KR20160103136A - 인자 viii 키메라 단백질 및 이들의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 FVIII 단백질 및 첫 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분을 포함하는 첫 번째 폴리펩티드, 그리고 VWF의 D' 도메인 및 D3 도메인을 포함하는 VWF 단백질, 길이에서 288개보다 적은 아미노산을 갖는 XTEN 서열, 그리고 두 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분을 포함하는 두 번째 폴리펩티드를 포함하는 키메라 단백질을 제공하고, 여기서 첫 번째 폴리펩티드 및 두 번째 폴리펩티드는 서로 연관된다. 본 발명은 또한, 뉴클레오티드, 벡터, 숙주 세포, 키메라 단백질을 이용하는 방법을 포함한다.
Description
전자적으로 제출된 서열 목록에 대한 언급
ASCII 텍스트 파일로 전자적으로 제출된 서열 목록 (명칭: 2159_441PC02_SequenceListing_ST25.txt; 크기: 823,500 바이트; 그리고 작성 일자: 2015년 1월 9일)의 내용은 전체적으로 본원에 참조로서 편입된다.
발명의 배경
A형 혈우병은 응고 인자 VIII (FVIII)을 인코딩하는 유전자에서 결함에 의해 유발된 출혈 장애이고, 그리고 10,000명 남아 출산마다 1-2명에 영향을 준다. Graw et al., Nat. Rev. Genet. 6(6): 488-501 (2005). A형 혈우병으로 영향을 받은 환자는 정제된 또는 재조합적으로 생산된 FVIII의 주입으로 치료될 수 있다. 모든 상업적으로 가용한 FVIII 산물은 하지만, 약 8-12 시간의 반감기를 갖는 것으로 알려져 있고, 환자에 빈번한 정맥내 투여를 필요로 한다. Weiner M.A. and Cairo, M.S., Pediatric Hematology Secrets, Lee, M.T., 12. Disorders of Coagulation, Elsevier Health Sciences, 2001; Lillicrap, D. Thromb. Res. 122 Suppl 4:S2-8 (2008)을 참조한다. 이에 더하여, FVIII 반감기를 연장하기 위해 다수의 접근법이 시도되었다. 가령, 응고 인자의 반감기를 연장하는 개발에서 접근법은 페길화, 당페길화, 그리고 알부민으로 접합을 포함한다. Dumont et al., Blood. 119(13): 3024-3030 (2012년 1월 13일자로 온라인 공개됨)을 참조한다. 하지만, 이용된 단백질 가공에 상관없이, 현재 개발 중인 지속성 FVIII 산물은 제한된 반감기 - 전임상 동물 모형에서 단지 약 1.5 내지 2 시간을 갖는 것으로 보고된다. 상기 참조. 일관된 결과가 인간에서 증명되었다, 예를 들면, rFVIIIFc는 A형 혈우병 환자에서 ADVATE®과 비교하여, 반감기를 ~ 1.7 배까지 향상시키는 것으로 보고되었다. 상기 참조. 이런 이유로, 반감기 증가는 경미한 향상에도 불구하고, 다른 T1/2 제한 인자의 존재를 지시할 수 있다. Liu, T. et al., 2007 ISTH 회의, 초록 #P-M-035; Henrik, A. et al., 2011 ISTH 회의, 초록 #P=MO-181; Liu, T. et al., 2011 ISTH 회의 초록 #P-WE-131을 참조한다.
혈장 폰빌레브란트 인자 (VWF)는 대략 16 시간 (13 내지 18 시간 범위에서 변함)의 반감기를 갖는다. Goudemand J, et al. J Thromb Haemost 2005;3:2219-27. VWF 반감기는 다수의 인자에 의해 영향을 받을 수 있다: 당화 패턴, ADAMTS-13 (트롬보스폰딘 모티프-13을 갖는 디스인테그린 및 금속단백질분해효소), 그리고 VWF에서 다양한 돌연변이.
혈장에서, 95-98%의 FVIII은 전장 VWF와의 단단한 비공유 복합체로 순환한다. 이러한 복합체의 형성은 생체내에서 FVIII의 적절한 혈장 수준의 유지에 중요하다. Lenting et al., Blood. 92(11): 3983-96 (1998); Lenting et al., J. Thromb. Haemost. 5(7): 1353-60 (2007). 전장 야생형 FVIII은 중쇄 (MW 200kD) 및 경쇄 (MW 73kD)를 갖는 이형이합체로서 주로 존재한다. FVIII이 중쇄 내에 위치 372 및 740에서, 그리고 경쇄 내에 위치 1689에서 단백질분해로 인해 활성화될 때, FVIII에 결합된 VWF는 활성화된 FVIII으로부터 제거된다. 활성화된 FVIII은 활성화된 인자 IX, 칼슘 및 인지질 ("테나아제 복합체")와 함께, 인자 X의 활성화를 유도하고, 대량의 트롬빈을 산출한다. 트롬빈은 차례로, 피브리노겐을 이후 개열하여 가용성 피브린 단위체를 형성하고, 이들은 이후, 자발적으로 중합하여 가용성 피브린 중합체를 형성한다. 트롬빈은 또한, 인자 XIII를 활성화시키는데, 이것은 칼슘과 함께, 가용성 피브린 중합체를 교차연결하고 안정시켜, 교차연결된 (불용성) 피브린을 형성하는데 역할을 한다. 활성화된 FVIII은 단백질분해에 의해 순환으로부터 빠르게 소실된다.
빈번한 투약 및 투약 일정에 의해 유발된 불편함으로 인해, 덜 빈번한 투여를 필요로 하는 FVIII 산물, 다시 말하면, 1.5 내지 2 배 반감기 제한보다 긴 반감기를 갖는 FVIII 산물을 개발하는 것이 여전히 요구된다.
발명의 짧은 요약
본 발명은 (i) 첫 번째 면역글로불린 ("Ig") 불변 영역 또는 이의 부분에 융합된 인자 VIII ("FVIII") 단백질을 포함하는 첫 번째 폴리펩티드 및 (ii) 중간의 XTEN 서열에 의해 두 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분에 융합된 VWF의 D' 도메인 및 D3 도메인을 포함하는 폰빌레브란트 인자 ("VWF") 단백질을 포함하는 두 번째 폴리펩티드를 포함하는 키메라 단백질을 제공하고, 여기서 XTEN 서열은 288개보다 적은 아미노산 잔기를 내포하고, 그리고 여기서 첫 번째 폴리펩티드는 두 번째 폴리펩티드에 연결되거나 또는 연관된다. 일정한 구체예는 본원에서 설명된 바와 같은 키메라 단백질을 포함하고, 여기서 두 번째 폴리펩티드에서 XTEN 서열은 12개 아미노산 및 287개 아미노산 사이의 길이를 갖는 아미노산 서열로 구성된다.
또한, 본원에서 설명된 바와 같은 키메라 단백질이 개시되고, 여기서 키메라 단백질은 첫 번째 폴리펩티드 및 두 번째 폴리펩티드를 포함하는 상응하는 융합 단백질과 비교하여 더욱 긴 반감기를 전시하고, 여기서 융합 단백질의 두 번째 폴리펩티드는 최소한 288개 아미노산을 내포하는 XTEN 서열을 포함한다. 일부 구체예는 최소한 288개 아미노산을 내포하는 XTEN 서열 AE288을 포함한다. 일부 구체예에서 AE288은 서열 번호: 8이다.
또한, 본원에서 설명된 바와 같은 키메라 단백질이 개시되고, 여기서 두 번째 폴리펩티드의 XTEN 서열은 약 36개, 약 42개, 약 72개, 또는 약 144개 아미노산을 내포한다. 일부 구체예에서, 두 번째 폴리펩티드의 XTEN 서열은 AE42, AE72, AE144, AG42, AG72, 또는 AG144에서 선택된다.
일부 구체예는 본원에서 설명된 바와 같은 키메라 단백질을 포함하고, 여기서 두 번째 폴리펩티드의 XTEN 서열은 서열 번호: 9, 서열 번호: 10, 서열 번호: 11, 서열 번호: 55; 서열 번호: 56; 서열 번호: 57; 서열 번호: 58; 서열 번호: 58; 서열 번호: 59; 서열 번호: 14; 서열 번호: 60; 서열 번호: 61; 서열 번호: 62; 또는 서열 번호: 63에서 선택된다.
일정한 구체예에서, 첫 번째 폴리펩티드는 FVIII 단백질을 첫 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분과 연결하는 두 번째 XTEN 서열을 더욱 포함한다. 또한, 본원에서 설명된 바와 같은 키메라 단백질이 개시되고, 여기서 첫 번째 폴리펩티드는 FVIII 단백질 내에 하나 또는 그 이상의 삽입 부위에서 삽입되는 세 번째 XTEN 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 첫 번째 폴리펩티드는 FVIII 단백질 내에 하나 또는 그 이상의 삽입 부위에서 삽입되는 두 번째 XTEN 서열을 더욱 포함한다. 일정한 구체예에서, 첫 번째 폴리펩티드는 FVIII 단백질을 첫 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분과 연결하는 세 번째 XTEN 서열을 포함한다.
또한, 본원에서 설명된 바와 같은 키메라 단백질이 개시되고, 여기서 두 번째 XTEN 서열, 세 번째 XTEN 서열, 또는 두 번째 및 세 번째 XTEN 서열은 AE42, AE72, AE864, AE576, AE288, AE144, AG864, AG576, AG288, 그리고 AG144에서 각각 독립적으로 선택된다. 일부 구체예에서, 두 번째 XTEN 서열, 세 번째 XTEN 서열, 또는 두 번째 및 세 번째 XTEN 서열은 서열 번호: 8; 서열 번호: 9, 서열 번호: 10, 서열 번호: 11, 서열 번호: 17; 서열 번호: 54; 서열 번호: 19; 서열 번호: 16; 서열 번호: 18; 서열 번호: 15; 서열 번호: 55; 서열 번호: 56; 서열 번호: 57; 서열 번호: 58; 서열 번호: 59; 서열 번호: 14; 서열 번호: 60; 서열 번호: 61; 서열 번호: 62; 또는 서열 번호: 63에서 각각 독립적으로 선택된다. 일정한 구체예에서, 두 번째 XTEN 서열, 세 번째 XTEN 서열, 또는 두 번째 및 세 번째 XTEN 서열 둘 모두 각각 독립적으로 AE288 또는 AG288이다. 일부 구체예에서, 두 번째 폴리펩티드에서 XTEN 서열은 링커에 의해 두 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분에 융합된다. 일정한 구체예에서 링커는 개열가능 링커이다.
일부 구체예는 본원에서 설명된 바와 같은 키메라 단백질을 포함하고, 여기서 링커는 인자 XIa, 인자 XIIa, 칼리크레인, 인자 VIIa, 인자 IXa, 인자 Xa, 인자 IIa (트롬빈), 엘라스타아제-2, 그랜자임-B, TEV, 엔테로키나아제, 프로테아제 3C, 소타아제 A, MMP-12, MMP-13, MMP-17, 그리고 MMP-20에서 선택되는 프로테아제에 의해 개열가능하다. 일부 구체예에서 링커는 인자 IIa (트롬빈)에 의해 개열가능하다.
또한, 본원에서 설명된 바와 같은 키메라 단백질이 개시되고, 여기서 링커는 RRRR (서열 번호: 102), RKRRKR (서열 번호: 103), RRRRS (서열 번호: 104), TQSFNDFTR (서열 번호: 1), SVSQTSKLTR (서열 번호: 3), DFLAEGGGVR (서열 번호: 4), TTKIKPR (서열 번호: 5), LVPRG (서열 번호: 6), ALRPR (서열 번호: 7), KLTRAET (서열 번호: 121), DFTRVVG (서열 번호: 122), TMTRIVGG (서열 번호: 123), SPFRSTGG (서열 번호: 124), LQVRIVGG (서열 번호: 125), PLGRIVGG (서열 번호: 126), IEGRTVGG (서열 번호: 127), LTPRSLLV (서열 번호: 128), LGPVSGVP (서열 번호: 129), VAGDSLEE (서열 번호: 130), GPAGLGGA (서열 번호: 131), GPAGLRGA (서열 번호: 132), APLGLRLR (서열 번호: 133), PALPLVAQ (서열 번호: 134), ENLYFQG (서열 번호: 135), DDDKIVGG (서열 번호: 136), LEVLFQGP (서열 번호: 137), LPKTGSES (서열 번호: 138), DKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (서열 번호: 88), 그리고 IEPRSFS (서열 번호: 194)에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 하나 또는 그 이상의 개열 부위를 포함한다. 일부 구체예에서, 링커는 TLDPRSFLLRNPNDKYEPFWEDEEK (서열 번호: 146)를 포함한다. 일정한 구체예에서, 개열 부위는 LVPRG (서열 번호: 6)의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구체예에서, 개열 부위는 IEPRSFS (서열 번호: 194)의 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 개열 부위는 IEPRSFS (서열 번호: 194)의 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 개열 부위는 FVIII의 전장 a2 영역이 아니다. 일부 구체예에서, 개열 부위는 최소한 서열 IEPR (서열 번호: 200)을 포함하는 FVIII의 a2 영역의 단편을 포함한다. 다른 구체예에서, 개열 부위는 최소한 서열 IEPR (서열 번호: 200)을 포함하는 FVIII의 a2 영역의 단편을 포함하고, 여기서 개열 부위는 전장 a2 영역이 아니다. 일정한 구체예에서, 개열 부위는 본원에서 제시된 바와 같이 또는 당분야에서 공지된 바와 같이 트롬빈 개열 검정에서 개열가능하다.
일부 구체예는 본원에서 설명된 바와 같은 키메라 단백질을 포함하고, 여기서 첫 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분은 첫 번째 Fc 영역을 포함하고 및/또는 두 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분은 두 번째 Fc 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 첫 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분 및 두 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분은 키메라 단백질의 반감기를 연장한다. 일부 구체예에서, 첫 번째 폴리펩티드 및 두 번째 폴리펩티드는 링커에 의해 융합된다. 일정한 구체예에서, 첫 번째 폴리펩티드 및 두 번째 폴리펩티드는 처리가능 링커에 의해 융합된다. 일부 구체예에서, 첫 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분은 두 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분과 연관된다. 일정한 구체예에서, 첫 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분은 공유 결합에 의해, 두 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분과 연관된다. 일부 구체예에서, 공유 결합은 이황화 결합이다.
다음 화학식 (a)-(hh) 각각을 포함하는 키메라 단백질이 또한 개시된다:
(a)
FVIII-F1:F2-L2-X-L1-V;
(b)
FVIII-F1:V-L1-X-L2-F2;
(c)
F1-FVIII:F2-L2-X-L1-V;
(d)
F1-FVIII:V-L1-X-L2-F2;
(e)
FVIII-X2-F1:F2-L2-X1-L1-V;
(f)
FVIII-X2-F1:V-L1-X1-L2-F2;
(g)
FVIII(X2)-F1:F2-L2-X1-L1-V;
(h)
FVIII(X2)-F1:V-L1-X1-L2-F2;
(i)
F1-X2-F1:F2-L2-X1-L1-V;
(j)
F1-X2-F1:V-L1-X1-L2-F2;
(k)
V-L1-X-L2-F2-L3-FVIII-L4-F1;
(l)
V-L1-X-L2-F2-L3-F1-L4-FVIII;
(m)
F1-L4-FVIII-L3-F2-L2-X-L1-V;
(n)
FVIII-L4-F1-L3-F2-L2-X-L1-V;
(o)
FVIII-L4-F1-L3-V-L1-X-L2-F2;
(p)
FVIII-L4-F1-L3-F2-L2-X-L1-V;
(q)
F2-L2-X-L1-V-L3-F1-L4-FVIII;
(r)
F2-L2-X-L1-V-L3-FVIII-L4-F1;
(s)
V-L1-X1-L2-F2-L3-FVIII(X2)-L4-F1;
(t)
V-L1-X1-L2-F2-L3-F1-L4-FVIII(X2);
(u)
F1-L4-FVIII(X2)-L3-F2-L2-X1-L1-V;
(v)
F-L4-FVIII(X2)-L3-V-L1-X1-L2-F2;
(w)
FVIII(X2)-L4-F1-L3-V-L1-X1-L2-F2;
(x)
FVIII(X2)-L4-F1-L3-F2-L2-X1-L1-V;
(y)
F2-L2-X1-L1-V-L3-F1-L4-FVIII(X2);
(z)
F2-L2-X1-L1-V-L3-FVIII(X2)-L4-F1;
(aa)
V-L1-X2-L2-F2-L3-FVIII-L4-X2-L5-F1;
(bb)
V-L1-X2-L2-F2-L3-F1-L5-X2-L4-FVIII;
(cc)
F1-L5-X2-L4-FVIII-L3-F2-L2-X2-L1-V;
(dd)
F1-L5-X2-L4-FVIII-L3-V-L1-X2-L2-F2;
(ee)
FVIII-L5-X2-L4-F2-L3-V-L1-X1-L2-F1;
(ff)
FVIII-L5-X2-L4-F2-L3-F1-L2-X1-L1-V;
(gg)
F1-L2-X1-L1-V-L3-F2-L4-X2-L5-FVIII; 또는
(hh)
F1-L2-X1-L1-V-L3-FVIII-L5-X2-L4-F2;
여기서 V는 VWF 단백질이고, 이것은 D' 도메인 및 D3 도메인을 포함하고, X 또는 X1은 288개보다 적은 아미노산을 내포하는 첫 번째 XTEN 서열이고, X2는 두 번째 XTEN 서열이고, FVIII은 FVIII 단백질을 포함하고, FVIII(X2)는 FVIII 단백질 내에 하나 또는 그 이상의 삽입 부위에 삽입된 두 번째 XTEN 서열을 갖는 FVIII 단백질을 포함하고, F1은 첫 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분이고, F2는 두 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분이고, L1, L2, L3, L4, 또는 L5는 임의선택적 링커이고, (-)는 펩티드 결합이고; 그리고 (:)는 공유 결합 또는 비공유 결합이다.
일부 구체예는 본원에서 설명된 바와 같은 키메라 단백질을 포함하고, 여기서 X 또는 X1은 12개 아미노산 및 287개 아미노산 사이의 길이에서 아미노산 서열로 구성된다.
일정한 구체예에서, 본원에서 설명된 바와 같은 키메라 단백질은 X 또는 X1이 AE288인 점을 제외하고, 상기 화학식을 포함하는 상응하는 키메라 단백질과 비교하여 더욱 긴 반감기를 전시한다. 일부 구체예에서, AE288은 서열 번호:8이다.
일부 구체예는 본원에서 설명된 바와 같은 키메라 단백질을 포함하고, 여기서 화학식에서 X 또는 X1은 약 36개, 약 42개, 약 72개, 또는 약 144개 아미노산을 내포한다. 일정한 구체예에서, 화학식에서 X 또는 X1은 AE42, AE72, AE144, AG42, AG72, 또는 AG144에서 선택된다. 일부 구체예에서, 화학식에서 X 또는 X1은 서열 번호: 9, 서열 번호: 10, 서열 번호: 11, 서열 번호: 55; 서열 번호: 56; 서열 번호: 57; 서열 번호: 58; 서열 번호: 59; 서열 번호: 14; 서열 번호: 60; 서열 번호: 61; 서열 번호: 62; 또는 서열 번호: 63에서 선택된다. 일정한 구체예에서, X2는 최소한 약 36개 아미노산, 최소한 약 42개 아미노산, 최소한 약 144개 아미노산, 최소한 약 288개 아미노산, 최소한 약 576개 아미노산, 최소한 약 864개 아미노산의 길이를 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일정한 구체예에서, X2는 AE42, AE72, AE864, AE576, AE288, AE144, AG864, AG576, AG288, 그리고 AG144에서 선택된다. 일부 구체예에서, X2는 서열 번호: 8; 서열 번호: 9; 서열 번호: 10; 서열 번호: 11; 서열 번호: 17; 서열 번호: 54; 서열 번호: 19; 서열 번호: 16; 서열 번호: 18; 서열 번호: 15; 서열 번호: 55; 서열 번호: 56; 서열 번호: 57; 서열 번호: 58; 서열 번호: 59; 서열 번호: 14; 서열 번호: 60; 서열 번호: 61; 서열 번호: 62; 또는 서열 번호: 63에서 선택된다. 일정한 구체예에서, X2는 AE288 또는 AG288이다.
X 또는 X1 및/또는 X2를 포함하지 않는 키메라 단백질과 비교하여 더욱 긴 반감기를 전시하는 X 또는 X1 및/또는 X2를 포함하는, 본원에서 설명된 바와 같은 키메라 단백질이 또한 개시된다. 일부 구체예에서, L1 및/또는 L2는 개열가능 링커이다. 일정한 구체예에서, L4 및/또는 L5는 개열가능 링커이다. 일정한 구체예에서, 링커는 인자 XIa, 인자 XIIa, 칼리크레인, 인자 VIIa, 인자 IXa, 인자 Xa, 인자 IIa (트롬빈), 엘라스타아제-2, 그랜자임-B, TEV, 엔테로키나아제, 프로테아제 3C, 소타아제 A, MMP-12, MMP-13, MMP-17, 그리고 MMP-20에서 선택되는 프로테아제에 의해 개열가능하다. 일부 구체예에서, 링커는 인자 IIa (트롬빈)에 의해 개열가능하다.
일부 구체예는 본원에서 설명된 바와 같은 키메라 단백질을 포함하고, 여기서 링커는 RRRR (서열 번호: 102), RKRRKR (서열 번호: 103), RRRRS (서열 번호: 104), TQSFNDFTR (서열 번호: 2), SVSQTSKLTR (서열 번호: 3), DFLAEGGGVR (서열 번호: 4), TTKIKPR (서열 번호: 5), LVPRG (서열 번호: 6), ALRPR (서열 번호: 7), KLTRAET (서열 번호: 121), DFTRVVG (서열 번호: 122), TMTRIVGG (서열 번호: 123), SPFRSTGG (서열 번호: 124), LQVRIVGG (서열 번호: 125), PLGRIVGG (서열 번호: 126), IEGRTVGG (서열 번호: 127), LTPRSLLV (서열 번호: 128), LGPVSGVP (서열 번호: 129), VAGDSLEE (서열 번호: 130), GPAGLGGA (서열 번호: 131), GPAGLRGA (서열 번호: 132), APLGLRLR (서열 번호: 133), PALPLVAQ (서열 번호: 134), ENLYFQG (서열 번호: 135), DDDKIVGG (서열 번호: 136), LEVLFQGP (서열 번호: 137), 그리고 LPKTGSES (서열 번호: 138)에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 하나 또는 그 이상의 개열 부위를 포함한다. 일부 구체예에서, 링커는 TLDPRSFLLRNPNDKYEPFWEDEEK (서열 번호: 146)을 포함한다. 일정한 구체예에서, 링커는 LVPRG (서열 번호: 6)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 링커는 FVIII의 a1 영역, FVIII의 a2 영역, FVIII의 a3 영역, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일정한 구체예에서, 링커는 FVIII의 a2 영역의 단편을 포함한다. a2 영역의 단편은 일부 경우에, 서열 DKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (서열 번호: 88)을 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, IEPRSFS (서열 번호: 194)의 서열을 갖는 단편을 비롯한 FVIII의 a2 영역의 더욱 작은 단편이 이용될 수 있다. 특정 구체예에서, 링커는 IEPRSFS (서열 번호: 194)의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구체예에서, 링커는 IEPRSFS (서열 번호: 194)의 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 링커는 FVIII의 전장 a2 영역이 아니다.
본원에서 설명된 바와 같은 키메라 단백질이 또한 개시되고, 여기서 FVIII의 a2 영역은 ISDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (서열 번호: 106) 또는 DKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (서열 번호: 88)과 최소한 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, a1 영역은 ISMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSV (서열 번호: 107)와 최소한 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일정한 구체예에서, a3 영역은 ISEITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQ (서열 번호: 108)와 최소한 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, F1은 첫 번째 Fc 영역을 포함하고 및/또는 F2는 두 번째 Fc 영역을 포함한다.
일부 구체예는 본원에서 설명된 바와 같은 키메라 단백질을 포함하고, 여기서 F1 및 F2를 포함하는 키메라 단백질은 F1 및 F2를 포함하지 않는 키메라 단백질과 비교하여 더욱 긴 반감기를 전시한다. 일정한 구체예에서, L3은 처리가능 링커이다. 일부 구체예에서, VWF 단백질은 비공유 결합에 의해 FVIII 단백질과 연관된다. 일부 구체예에서, 키메라 단백질의 반감기는 VWF 단백질 및/또는 XTEN 서열이 없는 FVIII 단백질과 비교하여 또는 야생형 FVIII과 비교하여 연장된다. 일정한 구체예에서, 키메라 단백질의 반감기는 VWF 단백질 또는 XTEN 서열이 없는 FVIII 단백질보다 또는 야생형 FVIII보다 최소한 약 1.5 배, 최소한 약 2 배, 최소한 약 2.5 배, 최소한 약 3 배, 최소한 약 4 배, 최소한 약 5 배, 최소한 약 6 배, 최소한 약 7 배, 최소한 약 8 배, 최소한 약 9 배, 최소한 약 10 배, 최소한 약 11 배, 또는 최소한 약 12 배 연장된다.
본원에서 설명된 바와 같은 키메라 단백질이 또한 개시되고, 여기서 키메라 단백질의 반감기는 최소한 약 17 시간, 최소한 약 18 시간, 최소한 약 19 시간, 최소한 약 20 시간, 최소한 약 21 시간, 최소한 약 22 시간, 최소한 약 23 시간, 최소한 약 24 시간, 최소한 약 25 시간, 최소한 약 26 시간, 최소한 약 27 시간, 최소한 약 28 시간, 최소한 약 29 시간, 최소한 약 30 시간, 최소한 약 31 시간, 최소한 약 32 시간, 최소한 약 33 시간, 최소한 약 34 시간, 최소한 약 35 시간, 최소한 약 36 시간, 최소한 약 48 시간, 최소한 약 60 시간, 최소한 약 72 시간, 최소한 약 84 시간, 최소한 약 96 시간, 또는 최소한 약 108 시간이다. 일부 구체예에서, 키메라 단백질의 반감기는 HemA 생쥐에서 약 40 시간이다. 일정한 구체예에서, VWF 단백질은 VWF 간극 수용체에 실제적으로 결합하지 않는다. 일부 구체예에서, VWF 단백질은 FVIII 단백질을 하나 또는 그 이상의 프로테아제 개열로부터 보호하거나, FVIII 단백질을 활성화로부터 보호하거나, FVIII 단백질의 중쇄 및/또는 경쇄를 안정시키거나, 또는 하나 또는 그 이상의 스캐빈저 수용체에 의한 FVIII 단백질의 소실을 예방할 수 있다.
일부 구체예는 본원에서 설명된 바와 같은 키메라 단백질을 포함하고, 여기서 VWF 단백질은 FVIII 단백질 상에서 VWF 결합 부위를 차폐하거나 또는 차단함으로써, 내인성 VWF가 FVIII 단백질에 결합하는 것을 저해하거나 또는 예방한다. 일정한 구체예에서, VWF 결합 부위는 FVIII 단백질의 A3 도메인 또는 C2 도메인 또는 A3 도메인 및 C2 도메인 둘 모두에서 위치된다. 일부 구체예에서, VWF 결합 부위는 서열 번호: 65의 아미노산 1669 내지 1689 및 2303 내지 2332에 상응하는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 첫 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분 및 두 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분은 동일하거나 또는 상이하다. 일정한 구체예에서, FVIII 단백질은 최소한 2개의 XTEN 서열, 최소한 3개의 XTEN 서열, 최소한 4개의 XTEN 서열, 최소한 5개의 XTEN 서열, 또는 최소한 6개의 XTEN 서열에 연결되고 및/또는 이들 서열로 삽입된다.
본원에서 설명된 바와 같은 키메라 단백질이 또한 개시되고, 여기서 FVIII 단백질은 A1 도메인, a1 산성 영역, A2 도메인, a2 산성 영역, B 도메인, A3 도메인, a3 산성 영역, C1 도메인, C2 도메인, 이들의 하나 또는 그 이상의 단편, 그리고 이들의 임의의 조합에서 선택되는 FVIII의 하나 또는 그 이상의 도메인을 포함한다.
본원에서 설명된 바와 같은 키메라 단백질이 또한 개시되고, 여기서 FVIII 단백질 내에 하나 또는 그 이상의 삽입 부위는 A1 도메인, a1 산성 영역, A2 도메인, a2 산성 영역, A3 도메인, B 도메인, C1 도메인, C2 도메인, 그리고 이들의 임의의 조합에서 선택되는 FVIII 단백질의 하나 또는 그 이상의 도메인 내에, 또는 A1 도메인 및 a1 산성 영역, a1 산성 영역 및 A2 도메인, A2 도메인 및 a2 산성 영역, a2 산성 영역 및 B 도메인, B 도메인 및 A3 도메인, A3 도메인 및 C1 도메인, C1 도메인 및 C2 도메인, 그리고 이들의 임의의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 FVIII 단백질의 하나 또는 그 이상의 도메인 사이에, 또는 A1 도메인 및 a1 산성 영역, a1 산성 영역 및 A2 도메인, A2 도메인 및 a2 산성 영역, a2 산성 영역 및 B 도메인, B 도메인 및 A3 도메인, A3 도메인 및 C1 도메인, C1 도메인 및 C2 도메인, 그리고 이들의 임의의 조합에서 선택되는 FVIII 단백질의 두 도메인 사이에 위치된다. 일부 구체예에서, FVIII 단백질 내에 하나 또는 그 이상의 삽입 부위는 표 7, 표 8, 표 9 및 표 10에서 아미노산 잔기로 구성된 군에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 아미노산이다. 일정한 구체예에서, FVIII 단백질 내에 삽입 부위는 성숙 FVIII 단백질 (서열 번호: 65)에 상응하는 아미노산 745의 즉시 하류에 위치된다. 일부 구체예에서, FVIII 단백질 내에 삽입 부위는 성숙 FVIII 단백질 (서열 번호: 65)에 상응하는 잔기 1656 및 잔기 1900의 즉시 하류에 위치된다. 일부 구체예에서, FVIII 단백질 내에 삽입 부위는 성숙 FVIII 단백질 (서열 번호: 65)에 상응하는 잔기 26, 1656 및 1900의 즉시 하류에 위치된다. 일정한 구체예에서, FVIII 단백질 내에 삽입 부위는 성숙 FVIII 단백질 (서열 번호: 65)에 상응하는 잔기 403 및 745의 즉시 하류에 위치된다. 일부 구체예에서, FVIII 단백질 내에 삽입 부위는 성숙 FVIII 단백질 (서열 번호: 65)에 상응하는 잔기 745 및 1900의 즉시 하류에 위치된다. 일정한 구체예에서, FVIII 단백질 내에 삽입 부위는 성숙 FVIII 단백질 (서열 번호: 65)에 상응하는 잔기 18 및 745의 즉시 하류에 위치된다. 일부 구체예에서, FVIII 단백질은 이중 사슬 FVIII 동종형이다. 일부 구체예에서, FVIII 단백질은 단일 사슬 FVIII 동종형이다. 일정한 구체예에서, FVIII 단백질은 B 도메인 또는 이의 부분을 포함한다. 일부 구체예에서, FVIII 단백질은 SQ B 도메인 결실된 FVIII이다.
일부 구체예는 본원에서 설명된 바와 같은 키메라 단백질을 포함하고, 여기서 단일 사슬 FVIII 동종형은 전장 성숙 인자 VIII 폴리펩티드 (서열 번호: 65)에 상응하는 잔기 1648, 잔기 1645 또는 양쪽 잔기, 또는 SQ BDD 인자 VIII (서열 번호: 67)의 잔기 754, 잔기 751 또는 양쪽 잔기에 상응하는 잔기에서 최소한 하나의 아미노산 치환을 내포한다. 일정한 구체예에서, 아미노산 치환은 아르기닌 이외에 아미노산이다. 일부 구체예에서, 이중 사슬 FVIII 동종형은 FVIII의 중쇄를 포함하는 첫 번째 사슬 및 FVIII의 경쇄를 포함하는 두 번째 사슬을 포함하고, 여기서 중쇄 및 경쇄는 금속 결합에 의해 서로 연관된다. 일정한 구체예에서, D' 도메인은 서열 번호: 21의 아미노산 764 내지 866과 최소한 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, D3 도메인은 서열 번호: 21의 아미노산 867 내지 1240과 최소한 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일정한 구체예에서, VWF 단백질은 단위체이다.
본원에서 설명된 바와 같은 키메라 단백질이 또한 개시되고, 이것은 최소한 2개의 VWF 단백질, 최소한 3개의 VWF 단백질, 최소한 4개의 VWF 단백질, 최소한 5개의 VWF 단백질, 또는 최소한 6개의 VWF 단백질을 포함한다. 일정한 구체예에서, VWF 단백질은 서열 번호: 21의 아미노산 764 내지 1240과 최소한 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, VWF 단백질은 서열 번호: 21의 아미노산 764 내지 1240으로 본질적으로 구성되거나 또는 구성된다. 일정한 구체예에서, VWF 단백질은 서열 번호: 21의 잔기 1099, 잔기 1142, 또는 양쪽 잔기 1099 및 1142에 상응하는 잔기에서 최소한 하나의 아미노산 치환을 내포한다. 일부 구체예에서, VWF 단백질은 서열 번호: 21의 잔기 1099, 잔기 1142, 또는 양쪽 잔기 1099 및 1142에 상응하는 잔기를 대체하는 시스테인 이외의 아미노산을 내포한다. 일정한 구체예에서, VWF 단백질은 VWF의 D1 도메인, D2 도메인, 또는 D1 및 D2 도메인을 더욱 포함한다.
일부 구체예는 본원에서 설명된 바와 같은 키메라 단백질을 포함하고, 여기서 VWF 단백질은 A1 도메인, A2 도메인, A3 도메인, D4 도메인, B1 도메인, B2 도메인, B3 도메인, C1 도메인, C2 도메인, CK 도메인, 이들의 하나 또는 그 이상의 단편, 그리고 이들의 임의의 조합에서 선택되는 VWF 도메인을 더욱 포함한다.
본원에서 설명된 바와 같은 키메라 단백질이 또한 개시되고, 여기서 VWF 단백질은 (1) VWF의 D' 및 D3 도메인 또는 이들의 단편; (2) VWF의 D1, D' 및 D3 도메인 또는 이들의 단편; (3) VWF의 D2, D' 및 D3 도메인 또는 이들의 단편; (4) VWF의 D1, D2, D' 및 D3 도메인 또는 이들의 단편; 또는 (5) VWF의 D1, D2, D', D3 및 A1 도메인 또는 이들의 단편으로 본질적으로 구성되거나 또는 구성된다.
일부 구체예는 본원에서 설명된 바와 같은 키메라 단백질을 포함하고, 여기서 VWF 단백질은 VWF 단백질에 작동가능하게 연결되는 VWF 또는 FVIII의 신호 펩티드를 더욱 포함한다.
본원에서 설명된 바와 같은 키메라 단백질이 또한 개시되고, 여기서 링커 중에서 하나 또는 그 이상은 최소한 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800, 또는 2000개 아미노산 잔기의 길이를 갖는다. 일부 구체예에서, 링커 중에서 하나 또는 그 이상은 약 1 내지 약 2000개 아미노산 잔기의 길이를 갖는다. 일정한 구체예에서, 링커 중에서 하나 또는 그 이상은 gly/ser 펩티드를 포함한다. 일부 구체예에서, gly/ser 펩티드는 (Gly4Ser)n (서열 번호: 94) 또는 S(Gly4Ser)n (서열 번호: 164)의 화학식을 갖고, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10으로 구성된 군에서 선택되는 양의 정수이다. 일정한 구체예에서, (Gly4Ser)n 링커는 (Gly4Ser)3 (서열 번호: 100) 또는 (Gly4Ser)4 (서열 번호: 165)이다. 일부 구체예에서, 링커는 20개 아미노산, 35개 아미노산, 48개 아미노산, 73개 아미노산, 또는 95개 아미노산을 포함한다. 일정한 구체예에서, 개열가능 링커는 SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSLVPRGSGG (서열 번호: 166)이다.
일부 구체예에서, 본원에서 설명된 바와 같은 키메라 단백질은 폴리시알화, 페길화, 또는 헤실화된다.
본원에서 설명된 바와 같은 키메라 단백질이 또한 개시되고, 여기서 첫 번째 폴리펩티드는 FVIII161 (서열 번호: 69), FVIII169 (서열 번호: 70), FVIII173 (서열 번호: 72), FVIII195 (서열 번호: 73), FVIII196 (서열 번호: 74), FVIII199 (서열 번호: 75), FVIII201 (서열 번호: 76), FVIII203 (서열 번호: 77), FVIII204 (서열 번호: 78), FVIII205 (서열 번호: 79), FVIII266 (서열 번호: 80), FVIII267 (서열 번호: 81), FVIII268 (서열 번호: 82), FVIII269 (서열 번호: 83), FVIII271 (서열 번호: 84), FVIII272 (서열 번호: 85), 또는 FVIII282 (서열 번호: 159)와 최소한 약 80%, 90%, 95%, 99%, 또는 100% 동일성을 포함하고, 그리고 두 번째 폴리펩티드는 VWF057 (서열 번호: 152) 또는 VWF059 (서열 번호: 197)와 최소한 약 80%, 90%, 95%, 99%, 또는 100% 동일성을 포함한다. 일부 구체예에서, 첫 번째 폴리펩티드는 FVIII169 (서열 번호: 70)를 포함하고, 그리고 두 번째 폴리펩티드는 VWF057 (서열 번호: 152)을 포함한다. 다른 구체예에서, 첫 번째 폴리펩티드는 FVIII169 (서열 번호: 70)를 포함하고, 그리고 두 번째 폴리펩티드는 VWF059 (서열 번호: 197)를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 첫 번째 폴리펩티드는 FVIII169 (서열 번호: 70)를 포함하고, 그리고 두 번째 폴리펩티드는 VWF062 (서열 번호: 199)를 포함한다. 일부 구체예에서, 키메라 단백질은 치료가 필요한 개체로부터 출혈을 예방하고 및/또는 정지시키는데 유효하다.
본원에서 설명된 바와 같은 키메라 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 한 세트의 폴리뉴클레오티드가 또한 개시된다. 일부 구체예에서, 본원에서 설명된 바와 같은 폴리뉴클레오티드는 PC5 또는 PC7을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 사슬을 더욱 포함한다.
일부 구체예는 본원에서 설명된 바와 같은 폴리뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 세트에 작동가능하게 연결된 하나 또는 그 이상의 프로모터를 포함하는 벡터를 포함한다.
일부 구체예에서, 본원에서 설명된 바와 같은 벡터는 PC5 또는 PC7을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 사슬을 포함하는 추가 벡터를 더욱 포함한다.
본원에서 설명된 바와 같은 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포 또한 개시된다. 일부 구체예에서, 숙주 세포는 포유류 세포이다. 일정한 구체예에서, 포유류 세포는 HEK293 세포, CHO 세포, 그리고 BHK 세포에서 선택된다.
본원에서 설명된 바와 같은 키메라 단백질, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 또는 숙주 세포, 그리고 제약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 제약학적 조성물 또한 개시된다. 일부 구체예에서, 키메라 단백질은 야생형 FVIII 단백질과 비교하여 연장된 반감기를 갖는다. 일정한 구체예에서, 키메라 단백질의 반감기는 야생형 FVIII보다 최소한 약 1.5 배, 최소한 약 2 배, 최소한 약 2.5 배, 최소한 약 3 배, 최소한 약 4 배, 최소한 약 5 배, 최소한 약 6 배, 최소한 약 7 배, 최소한 약 8 배, 최소한 약 9 배, 최소한 약 10 배, 최소한 약 11 배, 또는 최소한 약 12 배 연장된다.
일부 구체예는 본원에서 설명된 바와 같은 조성물을 포함하고, 여기서 키메라 단백질의 반감기는 최소한 약 17 시간, 최소한 약 18 시간, 최소한 약 19 시간, 최소한 약 20 시간, 최소한 약 21 시간, 최소한 약 22 시간, 최소한 약 23 시간, 최소한 약 24 시간, 최소한 약 25 시간, 최소한 약 26 시간, 최소한 약 27 시간, 최소한 약 28 시간, 최소한 약 29 시간, 최소한 약 30 시간, 최소한 약 31 시간, 최소한 약 32 시간, 최소한 약 33 시간, 최소한 약 34 시간, 최소한 약 35 시간, 최소한 약 36 시간, 최소한 약 48 시간, 최소한 약 60 시간, 최소한 약 72 시간, 최소한 약 84 시간, 최소한 약 96 시간, 또는 최소한 약 108 시간이다. 일정한 구체예에서, 키메라 단백질의 반감기는 HemA 생쥐에서 약 40 시간이다. 일부 구체예에서, 본원에서 설명된 바와 같은 조성물은 국소 투여, 안구내 투여, 비경구 투여, 척수강내 투여, 경막하 투여 및 경구 투여로 구성된 군에서 선택되는 루트에 의해 투여된다. 일정한 구체예에서, 비경구 투여는 정맥내 또는 피하 투여이다.
일부 구체예에서, 본원에서 설명된 바와 같은 조성물은 치료가 필요한 개체에서 출혈 질환 또는 장애를 치료하는데 이용된다. 일정한 구체예에서, 출혈 질환 또는 장애는 출혈 응고 장애, 혈관절증, 근육 출혈, 구강내 출혈, 출혈, 근육 내로 출혈, 경구 출혈, 외상, 두부 외상, 위장관 출혈, 두개내 출혈, 복강내 출혈, 흉곽내 출혈, 뼈 골절, 중추신경계 출혈, 인두후 공간에서 출혈, 후복막 공간에서 출혈, 장요근 덮개에서 출혈 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군에서 선택된다. 일부 구체예에서, 개체는 수술을 받기로 예정된다. 일정한 구체예에서, 치료는 예방적 또는 주문형이다.
키메라 단백질의 반감기를 연장하거나 또는 증가시키는 방법이 또한 개시되고, 여기서 상기 방법은 본원에서 설명된 바와 같은 키메라 단백질, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 숙주 세포, 또는 조성물의 효과량을 치료가 필요한 개체에 추가하는 것을 포함하고, 여기서 VWF 단백질, XTEN 서열, 첫 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분, 그리고 두 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분은 키메라 단백질의 반감기를 증가시킨다.
일부 구체예는 치료가 필요한 개체에서 출혈 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 포함하고, 상기 방법은 본원에서 설명된 바와 같은 키메라 단백질, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 숙주 세포, 또는 조성물의 효과량을 투여하는 것을 포함하고, 여기서 출혈 질환 또는 장애는 출혈 응고 장애, 혈관절증, 근육 출혈, 구강내 출혈, 출혈, 근육 내로 출혈, 경구 출혈, 외상, 두부 외상, 위장관 출혈, 두개내 출혈, 복강내 출혈, 흉곽내 출혈, 뼈 골절, 중추신경계 출혈, 인두후 공간에서 출혈, 후복막 공간에서 출혈, 그리고 장요근 덮개에서 출혈로 구성된 군에서 선택된다. 일부 구체예에서, 개체는 동물이다. 일정한 구체예에서, 동물은 인간이다. 일부 구체예에서, 개체는 A형 혈우병으로 고통받고 있다. 일정한 구체예에서, 치료는 예방적 또는 주문형이다. 일부 구체예에서, 효과량은 0.1 μg/kg 내지 500 mg/kg이다.
본원에서 설명된 바와 같은 방법이 또한 개시되고, 여기서 본원에서 설명된 바와 같은 키메라 단백질, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 숙주 세포, 또는 조성물은 국소 투여, 안구내 투여, 비경구 투여, 척수강내 투여, 경막하 투여 및 경구 투여로 구성된 군에서 선택되는 루트에 의해 투여된다. 일정한 구체예에서, 비경구 투여는 정맥내 투여, 피하 투여, 근육내 투여, 그리고 피내 투여로 구성된 군에서 선택된다.
일부 구체예는 키메라 단백질을 만드는 방법을 포함하고, 상기 방법은 하나 또는 그 이상의 숙주 세포를 본원에서 설명된 바와 같은 폴리뉴클레오티드 또는 벡터로 형질감염시키고, 그리고 키메라 단백질을 숙주 세포에서 발현하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 본원에서 설명된 바와 같은 방법은 키메라 단백질을 단리하는 것을 더욱 포함한다. 일정한 구체예에서, 키메라 단백질은 개체에서 출혈을 정지시키고 및/또는 예방하는데 유효하다.
도면의 간단한 설명
도면 1은 Fc 영역에 융합된 FVIII 단백질 (A1-A2-부분적인 또는 전체 B-A3-C1-C2)을 포함하는 첫 번째 폴리펩티드 (여기서 XTEN이 FVIII 단백질 이내에 삽입 부위에서 삽입된다), 그리고 D'D3 도메인을 포함하는 VWF 단백질, 288개보다 적은 아미노산을 갖는 XTEN, 트롬빈 개열가능 링커 및 두 번째 Fc 영역을 포함하는 두 번째 폴리펩티드를 포함하는 키메라 단백질의 계통도를 보여준다. FVIII 단백질 내에 XTEN 삽입 및/또는 VWF 단백질에 융합은 수력학적 반지름을 증가시킴으로써 및 수용체-매개된 소실을 차단함으로써 키메라 단백질의 반감기를 연장한다. VWF의 D'D3 도메인은 내인성 VWF와의 FVIII 상호작용을 차단하고, FVIII 단백질을 안정시키고, 그리고 키메라 단백질의 반감기를 연장한다. Fc 도메인은 D'D3 도메인을 FVIII 단백질과 공유적으로 연결하고, 그리고 FcRn-매개된 재활용 경로를 통해 키메라 단백질의 반감기를 연장할 수 있다. 트롬빈-개열가능 링커는 FVIII 활성화 시에 D'D3 도메인의 방출을 할 수 있게 하고, 그리고 VWF의 FVIII 및 D'D3 도메인 사이에 정확한 정렬을 담보한다.
도면 2는 FVIII-XTEN-Fc:D'D3-XTEN-Fc 이형이합체에 대한 3가지 플라스미드 발현 시스템을 보여준다: XTEN이 B 도메인 내에 삽입되는 단일 사슬 FVIII-XTEN-Fc를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 첫 번째 플라스미드; D1D2D'D3-XTEN-Fc를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 두 번째 플라스미드, 여기서 XTEN 서열은 288개보다 적은 아미노산을 포함한다; 그리고 PACE, 프로펩티드 처리 효소를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 세 번째 플라스미드. 3개의 폴리펩티드가 이들 3개의 플라스미드로부터 발현될 때, VWF의 D1D2 프로펩티드 도메인은 세포내 처리에 의해 D'D3 도메인으로부터 처리될 수 있다. 결과의 복합체는 3개의 산물을 내포하는데, 첫 번째 분자는 FVIII-XTEN/D'D3 이형이합체이고, 두 번째 분자는 D'D3-XTEN-Fc의 부산물, 동종이합체이고, 그리고 세 번째 분자는 다른 부산물, 다시 말하면, FVIII(XTEN)-Fc이다.
도면 3은 이형이합체의 반감기 연장에 대한 XTEN 삽입의 부가 효과를 보여준다. FVIII169는 Fc 영역에 융합된 B 도메인 결실된 FVIII 단백질을 포함하고, 여기서 XTEN 서열 (가령, AE288)은 성숙 전장 FVIII에 상응하는 아미노산 745에서 삽입된다. FVIII205는 Fc 영역에 융합된 B 도메인 결실된 FVIII 단백질을 포함하고, 여기서 XTEN 서열 (가령, AE144)은 성숙 전장 FVIII에 상응하는 아미노산 18에서 삽입되고, 그리고 다른 XTEN 서열 (가령, AE288)은 성숙 전장 FVIII에 상응하는 아미노산 745에서 삽입된다. VWF031은 트롬빈 개열가능 링커에 의해 Fc 영역에 융합된 VWF의 D' 도메인 및 D3 도메인을 포함한다 (XTEN 없음). VWF034는 AE288 및 Fc 영역에 융합된 VWF의 D' 도메인 및 D3 도메인을 포함한다. FVIII169/VWF031 (반전된 삼각형)의 반감기는 HemA 생쥐에서 16.7 시간이다; FVIII205/VWF031 (원)의 반감기는 HemA 생쥐에서 29.4 시간이다; 그리고, FVIII169/VWF034 (사각형)의 반감기는 HemA 생쥐에서 31.1 시간이다.
도면 4는 AE144 XTEN이 VWF의 D'D3 도메인 및 Fc 도메인 사이에 삽입될 때 AE288 XTEN보다 더욱 우수한 반감기 연장을 부여한다는 것을 보여준다. 가령, VWF169/VWF034 (사각형)의 반감기는 HemA 생쥐에서 31.1. 시간이고, FVIII169/VWF057 (원)의 반감기는 HemA 생쥐에서 42 시간이다. VWF057은 AE144 및 Fc 영역에 융합된 VWF의 D'D3 도메인을 포함한다.
도면 5는 Fc 도메인이 키메라 단백질 이형이합체의 반감기 연장에 필요하다는 것을 보여준다. FVIII205/VWF031 (원)의 반감기가 HemA 생쥐에서, FcRn 결합 부위에서 돌연변이 (IHH 삼중 돌연변이 Fc)를 내포하고, 따라서 FcRn 경로를 통해 재활용될 수 없는 FVIII263/VWF050 (사각형)의 반감기와 비교되었을 때, FVIII263/VWF050의 반감기 (23 시간)는 VWF205/VWF031의 반감기 (29.4 시간)보다 짧다. 이것은 Fc 영역이 반감기 연장에 필요하다는 것을 지시한다.
도면 6A는 HemA 생쥐 꼬리 클립 모형에서, B 도메인 결실된 FVIII (SQ BDD FVIII)와 비교하여 FVIII-XTEN-Fc/D'D3-XTEN-Fc 이형이합체의 유사한 급성 효력을 보여준다. 생쥐는 75 IU/kg에서 투약되었고, 그리고 활성이 aPTT 검정에 의해 계측되었다. SQ BDD FVIII은 원으로서 도시되고, 반면 FVIII169/VWF034는 사각형으로서 도시되고, FVIII169/VWF057은 다이아몬드로서 도시되고, 그리고 운반제는 반전된 삼각형으로서 도시된다. FVIII169, VWF034, 그리고 VWF057의 구조체 상세는 본원의 다른 곳에서 도시된다. 도면 6B는 HemA 생쥐에서 37.5 IU/kg 용량에서 FVIII169/VWF034 및 B 도메인 결실된 FVIII (SQ BDD FVIII)의 급성 효력의 비교를 보여주고, 그리고 활성이 aPTT 검정에 의해 계측되었다. 각 치료군에서 생쥐의 중간 혈액 상실 (uL)은 수평선에 의해 표시되고, C57/BL6 생쥐에서 혈액 상실 (uL)은 속이 빈 삼각형으로서 도시된다; 37.5 IU/kg의 rBDD-FVIII의 투약 후 혈액 상실 (uL)은 속이 빈 원으로서 도시된다; 37.5 IU/kg FVIII169/VWF034의 투약 후 혈액 상실 (uL)은 속이 빈 사각형으로서 도시되고, 그리고 운반제의 투약 후 혈액 상실 (uL)은 반전된 삼각형으로서 도시된다.
도면 7A-B는 rFVIII169/VWF057 이형이합체가 꼬리 정맥 횡절단 출혈 모형에서 HemA 생쥐에 더욱 긴 보호를 제공한다는 것을 보여준다. 도면 7A는 꼬리 손상 전 72 시에 rFVIII169/VWF057 (사각형), 꼬리 손상 전 48 시에 SQ BDD-FVIII (다이아몬드), 꼬리 손상 전 24 시에 SQ BDD FVIII (반전된 삼각형), 그리고 운반제 (원)를 제공받았던 생쥐에서 재출혈 데이터를 보여준다. 활성은 aPTT 검정에 의해 계측되었다. X 축은 시간 (시)을 보여주고, 그리고 Y 축은 비-출혈 경향자의 퍼센트를 보여준다. 도면 7B는 도면 7A에서 도시된 생쥐의 4가지 범주에서 상응하는 생존 데이터를 보여준다. 꼬리 손상 전 72 시에 12 IU/kg의 FVIII169/VWF057을 제공받은 생쥐는 꼬리 손상 전 24 시에 SQ BDD FVIII 치료를 제공받은 생쥐와 비교하여, 재출혈 및 생존에서 유사한 보호를 보여주었다.
도면 8A는 손상 전 24 시에 rBDD-FVIII와 대비하여, 96 시에 rFVIII-XTEN-Fc/D'D3-XTEN-Fc 이형이합체를 제공받았던 생쥐에서 필적하는 재출혈 데이터를 보여준다. 채워진 사각형은 손상 전 24 시에 FVIII169/VWF034를 제공받았던 생쥐에서 재출혈 데이터를 보여준다; 속이 빈 사각형은 손상 전 96 시에 FVIII169/VWF034를 제공받았던 생쥐에서 재출혈 데이터를 보여준다; 채워진 다이아몬드는 손상 전 24 시에 FVIII169/VWF057을 제공받았던 생쥐에서 재출혈 데이터를 보여준다; 속이 빈 다이아몬드는 손상 전 96 시에 FVIII169/VWF057을 제공받았던 생쥐에서 재출혈 데이터를 보여준다; 채워진 원은 손상 전 24 시에 rBDD-FVIII을 제공받았던 생쥐에서 재출혈 데이터를 보여준다; 속이 빈 원은 손상 전 48 시에 rBDD-FVIII을 제공받았던 생쥐에서 재출혈 데이터를 보여준다; 그리고 채워진 삼각형은 운반제를 제공받았던 생쥐에서 재출혈 데이터를 보여준다. X 축은 시간 (시)을 보여주고, 그리고 y 축은 비-출혈 경향자의 퍼센트를 보여준다.
도면 8B는 손상 전 24 시에 rBDD-FVIII와 대비하여, 96 시에 rFVIII-XTEN-Fc/D'D3-XTEN-Fc 이형이합체를 제공받았던 생쥐에서 생존 곡선을 보여준다. X 축은 시간 (시)을 보여주고, 그리고 y 축은 생존의 퍼센트를 보여준다. 부호는 도면 8A에서와 동일하다.
도면 9는 대표적인 FVIII-VWF 이형이합체 및 FVIII169, FVIII286, VWF057, VWF059, 그리고 VWF062 구조체의 다이어그램을 보여준다. 가령, FVIII169 구조체는 Fc 영역에 융합된 R1648A 치환을 갖는 B 도메인 결실된 FVIII 단백질을 포함하고, 여기서 XTEN 서열 (가령, AE288)은 성숙 전장 FVIII에 상응하는 아미노산 745에서 삽입된다 (A1-a1-A2-a2-288XTEN-a3-A3-C1-C2-Fc). FVIII286 구조체는 Fc 영역에 융합된 R1648 치환을 갖는 B 도메인 결실된 FVIII 단백질을 포함하고, 여기서 XTEN 서열 (가령, AE288)은 성숙 전장 FVIII에 상응하는 아미노산 745에서 삽입되고, 추가 a2 영역이 FVIII 및 Fc 중간에 있다 (A1-a1-A2-a2-288XTEN-a3-A3-C1-C2-a2-Fc). VWF057은 LVPRG 트롬빈 부위 ("LVPRG"; 서열 번호: 6)를 포함하는 VWF 링커 및 GS 링커 ("GS")를 통해 Fc 영역에 연결된 VWF 단백질의 D'D3 도메인을 포함하는 VWF-Fc 융합 구조체 (D'D3 도메인에서 2개의 아미노산 치환, 다시 말하면, C336A 및 C379A를 가짐)인데, 여기서 XTEN 서열 (즉, AE144)은 D'D3 도메인 및 VWF 링커 사이에 삽입된다 (D'D3-144XTEN-GS+LVPRG-Fc). VWF059는 VWF 링커로서 FVIII의 산성 영역 2 (a2)를 통해 Fc 영역에 연결된 VWF 단백질의 D'D3 도메인을 포함하는 VWF-Fc 융합 구조체 (D'D3 도메인에서 2개의 아미노산 치환, 다시 말하면, C336A 및 C379A를 가짐)인데, 여기서 XTEN 서열 (즉, AE144)은 D'D3 도메인 및 VWF 링커 사이에 삽입된다. VWF062는 Fc 영역에 연결된 VWF 단백질의 D'D3 도메인을 포함하는 VWF-Fc 융합 구조체 (D'D3 도메인에서 2개의 아미노산 치환, 다시 말하면, C336A 및 C379A를 가짐)인데, 여기서 XTEN 서열 (즉, AE144)은 D'D3 도메인 및 Fc 영역 사이에 삽입된다 (D'D3-144XTEN-Fc).
도면 10은 FVIII/VWF 이형이합체 구조체, 예를 들면, FVIII169/VWF057, FVIII169/VWF059, FVIII169/VWF059A, 그리고 FVIII169/VWF073을 나타내는 계통도를 보여준다. 화살표는 트롬빈 개열 부위를 도입하기 위해 임의선택적 링커가 부가되는 부위를 보여준다. FVIII169/VWF057은 LVPRG (서열 번호: 6)를 포함하는 링커를 갖는다. FVIII169/VWF059는 FVIII a2 영역을 포함하는 링커 (즉, ISDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSDKTH (서열 번호: 106))를 갖는다. FVIII169/VWF059A는 절두된 FVIII a2 영역을 포함하는 링커 (즉, DKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSDKTH (서열 번호: 88))를 갖는다. FVIII169/VWF073은 IEPRSFS (서열 번호: 194)로 구성되는 FVIII a2 영역의 단편을 포함하는 VWF073 구조체 (서열 번호: 175) 내에 링커를 갖는다.
도면 11A-C는 FVIII169/VWF057 및 FVIII-Fc 대조의 트롬빈 소화 이후에 SDS-PAGE 이미지를 보여준다. 도면 11A는 항-D3 항체 (AB 96340)로 SDS-PAGE 겔의 염색을 보여준다. 화살표는 개열되지 않은, 전장 FVIII169/VWF057인 "LCFc:D'D3-XTEN-Fc"; 그리고 트롬빈에 의한 개열 이후에 결과의 단편인 "D'D3-144 XTEN"을 강조한다. 도면 11B는 항-HC 항체 (GMA012)로 SDS-PAGE 겔의 염색을 보여준다. 화살표는 FVIII 중쇄 ("HC") 및 FVIII A2 도메인을 강조한다. 도면 11C는 패널 A와 B의 오버레이를 보여준다. 표본은 각 패널의 위쪽에 지시된 시점에서 수집되었다. 화살표는 유관한 단백질을 지시한다.
도면 12A-C는 FVIII169/VWF059의 트롬빈 소화 이후에 SDS-PAGE 이미지를 보여준다. 도면 12A는 항-D3 항체 (AB 96340)로 SDS-PAGE 겔의 염색을 보여준다. 화살표는 개열되지 않은, 전장 FVIII169/VWF059인 "LCFc:D'D3-XTEN-Fc"; 그리고 트롬빈에 의한 개열 이후에 결과의 단편인 "D'D3-144 XTEN"을 강조한다. 도면 12B는 항-HC 항체 (GMA012)로 SDS-PAGE 겔의 염색을 보여준다. 화살표는 개열되지 않은, 전장 FVIII169/VWF059; 트롬빈에 의한 개열 이후에 결과의 단편인 D'D3-144 XTEN-a3; 그리고 FVIII의 A2 도메인인 "A2"를 강조한다. 도면 12C는 패널 A와 B의 오버레이를 보여준다. 표본은 각 패널의 위쪽에 지시된 시점에서 수집되었다.
도면 13은 BDD-FVIII 대조 (사각형)로 치료된 HemA 생쥐와 비교하여, FVIII169/VWF059 (원)으로 치료된 HemA 생쥐의 급성 효력 데이터를 보여준다. 혈액 상실 값은 꼬리 클립 이후에 계측되었다. p = 0.9883.
도면 1은 Fc 영역에 융합된 FVIII 단백질 (A1-A2-부분적인 또는 전체 B-A3-C1-C2)을 포함하는 첫 번째 폴리펩티드 (여기서 XTEN이 FVIII 단백질 이내에 삽입 부위에서 삽입된다), 그리고 D'D3 도메인을 포함하는 VWF 단백질, 288개보다 적은 아미노산을 갖는 XTEN, 트롬빈 개열가능 링커 및 두 번째 Fc 영역을 포함하는 두 번째 폴리펩티드를 포함하는 키메라 단백질의 계통도를 보여준다. FVIII 단백질 내에 XTEN 삽입 및/또는 VWF 단백질에 융합은 수력학적 반지름을 증가시킴으로써 및 수용체-매개된 소실을 차단함으로써 키메라 단백질의 반감기를 연장한다. VWF의 D'D3 도메인은 내인성 VWF와의 FVIII 상호작용을 차단하고, FVIII 단백질을 안정시키고, 그리고 키메라 단백질의 반감기를 연장한다. Fc 도메인은 D'D3 도메인을 FVIII 단백질과 공유적으로 연결하고, 그리고 FcRn-매개된 재활용 경로를 통해 키메라 단백질의 반감기를 연장할 수 있다. 트롬빈-개열가능 링커는 FVIII 활성화 시에 D'D3 도메인의 방출을 할 수 있게 하고, 그리고 VWF의 FVIII 및 D'D3 도메인 사이에 정확한 정렬을 담보한다.
도면 2는 FVIII-XTEN-Fc:D'D3-XTEN-Fc 이형이합체에 대한 3가지 플라스미드 발현 시스템을 보여준다: XTEN이 B 도메인 내에 삽입되는 단일 사슬 FVIII-XTEN-Fc를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 첫 번째 플라스미드; D1D2D'D3-XTEN-Fc를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 두 번째 플라스미드, 여기서 XTEN 서열은 288개보다 적은 아미노산을 포함한다; 그리고 PACE, 프로펩티드 처리 효소를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 세 번째 플라스미드. 3개의 폴리펩티드가 이들 3개의 플라스미드로부터 발현될 때, VWF의 D1D2 프로펩티드 도메인은 세포내 처리에 의해 D'D3 도메인으로부터 처리될 수 있다. 결과의 복합체는 3개의 산물을 내포하는데, 첫 번째 분자는 FVIII-XTEN/D'D3 이형이합체이고, 두 번째 분자는 D'D3-XTEN-Fc의 부산물, 동종이합체이고, 그리고 세 번째 분자는 다른 부산물, 다시 말하면, FVIII(XTEN)-Fc이다.
도면 3은 이형이합체의 반감기 연장에 대한 XTEN 삽입의 부가 효과를 보여준다. FVIII169는 Fc 영역에 융합된 B 도메인 결실된 FVIII 단백질을 포함하고, 여기서 XTEN 서열 (가령, AE288)은 성숙 전장 FVIII에 상응하는 아미노산 745에서 삽입된다. FVIII205는 Fc 영역에 융합된 B 도메인 결실된 FVIII 단백질을 포함하고, 여기서 XTEN 서열 (가령, AE144)은 성숙 전장 FVIII에 상응하는 아미노산 18에서 삽입되고, 그리고 다른 XTEN 서열 (가령, AE288)은 성숙 전장 FVIII에 상응하는 아미노산 745에서 삽입된다. VWF031은 트롬빈 개열가능 링커에 의해 Fc 영역에 융합된 VWF의 D' 도메인 및 D3 도메인을 포함한다 (XTEN 없음). VWF034는 AE288 및 Fc 영역에 융합된 VWF의 D' 도메인 및 D3 도메인을 포함한다. FVIII169/VWF031 (반전된 삼각형)의 반감기는 HemA 생쥐에서 16.7 시간이다; FVIII205/VWF031 (원)의 반감기는 HemA 생쥐에서 29.4 시간이다; 그리고, FVIII169/VWF034 (사각형)의 반감기는 HemA 생쥐에서 31.1 시간이다.
도면 4는 AE144 XTEN이 VWF의 D'D3 도메인 및 Fc 도메인 사이에 삽입될 때 AE288 XTEN보다 더욱 우수한 반감기 연장을 부여한다는 것을 보여준다. 가령, VWF169/VWF034 (사각형)의 반감기는 HemA 생쥐에서 31.1. 시간이고, FVIII169/VWF057 (원)의 반감기는 HemA 생쥐에서 42 시간이다. VWF057은 AE144 및 Fc 영역에 융합된 VWF의 D'D3 도메인을 포함한다.
도면 5는 Fc 도메인이 키메라 단백질 이형이합체의 반감기 연장에 필요하다는 것을 보여준다. FVIII205/VWF031 (원)의 반감기가 HemA 생쥐에서, FcRn 결합 부위에서 돌연변이 (IHH 삼중 돌연변이 Fc)를 내포하고, 따라서 FcRn 경로를 통해 재활용될 수 없는 FVIII263/VWF050 (사각형)의 반감기와 비교되었을 때, FVIII263/VWF050의 반감기 (23 시간)는 VWF205/VWF031의 반감기 (29.4 시간)보다 짧다. 이것은 Fc 영역이 반감기 연장에 필요하다는 것을 지시한다.
도면 6A는 HemA 생쥐 꼬리 클립 모형에서, B 도메인 결실된 FVIII (SQ BDD FVIII)와 비교하여 FVIII-XTEN-Fc/D'D3-XTEN-Fc 이형이합체의 유사한 급성 효력을 보여준다. 생쥐는 75 IU/kg에서 투약되었고, 그리고 활성이 aPTT 검정에 의해 계측되었다. SQ BDD FVIII은 원으로서 도시되고, 반면 FVIII169/VWF034는 사각형으로서 도시되고, FVIII169/VWF057은 다이아몬드로서 도시되고, 그리고 운반제는 반전된 삼각형으로서 도시된다. FVIII169, VWF034, 그리고 VWF057의 구조체 상세는 본원의 다른 곳에서 도시된다. 도면 6B는 HemA 생쥐에서 37.5 IU/kg 용량에서 FVIII169/VWF034 및 B 도메인 결실된 FVIII (SQ BDD FVIII)의 급성 효력의 비교를 보여주고, 그리고 활성이 aPTT 검정에 의해 계측되었다. 각 치료군에서 생쥐의 중간 혈액 상실 (uL)은 수평선에 의해 표시되고, C57/BL6 생쥐에서 혈액 상실 (uL)은 속이 빈 삼각형으로서 도시된다; 37.5 IU/kg의 rBDD-FVIII의 투약 후 혈액 상실 (uL)은 속이 빈 원으로서 도시된다; 37.5 IU/kg FVIII169/VWF034의 투약 후 혈액 상실 (uL)은 속이 빈 사각형으로서 도시되고, 그리고 운반제의 투약 후 혈액 상실 (uL)은 반전된 삼각형으로서 도시된다.
도면 7A-B는 rFVIII169/VWF057 이형이합체가 꼬리 정맥 횡절단 출혈 모형에서 HemA 생쥐에 더욱 긴 보호를 제공한다는 것을 보여준다. 도면 7A는 꼬리 손상 전 72 시에 rFVIII169/VWF057 (사각형), 꼬리 손상 전 48 시에 SQ BDD-FVIII (다이아몬드), 꼬리 손상 전 24 시에 SQ BDD FVIII (반전된 삼각형), 그리고 운반제 (원)를 제공받았던 생쥐에서 재출혈 데이터를 보여준다. 활성은 aPTT 검정에 의해 계측되었다. X 축은 시간 (시)을 보여주고, 그리고 Y 축은 비-출혈 경향자의 퍼센트를 보여준다. 도면 7B는 도면 7A에서 도시된 생쥐의 4가지 범주에서 상응하는 생존 데이터를 보여준다. 꼬리 손상 전 72 시에 12 IU/kg의 FVIII169/VWF057을 제공받은 생쥐는 꼬리 손상 전 24 시에 SQ BDD FVIII 치료를 제공받은 생쥐와 비교하여, 재출혈 및 생존에서 유사한 보호를 보여주었다.
도면 8A는 손상 전 24 시에 rBDD-FVIII와 대비하여, 96 시에 rFVIII-XTEN-Fc/D'D3-XTEN-Fc 이형이합체를 제공받았던 생쥐에서 필적하는 재출혈 데이터를 보여준다. 채워진 사각형은 손상 전 24 시에 FVIII169/VWF034를 제공받았던 생쥐에서 재출혈 데이터를 보여준다; 속이 빈 사각형은 손상 전 96 시에 FVIII169/VWF034를 제공받았던 생쥐에서 재출혈 데이터를 보여준다; 채워진 다이아몬드는 손상 전 24 시에 FVIII169/VWF057을 제공받았던 생쥐에서 재출혈 데이터를 보여준다; 속이 빈 다이아몬드는 손상 전 96 시에 FVIII169/VWF057을 제공받았던 생쥐에서 재출혈 데이터를 보여준다; 채워진 원은 손상 전 24 시에 rBDD-FVIII을 제공받았던 생쥐에서 재출혈 데이터를 보여준다; 속이 빈 원은 손상 전 48 시에 rBDD-FVIII을 제공받았던 생쥐에서 재출혈 데이터를 보여준다; 그리고 채워진 삼각형은 운반제를 제공받았던 생쥐에서 재출혈 데이터를 보여준다. X 축은 시간 (시)을 보여주고, 그리고 y 축은 비-출혈 경향자의 퍼센트를 보여준다.
도면 8B는 손상 전 24 시에 rBDD-FVIII와 대비하여, 96 시에 rFVIII-XTEN-Fc/D'D3-XTEN-Fc 이형이합체를 제공받았던 생쥐에서 생존 곡선을 보여준다. X 축은 시간 (시)을 보여주고, 그리고 y 축은 생존의 퍼센트를 보여준다. 부호는 도면 8A에서와 동일하다.
도면 9는 대표적인 FVIII-VWF 이형이합체 및 FVIII169, FVIII286, VWF057, VWF059, 그리고 VWF062 구조체의 다이어그램을 보여준다. 가령, FVIII169 구조체는 Fc 영역에 융합된 R1648A 치환을 갖는 B 도메인 결실된 FVIII 단백질을 포함하고, 여기서 XTEN 서열 (가령, AE288)은 성숙 전장 FVIII에 상응하는 아미노산 745에서 삽입된다 (A1-a1-A2-a2-288XTEN-a3-A3-C1-C2-Fc). FVIII286 구조체는 Fc 영역에 융합된 R1648 치환을 갖는 B 도메인 결실된 FVIII 단백질을 포함하고, 여기서 XTEN 서열 (가령, AE288)은 성숙 전장 FVIII에 상응하는 아미노산 745에서 삽입되고, 추가 a2 영역이 FVIII 및 Fc 중간에 있다 (A1-a1-A2-a2-288XTEN-a3-A3-C1-C2-a2-Fc). VWF057은 LVPRG 트롬빈 부위 ("LVPRG"; 서열 번호: 6)를 포함하는 VWF 링커 및 GS 링커 ("GS")를 통해 Fc 영역에 연결된 VWF 단백질의 D'D3 도메인을 포함하는 VWF-Fc 융합 구조체 (D'D3 도메인에서 2개의 아미노산 치환, 다시 말하면, C336A 및 C379A를 가짐)인데, 여기서 XTEN 서열 (즉, AE144)은 D'D3 도메인 및 VWF 링커 사이에 삽입된다 (D'D3-144XTEN-GS+LVPRG-Fc). VWF059는 VWF 링커로서 FVIII의 산성 영역 2 (a2)를 통해 Fc 영역에 연결된 VWF 단백질의 D'D3 도메인을 포함하는 VWF-Fc 융합 구조체 (D'D3 도메인에서 2개의 아미노산 치환, 다시 말하면, C336A 및 C379A를 가짐)인데, 여기서 XTEN 서열 (즉, AE144)은 D'D3 도메인 및 VWF 링커 사이에 삽입된다. VWF062는 Fc 영역에 연결된 VWF 단백질의 D'D3 도메인을 포함하는 VWF-Fc 융합 구조체 (D'D3 도메인에서 2개의 아미노산 치환, 다시 말하면, C336A 및 C379A를 가짐)인데, 여기서 XTEN 서열 (즉, AE144)은 D'D3 도메인 및 Fc 영역 사이에 삽입된다 (D'D3-144XTEN-Fc).
도면 10은 FVIII/VWF 이형이합체 구조체, 예를 들면, FVIII169/VWF057, FVIII169/VWF059, FVIII169/VWF059A, 그리고 FVIII169/VWF073을 나타내는 계통도를 보여준다. 화살표는 트롬빈 개열 부위를 도입하기 위해 임의선택적 링커가 부가되는 부위를 보여준다. FVIII169/VWF057은 LVPRG (서열 번호: 6)를 포함하는 링커를 갖는다. FVIII169/VWF059는 FVIII a2 영역을 포함하는 링커 (즉, ISDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSDKTH (서열 번호: 106))를 갖는다. FVIII169/VWF059A는 절두된 FVIII a2 영역을 포함하는 링커 (즉, DKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSDKTH (서열 번호: 88))를 갖는다. FVIII169/VWF073은 IEPRSFS (서열 번호: 194)로 구성되는 FVIII a2 영역의 단편을 포함하는 VWF073 구조체 (서열 번호: 175) 내에 링커를 갖는다.
도면 11A-C는 FVIII169/VWF057 및 FVIII-Fc 대조의 트롬빈 소화 이후에 SDS-PAGE 이미지를 보여준다. 도면 11A는 항-D3 항체 (AB 96340)로 SDS-PAGE 겔의 염색을 보여준다. 화살표는 개열되지 않은, 전장 FVIII169/VWF057인 "LCFc:D'D3-XTEN-Fc"; 그리고 트롬빈에 의한 개열 이후에 결과의 단편인 "D'D3-144 XTEN"을 강조한다. 도면 11B는 항-HC 항체 (GMA012)로 SDS-PAGE 겔의 염색을 보여준다. 화살표는 FVIII 중쇄 ("HC") 및 FVIII A2 도메인을 강조한다. 도면 11C는 패널 A와 B의 오버레이를 보여준다. 표본은 각 패널의 위쪽에 지시된 시점에서 수집되었다. 화살표는 유관한 단백질을 지시한다.
도면 12A-C는 FVIII169/VWF059의 트롬빈 소화 이후에 SDS-PAGE 이미지를 보여준다. 도면 12A는 항-D3 항체 (AB 96340)로 SDS-PAGE 겔의 염색을 보여준다. 화살표는 개열되지 않은, 전장 FVIII169/VWF059인 "LCFc:D'D3-XTEN-Fc"; 그리고 트롬빈에 의한 개열 이후에 결과의 단편인 "D'D3-144 XTEN"을 강조한다. 도면 12B는 항-HC 항체 (GMA012)로 SDS-PAGE 겔의 염색을 보여준다. 화살표는 개열되지 않은, 전장 FVIII169/VWF059; 트롬빈에 의한 개열 이후에 결과의 단편인 D'D3-144 XTEN-a3; 그리고 FVIII의 A2 도메인인 "A2"를 강조한다. 도면 12C는 패널 A와 B의 오버레이를 보여준다. 표본은 각 패널의 위쪽에 지시된 시점에서 수집되었다.
도면 13은 BDD-FVIII 대조 (사각형)로 치료된 HemA 생쥐와 비교하여, FVIII169/VWF059 (원)으로 치료된 HemA 생쥐의 급성 효력 데이터를 보여준다. 혈액 상실 값은 꼬리 클립 이후에 계측되었다. p = 0.9883.
발명의 상세한 설명
본 발명은 XTEN 서열에 의해 2개의 폴리펩티드, 첫 번째 Ig 불변 영역에 융합된 FVIII 단백질을 포함하는 첫 번째 폴리펩티드 및 두 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분에 융합된 VWF 단백질을 포함하는 두 번째 폴리펩티드를 포함하는 키메라 단백질에 관계하고, 여기서 XTEN 서열은 288개보다 적은 아미노산을 내포한다.
I.
정의
단수 ("a" 또는 "an") 실체는 하나 또는 그 이상의 실체를 지칭하는 것으로 언급된다; 예로서, "뉴클레오티드 서열"은 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드 서열을 나타내는 것으로 이해된다. 따라서, 단수 ("a" 또는 "an"), "하나 또는 그 이상" 및 "최소한 하나"는 본원에서 교체가능하게 이용될 수 있다.
게다가, "및/또는"는 본원에서 이용되는 경우에, 다른 특질 또는 성분과 함께 또는 다른 특질 또는 성분 없이 2개의 특정된 특질 또는 성분 각각의 특정한 개시로서 간주된다. 따라서, 본원에서 관용구, 예를 들면, "A 및/또는 B"에서 이용된 바와 같은 용어 "및/또는"은 "A와 B," "A 또는 B," "A (단독)", 그리고 "B" (단독)를 포함하는 것으로 의도된다. 유사하게, 관용구, 예를 들면, "A, B, 및/또는 C"에서 이용된 바와 같은 용어 "및/또는"은 다음의 양상 각각을 포괄하는 것으로 의도된다: A, B, 그리고 C; A, B, 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A와 C; A와 B; B와 C; A (단독); B (단독); 그리고 C (단독).
양상이 본원에서 언어 "포함하는"으로 설명될 때는 언제나, "구성되는" 및/또는 "본질적으로 구성되는"의 면에서 설명된 다른 모든 면에서 유사한 양상 역시 제공되는 것으로 이해된다.
달리 정의되지 않으면, 본원에서 이용된 모든 기술 용어와 과학 용어는 본 발명이 관련되는 당해 분야의 평균적 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 가령, the Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press; 그리고 the Oxford Dictionary Of Biochemistry and Molecular Biology, 개정판, 2000, Oxford University Press는 당업자에게 본 발명에서 이용된 많은 용어의 일반 사전을 제공한다.
단위, 접두사, 그리고 부호는 그들의 Systme International de Unites (SI) 인정된 형태에서 표시된다. 수치 범위는 범위를 규정하는 숫자를 포괄한다. 달리 지시되지 않으면, 아미노산 서열은 아미노에서 카르복시 방향으로 왼쪽에서 오른쪽으로 기재된다. 본원에서 제공된 표제는 본 발명의 다양한 양상의 제한이 아니며, 이들은 전체로서 본 명세서에 참조될 수 있다. 따라서, 바로 아래에 규정된 용어는 전체적으로 본 명세서를 참조함으로써 더욱 충분히 규정된다.
용어 "약"은 대략, 거의, 쯤, 또는 영역 내를 의미하기 위해 본원에서 이용된다. 용어 "약"이 수치 범위와 함께 이용될 때, 이것은 진술된 수치 값 위아래로 경계를 확장함으로써 상기 범위를 수식한다. 일반적으로, 용어 "약"은 가령, 위로 또는 아래로 (더욱 높은 또는 더욱 낮은) 10 퍼센트의 분산에 의해 언급된 값 위아래로 수치 값을 수식할 수 있다.
용어 "폴리뉴클레오티드" 또는 "뉴클레오티드"는 단수 핵산뿐만 아니라 복수 핵산을 포괄하는 것으로 의도되고, 그리고 단리된 핵산 분자 또는 구조체, 예를 들면, 전령 RNA (mRNA) 또는 플라스미드 DNA (pDNA)를 지칭한다. 일정한 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 전통적인 포스포디에스테르 결합 또는 비-전통적인 결합 (가령, 예로서 펩티드 핵산 (PNA)에서 발견된 아미드 결합)을 포함한다. 용어 "핵산"은 폴리뉴클레오티드 내에 존재하는 임의의 한 가지 또는 그 이상 핵산 분절, 예를 들면, DNA 또는 RNA 단편을 지칭한다. "단리된 핵산 또는 폴리뉴클레오티드"는 선천적 환경으로부터 이전된 핵산 분자, DNA 또는 RNA인 것으로 의도된다. 가령, 벡터에 내포된 인자 VIII 폴리펩티드를 인코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 목적을 위해 단리된 것으로 간주된다. 단리된 폴리뉴클레오티드의 추가 실례에는 이종성 숙주 세포 내에 유지된 또는 용액에서 다른 폴리뉴클레오티드로부터 정제된 (부분적으로 또는 실질적으로) 재조합 폴리뉴클레오티드가 포함된다. 단리된 RNA 분자는 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 생체내 또는 시험관내 RNA 전사체를 포함한다. 본 발명에 따른 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 합성적으로 생산된 이런 분자를 더욱 포함한다. 이에 더하여, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 조절 요소, 예를 들면, 프로모터, 인핸서, 리보솜 결합 부위, 또는 전사 종결 신호를 포함할 수 있다.
본원에서 이용된 바와 같이, "코딩 영역" 또는 "코딩 서열"은 아미노산으로 번역가능한 코돈으로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 부분이다. 비록 "종결 코돈" (TAG, TGA, 또는 TAA)은 전형적으로 아미노산으로 번역되지 않지만, 이것은 코딩 영역의 부분인 것으로 고려될 수 있고, 하지만 임의의 측면 서열, 예를 들면, 프로모터, 리보솜 결합 부위, 전사 종결인자, 인트론, 기타 등등은 코딩 영역의 부분이 아니다. 코딩 영역의 경계는 전형적으로, 결과의 폴리펩티드의 아미노 말단을 인코딩하는 5' 말단에서 개시 코돈, 그리고 결과의 폴리펩티드의 카르복실 말단을 인코딩하는 3' 말단에서 번역 종결 코돈에 의해 결정된다. 본 발명의 2개 또는 그 이상의 코딩 영역이 단일 폴리뉴클레오티드 구조체 내에, 예를 들면, 단일 벡터 상에, 또는 별개의 폴리뉴클레오티드 구조체 내에, 예를 들면, 별개의 (상이한) 벡터 상에 존재할 수 있다. 따라서, 단일 벡터는 단지 단일 코딩 영역을 내포하거나, 또는 2개 또는 그 이상의 코딩 영역을 포함할 수 있다는 결론이 나온다, 예를 들면, 단일 벡터는 아래에 설명된 바와 같이 결합 도메인-A 및 결합 도메인-B를 별도로 인코딩할 수 있다. 이에 더하여, 본 발명의 벡터, 폴리뉴클레오티드, 또는 핵산은 본 발명의 결합 도메인을 인코딩하는 핵산에 융합되거나 또는 융합되지 않은 이종성 코딩 영역을 인코딩할 수 있다. 이종성 코딩 영역은 제한 없이, 특수한 요소 또는 모티프, 예를 들면, 분비성 신호 펩티드 또는 이종성 기능적 도메인을 포함한다.
포유류 세포에 의해 분비된 일정한 단백질은 일단 조면소포체를 교차하여 성장 단백질 사슬의 이출이 시작되면, 성숙 단백질로부터 개열되는 분비성 신호 펩티드와 연관된다. 당업자는 신호 펩티드가 일반적으로 폴리펩티드의 N 말단에 융합되고, 그리고 완전한 또는 "전장" 폴리펩티드로부터 개열되어 폴리펩티드의 분비된 또는 "성숙" 형태를 생산한다는 것을 인식한다. 일정한 구체예에서, 선천적 신호 펩티드 또는 폴리펩티드의 분비를 주도하는 능력을 유지하는 서열의 기능적 유도체는 이것과 작동가능하게 연관된다. 대안으로, 이종성 포유류 신호 펩티드, 예를 들면, 인간 조직 플라스미노겐 활성제 (TPA) 또는 생쥐 β-글루쿠론산분해효소 신호 펩티드, 또는 이들의 기능적 유도체가 이용될 수 있다.
용어 "하류"는 뉴클레오티드 서열을 지칭할 때, 핵산 또는 뉴클레오티드 서열이 참조 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치된다는 것을 의미한다. 일정한 구체예에서, 하류 뉴클레오티드 서열은 전사의 출발점을 뒤따르는 서열에 관계한다. 가령, 유전자의 번역 개시 코돈은 전사의 시작 부위의 하류에 위치된다. 용어 "하류"는 폴리펩티드 서열을 지칭할 때, 아미노산 또는 아미노산 삽입 부위가 참조 아미노산의 C 말단에서 위치된다는 것을 의미한다. 가령, 성숙 야생형 FVIII 단백질에 상응하는 아미노산 745의 즉시 하류에 삽입 부위는 삽입 부위가 성숙 야생형 FVIII 단백질에 상응하는 아미노산 745 및 아미노산 746 사이에 있다는 것을 의미한다.
용어 "상류"는 참조 뉴클레오티드 서열의 5'에 위치되는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 일정한 구체예에서, 상류 뉴클레오티드 서열은 전사의 코딩 영역 또는 출발점의 5' 측면 상에 위치되는 서열에 관계한다. 가령, 대부분의 프로모터는 전사의 시작 부위의 상류에 위치된다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "조절 영역"은 코딩 영역의 상류 (5' 비코딩 서열), 이내, 또는 하류 (3' 비코딩 서열)에 위치된 뉴클레오티드 서열을 지칭하고, 그리고 연관된 코딩 영역의 전사, RNA 처리, 안정성, 또는 번역에 영향을 준다. 조절 영역은 프로모터, 번역 리더 서열, 인트론, 폴리아데닐화 인식 서열, RNA 처리 부위, 작동체 결합 부위 및 줄기-루프 구조를 포함할 수 있다. 코딩 영역이 진핵 세포에서 발현에 의도되면, 폴리아데닐화 신호 및 전사 종결 서열은 통상적으로, 코딩 서열의 3'에 위치될 것이다.
유전자 산물, 예를 들면, 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 하나 또는 그 이상의 코딩 영역과 작동가능하게 연관된 프로모터 및/또는 다른 전사 또는 번역 제어 요소를 포함할 수 있다. 작동가능한 연관에서 유전자 산물, 예를 들면, 폴리펩티드에 대한 코딩 영역은 유전자 산물의 발현을 조절 영역(들)의 영향 또는 제어 하에 두는 방식으로 하나 또는 그 이상의 조절 영역과 연관된다. 가령, 코딩 영역 및 프로모터는 프로모터 기능의 유도가 코딩 영역에 의해 인코딩된 유전자 산물을 인코딩하는 mRNA의 전사를 유발하면, 그리고 프로모터 및 코딩 영역 사이에 연쇄의 본성이 유전자 산물의 발현을 주도하는 프로모터의 능력을 간섭하지 않거나 또는 전사되는 DNA 주형의 능력을 간섭하지 않으면, "작동가능하게 연관된다". 프로모터 이외에 다른 전사 제어 요소, 예를 들면, 인핸서, 오퍼레이터, 억제인자, 그리고 전사 종결 신호 역시 유전자 산물 발현을 주도하기 위해 코딩 영역과 작동가능하게 연관될 수 있다.
다양한 전사 제어 영역은 당업자에게 공지되어 있다. 이들은 제한 없이, 척추동물 세포에서 기능하는 전사 제어 영역, 예를 들면, 하지만 제한 없이, 시토메갈로바이러스 (극초기 프로모터, 인트론-A와 함께), 유인원 바이러스 40 (초기 프로모터), 그리고 레트로바이러스 (가령, 라우스 육종 바이러스)로부터 프로모터 및 인핸서 분절을 포함한다. 다른 전사 제어 영역은 척추동물 유전자로부터 유래된 것들, 예를 들면, 액틴, 열 충격 단백질, 소 성장 호르몬 및 토끼 β-글로빈뿐만 아니라 진핵 세포에서 유전자 발현을 제어할 수 있는 다른 서열을 포함한다. 추가 적합한 전사 제어 영역은 조직 특이적 프로모터 및 인핸서뿐만 아니라 림포카인-유도성 프로모터 (가령, 인터페론 또는 인터류킨에 의해 유도성인 프로모터)를 포함한다.
유사하게, 다양한 번역 제어 요소는 당업자에게 공지된다. 이들은 리보솜 결합 부위, 번역 개시 및 종결 코돈, 그리고 피코르나바이러스로부터 유래된 요소 (특히, CITE 서열로서 또한 지칭되는 내부 리보솜 유입 부위, 또는 IRES)를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "발현"은 폴리뉴클레오티드가 유전자 산물, 예를 들면, RNA 또는 폴리펩티드를 생산하는 과정을 지칭한다. 이것은 제한 없이, 폴리뉴클레오티드의 전령 RNA (mRNA), 전달 RNA (tRNA), 작은 헤어핀 RNA (shRNA), 짧은 간섭 RNA (siRNA) 또는 임의의 다른 RNA 산물로의 전사, 그리고 mRNA의 폴리펩티드로의 번역을 포함한다. 발현은 "유전자 산물"을 생산한다. 본원에서 이용된 바와 같이, 유전자 산물은 핵산, 예를 들면, 유전자의 전사에 의해 생산된 전령 RNA, 또는 전사체로부터 번역되는 폴리펩티드일 수 있다. 본원에서 설명된 유전자 산물은 전사후 변형, 예를 들면, 폴리아데닐화 또는 스플라이싱을 갖는 핵산, 또는 번역후 변형, 예를 들면, 메틸화, 당화, 지질의 첨가, 다른 단백질 아단위와의 연관, 또는 단백질분해 개열을 갖는 폴리펩티드를 더욱 포함한다.
"벡터"는 핵산의 클로닝 및/또는 핵산의 숙주 세포 내로의 전달을 위한 임의의 운반제를 지칭한다. 벡터는 부착된 분절의 복제를 야기하기 위해 다른 핵산 분절이 부착될 수 있는 레플리콘일 수도 있다. "레플리콘"은 생체내에서 복제의 자율적인 단위로서 기능하는, 다시 말하면, 자체 제어 하에 복제할 수 있는 임의의 유전자 요소 (가령, 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스)를 지칭한다. 용어 "벡터"는 시험관내에서, 탈체에서 또는 생체내에서 핵산을 세포 내로 도입하기 위한 바이러스 및 비바이러스 운반제 둘 모두를 포함한다. 예로서, 플라스미드, 변형된 진핵 바이러스, 또는 변형된 세균 바이러스를 비롯한 다수의 벡터가 당분야에서 알려져 있고 이용된다. 폴리뉴클레오티드의 적합한 벡터 내로의 삽입은 적절한 폴리뉴클레오티드 단편을 상보성 점착 말단을 갖는 선택된 벡터 내로 결찰함으로써 달성될 수 있다.
벡터는 벡터를 통합한 세포의 선별 또는 확인을 제공하는 선별가능 마커 또는 리포터를 인코딩하도록 가공될 수 있다. 선별가능 마커 또는 리포터의 발현은 벡터 상에 내포된 다른 코딩 영역을 통합하고 발현하는 숙주 세포의 확인 및/또는 선별을 허용한다. 당분야에서 알려지고 이용되는 선별가능 마커 유전자의 실례는 다음을 포함한다: 암피실린, 스트렙토마이신, 젠타마이신, 카나마이신, 히그로마이신, 비알라포스 제초제, 술폰아미드, 기타 등등에 내성을 제공하는 유전자; 그리고 표현형 마커로서 이용되는 유전자, 다시 말하면, 안토시아닌 조절 유전자, 이소펜타닐 전달효소 유전자, 기타 등등. 당분야에서 알려지고 이용되는 리포터의 실례는 다음을 포함한다: 루시페라아제 (Luc), 녹색 형광 단백질 (GFP), 클로람페니콜 아세틸전달효소 (CAT), -갈락토시다아제 (LacZ), -글루쿠론산분해효소 (Gus), 기타 등등. 선별가능 마커는 리포터인 것으로 또한 고려될 수 있다.
용어 "플라스미드"는 세포의 중심 물질대사의 부분이 아니고, 그리고 통상적으로 환상 이중 가닥 DNA 분자의 형태인 유전자를 종종 운반하는 염색체외 요소를 지칭한다. 이런 요소는 임의의 공급원으로부터 유래되는 자율적으로 복제하는 서열, 유전체 통합 서열, 파지 또는 뉴클레오티드 서열, 선형, 환상, 또는 초나선의 단일- 또는 이중 가닥 DNA 또는 RNA일 수 있고, 여기서 다수의 뉴클레오티드 서열은 적절한 3' 번역되지 않은 서열과 함께 선별된 유전자 산물에 대한 프로모터 단편 및 DNA 서열을 세포 내로 도입할 수 있는 독특한 구성 내로 연결되거나 또는 재조합되었다.
이용될 수 있는 진핵 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 아데노 연관된 바이러스 벡터, 그리고 천연두바이러스, 예를 들면, 우두 바이러스 벡터, 배큘로바이러스 벡터, 또는 헤르페스바이러스 벡터를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 비바이러스 벡터는 플라스미드, 리포솜, 전기적으로 하전된 지질 (사이토펙틴), DNA-단백질 복합체, 그리고 바이오폴리머를 포함한다.
"클로닝 벡터"는 순차적으로 복제하는 핵산의 단위 길이이고 복제 기점을 포함하는 "레플리콘", 예를 들면, 플라스미드, 파지 또는 코스미드를 지칭하고, 여기에 다른 핵산 분절이 부착된 분절의 복제를 야기하기 위해 부착될 수 있다. 일정한 클로닝 벡터는 한 가지 세포 유형, 예를 들면, 세균에서 복제하고 다른 세포 유형, 예를 들면, 진핵 세포에서 발현할 수 있다. 클로닝 벡터는 전형적으로, 이러한 벡터를 포함하는 세포의 선별에 이용될 수 있는 하나 또는 그 이상의 서열 및/또는 관심되는 핵산 서열의 삽입을 위한 하나 또는 그 이상의 복수 클로닝 부위를 포함한다.
용어 "발현 벡터"는 숙주 세포 내로 삽입 이후에, 삽입된 핵산 서열의 발현을 할 수 있게 하도록 설계된 운반제를 지칭한다. 삽입된 핵산 서열은 앞서 설명된 바와 같이, 조절 영역과 작동가능한 연관 상태에서 배치된다.
벡터는 당분야에서 널리 공지된 방법, 예를 들면, 형질감염, 전기천공, 현미주입, 형질도입, 세포 융합, DEAE 덱스트란, 인산칼슘 침전, 리포펙션 (리소좀 융합), 유전자 총의 이용, 또는 DNA 벡터 전달체에 의해 숙주 세포 내로 도입된다.
"배양하다", "배양하기 위한" 및 "배양하는"은 본원에서 이용된 바와 같이, 세포 성장 또는 분열을 허용하거나 또는 세포를 살아있는 상태에서 유지하는 시험관내 조건 하에 세포를 배양하는 것을 의미한다. "배양된 세포"는 본원에서 이용된 바와 같이, 시험관내에서 증식되는 세포를 의미한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "폴리펩티드"는 단수 "폴리펩티드"뿐만 아니라 복수 "폴리펩티드"를 포괄하는 것으로 의도되고, 그리고 아미드 결합 (펩티드 결합으로서 또한 알려져 있음)에 의해 선형으로 연결된 단위체 (아미노산)로 구성된 분자를 지칭한다. 용어 "폴리펩티드"는 2개 또는 그 이상 아미노산의 임의의 사슬 또는 사슬들을 지칭하고, 그리고 특정한 길이의 산물을 지칭하지 않는다. 따라서, 펩티드, 디펩티드, 트리펩티드, 올리고펩티드, "단백질," "아미노산 사슬," 또는 2개 또는 그 이상 아미노산의 사슬 또는 사슬들을 지칭하는데 이용된 임의의 다른 용어는 "폴리펩티드"의 정의 내에 포함되고, 그리고 용어 "폴리펩티드"는 이들 용어 대신에, 또는 이들 용어와 교체 가능하게 이용될 수 있다. 용어 "폴리펩티드"는 제한 없이, 당화, 아세틸화, 인산화, 아미드화, 알려진 보호 기/차단 기에 의한 유도체화, 단백질분해 개열, 또는 비자연발생 아미노산에 의한 변형을 비롯하여, 폴리펩티드의 발현후 변형의 산물을 지칭하는 것으로 또한 의도된다. 폴리펩티드는 자연 생물학적 공급원으로부터 유래되거나 또는 재조합 기술에 의해 생산될 수 있지만, 지정된 핵산 서열로부터 반드시 번역되는 것은 아니다. 이것은 화학적 합성을 비롯한 임의의 방식으로 산출될 수 있다.
"단리된" 폴리펩티드 또는 이의 단편, 변이체, 또는 유도체는 자연 환경에 있지 않는 폴리펩티드를 지칭한다. 특정 수준의 정제가 필요한 것은 아니다. 가령, 단리된 폴리펩티드는 단순히, 선천적 또는 자연 환경으로부터 이전될 수 있다. 숙주 세포에서 발현된 재조합적으로 생산된 폴리펩티드 및 단백질은 임의의 적절한 기술에 의해 분리되거나, 분획되거나, 또는 부분적으로 또는 실제적으로 정제된 선천적 또는 재조합 폴리펩티드가 그러한 것처럼, 본 발명을 위해 단리된 것으로 고려된다.
폴리펩티드의 단편 또는 변이체, 그리고 이들의 임의의 조합 또한 본 발명에 포함된다. 본 발명의 폴리펩티드 결합 도메인 또는 결합 분자를 지칭할 때 용어 "단편" 또는 "변이체"는 참조 폴리펩티드의 성질 (가령, FcRn 결합 도메인 또는 Fc 변이체에 대한 FcRn 결합 친화성, FVIII 변이체에 대한 응고 활성, 또는 VWF 단편에 대한 FVIII 결합 활성) 중에서 최소한 일부를 유지하는 임의의 폴리펩티드를 포함한다. 폴리펩티드의 단편은 본원의 다른 곳에서 논의된 특이적 항체 단편에 더하여 단백질분해 단편뿐만 아니라 결실 단편을 포함하지만, 자연발생 전장 폴리펩티드 (또는 성숙 폴리펩티드)를 포함하지 않는다. 본 발명의 폴리펩티드 결합 도메인 또는 결합 분자의 변이체는 앞서 설명된 바와 같은 단편을 포함하고, 그리고 또한, 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입으로 인해 변경된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 변이체는 자연발생 또는 비자연발생일 수 있다. 비자연발생 변이체는 공지된 돌연변이유발 기술을 이용하여 생산될 수 있다. 변이체 폴리펩티드는 보존성 또는 비보존성 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 포함할 수 있다.
본원에서 이용된 용어 "VWF 단백질" 또는 "VWF 단백질들"은 FVIII과 상호작용하고, 그리고 전장 VWF에 의해 FVIII에 정상적으로 제공되는 최소한 하나 또는 그 이상의 성질, 예를 들면, FVIIIa로의 미성숙 활성화를 예방하고, 미성숙 단백질분해를 예방하고, 미성숙 소실을 야기할 수 있었던 인지질 막과의 연관을 예방하고, 나신 FVIII에 결합할 수 있지만 VWF-결합된 FVIII에 결합하지 않는 FVIII 간극 수용체에 결합을 예방하고, 및/또는 FVIII 중쇄 및 경쇄 상호작용을 안정시키는 것을 유지하는 임의의 VWF 단편을 의미한다.
"보존성 아미노산 치환"은 한 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 것이다. 염기성 측쇄 (가령, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (가령, 아스파르트산, 글루타민산), 하전되지 않은 극성 측쇄 (가령, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄 (가령, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지된 측쇄 (가령, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄 (가령, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 비롯한, 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리가 당분야에서 규정되었다. 따라서, 폴리펩티드에서 아미노산이 동일한 측쇄 패밀리로부터 다른 아미노산으로 대체되면, 치환은 보존성인 것으로 고려된다. 다른 구체예에서, 아미노산의 스트링은 측쇄 패밀리 구성원의 순서 및/또는 조성에서 상이한 구조적으로 유사한 스트링으로 보존성으로 대체될 수 있다.
당분야에서 공지된 바와 같이, 2개의 폴리펩티드 사이에 "서열 동일성"은 한 폴리펩티드의 아미노산 서열을 두 번째 폴리펩티드의 서열과 비교함으로써 결정된다. 본원에서 논의될 때, 임의의 특정 폴리펩티드가 다른 폴리펩티드와 최소한 약 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 100% 동일한 지의 여부는 당분야에서 공지된 방법 및 컴퓨터 프로그램/소프트웨어, 예를 들면, 하지만 제한 없이, BESTFIT 프로그램 (Wisconsin Sequence Analysis Package, Unix용 버전 8, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711)을 이용하여 결정될 수 있다. BESTFIT은 두 서열 사이에 상동성의 최고 분절을 찾기 위해, Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2: 482-489 (1981)의 국부 상동성 알고리즘을 이용한다. 특정 서열이 예로서, 본 발명에 따른 참고 서열과 95% 동일한 지를 결정하기 위해 BESTFIT 또는 임의의 다른 서열 정렬 프로그램을 이용할 때, 파라미터는 당연히, 동일성의 백분율이 참고 폴리펩티드 서열의 전장에 걸쳐 계산되고, 그리고 참고 서열에서 아미노산의 총수의 최대 5%의 상동성에서 갭이 허용되도록 설정된다.
본원에서 이용된 바와 같이, VWF 서열 또는 FVIII 단백질 서열에 "상응하는 아미노산" 또는 "동등한 아미노산"은 첫 번째 VWF 또는 FVIII 서열 및 두 번째 VWF 또는 FVIII 서열 사이에 동일성 또는 유사성을 최대화하는 정렬에 의해 확인된다. 두 번째 VWF 또는 FVIII 서열에서 동등한 아미노산을 확인하는데 이용된 번호는 첫 번째 VWF 또는 FVIII 서열에서 상응하는 아미노산을 확인하는데 이용된 번호에 근거된다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "삽입 부위"는 이종성 모이어티가 삽입될 수 있는 위치의 즉시 상류인, FVIII 폴리펩티드, 또는 이의 단편, 변이체 또는 유도체 내에 위치를 지칭한다. "삽입 부위"는 번호로서 특정되고, 상기 번호는 삽입의 위치의 즉시 N 말단인, 삽입 부위가 상응하는 성숙 선천적 FVIII (서열 번호: 65) 내에 아미노산의 번호이다. 가령, 관용구 "a3은 서열 번호: 65의 아미노산 1656에 상응하는 삽입 부위에서 XTEN을 포함한다"는 이종성 모이어티가 서열 번호: 65의 아미노산 1656 및 아미노산 1657에 상응하는 2개의 아미노산 사이에 위치된다는 것을 지시한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 관용구 "아미노산의 즉시 하류"는 아미노산의 말단 카르복실 기의 바로 오른쪽 옆에 위치를 지칭한다. 유사하게, 관용구 "아미노산의 즉시 상류"는 아미노산의 말단 아민 기의 바로 오른쪽 옆에 위치를 지칭한다. 이런 이유로, 본원에서 이용된 바와 같이, 관용구 "삽입 부위의 2개 아미노산 사이에"는 XTEN 또는 임의의 다른 폴리펩티드가 2개의 인접한 아미노산 사이에 삽입되는 위치를 지칭한다. 따라서, 관용구 "아미노산의 삽입된 즉시 하류" 및 "삽입 부위의 2개 아미노산 사이에 삽입된"은 "삽입 부위에서 삽입된"과 동의어로서 이용된다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "삽입된," "삽입된다," "내로 삽입된" 또는 문법적으로 관련된 용어는 선천적 성숙 인간 FVIII 내에 유사한 위치에 비하여 키메라 폴리펩티드 내에 XTEN의 위치를 지칭한다. 본원에서 이용된 바와 같이, 이들 용어는 선천적 성숙 인간 FVIII에 비하여 재조합 FVIII 폴리펩티드의 특징을 지칭하고, 그리고 키메라 폴리펩티드가 만들어진 임의의 방법 또는 과정을 지시하거나, 암시하거나 또는 의미하지 않는다. 가령, 본원에서 제공된 키메라 폴리펩티드에 관하여, 관용구 "XTEN은 FVIII 폴리펩티드의 잔기 745의 즉시 하류 내로 삽입된다"는 키메라 폴리펩티드가 선천적 성숙 인간 FVIII 내에 아미노산 745에 상응하는, 예를 들면, 선천적 성숙 인간 FVIII의 아미노산 745 및 746에 상응하는 아미노산들에 의해 경계를 이루는 아미노산의 즉시 하류에 XTEN을 포함한다는 것을 의미한다.
"융합" 또는 "키메라" 단백질은 자연에서 자연적으로 연결되지 않는 두 번째 아미노산 서열에 연결된 첫 번째 아미노산 서열을 포함한다. 별개의 단백질 내에 정상적으로 존재하는 아미노산 서열이 융합 폴리펩티드 내에서 합쳐질 수 있거나, 또는 동일한 단백질 내에 정상적으로 존재하는 아미노산 서열이 융합 폴리펩티드, 예를 들면, 본 발명의 인자 VIII 도메인 및 Ig Fc 도메인의 융합 내에서 새로운 배열에서 배치될 수 있다. 융합 단백질은 예로서, 화학적 합성에 의해, 또는 펩티드 영역이 원하는 관계에서 인코딩되는 폴리뉴클레오티드를 창출하고 번역함으로써 창출된다. 키메라 단백질은 공유, 비펩티드 결합 또는 비공유 결합에 의해 첫 번째 아미노산 서열과 연관된 두 번째 아미노산 서열을 더욱 포함할 수 있다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "반감기"는 생체내에서 특정 폴리펩티드의 생물학적 반감기를 지칭한다. 반감기는 개체에 투여된 양의 절반이 동물 내에서 순환 및/또는 다른 조직으로부터 소실되는데 필요한 시간에 의해 표현될 수 있다. 소정의 폴리펩티드의 소실 곡선이 시간의 함수로서 구축될 때, 곡선은 통상적으로 급속한 α-시기 및 더욱 긴 β-시기로 이상성이다. α-시기는 전형적으로, 혈관내 및 혈관외 공간 사이에 투여된 Fc 폴리펩티드의 평형화를 나타내고 부분적으로, 폴리펩티드의 크기에 의해 결정된다. β-시기는 전형적으로, 혈관내 공간에서 폴리펩티드의 분해대사를 나타낸다. 일부 구체예에서, FVIII 및 FVIII을 포함하는 키메라 단백질은 단상이고, 그리고 따라서, 알파 시기를 갖지 않고, 단지 단일 베타 시기만을 갖는다. 이런 이유로, 일정한 구체예에서, 용어 반감기는 본원에서 이용된 바와 같이, β-시기에서 폴리펩티드의 반감기를 지칭한다. 인간에서 인간 항체의 전형적인 β 시기 반감기는 21 일이다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "연결된"은 각각, 두 번째 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열에 공유적으로 또는 비공유적으로 결합된 첫 번째 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 첫 번째 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열이 두 번째 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열에 직접적으로 결합되거나 또는 병치될 수 있고, 또는 대안으로, 개재성 서열이 첫 번째 서열을 두 번째 서열에 공유적으로 연결할 수 있다. 용어 "연결된"은 C 말단 또는 N 말단에서 두 번째 아미노산 서열에 첫 번째 아미노산 서열의 융합을 의미할 뿐만 아니라 두 번째 아미노산 서열 (또는 첫 번째 아미노산 서열, 각각) 내에 임의의 2개의 아미노산 내로 전체 첫 번째 아미노산 서열 (또는 두 번째 아미노산 서열)의 삽입을 포함한다. 한 구체예에서, 첫 번째 아미노산 서열은 펩티드 결합 또는 링커에 의해 두 번째 아미노산 서열에 연결될 수 있다. 첫 번째 뉴클레오티드 서열은 포스포디에스테르 결합 또는 링커에 의해 두 번째 뉴클레오티드 서열에 연결될 수 있다. 링커는 펩티드 또는 폴리펩티드 (폴리펩티드 사슬의 경우) 또는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 사슬 (뉴클레오티드 사슬의 경우) 또는 임의의 화학적 모이어티 (폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드 사슬 둘 모두의 경우)일 수 있다. 용어 "연결된"은 또한, 하이픈 (-)에 의해 지시된다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "와 연관된"은 첫 번째 아미노산 사슬 및 두 번째 아미노산 사슬 사이에 형성된 공유 또는 비공유 결합을 지칭한다. 한 구체예에서, 용어 "와 연관된"은 공유, 비펩티드 결합 또는 비공유 결합을 의미한다. 이러한 연관은 콜론, 다시 말하면, (:)에 의해 지시될 수 있다. 다른 구체예에서, 이것은 펩티드 결합을 제외한 공유 결합을 의미한다. 가령, 아미노산 시스테인은 두 번째 시스테인 잔기 상에서 티올 기와 이황화 결합 또는 가교를 형성할 수 있는 티올 기를 포함한다. 대부분의 자연발생 IgG 분자에서, CH1 및 CL 영역은 이황화 결합에 의해 연관되고, 그리고 2개의 중쇄는 Kabat 넘버링 시스템을 이용하여 239 및 242에 상응하는 위치 (위치 226 또는 229, EU 넘버링 시스템)에서 2개의 이황화 결합에 의해 연관된다. 공유 결합의 실례는 펩티드 결합, 금속 결합, 수소 결합, 이황화 결합, 시그마 결합, 파이 결합, 델타 결합, 글리코시드 결합, 문외한적 결합, 굽은 결합, 배위 결합, 파이 주쇄, 이중 결합, 삼중 결합, 사중 결합, 5중 결합, 6중 결합, 접합, 하이퍼콘쥬게이션, 방향성, 햅토결합성, 또는 항결합을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 비공유 결합의 무제한적 실례는 이온 결합 (가령, 양이온-파이 결합 또는 염 결합), 금속 결합, 수소 결합 (가령, 양수소 결합, 양수소 복합체, 낮은 장벽 수소 결합, 또는 대칭적 수소 결합), 반 데르 발스 힘, 런던 분산력, 기계적 결합, 할로겐 결합, 아우로필리시티, 개재, 스태킹, 엔트로피 힘, 또는 화학적 극성을 포함한다.
본원에서 이용된 용어 "단위체-이합체 하이브리드"는 이황화 결합에 의해 서로 연관되는 첫 번째 폴리펩티드 사슬 및 두 번째 폴리펩티드 사슬을 포함하는 키메라 단백질을 지칭하고, 여기서 첫 번째 사슬은 응고 인자, 예를 들면, 인자 VIII 및 첫 번째 Fc 영역을 포함하고, 그리고 두 번째 사슬은 응고 인자 없이 두 번째 Fc 영역을 포함하거나, 이것으로 본질적으로 구성되거나, 또는 이것으로 구성된다. 단위체-이합체 하이브리드 구조체는 따라서, 단지 하나의 응고 인자만 갖는 단위체 양상 및 2개의 Fc 영역을 갖는 이합체 양상을 포함하는 하이브리드이다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "개열 부위" 또는 "효소적 개열 부위"는 효소에 의해 인식된 부위를 지칭한다. 일정한 효소적 개열 부위는 세포내 처리 부위를 포함한다. 한 구체예에서, 폴리펩티드는 이런 부위의 개열이 응괴 형성의 부위에서 발생하도록, 응고 연쇄 반응 동안 활성화되는 효소에 의해 개열된 효소적 개열 부위를 갖는다. 예시적인 이런 부위는 예로서, 트롬빈, 인자 XIa 또는 인자 Xa에 의해 인식된 것들을 포함한다. 예시적인 FXIa 개열 부위는 예로서, TQSFNDFTR (서열 번호: 1) 및 SVSQTSKLTR (서열 번호: 3)을 포함한다. 예시적인 트롬빈 개열 부위는 예로서, DFLAEGGGVR (서열번호: 4), TTKIKPR (서열번호: 5), LVPRG (서열번호: 6), ALRPR (서열번호: 7), ISDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (서열번호: 106), DKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (서열번호: 88), 그리고 IEPRSFS (서열번호: 194)를 포함한다. 다른 효소적 개열 부위는 당분야에서 공지되고 본원의 다른 곳에서 설명된다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "처리 부위" 또는 "세포내 처리 부위"는 폴리펩티드의 번역 후에 기능하는 효소에 대한 표적인 폴리펩티드 내에 효소적 개열 부위의 유형을 지칭한다. 한 구체예에서, 이런 효소는 골지 내강으로부터 트랜스-골지 구획으로 수송 동안 기능한다. 세포내 처리 효소는 세포로부터 단백질의 분비에 앞서 폴리펩티드를 개열한다. 이런 처리 부위의 실례는 예로서, 엔도펩티다아제의 PACE/퓨린 (여기서 PACE는 짝짓기된 염기성 아미노산 개열 효소에 대한 약어이다) 패밀리에 의해 표적화된 것들을 포함한다. 이들 효소는 골지 막에 국지화되고, 그리고 서열 모티프 Arg-[임의의 잔기]-(Lys 또는 Arg)-Arg의 카르복시 말단 측면 상에서 단백질을 개열한다. 본원에서 이용된 바와 같이, 효소의 "퓨린" 패밀리는 예로서, PCSK1 (PC1/Pc3으로서 또한 알려져 있음), PCSK2 (PC2로서 또한 알려져 있음), PCSK3 (퓨린 또는 PACE로서 또한 알려져 있음), PCSK4 (PC4로서 또한 알려져 있음), PCSK5 (PC5 또는 PC6으로서 또한 알려져 있음), PCSK6 (PACE로서 또한 알려져 있음), 또는 PCSK7 (PC7/LPC, PC8, 또는 SPC7로서 또한 알려져 있음)을 포함한다. 다른 처리 부위는 당분야에서 공지된다.
하나 이상의 처리 또는 개열 부위를 포함하는 구조체에서, 이런 부위는 동일하거나 상이할 수 있는 것으로 이해될 것이다.
용어 "퓨린"은 EC 번호 3.4.21.75에 상응하는 효소를 지칭한다. 퓨린은 서브틸리신-유사 전단백질 전환효소인데, 이것은 PACE (짝짓기된 염기성 아미노산 개열 효소)로서 또한 알려져 있다. 퓨린은 비활성 전구체 단백질의 섹션을 결실시켜 이들을 생물학적으로 활성 단백질로 전환한다. 세포내 수송 동안, VWF의 프로펩티드는 퓨린 효소에 의해 성숙 VWF 분자로부터 개열될 수 있다. 일부 구체예에서, 퓨린은 VWF의 D'D3으로부터 D1D2를 개열한다. 다른 구체예에서, 퓨린을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 D1D2 도메인이 퓨린에 의해 세포내에 개열될 수 있도록, VWF 단편을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열과 함께 발현될 수 있다.
하나 이상의 처리 또는 개열 부위를 포함하는 구조체에서, 이런 부위는 동일하거나 상이할 수 있는 것으로 이해될 것이다.
본원에서 이용된 바와 같이, "처리가능 링커"는 본원의 다른 곳에서 설명되는, 최소한 하나의 세포내 처리 부위를 포함하는 링커를 지칭한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 지혈 장애는 자발적으로 또는 외상의 결과로서, 섬유소 응괴를 형성하는 손상된 능력 또는 능력 없음으로 인해, 출혈의 소인에 의해 특징화되는 유전적으로 유전된 또는 후천성 질환을 의미한다. 이런 장애의 실례는 혈우병을 포함한다. 3가지 주요 형태는 A형 혈우병 (인자 VIII 결핍), B형 혈우병 (인자 IX 결핍 또는 "크리스마스병") 및 C형 혈우병 (인자 XI 결핍, 경미한 출혈 경향)이다. 다른 지혈 장애는 예로서, 폰빌레브란트 질환, 인자 XI 결핍 (PTA 결핍), 인자 XII 결핍, 피브리노겐, 프로트롬빈, 인자 V, 인자 VII, 인자 X 또는 인자 XIII에서 결핍 또는 구조적 비정상, GPIb에서 결함 또는 결핍인 베르나르 술리에 증후군을 포함한다. VWF에 대한 수용체인 GPIb는 결함성이고 일차 응괴 형성 (일차 지혈)의 결여 및 증가된 출혈 경향, 그리고 글란즈만 네겔리 혈소판무력증 (글란츠만 혈소판기능저하증)을 야기할 수 있다. 간부전 (급성과 만성 형태)에서, 간에 의한 응고 인자의 생산이 불충분하다; 이것은 출혈 위험을 증가시킬 수 있다.
본 발명의 키메라 분자는 예방적으로 이용될 수 있다. 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "예방적 치료"는 출혈 에피소드에 앞서 분자의 투여를 지칭한다. 한 구체예에서, 전신 지혈 작용제가 필요한 개체는 수술을 받고 있거나, 또는 받을 예정이다. 본 발명의 키메라 단백질은 예방제로서 수술에 앞서 또는 수술 이후에 투여될 수 있다. 본 발명의 키메라 단백질은 급성 출혈 에피소드를 제어하기 위해, 수술 동안 또는 수술 후 투여될 수 있다. 수술은 간 이식, 간 적출, 치과 시술, 또는 줄기 세포 이식을 포함할 수 있지만 이들에 한정되지 않는다.
본 발명의 키메라 단백질은 또한, 주문형 치료에 이용된다. 용어 "주문형 치료"는 출혈 에피소드의 증상에 대한 응답으로 또는 출혈을 유발할 수 있는 활동 전에 키메라 분자의 투여를 지칭한다. 한 양상에서, 주문형 치료는 출혈이 시작될 때, 예를 들면, 손상 후, 또는 출혈이 예상될 때, 예를 들면, 수술 전에 개체에 제공될 수 있다. 다른 양상에서, 주문형 치료는 출혈의 위험을 증가시키는 활동, 예를 들면, 접촉 스포츠에 앞서 제공될 수 있다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "급성 출혈"은 근원적인 원인에 상관없이 출혈 에피소드를 지칭한다. 가령, 개체는 외상, 요독증, 유전성 출혈 장애 (가령, 인자 VII 결핍), 혈소판 장애, 또는 응고 인자에 대한 항체의 발달로 인한 내성을 가질 수 있다.
본원에서 이용된 바와 같이, "치료하다", "치료", "치료하는"은 예로서, 질환 또는 장애의 심각도에서 감소; 질환 코스의 지속 기간에서 감소; 질환 또는 장애와 연관된 하나 또는 그 이상의 증상의 개선; 질환 또는 장애를 반드시 치료할 필요 없이, 질환 또는 장애를 앓는 개체에 유익한 효과의 제공, 또는 질환 또는 장애와 연관된 하나 또는 그 이상의 증상의 예방을 지칭한다. 한 구체예에서, 용어 "치료하는" 또는 "치료"는 본 발명의 키메라 단백질 또는 VWF 단편을 투여함으로써, 개체에서 FVIII 트로프 수준을 최소한 약 1 IU/dL, 2 IU/dL, 3 IU/dL, 4 IU/dL, 5 IU/dL, 6 IU/dL, 7 IU/dL, 8 IU/dL, 9 IU/dL, 10 IU/dL, 11 IU/dL, 12 IU/dL, 13 IU/dL, 14 IU/dL, 15 IU/dL, 16 IU/dL, 17 IU/dL, 18 IU/dL, 19 IU/dL, 또는 20 IU/dL에 유지하는 것을 의미한다. 다른 구체예에서, "치료하는" 또는 "치료"는 FVIII 트로프 수준을 약 1 및 약 20 IU/dL, 약 2 및 약 20 IU/dL, 약 3 및 약 20 IU/dL, 약 4 및 약 20 IU/dL, 약 5 및 약 20 IU/dL, 약 6 및 약 20 IU/dL, 약 7 및 약 20 IU/dL, 약 8 및 약 20 IU/dL, 약 9 및 약 20 IU/dL, 또는 약 10 및 약 20 IU/dL 사이에 유지하는 것을 의미한다. 질환 또는 장애의 "치료" 또는 "치료하는"은 또한, 개체에서 FVIII 활성을 비-혈우병 환자 개체에서 FVIII 활성의 최소한 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 또는 20%에 필적하는 수준에서 유지하는 것을 포함할 수 있다. 치료에 필요한 최소 트로프 수준은 하나 또는 그 이상의 공지된 방법에 의해 계측될 수 있고 각 개인에 대해 조정 (증가 또는 감소)될 수 있다.
II.
키메라 단백질
본 발명은 FVIII 반감기 제한 인자, 다시 말하면, 내인성 VWF가 FVIII 단백질과 연관되는 것을 예방하거나 또는 저해함으로써, XTEN 서열에 융합된 VWF 단백질을 이용하여 키메라 단백질의 반감기를 연장하는 것에 관계한다. 내인성 VWF는 비공유 복합체에서 FVIII 중에서 약 95% 내지 약 98%와 연관된다. 내인성 VWF가 FVIII 반감기 제한 인자이긴 하지만, FVIII 단백질에 결합된 내인성 VWF 역시 FVIII을 다양한 방식으로 보호하는 것으로 알려져 있다. 가령, 전장 VWF (약 250 kDa를 갖는 다합체로서)는 프로테아제 개열 및 FVIII 활성화로부터 FVIII을 보호하고, FVIII 중쇄 및/또는 경쇄를 안정시키고, 그리고 스캐빈저 수용체에 의한 FVIII의 소실을 예방할 수 있다. 하지만, 동시에, 내인성 VWF는 포음작용을 예방함으로써 및 FVIII-VWF 복합체를 VWF 소실 경로를 통해 시스템으로부터 청소함으로써 FVIII 반감기를 제한한다. 이론에 의해 한정됨 없이, 내인성 VWF는 반감기 증량제에 융합된 키메라 단백질의 반감기가 야생형 FVIII의 반감기보다 약 2-배 이상 길어지는 것을 예방하는 반감기 제한 인자인 것으로 생각된다. 이런 이유로, 본 발명은 D' 도메인 및 D3 도메인을 포함하는 VWF 단백질 (가령, VWF 단편)을 이용하여 내인성 VWF 및 FVIII 단백질 사이에 상호작용을 예방하거나 또는 저해하고, 그리고 이와 동시에, Ig 불변 영역 또는 이의 부분과 합동으로 XTEN 서열을 이용함으로써 결과의 FVIII 단백질(들)의 반감기를 증가시키는 것에 관계한다. 특히, 본 발명은 더욱 짧은 XTEN 서열 (즉, 길이에서 288개보다 적은 아미노산을 내포하는 XTEN, 다시 말하면, 288개 아미노산보다 짧은 XTEN)이 키메라 단백질의 반감기를 연장하는데 더욱 우수하다는 것을 보여준다.
한 구체예에서, 본 발명은 (i) 첫 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분에 융합된 FVIII 단백질을 포함하는 첫 번째 폴리펩티드 및 (ii) 중간의 XTEN 서열에 의해 두 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분에 융합된 VWF의 D' 도메인 및 D3 도메인을 포함하는 VWF 단백질을 포함하는 두 번째 폴리펩티드를 포함하는 키메라 단백질에 관계하고, 여기서 XTEN 서열은 288개보다 적은 아미노산 잔기를 내포하고, 그리고 여기서 첫 번째 폴리펩티드는 두 번째 폴리펩티드에 연결되거나 또는 연관된다. 다른 구체예에서, 두 번째 폴리펩티드 내에 XTEN 서열은 12개 아미노산 및 287개 아미노산 사이의 길이를 갖는 아미노산 서열로 구성된다. 다른 구체예에서, 키메라 단백질은 첫 번째 폴리펩티드 및 두 번째 폴리펩티드를 포함하는 상응하는 융합 단백질과 비교하여 더욱 긴 반감기를 전시하고, 여기서 두 번째 폴리펩티드는 최소한 288개 아미노산, 예를 들면, AE288, 예를 들면, 서열 번호: 8을 내포하는 XTEN 서열을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 두 번째 폴리펩티드 내에 XTEN 서열은 최소한 약 36개, 최소한 약 42개, 최소한 약 72개, 또는 최소한 약 144개 아미노산, 하지만 288개보다 적은 아미노산, 예를 들면, AE42, AE72, AE144 (AE144, AE144_2A, AE144_3B, AE144_4A, AE144_5A, AE144_6B), AG42, AG72, 또는 AG144 (AG144, AG144_A, AG144_B, AG144_C, AG144_F), 예를 들면, 서열 번호: 9, 서열 번호: 10, 서열 번호: 11, 서열 번호: 55; 서열 번호: 56; 서열 번호: 57; 서열 번호: 58; 서열 번호: 59; 서열 번호: 14; 서열 번호: 60; 서열 번호: 61; 서열 번호: 62; 또는 서열 번호: 63을 내포한다.
본 발명의 키메라 단백질은 FVIII 단백질을 첫 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분과 연결하는 두 번째 XTEN 서열을 더욱 포함할 수 있다.
일정한 구체예에서, 본 발명은 (i) 첫 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분에 융합된 FVIII 단백질을 포함하는 첫 번째 폴리펩티드 및 (ii) 중간의 첫 번째 XTEN 서열에 의해 두 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분에 융합된 VWF의 D' 도메인 및 D3 도메인을 포함하는 VWF 단백질을 포함하는 두 번째 폴리펩티드를 포함하는 키메라 단백질에 관계하고, 여기서 XTEN 서열은 288개보다 적은 아미노산 잔기를 내포하고, 그리고 여기서 첫 번째 폴리펩티드는 두 번째 폴리펩티드에 연결되거나 또는 연관되고, 그리고 여기서 첫 번째 폴리펩티드는 FVIII 단백질 내에 하나 또는 그 이상의 삽입 부위에서 삽입되거나 또는 FVIII 단백질 및/또는 첫 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분에 융합되는 두 번째 XTEN 서열을 더욱 포함한다. 이런 이유로, 한 구체예에서, 두 번째 XTEN 서열은 FVIII 단백질 내에 하나 또는 그 이상의 삽입 부위에서 삽입된다. 다른 구체예에서, 두 번째 XTEN 서열은 FVIII 단백질 및/또는 첫 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분에 융합된다. 다른 구체예에서, 두 번째 XTEN 서열은 FVIII 단백질 내에 하나 또는 그 이상의 삽입 부위에서 삽입되고, 그리고 세 번째 XTEN 서열은 FVIII 단백질 및/또는 첫 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분에 융합된다.
두 번째 및/또는 세 번째 XTEN 서열은 임의의 길이의 XTEN 아미노산일 수 있다. 가령, 두 번째 및/또는 세 번째 XTEN 서열, 예를 들면, AE42, AE72, AE864, AE576, AE288, AE144, AG864, AG576, AG288, 그리고 AG144, 예를 들면, 서열 번호: 8; 서열 번호: 9, 서열 번호: 10, 서열 번호: 11, 서열 번호: 17; 서열 번호: 54; 서열 번호: 19; 서열 번호: 16; 서열 번호: 18; 서열 번호: 15; 서열 번호: 55; 서열 번호: 56; 서열 번호: 57; 서열 번호: 58; 서열 번호: 59; 서열 번호: 14; 서열 번호: 60; 서열 번호: 61; 서열 번호: 62; 또는 서열 번호: 63은 본원의 다른 곳에서 개시된다. 특정 구체예에서, 두 번째 및/또는 세 번째 XTEN 서열은 AE288 또는 AG288, 예를 들면, 서열 번호: 8 또는 19이다.
일정한 구체예에서, 본 발명은 다음을 포함하는 키메라 단백질에 관계한다: (i) 임의선택적 링커에 의해 첫 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분에 융합된 FVIII 단백질을 포함하는 첫 번째 폴리펩티드, 여기서 임의선택적 XTEN 서열 (X2)은 FVIII 단백질 내에 하나 또는 그 이상의 삽입 부위에서 삽입되거나 또는 FVIII 단백질 또는 첫 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분에 융합되고, 그리고 (ii) VWF 단백질 및 두 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분 사이에 XTEN 서열 (X1)에 의해 두 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분에 융합된 VWF의 D' 도메인 및 D3 도메인을 포함하는 VWF 단백질을 포함하는 두 번째 폴리펩티드, 여기서 XTEN 서열 (X1)은 288개보다 적은 아미노산 잔기를 내포하고 링커에 의해 VWF 단백질에 융합되고, 그리고 여기서 첫 번째 폴리펩티드 및 두 번째 폴리펩티드는 연관된다. 일부 구체예에서, 본 발명은 다음을 포함하는 키메라 단백질에 관계한다: (i) 임의선택적 링커에 의해 첫 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분에 융합된 FVIII 단백질을 포함하는 첫 번째 폴리펩티드, 여기서 임의선택적 XTEN 서열 (X2)은 FVIII 단백질 내에 하나 또는 그 이상의 삽입 부위에서 삽입되거나 또는 FVIII 단백질 또는 첫 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분에 융합되고, 그리고 (ii) VWF 단백질 및 두 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분 사이에 XTEN 서열 (X1)에 의해 두 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분에 융합된 VWF의 D' 도메인 및 D3 도메인을 포함하는 VWF 단백질을 포함하는 두 번째 폴리펩티드, 여기서 XTEN 서열 (X1)은 288개보다 적은 아미노산 잔기를 내포하고 링커에 의해 두 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분에 융합되고, 그리고 여기서 첫 번째 폴리펩티드 및 두 번째 폴리펩티드는 연관된다. 다른 구체예에서, XTEN 서열 (X1)을 VWF 단백질 또는 두 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분과 융합하는 링커는 개열가능 링커이다. 개열가능 링커의 무제한적 실례는 본원의 다른 곳에서 도시된다. 특정 구체예에서, 링커는 트롬빈 개열가능 링커이다.
일부 구체예에서, 키메라 단백질은 2개 폴리펩티드 사슬이고, 첫 번째 사슬은 앞서 설명된 첫 번째 폴리펩티드를 포함하고 두 번째 사슬은 앞서 설명된 두 번째 폴리펩티드를 포함한다. 가령, 이들 2개 폴리펩티드 사슬은 다음을 포함한다: (i) 단일 사슬 FVIII 단백질, 첫 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분, 그리고 FVIII 단백질 내에 하나 또는 그 이상의 삽입 부위에서 삽입되거나 또는 FVIII 단백질 또는 첫 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분에 융합되는 임의선택적 XTEN 서열을 포함하는 첫 번째 사슬, 그리고 (ii) 중간의 XTEN 서열 (X1)에 의해 두 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분에 융합된 VWF 단백질을 포함하는 두 번째 사슬, 여기서 XTEN 서열 (X1)은 288개보다 적은 아미노산을 내포한다.
일정한 구체예에서, 키메라 단백질은 2개 폴리펩티드 사슬이고, 첫 번째 사슬은 FVIII 단백질의 중쇄를 포함하고, 그리고 두 번째 사슬은 N 말단으로부터 C 말단으로, FVIII 단백질의 경쇄, FVIII 단백질 내에 하나 또는 그 이상의 삽입 부위에서 삽입되거나 또는 FVIII 단백질 또는 첫 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분에 융합되는 임의선택적 XTEN 서열, 그리고 첫 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분, 임의선택적 링커 (가령, 처리가능 링커), VWF 단백질, XTEN 서열 (X1), 두 번째 임의선택적 링커 (가령, 개열가능 링커), 그리고 두 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분을 포함한다.
다른 구체예에서, 키메라 단백질은 3개 폴리펩티드 사슬이고, (i) 첫 번째 사슬은 FVIII 단백질의 중쇄를 포함하고, (ii) 두 번째 사슬은 FVIII 단백질의 경쇄, 첫 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분, 그리고 FVIII 단백질의 중쇄 또는 경쇄 내에 하나 또는 그 이상의 삽입 부위에서 삽입되거나 또는 FVIII 단백질 또는 첫 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분에 융합되는 임의선택적 XTEN 서열을 포함하고, 그리고 (iii) 세 번째 사슬은 중간의 XTEN 서열 (X1)에 의해 두 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분에 융합된 VWF 단백질을 포함하고, 여기서 첫 번째 사슬 및 두 번째 사슬은 비공유 결합, 예를 들면, 금속 결합에 의해 연관되고, 그리고 두 번째 사슬 및 세 번째 사슬은 공유 결합, 예를 들면, 이황화 결합에 의해 연관된다.
또 다른 구체예에서, 키메라 단백질은 N 말단으로부터 C 말단으로, 단일 사슬 FVIII 단백질, FVIII 단백질 내에 하나 또는 그 이상의 삽입 부위에서 삽입되거나 또는 FVIII 단백질 또는 첫 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분에 융합되는 임의선택적 XTEN 서열, 그리고 첫 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분, 임의선택적 링커 (가령, 처리가능 링커), VWF 단백질, XTEN 서열 (X1), 두 번째 임의선택적 링커 (가령, 개열가능 링커), 그리고 두 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분을 포함하는 단일 사슬이다.
일정한 구체예에서, 키메라 단백질은 다음 화학식 (a)-(hh) 중에서 한 가지를 포함한다:
(a)
FVIII-F1:F2-L2-X-L1-V;
(b)
FVIII-F1:V-L1-X-L2-F2;
(c)
F1-FVIII:F2-L2-X-L1-V;
(d)
F1-FVIII:V-L1-X-L2-F2;
(e)
FVIII-X2-F1:F2-L2-X1-L1-V;
(f)
FVIII-X2-F1:V-L1-X1-L2-F2;
(g)
FVIII(X2)-F1:F2-L2-X1-L1-V;
(h)
FVIII(X2)-F1:V-L1-X1-L2-F2;
(i)
F1-X2-F1:F2-L2-X1-L1-V;
(j)
F1-X2-F1:V-L1-X1-L2-F2;
(k)
V-L1-X-L2-F2-L3-FVIII-L4-F1;
(l)
V-L1-X-L2-F2-L3-F1-L4-FVIII;
(m)
F1-L4-FVIII-L3-F2-L2-X-L1-V;
(n)
FVIII-L4-F1-L3-F2-L2-X-L1-V;
(o)
FVIII-L4-F1-L3-V-L1-X-L2-F2;
(p)
FVIII-L4-F1-L3-F2-L2-X-L1-V;
(q)
F2-L2-X-L1-V-L3-F1-L4-FVIII;
(r)
F2-L2-X-L1-V-L3-FVIII-L4-F1;
(s)
V-L1-X1-L2-F2-L3-FVIII(X2)-L4-F1;
(t)
V-L1-X1-L2-F2-L3-F1-L4-FVIII(X2);
(u)
F1-L4-FVIII(X2)-L3-F2-L2-X1-L1-V;
(v)
F-L4-FVIII(X2)-L3-V-L1-X1-L2-F2;
(w)
FVIII(X2)-L4-F1-L3-V-L1-X1-L2-F2;
(x)
FVIII(X2)-L4-F1-L3-F2-L2-X1-L1-V;
(y)
F2-L2-X1-L1-V-L3-F1-L4-FVIII(X2);
(z)
F2-L2-X1-L1-V-L3-FVIII(X2)-L4-F1;
(aa)
V-L1-X2-L2-F2-L3-FVIII-L4-X2-L5-F1;
(bb)
V-L1-X2-L2-F2-L3-F1-L5-X2-L4-FVIII;
(cc)
F1-L5-X2-L4-FVIII-L3-F2-L2-X2-L1-V;
(dd)
F1-L5-X2-L4-FVIII-L3-V-L1-X2-L2-F2;
(ee)
FVIII-L5-X2-L4-F2-L3-V-L1-X1-L2-F1;
(ff)
FVIII-L5-X2-L4-F2-L3-F1-L2-X1-L1-V;
(gg)
F1-L2-X1-L1-V-L3-F2-L4-X2-L5-FVIII; 또는
(hh)
F1-L2-X1-L1-V-L3-FVIII-L5-X2-L4-F2;
여기서 V는 VWF 단백질이고, 이것은 D' 도메인 및 D3 도메인을 포함하고,
X 또는 X1은 288개보다 적은 아미노산을 내포하는 첫 번째 XTEN 서열이고,
X2는 두 번째 XTEN 서열이고,
FVIII은 FVIII 단백질을 포함하고,
FVIII(X2)는 FVIII 단백질 내에 하나 또는 그 이상의 삽입 부위에 삽입된 두 번째 XTEN 서열을 갖는 FVIII 단백질을 포함하고,
F1은 첫 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분이고,
F2는 두 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분이고,
L1, L2, L3, L4, 또는 L5는 임의선택적 링커이고,
(-)는 펩티드 결합이고; 그리고
(:)는 공유 결합 또는 비공유 결합이다.
한 구체예에서, X 또는 X1은 12개 아미노산 및 287개 아미노산 사이의 길이를 갖는 아미노산 서열로 구성된다. 다른 구체예에서, 키메라 단백질은 X 또는 X1이 AE288, 예를 들면, 서열 번호: 8인 화학식을 포함하는 상응하는 융합 단백질과 비교하여 더욱 긴 반감기를 전시한다.
다른 구체예에서, 화학식 내에 X 또는 X1은 최소한 약 36개, 최소한 약 42개, 최소한 약 72개, 또는 최소한 약 144개 아미노산, 하지만 288개보다 적은 아미노산, 예를 들면, AE42, AE72, AE144 (AE144, AE144_2A, AE144_3B, AE144_4A, AE144_5A, AE144_6B), AG42, AG72, 또는 AG144 (AG144, AG144_A, AG144_B, AG144_C, AG144_F), 예를 들면, 서열 번호: 9, 서열 번호: 10, 서열 번호: 11, 서열 번호: 55; 서열 번호: 56; 서열 번호: 57; 서열 번호: 58; 서열 번호: 59; 서열 번호: 14; 서열 번호: 60; 서열 번호: 61; 서열 번호: 62; 또는 서열 번호: 63을 내포한다.
또 다른 구체예에서, X2는 최소한 약 36개 아미노산, 최소한 42개 아미노산, 최소한 144개 아미노산, 최소한 288개 아미노산, 최소한 576개 아미노산, 또는 최소한 864개 아미노산의 길이를 갖는 아미노산 서열, 예를 들면, AE42, AE72, AE864, AE576, AE288, AE144, AG864, AG576, AG288, 또는 AG144, 예를 들면, 서열 번호: 9; 서열 번호: 10; 서열 번호: 15; 서열 번호: 16; 서열 번호: 8; 서열 번호: 11; 서열 번호: 17; 서열 번호: 18, 서열 번호: 19, 또는 서열 번호: 14를 포함한다. 특정 구체예에서, X2는 AE288 또는 AG288, 예를 들면, 서열 번호: 8 또는 19이다.
일정한 구체예에서, X 또는 X1 및/또는 X2를 포함하는 키메라 단백질은 X 또는 X1 및/또는 X2가 없는 키메라 단백질과 비교하여 연장된 반감기를 갖는다. 다른 구체예에서, L1 및/또는 L2는 개열가능 링커이다. 또 다른 구체예에서, L4 및/또는 L5는 개열가능 링커이다.
II.A. 폰빌레브란트 인자 (VWF) 단백질
VWF (F8VWF로서 또한 알려져 있음)는 혈장 내에 존재하고, 그리고 내피 (다세관체에서), 거대핵세포 (혈소판의 α-과립), 그리고 내피하 결합 조직에서 구조성으로 생산되는 큰 다중결합 당단백질이다. 기본 VWF 단위체는 2813개 아미노산 단백질이다. 모든 단위체는 특정한 기능을 갖는 다수의 특정한 도메인, D'/D3 도메인 (이것은 인자 VIII에 결합한다), A1 도메인 (이것은 혈소판 GPIb-수용체, 헤파린, 및/또는 아마도 콜라겐에 결합한다), A3 도메인 (이것은 콜라겐에 결합한다), C1 도메인 (여기서 RGD 도메인이 혈소판 인테그린 αIIbβ3이 활성화될 때, 이것에 결합한다), 그리고 단백질의 C 말단 단부에서 "시스테인 매듭" 도메인 (VWF는 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF), 전환 성장 인자-β (TGFβ) 및 β-인간 융모생식선자극호르몬 (βHCG)과 이것을 공유한다)을 내포한다.
한 구체예에서, VWF 단백질은 VWF 단편이다. 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "VWF 단편"은 FVIII에 내인성 VWF의 결합을 저해할 수 있는, D' 도메인 및 D3 도메인을 포함하는 기능적 VWF 단편을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 한 구체예에서, VWF 단편은 FVIII 단백질에 결합한다. 다른 구체예에서, VWF 단편은 FVIII 단백질 상에서 VWF 결합 부위를 차단하고, 따라서 FVIII 단백질 및 내인성 VWF의 상호작용을 저해한다. VWF 단편은 VWF의 이들 활성을 유지하는 유도체, 변이체, 돌연변이체, 또는 유사체를 포함한다.
인간 VWF에 대한 2813개 단위체 아미노산 서열은 Genbank에서 수탁 번호 _NP_000543.2__로서 보고된다. 인간 VWF를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 Genbank에서 수탁 번호 __NM_000552.3_로서 보고된다. 인간 VWF의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호: 20으로서 지정된다. 서열 번호: 21은 전장 VWF의 아미노산 서열이다. VWF의 각 도메인은 표 1에서 열거된다.
본원에서 이용된 바와 같은 VWF 단백질은 VWF의 D' 도메인 및 D3 도메인을 포함하는 VWF 단편일 수 있고, 여기서 VWF 단편은 인자 VIII (FVIII)에 결합하고 FVIII에 내인성 VWF (전장 VWF)의 결합을 저해한다. D' 도메인 및 D3 도메인을 포함하는 VWF 단편은 A1 도메인, A2 도메인, A3 도메인, D1 도메인, D2 도메인, D4 도메인, B1 도메인, B2 도메인, B3 도메인, C1 도메인, C2 도메인, CK 도메인, 이들의 하나 또는 그 이상의 단편, 그리고 이들의 임의의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 VWF 도메인을 더욱 포함할 수 있다. 한 구체예에서, VWF 단편은 (1) VWF의 D' 및 D3 도메인 또는 이들의 단편; (2) VWF의 D1, D' 및 D3 도메인 또는 이들의 단편; (3) VWF의 D2, D' 및 D3 도메인 또는 이들의 단편; (4) VWF의 D1, D2, D' 및 D3 도메인 또는 이들의 단편; 또는 (5) VWF의 D1, D2, D', D3 및 A1 도메인 또는 이들의 단편을 포함하거나, 이들로 본질적으로 구성되거나, 또는 이들로 구성된다. 본원에서 설명된 VWF 단편은 VWF 간극 수용체에 결합하는 부위를 내포하지 않는다. 다른 구체예에서, 본원에서 설명된 VWF 단편은 서열 번호: 21의 아미노산 764 내지 1274가 아니다. 본 발명의 VWF 단편은 VWF 단편에 연결되거나 또는 융합된 임의의 다른 서열을 포함할 수 있다. 가령, 본원에서 설명된 VWF 단편은 신호 펩티드를 더욱 포함할 수 있다.
한 구체예에서, D' 도메인 및 D3 도메인을 포함하는 VWF 단편은 FVIII 단백질에 결합하거나 또는 연관된다. FVIII 단백질에 결합하거나 또는 연관함으로써, 본 발명의 VWF 단편은 FVIII을 프로테아제 개열 및 FVIII 활성화로부터 보호하고, FVIII의 중쇄 및 경쇄를 안정시키고, 그리고 스캐빈저 수용체에 의한 FVIII의 소실을 예방한다. 다른 구체예에서, VWF 단편은 FVIII 단백질에 결합하거나 또는 연관되고, 그리고 인지질 및 활성화된 단백질 C에 FVIII 단백질의 결합을 차단하거나 또는 예방한다. FVIII 단백질 및 내인성, 전장 VWF의 결합을 예방하거나 또는 저해함으로써, 본 발명의 VWF 단편은 VWF 간극 수용체에 의한 FVIII의 소실을 감소시키고, 따라서 키메라 단백질의 반감기를 연장한다. 키메라 단백질의 반감기 연장은 따라서, VWF 간극 수용체 결합 부위를 결여하는 VWF 단편의 FVIII 단백질에 결합 또는 연관, 그리고 VWF 간극 수용체 결합 부위를 내포하는 내인성 VWF로부터 VWF 단편에 의한 FVIII 단백질의 차폐 또는 보호에 기인한다. VWF 단편에 결합된 또는 이것에 의해 보호된 FVIII 단백질은 또한, FVIII 단백질의 재활용을 허용할 수 있다. 전장 VWF 분자에서 내포된 VWF 소실 경로 수용체 결합 부위를 제거함으로써, 본 발명의 FVIII/VWF 이형이합체는 VWF 소실 경로로부터 보호되고, FVIII 반감기를 더욱 연장한다.
한 구체예에서, 본 발명에 유용한 VWF 단백질은 VWF의 D' 도메인 및 D3 도메인을 포함하고, 여기서 D' 도메인은 서열 번호: 21의 아미노산 764 내지 866과 최소한 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일하고, 여기서 VWF 단백질은 FVIII에 내인성 VWF의 결합을 예방하거나 또는 저해한다. 다른 구체예에서, VWF 단백질은 VWF의 D' 도메인 및 D3 도메인을 포함하고, 여기서 D3 도메인은 서열 번호: 21의 아미노산 867 내지 1240과 최소한 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일하고, 여기서 VWF 단백질은 FVIII에 내인성 VWF의 결합을 예방하거나 또는 저해한다. 일부 구체예에서, 본원에서 설명된 VWF 단백질은 서열 번호: 21의 아미노산 764 내지 1240과 최소한 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 VWF의 D' 도메인 및 D3 도메인을 포함하거나, 이들로 본질적으로 구성되거나, 또는 이들로 구성되고, 여기서 VWF 단백질은 FVIII에 내인성 VWF의 결합을 예방하거나 또는 저해한다. 다른 구체예에서, VWF 단백질은 서열 번호: 21의 아미노산 23 내지 1240과 최소한 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 D1, D2, D' 및 D3 도메인을 포함하거나, 이들로 본질적으로 구성되거나, 또는 이들로 구성되고, 여기서 VWF 단백질은 FVIII에 내인성 VWF의 결합을 예방하거나 또는 저해한다. 또 다른 구체예에서, VWF 단백질은 거기에 작동가능하게 연결된 신호 펩티드를 더욱 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명에 유용한 VWF 단백질은 (1) D'D3 도메인, D1D'D3 도메인, D2D'D3 도메인, 또는 D1D2D'D3 도메인 및 (2) 최대 약 10개 아미노산 (가령, 서열 번호: 21의 아미노산 764 내지 1240으로부터 서열 번호: 21의 아미노산 764 내지 1250까지 임의의 서열), 최대 약 15개 아미노산 (가령, 서열 번호: 21의 아미노산 764 내지 1240으로부터 서열 번호: 21의 아미노산 764 내지 1255까지 임의의 서열), 최대 약 20개 아미노산 (가령, 서열 번호: 21의 아미노산 764 내지 1240으로부터 서열 번호: 21의 아미노산 764 내지 1260까지 임의의 서열), 최대 약 25개 아미노산 (가령, 서열 번호: 21의 아미노산 764 내지 1240으로부터 서열 번호: 21의 아미노산 764 내지 1265까지 임의의 서열), 또는 최대 약 30개 아미노산 (가령, 서열 번호: 21의 아미노산 764 내지 1240으로부터 서열 번호: 21의 아미노산 764 내지 1260까지 임의의 서열)의 추가 VWF 서열로 본질적으로 구성되거나 또는 구성된다. 특정 구체예에서, D' 도메인 및 D3 도메인을 포함하거나 또는 이들로 본질적으로 구성되는 VWF 단백질은 서열 번호: 21의 아미노산 764 내지 1274가 아니고, 또한 전장 성숙 VWF도 아니다. 일부 구체예에서, D1D2 도메인은 D'D3 도메인과 트랜스 (trans)로 발현된다. 일부 구체예에서, D1D2 도메인은 D'D3 도메인과 시스 (cis)로 발현된다.
다른 구체예에서, D1D2 도메인에 연결된 D'D3 도메인을 포함하는 VWF 단백질은 세포내 개열 부위, 예를 들면, (PACE (퓨린) 또는 PC5에 의한 개열 부위)를 더욱 포함하고, 발현 시에 D'D3 도메인으로부터 D1D2 도메인의 개열을 허용한다. 세포내 개열 부위의 무제한적 실례는 본원의 다른 곳에서 개시된다.
또 다른 구체예에서, VWF 단백질은 D' 도메인 및 D3 도메인을 포함하지만, (1) 서열 번호: 21에 상응하는 아미노산 1241 내지 2813, (2) 서열 번호: 21에 상응하는 아미노산 1270 내지 아미노산 2813, (3) 서열 번호: 21에 상응하는 아미노산 1271 내지 아미노산 2813, (4) 서열 번호: 21에 상응하는 아미노산 1272 내지 아미노산 2813, (5) 서열 번호: 21에 상응하는 아미노산 1273 내지 아미노산 2813, (6) 서열 번호: 21에 상응하는 아미노산 1274 내지 아미노산 2813, 그리고 이들의 임의의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하지 않는다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 VWF 단백질은 D' 도메인, D3 도메인, 그리고 A1 도메인에 상응하는 아미노산 서열을 포함하거나, 이것으로 본질적으로 구성되거나, 또는 이것으로 구성되고, 여기서 아미노산 서열은 서열 번호: 21의 아미노산 764 내지 1479와 최소한 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일하고, 여기서 VWF 단백질은 FVIII에 내인성 VWF의 결합을 예방한다. 특정 구체예에서, VWF 단백질은 서열 번호: 21의 아미노산 764 내지 1274가 아니다.
일부 구체예에서, 본 발명의 VWF 단백질은 D' 도메인 및 D3 도메인을 포함하지만, (1) A1 도메인, (2) A2 도메인, (3) A3 도메인, (4) D4 도메인, (5) B1 도메인, (6) B2 도메인, (7) B3 도메인, (8) C1 도메인, (9) C2 도메인, (10) CK 도메인, (11) CK 도메인 및 C2 도메인, (12) CK 도메인, C2 도메인, 그리고 C1 도메인, (13) CK 도메인, C2 도메인, C1 도메인, B3 도메인, (14) CK 도메인, C2 도메인, C1 도메인, B3 도메인, B2 도메인, (15) CK 도메인, C2 도메인, C1 도메인, B3 도메인, B2 도메인, 그리고 B1 도메인, (16) CK 도메인, C2 도메인, C1 도메인, B3 도메인, B2 도메인, B1 도메인, 그리고 D4 도메인, (17) CK 도메인, C2 도메인, C1 도메인, B3 도메인, B2 도메인, B1 도메인, D4 도메인, 그리고 A3 도메인, (18) CK 도메인, C2 도메인, C1 도메인, B3 도메인, B2 도메인, B1 도메인, D4 도메인, A3 도메인, 그리고 A2 도메인, (19) CK 도메인, C2 도메인, C1 도메인, B3 도메인, B2 도메인, B1 도메인, D4 도메인, A3 도메인, A2 도메인, 그리고 A1 도메인, 그리고 (20) 이들의 임의의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 최소한 하나의 VWF 도메인을 포함하지 않는다.
또 다른 구체예에서, VWF 단백질은 D'D3 도메인 및 하나 또는 그 이상의 도메인 또는 모듈을 포함한다. 이런 도메인 또는 모듈의 실례는 전체적으로 본원에 참조로서 편입되는, 2012년 4월 6일자 온라인 공개된 Zhour et al., Blood: DOI 10.1182/blood-2012-01-405134에서 개시된 도메인 및 모듈을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 가령, VWF 단백질은 D'D3 도메인 및 A1 도메인, A2 도메인, A3 도메인, D4N 모듈, VWD4 모듈, C8-4 모듈, TIL-4 모듈, C1 모듈, C2 모듈, C3 모듈, C4 모듈, C5 모듈, C5 모듈, C6 모듈, 그리고 이들의 임의의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 도메인 또는 모듈을 포함할 수 있다.
또 다른 구체예에서, VWF 단백질은 이종성 모이어티에 연결되고, 여기서 이종성 모이어티는 VWF 단백질의 N 말단 또는 C 말단에 연결되거나 또는 VWF 단백질 내에 하나 또는 그 이상의 아미노산 (가령, 하나 또는 그 이상의 XTEN 삽입 부위)의 즉시 하류에 삽입된다. 가령, VWF 단백질 내에 이종성 모이어티에 대한 삽입 부위는 D' 도메인, D3 도메인, 또는 둘 모두에 있을 수 있다. 이종성 모이어티는 반감기 증량제일 수 있다.
일정한 구체예에서, 본 발명에 유용한 VWF 단백질은 다합체, 예를 들면, 이합체, 삼합체, 사합체, 오합체, 헥사머, 헵타머, 또는 고차 다합체를 형성한다. 다른 구체예에서, VWF 단백질은 단지 하나의 VWF 단백질을 갖는 단위체이다. 일부 구체예에서, 본 발명의 VWF 단백질은 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환, 결실, 부가, 또는 변형을 가질 수 있다. 한 구체예에서, VWF 단백질은 VWF 단백질이 이황화 결합을 형성할 수 없거나 또는 이합체 또는 다합체를 형성할 수 없도록, 아미노산 치환, 결실, 부가, 또는 변형을 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 아미노산 치환은 D' 도메인 및 D3 도메인 범위 안에 있다. 특정 구체예에서, 본 발명에 유용한 VWF 단백질은 서열 번호: 21에 상응하는 잔기 1099, 잔기 1142, 또는 잔기 1099 및 1142 둘 모두에 상응하는 잔기에서 최소한 하나의 아미노산 치환을 내포한다. 최소한 하나의 아미노산 치환은 야생형 VWF에서 자연적으로 발생하지 않는 임의의 아미노산일 수 있다. 가령, 아미노산 치환은 시스테인 이외에 임의의 아미노산, 예를 들면, 이소류신, 알라닌, 류신, 아스파라긴, 리신, 아스파르트산, 메티오닌, 페닐알라닌, 글루타민산, 트레오닌, 글루타민, 트립토판, 글리신, 발린, 프롤린, 세린, 티로신, 아르기닌, 또는 히스티딘일 수 있다. 다른 실례에서, 아미노산 치환은 VWF 단백질이 다합체를 형성하는 것을 예방하거나 또는 저해하는 하나 또는 그 이상의 아미노산을 갖는다.
일정한 구체예에서, 본원에서 유용한 VWF 단백질은 예로서, FVIII에 대한 결합 친화성을 향상시키기 위해, FVIII와의 상호작용이 향상되도록 더욱 변형될 수 있다. 무제한적 실례로서, VWF 단백질은 서열 번호: 21의 아미노산 764에 상응하는 잔기에서 세린 잔기 및 서열 번호: 21의 아미노산 773에 상응하는 잔기에서 리신 잔기를 포함한다. 잔기 764 및/또는 773은 FVIII에 대한 VWF 단백질의 결합 친화성에 기여할 수 있다. 다른 구체예에서, 본 발명에 유용한 VWF 단백질은 다른 변형을 가질 수 있다, 예를 들면, 단백질은 페길화되거나, 당화되거나, 헤실화되거나, 또는 폴리시알화될 수 있다.
II. B. XTEN 서열
본원에서 이용된 바와 같이, "XTEN 서열"은 작은 친수성 아미노산으로 주로 구성되는 비자연발생, 실제적으로 비-반복 서열을 갖는 연장된 길이 폴리펩티드를 지칭하는데, 상기 서열은 생리학적 조건 하에 이차 또는 삼차 구조를 낮은 정도에서 갖거나 또는 갖지 않는다. 키메라 단백질 상대로서, XTEN은 담체로서 역할을 할 수 있고, 키메라 단백질을 창출하기 위해 본 발명의 VWF 단백질 또는 FVIII 서열에 연결될 때 일정한 바람직한 약동학적, 물리화학적 및 제약학적 성질을 부여한다. 이런 바람직한 성질은 증강된 약동학적 파라미터 및 용해도 특징을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 본원에서 이용된 바와 같이, "XTEN"은 항체 또는 항체 단편, 예를 들면, 경쇄 또는 중쇄의 단일 사슬 항체 또는 Fc 단편을 특정적으로 배제한다.
본 발명은 더욱 짧은 XTEN 서열이 VWF 단백질 및/또는 두 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분에 융합될 때, 이러한 XTEN 서열이 더욱 긴 XTEN 서열과 비교하여 향상된 반감기 연장 성질을 제공한다는 것을 제시한다. 이런 이유로, VWF 단백질 및/또는 두 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분에 융합된 XTEN 서열은 길이에서 288개보다 적은 아미노산을 내포한다, 다시 말하면, 288개 아미노산보다 짧다. 한 구체예에서, VWF 단백질 및/또는 두 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분에 융합된 XTEN 서열은 12개 아미노산 및 287개 아미노산 사이의 길이를 갖는 아미노산 서열로 구성된다. 다른 구체예에서, VWF 단백질 및/또는 두 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분에 융합된 XTEN 서열은 최소한 약 36개 아미노산, 최소한 약 42개 아미노산, 최소한 약 72개 아미노산, 또는 최소한 약 144개 아미노산, 하지만 288개보다 적은 아미노산을 포함한다. 다른 구체예에서, VWF 단백질 및/또는 두 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분에 융합된 XTEN 서열은 AE36, AG36, AE42, AG42, AE72, AG72, AE144, 또는 AG144에서 선택된다. 한 구체예에서, VWF 단백질 및/또는 두 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분에 융합된 XTEN 서열은 서열 번호: 9, 서열 번호: 10, 서열 번호: 11, 또는 서열 번호: 14와 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열이고, 여기서 키메라 단백질은 XTEN 서열이 없는 키메라 단백질과 비교하여 향상된 반감기를 전시한다.
본 발명의 키메라 단백질은 추가 (두 번째, 세 번째, 또는 그 이상) XTEN 서열을 더욱 포함할 수 있다. 추가 XTEN 서열은 FVIII 단백질 또는 첫 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분에 더욱 융합될 수 있다. 추가 XTEN 서열은 임의의 길이일 수 있다. 가령, FVIII 단백질 또는 첫 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분에 융합된 추가 XTEN 서열은 약 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800, 또는 2000개보다 큰 아미노산 잔기를 갖는 펩티드 또는 폴리펩티드이다. 일정한 구체예에서, 추가 XTEN 서열은 약 20 내지 약 3000개보다 큰 아미노산 잔기, 약 30 내지 약 2500개보다 큰 잔기, 약 40 내지 약 2000개보다 큰 잔기, 약 50 내지 약 1500개보다 큰 잔기, 약 60 내지 약 1000개보다 큰 잔기, 약 70 내지 약 900개보다 큰 잔기, 약 80 내지 약 800개보다 큰 잔기, 약 90 내지 약 700개보다 큰 잔기, 약 100 내지 약 600개보다 큰 잔기, 약 110 내지 약 500개보다 큰 잔기, 또는 약 120 내지 약 400개보다 큰 잔기를 갖는 펩티드 또는 폴리펩티드이다.
이들 XTEN 서열 (즉, VWF 단백질 및/또는 두 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분에 융합된 XTEN 서열, 또는 FVIII 단백질 및/또는 첫 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분에 융합되거나 또는 FVIII 단백질 내에 하나 또는 그 이상의 삽입 부위에서 삽입된 XTEN 서열)은 9 내지 14개 아미노산 잔기의 하나 또는 그 이상의 서열 모티프 또는 상기 서열 모티프와 최소한 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 여기서 모티프는 글리신 (G), 알라닌 (A), 세린 (S), 트레오닌 (T), 글루타민산염 (E) 및 프롤린 (P)으로 구성된 군에서 선택되는 4 내지 6개 유형의 아미노산을 포함하거나, 이들로 본질적으로 구성되거나, 또는 이들로 구성된다. US 2010-0239554 A1을 참조한다.
일부 구체예에서, XTEN 서열은 비중복 서열 모티프를 포함하고, 여기서 상기 서열의 최소한 약 80%, 또는 최소한 약 85%, 또는 최소한 약 90%, 또는 최소한 약 91%, 또는 최소한 약 92%, 또는 최소한 약 93%, 또는 최소한 약 94%, 또는 최소한 약 95%, 또는 최소한 약 96%, 또는 최소한 약 97%, 또는 최소한 약 98%, 또는 최소한 약 99% 또는 약 100%가 표 2A에서 선택되는 단일 모티프 패밀리에서 선택되는 비중복 서열의 복수 단위로 구성되고, 패밀리 서열을 유발한다. 본원에서 이용된 바와 같이, "패밀리"는 XTEN이 단지 표 2A로부터 단일 모티프 범주; 다시 말하면, AD, AE, AF, AG, AM, AQ, BC, 또는 BD XTEN으로부터 선별된 모티프를 갖고, 그리고 패밀리 모티프로부터가 아닌 XTEN 내에 임의의 다른 아미노산이 필요한 성질을 달성하기 위해, 예를 들면, 인코딩 뉴클레오티드에 의한 제한 부위의 통합을 허용하거나, 개열 서열의 통합을 허용하거나, 또는 FVIII 또는 VWF에 더욱 우수한 연쇄를 달성하기 위해 선별된다는 것을 의미한다. XTEN 패밀리의 일부 구체예에서, XTEN 서열은 AD 모티프 패밀리, 또는 AE 모티프 패밀리, 또는 AF 모티프 패밀리, 또는 AG 모티프 패밀리, 또는 AM 모티프 패밀리, 또는 AQ 모티프 패밀리, 또는 BC 패밀리, 또는 BD 패밀리의 비중복 서열 모티프의 복수 단위를 포함하고, 결과의 XTEN은 앞서 설명된 상동성의 범위를 전시한다. 다른 구체예에서, XTEN은 표 2A의 모티프 패밀리 중에서 2개 또는 그 이상으로부터 모티프 서열의 복수 단위를 포함한다. 이들 서열은 아래에 더욱 충분히 설명된, 순 전하, 친수성, 이차 구조의 결여, 또는 모티프의 아미노산 조성에 의해 부여되는 반복성의 결여와 같은 성질을 비롯한 원하는 물리적/화학적 특징을 달성하도록 선별될 수 있다. 본 단락에서 앞서 설명된 구체예에서, XTEN 내로 통합된 모티프는 약 36 내지 약 3000개 아미노산 잔기의 XTEN을 달성하기 위해, 본원에서 설명된 방법을 이용하여 선별되고 조립될 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명에서 이용된 XTEN 서열은 AE42, AG42, AE48, AM48, AE72, AG72, AE108, AG108, AE144, AF144, AG144, AE180, AG180, AE216, AG216, AE252, AG252, AE288, AG288, AE324, AG324, AE360, AG360, AE396, AG396, AE432, AG432, AE468, AG468, AE504, AG504, AF504, AE540, AG540, AF540, AD576, AE576, AF576, AG576, AE612, AG612, AE624, AE648, AG648, AG684, AE720, AG720, AE756, AG756, AE792, AG792, AE828, AG828, AD836, AE864, AF864, AG864, AM875, AE912, AM923, AM1318, BC864, BD864, AE948, AE1044, AE1140, AE1236, AE1332, AE1428, AE1524, AE1620, AE1716, AE1812, AE1908, AE2004A, AG948, AG1044, AG1140, AG1236, AG1332, AG1428, AG1524, AG1620, AG1716, AG1812, AG1908, 그리고 AG2004로 구성된 군에서 선택되는 서열과 최소한 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일하다. US 2010-0239554 A1을 참조한다.
한 구체예에서, XTEN 서열은 AE42 (서열 번호: 9), AE72 (서열 번호: 10), AE144_2A (서열 번호: 55), AE144_3B (서열 번호: 56), AE144_4A (서열 번호: 57), AE144_5A (서열 번호: 58), AE144_6B (서열 번호: 59), AG144_A (서열 번호: 60), AG144_B (서열 번호: 61), AG144_C (서열 번호: 62), AG144_F (서열 번호: 63), AE864 (서열 번호: 15), AE576 (서열 번호: 16), AE288 (서열 번호: 8), AE288_2 (서열 번호: 54), AE144 (서열 번호: 11), AG864 (서열 번호: 17), AG576 (서열 번호: 18), AG288 (서열 번호: 19), AG144 (서열 번호: 14), 그리고 이들의 임의의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열과 최소한 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하다. 다른 구체예에서, XTEN 서열은 AE42 (서열 번호: 9), AE72 (서열 번호: 10), AE144_2A (서열 번호: 55), AE144_3B (서열 번호: 56), AE144_4A (서열 번호: 57), AE144_5A (서열 번호: 58), AE144_6B (서열 번호: 59), AG144_A (서열 번호: 60), AG144_B (서열 번호: 61), AG144_C (서열 번호: 62), AG144_F (서열 번호: 63), AE864 (서열 번호: 15), AE576 (서열 번호: 16), AE288 (서열 번호: 8), AE288_2 (서열 번호: 54), AE144 (서열 번호: 11), AG864 (서열 번호: 17), AG576 (서열 번호: 18), AG288 (서열 번호: 19), AG144 (서열 번호: 14), 그리고 이들의 임의의 조합으로 구성된 군에서 선택된다. 특정한 구체예에서, XTEN 서열은 AE288이다. 본 발명의 일정한 XTEN 서열에 대한 아미노산 서열은 표 2B에서 도시된다.
XTEN 성분(들)이 글리신 (G), 알라닌 (A), 세린 (S), 트레오닌 (T), 글루타민산염 (E) 및 프롤린 (P)에서 선택되는 4, 5, 또는 6개 유형의 아미노산으로 구성되는 아미노산의 100% 이하, 또는 표 3으로부터 서열 모티프 또는 표 4 및 13-17의 XTEN 서열로 구성되는 서열의 100% 이하를 갖는 이들 구체예에서, XTEN의 다른 아미노산 잔기는 다른 14개 자연 L-아미노산 중에서 한 가지에서 선택되지만, XTEN 서열이 최소한 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 최소한 약 99% 친수성 아미노산을 내포하도록 친수성 아미노산에서 우선적으로 선택된다. 글리신 (G), 알라닌 (A), 세린 (S), 트레오닌 (T), 글루타민산염 (E) 및 프롤린 (P)이 아닌 XTEN 아미노산은 XTEN 서열 전역에서 산재되거나, 서열 모티프 내에 또는 사이에 위치되거나, 또는 예로서, XTEN 및 FVIII 또는 VWF 성분 사이에 링커를 창출하기 위해 XTEN 서열의 하나 또는 그 이상의 짧은 스트레치에서 농축된다. XTEN 성분이 글리신 (G), 알라닌 (A), 세린 (S), 트레오닌 (T), 글루타민산염 (E) 및 프롤린 (P) 이외에 아미노산을 포함하는 이런 경우에, 결과의 서열이 일반적으로 이차 구조를 결여하도록, 예를 들면, 본원에서 개시된 방법에 의해 결정될 때 2%보다 많은 알파 나선 또는 2%보다 많은 베타-시트를 갖지 않도록, 아미노산의 약 2% 이하 또는 약 1% 이하가 소수성 잔기인 것이 바람직하다. XTEN의 구성에서 덜 선호되는 소수성 잔기는 트립토판, 페닐알라닌, 티로신, 류신, 이소류신, 발린, 그리고 메티오닌을 포함한다. 추가적으로, 다음의 아미노산을 5%보다 적게 또는 4%보다 적게 또는 3%보다 적게 또는 2%보다 적게 또는 1%보다 적게 내포하거나 또는 내포하지 않은 XTEN 서열을 설계할 수 있다: 시스테인 (이황화물 형성 및 산화를 방지하기 위해), 메티오닌 (산화를 방지하기 위해), 아스파라긴 및 글루타민 (탈아미드화를 방지하기 위해). 따라서, 일부 구체예에서, 글리신 (G), 알라닌 (A), 세린 (S), 트레오닌 (T), 글루타민산염 (E) 및 프롤린 (P)에 더하여 다른 아미노산을 포함하는 XTEN 성분은 Chou-Fasman 알고리즘에 의해 계측될 때 알파-나선 및 베타-시트에 기여하는 잔기의 5% 이하를 갖는 서열을 갖고, 그리고 GOR 알고리즘에 의해 계측될 때 최소한 90%, 또는 최소한 약 95% 또는 그 이상의 무작위 코일 형성을 갖는다.
추가 구체예에서, 본 발명에서 이용된 XTEN 서열은 본 발명의 키메라 단백질의 물리적 또는 화학적 성질, 예를 들면, 약물동력학에 영향을 준다. 본 발명에서 이용된 XTEN 서열은 다음의 유리한 성질 중에서 한 가지 또는 그 이상을 전시할 수 있다: 입체형태적 유연성, 증강된 수성 용해도, 고도의 프로테아제 내성, 낮은 면역원성, 포유류 수용체에 낮은 결합, 또는 증가된 수력학적 (또는 스토크스) 반지름. 특정한 구체예에서, 본 발명에서 FVIII 단백질에 연결된 XTEN 서열은 본원에서 설명된 키메라 단백질이 야생형 FVIII과 비교하여 증가된 기간 동안 생체내에서 머물도록, 증가된 약동학적 성질, 예를 들면, 더욱 긴 말단 반감기 또는 증가된 곡선 아래 면적 (AUC)을 갖는다. 추가 구체예에서, 본 발명에서 이용된 XTEN 서열은 FVIII 단백질이 야생형 FVIII과 비교하여 증가된 기간 동안 생체내에서 머물도록, 증가된 약동학적 성질, 예를 들면, 더욱 긴 말단 반감기 또는 증가된 곡선 아래 면적 (AUC)을 갖는다.
본 발명의 한 구체예는 Fc 영역에 융합된 FVIII 부분 및 Fc 영역에 융합된 VWF 부분을 포함하는 FVIII/VWF 융합 단백질이고, 여기서 XTEN 서열 (가령, AE288)은 FVIII 부분 내에 삽입되고, 그리고 여기서 288개보다 적은 아미노산을 갖는 XTEN 서열 (가령, AE144)은 VWF 부분 및 Fc 부분 사이에 삽입된다. 실시예에서 설명된 바와 같이, VWF 부분 및 Fc 부분 사이에 288개보다 적은 아미노산을 갖는 XTEN의 삽입은 VWF 부분 및 Fc 부분 사이에 288개 아미노산을 갖는 XTEN의 삽입보다 키메라 단백질의 약물동력학에 대한 더욱 큰 효과를 갖는다. 가령, FVIII/VWF 융합 단백질 내에 VWF 부분 및 Fc 부분 사이에 288개보다 적은 아미노산을 갖는 XTEN 서열의 삽입은 288개 아미노산을 갖는 XTEN과 비교하여 키메라 단백질의 말단 반감기를 증가시킬 수 있다. 일부 구체예에서, 말단 반감기는 288개 아미노산을 갖는 XTEN 서열의 삽입에 비하여, 최소한 약 5%, 최소한 약 10%, 최소한 약 15%, 최소한 약 20%, 최소한 약 25%, 또는 최소한 약 30% 증가된다. 특정 구체예에서, 말단 반감기는 288개 아미노산을 갖는 XTEN의 삽입에 비하여 최소한 약 35% 증가된다. 288개보다 적은 아미노산을 갖는 XTEN 서열의 삽입은 또한, 키메라 단백질의 AUC 값을 증가시킬 수 있다. 일부 구체예에서, AUC는 288개 아미노산을 갖는 XTEN의 삽입에 비하여 최소한 약 50%, 최소한 약 100%, 또는 최소한 약 200% 증가된다. 특정 구체예에서, AUC는 약 2-배 증가된다. 288개보다 적은 아미노산을 갖는 XTEN 서열의 삽입은 또한, 키메라 단백질의 소실을 감소시킬 수 있다. 가령, 소실은 288개 아미노산을 갖는 XTEN 서열의 삽입에 비하여, 최소한 약 5%, 최소한 약 10%, 최소한 약 15%, 최소한 약 20%, 최소한 약 25%, 또는 최소한 약 30% 감소될 수 있다. 288개보다 적은 아미노산을 갖는 XTEN 서열의 삽입은 288개 아미노산을 갖는 XTEN의 삽입에 비하여, 평균 체류 시간 (MRT)을 증가시키고 및/또는 항정 상태에서 겉보기 분포 용적 (Vss)을 감소시킬 수 있다.
다양한 방법 및 검정이 XTEN 서열을 포함하는 단백질의 물리적/화학적 성질을 결정하는데 이용될 수 있다. 이런 방법은 분석적 원심분리, EPR, HPLC-이온 교환, HPLC-크기 배제, HPLC-역상, 광 산란, 모세관 전기영동, 환상 이색성, 시차 주사 열량측정법, 형광, HPLC-이온 교환, HPLC-크기 배제, IR, NMR, 라만 분광법, 굴절측정법, 그리고 UV/가시적인 분광법을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 추가 방법은 Amau et al., Prot Expr and Purif 48, 1-13 (2006)에서 개시된다.
본 발명에 따라 이용될 수 있는 XTEN 서열의 추가 실례는 US 특허 공개 번호 2010/0239554 A1, 2010/0323956 A1, 2011/0046060 A1, 2011/0046061 A1, 2011/0077199 A1, 또는 2011/0172146 A1, 또는 국제 특허 공개 번호 WO 2010091122 A1, WO 2010144502 A2, WO 2010144508 A1, WO 2011028228 A1, WO 2011028229 A1, WO 2011028344 A2, 또는 WO 20130122617 A1에서 개시된다.
II.C. 인자 VIII (FVIII) 단백질
본원에서 이용된 바와 같이, "FVIII 단백질"은 달리 명시되지 않으면, 응고에서 정상적인 역할 중인 기능적 FVIII 폴리펩티드를 의미한다. 용어 FVIII 단백질은 응고 경로에서 전장 야생형 인자 VIII의 기능을 유지하는 이의 기능적 단편, 변이체, 유사체, 또는 유도체를 포함한다. "FVIII 단백질"은 FVIII 폴리펩티드 (또는 단백질) 또는 FVIII과 교체가능하게 이용된다. FVIII 기능의 실례는 응고를 활성화시키는 능력, 인자 IX에 대한 보조인자로서 행동하는 능력, 또는 Ca2+ 및 인지질의 존재에서 인자 IX와 테나아제 복합체를 형성하는 능력을 포함하지만 이들에 한정되지 않고, 이것은 이후, 인자 X를 활성화된 형태 Xa로 전환시킨다. FVIII 단백질은 인간, 돼지, 개, 쥐, 또는 뮤린 FVIII 단백질일 수 있다. 이에 더하여, 인간 및 다른 종 FVIII으로부터 사이에 비교는 기능에 필요할 개연성이 있는 보존된 잔기를 확인하였다 (Cameron et al., Thromb. Haemost. 79:317-22 (1998); US 6,251,632).
응고 시스템의 기능을 사정하는 다수의 시험이 가용하다: 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간 (aPTT) 시험, 발색 검정, ROTEM 검정, 프로트롬빈 시간 (PT) 시험 (또한, INR을 결정하는데 이용됨), 피브리노겐 시험 (종종, Clauss 방법에 의해), 혈소판 수치, 혈소판 기능 시험 (종종, PFA-100에 의해), TCT, 출혈 시간, 혼합 시험 (환자의 혈장이 정상적인 혈장과 혼합되면 이상이 교정되는 지의 여부), 응고 인자 검정, 항인지질 항체, D-이합체, 유전자 시험 (가령, 인자 V 라이덴, 프로트롬빈 돌연변이 G20210A), 묽은 러셀 살무사 독액 시간 (dRVVT), 기타 혈소판 기능 시험, 혈전 탄성 묘사도 (TEG 또는 Sonoclot), 혈전 탄성 검사 (TEM®, 예를 들면, ROTEM®), 또는 유글로불린 용해 시간 (ELT).
aPTT 시험은 "내재성" (또한, 접촉 활성화 경로로 지칭됨) 및 통상적인 응고 경로 둘 모두의 효력을 계측하는 성과 지표이다. 본 시험은 상업적으로 가용한 재조합 응고 인자, 예를 들면, FVIII 또는 FIX의 응고 활성을 계측하는데 통상적으로 이용된다. 이것은 외인성 경로를 계측하는 프로트롬빈 시간 (PT)과 함께 이용된다.
ROTEM 분석은 지혈의 전체 동역학: 응고 시간, 응괴 형성, 응괴 안정성 및 용해에 대한 정보를 제공한다. 혈전 탄성 검사에서 상이한 파라미터는 혈장 응고 시스템의 활성, 혈소판 기능, 피브린용해, 또는 이들 상호작용에 영향을 주는 많은 인자에 의존한다. 이러한 검정은 이차 지혈의 완전한 검토를 제공할 수 있다.
FVIII 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드 서열은 알려져 있고, 많은 기능적 단편, 돌연변이체 및 변형된 이형 역시 그러하다. 인간 FVIII 서열 (전장)의 실례는 아래에 도시된다.
FVIII 폴리펩티드는 전장 FVIII, N 말단에서 Met을 제외한 전장 FVIII, 성숙 FVIII (신호 서열 제외), N 말단에서 추가 Met를 갖는 성숙 FVIII, 및/또는 B 도메인의 완전한 또는 부분적인 결실을 갖는 FVIII을 포함한다. 일정한 구체예에서, FVIII 변이체는 부분적인 또는 완전한 결실인 지에 상관없이, B 도메인 결실을 포함한다.
선천적 성숙 인간 FVIII의 서열은 서열 번호: 65로서 제시된다. 선천적 FVIII 단백질은 다음의 화학식을 갖는다: A1-a1-A2-a2-B-a3-A3-C1-C2, 여기서 A1, A2 및 A3은 구조적으로-관련된 "A 도메인"이고, B는 "B 도메인"이고, C1 및 C2는 구조적으로-관련된 "C 도메인"이고, 그리고 a1, a2 및 a3은 산성 스페이서 영역이다. 서열 번호:65에서 일차 아미노산 서열 위치를 참조하면, 인간 FVIII의 A1 도메인은 Ala1로부터 약 Arg336까지 걸쳐 있고, a1 스페이서 영역은 약 Met337로부터 약 Val374까지 걸쳐 있고, A2 도메인은 약 Ala375로부터 약 Tyr719까지 걸쳐 있고, a2 스페이서 영역은 약 Glu720으로부터 약 Arg740까지 걸쳐 있고, B 도메인은 약 Ser741로부터 약 Arg 1648까지 걸쳐 있고, a3 스페이서 영역은 약 Glu1649로부터 약 Arg1689까지 걸쳐 있고, A3 도메인은 약 Ser1690으로부터 약 Leu2025까지 걸쳐 있고, C1 도메인은 약 Gly2026으로부터 약 Asn2072까지 걸쳐 있고, 그리고 C2 도메인은 약 Ser2073으로부터 Tyr2332까지 걸쳐 있다. 특정한 단백질분해 개열 부위 이외에, FVIII의 도메인 및 영역 사이에 경계의 위치의 지정은 상이한 참고문헌에서 변할 수 있다. 본원에서 언급된 경계는 이런 이유로, 용어 "약"의 이용에 의해 근사로서 지정된다.
인간 FVIII 유전자는 포유류 세포에서 단리되고 발현되었다 (Toole, J. J., et al., Nature 312:342-347 (1984); Gitschier, J., et al., Nature 312:326-330 (1984); Wood, W. I., et al., Nature 312:330-337 (1984); Vehar, G. A., et al., Nature 312:337-342 (1984); WO 87/04187; WO 88/08035; WO 88/03558; 그리고 U.S. 특허 번호 4,757,006). FVIII 아미노산 서열은 U.S. 특허 번호 4,965,199에서 보여지는 바와 같이 cDNA로부터 추론되었다. 이에 더하여, 부분적으로 또는 완전히 B-도메인 결실된 FVIII가 U.S. 특허 번호 4,994,371 및 4,868,112에서 도시된다. 일부 구체예에서, 인간 FVIII B-도메인은 U.S. 특허 번호 5,004,803에서 보여지는 바와 같이 인간 인자 V B-도메인으로 대체된다. 인간 인자 VIII을 인코딩하는 cDNA 서열 및 아미노산 서열은 각각, US 출원 공개 번호 2005/0100990의 서열 번호: 1 및 2에서 도시된다.
돼지 FVIII 서열은 Toole, J. J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5939-5942 (1986)에서 공개된다. 게다가, 돼지 비장 cDNA 라이브러리로부터 FVIII 서열의 PCR 증폭으로부터 획득된 완전한 돼지 cDNA 서열이 Healey, J. F., et al., Blood 88:4209-4214 (1996)에서 보고되었다. 모든 도메인, 모든 아단위, 그리고 특정한 아미노산 서열의 치환을 갖는 하이브리드 인간/돼지 FVIII은 U.S. 특허 번호 5,364,771 (Lollar 및 Runge), 그리고 WO 93/20093에서 개시되었다. 더욱 최근에, 돼지 FVIII 및 돼지 A1 및/또는 A2 도메인이 상응하는 인간 도메인을 대체하는 키메라 FVIII의 A1 및 A2 도메인의 뉴클레오티드 및 상응하는 아미노산 서열이 WO 94/11503에서 보고되었다. U.S. 특허 번호 5,859,204, Lollar, J. S.는 또한, 돼지 cDNA 및 추론된 아미노산 서열을 개시한다. U.S. 특허 번호 6,458,563은 B-도메인-결실된 돼지 FVIII을 개시한다.
U.S. 특허 번호 5,859,204 (Lollar, J. S.)는 감소된 항원성 및 감소된 면역반응성을 갖는 FVIII의 기능적 돌연변이체를 보고한다. U.S. 특허 번호 6,376,463 (Lollar, J. S.)은 또한, 감소된 면역반응성을 갖는 FVIII의 돌연변이체를 보고한다. US 출원 공개 번호 2005/0100990 (Saenko et al.)은 FVIII의 A2 도메인에서 기능적 돌연변이를 보고한다.
한 구체예에서, FVIII (또는 키메라 단백질의 FVIII 부분)은 서열 번호: 67의 아미노산 1 내지 1438 또는 서열 번호: 65의 아미노산 1 내지 2332의 FVIII 아미노산 서열 (신호 서열 없음) 또는 서열 번호: 64의 아미노산 1 내지 19 및 서열 번호: 67의 1 내지 1438 또는 서열 번호: 64의 아미노산 1 내지 19 및 서열 번호: 65의 아미노산 1 내지 2332의 FVIII 아미노산 서열 (신호 서열 없음)과 최소한 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일할 수 있고, 여기서 FVIII은 응고 활성을 갖는다, 예를 들면, 인자 IX를 보조인자로서 활성화시켜 인자 X를 활성화된 인자 X로 전환한다. FVIII (또는 키메라 단백질의 FVIII 부분)은 서열 번호: 67의 아미노산 1 내지 1438 또는 서열 번호: 65의 아미노산 1 내지 2332의 FVIII 아미노산 서열 (신호 서열 없음)과 동일할 수 있다. FVIII은 신호 서열을 더욱 포함할 수 있다.
FVIII의 "B-도메인"은 본원에서 이용된 바와 같이, 내부 아미노산 서열 동일성 및 단백질분해 개열의 부위, 예를 들면, 전장 인간 FVIII의 잔기 Ser741-Arg1648에 의해 규정되는 당분야에서 공지된 B-도메인과 동일하다. 다른 인간 FVIII 도메인은 다음의 아미노산 잔기에 의해 규정된다: A1, 잔기 Ala1-Arg372; A2, 잔기 Ser373-Arg740; A3, 잔기 Ser1690-Asn2019; C1, 잔기 Lys2020-Asn2172; C2, 잔기 Ser2173-Tyr2332. A3-C1-C2 서열은 잔기 Ser1690-Tyr2332를 포함한다. 나머지 서열, 잔기 Glu1649-Arg1689는 통상적으로 a3 산성 영역으로서 지칭된다. 돼지, 생쥐 및 개 FVIII에 대한 B-도메인을 비롯한 모든 도메인에 대한 경계의 위치 역시 당분야에서 알려져 있다. 한 구체예에서, FVIII의 B 도메인은 결실된다 ("B-도메인-결실된 인자 VIII" 또는 "BDD FVIII"). BDD FVIII의 실례는 REFACTO® (재조합 BDD FVIII)인데, 이것은 표 5에서 서열의 인자 VIII 부분과 동일한 서열을 갖는다. (BDD FVIII 중쇄는 이중 밑줄 표시된다; B 도메인은 이탤릭체로 표시된다; 그리고 BDD FVIII 경쇄는 평문으로 표시된다). 표 6을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호: 68)은 표 6에서 도시된다.
"B-도메인-결실된 FVIII"은 U.S. 특허 번호 6,316,226, 6,346,513, 7,041,635, 5,789,203, 6,060,447, 5,595,886, 6,228,620, 5,972,885, 6,048,720, 5,543,502, 5,610,278, 5,171,844, 5,112,950, 4,868,112, 그리고 6,458,563에서 개시된 완전한 또는 부분적인 결실을 가질 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 B-도메인-결실된 FVIII 서열은 U.S. 특허 번호 6,316,226의 칼럼 4, 라인 4 내지 칼럼 5, 라인 28 및 실시예 1-5에서 (또한 US 6,346,513에서) 개시된 결실 중에서 임의의 하나를 포함한다. 다른 구체예에서, B-도메인 결실된 인자 VIII은 S743/Q1638 B-도메인 결실된 인자 VIII (SQ BDD FVIII) (가령, 아미노산 744로부터 아미노산 1637까지 결실을 갖는 인자 VIII, 예를 들면, 서열 번호: 65의 아미노산 1-743 및 아미노산 1638-2332, 다시 말하면, 서열 번호: 67을 갖는 인자 VIII). 일부 구체예에서, 본 발명의 B-도메인-결실된 FVIII은 U.S. 특허 번호 5,789,203의 칼럼 2, 라인 26-51 및 실시예 5-8에서 (또한 US 6,060,447, US 5,595,886, 그리고 US 6,228,620에서) 개시된 결실을 갖는다. 일부 구체예에서, B-도메인-결실된 인자 VIII은 US 특허 번호 5,972,885의 칼럼 1, 라인 25 내지 칼럼 2, 라인 40; U.S. 특허 번호 6,048,720의 칼럼 6, 라인 1-22 및 실시예 1; U.S. 특허 번호 5,543,502의 칼럼 2, 라인 17-46; U.S. 특허 번호 5,171,844의 칼럼 4, 라인 22 내지 칼럼 5, 라인 36; U.S. 특허 번호 5,112,950의 칼럼 2, 라인 55-68, 도면 2, 그리고 실시예 1; U.S. 특허 번호 4,868,112의 칼럼 2, 라인 2 내지 칼럼 19, 라인 21 및 표 2; U.S. 특허 번호 7,041,635의 칼럼 2, 라인 1 내지 칼럼 3, 라인 19, 칼럼 3, 라인 40 내지 칼럼 4, 라인 67, 칼럼 7, 라인 43 내지 칼럼 8, 라인 26, 그리고 칼럼 11, 라인 5 내지 칼럼 13, 라인 39; 또는 U.S. 특허 번호 6,458,563의 칼럼 4, 라인 25-53에서 설명된 결실을 갖는다. 일부 구체예에서, B-도메인-결실된 FVIII은 B 도메인 중에서 대부분의 결실을 갖지만, WO 91/09122에서 개시된 바와 같이, 일차 번역 산물의 2개 폴리펩티드 사슬로의 생체내 단백질분해 처리에 필수적인 B 도메인의 아미노 말단 서열을 여전히 내포한다. 일부 구체예에서, B-도메인-결실된 FVIII은 아미노산 747-1638의 결실, 다시 말하면, B 도메인의 사실상 완전한 결실로 작제된다. Hoeben R.C., et al. J. Biol. Chem. 265 (13): 7318-7323 (1990). B-도메인-결실된 인자 VIII은 또한, FVIII의 아미노산 771-1666 또는 아미노산 868-1562의 결실을 내포할 수 있다. Meulien P., et al. Protein Eng. 2(4): 301-6 (1988). 본 발명의 일부인 추가 B 도메인 결실은 다음을 포함한다: 아미노산 982 내지 1562 또는 760 내지 1639 (Toole et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1986) 83, 5939-5942)), 797 내지 1562 (Eaton, et al. Biochemistry (1986) 25:8343-8347)), 741 내지 1646 (Kaufman (PCT 공개된 출원 번호 WO 87/04187)), 747-1560 (Sarver, et al., DNA (1987) 6:553-564)), 741 내지 1648 (Pasek (PCT 출원 번호 88/00831)), 또는 816 내지 1598 또는 741 내지 1648 (Lagner (Behring Inst. Mitt. (1988) No 82:16-25, EP 295597))의 결실. 다른 구체예에서, BDD FVIII은 전장 FVIII 서열의 아미노산 서열에 상응하는 하나 또는 그 이상의 N-연결된 당화 부위, 예를 들면, 잔기 757, 784, 828, 900, 963, 또는 임의선택적으로 943을 유지하는 B-도메인의 FVIII 폴리펩티드 내포 단편을 포함한다. B-도메인 단편의 실례는 Miao, H.Z., et al., Blood 103(a): 3412-3419 (2004), Kasuda, A, et al., J. Thromb. Haemost. 6: 1352-1359 (2008), 그리고 Pipe, S.W., et al., J. Thromb. Haemost. 9: 2235-2242 (2011)에서 개시된 바와 같은 B-도메인의 226개 아미노산 또는 163개 아미노산을 포함한다 (즉, B 도메인의 첫 번째 226개 아미노산 또는 163개 아미노산이 유지된다). 또 다른 구체예에서, BDD FVIII은 BDD FVIII 단백질의 발현을 향상시키기 위해 잔기 309에서 점 돌연변이 (Phe로부터 Ser로)를 더욱 포함한다. Miao, H.Z., et al., Blood 103(a): 3412-3419 (2004)를 참조한다. 또 다른 구체예에서, BDD FVIII은 B-도메인의 부분을 내포하지만, 하나 또는 그 이상의 퓨린 개열 부위 (가령, Arg1313 및 Arg 1648)를 내포하지 않는 FVIII 폴리펩티드를 포함한다. Pipe, S.W., et al., J. Thromb. Haemost. 9: 2235-2242 (2011)를 참조한다. 전술한 결실 각각은 임의의 FVIII 서열에서 만들어질 수 있다.
일부 구체예에서, FVIII은 부분적인 B-도메인을 갖는다. 일부 구체예에서, 부분적인 B-도메인을 갖는 FVIII 단백질은 FVIII198이다. FVIII198은 단일 사슬 FVIIIFc 분자-226N6을 내포하는 부분적인 B-도메인이다. 숫자 226은 FVIII B-도메인의 N 말단 226 아미노산을 나타내고, 그리고 N6은 B-도메인 내에 6개 N-당화 부위를 나타낸다.
한 구체예에서, FVIII은 아미노산 1648에서 아르기닌 (전장 인자 VIII 또는 서열 번호: 65에서), 아미노산 754에서 아르기닌 (S743/Q1638 B-도메인 결실된 인자 VIII 또는 서열 번호: 67에서), 또는 상응하는 아르기닌 잔기 (다른 변이체에서) 바로 뒤에서 개열되고, 따라서 중쇄 및 경쇄를 유발한다. 다른 구체예에서, FVIII은 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 이들은 금속 이온-매개된 비공유 결합에 의해 연결되거나 또는 연관된다.
다른 구체예에서, FVIII은 아미노산 1648에서 아르기닌 (전장 FVIII 또는 서열 번호: 65에서), 아미노산 754에서 아르기닌 (S743/Q1638 B-도메인-결실된 FVIII 또는 서열 번호: 67에서), 또는 상응하는 아르기닌 잔기 (다른 변이체에서) 바로 뒤에서 개열되지 않았던 단일 사슬 FVIII이다. 단일 사슬 FVIII은 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 아미노산 치환은 전장 성숙 인자 VIII 폴리펩티드 (서열 번호: 65)의 잔기 1648, 잔기 1645 또는 둘 모두, 또는 SQ BDD 인자 VIII (서열 번호: 67)의 잔기 754, 잔기 751 또는 둘 모두에 상응하는 잔기에서 존재한다. 아미노산 치환은 아르기닌 이외에 임의의 아미노산, 예를 들면, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트레오닌, 트립토판, 발린, 알라닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민산, 글루타민, 글리신, 프롤린, 셀레노시스테인, 세린, 티로신, 히스티딘, 오르니틴, 피롤리신, 또는 타우린일 수 있다.
FVIII은 더 나아가, 트롬빈에 의해 개열되고, 그리고 이후, FVIIIa로서 활성화되어, 활성화된 인자 IX (FIXa)에 대한 보조인자로서 역할할 수 있다. 그리고 활성화된 FIX는 활성화된 FVIII과 함께, Xase 복합체를 형성하고 인자 X를 활성화된 인자 X (FXa)로 전환시킨다. 활성화를 위해, FVIII은 아미노산 372, 740 및 1689 (B-도메인 결실된 FVIII 서열 내에 아미노산 372, 740 및 795에 상응)에서 3개의 아르기닌 잔기 뒤에서 트롬빈에 의해 개열되고, 이러한 개열은 50kDa A1, 43kDa A2, 그리고 73kDa A3-C1-C2 사슬을 갖는 FVIIIa를 산출한다. 한 구체예에서, 본 발명에 유용한 FVIII 단백질은 비-활성 FVIII이다. 다른 구체예에서, FVIII 단백질은 활성화된 FVIII이다.
VWF 단백질에 연결되거나 또는 연관된 FVIII 폴리펩티드를 갖는 단백질은 서열 번호: 65 또는 67과 최소한 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함할 수 있고, 여기서 상기 서열은 FVIII 응고 활성을 갖는다, 예를 들면, 인자 IX를 보조인자로서 활성화시켜 인자 X를 활성화된 인자 X (FXa)로 전환시킨다.
본원에서 이용된 바와 같이, "하이브리드" 또는 "키메라" 폴리펩티드 및 단백질은 첫 번째 폴리펩티드 사슬, 예를 들면, 288개보다 적은 아미노산을 갖는 XTEN 서열 및 첫 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분에 융합된 VWF 단백질, 그리고 두 번째 폴리펩티드 사슬, 예를 들면, 두 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분에 융합된 FVIII 단백질의 조합을 포함하고, 따라서 이형이합체를 형성한다. 한 구체예에서, 하이브리드에서 첫 번째 폴리펩티드 및 두 번째 폴리펩티드는 단백질-단백질 상호작용, 예를 들면 전하-전하 또는 소수성 상호작용을 통해 서로 연관된다. 다른 구체예에서, 첫 번째 폴리펩티드는 VWF 단백질-XTEN-Fc 융합 단백질을 포함하고, 그리고 두 번째 폴리펩티드는 FVIII-Fc 융합 단백질을 포함하여, 하이브리드 이형이합체가 만들어지고, 여기서 XTEN은 288개보다 적은 아미노산을 내포한다. 다른 구체예에서, 첫 번째 폴리펩티드는 VWF 단백질-XTEN-Fc 융합 단백질을 포함하고, 그리고 두 번째 폴리펩티드는 FVIII(X)-Fc 융합 단백질을 포함하여, 하이브리드 이형이합체가 만들어지고, 여기서 XTEN은 288개보다 적은 아미노산을 내포한다. 첫 번째 폴리펩티드 및 두 번째 폴리펩티드는 첫 번째 Fc 영역 및 두 번째 Fc 영역 사이에 공유 결합, 예를 들면, 이황화 결합을 통해 연관될 수 있다. 첫 번째 폴리펩티드 및 두 번째 폴리펩티드는 VWF 단편 및 FVIII 단백질 사이에 결합에 의해 서로 더욱 연관될 수 있다.
본 발명에서 유용한 FVIII 단백질은 하나 또는 그 이상의 추가 XTEN 서열을 갖는 FVIII을 포함할 수 있는데, 이들은 FVIII 응고 활성에 영향을 주지 않는다. 이런 XTEN 서열은 FVIII 단백질의 C 말단 또는 N 말단에 융합되거나 또는 FVIII 단백질 내에 2개의 아미노산 잔기 중에서 하나 또는 그 이상 사이에 삽입될 수 있는데, 이들 삽입은 FVIII 응고 활성 또는 FVIII 기능에 영향을 주지 않는다. 한 구체예에서, 삽입은 FVIII 단백질의 약동학적 성질 (가령, 반감기)을 향상시킨다. 다른 구체예에서, 삽입은 복수 삽입, 예를 들면, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 10개 이상의 삽입일 수 있다. 삽입 부위의 실례는 표 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15에서 열거된 부위 또는 이들의 임의의 조합을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.
하나 또는 그 이상의 XTEN 서열에 연결된 FVIII 단백질은 FVIII(X2) 또는 FVIII (a→b) -X-FVIII (c→d) 로서 표현될 수 있고, 여기서 FVIII (a→b) 는 아미노산 잔기 "a"로부터 아미노산 잔기 "b"까지 FVIII 단백질의 첫 번째 부분을 포함하거나, 이것으로 본질적으로 구성되거나, 또는 이것으로 구성되고; X2는 하나 또는 그 이상의 XTEN 서열을 포함하거나, 이들로 본질적으로 구성되거나, 또는 이들로 구성되고, FVIII (c→d) 는 아미노산 잔기 "c"로부터 아미노산 잔기 "d"까지 FVIII 단백질의 두 번째 부분을 포함하거나, 이것으로 본질적으로 구성되거나, 또는 이것으로 구성되고;
a는 FVIII 단백질의 첫 번째 부분의 N 말단 아미노산 잔기이고,
b는 FVIII 단백질의 첫 번째 부분의 C 말단 아미노산 잔기이지만, 또한 XTEN 서열이 삽입되는 삽입 부위의 2개 아미노산의 N 말단 아미노산 잔기이고,
c는 FVIII 단백질의 두 번째 부분의 N 말단 아미노산 잔기이지만, 또한 XTEN 서열이 삽입되는 삽입 부위의 2개 아미노산의 C 말단 아미노산 잔기이고, 그리고
d는 FVIII 단백질의 C 말단 아미노산 잔기이고, 그리고
여기서 FVIII 단백질의 첫 번째 부분 및 FVIII 단백질의 두 번째 부분은 서로 동일하지 않고, 그리고 FVIII 단백질이 FVIII 응고 활성을 갖도록, 나란히 충분한 길이를 갖는다.
한 구체예에서, FVIII 단백질의 첫 번째 부분 및 FVIII 단백질의 두 번째 부분은 각각, 서열 번호: 65 [전장 성숙 FVIII 서열] 또는 서열 번호: 67 [B-도메인 결실된 FVIII], 예를 들면, N 말단 부분 및 C 말단 부분의 단편이다. 일정한 구체예에서, FVIII 단백질의 첫 번째 부분은 FVIII 단백질의 A1 도메인 및 A2 도메인을 포함한다. FVIII 단백질의 두 번째 부분은 A3 도메인, C1 도메인 및 임의선택적으로 C2 도메인을 포함한다. 또 다른 구체예에서, FVIII 단백질의 첫 번째 부분은 A1 도메인 및 A2 도메인을 포함하고, 그리고 FVIII 단백질의 두 번째 부분은 B 도메인, A3 도메인, C1 도메인 및 임의선택적으로 C2 도메인의 부분을 포함한다. 또 다른 구체예에서, FVIII 단백질의 첫 번째 부분은 FVIII 단백질의 A1 도메인, A2 도메인 및 B 도메인의 부분을 포함하고, 그리고 FVIII 단백질의 두 번째 부분은 A3 도메인, C1 도메인 및 임의선택적으로 C2 도메인을 포함한다. 또 다른 구체예에서, FVIII 단백질의 첫 번째 부분은 FVIII 단백질의 A1 도메인, A2 도메인 및 B 도메인의 첫 번째 부분을 포함한다. FVIII 단백질의 두 번째 부분은 B 도메인의 두 번째 부분, A3 도메인, C1 도메인 및 임의선택적으로 C2 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, 2개의 아미노산 ("b" 및 "c")은 표 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 및 15에서 도시된 아미노산 잔기 삽입 부위 중에서 임의의 한 가지 또는 그 이상일 수 있다. 가령, "b"는 하나 또는 그 이상의 XTEN 서열이 삽입되거나 또는 연결되는 부위의 즉시 상류에 아미노산 잔기일 수 있고, 그리고 "c"는 하나 또는 그 이상의 XTEN 서열이 삽입되거나 또는 연결되는 부위의 즉시 하류에 아미노산 잔기일 수 있다. 일부 구체예에서, "a"는 FVIII 단백질의 첫 번째 성숙 아미노산 서열이고, 그리고 "d"는 FVIII 단백질의 마지막 아미노산 서열이다. 가령, FVIII (a→b) 은 서열 번호: 67 [B 도메인 결실된 FVIII 아미노산 서열] 또는 서열 번호: 65 [전장 FVIII]의 아미노산 1 내지 745와 최소한 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열일 수 있고, 그리고 FVIII (c→d) 는 각각, 서열 번호: 67의 아미노산 746 내지 1438 또는 서열 번호: 65의 아미노산 1641 내지 2332일 수 있다.
일부 양상에서, FVIII 단백질 내에 삽입 부위는 N 말단, A1 도메인, A2 도메인, A3 도메인, B 도메인, C1 도메인, C2 도메인, C 말단, 또는 이들의 2개 또는 그 이상 조합인, FVIII 단백질의 하나 또는 그 이상의 도메인에서 위치되거나, 또는 A1 도메인 및 a1 산성 영역, 그리고 a1 산성 영역 및 A2 도메인, A2 도메인 및 a2 산성 영역, a2 산성 영역 및 B 도메인, B 도메인 및 A3 도메인, 그리고 A3 도메인 및 C1 도메인, C1 도메인 및 C2 도메인, 또는 이들의 임의의 조합인, FVIII 단백질의 2개 도메인 사이에 위치된다. 가령, XTEN 서열이 삽입될 수 있는 삽입 부위는 N 말단 및 A1 도메인, N 말단 및 A2 도메인, N 말단 및 A3 도메인, N 말단 및 B 도메인, N 말단 및 C1 도메인, N 말단 및 C2 도메인, N 말단 및 C 말단, A1 및 A2 도메인, A1 및 A3 도메인, A1 및 B 도메인, A1 및 C1 도메인, A1 및 C2 도메인, A1 도메인 및 C 말단, A2 및 A3 도메인, A2 및 B 도메인, A2 및 C1 도메인, A2 및 C2 도메인, A2 도메인 및 C 말단, A3 및 B 도메인, A3 및 C1 도메인, A3 및 C2 도메인, A3 도메인 및 C 말단, B 및 C1 도메인, B 및 C2 도메인, B 도메인 및 C 말단, C1 및 C2 도메인, C1 및 C 말단, C2 도메인 및 C 말단, 그리고 이들의 2개 또는 그 이상 조합으로 구성된 군에서 선택된다. 삽입 부위의 무제한적 실례는 표 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 및 15에서 열거된다.
XTEN 서열이 FVIII 단백질 내에 하나 또는 그 이상의 아미노산 (가령, 하나 또는 그 이상의 XTEN 삽입 부위)의 즉시 하류에 삽입되거나 또는 C 말단 또는 N 말단에서 연결된 FVIII 단백질은 XTEN 서열에 연쇄 또는 상기 서열에 의한 삽입 후 FVIII 활성을 유지한다. XTEN 서열은 이들 삽입이 FVIII 활성에 영향을 주지 않도록 (즉, FVIII 단백질이 응고 성질을 여전히 유지하도록), FVIII 단백질에 1회 또는 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 또는 6회 이상 삽입될 수 있다.
본 발명에서 유용한 FVIII 단백질은 임의선택적 링커에 의해 FVIII 단백질의 N 말단 또는 C 말단에서 하나 또는 그 이상의 XTEN 폴리펩티드에 연결되거나 또는 하나 또는 그 이상의 임의선택적 링커에 의해 FVIII 단백질 내에 하나 또는 그 이상의 아미노산 (가령, 하나 또는 그 이상의 XTEN 삽입 부위)의 즉시 하류에 삽입될 수 있다. 한 구체예에서, XTEN 서열이 삽입되는 2개의 아미노산 잔기 또는 XTEN 서열이 연결되는 아미노산 잔기는 표 7, 표 8, 표 9 및 표 10에서 잔기, 그리고 이들의 임의의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 서열 번호: 65 [전장 성숙 FVIII]의 2개 또는 1개 아미노산 잔기에 상응한다.
다른 구체예에서, 최소한 하나의 XTEN 서열은 본원에서 개시된 임의의 하나 또는 그 이상의 XTEN 삽입 부위 또는 이들의 임의의 조합에서 삽입된다. 한 양상에서, 최소한 하나의 XTEN 서열은 표 7에서 개시된 하나 또는 그 이상의 아미노산에서 개시된 하나 또는 그 이상의 XTEN 삽입 부위에서 삽입된다.
일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 XTEN 서열은 서열 번호: 65에 상응하는 아미노산 32, 220, 224, 336, 339, 399, 416, 603, 1656, 1711, 1725, 1905, 또는 1910, 또는 이들의 임의의 조합으로부터 위로 또는 아래로 약 6개 아미노산 내에 삽입된다.
다른 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 XTEN 서열은 표 9에서 하나 또는 그 이상의 삽입 부위로 구성된 군에서 선택되는 전장 성숙 인간 FVIII에 상응하는 하나 또는 그 이상의 아미노산의 즉시 하류에 삽입된다.
또 다른 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 XTEN은 FVIII의 B 도메인에 삽입된다. 한 가지 실례에서, XTEN은 서열 번호: 65에 상응하는 아미노산 740 및 1640 사이에 삽입되고, 여기서 아미노산 740 및 1640 사이에 FVIII 서열은 임의선택적으로 존재하지 않는다. 다른 실례에서, XTEN은 서열 번호: 65에 상응하는 아미노산 741 및 1690 사이에 삽입되고, 여기서 아미노산 740 및 1690 사이에 FVIII 서열은 임의선택적으로 존재하지 않는다. 다른 실례에서, XTEN은 서열 번호: 65에 상응하는 아미노산 741 및 1648 사이에 삽입되고, 여기서 아미노산 741 및 1648 사이에 FVIII 서열은 임의선택적으로 존재하지 않는다. 또 다른 실례에서, XTEN은 서열 번호: 65에 상응하는 아미노산 743 및 1638 사이에 삽입되고, 여기서 아미노산 743 및 1638 사이에 FVIII 서열은 임의선택적으로 존재하지 않는다. 또 다른 실례에서, XTEN은 서열 번호: 65에 상응하는 아미노산 745 및 1656 사이에 삽입되고, 여기서 아미노산 745 및 1656 사이에 FVIII 서열은 임의선택적으로 존재하지 않는다. 일부 실례에서, XTEN은 서열 번호: 65에 상응하는 아미노산 745 및 1657 사이에 삽입되고, 여기서 아미노산 745 및 1657 사이에 FVIII 서열은 임의선택적으로 존재하지 않는다. 일정한 실례에서, XTEN은 서열 번호: 65에 상응하는 아미노산 745 및 1667 사이에 삽입되고, 여기서 아미노산 745 및 1667 사이에 FVIII 서열은 임의선택적으로 존재하지 않는다. 또 다른 실례에서, XTEN은 서열 번호: 65에 상응하는 아미노산 745 및 1686 사이에 삽입되고, 여기서 아미노산 745 및 1686 사이에 FVIII 서열은 임의선택적으로 존재하지 않는다. 일부 다른 실례에서, XTEN은 서열 번호: 65에 상응하는 아미노산 747 및 1642 사이에 삽입되고, 여기서 아미노산 747 및 1642 사이에 FVIII 서열은 임의선택적으로 존재하지 않는다. 또 다른 실례에서, XTEN은 서열 번호: 65에 상응하는 아미노산 751 및 1667 사이에 삽입되고, 여기서 아미노산 751 및 1667 사이에 FVIII 서열은 임의선택적으로 존재하지 않는다.
일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 XTEN은 표 10에서 아미노산 잔기로 구성된 군에서 선택되는 삽입 부위의 아미노산의 즉시 하류에 하나 또는 그 이상의 아미노산에서 삽입된다.
한 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 XTEN 삽입 부위는 FVIII 단백질의 하나 또는 그 이상의 표면-노출된, 유연한 루프 구조 (가령, 허용적 루프) 내에 위치된다. 가령, 최소한 하나의 XTEN 서열은 재조합 단백질의 응혈원 활성, 또는 생체내에서 또는 시험관내에서 숙주 세포에서 발현되는 재조합 단백질의 능력을 제거하지 않으면서, 최소한 하나의 XTEN 폴리펩티드가 삽입될 수 있는 최소한 2개의 "허용적 루프"를 포함하는 각 FVIII "A" 도메인에 삽입될 수 있다. 허용적 루프는 다른 속성 중에서, 높은 표면 또는 용매 노출 및 높은 입체형태적 유연성을 갖는 최소한 하나의 XTEN 서열의 삽입을 허용하는 영역이다. A1 도메인은 허용적 루프-1 (A1-1) 영역 및 허용적 루프-2 (A1-2) 영역을 포함하고, A2 도메인은 허용적 루프-1 (A2-1) 영역 및 허용적 루프-2 (A2-2) 영역을 포함하고, A3 도메인은 허용적 루프-1 (A3-1) 영역 및 허용적 루프-2 (A3-2) 영역을 포함한다.
한 양상에서, FVIII A1 도메인 내에 첫 번째 허용적 루프 (A1-1)는 베타 가닥 1 및 베타 가닥 2 사이에 위치되고, 그리고 FVIII A2 도메인 내에 두 번째 허용적 루프 (A1-2)는 베타 가닥 11 및 베타 가닥 12 사이에 위치된다. FVIII A2 도메인 내에 첫 번째 허용적 루프 (A2-1)는 베타 가닥 22 및 베타 가닥 23 사이에 위치되고, 그리고 FVIII A2 도메인 내에 두 번째 허용적 루프 (A2-2)는 베타 가닥 32 및 베타 가닥 33 사이에 위치된다. FVIII A3 도메인 내에 첫 번째 허용적 루프 (A3-1)는 베타 가닥 38 및 베타 가닥 39 사이에 위치되고, 그리고 FVIII A3 도메인 내에 두 번째 허용적 루프 (A3-2)는 베타 가닥 45 및 베타 가닥 46 사이에 위치된다. 일정한 양상에서, A1-1을 포함하는 표면-노출된, 유연한 루프 구조는 서열 번호: 65의 대략 아미노산 15로부터 대략 아미노산 45까지, 예를 들면, 서열 번호: 65의 대략 아미노산 18로부터 대략 아미노산 41까지 선천적 성숙 인간 FVIII 내에 영역에 상응한다. 다른 양상에서, A1-2를 포함하는 표면-노출된, 유연한 루프 구조는 서열 번호: 65의 대략 아미노산 201로부터 대략 아미노산 232까지, 예를 들면, 서열 번호: 65의 대략 아미노산 218로부터 대략 아미노산 229까지 선천적 성숙 인간 FVIII 내에 영역에 상응한다. 또 다른 양상에서, A2-1을 포함하는 표면-노출된, 유연한 루프 구조는 서열 번호: 65의 대략 아미노산 395로부터 대략 아미노산 421까지, 예를 들면, 서열 번호: 65의 대략 아미노산 397로부터 대략 아미노산 418까지 선천적 성숙 인간 FVIII 내에 영역에 상응한다. 또 다른 구체예에서, A2-2를 포함하는 표면-노출된, 유연한 루프 구조는 서열 번호: 65의 대략 아미노산 577로부터 대략 아미노산 635까지, 예를 들면, 서열 번호: 65의 대략 아미노산 595로부터 대략 아미노산 607까지 선천적 성숙 인간 FVIII 내에 영역에 상응한다. 일정한 양상에서, A3-1을 포함하는 표면-노출된, 유연한 루프 구조는 서열 번호: 65의 대략 아미노산 1705로부터 대략 아미노산 1732까지, 예를 들면, 서열 번호: 65의 대략 아미노산 1711로부터 대략 아미노산 1725까지 선천적 성숙 인간 FVIII 내에 영역에 상응한다. 또 다른 양상에서, A3-2를 포함하는 표면-노출된, 유연한 루프 구조는 서열 번호: 65의 대략 아미노산 1884로부터 대략 아미노산 1917까지, 예를 들면, 서열 번호: 65의 대략 아미노산 1899로부터 대략 아미노산 1911까지 선천적 성숙 인간 FVIII 내에 영역에 상응한다.
다른 구체예에서, 최소한 하나의 XTEN 서열이 삽입되는 하나 또는 그 이상의 아미노산은 전장 성숙 FVIII 폴리펩티드에 상응하는 a3 도메인, 예를 들면, 아미노산 1649 내지 1689 내에 위치된다. 특정 구체예에서, XTEN 서열은 서열 번호: 65 (전장 성숙 FVIII)의 아미노산 1656 및 1657 사이에 삽입된다. 특정한 구체예에서, 서열 번호: 65에 상응하는 아미노산 1656의 즉시 하류에 삽입된 XTEN 서열을 포함하는 FVIII 단백질은 서열 번호: 65에 상응하는 아미노산 745로부터 아미노산 1656까지 결실을 더욱 포함한다.
일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 XTEN 삽입을 위한 하나 또는 그 이상의 삽입 부위는 다음과 같이 구성된 군에서 선택되는, 성숙 전장 FVIII에 상응하는 하나 또는 그 이상의 아미노산의 즉시 하류이다:
(1) 아미노산 3,
(2) 아미노산 18,
(3) 아미노산 22,
(4) 아미노산 26,
(5) 아미노산 32,
(6) 아미노산 40,
(7) 아미노산 60,
(8) 아미노산 65,
(9) 아미노산 81,
(10) 아미노산 116,
(11) 아미노산 119,
(12) 아미노산 130,
(13) 아미노산 188,
(14) 아미노산 211,
(15) 아미노산 216,
(16) 아미노산 220,
(17) 아미노산 224,
(18) 아미노산 230,
(19) 아미노산 333,
(20) 아미노산 336,
(21) 아미노산 339,
(22) 아미노산 375,
(23) 아미노산 399,
(24) 아미노산 403,
(25) 아미노산 409,
(26) 아미노산 416,
(26) 아미노산 442,
(28) 아미노산 487,
(29) 아미노산 490,
(30) 아미노산 494,
(31) 아미노산 500,
(32) 아미노산 518,
(33) 아미노산 599,
(34) 아미노산 603,
(35) 아미노산 713,
(36) 아미노산 745,
(37) 아미노산 1656,
(38) 아미노산 1711,
(39) 아미노산 1720,
(40) 아미노산 1725,
(41) 아미노산 1749,
(42) 아미노산 1796,
(43) 아미노산 1802,
(44) 아미노산 1827,
(45) 아미노산 1861,
(46) 아미노산 1896,
(47) 아미노산 1900,
(48) 아미노산 1904,
(49) 아미노산 1905,
(50) 아미노산 1910,
(51) 아미노산 1937,
(52) 아미노산 2019,
(53) 아미노산 2068,
(54) 아미노산 2111,
(55) 아미노산 2120,
(56) 아미노산 2171,
(57) 아미노산 2188,
(58) 아미노산 2227,
(59) 아미노산 2277, 그리고
(60) 이들의 2개 또는 그 이상 조합.
한 구체예에서, 본 발명에 유용한 FVIII 단백질은 2개의 XTEN 서열을 포함하고, 첫 번째 XTEN 서열은 첫 번째 XTEN 삽입 부위 내로 삽입되고, 그리고 두 번째 XTEN은 두 번째 XTEN 삽입 부위 내로 삽입된다. 첫 번째 XTEN 삽입 부위 및 두 번째 XTEN 삽입 부위의 무제한적 실례는 표 11에서 열거된다.
FVIII 단백질에 삽입되거나 또는 연결된 이들 2개 XTEN은 동일하거나 상이할 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명에 유용한 FVIII 단백질은 FVIII 단백질에 삽입된 2개의 XTEN 서열을 포함하고, 첫 번째 XTEN 서열은 서열 번호: 65에 상응하는 아미노산 745의 즉시 하류에 삽입되고, 그리고 두 번째 XTEN 서열은 서열 번호: 65에 상응하는 아미노산 2332 (C 말단)의 즉시 하류에 삽입된다. 다른 구체예에서, 첫 번째 XTEN 서열은 서열 번호: 65에 상응하는 아미노산 18, 26, 40, 1656 또는 1720의 즉시 하류에 삽입되고, 그리고 두 번째 XTEN 서열은 서열 번호: 65에 상응하는 아미노산 403의 즉시 하류에 삽입된다. 또 다른 구체예에서, 첫 번째 XTEN 서열은 서열 번호: 65에 상응하는 아미노산 18, 26 또는 40의 즉시 하류에 삽입되고, 그리고 두 번째 XTEN 서열은 서열 번호: 65에 상응하는 아미노산 599의 즉시 하류에 삽입된다. 또 다른 구체예에서, 첫 번째 XTEN 서열은 서열 번호: 65에 상응하는 아미노산 1656의 즉시 하류에 삽입되고, 그리고 두 번째 XTEN 서열은 서열 번호: 65에 상응하는 아미노산 18, 26, 40, 399, 403, 1725, 1720, 1900, 1905 또는 2332의 즉시 하류에 삽입된다. 일정한 구체예에서, 첫 번째 XTEN 서열은 서열 번호: 65에 상응하는 아미노산 1900의 즉시 하류에 삽입되고, 그리고 두 번째 XTEN 서열은 서열 번호: 65에 상응하는 아미노산 18, 26 또는 40의 즉시 하류에 삽입된다. 일부 구체예에서, 첫 번째 XTEN 서열은 서열 번호: 65에 상응하는 아미노산 18, 26 또는 40의 즉시 하류에 삽입되고, 그리고 두 번째 XTEN 서열은 서열 번호: 65에 상응하는 아미노산 399의 즉시 하류에 삽입된다. 다른 구체예에서, 첫 번째 XTEN 서열은 서열 번호: 65에 상응하는 아미노산 1720의 즉시 하류에 삽입되고, 그리고 두 번째 XTEN 서열은 서열 번호: 65에 상응하는 아미노산 18, 26 또는 40의 즉시 하류에 삽입된다. 또 다른 구체예에서, 첫 번째 XTEN 서열은 서열 번호: 65에 상응하는 아미노산 1720의 즉시 하류에 삽입되고, 그리고 두 번째 XTEN 서열은 서열 번호: 65에 상응하는 아미노산 18의 즉시 하류에 삽입된다. 특정 구체예에서, FVIII 단백질은 2개의 XTEN 서열을 포함하고, 첫 번째 XTEN 서열은 서열 번호: 65에 상응하는 아미노산 745의 즉시 하류에 삽입되고, 그리고 두 번째 XTEN 서열은 서열 번호: 65에 상응하는 아미노산 2332의 즉시 하류에 삽입되고, 여기서 FVIII 단백질은 서열 번호: 65에 상응하는 아미노산 745로부터 서열 번호: 65에 상응하는 아미노산 1685까지 결실, 서열 번호: 65에 상응하는 아미노산 1680에서 돌연변이 또는 치환, 예를 들면, Y1680F, 서열 번호: 65에 상응하는 아미노산 1648에서 돌연변이 또는 치환, 예를 들면, R1648A, 또는 서열 번호: 65에 상응하는 아미노산 1648, 예를 들면, R1648A 및 서열 번호: 65에 상응하는 아미노산 1680, 예를 들면, Y1680F에서 최소한 2개의 돌연변이 또는 치환을 더욱 갖는다. 특정한 구체예에서, FVIII 단백질은 2개의 XTEN 서열을 포함하고, 첫 번째 XTEN은 서열 번호: 65에 상응하는 아미노산 1656의 즉시 하류에 삽입되고, 그리고 두 번째 XTEN 서열은 서열 번호: 65의 아미노산 2332의 즉시 하류에 삽입되고, 여기서 FVIII 단백질은 서열 번호: 65에 상응하는 아미노산 745로부터 아미노산 1656까지 결실을 더욱 갖는다.
일정한 구체예에서, FVIII 단백질은 3개의 XTEN 서열을 포함하고, 첫 번째 XTEN 서열은 첫 번째 XTEN 삽입 부위 내로 삽입되고, 두 번째 XTEN 서열은 두 번째 XTEN 서열 내로 삽입되고, 그리고 세 번째 XTEN 서열은 세 번째 XTEN 삽입 부위 내로 삽입된다. 첫 번째, 두 번째 또는 세 번째 XTEN 서열은 동일하거나 상이할 수 있다. 첫 번째, 두 번째 및 세 번째 삽입 부위는 본원에서 개시된 삽입 부위 중에서 임의의 한 가지의 군에서 선택될 수 있다. 일부 구체예에서, 3개의 XTEN 서열을 포함하는 FVIII 단백질은 예로서, 서열 번호: 65에 상응하는 아미노산 1648에서 돌연변이 또는 치환, 예를 들면, R1648A를 더욱 포함할 수 있다. 가령, 첫 번째, 두 번째 및 세 번째 XTEN 삽입 부위의 무제한적 실례는 표 12에서 열거된다.
일부 구체예에서, FVIII 단백질은 3개의 XTEN 서열을 포함하고, 첫 번째 XTEN 서열은 서열 번호: 65에 상응하는 아미노산 26의 즉시 하류에 삽입되고, 두 번째 XTEN 서열은 서열 번호: 65에 상응하는 아미노산 403의 하류에 삽입되고, 그리고 세 번째 XTEN 서열은 서열 번호: 65에 상응하는 아미노산 1656, 1720 또는 1900의 하류에 삽입된다. 다른 구체예에서, 첫 번째 XTEN 서열은 서열 번호: 65에 상응하는 아미노산 26의 즉시 하류에 삽입되고, 두 번째 XTEN 서열은 서열 번호: 65에 상응하는 아미노산 1656의 하류에 삽입되고, 그리고 세 번째 XTEN 서열은 서열 번호: 65에 상응하는 아미노산 1720 또는 1900의 하류에 삽입된다. 또 다른 구체예에서, 첫 번째 XTEN 서열은 서열 번호: 65에 상응하는 아미노산 26의 즉시 하류에 삽입되고, 두 번째 XTEN 서열은 서열 번호: 65에 상응하는 아미노산 1720의 하류에 삽입되고, 그리고 세 번째 XTEN 서열은 서열 번호: 65에 상응하는 아미노산 1900의 하류에 삽입된다. 또 다른 구체예에서, 첫 번째 XTEN 서열은 서열 번호: 65에 상응하는 아미노산 403의 즉시 하류에 삽입되고, 두 번째 XTEN 서열은 서열 번호: 65에 상응하는 아미노산 1656의 하류에 삽입되고, 그리고 세 번째 XTEN 서열은 서열 번호: 65에 상응하는 아미노산 1720 또는 1900의 하류에 삽입된다. 다른 구체예에서, 첫 번째 XTEN 서열은 서열 번호: 65에 상응하는 아미노산 403 또는 1656의 즉시 하류에 삽입되고, 두 번째 XTEN 서열은 서열 번호: 65에 상응하는 아미노산 1720의 하류에 삽입되고, 그리고 세 번째 XTEN 서열은 서열 번호: 65에 상응하는 아미노산 1900의 하류에 삽입된다. 다른 구체예에서, 첫 번째 XTEN 서열은 서열 번호: 65에 상응하는 아미노산 18, 26, 40, 399, 403, 1711, 1720, 1725, 1900, 1905 또는 1910의 즉시 하류에 삽입되고, 두 번째 XTEN 서열은 서열 번호: 65에 상응하는 아미노산 745의 하류에 삽입되고, 그리고 세 번째 XTEN 서열은 서열 번호: 65에 상응하는 아미노산 2332의 하류에 삽입된다.
다른 구체예에서, 본 발명에서 FVIII 단백질은 4개의 XTEN 서열을 포함하고, 첫 번째 XTEN 서열은 첫 번째 삽입 부위 내로 삽입되고, 두 번째 XTEN 서열은 두 번째 삽입 부위 내로 삽입되고, 세 번째 XTEN 서열은 세 번째 삽입 부위 내로 삽입되고, 그리고 네 번째 XTEN 서열은 네 번째 삽입 부위 내로 삽입된다. 첫 번째, 두 번째, 세 번째 및 네 번째 XTEN 서열은 동일하거나, 상이하거나, 또는 이들의 조합일 수 있다. 일부 구체예에서, 4개의 XTEN 서열을 포함하는 FVIII 단백질은 예로서, 서열 번호: 65에 상응하는 아미노산 1648에서 돌연변이 또는 치환, 예를 들면, R1648A를 더욱 포함할 수 있다. 첫 번째, 두 번째, 세 번째 및 네 번째 XTEN 삽입 부위의 무제한적 실례는 표 13에서 열거된다.
일부 구체예에서, FVIII 단백질은 5개의 XTEN 서열을 포함하고, 첫 번째 XTEN 서열은 첫 번째 삽입 부위 내로 삽입되고, 두 번째 XTEN 서열은 두 번째 삽입 부위 내로 삽입되고, 세 번째 XTEN 서열은 세 번째 XTEN 삽입 부위 내로 삽입되고, 네 번째 XTEN 서열은 네 번째 XTEN 삽입 부위 내로 삽입되고, 그리고 다섯 번째 XTEN 서열은 다섯 번째 XTEN 삽입 부위 내로 삽입된다. 첫 번째, 두 번째, 세 번째, 네 번째 또는 다섯 번째 XTEN 서열은 동일하거나, 상이하거나, 또는 이들의 조합일 수 있다. 첫 번째, 두 번째, 세 번째, 네 번째 및 다섯 번째 삽입 부위의 무제한적 실례는 표 14에서 열거된다.
일정한 구체예에서, FVIII 단백질은 6개의 XTEN 서열을 포함하고, 첫 번째 XTEN 서열은 첫 번째 XTEN 삽입 부위 내로 삽입되고, 두 번째 XTEN 서열은 두 번째 XTEN 삽입 부위 내로 삽입되고, 세 번째 XTEN 서열은 세 번째 XTEN 삽입 부위 내로 삽입되고, 네 번째 XTEN 서열은 네 번째 XTEN 삽입 부위 내로 삽입되고, 다섯 번째 XTEN 서열은 다섯 번째 XTEN 삽입 부위 내로 삽입되고, 그리고 여섯 번째 XTEN 서열은 여섯 번째 XTEN 삽입 부위 내로 삽입된다. 첫 번째, 두 번째, 세 번째, 네 번째, 다섯 번째 또는 여섯 번째 XTEN 서열은 동일하거나, 상이하거나, 또는 이들의 조합일 수 있다. 이들 6개 XTEN 삽입 부위의 실례는 표 15에서 열거된 삽입 부위를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.
특정 실례에서, 첫 번째 XTEN은 서열 번호: 65에 상응하는 아미노산 26 및 27 사이에 삽입되고, 그리고 두 번째 XTEN은 서열 번호: 65 (전장 성숙 FVIII)에 상응하는 아미노산 1720 및 1721 사이에 삽입된다. 다른 실례에서, 첫 번째 XTEN은 서열 번호: 65에 상응하는 아미노산 403 및 404 사이에 삽입되고, 그리고 두 번째 XTEN은 서열 번호: 65에 상응하는 아미노산 1720 및 1721 사이에 삽입된다. 일부 실례에서, 첫 번째 XTEN은 서열 번호: 65에 상응하는 아미노산 1656 및 1657 사이에 삽입되고, 그리고 두 번째 XTEN은 서열 번호: 65에 상응하는 아미노산 1720 및 1721 사이에 삽입된다. 다른 실례에서, 첫 번째 XTEN은 서열 번호: 65에 상응하는 아미노산 26 및 27 사이에 삽입되고, 두 번째 XTEN은 서열 번호: 65에 상응하는 아미노산 1656 및 1657 사이에 삽입되고, 그리고 세 번째 XTEN은 서열 번호: 65에 상응하는 아미노산 1720 및 1721 사이에 삽입된다. 또 다른 구체예에서, 첫 번째 XTEN은 서열 번호: 65에 상응하는 아미노산 403 및 404 사이에 삽입되고, 두 번째 XTEN은 서열 번호: 65에 상응하는 아미노산 1656 및 1657 사이에 삽입되고, 그리고 세 번째 XTEN은 서열 번호: 65에 상응하는 아미노산 1720 및 1721 사이에 삽입된다. 또 다른 구체예에서, 첫 번째 XTEN은 서열 번호: 65에 상응하는 아미노산 403 및 404 사이에 삽입되고, 두 번째 XTEN은 서열 번호: 65에 상응하는 아미노산 1656 및 1657 사이에 삽입되고, 그리고 세 번째 XTEN은 서열 번호: 65에 상응하는 아미노산 1720 및 1721 사이에 삽입된다. 일정한 구체예에서, 첫 번째 XTEN은 서열 번호: 65에 상응하는 아미노산 26 및 27 사이에 삽입되고, 두 번째 XTEN은 서열 번호: 65에 상응하는 아미노산 1720 및 1721 사이에 삽입되고, 그리고 세 번째 XTEN은 서열 번호: 65에 상응하는 아미노산 1900 및 1901 사이에 삽입된다. 일부 구체예에서, 첫 번째 XTEN은 서열 번호: 65에 상응하는 아미노산 26 및 27 사이에 삽입되고, 두 번째 XTEN은 서열 번호: 65에 상응하는 아미노산 1656 및 1657 사이에 삽입되고, 세 번째 XTEN은 서열 번호: 65에 상응하는 아미노산 1720 및 1721 사이에 삽입되고, 그리고 네 번째 XTEN은 서열 번호: 65에 상응하는 아미노산 1900 및 1901 사이에 삽입된다.
특정 구체예에서, XTEN 서열은 전장 인자 VIII의 아미노산 745 및 746 또는 B-도메인 결실된 인자 VIII의 상응하는 삽입 부위 사이에 삽입된다.
일부 구체예에서, 본 발명의 키메라 단백질은 2개의 폴리펩티드 서열을 포함하고, 첫 번째 폴리펩티드 서열은 FVIII-161 (서열 번호: 69), FVIII-169 (서열 번호: 70), FVIII-170 (서열 번호: 71), FVIII-173 (서열 번호: 72); FVIII-195 (서열 번호: 73); FVIII-196 (서열 번호: 74), FVIII199 (서열 번호: 75), FVIII-201 (서열 번호: 76); FVIII-203 (서열 번호: 77), FVIII-204 (서열 번호: 78), FVIII-205 (서열 번호: 79), FVIII-266 (서열 번호: 80), FVIII-267 (서열 번호: 81), FVIII-268 (서열 번호: 82), FVIII-269 (서열 번호: 83), FVIII-271 (서열 번호: 84) 또는 FVIII-272 (서열 번호: 85)에서 선택되는 서열과 최소한 약 80%, 90%, 95%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 두 번째 폴리펩티드 서열은 VWF031 (서열 번호: 86), VWF034 (서열 번호: 87), 또는 VWF-036에서 선택되는 서열과 최소한 약 80%, 90%, 95%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
II.D. Ig 불변 영역 또는 이의 부분
본 발명의 키메라 단백질은 또한, 2개의 Ig 불변 영역 또는 이의 부분, 임의선택적 링커에 의해 FVIII 단백질에 융합된 첫 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분 및 288개보다 적은 아미노산을 갖는 XTEN 서열을 통해 VWF 단백질에 융합된 두 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분을 포함한다. Ig 불변 영역 또는 이의 부분은 XTEN 서열 및 VWF 단백질과 합동으로 키메라 단백질의 약동학적 또는 약력학적 성질을 향상시킬 수 있다. 일정한 구체예에서, Ig 불변 영역 또는 이의 부분은 Ig 불변 영역 또는 이의 부분에 융합된 분자의 반감기를 연장한다.
Ig 불변 영역은 CH (불변 중쇄) 도메인으로 표시된 도메인 (CH1, CH2 등)으로 구성된다. 아이소타입 (다시 말하면, IgG, IgM, IgA, IgD, 또는 IgE)에 따라, 불변 영역은 3개 또는 4개의 CH 도메인으로 구성될 수 있다. 일부 아이소타입 (가령, IgG) 불변 영역은 또한, 힌지 영역을 내포한다. Janeway et al. 2001, Immunobiology, Garland Publishing, N.Y., N.Y.를 참조한다.
본 발명의 키메라 단백질을 생산하기 위한 Ig 불변 영역 또는 이의 부분은 다수의 상이한 공급원으로부터 획득될 수 있다. 일부 구체예에서, Ig 불변 영역 또는 이의 부분은 인간 Ig로부터 유래된다. 하지만, Ig 불변 영역 또는 이의 부분은 예로서, 설치류 (가령, 생쥐, 쥐, 토끼, 기니 피그) 또는 비인간 영장류 (가령, 침팬지, 마카크) 종을 비롯한 다른 포유류 종의 Ig로부터 유래될 수 있는 것으로 이해된다. 게다가, Ig 불변 영역 또는 이의 부분은 IgM, IgG, IgD, IgA 및 IgE를 비롯한 임의의 Ig 부류, 그리고 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 비롯한 임의의 Ig 아이소타입으로부터 유래될 수 있다. 한 구체예에서, 인간 아이소타입 IgG1이 이용된다.
다양한 Ig 불변 영역 유전자 서열 (가령, 인간 불변 영역 유전자 서열)은 공개적으로 접근가능한 기탁물의 형태에서 가용하다. 특정 작동체 기능을 갖거나 (또는 특정 작동체 기능을 결여하거나) 또는 면역원성을 감소시키는 특정 변형을 갖는 불변 영역 도메인 서열이 선별될 수 있다. 항체 및 항체-인코딩 유전자의 많은 서열이 공개되었고, 그리고 적합한 Ig 불변 영역 서열 (가령, 힌지, CH2, 및/또는 CH3 서열, 또는 이들의 부분)은 당분야에서 인정된 기술을 이용하여 이들 서열로부터 유래될 수 있다. 전술한 방법 중에서 한 가지를 이용하여 획득된 유전 물질은 이후, 본 발명의 폴리펩티드를 획득하기 위해 변경되거나 또는 합성될 수 있다. 본 발명의 범위는 불변 영역 DNA 서열의 대립형질, 변이체 및 돌연변이를 포괄하는 것으로 더욱 인지될 것이다.
Ig 불변 영역 또는 이의 부분의 서열은 예로서, 관심되는 도메인을 증폭하도록 선별되는 중합효소 연쇄 반응 및 프라이머를 이용하여 클로닝될 수 있다. 항체로부터 Ig 불변 영역 또는 이의 부분의 서열을 클로닝하기 위해, mRNA가 하이브리도마, 비장 또는 림프 세포로부터 단리되고, DNA로 역전사되고, 그리고 항체 유전자가 PCR에 의해 증폭될 수 있다. PCR 증폭 방법은 U.S. 특허 번호 4,683,195; 4,683,202; 4,800,159; 4,965,188; 그리고 예로서, "PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications" Innis et al. eds., Academic Press, San Diego, CA (1990); Ho et al. 1989. Gene 77:51; Horton et al. 1993. Methods Enzymol. 217:270)에서 상세하게 설명된다. PCR은 공통 불변 영역 프라이머에 의해 또는 공개된 중쇄와 경쇄 DNA 및 아미노산 서열에 근거된 더욱 특정한 프라이머에 의해 시작될 수 있다. 앞서 논의된 바와 같이, PCR은 또한, 항체 경쇄와 중쇄를 인코딩하는 DNA 클론을 단리하는데 이용될 수 있다. 이러한 경우에, 라이브러리는 공통 프라이머 또는 더욱 큰 상동성 프로브, 예를 들면, 생쥐 불변 영역 프로브에 의해 선별검사될 수 있다. 항체 유전자의 증폭에 적합한 다양한 프라이머 세트는 당분야에서 공지된다 (가령, 정제된 항체의 N 말단 서열에 근거된 5' 프라이머 (Benhar and Pastan. 1994. Protein Engineering 7:1509); cDNA 단부의 신속 증폭 (Ruberti, F. et al. 1994. J. Immunol. Methods 173:33); 항체 리더 서열 (Larrick et al. 1989 Biochem. Biophys. Res. Commun. 160:1250). 항체 서열의 클로닝은 1995년 1월 25일자 제출된 Newman et al., U.S. 특허 번호 5,658,570에서 더욱 설명되고, 이것은 본원에 참조로서 편입된다.
본원에서 이용된 Ig 불변 영역은 모든 도메인 및 힌지 영역 또는 이의 부분을 포함할 수 있다. 한 구체예에서, Ig 불변 영역 또는 이의 부분은 CH2 도메인, CH3 도메인, 그리고 힌지 영역, 다시 말하면, Fc 영역 또는 FcRn 결합 상대를 포함한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "Fc 영역"은 선천적 Ig의 Fc 영역에 상응하는, 다시 말하면, 두 중쇄의 개별 Fc 도메인의 이합체성 연관에 의해 형성되는 폴리펩티드의 부분으로서 규정된다. 선천적 Fc 영역은 다른 Fc 영역과 동종이합체를 형성한다. 대조적으로, 용어 "유전적으로-융합된 Fc 영역" 또는 "단일 사슬 Fc 영역" (scFc 영역)은 본원에서 이용된 바와 같이, 단일 폴리펩티드 사슬 내에 유전적으로 연결된 (다시 말하면, 단일 인접한 유전자 서열에서 인코딩된) Fc 도메인으로 구성된 합성 이합체성 Fc 영역을 지칭한다.
한 구체예에서, "Fc 영역"은 파파인 개열 부위 (즉, 중쇄 불변 영역의 첫 번째 잔기를 114라고 간주할 때, IgG에서 잔기 216)의 바로 상류에 힌지 영역에서 시작하고 항체의 C 말단에서 끝나는 단일 Ig 중쇄의 부분을 지칭한다. 따라서, 완전한 Fc 도메인은 최소한 힌지 도메인, CH2 도메인, 그리고 CH3 도메인을 포함한다.
Ig 불변 영역의 Fc 영역은 Ig 아이소타입에 따라, CH2, CH3 및 CH4 도메인뿐만 아니라 힌지 영역을 포함할 수 있다. Ig의 Fc 영역을 포함하는 키메라 단백질은 증가된 안정성, 증가된 혈청 반감기 (Capon et al., 1989, Nature 337:525를 참조한다)뿐만 아니라 Fc 수용체, 예를 들면, 신생아 Fc 수용체 (FcRn)에 결합을 비롯한 여러 바람직한 성질을 키메라 단백질에 부여하고 (U.S. 특허 번호 6,086,875, 6,485,726, 6,030,613; WO 03/077834; US2003-0235536A1), 이들은 전체적으로 본원에 참조로서 편입된다.
Ig 불변 영역 또는 이의 부분은 FcRn 결합 상대일 수 있다. FcRn은 성체 상피 조직에서 활성이고, 그리고 장의 내강, 폐 기도, 코 표면, 질 표면, 결장 및 직장 표면에서 발현된다 (U.S. 특허 번호 6,485,726). FcRn 결합 상대는 FcRn에 결합하는 Ig의 부분이다.
FcRn 수용체는 인간을 비롯한 여러 포유류 종으로부터 단리되었다. 인간 FcRn, 원숭이 FcRn, 쥐 FcRn, 그리고 생쥐 FcRn의 서열은 알려져 있다 (Story et al. 1994, J. Exp. Med. 180:2377). FcRn 수용체는 상대적으로 낮은 pH에서 IgG에 결합하고 (하지만, 다른 Ig 부류, 예를 들면, IgA, IgM, IgD 및 IgE에는 결합하지 않는다), IgG를 장막 방향으로 내강에서 관세포로 활발하게 수송하고, 그리고 이후, 사이질액에서 발견되는 상대적으로 더욱 높은 pH에서 IgG를 방출한다. 이것은 폐 및 장관 상피 (Israel et al. 1997, Immunology 92:69), 신장 근위 세뇨관 상피 (Kobayashi et al. 2002, Am. J. Physiol. Renal Physiol. 282:F358)뿐만 아니라 코 상피, 질 표면 및 담도계 표면을 비롯하여, 성체 상피 조직 (U.S. 특허 번호 6,485,726, 6,030,613, 6,086,875; WO 03/077834; US2003-0235536A1)에서 발현된다.
본 발명에서 유용한 FcRn 결합 상대는 전체 IgG, IgG의 Fc 단편, 그리고 FcRn 수용체의 완전한 결합 영역을 포함하는 다른 단편을 비롯한 FcRn 수용체에 의해 특이적으로 결합될 수 있는 분자를 포괄한다. FcRn 수용체에 결합하는 IgG의 Fc 부분의 영역은 X선 결정학에 근거하여 설명되었다 (Burmeister et al. 1994, Nature 372:379). Fc의 FcRn과의 주요 접촉 구역은 CH2 및 CH3 도메인의 접합부에 근접한다. Fc-FcRn 접촉은 모두 단일 Ig 중쇄 이내이다. FcRn 결합 상대는 전체 IgG, IgG의 Fc 단편, 그리고 FcRn의 완전한 결합 영역을 포함하는 IgG의 다른 단편을 포함한다. 주요 접촉 부위는 CH2 도메인의 아미노산 잔기 248, 250-257, 272, 285, 288, 290-291, 308-311 및 314, 그리고 CH3 도메인의 아미노산 잔기 385-387, 428 및 433-436을 포함한다. Ig 또는 Ig 단편, 또는 영역의 아미노산 번호에 대한 모든 언급은 Kabat et al. 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Public Health, Bethesda, Md에 근거된다.
FcRn에 결합된 Fc 영역 또는 FcRn 결합 상대는 FcRn에 의해 상피 장벽을 교차하여 효과적으로 왕복될 수 있고, 따라서 원하는 치료적 분자를 전신적으로 투여하는 비침습성 수단을 제공한다. 추가적으로, Fc 영역 또는 FcRn 결합 상대를 포함하는 융합 단백질은 FcRn을 발현하는 세포에 의해 세포내섭취된다. 하지만, 분해에 대해 표시되는 대신에, 이들 융합 단백질은 다시 한 번 순환 내로 재활용되고, 따라서 이들 단백질의 생체내 반감기를 증가시킨다. 일정한 구체예에서, Ig 불변 영역의 부분은 이황화 결합 및 다른 비특이적 상호작용을 통해, 다른 Fc 영역 또는 다른 FcRn 결합 상대와 전형적으로 연관하여 이합체 및 고차 다합체를 형성하는 Fc 영역 또는 FcRn 결합 상대이다.
2개의 FcRn 수용체가 단일 Fc 분자에 결합할 수 있다. 결정학적 데이터는 각 FcRn 분자가 Fc 동종이합체의 단일 폴리펩티드에 결합한다는 것을 암시한다. 한 구체예에서, FcRn 결합 상대, 예를 들면, IgG의 Fc 단편을 생물학적으로 활성 분자에 연결하는 것은 생물학적으로 활성 분자를 경구, 협측, 설하, 직장, 질, 코로 또는 폐 루트를 통해 투여된 에어로졸로서, 또는 눈 루트를 통해 전달하는 수단을 제공한다. 다른 구체예에서, 키메라 단백질은 침습성으로, 예를 들면, 피하, 정맥내 투여될 수 있다.
FcRn 결합 상대 영역은 Fc 영역의 FcRn 수용체에 의한 결과적인 능동 운반으로, FcRn 수용체에 의해 특이적으로 결합될 수 있는 분자 또는 이의 부분이다. "특이적으로 결합된"은 생리학적 조건 하에 상대적으로 안정되는 복합체를 형성하는 두 분자를 지칭한다. 특이적 결합은 중간 내지 높은 수용력과 함께 통상적으로 낮은 친화성을 갖는 비특이적 결합으로부터 구별되는 높은 친화성 및 낮은 내지 중간 수용력에 의해 특징화된다. 전형적으로, 결합은 친화성 상수 KA가 106 M-1보다 높거나, 또는 108 M-1보다 높을 때 특이적인 것으로 고려된다. 필요하면, 비특이적 결합은 결합 조건을 변화시킴으로써, 특이적 결합에 실제적으로 영향을 주지 않으면서 감소될 수 있다. 적절한 결합 조건, 예를 들면, 분자의 농도, 용액의 이온 강도, 온도, 결합에 허용된 시간, 차단제 (가령, 혈청 알부민, 우유 카제인)의 농도 등은 일과적인 기술을 이용하여 당업자에 의해 최적화될 수 있다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 키메라 단백질은 하나 또는 그 이상의 절두된 Fc 영역을 포함하는데, 이들은 그럼에도 불구하고, Fc 수용체 (FcR) 결합 성질을 Fc 영역에 부여하는데 충분하다. 가령, FcRn에 결합하는 Fc 영역의 부분 (즉, FcRn 결합 부분)은 IgG1의 대략 아미노산 282 내지 438을 포함한다, EU 넘버링 (일차 접촉 부위는 CH2 도메인의 아미노산 248, 250-257, 272, 285, 288, 290-291, 308-311 및 314, 그리고 CH3 도메인의 아미노산 잔기 385-387, 428 및 433-436이다). 따라서, 본 발명의 Fc 영역은 FcRn 결합 부분을 포함하거나 또는 이것으로 구성될 수 있다. FcRn 결합 부분은 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 비롯한 임의의 아이소타입의 중쇄로부터 유래될 수 있다. 한 구체예에서, 인간 아이소타입 IgG1의 항체로부터 FcRn 결합 부분이 이용된다. 다른 구체예에서, 인간 아이소타입 IgG4의 항체로부터 FcRn 결합 부분이 이용된다.
다른 구체예에서, "Fc 영역"은 Fc 도메인의 아미노산 서열 또는 Fc 도메인으로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다. 일정한 구체예에서, Fc 영역은 다음 중에서 최소한 하나: 힌지 (가령, 상부, 중앙, 및/또는 하부 힌지 영역) 도메인 (EU 넘버링에 따라 항체 Fc 영역의 대략 아미노산 216-230), CH2 도메인 (EU 넘버링에 따라 항체 Fc 영역의 대략 아미노산 231-340), CH3 도메인 (EU 넘버링에 따라 항체 Fc 영역의 대략 아미노산 341-438), CH4 도메인, 또는 이들의 변이체, 부분 또는 단편을 포함한다. 다른 구체예에서, Fc 영역은 완전한 Fc 도메인 (즉, 힌지 도메인, CH2 도메인, 그리고 CH3 도메인)을 포함한다. 일부 구체예에서, Fc 영역은 CH3 도메인 (또는 이의 부분)에 융합된 힌지 도메인 (또는 이의 부분), CH2 도메인 (또는 이의 부분)에 융합된 힌지 도메인 (또는 이의 부분), CH3 도메인 (또는 이의 부분)에 융합된 CH2 도메인 (또는 이의 부분), 힌지 도메인 (또는 이의 부분) 및 CH3 도메인 (또는 이의 부분) 둘 모두에 융합된 CH2 도메인 (또는 이의 부분)을 포함하거나, 이들로 본질적으로 구성되거나, 또는 이들로 구성된다. 또 다른 구체예에서, Fc 영역은 CH2 도메인의 최소한 일부 (가령, CH2 도메인 중에서 전부 또는 일부)를 결여한다. 특정 구체예에서, Fc 영역은 EU 번호 221 내지 447에 상응하는 아미노산을 포함하거나 또는 이들로 구성된다.
본원에서 F, F1, 또는 F2로서 표시된 Fc 영역은 다수의 상이한 공급원으로부터 획득될 수 있다. 한 구체예에서, 폴리펩티드의 Fc 영역은 인간 Ig로부터 유래된다. 하지만, Fc 영역은 예로서, 설치류 (가령, 생쥐, 쥐, 토끼, 또는 기니 피그) 또는 비인간 영장류 (가령, 침팬지, 마카크) 종을 비롯한 다른 포유류 종의 Ig로부터 유래될 수 있는 것으로 이해된다. 게다가, Fc 도메인의 폴리펩티드 또는 이의 부분은 IgM, IgG, IgD, IgA 및 IgE를 비롯한 임의의 Ig 부류, 그리고 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 비롯한 임의의 Ig 아이소타입으로부터 유래될 수 있다. 다른 구체예에서, 인간 아이소타입 IgG1이 이용된다.
일정한 구체예에서, Fc 변이체는 상기 야생형 Fc 도메인을 포함하는 Fc 영역에 의해 부여된 최소한 하나의 작동체 기능에서 변화 (가령, Fc 수용체 (가령, FcγRI, FcγRII, 또는 FcγRIII) 또는 보체 단백질 (가령, C1q)에 결합하거나, 또는 항체-의존성 세포독성 (ADCC), 식균작용 또는 보체 의존성 세포독성 (CDCC)을 촉발하는 Fc 영역의 능력에서 향상 또는 감소)를 부여한다. 다른 구체예에서, Fc 변이체는 가공된 시스테인 잔기를 제공한다.
본 발명의 Fc 영역은 작동체 기능 및/또는 FcR 또는 FcRn 결합에서 변화 (가령, 증강 또는 감소)를 부여하는 것으로 알려져 있는 당분야에서 인정된 Fc 변이체를 이용할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 결합 분자는 예로서, 국제 PCT 공보 WO88/07089A1, WO96/14339A1, WO98/05787A1, WO98/23289A1, WO99/51642A1, WO99/58572A1, WO00/09560A2, WO00/32767A1, WO00/42072A2, WO02/44215A2, WO02/060919A2, WO03/074569A2, WO04/016750A2, WO04/029207A2, WO04/035752A2, WO04/063351A2, WO04/074455A2, WO04/099249A2, WO05/040217A2, WO04/044859, WO05/070963A1, WO05/077981A2, WO05/092925A2, WO05/123780A2, WO06/019447A1, WO06/047350A2 및 WO06/085967A2; US 특허 공개 번호 US2007/0231329, US2007/0231329, US2007/0237765, US2007/0237766, US2007/0237767, US2007/0243188, US20070248603, US20070286859, US20080057056; 또는 US 특허 5,648,260; 5,739,277; 5,834,250; 5,869,046; 6,096,871; 6,121,022; 6,194,551; 6,242,195; 6,277,375; 6,528,624; 6,538,124; 6,737,056; 6,821,505; 6,998,253; 7,083,784; 7,404,956 및 7,317,091에서 개시된 아미노산 위치 중에서 하나 또는 그 이상에서 변화 (가령, 치환)을 포함할 수 있고, 이들은 각각 본원에 참조로서 편입된다. 한 구체예에서, 특정한 변화 (가령, 당분야에서 개시된 하나 또는 그 이상의 아미노산의 특정한 치환)가 개시된 아미노산 위치 중에서 하나 또는 그 이상에서 만들어질 수 있다. 다른 구체예에서, 개시된 아미노산 위치 중에서 하나 또는 그 이상에서 상이한 변화 (가령, 당분야에서 개시된 하나 또는 그 이상의 아미노산 위치의 상이한 치환)가 만들어질 수 있다.
IgG의 Fc 영역 또는 FcRn 결합 상대는 FcRn에 의해 결합될 변형된 IgG 또는 이의 Fc 단편 또는 부분을 산출하기 위한 충분히 인정된 절차, 예를 들면, 특정 부위 돌연변이유발 등에 따라 변형될 수 있다. 이런 변형은 FcRn 접촉 부위로부터 멀리 떨어진 변형뿐만 아니라 FcRn에 결합을 보존하거나 또는 심지어 증강하는 접촉 부위 내에 변형을 포함한다. 가령, 인간 IgG1 Fc (Fc γ1)에서 다음의 단일 아미노산 잔기가 FcRn에 대한 Fc 결합 친화성의 유의미한 상실 없이 치환될 수 있다: P238A, S239A, K246A, K248A, D249A, M252A, T256A, E258A, T260A, D265A, S267A, H268A, E269A, D270A, E272A, L274A, N276A, Y278A, D280A, V282A, E283A, H285A, N286A, T289A, K290A, R292A, E293A, E294A, Q295A, Y296F, N297A, S298A, Y300F, R301A, V303A, V305A, T307A, L309A, Q311A, D312A, N315A, K317A, E318A, K320A, K322A, S324A, K326A, A327Q, P329A, A330Q, P331A, E333A, K334A, T335A, S337A, K338A, K340A, Q342A, R344A, E345A, Q347A, R355A, E356A, M358A, T359A, K360A, N361A, Q362A, Y373A, S375A, D376A, A378Q, E380A, E382A, S383A, N384A, Q386A, E388A, N389A, N390A, Y391F, K392A, L398A, S400A, D401A, D413A, K414A, R416A, Q418A, Q419A, N421A, V422A, S424A, E430A, N434A, T437A, Q438A, K439A, S440A, S444A, 그리고 K447A, 여기서 예로서, P238A는 위치 번호 238에서 알라닌에 의해 치환된 야생형 프롤린을 나타낸다. 실례로서, 특정한 구체예는 N297A 돌연변이를 통합하고, 고도로 보존된 N-당화 부위를 제거한다. 알라닌에 더하여, 다른 아미노산이 상기 특정된 위치에서 야생형 아미노산을 대신할 수 있다. 돌연변이가 Fc 내로 단독적으로 도입되어, 선천적 Fc와 상이한 100개 이상의 Fc 영역을 발생시킬 수 있다. 추가적으로, 이들 개별 돌연변이 중에서 2개, 3개 또는 그 이상의 조합이 함께 도입되어, 수백 개 이상의 Fc 영역을 발생시킬 수 있다. 게다가, 본 발명의 구조체의 Fc 영역 중에서 하나가 돌연변이되고 상기 구조체의 다른 Fc 영역이 전혀 돌연변이되지 않거나, 또는 이들 둘 모두 돌연변이될 수 있지만 상이한 돌연변이를 갖는다.
상기 돌연변이 중에서 일부는 새로운 기능성을 Fc 영역 또는 FcRn 결합 상대에 부여할 수 있다. 가령, 한 구체예는 N297A를 통합하여, 고도로 보존된 N-당화 부위를 제거한다. 이러한 돌연변이의 효과는 면역원성을 감소시키고, 따라서 Fc 영역의 순환 반감기를 증강하고, 그리고 FcRn에 대한 친화성을 손상시키지 않으면서, Fc 영역이 FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB 및 FcγRIIIA에 결합할 수 없게 만드는 것이다 (Routledge et al. 1995, Transplantation 60:847; Friend et al. 1999, Transplantation 68:1632; Shields et al. 1995, J. Biol. Chem. 276:6591). 앞서 설명된 돌연변이로부터 발생하는 새로운 기능성의 추가 실례로서, FcRn에 대한 친화성이 일부 경우에 야생형의 것을 초과하여 증가될 수 있다. 이러한 증가된 친화성은 증가된 "온" 레이트, 감소된 "오프" 레이트, 또는 증가된 "온" 레이트 및 감소된 "오프" 레이트 둘 모두를 반영할 수 있다. FcRn에 대한 증가된 친화성을 부여하는 것으로 생각되는 돌연변이의 실례는 T256A, T307A, E380A 및 N434A를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다 (Shields et al. 2001, J. Biol. Chem. 276:6591).
추가적으로, 최소한 3개의 인간 Fc 감마 수용체가 하부 힌지 영역 내에 IgG 상에서 결합 부위, 일반적으로 아미노산 234-237을 인식하는 것으로 보인다. 이런 이유로, 새로운 기능성 및 잠재적으로 감소된 면역원성의 다른 실례가 예로서, 인간 IgG1 "ELLG"의 아미노산 233-236을 IgG2 "PVA" (1개의 아미노산 결실을 가짐)로부터 상응하는 서열로 대체함으로써, 이러한 영역의 돌연변이로부터 발생할 수 있다. 다양한 작동체 기능을 매개하는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII은 이런 돌연변이가 도입되었을 때 IgG1에 결합하지 않을 것으로 보인다. Ward and Ghetie 1995, Therapeutic Immunology 2:77 및 Armour et al. 1999, Eur. J. Immunol. 29:2613.
한 구체예에서, Ig 불변 영역 또는 이의 부분, 예를 들면, Fc 영역은 서열 PKNSSMISNTP (U.S. 특허 번호 5,739,277의 서열 번호: 89 또는 서열 번호: 3)를 포함하고, 그리고 HQSLGTQ (서열 번호: 90), HQNLSDGK (서열 번호: 91), HQNISDGK (서열 번호: 92), 또는 VISSHLGQ (서열 번호: 93) (또는 각각, U.S. 특허 번호 5,739,277의 서열 번호: 11, 1, 2 및 31)에서 선택되는 서열을 임의선택적으로 더욱 포함하는 폴리펩티드이다.
다른 구체예에서, 면역글로불린 불변 영역 또는 이의 부분은 힌지 영역 또는 이의 부분에서, 다른 면역글로불린 불변 영역 또는 이의 부분과 하나 또는 그 이상의 이황화 결합을 형성하는 아미노산 서열을 포함한다. 면역글로불린 불변 영역 또는 이의 부분에 의한 이황화 결합은 FVIII을 포함하는 첫 번째 폴리펩티드 및 VWF 단편을 포함하는 두 번째 폴리펩티드를 함께 배치하고, 따라서 내인성 VWF가 VWF 단편을 대체하지 않고 FVIII에 결합하지 않는다. 이런 이유로, 첫 번째 면역글로불린 불변 영역 또는 이의 부분 및 두 번째 면역글로불린 불변 영역 또는 이의 부분 사이에 이황화 결합은 내인성 VWF 및 FVIII 단백질 사이에 상호작용을 예방한다. VWF 및 FVIII 단백질 사이에 상호작용의 이러한 저해는 키메라 단백질의 반감기가 2 배 한계를 초과하도록 허용한다. 힌지 영역 또는 이의 부분은 CH1, CH2, CH3 중에서 하나 또는 그 이상의 도메인, 이들의 단편, 그리고 이들의 임의의 조합에 더욱 연결될 수 있다. 특정 구체예에서, 면역글로불린 불변 영역 또는 이의 부분은 힌지 영역 및 CH2이다.
일정한 구체예에서, Ig 불변 영역 또는 이의 부분은 반-당화된다. 가령, 2개의 Fc 영역 또는 FcRn 결합 상대를 포함하는 키메라 단백질은 첫 번째, 당화된, Fc 영역 (가령, 당화된 CH2 영역) 또는 FcRn 결합 상대 및 두 번째, 비당화된, Fc 영역 (가령, 비당화된 CH2 영역) 또는 FcRn 결합 상대를 내포할 수 있다. 한 구체예에서, 링커는 당화된 및 비당화된 Fc 영역 사이에 삽입될 수 있다. 다른 구체예에서, Fc 영역 또는 FcRn 결합 상대는 완전히 당화된다, 다시 말하면, 모든 Fc 영역이 당화된다. 다른 구체예에서, Fc 영역은 비당화될 수 있다, 다시 말하면, Fc 모이어티 중에서 어느 것도 당화되지 않는다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 키메라 단백질은 Ig 불변 영역 또는 이의 부분에 아미노산 치환 (가령, Fc 변이체)을 포함하는데, 이것은 Ig 불변 영역의 항원-독립된 작동체 기능, 특히 상기 단백질의 순환 반감기를 변경한다.
이런 단백질은 이들 치환을 결여하는 단백질과 비교할 때, FcRn에 증가된 또는 감소된 결합을 전시하고, 그리고 이런 이유로, 각각 혈청에서 증가된 또는 감소된 반감기를 갖는다. FcRn에 대한 향상된 친화성을 갖는 Fc 변이체는 더욱 긴 혈청 반감기를 가질 것으로 기대되고, 그리고 이런 분자는 예로서, 만성 질환 또는 장애를 치료하기 위해, 투여된 폴리펩티드의 긴 반감기가 요망되는 포유동물을 치료하는 방법에서 유용한 적용을 갖는다 (가령, US 특허 7,348,004, 7,404,956 및 7,862,820을 참조한다). 대조적으로, 감소된 FcRn 결합 친화성을 갖는 Fc 변이체는 더욱 짧은 반감기를 가질 것으로 예상되고, 그리고 이런 분자는 또한, 예로서 단축된 순환 시간이 가령, 생체내 진단적 영상화에 유리할 수 있는 포유동물에 투여에 유용하거나, 또는 시작 폴리펩티드가 연장된 기간 동안 순환에서 존재할 때 독성 부작용을 갖는 상황에서 유용하다. 감소된 FcRn 결합 친화성을 갖는 Fc 변이체는 또한, 태반을 교차할 개연성이 덜하고, 따라서 임신 여성에서 질환 또는 장애의 치료에도 유용하다. 이에 더하여, 감소된 FcRn 결합 친화성이 요망될 수 있는 다른 적용은 뇌, 신장, 및/또는 간으로 국부화가 요망되는 적용을 포함한다. 한 예시적인 구체예에서, 본 발명의 키메라 단백질은 맥관구조로부터 신장 사구체의 상피를 교차하여 감소된 수송을 전시한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 키메라 단백질은 뇌로부터 혈액 뇌 장벽 (BBB)을 교차하여, 맥관 공간 내로 감소된 수송을 전시한다. 한 구체예에서, 변경된 FcRn 결합을 갖는 단백질은 Ig 불변 영역의 "FcRn 결합 루프" 내에 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환을 갖는 최소한 하나의 Fc 영역 또는 FcRn 결합 상대 (가령, 1개 또는 2개의 Fc 영역 또는 FcRn 결합 상대)를 포함한다. FcRn 결합 루프는 야생형, 전장, Fc 영역의 아미노산 잔기 280-299 (EU 넘버링에 따라)로 구성된다. 다른 구체예에서, 변경된 FcRn 결합 친화성을 갖는 본 발명의 키메라 단백질에서 Ig 불변 영역 또는 이의 부분은 15 FcRn "접촉 구역" 내에 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환을 갖는 최소한 하나의 Fc 영역 또는 FcRn 결합 상대를 포함한다. 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 15 FcRn "접촉 구역"은 야생형, 전장 Fc 모이어티의 다음의 위치에서 잔기를 포함한다: 243-261, 275-280, 282-293, 302-319, 336-348, 367, 369, 372-389, 391, 393, 408, 424, 425-440 (EU 넘버링). 다른 구체예에서, 변경된 FcRn 결합 친화성을 갖는 본 발명의 Ig 불변 영역 또는 이의 부분은 다음의 EU 위치 중에서 임의의 하나에 상응하는 아미노산 위치에서 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환을 갖는 최소한 하나의 Fc 영역 또는 FcRn 결합 상대를 포함한다: 256, 277-281, 283-288, 303-309, 313, 338, 342, 376, 381, 384, 385, 387, 434 (가령, N434A 또는 N434K), 그리고 438. FcRn 결합 활성을 변경하는 예시적인 아미노산 치환은 본원에 참조로서 편입되는 국제 PCT 공개 번호 WO05/047327에서 개시된다.
본 발명에서 이용된 Fc 영역 또는 FcRn 결합 상대는 또한, 키메라 단백질의 당화를 변경하는 당분야에서 인정된 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 가령, VWF 단편 또는 FVIII 단백질에 연결된 키메라 단백질의 Fc 영역 또는 FcRn 결합 상대는 감소된 당화 (가령, N- 또는 O-연결된 당화)를 야기하는 돌연변이를 갖는 Fc 영역을 포함할 수 있거나, 또는 야생형 Fc 모이어티의 변경된 글리코형 (가령, 낮은 푸코오스 또는 푸코오스-없는 글리칸)을 포함할 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명의 처리되지 않은 키메라 단백질은 본원에서 설명된 Ig 불변 영역 또는 이의 부분에서 독립적으로 선택되는 2개 또는 그 이상의 성분 Ig 불변 영역 또는 이의 부분을 갖는 유전적으로 융합된 Fc 영역 (즉, scFc 영역)을 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 이합체성 Fc 영역의 Fc 영역은 동일하다. 다른 구체예에서, Fc 영역 중에서 최소한 2개가 상이하다. 가령, 본 발명의 단백질의 Fc 영역 또는 FcRn 결합 상대는 동일한 숫자의 아미노산 잔기를 포함하거나 또는 이들은 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기 (가령, 약 5개 아미노산 잔기 (가령, 1, 2, 3, 4, 또는 5개 아미노산 잔기), 약 10개 잔기, 약 15개 잔기, 약 20개 잔기, 약 30개 잔기, 약 40개 잔기, 또는 약 50개 잔기)에 의해 길이에서 상이할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 단백질의 Fc 영역 또는 FcRn 결합 상대는 서열 내에 하나 또는 그 이상의 아미노산 위치에서 상이할 수 있다. 가령, Fc 영역 또는 FcRn 결합 상대 중에서 최소한 2개가 약 5개 아미노산 위치 (가령, 1, 2, 3, 4, 또는 5개 아미노산 위치), 약 10개 위치, 약 15개 위치, 약 20개 위치, 약 30개 위치, 약 40개 위치, 또는 약 50개 위치)에서 상이할 수 있다.
II.E. 링커
본 발명의 키메라 단백질은 하나 또는 그 이상의 링커를 더욱 포함한다. 링커의 한 가지 유형은 개열가능 링커인데, 이것은 생체내에서, 예를 들면, 응고의 부위에서 개체에 투여될 때 다양한 프로테아제에 의해 개열될 수 있다. 한 구체예에서, 개열가능 링커는 응고 연쇄 반응의 부위에서 XTEN 서열로부터, 따라서 키메라 단백질로부터 모이어티, 예를 들면, VWF 단백질의 개열을 허용하고, 따라서 활성화된 FVIII (FVIIIa)이 이의 FVIIIa 활성을 갖도록 허용한다. 링커의 다른 유형은 처리가능 링커인데, 이것은 세포내 개열 부위를 내포하고, 따라서 숙주 세포에서 세포내 처리 효소에 의해 개열될 수 있고, 폴리펩티드의 편의한 발현 및 키메라 단백질의 형성을 허용한다.
하나 또는 그 이상의 링커가 키메라 단백질 내에 임의의 두 단백질 사이에 존재할 수 있다. 한 구체예에서, 키메라 단백질은 (i) FVIII 단백질 및 (ii) 첫 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분을 포함하는 첫 번째 폴리펩티드, 그리고 (iii) VWF 단백질, (iv) 링커 (가령, 개열가능 링커), (v) XTEN 서열, 그리고 (vi) 두 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분을 포함하는 두 번째 폴리펩티드를 포함한다. 다른 구체예에서, 키메라 단백질은 (i) FVIII 단백질 및 (ii) 첫 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분을 포함하는 첫 번째 폴리펩티드, 그리고 (iii) VWF 단백질, (iv) XTEN 서열, (v) 링커 (가령, 개열가능 링커), 그리고 (vi) 두 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분을 포함하는 두 번째 폴리펩티드를 포함한다. 다른 구체예에서, 키메라 단백질은 (i) FVIII 단백질 및 (ii) 첫 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분을 포함하는 첫 번째 폴리펩티드, 그리고 (iii) VWF 단백질, (iv) 첫 번째 링커 (가령, 개열가능 링커), (v) XTEN 서열, (vi) 두 번째 링커 (가령, 개열가능 링커), 그리고 (vii) 두 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분을 포함하는 두 번째 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 첫 번째 폴리펩티드는 FVIII 단백질 및 첫 번째 Ig 불변 영역 사이에 링커, 예를 들면, 개열가능 링커를 더욱 포함한다.
일정한 구체예에서, 키메라 단백질은 (i) FVIII 단백질, (ii) 첫 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분, (iii) 링커 (가령, 처리가능 링커), (iv) VWF 단백질, (v) XTEN 서열, 그리고 (vi) 두 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분을 포함하는 단일 사슬을 포함한다. 다른 구체예에서, 키메라 단백질은 (i) FVIII 단백질, (ii) 첫 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분, (iii) 첫 번째 링커 (가령, 처리가능 링커), (iv) VWF 단백질, (v) 두 번째 링커 (가령, 개열가능 링커), (vi) XTEN 서열, 그리고 (vii) 두 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분을 포함하는 단일 사슬을 포함한다. 처리가능 링커는 키메라 단백질이 숙주 세포에서 발현된 후에 처리될 수 있다; 따라서 숙주 세포에서 생산된 키메라 단백질은 2개 또는 3개의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 최종 형태일 수 있다.
본 발명에서 유용한 링커는 임의의 유기 분자를 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 링커는 중합체, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 또는 히드록시에틸 전분 (HES)을 포함한다. 다른 구체예에서, 링커는 아미노산 서열을 포함한다. 링커는 최소한 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 또는 2000개 아미노산을 포함할 수 있다. 링커는 1-5개 아미노산, 1-10개 아미노산, 1-20개 아미노산, 10-50개 아미노산, 50-100개 아미노산, 100-200개 아미노산, 200-300개 아미노산, 300-400개 아미노산, 400-500개 아미노산, 500-600개 아미노산, 600-700개 아미노산, 700-800개 아미노산, 800-900개 아미노산, 또는 900-1000개 아미노산을 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 링커는 XTEN 서열을 포함한다. XTEN의 추가 실례가 본 발명에 따라 이용될 수 있고, 그리고 US 특허 공개 번호 2010/0239554 A1, 2010/0323956 A1, 2011/0046060 A1, 2011/0046061 A1, 2011/0077199 A1, 또는 2011/0172146 A1, 또는 국제 특허 공개 번호 WO 2010091122 A1, WO 2010144502 A2, WO 2010144508 A1, WO 2011028228 A1, WO 2011028229 A1, 또는 WO 2011028344 A2에서 개시된다. 다른 구체예에서, 링커는 PAS 서열이다.
한 구체예에서, 링커는 중합체, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 또는 히드록시에틸 전분 (HES)이다. 다른 구체예에서, 링커는 아미노산 서열이다. 링커는 최소한 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 또는 2000개 아미노산을 포함할 수 있다. 링커는 1-5개 아미노산, 1-10개 아미노산, 1-20개 아미노산, 10-50개 아미노산, 50-100개 아미노산, 100-200개 아미노산, 200-300개 아미노산, 300-400개 아미노산, 400-500개 아미노산, 500-600개 아미노산, 600-700개 아미노산, 700-800개 아미노산, 800-900개 아미노산, 또는 900-1000개 아미노산을 포함할 수 있다.
링커의 실례는 당분야에서 널리 공지된다. 한 구체예에서, 링커는 서열 Gn을 포함한다. 링커는 서열 (GA)n을 포함할 수 있다. 링커는 서열 (GGS)n을 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 링커는 (GGGS)n (서열 번호: 101)을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 링커는 서열 (GGS)n(GGGGS)n (서열 번호: 95)을 포함한다. 이들 경우에, n은 1 내지 100의 정수일 수 있다. 다른 경우에, n은 1 내지 20의 정수, 다시 말하면, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20일 수 있다. 링커의 실례는 GGG, SGGSGGS (서열 번호: 96), GGSGGSGGSGGSGGG (서열 번호: 97), GGSGGSGGGGSGGGGS (서열 번호: 98), GGSGGSGGSGGSGGSGGS (서열 번호: 99), 또는 GGGGSGGGGSGGGGS (서열 번호: 100)를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 링커는 VWF 단백질 활성 또는 인자 VIII의 응고 활성을 제거하거나 또는 축소하지 않는다. 임의선택적으로, 링커는 예로서, 입체 장해의 효과를 더욱 축소하고 VWF 단백질 또는 인자 VIII 부분이 표적 결합 부위에 더욱 접근가능하게 만듦으로써, VWF 단백질 활성 또는 인자 VIII 단백질의 응고 활성을 증강한다.
한 구체예에서, 키메라 단백질에 유용한 링커는 15-25개 아미노산 길이이다. 다른 구체예에서, 키메라 단백질에 유용한 링커는 15-20개 아미노산 길이이다. 일부 구체예에서, 키메라 단백질에 유용한 링커는 10-25개 아미노산 길이이다. 다른 구체예에서, 키메라 단백질에 유용한 링커는 15개 아미노산 길이이다. 또 다른 구체예에서, 키메라 단백질에 대한 링커는 (GGGGS)n (서열 번호: 94)인데, 여기서 G는 글리신을 나타내고, S는 세린을 나타내고, 그리고 n은 1 내지 20의 정수이다.
II. F. 개열 부위
개열가능 링커는 다른 분자로부터 한 분자를 방출하기 위해, 화학적으로 (가령, 에스테르 결합의 가수분해), 효소적으로 (즉, 프로테아제 개열 서열의 통합), 또는 광분해로 (가령, 발색단, 예를 들면, 3-아미노-3-(2-니트로페닐) 프로프리온산 (ANP)) 개열될 수 있는 모이어티를 통합할 수 있다.
한 구체예에서, 개열가능 링커는 N 말단 또는 C 말단 또는 둘 모두에서 하나 또는 그 이상의 개열 부위를 포함한다. 다른 구체예에서, 개열가능 링커는 하나 또는 그 이상의 개열 부위로 본질적으로 구성되거나 또는 구성된다. 다른 구체예에서, 개열가능 링커는 본원에서 설명된 이종성 아미노산 링커 서열 또는 중합체 및 하나 또는 그 이상의 개열 부위를 포함한다.
일정한 구체예에서, 개열가능 링커는 숙주 세포에서 개열될 수 있는 하나 또는 그 이상의 개열 부위 (즉, 세포내 처리 부위)를 포함한다. 개열 부위의 무제한적 실례는 RRRR (서열 번호: 102), RKRRKR (서열 번호: 103), 그리고 RRRRS (서열 번호: 104)를 포함한다.
일부 구체예에서, 개열가능 링커는 FVIII으로부터 a1 영역, FVIII으로부터 a2 영역, FVIII으로부터 a3 영역, X-V-P-R (서열 번호: 105)을 포함하는 트롬빈 개열 부위 및 PAR1 엑소시트 상호작용 모티프를 포함하고, 여기서 X는 지방족 아미노산, 또는 이들의 임의의 조합이다. 전장 FVIII에 상응하는 Glu720 내지 Arg740과 최소한 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 a2 영역을 포함하고, 여기서 a2 영역은 트롬빈에 의해 개열될 수 있다. 특정 구체예에서, 본 발명에 유용한 개열가능 링커는 ISDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (서열 번호: 106)를 포함하는 a2 영역을 포함한다. 다른 구체예에서, 본 발명을 위한 개열가능 링커는 전장 FVIII에 상응하는 Met337 내지 Arg372와 최소한 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 a1 영역을 포함하고, 여기서 a1 영역은 트롬빈에 의해 개열될 수 있다. 특정 구체예에서, a1 영역은 ISMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSV (서열 번호: 107)를 포함한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 개열가능 링커는 전장 FVIII에 상응하는 Glu1649 내지 Arg1689와 최소한 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 a3 영역을 포함하고, 여기서 a3 영역은 트롬빈에 의해 개열될 수 있다. 특정한 구체예에서, 본 발명의 개열가능 링커는 ISEITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQ (서열 번호: 108)를 포함하는 a3 영역을 포함한다.
다른 구체예에서, 개열가능 링커는 X-V-P-R (서열 번호: 105) 및 PAR1 엑소시트 상호작용 모티프를 포함하는 트롬빈 개열 부위를 포함하고, 그리고 여기서 PAR1 엑소시트 상호작용 모티프는 S-F-L-L-R-N (서열 번호: 109)을 포함한다. PAR1 엑소시트 상호작용 모티프는 P, P-N, P-N-D, P-N-D-K (서열 번호: 110), P-N-D-K-Y (서열 번호: 111), P-N-D-K-Y-E (서열 번호: 112), P-N-D-K-Y-E-P (서열 번호: 113), P-N-D-K-Y-E-P-F (서열 번호: 114), P-N-D-K-Y-E-P-F-W (서열 번호: 115), P-N-D-K-Y-E-P-F-W-E (서열 번호: 116), P-N-D-K-Y-E-P-F-W-E-D (서열 번호: 117), P-N-D-K-Y-E-P-F-W-E-D-E (서열 번호: 118), P-N-D-K-Y-E-P-F-W-E-D-E-E (서열 번호: 119), P-N-D-K-Y-E-P-F-W-E-D-E-E-S (서열 번호: 120), 또는 이들의 임의의 조합에서 선택되는 아미노산 서열을 더욱 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 지방족 아미노산은 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 또는 이소류신에서 선택된다.
다른 구체예에서, 개열가능 링커는 개열가능 링커를 포함하는 키메라 단백질이 개체에 투여된 후, 프로테아제에 의해 개열되는 하나 또는 그 이상의 개열 부위를 포함한다. 한 구체예에서, 개열 부위는 인자 XIa, 인자 XIIa, 칼리크레인, 인자 VIIa, 인자 IXa, 인자 Xa, 인자 IIa (트롬빈), 엘라스타아제-2, MMP-12, MMP-13, MMP-17, 그리고 MMP-20으로 구성된 군에서 선택되는 프로테아제에 의해 개열된다. 다른 구체예에서, 개열 부위는 FXIa 개열 부위 (가령, KLTR↓AET (서열 번호: 121)), FXIa 개열 부위 (가령, DFTR↓VVG (서열 번호: 122)), FXIIa 개열 부위 (가령, TMTR↓IVGG (서열 번호: 123)), 칼리크레인 개열 부위 (가령, SPFR↓STGG (서열 번호: 124)), FVIIa 개열 부위 (가령, LQVR↓IVGG (서열 번호: 125)), FIXa 개열 부위 (가령, PLGR↓IVGG (서열 번호: 126)), FXa 개열 부위 (가령, IEGR↓TVGG (서열 번호: 127)), FIIa (트롬빈) 개열 부위 (가령, LTPR↓SLLV (서열 번호: 128)), 엘라스타아제-2 개열 부위 (가령, LGPV↓SGVP (서열 번호: 129)), 그랜자임-B 개열 (가령, VAGD↓SLEE (서열 번호: 130)), MMP-12 개열 부위 (가령, GPAG↓LGGA (서열 번호: 131)), MMP-13 개열 부위 (가령, GPAG↓LRGA (서열 번호: 132)), MMP-17 개열 부위 (가령, APLG↓LRLR (서열 번호: 133)), MMP-20 개열 부위 (가령, PALP↓LVAQ (서열 번호: 134)), TEV 개열 부위 (가령, ENLYFQ↓G (서열 번호: 135)), 엔테로키나아제 개열 부위 (가령, DDDK↓IVGG (서열 번호: 136)), 프로테아제 3C (PreScission™) 개열 부위 (가령, LEVLFQ↓GP (서열 번호: 137)), 그리고 소타아제 A 개열 부위 (가령, LPKT↓GSES) (서열 번호: 138)로 구성된 군에서 선택된다. 일정한 구체예에서, FXIa 개열 부위는 예로서, TQSFNDFTR (서열 번호: 1) 및 SVSQTSKLTR (서열 번호: 3)을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 무제한적 예시적인 트롬빈 개열 부위는 예로서, DFLAEGGGVR (서열 번호: 4), TTKIKPR (서열 번호: 5), LVPRG (서열 번호: 6), DKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (서열 번호: 88), 또는 IEPRSFS (서열 번호: 194), 그리고 ALRPR (서열 번호: 7) (가령, ALRPRVVGGA (서열 번호: 145))를 포함하거나, 이것으로 본질적으로 구성되거나, 또는 이것으로 구성되는 서열을 포함한다.
특정한 구체예에서, 개열 부위는 TLDPRSFLLRNPNDKYEPFWEDEEK (서열 번호: 146)이다. 다른 구체예에서, 개열 부위는 DKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (서열 번호: 88) 또는 이의 단편을 포함한다. 특정 구체예에서, 개열 부위는 IEPRSFS (서열 번호: 194)를 포함한다. 다른 구체예에서, 개열 부위는 EPRSFS (서열 번호: 195)를 포함하고, 여기서 개열 부위는 FVIII의 전장 a2 영역이 아니다. 또 다른 구체예에서, 개열 부위는 IEPR (서열 번호: 200)을 포함한다. 다른 구체예에서, 개열 부위는 IEPR (서열 번호: 200)을 포함하고, 여기서 개별 부위는 FVIII의 전장 a2 영역이 아니거나 또는 FVIII의 전장 a2 영역을 포함하지 않는다. 다른 구체예에서, 개열 부위는 DKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (서열 번호: 88), KNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (서열 번호: 139), NTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (서열 번호: 140), TGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (서열 번호: 141), GDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (서열 번호: 142), DYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (서열 번호: 143), YYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (서열 번호: 144), YEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (서열 번호: 176), EDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (서열 번호: 177), DSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (서열 번호: 178), SYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (서열 번호: 179), YEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (서열 번호: 180), EDISAYLLSKNNAIEPRSFS (서열 번호: 181), DISAYLLSKNNAIEPRSFS (서열 번호: 182), ISAYLLSKNNAIEPRSFS (서열 번호: 183), SAYLLSKNNAIEPRSFS (서열 번호: 184), AYLLSKNNAIEPRSFS (서열 번호: 185), YLLSKNNAIEPRSFS (서열 번호: 186), LLSKNNAIEPRSFS (서열 번호: 187), LSKNNAIEPRSFS (서열 번호: 188), SKNNAIEPRSFS (서열 번호: 189), KNNAIEPRSFS (서열 번호: 190), NNAIEPRSFS (서열 번호: 191), NAIEPRSFS (서열 번호: 192), AIEPRSFS (서열 번호: 193), 또는 IEPRSFS (서열 번호: 194)를 포함한다. 다른 구체예에서, 개열 부위는 DKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (서열 번호: 88), KNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (서열 번호: 139), NTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (서열 번호: 140), TGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (서열 번호: 141), GDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (서열 번호: 142), DYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (서열 번호: 143), YYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (서열 번호: 144), YEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (서열 번호: 176), EDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (서열 번호: 177), DSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (서열 번호: 178), SYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (서열 번호: 179), YEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (서열 번호: 180), EDISAYLLSKNNAIEPRSFS (서열 번호: 181), DISAYLLSKNNAIEPRSFS (서열 번호: 182), ISAYLLSKNNAIEPRSFS (서열 번호: 183), SAYLLSKNNAIEPRSFS (서열 번호: 184), AYLLSKNNAIEPRSFS (서열 번호: 185), YLLSKNNAIEPRSFS (서열 번호: 186), LLSKNNAIEPRSFS (서열 번호: 187), LSKNNAIEPRSFS (서열 번호: 188), SKNNAIEPRSFS (서열 번호: 189), KNNAIEPRSFS (서열 번호: 190), NNAIEPRSFS (서열 번호: 191), NAIEPRSFS (서열 번호: 192), AIEPRSFS (서열 번호: 193), 또는 IEPRSFS (서열 번호:194)를 포함하고, 여기서 개열 부위는 전장 FVIII a2 영역이 아니다. 일정한 구체예에서, 개열가능 링커는 본원에서 제시된 바와 같이 또는 당분야에서 공지된 바와 같이 트롬빈 개열 검정에서 개열가능하다.
III.
폴리뉴클레오티드, 벡터, 그리고 숙주 세포
본 발명의 키메라 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 역시 본 발명에서 제공된다. 한 구체예에서, 첫 번째 폴리펩티드 사슬 및 두 번째 폴리펩티드 사슬은 단일 폴리뉴클레오티드 사슬에 의해 인코딩될 수 있다. 다른 구체예에서, 첫 번째 폴리펩티드 사슬 및 두 번째 폴리펩티드 사슬은 2개의 상이한 폴리뉴클레오티드, 다시 말하면, 첫 번째 뉴클레오티드 서열 및 두 번째 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된다. 다른 구체예에서, 첫 번째 뉴클레오티드 서열 및 두 번째 뉴클레오티드 서열은 2개의 상이한 폴리뉴클레오티드 (가령, 상이한 벡터) 상에 있다.
본 발명은 단일 폴리펩티드 사슬 (가령, FVIII(X2)-F1-L3-F2-L2-X1-L1-V)을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 FVIII(X2)는 XTEN 서열이 하나 또는 그 이상의 삽입 부위에서 삽입되는 FVIII 단백질을 포함하고, F1은 첫 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분, 예를 들면, 첫 번째 Fc 영역을 포함하고, L1은 첫 번째 링커를 포함하고, V는 VWF 단백질을 포함하고, X1은 길이에서 288개보다 적은 아미노산을 갖는 XTEN 서열을 포함하고, L2는 두 번째 링커를 포함하고, L3은 세 번째 링커를 포함하고, 그리고 F2는 두 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분, 예를 들면, 두 번째 Fc 영역을 포함한다. 본 발명은 또한, 2개의 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 첫 번째 폴리뉴클레오티드 서열은 첫 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분에 융합된 FVIII 단백질을 포함하는 첫 번째 폴리펩티드를 인코딩하고, 그리고 두 번째 폴리뉴클레오티드 서열은 VWF 단백질, 길이에서 288개보다 적은 아미노산을 갖는 XTEN 서열, 그리고 두 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분을 포함하는 두 번째 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구체예에서, 2개의 폴리펩티드 사슬 또는 3개의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 키메라 단백질이 단일 폴리뉴클레오티드 사슬에 의해 인코딩되고, 그리고 이후, 2개 또는 3개 (또는 그 이상)의 폴리펩티드 사슬로 처리될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 이들 폴리펩티드 사슬을 포함하는 키메라 단백질은 2개 또는 3개의 폴리뉴클레오티드 사슬에 의해 인코딩될 수 있다.
다른 구체예에서, 폴리뉴클레오티드의 세트는 단백질 전환효소를 인코딩하는 추가 뉴클레오티드 사슬 (가령, 키메라 폴리펩티드가 단일 폴리뉴클레오티드 사슬에 의해 인코딩될 때, 두 번째 뉴클레오티드 사슬 또는 키메라 단백질이 2개의 폴리뉴클레오티드 사슬에 의해 인코딩될 때, 세 번째 뉴클레오티드 사슬)을 더욱 포함한다. 단백질 전환효소는 전단백질 전환효소 서브틸리신/켁신 유형 5 (PCSK5 또는 PC5), 전단백질 전환효소 서브틸리신/켁신 유형 7 (PCSK7 또는 PC5), 효모 Kex 2, 전단백질 전환효소 서브틸리신/켁신 유형 3 (PACE 또는 PCSK3), 그리고 이들의 2개 또는 그 이상 조합으로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 일부 구체예에서, 단백질 전환효소는 PACE, PC5, 또는 PC7이다. 특정한 구체예에서, 단백질 전환효소는 PC5 또는 PC7이다. 국제 출원 번호 PCT/US2011/043568을 참조한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 발현 벡터는 적절한 숙주 세포 내로 도입될 때, 삽입된 코딩 서열의 전사 및 번역에 필요한 요소, 또는 RNA 바이러스 벡터의 경우에, 복제 및 번역에 필요한 요소를 내포하는 임의의 핵산 구조체를 지칭한다. 발현 벡터는 플라스미드, 파지미드, 바이러스, 그리고 이들의 유도체를 포함할 수 있다.
본 발명의 발현 벡터는 본원에서 설명된 키메라 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 것이다. 한 구체예에서, FVIII 단백질 및 첫 번째 Ig 불변 영역을 포함하는 첫 번째 폴리펩티드, VWF 단백질, 288개보다 적은 아미노산을 갖는 XTEN 서열 및 두 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분을 포함하는 두 번째 폴리펩티드, 또는 둘 모두에 대한 코딩 서열 중에서 하나 또는 그 이상이 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결된다. 본원에서 이용된 바와 같이, 2개의 핵산 서열은 각 성분 핵산 서열이 자신의 기능성을 유지하도록 허용하는 방식으로 그들이 공유 연결될 때, 작동가능하게 연결된다. 코딩 서열 및 유전자 발현 제어 서열은 코딩 서열의 발현 또는 전사 및/또는 번역을 유전자 발현 제어 서열의 영향 또는 제어 하에 배치하는 방식으로 그들이 공유 연결될 때, 작동가능하게 연결된 것으로 일컬어진다. 2개의 DNA 서열은 5' 유전자 발현 서열에서 프로모터의 유도가 코딩 서열의 전사를 유발하지 않고, 그리고 이들 두 DNA 서열 사이에 연쇄의 본성이 (1) 프레임시프트 돌연변이의 도입을 유발하지 않으면, (2) 코딩 서열의 전사를 주도하는 프로모터 영역의 능력을 간섭하지 않으면, 또는 (3) 단백질로 번역되는 상응하는 RNA 전사체의 능력을 간섭하지 않으면, 작동가능하게 연결된 것으로 일컬어진다. 따라서, 유전자 발현 서열은 유전자 발현 서열이 결과의 전사체가 원하는 단백질 또는 폴리펩티드로 번역되도록 코딩 핵산 서열의 전사를 실행할 수 있으면, 코딩 핵산 서열에 작동가능하게 연결될 것이다.
본원에서 이용된 바와 같은 유전자 발현 제어 서열은 자신이 작동가능하게 연결되는 코딩 핵산의 효율적인 전사 및 번역을 용이하게 하는 임의의 조절 뉴클레오티드 서열, 예를 들면, 프로모터 서열 또는 프로모터-인핸서 조합이다. 유전자 발현 제어 서열은 예로서, 포유류 또는 바이러스 프로모터, 예를 들면, 구조성 또는 유도성 프로모터일 수 있다. 구조성 포유류 프로모터는 다음의 유전자에 대한 프로모터를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다: 하이포크산틴 포스포리보실 전달효소 (HPRT), 아데노신 탈아미노효소, 피루브산염 키나아제, 베타-액틴 프로모터, 그리고 다른 구조성 프로모터. 진핵 세포에서 구조성으로 기능하는 예시적인 바이러스 프로모터는 예로서, 시토메갈로바이러스 (CMV), 유인원 바이러스 (가령, SV40), 유두종 바이러스, 아데노바이러스, 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), 라우스 육종 바이러스, 시토메갈로바이러스, 몰로니 백혈병 바이러스의 긴 말단 반복 (LTR), 그리고 다른 레트로바이러스로부터 프로모터, 그리고 단순 헤르페스 바이러스의 티미딘 키나아제 프로모터를 포함한다. 다른 구조성 프로모터는 당업자에게 공지된다. 본 발명의 유전자 발현 서열로서 유용한 프로모터는 또한, 유도성 프로모터를 포함한다. 유도성 프로모터는 유도제의 존재에서 발현된다. 가령, 메탈로티오네인 프로모터는 일정한 금속 이온의 존재에서 전사 및 번역을 증진하도록 유도된다. 다른 유도성 프로모터는 당업자에게 공지된다.
일반적으로, 유전자 발현 제어 서열은 필요에 따라, 각각 전사 및 번역의 개시와 관련된 5' 비-전사 및 5' 비-번역 서열, 예를 들면, TATA 박스, 캡핑 서열, CAAT 서열 등을 포함할 것이다. 특히, 이런 5' 비-전사 서열은 작동가능하게 결합된 코딩 핵산의 전사 제어를 위한 프로모터 서열을 포함하는 프로모터 영역을 포함할 것이다. 유전자 발현 서열은 필요에 따라, 인핸서 서열 또는 상류 활성체 서열을 임의선택적으로 포함한다.
바이러스 벡터는 다음의 바이러스로부터 핵산 서열을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다: 레트로바이러스, 예를 들면, 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스, 하비 뮤린 육종 바이러스, 뮤린 유방 종양 바이러스 및 라우스 육종 바이러스; 아데노바이러스, 아데노 연관된 바이러스; SV40-유형 바이러스; 폴리오마바이러스; 엡스타인 바르 바이러스; 유두종 바이러스; 헤르페스 바이러스; 우두 바이러스; 소아마비 바이러스; 그리고 RNA 바이러스, 예를 들면, 레트로바이러스. 당분야에서 널리 공지된 다른 벡터가 쉽게 이용될 수 있다. 일정한 바이러스 벡터는 비필수적인 유전자가 관심되는 유전자로 대체된 비-세포변성 진핵 바이러스에 근거된다. 비-세포변성 바이러스는 레트로바이러스를 포함하는데, 이들의 생활 주기는 유전체 바이러스 RNA의 DNA로의 역전사 및 숙주 세포 DNA 내로 차후 프로바이러스 통합을 수반한다. 레트로바이러스는 인간 유전자 요법 시험에 승인되었다. 복제-결함성 (즉, 원하는 단백질의 합성을 주도할 수 있지만, 감염성 입자를 제조할 수 없는) 레트로바이러스가 가장 유용하다. 이런 유전적으로 변경된 레트로바이러스 발현 벡터는 생체내에서 유전자의 높은 효율 형질도입을 위한 보편적인 유용성을 갖는다. 복제-결함성 레트로바이러스를 생산하기 위한 표준 프로토콜 (플라스미드 내로 외인성 유전 물질의 통합, 플라스미드로 포장 세포주의 형질감염, 포장 세포주에 의한 재조합 레트로바이러스의 생산, 조직 배양 배지로부터 바이러스 입자의 수집, 그리고 바이러스 입자로 표적 세포의 감염의 단계 포함)은 Kriegler, M., Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, W.H. Freeman Co., New York (1990) 및 Murry, E. J., Methods in Molecular Biology, Vol. 7, Humana Press, Inc., Cliffton, N.J. (1991)에서 제공된다.
한 구체예에서, 바이러스는 아데노 연관된 바이러스, 이중 가닥 DNA 바이러스이다. 아데노 연관된 바이러스는 복제-결함성이도록 가공될 수 있고, 그리고 넓은 범위의 세포 유형 및 종을 감염시킬 수 있다. 이것은 열 및 지질 용매 안정성; 조혈 세포를 비롯한 다양한 계통의 세포에서 높은 형질도입 빈도; 그리고 중복감염 저해의 결여, 따라서 복수 계열의 형질도입 허용과 같은 이점을 더욱 갖는다. 보고된 바에 따르면, 아데노 연관된 바이러스는 부위 특이적 방식으로 인간 세포 DNA 내로 통합할 수 있고, 따라서 레트로바이러스 감염의 특징을 이루는 삽입 돌연변이유발의 가능성 및 삽입된 유전자 발현의 가변성을 최소화한다. 이에 더하여, 야생형 아데노 연관된 바이러스 감염은 도태 압력의 부재에서 100회 이상의 계대 동안 조직 배양에서 추적되었는데, 이것은 아데노 연관된 바이러스 유전체 통합이 상대적으로 안정된 이벤트라는 것을 암시한다. 아데노 연관된 바이러스는 또한, 염색체외 방식으로 기능할 수 있다.
다른 벡터는 플라스미드 벡터를 포함한다. 플라스미드 벡터는 당분야에서 광범위하게 설명되었고, 그리고 당업자에게 널리 공지되어 있다. 가령, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989를 참조한다. 지난 수년간, 플라스미드 벡터는 숙주 유전체 내에서 복제하고 숙주 유전체 내로 통합하는 능력 없음 때문에, 생체내에서 유전자를 세포에 전달하는데 특히 유리한 것으로 밝혀졌다. 하지만, 숙주 세포와 양립성인 프로모터를 갖는 플라스미드는 플라스미드 내에서 작동가능하게 인코딩된 유전자로부터 펩티드를 발현할 수 있다. 상업적인 공급업체로부터 가용한 일부 통상적으로 이용되는 플라스미드는 pBR322, pUC18, pUC19, 다양한 pcDNA 플라스미드, pRC/CMV, 다양한 pCMV 플라스미드, pSV40, 그리고 pBlueScript를 포함한다. 특정한 플라스미드의 추가 실례는 pcDNA3.1, 카탈로그 번호 V79020; pcDNA3.1/hygro, 카탈로그 번호 V87020; pcDNA4/myc-His, 카탈로그 번호 V86320; 그리고 pBudCE4.1, 카탈로그 번호 V53220 (이들 모두 Invitrogen (Carlsbad, CA.)으로부터)을 포함한다. 다른 플라스미드는 당업자에게 널리 공지되어 있다. 추가적으로, 플라스미드는 DNA의 특정한 단편을 제거하고 및/또는 추가하기 위해 표준 분자생물학 기술을 이용하여 맞춤 설계될 수 있다.
본 발명의 단백질을 생산하는데 이용될 수 있는 한 가지 곤충 발현 시스템에서, 아우토그라파 칼리포니카 (Autographa californica) 핵 다한증 바이러스 (AcNPV)가 외래 유전자를 발현하기 위한 벡터로서 이용된다. 상기 바이러스는 스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) 세포에서 성장한다. 코딩 서열은 상기 바이러스의 비필수적인 영역 (가령, 다면체 유전자) 내로 클로닝되고 ACNPV 프로모터 (가령, 다면체 프로모터)의 제어 하에 배치될 수 있다. 코딩 서열의 성공적인 삽입은 다면체 유전자의 비활성화 및 비-폐쇄된 재조합 바이러스 (즉, 다면체 유전자에 의해 코딩된 단백질성 피막을 결여하는 바이러스)의 생산을 유발할 것이다. 이들 재조합 바이러스는 이후, 스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) 세포를 감염시키는데 이용되고, 여기서 삽입된 유전자가 발현된다. (가령, Smith et al. (1983) J Virol 46:584; U.S. 특허 번호 4,215,051을 참조한다). 이러한 발현 시스템의 추가 실례는 Ausubel et al., eds. (1989) Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience에서 발견될 수 있다.
본 발명의 단백질을 발현하는데 이용될 수 있는 다른 시스템은 "GS 발현 시스템" (Lonza Biologics PLC, Berkshire UK)으로서 또한 지칭된 글루타민 합성효소 유전자 발현 시스템이다. 이러한 발현 시스템은 U.S. 특허 번호 5,981,216에서 상세하게 설명된다.
포유류 숙주 세포에서, 다수의 바이러스 기초된 발현 시스템이 활용될 수 있다. 아데노바이러스가 발현 벡터로서 이용되는 경우에, 코딩 서열은 아데노바이러스 전사/번역 제어 복합체, 예를 들면, 후기 프로모터 및 삼부 리더 서열에 결찰될 수 있다. 이러한 키메라 유전자는 이후, 시험관내 또는 생체내 재조합에 의해 아데노바이러스 유전체에서 삽입될 수 있다. 바이러스 유전체의 비필수적인 영역 (가령, 영역 E1 또는 E3)에서 삽입은 감염된 숙주에서 생존가능하고 펩티드를 발현할 수 있는 재조합 바이러스를 유발할 것이다. 가령, Logan & Shenk (1984) Proc Natl Acad Sci USA 81:3655)를 참조한다. 대안으로, 우두 7.5 K 프로모터가 이용될 수 있다. 가령, Mackett et al. (1982) Proc Natl Acad Sci USA 79:7415; Mackett et al. (1984) J Virol 49:857; Panicali et al. (1982) Proc Natl Acad Sci USA 79:4927을 참조한다.
생산의 효율을 증가시키기 위해, 폴리뉴클레오티드는 효소적 개열 부위에 의해 분리된 본 발명의 단백질의 복수 단위를 인코딩하도록 설계될 수 있다. 결과의 폴리펩티드는 폴리펩티드 단위를 회수하기 위해 개열될 수 있다 (가령, 적절한 효소로 처리에 의해). 이것은 단일 프로모터에 의해 주동된 폴리펩티드의 수율을 증가시킬 수 있다. 적절한 바이러스 발현 시스템에서 이용될 때, mRNA에 의해 인코딩된 각 폴리펩티드의 번역은 예로서, 내부 리보솜 유입 부위, IRES에 의해 전사체에서 내부로 지향된다. 따라서, 폴리시스트론성 구조체는 단일, 큰 폴리시스트론성 mRNA의 전사를 주도하고, 이것은 차례로, 복수, 개별 폴리펩티드의 번역을 주도한다. 이러한 접근법은 다단백질의 생산 및 효소적 처리를 제거하고, 그리고 단일 프로모터에 의해 주동된 폴리펩티드의 수율을 유의미하게 증가시킬 수 있다.
형질전환에서 이용된 벡터는 형질전환체를 확인하는데 이용된 선별가능 마커를 통상적으로 내포할 것이다. 세균 시스템에서, 이것은 항생제 내성 유전자, 예를 들면, 암피실린 또는 카나마이신을 포함할 수 있다. 배양된 포유류 세포에서 이용을 위한 선별가능 마커는 약물, 예를 들면, 네오마이신, 히그로마이신, 그리고 메토트렉사트에 내성을 부여하는 유전자를 포함한다. 선별가능 마커는 증폭가능 선별가능 마커일 수 있다. 한 가지 증폭가능 선별가능 마커는 디히드로폴레이트 환원효소 (DHFR) 유전자이다. Simonsen C C et al. (1983) Proc Natl Acad Sci USA 80:2495-9. 선별가능 마커는 Thilly (1986) Mammalian Cell Technology, Butterworth Publishers, Stoneham, Mass.에 의해 재검토되고, 그리고 선별가능 마커의 선택은 당업자의 수준 범위 내에 있다.
선별가능 마커는 관심되는 유전자와 동시에 별개의 플라스미드 상에서 세포 내로 도입될 수 있거나, 또는 이들은 동일한 플라스미드 상에서 도입될 수 있다. 동일한 플라스미드 상에서라면, 선별가능 마커 및 관심되는 유전자는 상이한 프로모터 또는 동일한 프로모터의 제어 하에 있을 수 있는데, 후자 배열은 디시스트론 메시지를 생산한다. 이러한 유형의 구조체는 당분야에서 공지된다 (가령, U.S. 특허 번호 4,713,339).
발현 벡터는 재조합적으로 생산된 단백질의 쉬운 정제를 허용하는 태그를 인코딩할 수 있다. 실례는 벡터 pUR278 (Ruther et al. (1983) EMBO J 2:1791)을 포함하지만 이에 한정되지 않고, 여기서 발현되는 단백질에 대한 코딩 서열은 태깅된 융합 단백질이 생산되도록, lac z 코딩 영역과 인프레임으로 벡터 내로 결찰될 수 있다; pGEX 벡터는 글루타티온 S-전달효소 (GST) 태그를 갖는 본 발명의 단백질을 발현하는데 이용될 수 있다. 이들 단백질은 통상적으로 가용성이고, 그리고 글루타티온-아가로오스 비드에 흡착, 그 이후에 유리 글루타티온의 존재에서 용리에 의해 세포로부터 쉽게 정제될 수 있다. 이들 벡터는 정제 후 태그의 쉬운 제거를 위한 개열 부위 (트롬빈 또는 인자 Xa 프로테아제 또는 PreScission PROTEASETM (Pharmacia, Peapack, N.J.))를 포함한다.
발현 벡터 또는 벡터들은 이후, 적합한 표적 세포 내로 형질감염되거나 또는 동시형질감염되고, 상기 세포는 폴리펩티드를 발현할 것이다. 당분야에서 공지된 형질감염 기술은 인산칼슘 침전 (Wigler et al. (1978) Cell 14:725), 전기천공 (Neumann et al. (1982) EMBO J 1:841), 그리고 리포솜-기초된 시약을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 원핵 및 진핵 세포 둘 모두를 비롯한 다양한 숙주-발현 벡터 시스템이 본원에서 설명된 단백질을 발현하는데 활용될 수 있다. 이들은 적절한 코딩 서열을 내포하는 재조합 박테리오파지 DNA 또는 플라스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 미생물, 예를 들면, 세균 (가령, 대장균 (E. coli)); 적절한 코딩 서열을 내포하는 재조합 효모 또는 균류 발현 벡터로 형질전환된 효모 또는 실모양 균류; 적절한 코딩 서열을 내포하는 재조합 바이러스 발현 벡터 (가령, 배큘로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템; 재조합 바이러스 발현 벡터 (가령, 콜리플라워 모자이크 바이러스 또는 담배 모자이크 바이러스)로 감염되거나 또는 적절한 코딩 서열을 내포하는 재조합 플라스미드 발현 벡터 (가령, Ti 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포 시스템; 또는 포유류 세포 (가령, HEK 293, CHO, Cos, HeLa, HKB11, 그리고 BHK 세포)를 비롯한 동물 세포 시스템을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.
한 구체예에서, 숙주 세포는 진핵 세포이다. 본원에서 이용된 바와 같이, 진핵 세포는 확정적인 핵을 갖는 임의의 동물 또는 식물 세포를 지칭한다. 동물의 진핵 세포는 척추동물, 예를 들면, 포유동물의 세포, 그리고 무척추동물, 예를 들면, 곤충의 세포를 포함한다. 식물의 진핵 세포는 제한 없이, 효모 세포를 특이적으로 포함할 수 있다. 진핵 세포는 원핵 세포, 예를 들면, 세균과 상이하다.
일정한 구체예에서, 진핵 세포는 포유류 세포이다. 포유류 세포는 포유동물로부터 유래된 임의의 세포이다. 포유류 세포는 특정적으로, 포유류 세포주를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 한 구체예에서, 포유류 세포는 인간 세포이다. 다른 구체예에서, 포유류 세포는 HEK 293 세포이고, 이것은 인간 배아 신장 세포주이다. HEK 293 세포는 American Type Culture Collection, Manassas, VA로부터 CRL-1533으로서, 그리고 Invitrogen (Carlsbad, Calif.)으로부터 293-H 세포, 카탈로그 번호 11631-017 또는 293-F 세포, 카탈로그 번호 11625-019로서 가용하다. 일부 구체예에서, 포유류 세포는 PER.C6® 세포이고, 이것은 망막으로부터 유래된 인간 세포주이다. PER.C6® 세포는 Crucell (Leiden, The Netherlands)로부터 가용하다. 다른 구체예에서, 포유류 세포는 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포이다. CHO 세포는 American Type Culture Collection, Manassas, VA로부터 가용하다 (가령, CHO-K1; CCL-61). 또 다른 구체예에서, 포유류 세포는 아기 햄스터 신장 (BHK) 세포이다. BHK 세포는 American Type Culture Collection, Manassas, Va로부터 가용하다 (가령, CRL-1632). 일부 구체예에서, 포유류 세포는 HKB11 세포이고, 이것은 HEK293 세포 및 인간 B 세포주의 하이브리드 세포주이다. Mei et al., Mol. Biotechnol. 34(2): 165-78 (2006).
한 구체예에서, FVIII(X2)-Fc 융합 코딩 서열, VWF 단백질-L1-X1-L2-Fc 코딩 서열, 또는 둘 모두 및 선별가능 마커, 예를 들면, 제오신 내성을 포함하는 플라스미드가 키메라 단백질의 생산을 위해 HEK 293 세포 내로 형질감염된다.
다른 구체예에서, FVIII-Fc 융합 코딩 서열, VWF 단백질-L1-X-L2-Fc 코딩 서열, 또는 둘 모두 및 선별가능 마커, 예를 들면, 제오신 내성을 포함하는 플라스미드가 키메라 단백질의 생산을 위해 HEK 293 세포 내로 형질감염된다.
일부 구체예에서, FVIII(X2)-Fc 융합 코딩 서열 및 첫 번째 선별가능 마커, 예를 들면, 제오신 내성 유전자를 포함하는 첫 번째 플라스미드, 그리고 VWF 단백질-L1-X1-L2-Fc 코딩 서열 및 두 번째 선별가능 마커, 예를 들면, 네오마이신 내성 유전자를 포함하는 두 번째 플라스미드, 그리고 단백질 전환효소 코딩 서열 및 세 번째 선별가능 마커, 예를 들면, 히그로마이신 내성 유전자를 포함하는 세 번째 플라스미드가 키메라 단백질의 생산을 위해 HEK 293 세포 내로 동시형질감염된다. 첫 번째와 두 번째 플라스미드는 동등한 양 (즉, 1:1 몰 비율)으로 도입될 수 있거나, 또는 이들은 불공평한 양으로 도입될 수 있다.
또 다른 구체예에서, FVIII-Fc 융합 코딩 서열 및 첫 번째 선별가능 마커, 예를 들면, 제오신 내성 유전자를 포함하는 첫 번째 플라스미드, 그리고 VWF 단백질-L1-X-L2-Fc 코딩 서열 및 두 번째 선별가능 마커, 예를 들면, 네오마이신 내성 유전자를 포함하는 두 번째 플라스미드, 그리고 단백질 전환효소 코딩 서열 및 세 번째 선별가능 마커, 예를 들면, 히그로마이신 내성 유전자를 포함하는 세 번째 플라스미드가 키메라 단백질의 생산을 위해 HEK 293 세포 내로 동시형질감염된다. 첫 번째와 두 번째 플라스미드는 동등한 양 (즉, 1:1 몰 비율)으로 도입될 수 있거나, 또는 이들은 불공평한 양으로 도입될 수 있다.
또 다른 구체예에서, FVIII(X2)-Fc 융합 코딩 서열 및 첫 번째 선별가능 마커, 예를 들면, 제오신 내성 유전자를 포함하는 첫 번째 플라스미드, 그리고 VWF 단백질-L1-X1-L2-Fc 융합 코딩 서열 및 두 번째 선별가능 마커, 예를 들면, 네오마이신 내성 유전자를 포함하는 두 번째 플라스미드, 그리고 단백질 전환효소 코딩 서열 및 세 번째 선별가능 마커, 예를 들면, 히그로마이신 내성 유전자를 포함하는 세 번째 플라스미드가 키메라 단백질의 생산을 위해 HEK 293 세포 내로 동시형질감염된다. 첫 번째와 두 번째 플라스미드는 동등한 양 (즉, 1:1 몰 비율)으로 도입될 수 있거나, 또는 이들은 불공평한 양으로 도입될 수 있다.
일정한 구체예에서, 키메라 단백질 인코딩 FVIII (XTEN이 있거나 또는 없음)-F1-L3-F2-L2-X-L1-V 코딩 서열 및 첫 번째 선별가능 마커, 예를 들면, 제오신 내성 유전자를 포함하는 첫 번째 플라스미드, 그리고 단백질 전환효소 코딩 서열 및 두 번째 선별가능 마커, 예를 들면, 히그로마이신 내성 유전자를 포함하는 두 번째 플라스미드가 키메라 단백질의 생산을 위해 HEK 293 세포 내로 동시형질감염된다. FVIII(X)-F1 코딩 서열 및 V-L2-X-L1-F2 코딩 서열에 대한 프로모터는 상이할 수 있거나 또는 이들은 동일할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 형질감염된 세포는 안정되게 형질감염된다. 이들 세포는 당업자에게 공지된 전통적인 기술을 이용하여, 안정된 세포주로서 선별되고 유지될 수 있다.
단백질의 DNA 구조체를 내포하는 숙주 세포는 적절한 성장 배지에서 성장된다. 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "적절한 성장 배지"는 세포의 성장에 필요한 영양소를 내포하는 배지를 의미한다. 세포 성장에 필요한 영양소는 탄소원, 질소원, 필수 아미노산, 비타민, 무기질, 그리고 성장 인자를 포함할 수 있다. 임의선택적으로, 배지는 하나 또는 그 이상의 선별 인자를 내포할 수 있다. 임의선택적으로, 배지는 송아지 혈청 또는 소 태아 혈청 (FCS)을 내포할 수 있다. 한 구체예에서, 배지는 IgG를 실제적으로 내포하지 않는다. 성장 배지는 일반적으로, 예로서 DNA 구조체 상에서 선별가능 마커에 의해 보완되거나 또는 DNA 구조체로 동시형질감염되는 필수적인 영양소에서 약물 선별 또는 결핍에 의해, DNA 구조체를 내포하는 세포에 대해 선별할 것이다. 배양된 포유류 세포는 일반적으로, 상업적으로 가용한 혈청-내포 또는 혈청-없는 배지 (가령, MEM, DMEM, DMEM/F12)에서 성장된다. 한 구체예에서, 배지는 CD293 (Invitrogen, Carlsbad, CA.)이다. 다른 구체예에서, 배지는 CD17 (Invitrogen, Carlsbad, CA.)이다. 이용된 특정 세포주에 적절한 배지의 선별은 당업자의 수준 범위 안에 있다.
키메라 단백질의 두 폴리펩티드 사슬을 공동발현하기 위해, 숙주 세포는 양쪽 사슬의 발현을 허용하는 조건 하에 배양된다. 본원에서 이용된 바와 같이, 배양하는 것은 최소한 확정된 시간 동안, 생존 세포를 시험관내에서 유지하는 것을 지칭한다. 유지하는 것은 생존 세포의 개체군에서 증가를 포함할 수 있긴 하지만, 반드시 그러할 필요는 없다. 가령, 배양 동안 유지된 세포는 개체군에서 정적일 수 있지만, 여전히 생존가능하고 원하는 산물, 예를 들면, 재조합 단백질 또는 재조합 융합 단백질을 생산할 수 있다. 진핵 세포를 배양하기 위한 적합한 조건은 당분야에서 널리 공지되고 배양 배지, 배지 보충물, 온도, pH, 산소 포화도 등의 적절한 선별을 포함한다. 상업적인 목적을 위해, 배양하는 것은 진탕기 플라스크, 롤러 병, 중공 섬유 생물반응기, 교반된-탱크 생물반응기, 에어리프트 생물반응기, 웨이브 생물반응기 등을 비롯한 정률증가 시스템의 다양한 유형 중에서 한 가지의 이용을 포함할 수 있다.
세포 배양 조건은 또한, VWF 단편 및 FVIII 단백질의 연관을 허용하도록 선별된다. VWF 단편 및/또는 FVIII 단백질의 발현을 허용하는 조건은 비타민 K의 공급원의 존재를 포함할 수 있다. 가령, 한 구체예에서, 안정되게 형질감염된 HEK 293 세포는 4 mM 글루타민으로 보충된 CD293 배지 (Invitrogen, Carlsbad, CA) 또는 OptiCHO 배지 (Invitrogen, Carlsbad, CA)에서 배양된다.
한 양상에서, 본 발명은 본 발명의 키메라 단백질을 발현하거나, 만들거나, 또는 생산하는 방법에 관계하고, 상기 방법은 a) 키메라 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 형질감염시키고, 그리고 b) 키메라 단백질을 발현하는데 적합한 조건 하에 배양 배지에서 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하고, 여기서 키메라 단백질이 발현된다.
추가 구체예에서, 첫 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분에 연결된 FVIII 단백질 및/또는 XTEN 서열에 의해 두 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분에 융합된 VWF 단백질을 내포하는 단백질 산물이 배지 내로 분비된다. 배지는 세포로부터 분리되고, 농축되고, 여과되고, 그리고 이후, 2개 또는 3개의 친화성 칼럼, 예를 들면, 단백질 A 칼럼 및 1개 또는 2개의 음이온 교환 칼럼 위에 통과된다.
일정한 양상에서, 본 발명은 본원에서 설명된 방법에 의해 생산된 키메라 단백질에 관계한다.
시험관내 생산은 본 발명의 원하는 변경된 폴리펩티드를 대량으로 제공하기 위한 정률증가를 허용한다. 조직 배양 조건 하에 포유류 세포 배양을 위한 기술은 당분야에서 공지되고, 그리고 예로서, 에어리프트 반응기에서 또는 연속적 교반기 반응기에서 균질한 현탁 배양, 또는 예로서, 중공 섬유, 마이크로캡슐, 아가로오스 마이크로비드 또는 세라믹 카트리지에서 고정된 또는 포획된 세포 배양을 포함한다. 필요하면 및/또는 원하는 경우에, 폴리펩티드의 용액은 관례적인 크로마토그래피 방법, 예를 들면, 겔 여과, 이온-교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC, DEAE-셀룰로오스 위에서 크로마토그래피 또는 친화성 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다.
IV.
제약학적 조성물
본 발명의 키메라 단백질을 내포하는 조성물은 적합한 제약학적으로 허용되는 담체를 내포할 수 있다. 가령, 이들은 작용 부위에 전달을 위해 설계된 제조물로 활성 화합물의 가공을 용이하게 하는 부형제 및/또는 보조제를 내포할 수 있다.
제약학적 조성물은 일시 주사에 의한 비경구 투여 (즉, 정맥내, 피하, 또는 근육내) 용으로 조제될 수 있다. 주사를 위한 제제는 단위 약형에서, 예를 들면, 보존제가 첨가된 앰풀 또는 다중분량 용기에서 제공될 수 있다. 조성물은 현탁액, 용액, 또는 유성 또는 수성 운반제에서 유제와 같은 형태를 취할 수 있고, 그리고 조제 작용제, 예를 들면, 현탁제, 안정제 및/또는 분산제를 내포한다. 대안으로, 활성 성분은 적합한 운반제, 예를 들면, 발열원 없는 증류수로 구성을 위한 분말 형태일 수 있다.
비경구 투여에 적합한 제제는 또한, 수용성 형태에서 활성 화합물의 수용액, 예를 들면, 수용성 염을 포함한다. 이에 더하여, 적절한 유성 주사 현탁액으로서 활성 화합물의 현탁액이 투여될 수 있다. 적합한 친유성 용매 또는 운반제는 지방유, 예를 들면, 참기름, 또는 합성 지방산 에스테르, 예를 들면, 에틸 올레산염 또는 트리글리세리드를 포함한다. 수성 주사 현탁액은 예로서, 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 소르비톨 및 덱스트란을 비롯하여, 현탁액의 점성을 증가시키는 물질을 내포할 수 있다. 임의선택적으로, 현탁액은 또한, 안정제를 내포할 수 있다. 리포솜은 또한, 세포 또는 간질성 공간 내로 전달을 위해 본 발명의 분자를 캡슐화하는데 이용될 수 있다. 예시적인 제약학적으로 허용되는 담체는 생리학적으로 양립성 용매, 분산 매체, 코팅, 항균제 및 항진균제, 등장성 작용제 및 흡수 지연제, 물, 식염수, 인산염 완충된 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등이다. 일부 구체예에서, 조성물은 등장성 작용제, 예를 들면, 당, 다가알코올, 예를 들면, 만니톨, 소르비톨, 또는 염화나트륨을 포함한다. 다른 구체예에서, 조성물은 제약학적으로 허용되는 물질, 예를 들면, 적심제 또는 소량의 보조 물질, 예를 들면, 적심제 또는 유화제, 보존제 또는 완충액을 포함하고, 이들은 활성 성분의 저장 수명 또는 유용성을 증강한다.
본 발명의 조성물은 예로서, 액체 (가령, 주사가능 및 주입가능 용액), 분산액, 현탁액, 반고체 및 고체 약형을 비롯한 다양한 형태일 수 있다. 바람직한 형태는 투여 방식 및 치료적 적용에 좌우된다.
조성물은 용액, 마이크로유제, 분산액, 리포솜, 또는 높은 약물 농도에 적합한 다른 정연한 구조로서 조제될 수 있다. 무균 주사가능 용액은 필요한 양의 활성 성분을 필요에 따라, 상기 열거된 성분 중에서 한 가지 또는 조합을 포함하는 적절한 용매에 통합하고, 그 이후에 여과 살균함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 성분을 기초 분산 매체 및 상기 열거된 것들로부터 필요한 다른 성분을 내포하는 무균 운반제 내로 통합함으로써 제조된다. 무균 주사가능 용액의 제조를 위한 무균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 진공 건조와 동결 건조인데, 이것은 이전에 무균-여과된 용액으로부터 활성 성분 + 임의의 추가 원하는 성분의 분말을 산출한다. 용액의 적절한 유동성은 예로서, 코팅, 예를 들면, 레시틴의 이용에 의해, 분산의 경우에 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 그리고 계면활성제의 이용에 의해 유지될 수 있다. 주사가능 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연하는 작용제, 예를 들면, 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 조성물 내에 포함함으로써 달성될 수 있다.
활성 성분은 제어된 방출 제제 또는 장치로 조제될 수 있다. 이런 제제와 장치의 실례는 이식물, 경피 패치, 그리고 미세캡슐화된 전달 시스템을 포함한다. 생물분해성, 생체적합성 중합체, 예를 들면, 에틸렌 비닐 아세트산염, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 그리고 폴리유산이 이용될 수 있다. 이런 제제와 장치의 제조를 위한 방법은 당분야에서 공지된다. 가령, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978을 참조한다.
주사가능 저장소 제제는 약물의 마이크로캡슐화된 매트릭스를 생물분해성 중합체, 예를 들면, 폴리락티드-폴리글리콜리드에서 형성함으로써 만들어질 수 있다. 약물 대 중합체의 비율, 그리고 이용된 중합체의 성격에 따라, 약물 방출의 속도가 제어될 수 있다. 다른 예시적인 생물분해성 중합체는 폴리오르토에스테르 및 폴리무수물이다. 저장소 주사가능 제제는 또한, 리포솜 또는 마이크로유제에 약물을 가둠으로써 제조될 수 있다.
보충 활성 화합물이 조성물 내로 통합될 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명의 키메라 단백질은 다른 응고 인자, 또는 이의 변이체, 단편, 유사체, 또는 유도체로 조제된다. 가령, 응고 인자는 인자 V, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 X, 인자 XI, 인자 XII, 인자 XIII, 프로트롬빈, 피브리노겐, 폰빌레브란트 인자 또는 재조합 가용성 조직 인자 (rsTF) 또는 전술한 것들 중에서 한 가지의 활성화된 형태를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 지혈 작용제의 응고 인자는 또한, 항섬유소용해 약물, 예를 들면, 엡실론-아미노-카프로산, 트라넥사믹산을 포함할 수 있다.
투약 섭생은 최적 요구 반응을 제공하기 위해 조정될 수 있다. 가령, 단일 일시 주사가 투여될 수 있거나, 여러 분할된 용량이 시간의 추이에서 투여될 수 있거나, 또는 용량이 치료 상황의 긴급성에 의해 지시된 바와 같이 비례적으로 감소되거나 또는 증가될 수 있다. 투여의 용이함 및 용량의 균일성을 위해 비경구 조성물을 투약 단위 형태로 조제하는 것이 유리하다. 가령, Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., Easton, Pa. 1980)를 참조한다.
활성 화합물에 더하여, 액체 약형은 비활성 성분, 예를 들면, 물, 에틸 알코올, 에틸 탄산염, 에틸 아세트산염, 벤질 알코올, 벤질 벤조산염, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜, 디메틸포름아미드, 오일, 글리세롤, 테트라히드로푸르푸릴 알코올, 폴리에틸렌 글리콜, 그리고 소르비탄의 지방산 에스테르를 내포할 수 있다.
적절한 제약학적 담체의 무제한적 실례는 또한, E. W. Martin에 의한 Remington's Pharmaceutical Sciences에서 설명된다. 부형제의 일부 실례에는 전분, 글루코오스, 락토오스, 수크로오스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카 겔, 스테아르산나트륨, 글리세롤 모노스테아레이트, 활석, 염화나트륨, 건조된 탈지유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등이 포함된다. 조성물은 pH 완충 시약, 그리고 적심제 또는 유화제를 또한 내포할 수 있다.
경구 투여를 위해, 제약학적 조성물은 전통적인 수단에 의해 제조된 정제 또는 캡슐의 형태를 취할 수 있다. 조성물은 또한, 액체, 예를 들면, 시럽 또는 현탁액으로서 제조될 수 있다. 액체는 현탁제 (가령, 소르비톨 시럽, 셀룰로오스 유도체 또는 수소첨가된 식용 지방), 유화제 (레시틴 또는 아카시아), 비수성 운반제 (가령, 아몬드유, 유성 에스테르, 에틸 알코올, 또는 분획된 식물성 오일), 그리고 보존제 (가령, 메틸 또는 프로필-p-히드록시벤조에이트 또는 소르브산)을 포함할 수 있다. 제조물은 풍미제, 착색제 및 감미제를 또한 포함할 수 있다. 대안으로, 조성물은 물 또는 다른 적합한 운반제로 구성을 위한 건성 산물로서 제공될 수 있다.
협측 투여를 위해, 조성물은 전통적인 프로토콜에 따라, 정제 또는 로젠지의 형태를 취할 수 있다.
흡입에 의한 투여를 위해, 본 발명에 따른 이용을 위한 화합물은 부형제를 포함하거나 또는 포함하지 않는 분무된 에어로졸의 형태에서 또는 임의선택적으로 추진제, 예를 들면, 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로메탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 가스로, 가압된 팩 또는 연무기로부터 에어로졸 스프레이의 형태에서 편의하게 전달된다. 가압된 에어로졸의 경우에, 복용 단위는 계량된 양을 전달하는 밸브를 제공함으로써 결정될 수 있다. 흡입기 또는 취입기에서 이용을 위한 예로서, 젤라틴의 캡슐 및 카트리지는 화합물의 분말 믹스 및 적합한 분말 기제, 예를 들면, 락토오스 또는 전분을 내포하도록 조제될 수 있다.
제약학적 조성물은 또한, 예로서 전통적인 좌약 기제, 예를 들면, 코코아 버터 또는 다른 글리세리드를 내포하는 좌약 또는 정체 관장으로서 직장 투여용으로 조제될 수 있다.
한 구체예에서, 제약학적 조성물은 키메라 단백질, 키메라 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포, 그리고 제약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 키메라 단백질에서 FVIII 단백질은 야생형 FVIII 단백질 또는 VWF 단편이 없는 상응하는 FVIII 단백질과 비교하여 연장된 반감기를 갖는다. 한 구체예에서, 여기서 키메라 단백질의 반감기는 야생형 FVIII보다 최소한 약 1.5 배, 최소한 약 2 배, 최소한 약 2.5 배, 최소한 약 3 배, 최소한 약 4 배, 최소한 약 5 배, 최소한 약 6 배, 최소한 약 7 배, 최소한 약 8 배, 최소한 약 9 배, 최소한 약 10 배, 최소한 약 11 배, 또는 최소한 약 12 배 길게 연장된다. 다른 구체예에서, 인자 VIII의 반감기는 최소한 약 17 시간, 최소한 약 18 시간, 최소한 약 19 시간, 최소한 약 20 시간, 최소한 약 21 시간, 최소한 약 22 시간, 최소한 약 23 시간, 최소한 약 24 시간, 최소한 약 25 시간, 최소한 약 26 시간, 최소한 약 27 시간, 최소한 약 28 시간, 최소한 약 29 시간, 최소한 약 30 시간, 최소한 약 31 시간, 최소한 약 32 시간, 최소한 약 33 시간, 최소한 약 34 시간, 최소한 약 35 시간, 최소한 약 36 시간, 최소한 약 48 시간, 최소한 약 60 시간, 최소한 약 72 시간, 최소한 약 84 시간, 최소한 약 96 시간, 또는 최소한 약 108 시간이다.
일부 구체예에서, 조성물은 국소 투여, 안구내 투여, 비경구 투여, 척수강내 투여, 경막하 투여 및 경구 투여로 구성된 군에서 선택되는 루트에 의해 투여된다. 비경구 투여는 정맥내 또는 피하 투여일 수 있다.
다른 구체예에서, 조성물은 치료가 필요한 개체에서 출혈 질환 또는 장애를 치료하는데 이용된다. 출혈 질환 또는 장애는 출혈 응고 장애, 혈관절증, 근육 출혈, 구강내 출혈, 출혈, 근육 내로 출혈, 경구 출혈, 외상, 두부 외상, 위장관 출혈, 두개내 출혈, 복강내 출혈, 흉곽내 출혈, 뼈 골절, 중추신경계 출혈, 인두후 공간에서 출혈, 후복막 공간에서 출혈, 장요근 덮개에서 출혈 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군에서 선택된다. 또 다른 구체예에서, 개체는 수술을 받기로 예정된다. 또 다른 구체예에서, 치료는 예방적 또는 주문형이다.
V. 유전자 요법
본 발명의 키메라 단백질은 출혈 응고 장애, 혈관절증, 근육 출혈, 구강내 출혈, 출혈, 근육 내로 출혈, 경구 출혈, 외상, 두부 외상, 위장관 출혈, 두개내 출혈, 복강내 출혈, 흉곽내 출혈, 뼈 골절, 중추신경계 출혈, 인두후 공간에서 출혈, 후복막 공간에서 출혈, 그리고 장요근 덮개에서 출혈로 구성된 군에서 선택되는 출혈 질환 또는 장애의 치료에 유전자 요법 접근법을 이용하여, 포유동물, 예를 들면, 인간 환자에서 생체내에서 생산될 수 있고 치료적으로 유익할 것이다. 한 구체예에서, 출혈 질환 또는 장애는 혈우병이다. 다른 구체예에서, 출혈 질환 또는 장애는 A형 혈우병이다. 이것은 적합한 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결된 적합한 키메라 단백질-인코딩 핵산의 투여를 수반한다. 일정한 구체예에서, 이들 서열은 바이러스 벡터 내로 통합된다. 이런 유전자 요법을 위한 적합한 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 바쿨로바이러스 벡터, 엡스타인 바르 바이러스 벡터, 파포바바이러스 벡터, 우두 바이러스 벡터, 단순 포진 바이러스 벡터, 그리고 아데노 연관된 바이러스 (AAV) 벡터를 포함한다. 바이러스 벡터는 복제-결함성 바이러스 벡터일 수 있다. 다른 구체예에서, 아데노바이러스 벡터는 이의 E1 유전자 또는 E3 유전자에서 결실을 갖는다. 아데노바이러스 벡터가 이용될 때, 포유동물은 선별가능 마커 유전자를 인코딩하는 핵산에 노출될 수 없다. 다른 구체예에서, 서열은 당업자에게 공지된 비바이러스 벡터 내로 통합된다.
VI. 키메라 단백질을 이용하는 방법
본 발명은 FVIII 단백질에 내인성 VWF 결합을 예방하거나 또는 저해하기 위해 본원에서 설명된 키메라 단백질을 이용하는 방법에 관계한다. 본 발명은 XTEN 및 Ig 불변 영역 또는 이의 부분에 연결된 FVIII 단백질을 갖는 키메라 단백질을 이용하는 방법에 또한 관계한다.
본 발명의 한 가지 양상은 내인성 VWF로부터 FVIII 상에서 VWF 결합 부위를 차단하거나 또는 차폐하고, 그리고 이와 동시에, 반감기 증량제일 수 있는 Ig 불변 영역 또는 이의 부분과 합동으로 XTEN 서열을 이용하여 키메라 단백질의 반감기를 연장함으로써 내인성 VWF와의 FVIII 상호작용을 예방하거나 또는 저해하는 것에 관계한다. 한 구체예에서, 본 발명은 야생형 FVIII보다 긴 반감기를 갖는 FVIII 단백질을 작제하는 방법에 관계한다. 상기 방법에서 유용한 키메라 단백질은 본원에서 설명된 임의의 한 가지 또는 그 이상의 키메라 단백질을 포함한다.
본 발명의 다른 양상은 야생형 FVIII보다 긴 반감기를 갖는 FVIII 단백질을 포함하는 키메라 단백질을 치료가 필요한 개체에 투여하는 방법을 포함하고, 여기서 상기 방법은 본원에서 설명된 키메라 단백질을 개체에 투여하는 것을 포함한다.
한 구체예에서, 본 발명은 FVIII 단백질과의 내인성 VWF 상호작용을 예방하거나 또는 저해하는, FVIII 단백질 및 VWF 단백질을 포함하는 키메라 단백질의 반감기를 향상시키기 위해 XTEN 서열 및 Ig 불변 영역 또는 이의 부분을 이용하는 방법에 관계한다. XTEN 서열에 연결되고 (가령, FVIII(X)), 그리고 이후, XTEN 및 Ig 불변 영역 또는 이의 부분에 융합된 VWF 단백질에 결합되거나 또는 연관된 FVIII 단백질은 VWF의 소실 경로로부터 차폐되거나 또는 보호되고, 따라서 VWF 단백질에 결합되지 않은 FVIII 단백질과 비교하여 소실을 감소시켰다. 보호된 FVIII 단백질은 따라서, XTEN 서열 및 VWF 단백질에 결합되거나 또는 연관되지 않은 FVIII 단백질과 비교하여 반감기의 최대 연장을 갖는다. 일정한 구체예에서, VWF 단백질과 연관되거나 또는 이것에 의해 보호되고 XTEN 서열에 연결된 FVIII 단백질은 VWF 간극 수용체에 의해 소실되지 않는다. 다른 구체예에서, VWF 단백질과 연관되거나 또는 이것에 의해 보호되고 XTEN 서열에 연결된 FVIII 단백질은 VWF 단백질과 연관되거나 또는 이것에 의해 보호되지 않고 XTEN 서열에 연결되지 않은 FVIII 단백질보다 더욱 느리게 시스템으로부터 소실된다.
한 양상에서, XTEN 서열에 연결된 FVIII 단백질을 포함하는 키메라 단백질 또는 XTEN에 연결된 VWF 단백질에 결합되거나 또는 이것과 연관된 FVIII 단백질은 순환으로부터 감소된 소실을 갖는데, 그 이유는 상기 VWF 단백질이 VWF 간극 수용체 결합 부위를 내포하지 않기 때문이다. VWF 단백질은 VWF 소실 경로를 통해 시스템으로부터, VWF 단백질에 결합되거나 또는 이것과 연관된 FVIII의 소실을 예방하거나 또는 저해한다. 본 발명에 유용한 VWF 단백질은 또한, 내인성 VWF에 의해 제공되는 최소한 하나 또는 그 이상의 VWF-유사 FVIII 보호 성질을 제공할 수 있다. 일정한 구체예에서, VWF 단백질 또는 XTEN 서열은 또한, 하나 또는 그 이상의 FVIII 간극 수용체 결합 부위를 차폐하고, 따라서 이의 자체 소실 경로에 의한 FVIII의 소실을 예방할 수 있다.
일부 구체예에서, VWF 단백질 또는 XTEN 서열에 의한 내인성 VWF에 FVIII 단백질 결합의 예방 또는 저해는 시험관내 또는 생체내일 수 있다.
본원에서 설명된 키메라 단백질을 치료가 필요한 개체에 투여하는 것을 포함하는, 키메라 단백질의 반감기를 증가시키는 방법 역시 제공된다. 전장 VWF에 결합되거나 또는 이것과 연관된 비활성화된 FVIII의 반감기는 혈장에서 약 12 내지 14 시간이다. 순환 중인 VWF가 거의 없는 VWD 유형 3에서, FVIII의 반감기는 단지 약 6 시간이고, FVIII의 감소된 농도로 인해 이런 환자에서 경등도 내지 중등도 A형 혈우병의 증상을 야기한다. 본 발명의 VWF 단편 또는 XTEN 서열에 연결되거나 또는 연관된 키메라 단백질의 반감기는 전장 VWF에 결합되거나 또는 이것과 연관된 비활성화된 FVIII의 반감기보다 최소한 약 1.5 배, 1.6 배, 1.7 배, 1.8 배, 1.9 배, 2.0 배, 2.1 배, 2.2 배, 2.3 배, 2.4 배, 2.6 배, 2.7. 배, 2.8 배, 2.9 배, 3.0 배, 3.1 배, 3.2 배, 3.3 배, 3.4 배, 3.5 배, 3.6 배, 3.7 배, 3.8 배, 3.9 배, 또는 4.0 배 높게 증가할 수 있다.
한 구체예에서, FVIII 단백질 및 첫 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분을 포함하는 첫 번째 폴리펩티드, 그리고 VWF 단백질, 288개보다 적은 아미노산을 갖는 XTEN 및 Ig 불변 영역 또는 이의 부분을 포함하는 두 번째 폴리펩티드를 포함하는 키메라 단백질은 동일한 첫 번째 폴리펩티드 및 XTEN 서열 또는 야생형 FVIII이 없는 두 번째 폴리펩티드를 포함하는 상응하는 키메라 단백질보다 최소한 약 2 배, 2.5 배, 3.0 배, 3.5 배, 4.0 배, 4.5 배, 5.0 배, 5.5 배, 6.0 배, 7 배, 8 배, 9 배, 또는 10 배 높은 반감기를 전시한다. 다른 구체예에서, FVIII 단백질 및 첫 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분을 포함하는 첫 번째 폴리펩티드, 그리고 VWF 단백질, 288개보다 적은 아미노산을 갖는 XTEN 및 Ig 불변 영역 또는 이의 부분을 포함하는 두 번째 폴리펩티드를 포함하는 키메라 단백질은 동일한 첫 번째 폴리펩티드 및 XTEN 서열 또는 야생형 FVIII이 없는 두 번째 폴리펩티드를 포함하는 상응하는 키메라 단백질보다 약 2 내지 약 5 배, 약 3 내지 약 10 배, 약 5 내지 약 15 배, 약 10 내지 약 20 배, 약 15 내지 약 25 배, 약 20 내지 약 30 배, 약 25 내지 약 35 배, 약 30 내지 약 40 배, 약 35 내지 약 45 배 높은 반감기를 전시한다. 특정한 구체예에서, 본 발명의 키메라 단백질의 반감기는 FVIII 및 VWF 이중 녹아웃 생쥐에서 야생형 FVIII의 반감기보다 최소한 약 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 또는 40 배 높게 증가한다.
일정한 구체예에서, 키메라 단백질은 생쥐에서 약 40 시간의 반감기를 전시한다.
일부 구체예에서, 키메라 단백질의 반감기는 내인성 VWF와 연관된 FVIII의 반감기보다 길다. 다른 구체예에서, 키메라 단백질의 반감기는 야생형 FVIII 또는 내인성 VWF와 연관된 FVIII 단백질의 반감기의 최소한 약 1.5 배, 2 배, 2.5 배, 3.5 배, 3.6 배, 3.7 배, 3.8 배, 3.9 배, 4.0 배, 4.5 배, 또는 5.0 배이다.
일부 구체예에서, 본 발명의 결과로서 키메라 단백질의 반감기는 VWF 단백질이 없는 FVIII 단백질 또는 야생형 FVIII과 비교하여 연장된다. 본 발명의 키메라 단백질의 반감기는 VWF 단백질이 없는 키메라 단백질 또는 야생형 FVIII의 반감기보다 최소한 약 1.5 배, 최소한 약 2 배, 최소한 약 2.5 배, 최소한 약 3 배, 최소한 약 4 배, 최소한 약 5 배, 최소한 약 6 배, 최소한 약 7 배, 최소한 약 8 배, 최소한 약 9 배, 최소한 약 10 배, 최소한 약 11 배, 또는 최소한 약 12 배 길다. 한 구체예에서, FVIII의 반감기는 야생형 FVIII의 반감기보다 약 1.5-배 내지 약 20-배, 약 1.5 배 내지 약 15 배, 또는 약 1.5 배 내지 약 10 배 길다. 다른 구체예에서, FVIII의 반감기는 야생형 FVIII 또는 VWF 단백질이 없는 FVIII 단백질과 비교하여 약 2-배 내지 약 10-배, 약 2-배 내지 약 9-배, 약 2-배 내지 약 8-배, 약 2-배 내지 약 7-배, 약 2-배 내지 약 6-배, 약 2-배 내지 약 5-배, 약 2-배 내지 약 4-배, 약 2-배 내지 약 3-배, 약 2.5-배 내지 약 10-배, 약 2.5-배 내지 약 9-배, 약 2.5-배 내지 약 8-배, 약 2.5-배 내지 약 7-배, 약 2.5-배 내지 약 6-배, 약 2.5-배 내지 약 5-배, 약 2.5-배 내지 약 4-배, 약 2.5-배 내지 약 3-배, 약 3-배 내지 약 10-배, 약 3-배 내지 약 9-배, 약 3-배 내지 약 8-배, 약 3-배 내지 약 7-배, 약 3-배 내지 약 6-배, 약 3-배 내지 약 5-배, 약 3-배 내지 약 4-배, 약 4-배 내지 약 6 배, 약 5-배 내지 약 7-배, 또는 약 6-배 내지 약 8 배 연장된다. 다른 구체예에서, 본 발명의 키메라 단백질의 반감기는 최소한 약 17 시간, 최소한 약 18 시간, 최소한 약 19 시간, 최소한 약 20 시간, 최소한 약 21 시간, 최소한 약 22 시간, 최소한 약 23 시간, 최소한 약 24 시간, 최소한 약 25 시간, 최소한 약 26 시간, 최소한 약 27 시간, 최소한 약 28 시간, 최소한 약 29 시간, 최소한 약 30 시간, 최소한 약 31 시간, 최소한 약 32 시간, 최소한 약 33 시간, 최소한 약 34 시간, 최소한 약 35 시간, 최소한 약 36 시간, 최소한 약 40 시간, 최소한 약 48 시간, 최소한 약 60 시간, 최소한 약 72 시간, 최소한 약 84 시간, 최소한 약 96 시간, 또는 최소한 약 108 시간이다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 키메라 단백질의 반감기는 약 15 시간 내지 약 2 주, 약 16 시간 내지 약 1 주, 약 17 시간 내지 약 1 주, 약 18 시간 내지 약 1 주, 약 19 시간 내지 약 1 주, 약 20 시간 내지 약 1 주, 약 21 시간 내지 약 1 주, 약 22 시간 내지 약 1 주, 약 23 시간 내지 약 1 주, 약 24 시간 내지 약 1 주, 약 36 시간 내지 약 1 주, 약 48 시간 내지 약 1 주, 약 60 시간 내지 약 1 주, 약 24 시간 내지 약 6 일, 약 24 시간 내지 약 5 일, 약 24 시간 내지 약 4 일, 약 24 시간 내지 약 3 일, 또는 약 24 시간 내지 약 2 일이다.
일부 구체예에서, 개체마다 본 발명의 키메라 단백질의 평균 반감기는 약 15 시간, 약 16 시간, 약 17 시간, 약 18 시간, 약 19 시간, 약 20 시간, 약 21 시간, 약 22 시간, 약 23 시간, 약 24 시간 (1 일), 약 25 시간, 약 26 시간, 약 27 시간, 약 28 시간, 약 29 시간, 약 30 시간, 약 31 시간, 약 32 시간, 약 33 시간, 약 34 시간, 약 35 시간, 약 36 시간, 약 40 시간, 약 44 시간, 약 48 시간 (2 일), 약 54 시간, 약 60 시간, 약 72 시간 (3 일), 약 84 시간, 약 96 시간 (4 일), 약 108 시간, 약 120 시간 (5 일), 약 6 일, 약 7 일 (1 주), 약 8 일, 약 9 일, 약 10 일, 약 11 일, 약 12 일, 약 13 일, 또는 약 14 일이다.
이에 더하여, 본 발명은 키메라 단백질의 효과량을 투여하는 것을 포함하는, 출혈 질환 또는 장애를 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다. 한 구체예에서, 출혈 질환 또는 장애는 출혈 응고 장애, 혈관절증, 근육 출혈, 구강내 출혈, 출혈, 근육 내로 출혈, 경구 출혈, 외상, 두부 외상, 위장관 출혈, 두개내 출혈, 복강내 출혈, 흉곽내 출혈, 뼈 골절, 중추신경계 출혈, 인두후 공간에서 출혈, 후복막 공간에서 출혈, 그리고 장요근 덮개에서 출혈로 구성된 군에서 선택된다. 특정한 구체예에서, 출혈 질환 또는 장애는 A형 혈우병이다.
본 발명에 의해 제조된 내인성 VWF와 FVIII 단백질의 상호작용을 예방하거나 또는 저해하는, 본원에서 설명된 VWF 단백질과 합동으로 XTEN 서열 및 Ig 불변 영역 또는 이의 부분을 포함하는 키메라 단백질은 지혈 장애를 앓는 개체를 치료하는 방법 및 전신 지혈 작용제가 필요한 개체를 치료하는 방법을 포함하지만 이들에 한정되지 않는, 당업자에 의해 인정되는 많은 용도를 갖는다. 한 구체예에서, 본 발명은 키메라 단백질의 치료 효과량을 투여하는 것을 포함하는, 지혈 장애를 앓는 개체를 치료하는 방법에 관계한다.
키메라 단백질에서 FVIII 단백질 부분은 음성으로 하전된 인지질 표면 상에서 인자 IX에 대한 보조인자로서 역할하고, 따라서 Xase 복합체를 형성함으로써 지혈 장애를 치료하거나 또는 예방한다. 인지질 표면에 활성화된 응고 인자의 결합은 이러한 과정을 맥관 피해의 부위에 국지화한다. 인지질 표면 상에서, 인자 VIIIa는 인자 IXa에 의한 인자 X 활성화의 최대 속도를 대략 200,000-배 증가시켜, 트롬빈 산출의 큰 이차 폭발을 야기한다.
본 발명의 키메라 단백질은 임의의 지혈 장애를 치료하는데 이용될 수 있다. 본 발명의 키메라 단백질을 투여함으로써 치료될 수 있는 지혈 장애는 A형 혈우병뿐만 아니라 인자 VIII에 관련된 결핍 또는 구조적 비정상을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 한 구체예에서, 지혈 장애는 A형 혈우병이다.
본 발명의 키메라 단백질은 지혈 장애를 앓는 개체를 치료하기 위해 예방적으로 이용될 수 있다. 본 발명의 키메라 단백질은 지혈 장애를 앓는 개체에서 급성 출혈 에피소드를 치료하는데 이용될 수 있다. 다른 구체예에서, 지혈 장애는 결함성 응고 인자, 예를 들면, 폰빌레브란트 인자의 결과일 수 있다. 한 구체예에서, 지혈 장애는 유전된 장애이다. 다른 구체예에서, 지혈 장애는 후천성 장애이다. 후천성 장애는 근원적인 속발성 질환 또는 장애로부터 발생할 수 있다. 관련 없는 장애는 실례로서, 하지만 제한 없이, 암, 자가면역 질환, 또는 임신일 수 있다. 후천성 장애는 노령으로부터 또는 근원적인 속발성 장애를 치료하기 위한 약제 (가령, 암 화학요법)로부터 발생할 수 있다.
본 발명은 또한, 선천성 지혈 장애를 앓지 않지만, 예로서 항-FVIII 항체의 발달 또는 수술로 인해 지혈 장애의 획득을 유발하는 속발성 질환 또는 장애를 앓는 개체를 치료하는 방법에 관계한다. 본 발명은 따라서, 본 발명 방법에 의해 제조된 키메라 단백질의 치료 효과량을 투여하는 것을 포함하는, 전신 지혈 작용제가 필요한 개체를 치료하는 방법에 관계한다.
본 발명은 또한, FVIII의 면역원성을 감소시키거나 또는 FVIII에 대항하여 더욱 적은 면역원성을 유도하는 방법에 관련되고, 이들 방법은 본원에서 설명된 키메라 단백질, 또는 이들을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 효과량을 투여하는 것을 포함한다.
한 구체예에서, 전신 지혈 작용제가 필요한 개체는 수술을 받고 있거나, 또는 받을 예정이다. 본 발명의 키메라 단백질은 예방적 섭생으로서 수술에 앞서, 수술 동안 또는 수술 후 투여될 수 있다. 본 발명의 키메라 단백질은 급성 출혈 에피소드를 제어하기 위해, 수술에 앞서, 수술 동안 또는 수술 후 투여될 수 있다.
본 발명의 키메라 단백질은 지혈 장애를 앓지 않는, 급성 출혈 에피소드를 갖는 개체를 치료하는데 이용될 수 있다. 급성 출혈 에피소드는 심각한 외상, 예를 들면, 수술, 자동차 사고, 상처, 총격 열상, 또는 통제되지 않은 출혈을 유발하는 임의의 다른 외상성 이벤트로부터 발생할 수 있다. 출혈 에피소드의 무제한적 실례는 출혈 응고 장애, 혈관절증, 근육 출혈, 구강내 출혈, 출혈, 근육 내로 출혈, 경구 출혈, 외상, 두부 외상, 위장관 출혈, 두개내 출혈, 복강내 출혈, 흉곽내 출혈, 뼈 골절, 중추신경계 출혈, 인두후 공간에서 출혈, 후복막 공간에서 출혈, 장요근 덮개에서 출혈 및 이들의 임의의 조합을 포함한다.
예방적 적용에서, 본 발명의 키메라 단백질을 내포하는 하나 또는 그 이상의 조성물 또는 이들의 칵테일은 환자의 내성을 증강하거나 또는 질환 또는 장애와 연관된 증상을 감소시키기 위해 아직 질환 상태에 있지 않은 환자에 투여된다. 이런 양은 "예방 효과 용량"인 것으로 규정된다. 치료적 적용에서, 상대적으로 짧은 간격에서 상대적으로 높은 용량 (가령, 투약마다 약 1 내지 400 mg/kg의 폴리펩티드, 방사면역 접합체의 경우에 5 내지 25 mg의 용량 및 세포독소-약물 변형된 폴리펩티드의 경우에 더욱 높은 용량이 더욱 통상적으로 이용됨)이 질환의 진행이 감소되거나 또는 종결될 때까지, 그리고 환자가 질환의 증상의 부분적인 또는 완전한 개선을 보여줄 때까지 때때로 필요하다. 그 후에, 환자는 예방적 섭생으로 투여될 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 키메라 단백질 또는 조성물은 주문형 치료에 이용되는데, 이것은 출혈 에피소드, 혈관절증, 근육 출혈, 구강내 출혈, 출혈, 근육 내로 출혈, 경구 출혈, 외상, 두부 외상 (머리 외상), 위장관 출혈, 두개내 출혈, 복강내 출혈, 흉곽내 출혈, 뼈 골절, 중추신경계 출혈, 인두후 공간에서 출혈, 후복막 공간에서 출혈, 또는 장요근 덮개에서 출혈에 대한 치료를 포함한다. 개체는 외과적 예방, 수술전후 관리, 또는 수술에 대한 치료가 필요할 수 있다. 이런 수술은 예로서, 소수술, 대수술, 치아 추출, 편도절제술, 서혜부 탈장절개술, 윤활막절제술, 전체 무릎 대체, 개두술, 골접합술, 외상 수술, 두개내 수술, 복강내 수술, 흉곽내 수술, 또는 관절 대체 수술을 포함한다.
한 구체예에서, 본 발명의 키메라 단백질은 정맥내, 피하, 근육내, 또는 임의의 점막 표면을 통해, 예를 들면, 경구, 설하, 협측, 코, 직장, 질 또는 폐 루트를 통해 투여된다. 본 발명의 VWF 단편 및 FVIII 단백질을 포함하는 키메라 단백질은 출혈의 부위에 키메라 단백질의 느린 방출을 허용하는 바이오폴리머 고체 지지체 내에 이식되거나 또는 이것에 연결될 수 있고, 또는 붕대/드레싱 내로 이식될 수 있다. 키메라 단백질의 용량은 개체 및 이용된 특정 투여 루트에 따라 변할 것이다. 용량은 0.1 내지 100,000 μg/kg 체중 범위에서 변할 수 있다. 한 구체예에서, 용량 범위는 0.1-1,000 μg/kg이다. 다른 구체예에서, 용량 범위는 0.1-500 μg/kg이다. 단백질은 연속적으로 또는 특정한 시간 간격에서 투여될 수 있다. 시험관내 검정이 투여를 위한 최적 용량 범위 및/또는 일정을 결정하는데 이용될 수 있다. 응고 인자 활성을 계측하는 시험관내 검정, 예를 들면, STA-CLOT VIIa-rTF 응고 검정 또는 ROTEM 응고 검정은 당분야에서 공지된다. 추가적으로, 유효 용량은 동물 모형, 예를 들면, 혈우병 개로부터 획득된 용량 반응 곡선으로부터 외삽될 수 있다 (Mount et al. 2002, Blood 99(8):2670).
지금까지 상세하게 설명되었기 때문에, 본 발명은 다음 실시예를 참조하면 더욱 명확하게 이해될 것인데, 이들 실시예는 단지 예시의 목적으로만 본원에 포함되고 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 본원에서 언급된 모든 특허, 간행물, 그리고 논문은 명시적으로 및 특이적으로 본원에 참조로서 편입된다.
실시예
실시예 전역에서, 달리 명시되지 않으면 다음의 재료와 방법이 이용되었다.
재료와 방법
일반적으로, 본 발명의 실시는 달리 지시되지 않으면, 화학, 생물물리학, 분자생물학의 전통적인 기술, 재조합 DNA 기술, 면역학 (특히, 가령, 항체 기술), 그리고 전기이동에서 표준 기술을 이용한다. 가령, Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Antibody Engineering Protocols (Methods in Molecular Biology), 510, Paul, S., Humana Pr (1996); Antibody Engineering: A Practical Approach (Practical Approach Series, 169), McCafferty, Ed., Irl Pr (1996); Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow et al., CS.H.L. Press, Pub. (1999); 그리고 Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons (1992)를 참조한다.
실시예 1: FVIII-XTEN-Fc/D'D3-XTEN-Fc 이형이합체
본 발명은 IgG의 Fc 도메인을 통해 폰빌레브란트 인자 (VWF) 단백질의 D'D3 도메인에 연계되는 키메라 FVIII 분자를 산출하는 것에 관계한다. 부착된 D'D3 도메인은 FVIII과 내인성 VWF 다합체의 상호작용을 예방한다. 이러한 분자는 키메라 단백질의 약물동력학을 향상시키기 위해 다른 반감기 연장 기술을 통합하는 플랫폼으로서 역할을 한다. XTEN 서열은 FVIII/VWF 이형이합체의 반감기를 증가시키기 위해, FVIII B-도메인 내로 및 D'D3 및 Fc 영역 중간에 통합되었다.
D'D3 및 Fc 중간에 트롬빈 개열 부위는 트롬빈에 의한 FVIII 분자의 활성화 시에 D'D3 도메인의 방출을 허용한다.
실시예 2: FVIII-XTEN-Fc/D'D3-Fc 이형이합체의 플라스미드 작제
VWF050- VWF031에서 IHH 삼중 돌연변이의 클로닝
Fc 내에 IHH 삼중 돌연변이는 FcRn와의 상호작용을 예방하고, 따라서 FcRn 경로에 의한 Fc 내포 분자의 재활용이 없다. Fc 내에 3개의 돌연변이는 I253A, H310A, H435A이다.
VWF050은 RsRII 및 Not 1 제한 부위 사이에서, VWF031 플라스미드의 Fc 영역을 IHH 삼중 돌연변이를 내포하는 Fc 단편으로 스와핑함으로써 산출되었다.
VWF057의 클로닝 - 144 AE XTEN +35aa 트롬빈 개열가능 링커를 갖는 VWF-Fc를 클로닝.
올리고
ESC 155- VWF034-후방에서 144 AE XTEN에 대한 올리고
CCCCGCCACCGGATCCCCCGCCACCGGATCCCCCGCCACCGGATCCCCCGCCACCGGAACCTCCACCGCCGCTCGAGGCACCTTCTTCAGTGCTGGTGGGCGAGCCCGCTGGTGACCCTTCCTC
ESC 156- VWF034-후방에서 144 AE XTEN- GS 링커에 대한 올리고
GGGGAAGAGGAAGACTGACGGTCCGCCCAGGAGTTCTGGAGCTGGGCACGGTGGGCATGTGTGAGTTTTGTCGCCTCCGCTGCCCCGGGGGACCAGGGATCCCCCGCCACCGGATCCCCCGCCACCGGATCCCCCGCCACCGGATCCCCCGC
ESC 157- VWF031-전방에서 144 AE XTEN에 대한 올리고
GTGAAGCCTGCCAGGAGCCGATATCGGGCGCGCCAACATCAGAGAGCGCCACCCCTGAAAGTGGTCCCGGGAGCGAGCCAGC
PCR은 트롬빈 개열 부위를 갖는 144 AE-XTEN + 35 aa GS 링커를 획득하기 위해 2회 행위되었다.
첫 번째 PCR 반응은 주형으로서 144- AE XTEN 코딩 DNA 및 ESC 157/ESC155 프라이머 쌍을 이용하여 행위되었다. 이러한 반응으로부터 획득된 약 550 bp 길이 PCR 산물은 두 번째 PCR 반응을 위한 주형으로서 이용되었고, 그리고 ESC 157/156 프라이머 쌍을 이용하여 증폭되었다. 이러한 반응은 ~ 700 bp 길이 산물을 제공하였다. 이러한 700 bp PCR 산물 및 VWF034 플라스미드는 이후, EcoRV-HF 및 RsRII로 소화되었다. 소화된 것으로부터 플라스미드 중추.
VWF034는 이후, 700bp PCR 산물을 결찰하는데 이용되었다.
VWF058- VWF034에서 IHH 삼중 돌연변이의 클로닝
Fc 내에 IHH 삼중 돌연변이는 FcRn과의 상호작용을 예방하고, 따라서 FcRn 경로에 의한 Fc 내포 분자의 재활용이 없다. Fc 내에 3개의 돌연변이는 I253A, H310A, H435A이다.
VWF058은 RsRII 및 Not 1 제한 부위 사이에서, VWF034 플라스미드의 Fc 영역을 IHH 삼중 돌연변이를 내포하는 Fc 단편으로 스와핑함으로써 산출되었다.
FVIII-263- IHH 삼중 돌연변이를 갖는 FVIII 205의 클로닝
Fc 내에 IHH 삼중 돌연변이는 FcRn과의 상호작용을 예방하고, 따라서 FcRn 경로에 의한 Fc 내포 분자의 재활용이 없다. Fc 내에 3개의 돌연변이는 I253A, H310A, H435A이다.
FVIII-263은 RsRII 및 Not 1 제한 부위 사이에서, FVIII 205 플라스미드의 Fc 영역을 IHH 삼중 돌연변이를 내포하는 Fc 단편으로 스와핑함으로써 산출되었다.
FVIII-282- B-도메인 내에 144 AE XTEN을 갖는 FVIII-Fc의 클로닝
ESC 158-B-도메인-전방 내에 144 AE XTEN에 대한 올리고 AAGAAGCTTCTCTCAAAACGGCGCGCCAACATCAGAGAGCGCCACCCCTGAAAGTGGTCCCGGGAGCGAGCCAGCCACATCTGGGTCGGAAACGCCAGGC
ESC 159-B-도메인-후방 내에 144 AE XTEN에 대한 올리고 GGTATCATCATAATCGATTTCCTCTTGATCTGACTGAAGAGTAGTACGAGTTATTTCAGCTTGATGGCGTTTCAAGACTGGTGGGCTCGAGGCACCTTCTTCAGTGCTGGTGGGCGAGCCCGCTGGTGACCCTTCCTCAGTGGACGTAGG
첫 번째 PCR 반응은 주형으로서 144- AE XTEN 코딩 DNA 및 ESC 158/ESC159 프라이머 쌍을 이용하여 행위되었다. 이러한 반응으로부터 획득된 약 550 bp 길이 PCR 산물 및 FVIII 169 플라스미드는 이후, AscI 및 Cla1로 소화되었다. 소화된 FVIII 169로부터 플라스미드 중추는 이후, FVIII 282를 획득하기 위해 550 bp PCR 산물을 결찰하는데 이용되었다.
FVIII-283- IHH 삼중 돌연변이를 갖는 FVIII 169의 클로닝
Fc 내에 IHH 삼중 돌연변이는 FcRn과의 상호작용을 예방하고, 따라서 FcRn 경로에 의한 Fc 내포 분자의 재활용이 없다. Fc 내에 3개의 돌연변이는 I253A, H310A, H435A이다.
FVIII-283은 RsRII 및 Not 1 제한 부위 사이에서, FVIII 169 플라스미드의 Fc 영역을 IHH 삼중 돌연변이를 내포하는 Fc 단편으로 스와핑함으로써 산출되었다.
실시예 3: HEK293 세포에서 FVIII-XTEN-Fc/D'D3-XTEN-Fc의 생산
도면 2. FVIII-XTEN-Fc/D'D3-XTEN-Fc 구조체의 발현을 보여주는 계통도. 3개 플라스미드 동시형질감염은 폴리에틸렌이민 (PEI)을 이용하여 HEK293 세포에서 행위되었다. 첫 번째 플라스미드는 FVIII-XTEN-Fc의 발현을 유도하고, 두 번째 플라스미드는 D1D2D'D3-XTEN-Fc를 발현하고, 그리고 세 번째 플라스미드는 PACE/퓨린을 발현하는데, 이것은 프로펩티드, 다시 말하면, D1D2 도메인을 D1D2D'D3-XTEN-Fc로부터 효소적으로 제거하는데 필요하다. 이러한 3개 플라스미드 발현 시스템의 산물은 FVIII-XTEN-Fc/D'D3-XTEN-Fc 이형이합체, D'D3-XTEN-Fc 동종이합체 및 미량의 FVIII-XTEN-Fc 반접합성 루킹 종류를 포함한다.
실시예 4: FVIII-XTEN-Fc/D'D3-XTEN-Fc 이형이합체의 정제
FVIII-XTEN-Fc/D'D3-XTEN-Fc 이형이합체를 정제하기 위해, 접선 유동 여과 (TFF) 단계가 먼저, 조건부 배지를 10 배 농축하는데 이용되었다. 여과액에서 산물은 이후, 친화성 크로마토그래피, 그 이후에 탈염 칼럼을 이용하여 더욱 정제되었다. 분자의 순도는 HPLC-SEC에 의해 허용되었고 웨스턴 블롯팅에 의해 더욱 확증되었다. 상기 분자의 비활성도는 FVIII 활성 검정 (실례 5) 및 OD280 계측에 의해 계측될 때, B-도메인 결실된 FVIII에 필적하였다.
실시예 5: FVIII-XTEN-Fc/D'D3-XTEN-Fc 이형이합체의 비활성도
FVIII-XTEN-Fc/D'D3-XTEN-Fc 이형이합체의 활성은 FVIII 발색 검정 및 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간 (aPTT) 검정에 의해 계측되었다. SQ BDD-FVIII, rFVIII169/VWF034 및 rFVIII169/VWF057의 특정한 발색 활성 및 특정한 aPTT 활성은 표 16에서 열거되었다. SQ BDD-FVIII와 비교하여, 우리는 rFVIII169/VWF034 및 rFVIII169/VWF057에 대한 필적하는 특정한 발색 활성 및 특정한 aPTT 활성에서 60% 감소를 관찰하였다.
FVIII 발색 검정
FVIII 활성은 DiaPharma로부터 COATEST SP FVIII 키트 (제품 #: K824086)를 이용하여 계측되었고, 그리고 모든 배양은 진탕하면서 37℃ 평판 가열기에서 수행되었다.
혈액 응고 인자 VIII에 대한 WHO 8차 국제 표준:C, 농축물, 코드 07/350이 검정 표준으로서 이용되었는데, 표준의 범위는 100 mIU/mL 내지 0.78 mIU/mL이었다. 모아진 정상 인간 혈장 검정 대조 및 시험 표본 (1X Coatest 완충액으로 희석됨)이 Immulon 2HB 96-웰 평판 내로 2중으로 (25 μL/웰) 첨가되었다. 새로 제조된 IXa/FX/인지질 믹스 (50 μL), 25 μL의 25mM CaCl2, 그리고 50 μL의 FXa 기질이 각 웰 내로 순차적으로 첨가되고 각 첨가 사이에 5 분간 배양되었다. 기질과 함께 배양한 후, 25 μL의 20% 아세트산이 색채 반응을 종결하기 위해 첨가되었고, 그리고 OD405의 흡광도가 SpectraMax 플러스 (Molecular Devices) 기기로 계측되었다. 데이터는 SoftMax Pro 소프트웨어 (버전 5.2)로 분석되었다. 정량의 최저 수준 (LLOQ)은 7.8 mIU/mL이었다.
FVIII aPTT 검정
FVIII aPTT 검정은 아래와 같이 Sysmex CA-1500 응고 분석기에서 수행되었다: 먼저, aPTT 완충액 (50 mM Tris, 100 mM NaCl, 1% HSA, pH 7.4)에서 50 uL의 수동으로 희석된 표본, 표준 및 대조가 기기에 의해 반응 큐벳 내로 첨가되고, 그 이후에 50 uL의 FVIII-결함성 혈장 (George King Bio-Medical, 제품 #: 0800)이 첨가되었다. 37℃에서 1 분 동안 배양 이후에, 50 uL의 aPTT 시약 (Actin® FSL 활성화된 세팔로플라스틴 시약 - Dade Behring, 참조 # B4219-2)이 반응 혼합물에 첨가되고, 그리고 37℃에서 4 분 동안 배양되었다. 차후에, 50 ul의 20 mM CaCl2 (Dade Behring, 참조 # ORFO37)가 첨가되었고, 그리고 반응 큐벳은 혼합물 내에 굴절 광의 양을 계측하기 위해 4개의 분광광도계 통로 위치 중에서 하나로 즉시 이전되었고, 이것은 기기의 소프트웨어 알고리즘에 의해 응고의 개시로 전환되었다. 보고된 응고 시간은 응괴 형성의 개시 때까지 CaCl2의 첨가로부터 시간의 길이이었다. 검정 표준은 WHO 8차 국제 FVIII 표준을 100 mIU/ml 내지 0.78 mIU/ml의 범위에서 aPTT 완충액에 희석함으로써 산출되었다. 표준 곡선은 MS Excel에서 x 축으로서 FVIII 활성 (mIU/mL)의 로그 (베이스 10)와 대비하여 y 축으로서 응고 시간 (초 단위)으로서 플롯팅되었고, 그리고 개별 표본의 활성은 이러한 표준 곡선의 선형 회귀선에 대한 공식을 이용하여 계산되었다. 검정 성과에 근거하여, 정량의 최저 한계 (LLOQ)는 7.8 mIU/mL이었다.
실시예 6: 이형이합체의 반감기 연장에 대한 XTEN 삽입의 부가 효과
XTEN 삽입은 반감기 연장을 위해 이형이합체 내로 통합되었다. FVIII B-도메인에서 단일 288개 아미노산 (aa) AE-XTEN의 삽입은 도면 3에서 rFVIII169/VWF031에 의해 증명된 바와 같이, HemA 생쥐에서 이형이합체의 16.7 시간 반감기를 유발하였다. 이형이합체의 반감기를 더욱 향상시키기 위해, 144 aa 또는 288 aa 길이에서 두 번째 XTEN 삽입이 각각 FVIII A1 도메인 내에 또는 D'D3 단편의 즉시 하류에서 FVIII169/VWF031 내로 통합되었고, 이들 이형이합체 변이체는 FVIII205/VWF031 및 FVIII169/VWF034로서 명명되었다.
rFVIII169/VWF031, rFVIII205/VWF031 및 rFVIII169/VWF034의 반감기는 200 IU/kg 용량에서 시험 분자의 단일 정맥내 투여에 의해 FVIII 결함성 (HemA) 생쥐에서 평가되었다. 혈장 표본은 도면 3에서 지시된 바와 같은 지정 시점에서 수집되었고, 이들 표본의 FVIII 활성이 FVIII 발색 검정에 의해 결정되었고, PK 파라미터가 WinNonlin-Phoenix 프로그램을 이용하여 계산되고 표 17에서 열거되었다.
도면 3 및 표 17에서 보여지는 바와 같이, FVIII의 A1 도메인에서 또는 D'D3의 하류에서 두 번째 XTEN 삽입의 부가는 이형이합체의 반감기를 각각, 29.45 또는 31.10까지 더욱 향상시킨다. 게다가, 소실 및 AUC에서 2-배보다 많은 향상이 또한, 양쪽 XTEN 삽입으로부터 관찰되었다.
실시예 7: 144 aa AE-XTEN은 D'D3 및 Fc 도메인 중간에 삽입될 때, 288 aa AE-XTEN보다 더욱 우수한 반감기 이익을 부여한다.
다른 이형이합체-FVIII169/VWF057이 D'D3-XTEN-Fc 사슬 내에 XTEN 삽입의 최적 길이를 확인하는 노력에서 작제되었는데, 여기서 XTEN 삽입의 길이는 288aa로부터 144aa로 감소되었다. 도면 4에서 보여지는 바와 같이, rFVIII169/VWF034와 비교하여, rFVIII169/VWF057의 반감기는 31 시간에서 42 시간으로 증가되었다. 향상된 소실 및 AUC 또한 rFVIII169/VWF057에 대해 관찰되었고, 데이터는 표 18에서 열거되었다. 따라서, 144aa AE-XTEN 삽입은 FVIII-XTEN-Fc/D'D3-XTEN-Fc 이형이합체의 D'D3 및 Fc 도메인 사이에 삽입될 때, AE-288aa XTEN보다 더욱 최적이다.
실시예 8: Fc 도메인은 이형이합체의 반감기를 연장한다
Fc 도메인은 FcRn 매개된 재활용 경로를 통해 이의 융합 단백질의 반감기를 연장한다. 이형이합체의 반감기 연장에서 Fc 도메인의 필요를 확증하기 위해, 야생형 Fc 도메인은 rFVIII205/VWF031에서 삼중 돌연변이체 (I253A/H310A/H435A; IHH)에 의해 대체되어 rFVIII263/VWF050을 형성하고, 그리고 FcRn 결합의 완전한 제거는 rFVIII263/VWF050에 대한 표면 플라스몬 공명 (Biacore) 검정에 의해 확증되었다. FVIII263/VWF050의 반감기는 rFVIII205/VWF031과 비교하여 HemA 생쥐에서 평가되었다. 증가된 소실율뿐만 아니라 감소된 반감기 및 AUC가 도면 5 및 표 19에서 보여지는 바와 같이 rFVIII263/VWF050에 대해 관찰되었다. 이러한 결과는 FVIII 및 D'D3의 공유 결합을 담보하는 것에 더하여, Fc 도메인 역시 이형이합체의 반감기 향상에 필요하다는 것을 증명하였다.
실시예 9: HemA 생쥐 꼬리 클립 출혈 모형에서 FVIII-XTEN-Fc/D'D3-XTEN-Fc 이형이합체의 급성 효력
선도 이형이합체 후보의 급성 효력은 HemA 생쥐 꼬리 클립 출혈 모형을 이용하여 평가되었다.
8-12 주령 수컷 HemA 생쥐는 4가지 치료군으로 무작위화되고, 그리고 각각, SQ BDD-FVIII, rFVIII169/VWF034, rFVIII169/VWF057 또는 운반제 용액의 단일 정맥내 투여로 처리되었다. FVIII의 삽화적 치료를 모의하기 위해 (정상적인 FVIII 혈장 수준의 50-100%를 재구성하기 위해), 선별된 FVIII 치료 용량은 FVIII aPTT 활성에 의해 계측될 때 75 IU/kg이다. 이러한 용량 수준에서, 모든 시험 FVIII 변이체는 투약후 5분에 정상적인 뮤린 혈장 FVIII 활성의 ~70%를 재구성할 것이다.
본 연구에서 각 개별 동물로부터 혈액 상실 용적은 도면 6에서 플롯팅되었다. 혈액 상실 용적에서 유의미한 감소가 운반제 처리된 동물과 비교하여, 모든 FVIII 치료군에 대해 관찰되었다. 3가지 FVIII 치료군 내에서, 혈액 상실 감소에서 어떤 통계학적으로 유의미한 차이도 발견되지 않았는데, 이것은 이형이합체 분자가 주문형 치료에 대해 SQ BDD-FVIII만큼 잠재적으로 유효할 수 있었다는 것을 암시한다.
본 연구에서 각 개별 동물로부터 혈액 상실 용적은 도면 6에서 플롯팅되었다. 혈액 상실 용적에서 유의미한 감소는 운반제 처리된 동물과 비교하여, 모든 FVIII 치료군에 대해 관찰되었다. 3가지 FVIII 치료군 내에서, 혈액 상실 감소에서 어떤 통계학적으로 유의미한 차이도 발견되지 않았는데, 이것은 이형이합체 분자가 주문형 치료에 대해 SQ BDD-FVIII만큼 잠재적으로 유효할 수 있었다는 것을 암시한다.
이에 더하여, HemA 생쥐는 더욱 낮은 용량 (37.5 IU/kg)의 rBDD-FVIII 또는 rFVIII169/VWF034로 처리되었고, 그리고 결과는 도면 6B에서 도시된다. 75 IU/kg 용량으로서 동일할 때, rFVIII169/VWF034는 꼬리 클립 손상후 HemA 생쥐에 BDD-FVIII과 유사한 보호를 제공하였는데, 이것은 상기 분자가 HemA 생쥐에서 정상적인 뮤린 순환 FVIII 수준의 ~35%에서 심각한 출혈 에피소드를 치료하는데 여전히 유효했다는 것을 지시한다.
꼬리 클립 절차는 아래와 같이 수행되었다. 간단히 말하면, 생쥐는 꼬리 손상에 앞서 50 mg/kg 케타민/0.5 mg/kg 덱스메데토미딘 칵테일로 마취되고, 그리고 체온을 유지하는데 도움을 주기 위해 37℃ 가열 패드 상에 배치되었다. 생쥐의 꼬리는 이후, 곁맥을 팽창시키기 위해 10 분 동안 37℃ 식염수에 집어넣어졌다. 정맥 팽창 후, FVIII 변이체 또는 운반제 용액이 꼬리 정맥을 통해 주사되었고, 그리고 꼬리의 원위 5 mm가 이후, 투약후 5분에 곧은 날이 있는 #11 스캘펄을 이용하여 컷오프되었다. 흘러나온 혈액은 30 분 동안 13 ml의 37℃ 식염수 내로 수집되었고, 그리고 혈액 상실 용적은 혈액 수집 튜브의 중량 변화에 의해 결정되었다: 혈액 상실 용적 = (수집 튜브 끝 중량 - 시작 중량 + 0.10) ml. 통계학적 분석은 t 검증 (만-휘트니 검증) 및 일원 변량분석 (ANOVA) (크러스칼 왈리스 검증, 사후 검증: Dunns 복수 비교 시험)을 이용하여 수행되었다.
실시예 10: HemA 생쥐 꼬리 정맥 횡절단 출혈 모형에서 FVIII-XTEN-Fc/D'D3-XTEN-Fc 이형이합체의 예방적 효력
FVIII169/VWF057의 예방적 효력은 HemA 생쥐 꼬리 정맥 횡절단 (TVT) 모형에서 시험되었다. TVT 모형은 생쥐 꼬리의 곁맥에 손상을 도입함으로써 출혈을 유도하는데, 이것은 혈우병 출혈 장애를 앓는 환자에서 자연 출혈 에피소드를 모의한다.
8-10 주령 수컷 HemA 생쥐는 4가지 치료군으로 무작위화되었고, 그리고 꼬리 정맥 손상에 앞서 72 시에 FVIII169/VWF057, 또는 손상에 앞서 24 시 또는 48 시에 SQ BDD-FVIII으로 처리되었다. 운반제 처리된 동물은 음성 대조로서 이용되었다. 손상후 24 시간 이내에 과도한 혈액 상실로 인한 재출혈 또는 안락사의 이벤트는 도면 7에서 플롯팅되었다.
도면 7에서 보여지는 바와 같이, 손상후 단지 제한된 보호만 관찰되었던, TVT 전 48 시에 SQ BDD-FVIII으로 처리된 생쥐와 달리, 꼬리 손상에 앞서 72 시에 rFVIII169/VWF057을 제공받았던 생쥐는 TVT 전 24 시에 SQ BDD-FVIII 치료를 제공받았던 생쥐와 비교하여, 재출혈 및 생존에서 유사한 보호를 가졌는데, 이것은 rFVIII169/VWF057이 TVT 모형에서 HemA 생쥐에 최소한 3-배 또는 그 이상 (가령, 4-배) 긴-보호를 제공할 수 있다는 것을 지시한다. 이런 이유로, rFVIII169/VWF057은 현재 FVIII 예방의 치료 빈도를 유의미하게 감소시킬지도 모른다.
유사하게, HemA 생쥐는 꼬리 정맥 손상에 앞서 24 또는 96 시에 FVIII-XTEN-Fc/D'D3-XTEN-Fc 이형이합체: rFVIII169/VWF034 및 rFVIII169/VWF057로 처리되었다. 이들 처리의 재출혈 및 생존 데이터는 손상에 앞서 24 또는 48 시에 rBDD-FVIII 및 운반제에 의한 데이터와 비교되었다. 꼬리 정맥 손상에 앞서 24 시에 rBDD-FVIII으로 처리된 생쥐에서 재출혈은 운반제로 처리된 생쥐와 유사한 반면, 손상에 앞서 24 시에 이형이합체로 처리된 생쥐의 재출혈 데이터는 운반제 치료군보다 훨씬 우수하다. 게다가, 손상에 앞서 96 시에 이형이합체로 처리된 생쥐의 재출혈 데이터는 손상에 앞서 24 시에 rBDD-FVIII를 제공받았던 생쥐에 필적하였다. TVT 손상후 24 시에 생존율의 경우에, rBDD-FVIII으로 처리된 생쥐의 50%보다 적은 생존율과 대조적으로, FVIII 분자가 손상에 앞서 24 시에 투여되었을 때, FVIII-XTEN-Fc/D'D3-XTEN-Fc 이형이합체 처리에서 90%보다 많은 생쥐가 TVT 손상으로부터 생존하였다. 이에 더하여, 꼬리 정맥 손상에 앞서 96 시에 FVIII-XTEN-Fc/D'D3-XTEN-Fc 이형이합체로 처리된 생쥐에서 생존은 손상에 앞서 24 시에 rBDD-FVIII 처리를 제공받았던 생쥐와 비교할 때, 더욱 우수하거나 (rFVIII169/VWF034의 경우에) 또는 필적하였다 (rFVIII169/VWF057의 경우에). 재출혈 및 생존 데이터 둘 모두 rBDD-FVIII 처리에 비해 FVIII-XTEN-Fc/D'D3-XTEN-Fc 이형이합체 처리의 4-배 효력 연장을 지시하였다.
HemA 생쥐 꼬리 정맥 횡절단 모형
꼬리 정맥 횡절단 절차는 아래와 같이 수행되었다. 생쥐는 50 mg/kg의 케타민, 0.125 mg/kg의 덱스메데토미딘, 그리고 0.1 mg/kg의 부프레넥스를 내포하는 칵테일로 마취되었다. 적합한 마취 깊이에서, 생쥐의 편측 꼬리 정맥은 꼬리의 직경이 대략 2.7 mm인 구역에서 곧은 날이 있는 번호 11 외과적 블레이드로 횡절단되었다. 흘러나온 혈액은 상처의 깨끗한 관찰을 담보하기 위해 따뜻한 식염수로 씻겼다. 처리된 생쥐는 이후, 그 다음 24 시간 동안 백색 페이퍼 침구가 있는 깨끗한 케이지에서 단일 수용되었다. 꼬리 재출혈 및 생쥐의 신체 활동이 꼬리 손상후 12 시간까지 시간별로 관찰되고 기록되었다. 빈사 생쥐는 즉시 안락사되었고, 그리고 최종 관찰이 꼬리 손상후 24 시에 수행되었다. 혈우병 환자에서 출혈 상황을 모의하고 마취로부터 동물의 완전한 회복을 담보하기 위해, 1 mg/kg의 아티파메졸 용액이 꼬리 정맥 횡절단의 시작 시점에서 덱스메데토미딘 효과를 반전시키기 위해 제공되었다. 0.1 mg/kg 부프레넥스의 추가 용량이 하룻밤 통증 관리를 위해 12 시간 관찰 기간의 종결점에서 투여되었다. 재출혈까지 시간 및 안락사까지 시간의 생존 곡선이 데이터 분석을 위해 산출되었고, 그리고 로그 순위 (Mantel-COX) 검정이 통계 평가에 이용되었다.
실시예 11: FVIII169/VWF059 및 다른 구조체의 제조
pSYN FVIII 310 클로닝:
N 말단에서 BamH1 부위 및 C 말단에서 Cla 1 부위와 측면에서 접하는 합성 DNA 단편은 상업적으로 만들어졌다. 이러한 합성 DNA는 pSYN FVIII 169 구조체 (서열 번호: 155)에서 Cla1 영역에 BamH1을 대체하는데 이용되었다. 합성 DNA 및 pSYN FVIII 169 DNA 둘 모두 BamH1 및 Cla1로 이중 절단되고, 소화된 합성 DNA는 소화된 pSYN FVIII 169 내로 삽입되어 pSYN FVIII 310 (서열 번호:168; 표 20)을 창출하였다.
pSYN FVIII 312 클로닝:
N 말단에서 BamH1 부위 및 C 말단에서 Afe 1 부위와 측면에서 접하는 합성 DNA 단편은 상업적으로 만들어졌다. 이러한 합성 DNA는 pSYN FVIII 169 구조체 (서열 번호: 155)에서 Afe1 영역에 BamH1을 대체하는데 이용되었다. 합성 DNA 및 pSYN FVIII 169 DNA 둘 모두 BamH1 및 Afe1로 이중 절단되고, 소화된 합성 DNA는 소화된 pSYN FVIII 169 내로 삽입되어 pSYN FVIII 312 (서열 번호: 169; 표 20)를 창출하였다. pSYN FVIII 312A (서열 번호: 2; 표 20)는 FVIII 및 XTEN의 접합부에서 아미노산 잔기 GAP를 코딩하는 AscI 부위를 제거하기 위해 pSYN FVIII312로부터 창출되었다.
pSYN VWF059 및 VWF073 클로닝:
D'D3-XTEN 및 Fc 사이에 상이한 링커 영역을 코딩하는 다양한 합성 DNA 단편이 만들어졌다. 이들 합성 DNA 단편은 N 말단에서 Asc1 부위 및 C 말단에서 Not 1 부위와 측면에서 접하였다. 이들 합성 DNA는 pSYN VWF057 구조체 (서열 번호: 152) 내에 Not1 영역에 Asc1을 대체하는데 이용되었다. pSYN VWF059 구조체 (표 21)는 링커 영역 (서열 번호: 13)을 포함하는데, 이것은 전체 FVIII 산성 영역 2 (a2)를 포함한다. 이러한 부위는 트롬빈에 의해 개열되는 것으로 보고되고, 그리고 FVIII 활성화 시에 D'D3XTEN이 방출된다. pSYN VWF073 구조체 (표 21)는 FVIII 산성 영역 2 (a2)의 트롬빈 개열 부위 (즉, IEPRSFS) (서열 번호: 23)만을 내포한다. 합성 DNA 및 pSYN VWF057 DNA 둘 모두 Asc1 및 Not1로 이중 절단되었다. 소화된 합성 DNA는 소화된 pSYN VWF057 내로 삽입되어 pSYN VWF059 및 pSYN VWF073을 창출하였다. pSYN VWF59A 구조체 (표 21)는 EcoRV 제한 부위를 제거함으로써 pSYN VWF059로부터 산출되었다. FVIII169/VWF057 및 FVIII169/VWF059 이형이합체 단백질은 HEK293 세포에서 FVIII169 및 VWF057 또는 VWF059의 공동발현에 의해 산출되었다.
실시예 12: Fc로부터 D'D3의 방출을 분석하기 위한 FVIII 이형이합체의 트롬빈 소화
2가지 FVIII 이형이합체 단백질이 트롬빈 소화 실험에서 시험되었고, 그리고 트롬빈에 의한 이들의 개열 비율이 조사되었다. 이러한 실험에서 이용된 2개의 이형이합체 구조체는 FVIIIFc와 함께 FVIII169/VWF057 이형이합체 및 FVIII169/VWF059 이형이합체이었다. FVIII169/VWF057 및 FVIII169/VWF059 이형이합체는 전술된다. 3가지 소화 반응이 수행되었다: i) FVIIIFc ii) FVIII169/VWF057 (도면 11), 그리고 iii) FVIII 169/VWF059 (도면 12). 시험 표본은 대략 22:1의 FVIII:트롬빈의 몰 비율에서 인간 α- 트롬빈으로 처리되었다. 각 반응물은 37℃ 수조에서 배양되었다. 각 지시된 시점 (t = 5, 15, 30, 45, 60 분)에, 22.5 μL 표본이 뽑혀지고, 22.5 μL 비-환원 2x SDS 적하 염료로 중지되고, 그리고 3 분 동안 가열되었다. 소화된 단백질은 이후, SDS-PAGE 겔 상에서 이동되었다. 웨스턴 블롯팅이 LICOR 시스템을 이용하여 항-FVIII 중쇄 (GMA012) 및 항-VWF-D3 (Ab96340) 항체를 이용하여 수행되었다.
도면 11에서 보여지는 바와 같이, 트롬빈에 FVIII169/VWF057의 노출은 D'D3-XTEN-Fc의 검출된 수준에서 점진적인 감소를 유발하고, 개열된 산물인 D'D3-144 XTEN의 수준에서 증가와 상관하였다. 개열되지 않은 FVIII169/VWF057은 15 분 후 남겨졌다. 반대로, 도면 12는 5 분 후 검출가능한 개열되지 않은 FVIII 169/VWF059가 거의 또는 전혀 없음에 의해 증거된 바와 같이, FVIII 169/VWF059가 트롬빈에 의해 더욱 급속하게 개열된다는 것을 보여준다. 따라서, FVIII 169/VWF059는 FVIII169/VWF057과 비교하여, 트롬빈 활성화 시에 Fc로부터 D'D3의 더욱 우수한 방출을 보여주었다.
병렬 실험이 질량 분광법 (MS)을 이용하여 트롬빈 개열을 조사하기 위해 행위되었다. MS에 의해, FVIII 169/VWF059는 VWF057과 비교하여, Fc로부터 D'D3의 더욱 우수한 방출을 다시 한 번 보여주었다.
실시예 13: HemA 생쥐에서 FVIII169/VWF059의 생체내 평가
FVIII169/VWF059의 약동학적 프로필 및 생체내 효능을 더욱 평가하기 위해, HemA 생쥐는 150 IU/kg 용량에서 정맥내 투여를 통해 FVIII169/VWF059로 처리되었다. 혈장 표본은 주사후 5 분, 24, 48, 72, 96 및 120 시에 정맥 대정맥 혈액 수집을 통해 수집되었다. 혈장 표본에서 FVIII 활성은 FVIII 발색 검정에 의해 계측되었고, 그리고 PK 파라미터는 Phoenix 프로그램을 이용하여 계산되었다. FVIII169/VWF059의 유사한 PK 프로필이 표 22에서 보여지는 바와 같이, FVIII169/VWF057과 비교하여 관찰되었는데, 이것은 a2 트롬빈 개열 링커가 이형이합체의 PK 프로필에 대한 부정적인 효과를 갖는다는 것을 지시한다.
FVIII169/VWF059의 급성 효력은 야생형 BDD-FVIII과 비교하여, HemA 생쥐 꼬리 클립 모형 (실시예 9에서 설명됨)에서 평가되었다. HemA 생쥐는 75 IU/kg의 FVIII169/VWF059 또는 BDD-FVIII으로 처리되었고, 그리고 각 실험 생쥐의 혈액 상실 용적이 도면 13에서 플롯팅되었다. BDD-FVIII와 비교하여, FVIII169/VWF059는 HemA 생쥐에 동일한 정도의 보호를 제공하였는데 (p=0.9883), 이것은 FVIII169/VWF059가 생체내에서 완전히 기능적이라는 것을 지시한다.
FVIII
-
XTEN
-
Fc
/
D'D3
-
Fc
이형이합체의
플라스미드
작제
특정한 구체예의 전술한 설명은 타인이 당해 분야의 기술 내에 지식을 적용함으로써, 과도한 실험 없이, 본 발명의 일반적인 개념으로부터 벗어나지 않으면서, 이런 특정한 구체예를 다양한 적용을 위해 쉽게 변형하고 및/또는 적합하게 할 수 있을 만큼 완전히 본 발명의 전반적인 성격을 드러낼 것이다. 이런 이유로, 이런 적응과 변형은 본원에서 제공된 교시와 보도에 기초하여, 개시된 구체예의 등가물의 의미와 범위 내에 있는 것으로 의도된다. 본원에서 관용구 또는 용어는 제한이 아닌 설명을 목적으로 하고, 따라서 본 명세서의 용어 또는 어법은 이들 교시와 보도에 비추어 당업자에 의해 해석되어야 하는 것으로 이해된다.
본 발명의 다른 구체예는 본 명세서의 고려 및 본원에서 개시된 발명의 실시로부터 당업자에게 명백할 것이다. 본 명세서와 실시예는 단지 예시로서 고려되고, 본 발명의 진정한 범위와 사상은 아래 청구항에 의해 지시되는 것으로 의도된다.
본원에서 인용된 모든 특허 및 간행물은 본원에서 전체적으로 완전히 참조로서 편입된다.
SEQUENCE LISTING
<110> BIOGEN IDEC MA INC.
CHHABRA, EKTA SETH
LIU, TONGYAO
<120> FACTOR VIII COMPLEX WITH VON WILLEBRAND FACTOR AND XTEN, AND USES
THEREOF
<130> 2159.441PC02/C-K/BMD
<140> To Be Assigned
<141> Herewith
<150> 61/988,104
<151> 2014-05-02
<150> 61/926,226
<151> 2014-01-10
<160> 200
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 1
Thr Gln Ser Phe Asn Asp Phe Thr Arg
1 5
<210> 2
<211> 302
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pSYN FVIII 312A
<400> 2
Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu
1 5 10 15
Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly
20 25 30
Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala
35 40 45
Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu
50 55 60
Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly
65 70 75 80
Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Glu Ser
85 90 95
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser
100 105 110
Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly
115 120 125
Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Ser Pro Ala Gly
130 135 140
Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly
145 150 155 160
Ser Ala Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly
165 170 175
Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Glu Ser
180 185 190
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser
195 200 205
Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly
210 215 220
Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Thr Glu
225 230 235 240
Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly
245 250 255
Ser Ala Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly
260 265 270
Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu
275 280 285
Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Ala Ser Ser Glu Ile Thr Arg
290 295 300
<210> 3
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 3
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1 5 10
<210> 4
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 4
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1 5 10
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
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<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 6
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1 5
<210> 7
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 7
Ala Leu Arg Pro Arg
1 5
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<211> 288
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> XTEN AE288
<400> 8
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1 5 10 15
Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro
20 25 30
Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro
35 40 45
Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr
50 55 60
Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr
65 70 75 80
Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro
85 90 95
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Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr
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Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Glu
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Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro
165 170 175
Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro
180 185 190
Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro
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Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro
225 230 235 240
Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ser Glu Pro
245 250 255
Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro
260 265 270
Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> XTEN AE42
<400> 9
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1 5 10 15
Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala
20 25 30
Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Ala Ser Ser
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> XTEN AE72
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20 25 30
Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu
35 40 45
Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr
50 55 60
Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ala Ser Ser
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<211> 143
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> XTEN AE144
<400> 11
Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu
1 5 10 15
Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly
20 25 30
Ser Glu Thr Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu
35 40 45
Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ser Glu Pro
50 55 60
Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly
65 70 75 80
Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro
85 90 95
Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Glu
100 105 110
Ser Ala Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser
115 120 125
Glu Thr Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro
130 135 140
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<211> 56
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pSYN VWF057
<400> 12
Thr Ser Thr Glu Glu Gly Ala Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Val Pro Arg
35 40 45
Gly Ser Gly Gly Asp Lys Thr His
50 55
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gaaactgagg ctgggtacta caagctgtcc ggtgaggcct atggctttgt ggccaggatc 420
gatggcagcg gcaactttca agtcctgctg tcagacagat acttcaacaa gacctgcggg 480
ctgtgtggca actttaacat ctttgctgaa gatgacttta tgacccaaga agggaccttg 540
acctcggacc cttatgactt tgccaactca tgggctctga gcagtggaga acagtggtgt 600
gaacgggcat ctcctcccag cagctcatgc aacatctcct ctggggaaat gcagaagggc 660
ctgtgggagc agtgccagct tctgaagagc acctcggtgt ttgcccgctg ccaccctctg 720
gtggaccccg agccttttgt ggccctgtgt gagaagactt tgtgtgagtg tgctgggggg 780
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cgcatccagc atacagtgac ggcctccgtg cgcctcagct acggggagga cctgcagatg 1500
gactgggatg gccgcgggag gctgctggtg aagctgtccc ccgtctatgc cgggaagacc 1560
tgcggcctgt gtgggaatta caatggcaac cagggcgacg acttccttac cccctctggg 1620
ctggcrgagc cccgggtgga ggacttcggg aacgcctgga agctgcacgg ggactgccag 1680
gacctgcaga agcagcacag cgatccctgc gccctcaacc cgcgcatgac caggttctcc 1740
gaggaggcgt gcgcggtcct gacgtccccc acattcgagg cctgccatcg tgccgtcagc 1800
ccgctgccct acctgcggaa ctgccgctac gacgtgtgct cctgctcgga cggccgcgag 1860
tgcctgtgcg gcgccctggc cagctatgcc gcggcctgcg cggggagagg cgtgcgcgtc 1920
gcgtggcgcg agccaggccg ctgtgagctg aactgcccga aaggccaggt gtacctgcag 1980
tgcgggaccc cctgcaacct gacctgccgc tctctctctt acccggatga ggaatgcaat 2040
gaggcctgcc tggagggctg cttctgcccc ccagggctct acatggatga gaggggggac 2100
tgcgtgccca aggcccagtg cccctgttac tatgacggtg agatcttcca gccagaagac 2160
atcttctcag accatcacac catgtgctac tgtgaggatg gcttcatgca ctgtaccatg 2220
agtggagtcc ccggaagctt gctgcctgac gctgtcctca gcagtcccct gtctcatcgc 2280
agcaaaagga gcctatcctg tcggcccccc atggtcaagc tggtgtgtcc cgctgacaac 2340
ctgcgggctg aagggctcga gtgtaccaaa acgtgccaga actatgacct ggagtgcatg 2400
agcatgggct gtgtctctgg ctgcctctgc cccccgggca tggtccggca tgagaacaga 2460
tgtgtggccc tggaaaggtg tccctgcttc catcagggca aggagtatgc ccctggagaa 2520
acagtgaaga ttggctgcaa cacttgtgtc tgtcgggacc ggaagtggaa ctgcacagac 2580
catgtgtgtg atgccacgtg ctccacgatc ggcatggccc actacctcac cttcgacggg 2640
ctcaaatacc tgttccccgg ggagtgccag tacgttctgg tgcaggatta ctgcggcagt 2700
aaccctggga cctttcggat cctagtgggg aataagggat gcagccaccc ctcagtgaaa 2760
tgcaagaaac gggtcaccat cctggtggag ggaggagaga ttgagctgtt tgacggggag 2820
gtgaatgtga agaggcccat gaaggatgag actcactttg aggtggtgga gtctggccgg 2880
tacatcattc tgctgctggg caaagccctc tccgtggtct gggaccgcca cctgagcatc 2940
tccgtggtcc tgaagcagac ataccaggag aaagtgtgtg gcctgtgtgg gaattttgat 3000
ggcatccaga acaatgacct caccagcagc aacctccaag tggaggaaga ccctgtggac 3060
tttgggaact cctggaaagt gagctcgcag tgtgctgaca ccagaaaagt gcctctggac 3120
tcatcccctg ccacctgcca taacaacatc atgaagcaga cgatggtgga ttcctcctgt 3180
agaatcctta ccagtgacgt cttccaggac tgcaacaagc tggtggaccc cgagccatat 3240
ctggatgtct gcatttacga cacctgctcc tgtgagtcca ttggggactg cgcctgcttc 3300
tgcgacacca ttgctgccta tgcccacgtg tgtgcccagc atggcaaggt ggtgacctgg 3360
aggacggcca cattgtgccc ccagagctgc gaggagagga atctccggga gaacgggtat 3420
gagtgtgagt ggcgctataa cagctgtgca cctgcctgtc aagtcacgtg tcagcaccct 3480
gagccactgg cctgccctgt gcagtgtgtg gagggctgcc atgcccactg ccctccaggg 3540
aaaatcctgg atgagctttt gcagacctgc gttgaccctg aagactgtcc agtgtgtgag 3600
gtggctggcc ggcgttttgc ctcaggaaag aaagtcacct tgaatcccag tgaccctgag 3660
cactgccaga tttgccactg tgatgttgtc aacctcacct gtgaagcctg ccaggagccg 3720
ggaggcctgg tggtgcctcc cacagatgcc ccggtgagcc ccaccactct gtatgtggag 3780
gacatctcgg aaccgccgtt gcacgatttc tactgcagca ggctactgga cctggtcttc 3840
ctgctggatg gctcctccag gctgtccgag gctgagtttg aagtgctgaa ggcctttgtg 3900
gtggacatga tggagcggct gcgcatctcc cagaagtggg tccgcgtggc cgtggtggag 3960
taccacgacg gctcccacgc ctacatcggg ctcaaggacc ggaagcgacc gtcagagctg 4020
cggcgcattg ccagccaggt gaagtatgcg ggcagccagg tggcctccac cagcgaggtc 4080
ttgaaataca cactgttcca aatcttcagc aagatcgacc gccctgaagc ctcccgcatc 4140
gccctgctcc tgatggccag ccaggagccc caacggatgt cccggaactt tgtccgctac 4200
gtccagggcc tgaagaagaa gaaggtcatt gtgatcccgg tgggcattgg gccccatgcc 4260
aacctcaagc agatccgcct catcgagaag caggcccctg agaacaaggc cttcgtgctg 4320
agcagtgtgg atgagctgga gcagcaaagg gacgagatcg ttagctacct ctgtgacctt 4380
gcccctgaag cccctcctcc tactctgccc cccgacatgg cacaagtcac tgtgggcccg 4440
gggctcttgg gggtttcgac cctggggccc aagaggaact ccatggttct ggatgtggcg 4500
ttcgtcctgg aaggatcgga caaaattggt gaagccgact tcaacaggag caaggagttc 4560
atggaggagg tgattcagcg gatggatgtg ggccaggaca gcatccacgt cacggtgctg 4620
cagtactcct acatggtgac cgtggagtac cccttcagcg aggcacagtc caaaggggac 4680
atcctgcagc gggtgcgaga gatccgctac cagggcggca acaggaccaa cactgggctg 4740
gccctgcggt acctctctga ccacagcttc ttggtcagcc agggtgaccg ggagcaggcg 4800
cccaacctgg tctacatggt caccggaaat cctgcctctg atgagatcaa gaggctgcct 4860
ggagacatcc aggtggtgcc cattggagtg ggccctaatg ccaacgtgca ggagctggag 4920
aggattggct ggcccaatgc ccctatcctc atccaggact ttgagacgct cccccgagag 4980
gctcctgacc tggtgctgca gaggtgctgc tccggagagg ggctgcagat ccccaccctc 5040
tcccctgcac ctgactgcag ccagcccctg gacgtgatcc ttctcctgga tggctcctcc 5100
agtttcccag cttcttattt tgatgaaatg aagagtttcg ccaaggcttt catttcaaaa 5160
gccaatatag ggcctcgtct cactcaggtg tcagtgctgc agtatggaag catcaccacc 5220
attgacgtgc catggaacgt ggtcccggag aaagcccatt tgctgagcct tgtggacgtc 5280
atgcagcggg agggaggccc cagccaaatc ggggatgcct tgggctttgc tgtgcgatac 5340
ttgacttcag aaatgcatgg tgccaggccg ggagcctcaa aggcggtggt catcctggtc 5400
acggacgtct ctgtggattc agtggatgca gcagctgatg ccgccaggtc caacagagtg 5460
acagtgttcc ctattggaat tggagatcgc tacgatgcag cccagctacg gatcttggca 5520
ggcccagcag gcgactccaa cgtggtgaag ctccagcgaa tcgaagacct ccctaccatg 5580
gtcaccttgg gcaattcctt cctccacaaa ctgtgctctg gatttgttag gatttgcatg 5640
gatgaggatg ggaatgagaa gaggcccggg gacgtctgga ccttgccaga ccagtgccac 5700
accgtgactt gccagccaga tggccagacc ttgctgaaga gtcatcgggt caactgtgac 5760
cgggggctga ggccttcgtg ccctaacagc cagtcccctg ttaaagtgga agagacctgt 5820
ggctgccgct ggacctgccc ctgygtgtgc acaggcagct ccactcggca catcgtgacc 5880
tttgatgggc agaatttcaa gctgactggc agctgttctt atgtcctatt tcaaaacaag 5940
gagcaggacc tggaggtgat tctccataat ggtgcctgca gccctggagc aaggcagggc 6000
tgcatgaaat ccatcgaggt gaagcacagt gccctctccg tcgagstgca cagtgacatg 6060
gaggtgacgg tgaatgggag actggtctct gttccttacg tgggtgggaa catggaagtc 6120
aacgtttatg gtgccatcat gcatgaggtc agattcaatc accttggtca catcttcaca 6180
ttcactccac aaaacaatga gttccaactg cagctcagcc ccaagacttt tgcttcaaag 6240
acgtatggtc tgtgtgggat ctgtgatgag aacggagcca atgacttcat gctgagggat 6300
ggcacagtca ccacagactg gaaaacactt gttcaggaat ggactgtgca gcggccaggg 6360
cagacgtgcc agcccatcct ggaggagcag tgtcttgtcc ccgacagctc ccactgccag 6420
gtcctcctct taccactgtt tgctgaatgc cacaaggtcc tggctccagc cacattctat 6480
gccatctgcc agcaggacag ttgccaccag gagcaagtgt gtgaggtgat cgcctcttat 6540
gcccacctct gtcggaccaa cggggtctgc gttgactgga ggacacctga tttctgtgct 6600
atgtcatgcc caccatctct ggtctacaac cactgtgagc atggctgtcc ccggcactgt 6660
gatggcaacg tgagctcctg tggggaccat ccctccgaag gctgtttctg ccctccagat 6720
aaagtcatgt tggaaggcag ctgtgtccct gaagaggcct gcactcagtg cattggtgag 6780
gatggagtcc agcaccagtt cctggaagcc tgggtcccgg accaccagcc ctgtcagatc 6840
tgcacatgcc tcagcgggcg gaaggtcaac tgcacaacgc agccctgccc cacggccaaa 6900
gctcccacgt gtggcctgtg tgaagtagcc cgcctccgcc agaatgcaga ccagtgctgc 6960
cccgagtatg agtgtgtgtg tgacccagtg agctgtgacc tgcccccagt gcctcactgt 7020
gaacgtggcc tccagcccac actgaccaac cctggcgagt gcagacccaa cttcacctgc 7080
gcctgcagga aggaggagtg caaaagagtg tccccaccct cctgcccccc gcaccgtttg 7140
cccacccttc ggaagaccca gtgctgtgat gagtatgagt gtgcctgcaa ctgtgtcaac 7200
tccacagtga gctgtcccct tgggtacttg gcctcaaccg ccaccaatga ctgtggctgt 7260
accacaacca cctgccttcc cgacaaggtg tgtgtccacc gaagcaccat ctaccctgtg 7320
ggccagttct gggaggaggg ctgcgatgtg tgcacctgca ccgacatgga ggatgccgtg 7380
atgggcctcc gcgtggccca gtgctcccag aagccctgtg aggacagctg tcggtcgggc 7440
ttcacttacg ttctgcatga aggcgagtgc tgtggaaggt gcctgccatc tgcctgtgag 7500
gtggtgactg gctcaccgcg gggggactcc cagtcttcct ggaagagtgt cggctcccag 7560
tgggcctccc cggagaaccc ctgcctcatc aatgagtgtg tccgagtgaa ggaggaggtc 7620
tttatacaac aaaggaacgt ctcctgcccc cagctggagg tccctgtctg cccctcgggc 7680
tttcagctga gctgtaagac ctcagcgtgc tgcccaagct gtcgctgtga gcgcatggag 7740
gcctgcatgc tcaatggcac tgtcattggg cccgggaaga ctgtgatgat cgatgtgtgc 7800
acgacctgcc gctgcatggt gcaggtgggg gtcatctctg gattcaagct ggagtgcagg 7860
aagaccacct gcaacccctg ccccctgggt tacaaggaag aaaataacac aggtgaatgt 7920
tgtgggagat gtttgcctac ggcttgcacc attcagctaa gaggaggaca gatcatgaca 7980
ctgaagcgtg atgagacgct ccaggatggc tgtgatactc acttctgcaa ggtcaatgag 8040
agaggagagt acttctggga gaagagggtc acaggctgcc caccctttga tgaacacaag 8100
tgtcttgctg agggaggtaa aattatgaaa attccaggca cctgctgtga cacatgtgag 8160
gagcctgagt gcaacgacat cactgccagg ctgcagtatg tcaaggtggg aagctgtaag 8220
tctgaagtag aggtggatat ccactactgc cagggcaaat gtgccagcaa agccatgtac 8280
tccattgaca tcaacgatgt gcaggaccag tgctcctgct gctctccgac acggacggag 8340
cccatgcagg tggccctgca ctgcaccaat ggctctgttg tgtaccatga ggttctcaat 8400
gccatggagt gcaaatgctc ccccaggaag tgcagcaagt ga 8442
<210> 21
<211> 2813
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (2016)..(2016)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 21
Met Ile Pro Ala Arg Phe Ala Gly Val Leu Leu Ala Leu Ala Leu Ile
1 5 10 15
Leu Pro Gly Thr Leu Cys Ala Glu Gly Thr Arg Gly Arg Ser Ser Thr
20 25 30
Ala Arg Cys Ser Leu Phe Gly Ser Asp Phe Val Asn Thr Phe Asp Gly
35 40 45
Ser Met Tyr Ser Phe Ala Gly Tyr Cys Ser Tyr Leu Leu Ala Gly Gly
50 55 60
Cys Gln Lys Arg Ser Phe Ser Ile Ile Gly Asp Phe Gln Asn Gly Lys
65 70 75 80
Arg Val Ser Leu Ser Val Tyr Leu Gly Glu Phe Phe Asp Ile His Leu
85 90 95
Phe Val Asn Gly Thr Val Thr Gln Gly Asp Gln Arg Val Ser Met Pro
100 105 110
Tyr Ala Ser Lys Gly Leu Tyr Leu Glu Thr Glu Ala Gly Tyr Tyr Lys
115 120 125
Leu Ser Gly Glu Ala Tyr Gly Phe Val Ala Arg Ile Asp Gly Ser Gly
130 135 140
Asn Phe Gln Val Leu Leu Ser Asp Arg Tyr Phe Asn Lys Thr Cys Gly
145 150 155 160
Leu Cys Gly Asn Phe Asn Ile Phe Ala Glu Asp Asp Phe Met Thr Gln
165 170 175
Glu Gly Thr Leu Thr Ser Asp Pro Tyr Asp Phe Ala Asn Ser Trp Ala
180 185 190
Leu Ser Ser Gly Glu Gln Trp Cys Glu Arg Ala Ser Pro Pro Ser Ser
195 200 205
Ser Cys Asn Ile Ser Ser Gly Glu Met Gln Lys Gly Leu Trp Glu Gln
210 215 220
Cys Gln Leu Leu Lys Ser Thr Ser Val Phe Ala Arg Cys His Pro Leu
225 230 235 240
Val Asp Pro Glu Pro Phe Val Ala Leu Cys Glu Lys Thr Leu Cys Glu
245 250 255
Cys Ala Gly Gly Leu Glu Cys Ala Cys Pro Ala Leu Leu Glu Tyr Ala
260 265 270
Arg Thr Cys Ala Gln Glu Gly Met Val Leu Tyr Gly Trp Thr Asp His
275 280 285
Ser Ala Cys Ser Pro Val Cys Pro Ala Gly Met Glu Tyr Arg Gln Cys
290 295 300
Val Ser Pro Cys Ala Arg Thr Cys Gln Ser Leu His Ile Asn Glu Met
305 310 315 320
Cys Gln Glu Arg Cys Val Asp Gly Cys Ser Cys Pro Glu Gly Gln Leu
325 330 335
Leu Asp Glu Gly Leu Cys Val Glu Ser Thr Glu Cys Pro Cys Val His
340 345 350
Ser Gly Lys Arg Tyr Pro Pro Gly Thr Ser Leu Ser Arg Asp Cys Asn
355 360 365
Thr Cys Ile Cys Arg Asn Ser Gln Trp Ile Cys Ser Asn Glu Glu Cys
370 375 380
Pro Gly Glu Cys Leu Val Thr Gly Gln Ser His Phe Lys Ser Phe Asp
385 390 395 400
Asn Arg Tyr Phe Thr Phe Ser Gly Ile Cys Gln Tyr Leu Leu Ala Arg
405 410 415
Asp Cys Gln Asp His Ser Phe Ser Ile Val Ile Glu Thr Val Gln Cys
420 425 430
Ala Asp Asp Arg Asp Ala Val Cys Thr Arg Ser Val Thr Val Arg Leu
435 440 445
Pro Gly Leu His Asn Ser Leu Val Lys Leu Lys His Gly Ala Gly Val
450 455 460
Ala Met Asp Gly Gln Asp Ile Gln Leu Pro Leu Leu Lys Gly Asp Leu
465 470 475 480
Arg Ile Gln His Thr Val Thr Ala Ser Val Arg Leu Ser Tyr Gly Glu
485 490 495
Asp Leu Gln Met Asp Trp Asp Gly Arg Gly Arg Leu Leu Val Lys Leu
500 505 510
Ser Pro Val Tyr Ala Gly Lys Thr Cys Gly Leu Cys Gly Asn Tyr Asn
515 520 525
Gly Asn Gln Gly Asp Asp Phe Leu Thr Pro Ser Gly Leu Ala Glu Pro
530 535 540
Arg Val Glu Asp Phe Gly Asn Ala Trp Lys Leu His Gly Asp Cys Gln
545 550 555 560
Asp Leu Gln Lys Gln His Ser Asp Pro Cys Ala Leu Asn Pro Arg Met
565 570 575
Thr Arg Phe Ser Glu Glu Ala Cys Ala Val Leu Thr Ser Pro Thr Phe
580 585 590
Glu Ala Cys His Arg Ala Val Ser Pro Leu Pro Tyr Leu Arg Asn Cys
595 600 605
Arg Tyr Asp Val Cys Ser Cys Ser Asp Gly Arg Glu Cys Leu Cys Gly
610 615 620
Ala Leu Ala Ser Tyr Ala Ala Ala Cys Ala Gly Arg Gly Val Arg Val
625 630 635 640
Ala Trp Arg Glu Pro Gly Arg Cys Glu Leu Asn Cys Pro Lys Gly Gln
645 650 655
Val Tyr Leu Gln Cys Gly Thr Pro Cys Asn Leu Thr Cys Arg Ser Leu
660 665 670
Ser Tyr Pro Asp Glu Glu Cys Asn Glu Ala Cys Leu Glu Gly Cys Phe
675 680 685
Cys Pro Pro Gly Leu Tyr Met Asp Glu Arg Gly Asp Cys Val Pro Lys
690 695 700
Ala Gln Cys Pro Cys Tyr Tyr Asp Gly Glu Ile Phe Gln Pro Glu Asp
705 710 715 720
Ile Phe Ser Asp His His Thr Met Cys Tyr Cys Glu Asp Gly Phe Met
725 730 735
His Cys Thr Met Ser Gly Val Pro Gly Ser Leu Leu Pro Asp Ala Val
740 745 750
Leu Ser Ser Pro Leu Ser His Arg Ser Lys Arg Ser Leu Ser Cys Arg
755 760 765
Pro Pro Met Val Lys Leu Val Cys Pro Ala Asp Asn Leu Arg Ala Glu
770 775 780
Gly Leu Glu Cys Thr Lys Thr Cys Gln Asn Tyr Asp Leu Glu Cys Met
785 790 795 800
Ser Met Gly Cys Val Ser Gly Cys Leu Cys Pro Pro Gly Met Val Arg
805 810 815
His Glu Asn Arg Cys Val Ala Leu Glu Arg Cys Pro Cys Phe His Gln
820 825 830
Gly Lys Glu Tyr Ala Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Gly Cys Asn Thr
835 840 845
Cys Val Cys Arg Asp Arg Lys Trp Asn Cys Thr Asp His Val Cys Asp
850 855 860
Ala Thr Cys Ser Thr Ile Gly Met Ala His Tyr Leu Thr Phe Asp Gly
865 870 875 880
Leu Lys Tyr Leu Phe Pro Gly Glu Cys Gln Tyr Val Leu Val Gln Asp
885 890 895
Tyr Cys Gly Ser Asn Pro Gly Thr Phe Arg Ile Leu Val Gly Asn Lys
900 905 910
Gly Cys Ser His Pro Ser Val Lys Cys Lys Lys Arg Val Thr Ile Leu
915 920 925
Val Glu Gly Gly Glu Ile Glu Leu Phe Asp Gly Glu Val Asn Val Lys
930 935 940
Arg Pro Met Lys Asp Glu Thr His Phe Glu Val Val Glu Ser Gly Arg
945 950 955 960
Tyr Ile Ile Leu Leu Leu Gly Lys Ala Leu Ser Val Val Trp Asp Arg
965 970 975
His Leu Ser Ile Ser Val Val Leu Lys Gln Thr Tyr Gln Glu Lys Val
980 985 990
Cys Gly Leu Cys Gly Asn Phe Asp Gly Ile Gln Asn Asn Asp Leu Thr
995 1000 1005
Ser Ser Asn Leu Gln Val Glu Glu Asp Pro Val Asp Phe Gly Asn
1010 1015 1020
Ser Trp Lys Val Ser Ser Gln Cys Ala Asp Thr Arg Lys Val Pro
1025 1030 1035
Leu Asp Ser Ser Pro Ala Thr Cys His Asn Asn Ile Met Lys Gln
1040 1045 1050
Thr Met Val Asp Ser Ser Cys Arg Ile Leu Thr Ser Asp Val Phe
1055 1060 1065
Gln Asp Cys Asn Lys Leu Val Asp Pro Glu Pro Tyr Leu Asp Val
1070 1075 1080
Cys Ile Tyr Asp Thr Cys Ser Cys Glu Ser Ile Gly Asp Cys Ala
1085 1090 1095
Cys Phe Cys Asp Thr Ile Ala Ala Tyr Ala His Val Cys Ala Gln
1100 1105 1110
His Gly Lys Val Val Thr Trp Arg Thr Ala Thr Leu Cys Pro Gln
1115 1120 1125
Ser Cys Glu Glu Arg Asn Leu Arg Glu Asn Gly Tyr Glu Cys Glu
1130 1135 1140
Trp Arg Tyr Asn Ser Cys Ala Pro Ala Cys Gln Val Thr Cys Gln
1145 1150 1155
His Pro Glu Pro Leu Ala Cys Pro Val Gln Cys Val Glu Gly Cys
1160 1165 1170
His Ala His Cys Pro Pro Gly Lys Ile Leu Asp Glu Leu Leu Gln
1175 1180 1185
Thr Cys Val Asp Pro Glu Asp Cys Pro Val Cys Glu Val Ala Gly
1190 1195 1200
Arg Arg Phe Ala Ser Gly Lys Lys Val Thr Leu Asn Pro Ser Asp
1205 1210 1215
Pro Glu His Cys Gln Ile Cys His Cys Asp Val Val Asn Leu Thr
1220 1225 1230
Cys Glu Ala Cys Gln Glu Pro Gly Gly Leu Val Val Pro Pro Thr
1235 1240 1245
Asp Ala Pro Val Ser Pro Thr Thr Leu Tyr Val Glu Asp Ile Ser
1250 1255 1260
Glu Pro Pro Leu His Asp Phe Tyr Cys Ser Arg Leu Leu Asp Leu
1265 1270 1275
Val Phe Leu Leu Asp Gly Ser Ser Arg Leu Ser Glu Ala Glu Phe
1280 1285 1290
Glu Val Leu Lys Ala Phe Val Val Asp Met Met Glu Arg Leu Arg
1295 1300 1305
Ile Ser Gln Lys Trp Val Arg Val Ala Val Val Glu Tyr His Asp
1310 1315 1320
Gly Ser His Ala Tyr Ile Gly Leu Lys Asp Arg Lys Arg Pro Ser
1325 1330 1335
Glu Leu Arg Arg Ile Ala Ser Gln Val Lys Tyr Ala Gly Ser Gln
1340 1345 1350
Val Ala Ser Thr Ser Glu Val Leu Lys Tyr Thr Leu Phe Gln Ile
1355 1360 1365
Phe Ser Lys Ile Asp Arg Pro Glu Ala Ser Arg Ile Ala Leu Leu
1370 1375 1380
Leu Met Ala Ser Gln Glu Pro Gln Arg Met Ser Arg Asn Phe Val
1385 1390 1395
Arg Tyr Val Gln Gly Leu Lys Lys Lys Lys Val Ile Val Ile Pro
1400 1405 1410
Val Gly Ile Gly Pro His Ala Asn Leu Lys Gln Ile Arg Leu Ile
1415 1420 1425
Glu Lys Gln Ala Pro Glu Asn Lys Ala Phe Val Leu Ser Ser Val
1430 1435 1440
Asp Glu Leu Glu Gln Gln Arg Asp Glu Ile Val Ser Tyr Leu Cys
1445 1450 1455
Asp Leu Ala Pro Glu Ala Pro Pro Pro Thr Leu Pro Pro Asp Met
1460 1465 1470
Ala Gln Val Thr Val Gly Pro Gly Leu Leu Gly Val Ser Thr Leu
1475 1480 1485
Gly Pro Lys Arg Asn Ser Met Val Leu Asp Val Ala Phe Val Leu
1490 1495 1500
Glu Gly Ser Asp Lys Ile Gly Glu Ala Asp Phe Asn Arg Ser Lys
1505 1510 1515
Glu Phe Met Glu Glu Val Ile Gln Arg Met Asp Val Gly Gln Asp
1520 1525 1530
Ser Ile His Val Thr Val Leu Gln Tyr Ser Tyr Met Val Thr Val
1535 1540 1545
Glu Tyr Pro Phe Ser Glu Ala Gln Ser Lys Gly Asp Ile Leu Gln
1550 1555 1560
Arg Val Arg Glu Ile Arg Tyr Gln Gly Gly Asn Arg Thr Asn Thr
1565 1570 1575
Gly Leu Ala Leu Arg Tyr Leu Ser Asp His Ser Phe Leu Val Ser
1580 1585 1590
Gln Gly Asp Arg Glu Gln Ala Pro Asn Leu Val Tyr Met Val Thr
1595 1600 1605
Gly Asn Pro Ala Ser Asp Glu Ile Lys Arg Leu Pro Gly Asp Ile
1610 1615 1620
Gln Val Val Pro Ile Gly Val Gly Pro Asn Ala Asn Val Gln Glu
1625 1630 1635
Leu Glu Arg Ile Gly Trp Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ile Gln Asp
1640 1645 1650
Phe Glu Thr Leu Pro Arg Glu Ala Pro Asp Leu Val Leu Gln Arg
1655 1660 1665
Cys Cys Ser Gly Glu Gly Leu Gln Ile Pro Thr Leu Ser Pro Ala
1670 1675 1680
Pro Asp Cys Ser Gln Pro Leu Asp Val Ile Leu Leu Leu Asp Gly
1685 1690 1695
Ser Ser Ser Phe Pro Ala Ser Tyr Phe Asp Glu Met Lys Ser Phe
1700 1705 1710
Ala Lys Ala Phe Ile Ser Lys Ala Asn Ile Gly Pro Arg Leu Thr
1715 1720 1725
Gln Val Ser Val Leu Gln Tyr Gly Ser Ile Thr Thr Ile Asp Val
1730 1735 1740
Pro Trp Asn Val Val Pro Glu Lys Ala His Leu Leu Ser Leu Val
1745 1750 1755
Asp Val Met Gln Arg Glu Gly Gly Pro Ser Gln Ile Gly Asp Ala
1760 1765 1770
Leu Gly Phe Ala Val Arg Tyr Leu Thr Ser Glu Met His Gly Ala
1775 1780 1785
Arg Pro Gly Ala Ser Lys Ala Val Val Ile Leu Val Thr Asp Val
1790 1795 1800
Ser Val Asp Ser Val Asp Ala Ala Ala Asp Ala Ala Arg Ser Asn
1805 1810 1815
Arg Val Thr Val Phe Pro Ile Gly Ile Gly Asp Arg Tyr Asp Ala
1820 1825 1830
Ala Gln Leu Arg Ile Leu Ala Gly Pro Ala Gly Asp Ser Asn Val
1835 1840 1845
Val Lys Leu Gln Arg Ile Glu Asp Leu Pro Thr Met Val Thr Leu
1850 1855 1860
Gly Asn Ser Phe Leu His Lys Leu Cys Ser Gly Phe Val Arg Ile
1865 1870 1875
Cys Met Asp Glu Asp Gly Asn Glu Lys Arg Pro Gly Asp Val Trp
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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gly Ser
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Gly Ser Ser Thr Pro Ser Gly Ala Thr Gly Ser Pro Gly Ser Ser Pro
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Ser Ala Ser Thr Gly Thr Gly Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser
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Thr Gly Ser Pro Gly Ser Ser Pro Ser Ala Ser Thr Gly Thr Gly Pro
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Asn Arg Ser Pro Leu Pro Ile Ala Lys Val Ser Ser Phe Pro Ser
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Ile Arg Pro Ile Tyr Leu Thr Arg Val Leu Phe Gln Asp Asn Ser
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Ser His Leu Pro Ala Ala Ser Tyr Arg Lys Lys Asp Ser Gly Val
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Ser Leu Ala Ile Leu Thr Leu Glu Met Thr Gly Asp Gln Arg Glu
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Val Ala Thr Glu Ser Ser Ala Lys Thr Pro Ser Lys Leu Leu Asp
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Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile Met Val
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Gly Gln Trp Ala Pro Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser
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Ala Arg Gln Lys Phe Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile
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2240 2245 2250
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Leu Ala Lys Glu Lys Thr Gln Thr Leu His Lys Phe Ile Leu Leu
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Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly Lys Ser Trp His Ser Glu Thr Lys
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Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val Tyr Trp His Val Ile
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Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile Phe Leu Glu Gly
2420 2425 2430
His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser Leu Glu Ile
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Gly Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His Asp
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Gly Tyr Val Phe Asp Ser Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu
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Leu Ser Val Phe Phe Ser Gly Tyr Thr Phe Lys His Lys Met Val
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Leu Ser Glu Lys Asn Lys Val Val Val Gly Lys Gly Glu Phe Thr
3305 3310 3315
Lys Asp Val Gly Leu Lys Glu Met Val Phe Pro Ser Ser Arg Asn
3320 3325 3330
Leu Phe Leu Thr Asn Leu Asp Asn Leu His Glu Asn Asn Thr His
3335 3340 3345
Asn Gln Glu Lys Lys Ile Gln Glu Glu Ile Glu Lys Lys Glu Thr
3350 3355 3360
Leu Ile Gln Glu Asn Val Val Leu Pro Gln Ile His Thr Val Thr
3365 3370 3375
Gly Thr Lys Asn Phe Met Lys Asn Leu Phe Leu Leu Ser Thr Arg
3380 3385 3390
Gln Asn Val Glu Gly Ser Tyr Asp Gly Ala Tyr Ala Pro Val Leu
3395 3400 3405
Gln Asp Phe Arg Ser Leu Asn Asp Ser Thr Asn Arg Thr Lys Lys
3410 3415 3420
His Thr Ala His Phe Ser Lys Lys Gly Glu Glu Glu Asn Leu Glu
3425 3430 3435
Gly Leu Gly Asn Gln Thr Lys Gln Ile Val Glu Lys Tyr Ala Cys
3440 3445 3450
Thr Thr Arg Ile Ser Pro Asn Thr Ser Gln Gln Asn Phe Val Thr
3455 3460 3465
Gln Arg Ser Lys Arg Ala Leu Lys Gln Phe Arg Leu Pro Leu Glu
3470 3475 3480
Glu Thr Glu Leu Glu Lys Arg Ile Ile Val Asp Asp Thr Ser Thr
3485 3490 3495
Gln Trp Ser Lys Asn Met Lys His Leu Thr Pro Ser Thr Leu Thr
3500 3505 3510
Gln Ile Asp Tyr Asn Glu Lys Glu Lys Gly Ala Ile Thr Gln Ser
3515 3520 3525
Pro Leu Ser Asp Cys Leu Thr Arg Ser His Ser Ile Pro Gln Ala
3530 3535 3540
Asn Arg Ser Pro Leu Pro Ile Ala Lys Val Ser Ser Phe Pro Ser
3545 3550 3555
Ile Arg Pro Ile Tyr Leu Thr Arg Val Leu Phe Gln Asp Asn Ser
3560 3565 3570
Ser His Leu Pro Ala Ala Ser Tyr Arg Lys Lys Asp Ser Gly Val
3575 3580 3585
Gln Glu Ser Ser His Phe Leu Gln Gly Ala Lys Lys Asn Asn Leu
3590 3595 3600
Ser Leu Ala Ile Leu Thr Leu Glu Met Thr Gly Asp Gln Arg Glu
3605 3610 3615
Val Gly Ser Leu Gly Thr Ser Ala Thr Asn Ser Val Thr Tyr Lys
3620 3625 3630
Lys Val Glu Asn Thr Val Leu Pro Lys Pro Asp Leu Pro Lys Thr
3635 3640 3645
Ser Gly Lys Val Glu Leu Leu Pro Lys Val His Ile Tyr Gln Lys
3650 3655 3660
Asp Leu Phe Pro Thr Glu Thr Ser Asn Gly Ser Pro Gly His Leu
3665 3670 3675
Asp Leu Val Glu Gly Ser Leu Leu Gln Gly Thr Glu Gly Ala Ile
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3710 3715 3720
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Glu Trp Lys Ser Gln Glu Lys Ser Pro Glu Lys Thr Ala Phe Lys
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Lys Lys Asp Thr Ile Leu Ser Leu Asn Ala Cys Glu Ser Asn His
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Ala Ile Ala Ala Ile Asn Glu Gly Gln Asn Lys Pro Glu Ile Glu
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Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe Gln Lys Lys Thr Arg His Tyr
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3860 3865 3870
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Ala Trp Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His
3995 4000 4005
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4010 4015 4020
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Ile Asn Ala Trp Ser Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val
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Asp Leu Leu Ala Pro Met Ile Ile His Gly Ile Lys Thr Gln Gly
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Ala Arg Gln Lys Phe Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile
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Met Tyr Ser Leu Asp Gly Lys Lys Trp Gln Thr Tyr Arg Gly Asn
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Ser Thr Gly Thr Leu Met Val Phe Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser
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Gly Ile Lys His Asn Ile Phe Asn Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr
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Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr Leu Arg
4310 4315 4320
Met Glu Leu Met Gly Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu
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Gly Met Glu Ser Lys Ala Ile Ser Asp Ala Gln Ile Thr Ala Ser
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Ser Tyr Phe Thr Asn Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala
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Arg Leu His Leu Gln Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro Gln Val
4370 4375 4380
Asn Asn Pro Lys Glu Trp Leu Gln Val Asp Phe Gln Lys Thr Met
4385 4390 4395
Lys Val Thr Gly Val Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu Leu Thr
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Ser Met Tyr Val Lys Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gln Asp Gly
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4490
<210> 66
<211> 7053
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Full-Length FVIII
<400> 66
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acctcagtcg tgtacaaaaa gactctgttt gtagaattca cggatcacct tttcaacatc 240
gctaagccaa ggccaccctg gatgggtctg ctaggtccta ccatccaggc tgaggtttat 300
gatacagtgg tcattacact taagaacatg gcttcccatc ctgtcagtct tcatgctgtt 360
ggtgtatcct actggaaagc ttctgaggga gctgaatatg atgatcagac cagtcaaagg 420
gagaaagaag atgataaagt cttccctggt ggaagccata catatgtctg gcaggtcctg 480
aaagagaatg gtccaatggc ctctgaccca ctgtgcctta cctactcata tctttctcat 540
gtggacctgg taaaagactt gaattcaggc ctcattggag ccctactagt atgtagagaa 600
gggagtctgg ccaaggaaaa gacacagacc ttgcacaaat ttatactact ttttgctgta 660
tttgatgaag ggaaaagttg gcactcagaa acaaagaact ccttgatgca ggatagggat 720
gctgcatctg ctcgggcctg gcctaaaatg cacacagtca atggttatgt aaacaggtct 780
ctgccaggtc tgattggatg ccacaggaaa tcagtctatt ggcatgtgat tggaatgggc 840
accactcctg aagtgcactc aatattcctc gaaggtcaca catttcttgt gaggaaccat 900
cgccaggcgt ccttggaaat ctcgccaata actttcctta ctgctcaaac actcttgatg 960
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gatgacaact ctccttcctt tatccaaatt cgctcagttg ccaagaagca tcctaaaact 1200
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ttgattatat ttaagaatca agcaagcaga ccatataaca tctaccctca cggaatcact 1500
gatgtccgtc ctttgtattc aaggagatta ccaaaaggtg taaaacattt gaaggatttt 1560
ccaattctgc caggagaaat attcaaatat aaatggacag tgactgtaga agatgggcca 1620
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gatctagctt caggactcat tggccctctc ctcatctgct acaaagaatc tgtagatcaa 1740
agaggaaacc agataatgtc agacaagagg aatgtcatcc tgttttctgt atttgatgag 1800
aaccgaagct ggtacctcac agagaatata caacgctttc tccccaatcc agctggagtg 1860
cagcttgagg atccagagtt ccaagcctcc aacatcatgc acagcatcaa tggctatgtt 1920
tttgatagtt tgcagttgtc agtttgtttg catgaggtgg catactggta cattctaagc 1980
attggagcac agactgactt cctttctgtc ttcttctctg gatatacctt caaacacaaa 2040
atggtctatg aagacacact caccctattc ccattctcag gagaaactgt cttcatgtcg 2100
atggaaaacc caggtctatg gattctgggg tgccacaact cagactttcg gaacagaggc 2160
atgaccgcct tactgaaggt ttctagttgt gacaagaaca ctggtgatta ttacgaggac 2220
agttatgaag atatttcagc atacttgctg agtaaaaaca atgccattga accaagaagc 2280
ttctcccaga attcaagaca ccctagcact aggcaaaagc aatttaatgc caccacaatt 2340
ccagaaaatg acatagagaa gactgaccct tggtttgcac acagaacacc tatgcctaaa 2400
atacaaaatg tctcctctag tgatttgttg atgctcttgc gacagagtcc tactccacat 2460
gggctatcct tatctgatct ccaagaagcc aaatatgaga ctttttctga tgatccatca 2520
cctggagcaa tagacagtaa taacagcctg tctgaaatga cacacttcag gccacagctc 2580
catcacagtg gggacatggt atttacccct gagtcaggcc tccaattaag attaaatgag 2640
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tcaaataatc tgatttcaac aattccatca gacaatttgg cagcaggtac tgataataca 2760
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attgagaata gtccatcagt ctggcaaaat atattagaaa gtgacactga gtttaaaaaa 3180
gtgacacctt tgattcatga cagaatgctt atggacaaaa atgctacagc tttgaggcta 3240
aatcatatgt caaataaaac tacttcatca aaaaacatgg aaatggtcca acagaaaaaa 3300
gagggcccca ttccaccaga tgcacaaaat ccagatatgt cgttctttaa gatgctattc 3360
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caaggcccca gtccaaagca attagtatcc ttaggaccag aaaaatctgt ggaaggtcag 3480
aatttcttgt ctgagaaaaa caaagtggta gtaggaaagg gtgaatttac aaaggacgta 3540
ggactcaaag agatggtttt tccaagcagc agaaacctat ttcttactaa cttggataat 3600
ttacatgaaa ataatacaca caatcaagaa aaaaaaattc aggaagaaat agaaaagaag 3660
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aatttcatga agaacctttt cttactgagc actaggcaaa atgtagaagg ttcatatgac 3780
ggggcatatg ctccagtact tcaagatttt aggtcattaa atgattcaac aaatagaaca 3840
aagaaacaca cagctcattt ctcaaaaaaa ggggaggaag aaaacttgga aggcttggga 3900
aatcaaacca agcaaattgt agagaaatat gcatgcacca caaggatatc tcctaataca 3960
agccagcaga attttgtcac gcaacgtagt aagagagctt tgaaacaatt cagactccca 4020
ctagaagaaa cagaacttga aaaaaggata attgtggatg acacctcaac ccagtggtcc 4080
aaaaacatga aacatttgac cccgagcacc ctcacacaga tagactacaa tgagaaggag 4140
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caagcaaata gatctccatt acccattgca aaggtatcat catttccatc tattagacct 4260
atatatctga ccagggtcct attccaagac aactcttctc atcttccagc agcatcttat 4320
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aacctttctt tagccattct aaccttggag atgactggtg atcaaagaga ggttggctcc 4440
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aaaccagact tgcccaaaac atctggcaaa gttgaattgc ttccaaaagt tcacatttat 4560
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ttggatcctc ttgcttggga taaccactat ggtactcaga taccaaaaga agagtggaaa 4800
tcccaagaga agtcaccaga aaaaacagct tttaagaaaa aggataccat tttgtccctg 4860
aacgcttgtg aaagcaatca tgcaatagca gcaataaatg agggacaaaa taagcccgaa 4920
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attgactatg atgataccat atcagttgaa atgaagaagg aagattttga catttatgat 5100
gaggatgaaa atcagagccc ccgcagcttt caaaagaaaa cacgacacta ttttattgct 5160
gcagtggaga ggctctggga ttatgggatg agtagctccc cacatgttct aagaaacagg 5220
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tcctttactc agcccttata ccgtggagaa ctaaatgaac atttgggact cctggggcca 5340
tatataagag cagaagttga agataatatc atggtaactt tcagaaatca ggcctctcgt 5400
ccctattcct tctattctag ccttatttct tatgaggaag atcagaggca aggagcagaa 5460
cctagaaaaa actttgtcaa gcctaatgaa accaaaactt acttttggaa agtgcaacat 5520
catatggcac ccactaaaga tgagtttgac tgcaaagcct gggcttattt ctctgatgtt 5580
gacctggaaa aagatgtgca ctcaggcctg attggacccc ttctggtctg ccacactaac 5640
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atctttgatg agaccaaaag ctggtacttc actgaaaata tggaaagaaa ctgcagggct 5760
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aatggctaca taatggatac actacctggc ttagtaatgg ctcaggatca aaggattcga 5880
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caatatggac agtgggcccc aaagctggcc agacttcatt attccggatc aatcaatgcc 6240
tggagcacca aggagccctt ttcttggatc aaggtggatc tgttggcacc aatgattatt 6300
cacggcatca agacccaggg tgcccgtcag aagttctcca gcctctacat ctctcagttt 6360
atcatcatgt atagtcttga tgggaagaag tggcagactt atcgaggaaa ttccactgga 6420
accttaatgg tcttctttgg caatgtggat tcatctggga taaaacacaa tatttttaac 6480
cctccaatta ttgctcgata catccgtttg cacccaactc attatagcat tcgcagcact 6540
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agtaaagcaa tatcagatgc acagattact gcttcatcct actttaccaa tatgtttgcc 6660
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caggtgaata atccaaaaga gtggctgcaa gtggacttcc agaagacaat gaaagtcaca 6780
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ctgactcgct accttcgaat tcacccccag agttgggtgc accagattgc cctgaggatg 7020
gaggttctgg gctgcgaggc acaggacctc tac 7053
<210> 67
<211> 1438
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BDD FVIII
<400> 67
Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser Trp Asp Tyr
1 5 10 15
Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg Phe Pro Pro
20 25 30
Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val Tyr Lys Lys
35 40 45
Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile Ala Lys Pro
50 55 60
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65 70 75 80
Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val
85 90 95
Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser Glu Gly Ala
100 105 110
Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp Asp Lys Val
115 120 125
Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu Lys Glu Asn
130 135 140
Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser Tyr Leu Ser
145 150 155 160
His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile Gly Ala Leu
165 170 175
Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr Gln Thr Leu
180 185 190
His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly Lys Ser Trp
195 200 205
His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp Ala Ala Ser
210 215 220
Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr Val Asn Arg
225 230 235 240
Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val Tyr Trp His
245 250 255
Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile Phe Leu Glu
260 265 270
Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser Leu Glu Ile
275 280 285
Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met Asp Leu Gly
290 295 300
Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His Asp Gly Met
305 310 315 320
Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro Gln Leu Arg
325 330 335
Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp Leu Thr Asp
340 345 350
Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser Pro Ser Phe
355 360 365
Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr Trp Val His
370 375 380
Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro Leu Val Leu
385 390 395 400
Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn Asn Gly Pro
405 410 415
Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met Ala Tyr Thr
420 425 430
Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu Ser Gly Ile
435 440 445
Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu Leu Ile Ile
450 455 460
Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro His Gly Ile
465 470 475 480
Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys Gly Val Lys
485 490 495
His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe Lys Tyr Lys
500 505 510
Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp Pro Arg Cys
515 520 525
Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg Asp Leu Ala
530 535 540
Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu Ser Val Asp
545 550 555 560
Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val Ile Leu Phe
565 570 575
Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu Asn Ile Gln
580 585 590
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595 600 605
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625 630 635 640
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Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr Leu Phe Pro
660 665 670
Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro Gly Leu Trp
675 680 685
Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly Met Thr Ala
690 695 700
Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu
705 710 715 720
Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala
725 730 735
Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Pro Pro Val Leu Lys Arg His
740 745 750
Gln Arg Glu Ile Thr Arg Thr Thr Leu Gln Ser Asp Gln Glu Glu Ile
755 760 765
Asp Tyr Asp Asp Thr Ile Ser Val Glu Met Lys Lys Glu Asp Phe Asp
770 775 780
Ile Tyr Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe Gln Lys Lys
785 790 795 800
Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp Asp Tyr Gly
805 810 815
Met Ser Ser Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg Ala Gln Ser Gly Ser
820 825 830
Val Pro Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr Asp Gly Ser
835 840 845
Phe Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu His Leu Gly Leu
850 855 860
Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile Met Val Thr
865 870 875 880
Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser Ser Leu Ile
885 890 895
Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu Pro Arg Lys Asn Phe
900 905 910
Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp Lys Val Gln His His
915 920 925
Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys Ala Trp Ala Tyr Phe
930 935 940
Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His Ser Gly Leu Ile Gly Pro
945 950 955 960
Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu Asn Pro Ala His Gly Arg Gln
965 970 975
Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr Ile Phe Asp Glu Thr
980 985 990
Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Met Glu Arg Asn Cys Arg Ala Pro
995 1000 1005
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1010 1015 1020
Phe His Ala Ile Asn Gly Tyr Ile Met Asp Thr Leu Pro Gly Leu
1025 1030 1035
Val Met Ala Gln Asp Gln Arg Ile Arg Trp Tyr Leu Leu Ser Met
1040 1045 1050
Gly Ser Asn Glu Asn Ile His Ser Ile His Phe Ser Gly His Val
1055 1060 1065
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1070 1075 1080
Leu Tyr Pro Gly Val Phe Glu Thr Val Glu Met Leu Pro Ser Lys
1085 1090 1095
Ala Gly Ile Trp Arg Val Glu Cys Leu Ile Gly Glu His Leu His
1100 1105 1110
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1130 1135 1140
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Leu His Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala Trp Ser Thr Lys Glu Pro
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1175 1180 1185
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1220 1225 1230
Gly Asn Val Asp Ser Ser Gly Ile Lys His Asn Ile Phe Asn Pro
1235 1240 1245
Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser
1250 1255 1260
Ile Arg Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu Met Gly Cys Asp Leu Asn
1265 1270 1275
Ser Cys Ser Met Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys Ala Ile Ser Asp
1280 1285 1290
Ala Gln Ile Thr Ala Ser Ser Tyr Phe Thr Asn Met Phe Ala Thr
1295 1300 1305
Trp Ser Pro Ser Lys Ala Arg Leu His Leu Gln Gly Arg Ser Asn
1310 1315 1320
Ala Trp Arg Pro Gln Val Asn Asn Pro Lys Glu Trp Leu Gln Val
1325 1330 1335
Asp Phe Gln Lys Thr Met Lys Val Thr Gly Val Thr Thr Gln Gly
1340 1345 1350
Val Lys Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr Val Lys Glu Phe Leu Ile
1355 1360 1365
Ser Ser Ser Gln Asp Gly His Gln Trp Thr Leu Phe Phe Gln Asn
1370 1375 1380
Gly Lys Val Lys Val Phe Gln Gly Asn Gln Asp Ser Phe Thr Pro
1385 1390 1395
Val Val Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu Leu Thr Arg Tyr Leu Arg
1400 1405 1410
Ile His Pro Gln Ser Trp Val His Gln Ile Ala Leu Arg Met Glu
1415 1420 1425
Val Leu Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu Tyr
1430 1435
<210> 68
<211> 4371
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BDD FVIII
<400> 68
atgcaaatag agctctccac ctgcttcttt ctgtgccttt tgcgattctg ctttagtgcc 60
accagaagat actacctggg tgcagtggaa ctgtcatggg actatatgca aagtgatctc 120
ggtgagctgc ctgtggacgc aagatttcct cctagagtgc caaaatcttt tccattcaac 180
acctcagtcg tgtacaaaaa gactctgttt gtagaattca cggatcacct tttcaacatc 240
gctaagccaa ggccaccctg gatgggtctg ctaggtccta ccatccaggc tgaggtttat 300
gatacagtgg tcattacact taagaacatg gcttcccatc ctgtcagtct tcatgctgtt 360
ggtgtatcct actggaaagc ttctgaggga gctgaatatg atgatcagac cagtcaaagg 420
gagaaagaag atgataaagt cttccctggt ggaagccata catatgtctg gcaggtcctg 480
aaagagaatg gtccaatggc ctctgaccca ctgtgcctta cctactcata tctttctcat 540
gtggacctgg taaaagactt gaattcaggc ctcattggag ccctactagt atgtagagaa 600
gggagtctgg ccaaggaaaa gacacagacc ttgcacaaat ttatactact ttttgctgta 660
tttgatgaag ggaaaagttg gcactcagaa acaaagaact ccttgatgca ggatagggat 720
gctgcatctg ctcgggcctg gcctaaaatg cacacagtca atggttatgt aaacaggtct 780
ctgccaggtc tgattggatg ccacaggaaa tcagtctatt ggcatgtgat tggaatgggc 840
accactcctg aagtgcactc aatattcctc gaaggtcaca catttcttgt gaggaaccat 900
cgccaggcgt ccttggaaat ctcgccaata actttcctta ctgctcaaac actcttgatg 960
gaccttggac agtttctact gttttgtcat atctcttccc accaacatga tggcatggaa 1020
gcttatgtca aagtagacag ctgtccagag gaaccccaac tacgaatgaa aaataatgaa 1080
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gatgacaact ctccttcctt tatccaaatt cgctcagttg ccaagaagca tcctaaaact 1200
tgggtacatt acattgctgc tgaagaggag gactgggact atgctccctt agtcctcgcc 1260
cccgatgaca gaagttataa aagtcaatat ttgaacaatg gccctcagcg gattggtagg 1320
aagtacaaaa aagtccgatt tatggcatac acagatgaaa cctttaagac tcgtgaagct 1380
attcagcatg aatcaggaat cttgggacct ttactttatg gggaagttgg agacacactg 1440
ttgattatat ttaagaatca agcaagcaga ccatataaca tctaccctca cggaatcact 1500
gatgtccgtc ctttgtattc aaggagatta ccaaaaggtg taaaacattt gaaggatttt 1560
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actaaatcag atcctcggtg cctgacccgc tattactcta gtttcgttaa tatggagaga 1680
gatctagctt caggactcat tggccctctc ctcatctgct acaaagaatc tgtagatcaa 1740
agaggaaacc agataatgtc agacaagagg aatgtcatcc tgttttctgt atttgatgag 1800
aaccgaagct ggtacctcac agagaatata caacgctttc tccccaatcc agctggagtg 1860
cagcttgagg atccagagtt ccaagcctcc aacatcatgc acagcatcaa tggctatgtt 1920
tttgatagtt tgcagttgtc agtttgtttg catgaggtgg catactggta cattctaagc 1980
attggagcac agactgactt cctttctgtc ttcttctctg gatatacctt caaacacaaa 2040
atggtctatg aagacacact caccctattc ccattctcag gagaaactgt cttcatgtcg 2100
atggaaaacc caggtctatg gattctgggg tgccacaact cagactttcg gaacagaggc 2160
atgaccgcct tactgaaggt ttctagttgt gacaagaaca ctggtgatta ttacgaggac 2220
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ttctctcaaa acccaccagt cttgaaacgc catcaacggg aaataactcg tactactctt 2340
cagtcagatc aagaggaaat tgactatgat gataccatat cagttgaaat gaagaaggaa 2400
gattttgaca tttatgatga ggatgaaaat cagagccccc gcagctttca aaagaaaaca 2460
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catgttctaa gaaacagggc tcagagtggc agtgtccctc agttcaagaa agttgttttc 2580
caggaattta ctgatggctc ctttactcag cccttatacc gtggagaact aaatgaacat 2640
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cagaggcaag gagcagaacc tagaaaaaac tttgtcaagc ctaatgaaac caaaacttac 2820
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tccggatcaa tcaatgcctg gagcaccaag gagccctttt cttggatcaa ggtggatctg 3600
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ctctacatct ctcagtttat catcatgtat agtcttgatg ggaagaagtg gcagacttat 3720
cgaggaaatt ccactggaac cttaatggtc ttctttggca atgtggattc atctgggata 3780
aaacacaata tttttaaccc tccaattatt gctcgataca tccgtttgca cccaactcat 3840
tatagcattc gcagcactct tcgcatggag ttgatgggct gtgatttaaa tagttgcagc 3900
atgccattgg gaatggagag taaagcaata tcagatgcac agattactgc ttcatcctac 3960
tttaccaata tgtttgccac ctggtctcct tcaaaagctc gacttcacct ccaagggagg 4020
agtaatgcct ggagacctca ggtgaataat ccaaaagagt ggctgcaagt ggacttccag 4080
aagacaatga aagtcacagg agtaactact cagggagtaa aatctctgct taccagcatg 4140
tatgtgaagg agttcctcat ctccagcagt caagatggcc atcagtggac tctctttttt 4200
cagaatggca aagtaaaggt ttttcaggga aatcaagact ccttcacacc tgtggtgaac 4260
tctctagacc caccgttact gactcgctac cttcgaattc acccccagag ttgggtgcac 4320
cagattgccc tgaggatgga ggttctgggc tgcgaggcac aggacctcta c 4371
<210> 69
<211> 2754
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pSYN-FVIII-161
<400> 69
Met Gln Ile Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys Leu Leu Arg Phe
1 5 10 15
Cys Phe Ser Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser
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Trp Asp Tyr Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg
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Phe Pro Pro Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val
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Tyr Lys Lys Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile
65 70 75 80
Ala Lys Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln
85 90 95
Ala Glu Val Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser
100 105 110
His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser
115 120 125
Glu Gly Ala Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp
130 135 140
Asp Lys Val Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu
145 150 155 160
Lys Glu Asn Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser
165 170 175
Tyr Leu Ser His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile
180 185 190
Gly Ala Leu Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr
195 200 205
Gln Thr Leu His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly
210 215 220
Lys Ser Trp His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp
225 230 235 240
Ala Ala Ser Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr
245 250 255
Val Asn Arg Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val
260 265 270
Tyr Trp His Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile
275 280 285
Phe Leu Glu Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser
290 295 300
Leu Glu Ile Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met
305 310 315 320
Asp Leu Gly Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His
325 330 335
Asp Gly Met Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro
340 345 350
Gln Leu Arg Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp
355 360 365
Leu Thr Asp Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser
370 375 380
Pro Ser Phe Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr
385 390 395 400
Trp Val His Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro
405 410 415
Leu Val Leu Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn
420 425 430
Asn Gly Pro Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met
435 440 445
Ala Tyr Thr Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu
450 455 460
Ser Gly Ile Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu
465 470 475 480
Leu Ile Ile Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro
485 490 495
His Gly Ile Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys
500 505 510
Gly Val Lys His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe
515 520 525
Lys Tyr Lys Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp
530 535 540
Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg
545 550 555 560
Asp Leu Ala Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu
565 570 575
Ser Val Asp Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val
580 585 590
Ile Leu Phe Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu
595 600 605
Asn Ile Gln Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp
610 615 620
Pro Glu Phe Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val
625 630 635 640
Phe Asp Ser Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp
645 650 655
Tyr Ile Leu Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe
660 665 670
Ser Gly Tyr Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr
675 680 685
Leu Phe Pro Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro
690 695 700
Gly Leu Trp Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly
705 710 715 720
Met Thr Ala Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp
725 730 735
Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys
740 745 750
Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Pro Pro Val Leu
755 760 765
Lys Arg His Gln Arg Glu Ile Thr Arg Thr Thr Leu Gln Ser Asp Gln
770 775 780
Glu Glu Ile Asp Tyr Asp Asp Thr Ile Ser Val Glu Met Lys Lys Glu
785 790 795 800
Asp Phe Asp Ile Tyr Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe
805 810 815
Gln Lys Lys Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp
820 825 830
Asp Tyr Gly Met Ser Ser Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg Ala Gln
835 840 845
Ser Gly Ser Val Pro Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr
850 855 860
Asp Gly Ser Phe Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu His
865 870 875 880
Leu Gly Leu Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile
885 890 895
Met Val Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser
900 905 910
Ser Leu Ile Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu Pro Arg
915 920 925
Lys Asn Phe Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp Lys Val
930 935 940
Gln His His Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys Ala Trp
945 950 955 960
Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His Ser Gly Leu
965 970 975
Ile Gly Pro Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu Asn Pro Ala His
980 985 990
Gly Arg Gln Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr Ile Phe
995 1000 1005
Asp Glu Thr Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Met Glu Arg Asn
1010 1015 1020
Cys Arg Ala Pro Cys Asn Ile Gln Met Glu Asp Pro Thr Phe Lys
1025 1030 1035
Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala Ile Asn Gly Tyr Ile Met Asp Thr
1040 1045 1050
Leu Pro Gly Leu Val Met Ala Gln Asp Gln Arg Ile Arg Trp Tyr
1055 1060 1065
Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn Ile His Ser Ile His Phe
1070 1075 1080
Ser Gly His Val Phe Thr Val Arg Lys Lys Glu Glu Tyr Lys Met
1085 1090 1095
Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly Val Phe Glu Thr Val Glu Met
1100 1105 1110
Leu Pro Ser Lys Ala Gly Ile Trp Arg Val Glu Cys Leu Ile Gly
1115 1120 1125
Glu His Leu His Ala Gly Met Ser Thr Leu Phe Leu Val Tyr Ser
1130 1135 1140
Asn Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Met Ala Ser Gly His Ile Arg
1145 1150 1155
Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp Ala Pro
1160 1165 1170
Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala Trp Ser
1175 1180 1185
Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val Asp Leu Leu Ala Pro
1190 1195 1200
Met Ile Ile His Gly Ile Lys Thr Gln Gly Ala Arg Gln Lys Phe
1205 1210 1215
Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp
1220 1225 1230
Gly Lys Lys Trp Gln Thr Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu
1235 1240 1245
Met Val Phe Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser Gly Ile Lys His Asn
1250 1255 1260
Ile Phe Asn Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro
1265 1270 1275
Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu Met Gly
1280 1285 1290
Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys
1295 1300 1305
Ala Ile Ser Asp Ala Gln Ile Thr Ala Ser Ser Tyr Phe Thr Asn
1310 1315 1320
Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala Arg Leu His Leu Gln
1325 1330 1335
Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro Gln Val Asn Asn Pro Lys Glu
1340 1345 1350
Trp Leu Gln Val Asp Phe Gln Lys Thr Met Lys Val Thr Gly Val
1355 1360 1365
Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr Val Lys
1370 1375 1380
Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gln Asp Gly His Gln Trp Thr Leu
1385 1390 1395
Phe Phe Gln Asn Gly Lys Val Lys Val Phe Gln Gly Asn Gln Asp
1400 1405 1410
Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu Leu Thr
1415 1420 1425
Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp Val His Gln Ile Ala
1430 1435 1440
Leu Arg Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu Tyr Asp
1445 1450 1455
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1460 1465 1470
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
1475 1480 1485
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
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Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
1505 1510 1515
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
1520 1525 1530
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
1535 1540 1545
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
1550 1555 1560
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
1565 1570 1575
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Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
1640 1645 1650
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
1655 1660 1665
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1670 1675 1680
Lys Arg Arg Arg Arg Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1685 1690 1695
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1700 1705 1710
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Lys Arg Arg Lys Arg Ser Leu Ser
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<211> 1984
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FVIII 195 (dual chain FVIIIFc with two 144 AE XTENs at amino acid
1656 and 1900)
<400> 73
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290 295 300
Leu Glu Ile Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met
305 310 315 320
Asp Leu Gly Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His
325 330 335
Asp Gly Met Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro
340 345 350
Gln Leu Arg Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp
355 360 365
Leu Thr Asp Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser
370 375 380
Pro Ser Phe Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr
385 390 395 400
Trp Val His Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro
405 410 415
Leu Val Leu Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn
420 425 430
Asn Gly Pro Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met
435 440 445
Ala Tyr Thr Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu
450 455 460
Ser Gly Ile Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu
465 470 475 480
Leu Ile Ile Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro
485 490 495
His Gly Ile Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys
500 505 510
Gly Val Lys His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe
515 520 525
Lys Tyr Lys Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp
530 535 540
Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg
545 550 555 560
Asp Leu Ala Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu
565 570 575
Ser Val Asp Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val
580 585 590
Ile Leu Phe Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu
595 600 605
Asn Ile Gln Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp
610 615 620
Pro Glu Phe Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val
625 630 635 640
Phe Asp Ser Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp
645 650 655
Tyr Ile Leu Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe
660 665 670
Ser Gly Tyr Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr
675 680 685
Leu Phe Pro Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro
690 695 700
Gly Leu Trp Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly
705 710 715 720
Met Thr Ala Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp
725 730 735
Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys
740 745 750
Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Pro Pro Val Leu
755 760 765
Lys Arg His Gln Arg Glu Ile Thr Arg Thr Thr Leu Gln Gly Ala Pro
770 775 780
Gly Thr Pro Gly Ser Gly Thr Ala Ser Ser Ser Pro Gly Ala Ser Pro
785 790 795 800
Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser
805 810 815
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820 825 830
Gly Ser Ser Pro Ser Ala Ser Thr Gly Thr Gly Pro Gly Thr Pro Gly
835 840 845
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850 855 860
Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro
865 870 875 880
Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro Gly Ser Ser Thr
885 890 895
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900 905 910
Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro
915 920 925
Ala Ser Ser Ser Asp Gln Glu Glu Ile Asp Tyr Asp Asp Thr Ile Ser
930 935 940
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945 950 955 960
Gln Ser Pro Arg Ser Phe Gln Lys Lys Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala
965 970 975
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980 985 990
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1010 1015 1020
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1025 1030 1035
Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile Met Val Thr Phe Arg Asn Gln
1040 1045 1050
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1055 1060 1065
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1070 1075 1080
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1085 1090 1095
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1100 1105 1110
Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His Ser Gly Leu Ile Gly
1115 1120 1125
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1130 1135 1140
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1220 1225 1230
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1235 1240 1245
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1250 1255 1260
Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Ser Pro Ala Gly
1265 1270 1275
Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr
1280 1285 1290
Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly
1295 1300 1305
Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ala
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Ser Ser Ala Pro Cys Asn Ile Gln Met Glu Asp Pro Thr Phe Lys
1325 1330 1335
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1340 1345 1350
Leu Pro Gly Leu Val Met Ala Gln Asp Gln Arg Ile Arg Trp Tyr
1355 1360 1365
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1370 1375 1380
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1400 1405 1410
Leu Pro Ser Lys Ala Gly Ile Trp Arg Val Glu Cys Leu Ile Gly
1415 1420 1425
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1430 1435 1440
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1445 1450 1455
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1460 1465 1470
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1475 1480 1485
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Met Ile Ile His Gly Ile Lys Thr Gln Gly Ala Arg Gln Lys Phe
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1520 1525 1530
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1535 1540 1545
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1550 1555 1560
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1580 1585 1590
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1595 1600 1605
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1610 1615 1620
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1625 1630 1635
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1655 1660 1665
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1730 1735 1740
Leu Arg Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu Tyr Asp
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1760 1765 1770
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
1775 1780 1785
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
1790 1795 1800
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1805 1810 1815
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1820 1825 1830
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1835 1840 1845
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1850 1855 1860
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1865 1870 1875
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1880 1885 1890
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1895 1900 1905
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1910 1915 1920
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1925 1930 1935
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
1940 1945 1950
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1955 1960 1965
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1970 1975 1980
Lys
<210> 74
<211> 2134
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FVIII 196 (dual chain FVIIIFc with three 144 AE XTENs at amino
acid 26, 1656 and 1900)
<400> 74
Met Gln Ile Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys Leu Leu Arg Phe
1 5 10 15
Cys Phe Ser Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser
20 25 30
Trp Asp Tyr Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Gly Ala Pro
35 40 45
Gly Ser Ser Pro Ser Ala Ser Thr Gly Thr Gly Pro Gly Ser Ser Pro
50 55 60
Ser Ala Ser Thr Gly Thr Gly Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser
65 70 75 80
Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro
85 90 95
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100 105 110
Ser Ala Ser Thr Gly Thr Gly Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser
115 120 125
Thr Gly Ser Pro Gly Ser Ser Pro Ser Ala Ser Thr Gly Thr Gly Pro
130 135 140
Gly Thr Pro Gly Ser Gly Thr Ala Ser Ser Ser Pro Gly Ser Ser Thr
145 150 155 160
Pro Ser Gly Ala Thr Gly Ser Pro Gly Ser Ser Thr Pro Ser Gly Ala
165 170 175
Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro
180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Leu Gly Pro Thr Ile Gln Ala Glu Val Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr
245 250 255
Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val
260 265 270
Ser Tyr Trp Lys Ala Ser Glu Gly Ala Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser
275 280 285
Gln Arg Glu Lys Glu Asp Asp Lys Val Phe Pro Gly Gly Ser His Thr
290 295 300
Tyr Val Trp Gln Val Leu Lys Glu Asn Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro
305 310 315 320
Leu Cys Leu Thr Tyr Ser Tyr Leu Ser His Val Asp Leu Val Lys Asp
325 330 335
Leu Asn Ser Gly Leu Ile Gly Ala Leu Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser
340 345 350
Leu Ala Lys Glu Lys Thr Gln Thr Leu His Lys Phe Ile Leu Leu Phe
355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
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405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
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450 455 460
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465 470 475 480
Ile Ser Ser His Gln His Asp Gly Met Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp
485 490 495
Ser Cys Pro Glu Glu Pro Gln Leu Arg Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala
500 505 510
Glu Asp Tyr Asp Asp Asp Leu Thr Asp Ser Glu Met Asp Val Val Arg
515 520 525
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530 535 540
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545 550 555 560
Asp Trp Asp Tyr Ala Pro Leu Val Leu Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr
565 570 575
Lys Ser Gln Tyr Leu Asn Asn Gly Pro Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr
580 585 590
Lys Lys Val Arg Phe Met Ala Tyr Thr Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg
595 600 605
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610 615 620
Glu Val Gly Asp Thr Leu Leu Ile Ile Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg
625 630 635 640
Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro His Gly Ile Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr
645 650 655
Ser Arg Arg Leu Pro Lys Gly Val Lys His Leu Lys Asp Phe Pro Ile
660 665 670
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675 680 685
Gly Pro Thr Lys Ser Asp Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser
690 695 700
Phe Val Asn Met Glu Arg Asp Leu Ala Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu
705 710 715 720
Leu Ile Cys Tyr Lys Glu Ser Val Asp Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met
725 730 735
Ser Asp Lys Arg Asn Val Ile Leu Phe Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg
740 745 750
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755 760 765
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770 775 780
Ser Ile Asn Gly Tyr Val Phe Asp Ser Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu
785 790 795 800
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805 810 815
Phe Leu Ser Val Phe Phe Ser Gly Tyr Thr Phe Lys His Lys Met Val
820 825 830
Tyr Glu Asp Thr Leu Thr Leu Phe Pro Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe
835 840 845
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850 855 860
Asp Phe Arg Asn Arg Gly Met Thr Ala Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys
865 870 875 880
Asp Lys Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser
885 890 895
Ala Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser
900 905 910
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915 920 925
Thr Leu Gln Gly Ala Pro Gly Thr Pro Gly Ser Gly Thr Ala Ser Ser
930 935 940
Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro Gly Ala
945 950 955 960
Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr
965 970 975
Ser Ser Thr Gly Ser Pro Gly Ser Ser Pro Ser Ala Ser Thr Gly Thr
980 985 990
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995 1000 1005
Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly
1010 1015 1020
Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser
1025 1030 1035
Thr Gly Ser Pro Gly Ser Ser Thr Pro Ser Gly Ala Thr Gly Ser
1040 1045 1050
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1055 1060 1065
Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro Ala Ser Ser Ser Asp
1070 1075 1080
Gln Glu Glu Ile Asp Tyr Asp Asp Thr Ile Ser Val Glu Met Lys
1085 1090 1095
Lys Glu Asp Phe Asp Ile Tyr Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser Pro
1100 1105 1110
Arg Ser Phe Gln Lys Lys Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Val
1115 1120 1125
Glu Arg Leu Trp Asp Tyr Gly Met Ser Ser Ser Pro His Val Leu
1130 1135 1140
Arg Asn Arg Ala Gln Ser Gly Ser Val Pro Gln Phe Lys Lys Val
1145 1150 1155
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Arg Gly Glu Leu Asn Glu His Leu Gly Leu Leu Gly Pro Tyr Ile
1175 1180 1185
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1235 1240 1245
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1250 1255 1260
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1265 1270 1275
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1280 1285 1290
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1310 1315 1320
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1325 1330 1335
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1340 1345 1350
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1355 1360 1365
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1370 1375 1380
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1385 1390 1395
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1400 1405 1410
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1415 1420 1425
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1430 1435 1440
Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly
1445 1450 1455
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1475 1480 1485
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1505 1510 1515
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1550 1555 1560
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1565 1570 1575
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1580 1585 1590
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1595 1600 1605
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1610 1615 1620
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1625 1630 1635
Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val Asp Leu Leu Ala Pro
1640 1645 1650
Met Ile Ile His Gly Ile Lys Thr Gln Gly Ala Arg Gln Lys Phe
1655 1660 1665
Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp
1670 1675 1680
Gly Lys Lys Trp Gln Thr Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu
1685 1690 1695
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1700 1705 1710
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1715 1720 1725
Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu Met Gly
1730 1735 1740
Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys
1745 1750 1755
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1760 1765 1770
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1775 1780 1785
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1835 1840 1845
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1850 1855 1860
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1940 1945 1950
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1985 1990 1995
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2000 2005 2010
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
2015 2020 2025
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
2030 2035 2040
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
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Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
2060 2065 2070
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
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Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
2090 2095 2100
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
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Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
2120 2125 2130
Lys
<210> 75
<211> 1984
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FVIII 199 (single chain FVIIIFc with three 144 AE XTENs at amino
acid 1656 and 1900)
<400> 75
Met Gln Ile Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys Leu Leu Arg Phe
1 5 10 15
Cys Phe Ser Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser
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Trp Asp Tyr Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg
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Tyr Lys Lys Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile
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His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser
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Asp Lys Val Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu
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Gly Ala Leu Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr
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210 215 220
Lys Ser Trp His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp
225 230 235 240
Ala Ala Ser Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr
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Val Asn Arg Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FVIII 201 (single chain FVIIIFc with three 144 AE XTENs at amino
acid 26, 1656 &1900)
<400> 76
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245 250 255
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260 265 270
Ser Tyr Trp Lys Ala Ser Glu Gly Ala Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser
275 280 285
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Leu Cys Leu Thr Tyr Ser Tyr Leu Ser His Val Asp Leu Val Lys Asp
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Leu Asn Ser Gly Leu Ile Gly Ala Leu Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser
340 345 350
Leu Ala Lys Glu Lys Thr Gln Thr Leu His Lys Phe Ile Leu Leu Phe
355 360 365
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Lys Ser Gln Tyr Leu Asn Asn Gly Pro Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr
580 585 590
Lys Lys Val Arg Phe Met Ala Tyr Thr Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg
595 600 605
Glu Ala Ile Gln His Glu Ser Gly Ile Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly
610 615 620
Glu Val Gly Asp Thr Leu Leu Ile Ile Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg
625 630 635 640
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645 650 655
Ser Arg Arg Leu Pro Lys Gly Val Lys His Leu Lys Asp Phe Pro Ile
660 665 670
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675 680 685
Gly Pro Thr Lys Ser Asp Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser
690 695 700
Phe Val Asn Met Glu Arg Asp Leu Ala Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu
705 710 715 720
Leu Ile Cys Tyr Lys Glu Ser Val Asp Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met
725 730 735
Ser Asp Lys Arg Asn Val Ile Leu Phe Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg
740 745 750
Ser Trp Tyr Leu Thr Glu Asn Ile Gln Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala
755 760 765
Gly Val Gln Leu Glu Asp Pro Glu Phe Gln Ala Ser Asn Ile Met His
770 775 780
Ser Ile Asn Gly Tyr Val Phe Asp Ser Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu
785 790 795 800
His Glu Val Ala Tyr Trp Tyr Ile Leu Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp
805 810 815
Phe Leu Ser Val Phe Phe Ser Gly Tyr Thr Phe Lys His Lys Met Val
820 825 830
Tyr Glu Asp Thr Leu Thr Leu Phe Pro Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe
835 840 845
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850 855 860
Asp Phe Arg Asn Arg Gly Met Thr Ala Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys
865 870 875 880
Asp Lys Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser
885 890 895
Ala Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser
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930 935 940
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Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr
965 970 975
Ser Ser Thr Gly Ser Pro Gly Ser Ser Pro Ser Ala Ser Thr Gly Thr
980 985 990
Gly Pro Gly Thr Pro Gly Ser Gly Thr Ala Ser Ser Ser Pro Gly Ala
995 1000 1005
Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly
1010 1015 1020
Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser
1025 1030 1035
Thr Gly Ser Pro Gly Ser Ser Thr Pro Ser Gly Ala Thr Gly Ser
1040 1045 1050
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1055 1060 1065
Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro Ala Ser Ser Ser Asp
1070 1075 1080
Gln Glu Glu Ile Asp Tyr Asp Asp Thr Ile Ser Val Glu Met Lys
1085 1090 1095
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1100 1105 1110
Arg Ser Phe Gln Lys Lys Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Val
1115 1120 1125
Glu Arg Leu Trp Asp Tyr Gly Met Ser Ser Ser Pro His Val Leu
1130 1135 1140
Arg Asn Arg Ala Gln Ser Gly Ser Val Pro Gln Phe Lys Lys Val
1145 1150 1155
Val Phe Gln Glu Phe Thr Asp Gly Ser Phe Thr Gln Pro Leu Tyr
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Arg Gly Glu Leu Asn Glu His Leu Gly Leu Leu Gly Pro Tyr Ile
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Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile Met Val Thr Phe Arg Asn Gln
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Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser Ser Leu Ile Ser Tyr Glu
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Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu Pro Arg Lys Asn Phe Val Lys
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1325 1330 1335
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1340 1345 1350
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1355 1360 1365
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1370 1375 1380
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Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr
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Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly
1445 1450 1455
Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ala
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1535 1540 1545
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Leu Pro Ser Lys Ala Gly Ile Trp Arg Val Glu Cys Leu Ile Gly
1565 1570 1575
Glu His Leu His Ala Gly Met Ser Thr Leu Phe Leu Val Tyr Ser
1580 1585 1590
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1595 1600 1605
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Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly Lys Ser Trp His Ser Glu
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Cys Gln Glu Arg Cys Val Asp Gly Cys Ser Cys Pro Glu Gly Gln Leu
325 330 335
Leu Asp Glu Gly Leu Cys Val Glu Ser Thr Glu Cys Pro Cys Val His
340 345 350
Ser Gly Lys Arg Tyr Pro Pro Gly Thr Ser Leu Ser Arg Asp Cys Asn
355 360 365
Thr Cys Ile Cys Arg Asn Ser Gln Trp Ile Cys Ser Asn Glu Glu Cys
370 375 380
Pro Gly Glu Cys Leu Val Thr Gly Gln Ser His Phe Lys Ser Phe Asp
385 390 395 400
Asn Arg Tyr Phe Thr Phe Ser Gly Ile Cys Gln Tyr Leu Leu Ala Arg
405 410 415
Asp Cys Gln Asp His Ser Phe Ser Ile Val Ile Glu Thr Val Gln Cys
420 425 430
Ala Asp Asp Arg Asp Ala Val Cys Thr Arg Ser Val Thr Val Arg Leu
435 440 445
Pro Gly Leu His Asn Ser Leu Val Lys Leu Lys His Gly Ala Gly Val
450 455 460
Ala Met Asp Gly Gln Asp Ile Gln Leu Pro Leu Leu Lys Gly Asp Leu
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Arg Ile Gln His Thr Val Thr Ala Ser Val Arg Leu Ser Tyr Gly Glu
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Asp Leu Gln Met Asp Trp Asp Gly Arg Gly Arg Leu Leu Val Lys Leu
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545 550 555 560
Asp Leu Gln Lys Gln His Ser Asp Pro Cys Ala Leu Asn Pro Arg Met
565 570 575
Thr Arg Phe Ser Glu Glu Ala Cys Ala Val Leu Thr Ser Pro Thr Phe
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Ala Leu Ala Ser Tyr Ala Ala Ala Cys Ala Gly Arg Gly Val Arg Val
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725 730 735
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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Val Pro Arg Gly Ser
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr
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130 135 140
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325 330 335
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370 375 380
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Ala Asp Asp Arg Asp Ala Val Cys Thr Arg Ser Val Thr Val Arg Leu
435 440 445
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450 455 460
Ala Met Asp Gly Gln Asp Ile Gln Leu Pro Leu Leu Lys Gly Asp Leu
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485 490 495
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1-20 times
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Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
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Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
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<212> PRT
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<223> Linker
<400> 97
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
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Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 99
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker, where the sequence can be repeated between 1-00 times or
1-20 times
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Gly Gly Gly Ser
1
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<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cleavage site
<400> 102
Arg Arg Arg Arg
1
<210> 103
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cleavage site
<400> 103
Arg Lys Arg Arg Lys Arg
1 5
<210> 104
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cleavage site
<400> 104
Arg Arg Arg Arg Ser
1 5
<210> 105
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Thrombin cleavable site
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa is an aliphatic amino acid
<400> 105
Xaa Val Pro Arg
1
<210> 106
<211> 34
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cleavable linker
<400> 106
Ile Ser Asp Lys Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu Asp
1 5 10 15
Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser
20 25 30
Phe Ser
<210> 107
<211> 40
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cleavable linker
<400> 107
Ile Ser Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp Leu
1 5 10 15
Thr Asp Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser Pro
20 25 30
Ser Phe Ile Gln Ile Arg Ser Val
35 40
<210> 108
<211> 46
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cleavable linker
<400> 108
Ile Ser Glu Ile Thr Arg Thr Thr Leu Gln Ser Asp Gln Glu Glu Ile
1 5 10 15
Asp Tyr Asp Asp Thr Ile Ser Val Glu Met Lys Lys Glu Asp Phe Asp
20 25 30
Ile Tyr Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe Gln
35 40 45
<210> 109
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PAR1 exosite interaction motif
<400> 109
Ser Phe Leu Leu Arg Asn
1 5
<210> 110
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PAR1 exosite interaction motif
<400> 110
Pro Asn Asp Lys
1
<210> 111
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PAR1 exosite interaction motif
<400> 111
Pro Asn Asp Lys Tyr
1 5
<210> 112
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PAR1 exosite interaction motif
<400> 112
Pro Asn Asp Lys Tyr Glu
1 5
<210> 113
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PAR1 exosite interaction motif
<400> 113
Pro Asn Asp Lys Tyr Glu Pro
1 5
<210> 114
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PAR1 exosite interaction motif
<400> 114
Pro Asn Asp Lys Tyr Glu Pro Phe
1 5
<210> 115
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PAR1 exosite interaction motif
<400> 115
Pro Asn Asp Lys Tyr Glu Pro Phe Trp
1 5
<210> 116
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PAR1 exosite interaction motif
<400> 116
Pro Asn Asp Lys Tyr Glu Pro Phe Trp Glu
1 5 10
<210> 117
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PAR1 exosite interaction motif
<400> 117
Pro Asn Asp Lys Tyr Glu Pro Phe Trp Glu Asp
1 5 10
<210> 118
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PAR1 exosite interaction motif
<400> 118
Pro Asn Asp Lys Tyr Glu Pro Phe Trp Glu Asp Glu
1 5 10
<210> 119
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PAR1 exosite interaction motif
<400> 119
Pro Asn Asp Lys Tyr Glu Pro Phe Trp Glu Asp Glu Glu
1 5 10
<210> 120
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PAR1 exosite interaction motif
<400> 120
Pro Asn Asp Lys Tyr Glu Pro Phe Trp Glu Asp Glu Glu Ser
1 5 10
<210> 121
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FXIa cleavage site
<400> 121
Lys Leu Thr Arg Ala Glu Thr
1 5
<210> 122
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FXIa cleavage site
<400> 122
Asp Phe Thr Arg Val Val Gly
1 5
<210> 123
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FXIIa cleavage site
<400> 123
Thr Met Thr Arg Ile Val Gly Gly
1 5
<210> 124
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Kallikrein cleavage site
<400> 124
Ser Pro Phe Arg Ser Thr Gly Gly
1 5
<210> 125
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FVIIa cleavage site
<400> 125
Leu Gln Val Arg Ile Val Gly Gly
1 5
<210> 126
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FIXa cleavage site
<400> 126
Pro Leu Gly Arg Ile Val Gly Gly
1 5
<210> 127
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FXa cleavage site
<400> 127
Ile Glu Gly Arg Thr Val Gly Gly
1 5
<210> 128
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FIIa (thrombin) cleavage site
<400> 128
Leu Thr Pro Arg Ser Leu Leu Val
1 5
<210> 129
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Elastase-2 cleavage site
<400> 129
Leu Gly Pro Val Ser Gly Val Pro
1 5
<210> 130
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Granzyme-B cleavage
<400> 130
Val Ala Gly Asp Ser Leu Glu Glu
1 5
<210> 131
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MMP-12 cleavage site
<400> 131
Gly Pro Ala Gly Leu Gly Gly Ala
1 5
<210> 132
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MMP-13 cleavage site
<400> 132
Gly Pro Ala Gly Leu Arg Gly Ala
1 5
<210> 133
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MMP-17 cleavage site
<400> 133
Ala Pro Leu Gly Leu Arg Leu Arg
1 5
<210> 134
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MMP-20 cleavage site
<400> 134
Pro Ala Leu Pro Leu Val Ala Gln
1 5
<210> 135
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TEV cleavage site
<400> 135
Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly
1 5
<210> 136
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Enterokinase cleavage site
<400> 136
Asp Asp Asp Lys Ile Val Gly Gly
1 5
<210> 137
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Protease 3C (PRESCISSION) cleavage site
<400> 137
Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro
1 5
<210> 138
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sortase A cleavage site
<400> 138
Leu Pro Lys Thr Gly Ser Glu Ser
1 5
<210> 139
<211> 31
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cleavable linker
<400> 139
Lys Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala
1 5 10 15
Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser
20 25 30
<210> 140
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cleavable linker
<400> 140
Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr
1 5 10 15
Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser
20 25 30
<210> 141
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cleavable linker
<400> 141
Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu
1 5 10 15
Leu Ser Lys Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser
20 25
<210> 142
<211> 28
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cleavable linker
<400> 142
Gly Asp Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu
1 5 10 15
Ser Lys Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser
20 25
<210> 143
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cleavable linker
<400> 143
Asp Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser
1 5 10 15
Lys Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser
20 25
<210> 144
<211> 26
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cleavable linker
<400> 144
Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys
1 5 10 15
Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser
20 25
<210> 145
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Thrombin cleavage site
<400> 145
Ala Leu Arg Pro Arg Val Val Gly Gly Ala
1 5 10
<210> 146
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 146
Thr Leu Asp Pro Arg Ser Phe Leu Leu Arg Asn Pro Asn Asp Lys Tyr
1 5 10 15
Glu Pro Phe Trp Glu Asp Glu Glu Lys
20 25
<210> 147
<211> 4548
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VWF031
<400> 147
atgattcctg ccagatttgc cggggtgctg cttgctctgg ccctcatttt gccagggacc 60
ctttgtgcag aaggaactcg cggcaggtca tccacggccc gatgcagcct tttcggaagt 120
gacttcgtca acacctttga tgggagcatg tacagctttg cgggatactg cagttacctc 180
ctggcagggg gctgccagaa acgctccttc tcgattattg gggacttcca gaatggcaag 240
agagtgagcc tctccgtgta tcttggggaa ttttttgaca tccatttgtt tgtcaatggt 300
accgtgacac agggggacca aagagtctcc atgccctatg cctccaaagg gctgtatcta 360
gaaactgagg ctgggtacta caagctgtcc ggtgaggcct atggctttgt ggccaggatc 420
gatggcagcg gcaactttca agtcctgctg tcagacagat acttcaacaa gacctgcggg 480
ctgtgtggca actttaacat ctttgctgaa gatgacttta tgacccaaga agggaccttg 540
acctcggacc cttatgactt tgccaactca tgggctctga gcagtggaga acagtggtgt 600
gaacgggcat ctcctcccag cagctcatgc aacatctcct ctggggaaat gcagaagggc 660
ctgtgggagc agtgccagct tctgaagagc acctcggtgt ttgcccgctg ccaccctctg 720
gtggaccccg agccttttgt ggccctgtgt gagaagactt tgtgtgagtg tgctgggggg 780
ctggagtgcg cctgccctgc cctcctggag tacgcccgga cctgtgccca ggagggaatg 840
gtgctgtacg gctggaccga ccacagcgcg tgcagcccag tgtgccctgc tggtatggag 900
tataggcagt gtgtgtcccc ttgcgccagg acctgccaga gcctgcacat caatgaaatg 960
tgtcaggagc gatgcgtgga tggctgcagc tgccctgagg gacagctcct ggatgaaggc 1020
ctctgcgtgg agagcaccga gtgtccctgc gtgcattccg gaaagcgcta ccctcccggc 1080
acctccctct ctcgagactg caacacctgc atttgccgaa acagccagtg gatctgcagc 1140
aatgaagaat gtccagggga gtgccttgtc actggtcaat cccacttcaa gagctttgac 1200
aacagatact tcaccttcag tgggatctgc cagtacctgc tggcccggga ttgccaggac 1260
cactccttct ccattgtcat tgagactgtc cagtgtgctg atgaccgcga cgctgtgtgc 1320
acccgctccg tcaccgtccg gctgcctggc ctgcacaaca gccttgtgaa actgaagcat 1380
ggggcaggag ttgccatgga tggccaggac atccagctcc ccctcctgaa aggtgacctc 1440
cgcatccagc atacagtgac ggcctccgtg cgcctcagct acggggagga cctgcagatg 1500
gactgggatg gccgcgggag gctgctggtg aagctgtccc ccgtctatgc cgggaagacc 1560
tgcggcctgt gtgggaatta caatggcaac cagggcgacg acttccttac cccctctggg 1620
ctggcggagc cccgggtgga ggacttcggg aacgcctgga agctgcacgg ggactgccag 1680
gacctgcaga agcagcacag cgatccctgc gccctcaacc cgcgcatgac caggttctcc 1740
gaggaggcgt gcgcggtcct gacgtccccc acattcgagg cctgccatcg tgccgtcagc 1800
ccgctgccct acctgcggaa ctgccgctac gacgtgtgct cctgctcgga cggccgcgag 1860
tgcctgtgcg gcgccctggc cagctatgcc gcggcctgcg cggggagagg cgtgcgcgtc 1920
gcgtggcgcg agccaggccg ctgtgagctg aactgcccga aaggccaggt gtacctgcag 1980
tgcgggaccc cctgcaacct gacctgccgc tctctctctt acccggatga ggaatgcaat 2040
gaggcctgcc tggagggctg cttctgcccc ccagggctct acatggatga gaggggggac 2100
tgcgtgccca aggcccagtg cccctgttac tatgacggtg agatcttcca gccagaagac 2160
atcttctcag accatcacac catgtgctac tgtgaggatg gcttcatgca ctgtaccatg 2220
agtggagtcc ccggaagctt gctgcctgac gctgtcctca gcagtcccct gtctcatcgc 2280
agcaaaagga gcctatcctg tcggcccccc atggtcaagc tggtgtgtcc cgctgacaac 2340
ctgcgggctg aagggctcga gtgtaccaaa acgtgccaga actatgacct ggagtgcatg 2400
agcatgggct gtgtctctgg ctgcctctgc cccccgggca tggtccggca tgagaacaga 2460
tgtgtggccc tggaaaggtg tccctgcttc catcagggca aggagtatgc ccctggagaa 2520
acagtgaaga ttggctgcaa cacttgtgtc tgtcgggacc ggaagtggaa ctgcacagac 2580
catgtgtgtg atgccacgtg ctccacgatc ggcatggccc actacctcac cttcgacggg 2640
ctcaaatacc tgttccccgg ggagtgccag tacgttctgg tgcaggatta ctgcggcagt 2700
aaccctggga cctttcggat cctagtgggg aataagggat gcagccaccc ctcagtgaaa 2760
tgcaagaaac gggtcaccat cctggtggag ggaggagaga ttgagctgtt tgacggggag 2820
gtgaatgtga agaggcccat gaaggatgag actcactttg aggtggtgga gtctggccgg 2880
tacatcattc tgctgctggg caaagccctc tccgtggtct gggaccgcca cctgagcatc 2940
tccgtggtcc tgaagcagac ataccaggag aaagtgtgtg gcctgtgtgg gaattttgat 3000
ggcatccaga acaatgacct caccagcagc aacctccaag tggaggaaga ccctgtggac 3060
tttgggaact cctggaaagt gagctcgcag tgtgctgaca ccagaaaagt gcctctggac 3120
tcatcccctg ccacctgcca taacaacatc atgaagcaga cgatggtgga ttcctcctgt 3180
agaatcctta ccagtgacgt cttccaggac tgcaacaagc tggtggaccc cgagccatat 3240
ctggatgtct gcatttacga cacctgctcc tgtgagtcca ttggggactg cgccgcattc 3300
tgcgacacca ttgctgccta tgcccacgtg tgtgcccagc atggcaaggt ggtgacctgg 3360
aggacggcca cattgtgccc ccagagctgc gaggagagga atctccggga gaacgggtat 3420
gaggctgagt ggcgctataa cagctgtgca cctgcctgtc aagtcacgtg tcagcaccct 3480
gagccactgg cctgccctgt gcagtgtgtg gagggctgcc atgcccactg ccctccaggg 3540
aaaatcctgg atgagctttt gcagacctgc gttgaccctg aagactgtcc agtgtgtgag 3600
gtggctggcc ggcgttttgc ctcaggaaag aaagtcacct tgaatcccag tgaccctgag 3660
cactgccaga tttgccactg tgatgttgtc aacctcacct gtgaagcctg ccaggagccg 3720
atatctggcg gtggaggttc cggtggcggg ggatccggcg gtggaggttc cggcggtgga 3780
ggttccggtg gcgggggatc cggtggcggg ggatccctgg tcccccgggg cagcggcggt 3840
ggaggttccg gtggcggggg atccgacaaa actcacacat gcccaccgtg cccagctcca 3900
gaactcctgg gcggaccgtc agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga caccctcatg 3960
atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga agaccctgag 4020
gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg 4080
gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac 4140
tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aagccctccc agcccccatc 4200
gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc 4260
ccatcccgcg atgagctgac caagaaccag gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc 4320
tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa caactacaag 4380
accacgcctc ccgtgttgga ctccgacggc tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg 4440
gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg 4500
cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc ctgtctccgg gtaaatga 4548
<210> 148
<211> 5379
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VWF034
<400> 148
atgattcctg ccagatttgc cggggtgctg cttgctctgg ccctcatttt gccagggacc 60
ctttgtgcag aaggaactcg cggcaggtca tccacggccc gatgcagcct tttcggaagt 120
gacttcgtca acacctttga tgggagcatg tacagctttg cgggatactg cagttacctc 180
ctggcagggg gctgccagaa acgctccttc tcgattattg gggacttcca gaatggcaag 240
agagtgagcc tctccgtgta tcttggggaa ttttttgaca tccatttgtt tgtcaatggt 300
accgtgacac agggggacca aagagtctcc atgccctatg cctccaaagg gctgtatcta 360
gaaactgagg ctgggtacta caagctgtcc ggtgaggcct atggctttgt ggccaggatc 420
gatggcagcg gcaactttca agtcctgctg tcagacagat acttcaacaa gacctgcggg 480
ctgtgtggca actttaacat ctttgctgaa gatgacttta tgacccaaga agggaccttg 540
acctcggacc cttatgactt tgccaactca tgggctctga gcagtggaga acagtggtgt 600
gaacgggcat ctcctcccag cagctcatgc aacatctcct ctggggaaat gcagaagggc 660
ctgtgggagc agtgccagct tctgaagagc acctcggtgt ttgcccgctg ccaccctctg 720
gtggaccccg agccttttgt ggccctgtgt gagaagactt tgtgtgagtg tgctgggggg 780
ctggagtgcg cctgccctgc cctcctggag tacgcccgga cctgtgccca ggagggaatg 840
gtgctgtacg gctggaccga ccacagcgcg tgcagcccag tgtgccctgc tggtatggag 900
tataggcagt gtgtgtcccc ttgcgccagg acctgccaga gcctgcacat caatgaaatg 960
tgtcaggagc gatgcgtgga tggctgcagc tgccctgagg gacagctcct ggatgaaggc 1020
ctctgcgtgg agagcaccga gtgtccctgc gtgcattccg gaaagcgcta ccctcccggc 1080
acctccctct ctcgagactg caacacctgc atttgccgaa acagccagtg gatctgcagc 1140
aatgaagaat gtccagggga gtgccttgtc actggtcaat cccacttcaa gagctttgac 1200
aacagatact tcaccttcag tgggatctgc cagtacctgc tggcccggga ttgccaggac 1260
cactccttct ccattgtcat tgagactgtc cagtgtgctg atgaccgcga cgctgtgtgc 1320
acccgctccg tcaccgtccg gctgcctggc ctgcacaaca gccttgtgaa actgaagcat 1380
ggggcaggag ttgccatgga tggccaggac atccagctcc ccctcctgaa aggtgacctc 1440
cgcatccagc atacagtgac ggcctccgtg cgcctcagct acggggagga cctgcagatg 1500
gactgggatg gccgcgggag gctgctggtg aagctgtccc ccgtctatgc cgggaagacc 1560
tgcggcctgt gtgggaatta caatggcaac cagggcgacg acttccttac cccctctggg 1620
ctggcggagc cccgggtgga ggacttcggg aacgcctgga agctgcacgg ggactgccag 1680
gacctgcaga agcagcacag cgatccctgc gccctcaacc cgcgcatgac caggttctcc 1740
gaggaggcgt gcgcggtcct gacgtccccc acattcgagg cctgccatcg tgccgtcagc 1800
ccgctgccct acctgcggaa ctgccgctac gacgtgtgct cctgctcgga cggccgcgag 1860
tgcctgtgcg gcgccctggc cagctatgcc gcggcctgcg cggggagagg cgtgcgcgtc 1920
gcgtggcgcg agccaggccg ctgtgagctg aactgcccga aaggccaggt gtacctgcag 1980
tgcgggaccc cctgcaacct gacctgccgc tctctctctt acccggatga ggaatgcaat 2040
gaggcctgcc tggagggctg cttctgcccc ccagggctct acatggatga gaggggggac 2100
tgcgtgccca aggcccagtg cccctgttac tatgacggtg agatcttcca gccagaagac 2160
atcttctcag accatcacac catgtgctac tgtgaggatg gcttcatgca ctgtaccatg 2220
agtggagtcc ccggaagctt gctgcctgac gctgtcctca gcagtcccct gtctcatcgc 2280
agcaaaagga gcctatcctg tcggcccccc atggtcaagc tggtgtgtcc cgctgacaac 2340
ctgcgggctg aagggctcga gtgtaccaaa acgtgccaga actatgacct ggagtgcatg 2400
agcatgggct gtgtctctgg ctgcctctgc cccccgggca tggtccggca tgagaacaga 2460
tgtgtggccc tggaaaggtg tccctgcttc catcagggca aggagtatgc ccctggagaa 2520
acagtgaaga ttggctgcaa cacttgtgtc tgtcgggacc ggaagtggaa ctgcacagac 2580
catgtgtgtg atgccacgtg ctccacgatc ggcatggccc actacctcac cttcgacggg 2640
ctcaaatacc tgttccccgg ggagtgccag tacgttctgg tgcaggatta ctgcggcagt 2700
aaccctggga cctttcggat cctagtgggg aataagggat gcagccaccc ctcagtgaaa 2760
tgcaagaaac gggtcaccat cctggtggag ggaggagaga ttgagctgtt tgacggggag 2820
gtgaatgtga agaggcccat gaaggatgag actcactttg aggtggtgga gtctggccgg 2880
tacatcattc tgctgctggg caaagccctc tccgtggtct gggaccgcca cctgagcatc 2940
tccgtggtcc tgaagcagac ataccaggag aaagtgtgtg gcctgtgtgg gaattttgat 3000
ggcatccaga acaatgacct caccagcagc aacctccaag tggaggaaga ccctgtggac 3060
tttgggaact cctggaaagt gagctcgcag tgtgctgaca ccagaaaagt gcctctggac 3120
tcatcccctg ccacctgcca taacaacatc atgaagcaga cgatggtgga ttcctcctgt 3180
agaatcctta ccagtgacgt cttccaggac tgcaacaagc tggtggaccc cgagccatat 3240
ctggatgtct gcatttacga cacctgctcc tgtgagtcca ttggggactg cgccgcattc 3300
tgcgacacca ttgctgccta tgcccacgtg tgtgcccagc atggcaaggt ggtgacctgg 3360
aggacggcca cattgtgccc ccagagctgc gaggagagga atctccggga gaacgggtat 3420
gaggctgagt ggcgctataa cagctgtgca cctgcctgtc aagtcacgtg tcagcaccct 3480
gagccactgg cctgccctgt gcagtgtgtg gagggctgcc atgcccactg ccctccaggg 3540
aaaatcctgg atgagctttt gcagacctgc gttgaccctg aagactgtcc agtgtgtgag 3600
gtggctggcc ggcgttttgc ctcaggaaag aaagtcacct tgaatcccag tgaccctgag 3660
cactgccaga tttgccactg tgatgttgtc aacctcacct gtgaagcctg ccaggagccg 3720
atatcgggta cctcagagtc tgctaccccc gagtcagggc caggatcaga gccagccacc 3780
tccgggtctg agacacccgg gacttccgag agtgccaccc ctgagtccgg acccgggtcc 3840
gagcccgcca cttccggctc cgaaactccc ggcacaagcg agagcgctac cccagagtca 3900
ggaccaggaa catctacaga gccctctgaa ggctccgctc cagggtcccc agccggcagt 3960
cccactagca ccgaggaggg aacctctgaa agcgccacac ccgaatcagg gccagggtct 4020
gagcctgcta ccagcggcag cgagacacca ggcacctctg agtccgccac accagagtcc 4080
ggacccggat ctcccgctgg gagccccacc tccactgagg agggatctcc tgctggctct 4140
ccaacatcta ctgaggaagg tacctcaacc gagccatccg agggatcagc tcccggcacc 4200
tcagagtcgg caaccccgga gtctggaccc ggaacttccg aaagtgccac accagagtcc 4260
ggtcccggga cttcagaatc agcaacaccc gagtccggcc ctgggtctga acccgccaca 4320
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ggcggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 4800
acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 4860
aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 4920
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ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 5040
atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 5100
gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 5160
gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 5220
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tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaatga 5379
<210> 149
<211> 4548
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VWF050 (IHH triple mutant)
<400> 149
atgattcctg ccagatttgc cggggtgctg cttgctctgg ccctcatttt gccagggacc 60
ctttgtgcag aaggaactcg cggcaggtca tccacggccc gatgcagcct tttcggaagt 120
gacttcgtca acacctttga tgggagcatg tacagctttg cgggatactg cagttacctc 180
ctggcagggg gctgccagaa acgctccttc tcgattattg gggacttcca gaatggcaag 240
agagtgagcc tctccgtgta tcttggggaa ttttttgaca tccatttgtt tgtcaatggt 300
accgtgacac agggggacca aagagtctcc atgccctatg cctccaaagg gctgtatcta 360
gaaactgagg ctgggtacta caagctgtcc ggtgaggcct atggctttgt ggccaggatc 420
gatggcagcg gcaactttca agtcctgctg tcagacagat acttcaacaa gacctgcggg 480
ctgtgtggca actttaacat ctttgctgaa gatgacttta tgacccaaga agggaccttg 540
acctcggacc cttatgactt tgccaactca tgggctctga gcagtggaga acagtggtgt 600
gaacgggcat ctcctcccag cagctcatgc aacatctcct ctggggaaat gcagaagggc 660
ctgtgggagc agtgccagct tctgaagagc acctcggtgt ttgcccgctg ccaccctctg 720
gtggaccccg agccttttgt ggccctgtgt gagaagactt tgtgtgagtg tgctgggggg 780
ctggagtgcg cctgccctgc cctcctggag tacgcccgga cctgtgccca ggagggaatg 840
gtgctgtacg gctggaccga ccacagcgcg tgcagcccag tgtgccctgc tggtatggag 900
tataggcagt gtgtgtcccc ttgcgccagg acctgccaga gcctgcacat caatgaaatg 960
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cactccttct ccattgtcat tgagactgtc cagtgtgctg atgaccgcga cgctgtgtgc 1320
acccgctccg tcaccgtccg gctgcctggc ctgcacaaca gccttgtgaa actgaagcat 1380
ggggcaggag ttgccatgga tggccaggac atccagctcc ccctcctgaa aggtgacctc 1440
cgcatccagc atacagtgac ggcctccgtg cgcctcagct acggggagga cctgcagatg 1500
gactgggatg gccgcgggag gctgctggtg aagctgtccc ccgtctatgc cgggaagacc 1560
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ctggcggagc cccgggtgga ggacttcggg aacgcctgga agctgcacgg ggactgccag 1680
gacctgcaga agcagcacag cgatccctgc gccctcaacc cgcgcatgac caggttctcc 1740
gaggaggcgt gcgcggtcct gacgtccccc acattcgagg cctgccatcg tgccgtcagc 1800
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gaggcctgcc tggagggctg cttctgcccc ccagggctct acatggatga gaggggggac 2100
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catgtgtgtg atgccacgtg ctccacgatc ggcatggccc actacctcac cttcgacggg 2640
ctcaaatacc tgttccccgg ggagtgccag tacgttctgg tgcaggatta ctgcggcagt 2700
aaccctggga cctttcggat cctagtgggg aataagggat gcagccaccc ctcagtgaaa 2760
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agaatcctta ccagtgacgt cttccaggac tgcaacaagc tggtggaccc cgagccatat 3240
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tgcgacacca ttgctgccta tgcccacgtg tgtgcccagc atggcaaggt ggtgacctgg 3360
aggacggcca cattgtgccc ccagagctgc gaggagagga atctccggga gaacgggtat 3420
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gagccactgg cctgccctgt gcagtgtgtg gagggctgcc atgcccactg ccctccaggg 3540
aaaatcctgg atgagctttt gcagacctgc gttgaccctg aagactgtcc agtgtgtgag 3600
gtggctggcc ggcgttttgc ctcaggaaag aaagtcacct tgaatcccag tgaccctgag 3660
cactgccaga tttgccactg tgatgttgtc aacctcacct gtgaagcctg ccaggagccg 3720
atatctggcg gtggaggttc cggtggcggg ggatccggcg gtggaggttc cggcggtgga 3780
ggttccggtg gcgggggatc cggtggcggg ggatccctgg tcccccgggg cagcggcggt 3840
ggaggttccg gtggcggggg atccgacaaa actcacacat gcccaccgtg cccagctcca 3900
gaactcctgg gcggaccgtc agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga caccctcatg 3960
gcctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga agaccctgag 4020
gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg 4080
gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct ggcccaggac 4140
tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aagccctccc agcccccatc 4200
gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc 4260
ccatcccgcg atgagctgac caagaaccag gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc 4320
tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa caactacaag 4380
accacgcctc ccgtgttgga ctccgacggc tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg 4440
gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg 4500
cacaacgcct acacgcagaa gagcctctcc ctgtctccgg gtaaatga 4548
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<211> 1515
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VWF050 (IHH triple mutant)
<400> 150
Met Ile Pro Ala Arg Phe Ala Gly Val Leu Leu Ala Leu Ala Leu Ile
1 5 10 15
Leu Pro Gly Thr Leu Cys Ala Glu Gly Thr Arg Gly Arg Ser Ser Thr
20 25 30
Ala Arg Cys Ser Leu Phe Gly Ser Asp Phe Val Asn Thr Phe Asp Gly
35 40 45
Ser Met Tyr Ser Phe Ala Gly Tyr Cys Ser Tyr Leu Leu Ala Gly Gly
50 55 60
Cys Gln Lys Arg Ser Phe Ser Ile Ile Gly Asp Phe Gln Asn Gly Lys
65 70 75 80
Arg Val Ser Leu Ser Val Tyr Leu Gly Glu Phe Phe Asp Ile His Leu
85 90 95
Phe Val Asn Gly Thr Val Thr Gln Gly Asp Gln Arg Val Ser Met Pro
100 105 110
Tyr Ala Ser Lys Gly Leu Tyr Leu Glu Thr Glu Ala Gly Tyr Tyr Lys
115 120 125
Leu Ser Gly Glu Ala Tyr Gly Phe Val Ala Arg Ile Asp Gly Ser Gly
130 135 140
Asn Phe Gln Val Leu Leu Ser Asp Arg Tyr Phe Asn Lys Thr Cys Gly
145 150 155 160
Leu Cys Gly Asn Phe Asn Ile Phe Ala Glu Asp Asp Phe Met Thr Gln
165 170 175
Glu Gly Thr Leu Thr Ser Asp Pro Tyr Asp Phe Ala Asn Ser Trp Ala
180 185 190
Leu Ser Ser Gly Glu Gln Trp Cys Glu Arg Ala Ser Pro Pro Ser Ser
195 200 205
Ser Cys Asn Ile Ser Ser Gly Glu Met Gln Lys Gly Leu Trp Glu Gln
210 215 220
Cys Gln Leu Leu Lys Ser Thr Ser Val Phe Ala Arg Cys His Pro Leu
225 230 235 240
Val Asp Pro Glu Pro Phe Val Ala Leu Cys Glu Lys Thr Leu Cys Glu
245 250 255
Cys Ala Gly Gly Leu Glu Cys Ala Cys Pro Ala Leu Leu Glu Tyr Ala
260 265 270
Arg Thr Cys Ala Gln Glu Gly Met Val Leu Tyr Gly Trp Thr Asp His
275 280 285
Ser Ala Cys Ser Pro Val Cys Pro Ala Gly Met Glu Tyr Arg Gln Cys
290 295 300
Val Ser Pro Cys Ala Arg Thr Cys Gln Ser Leu His Ile Asn Glu Met
305 310 315 320
Cys Gln Glu Arg Cys Val Asp Gly Cys Ser Cys Pro Glu Gly Gln Leu
325 330 335
Leu Asp Glu Gly Leu Cys Val Glu Ser Thr Glu Cys Pro Cys Val His
340 345 350
Ser Gly Lys Arg Tyr Pro Pro Gly Thr Ser Leu Ser Arg Asp Cys Asn
355 360 365
Thr Cys Ile Cys Arg Asn Ser Gln Trp Ile Cys Ser Asn Glu Glu Cys
370 375 380
Pro Gly Glu Cys Leu Val Thr Gly Gln Ser His Phe Lys Ser Phe Asp
385 390 395 400
Asn Arg Tyr Phe Thr Phe Ser Gly Ile Cys Gln Tyr Leu Leu Ala Arg
405 410 415
Asp Cys Gln Asp His Ser Phe Ser Ile Val Ile Glu Thr Val Gln Cys
420 425 430
Ala Asp Asp Arg Asp Ala Val Cys Thr Arg Ser Val Thr Val Arg Leu
435 440 445
Pro Gly Leu His Asn Ser Leu Val Lys Leu Lys His Gly Ala Gly Val
450 455 460
Ala Met Asp Gly Gln Asp Ile Gln Leu Pro Leu Leu Lys Gly Asp Leu
465 470 475 480
Arg Ile Gln His Thr Val Thr Ala Ser Val Arg Leu Ser Tyr Gly Glu
485 490 495
Asp Leu Gln Met Asp Trp Asp Gly Arg Gly Arg Leu Leu Val Lys Leu
500 505 510
Ser Pro Val Tyr Ala Gly Lys Thr Cys Gly Leu Cys Gly Asn Tyr Asn
515 520 525
Gly Asn Gln Gly Asp Asp Phe Leu Thr Pro Ser Gly Leu Ala Glu Pro
530 535 540
Arg Val Glu Asp Phe Gly Asn Ala Trp Lys Leu His Gly Asp Cys Gln
545 550 555 560
Asp Leu Gln Lys Gln His Ser Asp Pro Cys Ala Leu Asn Pro Arg Met
565 570 575
Thr Arg Phe Ser Glu Glu Ala Cys Ala Val Leu Thr Ser Pro Thr Phe
580 585 590
Glu Ala Cys His Arg Ala Val Ser Pro Leu Pro Tyr Leu Arg Asn Cys
595 600 605
Arg Tyr Asp Val Cys Ser Cys Ser Asp Gly Arg Glu Cys Leu Cys Gly
610 615 620
Ala Leu Ala Ser Tyr Ala Ala Ala Cys Ala Gly Arg Gly Val Arg Val
625 630 635 640
Ala Trp Arg Glu Pro Gly Arg Cys Glu Leu Asn Cys Pro Lys Gly Gln
645 650 655
Val Tyr Leu Gln Cys Gly Thr Pro Cys Asn Leu Thr Cys Arg Ser Leu
660 665 670
Ser Tyr Pro Asp Glu Glu Cys Asn Glu Ala Cys Leu Glu Gly Cys Phe
675 680 685
Cys Pro Pro Gly Leu Tyr Met Asp Glu Arg Gly Asp Cys Val Pro Lys
690 695 700
Ala Gln Cys Pro Cys Tyr Tyr Asp Gly Glu Ile Phe Gln Pro Glu Asp
705 710 715 720
Ile Phe Ser Asp His His Thr Met Cys Tyr Cys Glu Asp Gly Phe Met
725 730 735
His Cys Thr Met Ser Gly Val Pro Gly Ser Leu Leu Pro Asp Ala Val
740 745 750
Leu Ser Ser Pro Leu Ser His Arg Ser Lys Arg Ser Leu Ser Cys Arg
755 760 765
Pro Pro Met Val Lys Leu Val Cys Pro Ala Asp Asn Leu Arg Ala Glu
770 775 780
Gly Leu Glu Cys Thr Lys Thr Cys Gln Asn Tyr Asp Leu Glu Cys Met
785 790 795 800
Ser Met Gly Cys Val Ser Gly Cys Leu Cys Pro Pro Gly Met Val Arg
805 810 815
His Glu Asn Arg Cys Val Ala Leu Glu Arg Cys Pro Cys Phe His Gln
820 825 830
Gly Lys Glu Tyr Ala Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Gly Cys Asn Thr
835 840 845
Cys Val Cys Arg Asp Arg Lys Trp Asn Cys Thr Asp His Val Cys Asp
850 855 860
Ala Thr Cys Ser Thr Ile Gly Met Ala His Tyr Leu Thr Phe Asp Gly
865 870 875 880
Leu Lys Tyr Leu Phe Pro Gly Glu Cys Gln Tyr Val Leu Val Gln Asp
885 890 895
Tyr Cys Gly Ser Asn Pro Gly Thr Phe Arg Ile Leu Val Gly Asn Lys
900 905 910
Gly Cys Ser His Pro Ser Val Lys Cys Lys Lys Arg Val Thr Ile Leu
915 920 925
Val Glu Gly Gly Glu Ile Glu Leu Phe Asp Gly Glu Val Asn Val Lys
930 935 940
Arg Pro Met Lys Asp Glu Thr His Phe Glu Val Val Glu Ser Gly Arg
945 950 955 960
Tyr Ile Ile Leu Leu Leu Gly Lys Ala Leu Ser Val Val Trp Asp Arg
965 970 975
His Leu Ser Ile Ser Val Val Leu Lys Gln Thr Tyr Gln Glu Lys Val
980 985 990
Cys Gly Leu Cys Gly Asn Phe Asp Gly Ile Gln Asn Asn Asp Leu Thr
995 1000 1005
Ser Ser Asn Leu Gln Val Glu Glu Asp Pro Val Asp Phe Gly Asn
1010 1015 1020
Ser Trp Lys Val Ser Ser Gln Cys Ala Asp Thr Arg Lys Val Pro
1025 1030 1035
Leu Asp Ser Ser Pro Ala Thr Cys His Asn Asn Ile Met Lys Gln
1040 1045 1050
Thr Met Val Asp Ser Ser Cys Arg Ile Leu Thr Ser Asp Val Phe
1055 1060 1065
Gln Asp Cys Asn Lys Leu Val Asp Pro Glu Pro Tyr Leu Asp Val
1070 1075 1080
Cys Ile Tyr Asp Thr Cys Ser Cys Glu Ser Ile Gly Asp Cys Ala
1085 1090 1095
Ala Phe Cys Asp Thr Ile Ala Ala Tyr Ala His Val Cys Ala Gln
1100 1105 1110
His Gly Lys Val Val Thr Trp Arg Thr Ala Thr Leu Cys Pro Gln
1115 1120 1125
Ser Cys Glu Glu Arg Asn Leu Arg Glu Asn Gly Tyr Glu Ala Glu
1130 1135 1140
Trp Arg Tyr Asn Ser Cys Ala Pro Ala Cys Gln Val Thr Cys Gln
1145 1150 1155
His Pro Glu Pro Leu Ala Cys Pro Val Gln Cys Val Glu Gly Cys
1160 1165 1170
His Ala His Cys Pro Pro Gly Lys Ile Leu Asp Glu Leu Leu Gln
1175 1180 1185
Thr Cys Val Asp Pro Glu Asp Cys Pro Val Cys Glu Val Ala Gly
1190 1195 1200
Arg Arg Phe Ala Ser Gly Lys Lys Val Thr Leu Asn Pro Ser Asp
1205 1210 1215
Pro Glu His Cys Gln Ile Cys His Cys Asp Val Val Asn Leu Thr
1220 1225 1230
Cys Glu Ala Cys Gln Glu Pro Ile Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1235 1240 1245
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1250 1255 1260
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Val Pro Arg Gly Ser
1265 1270 1275
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr
1280 1285 1290
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
1295 1300 1305
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ala Ser Arg
1310 1315 1320
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
1325 1330 1335
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
1340 1345 1350
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
1355 1360 1365
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu Ala Gln Asp Trp Leu Asn
1370 1375 1380
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
1385 1390 1395
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
1400 1405 1410
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
1415 1420 1425
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
1430 1435 1440
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
1445 1450 1455
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
1460 1465 1470
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
1475 1480 1485
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Ala
1490 1495 1500
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
1505 1510 1515
<210> 151
<211> 4959
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VWF057
<400> 151
atgattcctg ccagatttgc cggggtgctg cttgctctgg ccctcatttt gccagggacc 60
ctttgtgcag aaggaactcg cggcaggtca tccacggccc gatgcagcct tttcggaagt 120
gacttcgtca acacctttga tgggagcatg tacagctttg cgggatactg cagttacctc 180
ctggcagggg gctgccagaa acgctccttc tcgattattg gggacttcca gaatggcaag 240
agagtgagcc tctccgtgta tcttggggaa ttttttgaca tccatttgtt tgtcaatggt 300
accgtgacac agggggacca aagagtctcc atgccctatg cctccaaagg gctgtatcta 360
gaaactgagg ctgggtacta caagctgtcc ggtgaggcct atggctttgt ggccaggatc 420
gatggcagcg gcaactttca agtcctgctg tcagacagat acttcaacaa gacctgcggg 480
ctgtgtggca actttaacat ctttgctgaa gatgacttta tgacccaaga agggaccttg 540
acctcggacc cttatgactt tgccaactca tgggctctga gcagtggaga acagtggtgt 600
gaacgggcat ctcctcccag cagctcatgc aacatctcct ctggggaaat gcagaagggc 660
ctgtgggagc agtgccagct tctgaagagc acctcggtgt ttgcccgctg ccaccctctg 720
gtggaccccg agccttttgt ggccctgtgt gagaagactt tgtgtgagtg tgctgggggg 780
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tataggcagt gtgtgtcccc ttgcgccagg acctgccaga gcctgcacat caatgaaatg 960
tgtcaggagc gatgcgtgga tggctgcagc tgccctgagg gacagctcct ggatgaaggc 1020
ctctgcgtgg agagcaccga gtgtccctgc gtgcattccg gaaagcgcta ccctcccggc 1080
acctccctct ctcgagactg caacacctgc atttgccgaa acagccagtg gatctgcagc 1140
aatgaagaat gtccagggga gtgccttgtc actggtcaat cccacttcaa gagctttgac 1200
aacagatact tcaccttcag tgggatctgc cagtacctgc tggcccggga ttgccaggac 1260
cactccttct ccattgtcat tgagactgtc cagtgtgctg atgaccgcga cgctgtgtgc 1320
acccgctccg tcaccgtccg gctgcctggc ctgcacaaca gccttgtgaa actgaagcat 1380
ggggcaggag ttgccatgga tggccaggac atccagctcc ccctcctgaa aggtgacctc 1440
cgcatccagc atacagtgac ggcctccgtg cgcctcagct acggggagga cctgcagatg 1500
gactgggatg gccgcgggag gctgctggtg aagctgtccc ccgtctatgc cgggaagacc 1560
tgcggcctgt gtgggaatta caatggcaac cagggcgacg acttccttac cccctctggg 1620
ctggcggagc cccgggtgga ggacttcggg aacgcctgga agctgcacgg ggactgccag 1680
gacctgcaga agcagcacag cgatccctgc gccctcaacc cgcgcatgac caggttctcc 1740
gaggaggcgt gcgcggtcct gacgtccccc acattcgagg cctgccatcg tgccgtcagc 1800
ccgctgccct acctgcggaa ctgccgctac gacgtgtgct cctgctcgga cggccgcgag 1860
tgcctgtgcg gcgccctggc cagctatgcc gcggcctgcg cggggagagg cgtgcgcgtc 1920
gcgtggcgcg agccaggccg ctgtgagctg aactgcccga aaggccaggt gtacctgcag 1980
tgcgggaccc cctgcaacct gacctgccgc tctctctctt acccggatga ggaatgcaat 2040
gaggcctgcc tggagggctg cttctgcccc ccagggctct acatggatga gaggggggac 2100
tgcgtgccca aggcccagtg cccctgttac tatgacggtg agatcttcca gccagaagac 2160
atcttctcag accatcacac catgtgctac tgtgaggatg gcttcatgca ctgtaccatg 2220
agtggagtcc ccggaagctt gctgcctgac gctgtcctca gcagtcccct gtctcatcgc 2280
agcaaaagga gcctatcctg tcggcccccc atggtcaagc tggtgtgtcc cgctgacaac 2340
ctgcgggctg aagggctcga gtgtaccaaa acgtgccaga actatgacct ggagtgcatg 2400
agcatgggct gtgtctctgg ctgcctctgc cccccgggca tggtccggca tgagaacaga 2460
tgtgtggccc tggaaaggtg tccctgcttc catcagggca aggagtatgc ccctggagaa 2520
acagtgaaga ttggctgcaa cacttgtgtc tgtcgggacc ggaagtggaa ctgcacagac 2580
catgtgtgtg atgccacgtg ctccacgatc ggcatggccc actacctcac cttcgacggg 2640
ctcaaatacc tgttccccgg ggagtgccag tacgttctgg tgcaggatta ctgcggcagt 2700
aaccctggga cctttcggat cctagtgggg aataagggat gcagccaccc ctcagtgaaa 2760
tgcaagaaac gggtcaccat cctggtggag ggaggagaga ttgagctgtt tgacggggag 2820
gtgaatgtga agaggcccat gaaggatgag actcactttg aggtggtgga gtctggccgg 2880
tacatcattc tgctgctggg caaagccctc tccgtggtct gggaccgcca cctgagcatc 2940
tccgtggtcc tgaagcagac ataccaggag aaagtgtgtg gcctgtgtgg gaattttgat 3000
ggcatccaga acaatgacct caccagcagc aacctccaag tggaggaaga ccctgtggac 3060
tttgggaact cctggaaagt gagctcgcag tgtgctgaca ccagaaaagt gcctctggac 3120
tcatcccctg ccacctgcca taacaacatc atgaagcaga cgatggtgga ttcctcctgt 3180
agaatcctta ccagtgacgt cttccaggac tgcaacaagc tggtggaccc cgagccatat 3240
ctggatgtct gcatttacga cacctgctcc tgtgagtcca ttggggactg cgccgcattc 3300
tgcgacacca ttgctgccta tgcccacgtg tgtgcccagc atggcaaggt ggtgacctgg 3360
aggacggcca cattgtgccc ccagagctgc gaggagagga atctccggga gaacgggtat 3420
gaggctgagt ggcgctataa cagctgtgca cctgcctgtc aagtcacgtg tcagcaccct 3480
gagccactgg cctgccctgt gcagtgtgtg gagggctgcc atgcccactg ccctccaggg 3540
aaaatcctgg atgagctttt gcagacctgc gttgaccctg aagactgtcc agtgtgtgag 3600
gtggctggcc ggcgttttgc ctcaggaaag aaagtcacct tgaatcccag tgaccctgag 3660
cactgccaga tttgccactg tgatgttgtc aacctcacct gtgaagcctg ccaggagccg 3720
atatcgggcg cgccaacatc agagagcgcc acccctgaaa gtggtcccgg gagcgagcca 3780
gccacatctg ggtcggaaac gccaggcaca agtgagtctg caactcccga gtccggacct 3840
ggctccgagc ctgccactag cggctccgag actccgggaa cttccgagag cgctacacca 3900
gaaagcggac ccggaaccag taccgaacct agcgagggct ctgctccggg cagcccagcc 3960
ggctctccta catccacgga ggagggcact tccgaatccg ccaccccgga gtcagggcca 4020
ggatctgaac ccgctacctc aggcagtgag acgccaggaa cgagcgagtc cgctacaccg 4080
gagagtgggc cagggagccc tgctggatct cctacgtcca ctgaggaagg gtcaccagcg 4140
ggctcgccca ccagcactga agaaggtgcc tcgagcggcg gtggaggttc cggtggcggg 4200
ggatccggtg gcgggggatc cggtggcggg ggatccggtg gcgggggatc cctggtcccc 4260
cggggcagcg gaggcgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagctcc agaactcctg 4320
ggcggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 4380
acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 4440
aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 4500
tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 4560
ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 4620
atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 4680
gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 4740
gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 4800
cccgtgttgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 4860
aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 4920
tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaatga 4959
<210> 152
<211> 1652
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VWF057
<400> 152
Met Ile Pro Ala Arg Phe Ala Gly Val Leu Leu Ala Leu Ala Leu Ile
1 5 10 15
Leu Pro Gly Thr Leu Cys Ala Glu Gly Thr Arg Gly Arg Ser Ser Thr
20 25 30
Ala Arg Cys Ser Leu Phe Gly Ser Asp Phe Val Asn Thr Phe Asp Gly
35 40 45
Ser Met Tyr Ser Phe Ala Gly Tyr Cys Ser Tyr Leu Leu Ala Gly Gly
50 55 60
Cys Gln Lys Arg Ser Phe Ser Ile Ile Gly Asp Phe Gln Asn Gly Lys
65 70 75 80
Arg Val Ser Leu Ser Val Tyr Leu Gly Glu Phe Phe Asp Ile His Leu
85 90 95
Phe Val Asn Gly Thr Val Thr Gln Gly Asp Gln Arg Val Ser Met Pro
100 105 110
Tyr Ala Ser Lys Gly Leu Tyr Leu Glu Thr Glu Ala Gly Tyr Tyr Lys
115 120 125
Leu Ser Gly Glu Ala Tyr Gly Phe Val Ala Arg Ile Asp Gly Ser Gly
130 135 140
Asn Phe Gln Val Leu Leu Ser Asp Arg Tyr Phe Asn Lys Thr Cys Gly
145 150 155 160
Leu Cys Gly Asn Phe Asn Ile Phe Ala Glu Asp Asp Phe Met Thr Gln
165 170 175
Glu Gly Thr Leu Thr Ser Asp Pro Tyr Asp Phe Ala Asn Ser Trp Ala
180 185 190
Leu Ser Ser Gly Glu Gln Trp Cys Glu Arg Ala Ser Pro Pro Ser Ser
195 200 205
Ser Cys Asn Ile Ser Ser Gly Glu Met Gln Lys Gly Leu Trp Glu Gln
210 215 220
Cys Gln Leu Leu Lys Ser Thr Ser Val Phe Ala Arg Cys His Pro Leu
225 230 235 240
Val Asp Pro Glu Pro Phe Val Ala Leu Cys Glu Lys Thr Leu Cys Glu
245 250 255
Cys Ala Gly Gly Leu Glu Cys Ala Cys Pro Ala Leu Leu Glu Tyr Ala
260 265 270
Arg Thr Cys Ala Gln Glu Gly Met Val Leu Tyr Gly Trp Thr Asp His
275 280 285
Ser Ala Cys Ser Pro Val Cys Pro Ala Gly Met Glu Tyr Arg Gln Cys
290 295 300
Val Ser Pro Cys Ala Arg Thr Cys Gln Ser Leu His Ile Asn Glu Met
305 310 315 320
Cys Gln Glu Arg Cys Val Asp Gly Cys Ser Cys Pro Glu Gly Gln Leu
325 330 335
Leu Asp Glu Gly Leu Cys Val Glu Ser Thr Glu Cys Pro Cys Val His
340 345 350
Ser Gly Lys Arg Tyr Pro Pro Gly Thr Ser Leu Ser Arg Asp Cys Asn
355 360 365
Thr Cys Ile Cys Arg Asn Ser Gln Trp Ile Cys Ser Asn Glu Glu Cys
370 375 380
Pro Gly Glu Cys Leu Val Thr Gly Gln Ser His Phe Lys Ser Phe Asp
385 390 395 400
Asn Arg Tyr Phe Thr Phe Ser Gly Ile Cys Gln Tyr Leu Leu Ala Arg
405 410 415
Asp Cys Gln Asp His Ser Phe Ser Ile Val Ile Glu Thr Val Gln Cys
420 425 430
Ala Asp Asp Arg Asp Ala Val Cys Thr Arg Ser Val Thr Val Arg Leu
435 440 445
Pro Gly Leu His Asn Ser Leu Val Lys Leu Lys His Gly Ala Gly Val
450 455 460
Ala Met Asp Gly Gln Asp Ile Gln Leu Pro Leu Leu Lys Gly Asp Leu
465 470 475 480
Arg Ile Gln His Thr Val Thr Ala Ser Val Arg Leu Ser Tyr Gly Glu
485 490 495
Asp Leu Gln Met Asp Trp Asp Gly Arg Gly Arg Leu Leu Val Lys Leu
500 505 510
Ser Pro Val Tyr Ala Gly Lys Thr Cys Gly Leu Cys Gly Asn Tyr Asn
515 520 525
Gly Asn Gln Gly Asp Asp Phe Leu Thr Pro Ser Gly Leu Ala Glu Pro
530 535 540
Arg Val Glu Asp Phe Gly Asn Ala Trp Lys Leu His Gly Asp Cys Gln
545 550 555 560
Asp Leu Gln Lys Gln His Ser Asp Pro Cys Ala Leu Asn Pro Arg Met
565 570 575
Thr Arg Phe Ser Glu Glu Ala Cys Ala Val Leu Thr Ser Pro Thr Phe
580 585 590
Glu Ala Cys His Arg Ala Val Ser Pro Leu Pro Tyr Leu Arg Asn Cys
595 600 605
Arg Tyr Asp Val Cys Ser Cys Ser Asp Gly Arg Glu Cys Leu Cys Gly
610 615 620
Ala Leu Ala Ser Tyr Ala Ala Ala Cys Ala Gly Arg Gly Val Arg Val
625 630 635 640
Ala Trp Arg Glu Pro Gly Arg Cys Glu Leu Asn Cys Pro Lys Gly Gln
645 650 655
Val Tyr Leu Gln Cys Gly Thr Pro Cys Asn Leu Thr Cys Arg Ser Leu
660 665 670
Ser Tyr Pro Asp Glu Glu Cys Asn Glu Ala Cys Leu Glu Gly Cys Phe
675 680 685
Cys Pro Pro Gly Leu Tyr Met Asp Glu Arg Gly Asp Cys Val Pro Lys
690 695 700
Ala Gln Cys Pro Cys Tyr Tyr Asp Gly Glu Ile Phe Gln Pro Glu Asp
705 710 715 720
Ile Phe Ser Asp His His Thr Met Cys Tyr Cys Glu Asp Gly Phe Met
725 730 735
His Cys Thr Met Ser Gly Val Pro Gly Ser Leu Leu Pro Asp Ala Val
740 745 750
Leu Ser Ser Pro Leu Ser His Arg Ser Lys Arg Ser Leu Ser Cys Arg
755 760 765
Pro Pro Met Val Lys Leu Val Cys Pro Ala Asp Asn Leu Arg Ala Glu
770 775 780
Gly Leu Glu Cys Thr Lys Thr Cys Gln Asn Tyr Asp Leu Glu Cys Met
785 790 795 800
Ser Met Gly Cys Val Ser Gly Cys Leu Cys Pro Pro Gly Met Val Arg
805 810 815
His Glu Asn Arg Cys Val Ala Leu Glu Arg Cys Pro Cys Phe His Gln
820 825 830
Gly Lys Glu Tyr Ala Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Gly Cys Asn Thr
835 840 845
Cys Val Cys Arg Asp Arg Lys Trp Asn Cys Thr Asp His Val Cys Asp
850 855 860
Ala Thr Cys Ser Thr Ile Gly Met Ala His Tyr Leu Thr Phe Asp Gly
865 870 875 880
Leu Lys Tyr Leu Phe Pro Gly Glu Cys Gln Tyr Val Leu Val Gln Asp
885 890 895
Tyr Cys Gly Ser Asn Pro Gly Thr Phe Arg Ile Leu Val Gly Asn Lys
900 905 910
Gly Cys Ser His Pro Ser Val Lys Cys Lys Lys Arg Val Thr Ile Leu
915 920 925
Val Glu Gly Gly Glu Ile Glu Leu Phe Asp Gly Glu Val Asn Val Lys
930 935 940
Arg Pro Met Lys Asp Glu Thr His Phe Glu Val Val Glu Ser Gly Arg
945 950 955 960
Tyr Ile Ile Leu Leu Leu Gly Lys Ala Leu Ser Val Val Trp Asp Arg
965 970 975
His Leu Ser Ile Ser Val Val Leu Lys Gln Thr Tyr Gln Glu Lys Val
980 985 990
Cys Gly Leu Cys Gly Asn Phe Asp Gly Ile Gln Asn Asn Asp Leu Thr
995 1000 1005
Ser Ser Asn Leu Gln Val Glu Glu Asp Pro Val Asp Phe Gly Asn
1010 1015 1020
Ser Trp Lys Val Ser Ser Gln Cys Ala Asp Thr Arg Lys Val Pro
1025 1030 1035
Leu Asp Ser Ser Pro Ala Thr Cys His Asn Asn Ile Met Lys Gln
1040 1045 1050
Thr Met Val Asp Ser Ser Cys Arg Ile Leu Thr Ser Asp Val Phe
1055 1060 1065
Gln Asp Cys Asn Lys Leu Val Asp Pro Glu Pro Tyr Leu Asp Val
1070 1075 1080
Cys Ile Tyr Asp Thr Cys Ser Cys Glu Ser Ile Gly Asp Cys Ala
1085 1090 1095
Ala Phe Cys Asp Thr Ile Ala Ala Tyr Ala His Val Cys Ala Gln
1100 1105 1110
His Gly Lys Val Val Thr Trp Arg Thr Ala Thr Leu Cys Pro Gln
1115 1120 1125
Ser Cys Glu Glu Arg Asn Leu Arg Glu Asn Gly Tyr Glu Ala Glu
1130 1135 1140
Trp Arg Tyr Asn Ser Cys Ala Pro Ala Cys Gln Val Thr Cys Gln
1145 1150 1155
His Pro Glu Pro Leu Ala Cys Pro Val Gln Cys Val Glu Gly Cys
1160 1165 1170
His Ala His Cys Pro Pro Gly Lys Ile Leu Asp Glu Leu Leu Gln
1175 1180 1185
Thr Cys Val Asp Pro Glu Asp Cys Pro Val Cys Glu Val Ala Gly
1190 1195 1200
Arg Arg Phe Ala Ser Gly Lys Lys Val Thr Leu Asn Pro Ser Asp
1205 1210 1215
Pro Glu His Cys Gln Ile Cys His Cys Asp Val Val Asn Leu Thr
1220 1225 1230
Cys Glu Ala Cys Gln Glu Pro Ile Ser Gly Ala Pro Thr Ser Glu
1235 1240 1245
Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser
1250 1255 1260
Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser
1265 1270 1275
Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly
1280 1285 1290
Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr
1295 1300 1305
Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro
1310 1315 1320
Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser
1325 1330 1335
Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly
1340 1345 1350
Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Pro Ala
1355 1360 1365
Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro
1370 1375 1380
Thr Ser Thr Glu Glu Gly Ala Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1385 1390 1395
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1400 1405 1410
Gly Gly Gly Ser Leu Val Pro Arg Gly Ser Gly Gly Asp Lys Thr
1415 1420 1425
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
1430 1435 1440
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
1445 1450 1455
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
1460 1465 1470
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
1475 1480 1485
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
1490 1495 1500
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
1505 1510 1515
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
1520 1525 1530
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
1535 1540 1545
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
1550 1555 1560
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
1565 1570 1575
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
1580 1585 1590
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
1595 1600 1605
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
1610 1615 1620
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
1625 1630 1635
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
1640 1645 1650
<210> 153
<211> 5379
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VWF058 (VWF034 with IHH mutation)
<400> 153
atgattcctg ccagatttgc cggggtgctg cttgctctgg ccctcatttt gccagggacc 60
ctttgtgcag aaggaactcg cggcaggtca tccacggccc gatgcagcct tttcggaagt 120
gacttcgtca acacctttga tgggagcatg tacagctttg cgggatactg cagttacctc 180
ctggcagggg gctgccagaa acgctccttc tcgattattg gggacttcca gaatggcaag 240
agagtgagcc tctccgtgta tcttggggaa ttttttgaca tccatttgtt tgtcaatggt 300
accgtgacac agggggacca aagagtctcc atgccctatg cctccaaagg gctgtatcta 360
gaaactgagg ctgggtacta caagctgtcc ggtgaggcct atggctttgt ggccaggatc 420
gatggcagcg gcaactttca agtcctgctg tcagacagat acttcaacaa gacctgcggg 480
ctgtgtggca actttaacat ctttgctgaa gatgacttta tgacccaaga agggaccttg 540
acctcggacc cttatgactt tgccaactca tgggctctga gcagtggaga acagtggtgt 600
gaacgggcat ctcctcccag cagctcatgc aacatctcct ctggggaaat gcagaagggc 660
ctgtgggagc agtgccagct tctgaagagc acctcggtgt ttgcccgctg ccaccctctg 720
gtggaccccg agccttttgt ggccctgtgt gagaagactt tgtgtgagtg tgctgggggg 780
ctggagtgcg cctgccctgc cctcctggag tacgcccgga cctgtgccca ggagggaatg 840
gtgctgtacg gctggaccga ccacagcgcg tgcagcccag tgtgccctgc tggtatggag 900
tataggcagt gtgtgtcccc ttgcgccagg acctgccaga gcctgcacat caatgaaatg 960
tgtcaggagc gatgcgtgga tggctgcagc tgccctgagg gacagctcct ggatgaaggc 1020
ctctgcgtgg agagcaccga gtgtccctgc gtgcattccg gaaagcgcta ccctcccggc 1080
acctccctct ctcgagactg caacacctgc atttgccgaa acagccagtg gatctgcagc 1140
aatgaagaat gtccagggga gtgccttgtc actggtcaat cccacttcaa gagctttgac 1200
aacagatact tcaccttcag tgggatctgc cagtacctgc tggcccggga ttgccaggac 1260
cactccttct ccattgtcat tgagactgtc cagtgtgctg atgaccgcga cgctgtgtgc 1320
acccgctccg tcaccgtccg gctgcctggc ctgcacaaca gccttgtgaa actgaagcat 1380
ggggcaggag ttgccatgga tggccaggac atccagctcc ccctcctgaa aggtgacctc 1440
cgcatccagc atacagtgac ggcctccgtg cgcctcagct acggggagga cctgcagatg 1500
gactgggatg gccgcgggag gctgctggtg aagctgtccc ccgtctatgc cgggaagacc 1560
tgcggcctgt gtgggaatta caatggcaac cagggcgacg acttccttac cccctctggg 1620
ctggcggagc cccgggtgga ggacttcggg aacgcctgga agctgcacgg ggactgccag 1680
gacctgcaga agcagcacag cgatccctgc gccctcaacc cgcgcatgac caggttctcc 1740
gaggaggcgt gcgcggtcct gacgtccccc acattcgagg cctgccatcg tgccgtcagc 1800
ccgctgccct acctgcggaa ctgccgctac gacgtgtgct cctgctcgga cggccgcgag 1860
tgcctgtgcg gcgccctggc cagctatgcc gcggcctgcg cggggagagg cgtgcgcgtc 1920
gcgtggcgcg agccaggccg ctgtgagctg aactgcccga aaggccaggt gtacctgcag 1980
tgcgggaccc cctgcaacct gacctgccgc tctctctctt acccggatga ggaatgcaat 2040
gaggcctgcc tggagggctg cttctgcccc ccagggctct acatggatga gaggggggac 2100
tgcgtgccca aggcccagtg cccctgttac tatgacggtg agatcttcca gccagaagac 2160
atcttctcag accatcacac catgtgctac tgtgaggatg gcttcatgca ctgtaccatg 2220
agtggagtcc ccggaagctt gctgcctgac gctgtcctca gcagtcccct gtctcatcgc 2280
agcaaaagga gcctatcctg tcggcccccc atggtcaagc tggtgtgtcc cgctgacaac 2340
ctgcgggctg aagggctcga gtgtaccaaa acgtgccaga actatgacct ggagtgcatg 2400
agcatgggct gtgtctctgg ctgcctctgc cccccgggca tggtccggca tgagaacaga 2460
tgtgtggccc tggaaaggtg tccctgcttc catcagggca aggagtatgc ccctggagaa 2520
acagtgaaga ttggctgcaa cacttgtgtc tgtcgggacc ggaagtggaa ctgcacagac 2580
catgtgtgtg atgccacgtg ctccacgatc ggcatggccc actacctcac cttcgacggg 2640
ctcaaatacc tgttccccgg ggagtgccag tacgttctgg tgcaggatta ctgcggcagt 2700
aaccctggga cctttcggat cctagtgggg aataagggat gcagccaccc ctcagtgaaa 2760
tgcaagaaac gggtcaccat cctggtggag ggaggagaga ttgagctgtt tgacggggag 2820
gtgaatgtga agaggcccat gaaggatgag actcactttg aggtggtgga gtctggccgg 2880
tacatcattc tgctgctggg caaagccctc tccgtggtct gggaccgcca cctgagcatc 2940
tccgtggtcc tgaagcagac ataccaggag aaagtgtgtg gcctgtgtgg gaattttgat 3000
ggcatccaga acaatgacct caccagcagc aacctccaag tggaggaaga ccctgtggac 3060
tttgggaact cctggaaagt gagctcgcag tgtgctgaca ccagaaaagt gcctctggac 3120
tcatcccctg ccacctgcca taacaacatc atgaagcaga cgatggtgga ttcctcctgt 3180
agaatcctta ccagtgacgt cttccaggac tgcaacaagc tggtggaccc cgagccatat 3240
ctggatgtct gcatttacga cacctgctcc tgtgagtcca ttggggactg cgccgcattc 3300
tgcgacacca ttgctgccta tgcccacgtg tgtgcccagc atggcaaggt ggtgacctgg 3360
aggacggcca cattgtgccc ccagagctgc gaggagagga atctccggga gaacgggtat 3420
gaggctgagt ggcgctataa cagctgtgca cctgcctgtc aagtcacgtg tcagcaccct 3480
gagccactgg cctgccctgt gcagtgtgtg gagggctgcc atgcccactg ccctccaggg 3540
aaaatcctgg atgagctttt gcagacctgc gttgaccctg aagactgtcc agtgtgtgag 3600
gtggctggcc ggcgttttgc ctcaggaaag aaagtcacct tgaatcccag tgaccctgag 3660
cactgccaga tttgccactg tgatgttgtc aacctcacct gtgaagcctg ccaggagccg 3720
atatcgggta cctcagagtc tgctaccccc gagtcagggc caggatcaga gccagccacc 3780
tccgggtctg agacacccgg gacttccgag agtgccaccc ctgagtccgg acccgggtcc 3840
gagcccgcca cttccggctc cgaaactccc ggcacaagcg agagcgctac cccagagtca 3900
ggaccaggaa catctacaga gccctctgaa ggctccgctc cagggtcccc agccggcagt 3960
cccactagca ccgaggaggg aacctctgaa agcgccacac ccgaatcagg gccagggtct 4020
gagcctgcta ccagcggcag cgagacacca ggcacctctg agtccgccac accagagtcc 4080
ggacccggat ctcccgctgg gagccccacc tccactgagg agggatctcc tgctggctct 4140
ccaacatcta ctgaggaagg tacctcaacc gagccatccg agggatcagc tcccggcacc 4200
tcagagtcgg caaccccgga gtctggaccc ggaacttccg aaagtgccac accagagtcc 4260
ggtcccggga cttcagaatc agcaacaccc gagtccggcc ctgggtctga acccgccaca 4320
agtggtagtg agacaccagg atcagaacct gctacctcag ggtcagagac acccggatct 4380
ccggcaggct caccaacctc cactgaggag ggcaccagca cagaaccaag cgagggctcc 4440
gcacccggaa caagcactga acccagtgag ggttcagcac ccggctctga gccggccaca 4500
agtggcagtg agacacccgg cacttcagag agtgccaccc ccgagagtgg cccaggcact 4560
agtaccgagc cctctgaagg cagtgcgcca gattctggcg gtggaggttc cggtggcggg 4620
ggatccggtg gcgggggatc cggtggcggg ggatccggtg gcgggggatc cctggtcccc 4680
cggggcagcg gaggcgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagctcc agaactcctg 4740
ggcggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat ggcctcccgg 4800
acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 4860
aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 4920
tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tggcccagga ctggctgaat 4980
ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 5040
atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgc 5100
gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 5160
gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 5220
cccgtgttgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 5280
aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaacgcc 5340
tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaatga 5379
<210> 154
<211> 1792
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VWF058 (VWF034 with IHH mutation)
<400> 154
Met Ile Pro Ala Arg Phe Ala Gly Val Leu Leu Ala Leu Ala Leu Ile
1 5 10 15
Leu Pro Gly Thr Leu Cys Ala Glu Gly Thr Arg Gly Arg Ser Ser Thr
20 25 30
Ala Arg Cys Ser Leu Phe Gly Ser Asp Phe Val Asn Thr Phe Asp Gly
35 40 45
Ser Met Tyr Ser Phe Ala Gly Tyr Cys Ser Tyr Leu Leu Ala Gly Gly
50 55 60
Cys Gln Lys Arg Ser Phe Ser Ile Ile Gly Asp Phe Gln Asn Gly Lys
65 70 75 80
Arg Val Ser Leu Ser Val Tyr Leu Gly Glu Phe Phe Asp Ile His Leu
85 90 95
Phe Val Asn Gly Thr Val Thr Gln Gly Asp Gln Arg Val Ser Met Pro
100 105 110
Tyr Ala Ser Lys Gly Leu Tyr Leu Glu Thr Glu Ala Gly Tyr Tyr Lys
115 120 125
Leu Ser Gly Glu Ala Tyr Gly Phe Val Ala Arg Ile Asp Gly Ser Gly
130 135 140
Asn Phe Gln Val Leu Leu Ser Asp Arg Tyr Phe Asn Lys Thr Cys Gly
145 150 155 160
Leu Cys Gly Asn Phe Asn Ile Phe Ala Glu Asp Asp Phe Met Thr Gln
165 170 175
Glu Gly Thr Leu Thr Ser Asp Pro Tyr Asp Phe Ala Asn Ser Trp Ala
180 185 190
Leu Ser Ser Gly Glu Gln Trp Cys Glu Arg Ala Ser Pro Pro Ser Ser
195 200 205
Ser Cys Asn Ile Ser Ser Gly Glu Met Gln Lys Gly Leu Trp Glu Gln
210 215 220
Cys Gln Leu Leu Lys Ser Thr Ser Val Phe Ala Arg Cys His Pro Leu
225 230 235 240
Val Asp Pro Glu Pro Phe Val Ala Leu Cys Glu Lys Thr Leu Cys Glu
245 250 255
Cys Ala Gly Gly Leu Glu Cys Ala Cys Pro Ala Leu Leu Glu Tyr Ala
260 265 270
Arg Thr Cys Ala Gln Glu Gly Met Val Leu Tyr Gly Trp Thr Asp His
275 280 285
Ser Ala Cys Ser Pro Val Cys Pro Ala Gly Met Glu Tyr Arg Gln Cys
290 295 300
Val Ser Pro Cys Ala Arg Thr Cys Gln Ser Leu His Ile Asn Glu Met
305 310 315 320
Cys Gln Glu Arg Cys Val Asp Gly Cys Ser Cys Pro Glu Gly Gln Leu
325 330 335
Leu Asp Glu Gly Leu Cys Val Glu Ser Thr Glu Cys Pro Cys Val His
340 345 350
Ser Gly Lys Arg Tyr Pro Pro Gly Thr Ser Leu Ser Arg Asp Cys Asn
355 360 365
Thr Cys Ile Cys Arg Asn Ser Gln Trp Ile Cys Ser Asn Glu Glu Cys
370 375 380
Pro Gly Glu Cys Leu Val Thr Gly Gln Ser His Phe Lys Ser Phe Asp
385 390 395 400
Asn Arg Tyr Phe Thr Phe Ser Gly Ile Cys Gln Tyr Leu Leu Ala Arg
405 410 415
Asp Cys Gln Asp His Ser Phe Ser Ile Val Ile Glu Thr Val Gln Cys
420 425 430
Ala Asp Asp Arg Asp Ala Val Cys Thr Arg Ser Val Thr Val Arg Leu
435 440 445
Pro Gly Leu His Asn Ser Leu Val Lys Leu Lys His Gly Ala Gly Val
450 455 460
Ala Met Asp Gly Gln Asp Ile Gln Leu Pro Leu Leu Lys Gly Asp Leu
465 470 475 480
Arg Ile Gln His Thr Val Thr Ala Ser Val Arg Leu Ser Tyr Gly Glu
485 490 495
Asp Leu Gln Met Asp Trp Asp Gly Arg Gly Arg Leu Leu Val Lys Leu
500 505 510
Ser Pro Val Tyr Ala Gly Lys Thr Cys Gly Leu Cys Gly Asn Tyr Asn
515 520 525
Gly Asn Gln Gly Asp Asp Phe Leu Thr Pro Ser Gly Leu Ala Glu Pro
530 535 540
Arg Val Glu Asp Phe Gly Asn Ala Trp Lys Leu His Gly Asp Cys Gln
545 550 555 560
Asp Leu Gln Lys Gln His Ser Asp Pro Cys Ala Leu Asn Pro Arg Met
565 570 575
Thr Arg Phe Ser Glu Glu Ala Cys Ala Val Leu Thr Ser Pro Thr Phe
580 585 590
Glu Ala Cys His Arg Ala Val Ser Pro Leu Pro Tyr Leu Arg Asn Cys
595 600 605
Arg Tyr Asp Val Cys Ser Cys Ser Asp Gly Arg Glu Cys Leu Cys Gly
610 615 620
Ala Leu Ala Ser Tyr Ala Ala Ala Cys Ala Gly Arg Gly Val Arg Val
625 630 635 640
Ala Trp Arg Glu Pro Gly Arg Cys Glu Leu Asn Cys Pro Lys Gly Gln
645 650 655
Val Tyr Leu Gln Cys Gly Thr Pro Cys Asn Leu Thr Cys Arg Ser Leu
660 665 670
Ser Tyr Pro Asp Glu Glu Cys Asn Glu Ala Cys Leu Glu Gly Cys Phe
675 680 685
Cys Pro Pro Gly Leu Tyr Met Asp Glu Arg Gly Asp Cys Val Pro Lys
690 695 700
Ala Gln Cys Pro Cys Tyr Tyr Asp Gly Glu Ile Phe Gln Pro Glu Asp
705 710 715 720
Ile Phe Ser Asp His His Thr Met Cys Tyr Cys Glu Asp Gly Phe Met
725 730 735
His Cys Thr Met Ser Gly Val Pro Gly Ser Leu Leu Pro Asp Ala Val
740 745 750
Leu Ser Ser Pro Leu Ser His Arg Ser Lys Arg Ser Leu Ser Cys Arg
755 760 765
Pro Pro Met Val Lys Leu Val Cys Pro Ala Asp Asn Leu Arg Ala Glu
770 775 780
Gly Leu Glu Cys Thr Lys Thr Cys Gln Asn Tyr Asp Leu Glu Cys Met
785 790 795 800
Ser Met Gly Cys Val Ser Gly Cys Leu Cys Pro Pro Gly Met Val Arg
805 810 815
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820 825 830
Gly Lys Glu Tyr Ala Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Gly Cys Asn Thr
835 840 845
Cys Val Cys Arg Asp Arg Lys Trp Asn Cys Thr Asp His Val Cys Asp
850 855 860
Ala Thr Cys Ser Thr Ile Gly Met Ala His Tyr Leu Thr Phe Asp Gly
865 870 875 880
Leu Lys Tyr Leu Phe Pro Gly Glu Cys Gln Tyr Val Leu Val Gln Asp
885 890 895
Tyr Cys Gly Ser Asn Pro Gly Thr Phe Arg Ile Leu Val Gly Asn Lys
900 905 910
Gly Cys Ser His Pro Ser Val Lys Cys Lys Lys Arg Val Thr Ile Leu
915 920 925
Val Glu Gly Gly Glu Ile Glu Leu Phe Asp Gly Glu Val Asn Val Lys
930 935 940
Arg Pro Met Lys Asp Glu Thr His Phe Glu Val Val Glu Ser Gly Arg
945 950 955 960
Tyr Ile Ile Leu Leu Leu Gly Lys Ala Leu Ser Val Val Trp Asp Arg
965 970 975
His Leu Ser Ile Ser Val Val Leu Lys Gln Thr Tyr Gln Glu Lys Val
980 985 990
Cys Gly Leu Cys Gly Asn Phe Asp Gly Ile Gln Asn Asn Asp Leu Thr
995 1000 1005
Ser Ser Asn Leu Gln Val Glu Glu Asp Pro Val Asp Phe Gly Asn
1010 1015 1020
Ser Trp Lys Val Ser Ser Gln Cys Ala Asp Thr Arg Lys Val Pro
1025 1030 1035
Leu Asp Ser Ser Pro Ala Thr Cys His Asn Asn Ile Met Lys Gln
1040 1045 1050
Thr Met Val Asp Ser Ser Cys Arg Ile Leu Thr Ser Asp Val Phe
1055 1060 1065
Gln Asp Cys Asn Lys Leu Val Asp Pro Glu Pro Tyr Leu Asp Val
1070 1075 1080
Cys Ile Tyr Asp Thr Cys Ser Cys Glu Ser Ile Gly Asp Cys Ala
1085 1090 1095
Ala Phe Cys Asp Thr Ile Ala Ala Tyr Ala His Val Cys Ala Gln
1100 1105 1110
His Gly Lys Val Val Thr Trp Arg Thr Ala Thr Leu Cys Pro Gln
1115 1120 1125
Ser Cys Glu Glu Arg Asn Leu Arg Glu Asn Gly Tyr Glu Ala Glu
1130 1135 1140
Trp Arg Tyr Asn Ser Cys Ala Pro Ala Cys Gln Val Thr Cys Gln
1145 1150 1155
His Pro Glu Pro Leu Ala Cys Pro Val Gln Cys Val Glu Gly Cys
1160 1165 1170
His Ala His Cys Pro Pro Gly Lys Ile Leu Asp Glu Leu Leu Gln
1175 1180 1185
Thr Cys Val Asp Pro Glu Asp Cys Pro Val Cys Glu Val Ala Gly
1190 1195 1200
Arg Arg Phe Ala Ser Gly Lys Lys Val Thr Leu Asn Pro Ser Asp
1205 1210 1215
Pro Glu His Cys Gln Ile Cys His Cys Asp Val Val Asn Leu Thr
1220 1225 1230
Cys Glu Ala Cys Gln Glu Pro Ile Ser Gly Thr Ser Glu Ser Ala
1235 1240 1245
Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser
1250 1255 1260
Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro
1265 1270 1275
Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser
1280 1285 1290
Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro
1295 1300 1305
Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser
1310 1315 1320
Thr Glu Glu Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro
1325 1330 1335
Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser
1340 1345 1350
Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser
1355 1360 1365
Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser
1370 1375 1380
Thr Glu Glu Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro
1385 1390 1395
Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser
1400 1405 1410
Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala
1415 1420 1425
Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser
1430 1435 1440
Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro
1445 1450 1455
Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser
1460 1465 1470
Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro
1475 1480 1485
Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser
1490 1495 1500
Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro
1505 1510 1515
Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Asp Ser Gly
1520 1525 1530
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1535 1540 1545
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Val Pro Arg Gly Ser
1550 1555 1560
Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
1565 1570 1575
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
1580 1585 1590
Asp Thr Leu Met Ala Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
1595 1600 1605
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
1610 1615 1620
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
1625 1630 1635
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
1640 1645 1650
Leu Ala Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
1655 1660 1665
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
1670 1675 1680
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
1685 1690 1695
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
1700 1705 1710
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
1715 1720 1725
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
1730 1735 1740
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
1745 1750 1755
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
1760 1765 1770
His Glu Ala Leu His Asn Ala Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
1775 1780 1785
Ser Pro Gly Lys
1790
<210> 155
<211> 5937
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FVIII 169
<400> 155
atgcaaatag agctctccac ctgcttcttt ctgtgccttt tgcgattctg ctttagtgcc 60
accagaagat actacctggg tgcagtggaa ctgtcatggg actatatgca aagtgatctc 120
ggtgagctgc ctgtggacgc aagatttcct cctagagtgc caaaatcttt tccattcaac 180
acctcagtcg tgtacaaaaa gactctgttt gtagaattca cggatcacct tttcaacatc 240
gctaagccaa ggccaccctg gatgggtctg ctaggtccta ccatccaggc tgaggtttat 300
gatacagtgg tcattacact taagaacatg gcttcccatc ctgtcagtct tcatgctgtt 360
ggtgtatcct actggaaagc ttctgaggga gctgaatatg atgatcagac cagtcaaagg 420
gagaaagaag atgataaagt cttccctggt ggaagccata catatgtctg gcaggtcctg 480
aaagagaatg gtccaatggc ctctgaccca ctgtgcctta cctactcata tctttctcat 540
gtggacctgg taaaagactt gaattcaggc ctcattggag ccctactagt atgtagagaa 600
gggagtctgg ccaaggaaaa gacacagacc ttgcacaaat ttatactact ttttgctgta 660
tttgatgaag ggaaaagttg gcactcagaa acaaagaact ccttgatgca ggatagggat 720
gctgcatctg ctcgggcctg gcctaaaatg cacacagtca atggttatgt aaacaggtct 780
ctgccaggtc tgattggatg ccacaggaaa tcagtctatt ggcatgtgat tggaatgggc 840
accactcctg aagtgcactc aatattcctc gaaggtcaca catttcttgt gaggaaccat 900
cgccaggcta gcttggaaat ctcgccaata actttcctta ctgctcaaac actcttgatg 960
gaccttggac agtttctact gttttgtcat atctcttccc accaacatga tggcatggaa 1020
gcttatgtca aagtagacag ctgtccagag gaaccccaac tacgaatgaa aaataatgaa 1080
gaagcggaag actatgatga tgatcttact gattctgaaa tggatgtggt caggtttgat 1140
gatgacaact ctccttcctt tatccaaatt cgctcagttg ccaagaagca tcctaaaact 1200
tgggtacatt acattgctgc tgaagaggag gactgggact atgctccctt agtcctcgcc 1260
cccgatgaca gaagttataa aagtcaatat ttgaacaatg gccctcagcg gattggtagg 1320
aagtacaaaa aagtccgatt tatggcatac acagatgaaa cctttaagac tcgtgaagct 1380
attcagcatg aatcaggaat cttgggacct ttactttatg gggaagttgg agacacactg 1440
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gatgtccgtc ctttgtattc aaggagatta ccaaaaggtg taaaacattt gaaggatttt 1560
ccaattctgc caggagaaat attcaaatat aaatggacag tgactgtaga agatgggcca 1620
actaaatcag atcctcggtg cctgacccgc tattactcta gtttcgttaa tatggagaga 1680
gatctagctt caggactcat tggccctctc ctcatctgct acaaagaatc tgtagatcaa 1740
agaggaaacc agataatgtc agacaagagg aatgtcatcc tgttttctgt atttgatgag 1800
aaccgaagct ggtacctcac agagaatata caacgctttc tccccaatcc agctggagtg 1860
cagcttgagg atccagagtt ccaagcctcc aacatcatgc acagcatcaa tggctatgtt 1920
tttgatagtt tgcagttgtc agtttgtttg catgaggtgg catactggta cattctaagc 1980
attggagcac agactgactt cctttctgtc ttcttctctg gatatacctt caaacacaaa 2040
atggtctatg aagacacact caccctattc ccattctcag gagaaactgt cttcatgtcg 2100
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agttatgaag atatttcagc atacttgctg agtaaaaaca atgccattga accaagaagc 2280
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tcagagccag ccacctccgg gtctgagaca cccgggactt ccgagagtgc cacccctgag 2400
tccggacccg ggtccgagcc cgccacttcc ggctccgaaa ctcccggcac aagcgagagc 2460
gctaccccag agtcaggacc aggaacatct acagagccct ctgaaggctc cgctccaggg 2520
tccccagccg gcagtcccac tagcaccgag gagggaacct ctgaaagcgc cacacccgaa 2580
tcagggccag ggtctgagcc tgctaccagc ggcagcgaga caccaggcac ctctgagtcc 2640
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tctcctgctg gctctccaac atctactgag gaaggtacct caaccgagcc atccgaggga 2760
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atcgattatg atgataccat atcagttgaa atgaagaagg aagattttga catttatgat 3300
gaggatgaaa atcagagccc ccgcagcttt caaaagaaaa cacgacacta ttttattgct 3360
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tcctttactc agcccttata ccgtggagaa ctaaatgaac atttgggact cctggggcca 3540
tatataagag cagaagttga agataatatc atggtaactt tcagaaatca ggcctctcgt 3600
ccctattcct tctattctag ccttatttct tatgaggaag atcagaggca aggagcagaa 3660
cctagaaaaa actttgtcaa gcctaatgaa accaaaactt acttttggaa agtgcaacat 3720
catatggcac ccactaaaga tgagtttgac tgcaaagcct gggcttattt ctctgatgtt 3780
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atctttgatg agaccaaaag ctggtacttc actgaaaata tggaaagaaa ctgcagggct 3960
ccctgcaata tccagatgga agatcccact tttaaagaga attatcgctt ccatgcaatc 4020
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tggtatctgc tcagcatggg cagcaatgaa aacatccatt ctattcattt cagtggacat 4140
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attggcgagc atctacatgc tgggatgagc acactttttc tggtgtacag caataagtgt 4320
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tggagcacca aggagccctt ttcttggatc aaggtggatc tgttggcacc aatgattatt 4500
cacggcatca agacccaggg tgcccgtcag aagttctcca gcctctacat ctctcagttt 4560
atcatcatgt atagtcttga tgggaagaag tggcagactt atcgaggaaa ttccactgga 4620
accttaatgg tcttctttgg caatgtggat tcatctggga taaaacacaa tatttttaac 4680
cctccaatta ttgctcgata catccgtttg cacccaactc attatagcat tcgcagcact 4740
cttcgcatgg agttgatggg ctgtgattta aatagttgca gcatgccatt gggaatggag 4800
agtaaagcaa tatcagatgc acagattact gcttcatcct actttaccaa tatgtttgcc 4860
acctggtctc cttcaaaagc tcgacttcac ctccaaggga ggagtaatgc ctggagacct 4920
caggtgaata atccaaaaga gtggctgcaa gtggacttcc agaagacaat gaaagtcaca 4980
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atctccagca gtcaagatgg ccatcagtgg actctctttt ttcagaatgg caaagtaaag 5100
gtttttcagg gaaatcaaga ctccttcaca cctgtggtga actctctaga cccaccgtta 5160
ctgactcgct accttcgaat tcacccccag agttgggtgc accagattgc cctgaggatg 5220
gaggttctgg gctgcgaggc acaggacctc tacgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc 5280
ccagctccag aactcctggg cggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac 5340
accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa 5400
gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca 5460
aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg 5520
caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca 5580
gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac 5640
accctgcccc catcccggga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc 5700
aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac 5760
aactacaaga ccacgcctcc cgtgttggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag 5820
ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat 5880
gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaatga 5937
<210> 156
<211> 6387
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FVIII 263 (IHH triple mutant)
<400> 156
atgcaaatag agctctccac ctgcttcttt ctgtgccttt tgcgattctg ctttagtgcc 60
accagaagat actacctggg tgcagtggaa ctgtcatggg actatatgca aggcgcgcca 120
acatcagaga gcgccacccc tgaaagtggt cccgggagcg agccagccac atctgggtcg 180
gaaacgccag gcacaagtga gtctgcaact cccgagtccg gacctggctc cgagcctgcc 240
actagcggct ccgagactcc gggaacttcc gagagcgcta caccagaaag cggacccgga 300
accagtaccg aacctagcga gggctctgct ccgggcagcc cagccggctc tcctacatcc 360
acggaggagg gcacttccga atccgccacc ccggagtcag ggccaggatc tgaacccgct 420
acctcaggca gtgagacgcc aggaacgagc gagtccgcta caccggagag tgggccaggg 480
agccctgctg gatctcctac gtccactgag gaagggtcac cagcgggctc gcccaccagc 540
actgaagaag gtgcctcgag cagtgatctc ggtgagctgc ctgtggacgc aagatttcct 600
cctagagtgc caaaatcttt tccattcaac acctcagtcg tgtacaaaaa gactctgttt 660
gtagaattca cggatcacct tttcaacatc gctaagccaa ggccaccctg gatgggtctg 720
ctaggtccta ccatccaggc tgaggtttat gatacagtgg tcattacact taagaacatg 780
gcttcccatc ctgtcagtct tcatgctgtt ggtgtatcct actggaaagc ttctgaggga 840
gctgaatatg atgatcagac cagtcaaagg gagaaagaag atgataaagt cttccctggt 900
ggaagccata catatgtctg gcaggtcctg aaagagaatg gtccaatggc ctctgaccca 960
ctgtgcctta cctactcata tctttctcat gtggacctgg taaaagactt gaattcaggc 1020
ctcattggag ccctactagt atgtagagaa gggagtctgg ccaaggaaaa gacacagacc 1080
ttgcacaaat ttatactact ttttgctgta tttgatgaag ggaaaagttg gcactcagaa 1140
acaaagaact ccttgatgca ggatagggat gctgcatctg ctcgggcctg gcctaaaatg 1200
cacacagtca atggttatgt aaacaggtct ctgccaggtc tgattggatg ccacaggaaa 1260
tcagtctatt ggcatgtgat tggaatgggc accactcctg aagtgcactc aatattcctc 1320
gaaggtcaca catttcttgt gaggaaccat cgccaggcta gcttggaaat ctcgccaata 1380
actttcctta ctgctcaaac actcttgatg gaccttggac agtttctact gttttgtcat 1440
atctcttccc accaacatga tggcatggaa gcttatgtca aagtagacag ctgtccagag 1500
gaaccccaac tacgaatgaa aaataatgaa gaagcggaag actatgatga tgatcttact 1560
gattctgaaa tggatgtggt caggtttgat gatgacaact ctccttcctt tatccaaatt 1620
cgctcagttg ccaagaagca tcctaaaact tgggtacatt acattgctgc tgaagaggag 1680
gactgggact atgctccctt agtcctcgcc cccgatgaca gaagttataa aagtcaatat 1740
ttgaacaatg gccctcagcg gattggtagg aagtacaaaa aagtccgatt tatggcatac 1800
acagatgaaa cctttaagac tcgtgaagct attcagcatg aatcaggaat cttgggacct 1860
ttactttatg gggaagttgg agacacactg ttgattatat ttaagaatca agcaagcaga 1920
ccatataaca tctaccctca cggaatcact gatgtccgtc ctttgtattc aaggagatta 1980
ccaaaaggtg taaaacattt gaaggatttt ccaattctgc caggagaaat attcaaatat 2040
aaatggacag tgactgtaga agatgggcca actaaatcag atcctcggtg cctgacccgc 2100
tattactcta gtttcgttaa tatggagaga gatctagctt caggactcat tggccctctc 2160
ctcatctgct acaaagaatc tgtagatcaa agaggaaacc agataatgtc agacaagagg 2220
aatgtcatcc tgttttctgt atttgatgag aaccgaagct ggtacctcac agagaatata 2280
caacgctttc tccccaatcc agctggagtg cagcttgagg atccagagtt ccaagcctcc 2340
aacatcatgc acagcatcaa tggctatgtt tttgatagtt tgcagttgtc agtttgtttg 2400
catgaggtgg catactggta cattctaagc attggagcac agactgactt cctttctgtc 2460
ttcttctctg gatatacctt caaacacaaa atggtctatg aagacacact caccctattc 2520
ccattctcag gagaaactgt cttcatgtcg atggaaaacc caggtctatg gattctgggg 2580
tgccacaact cagactttcg gaacagaggc atgaccgcct tactgaaggt ttctagttgt 2640
gacaagaaca ctggtgatta ttacgaggac agttatgaag atatttcagc atacttgctg 2700
agtaaaaaca atgccattga accaagaagc ttctctcaaa acggcgcgcc aggtacctca 2760
gagtctgcta cccccgagtc agggccagga tcagagccag ccacctccgg gtctgagaca 2820
cccgggactt ccgagagtgc cacccctgag tccggacccg ggtccgagcc cgccacttcc 2880
ggctccgaaa ctcccggcac aagcgagagc gctaccccag agtcaggacc aggaacatct 2940
acagagccct ctgaaggctc cgctccaggg tccccagccg gcagtcccac tagcaccgag 3000
gagggaacct ctgaaagcgc cacacccgaa tcagggccag ggtctgagcc tgctaccagc 3060
ggcagcgaga caccaggcac ctctgagtcc gccacaccag agtccggacc cggatctccc 3120
gctgggagcc ccacctccac tgaggaggga tctcctgctg gctctccaac atctactgag 3180
gaaggtacct caaccgagcc atccgaggga tcagctcccg gcacctcaga gtcggcaacc 3240
ccggagtctg gacccggaac ttccgaaagt gccacaccag agtccggtcc cgggacttca 3300
gaatcagcaa cacccgagtc cggccctggg tctgaacccg ccacaagtgg tagtgagaca 3360
ccaggatcag aacctgctac ctcagggtca gagacacccg gatctccggc aggctcacca 3420
acctccactg aggagggcac cagcacagaa ccaagcgagg gctccgcacc cggaacaagc 3480
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cccggcactt cagagagtgc cacccccgag agtggcccag gcactagtac cgagccctct 3600
gaaggcagtg cgccagcctc gagcccacca gtcttgaaac gccatcaagc tgaaataact 3660
cgtactactc ttcagtcaga tcaagaggaa atcgattatg atgataccat atcagttgaa 3720
atgaagaagg aagattttga catttatgat gaggatgaaa atcagagccc ccgcagcttt 3780
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tttaaagaga attatcgctt ccatgcaatc aatggctaca taatggatac actacctggc 4500
ttagtaatgg ctcaggatca aaggattcga tggtatctgc tcagcatggg cagcaatgaa 4560
aacatccatt ctattcattt cagtggacat gtgttcactg tacgaaaaaa agaggagtat 4620
aaaatggcac tgtacaatct ctatccaggt gtttttgaga cagtggaaat gttaccatcc 4680
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cctgtggtga actctctaga cccaccgtta ctgactcgct accttcgaat tcacccccag 5640
agttgggtgc accagattgc cctgaggatg gaggttctgg gctgcgaggc acaggacctc 5700
tacgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagctccag aactcctggg cggaccgtca 5760
gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatgg cctcccggac ccctgaggtc 5820
acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 5880
gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 5940
taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg gcccaggact ggctgaatgg caaggagtac 6000
aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 6060
aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccgcga tgagctgacc 6120
aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 6180
gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgttggac 6240
tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 6300
gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaacgccta cacgcagaag 6360
agcctctccc tgtctccggg taaatga 6387
<210> 157
<211> 2128
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FVIII 263 (IHH triple mutant)
<400> 157
Met Gln Ile Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys Leu Leu Arg Phe
1 5 10 15
Cys Phe Ser Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser
20 25 30
Trp Asp Tyr Met Gln Gly Ala Pro Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu
35 40 45
Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly
50 55 60
Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala
65 70 75 80
Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu
85 90 95
Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly
100 105 110
Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Glu Ser
115 120 125
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser
130 135 140
Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly
145 150 155 160
Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Ser Pro Ala Gly
165 170 175
Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Ala Ser Ser Ser Asp Leu Gly Glu
180 185 190
Leu Pro Val Asp Ala Arg Phe Pro Pro Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro
195 200 205
Phe Asn Thr Ser Val Val Tyr Lys Lys Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr
210 215 220
Asp His Leu Phe Asn Ile Ala Lys Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu
225 230 235 240
Leu Gly Pro Thr Ile Gln Ala Glu Val Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr
245 250 255
Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val
260 265 270
Ser Tyr Trp Lys Ala Ser Glu Gly Ala Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser
275 280 285
Gln Arg Glu Lys Glu Asp Asp Lys Val Phe Pro Gly Gly Ser His Thr
290 295 300
Tyr Val Trp Gln Val Leu Lys Glu Asn Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro
305 310 315 320
Leu Cys Leu Thr Tyr Ser Tyr Leu Ser His Val Asp Leu Val Lys Asp
325 330 335
Leu Asn Ser Gly Leu Ile Gly Ala Leu Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser
340 345 350
Leu Ala Lys Glu Lys Thr Gln Thr Leu His Lys Phe Ile Leu Leu Phe
355 360 365
Ala Val Phe Asp Glu Gly Lys Ser Trp His Ser Glu Thr Lys Asn Ser
370 375 380
Leu Met Gln Asp Arg Asp Ala Ala Ser Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met
385 390 395 400
His Thr Val Asn Gly Tyr Val Asn Arg Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly
405 410 415
Cys His Arg Lys Ser Val Tyr Trp His Val Ile Gly Met Gly Thr Thr
420 425 430
Pro Glu Val His Ser Ile Phe Leu Glu Gly His Thr Phe Leu Val Arg
435 440 445
Asn His Arg Gln Ala Ser Leu Glu Ile Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr
450 455 460
Ala Gln Thr Leu Leu Met Asp Leu Gly Gln Phe Leu Leu Phe Cys His
465 470 475 480
Ile Ser Ser His Gln His Asp Gly Met Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp
485 490 495
Ser Cys Pro Glu Glu Pro Gln Leu Arg Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala
500 505 510
Glu Asp Tyr Asp Asp Asp Leu Thr Asp Ser Glu Met Asp Val Val Arg
515 520 525
Phe Asp Asp Asp Asn Ser Pro Ser Phe Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala
530 535 540
Lys Lys His Pro Lys Thr Trp Val His Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu
545 550 555 560
Asp Trp Asp Tyr Ala Pro Leu Val Leu Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr
565 570 575
Lys Ser Gln Tyr Leu Asn Asn Gly Pro Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr
580 585 590
Lys Lys Val Arg Phe Met Ala Tyr Thr Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg
595 600 605
Glu Ala Ile Gln His Glu Ser Gly Ile Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly
610 615 620
Glu Val Gly Asp Thr Leu Leu Ile Ile Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg
625 630 635 640
Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro His Gly Ile Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr
645 650 655
Ser Arg Arg Leu Pro Lys Gly Val Lys His Leu Lys Asp Phe Pro Ile
660 665 670
Leu Pro Gly Glu Ile Phe Lys Tyr Lys Trp Thr Val Thr Val Glu Asp
675 680 685
Gly Pro Thr Lys Ser Asp Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser
690 695 700
Phe Val Asn Met Glu Arg Asp Leu Ala Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu
705 710 715 720
Leu Ile Cys Tyr Lys Glu Ser Val Asp Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met
725 730 735
Ser Asp Lys Arg Asn Val Ile Leu Phe Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg
740 745 750
Ser Trp Tyr Leu Thr Glu Asn Ile Gln Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala
755 760 765
Gly Val Gln Leu Glu Asp Pro Glu Phe Gln Ala Ser Asn Ile Met His
770 775 780
Ser Ile Asn Gly Tyr Val Phe Asp Ser Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu
785 790 795 800
His Glu Val Ala Tyr Trp Tyr Ile Leu Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp
805 810 815
Phe Leu Ser Val Phe Phe Ser Gly Tyr Thr Phe Lys His Lys Met Val
820 825 830
Tyr Glu Asp Thr Leu Thr Leu Phe Pro Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe
835 840 845
Met Ser Met Glu Asn Pro Gly Leu Trp Ile Leu Gly Cys His Asn Ser
850 855 860
Asp Phe Arg Asn Arg Gly Met Thr Ala Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys
865 870 875 880
Asp Lys Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser
885 890 895
Ala Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser
900 905 910
Gln Asn Gly Ala Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly
915 920 925
Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser
930 935 940
Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser
945 950 955 960
Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly
965 970 975
Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ser Pro
980 985 990
Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr
995 1000 1005
Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu
1010 1015 1020
Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly
1025 1030 1035
Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Ser Pro Ala
1040 1045 1050
Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser
1055 1060 1065
Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser
1070 1075 1080
Gly Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly
1085 1090 1095
Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro
1100 1105 1110
Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser
1115 1120 1125
Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr
1130 1135 1140
Glu Glu Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly
1145 1150 1155
Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ser Glu Pro
1160 1165 1170
Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr
1175 1180 1185
Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser
1190 1195 1200
Ala Pro Ala Ser Ser Pro Pro Val Leu Lys Arg His Gln Ala Glu
1205 1210 1215
Ile Thr Arg Thr Thr Leu Gln Ser Asp Gln Glu Glu Ile Asp Tyr
1220 1225 1230
Asp Asp Thr Ile Ser Val Glu Met Lys Lys Glu Asp Phe Asp Ile
1235 1240 1245
Tyr Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe Gln Lys Lys
1250 1255 1260
Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp Asp Tyr
1265 1270 1275
Gly Met Ser Ser Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg Ala Gln Ser
1280 1285 1290
Gly Ser Val Pro Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr
1295 1300 1305
Asp Gly Ser Phe Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu
1310 1315 1320
His Leu Gly Leu Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp
1325 1330 1335
Asn Ile Met Val Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser
1340 1345 1350
Phe Tyr Ser Ser Leu Ile Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly
1355 1360 1365
Ala Glu Pro Arg Lys Asn Phe Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr
1370 1375 1380
Tyr Phe Trp Lys Val Gln His His Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu
1385 1390 1395
Phe Asp Cys Lys Ala Trp Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu
1400 1405 1410
Lys Asp Val His Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Val Cys His
1415 1420 1425
Thr Asn Thr Leu Asn Pro Ala His Gly Arg Gln Val Thr Val Gln
1430 1435 1440
Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr Ile Phe Asp Glu Thr Lys Ser Trp
1445 1450 1455
Tyr Phe Thr Glu Asn Met Glu Arg Asn Cys Arg Ala Pro Cys Asn
1460 1465 1470
Ile Gln Met Glu Asp Pro Thr Phe Lys Glu Asn Tyr Arg Phe His
1475 1480 1485
Ala Ile Asn Gly Tyr Ile Met Asp Thr Leu Pro Gly Leu Val Met
1490 1495 1500
Ala Gln Asp Gln Arg Ile Arg Trp Tyr Leu Leu Ser Met Gly Ser
1505 1510 1515
Asn Glu Asn Ile His Ser Ile His Phe Ser Gly His Val Phe Thr
1520 1525 1530
Val Arg Lys Lys Glu Glu Tyr Lys Met Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr
1535 1540 1545
Pro Gly Val Phe Glu Thr Val Glu Met Leu Pro Ser Lys Ala Gly
1550 1555 1560
Ile Trp Arg Val Glu Cys Leu Ile Gly Glu His Leu His Ala Gly
1565 1570 1575
Met Ser Thr Leu Phe Leu Val Tyr Ser Asn Lys Cys Gln Thr Pro
1580 1585 1590
Leu Gly Met Ala Ser Gly His Ile Arg Asp Phe Gln Ile Thr Ala
1595 1600 1605
Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp Ala Pro Lys Leu Ala Arg Leu His
1610 1615 1620
Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala Trp Ser Thr Lys Glu Pro Phe Ser
1625 1630 1635
Trp Ile Lys Val Asp Leu Leu Ala Pro Met Ile Ile His Gly Ile
1640 1645 1650
Lys Thr Gln Gly Ala Arg Gln Lys Phe Ser Ser Leu Tyr Ile Ser
1655 1660 1665
Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp Gly Lys Lys Trp Gln Thr
1670 1675 1680
Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu Met Val Phe Phe Gly Asn
1685 1690 1695
Val Asp Ser Ser Gly Ile Lys His Asn Ile Phe Asn Pro Pro Ile
1700 1705 1710
Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg
1715 1720 1725
Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu Met Gly Cys Asp Leu Asn Ser Cys
1730 1735 1740
Ser Met Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys Ala Ile Ser Asp Ala Gln
1745 1750 1755
Ile Thr Ala Ser Ser Tyr Phe Thr Asn Met Phe Ala Thr Trp Ser
1760 1765 1770
Pro Ser Lys Ala Arg Leu His Leu Gln Gly Arg Ser Asn Ala Trp
1775 1780 1785
Arg Pro Gln Val Asn Asn Pro Lys Glu Trp Leu Gln Val Asp Phe
1790 1795 1800
Gln Lys Thr Met Lys Val Thr Gly Val Thr Thr Gln Gly Val Lys
1805 1810 1815
Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr Val Lys Glu Phe Leu Ile Ser Ser
1820 1825 1830
Ser Gln Asp Gly His Gln Trp Thr Leu Phe Phe Gln Asn Gly Lys
1835 1840 1845
Val Lys Val Phe Gln Gly Asn Gln Asp Ser Phe Thr Pro Val Val
1850 1855 1860
Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu Leu Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His
1865 1870 1875
Pro Gln Ser Trp Val His Gln Ile Ala Leu Arg Met Glu Val Leu
1880 1885 1890
Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu Tyr Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
1895 1900 1905
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
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Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
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Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
1955 1960 1965
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
1970 1975 1980
Val Ser Val Leu Thr Val Leu Ala Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
1985 1990 1995
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
2000 2005 2010
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
2015 2020 2025
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
2030 2035 2040
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
2045 2050 2055
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
2060 2065 2070
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
2075 2080 2085
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
2090 2095 2100
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Ala Tyr Thr
2105 2110 2115
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
2120 2125
<210> 158
<211> 5505
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FVIII 282
<400> 158
atgcaaatag agctctccac ctgcttcttt ctgtgccttt tgcgattctg ctttagtgcc 60
accagaagat actacctggg tgcagtggaa ctgtcatggg actatatgca aagtgatctc 120
ggtgagctgc ctgtggacgc aagatttcct cctagagtgc caaaatcttt tccattcaac 180
acctcagtcg tgtacaaaaa gactctgttt gtagaattca cggatcacct tttcaacatc 240
gctaagccaa ggccaccctg gatgggtctg ctaggtccta ccatccaggc tgaggtttat 300
gatacagtgg tcattacact taagaacatg gcttcccatc ctgtcagtct tcatgctgtt 360
ggtgtatcct actggaaagc ttctgaggga gctgaatatg atgatcagac cagtcaaagg 420
gagaaagaag atgataaagt cttccctggt ggaagccata catatgtctg gcaggtcctg 480
aaagagaatg gtccaatggc ctctgaccca ctgtgcctta cctactcata tctttctcat 540
gtggacctgg taaaagactt gaattcaggc ctcattggag ccctactagt atgtagagaa 600
gggagtctgg ccaaggaaaa gacacagacc ttgcacaaat ttatactact ttttgctgta 660
tttgatgaag ggaaaagttg gcactcagaa acaaagaact ccttgatgca ggatagggat 720
gctgcatctg ctcgggcctg gcctaaaatg cacacagtca atggttatgt aaacaggtct 780
ctgccaggtc tgattggatg ccacaggaaa tcagtctatt ggcatgtgat tggaatgggc 840
accactcctg aagtgcactc aatattcctc gaaggtcaca catttcttgt gaggaaccat 900
cgccaggcta gcttggaaat ctcgccaata actttcctta ctgctcaaac actcttgatg 960
gaccttggac agtttctact gttttgtcat atctcttccc accaacatga tggcatggaa 1020
gcttatgtca aagtagacag ctgtccagag gaaccccaac tacgaatgaa aaataatgaa 1080
gaagcggaag actatgatga tgatcttact gattctgaaa tggatgtggt caggtttgat 1140
gatgacaact ctccttcctt tatccaaatt cgctcagttg ccaagaagca tcctaaaact 1200
tgggtacatt acattgctgc tgaagaggag gactgggact atgctccctt agtcctcgcc 1260
cccgatgaca gaagttataa aagtcaatat ttgaacaatg gccctcagcg gattggtagg 1320
aagtacaaaa aagtccgatt tatggcatac acagatgaaa cctttaagac tcgtgaagct 1380
attcagcatg aatcaggaat cttgggacct ttactttatg gggaagttgg agacacactg 1440
ttgattatat ttaagaatca agcaagcaga ccatataaca tctaccctca cggaatcact 1500
gatgtccgtc ctttgtattc aaggagatta ccaaaaggtg taaaacattt gaaggatttt 1560
ccaattctgc caggagaaat attcaaatat aaatggacag tgactgtaga agatgggcca 1620
actaaatcag atcctcggtg cctgacccgc tattactcta gtttcgttaa tatggagaga 1680
gatctagctt caggactcat tggccctctc ctcatctgct acaaagaatc tgtagatcaa 1740
agaggaaacc agataatgtc agacaagagg aatgtcatcc tgttttctgt atttgatgag 1800
aaccgaagct ggtacctcac agagaatata caacgctttc tccccaatcc agctggagtg 1860
cagcttgagg atccagagtt ccaagcctcc aacatcatgc acagcatcaa tggctatgtt 1920
tttgatagtt tgcagttgtc agtttgtttg catgaggtgg catactggta cattctaagc 1980
attggagcac agactgactt cctttctgtc ttcttctctg gatatacctt caaacacaaa 2040
atggtctatg aagacacact caccctattc ccattctcag gagaaactgt cttcatgtcg 2100
atggaaaacc caggtctatg gattctgggg tgccacaact cagactttcg gaacagaggc 2160
atgaccgcct tactgaaggt ttctagttgt gacaagaaca ctggtgatta ttacgaggac 2220
agttatgaag atatttcagc atacttgctg agtaaaaaca atgccattga accaagaagc 2280
ttctctcaaa acggcgcgcc aacatcagag agcgccaccc ctgaaagtgg tcccgggagc 2340
gagccagcca catctgggtc ggaaacgcca ggcacaagtg agtctgcaac tcccgagtcc 2400
ggacctggct ccgagcctgc cactagcggc tccgagactc cgggaacttc cgagagcgct 2460
acaccagaaa gcggacccgg aaccagtacc gaacctagcg agggctctgc tccgggcagc 2520
ccagccggct ctcctacatc cacggaggag ggcacttccg aatccgccac cccggagtca 2580
gggccaggat ctgaacccgc tacctcaggc agtgagacgc caggaacgag cgagtccgct 2640
acaccggaga gtgggccagg gagccctgct ggatctccta cgtccactga ggaagggtca 2700
ccagcgggct cgcccaccag cactgaagaa ggtgcctcga gcccaccagt cttgaaacgc 2760
catcaagctg aaataactcg tactactctt cagtcagatc aagaggaaat cgattatgat 2820
gataccatat cagttgaaat gaagaaggaa gattttgaca tttatgatga ggatgaaaat 2880
cagagccccc gcagctttca aaagaaaaca cgacactatt ttattgctgc agtggagagg 2940
ctctgggatt atgggatgag tagctcccca catgttctaa gaaacagggc tcagagtggc 3000
agtgtccctc agttcaagaa agttgttttc caggaattta ctgatggctc ctttactcag 3060
cccttatacc gtggagaact aaatgaacat ttgggactcc tggggccata tataagagca 3120
gaagttgaag ataatatcat ggtaactttc agaaatcagg cctctcgtcc ctattccttc 3180
tattctagcc ttatttctta tgaggaagat cagaggcaag gagcagaacc tagaaaaaac 3240
tttgtcaagc ctaatgaaac caaaacttac ttttggaaag tgcaacatca tatggcaccc 3300
actaaagatg agtttgactg caaagcctgg gcttatttct ctgatgttga cctggaaaaa 3360
gatgtgcact caggcctgat tggacccctt ctggtctgcc acactaacac actgaaccct 3420
gctcatggga gacaagtgac agtacaggaa tttgctctgt ttttcaccat ctttgatgag 3480
accaaaagct ggtacttcac tgaaaatatg gaaagaaact gcagggctcc ctgcaatatc 3540
cagatggaag atcccacttt taaagagaat tatcgcttcc atgcaatcaa tggctacata 3600
atggatacac tacctggctt agtaatggct caggatcaaa ggattcgatg gtatctgctc 3660
agcatgggca gcaatgaaaa catccattct attcatttca gtggacatgt gttcactgta 3720
cgaaaaaaag aggagtataa aatggcactg tacaatctct atccaggtgt ttttgagaca 3780
gtggaaatgt taccatccaa agctggaatt tggcgggtgg aatgccttat tggcgagcat 3840
ctacatgctg ggatgagcac actttttctg gtgtacagca ataagtgtca gactcccctg 3900
ggaatggctt ctggacacat tagagatttt cagattacag cttcaggaca atatggacag 3960
tgggccccaa agctggccag acttcattat tccggatcaa tcaatgcctg gagcaccaag 4020
gagccctttt cttggatcaa ggtggatctg ttggcaccaa tgattattca cggcatcaag 4080
acccagggtg cccgtcagaa gttctccagc ctctacatct ctcagtttat catcatgtat 4140
agtcttgatg ggaagaagtg gcagacttat cgaggaaatt ccactggaac cttaatggtc 4200
ttctttggca atgtggattc atctgggata aaacacaata tttttaaccc tccaattatt 4260
gctcgataca tccgtttgca cccaactcat tatagcattc gcagcactct tcgcatggag 4320
ttgatgggct gtgatttaaa tagttgcagc atgccattgg gaatggagag taaagcaata 4380
tcagatgcac agattactgc ttcatcctac tttaccaata tgtttgccac ctggtctcct 4440
tcaaaagctc gacttcacct ccaagggagg agtaatgcct ggagacctca ggtgaataat 4500
ccaaaagagt ggctgcaagt ggacttccag aagacaatga aagtcacagg agtaactact 4560
cagggagtaa aatctctgct taccagcatg tatgtgaagg agttcctcat ctccagcagt 4620
caagatggcc atcagtggac tctctttttt cagaatggca aagtaaaggt ttttcaggga 4680
aatcaagact ccttcacacc tgtggtgaac tctctagacc caccgttact gactcgctac 4740
cttcgaattc acccccagag ttgggtgcac cagattgccc tgaggatgga ggttctgggc 4800
tgcgaggcac aggacctcta cgacaaaact cacacatgcc caccgtgccc agctccagaa 4860
ctcctgggcg gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc 4920
tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc 4980
aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag 5040
gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg 5100
ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag 5160
aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca 5220
tcccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat 5280
cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc 5340
acgcctcccg tgttggactc cgacggctcc ttcttcctct acagcaagct caccgtggac 5400
aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac 5460
aaccactaca cgcagaagag cctctccctg tctccgggta aatga 5505
<210> 159
<211> 1834
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FVIII 282
<400> 159
Met Gln Ile Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys Leu Leu Arg Phe
1 5 10 15
Cys Phe Ser Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser
20 25 30
Trp Asp Tyr Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg
35 40 45
Phe Pro Pro Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val
50 55 60
Tyr Lys Lys Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile
65 70 75 80
Ala Lys Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln
85 90 95
Ala Glu Val Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser
100 105 110
His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser
115 120 125
Glu Gly Ala Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp
130 135 140
Asp Lys Val Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu
145 150 155 160
Lys Glu Asn Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser
165 170 175
Tyr Leu Ser His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile
180 185 190
Gly Ala Leu Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr
195 200 205
Gln Thr Leu His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly
210 215 220
Lys Ser Trp His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp
225 230 235 240
Ala Ala Ser Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr
245 250 255
Val Asn Arg Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val
260 265 270
Tyr Trp His Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile
275 280 285
Phe Leu Glu Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser
290 295 300
Leu Glu Ile Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met
305 310 315 320
Asp Leu Gly Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His
325 330 335
Asp Gly Met Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro
340 345 350
Gln Leu Arg Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp
355 360 365
Leu Thr Asp Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser
370 375 380
Pro Ser Phe Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr
385 390 395 400
Trp Val His Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro
405 410 415
Leu Val Leu Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn
420 425 430
Asn Gly Pro Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met
435 440 445
Ala Tyr Thr Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu
450 455 460
Ser Gly Ile Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu
465 470 475 480
Leu Ile Ile Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro
485 490 495
His Gly Ile Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys
500 505 510
Gly Val Lys His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe
515 520 525
Lys Tyr Lys Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp
530 535 540
Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg
545 550 555 560
Asp Leu Ala Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu
565 570 575
Ser Val Asp Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val
580 585 590
Ile Leu Phe Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu
595 600 605
Asn Ile Gln Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp
610 615 620
Pro Glu Phe Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val
625 630 635 640
Phe Asp Ser Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp
645 650 655
Tyr Ile Leu Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe
660 665 670
Ser Gly Tyr Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr
675 680 685
Leu Phe Pro Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro
690 695 700
Gly Leu Trp Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly
705 710 715 720
Met Thr Ala Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp
725 730 735
Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys
740 745 750
Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Gly Ala Pro Thr
755 760 765
Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr
770 775 780
Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser
785 790 795 800
Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr
805 810 815
Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro
820 825 830
Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr
835 840 845
Glu Glu Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser
850 855 860
Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala
865 870 875 880
Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr
885 890 895
Glu Glu Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Ala
900 905 910
Ser Ser Pro Pro Val Leu Lys Arg His Gln Ala Glu Ile Thr Arg Thr
915 920 925
Thr Leu Gln Ser Asp Gln Glu Glu Ile Asp Tyr Asp Asp Thr Ile Ser
930 935 940
Val Glu Met Lys Lys Glu Asp Phe Asp Ile Tyr Asp Glu Asp Glu Asn
945 950 955 960
Gln Ser Pro Arg Ser Phe Gln Lys Lys Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala
965 970 975
Ala Val Glu Arg Leu Trp Asp Tyr Gly Met Ser Ser Ser Pro His Val
980 985 990
Leu Arg Asn Arg Ala Gln Ser Gly Ser Val Pro Gln Phe Lys Lys Val
995 1000 1005
Val Phe Gln Glu Phe Thr Asp Gly Ser Phe Thr Gln Pro Leu Tyr
1010 1015 1020
Arg Gly Glu Leu Asn Glu His Leu Gly Leu Leu Gly Pro Tyr Ile
1025 1030 1035
Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile Met Val Thr Phe Arg Asn Gln
1040 1045 1050
Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser Ser Leu Ile Ser Tyr Glu
1055 1060 1065
Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu Pro Arg Lys Asn Phe Val Lys
1070 1075 1080
Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp Lys Val Gln His His Met
1085 1090 1095
Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys Ala Trp Ala Tyr Phe
1100 1105 1110
Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His Ser Gly Leu Ile Gly
1115 1120 1125
Pro Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu Asn Pro Ala His Gly
1130 1135 1140
Arg Gln Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr Ile Phe
1145 1150 1155
Asp Glu Thr Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Met Glu Arg Asn
1160 1165 1170
Cys Arg Ala Pro Cys Asn Ile Gln Met Glu Asp Pro Thr Phe Lys
1175 1180 1185
Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala Ile Asn Gly Tyr Ile Met Asp Thr
1190 1195 1200
Leu Pro Gly Leu Val Met Ala Gln Asp Gln Arg Ile Arg Trp Tyr
1205 1210 1215
Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn Ile His Ser Ile His Phe
1220 1225 1230
Ser Gly His Val Phe Thr Val Arg Lys Lys Glu Glu Tyr Lys Met
1235 1240 1245
Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly Val Phe Glu Thr Val Glu Met
1250 1255 1260
Leu Pro Ser Lys Ala Gly Ile Trp Arg Val Glu Cys Leu Ile Gly
1265 1270 1275
Glu His Leu His Ala Gly Met Ser Thr Leu Phe Leu Val Tyr Ser
1280 1285 1290
Asn Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Met Ala Ser Gly His Ile Arg
1295 1300 1305
Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp Ala Pro
1310 1315 1320
Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala Trp Ser
1325 1330 1335
Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val Asp Leu Leu Ala Pro
1340 1345 1350
Met Ile Ile His Gly Ile Lys Thr Gln Gly Ala Arg Gln Lys Phe
1355 1360 1365
Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp
1370 1375 1380
Gly Lys Lys Trp Gln Thr Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu
1385 1390 1395
Met Val Phe Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser Gly Ile Lys His Asn
1400 1405 1410
Ile Phe Asn Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro
1415 1420 1425
Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu Met Gly
1430 1435 1440
Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys
1445 1450 1455
Ala Ile Ser Asp Ala Gln Ile Thr Ala Ser Ser Tyr Phe Thr Asn
1460 1465 1470
Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala Arg Leu His Leu Gln
1475 1480 1485
Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro Gln Val Asn Asn Pro Lys Glu
1490 1495 1500
Trp Leu Gln Val Asp Phe Gln Lys Thr Met Lys Val Thr Gly Val
1505 1510 1515
Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr Val Lys
1520 1525 1530
Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gln Asp Gly His Gln Trp Thr Leu
1535 1540 1545
Phe Phe Gln Asn Gly Lys Val Lys Val Phe Gln Gly Asn Gln Asp
1550 1555 1560
Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu Leu Thr
1565 1570 1575
Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp Val His Gln Ile Ala
1580 1585 1590
Leu Arg Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu Tyr Asp
1595 1600 1605
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1610 1615 1620
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
1625 1630 1635
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
1640 1645 1650
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
1655 1660 1665
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
1670 1675 1680
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
1685 1690 1695
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
1700 1705 1710
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
1715 1720 1725
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
1730 1735 1740
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
1745 1750 1755
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
1760 1765 1770
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
1775 1780 1785
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
1790 1795 1800
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
1805 1810 1815
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1820 1825 1830
Lys
<210> 160
<211> 5937
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FVIII 283 (FVIII 169 with IHH triple mutation)
<400> 160
atgcaaatag agctctccac ctgcttcttt ctgtgccttt tgcgattctg ctttagtgcc 60
accagaagat actacctggg tgcagtggaa ctgtcatggg actatatgca aagtgatctc 120
ggtgagctgc ctgtggacgc aagatttcct cctagagtgc caaaatcttt tccattcaac 180
acctcagtcg tgtacaaaaa gactctgttt gtagaattca cggatcacct tttcaacatc 240
gctaagccaa ggccaccctg gatgggtctg ctaggtccta ccatccaggc tgaggtttat 300
gatacagtgg tcattacact taagaacatg gcttcccatc ctgtcagtct tcatgctgtt 360
ggtgtatcct actggaaagc ttctgaggga gctgaatatg atgatcagac cagtcaaagg 420
gagaaagaag atgataaagt cttccctggt ggaagccata catatgtctg gcaggtcctg 480
aaagagaatg gtccaatggc ctctgaccca ctgtgcctta cctactcata tctttctcat 540
gtggacctgg taaaagactt gaattcaggc ctcattggag ccctactagt atgtagagaa 600
gggagtctgg ccaaggaaaa gacacagacc ttgcacaaat ttatactact ttttgctgta 660
tttgatgaag ggaaaagttg gcactcagaa acaaagaact ccttgatgca ggatagggat 720
gctgcatctg ctcgggcctg gcctaaaatg cacacagtca atggttatgt aaacaggtct 780
ctgccaggtc tgattggatg ccacaggaaa tcagtctatt ggcatgtgat tggaatgggc 840
accactcctg aagtgcactc aatattcctc gaaggtcaca catttcttgt gaggaaccat 900
cgccaggcta gcttggaaat ctcgccaata actttcctta ctgctcaaac actcttgatg 960
gaccttggac agtttctact gttttgtcat atctcttccc accaacatga tggcatggaa 1020
gcttatgtca aagtagacag ctgtccagag gaaccccaac tacgaatgaa aaataatgaa 1080
gaagcggaag actatgatga tgatcttact gattctgaaa tggatgtggt caggtttgat 1140
gatgacaact ctccttcctt tatccaaatt cgctcagttg ccaagaagca tcctaaaact 1200
tgggtacatt acattgctgc tgaagaggag gactgggact atgctccctt agtcctcgcc 1260
cccgatgaca gaagttataa aagtcaatat ttgaacaatg gccctcagcg gattggtagg 1320
aagtacaaaa aagtccgatt tatggcatac acagatgaaa cctttaagac tcgtgaagct 1380
attcagcatg aatcaggaat cttgggacct ttactttatg gggaagttgg agacacactg 1440
ttgattatat ttaagaatca agcaagcaga ccatataaca tctaccctca cggaatcact 1500
gatgtccgtc ctttgtattc aaggagatta ccaaaaggtg taaaacattt gaaggatttt 1560
ccaattctgc caggagaaat attcaaatat aaatggacag tgactgtaga agatgggcca 1620
actaaatcag atcctcggtg cctgacccgc tattactcta gtttcgttaa tatggagaga 1680
gatctagctt caggactcat tggccctctc ctcatctgct acaaagaatc tgtagatcaa 1740
agaggaaacc agataatgtc agacaagagg aatgtcatcc tgttttctgt atttgatgag 1800
aaccgaagct ggtacctcac agagaatata caacgctttc tccccaatcc agctggagtg 1860
cagcttgagg atccagagtt ccaagcctcc aacatcatgc acagcatcaa tggctatgtt 1920
tttgatagtt tgcagttgtc agtttgtttg catgaggtgg catactggta cattctaagc 1980
attggagcac agactgactt cctttctgtc ttcttctctg gatatacctt caaacacaaa 2040
atggtctatg aagacacact caccctattc ccattctcag gagaaactgt cttcatgtcg 2100
atggaaaacc caggtctatg gattctgggg tgccacaact cagactttcg gaacagaggc 2160
atgaccgcct tactgaaggt ttctagttgt gacaagaaca ctggtgatta ttacgaggac 2220
agttatgaag atatttcagc atacttgctg agtaaaaaca atgccattga accaagaagc 2280
ttctctcaaa acggcgcgcc aggtacctca gagtctgcta cccccgagtc agggccagga 2340
tcagagccag ccacctccgg gtctgagaca cccgggactt ccgagagtgc cacccctgag 2400
tccggacccg ggtccgagcc cgccacttcc ggctccgaaa ctcccggcac aagcgagagc 2460
gctaccccag agtcaggacc aggaacatct acagagccct ctgaaggctc cgctccaggg 2520
tccccagccg gcagtcccac tagcaccgag gagggaacct ctgaaagcgc cacacccgaa 2580
tcagggccag ggtctgagcc tgctaccagc ggcagcgaga caccaggcac ctctgagtcc 2640
gccacaccag agtccggacc cggatctccc gctgggagcc ccacctccac tgaggaggga 2700
tctcctgctg gctctccaac atctactgag gaaggtacct caaccgagcc atccgaggga 2760
tcagctcccg gcacctcaga gtcggcaacc ccggagtctg gacccggaac ttccgaaagt 2820
gccacaccag agtccggtcc cgggacttca gaatcagcaa cacccgagtc cggccctggg 2880
tctgaacccg ccacaagtgg tagtgagaca ccaggatcag aacctgctac ctcagggtca 2940
gagacacccg gatctccggc aggctcacca acctccactg aggagggcac cagcacagaa 3000
ccaagcgagg gctccgcacc cggaacaagc actgaaccca gtgagggttc agcacccggc 3060
tctgagccgg ccacaagtgg cagtgagaca cccggcactt cagagagtgc cacccccgag 3120
agtggcccag gcactagtac cgagccctct gaaggcagtg cgccagcctc gagcccacca 3180
gtcttgaaac gccatcaagc tgaaataact cgtactactc ttcagtcaga tcaagaggaa 3240
atcgattatg atgataccat atcagttgaa atgaagaagg aagattttga catttatgat 3300
gaggatgaaa atcagagccc ccgcagcttt caaaagaaaa cacgacacta ttttattgct 3360
gcagtggaga ggctctggga ttatgggatg agtagctccc cacatgttct aagaaacagg 3420
gctcagagtg gcagtgtccc tcagttcaag aaagttgttt tccaggaatt tactgatggc 3480
tcctttactc agcccttata ccgtggagaa ctaaatgaac atttgggact cctggggcca 3540
tatataagag cagaagttga agataatatc atggtaactt tcagaaatca ggcctctcgt 3600
ccctattcct tctattctag ccttatttct tatgaggaag atcagaggca aggagcagaa 3660
cctagaaaaa actttgtcaa gcctaatgaa accaaaactt acttttggaa agtgcaacat 3720
catatggcac ccactaaaga tgagtttgac tgcaaagcct gggcttattt ctctgatgtt 3780
gacctggaaa aagatgtgca ctcaggcctg attggacccc ttctggtctg ccacactaac 3840
acactgaacc ctgctcatgg gagacaagtg acagtacagg aatttgctct gtttttcacc 3900
atctttgatg agaccaaaag ctggtacttc actgaaaata tggaaagaaa ctgcagggct 3960
ccctgcaata tccagatgga agatcccact tttaaagaga attatcgctt ccatgcaatc 4020
aatggctaca taatggatac actacctggc ttagtaatgg ctcaggatca aaggattcga 4080
tggtatctgc tcagcatggg cagcaatgaa aacatccatt ctattcattt cagtggacat 4140
gtgttcactg tacgaaaaaa agaggagtat aaaatggcac tgtacaatct ctatccaggt 4200
gtttttgaga cagtggaaat gttaccatcc aaagctggaa tttggcgggt ggaatgcctt 4260
attggcgagc atctacatgc tgggatgagc acactttttc tggtgtacag caataagtgt 4320
cagactcccc tgggaatggc ttctggacac attagagatt ttcagattac agcttcagga 4380
caatatggac agtgggcccc aaagctggcc agacttcatt attccggatc aatcaatgcc 4440
tggagcacca aggagccctt ttcttggatc aaggtggatc tgttggcacc aatgattatt 4500
cacggcatca agacccaggg tgcccgtcag aagttctcca gcctctacat ctctcagttt 4560
atcatcatgt atagtcttga tgggaagaag tggcagactt atcgaggaaa ttccactgga 4620
accttaatgg tcttctttgg caatgtggat tcatctggga taaaacacaa tatttttaac 4680
cctccaatta ttgctcgata catccgtttg cacccaactc attatagcat tcgcagcact 4740
cttcgcatgg agttgatggg ctgtgattta aatagttgca gcatgccatt gggaatggag 4800
agtaaagcaa tatcagatgc acagattact gcttcatcct actttaccaa tatgtttgcc 4860
acctggtctc cttcaaaagc tcgacttcac ctccaaggga ggagtaatgc ctggagacct 4920
caggtgaata atccaaaaga gtggctgcaa gtggacttcc agaagacaat gaaagtcaca 4980
ggagtaacta ctcagggagt aaaatctctg cttaccagca tgtatgtgaa ggagttcctc 5040
atctccagca gtcaagatgg ccatcagtgg actctctttt ttcagaatgg caaagtaaag 5100
gtttttcagg gaaatcaaga ctccttcaca cctgtggtga actctctaga cccaccgtta 5160
ctgactcgct accttcgaat tcacccccag agttgggtgc accagattgc cctgaggatg 5220
gaggttctgg gctgcgaggc acaggacctc tacgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc 5280
ccagctccag aactcctggg cggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac 5340
accctcatgg cctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa 5400
gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca 5460
aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg 5520
gcccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca 5580
gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac 5640
accctgcccc catcccggga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc 5700
aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac 5760
aactacaaga ccacgcctcc cgtgttggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag 5820
ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat 5880
gaggctctgc acaacgccta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaatga 5937
<210> 161
<211> 1978
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FVIII 283 (FVIII 169 with IHH triple mutation)
<400> 161
Met Gln Ile Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys Leu Leu Arg Phe
1 5 10 15
Cys Phe Ser Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser
20 25 30
Trp Asp Tyr Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg
35 40 45
Phe Pro Pro Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val
50 55 60
Tyr Lys Lys Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile
65 70 75 80
Ala Lys Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln
85 90 95
Ala Glu Val Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser
100 105 110
His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser
115 120 125
Glu Gly Ala Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp
130 135 140
Asp Lys Val Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu
145 150 155 160
Lys Glu Asn Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser
165 170 175
Tyr Leu Ser His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile
180 185 190
Gly Ala Leu Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr
195 200 205
Gln Thr Leu His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly
210 215 220
Lys Ser Trp His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp
225 230 235 240
Ala Ala Ser Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr
245 250 255
Val Asn Arg Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val
260 265 270
Tyr Trp His Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile
275 280 285
Phe Leu Glu Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser
290 295 300
Leu Glu Ile Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met
305 310 315 320
Asp Leu Gly Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His
325 330 335
Asp Gly Met Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro
340 345 350
Gln Leu Arg Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp
355 360 365
Leu Thr Asp Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser
370 375 380
Pro Ser Phe Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr
385 390 395 400
Trp Val His Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro
405 410 415
Leu Val Leu Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn
420 425 430
Asn Gly Pro Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met
435 440 445
Ala Tyr Thr Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu
450 455 460
Ser Gly Ile Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu
465 470 475 480
Leu Ile Ile Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro
485 490 495
His Gly Ile Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys
500 505 510
Gly Val Lys His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe
515 520 525
Lys Tyr Lys Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp
530 535 540
Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg
545 550 555 560
Asp Leu Ala Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu
565 570 575
Ser Val Asp Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val
580 585 590
Ile Leu Phe Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu
595 600 605
Asn Ile Gln Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp
610 615 620
Pro Glu Phe Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val
625 630 635 640
Phe Asp Ser Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp
645 650 655
Tyr Ile Leu Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe
660 665 670
Ser Gly Tyr Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr
675 680 685
Leu Phe Pro Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro
690 695 700
Gly Leu Trp Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly
705 710 715 720
Met Thr Ala Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp
725 730 735
Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys
740 745 750
Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Gly Ala Pro Gly
755 760 765
Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala
770 775 780
Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu
785 790 795 800
Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly
805 810 815
Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu
820 825 830
Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser
835 840 845
Thr Glu Glu Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly
850 855 860
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser
865 870 875 880
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser
885 890 895
Thr Glu Glu Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly
900 905 910
Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Glu Ser
915 920 925
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu
930 935 940
Ser Gly Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly
945 950 955 960
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala
965 970 975
Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser
980 985 990
Thr Glu Glu Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly
995 1000 1005
Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ser Glu Pro
1010 1015 1020
Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr
1025 1030 1035
Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser
1040 1045 1050
Ala Pro Ala Ser Ser Pro Pro Val Leu Lys Arg His Gln Ala Glu
1055 1060 1065
Ile Thr Arg Thr Thr Leu Gln Ser Asp Gln Glu Glu Ile Asp Tyr
1070 1075 1080
Asp Asp Thr Ile Ser Val Glu Met Lys Lys Glu Asp Phe Asp Ile
1085 1090 1095
Tyr Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe Gln Lys Lys
1100 1105 1110
Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp Asp Tyr
1115 1120 1125
Gly Met Ser Ser Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg Ala Gln Ser
1130 1135 1140
Gly Ser Val Pro Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr
1145 1150 1155
Asp Gly Ser Phe Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu
1160 1165 1170
His Leu Gly Leu Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp
1175 1180 1185
Asn Ile Met Val Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser
1190 1195 1200
Phe Tyr Ser Ser Leu Ile Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly
1205 1210 1215
Ala Glu Pro Arg Lys Asn Phe Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr
1220 1225 1230
Tyr Phe Trp Lys Val Gln His His Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu
1235 1240 1245
Phe Asp Cys Lys Ala Trp Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu
1250 1255 1260
Lys Asp Val His Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Val Cys His
1265 1270 1275
Thr Asn Thr Leu Asn Pro Ala His Gly Arg Gln Val Thr Val Gln
1280 1285 1290
Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr Ile Phe Asp Glu Thr Lys Ser Trp
1295 1300 1305
Tyr Phe Thr Glu Asn Met Glu Arg Asn Cys Arg Ala Pro Cys Asn
1310 1315 1320
Ile Gln Met Glu Asp Pro Thr Phe Lys Glu Asn Tyr Arg Phe His
1325 1330 1335
Ala Ile Asn Gly Tyr Ile Met Asp Thr Leu Pro Gly Leu Val Met
1340 1345 1350
Ala Gln Asp Gln Arg Ile Arg Trp Tyr Leu Leu Ser Met Gly Ser
1355 1360 1365
Asn Glu Asn Ile His Ser Ile His Phe Ser Gly His Val Phe Thr
1370 1375 1380
Val Arg Lys Lys Glu Glu Tyr Lys Met Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr
1385 1390 1395
Pro Gly Val Phe Glu Thr Val Glu Met Leu Pro Ser Lys Ala Gly
1400 1405 1410
Ile Trp Arg Val Glu Cys Leu Ile Gly Glu His Leu His Ala Gly
1415 1420 1425
Met Ser Thr Leu Phe Leu Val Tyr Ser Asn Lys Cys Gln Thr Pro
1430 1435 1440
Leu Gly Met Ala Ser Gly His Ile Arg Asp Phe Gln Ile Thr Ala
1445 1450 1455
Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp Ala Pro Lys Leu Ala Arg Leu His
1460 1465 1470
Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala Trp Ser Thr Lys Glu Pro Phe Ser
1475 1480 1485
Trp Ile Lys Val Asp Leu Leu Ala Pro Met Ile Ile His Gly Ile
1490 1495 1500
Lys Thr Gln Gly Ala Arg Gln Lys Phe Ser Ser Leu Tyr Ile Ser
1505 1510 1515
Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp Gly Lys Lys Trp Gln Thr
1520 1525 1530
Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu Met Val Phe Phe Gly Asn
1535 1540 1545
Val Asp Ser Ser Gly Ile Lys His Asn Ile Phe Asn Pro Pro Ile
1550 1555 1560
Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg
1565 1570 1575
Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu Met Gly Cys Asp Leu Asn Ser Cys
1580 1585 1590
Ser Met Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys Ala Ile Ser Asp Ala Gln
1595 1600 1605
Ile Thr Ala Ser Ser Tyr Phe Thr Asn Met Phe Ala Thr Trp Ser
1610 1615 1620
Pro Ser Lys Ala Arg Leu His Leu Gln Gly Arg Ser Asn Ala Trp
1625 1630 1635
Arg Pro Gln Val Asn Asn Pro Lys Glu Trp Leu Gln Val Asp Phe
1640 1645 1650
Gln Lys Thr Met Lys Val Thr Gly Val Thr Thr Gln Gly Val Lys
1655 1660 1665
Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr Val Lys Glu Phe Leu Ile Ser Ser
1670 1675 1680
Ser Gln Asp Gly His Gln Trp Thr Leu Phe Phe Gln Asn Gly Lys
1685 1690 1695
Val Lys Val Phe Gln Gly Asn Gln Asp Ser Phe Thr Pro Val Val
1700 1705 1710
Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu Leu Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His
1715 1720 1725
Pro Gln Ser Trp Val His Gln Ile Ala Leu Arg Met Glu Val Leu
1730 1735 1740
Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu Tyr Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
1745 1750 1755
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
1760 1765 1770
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ala Ser Arg Thr Pro
1775 1780 1785
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
1790 1795 1800
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
1805 1810 1815
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
1820 1825 1830
Val Ser Val Leu Thr Val Leu Ala Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
1835 1840 1845
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
1850 1855 1860
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
1865 1870 1875
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
1880 1885 1890
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
1895 1900 1905
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
1910 1915 1920
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
1925 1930 1935
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
1940 1945 1950
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Ala Tyr Thr
1955 1960 1965
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
1970 1975
<210> 162
<211> 5055
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pSYNFVIII 010 (Dual chain FVIIIFc)
<400> 162
atgcaaatag agctctccac ctgcttcttt ctgtgccttt tgcgattctg ctttagtgcc 60
accagaagat actacctggg tgcagtggaa ctgtcatggg actatatgca aagtgatctc 120
ggtgagctgc ctgtggacgc aagatttcct cctagagtgc caaaatcttt tccattcaac 180
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gctaagccaa ggccaccctg gatgggtctg ctaggtccta ccatccaggc tgaggtttat 300
gatacagtgg tcattacact taagaacatg gcttcccatc ctgtcagtct tcatgctgtt 360
ggtgtatcct actggaaagc ttctgaggga gctgaatatg atgatcagac cagtcaaagg 420
gagaaagaag atgataaagt cttccctggt ggaagccata catatgtctg gcaggtcctg 480
aaagagaatg gtccaatggc ctctgaccca ctgtgcctta cctactcata tctttctcat 540
gtggacctgg taaaagactt gaattcaggc ctcattggag ccctactagt atgtagagaa 600
gggagtctgg ccaaggaaaa gacacagacc ttgcacaaat ttatactact ttttgctgta 660
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accactcctg aagtgcactc aatattcctc gaaggtcaca catttcttgt gaggaaccat 900
cgccaggcgt ccttggaaat ctcgccaata actttcctta ctgctcaaac actcttgatg 960
gaccttggac agtttctact gttttgtcat atctcttccc accaacatga tggcatggaa 1020
gcttatgtca aagtagacag ctgtccagag gaaccccaac tacgaatgaa aaataatgaa 1080
gaagcggaag actatgatga tgatcttact gattctgaaa tggatgtggt caggtttgat 1140
gatgacaact ctccttcctt tatccaaatt cgctcagttg ccaagaagca tcctaaaact 1200
tgggtacatt acattgctgc tgaagaggag gactgggact atgctccctt agtcctcgcc 1260
cccgatgaca gaagttataa aagtcaatat ttgaacaatg gccctcagcg gattggtagg 1320
aagtacaaaa aagtccgatt tatggcatac acagatgaaa cctttaagac tcgtgaagct 1380
attcagcatg aatcaggaat cttgggacct ttactttatg gggaagttgg agacacactg 1440
ttgattatat ttaagaatca agcaagcaga ccatataaca tctaccctca cggaatcact 1500
gatgtccgtc ctttgtattc aaggagatta ccaaaaggtg taaaacattt gaaggatttt 1560
ccaattctgc caggagaaat attcaaatat aaatggacag tgactgtaga agatgggcca 1620
actaaatcag atcctcggtg cctgacccgc tattactcta gtttcgttaa tatggagaga 1680
gatctagctt caggactcat tggccctctc ctcatctgct acaaagaatc tgtagatcaa 1740
agaggaaacc agataatgtc agacaagagg aatgtcatcc tgttttctgt atttgatgag 1800
aaccgaagct ggtacctcac agagaatata caacgctttc tccccaatcc agctggagtg 1860
cagcttgagg atccagagtt ccaagcctcc aacatcatgc acagcatcaa tggctatgtt 1920
tttgatagtt tgcagttgtc agtttgtttg catgaggtgg catactggta cattctaagc 1980
attggagcac agactgactt cctttctgtc ttcttctctg gatatacctt caaacacaaa 2040
atggtctatg aagacacact caccctattc ccattctcag gagaaactgt cttcatgtcg 2100
atggaaaacc caggtctatg gattctgggg tgccacaact cagactttcg gaacagaggc 2160
atgaccgcct tactgaaggt ttctagttgt gacaagaaca ctggtgatta ttacgaggac 2220
agttatgaag atatttcagc atacttgctg agtaaaaaca atgccattga accaagaagc 2280
ttctctcaaa acccaccagt cttgaaacgc catcaacggg aaataactcg tactactctt 2340
cagtcagatc aagaggaaat tgactatgat gataccatat cagttgaaat gaagaaggaa 2400
gattttgaca tttatgatga ggatgaaaat cagagccccc gcagctttca aaagaaaaca 2460
cgacactatt ttattgctgc agtggagagg ctctgggatt atgggatgag tagctcccca 2520
catgttctaa gaaacagggc tcagagtggc agtgtccctc agttcaagaa agttgttttc 2580
caggaattta ctgatggctc ctttactcag cccttatacc gtggagaact aaatgaacat 2640
ttgggactcc tggggccata tataagagca gaagttgaag ataatatcat ggtaactttc 2700
agaaatcagg cctctcgtcc ctattccttc tattctagcc ttatttctta tgaggaagat 2760
cagaggcaag gagcagaacc tagaaaaaac tttgtcaagc ctaatgaaac caaaacttac 2820
ttttggaaag tgcaacatca tatggcaccc actaaagatg agtttgactg caaagcctgg 2880
gcttatttct ctgatgttga cctggaaaaa gatgtgcact caggcctgat tggacccctt 2940
ctggtctgcc acactaacac actgaaccct gctcatggga gacaagtgac agtacaggaa 3000
tttgctctgt ttttcaccat ctttgatgag accaaaagct ggtacttcac tgaaaatatg 3060
gaaagaaact gcagggctcc ctgcaatatc cagatggaag atcccacttt taaagagaat 3120
tatcgcttcc atgcaatcaa tggctacata atggatacac tacctggctt agtaatggct 3180
caggatcaaa ggattcgatg gtatctgctc agcatgggca gcaatgaaaa catccattct 3240
attcatttca gtggacatgt gttcactgta cgaaaaaaag aggagtataa aatggcactg 3300
tacaatctct atccaggtgt ttttgagaca gtggaaatgt taccatccaa agctggaatt 3360
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gtgtacagca ataagtgtca gactcccctg ggaatggctt ctggacacat tagagatttt 3480
cagattacag cttcaggaca atatggacag tgggccccaa agctggccag acttcattat 3540
tccggatcaa tcaatgcctg gagcaccaag gagccctttt cttggatcaa ggtggatctg 3600
ttggcaccaa tgattattca cggcatcaag acccagggtg cccgtcagaa gttctccagc 3660
ctctacatct ctcagtttat catcatgtat agtcttgatg ggaagaagtg gcagacttat 3720
cgaggaaatt ccactggaac cttaatggtc ttctttggca atgtggattc atctgggata 3780
aaacacaata tttttaaccc tccaattatt gctcgataca tccgtttgca cccaactcat 3840
tatagcattc gcagcactct tcgcatggag ttgatgggct gtgatttaaa tagttgcagc 3900
atgccattgg gaatggagag taaagcaata tcagatgcac agattactgc ttcatcctac 3960
tttaccaata tgtttgccac ctggtctcct tcaaaagctc gacttcacct ccaagggagg 4020
agtaatgcct ggagacctca ggtgaataat ccaaaagagt ggctgcaagt ggacttccag 4080
aagacaatga aagtcacagg agtaactact cagggagtaa aatctctgct taccagcatg 4140
tatgtgaagg agttcctcat ctccagcagt caagatggcc atcagtggac tctctttttt 4200
cagaatggca aagtaaaggt ttttcaggga aatcaagact ccttcacacc tgtggtgaac 4260
tctctagacc caccgttact gactcgctac cttcgaattc acccccagag ttgggtgcac 4320
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cacacatgcc caccgtgccc agctccagaa ctcctgggcg gaccgtcagt cttcctcttc 4440
cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg 4500
gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag 4560
gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc 4620
agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc 4680
tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc 4740
cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc 4800
agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 4860
aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgttggactc cgacggctcc 4920
ttcttcctct acagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc 4980
tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg 5040
tctccgggta aatga 5055
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pSYNFVIII 010 (Dual chain FVIIIFc)
<400> 163
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1 5 10 15
Cys Phe Ser Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser
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Trp Asp Tyr Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg
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Phe Pro Pro Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val
50 55 60
Tyr Lys Lys Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile
65 70 75 80
Ala Lys Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln
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100 105 110
His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser
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130 135 140
Asp Lys Val Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu
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165 170 175
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Gly Ala Leu Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr
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210 215 220
Lys Ser Trp His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp
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Ala Ala Ser Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr
245 250 255
Val Asn Arg Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val
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Tyr Trp His Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile
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Leu Glu Ile Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met
305 310 315 320
Asp Leu Gly Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His
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Asp Gly Met Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro
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Gln Leu Arg Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp
355 360 365
Leu Thr Asp Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser
370 375 380
Pro Ser Phe Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr
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Trp Val His Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro
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420 425 430
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Ser Gly Ile Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu
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Leu Ile Ile Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro
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500 505 510
Gly Val Lys His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe
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Asp Leu Ala Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu
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Ile Leu Phe Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu
595 600 605
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610 615 620
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625 630 635 640
Phe Asp Ser Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp
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Tyr Ile Leu Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe
660 665 670
Ser Gly Tyr Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr
675 680 685
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690 695 700
Gly Leu Trp Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly
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Met Thr Ala Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp
725 730 735
Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys
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Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Pro Pro Val Leu
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Asp Phe Asp Ile Tyr Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe
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Asp Tyr Gly Met Ser Ser Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg Ala Gln
835 840 845
Ser Gly Ser Val Pro Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr
850 855 860
Asp Gly Ser Phe Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu His
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Leu Gly Leu Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile
885 890 895
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900 905 910
Ser Leu Ile Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu Pro Arg
915 920 925
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930 935 940
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Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His Ser Gly Leu
965 970 975
Ile Gly Pro Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu Asn Pro Ala His
980 985 990
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1010 1015 1020
Cys Arg Ala Pro Cys Asn Ile Gln Met Glu Asp Pro Thr Phe Lys
1025 1030 1035
Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala Ile Asn Gly Tyr Ile Met Asp Thr
1040 1045 1050
Leu Pro Gly Leu Val Met Ala Gln Asp Gln Arg Ile Arg Trp Tyr
1055 1060 1065
Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn Ile His Ser Ile His Phe
1070 1075 1080
Ser Gly His Val Phe Thr Val Arg Lys Lys Glu Glu Tyr Lys Met
1085 1090 1095
Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly Val Phe Glu Thr Val Glu Met
1100 1105 1110
Leu Pro Ser Lys Ala Gly Ile Trp Arg Val Glu Cys Leu Ile Gly
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Glu His Leu His Ala Gly Met Ser Thr Leu Phe Leu Val Tyr Ser
1130 1135 1140
Asn Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Met Ala Ser Gly His Ile Arg
1145 1150 1155
Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp Ala Pro
1160 1165 1170
Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala Trp Ser
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Met Ile Ile His Gly Ile Lys Thr Gln Gly Ala Arg Gln Lys Phe
1205 1210 1215
Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp
1220 1225 1230
Gly Lys Lys Trp Gln Thr Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu
1235 1240 1245
Met Val Phe Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser Gly Ile Lys His Asn
1250 1255 1260
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1280 1285 1290
Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys
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Ala Ile Ser Asp Ala Gln Ile Thr Ala Ser Ser Tyr Phe Thr Asn
1310 1315 1320
Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala Arg Leu His Leu Gln
1325 1330 1335
Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro Gln Val Asn Asn Pro Lys Glu
1340 1345 1350
Trp Leu Gln Val Asp Phe Gln Lys Thr Met Lys Val Thr Gly Val
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Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr Val Lys
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Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gln Asp Gly His Gln Trp Thr Leu
1385 1390 1395
Phe Phe Gln Asn Gly Lys Val Lys Val Phe Gln Gly Asn Gln Asp
1400 1405 1410
Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu Leu Thr
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Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp Val His Gln Ile Ala
1430 1435 1440
Leu Arg Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu Tyr Asp
1445 1450 1455
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1460 1465 1470
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
1475 1480 1485
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
1490 1495 1500
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
1505 1510 1515
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
1520 1525 1530
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
1535 1540 1545
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
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Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
1565 1570 1575
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
1580 1585 1590
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
1595 1600 1605
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
1610 1615 1620
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
1625 1630 1635
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
1640 1645 1650
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
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Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1670 1675 1680
Lys
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<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker, where the sequence can be repeated betweeen 1-10 times
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1 5
<210> 165
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 165
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 166
<211> 34
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 166
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Val Pro Arg Gly Ser
20 25 30
Gly Gly
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<211> 314
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pSYN FVIII 169
<400> 167
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1 5 10 15
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20 25 30
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser
115 120 125
Gly Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Ser
130 135 140
Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Thr Glu Pro
145 150 155 160
Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser
165 170 175
Gly Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr
180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro
245 250 255
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260 265 270
Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr
275 280 285
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290 295 300
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pSYN FVIII 310
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Pro Arg Ser Phe Gly Ala Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu
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20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly
65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Ser Pro Ala Gly
130 135 140
Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly
145 150 155 160
Ser Ala Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly
165 170 175
Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Glu Ser
180 185 190
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser
195 200 205
Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly
210 215 220
Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Thr Glu
225 230 235 240
Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly
245 250 255
Ser Ala Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly
260 265 270
Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu
275 280 285
Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Ala Ser Ser Glu Ile Thr Arg
290 295 300
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<211> 305
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pSYN FVIII 312
<400> 169
Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Gly Ala Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala
1 5 10 15
Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu
20 25 30
Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser
35 40 45
Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala
50 55 60
Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser
65 70 75 80
Ala Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr
85 90 95
Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr
100 105 110
Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser
115 120 125
Gly Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Ser
130 135 140
Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Thr Glu Pro
145 150 155 160
Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser
165 170 175
Gly Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr
180 185 190
Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr
195 200 205
Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu
210 215 220
Thr Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr
225 230 235 240
Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro
245 250 255
Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu
260 265 270
Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr
275 280 285
Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Ala Ser Ser Glu Ile Thr
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Arg
305
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pSYN FVIII 310 (encoding FVIII with complete B-domain deletion
except 2 amino acid residues and 288 AE-XTEN inserted after aa
742)
<400> 170
atgcaaatag agctctccac ctgcttcttt ctgtgccttt tgcgattctg ctttagtgcc 60
accagaagat actacctggg tgcagtggaa ctgtcatggg actatatgca aagtgatctc 120
ggtgagctgc ctgtggacgc aagatttcct cctagagtgc caaaatcttt tccattcaac 180
acctcagtcg tgtacaaaaa gactctgttt gtagaattca cggatcacct tttcaacatc 240
gctaagccaa ggccaccctg gatgggtctg ctaggtccta ccatccaggc tgaggtttat 300
gatacagtgg tcattacact taagaacatg gcttcccatc ctgtcagtct tcatgctgtt 360
ggtgtatcct actggaaagc ttctgaggga gctgaatatg atgatcagac cagtcaaagg 420
gagaaagaag atgataaagt cttccctggt ggaagccata catatgtctg gcaggtcctg 480
aaagagaatg gtccaatggc ctctgaccca ctgtgcctta cctactcata tctttctcat 540
gtggacctgg taaaagactt gaattcaggc ctcattggag ccctactagt atgtagagaa 600
gggagtctgg ccaaggaaaa gacacagacc ttgcacaaat ttatactact ttttgctgta 660
tttgatgaag ggaaaagttg gcactcagaa acaaagaact ccttgatgca ggatagggat 720
gctgcatctg ctcgggcctg gcctaaaatg cacacagtca atggttatgt aaacaggtct 780
ctgccaggtc tgattggatg ccacaggaaa tcagtctatt ggcatgtgat tggaatgggc 840
accactcctg aagtgcactc aatattcctc gaaggtcaca catttcttgt gaggaaccat 900
cgccaggcgt ccttggaaat ctcgccaata actttcctta ctgctcaaac actcttgatg 960
gaccttggac agtttctact gttttgtcat atctcttccc accaacatga tggcatggaa 1020
gcttatgtca aagtagacag ctgtccagag gaaccccaac tacgaatgaa aaataatgaa 1080
gaagcggaag actatgatga tgatcttact gattctgaaa tggatgtggt caggtttgat 1140
gatgacaact ctccttcctt tatccaaatt cgctcagttg ccaagaagca tcctaaaact 1200
tgggtacatt acattgctgc tgaagaggag gactgggact atgctccctt agtcctcgcc 1260
cccgatgaca gaagttataa aagtcaatat ttgaacaatg gccctcagcg gattggtagg 1320
aagtacaaaa aagtccgatt tatggcatac acagatgaaa cctttaagac tcgtgaagct 1380
attcagcatg aatcaggaat cttgggacct ttactttatg gggaagttgg agacacactg 1440
ttgattatat ttaagaatca agcaagcaga ccatataaca tctaccctca cggaatcact 1500
gatgtccgtc ctttgtattc aaggagatta ccaaaaggtg taaaacattt gaaggatttt 1560
ccaattctgc caggagaaat attcaaatat aaatggacag tgactgtaga agatgggcca 1620
actaaatcag atcctcggtg cctgacccgc tattactcta gtttcgttaa tatggagaga 1680
gatctagctt caggactcat tggccctctc ctcatctgct acaaagaatc tgtagatcaa 1740
agaggaaacc agataatgtc agacaagagg aatgtcatcc tgttttctgt atttgatgag 1800
aaccgaagct ggtacctcac agagaatata caacgctttc tccccaatcc agctggagtg 1860
cagcttgagg atccagagtt ccaagcctcc aacatcatgc acagcatcaa tggctatgtt 1920
tttgatagtt tgcagttgtc agtttgtttg catgaggtgg catactggta cattctaagc 1980
attggagcac agactgactt cctttctgtc ttcttctctg gatatacctt caaacacaaa 2040
atggtctatg aagacacact caccctattc ccattctcag gagaaactgt cttcatgtcg 2100
atggaaaacc caggtctatg gattctgggg tgccacaact cagactttcg gaacagaggc 2160
atgaccgcct tactgaaggt ttctagttgt gacaagaaca ctggtgatta ttacgaggac 2220
agttatgaag atatttcagc atacttgctg agtaaaaaca atgccattga accaagaagc 2280
ttcggtacct cagagtctgc tacccccgag tcagggccag gatcagagcc agccacctcc 2340
gggtctgaga cacccgggac ttccgagagt gccacccctg agtccggacc cgggtccgag 2400
cccgccactt ccggctccga aactcccggc acaagcgaga gcgctacccc agagtcagga 2460
ccaggaacat ctacagagcc ctctgaaggc tccgctccag ggtccccagc cggcagtccc 2520
actagcaccg aggagggaac ctctgaaagc gccacacccg aatcagggcc agggtctgag 2580
cctgctacca gcggcagcga gacaccaggc acctctgagt ccgccacacc agagtccgga 2640
cccggatctc ccgctgggag ccccacctcc actgaggagg gatctcctgc tggctctcca 2700
acatctactg aggaaggtac ctcaaccgag ccatccgagg gatcagctcc cggcacctca 2760
gagtcggcaa ccccggagtc tggacccgga acttccgaaa gtgccacacc agagtccggt 2820
cccgggactt cagaatcagc aacacccgag tccggccctg ggtctgaacc cgccacaagt 2880
ggtagtgaga caccaggatc agaacctgct acctcagggt cagagacacc cggatctccg 2940
gcaggctcac caacctccac tgaggagggc accagcacag aaccaagcga gggctccgca 3000
cccggaacaa gcactgaacc cagtgagggt tcagcacccg gctctgagcc ggccacaagt 3060
ggcagtgaga cacccggcac ttcagagagt gccacccccg agagtggccc aggcactagt 3120
accgagccct ctgaaggcag tgcgccagcc tcgagcgaaa taactcgtac tactcttcag 3180
tcagatcaag aggaaatcga ttatgatgat accatatcag ttgaaatgaa gaaggaagat 3240
tttgacattt atgatgagga tgaaaatcag agcccccgca gctttcaaaa gaaaacacga 3300
cactatttta ttgctgcagt ggagaggctc tgggattatg ggatgagtag ctccccacat 3360
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gaatttactg atggctcctt tactcagccc ttataccgtg gagaactaaa tgaacatttg 3480
ggactcctgg ggccatatat aagagcagaa gttgaagata atatcatggt aactttcaga 3540
aatcaggcct ctcgtcccta ttccttctat tctagcctta tttcttatga ggaagatcag 3600
aggcaaggag cagaacctag aaaaaacttt gtcaagccta atgaaaccaa aacttacttt 3660
tggaaagtgc aacatcatat ggcacccact aaagatgagt ttgactgcaa agcctgggct 3720
tatttctctg atgttgacct ggaaaaagat gtgcactcag gcctgattgg accccttctg 3780
gtctgccaca ctaacacact gaaccctgct catgggagac aagtgacagt acaggaattt 3840
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cgcttccatg caatcaatgg ctacataatg gatacactac ctggcttagt aatggctcag 4020
gatcaaagga ttcgatggta tctgctcagc atgggcagca atgaaaacat ccattctatt 4080
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aatctctatc caggtgtttt tgagacagtg gaaatgttac catccaaagc tggaatttgg 4200
cgggtggaat gccttattgg cgagcatcta catgctggga tgagcacact ttttctggtg 4260
tacagcaata agtgtcagac tcccctggga atggcttctg gacacattag agattttcag 4320
attacagctt caggacaata tggacagtgg gccccaaagc tggccagact tcattattcc 4380
ggatcaatca atgcctggag caccaaggag cccttttctt ggatcaaggt ggatctgttg 4440
gcaccaatga ttattcacgg catcaagacc cagggtgccc gtcagaagtt ctccagcctc 4500
tacatctctc agtttatcat catgtatagt cttgatggga agaagtggca gacttatcga 4560
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aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga 5580
gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc 5640
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ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 5820
tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 5880
ccgggtaaat ga 5892
<210> 171
<211> 1944
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pSYN FVIII 310 (FVIII with complete B-domain deletion except 2
amino acid residues and 288 AE-XTEN inserted after aa 742)
<400> 171
Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser Trp Asp Tyr
1 5 10 15
Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg Phe Pro Pro
20 25 30
Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val Tyr Lys Lys
35 40 45
Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile Ala Lys Pro
50 55 60
Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln Ala Glu Val
65 70 75 80
Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val
85 90 95
Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser Glu Gly Ala
100 105 110
Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp Asp Lys Val
115 120 125
Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu Lys Glu Asn
130 135 140
Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser Tyr Leu Ser
145 150 155 160
His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile Gly Ala Leu
165 170 175
Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr Gln Thr Leu
180 185 190
His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly Lys Ser Trp
195 200 205
His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp Ala Ala Ser
210 215 220
Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr Val Asn Arg
225 230 235 240
Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val Tyr Trp His
245 250 255
Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile Phe Leu Glu
260 265 270
Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser Leu Glu Ile
275 280 285
Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met Asp Leu Gly
290 295 300
Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His Asp Gly Met
305 310 315 320
Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro Gln Leu Arg
325 330 335
Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp Leu Thr Asp
340 345 350
Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser Pro Ser Phe
355 360 365
Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr Trp Val His
370 375 380
Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro Leu Val Leu
385 390 395 400
Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn Asn Gly Pro
405 410 415
Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met Ala Tyr Thr
420 425 430
Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu Ser Gly Ile
435 440 445
Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu Leu Ile Ile
450 455 460
Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro His Gly Ile
465 470 475 480
Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys Gly Val Lys
485 490 495
His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe Lys Tyr Lys
500 505 510
Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp Pro Arg Cys
515 520 525
Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg Asp Leu Ala
530 535 540
Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu Ser Val Asp
545 550 555 560
Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val Ile Leu Phe
565 570 575
Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu Asn Ile Gln
580 585 590
Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp Pro Glu Phe
595 600 605
Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val Phe Asp Ser
610 615 620
Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp Tyr Ile Leu
625 630 635 640
Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe Ser Gly Tyr
645 650 655
Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr Leu Phe Pro
660 665 670
Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro Gly Leu Trp
675 680 685
Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly Met Thr Ala
690 695 700
Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu
705 710 715 720
Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala
725 730 735
Ile Glu Pro Arg Ser Phe Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser
740 745 750
Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr
755 760 765
Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr
770 775 780
Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser
785 790 795 800
Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ser
805 810 815
Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Glu Ser Ala
820 825 830
Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu
835 840 845
Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser
850 855 860
Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Ser Pro Ala Gly Ser
865 870 875 880
Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser
885 890 895
Ala Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr
900 905 910
Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala
915 920 925
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930 935 940
Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser
945 950 955 960
Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Thr Glu Pro
965 970 975
Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser
980 985 990
Ala Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr
995 1000 1005
Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu
1010 1015 1020
Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Ala Ser Ser Glu Ile Thr Arg Thr
1025 1030 1035
Thr Leu Gln Ser Asp Gln Glu Glu Ile Asp Tyr Asp Asp Thr Ile
1040 1045 1050
Ser Val Glu Met Lys Lys Glu Asp Phe Asp Ile Tyr Asp Glu Asp
1055 1060 1065
Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe Gln Lys Lys Thr Arg His Tyr
1070 1075 1080
Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp Asp Tyr Gly Met Ser Ser
1085 1090 1095
Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg Ala Gln Ser Gly Ser Val Pro
1100 1105 1110
Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr Asp Gly Ser Phe
1115 1120 1125
Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu His Leu Gly Leu
1130 1135 1140
Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile Met Val
1145 1150 1155
Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser Ser
1160 1165 1170
Leu Ile Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu Pro Arg
1175 1180 1185
Lys Asn Phe Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp Lys
1190 1195 1200
Val Gln His His Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys
1205 1210 1215
Ala Trp Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His
1220 1225 1230
Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu
1235 1240 1245
Asn Pro Ala His Gly Arg Gln Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu
1250 1255 1260
Phe Phe Thr Ile Phe Asp Glu Thr Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu
1265 1270 1275
Asn Met Glu Arg Asn Cys Arg Ala Pro Cys Asn Ile Gln Met Glu
1280 1285 1290
Asp Pro Thr Phe Lys Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala Ile Asn Gly
1295 1300 1305
Tyr Ile Met Asp Thr Leu Pro Gly Leu Val Met Ala Gln Asp Gln
1310 1315 1320
Arg Ile Arg Trp Tyr Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn Ile
1325 1330 1335
His Ser Ile His Phe Ser Gly His Val Phe Thr Val Arg Lys Lys
1340 1345 1350
Glu Glu Tyr Lys Met Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly Val Phe
1355 1360 1365
Glu Thr Val Glu Met Leu Pro Ser Lys Ala Gly Ile Trp Arg Val
1370 1375 1380
Glu Cys Leu Ile Gly Glu His Leu His Ala Gly Met Ser Thr Leu
1385 1390 1395
Phe Leu Val Tyr Ser Asn Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Met Ala
1400 1405 1410
Ser Gly His Ile Arg Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser Gly Gln Tyr
1415 1420 1425
Gly Gln Trp Ala Pro Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser
1430 1435 1440
Ile Asn Ala Trp Ser Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val
1445 1450 1455
Asp Leu Leu Ala Pro Met Ile Ile His Gly Ile Lys Thr Gln Gly
1460 1465 1470
Ala Arg Gln Lys Phe Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile
1475 1480 1485
Met Tyr Ser Leu Asp Gly Lys Lys Trp Gln Thr Tyr Arg Gly Asn
1490 1495 1500
Ser Thr Gly Thr Leu Met Val Phe Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser
1505 1510 1515
Gly Ile Lys His Asn Ile Phe Asn Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr
1520 1525 1530
Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr Leu Arg
1535 1540 1545
Met Glu Leu Met Gly Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu
1550 1555 1560
Gly Met Glu Ser Lys Ala Ile Ser Asp Ala Gln Ile Thr Ala Ser
1565 1570 1575
Ser Tyr Phe Thr Asn Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala
1580 1585 1590
Arg Leu His Leu Gln Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro Gln Val
1595 1600 1605
Asn Asn Pro Lys Glu Trp Leu Gln Val Asp Phe Gln Lys Thr Met
1610 1615 1620
Lys Val Thr Gly Val Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu Leu Thr
1625 1630 1635
Ser Met Tyr Val Lys Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gln Asp Gly
1640 1645 1650
His Gln Trp Thr Leu Phe Phe Gln Asn Gly Lys Val Lys Val Phe
1655 1660 1665
Gln Gly Asn Gln Asp Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser Leu Asp
1670 1675 1680
Pro Pro Leu Leu Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp
1685 1690 1695
Val His Gln Ile Ala Leu Arg Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala
1700 1705 1710
Gln Asp Leu Tyr Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1715 1720 1725
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1730 1735 1740
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
1745 1750 1755
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
1760 1765 1770
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
1775 1780 1785
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
1790 1795 1800
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
1805 1810 1815
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
1820 1825 1830
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
1835 1840 1845
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
1850 1855 1860
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
1865 1870 1875
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
1880 1885 1890
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
1895 1900 1905
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
1910 1915 1920
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
1925 1930 1935
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
1940
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<211> 5900
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pSYN FVIII 312 (FVIII with complete B-domain deletion except 5
amino acid residues and 288 AE-XTEN inserted after aa 745- FVIII
B5 version)
<400> 172
atgcaaatag agctctccac ctgcttcttt ctgtgccttt tgcgattctg ctttagtgcc 60
accagaagat actacctggg tgcagtggaa ctgtcatggg actatatgca aagtgatctc 120
ggtgagctgc ctgtggacgc aagatttcct cctagagtgc caaaatcttt tccattcaac 180
acctcagtcg tgtacaaaaa gactctgttt gtagaattca cggatcacct tttcaacatc 240
gctaagccaa ggccaccctg gatgggtctg ctaggtccta ccatccaggc tgaggtttat 300
gatacagtgg tcattacact taagaacatg gcttcccatc ctgtcagtct tcatgctgtt 360
ggtgtatcct actggaaagc ttctgaggga gctgaatatg atgatcagac cagtcaaagg 420
gagaaagaag atgataaagt cttccctggt ggaagccata catatgtctg gcaggtcctg 480
aaagagaatg gtccaatggc ctctgaccca ctgtgcctta cctactcata tctttctcat 540
gtggacctgg taaaagactt gaattcaggc ctcattggag ccctactagt atgtagagaa 600
gggagtctgg ccaaggaaaa gacacagacc ttgcacaaat ttatactact ttttgctgta 660
tttgatgaag ggaaaagttg gcactcagaa acaaagaact ccttgatgca ggatagggat 720
gctgcatctg ctcgggcctg gcctaaaatg cacacagtca atggttatgt aaacaggtct 780
ctgccaggtc tgattggatg ccacaggaaa tcagtctatt ggcatgtgat tggaatgggc 840
accactcctg aagtgcactc aatattcctc gaaggtcaca catttcttgt gaggaaccat 900
cgccaggcgt ccttggaaat ctcgccaata actttcctta ctgctcaaac actcttgatg 960
gaccttggac agtttctact gttttgtcat atctcttccc accaacatga tggcatggaa 1020
gcttatgtca aagtagacag ctgtccagag gaaccccaac tacgaatgaa aaataatgaa 1080
gaagcggaag actatgatga tgatcttact gattctgaaa tggatgtggt caggtttgat 1140
gatgacaact ctccttcctt tatccaaatt cgctcagttg ccaagaagca tcctaaaact 1200
tgggtacatt acattgctgc tgaagaggag gactgggact atgctccctt agtcctcgcc 1260
cccgatgaca gaagttataa aagtcaatat ttgaacaatg gccctcagcg gattggtagg 1320
aagtacaaaa aagtccgatt tatggcatac acagatgaaa cctttaagac tcgtgaagct 1380
attcagcatg aatcaggaat cttgggacct ttactttatg gggaagttgg agacacactg 1440
ttgattatat ttaagaatca agcaagcaga ccatataaca tctaccctca cggaatcact 1500
gatgtccgtc ctttgtattc aaggagatta ccaaaaggtg taaaacattt gaaggatttt 1560
ccaattctgc caggagaaat attcaaatat aaatggacag tgactgtaga agatgggcca 1620
actaaatcag atcctcggtg cctgacccgc tattactcta gtttcgttaa tatggagaga 1680
gatctagctt caggactcat tggccctctc ctcatctgct acaaagaatc tgtagatcaa 1740
agaggaaacc agataatgtc agacaagagg aatgtcatcc tgttttctgt atttgatgag 1800
aaccgaagct ggtacctcac agagaatata caacgctttc tccccaatcc agctggagtg 1860
cagcttgagg atccagagtt ccaagcctcc aacatcatgc acagcatcaa tggctatgtt 1920
tttgatagtt tgcagttgtc agtttgtttg catgaggtgg catactggta cattctaagc 1980
attggagcac agactgactt cctttctgtc ttcttctctg gatatacctt caaacacaaa 2040
atggtctatg aagacacact caccctattc ccattctcag gagaaactgt cttcatgtcg 2100
atggaaaacc caggtctatg gattctgggg tgccacaact cagactttcg gaacagaggc 2160
atgaccgcct tactgaaggt ttctagttgt gacaagaaca ctggtgatta ttacgaggac 2220
agttatgaag atatttcagc atacttgctg agtaaaaaca atgccattga accaagaagc 2280
ttctctcaaa acggtacctc agagtctgct acccccgagt cagggccagg atcagagcca 2340
gccacctccg ggtctgagac acccgggact tccgagagtg ccacccctga gtccggaccc 2400
gggtccgagc ccgccacttc cggctccgaa actcccggca caagcgagag cgctacccca 2460
gagtcaggac caggaacatc tacagagccc tctgaaggct ccgctccagg gtccccagcc 2520
ggcagtccca ctagcaccga ggagggaacc tctgaaagcg ccacacccga atcagggcca 2580
gggtctgagc ctgctaccag cggcagcgag acaccaggca cctctgagtc cgccacacca 2640
gagtccggac ccggatctcc cgctgggagc cccacctcca ctgaggaggg atctcctgct 2700
ggctctccaa catctactga ggaaggtacc tcaaccgagc catccgaggg atcagctccc 2760
ggcacctcag agtcggcaac cccggagtct ggacccggaa cttccgaaag tgccacacca 2820
gagtccggtc ccgggacttc agaatcagca acacccgagt ccggccctgg gtctgaaccc 2880
gccacaagtg gtagtgagac accaggatca gaacctgcta cctcagggtc agagacaccc 2940
ggatctccgg caggctcacc aacctccact gaggagggca ccagcacaga accaagcgag 3000
ggctccgcac ccggaacaag cactgaaccc agtgagggtt cagcacccgg ctctgagccg 3060
gccacaagtg gcagtgagac acccggcact tcagagagtg ccacccccga gagtggccca 3120
ggcactagta ccgagccctc tgaaggcagt gcgccagcct cgagcgaaat aactcgtact 3180
actcttcagt cagatcaaga ggaaatcgat tatgatgata ccatatcagt tgaaatgaag 3240
aaggaagatt ttgacattta tgatgaggat gaaaatcaga gcccccgcag ctttcaaaag 3300
aaaacacgac actattttat tgctgcagtg gagaggctct gggattatgg gatgagtagc 3360
tccccacatg ttctaagaaa cagggctcag agtggcagtg tccctcagtt caagaaagtt 3420
gttttccagg aatttactga tggctccttt actcagccct tataccgtgg agaactaaat 3480
gaacatttgg gactcctggg gccatatata agagcagaag ttgaagataa tatcatggta 3540
actttcagaa atcaggcctc tcgtccctat tccttctatt ctagccttat ttcttatgag 3600
gaagatcaga ggcaaggagc agaacctaga aaaaactttg tcaagcctaa tgaaaccaaa 3660
acttactttt ggaaagtgca acatcatatg gcacccacta aagatgagtt tgactgcaaa 3720
gcctgggctt atttctctga tgttgacctg gaaaaagatg tgcactcagg cctgattgga 3780
ccccttctgg tctgccacac taacacactg aaccctgctc atgggagaca agtgacagta 3840
caggaatttg ctctgttttt caccatcttt gatgagacca aaagctggta cttcactgaa 3900
aatatggaaa gaaactgcag ggctccctgc aatatccaga tggaagatcc cacttttaaa 3960
gagaattatc gcttccatgc aatcaatggc tacataatgg atacactacc tggcttagta 4020
atggctcagg atcaaaggat tcgatggtat ctgctcagca tgggcagcaa tgaaaacatc 4080
cattctattc atttcagtgg acatgtgttc actgtacgaa aaaaagagga gtataaaatg 4140
gcactgtaca atctctatcc aggtgttttt gagacagtgg aaatgttacc atccaaagct 4200
ggaatttggc gggtggaatg ccttattggc gagcatctac atgctgggat gagcacactt 4260
tttctggtgt acagcaataa gtgtcagact cccctgggaa tggcttctgg acacattaga 4320
gattttcaga ttacagcttc aggacaatat ggacagtggg ccccaaagct ggccagactt 4380
cattattccg gatcaatcaa tgcctggagc accaaggagc ccttttcttg gatcaaggtg 4440
gatctgttgg caccaatgat tattcacggc atcaagaccc agggtgcccg tcagaagttc 4500
tccagcctct acatctctca gtttatcatc atgtatagtc ttgatgggaa gaagtggcag 4560
acttatcgag gaaattccac tggaacctta atggtcttct ttggcaatgt ggattcatct 4620
gggataaaac acaatatttt taaccctcca attattgctc gatacatccg tttgcaccca 4680
actcattata gcattcgcag cactcttcgc atggagttga tgggctgtga tttaaatagt 4740
tgcagcatgc cattgggaat ggagagtaaa gcaatatcag atgcacagat tactgcttca 4800
tcctacttta ccaatatgtt tgccacctgg tctccttcaa aagctcgact tcacctccaa 4860
gggaggagta atgcctggag acctcaggtg aataatccaa aagagtggct gcaagtggac 4920
ttccagaaga caatgaaagt cacaggagta actactcagg gagtaaaatc tctgcttacc 4980
agcatgtatg tgaaggagtt cctcatctcc agcagtcaag atggccatca gtggactctc 5040
ttttttcaga atggcaaagt aaaggttttt cagggaaatc aagactcctt cacacctgtg 5100
gtgaactctc tagacccacc gttactgact cgctaccttc gaattcaccc ccagagttgg 5160
gtgcaccaga ttgccctgag gatggaggtt ctgggctgcg aggcacagga cctctacgac 5220
aaaactcaca catgcccacc gtgcccagct ccagaactcc tgggcggacc gtcagtcttc 5280
ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 5340
gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 5400
gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt 5460
gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 5520
aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 5580
cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggatgagct gaccaagaac 5640
caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 5700
gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgtt ggactccgac 5760
ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 5820
gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 5880
tccctgtctc cgggtaaatg 5900
<210> 173
<211> 1947
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pSYN FVIII 312 (FVIII with complete B-domain deletion except 5
amino acid residues and 288 AE-XTEN inserted after aa 745- FVIII
B5 version)
<400> 173
Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser Trp Asp Tyr
1 5 10 15
Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg Phe Pro Pro
20 25 30
Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val Tyr Lys Lys
35 40 45
Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile Ala Lys Pro
50 55 60
Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln Ala Glu Val
65 70 75 80
Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val
85 90 95
Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser Glu Gly Ala
100 105 110
Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp Asp Lys Val
115 120 125
Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu Lys Glu Asn
130 135 140
Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser Tyr Leu Ser
145 150 155 160
His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile Gly Ala Leu
165 170 175
Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr Gln Thr Leu
180 185 190
His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly Lys Ser Trp
195 200 205
His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp Ala Ala Ser
210 215 220
Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr Val Asn Arg
225 230 235 240
Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val Tyr Trp His
245 250 255
Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile Phe Leu Glu
260 265 270
Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser Leu Glu Ile
275 280 285
Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met Asp Leu Gly
290 295 300
Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His Asp Gly Met
305 310 315 320
Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro Gln Leu Arg
325 330 335
Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp Leu Thr Asp
340 345 350
Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser Pro Ser Phe
355 360 365
Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr Trp Val His
370 375 380
Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro Leu Val Leu
385 390 395 400
Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn Asn Gly Pro
405 410 415
Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met Ala Tyr Thr
420 425 430
Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu Ser Gly Ile
435 440 445
Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu Leu Ile Ile
450 455 460
Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro His Gly Ile
465 470 475 480
Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys Gly Val Lys
485 490 495
His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe Lys Tyr Lys
500 505 510
Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp Pro Arg Cys
515 520 525
Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg Asp Leu Ala
530 535 540
Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu Ser Val Asp
545 550 555 560
Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val Ile Leu Phe
565 570 575
Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu Asn Ile Gln
580 585 590
Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp Pro Glu Phe
595 600 605
Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val Phe Asp Ser
610 615 620
Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp Tyr Ile Leu
625 630 635 640
Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe Ser Gly Tyr
645 650 655
Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr Leu Phe Pro
660 665 670
Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro Gly Leu Trp
675 680 685
Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly Met Thr Ala
690 695 700
Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu
705 710 715 720
Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala
725 730 735
Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr
740 745 750
Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr
755 760 765
Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu
770 775 780
Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr
785 790 795 800
Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala
805 810 815
Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser
820 825 830
Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser
835 840 845
Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly
850 855 860
Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Ser Pro
865 870 875 880
Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser
885 890 895
Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly
900 905 910
Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser
915 920 925
Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser
930 935 940
Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr
945 950 955 960
Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser
965 970 975
Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser
980 985 990
Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr
995 1000 1005
Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr
1010 1015 1020
Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Ala Ser Ser Glu Ile
1025 1030 1035
Thr Arg Thr Thr Leu Gln Ser Asp Gln Glu Glu Ile Asp Tyr Asp
1040 1045 1050
Asp Thr Ile Ser Val Glu Met Lys Lys Glu Asp Phe Asp Ile Tyr
1055 1060 1065
Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe Gln Lys Lys Thr
1070 1075 1080
Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp Asp Tyr Gly
1085 1090 1095
Met Ser Ser Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg Ala Gln Ser Gly
1100 1105 1110
Ser Val Pro Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr Asp
1115 1120 1125
Gly Ser Phe Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu His
1130 1135 1140
Leu Gly Leu Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn
1145 1150 1155
Ile Met Val Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe
1160 1165 1170
Tyr Ser Ser Leu Ile Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala
1175 1180 1185
Glu Pro Arg Lys Asn Phe Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr
1190 1195 1200
Phe Trp Lys Val Gln His His Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe
1205 1210 1215
Asp Cys Lys Ala Trp Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys
1220 1225 1230
Asp Val His Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Val Cys His Thr
1235 1240 1245
Asn Thr Leu Asn Pro Ala His Gly Arg Gln Val Thr Val Gln Glu
1250 1255 1260
Phe Ala Leu Phe Phe Thr Ile Phe Asp Glu Thr Lys Ser Trp Tyr
1265 1270 1275
Phe Thr Glu Asn Met Glu Arg Asn Cys Arg Ala Pro Cys Asn Ile
1280 1285 1290
Gln Met Glu Asp Pro Thr Phe Lys Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala
1295 1300 1305
Ile Asn Gly Tyr Ile Met Asp Thr Leu Pro Gly Leu Val Met Ala
1310 1315 1320
Gln Asp Gln Arg Ile Arg Trp Tyr Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn
1325 1330 1335
Glu Asn Ile His Ser Ile His Phe Ser Gly His Val Phe Thr Val
1340 1345 1350
Arg Lys Lys Glu Glu Tyr Lys Met Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr Pro
1355 1360 1365
Gly Val Phe Glu Thr Val Glu Met Leu Pro Ser Lys Ala Gly Ile
1370 1375 1380
Trp Arg Val Glu Cys Leu Ile Gly Glu His Leu His Ala Gly Met
1385 1390 1395
Ser Thr Leu Phe Leu Val Tyr Ser Asn Lys Cys Gln Thr Pro Leu
1400 1405 1410
Gly Met Ala Ser Gly His Ile Arg Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser
1415 1420 1425
Gly Gln Tyr Gly Gln Trp Ala Pro Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr
1430 1435 1440
Ser Gly Ser Ile Asn Ala Trp Ser Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp
1445 1450 1455
Ile Lys Val Asp Leu Leu Ala Pro Met Ile Ile His Gly Ile Lys
1460 1465 1470
Thr Gln Gly Ala Arg Gln Lys Phe Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln
1475 1480 1485
Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp Gly Lys Lys Trp Gln Thr Tyr
1490 1495 1500
Arg Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu Met Val Phe Phe Gly Asn Val
1505 1510 1515
Asp Ser Ser Gly Ile Lys His Asn Ile Phe Asn Pro Pro Ile Ile
1520 1525 1530
Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser
1535 1540 1545
Thr Leu Arg Met Glu Leu Met Gly Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser
1550 1555 1560
Met Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys Ala Ile Ser Asp Ala Gln Ile
1565 1570 1575
Thr Ala Ser Ser Tyr Phe Thr Asn Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro
1580 1585 1590
Ser Lys Ala Arg Leu His Leu Gln Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg
1595 1600 1605
Pro Gln Val Asn Asn Pro Lys Glu Trp Leu Gln Val Asp Phe Gln
1610 1615 1620
Lys Thr Met Lys Val Thr Gly Val Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser
1625 1630 1635
Leu Leu Thr Ser Met Tyr Val Lys Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser
1640 1645 1650
Gln Asp Gly His Gln Trp Thr Leu Phe Phe Gln Asn Gly Lys Val
1655 1660 1665
Lys Val Phe Gln Gly Asn Gln Asp Ser Phe Thr Pro Val Val Asn
1670 1675 1680
Ser Leu Asp Pro Pro Leu Leu Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro
1685 1690 1695
Gln Ser Trp Val His Gln Ile Ala Leu Arg Met Glu Val Leu Gly
1700 1705 1710
Cys Glu Ala Gln Asp Leu Tyr Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
1715 1720 1725
Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
1730 1735 1740
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
1745 1750 1755
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
1760 1765 1770
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
1775 1780 1785
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
1790 1795 1800
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
1805 1810 1815
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
1820 1825 1830
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
1835 1840 1845
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
1850 1855 1860
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
1865 1870 1875
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
1880 1885 1890
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
1895 1900 1905
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
1910 1915 1920
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
1925 1930 1935
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
1940 1945
<210> 174
<211> 4977
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pSYN VWF073 (VWFD1D2D'D3- 144 AE XTEN- FVIII truncated a2
thrombin site-Fc)
<400> 174
atgattcctg ccagatttgc cggggtgctg cttgctctgg ccctcatttt gccagggacc 60
ctttgtgcag aaggaactcg cggcaggtca tccacggccc gatgcagcct tttcggaagt 120
gacttcgtca acacctttga tgggagcatg tacagctttg cgggatactg cagttacctc 180
ctggcagggg gctgccagaa acgctccttc tcgattattg gggacttcca gaatggcaag 240
agagtgagcc tctccgtgta tcttggggaa ttttttgaca tccatttgtt tgtcaatggt 300
accgtgacac agggggacca aagagtctcc atgccctatg cctccaaagg gctgtatcta 360
gaaactgagg ctgggtacta caagctgtcc ggtgaggcct atggctttgt ggccaggatc 420
gatggcagcg gcaactttca agtcctgctg tcagacagat acttcaacaa gacctgcggg 480
ctgtgtggca actttaacat ctttgctgaa gatgacttta tgacccaaga agggaccttg 540
acctcggacc cttatgactt tgccaactca tgggctctga gcagtggaga acagtggtgt 600
gaacgggcat ctcctcccag cagctcatgc aacatctcct ctggggaaat gcagaagggc 660
ctgtgggagc agtgccagct tctgaagagc acctcggtgt ttgcccgctg ccaccctctg 720
gtggaccccg agccttttgt ggccctgtgt gagaagactt tgtgtgagtg tgctgggggg 780
ctggagtgcg cctgccctgc cctcctggag tacgcccgga cctgtgccca ggagggaatg 840
gtgctgtacg gctggaccga ccacagcgcg tgcagcccag tgtgccctgc tggtatggag 900
tataggcagt gtgtgtcccc ttgcgccagg acctgccaga gcctgcacat caatgaaatg 960
tgtcaggagc gatgcgtgga tggctgcagc tgccctgagg gacagctcct ggatgaaggc 1020
ctctgcgtgg agagcaccga gtgtccctgc gtgcattccg gaaagcgcta ccctcccggc 1080
acctccctct ctcgagactg caacacctgc atttgccgaa acagccagtg gatctgcagc 1140
aatgaagaat gtccagggga gtgccttgtc actggtcaat cccacttcaa gagctttgac 1200
aacagatact tcaccttcag tgggatctgc cagtacctgc tggcccggga ttgccaggac 1260
cactccttct ccattgtcat tgagactgtc cagtgtgctg atgaccgcga cgctgtgtgc 1320
acccgctccg tcaccgtccg gctgcctggc ctgcacaaca gccttgtgaa actgaagcat 1380
ggggcaggag ttgccatgga tggccaggac atccagctcc ccctcctgaa aggtgacctc 1440
cgcatccagc atacagtgac ggcctccgtg cgcctcagct acggggagga cctgcagatg 1500
gactgggatg gccgcgggag gctgctggtg aagctgtccc ccgtctatgc cgggaagacc 1560
tgcggcctgt gtgggaatta caatggcaac cagggcgacg acttccttac cccctctggg 1620
ctggcggagc cccgggtgga ggacttcggg aacgcctgga agctgcacgg ggactgccag 1680
gacctgcaga agcagcacag cgatccctgc gccctcaacc cgcgcatgac caggttctcc 1740
gaggaggcgt gcgcggtcct gacgtccccc acattcgagg cctgccatcg tgccgtcagc 1800
ccgctgccct acctgcggaa ctgccgctac gacgtgtgct cctgctcgga cggccgcgag 1860
tgcctgtgcg gcgccctggc cagctatgcc gcggcctgcg cggggagagg cgtgcgcgtc 1920
gcgtggcgcg agccaggccg ctgtgagctg aactgcccga aaggccaggt gtacctgcag 1980
tgcgggaccc cctgcaacct gacctgccgc tctctctctt acccggatga ggaatgcaat 2040
gaggcctgcc tggagggctg cttctgcccc ccagggctct acatggatga gaggggggac 2100
tgcgtgccca aggcccagtg cccctgttac tatgacggtg agatcttcca gccagaagac 2160
atcttctcag accatcacac catgtgctac tgtgaggatg gcttcatgca ctgtaccatg 2220
agtggagtcc ccggaagctt gctgcctgac gctgtcctca gcagtcccct gtctcatcgc 2280
agcaaaagga gcctatcctg tcggcccccc atggtcaagc tggtgtgtcc cgctgacaac 2340
ctgcgggctg aagggctcga gtgtaccaaa acgtgccaga actatgacct ggagtgcatg 2400
agcatgggct gtgtctctgg ctgcctctgc cccccgggca tggtccggca tgagaacaga 2460
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catgtgtgtg atgccacgtg ctccacgatc ggcatggccc actacctcac cttcgacggg 2640
ctcaaatacc tgttccccgg ggagtgccag tacgttctgg tgcaggatta ctgcggcagt 2700
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tgcaagaaac gggtcaccat cctggtggag ggaggagaga ttgagctgtt tgacggggag 2820
gtgaatgtga agaggcccat gaaggatgag actcactttg aggtggtgga gtctggccgg 2880
tacatcattc tgctgctggg caaagccctc tccgtggtct gggaccgcca cctgagcatc 2940
tccgtggtcc tgaagcagac ataccaggag aaagtgtgtg gcctgtgtgg gaattttgat 3000
ggcatccaga acaatgacct caccagcagc aacctccaag tggaggaaga ccctgtggac 3060
tttgggaact cctggaaagt gagctcgcag tgtgctgaca ccagaaaagt gcctctggac 3120
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ccagctccag aactcctggg cggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac 4380
accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa 4440
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site-Fc)
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Phe Val Asn Gly Thr Val Thr Gln Gly Asp Gln Arg Val Ser Met Pro
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Leu Ser Gly Glu Ala Tyr Gly Phe Val Ala Arg Ile Asp Gly Ser Gly
130 135 140
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Leu Cys Gly Asn Phe Asn Ile Phe Ala Glu Asp Asp Phe Met Thr Gln
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Val Ser Pro Cys Ala Arg Thr Cys Gln Ser Leu His Ile Asn Glu Met
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Leu Asp Glu Gly Leu Cys Val Glu Ser Thr Glu Cys Pro Cys Val His
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Pro Gly Glu Cys Leu Val Thr Gly Gln Ser His Phe Lys Ser Phe Asp
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Asn Arg Tyr Phe Thr Phe Ser Gly Ile Cys Gln Tyr Leu Leu Ala Arg
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Ala Asp Asp Arg Asp Ala Val Cys Thr Arg Ser Val Thr Val Arg Leu
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Ala Met Asp Gly Gln Asp Ile Gln Leu Pro Leu Leu Lys Gly Asp Leu
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Arg Ile Gln His Thr Val Thr Ala Ser Val Arg Leu Ser Tyr Gly Glu
485 490 495
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Arg Val Glu Asp Phe Gly Asn Ala Trp Lys Leu His Gly Asp Cys Gln
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Asp Leu Gln Lys Gln His Ser Asp Pro Cys Ala Leu Asn Pro Arg Met
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Thr Arg Phe Ser Glu Glu Ala Cys Ala Val Leu Thr Ser Pro Thr Phe
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Glu Ala Cys His Arg Ala Val Ser Pro Leu Pro Tyr Leu Arg Asn Cys
595 600 605
Arg Tyr Asp Val Cys Ser Cys Ser Asp Gly Arg Glu Cys Leu Cys Gly
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Leu Ser Ser Pro Leu Ser His Arg Ser Lys Arg Ser Leu Ser Cys Arg
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Leu Lys Tyr Leu Phe Pro Gly Glu Cys Gln Tyr Val Leu Val Gln Asp
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Gly Cys Ser His Pro Ser Val Lys Cys Lys Lys Arg Val Thr Ile Leu
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Arg Pro Met Lys Asp Glu Thr His Phe Glu Val Val Glu Ser Gly Arg
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Tyr Ile Ile Leu Leu Leu Gly Lys Ala Leu Ser Val Val Trp Asp Arg
965 970 975
His Leu Ser Ile Ser Val Val Leu Lys Gln Thr Tyr Gln Glu Lys Val
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Cys Gly Leu Cys Gly Asn Phe Asp Gly Ile Gln Asn Asn Asp Leu Thr
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Ser Ser Asn Leu Gln Val Glu Glu Asp Pro Val Asp Phe Gly Asn
1010 1015 1020
Ser Trp Lys Val Ser Ser Gln Cys Ala Asp Thr Arg Lys Val Pro
1025 1030 1035
Leu Asp Ser Ser Pro Ala Thr Cys His Asn Asn Ile Met Lys Gln
1040 1045 1050
Thr Met Val Asp Ser Ser Cys Arg Ile Leu Thr Ser Asp Val Phe
1055 1060 1065
Gln Asp Cys Asn Lys Leu Val Asp Pro Glu Pro Tyr Leu Asp Val
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Cys Ile Tyr Asp Thr Cys Ser Cys Glu Ser Ile Gly Asp Cys Ala
1085 1090 1095
Ala Phe Cys Asp Thr Ile Ala Ala Tyr Ala His Val Cys Ala Gln
1100 1105 1110
His Gly Lys Val Val Thr Trp Arg Thr Ala Thr Leu Cys Pro Gln
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Trp Arg Tyr Asn Ser Cys Ala Pro Ala Cys Gln Val Thr Cys Gln
1145 1150 1155
His Pro Glu Pro Leu Ala Cys Pro Val Gln Cys Val Glu Gly Cys
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His Ala His Cys Pro Pro Gly Lys Ile Leu Asp Glu Leu Leu Gln
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Thr Cys Val Asp Pro Glu Asp Cys Pro Val Cys Glu Val Ala Gly
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Pro Glu His Cys Gln Ile Cys His Cys Asp Val Val Asn Leu Thr
1220 1225 1230
Cys Glu Ala Cys Gln Glu Pro Gly Ala Pro Thr Ser Glu Ser Ala
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Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser
1250 1255 1260
Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro
1265 1270 1275
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1280 1285 1290
Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro
1295 1300 1305
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1310 1315 1320
Thr Glu Glu Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro
1325 1330 1335
Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser
1340 1345 1350
Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser
1355 1360 1365
Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser
1370 1375 1380
Thr Glu Glu Gly Ala Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
1385 1390 1395
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
1400 1405 1410
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gly
1415 1420 1425
Ser Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
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Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
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Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
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Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
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Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
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Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
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Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
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Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
1550 1555 1560
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
1565 1570 1575
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
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Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
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Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
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Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
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Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser
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Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser
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Glu Pro Arg Ser Phe Ser
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<211> 4959
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pSYN VWF059 (VWF D'D3-Fc with acidic region 2 (a2) thrombin site
in the linker)
<400> 196
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ctgtgggagc agtgccagct tctgaagagc acctcggtgt ttgcccgctg ccaccctctg 720
gtggaccccg agccttttgt ggccctgtgt gagaagactt tgtgtgagtg tgctgggggg 780
ctggagtgcg cctgccctgc cctcctggag tacgcccgga cctgtgccca ggagggaatg 840
gtgctgtacg gctggaccga ccacagcgcg tgcagcccag tgtgccctgc tggtatggag 900
tataggcagt gtgtgtcccc ttgcgccagg acctgccaga gcctgcacat caatgaaatg 960
tgtcaggagc gatgcgtgga tggctgcagc tgccctgagg gacagctcct ggatgaaggc 1020
ctctgcgtgg agagcaccga gtgtccctgc gtgcattccg gaaagcgcta ccctcccggc 1080
acctccctct ctcgagactg caacacctgc atttgccgaa acagccagtg gatctgcagc 1140
aatgaagaat gtccagggga gtgccttgtc actggtcaat cccacttcaa gagctttgac 1200
aacagatact tcaccttcag tgggatctgc cagtacctgc tggcccggga ttgccaggac 1260
cactccttct ccattgtcat tgagactgtc cagtgtgctg atgaccgcga cgctgtgtgc 1320
acccgctccg tcaccgtccg gctgcctggc ctgcacaaca gccttgtgaa actgaagcat 1380
ggggcaggag ttgccatgga tggccaggac atccagctcc ccctcctgaa aggtgacctc 1440
cgcatccagc atacagtgac ggcctccgtg cgcctcagct acggggagga cctgcagatg 1500
gactgggatg gccgcgggag gctgctggtg aagctgtccc ccgtctatgc cgggaagacc 1560
tgcggcctgt gtgggaatta caatggcaac cagggcgacg acttccttac cccctctggg 1620
ctggcggagc cccgggtgga ggacttcggg aacgcctgga agctgcacgg ggactgccag 1680
gacctgcaga agcagcacag cgatccctgc gccctcaacc cgcgcatgac caggttctcc 1740
gaggaggcgt gcgcggtcct gacgtccccc acattcgagg cctgccatcg tgccgtcagc 1800
ccgctgccct acctgcggaa ctgccgctac gacgtgtgct cctgctcgga cggccgcgag 1860
tgcctgtgcg gcgccctggc cagctatgcc gcggcctgcg cggggagagg cgtgcgcgtc 1920
gcgtggcgcg agccaggccg ctgtgagctg aactgcccga aaggccaggt gtacctgcag 1980
tgcgggaccc cctgcaacct gacctgccgc tctctctctt acccggatga ggaatgcaat 2040
gaggcctgcc tggagggctg cttctgcccc ccagggctct acatggatga gaggggggac 2100
tgcgtgccca aggcccagtg cccctgttac tatgacggtg agatcttcca gccagaagac 2160
atcttctcag accatcacac catgtgctac tgtgaggatg gcttcatgca ctgtaccatg 2220
agtggagtcc ccggaagctt gctgcctgac gctgtcctca gcagtcccct gtctcatcgc 2280
agcaaaagga gcctatcctg tcggcccccc atggtcaagc tggtgtgtcc cgctgacaac 2340
ctgcgggctg aagggctcga gtgtaccaaa acgtgccaga actatgacct ggagtgcatg 2400
agcatgggct gtgtctctgg ctgcctctgc cccccgggca tggtccggca tgagaacaga 2460
tgtgtggccc tggaaaggtg tccctgcttc catcagggca aggagtatgc ccctggagaa 2520
acagtgaaga ttggctgcaa cacttgtgtc tgtcgggacc ggaagtggaa ctgcacagac 2580
catgtgtgtg atgccacgtg ctccacgatc ggcatggccc actacctcac cttcgacggg 2640
ctcaaatacc tgttccccgg ggagtgccag tacgttctgg tgcaggatta ctgcggcagt 2700
aaccctggga cctttcggat cctagtgggg aataagggat gcagccaccc ctcagtgaaa 2760
tgcaagaaac gggtcaccat cctggtggag ggaggagaga ttgagctgtt tgacggggag 2820
gtgaatgtga agaggcccat gaaggatgag actcactttg aggtggtgga gtctggccgg 2880
tacatcattc tgctgctggg caaagccctc tccgtggtct gggaccgcca cctgagcatc 2940
tccgtggtcc tgaagcagac ataccaggag aaagtgtgtg gcctgtgtgg gaattttgat 3000
ggcatccaga acaatgacct caccagcagc aacctccaag tggaggaaga ccctgtggac 3060
tttgggaact cctggaaagt gagctcgcag tgtgctgaca ccagaaaagt gcctctggac 3120
tcatcccctg ccacctgcca taacaacatc atgaagcaga cgatggtgga ttcctcctgt 3180
agaatcctta ccagtgacgt cttccaggac tgcaacaagc tggtggaccc cgagccatat 3240
ctggatgtct gcatttacga cacctgctcc tgtgagtcca ttggggactg cgccgcattc 3300
tgcgacacca ttgctgccta tgcccacgtg tgtgcccagc atggcaaggt ggtgacctgg 3360
aggacggcca cattgtgccc ccagagctgc gaggagagga atctccggga gaacgggtat 3420
gaggctgagt ggcgctataa cagctgtgca cctgcctgtc aagtcacgtg tcagcaccct 3480
gagccactgg cctgccctgt gcagtgtgtg gagggctgcc atgcccactg ccctccaggg 3540
aaaatcctgg atgagctttt gcagacctgc gttgaccctg aagactgtcc agtgtgtgag 3600
gtggctggcc ggcgttttgc ctcaggaaag aaagtcacct tgaatcccag tgaccctgag 3660
cactgccaga tttgccactg tgatgttgtc aacctcacct gtgaagcctg ccaggagccg 3720
atatcgggcg cgccaacatc agagagcgcc acccctgaaa gtggtcccgg gagcgagcca 3780
gccacatctg ggtcggaaac gccaggcaca agtgagtctg caactcccga gtccggacct 3840
ggctccgagc ctgccactag cggctccgag actccgggaa cttccgagag cgctacacca 3900
gaaagcggac ccggaaccag taccgaacct agcgagggct ctgctccggg cagcccagcc 3960
ggctctccta catccacgga ggagggcact tccgaatccg ccaccccgga gtcagggcca 4020
ggatctgaac ccgctacctc aggcagtgag acgccaggaa cgagcgagtc cgctacaccg 4080
gagagtgggc cagggagccc tgctggatct cctacgtcca ctgaggaagg gtcaccagcg 4140
ggctcgccca ccagcactga agaaggtgcc tcgatatctg acaagaacac tggtgattat 4200
tacgaggaca gttatgaaga tatttcagca tacttgctga gtaaaaacaa tgccattgaa 4260
ccaagaagct tctctgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagctcc agaactcctg 4320
ggcggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 4380
acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 4440
aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 4500
tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 4560
ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 4620
atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 4680
gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 4740
gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 4800
cccgtgttgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 4860
aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 4920
tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaatga 4959
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<211> 1652
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pSYN VWF059 (VWF D'D3-Fc with LVPR thrombin site in the linker)
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Met Ile Pro Ala Arg Phe Ala Gly Val Leu Leu Ala Leu Ala Leu Ile
1 5 10 15
Leu Pro Gly Thr Leu Cys Ala Glu Gly Thr Arg Gly Arg Ser Ser Thr
20 25 30
Ala Arg Cys Ser Leu Phe Gly Ser Asp Phe Val Asn Thr Phe Asp Gly
35 40 45
Ser Met Tyr Ser Phe Ala Gly Tyr Cys Ser Tyr Leu Leu Ala Gly Gly
50 55 60
Cys Gln Lys Arg Ser Phe Ser Ile Ile Gly Asp Phe Gln Asn Gly Lys
65 70 75 80
Arg Val Ser Leu Ser Val Tyr Leu Gly Glu Phe Phe Asp Ile His Leu
85 90 95
Phe Val Asn Gly Thr Val Thr Gln Gly Asp Gln Arg Val Ser Met Pro
100 105 110
Tyr Ala Ser Lys Gly Leu Tyr Leu Glu Thr Glu Ala Gly Tyr Tyr Lys
115 120 125
Leu Ser Gly Glu Ala Tyr Gly Phe Val Ala Arg Ile Asp Gly Ser Gly
130 135 140
Asn Phe Gln Val Leu Leu Ser Asp Arg Tyr Phe Asn Lys Thr Cys Gly
145 150 155 160
Leu Cys Gly Asn Phe Asn Ile Phe Ala Glu Asp Asp Phe Met Thr Gln
165 170 175
Glu Gly Thr Leu Thr Ser Asp Pro Tyr Asp Phe Ala Asn Ser Trp Ala
180 185 190
Leu Ser Ser Gly Glu Gln Trp Cys Glu Arg Ala Ser Pro Pro Ser Ser
195 200 205
Ser Cys Asn Ile Ser Ser Gly Glu Met Gln Lys Gly Leu Trp Glu Gln
210 215 220
Cys Gln Leu Leu Lys Ser Thr Ser Val Phe Ala Arg Cys His Pro Leu
225 230 235 240
Val Asp Pro Glu Pro Phe Val Ala Leu Cys Glu Lys Thr Leu Cys Glu
245 250 255
Cys Ala Gly Gly Leu Glu Cys Ala Cys Pro Ala Leu Leu Glu Tyr Ala
260 265 270
Arg Thr Cys Ala Gln Glu Gly Met Val Leu Tyr Gly Trp Thr Asp His
275 280 285
Ser Ala Cys Ser Pro Val Cys Pro Ala Gly Met Glu Tyr Arg Gln Cys
290 295 300
Val Ser Pro Cys Ala Arg Thr Cys Gln Ser Leu His Ile Asn Glu Met
305 310 315 320
Cys Gln Glu Arg Cys Val Asp Gly Cys Ser Cys Pro Glu Gly Gln Leu
325 330 335
Leu Asp Glu Gly Leu Cys Val Glu Ser Thr Glu Cys Pro Cys Val His
340 345 350
Ser Gly Lys Arg Tyr Pro Pro Gly Thr Ser Leu Ser Arg Asp Cys Asn
355 360 365
Thr Cys Ile Cys Arg Asn Ser Gln Trp Ile Cys Ser Asn Glu Glu Cys
370 375 380
Pro Gly Glu Cys Leu Val Thr Gly Gln Ser His Phe Lys Ser Phe Asp
385 390 395 400
Asn Arg Tyr Phe Thr Phe Ser Gly Ile Cys Gln Tyr Leu Leu Ala Arg
405 410 415
Asp Cys Gln Asp His Ser Phe Ser Ile Val Ile Glu Thr Val Gln Cys
420 425 430
Ala Asp Asp Arg Asp Ala Val Cys Thr Arg Ser Val Thr Val Arg Leu
435 440 445
Pro Gly Leu His Asn Ser Leu Val Lys Leu Lys His Gly Ala Gly Val
450 455 460
Ala Met Asp Gly Gln Asp Ile Gln Leu Pro Leu Leu Lys Gly Asp Leu
465 470 475 480
Arg Ile Gln His Thr Val Thr Ala Ser Val Arg Leu Ser Tyr Gly Glu
485 490 495
Asp Leu Gln Met Asp Trp Asp Gly Arg Gly Arg Leu Leu Val Lys Leu
500 505 510
Ser Pro Val Tyr Ala Gly Lys Thr Cys Gly Leu Cys Gly Asn Tyr Asn
515 520 525
Gly Asn Gln Gly Asp Asp Phe Leu Thr Pro Ser Gly Leu Ala Glu Pro
530 535 540
Arg Val Glu Asp Phe Gly Asn Ala Trp Lys Leu His Gly Asp Cys Gln
545 550 555 560
Asp Leu Gln Lys Gln His Ser Asp Pro Cys Ala Leu Asn Pro Arg Met
565 570 575
Thr Arg Phe Ser Glu Glu Ala Cys Ala Val Leu Thr Ser Pro Thr Phe
580 585 590
Glu Ala Cys His Arg Ala Val Ser Pro Leu Pro Tyr Leu Arg Asn Cys
595 600 605
Arg Tyr Asp Val Cys Ser Cys Ser Asp Gly Arg Glu Cys Leu Cys Gly
610 615 620
Ala Leu Ala Ser Tyr Ala Ala Ala Cys Ala Gly Arg Gly Val Arg Val
625 630 635 640
Ala Trp Arg Glu Pro Gly Arg Cys Glu Leu Asn Cys Pro Lys Gly Gln
645 650 655
Val Tyr Leu Gln Cys Gly Thr Pro Cys Asn Leu Thr Cys Arg Ser Leu
660 665 670
Ser Tyr Pro Asp Glu Glu Cys Asn Glu Ala Cys Leu Glu Gly Cys Phe
675 680 685
Cys Pro Pro Gly Leu Tyr Met Asp Glu Arg Gly Asp Cys Val Pro Lys
690 695 700
Ala Gln Cys Pro Cys Tyr Tyr Asp Gly Glu Ile Phe Gln Pro Glu Asp
705 710 715 720
Ile Phe Ser Asp His His Thr Met Cys Tyr Cys Glu Asp Gly Phe Met
725 730 735
His Cys Thr Met Ser Gly Val Pro Gly Ser Leu Leu Pro Asp Ala Val
740 745 750
Leu Ser Ser Pro Leu Ser His Arg Ser Lys Arg Ser Leu Ser Cys Arg
755 760 765
Pro Pro Met Val Lys Leu Val Cys Pro Ala Asp Asn Leu Arg Ala Glu
770 775 780
Gly Leu Glu Cys Thr Lys Thr Cys Gln Asn Tyr Asp Leu Glu Cys Met
785 790 795 800
Ser Met Gly Cys Val Ser Gly Cys Leu Cys Pro Pro Gly Met Val Arg
805 810 815
His Glu Asn Arg Cys Val Ala Leu Glu Arg Cys Pro Cys Phe His Gln
820 825 830
Gly Lys Glu Tyr Ala Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Gly Cys Asn Thr
835 840 845
Cys Val Cys Arg Asp Arg Lys Trp Asn Cys Thr Asp His Val Cys Asp
850 855 860
Ala Thr Cys Ser Thr Ile Gly Met Ala His Tyr Leu Thr Phe Asp Gly
865 870 875 880
Leu Lys Tyr Leu Phe Pro Gly Glu Cys Gln Tyr Val Leu Val Gln Asp
885 890 895
Tyr Cys Gly Ser Asn Pro Gly Thr Phe Arg Ile Leu Val Gly Asn Lys
900 905 910
Gly Cys Ser His Pro Ser Val Lys Cys Lys Lys Arg Val Thr Ile Leu
915 920 925
Val Glu Gly Gly Glu Ile Glu Leu Phe Asp Gly Glu Val Asn Val Lys
930 935 940
Arg Pro Met Lys Asp Glu Thr His Phe Glu Val Val Glu Ser Gly Arg
945 950 955 960
Tyr Ile Ile Leu Leu Leu Gly Lys Ala Leu Ser Val Val Trp Asp Arg
965 970 975
His Leu Ser Ile Ser Val Val Leu Lys Gln Thr Tyr Gln Glu Lys Val
980 985 990
Cys Gly Leu Cys Gly Asn Phe Asp Gly Ile Gln Asn Asn Asp Leu Thr
995 1000 1005
Ser Ser Asn Leu Gln Val Glu Glu Asp Pro Val Asp Phe Gly Asn
1010 1015 1020
Ser Trp Lys Val Ser Ser Gln Cys Ala Asp Thr Arg Lys Val Pro
1025 1030 1035
Leu Asp Ser Ser Pro Ala Thr Cys His Asn Asn Ile Met Lys Gln
1040 1045 1050
Thr Met Val Asp Ser Ser Cys Arg Ile Leu Thr Ser Asp Val Phe
1055 1060 1065
Gln Asp Cys Asn Lys Leu Val Asp Pro Glu Pro Tyr Leu Asp Val
1070 1075 1080
Cys Ile Tyr Asp Thr Cys Ser Cys Glu Ser Ile Gly Asp Cys Ala
1085 1090 1095
Ala Phe Cys Asp Thr Ile Ala Ala Tyr Ala His Val Cys Ala Gln
1100 1105 1110
His Gly Lys Val Val Thr Trp Arg Thr Ala Thr Leu Cys Pro Gln
1115 1120 1125
Ser Cys Glu Glu Arg Asn Leu Arg Glu Asn Gly Tyr Glu Ala Glu
1130 1135 1140
Trp Arg Tyr Asn Ser Cys Ala Pro Ala Cys Gln Val Thr Cys Gln
1145 1150 1155
His Pro Glu Pro Leu Ala Cys Pro Val Gln Cys Val Glu Gly Cys
1160 1165 1170
His Ala His Cys Pro Pro Gly Lys Ile Leu Asp Glu Leu Leu Gln
1175 1180 1185
Thr Cys Val Asp Pro Glu Asp Cys Pro Val Cys Glu Val Ala Gly
1190 1195 1200
Arg Arg Phe Ala Ser Gly Lys Lys Val Thr Leu Asn Pro Ser Asp
1205 1210 1215
Pro Glu His Cys Gln Ile Cys His Cys Asp Val Val Asn Leu Thr
1220 1225 1230
Cys Glu Ala Cys Gln Glu Pro Ile Ser Gly Ala Pro Thr Ser Glu
1235 1240 1245
Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser
1250 1255 1260
Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser
1265 1270 1275
Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly
1280 1285 1290
Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr
1295 1300 1305
Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro
1310 1315 1320
Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser
1325 1330 1335
Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly
1340 1345 1350
Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Pro Ala
1355 1360 1365
Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro
1370 1375 1380
Thr Ser Thr Glu Glu Gly Ala Ser Ile Ser Asp Lys Asn Thr Gly
1385 1390 1395
Asp Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu
1400 1405 1410
Ser Lys Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Asp Lys Thr
1415 1420 1425
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
1430 1435 1440
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
1445 1450 1455
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
1460 1465 1470
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
1475 1480 1485
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
1490 1495 1500
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
1505 1510 1515
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
1520 1525 1530
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
1535 1540 1545
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
1550 1555 1560
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
1565 1570 1575
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
1580 1585 1590
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
1595 1600 1605
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
1610 1615 1620
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
1625 1630 1635
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
1640 1645 1650
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> pSYN VWF062 (VWF D'D3-Fc with no thrombin site in the linker)
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ctggagtgcg cctgccctgc cctcctggag tacgcccgga cctgtgccca ggagggaatg 840
gtgctgtacg gctggaccga ccacagcgcg tgcagcccag tgtgccctgc tggtatggag 900
tataggcagt gtgtgtcccc ttgcgccagg acctgccaga gcctgcacat caatgaaatg 960
tgtcaggagc gatgcgtgga tggctgcagc tgccctgagg gacagctcct ggatgaaggc 1020
ctctgcgtgg agagcaccga gtgtccctgc gtgcattccg gaaagcgcta ccctcccggc 1080
acctccctct ctcgagactg caacacctgc atttgccgaa acagccagtg gatctgcagc 1140
aatgaagaat gtccagggga gtgccttgtc actggtcaat cccacttcaa gagctttgac 1200
aacagatact tcaccttcag tgggatctgc cagtacctgc tggcccggga ttgccaggac 1260
cactccttct ccattgtcat tgagactgtc cagtgtgctg atgaccgcga cgctgtgtgc 1320
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tgcctgtgcg gcgccctggc cagctatgcc gcggcctgcg cggggagagg cgtgcgcgtc 1920
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tgcgtgccca aggcccagtg cccctgttac tatgacggtg agatcttcca gccagaagac 2160
atcttctcag accatcacac catgtgctac tgtgaggatg gcttcatgca ctgtaccatg 2220
agtggagtcc ccggaagctt gctgcctgac gctgtcctca gcagtcccct gtctcatcgc 2280
agcaaaagga gcctatcctg tcggcccccc atggtcaagc tggtgtgtcc cgctgacaac 2340
ctgcgggctg aagggctcga gtgtaccaaa acgtgccaga actatgacct ggagtgcatg 2400
agcatgggct gtgtctctgg ctgcctctgc cccccgggca tggtccggca tgagaacaga 2460
tgtgtggccc tggaaaggtg tccctgcttc catcagggca aggagtatgc ccctggagaa 2520
acagtgaaga ttggctgcaa cacttgtgtc tgtcgggacc ggaagtggaa ctgcacagac 2580
catgtgtgtg atgccacgtg ctccacgatc ggcatggccc actacctcac cttcgacggg 2640
ctcaaatacc tgttccccgg ggagtgccag tacgttctgg tgcaggatta ctgcggcagt 2700
aaccctggga cctttcggat cctagtgggg aataagggat gcagccaccc ctcagtgaaa 2760
tgcaagaaac gggtcaccat cctggtggag ggaggagaga ttgagctgtt tgacggggag 2820
gtgaatgtga agaggcccat gaaggatgag actcactttg aggtggtgga gtctggccgg 2880
tacatcattc tgctgctggg caaagccctc tccgtggtct gggaccgcca cctgagcatc 2940
tccgtggtcc tgaagcagac ataccaggag aaagtgtgtg gcctgtgtgg gaattttgat 3000
ggcatccaga acaatgacct caccagcagc aacctccaag tggaggaaga ccctgtggac 3060
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aggacggcca cattgtgccc ccagagctgc gaggagagga atctccggga gaacgggtat 3420
gaggctgagt ggcgctataa cagctgtgca cctgcctgtc aagtcacgtg tcagcaccct 3480
gagccactgg cctgccctgt gcagtgtgtg gagggctgcc atgcccactg ccctccaggg 3540
aaaatcctgg atgagctttt gcagacctgc gttgaccctg aagactgtcc agtgtgtgag 3600
gtggctggcc ggcgttttgc ctcaggaaag aaagtcacct tgaatcccag tgaccctgag 3660
cactgccaga tttgccactg tgatgttgtc aacctcacct gtgaagcctg ccaggagccg 3720
atatcgggcg cgccaacatc agagagcgcc acccctgaaa gtggtcccgg gagcgagcca 3780
gccacatctg ggtcggaaac gccaggcaca agtgagtctg caactcccga gtccggacct 3840
ggctccgagc ctgccactag cggctccgag actccgggaa cttccgagag cgctacacca 3900
gaaagcggac ccggaaccag taccgaacct agcgagggct ctgctccggg cagcccagcc 3960
ggctctccta catccacgga ggagggcact tccgaatccg ccaccccgga gtcagggcca 4020
ggatctgaac ccgctacctc aggcagtgag acgccaggaa cgagcgagtc cgctacaccg 4080
gagagtgggc cagggagccc tgctggatct cctacgtcca ctgaggaagg gtcaccagcg 4140
ggctcgccca ccagcactga agaaggtgcc tcgagcgaca aaactcacac atgcccaccg 4200
tgcccagctc cagaactcct gggcggaccg tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag 4260
gacaccctca tgatctcccg gacccctgag gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac 4320
gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag 4380
acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc 4440
ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc 4500
ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa gccaaagggc agccccgaga accacaggtg 4560
tacaccctgc ccccatcccg ggatgagctg accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg 4620
gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag 4680
aacaactaca agaccacgcc tcccgtgttg gactccgacg gctccttctt cctctacagc 4740
aagctcaccg tggacaagag caggtggcag caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg 4800
catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag aagagcctct ccctgtctcc gggtaaatga 4860
<210> 199
<211> 1619
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pSYN VWF062 (VWF D'D3-Fc with no thrombin site in the linker)
<400> 199
Met Ile Pro Ala Arg Phe Ala Gly Val Leu Leu Ala Leu Ala Leu Ile
1 5 10 15
Leu Pro Gly Thr Leu Cys Ala Glu Gly Thr Arg Gly Arg Ser Ser Thr
20 25 30
Ala Arg Cys Ser Leu Phe Gly Ser Asp Phe Val Asn Thr Phe Asp Gly
35 40 45
Ser Met Tyr Ser Phe Ala Gly Tyr Cys Ser Tyr Leu Leu Ala Gly Gly
50 55 60
Cys Gln Lys Arg Ser Phe Ser Ile Ile Gly Asp Phe Gln Asn Gly Lys
65 70 75 80
Arg Val Ser Leu Ser Val Tyr Leu Gly Glu Phe Phe Asp Ile His Leu
85 90 95
Phe Val Asn Gly Thr Val Thr Gln Gly Asp Gln Arg Val Ser Met Pro
100 105 110
Tyr Ala Ser Lys Gly Leu Tyr Leu Glu Thr Glu Ala Gly Tyr Tyr Lys
115 120 125
Leu Ser Gly Glu Ala Tyr Gly Phe Val Ala Arg Ile Asp Gly Ser Gly
130 135 140
Asn Phe Gln Val Leu Leu Ser Asp Arg Tyr Phe Asn Lys Thr Cys Gly
145 150 155 160
Leu Cys Gly Asn Phe Asn Ile Phe Ala Glu Asp Asp Phe Met Thr Gln
165 170 175
Glu Gly Thr Leu Thr Ser Asp Pro Tyr Asp Phe Ala Asn Ser Trp Ala
180 185 190
Leu Ser Ser Gly Glu Gln Trp Cys Glu Arg Ala Ser Pro Pro Ser Ser
195 200 205
Ser Cys Asn Ile Ser Ser Gly Glu Met Gln Lys Gly Leu Trp Glu Gln
210 215 220
Cys Gln Leu Leu Lys Ser Thr Ser Val Phe Ala Arg Cys His Pro Leu
225 230 235 240
Val Asp Pro Glu Pro Phe Val Ala Leu Cys Glu Lys Thr Leu Cys Glu
245 250 255
Cys Ala Gly Gly Leu Glu Cys Ala Cys Pro Ala Leu Leu Glu Tyr Ala
260 265 270
Arg Thr Cys Ala Gln Glu Gly Met Val Leu Tyr Gly Trp Thr Asp His
275 280 285
Ser Ala Cys Ser Pro Val Cys Pro Ala Gly Met Glu Tyr Arg Gln Cys
290 295 300
Val Ser Pro Cys Ala Arg Thr Cys Gln Ser Leu His Ile Asn Glu Met
305 310 315 320
Cys Gln Glu Arg Cys Val Asp Gly Cys Ser Cys Pro Glu Gly Gln Leu
325 330 335
Leu Asp Glu Gly Leu Cys Val Glu Ser Thr Glu Cys Pro Cys Val His
340 345 350
Ser Gly Lys Arg Tyr Pro Pro Gly Thr Ser Leu Ser Arg Asp Cys Asn
355 360 365
Thr Cys Ile Cys Arg Asn Ser Gln Trp Ile Cys Ser Asn Glu Glu Cys
370 375 380
Pro Gly Glu Cys Leu Val Thr Gly Gln Ser His Phe Lys Ser Phe Asp
385 390 395 400
Asn Arg Tyr Phe Thr Phe Ser Gly Ile Cys Gln Tyr Leu Leu Ala Arg
405 410 415
Asp Cys Gln Asp His Ser Phe Ser Ile Val Ile Glu Thr Val Gln Cys
420 425 430
Ala Asp Asp Arg Asp Ala Val Cys Thr Arg Ser Val Thr Val Arg Leu
435 440 445
Pro Gly Leu His Asn Ser Leu Val Lys Leu Lys His Gly Ala Gly Val
450 455 460
Ala Met Asp Gly Gln Asp Ile Gln Leu Pro Leu Leu Lys Gly Asp Leu
465 470 475 480
Arg Ile Gln His Thr Val Thr Ala Ser Val Arg Leu Ser Tyr Gly Glu
485 490 495
Asp Leu Gln Met Asp Trp Asp Gly Arg Gly Arg Leu Leu Val Lys Leu
500 505 510
Ser Pro Val Tyr Ala Gly Lys Thr Cys Gly Leu Cys Gly Asn Tyr Asn
515 520 525
Gly Asn Gln Gly Asp Asp Phe Leu Thr Pro Ser Gly Leu Ala Glu Pro
530 535 540
Arg Val Glu Asp Phe Gly Asn Ala Trp Lys Leu His Gly Asp Cys Gln
545 550 555 560
Asp Leu Gln Lys Gln His Ser Asp Pro Cys Ala Leu Asn Pro Arg Met
565 570 575
Thr Arg Phe Ser Glu Glu Ala Cys Ala Val Leu Thr Ser Pro Thr Phe
580 585 590
Glu Ala Cys His Arg Ala Val Ser Pro Leu Pro Tyr Leu Arg Asn Cys
595 600 605
Arg Tyr Asp Val Cys Ser Cys Ser Asp Gly Arg Glu Cys Leu Cys Gly
610 615 620
Ala Leu Ala Ser Tyr Ala Ala Ala Cys Ala Gly Arg Gly Val Arg Val
625 630 635 640
Ala Trp Arg Glu Pro Gly Arg Cys Glu Leu Asn Cys Pro Lys Gly Gln
645 650 655
Val Tyr Leu Gln Cys Gly Thr Pro Cys Asn Leu Thr Cys Arg Ser Leu
660 665 670
Ser Tyr Pro Asp Glu Glu Cys Asn Glu Ala Cys Leu Glu Gly Cys Phe
675 680 685
Cys Pro Pro Gly Leu Tyr Met Asp Glu Arg Gly Asp Cys Val Pro Lys
690 695 700
Ala Gln Cys Pro Cys Tyr Tyr Asp Gly Glu Ile Phe Gln Pro Glu Asp
705 710 715 720
Ile Phe Ser Asp His His Thr Met Cys Tyr Cys Glu Asp Gly Phe Met
725 730 735
His Cys Thr Met Ser Gly Val Pro Gly Ser Leu Leu Pro Asp Ala Val
740 745 750
Leu Ser Ser Pro Leu Ser His Arg Ser Lys Arg Ser Leu Ser Cys Arg
755 760 765
Pro Pro Met Val Lys Leu Val Cys Pro Ala Asp Asn Leu Arg Ala Glu
770 775 780
Gly Leu Glu Cys Thr Lys Thr Cys Gln Asn Tyr Asp Leu Glu Cys Met
785 790 795 800
Ser Met Gly Cys Val Ser Gly Cys Leu Cys Pro Pro Gly Met Val Arg
805 810 815
His Glu Asn Arg Cys Val Ala Leu Glu Arg Cys Pro Cys Phe His Gln
820 825 830
Gly Lys Glu Tyr Ala Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Gly Cys Asn Thr
835 840 845
Cys Val Cys Arg Asp Arg Lys Trp Asn Cys Thr Asp His Val Cys Asp
850 855 860
Ala Thr Cys Ser Thr Ile Gly Met Ala His Tyr Leu Thr Phe Asp Gly
865 870 875 880
Leu Lys Tyr Leu Phe Pro Gly Glu Cys Gln Tyr Val Leu Val Gln Asp
885 890 895
Tyr Cys Gly Ser Asn Pro Gly Thr Phe Arg Ile Leu Val Gly Asn Lys
900 905 910
Gly Cys Ser His Pro Ser Val Lys Cys Lys Lys Arg Val Thr Ile Leu
915 920 925
Val Glu Gly Gly Glu Ile Glu Leu Phe Asp Gly Glu Val Asn Val Lys
930 935 940
Arg Pro Met Lys Asp Glu Thr His Phe Glu Val Val Glu Ser Gly Arg
945 950 955 960
Tyr Ile Ile Leu Leu Leu Gly Lys Ala Leu Ser Val Val Trp Asp Arg
965 970 975
His Leu Ser Ile Ser Val Val Leu Lys Gln Thr Tyr Gln Glu Lys Val
980 985 990
Cys Gly Leu Cys Gly Asn Phe Asp Gly Ile Gln Asn Asn Asp Leu Thr
995 1000 1005
Ser Ser Asn Leu Gln Val Glu Glu Asp Pro Val Asp Phe Gly Asn
1010 1015 1020
Ser Trp Lys Val Ser Ser Gln Cys Ala Asp Thr Arg Lys Val Pro
1025 1030 1035
Leu Asp Ser Ser Pro Ala Thr Cys His Asn Asn Ile Met Lys Gln
1040 1045 1050
Thr Met Val Asp Ser Ser Cys Arg Ile Leu Thr Ser Asp Val Phe
1055 1060 1065
Gln Asp Cys Asn Lys Leu Val Asp Pro Glu Pro Tyr Leu Asp Val
1070 1075 1080
Cys Ile Tyr Asp Thr Cys Ser Cys Glu Ser Ile Gly Asp Cys Ala
1085 1090 1095
Ala Phe Cys Asp Thr Ile Ala Ala Tyr Ala His Val Cys Ala Gln
1100 1105 1110
His Gly Lys Val Val Thr Trp Arg Thr Ala Thr Leu Cys Pro Gln
1115 1120 1125
Ser Cys Glu Glu Arg Asn Leu Arg Glu Asn Gly Tyr Glu Ala Glu
1130 1135 1140
Trp Arg Tyr Asn Ser Cys Ala Pro Ala Cys Gln Val Thr Cys Gln
1145 1150 1155
His Pro Glu Pro Leu Ala Cys Pro Val Gln Cys Val Glu Gly Cys
1160 1165 1170
His Ala His Cys Pro Pro Gly Lys Ile Leu Asp Glu Leu Leu Gln
1175 1180 1185
Thr Cys Val Asp Pro Glu Asp Cys Pro Val Cys Glu Val Ala Gly
1190 1195 1200
Arg Arg Phe Ala Ser Gly Lys Lys Val Thr Leu Asn Pro Ser Asp
1205 1210 1215
Pro Glu His Cys Gln Ile Cys His Cys Asp Val Val Asn Leu Thr
1220 1225 1230
Cys Glu Ala Cys Gln Glu Pro Ile Ser Gly Ala Pro Thr Ser Glu
1235 1240 1245
Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser
1250 1255 1260
Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser
1265 1270 1275
Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly
1280 1285 1290
Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr
1295 1300 1305
Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro
1310 1315 1320
Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser
1325 1330 1335
Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly
1340 1345 1350
Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Pro Ala
1355 1360 1365
Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro
1370 1375 1380
Thr Ser Thr Glu Glu Gly Ala Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys
1385 1390 1395
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
1400 1405 1410
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
1415 1420 1425
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
1430 1435 1440
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
1445 1450 1455
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
1460 1465 1470
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
1475 1480 1485
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
1490 1495 1500
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
1505 1510 1515
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
1520 1525 1530
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
1535 1540 1545
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
1550 1555 1560
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
1565 1570 1575
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
1580 1585 1590
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
1595 1600 1605
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
1610 1615
<210> 200
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cleavable linker
<400> 200
Ile Glu Pro Arg
1
Claims (149)
- (i) 첫 번째 면역글로불린 ("Ig") 불변 영역 또는 이의 부분에 융합된 인자 VIII ("FVIII") 단백질을 포함하는 첫 번째 폴리펩티드 및 (ii) 중간의 XTEN 서열에 의해 두 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분에 융합된 VWF의 D' 도메인 및 D3 도메인을 포함하는 폰빌레브란트 인자 ("VWF") 단백질을 포함하는 두 번째 폴리펩티드를 포함하는 키메라 단백질에 있어서, XTEN 서열은 288개보다 적은 아미노산 잔기를 내포하고, 그리고 여기서 첫 번째 폴리펩티드는 두 번째 폴리펩티드에 연결되거나 또는 연관된 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 1에 있어서, 두 번째 폴리펩티드에서 XTEN 서열은 12개 아미노산 및 287개 아미노산 사이의 길이를 갖는 아미노산 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 1 또는 2에 있어서, 키메라 단백질은 첫 번째 폴리펩티드 및 두 번째 폴리펩티드를 포함하는 상응하는 융합 단백질과 비교하여 더욱 긴 반감기를 전시하고, 여기서 융합 단백질의 두 번째 폴리펩티드는 최소한 288개 아미노산을 내포하는 XTEN 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 3에 있어서, 최소한 288개 아미노산을 내포하는 XTEN 서열은 AE288인 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 4에 있어서, AE288은 서열 번호: 8인 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 1 내지 5 중에서 어느 한 항에 있어서, 두 번째 폴리펩티드의 XTEN 서열은 약 36개, 약 42개, 약 72개, 또는 약 144개 아미노산을 내포하는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 6에 있어서, 두 번째 폴리펩티드의 XTEN 서열은 AE42, AE72, AE144, AG42, AG72, 또는 AG144에서 선택되는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 7에 있어서, 두 번째 폴리펩티드의 XTEN 서열은 서열 번호: 9, 서열 번호: 10, 서열 번호: 11, 서열 번호: 55; 서열 번호: 56; 서열 번호: 57; 서열 번호: 58; 서열 번호: 59; 서열 번호: 14; 서열 번호: 60; 서열 번호: 61; 서열 번호: 62; 서열 번호: 63에서 선택되는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 1 내지 8 중에서 어느 한 항에 있어서, 첫 번째 폴리펩티드는 FVIII 단백질을 첫 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분과 연결하는 두 번째 XTEN 서열을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 9에 있어서, 첫 번째 폴리펩티드는 FVIII 단백질 내에 하나 또는 그 이상의 삽입 부위에서 삽입되는 세 번째 XTEN 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 1 내지 8 중에서 어느 한 항에 있어서, 첫 번째 폴리펩티드는 FVIII 단백질 내에 하나 또는 그 이상의 삽입 부위에서 삽입되는 두 번째 XTEN 서열을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 11에 있어서, 첫 번째 폴리펩티드는 FVIII 단백질을 첫 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분과 연결하는 세 번째 XTEN 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 9 내지 12 중에서 어느 한 항에 있어서, 두 번째 XTEN 서열, 세 번째 XTEN 서열, 또는 두 번째 및 세 번째 XTEN 서열은 AE42, AE72, AE864, AE576, AE288, AE144, AG864, AG576, AG288, 그리고 AG144에서 각각 독립적으로 선택되는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 13에 있어서, 두 번째 XTEN 서열, 세 번째 XTEN 서열, 또는 두 번째 및 세 번째 XTEN 서열은 서열 번호: 8; 서열 번호: 9, 서열 번호: 10, 서열 번호: 11, 서열 번호: 17; 서열 번호: 54; 서열 번호: 19; 서열 번호: 16; 서열 번호: 18; 서열 번호: 15; 서열 번호: 55; 서열 번호: 56; 서열 번호: 57; 서열 번호: 58; 서열 번호: 59; 서열 번호: 14; 서열 번호: 60; 서열 번호: 61; 서열 번호: 62; 또는 서열 번호: 63에서 각각 독립적으로 선택되는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 13 또는 14에 있어서, 두 번째 XTEN 서열, 세 번째 XTEN 서열, 또는 두 번째 및 세 번째 XTEN 서열 둘 모두 각각 독립적으로 AE288 또는 AG288인 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 1 내지 15 중에서 어느 한 항에 있어서, 두 번째 폴리펩티드에서 XTEN 서열은 링커에 의해 두 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분에 융합된 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 16에 있어서, 링커는 개열가능 링커인 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 17에 있어서, 링커는 인자 XIa, 인자 XIIa, 칼리크레인, 인자 VIIa, 인자 IXa, 인자 Xa, 인자 IIa (트롬빈), 엘라스타아제-2, 그랜자임-B, TEV, 엔테로키나아제, 프로테아제 3C, 소타아제 A, MMP-12, MMP-13, MMP-17, 그리고 MMP-20에서 선택되는 프로테아제에 의해 개열가능한 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 18에 있어서, 링커는 인자 IIa (트롬빈)에 의해 개열가능한 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 17에 있어서, 링커는 RRRR (서열 번호: 102), RKRRKR (서열 번호: 103), RRRRS (서열 번호: 104), TQSFNDFTR (서열 번호: 2), SVSQTSKLTR (서열 번호: 3), DFLAEGGGVR (서열 번호: 4), TTKIKPR (서열 번호: 5), LVPRG (서열 번호: 6), ALRPR (서열 번호: 7), KLTRAET (서열 번호: 121), DFTRVVG (서열 번호: 122), TMTRIVGG (서열 번호: 123), SPFRSTGG (서열 번호: 124), LQVRIVGG (서열 번호: 125), PLGRIVGG (서열 번호: 126), IEGRTVGG (서열 번호: 127), LTPRSLLV (서열 번호: 128), LGPVSGVP (서열 번호: 129), VAGDSLEE (서열 번호: 130), GPAGLGGA (서열 번호: 131), GPAGLRGA (서열 번호: 132), APLGLRLR (서열 번호: 133), PALPLVAQ (서열 번호: 134), ENLYFQG (서열 번호: 135), DDDKIVGG (서열 번호: 136), LEVLFQGP (서열 번호: 137), 그리고 LPKTGSES (서열 번호: 138)에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 하나 또는 그 이상의 개열 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 17에 있어서, 링커는 TLDPRSFLLRNPNDKYEPFWEDEEK (서열 번호: 146)을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 20에 있어서, 개열 부위는 LVPRG (서열 번호: 6)의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 1 내지 22 중에서 어느 한 항에 있어서, 첫 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분은 첫 번째 Fc 영역을 포함하고 및/또는 두 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분은 두 번째 Fc 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 23에 있어서, 첫 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분 및 두 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분은 키메라 단백질의 반감기를 연장하는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 1 내지 24 중에서 어느 한 항에 있어서, 첫 번째 폴리펩티드 및 두 번째 폴리펩티드는 링커에 의해 융합된 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 25에 있어서, 첫 번째 폴리펩티드 및 두 번째 폴리펩티드는 처리가능 링커에 의해 융합된 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 1 내지 24 중에서 어느 한 항에 있어서, 첫 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분은 두 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분과 연관된 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 27에 있어서, 첫 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분은 공유 결합에 의해, 두 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분과 연관된 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 28에 있어서, 공유 결합은 이황화 결합인 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 다음 화학식 (a)-(hh) 각각을 포함하는 키메라 단백질:
(a) FVIII-F1:F2-L2-X-L1-V;
(b) FVIII-F1:V-L1-X-L2-F2;
(c) F1-FVIII:F2-L2-X-L1-V;
(d) F1-FVIII:V-L1-X-L2-F2;
(e) FVIII-X2-F1:F2-L2-X1-L1-V;
(f) FVIII-X2-F1:V-L1-X1-L2-F2;
(g) FVIII(X2)-F1:F2-L2-X1-L1-V;
(h) FVIII(X2)-F1:V-L1-X1-L2-F2;
(i) F1-X2-F1:F2-L2-X1-L1-V;
(j) F1-X2-F1:V-L1-X1-L2-F2;
(k) V-L1-X-L2-F2-L3-FVIII-L4-F1;
(l) V-L1-X-L2-F2-L3-F1-L4-FVIII;
(m) F1-L4-FVIII-L3-F2-L2-X-L1-V;
(n) FVIII-L4-F1-L3-F2-L2-X-L1-V;
(o) FVIII-L4-F1-L3-V-L1-X-L2-F2;
(p) FVIII-L4-F1-L3-F2-L2-X-L1-V;
(q) F2-L2-X-L1-V-L3-F1-L4-FVIII;
(r) F2-L2-X-L1-V-L3-FVIII-L4-F1;
(s) V-L1-X1-L2-F2-L3-FVIII(X2)-L4-F1;
(t) V-L1-X1-L2-F2-L3-F1-L4-FVIII(X2);
(u) F1-L4-FVIII(X2)-L3-F2-L2-X1-L1-V;
(v) F-L4-FVIII(X2)-L3-V-L1-X1-L2-F2;
(w) FVIII(X2)-L4-F1-L3-V-L1-X1-L2-F2;
(x) FVIII(X2)-L4-F1-L3-F2-L2-X1-L1-V;
(y) F2-L2-X1-L1-V-L3-F1-L4-FVIII(X2);
(z) F2-L2-X1-L1-V-L3-FVIII(X2)-L4-F1;
(aa) V-L1-X2-L2-F2-L3-FVIII-L4-X2-L5-F1;
(bb) V-L1-X2-L2-F2-L3-F1-L5-X2-L4-FVIII;
(cc) F1-L5-X2-L4-FVIII-L3-F2-L2-X2-L1-V;
(dd) F1-L5-X2-L4-FVIII-L3-V-L1-X2-L2-F2;
(ee) FVIII-L5-X2-L4-F2-L3-V-L1-X1-L2-F1;
(ff) FVIII-L5-X2-L4-F2-L3-F1-L2-X1-L1-V;
(gg) F1-L2-X1-L1-V-L3-F2-L4-X2-L5-FVIII; 또는
(hh) F1-L2-X1-L1-V-L3-FVIII-L5-X2-L4-F2;
여기서 V는 VWF 단백질이고, 이것은 D' 도메인 및 D3 도메인을 포함하고,
X 또는 X1은 288개보다 적은 아미노산을 내포하는 첫 번째 XTEN 서열이고,
X2는 두 번째 XTEN 서열이고,
FVIII은 FVIII 단백질을 포함하고,
FVIII(X2)는 FVIII 단백질 내에 하나 또는 그 이상의 삽입 부위에 삽입된 두 번째 XTEN 서열을 갖는 FVIII 단백질을 포함하고,
F1은 첫 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분이고,
F2는 두 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분이고,
L1, L2, L3, L4, 또는 L5는 임의선택적 링커이고,
(-)는 펩티드 결합이고; 그리고
(:)는 공유 결합 또는 비공유 결합이다. - 청구항 30에 있어서, X 또는 X1은 12개 아미노산 및 287개 아미노산 사이의 길이에서 아미노산 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 30 또는 31에 있어서, X 또는 X1이 AE288인 점을 제외하고, 상기 화학식을 포함하는 상응하는 키메라 단백질과 비교하여 더욱 긴 반감기를 전시하는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 32에 있어서, AE288은 서열 번호: 8인 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 30 내지 33 중에서 어느 한 항에 있어서, 화학식에서 X 또는 X1은 약 36개, 약 42개, 약 72개, 또는 약 144개 아미노산을 내포하는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 34에 있어서, 화학식에서 X 또는 X1은 AE42, AE72, AE144, AG42, AG72, 또는 AG144에서 선택되는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 34에 있어서, 화학식에서 X 또는 X1은 서열 번호: 9, 서열 번호: 10, 서열 번호: 11, 서열 번호: 55; 서열 번호: 56; 서열 번호: 57; 서열 번호: 58; 서열 번호: 59; 서열 번호: 14; 서열 번호: 60; 서열 번호: 61; 서열 번호: 62; 또는 서열 번호: 63에서 선택되는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 30 내지 36 중에서 어느 한 항에 있어서, X2는 최소한 약 36개 아미노산, 최소한 약 42개 아미노산, 최소한 약 144개 아미노산, 최소한 약 288개 아미노산, 최소한 약 576개 아미노산, 또는 최소한 약 864개 아미노산의 길이를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 37에 있어서, X2는 AE42, AE72, AE864, AE576, AE288, AE144, AG864, AG576, AG288, 그리고 AG144에서 선택되는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 37에 있어서, X2는 서열 번호: 8; 서열 번호: 9; 서열 번호: 10; 서열 번호: 11; 서열 번호: 17; 서열 번호: 54; 서열 번호: 19; 서열 번호: 16; 서열 번호: 18; 서열 번호: 15; 서열 번호: 55; 서열 번호: 56; 서열 번호: 57; 서열 번호: 58; 서열 번호: 59; 서열 번호: 14; 서열 번호: 60; 서열 번호: 61; 서열 번호: 62; 또는 서열 번호: 63에서 선택되는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 37에 있어서, X2는 AE288 또는 AG288인 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 30 내지 40 중에서 어느 한 항에 있어서, X 또는 X1 및/또는 X2를 포함하는 키메라 단백질은 X 또는 X1 및/또는 X2를 포함하지 않는 키메라 단백질과 비교하여 더욱 긴 반감기를 전시하는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 30 내지 41 중에서 어느 한 항에 있어서, L1 및/또는 L2는 개열가능 링커인 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 30 내지 41 중에서 어느 한 항에 있어서, L4 및/또는 L5는 개열가능 링커인 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 42 또는 43에 있어서, 링커는 인자 XIa, 인자 XIIa, 칼리크레인, 인자 VIIa, 인자 IXa, 인자 Xa, 인자 IIa (트롬빈), 엘라스타아제-2, 그랜자임-B, TEV, 엔테로키나아제, 프로테아제 3C, 소타아제 A, MMP-12, MMP-13, MMP-17, 그리고 MMP-20에서 선택되는 프로테아제에 의해 개열가능한 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 42 또는 43에 있어서, 링커는 인자 IIa (트롬빈)에 의해 개열가능한 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 42 또는 43에 있어서, 링커는 RRRR (서열 번호: 102), RKRRKR (서열 번호: 103), RRRRS (서열 번호: 104), TQSFNDFTR (서열 번호: 1), SVSQTSKLTR (서열 번호: 3), DFLAEGGGVR (서열 번호: 4), TTKIKPR (서열 번호: 5), LVPRG (서열 번호: 6), ALRPR (서열 번호: 7), KLTRAET (서열 번호: 121), DFTRVVG (서열 번호: 122), TMTRIVGG (서열 번호: 123), SPFRSTGG (서열 번호: 124), LQVRIVGG (서열 번호: 125), PLGRIVGG (서열 번호: 126), IEGRTVGG (서열 번호: 127), LTPRSLLV (서열 번호: 128), LGPVSGVP (서열 번호: 129), VAGDSLEE (서열 번호: 130), GPAGLGGA (서열 번호: 131), GPAGLRGA (서열 번호: 132), APLGLRLR (서열 번호: 133), PALPLVAQ (서열 번호: 134), ENLYFQG (서열 번호: 135), DDDKIVGG (서열 번호: 136), LEVLFQGP (서열 번호: 137), 그리고 LPKTGSES (서열 번호: 138)에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 하나 또는 그 이상의 개열 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 42 또는 43에 있어서, 링커는 TLDPRSFLLRNPNDKYEPFWEDEEK (서열 번호: 146)을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 42 또는 43에 있어서, 링커는 LVPRG (서열 번호: 6)의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 42 또는 43에 있어서, 링커는 FVIII의 a1 영역, FVIII의 a2 영역, FVIII의 a3 영역, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 49에 있어서, FVIII의 a2 영역은 ISDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (서열 번호: 106)와 최소한 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 49에 있어서, a1 영역은 ISMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSV (서열 번호: 107)와 최소한 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 49에 있어서, a3 영역은 ISEITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQ (서열 번호: 108)와 최소한 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 30 내지 52 중에서 어느 한 항에 있어서, F1은 첫 번째 Fc 영역을 포함하고 및/또는 F2는 두 번째 Fc 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 30 내지 53 중에서 어느 한 항에 있어서, F1 및 F2를 포함하는 키메라 단백질은 F1 및 F2를 포함하지 않는 키메라 단백질과 비교하여 더욱 긴 반감기를 전시하는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 30 내지 54 중에서 어느 한 항에 있어서, L3은 처리가능 링커인 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 1 내지 55 중에서 어느 한 항에 있어서, VWF 단백질은 비공유 결합에 의해 FVIII 단백질과 연관된 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 1 내지 56 중에서 어느 한 항에 있어서, 키메라 단백질의 반감기는 VWF 단백질 및/또는 XTEN 서열이 없는 FVIII 단백질과 비교하여 또는 야생형 FVIII과 비교하여 연장된 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 57에 있어서, 키메라 단백질의 반감기는 VWF 단백질 또는 XTEN 서열이 없는 FVIII 단백질보다 또는 야생형 FVIII보다 최소한 약 1.5 배, 최소한 약 2 배, 최소한 약 2.5 배, 최소한 약 3 배, 최소한 약 4 배, 최소한 약 5 배, 최소한 약 6 배, 최소한 약 7 배, 최소한 약 8 배, 최소한 약 9 배, 최소한 약 10 배, 최소한 약 11 배, 또는 최소한 약 12 배 연장된 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 57에 있어서, 키메라 단백질의 반감기는 최소한 약 17 시간, 최소한 약 18 시간, 최소한 약 19 시간, 최소한 약 20 시간, 최소한 약 21 시간, 최소한 약 22 시간, 최소한 약 23 시간, 최소한 약 24 시간, 최소한 약 25 시간, 최소한 약 26 시간, 최소한 약 27 시간, 최소한 약 28 시간, 최소한 약 29 시간, 최소한 약 30 시간, 최소한 약 31 시간, 최소한 약 32 시간, 최소한 약 33 시간, 최소한 약 34 시간, 최소한 약 35 시간, 최소한 약 36 시간, 최소한 약 48 시간, 최소한 약 60 시간, 최소한 약 72 시간, 최소한 약 84 시간, 최소한 약 96 시간, 또는 최소한 약 108 시간인 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 57에 있어서, 키메라 단백질의 반감기는 HemA 생쥐에서 약 40 시간인 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 1 내지 60 중에서 어느 한 항에 있어서, VWF 단백질은 VWF 간극 수용체에 실제적으로 결합하지 않는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 1 내지 61 중에서 어느 한 항에 있어서, VWF 단백질은 FVIII 단백질을 하나 또는 그 이상의 프로테아제 개열로부터 보호하거나, FVIII 단백질을 활성화로부터 보호하거나, FVIII 단백질의 중쇄 및/또는 경쇄를 안정시키거나, 또는 하나 또는 그 이상의 스캐빈저 수용체에 의한 FVIII 단백질의 소실을 예방할 수 있는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 1 내지 62 중에서 어느 한 항에 있어서, VWF 단백질은 FVIII 단백질 상에서 VWF 결합 부위를 차폐하거나 또는 차단함으로써, 내인성 VWF가 FVIII 단백질에 결합하는 것을 저해하거나 또는 예방하는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 63에 있어서, VWF 결합 부위는 FVIII 단백질의 A3 도메인 또는 C2 도메인 또는 A3 도메인 및 C2 도메인 둘 모두에서 위치되는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 63에 있어서, VWF 결합 부위는 서열 번호: 65의 아미노산 1669 내지 1689 및 2303 내지 2332에 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 1 내지 65 중에서 어느 한 항에 있어서, 첫 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분 및 두 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분은 동일한 또는 상이한 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 1 내지 66 중에서 어느 한 항에 있어서, FVIII 단백질은 최소한 2개의 XTEN 서열, 최소한 3개의 XTEN 서열, 최소한 4개의 XTEN 서열, 최소한 5개의 XTEN 서열, 또는 최소한 6개의 XTEN 서열에 연결되고 및/또는 이들 서열로 삽입된 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 1 내지 67 중에서 어느 한 항에 있어서, FVIII 단백질은 A1 도메인, a1 산성 영역, A2 도메인, a2 산성 영역, B 도메인, A3 도메인, a3 산성 영역, C1 도메인, C2 도메인, 이들의 하나 또는 그 이상의 단편, 그리고 이들의 임의의 조합에서 선택되는 FVIII의 하나 또는 그 이상의 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 10 내지 68 중에서 어느 한 항에 있어서, FVIII 단백질 내에 하나 또는 그 이상의 삽입 부위는 A1 도메인, a1 산성 영역, A2 도메인, a2 산성 영역, A3 도메인, B 도메인, C1 도메인, C2 도메인, 그리고 이들의 임의의 조합에서 선택되는 FVIII 단백질의 하나 또는 그 이상의 도메인 내에, 또는 A1 도메인 및 a1 산성 영역, a1 산성 영역 및 A2 도메인, A2 도메인 및 a2 산성 영역, a2 산성 영역 및 B 도메인, B 도메인 및 A3 도메인, A3 도메인 및 C1 도메인, C1 도메인 및 C2 도메인, 그리고 이들의 임의의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 FVIII 단백질의 하나 또는 그 이상의 도메인 사이에, 또는 A1 도메인 및 a1 산성 영역, a1 산성 영역 및 A2 도메인, A2 도메인 및 a2 산성 영역, a2 산성 영역 및 B 도메인, B 도메인 및 A3 도메인, A3 도메인 및 C1 도메인, C1 도메인 및 C2 도메인, 그리고 이들의 임의의 조합에서 선택되는 FVIII 단백질의 두 도메인 사이에 위치되는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 10 내지 68 중에서 어느 한 항에 있어서, FVIII 단백질 내에 하나 또는 그 이상의 삽입 부위는 표 7, 표 8, 표 9 및 표 10에서 아미노산 잔기로 구성된 군에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 아미노산인 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 70에 있어서, FVIII 단백질 내에 삽입 부위는 성숙 FVIII 단백질 (서열 번호: 65)에 상응하는 아미노산 745의 즉시 하류에 위치되는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 10 내지 68 중에서 어느 한 항에 있어서, FVIII 단백질 내에 삽입 부위는 성숙 FVIII 단백질 (서열 번호: 65)에 상응하는 잔기 1656 및 잔기 1900의 즉시 하류에 위치되는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 10 내지 68 중에서 어느 한 항에 있어서, FVIII 단백질 내에 삽입 부위는 성숙 FVIII 단백질 (서열 번호: 65)에 상응하는 잔기 26, 1656 및 1900의 즉시 하류에 위치되는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 10 내지 68 중에서 어느 한 항에 있어서, FVIII 단백질 내에 삽입 부위는 성숙 FVIII 단백질 (서열 번호: 65)에 상응하는 잔기 403 및 745의 즉시 하류에 위치되는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 10 내지 68 중에서 어느 한 항에 있어서, FVIII 단백질 내에 삽입 부위는 성숙 FVIII 단백질 (서열 번호: 65)에 상응하는 잔기 745 및 1900의 즉시 하류에 위치되는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 10 내지 68 중에서 어느 한 항에 있어서, FVIII 단백질 내에 삽입 부위는 성숙 FVIII 단백질 (서열 번호: 65)에 상응하는 잔기 18 및 745의 즉시 하류에 위치되는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 1 내지 76 중에서 어느 한 항에 있어서, FVIII 단백질은 이중 사슬 FVIII 동종형인 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 1 내지 76 중에서 어느 한 항에 있어서, FVIII 단백질은 단일 사슬 FVIII 동종형인 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 1 내지 78 중에서 어느 한 항에 있어서, FVIII 단백질은 B 도메인 또는 이의 부분을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 79에 있어서, FVIII 단백질은 SQ B 도메인 결실된 FVIII인 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 78 또는 79에 있어서, 단일 사슬 FVIII 동종형은 전장 성숙 인자 VIII 폴리펩티드 (서열 번호: 65)에 상응하는 잔기 1648, 잔기 1645 또는 양쪽 잔기, 또는 SQ BDD 인자 VIII (서열 번호: 67)의 잔기 754, 잔기 751 또는 양쪽 잔기에 상응하는 잔기에서 최소한 하나의 아미노산 치환을 내포하는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 81에 있어서, 아미노산 치환은 아르기닌 이외에 아미노산인 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 77에 있어서, 이중 사슬 FVIII 동종형은 FVIII의 중쇄를 포함하는 첫 번째 사슬 및 FVIII의 경쇄를 포함하는 두 번째 사슬을 포함하고, 여기서 중쇄 및 경쇄는 금속 결합에 의해 서로 연관된 것을 특징으로 하는 키메라.
- 청구항 1 내지 83 중에서 어느 한 항에 있어서, D' 도메인은 서열 번호: 21의 아미노산 764 내지 866과 최소한 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 1 내지 84 중에서 어느 한 항에 있어서, D3 도메인은 서열 번호: 21의 아미노산 867 내지 1240과 최소한 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 1 내지 85 중에서 어느 한 항에 있어서, VWF 단백질은 단위체인 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 1 내지 86 중에서 어느 한 항에 있어서, 최소한 2개의 VWF 단백질, 최소한 3개의 VWF 단백질, 최소한 4개의 VWF 단백질, 최소한 5개의 VWF 단백질, 또는 최소한 6개의 VWF 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 1 내지 87 중에서 어느 한 항에 있어서, VWF 단백질은 서열 번호: 21의 아미노산 764 내지 1240과 최소한 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 88에 있어서, VWF 단백질은 서열 번호: 21의 아미노산 764 내지 1240으로 본질적으로 구성되거나 또는 구성되는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 1 내지 89 중에서 어느 한 항에 있어서, VWF 단백질은 서열 번호: 21의 잔기 1099, 잔기 1142, 또는 양쪽 잔기 1099 및 1142에 상응하는 잔기에서 최소한 하나의 아미노산 치환을 내포하는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 1 내지 89 중에서 어느 한 항에 있어서, VWF 단백질은 서열 번호: 21의 잔기 1099, 잔기 1142, 또는 양쪽 잔기 1099 및 1142에 상응하는 잔기를 대체하는 시스테인 이외의 아미노산을 내포하는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 1 내지 91 중에서 어느 한 항에 있어서, VWF 단백질은 VWF의 D1 도메인, D2 도메인, 또는 D1 및 D2 도메인을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 1 내지 92 중에서 어느 한 항에 있어서, VWF 단백질은 A1 도메인, A2 도메인, A3 도메인, D4 도메인, B1 도메인, B2 도메인, B3 도메인, C1 도메인, C2 도메인, CK 도메인, 이들의 하나 또는 그 이상의 단편, 그리고 이들의 임의의 조합에서 선택되는 VWF 도메인을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 1 내지 92 중에서 어느 한 항에 있어서, VWF 단백질은 (1) VWF의 D' 및 D3 도메인 또는 이들의 단편; (2) VWF의 D1, D' 및 D3 도메인 또는 이들의 단편; (3) VWF의 D2, D' 및 D3 도메인 또는 이들의 단편; (4) VWF의 D1, D2, D' 및 D3 도메인 또는 이들의 단편; 또는 (5) VWF의 D1, D2, D', D3 및 A1 도메인 또는 이들의 단편으로 본질적으로 구성되거나 또는 구성되는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 1 내지 94 중에서 어느 한 항에 있어서, VWF 단백질은 VWF 단백질에 작동가능하게 연결되는 VWF 또는 FVIII의 신호 펩티드를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 16 내지 95 중에서 어느 한 항에 있어서, 링커 중에서 하나 또는 그 이상은 최소한 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800, 또는 2000개 아미노산 잔기의 길이를 갖는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 16 내지 95 중에서 어느 한 항에 있어서, 링커 중에서 하나 또는 그 이상은 약 1 내지 약 2000개 아미노산 잔기의 길이를 갖는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 96 또는 97에 있어서, 링커 중에서 하나 또는 그 이상은 gly/ser 펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 98에 있어서, gly/ser 펩티드는 (Gly4Ser)n (서열 번호: 94) 또는 S(Gly4Ser)n (서열 번호: 164)의 화학식을 갖고, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10으로 구성된 군에서 선택되는 양의 정수인 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 99에 있어서, (Gly4Ser)n 링커는 (Gly4Ser)3 (서열 번호: 100) 또는 (Gly4Ser)4 (서열 번호: 165)인 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 16 내지 100 중에서 어느 한 항에 있어서, 링커는 20개 아미노산, 35개 아미노산, 48개 아미노산, 73개 아미노산, 또는 95개 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 17 내지 29 및 42 내지 101 중에서 어느 한 항에 있어서, 개열가능 링커는 SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSLVPRGSGG (서열 번호: 166)인 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 1 내지 102 중에서 어느 한 항에 있어서, 폴리시알화된, 페길화된, 또는 헤실화된 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 1 내지 20 중에서 어느 한 항에 있어서, 첫 번째 폴리펩티드는 FVIII161 (서열 번호: 69), FVIII169 (서열 번호: 70), FVIII173 (서열 번호: 72), FVIII195 (서열 번호: 73), FVIII196 (서열 번호: 74), FVIII199 (서열 번호: 75), FVIII201 (서열 번호: 76), FVIII203 (서열 번호: 77), FVIII204 (서열 번호: 78), FVIII205 (서열 번호: 79), FVIII266 (서열 번호: 80), FVIII267 (서열 번호: 81), FVIII268 (서열 번호: 82), FVIII269 (서열 번호: 83), FVIII271 (서열 번호: 84), FVIII272 (서열 번호: 85), 또는 FVIII282 (서열 번호: 159)와 최소한 약 80%, 90%, 95%, 99%, 또는 100% 동일성을 포함하고, 그리고 두 번째 폴리펩티드는 VWF057 (서열 번호: 152)과 최소한 약 80%, 90%, 95%, 99%, 또는 100% 동일성을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 104에 있어서, 첫 번째 폴리펩티드는 FVIII169 (서열 번호: 70)를 포함하고, 그리고 두 번째 폴리펩티드는 VWF057 (서열 번호: 152)을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 1 내지 105 중에서 어느 한 항에 있어서, 키메라 단백질은 치료가 필요한 개체로부터 출혈을 예방하고 및/또는 정지시키는데 유효한 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 1 내지 106 중에서 어느 한 항의 키메라 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 한 세트의 폴리뉴클레오티드.
- 청구항 107에 있어서, PC5 또는 PC7을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 사슬을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
- 청구항 107 또는 108의 폴리뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 세트에 작동가능하게 연결된 하나 또는 그 이상의 프로모터를 포함하는 벡터.
- 청구항 109에 있어서, PC5 또는 PC7을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 사슬을 포함하는 추가 벡터를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
- 청구항 107 또는 108의 폴리뉴클레오티드 또는 청구항 109 또는 110의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
- 청구항 111에 있어서, 포유류 세포인 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
- 청구항 112에 있어서, 포유류 세포는 HEK293 세포, CHO 세포, 그리고 BHK 세포에서 선택되는 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
- 청구항 1 내지 106 중에서 어느 한 항의 키메라 단백질, 청구항 107 또는 108의 폴리뉴클레오티드, 청구항 109 또는 110의 벡터, 또는 청구항 111 내지 113 중에서 어느 한 항의 숙주 세포, 그리고 제약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 제약학적 조성물.
- 청구항 114에 있어서, FVIII 단백질은 야생형 FVIII 단백질과 비교하여 연장된 반감기를 갖는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
- 청구항 114 또는 115에 있어서, 키메라 단백질의 반감기는 야생형 FVIII보다 최소한 약 1.5 배, 최소한 약 2 배, 최소한 약 2.5 배, 최소한 약 3 배, 최소한 약 4 배, 최소한 약 5 배, 최소한 약 6 배, 최소한 약 7 배, 최소한 약 8 배, 최소한 약 9 배, 최소한 약 10 배, 최소한 약 11 배, 또는 최소한 약 12 배 연장된 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
- 청구항 114 또는 115에 있어서, 키메라 단백질의 반감기는 최소한 약 17 시간, 최소한 약 18 시간, 최소한 약 19 시간, 최소한 약 20 시간, 최소한 약 21 시간, 최소한 약 22 시간, 최소한 약 23 시간, 최소한 약 24 시간, 최소한 약 25 시간, 최소한 약 26 시간, 최소한 약 27 시간, 최소한 약 28 시간, 최소한 약 29 시간, 최소한 약 30 시간, 최소한 약 31 시간, 최소한 약 32 시간, 최소한 약 33 시간, 최소한 약 34 시간, 최소한 약 35 시간, 최소한 약 36 시간, 최소한 약 48 시간, 최소한 약 60 시간, 최소한 약 72 시간, 최소한 약 84 시간, 최소한 약 96 시간, 또는 최소한 약 108 시간인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
- 청구항 114 또는 115에 있어서, 키메라 단백질의 반감기는 HemA 생쥐에서 약 40 시간인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
- 청구항 114 내지 118 중에서 어느 한 항에 있어서, 국소 투여, 안구내 투여, 비경구 투여, 척수강내 투여, 경막하 투여 및 경구 투여로 구성된 군에서 선택되는 루트에 의해 투여되는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
- 청구항 119에 있어서, 비경구 투여는 정맥내 또는 피하 투여인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
- 청구항 114 내지 120 중에서 어느 한 항에 있어서, 치료가 필요한 개체에서 출혈 질환 또는 장애를 치료하는데 이용되는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
- 청구항 121에 있어서, 출혈 질환 또는 장애는 출혈 응고 장애, 혈관절증, 근육 출혈, 구강내 출혈, 출혈, 근육 내로 출혈, 경구 출혈, 외상, 두부 외상, 위장관 출혈, 두개내 출혈, 복강내 출혈, 흉곽내 출혈, 뼈 골절, 중추신경계 출혈, 인두후 공간에서 출혈, 후복막 공간에서 출혈, 장요근 덮개에서 출혈 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
- 청구항 121 또는 122에 있어서, 개체는 수술을 받기로 예정된 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
- 청구항 114 내지 123 중에서 어느 한 항에 있어서, 치료는 예방적 또는 주문형인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
- 키메라 단백질의 반감기를 연장하거나 또는 증가시키는 방법에 있어서, 상기 방법은 청구항 1 내지 106 중에서 어느 한 항의 키메라 단백질, 청구항 107 또는 108의 폴리뉴클레오티드, 청구항 109 또는 110의 벡터, 청구항 111 내지 113 중에서 어느 한 항의 숙주 세포, 또는 청구항 114 내지 124 중에서 어느 한 항의 조성물의 효과량을 치료가 필요한 개체에 추가하는 것을 포함하고, 여기서 VWF 단백질, XTEN 서열, 첫 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분, 그리고 두 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분은 키메라 단백질의 반감기를 증가시키는 것을 특징으로 하는 방법.
- 치료가 필요한 개체에서 출혈 질환 또는 장애를 치료하는 방법에 있어서, 청구항 1 내지 106 중에서 어느 한 항의 키메라 단백질, 청구항 107 또는 108의 폴리뉴클레오티드, 청구항 109 또는 110의 벡터, 청구항 111 내지 113 중에서 어느 한 항의 숙주 세포, 또는 청구항 114 내지 124 중에서 어느 한 항의 조성물의 효과량을 투여하는 것을 포함하고, 여기서 출혈 질환 또는 장애는 출혈 응고 장애, 혈관절증, 근육 출혈, 구강내 출혈, 출혈, 근육 내로 출혈, 경구 출혈, 외상, 두부 외상, 위장관 출혈, 두개내 출혈, 복강내 출혈, 흉곽내 출혈, 뼈 골절, 중추신경계 출혈, 인두후 공간에서 출혈, 후복막 공간에서 출혈, 그리고 장요근 덮개에서 출혈로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 125 또는 126에 있어서, 개체는 동물인 것을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 127에 있어서, 동물은 인간인 것을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 127 또는 128에 있어서, 개체는 A형 혈우병으로 고통받고 있는 것을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 126 내지 129 중에서 어느 한 항에 있어서, 치료는 예방적 또는 주문형인 것을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 126 내지 130 중에서 어느 한 항에 있어서, 효과량은 0.1 μg/kg 내지 500 mg/kg인 것을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 125 내지 131 중에서 어느 한 항에 있어서, 청구항 1 내지 106 중에서 어느 한 항의 키메라 단백질, 청구항 107 또는 108의 폴리뉴클레오티드, 청구항 109 또는 110의 벡터, 청구항 111 내지 113 중에서 어느 한 항의 숙주 세포, 또는 청구항 114 내지 124 중에서 어느 한 항의 조성물은 국소 투여, 안구내 투여, 비경구 투여, 척수강내 투여, 경막하 투여 및 경구 투여로 구성된 군에서 선택되는 루트에 의해 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 132에 있어서, 비경구 투여는 정맥내 투여, 피하 투여, 근육내 투여, 그리고 피내 투여로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 키메라 단백질을 만드는 방법에 있어서, 하나 또는 그 이상의 숙주 세포를 청구항 107 또는 108의 폴리뉴클레오티드 또는 청구항 109 또는 110의 벡터로 형질감염시키고, 그리고 키메라 단백질을 숙주 세포에서 발현하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 134에 있어서, 키메라 단백질을 단리하는 것을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 124 내지 135 중에서 어느 한 항에 있어서, 키메라 단백질은 개체에서 출혈을 정지시키고 및/또는 예방하는데 유효한 것을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 19에 있어서, 링커는 FVIII의 a2 영역 또는 이의 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 137에 있어서, 링커는 DKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (서열 번호: 88)과 최소한 약 80%, 최소한 약 85%, 최소한 약 90%, 최소한 약 95%, 최소한 약 96%, 최소한 약 97%, 최소한 약 98%, 또는 최소한 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 19에 있어서, 링커는 아미노산 서열 IEPR (서열 번호: 200) 또는 IEPRSFS (서열 번호: 194)를 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 138 또는 139에 있어서, 링커는 FVIII의 전장 a2 영역이 아닌 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 42 또는 43에 있어서, 링커는 FVIII의 a2 영역의 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 141에 있어서, 링커는 서열 번호: 88, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 그리고 200에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 142에 있어서, 링커는 아미노산 서열 IEPR (서열 번호: 200) 또는 IEPRSFS (서열 번호: 194)를 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 141 내지 143 중에서 어느 한 항에 있어서, 링커는 FVIII의 전장 a2 영역이 아닌 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 다음을 포함하는 키메라 단백질:
(i) 첫 번째 면역글로불린 ("Ig") 불변 영역 또는 이의 부분에 융합된 인자 VIII ("FVIII") 단백질을 포함하는 첫 번째 폴리펩티드, 여기서 FVIII 단백질은 288-아미노산 길이 XTEN 서열을 포함하고; 그리고
(ii) 중간의 144-아미노산 XTEN 서열에 의해 두 번째 Ig 불변 영역 또는 이의 부분에 융합된 VWF의 D' 도메인 및 D3 도메인을 포함하는 폰빌레브란트 인자 ("VWF") 단백질을 포함하는 두 번째 폴리펩티드;
여기서 첫 번째 폴리펩티드는 첫 번째와 두 번째 Ig 불변 영역을 통해 두 번째 폴리펩티드에 연결되거나 또는 연관된다. - 청구항 145에 있어서, 144-아미노산 XTEN 서열 및 두 번째 Ig 불변 영역 사이에 개열가능 링커를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 146에 있어서, 개열가능 링커는 트롬빈에 의해 개열가능한 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 146 또는 147에 있어서, 개열가능 링커는 IEPR (서열 번호: 200) 또는 IEPRSFS (서열 번호: 194)를 포함하는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 청구항 146 또는 147에 있어서, 개열가능 링커는 IEPR (서열 번호: 200) 또는 IEPRSFS (서열 번호: 194)를 포함하는 아미노산 서열을 갖고, 그리고 여기서 링커는 FVIII의 전장 a2 영역이 아닌 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
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