíclicos. Los ejemplos de heteroarilo incluyen furanilo, tiofenilo, pirrolilo, imidazolilo, pirazolilo, tiazolilo, isotiazolilo, oxazolilo, isoxazolilo, 1 ,2,5-oxadiazolilo, 1,2,4-oxadiazolilo, 1 ,2,3-oxadiazolilo, 1 ,3,4-oxadiazolilo, 1 ,2,5-tiadiazolilo, 1 ,2,4-tiadiazolilo, 1 ,2,3-tiadiazolilo, 1 ,3,4-tiadiazolilo, 1 ,2,3-triazolilo, 1 ,2,4-triazolilo, 1 ,2,5-triazolilo, piridilo, pirimidinilo, pirazinilo, piridazinilo, 1 ,2,3-triazinilo, 1 ,2,4-triazinilo y 1 ,3,5-triazinilo.
Como se utiliza en la presente, el término "cicloalquilo" se refiere a los grupos hidrocarburo monocíclicos, bicíclicos o tricíclicos, saturados o parcialmente insaturados de 3 a 12 átomos de carbono. A menos que se disponga de otra manera, cicloalquilo se refiere a los grupos hidrocarburo cíclicos que tienen entre 3 y 10 átomos de carbono del anillo, o entre 3 y 7 átomos de carbono del anillo. Los grupos hidrocarburo bicíclicos de ejemplo incluyen octahidro-indilo, decahidro-naftilo. Los grupos hidrocarburo tricíclicos de ejemplo incluyen biciclo-[2.1.1]-hexilo, biciclo-[2.2.1 ]-heptilo, biciclo-[2.2.1]-heptenilo, 6,6-dimetil-biciclo-[3.1.1 ]-heptilo, 2,6,6-trimetil-biciclo-[3.1.1 ]-heptilo, biciclo-[2.2.2]-octilo. Los grupos hidrocarburo tetracíclicos de ejemplo incluyen adamantilo.
Como se utiliza en la presente, el término "oxilo" se refiere a un grupo de enlace -O-.
Como se utiliza en la presente, el término "carboxilo" o "carboxi" es -COOH.
Como se utiliza en la presente, todos los sustituyentes se escriben de una manera para mostrar el orden de los grupos funcionales (grupos) de los que se componen. Los grupos funcionales se definen anteriormente en la presente.
En la presente se describen diferentes modalidades enumeradas de la invención. Se reconocerá que las características especificadas en cada modalidad se pueden combinar con otras características especificadas para proporcionar otras modalidades de la presente invención.
En una modalidad, la invención proporciona un compuesto de la fórmula (I) y/o una sal farmacéuticamente aceptable y/o un solvato del mismo, seleccionado a partir de un compuesto de la fórmula (I'): en donde R1, R5, R7, R30, Y, V, W, U y Q son como se definen anteriormente.
En una modalidad, la invención proporciona un compuesto de la fórmula (I) y/o una sal farmacéuticamente aceptable y/o un solvato del mismo, seleccionado a partir de un compuesto de la fórmula (la): en donde R1, R5, R7, R30, Y, V, U y Q son como se definen anteriormente.
En una modalidad, la invención proporciona un compuesto de la fórmula (I) y/o una sal farmacéuticamente aceptable y/o un solvato del mismo, seleccionado a partir de un compuesto de la fórmula (la'): en donde R1, R5, R7, R30 Y, V, U y Q son como se definen anteriormente.
En otra modalidad, la invención proporciona un compuesto de la fórmula (I) y/o una sal farmacéuticamente aceptable y/o un solvato del mismo, seleccionado a partir de un compuesto de la fórmula (Ib): en donde R\ R5, R7, R30, V, W, U y Q son como se definen anteriormente.
En otra modalidad, la invención proporciona un compuesto de la fórmula (I) y/o una sal farmacéuticamente aceptable y/o un solvato del mismo, seleccionado a partir de un compuesto de la fórmula (Ib'): en donde R\ R5, R7, R30, V, W, U y Q son como se definen anteriormente.
En otra modalidad, la invención proporciona un compuesto de la fórm ula (I ) y/o una sal farmacéuticamente aceptable y/o un solvato del m ism o , seleccionado a partir de un com puesto de la fórm ula (le): en donde R1 , R5, R7, U y Q son como se definen anteriormente.
En otra modalidad, la invención proporciona un compuesto de la fórmula (I ) y/o una sal farmacéuticamente aceptable y/o un solvato del mismo, seleccionado a partir de un compuesto de la fórmula (le'): en donde R1 , R5, R7, U y Q son como se definen anteriormente. En otra modalidad, la invención proporciona un compuesto de la fórmula (I) y/o una sal farmacéuticamente aceptable y/o un solvato del mismo, seleccionado a partir de un compuesto de la fórmula (Id): en donde R1, R5, R7, U y Q son como se definen anteriormente.
En otra modalidad, la invención proporciona un compuesto de la fórmula (I) y/o una sal farmacéuticamente aceptable y/o un solvato del mismo, seleccionado a partir de un compuesto de la fórmula (Id'): en donde R1, R5, R7, U y Q son como se definen anteriormente.
En otra modalidad, la invención proporciona un compuesto de la fórmula (I) y/o una sal farmacéuticamente aceptable y/o un solvato del mismo, seleccionado a partir de un compuesto de la fórmula (le): en donde R\ R5, R6 y R7 son como se definen anteriormente.
En otra modalidad, la invención proporciona un compuesto de la fórmula (I) y/o una sal farmacéuticamente aceptable y/o un solvato del mismo, seleccionado a partir de un compuesto de la fórmula (le'): en donde R1, R5, R6 y R7 son como se definen anteriormente. En otra modalidad, la invención proporciona un compuesto de la fórmula (I) y/o una sal farmacéuticamente aceptable y/o un solvato del mismo, seleccionado a partir de un compuesto de la fórmula (If): en donde R1, R5, R6 y R7 son como se definen anteriormente.
En otra modalidad, la invención proporciona un compuesto de la fórmula (I) y/o una sal farmacéuticamente aceptable y/o un solvato del mismo, seleccionado a partir de un compuesto de la fórmula (If): en donde R , R5, R6 y R7 son como se definen anteriormente. En otra modalidad, la invención proporciona un compuesto de la fórmula (I) y/o una sal farmacéuticamente aceptable y/o un solvato del mismo, seleccionado a partir de un compuesto de la fórmula (Ig): en donde X, R4, R5, R6 y R7 son como se definen anteriormente.
En otra modalidad, la invención proporciona un compuesto de la fórmula (I) y/o una sal farmacéuticamente aceptable y/o un solvato del mismo, seleccionado a partir de un compuesto de la fórmula (Ig'): en donde X, R4, R5, R6 y R7 son como se definen anteriormente.
En otra modalidad, la invención proporciona un compuesto de la fórmula (I) y/o una sal farmacéuticamente aceptable y/o un solvato del mismo, seleccionado a partir de un compuesto de la fórmula (Ih): en donde X, R4, R5, R6 y R7 son como se definen anteriormente.
En otra modalidad, la invención proporciona un compuesto de la fórmula (I) y/o una sal farmacéuticamente aceptable y/o un solvato del mismo, seleccionado a partir de un compuesto de la fórmula (Ih'): en donde X, R4, R5, R6 y R7 son como se definen anteriormente.
En otra modalidad, la invención proporciona un compuesto de la fórmula (I) y/o una sal farmacéuticamente aceptable y/o un solvato del mismo, seleccionado a partir de un compuesto de la fórmula (li): en donde R4, R5, R6 y R7 son como se definen anteriormente.
En otra modalidad, la invención proporciona un compuesto de la fórmula (I) y/o una sal farmacéuticamente aceptable y/o un solvato del mismo, seleccionado a partir de un compuesto de la fórmula (li'): en donde R4, R5, R6 y R7 son como se definen anteriormente. En otra modalidad, la invención proporciona un compuesto de la fórmula (I) y/o una sal farmacéuticamente aceptable y/o un solvato del mismo, seleccionado a partir de un compuesto de la fórmula (Ij): En otra modalidad, la invención proporciona un compuesto de la fórmula (I) y/o una sal farmacéuticamente aceptable y/o un solvato del mismo, seleccionado a partir de un compuesto de la fórmula (Ij'): En otra modalidad, la invención proporciona un compuesto de las fórmulas (I), (G), (la), (la'), (Ib), (Ib') (le), (IC), (Id), (Id'), (le), (le'), (If), (If), (Ig), (lg'), (Ih), (lh'), (li), (li'), (Ij) o (Ij') y/o una sal farmacéuticamente aceptable y/o un solvato del m ism o , en donde: R4 se selecciona a partir de alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, hidroxi-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, alcoxilo de 1 a 8 átomos de carbono-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, ciano-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, N , N-di-alquilo de 1 a 4 átomos de carbono-amino-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono , alquilo de 1 a 4 átomos de carbono-sulfonil-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, fenilo, heterociclilo, heterociclil-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, cicloalquilo de 3 a 12 átomos de carbono, heteroarilo, heteroaril-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, alcoxilo de 1 a 8 átomos de carbono, en donde el alquilo de 1 a 8 átomos de carbono en N-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-amino y en N , N-di-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-amino puede estar insustituido o sustituido por halógeno, hidroxilo, o alcoxilo de 1 a 4 átomos de carbono, en donde el cicloalquilo de 3 a 1 2 átomos de carbono en cicloalquilo de 3 a 12 átomos de carbono y en cicloalquilo de 3 a 1 2 átomos de carbono-alq uilo de 1 a 8 átomos de carbono puede estar insustituido o sustituido por halógeno, hidroxilo, o alcoxilo de 1 a 4 átomos de carbono; en donde el 'heterociclilo' es un sistema de anillo monocíclico de 3 a 7 miembros saturado o parcialmente insaturado que contiene de 1 a 3 heteroátomos seleccionados a partir de N , O o S, que está insustituido o sustituido por 1 a 5 sustituyentes seleccionados a partir de oxo, halógeno, alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, halo-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, hidroxi-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, hidroxilo, alcoxilo de 1 a 8 átomos de carbono, alcoxilo de 1 a 8 átomos de carbono-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, amino, N-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-amino, N,N-di-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-amino, alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-carbonilo, halo-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-carbonilo, hidroxi-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-carbonilo o alcoxilo de 1 a 8 átomos de carbono-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-carbonilo; en donde el 'heterociclilo' se puede unir en un heteroátomo o en un átomo de carbono, y en donde los heteroátomos de N y/o S también se pueden oxidar opcionalmente hasta diferentes estados de oxidación, en donde el 'heteroarilo' es un sistema de anillo monocíclico de 3 a 7 miembros completamente insaturado que contiene de 1 a 3 heteroátomos seleccionados a partir de N, O o S, o pirazolo-[1 ,5-a]-pirimidina o imidazo-[2, 1 -b]-tiazol, cada uno de los cuales está insustituido o sustituido por 1 a 5 sustituyentes seleccionados a partir de halógeno, alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, halo-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, hidroxi-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, hidroxilo, alcoxilo de 1 a 8 átomos de carbono, alcoxilo de 1 a 8 átomos de carbono-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, amino, N-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-amino, N,N-di-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-amino, alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-carbonilo, halo-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-carbonilo, hidroxi-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-carbonilo o alcoxilo de 1 a 8 átomos de carbono-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-carbonilo; en donde el 'heteroarilo' se puede unir en un heteroátomo o en un átomo de carbono, y en donde los heteroátomos de N y/o S también se pueden oxidar opcionalmente hasta diferentes estados de oxidación.
En otra modalidad, la invención proporciona un compuesto de las fórmulas (I), (G), (la), (la'), (Ib), (Ib') (le), (IC), (Id), (Id'), (le), (le'), (If), (If), (Ig), (lg'), (Ih), (lh'), (li), (?'), (Ij) o (lj') y/o una sal farmacéuticamente aceptable y/o un solvato del mismo, en donde: R4 se selecciona a partir de alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, hidroxi-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, alcoxilo de 1 a 8 átomos de carbono-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, ciano-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, N,N-di-alquilo de 1 a 4 átomos de carbono-amino-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono-sulfonil-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, fenilo, heterociclilo, heterociclil-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, cicloalquilo de 3 a 12 átomos de carbono, heteroarilo, heteroaril-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, alcoxilo de 1 a 8 átomos de carbono, en donde el alquilo de 1 a 8 átomos de carbono en N-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-amino y en N,N-di-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-amino puede estar insustituido o sustituido por halógeno, hidroxilo, o alcoxilo de 1 a 4 átomos de carbono, en donde el cicloalquilo de 3 a 12 átomos de carbono en cicloalquilo de 3 a 12 átomos de carbono y en cicloalquilo de 3 a 12 átomos de carbono-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono puede estar insustituido o sustituido por halógeno, hidroxilo, o alcoxilo de 1 a 4 átomos de carbono; en donde el 'heterocicIMo' se selecciona a partir de pirrolidinilo, tetrahidro-furanilo, tetrahidro-tiofenilo, tetrahidro-piranilo, piperidinilo, tetrahidro-tiopiranilo, morfolinilo, dioxanilo o dihidro-piranilo, cada uno de los cuales está insustituido o sustituido por 1 a 3 sustituyentes seleccionados a partir de oxo, alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, o alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-carbonilo; en donde el 'heterocicIMo' se puede unir en un heteroátomo o en un átomo de carbono, y en donde los heteroátomos de N y/o S también se pueden oxidar opcionalmente hasta diferentes estados de oxidación, en donde el 'heteroarilo' se selecciona a partir de imidazolilo, pirazolilo, tiazolilo, oxazolilo, 1 ,2,5-oxadiazolilo, 1 ,3,4-oxadiazolilo, piridilo, pirimidinilo, pirazinilo, pirazolo-[1 ,5-a]-pirimidina o imidazo-[2, 1 -b]-tiazol, cada uno de los cuales está insustituido o sustituido por 1 a 3 sustituyentes seleccionados a partir de alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, hidroxilo o amino; en donde el 'heteroarilo' se puede unir en un heteroátomo o en un átomo de carbono, y en donde los heteroátomos de N y/o S también se pueden oxidar opcionalmente hasta diferentes estados de oxidación.
En otra modalidad, la invención proporciona un compuesto de las fórmulas (I), (G), (la), (la'), (Ib), (Ib') (le), (le'), (Id), (Id'), (le), (le'), (If), (lf), (Ig), (lg'), (Ih), (lh'), (li), (?'), (Ij) o (lj') y/o una sal farmacéuticamente aceptable y/o un solvato del mismo, en donde: R6 se selecciona a partir de halógeno, alcoxilo de 1 a 4 átomos de carbono, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono-sulfonilo, o halo-alcoxilo de 1 a 4 átomos de carbono.
En otra modalidad, la invención proporciona un compuesto de las fórmulas (I), (G), (la), (la'), (Ib), (Ib') (le), (IC), (Id), (Id'), (le), (le'), (If), (lf), (Ig), (lg'), (Ih), (lh'), (li), (?'), (Ij) o (lj') y/o una sal farmacéuticamente aceptable y/o un solvato del mismo, en donde: R7 se selecciona a partir de hidrógeno, halógeno, ciano, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, halo-alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, o alcoxilo de 1 a 4 átomos de carbono.
En otra modalidad, la invención proporciona un compuesto de las fórmulas (I), (G), (la), (la'), (Ib), (Ib') (le), (IC), (Id), (Id'), (le), (le'), (lf), (lf), (lg), (lg'), (lh), (lh'), (li), (?'), (lj) o (lj') y/o una sal farmacéuticamente aceptable y/o un solvato del mismo, en donde: R4 se selecciona a partir de alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, hidroxi-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, alcoxilo de 1 a 8 átomos de carbono-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, ciano-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, N,N-di-alquilo de 1 a 4 átomos de carbono-amino-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono-sulfonil-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, fenilo, heterociclilo, heterociclil-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, cicloalquilo de 3 a 12 átomos de carbono, heteroarilo, heteroaril-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, alcoxilo de 1 a 8 átomos de carbono, en donde el alquilo de 1 a 8 átomos de carbono en N-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-amino y en N,N-di-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-amino puede estar insustituido o sustituido por halógeno, hidroxilo, o alcoxilo de 1 a 4 átomos de carbono, en donde el cicloalquilo de 3 a 12 átomos de carbono en cicloalquilo de 3 a 12 átomos de carbono y en cicloalquilo de 3 a 12 átomos de carbono-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono puede estar insustituido o sustituido por halógeno, hidroxilo, o alcoxilo de 1 a 4 átomos de carbono; en donde el 'heterociclilo' es un sistema de anillo monocíclico de 3 a 7 miembros saturado o parcialmente insaturado que contiene de 1 a 3 heteroátomos seleccionados a partir de N, O o S, que está insustituido o sustituido por 1 a 5 sustituyentes seleccionados a partir de oxo, halógeno, alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, halo-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, hidroxi-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, hidroxilo, alcoxilo de 1 a 8 átomos de carbono, alcoxilo de 1 a 8 átomos de carbono-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, amino, N-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-amino, N,N-di-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-amino, alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-carbonilo, halo-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-carbonilo, hidroxi-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-carbonilo o alcoxilo de 1 a 8 átomos de carbono-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-carbonilo; en donde el 'heterociclilo' se puede unir en un heteroátomo o en un átomo de carbono, y en donde los heteroátomos de N y/o S también se pueden oxidar opcionalmente hasta diferentes estados de oxidación, en donde el 'heteroarilo' es un sistema de anillo monocíclico de 3 a 7 miembros completamente insaturado que contiene de 1 a 3 heteroátomos seleccionados a partir de N, O o S, o pirazolo-[1 ,5-a]-pirimidina o imidazo-[2, 1 -b]-tiazol, cada uno de los cuales está insustituido o sustituido por 1 a 5 sustituyentes seleccionados a partir de halógeno, alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, halo-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, hidroxi-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, hidroxilo, alcoxilo de 1 a 8 átomos de carbono, alcoxilo de 1 a 8 átomos de carbono-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, amino, N-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-amino, N,N-di-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-amino, alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-carbonilo, halo-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-carbonilo, hidroxi-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-carbonilo o alcoxilo de 1 a 8 átomos de carbono-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-carbonilo; en donde el 'heteroarilo' se puede unir en un heteroátomo o en un átomo de carbono, y en donde los heteroátomos de N y/o S también se pueden oxidar opcionalmente hasta diferentes estados de oxidación; y R6 se selecciona a partir de halógeno, alcoxilo de 1 a 4 átomos de carbono, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono-sulfonilo, o halo-alcoxilo de 1 a 4 átomos de carbono.
En otra modalidad, la invención proporciona un compuesto de las fórmulas (I), (G), (la), (la'), (Ib), (Ib') (le), (IC), (Id), (Id'), (le), (le'), (If), (lf), (Ig), (lg'), (Ih), (lh'), (li), (?'), (Ij) o (lj') y/o una sal farmacéuticamente aceptable y/o un solvato del mismo, en donde: R4 se selecciona a partir de alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, hidroxi-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, alcoxilo de 1 a 8 átomos de carbono-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, ciano-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, N ,?-di-alquilo de 1 a 4 átomos de carbono-amino-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono-sulfonil-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, fenilo, heterociclilo, heterociclil-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, cicloalquilo de 3 a 12 átomos de carbono, heteroarilo, heteroaril-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, alcoxilo de 1 a 8 átomos de carbono, en donde el alquilo de 1 a 8 átomos de carbono en N-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-amino y en N ,N-di-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-amino puede estar insustituido o sustituido por halógeno, hidroxilo, o alcoxilo de 1 a 4 átomos de carbono, en donde el cicloalquilo de 3 a 12 átomos de carbono en cicloalquilo de 3 a 12 átomos de carbono y en cicloalquilo de 3 a 12 átomos de carbono-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono puede estar insustituido o sustituido por halógeno, hidroxilo, o alcoxilo de 1 a 4 átomos de carbono; en donde el 'heterociclilo' es un sistema de anillo monocíclico de 3 a 7 miembros saturado o parcialmente insaturado que contiene de 1 a 3 heteroátomos seleccionados a partir de N, O o S, que está insustituido o sustituido por 1 a 5 sustituyentes seleccionados a partir de oxo, halógeno, alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, halo-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, hidroxi-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, hidroxilo, alcoxilo de 1 a 8 átomos de carbono, alcoxilo de 1 a 8 átomos de carbono-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, amino, N-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-amino, N , N-di-a Iq uilo de 1 a 8 átomos de carbono-amino, alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-carbonilo, halo-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-carbonilo, hidroxi-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-carbonilo o alcoxilo de 1 a 8 átomos de carbono-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-carbonilo; en donde el 'heterociclilo' se puede unir en un heteroátomo o en un átomo de carbono, y en donde los heteroátomos de N y/o S también se pueden oxidar opcionaimente hasta diferentes estados de oxidación, en donde el 'heteroarilo' es un sistema de anillo monocíclico de 3 a 7 miembros completamente insaturado que contiene de 1 a 3 heteroátomos seleccionados a partir de N, O o S, o pirazolo-[1 ,5-a]-pirimidina o imidazo-[2,1 -b]-tiazol, cada uno de los cuales está insustituido o sustituido por 1 a 5 sustituyentes seleccionados a partir de halógeno, alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, halo-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, hidroxi-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, hidroxilo, alcoxilo de 1 a 8 átomos de carbono, alcoxilo de 1 a 8 átomos de carbono-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, amino, N-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-amino, N , N-d i-alqu ilo de 1 a 8 átomos de carbono-amino, alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-carbonilo, halo-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-carbonilo, hidroxi-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-carbonilo o alcoxilo de 1 a 8 átomos de carbono-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-carbonilo; en donde el 'heteroarilo' se puede unir en un heteroátomo o en un átomo de carbono, y en donde los heteroátomos de N y/o S también se pueden oxidar opcionaimente hasta diferentes estados de oxidación; y R7 se selecciona a partir de hidrógeno, halógeno, ciano, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, halo-alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, o alcoxilo de 1 a 4 átomos de carbono.
En otra modalidad, la invención proporciona un compuesto de las fórmulas (I), (G), (la), (la'), (Ib), (Ib') (le), (le'), (Id), (Id'), (le), (le'), (If), (lf), (Ig), (lg'), (Ih), (lh'), (li), (??'), (Ij) o (Ij1) y/o una sal farmacéuticamente aceptable y/o un solvato del mismo, en donde: R4 se selecciona a partir de alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, hidroxi-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, alcoxilo de 1 a 8 átomos de carbono-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, ciano-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, N,N-di-alquilo de 1 a 4 átomos de carbono-amino-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono-sulfonil-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, fenilo, heterociclilo, heterociclil-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, cicloalquilo de 3 a 12 átomos de carbono, heteroarilo, heteroaril-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, alcoxilo de 1 a 8 átomos de carbono, en donde el alquilo de 1 a 8 átomos de carbono en N-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-amino y en N,N-di-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-amino puede estar insustituido o sustituido por halógeno, hidroxilo, o alcoxilo de 1 a 4 átomos de carbono, en donde el cicloalquilo de 3 a 12 átomos de carbono en cicloalquilo de 3 a 12 átomos de carbono y en cicloalquilo de 3 a 12 átomos de carbono-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono puede estar insustituido o sustituido por halógeno, hidroxilo, o alcoxilo de 1 a 4 átomos de carbono; en donde el 'heterociclilo' es un sistema de anillo monocíclico de 3 a 7 miembros saturado o parcialmente insaturado que contiene de 1 a 3 heteroátomos seleccionados a partir de N, O o S, que está insustituido o sustituido por 1 a 5 sustituyentes seleccionados a partir de oxo, halógeno, alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, halo-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, hidroxi-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, hidroxilo, alcoxilo de 1 a 8 átomos de carbono, alcoxilo de 1 a 8 átomos de carbono-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, amino, N-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-amino, , N-di-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-amino, alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-carbonilo, halo-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-carbonilo, hidroxi-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-carbonilo o alcoxilo de 1 a 8 átomos de carbono-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-carbonilo; en donde el 'heterociclilo' se puede unir en un heteroátomo o en un átomo de carbono, y en donde los heteroátomos de N y/o S también se pueden oxidar opcionalmente hasta diferentes estados de oxidación, en donde el 'heteroarilo' es un sistema de anillo monocíclico de 3 a 7 miembros completamente insaturado que contiene de 1 a 3 heteroátomos seleccionados a partir de N, O o S, o pirazolo-[1 ,5-a]-pirimidina o ¡midazo-[2, 1 -b]-tiazol, cada uno de los cuales está insustituido o sustituido por 1 a 5 sustituyentes seleccionados a partir de halógeno, alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, halo-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, hidroxi-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, hidroxilo, alcoxilo de 1 a 8 átomos de carbono, alcoxilo de 1 a 8 átomos de carbono-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, amino, N-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-amino, N, N-di-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-amino, alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-carbonilo, halo-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-carboniio, hidroxi-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-carboniio o alcoxilo de 1 a 8 átomos de carbono-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-carboniio; en donde el 'heteroarilo' se puede unir en un heteroátomo o en un átomo de carbono, y en donde los heteroátomos de N y/o S también se pueden oxidar opcionalmente hasta diferentes estados de oxidación; R6 se selecciona a partir de halógeno, alcoxilo de 1 a 4 átomos de carbono, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono-sulfonilo, o halo-alcoxilo de 1 a 4 átomos de carbono; y R7 se selecciona a partir de hidrógeno, halógeno, ciano, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, halo-alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, o alcoxilo de 1 a 4 átomos de carbono.
En otra modalidad, los compuestos individuales de acuerdo con la invención son aquéllos enlistados en la sección de Ejemplos más adelante.
Como se utiliza en la presente, el término "un isómero óptico" o "un estereoisómero" se refiere a cualquiera de las diferentes configuraciones estereoisoméricas, las cuales pueden existir para un compuesto dado de la presente invención, e incluyen los isómeros geométricos. Se entiende que un sustituyente se puede unir en un centro quiral de un átomo de carbono. El término "quiral" se refiere a las moléculas que tienen la propiedad de no poderse sobreponer en su compañera de imagen de espejo, mientras que el término "aquiral" se refiere a las moléculas que se pueden sobreponer en su compañera de imagen de espejo. Por consiguiente, la invención incluye los enantiómeros, diaestereómeros o racematos del compuesto. "Enantiómeros" son un par de estereoisómeros que son imágenes de espejo que no se pueden sobreponer una en la otra. Una mezcla de 1:1 de un par de enantiómeros es una mezcla "racémica". El término se utiliza para designar una mezcla racémica donde sea apropiado. "Diaestereoisómeros" son estereoisómeros que tienen cuando menos dos átomos asimétricos, pero que no son imágenes de espejo uno del otro. La estereoquímica absoluta se especifica de acuerdo con el sistema de Cahn-Ingold-Prelog R-S. Cuando un compuesto es un enantiómero puro, la estereoquímica en cada átomo de carbono quiral se puede especificar mediante cualquiera de R o S. Los compuestos resueltos cuya configuración absoluta se desconoce, se pueden designar como (+) o (-) dependiendo de la dirección (dextrógira o levógira) en que roten la luz polarizada en el plano a la longitud de onda de la línea de sodio D. Algunos de los compuestos descritos en la presente contienen uno o más centros o ejes asimétricos y, por consiguiente, pueden dar lugar a enantiómeros, diaestereómeros, y otras formas estereoisoméricas que se puedan definir en términos de estereoquímica absoluta, como (R) o (S).
Dependiendo de la elección de los materiales de partida y de los procedimientos, los compuestos pueden estar presentes en la forma de uno de los posibles isómeros o como mezclas de los mismos, por ejemplo, como los isómeros ópticos puros, o como mezclas de isómeros, tales como racematos y mezclas de diaestereoisómeros, dependiendo del número de átomos de carbono asimétricos. La presente invención pretende incluir todos los posibles isómeros, incluyendo las mezclas racémicas, las mezclas diaestereoméricas, y las formas ópticamente puras. Los isómeros (R) y (S) ópticamente activos se pueden preparar utilizando sintones quirales o reactivos quirales, o se pueden resolver empleando técnicas convencionales. Si el compuesto contiene un doble enlace, el sustituyente puede estar en la configuración E o Z. Si el compuesto contiene a dicicloalquilo sustituido, el sustituyente de cicloalquilo puede tener una configuración cis o trans. También se pretende incluir a todas las formas tautoméricas.
Como se utilizan en la presente, los términos "sal" o "sales" se refieren a una sal de adición de ácido o de base de un compuesto de la invención. Las "sales" incluyen en particular las "sales farmacéuticas aceptables". El término "sales farmacéuticamente aceptables" se refiere a las sales que retienen la efectividad biológica y las propiedades de los compuestos de esta invención, y que típicamente no sean biológicamente o de otra manera indeseables. En muchos casos, los compuestos de la presente invención son capaces de formar sales de ácido y/o de base en virtud de la presencia de los grupos amino y/o carboxilo, o grupos similares a los mismos.
Las sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables se pueden formar con ácidos inorgánicos y ácidos orgánicos, por ejemplo, las sales de acetato, aspartato, benzoato, besilato, bromuro/bromhidrato, bicarbonato/carbonato, bisulfato/sulfato, canforsulfonato, cloruro/clorhidrato, clorteofilonato, citrato, etan-disulfonato, fumarato, gluceptato, gluconato, glucuronato, hipurato, yodhidrato/yoduro, isetionato, lactato, lactobionato, lauril-sulfato, malato, maleato, malonato, mandelato, mesilato, metil-sulfato, naftoato, napsilato, nicotinato, nitrato, octadecanoato, oleato, oxalato, palmitato, pamoato, fosfato / fosfato ácido / fosfato diácido, poligalacturonato, propionato, estearato, succinato, sulfosalicilato, tartrato, tosilato, y trifluoro-acetato.
Los ácidos inorgánicos a partir de los cuales se pueden derivar las sales incluyen, por ejemplo, ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, y similares.
Los ácidos orgánicos a partir de los cuales se pueden derivar las sales incluyen, por ejemplo, ácido acético, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido oxálico, ácido maleico, ácido malónico, ácido succínico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido mandélico, ácido metan-sulfónico, ácido etan-sulfónico, ácido p-toluen-sulfónico, ácido sulfosalicílico, y similares. Las sales de adición de base farmacéuticamente aceptables se pueden formar con bases inorgánicas y orgánicas.
Las bases inorgánicas a partir de las cuales se pueden derivar las sales incluyen, por ejemplo, las sales de amonio y de los metales a partir de las columnas I a XII de la Tabla Periódica. En ciertas modalidades, las sales se derivan a partir de sodio, potasio, amonio, calcio, magnesio, hierro, plata, zinc, y cobre; las sales particularmente adecuadas incluyen las sales de amonio, potasio, sodio, calcio, y magnesio.
Las bases orgánicas a partir de las cuales se pueden derivar las sales incluyen, por ejemplo, aminas primarias, secundarias, y terciarias, aminas sustituidas, incluyendo las aminas sustituidas que se presentan naturalmente, aminas cíclicas, resinas básicas de intercambio de iones, y similares. Ciertas aminas orgánicas incluyen isopropil-amina, benzatina, colinato, dietanolamina, dietil-amina, Usina, meglumina, piperazina, y trometamina.
Las sales farmacéuticamente aceptables de la presente invención se pueden sintetizar a partir de una fracción básica o ácida, mediante métodos químicos convencionales. En términos generales, estas sales se pueden preparar mediante la reacción de las formas del ácido libre de estos compuestos con una cantidad estequiométrica de la base apropiada (tales como hidróxido, carbonato, bicarbonato de Na, Ca, Mg, o K, o similares), o mediante la reacción de las formas de base libre de estos compuestos con una cantidad estequiométrica del ácido apropiado. Estas reacciones típicamente se llevan a cabo en agua o en un solvente orgánico, o en una mezcla de los dos. En términos generales, es deseable el uso de un medio no acuoso como éter, acetato de etilo, etanol, isopropanol, o acetonitrilo, en donde sea practicable. Se pueden encontrar listas de sales adecuadas adicionales, por ejemplo, en "Remington's Pharmaceutical Sciences", 20a Edición, Mack Publishing Company, Easton, Pa., (1985); y en "Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use" por Stahl y Wermuth (Wiley-VCH, Weinheim, Alemania, 2002).
Cualquier fórmula dada en la presente también pretende representar las formas no marcadas así como las formas isotópicamente marcadas de los compuestos. Los compuestos isotópicamente marcados tienen las estructuras ilustradas por las fórmulas dadas en la presente, excepto que uno o más átomos son reemplazados por un átomo que tiene una masa atómica o número de masa seleccionados. Los ejemplos de los isótopos que se pueden incorporar en los compuestos de la invención incluyen los isótopos de hidrógeno, carbono, nitrógeno, oxígeno, fósforo, flúor, y cloro, tales como 2H, 3H, 11C, 3C, 4C, 15N, 18F 31P, 32P, 35S, 36CI, 125l, respectivamente. La invención incluye diferentes compuestos isotópicamente marcados como se definen en la presente, por ejemplo, aquéllos en donde están presentes los isótopos radioactivos, tales como 3H y 14C, o aquéllos en donde están presentes los isótopos no radioactivos, tales como 2H y 13C. Estos compuestos isotópicamente marcados son útiles en los estudios metabólicos (con 14C), en los estudios de cinética de reacción (con, por ejemplo 2H ó 3H), en las técnicas de detección o de formación de imágenes , tales como tom og rafía por em isión de positrones (P ET) o tomog rafía com putarizada con em isión de un solo fotó n (SP ECT) , incluyendo los ensayos de d istribución del fárm aco o del sustrato en el tejido, o en el tratam iento rad ioactivo de los pacientes . En particula r, puede ser particularmente deseable u n com puesto de 1 8F o marcado para los estudios de PET o SPECT. Los compuestos isotópicamente marcados de la fórmula (I) se pueden preparar en términos generales mediante las técnicas convencionales conocidas por los expertos en este campo o mediante procesos análogos a aquéllos descritos en los ejemplos y preparaciones acompañantes, utilizando u n reactivo isotópicamente marcado apropiado en lugar del reactivo no marcado previamente empleado.
Además, la sustitución con isótopos más pesados, en particular deuterio (es decir, 2H o D) puede proporcionar ciertas ventajas terapéuticas resultantes de la mayor estabilidad metabólica , por ejemplo un aumento de la vida media in vivo o req uerimientos de dosificación reducida o una mejora en el índice terapéutico. Se entiende q ue el deuterio en este contexto se considera como un sustituyente de u n compuesto de la fórmula (I). La concentración de este isótopo más pesado, específicamente deuterio, se puede definir por el factor de enriquecimiento isotópico. El término "factor de enriquecimiento isotópico", como se utiliza en la presente, significa la proporción entre la abu ndancia isotópica y la abundancia natural de un isótopo especificado. Si u n sustituyente en un compuesto de esta invención es denotado como deuterio, este compuesto tiene un factor de enriquecimiento isotópico para cada átomo de deuterio designado de cuando menos 3500 (52.5 por ciento de incorporación de deuterio en cada átomo de deuterio designado), de cuando menos 4000 (60 por ciento de incorporación de deuterio), de cuando menos 4500 (67.5 por ciento de incorporación de deuterio), de cuando menos 5000 (75 por ciento de incorporación de deuterio), de cuando menos 5500 (82.5 por ciento de incorporación de deuterio), de cuando menos 6000 (90 por ciento de incorporación de deuterio), de cuando menos 6333.3 (95 por ciento de incorporación de deuterio), de cuando menos 6466.7 (97 por ciento de incorporación de deuterio), de cuando menos 6600 (99 por ciento de incorporación de deuterio), o de cuando menos 6633.3 (99.5 por ciento de incorporación de deuterio).
Los solvatos farmacéuticamente aceptables de acuerdo con la invención incluyen aquéllos en donde el solvente de cristalización puede ser isotópicamente sustituido, por ejemplo, D20, d6-acetona, DMSQ-de.
Los compuestos de la invención, es decir, los compuestos de la fórmula (I), que contienen grupos capaces de actuar como donadores y/o aceptores para los enlaces de hidrógeno, pueden ser capaces de formar co-cristales con formadores de co-cristales adecuados. Estos co-cristales se pueden preparar a partir de los compuestos de la fórmula (I) mediante los procedimientos de formación de co-cristales conocidos. Estos procedimientos incluyen molienda, calentamiento, co-sublimación, co-fusión, o contacto en solución de los compuestos de la fórmula (I) con el formador de co-cristales bajo condiciones de cristalización, y el aislamiento de los co-cristales formados de esta manera. Los formadores de co-cristales adecuados incluyen aquéllos descritos en la Publicación Internacional Número WO 2004/078163. Por consiguiente, la invención proporciona además co-cristales, los cuales comprenden un compuesto de la fórmula (I).
Como se utiliza en la presente, el término "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, tensoactivos, antioxidantes, conservadores (por ejemplo, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos), agentes isotónicos, agentes retardantes de absorción, sales, conservadores, estabilizantes de fármacos, aglutinantes, excipientes, agentes de desintegración, lubricantes, agentes edulcorantes, agentes saborizantes, tintes, y similares, y combinaciones de los mismos, como serían conocidos por los expertos en este campo (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Edición, Mack Printing Company, 1990, páginas 1289-1329). Excepto hasta donde cualquier vehículo convencional sea incompatible con el ingrediente activo, se contempla su uso en las composiciones terapéuticas o farmacéuticas.
El término "una cantidad terapéuticamente efectiva" de un compuesto de la presente invención se refiere a una cantidad del compuesto de la presente invención que provocará la respuesta biológica o médica de un sujeto, por ejemplo, la reducción o inhibición de la actividad de una enzima o de una proteína, o que mitigará los síntomas, aliviará las condiciones, hará más lento o retardará el progreso de la enfermedad, o prevendrá una enfermedad, etc. En una modalidad no limitante, el término "una cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la cantidad del compuesto de la presente invención que, cuando se administra a un sujeto, es efectiva para: (1) cuando menos parcialmente aliviar, inhibir, impedir y/o mitigar una condición, o un trastorno, o una enfermedad (i) mediada por PI3K, o (ii) asociada con la actividad de PI3K, o (iii) caracterizada por una actividad (normal o anormal) de PI3K, o (2) reducir o inhibir la actividad de PI3K, o (3) reducir o inhibir la expresión de PI3K. En otra modalidad no limitante, el término "una cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la cantidad del compuesto de la presente invención que, cuando se administra a una célula, o a un tejido, o a un material biológico no celular, o a un medio, es efectiva para reducir o inhibir cuando menos parcialmente la actividad de PI3K; o para reducir o inhibir cuando menos parcialmente la expresión de PI3K. El significado del término "una cantidad terapéuticamente efectiva" como se ilustra en la modalidad anterior para PI3K también se aplica por el mismo medio a cualesquiera otras proteínas/péptidos/enzimas relevantes.
Como se utiliza en la presente, el término "sujeto" se refiere a un animal. Típicamente, el animal es un mamífero. Un sujeto también se refiere, por ejemplo, a primates (por ejemplo, a seres humanos, masculinos o femeninos), reses, ovejas, cabras, caballos, perros, gatos, conejos, ratas, ratones, peces, aves y similares. En ciertas modalidades, el sujeto es un primate. En todavía otras modalidades, el sujeto es un ser humano.
Como se utiliza en la presente, el término "inhibir", "inhibición", o "inhibiendo" se refiere a la reducción o supresión de una condición, síntoma, o trastorno, o enfermedad dados, o a una disminución significativa en la actividad de la línea base de una actividad o proceso biológico.
Como se utiliza en la presente, el término "tratar", "tratando", o "tratamiento" de cualquiera enfermedad o trastorno, se refiere, en una modalidad, a mitigar la enfermedad o el trastorno (es decir, hacer más lento o detener o reducir el desarrollo de la enfermedad, o de cuando menos uno de los síntomas clínicos de la misma). En otra modalidad, "tratar", "tratando", o "tratamiento" se refiere a aliviar o mitigar cuando menos un parámetro físico, incluyendo aquéllos que no puedan ser discernibles por parte del paciente. En todavía otra modalidad, "tratar", "tratando", o "tratamiento" se refiere a modular la enfermedad o el trastorno, ya sea físicamente (por ejemplo, la estabilización de un síntoma discernible), fisiológicamente (por ejemplo, la estabilización de un parámetro físico), o ambas. En todavía otra modalidad, "tratar", "tratando", o "tratamiento" se refiere a prevenir o retardar el establecimiento o desarrollo o progreso de la enfermedad o del trastorno.
Como se utiliza en la presente, un sujeto está "en necesidad de" tratamiento, si este sujeto se beneficiaría biológicamente, médicamente, o en su calidad de vida, a partir de dicho tratamiento.
Como se utiliza en la presente, el término "un", "uno", "el", y términos similares utilizados en el contexto de la presente invención (en especial en el contexto de las reivindicaciones), se deben interpretar para cubrir tanto el singular como el plural, a menos que se indique de otra manera en la presente o que sea claramente contradicho por el contexto.
Todos los métodos descritos en la presente se pueden llevar a cabo en cualquier orden adecuado, a menos que se indique de otra manera en la presente o que sea claramente contradicho de otra manera por el contexto. El uso de cualquiera y todos los ejemplos, o del lenguaje de ejemplo (por ejemplo, "tal como") proporcionados en la presente, pretende meramente iluminar mejor la invención, y no presenta una limitación sobre el alcance de la invención reivindicada de otra manera.
Cualquier átomo asimétrico (por ejemplo, carbono, o similares) de los compuestos de la presente invención, puede estar presente en una configuración racémica o enantioméricamente enriquecida, por ejemplo en la configuración (R), (S) o (R,S). En ciertas modalidades, cada átomo asimétrico tiene un exceso enantiomérico de cuando menos el 50 por ciento, un exceso enantiomérico de cuando menos el 60 por ciento, un exceso enantiomérico de cuando menos el 70 por ciento, un exceso enantiomérico de cuando menos el 80 por ciento, un exceso enantiomérico de cuando menos el 90 por ciento, un exceso enantiomérico de cuando menos el 95 por ciento, o un exceso enantiomérico de cuando menos el 99 por ciento en la configuración (R) o (S). Los sustituyentes en los átomos con dobles enlaces insaturados, si es posible, pueden estar presentes en la forma c/s (Z) o trans (E).
De conformidad con lo anterior, como se utiliza en la presente, un compuesto de la presente invención puede estar en la forma de uno de los posibles isómeros, rotámeros, atropisómeros, tautómeros, o mezclas de los mismos, por ejemplo, como isómeros geométricos (c/s o trans), diaestereómeros, isómeros ópticos (antípodas), o racematos sustancialmente puros, o mezclas de los mismos.
Cualesquiera mezclas de isómeros resultantes se pueden separar con base en las diferencias fisicoquímicas de los constituyentes, en los isómeros geométricos u ópticos diaestereómeros, racematos puros o sustancialmente puros, por ejemplo, mediante cromatografía y/o cristalización fraccionaria.
Cualesquiera racematos resultantes de los productos finales o intermediarios se pueden resolver en los antípodas ópticos mediante los métodos conocidos, por ejemplo, mediante la separación de las sales diaestereoméricas de los mismos, obtenidas con un ácido o base ópticamente activos, y liberando el compuesto ácido o básico ópticamente activo. En particular, por consiguiente, se puede emplear una fracción básica para resolver los compuestos de la presente invención en sus antípodas ópticos, por ejemplo, mediante la cristalización fraccionaria de una sal formada con un ácido ópticamente activo, por ejemplo, ácido tartárico, ácido dibenzoil- tartárico, ácido diacetil-tartárico, ácido di-O, O'-p-toluoil-tartárico, ácido mandélico, ácido málico, o ácido canfor-10-sulfónico. Los productos racémicos también se pueden resolver mediante cromatografía quiral, por ejemplo, cromatografía de líquidos a alta presión (HPLC), utilizando un adsorbente quiral.
Adicionalmente, los compuestos de la presente invención, incluyendo sus sales, también se pueden obtener en la forma de sus hidratos, o pueden incluir otros solventes utilizados para su cristalización. Los compuestos de la presente invención pueden formar, inherentemente o por diseño, solvatos, con los solventes farmacéuticamente aceptables (incluyendo agua); por consiguiente, se pretende que la invención abarque las formas tanto solvatadas como no solvatadas. El término "solvato" se refiere a un complejo molecular de un compuesto de la presente invención (incluyendo las sales farmacéuticamente aceptables del mismo) con una o más moléculas de solvente. Estas moléculas de solvente son aquéllas comúnmente utilizadas en la técnica farmacéutica que sean conocidas como inocuas para el receptor, por ejemplo, agua, etanol, y similares. El término "hidrato" se refiere al complejo en donde la molécula de solvente es agua.
Los compuestos de la presente invención, incluyendo las sales, hidratos y solvatos de los mismos, pueden formar, inherentemente o por diseño, polimorfos.
Típicamente, los compuestos de la fórmula (I) se pueden preparar de acuerdo con los métodos proporcionados a continuación.
En una modalidad, la invención se refiere a un proceso para la elaboración de un compuesto de la fórmula (I) (Método A), el cual comprende los pasos a, b, c, d.
El compuesto de la fórmula (I) se obtiene por medio del paso c de desproteger PG1 a partir del compuesto de la fórmula (F), en donde PG1 representa un grupo protector adecuado, tal como un grupo Boc, y los otros sustituyentes son como se definen anteriormente, seguido por el paso de reacción de acoplamiento d con R1-Act1, Paso d: en donde R es -C(0)-R4 o -S(0)2-R4, en donde R4 se define anteriormente, y Act1 representa un grupo activador o un grupo hidroxilo: La reacción de acoplamiento es la formación de una amida, urea, éster carbámico o sulfonamida. Hay muchas maneras conocidas de preparar amidas, urea, ésteres carbámicos o sulfonamidas. El paso de reacción de acoplamiento se puede llevar a cabo con Act1 que representa un grupo activador, de preferencia en un procedimiento de un paso o con Act1 que representa un grupo hidroxilo involucrando un procedimiento ya sea de uno o de dos pasos. Para los ejemplos de las formaciones de enlaces de amida, véase Mantalbetti, C.A.G.N y Falque, V., Amide bond formation and peptide coupling, Tetrahedron, 2005, 61(46), páginas 10827-10852 y las referencias citadas en el mismo. Para los ejemplos de la síntesis de urea, véase Sartori, G.; Maggi, R. Acyclic and cyclic ureas, Science of Synthesís (2005), 18, 665-758; Gallou, Isabelle. Unsymmetrical ureas Synthetic methodologies and application in drug design, Organic Preparations and Procedures International (2007), 39(4), 355-383. Para los ejemplos de la síntesis de carbamato, véase Adams, Philip; Barón, Frank A. Esters of carbamic acid, Chemical Reviews (1965), 65(5), 567-602. Los ejemplos proporcionados en la presente, por consiguiente, no pretenden ser exhaustivos, sino meramente ilustrativos; Paso c2: en donde R1 se selecciona a partir de fenilo, piridilo, pirimidinilo, pirazinilo, piridazinilo, 1 ,2,3-triazinilo, 1,2,4-triazinilo o 1 ,3,5-triazinilo, y Act1 representa halógeno, en particular yodo o bromo: La reacción de acoplamiento se lleva a cabo en la presencia de una base de amina, tal como N,N-d¡-isopropil-etil-amina. La reacción se lleva a cabo en la presencia de un solvente orgánico o sin un solvente, bajo calentamiento con microondas. De una manera alternativa, la reacción se lleva a cabo bajo las condiciones de Buchwald-Hartwig acostumbradas, tales como las condiciones descritas anteriormente. La reacción de preferencia se lleva a cabo bajo un gas inerte, tal como nitrógeno o argón.
E l com puesto de la fórmula (F) se obtiene por medio del paso b de acoplam iento del com puesto de la fórm ula (C) , en donde PG 1 representa un grupo protector adecuado, tal como u n Boc, y los otros sustituyentes son como se definen anteriormente, (C) con un compuesto de la fórmula (D), en donde X' representa halógeno, tal como yodo o bromo, y los otros sustituyentes son como se definen anteriormente, (D) bajo las condiciones de Buchwald-Hartwig acostumbradas, utilizando una combinación adecuada de catalizador de Pd / ligando, tal como Pd2(dba)3/2-(diciclohexil-fosfino)-bifen ilo o Pd2(dba)3/2-diciclohexil-fosfino-2',4',6'-tri-isopropil-bifenilo, Pd2(dba)3/X-Phos, Pd2(dba)3/(rac)-BI NAP, Pd(OAc)2/(rac)-BI NAP o bis-(tri-terbutil-fosfina)-paladio, y una base adecuada, tal como NaOtBu , Cs2C03 ó K3PO4 y u n solvente orgánico, tal como tolueno, dioxano o tetrahidrofurano (THF) . La reacción se agita a una temperatura de aproximadamente 60°C a 140°C, por ejemplo, de 100°C a 110°C, y opcionalmente se lleva a cabo en un reactor de microondas. La reacción de preferencia se lleva a cabo bajo un gas inerte, tal como nitrógeno o argón.
El compuesto de la fórmula (C) se obtiene por medio del paso a de acoplamiento del compuesto de la fórmula (A), en donde los sustituyentes son como se definen anteriormente, con un compuesto de la fórmula (B), en donde PG1 representa un grupo protector adecuado, tal como un grupo Boc, y Act2 es un grupo activador o H, y los otros sustituyentes son como se definen anteriormente, (B) Paso al: en donde Y es O, y Act2 representa un grupo activador, tal como un mesilato: La reacción tiene lugar en la presencia de una base adecuada, tal como hidróxido de sodio (NaH), K2C03 ó terbutóxido de potasio (tBuOK), en un solvente orgánico polar adecuado, tal como dimetil-formamida, tetrahidrofurano (THF), 2-metil-tetrahidrofurano (THF) o Dioxano, a una temperatura adecuada , tal como desde la temperatura am biente hasta 1 00°C ; Paso a2 : en donde Y es O , y Act2 representa H : La reacción tiene lugar utilizando las condiciones de M itsunobu acostumbradas, por ejemplo, utilizando Ph3P y DEAD, en un solvente orgánico, tal como tetrahidrofu rano (TH F) , bajo condiciones de gas inerte, a una temperatura elevada, tal como a 70°C.
Paso a3: en donde Y es N H, y Act2 representa H : se emplea una reacción de acoplamiento de fosfonio promovida por una base, en donde un compuesto de la fórmula (A) , en un solvente adecuado, tal como acetonitrilo, se hace reaccionar con una sal de fosfonio, tal como hexafluoro-fosfato de benzotriazol-1 -iloxi-tris-(dimetil-amino)-fosfonio (BOP), en la presencia de una base, tal como 1 ,8-diaza-7-biciclo-[5.4.0]-undeceno (DBU), seguida por la adición de un compuesto de la fórmula (B). La mezcla de reacción se agita a una temperatura de 20°C a 100°C .
En otra modalidad, la invención se refiere a un proceso para la elaboración de un compuesto de la fórmula (I) (Método A-a) , el cual comprende los pasos a y b como se definen anteriormente para el Método A, utilizando un compuesto de la fórmula (B), en donde PG1 representa R1 .
En otra modalidad , la invención se refiere a un proceso para la elaboración de un compuesto de la fórmula (I) (Método B) , el cual comprende los pasos e, b, f, a, c, y d .
El compuesto de la fórmula (I ) se obtiene por medio de los pasos c y d como se describen anteriormente para el Método A, a partir del compuesto de la fórmula (F).
El compuesto de la fórmula (F) se obtiene por medio del paso f de desproteger PG2 a partir del compuesto de la fórmula (E), en donde PG2 es un grupo protector adecuado, tal como un grupo protector de sililo, y los otros sustituyentes son como se definen anteriormente, (E) seguido por el paso de reacción de acoplamiento a, como se describe anteriormente para el Método A, con el compuesto de la fórmula (B).
El compuesto de la fórmula (E) se obtiene por medio del paso e de proteger el compuesto de la fórmula (A) con un grupo protector adecuado PG2, seguido por el compuesto de la fórmula (E), en donde PG2 es un grupo protector adecuado, tal como un grupo protector de sililo, seguido por el paso de reacción de acoplamiento b, como se describe anteriormente para el Método A, con el compuesto de la fórmula (D).
En otra modalidad, la invención se refiere a un proceso para la elaboración de un compuesto de la fórmula (I) (Método B-a), el cual comprende los pasos e, b, y f como se definen anteriormente para el Método B, utilizando un compuesto de la fórmula (B), en donde PG1 representa R1.
En otra modalidad, la invención se refiere a un proceso para la elaboración de un compuesto de la fórmula (I) (Método C), utilizando un compuesto de la fórmula (A ), en donde X" representa halógeno, y los otros sustituyentes son como se definen anteriormente, el cual comprende los pasos b, c, y d como se definen anteriormente para el Método B, utilizando un compuesto de la fórmula (B), y un paso modificado a4: Paso a4: en donde Y es NH, y Act2 es H: La reacción tiene lugar en la presencia de una base adecuada, tal como, por ejemplo, carbonato de potasio o una base de amina adecuada, tal como trietil-amina o N,N-di-isopropil-etil-amina, a una temperatura elevada, tal como de 100°C a 140°C. De una manera alternativa, la reacción se lleva a cabo bajo las condiciones de Buchwald-Hartwig acostumbradas, tales como las condiciones descritas anteriormente. La reacción de preferencia se lleva a cabo bajo un gas inerte, tal como nitrógeno o argón.
En otra modalidad, la invención se refiere a un proceso para la elaboración de u n com puesto de la fórm ula (I ) (Método C-a) , el cual com prende los pasos b, a4 , c, y d como se definen anteriormente para el m étodo B 1 , utilizando un compuesto de la fórmula (B) , en donde PG representa R 1.
El término "grupo activador", como se utiliza en la presente, se refiere a u n grupo que puede activar un ácido carboxílico, un ácido carbónico, o un derivado de ácido carbónico, para acoplarse con una fracción de amina para formar una fracción de amida, urea o éster carbámico, respectivamente, (Act1 ) , o con u n g rupo que pueda activar un g rupo hidroxilo para acoplarse con otra fracción de hidroxilo para formar un éter (Act2) .
Los grupos que pueden activar un ácido carboxílico, un ácido carbónico , o u n derivado de ácido carbónico, para acoplarse con u na fracción de amina para formar una fracción de amida, u rea o éster carbámico, son los cloru ros, o los g rupos resultantes de la reacción del derivado de ácido con un agente activador. Los agentes activadores adecuados son conocidos por la persona experta , y los ejemplos de tales reactivos activadores son los derivados de carbodi-imida , los derivados de pentafluoro-fenil-éster, los derivados de triazol, y los derivados de imidazol.
Los grupos que pueden activar u n g rupo hidroxilo para acoplarse con otra fracción de hidroxilo para formar un éter son los grupos conocidos por la persona experta , y los ejemplos de tales grupos activadores son los mesilatos y tosilatos.
El término "g rupo protector", como se utiliza en la presente, se refiere a un grupo que protege a un grupo funcional que está presente en los materiales de partida y no se pretende que tome parte en la reacción. En los pasos adicionales del proceso, llevados a cabo como se desee, los grupos funcionales de los compuestos de partida que no deban tomar parte en la reacción pueden estar presentes en una forma desprotegida, o se pueden proteger, por ejemplo, mediante uno o más grupos protectores. Los grupos protectores entonces se remueven total o parcialmente de acuerdo con uno de los métodos conocidos. Los grupos protectores, y la manera en la que se introducen y se remueven, se describen, por ejemplo, en "Protective Groups in Organic Chemistry", Plenum Press, Londres, Nueva York 1973, y en "Methoden der organischen Chemie", Houben-Weyl, 4a. Edición, Volumen 15/1, Georg-Thieme-Verlag, Stuttgart 1974, y en Theodora W. Greene, "Protective Groups in Organic Synthesis", John Wiley & Sons, Nueva York 1981. Una característica de los grupos protectores es que se pueden remover fácilmente, es decir, sin la presentación de reacciones secundarias indeseadas, por ejemplo, mediante solvólisis, reducción, fotolisis, o de una manera alternativa, bajo condiciones fisiológicas.
La invención incluye además cualquier variante de los presentes procesos, en donde se utiliza un producto intermediario que se pueda obtener en cualquier etapa de los mismos como material de partida y se llevan a cabo los pasos restantes, o en donde los materiales de partida se forman in situ bajo las condiciones de reacción, o en donde los componentes de la reacción se utilizan en la forma de sus sales o de un m aterial ópticamente puro .
Los com puestos de la invenció n e intermediarios tam bién se pueden convertir unos en otros de acuerdo con los métodos conocidos generalmente por los expertos en este campo .
Los intermediarios y los productos finales se pueden procesar y/o purificar de acuerdo con los métodos convencionales , por ejem plo, em pleando métodos cromatográficos, métodos de distribución , (re-)cristalización , y similares.
Lo siguiente se aplica en general a todos los procesos mencionados anteriormente en la presente y más adelante en la presente.
Todos los pasos de proceso anteriormente mencionados se pueden llevar a cabo en condiciones de reacción que son conocidas por los expertos en este campo, incluyendo aquéllas mencionadas de una manera específica, en ausencia, o, por costumbre, en la presencia de solventes o diluyentes, incluyendo, por ejemplo, solventes o diluyentes que sean inertes hacia los reactivos utilizados y los disuelvan, en ausencia o en la presencia de catalizadores, agentes de condensación o neutralizantes, por ejemplo intercambiadores de iones, tales como intercambiadores de cationes, por ejemplo, en la forma de H + , dependiendo de la naturaleza de la reacción y/o de los reactivos, a temperatura reducida, normal , o elevada, por ejemplo en un intervalo de temperatura de aproximadamente -1 00°C a aproximadamente 1 90°C, incluyendo, por ejemplo, de aproximadamente -80°C a aproximadamente 150°C, por ejemplo de -80°C a -60°C, a temperatura ambiente, de -20°C a 40°C, o a la temperatura de reflujo, bajo presión atmosférica o en un recipiente cerrado, en donde sea apropiado bajo presión, y/o en una atmósfera inerte, por ejemplo bajo una atmósfera de argón o de nitrógeno.
En todas las etapas de las reacciones, las mezclas de isómeros que se formen se pueden separar en los isómeros individuales, por ejemplo en los diaestereoisomeros o enantiomeros, o en cualesquiera mezclas de isómeros deseadas, por ejemplo racematos, o mezclas de diaestereoisomeros, por ejemplo de una manera análoga a los métodos descritos anteriormente en la presente.
Los solventes a partir de los cuales se pueden seleccionar aquellos solventes que sean adecuados para cualquier reacción particular, incluyen aquéllos mencionados específicamente o, por ejemplo, agua, ésteres, tales como alcanoatos inferiores de alquilo inferior, por ejemplo acetato de etilo, éteres, tales como éteres alifáticos, por ejemplo dietil-éter, o éteres cíclicos, por ejemplo tetrahidrofurano (THF) o dioxano, hidrocarburos aromáticos líquidos, tales como benceno o tolueno, alcoholes, tales como metanol, etanol o 1- ó 2-propanol, nitrilos, tales como acetonitrilo, hidrocarburos halogenados, tal como cloruro de metileno o cloroformo, amidas de ácido, tales como dimetil-formamida (DMF) o dimetil-acetamida, bases, tales como bases de nitrógeno heterocíclicas, por ejemplo pirid ina o N-metil-pirrolidin-2-ona , an h íd ridos de ácido carboxílico, tales como anh ídridos del ácido alcanoico inferior, por ejemplo anh ídrido acético, hidrocarburos cíclicos, lineales o ramificados, tales como ciclohexano, hexano o isopentano, metil-ciclohexano, o las mezclas de estos solventes, por ejemplo soluciones acuosas, a menos que se ind ique de otra manera en la descripción de los procesos. Estas mezclas de solventes también se pueden utilizar en el procesamiento, por ejemplo mediante cromatog rafía o división .
Los compuestos, incluyendo sus sales, también se pueden obtener en la forma de hidratos, o sus cristales , por ejemplo, pueden incluir al solvente utilizado para la cristalización . Puede haber diferentes formas cristalinas presentes .
La invención se refiere también a las formas del proceso en donde se utiliza un compuesto q ue se pueda obtener como u n intermediario en cualquier etapa del proceso como material de partida y se llevan a cabo los pasos restantes del proceso, o en donde se forma un material de partida bajo las condiciones de reacción o se utiliza en la forma de u n derivado, por ejemplo en una forma proteg ida o en la forma de u na sal , o se produce un compuesto que se pueda obtener mediante el proceso de acuerdo con la invención bajo las condiciones del proceso y se procesa adicionalmente in situ.
En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica , la cual comprende un compuesto de la presente invención , o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica se puede formular para vías de administración particulares, tales como administración oral, administración parenteral, y administración rectal, etc. En adición, las composiciones farmacéuticas de la presente invención, se pueden configurar en una forma sólida (incluyendo, sin limitación, cápsulas, tabletas, pildoras, gránulos, polvos o supositorios), o en una forma líquida (incluyendo, sin limitación, soluciones, suspensiones o emulsiones). Las composiciones farmacéuticas se pueden someter a las operaciones farmacéuticas convencionales, tales como esterilización y/o pueden contener diluyentes inertes, agentes lubricantes, o agentes reguladores convencionales, así como adyuvantes, tales como conservadores, estabilizantes, agentes humectantes, emulsionantes y reguladores del pH, etc.
Típicamente, las composiciones farmacéuticas son tabletas o cápsulas de gelatina, las cuales comprenden el ingrediente activo junto con: a) diluyentes, por ejemplo, lactosa, dextrosa, sacarosa, manitol, sorbitol, celulosa y/o glicina; b) lubricantes, por ejemplo, sílice, talco, ácido esteárico, su sal de magnesio o de calcio y/o polietilenglicol; para tabletas también, c) aglutinantes, por ejemplo, silicato de magnesio y aluminio, pasta de almidón, gelatina, tragacanto, metil-celulosa, carboxi-metil-celulosa de sodio y/o polivinil-pirrolidona; si se desea, d) desintegrantes, por ejemplo, almidones, agar, ácido algínico o su sal sódica, o mezclas efervescentes; y/o e) absorbentes, colorantes, saborizantes y edulcorantes. Las tabletas se pueden recubrir con película o se pueden recubrir entéricamente de acuerdo con los métodos conocidos en la técnica.
Las composiciones adecuadas para administración oral incluyen una cantidad efectiva de un compuesto de la invención en la forma de tabletas, grageas, suspensiones acuosas u oleosos, polvos o gránulos dispersables, emulsiones, cápsulas duras o blandas, o jarabes o elíxires. Las composiciones pretendidas para uso oral se preparan de acuerdo con cualquier método conocido en la materia para la elaboración de composiciones farmacéuticas, y estas composiciones pueden contener uno o más agentes seleccionados a partir del grupo que consiste en agentes edulcorantes, agentes saborizantes, agentes colorantes, y agentes conservadores, con el objeto de proporcionar preparaciones farmacéuticamente elegantes y sabrosas. Las tabletas pueden contener al ingrediente activo mezclado con excipientes farmacéuticamente aceptables no tóxicos que sean adecuados para la elaboración de tabletas. Estos excipientes son, por ejemplo, diluyentes inertes, tales como carbonato de calcio, carbonato de sodio, lactosa, fosfato de calcio, o fosfato de sodio; agentes de granulación y desintegrantes, por ejemplo almidón de maíz, o ácido algínico; agentes aglutinantes, por ejemplo almidón, gelatina, o acacia; y agentes lubricantes, por ejemplo estearato de magnesio, ácido esteárico, o talco. Las tabletas son no recubiertas o son recubiertas mediante técnicas conocidas para demorar la desintegración y absorción en el tracto gastrointestinal y de esta manera proporcionar una acción sostenida durante un período más largo. Por ejemplo, se puede emplear un material de demora de tiempo, tal como monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo. Las formulaciones para uso oral se pueden presentar como cápsulas de gelatina dura, en donde el ingrediente activo se mezcla con un diluyente sólido inerte, por ejemplo carbonato de calcio, fosfato de calcio, o caolín, o como cápsulas de gelatina blanda, en donde el ingrediente activo se mezcla con agua o un medio oleoso, por ejemplo aceite de cacahuate, parafina líquida, o aceite de oliva.
Ciertas composiciones inyectables son soluciones o suspensiones isotónicas acuosas, y los supositorios convenientemente se preparan a partir de emulsiones o suspensiones grasas. Estas composiciones se pueden esterilizar y/o pueden contener adyuvantes, tales como agentes conservadores, estabilizantes, humectantes, o emulsionantes, promotores de solución, sales para regular la presión osmótica, y/o reguladores del pH. En adición, también pueden contener otras sustancias terapéuticamente valiosas. Estas composiciones se preparan de acuerdo con los métodos convencionales de mezcla, granulación, o recubrimiento, respectivamente, y contienen de aproximadamente el 0.1 al 75 por ciento, o contienen de aproximadamente el 1 al 50 por ciento del ingrediente activo.
Las composiciones adecuadas para aplicación transdérmica incluyen una cantidad efectiva de un compuesto de la invención con un vehículo adecuado. Los vehículos adecuados para suministro transdérmico incluyen solventes farmacéuticamente aceptables absorbibles para ayudar al paso a través de la piel del huésped. Por ejemplo, los dispositivos transdérmicos están en la forma de un parche que comprende un miembro de respaldo, un depósito que contiene al compuesto opcionalmente con vehículos, opcionalmente una barrera de control de velocidad para suministrar el compuesto de la piel del huésped a una velocidad controlada y previamente determinada durante un período de tiempo prolongado, y elementos para asegurar el dispositivo a la piel.
Las composiciones adecuadas para aplicación tópica, por ejemplo, a la piel y a los ojos, incluyen soluciones acuosas, suspensiones, ungüentos, cremas, geles, o formulaciones en rociables, por ejemplo para el suministro mediante aerosol o similar. Estos sistemas de suministro tópico serán en particular apropiados para aplicación dérmica, por ejemplo para el tratamiento de cáncer de piel, por ejemplo para uso profiláctico en cremas solares, lociones, aerosoles, y similares. Por consiguiente, son particularmente adecuados para utilizarse en formulaciones tópicas, incluyendo cosméticas, bien conocidas en este campo. Pueden contener solubilizantes, estabilizantes, agentes potenciadores de tonicidad, reguladores del pH, y conservadores.
Como se utiliza en la presente, una aplicación tópica también puede pertenecer a una inhalación o a una aplicación intranasal. De una manera conveniente se pueden suministrar en la forma de un polvo seco (ya sea solo, como una mezcla, por ejemplo una mezcla seca con lactosa, o bien como una partícula componente mezclada, por ejemplo con fosfolípidos) a partir de un inhalador de polvo seco, o como una presentación de aspersión en aerosol a partir de un recipiente presurizado, bomba, aspersor, atomizador o nebulizador, con o sin el uso de un propelente adecuado.
La presente invención proporciona además composiciones farmacéuticas y formas de dosificación anhidras, las cuales comprenden los compuestos de la presente invención como ingredientes activos, debido a que el agua puede facilitar la degradación de ciertos compuestos.
Las composiciones farmacéuticas y formas de dosificación anhidras de la invención se pueden preparar utilizando ingredientes anhidros o que contengan una baja humedad, y condiciones de baja humedad. Una composición farmacéutica anhidra se puede preparar y almacenar de tal manera que se mantenga su naturaleza anhidra. De conformidad con lo anterior, las composiciones anhidras de preferencia se empacan utilizando materiales que se sepa que impiden la exposición al agua, de tal modo que se puedan incluir en kits de formulación adecuados. Los ejemplos del empaque adecuado incluyen, pero no se limitan a, láminas herméticamente selladas, plásticos, recipientes de dosis unitaria (por ejemplo, frascos), paquetes de burbujas, y paquetes de tiras.
La invención proporciona además composiciones farmacéuticas y formas de dosificación que comprenden uno o más agentes que reducen la velocidad a la cual se descompondrá el compuesto de la presente invención como un ingrediente activo. Estos agentes, que son referidos en la presente como "estabilizantes", incluyen, pero no se limitan a, antioxidantes, tales como ácido ascórbico, reguladores del pH, o reguladores de sales, etc.
Los compuestos de la fórmula I, en forma libre o en forma de sal, exhiben valiosas propiedades farmacológicas, por ejemplo, propiedades moduladoras de PI3K, por ejemplo, como se indica en las pruebas in vitro e in vivo proporcionadas en las siguientes secciones y, por consiguiente, se indican para terapia o para utilizarse como productos químicos de investigación, por ejemplo, como compuestos de herramienta.
Los compuestos de la invención pueden ser útiles en el tratamiento de condiciones, enfermedades o trastornos, incluyendo la inmunopatología asociada con enfermedades o infecciones en donde una o más de las funciones de las células-B, tales como la producción de anticuerpos, la presentación de antígeno, la producción de citoquinas o la organogénesis linfoide, sean anormales o sean indeseables, incluyendo artritis reumatoide, pénfigo vulgar y las enfermedades relacionadas, púrpura trombocitopénica idiopática, lupus eritematoso sistémico, esclerosis múltiple, miastenia grave, síndrome de Sjógren, anemia hemolítica autoi'nmune, vasculitidas asociadas con ANCA, crioglobulinemia, púrpura trombocitopénica trombótica, urticaria autoinmune crónica, alergia (dermatitis atópica, dermatitis por contacto, rinitis alérgica), síndrome de Goodpasture, AMR (rechazo de trasplante mediado por anticuerpos), rechazo de trasplante híper-agudo, agudo y crónico mediado por células-B, y cánceres de origen hematopoiético, incluyendo, pero no limitándose a, mieloma múltiple; leucemia mielógena aguda; leucemia mielógena crónica; leucemia linfocítica; leucemia mieloide; linfoma no de Hodgkin; linfomas; policitemia vera; trombocitemia esencial; mielofibrosis con metaplasia mieloide; y enfermedad de Walden Stróem.
La invención incluye métodos para el tratamiento de condiciones, enfermedades o trastornos en donde una o más de las funciones de los neutrófilos, tales como la liberación de superóxido, la exocitosis estimulada, o la migración quimioatráctica sean anormales o sean indeseables, incluyendo artritis reumatoide, sepsis, trastornos pulmonares o respiratorios, tales como asma, dermatosis inflamatorias, tales como soriasis, así como en la inmunopatología asociada con enfermedades o infecciones y otras.
La invención incluye métodos para el tratamiento de condiciones, enfermedades o trastornos en donde una o más de las funciones de los basófilos y mastocitos, tales como la migración quimioatráctica o la desgranulación mediada por IgE-alergeno sean anormales o sean indeseables, incluyendo las enfermedades alérgicas (dermatitis atópica, dermatitis por contacto, rinitis alérgica), así como otros trastornos, tales como enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), asma o enfisema.
La invención incluye métodos para el tratamiento de condiciones, enfermedades o trastornos en donde una o más de las funciones de las células-T, tales como la producción de citoquinas o la citotoxicidad mediada por células sean anormales o sean indeseables, incluyendo artritis reumatoide, esclerosis múltiple, rechazo agudo o crónico de injertos de células, tejidos u órganos, o cánceres de origen hematopoiético, así como en la inmunopatología asociada con enfermedades o infecciones.
Además, la invención incluye métodos para el tratamiento de las enfermedades neurodegenerativas, las enfermedades cardiovasculares y la acumulación de plaquetas.
Además, la invención incluye los métodos para el tratamiento de enfermedades de la piel, tales como porfiria cutánea tardía, erupción ligera polimorfa, dermatomiositis, urticaria solar, liquen plano oral, paniculitis, esclerodermia, vasculitis con urticaria.
Además, la invención incluye los métodos para el tratamiento de las enfermedades inflamatorias crónicas, tales como sarcoidosis, granuloma anular.
En otras modalidades, la condición o el trastorno (por ejemplo, mediado por PI3K) se selecciona a partir del grupo que consiste en: policitemia vera, trombocitemia esencial, mielofibrosis con metaplasia mieloide, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), síndrome de insuficiencia respiratoria de adultos (ARDS), síndrome de Loffler, neumonía eosinofílica, infestación parasitaria (en particular de metazoarios) (incluyendo eosinofilia tropical), aspergilosis broncopulmonar, poliarteritis nodosa (incluyendo síndrome de Churg-Strauss), granuloma eosinofílico, trastornos relacionados con los eosinófilos que afecten a las vías respiratorias, ocasionados por reacción a fármacos, soriasis, dermatitis por contacto, dermatitis atópica, alopecia areata, eritema multiforme, dermatitis herpetiforme, esclerodermia, vitíligo, angitis por hipersensibilidad, urticaria, penfigoide bulloso, lupus eritematoso, pénfigo, epidermólisis bullosa adquirida, trastornos hematológicos autoinmunes (por ejemplo, anemia hemolítica, anemia aplásica, anemia de glóbulos rojos puros, y trombocitopenia idiopática), lupus eritematoso sistémico, policondritis, esclerodermia, granulomatosis de Wegener, dermatomiositis, hepatitis activa crónica, miastenia grave, síndrome de Steven-Johnson, prurito idiopático, enfermedad inflamatoria autoinmune del intestino (por ejemplo, colitis ulcerativa y enfermedad de Crohn), oftalmopatía endocrina, enfermedad de Graves, sarcoidosis, alveolitis, neumonitis por hipersensibilidad crónica, esclerosis múltiple, cirrosis biliar primaria, uveítis (anterior y posterior), fibrosis pulmonar intersticial, artritis soriática, glomerulonefritis, enfermedades cardiovasculares, ateroesclerosis, hipertensión, trombosis venosa profunda, embolia, infarto de miocardio, angina inestable, tromboembolismo, embolia pulmonar, enfermedades trombolíticas, isquemia arterial aguda, oclusiones trombóticas periféricas, y enfermedad de arterias coronarias, lesiones por reperfusión, retinopatía, tal como retinopatía diabética o retinopatía inducida por oxígeno hiperbárico, y condiciones caracterizadas por una presión infraocular elevada o por secreción del humor acuoso ocular, tales como glaucoma.
En otra modalidad, los compuestos de la presente invención son útiles en el tratamiento, prevención, o mitigación de enfermedades autoinmunes y de condiciones inflamatorias, en particular condiciones inflamatorias con una etiología que incluye un componente autoinmune, tal como artritis (por ejemplo, artritis reumatoide, artritis crónica progrediente, y artritis deformante), y enfermedades reumáticas, incluyendo condiciones inflamatorias y enfermedades reumáticas que involucran pérdida ósea, dolor inflamatorio, espondiloartropatías, incluyendo espondilitis anquilosante, síndrome de Reiter, artritis reactiva, artritis soriática, y artritis enterofática, hipersensibilidad (incluyendo tanto hipersensibilidad de las vías respiratorias como hipersensibilidad dérmica), y alergias. Las enfermedades autoinmunes específicas para las cuales se pueden emplear los anticuerpos de la invención incluyen trastornos hematológicos autoinmunes (incluyendo, por ejemplo, anemia hemolítica, anemia aplásica, anemia de glóbulos rojos puros, y trombocitopenia idiopática), hemofilia adquirida A, enfermedad de aglutinina fría, crioglobulinemia, púrpura trombocitopénica trombótica, síndrome de Sjógren, lupus eritematoso sistémico, trastornos inflamatorios musculares, policondritis, esclerodoma, vasculitis asociada con anticuerpos citoplásmicos anti- neutrófilos, neuropatía mediada por IgM, síndrome de opsoclonus mioclonus, granulomatosis de Wegener, dermatomiositis, hepatitis activa crónica, miastenia grave, soriasis, síndrome de Steven-Johnson, pénfigo vulgar, pénfigo foliacius, prurito idiopático, enfermedad inflamatoria autoinmune del intestino (incluyendo, por ejemplo, colitis ulcerativa, enfermedad de Crohn y Síndrome de intestino irritable), oftalmopatía endocrina, enfermedad de Graves, sarcoidosis, esclerosis múltiple, neuromielitis óptica, cirrosis biliar primaria, diabetes juvenil (diabetes mellitus tipo I), uveítis (anterior, intermedia y posterior, así como panuveítis), queratoconjuntivitis sicca y queratoconjuntivitis vernal, fibrosis pulmonar intersticial, artritis soriática, y glomerulonefritis (con y sin síndrome nefrótico, por ejemplo, incluyendo síndrome nefrótico idiopático o nefropatía de cambios mínimos), tumores, enfermedad inflamatoria de la piel y de la córnea, miositis, aflojamiento de implantes óseos, trastornos metabólicos, tales como ateroesclerosis, diabetes, y dislipidemia.
En otra modalidad, los compuestos de la presente invención son útiles en el tratamiento de condiciones o trastornos seleccionados a partir del grupo que consiste en linfoma de células-B cutáneo primario, enfermedad inmunoampollar, pénfigo vulgar, pénfigo foliáceo, la forma endémica de pénfigo brasileño (Fogo selvagem), pénfigo paraneoplásico, penfigoide bulloso, penfigoide de la membrana mucosa, epidermólisis bullosa adquirida, enfermedad crónica del injerto contra el huésped, dermatomiositis, lupus eritematoso sistémico, vasculitis, vasculitis de vasos pequeños, vasculitis por urticaria hipocomplementémica, vasculitis por anticuerpos citoplásmicos anti-neutrófilos, crioglobulinemia, síndrome de Schnitzler, macroglobulinemia de Waldenstrom, angioedema, vitíligo, lupus eritematoso sístémico, púrpura trombocitopénica idiopática, esclerosis múltiple, enfermedad por aglutinina de resfriado, anemia hemolítica autoinmune, vasculitis asociada con anticuerpos citoplásmicos anti-neutrófilos, enfermedad del injerto contra el huésped, crioglobulinemia, y trombocitopenia trombótica.
Por consiguiente, como una modalidad adicional, la presente invención proporciona el uso de un compuesto de las fórmulas (I), (G), (la), (la'), (Ib), (Ib') (le), (IC), (Id), (Id'), (le), (le'), (If), (If), (Ig), (lg'), (Ih), (??'), (li), (?'), (Ij) o (lj') en terapia. En una modalidad adicional, la terapia se selecciona a partir de una enfermedad que se puede tratar mediante la inhibición de PI3K. En otra modalidad, la enfermedad se selecciona a partir de la lista anteriormente mencionada, de una manera adecuada a partir de trastornos autoinmunitarios, enfermedades inflamatorias, enfermedades alérgicas, enfermedades de las vías respiratorias, tales como asma y enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), rechazo de trasplante; la producción de anticuerpos, la presentación de antígeno, la producción de citoquinas o la organogénesis linfoide son anormales o son indeseables, incluyendo artritis reumatoide, pénfigo vulgar, púrpura trombocitopénica idiopática, lupus eritematoso sístémico, esclerosis múltiple, míastenía grave, síndrome de Sjógren, anemia hemolítica autoinmune, vasculitidas asociadas con ANCA, crioglobulinemia, púrpura trombocitopénica trombótica, urticaria autoinmune crónica, alergia (dermatitis atópica, dermatitis por contacto, rinitis alérgica), síndrome de Goodpasture, AMR (rechazo de trasplante mediado por anticuerpos), rechazo de trasplante híper-agudo, agudo y crónico mediado por células-B, y cánceres de origen hematopoiético, incluyendo, pero no limitándose a, mieloma múltiple; una leucemia; leucemia mielógena aguda; leucemia mielógena crónica; leucemia linfocítica; leucemia mieloide; linfoma no de Hodgkin; linfomas; policitemia vera; trombocitemia esencial; mielofibrosis con metaplasia mieloide; y enfermedad de Walden Stroem; de una manera más adecuada, a partir de artritis reumatoide (RA), pénfigo vulgar (PV), púrpura trombocitopénica idiopática (ITP), púrpura trombocitopénica trombótica (TTP), anemia hemolítica autoinmune (AIHA), hemofilia adquirida tipo A (AHA), lupus eritematoso sistémico (SLE), esclerosis múltiple (MS), miastenia grave (MG), síndrome de Sjógren (SS), vasculitidas asociadas con ANCA, crioglobulinemia, urticaria autoinmune crónica (CAU), alergia (dermatitis atópica, dermatitis por contacto, rinitis alérgica), síndrome de Goodpasture, rechazo de trasplante y cánceres de origen hematopoiético, así como en la inmunopatología asociada con enfermedades o infecciones, por ejemplo, en malaria grave y cerebral, tripanosomiasis, Leishmaniasis, toxoplasmosis y neurocisticercosis.
En otra modalidad, la invención proporciona un método para el tratamiento de una enfermedad que se trato mediante la inhibición de PI3K, el cual comprende la administración de una cantidad terapéuticamente aceptable de un compuesto de las fórmulas (I), (G), (la), (la'), (Ib), (Ib') (le), (le'), (Id), (Id'), (le), (le'), (If), (lf), (Ig), (Ig'), (Ih), (lh'), (li), (?'), (Ij) o (lj'). En una modalidad adicional, la enfermedad se selecciona a partir de la lista anteriormente mencionada, de una manera adecuada a partir de trastornos autoinmunitarios, enfermedades inflamatorias, enfermedades alérgicas, enfermedades de las vías respiratorias, tales como asma y enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), rechazo de trasplante; la producción de anticuerpos, la presentación de antígeno, la producción de citoquinas o la organogénesis linfoide son anormales o son indeseables, incluyendo artritis reumatoide, pénfigo vulgar, púrpura trombocitopénica idiopática, lupus eritematoso sistémico, esclerosis múltiple, miastenia grave, síndrome de Sjógren, anemia hemolítica autoinmune, vasculitidas asociadas con ANCA, crioglobulinemia, púrpura trombocitopénica trombótica, urticaria autoinmune crónica, alergia (dermatitis atópica, dermatitis por contacto, rinitis alérgica), síndrome de Goodpasture, AMR (rechazo de trasplante mediado por anticuerpos), rechazo de trasplante híper-agudo, agudo y crónico mediado por células-B, y cánceres de origen hematopoiético, incluyendo, pero no limitándose a, mieloma múltiple; una leucemia; leucemia mielógena aguda; leucemia mielógena crónica; leucemia linfocítica; leucemia mieloide; linfoma no de Hodgkin; linfomas; policitemia vera; trombocitemia esencial; mielofibrosis con metaplasia mieloide; y enfermedad de Walden Stróem; de una manera más adecuada, a partir de artritis reumatoide (RA), pénfigo vulgar (PV), púrpura trombocitopénica idiopática (ITP), púrpura trombocitopénica trombótica (TTP), anemia emolítica autoinmune (AIHA), hemofilia adquirida tipo A (AHA), lupus eritematoso sistémico (SLE), esclerosis múltiple (MS), miastenia grave (MG), síndrome de Sjógren (SS), vasculitidas asociadas con ANCA, crioglobulinemia, urticaria autoinmune crónica (CAU), alergia (dermatitis atópica, dermatitis por contacto, rinitis alérgica), síndrome de Goodpasture, rechazo de trasplante y cánceres de origen hematopoiético, así como en la inmunopatología asociada con enfermedades o infecciones, por ejemplo, en malaria grave y cerebral, tripanosomiasis, Leishmaniasis, toxoplasmosis y neurocisticercosis.
Por consiguiente, como una modalidad adicional, la presente invención proporciona el uso de un compuesto de las fórmulas (I), (G), (la), (la'), (Ib), (Ib') (le), (le'), (Id), (Id'), (le), (le'), (If), (If), (Ig), (lg'), (Ih), (lh'), (li), (?'), (Ij) o (lj') para la elaboración de un medicamento. En una modalidad adicional, el medicamento es para el tratamiento de una enfermedad que se pueda tratar mediante la inhibición de PI3K. En otra modalidad, la enfermedad se selecciona a partir de la lista anteriormente mencionada, de una manera adecuada a partir de trastornos autoinmunitarios, enfermedades inflamatorias, enfermedades alérgicas, enfermedades de las vías respiratorias, tales como asma y enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), rechazo de trasplante; la producción de anticuerpos, la presentación de antígeno, la producción de citoquinas o la organogénesis linfoide son anormales o son indeseables, incluyendo artritis reumatoide, pénfigo vulgar, púrpura trombocitopénica idiopática, lupus eritematoso sistémico, esclerosis múltiple, miastenia grave, síndrome de Sjogren, anemia hemolítica autoinmune, vasculitidas asociadas con ANCA, crioglobulinemia, púrpura trombocitopénica trombótica, urticaria autoinmune crónica, alergia (dermatitis atópica, dermatitis por contacto, rinitis alérgica), síndrome de Goodpasture, AMR (rechazo de trasplante mediado por anticuerpos), rechazo de trasplante híper-agudo, agudo y crónico mediado por células-B, y cánceres de origen hematopoiético, incluyendo, pero no limitándose a, mieloma múltiple; una leucemia; leucemia mielógena aguda; leucemia mielógena crónica; leucemia linfocítica; leucemia mieloide; linfoma no de Hodgkin; linfomas; policitemia vera; trombocitemia esencial; mielofibrosis con metaplasia mieloide; y enfermedad de Walden Stróem; de una manera más adecuada, a partir de artritis reumatoide (RA), pénfigo vulgar (PV), púrpura trombocitopénica idiopática (ITP), púrpura trombocitopénica trombótica (TTP), anemia hemolítica autoinmune (AIHA), hemofilia adquirida tipo A (AHA), lupus eritematoso sistémico (SLE), esclerosis múltiple (MS), miastenia grave (MG), síndrome de Sjogren (SS), vasculitidas asociadas con ANCA, crioglobulinemia, urticaria autoinmune crónica (CAU), alergia (dermatitis atópica, dermatitis por contacto, rinitis alérgica), síndrome de Goodpasture, rechazo de trasplante y cánceres de origen hematopoiético, así como en la inmunopatología asociada con enfermedades o infecciones, por ejemplo, en malaria grave y cerebral, tripanosomiasis, Leishmaniasis, toxoplasmosis y neurocisticercosis.
La composición o una combinación farmacéutica de la presente invención puede estar en una dosificación unitaria de aproximadamente 1 a 1,000 miligramos de ingrediente(s) activo(s) para un sujeto de aproximadamente 50 a 70 kilogramos, o de aproximadamente 1 a 500 miligramos, o de aproximadamente 1 a 250 miligramos, o de aproximadamente 1 a 150 miligramos, o de aproximadamente 0.5 a 100 miligramos, o de aproximadamente 1 a 50 miligramos de ingredientes activos. La dosificación terapéuticamente efectiva de un compuesto, de la composición farmacéutica, o de las combinaciones de los mismos, depende de la especie del sujeto, del peso corporal, de la edad y condición individual, del trastorno o enfermedad que se esté tratando, o de la gravedad de la misma. Un médico, clínico, o veterinario de una experiencia ordinaria puede determinar fácilmente la cantidad efectiva de cada uno de los ingredientes activos necesaria para prevenir, tratar, o inhibir el progreso del trastorno o de la enfermedad.
Las propiedades de dosificación anteriormente citadas se pueden demostrar en pruebas in vitro e in vivo utilizando convenientemente mamíferos, por ejemplo, ratones, ratas, perros, monos u órganos aislados, tejidos y preparaciones de los mismos.
Los compuestos de la presente invención se pueden aplicar in vitro en la forma de soluciones, por ejemplo, soluciones acuosas, e in vivo ya sea enteralmente, parenteralmente, de una manera conveniente intravenosamente, por ejemplo, como una suspensión o en solución acuosa. La dosificación in vitro puede estar en el intervalo de concentraciones de entre aproximadamente 10"3 molar y 10~9 molar. Una cantidad terapéuticamente efectiva in vivo, dependiendo de la vía de administración, puede estar en el intervalo de entre aproximadamente 0.1 y 500 miligramos/kilogramo, o de entre aproximadamente 1 y 100 miligramos/kilogramo.
El compuesto de la presente invención se puede administrar ya sea de una manera simultánea con, o antes o después de, uno o más agentes terapéuticos diferentes. El compuesto de la presente invención se puede administrar por separado, por la misma o diferente vía de administración, o juntos en la misma composición farmacéutica que los otros agentes.
En una modalidad, la invención proporciona un producto que comprende un compuesto de la fórmula (I), y cuando menos otro agente terapéutico, como una preparación combinada para su uso simultáneo, separado, o en secuencia, en terapia. En una modalidad, la terapia es el tratamiento de una enfermedad o condición mediada por la actividad de las enzimas de PI3K. Los productos proporcionados como una preparación combinada incluyen una composición que comprende el compuesto de la fórmula (I), y el (los) otro(s) agente(s) terapéutico(s) juntos en la misma composición farmacéutica , o el com puesto de la fórm ula (I ), y el (los) otro(s) agente(s) terapéutico(s) en u na form a sepa rada , por ejem plo , en la forma de un kit.
En una modalidad , la invención proporciona una composición farmacéutica, la cual comprende un compuesto de la fórmula (I) , y otro(s) agente(s) terapéutico(s). Opcionalmente , la composición farmacéutica puede comprender un veh ículo farmacéuticamente aceptable, como se describe anteriormente.
En una modalidad, la invención proporciona un kit, el cual comprende dos o más composiciones farmacéuticas separadas, cuando menos una de las cuales conteniendo u n compuesto de la fórmula (I). En una modalidad, el kit comprende medios para conservar por separado estas composiciones, tales como un recipiente, un frasco dividido, o un paquete de lámina dividido. Un ejemplo de este kit e un paquete de burbuja, como se utiliza típicamente para el empaque de tabletas, cápsulas, y similares.
El kit de la invención se puede utilizar para administrar diferentes formas de dosificación , por ejemplo, oral y parenteral, para administrar las composiciones separadas a diferentes intervalos de dosificación, o para titular las composiciones separadas una contra la otra . Para ayudar al cumplimiento, el kit de la invención típicamente comprende instrucciones para su administración.
En las terapias de combinación de la invención, el compuesto de la invención y el otro agente terapéutico pueden ser elaborados y/o formulados por los mismos o diferentes fabricantes. Más aún, el com puesto de la invención y el otro agente terapéutico se pueden juntar en u na terapia de com binación : (i) antes de liberar el producto de com bi nación a los médicos (por ejem plo, en el caso de un kit que comprenda el compuesto de la invención y el otro agente terapéutico); (ii) por los médicos mismos (o bajo la g u ía del médico) poco antes de la administración ; (iii) en los pacientes mismos, por ejemplo, du rante la administración en secuencia del compuesto de la invención y el otro agente terapéutico.
De conformidad con lo anterior, la invención proporciona el uso de u n compuesto de la fórmula (I) para el tratamiento de una enfermedad o cond ición mediada por la actividad de las enzimas de PI3K, en donde el medicamento se prepara para su administración con otro agente terapéutico. La invención también proporciona el uso de otro agente terapéutico para el tratamiento de una enfermedad o condición mediada por la actividad de las enzimas de PI3K, en donde el medicamento se administra con un compuesto de la fórmula (I ) .
La invención también proporciona un compuesto de la fórmula (I) para utilizarse en u n método para el tratamiento de una enfermedad o condición mediada por la actividad de las enzimas de PI3K, en donde el compuesto de la fórmula (I) se prepara para su admin istración con otro agente terapéutico. La invención también proporciona otro agente terapéutico para utilizarse en un método para el tratamiento de una enfermedad o condición mediada por la actividad de las enzimas de P I3K, en donde el otro agente terapéutico se prepara para su administración con un compuesto de la fórmula (I). La invención también proporciona un compuesto de la fórmula (I) para utilizarse en un método para el tratamiento de una enfermedad o condición mediada por la actividad de las enzimas de PI3K en donde el compuesto de la fórmula (I) se administra con otro agente terapéutico. La invención también proporciona otro agente terapéutico para utilizarse en un método para el tratamiento de una enfermedad o condición mediada por la actividad de las enzimas de PI3K en donde el otro agente terapéutico se administra con un compuesto de la fórmula (I).
La invención también proporciona el uso de un compuesto de la fórmula (I) para el tratamiento de una enfermedad o condición mediada por la actividad de las enzimas de PI3K, en donde el paciente ha sido tratado previamente (por ejemplo, dentro de 24 horas) con otro agente terapéutico. La invención también proporciona el uso de otro agente terapéutico para el tratamiento de una enfermedad o condición mediada por la actividad de las enzimas de PI3K, en donde el paciente ha sido tratado previamente (por ejemplo, dentro de 24 horas) con un compuesto de la fórmula (I).
Los compuestos de la fórmula I se pueden administrar como el único ingrediente activo, o en conjunto con, por ejemplo, como un adyuvante para, otros fármacos, por ejemplo, agentes inmunosupresores o inmunomoduladores u otros agentes antiinflamatorios, por ejemplo, para el tratamiento o la prevención de rechazo agudo o crónico de alo- o xeno-injerto, o de los trastornos inflamatorios o autoinmunes, o un agente quimioterapéutico, por ejemplo, un agente anti-proliferativo de las células malignas. Por ejemplo, los compuestos de la fórmula I se pueden utilizar en combinación con un inhibidor de calcineurina, por ejemplo, ciclosporina A o FK 506; un inhibidor de mTOR, por ejemplo, rapamicina, 40-O-(2-hidroxi-etil)-rapamicina, CCI779, ABT578, AP23573, TAFA-93, biolimus-7 o biolimus-9; una ascomicina con propiedades inmunosupresoras, por ejemplo, ABT-281, ASM981, etc.; corticosteroides; ciclofosfamida; azatiopreno; metotrexato; leflunomida; mizoribina; ácido micofenólico o su sal; micofenolato-mofetil; 15-desoxi-espergualina o un homólogo, análogo o derivado inmunosupresor de la misma; un inhibidor de PKC, por ejemplo, como se da a conocer en las Publicaciones Internacionales Números WO 02/38561 o WO 03/82859, por ejemplo, el compuesto del Ejemplo 56 ó 70; un inhibidor de cinasa JAK3, por ejemplo, N-bencil-3,4-dihidroxi-benciliden-ciano-acetamida / a-ciano-(3,4-dihidroxi)-]N-bencil-cinamamida (Tirfostina AG 490), prodigiosina 25-C (PNU156804), [4-(4'-hidroxi-fenil)-amino-6,7-dimetoxi-quinazolina] (WHI-P131), [4-(3'-bromo-4'-hidroxil-fenil)-amino-6,7-dimetoxi-quinazolina] (WHI-P154), [4-(3',5'-dibromo-4,-hidroxil-fenil)-amino-6,7-dimetoxi-quinazolina] WHI-P97, KRX-211, 3-{(3R,4R)-4-metil-3-[metil-(7H-pirrolo-[2,3-d]-pirimidin-4-il)-amino]-piperidin-1 -il}-3-oxo-propionitrilo, en forma libre o en una forma de sal farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, el mono-citrato (también denominado como CP-690,550), o un compuesto como se da a conocer en las Publicaciones Internacionales Números WO 04/052359 o WO 05/066156; anticuerpos monoclonales inmunosupresores, por ejemplo, los anticuerpos monoclonales para los receptores de leucocitos, por ejemplo, MHC, CD2, CD3, CD4, CD7, CD8, CD25, CD28, CD40, CD45, CD52, CD58, CD80, CD86 o sus ligandos; otros compuestos inmunomoduladores, por ejemplo, una molécula de enlace recombinante que tenga cuando menos una porción del dominio extracelular de CTLA4 o un mutante de la misma, por ejemplo, cuando menos una porción extracelular de CTLA4 o un mutante de la misma unida a una secuencia de proteína que no es CTLA4, por ejemplo, CTLA4lg (por ejemplo, designada como ATCC 68629) o un mutante de la misma, por ejemplo, LEA29Y; inhibidores de moléculas de adhesión, por ejemplo, antagonistas de LFA-1, antagonistas de ICAM-1 ó -3, antagonistas de VCAM-4 o antagonistas de VLA-4; o antihistaminas; o antitusivos, o un agente broncodilatador; o un bloqueador de los receptores de angiotensinas; o un agente anti-infeccioso.
Cuando los compuestos de la fórmula I se administran en conjunto con otra terapia inmunosupresora / inmunomoduladora, antiinflamatoria, quimioterapéutica o anti-infecciosa, las dosificaciones del compuesto inmunosupresor, inmunomodulador, anti-inflamatorio, quimioterapéutico o anti-infeccioso co-administrado, desde luego, variarán dependiendo del tipo de co-fármaco empleado, por ejemplo, si es un esteroide o un inhibidor de calcineurina, del fármaco específico empleado, de la condición que se esté tratando, etc.
Un compuesto de la fórmula (I) también se puede utilizar con ventaja uno en combinación con otro, o en combinación con otros agentes terapéuticos, en especial otros agentes anti-proliferativos. Estos agentes anti-proliferativos incluyen, pero no se limitan a, los inhibidores de aromatasa; anti-estrógenos; inhibidores de topoisomerasa I; inhibidores de topoisomerasa II; agentes activos en microtúbulos; agentes alquilantes; inhibidores de desacetilasa de histona; compuestos que inducen los procesos de diferenciación celular; inhibidores de ciclo-oxigenasa; inhibidores de MMP; inhibidores de mTOR; anti-metabolitos anti-neoplásicos; compuestos de platina; compuestos que dirigen/reducen una actividad de cinasa de proteína o de lípido, y otros compuestos anti-angiogénicos; compuestos que dirigen, reducen, o inhiben la actividad de una fosfatasa de proteína o de lípido; agonistas de gonadorelina; anti-andrógenos; inhibidores de amino-peptidasa de metionina; bisfosfonatos; modificadores de la respuesta biológica; anticuerpos anti-proliferativos; inhibidores de heparanasa; inhibidores de las isoformas oncogénicas Ras; inhibidores de telomerasa; inhibidores de proteasoma; agentes utilizados en el tratamiento de malignidades hematológicas; compuestos que dirigen, reducen, o inhiben la actividad de Flt-3; inhibidores de Hsp90; temozolomida (TEMODAL®); y leucovorina.
El término "inhibidor de aromatasa", como se utiliza en la presente, se refiere a un compuesto que inhibe la producción de estrógeno, es decir, la conversión de los sustratos androstenodiona y testosterona hasta estrona y estradiol, respectivamente. El término incluye, pero no se limita a, esteroides, en especial atamestano, exemestano y formestano; y, en particular, no esteroides, en especial amino-glutetimida, rogletimida, pirido-glutetimida, trilostano, testolactona, quetoconazol, vorozol, fadrozol, anastrozol y letrozol. El exemestano se puede administrar, por ejemplo, en la forma como se comercia, por ejemplo, bajo la marca comercial registrada AROMASIN. El formestano se puede administrar, por ejemplo, en la forma como se comercia, por ejemplo, bajo la marca comercial registrada LENTARON. El fadrozol se puede administrar, por ejemplo, en la forma como se comercia, por ejemplo, bajo la marca comercial registrada AFEMA. El anastrozol se puede administrar, por ejemplo, en la forma como se comercia, por ejemplo, bajo la marca comercial registrada ARIMIDEX. El letrozol se puede administrar, por ejemplo, en la forma como se comercia, por ejemplo, bajo la marca comercial registrada FEMARA o FEMAR. La amino-glutetimida se puede administrar, por ejemplo, en la forma como se comercia, por ejemplo, bajo la marca comercial registrada ORIMETEN. Una combinación de la invención que comprenda un agente quimioterapéutico que sea un inhibidor de aromatasa, es en particular útil para el tratamiento de los tumores positivos para el receptor de hormonas, por ejemplo, tumores de mama.
El término "anti-estrógeno", como se utiliza en la presente, se refiere a un compuesto que antagoniza el efecto de los estrógenos al nivel del receptor de estrógeno. El término incluye, pero no se limita a, tamoxifeno, fulvestrant, raloxifeno, y clorhidrato de raloxifeno. El tamoxifeno se puede administrar, por ejemplo, en la forma como se comercia, por ejemplo, bajo la marca comercial registrada NOLVADEX. El clorhidrato de raloxifeno se puede administrar, por ejemplo, en la forma como se comercia, por ejemplo, bajo la marca comercial registrada EVISTA. El fulvestrant se puede formular como se da a conocer en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,659,516, o se puede administrar, por ejemplo, en la forma como se comercia, por ejemplo, bajo la marca comercial registrada FASLODEX. Una combinación de la invención que comprenda un agente quimioterapéutico que sea un anti-estrógeno es en particular útil para el tratamiento de los tumores positivos para el receptor de estrógeno, por ejemplo, tumores de mama.
El término "anti-andrógeno", como se utiliza en la presente, se refiere a cualquier sustancia que sea capaz de inhibir los efectos biológicos de las hormonas androgénicas e incluye, pero no se limita a, bicalutamida (CASODEX), que se puede formular, por ejemplo, como se da a conocer en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,636,505.
El término "agonista de gonadorelina", como se utiliza en la presente, incluye, pero no se limita a, abarelix, goserelina, y acetato de goserelina. La goserelina se da a conocer en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,100,274, y se puede administrar, por ejemplo, en la forma como se comercia, por ejemplo, bajo la marca comercial registrada ZOLADEX. El abarelix se puede formular, por ejemplo, como se da a conocer en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,843,901.
El término "inhibidor de topoisomerasa I", como se utiliza en la presente, incluye, pero no se limita a, topotecano, gimatecano, irinotecano, camptotecina y sus análogos, 9-nitro-camptotecina, y el conjugado de camptotecina macromolecular PNU-166148 (compuesto A1 de la Publicación Internacional Número WO 99/17804). El irinotecano se puede administrar, por ejemplo, en la forma como se comercia, por ejemplo, bajo la marca comercial registrada CAMPTOSAR. El topotecano se puede administrar, por ejemplo, en la forma como se comercia, por ejemplo, bajo la marca comercial registrada HYCAMTIN.
El término "inhibidor de topoisomerasa II", como se utiliza en la presente, incluye, pero no se limita a, las antraciclinas, tales como doxorrubicina, incluyendo la formulación liposomal, por ejemplo, CAELYX; daunorrubicina; epirrubicina; idarrubicina; nemorrubicina; las antraquinonas mitoxantrona y losoxantrona; y las podofilotoxinas etoposida y teniposida. La etoposida se puede administrar, por ejemplo, en la forma como se comercia, por ejemplo, bajo la marca comercial registrada ETOPOPHOS. La teniposida se puede administrar, por ejemplo, en la forma como se comercia, por ejemplo, bajo la marca comercial registrada VM 26-BRISTOL. La doxorrubicina se puede administrar, por ejemplo, en la forma como se comercia, por ejemplo, bajo la marca comercial registrada ADRIBLASTIN o ADRIAMYCIN. La epirrubicina se puede administrar, por ejemplo, en la forma como se comercia, por ejemplo, bajo la marca comercial registrada FARMORUBICIN. La idarrubicina se puede administrar, por ejemplo, en la forma como se comercia, por ejemplo, bajo la marca comercial registrada ZAVEDOS. La mitoxantrona se puede administrar, por ejemplo, en la forma como se comercia, por ejemplo, bajo la marca comercial registrada NOVANTRON.
El término "agente activo en microtúbulos" se refiere a los agentes estabilizantes de microtúbulos, agentes desestabilizantes de microtúbulos, y a los inhibidores de la polimerización de microtubulina, incluyendo, pero no limitándose a, taxanos, por ejemplo, paclitaxel y docetaxel; alcaloides vinca, por ejemplo, vinblastina, en especial sulfato de vinblastina; vincristina, en especial sulfato de vincristina, y vinorelbina; discodermolidas; colquicina; y epotilonas y derivados de las mismas, por ejemplo, epotilona B o D o derivados de las mismas. El paclitaxel se puede administrar, por ejemplo, en la forma como se comercia, por ejemplo, TAXOL. El docetaxel se puede administrar, por ejemplo, en la forma como se comercia, por ejemplo, bajo la marca comercial registrada TAXOTERE. El sulfato de vinblastina se puede administrar, por ejemplo, en la forma como se comercia, por ejemplo, bajo la marca comercial registrada VINBLASTIN R.P. El sulfato de vincristina se puede administrar, por ejemplo, en la forma como se comercia, por ejemplo, bajo la marca comercial registrada FARMISTIN. La discodermolida se puede obtener, por ejemplo, como se da a conocer en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,010,099. También se incluyen los derivados de epotilona que se dan a conocer en la Publicación Internacional Número WO 98/10121, en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 6,194,181, en la Publicación Internacional Número WO 98/25929, en la Publicación Internacional Número WO 98/08849, en la Publicación Internacional Número WO 99/43653, en la Publicación Internacional Número WO 98/22461, y en la Publicación Internacional Número WO 00/31247. Se prefieren en especial epotilona A y/o B.
El término "agente alquilante", como se utiliza en la presente, incluye, pero no se limita a, ciclofosfamida, ifosfamida, melfalano o nitrosourea (BCNU o Gliadel). La ciclofosfamida se puede administrar, por ejemplo, en la forma como se comercia, por ejemplo, bajo la marca comercial registrada CICLOSTIN. La ifosfamida se puede administrar, por ejemplo, en la forma como se comercia, por ejemplo, bajo la marca comercial registrada HOLOXAN.
El término "inhibidores de desacetilasa de histona" o "inhibidores de HDAC", se refiere a los compuestos que inhiben la desacetilasa de histona, y que poseen una actividad anti-proliferativa. Esto incluye a los compuestos que se dan a conocer en la Publicación Internacional Número WO 02/22577, en especial ?7-hidroxi-3-[4-[[(2-hidroxi-etil)[2-(1H-indol-3-il)-etil]-amino]-metil]-fenil]-2E-2-propenamida, N-hidroxi-3-[4-[[[2-(2-metil-1 H-indol-3-il)-etil]-amino]-metil]-fenil]-2E-2-propenamida, y las sales farmacéuticamente aceptables de las mismas. Además incluye en especial el ácido hidroxámico de suberoil-anilida (SAHA).
El término "antimetabolito anti-neoplásico" incluye, pero no se limita a, 5-fluoro-uracilo o 5-FU; capecitabina; gemcitabina; agentes desmetilantes del ADN, tales como 5-azacitidina y decitabina; metotrexato y edatrexato; y antagonistas de ácido fólico, tales como pemetrexed. La capecitabina se puede administrar, por ejemplo, en la forma como se comercia, por ejemplo, bajo la marca comercial registrada XELODA. La gemcitabina se puede administrar, por ejemplo, en la forma como se comercia, por ejemplo, bajo la marca comercial registrada GEMZAR. También se incluye el anticuerpo monoclonal trastuzumab, el cual se puede administrar, por ejemplo, en la forma como se comercia, por ejemplo, bajo la marca comercial registrada HERCEPTIN.
El término "compuesto de platina", como se utiliza en la presente, incluye, pero no se limita a, carboplatina, c/s-platina, cisplatino, y oxaliplatina. La carboplatina se puede administrar, por ejemplo, en la forma como se comercia, por ejemplo, bajo la marca comercial registrada CARBOPLAT. La oxaliplatina se puede administrar, por ejemplo, en la forma como se comercia, por ejemplo, bajo la marca comercial registrada ELOXATIN.
El término "compuestos que dirigen/reducen una actividad de cinasa de proteína o de lípido; o una actividad de fosfatasa de proteína o de lípido; u otros compuestos anti-angiogénicos", como se utiliza en la presente, incluye, pero no se limita a, los inhibidores de cinasa de proteína tirosina y/o de cinasa de serina y/o treonina, o los inhibidores de cinasa de lípido, por ejemplo: a) compuestos que dirigen, reducen, o inhiben la actividad de los receptores del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFR), tales como los compuestos que dirigen, reducen, o inhiben la actividad de PDGFR, en especial los compuestos que inhiben al receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas, por ejemplo, un derivado de N-fenil-2-pirimidin-amina, por ejemplo, imatinib, SU101, SU6668 y GFB-111; b) compuestos que dirigen, reducen, o inhiben la actividad de los receptores del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR); c) compuestos que dirigen, reducen, o inhiben la actividad del receptor del factor de crecimiento tipo insulina I (IGF-IR), tales como los compuestos que dirigen, reducen, o inhiben la actividad de IGF-IR, en especial los compuestos que inhiben el receptor IGF-IR, tales como los compuestos que se dan a conocer en la Publicación Internacional Número WO 02/092599; d) compuestos que dirigen, reducen, o inhiben la actividad de la familia de la cinasa de tirosina receptora Trk; e) compuestos que dirigen, reducen, o inhiben la actividad de la familia de cinasa de tirosina receptora Axl; f) compuestos que dirigen, reducen, o inhiben la actividad del receptor c-Met; g) compuestos que dirigen, reducen, o inhiben la actividad de la cinasa de tirosina receptora Kit/SCFR; h) compuestos que dirigen, reducen, o inhiben la actividad de las cinasas de tirosina receptoras C-kit - (parte de la familia PDGFR), tales como los compuestos que dirigen, reducen, o inhiben la actividad de la familia de la cinasa de tirosina receptora c-Kit, en especial los compuestos que inhiben al receptor c-Kit, por ejemplo, imatinib; i) compuestos que dirigen, reducen, o inhiben la actividad de los miembros de la familia c-Abl y sus productos de fusión genética, por ejemplo, cinasa BCR-Abl, tales como los compuestos que dirigen la disminución o inhiben la actividad de los miembros de la familia c-Abl y sus productos de fusión genética, por ejemplo, un derivado de N-fenil-2-pirimidin-amina, por ejemplo, imatinib, PD180970, AG957, NSC 680410, ó PD173955 de ParkeDavis; j) compuestos que dirigen, reducen, o inhiben la actividad de los miembros de la cinasa C de proteína (PKC), y la familia de cinasas de serina/treonina Raf, los miembros de la familia de MEK, SRC, JAK, FAK, PDK, y los miembros de la familia de Ras/MAPK, o de la familia de la cinasa P I (3), o de la familia de cinasa relacionada con cinasa Pl(3), y/o los miembros de la familia de cinasa dependiente de ciclina (CDK), y son en especial los derivados de estaurosporina que se dan a conocer en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,093,330, por ejemplo, midostaurina; los ejemplos de compuestos adicionales incluyen, por ejemplo, UCN-01; safingol; BAY 43-9006; Briostatina 1; Perifosina; llmofosina; RO 318220 y RO 320432; GO 6976; Isis 3521; LY333531 /LY379196; los compuestos de isoquinolina, tales como aquéllos que se dan a conocer en la Publicación Internacional Número WO 00/09495; FTIs; PD184352; o QAN697 (un inhibidor de P13K); k) compuestos que dirigen, reducen, o inhiben la actividad de los inhibidores de cinasa de proteína tirosina, tales como los compuestos que dirigen, reducen, o inhiben la actividad de los inhibidores de cinasa de proteína tirosina, que incluyen mesilato de Imatinib (GLEEVEC) o tirfostina. Una tirfostina es de preferencia un compuesto de bajo peso molecular (Mr < 1500), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en especial un compuesto seleccionado a partir de la clase de benciliden-malonitrilo o la clase de compuestos de S-aril-bencen-malonitrilo o de quinolina del bisustrato, más especialmente cualquier compuesto seleccionado a partir del grupo que consiste en Tirfostina A23/RG-50810, AG 99, Tirfostina AG 213, Tirfostina AG 1748, Tirfostina AG 490, Tirfostina B44, enantiómero de Tirfostina B44 (+), Tirfostina AG 555, AG 494, Tirfostina AG 556, AG957, y adafostina (adamantil-éster del ácido 4-{[(2,5-dihidroxi-fenil)-metil]-amino}-benzoico, NSC 680410, adafostina; y I) compuestos que dirigen, reducen, o inhiben la actividad de la familia de cinasas de tirosina receptoras del factor de crecimiento epidérmico (EGFR, ErbB2, ErbB3, ErbB4 como homo- o hetero-dímeros), tales como los compuestos que dirigen, reducen, o inhiben la actividad de la familia de receptores del factor de crecimiento epidérmico, y son en especial los compuestos, proteínas o anticuerpos que inhiben a los miembros de la familia de cinasa de tirosina receptora del factor de crecimiento epidérmico, por ejemplo, el receptor de EGF, ErbB2, ErbB3 y ErbB4, o que se enlazan con el factor de crecimiento epidérmico o con los ligandos relacionados con el factor de crecimiento epidérmico, y son en particular los compuestos, proteínas, o anticuerpos monoclonales genérica y específicamente dados a conocer en la Publicación Internacional Número WO 97/02266, por ejemplo, el compuesto del Ejemplo 39, o en las Patentes Números EP 0564 409; WO 99/03854; EP 0520722; EP 0 566 226; EP 0 787 722; EP 0837063; US 5,747,498; WO 98/10767; WO 97/30034; WO 97/49688; WO 97/38983 y, en especial, la Publicación Internacional Número WO 96/30347, por ejemplo, el compuesto conocido como CP 358774; la Publicación Internacional Número WO 96/33980, por ejemplo, el compuesto ZD 1839; y la Publicación Internacional Número WO 95/03283, por ejemplo, el compuesto ZM105180, por ejemplo, trastuzumab (HERCEPTIN), cetuximab, Iressa, Tarceva, OSI-774, CI-1033, EKB-569, GW-2016, E1.1, E2.4, E2.5, E6.2, E6.4, E2.11, E6.3 o E7.6.3; y los derivados de 7H-pirrolo-[2,3-d]-pirimidina, los cuales se dan a conocer en la Publicación Internacional Número WO 03/013541.
Otros compuestos anti-angiogénicos incluyen los compuestos que tienen otro mecanismo para su actividad, por ejemplo, no relacionado con la inhibición de la cinasa de proteína o de lípido, por ejemplo, talidomida (THALOMID), y TNP-470.
Los compuestos que dirigen, reducen, o inhiben la actividad de una fosfatasa de proteína o de lípido son, por ejemplo, los inhibidores de fosfatasa 1, fosfatase 2A, PTEN o CDC25, por ejemplo, ácido ocadaico o un derivado del mismo.
Los compuestos que inducen los procesos de diferenciación celular son, por ejemplo, ácido retinoico, a-, ?-, ó d-tocoferol, o a-, ?-, ó d-tocotrienol.
El término "inhibidor de ciclo-oxigenasa", como se utiliza en la presente, incluye, pero no se limita a, por ejemplo, los inhibidores de Cox-2, ácido 2-aril-amino-fenil-acético sustituido por 5-alquilo y sus derivados, tales como celecoxib (CELEBREX), rofecoxib (VIOXX), etoricoxib, valdecoxib, o un ácido 5-alquil-2-aril-amino-fenil-acético, por ejemplo, ácido 5-metil-2-(2'-cloro-6'-fluoro-anilino)-fenil-acético, o lumiracoxib.
El término "bisfosfonatos", como se utiliza en la presente, incluye, pero no se limita a, ácido etridónico, clodrónico, tiludrónico, pamidrónico, alendrónico, ibandrónico, risedrónico, y zoledrónico. El "ácido etridónico" se puede administrar, por ejemplo, en la forma como se comercia, por ejemplo, bajo la marca comercial registrada DIDRONEL. El "ácido clodrónico" se puede administrar, por ejemplo, en la forma como se comercia, por ejemplo, bajo la marca comercial registrada BONEFOS. El "ácido tiludrónico" se puede administrar, por ejemplo, en la forma como se comercia, por ejemplo, bajo la marca comercial registrada SKELID. El "ácido pamidrónico" se puede administrar, por ejemplo, en la forma como se comercia, por ejemplo, bajo la marca comercial registrada AREDIAMR. El "ácido alendrónico" se puede administrar, por ejemplo, en la forma como se comercia, por ejemplo, bajo la marca comercial registrada FOSAMAX. El "ácido ibandrónico" se puede administrar, por ejemplo, en la forma como se comercia, por ejemplo, bajo la marca comercial registrada BONDRANAT. El "ácido risedrónico" se puede administrar, por ejemplo, en la forma como se comercia, por ejemplo, bajo la marca comercial registrada ACTONEL. El "ácido zoledrónico" se puede administrar, por ejemplo, en la forma como se comercia, por ejemplo, bajo la marca comercial registrada ZOMETA.
El término "inhibidores de mTOR" se refiere a compuestos que inhiben el objetivo de mamífero de rapamicina (mTOR), y que poseen una actividad anti-proliferativa, tal como sirolimus (Rapamune®), everolimus (CerticanMR), CCI-779 y ABT578.
El término "inhibidor de heparanasa", como se utiliza en la presente, se refiere a compuestos que dirigen, reducen, o inhiben la degradación del sulfato de heparina. El término incluye, pero no se limita a, PI-88.
El término "modificador de la respuesta biológica", como se utiliza en la presente, se refiere a una linfocina o interferones, por ejemplo, interferón ?.
El término "inhibidor de las isoformas oncogénicas Ras", por ejemplo, H-Ras, K-Ras, o N-Ras, como se utiliza en la presente, se refiere a compuestos que dirigen, reducen, o inhiben la actividad oncogénica de Ras, por ejemplo, un "inhibidor de farnesil-transferasa" por ejemplo, L-744832, DK8G557 o R115777 (Zarnestra).
El término "inhibidor de telomerasa", como se utiliza en la presente, se refiere a compuestos que dirigen, reducen, o inhiben la actividad de la telomerasa. Los compuestos que dirigen, reducen, o inhiben la actividad de telomerasa, son en especial los compuestos que inhiben al receptor de telomerasa, por ejemplo, telomestatina.
El término "inhibidor de amino-peptidasa de metionina", como se utiliza en la presente, se refiere a compuestos que dirigen, reducen, o inhiben la actividad de la amino-peptidasa de metionina. Los compuestos que dirigen, reducen, o inhiben la actividad de la amino-peptidasa de metionina son, por ejemplo, bengamida o un derivado de la misma.
El término "inhibidor de proteasoma", como se utiliza en la presente, se refiere a compuestos que dirigen, reducen, o inhiben la actividad del proteasoma. Los compuestos que dirigen, reducen, o inhiben la actividad del proteasoma incluyen, por ejemplo, PS-341 y MLN 341.
El término "inhibidor de metaloproteinasa de matriz" o ("inhibidor de MMP"), como se utiliza en la presente, incluye, pero no se limita a, inhibidores peptidomiméticos y no peptidomiméticos de colágeno, derivados de tetraciclina, por ejemplo, el inhibidor peptidomimético de hidroxamato batimastato y su análogo oralmente biodisponible marimastato (BB-2516), prinomastato (AG3340), metastato (NSC 683551) BMS-279251 , BAY 12-9566, TAA211, MMI270B o AAJ996.
El término "agentes utilizados en el tratamiento de malignidades hematológicas", como se utiliza en la presente, incluye, pero no se limita a, inhibidores de cinasa de tirosina tipo FMS, por ejemplo, los compuestos que dirigen, reducen, o inhiben la actividad de los receptores de cinasa de tirosina tipo FMS (Flt-3R); interferón, 1 -b-D-arabino-furanosil-citosina (ara-c) y bisulfano; e inhibidores de ALK, por ejemplo, los compuestos que dirigen, reducen, o inhiben la cinasa de linfoma anaplásico.
Los compuestos que dirigen, reducen, o inhiben la actividad de los receptores de cinasa de tirosina tipo FMS (Flt-3 R) son en especial los compuestos, proteínas o anticuerpos que inhiben a los miembros de la familia de la cinasa receptora Flt-3R, por ejemplo, PKC412, midostaurina, un derivado de estaurosporina, SU11248 y MLN518.
El término "inhibidores de HSP90", como se utiliza en la presente, incluye, pero no se limita a, los compuestos que dirigen, reducen, o inhiben la actividad intrínseca de la ATPasa de HSP90; que degradan, dirigen, reducen, o inhiben las proteínas clientes de HSP90 por medio de la senda de proteasoma de ubiquitina. Los compuestos que dirigen, reducen, o inhiben la actividad intrínseca de la ATPasa de HSP90 son en especial los compuestos, proteínas o anticuerpos que inhiben la actividad de ATPasa de HSP90, por ejemplo, 17-alil-amino, 17-desmetoxi-geldanamicina (17AAG), un derivado de geldanamicina; otros compuestos relacionados con geldanamicina; radicicol, e inhibidores de desacetilasa de histona (HDAC).
El término "anticuerpos anti-proliferativos", com o se utiliza en la presente , incluye , pero no se lim ita a , trastuzumab (Herceptin R), trastuzumab-DM 1 , erlotinib (TarcevaM R) , bevacizumab (AvastinMR), rituximab (Rituxan®) , PR064553 (anti-CD40) y Anticuerpo 2C4. Anticuerpos significan , por ejemplo, los anticuerpos monoclonales intactos, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos formados a partir de cuando menos 2 anticuerpos intactos, y fragmentos de anticuerpos, siempre q ue éstos exhiban la actividad biológica deseada .
Para el tratamiento de leucemia mieloide aguda (AM L) , los compuestos de la fórmula (I) se pueden utilizar en combinación con las terapias convencionales de leucemia, en especial en combinación con las terapias empleadas para el tratamiento de leucemia mieloide aguda. En particular, los compuestos de la fórmula ( I) se pueden administrar en combinación con , por ejemplo, los in hibidores de farnesil-transferasa y/u otros fármacos útiles para el tratamiento de leucemia mieloide aguda (AML), tales como Daunorrubicina, Adriamicina, Ara-C , VP-16, Teniposida , M itoxantrona , Idarrubicina , Carboplatino, y PKC41 2.
Un compuesto de la fórmula (I) también se puede utilizar con ventaja en combinación u no con otro o en combinación con otros agentes terapéuticos, en especial otros agentes contra la malaria . Estos agentes contra la malaria incluyen , pero no se limitan a, proguanil , clorproguanil , trimetoprim, cloroquina, mefloquina , lumefantrina, atovacuona, pirimetamina-sulfadoxina, pirimetamina- dapsona, halofantrina, quinina, quinidina, amodiaquina, amopiroquina, sulfonamidas, artemisinina, artefleno, artemeter, artesunato, primaquina, NO inhalado, L-arginina, Dipropilen-tri-amina NONOato (donador de NO), Rosiglitazona (agonista de PPARY), carbón activado, Eritropoietina, Levamisol, y pironaridina.
Un compuesto de la fórmula (I) también se puede utilizar con ventaja en combinación uno con otro o en combinación con otros agentes terapéuticos, tales como los utilizados para el tratamiento de Leishmaniasis, Tripanosomiasis, Toxoplasmosis y Neurocisticercosis. Estos agentes incluyen, pero no se limitan a, sulfato de cloroquina, atovacuona-proguanil, artemeter-lumefantrina, sulfato de quinina, artesunato, quinina, doxiciclina, clindamicina, antimoniato de meglumina, estibogluconato de sodio, miltefosina, quetoconazol, pentamidina, anfotericina B (AmB), AmB liposomal, paromomicina, eflornitina, nifurtimox, suramina, melarsoprol, prednisolona, benzonidazol, sulfadiazina, pirimetamina, clindamicina, trimetropim, sulfametoxazol, azitromicina, atovacuona, dexametasona, prazicuantel, albendazol, beta-lactamas, fluoro-quinolonas, macrolidas, amino-glicósidos, sulfadiazina y pirimetamina.
La estructura de los agentes activos identificados por números de código, nombres genéricos o comerciales, se puede tomar de la edición actual del compendio estándar "The Merck Index" o de las bases de datos, por ejemplo, Patents International, por ejemplo, IMS World Publications.
Los compuestos anteriormente mencionados, los cuales se pueden utilizar en combinación con un compuesto de la fórmula (I), se pueden preparar y administrar como se describe en la técnica, tal como en los documentos citados anteriormente.
Un compuesto de la fórmula (I) también se puede utilizar con ventaja en combinación con los procesos terapéuticos conocidos, por ejemplo, la administración de hormonas o en especial radiación.
Un compuesto de la fórmula (I) se puede utilizar en particular como un radiosensibilizante, en especial para el tratamiento de tumores que exhiban una pobre sensibilidad a la radioterapia.
"Combinación" se refiere a ya sea una combinación fija en una forma unitaria de dosificación, o bien a un kit de partes para la administración combinada, en donde un compuesto de la fórmula (I), y un componente de combinación (por ejemplo, otro fármaco como se explica más adelante, también referido como "agente terapéutico" o "co-agente") se pueden administrar independientemente al mismo tiempo o por separado dentro de intervalos de tiempo, en especial en donde estos intervalos de tiempo permitan que los componentes de la combinación muestren un efecto cooperativo, por ejemplo, sinérgico. Los términos "co-administración" o "administración combinada" o similares, como se utilizan en la presente, pretenden abarcar la administración del componente de combinación seleccionado a un solo sujeto que lo necesite, por ejemplo, un paciente, y se pretende que incluyan los regímenes de tratamiento en donde los agentes no necesariamente se administren por la misma vía de administración o al mismo tiempo. El término "combinación farmacéutica", como se utiliza en la presente, significa un producto que resulta de la mezcla o combinación de más de un ingrediente activo, e incluye tanto las combinaciones fijas como no fijas de los ingredientes activos. El término "combinación fija" significa que los ingredientes activos, por ejemplo, un compuesto de la fórmula (I), y un componente de combinación, se administran ambos a un paciente de una manera simultánea en la forma de una sola entidad o dosificación. El término "combinación no fija" significa que los ingredientes activos, por ejemplo, un compuesto de la fórmula (I), y un componente de combinación, se administran ambos a un paciente como entidades separadas, ya sea de una manera simultánea, concurrente, o en secuencia, sin límites de tiempo específicos, en donde esta administración proporcione niveles terapéuticamente efectivos de los dos compuestos en el cuerpo del paciente. Esto último también se aplica a la terapia de cóctel, por ejemplo, la administración de tres o más ingredientes activos.
EJEMPLOS Detalles experimentales: Los siguientes ejemplos pretenden ilustrar la invención y no deben interpretarse como limitaciones sobre la misma. Las temperaturas se dan en grados Celsius. Si no se menciona de otra manera, todas las evaporaciones se llevan a cabo bajo presión reducida, típicamente entre aproximadamente 15 mm Hg y 100 mm Hg (= de 20 a 133 mbar). La estructura de los productos finales, intermediarios y materiales de partida se confirma mediante los métodos analíticos convencionales, por ejemplo, microanálisis y características espectroscópicas, por ejemplo, MS, IR, RMN. Las abreviaturas empleadas son aquéllas convencionales en la materia.
Todos los materiales de partida, bloques de construcción, reactivos, ácidos, bases, agentes deshidratantes, solventes, y catalizadores utilizados para sintetizar los compuestos de la presente invención son cualquiera de aquéllos comercialmente disponibles, o se pueden producir mediante los métodos de síntesis orgánica conocidos por un experto ordinario en este campo (Houben-Weyl, 4a Edición 1952, Methods of Organic Synthesis, Thieme, Volumen 21). Además, los compuestos de la presente invención se pueden producir mediante los métodos de síntesis orgánica conocidos por un experto ordinario en este campo, como se muestra en los siguientes ejemplos.
Abreviaturas ACN acetonitrilo AcOH ácido acético aq. acuoso Boc terbutoxi-carbonilo Boc20 dicarbonato de diterbutilo tBu terbutilo tBuOH terbutanol BrettPhos 2-(diciclohexil-fosfino)-3,6-dimetoxi-2'- 4'-6'-tri-¡sopropil-1 , 1 '-bife ni lo br s singulete amplio COMU hexafluorofosfato de (1 -ciano-2-etoxi-2- oxo-et¡liden-am¡no-oxi)-dimetil-amino- morfolino-carbenio conc. concentrado d día(s) d doblete dd doblete de dobletes dba dibenciliden-acetona DCM dicloro-metano DEA dietil-amina DEAD azodicarboxilato de dietilo DEAP dietil-amino-piridina DIPEA di-isopropil-etil-amina DMF dimetil-formamida DMME dimetoxi-metano D SO sulfóxido de dimetilo DPPA difenil-fosforil-azida DPPF 1 ,1 '-bis-(difenil-fosfino)-ferroceno EDC clorhidrato de 1 -(3-dimetil-amino-propil)- 3-etil-carbodi-imida eq. equivalente(s) ESI ionización por electroaspersión Et3N trietil-amina Et20 dietil-éter EtOAc acetato de etilo EtOH etanol h hora(s) HATU hexafluorofosfato de 0-(7-aza- benzotnazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametil- uronio HBTU hexafluorofosfato de 0-(1H- benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametil- uronio HMDS hexametil-disilazano HOBT 1 -hidroxi-benzotriazol HPLC cromatografía de líquidos de alto rendimiento IPA isopropanol LCMS cromatografía de líquidos con espectrometría de masas mCPBA ácido meta-cloroperoxi-benzoico MeOH metanol m multiplete min minuto(s) MS espectrometría de masas mw microondas RMN espectrometría de resonancia magnética nuclear NaOtBu terbutóxido de sodio NP fase normal OBD densidad de lecho óptim a Pd2(dba)3 tris-(dibenciliden-acetona)-dipaladio SPE PL-HCO3 cartucho de bicarbonato soportado por pol ímero para la remoción de ácido prep. preparación PPh3 trifenil-fosfina q cuarteto Rac-BI NAP 2 ,2'-bis-(di-p-tolil-fosfino)-1 , 1 '-binaftilo racémico RP fase inversa Rt tiempo de retención rt temperatu ra ambiente RuPhos 2-diciclohexil-fosfino-2' ,6'-di-isopropoxi- 1 , 1 '-bifenilo sat. satu rado SCX-2 poliestireno macroporoso de ácido sulfónico soportado por polímero soln . solución t triplete TBM E terbutil-metil-éter TBAF fluoru ro de tetrabutil-amonio TBDMSCI cloru ro de terbut M-d imetil-sililo TMTB tetra metí l-te rbuti lo -XPhos 2-diterbutil-fosfino-3,4,5,6-tetrametil- 2\4\6,-tri-isopropil-bifenilo TFA ácido trifluoro-acético THF tetrahidrofurano TLC cromatografía de capa delgada UPLC cromatografía de líquidos de ultra-alto rendimiento XPhos 2-diciclohexil-fosfino-2',4,,6'-tri- isopropil-bifenilo Pd[RuPhos] (2-diciclohexil-fosfino-2'6'-di-isopropil- 11'-bifenil)-(2-(2-amino-etil)-fenil)- paladio(ll) El equipo de microondas utilizado es un Biotage Initiator®.
Todos los compuestos se nombran utilizando AutoNom.
Preparación de Ejemplos - Procedimientos Generales Esquema 1 (R)-pirrolidin-3-ol a) El (R)-pirrolidin-3-ol y un cloruro de ácido de la fórmula R4C(0)CI o ácido carboxílico de la fórmula R C(0)OH se hicieron reaccionar para preparar una amida de la fórmula general II. Los expertos en este campo apreciarán que hay muchas maneras conocidas de preparar amidas. Por ejemplo, véase Mantalbetti, C.A.G.N y Falque, V., Amide bond formation and peptide coupling, Tetrahedron, 2005, 61(46), páginas 10827-10852 y las referencias citadas en el mismo. Se han empleado los siguientes métodos generales i - ii. i. Una solución del ácido carboxílico y dimetil-formamida (DMF) (1 equivalente) en dicloro-metano (DCM) se trató con cloruro de oxalilo (1.5 equivalentes) durante 1 hora a 3°C. La mezcla de reacción se concentró bajo presión reducida, se disolvió en dicloro-metano (DCM), y se agregó a una solución de clorhidrato de (R)-pirrolidin-3-ol (1.0 equivalentes), y Et3N (2.5 equivalentes) en dicloro-metano (DCM) a 3°C. La mezcla resultante se agitó vigorosamente a 3°C durante 1 hora, y entonces se concentró bajo presión reducida. El residuo se trató con EtOAc y se filtró. El residuo se lavó con EtOAc, y los filtrados combinados se concentraron bajo presión reducida y se purificaron mediante cromatografía por evaporación instantánea. ii. Una solución de un cloruro de ácido comercial (1.0 equivalentes) en dicloro-metano (DCM) se agregó a una solución de clorhidrato de (R)-pirrolidin-3-ol (1.0 equivalentes), y Et3N (2.5 equivalentes) en dicloro-metano (DCM) a 3°C. La mezcla resultante se agitó vigorosamente a 3°C durante 1 hora, y entonces se concentró bajo presión reducida. El residuo se trató con EtOAc y se filtró. El residuo se lavó con EtOAc, y los filtrados combinados se concentraron bajo presión reducida y se purificaron mediante crom atografía por evaporación instantánea .
Las condiciones típicas para las reacciones de formación de enlace de am ida se ejem plifican en la sección B) Cond iciones de formación de enlace de am ida , m ás adelante. b) Los mesilatos de los com puestos de la fórm ula general II se prepararon mediante las condiciones acostumbradas, de preferencia mediante la reacción del II con cloruro de metan-sulfonilo (2 eq uivalentes) , y Et3N (2 equivalentes) en dicloro-metano (DCM) a 0°C. c) Los compuestos de la fórmula general V se prepararon mediante la reacción del 3,4-dihidro-2H-benzo-[1 ,4]-oxazin-6-ol IV con los compuestos de la fórmula general III en la presencia de una base adecuada, tal como hidru ro de sodio (NaH) , y u n solvente orgánico polar, tal como dimetil-formamida (D F) , bajo condiciones de gas inerte a 50°C. Las condiciones típicas para estas reacciones se ejemplifican en la sección C) Condiciones de introducción de cadena lateral , más adelante. d) Acoplamiento cruzado de Buchwald-Hartwig entre el V y un haluro de arilo de la fórmula general R2-X\ en donde X' = bromo o yodo, se llevó a cabo bajo las condiciones de Buchwald-Hartwig acostumbradas, utilizando una combinación de catalizador de Pd / ligando, tal como de preferencia Pd2(dba)3/2-(diciclohexil-fosfino)-bifenilo o Pd2(dba)3/2-diciclohexil-fosfino-2',4',6'-tri-isopropil-bifenilo o bis-(tri-terbutil-fosfina)-paladio, y una base, tal como de preferencia NaOtBu, y un solvente orgánico, tal como de preferencia tolueno. La reacción de preferencia se agitó a una temperatura de aproximadamente 80°C a 120°C, de preferencia de 110°C, y de preferencia se llevó a cabo en un reactor de microondas. La reacción de preferencia se llevó a cabo bajo un gas inerte, tal como nitrógeno o argón. Los compuestos finales se purificaron mediante cromatografía normal o en fase inversa. Las condiciones típicas para las reacciones de acoplamiento cruzado de Buchwald-Hartwig se ejemplifican en la sección A) Aminaciones o hidroxilaciones de Buchwald, más adelante.
Esquema X VI a) El (S)-3-((3,4-dihidro-2H-benzo-[b][1 ,4]-oxazin-6-il)-oxi)-pirrolidin-1 -carboxilato de terbutilo (compuesto VIII) se preparó mediante la reacción del 3,4-dihidro-2H-benzo-[1 ,4]-oxazin-6-ol IV con un compuesto de la fórmula general VII mediante uno de los siguientes métodos: i) para X = mesilato, los compuestos IV y VII se hicieron reaccionar en la presencia de una base adecuada, tal como hidruro de sodio (NaH), y un solvente orgánico polar, tal como dimetil-formamida (DMF), bajo condiciones de gas inerte, a temperatura ambiente; ii) para X = H, los compuestos de la fórmula general IV y VII se hicieron reaccionar utilizando las condiciones de Mitsunobu acostumbradas, de preferencia utilizando Ph3P (1.4 equivalentes), y azodicarboxilato de dietilo (1.4 equivalentes) en un solvente orgánico, tal como tetrahidrofurano (THF), bajo condiciones de gas inerte, a una temperatura de preferencia de 70°C. Las condiciones típicas para estas reacciones se ejemplifican en la sección C) Condiciones de introducción de cadena lateral, más adelante. b) El acoplamiento cruzado de Buchwald-Hartwig entre el VIII y un haluro de arilo de la fórmula general R -X', en donde X' = bromo o yodo, se llevó a cabo bajo las condiciones de Buchwald-Hartwig acostumbradas, utilizando una combinación de catalizador de Pd / ligando, tal como de preferencia Pd2(dba)3/X-Phos, Pd2(dba)3/(rac)-BINAP, Pd(OAc)2/(rac)-BINAP o bis-(tri-terbutil-fosfina)-paladio, y una base, tal como de preferencia NaOtBu, Cs2C03 ó K3PO4 y un solvente orgánico, tal como de preferencia tolueno, dioxano o tetrahidrofurano (THF). La reacción de preferencia se agitó a una temperatura de aproximadamente 60°C a 120°C, y de preferencia se llevó a cabo en un reactor de microondas. La reacción de preferencia se llevó a cabo bajo un gas inerte, tal como nitrógeno o argón. Las condiciones típicas para las reacciones de acoplamiento cruzado de Buchwald-Hartwig se ejemplifican en la sección A) Aminaciones o hidroxilaciones de Buchwald, más adelante. c) La desprotección de N-BOC de los compuestos de la fórmula general IX se llevó a cabo bajo las condiciones de desprotección de BOC acostumbradas, utilizando entre los posibles ácidos, de preferencia ácido trifluoro-acético (TFA) y un solvente orgánico, de preferencia dicloro-metano (DCM). La reacción de preferencia se llevó a cabo a temperatura ambiente. d) Un compuesto de la fórmula general X y un cloruro de ácido de la fórmula R4C(0)CI o un ácido carboxílico de la fórmula R C(0)OH se hicieron reaccionar para preparar una amida de la fórmula general VI utilizando las condiciones de acoplamiento de amida acostumbradas: en adición a los métodos descritos en el esquema 1, paso a), los reactivos de acoplamiento preferidos fueron HBTU, HOBt/EDC, COMU/DIPEA. Los acoplamientos se llevaron a cabo en un solvente orgánico, tal como de preferencia dimetil-formamida (DMF) o dicloro-metano (DCM), y los compuestos finales se purificaron mediante cromatografía normal o en fase inversa. Las condiciones típicas para las reacciones de formación de enlace de amida se ejemplifican en la sección B) Condiciones de formación de enlace de amida, más adelante.
Esquema 3 a) El 3,4-dihidro-2H-benzo-[1 ,4]-oxazin-6-ol IV se O-protegió empleando los procedimientos de sililación convencionales, utilizando un reactivo de sililación, de preferencia TBDMSCI, y una base, de preferencia NaH, en un solvente orgánico, de preferencia tetra h idrofu rano (TH F), a tem peratura am biente. b) E l acoplam iento cruzado de Buchwaid-H artwig entre el XI y un haluro de arilo de la fórmula general R2-X' , en donde X' = bromo o yodo, se llevó a cabo bajo las condiciones de Buchwaid-Hartwig acostumbradas, utilizando una combinación de catalizador de Pd / ligando, tal como de preferencia Pd2(dba)3/X-Phos, Pd2(dba)3/ diciclohexil-fosfino-2',4',6'-tri-isopropil-bifenilo o bis-(tri-terbutil-fosfina)-paladio, y una base, tal como de preferencia NaOtBu , y un solvente orgánico, tal como de preferencia tolueno. La reacción de preferencia se agitó a una temperatu ra de aproximadamente 1 1 0°C a 140°C , y de preferencia se llevó a cabo en un reactor de microondas. La reacción de preferencia se llevó a cabo bajo un gas inerte, tal como nitrógeno o argón. Las condiciones típicas para las reacciones de acoplamiento cruzado de Buchwaid-Hartwig se ejemplifican en la sección A) Aminaciones o hidroxilaciones de Buchwald , más adelante . c) La desprotección de O-TBDMS de los compuestos de la fórmula general XII se llevó a cabo bajo las condiciones de desprotección acostumbradas, utilizando de preferencia TBAF y un solvente orgánico, de preferencia tetrahidrofu rano (TH F). La reacción de preferencia se llevó a cabo a temperatura ambiente d) Los compuestos de la fórmula general XII I se acoplaron con los mesilatos de la fórmula general II I, utilizando una base adecuada, tal como de preferencia hidruro de sodio (NaH) o K2C03 y un solvente orgánico polar, tal como dimetil-formamida (DM F) , bajo condiciones de gas inerte, a temperatura ambiente o a temperaturas elevadas de hasta 100°C. Los compuestos finales se purificaron mediante cromatografía normal o en fase inversa. Las condiciones típicas para estas reacciones se ejemplifican en la sección C) Condiciones de introducción de cadena lateral, más adelante.
Esquema 4 XV VI a) Los compuestos de la fórmula general XIII (preparados como se describe en el esquema 3) se hicieron reaccionar con los compuestos de la fórmula general VII mediante uno de los siguientes m étodos : 1 ) para X = mesilato , los com puestos XIII y VII se hicieran reaccionar en la presencia de una base adecuada , tal como hidruro de sodio (NaH) , y un solvente orgánico polar, tal como dimetil-formamida (DM F), bajo condiciones de gas inerte, a temperatura ambiente; ii) para X = H , los compuestos de la fórmula general XIII y VI I se hicieron reaccionar utilizando las condiciones de M itsunobu acostumbradas, de preferencia utilizando Ph3P ( 1 .4 equivalentes) , y azodicarboxilato de dietilo (1 .4 eq uivalentes) en u n solvente orgánico, tal como tetrahidrofu rano (TH F) , bajo condiciones de gas inerte, a una temperatu ra de preferencia de 70°C . Las condiciones típicas para estas reacciones se ejemplifican en la sección C) Condiciones de introducción de cadena lateral , más adelante. b) La desprotección de N-BOC se llevó a cabo bajo las condiciones de desprotección de BOC acostumbradas, utilizando entre los posibles ácidos, de preferencia ácido trifluoro-acético, y un solvente orgánico, de preferencia CH2CI2. La reacción de preferencia se llevó a cabo a temperatura ambiente. c) La formación de enlace de amida se llevó a cabo utilizando los compuestos de la fórmula general XV y un cloru ro de ácido de la fórmu la R C(0)CI o ácido carboxílico de la fórmula R C(0)OH , para preparar una amida de la fórmula general VI; se utilizaron las condiciones de acoplamiento de enlace de amida acostumbradas, como se describen en el esquema 1 , paso a) . En adición a los métodos descritos en el esquema 1 , paso a) , se utilizó el acoplamiento de ácidos carboxílicos utilizando HOBt/EDC o el acoplamiento utilizando cloroformatos o cloruros carbámicos. Los acoplamientos se llevaron a cabo en un solvente orgánico, tal como de preferencia dimetil-formamida (DMF) o dicloro-metano (DCM), y los compuestos finales se purificaron mediante cromatografía normal o en fase inversa. Las condiciones típicas para las reacciones de formación de enlace de amida se ejemplifican en la sección B) Condiciones de formación de enlace de amida, más adelante.
Esquema 5 a) La 7-cloro-2 , 3-dihid ro-1 H -pirido-[3 ,4-b][1 ,4]-oxazi na XVI I se preparó a partir de la 7-cloro-1 H-pirido-[3,4-b][1 ,4]-oxazin-2-ona XVI mediante los métodos de reducción acostumbrados, utilizando como el agente de reducción , de preferencia BH3*TH F , y como el solvente de preferencia tetrahidrofurano (TH F) . El XVI está disponible por medio de nitración de flujo del 2-cloro-5-(2-metox¡-2-oxoetoxi)-piridin-1 -óxido, seguida por reducción y ciclación . b) El acoplamiento cruzado entre el XVII y un haluro de arilo de la fórmula general R2-X' , en donde X' = bromo o yodo , se llevó a cabo bajo las condiciones de Buchwald-Hartwig acostumbradas, utilizando u na combinación de catalizador de Pd / ligando, tal como de preferencia Pd2(dba)3/X-Phos, y una base, tal como de preferencia Cs2C03, y un solvente orgánico, tal como de preferencia dioxano. La reacción de preferencia se agitó a una temperatu ra de aproximadamente 1 00°C y se pudo llevar a cabo en un reactor de microondas. La reacción de preferencia se llevó a cabo bajo un gas inerte, tal como nitrógeno o argón . Las condiciones típicas para las reacciones de acoplamiento cruzado de Buchwald-Hartwig se ejemplifican en la sección A) Aminaciones o hidroxilaciones de Buchwald, más adelante. c) La hidroxilación del XVII I se llevó a cabo utilizando KOH acuoso y una combinación de catalizador de Pd / ligando, tal como de preferencia Pd2(dba)3/tetrametil-terbutil-Xphos, y un solvente orgánico, tal como de preferencia dioxano. La reacción de preferencia se agitó a una temperatu ra de aproximadamente 1 00°C.
La reacción de preferencia se llevó a cabo bajo u n gas inerte, tal com o n itrógeno o argón . d) E l acoplam iento de u n com puesto de la fórm ula general XIX con un compuesto de la fórmula general VII se llevó a cabo utilizando una base adecuada, tal como hidruro de sodio (NaH , Cs2C03, K2C03) , y un solvente orgánico polar, tal como dimetil-formamida (D F), bajo condiciones de gas inerte, a una temperatura de preferencia de 60°C a 80°C. Las condiciones típicas para estas reacciones se ejemplifican en la sección C) Condiciones de introducción de cadena lateral , más adelante. e) La desprotección de N-BOC se llevó a cabo bajo las cond iciones de desprotección de BOC acostumbradas , utilizando entre los posibles ácidos, de preferencia ácido trifluoro-acético, y un solvente orgánico, de preferencia CH2CI2. La reacción de preferencia se llevó a cabo a temperatura ambiente . f) La formación de enlace de amida se llevó a cabo utilizando los compuestos de la fórmula general XXI y un cloruro de ácido de la fórmu la R C(0)CI o ácido carboxílico de la fórmula R C(0)OH , para preparar una amida de la fórmula general XXII; se utilizaron las condiciones de acoplamiento de enlace de amida acostumbradas, como se describen en el esquema 1 , paso a), en adición , se aplicó el acoplamiento de ácidos carboxílicos utilizando HOBt/EDC . Los acoplamientos se llevaron a cabo en un solvente orgánico, tal como de preferencia dimetil-formamida (DM F) o dicloro-metano (DCM), y los compuestos finales se purificaron mediante cromatografía normal o en fase inversa. Las condiciones típicas para las reacciones de formación de enlace de amida se ejemplifican en la sección B) Condiciones de formación de enlace de amida, más adelante.
Esquema 6 a) La hidroxilación de la 7-cloro-2,3-dihidro-1 H-pirido-[3,4- b][1,4]-oxazina XVII para dar el 2,3-dihidro-1 H-pirido-[3,4-b][1 ,4]- oxazin-7-ol XXIII se llevó a cabo utilizando KOH acuoso y una combinación de catalizador de Pd / ligando, tal como de preferencia Pd2(dba)3/tetrametil-terbut¡l-Xphos, y un solvente orgánico, tal como de preferencia dioxano. La reacción de preferencia se agitó a una temperatu ra de aproximadamente 1 00°C. La reacción de preferencia se llevó a cabo bajo un gas inerte, tal como nitrógeno o argón . b) El acoplamiento del compuesto XXIII con el mesilato VI I se efectuó utilizando una base adecuada, tal como hid ruro de sodio (NaH) , y un solvente orgánico polar, tal como dimetil-formamida (DM F), bajo condiciones de gas inerte, a una temperatura de preferencia de 80°C. Las condiciones típicas para estas reacciones se ejemplifican en la sección C) Condiciones de introducción de cadena lateral , más adelante. c) El acoplamiento cruzado entre el XXIV y un haluro de arilo de la fórmula general R2-X' , en donde X' = bromo o yodo, se llevó a cabo bajo las condiciones de Buchwald-Hartwig acostumbradas, utilizando una combinación de catalizador de Pd / ligando, tal como de preferencia Pd2(dba)3/X-Phos o Pd2(dba)3/(rac)-BI NAP, y una base, tal como de preferencia Cs2C03 ó NaOtBu , y un solvente orgánico, tal como de preferencia dioxano o tolueno. La reacción de preferencia se agitó a una temperatura de aproximadamente 1 00°C y se pudo llevar a cabo en un reactor de microondas. La reacción de preferencia se llevó a cabo bajo un gas inerte, tal como nitrógeno o argón . Las condiciones típicas para las reacciones de acoplamiento cruzado de Buchwald-Hartwig se ejemplifican en la sección A) Aminaciones o h idroxilaciones de Buchwald, más adelante. d) La desprotección de N-BOC se llevó a cabo bajo las condiciones de desprotección de BOC acostumbradas, utilizando entre los posibles ácidos, de preferencia ácido trifluoro-acético, y un solvente orgánico, de preferencia CH2CI2. La reacción de preferencia se llevó a cabo a temperatura ambiente e) La formación de enlace de amida se llevó a cabo utilizando los compuestos de la fórmula general XXI y un cloruro de ácido de la fórmula R C(0)CI o ácido carboxílico de la fórmula R4C(0)OH, para preparar una amida de la fórmula general XXII; se utilizaron las condiciones de acoplamiento de enlace de amida acostumbradas, como se describen en el esquema 1, paso a), o se aplicó el acoplamiento de ácidos carboxílicos utilizando HBTU, HOBt/EDC o HATU. Los acoplamientos se llevaron a cabo en un solvente orgánico, tal como de preferencia dimetil-formamida (D F) o dicloro-metano (DCM), y los compuestos finales se purificaron mediante cromatografía normal o en fase inversa. Las condiciones típicas para las reacciones de formación de enlace de amida se ejemplifican en la sección B) Condiciones de formación de enlace de amida, más adelante.
Información general de cromatografía LCMS método M1 (RtM1) HPLC-dimensiones de la columna:2.1 x 50 milímetros.
HPLC-tipo de columna: Acquity UPLC HSS T3, 1.8 mieras.
HPLC-eluyente: A) agua + ácido fórmico al 0.05 por ciento por volumen + acetato de amonio 3.75 mM, B) acetonitrilo (ACN) + ácido fórmico al 0.04 por ciento por volumen.
HPLC-gradiente: Del 2 al 98 por ciento de B en 1.4 minutos, 98 por ciento de B en 0.45 minutos, flujo = 1.2 mililitros / minuto.
HPLC-temperatura de la columna: 50°C.
LCMS método M2 (RtM2) HPLC-dimensiones de la columna: 2.1 x 30 milímetros.
HPLC-tipo de columna: Ascentis Express C18, 2.7 mieras.
HPLC-eluyente: A) agua + ácido fórmico al 0.05 por ciento por volumen + acetato de amonio 3.75 mM, B) acetonitrilo (ACN) + ácido fórmico al 0.04 por ciento por volumen.
HPLC-gradiente: Del 2 al 98 por ciento de B en 1.4 minutos, 0.75 minutos con el 98 por ciento de B, flujo = 1.2 mililitros / minuto.
HPLC-temperatura de la columna: 50°C.
LCMS método M3 (RtM3) HPLC-dimensiones de la columna: 2.1 x 30 milímetros.
HPLC-tipo de columna: Ascentis Express C18, 2.7 mieras.
HPLC-eluyente: A) agua + ácido fórmico al 0.05 por ciento por volumen + acetato de amonio 3.75 mM, B) acetonitrilo (ACN) + ácido fórmico al 0.04 por ciento por volumen.
HPLC-gradiente: Del 2 al 98 por ciento de B en 8.5 minutos, 1 minuto con el 98 por ciento de B, flujo = 1.2 mililitros / minuto.
HPLC-temperatura de la columna: 50°C.
LCMS método M4 (RtM4) HPLC-dimensiones de la columna:4.6 x 50 milímetros.
HPLC-tipo de columna: SunFire C18, 5 mieras.
HPLC-eluyente: A) agua + ácido trifluoro-acético (TFA) al 0.1 por ciento por volumen, B) acetonitrilo (ACN) + ácido trifluoro-acético (TFA) al 0.1 por ciento por volumen.
HPLC-gradiente: Del 5 al 100 por ciento de B en 8.0 minutos B, flujo = 2 mililitros / minuto.
HPLC-temperatura de la columna: 40°C.
LCMS método M5 (RtM5) HPLC-dimensiones de la columna: 0.46 x 25 centímetros.
HPLC-tipo de columna: Chiralcel OJ-H (1189).
HPLC-eluyente: EtOH/MeOH, 60:40.
HPLC-gradiente: Isocrática, flujo = 0.5 mililitros / minuto.
Detector: UV 220 nanómetros.
LCMS método M6 (RtM6) HPLC-dimensiones de la columna:2.1 x 30 milímetros.
HPLC-tipo de columna: Ascentis Express C18, 2.7 mieras.
HPLC-eluyente: A) agua + ácido trifluoro-acético (TFA) al 0.05 por ciento, B) acetonitrilo (ACN) + ácido trifluoro-acético (TFA) al 0.04 por ciento.
HPLC-gradiente: Del 2 al 98 por ciento de B en 1.4 minutos, 0.75 minutos con el 98 por ciento de B, flujo = 1.2 mililitros / minuto.
HPLC-temperatura de la columna: 50°C.
LCMS método M7 (RtM7) HPLC-dimensiones de la columna: 2.1 x 30 milímetros.
HPLC-tipo de columna: Ascentis Express C18, 2.7 mieras.
HPLC-eluyente: A) agua + ácido trifluoro-acético (TFA) al 0.05 por ciento, B) acetonitrilo (ACN) + ácido trifluoro-acético (TFA) al 0.04 por ciento.
HPLC-gradiente: Del 10 al 95 por ciento de B en 3.0 minutos, 1 minuto con el 95 por ciento de B, flujo = 1.2 mililitros / minuto.
HPLC-temperatura de la columna: 50°C.
LCMS método M8 (RtM8) HPLC-dimensiones de la columna: 2.1 x 30 milímetros.
HPLC-tipo de columna: Ascentis Express C182.7 mieras.
HPLC-eluyente: A) agua + ácido fórmico al 0.05 por ciento + acetato de amonio 3.75 mM, B) acetonitrilo + ácido fórmico al 0.04 por ciento.
HPLC-gradiente: Del 10 al 95 por ciento de B en 3.0 minutos, flujo = 1.2 mililitros / minuto.
LCMS método M9 (Rt„9) HPLC-dimensiones de la columna: 2.1 x 30 milímetros.
HPLC-tipo de columna: Ascentis Express C182.7 mieras.
HPLC-eluyente: A) agua + ácido fórmico al 0.05 por ciento + acetato de amonio 3.75 mM, B) acetonitrilo + ácido fórmico al 0.04 por ciento.
HPLC-gradiente: 10 por ciento de B en 0.0 a 0.5 minutos, entonces de 0.5 minutos a 3.0 minutos con gradiente del 10 al 95 por ciento de B, flujo = 1.2 mililitros / minuto.
LCMS método M10 (RtM10) HPLC-dimensiones de la columna: 2.1 x 50 milímetros.
HPLC-tipo de columna: Acquity UPLC BEH C18 1.7 mieras.
HPLC-eluyente: A) agua + ácido fórmico al 0.1 por ciento por volumen, B) acetonitrilo.
HPLC-gradiente: Del 20 al 25 por ciento de B en 1.00 minutos, entonces del 25 al 95 por ciento de B en 3.20 minutos, entonces del 95 al 100 por ciento de B en 0.10 minutos, entonces 100 por ciento durante 0.20 minutos, flujo = 0.7 mililitros / minuto.
LCMS método M11 (RtM11) HPLC-dimensiones de la columna: 2.1 x 50 milímetros.
HPLC-tipo de columna: Acquity UPLC BEH C18, 1.7 mieras.
HPLC-eluyente: A) agua + ácido fórmico al 0.1 por ciento por volumen, B) acetonitrilo.
HPLC-gradiente: Del 5 al 10 por ciento de B en 1.00 minutos, entonces del 10 al 90 por ciento de B en 3.00 minutos, entonces del 90 al 100 por ciento de B en 0.10 minutos, entonces 100 por ciento durante 0.40 minutos, flujo = 0.7 mililitros / minuto.
LCMS método M12 (RtM12) HPLC-dimensiones de la columna: 2.1 x 30 milímetros.
HPLC-tipo de columna: Ascentis Express C18, 2.7 mieras. HPLC-eluyente: A) agua + ácido trifluoro-acético (TFA) al 0.1 por ciento por volumen, B) acetonitrilo.
HPLC-gradiente: Del 10 al 95 por ciento de B durante 1.7 minutos, y 1.2 mililitros / minuto como el flujo de solvente, y entonces el 95 por ciento de B durante 0.7 minutos, flujo = 1.4 mililitros / minuto.
LCMS método M13 (RtMi3) HPLC-dimensiones de la columna: 2.1 x 30 milímetros.
HPLC-tipo de columna: Ascentis Express C18, 2.7 mieras.
HPLC-eluyente: A) agua + ácido fórmico al 0.05 por ciento + acetato de amonio 3.75 mM, B) acetonitrilo + ácido fórmico al 0.04 por ciento.
HPLC-gradiente: Del 10 al 95 por ciento de B en 3.7 minutos, flujo = 1.2 mililitros / minuto.
LCMS método M14 (RtM14) HPLC-dimensiones de la columna: 2.1 x 30 milímetros.
HPLC-tipo de columna: Ascentis Express C18, 2.7 mieras. HPLC-eluyente: A) agua + ácido fórmico al 0.05 por ciento + acetato de amonio 3.75 mM, B) acetonitrilo + ácido fórmico al 0.04 por ciento.
HPLC-gradiente: Del 10 al 95 por ciento de B en 1.5 minutos, 1 minuto con el 95 por ciento de B, flujo = 1.2 mililitros / minuto.
LCMS método M15 (RtM1s) HPLC-dimensiones de la columna: 0.46 x 25 centímetros.
HPLC-tipo de columna: Chiralcel OD-H (1194).
HPLC-eluyente: Hexano/EtOH, 50:50 + DEA al 0.05 por ciento.
HPLC-gradiente: Isocrática, flujo = 0.5 mililitros / minuto.
Detector: UV 220 nanómetros.
LCMS método M16 (Rt HPLC-dimensiones de la columna: 2.1 x 50 milímetros.
HPLC-tipo de columna: Acquity UPLC HSS T3, 1.8 mieras.
HPLC-eluyente: A) agua + ácido fórmico al 0.05 por ciento por volumen + acetato de amonio 3.75 mM, B) acetonitrilo (ACN) + ácido fórmico al 0.04 por ciento por volumen.
HPLC-gradiente: Del 5 al 98 por ciento de B en 1.4 minutos, 98 por ciento de B en 0.4 minutos, flujo = 1.0 mililitros / minuto.
HPLC-temperatura de la columna: 60°C.
Difracción en polvo de ravos-X Instrumentación: Método X1 Instrumento: Bruker D8 GADDS Discover Irradiación: CuKa (40 kV, 40 mA) Detector: HI-STAR Detector de área Rango de exploración: 6°-39° (valor 2-Theta) Determinación del punto de fusión: El punto de fusión se determinó mediante calorimetría de exploración diferencial (DSC), la calorimetría de exploración diferencial (DSC) fue como se registró en un TA Instruments DSC Q2000 utilizando una velocidad de calentamiento de 10°C/minuto. Una muestra de 0.6 miligramos se pesó en una bandeja de aluminio estándar (bandeja + tapa, TA 900786.901, 900779.901). El instrumento se operó utilizando el software Thermal Advantage Q-Series V.2.6.0.367 y el software Thermal Advantage V4.6.9. Los eventos térmicos se caracterizaron utilizando el Universal Analysis V4.3A Construcción 4.3.0.6. Las muestras se midieron contra la bandeja de muestra sin orificio. La muestra se trató de acuerdo con el siguiente protocolo: Paso 1 : EQUILIBRAR a 0°C.
Paso 2: Rampa a 10°C/minuto hasta 300°C.
Preparación de ejemplos Cuando se menciona que los compuestos se prepararon de la manera descrita para un ejemplo anterior, la persona experta apreciará que los tiempos de reacción, el número de equivalentes de reactivos, y las temperaturas de reacción se pueden modificar para cada reacción específica, y que, no obstante, puede ser necesario o recomendable emplear condiciones de procesamiento o de purificación diferentes.
Ejemplo A1: (S)-(3-((4-(6-metoxi-5-metil-piridin-3-il)-3,4-dihidro-2H-benzo-[b][1 ,4]-oxazin-6-il)-oxi)-pirrolidin-1 -il)-(tetrahidro-2H-piran-4-il)-metanona (de acuerdo con el esquema 1) a1) (R)-(3-hidroxi-pirrol¡d¡n-1-il)-(tetrahidro-2H-piran-4-M)-metanona Una solución agitada de ácido tetrahidro-2H-piran-4-carboxílico (CAS registro 5337-03-1) (0.200 gramos, 1.537 milimoles), y dimetil-formamida (DMF) (0.012 mililitros, 0.154 milimoles) en dicloro-metano (DCM) (3 mililitros) se trató con cloruro de oxalilo (0.202 mililitros, 2.305 milimoles) a 3°C. Después de 1 hora a 3°C, la mezcla de reacción se concentró bajo presión reducida. El residuo entonces se disolvió en dicloro-metano (DCM) (2 mililitros), y se agregó a una solución agitada de clorhidrato de (R)-pirrolidin-3-ol (CAS registro 104706-47-0) (0.190 gramos, 1.537 milimoles), y Et3N (0.535 mililitros, 3.84 milimoles) en dicloro-metano (DCM) (3 mililitros) a 3°C. Después de 1 hora a 3°C, la mezcla de reacción se concentró bajo presión reducida. El residuo se trató con EtOAc (10 mililitros), y se filtró. El residuo se lavó con EtOAc, y los filtrados combinados se concentraron bajo presión reducida. El producto crudo se purificó mediante cromatografía por evaporación instantánea sobre gel de sílice (gradiente de dicloro-metano (DCM) / metanol), para proporcionar el compuesto del título como un sólido blanco.
ESIMS: 200 [(M + H)+J. 1H RMN (400 MHz, CDCI3): d 4.61-4.50 (m, 1H), 4.10-4.02 (m, 2H), 3.77-3.40 (m, 6H), 2.70-2.53 (m, 1H), 2.20-1.85 (m, 4H), 1.75- 1.69 (m, 3H).
Método alternativo a2: en lugar de preparar el cloruro de ácido in situ, se utilizó un cloruro de ácido comercialmente disponible como el cloruro de propanoílo (CAS registro 79-03-8). b1) Metan-sulfonato de (R)-1 -(tetrahidro-2H-piran-4-carbonil)-pirrolidin-3-ilo Una solución agitada de la (R)-(3-hidroxi-pirrolidin-1 -il)-(tetrahidro-2H-piran-4-il)-metanona (0.245 gramos, 1.230 milimoles) en dicloro-metano (DCM) (10 mililitros) se trató con Et3N (0.343 mililitros, 2.459 milimoles), y cloruro de metan-sulfonilo (0.192 mililitros, 2.459 milimoles) a 0°C. Después de 1 hora a 0°C, se agregó agua (20 mililitros). La capa orgánica se lavó con una solución saturada de NaCI (20 mililitros), se secó con MgS04, se filtró, y se concentró bajo presión reducida. El producto crudo se purificó mediante trituración con dietil-éter para proporcionar el compuesto del título como un sólido blanco.
ESIMS: 278 [(M + H)+]. 1H RMN (400 MHz, CDCI3): d 5.40-.5.29 (m, 1H), 4.10-4.02 (m, 2H), 3.94-3.87 (m, 1H), 3.82-3.56 (m. 3H), 3.52-3.41 (m, 2H), 3.11-3.04 (m, 3H), 2.70-2.10 (m, 3H), 2.02-2.87 (m, 2H), 1.72-1.57 (m, 2H). d) (S)-(3-((3,4-dihidro-2H-benzo-[b][1,4]-oxazin-6-il)-oxi)-pirrolidin-1-il)-(tetrahidro-2H-piran-4-il)-metanona Una solución agitada del 3,4-dihidro-2H-benzoxazin-6-ol (CAS registro 26021-57-8) (0.140 gramos, 0.926 milimoles) en dimetil- formamida (DMF) (3 mililitros) se trató con hidruro de sodio (al 60 por ciento en aceite mineral, 0.445 gramos, 1.111 milimoles), a temperatura ambiente. Después de 10 minutos a temperatura ambiente, se agregó metan-sulfonato de (R)-1 -(tetrahidro-2H-piran-4-carbonil)-pirrolidin-3-ilo (0.283 gramos, 1.019 milimoles). El frasco se tapó y se calentó a 50°C durante 3 horas. Después de este tiempo, la mezcla de reacción se concentró bajo presión reducida. El residuo se disolvió en EtOAc (50 mililitros), y se agregó agua (50 mililitros). La capa orgánica se lavó con una solución saturada de NaCI (20 mililitros), se secó con MgS04, se filtró, y se concentró bajo presión reducida. El producto crudo se purificó mediante cromatografía por evaporación instantánea sobre gel de sílice (gradiente de dicloro-metano (DCM) / metanol), para proporcionar el compuesto del título como un sólido amorfo color gris.
HPLC RtMio= 2.07 minutos; ESI S: 333 [(M + H)+]. 1H RMN (400 Hz, DMSO-d6): d 6.55-6.50 (m, 1H), 6.15-6.11 (m, 1H), 6.07-6.00 (m, 1H), 5.77 (br s, 1H), 4.88-4.74 (m, 1H), 4.06-4.01 (m, 2H), 3.90-3.22 (m, 10H), 2.75-2.58 (m, 1H), 2.15-1.95 (m, 2H), 1.65-1.45 (m, 4H). d1) (S)-(3-((4-(6-metoxi-5-metil-piridin-3-il)-3,4-dihidro-2H-benzo-[b][1 ,4]-oxazin-6-il)-oxi)-pirrolidin-1 -il)-(tetrahidro-2H-piran-4-il)-metanona Una solución agitada de la (S)-(3-((3,4-dihidro-2H-benzo-[b][1 ,4]-oxazin-6-il)-oxi)-pirrolidin-1 -il)-(tetrahidro-2H-piran-4-il)-metanona (0.050 gramos, 0.150 milimoles) en tolueno (1 mililitro) se trató con 5-bromo-2-metoxi-3-metil-piridina (CAS registro 760207-87- 2) (0.030 gramos, 0.150 milimoles), NaOtBu (0.022 gramos, 0.226 milimoles), 2-(diciclohexil-fosfino)-bifenilo (CAS registro 247940-06- 3) , y Pd2(dba)3 (0.004 gramos, 0.005 milimoles), a temperatura ambiente bajo argón. El frasco de reacción se tapó y se calentó a 110°C en un reactor de microondas durante 3 horas. Después de este tiempo, la mezcla de reacción se concentró bajo presión reducida. El producto crudo se purificó mediante cromatografía por evaporación instantánea sobre gel de sílice (gradiente de ciclohexano / EtOAc), para proporcionar el compuesto del título como un sólido grisáceo.
HPLC RtM10= 2.85 minutos; ESIMS: 454 [( + H)+]. 1H RMN (400 MHz, CD3OD): d 7.90-7.85 (m, 1H), 7.49-7.44 (m, 1H), 6.76-6.69 (m, 1H), 6.32-6.24 (m, 1H), 6.07-6.02 (m, 1H), 4.86-4.73 (m, 1H), 4.29-4.23 (m, 2H), 4.02-3.92 (m, 5H), 3.80-3.40 (m, 8H), 2.85-2.60 (m, 1H), 2.25-1.91 (m, 5H), 1.85-1.50 (m, 4H).
Método alternativo d2: El 2-(diciclohexil-fosfino)-bifenilo (CAS registro 247940-06-3) fue reemplazado con el 2-diciclohexil-fosfino-2',4',6'-tri-isopropil-bifenilo (CAS registro 564483-18-7).
Método alternativo d3: El 2-(diciclohexil-fosfino)-bifenilo (CAS registro 247940-06-3), y el Pd2(dba)3 fueron reemplazados con bis-(tri-terbutil-fosfina)-paladio (CAS registro 53199-31-8).
Ejemplos A2 a A43: Los compuestos enlistados en la Tabla 1 se prepararon mediante un procedimiento análogo a aquél empleado en el Ejemplo A1.
Tabla 1 Ejemplo B1: {(S)-3-[4-(6-metan-sulfonil-5-metil-piridin-3-il)-3,4- dihidro-2H-benzo-[1 ,4]-oxazin-6-iloxi]-pirrolidin-1 -il}-(tetrahidro- piran-4-il)-metanona (de acuerdo con el esquema 2) a) Terbutil-éster del ácido (S)-3-(3,4-d¡hidro-2H-benzo-[1 ,4]- oxazin-6-iloxi)-pirrolidin-1 -carboxílico Una solución del 3,4-dihidro-2H-benzo-[1 ,4]-oxazin-6-ol (CAS registro 26021-57-8) (4.0 gramos, 26.5 milimoles) en dimetil- formamida (DMF) (150 mililitros) se trató con NaH (2.117 gramos, 52.9 milimoles) durante 20 minutos a 20°C. Se agregó el terbutil- éster del ácido (R)-3-metan-sulfoniloxi-pirrolidin-1 -carboxílico (CAS registro 127423-61-4) (9.13 gramos, 34.4 milimoles). Después de agitar durante 22 horas a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se concentró a sequedad, entonces se absorbió con EtOAc, se filtró a través de Hyflo, y el filtrado se lavó con una solución acuosa saturada de Na2C03. Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron sobre Na2S04, se filtraron, y se evaporaron. El producto crudo se purificó mediante cromatografía por evaporación instantánea sobre gel de sílice (ciclohexano / isopropanol, de 100:0 a 85:15, en 40 minutos), para proporcionar el compuesto del título como un aceite color amarillo.
HPLC RtM8=1 84 minutos; ESIMS: 321 [(M + H)+]. 1H RMN (400 MHz, DMSO): 6.52 (d, 1H), 6.12 (d, 1H), 6.02 (m, 1H), 5.76 (m, 1H), 4.75 (br s, 1H), 4.01-40.5 (m, 2H), 3.27-3.50 (m, 4H), 3.22-3.26 (m, 2H), 1.95-2.08 (m, 2H), 1.39 (m, 9H). b) Terbutil-éster del ácido (S)-3-[4-(6-metan-sulfonil-5-metil-piridin-3-il)-3,4-dihidro-2H-benzo-[1 ,4]-oxazin-6-iloxi]-pirrolidin-1 -carboxílico Una mezcla del terbutil-éster del ácido (S)-3-(3,4-dihidro-2H-benzo-[1 ,4]-oxazin-6-iloxi)-pirrolidin-1 -carboxílico (2.12 gramos, 6.62 milimoles), 5-bromo-2-metan-sulfonil-3-metil-piridina (Intermediario IA1) (2.091 gramos, 7.94 milimoles), NaOtBu (1.272 gramos, 13.23 milimoles), ligando de XPhos (0.158 gramos, 0.331 milimoles), y Pd2(dba)3 (0.303 gramos, 0.331 milimoles) en dioxano (3.5 mililitros) se desgasificó y se agitó durante 12 horas a 110°C. Se agregó una solución acuosa saturada de NaHC03, y la mezcla de reacción se extrajo con EtOAc. Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron sobre Na2S04, se filtraron, y se evaporaron. El producto crudo se purificó mediante cromatografía por evaporación instantánea sobre gel de sílice (ciclohexano / EtOAc, de 100:0 a 50:50), para proporcionar el compuesto del título.
HPLC RtM14 =1.25 minutos; ESIMS: 490 [(M + H)+]. 1H RMN (400 MHz, CDCI3): d 8.33 (d, 1H), 7.43 (d, 1H), 6.86 (d, 1H), 6.59 (d, 1H), 6.47 (m, 1H), 4.69-4.73 (m,12H), 4.23-4.28 (m, 2H), 3.73-3.78 (m, 2H), 3.41-3.58 (m, 4H), 3.34 (s, 3H), 2.69 (s, 3H), 1.96-2.17 (m, 2H), 1.46 (s, 9H). c) 4-(6-metan-sulfonil-5-metil-p¡ridin-3-il)-6-((S)-pirrolidin-3-iloxi)-3,4-dihidro-2H-benzo-[1,4]-oxazina Una solución del terbutil-éster del ácido (S)-3-[4-(6-metan-sulfonil-5-metil-piridin-3-il)-3,4-dihidro-2H-benzo-[1 ,4]-oxazin-6-iloxi]-pirrolidin-1-carboxílico (1.5 gramos, 3.06 milimoles), y ácido trifluoro-acético (TFA) (0.236 mililitros, 3.06 milimoles) en dicloro-metano (DCM) (15 mililitros) se agitó durante 1 hora a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se enfrió a 0°C, se agregó una solución saturada de Na2C03, y la mezcla de reacción se extrajo con dicloro-metano (DCM). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre Na2S04, se filtraron, y se evaporaron, para proporcionar el compuesto del título.
HPLC RtM2 =0.66 minutos; ESIMS: 390 [(M + H)+]. 1H RMN (400 MHz, CDCI3): d 8.33 (d, 1H), 7.43 (d, 1H), 6.86 (d, 1H), 6.58 (d, 1H), 6.47 (m, 1H), 4.68 (m, 1H), 4.22-4.27 (m, 2H), 3.73-3.78 (m, 2H), 3.33 (s, 3H), 3.12-3.22 (m, 2H), 2.86-3.04 (m, 2H), 2.68 (s, 3H), 1.88-2.08 (m, 2H). d) {(S)-3-[4-(6-metan-sulfonil-5-metil-piridin-3-il)-3,4-dihidro-2H-benzo-[ ,4]-oxazin-6-iloxi]-pirrolidin-1 -il}-(tetrahidro-piran-4-il)-metanona Una mezcla de la 4-(6-metan-sulfonil-5-metil-piridin-3-il)-6-((S)-pirrolidin-3-iloxi)-3,4-dihidro-2H-benzo-[ ,4]-oxazina (0.085 gramos, 0.218 milimoles), cloruro de tetrahidro-2H-piran-4-carbonilo (CAS registro 40191-32-0) (0.049 miligramos, 0.327 milimoles), y Et3N (0.046 mililitros, 0.327 milimoles) en dicloro-metano (DCM) (4 mililitros) se agitó a temperatura ambiente durante 15 minutos. La mezcla de reacción se concentró a sequedad. El producto crudo se purificó mediante RP-HPLC de preparación (columna SunFire C18, H20 + ácido trifluoro-acético (TFA) al 0.1 por ciento / acetonitrilo (ACN) + ácido trifluoro-acético (TFA) al 0.1 por ciento, de 90:10 a 30:70 en 12 minutos), para proporcionar el compuesto del título como un sólido blanco.
HPLC RtM7=1.62 minutos; ESI S: 502 [(M + H)+]. 1H RMN (400 MHz, DMSO): d 8.38-8.42 (m, 1H), 7.72 (m, 1H), 6.84 (d, 1H), 6.67 (m, 1H), 6.50-6.57 (m, 1H), 4.82-4.94 (m, 1H), 4.20 (m, 2H), 3.31 (s, 3H), 3.28-3.88 (m, 10H), 2.59-2.73 (m, 1H), 2.56 (s, 3H), 1.95-2.13 (m, 2H), 1.44-1.62 (m, 4H).
Ejemplos B2 a B122: Los compuestos enlistados en la Tabla 2 se prepararon mediante un procedimiento análogo a aquél empleado en el Ejemplo B1.
Tabla 2 H PLC Rt MS Compuesto / Ejemplo [m in] [m/z; Condiciones de Reacción (método) ( + 1 ? (1 , 1 -dioxo-tetrahidro-1 lambda*6*- tiofen-3-il)-{(S)-3-[4-(6-metan-sulfon¡l- 5-metil-pirid¡n-3-M)-3,4-dihidro-2H- 0.87 B35 536 benzo-[1 ,4]-oxazin-6-iloxi]-p¡rrolid¡n-1 - (M2) il}-metanona Condición de aminación de Buchwaid : CA6 Condición de enlace de amida : CB4 Condición de introducción de cadena lateral: CC2 Precursores utilizados: CAS 26021 - 57-8, CAS 1 27423-61 -4, IA1 , CAS 4785-67-5 HPLC Rt MS Compuesto / Ejemplo [min] [m/z; Condiciones de Reacción (método) (M + 1)+] 3-{(S)-3-[4-(5-fluoro-6-metoxi-p¡ridin- 3-il)-3,4-dihidro-2H-benzo-[1,4]- 1.85 B116 oxazin-6-iloxi]-pirrolidin-1 -il}-3-oxo- 413 (M8) propionitrilo Condición de aminación de Buchwaid: CA6 Condición de enlace de amida: CB1 Condición de introducción de cadena lateral: CC2 Precursores utilizados: CAS 26021- 57-8 / 127423-61-4 / IA10 / 372-09-8 Ejem plo C1 : 2-metoxi-5-{6-[(S)-1 -(tetrahidro-piran-4-carbonil)-pirrolidi n-3-iloxi]-2,3-dihidro-benzo-[1 ,4]-oxazin-4-M}-nicotinonitrilo (de acuerdo con el esquema 3) a) 6-(terbutil-dimetil-silaniloxi)-3,4-dihidro-2H-benzo-[1 ,4]-oxazina Bajo argón, se agregó NaH (2.96 gramos, 74.1 milimoles) en porciones a una solución del 3,4-dihidro-2H-benzo-[1 ,4]-oxazin-6-ol (CAS registro 26021-57-8) (5.60 gramos, 37.0 milimoles) en tetrahidrofurano (THF) (200 mililitros). Después de agitar a temperatura ambiente durante 20 minutos, se agregó lentamente TBDMSCI (CAS registro 18162-48-6) (7.26 gramos, 48.2 milimoles), y se continuó la agitación durante 1 hora. La mezcla de reacción se diluyó con Et20, se lavó con una solución acuosa saturada de NaHC03 y salmuera. La fase orgánica se secó sobre MgS04, se concentró, y se obtuvo el compuesto del título después de la cromatografía por evaporación instantánea sobre gel de sílice (ciciohexano / EtOAc, de 100:0 a 60:40 durante 15 minutos), como un aceite amarillo (9.20 gramos, 94 por ciento de rendimiento).
HPLC RtM10= 3.65 minutos; ESIMS: 266 [(M + H)+]. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): d 6.46 (d, 1H), 6.08 (d, 1H), 5.91 (m, 1H), 5.71 (br s, 1H), 3.91-4.12 (m, 2H), 3.12-3.28 (m, 2H), 0.87-1.01 (s, 9H), 0.03-0.21 (S, 3H). b) 5-[6-(terbutil-dimetil-silaniloxi)-2,3-dihidro-benzo-[1 ,4]-oxazin-4-il]-2-metoxi-nicotinonitrilo Bajo argón, se agregaron XPhos (CAS registro 564483-18-7) (0.79 gramos, 1.7 milimoles), y Pd2(dba)3 (CAS registro 51364-51-3) (1.52 gramos, 1.7 milimoles) a una suspensión de 6-(terbutil-dimetil-silaniloxi)-3,4-dihidro-2H-benzo-[1 ,4]-oxazina (9.00 gramos, 33.2 milimoles), 5-bromo-2-metoxi-nicotinonitrilo (CAS registro 941294-54-8) (7.79 gramos, 36.6 milimoles), y NaOtBu (4.79 gramos, 49.8 milimoles) en tolueno (270 mililitros). La mezcla de reacción se agitó a 110°C durante 1 hora, y se concentró, para proporcionar un sólido color café, el cual se lavó con una mezcla de DCM/MeOH (8:2), y se filtró. El filtrado se concentró, el residuo obtenido se disolvió en DCM/MeOH (8:2), se filtró sobre Hyflo, el filtrado se concentró y se trituró con metanol, para proporcionar el compuesto del título como un sólido amarillo (10.14 gramos, 77 por ciento de rendimiento).
HPLC RtM11 =3.89 minutos; ESIMS: 398 [(M + H)+]. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): d 8.35-8.51 (m, 1H), 8.16-8.31 (m, 1H), 6.60-6.79 (m, 1H), 6.15-6.32 (m, 1H), 5.92-6.09 (m, 1H), 4.00 (s, 3H), 3.51-3.74 (m, 2H), 0.87 (s, 9H), 0.07 (s, 6H). c) 5-(6-hidroxi-2,3-dihidro-benzo-[1 ,4]-oxazin-4-¡l)-2-metoxi-nicotinonitrilo Se agregó TBAF (1 en tetrahidrofurano (THF)) (37.7 mililitros, 37.7 milimoles), a una solución de 5-[6-(terbutil-dimetil-silaniloxi)-2,3-dihidro-benzo-[1 ,4]-oxazin-4-il]-2-metoxi-nicotinonitrilo (10 gramos, 25.2 milimoles) disuelto en tetrahidrofurano (THF) (200 mililitros). La solución se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos, se diluyó con EtOAc, se lavó con una solución acuosa saturada de NaHC03 y salmuera. Las capas acuosas se retro-extrajeron con EtOAc, y la concentración de las fases orgánicas después de secar sobre MgS04 proporcionó un residuo color café, el cual se disolvió en DCM/MeOH (1:1), y se filtró sobre Hyflo. La concentración y trituración con Et20 del filtrado proporcionó el compuesto del título como un sólido color café (6.63 gramos, 93 por ciento de rendimiento).
HPLC RtMio=2.56 minutos; ESIMS: 284 [(M + H)+]. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): d 8.70 (br. s, 1H), 8.44 (d, 1H), 8.28 (d, 1H), 6.62 (d, 1H), 6.12 (m, 1H), 6.01 (d, 1H), 4.11-4.32 (m, 2H), 4.01 (s, 3H), 3.54-3.68 (m, 2H). d) 2-metoxi-5-{6-[(S)-1 -(tetrahidro-piran-4-carbonil)-pirrolidin-3-iloxi]-2,3-dihidro-benzo-[ ,4]-oxazin-4-il}-nicotinonitrilo Bajo argón, se agregó NaH (31 miligramos, 0.78 milimoles), a una solución de 5-(6-hidroxi-2,3-dihidro-benzo-[1 ,4]-oxazin-4-M)-2-metoxi-nicotinonitrilo (100 miligramos, 0.35 milimoles) en dimetil-formamida (DMF) (2 mililitros), y se agitó a temperatura ambiente durante 5 minutos. Se agregó el (R)-1-(tetrahidro-piran-4-carbonil)-pirrolidin-3-il-éster de ácido metan-sulfónico (intermediario I C 1 ) (98.0 miligramos, 0.35 milimoles), y la mezcla de reacción se agitó a 50°C durante 4 horas. Después de enfriarse, se agregó NaH (0.5 equivalentes, 8.47 miligramos, 0.21 milimoles), la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 5 minutos, y se agregó el (R)-1 -(tetrahidro-piran-4-carbonil)-pirrolidin-3-il-éster de ácido metan-sulfónico (intermediario IC1) (49.0 miligramos, 0.18 milimoles). La mezcla de reacción se agitó a 50°C durante 1 hora. La concentración y la purificación mediante RP-HPLC de preparación (Sunfire Prep C18 OBD 30 x 100 milímetros, 5 mieras; solvente A: H20 + ácido trifluoro-acético (TFA) al 0.1 por ciento por volumen; solvente B: CH3CN + ácido trifluoro-acético (TFA) al 0.1 por ciento por volumen) proporcionó, después de la basificación de las fracciones combinadas y de la extracción con EtOAc, el compuesto del título como un sólido amarillo (72 miligramos, 43 por ciento de rendimiento).
HPLC RtMio=2.72 minutos; ESIMS: 465 [(M + H)+]. 1H RMN (400 MHz, CD3OD): d 8.36 (d, 1H), 8.06 (t, 1H), 6.78 (m, 1H), 6.37 (m, 1H), 6.17 (m, 1H), 4.81 (br s, 1H), 4.17-4.37 (m, 2H), 4.08 (s, 3H), 3.90-4.03 (m, 2H), 3.56-3.81 (m, 5H), 3.39-3.54 (m, 3H), 2.59-2.89 (m, 1H), 1.87-2.29 (m, 2H), 1.48-1.87 (m, 4H).
Ejemplos C2 a C26: Los compuestos enlistados en la Tabla 3 se prepararon mediante un procedimiento análogo a aquél empleado en el Ejemplo C1.
Tabla 3 Ejemplo DI: <S)-2-metoxi-5-(6-((1 -(1 -metil-1 H-imidazol-4-carbonil)-pirrolidin-3-il)-oxi)-2H-benzo-[b][1,4]-oxazin-4(3H)-il)-nicotinonitrilo (de acuerdo con el esquema 4) a1) 6-((terbutil-dimetil-s¡l¡l)-ox¡)-3,4-d¡hidro-2H-benzo-[b][1,4]-oxazina Una solución agitada del 3,4-dihidro-2H-1 ,4-benzoxazin-6-ol (CAS registro 226021-57-8) (6.00 gramos, 39.70 milimoles) en tetrahidrofurano (THF) (200 mililitros) se trató con hidruro de sodio (al 60 por ciento en aceite mineral, 3.18 gramos, 79.00 milimoles), a temperatura ambiente. Después de 20 minutos a temperatura ambiente, se agregó TBDMSCI (7.78 gramos, 51.6 milimoles), y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1.5 horas. Después de este tiempo, se agregaron dietil-éter (500 mililitros), y una solución acuosa saturada de NaHC03 (100 mililitros). La capa acuosa se extrajo con dietil-éter, y los extractos orgánicos combinados se secaron con MgS04, se filtraron, y se concentraron bajo presión reducida. El producto crudo se purificó mediante cromatografía por evaporación instantánea sobre gel de sílice (gradiente de ciclohexano / EtOAc), para proporcionar el compuesto del título como un aceite color amarillo.
HPLC RtM11 = 3.37 minutos; ESIMS: 266 [(M + H)+]. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): d 6.48-6.44 (m, 1H), 6.09-6.05 (m, 1H), 5.94-5.89 (m, 1H), 5.76-5.70 (m, 1H), 4.06-4.00 (m, 2H), 3.25-3.19 (m, 2H), 0.92 (s, 9H), 0.12 (s, 6H). b1) 5-(6-((terbutil-dimetil-silil)-oxi)-2H-benzo-[b][1,4]-oxazin-4(3H)-il)-2-metoxi-nicotinonitrilo, Una solución agitada de la 6-((terbutil-dimetil-silil)-oxi)-3,4-dihidro-2H-benzo-[b][1 ,4]-oxazina (8.88 gramos, 32.80 milimoles) en tolueno (270 mililitros) se trató con 5-bromo-2-metoxi-nicotinonitrilo (CAS registro 941294-54-8) (7.68 gramos, 36.10 milimoles), NaOtBu (4.87 gramos, 49.2 milimoles), 2-diciclohexil-fosfino-2',4',6'-tri-isopropil-bifenilo (CAS registro 564483-18-7) (0.806 gramos, 1.64 milimoles), y Pd2dba3 (1.501 gramos, 1.64 milimoles), a temperatura ambiente bajo argón. La mezcla de reacción se calentó a 110°C durante 1.5 horas. Después de este tiempo, la mezcla de reacción se concentró bajo presión reducida. El residuo se disolvió en dicloro-metano (DCM) (200 mililitros), se filtró a través de un cojín de Celite, y se concentró bajo presión reducida. El residuo se disolvió en MeOH, y se sónico varias veces para dar un precipitado color amarillo/naranja. El residuo se filtró, se lavó con metanol, y se secó al vacío, para proporcionar el compuesto del título como un sólido amarillo.
HPLC RtMii = 3.90 minutos; ESIMS: 398 [(M + H)+]. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): d 8.45-8.42 (m, 1H), 8.28-8.24 (m, 1H), 6.72-6.68 (m, 1H), 6.24-6.19 (m, 1H), 6.06-6.03 (m, 1H), 4.24-4.18 (m, 2H), 4.00 (s, 3H), 3.66-3.61 (m, 2H), 0.87 (s, 9H), 0.07 (s, 6H).
Método alternativo b2: El diciclohexil-fosfino-2',4',6'-tri-isopropil-bifenilo (CAS registro 564483-18-7) y el Pd2(dba)3 fueron reemplazados con bis-(tri-terbutil-fosfina)-paladio (CAS registro 53199-31-8) d) 5-(6-h¡droxi-2H-benzo-[b][1,4]-oxazin-4(3H)-il)-2-metoxi-nicotinonitrilo, Una solución agitada del 5-(6-((terbutil-dimetil-silil)-oxi)-2H-benzo-[b][1 ,4]-oxazin-4(3H)-il)-2-metoxi-nicotinonitrilo (10.85 gramos, 27.30 milimoles) en tetrahidrofurano (THF) (220 mililitros) se trató con TBAF (1.0 M en tetrahidrofurano (THF), 40.9 mililitros, 40.90 milimoles), a temperatura ambiente. Después de 40 minutos a temperatura ambiente, se agregaron EtOAc (300 mililitros), y una solución acuosa saturada de NaHC03 (200 mililitros). Los extractos orgánicos se secaron con MgS04, se filtraron, y se concentraron bajo presión reducida. El producto crudo se purificó mediante trituración con dietil-éter para proporcionar el compuesto del título como un sólido color café pálido.
HPLC RtM11 = 2.00 minutos; ESIMS: 284 [(M + H)+]. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): d 8.71 (s, 1H), 8.44 (d, 1H), 8.29 (d, 1H), 6.61 (d, 1H), 6.12 (dd, 1H), 6.01 (d, 1H), 4.21-4.16 (m, 2H), 4.01 (s, 3H), 3.64-3.59 (m, 2H). d1) (S)-3-((4-(5-ciano-6-metoxi-piridin-3-il)-3,4-dihidro-2H-benzo-[b][1 ,4]-oxazin-6-il)-oxi)-pirrolidin-1 -car boxi lato de terbutilo Una solución agitada del 5-(6-hidroxi-2H-benzo-[b][1 ,4]-oxazin- 4(3H)-il)-2-metoxi-nicotinonitrilo (3.70 gramos, 13.06 milimoles) en dimetil-formamida (DMF) (60 mililitros) se trató con hidruro de sodio (al 60 por ciento en aceite mineral, 1.31 gramos, 32.70 milimoles), a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 15 minutos. Después de este tiempo, se agregó (R)-1-Boc-3-metan-sulfoniloxi-pirrolidina (CAS registro 141699-57-2) (5.36 gramos, 19.59 milimoles), y la mezcla de reacción se agitó a 50°C durante 3 horas. Después de este tiempo, la mezcla de reacción se concentró bajo presión reducida. El producto crudo se purificó mediante cromatografía por evaporación instantánea sobre gel de sílice (gradiente de ciclohexano / acetona), para proporcionar el compuesto del título como un sólido amarillo.
HPLC RtMii = 3.13 minutos; ESIMS: 453 [(M + H)+]. 1H RMN (400 MHz, CDCI3): d 8.31 (d, 1H), 7.81 (d, 1H), 6.82 (d, 1H), 6.32 (dd, 1H), 6.14 (d, 1H), 4.74-4.68 (m, 1H), 4.32-4.28 (m, 2H), 4.09 (s, 3H), 3.67-3.62 (m, 2H), 3.59-3.39 (m, 4H), 2.17-1.92 (m, 2H), 1.47 (s, 9H).
Método alternativo d2: El alcohol mesilado, hidruro de sodio y dimetil-formamida (DMF) fueron reemplazados con la hidroxi-isoxazolidina, el azodicarboxilato de dietilo (DEAD), y el tetrahidrofurano (THF) correspondientes utilizando las condiciones de Mitsunobu descritas en el método CC4. e1) (S)-2-metoxi-5-(6-(pirrolidin-3-iloxi)-2H-benzo-tb][ ,4]-oxazin-4(3H)-il)-nicotinonitrilo Una solución agitada del (S)-3-((4-(5-ciano-6-metoxi-piridin-3-il)-3,4-dihidro-2H-benzo-[b][1 ,4]-oxazin-6-il)-oxi)-pirrolidin-1 -carboxilato de terbutilo (4.35 gramos, 9.32 milimoles) en dicloro-metano (DCM) (160 mililitros) se trató con ácido trifluoro-acético (TFA) (35.9 mililitros, 466 milimoles), a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. Después de este tiempo, la mezcla de reacción se concentró bajo presión reducida. El residuo se disolvió en dicloro-metano (DCM) (500 mililitros), y se agregó una solución acuosa saturada de NaHC03 (500 mililitros). Los extractos orgánicos se lavaron con una solución acuosa saturada de NaCI (50 mililitros), se secaron con MgS04, se filtraron, y se concentraron bajo presión reducida. El producto crudo (compuesto del título, sólido amarillo) se utilizó en el siguiente paso sin mayor purificación.
HPLC RtMio= 2.06 minutos; ESIMS: 353 [(M + H)+].
H RMN (400 Hz, CDCI3): d 8.31 (d, 1H), 7.82 (d, 1H), 6.82 (d, 1H), 6.32 (dd, 1H), 6.12 (d, 1H), 4.71-4.65 (m, 1H), 4.32-4.27 (m, 2H), 4.09 (s, 3H), 3.67-3.62 (m, 2H), 3.22-2.90 (m, 4H), 2.08-1.88 (m, 2H). f1) (S)-2-metoxi-5-(6-((1-(1-metil-1H-imidazol-4-carbonil)-pirrolidin-3-il)-oxi)-2H-benzo-[b][1,4]-oxazin-4(3H)-il)-nicotinonitrilo, Una solución agitada del ácido 1-metil-1 H-imidazol-4-carboxílico (CAS registro 41716-18-1) (0.578 gramos, 4.45 milimoles) en dimetil-formamida (DMF) (40 mililitros) se trató con HOBT (0.695 gramos, 4.45 milimoles), EDC (0.870 gramos, 4.45 milimoles), y Et3N (1.24 mililitros, 8.90 milimoles), a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 15 minutos. Después de este tiempo, se agregó (S)-2-metoxi-5-(6-(pirrolidin-3-iloxi)-2H-benzo-[b][1 ,4]-oxazin-4(3H)-il)-nicotinonitrilo (1.10 gramos, 2.97 milimoles), y la mezcla de reacción se agitó durante 3 horas 15 minutos a temperatura ambiente. Después de este tiempo, la mezcla de reacción se concentró bajo presión reducida. El residuo se disolvió en dicloro-metano (DCM) (200 mililitros), y se agregó una solución acuosa saturada de NaHC03 (200 mililitros). Los extractos orgánicos se secaron con MgS04, se filtraron, y se concentraron bajo presión reducida. El producto crudo se purificó mediante cromatografía por evaporación instantánea sobre gel de sílice (gradiente de dicloro-metano (DCM) / metanol), y HPLC de preparación (columna SunFire C18, CH3CN / ácido trifluoro-acético (TFA) al 1 por ciento en un gradiente de H20, las fracciones puras se trataron con dicloro-metano (DCM) y una solución acuosa saturada de NaHC03; los extractos orgánicos combinados se secaron con MgS04, se filtraron, y se concentraron bajo presión reducida), para proporcionar el compuesto del título como un sólido amarillo.
HPLC RtMio= 2.27 minutos; ESIMS: 461 [(M + H)+]. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): d 8.46-8.41 (m, 1H), 8.30-8.26 (m, 1H), 7.66-7.59 (m, 2H), 6.77-6.72 (m, 1H), 6.37-6.29 (m, 1H), 6.14-6.07 (m, 1H), 4.90-4.79 (m, 1H), 4.25-4.11 (m, 3H), 3.99 (s, 3H), 3.98-3.78 (m, 1H), 3.70-3.41 (m, 7H), 2.10-1.93 (m, 2H).
Método alternativo f2: El ácido carboxílico, HOBT, EDC y dimetil-formamida (DMF) fueron reemplazados con el cloruro de ácido carboxílico y dicloro-metano (DCM).
Método alternativo f3: El ácido carboxílico, HOBT, EDC y dimetil-formamida (DMF) fueron reemplazados con cloroformato y dicloro-metano (DCM).
Método alternativo f4: El ácido carboxílico, HOBT y EDC fueron reemplazados con cloruro carbámico.
Ejemplos D2 a D40: Los compuestos enlistados en la Tabla 4 se prepararon mediante un procedimiento análogo a aquél empleado en el Ejemplo D1.
Tabla 4 Ejemplo E1 : {(S)-3-[1 -(6-metoxi-5-met¡l-p¡ridin-3-il)-2,3-dihidro-1 H-pi rido-[3,4-b][1 ,4]-oxazin-7-iloxi]-pirrol idin-1 -i l}-(1 -metil-1 H-imidazol-4-il)-metanona (de acuerdo con el esquema 5) a) 7-cloro-2,3-dihidro-1 H-pirido-[3,4-b][1 ,4]-oxazina Una mezcla de la 7-cloro-1 H-pirido-[3,4-b][1 ,4]-oxazin-2-ona (CAS registro 928118-43-8) (630 miligramos, 3.41 milimoles), y BH3*THF (1 M en tetrahidrofurano (THF)) (10.2 mililitros, 10.2 milimoles) en tetrahidrofurano (THF) (20 mililitros) se agitó durante 2 horas a 80°C. La mezcla de reacción se apagó con MeOH, se agregó una solución acuosa de NaOH 1 M, y la mezcla se extrajo con EtOAc. Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron sobre Na2S04, se filtraron, y se evaporaron. El producto crudo se purificó mediante cromatografía por evaporación instantánea sobre gel de sílice (heptano / EtOAc, de 100:0 a 50:50 en 12 minutos), para proporcionar el compuesto del título como un sólido blanco (432 miligramos, 74 por ciento de rendimiento).
HPLC RtM1 =0.47 minutos; ESIMS: 171 [(M+H)+]. 1H RMN (400 Hz, CDCI3): d 7.74 (s, 1H), 6.46 (s, 1H), 4.43 (br s, 1H) 4.21-4.25 (m, 2H), 3.48-3.51 (m, 2H). b) 7-cloro-1-(6-metoxi-5-metil-piridin-3-il)-2,3-dihidro-1 H-pirido-[3,4-b][1,4]-oxazina Una mezcla de la 7-cloro-2,3-dihidro-1 H-pirido-[3,4-b][1 ,4]-oxazina (127 miligramos, 0.74 milimoles), 5-bromo-2-metoxi-3-metil-piridina (CAS registro 760207-87-2) (0.196 gramos, 0.986 milimoles), Cs2C03 (534 miligramos, 1.64 milimoles), y XPhos (28 miligramos, 0.06 milimoles) en dioxano (3.5 mililitros) se desgasificó con argón y se agregó Pd2(dba)3 (27 miligramos, 0.03 milimoles). Después de agitar durante 3.5 horas a 100°C, la mezcla de reacción se filtró sobre Hyflo, se agregó una solución acuosa saturada de NaHC03, y la mezcla se extrajo con EtOAc. Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron sobre Na2S04, se filtraron, y se evaporaron. El producto crudo se purificó mediante cromatografía por evaporación instantánea sobre gel de sílice (heptano / EtOAc, de 95:5 a 40:60, en 14 minutos), para proporcionar el compuesto del título como un sólido de color pálido (190 miligramos, 87 por ciento de rendimiento).
HPLC RtM1 =1.04 minutos; ESIMS: 292 [(M+H)+]. 1H RMN (400 MHz, CDCI3): d 7.94 (d, 1H), 7.80 (s, 1H), 7.31 (d, 1H), 6.31 (s, 1H), 4.34-4.37 (m, 2H), 4.01 (s, 3H), 3.68-3.72 (m, 2H), 2.24 (s, 3H). c) 1-(6-metoxi-5-metil-piridin-3-il)-2,3-dihidro-1 H-pirido-[3,4-b][1 ,4]-oxazin-7-ol Una mezcla de la 7-cloro-1 -(6-metoxi-5-metil-piridin-3-il)-2,3-dihidro-1 H-pirido-[3,4-b][1 ,4]-oxazina (190 miligramos, 0.65 mili-moles), tetrametil-terbutil-XPhos (13 miligramos, 0.03 milimoles) en dioxano (3 mililitros), y una solución acuosa de KOH 5M (0.04 mililitros, 1.95 milimoles) se desgasificó con argón, y se agregó Pd2(dba)3 (6 miligramos, 0.01 milimoles). Después de agitar durante 17.5 horas a 100°C, la mezcla de reacción se filtró sobre Hyflo, el filtrado se secó sobre Na2S04, se filtró, y se evaporó. El producto crudo se purificó mediante cromatografía por evaporación instantánea sobre gel de sílice (EtOAc / metanol, de 100:0 a 85:15, en 17 minutos), para proporcionar el compuesto del título como un sólido blanco (111 miligramos, 62 por ciento de rendimiento).
HPLC RtMi =0.67 minutos; ESIMS: 274 [(M + H)+]. 1H RMN (400 MHz, CDCI3): d 10.32 (br s, 1H), 8.02 (d, 1H), 7.62 (m, 1H), 6.89 (s, 1H), 4.84 (s, 1H), 4.17-4.21 (m, 2H), 3.91 (s, 3H), 3.61-3.66 (m, 2H), 2.17 (s, 3H). d) Terbutil-éster del ácido (S)-3-[1 -(6-metoxi-5-metil-piridin-3-il)-2,3-dihidro-1H-pirido-[3,4-b][1,4]-oxazin-7-iloxi]-pirrolidin-1-carboxílico Una solución del 1 -(6-metoxi-5-metil-piridin-3-il)-2,3-dihidro- 1 H-pirido-[3,4-b][1 ,4]-oxazin-7-ol (111 miligramos, 0.41 milimoles) en dimetil-formamida (DMF) (3 mililitros) se trató con NaH (33 miligramos, 0.81 milimoles) durante 10 minutos a 20°C. Se agregó el terbutil-éster del ácido (R)-3-metan-sulfoniloxi-pirrolidin-1 -carboxílico (CAS registro 127423-61-4) (162 miligramos, 0.61 milimoles). Después de agitar durante 19 horas a 60°C, y durante 18 horas a 80°C, se agregó una solución acuosa saturada de NaHC03, y la mezcla de reacción se extrajo con terbutil-metil-éter (TBME). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron sobre Na2S04, se filtraron, y se evaporaron. El producto crudo se purificó mediante cromatografía por evaporación instantánea sobre gel de sílice (heptano / EtOAc, de 93:7 a 40:60, en 13.5 minutos), para proporcionar el compuesto del título como un aceite amarillo pálido (107 miligramos, 59 por ciento de rendimiento).
HPLC RtMi =1.21 minutos; ESIMS: 443 [(M+H)+]. 1H RMN (400 MHz, CDCI3): d 7.93 (d, 1H), 7.61 (br s, 1H), 7.32 (br s 1H), 5.71 (s, 1H), 5.41 (br s, 1H), 4.32 (br s, 2H), 3.99 (s, 3H), 3.65-3.70 (m, 2H), 3.37-3.61 (m, 4H), 2.23 (s, 3H), 1.58 (s, 9H), 0.82-0.97 (m, 2H). e) 1-(6-metoxi-5-metil-piridin-3-il)-7-((S)-pirrolidin-3-iloxi)-2,3-dihidro-1 H-pirido-[3,4-b][1 ,4]-oxazina Una solución del terbutil-éster del ácido (S)-3-[1 -(6-metoxi-5-metil-piridin-3-il)-2,3-dihidro-1 H-pirido-[3,4-b][1 ,4]-oxazin-7-ilox¡]-pirrolidin-1 -carboxílico (103 miligramos, 0.23 milimoles), y ácido trifluoro-acético (TFA) (0.179 mililitros, 2.33 milimoles) en dicloro-metano (DCM) (1.8 mililitros) se agitó durante 18 horas a temperatura ambiente. Se agregó una solución acuosa saturada de Na2C03, y la mezcla de reacción se extrajo con dicloro-metano (DCM). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron sobre Na2S04, se filtraron, y se evaporaron; el compuesto del título se obtuvo como una espuma color amarillo pálido (72 miligramos, 90 por ciento de rendimiento).
HPLC RtMi =0.64 minutos; ESIMS: 343 [(M+H)+]. 1H RMN (400 MHz, CDCI3): d 7.93 (d, 1H), 7.62 (s, 1H), 7.32 (m, 1H), 5.70 (s, 1H), 5.29-5.35 (m, 1H), 4.29-4.33 (m, 2H), 3.99 (s, 3H), 3.65-3.69 (m, 2H), 2.82-3.14 (m, 4H), 2.22 (s, 3H), 1.80-2.10 (m, 2H). f) {(S)-3-[1 -(6-metoxi-5-met¡l-p¡rid¡n-3-il)-2,3-dihidro-1 H-pirido-[3,4-b][1 ,4]-oxazin-7-iloxi]-pirrol¡din-1 -il}-(1 -metil-1 H-imidazol-4-il)-metanona Una mezcla del ácido 1 -metil-1 H-imidazol-4-carboxílico (CAS registro 41716-18-1) (15 miligramos, 0.12 milimoles), HBTU (53 miligramos, 0.14 milimoles), y di-isopropil-etil-amina (DIPEA) (0.025 mililitros, 0.14 milimoles) en dimetil-formamida (DMF) (0.6 mililitros) se agitó a temperatura ambiente durante 5 minutos. Se agregó una solución de 1 -(6-metoxi-5-metil-pir¡din-3-il)-7-((S)-pirrolidin-3-iloxi)-2,3-dihidro-1 H-pirido-[3,4-b][1 ,4]-oxazina (0.037 gramos, 0.11 mili-moles) en dimetil-formamida (DMF) (0.6 mililitros). Después de agitar durante 20 horas a temperatura ambiente, se agregó agua, y la mezcla de reacción se extrajo con EtOAc. Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron sobre Na2S04l se filtraron, y se evaporaron. El producto crudo se purificó mediante RP-HPLC de preparación (columna SunFire C18, H20 + ácido trifluoro-acético (TFA) al 0.1 por ciento / acetonitrilo (ACN) + ácido trifluoro-acético (TFA) al 0.1 por ciento, de 90:10 a 60:40 en 16 minutos), para proporcionar el compuesto del título como una espuma color amarillo pálido (24 miligramos, 49 por ciento de rendimiento).
HPLC RtMi =0.74 minutos; ESIMS: 451 [(M+H)+]. 1H RMN (400 MHz, DIVISO): d 8.00 (m, 1H), 7.58-7.63 (m, 3H), 7.53 (d, 1H), 5.51 (d, 1H), 5.29-5.40 (m, 1H), 4.23-4.29 (m, 2H), 3.99 (s, 3H), 3.77-4.19 (m, 2H), 3.66 (m, 5H), 3.39-3.63 (m, 2H), 2.15 (s, 3H), 1.89-2.11 (m, 2H).
Ejemplos E2 a 11 : Los compuestos enlistados en la Tabla 5 se prepararon mediante un procedimiento análogo a aquél empleado en el Ejemplo E1.
Tabla 5 HPLC Rt MS Compuesto / Ejemplo [min] [m/z; Condiciones de reacción (método) TerbutM-éster del ácido (S)-3-[1-(6- metoxi-5-metil-piridin-3-il)-2,3-dihidro- 1.19 E2 443 1 H-pirido-[3,4-b][1 ,4]-oxazin-7-iloxi]- (M1) pirrolidin-1 -carboxílico Condición de aminación de Buchwaid: CA4 Condición de introducción de cadena lateral: CC1 Precursores utilizados: CAS 928118- 43-8, IA9, 127423-61-4 Ejemplos de Referencia E12 a E13: Los compuestos enlistados en la Tabla 5a se prepararon mediante un procedimiento análogo a aquél empleado en el Ejemplo E1, aplicando estrategias de grupos protectores adecuadas.
Tabla 5a Ejemplo F1 : (1 ,1 -dioxo-hexahidro-1 lambda*6*-tiopiran-4-il)-{(S)-3-[1 -(6-metoxi-5-metil-piridin-3-il)-2,3-dihidro-1 H-pirido-[3,4-b][1 ,4]-oxazin-7-iloxi]-pirrolidin-1 -il}-metanona (de acuerdo con el esquema 6) Pd2(dba)3 (CH3)4-t-butil-X-Phos . U n BH3,THF, THF, p ? M KOH, dioxano /H20 YVT 1 h'75°C 5h, 10u¾ a) 7-cloro-2,3-dihidro-1 H-pirido-[3,4-b][1 ,4]-oxazina Una solución de la 7-cloro-1 H-pirido-[3,4-b][ ,4]-oxazin-2-ona (CAS registro 928118-43-8) (3.70 gramos, 20 milimoles) en tetrahidrofurano (THF) (63 mililitros) se trató con BH3*THF (1M en tetrahidrofurano (THF), 47 mililitros, 47 milimoles). La mezcla de reacción se agitó a 75°C durante 1 hora, entonces se enfrió a temperatura ambiente, y se apagó con metanol (24 mililitros, 600 milimoles). La mezcla de reacción se concentró bajo presión reducida, y el residuo se absorbió con EtOAc, y se lavó con una solución acuosa saturada de NaHC03. La capa orgánica se secó sobre MgS04, se filtró, y se concentró bajo presión reducida, para proporcionar el producto del título como un sólido amarillo pálido (3.3 gramos, 96 por ciento de rendimiento).
UPLC RtMi =0.47 minutos; ESIMS: 171 [(M+H)+]. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): d 7.53 (s, 1H), 7.11 (br s, 1H), 6.47 (s, 1H), 4.09 (t, 2H), 3.17-3.38 (m, 2H). b) 2,3-dihidro-1H-pirido-[3,4-b][1,4]-oxazin-7-ol Una mezcla de la 7-cloro-2,3-dihidro-1 H-pirido-[3,4-b][1 ,4]-oxazina (1.08 gramos, 6.33 milimoles), una solución acuosa de KOH (1.07 gramos, 19 milimoles de KOH en 5.4 mililitros de agua), 2-diterbutil-fosfino-3,4,5,6-tetrametil-2',4',6-tri-i-propil-bifenilo al 98 por ciento (0.30 gramos, 0.63 milimoles), y Pd2(dba)3 (0.29 gramos, 0.32 milimoles) en dioxano (32.5 mililitros), se desgasificó tres veces con nitrógeno, el tubo se selló, y la mezcla de reacción se agitó a 100°C durante 5 horas. Después de enfriarse a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se filtró a través de Hyflo, y se enjuagó con EtOAc y metanol. Los filtrados se concentraron, y se obtuvo el compuesto del título después de la cromatografía por evaporación instantánea sobre gel de sílice (dicloro-metano (DCM) / MeOH, de 98:2 a 75:25), como un residuo color naranja (660 miligramos, 69 por ciento de rendimiento).
UPLC R t i =0.34 minutos; ESIMS: 153 [(M+H)+]. 1H RMN (400 Hz, DMSO-d6): d 10.33 (br s, 1H), 7.03 (br s, 1H), 6.71 (s, 1H), 5.15 (s, 1H), 3.95 (t, 2H), 3.25 (m, 2H). c) Terbutil-éster del ácido (S)-3-(2,3-dihidro-1 H-pirido-[3,4-b][ ,4]-oxazin-7-iloxi)-pirrolidin-1 -carboxílico Una solución seca de 2,3-dihidro-1 H-pirido-[3,4-b][1 ,4]-oxazin-7-ol (0.66 gramos, 4.34 milimoles), y terbutil-éster del ácido (R)-3-metan-sulfoniloxi-pirrolidin-1 -carboxílico (CAS registro 127423-61-4) (1.73 gramos, 6.51 milimoles) en dimetil-formamida (DMF) (40 mililitros) se trató con hidruro de sodio (al 60 por ciento en aceite mineral, 0.21 gramos, 8.68 milimoles), y la mezcla de reacción se agitó a 80°C durante 18 horas. Después de enfriarse a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se diluyó con el terbutil-metil-éter (TBME), y se lavó con una solución acuosa saturada de NaHC03. La capa orgánica se secó sobre MgS04, se filtró, se concentró, y se obtuvo el compuesto del título después de la cromatografía por evaporación instantánea sobre gel de sílice (ciciohexano / EtOAc, de 95:5 a 30:70), como un aceite amarillo (1.035 gramos, pureza del 75 por ciento, 56 por ciento de rendimiento) UPLC RtM1 =0.65 minutos; ESIMS: 322 [( + H)+]. 1H RMN (400 MHz, CDCI3): d 7.54 (s, 1H), 5.86 (s, 1H), 5.42 (br s, 1H), 4.25-4.41 (m, 1H), 4.19 (t, 2H), 3.38-3.66 (m, 6H), 2.00-2.18 (m, 2H), 1.46 (d, 9H). d) Terbutil-éster del ácido (S)-3-[1 -(6-metoxi-5-metil-piridin-3-il)-2,3-dihidro-1 H-pirido-[3,4-b][1,4]-oxazin-7-iloxi]-pirrolidin-1-carboxilico Una mezcla del terbutil-éster del ácido (S)-3-(2,3-dihidro-1 H-pirido-[3,4-b][1 ,4]-oxazin-7-iloxi)-pirrolidin-1 -carboxílico (254 mili-gramos, 0.79 milimoles), 5-bromo-2-metoxi-3-metil-piridina (CAS registro 760207-87-2) (208 miligramos, 1.03 milimoles), XPhos (30 miligramos, 0.06 milimoles), y NaOtBu (167 miligramos, 1.74 mili-moles) en dioxano (6 mililitros), se desgasificó con argón durante 5 minutos, y entonces se agregó Pd2(dba)3 (29 miligramos, 0.03 mili-moles). El tubo se llenó con argón, se selló, y la mezcla de reacción se agitó a 100°C durante 2 horas. Después de enfriarse a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se filtró a través de Hyflo, se enjuagó con EtOAc, y los filtrados se lavaron con una solución acuosa saturada de NaHC03. La capa acuosa se re-extrajo dos veces con EtOAc, las capas orgánicas combinadas se secaron sobre Na2S04, se filtraron, se concentraron, y se obtuvo el compuesto del título después de la cromatografía por evaporación instantánea sobre gel de sílice (heptano / EtOAc, de 100:0 a 50:50), como una goma transparente (274 miligramos, 78 por ciento de rendimiento).
UPLC RtM1 =1.20 minutos; ESIMS: 443 [( + H)+], 1H R N (400 MHz, CDCI3): d 7.93 (d, 1H), 7.61 (br s, 1H), 7.30-7.35 (m, 1H), 5.71 (s, 1H), 5.34-5.46 (m, 1H), 4.31 (br s, 2H), 3.99 (s, 3H), 3.68 (t, 2H), 3.34-3.62 (m, 4H), 2.23 (s, 3H), 2.01-2.09 (m, 2H), 1.44 (s, 9H). e) 1 -(6-metoxi-5-metil-piridin-3-il)-7-((S)-pirrolidin-3-iloxi)-2,3-dihidro-1 H-pirido-[3,4-b][1 ,4]-oxazina Una solución del terbutil-éster del ácido (S)-3-[1 -(6-metox¡-5-metil-piridin-3-il)-2,3-dihidro-1 H-pirido-[3,4-b][1 ,4]-oxazin-7-ilox¡]-pirrolidin-1 -carboxílico (364 miligramos, 0.82 milimoles) en dicloro-metano (DCM) (6 mililitros) se trató con ácido trifluoro-acético (TFA) (0.63 mililitros, 8.23 milimoles), y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 18 horas, entonces se apagó con una solución acuosa saturada de NaHC03 y se extrajo con dicloro-metano (DCM). La capa orgánica se secó sobre MgS04, se filtró, y se concentró bajo presión reducida, para proporcionar el producto del título como un aceite color rojo, el cual se utilizó en el siguiente paso sin mayor purificación (313 miligramos, pureza del 90 por ciento, rendimiento cuantitativo).
UPLC RtMi =0.65 minutos; ESIMS: 343 [(M+H)+]. 1H RMN (400 MHz, CDCI3): d 7.93 (d, 1H), 7.62 (s, 1H), 7.32 (d, 1H), 5.70 (s, 1H), 5.26-5.36 (m, 1H), 4.31 (t, 2H), 3.99 (s, 3H), 3.67 (t, 2H), 2.95-3.15 (m, 3H), 2.81-2.92 (m, 1H), 2.22 (s, 3H), 1.98-2.10 (m, 1H), 1.79-1.90 (m, 1H). f) (1,1-dioxo-hexahidro-1lambda*6*-tiopiran-4-il)-{(S)-3-[1-(6- metoxi-5-metM^iridin-3-M)-2,3-dihidro-1 H-pirido-[3,4-b][1,4]-oxazin-7-iloxi]-pirrolidin-1 -il}-metanona Una solución del ácido 1 ,1-dioxo-hexahidro-1 lambda*6*-tio-piran-4-carboxílico (CAS registro 64096-87-3) (106 miligramos, 0.59 milimoles) en dimetil-formamida (D F) (4 mililitros) se trató con HBTU (225 miligramos, 0.59 milimoles), y di-isopropil-etil-amina (DIPEA) (0.24 mililitros, 1.37 milimoles). La solución color naranja resultante se agitó a temperatura ambiente durante 5 minutos, y entonces se agregó una solución de la 1 -(6-metoxi-5-metil-piridin-3-il)-7-((S)-pirrolidin-3-iloxi)-2,3-dihidro-1H-pirido-[3,4-b][1 ,4]-oxazina (156 miligramos, 0.46 milimoles) en dimetil-formamida (DMF) (2 mililitros). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora, entonces se concentró bajo presión reducida, y el residuo se absorbió con dicloro-metano (DCM), y se lavó con una solución acuosa saturada de NaHC03. La capa orgánica se secó pasándola a través de un cartucho de separación de fases, se concentró, y se obtuvo el compuesto del título después de la cromatografía SFC (columna DEAP (250 milímetros x 30 milímetros, 60A, 5 mieras) Princeton, gradiente del 11 al 16 por ciento de metanol en C02 súper-crítico en 6 minutos), como un sólido ligeramente coloreado (112 miligramos, 49 por ciento de rendimiento).
UPLC RtMi =0.81 minutos; ESIMS: 503 [(M+H)+]. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): d 8.01 (s, 1H), 7.61 (m, 1H), 7.52 (d, 1H), 5.52 (d, 1H), 5.24-5.43 (m, 1H), 4.26 (br s, 2H), 3.89 (s, 3H), 3.59-3.79 (m, 3H), 3.41-3.56 (m, 2H), 3.21-3.39 (m, 1H), 2.98-3.21 (m, 4H), 2.67-2.83 (m, 1H), 1.84-2.20 (m, 9H). 1H RMN (600 MHz, DMSO-d6): d 8.01 (s, 1H), 7.63-7.59 (m, 1H), 7.55-7.51 (m, 1H), 5.55-5.51 (m, 1H), 5.43-5.24 (m, 1H), 4.29-4.22 (m, 2H), 3.90 (s, 3H), 3.80-3.60 (m, 2H), 3.56-3.37 (m, 3H), 3.28-2.99 (m, 5H), 2.89-2.66 (m, 1H), 2.19-2.09 (m, 4H), 2.08-1.98 (m, 2H), 1.98-1.86 (m, 3H).
Cristalización del Ejemplo F1 mediante calentamiento y enfriamiento en isopropanol / dietil-éter 474 miligramos del Ejemplo F1 amorfo se suspendieron en 1.4 mililitros de isopropanol. La mezcla se calentó a 70°C, y se agitó a 70°C para permitir la disolución completa del Ejemplo F1. La solución se enfrió a temperatura ambiente, se formó un residuo pegajoso. Se agregaron 2 mililitros de dietil-éter, y la pasta acuosa se agitó durante 48 horas. Se formó una suspensión blanca. La suspensión se filtró y el sólido se secó a 40°C, 15 mbar. Se obtuvo un polvo blanco fino. El material contuvo solamente un ligero solvente residual (<0.5 por ciento). Se obtuvo una forma cristalina anhidra del Ejemplo F1 con un punto de fusión de fraguado de 148.77°C.
Lista de los picos 2-Theta más significativos a partir del patrón de difracción en polvo de rayos-X con tolerancias de ±0.5 de la forma anhidra del Ejemplo F1 (Método M1) (incluyendo los picos bajos/ débiles para información). Nota: Esta lista de picos no es exhaustiva sino que son solamente "entre otros".
Ejemplos F2 a F15: Los compuestos enlistados en la Tabla 6 se prepararon mediante un procedimiento análogo a aquél empleado en el Ejemplo F1.
Tabla 6 HPLC Rt Compuesto / Ejemplo [min] Condiciones de reacción l(método) {(S)-3-[1-(5-difluoro-metil-6-metoxi- piridin-3-il)-2,3-dihidro-1 H-pirido- [3,4-b][1 ,4]-oxazin-7-iloxi]-p¡rrolid¡n- 0.82 F7 1-il}-(1 ,1 -dioxo-hexahidro- (M1) 1 lambda*6*-tiopiran-4-il)-metanona Condición de aminación de Buchwald: CA2 Condición de enlace de amida: CB2 Condición de introducción de cadena lateral: CC1 Precursores utilizados: CAS 928118- 43-8 / 127423-61-4 / IA6 / 64096- 87-3 HPLC Rt MS Compuesto / Ejemplo [min] [m/z; Condiciones de reacción (método) (M+1)+] {(S)-3-[1-(5-difluoro-metil-6-metoxi- piridin-3-il)-2,3-dihidro-1 H-pirido- [3,4-b][1 ,4]-oxazin-7-iloxi]-pirrolidin- 0.77 F10 487 1-M}-(1-metil-1H-imidazol-4-M)- (M1) metanona Condición de aminación de Buchwald: CA2 Condición de enlace de amida: CB3 Condición de introducción de cadena lateral: CC1 Precursores utilizados: CAS 928118- 43-8 / 127423-61-4 / IA6 / 41716- 18-1 Ejemplo G1 : lmidazo-[2,1 -b]-tiazol-6-il-{(S)-3-[1 -(6-metoxi-5- trifluoro-metil-piridin-3-il)-2,3-dihidro-1H-pirido-[3,4-b][1,4]- oxazin-7-iloxi]-pirrolidin-1 -il}-metanona a) 7-bromo-2,3-dihidro-1 H-pirido-[3,4-b][1 ,4]-oxazina Una solución de la 7-bromo-1 H-pirido-[3,4-b][1 ,4]-oxazin-2-ona (CAS registro 943995-72-0) (2.93 gramos, 12.79 milimoles) en tetrahidrofurano (THF) (40 mililitros) se trató con BH3*THF (1M en tetrahidrofurano (THF), 30 mililitros, 30 milimoles). La mezcla de reacción se agitó a 80°C durante 1.5 horas, entonces se enfrió a temperatura ambiente, y se apagó con metanol. La mezcla de reacción se concentró bajo presión reducida, y el residuo se absorbió con EtOAc, y se lavó con una solución acuosa de NaOH 1M. La capa orgánica se secó sobre Na2S0 , se filtró, y se concentró bajo presión reducida, para proporcionar el producto del título como un sólido blanco. (2.48 gramos, 90 por ciento de rendimiento).
UPLC RtMi =0.49 minutos; ESIMS: 217 [(M+H)+]. 1H R N (400 MHz, CDCI3): d 7.72 (s, 1H), 6.60 (s, 1H), 4.42 (br s, 1H), 4.20-4.24 (m, 2H), 3.49 (m, 2H). b) Bencil-éster del ácido 7-bromo-2,3-dihidro-pirido-[3,4-b][1 ,4]-oxazin-1 -carboxílico Una solución seca de la 7-bromo-2,3-dihidro-1 H-pirido-[3,4-b][1 ,4]-oxazina (1.85 gramos, 8.60 milimoles) en tetrahidrofurano (THF) (50 mililitros) se trató en porciones a 0°C con NaH al 60 por ciento en aceite mineral (0.52 gramos, 12.90 milimoles), y la mezcla de reacción se agitó a 0°C durante 1 hora. Se agregó por goteo cloroformato de bencilo (CAS registro 501-53-1) (1.40 mililitros, 9.85 milimoles), y la mezcla de reacción se dejó calentar a temperatura ambiente, y se agitó durante 20 horas; finalmente se apagó con metanol, y entonces se diluyó con una solución acuosa saturada de NaHC03 y se extrajo con EtOAc. La capa orgánica se secó sobre Na2S04, se filtró, se concentró, y se obtuvo el compuesto del título después de la cromatografía por evaporación instantánea sobre gel de sílice (heptano / EtOAc, de 100:0 a 60:40), como un sólido blanco (2.06 gramos, 68 por ciento de rendimiento).
UPLC RtMi =1.14 minutos; ESIMS: 349 [( + H)+]. 1H RMN (400 MHz, CDCI3): d 8.28 (br s, 1H), 7.98 (s, 1H), 7.35-7.46 (m, 5H), 5.30 (s, 2H), 4.20-4.27 (m, 2H), 3.92-4.01 (m, 2H). c) 2,3-dihidro-1 H-pirido-[3,4-b][1 ,4]-oxazin-7-ol Una mezcla del bencil-éster del ácido 7-bromo-2,3-dihidro-pirido-[3,4-b][1 ,4]-oxazin-1 -carboxílico (1.27 gramos, 3.63 milimoles), una solución acuosa de KOH (0.90 gramos, 16 milimoles de KOH en 3.2 mililitros de agua), y 2-diterbutil-fosfino-3,4,5,6-tetrametil-2',4',6-tri-i-propil-bifenilo al 98 por ciento (0.26 gramos, 0.54 milimoles) en dioxano (16 mililitros), se desgasificó con argón durante 5 minutos, y entonces se agregó Pd2(dba)3 (0.25 gramos, 0.27 milimoles). El tubo se llenó con argón, entonces se selló, y la mezcla de reacción se agitó a 100°C durante 19 horas. Después de enfriarse a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se filtró a través de Hyflo, y se enjuagó con EtOAc y metanol. Los filtrados se secaron sobre Na2S04, se filtraron, se concentraron, y se obtuvo el compuesto del título después de la cromatografía por evaporación instantánea sobre gel de sílice (dicloro-metano (DCM) / MeOH, de 95:5 a 60:40), como un residuo color naranja (262 miligramos, 47 por ciento de rendimiento).
UPLC RtMi =0.32 minutos; ESIMS: 153 [(M + H)+] 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): d 10.33 (br.s, 1H), 7.03 (br.s, 1H), 6.71 (s, 1H), 5.15 (s, 1H), 3.95 (t, 2H), 3.25 (td, 2H). d) Terbutil-éster del ácido (S)-3-(2, 3-d¡hidro-1 H-pirido-[3,4-b][1 ,4]-oxazin-7-iloxi)-pirrolidin-1 -carboxílico Una solución seca del 2,3-dihidro-1 H-pirido-[3,4-b][1 ,4]-oxazin-7-ol (200 miligramos, 0.66 milimoles), y terbutil-éster del ácido (R)-3-metan-sulfoniloxi-pirrolidin-1 -carboxílico (CAS registro 127423-61-4) (262 miligramos, 0.99 milimoles) en dimetil-formamida (DMF) (6 mililitros) se trató con hidruro de sodio al 60 por ciento en aceite mineral (53 miligramos, 1.33 milimoles), y la mezcla de reacción se agitó a 80°C durante 17 horas. Después de enfriarse a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se diluyó con el terbutil-metil-éter (TBME), y se lavó con una solución acuosa saturada de NaHC03. La capa orgánica se secó sobre Na2S04, se filtró, se concentró, y se obtuvo el compuesto del título después de la cromatografía por evaporación instantánea sobre gel de sílice (heptano / EtOAc, de 88:12 a 0:100), como un aceite (140 miligramos, 66 por ciento de rendimiento).
UPLC RtM1 =0.66 minutos; ESIMS: 322 [(M+H)+]. 1H RMN (400 MHz, CDCI3): d 7.54 (s, 1H), 5.86 (s, 1H), 5.42 (br.s, 1H), 4.25-4.41 (m, 1H), 4.19 (t, 2H), 3.38-3.66 (m, 6H), 2.00-2.18 (m, 2H), 1.46 (d, 9H). e) Terbutil-éster del ácido (S)-3-[1 -(6-metoxi-5-trifluoro-metil-piridin-3-il)-2,3-dihidro-1 H-pirido-[3,4-b][1 ,4]-oxazin-7-iloxi]-pirrolidin-1 -carboxílico Una mezcla del terbutil-éster del ácido (S)-3-(2,3-dihidro-1 H-pirido-[3,4-b][1 ,4]-oxazin-7-iloxi)-pirrolidin-1 -carboxílico (115 miligramos, 0.36 milimoles), 5-bromo-2-metoxi-3-trifluoro-metil-piridina (CAS registro 1214377-42-0) (119 miligramos, 0.47 milimoles), XPhos (14 miligramos, 0.03 milimoles), y NaOtBu (76 miligramos, 0.79 milimoles) en dioxano (2.5 mililitros), se desgasificó con argón durante 5 minutos, y entonces se agregó Pd2(dba)3 (13 miligramos, 0.01 milimoles). El tubo se llenó con argón, entonces se selló, y la mezcla de reacción se agitó a 100°C durante 2 horas. Después de enfriarse a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se filtró a través de Hyflo, se enjuagó con EtOAc, y los filtrados se lavaron con una solución acuosa saturada de NaHC03. La capa orgánica se secó sobre Na2S04, se filtró, se concentró, y se obtuvo el compuesto del título después de la cromatografía por evaporación instantánea sobre gel de sílice (heptano / EtOAc, de 93:7 a 40:60), como una goma transparente. (91 miligramos, 51 por ciento de rendimiento).
UPLC RtM1 =1.27 minutos; ESIMS: 497 [(M+H)+]. 1H RMN (400 MHz, CDCI3): d 8.29 (d, 1H), 7.79 (d, 1H), 7.64 (d, 1H), 5.70 (s, 1H), 5.36-5.46 (m, 1H), 4.34 (br s, 2H), 4.09 (s, 3H), 3.70 (t, 2H), 3.34-3.62 (m, 4H), 2.02-2.11 (m, 2H), 1.44 (s, 9H). f) 1 -(6-metoxi-5-trifluoro-metil-piridin-3-il)-7-((S)-pirrolidin-3-iloxi)-2,3-dihidro-1 H-pirido-[3,4-b][1 ,4]-oxazina Una solución del terbutil-éster del ácido (S)-3-[1 -(6-metox¡-5-trifluoro-metil-piridin-3-il)-2,3-dihidro-1 H-pirido-[3,4-b][1 ,4]-oxazin-7-iloxi]-pirrolidin-1 -carboxílico (88 miligramos, 0.18 milimoles) en dicloro-metano (DCM) (1.3 mililitros) se trató con ácido trifluoro-acético (TFA) (0.14 mililitros, 1.77 milimoles), y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 17 horas, entonces se apagó con una solución acuosa saturada de Na2C03 y se extrajo con dicloro-metano (DCM). La capa orgánica se secó sobre Na2S04, se filtró, y se concentró bajo presión reducida, para proporcionar el compuesto del título (66 miligramos, 94 por ciento de rendimiento).
UPLC RtMi =0.72 minutos; ESIMS: 397 [(M+H)+j. 1H RMN (400 MHz, CDCI3): d 8.28 (d, 1H), 7.79 (d, 1H), 7.65 (s, 1H), 5.68 (s, 1H), 5.31-5.39 (m, 1H), 4.31-4.37 (m, 2H), 4.08 (s, 3H), 3.67-3.72 (m, 2H), 3.01-3.18 (m, 3H), 2.85-2.97 (m, 1H), 2.01-2.13 (m, 1H), 1.82-1.95 (m, 1H). g) lmidazo-[2,1-b]-tiazol-6-il-{(S)-3-[1-(6-metoxi-5-trifluoro-metil-piridin-3-il)-2,3-dihidro-1H-pirido-[3,4-b][1,4]-oxazin-7-iloxi]-pirrolidin-1 -il}-metanona Una solución del ácido ¡midazo-[2,1-b]-tiazol-6-carboxílico, y bromhidrato (1:1) (CAS registro 725234-39-9) (25 miligramos, 0.10 milimoles) en dimetil-formamida (DMF) (0.45 mililitros) se trató con HBTU (41 miligramos, 0.11 milimoles), y di-isopropil-etil-amina (DIPEA) (0.04 mililitros, 0.21 milimoles). La solución color naranja resultante se agitó a temperatura ambiente durante 5 minutos, y entonces se agregó una solución de 1 -(6-metoxi-5-trifluoro-metil-piridin-3-il)-7-((S)-pirrolidin-3-iloxi)-2,3-dihidro-1 H-pir¡do-[3,4-b][1 ,4]-oxazina (32 miligramos, 0.08 milimoles) en dimetil-formamida (DMF) (0.45 mililitros). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 17 horas, entonces se concentró bajo presión reducida, y el residuo se absorbió con EtOAc, y se lavó con salmuera. La capa orgánica se secó sobre Na2S04, se filtró, se concentró, y se obtuvo el compuesto del título después de la HPLC de preparación en fase inversa (RP) (Sunfire Prep C18, 30 x 100 milímetros, 5 mieras; solvente A: H20 + ácido trifluoro-acético (TFA) al 0.1 por ciento por volumen; solvente B: CH3CN + ácido trifluoro-acético (TFA) al 0.1 por ciento por volumen, gradiente del 15 al 45 por ciento de B en 16 minutos). Después de la filtración sobre un cartucho SPE Agilent PL-HC03 MP, se obtuvo el compuesto del título como un sólido (23 miligramos, 52 por ciento de rendimiento).
UPLC RtMi =1.00 minutos; ESIMS: 547 [(M+H)+]. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): d 8.49 (dd, 1H), 8.16-8.20 (m, 2H), 7.92 (dd, 1H), 7.57 (d, 1H), 7.37 (dd, 1H), 5.63 (d, 1H), 5.33-5.45 (m, 1H), 4.25-4.31 (m, 2H), 3.52-4.14 (m, 9H), 1.88-2.12 (m, 2H).
Ejemplos G2 a G3: Los compuestos enlistados en la Tabla 7 se prepararon mediante un procedimiento análogo a aquél empleado en el Ejemplo G1.
Tabla 7 Ejemplos H1 a H16: Los compuestos enlistados en la Tabla 8 se prepararon mediante la separación cromatográfica de los diaestereómeros.
Tabla 8 HPLC Rt MS Compuesto / Ejemplo [min] [m/z; Condiciones de reacción (método) ( +1)+] {(S)-3-[4-(5,6-dimetoxi-piridin-3-il)- 3,4-dihidro-2H-benzo-[1 ,4]-oxazin-6- iloxi]-pirrolidin-1 -il}-(tetrahidrofuran-2- 0.91 H7 il)-metanona 472 (M2) Condición de aminación de Buchwaid: CA9 Condición de enlace de amida: CB4 Condición de introducción de cadena lateral: CC2 Precursores utilizados: IA29, CAS 52605-98-8, 127423-61-4 / 1264293- 76-6 Método de separación quiral: CD1 Ejemplo 11 : (1 ,1 -dioxo-hexahidro-1 lambda*6*-tiopiran-4-il)-{(S)-3-[5-fluoro-4-(6-metoxi-5-metil-piridin-3-il)-3,4-dihidro-2H-benzo-[1 ,4]-oxazin-6-iloxi]-pirrolidin-1 -il}-metanona a) 5-fluoro-6-metoxi-4H-benzo-[1 ,4]-oxazin-3-ona Una solución de la 6-bromo-5-fluoro-4H-benzo-[1 ,4]-oxazin-3- ona (CAS registro 1029421-36-0) (5.0 gramos, 20 milimoles) en metanol (10 mililitros) se trató con una solución de metóxido de sodio (al 30 por ciento en MeOH, 11.3 mililitros, 61 milimoles), y Cul (0.4 gramos, 2 milimoles). Después de agitar durante 20 horas a 80°C, la reacción se apagó con una solución acuosa saturada de NaHC03, y se extrajo con EtOAc. La capa orgánica se secó sobre Na2S04, se filtró, y se concentró bajo presión reducida, para obtener un sólido amarillo pálido. (2.2 gramos, 92 por ciento de rendimiento).
UPLC RtMi =0.64 minutos. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): d 6.74 (m, 2H), 4.53 (s, 2H), 3.79 (s, 3H). b) 5-fluoro-6-hidroxi-4H-benzo-[1 ,4]-oxazin-3-ona Una solución de la 5-fluoro-6-metoxi-4H-benzo-[1 ,4]-oxazin-3-ona (2.0 gramos, 10 milimoles) en dicloro-metano (DCM) (50 mililitros) se trató a 0°C con tribromuro de boro (9.6 mililitros, 101 milimoles). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 17 horas, entonces se enfrió a 0°C, y se apagó con metanol. La mezcla se concentró bajo presión reducida, y el residuo se absorbió con EtOAc, y se lavó con una solución acuosa saturada de NaHC03. La capa orgánica se lavó con una solución acuosa de Na2S20 al 10 por ciento, se secó sobre Na2S04, se filtró, y se concentró bajo presión reducida. Se obtuvo el compuesto del título después de la cromatografía por evaporación instantánea sobre gel de sílice (hexano / EtOAc, de 100:0 a 60:40), como un sólido color café (780 miligramos, 42 por ciento de rendimiento).
UPLC R t M i =0.49 minutos; ESIMS: 228 [(M+HCOO)]. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): d 11.00 (s, 1H), 6.65 (d, 1H), 6.45 (t, 1H), 4.50 (s, 2H). c) 5-f luoro-3,4-dihidro-2H-benzo-[1 ,4]-oxazin-6-ol Una solución de la 5-fluoro-6-hidroxi-4H-benzo-[1 ,4]-oxazin-3-ona (780 miligramos, 4.2 milimoles) en tetrahidrofurano (THF) (10 mililitros) se trató con BH3*THF (1M en tetrahidrofurano (THF), 12.8 mililitros, 12.8 milimoles). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 17 horas, entonces se enfrió a 0°C, y se apagó con metanol (30 mililitros). La mezcla de reacción se concentró bajo presión reducida, para obtener un aceite color café (720 miligramos, rendimiento cuantitativo).
UPLC RtMi =0.54 minutos; ESIMS: 170 [(M+H)+J. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): d 8.95 (s, 1H), 6.45 (d, 1H), 6.00 (t, 1H), 4.09 (m, 2H), 3.45 (m, 2H). d) Terbutil-éster del ácido (S)-3-(5-f I uoro-3,4-dihidro-2H-benzo-[1 ,4]-oxazin-6-iloxi)-pirrolidin-1 -carboxílico Una solución de trifenil-fosfina (1.5 gramos, 5.7 milimoles) en tetrahidrofurano (THF) (20 mililitros) se trató a 0°C con azodicarboxilato de dietilo (0.900 mililitros, 5.69). La solución color naranja se agitó durante 10 minutos a temperatura ambiente, y entonces se agregaron 5-fluoro-3,4-dihidro-2H-benzo-[1 ,4]-oxazin-6-ol (740 miligramos, 4.37 milimoles), y (R)-3-hidroxi-pirrolidin-1 -carboxilato de terbutilo (1,065 miligramos, 5.69 milimoles). La mezcla de reacción se agitó durante 19 horas a 60°C, y entonces se concentró bajo presión reducida. Se obtuvo el compuesto del título después de la cromatografía por evaporación instantánea sobre gel de sílice (Hexano / EtOAc, de 100:0 a 70:30), como un aceite incoloro (1.1 gramos, 74 por ciento de rendimiento).
UPLC Rt i =1.07 minutos; ESIMS: 339 [(M+H)+]. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): d 6.45 (d, 1H), 6.00 (t, 1H), 5.42 (br.s, 1H), 4.25-4.41 (m, 1H), 4.19 (t, 2H), 3.38-3.66 (m, 6H), 2.00-2.18 (m, 2H), 1.46 (d, 9H). e) Terbutil-éster del ácido (S)-3-[5-fluoro-4-(6-metoxi-5-metil-piridin-3-il)-3,4-dihidro-2H-benzo-[1 ,4]-oxazin-6-iloxi]-pirrolidin-1 -carboxílico Una mezcla del terbutil-éster del ácido (S)-3-(5-fluoro-3,4-dihidro-2H-benzo-[1 ,4]-oxazin-6-iloxi)-pirrolidin-1 -carboxílico (100 miligramos, 0.296 milimoles), 5-bromo-2-metoxi-3-metil-piridina (CAS registro 760207-87-2, 179 miligramos, 0.887 milimoles), RuPhos (6.90 miligramos, 0.015 milimoles), NaOtBu (85 miligramos, 0.887 milimoles), y (2-diciclohexil-fosfino-2'6'-di-isopropil-11 '-bifen il)-(2-(2-amino-etil)-fenil)-paladio(ll) (12.07 miligramos, 0.015 milimoles) en dioxano (2 mililitros) se desgasificó con argón, entonces se selló, y la mezcla de reacción se agitó a 100°C durante 23 horas. Después de enfriarse a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se filtró a través de Hyflo, se enjuagó con EtOAc, y los filtrados se lavaron con una solución acuosa saturada de NaHC03. La capa orgánica se secó sobre Na2S04, se filtró, se concentró, y se obtuvo el compuesto del título después de la cromatografía por evaporación instantánea sobre gel de sílice (Hexano / EtOAc, de 100:0 a 70:30), como un aceite amarillo(123 miligramos, rendimiento del 63 por ciento).
UPLC RtMi =1.29 minutos; ESIMS: 460 [(M+H)+].
H RMN (400 MHz, DMSO-d6): d 7.75 (d, 1H),7.45 (d, 1H), 6.55 (t, 1H), 6.35 (d, 1H), 4.75 (m, 1H), 4.15 (t, 2H), 3.84 (s, 3H), 3.60 (t, 2H), 3.38-3.66 (m, 4H), 2.12 (s, 3H), 2.00-2.18 (m, 2H), 1.46 (d, 9H). f) 5-fluoro-4-(6-metoxi-5-metil-piridin-3-il)-6-((S)-pirrolidin-3-iloxi)-3,4-dihidro-2H-benzo-[1 ,4]-oxazina Una solución del terbutil-éster del ácido (S)-3-[5-fluoro-4-(6-metoxi-5-metil-piridin-3-il)-3,4-dihidro-2H-benzo-[1 ,4]-oxazin-6-iloxi]-pirrolidin-1 -carboxílico (123 miligramos, 0.185 milimoles) en dicloro-metano (DCM) (2 mililitros) se trató con HCI 4N/dioxano (0.046 mililitros, 0.185 milimoles). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 días, y entonces se concentró bajo presión reducida, para obtener un aceite negro (100 miligramos, 79 por ciento de rendimiento).
UPLC RtMi =0.73 minutos; ESIMS: 360 [(M+H)+]. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): d 7.75 (d, 1H),7.45 (d, 1H), 6.80 (m, 1H), 6.75 (m, 1H), 5.20 (m, 1H), 4.15 (t, 2H), 3.84 (s, 3H), 3.60 (t, 2H), 3.38-3.66 (m, 4H), 2.12 (s, 3H), 2.00-2.18 (m, 2H). g) (1 ,1 -dioxo-hexahidro-1 lambda*6*-tiopiran-4-il)-{(S)-3-[5-fluoro-4-(6-metoxi-5-metil-piridin-3-il)-3,4-dihidro-2H-benzo-[1 ,4]-oxazin-6-iloxi]-pirrolidin-1-il}-metanona Una solución del ácido 1 , 1 -dioxo-hexahidro-1 lambda*6*-tiopiran-4-carboxílico (CAS registro 64096-87-3) (33.9 miligramos, 0.15 milimoles) en dicloro-metano (DCM) (2 mililitros) se trató a temperatura ambiente con Et3N (0.061 mililitros, 0.440 milimoles), y HATU (55.7 miligramos, 0.147 milimoles). La solución color naranja resultante se agitó a temperatura ambiente durante 20 minutos, y entonces se agregó una solución de 5-fluoro-4-(6-metoxi-5-metil-piridin-3-il)-6-((S)-pirrolidin-3-iloxi)-3,4-dihidro-2H-benzo-[1 ,4]-oxazina (100 miligramos, 0.147 milimoles) en dicloro-metano (DCM) (2 mililitros). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1.5 horas, entonces se diluyó con EtOAc, y se lavó con una solución acuosa saturada de NaHC03. La capa orgánica se secó sobre Na2S0 , se filtró, se concentró, y se obtuvo el compuesto del título después de la RP-HPLC de preparación (columna SunFire C18 OBD 5 mieras, 30 x 100 milímetros, gradiente del 25 por ciento al 45 por ciento de acetonitrilo (ACN) en 16 minutos). Las fracciones se liofilizaron y se filtraron sobre un cartucho SPE PL-HCO3 MP para dar un sólido color café (54 miligramos, 71 por ciento de rendimiento).
UPLC RtM1 =0.94 minutos; ESIMS: 520 [(M+H)+].
H RMN (400 MHz, DMSO-d6): d 7.75 (d, 1H),7.45 (d, 1H), 6.55 (t, 1H), 6.35 (d, 1H), 4.75 (m, 1H), 4.15 (t, 2H), 3.84 (s, 3H), 3.59-3.79 (m, 3H), 3.41-3.56 (m, 2H), 3.21-3.39 (m, 1H), 2.98-3.21 (m, 4H), 2.67-2.83 (m, 1H), 1.84-2.20 (m, 9H).
Ejemplos 12 a 13: Los compuestos enlistados en la Tabla 9 se prepararon mediante un procedimiento análogo a aquél empleado en el Ejemplo 11.
Tabla 9 HPLC Rt MS Compuesto / Ejemplo [min] [m/z; Condiciones de reacción (método) (M + 1)+] {(S)-3-[4-(5-d¡fluoro-metil-6-metoxi- piridin-3-il)-5-fluoro-3,4-d¡h¡dro-2H- benzo-[1 ,4]-oxazin-6-iloxi]-pirrolidin- 0.97 12 1-il}-(1 ,1 -dioxo-hexahidro- 556 ( 2) 1 lambda*6*-tiopiran-4-il)-metanona Condición de aminación de Buchwald: CA11 Condición de enlace de amida: CB3 Condición de introducción de cadena lateral: CC4 Precursores utilizados: IA6.CAS 1254123-51-7 / 127423-61-4, / 64096- 87-3 Ejemplo J: 5-{6-[(S)-1-((S)-1-acetil-pirrolid¡n-3-carbonil)-pirrolidin-3-iloxi]-2,3-dihidro-benzo-[1 ,4]-oxazin-4-il}-2-metoxi-nicotinonitrilo Una solución del 2-metoxi-5-{6-[(S)-1-((S)-pirrolidin-3-carbonil)-pirrolidin-3-iloxi]-2,3-dihidro-benzo-[1 ,4]-oxazin-4-il}-nicotinonitrilo (Ejemplo D39; 23 miligramos, 0.051 milimoles) en dicloro-metano (DCM) (1 mililitro) se trató con Et3N (0.014 mililitros, 10.4 miligramos, 0.102 milimoles). La solución se agitó a temperatura ambiente durante 10 minutos, y entonces se agregó cloruro de acetilo (0.0044 mililitros, 4.87 miligramos, 0.061 milimoles). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1.5 horas. Se agregaron otros 2 equivalentes de Et3N (0.014 mililitros, 10.4 miligramos, 0.102 milimoles). y 1 equivalente de cloruro de acetilo ((0.0037 mililitros, 4.06 miligramos, 0.051 milimoles), se continuó la agitación a temperatura ambiente durante 1.5 horas. La mezcla de reacción se diluyó con dicloro-metano (DCM) y una solución acuosa saturada de NaHC03, entonces se pasó a través de un separador de fases, la capa acuosa se extrajo dos veces con dicloro-metano (DCM), las capas orgánicas combinadas se concentraron, para dar el compuesto del título como un aceite amarillo, el cual se purificó mediante RP-HPLC de preparación (columna SunFire C18, del 10 al 85 por ciento de acetonitrilo (ACN) en 20 minutos). Las fracciones se extrajeron con dicloro-metano (DCM)/NaHC03, se secaron sobre MgS04, se concentraron, y se liofilizaron, para dar el compuesto del título como una espuma amarilla (14 miligramos, 53 por ciento de rendimiento).
HPLC RtM10=2.55 minutos; ESIMS: 492 [(M + H)+].
Ejemplo K: 5-{6-[(S)-1 -((R)-1 -acetil-pirrolidin-3-carbonil)- pirrolidin-3-¡loxi]-2,3-dihidro-benzo-[ ,4]-oxazin-4-il}-2-metoxi- nicotinonitrilo Este Ejemplo se preparó en analogía al Ejemplo J, empezando a partir del 2-metoxi-5-{6-[(S)-1-((R)-pirrolidin-3-carbonil)-pirrolidin- 3-iloxi]-2,3-dihidro-benzo-[1 ,4]-oxazin-4-il}-nicotinonitrilo (Ejemplo D40).
H PLC RtM i o=2.55 minutos ; ES I MS: 492 [(M + H)+].
Ejem plo L: 2-metoxi-5-{6-[(S)-1 -((R)-1 -metil-pirrol idin-3-carbonil)-pirrolidin-3-iloxi]-2,3-dihidro-benzo-[1 ,4]-oxazin-4-il}-nicoti nonitrilo U na solución del 2-metoxi-5-{6-[(S)-1 -((R)-pirrolidin-3-carbonil)-pirrolidin-3-iloxi]-2 ,3-dihidro-benzo-[1 ,4]-oxazin-4-il}-nicotinonitrilo (Ejemplo D40 , 26 miligramos, 0.058 milimoles) en metanol (1 mililitro) se trató con una solución acuosa de formaldeh ído al 37 por ciento (0.043 mililitros, 46.9 miligramos, 0.578 milimoles) , y ácido acético (0.004 mililitros, 4.1 7 miligramos, 0.0069 milimoles). La solución se agitó bajo argón a temperatura ambiente durante 45 minutos, y entonces se agregó NaBH3CN (5.65 miligramos de u n sólido al 90 por ciento, 0.081 milimoles) . La mezcla resultante se agitó a temperatu ra ambiente durante 45 minutos, se diluyó con dicloro-metano (DCM) y una solución acuosa satu rada de NaHC03. La capa acuosa se re-extrajo dos veces con dicloro-metano (DCM) , las capas orgánicas combinadas se secaron sobre MgS04, y se concentraron, para dar el compuesto del título crudo que se purificó mediante RP-HPLC de preparación (columna SunFire C18, gradiente del 5 al 75 por ciento de acetonitrilo (ACN) en 20 minutos). Las fracciones se extrajeron con dicloro-metano (DCM)/una solución acuosa saturada de NaHC03, se secaron sobre MgS04, se concentraron, y se liofilizaron, para dar el compuesto del título como una espuma amarilla (20 miligramos, 72 por ciento de rendimiento).
HPLC RtMii=2.24 minutos; ESIMS: 464 [(M + H)+].
Ejemplo M: 4-(6-metan-sulfonil-5-metil-piridin-3-il)-6-((S)-1 -piridin-2-il-pirrolidin-3-iloxi)-3,4-dihidro-2H-benzo-[1 ,4]-oxazina Una solución de la 4-(6-metan-sulfonil-5-metil-piridin-3-il)-6-((S)-1-piridin-2-il-pirrolidin-3-iloxi)-3,4-dihidro-2H-benzo-[1 ,4]-oxazina (preparada como se describe en el Ejemplo B1; 60 miligramos, 0.154 milimoles), 2-cloro-piridina (CAS 109-09-1, 0.017 mililitros, 21.0 miligramos, 0.185 milimoles), Xphos (8.81 miligramos, 0.018 milimoles), y Cs2C03 (125 miligramos, 0.385 milimoles) en dioxano (1 mililitro), se desgasificó con argón, y entonces se agregó Pd2(dba)3 (7.05 miligramos, 0.0077 milimoles). La mezcla de reacción se calentó a 80°C durante 6 horas, se agregó XPhos (8.81 miligramos, 0.018 milimoles), la mezcla nuevamente se desgasificó con argón, y se agregó Pd2(dba)3 (7.05 miligramos, 0.0077 milimoles). Se continuó la agitación durante la noche a 80°C. La mezcla se filtró a través de Celite, y se concentró, para dar el compuesto del título que se purificó mediante NP-HPLC (columna Grace Grom Saphir 65 Si, gradiente de heptano:EtOAc:MeOH, de 68:30:2 a 0:65:35 en 12 minutos), rendimiento de 32 miligramos (45 por ciento).
HPLC RtMi =0.72 minutos; ESIMS: 467 [(M + H)+] 1H RMN (400 MHz, CDCI3): d 8.32 (d, 1H), 8.14-8.12 (m, 1H), 7.49-7.39 (m, 2H), 6.86 (d, 1H), 6.61 (d, 1H), 6.57-6.46 (m, 2H), 6.37 (d, 1H), 4.92-4.85 (m, 1H), 4.26-4.24 (m, 2H), 3.76-3.74 (m, 2H), 3.71 (d, 2H), 3.63-3.55 (m, 2H), 3.32 (s, 3H), 2.67 (s, 3H), 2.35-2.27 (m, 1H), 2.26-2.15 (m, 1H).
Ejemplo N: 4-(6-metan-sulfonil-5-metil-piridin-3-il)-6-((S)-1 -pir¡midin-2-il-pirrolidin-3-ilox¡)-3,4-dihidro-2H-benzo-[1 ,4]-oxazina Una solución de la 4-(6-metan-sulfonil-5-metil-piridin-3-il)-6- ((S)-1 -piridin-2-il-pirrolidin-3-iloxi)-3,4-dihidro-2H-benzo-[1 ,4]-oxazina (preparada como se describe en el Ejemplo B1¡ 60 miligramos, 0.154 milimoles), 2-cloro-pirimidina (CAS 1722-12-9, 24.7 miligramos, 0.216 milimoles), y di-isopropil-etil-amina (DIPEA) (0.054 mililitros, 39.8 miligramos, 0.308 milimoles) en acetonitrilo (ACN) (1 mililitro), se calentó a 140°C durante 30 minutos en un reactor de microondas. El producto se extrajo con una solución acuosa saturada de NaHC03 y EtOAc, se filtró, y se concentró, para proporcionar el compuesto del título que se purificó mediante NP-HPLC de preparación (columna Grace Grom Saphir 65 Si, gradiente de heptano:EtOAc:MeOH, de 68:30:2 a 0:65:35 en 12 minutos), rendimiento de 45 miligramos (63 por ciento).
HPLC RtM1=0.97 minutos; ESIMS: 468 [(M + H)+] 1H RMN (400 MHz, CDCI3): d 8.37-8.26 (m, 3H), 7.44 (d, 1H), 6.87 (d, 1H), 6.62 (d, 1H), 6.56-6.46 (m, 2H), 4.92-4.84 (m, 1H), 4.27-4.25 (m, 2H), 3.90-3.63 (m, 6H), 3.33 (s, 3H), 2.69 (s, 3H), 2.37-2.13 (m, 2H).
Ejemplo 01: 2-metoxi-5-{2-metil-6-[(S)-1 -(tetrahidro-piran-4-carbonil)-pirrolidin-3-iloxi]-2,3-d¡hidro-benzo-[1 ,4]-oxazin-4-il}-nicotinonitrilo a) a) N-(5-benciloxi-2-hidroxi-fenil)-2-cloro-propionamida Una solución de ácido 2-cloro-propiónico (CAS registro 598-78-7) (0.914 mililitros, 7.53 milimoles) en dimetil-formamida (DM F) (20 mililitros) se trató con Et3N (1 .259 mililitros, 9.03 milimoles) , y HATU (3.05 gramos, 8.03 milimoles) . La solución resultante se agitó a temperatura ambiente du rante 30 min utos, entonces se agregó el 2-amino-4-benciloxi-fenol (CAS registro 1 02580-07-4) ( 1 .08 gramos, 5.02 milimoles) . La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 5 minutos, se diluyó con EtOAc y se concentró. Se obtuvo el compuesto del título después de la cromatografía por evaporación instantánea sobre gel de sílice (ciciohexano / EtOAc, de 100:0 a 50:50), como un sólido color naranja (617 miligramos, 40 por ciento de rendimiento).
UPLC RtMi4=1.32 minutos; ESIMS: 306 [(M + H)+]. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): d 9.50 (d, 1H), 7.70 (br,s 1H), 7.45 (m, 5H), 6.80 (d, 1H), 6.65 (dd, 1H), 5.00 (s, 2H), 2.65 (s, 3H). b) 6-benciloxi-2-metil-4H-benzo-[1 ,4]-oxazin-3-ona Una solución seca de la N-(5-benciloxi-2-hidroxi-fenil)-2-cloro-propionamida (617 miligramos, 2.0 milimoles) en dimetil-formamida (DMF) (15 mililitros) se trató a 0°C con hidruro de sodio al 95 por ciento (58.1 miligramos, 2.4 milimoles). Después de agitar a temperatura ambiente durante 1 hora, la mezcla de reacción se diluyó con dicloro-metano (DCM), y se lavó con agua. La capa orgánica se secó sobre Na2S04, se filtró, se concentró, y se obtuvo el compuesto del título después de la cromatografía por evaporación instantánea sobre gel de sílice (ciciohexano / EtOAc, de 100:0 a 80:20), como un sólido blanco (146 miligramos, 27 por ciento de rendimiento).
UPLC RtMi4=1.30 minutos; ESIMS: 270 [(M + H)+]. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): d 10.80 (s, 1H), 7.45 (m, 5H), 6.85 (d, 1H), 6.65 (m, 2H), 5.00 (s, 2H), 4.55 (q, 1H), 1.45 (d, 3H). c) 6-benciloxi-2-metil-3,4-dihidro-2H-benzo-[1 ,4]-oxazina Una solución de la 6-benciloxi-2-met¡l-4H-benzo-[1 ,4]-oxazin-3- ona (146 miligramos, 0.54 milimoles) en tetrahidrofurano (THF) (4 mililitros) se trató a 0°C con BH3*THF (1M en tetrahidrofurano (THF), 0.813 mililitros, 0.813 milimoles). Después de agitar a 35°C durante 1 hora, la mezcla de reacción se enfrió a 0°C, se apagó con agua (0.5 mililitros), y una solución acuosa de NaOH 4N (0.5 mililitros), y entonces se diluyó con EtOAc. La capa orgánica se secó sobre Na2S04, se filtró, se concentró, y se obtuvo el compuesto del título como un sólido blanco (125 miligramos, 90 por ciento de rendimiento).
UPLC RtMi4 =1.40 minutos; ESIMS: 256 [(M + H)+]. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): d 7.45 (m, 5H), 6.50 (d, 1H), 6.20 (d, 1H), 6.10 (dd, 1H), 5.35 (s, 1H), 4.90 (s, 2H), 4.00 (m, 1H), 3.25 (m, 1H), 2.90 (m, 1H), 1.35 (d, 3H). d) 2-metil-3,4-dihidro-2H-benzo-[1 ,4]-oxazin-6-ol Una solución de la 6-benciloxi-2-metil-3,4-dihidro-2H-benzo- [1 ,4]-oxazina (124 miligramos, 0.486 milimoles) en metanol (10 mililitros) se trató a temperatura ambiente con formato de amonio (276 miligramos, 4.37 milimoles), y Pd(OH)2 (68.2 miligramos, 0.486 milimoles). La mezcla de reacción se agitó a 60°C durante 15 minutos. Después de enfriarse a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se filtró a través de Hyflo, se enjuagó con dicloro-metano (DCM) y metanol, y entonces los filtrados se concentraron. Se obtuvo el compuesto del título después de la cromatografía por evaporación instantánea sobre gel de sílice (dicloro-metano (DCM) / MeOH, de 100:0 a 90:10), como un sólido color café. (69.4 miligramos, 87 por ciento de rendimiento).
UPLC tMi4=0.56 minutos; ESIMS: 166 [(M + H)+]. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): d 8.50 (s, 1H), 6.45 (d, 1H), 6.00 (d, 1H), 5.85 (dd, 1H), 5.25 (s, 1H), 4.00 (m, 1H), 3.25 (m, 1H), 2.90 (m, 1H), 1.35 (d, 3H). e) [(S)-3-(2-metil-3,4-dihidro-2H-benzo-[1 ,4]-oxazin-6-iloxi)-pirrolidin-1 -il]-(tetrahidro-piran-4-il)-metanona Una solución seca del 2-metil-3,4-dihidro-2H-benzo-[1 ,4]-oxazin-6-ol (69 miligramos, 0.42 milimoles), y metan-sulfonato de (R)-1 -(tetrahidro-2H-piran-4-carbonil)-pirrolidin-3-ilo (intermediario C1, 209 miligramos, 0.75 milimoles) en dimetil-formamida (DMF) (1.4 mililitros) se trató con hidruro de sodio al 60 por ciento en aceite mineral (15.8 miligramos, 0.63 milimoles), y la mezcla de reacción se agitó a 50°C durante 18 horas. La mezcla de reacción se diluyó con EtOAc, y se lavó con una solución acuosa saturada de NaHC03. La capa orgánica se secó sobre Na2S04, se filtró, se concentró, y se obtuvo el compuesto del título después de la cromatografía por evaporación instantánea sobre gel de sílice (dicloro-metano (DCM) / MeOH, de 100:0 a 95:5), como un sólido pegajoso color rojo-naranja (128 miligramos, 88 por ciento de rendimiento).
UPLC RtMi4=1.01 minutos; ESIMS: 347 [(M + H)+] 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): d 6.50 (d, 1H), 6.25 (d, 1H), 6.00 (d, 1H), 6.05 (m, 1H), 5.65 (m, 2H), 5.35 (d, 2H), 4.45 (d, 2H), 3.00-4.00 (m, 6H), 2.00-2.40 (m, 4H), 1.5 (m, 4H) f) 2-metoxi-5-{2-metil-6-[(S)-1 -(tetrahidro-piran-4-carbonil)- pirrolidin-3-iloxi]-2,3-dihidro-benzo-[1 ,4]-oxazin-4-il}-nicotinonitrilo Una mezcla de la (S)-(3-(2-metil-3,4-dihidro-2H-benzo-[b][1 ,4]-oxazin-6-¡loxi)-pirrolidin-1 -il)-(tetrah¡dro-2H-piran-4-il)-metanona (128 miligramos, 0.369 milimoles), 5-bromo-2-metoxi-nicotinonitrilo (CAS registro 941294-54-8, IA12), (94 miligramos, 0.443 milimoles), XPhos (8.81 miligramos, 0.018 milimoles), NaOtBu (53.3 miligramos, 0.554 milimoles), y Pd2(dba)3 (16.92 miligramos, 0.018 milimoles) en tolueno (2.5 mililitros), se desgasificó con argón. La mezcla de reacción se agitó a 80°C durante 20 minutos. Después de enfriarse a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se filtró a través de Hyflo, se enjuagó con EtOAc, y los filtrados se lavaron con una solución acuosa saturada de NaHC03. La capa orgánica se secó sobre Na2S04, se filtró, y se concentró. Se obtuvo el compuesto del título después de la RP-HPLC de preparación (columna SunFire C18 OBD 5 milímetros, 30 x 100 milímetros, gradiente del 32 por ciento al 67 por ciento de acetonitrilo (ACN) en 15 minutos). Las fracciones se liofilizaron y se filtraron sobre un cartucho SPE PL-HC03 MP, para dar un sólido color café (39.1 miligramos, 22 por ciento de rendimiento).
UPLC RtMi4=1.10 minutos; ESIMS: 479 [(M + H)+]. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6, 394 K): d 8.40-8.30 (m, 1H), 8.10-8.00 (m, 1H), 6.75 (d, 1H), 6.35 (m, 1H), 6.15 (m, 1H), 4.75 (m, 1H), 4.00 (s, 3H), 3.85 (m, 1H), 3.75-3.00 (m, 5H), 2.65 (m, 1H), 2.00 (m, 1H), 1.65 (m, 2H), 1.44 (d, 3H).
Ejem plos 02 a Q3: Los compuestos enlistados en la Tabla 1 0 se prepararon mediante la separación cromatográfica de los diaestereómeros.
Tabla 1 0 Ejemplo P: 2-metoxi-5-{6-[(S)-1 -(1 -metil-piperidin-4-il-metil)-pirrolidin-3-iloxi]-2,3-dihidro-benzo-[1 ,4]-oxazin-4-il}-nicotinonitrilo a) (S)-4-((3-(4-(5-ciano-6-metoxi-piridin-3-il)-3,4-dih¡dro-2H-benzo-[b][1 ,4]-oxazin-6-iloxi)-pirrolidin-1 -il)-metil)-piperidin-1 -carboxilato de terbutilo Una solución del 2-metoxi-5-[6-((S)-pirrolidin-3-iloxi)-2,3-dihidro-benzo-[1 ,4]-oxazin-4-il]-nicotinonitrilo (véase análogo B1, c), 95 miligramos, 0.270 milimoles) en dicloro-etano (4.5 mililitros) se trató con 4-formil-piperidin-1 -carboxilato de terbutilo (60 miligramos, 0.281 milimoles). Después de agitar durante 2 días a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se diluyó con dicloro-metano (DCM) y una solución acuosa saturada de NaHC03. La capa orgánica se secó sobre Na2S04, se filtró, se concentró, y se obtuvo el compuesto del título después de la cromatografía por evaporación instantánea sobre gel de sílice (ciclohexano / EtOAc, de 100:0 a 0:100), rendimiento de 66 miligramos (40 por ciento) .
UPLC RtMi =1.66 minutos; ESIMS: 550 [(M+H)+]. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): d 8.35 (d, 1H), 7.75 (d, 1H), 7.35 (s, 1H), 7.85 (d, 1H), 6.35 (dd, 1H), 6.10 (d, 1H), 4.65 (m, 1H), 4.45 (m, 2H), 3.60 (m, 2H), 2.75-2.15 (m, 4H), 1.50 (s, 9H). b) (S)-2-metoxi-5-(6-(1 -(piperidin-4-il-metil)-pirrolidin-3-iloxi)-2H-benzo-[b][1,4]-oxazin-4(3H)-il)-nicotinonitrilo Una solución del (S)-4-((3-(4-(5-ciano-6-metoxi-piridin-3-il)-3,4-dihidro-2H-benzo-[b][1 ,4]-oxazin-6-iloxi)-pirrolidin-1 - il)-metil)-piperidin-1 -carboxilato de terbutilo (66 miligramos, 0.120 milimoles) en dicloro-metano (DCM) (2 mililitros) se trató con ácido trifluoro-acético (TFA) (0.093 mililitros, 1.20 milimoles). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 17 horas, entonces se apagó con una solución acuosa saturada de Na2C03 y se extrajo con dicloro-metano (DCM). La capa orgánica se secó sobre Na2S04, se filtró, y se concentró bajo presión reducida, para proporcionar el producto del título (36 miligramos, 67 por ciento de rendimiento).
UPLC RtM1 =1.03 minutos; ESIMS: 450 [(M+H)+]. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): d 8.35 (d, 1H), 7.80 (d, 1H), 7.25 (s, 1H), 6.80 (d, 1H), 6.25 (m, 1H), 6.15 (d, 1H), 4.65 (m, 1H), 4.45 (m, 2H), 3.60 (m, 2H), 2.75-2.15 (m, 4H). c) (S)-2-metoxi-5-(6-(1 -((1 -metil-piperidin^-iO-metilJ-pirrolidin-S-iloxO^H-benzo-Ibltl ,4]-oxazin-4(3H)-il)-nicotinonitrilo Una solución del (S)-2-metox¡-5-(6-(1 -(piperidin-4-il-metil)-pirrolidin-3-iloxi)-2H-benzo-[b][1 ,4]-oxazin-4(3H)-il)-nicotinonitrilo (36 miligramos, 0.080 milimoles) en dicloro-etano (2 mililitros) se trató con una solución acuosa de formaldehído al 37 por ciento (8.94 microlitros, 0.120 milimoles). La solución se agitó bajo argón a temperatura ambiente durante 15 minutos, y entonces se agregó NaBH3CN (50.9 miligramos, 0.240 milimoles). La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos, se diluyó con dicloro-metano (DCM) y una solución acuosa saturada de NaHC03. La capa orgánica se secó sobre Na2S04 y se concentró. Se obtuvo el compuesto del título después de la purificación mediante RP-HPLC de preparación (columna SunFire C18, gradiente del 15 al 50 por ciento de acetonitrilo (ACN) en 15 minutos). Las fracciones se extrajeron con dicloro-metano (DCM)/una solución acuosa saturada de NaHC03, se secaron sobre Na2S04, se concentraron, y se liofilizaron, para dar el compuesto del título (18 miligramos, 48 por ciento de rendimiento).
UPLC RtMi =1.04 minutos; ESIMS: 464 [( + H)+]. 1H RMN (400 MHz, CDCI3): d 8.35 (d, 1H), 7.85 (d, 1H), 7.45 (s, 1H), 6.75 (d, 1H), 6.35 (dd, 1H), 6.15 (d, 1H), 4.65 (m, 1H), 4.45 (m, 2H), 3.25 (m, 2H), 2.75-2.15 (m, 4H), 2.65 (s, 3H), 1.95 (m, 2H), 1.65 (m, 2H).
Ejemplo Q: {(S)-3-[4-(6-metoxi-5-metil-p¡ridin-3-il)-3,4-dihidro-2H-benzo-[1 ,4]-oxazin-6-iloxi]-pirrolidin-1 -il}-(tetrahidro-piran-4-il)-metanona a) 6-(terbutil-dimetil-silaniloxi)-4H-benzo-[1 ,4]-oxazin-3-ona Una solución de la 6-hidroxi-2H-benzo-[b][1 ,4]-oxazin-3(4H)-ona (CAS registro 53412-38-7) (1076 miligramos, 6.52 milimoles) en dimetil-formamida (DMF) (8 mililitros) se trató a temperatura ambiente con TBDMSCI (1080 miligramos, 7.17 milimoles) e imidazol (532 miligramos, 7.82 milimoles). Después de agitar durante 18 horas a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se diluyó con dicloro-metano (DCM), y se lavó con agua. La capa orgánica se secó sobre Na2S0 , se filtró, se concentró, y se obtuvo el compuesto del título después de la cromatografía por evaporación instantánea sobre gel de sílice (ciciohexano / EtOAc, de 100:0 a 50:50), como un sólido blanco (1.18 gramos, 65 por ciento de rendimiento).
UPLC RtM2=1.91 minutos; ESIMS: 280 [(M+H)+]. 1H RMN (400 MHz, CDCI3): d 7.85 (br,s 1H), 7.35 (s, 1H), 6.85 (d, 1H), 6.45 (m, 1H), 6.30 (d, 1H), 4.50 (s, 2H), 1.00 (s, 9H), 0.25 (s, 6H). b) 3,3-dideutero-3,4-dihidro-2H-benzo-[1 ,4]-oxazin-6-ol Una solución de la 6-(terbutil-dimetil-silaniloxi)-4H-benzo-[1 ,4]-oxazin-3-ona (8.34 gramos, 29.8 milimoles) en tetrahidrofurano (THF) (100 mililitros) se trató a 0°C con deuteriuro de litio y aluminio (2.26 gramos, 59.7 milimoles). Después de agitar durante 18 horas a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se agregó a una solución acuosa fría de sal de Rochelle 1 M, y se extrajo con EtOAc. La capa orgánica se secó sobre Na2S0 , se filtró, se concentró, y se obtuvo el compuesto del título después de la cromatografía por evaporación instantánea sobre gel de sílice (ciciohexano / EtOAc, de 100:0 a 0:100), como un sólido blanco (1.40 gramos, 31 por ciento de rendimiento).
UPLC RtM9 =0.69 minutos; ESIMS: 154 [(M + H)+]. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): d 8.50 (s 1H), 6.45 (d, 1H), 6.00 (d, 1H), 5.85 (m, 1H), 5.15 (s, 1H), 4.00 (s, 2H). c) Terbutil-éster del ácido (S)-3-(3,3-dideutero-3,4-dihidro-2H-benzo-[1 ,4]-oxazin-6-iloxi)-pirrolidin-1 -carboxílico Una solución seca del 3,3-dideutero-3,4-dihidro-2H-benzo-[1 ,4]-oxazin-6-ol (1.44 gramos, 9.40 milimoles), y terbutil-éster del ácido (R)-3-metan-sulfoniloxi-pirrolidin-1 -carboxílico (CAS registro 127423-61-4) (5.49 gramos, 20.68 milimoles) en dimetil-formamida (DMF) (10 mililitros) se trató con hidruro de sodio al 60 por ciento en aceite mineral (0.752 gramos, 18.80 milimoles), y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 días. La mezcla de reacción se diluyó con EtOAc, y se lavó con una solución acuosa saturada de NaHC03. La capa orgánica se secó sobre Na2S04, se filtró, se concentró, y se purificó mediante cromatografía por evaporación instantánea sobre gel de sílice (ciciohexano / EtOAc, de 100:0 a 0:100), para proporcionar 4.12 gramos (rendimiento cuantitativo) del compuesto del título.
UPLC Rt i =1.07 minutos; ESIMS: 323 [(M+H)+]. 1H RMN (400 MHz, CDCI3): d 6.65 (m, 1H), 6.15 (m, 2H), 5.35 (m, 1H), 4.85 (m, 2H), 3.50 (m, 4H), 2.15 (m, 2H), 1.50 (s, 9H). d) Terbutil-éster del ácido (S)-3-[4-(6-metoxi-5-metil-piridin-3- il)-3,3-dideutero-3,4-dihidro-2H-benzo-[1 ,4]-oxazin-6-iloxi]-pirrolidin-1 -carboxílico Este Ejemplo se preparó en analogía al Ejemplo G1, e).
UPLC RtMi =2.00 minutos; ESIMS: 444 [(M+H)+]. 1H RMN (400 MHz, CDCI3): d 7.95 (br.s, 1H), 7.45 (br.s, 1H), 6.80 (m, 1H), 6.25 (m, 1H), 4.75 (m, 1H), 4.35 (s, 2H), 4.00 (s, 3H), 3.50 (m, 4H), 2.25 (m, 2H), 1.50 (s, 9H). e) 4-(6-metoxi-5-metil-piridin-3-il)-3,3-dideutero-6-((S)-pirrolidin-3-iloxi)-3,4-dihidro-2H-benzo-[1 ,4]-oxazina Este Ejemplo se preparó en analogía al Ejemplo G1, f).
UPLC RtM1 =1.26 minutos; ESIMS: 342 [(M + H)+]. 1H RMN (400 MHz, CDCI3): d 7.95 (br.s, 1H), 7.45 (br.s, 1H), 6.80 (m, 1H), 6.25 (m, 1H), 4.75 (m, 1H), 4.35 (s, 2H), 4.00 (s, 3H), 3.15 (m, 2H), 2.75 (m, 2H), 2.25 (m, 2H). f) {(S)-3-[4-(6-metox¡-5-metil-piridin-3-il)-3,4-dihidro-2H-benzo-[1 ,4]-oxazin-6-iloxi]-pirrolidin-1 -il}-(tetrahidro-piran-4-il)-metanona Este Ejemplo se preparó en analogía al Ejemplo B1, d).
UPLC RtM1 =1.65 minutos; ESIMS: 456 [(M + H)+]. 1H RMN (400 MHz, CDCI3, 298 K): d 8.45 (m, 1H), 8.29 (s, 1H), 7.21 (t, 1H), 6.20 (t, 1H), 6.10 (s, 1H), 5.00 (d, 1H), 4.37 (t, 2H), 4.00 (m, 3H), 3.39-3.74 (m, 4H), 2.50 (m, 2H), 2.35 (s, 3H), 1.09-2.10 (m, 5H).
Ejemplo R: 5-{6-[(S)-1 -(4-hidroxi-ciclohexan-carbonil)-pirrolidin-3-iloxi]-2,3-dihidro-benzo-[1 ,4]-oxazin-4-il}-2-metoxi- nicotinonitrilo Este Ejemplo se preparó en analogía al Ejemplo J, empezando a partir del 2-metoxi-5-{6-[(S)-1-((S)-pirrolidin-3-carbonil)-pirrolidin-3-iloxi]-2,3-dihidro-benzo-[1 ,4]-oxazin-4-il}-nicotinonitrilo.
UPLC RtMi4=0.91 minutos; ESIMS: 478 [(M + H)+]. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): d 8.43 (d, 1H), 8.28 (d, 1H), 6.73 (m, 1H), 6.34 (m, 1H), 6.08 (dd, 1H), 4.76 (d, 1H), 4.51 (m, 1H), 4.22 (s, 2H), 4.00 (s, 3H), 3.20-3.71 (m, 9H), 1.09-2.10 (m, 10H). Ejemplo S: 2-metoxi-5-{6-[(S)-1 -(2-piridin-4-il-acetil)-pirrolidin-3-iloxi]-2,3-dihidro-benzo-[1 ,4]-oxazin-4-il}-nicotinonitrilo Este Ejemplo se preparó en analogía al Ejemplo J, empezando a partir del 2-metoxi-5-{6-[(S)-1 -((S)-pirrolidin-3-carbonil)-pirrolidin-3-iloxi]-2,3-dihidro-benzo-[1 ,4]-oxazin-4-il}-nicotinonitrilo.
UPLC RtMi4=0.82 minutos; ESIMS: 471 [(M + H)+] 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): d 8.45 (m, 3H), 8.29 (s, 1H), 7.21 (m, 2H), 6.74 (m, 1H), 6.33 (m, 1H), 6.10 (m, 1H), 4.87 (d, 1H), 4.22 (s, 2H), 4.00 (s, 3H), 3.39-3.74 (m, 8H), 1.09-2.10 (m, 2H).
Ejemplo T: {(S)-3-[4-(5-amino-6-metoxi-piridin-3-il)-3,4-dihidro-2H-benzo-[1 ,4]-oxazin-6-iloxi]-pirrolidin-1 -il}-(1 -metil-1 H-imidazol-4-il)-metanona a) metil-éster del ácido 5-[6-((S)-1-terbutoxi-carbonil-pirrolidin-3-iloxi)-2,3-dihidro-benzo-[1 ,4]-oxazin-4-il]-2-metoxi-nicotinico Bajo argón, se agregaron K3P04 (815 miligramos, 2.00 milimoles), y bis-(terbutil-fosfina)-paladio (29.4 miligramos. 0.06 mili-moles) a una solución del terbutil-éster del ácido (S)-3-(3,4-dihidro-2H-benzo-[1 ,4]-oxazin-6-iloxi)-pirrolidin-1 -carboxílico (preparado como se describe en el paso a) ejemplo B) (615 miligramos, 1.92 milimoles), y metil-éster del ácido 5-bromo-2-metoxi-nicotínico (IA 22, CAS registro 122433-41-4) (614 miligramos, 1.30 milimoles) en tolueno (6 mililitros). La mezcla de reacción se desgasificó con argón durante 15 minutos, y luego se agitó a 110°C durante 18 horas, se diluyó con EtOAc, y se lavó con una solución acuosa saturada de NaHC03. La capa orgánica se secó sobre MgS04 y se concentró, para proporcionar el compuesto del título crudo que se purificó mediante cromatografía por evaporación instantánea sobre gel de sílice (heptano / EtOAc, de 90:10 a 0:100), para dar una goma amarilla (474 miligramos, 51 por ciento de rendimiento).
UPLC RtM2 =1.36 minutos; ESIMS: 486 [(M+H)+]. b) Ácido 5-[6-((S)-1 -terbutoxi-carbonil-pirrolidin-3-iloxi)-2,3-dihidro-benzo-[1 ,4]-oxazin-4-il]-2-metoxi-nicotínico Una solución del metil-éster del ácido 5-[6-((S)-1 -terbutoxi-carbonil-pirrolidin-3-iloxi)-2,3-dihidro-benzo-[1 ,4]-oxazin-4-il]-2-metoxi-nicotínico (483 miligramos, 0.99 milimoles) en dioxano (5 mililitros) se trató con una solución de gránulos de hidróxido de sodio (119 miligramos, 2.98 milimoles) en agua (2 mililitros). La solución se agitó a 80°C durante 1 hora. La mezcla de reacción se acidificó hasta un pH de 3 con una solución acuosa de HCI 1N, y se extrajo con EtOAc. Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre MgS04 y se concentraron, para proporcionar el compuesto del título después de la cromatografía por evaporación instantánea sobre gel de sílice (heptano / EtOAc, de 100:0 a 0:100, entonces EtOAc/MeOH, de 90:10 a 80:20), como un sólido (370 miligramos, 79 por ciento de rendimiento).
UPLC RtM6=1-79 minutos; ESIMS: 372 [( + H-100)+] H RMN (400 MHz, CDCI3): d 8.22-8.48 (m, 2H), 6.82 (d, 1H), 6.33 (m,1H), 6.21 (d, 1H), 4.60-4.76 (m, 1H), 4.27-4.41 (m, 2H), 4.15-4.27 (m, 3H), 3.62-3.77 (m, 2H), 3.31-3.58 (m, 5H), 1.85-2.19 (m, 2H), 1.34-1.56 (m, 9H) c) Terbutil-éster del ácido (S)-3-[4-(5-terbutoxi-carbonil-amino-6-metoxi-piridin-3-il)-3,4-dihidro-2H-benzo-[1 ,4]-oxazin-6-iloxi]-pirrolidin-1 -carboxilico Una solución del ácido 5-[6-((S)-1 -terbutoxi-carbonil-pirrolidin-3-iloxi)-2,3-dihidro-benzo-[1 ,4]-oxazin-4-il]-2-metoxi-nicotínico (370 miligramos, 0.78 milimoles), y Et3N (0.28 mililitros, 1.96 milimoles) en tBuOH (5 mililitros) se trató con DPPA (CAS registro 26386-88-9) (0.17 mililitros, 0.78 milimoles), y se agitó a 100°C durante 6 horas. Se agregaron dicloro-metano (DCM) y una solución acuosa saturada de NaHC03, la capa orgánica se separó mediante elución a través de un cartucho de separación de fases, y se concentró, para proporcionar el compuesto del título después de la cromatografía por evaporación instantánea sobre gel de sílice (heptano / EtOAc, de 100:0 a 50:50), como un goma color rosado (114 miligramos, 24 por ciento).
UPLC RtM2=1.36 minutos; ESIMS: 486 [(M + H)+]. 1H RMN (400 MHz, CDCI3): d 8.42 (br s, 1H), 7.75 (d, 1H), 7.02 (s, 1H), 6.78 (d, 1H), 6.15-6.41 (m, 1H), 4.71 (br s, 1H), 4.23-4.39 (m, 2H), 4.09-4.22 (m, 3H), 3.62-3.75 (m, 2H), 3.31-3.58 (m, 4H), 1.86-2.26 (m, 2H), 1.40-1.60 (m, 18H). d) 2-metoxi-5-[6-((S)-pirrolidin-3-iloxi)-2,3-dihidro-benzo-[1 ,4]-oxazin-4-il]-piridin-3-il -amina Una solución del terbutil-éster del ácido (S)-3-[4-(5-terbutoxi-carbonil-amino-6-metoxi-piridin-3-il)-3,4-dihidro-2H-benzo-[1 ,4]-oxazin-6-iloxi]-pirrolidin-1-carboxílico (130 miligramos, 0.24 mili-moles) en dicloro-metano (DCM) (2 mililitros) se trató con ácido trifluoro-acético (TFA) (CAS registro 76-05-1), y se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. La mezcla de reacción se concentró para proporcionar el compuesto del título después de la elución a partir de un cartucho Isolute SCX-2 de 2 gramos (eluyente de MeOH, y luego NH3/MeOH 2M), como una goma amarilla (88 miligramos, cuantitativo, cruda).
UPLC RtM2=1-25 minutos; ESIMS: 343 [(M+H)+]. e) {(S)-3-[4-(5-amino-6-metoxi-piridin-3-il)-3,4-dihidro-2H-benzo-[1 ,4]-oxazin-6-iloxi]-pirrolidin-1 -il}-(1 -metil-1 H-imidazol-4- il)-metanona Una solución del ácido 1 -metil-1 H-imidazol-4-carboxílico (CAS registro 41716-18-1) (36.0 miligramos, 0.26 milimoles), y Et3N (0.11 mililitros, 0.78 milimoles) en dimetil-formamida (DMF) (1 mililitro) se trató con HBTU (CAS registro 94790-37) (107 miligramos, 0.28 milimoles). Después de agitar a temperatura ambiente durante 20 minutos, la mezcla de reacción se enfrió a 5°C, y se agregó una solución de 2-metoxi-5-[6-((S)-pirrolidin-3-iloxi)-2,3-dihidro-benzo-[1 ,4]-oxazin-4-il]-piridin-3-il-amina (88 miligramos, 0.26 milimoles) en dimetil-formamida (DMF) (3 mililitros). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora, se concentró, y el residuo se absorbió en dicloro-metano (DCM) (10 mililitros), se lavó con una solución acuosa saturada de NaHC03 (5 mililitros), la capa orgánica se separó mediante elución a través de un cartucho de separación de fases y se concentró. El residuo se purificó mediante cromatografía por evaporación instantánea sobre gel de sílice (heptano / EtOAc, de 100:0 a 0:100), las fracciones combinadas se concentraron, se disolvieron en tBuOH/H20 y se liofilizaron, para proporcionar el compuesto del título como un sólido incoloro (21 miligramos, 37 por ciento de rendimiento).
UPLC RtM2=0.85 minutos; ESIMS: 451 [(M+H)+].
H RMN (400 MHz, CD3OD): d 7.64 (s, 1H), 7.62 (s, 1H), 7.65 m, 1H), 6.93 (m, 1H), 6.70 (m, 1H), 6.20-6.34 (m, 1H), 6.15 (m, 1H), 4.81 (m, 1H), 4.19-4.31 (m, 2H), 3.90-4.05 (m, 4H), 3.55-3.83 (m, 8H), 2.04-2.28 (m, 2H).
Ejemplo U: N-(2-metoxi-5-{6-[(S)- -(1 -metil-1 H-imidazol-4-carbonil)-pirrolidin-3-iloxi]-2,3-dihidro-benzo-[1 ,4]-oxazin-4-il}-piridin-3-il)-metan-sulfonamida Una solución de la {(S)-3-[4-(5-amino-6-metoxi-piridin-3-il)-3,4-dihidro-2H-benzo-[1 ,4]-oxaziniloxi]-pirrolidin-1 -i l}-(1 -metil-1 H-imidazol-4-il)-metanona (22.9 miligramos, 0.05 milimoles) en piridina (1 mililitro) se trató con cloruro de metan-sulfonilo (CAS registro 124-63-0) (0.08 mililitros, 0.97 milimoles), y se agitó a 50°C durante 18 horas. La mezcla de reacción se diluyó con dicloro-metano (DCM) y H20, la capa orgánica se separó mediante elución a través de un cartucho de separación de fases y se concentró. El residuo se purificó mediante cromatografía por evaporación instantánea sobre gel de sílice (heptano / EtOAc, de 100:0 a 0:100, y luego EtOAc/MeOH, de 90:10 a 80:20), las fracciones combinadas se concentraron, se disolvieron en tBuOH/H20 y se liofilizaron, para proporcionar el compuesto del título como un sólido incoloro (14 miligramos, 49 por ciento).
UPLC RtM2 =1.39 minutos; ESIMS: 529 [(M + H)+]. 1H RMN (400 MHz, CD3OD): d 7.87 (d, 1H), 7.41-7.76 (m, 3H), 6.73 (m, 1H), 6.02-6.44 (m, 2H), 4.14-4.39 (m, 2H), 3.87-4.12 (m, 5H), 3.55-3.84 (m, 8H), 2.85-3.08 (m, 3H), 1.75-2.40 (m, 2H).
Ejemplo V: (1 ,1 -dioxo-hexahidro-1 lambda*6*-tiopiran-4-il)-{(S)-3-[4-(6-metoxi-5-metil-piridin-3-il)-5-metil-3,4-dihidro-2H-benzo-[1 ,4]-oxazin-6-iloxi]-pirrolidin-1 -il}-metanona a) 6-metoxi-5-metil-4H-benzo-[1 ,4]-oxazin-3-ona Una solución de la 6-bromo-5-metil-4H-benzo-[1 ,4]-oxazin-3-ona (CAS registro 1 154740-47-2) (1 ,000 miligramos, 4.1 3 milimoles) , y Cul (79 miligramos, 0.41 milimoles) en NaOMe al 30 por ciento en metanol (8.1 mililitros) se agitó a 1 30°C du rante 5 horas. La mezcla color naranja/café se enfrió a temperatura ambiente, se d iluyó con EtOAc, y se lavó con u na solución acuosa saturada de NaHC03. Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre MgS04 l y se concentraron , para proporcionar un sólido color naranja. La trituración con ciclohexano proporcionó el compuesto del título como un sólido color rosado (647 miligramos, 70 por ciento de rendimiento).
H PLC RtM i =0.73 minutos. 1 H RMN (400 M Hz, DMSO-d6) : d 1 0.21 (s, 1 H) , 6.76 (d , 1 H) , 6.53 (d , 1 H), 4.42 (s, 2H) , 3.71 (s, 3H) , 2.05 (s, 3H) . b) 6-hidroxi-5-metil-4H-benzo-[1 ,4]-oxazin-3-ona U na suspensión de la 6-metoxi-5-metil-4H-benzo-[1 ,4]-oxazin-3-ona (647 miligramos, 3.35 milimoles) en dicloro-metano (DCM) (30 mililitros) se trató bajo argón a temperatura ambiente con BBr3 (3.16 mililitros, 33.5 milimoles) , y se agitó durante 1 8 horas a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se apagó mediante la adición por goteo de metanol a 0°C hasta la obtención de una solución transparente. Después de la remoción de los solventes, el residuo se vertió sobre hielo / una solución acuosa saturada de Na HC03, y se extrajo con EtOAc. La capa orgánica se secó sobre MgS04 y se concentró, para proporcionar el compuesto del título como un sólido color café (647 miligramos, crudo), el cual se utilizó en el siguiente paso sin mayor purificación.
HPLC Rt i =0.49 minutos. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): d 10.11 (s, 1H), 6.43 (d, 1H), 5.98 (d, 1H), 4.57 (s, 2H), 1.89 (s, 3H). c) 5-metil-3,4-dih¡dro-2H-benzo-[1 ,4]-oxazin-6-ol Una solución de la 6-hidroxi-5-metil-4H-benzo-[1 ,4]-oxazin-3-ona (647 miligramos, 3.61 milimoles) en tetrahidrofurano (THF) (20 mililitros) se trató bajo argón a 0°C con BH3*THF (1M en tetrahidrofurano (THF), 10.83 mililitros, 10.83 milimoles), y se agitó durante 18 horas a temperatura ambiente. Se agregó metanol, y la solución se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora, y se concentró para proporcionar un residuo, el cual se disolvió en tetrahidrofurano (THF) (20 mililitros), se trató con BH3*THF (1M en tetrahidrofurano (THF), 10.83 mililitros, 10.83 milimoles), y se agitó a temperatura ambiente durante 18 horas. Se agregó metanol, la solución se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas, y se concentró a sequedad, para proporcionar el compuesto del título como un sólido color café (600 miligramos, crudo), el cual se utilizó en el siguiente paso sin mayor purificación.
HPLC RtMi =0.49 minutos; ESIMS: 166 [( + H)+]. d) Terbutil-éster del ácido (S)-3-(5-metil-3,4-dihidro-2H-benzo-[1 ,4]-oxazin-6-iloxi)-pirrolidin-1-carboxílico Una solución de trifenil-fosfina (1.33 gramos, 5.09 milimoles) en tetrahidrofurano (THF) (10 mililitros) se trató con azodicarboxilato de dietilo (0.8 mililitros, 5.09 milimoles), seguido por el terbutil-éster del ácido (R)-3-hidroxi-pirrolidin-1 -carboxílico (CAS registro 127423-61-4) (1 gramo, 5.45 milimoles), y 5-metil-3,4-dihidro-2H-benzo-[1 ,4]-oxazin-6-ol (600 miligramos, 3.63 milimoles). La solución color rojo/café resultante se agitó a 70°C durante 18 horas. La mezcla color café se enfrió, se diluyó con EtOAc, y se lavó con una solución acuosa saturada de NaHC03. Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre gS04, se filtraron, y se concentraron, para proporcionar un aceite color café. El producto crudo se purificó tres veces mediante cromatografía por evaporación instantánea sobre gel de sílice (ciclohexano / EtOAc, de 90:10 a 40:60), para proporcionar el compuesto del título como un aceite incoloro (130 miligramos, 11 por ciento de rendimiento) HPLC RtMi =1.09 minutos; ESIMS: 335 [(? + ?)+]· 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): d 6.44 (d, 1H), 6.22-6.04 (m, 1H), 5.24 (br s, 1H), 4.75 (br s, 1H), 4.07-3.93 (m, 2H), 3.45-3.33 (m, 3H), 3.28 (d, 7H), 2.00 (d, 2H), 1.83 (d, 3H), 1.46-1.32 (m, 9H). e) Terbutil-éster del ácido (S)-3-[4-(6-metoxi-5-metil-piridin-3-il)-5-metil-3,4-dihidro-2H-benzo-[1 ,4]-oxazin-6-iloxi]-pirrolidin-1 -carboxílico Una solución del terbutil-éster del ácido (S)-3-(5-metil-3,4-dihidro-2H-benzo-[1 , 4]-oxazin-6-iloxi)-p i rro lid i n-1 -carboxílico (120 miligramos, 0.36 milimoles), 5-bromo-2-metoxi-3-metil-piridina (CAS registro 760207-87-2) (145 miligramos, 0.72 milimoles), NaOtBu (103 miligramos, 1.08 milimoles), RuPhos (CAS registro 787618-22-8) (8 miligramos, 0.02 milimoles) y un ciclo de [RuPhos]-paladio (CAS registro 787618-22-8) (15 miligramos, 0.02 milimoles) en dioxano (2 mililitros) se agitó a 100°C durante 18 horas. La mezcla color naranja/café se enfrió, se diluyó con EtOAc, y se lavó con agua. Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre MgS04, se filtraron, y se concentraron, para proporcionar un aceite color café. El producto crudo se purificó tres veces mediante cromatografía por evaporación instantánea sobre gel de sílice (ciclohexano / EtOAc, de 95:05 a 60:40), para proporcionar el compuesto del título como un aceite amarillo (97 miligramos, 60 por ciento de rendimiento).
HPLC RtMi =1.37 minutos; ESIMS: 456 [(M + H)+]. 1H R N (400 MHz, DMSO-d6): d 7.40 (d, 1H), 7.28-7.07 (m, 1H), 6.74 (s, 2H), 4.84 (br s, 1H), 3.96 (br s, 2H), 3.80 (s, 2H), 3.57 (br s, 2H), 3.44-3.19 (m, 10H), 2.08 (s, 3H), 2.05-1.92 (m, 2H), 1.60 (d, 3H), 1.34 (d, 9H). f) (1,1-dioxo-hexahidro-1lambda*6*-tiopiran-4-il)-{(S)-3-[4-(6-metoxi-5-metil-piridin-3-il)-5-metil-3,4-dihidro-2H-benzo-[1 ,4]-oxazin-6-iloxi]-pirrolidin-1 -il}-metanona Una solución del terbutil-éster del ácido (S)-3-[4-(6-metox¡-5-metil-piridin-3-il)-5-metil-3,4-dihidro-2H-benzo-[1 ,4]-oxazin-6-iloxi]-pirrolidin-1-carboxílico (97 miligramos, 0.21 milimoles) en dicloro-metano (DCM) (3 mililitros) se trató bajo argón a temperatura ambiente con ácido trifluoro-acético (TFA) (0.16 mililitros, 2.13 milimoles), y se agitó durante 6 horas. La mezcla de reacción se apagó con una solución acuosa saturada de NaHC03, y la solución orgánica se separó a través de un cartucho de separación de fases, proporcionando una solución amarilla. A la solución amarilla se le agregaron ácido 1 , 1 -dioxo-hexahidro-1 lambda*6*-tiopiran-4-carboxílico (CAS registro 64096-87-3) (49 miligramos, 0.28 milimoles), Et3N (0.09 mililitros, 0.64 milimoles), EDC (62 miligramos, 0.32 milimoles), y HOBT (49 miligramos, 0.32 milimoles), y se agitó a temperatura ambiente durante 18 horas. La mezcla de reacción se apagó con una solución acuosa saturada de NaHC03, y la capa orgánica se separó pasándola a través de un cartucho de separación de fases, entonces se concentró y se purificó mediante RP-HPLC de preparación (columna SunFire C18 OBD 5 milímetros, 30 x 100 milímetros, Solvente A: H20 (ácido trifluoro-acético (TFA) al 0.1 por ciento) Solvente B: CH3CN (ácido trifluoro-acético (TFA) al 0.1 por ciento)), para proporcionar el compuesto del título como un sólido blanco (76 miligramos, 70 por ciento de rendimiento).
HPLC RtMi =0.98 minutos; ESIMS: 516 [(M + H)+]. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6, 375K): d 7.44 (br s, 1H), 7.18 (br s, 1H), 6.75 (s, 2H), 4.88 (br s, 1 H), 4.02 (t, 2H), 3.86 (s, 3H), 3.81-3.33 (m, 6H), 3.24-3.06 (m, 4H), 2.83 (br s, 1H), 1.66 (s, 3H). Rotámeros.
Ejemplo W: {(S)-3-[4-(6-metan-sulfonil-5-metil-piridin-3-il)-5-metil-3,4-dihidro-2H-benzo-[1 ,4]-oxazin-6-iloxi]-pirrolidin-1 -il}-(tetrahidro-piran-4-il)-metanona a) 6-bromo-5-metil-3,4-dihidro-2H-benzo-[1 ,4]-oxazina Una solución de la 6-bromo-5-metil-4H-benzo-[1 ,4]-oxazin-3-ona (CAS registro 1154740-47-2) (425 miligramos, 1.56 milimoles) en tetrahidrofurano (THF) (9 mililitros) se trató bajo argón a 0°C con BH3*THF (1 en tetrahidrofurano (THF), 4.7 mililitros, 4.69 milimoles), y se agitó durante 18 horas a temperatura ambiente. Se agregó BH3.THF 1M (2 mililitros), y se continuó la agitación durante otras 24 horas. La mezcla de reacción se concentró y se purificó mediante cromatografía por evaporación instantánea sobre gel de sílice (ciclohexano / EtOAc, de 100:0 a 80:20), para proporcionar el compuesto del título como un sólido color naranja (324 miligramos, 86 por ciento de rendimiento).
HPLC RtMi =1.04 minutos; ESIMS: 228, 230 [(M + H)+]. 1H RMN (400 Hz, DMSO-d6): d 6.68 (d, 1H), 6.48 (d, 1H), 5.54 (br s, 1H), 4.04 (t, 2H), 3.36-3.26 (m, 2H), 2.11(s, 3H). b) 6-bromo-4-(6-metan-sulfonil-5-metil-pirid¡n-3-il)-5-metil-3,4-dihidro-2H-benzo-[1 ,4]-oxazina Una solución de la 6-bromo-5-metil-3,4-dihidro-2H-benzo-[1 ,4]-oxazina (324 miligramos, 1.42 milimoles), el intermediario IA1 (391 miligramos, 1.56 milimoles), Cs2C03 (1018 miligramos, 3.13 mili-moles), BINAP (CAS registro 98327-87-8) (44 miligramos, 0.07 milimoles), y Pd(OAc)2 (CAS registro 3375-31-3) (32 miligramos, 0.14 milimoles) en tolueno (13 mililitros), se agitó a 100°C durante 18 horas. Se volvieron a cargar el catalizador y el ligando, y se continuó la agitación durante otras 24 horas a 100°C, la mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente, se diluyó con EtOAc, y se lavó con agua. La concentración de la capa orgánica y la purificación mediante cromatografía por evaporación instantánea sobre gel de sílice (ciclohexano / EtOAc, de 97:03 a 40:60) proporcionaron el compuesto del título como un sólido color naranja (345 miligramos, 58 por ciento de rendimiento).
HPLC RtM1 =1.13 minutos; ESIMS: 397,399 [(M + H)+]. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): d 7.99 (br. s, 1H), 7.37 (d, 1H), 7.24 (br. s, 1H), 6.83 (d, 1H), 4.13 (t, 2H), 3.97-3.86 (m, 2H), 3.30 (s, 3H), 2.52 (s, 3H), 1.93 (s, 3H). c) Bencil-[4-(6-metan-sulfonil-5-metil-piridin-3-il)-5-metil-3,4-dihidro-2H-benzo-[1 ,4]-oxazin-6-il]-amina Una solución de la 6-bromo-4-(6-metan-sulfonil-5-metil-piridin-3-il)-5-metil-3,4-dihidro-2H-benzo-[1 ,4]-oxazina (324 miligramos, 0.82 milimoles), bencil-amina (350 miligramos, 3.26 milimoles), NaOtBu (157 miligramos, 1.63 milimoles), RuPhos (CAS registro 787618-22-8) (30 miligramos, 0.06 milimoles), y el ciclo de [BrettPhos]-paladio (CAS registro 1148148-01-9) (52 miligramos, 0.06 milimoles) en dioxano (16 mililitros), se agitó a 80°C durante 0.5 horas. La filtración, la concentración del filtrado, y la purificación mediante cromatografía por evaporación instantánea sobre gel de sílice (ciclohexano / EtOAc, de 88:12 a 35:65), proporcionaron el compuesto del título como un aceite amarillo (228 miligramos, 66 por ciento de rendimiento).
HPLC RtM1 =1.13 minutos; ESIMS: 424 [( + H)+].
H RMN (400 MHz, DMSO-d6): d 7.94 (br s, 1H), 7.40-7.33 (m, 2H), 7.30 (t, 2H), 7.19 (t, 2H), 6.58 (d, 1H), 6.30 (d, 1H), 5.25 (t, 1H), 4.30 (d, 2H), 4.04-3.97 (m, 2H), 3.90 (d, 2H), 3.29 (S, 3H), 2.51 (br s, 3H), 1.76 (s, 3H). d) 4-(6-metan-sulfonil-5-metil-piridin-3-il)-5-metil-3,4-dihidro-2H-benzo-[1 ,4]-oxazin-6-il -amina Una solución de la bencil-[4-(6-metan-sulfonil-5-metil-piridin-3-il)-5-metil-3,4-dihidro-2H-benzo-[1 ,4]-oxazin-6-il]-amina (228 miligramos, 0.53 milimoles), ácido acético (0.21 mililitros, 3.70 milimoles), y Pd/C en metanol (MeOH)/tetrahidrofurano (THF) (2.5/2.5 mililitros) se hidrogenó con H2 a temperatura ambiente durante 65 horas. La filtración y concentración del filtrado proporcionó el compuesto del título como un aceite color verde (200 miligramos, crudo, incluyendo el AcOH restante).
HPLC RtMi =0.64 minutos; ESIMS: 334 [( + H)+]. 1H R N (400 MHz, DMSO-d6): d 7.96 (br s, 1H), 7.17 (br s, 1H), 6.62-6.54 (d, 1H), 6.54-6.45(d, 1H), 4.48 (br s, 2H), 4.01 (t, 2H), 3.88 (br s, 2H), 3.28 (s, 3H), 1.88 (d, 3H), 1.63 (s, 3H). e) 4-(6-metan-sulfonil-5-metil-piridin-3-il)-5-metil-3,4-dihidro-2H-benzo-[1 ,4]-oxazin-6-ol Una solución de la 4-(6-metan-sulfonil-5-metil-piridin-3-il)-5-metil-3,4-dihidro-2H-benzo-[1 ,4]-oxazin-6-il-amina (200 miligramos, 0.60 milimoles) en agua (3.5 mililitros) y H2S04 (0.32 mililitros) se agregó por goteo a una solución de nitrito de sodio (49.7 miligramos, 0.72 milimoles) en agua (10 mililitros) a 0°C. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 3 días. La mezcla de reacción se filtró, y el filtrado se apagó con una solución acuosa saturada de NaHC03 y se extrajo con EtOAc. La capa orgánica se secó sobre MgS04, se filtró, y se concentró, para proporcionar un aceite color café. La purificación mediante cromatografía por evaporación instantánea sobre gel de sílice (dicloro-metano (DCM) / metanol, de 88:12 a 80:20) proporcionó el compuesto del título como un aceite color café (50 miligramos, 25 por ciento de rendimiento).
HPLC RtMi =0.78 minutos; ESIMS: 335 [( + H)+]. f) (1,1-dioxo-hexahidro-1lambda*6*-tiopiran-4-il)-{(S)-3-[4-(6-metoxi-5-metil-piridin-3-il)-5-metil-3,4-dihidro-2H-benzo-[1 ,4]-oxazin-6-iloxi]-pirrolidin-1 -il}-metanona Una solución de trifenil-fosfina (55 miligramos, 0.21 milimoles) en tetrahidrofurano (THF) (2.5 mililitros) se trató con azodicarboxilato de dietilo (0.03 mililitros, 0.21 milimoles), seguido por el terbutil-éster del ácido (R)-3-hidroxi-pirrolidin-1 -carboxílico (CAS registro 127423-61-4) (33 miligramos, 0.18 milimoles), y 4-(6-metan-sulfonil-5-metil-piridin-3-il)-5-metil-3,4-dihidro-2H-benzo-[1 ,4]-oxazin-6-ol (50 miligramos, 0.15 milimoles). La solución color rojo/café resultante se agitó a 70°C durante 18 horas. La mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente, se diluyó con EtOAc, y se lavó con una solución acuosa saturada de NaHC03. La capa orgánica se secó sobre MgS04. Se concentró y se purificó mediante cromatografía por evaporación instantánea sobre gel de sílice (ciclohexano / EtOAc, de 90:10 a 40:60), para proporcionar el compuesto del título como un sólido color naranja (44 miligramos, 58 por ciento de rendimiento).
HPLC RtMi =1.16 minutos; ESIMS: 504 [(M + H)+]. g) {(S)-3-[4-(6-metan-sulfonil-5-metil-piridin-3-il)-5-meti 1-3,4-dihidro-2H-benzo-[1 ,4]-oxazin-6-iloxi]-pirrolidin-1 -il}-(tetrahidro-piran-4-il)-metanona Una solución de la (1 , 1 -dioxo-hexahidro-1 lambda*6*-tiopiran-4-il)-{(S)-3-[4-(6-metoxi-5-metil-piridin-3-il)-5-metil-3,4-dihidro-2H-benzo-[1,4]-oxazin-6-iloxi]-pirrolidin-1-il}-metanona (44 miligramos, 0.09 milimoles) en dicloro-metano (DCM) (4 mililitros) se trató bajo argón a temperatura ambiente con ácido trifluoro-acético (TFA) (0.07 mililitros, 0.17 milimoles), y se agitó durante 18 horas. La mezcla de reacción se apagó con una solución acuosa saturada de NaHC03, y la solución orgánica se separó a través de un cartucho de separación de fases, se concentró, y se purificó mediante cromatografía por evaporación instantánea sobre gel de sílice (dicloro-metano (DCM) / metanol, de 100:0 a 90:10). El producto obtenido se disolvió en dicloro-metano (DCM) (4 mililitros), y se agregó Et3N. A la mezcla de reacción se le agregó cloruro de tetrahidro-piran-4-carbonilo (CAS registro 40191-32-0) (15 miligramos, 0.10 milimoles), a 0°C, y la solución color naranja resultante se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas. La mezcla de reacción se apagó con una solución acuosa saturada de NaHC03, y la capa orgánica se separó mediante elución a través de un cartucho de separación de fases, se concentró, y se purificó mediante SFC (columna NH2 (250 x 30 milímetros (longitud x anchura), 60A, 5 mieras, Princeton, gradiente de metanol en C02 súper-crítico), para proporcionar el compuesto del título como un aceite amarillo (15 miligramos, 32 por ciento de rendimiento).
HPLC RtM1 =0.88 minutos; ESIMS: 516 [(M + H)+j. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6, 375K): d 7.98 (br s, 1 H), 7.19 (br s, 1 H), 6.92 - 6.85 (m, 1 H), 6.85 - 6.77 (m, 1 H), 4.95 (br s, 1 H), 4.12 (t, 2 H), 3.92 (t, 2 H), 3.88 (br s, 2 H), 3.61 (br s, 3 H), 3.38 (td, 2 H), 3.27 (s, 3 H), 2.68 (d, 1 H), 2.56 (s, 3 H), 2.17 (br s, 2 H), 1.73 (s, 3 H), 1.58 (br s, 4 H). Rotámeros.
Ejemplo X: {(S)-3-[4-(5-difluoro-metil-6-metoxi-p¡ridin-3-il)-5- metil-3,4-dihidro-2H-benzo-[1 ,4]-oxazin-6-iloxi]-pirrolidin-1 -il}- (1 ,1-dioxo-hexahidro-1 lambda*6*-tiopiran-4-il)-metanona 6-bromo-5-metil-3,4-dihidro-2H-benzo-[ ,4]-oxazina Una solución de la 6-bromo-5-metil-4H-benzo-[1 ,4]-oxazin- ona (CAS registro 1154740-47-2) (2.8 gramos, 11.56 milimoles) en tetrahidrofurano (THF) (50 mililitros) se trató bajo argón con BH3*THF (1M en tetrahidrofurano (THF), 34.7 mililitros, 34.70 milimoles), y se calentó bajo reflujo durante 2 horas. Se agregó metanol, y la solución se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora, se concentró, y se purificó mediante cromatografía por evaporación instantánea sobre gel de sílice (ciciohexano / EtOAc, de 100:0 a 80:20), para proporcionar el compuesto del título como un sólido color naranja (1.8 gramos, 68 por ciento de rendimiento).
HPLC RtMi =1-04 minutos; ESIMS: 228, 230 [(M + H)+]. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): d 6.68 (d, 1H), 6.48 (d, 1H), 5.54 (br s, 1H), 4.04 (t, 2H), 3.36-3.26 (m, 2H), 2.11 (s, 3H). b) 6-bromo-4-(5-difluoro-metil-6-metoxi-piridin-3-il)-5-metil-3,4-dihidro-2H-benzo-[1 ,4] -oxazina Una solución de la 6-bromo-5-metil-3,4-dihidro-2H-benzo-[1 ,4]-oxazina (500 miligramos, 2.19 milimoles), el intermediario IA6 (574 miligramos, 2.41 milimoles), NaOtBu (421 miligramos, 4.38 mili-moles), BrettPhos (CAS registro 1070663-78-3) (59 miligramos, 0.11 milimoles), y un ciclo de [BrettPhosj-paladio (CAS registro 1148148-01-9) (88 miligramos, 0.11 milimoles) en dioxano (11 mililitros), se agitó a 100°C durante 18 horas. Se volvieron a cargar el catalizador y el ligando, y se continuó la agitación a 100°C durante 48 horas. La mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente, se diluyó con EtOAc, y se lavó con una solución acuosa saturada de NaHC03. La capa orgánica se secó sobre MgS04, y se concentró, para proporcionar un aceite color café. La purificación mediante cromatografía por evaporación instantánea sobre gel de sílice (ciclohexano / EtOAc, de 100:0 a 80:20) proporcionó el compuesto del título como un aceite color café (150 miligramos, 18 por ciento de rendimiento).
HPLC RtMi =1.34 minutos; ESIMS: 385, 387 [(M + H)+]. c) 4-(5-difluoro-metil-6-metoxi-piridin-3-il)-5-metil-3,4-dihidro-2H-benzo-[1 ,4]-oxazin-6-ol Una mezcla de la 6-bromo-4-(5-difluoro-metil-6-metoxi-piridin-3-il)-5-metil-3,4-dihidro-2H-benzo-[1 ,4]-oxazina (150 miligramos, 0.39 milimoles), KOH (65 miligramos, 1.17 milimoles) en agua (0.33 mililitros), tetrametil-terbutil-XPhos (CAS registro 857356-94-6) (18.72 miligramos, 0.04 milimoles), y Pd2(dba)3 (17.83 miligramos, 0.02 milimoles) en dioxano (2 mililitros), se desgasificó con nitrógeno y se calentó a 100°C durante 18 horas. La filtración, la concentración, y la purificación mediante cromatografía por evaporación instantánea sobre gel de sílice (ciclohexano / EtOAc, de 100:0 a 70:30), proporcionaron el compuesto del título como un aceite color naranja (65 miligramos, 52 por ciento de rendimiento).
HPLC RtMi =1.01 minutos; ESIMS: 323 [(M+H)+]. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): d 8.83 (s, 1H), 7.89 (d, 1H), 7.36 (d, 1H), 7.00 (t, 1H), 6.61 (d, 1H), 6.55 (d, 1H), 3.93 (t, 2H), 3.88 (s, 3H), 3.65 (t, 2H), 1.60 (s, 3H). d) Terbutil-éster del ácido (S)-3-[4-(5-difluoro-metil-6-metox¡-piridin-3-il)-5-metil-3,4-dihidro-2H-benzo-[1 ,4]-oxazin-6-iloxi]- pi r rol i din -1 -car boxíl i colina solución de trifenil-fosfina (74 miligramos, 0.28 milimoles) en tetrahidrofurano (THF) (2 mililitros) se trató con azodicarboxilato de dietilo (0.04 mililitros, 0.28 milimoles), seguido por el terbutil-éster del ácido (R)-3-hidroxi-pirrolidin-1 -carboxílico (CAS registro 127423-61-4) (45 miligramos, 0.24 milimoles), y 4-(5-difluoro-metil-6-metoxi-piridin-3-il)-5-metil-3,4-dihidro-2H-benzo-[1 ,4]-oxazin-6-ol (65 miligramos, 0.20 milimoles). La solución color rojo/café resultante se agitó a 70°C durante 18 horas, se enfrió a temperatura ambiente, se diluyó con EtOAc, y se lavó con una solución acuosa saturada de NaHC03. La capa orgánica se secó sobre MgS04, se concentró, y se purificó mediante cromatografía por evaporación instantánea sobre gel de sílice (ciclohexano / EtOAc, de 100:0 a 70:30), para proporcionar el compuesto del título como un sólido amarillo (51 miligramos, 42 por ciento de rendimiento).
HPLC RtMi =1.36 minutos; ESIMS: 492 [(M + H)+].
H RMN (400 MHz, DMSO-d6): d 7.92-7.75 (m, 1H), 7.46-7.33 (m, 1H), 7.19-6.84 (t, 1H), 6.77 (s, 2H), 4.86 (br s, 1H), 3.98 (br s, 2H), 3.88 (s, 3H), 3.73-3.55 (m, 2H), 3.46-3.33 (m, 2H), 2.12-1.95 (m, 2H), 1.65-1.55 (m, 3H), 1.34 (br s, 9H). Rotámeros. e) {(S)-3-t4-(5-difluoro-metil-6-metoxi-piridin-3-il)-5-metil-3,4-dihidro-2H-benzo-[1 ,4]-oxazin-6-iloxi]-pirrolidin-1 -il}-(1 ,1 -dioxo-hexahidro-1 lambda*6*-tiopiran-4-il)-metanona Una solución del terbutil-éster del ácido (S)-3-[4-(5-difluoro-metil-6-metoxi-piridin-3-il)-5-metil-3,4-dihidro-2H-benzo-[1 ,4]-oxazin- 6-iloxi]-pirrolidin-1 -carboxílico (51 miligramos, 0.10 milimoles) en dicloro-metano (DCM) (3 mililitros) se trató bajo argón a temperatura ambiente con ácido trifluoro-acético (TFA) (0.08 mililitros, 1.10 milimoles), y se agitó durante 18 horas. La mezcla de reacción se apagó con una solución acuosa saturada de NaHC03, y la solución orgánica se separó a través de una separación de fases, proporcionando una solución amarilla. Se agregaron ácido 1,1-dioxo-hexahidro-1 lambda*6*-tiopiran-4-carboxílico (CAS registro 64096-87-3) (25 miligramos, 0.14 milimoles), Et3N (0.05 mililitros, 0.33 milimoles), EDC (31 miligramos, 0.16 milimoles), y HOBT (25 miligramos, 0.16 milimoles), y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas. La mezcla de reacción se apagó con una solución acuosa saturada de NaHC03. La capa orgánica se separó mediante elución a través de un cartucho de separación de fases, el producto crudo se purificó sobre SFC (columna Reprosil NH2 (250 x 30 milímetros (longitud x anchura), 60A, 5 mieras, Princeton, gradiente de metanol en C02 súper-crítico), para proporcionar el compuesto del título como un aceite amarillo (19 miligramos, 30 por ciento de rendimiento).
HPLC RtM1 =1.00 minutos; ESIMS: 552 [(M+H)+]. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6, 375K): d 7.85 (br s, 1 H), 7.43 (br s, 1H), 6.96 (t, 1H), 6.80 (s, 2H), 5.11-4.71 (m, 1H), 4.04 (t, 2 H), 3.94 (s, 3H), 3.70 (d, 2 H), 3.63 (br s, 2 H), 3.52 (br s, 2 H), 3.23-3.04 (m, 4H), 2.92-2.73 (m, 1H), 2.16 (br s, 2 H), 2.06 (br s, 4H), 1.67 (s, 3 H), Rotámeros.
Ejemplo Y: 2-metoxi-5-{6-[(S)-1 -(tetra hidro-pi ra ?-4-carbonil)-pirrolidin-3-il-amino]-2,3-dihidro-benzo-[1 ,4]-oxazin-4-il}-nicotinonitrilo a) 5-yodo-2-metoxi-nicotinonitrilo Una mezcla del 2-metoxi-nicotinonitrilo (CAS registro 7254-34- (10 gramos, 74.6 milimoles), y N-yodo-succinimida (CAS registro 516-12-1) (25.2 gramos, 112 milimoles) se trató con ácido trifluoro-acético (TFA) (CAS registro 76-05-1) (68.9 mililitros, 895 milimoles), y anhídrido trifluoro-acético (CAS registro 407-25-0) (31.6 mililitros, 224 milimoles), y la mezcla de reacción se calentó a 90°C durante 18 horas; entonces se enfrió a temperatura ambiente, y se vertió en hielo. La mezcla se basificó lentamente utilizando una solución acuosa de NaOH al 30 por ciento, se diluyó con agua, y se extrajo con EtOAc. La capa orgánica se lavó sucesivamente con una solución acuosa de tiosulfato de sodio al 20 por ciento, y una solución acuosa saturada de NaHC03, se secó sobre Na2S04, se filtró, y se concentró. Se obtuvo el compuesto del título después de la cromatografía por evaporación instantánea sobre gel de sílice (ciclohexano / EtOAc, de 100:0 a 20:80), como un sólido (12.2 gramos, rendimiento del 63 por ciento).
UPLC RtMi4=1 30 minutos; ESI S: 261 [(M + H)+]. 1H RMN (400 Hz, CDCI3): d 8.54 (d, 1H), 8.11 (d, 1H), 4.06 (s, 3H). b) 5-(6-bromo-2,3-dihidro-benzo-[1 ,4]-oxazin-4-M)-2-metoxi-nicotinonitrilo Una mezcla de la 6-bromo-3,4-dihidro-2H-benzo-[1 ,4]-oxazina (CAS registro 105655-01-4) (5.0 gramos, 23.36 milimoles), 5-yodo-2-metoxi-nicotinonitrilo (12.2 gramos, 46.7 milimoles), y NaOtBu (2.69 gramos, 28.0 milimoles) en tolueno (50 mililitros), se desgasificó con argón durante 10 minutos, y entonces se agregó bis-(tri-terbutil-fosfina)-paladio(O) (0.36 gramos, 0.70 milimoles). La mezcla de reacción se agitó a 110°C durante 18 horas bajo argón. Después de enfriarse a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se filtró a través de Celite, se enjuagó con EtOAc, y los filtrados se lavaron con una solución acuosa saturada de NaHC03. La capa orgánica se secó sobre Na2S04, se filtró, se concentró, y se purificó mediante cromatografía por evaporación instantánea sobre gel de sílice (ciclohexano / EtOAc, de 100:0 a 50:50), para proporcionar el compuesto del título (4.2 gramos, 52 por ciento de rendimiento).
UPLC RtM14=1.55 minutos; ESIMS: 348 [(M + H)+]. 1H RMN (400 MHz, CDCI3): d 8.31 (d, 1H), 7.80 (d, 1H), 6.89 (dd, 1H), 6.78 (d, 1H), 6.67 (d, 1H), 4.30-4.35 (m, 2H), 4.10 (s, 3H), 3.61-3.66 (m, 2H). c) Terbutil-éster del ácido (S)-3-[4-(5-ciano-6-metoxi-piridin-3-il)-3,4-dihidro-2H-benzo-[1 ,4]-oxazin-6-il-amino]-pirrolidin-1 -carboxílico Una mezcla del 5-(6-bromo-2,3-dihidro-benzo-[1 ,4]-oxazin-4-il)-2-metoxi-nicotinonitrilo (300 miligramos, 0.87 milimoles), terbutil-éster del ácido (S)-3-amino-pirrolidin-1-carboxílico (CAS registro 147081-44-5) (0.26 mililitros, 1.47 milimoles), 2-(diciclohexil-fosfino)-bifenilo (CAS registro 247940-06-3) (18.2 miligramos, 0.05 milimoles), y NaOtBu (100 miligramos, 1.04 milimoles) en tolueno (10 mililitros), se desgasificó con argón durante 10 minutos, y entonces se agregó Pd2(dba)3 (23.8 miligramos, 0.03 milimoles). La mezcla de reacción se agitó a 110°C durante 1 hora bajo argón. Después de enfriarse a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se filtró a través de Celite, se enjuagó con EtOAc, y los filtrados se concentraron. Se obtuvo el compuesto del título después de la cromatografía por evaporación instantánea sobre gel de sílice (ciclohexano / EtOAc, de 100:0 a 70:30) como una espuma amarilla (150 miligramos, 37 por ciento de rendimiento).
UPLC Rt MU = 2.73 minutos; ESIMS: 452 [(M + H)+]. 1H RMN (400 MHz, CD3OD): d 8.36 (d, 1H), 8.04 (d, 1H), 6.68 (s, 1H), 6.19 (dd, 1H), 6.03 (s, 1H), 4.19-4.24 (m, 2H), 4.06 (s, 3H), 3.81-3.89 (m, 1H), 3.62-3.68 (m, 2H), 3.48-3.56 (m, 1H), 3.35-3.48 (m, 2H), 3.08-3.18 (m, 1H), 2.05-2.18 (m, 1H), 1.75-1.87 (m, 1H), 1.46 (s, 9H). d) 2-metox¡-5-[6-((S)-pirrolidin-3-il-amino)-2,3-d¡hidro-benzo-[1 ,4]-oxazin-4-il]-nicotinonitrilo Una solución del terbutil-éster del ácido (S)-3-[4-(5-ciano-6-metoxi-piridin-3-il)-3,4-dihidro-2H-benzo-[1 ,4]-oxazin-6-il-amino]-pirrolidin-1 -carboxílico (144 miligramos, 0.32 milimoles) en CH2CI2 (4 mililitros) se trató con ácido trifluoro-acético (TFA) (0.49 mililitros, 6.38 milimoles). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas, se apagó con una solución acuosa saturada de NaHC03, y se extrajo con dicloro-metano (DCM). La capa orgánica se secó sobre Na2S04, se filtró, y se concentró bajo presión reducida, para proporcionar el producto del título como una espuma amarilla (120 miligramos, 100 por ciento de rendimiento).
UPLC Rt MI i = 2.06 minutos; ESIMS: 352 [(M + H)+]. 1H RMN (400 MHz, CD3OD): d 8.36 (d, 1H), 8.04 (d, 1H), 6.69 (d, 1H), 6.17 (dd, 1H), 6.00 (d, 1H), 4.19-4.26 (m, 2H), 4.06 (s, 3H), 3.80-3.90 (m, 1H), 3.62-3.69 (m, 2H), 3.10-3.20 (m, 2H), 2.98-3.09 (m, 1H), 2.82-2.90 (m, 1H), 2.06-2.18 (m, 1H), 1.70-1.81 (m, 1H). e) 2-metoxi-5-{6-[(S)-1 -(tetrahidro-piran-4-carbonil)-pirrolidin-3-il-amino]-2,3-dihidro-benzo-[1 ,4]-oxazin-4-M}-nicotinonitrilo A 0°C, una solución del 2-metoxi-5-[6-((S)-pirrolidin-3-il-amino)-2,3-dihidro-benzo-[1 ,4]-oxazin-4-il]-nicotinonitrilo (27 miligramos, 0.08 milimoles) en CH2CI2 (1 mililitro) se trató con Et3N (0.02 mililitros, 0.12 milimoles), y cloruro de tetrahidro-piran-4-carbonilo (CAS registro 40191-32-0) (11 microlitros, 0.09 milimoles). La mezcla de reacción se agitó a 0°C durante 1 hora, entonces se apagó con una solución acuosa saturada de NaHC03, y se extrajo con dicloro-metano (DCM). La capa orgánica se secó sobre Na2S04, se filtró, y se concentró, y se obtuvo el compuesto del título después de la RP-HPLC de preparación (columna Sunfire Prep C18 OBD 30 x 100 milímetros, 5 mieras; solvente A: H20 + ácido trifluoro-acético (TFA) al 0.1 por ciento por volumen; solvente B: CH3CN + ácido trifluoro-acético (TFA) al 0.1 por ciento por volumen, gradiente del 5 al 60 por ciento de B en 20 minutos), y de la filtración sobre un cartucho SPE Agilent PL-HC03 MP como un sólido amarillo (9 miligramos, 25 por ciento de rendimiento).
UPLC RtM2= 1.19 minutos; ESIMS: 464 [( + H)+]. 1H RMN (400 Hz, CD3OD): d 8.36 (d, 1H), 8.05 (m, 1H), 6.69 (dd, 1H), 6.15-6.23 (m, 1H), 5.97-6.07 (m, 1H), 4.15-4.29 (m, 2H), 4.06 (s, 3H), 3.82-4.03 (m, 3H), 3.35-3.80 (m, 8H), 2.65-2.84 (m, 1H), 2.03-2.28 (m, 1H), 1.49-2.03 (m, Condiciones de acoplamiento Aminaciones o hidroxilaciones de Buchwald B) Condiciones de formación de enlace de amida C) Condiciones de introducción de cadena lateral CC1 ) Uti lizando mesi lato A temperatura ambiente, una solución seca del intermediario de piridin-2-ol (1 equivalente), y el intermediario de mesilato (de 1 .1 a 2 equivalentes) en dimetil-formamida (DM F) (0.1 7 M) , se trató con NaH en aceite mineral (de 2 a 3 equivalentes), y la mezcla de reacción se agitó a 20-80°C durante 4 a 72 horas.
CC2) Uti lizando mesi lato A temperatura ambiente, una solución seca del intermediario de aril-6-ol (1 equ ivalente) , y el intermediario de mesilato (1 .1 -2 equivalentes) en dimetil-formamida (DM F) (0.1 7M), se trató con NaH en aceite mineral (de 2 a 3 equivalentes) , y la mezcla de reacción se agitó a 50-80°C durante 4 a 72 horas.
CC3) Utilizando mesi lato A temperatura ambiente, una solución seca del intermediario de aril-6-ol (1 equivalente), y el intermediario de mesilato (2.5 equivalentes) en dimetil-formamida (DMF) (0.06M), se trató con K2C03 (4 equivalentes), y la mezcla de reacción se agitó de 85°C a 100°C durante 4 a 50 horas.
CC4) Utilizando Mitsunobu A temperatura ambiente, se agregaron DEAD (1.4 equivalentes), terbutil-éster del ácido (R)-3-hidroxi-pirrolidin-1 - carboxílico (1.5 equivalentes), y el intermediario de aril-6-ol (1 equivalente) a una solución de trifenil-fosfina (1.4 equivalentes) en tetrahidrofurano (THF) (0.30M) . La solución color rojo/café se agitó a 70°C durante 18 horas.
Condiciones para la cromatografía separación quiral Preparación de intermediarios IA) Bromuros aromáticos Intermediario IA1 : 5-bromo-2-metan-sulfonil-3-metil-pi ridina Una solución de 5-bromo-2-metil-sulfanil-3-metil-piridina (9.04 gramos, 41 .4 milimoles) en dicloro-metano (DCM) (83 mililitros) se trató a 0°C con mCPBA (21 .46 gramos, 1 24 milimoles) . Después de agitar durante 18 horas a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se agregó a una solución acuosa de NaO H 2 N, y se extrajo con dicloro-metano (DCM). La capa orgánica se secó sobre Na2S0 , se concentró, y se obtuvo el compuesto del título después de la trituración con ciciohexano, para proporcionar un sólido blanco (9.25 gramos, 89 por ciento de rendimiento).
UPLC RtM1 =0.81 minutos; MS (ESI, m/z): 250.1 [(M + H+] 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): d 8.68 (d, 1H), 8.30 (d, 1H), 3.37 (s, 3H), 2.58 (s, 3H).
Intermediario IA2: 5-brom ?-3-fl u oro2-metan -s ulfon i I -piridina Una solución de la 5-bromo-3-fluoro-2-metil-sulfanil-piridina (222 miligramos, 1.0 milimoles) en dicloro-metano (DCM) (5 mililitros) se trató a 0°C con mCPBA (518 miligramos, 3.0 milimoles). Después de agitar durante 1.5 horas a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se agregó a una solución acuosa de NaOH 2N, y se extrajo con dicloro-metano (DCM). La capa orgánica se secó sobre Na2S04, se concentró, y se obtuvo el compuesto del título como un sólido blanco (241 miligramos, 95 por ciento de rendimiento), el cual se utilizó sin mayor purificación.
UPLC Rt i =0.63 minutos; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): d 8.75 (d, 1H), 8.60 (d, 1H), 3.40 (s, 3H).
Intermediario IA3: 5-bromo-2-metan-sulfonil-3-trifluoro-metil-piridina Una solución de la 5-bromo-2-metil-sulfanil-3-trifluoro-metil-piridina (1.40 gramos, 1.16 milimoles) en dicloro-metano (DCM) (30 mililitros) se trató a 0°C con mCPBA (2.67 gramos, 15.48 milimoles).
Después de agitar durante 18 horas a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se agregó a una solución acuosa de NaOH 4N, y se extrajo con dicloro-metano (DCM). La capa orgánica se secó sobre Na2S04, se filtró, se concentró, y se obtuvo el compuesto del título después de la cromatografía por evaporación instantánea sobre gel de sílice (hexano / EtOAc, de 100:0 a 70:30), como un sólido blanco (940 miligramos, 60 por ciento de rendimiento).
UPLC RtMi =0.87 minutos; MS (ESI, m/z): 323.0 [(M + NH4)+]. 1H RMN (400 MHz, CDCI3): d 9.45 (d, 1H), 8.76 (d, 1H), 3.57 (s, 3H).
Intermediario IA4: 5-bromo-3-dif luoro-metil-2-metan-sulfonil-piridina a) 2,5-dibromo-3-difluoro-metil-piridina Una solución de trifluoruro de Et3N (1.80 mililitros, 11.3 milimoles) en dicloro-metano (DCM) (40 mililitros) se trató a 0°C con Xtalfluor-E (2.67 gramos, 15.5 milimoles), y 2,5-dibromo-piridin-3-carbaldehído (1.0 gramo, 3.77 milimoles). Después de agitar durante 19 horas a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se diluyó con el terbutil-metil-éter (TBME), y se lavó con una solución acuosa saturada de NaHC03. La capa orgánica se secó sobre Na2S04, y se concentró, para dejar un aceite amarillo (950 miligramos, 88 por ciento de rendimiento), el cual se utilizó sin mayor purificación.
UPLC RtMi =1.05 minutos; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): d 8.57 (d, 1H), 8.48 (d, 1H), 7.14 (t, 1H), 3.35 (s, 3H). b) 5-bromo-3-difluoro-metil-2-metan-sulfonil-piridina Una solución de la 2,5-dibromo-3-difluoro-metil-piridina (1400 miligramos, 1.16 milimoles) en dimetil-formamida (DMF) (10 mililitros) se trató a 0°C con metan-tiolato de sodio (348 miligramos, 4.97 milimoles). Después de agitar durante 1.5 horas a temperatura ambiente, la reacción se enfrió a 0°C, y se agregó mCPBA (2857 miligramos, 16.56 milimoles) a la mezcla de reacción. Después de agitar durante 1 hora a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se agregó a una solución acuosa de NaOH 4N, y se extrajo con terbutil-metil-éter (TBME). La capa orgánica se secó sobre Na2S04, se filtró, se concentró, y se obtuvo el compuesto del título después de la cromatografía por evaporación instantánea sobre gel de sílice (hexano / EtOAc, de 100/0 a 80/20), como un sólido blanco (498 miligramos, 53 por ciento de rendimiento).
UPLC RtMi =0.86 minutos; 1H RMN (400 MHz, CDCI3): d 8.67 (d, 1H), 8.45 (d, 1H), 7.37 (t, 1H), 3.37 (s, 3H).
Intermediario IA5: 5-bromo-3-fluoro-metil-2-metan-sulfonil-piridina a) 5-bromo-2-cloro-3-fluoro-metil-piridina Una solución de trifluoruro de Et3N (1.76 mililitros, 10.79 milimoles) en dicloro-metano (DCM) (20 mililitros) se trató a 0°C con Xtalfluor-E (1.65 gramos, 7.19 milimoles), y (5-bromo-2-cloro-piridin-3-il)-metanol (0.80 gramos, 3.60 milimoles). Después de agitar durante 18 horas a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se diluyó con el terbutil-metil-éter (TBME), y se lavó con una solución acuosa saturada de NaHC03. La capa orgánica se secó sobre Na2S04, se concentró, y se obtuvo el compuesto del título después de la cromatografía por evaporación instantánea sobre gel de sílice (hexano / EtOAc, de 100/0 a 90/10), como un aceite incoloro (286 miligramos, 35 por ciento de rendimiento).
UPLC Rt i =0.98 minutos; 1H RMN (400 MHz, CDCI3): d 8.53 (d, 1H), 8.45 (d, 1H), 5.52 (d, 1H) b) 5-bromo-3-fluoro-metil-2-metan-sulfonil-piridina Una solución de la 2,5-dibromo-3-difluoro-metil-piridina (1.4 gramos, 1.16 milimoles) en dimetil-formamida (DMF) (10 mililitros) se trató a 0°C con metan-tiolato de sodio (348 miligramos, 4.97 milimoles). Después de agitar a temperatura ambiente durante 1.5 horas, la reacción se enfrió a 0°C, y se introdujo mCPBA (2857 miligramos, 16.56 milimoles) a la mezcla de reacción. Después de agitar durante 1 hora a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se agregó a una solución acuosa de NaOH 4N, y se extrajo con terbutil-metil-éter (TBME). La capa orgánica se secó sobre Na2S04, se filtró, se concentró, y se obtuvo el compuesto del título después de la cromatografía por evaporación instantánea sobre gel de sílice (hexano / EtOAc, de 100/0 a 80/20), como un sólido blanco (498 miligramos, 53 por ciento de rendimiento).
UPLC RtMi =0.86 minutos; 1H RMN (400 MHz, CDCI3): d 8.67 (d, 1H), 8.45 (d, 1H), 7.37 (t, 1H), 3.37 (s, 3H).
Intermediario IA7: 5-bromo-3-fluoro-metil-2-metox¡-piridina Una solución del (5-bromo-2-metoxi-piridin-3-il)-metanol (343 miligramos, 1.57 milimoles) en dicloro-metano (DCM) (7 mililitros) se trató a 0°C con desoxo-flúor (1.5 mililitros, 3.46 milimoles), y EtOH (27.6 microlitros, 0.47 milimoles). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente, se apagó con una solución acuosa saturada de NaHC03 y se extrajo con dicloro-metano (DCM). La capa orgánica se secó sobre Na2S04, y se concentró para proporcionar el compuesto del título después de la cromatografía por evaporación instantánea sobre gel de sílice (hexano/EtOAc, 80:20), como un aceite amarillo (80 miligramos, 23 por ciento de rendimiento).
UPLC RtMi =1.07 minutos; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): d 8.32 (t, 1H), 8.00 (t, 1H), 5.37 (d, 2H), 3.89 (s, 3H).
Intermediario IA24: 1 -(5-bromo-2-metoxi-piridin-3-sulfonil)-4-metil-piperazina a) (5-bromo-2-metan-sulfonil-piridin-3-il)-metil-amina Una solución de cloruro del 5-bromo-2-cloro-piridin-3-sulfonilo (CAS registro 1146290-19-8) (580 miligramos, 1.99 milimoles), y Et3N (0.55 mililitros, 3.99 milimoles) en dicloro-metano (DCM) (20 mililitros) a 0°C, se trató con 1 -metil-piperazina (0.33 mililitros, 2.99 milimoles); la mezcla resultante se agitó a 0°C durante 20 minutos y a temperatura ambiente durante 18 horas. La mezcla se diluyó con dicloro-metano (DCM) (30 mililitros), y se lavó con una solución acuosa saturada de NaHC03. La capa orgánica se secó sobre MgS04, se concentró, y se purificó mediante cromatografía por evaporación instantánea sobre gel de sílice (dicloro-metano (DCM) / metanol, de 100:0 a 90:10), para proporcionar el compuesto del título como un sólido color naranja (420 miligramos, 59 por ciento de rendimiento).
HPLC RtM2 =1-49 minutos; ESIMS: 356 [(M + H)+]. 1H RMN (400 MHz, CDCI3): d 8.62 (d, 1H), 8.50 (d, 1H), 3.57-3.29 (t, 4H), 2.50 (t, 4H), 2.33(s, 3H). b) 1-(5-bromo-2-metoxi-piridin-3-sulfonil)-4-metil-piperazina Una solución de la 1-(5-bromo-2-cloro-piridin-3-sulfonil)-4-metil-piperazina (420 miligramos, 1.18 milimoles) en tetrahidrofurano (THF) (10 mililitros) se trató en porciones con metóxido de sodio (192 miligramos, 3.55 milimoles). La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 18 horas. La mezcla se apagó mediante la adición de agua y se extrajo con EtOAc. Las capas orgánicas combinadas se lavaron con una solución acuosa saturada de NaHC03 y se secaron sobre MgS04, se concentraron, y se purificaron mediante cromatografía por evaporación instantánea sobre gel de sílice (dicloro-metano (DCM) / metanol, de 100:0 a 90:10), para proporcionar el compuesto del título (358 miligramos, 85 por ciento de rendimiento).
HPLC RtM2 =1-47 minutos; ESIMS: 350, 352 [(M + H)+]. 1H RMN (400 MHz, CDCI3): d 8.36 (d, 1H), 8.28 (d, 1H), 4.05 (s, 3H), 3.35 (br s, 4 H), 2.49 (br s, 4 H), 2.33 (s, 3H).
Intermediario IA30: 3-bromo-5-(propan-2-sulfonil)-piridina 1. Propan-2-tiolato de sodio Una solución de la 3,5-dibromo-piridina (CAS registro 625-92-3) (495 miligramos, 2.09 milimoles) en NMP (5 mililitros) se trató con propan-2-tiolato de sodio (CAS registro 20607-43-6) (205 miligramos, 2.09 milimoles); la mezcla resultante se agitó a 80°C durante 2 horas. La mezcla se enfrió y se diluyó con EtOAc, se lavó con agua (2 veces), y entonces con salmuera. La capa orgánica se secó sobre MgS04 y se concentró. El residuo obtenido se disolvió en dicloro-metano (DCM) (10 mililitros), se trató con mCPBA (1,083 miligramos, 6.27 milimoles), y se agitó a temperatura ambiente durante 18 horas. Se agregó una solución acuosa de sulfito de sodio al 10 por ciento, y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. Las fases se separaron, y la capa orgánica se lavó con una solución acuosa saturada de NaHC03, se secó sobre gS04, se concentró, y se purificó mediante cromatografía por evaporación instantánea sobre gel de sílice (ciclohexano / EtOAc, de 100:0 a 00:100), para proporcionar el compuesto del título (364 miligramos, 59 por ciento de rendimiento).
HPLC RtM2 =0.77 minutos; ESIMS: 264, 266 [(M + H)+]. 1H RMN (400 MHz, CDCI3): d 8.98 (dd, 2H), 8.33 (t, 1H),3.34-3.17 (m, 1H), 1.37 (d, 6H).
Intermediario IA44: 5-bromo-2-etan-sulfinil-piridina a) 5-bromo-2-etil-sulfanil-piridina Una mezcla de la 2,5-dibromo-piridina (CAS registro 588729-99-1) (1.15 gramos, 4.85 milimoles), y etantiolato de sodio (CAS registro 811-51-8)-(2.04 gramos, 24.27 milimoles) en sulfóxido de dimetilo (DMSO) (15 mililitros) se agitó a temperatura ambiente durante 18 horas. Se agregó agua, y la mezcla se extrajo con dicloro-metano (DCM). La capa orgánica se secó pasándola a través de un cartucho de separación de fases, se concentró y se purificó mediante cromatografía por evaporación instantánea sobre gel de sílice (ciclohexano / EtOAc, de 100:0 a 70:30), para proporcionar el compuesto del título como un aceite color naranja (1.09 gramos, 92 por ciento de rendimiento).
HPLC RtM2=1.25 minutos; ESIMS: 218, 220 [(M + H)+]. b) 5-bromo-2-etan-sulfinil-piridina Una solución de la 5-bromo-2-etil-sulfanil-piridina (1.09 gramos, 4.49 milimoles) en dicloro-metano (DCM) (15 mililitros) se trató con mCPBA (1.55 gramos, 8.98 milimoles). La solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 15 minutos.
La mezcla se apagó mediante la adición de una solución acuosa de NaOH 2M, y se extrajo con dicloro-metano (DCM). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre MgS04, y se concentraron. El compuesto se purificó mediante RP-HPLC de preparación (columna SunFire C18 OBD, gradiente del 5 al 60 por ciento de acetonitrilo (ACN) en 15 minutos), para proporcionar el compuesto del título como un aceite incoloro (490 miligramos, 45 por ciento de rendimiento).
HPLC RtM2=0.65 minutos; ESIMS: 234, 236 [(M + H)+]. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): d 8.85 (d, 1H), 8.37 (dd, 1H), 7.80 (d, 1H), 3.33 (s, 2H), 3.27-3.10 (m, 1H), 2.94-2.72 (m, 1 H), 1.01 (t, 3 H).
Intermediario IA45: 5-bromo-2-metan-sulfonil-3-metoxi-piridina a)5-bromo-3-metoxi-2-metil-sulfanil-piridina Una mezcla de la 2,5-dibromo-3-metoxi-piridina (CAS registro 1142191-57-8) (550 miligramos, 2.06 milimoles), y metan-tiolato de sodio (CAS registro 5188-07-8)-(722 miligramos, 10.30 milimoles) en sulfóxido de dimetilo (DMSO) (1.5 mililitros) se agitó a temperatura ambiente durante 0.5 horas. Se agregó agua, y la mezcla se extrajo con dicloro-metano (DCM). La capa orgánica se secó pasándola a través de un cartucho de separación de fases y se concentró, para proporcionar el compuesto del título como un aceite incoloro (1.50 gramos, 93 por ciento de rendimiento, crudo). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): d 8.19 (d, 1H), 7.53 (d, 1H), 3.89 (s, 3H), 3.32 (s, 3H). b) 5-bromo-2-metan-sulfonil-3-metoxi-piridina Una solución de la 5-bromo-3-metoxi-2-metil-sulfanil-piridina (1.50 gramos, 2.24 milimoles) en dicloro-metano (DCM) (10 mililitros) se trató con mCPBA (1.55 gramos, 8.97 milimoles). La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 18 horas . La mezcla se apagó mediante la adición de una solución acuosa de NaOH 2M, y se extrajo con dicloro-metano (DCM). La capa orgánica se secó pasándola a través de un cartucho de separación de fases y se concentró, para proporcionar el compuesto del título (400 miligramos, 33 por ciento de rendimiento como un producto crudo).
HPLC RtM2=0.75 minutos; ESIMS: 268[(M + H)+]. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): d 8.41 (d, 1H), 8.17 (s, 1H), 4.01 (s, 3H), 3.30 (s, 3H).
Intermediario IA51: (5-bromo-2-metan-sulfonil-piridin-3-il)-metil-amina a) (5-bromo-2-cloro-piridin-3-il)-meti l-amina Una solución de la 5-bromo-2-cloro-piridin-3-il-amina (CAS registro 588729-99-1) (565 miligramos, 2.72 milimoles) en tetrahidrofurano (THF) (4 mililitros) a 0°C se trató con BuLi 1.6M en hexano (0.17 mililitros, 0.17 milimoles); la mezcla resultante se agitó a 0°C durante 0.5 horas, y entonces se agregó lentamente yoduro de metilo (0.17 mililitros, 2.72 milimoles). La mezcla de reacción se dejó calentar a temperatura ambiente, y se agitó durante 18 horas. La mezcla color naranja/café se vertió en una solución acuosa saturada de NaHC03, y se extrajo con EtOAc. La capa orgánica se secó sobre MgSO-i, se concentró, y se purificó mediante cromatografía por evaporación instantánea sobre gel de sílice (ciciohexano / EtOAc, de 95:5 a 60:40), para proporcionar el compuesto del título como un sólido color naranja (354 miligramos, 59 por ciento de rendimiento).
HPLC RtMi =0.94 minutos; ESI S: 221, 223, 225 [(M + H)+]. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): d 7.65 (d, 1H), 7.14 (d, 1H), 6.11 (d, 1H), 2.74 (d, 3H). b) (5-brom ?-2-metan-sulfon i l-piri di n-3-il)-met¡ l-amina Una solución de la (5-bromo-2-cloro-piridin-3-il)-metil-amina (354 miligramos, 1.60 milimoles) en dimetil-formamida (DMF) (2.6 mililitros) se trató con metan-tiolato de sodio (168 miligramos, 2.40 milimoles) a 0°C. La solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 2 días, y se calentó a 60°C durante 4 días. La mezcla se apagó a 0°C mediante la adición de una solución acuosa de NaOH 2M, y se extrajo con dicloro-metano (DCM). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre MgS04 y se concentraron, para proporcionar un aceite color naranja, el cual se disolvió en dicloro-metano (DCM) (5 mililitros), y se trató a 0°C con mCPBA (CAS registro 937-14-4) (827 miligramos, 4.79 milimoles), y se agitó durante 18 horas a temperatura ambiente. La mezcla se apagó a 0°C mediante la adición de una solución acuosa de NaOH 2M, y se extrajo con dicloro-metano (DCM). Los materiales orgánicos combinados se secaron sobre MgS04, se concentraron, y se purificaron mediante cromatografía por evaporación instantánea sobre gel de sílice (ciclohexano / EtOAc, de 92:8 a 32:68), para proporcionar el compuesto del título como un sólido color naranja (174 miligramos, 41 por ciento de rendimiento).
HPLC RtMi =0.78 minutos; ESIMS: 265, 267 [(M + H)+]. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): d 7.95 (d, 1H), 7.50 (d, 1H), 6.70-6.59 (m, 1H), 3.26 (s, 3H), 2.82 (d, 3H).
Intermediario IA52: (5-bromo-2-metan-sulfonil-piridin-3-il)-dimetil-amina a) (5-bromo-2-cloro-piridin-3-il)-metil-amina Una solución de la 5-bromo-2-cloro-piridin-3-il-amina (CAS registro 588729-99-1) (1 gramo, 4.82 milimoles) en tetrahidrofurano (THF) (7 mililitros) a 0°C se trató con BuLi 1.6M en hexano (6 mililitros, 9.64 milimoles); la mezcla resultante se agitó a 0°C durante 0.5 horas, entonces se agregó lentamente yoduro de metilo (0.60 mililitros, 9.64 milimoles). La mezcla de reacción se dejó calentar a temperatura ambiente, y se agitó durante 18 horas. La mezcla color naranja/café se vertió sobre una solución acuosa saturada de NaHC03, y se extrajo con EtOAc, la capa orgánica se secó sobre MgS04, se concentró, y se purificó mediante cromatografía por evaporación instantánea sobre gel de sílice (ciclohexano / EtOAc, de 95:05 a 70:30), para proporcionar el compuesto del título como un sólido color naranja (182 miligramos, 17 por ciento de rendimiento).
HPLC RtM =0.94 minutos; ESIMS: 221, 223[(M + H)+]. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): d 7.65 (d, 1H), 7.14 (d, 1H), 6.11 (d, 1H), 2.74 (d, 3H). b) (5-bromo-2-cloro-piridin-3-M)-dimetil -amina Una solución de la (5-bromo-2-cloro-piridin-3-il)-metil-amina (182 miligramos, 0.82 milimoles) en dimetil-formamida (DMF) (4 mililitros) se trató con NaH (23 miligramos, 0.99 milimoles), a temperatura ambiente, y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 0.5 horas; se agregó yoduro de metilo (0.06 mililitros, 0.99 milimoles), y la mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. La mezcla se diluyó con el terbutil-metil-éter (TBME), y se lavó con a una solución acuosa saturada de NaHC03, la capa orgánica se secó sobre MgS04 y se concentró, para proporcionar el compuesto del título como un aceite color naranja (174 miligramos, 90 por ciento de rendimiento). Se utilizó sin mayor purificación.
HPLC RtM1 =1.03 minutos; ESIMS: 235, 237 [(M + H)+]. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): d 8.10 (d, 1H), 7.70 (d, 1H), (s, 6H). c) (5-bromo-2-metan-sulfonil-piridin-3-il)-metil-amina Una solución de la (5-bromo-2-cloro-piridin-3-il)-dimetil-amina (174 miligramos, 0.74 milimoles) en dimetil-formamida (DMF) (5 mililitros) se trató con metan-tiolato de sodio (104 miligramos, 1.48 milimoles), a temperatura ambiente; la solución resultante se agitó a 80°C durante 18 horas. A 0°C, la mezcla se apagó mediante la adición de una solución acuosa de NaOH 2M, y entonces se extrajo con terbutil-metil-éter (TBME). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre MgS04 y se concentraron, para proporcionar un aceite color naranja, el cual se disolvió en dicloro-metano (DCM) (5 mililitros), se trató a 0°C con mCPBA (CAS registro 937-14-4) (382 miligramos, 2.21 milimoles), y se agitó durante 18 horas a temperatura ambiente. A 0°C, la mezcla se apagó mediante la adición de una solución acuosa de NaOH 2M, y entonces se extrajo con dicloro-metano (DCM). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre MgS04, se concentraron, y se purificaron mediante cromatografía por evaporación instantánea sobre gel de sílice (ciclohexano / EtOAc, de 88:12 a 00:100), para proporcionar el compuesto del título como un sólido color naranja (50 miligramos, rendimiento del 24 por ciento).
HPLC RtMi =0.83 minutos; ESIMS: 279, 281 [(M + H)+J. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): d 8.25 (d, 1H), 7.90 (d, 1H), 3.29 (s, 3H), 2.91 (s, 6H).
Intermediario IA65: 5-bromo-2,N-dimetoxi-bencen-sulfonamida Una solución del cloruro de 5-bromo-2-metoxi-bencen-sulfonilo (CAS registro 23095-05-8) (218 miligramos, 0.76 milimoles), y Et3N (0.55 mililitros, 3.99 milimoles) en dicloro-metano (DCM) (20 mililitros) a 0°C, se agitó durante 15 minutos y se trató con O-metil-hidroxilamina (36 miligramos, 0.76 milimoles); la mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 18 horas. La mezcla se dividió entre EtOAc y agua. La capa orgánica se lavó con una solución acuosa saturada de NaHC03, se secó sobre MgS0 , se concentró, y se purificó mediante cromatografía por evaporación instantánea sobre gel de sílice (ciclohexano / EtOAc, de 100:0 a 0:100), para proporcionar el compuesto del título (189 miligramos, 84 por ciento de rendimiento). (dd, 1 H), 6.97 (d, 1 H), 4.01 (s, 3 H), 3.81 (s, 3 H). Ácidos carboxilicos o cloruros de ácidos Ejem plo IB1 /I B2 : (S)-ácido tetrahidrof uran-3-carboxílico / (R)-ácido tetrahidrofuran-3-carboxílico a) Bencil-éster del ácido tetrahidrofuran-3-carboxíl ico Una solución del ácido tetrahid rofuran-3-carboxílico (CAS registro 89364-31 -8) (4.00 gramos, 34.40 milimoles) en dimetil-formamida (DMF) (20 mililitros) se trató con K2C03 (9.52 gramos, 68.9 milimoles), y bromuro de bencilo (CAS registro 100-39-0) (8.18 mililitros, 68.9 milimoles) a 100°C durante 18 horas. La mezcla se enfrió a temperatura ambiente, se diluyó con EtOAc, y se lavó con agua y salmuera. Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre MgS0 , se concentraron, y se purificaron mediante cromatografía por evaporación instantánea sobre gel de sílice (ciclohexano / EtOAc, de 92:8 a 34:66), para proporcionar el compuesto del título como un aceite incoloro (6.93 gramos, 98 por ciento de rendimiento).
HPLC RtM2 =0.94 minutos; ESIMS: 207 [(M + H)+]. 1H RMN (400 MHz, CDCI3): d 7.50-7.26 (m, 5H), 5.17 (m, 2H), 4.05-3.75 (m, 4H), 3.29-3.05(m, 1H), 2.36-2.09 (m, 2H). b) Separación de enantiómeros del bencil-éster del ácido tetrahidrofuran-3-carboxílico Pico 1 Pico 2 Información del método: Columna: Chiralpak AD-PREP Solvente: HEPTANO/ETOH/MEOH, 95/2.5/2.5 Flujo: 1.0 mililitro/minuto Onda larga: 210 nanómetros Máquina: Agilent 1200 DAD Magellan Solución: EtOH Después de la separación de 6.347 gramos del racémico, se obtuvieron 2 picos: pico 1 en 9.086 minutos (2.43 gramos, exceso enantiomérico (ee) > 99 por ciento), y pico 2 en 10.584 minutos (2.19 gramos, exceso enantiomérico (ee) > 99 por ciento).
HPLC (pico 1 ó 2) RtM2 = 0.92 minutos; ESIMS: 207 [(M + H)+]. H RMN (pico 1) (400 MHz, CDCI3): d 7.48-7.29 (m, 5H), 5.23-5.07 (m, 2H), 4.05-3.77 (m, 4H), 3.23-3.10(m, 1H), 2.35-2.06 (m, 2H). 1H RMN (pico 2) (400 MHz, CDCI3): d 7.51-7.31 (m, 5H), 5.23-5.09 (m, 2H), 4.07-3.77 (m, 4H), 3.24-3.07 (m, 1H), 2.35-2.06 (m, 2H). c) (S)-ácido tetrahidrofuran-3-carboxílico / (R)-ácido tetra-hidrofuran-3-carboxílico Una solución de un bencil-éster del ácido tetrahidrofuran-3- carboxílico enantioméricamente puro (pico 1 ó pico 2, 200 miligramos, 0.97 milimoles), Pd/C (103 miligramos, 0.97 milimoles) en EtOH (2 mililitros), se hidrogenó con H2 a temperatura ambiente durante 18 horas. La filtración de la mezcla de reacción y la concentración del filtrado proporcionaron el compuesto del título como un aceite incoloro (125 miligramos (Pico 1), 111 miligramos (Pico 2), crudo). 1H RMN (ambos enantiómeros) (400 MHz, DMSO-d6): d 12.40 (br s, 1H), 3.84-3.59 (m, 4H), 3.00 (m, 1H), 2.08-1.92(m, 1H).
Ejemplo IB3): Ácido 5-terbutoxi-carbonil-amino-1 -metil- H-imidazol-4-carboxílico a) Etil-éster del ácido 5-di-(terbutoxi-carbonil)-am¡no-1 -metil-1 H-imidazol-4-carboxílico Una solución del etil-éster del ácido 5-amino-1 -metil-1 H-imidazol-4-carboxílico (CAS registro 54147-04-5) (82 miligramos, 0.49 milimoles) en tetrahidrofurano (THF) (4 mililitros) se trató a -50°C con una solución de LiHMDS 1M en tetrahidrofurano (THF) (0.97 mililitros, 0.97 milimoles), y la mezcla de reacción se agitó a - 50°C durante 10 minutos; entonces se agregó una solución de Boc20 (237 miligramos, 1.07 milimoles) en tetrahidrofurano (THF) (1.5 mililitros). La mezcla de reacción se dejó calentar lentamente a temperatura ambiente, entonces hasta 50°C, y se agitó durante 15 horas a 50°C. La mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente, se diluyó con EtOAc, y se apagó con H20. La capa orgánica se secó sobre Na2S04, se filtró, se concentró, y se obtuvo el compuesto del título después de la cromatografía por evaporación instantánea sobre gel de sílice (heptano / EtOAc, de 85:15 a 0:100), como un sólido blanco (140 miligramos, 78 por ciento de rendimiento).
UPLC RtMi =0.96 minutos; ESIMS: 370 [(M+H)+] 1H RMN (400 MHz, CDCI3, 298 K): d 4.33 (q, 2H), 3.50 (s, 3H), 1.41 (s, 18H), 1.35 (t, 3H). b) Ácido 5-terbutoxi-carbonil-amino-1 -metil-1 H-imidazol-4- carboxílico Una solución del etil-éster del ácido 5-di-(terbutoxi-carbonil)- amino-1 -metil-1 H-imidazol-4-carboxílico (167 miligramos, 0.452 mili- moles) en tetrahidrofurano (THF) (2.2 mililitros), y H20 (2.2 mililitros) se trató con LiOH (54.1 miligramos, 2.26 milimoles), y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 18 horas, entonces se apagó con una solución acuosa de HCI 1M, para alcanzar un pH de 2, y se extrajo con EtOAc. La capa orgánica se secó sobre Na2S04, se filtró, se concentró para proporcionar el compuesto del título. (70 miligramos, 65 por ciento de rendimiento).
UPLC RtMi =0.47 minutos; ESIMS: 242 [(M + H)+] 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): d 12.42 (br.s., 1H), 8.98 (br.s., 1H), 7.82 (s, 1H), 3.45 (s, 3H), 1.41 (s, 9H).
IC) Derivados o análogos de pirrolidinol Intermediario IC1: ( )-1 -(tetrahidro-piran-4-carbonil)-pirrolidin-3-il-éster de ácido metan-sulfónico a) ((R)-3-hidroxi-pirrolidin-1 -il)-(tetrahidro-piran-4-il)-metanona Se agregó cloruro de oxalilo (0.20 mililitros, 3.84 milimoles) a una solución del ácido tetrahidro-piran-4-carboxílico (CAS registro 5337-03-1), y dimetil-formamida (DMF) (0.012 mililitros, 0.15 milimoles). La mezcla de reacción se agitó a 3°C durante 1 hora. La concentración de la mezcla de reacción bajo presión reducida (170 mbar) a 40°C (baño de agua) proporcionó el intermediario de acilo como un aceite incoloro. El Intermediario se disolvió en dicloro-metano (DCM) (2 mililitros), y se agregó a una solución de clorhidrato de (R)-pirrolidin-3-ol (CAS registro 104706-47-0) (190 miligramos, 1.54 milimoles) en dicloro-metano (DCM) (3 mililitros), se enfrió a 3°C, y la suspensión blanca formada se agitó a 3°C durante 1 hora. La mezcla de reacción se concentró; se agregó EtOAc al residuo, el cual se filtró y se lavó con EtOAc. La concentración y la purificación del filtrado mediante cromatografía por evaporación instantánea sobre gel de sílice (DCM /DCM: metanol (9:1), de 100:0 a 60:40 durante 11 minutos) proporcionaron el compuesto del título como un sólido blanco (250 miligramos, 82 por ciento de rendimiento).
ESIMS: 200 [(M + H)+]. 1H RMN (400 MHz, CDCI3): d 4.43 - 4.65 (m, 1H), 3.95-4.16 (m, 2H), 3.30-3.82 (m, 6H), 2.45-2.75 (m, 1H), 1.83-2.30 (m, 4H), 1.54-1.78 (m, 3H). b) (R)-1 -(tetrahidro-piran-4-carbonil)-pirrolidin-3-il-éster de ácido metan-sulfónico Bajo argón, se agregó cloruro de metan-sulfonilo (CAS registro 124-63-0) (3.52 mililitros, 45.2 milimoles) a una solución de ((R)-3-hidroxi-pirrolidin-1-il)-(tetrahidro-piran-4-il)-metanona (6 gramos, 22.6 milimoles), y Et3N (6.30 mililitros, 45.2 milimoles) en dicloro-metano (DCM) (100 mililitros) a -10°C. La solución se agitó a 0°C durante 1 hora, se diluyó con H20 y dicloro-metano (DCM), la capa orgánica se lavó dos veces con H20 y salmuera, y se secó sobre MgS04. La concentración y trituración del aceite resultante con dietil-éter proporcionó el compuesto del título como un sólido grisáceo (5.3 gramos, 84 por ciento).
ESIMS: 278 [(M+H)+]. 1H RMN (400 MHz, CDCI3): d 5.22-5.44 (m, 1H), 3.96-4.13 (m, 2H), 3.85-3.96 (m, 1H), 3.56-3.83 (m, 3H), 3.36-3.53 (m, 2H), 3.08 (d, 3H), 2.07-2.75 (m, 3H), 1.93 (m, 2H), 1.51-1.75 (m, 3H).
Intermediario IC2: (S)-(tetrahidro-piran-4-carbonil)-pirrolidin-3-il-éster de ácido metan-sulfónico a) ((S)-3-hidroxi-pirrolidin-1 -il)-(tetrahidro-piran-4-il)-metanona Una solución de cloruro de tetrahidro-piran-4-carbonilo (CAS registro 40191-32-0) (316 miligramos, 2.02 milimoles) en dicloro-metano (DCM) (2 mililitros) se agregó por goteo (0°C <T <10°C) a una solución de (S)-pirrolidin-3-ol (CAS registro 100243-39-8) (250 miligramos, 2.02 milimoles), y Et3N (0.62 mililitros, 4.45 milimoles) en dicloro-metano (DCM) (5 mililitros). La mezcla de reacción se agitó a 3°C durante 1 hora. Los volátiles se concentraron y se agregó EtOAc al residuo, el sólido restante se filtró y se lavó con EtOAc, y la concentración del filtrado proporcionó el compuesto del título como un sólido blanco (390 miligramos, 97 por ciento de rendimiento).
ESIMS: 200 [(M + H)+]. 1H RMN (400 MHz, CDCI3): d 4.55 (d, 1H), 3.96-4.11 (m, 2H), 3.36-3.80 (m, 6H), 2.48-2.74 (m, 1H), 1.52-2.20 (m, 7H). b) (S)-1 -(tetrahidro-piran-4-carbonil)-pirrolidin-3-il-éster de ácido metan-sulfónico Bajo argón, se agregó cloruro de metan-sulfonilo (CAS registro 124-63-0) (0.23 mililitros, 2.94 milimoles) a una solución de la ((S)-3-hidroxi-pirrolidin-1-il)-(tetrahidro-piran-4-il)-metanona (0.39 gramos, 1.96 milimoles), y Et3N (0.55 mililitros, 3.91 milimoles) en dicloro-metano (DCM) (10 mililitros) a -10°C. La solución se agitó a 3°C durante 1 hora, se diluyó con H20 y dicloro-metano (DCM), la capa orgánica se lavó dos veces con H20 y salmuera, y entonces se secó sobre MgS04. La concentración y trituración del aceite resultante con dietil-éter proporcionó el compuesto del título como un sólido blanco (0.45 gramos, 83 por ciento de rendimiento).
ESIMS: 278 [(M + H)+]. 1H RMN (400 MHz, CDCI3): d 5.25-5.44 (m, 1H), 3.99-4.16 (m, 2H), 3.85-3.95 (m, 1H), 3.56-3.83 (m, 3H), 3.37-3.54 (m, 2H), 3.08 (d, 3H), 2.09-2.78 (m, 3H), 1.93 (m, 2H), 1.51-1.76 (m, 2H).
Intermediario IC3: (S)-1 -propionil-pirrolidin-3-il-éster de ácido metan-sulfónico a) 1-((S)-3-hidroxi-pirrolidin-1-il)-propan-1-ona Se agregó por goteo cloruro de propionilo (CAS registro 79-03-8) (4.78 mililitros, 54.8 milimoles) durante un período de 15 minutos a una solución de (S)-pirrolidin-3-ol (CAS registro 100243-39-8) (4.8 gramos, 55.9 milimoles), y Et3N (8.74 mililitros, 63.1 milimoles) a 5°C, la solución se dejó calentar a temperatura ambiente, y se agitó durante 1 hora. Se agregaron H20 (10 mililitros) y una solución acuosa saturada de NaHC03, (10 mililitros) a la solución, la fase orgánica se lavó con salmuera (10 mililitros) y una solución acuosa de HCI 0.25M (20 mililitros). Las capas acuosas combinadas se concentraron y se extrajeron con EtOAc (100 mililitros, 2 veces), las fases orgánicas combinadas se secaron sobre MgS04 y se concentraron, para proporcionar el compuesto del título como un aceite amarillo pálido (4.80 gramos, 54 por ciento de rendimiento). 1H RMN (400 MHz, CDCI3): d 4.54 (d, 1H), 3.31-3.73 (m, 3H) 3.12 (m, 1H), 1.82-2.46 (m, 5H), 1.17 (t, 3H) b) (S)-1 -propionil-pirrolidin-3-M-éster de ácido metan-sulfónico se agregó cloruro de metan-sulfonilo (CAS registro 124-63-0) (1.36 mililitros, 17.46 milimoles), durante un período de 10 minutos, a una solución de 1 -((S)-3-h id roxi-pi rro lidi n - 1 -il)-propan-1 -ona (2.5 gramos, 17.4 milimoles) y Et3N (2.43 mililitros, 17.4 milimoles) en dicloro-metano (DCM) (50 mililitros) a 5°C. La solución se dejó calentar a temperatura ambiente, y se agitó durante 18 horas, entonces se agregaron cloruro de metan-sulfonilo (CAS registro 124-63-0) (1.36 mililitros, 17.46 milimoles), y Et3N (2.43 mililitros, 17.4 milimoles) a la mezcla de reacción, la cual se agitó durante 48 horas a temperatura ambiente. Se agregaron dicloro-metano (DCM) y H20 a la solución, y la fase orgánica se separó a través de un cartucho de separación de fases, se concentró, y se obtuvo el compuesto del título después de la cromatografía por evaporación instantánea sobre gel de sílice (EtOAc / metanol, de 100:0 a 95:5 durante 40 minutos), como un aceite incoloro (2.7 gramos, 66 por ciento de rendimiento). 1H RMN (400 MHz, CDCI3): d 5.19-5.42 (m, 1H), 3.48-3.99 (m, 4H), 3.06 (d, 3H).2.04-2.54 (m, 4H), 1.16 (t, 3H).
Intermediario IC4: (R)-1-propionil-pirrolidin-3-il-éster de ácido metan-sulfónico a) 1-((R)-3-hidroxi-pirrolidin-1-il)-propan-1-ona agregó cloruro de propionilo (CAS registro 79-03-8) (7.06 mililitros, 81 milimoles) (0°C <T <10°C), durante un período de 15 minutos, a una suspensión de (R)-pirrolidin-3-ol (CAS registro 2799-21-5) (10 gramos, 81 milimoles), y Et3N (23.6 mililitros, 170 milimoles) en dicloro-metano (DCM) (150 mililitros) que se enfrió previamente a -10°C. La suspensión grisácea se agitó a 0°C durante 2 horas, se agregó metanol (9.82 mililitros, 243 milimoles), y la mezcla se dejó agitándose a temperatura ambiente durante 1 hora. La concentración y dilución del residuo con Et20 (200 mililitros) proporcionó, después de la filtración y concentración del filtrado, el compuesto del título como un aceite amarillo (11.2 gramos, 95 por ciento).
ESIMS: 144 [(M + H)+]. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): d 4.81-5.04 (m, 1H), 4.15-4.38 (m, 1H), 3.35-3.59 (m, 2H), 3.16-3.29 (m, 2H), 2.11-2.33 (m, 2H), 1.65-2.00 (m, 2H), 0.98 (td, 3H). b) (R)-1 -propionil-pirrolidin-3-il-éster de ácido metan-sulfónico Bajo argón, se agregó por goteo cloruro de metan-sulfonilo (CAS registro 124-63-0) (0.16 mililitros, 2.09 milimoles), durante un período de 5 minutos, a una solución de 1-((R)-3-hidroxi-pirrolidin-1-il)-propan-1 -ona (300 miligramos, 2.09 milimoles), y Et3N (0.29 mililitros, 2.09 milimoles) en dicloro-metano (DCM) (10 mililitros) a 5°C, y la mezcla de reacción se dejó agitándose a temperatura ambiente durante 18 horas. Entonces se agregaron cloruro de metan- sulfonilo (CAS registro 124-63-0) (0.16 mililitros, 2.09 milimoles), y Et3N (0.29 mililitros, 2.09 milimoles) a la mezcla de reacción, la cual se agitó a temperatura ambiente durante 48 horas. Se agregaron dicloro-metano (DCM) y H20 a la solución, y la fase orgánica se separó a través de un cartucho de separación de fases y se concentró. Se obtuvo el compuesto del título después de la cromatografía por evaporación instantánea sobre gel de sílice (EtOAc / metanol, de 100:0 a 95:5 durante 25 minutos), como un aceite incoloro (420 miligramos, 86 por ciento).
H RMN (400 MHz, CDCI3): d 5.21-5.44 (m, 1H). 3.49-4.03 (m, 4H), 2.98-3.12 (m, 3H), 1.97-2.54 (m, 4H), 1.18 (t, 3H).
ID) Derivados o análogos de DBO Evaluación Biológica La actividad de u n compuesto de acuerdo con la presente invención se puede evaluar mediante los siguientes métodos in vitro e in vivo.
Ensayos Biológicos 1 Determi nación de la inhibición enzimática de las isoformas PI3K alfa y PI3K delta 1 .1 Prueba de la actividad de la cinasa de lípido La eficacia de los compuestos de los Ejemplos 1 a 1 1 7 como inhibidores de cinasa PI3 se puede demostrar como sigue: La reacción de cinasa se lleva a cabo en un volumen final de 50 microlitros por pozo de una placa COSTAR de 96 pozos de media área. Las concentraciones finales de ATP y fosfatidil-inositol en el ensayo son de 5 µ ? y 6 microg ramos/mililitro, respectivamente. La reacción se inicia mediante la adición de cinasa PI3, por ejemplo, la cinasa P I3 d. ?1 10d Los componentes del ensayo se agregan por pozo como sigue: • 10 microlitros del compuesto de prueba en sulfóxido de dimetilo al 5 por ciento por pozo en las columnas 2-1 .
• La actividad total se determina mediante la adición de 10 microlitros de sulfóxido de dimetilo al 5 por ciento por volumen/ volumen en los primeros 4 pozos de la columna 1 y en los últimos 4 pozos de la columna 1 2.
· El fondo se determina mediante la adición del compuesto de control 1 0 µ ? a los últim os 4 pozos de la colu m na 1 y a los prim eros 4 pozos de la colum na 1 2.
• Se preparan 2 mililitros de 'mezcla de ensayo' por placa: 1 .912 mililitros de regulador de ensayo H EPES, 8.33 microlitros de un suministro 3 mM de ATP para dar una concentración final de 5 µ ? por pozo, 1 microlitro de [33P]ATP en la fecha de actividad , dando 0.05 pCi por pozo, 30 microlitros de 1 miligramo/mililitro de suministro de Pl , dando una concentración final de 6 microg ramos/mililitro por pozo, 5 microlitros de un suministro de MgCI2 1 M , dando una concentración final de 1 mM por pozo.
• Se ag regan 20 microlitros de la mezcla de ensayo por pozo.
• Se preparan 2 mililitros de 'mezcla enzimática' por placa (x* microlitros de cinasa PI3 ? 1 1 0ß en 2 mililitros de regulador de cinasa) . La 'mezcla enzimática' se mantiene sobre hielo du rante la adición a las placas de ensayo.
• Se ag regan 20 microlitros de 'mezcla enzimática' por pozo para iniciar la reacción .
• La placa se incuba entonces a temperatura ambiente durante 90 minutos.
• La reacción se termina mediante la adición de 50 microlitros de suspensión de perlas WGA-SPA (perlas de Ensayo de Proxim idad de Centelleo recubiertas con ag lutinina de germen de trigo) por pozo.
• La placa de ensayo se sella, utilizando un sello de calor TopSeal-S para microplacas de poliestireno (Perkin Elmer LAS [Deutschland] GmbH , Rodgau, Alemania) , y se incuba a temperatura ambiente durante cuando menos 60 minutos.
• La placa de ensayo entonces se centrifuga a 1 ,500 revoluciones por minuto durante 2 minutos, utilizando el centrífugo de banco Jouan (Jouan I nc. , Nantes, Francia) .
· La placa de ensayo se cuenta, utilizando u n Packard TopCount, contándose cada pozo durante 20 segundos.
• El volumen de enzima depende de la actividad enzimática del lote en uso.
En un ensayo más preferido, la reacción de cinasa se lleva a cabo en un volumen final de 1 0 microlitros por pozo de una placa negra de bajo volumen sin enlace CORN I NG de 384 pozos (Cat. No. #3676) . Las concentraciones finales de ATP y fosfatidil-inositol (Pl) en el ensayo son de 1 µ ? y 1 0 microgramos/mililitro, respectivamente. La reacción se inicia mediante la adición de ATP.
Los componentes del ensayo se agregan por pozo como sigue: 50 nanolitros de los compuestos de prueba en sulfóxido de dimetilo al 90 por ciento por pozo, en las columnas 1 -20, 8 concentraciones ( 1 /3 y 1 /3.33 paso de dilución en serie) individualmente.
. Control bajo: 50 nanolitros de sulfóxido de dimetilo al 90 por ciento en la mitad de los pozos de las columnas 23-24 (0.45 por ciento final).
Control alto: 50 nanolitros del compuesto de referencia (por ejemplo, el compuesto del Ejemplo 7 de la Publicación Internacional Número WO 2006/122806) en la otra mitad de las columnas 23-24 (2.5 mieras final).
Estándar: 50 nanolitros del compuesto de referencia como justamente se mencionó, diluido como los compuestos de prueba en las columnas 21-22.
Se preparan 20 mililitros de 'regulador' por ensayo: 200 microlitros de TRIS'HCI 1M, pH de 7.5 (10 mM final). 60 microlitros de MgCI21M (3 mM final). 500 microlitros de NaCI 2M (50 mM final). 100 microlitros de CHAPS al 10 por ciento (0.05 por ciento final). 200 microlitros de DTT 100mM (1mM final). 18.94 mililitros de agua nanopura.
Se preparan 10 mililitros de '?G por ensayo: 200 microlitros de 1 miligramo/mililitro de L-alfa- fosfatidil-inositol (Hígado Bovino, Avanti Polar Lipids, Cat. No.840042C MW=909.12) preparado en octil-glucósido al 3 por ciento (10 microgramos/ mililitro final). 9.8 mililitros de 'regulador'.
Se preparan 10 mililitros 'ATP' por ensayo: 6.7 microlitros de un suministro 3 mM de ATP, dando una concentración final de 1 µ? por pozo. 10 mililitros de 'regulador'.
Se preparan 2.5 mililitros de cada construcción de PI3K por ensayo en '?G con la siguiente concentración final: PI3K alfa-EMV B107510 nM.
Beta-EMV BV94925 nM.
Delta-EMV BV1060 10 nM.
Gamma-EMV BV950 150 nM.
Se agregan 5 microlitros de 'PI/PI3K' por pozo. Se agregan 5 microlitros de 'ATP' por pozo para iniciar la reacción.
Las placas se incuban entonces a temperatura ambiente durante 60 minutos (alfa, beta, delta) o 120 minutos (gamma).
La reacción se termina mediante la adición de 10 microlitros de Kinase-Glo (Promega Cat. No. #6714).
Las placas de ensayo se leen después de 10 minutos en un lector Synergy 2 (BioTek, Vermont, EUA) con un tiempo de integración de 100 milisegundos y la sensibilidad establecida en 191.
• Resultado: El control alto es de alrededor de 60,000 conteos, y el control bajo es de 30,000 ó más bajo.
Este ensayo de luminiscencia da una proporción Z' útil de entre 0.4 y 0.7.
El valor Z' es una medición universal de la seguridad de un ensayo . U n Z' de entre 0.5 y 1 .0 se considera com o un ensayo excelente.
Para este ensayo , se preparan las construcciones de P I3K mencionadas com o sigue: 1 .2 Generación de construcciones genéticas Se utilizan dos construcciones diferentes, BV 1052 y BV 1075, para generar las proteínas de cinasa PI3 a para el rastreo de los compuestos.
PI3Ka BV-1 052 p85(iSH2) - enlazador Glv -p1 1 0a(D20aa) - C-term marca H is Se generan los productos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para el dominio inter-SH2 (¡SH2) de la subunidad p85 y para la subunidad p1 1 0-a (con una supresión de los primeros 20 aminoácidos) , y se fusionan mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) traslapada.
El producto ¡SH2 de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se genera a partir del ADNc de la primera cadena, utilizando inicialmente los cebadores: gwG 30-p01 (5'-CGAGAATATGATAGATTATATGAAGAAT-3') (SEQ I D NO: 1 ) , y gwG 1 30-p02 (5'-TGGTTT-AATGCTGTTCATACG TTTGTCAAT-3') (SEQ I D NO: 2).
Subsiguientemente, en u na reacción en cadena de la polimerasa (PCR) secundaria, Gateway (I nvitrogen AG , Basilea, Suiza) , se agregan los sitios de recombinación AttB 1 y las secuencias enlazadoras en los extremos 5' y 3' del fragmento iSH2 de p85, respectivamente, utilizando los cebadores: gwG130-p03 (5' - GGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTAC GAAGGAGATATACATATGCGAGAATATGATAGATTATATGAAGAAT -3') (SEQ ID NO: 3) y gwG152-p04 (5' - TACCATAATTCCACCACCACCACCGGAAATT CCCCCTGGTTTAATGCTGTTCATACGTTTGTCAAT - 3') (SEQ ID NO: 4).
El fragmento p110-a también se genera a partir del ADNc de la primera cadena, utilizando inicialmente los cebadores: gwG152-p01 (5' - CTAGTGGAATGTTTACTACCAAATGG - 3') (SEQ ID NO: 5), y gwG152-p02 (5' - GTTCAATG-CATGCTGTTTAATTGTGT - 3 ) (SEQ ID NO: 6).
En una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) subsiguiente, se agregan la secuencia enlazadora y una marca de Histidina en el extremo 5' y en el extremo 3' del fragmento p110-a, respectivamente, utilizando los cebadores: gw152-p03 (5' - GGGGGAATTTCCGGTGGTGGTGGTGGAATTA TGGTACTAGTGGAATGTTTACTACCAAATGGA - 3') (SEQ ID NO: 7), y gwG152-p06 (5' - AGCTCCGTGATGGTGATGGTGATGTGCTCC GTTCAATGCATGCTGTTTAATTGTGT - 3') (SEQ ID NO: 8).
La proteína de fusión p85-iSH2/p110-a se ensambla en una tercera reacción en cadena de la polimerasa (PCR) mediante los enlazadores traslapados en el extremo 3' del fragmento iSH2 y el extremo 5' del fragmento p110-a, utilizando el cebador gwG130-p03 anteriormente mencionado, y un cebador que contenía una marca de Histidina traslapada y las secuencias de recombinación de AttB2: (5'-GGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTAAGCTCCGTG ATGGTGATGGTGATGTGCTCC-3') (SEO. ID NO: 9).
El producto final se recombina en una reacción OR (Invitrogen) en el vector donador pDONR201 para generar el clon de entrada ORF318. Este clon se verifica mediante secuenciación, y se utiliza en una reacción LR Gateway para transferir el inserto al vector pBlueBac4.5 adaptado con Gateway (Invitrogen) para la generación del vector de expresión de baculovirus LR410.
PI3Ka BV-1075 p85(iSH2) - enlazador 12XGIv - p110a(D20aa) - C -term marca His La construcción para el Baculovirus BV-1075 se genera mediante un ligamiento de tres partes comprendidas de un fragmento p85 y un fragmento p110-a clonado en el vector pBlueBac4.5. El fragmento p85 se deriva a partir del piásmido p1661-2 digerido con Nhe/Spe. El fragmento p110-a derivado a partir de LR410 (véase anteriormente) como un fragmento Spel/Hindlll. El vector de clonación pBlueBac4.5 (Invitrogen) se digiere con Nhe/Hindlll. Esto da como resultado la construcción PED 153.8.
El componente (iSH2) de p85 se genera mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR), utilizando el ORF 318 (descrito anteriormente) como una plantilla, y un cebador hacia adelante: KAC1028 (5' - GCTAGCATGCGAGAATATGATAGATTATATGAA GAATATACC) (SEQ ID NO: 10), y dos cebadores en reversa: KAC1029 (5' - GCCTCCACCACCTCCGCCTGGTTTAATGCTGT TCATACGTTTGTC) (SEQ ID NO: 11), y KAC1039 (5' - TACTAGTCCGCCTCCACCACCTCCGCCTCCAC CACCTCCGCC) (SEQ ID NO: 12).
Los dos cebadores en reversa se traslapan e incorporan el enlazador 12x Gly y la secuencia N-terminal del gen p110a para el sitio Spel. El enlazador 12x Gly reemplaza al enlazador de la construcción BV1052. El fragmento de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se clona en pCR2.1 TOPO (Invitrogen). De los clones resultantes, se determina que el p1661-2 es el correcto. Este plásmido se digiere con Nhe y Spel, y el fragmento resultante se aisla en gel y se purifica para la sub-clonación.
El fragmento de clonación p110-a se genera mediante la digestión enzimática del clon LR410 (véase anteriormente) con Spe I y Hindlll. El sitio Spel está en la región codificante del gen p110a. El fragmento resultante se aisla en gel y se purifica para la sub-clonación.
El vector de clonación, pBlueBac4.5 (Invitrogen), se prepara mediante digestión enzimática con Nhe y Hindlll. El vector de corte se purifica con una columna Qiagen (Qiagen N.V, Venlo, Holanda), y entonces se desfosforila con fosfatasa alcalina de intestino de becerro (CIP) (New England BioLabs, Ipswich, MA). Después de completarse la reacción de CIP, nuevamente se purifica en columna el vector de corte, para generar el vector final. Se lleva a cabo un ligamiento de tres partes, utilizando ligasa Roche Rapid y las especificaciones del vendedor.
PI3KR BV-949 p85(iSH2) - enlazador Glv - p110f¿ (longitud completa) - C-term marca His Se generan los productos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para el dominio inter-SH2 (¡SH2) de la subunidad p85 y para la subunidad p 11 O-ß de longitud completa, y se fusionan mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) traslapada.
El producto iSH2 de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se genera a partir del ADNc de la primera cadena inicialmente, utilizando los cebadores: gwG130-p01 (5'-CGAGAATATGATAGATTATATGAAGAAT-3') (SEQ ID NO: 1), y gwG130-p02 (5'-TGGTTTAATGCTGTTCATACG TTTGTCAAT-3') (SEQ ID NO: 2).
Subsiguientemente, en una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) secundaria, se agregan los sitios AttB1 de recombinación Gateway (Invitrogen) y las secuencias enlazadoras en el extremo 5' y en el extremo 3' del fragmento iSH2 de p85, respectivamente, utilizando los cebadores: gwG130-p03 (5' - GGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT ACGAAGGAGATATACATATGCGAGAATATGATAGATTATATGAAGAA T - 3') (SEQ ID NO: 3), y gwG130-p05 (5' - ACTGAAGCATCCTCCTCCTCCTCCTCCT GGTTTAATGCTGTTCATACGTTTGTC - 3') (SEQ ID NO: 13).
El fragmento ?110-ß también se genera a partir del ADNc de la primera cadena inicialmente, utilizando los cebadores: gwG130-p04 (5' - ATTAAACCAGGAGGAGGAGGAGGAGG ATGCTTCAGTTTCATAATGCC-TCCTGCT - 3') (SEQ ID NO: 4) que contiene las secuencias enlazadoras y el extremo 5' de p110-ß, y gwG130-p06 (5' - AGCTCCGTGATGGTGATGGTGATGTGC TCCAGATCTGTAGTCTTT-CCGAACTGTGTG - 3') (SEQ ID NO: 14) que contiene las secuencias del extremo 3' de ?110-ß fusionado con una marca de Histidina.
La proteína de fusión p85-iSH2/p110-ß se ensambla mediante una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) traslapada, para la reacción de los enlazadores en el extremo 3' del fragmento ¡SH2 y en el extremo 5' del fragmento ?110-ß, utilizando el cebador gwG130-p03 anteriormente mencionado y un cebador que contiene una marca de Histidina traslapada y la secuencia de recombinación de AttB2: (5' - GGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTAAGCTCCG TGATGGTGATGGTGATGTGCTCC - 3') (SEQ ID NO: 15).
Este producto final se recombina en una reacción Gateway (Invitrogen) en el vector donador pDONR201 para generar el clon de entrada ORF253. Este clon se verifica mediante secuenciación, y se utiliza en una reacción LR Gateway para transferir el inserto al vector pBlueBac4.5 adaptado con Gateway (Invitrogen) para la generación del vector de expresión de baculovirus LR280.
PI3K5 BV-1060 p85(iSH2) - enlazador Glv - p110d (longitud completa) - C-term marca His Se generan los productos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para el dominio inter-SH2 (iSH2) de la subunidad p85 y para la subunidad p110-d de longitud completa, y se fusionan mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) traslapada.
El producto ¡SH2 de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se genera a partir del ADNc de la primera cadena, utilizando inicialmente los cebadores: gwG130-p01 (5' - CGAGAATATGATAGATTATATGAAGAAT - 3') (SEQ ID NO: 1), y gwG130-p02 (5' - TGGTTTAATGCTGTTCA-TACGTTTGTCAAT - 3') (SEQ ID NO: 2).
Subsiguientemente, en una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) secundaria, se agregan los sitios AttB1 de recombinación Gateway (Invitrogen) y las secuencias enlazadoras en los extremos 5' y 3' del fragmento iSH2 de p85, respectivamente, utilizando los cebadores: gwG130-p03 (5' - GGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGC TACGAAGGAGATATACATATGCGAGAATATGATAGATTATATGAAGA AT - 3') (SEQ ID NO: 3), y gwG154-p04 (5' - TCCTCCTCCTCCTCCTCCTGGTTTAATG CTGTTCATACGTTTGTC - 3') (SEQ ID NO: 16).
El fragmento p110-a también se genera a partir del ADNc de la primera cadena, utilizando inicialmente los cebadores: gwG154-p01 (5' - ATGCCCCCTGGGGTGGACTGCCCCAT -3') (SEQ ID NO: 17), y gwG154-p02 (5' - CTACTG-CCTGTTGTCTTTGGACACGT -3') (SEQ ID NO: 18).
En una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) subsiguiente, se agregan las secuencias enlazadoras y una marca de Histidina en el extremo 5' y en el extremo 3' del fragmento p 110-d , respectivamente, utilizando los cebadores: gw154-p03 (5' - ATTAAACCAGGAGGAGGAGGAGGAGG ACCCCCTGGGGTGGACTGCCCCATGGA - 3') (SEQ ID NO: 19), y gwG154-p06 (5' - AGCTCCGTGATGGTGATGGTGATGTGC TCCCTGCCTGTTGTCTTTGGACACGTTGT - 3') (SEQ ID NO: 20).
La proteína de fusión p85-iSH2/p1 0-d se ensambla en una tercera reacción en cadena de la polimerasa (PCR), mediante los enlazadores traslapados en el extremo 3' del fragmento ¡SH2 y en el extremo 5' del fragmento p110-d, utilizando el cebador gwG130-p03 anteriormente mencionado y un cebador que contenía una marca de Histidina traslapada, y la secuencia de recombinación de AttB2 Gateway (Invitrogen): (5' - GGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTAAGCTCCGT GATGGTGATGGTGATGTGCTCC - 3') (SEQ ID NO: 21).
Este producto final se recombina en una reacción Gateway (Invitrogen) en el vector donador pDONR201 para generar el clon de entrada ORF319. Este clon se verifica mediante secuenciación, y se utiliza en una reacción LR Gateway para transferir el inserto al vector pBlueBac4.5 adaptado con Gateway (Invitrogen) para la generación del vector de expresión de baculovirus LR415.
PI3Kv BV-950 ?11 Qq(D144aa)- C-term marca Hís Esta construcción se obtiene en Roger Williams Lab, MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, Reino Unido (Noviembre, 2003). Descripción de la construcción en: Pacold M. E. y colaboradores (2000) Cell 103, 931-943. 1.3 Expresión y purificación de proteínas Métodos para generar el baculovirus recombinante y la proteína para las isoformas de PI3K: Los plásmidos pBlue-Bac4.5 (para las isoformas a, b, y d) o pVL1393 (para g) que contienen los diferentes genes de cinasa PI3, se co-transfectan con el ADN genómico BaculoGold WT (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, EUA), empleando los métodos recomendados por el vendedor. Subsiguientemente, el baculovirus recombinante obtenido a partir de la transfección se purifica en placa sobre células de insecto Sf9, para proporcionar varios aislados que expresan la proteína recombinante. Los clones positivos se seleccionan mediante Western del anticuerpo anti-HIS o anti-isoforma. Para las isoformas de PI3K alfa y delta, se lleva a cabo una purificación de placa secundaria sobre los primeros suministros del virus clonal de PI3K. La amplificación de todos los aislados de baculovirus se lleva a cabo a una baja multiplicidad de infección (moi) para generar un suministro de alta titulación de pasaje bajo para la producción de la proteína. Los baculovirus se designan como BV1052 (a), y BV1075 (a), BV949 (ß), BV1060 (d), y BV950 (?).
La producción de la proteína involucra la infección (pasaje 3 o más bajo) de las células suspendidas Tn5 (Trichoplusia ni) o TiniPro (Expression Systems, LLC, Woodland, CA, EUA) en un medio sin proteínas en una multiplicidad de infección de 2 a 10 durante 39 a 48 horas en matraces Erlenmeyer de vidrio de 2 litros (110 revoluciones por minuto) o bio-reactores de ondas (22 a 25 revoluciones por minuto). Inicialmente, se siembran los bio-reactores con un volumen de procesamiento de 10 litros a una densidad de 35 células/mililitro a la mitad de la capacidad (5 litros). El reactor se balancea a 15 revoluciones por minuto en la fase de crecimiento celular durante 72 horas, complementado con oxígeno al 5 por ciento mezclado con aire (0.2 litros por minuto). Inmediatamente antes de la infección, se analizan los cultivos del reactor de ondas para determinar la densidad y la viabilidad, y se diluyen hasta aproximadamente 1.56 células/mililitro. Se agregan de 100 a 500 mililitros de virus de alta titulación de pasaje bajo, siguiendo de 2 a 4 horas de cultivo adicional. Se aumenta el oxígeno hasta el 35 por ciento para el período de infección de 39 a 48 horas, y se aumentan las revoluciones por minuto de la plataforma de balanceo a 25. Durante la infección, las células se monitorean mediante el bioproceso del analizador de viabilidad Vicell (Beckman Coulter, Inc, Fullerton, CA, EUA) para determinar la viabilidad, el diámetro, y la densidad. Se toman lecturas en el Nova Bioanalyzer (NOVA Biomedical Corp., Waltham, MA, EUA) de diferentes parámetros y metabolitos (pH, saturación de 02, glucosa, etc.) cada 12 a 18 horas, hasta la cosecha. Las células del bio-reactor de ondas se recolectan dentro de 40 horas después de la infección . Las células se recolectan media nte centrifugación (4 °C a 1 , 500 revoluciones por m inuto), y subsig uientemente se mantienen sobre h ielo d u rante la ag ru pación de los grán ulos para la lisis y la purificación . Los g rupos de g ránulos se hacen con pequeñas cantidades de medio de G race no com plem entado frío (sin inhibidores de proteasa) .
Protocolo de purificación de PI3K alfa para HTS (BV1052) La PI3K alfa se pu rifica en tres pasos cromatográficos : cromatografía de afinidad de metal inmovilizado sobre una resina de Ni-Sepharose (G E Healthcare, que pertenece a General Electric Company, Fairfield , CT, EUA) , filtración de gel, utilizando u na columna Superdex 200 26/60 (GE Healthcare) , y finalmente un paso de intercambio de cationes sobre una columna SP-XL (GE Healthcare). Todos los reg uladores se enfrían hasta 4°C, y la lisis se lleva a cabo enfriados sobre hielo. El fraccionamiento de la columna se lleva a cabo rápidamente a temperatura ambiente.
Típicamente, las células de insecto congeladas se Usan en un regulador de lisis hipertónico, y se aplican a una columna I MAC preparada. La resina se lava con 3 a 5 volúmenes de columna de regulador de lisis, seguidos por 3 a 5 volúmenes de columna de regulador de lavado que contiene imidazol 45 inM, y entonces se eluye la proteína objetivo con un regulador que contiene imidazol 250 mM. Las fracciones se analizan mediante geles de SDS-PAG E teñidos con Coomassie, y las fracciones que contienen la proteína objetivo se reservan y se aplican a una columna de G FC preparada.
Las fracciones a partir de la columna de GFC se analizan mediante geles de SDS-PAGE teñidos con Coomassie, y se reservan las fracciones que contienen la proteína objetivo. La reserva a partir de la columna de GFC se diluye en un regulador bajo en sal, y se aplica a una columna SP-XL preparada. La columna se lava con regulador bajo en sal hasta que se alcanza una absorbencia de la línea base de A280 estable, y se eluye utilizando un gradiente en 20 volúmenes de columna desde NaCI 0 mM hasta NaCI 500 mM. Nuevamente, las fracciones a partir de la columna SP-XL se analizan mediante geles de SDS-PAGE teñidos con Coomassie, y se reservan las fracciones que contienen la proteína objetivo. La reserva final se dializa en un regulador de almacenamiento que contiene glicerol al 50 por ciento, y se almacena a -20°C. La reserva final se ensaya para determinar la actividad en un ensayo de cinasa de fosfoinositol.
Protocolo de purificación de PI3K beta para HTS (BV949) La PI3K beta se purifica en dos pasos cromatográficos: cromatografía de afinidad de metal inmovilizado (IMAC) sobre una resina de Ni-Sepharose (GE Healthcare), y filtración de gel (GFC), utilizando una columna Superdex 200 26/60 (GE Healthcare). Todos los reguladores se enfrían hasta 4°C, y la lisis se lleva a cabo enfriados sobre hielo. El fraccionamiento de la columna se lleva a cabo rápidamente a temperatura ambiente.
Típicamente, las células de insecto congeladas se lisan en un regulador de lisis hipertónico, y se aplican a una columna IMAC preparada. La resina se lava con 3 a 5 volúmenes de columna de regulador de lisis, seguidos por 3 a 5 volúmenes de columna de regulador de lavado que contiene imidazol 45 mM, y entonces se eluye la proteína objetivo con un regulador que contiene imidazol 250 mM. Las fracciones se analizan mediante geles de SDS-PAGE teñidos con Coomassie, y las fracciones que contienen la proteína objetivo se reservan y se aplican a una columna de GFC preparada. Las fracciones a partir de la columna de GFC se analizan mediante geles de SDS-PAGE teñidos con Coomassie, y se reservan las fracciones que contienen la proteína objetivo. La reserva final se dializa en un regulador de almacenamiento que contiene glicerol al 50 por ciento, y se almacena a -20°C. La reserva final se ensaya para determinar la actividad de cinasa de fosfoinositol.
Protocolo de purificación de PI3K gamma para HTS (BV950) La PI3K gamma se purifica en dos pasos cromatográficos: cromatografía de afinidad de metal inmovilizado (IMAC) sobre una resina de Ni-Sepharose (GE Healthcare), y filtración de gel (GFC), utilizando una columna Superdex 200 26/60 (GE Healthcare). Todos los reguladores se enfrían hasta 4°C, y la lisis se lleva a cabo enfriados sobre hielo. El fraccionamiento de la columna se lleva a cabo rápidamente a temperatura ambiente. Típicamente, las células de insecto congeladas se Usan en un regulador de lisis hipertónico, y se aplican a una columna IMAC preparada. La resina se lava con 3 a 5 volúmenes de columna de regulador de lisis, seguidos por 3 a 5 volúmenes de columna de regulador de lavado que contiene imidazol 45 mM, y entonces se eluye la proteína objetivo con un regulador que contiene imidazol 250 mM. Las fracciones se analizan mediante geles de SDS-PAGE teñidos con Coomassie, y las fracciones que contienen la proteína objetivo se reservan y se aplican a una columna de GFC preparada. Las fracciones a partir de la columna de GFC se analizan mediante geles de SDS-PAGE teñidos con Coomassie, y se reservan las fracciones que contienen la proteína objetivo. La reserva final se dializa en un regulador de almacenamiento que contiene glicerol al 50 por ciento, y se almacena a -20°C. La reserva final se ensaya para determinar la actividad de cinasa de fosfoinositol.
Protocolo de purificación de PI3K delta para HTS (BV1060) La PI3K delta se purifica en tres pasos cromatográficos: cromatografía de afinidad de metal inmovilizado sobre una resina de Ni-Sepharose (GE Healthcare), filtración de gel, utilizando una columna Superdex 200 26/60 (GE Healthcare), y finalmente un paso de intercambio de aniones sobre una columna Q-HP (GE Healthcare). Todos los reguladores se enfrían hasta 4°C, y la lisis se lleva a cabo enfriados sobre hielo. El fraccionamiento de la columna se lleva a cabo rápidamente a temperatura ambiente. Típicamente, las células de insecto congeladas se lisan en un regulador de lisis hipertónico, y se aplican a una columna IMAC preparada. La resina se lava con 3 a 5 volúmenes de columna de regulador de lisis, seguidos por 3 a 5 volúmenes de columna de regulador de lavado que contiene imidazol 45 mM, y entonces se eluye la proteína objetivo con un regulador que contiene imidazol 250 mM. Las fracciones se analizan mediante geles de SDS-PAGE teñidos con Coomassie, y las fracciones que contienen la proteína objetivo se reservan y se aplican a una columna de GFC preparada. Las fracciones a partir de la columna de GFC se analizan mediante geles de SDS-PAGE teñidos con Coomassie, y se reservan las fracciones que contienen la proteína objetivo. La reserva a partir de la columna de GFC se diluye en un regulador bajo en sal, y se aplica a una columna Q-HP preparada. La columna se lava con regulador bajo en sal hasta que se alcanza una absorbencia de la línea base de A280 estable, y se eluye utilizando un gradiente en 20 volúmenes de columna desde NaCI 0 mM hasta NaCI 500 mM. Nuevamente, las fracciones a partir de la columna Q-HP se analizan mediante geles de SDS-PAGE teñidos con Coomassie, y se reservan las fracciones que contienen la proteína objetivo. La reserva final se dializa en un regulador de almacenamiento que contiene glicerol al 50 por ciento, y se almacena a -20°C. La reserva final se ensaya para determinar la actividad de cinasa de fosfoinositol.
La IC50 se determina mediante una rutina de ajuste de curva de cuatro parámetros que viene junto con "excel fit". Se emplea una ecuación logística de cuatro parámetros para calcular los valores IC50 (IDBS XLfit) del porcentaje de inhibición de cada compuesto en 8 concentraciones (usualmente 10, 3.0, 1.0, 0.3, 0.1, 0.030,0.010 y 0.003 µ?). De una manera alternativa, Los valores IC50 se calculan utilizando idbsXLfit modelo 204, el cual es un modelo logístico de 4 parámetros.
Todavía de una manera alternativa, para un ensayo de agotamiento de ATP, los compuestos de la fórmula (I) que se van a probar se disuelven en sulfóxido de dimetilo y se distribuyen directamente en una placa blanca de 384 pozos a 0.5 microlitros por pozo. Para iniciar la reacción, se agregan 10 microlitros de cinasa PI3 10 nM y 5 microgramos/mililitro de 1 -alfa-fosfatidil-inositol (Pl) a cada pozo, seguidos por 10 microlitros de ATP 2 µ?. La reacción se lleva a cabo hasta que se agota aproximadamente el 50 por ciento del ATP, y entonces se detiene mediante la adición de 20 microlitros de solución Kinase-Glo (Promega Corp., Madison, Wl, EUA). La reacción detenida se incuba durante 5 minutos, y luego se detecta el ATP restante por medio de luminiscencia. Entonces se determinan los valores IC50.
En una modalidad de la presente invención, el inhibidor de PI3K, en donde este inhibidor tiene una acción inhibidora sobre la PI3K isoforma delta, en donde el intervalo de actividad, expresado como IC50, en el ensayo enzimático de PI3K delta, es de entre 1 nM y 500 nM.
En otra modalidad de la presente invención, el inhibidor de PI3K, en donde este inhibidor tiene una acción inhibidora sobre la PI3K isoforma delta, en donde el intervalo de actividad, expresado como IC50, en el ensayo enzimático de PI3K delta, es de entre 1 nM y 100 nM.
En otra modalidad de la presente invención, el inhibidor de PI3K, en donde este inhibidor tiene una acción inhibidora sobre la PI3K isoforma delta, en donde el intervalo de actividad, expresado como IC50) en el ensayo enzimático de PI3K delta, es de entre 0.5nM y 10 nM.
En una modalidad de la presente invención, el inhibidor de PI3K, en donde este inhibidor tiene una acción inhibidora sobre la PI3K isoforma delta, en donde el intervalo de actividad, expresado como IC50, en el ensayo celular de PI3K delta, es de entre 1 nM y 1000 nM.
En otra modalidad de la presente invención, el inhibidor de PI3K, en donde este inhibidor tiene una acción inhibidora sobre la PI3K isoforma delta, en donde el intervalo de actividad, expresado como IC5o, en el ensayo celular de PI3K delta, es de entre 1 nM y 500 nM.
En otra modalidad de la presente invención, el inhibidor de PI3K, en donde este inhibidor tiene una acción inhibidora sobre la PI3K isoforma delta, en donde el inhibidor muestra una selectividad para la PI3K isoforma delta sobre una o más de las otras isoformas, en donde esta selectividad es de cuando menos 10 veces.
En otra modalidad de la presente invención, el inhibidor de PI3K, en donde este inhibidor tiene una acción inhibidora sobre la PI3K isoforma delta, en donde el inhibidor muestra una selectividad para la PI3K isoforma delta sobre una o más de las otras isoformas, en donde esta selectividad es de cuando menos 20 veces.
En otra modalidad de la presente invención, el inhibidor de PI3K, en donde este inhibidor tiene una acción inhibidora sobre la PI3K isoforma delta, en donde el inhibidor muestra una selectividad para la PI3K isoforma delta sobre los diferentes parálogos PI3K a y ß, en donde esta selectividad es de cuando menos 10 veces.
En otra modalidad de la presente invención, el inhibidor de PI3K, en donde este inhibidor tiene una acción inhibidora sobre la PI3K isoforma delta, en donde el inhibidor muestra una selectividad para la PI3K isoforma delta sobre los diferentes parálogos PI3K a y ß, en donde esta selectividad es de cuando menos 20 veces.
En otra modalidad de la presente invención, el inhibidor de PI3K, en donde este inhibidor tiene una acción inhibidora sobre la PI3K isoforma delta, en donde el intervalo de actividad, expresado como IC50, en el ensayo celular de PI3K delta, es de entre 1 nM y 500 nM, y en donde este inhibidor tiene una acción inhibidora sobre la PI3K isoforma delta, en donde el inhibidor muestra una selectividad para la PI3K isoforma delta sobre los diferentes parálogos PI3K a y ß, en donde esta selectividad es de cuando menos 10 veces.
En otra modalidad de la presente invención, el inhibidor de PI3K, en donde este inhibidor tiene una acción inhibidora sobre la PI3K isoforma delta, en donde el intervalo de actividad, expresado como IC50, en el ensayo celular de PI3K delta, es de entre 1 nM y 500 nM, y en donde este inhibidor tiene una acción inhibidora sobre la PI3K isoforma delta, en donde el inhibidor muestra una selectividad para la PI3K isoforma delta sobre los diferentes parálogos PI3K a y ß, en donde esta selectividad es de cuando menos 20 veces. 2. Ensayos Cel ulares 2.1 Fosfori lación de Akt 1 /2 (S473) mediada por ci nasa de fosfoi nositida-3 (PI3K) en células de Rata-1 Las células de Rata-1 que sobre-expresan establemente una forma miristoilada de la subunidad catalítica de la cinasa de fosfoinositida-3 (PI 3K) alfa , beta o delta humana, se aplicaron en placas de 384 pozos en una densidad de 7,500 (P I3K alfa) , 6,200 (PI3K beta), ó 4,000 (PI3K delta) células en 30 microlitros de medio de crecimiento Complete (medio de Eagle modificado por Dulbecco (D EM alto en glucosa) complementado con suero bovino fetal al 1 0 por ciento (volumen/volumen), aminoácidos no esenciales M EM al 1 por ciento (volumen/volumen), H EPES 1 0 mM , L-glutamina 2 mM , 1 0 microgramos/mililitro de puromicina, y Penicilina/Estreptomicina al 1 por ciento (volumen/volumen)) , y se incubaron a 37°C / C02 al 5 por ciento / 95 por ciento de humedad , d urante 24 horas. Los compuestos se diluyeron en placas con compuesto de 384 pozos, para obtener diluciones en serie de 8 puntos para 40 compuestos de prueba en sulfóxido de dimetilo al 90 por ciento, así como para 4 compuestos de referencia más 1 6 controles altos y 1 6 controles bajos (inhibidos) . Las placas de pre-dilución se prepararon mediante la dosificación por pipeta de 250 nanolitros de las soluciones de compuestos en placas de polipropileno de 384 pozos, utilizando un dosificador en nanolitros Hummingwell . Los compuestos se diluyeron previamente mediante la adición de 49.75 microlitros de medio de crecim iento Com plete. Se transfirieron 1 0 m icrolitros de la solución de com puesto previamente dilu ida a la placa de células utilizando un portador de pipetas de 384 pozos , lo cual d io como resu ltado u na concentración final en sulfóxido de di metilo del 0.1 1 por ciento. Las células se incubaron durante 1 hora a 37°C / C02 al 5 por ciento / 95 por ciento de h umedad. El sobrenadante se removió, las células se Usaron en 20 microlitros de reg ulador de lisis para la detección AlfaScreen® SureFire®.
Para la detección de p-AKT(Ser473), se utilizó el Kit de Ensayo SureFire® p-Akt 1 /2 (Ser473) (Perkin Elmer, EUA) . Se transfirieron 5 microlitros de lisado celular a las placas Proxiplate de 384 pozos de bajo volumen para la detección utilizando un portador de pipetas de 384 pozos. La adición de los reactivos AlfaScreen® SureFire® se hizo de acuerdo con el protocolo del fabricante. Primero, se agregaron 5 microlitros de regulador de reacción más la mezcla reg uladora de activación que contenía los granos aceptores AlfaScreen®, la placa se selló, y se incubó en un agitador de placas durante 2 horas a temperatura ambiente. Seg undo, se agregaron 2 microlitros de regulador de dilución que conten ía granos donantes AlfaScreen®, y la placa se incubó en un agitador de placas como anteriormente, du rante 2 horas adicionales. La placa se leyó en un lector de placas compatible con AlfaScreen®, los ajustes estándares AlfaScreen®. 2.2 Determ i nación de la activación de cél u las-B de m u ri no Se ha reconocido que la PI3KÓ modula la función de las células-B cuando se estimulan las células a través del receptor de células-B (BCR) (Okkenhaug y colaboradores, Science 297: 1031 (2002)). Para evaluar la propiedad inhibidora de los compuestos sobre la activación de las células-B, se mide la sobre-regulación de los marcadores de activación CD86 y CD69 en las células-B de murino derivadas a partir de anticuerpos de bazo de ratón después de la estimulación con anti-lgM. CD69 es un marcador de activación bien conocido para las células B y T (Sancho y colaboradores, Trends Immunol. 26: 136 (2005). CD86 (también conocido como B7-2) se expresa primordialmente en las células presentadoras de antígeno, incluyendo las células-B. Las células-B en reposo expresan CD86 en bajos niveles, pero lo sobre-regulan en seguida de la estimulación, por ejemplo, del receptor de células-B (BCR) o del receptor de IL-4. El CD86 sobre una célula-B interactúa con el CD28 sobre las células-T. Esta interacción es requerida para una activación óptima de las células-T y para la generación de una respuesta óptima de IgG 1 (Carreno y colaboradores, Annu Rev Immunol.20: 29 (2002)).
Se recolectan los bazos a partir de los ratones Balb/c, se aislan los esplenocitos, y se lavan dos veces con RPMI conteniendo suero bovino fetal (FBS) al 10 por ciento, HEPES 10 mM, y 100 Unidades/mililitro de penicilina/estreptomicina. El RPMI complementado de esta manera es subsiguientemente referido como el medio. Las células se ajustan a 2.5 X 106 células/mililitro en el medio, y se agregan 200 microlitros de la suspensión celular (5 x 106 células) a los pozos apropiados de las placas de 96 pozos.
Entonces las células se estimulan mediante la adición de 50 microlitros de mAb anti-lgM en el medio (concentración final: 30 microgramos/mililitro). Después de la incubación durante 24 horas a 37°C, las células se tiñen con los siguientes cócteles de anticuerpos: CD86-FITC anti-ratón, CD69-PerCP-Cy5.5 anti-ratón, CD19-PerCP anti-ratón, para la evaluación de las células-B, y CD3-FITC antiratón, CD69-PE anti-ratón, para la evaluación de las células-T (2 microlitros de cada anticuerpo/pozo). Después de una hora a temperatura ambiente (RT) en la oscuridad, las células se transfieren a las placas Deepwell de 96 pozos. Las células se lavan una vez con 1 mililitro de suero regulado con fosfato conteniendo suero bovino fetal (FBS) al 2 por ciento, y después de volver a suspender en 200 microlitros, las muestras se analizan en un citómetro de flujo FACS Calibur. Los linfocitos se pasan a la transferencia de puntos FSC/SSC de acuerdo con el tamaño y la granularidad, y se analizan adicionalmente para la expresión de CD19, CD3, y los marcadores de activación (CD86, CD69). Los datos se calculan a partir de las transferencias de puntos como el porcentaje de las células que se tiñen positivamente para los marcadores de activación dentro de la población de CD19+ o CD3+ utilizando el Software BD CellQest.
Para evaluar la propiedad inhibidora de los compuestos, primero se disuelven los compuestos y se diluyen en sulfóxido de dimetilo, seguido por una dilución a 1:50 en el medio. Los esplenocitos a partir de los ratones Balb/c se aislan, se vuelven a suspender, y se transfieren a las placas de 96 pozos, como se describe anteriormente (200 microlitros/pozo). Se agregan los compuestos diluidos o el solvente a las placas (25 microlitros), y se incuban a 37°C durante 1 hora. Entonces los cultivos se estimulan con 25 microlitros de mAb anti-IgM/pozo (concentración final de 30 microgramos/mililitro) durante 24 horas a 37°C, y se tiñen con CD86-FITC anti-ratón y CD19-PerCP anti-ratón (2 microlitros de cada anticuerpo/pozo). La expresión del CD86 en las células-B positivas para CD19 se cuantifica mediante citometría de flujo, como se describe anteriormente. 2.3 Determinación de activación de células-B de rata Se ha reconocido que ??3?d modula la función de las células-B cuando se estimulan las células a través del receptor de células-B (BCR) (Okkenhaug y colaboradores, Science 297: 1031 (2002). Para evaluar la propiedad inhibidora de los compuestos sobre la activación de las células-B, se mide la sobre-regulación de los marcadores de activación CD86 sobre las células-B de rata derivadas a partir de sangre entera después de la estimulación con anti-lgM e IL-4 recombinante. La molécula CD86 (también conocida como B7-2) se expresa primordialmente en las células presentadoras de antígeno, incluyendo las células-B. Las células-B en reposo expresan CD86 en bajos niveles, pero la sobre-regulan en seguida de la estimulación, por ejemplo, del BCR o del receptor de IL-4. La CD86 sobre una célula-B interactúa con CD28 sobre las células-T. Esta interacción se requiere para la activación óptima de las células- T y para la generación de una respuesta óptima de IgG 1 (Carreno y colaboradores, Annu Rev Immunol.20: 29 (2002)).
Recolección de sangre de rata Se recolectó sangre entera a partir de la aorta abdominal de ratas Lewis machos adultas (LEW/HanHsd) o utilizando una jeringa de 10 mililitros con aguja hipodérmica previamente recubierta con heparina de sodio. La sangre se transfirió a tubos Falcon de 50 mililitros, y la concentración del anticoagulante se ajustó a 100 Unidades/mililitro.
Estimulación de células-B de rata v tratamiento con un inhibidor específico Para la evaluación de los efectos in vitro de los fármacos inmunosupresores, la sangre heparinizada se diluyó previamente hasta el 50 por ciento con el medio. Como el medio sirvió el DMEM alto en glucosa (Animed cat # 1-26F01-I) complementado con 100 Unidades/mililitro de penicilina, 100 miligramos/mililitro de estreptomicina, L-glutamina 2 mM, 50 miligramos/mililitro de dextrano 40, y suero fetal de becerro al 5 por ciento (FCS, Fetaclone I, Gibco #10270-106). Entonces, 190 microlitros de sangre previamente diluida se salpicaron con 10 microlitros del compuesto de prueba previamente diluido en placas de microtitulación de fondo en U de 96 pozos (Nunc), lo cual dio como resultado una dilución en serie triple con un intervalo de concentración de 20 a 0.0003 µ?. Los pozos de control se trataron previamente con sulfóxido de dimetilo (DMSO) para obtener una concentración final de sulfóxido de dimetilo (DMSO) del 0.5 por ciento. Los cultivos se establecieron por duplicado, se mezclaron bien con agitación sobre un agitador de placas (Heidolph Titramax 101; 30 segundos, velocidad 900), pasándose por pipeta hacia arriba y hacia abajo, y se agitaron sobre el agitador de placas nuevamente. Los cultivos se incubaron a 37°C, con C02 al 5 por ciento durante 1 hora. Entonces, se agregaron 20 microlitros de Ab policlonal de IgM de cabra anti-rata (Serotec, cat # 302001), y 10 microlitros de rlL-4 recombinante diluida (Immunotools # 340085) para obtener concentraciones finales de 30 microgramos/ mililitro y de 5 nanogramos/mililitro, respectivamente. Las placas se mezclaron con agitación sobre un agitador de placas como anteriormente, y se incubaron durante 24 horas a 37°C, con C02 al 5 por ciento.
Determinación de activación de células-B mediante citometría de fluio Después de la incubación, se agregaron 15 microlitros de una solución de EDTA 25 mM por pozo, y se agitaron durante 15 minutos para desprender las células adherentes. Para el análisis de los marcadores de activación superficiales, las muestras se tiñeron entonces con CD45RA anti-rata marcado con PE-Cy5 (BD cat # 557015) para permitir el paso de las células-B en el análisis FACS. En adición, las muestras se tiñeron con CD86 anti-rata marcado con PE (BD cat # 551396). Todos los procedimientos de teñido se llevaron a cabo a temperatura ambiente durante 30 minutos en la oscuridad. Después de la incubación, las muestras se transfirieron a las placas de microtitulación de fondo en V de 96 pozos profundos (Corning # 396096) que contenían 2 mililitros/pozo de Solución de Lisis BD (BD # 349202). Después de la lisis de los eritrocitos, las muestras se lavaron con 2 mililitros de CellWASH (BD # 349524). Los datos se adquirieron en un citómetro de flujo LSRII o FACScalibur (BD Biosciences), utilizando el software Cellquest Plus o DIVA (versión 6.1.1), respectivamente. Los linfocitos se pasaron a la transferencia de puntos FSC/SSC de acuerdo con el tamaño y la granularidad, y se analizaron adicionalmente para la expresión de CD45RA y los marcadores de activación. Los datos se calcularon a partir de las transferencias de puntos o los histogramas como el porcentaje de las células positivamente teñidas para los marcadores de activación dentro de la población CD45RA + .
Evaluación Estadística El porcentaje de inhibición de activación de células-B después de la exposición al fármaco se calculó mediante la siguiente fórmula: Estimulación sin fármaco - estimulación con fármaco % Inhibición = 100 x Estimulación sin fármaco - no estimuladas Se utilizó el software ORIGIN 7 (OriginLab Corporation, Northampton, MA) para el ajuste de la curva de regresión no lineal. Se obtuvo la concentración del fármaco que daba como resultado una inhibición del 50 por ciento (IC5o) mediante el ajuste de la ecuación de H ill para los datos de in hibición . 2.4 Determ i nación de IL-6 i nducida por TLR9 en esplenocitos de ratón Preparación de suspensión de células ind ividuales a partir de bazo de ratón Los bazos se disectaron a parti r de ratones C57BL/6 inmediatamente en seguida de la eutanasia. El exceso de grasa se recortó de los bazos antes de triturar el bazo a través de un cernidor de células de 0.4 mieras utilizando un émbolo de una jeringa de 5 mililitros. Se preparó una suspensión de células individuales, y el volumen se ajustó a 1 5 mililitros en un tubo Falcon de 50 mililitros utilizando suero regulado con fosfato (PBS) frío. Las células se centrifugaron a 1 500 revoluciones por min uto durante 5 minutos a 4°C antes de remover el sobrenadante y de volver a suspender en 5 mililitros de regulador de lisis de glóbulos rojos sang u íneos por bazo, y de la incubación durante 5 minutos a temperatura ambiente. Se agregó suero regulado con fosfato (PBS) helado (30 mililitros) a las células antes de la centrifugación a 1 500 revoluciones por minuto durante 5 min utos a 4°C. El sobrenadante se removió y las células se lavaron dos veces con 40 mililitros del medio de cultivo de esplenocitos de murino (MSCM) . El MSCM consistió en RPM I complementado con 1 00 unidades/mililitro de penicilina y 1 00 microgramos/mililitro de estreptomicina, aminoácidos no esenciales 1 x, piruvato de sodio 1 mM , ß-mercaptoetanol 0.05 m M , y suero bovino fetal (FBS) inactivado por calor al 1 0 por ciento. Las células se volvieron a suspender en 1 0-20 m ililitros de M S CM y se contaron utilizando u n contador de células Countess . Se obtuvieron aproxim adamente 60 x 1 06 esplenocitos a partir de u n solo bazo de ratón C57BL/6.
Estimulación de esplenocitos de murino y tratamiento con un inhibidor específico Los esplenocitos se emplacaron en u na densidad final de 2 x 105 células/pozo en un volumen de 1 00 microlitros en placas de fondo plano de 96 pozos, y se incubaron en una incubadora humidificada a 37°C d u rante 2 a 4 horas. Después, los compuestos que se iban a probar se dosificaron utilizando una máquina automatizada de manejo de líquidos, utilizando placas de suministro de compuestos previamente preparadas. Las placas de suministro consistieron en los compuestos (en u n 90 por ciento/1 0 por ciento de DMSO/ddH20) arreglados en 8 a 1 0 puntos utilizando diluciones dobles o triples. La máquina de manejo de líquidos dosificó 1 microlitro de cada dilución a partir de la placa de fuente de compuesto previamente preparada, hacia el pozo de destino apropiado de la placa de 96 pozos. La concentración de partida final de los compuestos en el cultivo celular fue de 1 0 µ? . La concentración final de sulfóxido de d imetilo (DMSO) en los cultivos celulares fue del 0.5 por ciento. Las células se incubaron con los compuestos durante 1 hora antes de la adición del ligando de TLR. Entonces, se ag regó una concentración 10x EC80 de CpG 1 826 en un volumen de 20 microlitros (para un volumen de cultivo final de 200 microlitros), sobre lo cual, los cultivos se incubaron durante la noche en una incubadora humidificada a 37°C.
Determinación de lnterleucina-6 mediante ELISA Después del cultivo durante la noche, las placas se centrifugaron a 2,000 revoluciones por minuto durante 5 minutos a temperatura ambiente. Subsiguientemente, se transfirieron 150 microlitros de cada cultivo a placas de fondo en V de 96 pozos, y se midieron los niveles de IL-6 utilizando un kit de ELISA de emparedado de IL-6 de ratón comercialmente disponible. Dicho de una manera breve, las placas se recubrieron durante la noche con el anticuerpo de captura antes del bloqueo durante 1 hora con suero regulado con fosfato (PBS)/albúmina de suero bovino (BSA) al 0.1 por ciento. Las muestras y los estándares se agregaron en un volumen de 50 microlitros, y la placa se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de la remoción de los estándares/muestras, la placa se lavó utilizando suero regulado con fosfato (PBS)/Tween al 0.05 por ciento antes de la adición de 50 microlitros del anticuerpo de detección biotinilado, sobre lo cual la placa se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente con agitación. Las placas se lavaron nuevamente antes de la adición de 50 microlitros de estreptavidina-peroxidasa de radícula roja por pozo durante 20 minutos. En seguida de los lavados adicionales de la placa, se agregaron 50 microlitros de substrato TMB a cada pozo, y las placas se incubaron durante 20 minutos antes de la adición de 25 microlitros/pozo de solución de paro. Se midieron los niveles de IL-6 utilizando un lector de placas SpectraMax 190 (450 nm), y se analizaron utilizando el software SoftMax Pro y GraphPad Prism. 2.5 Determinación de IFNalfa inducido por TLR9 en células humanas mononucleares de sangre periférica (PBMC) Preparación de células humanas mononucleares de sangre periférica (PBMC) a partir de sangre humana fresca Se recolectó sangre humana (aproximadamente 75 mililitros) en 10 tubos S-Monovette que contenían Heparina (S-Monovette 7.5 mililitros de NH Heparina, 16 Unidades Internacionales/mililitro de sangre; Starstedt). Los tubos LeucosepMR (30 mililitros, #227290; Greiner Bio-one) se prepararon mediante la adición de 15 mililitros del medio de separación de linfocitos LSM1077 R por tubo (#J15-004; PAA Laboratories), y centrifugación durante 30 segundos a 1,000 g. Se transfirieron unos 25 mililitros de sangre a tubos LeucosepMR en seguida de la dilución con partes iguales de suero regulado con fosfato (PBS) (sin Ca2+/Mg2+; #14190-094). Las muestras se centrifugaron a 800 g durante 20 minutos a 22°C utilizando un centrífugo Eppendorf 5810R sin freno. La capa de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se removió cuidadosamente de la interfase del plasma:medio de separación, y se transfirió a un tubo limpio de 50 mililitros. Las células se lavaron una vez mediante la adición de suero regulado con fosfato (PBS) (hasta 45 mililitros), y se centrifugaron (1,400 revoluciones por minuto, 10 minutos a 22°C) con freno (ajustado a la velocidad 9), utilizando un Eppendorf 5810R. Las células aglomeradas se volvieron a suspender cuidadosamente en el Medio (RPMI 1640 + GlutaMAX-l, 2-mercaptoetanol 0.05 mM, HEPES 10 mM, y suero fetal de becerro (FCS) al 5 por ciento por volumen/volumen), y las muestras se reservaron. Los componentes del medio de 2-mercaptoetanol (#31350-010; 50 mM), Hepes (#15630-056, 1M), y RPMI 1640 (1x) + GlutaMAX-l (#61870-010) se obtuvieron en Gibco. El suero fetal de becerro (FCS) (#2-01F36-1) se obtuvo en Amimed. Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se contaron utilizando un contador de células Countess® Automated (la muestra se diluyó previamente a 1:10 en el Medio, antes de la adición de un volumen igual (10 microlitros) de Azul de Tripano). Las células se diluyeron hasta 4 x 106 células/mililitro, y se sembraron en placas de 384 pozos (#353962; Becton Dickinson AG), para dar un volumen final de 25 microlitros (es decir, 1 x 105 células/pozo).
Estimulación de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) v tratamiento con el inhibidor específico Los compuestos se diluyeron previamente en sulfóxido de dimetilo (DMSO) al 100 por ciento en volumen/volumen (#41640-100 mililitros; Sigma-Aldrich), seguido por la transferencia en el Medio (para alcanzar una concentración final de sulfóxido de dimetilo (DMSO) del 0.25 por ciento). Las células se trataron con la dilución apropiada del compuesto (5 microlitros) o del control de vehículo (5 microlitros), y se incubaron durante 30 minutos a 37°C en una incubadora humidificada en aire con C02 al 5 por ciento (volumen/ volumen). Las células se estimularon con CpG2216 (0.3 µ?; #tlrl- hodna; Invivogen) o con el control de vehículo (10 microlitros/pozo), y se incubaron durante 20 horas. Las placas se centrifugaron brevemente (200 x g durante 2 minutos a 22°C), y se removieron muestras del sobrenadante (30 microlitros) para la cuantificación de los niveles de IFNa.
Cuantificación de IFNa utilizando la tecnología AlphaLISA Para la cuantificación de IFNalfa, se utilizó el kit AlphaLISA de interferón humano (#AL264F) de PerkinElmer. Se preparó fresca una mezcla de anticuerpos que contenía gránulos aceptores anti-IFNa (5 microgramos/mililitro final), y anticuerpo biotinilado anti-IFNa (0.5 nM final), y se dosificó (5 microlitros) en placas OptiplatesMR de 384 pozos (#6007299; PerkinElmer). Se preparó una dilución de los estándares de IFNa conocidos (IFNa B humano (2b)), y se agregaron junto con los sobrenadantes celulares (5 microlitros) a las placas anteriores. Las placas se centrifugaron brevemente (pulso a 200 g), se cubrieron con película selladora con adhesivo, se pusieron en vórtex, y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente en la oscuridad. Se prepararon gránulos donadores recubiertos con estreptavidina (20 microgramos/mililitro final), y se agregaron a cada pozo (5 microlitros) en un área luz oscura (mezcla sensible a la luz). Las placas se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente (Las placas no deben centrifugarse ni cubrirse). Después de la incubación, las placas se leyeron con un lector de múltiples placas EnVisionMR equipado con la opción ALPHA utilizando los propios "ajustes estándares AlphaScreen" del instrumento (por ejemplo, tiempo total de medición: 550 milisegundos, Láser de 680 nanómetros, tiempo de excitación: 180 milisegundos, espejo: D640 as, filtro de emisión: M570w, longitud de onda central de 570 nanómetros, anchura de banda de 100 nanómetros, transmitancia del 75 por ciento). Los datos se recolectaron para el análisis y la cuantificación de los niveles de IFNa.
Evaluación v análisis de datos Los datos se analizaron utilizando Excel XL Fit 4.0 (Microsoft) con la adición XLfit (IDBS; versión 4.3.2). Se determinaron las concentraciones específicas de IFNa siguiendo la extrapolación a las curvas estándares utilizando el IFNa B humano (2b). Los valores ICS0 individuales de los compuestos se determinaron mediante regresión no lineal después del ajuste de las curvas a los datos experimentales. 3. Determinación de la producción de anticuerpos en glóbulos rojos sanguíneos de ovejas (SRBC).
En breve, las ratas OFA se inyectaron intravenosamente (i.v.) con eritrocitos de ovejas en el día 0 (dO), y se trataron oralmente en cuatro días consecutivos (dO a d3) con los compuestos en investigación. Se prepararon suspensiones de células de bazo el día 4 (d4), y los linfocitos se aplicaron a agar blando en la presencia de las células indicadoras (SRBC), y el complemento. La lisis de las células indicadoras debida a la secreción de los anticuerpos específicos de SRBC (predominantemente de la subclase IgM), y a la presencia del complemento, proporcionó las placas. El número de placas por placa se contó y se expresó como el número de placas por bazo.
Inmunización: Los grupos de cinco ratas OFA hembras se inmunizaron en el día 0 con 2 x 108/mililitro de SRBC (obtenidas en Laboratory Animal Services LAS, Novartis Pharma AG), en un volumen de 0.5 mililitros por rata por inyección intravenosa (i.v.).
Tratamiento con el compuesto: Los animales se trataron con el compuesto suspendido en CMC al 0.5 por ciento, Tween 80 al 0.5 por ciento, durante 4 días consecutivos (días 0, 1, 2 y 3) empezando en el día de la inmunización. El compuesto se administró oralmente dos veces al día con intervalos de 12 horas entre dosis, en un volumen de aplicación de 5 mililitros/kilogramo de peso corporal.
Preparación de suspensiones de células de bazo: En el día 4, los animales se sacrificaron con C02 Los bazos se removieron, se pesaron, y se depositaron en tubos de plástico que contenían 10 mililitros de solución de sal balanceada de Hank fría (4°C) (HBSS; Gibco, pH de 7.3, conteniendo 1 miligramo de Rojo de Fenol / 100 mililitros) para cada bazo de rata. Los bazos se homogeneizaron con un pistilo de vidrio, se dejaron sobre hielo durante 5 minutos, y se transfirió 1 mililitro del sobrenadante a un nuevo tubo. Las células se lavaron una vez en 4 mililitros de solución de sal balanceada de Hank (HBSS), y entonces los sobrenadantes se desecharon, y los gránulos se volvieron a suspender en 1 mililitro de solución de s al balanceada de H ank (H BS S) . Los n úmeros de linfocitos por bazo se determ inaron med iante el contador de células autom atizado , y las suspensiones de célu las de bazo se ajusta ron a una concentración de célu las de 30 x 1 06/milil¡tro.
Ensayo de formación de placas: Se prepararon cajas de Petri de agar blando con agarosa al 0.7 por ciento (SERVA) en solución de sal balanceada de Hank (H BSS) .
En adición , se preparó un mililitro de agarosa al 0.7 por ciento en tubos de plástico, y se mantuvo a 48°C en u n baño de agua. Se agregaron unos 50 microlitros de una suspensión de células de bazo a 30 x 1 06/mililitro, y 50 microlitros de SRBC a 40 x 1 08/m i I i litro , se mezclaron rápidamente (Vórtex) , y se vertieron sobre los platos de agarosa preparados. Las cajas de Petri se inclinaron ligeramente para lograr una distribución uniforme de la mezcla celular sobre la capa de agarosa . Los platos se dejaron a temperatura ambiente durante 1 5 mi nutos, y entonces se incubaron a 37°C durante 60 minutos. Entonces, se agregaron 1 .4 mililitros de complemento de cobayo (Harían; 1 0 por ciento), y se contin uó la incubación durante otros 60 minutos a 37°C. Los anticuerpos específicos de SRBC fueron liberados por las células-B fuera de la placa enlazadas al antígeno (SRBC) en su vecindad . Estos complejos de antígeno-anticuerpo activaron el complemento y condujeron a la lisis de las SRBC , dejando una mancha brillante (placa) dentro de la capa roja de eritrocitos. Las placas se contaron con un microscopio.
Se utilizó la siguiente fórmula para la determinación de la inhibición de la formación de placa: % Inhibición = C * 100 / V-100 con: V = número promedio de placas/bazo pOara el grupo de vehículo; C = número promedio de placas/bazo para el grupo tratado con el compuesto.
Referencias: N.K. Jerne y A. A. Nordin (1963) Plaque formation in agar by single antibody-producing cells. Science 140: 405.
N.K. Jerne, A. A. Nordin y C. Henry (1963) The agar plaque technique for recognizing antibody-producing cells. En: "Cell Bound Antibodies", B. Amos y H. Koprowski, Editores, Wistar Inst. Press, Filadelfia, páginas 109-125.
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REIVINDICACIONES
1. Un compuesto de la fórmula (I): o una sal del mismo, en donde: Y se selecciona a partir de O o NH; V se selecciona a partir de CR5 ó N; W se selecciona a partir de CH2, u O; U se selecciona a partir de N o CH; Q se selecciona a partir de N o CR6; en donde U y Q no son ambos N; R1 se selecciona a partir de fenilo, piridilo, pirimidinilo, pirazinilo, piridazinilo, 1 ,2,3-triazinilo, 1 ,2,4-triazinilo, 1 ,3,5-triazinilo, o -X-R4 en donde X se selecciona a partir de C(O), S(0)2 ó CH2, y R4 se selecciona a partir de alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, halo-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, hidroxi-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, alcoxilo de 1 a 8 átomos de carbono-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, ciano-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, N,N-di-alquilo de 1 a 4 átomos de carbono-amino-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono-sulfon il-alq uilo de 1 a 8 átomos de carbono, fenilo, heterociclilo, heterociclil-oxilo, heterociclil-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, cicloalquilo de 3 a 12 átomos de carbono, cicloalquiloxilo de 3 a 12 átomos de carbono, cicloalquilo de 3 a 12 átomos de carbono-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, heteroarilo, heteroaril-oxilo, heteroaril-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, hidroxilo, alcoxilo de 1 a 8 átomos de carbono, amino, N-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-amino, o N,N-di-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-amino, en donde el alquilo de 1 a 8 átomos de carbono en N-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-amino y en N , N-di-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-amino puede estar insustituido o sustituido por halógeno, hidroxilo, o alcoxilo de 1 a 4 átomos de carbono, en donde el cicloalquilo de 3 a 12 átomos de carbono en cicloalquilo de 3 a 12 átomos de carbono y en cicloalquilo de 3 a 12 átomos de carbono-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono puede estar insustituido o sustituido por 1 a 5 sustituyentes seleccionados a partir de halógeno, hidroxilo, o alcoxilo de 1 a 4 átomos de carbono; en donde el 'heterociclilo' es un sistema de anillo monocíclico de 3 a 7 miembros saturado o parcialmente insaturado que contiene de 1 a 3 heteroátomos seleccionados a partir de N, O o S, cada uno de los cuales está insustituido o sustituido por 1 a 5 sustituyentes seleccionados a partir de oxo, halógeno, alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, halo-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, hidroxi-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, hidroxilo, alcoxilo de 1 a 8 átomos de carbono, alcoxilo de 1 a 8 átomos de carbono-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, amino, N-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-amino, N,N-di-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-amino, alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-carbonilo, halo-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-carbonilo, hidroxi-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-carbonilo o alcoxilo de 1 a 8 átomos de carbono-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-carbonilo; en donde el 'heterociclilo' se puede unir en un heteroátomo o en un átomo de carbono, y en donde los heteroátomos de N y/o S también se pueden oxidar opcionalmente hasta diferentes estados de oxidación, en donde el 'heteroarilo' es un sistema de anillo monocíclico de 3 a 7 miembros completamente insaturado que contiene de 1 a 3 heteroátomos seleccionados a partir de N, O o S, o pirazolo-[1 ,5-a]-pirimidina o imidazo-[2, 1 -b]-tiazol, cada uno de los cuales está insustituido o sustituido por 1 a 5 sustituyentes seleccionados a partir de halógeno, alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, halo-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, hidroxi-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, hidroxilo, alcoxilo de 1 a 8 átomos de carbono, alcoxilo de 1 a 8 átomos de carbono-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, amino, N-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-amino, N,N-di-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-amino, alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-carbonilo, halo-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-carbonilo, hidroxi-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-carbonilo o alcoxilo de 1 a 8 átomos de carbono-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-carbonilo; en donde el 'heteroarilo' se puede unir en un heteroátomo o en un átomo de carbono, y en donde los heteroátomos de N y/o S también se pueden oxidar opcionalmente hasta diferentes estados de oxidación; R6 se selecciona a partir de hidrógeno, halógeno, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, halo-alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, alcoxilo de 1 a 4 átomos de carbono, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono-sulfonilo, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono-sulfinilo, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono-sulfanilo, halo-alcoxilo de 1 a 4 átomos de carbono, alcoxilo de 1 a 4 átomos de carbono-alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, amino, N-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-amino, N,N-di-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-amino; R7 se selecciona a partir de hidrógeno, halógeno, ciano, nitro, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, halo-alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, alcoxilo de 1 a 4 átomos de carbono, N(R8)2-sulfonilo, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono-sulfonilo, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono-sulfonil-amino, alcoxilo de 1 a 8 átomos de carbono-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, amino, N-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-amino, o N,N-di-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-amino; o R6 y R7, son juntos CH=CH-CH = CH, en donde R8 se selecciona independientemente a partir de hidrógeno, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, alcoxilo de 1 a 4 átomos de carbono, o dos R8 junto con el nitrógeno con el que están unidos, forman un anillo heterocíclico de 4 a 7 miembros que contiene de 1 a 2 heteroátomos seleccionados a partir de N, O, S, que está insustituido o sustituido por 1 a 3 sustituyentes seleccionados a partir de alquilo de 1 a 4 átomos de carbono; R5 se selecciona independientemente a partir de H, D, F o alquilo de 1 a 2 átomos de carbono; R30 se selecciona independientemente a partir de H, D o F.
2. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 o una sal del mismo, de la fórmula (le'):
3. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 o una sal del mismo, de la fórmula (Id'): (Id').
4. Un compuesto de acuerdo con cualquiera reivindicaciones 1 ó 2 o una sal del mismo, de la fórmula (le1)
5. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 ó 3, o una sal del mismo, de la fórmula (lf):
6. Un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o una sal del mismo, en donde: R1 se selecciona a partir de fenilo, piridilo, pirimidinilo, pirazinilo, piridazinilo, 1 ,2,3-triazinilo, 1 ,2,4-triazinilo, 1 ,3,5-triazinilo, o -X-R4, en donde: R4 se selecciona a partir de alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, hidroxi-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, alcoxilo de 1 a 8 átomos de carbono-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, ciano-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, N,N-di-alquilo de 1 a 4 átomos de carbono-amino-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono-sulfonil-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, fenilo, heterociclilo, heterociclil-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, cicloalquilo de 3 a 12 átomos de carbono, heteroarilo, heteroaril-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, alcoxilo de 1 a 8 átomos de carbono, en donde el alquilo de 1 a 8 átomos de carbono en N-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-amino y en N,N-di-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-amino puede estar insustituido o sustituido por halógeno, hidroxilo, o alcoxilo de 1 a 4 átomos de carbono, en donde el cicloalquilo de 3 a 12 átomos de carbono en cicloalquilo de 3 a 12 átomos de carbono y en cicloalquilo de 3 a 12 átomos de carbono-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono puede estar insustituido o sustituido por halógeno, hidroxilo, 0 alcoxilo de 1 a 4 átomos de carbono; en donde el 'heterociclilo' es un sistema de anillo monocíclico de 3 a 7 miembros saturado o parcialmente insaturado que contiene de 1 a 3 heteroátomos seleccionados a partir de N, O o S, que está insustituido o sustituido por 1 a 5 sustituyentes seleccionados a partir de oxo, halógeno, alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, halo-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, hidroxi-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, hidroxilo, alcoxilo de 1 a 8 átomos de carbono, alcoxilo de 1 a 8 átomos de carbono-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, amino, N-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-amino, N,N-di-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-amino, alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-carbonilo, halo-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-carbonilo, hidroxi-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-carbonilo o alcoxilo de 1 a 8 átomos de carbono-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-carbonilo; en donde el 'heterociclilo' se puede unir en un heteroátomo o en un átomo de carbono, y en donde los heteroátomos de N y/o S también se pueden oxidar opcionalmente hasta diferentes estados de oxidación, en donde el 'heteroarilo' es un sistema de anillo monocíclico de 3 a 7 miembros completamente insaturado que contiene de 1 a 3 heteroátomos seleccionados a partir de N, O o S, o pirazolo-[1 ,5-a]-pirimidina o imidazo-[2, 1 -b]-tiazol, cada uno de los cuales está insustituido o sustituido por 1 a 5 sustituyentes seleccionados a partir de halógeno, alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, halo-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, hidroxi-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, hidroxilo, alcoxilo de 1 a 8 átomos de carbono, alcoxilo de 1 a 8 átomos de carbono-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, amino, N-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-amino, N , N -di-alq uilo de 1 a 8 átomos de carbono-amino, alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-carbonilo, halo-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-carbonilo, hidroxi-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-carbonilo o alcoxilo de 1 a 8 átomos de carbono-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-carbonilo; en donde el 'heteroarilo' se puede unir en un heteroátomo o en un átomo de carbono, y en donde los heteroátomos de N y/o S tam bién se pueden oxida r opcionalm ente hasta d iferentes estados de oxidación .
7. U n com puesto de acuerdo con cualq uiera de las reivindicaciones 1 a 6 o una sal del m is mo , en donde : R1 se selecciona a partir de: -X-R4, en donde: R4 se selecciona a partir de alqu ilo de 1 a 8 átomos de carbono, hidroxi-alq uilo de 1 a 8 átomos de carbono, alcoxilo de 1 a 8 átomos de carbono-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, ciano-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, N , N-di-alquilo de 1 a 4 átomos de carbono-amino-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono-sulfonil-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, fenilo, heterociclilo, heterociclil-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, cicloalquilo de 3 a 1 2 átomos de carbono, heteroarilo, heteroaril-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, alcoxilo de 1 a 8 átomos de carbono, en donde el alquilo de 1 a 8 átomos de carbono en N-alqu ilo de 1 a 8 átomos de carbono-amino y en N , N-di-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-amino puede estar insustituido o sustituido por halógeno, hidroxilo, o alcoxilo de 1 a 4 átomos de carbono, en donde el cicloalquilo de 3 a 1 2 átomos de carbono en cicloalquilo de 3 a 1 2 átomos de carbono y en cicloalquilo de 3 a 12 átomos de carbono-alq uilo de 1 a 8 átomos de carbono puede estar insustituido o sustituido por halógeno, h id roxilo, o alcoxilo de 1 a 4 átomos de carbono ; en donde el 'heterociclilo' es un sistema de anillo monocíclico de 3 a 7 miembros saturado o parcialmente insaturado que contiene de 1 a 3 heteroátomos seleccionados a partir de N, O o S, que está insustituido o sustituido por 1 a 5 sustituyentes seleccionados a partir de oxo, halógeno, alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, halo-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, hidroxi-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, hidroxilo, alcoxilo de 1 a 8 átomos de carbono, alcoxilo de 1 a 8 átomos de carbono-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, amino, N-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-amino, N,N-di-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-amino, alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-carbonilo, halo-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-carbonilo, hidroxi-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-carbonilo o alcoxilo de 1 a 8 átomos de carbono-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-carbonilo; en donde el 'heterociclilo' se puede unir en un heteroátomo o en un átomo de carbono, y en donde los heteroátomos de N y/o S también se pueden oxidar opcionalmente hasta diferentes estados de oxidación, en donde el 'heteroarilo' es un sistema de anillo monocíclico de 3 a 7 miembros completamente insaturado que contiene de 1 a 3 heteroátomos seleccionados a partir de N, O o S, o pirazolo-[1 ,5-a]-pirimidina o imidazo-[2, 1 -b]-tiazol, cada uno de los cuales está insustituido o sustituido por 1 a 5 sustituyentes seleccionados a partir de halógeno, alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, halo-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, hidroxi-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, hidroxilo, alcoxilo de 1 a 8 átomos de carbono, alcoxilo de 1 a 8 átomos de carbono-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, amino, N-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-amino, N,N-di-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-amino, alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-carbonilo, halo-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-carbonilo, hidroxi-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-carbonilo o alcoxilo de 1 a 8 átomos de carbono-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono-carbonilo; en donde el 'heteroarilo' se puede unir en un heteroátomo o en un átomo de carbono, y en donde los heteroátomos de N y/o S también se pueden oxidar opcionalmente hasta diferentes estados de oxidación; 6 se selecciona a partir de halógeno, alcoxilo de 1 a 4 átomos de carbono, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono-sulfonilo, o halo-alcoxilo de 1 a 4 átomos de carbono y R7 se selecciona a partir de hidrógeno, halógeno, ciano, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, halo-alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, o alcoxilo de 1 a 4 átomos de carbono.
8. Un compuesto de la reivindicación 1 en una forma cristalina.
9. Un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para utilizarse como un medicamento.
10. Una combinación que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y uno o más co-agentes terapéuticamente activos.
11. Un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para utilizarse en el tratamiento de un trastorno o de una enfermedad seleccionada a partir de artritis reumatoide (RA), pénfigo vulgar (PV), la forma endémica de pénfigo brasileño (Fogo selvagem), púrpura trombocitopénica idiopática (ITP), púrpura trombocitopénica trombótica (TTP), anemia hemolítica autoinmune (AIHA), hemofilia adquirida tipo A (AHA), lupus eritematoso sistémico (SLE), esclerosis múltiple (MS), miastenia grave (MG), síndrome de Sjógren (SS), vasculitidas asociadas con ANCA, crioglobulinemia, urticaria autoinmune crónica (CAU), alergia (dermatitis atópica, dermatitis por contacto, rinitis alérgica), síndrome de Goodpasture, rechazo de trasplante, cánceres de origen hematopoiético, malaria grave y cerebral, tripanosomiasis, Leishmaniasis, toxoplasmosis y neurocisticercosis.
12. Una composición farmacéutica, la cual comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables.
13. Un método para modular la actividad de las enzimas de PI3K, de preferencia de la isoforma ??3?d en un sujeto, en donde el método comprende administrar al sujeto, una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
14. Un método para el tratamiento de un trastorno o de una enfermedad seleccionada a partir de artritis reumatoide (RA), pénfigo vulgar (PV), la forma endémica de pénfigo brasileño (Fogo selvagem), púrpura trombocitopénica idiopática (ITP), púrpura trombocitopénica trombótica (TTP), anemia hemolítica autoinmune (AIHA), hemofilia adquirida tipo A (AHA), lupus eritematoso sistémico (SLE), esclerosis múltiple (MS), miastenia grave (MG), síndrome de Sjógren (SS), vasculitidas asociadas con ANCA, crioglobulinemia, urticaria autoinmune crónica (CAU), alergia (dermatitis atópica, dermatitis por contacto, rinitis alérgica), síndrome de Goodpasture, rechazo de trasplante, cánceres de origen hematopoiético, malaria grave y cerebral, tripanosomiasis, Leishmaniasis, toxoplasmosis y neurocisticercosis, el cual comprende administrar a un sujeto, una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
15. El uso de un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o de una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de un trastorno o de una enfermedad seleccionada a partir de artritis reumatoide (RA), pénfigo vulgar (PV), la forma endémica de pénfigo brasileño (Fogo selvagem), púrpura trombocitopénica idiopática (ITP), púrpura trombocitopénica trombótica (TTP), anemia hemolítica autoinmune (AIHA), hemofilia adquirida tipo A (AHA), lupus eritematoso sistémico (SLE), esclerosis múltiple (MS), miastenia grave (MG), síndrome de Sjógren (SS), vasculitidas asociadas con ANCA, crioglobulinemia, urticaria autoinmune crónica (CAU), alergia (dermatitis atópica, dermatitis por contacto, rinitis alérgica), síndrome de Goodpasture, rechazo de trasplante, cánceres de origen hematopoiético, malaria grave y cerebral, tripanosomiasis, Leishmaniasis, toxoplasmosis y neurocisticercosis.
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