ES2927475T3

ES2927475T3 - Proteínas quiméricas de factor VIII y usos de las mismas

Info

Publication number: ES2927475T3
Application number: ES15735473T
Authority: ES
Inventors: Ekta Seth Chhabra; Tongyao Liu
Original assignee: Bioverativ Therapeutics Inc
Current assignee: Bioverativ Therapeutics Inc
Priority date: 2014-01-10
Filing date: 2015-01-09
Publication date: 2022-11-07
Anticipated expiration: 2035-01-09
Also published as: CN106456718A; LT4176894T; JP6749836B2; JP2022118129A; AU2020277146A1; WO2015106052A1; US20170073393A1; AU2015204646B2; MX2022001134A; SG10201805924PA; SG10201913697UA; EP4389139A2; IL282168B; DK4176894T3; FI4176894T3; BR112016015512B1; EA201691111A1; US20220275057A1; CN116621991A; UA120917C2

Abstract

La presente invención proporciona una proteína quimérica que comprende un primer polipéptido que comprende una proteína FVIII y una primera región constante de Ig o una porción de la misma y un segundo polipéptido que comprende una proteína VWF que comprende el dominio D' y el dominio D3 de VWF, una secuencia XTEN que tiene menos de 288 aminoácidos de longitud, y una segunda región constante de Ig o una porción de la misma, en la que el primer polipéptido y el segundo polipéptido están asociados entre sí. La invención también incluye nucleótidos, vectores, células huésped, métodos para usar las proteínas quiméricas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Proteínas quiméricas de factor VIII y usos de las mismas

Antecedentes de la invención

La hemofilia A es un trastorno hemorrágico provocado por defectos en el gen que codifica el factor de coagulación VIII (FVIII) y afecta a 1-2 de cada 10000 nacimientos de sexo masculino. Graw et al., Nat. Rev. Genet. 6(6): 488-501 (2005). Los pacientes afectados con hemofilia A pueden tratarse con infusión de FVIII purificado o producido de forma recombinante. Se sabe que todos los productos de FVIII disponibles en el mercado, sin embargo, tiene una semivida de aproximadamente 8-12 horas, lo que requiere administración intravenosa frecuente a los pacientes. Véase Weiner M.A. y Cairo, M.S., Pediatric Hematology Secrets, Lee, M.T., 12. Disorders of Coagulation, Elsevier Health Sciences, 2001; Lillicrap, D. Thromb. Res. 122 Supl. 4:S2-8 (2008). Además, se han intentado varias estrategias para prolongar la semivida de FVIII. Por ejemplo, las estrategias en desarrollo para prolongar la semivida de factores de coagulación incluyen pegilación, glucopegilación y conjugación con albúmina. Véase Dumont et al., Blood. 119(13): 3024-3030 (publicado en línea, 13 de enero de 2012). Independientemente de la manipulación proteínica usada, sin embargo, se ha informado de que los productos de FVIII de acción prolongada actualmente en desarrollo tienen semividas limitadas, únicamente hasta aproximadamente 1,5 a 2 horas en modelos animales preclínicos. Véase id. Se han demostrado resultados coherentes en seres humanos, por ejemplo, se informó de que rFVIIIFc mejora la semivida hasta ~1,7 veces en comparación con ADVATE® en pacientes con hemofilia A. Véase Id. Por lo tanto, los aumentos de la semivida, a pesar de mejoras mínimas, pueden indicar la presencia de otros factores limitantes de T1/2. Véase Liu, T. et al., 2007 ISTH meeting, resumen n.° P-M-035; Henrik, A. et al., 2011 ISTH meeting, resumen n.° P=MO-181; Liu, T. et al., 2011 ISTH meeting resumen n.° P-WE-131.

El factor de Von Willebrand (VWF) en plasma tiene una semivida de aproximadamente 16 horas (que varía de 13 a 18 horas). Goudemand J, et al. J Thromb Haemost 2005;3:2219-27. La semivida de VWF puede verse afectada por varios factores: patrón de glucosilación, ADAMTS-13 (una desintegrina y metaloproteasa con el motivo 13 de trombospondina) y diversas mutaciones en VWF.

En plasma, un 95-98 % de FVIII circula en un complejo no covalente compacto con VWF de longitud completa. La formación de este complejo es importante para el mantenimiento de los niveles plasmáticos apropiados de FVIII in vivo. Lenting et al., Blood. 92(11): 3983-96 (1998); Lenting et al., J. Thromb. Haemost. 5(7): 1353-60 (2007). El FVIII de tipo silvestre de longitud completa está principalmente presente como un heterodímero que tiene una cadena pesada (PM 200 kDa) y una cadena ligera (PM 73 kDa). Cuando FVIII se activa debido a la proteólisis en las posiciones 372 y 740 en la cadena pesada y en la posición 1689 en la cadena ligera, el VWF unido a FVIII se retira del FVIII activado. El FVIII activado, junto con el factor IX activado, calcio y fosfolípido ("complejo tenasa"), induce la activación de factor X, generando grandes cantidades de trombina. La trombina, a su vez, entonces escinde el fibrinógeno para formar monómeros de fibrina solubles, que entonces polimerizan espontáneamente para formar el polímero de fibrina soluble. La trombina también activa el factor XIII que, junto con calcio, sirve para reticular y estabilizar el polímero de fibrina soluble, formando fibrina reticulada (insoluble). El FVIII activado se elimina rápido de la circulación por proteólisis.

Debido a la dosificación frecuente y las inconveniencias provocadas por la pauta de dosificación, aún hay una necesidad de desarrollar productos de FVIII que requieran administración menos frecuente, es decir, un producto de FVIII que tenga una semivida más larga que 1,5 a 2 veces la limitación de la semivida.

Breve sumario de la invención

La presente invención proporciona una proteína quimérica que comprende

(i) un primer polipéptido que comprende

(a) una proteína de factor VIII ("FVIII"),

(b) un XTEN del primer polipéptido, y

(c) una primera región Fc,

en la que la proteína FVIII tiene una actividad de FVIII; y

(ii) un segundo polipéptido, que comprende

(a) un fragmento de factor de Von Willebrand ("VWF") que comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en los aminoácidos 764 a 1240 de SEQ ID NO: 21,

(b) un XTEN del segundo polipéptido,

(c) un conector escindible de 10 a 50 aminoácidos que comprende una región a2 de FVIII que comprende la secuencia de aminoácidos de Glu720 a Arg740 correspondiente a SEQ ID NO: 65, en la que la región a2 puede escindirse por trombina, y

(d) una segunda región Fc,

en la que el fragmento de VWF se une a la proteína FVIII;

en la que el XTEN del segundo polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 58; en la que el XTEN del primer polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 8; en la que la primera región Fc se asocia con la segunda región Fc mediante un enlace disulfuro; y en la que la semivida de la proteína quimérica se prolonga en comparación con una proteína FVIII sin el fragmento de VWF.

La presente invención también proporciona una proteína quimérica que comprende

(i) un primer polipéptido, que comprende

(a) una proteína de factor VIII ("FVIII"),

(b) un XTEN del primer polipéptido, y

(c) una primera región Fc,

en la que la proteína FVIII tiene una actividad de FVIII; y

(ii) un segundo polipéptido, que comprende

(b) un XTEN del segundo polipéptido,

(d) una segunda región Fc,

en la que el fragmento de VWF se une a la proteína FVIII,

en la que el fragmento de VWF contiene un aminoácido distinto de cisteína sustituido en un residuo correspondiente a los residuos 1099 y 1142 de SEQ ID NO: 21;

En determinadas realizaciones, el primer polipéptido comprende además una segunda secuencia de XTEN que liga la proteína FVIII con la primera región Fc. También se divulga la proteína quimérica como se describe en este documento, en la que el primer polipéptido comprende una tercera secuencia de XTEN que se inserta en uno o más sitios de inserción dentro de la proteína FVIII. En algunas realizaciones, el primer polipéptido comprende además una segunda secuencia de XTEN que se inserta en uno o más sitios de inserción dentro de la proteína FVIII. En determinadas realizaciones, el primer polipéptido comprende una tercera secuencia de XTEN que liga la proteína FVIII con la primera región Fc.

También se divulga la proteína quimérica como se describe en este documento, en la que la segunda secuencia de XTEN, la tercera secuencia de XTEN o la segunda y tercera secuencia de XTEN cada una se selecciona independientemente de AE42, AE72, AE864, AE576, AE288, AE144, AG864, AG576, AG288 y AG144. En algunas realizaciones, la segunda secuencia de XTEN, la tercera secuencia de XTEN o la segunda y tercera secuencia de XTEN cada una se selecciona independientemente de SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 9, SEQ ⁱD NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 54; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 56; SEQ ID NO: 57; SEQ ID NO: 58; SEQ ID NO: 59; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 60; SEQ ID NO: 61; SEQ ID NO: 62; o SEQ ID NO: 63. En determinadas realizaciones, la segunda secuencia de XTEN, la tercera secuencia de XTEN o tanto la segunda como la tercera secuencia de XTEN son cada una independientemente AE288 o AG288.

La primera región Fc y la segunda región Fc pueden prolongar la semivida de la proteína quimérica. En algunas realizaciones, el primer polipéptido y el segundo polipéptido se fusionan mediante un conector. En determinadas realizaciones, el primer polipéptido y el segundo polipéptido se fusionan mediante un conector procesable. En algunas realizaciones, la primera región Fc se asocia con la segunda región Fc. En determinadas realizaciones, la primera región Fc se asocia con la segunda región Fc mediante un enlace covalente. En algunas realizaciones, el enlace covalente es un enlace disulfuro.

En determinadas realizaciones, el conector comprende un fragmento de la región a2 de FVIII. El fragmento de la región a2 puede comprender, en algunos casos, la secuencia DKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 88). En una realización particular, el conector comprende la secuencia de aminoácidos de IEPRSFS (SEQ ID NO: 194). En otra realización, el conector comprende la secuencia de aminoácidos de IEPRSFS (SEQ ID NO: 194), en la que el conector no es la región a2 de longitud completa de FVIII.

También se divulga la proteína quimérica como se describe en este documento, en la que la región a2 de FVIII comprende una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente un 80 %, aproximadamente un 85 %, aproximadamente un 90 %, aproximadamente un 95 % o un 100 % idéntica a ISDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 106) o DKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 88).

También se divulga la proteína quimérica como se describe en este documento, en la que la semivida de la proteína quimérica es al menos aproximadamente 17 horas, al menos aproximadamente 18 horas, al menos aproximadamente 19 horas, al menos aproximadamente 20 horas, al menos aproximadamente 21 horas, al menos aproximadamente 22 horas, al menos aproximadamente 23 horas, al menos aproximadamente 24 horas, al menos aproximadamente 25 horas, al menos aproximadamente 26 horas, al menos aproximadamente 27 horas, al menos aproximadamente 28 horas, al menos aproximadamente 29 horas, al menos aproximadamente 30 horas, al menos aproximadamente 31 horas, al menos aproximadamente 32 horas, al menos aproximadamente 33 horas, al menos aproximadamente 34 horas, al menos aproximadamente 35 horas, al menos aproximadamente 36 horas, al menos aproximadamente 48 horas, al menos aproximadamente 60 horas, al menos aproximadamente 72 horas, al menos aproximadamente 84 horas, al menos aproximadamente 96 horas o al menos aproximadamente 108 horas. En algunas realizaciones, la semivida de la proteína quimérica es aproximadamente 40 horas en ratones HemA. En determinadas realizaciones, el fragmento de VWF no se une sustancialmente a un receptor de eliminación de VWF. En algunas realizaciones, el fragmento de VWF puede proteger la proteína FVIII de una o más escisiones por proteasa, proteger la proteína FVIII de la activación, estabilizar la cadena pesada y/o la cadena ligera de la proteína FVIII o evitar la eliminación de la proteína FVIII por uno o más receptores depuradores.

Algunas realizaciones incluyen la proteína quimérica como se describe en este documento, en la que el fragmento de VWF inhibe o evita que VWF endógeno se una a la proteína FVIII protegiendo o bloqueando un sitio de unión a VWF en la proteína FVIII. En determinadas realizaciones, el sitio de unión de VWF está localizado en el dominio A3 o el dominio C2 de la proteína FVIII o tanto el dominio A3 como el dominio C2. En algunas realizaciones, el sitio de unión a VWF comprende la secuencia de aminoácidos correspondiente a los aminoácidos 1669 a 1689 y 2303 a 2332 de SEQ ID NO: 65. En algunas realizaciones, la primera región Fc y la segunda región Fc son idénticas o diferentes.

También se divulga la proteína quimérica como se describe en este documento, en la que la proteína FVIII comprende uno o más dominios de FVIII seleccionados de un dominio A1, dominio ácido a1, un dominio A2, dominio ácido a2, un dominio B, un dominio A3, dominio ácido a3, un dominio C1, un dominio C2, uno o más fragmentos de los mismos, y cualquier combinación de los mismos.

También se divulga la proteína quimérica como se describe en este documento, en la que el uno o más sitios de inserción en la proteína FVIII está localizados dentro de uno o más dominios de la proteína FVIII seleccionados del dominio A1, la región ácida a1, el dominio A2, la región ácida a2, el dominio A3, el dominio B, el dominio C1, el dominio C2 y cualquier combinación de los mismos o entre uno o más dominios de la proteína FVIII seleccionados del grupo que consiste en el dominio A1 y región ácida a1, la región ácida a1 y dominio A2, el dominio A2 y región ácida a2, la región ácida a2 y dominio B, el dominio B y dominio A3, el dominio A3 y dominio C1, el dominio C1 y dominio C2, y cualquier combinación de los mismos o entre dos dominios de la proteína FVIII seleccionados del dominio A1 y región ácida a1, la región ácida a1 y dominio A2, el dominio A2 y región ácida a2, la región ácida a2 y dominio B, el dominio B y dominio A3, el dominio A3 y dominio C1, el dominio C1 y dominio C2, y cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el uno o más sitios de inserción en la proteína FVIII son uno o más aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en los residuos aminoacídicos de la tabla 7, tabla 8, tabla 9 y tabla 10. En determinadas realizaciones, los sitios de inserción en la proteína FVIII están localizados inmediatamente posteriores al aminoácido 745 correspondiente a la proteína FVIII madura (SEQ ID NO: 65). En algunas realizaciones, los sitios de inserción en la proteína FVIII están localizados inmediatamente posteriores al residuo 1656 y residuo 1900 correspondientes a la proteína FVIII madura (SEQ ID NO: 65). En algunas realizaciones, los sitios de inserción en la proteína FVIII están inmediatamente posteriores a los residuos 26, 1656 y 1900 correspondientes a la proteína FVIII madura (SEQ ID NO: 65). En determinadas realizaciones, los sitios de inserción en la proteína FVIII están inmediatamente posteriores a los residuos 403 y 745 correspondientes a la proteína FVIII madura (SEQ ID NO: 65). En algunas realizaciones, los sitios de inserción en la proteína FVIII están inmediatamente posteriores a los residuos 745 y 1900 correspondientes a la proteína FVIII madura (SEQ ID NO: 65). En determinadas realizaciones, los sitios de inserción en la proteína FVIII están inmediatamente posteriores a los residuos 18 y 745 correspondientes a la proteína FVIII madura (SEQ ID NO: 65). En algunas realizaciones, la proteína FVIII es una isoforma de FVIII de cadena doble. En algunas realizaciones, la proteína FVIII es una isoforma de FVIII de cadena sencilla. En determinadas realizaciones, la proteína FVIII comprende el dominio B o una parte del mismo. En algunas realizaciones, la proteína FVIII es un FVIII con el dominio B SQ eliminado.

Algunas realizaciones incluyen la proteína quimérica como se describe en este documento, en la que la isoforma de FVIII de cadena sencilla contiene al menos una sustitución aminoacídica en un residuo correspondiente al residuo 1648, residuo 1645 o ambos residuos correspondientes al polipéptido de factor VIII maduro de longitud completa (SEQ ID nO: 65) o residuo 754, residuo 751 o ambos residuos de factor VIII BDD SQ (SEQ ID NO: 67). En determinadas realizaciones, la sustitución aminoacídica es un aminoácido distinto de arginina. En algunas realizaciones, la isoforma de FVIII de cadena doble comprende una primera cadena que comprende una cadena pesada de FVIII y una segunda cadena que comprende una cadena ligera de FVIII, en la que la cadena pesada y la cadena ligera se asocian entre sí mediante un enlace metálico. En este documento se divulga un dominio D' que puede comprender una secuencia de aminoácidos al menos un 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a los aminoácidos 764 a 866 de SEQ ID NO: 21. En este documento también se divulga un dominio D3 que puede comprender una secuencia de aminoácidos al menos un 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a los aminoácidos 867 a 1240 de SEQ ID NO: 21. La proteína VWF puede ser un monómero.

También se divulga la proteína quimérica como se describe en este documento, que comprende al menos dos proteínas VWF, al menos tres proteínas VWF, al menos cuatro proteínas VWF, al menos cinco proteínas VWF o al menos seis proteínas VWF. En este documento se divulgan proteínas VWF que pueden comprender una secuencia de aminoácidos al menos un 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a los aminoácidos 764 a 1240 de SEQ ID NO: 21. En algunas realizaciones, la proteína VWF consiste esencialmente en o consiste en los aminoácidos 764 a 1240 de SEQ ID NO: 21. Una proteína VWF puede contener al menos una sustitución aminoacídica en un residuo correspondiente al residuo 1099, residuo 1142 o ambos residuos 1099 y 1142 de SEQ ID NO: 21. Una proteína VWF puede contener un aminoácido distinto de cisteína sustituido en un residuo correspondiente al residuo 1099, residuo 1142 o ambos residuos 1099 y 1142 de SEQ ID NO: 21. En una realización particular de la invención, el fragmento de VWF contiene un residuo de alanina sustituido en los residuos correspondientes a los residuos 1099 y 1142 de SEQ ID NO: 21. Una proteína VWF puede comprender además el dominio D1, el dominio D2 o los dominios D1 y D2 de VWF.

En la proteína quimérica como se describe en este documento, la proteína VWF puede comprender además un dominio de VWF seleccionado del dominio A1, el dominio A2, el dominio A3, el dominio D4, el dominio B1, el dominio B2, el dominio B3, el dominio C1, el dominio C2, el dominio CK, uno o más fragmentos de los mismos, y cualquier combinación de los mismos.

También se divulga la proteína quimérica como se describe en este documento, en la que la proteína VWF consiste esencialmente en o consiste en: (1) los dominios D' y D3 de VWF o fragmentos de los mismos; (2) los dominios D1, D' y D3 de VWF o fragmentos de los mismos; (3) los dominios D2, D' y D3 de VWF o fragmentos de los mismos; (4) los dominios D1, D2, D' y D3 de VWF o fragmentos de los mismos; o (5) los dominios D1, D2, D', D3 y A1 de VWF o fragmentos de los mismos.

También se divulga la proteína quimérica como se describe en este documento, en la que la proteína VWF comprende además un péptido señal de VWF o FVIII que está unido de forma funcional a la proteína VWF.

En algunas realizaciones, la proteína quimérica como se describe en este documento está polisialilada, pegilada o hesilada.

También se divulga la proteína quimérica como se describe en este documento, en la que el primer polipéptido comprende al menos aproximadamente un 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o 100 % idéntico a FVIII161 (SEQ ID NO: 69), FVIII169 (SEQ ID NO: 70), FVIII173 (SEQ ID NO: 72), FVIII195 (SEQ ID NO: 73), FVIII196 (SEQ ID NO: 74), FVIII199 (SEQ ID NO: 75), FVIII201 (SEQ ID NO: 76), FVIII203 (SEQ ID NO: 77), FVIII204 (SEQ ID NO: 78), FVIII205 (SEQ ID NO: 79), FVIII266 (SEQ ID NO: 80), FVIII267 (SEQ ID NO: 81), FVIII268 (SEQ ID NO: 82), FVIII269 (SEQ ID NO: 83), FVIII271 (SEQ ID NO: 84), FVIII272 (SEQ ID NO: 85), o FVIII282 (SEQ ID NO: 159) y el segundo polipéptido comprende al menos aproximadamente un 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o 100 % idéntico a VWF059 (SEQ ID nO: 197). En otras realizaciones, el primero polipéptido comprende FVIII169 (SEQ ID NO: 70) y el segundo polipéptido comprende VWF059 (SEQ ID NO: 197). En algunas realizaciones, la proteína quimérica es eficaz en la prevención y/o detención de la hemorragia de un sujeto que lo necesita.

También se divulga un polinucleótido o un conjunto de polinucleótidos que codifica la proteína quimérica como se describe en este documento. En algunas realizaciones, el polinucleótido como se describe en este documento, comprende además una cadena polinucleotídica, que codifica PC5 o PC7.

Algunas realizaciones incluyen un vector que comprende el polinucleótido como se describe en este documento y uno o más promotores unidos de forma funcional al polinucleótido o el conjunto de polinucleótidos.

En algunas realizaciones, el vector como se describe en este documento, comprende además un vector adicional, que comprende una cadena polinucleotídica que codifica PC5 o PC7.

También se divulga una célula hospedadora que comprende el polinucleótido o el vector como se describe en este documento. En algunas realizaciones, la célula hospedadora es una célula de mamífero. En determinadas realizaciones la célula de mamífero se selecciona de célula HEK293, célula CHO y célula BHK.

También se divulga una composición farmacéutica que comprende la proteína quimérica y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, la proteína quimérica tiene semivida prolongada en comparación con la proteína FVIII de tipo silvestre. En determinadas realizaciones, la semivida de la proteína quimérica se prolonga al menos aproximadamente 1,5 veces, al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 2,5 veces, al menos aproximadamente 3 veces, al menos aproximadamente 4 veces, al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 6 veces, al menos aproximadamente 7 veces, al menos aproximadamente 8 veces, al menos aproximadamente 9 veces, al menos aproximadamente 10 veces, al menos aproximadamente 11 veces o al menos aproximadamente 12 veces más que FVIII de tipo silvestre.

Algunas realizaciones incluyen la composición como se describe en este documento, en la que la semivida de la proteína quimérica es al menos aproximadamente 17 horas, al menos aproximadamente 18 horas, al menos aproximadamente 19 horas, al menos aproximadamente 20 horas, al menos aproximadamente 21 horas, al menos aproximadamente 22 horas, al menos aproximadamente 23 horas, al menos aproximadamente 24 horas, al menos aproximadamente 25 horas, al menos aproximadamente 26 horas, al menos aproximadamente 27 horas, al menos aproximadamente 28 horas, al menos aproximadamente 29 horas, al menos aproximadamente 30 horas, al menos aproximadamente 31 horas, al menos aproximadamente 32 horas, al menos aproximadamente 33 horas, al menos aproximadamente 34 horas, al menos aproximadamente 35 horas, al menos aproximadamente 36 horas, al menos aproximadamente 48 horas, al menos aproximadamente 60 horas, al menos aproximadamente 72 horas, al menos aproximadamente 84 horas, al menos aproximadamente 96 horas o al menos aproximadamente 108 horas. En determinadas realizaciones, la semivida de la proteína quimérica es aproximadamente 40 horas en ratones HemA. En algunas realizaciones, la composición como se describe en este documento se administra mediante una vía seleccionada del grupo que consiste en administración tópica, administración intraocular, administración parenteral, administración intratecal, administración subdural y administración oral. En determinadas realizaciones, la administración parenteral es administración intravenosa o subcutánea. En algunas realizaciones, la composición como se describe en este documento se usa para tratar una enfermedad o afección hemorrágica en un sujeto que lo necesita. En determinadas realizaciones, la enfermedad o afección hemorrágica se selecciona del grupo que consiste en un trastorno hemorrágico de coagulación, hemartrosis, sangrado muscular, sangrado bucal, hemorragia, hemorragia en músculos, hemorragia bucal, traumatismo, traumatismo en la cabeza, sangrado gastrointestinal, hemorragia intracraneal, hemorragia intraabdominal, hemorragia intratorácica, fractura de hueso, sangrado en el sistema nervioso central, sangrado en el espacio retrofaríngeo, sangrado en el espacio retroperitoneal, sangrado en la vaina del iliopsoas y cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el sujeto se somete a cirugía programada. En determinadas realizaciones, el tratamiento es profiláctico o a demanda.

También se divulga un método de prolongación o aumento de la semivida de la proteína quimérica, en el que el método comprende añadir una cantidad eficaz de la proteína quimérica o la composición como se describe en este documento a un sujeto que lo necesita, en la que la proteína VWF, la secuencia de XTEN, la primera región constante de Ig o una parte de la misma, y la segunda región constante de Ig o una parte de la misma aumentan la semivida de la proteína quimérica.

Algunas realizaciones incluyen la proteína quimérica o la composición como se describe en este documento para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad o trastorno hemorrágico en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar una cantidad eficaz de la proteína quimérica o la composición como se describe en este documento, en la que la enfermedad o trastorno hemorrágico se selecciona del grupo que consiste en un trastorno hemorrágico de coagulación, hemartrosis, sangrado muscular, sangrado bucal, hemorragia, hemorragia en músculos, hemorragia bucal, traumatismo, traumatismo en la cabeza, sangrado gastrointestinal, hemorragia intracraneal, hemorragia intraabdominal, hemorragia intratorácica, fractura de hueso, sangrado en el sistema nervioso central, sangredo en el espacio retrofaríngeo, sangrado en el espacio retroperitoneal y sangrado en el vaina del iliopsoas. En algunas realizaciones, el sujeto es un animal. En determinadas realizaciones, el animal es un ser humano. En algunas realizaciones, el sujeto padece hemofilia A. En determinadas realizaciones, el tratamiento es profiláctico o a demanda. En algunas realizaciones, la cantidad eficaz es de 0,1 pg/kg a 500 mg/kg.

También se divulga un método como se describe en este documento, en el que la proteína quimérica o la composición como se describe en este documento se administra mediante una vía seleccionada del grupo que consiste en administración tópica, administración intraocular, administración parenteral, administración intratecal, administración subdural y administración oral. En determinadas realizaciones, la administración parenteral se selecciona del grupo que consiste en administración intravenosa, administración subcutánea, administración intramuscular y administración intradérmica.

También se divulga un método de preparación de una proteína quimérica, que comprende transfectar una o más células hospedadoras con el polinucleótido o el vector como se describe en este documento y expresar la proteína quimérica en la célula hospedadora. El método como se describe en este documento puede comprender además aislar la proteína quimérica. La proteína quimérica es eficaz en detener y/o evitar la hemorragia en el sujeto.

Breve descripción de los dibujos/figuras

La figura 1 muestra un diagrama esquemático de una proteína quimérica que comprende un primer polipéptido que comprende una proteína FVIII (A1-A2-parcial o completo B-A3-C1-C2) fusionado a una región Fc, en la que se inserta un XTEN en un sitio de inserción dentro de la proteína FVIII y un segundo polipéptido que comprende una proteína VWF que comprende dominios D'D3, un XTEN que tiene menos de 288 aminoácidos, un conector escindible por trombina, y una segunda región Fc. Las inserciones de XTEN en la proteína FVIII y/o las fusiones a la proteína VWF prolongan la semivida de la proteína quimérica aumentado el radio hidrodinámico y bloqueando la eliminación mediada por receptor. Los dominios D'D3 de VWF bloquean la interacción de FVIII con VWF endógeno, estabilizan la proteína FVIII y prolongan la semivida de la proteína quimérica. Los dominios Fc pueden ligar covalentemente los dominios D'D3 con la proteína FVIII y prolongar la semivida de la proteína quimérica a través de la ruta de reciclado mediada por FcRn. El conector escindible por trombina posibilita la liberación de los dominios D'D3 tras activación de FVIII y garantiza la correcta alineación entre FVIII y los dominios D'D3 de VWF.

La figura 2 muestra un sistema de expresión de tres plásmidos para heterodímeros de FVIII-XTEN-Fc:D'D3-XTEN-Fc: un primer plásmido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica FVIII-XTEN-Fc monocatenario en que se inserta un XTEN en el dominio B; un segundo plásmido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica D1 D2D'D3-XTEN-Fc, en que la secuencia de XTEN comprende menos de 288 aminoácidos; y un tercer plásmido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica PACE, una enzima procesadora de propéptidos. Cuando los tres polipéptidos se expresan a partir de los tres plásmidos, los dominios propeptídicos D1D2 de VWF pueden procesarse a partir de los dominios D'D3 por procesamiento intracelular. El complejo resultante contiene tres productos, siendo la primera molécula heterodímeros de FVIII-XTEN/D'D3, siendo la segunda molécula un subproducto, homodímero de D'D3-XTEN-Fc, y siendo la tercera molécula otro subproducto, es decir, FVIII(XTEN)-Fc.

La figura 3 muestra lo efectos aditivos de las inserciones de XTEN sobre la prolongación de la semivida de los heterodímeros. FVIII169 comprende una proteína FVIII con el dominio B eliminado, fusionada a una región Fc, en la que se inserta una secuencia de XTEN (por ejemplo, AE288) en el aminoácido 745 correspondiente a FVIII de longitud completa maduro. FVIII205 comprende una proteína FVIII con el dominio B eliminado, fusionada a una región Fc, en la que se inserta una secuencia de XTEN (por ejemplo, un 144XTEN) en el aminoácido 18 correspondiente a FVIII de longitud completa maduro y se inserta otra secuencia de XTEN (por ejemplo, AE288) en el aminoácido 745 correspondiente a FVIII de longitud completa maduro. VWF031 comprende un dominio D' y un dominio D3 de VWF fusionado a una región Fc mediante un conector escindible por trombina (que no es XTEN). VWF034 comprende un dominio D' y un dominio D3 de VWF fusionado a AE288 y una región Fc. La semivida de FVIII169/VWF031 (triángulo invertido) es 16,7 horas en ratones HemA; la semivida de FVIII205/VWF031 (círculo) es 29,4 horas en ratones HemA; y la semivida de FVIII169/VWF034 (cuadrado) es 31,1 horas en ratones HemA.

La figura 4 muestra que un XTEN de 144 aminoácidos confiere mejor prolongación de la semivida que un XTEN de 288 aminoácidos cuando se inserta entre los dominios D'D3 de VWF y los dominios Fc. Por ejemplo, aunque la semivida de VWF169/VWF034 (cuadrado) es 31,1 horas en ratones HemA, la semivida de FVI11169/VWF057 (círculo) es 42 horas en ratones HemA. VWF057 comprende dominios D'D3 de VWF fusionados a un XTEN de 144 aminoácidos y una región Fc.

La figura 5 muestra que los dominios Fc son necesarios para la prolongación de la semivida de los heterodímeros de la proteína quimérica. Cuando la semivida de FVIII205/VWF031 (círculo) se comparaba en ratones HemA con la de FVIII263/VWF050 (cuadrado), que contiene mutaciones en los sitios de unión a FcRn (Fc con triple mutación IHH) y, por tanto, no podía reciclarse a través de la ruta de FcRn, la semivida de FVIII263/VWF050 (23 horas) es más corta que la de VWF205/VWF031 (29,4 horas). Esto indica que las regiones Fc son necesarias para la prolongación de la semivida.

La figura 6A muestra eficacia aguda similar de heterodímeros de FVIII-XTEN-Fc/D'D3-XTEN-Fc en comparación con FVIII con el dominio B eliminado (FVIII BDD SQ) en modelo de perforación de la cola de ratones HemA. A los ratones se les dosificó 75 UI/kg, y se midió la actividad por ensayo de aPTT. FVIII BDD SQ se muestra como un círculo, mientras que FVIII169/VWF034 se muestra como un cuadrado, FVIII169/VWF057 se muestra como un rombo y el vehículo se muestra como un triángulo invertido. Los detalles de construcción de FVIII169, VWF034 y VWF057 se muestran en otra parte en este documento. La figura 6B muestra una comparación de la eficacia aguda de FVIII169/VWF034 con FVIII con el dominio B eliminado (FVIII BDD SQ) en ratones HemA a dosis de 37,5 UI/kg, y se midió la actividad mediante ensayo de aPTT. La mediana de pérdida de sangre (ul) de ratones en cada grupo de tratamiento se indica mediante las líneas horizontales, la pérdida de sangre (ul) en ratones C57/BL6 se muestra como un triángulo vacío; la pérdida de sangre (ul) después de dosificar 37,5 UI/kg de rBDD-FVIII se muestra como un círculo vacío; la pérdida de sangre (ul) después de dosificar 37,5 UI/kg de FVIII169/VWF034 se muestra como un cuadrado vacío y la pérdida de sangre (ul) después de dosificar el vehículo se muestra como un triángulo invertido.

Las figuras 7A-B muestran que el heterodímero de rFVIII169/VWF057 proporciona protección más larga a ratones HemA en modelo de hemorragia por corte transversal de la vena de la cola. La figura 7A muestra los datos de hemorragia recurrente en ratones que recibieron rFVIII169/VWF057 a las 72 horas antes de la lesión en la cola (cuadrado), FVIII BDD SQ a las 48 horas antes de la lesión en la cola (rombo), FVIII BDD SQ a las 24 horas antes de la lesión en la cola (triángulo invertido) y vehículo (círculo). Se midió la actividad mediante ensayo de aPTT. El eje de abscisas muestra el tiempo en horas, y el eje de ordenadas muestra el porcentaje de no hemorrágicos. La figura 7B muestra los datos de supervivencia correspondientes en las cuatro categorías de los ratones mostrados en la figura 7A. Los ratones que recibieron 12 UI/kg de FVIII169/VWF057 72 horas antes de la lesión en la cola mostraron protección similar en hemorragia recurrente y supervivencia en comparación con los ratones que recibieron tratamiento con FVIII BDD SQ 24 horas antes de la lesión en la cola.

La figura 8A muestra los datos de hemorragia recurrente comparable en ratones que recibieron heterodímeros de rFVIII-XTEN-Fc/D'D3-XTEN-Fc a las 96 horas frente a rBDD-FVIII a las 24 horas antes de la lesión. Los cuadrados rellenos muestra los datos de hemorragia recurrente en ratones que recibieron FVIM169/VWF034 a las 24 horas antes de la lesión; los cuadrados vacíos muestran los datos de hemorragia recurrente en ratones que recibieron FVIN169/VWF034 a las 96 horas antes de la lesión; los rombos rellenos muestran los datos de hemorragia recurrente en ratones que recibieron FVIN169/VWF057 a las 24 horas antes de la lesión; los rombos vacíos muestran los datos de hemorragia recurrente en ratones que recibieron FVIM169/VWF057 a las 96 horas antes de la lesión; los círculos rellenos muestran los datos de hemorragia recurrente en ratones que recibieron rBDD-FVIII a las 24 horas antes de la lesión; los círculos vacíos muestran los datos de hemorragia recurrente en ratones que recibieron rBDD-FVIII a las 48 horas antes de la lesión; y los triángulos rellenos muestran los datos de hemorragia recurrente en ratones que recibieron vehículo. El eje de abscisas muestra el tiempo en horas, y el eje de ordenadas muestra el porcentaje de no hemorrágicos.

La figura 8B muestra la curva de supervivencia en ratones que recibieron heterodímeros de rFVIII-XTEN-Fc/D'D3-XTEN-Fc a las 96 horas frente a rBDD-FVIII a las 24 horas antes de la lesión. El eje de abscisas muestra el tiempo en horas, y el eje de ordenadas muestra el porcentaje de supervivencia. Los símbolos son iguales que en la figura 8A.

La figura 9 muestra un diagrama de heterodímeros de FVIII-VWF representativos y construcciones de FVIII169, FVIII286, VWF057, VWF059 y VWF062. Por ejemplo, la construcción de FVIII169 comprende una proteína FVIII con el dominio B eliminado con sustitución R1648A fusionada a una región Fc, en la que se inserta una secuencia de XTEN (por ejemplo, AE288) en el aminoácido 745 correspondiente a FVIII de longitud completa maduro (A1-a1-A2-a2-288XTEN-a3-A3-C1-C2-Fc). La construcción de FVIII286 comprende una proteína FVIII con el dominio B eliminado con sustitución R1648 fusionada a una región Fc, en la que se inserta una secuencia de XTEN (por ejemplo, AE288) en el aminoácido 745 correspondiente a FVIII de longitud completa maduro, con región a2 adicional entre FVIII y Fc (A1-a1-A2-a2-288XTEN-a3-A3-C1-C2-a2-Fc). VWF057 es una construcción de fusión de VWF-Fc que comprende el dominio D'D3 de la proteína VWF (con dos sustituciones aminoacídicas en el dominio D'D3, es decir, C336A y C379A) ligada a la región Fc mediante un conector de VWF, que comprende el sitio de trombina LVPRG ("LVPRG"; SEQ ID NO: 6) y el conector GS ("GS"), en la que se inserta una secuencia de XTEN (es decir, 144XTEN) entre el dominio D'D3 y el conector de VWF (D'D3-144XTEN-GS+LVPRG-Fc). VWF059 es una construcción de fusión de VWF-Fc que comprende el dominio D'D3 de la proteína VWF (con dos sustituciones aminoacídicas en el dominio D'D3, es decir, C336A y C379A) ligada a la región Fc mediante una región ácida 2 (a2) de FVIII como un conector de VWF, en la que se inserta una secuencia de XTEN (es decir, 144XTEN) entre el dominio D'D3 y el conector de VWF. VWF062 es una construcción de fusión de VWF-Fc que comprende el dominio D'D3 de la proteína VWF (con dos sustituciones aminoacídicas en el dominio D'D3, es decir, C336A y C379A) ligada a la región Fc, en la que se inserta una secuencia de XTEN (por ejemplo, 144XTEN) entre el dominio D'D3 y la región Fc (D'D3-144XTEN-Fc).

La figura 10 muestra un diagrama esquemático que representa construcciones heterodiméricas de FVIII/VWF, por ejemplo, FVIII169/VWF057, FVIII169/VWF059, FVIII 169/VWF059A y FVIII169/VWF073. La flecha muestra el sitio donde se añade un conector opcional para introducir un sitio de escisión por trombina. FVIII169/VWF057 tiene un conector que comprende LVPRG (SEQ ID NO: 6). FVIII169/VWF059 tiene un conector que comprende la región a2 de FVIII (es decir, ISDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSDKTH (SEQ ID NO: 106)). FVIII169/VWF059A tiene un conector que comprende una región a2 de FVIII truncada (es decir, DKNTGDYYEPSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSDKTH (SEQ ID NO: 88)). FVIII169/VWF073 tiene un conector dentro de la construcción de VWF073 (SEQ ID NO: 175) que comprende un fragmento de la región a2 de FVIII que consiste en IEPRSFS (SEQ ID NO: 194).

Las figuras 11A-C muestran imágenes de SDS-PAGE después de digestión con trombina de FVIII169/VWF057 y un control de FVIII-Fc. La figura 11A muestra la tinción del gel de SDS-PAGE con un anticuerpo anti-D3 (AB 96340). Las flechas resaltan "LCFc:D'D3-XTEN-Fc", que es FVIII169/VWF057 de longitud completa sin escindir; y "D'd3-144 XTEN", que es el fragmento resultante después de escisión mediante trombina. La figura 11B muestra la tinción del gel de SDS-PAGE con un anticuerpo anti-HC (GMA012). Las flechas resaltan la cadena pesada de FVIII ("HC") y el dominio A2 de FVIII. La figura 11C muestra la superposición de los paneles A y B. Se recogieron muestras en los puntos temporales indicados en la parte superior de cada panel. Las flechas señalan las proteínas pertinentes.

Las figuras 12A-C muestran imágenes de SDS-PAGE después de digestión con trombina de FVIII169/VWF059. La figura 12A muestra la tinción del gel de SDS-PAGE con un anticuerpo anti-D3 (AB 96340). Las flechas resaltan "LCFc:D'D3-XTEN-Fc", que es FVIII169/VWF059 de longitud completa sin escindir; y "D'D3-144 XTEN", que es el fragmento resultante después de escisión mediante trombina. La figura 12B muestra la tinción del gel de SDS-PAGE con un anticuerpo anti-HC (GMA012). Las flechas resaltan FVIII169/VWF059 de longitud completa sin escindir; D'D3-144 XTEN-a3, que es el fragmento resultante después de escisión mediante trombina; y "A2", que es el dominio A2 de FVIII. La figura 12C muestra la superposición de los paneles A y B. Se recogieron muestras en los puntos temporales indicados en la parte superior de cada panel.

La figura 13 muestra los datos de eficacia aguda de ratones HemA tratados con FVIII169/VWF059 (círculo) en comparación con ratones HemA tratados con un control de BDD-FVIII (cuadrado). Se midió el valor de pérdida de sangre después de perforación de cola. p = 0,9883.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a una proteína quimérica como se describe en el sumario de la invención.

I. Definiciones

Debe apreciarse que el término "un/o" o "una" entidad se refiere a una o más de esa entidad; por ejemplo, se entiende que "una secuencia de nucleótidos" representa una o más secuencias de nucleótidos. Por tanto, las expresiones "un/o" (o "una"), "uno o más" y "al menos uno" pueden usarse indistintamente en este documento.

Además, "y/o" cuando se usa en este documento debe aceptarse como divulgación específica de cada uno de los dos elementos o componentes especificados con o sin el otro. Por tanto, el término "y/o" como se usa en una frase tal como "A y/o B" en este documento pretende incluir "A y B," "A o B," "A" (en solitario) y "B" (en solitario). Asimismo, el término "y/o" como se usa en una frase tal como "A, B y/o C" pretende abarcar cada uno de los siguientes aspectos: A, B y C; A, B o C; A o C; A o B; B o C; A y C; A y B; B y C; A (en solitario); B (en solitario); y C (en solitario).

Se entiende que en cualquier parte que se describan aspectos en este documento con la expresión "que comprende", también se proporcionan aspectos análogos de otro modo descritos en términos de "que consiste en" y/o "que consiste esencialmente en".

Salvo que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el mismo significado que el comprendido habitualmente por un experto en la materia a la que se refiere esta divulgación. Por ejemplo, el Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2.a ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3.a ed., 1999, Academic Press; y el Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revisado, 2000, Oxford University Press, proporcionan a un experto un diccionario general de muchos de los términos usados en esta divulgación.

Las unidades, prefijos y símbolos se indican en la forma aceptada por el Sistema Internacional de Unidades (SI). Los intervalos numéricos incluyen los números que definen el intervalo. Salvo que se indique de otro modo, las secuencias de aminoácidos se escriben de izquierda a derecha en orientación amínica a carboxílica. Los encabezados proporcionados en este documento no son limitaciones de los diversos aspectos de la divulgación, que se puede obtener por referencia a la memoria descriptiva como un todo. Por consiguiente, los términos definidos inmediatamente a continuación se definen más completamente por referencia a la memoria descriptiva en su totalidad.

El término "aproximadamente" se usa en para indicar de forma aproximada a, prácticamente, alrededor de o en las regiones de. Cuando el término "aproximadamente" se usa junto con un intervalo numérico, modifica ese intervalo ampliando los límites por encima y por debajo de los valores numéricos expuestos. En general, el término "aproximadamente" puede modificar un valor numérico por encima y por debajo del valor indicado mediante una variación de, por ejemplo, un 10 por ciento, por encima o por debajo (mayor o menor).

Se pretende que el término "polinucleótido" o "nucleótido" abarque un ácido nucleico único, así como múltiples ácidos nucleicos, y se refiere a una molécula o construcción de ácido nucleico aislada, por ejemplo, ARN mensajero (ARNm) o ADN plasmídico (ADNp). En determinadas realizaciones, un polinucleótido comprende un enlace fosfodiéster convencional o un enlace no convencional (por ejemplo, un enlace amida, tal como se encuentra en ácidos peptidonucleicos (APN)). La expresión "ácido nucleico" se refiere a uno cualquiera o más segmentos de ácido nucleico, por ejemplo, fragmentos de ADN o ARN, presentes en un polinucleótido. Por ácido nucleico o polinucleótido "aislado" se entiende una molécula de ácido nucleico, ADN o ARN, que se ha retirado de su entorno natural. Por ejemplo, un polinucleótido recombinante que codifica un polipéptido de factor VIII contenido en un vector se considera aislado para los propósitos de la presente invención. Ejemplos adicionales de un polinucleótido aislado incluyen polinucleótidos recombinantes mantenidos en células hospedadoras heterólogas o purificados (parcial o sustancialmente) de otros polinucleótidos en una solución. Moléculas de ARN aisladas incluyen transcritos de ARN in vivo o in vitro de polinucleótidos de la presente invención. Polinucleótidos o ácidos nucleicos aislados de acuerdo con la presente invención incluyen además dichas moléculas producidas de forma sintética. Además, un polinucleótido o un ácido nucleico puede incluir elementos reguladores tales como promotores, potenciadores, sitios de unión al ribosoma o señales de terminación de la transcripción.

Como se usa en este documento, una "región codificante" o "secuencia codificante" es una parte de polinucleótido que consiste en codones traducibles en aminoácidos. Aunque típicamente un "codón de parada" (TAG, TGA o TAA) no se traduce en un aminoácido, puede considerarse que forma parte de una región codificante, pero cualquier secuencia flanqueante, por ejemplo, promotores, sitios de unión al ribosoma, terminadores transcripcionales, intrones y similares, no forman parte de una región codificante. Los límites de una región codificante se determinan típicamente mediante un codón de inicio en el extremo 5', que codifica el extremo amínico del polipéptido resultante, y un codón de parada traduccional en el extremo 3', que codifica el extremo carboxílico del polipéptido resultante. Dos o más regiones codificantes de la presente invención pueden estar presentes en una sola construcción polinucleotídica, por ejemplo, en un solo vector, o en construcciones polinucleotídicas separadas, por ejemplo, en vectores separados (diferentes). Se deduce, entonces, que un solo vector puede contener exactamente una sola región codificante, o comprender dos o más regiones codificantes, por ejemplo, un solo vector puede codificar por separado un dominio de unión A y un dominio de unión B como se describe a continuación. Además, un vector, polinucleótido o ácido nucleico de la invención puede codificar regiones codificantes heterólogas, fusionadas o no fusionadas a un ácido nucleico que codifica un dominio de unión de la invención. Las regiones codificantes heterólogas incluyen, sin limitación, elementos o motivos especializados, tales como un péptido señal secretor o un dominio funcional heterólogo.

Determinadas proteínas secretadas por células de mamífero se asocian con un péptido señal secretor que se escinde de la proteína madura una vez se ha iniciado la exportación de la cadena proteínica creciente a través del retículo endoplásmico rugoso. Los expertos en la materia son conscientes de que los péptidos señal en general se fusionan en el extremo N del polipéptido, y se escinden del polipéptido completo o "de longitud completa" para producir una forma secretada o "madura" del polipéptido. En determinadas realizaciones, un péptido señal natural o un derivado funcional de esa secuencia que retiene la capacidad de dirigir la secreción del polipéptido se asocia de manera funcional con el mismo. Como alternativa, puede usarse un péptido señal de mamífero heterólogo, por ejemplo, un péptido señal del activador tisular del plasminógeno (TPA) humano o la p-glucuronidasa de ratón, o un derivado funcional del mismo.

El término "posterior", cuando se refiere a una secuencia de nucleótidos, significa que un ácido nucleico o una secuencia de nucleótidos está ubicada 3' a una secuencia de nucleótidos de referencia. En determinadas realizaciones, las secuencias de nucleótidos posteriores se refieren a secuencias que siguen al punto de inicio de la transcripción. Por ejemplo, el codón de inicio de la traducción de un gen está ubicado posterior del sitio de inicio de la transcripción. El término "posterior", cuando se refiere a una secuencia polipeptídica, significa que el aminoácido o un sitio de inserción de aminoácido está ubicado en el extremo C de los aminoácidos de referencia. Por ejemplo, un sitio de inserción inmediatamente posterior del aminoácido 745 correspondiente a la proteína FVIII de tipo silvestre madura significa que el sitio de inserción está entre el aminoácido 745 y el aminoácido 746 correspondientes a la proteína FVIII de tipo silvestre madura.

El término "anterior" se refiere a una secuencia de nucleótidos que está ubicada 5' a una secuencia de nucleótidos de referencia. En determinadas realizaciones, las secuencias de nucleótidos anteriores se refieren a secuencias que están ubicadas en el lado 5' de una región codificante o punto de inicio de la transcripción. Por ejemplo, la mayoría de los promotores están ubicados anteriores al sitio de inicio de la transcripción.

Como se usa en este documento, la expresión "región reguladora" se refiere a secuencias de nucleótidos ubicadas anteriores (secuencias no codificantes 5'), dentro de, o posteriores (secuencias no codificantes 3') de una región codificante, y que influyen en la transcripción, procesamiento del ARN, estabilidad o traducción de la región codificante asociada. Las regiones reguladoras pueden incluir promotores, secuencias líder de traducción, intrones, secuencias de reconocimiento de poliadenilación, sitios de procesamiento de ARN, sitios de unión de efectores y estructuras de tallo-bucle. Si una región codificante está destinada a expresión en una célula eucariótica, una señal de poliadenilación y secuencia de terminación de la transcripción habitualmente estarán ubicadas 3' a la secuencia codificante.

Un polinucleótido que codifica un producto génico, por ejemplo, un polipéptido, puede incluir un promotor y/u otros elementos de control de la transcripción o traducción asociados de forma funcional con una o más regiones codificantes. En una asociación funcional, una región codificante de un producto génico, por ejemplo, un polipéptido, se asocia con una o más regiones reguladoras de tal manera que sitúe la expresión del producto génico bajo la influencia o control de la región o regiones reguladoras. Por ejemplo, una región codificante y un promotor están "asociados de forma funcional" si la inducción de la función promotora provoca la transcripción del ARNm que codifica el producto génico codificado por la región codificante, y si la naturaleza de la vinculación entre el promotor y la región codificante no interfiere con la capacidad del promotor de dirigir la expresión del producto génico o no interfiere con la capacidad del molde de ADN de transcribirse. Otros elementos de control de la transcripción, además de un promotor, por ejemplo, potenciadores, operadores, represores y señales de terminación de la transcripción, también pueden asociarse de forma funcional con una región codificante para dirigir la expresión del producto génico.

Los expertos en la materia conocen una diversidad de regiones de control de la transcripción. Estas incluyen, sin limitación, regiones de control de la transcripción que funcionan en células de vertebrado, tales como, aunque sin limitación, segmentos promotores y potenciadores de citomegalovirus (el promotor temprano inmediato, junto con intrón-A), virus de simio 40 (el promotor temprano) y retrovirus (tal como virus del sarcoma de Rous). Otras regiones de control de la transcripción incluyen las derivadas de genes de vertebrado tales como actina, proteína de choque térmico, hormona del crecimiento bovina y p-globina de conejo, así como otras secuencias que pueden controlar la expresión génica en células eucarióticas. Regiones de control de la transcripción adecuadas adicionales incluyen promotores y potenciadores específicos de tejido, así como promotores inducibles por linfocinas (por ejemplo, promotores inducibles por interferones o interleucinas).

Asimismo, los expertos en la materia conocen una diversidad de elementos de control de la traducción. Estos incluyen, aunque sin limitación, sitios de unión al ribosoma, codones de inicio y terminación de la traducción, y elementos derivados de picornavirus (particularmente un sitio interno de entrada del ribosoma, o IRES, también denominado secuencia CITE).

El término "expresión", como se usa en este documento, se refiere a un proceso por el que un polinucleótido produce un producto génico, por ejemplo, un ARN o un polipéptido. Incluye, sin limitación, la transcripción del polinucleótido en ARN mensajero (ARNm), ARN de transferencia (ARNt), Ar N en horquilla pequeño (ARNhp), Ar N interferente pequeño (ARNip) o cualquier otro producto de ARN, y la traducción de un ARNm en un polipéptido. La expresión produce un "producto génico". Como se usa en este documento, un producto génico puede ser un ácido nucleico, por ejemplo, un ARN mensajero producido por transcripción de un gen, o un polipéptido que se traduce desde un transcrito. Los productos génicos descritos en este documento incluyen además ácidos nucleicos con modificaciones postranscripcionales, por ejemplo, poliadenilación o empalme, o polipéptidos con modificaciones postraduccionales, por ejemplo, metilación, glucosilación, adición de lípidos, asociación con otras subunidades proteínicas o escisión proteolítica.

Un "vector" se refiere a cualquier vehículo para la clonación y/o transferencia de un ácido nucleico en una célula hospedadora. Un vector puede ser un replicón al que puede unirse otro segmento de ácido nucleico para conseguir la replicación del segmento unido. Un "replicón" se refiere a cualquier elemento genético (por ejemplo, plásmido, fago, cósmido, cromosoma, virus) que funcione como una unidad autónoma de replicación in vivo, es decir, con capacidad de replicación bajo su propio control. El término "vector" incluye vehículos tanto víricos como no víricos para introducir el ácido nucleico en una célula in vitro, ex vivo o in vivo. Se conoce y se usa una gran cantidad de vectores en la técnica incluyendo, por ejemplo, plásmidos, virus eucarióticos modificados o virus bacterianos modificados. La inserción de un polinucleótido en un vector adecuado puede realizarse ligando los fragmentos polinucleotídicos apropiados en un vector escogido que tiene extremos cohesivos complementarios.

Los vectores pueden manipularse para que codifiquen marcadores de selección o indicadores que proporcionan la selección o identificación de células que tienen el vector incorporado. La expresión de marcadores de selección o indicadores permite la identificación y/o selección de células hospedadoras que incorporan y expresan otras regiones codificantes contenidas en el vector. Ejemplos de genes marcadores de selección conocidos y usados en la técnica incluyen: genes que proporcionan resistencia a ampicilina, estreptomicina, gentamicina, kanamicina, higromicina, herbicida bialafós, sulfonamida y similares; y genes que se usan como marcadores fenotípicos, es decir, genes reguladores de antocianina, gen de la isopentanil transferasa y similares. Ejemplos de indicadores conocidos y usados en la técnica incluyen: luciferasa (Luc), proteína fluorescente verde (GFP), cloranfenicol acetiltransferasa (CAT), -galactosidasa (LacZ), -glucuronidasa (Gus) y similares. Los marcadores de selección también pueden considerarse indicadores.

El término "plásmido" se refiere a un elemento extracromosómico que a menudo porta un gen que no forma parte del metabolismo central de la célula, y habitualmente en forma de moléculas de ADN bicatenarias circulares. Dichos elementos pueden ser secuencias de replicación autónoma, secuencias de integración genómica, secuencias fágicas o de nucleótidos, lineales, circulares o superenrolladas, de un ADN o ARN mono- o bicatenario, derivadas de cualquier fuente, en que varias secuencias de nucleótidos se han unido o recombinado en una construcción única que puede introducir un fragmento promotor y secuencia de ADN para un producto génico seleccionado junto con una secuencia sin traducir 3' apropiada en una célula.

Vectores víricos eucarióticos que pueden usarse incluyen, aunque sin limitación, vectores adenovíricos, vectores retrovíricos, vectores víricos adenoasociados y poxvirus, por ejemplo, vectores víricos variolovacunales, vectores baculovíricos o vectores herpesvíricos. Vectores no víricos incluyen plásmidos, liposomas, líquidos cargados eléctricamente (citofectinas), complejos de ADN-proteína y biopolímeros.

Un "vector de clonación" se refiere a un "replicón", que es una longitud unitaria de un ácido nucleico que se replica secuencialmente y que comprende un origen de replicación, tal como un plásmido, fago o cósmido, al que puede unirse otro segmento de ácido nucleico para conseguir la replicación del segmento unido. Determinados vectores de clonación tienen capacidad de replicación en un tipo de célula, por ejemplo, bacterias y expresión en otro, por ejemplo, células eucarióticas. Los vectores de clonación típicamente comprenden una o más secuencias que pueden usarse para la selección de células que comprenden el vector y/o uno o más sitios de clonación múltiple para la inserción de secuencias de ácido nucleico de interés.

La expresión "vector de expresión" se refiere a un vehículo diseñado para posibilitar la expresión de una secuencia de ácido nucleico insertada después de su inserción en una célula hospedadora. La secuencia de ácido nucleico insertada se sitúa en asociación funcional con regiones reguladoras como se describe anteriormente.

Los vectores se introducen en células hospedadoras por métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, transfección, electroporación, microinyección, transducción, fusión de células, DEAE dextrano, precipitación con fosfato de calcio, lipofección (fusión de lisosomas), uso de una pistola génica o un transportador de vector de ADN.

"Cultivo", "cultivar" y "cultivando", como se usan en este documento, significan incubar células en condiciones in vitro que permitan el crecimiento o división celular o para mantener las células en un estado vivo. "Células cultivadas", como se usa en este documento, significa células que se propagan in vitro.

Como se usa en este documento, el término "polipéptido" pretende abarcar un "polipéptido" único, así como múltiples "polipéptidos", y se refiere a una molécula compuesta de monómeros (aminoácidos) unidos linealmente por enlaces amida (también conocidos como enlaces peptídicos). El término "polipéptido" se refiere a cualquier cadena o cadenas de dos o más aminoácidos, y no se refiere a una longitud específica del producto. Por tanto, se incluyen péptidos, dipéptidos, tripéptidos, oligopéptidos, "proteína", "cadena de aminoácidos" o cualquier otro término usado para referirse a una cadena o cadenas de dos o más aminoácidos, dentro de la definición de "polipéptido", y el término "polipéptido" puede usarse en lugar de, o indistintamente con cualquiera de estos términos. El término "polipéptido" también pretende referirse a los productos de modificaciones tras la expresión del polipéptido incluyendo, sin limitación, glucosilación, acetilación, fosforilación, amidación, derivatización mediante grupos protectores/bloqueantes conocidos, escisión proteolítica o modificación mediante aminoácidos que no son de origen natural. Un polipéptido puede obtenerse de una fuente biológica natural o producirse por tecnología recombinante, pero no se traduce necesariamente a partir de una secuencia de ácido nucleico designada. Puede generarse de cualquier manera, incluyendo por síntesis química.

Un polipéptido "aislado" o un fragmento, variante o derivado del mismo se refiere a un polipéptido que no está en su medio natural. No se requiere un nivel particular de purificación. Por ejemplo, un polipéptido aislado simplemente puede retirarse de su entorno original o natural. Las proteínas y polipéptidos producidos de forma recombinante expresados en células hospedadoras se consideran aislados para el propósito de la invención, ya que son polipéptidos naturales o recombinantes que se han separado, fraccionado o purificado parcial o sustancialmente por cualquier técnica adecuada.

También se divulgan fragmentos o variantes de polipéptidos, y cualquier combinación de los mismos. El término "fragmento" o "variante", cuando se refiere a dominios de unión o moléculas de unión a polipéptido de la presente invención incluyen cualquier polipéptido que retenga al menos algunas de las propiedades (por ejemplo, afinidad de unión a FcRn para un dominio de unión a FcRn o variante de Fc, actividad de coagulación para una variante de FVIII, o actividad de unión a FVIII para el fragmento de VWF) del polipéptido de referencia. Fragmentos de polipéptidos incluyen fragmentos proteolíticos, así como fragmentos de eliminación, además de fragmentos de anticuerpo específicos analizados en otra parte en este documento, pero no incluyen el polipéptido de longitud completa de origen natural (o polipéptido maduro). Variantes de dominios de unión o moléculas de unión a polipéptido de la presente invención incluyen fragmentos como se describe anteriormente, y también polipéptidos con secuencias de aminoácidos alteradas debido a sustituciones aminoacídicas, eliminaciones o inserciones. Las variantes pueden ser de origen natural o no natural. Las variantes que no son de origen natural pueden producirse usando técnicas de mutagénesis conocidas en la técnica. Los polipéptidos variantes pueden comprender sustituciones aminoacídicas conservativas o no conservativas, eliminaciones o adiciones.

La expresión "proteína VWF" o "proteínas VWF" usada en este documento significa cualquier fragmento de VWF que interactúe con FVIII y retenga al menos una o más propiedades que se proporcionan normalmente a FVIII mediante VWF de longitud completa, por ejemplo, prevención de la activación prematura de FVIIIa, prevención de la proteólisis prematura, prevención de la asociación con membranas fosfolipídicas que podría dar lugar a eliminación prematura, prevención de la unión a receptores de eliminación de FVIII que pueden unirse a FVIII desnudo, pero no a FVIII unido a VWF, y/o estabilización de las interacciones de la cadena pesada y cadena ligera de FVIII.

Una "sustitución aminoacídica conservativa" es una en que el residuo aminoacídico se remplaza con un residuo aminoacídico que tiene una cadena lateral similar. Familias de residuos aminoacídicos que tienen cadenas laterales similares se han definido en la técnica, incluyendo cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales apolares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales con ramificaciones beta (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Por tanto, si un aminoácido en un polipéptido se remplaza con otro aminoácido de la misma familia de cadena lateral, la sustitución se considera conservativa. En otra realización, una serie de aminoácidos puede remplazarse de forma conservativa con una serie estructuralmente similar que difiere en el orden y/o composición de miembros de la familia de cadena lateral.

Como se sabe en la técnica, la "identidad de secuencia" entre dos polipéptidos se determina comparando la secuencia de aminoácidos de un polipéptido con la secuencia de un segundo polipéptido. Cuando se analiza en este documento, que cualquier polipéptido particular sea al menos aproximadamente un 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % o 100 % idéntico a otro polipéptido puede determinarse usando métodos y programas informáticos o de ordenador conocidos en la técnica tales como, aunque sin limitación, el programa BESTFIT (Wisconsin Sequence Analysis Package, versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711). BESTFIT usa el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981), para hallar el mejor segmento de homología entre dos secuencias. Cuando se usa BESTFIT o cualquier otro programa de alineación de secuencias para determinar si una secuencia particular es, por ejemplo, un 95 % idéntica a una secuencia de referencia de acuerdo con la presente invención, los parámetros se establecen, por supuesto, de modo que el porcentaje de identidad se calcule sobre la longitud completa de la secuencia polipeptídica de referencia y que se permitan huecos en la homología de hasta un 5 % del número total de aminoácidos en la secuencia de referencia.

Como se usa en este documento, un "aminoácido correspondiente a" o un "aminoácido equivalente" en una secuencia de VWF o una secuencia de la proteína FVIII se identifica por alineación para maximizar la identidad o similitud entre una primera secuencia de VWF o FVIII y una segunda secuencia de VWF o FVIII. El número usado para identificar un aminoácido equivalente en una segunda secuencia de VWF o FVIII se basa en el número usado para identificar el aminoácido correspondiente en la primera secuencia de VWF o FVIII.

Como se usa en este documento, la expresión "sitio de inserción" se refiere a una posición en un polipéptido de FVIII, o fragmento, variante o derivado del mismo, que está inmediatamente anterior de la posición en la que puede insertarse un resto heterólogo. Un "sitio de inserción" se especifica como un número, siendo este número el número del aminoácido en el FVIII natural maduro (SEQ ID NO: 65) al que corresponde el sitio de inserción, que está inmediatamente N terminal a la posición de la inserción. Por ejemplo, la expresión "a3 comprende un XTEN en un sitio de inserción que corresponde al aminoácido 1656 de SEQ ID NO: 65" indica que el resto heterólogo está ubicado entre dos aminoácidos correspondientes al aminoácido 1656 y el aminoácido 1657 de SEQ ID NO: 65.

La expresión "inmediatamente posterior de un aminoácido", como se usa en este documento, se refiere una posición exactamente al lado del grupo carboxilo terminal del aminoácido. Asimismo, la expresión "inmediatamente anterior de un aminoácido" se refiere a la posición exactamente al lado del grupo amina terminal del aminoácido. Por lo tanto, la expresión "entre dos aminoácidos de un sitio de inserción", como se usa en este documento, se refiere a una posición en que un XTEN o cualquier otro polipéptido se inserta entre dos aminoácidos adyacentes. Por tanto, las expresiones "insertado inmediatamente posterior de un aminoácido" e "insertado entre dos aminoácidos de un sitio de inserción" se usan como sinónimos de "insertado en un sitio de inserción".

Las expresiones "insertado", "se inserta", "insertado en" o expresiones gramaticalmente relacionadas, como se usan en este documento, se refieren a la posición de un XTEN en un polipéptido quimérico con respecto a la posición análoga en FVIII humano maduro natural. Como se usan en este documento, las expresiones se refieren a las características del polipéptido de FVIII recombinante con respecto a FVIII humano maduro natural, y no indican, implican o insinúan ningún método o proceso por el que se preparó el polipéptido quimérico. Por ejemplo, en referencia a un polipéptido quimérico proporcionado en este documento, la expresión "se inserta un XTEN inmediatamente posterior al residuo 745 del polipéptido de FVIII" significa que el polipéptido quimérico comprende un XTEN inmediatamente posterior de un aminoácido que corresponde al aminoácido 745 en FVIII humano maduro natural, por ejemplo, unido por aminoácidos correspondientes a los aminoácidos 745 y 746 de FVIII humano maduro natural.

Una proteína "de fusión" o "quimérica" comprende una primera secuencia de aminoácidos ligada a una segunda secuencia de aminoácidos con la que no está ligada de forma natural en la naturaleza. Las secuencias de aminoácidos que existen normalmente en proteínas separadas pueden ponerse juntas en el polipéptido de fusión, o las secuencias de aminoácidos que existen normalmente en la misma proteína pueden colocarse en una nueva disposición en el polipéptido de fusión, por ejemplo, fusión de un dominio de factor VIII de la invención con un dominio Fc de Ig. Una proteína de fusión se crea, por ejemplo, por síntesis química, o creando y traduciendo un polinucleótido en que las regiones peptídicas están codificadas en la relación deseada. Una proteína quimérica puede comprender además una segunda secuencia de aminoácidos asociada con la primera secuencia de aminoácidos mediante un enlace covalente no peptídico o un enlace no covalente.

Como se usa en este documento, el término "semivida" se refiere a una semivida biológica de un polipéptido particular in vivo. La semivida puede representarse por el tiempo requerido para que la mitad de la cantidad administrada a un sujeto se elimine de la circulación y/u otros tejidos en el animal. Cuando se construye una curva de eliminación de un polipéptido dado como una función del tiempo, la curva habitualmente es bifásica con una fase a rápida y una fase p más larga. La fase a típicamente representa un equilibrio del polipéptido Fc administrado entre el espacio intra- y extravascular y se determina, en parte, mediante el tamaño del polipéptido. La fase p típicamente representa el catabolismo del polipéptido en el espacio intravascular. En algunas realizaciones, FVIII y las proteínas quiméricas que comprenden FVIII son monofásicas y, por tanto, no tienen una fase alfa, sino solamente la fase beta individual. Por lo tanto, en determinadas realizaciones, el término semivida, como se usa en este documento, se refiere a la semivida del polipéptido en la fase p. La semivida de la fase p típica de un anticuerpo humano en seres humanos es de 21 días.

El término "ligado", como se usa en este documento, se refiere a una primera secuencia de aminoácidos o secuencia de nucleótidos unida covalente o no covalentemente a una segunda secuencia de aminoácidos o secuencia de nucleótidos, respectivamente. La primera secuencia de aminoácidos o nucleótidos puede unirse o yuxtaponerse directamente a la segunda secuencia de aminoácidos o nucleótidos o, como alternativa, una secuencia intermedia puede unir covalentemente la primera secuencia a la segunda secuencia. El término "ligado" significa no solamente una fusión de una primera secuencia de aminoácidos a una segunda secuencia de aminoácidos en el extremo C o el extremo N, sino que también incluye la inserción de la primera secuencia de aminoácidos completa (o la segunda secuencia de aminoácidos) en dos aminoácidos cualesquiera en la segunda secuencia de aminoácidos (o la primera secuencia de aminoácidos, respectivamente). En una realización, la primera secuencia de aminoácidos puede ligarse a una segunda secuencia de aminoácidos mediante un enlace peptídico o un conector. La primera secuencia de nucleótidos puede ligarse a una segunda secuencia de nucleótidos mediante un enlace fosfodiéster o un conector. El conector puede ser un péptido o un polipéptido (para cadenas polinucleotídicas) o un nucleótido o cadena de nucleótidos (para cadenas de nucleótidos) o cualquier resto químico (tanto para cadenas polipeptídicas como polinucleotídicas). El término "ligado" también se indica mediante un guion (-).

Como se usa en este documento, la expresión "asociado con" se refiere a un enlace covalente o no covalente formado entre una primera cadena de aminoácidos y una segunda cadena de aminoácidos. En una realización, la expresión "asociado con" significa un enlace no peptídico covalente o un enlace no covalente. Esta asociación puede indicarse mediante dos puntos, es decir, (:). En otra realización, significa un enlace covalente excepto un enlace peptídico. Por ejemplo, el aminoácido cisteína comprende un grupo tiol que puede formar un enlace o puente disulfuro con un grupo tiol en un segundo residuo de cisteína. En la mayoría de moléculas de IgG de origen natural, las regiones CH1 y CL se asocian mediante un enlace disulfuro y las dos cadenas pesadas se asocian mediante dos enlaces disulfuro en las posiciones correspondientes a 239 y 242 usando el sistema de numeración de Kabat (posición 226 o 229, sistema de numeración EU). Ejemplos de enlaces covalentes incluyen, aunque sin limitación, un enlace peptídico, un enlace metálico, un enlace de hidrógeno, un enlace disulfuro, un enlace sigma, un enlace pi, un enlace delta, un enlace glucosídico, un enlace indiferente, un enlace curvado, un enlace dipolar, un contraenlace Pi, un doble enlace, un triple enlace, un cuádruple enlace, un quíntuple enlace, un séxtuple enlace, conjugación, hiperconjugación, aromaticidad, hapticidad o antiunión. Ejemplos no limitantes de enlace no covalente incluyen un enlace iónico (por ejemplo, enlace catiónico pi o enlace salino), un enlace metálico, un enlace de hidrógeno (por ejemplo, enlace de dihidrógeno, complejo de dihidrógeno, enlace de hidrógeno de barrera baja o enlace de hidrógeno simétrico), fuerza de van der Walls, fuerza de dispersión de London, un enlace mecánico, un enlace de halógeno, aurofilia, intercalación, apilamiento, fuerza entrópica o polaridad química.

La expresión "híbrido de monómero-dímero" usada en este documento se refiere a una proteína quimérica que comprende una primera cadena polipeptídica y una segunda cadena polipeptídica, que se asocian entre sí por un enlace disulfuro, en el que la primera cadena comprende un factor de coagulación, por ejemplo, factor VIII y una primera región Fc y la segunda cadena comprende, consiste esencialmente en o consiste en una segunda región Fc sin el factor de coagulación. La construcción de híbrido de monómero-dímero, por tanto, es un híbrido que comprende un aspecto monomérico que tiene solamente un factor de coagulación y un aspecto dimérico que tiene dos regiones Fc.

Como se usa en este documento, la expresión "sitio de escisión" o "sitio de escisión enzimática" se refiere a un sitio reconocido por una enzima. Determinados sitios de escisión enzimática comprenden un sitio de procesamiento intracelular. En una realización, un polipéptido tiene un sitio de escisión enzimática escindido mediante una enzima que se activa durante la reacción en cadena de coagulación, de modo que la escisión de dichos sitios se produce en el sitio de formación del coágulo. Dichos sitios ejemplares incluyen, por ejemplo, los reconocidos por trombina, factor XIa o factor Xa. Sitios de escisión de FXIa ejemplares incluyen, por ejemplo, TQSFNDFTR (SEQ ID NO: 1) y SVSQTSKLTR (SEQ ID NO: 3). Sitios de escisión de trombina ejemplares incluyen, por ejemplo, DFLAEGGGVR (s EQ ID NO: 4), TTKIKPR (SEQ ID NO: 5), LVPRG (SEQ ID NO: 6), ALRPR (SEQ ID NO: 7), ISDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 106), DKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 88) e IEPRSFS (SEQ ID NO: 194). Otros sitios de escisión enzimática son conocidos en la técnica y se describen en otra parte en este documento.

Como se usa en este documento, la expresión "sitio de procesamiento" o "sitio de procesamiento intracelular" se refiere a un tipo de sitio de escisión enzimática en un polipéptido que es una diana para enzimas que funcionan después de la traducción del polipéptido. En una realización, dichas enzimas funcionan durante el transporte desde la luz del Golgi hasta el compartimiento trans-Golgi. Las enzimas de procesamiento intracelular escinden los polipéptidos antes de la secreción de la proteína desde la célula. Ejemplos de dichos sitios de procesamiento incluyen, por ejemplo, los abordados por la familia de endopeptidasas de PACE/furina (donde PACE es un acrónimo de enzima de escisión de aminoácidos básicos emparejados - Pairedbasic Amino acid Cleaving Enzyme). Estas enzimas se localizan en la membrana del Golgi y escinden proteínas en el lado carboxiterminal del motivo de secuencia Arg-[cualquier residuo]-(Lys o Arg)-Arg. Como se usa en este documento la familia de enzimas de "furina" incluye, por ejemplo, PCSK1 (también conocida como PC1/Pc3), PCSK2 (también conocida como PC2), PCSK3 (también conocida como furina o PACE), PCSK4 (también conocida como PC4), PCSK5 (también conocida como PC5 o PC6), PCSK6 (también conocida como PACE4) o PCSK7 (también conocida como PC7/LPC, PC8 o SPC7). Otros sitios de procesamiento son conocidos en la técnica.

En construcciones que incluyen más de un sitio de procesamiento o escisión, se entenderá que dichos sitios pueden ser iguales o diferentes.

El término "furina" se refiere a las enzimas correspondientes a EC n.° 3.4.21.75. Furina es proproteína convertasa similar a subtilisina, que también se conoce como PACE (enzima de escisión de aminoácidos básicos emparejados). La furina elimina secciones de proteínas precursoras inactivas para convertirlas en proteínas biológicamente activas. Durante su transporte intracelular, el propéptido de VWF puede escindirse de la molécula de VWF madura mediante una enzima furina. En algunas realizaciones, la furina escinde D1D2 de D'D3 del VWF. En otras realizaciones, puede expresarse una secuencia de nucleótidos que codifica furina junto con la secuencia de nucleótidos que codifica un fragmento de VWF, de modo que puedan eliminarse por escisión los dominios D1D2 de forma intracelular mediante furina.

Un "conector procesable", como se usa en este documento, se refiere a un conector que comprende al menos un sitio de procesamiento intracelular, que se describe en otra parte de este documento.

Trastorno hemostático, como se usa en este documento, significa una afección hereditaria o adquirida caracterizada por una tendencia a hemorragia, espontáneamente o como resultado de traumatismo, debido a una capacidad alterada o incapacidad de formar un coágulo de fibrina. Ejemplos de dichos trastornos incluyen las hemofilias. Las tres formas principales son hemofilia A (deficiencia de factor VIII), hemofilia B (deficiencia de factor IX o "enfermedad de Christmas") y hemofilia C (deficiencia de factor XI, diátesis hemorrágica leve). Otros trastornos hemostáticos incluyen, por ejemplo, enfermedad de Von Willebrand, deficiencia de factor XI (deficiencia de PTA), deficiencia de factor XII, deficiencias o anomalías estructurales en el fibrinógeno, protrombina, factor V, factor VII, factor X o factor XIII, síndrome de Bernard-Soulier, que es un defecto o deficiencia en GPIb. GPIb, el receptor para VWF, puede ser defectuoso y dar lugar a la ausencia de formación del coágulo primario (hemostasis primaria) y diátesis hemorrágica aumentada), y trombastenia de Glanzman y Naegeli (trombastenia de Glanzmann). En insuficiencia hepática (formas aguda y crónica), hay producción insuficiente de factores de coagulación por parte del hígado; esto puede aumentar el riesgo de hemorragia.

Las moléculas quiméricas de la invención pueden usarse profilácticamente. Como se usa en este documento la expresión "tratamiento profiláctico" se refiere a la administración de una molécula antes de un episodio hemorrágico. En una realización, el sujeto que necesita un agente hemostático general se está sometiendo, o se va a someter, a cirugía. La proteína quimérica de la invención puede administrarse antes o después de cirugía de manera profiláctica. La proteína quimérica de la invención puede administrarse durante o después de cirugía para controlar un episodio hemorrágico agudo. La cirugía puede incluir, aunque sin limitación, trasplante de hígado, resección hepática, procedimientos dentales o trasplante de células madre.

La proteína quimérica de la invención también se usa para tratamiento a demanda. La expresión "tratamiento a demanda" se refiere a la administración de una molécula quimérica en respuesta a síntomas de un episodio hemorrágico o antes de una actividad que pueda provocar hemorragia. En un aspecto, el tratamiento a demanda puede administrarse a un sujeto cuando empieza la hemorragia, tal como después de una lesión, o cuando se espera hemorragia, tal como antes de cirugía. En otro aspecto, el tratamiento a demanda puede administrarse antes de actividades que aumenten el riesgo de hemorragia, tal como deportes de contacto.

Como se usa en este documento, la expresión "hemorragia aguda" se refiere a un episodio hemorrágico independientemente de la causa subyacente. Por ejemplo, un sujeto puede tener traumatismo, uremia, un trastorno hemorrágico hereditario (por ejemplo, deficiencia de factor VII), un trastorno de las plaquetas o resistencia debida al desarrollo de anticuerpos contra factores de coagulación.

Tratar, tratamiento, que trata, como se usan en este documento, se refieren a, por ejemplo, la reducción de la gravedad de una enfermedad o afección; la reducción de la duración del desarrollo de una enfermedad; la mejora de uno o más síntomas asociados con una enfermedad o afección; el aporte de efectos beneficiosos a un sujeto con una enfermedad o afección, sin curar necesariamente la enfermedad o afección, o la profilaxis de uno o más síntomas asociados con una enfermedad o afección. En una realización, el término "tratar" o "tratamiento" significa mantener un nivel mínimo de FVIII de al menos aproximadamente 1 IU/dL, 2 IU/dL, 3 IU/dL, 4 IU/dL, 5 IU/dL, 6 IU/dL, 7 IU/dL, 8 IU/dL, 9 IU/dL, 10 IU/dL, 11 IU/dL, 12 IU/dL, 13 IU/dL, 14 IU/dL, 15 IU/dL, 16 IU/dL, 17 IU/dL, 18 IU/dL, 19 IU/dL, o 20 IU/dL en un sujeto, administrando una proteína quimérica de la invención. En otra realización, tratar o tratamiento significa mantener un nivel mínimo de FVIII entre aproximadamente 1 y aproximadamente 20 UI/dl, aproximadamente 2 y aproximadamente 20 UI/dl, aproximadamente 3 y aproximadamente 20 UI/dl, aproximadamente 4 y aproximadamente 20 UI/dl, aproximadamente 5 y aproximadamente 20 UI/dl, aproximadamente 6 y aproximadamente 20 UI/dl, aproximadamente 7 y aproximadamente 20 UI/dl, aproximadamente 8 y aproximadamente 20 UI/dl, aproximadamente 9 y aproximadamente 20 UI/dl o aproximadamente 10 y aproximadamente 20 UI/dl. Tratamiento o tratar una enfermedad o afección también puede incluir mantener la actividad de FVIII en un sujeto a un nivel comparable a al menos aproximadamente un 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, o 20% de la actividad de FVIII en un sujeto no hemofílico. El nivel mínimo requerido para tratamiento puede medirse por uno o más métodos conocidos y puede ajustarse (aumentarse o disminuirse) para cada persona.

II. Proteínas quiméricas

La presente divulgación se refiere a prolongar la semivida de una proteína quimérica usando una proteína VWF fusionada a una secuencia de XTEN evitando o inhibiendo que un factor limitante de la semivida de FVIII, es decir, VWF endógeno, se asocie con la proteína FVIII. El VWF endógeno se asocia con aproximadamente un 95 % a aproximadamente un 98 % de FVIII en complejos no covalentes. Aunque el VWF endógeno es un factor limitante de la semivida de FVIII, también se sabe que el VWF endógeno unido a una proteína FVIII protege FVIII de diversas maneras. Por ejemplo, el VWF de longitud completa (como un multímero que tiene aproximadamente 250 kDa) puede proteger a FVIII de la escisión por proteasa y la activación de FVIII, estabilizar la cadena pesada y/o cadena ligera de FVIII, y evitar la eliminación de FVIII por receptores depuradores. Pero, al mismo tiempo, el VWF endógeno limita la semivida de FVIII evitando la pinocitosis y purgando el complejo de FVIII-VWF del sistema a través de la ruta de eliminación de VWF. Se cree, aunque sin limitarse a teoría alguna, que el VWF endógeno es un factor limitante de la semivida que evita que la semivida de una proteína quimérica fusionada a un prolongador de la semivida sea más larga de aproximadamente dos veces la de FVIII de tipo silvestre. Por lo tanto, la presente divulgación se refiere a prevenir o inhibir la interacción entre VWF endógeno y una proteína FVIII usando una proteína VWF que comprende un dominio D' y un dominio D3 (por ejemplo, un fragmento de VWF) y al mismo tiempo aumentar la semivida de una o más proteínas FVIII resultantes usando una secuencia de XTEN en combinación con una región constante de Ig o una parte de la misma. En particular, la presente invención muestra que una secuencia de XTEN más corta (es decir, XTEN que contiene menos de 288 aminoácidos de longitud, es decir, XTEN que es más corto que 288 aminoácidos) es mejor para prolongar la semivida de la proteína quimérica.

En una realización, la invención se refiere a una proteína quimérica como se describe en el sumario de la invención, en la que el segundo polipéptido, que comprende un fragmento de VWF que comprende un dominio D' y un dominio D3 de VWF fusionado a una segunda región Fc por una secuencia de XTEN entremedias, comprende una secuencia de XTEN que contiene menos de 288 residuos aminoacídicos y en la que el primer polipéptido se liga a o se asocia con el segundo polipéptido. En otras realizaciones, la proteína quimérica presenta una semivida más larga en comparación con una proteína de fusión correspondiente que comprende el primer polipéptido y el segundo polipéptido, en la que el segundo polipéptido comprende una secuencia de XTEN que contiene al menos 288 aminoácidos, por ejemplo, AE288, por ejemplo, SEQ ID NO: 8. En otras realizaciones más, la secuencia de XTEN en el segundo polipéptido contiene al menos 144 aminoácidos, pero menos de 288 aminoácidos.

La proteína quimérica de la invención puede comprender además una segunda secuencia de XTEN que liga la proteína FVIII con la primera región Fc.

En determinadas realizaciones, la invención se refiere a una proteína quimérica que comprende (i) un primer polipéptido que comprende una proteína FVIII fusionada a una primera región Fc y (ii) un segundo polipéptido que comprende un fragmento de VWF que comprende un dominio D' y un dominio D3 de VWF fusionado a una segunda región Fc por una primera secuencia de XTEN entremedias, en la que la secuencia de XTEN contiene menos de 288 residuos aminoacídicos y en la que el primer polipéptido se liga a o se asocia con el segundo polipéptido, y en la que el primer polipéptido comprende además una segunda secuencia de XTEN que se inserta en uno o más sitios de inserción dentro de la proteína FVIII.

La segunda y/o tercera secuencia de XTEN puede ser cualquier longitud de aminoácidos de XTEN. Por ejemplo, la segunda y/o tercera secuencia de XTEN se divulgan en otra parte de este documento, por ejemplo, AE42, AE72, AE864, AE576, AE288, AE144, AG864, AG576, AG288, y AG144, por ejemplo, SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 54; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 56; SEQ ID NO: 57; SEQ ID NO: 58; SEQ ID NO: 59; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 60; SEQ ID NO: 61; SEQ ID NO: 62; o SEQ ID NO: 63. En una realización particular, la segunda y/o tercera secuencia de XTEN es AE288 o AG288, por ejemplo, SEQ ID NO: 8 o 19.

En determinadas realizaciones, la proteína FVIII se fusiona a la primera región Fc mediante un conector opcional, en la que una secuencia de XTEN opcional (X2) se inserta en uno o más sitios de inserción dentro de la proteína FVIII o se fusiona a la proteína FVIII o a la primera región Fc de la misma, y (ii) un segundo polipéptido que comprende un fragmento de VWF que comprende un dominio D' y un dominio d 3 de VWF fusionado a una segunda región Fc mediante una secuencia de XTEN (X1) entre el fragmento de VWF y la segunda región Fc, en la que la secuencia de XTEN (X1) contiene menos de 288 residuos aminoacídicos y en la que el primer polipéptido y el segundo polipéptido se asocian. En algunas realizaciones, la proteína FVIII se fusiona a la primera región Fc mediante un conector opcional, en la que una secuencia de XTEN opcional (X2) se inserta en uno o más sitios de inserción dentro de la proteína FVIII o se fusiona a la proteína FVIII o a la primera región Fc, y (ii) el fragmento de VWF se fusiona a la segunda región Fc mediante una secuencia de XTEN (X1) entre el fragmento de VWF y la segunda región Fc, en la que la secuencia de XTEN (X1) contiene menos de 288 residuos aminoacídicos y se fusiona a la segunda región Fc mediante el conector escindible y en la que el primer polipéptido y el segundo polipéptido se asocian. En una realización particular, el conector escindible es un conector escindible por trombina.

En algunas realizaciones, la proteína quimérica de la invención es de dos cadenas polipeptídicas, comprendiendo la primera cadena el primer polipéptido descrito anteriormente y comprendiendo la segunda cadena el segundo polipéptido descrito anteriormente. Por ejemplo, las dos cadenas polipeptídicas comprenden (i) una primera cadena que comprende una proteína FVIII monocatenaria, una primera región Fc y una secuencia de XTEN que se inserta en uno o más sitios de inserción dentro de la proteína FVIII, y (ii) una segunda cadena que comprende el fragmento de VWF fusionado a la segunda región Fc mediante la secuencia de XTEN (X1) entremedias, en la que la secuencia de XTEN (X1) contiene menos de 288 aminoácidos.

En determinadas realizaciones, la proteína quimérica de la invención es de dos cadenas polipeptídicas, comprendiendo una primera cadena una cadena pesada de una proteína FVIII y comprendiendo una segunda cadena, del extremo N al extremo C, una cadena ligera de una proteína FVIII, la secuencia de XTEN que se inserta en uno o más sitios de inserción dentro de la proteína FVIII o se fusiona a la proteína FVIII o a la primera región Fc, y la primera región Fc, un conector opcional (por ejemplo, un conector procesable), el fragmento de VWF, la secuencia de XTEN (X1), el conector escindible y la segunda región Fc.

II.A. Proteínas de factor de Von Willebrand (VWF)

VWF (también conocido como F8VWF) es una glucoproteína multimérica grande presente en el plasma sanguíneo y producida de manera constitutiva en el endotelio (en los cuerpos de Weibel-Palade), los megacariocitos (gránulos-a de plaquetas) y el tejido conjuntivo subendotelial. El mónomero de VWF básico es una proteína de 2813 aminoácidos. Cada monómero contiene varios dominios específicos con una función específica, el dominio D'/D3 (que se une al factor VIII), el dominio A1 (que se une al receptor de GPIb plaquetario, heparina y/o posiblemente colágeno), el dominio A3 (que se une a colágeno), el dominio C1 (en que el dominio RGD se une a la integrina plaquetaria aIIbp3 cuando está activada) y el dominio de "nudo de cisterna" en el extremo C terminal de la proteína (que VWF comparte con el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), el factor-p de crecimiento transformante (TGFp) y la gonadotropina coriónica humana p (pHCG)).

En esta divulgación, la proteína VWF puede ser un fragmento de VWF. La expresión "un fragmento de VWF", como se usa en este documento, incluye, aunque sin limitación, fragmentos de VWF funcionales que comprenden un dominio D' y un dominio D3, que pueden inhibir la unión de VWF endógeno a FVIII. En una realización, el fragmento de VWF se une a la proteína FVIII. En otra realización, el fragmento de VWF bloquea el sitio de unión a VWF en la proteína FVIII, inhibiendo de ese modo la interacción de la proteína FVIII con VWF endógeno. Los fragmentos de VWF incluyen derivados, variantes, mutantes o análogos que retienen estas actividades de VWF.

La secuencia del monómero de 2813 aminoácidos para VWF humano se presenta como el número de acceso NP_000543.2 en Genbank. La secuencia de nucleótidos que codifica el VWF humano se presenta como el número de acceso NM_000552.3 en Genbank. Una secuencia de nucleótidos de VWF humano se denomina SEQ ID NO: 20. SEQ ID NO: 21 es la secuencia de aminoácidos de VWF de longitud completa. Cada dominio de VWF se enumera en la tabla 1.

Tabla 1. Secuencias de VWF

El fragmento de VWF como se usa en este documento comprende un dominio D' y un dominio D3 de VWF, en el que el fragmento de VWF se une al factor VIII (FVIII) e inhibe la unión de VWF endógeno (VWF de longitud completa) a FVIII. El fragmento de VWF que comprende el dominio D' y el dominio D3 puede comprender además un dominio de VWF seleccionado del grupo que consiste en un dominio A1, un dominio A2, un dominio A3, un dominio D1, un dominio D2, un dominio D4, un dominio B1, un dominio B2, un dominio B3, un dominio C1, un dominio C2, un dominio CK, uno o más fragmentos de los mismos y cualquier combinación de los mismos. En una realización, un fragmento de VWF comprende, consiste esencialmente en o consiste en: (1) los dominios D' y D3 de VWF o fragmentos de los mismos; (2) los dominios D1, D' y D3 de VWF o fragmentos de los mismos; (3) los dominios D2, D' y D3 de VWF o fragmentos de los mismos; (4) los dominios D1, D2, D' y D3 de VWF o fragmentos de los mismos; o (5) los dominios D1, D2, D', D3 y A1 de VWF o fragmentos de los mismos. El fragmento de VWF descrito en este documento no contiene un sitio de unión a un receptor de eliminación de VWF. El fragmento de VWF de la presente invención puede comprender cualquier otra secuencia ligada o fusionada al fragmento de VWF. Por ejemplo, un fragmento de VWF descrito en este documento puede comprender además un péptido señal.

En una realización, el fragmento de VWF que comprende un dominio D' y un dominio D3 se une a o se asocia con una proteína FVIII. Mediante la unión a o la asociación con una proteína FVIII, un fragmento de VWF de la invención protege a FVIII de la escisión por proteasa y la activación de FVIII, estabiliza la cadena pesada y la cadena ligera de FVIII, y evita la eliminación de FVIII por receptores depuradores. En otra realización, el fragmento de VWF se une a o se asocia con una proteína FVIII y bloquea o evita la unión de la proteína FVIII a fosfolípido y proteína C activada. Evitando o inhibiendo la unión de la proteína FVIII con VWF de longitud completa endógeno, el fragmento de VWF de la invención reduce la eliminación de FVIII mediante receptores de eliminación de VWF y, por tanto, prolonga la semivida de la proteína quimérica. La prolongación de la semivida de una proteína quimérica, por tanto, se debe a la unión de o la asociación con el fragmento de VWF que carece de un sitio de unión al receptor de eliminación de VWF de la proteína FVIII y el blindaje o protección de la proteína FVIII mediante el fragmento de VWF contra VWF endógeno, que contiene el sitio de unión al receptor de eliminación de VWF. La proteína FVIII unida a o protegida por el fragmento de VWF también puede permitir el reciclado de una proteína FVIII. Eliminando los sitios de unión al receptor de la ruta de eliminación de VWF contenidos en la molécula de VWF de longitud completa, los heterodímeros de FVIII/VWF de la invención se protegen contra la ruta de eliminación de VWF, prolongando más la semivida de FVIII.

Como se divulga en este documento, una proteína VWF puede comprender un dominio D' y un dominio D3 de VWF, en la que el dominio D' es al menos un 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% idéntico a los aminoácidos 764 a 866 de SEQ ID NO: 21, en la que la proteína VWF evita o inhibe la unión de VWF endógeno a FVIII. Una proteína VWF puede comprender el dominio D' y el dominio D3 de VWF, en la que el dominio D3 es al menos un 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% idéntico a los aminoácidos 867 a 1240 de SEQ ID NO: 21, en la que la proteína VWF evita o inhibe la unión de VWF endógeno a FVIII. Una proteína VWF divulgada en este documento puede comprender, consistir esencialmente en o consistir en el dominio D' y dominio D3 de VWF, que son al menos un 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% idénticos a los aminoácidos 764 a 1240 de SEQ ID NO: 21, en la que la proteína VWF evita o inhibe la unión de VWF endógeno a FVIII. Una proteína VWF puede comprender, consistir esencialmente en o consistir en los dominios D1, D2, D' y D3 al menos un 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% idénticos a los aminoácidos 23 a 1240 de SEQ ID NO: 21, en la que la proteína VWF evita o inhibe la unión de VWF endógeno a FVIII. Una proteína VWF puede comprender además un péptido señal unido de forma funcional a la misma.

En algunas realizaciones, un fragmento de VWF útil para la invención consiste esencialmente en o consiste en (1) el dominio D'D3, el dominio D1 D'D3, el dominio D2D'D3 o el dominio D1 D2D'D3 y (2) una secuencia de VWF adicional de hasta aproximadamente 10 aminoácidos (por ejemplo, cualquier secuencia de los aminoácidos 764 a 1240 de SEQ ID NO: 21 a los aminoácidos 764 a 1250 de SEQ ID NO: 21), hasta aproximadamente 15 aminoácidos (por ejemplo, cualquier secuencia de los aminoácidos 764 a 1240 de SEQ ID NO: 21 a los aminoácidos 764 a 1255 de SEQ ID NO: 21), hasta aproximadamente 20 aminoácidos (por ejemplo, cualquier secuencia de los aminoácidos 764 a 1240 de SEQ ID NO: 21 a los aminoácidos 764 a 1260 de SEQ ID NO: 21), hasta aproximadamente 25 aminoácidos (por ejemplo, cualquier secuencia de los aminoácidos 764 a 1240 de SEQ ID NO: 21 a los aminoácidos 764 a 1265 de SEQ ID NO: 21), o hasta aproximadamente 30 aminoácidos (por ejemplo, cualquier secuencia de los aminoácidos 764 a 1240 de SEQ ID NO: 21 a los aminoácidos 764 a 1260 de ^sE^qID ⁿO: 21). En una realización particular, el fragmento de VWF que comprende o consiste esencialmente en el dominio D' y el dominio D3 no es el VWF maduro de longitud completa. En algunas realizaciones, el dominio D1D2 se expresa en trans con el dominio D'D3. En algunas realizaciones, el dominio D1D2 se expresa en cis con el dominio D'D3.

En otras realizaciones, el fragmento de VWF que comprende los dominios D'D3 ligados a los dominios D1D2 comprende además un sitio de escisión intracelular, por ejemplo, (un sitio de escisión por PACE (furina) o PC5), que permite la escisión de los dominios D1D2 con respecto a los dominios D'D3 tras la expresión. Ejemplos no limitantes del sitio de escisión intracelular se divulgan en otra parte de este documento.

En otras realizaciones más, el fragmento de VWF comprende un dominio D' y un dominio D3, pero no comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (1) los aminoácidos 1241 a 2813 correspondientes a SEQ ID NO: 21, (2) los aminoácidos 1270 a 2813 correspondientes a SEQ ID NO: 21, (3) los aminoácidos 1271 a 2813 correspondientes a SEQ ID NO: 21, (4) los aminoácidos 1272 a 2813 correspondientes a SEQ ID NO: 21, (5) los aminoácidos 1273 a 2813 correspondientes a SEQ ID NO: 21, (6 ) los aminoácidos 1274 a 2813 correspondientes a SEQ ID NO: 21, y cualquier combinación de los mismos.

En algunas realizaciones, un fragmento de VWF de la invención comprende un dominio D' y un dominio D3, pero no comprende al menos un dominio de VWF seleccionado del grupo que consiste en (1) un dominio A1, (2) un dominio A2, (3) un dominio A3, (4) un dominio D4, (5) un dominio B1, (6 ) un dominio B2, (7) un dominio B3, (8 ) un dominio C1, (9) un dominio C2, (10) un dominio CK, (11) un dominio CK y un dominio C2, (12) un dominio CK, un dominio C2 y un dominio C1, (13) un dominio CK, un dominio C2, un dominio C1, un dominio B3, (14) un dominio CK, un dominio C2, un dominio C1, un dominio B3, un dominio B2, (15) un dominio CK, un dominio C2, un dominio C1, un dominio B3, un dominio B2 y un dominio B1, (16) un dominio CK, un dominio C2, un dominio C1, un dominio B3, un dominio B2, un dominio B1 y un dominio D4, (17) un dominio CK, un dominio C2, un dominio C1, un dominio B3, un dominio B2, un dominio B1, un dominio D4 y un dominio A3, (18) un dominio CK, un dominio C2, un dominio C1, un dominio B3, un dominio B2, un dominio B1, un dominio D4, un dominio A3 y un dominio A2, (19) un dominio CK, un dominio C2, un dominio C1, un dominio B3, un dominio B2, un dominio B1, un dominio D4, un dominio A3, un dominio A2 y un dominio A1, y (20) cualquier combinación de los mismos.

En otras realizaciones más, el fragmento de VWF comprende los dominios D'D3 y uno o más dominios o módulos. Ejemplos de dichos dominios o módulos incluyen, aunque sin limitación, los dominios y módulos divulgados en Zhour etal., Blood publicado en línea el 6 de abril 2012: DOI 10.1182/blood-2012-01 -405134. Por ejemplo, el fragmento de VWF puede comprender el dominio D'D3 y uno o más dominios o módulos seleccionados del grupo que consiste en dominio A1, dominio A2, dominio A3, módulo D4N, módulo VWD4, módulo C8-4, módulo TIL-4, módulo C1, módulo C2, módulo C3, módulo C4, módulo C5, módulo C5, módulo C6 y cualquier combinación de los mismos.

En otras realizaciones más, el fragmento de VWF se liga a un resto heterólogo, en el que el resto heterólogo se liga al extremo N o el extremo C del fragmento de VWF. El resto heterólogo puede ser un prolongador de la semivida.

En determinadas realizaciones, el fragmento de VWF es un monómero que tiene solamente un fragmento de VWF. En algunas realizaciones, el fragmento de VWF de la presente invención puede tener una o más sustituciones aminoacídicas, eliminaciones, adiciones o modificaciones. En una realización, el fragmento de VWF puede incluir sustituciones aminoacídicas, eliminaciones, adiciones o modificaciones de modo que el fragmento de VWF no pueda formar un enlace disulfuro o formar un dímero o un multímero. En otra realización, la sustitución aminoacídica es dentro del dominio D' y el dominio D3. En una realización particular, un fragmento de VWF útil para la invención contiene al menos una sustitución aminoacídica en un residuo correspondiente al residuo 1099, residuo 1142 o ambos residuos 1099 y 1142 correspondientes a SEQ ID NO: 21. La al menos una sustitución aminoacídica puede ser cualquier aminoácido que no sea de origen natural en el VWF de tipo silvestre. Por ejemplo, la sustitución aminoacídica puede ser cualquier aminoácido distinto de cisteína, por ejemplo, isoleucina, alanina, leucina, asparagina, lisina, ácido aspártico, metionina, fenilalanina, ácido glutámico, treonina, glutamina, triptófano, glicina, valina, prolina, serina, tirosina, arginina o histidina. En una realización particular, el fragmento de VWF contiene un residuo de alanina sustituido en los residuos correspondientes a los residuos 1099 y 1142 de SEQ ID NO: 21. En otro ejemplo, la sustitución aminoacídica tiene uno o más aminoácidos que evitan o inhiben que los fragmentos de VWF formen multímeros.

En determinadas realizaciones, el fragmento de VWF útil en este documento puede modificarse además para mejorar su interacción con FVIII, por ejemplo, para mejorar la afinidad de unión a FVIII. Como ejemplo no limitante, el fragmento de VWF comprende un residuo de serina en el residuo correspondiente al aminoácido 764 de SEQ ID NO: 21 y un residuo de lisina en el residuo correspondiente al aminoácido 773 de SEQ ID NO: 21. Los residuos 764 y/o 773 pueden contribuir a la afinidad de unión de los fragmentos de VWF a FVIII. En otras realizaciones, los fragmentos de VWF útiles para la invención pueden tener otras modificaciones, por ejemplo, la proteína puede pegilarse, glucosilarse, hesilarse o polisialilarse.

II. B. Secuencias de XTEN

Como se usa en este documento "secuencia de XTEN" se refiere a polipéptidos de longitud ampliada con secuencias que no son de origen natural, sustancialmente no repetitivas que están compuestas principalmente de pequeños aminoácidos hidrófilos, teniendo la secuencia un bajo grado o nada de estructura secundaria o terciaria en condiciones fisiológicas. Como compañero de la proteína, los XTEN pueden servir como vehículo, que confiere determinadas propiedades farmacocinéticas, fisicoquímicas y farmacéuticas deseables cuando se ligan a un fragmento de VWF o una secuencia de FVIII de la invención para crear una proteína quimérica. Dichas propiedades deseables incluyen, aunque sin limitación, parámetros farmacocinéticos y características de solubilidad potenciados. Como se usa en este documento, "XTEN" excluye específicamente anticuerpos o fragmentos de anticuerpo tales como anticuerpos monocatenarios o fragmentos Fc de una cadena ligera o una cadena pesada.

La presente invención proporciona que una secuencia de XTEN más corta proporciona una propiedad prolongadora de la semivida mejorada en comparación con una secuencia de XTEN más larga cuando la secuencia de XTEN se fusiona al fragmento de VWF y/o la segunda región Fc. Por lo tanto, la secuencia de XTEN fusionada al fragmento de VWF y/o la segunda región Fc contiene menos de 288 aminoácidos de longitud, es decir, es más corta que 288 aminoácidos. En otra realización, la secuencia de XTEN fusionada a la proteína VWF y/o la segunda región Fc comprende al menos 144 aminoácidos, pero menos de 288 aminoácidos. En otras realizaciones, la secuencia de XTEN se fusiona a un fragmento de VWF y/o la segunda región Fc. La proteína quimérica de la invención puede comprender además una (segunda, tercera o más) secuencia de XTEN adicional. La secuencia de XTEN adicional puede fusionarse además a la proteína FVIII o la primera región Fc. Las secuencias de XTEN adicionales pueden ser de cualquier longitud. Por ejemplo, la secuencia de XTEN adicional fusionada a la proteína FVIII o la primera región Fc es un péptido o un polipéptido que tiene más de aproximadamente 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800, o 2000 residuos aminoacídicos. En determinadas realizaciones, la secuencia de XTEN adicional es un péptido o un polipéptido que tiene más de aproximadamente 20 a aproximadamente 3000 residuos aminoacídicos, más de aproximadamente 30 a aproximadamente 2500 residuos, más de aproximadamente 40 a aproximadamente 2000 residuos, más de aproximadamente 50 a aproximadamente 1500 residuos, más de aproximadamente 60 a aproximadamente 1000 residuos, más de aproximadamente 70 a aproximadamente 900 residuos, más de aproximadamente 80 a aproximadamente 800 residuos, más de aproximadamente 90 a aproximadamente 700 residuos, más de aproximadamente 100 a aproximadamente 600 residuos, más de aproximadamente 110 a aproximadamente 500 residuos o más de aproximadamente 120 a aproximadamente 400 residuos.

Las secuencias de XTEN pueden comprender uno o más motivos de secuencia de 9 a 14 residuos aminoacídicos o una secuencia de aminoácidos al menos un 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% idéntica al motivo de secuencia, en la que el motivo comprende, consiste esencialmente en o consiste en 4 a 6 tipos de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en glicina (G), alanina (A), serina (S), treonina (T), glutamato (E) y prolina (P). Véase el documento u S 2010-0239554 A1.

La secuencia de XTEN puede comprender motivos de secuencia no solapantes en que al menos aproximadamente un 80 %, o al menos aproximadamente un 85 %, o al menos aproximadamente un 90 %, o al menos aproximadamente un 91 %, o al menos aproximadamente un 92 %, o al menos aproximadamente un 93 %, o al menos aproximadamente un 94 %, o al menos aproximadamente un 95 %, o al menos aproximadamente un 96 %, o al menos aproximadamente un 97 %, o al menos aproximadamente un 98 %, o al menos aproximadamente un 99 % o aproximadamente un 100 % de la secuencia consiste en múltiples unidades de secuencias no solapantes seleccionadas de una sola familia de motivos seleccionada de la tabla 2A, produciendo una secuencia de la familia. Como se usa en este documento, "familia" significa que el XTEN tiene motivos seleccionados solamente de una sola categoría de motivos de la tabla 2A; es decir, XTEN AD, AE, AF, AG, AM, AQ, BC o BD, y que cualquier otro aminoácido en el XTEN que no sea de un motivo de la familia se selecciona para conseguir una propiedad necesaria, tal como para permitir la incorporación de un sitio de restricción mediante los nucleótidos codificantes, la incorporación de una secuencia de escisión o para conseguir una mejor unión a FVIII o VWF. En las familias de XTEN, una secuencia de XTEN puede comprender múltiples unidades de motivos de secuencia no solapantes de la familia del motivo AD, o de la familia del motivo AE, o de la familia del motivo AF, o de la familia del motivo AG, o de la familia del motivo AM, o de la familia del motivo AQ, o de la familia BC, o de la familia BD, presentando el XTEN resultante el intervalo de homología descrito anteriormente. El XTEN puede comprender múltiples unidades de secuencias de motivo de dos o más de las familias de motivos de la tabla 2A. Estas secuencias pueden seleccionarse para conseguir características físicas/químicas deseadas, incluyendo propiedades tales como carga neta, hidrofilia, ausencia de estructura secundaria o ausencia de repetitividad, que las confiere la composición de aminoácidos de los motivos, descritos más completamente a continuación. Los motivos incorporados en el XTEN pueden seleccionarse y ensamblarse usando los métodos descritos en este documento para conseguir un XTEN de aproximadamente 36 a aproximadamente 3000 residuos aminoacídicos.

Tabla 2A. Motivos de secuencia de XTEN de 12 aminoácidos y familias de motivos

En esta divulgación, una secuencia de XTEN puede ser al menos un 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en AE42, AG42 AE48 AM48 AE72 AG72 AE108 AG108 AE144 AF144 AG144 AE180 AG180 AE216 AG216 AE252

AG1716, AG1812, AG1908, y AG2004. Véase el documento US 2010-0239554 A1.

En esta divulgación, una secuencia de XTEN puede ser al menos un 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en AE42 (SEQ ID NO: 9), AE72 (SEQ ID NO: 10), AE144 2A (SEQ IDNO: 55), AE144_3B (SEQ ID NO: 56), AE1444A (SEQ ID NO: 57), AE144_5A (SEQ ID NO: 58), AE144_6B (SEQ ID NO: 59), AG144_A (SEQ ID NO: 60), AG144 B (SEQ ID NO: 61), AG144_C (SEQ ID NO: 62), AG144 F (SEQ IDNO: 63), AE864 (SEQ ID NO: 15), AE576 (SEQ ID NO: 16), AE288 (SEQ ID NO: 8), AE2882 (SEQ ID NO: 54), AE144 (SEQ ID NO: 11), AG864 (SEQ ID NO: 17), AG576 (SEQ ID NO:

18), AG288 (SEQ ID NO: 19), AG144 (SEQ ID NO: 14), y cualquier combinación de las mismas. Una secuencia de XTEN puede seleccionarse del grupo que consiste en AE42 (SeQ ID NO: 9), AE72 (SEQ ID NO: 10), AE1442A (SEQ ID NO: 55), AE144_3B (SEQ ID NO: 56), AE1444A (SEQ ID NO: 57), AE1445A (SEQ ID NO: 58), AE144_6B (SEQ ID NO: 59), AG144_A (SEQ ID NO: 60), AG144_B (SEQ ID NO: 61), AG144_C (SEQ ID NO: 62), AG144_F (SEQ IDNO: 63), AE864 (SEQ ID NO: 15), AE576 (SEQ ID NO: 16), AE288 (SEQ ID NO: 8), AE288 2 (SEQ ID NO: 54), AE144 (SEQ ID NO: 11), AG864 (SEQ ID NO: 17), AG576 (SEQ ID NO: 18), AG288 (SEQ ID NO: 19), AG144 (SEQ ID NO: 14), y cualquier combinación de las mismas. Específicamente, una secuencia de XTEN puede ser AE288. Las secuencias de aminoácidos para determinadas secuencias de XTEN se muestran en la tabla 2B.

Tabla 2B. Secuencias de XTEN

Donde uno o más componentes del XTEN divulgados en este documento tienen menos de un 100 % de sus aminoácidos que consisten en 4, 5 o 6 tipos de aminoácido seleccionados de glicina (G), alanina (A), serina (S), treonina (T), glutamato (E) y prolina (P), o menos de un 100 % de la secuencia que consiste en los motivos de secuencia de la tabla 3 o las secuencias de XTEN de las tablas 4 y 13-17, los otros residuos aminoacídicos del XTEN se seleccionan de cualquiera de los otros 14 L-aminoácidos naturales, pero se seleccionan preferentemente de aminoácidos hidrófilos, de modo que la secuencia de XTEN contiene al menos aproximadamente un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o al menos aproximadamente un 99 % de aminoácidos hidrófilos. Los aminoácidos de XTEN que no son glicina (G), alanina (A), serina (S), treonina (T), glutamato (E) y prolina (P) se intercalan por toda la secuencia de XTEN, se localizan dentro o entre los motivos de secuencia, o se concentran en uno o más tramos cortos de la secuencia de XTEN, por ejemplo, para crear un conector entre los componentes de XTEN y de FVIII o VWF. En dichos casos donde el componente de XTEN comprende aminoácidos distintos de glicina (G), alanina (A), serina (S), treonina (T), glutamato (E) y prolina (P), se prefiere que menos de aproximadamente un 2 % o menos de aproximadamente un 1 % de los aminoácidos sean residuos hidrófobos, de modo que las secuencias resultantes en general carezcan de estructura secundaria, por ejemplo, que no tienen más de un 2 % de hélices alfa o un 2 % de láminas beta, como se determina por los métodos divulgados en este documento. Los residuos hidrófobos que están menos favorecidos en la construcción de XTEN incluyen triptófano, fenilalanina, tirosina, leucina, isoleucina, valina y metionina. Además, se pueden diseñar las secuencias de XTEN para que contengan menos de un 5 % o menos de un 4 % o menos de un 3 % o menos de un 2 % o menos de un 1 % o nada de los siguientes aminoácidos: cisteína (para evitar la formación de disulfuro y la oxidación), metionina (para evitar la oxidación), asparagina y glutamina (para evitar la desamidación). Por tanto, el componente de XTEN que comprende otros aminoácidos además de glicina (G), alanina (A), serina (S), treonina (T), glutamato (E) y prolina (P) puede tener una secuencia con menos de un 5 % de los residuos que contribuyen a las hélices alfa y las láminas beta como se mide por el algoritmo de Chou-Fasman y tener al menos un 90 %, o al menos aproximadamente un 95 % o más de formación de enrollamiento aleatorio como se mide por el algoritmo GOR.

En otras realizaciones, la secuencia de XTEN usada en la invención afecta a la propiedad física o química, por ejemplo, farmacocinética, de la proteína quimérica de la presente invención. La secuencia de XTEN usada en la presente invención puede presentar una o más de las siguientes propiedades ventajosas: flexibilidad conformacional, solubilidad acuosa potenciada, alto grado de resistencia a proteasa, baja inmunogenia, baja unión a receptores de mamífero, o radios hidrodinámicos (o de Stokes) aumentados. En una realización específica, la secuencia de XTEN ligada a una proteína FVIII en esta invención aumenta las propiedades farmacocinéticas tales como semivida terminal más larga o área bajo la curva (ABC) aumentada, de modo que la proteína quimérica descrita en este documento permanece in vivo durante un periodo aumentado de tiempo en comparación con FVIII de tipo silvestre. En otras realizaciones, la secuencia de XTEN usada en esta invención aumenta las propiedades farmacocinéticas tales como semivida terminal más larga o área bajo la curva (ABC) aumentada, de modo que la proteína FVIII permanece in vivo durante un periodo aumentado de tiempo en comparación con FVIII de tipo silvestre.

En este documento se divulga una proteína de fusión de FVIII/VWF que comprende una parte de FVIII fusionada a una región Fc y una parte de VWF fusionada a una región Fc, en la que se inserta una secuencia de XTEN (por ejemplo, AE288) dentro de la parte de FVIII, y en la que se inserta una secuencia de XTEN que tiene menos de 288 aminoácidos (por ejemplo, AE144) entre la parte de VWF y la parte de Fc. Como se describe en los ejemplos, la inserción de un XTEN que tiene menos de 288 aminoácidos entre la parte de VWF y la parte de Fc tiene un mayor efecto sobre la farmacocinética de la proteína quimérica que la inserción de un XTEN que tiene 288 aminoácidos entre la parte de VWF y la parte de Fc. Por ejemplo, la inserción de una secuencia de XTEN que tiene menos de 288 aminoácidos entre la parte de VWF y la parte de Fc en la proteína de fusión de FVIII/VWF puede aumentar la semivida terminal de la proteína quimérica en comparación con un XTEN que tiene 288 aminoácidos. En algunas realizaciones, la semivida terminal aumenta en al menos aproximadamente un 5 %, al menos aproximadamente un 10 %, al menos aproximadamente un 15 %, al menos aproximadamente un 20 %, al menos aproximadamente un 25 % o al menos aproximadamente un 30 %, con respecto a la inserción de una secuencia de XTEN que tiene 288 aminoácidos. En una realización particular, la semivida terminal aumenta en al menos aproximadamente un 35 % con respecto a la inserción de un XTEN que tiene 288 aminoácidos. La inserción de una secuencia de XTEN que tiene menos de 288 aminoácidos también puede aumentar el valor de ABC de la proteína quimérica. En algunas realizaciones, la ABC aumenta en al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 100 % o al menos aproximadamente un 200 % con respecto a la inserción de un XTEN que tiene 288 aminoácidos. En una realización particular, la ABC aumenta en aproximadamente dos veces. La inserción de una secuencia de XTEN que tiene menos de 288 aminoácidos también puede reducir la eliminación de la proteína quimérica. Por ejemplo, la eliminación puede disminuirse en al menos aproximadamente un 5 %, al menos aproximadamente un 10 %, al menos aproximadamente un 15 %, al menos aproximadamente un 20 %, al menos aproximadamente un 25 % o al menos aproximadamente un 30 %, con respecto a la inserción de una secuencia de XTEN que tiene 288 aminoácidos. La inserción de una secuencia de XTEN que tiene menos de 288 aminoácidos puede aumentar el tiempo medio de residencia (MRT) y/o disminuir el volumen aparente de distribución en estado de equilibrio (Vss) con respecto a la inserción de un XTEN que tiene 288 aminoácidos.

Puede emplearse una diversidad de métodos y ensayos para determinar las propiedades físicas/químicas de proteínas que comprenden la secuencia de XTEN. Dichos métodos incluyen, aunque sin limitación, centrifugación analítica, EPR, HPLC-intercambio iónico, HPLC-exclusión por tamaño, HPLC-fase inversa, dispersión de luz, electroforesis capilar, dicroísmo circular, calorimetría diferencial de barrido, fluorescencia, HPLC-intercambio iónico, HPLC-exclusión por tamaño, IR, RMN, espectroscopia de Raman, refractometría y espectroscopia UV/visible. Se divulgan métodos adicionales en Amau etal., Prot Expr and Purif 48, 1-13 (2006).

Ejemplos adicionales de secuencias de XTEN se divulgan en las publicaciones de patente de Estados Unidos n.° 2010/0239554 A 1,2010/0323956 A 1,2011/0046060 A 1,2011/0046061 A 1,2011/0077199 A1 o 2011/0172146 A1, o las publicaciones de patente internacional n.° WO 2010091122 A1, WO 2010144502 A2, WO 2010144508 A1, WO 2011028228 A1, WO 2011028229 A1, WO 2011028344 A2 o WO 20130122617 A1.

II.C. Proteína de factor VIII (FVIII)

"Una proteína FVIII", como se usa en este documento, significa un polipéptido FVIII funcional en su función normal en coagulación, salvo que se indique de otro modo. La expresión una proteína FVIII incluye un fragmento funcional, variante, análogo o derivado del mismo que retiene la función del factor VIII de tipo silvestre de longitud completa en la ruta de coagulación. "Una proteína FVIII" se usa indistintamente con polipéptido (o proteína) de FVIII o FVIII. Ejemplos de las funciones de FVIII incluyen, aunque sin limitación, una capacidad de activar la coagulación, una capacidad de actuar como cofactor para el factor IX, o una capacidad para formar un complejo de tenasa con factor IX en presencia de Ca2+ y fosfolípidos, que entonces convierte el factor X en la forma activada Xa. La proteína FVIII puede ser la proteína FVIII humana, porcina, canina, de rata o murina. Además, comparaciones entre FVIII de seres humanos y otras especies han identificado residuos conservados que probablemente se requieren para la función (Cameron et al., Thromb. Haemost. 79:317-22 (1998); documento ^uS 6.251.632).

Están disponibles varios ensayos para evaluar la función del sistema de coagulación: ensayos de tiempo de tromboplastina parcial activada (aPTT), ensayo cromogénico, ensayo de ROTEM, ensayo de tiempo de protrombina (PT) (también usado para determinar INR), ensayo de fibrinógeno (a menudo mediante el método de Clauss), recuento de plaquetas, ensayo de función plaquetaria (a menudo mediante PFA-100), TCT, tiempo de hemorragia, ensayo de mezcla (donde se corrige una anomalía si el plasma del paciente se mezcla con plasma normal), ensayos de factor de coagulación, anticuerpos antifosfolípido, dímero D, ensayos genéticos (por ejemplo, factor V Leiden, mutación de protrombina G20210A), tiempo de dilución de veneno de víbora de Russell (dRVVT), ensayos variados de función plaquetaria, tromboelastografía (TEG o Sonoclot), tromboelastometría (TEM®, por ejemplo, ROTEM®) o tiempo de lisis de euglobulina (ELT).

El ensayo de aPTT es un indicador de funcionamiento que mide la eficacia tanto de la ruta de coagulación "intrínseca" (también denominada ruta de activación por contacto) como de la común. Este ensayo se usa normalmente para medir la actividad de coagulación de factores de coagulación recombinantes disponibles en el mercado, por ejemplo, FVIII o FIX. Se usa junto con el tiempo de protrombina (PT), que mide la ruta extrínseca.

El análisis ROTEM proporciona información sobre la cinética global de la hemostasis: tiempo de coagulación, formación del coágulo, estabilidad del coágulo y lisis. Los diferentes parámetros en tromboelastometría dependen de la actividad del sistema de coagulación plasmático, la función plaquetaria, la fibrinólisis o muchos factores que influye en estas interacciones. Este ensayo puede proporcionar una visión completa de la hemostasis secundaria.

Las secuencias polipeptídicas y polinucleotídicas de FVIII son conocidas, como lo son muchos fragmentos funcionales, mutantes y versiones modificadas. Ejemplos de secuencias de FVIII humanas (de longitud completa) se muestran a continuación.

Tabla 3. Secuencia de aminoácidos de factor VIII de longitud completa (FVIII de longitud completa (péptido señal de FVIII subrayado; cadena pesada de FVIII con doble subra ado dominio B en cursiva cadena li era de FVIII en texto sin formato

Tabla 4. Secuencia de nucleótidos que codifica FVIII de longitud completa (SEQ ID NO: 66)*

661 ATG CAAATAGAGC TCTCCACCTG 721 CTTCTTTCTG TGCCTTTTGC GATTCTGCTT TAGTGCCACC AGAAGATACT ACCTGGGTGC 781 AGTGGAACTG TCATGGGACT ATATGCAAAG TGATCTCGGT GAGCTGCCTG TGGACGCAAG 841 ATTTCCTCCT AGAGTGCCAA AATCTTTTCC ATTCAACACC TCAGTCGTGT ACAAAAAGAC 901 TCTGTTTGTA GAATTCACGG ATCACCTTTT CAACATCGCT AAGCCAAGGC CACCCTGGAT 961 GGGTCTGCTA GGTCCTACCA TCCAGGCTGA GGTTTATGAT ACAGTGGTCA TTACACTTAA 1021 GAACATGGCT TCCCATCCTG TCAGTCTTCA TGCTGTTGGT GTATCCTACT GGAAAGCTTC 1081 TGAGGGAGCT GAATATGATG ATCAGACCAG TCAAAGGGAG AAAGAAGATG ATAAAGTCTT 1141 CCCTGGTGGA AGCCATACAT ATGTCTGGCA GGTCCTGAAA GAGAATGGTC CAATGGCCTC 1201 TGACCCACTG TGCCTTACCT ACTCATATCT TTCTCATGTG GACCTGGTAA AAGACTTGAA 1261 TTCAGGCCTC ATTGGAGCCC TACTAGTATG TAGAGAAGGG AGTCTGGCCA AGGAAAAGAC 1321 ACAGACCTTG CACAAATTTA TACTACTTTT TGCTGTATTT GATGAAGGGA AAAGTTGGCA 1381 CTCAGAAACA AAGAACTCCT TGATGCAGGA TAGGGATGCT GCATCTGCTC GGGCCTGGCC 1441 TAAAATGCAC ACAGTCAATG GTTATGTAAA CAGGTCTCTG CCAGGTCTGA TTGGATGCCA 1501 CAGGAAATCA GTCTATTGGC ATGTGATTGG AATGGGCACC ACTCCTGAAG TGCACTCAAT 1561 ATTCCTCGAA GGTCACACAT TTCTTGTGAG GAACCATCGC CAGGCGTCCT TGGAAATCTC 1621 GCCAATAACT TTCCTTACTG CTCAAACACT CTTGATGGAC CTTGGACAGT TTCTACTGTT 1681 TTGTCATATC TCTTCCCACC AACATGATGG CATGGAAGCT TATGTCAAAG TAGACAGCTG 1741 TCCAGAGGAA CCCCAACTAC GAATGAAAAA TAATGAAGAA GCGGAAGACT ATGATGATGA 1801 TCTTACTGAT TCTGAAATGG ATGTGGTCAG GTTTGATGAT GACAACTCTC CTTCCTTTAT 1861 CCAAATTCGC TCAGTTGCCA AGAAGCATCC TAAAACTTGG GTACATTACA TTGCTGCTGA 1921 AGAGGAGGAC TGGGACTATG CTCCCTTAGT CCTCGCCCCC GATGACAGAA GTTATAAAAG 1981 TCAATATTTG AACAATGGCC CTCAGCGGAT TGGTAGGAAG TACAAAAAAG TCCGATTTAT 2041 GGCATACACA GATGAAACCT TTAAGACTCG TGAAGCTATT CAGCATGAAT CAGGAATCTT 2101 GGGACCTTTA CTTTATGGGG AAGTTGGAGA CACACTGTTG ATTATATTTA AGAATCAAGC 2161 AAGCAGACCA TATAACATCT ACCCTCACGG AATCACTGAT GTCCGTCCTT TGTATTCAAG 2221 GAGATTACCA AAAGGTGTAA AACATTTGAA GGATTTTCCA ATTCTGCCAG GAGAAATATT 2281 CAAATATAAA TGGACAGTGA CTGTAGAAGA TGGGCCAACT AAATCAGATC CTCGGTGCCT 2341 GACCCGCTAT TACTCTAGTT TCGTTAATAT GGAGAGAGAT CTAGCTTCAG GACTCATTGG 2401 CCCTCTCCTC ATCTGCTACA AAGAATCTGT AGATCAAAGA GGAAACCAGA TAATGTCAGA 2461 CAAGAGGAAT GTCATCCTGT TTTCTGTATT TGATGAGAAC CGAAGCTGGT ACCTCACAGA 2521 GAATATACAA CGCTTTCTCC CCAATCCAGC TGGAGTGCAG CTTGAGGATC CAGAGTTCCA 2581 AGCCTCCAAC ATCATGCACA GCATCAATGG CTATGTTTTT GATAGTTTGC AGTTGTCAGT 2641 TTGTTTGCAT GAGGTGGCAT ACTGGTACAT TCTAAGCATT GGAGCACAGA CTGACTTCCT 2701 TTCTGTCTTC TTCTCTGGAT ATACCTTCAA ACACAAAATG GTCTATGAAG ACACACTCAC 2761 CCTATTCCCA TTCTCAGGAG AAACTGTCTT CATGTCGATG GAAAACCCAG GTCTATGGAT 2821 TCTGGGGTGC CACAACTCAG ACTTTCGGAA CAGAGGCATG ACCGCCTTAC TGAAGGTTTC 2881 TAGTTGTGAC AAGAACACTG GTGATTATTA CGAGGACAGT TATGAAGATA TTTCAGCATA 2941 CTTGCTGAGT AAAAACAATG CCATTGAACC AAGAAGCTTC TCCCAGAATT CAAGACACCC 3001 TAGCACTAGG CAAAAGCAAT TTAATGCCAC CACAATTCCA GAAAATGACA TAGAGAAGAC 3061 TGACCCTTGG TTTGCACACA GAACACCTAT GCCTAAAATA CAAAATGTCT CCTCTAGTGA 3121 TTTGTTGATG CTCTTGCGAC AGAGTCCTAC TCCACATGGG CTATCCTTAT CTGATCTCCA 3181 AGAAGCCAAA TATGAGACTT TTTCTGATGA TCCATCACCT GGAGCAATAG ACAGTAATAA 3241 CAGCCTGTCT GAAATGACAC ACTTCAGGCC ACAGCTCCAT CACAGTGGGG ACATGGTATT 3301 TACCCCTGAG TCAGGCCTCC AATTAAGATT AAATGAGAAA CTGGGGACAA CTGCAGCAAC 3361 AGAGTTGAAG AAACTTGATT TCAAAGTTTC TAGTACATCA AATAATCTGA TTTCAACAAT 3421 TCCATCAGAC AATTTGGCAG CAGGTACTGA TAATACAAGT TCCTTAGGAC CCCCAAGTAT 3481 GCCAGTTCAT TATGATAGTC AATTAGATAC CACTCTATTT GGCAAAAAGT CATCTCCCCT 3541 TACTGAGTCT GGTGGACCTC TGAGCTTGAG TGAAGAAAAT AATGATTCAA AGTTGTTAGA 3601 ATCAGGTTTA ATGAATAGCC AAGAAAGTTC ATGGGGAAAA AATGTATCGT CAACAGAGAG 3661 TGGTAGGTTA TTTAAAGGGA AAAGAGCTCA TGGACCTGCT TTGTTGACTA AAGATAATGC 3721 CTTATTCAAA GTTAGCATCT CTTTGTTAAA GACAAACAAA ACTTCCAATA ATTCAGCAAC 3781 TAATAGAAAG ACTCACATTG ATGGCCCATC ATTATTAATT GAGAATAGTC CATCAGTCTG 3841 GCAAAATATA TTAGAAAGTG ACACTGAGTT TAAAAAAGTG ACACCTTTGA TTCATGACAG 3901 AATGCTTATG GACAAAAATG CTACAGCTTT GAGGCTAAAT CATATGTCAA ATAAAACTAC 3961 TTCATCAAAA AACATGGAAA TGGTCCAACA GAAAAAAGAG GGCCCCATTC CACCAGATGC 4021 ACAAAATCCA GATATGTCGT TCTTTAAGAT GCTATTCTTG CCAGAATCAG CAAGGTGGAT 4081 ACAAAGGACT CATGGAAAGA ACTCTCTGAA CTCTGGGCAA GGCCCCAGTC CAAAGCAATT 4141 AGTATCCTTA GGACCAGAAA AATCTGTGGA AGGTCAGAAT TTCTTGTCTG AGAAAAACAA 4201 AGTGGTAGTA GGAAAGGGTG AATTTACAAA GGACGTAGGA CTCAAAGAGA TGGTTTTTCC 4261 AAGCAGCAGA AACCTATTTC TTACTAACTT GGATAATTTA CATGAAAATA ATACACACAA 4321 TCAAGAAAAA AAAATTCAGG AAGAAATAGA AAAGAAGGAA ACATTAATCC AAGAGAATGT 4381 AGTTTTGCCT CAGATACATA CAGTGACTGG CACTAAGAAT TTCATGAAGA ACCTTTTCTT 4441 ACTGAGCACT AGGCAAAATG TAGAAGGTTC ATATGACGGG GCATATGCTC CAGTACTTCA 4501 AGATTTTAGG TCATTAAATG ATTCAACAAA TAGAACAAAG AAACACACAG CTCATTTCTC 4561 AAAAAAAGGG GAGGAAGAAA ACTTGGAAGG CTTGGGAAAT CAAACCAAGC AAATTGTAGA 4621 GAAATATGCA TGCACCACAA GGATATCTCC TAATACAAGC CAGCAGAATT TTGTCACGCA 4681 ACGTAGTAAG AGAGCTTTGA AACAATTCAG ACTCCCACTA GAAGAAACAG AACTTGAAAA 4741 AAGGATAATT GTGGATGACA CCTCAACCCA GTGGTCCAAA AACATGAAAC ATTTGACCCC 4801 GAGCACCCTC ACACAGATAG ACTACAATGA GAAGGAGAAA GGGGCCATTA CTCAGTCTCC 4861 CTTATCAGAT TGCCTTACGA GGAGTCATAG CATCCCTCAA GCAAATAGAT CTCCATTACC 4921 CATTGCAAAG GTATCATCAT TTCCATCTAT TAGACCTATA TATCTGACCA GGGTCCTATT 4981 CCAAGACAAC TCTTCTCATC TTCCAGCAGC ATCTTATAGA AAGAAAGATT CTGGGGTCCA 5041 AGAAAGCAGT CATTTCTTAC AAGGAGCCAA AAAAAATAAC CTTTCTTTAG CCATTCTAAC 5101 CTTGGAGATG ACTGGTGATC AAAGAGAGGT TGGCTCCCTG GGGACAAGTG CCACAAATTC 5161 AGTCACATAC AAGAAAGTTG AGAACACTGT TCTCCCGAAA CCAGACTTGC CCAAAACATC

5221 TGGCAAAGTT GAATTGCTTC CAAAAGTTCA CATTTATCAG AAGGACCTAT TCCCTACGGA

5281 AACTAGCAAT GGGTCTCCTG GCCATCTGGA TCTCGTGGAA GGGAGCCTTC TTCAGGGAAC

5341 AGAGGGAGCG ATTAAGTGGA ATGAAGCAAA CAGACCTGGA AAAGTTCCCT TTCTGAGAGT

5401 AGCAACAGAA AGCTCTGCAA AGACTCCCTC CAAGCTATTG GATCCTCTTG CTTGGGATAA

5461 CCACTATGGT ACTCAGATAC CAAAAGAAGA GTGGAAATCC CAAGAGAAGT CACCAGAAAA

5521 AACAGCTTTT AAGAAAAAGG ATACCATTTT GTCCCTGAAC GCTTGTGAAA GCAATCATGC

5581 AATAGCAGCA ATAAATGAGG GACAAAATAA GCCCGAAATA GAAGTCACCT GGGCAAAGCA

5641 AGGTAGGACT GAAAGGCTGT GCTCTCAAAA CCCACCAGTC TTGAAACGCC ATCAACGGGA

5701 AATAACTCGT ACTACTCTTC AGTCAGATCA AGAGGAAATT GACTATGATG ATACCATATO

5761 AGTTGAAATG AAGAAGGAAG ATTTTGACAT TTATGATGAG GATGAAAATC AGAGCCCCCG

5821 CAGCTTTCAA AAGAAAACAC GACACTATTT TATTGCTGCA GTGGAGAGGC TCTGGGATTA

5881 TGGGATGAGT AGCTCCCCAC ATGTTCTAAG AAACAGGGCT CAGAGTGGCA GTGTCCCTCA

5941 GTTCAAGAAA GTTGTTTTCC AGGAATTTAC TGATGGCTCC TTTACTCAGC CCTTATACCG

6001 TGGAGAACTA AATGAACATT TGGGACTCCT GGGGCCATAT ATAAGAGCAG AAGTTGAAGA

6061 TAATATCATG GTAACTTTCA GAAATCAGGC CTCTCGTCCC TATTCCTTCT ATTCTAGCCT

6121 TATTTCTTAT GAGGAAGATC AGAGGCAAGG AGCAGAACCT AGAAAAAACT TTGTCAAGCC

6181 TAATGAAACC AAAACTTACT TTTGGAAAGT GCAACATCAT ATGGCACCCA CTAAAGATGA

6241 GTTTGACTGC AAAGCCTGGG CTTATTTCTC TGATGTTGAC CTGGAAAAAG ATGTGCACTC

6301 AGGCCTGATT GGACCCCTTC TGGTCTGCCA CACTAACACA CTGAACCCTG CTCATGGGAG

6361 ACAAGTGACA GTACAGGAAT TTGCTCTGTT TTTCACCATC TTTGATGAGA CCAAAAGCTG

6421 GTACTTCACT GAAAATATGG AAAGAAACTG CAGGGCTCCC TGCAATATCC AGATGGAAGA

6481 TCCCACTTTT AAAGAGAATT ATCGCTTCCA TGCAATCAAT GGCTACATAA TGGATACACT

6541 ACCTGGCTTA GTAATGGCTC AGGATCAAAG GATTCGATGG TATCTGCTCA GCATGGGCAG

6601 CAATGAAAAC ATCCATTCTA TTCATTTCAG TGGACATGTG TTCACTGTAC GAAAAAAAGA

6661 GGAGTATAAA ATGGCACTGT ACAATCTCTA TCCAGGTGTT TTTGAGACAG TGGAAATGTT

6721 ACCATCCAAA GCTGGAATTT GGCGGGTGGA ATGCCTTATT GGCGAGCATC TACATGCTGG

6781 GATGAGCACA CTTTTTCTGG TGTACAGCAA TAAGTGTCAG ACTCCCCTGG GAATGGCTTC

6841 TGGACACATT AGAGATTTTC AGATTACAGC TTCAGGACAA TATGGACAGT GGGCCCCAAA

6901 GCTGGCCAGA CTTCATTATT CCGGATCAAT CAATGCCTGG AGCACCAAGG AGCCCTTTTC

6961 TTGGATCAAG GTGGATCTGT TGGCACCAAT GATTATTCAC GGCATCAAGA CCCAGGGTGC

7021 CCGTCAGAAG TTCTCCAGCC TCTACATCTC TCAGTTTATC ATCATGTATA GTCTTGATGG

7081 GAAGAAGTGG CAGACTTATC GAGGAAATTC CACTGGAACC TTAATGGTCT TCTTTGGCAA

7141 TGTGGATTCA TCTGGGATAA AACACAATAT TTTTAACCCT CCAATTATTG CTCGATACAT

7201 CCGTTTGCAC CCAACTCATT ATAGCATTCG CAGCACTCTT CGCATGGAGT TGATGGGCTG

7261 TGATTTAAAT AGTTGCAGCA TGCCATTGGG AATGGAGAGT AAAGCAATAT CAGATGCACA

7321 GATTACTGCT TCATCCTACT TTACCAATAT GTTTGCCACC TGGTCTCCTT CAAAAGCTCG

7381 ACTTCACCTC CAAGGGAGGA GTAATGCCTG GAGACCTCAG GTGAATAATC CAAAAGAGTG

7441 GCTGCAAGTG GACTTCCAGA AGACAATGAA AGTCACAGGA GTAACTACTC AGGGAGTAAA

7501 ATCTCTGCTT ACCAGCATGT ATGTGAAGGA GTTCCTCATC TCCAGCAGTC AAGATGGCCA

7561 TCAGTGGACT CTCTTTTTTC AGAATGGCAA AGTAAAGGTT TTTCAGGGAA ATCAAGACTC

7621 CTTCACACCT GTGGTGAACT CTCTAGACCC ACCGTTACTG ACTCGCTACC TTCGAATTCA

7681 CCCCCAGAGT TGGGTGCACC AGATTGCCCT GAGGATGGAG GTTCTGGGCT GCGAGGCACA

7741 GGACCTCTAC

*Los ácidos nucleicos subrayados codifican un péptido señal.

Los polipéptidos de FVIII incluyen FVIII de longitud completa, FVIII de longitud completa menos Met en el extremo N, FVIII maduro (menos la secuencia señal), FVIII maduro con una Met adicional en el extremo N y/o FVIII con una eliminación completa o parcial del dominio B. En determinadas realizaciones, las variantes de FVIII incluyen eliminaciones del dominio B, sean eliminaciones parciales o completas.

La secuencia de FVIII humano maduro natural se presenta como SEQ ID NO: 65. Una proteína FVIII natural tiene la siguiente fórmula: A1-a1-A2-a2-B-a3-A3-C1-C2, donde A1, A2 y A3 son "dominios A" estructuralmente relacionados, B es el "dominio B", C1 y C2 son los "dominios C" estructuralmente relacionados y a1, a2 y a3 son regiones espaciadoras ácidas. Con referencia a la posición en la secuencia de aminoácidos primaria en SEQ ID NO:65, el dominio A1 de FVIII humano se extiende desde Ala1 hasta aproximadamente Arg336, la región espaciadora a1 se extiende desde aproximadamente Met337 hasta aproximadamente Val374, el dominio A2 se extiende desde aproximadamente Ala375 hasta aproximadamente Tyr719, la región espaciadora a2 se extiende desde aproximadamente Glu720 hasta aproximadamente Arg740, el dominio B se extiende desde aproximadamente Ser741 hasta aproximadamente Arg 1648, la región espaciadora a3 se extiende desde aproximadamente Glu1649 hasta aproximadamente Arg1689, el dominio A3 se extiende desde aproximadamente Ser1690 hasta aproximadamente Leu2025, el dominio C1 se extiende desde aproximadamente Gly2026 hasta aproximadamente Asn2072 y el dominio C2 se extiende desde aproximadamente Ser2073 hasta Tyr2332. A diferencia de los sitios de escisión proteolítica específicos, la designación de las ubicaciones de los límites entre los dominios y las regiones de FVIII puede variar en diferentes referencias de la literatura. Los límites indicados en este documento, por lo tanto, se designan como aproximados mediante el uso del término "aproximadamente".

El gen de FVIII humano se aisló y se expresó en célula de mamífero (Toole, J. J., et al., Nature 312:342-347 (1984); Gitschier, J., et a l, Nature 312:326-330 (1984); Wood, W. I., et a l, Nature 312:330-337 (1984); Vehar, G. A., et a l, Nature 312:337-342 (1984); documento W o 87/04187; documento WO 88/08035; documento WO 88/03558; y patente de Estados Unidos n.° 4.757.006). La secuencia de aminoácidos de FVIII se dedujo del ADNc como se muestra en la patente de Estados Unidos n.° 4.965.199. Además, FVIII con el dominio B parcial o completamente eliminado se muestra en las patentes de Estados Unidos n.° 4.994.371 y 4.868.112. En algunas realizaciones, el dominio B de FVIII humano se remplaza con el dominio B del factor V humano como se muestra en la patente de Estados Unidos n.° 5.004.803. La secuencia de ADNc que codifica el factor VIII humano y la secuencia de aminoácidos se muestran en SEQ ID NO: 1 y 2, respectivamente, de la publicación de solicitud de Estados Unidos n.° 2005/0100990.

La secuencia de FVIII porcino está publicada en Toole, J. J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5939-5942 (1986). Además, la secuencia de ADNc porcina completa obtenida de la amplificación por PCR de secuencias de FVIII de una colección de ADNc de bazo de cerdo se ha presentado en Healey, J. F., et al., Blood 88:4209-4214 (1996). El FVIII humano/porcino híbrido que tiene sustituciones de todos los dominios, todas las subunidades y secuencias de aminoácidos específicas se divulgaron en la patente de Estados Unidos n.° 5.364.771 de Lollar y Runge, y en el documento WO 93/20093. Más recientemente, las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos correspondientes de los dominios A1 y A2 de FVIII porcino y un FVIII quimérico con dominios A1 y/o A2 porcinos sustituidos en los dominios humanos correspondientes se presentaron en el documento WO 94/11503. La patente de Estados Unidos n.° 5.859.204, Lollar, J. S., también divulga el ADNc porcino y las secuencias de aminoácidos deducidas. La patente de Estados Unidos n.° 6.458.563 divulga un FVIII porcino con el dominio B eliminado.

La patente de Estados Unidos n.° 5.859.204 de Lollar, J. S. presenta mutantes funcionales de FVIII que tiene antigenicidad reducida e inmunorreactividad reducida. La patente de Estados Unidos n.° 6.376.463 de Lollar, J. S. también presenta mutantes de FVIII que tienen inmunorreactividad reducida. La publicación de solicitud de Estados Unidos n.° 2005/0100990 de Saenko et al. presenta mutaciones funcionales en el dominio A2 de FVIII.

En una realización, el FVIII (o parte de FVIII de una proteína quimérica) puede ser al menos un 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% idéntico a una secuencia de aminoácidos de FVIII de los aminoácidos 1 a 1438 de SEQ ID NO: 67 o los aminoácidos 1 a 2332 de SEQ ID NO: 65 (sin una secuencia señal) o una secuencia de aminoácidos de FVIII de los aminoácidos 1 a 19 de SEQ ID NO: 64 y 1 a 1438 de SEQ ID NO: 67 o los aminoácidos 1 a 19 de SEQ ID NO: 64 y los aminoácidos 1 a 2332 de SEQ ID NO: 65 (con una secuencia señal), en el que el FVIII tiene una actividad coagulante, por ejemplo, activa el factor IX como cofactor para convertir el factor X en factor X activado. El FVIII (o parte de FVIII de una proteína quimérica) puede ser idéntico a una secuencia de aminoácidos de FVIII de los aminoácidos 1 a 1438 de SEQ ID NO: 67 o los aminoácidos 1 a 2332 de SEQ ID NO: 65 (sin una secuencia señal). El FVIII puede comprender además una secuencia señal.

El "dominio B" de FVIII, como se usa en este documento, es igual que el dominio B conocido en la técnica que se define por la identidad de secuencia de aminoácidos interna y los sitios de escisión proteolítica, por ejemplo, los residuos Ser741-Arg1648 de FVIII humano de longitud completa. Los otros dominios de FVIII humano se definen por los siguientes residuos aminoacídicos: A1, residuos Ala1 -Arg372; A2, residuos Ser373-Arg740; A3, residuos Ser1690-Asn2019; C1, residuos Lys2020-Asn2172; C2, residuos Ser2173-Tyr2332. La secuencia A3-C1-C2 incluye los residuos Ser1690-Tyr2332. La secuencia restante, los residuos Glu1649-Arg1689, habitualmente se denominan región ácida a3. Las ubicaciones de los límites para todos los dominios, incluyendo los dominios B, para FVIII porcino, de ratón y canino también se conocen en la técnica. En una realización, el dominio B de FVIII se elimina ("factor VIII con el dominio B eliminado" o "FVIII BDD"). Un ejemplo de un FVIII Bd D es REFACTO® (FVIII BDD recombinante), que tiene la misma secuencia que la parte de factor VIII de la secuencia de la tabla 5. (Cadena pesada de FVIII BDD con doble subrayado; dominio B en cursiva; y cadena ligera de FVIII BDD en texto sin formato). Una secuencia de nucleótidos codificante de la tabla 6 (SEQ ID NO: 68) se muestra en la tabla 6.

Tabla 5. Secuencia de aminoácidos de factor VIII con el domino B eliminado (FVIII BDD)

BDD FVIII (SEQ ID NO: 67) ATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSWYKKTLFVEFTDHLFNIAKPRPPWMGLL GPTIQAEVYDTWITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLKEN GPMASDPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETKNSL MQDRDAASARAWPKMHTVNGYWRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQASLEI SPITFLTAQTLLMDLGQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDWRF DDDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFMAYT DETFKTREAIQHESGILGPLLYGEVGDTLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPIL PGEIFKYKWTVTVEDGPTKSDPRCLTRYYSSFVNMERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILF SVFDENRSWYLTENIQRFLPNPAGVQLEDPEFOASNIMHSINGYVFDSLOLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDF LSVFFSGYTFKHKMVYEDTLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNTGDYYE DSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSCWPPVL.KRfl'aREITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQ SPRSFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKWFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGL LGPYIRAEVEDNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKDEF DCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWYFTENMERNCRAP CNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMA LYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWRVECLIGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQW APKLARLHYSGSINAWSTKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQFIIMYSLDGKKWQTYRGN STGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQI TASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNNPKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLI SSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPWNSLDPPLLTRYLRIHPQSWVHQIALRMEVLGCEAQDLY Tabla 6. Secuencia de nucleótidos que codifica FVIII BDD (SEQ ID NO: 68)*

661 A TGCAAATAGA GCTCTCCACC TGCTTCTTTC 721 TGTGCCTTTT GCGATTCTGC TTTAGTGCCA CCAGAAGATA CTACCTGGGT GCAGTGGAAC 781 TGTCATGGGA CTATATGCAA AGTGATCTCG GTGAGCTGCC TGTGGACGCA AGATTTCCTC 841 CTAGAGTGCC AAAATCTTTT CCATTCAACA CCTCAGTCGT GTACAAAAAGACTCTGTTTG 901 TAGAATTCAC GGATCACCTT TTCAACATCG CTAAGCCAAG GCCACCCTGGATGGGTCTGC 961 TAGGTCCTAC CATCCAGGCT GAGGTTTATG ATACAGTGGT CATTACACTTAAGAACATGG 1021 CTTCCCATCC TGTCAGTCTT CATGCTGTTG GTGTATCCTA CTGGAAAGCT TCTGAGGGAG 1081 CTGAATATGA TGATCAGACC AGTCAAAGGG AGAAAGAAGA TGATAAAGTC TTCCCTGGTG 1141 GAAGCCATAC ATATGTCTGG CAGGTCCTGA AAGAGAATGG TCCAATGGCC TCTGACCCAC 12 01 TGTGCCTTAC CTACTCATAT CTTTCTCATG TGGACCTGGT AAAAGACTTG AATTCAGGCC 1261 TCATTGGAGC CCTACTAGTA TGTAGAGAAG GGAGTCTGGC CAAGGAAAAG ACACAGACCT 1321 TGCACAAATT TATACTACTT TTTGCTGTAT TTGATGAAGG GAAAAGTTGG CACTCAGAAA 1381 CAAAGAACTC CTTGATGCAG GATAGGGATG CTGCATCTGC TCGGGCCTGG CCTAAAATGC 1441 ACACAGTCAA TGGTTATGTA AACAGGTCTC TGCCAGGTCT GATTGGATGC CACAGGAAAT 1501 CAGTCTATTG GCATGTGATT GGAATGGGCA CCACTCCTGA AGTGCACTCA ATATTCCTCG 1561 AAGGTCACAC ATTTCTTGTG AGGAACCATC GCCAGGCGTC CTTGGAAATC TCGCCAATAA 1621 CTTTCCTTAC TGCTCAAACA CTCTTGATGG ACCTTGGACA GTTTCTACTG TTTTGTCATA 1681 TCTCTTCCCA CCAACATGAT GGCATGGAAG CTTATGTCAA AGTAGACAGC TGTCCAGAGG 1741 AACCCCAACT ACGAATGAAA AATAATGAAG AAGCGGAAGA CTATGATGAT GATCTTACTG 1801 ATTCTGAAAT GGATGTGGTC AGGTTTGATG ATGACAACTC TCCTTCCTTT ATCCAAATTC 1861 GCTCAGTTGC CAAGAAGCAT CCTAAAACTT GGGTACATTA CATTGCTGCT GAAGAGGAGG 1921 ACTGGGACTA TGCTCCCTTA GTCCTCGCCC CCGATGACAG AAGTTATAAA AGTCAATATT 1981 TGAACAATGG CCCTCAGCGG ATTGGTAGGA AGTACAAAAA AGTCCGATTT ATGGCATACA 2041 CAGATGAAAC CTTTAAGACT CGTGAAGCTA TTCAGCATGA ATCAGGAATC TTGGGACCTT 2101 TACTTTATGG GGAAGTTGGA GACACACTGT TGATTATATT TAAGAATCAA GCAAGCAGAC 2161 CATATAACAT CTACCCTCAC GGAATCACTG ATGTCCGTCC TTTGTATTCA AGGAGATTAC 2221 CAAAAGGTGT AAAACATTTG AAGGATTTTC CAATTCTGCC AGGAGAAATA TTCAAATATA 2281 AATGGACAGT GACTGTAGAA GATGGGCCAA CTAAATCAGA TCCTCGGTGC CTGACCCGCT 2341 ATTACTCTAG TTTCGTTAAT ATGGAGAGAG ATCTAGCTTC AGGACTCATT GGCCCTCTCC 2401 TCATCTGCTA CAAAGAATCT GTAGATCAAA GAGGAAACCA GATAATGTCA GACAAGAGGA 2461 ATGTCATCCT GTTTTCTGTA TTTGATGAGA ACCGAAGCTG GTACCTCACA GAGAATATAC 2521 AACGCTTTCT CCCCAATCCA GCTGGAGTGC AGCTTGAGGA TCCAGAGTTC CAAGCCTCCA 2581 ACATCATGCA CAGCATCAAT GGCTATGTTT TTGATAGTTT GCAGTTGTCA GTTTGTTTGC 2641 ATGAGGTGGC ATACTGGTAC ATTCTAAGCA TTGGAGCACA GACTGACTTC CTTTCTGTCT 2701 TCTTCTCTGG ATATACCTTC AAACACAAAA TGGTCTATGA AGACACACTC ACCCTATTCC 2761 CATTCTCAGG AGAAACTGTC TTCATGTCGA TGGAAAACCC AGGTCTATGG ATTCTGGGGT 2821 GCCACAACTC AGACTTTCGG AACAGAGGCA TGACCGCCTT ACTGAAGGTT TCTAGTTGTG 2881 ACAAGAACAC TGGTGATTAT TACGAGGACA GTTATGAAGA TATTTCAGCA TACTTGCTGA 2941 GTAAAAACAA TGCCATTGAA CCAAGAAGCT TCTCTCAAAA CCCACCAGTC TTGAAACGCC 3001 ATCAACGGGA AATAACTCGT ACTACTCTTC AGTCAGATCA AGAGGAAATT GACTATGATG 3061 ATACCATATO AGTTGAAATG AAGAAGGAAG ATTTTGACAT TTATGATGAG GATGAAAATC 3121 AGAGCCCCCG CAGCTTTCAA AAGAAAACAC GACACTATTT TATTGCTGCA GTGGAGAGGC 3181 TCTGGGATTA TGGGATGAGT AGCTCCCCAC ATGTTCTAAG AAACAGGGCT CAGAGTGGCA 3241 GTGTCCCTCA GTTCAAGAAA GTTGTTTTCC AGGAATTTAC TGATGGCTCC TTTACTCAGC 3301 CCTTATACCG TGGAGAACTA AATGAACATT TGGGACTCCT GGGGCCATATATAAGAGCAG 3361 AAGTTGAAGA TAATATCATG GTAACTTTCA GAAATCAGGC CTCTCGTCCC TATTCCTTCT 3421 ATTCTAGCCT TATTTCTTAT GAGGAAGATC AGAGGCAAGG AGCAGAACCT AGAAAAAACT 3481 TTGTCAAGCC TAATGAAACC AAAACTTACT TTTGGAAAGT GCAACATCATATGGCACCCA 3541 CTAAAGATGA GTTTGACTGC AAAGCCTGGG CTTATTTCTC TGATGTTGAC CTGGAAAAAG 3601 ATGTGCACTC AGGCCTGATT GGACCCCTTC TGGTCTGCCA CACTAACACA CTGAACCCTG 3661 CTCATGGGAG ACAAGTGACA GTACAGGAAT TTGCTCTGTT TTTCACCATC TTTGATGAGA 3721 CCAAAAGCTG GTACTTCACT GAAAATATGG AAAGAAACTG CAGGGCTCCC TGCAATATCC 3781 AGATGGAAGA TCCCACTTTT AAAGAGAATT ATCGCTTCCA TGCAATCAAT GGCTACATAA 3841 TGGATACACT ACCTGGCTTA GTAATGGCTC AGGATCAAAG GATTCGATGG TATCTGCTCA 3901 GCATGGGCAG CAATGAAAAC ATCCATTCTA TTCATTTCAG TGGACATGTG TTCACTGTAC 3961 GAAAAAAAGA GGAGTATAAA ATGGCACTGT ACAATCTCTA TCCAGGTGTT TTTGAGACAG

4021 TGGAAATGTT ACCATCCAAA GCTGGAATTT GGCGGGTGGAATGCCTTATT GGCGAGCATC

4081 TACATGCTGG GATGAGCACA CTTTTTCTGG TGTACAGCAA TAAGTGTCAG ACTCCCCTGG

4141 GAATGGCTTC TGGACACATT AGAGATTTTC AGATTACAGC TTCAGGACAA TATGGACAGT

4201 GGGCCCCAAA GCTGGCCAGA CTTCATTATT CCGGATCAAT CAATGCCTGG AGCACCAAGG

4261 AGCCCTTTTC TTGGATCAAG GTGGATCTGT TGGCACCAAT GATTATTCAC GGCATCAAGA

4321 CCCAGGGTGC CCGTCAGAAG TTCTCCAGCC TCTACATCTC TCAGTTTATC ATCATGTATA

4381 GTCTTGATGG GAAGAAGTGG CAGACTTATC GAGGAAATTC CACTGGAACC TTAATGGTCT

4441 TCTTTGGCAA TGTGGATTCA TCTGGGATAAAACACAATAT TTTTAACCCT CCAATTATTG

4501 CTCGATACAT CCGTTTGCAC CCAACTCATT ATAGCATTCG CAGCACTCTT CGCATGGAGT

4561 TGATGGGCTG TGATTTAAAT AGTTGCAGCA TGCCATTGGG AATGGAGAGT AAAGCAATAT

4621 CAGATGCACA GATTACTGCT TCATCCTACT TTACCAATAT GTTTGCCACC TGGTCTCCTT

4681 CAAAAGCTCG ACTTCACCTC CAAGGGAGGA GTAATGCCTG GAGACCTCAG GTGAATAATC

4741 CAAAAGAGTG GCTGCAAGTG GACTTCCAGAAGACAATGAAAGTCACAGGA GTAACTACTC

4801 AGGGAGTAAAATCTCTGCTT ACCAGCATGT ATGTGAAGGA GTTCCTCATC TCCAGCAGTC

4861 AAGATGGCCA TCAGTGGACT CTCTTTTTTCAGAATGGCAAAGTAAAGGTT TTTCAGGGAA

4921 ATCAAGACTC CTTCACACCT GTGGTGAACT CTCTAGACCC ACCGTTACTG ACTCGCTACC

4981 TTCGAATTCA CCCCCAGAGT TGGGTGCACCAGATTGCCCT GAGGATGGAG GTTCTGGGCT

5041 GCGAGGCACA GGACCTCTAC

*Los ácidos nucleicos subrayados codifican un péptido señal.

Un "FVIII con el dominio B eliminado" puede tener las eliminaciones completas o parciales divulgadas en las patentes de Estados Unidos n.° 6.316.226, 6.346.513, 7.041.635, 5.789.203, 6.060.447, 5.595.886, 6.228.620, 5.972.885, 6.048.720, 5.543.502, 5.610.278, 5.171.844, 5.112.950, 4.868.112 y 6.458.563. En algunas realizaciones, una secuencia de FVIII con el dominio B eliminado de la presente invención comprende una cualquiera de las eliminaciones divulgadas en col. 4, línea 4 a col. 5, línea 28 y los ejemplos 1-5 de la patente de Estados Unidos n.° 6.316.226 (también en el documento US 6.346.513). En otra realización, el factor VIII con el dominio B eliminado es el factor VIII con el dominio B S743/Q1638 eliminado (FVIII BDD SQ) (por ejemplo, factor VIII que tiene una eliminación del aminoácido 744 al aminoácido 1637, por ejemplo, factor VIII que tiene los aminoácidos 1-743 y aminoácidos 1638 2332 de SEQ ID NO: 65, es decir, Se Q ID NO: 67). En algunas realizaciones, un FVIII con el dominio B eliminado de la presente invención tiene una eliminación divulgada en col. 2, líneas 26-51 y ejemplos 5-8 de la patente de Estados Unidos n.° 5.789.203 (también documentos US 6.060.447, US 5.595.886 y US 6.228.620). En algunas realizaciones, un factor VIII con el dominio B eliminado tiene una eliminación descrita en col. 1, líneas 25 a col. 2, línea 40 de la patente de Estados Unidos n.° 5.972.885; col. 6, líneas 1 -22 y ejemplo 1 de la patente de Estados Unidos n.° 6.048.720; col. 2, líneas 17-46 de la patente de Estados Unidos n.° 5.543.502; col. 4, línea 22 a col. 5, línea 36 de la patente de Estados Unidos n.° 5.171.844; col. 2, líneas 55-68, figura 2 y ejemplo 1 de la patente de Estados Unidos n.° 5.112.950; col. 2, línea 2 a col. 19, línea 21 y tabla 2 de la patente de Estados Unidos n.° 4.868.112; col. 2, línea 1 a col. 3, línea 19, col. 3, línea 40 a col. 4, línea 67, col. 7, línea 43 a col. 8, línea 26 y col. 11, línea 5 a col. 13, línea 39 de la patente de Estados Unidos n.° 7.041.635; o col. 4, líneas 25-53 de la patente de Estados Unidos n.° 6.458.563. En algunas realizaciones, un FVIII con el dominio B eliminado tiene una eliminación de la mayor parte del dominio B, pero aún contiene secuencias aminoterminales del dominio B que son esenciales para el procesamiento proteolítico in vivo del producto de traducción primario en dos cadenas polipeptídicas, como se divulga en el documento WO 91/09122. En algunas realizaciones, un FVIII con el dominio B eliminado se construye con una eliminación de los aminoácidos 747 1638, es decir, casi una eliminación completa del dominio B. Hoeben R.C., et al. J. Biol. Chem. 265 (13): 7318-7323 (1990). Un factor VIII con el dominio B eliminado también puede contener una eliminación de los aminoácidos 771 1666 o aminoácidos 868-1562 de FVIII. Meulien P., et al. Protein Eng. 2(4): 301-6 (1988). Eliminaciones adicionales del dominio B que forman parte de la invención incluyen: eliminación de los aminoácidos 982 a 1562 o 760 a 1639 (Toole et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1986) 83, 5939-5942)), 797 a 1562 (Eaton, et al. Biochemistry (1986) 25:8343-8347)), 741 a 1646 (Kaufman (solicitud publicada PCT n.° WO 87/04187)), 747-1560 (Sarver, et al., DNA (1987) 6:553-564)), 741 a 1648 (Pasek (solicitud PCT n.° 88/00831)) o 816 a 1598 o 741 a 1648 (Lagner (Behring Inst. Mitt. (1988) n.° 82:16-25, documento EP 295597)). En otras realizaciones, el FVIII BDD incluye un polipéptido de FVIII que contiene fragmentos del dominio B que retienen uno o más sitios de glucosilación ligada a N, por ejemplo, los residuos 757, 784, 828, 900, 963, u opcionalmente 943, que corresponden a la secuencia de aminoácidos de la secuencia de FVIII de longitud completa. Ejemplos de los fragmentos del dominio B incluyen 226 aminoácidos o 163 aminoácidos del dominio B como se divulga en Miao, H.Z., et al., Blood 103(a): 3412-3419 (2004), Kasuda, A, et al., J. Thromb. Haemost. 6: 1352-1359 (2008) y Pipe, S.W., et al., J. Thromb. Haemost. 9: 2235-2242 (2011) (es decir, los primeros 226 aminoácidos o 163 aminoácidos del dominio B se retienen). En otras realizaciones más, el FVIII BDD comprende además una mutación puntual en el residuo 309 (de Phe a Ser) para mejorar la expresión de la proteína FVIII BDD. Véase, Miao, H.Z., et al., Blood 103(a): 3412-3419 (2004). En otras realizaciones más, el FVIII Bd D incluye un polipéptido de FVIII que contiene una parte del dominio B, pero que no contiene uno o más sitios de escisión por furina (por ejemplo, Arg1313 y Arg 1648). Véase, Pipe, S.W., et al., J. Thromb. Haemost. 9: 2235-2242 (2011). Cada una de las eliminaciones anteriores puede hacerse en cualquier secuencia de FVIII.

En algunas realizaciones, el FVIII tiene un dominio B parcial. En algunas realizaciones, la proteína FVIII con un dominio B parcial es FVIII198. FVIII198 es un dominio B parcial que contiene la molécula FVIIIFc monocatenaria-226N6. El número 226 representa el aminoácido 226 del extremo N del dominio B de FVIII, y N6 representa seis sitios de N-glucosilación en el dominio B.

En una realización, el FVIII se escinde justo después de la arginina en el aminoácido 1648 (en factor VIII de longitud completa o SEQ ID NO: 65), aminoácido 754 (en el factor VIII con el dominio B S743/Q1638 eliminado o SEQ ID NO: 67), o el residuo de arginina correspondiente (en otras variantes), produciendo de ese modo una cadena pesada y una cadena ligera. En otra realización, el FVIII comprende una cadena pesada y una cadena ligera, que se ligan o asocian mediante un enlace no covalente mediado por ion metálico.

En otras realizaciones, el FVIII es un FVIII monocatenario que no se ha escindido justo después de la arginina en el aminoácido 1648 (en FVIII de longitud completa o SEQ ID NO: 65), aminoácido 754 (en el FVIII con el dominio B S743/Q1638 eliminado o SEQ ID NO: 67), o el residuo de arginina correspondiente (en otras variantes). Un FVIII monocatenario puede comprender una o más sustituciones aminoacídicas. En una realización, la sustitución aminoacídica está en un residuo correspondiente al residuo 1648, el residuo 1645 o ambos del polipéptido de factor VIII maduro de longitud completa (SEQ ID NO: 65) o el residuo 754, el residuo 751 o ambos de factor VIII BDD SQ (SEQ ID NO: 67). La sustitución aminoacídica puede ser cualquier aminoácido distinto de arginina, por ejemplo, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, treonina, triptófano, valina, alanina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutámico, glutamina, glicina, prolina, selenocisteína, serina, tirosina, histidina, ornitina, pirrolisina o taurina.

El FVIII puede escindirse además por trombina y después puede activarse como FVIIIa, lo que sirve como cofactor para factor IX activado (FIXa). Y el FIX activado junto con FVIII activado forma un complejo Xasa y convierte el factor X en factor X activado (FXa). Para la activación, FVIII se escinde por trombina después de tres residuos de arginina, en los aminoácidos 372, 740 y 1689 (correspondientes a los aminoácidos 372, 740 y 795 en la secuencia de FVIII con el dominio B eliminado), generando la escisión FVIIIa que tiene las cadenas A1 de 50 kDa, A2 de 43 kDa y A3-C1-C2 de 73 kDa. En una realización, la proteína FVIII útil para la presente invención es FVIII no activo. En otra realización, la proteína FVIII es un FVIII activado.

La proteína que tiene el polipéptido de FVIII ligado a o asociado con la proteína VWF puede comprender una secuencia al menos un 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% idéntica a SEQ ID NO: 65 o 67, en la que la secuencia tiene la actividad coagulante de FVIII, por ejemplo, activación del factor IX como cofactor para convertir el factor X en factor X activado (FXa).

Las proteínas o polipéptidos "híbridos" o "quiméricos", como se usan en este documento, incluyen una combinación de una primera cadena polipeptídica, por ejemplo, la proteína VWF fusionada a una secuencia de XTEN que tiene menos de 288 aminoácidos y una primera región constante de Ig o una parte de la misma, con una segunda cadena polipeptídica, por ejemplo, una proteína FVIII fusionada a una segunda región constante de Ig o una parte de la misma, formando de ese modo un heterodímero. El primer polipéptido y el segundo polipéptido en un híbrido pueden asociarse entre sí mediante interacciones de proteína-proteína, tales como interacciones de carga-carga o hidrófobas. Un primer polipéptido puede comprender una proteína de fusión de proteína VWF-XTEN-Fc, y un segundo polipéptido puede comprender una proteína de fusión de FVIII-Fc, haciendo que el híbrido sea un heterodímero, en el que el XTEN contiene menos de 288 aminoácidos. El primer polipéptido puede comprender una proteína de fusión de proteína VWF-XTEN-Fc, y el segundo polipéptido puede comprender una proteína de fusión de FVIII(X)-Fc, haciendo que el híbrido sea un heterodímero, en el que el XTEN contiene menos de 288 aminoácidos. El primer polipéptido y el segundo polipéptido pueden asociarse a través de un enlace covalente, por ejemplo, un enlace disulfuro, entre la primera región Fc y la segunda región Fc. El primer polipéptido y el segundo polipéptido pueden asociarse además entre sí mediante unión entre el fragmento de VWF y la proteína FVIII.

Una proteína FVIII útil en la presente invención puede incluir FVIII que tiene una o más secuencias de XTEN adicionales, que no afectan a la actividad de coagulación de FVIII. Dichas secuencias de XTEN pueden fusionarse al extremo C o extremo N de la proteína FVIII o insertarse entre uno o más de los dos residuos aminoacídicos en la proteína FVIII mientras las inserciones no afecten a la actividad de coagulación de FVIII o la función de FVIII. En una realización, las inserciones mejoran las propiedades farmacocinéticas de la proteína FVIII (por ejemplo, semivida). En otra realización, las inserciones pueden ser múltiples inserciones, por ejemplo, más de dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez inserciones. Ejemplos de los sitios de inserción incluyen, aunque sin limitación, los sitios enumerados en las tablas 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o cualquier combinación de los mismos.

La proteína FVIII ligada a una o más secuencias de XTEN puede representarse como FVI11 (X2) o FVIIIa^ty-X-FVIIIa^d;, en la que FVIII comprende, consiste esencialmente en o consiste en una primera parte de una proteína FVIII del residuo aminoacídico "a" al residuo aminoacídico "b"; X2 comprende, consiste esencialmente en o consiste en una o más secuencias de XTEN, F V IIIa ^ comprende, consiste esencialmente en o consiste en una segunda parte de una proteína FVIII del residuo aminoacídico "c" al residuo aminoacídico "d";

a es el residuo aminoacídico N terminal de la primera parte de la proteína FVIII,

b es el residuo aminoacídico C terminal de la primera parte de la proteína FVIII, pero también es el residuo aminoacídico N terminal de los dos aminoácidos de un sitio de inserción en que se inserta la secuencia de

c es el residuo aminoacídico N terminal de la segunda parte de la proteína FVIII, pero también es el residuo aminoacídico C terminal de los dos aminoácidos de un sitio de inserción en que se inserta la secuencia de

d es el residuo aminoacídico C terminal de la proteína FVIII, y

en la que la primera parte de la proteína FVIII y la segunda parte de la proteína FVIII no son idénticas entre sí y son de suficiente longitud juntas, de modo que la proteína FVIII tenga una actividad de coagulación de FVIII.

En una realización, la primera parte de la proteína FVIII y la segunda parte de la proteína FVIII son fragmentos de SEQ ID NO: 65 [secuencia de FVIII madura de longitud completa] o SEQ ID NO: 67 [FVIII con el dominio B eliminado], por ejemplo, parte N terminal y parte C terminal, respectivamente. En determinadas realizaciones, la primera parte de la proteína FVIII comprende el dominio A1 y el dominio A2 de la proteína FVIII. La segunda parte de la proteína FVIII comprende el dominio A3, el dominio C1 y opcionalmente el dominio C2. En otras realizaciones más, la primera parte de la proteína FVIII comprende el dominio A1 y el dominio A2, y la segunda parte de la proteína FVIII comprende una parte del dominio B, el dominio A3, el dominio C1 y opcionalmente el dominio C2. En otras realizaciones más, la primera parte de la proteína FVIII comprende el dominio A1, el dominio A2 y una parte del dominio B de la proteína FVIII, y la segunda parte de la proteína FVIII comprende el dominio A3, el dominio C1 y opcionalmente el dominio C2.

En otras realizaciones más, la primera parte de la proteína FVIII comprende el dominio A1, el dominio A2 y una primera parte del dominio B de la proteína FVIII. La segunda parte de la proteína FVIII comprende una segunda parte del dominio B, el dominio A3, el dominio C1 y opcionalmente el dominio C2. En algunas realizaciones, los dos aminoácidos

("b" y "c") pueden ser uno cualquiera o más de los residuos aminoacídicos de los sitios de inserción mostrados en las tablas 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 y 15. Por ejemplo, "b" puede ser el residuo aminoacídico inmediatamente anterior del sitio en que se inserta o se liga una o más secuencias de XTEN, y "c" puede ser el residuo aminoacídico inmediatamente posterior del sitio en que se inserta o se liga la una o más secuencias de XTEN. En algunas realizaciones, "a" es la primera secuencia de aminoácidos madura de una proteína FVIII, y "d" es la última secuencia de aminoácidos de una proteína FVIII. Por ejemplo, FV III^b; puede ser una secuencia de aminoácidos al menos un

70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a los aminoácidos 1 a 745 de SEQ ID NO: 67 [secuencia de aminoácidos de FVIII con el dominio B eliminado] o SEQ ID NO: 65 [FVIII de longitud completa] y

F V I I I p u e d e ser los aminoácidos 746 a 1438 de SEQ ID NO: 67 o los aminoácidos 1641 a 2332 de SEQ ID NO:

65, respectivamente.

En algunos aspectos, el sitio de inserción en la proteína FVIII está ubicado en uno o más dominios de la proteína FVIII, que es el extremo N, el dominio A1, el dominio A2, el dominio A3, el dominio B, el dominio C1, el dominio C2, el extremo C, o dos o más combinaciones de los mismos o entre dos dominios de la proteína FVIII, que son el dominio

A1 y la región ácida a1, y la región ácida a1 y el dominio A2, el dominio A2 y la región ácida a2, la región ácida a2 y el dominio B, el dominio B y el dominio A3, y el dominio A3 y el dominio C1, el dominio C1 y el dominio C2, o cualquier combinación de los mismos. Por ejemplo, los sitios de inserción en que puede insertarse la secuencia de XTEN se seleccionan del grupo que consiste en el extremo N y el dominio A1, el extremo N y el dominio A2, el extremo N y el dominio A3, el extremo N y el dominio B, el extremo N y el dominio C1, el extremo N y el dominio C2, el extremo N y el extremo C, los dominios A1 y A2, los dominios A1 y A3, los dominios A1 y B, los dominios A1 y C1, los dominios A1 y C2, el dominio A1 y el extremo C, los dominios A2 y A3, los dominios A2 y B, los dominios A2 y C1, los dominios A2 y C2, el dominio A2 y el extremo C, los dominios A3 y B, los dominios A3 y C1, los dominios A3 y C2, el dominio A3 y el extremo C, los dominios B y C1, los dominios B y C2, el dominio B y el extremo C, los dominios C1 y C2, el dominio

C1 y el extremo C, el dominio C2 y el extremo C, y dos o más combinaciones de los mismos. Ejemplos no limitantes de sitios de inserción se enumeran en las tablas 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 y 15.

La proteína FVIII, en que se inserta la secuencia de XTEN inmediatamente posterior de uno o más aminoácidos (por ejemplo, uno o más sitios de inserción de XTEN) en la proteína FVIII o se liga en el extremo C o el extremo N, retiene la actividad de FVIII después de la unión a o inserción por la secuencia de XTEN. La secuencia de XTEN puede insertarse en la proteína FVIII una vez o más de una vez, dos veces, tres veces, cuatro veces, cinco veces o seis veces, de modo que las inserciones no afecten a la actividad de FVIII (es decir, la proteína FVIII aún retiene la propiedad de coagulación).

La proteína FVIII útil en la presente invención puede ligarse a uno o más polipéptidos XTEN en el extremo N o el extremo C de la proteína FVIII mediante un conector opcional o insertarse inmediatamente posterior a uno o más aminoácidos (por ejemplo, uno o más sitios de inserción de XTEN) en la proteína FVIII mediante uno o más conectores opcionales. En una realización, los dos residuos aminoacídicos en que se inserta la secuencia de XTEN o el residuo aminoacídico al que se liga la secuencia de XTEN corresponden a los dos residuos aminoacídicos o un residuo aminoacídico de SEQ ID NO: 65 [FVIII maduro de longitud completa] seleccionados del grupo que consiste en los residuos de la tabla 7, tabla 8, tabla 9 y tabla 10 y cualquier combinación de los mismos.

En otras realizaciones, se inserta al menos una secuencia de XTEN en uno cualquiera o más sitios de inserción de XTEN divulgados en este documento o cualquier combinación de los mismos. En un aspecto, se inserta al menos una secuencia de XTEN en uno o más sitios de inserción de XTEN divulgados en uno o más aminoácidos divulgados en la tabla 7.

Tabla 7: Sitios de inserción de XTEN ejemplares

En algunas realizaciones, se inserta una o más secuencias de XTEN en aproximadamente seis aminoácidos por encima o por debajo de los aminoácidos 32, 220, 224, 336, 339, 399, 416, 603, 1656, 1711, 1725, 1905 o 1910, correspondientes a SEQ ID NO: 65 o cualquier combinación de los mismos.

Tabla 8. Intervalos de inserción de XTEN ejemplares

En otras realizaciones, se inserta una o más secuencias de XTEN inmediatamente posteriores de uno o más aminoácidos correspondientes al FVIII humano maduro de longitud completa seleccionados del grupo que consiste en uno o más sitios de inserción de la tabla 9.

Tabla 9. Sitios o intervalos de inserción de XTEN ejemplares

En otras realizaciones más, se inserta uno o más XTEN en el dominio B de FVIII. En un ejemplo, se inserta un XTEN entre los aminoácidos 740 y 1640 correspondientes a SEQ ID NO: 65, en la que la secuencia de FVIII entre los aminoácidos 740 y 1640 opcionalmente no está presente. En otro ejemplo, se inserta un XTEN entre los aminoácidos 741 y 1690 correspondientes a SEQ ID NO: 65, en la que la secuencia de FVIII entre los aminoácidos 740 y 1690 opcionalmente no está presente. En otros ejemplos, se inserta un XTEN entre los aminoácidos 741 y 1648 correspondientes a SEQ ID NO: 65, en la que la secuencia de FVIII entre los aminoácidos 741 y 1648 opcionalmente no está presente. En otros ejemplos más, se inserta un XTEN entre los aminoácidos 743 y 1638 correspondientes a SEQ ID NO: 65, en la que la secuencia de FVIII entre los aminoácidos 743 y 1638 opcionalmente no está presente. En otros ejemplos más, se inserta un XTEN entre los aminoácidos 745 y 1656 correspondientes a SEQ ID NO: 65, en la que la secuencia de FVIII entre los aminoácidos 745 y 1656 opcionalmente no está presente. En algunos ejemplos, se inserta un XTEN entre los aminoácidos 745 y 1657 correspondientes a SEQ ID NO: 65, en la que la secuencia de FVIII entre los aminoácidos 745 y 1657 opcionalmente no está presente. En determinados ejemplos, se inserta un XTEN entre los aminoácidos 745 y 1667 correspondientes a SEQ ID NO: 65, en la que la secuencia de FVIII entre los aminoácidos 745 y 1667 opcionalmente no está presente. En otros ejemplos más, se inserta un XTEN entre los aminoácidos 745 y 1686 correspondientes a SEQ ID NO: 65, en la que la secuencia de FVIII entre los aminoácidos 745 y 1686 opcionalmente no está presente. En algunos otros ejemplos, se inserta un XTEN entre los aminoácidos 747 y 1642 correspondientes a SEQ ID NO: 65, en la que la secuencia de FVIII entre los aminoácidos 747 y 1642 opcionalmente no está presente. En otros ejemplos más, se inserta un XTEN entre los aminoácidos 751 y 1667 correspondientes a SEQ ID NO: 65, en la que la secuencia de FVIII entre los aminoácidos 751 y 1667 opcionalmente no está presente.

En algunas realizaciones, se inserta uno o más XTEN en uno o más aminoácidos inmediatamente posteriores de un aminoácido de un sitio de inserción seleccionado del grupo que consiste en los residuos aminoacídicos de la tabla 10.

Tabla 10: Sitio de inserción de XTEN en FVIII y denominaciones de construcción

En una realización, el uno o más sitios de inserción de XTEN están ubicados dentro de una o más estructuras de bucle flexibles, expuestas en la superficie de la proteína FVIII (por ejemplo, un bucle permisivo). Por ejemplo, puede insertarse al menos una secuencia de XTEN en cada dominio "A" de FVIII que comprende al menos dos "bucles permisivos" en que puede insertarse al menos un polipéptido XTEN sin eliminar la actividad procoagulante de la proteína recombinante, o la capacidad de las proteínas recombinantes de expresarse in vivo o in vitro en una célula hospedadora. Los bucles permisivos son regiones que permiten la inserción de al menos una secuencia de XTEN con, entre otros atributos, alta exposición en superficie o a disolvente y alta flexibilidad conformacional. El dominio A1 comprende una región de bucle permisivo-1 (A1 -1) y una región de bucle permisivo-2 (A1 -2), el dominio A2 comprende una región de bucle permisivo-1 (A2-1) y una región de bucle permisivo-2 (A2-2), el dominio A3 comprende una región de bucle permisivo-1 (A3-1) y una región de bucle permisivo-2 (A3-2).

En un aspecto, un primer bucle permisivo en el dominio A1 de FVIII (A1-1) está ubicado entre la hebra beta 1 y la hebra beta 2, y un segundo bucle permisivo en el dominio A2 de FVIII (A1-2) está ubicado entre la hebra beta 11 y la hebra beta 12. Un primer bucle permisivo en el dominio A2 de FVIII (A2-1) está ubicado entre la hebra beta 22 y la hebra beta 23, y un segundo bucle permisivo en el dominio A2 de FVIII (A2-2) está ubicado entre la hebra beta 32 y la hebra beta 33. Un primer bucle permisivo en el dominio A3 de FVIII (A3-1) está ubicado entre la hebra beta 38 y la hebra beta 39, y un segundo bucle permisivo en el dominio A3 de FVIII (A3-2) está ubicado entre la hebra beta 45 y la hebra beta 46. En determinados aspectos, la estructura de bucle flexible expuesto en la superficie que comprende A1-1 corresponde a una región en el FVIII humano maduro natural de aproximadamente el aminoácido 15 a aproximadamente el aminoácido 45 de SEQ ID NO: 65, por ejemplo, de aproximadamente el aminoácido 18 a aproximadamente el aminoácido 41 de SEQ ID NO: 65. En otros aspectos, la estructura de bucle flexible expuesto en la superficie que comprende A1-2 corresponde a una región en el FVIII humano maduro natural de aproximadamente el aminoácido 201 a aproximadamente el aminoácido 232 de SEQ ID NO: 65, por ejemplo, de aproximadamente el aminoácido 218 a aproximadamente el aminoácido 229 de SEQ ID NO: 65. En otros aspectos más, la estructura de bucle flexible expuesto en la superficie que comprende A2-1 corresponde a una región en el FVIII humano maduro natural de aproximadamente el aminoácido 395 a aproximadamente el aminoácido 421 de SEQ ID NO: 65, por ejemplo, de aproximadamente el aminoácido 397 a aproximadamente el aminoácido 418 de SEQ ID NO: 65. En otras realizaciones más, la estructura de bucle flexible expuesto en la superficie que comprende A2-2 corresponde a una región en el FVIII humano maduro natural de aproximadamente el aminoácido 577 a aproximadamente el aminoácido 635 de SEQ ID NO: 65, por ejemplo, de aproximadamente el aminoácido 595 a aproximadamente el aminoácido 607 de SEQ ID NO: 65. En determinados aspectos, la estructura de bucle flexible expuesto en la superficie que comprende A3-1 corresponde a una región en el FVIII humano maduro natural de aproximadamente el aminoácido 1705 a aproximadamente el aminoácido 1732 de SEQ ID NO: 65, por ejemplo, de aproximadamente el aminoácido 1711 a aproximadamente el aminoácido 1725 de SEQ ID NO: 65. En otros aspectos más, la estructura de bucle flexible expuesto en la superficie que comprende A3-2 corresponde a una región en el FVIII humano maduro natural de aproximadamente el aminoácido 1884 a aproximadamente el aminoácido 1917 de SEQ ID NO: 65, por ejemplo, de aproximadamente el aminoácido 1899 a aproximadamente el aminoácido 1911 de SEQ ID NO: 65.

En otra realización, el uno o más aminoácidos en que se inserta al menos una secuencia de XTEN están ubicados dentro del dominio a3, por ejemplo, los aminoácidos 1649 a 1689, correspondientes al polipéptido de FVIII maduro de longitud completa. En una realización particular, se inserta una secuencia de XTEN entre los aminoácidos 1656 y 1657 de SEQ ID NO: 65 (FVIII maduro de longitud completa). En una realización específica, una proteína FVIII que comprende una secuencia de XTEN insertada inmediatamente posterior del aminoácido 1656 correspondiente a SEQ ID NO: 65 comprende además una eliminación del aminoácido 745 al aminoácido 1656 correspondientes a SEQ ID NO: 65.

En algunas realizaciones, el uno o más sitios de inserción para una o más inserciones de XTEN están inmediatamente posteriores a uno o más aminoácidos correspondientes a FVIII de longitud completa maduro, seleccionados del grupo que consiste en:

(1) aminoácido 3, (2) aminoácido 18, (3) aminoácido 22, (4) aminoácido 26, (5) aminoácido 32, (6) aminoácido 40, (7) aminoácido 60, (8) aminoácido 65, (9) aminoácido 81, (10) aminoácido 116, (11) aminoácido 119, (12) aminoácido 130, (13) aminoácido 188, (14) aminoácido 211, (15) aminoácido 216, (16) aminoácido 220, (17) aminoácido 224, (18 ) aminoácido 230, (19) aminoácido 333, (20) aminoácido 336, (21 ) aminoácido 339, (22) aminoácido 375, (23) aminoácido 399, (24) aminoácido 403, (25) aminoácido 409, (26) aminoácido 416, (26) aminoácido 442, (28) aminoácido 487, (29) aminoácido 490, (30) aminoácido 494, (31) aminoácido 500, (32) aminoácido 518, (33) aminoácido 599, (34) aminoácido 603, (35) aminoácido 713, (36) aminoácido 745, (37) aminoácido 1656, (38) aminoácido 1711, (39 ) aminoácido 1720, (40) aminoácido 1725, (41) aminoácido 1749, (42) aminoácido 1796, (43 ) aminoácido 1802, (44) aminoácido 1827, (45) aminoácido 1861, (46) aminoácido 1896, (47) aminoácido 1900, (48) aminoácido 1904, (49) aminoácido 1905, (50) aminoácido 1910, (51) aminoácido 1937, (52 ) aminoácido 2019, (53) aminoácido 2068, (54) aminoácido 2111, (55) aminoácido 2120, (56) aminoácido 2171, (57) aminoácido 2188, (58) aminoácido 2227, (59) aminoácido 2277, y

(60 ) dos o más combinaciones de los mismos

En una realización, una proteína FVIII útil para la invención comprende dos secuencias de XTEN, una primera secuencia de XTEN insertada en un primer sitio de inserción de XTEN y un segundo XTEN insertado en un segundo sitio de inserción de XTEN. Ejemplos no limitantes del primer sitio de inserción de XTEN y el segundo sitio de inserción de XTEN se enumeran en la tabla 11.

Tabla 11. Sitios de inserción ejemplares para dos XTEN

Los dos XTEN insertados o ligados a la proteína FVIII pueden ser idénticos o diferentes. En algunas realizaciones, una proteína FVIII útil para la invención comprende dos secuencias de XTEN insertadas en la proteína FVIII, una primera secuencia de XTEN insertada inmediatamente posterior del aminoácido 745 correspondiente a SEQ ID NO: 65, y una segunda secuencia de XTEN insertada inmediatamente posterior del aminoácido 2332 correspondiente a SEQ ID NO: 65 (el extremo C). En otras realizaciones, la primera secuencia de XTEN se inserta inmediatamente posterior del aminoácido 18, 26, 40, 1656 o 1720 correspondiente a SEQ ID NO: 65, y una segunda secuencia de XTEN insertada inmediatamente posterior del aminoácido 403 correspondiente a SEQ ID NO: 65. En otras realizaciones más, la primera secuencia de XTEN se inserta inmediatamente posterior del aminoácido 18, 26 o 40 correspondiente a SEQ ID NO: 65, y una segunda secuencia de XTEN insertada inmediatamente posterior del aminoácido 599 correspondiente a s Eq ID NO: 65. En otras realizaciones más, la primera secuencia de XTEN se inserta inmediatamente posterior del aminoácido 1656 correspondiente a SEQ ID NO: 65, y una segunda secuencia de XTEN se inserta inmediatamente posterior del aminoácido 18, 26, 40, 399, 403, 1725, 1720, 1900, 1905 o 2332 correspondiente a SEQ ID NO: 65. En determinadas realizaciones, la primera secuencia de XTEN se inserta inmediatamente posterior del aminoácido 1900 correspondiente a SEQ ID NO: 65, y una segunda secuencia de XTEN se inserta inmediatamente posterior del aminoácido 18, 26 o 40 correspondiente a SEQ ID NO: 65. En algunas realizaciones más, la primera secuencia de XTEN se inserta inmediatamente posterior del aminoácido 18, 26 o 40 correspondiente a SEQ ID NO: 65, y una segunda secuencia de XTEN insertada inmediatamente posterior del aminoácido 399 correspondiente a SEQ ID NO: 65. En otras realizaciones, la primera secuencia de XTEN se inserta inmediatamente posterior del aminoácido 1720 correspondiente a SEQ ID NO: 65, y una segunda secuencia de XTEN se inserta inmediatamente posterior del aminoácido 18, 26 o 40 correspondiente a SEQ ID NO: 65. En otras realizaciones más, la primera secuencia de XTEN se inserta inmediatamente posterior del aminoácido 1720 correspondiente a SEQ ID NO: 65, y una segunda secuencia de XTEN insertada inmediatamente posterior del aminoácido 18 correspondiente a SEQ ID NO: 65. En una realización particular, la proteína FVIII comprende dos secuencias de XTEN, una primera secuencia de XTEN insertada inmediatamente posterior del aminoácido 745 correspondiente a SEQ ID NO: 65 y una segunda secuencia de XTEN insertada inmediatamente posterior del aminoácido 2332 correspondiente a SEQ ID NO: 65, en la que la proteína FVIII tiene además una eliminación del aminoácido 745 correspondiente a SEQ ID NO: 65 al aminoácido 1685 correspondiente a SEQ ID NO: 65, una mutación o sustitución en el aminoácido 1680 correspondiente a SEQ ID NO: 65, por ejemplo, Y1680F, una mutación o sustitución en el aminoácido 1648 correspondiente a SEQ ID NO: 65, por ejemplo, R1648A, o al menos dos mutaciones o sustituciones en el aminoácido 1648 correspondiente a SEQ ID NO: 65, por ejemplo, R1648A, y el aminoácido 1680 correspondiente a SEQ ID NO: 65, por ejemplo, Y1680F. En una realización específica, la proteína FVIII comprende dos secuencias de XTEN, una primera secuencia de XTEN insertada inmediatamente posterior del aminoácido 1656 correspondiente a SEQ ID NO: 65 y una segunda secuencia de XTEN insertada inmediatamente posterior del aminoácido 2332 de SEQ ID NO: 65, en la que la proteína FVIII tiene además una eliminación del aminoácido 745 al aminoácido 1656 correspondiente a SEQ ID NO: 65.

En determinadas realizaciones, una proteína FVIII comprende tres secuencias de XTEN, una primera secuencia de XTEN insertada en un primer sitio de inserción de XTEN, una segunda secuencia de XTEN insertada en una segunda secuencia de XTEN, y una tercera secuencia de XTEN insertada en un tercer sitio de inserción de XTEN. La primera, segunda o tercera secuencia de XTEN pueden ser idénticas o diferentes. El primer, segundo y tercer sitio de inserción pueden seleccionarse del grupo de uno cualquiera de los sitios de inserción divulgados en este documento. En algunas realizaciones, la proteína FVIII que comprende tres secuencias de XTEN puede comprender además una mutación o sustitución, por ejemplo, en el aminoácido 1648 correspondiente a SEQ ID NO: 65, por ejemplo, R1648A. Por ejemplo, ejemplos no limitantes del primer, segundo y tercer sitio de inserción de XTEN se enumeran en la tabla 12.

Tabla 12. Sitios de inserción ejemplares para tres XTEN

En algunas realizaciones, una proteína FVIII comprende tres secuencias de XTEN, una primera secuencia de XTEN insertada inmediatamente posterior del aminoácido 26 correspondiente a SEQ ID NO: 65, una segunda secuencia de XTEN insertada inmediatamente posterior del aminoácido 403 correspondiente a SEQ ID NO: 65, y una tercera secuencia de XTEN insertada posterior del aminoácido 1656, 1720 o 1900 correspondiente a SEQ ID NO: 65. En otras realizaciones, la primera secuencia de XTEN se inserta inmediatamente posterior del aminoácido 26 correspondiente a SEQ ID NO: 65, una segunda secuencia de XTEN se inserta posterior del aminoácido 1656 correspondiente a SEQ ID NO: 65, y una tercera secuencia de XTEN se inserta posterior del aminoácido 1720 o 1900 correspondiente a SEQ ID NO: 65. En otras realizaciones más, la primera secuencia de XTEN se inserta inmediatamente posterior del aminoácido 26 correspondiente a SEQ ID NO: 65, una segunda secuencia de XTEN se inserta posterior del aminoácido 1720 correspondiente a SEQ ID NO: 65, y una tercera secuencia de XTEN se inserta posterior del aminoácido 1900 correspondiente a SEQ ID NO: 65. En otras realizaciones más, la primera secuencia de XTEN se inserta inmediatamente posterior del aminoácido 403 correspondiente a SEQ ID NO: 65, una segunda secuencia de XTEN se inserta posterior del aminoácido 1656 correspondiente a SEQ ID NO: 65, y una tercera secuencia de XTEN se inserta posterior del aminoácido 1720 o 1900 correspondiente a SEQ ID NO: 65. En otras realizaciones, la primera secuencia de XTEN se inserta inmediatamente posterior del aminoácido 403 o 1656 correspondiente a SEQ ID NO: 65, una segunda secuencia de XTEN se inserta posterior del aminoácido 1720 correspondiente a SEQ ID NO: 65, y una tercera secuencia de XTEN se inserta posterior del aminoácido 1900 correspondiente a SEQ ID NO: 65. En otras realizaciones, la primera secuencia de XTEN se inserta inmediatamente posterior del aminoácido 18, 26, 40, 399, 403, 1711, 1720, 1725, 1900, 1905 o 1910 correspondiente a SEQ ID NO: 65, una segunda secuencia de XTEN se inserta posterior del aminoácido 745 correspondiente a SEQ ID NO: 65, y una tercera secuencia de XTEN se inserta posterior del aminoácido 2332 correspondiente a SEQ ID NO: 65.

En otras realizaciones, una proteína FVIII en la invención comprende cuatro secuencias de XTEN, una primera secuencia de XTEN insertada en un primer sitio de inserción, una segunda secuencia de XTEN insertada en un segundo sitio de inserción, una tercera secuencia de XTEN insertada en un tercer sitio de inserción y una cuarta secuencia de XTEN insertada en un cuarto sitio de inserción. La primera, segunda, tercera y cuarta secuencia de XTEN pueden ser idénticas, diferentes o combinaciones de las mismas. En algunas realizaciones, la proteína FVIII que comprende cuatro secuencias de XTEN puede comprender además una mutación o sustitución, por ejemplo, en el aminoácido 1648 correspondiente a SEQ ID NO: 65, por ejemplo, R1648A. Ejemplos no limitantes del primer, segundo, tercer y cuarto sitio de inserción de XTEN se enumeran en la tabla 13.

Tabla 13. Sitios de inserción ejemplares para cuatro XTEN

En algunas realizaciones, una proteína FVIII comprende cinco secuencias de XTEN, una primera secuencia de XTEN insertada en un primer sitio de inserción, una segunda secuencia de XTEN insertada en un segundo sitio de inserción, una tercera secuencia de XTEN insertada en un tercer sitio de inserción de XTEN, una cuarta secuencia de XTEN insertada en un cuarto sitio de inserción de XTEN y una quinta secuencia de XTEN insertada en un quinto sitio de inserción de XTEN. La primera, segunda, tercera, cuarta o quinta secuencia de XTEN pueden ser idénticas, diferentes o combinaciones de las mismas. Ejemplos no limitantes del primer, segundo, tercer, cuarto y quinto sitio de inserción se enumeran en la tabla 14.

Tabla 14. Sitios de inserción ejemplares para cinco XTEN

En un ejemplo particular, un primer XTEN se inserta entre los aminoácidos 26 y 27 correspondientes a SEQ ID NO: 65, y un segundo XTEN se inserta entre los aminoácidos 1720 y 1721 correspondientes a SEQ ID NO: 65 (FVIII maduro de longitud completa). En otro ejemplo, un primer XTEN se inserta entre los aminoácidos 403 y 404 correspondientes a SEQ ID NO: 65, y un segundo XTEN se inserta entre los aminoácidos 1720 y 1721 correspondientes a SEQ ID NO: 65. En algunos ejemplos, un primer XTEN se inserta entre los aminoácidos 1656 y 1657 correspondientes a SEQ ID NO: 65, y un segundo XTEN se inserta entre los aminoácidos 1720 y 1721 correspondientes a SEQ ID NO: 65. En otros ejemplos, un primer XTEN se inserta entre los aminoácidos 26 y 27 correspondientes a SEQ ID NO: 65, un segundo XTEN se inserta entre los aminoácidos 1656 y 1657 correspondientes a SEQ ID NO: 65, y un tercer XTEN se inserta entre los aminoácidos 1720 y 1721 correspondientes a SEQ ID NO: 65. En otras realizaciones más, un primer XTEN se inserta entre los aminoácidos 403 y 404 correspondientes a SEQ ID NO: 65, un segundo XTEN se inserta entre los aminoácidos 1656 y 1657 correspondientes a SEQ ID NO: 65, y un tercer XTEN se inserta entre los aminoácidos 1720 y 1721 correspondientes a SEQ ID NO: 65. En otras realizaciones más, un primer XTEN se inserta entre los aminoácidos 403 y 404 correspondientes a SEQ ID NO: 65, un segundo XTEN se inserta entre los aminoácidos 1656 y 1657 correspondientes a SEQ ID NO: 65, y un tercer XTEN se inserta entre los aminoácidos 1720 y 1721 correspondientes a SEQ ID NO: 65. En determinadas realizaciones, un primer XTEN se inserta entre los aminoácidos 26 y 27 correspondientes a SEQ ID NO: 65, un segundo XTEN se inserta entre los aminoácidos 1720 y 1721 correspondientes a SEQ ID NO: 65, y un tercer XTEN se inserta entre los aminoácidos 1900 y 1901 correspondientes a SEQ ID NO: 65. En algunas realizaciones, un primer XTEN se inserta entre los aminoácidos 26 y 27 correspondientes a SEQ ID NO: 65, un segundo XTEN se inserta entre los aminoácidos 1656 y 1657 correspondientes a SEQ ID NO: 65, un tercer XTEN se inserta entre los aminoácidos 1720 y 1721 correspondientes a SEQ ID NO: 65, y un cuarto XTEN se inserta entre 1900 y 1901 correspondientes a SEQ ID NO: 65.

En una realización particular, se inserta una secuencia de XTEN entre los aminoácidos 745 y 746 de un factor VIII de longitud completa o el sitio de inserción correspondiente del factor VIII con el dominio B eliminado.

En este documento se divulgan proteínas quiméricas que comprenden dos secuencias polipeptídicas, comprendiendo una primera secuencia polipeptídica una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente un 80 %, 90 %, 95 % o 100 % idéntica a una secuencia seleccionada de FVIII-161 (SEQ ID NO: 69), FVIII-169 (SEQ ID NO: 70), FVIII-170 (SEQ ID NO: 71), FVIII-173 (SEQ ID NO: 72); FVIII-195 (SEQ ID NO: 73); FVIII-196 (SEQ ID NO: 74), FVIII199 (SEQ ID NO: 75), FVIII-201 (SEQ ID NO: 76); FVIII-203 (SEQ ID NO: 77), FVIII-204 (SEQ ID NO: 78), FVIII-205 (SEQ ID NO: 79), FVIII-266 (SEQ ID NO: 80), FVIII-267 (SEQ ID NO: 81), FVIII-268 (SEQ ID NO: 82), FVIII-269 (SEQ ID NO: 83), FVIII-271 (SEQ ID NO: 84) o fV i II-272 (SEQ ID NO: 85) y una segunda secuencia polipeptídica que comprende una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente un 80 %, 90 %, 95 % o 100 % idéntica a una secuencia seleccionada de VWF031 (SEQ ID NO: 86), VWF034 (SEQ ID NO: 87) o VWF-036.

II.D. Región constante de Ig o una parte de la misma

Proteínas quiméricas divulgadas en este documento también incluyen dos regiones constantes de Ig o partes de las mismas, una primera región constante de Ig o una parte de la misma fusionada a una proteína FVIII mediante un conector opcional y una segunda región constante de Ig o una parte de la misma fusionada a una proteína VWF a través de la secuencia de XTEN que tiene menos de 288 aminoácidos. La región constante de Ig o una parte de la misma puede mejorar las propiedades farmacocinéticas o farmacodinámicas de la proteína quimérica en combinación con la secuencia de XTEN y la proteína VWF. La región constante de Ig o una parte de la misma puede prolongar la semivida de una molécula fusionada a la región constante de Ig o una parte de la misma.

Una región constante de Ig está compuesta de dominios indicados dominios CH (constantes de cadena pesada -constant heavy) (CH1, CH2, etc.). Dependiendo del isotipo, (es decir, IgG, IgM, IgA, IgD o IgE), la región constante puede estar compuesta de tres o cuatro dominios CH. Algunos isotipos (por ejemplo, IgG) de regiones constantes también contienen una región de bisagra. Véase, Janeway etal. 2001, Immunobiology, Garland Publishing, N.Y., N.Y.

Una región constante de Ig o una parte de la misma para producir la proteína quimérica de la presente invención puede obtenerse de varias fuentes diferentes. Una región constante de Ig o una parte de la misma puede obtenerse de una Ig humana. Se entiende, sin embargo, que la región constante de Ig o una parte de la misma puede obtenerse de una Ig de otra especie de mamífero, incluyendo, por ejemplo, una especie de roedor (por ejemplo, un ratón, rata, conejo, cobaya) o de primate no humano (por ejemplo, chimpancé, macaco). Además, la región constante de Ig o una parte de la misma puede obtenerse de cualquier clase de Ig, incluyendo IgM, IgG, IgD, IgA e IgE, y cualquier isotipo de Ig, incluyendo IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Específicamente, se usa el isotipo humano IgG1.

Está disponible una diversidad de las secuencias génicas de la región constante de Ig (por ejemplo, secuencias génicas de la región constante humana) en forma de depósitos accesibles al público. Puede seleccionarse la secuencia de los dominios de la región constante que tenga una función efectora particular (o que carezca de una función efectora particular) o con una modificación particular para reducir la inmunogenia. Muchas secuencias de anticuerpos y genes que codifican anticuerpos se han publicado y las secuencias de la región constante de Ig adecuadas (por ejemplo, secuencias de bisagra, CH2 y/o CH3, o partes de las mismas) pueden obtenerse de estas secuencias usando técnicas reconocidas en la técnica. El material genético obtenido usando cualquiera de los métodos anteriores después puede alterarse o sintetizarse para obtener polipéptidos de la presente invención. Se apreciará además que el alcance de esta invención abarca alelos, variantes y mutaciones de secuencias de ADN de la región constante.

Las secuencias de la región constante de Ig o una parte de la misma pueden clonarse, por ejemplo, usando la reacción en cadena de la polimerasa y cebadores que se seleccionan para amplificar el dominio de interés. Para clonar una secuencia de la región constante de Ig o una parte de la misma a partir de un anticuerpo, puede aislarse el ARNm de hibridoma, bazo o linfocitos, retrotranscribirse en ADN, y amplificarse los genes de anticuerpo por PCR. Se describen en detalle métodos de amplificación por PCR en las patentes de Estados Unidos n.° 4.683.195; 4.683.202; 4.800.159; 4.965.188; y en, por ejemplo, "PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications" Innis et al. eds., Academic Press, San Diego, CA (1990); Ho et al. 1989. Gene 77:51; Horton et al. 1993. Methods Enzymol. 217:270). La PCR puede iniciarse mediante cebadores de la región constante consenso o mediante cebadores más específicos basados en las secuencias publicadas de ADN y aminoácidos de la cadena pesada y ligera. Como se analiza anteriormente, también puede usarse PCR para aislar clones de ADN que codifican las cadenas ligeras y pesadas de anticuerpo. En este caso, las colecciones pueden cribarse mediante cebadores consenso o sondas homólogas más grandes, tales como sondas de la región constante de ratón. Se conocen en la técnica numerosos conjuntos de cebadores adecuados para amplificación de genes de anticuerpo (por ejemplo, cebadores 5' basados en la secuencia N terminal de anticuerpos purificados (Benhar y Pastan. 1994. Protein Engineering 7:1509); amplificación rápida de extremos de ADNc (Ruberti, F. et al. 1994. J. Immunol. Methods 173:33); secuencias líder de anticuerpo (Larrick et al. 1989 Biochem. Biophys. Res. Commun. 160:1250). La clonación de secuencias de anticuerpo se describe además en Newman et al., patente de Estados Unidos n.° 5.658.570, presentada el 25 de enero de 1995.

Una región constante de Ig usada en este documento puede incluir todos los dominios y la región de bisagra o parte de la misma. La región constante de Ig o una parte de la misma puede comprender el dominio CH2, el dominio CH3 y una región de bisagra, es decir, una región Fc o un compañero de unión a FcRn.

Como se usa en este documento, la expresión "región Fc" se define como la parte de un polipéptido que corresponde a la región Fc de Ig natural, es decir, formada por la asociación dimérica de los dominios Fc respectivos de sus dos cadenas pesadas. Una región Fc natural forma un homodímero con otra región Fc. En contraste, la expresión "región Fc fusionada genéticamente" o "región Fc monocatenaria" (región scFc), como se usa en este documento, se refiere a una región Fc dimérica sintética compuesta de dominios Fc ligados genéticamente dentro de una sola cadena polipeptídica (es decir, codificados en una sola secuencia genética contigua).

En una realización, la "región Fc" se refiere a la parte de una sola cadena pesada de Ig que empieza en la región de bisagra exactamente anterior del sitio de escisión con papaína (es decir, el residuo 216 en IgG, aceptando el primer residuo de la región constante de la cadena pesada como 114) y finalizando en el extremo C del anticuerpo. Por consiguiente, un dominio Fc completo comprende al menos un dominio de bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3.

La región Fc de una región constante de Ig, dependiendo del isotipo de la Ig, puede incluir los dominios CH2, CH3 y CH4, así como la región de bisagra. Las proteínas quiméricas que comprenden una región Fc de una Ig confieren varias propiedades deseables a una proteína quimérica, incluyendo estabilidad aumentada, semivida sérica aumentada (véase Capon et al., 1989, Nature 337: 525), así como unión a receptores de Fc tal como el receptor de Fc neonatal (FcRn) (patentes de Estados Unidos n.° 6.086.875, 6.485.726, 6.030.613; documento WO 03/077834; documento US2003-0235536A1).

Una región constante de Ig o una parte de la misma puede ser un compañero de unión a FcRn. FcRn es activo en tejidos epiteliales adultos y se expresa en la luz de los intestinos, vías respiratorias pulmonares, superficies nasales, superficies vaginales, superficies del colon y rectales (patente de Estados Unidos n.° 6.485.726). Un compañero de unión a FcRn es una parte de una Ig que se une a FcRn.

El receptor FcRn se ha aislado de varias especies de mamífero incluyendo seres humanos. Las secuencias del FcRn humano, FcRn de mono, FcRn de rata y FcRn de ratón son conocidas (Story et al. 1994, J. Exp. Med. 180:2377). El receptor FcRn se une a IgG (pero no a otras clases de Ig tales como IgA, IgM, IgD e IgE) a pH relativamente bajo, transporta activamente la IgG de forma transcelular en una dirección luminal a serosa, y después libera la IgG al pH relativamente más alto encontrado en los líquidos intersticiales. Se expresa en tejido epitelial adulto (patentes de Estados Unidos n.26.485.726, 6.030.613, 6.086.875; documento WO 03/077834; documento US2003-0235536A1), incluyendo epitelio pulmonar e intestinal (Israel et al. 1997, Immunology 92:69), epitelio tubular proximal renal (Kobayashi et al. 2002, Am. J. Physiol. Renal Physiol. 282:F358), así como epitelio nasal, superficies vaginales y superficies del sistema biliar.

Los compañeros de unión a FcRn útiles en la presente invención abarcan moléculas que pueden unirse específicamente por el receptor FcRn, incluyendo IgG completa, el fragmento Fc de IgG y otros fragmentos que incluyen la región de unión completa del receptor FcRn. La región de la parte Fc de IgG que se une al receptor FcRn se ha descrito basándose en cristalografía de rayos X (Burmeister et al. 1994, Nature 372:379). El área de contacto principal del Fc con el FcRn está cerca de la unión de los dominios CH2 y CH3. Los contactos de Fc-FcRn se producen todos dentro de una sola cadena pesada de Ig. Los compañeros de unión a FcRn incluyen IgG completa, el fragmento Fc de IgG y otros fragmentos de IgG que incluyen la región de unión completa de FcRn. Los sitios de contacto principales incluyen los residuos aminoacídicos 248, 250-257, 272, 285, 288, 290-291,308-311 y 314 del dominio CH2 y los residuos aminoacídicos 385-387, 428 y 433-436 del dominio CH3. Las referencias a numeración de aminoácidos de Ig o fragmentos de Ig, o regiones, se basan todas en Kabat et al. 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Public Health, Bethesda, Md.

Las regiones Fc o compañeros de unión a FcRn unidos a FcRn pueden trasladarse de forma eficaz a través de las barreras epiteliales mediante FcRn, proporcionando, por tanto, un medio no invasivo para administrar de forma sistémica una molécula terapéutica deseada. Además, las proteínas de fusión que comprenden una región Fc o un compañero de unión a FcRn se endocitan por células que expresan el FcRn. Pero, en lugar de marcarse para degradación, estas proteínas de fusión se reciclan a la circulación de nuevo, aumentando, por tanto, la semivida in vivo de estas proteínas. Las partes de las regiones constantes de Ig pueden ser una región Fc o un compañero de unión a FcRn que típicamente se asocia, mediante enlaces disulfuro y otras interacciones no específicas, con otra región Fc u otro compañero de unión a FcRn para formar dímeros y multímeros de orden superior.

Dos receptores FcRn pueden unirse a una sola molécula de Fc. Los datos cristalográficos sugieren que cada molécula de FcRn se une a un solo polipéptido del homodímero de Fc. En una realización, la unión del compañero de unión a FcRn, por ejemplo, un fragmento Fc de una IgG, a una molécula biológicamente activa proporciona un medio para suministrar la molécula biológicamente activa por vía oral, bucal, sublingual, rectal, vaginal, como un aerosol administrado por vía nasal o mediante una vía pulmonar, o mediante una vía ocular. En otra realización, la proteína quimérica puede administrarse de forma invasiva, por ejemplo, por vía subcutánea, por vía intravenosa.

Una región de compañero de unión a FcRn es una molécula o una parte de la misma que puede unirse específicamente por el receptor FcRn con el consecuente transporte activo mediante el receptor FcRn de la región Fc. Unirse específicamente se refiere a dos moléculas que forman un complejo que es relativamente estable en condiciones fisiológicas. La unión específica se caracteriza por una alta afinidad y una capacidad de baja a moderada que se distingue de la unión no específica que habitualmente tiene una baja afinidad con una capacidad de moderada a alta. Típicamente, la unión se considera específica cuando la constante de afinidad KA es mayor de 106 M-1, o mayor de 108 M-1. Si es necesario, la unión no específica puede reducirse sin afectar sustancialmente a la unión específica variando las condiciones de unión. Las condiciones de unión apropiadas, tales como la concentración de las moléculas, la fuerza iónica de la solución, la temperatura, el tiempo que se deja para la unión, la concentración de un agente bloqueante (por ejemplo, seroalbúmina, caseína de la leche), etc., pueden optimizarlas los expertos en la materia usando técnicas rutinarias.

En determinadas realizaciones, una proteína quimérica de la invención comprende una o más regiones Fc truncadas que son, no obstante, suficientes para conferir propiedades de unión al receptor de Fc (FcR) a la región Fc. Por ejemplo, la parte de una región Fc que se une a FcRn (es decir, la parte de unión a FcRn) comprende de aproximadamente los aminoácidos 282-438 de IgG1, numeración EU (siendo los sitios de contacto principales los aminoácidos 248, 250-257, 272, 285, 288, 290-291,308-311 y 314 del dominio CH2 y los residuos aminoacídicos 385 387, 428 y 433-436 del dominio CH3). Por tanto, una región Fc de la invención puede comprender o consistir en una parte de unión a FcRn. Las partes de unión a FcRn pueden derivar de cadenas pesadas de cualquier isotipo, incluyendo IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. En una realización, se usa una parte de unión a FcRn de un anticuerpo del isotipo humano IgG1. En otra realización, se usa una parte de unión a FcRn de un anticuerpo del isotipo humano IgG4.

En otra realización, la "región Fc" incluye una secuencia de aminoácidos de un dominio Fc o derivada de un dominio Fc. En determinadas realizaciones, una región Fc comprende al menos uno de: un dominio de bisagra (por ejemplo, región de bisagra superior, media y/o inferior) (aproximadamente los aminoácidos 216-230 de una región Fc de anticuerpo de acuerdo con la numeración EU), un dominio CH2 (aproximadamente los aminoácidos 231-340 de una región Fc de anticuerpo de acuerdo con la numeración EU), un dominio CH3 (aproximadamente los aminoácidos 341 -438 de una región Fc de anticuerpo de acuerdo con la numeración EU), un dominio CH4, o una variante, parte o fragmento de los mismos. En otras realizaciones, una región Fc comprende un dominio Fc completo (es decir, un dominio de bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3). En algunas realizaciones, una región Fc comprende, consiste esencialmente en o consiste en un dominio de bisagra (o una parte del mismo) fusionado a un dominio CH3 (o una parte del mismo), un dominio de bisagra (o una parte del mismo) fusionado a un dominio CH2 (o una parte del mismo), un dominio CH2 (o una parte del mismo) fusionado a un dominio CH3 (o una parte del mismo), un dominio CH2 (o una parte del mismo) fusionado tanto a un dominio de bisagra (o una parte del mismo) como a un dominio CH3 (o una parte del mismo). En otras realizaciones más, una región Fc carece de al menos una parte de un dominio CH2 (por ejemplo, todo o parte de un dominio CH2). En una realización particular, una región Fc comprende o consiste en los aminoácidos correspondientes a los números EU 221 a 447.

Las regiones Fc indicadas como F, F1 o F2 en este documento pueden obtenerse de varias fuentes diferentes. En una realización, una región Fc del polipéptido se obtiene de una Ig humana. Se entiende, sin embargo, que una región Fc puede obtenerse de una Ig de otra especie de mamífero, incluyendo, por ejemplo, una especie de roedor (por ejemplo, un ratón, rata, conejo o cobaya) o de primate no humano (por ejemplo, chimpancé, macaco). Además, el polipéptido de los dominios Fc o partes de los mismos puede obtenerse de cualquier clase de Ig, incluyendo IgM, IgG, IgD, IgA e IgE, y cualquier isotipo de Ig, incluyendo IgG 1, IgG2, IgG3 e IgG4. En otra realización, se usa el isotipo humano IgG1.

En determinadas realizaciones, la variante de Fc confiere un cambio en al menos una función efectora conferida por una región Fc que comprende dicho dominio Fc de tipo silvestre (por ejemplo, una mejora o reducción en la capacidad de la región Fc de unirse a receptores de Fc (por ejemplo, F^cyRI, F^cyRII o F^cyRIII) o proteínas del complemento (por ejemplo, C1q), o de desencadenar la citotoxicidad dependiente de anticuerpos (ADCC), fagocitosis o citotoxicidad dependiente del complemento (CDCC)). En otras realizaciones, la variante de Fc proporciona un residuo de cisteína manipulado.

Las regiones Fc de la invención pueden emplear variantes de Fc reconocidas en la técnica que se sabe que confieren un cambio (por ejemplo, una potenciación o reducción) en la función efectora y/o unión a FcR o FcRn. Específicamente, una molécula de unión de la invención puede incluir, por ejemplo, un cambio (por ejemplo, una sustitución) en una o más de las posiciones aminoacídicas divulgadas en las publicaciones PCT internacionales WO88/07089A1, WO96/14339A1, WO98/05787A1, WO98/23289A1, WO99/51642A1, WO99/58572A1, WO00/09560A2, WO00/32767A1, WO00/42072A2, WO02/44215A2, WO02/060919A2, WO03/074569A2, WO04/016750A2, WO04/029207A2, WO04/035752A2, WO04/063351A2, WO04/074455A2, WO04/099249A2, WO05/040217A2, WO04/044859, WO05/070963A1, WO05/077981A2, WO05/092925A2, WO05/123780A2, WO06/019447A1, WO06/047350A2 y WO06/085967A2; las publicaciones de patente de Estados Unidos n.° US2007/0231329, US2007/0231329, US2007/0237765, US2007/0237766, US2007/0237767, US2007/0243188, US20070248603, US20070286859, US20080057056; o las patentes de Estados Unidos 5.648.260; 5.739.277; 5.834.250; 5.869.046; 6.096.871; 6.121.022; 6.194.551; 6.242.195; 6.277.375; 6.528.624; 6.538.124; 6.737.056; 6.821.505; 6.998.253; 7.083.784; 7.404.956 y 7.317.091. En una realización, el cambio específico (por ejemplo, la sustitución específica de uno o más aminoácidos divulgados en la técnica) puede hacerse en una o más de las posiciones aminoacídicas divulgadas. En otra realización, puede hacerse un cambio diferente en una o más de las posiciones aminoacídicas divulgadas (por ejemplo, la sustitución diferente de una o más posiciones aminoacídicas divulgadas en la técnica).

La región Fc o compañero de unión a FcRn de IgG puede modificarse de acuerdo con procedimientos bien reconocidos tales como mutagénesis dirigida al sitio y similares para producir IgG modificada o fragmentos de Fc o partes de los mismos que se unirán por FcRn. Dichas modificaciones incluyen modificaciones lejos de los sitios de contacto de FcRn, así como modificaciones dentro de los sitios de contacto que conservan o incluso potencian la unión al FcRn. Por ejemplo, los siguientes residuos aminoacídicos individuales en Fc de IgG 1 humana (Fcy1 ) pueden sustituirse sin pérdida significativa de afinidad de unión de Fc por FcRn: P238A, S239A, K246A, K248A, ^d249A, M252A, T256A, E258A, T260A, D265A, S267A, H268A, E269A, D270A, E272A, L274A, N276A, Y278A, D280A, V282A, E283A, H285A, N286A, T289A, K290A, R292A, E293A, E294A, Q295A, Y296F, N297A, S298A, Y300F, R301A, V303A, V305A, T307A, L309A, Q311A, D312A, N315A, K317A, E318A, K320A, K322A, S324A, K326A, A327Q, P329A, A330Q, P331A, E333A, K334A, T335A, S337A, K338A, K340A, Q342A, R344A, E345A, Q347A, R355A, E356A, M358A, T359A, K360A, N361A, Q362A, Y373A, S375A, D376A, A378Q, E380A, E382A, S383A, N384A, Q386A, E388A, N389A, N390A, Y391F, K392A, L398A, S400A, D401A, D413A, K414A, R416A, Q418A, Q419A, N421A, V422A, S424A, E430A, N434A, T437A, Q438A, K439A, S440A, S444A, y K447A, donde, por ejemplo, P238A representa prolina de tipo silvestre sustituida por alanina en el número de posición 238. Como ejemplo, una realización específica incorpora la mutación N297A, que elimina un sitio de N-glucosilación altamente conservado. Además de alanina, pueden sustituirse otros aminoácidos en el lugar de aminoácidos de tipo silvestre en las posiciones especificadas anteriormente. Pueden introducirse mutaciones individualmente en Fc dando lugar a más de cien regiones Fc distintas de Fc natural. Además, pueden introducirse combinaciones de dos, tres o más de estas mutaciones individuales juntas, dando lugar a cientos más de regiones Fc. Además, una región Fc de una construcción de la invención puede mutarse y la otra región Fc de la construcción puede no mutarse en absoluto, o ambas pueden mutarse, pero con diferentes mutaciones.

Determinadas mutaciones anteriores pueden conferir nueva funcionalidad en la región Fc o compañero de unión a FcRn. Por ejemplo, una realización incorpora N297A, eliminando un sitio de N-glucosilación altamente conservado. El efecto de esta mutación es reducir la inmunogenia, potenciando de ese modo la semivida en circulación de la región Fc, y hacer que la región Fc sea incapaz de unirse a F^cyRI, F^cyRIIA, F^cyRIIB y F^cyRIIIA, sin comprometer la afinidad por FcRn (Routledge et al. 1995, Transplantation 60:847; Friend et al. 1999, Transplantation 68:1632; Shields et al.

1995, J. Biol. Chem. 276:6591). Como ejemplo adicional de la nueva funcionalidad que surge de las mutaciones descritas anteriormente puede aumentarse la afinidad por FcRn más allá de la de tipo silvestre en algunos casos. Esta afinidad aumentada puede reflejar una tasa "de asociación" aumentada, una tasa de "disociación" disminuida o tanto una tasa "de asociación" aumentada como una tasa de "disociación" disminuida. Ejemplos de mutaciones que se cree que confieren una afinidad aumentada por FcRn incluyen, aunque sin limitación, T256A, T307A, E380A y N434A (Shields et al. 2001, J. Biol. Chem. 276:6591).

Además, al menos tres receptores de Fc gamma humanos parecen reconocer un sitio de unión en IgG dentro de la región de bisagra inferior, en general los aminoácidos 234-237. Por lo tanto, otro ejemplo de la nueva funcionalidad y la posible inmunogenia disminuida puede surgir de mutaciones en esta región, como, por ejemplo, remplazando los aminoácidos 233-236 de IgG1 humana "ELLG" en la secuencia correspondiente de IgG2 "PVA" (con eliminación de un aminoácido). Se ha demostrado que F^cyRI, F^cyRII y F^cyRIII, que median diversas funciones efectoras, se unirán a IgG1 cuando se hayan introducido dichas mutaciones. Ward y Ghetie 1995, Therapeutic Immunology 2:77 y Armour et al. 1999, Eur. J. Immunol. 29:2613.

La región constante de Ig o una parte de la misma, por ejemplo, una región Fc, puede ser un polipéptido que incluye la secuencia PKNSSMISNTP (^sE^qID NO: 89 o SEQ ID NO: 3 de la patente de Estados Unidos n.° 5.739.277) y que opcionalmente incluye además una secuencia seleccionada de HQSLGTQ (SEQ ID NO: 90), HQNLSDGK (SEQ ID NO: 91), HQNISDGK (SEQ ID NO: 92), o VISSHLGQ (SEQ ID NO: 93) (o SEQ ID NOs: 11, 1,2 y 31, respectivamente de la patente de Estados Unidos n.° 5.739.277).

La región constante de inmunoglobulina o una parte de la misma puede comprender una secuencia de aminoácidos en la región de bisagra o una parte de la misma que forma uno o más enlaces disulfuro con otra región constante de inmunoglobulina o una parte de la misma. El enlace disulfuro por parte de la región constante de inmunoglobulina o una parte de la misma sitúa juntos el primer polipéptido que comprende FVIII y el segundo polipéptido que comprende el fragmento de VWF, de modo que el VWF endógeno no remplaza el fragmento de VWF y no se une al FVIII. Por lo tanto, el enlace disulfuro entre la primera región constante de inmunoglobulina o una parte de la misma y una segunda región constante de inmunoglobulina o una parte de la misma evita la interacción entre VWF endógeno y la proteína FVIII. Esta inhibición de la interacción entre el VWF y la proteína de FVIII permite que la semivida de la proteína quimérica vaya más allá del límite de dos veces. La región de bisagra o una parte de la misma puede unirse además a uno o más dominios de CH1, CH2, CH3, un fragmento de los mismos y cualquier combinación de los mismos. En particular, la región constante de inmunoglobulina o una parte de la misma puede ser una región de bisagra y CH2.

La región constante de Ig o una parte de la misma puede estar hemiglucosilada. Por ejemplo, la proteína quimérica que comprende dos regiones Fc o compañeros de unión a FcRn puede contener una primera región Fc glucosilada (por ejemplo, una región CH2 glucosilada) o compañero de unión a FcRn y una segunda región Fc aglucosilada (por ejemplo, una región CH2 aglucosilada) o compañero de unión a FcRn. En una realización, puede interponerse un conector entre las regiones Fc glucosiladas y aglucosiladas. En otra realización, la región Fc o compañero de unión a FcRn está completamente glucosilado, es decir, todas las regiones Fc están glucosiladas. En otras realizaciones, la región Fc puede estar aglucosilada, es decir, ninguno de los restos de Fc está glucosilado.

Una proteína quimérica como se divulga puede comprender una sustitución aminoacídica en una región constante de Ig o una parte de la misma (por ejemplo, variantes de Fc), que altera las funciones efectoras independientes de antígeno de la región constante de Ig, en particular la semivida en circulación de la proteína.

Dichas proteínas presentan unión aumentada o disminuida a FcRn en comparación con proteínas que carecen de estas sustituciones y, por lo tanto, tienen una semivida aumentada o disminuida en suero, respectivamente. Se prevé que las variantes de Fc con afinidad mejorada por FcRn tendrán semividas en suero más largas, y dichas moléculas tienen aplicaciones útiles en métodos de tratamiento de mamíferos donde se desea una semivida larga del polipéptido administrado, por ejemplo, para tratar una enfermedad o trastorno crónico (véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos 7.348.004, 7.404.956 y 7.862.820). En contraste, se espera que las variantes de Fc con afinidad de unión a FcRn disminuida tengan semividas más cortas, y dichas moléculas también son útiles, por ejemplo, para administración a un mamífero donde puede ser ventajoso un tiempo en circulación acortado, por ejemplo, para imágenes de diagnóstico in vivo o en situaciones donde el polipéptido de partida tiene efectos secundarios tóxicos cuando está presente en la circulación durante periodos prolongados. Las variantes de Fc con afinidad de unión a FcRn disminuida también tienen menor probabilidad de cruzar la placenta y, por tanto, también son útiles en el tratamiento de enfermedades o trastornos en mujeres embarazadas. Además, otras aplicaciones en que puede desearse afinidad de unión a FcRn reducida incluyen aquellas aplicaciones en que se desea localización en el cerebro, el riñón y/o el hígado. En una realización ejemplar, la proteína quimérica de la invención presenta transporte reducido a través del epitelio de los glomérulos renales de la vasculatura. En otra realización, la proteína quimérica de la invención presenta transporte reducido a través de la barrera hematoencefálica (BBB) del cerebro, al espacio vascular. En una realización, una proteína con unión alterada a FcRn comprende al menos una región Fc o compañero de unión a FcRn (por ejemplo, una o dos regiones Fc o compañeros de unión a FcRn) que tiene una o más sustituciones aminoacídicas dentro del "bucle de unión a FcRn" de una región constante de Ig. El bucle de unión a FcRn está compuesto de los residuos aminoacídicos 280-299 (de acuerdo con la numeración EU) de una región Fc de longitud completa de tipo silvestre. Una región constante de Ig o una parte de la misma en una proteína quimérica como se divulga que tiene afinidad de unión a FcRn alterada puede comprender al menos una región Fc o compañero de unión a FcRn que tiene una o más sustituciones aminoacídicas dentro de la "zona de contacto" con FcRn de 15 Á. Como se usa en este documento, la expresión "zona de contacto" con FcRn de 15 Á incluye residuos en las siguientes posiciones de un resto Fc de longitud completa de tipo silvestre: 243-261,275-280, 282-293, 302-319, 336-348, 367, 369, 372-389, 391, 393, 408, 424, 425-440 (numeración EU). Una región constante de Ig o una parte de la misma como se divulga que tiene afinidad de unión a FcRn alterada puede comprender al menos una región Fc o compañero de unión a FcRn que tiene una o más sustituciones aminoacídicas en una posición aminoacídica correspondientes a una cualquiera de las siguientes posiciones EU: 256, 277-281,283-288, 303-309, 313, 338, 342, 376, 381 ,384, 385, 387, 434 (p. ej., N434A o N434K), y 438. Sustituciones aminoacídicas ejemplares que alteraban la actividad de unión a FcRn se divulgan en la publicación PCT internacional n.° WO05/047327.

Una región Fc o compañero de unión a FcRn usado en la invención también puede comprender una sustitución aminoacídica reconocida en la técnica que altera la glucosilación de la proteína quimérica. Por ejemplo, la región Fc o compañero de unión a FcRn de la proteína quimérica ligada a un fragmento de VWF o una proteína FVIII puede comprender una región Fc que tiene una mutación que da lugar a glucosilación reducida (por ejemplo, glucosilación ligada a N u O) o puede comprender una glucoforma alterada del resto Fc de tipo silvestre (por ejemplo, un glucano bajo en fucosa o libre de fucosa).

Una proteína quimérica sin procesar puede comprender una región Fc fusionada genéricamente (es decir, región scFc) que tiene dos o más de sus regiones constantes de Ig constituyentes o una parte de las mismas independientemente seleccionadas de la región constante de Ig o una parte de la misma descrita en este documento. En una realización, las regiones Fc de una región Fc dimérica son iguales. En otra realización, al menos dos de las regiones Fc son diferentes. Por ejemplo, las regiones Fc o compañeros de unión a FcRn de las proteínas de la invención comprenden el mismo número de residuos aminoacídicos o pueden diferir en la longitud en uno o más residuos aminoacídicos (por ejemplo, en aproximadamente 5 residuos aminoacídicos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4 o 5 residuos aminoacídicos), aproximadamente 10 residuos, aproximadamente 15 residuos, aproximadamente 20 residuos, aproximadamente 30 residuos, aproximadamente 40 residuos o aproximadamente 50 residuos). En otras realizaciones más, las regiones Fc o compañeros de unión a FcRn de la proteína de la invención pueden diferir en la secuencia en una o más posiciones aminoacídicas. Por ejemplo, al menos dos de las regiones Fc o compañeros de unión a FcRn pueden diferir en aproximadamente 5 posiciones aminoacídicas (por ejemplo, 1, 2, 3, 4 o 5 posiciones aminoacídicas), aproximadamente 10 posiciones, aproximadamente 15 posiciones, aproximadamente 20 posiciones, aproximadamente 30 posiciones, aproximadamente 40 posiciones o aproximadamente 50 posiciones).

II.E. Conectores

La proteína quimérica de la presente invención comprende además uno o más conectores. Un tipo de conectores es un conector escindible, que puede escindirse por diversas proteasas cuando se administra a un sujeto in vivo, por ejemplo, en un sitio de coagulación. El conector escindible puede permitir la escisión del resto, por ejemplo, una proteína VWF, de la secuencia de XTEN, por tanto, de la proteína quimérica en el sitio de la reacción en cadena de coagulación, permitiendo de ese modo que FVIII activado (FVIIIa) obtenga su actividad de FVIIIa. Otro tipo de conectores es un conector procesable, que contiene un sitio de escisión intracelular y, por tanto, puede escindirse mediante una enzima de procesamiento intracelular en una célula hospedadora, permitiendo la expresión conveniente de un polipéptido y formación de una proteína quimérica.

Puede estar presente uno o más conectores entre dos proteínas cualesquiera en la proteína quimérica. La proteína quimérica de acuerdo con la invención comprende un primer polipéptido que comprende (i) una proteína FVIII y (ii) una primera región Fc de la misma y un segundo polipéptido que comprende (iii) un fragmento de VWF, (iv) un conector escindible, (v) una secuencia de XTEN y (vi) una segunda región Fc. En algunas realizaciones, el primer polipéptido comprende además un conector, por ejemplo, un conector escindible entre la proteína FVIII y la primera región Fc.

La proteína quimérica puede comprender una sola cadena que comprende (i) una proteína FVIII, (ii) una primera región constante de Ig o una parte de la misma, (iii) un conector (por ejemplo, un conector procesable), (iv) una proteína VWF, (v) una secuencia de XTEN y (vi) una segunda región constante de Ig o una parte de la misma. Una proteína quimérica puede comprender una sola cadena que comprende (i) una proteína FVIII, (ii) una primera región constante de Ig o una parte de la misma, (iii) un primer conector (por ejemplo, un conector procesable), (iv) una proteína VWF, (v) un segundo conector (por ejemplo, un conector escindible), (vi) una secuencia de XTEN y (vii) una segunda región constante de Ig o una parte de la misma. El conector procesable puede procesarse después de que la proteína quimérica se exprese en la célula hospedadora; por tanto, la proteína quimérica producida en la célula hospedadora puede estar en la forma final que comprende dos o tres cadenas polipeptídicas.

El conector puede comprender cualquier molécula orgánica. En una realización, el conector comprende un polímero, por ejemplo, polietilenglicol (PEG) o hidroxietil almidón (HES). En otra realización, el conector comprende una secuencia de aminoácidos. El conector puede comprender al menos aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400 ,500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, o 2000 aminoácidos. El conector puede comprender 1-5 aminoácidos, 1-10 aminoácidos, 1-20 aminoácidos, 10-50 aminoácidos, 50-100 aminoácidos, 100-200 aminoácidos, 200-300 aminoácidos, 300-400 aminoácidos, 400-500 aminoácidos, 500-600 aminoácidos, 600-700 aminoácidos, 700-800 aminoácidos, 800-900 aminoácidos o 900-1000 aminoácidos. En una realización, el conector comprende una secuencia de XTEN. Pueden usarse ejemplos adicionales de XTEN de acuerdo con la presente invención y se divulgan en las publicaciones de patente de Estados Unidos n.2 2010/0239554 A1, 2010/0323956 A1, 2011/0046060 A1, 2011/0046061 A1, 2011/0077199 A1 o 2011/0172146 A1, o las publicaciones de patente internacional n.° WO 2010091122 A1, WO 2010144502 A2, WO 2010144508 A1, WO 2011028228 A1, WO 2011028229 A1 o WO 2011028344 A2. En otra realización, el conector es una secuencia de PAS.

En una realización, el conector es un polímero, por ejemplo, polietilenglicol (PEG) o hidroxietil almidón (HES). En otra realización, el conector es una secuencia de aminoácidos. El conector puede comprender al menos aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, o 2000 aminoácidos. El conector puede comprender 1-5 aminoácidos, 1-10 aminoácidos, 1-20 aminoácidos, 10-50 aminoácidos, 50-100 aminoácidos, 100-200 aminoácidos, 200-300 aminoácidos, 300-400 aminoácidos, 400-500 aminoácidos, 500-600 aminoácidos, 600-700 aminoácidos, 700-800 aminoácidos, 800-900 aminoácidos o 900-1000 aminoácidos.

Ejemplos de conector son bien conocidos en la técnica. En una realización, el conector comprende la secuencia Gn. El conector puede comprender la secuencia (GA)n. El conector puede comprender la secuencia (GGS)n. En otras realizaciones, el conector comprende (GGGS)n(SEQ ID NO: 101). En otras realizaciones más, el conector comprende la secuencia (GGS)n(GGGGS)n(SEQ ID NO: 95). En estos casos, n puede ser un número entero de 1-100. En otros casos, n puede ser un número entero de 1 -20, es decir, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20. Ejemplos de conectores incluyen, aunque sin limitación, G^gG, S^gG^sGGS (S^eQ ⁱD NO: 96), GGSGGSGGSGGSGGG (SEQ ID NO: 97), GGSGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 98), GGSGGSGGSGGSGGSGGS (SEQ ID NO: 99) o GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 100). El conector no elimina o disminuye la actividad de la proteína VWF o la actividad coagulante del factor VIII. Opcionalmente, el conector potencia la actividad de la proteína VWF o la actividad coagulante de la proteína de factor VIII, por ejemplo, disminuyendo adicionalmente los efectos de impedimento estérico y haciendo que la proteína VWF o la parte de factor VIII sea más accesible a su sitio de unión diana.

En una realización, el conector útil para la proteína quimérica es de 15-25 aminoácidos de longitud. En otra realización, el conector útil para la proteína quimérica es de 15-20 aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, el conector para la proteína quimérica es de 10-25 aminoácidos de longitud. En otras realizaciones, el conector para la proteína quimérica es de 15 aminoácidos de longitud. En otras realizaciones más, el conector para la proteína quimérica es (GGGGS)n (SEQ ID NO: 94) donde G representa glicina, S representa serina y n es un número entero de 1 -20.

11. F. Sitios de escisión

Un conector escindible puede incorporar un resto que pueda escindirse químicamente (por ejemplo, hidrólisis de un enlace éster), enzimáticamente (es decir, incorporación de una secuencia de escisión por proteasa) o fotolíticamente (por ejemplo, un cromóforo tal como ácido 3-amino-3-(2-nitrofenil)propiónico (ANP)) para liberar una molécula de otra.

En una realización, un conector escindible comprende uno o más sitios de escisión en el extremo N o el extremo C o ambos. En otra realización, el conector escindible consiste esencialmente en o consiste en uno o más sitios escindibles. En otras realizaciones, el conector escindible comprende secuencias conectoras de aminoácidos heterólogas descritas en este documento o polímeros y uno o más sitios escindibles.

En determinadas realizaciones, un conector escindible comprende uno o más sitios escindibles que pueden escindirse en una célula hospedadora (es decir, sitios de procesamiento intracelular). Ejemplos no limitantes del sitio de escisión incluyen RRRR (SEQ ID NO: 102), RKRRKR (SEQ ID NO: 103) y RRRRS (SEQ ID NO: 104).

En algunas realizaciones, un conector escindible comprende una región a1 de FVIII, una región a2 de FVIII, una región a3 de FVIII, un sitio de escisión por trombina que comprende X-V-P-R (SEQ ID NO: 105) y un motivo de interacción con exositio PARI, en el que X es un aminoácido alifático, o cualquier combinación de los mismos. En una realización, un conector escindible comprende la región a2 que comprende una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente un 80 %, aproximadamente un 85 %, aproximadamente un 90 %, aproximadamente un 95 % o un 100 % idéntica a Glu720 hasta Arg740 correspondiente a FVIII de longitud completa, en el que la región a2 puede escindirse por trombina. En una realización particular, un conector escindible comprende una región a2 que comprende ISDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 106). En otras realizaciones, un conector escindible comprende la región a1 que comprende una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente un 80 %, aproximadamente un 85 %, aproximadamente un 90 %, aproximadamente un 95 % o un 100 % idéntica a Met337 hasta Arg372 correspondiente a FVIII de longitud completa, en el que la región a1 puede escindirse por trombina. En una realización particular, la región a1 comprende ISMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSV (SEQ ID NO: 107). En algunas realizaciones, un conector escindible de la invención comprende la región a3 que comprende una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente un 80 %, aproximadamente un 85 %, aproximadamente un 90 %, aproximadamente un 95 % o un 100 % idéntica a Glu1649 hasta Arg1689 correspondiente a FVIII de longitud completa, en el que la región a3 puede escindirse por trombina. En una realización específica, un conector escindible para la invención comprende una región a3 que comprende ISEITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQ (SEQ ID NO: 108).

En otras realizaciones, un conector escindible comprende el sitio de escisión por trombina que comprende X-V-P-R (SEQ ID NO: 105) y el motivo de escisión con exositio PARI y en el que el motivo de interacción con exositio PARI comprende S-F-L-L-R-N (SEQ ID NO: 109). El motivo de interacción con exositio PARI puede comprender además una secuencia de aminoácidos seleccionada de P, P-N, P-N-D, P-N-D-K (SEQ ID NO: 110), P-N-D-K-Y (SEQ ID NO: 111), P-N-D-K-Y-E (SEQ ID NO: 112), P-N-D-K-Y-E-P (SEQ ID NO: 113), P-N-D-K-Y-E-P-F (SEQ ID NO: 114), P-N-D-K-Y-E-P-F-W (SEQ ID NO: 115), P-N-D-K-Y-E-P-F-W-E (SEQ ID NO: 116), P-N-D-K-Y-E-P-F-W-E-D (SEQ ID NO: 117), P-N-D-K-Y-E-P-F-W-E-D-E (SEQ ID NO: 118), P-N-D-K-YE-P-F-W-E-D-E-E (SEQ ID NO: 119), P-N-D-K-Y-E-P-F-W-E-D-E-E-S (SEQ ID NO: 120) o cualquier combinación de las mismas. En algunas realizaciones, el aminoácido alifático se selecciona de glicina, alanina, valina, leucina o isoleucina.

En otras realizaciones, un conector escindible comprende uno o más sitios de escisión que se escinden por una proteasa después de administrar una proteína quimérica que comprende el conector escindible a un sujeto. En una realización, el sitio de escisión es escinde por una proteasa seleccionada del grupo que consiste en factor XIa, factor XIIa, calicreína, factor VIIa, factor IXa, factor Xa, factor IIa (trombina), elastasa-2, MMP-12, MMP-13, MMP-17 y MMP-20. En otra realización, el sitio de escisión se selecciona del grupo que consiste en un sitio de escisión por FXIa (por ejemplo, KLTR|AET (SEQ ID NO: 121)), un sitio de escisión por FXIa (por ejemplo, DFTR|VVG (SEQ ID NO: 122)), un sitio de escisión por FXIIa (por ejemplo, TMTR|IVGG (SEQ ID NO: 123)), un sitio de escisión por calicreína (por ejemplo, SPFR|S^tG^g(SEQ ID NO: 124)), un sitio de escisión por FVIIa (por ejemplo, LQVR|IVGG (SEQ ID N^o: 125)), un sitio de escisión por FIXa (por ejemplo, PLGR|IVGG (SEQ ID NO: 126)), un sitio de escisión por Fxa (por ejemplo, IEGR|TVGG (SEQ ID NO: 127)), un sitio de escisión por FIIa (trombina) (por ejemplo, LTPR^^sL^lV (S^eQ ID NO: 128)), un sitio de escisión por elastasa-2 (por ejemplo, LGPV|SGVP (SEQ ID NO: 129)), un sitio de escisión por granzima-B (por ejemplo, VAGD|SLEE (SEQ ID n O: 130)), un sitio de escisión por MMP-12 (por ejemplo, GPAG|LGGA (SEQ ID ⁿO: 131)), un sitio de escisión por MMP-13 (por ejemplo, GPAG|LRGA (SEQ ID NO: 132)), un sitio de escisión por MMP-17 (por ejemplo, APLG^l Rl R (SEQ ID NO: 133)), un sitio de escisión por MMP-20 (por ejemplo, PALP|LVAQ (SEQ ID NO: 134)), un sitio de escisión por TEV (por ejemplo, ENLYFQ|G (SEQ ID NO: 135)), un sitio de escisión por enterocinasa (por ejemplo, DDDK|IVGG (SEQ ID NO: 136)), un sitio de escisión por proteasa 3C (PRESCISSION™) (por ejemplo, l Ev LFQ|Gp (SEQ ID NO: 137)) y un sitio de escisión por sortasa A (por ejemplo, LPKT|GSES) (SEQ ID NO: 138). En determinadas realizaciones, los sitios de escisión por FXIa incluyen, aunque sin limitación, por ejemplo, TQSFNDFTR (SEQ ID NO: 1) y SVSQTSKLTR (SEQ ID NO: 3). Sitios de escisión por trombina ejemplares no limitantes incluyen, por ejemplo, DFLAEGGGVR (SEQ ID NO: 4), Tt K iKPR (SEQ ID NO: 5), LVPRG (SEQ ID NO: 6), DKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 88) o IEPRSFS (SEQ ID NO: 194), y una secuencia que comprende, que consiste esencialmente en o que consiste en ALRPR (SEQ ID NO: 7) (por ejemplo, ALRPRVVGGA (SEQ ID NO: 145)).

En una realización específica, el sitio de escisión es TLDPRSFLLRNPNDKYEPFWEDEEK (SEQ ID NO: 146). En otra realización, el sitio de escisión comprende DKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 88) o un fragmento del mismo. En una realización particular, el sitio de escisión comprende IEPRSFS (SEQ ID NO: 194). En otra realización, el sitio de escisión comprende EPRSFS (SEQ ID NO: 195), en el que el sitio de escisión no es la región a2 de longitud completa de FVIII. En otra realización más, el sitio de escisión comprende IEPR (SEQ ID NO: 200). En otra realización, el sitio de escisión comprende IEPR (SEQ ID NO: 200), en el que el sitio de escisión no es la región a2 de longitud completa de FVIII o no comprende la región a2 de longitud completa de FVIII. En otras realizaciones, el sitio de escisión comprende DKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 88), KNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 139), NTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 140), TGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 141), GDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 142), DYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 143), YYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 144), YEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 176), EDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 177), DSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 178), SYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 179), YEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 180), EDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 181), DISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 182), ISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 183), SAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 184), AYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 185), YLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 186), LLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 187), LSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 188), SKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 189), KNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 190), NNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 191), NAIEPRSFS (SEQ ID NO: 192), AIEPRSFS (SEQ ID NO: 193), o IEPRSFS (SEQ ID NO: 194). En otras realizaciones, el sitio de escisión comprende DKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 88), KNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 139), NTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 140), TGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 141), GDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 142), DYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 143), YYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 144), YEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 176), EDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 177), DSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 178), SYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 179), YEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 180), EDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 181), DISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 182), ISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 183), SAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 184), AYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 185), YLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 186), LLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 187), LSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 188), SKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 189), KNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 190), NNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 191), NAIEPRSFS (SEQ ID NO: 192), AIEPRSFS (SEQ ID NO: 193), o IEPRSFS (S^eQ ID NO: 194), en el que el sitio de escisión no es la región a2 de longitud completa de FVIII. En determinadas realizaciones, el conector escindible es escindible en un ensayo de escisión con trombina como se proporciona en este documento o como se sabe en la técnica.

III. Polinucleótidos, vectores y células hospedadoras

En la invención también se proporciona un polinucleótido que codifica una proteína quimérica de la invención. En una realización, la primera cadena polipeptídica y la segunda cadena polipeptídica pueden estar codificadas por una sola cadena polinucleotídica. En otra realización, la primera cadena polipeptídica y la segunda cadena polipeptídica están codificadas por dos polinucleótidos diferentes, es decir, una primera secuencia de nucleótidos y una segunda secuencia de nucleótidos. En otra realización, la primera secuencia de nucleótidos y la segunda secuencia de nucleótidos están en dos polinucleótidos diferentes (por ejemplo, vectores diferentes).

En este documento se divulga un polinucleótido que codifica una sola cadena polipeptídica (por ejemplo, FVIII(X2)-F1-L3-F2-L2-X1-L1-V), en la que FVIII(X2) comprende una proteína FVIII en que se inserta una secuencia de XTEN en uno o más sitios de inserción, F1 comprende una primera región constante de Ig o una parte de la misma, por ejemplo, una primera región Fc, L1 comprende un primer conector, V comprende una proteína VWF, X1 comprende una secuencia de XTEN que tiene menos de 288 aminoácidos de longitud, L2 comprende un segundo conector, L3 comprende un tercer conector y F2 comprende una segunda región constante de Ig o una parte de la misma, por ejemplo, una segunda región Fc. En este documento se divulgan dos polinucleótidos, una primera secuencia polinucleotídica que codifica un primer polipéptido que comprende una proteína FVIII fusionada a una primera región constante de Ig o una parte de la misma y una segunda secuencia polinucleotídica que codifica un segundo polipéptido que comprende una proteína VWF, una secuencia de XTEN que tiene menos de 288 aminoácidos de longitud y una segunda región constante de Ig o una parte de la misma. Una proteína quimérica que comprende dos cadenas polipeptídicas o tres cadenas polipeptídicas puede estar codificada por una sola cadena polinucleotídica, y después procesarse en dos o tres (o más) cadenas polipeptídicas. Además, una proteína quimérica que comprende estas cadenas polipeptídicas puede estar codificada por dos o tres cadenas polinucleotídicas.

En algunas realizaciones, el conjunto de polinucleótidos comprende además una cadena de nucleótidos adicional (por ejemplo, una segunda cadena de nucleótidos cuando el polipéptido quimérico está codificado por una sola cadena polinucleotídica o una tercera cadena de nucleótidos cuando la proteína quimérica está codificada por dos cadenas polinucleotídicas) que codifica una proteína convertasa. La proteína convertasa puede seleccionarse del grupo que consiste en proproteína convertasa subtilisina/kexina de tipo 5 (PCSK5 o PC5), proproteína convertasa subtilisina/kexina de tipo 7 (PCSK7 o PC5), una Kex 2 de levadura, proproteína convertasa subtilisina/kexina de tipo 3 (PACE o PCSK3), y dos o más combinaciones de las mismas. En algunas realizaciones, la proteína convertasa es PACE, PC5 o PC7. En una realización específica, la proteína convertasa es PC5 o PC7. Véase la solicitud internacional n.2 PCT/US2011/043568.

Como se usa en este documento, un vector de expresión se refiere a cualquier construcción de ácido nucleico que contiene los elementos necesarios para la transcripción y traducción de una secuencia codificante insertada, o en el caso de un vector vírico de ARN, los elementos necesarios para la replicación y traducción, cuando se introduce en una célula hospedadora apropiada. Los vectores de expresión pueden incluir plásmidos, fagómidos, virus y derivados de los mismos.

Los vectores de expresión de la divulgación incluirán polinucleótidos que codifican la proteína quimérica descrita en este documento. Una o más de las secuencias codificantes del primer polipéptido que comprende una proteína FVIII y una primera región constante de Ig, el segundo polipéptido que comprende una proteína VWF, una secuencia de XTEN que tiene menos de 288 aminoácidos y una segunda región constante de Ig o una parte de la misma, o ambos pueden unirse de forma funcional a una secuencia de control de la expresión. Como se usa en este documento, dos secuencias de ácido nucleico se unen de forma funcional cuando se unen covalentemente de tal manera que permita que cada secuencia de ácido nucleico componente retenga su funcionalidad. Una secuencia codificante y una secuencia de control de la expresión génica se dice que están unidas de forma funcional cuando se unen covalentemente de tal manera que sitúen la expresión o transcripción y/o traducción de la secuencia codificante bajo la influencia o control de la secuencia de control de la expresión génica. Dos secuencias de ADN se dice que están unidas de forma funcional si la inducción de un promotor en la secuencia de expresión génica 5' provoca la transcripción de la secuencia codificante y si la naturaleza de la unión entre las dos secuencias de ADN (1) no provoca la introducción de una mutación de desplazamiento del marco de lectura, (2) no interfiere con la capacidad de la región promotora de dirigir la transcripción de la secuencia codificante o (3) no interfiere con la capacidad del transcrito de ARN correspondiente de traducirse en una proteína. Por tanto, una secuencia de expresión génica estaría unida de forma funcional a una secuencia de ácido nucleico codificante si la secuencia de expresión génica pudiera lograr la transcripción de esta secuencia de ácido nucleico codificante de modo que el transcrito resultante se traduzca en la proteína o polipéptido deseado.

Una secuencia de control de la expresión génica, como se usa en este documento, es cualquier secuencia de nucleótidos reguladora, tal como una secuencia promotora o combinación de promotor-potenciador, que facilita la transcripción y traducción eficaces del ácido nucleico codificante al que está unida de forma funcional. La secuencia de control de la expresión génica puede ser, por ejemplo, un promotor de mamífero o vírico, tal como un promotor constitutivo o inducible. Los promotores de mamífero constitutivos incluyen, aunque sin limitación, los promotores para los siguientes genes: hipoxantina fosforribosil transferasa (HPRT), adenosina desaminasa, piruvato cinasa, promotor de beta-actina, y otros promotores constitutivos. Promotores víricos ejemplares que funcionan constitutivamente en células eucarióticas incluyen, por ejemplo, promotores del citomegalovirus (CMV), virus de simio (por ejemplo, SV40), papilomavirus, adenovirus, virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus del sarcoma de Rous, citomegalovirus, las repeticiones terminales largas (LTR) del virus de la leucemia de Moloney y otros retrovirus, y el promotor de la timidina cinasa del virus del herpes simple. Otros promotores constitutivos son conocidos por los expertos en la materia. Los promotores útiles como secuencias de expresión génica de la invención también incluyen promotores inducibles. Los promotores inducibles se expresan en presencia de un agente inductor. Por ejemplo, el promotor de la metalotioneína se induce para promover la transcripción y traducción en presencia de determinados iones metálicos. Otros promotores inducibles son conocidos por los expertos en la materia.

En general, la secuencia de control de la expresión génica incluirá, según lo necesario, secuencias que no se transcriben 5' y no se traducen 5' implicadas con el inicio de la transcripción y la traducción, respectivamente, tal como una secuencia TATA, secuencia de caperuza, secuencia CAAT y similares. Espacialmente, dichas secuencias que no se transcriben 5' incluirán una región promotora que incluye una secuencia promotora para el control transcripcional del ácido nucleico codificante unido de forma funcional. Las secuencias de expresión génica opcionalmente incluyen secuencias potenciadoras o secuencias activadores anteriores según se desee.

Los vectores víricos incluyen, aunque sin limitación, secuencias de ácido nucleico de los siguientes virus: retrovirus, tal como el virus de la leucemia murina de Moloney, virus del sarcoma murino de Harvey, virus del tumor mamario murino y virus del sarcoma de Rous; adenovirus, virus adenoasociado; virus del tipo SV40; poliomavirus; virus de Epstein-Barr; papilomavirus; herpesvirus; virus de la variolovacuna; poliovirus; y virus ARN tal como un retrovirus. Se pueden emplear fácilmente otros vectores bien conocidos en la técnica. Determinados vectores víricos se basan en virus eucarióticos no citopáticos en que se han remplazado genes no esenciales con el gen de interés. Virus no citopáticos incluyen retrovirus, cuyo ciclo vital implica retrotranscripción del ARN vírico genómico en ADN con posterior integración provírica en ADN de la célula hospedadora. Los retrovirus se han aprobado para ensayos de genoterapia en seres humanos. Los más útiles son aquellos retrovirus que son deficientes en la replicación (es decir, puede dirigir la síntesis de las proteínas deseadas, pero no pueden fabricar una partícula infecciosa). Dichos vectores de expresión retrovíricos genéticamente alterados tienen utilidad general para la transducción de alta eficacia de genes in vivo. Se proporcionan protocolos convencionales para producir retrovirus deficientes en la replicación (incluyendo las etapas de incorporación de material genético exógeno en un plásmido, transfección de una línea celular de empaquetado con plásmido, producción de retrovirus recombinantes mediante la línea celular de empaquetado, colección de partículas víricas de medio de histocultivo, e infección de las células diana con partículas víricas) en Kriegler, M., Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, W.H. Freeman Co., Nueva York (1990) y Murry, E. J., Methods in Molecular Biology, Vol. 7, Humana Press, Inc., Cliffton, N.J. (1991).

En una realización, el virus es un virus adenoasociado, un virus de ADN bicatenario. El virus adenoasociado puede manipularse para que sea deficiente en la replicación y pueda infectar una amplia serie de tipos celulares y especies. Además, tiene ventajas tales como estabilidad en calor y disolvente lipídico; altas frecuencias de transducción en células de diversas estirpes, incluyendo células hematopoyéticas; y ausencia de inhibición de superinfección permitiendo, por tanto, múltiples series de transducciones. Según se informa, el virus adenoasociado puede integrarse en ADN celular humano de una manera específica de sitio, minimizando de ese modo la posibilidad de mutagénesis por inserción y variabilidad de la expresión del gen insertado característica de infección retrovírica. Además, se han seguido infecciones por virus adenoasociado de tipo silvestre en histocultivo durante más de 100 pases en ausencia de presión selectiva, lo que implica que la integración genómica del virus adenoasociado es un acontecimiento relativamente estable. El virus adenoasociado también puede funcionar de una manera extracromosómica.

Otros vectores incluyen vectores plasmídicos. Los vectores plasmídicos se han descrito ampliamente en la técnica y son bien conocidos por los expertos en la materia. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. En los últimos años, los vectores plasmídicos se han encontrado particularmente ventajosos para suministrar genes a células in vivo a causa de su incapacidad de replicarse dentro e integrarse en un genoma hospedador. Estos plásmidos, sin embargo, que tienen un promotor compatible con la célula hospedadora, pueden expresar un péptido a partir de un gen codificado de forma funcional dentro del plásmido. Algunos plásmidos usados normalmente disponibles de proveedores comerciales incluyen pBR322, pUC18, pUC19, diversos plásmidos pcDNA, pRC/CMV, diversos plásmidos pCMV, pSV40 y pBlueScript. Ejemplos adicionales de plásmidos específicos incluyen pcDNA3.1, número de catálogo V79020; pcDNA3,1/hygro, número de catálogo V87020; pcDNA4/myc-His, número de catálogo V86320; y pBudCE4.1, número de catálogo V53220, todos de Invitrogen (Carlsbad, CA.). Otros plásmidos son bien conocidos por los expertos en la materia. Además, pueden diseñarse plásmidos de forma personalizada usando técnicas convencionales de biología molecular para retirar y/o añadir fragmentos específicos de ADN.

En un sistema de expresión de insecto que puede usarse para producir las proteínas de la invención, se usa el virus de la poliedrosis nuclear de Autographa californita (AcNPV) como vector para expresar los genes exógenos. El virus crece en células de Spodoptera frugiperda. Una secuencia codificante puede clonarse en regiones no esenciales (por ejemplo, el gen de poliedro) del virus y situarse bajo el control de un promotor de ACNPV (por ejemplo, el promotor de poliedro). La inserción satisfactoria de una secuencia codificante provocará la inactivación del gen de poliedro y la producción de virus recombinante no ocluido (es decir, virus que carece de la cubierta proteínica codificada por el gen de poliedro). Estos virus recombinantes se usan entonces para infectar células Spodoptera frugiperda en que se expresa el gen insertado. (Véase, por ejemplo, Smith et al. (1983) J Virol 46:584; patente de Estados Unidos n.° 4.215.051). Ejemplos adicionales de este sistema de expresión pueden encontrarse en Ausubel et al., eds. (1989) Current Protocols in Molecular Biology, vol. 2, Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience.

Otro sistema que puede usarse para expresar las proteínas de la invención es el sistema de expresión del gen de la glutamina sintetasa, también denominado "sistema de expresión de GS" (Lonza Biologics PLC, Berkshire Reino Unido). Este sistema de expresión se describe con detalle en la patente de Estados Unidos n.° 5.981.216.

En células hospedadoras de mamífero, pueden utilizarse varios sistemas de expresión basados en virus. En casos donde se usa un adenovirus como vector de expresión, puede ligarse una secuencia codificante a un complejo de control de la transcripción/traducción de adenovirus, por ejemplo, el promotor tardío y la secuencia líder tripartita. Este gen quimérico después puede insertarse en el genoma de adenovirus por recombinación in vitro o in vivo. La inserción de una región no esencial del genoma vírico (por ejemplo, región E1 o E3) producirá un virus recombinante que es viable y con capacidad de expresar el péptido en hospedadores infectados. (Véase, por ejemplo, Logan y Shenk (1984) Proc Natl Acad Sci USA 81:3655). Como alternativa, puede usarse el promotor de 7,5 K de la variolovacuna. Véase, por ejemplo, Mackett et al. (1982) Proc Natl Acad Sci USA 79:7415; Mackett et al. (1984) J Virol 49:857; Panicali et al. (1982) Proc Natl Acad Sci USA 79:4927.

Para aumentar la eficacia de producción, los polinucleótidos pueden diseñarse para que codifiquen múltiples unidades de la proteína de la invención separadas por sitios de escisión enzimática. El polipéptido resultante puede escindirse (por ejemplo, por tratamiento con la enzima apropiada) para recuperar las unidades polipeptídicas. Esto puede aumentar la producción de polipéptidos dirigidos por un solo promotor. Cuando se usan en sistemas de expresión víricos apropiados, la traducción de cada polipéptido codificado por el ARNm se dirige internamente en el transcrito; por ejemplo, por un sitio interno de entrada del ribosoma, IRES. Por tanto, la construcción policistrónica dirige la transcripción de un solo ARNm policistrónico grande que, a su vez, dirige la traducción de múltiples polipéptidos individuales. Esta estrategia elimina la producción y procesamiento enzimático de poliproteínas y puede aumentar significativamente la producción de polipéptidos dirigidos por un solo promotor.

Los vectores usados en transformación habitualmente contendrán un marcador de selección usado para identificar transformantes. En sistemas bacterianos, esto puede incluir un gen de resistencia a antibiótico tal como ampicilina o kanamicina. Marcadores de selección para su uso en células de mamífero cultivadas incluyen genes que confieren resistencia a fármacos, tal como neomicina, higromicina y metotrexato. El marcador de selección puede ser un marcador de selección amplificable. Un marcador de selección amplificable es el gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR). Simonsen C et al. (1983) Proc Natl Acad Sci USA 80:2495-9. Los marcadores de selección se revisan por Thilly (1986) Mammalian Cell Technology, Butterworth Publishers, Stoneham, Mass., y la elección de marcadores de selección pertenece al nivel de habilidades habituales en la técnica.

Pueden introducirse marcadores de selección en la célula en un plásmido separado al mismo tiempo que el gen de interés, o pueden introducirse en el mismo plásmido. Si están en el mismo plásmido, el marcador de selección y el gen de interés pueden estar bajo el control de diferentes promotores o el mismo promotor, produciendo la última disposición un mensaje dicistrónico. Las construcciones de este tipo son conocidas en la técnica (por ejemplo, patente de Estados Unidos n.° 4.713.339).

Los vectores de expresión pueden codificar marcas que permitan fácil purificación de la proteína producida de forma recombinante. Ejemplos incluyen, aunque sin limitación, el vector pUR278 (Ruther et al. (1983) EMBO J 2:1791), en que las secuencias codificantes de la proteína a expresar pueden ligarse en el vector en el mismo marco de lectura con la región codificante de lac z de modo que se produzca una proteína de fusión marcada; pueden usarse vectores pGEX para expresar proteínas de la invención con una marca de glutatión S-transferasa (GST). Estas proteínas habitualmente son solubles y pueden purificarse fácilmente de células por adsorción a microesferas de glutatiónagarosa seguido de elución en presencia de glutatión libre. Los vectores incluyen sitios de escisión (trombina o proteasa factor Xa o PRESCISSiOn PROTEASE™ (Pharmacia, Peapack, N.J.)) para una fácil eliminación de la marca después de la purificación.

El vector o vectores de expresión entonces se transfectan o cotransfectan en una célula diana adecuada, que expresará los polipéptidos. Las técnicas de transfección conocidas en la técnica incluyen, aunque sin limitación, precipitación con fosfato de calcio (Wigler et al. (1978) Cell 14:725), electroporación (Neumann et al. (1982) EMBO J 1:841) y reactivos basados en liposomas. Puede utilizarse una diversidad de sistemas de hospedador-vector de expresión para expresar las proteínas descritas en este documento incluyendo células tanto procarióticas como eucarióticas. Estos incluyen, aunque sin limitación, microorganismos tales como bacterias (por ejemplo, E. coli) transformadas con vectores de expresión de ADN de bacteriófago recombinante o ADN plasmídico que contienen una secuencia codificante apropiada; levaduras u hongos filamentosos transformados con vectores de expresión recombinantes de levadura u hongos que contienen una secuencia codificante apropiada; sistemas de células de insecto infectadas con vectores de expresión víricos recombinantes (por ejemplo, baculovirus) que contienen una secuencia codificante apropiada; sistemas de células vegetales infectados con vectores de expresión víricos recombinantes (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor o virus del mosaico del tabaco) o transformados con vectores de expresión plasmídicos recombinantes (por ejemplo, plásmido Ti) que contienen una secuencia codificante apropiada; o sistemas de células animales, incluyendo células de mamífero (por ejemplo, células HEK 293, CHO, Cos, HeLa, HKB11 y BHK).

En una realización, la célula hospedadora es una célula eucariótica. Como se usa en este documento, una célula eucariótica se refiere a cualquier célula animal o vegetal que tenga un núcleo definido. Células eucarióticas de animales incluyen células de vertebrados, por ejemplo, mamíferos, y células de invertebrados, por ejemplo, insectos. Células eucarióticas de plantas específicamente pueden incluir, sin limitación, células de levadura. Una célula eucariótica es distinta de una célula procariótica, por ejemplo, bacterias.

En determinadas realizaciones, la célula eucariótica es una célula de mamífero. Una célula de mamífero es cualquier célula derivada de un mamífero. Las células de mamífero específicamente incluyen, aunque sin limitación, líneas celulares de mamífero. En una realización, la célula de mamífero es una célula humana. En otra realización, la célula de mamífero es una célula HEK 293, que es una línea celular de riñón embrionario humano. Las células HEK 293 están disponibles como CRL-1533 de la American Type Culture Collection, Manassas, VA, y como células 293-H, n.° de catálogo 11631-017 o células 293-F, n.° de catálogo 11625-019 de Invitrogen (Carlsbad, Calif.). En algunas realizaciones, la célula de mamífero es una célula PER.C6®, que es una línea celular humana derivada de retina. Las células PER.C6® están disponibles de Crucell (Leiden, Países Bajos). En otras realizaciones, la célula de mamífero es una célula de ovario de hámster chino (CHO). Las células CHO están disponibles de la American Type Culture Collection, Manassas, VA. (por ejemplo, CHO-K1; CCL-61). En otras realizaciones más, la célula de mamífero es una célula de riñón de cría de hámster (BHK). Las células BHK están disponibles de la American Type Culture Collection, Manassas, Va. (por ejemplo, CRL-1632). En algunas realizaciones, la célula de mamífero es una célula HKB11, que es una línea celular híbrida de una célula HEK293 y una línea de linfocitos B humanos. Mei et al., Mol. Biotechnol.

34(2): 165-78 (2006).

Un plásmido que incluye una secuencia codificante de fusión de FVIII(X2)-Fc, una secuencia codificante de proteína VWF-L1-X1-L2-Fc o ambas y un marcador de selección, por ejemplo, resistencia a zeocina, puede transfectarse en células HEK 293, para la producción de una proteína quimérica.

Un plásmido que incluye una secuencia codificante de fusión de FVIII-Fc, una secuencia codificante de proteína VWF-L1-X-L2-Fc o ambas y un marcador de selección, por ejemplo, resistencia a zeocina, puede transfectarse en células HEK 293, para la producción de una proteína quimérica.

Un primer plásmido que incluye una secuencia codificante de fusión de FVI11 (X2)-Fc y un primer marcador de selección, por ejemplo, un gen de resistencia a zeocina, y un segundo plásmido que incluye una secuencia codificante de proteína VWF-L1-X1-L2-Fc y un segundo marcador de selección, por ejemplo, un gen de resistencia a neomicina, y un tercer plásmido que incluye una secuencia codificante de proteína convertasa y un tercer marcador de selección, por ejemplo, un gen de resistencia a higromicina, pueden cotransfectarse en células HEK 293, para la producción de la proteína quimérica. El primer y segundo plásmido pueden introducirse en cantidades iguales (es decir, relación molar 1:1), o pueden introducirse en cantidades desiguales.

Un primer plásmido que incluye una secuencia codificante de fusión de FVIII-Fc y un primer marcador de selección, por ejemplo, un gen de resistencia a zeocina, y un segundo plásmido que incluye una secuencia codificante de proteína VWF-L1-X-L2-Fc y un segundo marcador de selección, por ejemplo, un gen de resistencia a neomicina, y un tercer plásmido que incluye una secuencia codificante de proteína convertasa y un tercer marcador de selección, por ejemplo, un gen de resistencia a higromicina, pueden cotransfectarse en células HEK 293, para la producción de la proteína quimérica. El primer y segundo plásmido pueden introducirse en cantidades iguales (es decir, relación molar 1:1), o pueden introducirse en cantidades desiguales.

Un primer plásmido que incluye una secuencia codificante de fusión de FVIII(X2)-Fc y un primer marcador de selección, por ejemplo, un gen de resistencia a zeocina, y un segundo plásmido que incluye una secuencia codificante de fusión de proteína VWF-L1-X1-L2-Fc y un segundo marcador de selección, por ejemplo, un gen de resistencia a neomicina, y un tercer plásmido que incluye una secuencia codificante de proteína convertasa y un tercer marcador de selección, por ejemplo, un gen de resistencia a higromicina, pueden cotransfectarse en células HEK 293, para la producción de la proteína quimérica. El primer y segundo plásmido pueden introducirse en cantidades iguales (es decir, relación molar 1:1), o pueden introducirse en cantidades desiguales.

Un primer plásmido que incluye una secuencia codificante de proteína quimérica que codifica FVIII (con o sin XTEN)-F1-L3-F2-L2-X-L1 -V y un primer marcador de selección, por ejemplo, un gen de resistencia a zeocina, y un segundo plásmido que incluye una secuencia codificante de proteína convertasa y un segundo marcador de selección, por ejemplo, un gen de resistencia a higromicina, pueden cotransfectarse en células HEK 293, para la producción de la proteína quimérica. Los promotores para la secuencia codificante de FVIII(X)-F1 y la secuencia codificante de V-L2-X-L1-F2 pueden ser diferentes o pueden ser iguales.

En algunas realizaciones, las células transfectadas se transfectan de forma estable. Estas células pueden seleccionarse y mantenerse como una línea celular estable, usando técnicas convencionales conocidas por los expertos en la materia.

Las células hospedadoras que contienen construcciones de ADN de la proteína se cultivan en un medio de cultivo apropiado. Como se usa en este documento, la expresión "medio de cultivo apropiado" significa un medio que contiene nutrientes requeridos para el crecimiento de las células. Los nutrientes requeridos para el crecimiento de las células pueden incluir una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, aminoácidos esenciales, vitaminas, minerales y factores de crecimiento. Opcionalmente, el medio puede contener uno o más factores de selección. Opcionalmente, el medio puede contener suero bovino de ternero o suero fetal de ternero (FCS). En una realización, el medio no contiene sustancialmente IgG. El medio de cultivo en general seleccionará células que contienen la construcción de ADN por, por ejemplo, selección con fármaco o deficiencia en un nutriente esencial que se complementa mediante el marcador de selección en la construcción de ADN o se cotransfecta con la construcción de ADN. Las células de mamífero cultivadas en general se cultivan en medios que contienen suero o sin suero disponibles en el mercado (por ejemplo, MEM, DMEM, DMEM/F12). En una realización, el medio es CD293 (Invitrogen, Carlsbad, CA.). En otra realización, el medio es CD17 (Invitrogen, Carlsbad, CA.). La selección de un medio apropiado para la línea celular particular usada pertenece al nivel de las habilitades habituales en la técnica.

Para coexpresar las dos cadenas polipeptídicas de la proteína quimérica, las células hospedadoras se cultivan en condiciones que permiten la expresión de ambas cadenas. Como se usa en este documento, cultivar se refiere a mantener células vivas in vitro durante al menos un tiempo definido. El mantenimiento puede incluir, pero no necesariamente, un aumento en la población de células vivas. Por ejemplo, las células mantenidas en cultivo pueden ser de población estática, pero aún viables y con capacidad de producir un producto deseado, por ejemplo, una proteína recombinante o proteína de fusión recombinante. Las condiciones adecuadas para cultivar células eucarióticas son bien conocidas en la técnica e incluyen selección apropiada de medio de cultivo, complementos del medio, temperatura, pH, saturación de oxígeno y similares. Para propósitos comerciales, el cultivo puede incluir el uso de cualquiera de diversos tipos de sistemas que se pueden aumentar de escala incluyendo matraces de agitación, frascos rodantes, biorreactores de fibra hueca, biorreactores de depósito agitado, biorreactores suspendidos, biorreactores de ondas y otros.

Las condiciones de cultivo celular también se seleccionan para permitir la asociación del fragmento de VWF con la proteína FVIII. Las condiciones que permiten la expresión del fragmento de VWF y/o la proteína FVIII pueden incluir la presencia de una fuente de vitamina K. Por ejemplo, en una realización, se cultivan células HEK 293 transfectadas de forma estable en medio CD293 (Invitrogen, Carlsbad, CA) o medio OptiCHO (Invitrogen, Carlsbad, CA) complementado con glutamina 4 mM.

En un aspecto, la presente invención se refiere a un método de expresión, preparación o producción de la proteína quimérica de la invención, que comprende a) transfectar una célula hospedadora que comprende un polinucleótido que codifica la proteína quimérica y b) cultivar la célula hospedadora en un medio de cultivo en condiciones adecuadas para expresar la proteína quimérica, en la que se expresa la proteína quimérica.

El producto proteínico que contiene la proteína FVIII ligada a una primera región constante de Ig o una parte de la misma y/o la proteína VWF fusionada a una segunda región constante de Ig o una parte de la misma mediante una secuencia de XTEN puede secretarse en el medio. El medio se separa de las células, se concentra, se filtra y después se pasa sobre dos o tres columnas de afinidad, por ejemplo, una columna de proteína A y una o dos columnas de intercambio aniónico.

En determinados aspectos, la presente invención se refiere a la proteína quimérica producida por los métodos descritos en este documento.

La producción in vitro permite el aumento de escala para dar grandes cantidades de los polipéptidos alterados deseados de la invención. Las técnicas para el cultivo de células de mamífero en condiciones de histocultivo son conocidas en la técnica e incluyen cultivo en suspensión homogéneo, por ejemplo, en un reactor suspendido o en un reactor de agitación continua, o cultivo de células inmovilizadas o atrapadas, por ejemplo, en fibras huecas, microcápsulas, en microesferas de agarosa o cartuchos cerámicos. Si es necesario y/o si se desea, las soluciones de polipéptidos pueden purificarse por los métodos de cromatografía habituales, por ejemplo, filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de interacción hidrófoba (HIC), cromatografía sobre DEAE-celulosa o cromatografía de afinidad.

IV. Composición farmacéutica

Las composiciones que contienen la proteína quimérica de la presente invención pueden contener un vehículo farmacéuticamente aceptable adecuado. Por ejemplo, pueden contener excipientes y/o auxiliares que faciliten el procesamiento de los compuestos activos en preparaciones diseñadas para suministro al sitio de acción.

La composición farmacéutica puede formularse para administración parenteral (es decir, intravenosa, subcutánea o intramuscular) por inyección rápida. Las formulaciones para inyección pueden presentarse en forma monodosis, por ejemplo, en ampollas o en recipientes multidosis con un conservante añadido. Las composiciones pueden adoptar formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, y contener agentes de formulación, tales como agentes de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes. Como alternativa, el ingrediente activo puede estar en forma de polvo para su constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua apirógena.

Las formulaciones adecuadas para administración parenteral también incluyen soluciones acuosas de los compuestos activos en forma hidrosoluble, por ejemplo, sales hidrosolubles. Además, pueden administrarse suspensiones de los compuestos activos como suspensiones oleosas de inyección apropiadas. Los disolventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen aceites grasos, por ejemplo, aceite de sésamo o ésteres de ácido graso sintéticos, por ejemplo, oleato de etilo o triglicéridos. Las suspensiones acuosas de inyección pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, incluyendo, por ejemplo, carboximetilcelulosa sódica, sorbitol y dextrano. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizantes. También pueden usarse liposomas para encapsular las moléculas de la invención para suministro en células o espacios intersticiales. Vehículos farmacéuticamente aceptables ejemplares son disolventes fisiológicamente compatibles, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción, agua, solución salina, solución salina tamponada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares. En algunas realizaciones, la composición comprende agentes isotónicos, por ejemplo, glúcidos, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro de sodio. En otras realizaciones, las composiciones comprenden sustancias farmacéuticamente aceptables tales como agentes humectantes o cantidades mínimas de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, conservantes o tampones, que potencian la vida útil o eficacia de los ingredientes activos.

Las composiciones de la invención pueden estar en una diversidad de formas, incluyendo, por ejemplo, líquido (por ejemplo, soluciones inyectables y infundibles), dispersiones, suspensiones, formas farmacéuticas semisólidas y sólidas. La forma preferida depende del modo de administración y la aplicación terapéutica.

La composición puede formularse como una solución, microemulsión, dispersión, liposoma u otra estructura ordenada adecuada para una concentración de fármaco elevada. Pueden prepararse soluciones inyectables estériles incorporando el ingrediente activo en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido de esterilización por filtración. En general, las dispersiones se preparan incorporando el ingrediente activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son secado al vacío y secado por congelación que producen un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional a partir de una solución previamente filtrada a esterilidad. La fluidez apropiada de la solución puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de una dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La absorción prolongada de composiciones inyectables puede lograrse incluyendo en la composición un agente que retarde la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina.

El ingrediente activo puede formularse con una formulación o dispositivo de liberación controlada. Ejemplos de dichas formulaciones y dispositivos incluyen implantes, parches transdérmicos y sistemas de suministro microencapsulados. Pueden usarse polímeros biodegradables, biocompatibles, por ejemplo, acetato de etilenvinilo, polianhídridos, poli(ácido glicólico), colágeno, poliortoésteres y poli(ácido láctico). Los métodos para la preparación de dichas formulaciones y dispositivos son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1978.

Las formulaciones inyectables de liberación lenta pueden prepararse formando matrices microencapsuladas del fármaco en polímeros biodegradables tales como poliláctido-poliglicólido. Dependiendo de la relación entre fármaco y polímero y de la naturaleza del polímero empleado, puede controlarse la tasa de liberación del fármaco. Otros polímeros biodegradables ejemplares son poliortoésteres y polianhídridos. Las formulaciones inyectables de liberación lenta también pueden prepararse atrapando el fármaco en liposomas o microemulsiones.

Pueden incorporarse compuestos activos complementarios a las composiciones. En una realización, la proteína quimérica de la invención se formula con otro factor de coagulación, o una variante, fragmento, análogo o derivado del mismo. Por ejemplo, el factor de coagulación incluye, aunque sin limitación, factor V, factor VII, factor VIII, factor IX, factor X, factor XI, factor XII, factor XIII, protrombina, fibrinógeno, factor de Von Willebrand o tromboplastina tisular soluble recombinante (rsTF) o formas activadas de cualquiera de los precedentes. El factor de coagulación del agente hemostático también puede incluir fármacos antifibrinolíticos, por ejemplo, ácido épsilon-aminocaproico, ácido tranexámico.

Las pautas posológicas pueden ajustarse para proporcionar la respuesta deseada óptima. Por ejemplo, puede administrarse una única inyección rápida, pueden administrarse varias dosis divididas a lo largo del tiempo o puede reducirse o incrementarse de forma proporcional la dosis según indiquen las exigencias de la situación terapéutica. Resulta favorable formular composiciones parenterales en una forma monodosis para facilitar la administración y la uniformidad de la dosificación. Véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., Easton, Pa. 1980).

Además del compuesto activo, la forma farmacéutica líquida puede contener ingredientes inertes tales como agua, alcohol etílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, dimetilformamida, aceites, glicerol, alcohol tetrahidrofurfurílico, polietilenglicoles y ésteres de ácido graso de sorbitán.

También se describen ejemplos no limitantes de vehículos farmacéuticos adecuados en Remington's Pharmaceutical Sciences de E. W. Martin. Algunos ejemplos de excipientes incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche desnatada en polvo, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y similares. La composición también puede contener reactivos tamponantes del pH, y agentes humectantes o emulsionantes.

Para administración oral, la composición farmacéutica puede adoptar la forma de comprimidos o cápsulas preparadas por medios convencionales. La composición también puede prepararse como un líquido, por ejemplo, un jarabe o una suspensión. El líquido puede incluir agentes de suspensión (por ejemplo, jarabe de sorbitol, derivados de celulosa o grasas comestibles hidrogenadas), agentes emulsionantes (lecitina o goma arábiga), vehículos no acuosos (por ejemplo, aceite de almendra, ésteres oleosos, alcohol etílico o aceites vegetales fraccionados) y conservantes (por ejemplo, p-hidroxibenzoatos de metilo o propilo o ácido sórbico). Las preparaciones también pueden incluir agentes aromatizantes, colorantes y edulcorantes. Como alternativa, la composición puede presentarse como un producto seco para su constitución con agua u otro vehículo adecuado.

Para administración bucal, la composición puede adoptar la forma de comprimidos o grageas de acuerdo con protocolos convencionales.

Para administración por inhalación, los compuestos para su uso de acuerdo con la presente invención se suministran convenientemente en forma de un aerosol nebulizado con o sin excipientes o en forma de un pulverizador de aerosol desde un envase presurizado o nebulizador, opcionalmente con un propulsor, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluorometano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación puede determinarse proporcionando una válvula para suministrar una cantidad medida. Pueden formularse cápsulas y cartuchos de, por ejemplo, gelatina para su uso en un inhalador o insuflador, que contienen una mezcla en polvo del compuesto y una base en polvo adecuada tal como lactosa o almidón.

La composición farmacéutica también puede formularse para administración rectal como un supositorio o enema de retención, por ejemplo, que contiene bases de supositorio convencionales tales como manteca de cacao u otros glicéridos.

La composición farmacéutica de la invención comprende una proteína quimérica de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. La proteína FVIII en una proteína quimérica tiene semivida prolongada en comparación con proteína FVIII de tipo silvestre o la proteína FVIII correspondiente sin el fragmento de VWF. En una realización, la semivida de la proteína quimérica se prolonga al menos aproximadamente 1,5 veces, al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 2,5 veces, al menos aproximadamente 3 veces, al menos aproximadamente 4 veces, al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 6 veces, al menos aproximadamente 7 veces, al menos aproximadamente 8 veces, al menos aproximadamente 9 veces, al menos aproximadamente 10 veces, al menos aproximadamente 11 veces o al menos aproximadamente 12 veces más que FVIII de tipo silvestre. En otra realización, la semivida del factor VIII es al menos aproximadamente 17 horas, al menos aproximadamente 18 horas, al menos aproximadamente 19 horas, al menos aproximadamente 20 horas, al menos aproximadamente 21 horas, al menos aproximadamente 22 horas, al menos aproximadamente 23 horas, al menos aproximadamente 24 horas, al menos aproximadamente 25 horas, al menos aproximadamente 26 horas, al menos aproximadamente 27 horas, al menos aproximadamente 28 horas, al menos aproximadamente 29 horas, al menos aproximadamente 30 horas, al menos aproximadamente 31 horas, al menos aproximadamente 32 horas, al menos aproximadamente 33 horas, al menos aproximadamente 34 horas, al menos aproximadamente 35 horas, al menos aproximadamente 36 horas, al menos aproximadamente 48 horas, al menos aproximadamente 60 horas, al menos aproximadamente 72 horas, al menos aproximadamente 84 horas, al menos aproximadamente 96 horas o al menos aproximadamente 108 horas.

En algunas realizaciones, la composición se administra mediante una vía seleccionada del grupo que consiste en administración tópica, administración intraocular, administración parenteral, administración intratecal, administración subdural y administración oral. La administración parenteral puede ser administración intravenosa o subcutánea.

En otras realizaciones, la composición se usa para tratar una enfermedad o afección hemorrágica en un sujeto que lo necesita. La enfermedad o afección hemorrágica se selecciona del grupo que consiste en un trastorno hemorrágico de coagulación, hemartrosis, sangrado muscular, sangrado bucal, hemorragia, hemorragia en músculos, hemorragia bucal, traumatismo, traumatismo en la cabeza, sangrado gastrointestinal, hemorragia intracraneal, hemorragia intraabdominal, hemorragia intratorácica, fractura de hueso, sangrado en el sistema nervioso central, sangrado en el espacio retrofaríngeo, sangrado en el espacio retroperitoneal, sangrado en la vaina del iliopsoas y cualquier combinación de los mismos. En otras realizaciones más, el sujeto se somete a cirugía programada. En otras realizaciones más, el tratamiento es profiláctico o a demanda.

V. Genoterapia

Una proteína quimérica de la misma de la invención puede producirse in vivo en un mamífero, por ejemplo, un paciente humano, usando una estrategia de genoterapia para el tratamiento de una enfermedad o trastorno hemorrágico seleccionado del grupo que consiste en un trastorno hemorrágico de coagulación, hemartrosis, sangrado muscular, sangrado bucal, hemorragia, hemorragia en músculos, hemorragia bucal, traumatismo, traumatismo en la cabeza, sangrado gastrointestinal, hemorragia intracraneal, hemorragia intraabdominal, hemorragia intratorácica, fractura de hueso, sangrado en el sistema nervioso central, sangrado en el espacio retrofaríngeo, sangrado en el espacio retroperitoneal y sangrado en la vaina del iliopsoas, que sería terapéuticamente beneficioso. La enfermedad o trastorno hemorrágico puede ser hemofilia, por ejemplo, hemofilia A. Esto implica la administración de un ácido nucleico codificante de una proteína quimérica adecuada unido de forma funcional a secuencias adecuadas de control de la expresión. Estas secuencias pueden incorporarse en un vector vírico. Los vectores víricos adecuados para dicha genoterapia incluyen vectores adenovíricos, vectores lentivíricos, vectores baculovíricos, vectores de virus de Epstein Barr, vectores papovavíricos, vectores víricos variolovacunales, vectores de virus del herpes simple y vectores víricos adenoasociados (AAV). El vector vírico puede ser un vector vírico de replicación defectuosa. Un vector adenovírico puede tener una eliminación en su gen E1 o gen E3. Cuando se usa un vector adenovírico, el mamífero puede no estar expuesto a un ácido nucleico que codifica un gen marcador de selección. Las secuencias pueden incorporarse en un vector no vírico conocido por los expertos en la materia.

V. Métodos de uso de proteína quimérica

La presente invención se refiere a una proteína quimérica de la invención para su uso en un método para prevenir o inhibir la unión de VWF endógeno a una proteína FVIII. Se divulga un método de uso de una proteína quimérica que tiene una proteína FVIII ligada a XTEN y una región constante de Ig o una parte de la misma.

Un aspecto se refiere a prevenir o inhibir la interacción de FVIII con VWF endógeno bloqueando o protegiendo el sitio de unión a VWF en el FVIII de VWF endógeno y al mismo tiempo prolongando la semivida de la proteína quimérica usando una secuencia de XTEN en combinación con una región constante de Ig o una parte de la misma, que también puede ser un prolongador de la semivida. Se divulga un método de construcción de una proteína FVIII que tiene semivida más larga que FVIII de tipo silvestre. La proteína quimérica útil en el método incluye una cualquiera o más proteínas quiméricas descritas en este documento.

También se divulga un método de administración a un sujeto que lo necesita una proteína quimérica que comprende una proteína FVIII que tiene semivida más larga que FVIII de tipo silvestre, en el que el método comprende administrar la proteína quimérica descrita en este documento al sujeto.

También se divulga un método de uso de una secuencia de XTEN y una región constante de Ig o una parte de la misma para mejorar la semivida de una proteína quimérica que comprende proteína FVIII y una proteína VWF, que evita o inhibe la interacción de VWF endógeno con una proteína FVIII. Una proteína FVIII ligada a una secuencia de XTEN (por ejemplo, FVIII(X)) y después unida a o asociada con una proteína VWF fusionada a un XTEN y una región constante de Ig o una parte de la misma se blinda o protege de la ruta de eliminación de VWF y, por tanto, tiene eliminación reducida en comparación con la proteína FVIII no unida a la proteína VWF. La proteína FVIII protegida, por tanto, tiene prolongación máxima de la semivida en comparación con una proteína FVIII no unida a o asociada con la secuencia de XTEN y la proteína VWF. En un aspecto, la proteína FVIII asociada con o protegida por una proteína VWF y ligada a una secuencia de XTEN no se elimina mediante un receptor de eliminación de VWF. La proteína FVIII asociada con o protegida por una proteína VWF y ligada a una secuencia de XTEN puede eliminarse del sistema más lentamente que la proteína FVIII que no está asociada con o protegida por la proteína VWF y ligada a la secuencia de XTEN.

En un aspecto, la proteína quimérica que comprende la proteína FVIII ligada a una secuencia de XTEN o la proteína FVIII unida a o asociada con una proteína VWF ligada a XTEN tiene eliminación reducida de la circulación ya que la proteína VWF no contiene un sitio de unión al receptor de eliminación de VWF. La proteína VWF evita o inhibe la eliminación de FVIII unido a o asociado con la proteína VWF del sistema a través de la ruta de eliminación de VWF. Las proteínas VWF también pueden proporcionar al menos una o más propiedades de protección de FVIII similares a VWF que se proporcionan mediante VWF endógeno. La proteína VWF o la secuencia de XTEN también pueden enmascarar uno o más sitios de unión al receptor de eliminación de FVIII, evitando de ese modo la eliminación de FVIII mediante su propia ruta de eliminación.

La prevención o inhibición de la unión de una proteína FVIII a VWF endógeno por la proteína VWF o la secuencia de XTEN puede ser in vitro o in vivo.

También se divulga un método de aumento de la semivida de una proteína quimérica, que comprende administrar la proteína quimérica descrita en este documento a un sujeto que lo necesita. La semivida de FVIII no activado unido a o asociado con VWF de longitud completa es de aproximadamente 12 a 14 horas en plasma. En VWD de tipo 3, en el que no hay nada de VWF en circulación, la semivida de FVIII es solamente de aproximadamente seis horas, lo que da lugar a síntomas de hemofilia A de leve a moderada en dichos pacientes debido a concentraciones disminuidas de FVIII. La semivida de la proteína quimérica ligada a o asociada con el fragmento de VWF o la secuencia de XTEN de la presente invención puede aumentar al menos aproximadamente 1,5 veces, 1,6 veces, 1,7 veces, 1,8 veces, 1,9 veces, 2,0 veces, 2,1 veces, 2,2 veces, 2,3 veces, 2,4 veces, 2,6 veces, 2,7 veces, 2,8 veces, 2,9 veces, 3,0 veces, 3,1 veces, 3,2 veces, 3,3 veces, 3,4 veces, 3,5 veces, 3,6 veces, 3,7 veces, 3,8 veces, 3,9 veces o 4,0 veces mayor que la semivida del FVIII no activado unido a o asociado con VWF de longitud completa.

Una proteína quimérica que comprende un primer polipéptido que comprende una proteína FVIII y una primera región constante de Ig o una parte de la misma y un segundo polipéptido que comprende una proteína VWF, un XTEN que tiene menos de 288 aminoácidos, y una región constante de Ig o una parte de la misma puede presentar una semivida al menos aproximadamente 2 veces, 2,5 veces, 3,0 veces, 3,5 veces, 4,0 veces, 4,5 veces, 5,0 veces, 5,5 veces, 6,0 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces o 10 veces mayor que una proteína quimérica correspondiente que comprende el mismo primer polipéptido y el segundo polipéptido sin la secuencia de XTEN o FVIII de tipo silvestre. Una proteína quimérica que comprende un primer polipéptido que comprende una proteína FVIII y una primera región constante de Ig o una parte de la misma y un segundo polipéptido que comprende una proteína VWF, un XTEN que tiene menos de 288 aminoácidos, y una región constante de Ig o una parte de la misma puede presentar una semivida de aproximadamente 2 a aproximadamente 5 veces, de aproximadamente 3 a aproximadamente 10 veces, de aproximadamente 5 a aproximadamente 15 veces, de aproximadamente 10 a aproximadamente 20 veces, de aproximadamente 15 a aproximadamente 25 veces, de aproximadamente 20 a aproximadamente 30 veces, de aproximadamente 25 a aproximadamente 35 veces, de aproximadamente 30 a aproximadamente 40 veces, de aproximadamente 35 a aproximadamente 45 veces mayor que una proteína quimérica correspondiente que comprende el mismo primer polipéptido y el segundo polipéptido sin la secuencia de XTEN o FVIII de tipo silvestre. En una realización específica, la semivida de una proteína quimérica de la invención aumenta al menos aproximadamente 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40 veces mayor que la semivida del FVIII de tipo silvestre en un ratón con doble inactivación de FVIII y VWF.

En determinadas realizaciones, una proteína quimérica presenta una semivida de aproximadamente 40 horas en ratones.

En algunas realizaciones, la semivida de una proteína quimérica es más larga que la semivida de un FVIII asociado con VWF endógeno. En otras realizaciones, la semivida de la proteína quimérica es al menos aproximadamente 1,5 veces, 2 veces, 2,5 veces, 3,5 veces, 3,6 veces, 3,7 veces, 3,8 veces, 3,9 veces, 4,0 veces, 4,5 veces o 5,0 veces la semivida de FVIII de tipo silvestre o una proteína FVIII asociada con VWF endógeno.

En algunas realizaciones, como resultado de la invención, la semivida de la proteína quimérica está prolongada en comparación con una proteína FVIII sin el fragmento de VWF o FVIII de tipo silvestre. La semivida de la proteína quimérica de la invención es al menos aproximadamente 1,5 veces, al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 2,5 veces, al menos aproximadamente 3 veces, al menos aproximadamente 4 veces, al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 6 veces, al menos aproximadamente 7 veces, al menos aproximadamente 8 veces, al menos aproximadamente 9 veces, al menos aproximadamente 10 veces, al menos aproximadamente 11 veces o al menos aproximadamente 12 veces más larga que la semivida de una proteína quimérica sin el fragmento de VWF o FVIII de tipo silvestre. En una realización, la semivida de FVIII es de aproximadamente 1,5 veces a aproximadamente 20 veces, de aproximadamente 1,5 veces a aproximadamente 15 veces, o de aproximadamente 1,5 veces a aproximadamente 10 veces más larga que la semivida de FVIII de tipo silvestre. En otra realización, la semivida del FVIII se prolonga de aproximadamente 2 veces a aproximadamente 10 veces, de aproximadamente 2 veces a aproximadamente 9 veces, de aproximadamente 2 veces a aproximadamente 8 veces, de aproximadamente 2 veces a aproximadamente 7 veces, de aproximadamente 2 veces a aproximadamente 6 veces, de aproximadamente 2 veces a aproximadamente 5 veces, de aproximadamente 2 veces a aproximadamente 4 veces, de aproximadamente 2 veces a aproximadamente 3 veces, de aproximadamente 2,5 veces a aproximadamente 10 veces, de aproximadamente 2,5 veces a aproximadamente 9 veces, de aproximadamente 2,5 veces a aproximadamente 8 veces, de aproximadamente 2,5 veces a aproximadamente 7 veces, de aproximadamente 2,5 veces a aproximadamente 6 veces, de aproximadamente 2,5 veces a aproximadamente 5 veces, de aproximadamente 2,5 veces a aproximadamente 4 veces, de aproximadamente 2,5 veces a aproximadamente 3 veces, de aproximadamente 3 veces a aproximadamente 10 veces, de aproximadamente 3 veces a aproximadamente 9 veces, de aproximadamente 3 veces a aproximadamente 8 veces, de aproximadamente 3 veces a aproximadamente 7 veces, de aproximadamente 3 veces a aproximadamente 6 veces, de aproximadamente 3 veces a aproximadamente 5 veces, de aproximadamente 3 veces a aproximadamente 4 veces, de aproximadamente 4 veces a aproximadamente 6 veces, de aproximadamente 5 veces a aproximadamente 7 veces o de aproximadamente 6 veces a aproximadamente 8 veces en comparación con FVIII de tipo silvestre o una proteína FVIII sin el fragmento de VWF. En otras realizaciones, la semivida de la proteína quimérica de la invención es al menos aproximadamente 17 horas, al menos aproximadamente 18 horas, al menos aproximadamente 19 horas, al menos aproximadamente 20 horas, al menos aproximadamente 21 horas, al menos aproximadamente 22 horas, al menos aproximadamente 23 horas, al menos aproximadamente 24 horas, al menos aproximadamente 25 horas, al menos aproximadamente 26 horas, al menos aproximadamente 27 horas, al menos aproximadamente 28 horas, al menos aproximadamente 29 horas, al menos aproximadamente 30 horas, al menos aproximadamente 31 horas, al menos aproximadamente 32 horas, al menos aproximadamente 33 horas, al menos aproximadamente 34 horas, al menos aproximadamente 35 horas, al menos aproximadamente 36 horas, al menos aproximadamente 40 horas, al menos aproximadamente 48 horas, al menos aproximadamente 60 horas, al menos aproximadamente 72 horas, al menos aproximadamente 84 horas, al menos aproximadamente 96 horas o al menos aproximadamente 108 horas. En otras realizaciones más, la semivida de la proteína quimérica de la invención es de aproximadamente 15 horas a aproximadamente dos semanas, de aproximadamente 16 horas a aproximadamente una semana, de aproximadamente 17 horas a aproximadamente una semana, de aproximadamente 18 horas a aproximadamente una semana, de aproximadamente 19 horas a aproximadamente una semana, de aproximadamente 20 horas a aproximadamente una semana, de aproximadamente 21 horas a aproximadamente una semana, de aproximadamente 22 horas a aproximadamente una semana, de aproximadamente 23 horas a aproximadamente una semana, de aproximadamente 24 horas a aproximadamente una semana, de aproximadamente 36 horas a aproximadamente una semana, de aproximadamente 48 horas a aproximadamente una semana, de aproximadamente 60 horas a aproximadamente una semana, de aproximadamente 24 horas a aproximadamente seis días, de aproximadamente 24 horas a aproximadamente cinco días, de aproximadamente 24 horas a aproximadamente cuatro días, de aproximadamente 24 horas a aproximadamente tres días o de aproximadamente 24 horas a aproximadamente dos días.

En algunas realizaciones, el promedio de semivida de la proteína quimérica de la invención por sujeto es aproximadamente 15 horas, aproximadamente 16 horas, aproximadamente 17 horas, aproximadamente 18 horas, aproximadamente 19 horas, aproximadamente 20 horas, aproximadamente 21 horas, aproximadamente 22 horas, aproximadamente 23 horas, aproximadamente 24 horas (1 día), aproximadamente 25 horas, aproximadamente 26 horas, aproximadamente 27 horas, aproximadamente 28 horas, aproximadamente 29 horas, aproximadamente 30 horas, aproximadamente 31 horas, aproximadamente 32 horas, aproximadamente 33 horas, aproximadamente 34 horas, aproximadamente 35 horas, aproximadamente 36 horas, aproximadamente 40 horas, aproximadamente 44 horas, aproximadamente 48 horas (2 días), aproximadamente 54 horas, aproximadamente 60 horas, aproximadamente 72 horas (3 días), aproximadamente 84 horas, aproximadamente 96 horas (4 días), aproximadamente 108 horas, aproximadamente 120 horas (5 días), aproximadamente seis días, aproximadamente siete días (una semana), aproximadamente ocho días, aproximadamente nueve días, aproximadamente 10 días, aproximadamente 11 días, aproximadamente 12 días, aproximadamente 13 días o aproximadamente 14 días.

Además, la invención proporciona una proteína quimérica para su uso en un método de tratamiento o prevención de una enfermedad o trastorno hemorrágico, que comprende administrar una cantidad eficaz de una proteína quimérica. En una realización, la enfermedad o trastorno hemorrágico se selecciona del grupo que consiste en un trastorno hemorrágico de coagulación, hemartrosis, sangrado muscular, sangrado bucal, hemorragia, hemorragia en músculos, hemorragia bucal, traumatismo, traumatismo en la cabeza, sangrado gastrointestinal, hemorragia intracraneal, hemorragia intraabdominal, hemorragia intratorácica, fractura de hueso, sangrado en el sistema nervioso central, sangrado en el espacio retrofaríngeo, sangrado en el espacio retroperitoneal y sangrado en la vaina del iliopsoas. En una realización específica, la enfermedad o trastorno hemorrágico es hemofilia A.

La proteína quimérica que comprende una secuencia de XTEN y una región constante de Ig o una parte de la misma en combinación con una proteína VWF descrita en este documento, que evita o inhibe la interacción de la proteína FVIII con VWF endógeno preparada de acuerdo con la presente divulgación, tiene muchos usos, como reconocerán los expertos en la materia incluyendo, aunque sin limitación, métodos de tratamiento de un sujeto que tiene un trastorno hemostático y métodos de tratamiento de un sujeto que necesita un agente hemostático general. En una realización, la invención se refiere a la proteína quimérica de la invención para su uso en un método de tratamiento de un sujeto que tiene un trastorno hemostático, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína quimérica.

La parte de la proteína FVIII en la proteína quimérica trata o previene un trastorno hemostático sirviendo como cofactor al factor IX en una superficie fosfolipídica cargada negativamente, formando de ese modo un complejo de Xasa. La unión de factores de coagulación activados a una superficie fosfolipídica localiza este proceso en sitios de daño vascular. En una superficie fosfolipídica, el factor VIIIa aumenta la velocidad máxima de activación del factor X por el factor IXa, en aproximadamente 200000 veces, dando lugar a la segunda gran explosión de generación de trombina.

La proteína quimérica de la invención puede usarse para tratar cualquier trastorno hemostático. Los trastornos hemostáticos que pueden tratarse por la administración de la proteína quimérica de la invención incluyen, aunque sin limitación, hemofilia A, así como deficiencias o anomalías estructurales relacionadas con el factor VIII. En una realización, el trastorno hemostático es hemofilia A.

La proteína quimérica de la invención puede usarse profilácticamente para tratar a un sujeto con un trastorno hemostático. La proteína quimérica de la invención puede usarse para tratar un episodio hemorrágico agudo en un sujeto con un trastorno hemostático. En otra realización, el trastorno hemostático puede ser el resultado de un factor de coagulación defectuoso, por ejemplo, factor de Von Willebrand. En una realización, el trastorno hemostático es un trastorno hereditario. En otra realización, el trastorno hemostático es un trastorno adquirido. El trastorno adquirido puede ser el resultado de una enfermedad o afección secundaria subyacente. La afección no relacionada puede ser, como ejemplo, aunque sin limitación, cáncer, una enfermedad autoinmunitaria, o embarazo. El trastorno adquirido puede ser el resultado de edad avanzada o de medicación para tratar un trastorno secundario subyacente (por ejemplo, quimioterapia para el cáncer).

La invención también se refiere a la proteína quimérica de la invención para su uso en métodos de tratamiento de un sujeto que no tiene un trastorno hemostático congénito, sino que tiene una enfermedad o afección secundaria que provoca adquirir un trastorno hemostático, por ejemplo, debido al desarrollo de un anticuerpo anti-FVIII o cirugía. La invención, por tanto, se refiere a la proteína quimérica de la invención para su uso en un método de tratamiento de un sujeto que necesita un agente hemostático general, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína quimérica preparada por los presentes métodos.

La presente invención también se refiere a la proteína quimérica de la invención para su uso en métodos de reducción de la inmunogenia de FVIII o inducción de menos inmunogenia contra FVIII, que comprende administrar una cantidad eficaz de la proteína quimérica o los polinucleótidos que codifican la misma.

En una realización, el sujeto que necesita un agente hemostático general se está sometiendo, o se va a someter, a cirugía. La proteína quimérica de la invención puede administrarse antes, durante o después de cirugía como pauta profiláctica. La proteína quimérica de la invención puede administrarse antes, durante o después de cirugía para controlar un episodio hemorrágico agudo.

La proteína quimérica de la invención puede usarse para tratar a un sujeto que tiene un episodio hemorrágico agudo que no tiene un trastorno hemostático. El episodio hemorrágico agudo puede ser el resultado de traumatismo grave, por ejemplo, cirugía, un accidente de automóvil, herida, laceración, disparo de pistola o cualquier otro acontecimiento traumático que provoque hemorragia incontrolada. Ejemplos no limitantes de episodios hemorrágicos incluyen un trastorno hemorrágico de coagulación, hemartrosis, sangrado muscular, sangrado bucal, hemorragia, hemorragia en músculos, hemorragia bucal, traumatismo, traumatismo en la cabeza, sangrado gastrointestinal, hemorragia intracraneal, hemorragia intraabdominal, hemorragia intratorácica, fractura de hueso, sangrado en el sistema nervioso central, sangrado en el espacio retrofaríngeo, sangrado en el espacio retroperitoneal, sangrado en la vaina del iliopsoas y cualquier combinación de los mismos.

En aplicaciones profilácticas, se administra una o más composiciones que contienen la proteína quimérica de la invención o un cóctel de las mismas a un paciente que aún no tiene estado patológico para potenciar la resistencia del paciente o reducir los síntomas asociados con una enfermedad o trastorno. Dicha cantidad se define como "dosis eficaz profiláctica". En aplicaciones terapéuticas, a veces se requiere una dosificación relativamente alta (por ejemplo, de aproximadamente 1 a 400 mg/kg de polipéptido por dosis, siendo dosificaciones de 5 a 25 mg más habitualmente usadas para radioinmunoconjugados y dosis mayores para polipéptidos modificados con citotoxina-fármaco) a intervalos relativamente cortos hasta que se reduce o termina la progresión de la enfermedad, y hasta que el paciente muestra mejora parcial o completa de los síntomas de la enfermedad. Después de ello, se puede administrar al paciente una pauta profiláctica.

En algunas realizaciones, una proteína quimérica o una composición de la invención se usa para tratamiento a demanda, que incluye tratamiento para un episodio hemorrágico, hemartrosis, sangrado muscular, sangrado bucal, hemorragia, hemorragia en músculos, hemorragia bucal, traumatismo, traumatismo en la cabeza (traumatismo craneal), sangrado gastrointestinal, hemorragia intracraneal, hemorragia intraabdominal, hemorragia intratorácica, fractura de hueso, sangrado en el sistema nervioso central, sangrado en el espacio retrofaríngeo, sangrado en el espacio retroperitoneal o sangrado en la vaina del iliopsoas. El sujeto puede necesitar profilaxis quirúrgica, control perioperatorio o tratamiento para cirugía. Dichas cirugías incluyen, por ejemplo, cirugía menor, cirugía mayor, extracción de piezas dentales, amigdalectomía, herniotomía inguinal, sinovectomía, sustitución total de la rodilla, craneotomía, osteosíntesis, cirugía traumatológica, cirugía intracraneal, cirugía intraabdominal, cirugía intratorácica o cirugía de sustitución de articulación.

En una realización, la proteína quimérica de la presente invención se administra por vía intravenosa, subcutánea, intramuscular o mediante superficie mucosa, por ejemplo, por vía oral, sublingual, bucal, nasal, rectal, vaginal o mediante vía pulmonar. La proteína quimérica que comprende un fragmento de VWF y una proteína FVIII de la presente invención puede implantarse dentro de o ligarse a un suporte sólido biopolimérico que permite la liberación lenta de la proteína quimérica al sitio de hemorragia o implantarse en apósito/vendaje. La dosis de la proteína quimérica variará dependiendo del sujeto y de la vía particular de administración usada. Las dosificaciones pueden variar de 0,1 a 100000 pg/kg de peso corporal. En una realización, el intervalo de dosificación es 0,1-1000 pg/kg. En otra realización, el intervalo de dosificación es 0,1-500 pg/kg. La proteína puede administrarse de forma continua o a intervalos de tiempo específicos. Pueden emplearse ensayos in vitro para determinar intervalos y/o pautas óptimas de dosis para administración. Los ensayos in vitro que miden la actividad del factor de coagulación son conocidos en la técnica, por ejemplo, ensayo de coagulación de VIIa-rTF STA-CLOT o ensayo de coagulación ROTEM. Además, las dosis eficaces pueden extrapolarse de curvas de dosis-respuesta obtenidas de modelos animales, por ejemplo, un perro hemofílico (Mount et al. 2002, Blood 99(8):2670).

Habiendo descrito ahora la presente invención en detalle, la misma se comprenderá más claramente por referencia a los siguientes ejemplos, que se incluye con la misma con propósitos de ilustración solamente y no pretenden ser limitantes de la invención.

Ejemplos

Durante todos los ejemplos, se usaron los siguientes materiales y métodos salvo que se indique de otro modo. Materiales y métodos

En general, la práctica de la presente invención emplea, salvo que se indique de otro modo, técnicas convencionales de química, biofísica, biología molecular, tecnología de ADN recombinante, inmunología (especialmente, por ejemplo, tecnología de anticuerpos) y técnicas convencionales en electroforesis. Véase, por ejemplo, Sambrook, Fritsch y Maniatis, Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Antibody Engineering Protocols (Methods in Molecular Biology), 510, Paul, S., Humana Pr (1996); Antibody Engineering: A Practical Approach (Practical Approach Series, 169), McCafferty, Ed., Irl Pr (1996); Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow et al., CS.H.L. Press, Pub. (1999); y Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons (1992).

Ejemplo 1: Heterodímeros de FVIII-XTEN-Fc/D'D3-XTEN-Fc

La presente invención se refiere a generar una molécula de FVIII quimérica que se acopla al dominio D'D3 de la proteína de factor de Von Willebrand (VWF) mediante dominio Fc de IgG. El dominio D'D3 unido evita la interacción de FVIII con multímeros de VWF endógenos. Esta molécula sirve como plataforma para incorporar otras tecnologías de prolongación de la semivida para mejorar la farmacocinética de la proteína quimérica. Se incorporaron secuencias de XTEN en el dominio B de FVIII y entre D'D3 y la región Fc para aumentar la semivida del heterodímero de FVIII/VWF.

El sitio de escisión por trombina entre D'D3 y Fc permite la liberación del dominio D'D3 tras la activación de la molécula de FVIII por trombina.

Ejemplo 2: Construcción plasmídica de heterodímeros de FVIII-XTEN-Fc/D'D3-Fc

Clonación de VWF050 - triple mutación IHH en VWF031

La triple mutación IHH en Fc evita la interacción con FcRn, por tanto, no hay reciclado de la molécula que contiene Fc mediante la ruta de FcRn. Las 3 mutaciones en Fc son I253a , H310A, H435A.

VWF050 se generó intercambiando la región Fc del plásmido VWF031 con el fragmento Fc que contiene la triple mutación IHH entre los sitios de restricción RsRII y Not 1.

Clonación de VWF057 - clonación de VWF-Fc con XTEN AE144 conector escindible por trombina de 35 aa.

Oligos

ESC 155 - Oligo para XTEN AE144 en VWF034-rev CCCCGCCACCGGATCCCCCGCCACCGGATCCCCCGCCACCGGATCCCCCGCCACCGGAACCTC CACCGCCGCTCGAGGCACCTTCTTCAGTGCTGGTGGGCGAGCCCGCTGGTGACCCTTCCTC

ESC 156 - Oligo para XTEN AE144-conector GS en VWF034-rev GGGGAAGAGGAAGACTGACGGTCCGCCCAGGAGTTCTGGAGCTGGGCACGGTGGGCATGTGT GAGTTTTGTCGCCTCCGCTGCCCCGGGGGACCAGGGATCCCCCGCCACCGGATCCCCCGCCAC CGGATCCCCCGCCACCGGATCCCCCGCC ESC 157 - Oligo para XTEN AE144 en VWF031 -fwd GTGAAGCCTGCCAGGAGCCGATATCGGGCGCGCCAACATCAGAGAGCGCCACCCCTGAAAGT GGTCCCGGGAGCGAGCCAGC

Se hizo PCR dos veces para obtener el XTEN AE144 conector GS de 35 aa con sitio de escisión por trombina. La primera reacción de PCR se hizo usando el ADN codificante de XTEN AE144 como molde y el par de cebadores ESC 157/ESC 155. El producto de PCR de aproximadamente 550 pb de longitud obtenido de esta reacción se usó como molde para la segunda reacción de PCR y se amplificó usando el par de cebadores ESC 157/156. Esta reacción dio un producto de ~700 pb de longitud. Este producto de PCR de 700 pb y el plásmido VWF034 entonces se digirieron con EcoRV-HF y RsRII. Se digirió la estructura del plásmido.

VWF034 entonces se usó para ligar el producto de PCR de 700 pb.

Clonación de VWF058 - triple mutación IHH en VWF034

VWF058 se generó intercambiando la región Fc del plásmido VWF034 con el fragmento Fc que contiene la triple mutación IHH entre los sitios de restricción RsRII y Not 1.

Clonación de FVIII-263 - FVIII 205 con triple mutación IHH

La triple mutación IHH en Fc evita la interacción con FcRn, por tanto, no hay reciclado de la molécula que contiene Fc mediante la ruta de FcRn. Las 3 mutaciones en Fc son I253^a, H310A, H435A.

FVIII-263 se generó intercambiando la región Fc del plásmido FVIII 205 con el fragmento Fc que contiene la triple mutación IHH entre los sitios de restricción RsRII y Not 1.

Clonación de FVIII-282 - FVIII-Fc con XTEN AE144 en dominio B

ESC 158 - Oligo para XTEN AE144 en dominio B-fwd AAGAAGCTTCTCTCAAAACGGCGCGCCAACATCAGAGAGCGCCACCCCTGAAAGTGGTCCCG GGAGCGAGCCAGCCACATCTGGGTCGGAAACGCCAGGC ESC 159 - Oligo para XTEN AR144 en dominio B-rev GGTATCATCATAATCGATTTCCTCTTGATCTGACTGAAGAGTAGTACGAGTTATTTCAGCTTGA TGGCGTTTCAAGACTGGTGGGCTCGAGGCACCTTCTTCAGTGCTGGTGGGCGAGCCCGCTGGT GACCCTTCCTCAGTGGACGTAGG

La primera reacción de PCR se hizo usando el ADN codificante de XTEN AE144 como molde y el par de cebadores ESC 158/ESC159. El producto de PCR de aproximadamente 550 pb de longitud obtenido de esta reacción y el plásmido FVIII 169 entonces se digirieron con AscI y Cla1. La estructura del plásmido de FVIII 169 digerido entonces se usó para ligar el producto de PCR de 550 pb para obtener FVIII 282.

Clonación de FVIII-283 - FVIII 169 con triple mutación IHH

FVIII-283 se generó intercambiando la región Fc del plásmido FVIII 169 con el fragmento Fc que contiene la triple mutación IHH entre los sitios de restricción RsRII y Not 1.

Ejemplo 3: Producción de FVIII-XTEN-Fc/D'D3-XTEN-Fc en células HEK293

Figura 2. Diagrama esquemático que muestra la expresión de la construcción FVIII-XTEN-Fc/D'D3-XTEN-Fc. Se realizó cotransfección de tres plásmidos en células HEK293 usando polietilenimina (PEI). El primer plásmido obtiene la expresión de FVIII-XTEN-Fc, el segundo plásmido expresa D1D2DD3-XTEN-Fc y el tercer plásmido expresa PACE/furina, que es necesaria para eliminar enzimáticamente el propéptido, es decir, el dominio D1D2 de D1 D2D'D3-XTEN-Fc. Los productos de este sistema de expresión de tres plásmidos incluyen el heterodímero de FVIII-XTEN-Fc/D'D3-XTEN-Fc, el homodímero de D'D3-XTEN-Fc y restos de especies que parecen hemicigóticas de FVIII-XTEN-Fc.

Ejemplo 4: Purificación de heterodímeros de FVIII-XTEN-Fc/D'D3-XTEN-Fc

Para purificar los heterodímeros de FVIII-XTEN-Fc/D'D3-XTEN-Fc, se usó una etapa de filtración en flujo tangencial (TFF) para concentrar en primer lugar el medio acondicionado en 10 veces. Los productos del filtrado entonces se purificaron más usando cromatografía de afinidad seguida de una columna de desalación. La pureza de la molécula fue aceptable por HPLC-SEC y se confirmó adicionalmente por inmunoelectrotransferencia. La actividad específica de la molécula fue comparable a FVIII con el dominio B eliminado, medida por ensayo de actividad de FVIII (ejemplo 5) y medición de DO280.

Ejemplo 5: Actividad específica de heterodímeros de FVIII-XTEN-Fc/D'D3-XTEN-Fc

La actividad de heterodímeros de FVIII-XTEN-Fc/D'D3-XTEN-Fc se midió por ensayo cromogénico de FVIII y ensayo de tiempo de tromboplastina parcial activada (aPTT). La actividad cromogénica específica y la actividad aPTT específica de FVIII BDD SQ, rFVIII169/VWF034 y rFVIII169/VWF057 se enumeró en la tabla 15. En comparación con FVIII BDD SQ, se han observado actividades cromogénicas específicas comparables y una reducción del 60 % en la actividad aPTT específica para rFVIII169/VWF034 y rFVIII169/VWF057.

Tabla 15: Actividad específica de variantes heterodiméricas

Ensayos cromogénico de FVIII

La actividad de FVIII se midió usando el kit de FVIII COATEST SP de DiaPharma (producto n.°: K824086) y todas las incubaciones se realizaron en un calentador de placa de 37 °C con agitación.

El 8.° Modelo Internacional de la OMS para el Factor de Coagulación Sanguínea VI 11 :C, Concentrado, con código 07/350 se usó como patrón de ensayo, el intervalo del modelo fue de 100 mUI/ml a 0,78 mUI/ml. Se añadió un control de ensayo de plasma humano normal combinado y muestras de ensayo (diluidas con tampón IX Coatest) en placas de 96 pocillos Immulon 2HB por duplicado (25 gl/pocillo). Se añadió mezcla de IXa/FX/fosfolípido recién preparada (50 gl), 25 gl de CaCl225 mM y 50 gl de sustrato de FXa secuencialmente en cada pocillo con 5 minutos de incubación entre cada adición. Después de incubar con el sustrato, se añadieron 25 gl de ácido acético al 20 % para terminar la reacción de color, y se midió la absorbancia de DO405 con un instrumento SpectraMAX plus (Molecular Devices). Los datos se analizaron con el programa informático SoftMax Pro (versión 5.2). El nivel más bajo de cuantificación (LLOQ) es 7,8 mUI/ml.

Ensayo de aPTT de FVIII

El ensayo de aPTT de FVIII se realizó en el analizador de coagulación Sysmex CA-1500 como sigue: en primer lugar, se añadieron 50 ul de muestras diluidas manualmente, patrones y controles en tampón de aPTT (Tris 50 mM, NaCl 100 mM, HSA al 1 %, pH 7,4) por el instrumento en la cubeta de reacción, seguido de la adición de 50 ul de plasma deficiente de FVIII (George King Bio-Medical, producto n.°: 0800). Después de incubación a 37 °C durante 1 minuto, se añadieron 50 ul de reactivo de aPTT (reactivo de cefaloplastina activada Actin® FSL - Dade Behring, referencia n.° B4219-2) a la mezcla de reacción, y se incubó a 37 °C durante 4 minutos. Posteriormente, se añadieron 50 ul de CaCl2 20 mM (Dade Behring, referencia n.° ORFO37), y la cubeta de reacción se transfirió inmediatamente a una de cuatro posiciones de canal del espectrofotómetro para medir la cantidad de luz refractada en la mezcla, que se convirtió al inicio de coagulación por el algoritmo del programa informático del instrumento. El tiempo de coagulación informado fue la cantidad de tiempo desde la adición de CaCl2 hasta el inicio de la formación de coágulo. El patrón de ensayo se generó diluyendo el 8.° Modelo de FVIII Internacional de la OMS en un tampón de aPTT en un intervalo de 100 mUI/ml a 0,78 mUI/ml. La curva patrón se representó como el tiempo de coagulación (en segundos) como el eje de ordenadas frente al log (base 10) de la actividad de FVIII (mUI/ml) como el eje de abscisas en MS Excel, y la actividad de las muestras individuales se calculó usando la fórmula para la línea de regresión lineal de esta curva patrón. Basándose en el rendimiento del ensayo, el límite inferior de cuantificación (LLOQ) fue 7,8 mUI/ml.

Ejemplo 6: Efecto aditivo de inserciones de XTEN sobre la prolongación de la semivida del heterodímero Se incorporaron inserciones de XTEN en los heterodímeros para la prolongación de la semivida. La inserción de un solo XTEN AE de 288 aminoácidos (aa) en el dominio B de FVIII provocó una semivida de 16,7 horas del heterodímero en ratones HemA, como se demuestra por rFVIM169/VWF031 en la figura 3. Para mejorar más la semivida del heterodímero, se incorporó una segunda inserción de XTEN de 144 aa o 288 aa de longitud en FVIM169/VWF031 en el dominio A1 de FVIII o inmediatamente posterior del fragmento D'D3 respectivamente, las variantes heterodiméricas se denominaron FVIII205/VWF031 y FVIM169/VWF034.

La semivida de rFVIM169/VWF031, rFVIII205/VWF031 y rFVIM169/VWF034 se evaluó en ratones deficientes de FVIII (HemA) mediante una sola administración intravenosa de moléculas de ensayo a dosis de 200 UI/kg. Se recogieron muestras de plasma en los momentos puntuales designados como se indica en la figura 3, se determinó la actividad de FVIII de las muestras por ensayo cromogénico de FVIII, se calcularon los parámetros PK usando el programa WinNonlin-Phoenix y se enumeraron en la tabla 16.

Como se muestra en la figura 3 y la tabla 16, la adición de la segunda inserción de XTEN en el dominio A1 de FVIII o posterior de D'D3 mejora más la semivida del heterodímero hasta 29,45 o 31,10 respectivamente. Además, también se observaron mejoras de más de 2 veces en la eliminación y ABC a partir de ambas inserciones de XTEN.

Tabla 16: Parámetro PK de heterodímeros en ratones HemA

Ejemplo 7: XTEN AE 144 aa confiere mejor beneficio de semivida que XTEN AE 288 aa cuando se inserta entre los dom inios D'D3 y Fc.

Se construyó otro heterodímero, FVIII169/VWF057, en un esfuerzo por identificar la longitud óptima de la inserción de XTEN dentro de la cadena de D'D3-XTEN-Fc, en que la longitud de la inserción de XTEN se redujo hasta 144 aa desde 288 aa. Como se muestra en la figura 4, en comparación con rFVIII169/VWF034, la semivida de rFVIII169/VWF057 se aumentó de 31 h a 42 h. También se observó eliminación y ABC mejoradas para rFVIII169/VWF057, los datos se enumeran en la tabla 17. Por tanto, la inserción de XTEN A^e144 aa es más óptima que XTEN AE 288 aa cuando se inserta entre el dominio D'D3 y Fc de los heterodímeros de FVIII-XTEN-Fc/D'D3-XTEN-Fc.

Tabla 17: Parámetros PK de rFVIII169/VWF034 y rFVIII169/VWF057 en ratones HemA

Ejemplo 8: El dom inio Fc prolonga la semivida del heterodímero

Los dominios Fc prolongan la semivida de su proteína de fusión a través de la ruta de reciclado mediada por FcRn. Para confirmar la necesidad del dominio Fc en la prolongación de la semivida del heterodímero, los dominios Fc de tipo silvestre se remplazaron por un triple mutante (I253A/H310A/H435A; IHH) en rFVIII205/VWF031 para formar rFVIII263/VWF050, y se confirmó la eliminación completa de la unión a FcRn por ensayo de resonancia de plasmones superficiales (Biacore) para rFVIII263/VWF050. La semivida de FVIII263/VWF050 se evaluó en ratones HemA en comparación con rFVIII205/VWF031. Se observó tasa de eliminación aumentada, así como semivida y ABC reducidas para rFVIII263/VWF050 como se muestra en la figura 5 y la tabla 18. Este resultado demostró que, además de garantizar la unión covalente de FVIII y D'D3, los dominios Fc también son necesarios para la mejora de la semivida del heterodímero.

Tabla 18: Parámetros PK de rFVIII205/VWF031 y rFVIII263/VWF040 en ratones HemA

Ejemplo 9: Eficacia aguda de heterodímeros de FVIII-XTEN-Fc/D'D3-XTEN-Fc en modelo de hemorragia por perforación de la cola de ratón HemA

La eficacia aguda de candidatos principales de heterodímero se evaluó usando modelo de hemorragia por perforación de la cola de ratón HemA.

Se asignaron aleatoriamente ratones macho HemA de 8-12 semanas de edad en 4 grupos de tratamiento, y se trataron con una sola administración intravenosa de FVIII BDD SQ, rFVIM169/VWF034, rFVIN169/VWF057 o solución de vehículo, respectivamente. Para imitar el tratamiento episódico de FVIII (para reconstituir un 50-100 % del nivel plasmático de FVIII normal), la dosis de tratamiento de FVIII seleccionada es 75 UI/kg medida por la actividad aPTT de FVIII. A este nivel de dosis, todas las variantes de FVIII de ensayo reconstituirán ~70 % de la actividad de FVIII plasmático murino normal 5 min después de la dosificación.

Se representó el volumen de pérdida de sangre de cada animal individual en el estudio en la figura 6. Se observó reducción significativa en el volumen de pérdida de sangre para todos los grupos de tratamiento de FVIII en comparación con animales tratados con vehículo. Dentro de los tres grupos de tratamiento de FVIII, no se encontró diferencia estadística significativa en la reducción de pérdida de sangre, lo que sugiere que las moléculas heterodiméricas podría ser posiblemente tan eficaces como FVIII BDD SQ para tratamiento a demanda.

Además, los ratones HemA se trataron con una dosis inferior (37,5 UI/kg) de rBDD-FVIII o rFVIII169/VWF034, y los resultados se muestran en la figura 6B. Igual que la dosis de 75 UI/kg, rFVIII169/VWF034 proporcionó protección similar a FVIII BDD a los ratones HemA tras la lesión por perforación de la cola, lo que indica que la molécula aún era eficaz para tratar episodios hemorrágicos graves a ~35 % del nivel murino de FVIII en circulación normal en ratones HemA.

El procedimiento de perforación de la cola se realizó como sigue. En resumen, los ratones se anestesiaron con a 50 mg/kg de ketamina/0,5 mg/kg de cóctel de dexmedetomidina antes de la lesión en la cola y se situaron en una almohadilla de calentamiento a 37 °C para ayudar a mantener la temperatura corporal. Las colas de los ratones entonces se sumergieron en solución salina a 37 °C durante 10 minutos para dilatar la vena lateral. Después de la dilatación de la vena, se inyectaron variantes de FVIII o solución de vehículo mediante la vena de la cola y entonces se amputaron 5 mm distales de la cola usando un bisturí con borde recto n.° 11 a los 5 min después de la dosificación. Se recogió la sangre derramada en 13 ml de solución salina a 37 °C durante 30 minutos y se determinó el volumen de pérdida de sangre mediante el cambio de peso del tubo de recogida de sangre: volumen de pérdida de sangre = (peso final de tubo de recogida - peso inicial 0,10) ml. Se realizó análisis estadístico usando ensayo de la t (ensayo de Mann Whitney) y ANOVA unidireccional (ensayo de KRUSKAL-Wallis, ensayo posterior: ensayo de comparación múltiples de Dunns).

Ejemplo 10: Eficacia profiláctica de heterodímero de FVIII-XTEN-Fc/D'D3-XTEN-Fc en modelo de hemorragia por corte transversal de la vena de la cola de ratón HemA

La eficacia profiláctica de FVIII169/VWF057 se ensayó en modelo de corte transversal de la vena de la cola (TVT) de ratón HemA. El modelo de TVT induce hemorragia introduciendo lesión a la vena lateral de la cola del ratón, que imita los episodios hemorrágicos espontáneos en pacientes con trastorno hemorrágico de hemofilia.

Se asignaron aleatoriamente ratones macho HemA de 8-10 semanas de edad en cuatro grupos de tratamiento, y se trataron con FVIII169/VWF057 a las 72 h antes de la lesión en la vena de la cola, o FVIII b Dd SQ a las 24 h o 48 h antes de la lesión. Se usó animal tratado con vehículo como control negativo. Los acontecimientos de hemorragia recurrente o eutanasia debida a la pérdida excesiva de sangre en 24 h después de la lesión se representaron en la figura 7.

Como se muestra en la figura 7, a diferencia de los ratones tratados con FVIII BDD SQ a las 48 h antes de TVT, de los que se observó solamente protección limitada después de la lesión, los ratones que recibieron rFVIII169/VWF057 a las 72 h antes de la lesión en la cola tuvieron protección similar sobre hemorragia recurrente y supervivencia en comparación con los ratones que recibieron tratamiento con FVIII BDD SQ 24 h antes de TVT, lo que indica que rFVIII169/VWF057 puede proporcionar protección al menos 3 veces o más (por ejemplo, 4 veces) más larga a ratones HemA en modelo TVT. Por lo tanto, rFVIII169/VWF057 podría reducir significativamente la frecuencia de tratamiento de la profilaxis de FVIII actual.

Asimismo, los ratones HemA se trataron con heterodímeros de FVIII-XTEN-Fc/D'D3-XTEN-Fc: rFVIII169/VWF034 y rFVIII169/VWF057, a las 24 o 96 horas antes de la lesión en la vena de la cola. Los datos de hemorragia recurrente y supervivencia de los tratamientos se compararon con los datos de rBDD-FVIII a las 24 o 48 horas antes de la lesión y vehículo. Aunque la hemorragia recurrente en ratones tratados con rBDD-FVIII a las 24 horas antes de la lesión en la vena de la cola fue similar a los ratones tratados con vehículo, los datos de hemorragia recurrente de ratones tratados con los heterodímeros a las 24 h antes de la lesión son significativamente mejores que el grupo de tratamiento con vehículo. Además, los datos de hemorragia recurrente de ratones tratados con los heterodímeros a las 96 h antes de la lesión fueron comparables a ratones que recibieron rBDD-FVIII a las 24 h antes de la lesión. En cuanto a la tasa de supervivencia a las 24 h después de la lesión TVT, en contraste con la tasa de supervivencia de menos de un 50 % de ratones tratados con rBDD-FVIII, más de un 90 % de los ratones sobrevivieron a la lesión TVT con tratamiento con heterodímeros de FVIII-XTEN-Fc/D'D3-XTEN-Fc cuando las moléculas de FVIII se administraban a las 24 h antes de la lesión. Además, la supervivencia en ratones tratados con los heterodímeros de FVIII-XTEN-Fc/D'D3-XTEN-Fc a las 96 horas antes de la lesión en la vena de la cola fue mejor (en el caso de rFVIII169/VWF034) o comparable (en el caso de rFVIII169/VWF057) en comparación con los ratones que recibieron tratamiento con rBDD-FVIII a las 24 horas antes de la lesión. Tanto los datos de hemorragia recurrente como los de supervivencia habían indicado una prolongación de la eficacia de 4 veces del tratamiento con heterodímero de FVIII-XTEN-Fc/D'D3-XTEN-Fc frente a tratamiento con rBDD-FVIII.

Modelo de corte transversal de la vena de la cola de ratón HemA

El procedimiento de corte transversal de la vena de la cola se realizó como sigue. Los ratones se anestesiaron con un cóctel que contenía 50 mg/kg de ketamina, 0,125 mg/kg de dexmedetomidina y 0,1 mg/kg de Buprenex. A una profundidad anestésica adecuada, la vena de la cola lateral de los ratones se cortó transversalmente con hoja de bisturí de borde recto número 11 en una zona donde el diámetro de la cola es aproximadamente 2,7 mm. La sangre derramada se eliminó por lavado con solución salina caliente para garantizar la observación clara de la herida. Los ratones tratados entonces se alojaron individualmente en una jaula limpia con lecho de papel blando durante las siguientes 24 horas. Se observó la hemorragia recurrente de la cola y la actividad física del ratón y se registró cada hora hasta 12 horas después de la lesión en la cola. Los ratones moribundos se sacrificaron inmediatamente, y se realizó una observación final a las 24 horas después de la lesión en la cola. Para imitar la situación hemorrágica en pacientes con hemofilia y para garantizar la recuperación completa del animal de la anestesia, se administró 1 mg/kg de solución de atipamezol para invertir el efecto de dexmedetomidina al inicio del corte transversal de la vena de la cola. Se administró una dosis adicional de 0,1 mg/kg de Buprenex al final del periodo de observación de 12 horas durante control del dolor por la noche. La curva de supervivencia del tiempo hasta hemorragia recurrente y tiempo hasta eutanasia se generó para el análisis de los datos, y se usó ensayo del orden logarítmico (Mantel-COX) para evaluación estadística.

Ejemplo 11: Preparación de FVIII169/VWF059 y otras construcciones

Clonación de pSYN FVIII 310:

Se preparó comercialmente un fragmento de ADN sintético flanqueado con sitio BamHl en el extremo N y sitio Cla 1 en el extremo C. Este ADN sintético se usó para remplazar la región de BamHl a Cla1 en la construcción pSYN FVIII 169 (SEQ ID NO: 155). Tanto el ADN sintético como el ADN de pSYN FVIII 169 se digirieron doblemente con BamHl y Cla1, el ADN sintético digerido se insertó en pSYN FVIII 169 digerido para crear pSYN FVIII 310 (SEQ ID NO:168; tabla 19).

Clonación de pSYN FVIII 312:

Se preparó comercialmente un fragmento de ADN sintético flanqueado con sitio BamHl en el extremo N y sitio Afe 1 en el extremo C. Este ADN sintético se usó para remplazar la región de BamHl a Afe1 en la construcción pSYN FVIII 169 (SEQ ID NO: 155). Tanto el ADN sintético como el ADN de pSYN FVIII 169 se digirieron doblemente con BamHl y Afe1, el ADN sintético digerido se insertó en pSYN FVIII 169 digerido para crear pSYN FVIII 312 (SEQ ID NO: 169; tabla 19). pSYN FVIII 312A (SEQ ID NO: 2; tabla 19) se creó a partir de pSYN FVIII312 para retirar el sitio AscI que codifica los residuos aminoacídicos GAP en la unión de FVIII y XTEN.

Tabla 19: Construcciones de FVIII sintéticas.

Clonación de pSYN VWF059 y VWF073:

Se prepararon diversos fragmentos de ADN sintéticos que codifican diferentes regiones conectoras entre D'D3-XTEN y Fc. Estos fragmentos de ADN sintéticos se flanquearon con sitio Asc1 en el extremo N y sitio Not 1 en el extremo C. Estos ADN sintéticos se usaron para remplazar la región de Asc1 a Not1 en la construcción pSYN VWF057 (SEQ ID NO: 152). La construcción pSYN VWF059 (tabla 20) comprende una región conectora (SEQ ID NO: 13), que incluye la región ácida 2 (a2) de FVIII completa. Se informa de que este sitio se escinde por trombina, y tras la activación de FVIII se libera D'D3XTEN. La construcción pSYN VWF073 (tabla 20) contiene solamente el sitio de escisión por trombina de la región ácida 2 (a2) de FVIII (es decir, IEPRSFS) (SEQ ID NO: 23). Tanto el ADN sintético como el ADN de pSYN VWF057 se digirieron doblemente con Asc1 y Not1. El ADN sintético digerido se insertó en pSYN VWF057 digerido para crear pSYN VWF059 y pSYN VWF073. La construcción pSYN VWF59A (tabla 20) se generó a partir de pSYN VWF059 eliminando el sitio de restricción EcoRV. Se generaron proteínas heterodiméricas de FVIN169/VWF057 y FVIN169/VWF059 por coexpresión de FVIN169 y VWF057 o VWF059 en células HEK293.

Tabla 20: Construcciones de VWF sintéticas - regiones conectoras escindibles.

Ejemplo 12: Digestión con trombina de heterodímero de FVIII para analizar la liberación de D'D3 de Fc Se ensayaron dos proteínas heterodiméricas de FVIII en experimentos de digestión con trombina y se examinó su tasa de escisión por trombina. Las dos construcciones heterodiméricas usadas en este experimento fueron el heterodímero de FVIII169/VWF057 y el heterodímero de FVIII169/VWF059 junto con FVIIIFc. Los heterodímeros de FVIII169/VWF057 y FVIII169/VWF059 se describen anteriormente. Se realizaron tres reacciones de digestión: i) FVIIIFc, ii) FVIII169/VWF057 (figura 11) y iii) FVIII 169/VWF059 (figura 12). Las muestras de ensayo se trataron con a-trombina humana a una relación molar de FVIII:trombina de aproximadamente 22:1. Cada reacción se incubó en un baño de agua a 37 °C. A cada punto temporal indicado (t = 5, 15, 30, 45, 60 minutos), se extrajo una muestra de 22,5 pl, se detuvo con 22,5 pl de tinte de carga de SDS 2x no reductor, y se calentó durante 3 minutos. La proteína digerida entonces se procesó en un gel de SDS-PAGE. Se realizó inmunoelectrotransferencia usando anticuerpos anticadena pesada de FVIII (GMA012) y anti-VWF-D3 (Ab96340) usando un sistema LICOR.

Como se muestra en la figura 11, la exposición de FVIII169/VWF057 a trombina provocó una disminución gradual en el nivel detectado de D'D3-XTEN-Fc, que se correlaciona con un aumento en el nivel de D'D3-144 XTEN, el producto escindido. FVIII169/VWF057 sin escindir permaneció después de 15 minutos. A la inversa, la figura 12 muestra que FVIII 169/VWF059 se escinde más rápidamente por trombina, como se evidencia por el poco a ningún FVIII 169/VWF059 sin escindir detectable después de 5 minutos. Por consiguiente, FVIII 169/VWF059 mostró mejor liberación de D'D3 de Fc tras la activación con trombina en comparación con FVIII169/VWF057.

Se hicieron experimentos paralelos para investigar la escisión con trombina usando espectroscopia de masas (EM). Por EM, FVIII 169/VWF059 de nuevo mostró mejor liberación de D'D3 de Fc en comparación con VWF057.

Ejemplo 13: Evaluación in vivo de FVIII169/VWF059 en ratones HemA

Para evaluar adicionalmente el perfil farmacocinético y la potencia in vivo de FVIII169/VWF059, los ratones HemA se trataron con FVIII169/VWF059 a través de administración intravenosa a dosis de 150 UI/kg. Se recogieron muestras de plasma mediante recogida de sangre de la vena cava a los 5 minutos, 24, 48, 72, 96 y 120 horas tras la inyección. La actividad de FVIII en muestras de plasma se midió por ensayos cromogénico de FVIII y los parámetros PK se calcularon usando el programa Phoenix. Se observó un perfil PK similar de FVIII169/VWF059 en comparación con FVIII169/VWF057, como se muestra en la tabla 21, lo que indica que el conector de escisión por trombina a2 no tiene efecto negativo sobre el perfil PK del heterodímero.

Tabla 21: Perfil PK de FVIII169/VWF057 y FVIII169/VWF059 en ratones HemA

La eficacia aguda de FVIII169/VWF059 se evaluó en un modelo de perforación de la cola de ratón HemA (descrito en el ejemplo 9) en comparación con FVIII BDD de tipo silvestre. Los ratones HemA se trataron con 75 UI/kg de FVIII169/VWF059 o FVIII BDD, y se representó el volumen de pérdida de sangre de cada ratón experimental en la figura 13. En comparación con FVIII BDD, FVIII169/VWF059 proporcionó el mismo grado de protección a ratones HemA (p = 0,9883), lo que indica que FVIII169/VWF059 es completamente funcional in vivo.

Construcción plasmídica de heterodímeros de FVIII-XTEN-Fc/D'D3-Fc

Secuencia de nucleótidos de VWF031 (SEQ ID NO: 147)

1 ATGAT TCCTG CCAGA TTTGC CGGGG TGCTG CTTGC TCTGG CCCTCATTTT

51 GCCAG GGACC CTTTG TGCAGAAGGAACTCG CGGCA GGTCA TCCAC GGCCC

101 GATGC AGCCT TTTCG GAAGT GACTT CGTCA ACACC TTTGA TGGGA GCATG 151 TACAG CTTTG CGGGA TACTG CAGTT ACCTC CTGGC AGGGG GCTGC CAGAA 201 ACGCT CCTTC TCGAT TATTG GGGAC TTCCA GAATG GCAAG AGAGT GAGCC 251 TCTCC GTGTA TCTTG GGGAA TTTTT TGACA TCCAT TTGTT TGTCA ATGGT 301 ACCGT GACAC AGGGG GACCA AAGAG TCTCC ATGCC CTATG CCTCC AAAGG 351 GCTGT ATCTA GAAAC TGAGG CTGGG TACTA CAAGC TGTCC GGTGA GGCCT 401 ATGGC TTTGT GGCCA GGATC GATGG CAGCG GCAAC TTTCA AGTCC TGCTG 451 TCAGA CAGAT ACTTC AACAA GACCT GCGGG CTGTG TGGCA ACTTT AACAT 501 CTTTG CTGAA GATGA CTTTA TGACC CAAGA AGGGA CCTTG ACCTC GGACC 551 CTTAT GACTT TGCCA ACTCA TGGGC TCTGA GCAGT GGAGA ACAGT GGTGT 601 GAACG GGCAT CTCCT CCCAG CAGCT CATGC AACAT CTCCT CTGGG GAAAT 651 GCAGA AGGGC CTGTG GGAGC AGTGC CAGCT TCTGA AGAGC ACCTC GGTGT 701 TTGCC CGCTG CCACC CTCTG GTGGA CCCCG AGCCT TTTGT GGCCC TGTGT 751 GAGAA GACTT TGTGT GAGTG TGCTG GGGGG CTGGA GTGCG CCTGC CCTGC 801 CCTCC TGGAG TACGC CCGGA CCTGT GCCCA GGAGG GAATG GTGCT GTACG 851 GCTGG ACCGA CCACA GCGCG TGCAG CCCAG TGTGC CCTGC TGGTA TGGAG 901 TATAG GCAGT GTGTG TCCCC TTGCG CCAGG ACCTG CCAGA GCCTG CACAT 951 CAATG AAATG TGTCA GGAGC GATGC GTGGA TGGCT GCAGC TGCCC TGAGG 1001 GACAG CTCCT GGATG AAGGC CTCTG CGTGG AGAGC ACCGA GTGTC CCTGC 1051 GTGCA TTCCG GAAAG CGCTA CCCTC CCGGC ACCTC CCTCT CTCGA GACTG 1101 CAACA CCTGC ATTTG CCGAA ACAGC CAGTG GATCT GCAGC AATGA AGAAT 1151 GTCCA GGGGA GTGCC TTGTC ACTGG TCAAT CCCAC TTCAA GAGCT TTGAC 1201 AACAG ATACT TCACC TTCAG TGGGA TCTGC CAGTA CCTGC TGGCC CGGGA 1251 TTGCC AGGAC CACTC CTTCT CCATT GTCAT TGAGA CTGTC CAGTG TGCTG 1301 ATGAC CGCGA CGCTG TGTGC ACCCG CTCCG TCACC GTCCG GCTGC CTGGC 1351 CTGCA CAACA GCCTT GTGAA ACTGA AGCAT GGGGC AGGAG TTGCC ATGGA 1401 TGGCC AGGAC ATCCA GCTCC CCCTC CTGAA AGGTG ACCTC CGCAT CCAGC 1451 ATACA GTGAC GGCCT CCGTG CGCCT CAGCT ACGGG GAGGA CCTGC AGATG 1501 GACTG GGATG GCCGC GGGAG GCTGC TGGTG AAGCT GTCCC CCGTC TATGC 1551 CGGGA AGACC TGCGG CCTGT GTGGG AATTA CAATG GCAAC CAGGG CGACG 1601 ACTTC CTTAC CCCCT CTGGG CTGGC GGAGC CCCGG GTGGA GGACT TCGGG 1651 AACGC CTGGA AGCTG CACGG GGACT GCCAG GACCT GCAGA AGCAG CACAG 1701 CGATC CCTGC GCCCT CAACC CGCGC ATGAC CAGGT TCTCC GAGGA GGCGT 1751 GCGCG GTCCT GACGT CCCCC ACATT CGAGG CCTGC CATCG TGCCG TCAGC 1801 CCGCT GCCCT ACCTG CGGAA CTGCC GCTAC GACGT GTGCT CCTGC TCGGA 1851 CGGCC GCGAG TGCCT GTGCG GCGCC CTGGC CAGCT ATGCC GCGGC CTGCG 1901 CGGGG AGAGG CGTGC GCGTC GCGTG GCGCG AGCCA GGCCG CTGTG AGCTG 1951 AACTG CCCGA AAGGC CAGGT GTACC TGCAG TGCGG GACCC CCTGC AACCT 2001 GACCT GCCGC TCTCT CTCTT ACCCG GATGA GGAAT GCAAT GAGGC CTGCC 2051 TGGAG GGCTG CTTCT GCCCC CCAGG GCTCT ACATG GATGA GAGGG GGGAC 2101 TGCGT GCCCA AGGCC CAGTG CCCCT GTTAC TATGA CGGTG AGATC TTCCA 2151 GCCAG AAGAC ATCTT CTCAG ACCAT CACAC CATGT GCTAC TGTGA GGATG 2201 GCTTC ATGCA CTGTA CCATG AGTGG AGTCC CCGGA AGCTT GCTGC CTGAC 2251 GCTGT CCTCA GCAGT CCCCT GTCTC ATCGC AGCAA AAGGA GCCTA TCCTG 2301 TCGGC CCCCC ATGGT CAAGC TGGTG TGTCC CGCTG ACAAC CTGCG GGCTG 2351 AAGGG CTCGA GTGTA CCAAA ACGTG CCAGA ACTAT GACCT GGAGT GCATG 2401 AGCAT GGGCT GTGTC TCTGG CTGCC TCTGC CCCCC GGGCA TGGTC CGGCA 2451 TGAGA ACAGA TGTGT GGCCC TGGAA AGGTG TCCCT GCTTC CATCA GGGCA 2501 AGGAG TATGC CCCTG GAGAA ACAGT GAAGA TTGGC TGCAA CACTT GTGTC 2551 TGTCG GGACC GGAAG TGGAA CTGCA CAGAC CATGT GTGTG ATGCC ACGTG 2601 CTCCA CGATC GGCAT GGCCC ACTAC CTCAC CTTCG ACGGG CTCAA ATACC 2651 TGTTC CCCGG GGAGT GCCAG TACGT TCTGG TGCAG GATTA CTGCG GCAGT 2701 AACCC TGGGA CCTTT CGGAT CCTAG TGGGG AATAA GGGAT GCAGC CACCC 2751 CTCAG TGAAA TGCAA GAAAC GGGTC ACCAT CCTGG TGGAG GGAGG AGAGA 2801 TTGAG CTGTT TGACG GGGAG GTGAA TGTGA AGAGG CCCAT GAAGG ATGAG 2851 ACTCA CTTTG AGGTG GTGGA GTCTG GCCGG TACAT CATTC TGCTG CTGGG 2901 CAAAG CCCTC TCCGT GGTCT GGGAC CGCCA CCTGA GCATC TCCGT GGTCC 2951 TGAAG CAGAC ATACC AGGAG AAAGT GTGTG GCCTG TGTGG GAATT TTGAT 3001 GGCAT CCAGA ACAAT GACCT CACCA GCAGC AACCT CCAAG TGGAG GAAGA 3051 CCCTG TGGAC TTTGG GAACT CCTGG AAAGT GAGCT CGCAG TGTGC TGACA 3101 CCAGA AAAGT GCCTC TGGAC TCATC CCCTG CCACC TGCCA TAACA ACATC 3151 ATGAA GCAGA CGATG GTGGA TTCCT CCTGT AGAAT CCTTA CCAGT GACGT 3201 CTTCC AGGAC TGCAA CAAGC TGGTG GACCC CGAGC CATAT CTGGA TGTCT 3251 GCATT TACGA CACCT GCTCC TGTGA GTCCA TTGGG GACTG CGCCG CATTC 3301 TGCGA CACCA TTGCT GCCTA TGCCC ACGTG TGTGC CCAGC ATGGC AAGGT 3351 GGTGA CCTGG AGGAC GGCCA CATTG TGCCC CCAGA GCTGC GAGGA GAGGA 3401 ATCTC CGGGA GAACG GGTAT GAGGC TGAGT GGCGC TATAA CAGCT GTGCA 3451 CCTGC CTGTC AAGTC ACGTG TCAGC ACCCT GAGCC ACTGG CCTGC CCTGT 3501 GCAGT GTGTG GAGGG CTGCC ATGCC CACTG CCCTC CAGGG AAAAT CCTGG 3551 ATGAG CTTTT GCAGA CCTGC GTTGA CCCTG AAGAC TGTCC AGTGT GTGAG 3601 GTGGC TGGCC GGCGT TTTGC CTCAG GAAAG AAAGT CACCT TGAAT CCCAG 3651 TGACC CTGAG CACTG CCAGA TTTGC CACTG TGATG TTGTC AACCT CACCT 3701 GTGAA GCCTG CCAGG AGCCG ATATC TGGCG GTGGA GGTTC CGGTG GCGGG 3751 GGATC CGGCG GTGGA GGTTC CGGCG GTGGA GGTTC CGGTG GCGGG GGATC 3801 CGGTG GCGGG GGATC CCTGG TCCCC CGGGG CAGCG GCGGT GGAGG TTCCG 3851 GTGGC GGGGG ATCCG ACAAA ACTCA CACAT GCCCA CCGTG CCCAG CTCCA 3901 GAACT CCTGG GCGGA CCGTC AGTCT TCCTC TTCCC CCCAA AACCC AAGGA 3951 CACCC TCATG ATCTC CCGGA CCCCT GAGGT CACAT GCGTG GTGGT GGACG 4001 TGAGC CACGA AGACC CTGAG GTCAA GTTCA ACTGG TACGT GGACG GCGTG 4051 GAGGT GCATA ATGCC AAGAC AAAGC CGCGG GAGGA GCAGT ACAAC AGCAC 4101 GTACC GTGTG GTCAG CGTCC TCACC GTCCT GCACC AGGAC TGGCT GAATG 4151 GCAAG GAGTA CAAGT GCAAG GTCTC CAACA AAGCC CTCCC AGCCC CCATC 4201 GAGAA AACCA TCTCC AAAGC CAAAG GGCAG CCCCG AGAAC CACAG GTGTA 4251 CACCC TGCCC CCATC CCGCG ATGAG CTGAC CAAGA ACCAG GTCAG CCTGA 4301 CCTGC CTGGT CAAAG GCTTC TATCC CAGCG ACATC GCCGT GGAGT GGGAG 4351 AGCAA TGGGC AGCCG GAGAA CAACT ACAAG ACCAC GCCTC CCGTG TTGGA 4401 CTCCG ACGGC TCCTT CTTCC TCTAC AGCAA GCTCA CCGTG GACAA GAGCA 4451 GGTGG CAGCA GGGGA ACGTC TTCTC ATGCT CCGTG ATGCA TGAGG CTCTG 4501 CACAA CCACT ACACG CAGAA GAGCC TCTCC CTGTC TCCGG GTAAA TGA

Secuencia proteínica de VWF031 (SEQ ID NO: 86)

MIPARFAGVL LALALILPGT LCAEGTRGRS STARCSLFGS DFVNTFDGSM

51 YSFAGYCSYL LAGGCQKRSF SIIGDFQNGK RVSLSVYLGE FFDIHLFVNG 101 TVTQGDQRVS MPYASKGLYL ETEAGYYKLS GEAYGFVARI DGSGNFQVLL 151 SDRYFNKTCG LCGNFNIFAE DDFMTQEGTL TSDPYDFANS WALSSGEQWC 201 ERASPPSSSC NISSGEMQKG LWEQCQLLKS TSVFARCHPL VDPEPFVALC 251 EKTLCECAGG LECACPALLE YARTCAQEGM VLYGWTDHSA CSPVCPAGME 301 YRQCVSPCAR TCQSLHINEM CQERCVDGCS CPEGQLLDEG LCVESTECPC 351 VHSGKRYPPG TSLSRDCNTC ICRNSQWICS NEECPGECLV TGQSHFKSFD 401 NRYFTFSGIC QYLLARDCQD HSFSIVIETV QCADDRDAVC TRSVTVRLPG 451 LHNSLVKLKH GAGVAMDGQD IQLPLLKGDL RIQHTVTASV RLSYGEDLQM 501 DWDGRGRLLV KLSPVYAGKT CGLCGNYNGN QGDDFLTPSG LAEPRVEDFG 551 NAWKLHGDCQ DLQKQHSDPC ALNPRMTRFS EEACAVLTSP TFEACHRAVS 601 PLPYLRNCRY DVCSCSDGRE CLCGALASYAAACAGRGVRV AWREPGRCEL 651 NCPKGQVYLQ CGTPCNLTCR SLSYPDEECN EACLEGCFCP PGLYMDERGD 701 CVPKAQCPCY YDGEIFQPED IFSDHHTMCY CEDGFMHCTM SGVPGSLLPD 751 AVLSSPLSHR SKRSLSCRPP MVKLVCPADN LRAEGLECTK TCQNYDLECM 801 SMGCVSGCLC PPGMVRHENR CVALERCPCF HQGKEYAPGE TVKIGCNTCV 851 CRDRKWNCTD HVCDATCSTI GMAHYLTFDG LKYLFPGECQ YVLVQDYCGS 901 NPGTFRILVG NKGCSHPSVK CKKRVTILVE GGEIELFDGE VNVKRPMKDE 951 THFEWESGR YIILLLGKAL SWWDRHLSI SWLKQTYQE KVCGLCGNFD 1001 GIQNNDLTSS NLQVEEDPVD FGNSWKVSSQ CADTRKVPLD SSPATCHNNI 1051 MKQTMVDSSC RILTSDVFQD CNKLVDPEPY LDVCIYDTCS CESIGDCAAF 1101 CDTIAAYAHV CAQHGKWTW RTATLCPQSC EERNLRENGY EAEWRYNSCA 1151 PACQVTCQHP EPLACPVQCV EGCHAHCPPG KILDELLQTC VDPEDCPVCE 1201 VAGRRFASGK KVTLNPSDPE HCQICHCDW NLTCEACQEP ISGGGGSGGG

1251 GSGGGGSGGG GSGGGGSGGG GSLVPRGSGG GGSGGGGSDK THTCPPCPAP 1301 ELLGGPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV WDVSHEDPE VKFNWYVDGV 1351 EVHNAKTKPR EEQYNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKALPAPI 1401 EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSRDELTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE 1451 SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSKLTV DKSRWQQGNV FSCSVMHEAL 1501 HNHYTQKSLS LSPGK*

Secuencia de nucleótidos de VWF034 (SEQ ID NO: 148)

1 ATGAT TCCTG CCAGA TTTGC CGGGG TGCTG CTTGC TCTGG CCCTC ATTTT 51 GCCAG GGACC CTTTG TGCAG AAGGA ACTCG CGGCA GGTCA TCCAC GGCCC 101 GATGC AGCCT TTTCG GAAGT GACTT CGTCA ACACC TTTGA TGGGA GCATG 151 TACAG CTTTG CGGGA TACTG CAGTT ACCTC CTGGC AGGGG GCTGC CAGAA 201 ACGCT CCTTC TCGAT TATTG GGGAC TTCCA GAATG GCAAG AGAGT GAGCC 251 TCTCC GTGTA TCTTG GGGAA TTTTT TGACA TCCAT TTGTT TGTCA ATGGT 301 ACCGT GACAC AGGGG GACCA AAGAG TCTCC ATGCC CTATG CCTCC AAAGG 351 GCTGT ATCTA GAAAC TGAGG CTGGG TACTA CAAGC TGTCC GGTGA GGCCT 401 ATGGC TTTGT GGCCA GGATC GATGG CAGCG GCAAC TTTCA AGTCC TGCTG 451 TCAGA CAGAT ACTTC AACAA GACCT GCGGG CTGTG TGGCA ACTTT AACAT 501 CTTTG CTGAA GATGA CTTTA TGACC CAAGA AGGGA CCTTG ACCTC GGACC 551 CTTAT GACTT TGCCA ACTCA TGGGC TCTGA GCAGT GGAGA ACAGT GGTGT 601 GAACG GGCAT CTCCT CCCAG CAGCT CATGC AACAT CTCCT CTGGG GAAAT 651 GCAGA AGGGC CTGTG GGAGC AGTGC CAGCT TCTGA AGAGC ACCTC GGTGT 701 TTGCC CGCTG CCACC CTCTG GTGGA CCCCG AGCCT TTTGT GGCCC TGTGT 751 GAGAA GACTT TGTGT GAGTG TGCTG GGGGG CTGGA GTGCG CCTGC CCTGC 801 CCTCC TGGAG TACGC CCGGA CCTGT GCCCA GGAGG GAATG GTGCT GTACG 851 GCTGG ACCGA CCACA GCGCG TGCAG CCCAG TGTGC CCTGC TGGTA TGGAG 901 TATAG GCAGT GTGTG TCCCC TTGCG CCAGG ACCTG CCAGA GCCTG CACAT 951 CAATG AAATG TGTCA GGAGC GATGC GTGGA TGGCT GCAGC TGCCC TGAGG 1001 GACAG CTCCT GGATG AAGGC CTCTG CGTGG AGAGC ACCGA GTGTC CCTGC 1051 GTGCA TTCCG GAAAG CGCTA CCCTC CCGGC ACCTC CCTCT CTCGA GACTG 1101 CAACA CCTGC ATTTG CCGAA ACAGC CAGTG GATCT GCAGC AATGA AGAAT 1151 GTCCA GGGGA GTGCC TTGTC ACTGG TCAAT CCCAC TTCAA GAGCT TTGAC 1201 AACAG ATACT TCACC TTCAG TGGGA TCTGC CAGTA CCTGC TGGCC CGGGA 1251 TTGCC AGGAC CACTC CTTCT CCATT GTCAT TGAGA CTGTC CAGTG TGCTG 1301 ATGAC CGCGA CGCTG TGTGC ACCCG CTCCG TCACC GTCCG GCTGC CTGGC 1351 CTGCA CAACA GCCTT GTGAA ACTGA AGCAT GGGGC AGGAG TTGCC ATGGA 1401 TGGCC AGGAC ATCCA GCTCC CCCTC CTGAA AGGTG ACCTC CGCAT CCAGC 1451 ATACA GTGAC GGCCT CCGTG CGCCT CAGCT ACGGG GAGGA CCTGC AGATG 1501 GACTG GGATG GCCGC GGGAG GCTGC TGGTG AAGCT GTCCC CCGTC TATGC 1551 CGGGA AGACC TGCGG CCTGT GTGGG AATTA CAATG GCAAC CAGGG CGACG 1601 ACTTC CTTAC CCCCT CTGGG CTGGC GGAGC CCCGG GTGGA GGACT TCGGG 1651 AACGC CTGGA AGCTG CACGG GGACT GCCAG GACCT GCAGA AGCAG CACAG 1701 CGATC CCTGC GCCCT CAACC CGCGC ATGAC CAGGT TCTCC GAGGA GGCGT 1751 GCGCG GTCCT GACGT CCCCC ACATT CGAGG CCTGC CATCG TGCCG TCAGC 1801 CCGCT GCCCT ACCTG CGGAA CTGCC GCTAC GACGT GTGCT CCTGC TCGGA 1851 CGGCC GCGAG TGCCT GTGCG GCGCC CTGGC CAGCT ATGCC GCGGC CTGCG 1901 CGGGG AGAGG CGTGC GCGTC GCGTG GCGCG AGCCA GGCCG CTGTG AGCTG 1951 AACTG CCCGA AAGGC CAGGT GTACC TGCAG TGCGG GACCC CCTGC AACCT 2001 GACCT GCCGC TCTCT CTCTT ACCCG GATGA GGAAT GCAAT GAGGC CTGCC 2051 TGGAG GGCTG CTTCT GCCCC CCAGG GCTCT ACATG GATGA GAGGG GGGAC 2101 TGCGT GCCCA AGGCC CAGTG CCCCT GTTAC TATGA CGGTG AGATC TTCCA 2151 GCCAG AAGAC ATCTT CTCAG ACCAT CACAC CATGT GCTAC TGTGA GGATG 2201 GCTTC ATGCA CTGTA CCATG AGTGG AGTCC CCGGA AGCTT GCTGC CTGAC 2251 GCTGT CCTCA GCAGT CCCCT GTCTC ATCGC AGCAA AAGGA GCCTA TCCTG 2301 TCGGC CCCCC ATGGT CAAGC TGGTG TGTCC CGCTG ACAAC CTGCG GGCTG 2351 AAGGG CTCGA GTGTA CCAAA ACGTG CCAGA ACTAT GACCT GGAGT GCATG 2401 AGCAT GGGCT GTGTC TCTGG CTGCC TCTGC CCCCC GGGCA TGGTC CGGCA 2451 TGAGA ACAGA TGTGT GGCCC TGGAA AGGTG TCCCT GCTTC CATCA GGGCA 2501 AGGAG TATGC CCCTG GAGAA ACAGT GAAGA TTGGC TGCAA CACTT GTGTC 2551 TGTCG GGACC GGAAG TGGAA CTGCA CAGAC CATGT GTGTG ATGCC ACGTG 2601 CTCCA CGATC GGCAT GGCCC ACTAC CTCAC CTTCG ACGGG CTCAA ATACC 2651 TGTTC CCCGG GGAGT GCCAG TACGT TCTGG TGCAG GATTA CTGCG GCAGT 2701 AACCC TGGGA CCTTT CGGAT CCTAG TGGGG AATAA GGGAT GCAGC CACCC 2751 CTCAG TGAAA TGCAA GAAAC GGGTC ACCAT CCTGG TGGAG GGAGG AGAGA 2801 TTGAG CTGTT TGACG GGGAG GTGAA TGTGA AGAGG CCCAT GAAGG ATGAG 2851 ACTCA CTTTG AGGTG GTGGA GTCTG GCCGG TACAT CATTC TGCTG CTGGG 2901 CAAAG CCCTC TCCGT GGTCT GGGAC CGCCA CCTGA GCATC TCCGT GGTCC 2951 TGAAG CAGAC ATACC AGGAG AAAGT GTGTG GCCTG TGTGG GAATT TTGAT 3001 GGCAT CCAGA ACAAT GACCT CACCA GCAGC AACCT CCAAG TGGAG GAAGA 3051 CCCTG TGGAC TTTGG GAACT CCTGG AAAGT GAGCT CGCAG TGTGC TGACA 3101 CCAGA AAAGT GCCTC TGGAC TCATC CCCTG CCACC TGCCA TAACA ACATC 3151 ATGAA GCAGA CGATG GTGGA TTCCT CCTGT AGAAT CCTTA CCAGT GACGT 3201 CTTCC AGGAC TGCAA CAAGC TGGTG GACCC CGAGC CATAT CTGGA TGTCT 3251 GCATT TACGA CACCT GCTCC TGTGA GTCCA TTGGG GACTG CGCCG CATTC 3301 TGCGA CACCA TTGCT GCCTA TGCCC ACGTG TGTGC CCAGC ATGGC AAGGT 3351 GGTGA CCTGG AGGAC GGCCA CATTG TGCCC CCAGA GCTGC GAGGA GAGGA 3401 ATCTC CGGGA GAACG GGTAT GAGGC TGAGT GGCGC TATAA CAGCT GTGCA 3451 CCTGC CTGTC AAGTC ACGTG TCAGC ACCCT GAGCC ACTGG CCTGC CCTGT 3501 GCAGT GTGTG GAGGG CTGCC ATGCC CACTG CCCTC CAGGG AAAAT CCTGG 3551 ATGAG CTTTT GCAGA CCTGC GTTGA CCCTG AAGAC TGTCC AGTGT GTGAG 3601 GTGGC TGGCC GGCGT TTTGC CTCAG GAAAG AAAGT CACCT TGAAT CCCAG 3651 TGACC CTGAG CACTG CCAGA TTTGC CACTG TGATG TTGTC AACCT CACCT 3701 GTGAA GCCTG CCAGG AGCCG ATATC GGGTA CCTCA GAGTC TGCTA CCCCC 3751 GAGTC AGGGC CAGGA TCAGA GCCAG CCACC TCCGG GTCTG AGACA CCCGG 3801 GACTT CCGAG AGTGC CACCC CTGAG TCCGG ACCCG GGTCC GAGCC CGCCA 3851 CTTCC GGCTC CGAAA CTCCC GGCAC AAGCG AGAGC GCTAC CCCAG AGTCA 3901 GGACC AGGAA CATCT ACAGA GCCCT CTGAA GGCTC CGCTC CAGGG TCCCC 3951 AGCCG GCAGT CCCAC TAGCA CCGAG GAGGG AACCT CTGAA AGCGC CACAC 4001 CCGAA TCAGG GCCAG GGTCT GAGCC TGCTA CCAGC GGCAG CGAGA CACCA 4051 GGCAC CTCTG AGTCC GCCAC ACCAG AGTCC GGACC CGGAT CTCCC GCTGG 4101 GAGCC CCACC TCCAC TGAGG AGGGA TCTCC TGCTG GCTCT CCAAC ATCTA 4151 CTGAG GAAGG TACCT CAACC GAGCC ATCCG AGGGA TCAGC TCCCG GCACC 4201 TCAGA GTCGG CAACC CCGGA GTCTG GACCC GGAAC TTCCG AAAGT GCCAC 4251 ACCAG AGTCC GGTCC CGGGA CTTCA GAATC AGCAA CACCC GAGTC CGGCC 4301 CTGGG TCTGA ACCCG CCACA AGTGG TAGTG AGACA CCAGG ATCAG AACCT 4351 GCTAC CTCAG GGTCA GAGAC ACCCG GATCT CCGGC AGGCT CACCA ACCTC 4401 CACTG AGGAG GGCAC CAGCA CAGAA CCAAG CGAGG GCTCC GCACC CGGAA 4451 CAAGC ACTGA ACCCA GTGAG GGTTC AGCAC CCGGC TCTGA GCCGG CCACA 4501 AGTGG CAGTG AGACA CCCGG CACTT CAGAG AGTGC CACCC CCGAG AGTGG 4551 CCCAG GCACT AGTAC CGAGC CCTCT GAAGG CAGTG CGCCA GATTC TGGCG 4601 GTGGA GGTTC CGGTG GCGGG GGATC CGGTG GCGGG GGATC CGGTG GCGGG 4651 GGATC CGGTG GCGGG GGATC CCTGG TCCCC CGGGG CAGCG GAGGC GACAA 4701 AACTC ACACA TGCCC ACCGT GCCCA GCTCC AGAAC TCCTG GGCGG ACCGT 4751 CAGTC TTCCT CTTCC CCCCA AAACC CAAGG ACACC CTCAT GATCT CCCGG 4801 ACCCC TGAGG TCACA TGCGT GGTGG TGGAC GTGAG CCACG AAGAC CCTGA 4851 GGTCA AGTTC AACTG GTACG TGGAC GGCGT GGAGG TGCAT AATGC CAAGA 4901 CAAAG CCGCG GGAGG AGCAG TACAA CAGCA CGTAC CGTGT GGTCA GCGTC 4951 CTCAC CGTCC TGCAC CAGGA CTGGC TGAAT GGCAA GGAGT ACAAG TGCAA 5001 GGTCT CCAAC AAAGC CCTCC CAGCC CCCAT CGAGA AAACC ATCTC CAAAG 5051 CCAAA GGGCA GCCCC GAGAA CCACA GGTGT ACACC CTGCC CCCAT CCCGG 5101 GATGA GCTGA CCAAG AACCA GGTCA GCCTG ACCTG CCTGG TCAAA GGCTT 5151 CTATC CCAGC GACAT CGCCG TGGAG TGGGA GAGCA ATGGG CAGCC GGAGA 5201 ACAAC TACAA GACCA CGCCT CCCGT GTTGG ACTCC GACGG CTCCT TCTTC 5251 CTCTA CAGCA AGCTC ACCGT GGACA AGAGC AGGTG GCAGC AGGGG AACGT 5301 CTTCT CATGC TCCGT GATGC ATGAG GCTCT GCACA ACCAC TACAC GCAGA 5351 AGAGC CTCTC CCTGT CTCCG GGTAA ATGA

Secuencia proteínica de VWF034 (SEQ ID NO: 87)

1 MIPARFAGVL LALALILPGT LCAEGTRGRS STARCSLFGS DFVNTFDGSM 51 YSFAGYCSYL LAGGCQKRSF SIIGDFQNGK RVSLSVYLGE FFDIHLFVNG 101 TVTQGDQRVS MPYASKGLYL ETEAGYYKLS GEAYGFVARI DGSGNFQVLL 151 SDRYFNKTCG LCGNFNIFAE DDFMTQEGTL TSDPYDFANS WALSSGEQWC 201 ERASPPSSSC NISSGEMQKG LWEQCQLLKS TSVFARCHPL VDPEPFVALC 251 EKTLCECAGG LECACPALLE YARTCAQEGM VLYGWTDHSA CSPVCPAGME 301 YRQCVSPCAR TCQSLHINEM CQERCVDGCS CPEGQLLDEG LCVESTECPC 351 VHSGKRYPPG TSLSRDCNTC ICRNSQWICS NEECPGECLV TGQSHFKSFD 401 NRYFTFSGIC QYLLARDCQD HSFSIVIETV QCADDRDAVC TRSVTVRLPG 451 LHNSLVKLKH GAGVAMDGQD IQLPLLKGDL RIQHTVTASV RLSYGEDLQM 501 DWDGRGRLLV KLSPVYAGKT CGLCGNYNGN QGDDFLTPSG LAEPRVEDFG 551 NAWKLHGDCQ DLQKQHSDPC ALNPRMTRFS EEACAVLTSP TFEACHRAVS 601 PLPYLRNCRY DVCSCSDGRE CLOGALASYA AACAGRGVRV AWREPGRCEL 651 NCPKGQVYLQ CGTPCNLTCR SLSYPDEECN EACLEGCFCP PGLYMDERGD 701 CVPKAQCPCY YDGEIFQPED IFSDHHTMCY CEDGFMHCTM SGVPGSLLPD 751 AVLSSPLSHR SKRSLSCRPP MVKLVCPADN LRAEGLECTK TCQNYDLECM 801 SMGCVSGCLC PPGMVRHENR CVALERCPCF HQGKEYAPGE TVKIGCNTCV 851 CRDRKWNCTD HVCDATCSTI GMAHYLTFDG LKYLFPGECQ YVLVQDYCGS 901 NPGTFRILVG NKGCSHPSVK CKKRVTILVE GGEIELFDGE VNVKRPMKDE 951 THFEWESGR YIILLLGKAL SWWDRHLSI SWLKQTYQE KVCGLCGNFD 1001 GIQNNDLTSS NLQVEEDPVD FGNSWKVSSQ CADTRKVPLD SSPATCHNNI 1051 MKQTMVDSSC RILTSDVFQD CNKLVDPEPY LDVCIYDTCS CESIGDCAAF 1101 CDTIAAYAHV CAQHGKWTW RTATLCPQSC EERNLRENGY EAEWRYNSCA 1151 PACQVTCQHP EPLACPVQCV EGCHAHCPPG KILDELLQTC VDPEDCPVCE 1201 VAGRRFASGK KVTLNPSDPE HCQICHCDW NLTCEACQEP ISGTSESATP 1251 ESGPGSEPAT SGSETPGTSE SATPESGPGS EPATSGSETP GTSESATPES 1301 GPGTSTEPSE GSAPGSPAGS PTSTEEGTSE SATPESGPGS EPATSGSETP 1351 GTSESATPES GPGSPAGSPT STEEGSPAGS PTSTEEGTST EPSEGSAPGT 1401 SESATPESGP GTSESATPES GPGTSESATP ESGPGSEPAT SGSETPGSEP 1451 ATSGSETPGS PAGSPTSTEE GTSTEPSEGS APGTSTEPSE GSAPGSEPAT 1501 SGSETPGTSE SATPESGPGT STEPSEGSAP DIGGGGGSGG GGSLVPRGSG 1551 GDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVWDVSHE 1601 DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRWSVLTVL HQDWLNGKEY 1651 KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSRDELT KNQVSLTCLV 1701 KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ 1751 GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK*

Secuencia de nucleótidos de VWF050 (triple mutante IHH) (SEQ ID NO: 149)

1 ATGAT TCCTG CCAGA TTTGC CGGGG TGCTG CTTGC TCTGG CCCTC ATTTT 51 GCCAG GGACC CTTTG TGCAG AAGGA ACTCG CGGCA GGTCA TCCAC GGCCC 101 GATGC AGCCT TTTCG GAAGT GACTT CGTCA ACACC TTTGA TGGGA GCATG 151 TACAG CTTTG CGGGA TACTG CAGTT ACCTC CTGGC AGGGG GCTGC CAGAA 201 ACGCT CCTTC TCGAT TATTG GGGAC TTCCA GAATG GCAAG AGAGT GAGCC 251 TCTCC GTGTA TCTTG GGGAA TTTTT TGACA TCCAT TTGTT TGTCA ATGGT 301 ACCGT GACAC AGGGG GACCA AAGAG TCTCC ATGCC CTATG CCTCC AAAGG 351 GCTGT ATCTA GAAAC TGAGG CTGGG TACTA CAAGC TGTCC GGTGA GGCCT 401 ATGGC TTTGT GGCCA GGATC GATGG CAGCG GCAAC TTTCA AGTCC TGCTG 451 TCAGA CAGAT ACTTC AACAA GACCT GCGGG CTGTG TGGCA ACTTT AACAT 501 CTTTG CTGAA GATGA CTTTA TGACC CAAGA AGGGA CCTTG ACCTC GGACC 551 CTTAT GACTT TGCCA ACTCA TGGGC TCTGA GCAGT GGAGA ACAGT GGTGT 601 GAACG GGCAT CTCCT CCCAG CAGCT CATGC AACAT CTCCT CTGGG GAAAT 651 GCAGA AGGGC CTGTG GGAGC AGTGC CAGCT TCTGA AGAGC ACCTC GGTGT 701 TTGCC CGCTG CCACC CTCTG GTGGA CCCCG AGCCT TTTGT GGCCC TGTGT 751 GAGAA GACTT TGTGT GAGTG TGCTG GGGGG CTGGA GTGCG CCTGC CCTGC 801 CCTCC TGGAG TACGC CCGGA CCTGT GCCCA GGAGG GAATG GTGCT GTACG 851 GCTGG ACCGA CCACA GCGCG TGCAG CCCAG TGTGC CCTGC TGGTA TGGAG 901 TATAG GCAGT GTGTG TCCCC TTGCG CCAGG ACCTG CCAGA GCCTG CACAT 951 CAATG AAATG TGTCA GGAGC GATGC GTGGA TGGCT GCAGC TGCCC TGAGG 1001 GACAG CTCCT GGATG AAGGC CTCTG CGTGG AGAGC ACCGA GTGTC CCTGC 1051 GTGCA TTCCG GAAAG CGCTA CCCTC CCGGC ACCTC CCTCT CTCGA GACTG 1101 CAACA CCTGC ATTTG CCGAA ACAGC CAGTG GATCT GCAGC AATGA AGAAT 1151 GTCCA GGGGA GTGCC TTGTC ACTGG TCAAT CCCAC TTCAA GAGCT TTGAC 1201 AACAG ATACT TCACC TTCAG TGGGA TCTGC CAGTA CCTGC TGGCC CGGGA 1251 TTGCC AGGAC CACTC CTTCT CCATT GTCAT TGAGA CTGTC CAGTG TGCTG 1301 ATGAC CGCGA CGCTG TGTGC ACCCG CTCCG TCACC GTCCG GCTGC CTGGC 1351 CTGCA CAACA GCCTT GTGAA ACTGA AGCAT GGGGC AGGAG TTGCC ATGGA 1401 TGGCC AGGAC ATCCA GCTCC CCCTC CTGAA AGGTG ACCTC CGCAT CCAGC 1451 ATACA GTGAC GGCCT CCGTG CGCCT CAGCT ACGGG GAGGA CCTGC AGATG 1501 GACTG GGATG GCCGC GGGAG GCTGC TGGTG AAGCT GTCCC CCGTC TATGC 1551 CGGGA AGACC TGCGG CCTGT GTGGG AATTA CAATG GCAAC CAGGG CGACG 1601 ACTTC CTTAC CCCCT CTGGG CTGGC GGAGC CCCGG GTGGA GGACT TCGGG 1651 AACGC CTGGA AGCTG CACGG GGACT GCCAG GACCT GCAGA AGCAG CACAG 1701 CGATC CCTGC GCCCT CAACC CGCGC ATGAC CAGGT TCTCC GAGGA GGCGT 1751 GCGCG GTCCT GACGT CCCCC ACATT CGAGG CCTGC CATCG TGCCG TCAGC 1801 CCGCT GCCCT ACCTG CGGAA CTGCC GCTAC GACGT GTGCT CCTGC TCGGA 1851 CGGCC GCGAG TGCCT GTGCG GCGCC CTGGC CAGCT ATGCC GCGGC CTGCG 1901 CGGGG AGAGG CGTGC GCGTC GCGTG GCGCG AGCCA GGCCG CTGTG AGCTG 1951 AACTG CCCGA AAGGC CAGGT GTACC TGCAG TGCGG GACCC CCTGC AACCT 2001 GACCT GCCGC TCTCT CTCTT ACCCG GATGA GGAAT GCAAT GAGGC CTGCC 2051 TGGAG GGCTG CTTCT GCCCC CCAGG GCTCT ACATG GATGA GAGGG GGGAC 2101 TGCGT GCCCA AGGCC CAGTG CCCCT GTTAC TATGA CGGTG AGATC TTCCA 2151 GCCAG AAGAC ATCTT CTCAG ACCAT CACAC CATGT GCTAC TGTGA GGATG 2201 GCTTC ATGCA CTGTA CCATG AGTGG AGTCC CCGGA AGCTT GCTGC CTGAC 2251 GCTGT CCTCA GCAGT CCCCT GTCTC ATCGC AGCAA AAGGA GCCTA TCCTG 2301 TCGGC CCCCC ATGGT CAAGC TGGTG TGTCC CGCTG ACAAC CTGCG GGCTG 2351 AAGGG CTCGA GTGTA CCAAA ACGTG CCAGA ACTAT GACCT GGAGT GCATG 2401 AGCAT GGGCT GTGTC TCTGG CTGCC TCTGC CCCCC GGGCA TGGTC CGGCA 2451 TGAGA ACAGA TGTGT GGCCC TGGAA AGGTG TCCCT GCTTC CATCA GGGCA 2501 AGGAG TATGC CCCTG GAGAA ACAGT GAAGA TTGGC TGCAA CACTT GTGTC 2551 TGTCG GGACC GGAAG TGGAA CTGCA CAGAC CATGT GTGTG ATGCC ACGTG 2601 CTCCA CGATC GGCAT GGCCC ACTAC CTCAC CTTCG ACGGG CTCAA ATACC 2651 TGTTC CCCGG GGAGT GCCAG TACGT TCTGG TGCAG GATTA CTGCG GCAGT 2701 AACCC TGGGA CCTTT CGGAT CCTAG TGGGG AATAA GGGAT GCAGC CACCC 2751 CTCAG TGAAA TGCAA GAAAC GGGTC ACCAT CCTGG TGGAG GGAGG AGAGA 2801 TTGAG CTGTT TGACG GGGAG GTGAA TGTGA AGAGG CCCAT GAAGG ATGAG 2851 ACTCA CTTTG AGGTG GTGGA GTCTG GCCGG TACAT CATTC TGCTG CTGGG 2901 CAAAG CCCTC TCCGT GGTCT GGGAC CGCCA CCTGA GCATC TCCGT GGTCC 2951 TGAAG CAGAC ATACC AGGAG AAAGT GTGTG GCCTG TGTGG GAATT TTGAT 3001 GGCAT CCAGA ACAAT GACCT CACCA GCAGC AACCT CCAAG TGGAG GAAGA 3051 CCCTG TGGAC TTTGG GAACT CCTGG AAAGT GAGCT CGCAG TGTGC TGACA 3101 CCAGA AAAGT GCCTC TGGAC TCATC CCCTG CCACC TGCCA TAACA ACATC 3151 ATGAA GCAGA CGATG GTGGA TTCCT CCTGT AGAAT CCTTA CCAGT GACGT 3201 CTTCC AGGAC TGCAA CAAGC TGGTG GACCC CGAGC CATAT CTGGA TGTCT 3251 GCATT TACGA CACCT GCTCC TGTGA GTCCA TTGGG GACTG CGCCG CATTC 3301 TGCGA CACCA TTGCT GCCTA TGCCC ACGTG TGTGC CCAGC ATGGC AAGGT 3351 GGTGA CCTGG AGGAC GGCCA CATTG TGCCC CCAGA GCTGC GAGGA GAGGA 3401 ATCTC CGGGA GAACG GGTAT GAGGC TGAGT GGCGC TATAA CAGCT GTGCA 3451 CCTGC CTGTC AAGTC ACGTG TCAGC ACCCT GAGCC ACTGG CCTGC CCTGT 3501 GCAGT GTGTG GAGGG CTGCC ATGCC CACTG CCCTC CAGGG AAAAT CCTGG 3551 ATGAG CTTTT GCAGA CCTGC GTTGA CCCTG AAGAC TGTCC AGTGT GTGAG 3601 GTGGC TGGCC GGCGT TTTGC CTCAG GAAAG AAAGT CACCT TGAAT CCCAG 3651 TGACC CTGAG CACTG CCAGA TTTGC CACTG TGATG TTGTC AACCT CACCT 3701 GTGAA GCCTG CCAGG AGCCG ATATC TGGCG GTGGA GGTTC CGGTG GCGGG 3751 GGATC CGGCG GTGGA GGTTC CGGCG GTGGA GGTTC CGGTG GCGGG GGATC 3801 CGGTG GCGGG GGATC CCTGG TCCCC CGGGG CAGCG GCGGT GGAGG TTCCG 3851 GTGGC GGGGG ATCCG ACAAA ACTCA CACAT GCCCA CCGTG CCCAG CTCCA 3901 GAACT CCTGG GCGGA CCGTC AGTCT TCCTC TTCCC CCCAA AACCC AAGGA 3951 CACCC TCATG GCCTC CCGGA CCCCT GAGGT CACAT GCGTG GTGGT GGACG 4001 TGAGC CACGA AGACC CTGAG GTCAA GTTCA ACTGG TACGT GGACG GCGTG 4051 GAGGT GCATA ATGCC AAGAC AAAGC CGCGG GAGGA GCAGT ACAAC AGCAC 4101 GTACC GTGTG GTCAG CGTCC TCACC GTCCT GGCCC AGGAC TGGCT GAATG 4151 GCAAG GAGTA CAAGT GCAAG GTCTC CAACA AAGCC CTCCC AGCCC CCATC 4201 GAGAA AACCA TCTCC AAAGC CAAAG GGCAG CCCCG AGAAC CACAG GTGTA 4251 CACCC TGCCC CCATC CCGCG ATGAG CTGAC CAAGA ACCAG GTCAG CCTGA 4301 CCTGC CTGGT CAAAG GCTTC TATCC CAGCG ACATC GCCGT GGAGT GGGAG 4351 AGCAA TGGGC AGCCG GAGAA CAACT ACAAG ACCAC GCCTC CCGTG TTGGA 4401 CTCCG ACGGC TCCTT CTTCC TCTAC AGCAA GCTCA CCGTG GACAA GAGCA 4451 GGTGG CAGCA GGGGA ACGTC TTCTC ATGCT CCGTG ATGCA TGAGG CTCTG 4501 CACAA CGCCT ACACG CAGAA GAGCC TCTCC CTGTC TCCGG GTAAA TGA

Secuencia proteínica de VWF050 (triple mutante IHH) (SEQ ID NO: 150)

1 MIPARFAGVL LALALILPGT LCAEGTRGRS STARCSLFGS DFVNTFDGSM 51 YSFAGYCSYL LAGGCQKRSF SIIGDFQNGK RVSLSVYLGE FFDIHLFVNG 101 TVTQGDQRVS MPYASKGLYL ETEAGYYKLS GEAYGFVARI DGSGNFQVLL 151 SDRYFNKTCG LCGNFNIFAE DDFMTQEGTL TSDPYDFANS WALSSGEQWC 201 ERASPPSSSC NISSGEMQKG LWEQCQLLKS TSVFARCHPL VDPEPFVALC 251 EKTLCECAGG LECACPALLE YARTCAQEGM VLYGWTDHSA CSPVCPAGME 301 YRQCVSPCAR TCQSLHINEM CQERCVDGCS CPEGQLLDEG LCVESTECPC 351 VHSGKRYPPG TSLSRDCNTC ICRNSQWICS NEECPGECLV TGQSHFKSFD 401 NRYFTFSGIC QYLLARDCQD HSFSIVIETV QCADDRDAVC TRSVTVRLPG 451 LHNSLVKLKH GAGVAMDGQD IQLPLLKGDL RIQHTVTASV RLSYGEDLQM 501 DWDGRGRLLV KLSPVYAGKT CGLCGNYNGN QGDDFLTPSG LAEPRVEDFG 551 NAWKLHGDCQ DLQKQHSDPC ALNPRMTRFS EEACAVLTSP TFEACHRAVS 601 PLPYLRNCRY DVCSCSDGRE CLCGALASYA AACAGRGVRV AWREPGRCEL 651 NCPKGQVYLQ CGTPCNLTCR SLSYPDEECN EACLEGCFCP PGLYMDERGD 701 CVPKAQCPCY YDGEIFQPED IFSDHHTMCY CEDGFMHCTM SGVPGSLLPD 751 AVLSSPLSHR SKRSLSCRPP MVKLVCPADN LRAEGLECTK TCQNYDLECM 801 SMGCVSGCLC PPGMVRHENR CVALERCPCF HQGKEYAPGE TVKIGCNTCV 851 CRDRKWNCTD HVCDATCSTI GMAHYLTFDG LKYLFPGECQ YVLVQDYCGS 901 NPGTFRILVG NKGCSHPSVK CKKRVTILVE GGEIELFDGE VNVKRPMKDE 951 THFEWESGR YIILLLGKAL SWWDRHLSI SWLKQTYQE KVCGLCGNFD 1001 GIQNNDLTSS NLQVEEDPVD FGNSWKVSSQ CADTRKVPLD SSPATCHNNI 1051 MKQTMVDSSC RILTSDVFQD CNKLVDPEPY LDVCIYDTCS CESIGDCAAF 1101 CDTIAAYAHV CAQHGKWTW RTATLCPQSC EERNLRENGY EAEWRYNSCA 1151 PACQVTCQHP EPLACPVQCV EGCHAHCPPG KILDELLQTC VDPEDCPVCE 1201 VAGRRFASGK KVTLNPSDPE HCQICHCDW NLTCEACQEP ISGGGGSGGG 1251 GSGGGGSGGG GSGGGGSGGG GSLVPRGSGG GGSGGGGSDK THTCPPCPAP 1301 ELLGGPSVFL FPPKPKDTLM ASRTPEVTCV WDVSHEDPE VKFNWYVDGV 1351 EVHNAKTKPR EEQYNSTYRV VSVLTVLAQD WLNGKEYKCK VSNKALPAPI 1401 EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSRDELTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE 1451 SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSKLTV DKSRWQQGNV FSCSVMHEAL 1501 HNAYTQKSLS LSPGK*

Secuencia de nucleótidos de VWF057 (SEQ ID NO: 151)

1 ATGAT TCCTG CCAGA TTTGC CGGGG TGCTG CTTGC TCTGG CCCTC ATTTT 51 GCCAG GGACC CTTTG TGCAG AAGGA ACTCG CGGCA GGTCA TCCAC GGCCC 101 GATGC AGCCT TTTCG GAAGT GACTT CGTCA ACACC TTTGA TGGGA GCATG 151 TACAG CTTTG CGGGA TACTG CAGTT ACCTC CTGGC AGGGG GCTGC CAGAA 201 ACGCT CCTTC TCGAT TATTG GGGAC TTCCA GAATG GCAAG AGAGT GAGCC 251 TCTCC GTGTA TCTTG GGGAA TTTTT TGACA TCCAT TTGTT TGTCA ATGGT 301 ACCGT GACAC AGGGG GACCA AAGAG TCTCC ATGCC CTATG CCTCC AAAGG 351 GCTGT ATCTA GAAAC TGAGG CTGGG TACTA CAAGC TGTCC GGTGA GGCCT 401 ATGGC TTTGT GGCCA GGATC GATGG CAGCG GCAAC TTTCA AGTCC TGCTG 451 TCAGA CAGAT ACTTC AACAA GACCT GCGGG CTGTG TGGCA ACTTT AACAT 501 CTTTG CTGAA GATGA CTTTA TGACC CAAGA AGGGA CCTTG ACCTC GGACC 551 CTTAT GACTT TGCCA ACTCA TGGGC TCTGA GCAGT GGAGA ACAGT GGTGT 601 GAACG GGCAT CTCCT CCCAG CAGCT CATGC AACAT CTCCT CTGGG GAAAT 651 GCAGA AGGGC CTGTG GGAGC AGTGC CAGCT TCTGA AGAGC ACCTC GGTGT 701 TTGCC CGCTG CCACC CTCTG GTGGA CCCCG AGCCT TTTGT GGCCC TGTGT 751 GAGAA GACTT TGTGT GAGTG TGCTG GGGGG CTGGA GTGCG CCTGC CCTGC 801 CCTCC TGGAG TACGC CCGGA CCTGT GCCCA GGAGG GAATG GTGCT GTACG 851 GCTGG ACCGA CCACA GCGCG TGCAG CCCAG TGTGC CCTGC TGGTA TGGAG 901 TATAG GCAGT GTGTG TCCCC TTGCG CCAGG ACCTG CCAGA GCCTG CACAT 951 CAATG AAATG TGTCA GGAGC GATGC GTGGA TGGCT GCAGC TGCCC TGAGG 1001 GACAG CTCCT GGATG AAGGC CTCTG CGTGG AGAGC ACCGA GTGTC CCTGC 1051 GTGCA TTCCG GAAAG CGCTA CCCTC CCGGC ACCTC CCTCT CTCGA GACTG 1101 CAACA CCTGC ATTTG CCGAA ACAGC CAGTG GATCT GCAGC AATGA AGAAT 1151 GTCCA GGGGA GTGCC TTGTC ACTGG TCAAT CCCAC TTCAA GAGCT TTGAC 1201 AACAG ATACT TCACC TTCAG TGGGA TCTGC CAGTA CCTGC TGGCC CGGGA 1251 TTGCC AGGAC CACTC CTTCT CCATT GTCAT TGAGA CTGTC CAGTG TGCTG 1301 ATGAC CGCGA CGCTG TGTGC ACCCG CTCCG TCACC GTCCG GCTGC CTGGC 1351 CTGCA CAACA GCCTT GTGAA ACTGA AGCAT GGGGC AGGAG TTGCC ATGGA 1401 TGGCC AGGAC ATCCA GCTCC CCCTC CTGAA AGGTG ACCTC CGCAT CCAGC 1451 ATACA GTGAC GGCCT CCGTG CGCCT CAGCT ACGGG GAGGA CCTGC AGATG 1501 GACTG GGATG GCCGC GGGAG GCTGC TGGTG AAGCT GTCCC CCGTC TATGC 1551 CGGGA AGACC TGCGG CCTGT GTGGG AATTA CAATG GCAAC CAGGG CGACG 1601 ACTTC CTTAC CCCCT CTGGG CTGGC GGAGC CCCGG GTGGA GGACT TCGGG 1651 AACGC CTGGA AGCTG CACGG GGACT GCCAG GACCT GCAGA AGCAG CACAG 1701 CGATC CCTGC GCCCT CAACC CGCGC ATGAC CAGGT TCTCC GAGGA GGCGT 1751 GCGCG GTCCT GACGT CCCCC ACATT CGAGG CCTGC CATCG TGCCG TCAGC 1801 CCGCT GCCCT ACCTG CGGAA CTGCC GCTAC GACGT GTGCT CCTGC TCGGA 1851 CGGCC GCGAG TGCCT GTGCG GCGCC CTGGC CAGCT ATGCC GCGGC CTGCG 1901 CGGGG AGAGG CGTGC GCGTC GCGTG GCGCG AGCCA GGCCG CTGTG AGCTG 1951 AACTG CCCGA AAGGC CAGGT GTACC TGCAG TGCGG GACCC CCTGC AACCT 2001 GACCT GCCGC TCTCT CTCTT ACCCG GATGA GGAAT GCAAT GAGGC CTGCC 2051 TGGAG GGCTG CTTCT GCCCC CCAGG GCTCT ACATG GATGA GAGGG GGGAC 2101 TGCGT GCCCA AGGCC CAGTG CCCCT GTTAC TATGA CGGTG AGATC TTCCA 2151 GCCAG AAGAC ATCTT CTCAG ACCAT CACAC CATGT GCTAC TGTGA GGATG 2201 GCTTC ATGCA CTGTA CCATG AGTGG AGTCC CCGGA AGCTT GCTGC CTGAC 2251 GCTGT CCTCA GCAGT CCCCT GTCTC ATCGC AGCAA AAGGA GCCTA TCCTG 2301 TCGGC CCCCC ATGGT CAAGC TGGTG TGTCC CGCTG ACAAC CTGCG GGCTG 2351 AAGGG CTCGA GTGTA CCAAA ACGTG CCAGA ACTAT GACCT GGAGT GCATG 2401 AGCAT GGGCT GTGTC TCTGG CTGCC TCTGC CCCCC GGGCA TGGTC CGGCA 2451 TGAGA ACAGA TGTGT GGCCC TGGAA AGGTG TCCCT GCTTC CATCA GGGCA 2501 AGGAG TATGC CCCTG GAGAA ACAGT GAAGA TTGGC TGCAA CACTT GTGTC 2551 TGTCG GGACC GGAAG TGGAA CTGCA CAGAC CATGT GTGTG ATGCC ACGTG 2601 CTCCA CGATC GGCAT GGCCC ACTAC CTCAC CTTCG ACGGG CTCAA ATACC 2651 TGTTC CCCGG GGAGT GCCAG TACGT TCTGG TGCAG GATTA CTGCG GCAGT 2701 AACCC TGGGA CCTTT CGGAT CCTAG TGGGG AATAA GGGAT GCAGC CACCC 2751 CTCAG TGAAA TGCAA GAAAC GGGTC ACCAT CCTGG TGGAG GGAGG AGAGA 2801 TTGAG CTGTT TGACG GGGAG GTGAA TGTGA AGAGG CCCAT GAAGG ATGAG 2851 ACTCA CTTTG AGGTG GTGGA GTCTG GCCGG TACAT CATTC TGCTG CTGGG 2901 CAAAG CCCTC TCCGT GGTCT GGGAC CGCCA CCTGA GCATC TCCGT GGTCC 2951 TGAAG CAGAC ATACC AGGAG AAAGT GTGTG GCCTG TGTGG GAATT TTGAT 3001 GGCAT CCAGA ACAAT GACCT CACCA GCAGC AACCT CCAAG TGGAG GAAGA 3051 CCCTG TGGAC TTTGG GAACT CCTGG AAAGT GAGCT CGCAG TGTGC TGACA 3101 CCAGA AAAGT GCCTC TGGAC TCATC CCCTG CCACC TGCCA TAACA ACATC 3151 ATGAA GCAGA CGATG GTGGA TTCCT CCTGT AGAAT CCTTA CCAGT GACGT 3201 CTTCC AGGAC TGCAA CAAGC TGGTG GACCC CGAGC CATAT CTGGA TGTCT 3251 GCATT TACGA CACCT GCTCC TGTGA GTCCA TTGGG GACTG CGCCG CATTC 3301 TGCGA CACCA TTGCT GCCTA TGCCC ACGTG TGTGC CCAGC ATGGC AAGGT 3351 GGTGA CCTGG AGGAC GGCCA CATTG TGCCC CCAGA GCTGC GAGGA GAGGA 3401 ATCTC CGGGA GAACG GGTAT GAGGC TGAGT GGCGC TATAA CAGCT GTGCA 3451 CCTGC CTGTC AAGTC ACGTG TCAGC ACCCT GAGCC ACTGG CCTGC CCTGT 3501 GCAGT GTGTG GAGGG CTGCC ATGCC CACTG CCCTC CAGGG AAAAT CCTGG 3551 ATGAG CTTTT GCAGA CCTGC GTTGA CCCTG AAGAC TGTCC AGTGT GTGAG 3601 GTGGC TGGCC GGCGT TTTGC CTCAG GAAAG AAAGT CACCT TGAAT CCCAG 3651 TGACC CTGAG CACTG CCAGA TTTGC CACTG TGATG TTGTC AACCT CACCT 3701 GTGAA GCCTG CCAGG AGCCG ATATC GGGCG CGCCA ACATC AGAGA GCGCC 3751 ACCCC TGAAA GTGGT CCCGG GAGCG AGCCA GCCAC ATCTG GGTCG GAAAC 3801 GCCAG GCACA AGTGA GTCTG CAACT CCCGA GTCCG GACCT GGCTC CGAGC 3851 CTGCC ACTAG CGGCT CCGAG ACTCC GGGAA CTTCC GAGAG CGCTA CACCA 3901 GAAAG CGGAC CCGGA ACCAG TACCG AACCT AGCGA GGGCT CTGCT CCGGG 3951 CAGCC CAGCC GGCTC TCCTA CATCC ACGGA GGAGG GCACT TCCGA ATCCG 4001 CCACC CCGGA GTCAG GGCCA GGATC TGAAC CCGCT ACCTC AGGCA GTGAG 4051 ACGCC AGGAA CGAGC GAGTC CGCTA CACCG GAGAG TGGGC CAGGG AGCCC 4101 TGCTG GATCT CCTAC GTCCA CTGAG GAAGG GTCAC CAGCG GGCTC GCCCA 4151 CCAGC ACTGA AGAAG GTGCC TCGAG CGGCG GTGGA GGTTC CGGTG GCGGG 4201 GGATC CGGTG GCGGG GGATC CGGTG GCGGG GGATC CGGTG GCGGG GGATC 4251 CCTGG TCCCC CGGGG CAGCG GAGGC GACAA AACTC ACACA TGCCC ACCGT 4301 GCCCA GCTCC AGAAC TCCTG GGCGG ACCGT CAGTC TTCCT CTTCC CCCCA 4351 AAACC CAAGG ACACC CTCAT GATCT CCCGG ACCCC TGAGG TCACA TGCGT 4401 GGTGG TGGAC GTGAG CCACG AAGAC CCTGA GGTCA AGTTC AACTG GTACG 4451 TGGAC GGCGT aaixaa Tr.rñT ñATr.r raana raaar; e r a r a aaixaa jxarixa 4501 TACAA CAGCA CGTAC CGTGT GGTCA GCGTC CTCAC CGTCC TGCAC CAGGA 4551 CTGGC TGAAT GGCAA GGAGT ACAAG TGCAA GGTCT CCAAC AAAGC CCTCC 4601 CAGCC CCCAT CGAGA AAACC ATCTC CAAAG CCAAA GGGCA GCCCC GAGAA 4651 CCACA GGTGT ACACC CTGCC CCCAT CCCGG GATGA GCTGA CCAAG AACCA 4701 GGTCA GCCTG ACCTG CCTGG TCAAA GGCTT CTATC CCAGC GACAT CGCCG 4751 TGGAG TGGGA GAGCA ATGGG CAGCC GGAGA ACAAC TACAA GACCA CGCCT 4801 CCCGT GTTGG ACTCC GACGG CTCCT TCTTC CTCTA CAGCA AGCTC ACCGT 4851 GGACA AGAGC AGGTG GCAGC AGGGG AACGT CTTCT CATGC TCCGT GATGC 4901 ATGAG GCTCT GCACA ACCAC TACAC GCAGA AGAGC CTCTC CCTGT CTCCG 4951 GGTAA ATGA

Secuencia proteínica de VWF057 (SEQ ID NO: 152)

1 MIPARFAGVL LALALILPGT LCAEGTRGRS STARCSLFGS DFVNTFDGSM 51 YSFAGYCSYL LAGGCQKRSF SIIGDFQNGK RVSLSVYLGE FFDIHLFVNG 101 TVTQGDQRVS MPYASKGLYL ETEAGYYKLS GEAYGFVARI DGSGNFQVLL 151 SDRYFNKTCG LCGNFNIFAE DDFMTQEGTL TSDPYDFANS WALSSGEQWC 201 ERASPPSSSC NISSGEMQKG LWEQCQLLKS TSVFARCHPL VDPEPFVALC 251 EKTLCECAGG LECACPALLE YARTCAQEGM VLYGWTDHSA CSPVCPAGME 301 YRQCVSPCAR TCQSLHINEM CQERCVDGCS CPEGQLLDEG LCVESTECPC jOR jI i t ^{r u} orT/nvonr m _io _üT ^C _u ^{D r i} _ü ^{r , M r} _x ⁿ _^ ^{r '}T_-Ln_C-m_ÍMT_NOrMYT-T_L ⁿ c ^{'NT'ci'cir<'nr} _'JT ^H _X ^'c _j ^ir _'^ ^-< _X ^T _J ^\ _v ^r r X n r n o u 11 u l- '' T IA /k c-> u X' ' r J- i' 401 NRYFTFSGIC QYLLARDCQD HSFSIVIETV QCADDRDAVC TRSVTVRLPG 451 LHNSLVKLKH GAGVAMDGQD IQLPLLKGDL RIQHTVTASV RLSYGEDLQM 501 DWDGRGRLLV KLSPVYAGKT CGLCGNYNGN QGDDFLTPSG LAEPRVEDFG 551 NAWKLHGDCQ DLQKQHSDPC ALNPRMTRFS EEACAVLTSP TFEACHRAVS 601 PLPYLRNCRY DVCSCSDGRE CLCGALASYA AACAGRGVRV AWREPGRCEL 651 NCPKGQVYLQ CGTPCNLTCR SLSYPDEECN EACLEGCFCP PGLYMDERGD 701 CVPKAQCPCY YDGEIFQPED IFSDHHTMCY CEDGFMHCTM SGVPGSLLPD 751 AVLSSPLSHR SKRSLSCRPP MVKLVCPADN LRAEGLECTK TCQNYDLECM 801 SMGCVSGCLC PPGMVRHENR CVALERCPCF HQGKEYAPGE TVKIGCNTCV 851 CRDRKWNCTD HVCDATCSTI GMAHYLTFDG LKYLFPGECQ YVLVQDYCGS 901 NPGTFRILVG NKGCSHPSVK CKKRVTILVE GGEIELFDGEVNVKRPMKDE 951 THFEWESGR YIILLLGKAL SWWDRHLSI SWLKQTYQE KVCGLCGNFD 1001 GIQNNDLTSS NLQVEEDPVD FGNSWKVSSQ CADTRKVPLD SSPATCHNNI 1051 MKQTMVDSSC RILTSDVFQD CNKLVDPEPY LDVCIYDTCS CESIGDCAAF 1101 CDTIAAYAHV CAQHGKWTW RTATLCPQSC EERNLRENGY EAEWRYNSCA 1151 PACQVTCQHP EPLACPVQCV EGCHAHCPPG KILDELLQTCVDPEDCPVCE 1201 VAGRRFASGK KVTLNPSDPE HCQICHCDW NLTCEACQEP ISGAPTSESA 1251 TPESGPGSEP ATSGSETPGT SESATPESGP GSEPATSGSE TPGTSESATP 1301 ESGPGTSTEP SEGSAPGSPA GSPTSTEEGT SESATPESGP GSEPATSGSE 1351 TPGTSESATP ESGPGSPAGS PTSTEEGSPA GSPTSTEEGA SSGGGGSGGG 1401 GSGGGGSGGG GSGGGGSLVP RGSGGDKTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP 1451 KPKDTLMISR TPEVTCVWD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQ 1501 YNSTYRWSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE 1551 PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP 1601 PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP 1651 GK*

Secuencia de nucleótidos de VWF058 (VWF034 con mutación IHH) (SEQ ID NO: 153)

1 ATGAT TCCTG CCAGA TTTGC CGGGG TGCTG CTTGC TCTGG CCCTC ATTTT 51 GCCAG GGACC CTTTG TGCAG AAGGA ACTCG CGGCA GGTCA TCCAC GGCCC 101 GATGC AGCCT TTTCG GAAGT GACTT CGTCA ACACC TTTGA TGGGA GCATG 151 TACAG CTTTG CGGGA TACTG CAGTT ACCTC CTGGC AGGGG GCTGC CAGAA 201 ACGCT CCTTC TCGAT TATTG GGGAC TTCCA GAATG GCAAG AGAGT GAGCC 251 TCTCC GTGTA TCTTG GGGAA TTTTT TGACA TCCAT TTGTT TGTCA ATGGT 301 ACCGT GACAC AGGGG GACCA AAGAG TCTCC ATGCC CTATG CCTCC AAAGG 351 GCTGT ATCTA GAAAC TGAGG CTGGG TACTA CAAGC TGTCC GGTGA GGCCT 401 ATGGC TTTGT GGCCA GGATC GATGG CAGCG GCAAC TTTCA AGTCC TGCTG 451 TCAGA CAGAT ACTTC AACAA GACCT GCGGG CTGTG TGGCA ACTTT AACAT 501 CTTTG CTGAA GATGA CTTTA TGACC CAAGA AGGGA CCTTG ACCTC GGACC 551 CTTAT GACTT TGCCA ACTCA TGGGC TCTGA GCAGT GGAGA ACAGT GGTGT 601 GAACG GGCAT CTCCT CCCAG CAGCT CATGC AACAT CTCCT CTGGG GAAAT 651 GCAGA AGGGC CTGTG GGAGC AGTGC CAGCT TCTGA AGAGC ACCTC GGTGT 701 TTGCC CGCTG CCACC CTCTG GTGGA CCCCG AGCCT TTTGT GGCCC TGTGT 751 GAGAA GACTT TGTGT GAGTG TGCTG GGGGG CTGGA GTGCG CCTGC CCTGC 801 CCTCC TGGAG TACGC CCGGA CCTGT GCCCA GGAGG GAATG GTGCT GTACG 851 GCTGG ACCGA CCACA GCGCG TGCAG CCCAG TGTGC CCTGC TGGTA TGGAG 901 TATAG GCAGT GTGTG TCCCC TTGCG CCAGG ACCTG CCAGA GCCTG CACAT 951 CAATG AAATG TGTCA GGAGC GATGC GTGGA TGGCT GCAGC TGCCC TGAGG 1001 GACAG CTCCT GGATG AAGGC CTCTG CGTGG AGAGC ACCGA GTGTC CCTGC 1051 GTGCA TTCCG GAAAG CGCTA CCCTC CCGGC ACCTC CCTCT CTCGA GACTG 1101 CAACA CCTGC ATTTG CCGAA ACAGC CAGTG GATCT GCAGC AATGA AGAAT 1151 GTCCA GGGGA GTGCC TTGTC ACTGG TCAAT CCCAC TTCAA GAGCT TTGAC 1201 AACAG ATACT TCACC TTCAG TGGGA TCTGC CAGTA CCTGC TGGCC CGGGA 1251 TTGCC AGGAC CACTC CTTCT CCATT GTCAT TGAGA CTGTC CAGTG TGCTG 1301 ATGAC CGCGA CGCTG TGTGC ACCCG CTCCG TCACC GTCCG GCTGC CTGGC 1351 CTGCA CAACA GCCTT GTGAA ACTGA AGCAT GGGGC AGGAG TTGCC ATGGA 1401 TGGCC AGGAC ATCCA GCTCC CCCTC CTGAA AGGTG ACCTC CGCAT CCAGC 1451 ATACA GTGAC GGCCT CCGTG CGCCT CAGCT ACGGG GAGGA CCTGC AGATG 1501 GACTG GGATG GCCGC GGGAG GCTGC TGGTG AAGCT GTCCC CCGTC TATGC 1551 CGGGA AGACC TGCGG CCTGT GTGGG AATTA CAATG GCAAC CAGGG CGACG 1601 ACTTC CTTAC CCCCT CTGGG CTGGC GGAGC CCCGG GTGGA GGACT TCGGG 1651 AACGC CTGGA AGCTG CACGG GGACT GCCAG GACCT GCAGA AGCAG CACAG 1701 CGATC CCTGC GCCCT CAACC CGCGC ATGAC CAGGT TCTCC GAGGA GGCGT 1751 GCGCG GTCCT GACGT CCCCC ACATT CGAGG CCTGC CATCG TGCCG TCAGC 1801 CCGCT GCCCT ACCTG CGGAA CTGCC GCTAC GACGT GTGCT CCTGC TCGGA 1851 CGGCC GCGAG TGCCT GTGCG GCGCC CTGGC CAGCT ATGCC GCGGC CTGCG 1901 CGGGG AGAGG CGTGC GCGTC GCGTG GCGCG AGCCA GGCCG CTGTG AGCTG 1951 AACTG CCCGA AAGGC CAGGT GTACC TGCAG TGCGG GACCC CCTGC AACCT 2001 GACCT GCCGC TCTCT CTCTT ACCCG GATGA GGAAT GCAAT GAGGC CTGCC 2051 TGGAG GGCTG CTTCT GCCCC CCAGG GCTCT ACATG GATGA GAGGG GGGAC 2101 TGCGT GCCCA AGGCC CAGTG CCCCT GTTAC TATGA CGGTG AGATC TTCCA 2151 GCCAG AAGAC ATCTT CTCAG ACCAT CACAC CATGT GCTAC TGTGA GGATG 2201 GCTTC ATGCA CTGTA CCATG AGTGG AGTCC CCGGA AGCTT GCTGC CTGAC 2251 GCTGT CCTCA GCAGT CCCCT GTCTC ATCGC AGCAA AAGGA GCCTA TCCTG 2301 TCGGC CCCCC ATGGT CAAGC TGGTG TGTCC CGCTG ACAAC CTGCG GGCTG 2351 AAGGG CTCGA GTGTA CCAAA ACGTG CCAGA ACTAT GACCT GGAGT GCATG 2401 AGCAT GGGCT GTGTC TCTGG CTGCC TCTGC CCCCC GGGCA TGGTC CGGCA 2451 TGAGA ACAGA TGTGT GGCCC TGGAA AGGTG TCCCT GCTTC CATCA GGGCA 2501 AGGAG TATGC CCCTG GAGAA ACAGT GAAGA TTGGC TGCAA CACTT GTGTC 2551 TGTCG GGACC GGAAG TGGAA CTGCA CAGAC CATGT GTGTG ATGCC ACGTG 2601 CTCCA CGATC GGCAT GGCCC ACTAC CTCAC CTTCG ACGGG CTCAA ATACC 2651 TGTTC CCCGG GGAGT GCCAG TACGT TCTGG TGCAG GATTA CTGCG GCAGT 2701 AACCC TGGGA CCTTT CGGAT CCTAG TGGGG AATAA GGGAT GCAGC CACCC 2751 CTCAG TGAAA TGCAA GAAAC GGGTC ACCAT CCTGG TGGAG GGAGG AGAGA 2801 TTGAG CTGTT TGACG GGGAG GTGAA TGTGA AGAGG CCCAT GAAGG ATGAG 2851 ACTCA CTTTG AGGTG GTGGA GTCTG GCCGG TACAT CATTC TGCTG CTGGG 2901 CAAAG CCCTC TCCGT GGTCT GGGAC CGCCA CCTGA GCATC TCCGT GGTCC 2951 TGAAG CAGAC ATACC AGGAG AAAGT GTGTG GCCTG TGTGG GAATT TTGAT 3001 GGCAT CCAGA ACAAT GACCT CACCA GCAGC AACCT CCAAG TGGAG GAAGA 3051 CCCTG TGGAC TTTGG GAACT CCTGG AAAGT GAGCT CGCAG TGTGC TGACA 3101 CCAGA AAAGT GCCTC TGGAC TCATC CCCTG CCACC TGCCA TAACA ACATC 3151 ATGAA GCAGA CGATG GTGGA TTCCT CCTGT AGAAT CCTTA CCAGT GACGT 3201 CTTCC AGGAC TGCAA CAAGC TGGTG GACCC CGAGC CATAT CTGGA TGTCT 3251 GCATT TACGA CACCT GCTCC TGTGA GTCCA TTGGG GACTG CGCCG CATTC 3301 TGCGA CACCA TTGCT GCCTA TGCCC ACGTG TGTGC CCAGC ATGGC AAGGT 3351 GGTGA CCTGG AGGAC GGCCA CATTG TGCCC CCAGA GCTGC GAGGA GAGGA 3401 ATCTC CGGGA GAACG GGTAT GAGGC TGAGT GGCGC TATAA CAGCT GTGCA 3451 CCTGC CTGTC AAGTC ACGTG TCAGC ACCCT GAGCC ACTGG CCTGC CCTGT 3501 GCAGT GTGTG GAGGG CTGCC ATGCC CACTG CCCTC CAGGG AAAAT CCTGG 3551 ATGAG CTTTT GCAGA CCTGC GTTGA CCCTG AAGAC TGTCC AGTGT GTGAG 3601 GTGGC TGGCC GGCGT TTTGC CTCAG GAAAG AAAGT CACCT TGAAT CCCAG 3651 TGACC CTGAG CACTG CCAGA TTTGC CACTG TGATG TTGTC AACCT CACCT 3701 GTGAA GCCTG CCAGG AGCCG ATATC GGGTA CCTCA GAGTC TGCTA CCCCC 3751 GAGTC AGGGC CAGGA TCAGA GCCAG CCACC TCCGG GTCTG AGACA CCCGG 3801 GACTT CCGAG AGTGC CACCC CTGAG TCCGG ACCCG GGTCC GAGCC CGCCA 3851 CTTCC GGCTC CGAAA CTCCC GGCAC AAGCG AGAGC GCTAC CCCAG AGTCA 3901 GGACC AGGAA CATCT ACAGA GCCCT CTGAA GGCTC CGCTC CAGGG TCCCC 3951 AGCCG GCAGT CCCAC TAGCA CCGAG GAGGG AACCT CTGAA AGCGC CACAC 4001 CCGAA TCAGG GCCAG GGTCT GAGCC TGCTA CCAGC GGCAG CGAGA CACCA 4051 GGCAC CTCTG AGTCC GCCAC ACCAG AGTCC GGACC CGGAT CTCCC GCTGG 4101 GAGCC CCACC TCCAC TGAGG AGGGA TCTCC TGCTG GCTCT CCAAC ATCTA 4151 CTGAG GAAGG TACCT CAACC GAGCC ATCCG AGGGA TCAGC TCCCG GCACC 4201 TCAGA GTCGG CAACC CCGGA GTCTG GACCC GGAAC TTCCG AAAGT GCCAC 4251 ACCAG AGTCC GGTCC CGGGA CTTCA GAATC AGCAA CACCC GAGTC CGGCC 4301 CTGGG TCTGA ACCCG CCACA AGTGG TAGTG AGACA CCAGG ATCAG AACCT 4351 GCTAC CTCAG GGTCA GAGAC ACCCG GATCT CCGGC AGGCT CACCA ACCTC 4401 CACTG AGGAG GGCAC CAGCA CAGAA CCAAG CGAGG GCTCC GCACC CGGAA 4451 CAAGC ACTGA ACCCA GTGAG GGTTC AGCAC CCGGC TCTGA GCCGG CCACA 4501 AGTGG CAGTG AGACA CCCGG CACTT CAGAG AGTGC CACCC CCGAG AGTGG 4551 CCCAG GCACT AGTAC CGAGC CCTCT GAAGG CAGTG CGCCA GATTC TGGCG 4601 GTGGA GGTTC CGGTG GCGGG GGATC CGGTG GCGGG GGATC CGGTG GCGGG 4651 GGATC CGGTG GCGGG GGATC CCTGG TCCCC CGGGG CAGCG GAGGC GACAA 4701 AACTC ACACA TGCCC ACCGT GCCCA GCTCC AGAAC TCCTG GGCGG ACCGT 4751 CAGTC TTCCT CTTCC CCCCA AAACC CAAGG ACACC CTCAT GGCCT CCCGG 4801 ACOCO TGAGG TCACA TGCGT GGTGG TGGAC GTGAG CCACG AAGAC CCTGA 4851 GGTCA AGTTC AACTG GTACG TGGAC GGCGT GGAGG TGCAT AATGC CAAGA 4901 CAAAG CCGCG GGAGG AGCAG TACAA CAGOA CGTAC CGTGT GGTCA GCGTC 4951 CTCAC CGTCC TGGCC CAGGA CTGGC TGAAT GGCAA GGAGT ACAAG TGCAA 5001 GGTCT CCAAC AAAGC CCTCC CAGCC CCCAT CGAGA AAACC ATCTC CAAAG 5051 CCAAA GGGCA GCCCC GAGAA CCACA GGTGT ACACC CTGCC CCCAT CCCGC 5101 GATGA GCTGA CCAAG AACCA GGTCA GCCTG ACCTG CCTGG TCAAA GGCTT 5151 CTATC CCAGC GACAT CGCCG TGGAG TGGGA GAGOA ATGGG CAGCC GGAGA 5201 ACAAC TACAA GACCA CGCCT CCCGT GTTGG ACTCC GACGG CTCCT TCTTC 5251 CTCTA CAGOA AGCTC ACCGT GGACA AGAGC AGGTG GCAGC AGGGG AACGT 5301 CTTCT CATGC TCCGT GATGC ATGAG GCTCT GCACA ACGCC TACAC GCAGA 5351 AGAGC CTCTC CCTGT CTCCG GGTAA ATGA

Secuencia proteínica de VWF058 (VWF034 con mutación IHH) (SEQ ID NO: 154)

1 MIPARFAGVL LALALILPGT LCAEGTRGRS STARCSLFGS DFVNTFDGSM 51 YSFAGYCSYL LAGGCQKRSF SIIGDFQNGK RVSLSVYLGE FFDIHLFVNG 101 TVTQGDQRVS MPYASKGLYL ETEAGYYKLS GEAYGFVARI DGSGNFQVLL 151 SDRYFNKTCG LCGNFNIFAE DDFMTQEGTL TSDPYDFANS WALSSGEQWC 201 ERASPPSSSC NISSGEMQKG LWEQCQLLKS TSVFARCHPL VDPEPFVALC 251 EKTLCECAGG LECACPALLE YARTCAQEGM VLYGWTDHSA CSPVCPAGME 301 YRQCVSPCAR TCQSLHINEM CQERCVDGCS CPEGQLLDEG LCVESTECPC 351 VHSGKRYPPG TSLSRDCNTC ICRNSQWICS NEECPGECLV TGQSHFKSFD 401 NRYFTFSGIC QYLLARDCQD HSFSIVIETV QCADDRDAVC TRSVTVRLPG 451 LHNSLVKLKH GAGVAMDGQD IQLPLLKGDL RIQHTVTASV RLSYGEDLQM 501 DWDGRGRLLV KLSPVYAGKT CGLCGNYNGN QGDDFLTPSG LAEPRVEDFG 551 NAWKLHGDCQ DLQKQHSDPC ALNPRMTRFS EEACAVLTSP TFEACHRAVS 601 PLPYLRNCRY DVCSCSDGRE CLOGALASYA AACAGRGVRV AWREPGRCEL 651 NCPKGQVYLQ CGTPCNLTCR SLSYPDEECN EACLEGCFCP PGLYMDERGD 701 CVPKAQCPCY YDGEIFQPED IFSDHHTMCY CEDGFMHCTM SGVPGSLLPD 751 AVLSSPLSHR SKRSLSCRPP MVKLVCPADN LRAEGLECTK TCQNYDLECM 801 SMGCVSGCLC PPGMVRHENR CVALERCPCF HQGKEYAPGE TVKIGCNTCV 851 CRDRKWNCTD HVCDATCSTI GMAHYLTFDG LKYLFPGECQ YVLVQDYCGS 901 NPGTFRILVG NKGCSHPSVK CKKRVTILVE GGEIELFDGE VNVKRPMKDE 951 THFEWESGR YIILLLGKAL SWWDRHLSI SWLKQTYQE KVCGLCGNFD 1001 GIQNNDLTSS NLQVEEDPVD FGNSWKVSSQ CADTRKVPLD SSPATCHNNI 1051 MKQTMVDSSC RILTSDVFQD CNKLVDPEPY LDVCIYDTCS CESIGDCAAF 1101 CDTIAAYAHV CAQHGKWTW RTATLCPQSC EERNLRENGY EAEWRYNSCA 1151 PACQVTCQHP EPLACPVQCV EGCHAHCPPG KILDELLQTC VDPEDCPVCE 1201 VAGRRFASGK KVTLNPSDPE HCQICHCDW NLTCEACQEP ISGTSESATP 1251 ESGPGSEPAT SGSETPGTSE SATPESGPGS EPATSGSETP GTSESATPES 1301 GPGTSTEPSE GSAPGSPAGS PTSTEEGTSE SATPESGPGS EPATSGSETP 1351 GTSESATPES GPGSPAGSPT STEEGSPAGS PTSTEEGTST EPSEGSAPGT 1401 SESATPESGP GTSESATPES GPGTSESATP ESGPGSEPAT SGSETPGSEP 1451 ATSGSETPGS PAGSPTSTEE GTSTEPSEGS APGTSTEPSE GSAPGSEPAT 1501 SGSETPGTSE SATPESGPGT STEPSEGSAP DSGGGGSGGG GSGGGGSGGG 1551 GSGGGGSLVP RGSGGDKTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMASR 1601 TPEVTCVWD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRWSV 1651 LTVLAQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR 1701 DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF 1751 LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNA YTQKSLSLSP GK*

Secuencia de nucleótidos de FVIII 169 (SEQ ID NO: 155)

1 ATGCA AATAG AGCTC TCCAC CTGCT TCTTT CTGTG CCTTT TGCGA TTCTG 51 CTTTA GTGCC ACCAG AAGAT ACTAC CTGGG TGCAG TGGAA CTGTC ATGGG 101 ACTAT ATGCA AAGTG ATCTC GGTGA GCTGC CTGTG GACGC AAGAT TTCCT 151 CCTAG AGTGC CAAAA TCTTT TCCAT TCAAC ACCTC AGTCG TGTAC AAAAA 201 GACTC TGTTT GTAGA ATTCA CGGAT CACCT TTTCA ACATC GCTAA GCCAA 251 GGCCA CCCTG GATGG GTCTG CTAGG TCCTA CCATC CAGGC TGAGG TTTAT 301 GATAC AGTGG TCATT ACACT TAAGA ACATG GCTTC CCATC CTGTC AGTCT 351 TCATG CTGTT GGTGT ATCCT ACTGG AAAGC TTCTG AGGGA GCTGA ATATG 401 ATGAT CAGAC CAGTC AAAGG GAGAA AGAAG ATGAT AAAGT CTTCC CTGGT 451 GGAAG CCATA CATAT GTCTG GCAGG TCCTG AAAGA GAATG GTCCA ATGGC 501 CTCTG ACCCA CTGTG CCTTA CCTAC TCATA TCTTT CTCAT GTGGA CCTGG 551 TAAAA GACTT GAATT CAGGC CTCAT TGGAG CCCTA CTAGT ATGTA GAGAA 601 GGGAG TCTGG CCAAG GAAAA GACAC AGACC TTGCA CAAAT TTATA CTACT 651 TTTTG CTGTA TTTGA TGAAG GGAAA AGTTG GCACT CAGAA ACAAA GAACT 701 CCTTG ATGCA GGATA GGGAT GCTGC ATCTG CTCGG GCCTG GCCTA AAATG 751 CACAC AGTCA ATGGT TATGT AAACA GGTCT CTGCC AGGTC TGATT GGATG 801 CCACA GGAAA TCAGT CTATT GGCAT GTGAT TGGAA TGGGC ACCAC TCCTG 851 AAGTG CACTC AATAT TCCTC GAAGG TCACA CATTT CTTGT GAGGA ACCAT 901 CGCCA GGCTA GCTTG GAAAT CTCGC CAATA ACTTT CCTTA CTGCT CAAAC 951 ACTCT TGATG GACCT TGGAC AGTTT CTACT GTTTT GTCAT ATCTC TTCCC 1001 ACCAA CATGA TGGCA TGGAA GCTTA TGTCA AAGTA GACAG CTGTC CAGAG 1051 GAACC CCAAC TACGA ATGAA AAATA ATGAA GAAGC GGAAG ACTAT GATGA 1101 TGATC TTACT GATTC TGAAA TGGAT GTGGT CAGGT TTGAT GATGA CAACT 1151 CTCCT TCCTT TATCC AAATT CGCTC AGTTG CCAAG AAGCA TCCTA AAACT 1201 TGGGT ACATT ACATT GCTGC TGAAG AGGAG GACTG GGACT ATGCT CCCTT 1251 AGTCC TCGCC CCCGA TGACA GAAGT TATAA AAGTC AATAT TTGAA CAATG 1301 GCCCT CAGCG GATTG GTAGG AAGTA CAAAA AAGTC CGATT TATGG CATAC 1351 ACAGA TGAAA CCTTT AAGAC TCGTG AAGCT ATTCA GCATG AATCA GGAAT 1401 CTTGG GACCT TTACT TTATG GGGAA GTTGG AGACA CACTG TTGAT TATAT 1451 TTAAG AATCA AGCAA GCAGA CCATA TAACA TCTAC CCTCA CGGAA TCACT 1501 GATGT CCGTC CTTTG TATTC AAGGA GATTA CCAAA AGGTG TAAAA CATTT 1551 GAAGG ATTTT CCAAT TCTGC CAGGA GAAAT ATTCA AATAT AAATG GACAG 1601 TGACT GTAGA AGATG GGCCA ACTAA ATCAG ATCCT CGGTG CCTGA CCCGC 1651 TATTA CTCTA GTTTC GTTAA TATGG AGAGA GATCT AGCTT CAGGA CTCAT 1701 TGGCC CTCTC CTCAT CTGCT ACAAA GAATC TGTAG ATCAA AGAGG AAACC 1751 AGATA ATGTC AGACA AGAGG AATGT CATCC TGTTT TCTGT ATTTG ATGAG 1801 AACCG AAGCT GGTAC CTCAC AGAGA ATATA CAACG CTTTC TCCCC AATCC 1851 AGCTG GAGTG CAGCT TGAGG ATCCA GAGTT CCAAG CCTCC AACAT CATGC 1901 ACAGC ATCAA TGGCT ATGTT TTTGA TAGTT TGCAG TTGTC AGTTT GTTTG 1951 CATGA GGTGG CATAC TGGTA CATTC TAAGC ATTGG AGCAC AGACT GACTT 2001 CCTTT CTGTC TTCTT CTCTG GATAT ACCTT CAAAC ACAAA ATGGT CTATG 2051 AAGAC ACACT CACCC TATTC CCATT CTCAG GAGAA ACTGT CTTCA TGTCG 2101 ATGGA AAACC CAGGT CTATG GATTC TGGGG TGCCA CAACT CAGAC TTTCG 2151 GAACA GAGGC ATGAC CGCCT TACTG AAGGT TTCTA GTTGT GACAA GAACA 2201 CTGGT GATTA TTACG AGGAC AGTTA TGAAG ATATT TCAGC ATACT TGCTG 2251 AGTAA AAACA ATGCC ATTGA ACCAA GAAGC TTCTC TCAAA ACGGC GCGCC 2301 AGGTA CCTCA GAGTC TGCTA CCCCC GAGTC AGGGC CAGGA TCAGA GCCAG 2351 CCACC TCCGG GTCTG AGACA CCCGG GACTT CCGAG AGTGC CACCC CTGAG 2401 TCCGG ACCCG GGTCC GAGCC CGCCA CTTCC GGCTC CGAAA CTCCC GGCAC 2451 AAGCG AGAGC GCTAC CCCAG AGTCA GGACC AGGAA CATCT ACAGA GCCCT 2501 CTGAA GGCTC CGCTC CAGGG TCCCC AGCCG GCAGT CCCAC TAGCA CCGAG 2551 GAGGG AACCT CTGAA AGCGC CACAC CCGAA TCAGG GCCAG GGTCT GAGCC 2601 TGCTA CCAGC GGCAG CGAGA CACCA GGCAC CTCTG AGTCC GCCAC ACCAG 2651 AGTCC GGACC CGGAT CTCCC GCTGG GAGCC CCACC TCCAC TGAGG AGGGA 2701 TCTCC TGCTG GCTCT CCAAC ATCTA CTGAG GAAGG TACCT CAACC GAGCC 2751 ATCCG AGGGA TCAGC TCCCG GCACC TCAGA GTCGG CAACC CCGGA GTCTG 2801 GACCC GGAAC TTCCG AAAGT GCCAC ACCAG AGTCC GGTCC CGGGA CTTCA 2851 GAATC AGCAA CACCC GAGTC CGGCC CTGGG TCTGA ACCCG CCACA AGTGG 2901 TAGTG AGACA CCAGG ATCAG AACCT GCTAC CTCAG GGTCA GAGAC ACCCG 2951 GATCT CCGGC AGGCT CACCA ACCTC CACTG AGGAG GGCAC CAGCA CAGAA 3001 CCAAG CGAGG GCTCC GCACC CGGAA CAAGC ACTGA ACCCA GTGAG GGTTC 3051 AGCAC CCGGC TCTGA GCCGG CCACA AGTGG CAGTG AGACA CCCGG CACTT 3101 CAGAG AGTGC CACCC CCGAG AGTGG CCCAG GCACT AGTAC CGAGC CCTCT 3151 GAAGG CAGTG CGCCA GCCTC GAGCC CACCA GTCTT GAAAC GCCAT CAAGC 3201 TGAAA TAACT CGTAC TACTC TTCAG TCAGA TCAAG AGGAA ATCGA TTATG 3251 ATGAT ACCAT ATCAG TTGAA ATGAA GAAGG AAGAT TTTGA CATTT ATGAT 3301 GAGGA TGAAA ATCAG AGCCC CCGCA GCTTT CAAAA GAAAA CACGA CACTA 3351 TTTTA TTGCT GCAGT GGAGA GGCTC TGGGA TTATG GGATG AGTAG CTCCC 3401 CACAT GTTCT AAGAA ACAGG GCTCA GAGTG GCAGT GTCCC TCAGT TCAAG 3451 AAAGT TGTTT TCCAG GAATT TACTG ATGGC TCCTT TACTC AGCCC TTATA 3501 CCGTG GAGAA CTAAA TGAAC ATTTG GGACT CCTGG GGCCA TATAT AAGAG 3551 CAGAA GTTGA AGATA ATATC ATGGT AACTT TCAGA AATCA GGCCT CTCGT 3601 CCCTA TTCCT TCTAT TCTAG CCTTA TTTCT TATGA GGAAG ATCAG AGGCA 3651 AGGAG CAGAA CCTAG AAAAA ACTTT GTCAA GCCTA ATGAA ACCAA AACTT 3701 ACTTT TGGAA AGTGC AACAT CATAT GGCAC CCACT AAAGA TGAGT TTGAC 3751 TGCAA AGCCT GGGCT TATTT CTCTG ATGTT GACCT GGAAA AAGAT GTGCA 3801 CTCAG GCCTG ATTGG ACCCC TTCTG GTCTG CCACA CTAAC ACACT GAACC 3851 CTGCT CATGG GAGAC AAGTG ACAGT ACAGG AATTT GCTCT GTTTT TCACC 3901 ATCTT TGATG AGACC AAAAG CTGGT ACTTC ACTGA AAATA TGGAA AGAAA 3951 CTGCA GGGCT CCCTG CAATA TCCAG ATGGA AGATC CCACT TTTAA AGAGA 4001 ATTAT CGCTT CCATG CAATC AATGG CTACA TAATG GATAC ACTAC CTGGC 4051 TTAGT AATGG CTCAG GATCA AAGGA TTCGA TGGTA TCTGC TCAGC ATGGG 4101 CAGCA ATGAA AACAT CCATT CTATT CATTT CAGTG GACAT GTGTT CACTG 4151 TACGA AAAAA AGAGG AGTAT AAAAT GGCAC TGTAC AATCT CTATC CAGGT 4201 GTTTT TGAGA CAGTG GAAAT GTTAC CATCC AAAGC TGGAA TTTGG CGGGT 4251 GGAAT GCCTT ATTGG CGAGC ATCTA CATGC TGGGA TGAGC ACACT TTTTC 4301 TGGTG TACAG CAATA AGTGT CAGAC TCCCC TGGGA ATGGC TTCTG GACAC 4351 ATTAG AGATT TTCAG ATTAC AGCTT CAGGA CAATA TGGAC AGTGG GCCCC 4401 AAAGC TGGCC AGACT TCATT ATTCC GGATC AATCA ATGCC TGGAG CACCA 4451 AGGAG CCCTT TTCTT GGATC AAGGT GGATC TGTTG GCACC AATGA TTATT 4501 CACGG CATCA AGACC CAGGG TGCCC GTCAG AAGTT CTCCA GCCTC TACAT 4551 CTCTC AGTTT ATCAT CATGT ATAGT CTTGA TGGGA AGAAG TGGCA GACTT 4601 ATCGA GGAAA TTCCA CTGGA ACCTT AATGG TCTTC TTTGG CAATG TGGAT 4651 TCATC TGGGA TAAAA CACAA TATTT TTAAC CCTCC AATTA TTGCT CGATA 4701 CATCC GTTTG CACCC AACTC ATTAT AGCAT TCGCA GCACT CTTCG CATGG 4751 AGTTG ATGGG CTGTG ATTTA AATAG TTGCA GCATG CCATT GGGAA TGGAG 4801 AGTAA AGCAA TATCA GATGC ACAGA TTACT GCTTC ATCCT ACTTT ACCAA 4851 TATGT TTGCC ACCTG GTCTC CTTCA AAAGC TCGAC TTCAC CTCCA AGGGA 4901 GGAGT AATGC CTGGA GACCT CAGGT GAATA ATCCA AAAGA GTGGC TGCAA 4951 GTGGA CTTCC AGAAG ACAAT GAAAG TCACA GGAGT AACTA CTCAG GGAGT 5001 AAAAT CTCTG CTTAC CAGCA TGTAT GTGAA GGAGT TCCTC ATCTC CAGCA 5051 GTCAA GATGG CCATC AGTGG ACTCT CTTTT TTCAG AATGG CAAAG TAAAG 5101 GTTTT TCAGG GAAAT CAAGA CTCCT TCACA CCTGT GGTGA ACTCT CTAGA 5151 CCCAC CGTTA CTGAC TCGCT ACCTT CGAAT TCACC CCCAG AGTTG GGTGC 5201 ACCAG ATTGC CCTGA GGATG GAGGT TCTGG GCTGC GAGGC ACAGG ACCTC 5251 TACGA CAAAA CTCAC ACATG CCCAC CGTGC CCAGC TCCAG AACTC CTGGG 5301 CGGAC CGTCA GTCTT CCTCT TCCCC CCAAA ACCCA AGGAC ACCCT CATGA 5351 TCTCC CGGAC CCCTG AGGTC ACATG CGTGG TGGTG GACGT GAGCC ACGAA 5401 GACCC TGAGG TCAAG TTCAA CTGGT ACGTG GACGG CGTGG AGGTG CATAA 5451 TGCCA AGACA AAGCC GCGGG AGGAG CAGTA CAACA GCACG TACCG TGTGG 5501 TCAGC GTCCT CACCG TCCTG CACCA GGACT GGCTG AATGG CAAGG AGTAC 5551 AAGTG CAAGG TCTCC AACAA AGCCC TCCCA GCCCC CATCG AGAAA ACCAT 5601 CTCCA AAGCC AAAGG GCAGC CCCGA GAACC ACAGG TGTAC ACCCT GCCCC 5651 CATCC CGGGA TGAGC TGACC AAGAA CCAGG TCAGC CTGAC CTGCC TGGTC 5701 AAAGG CTTCT ATCCC AGCGA CATCG CCGTG GAGTG GGAGA GCAAT GGGCA 5751 GCCGG AGAAC AACTA CAAGA CCACG CCTCC CGTGT TGGAC TCCGA CGGCT 5801 CCTTC TTCCT CTACA GCAAG CTCAC CGTGG ACAAG AGCAG GTGGC AGCAG 5851 GGGAA CGTCT TCTCA TGCTC CGTGA TGCAT GAGGC TCTGC ACAAC CACTA 5901 CACGC AGAAG AGCCT CTCCC TGTCT CCGGG TAAAT GA

Secuencia proteínica de FVIII 169 (SEQ ID NO: 70)

i MQIELSTCFF LCLLRFCFSA TRRYYLGAVE LSWDYMQSDL GELPVDARFP 51 PRVPKSFPFN TSWYKKTLF VEFTDHLFNI AKPRPPWMGL LGPTIQAEVY 101 DTWITLKNM ASHPVSLHAV GVSYWKASEG AEYDDQTSQR EKEDDKVFPG 151 GSHTYVWQVL KENGPMASDP LCLTYSYLSH VDLVKDLNSG LIGALLVCRE 201 GSLAKEKTQT LHKFILLFAV FDEGKSWHSE TKNSLMQDRD AASARAWPKM 251 HTVNGYVNRS LPGLIGCHRK SVYWHVIGMG TTPEVHSIFL EGHTFLVRNH 301 RQASLEISPI TFLTAQTLLM DLGQFLLFCH ISSHQHDGME AYVKVDSCPE 351 EPQLRMKNNE EAEDYDDDLT DSEMDWRFD DDNSPSFIQI RSVAKKHPKT 401 WVHYIAAEEE DWDYAPLVLA PDDRSYKSQY LNNGPQRIGR KYKKVRFMAY 451 TDETFKTREA IQHESGILGP LLYGEVGDTL LIIFKNQASR PYNIYPHGIT 501 DVRPLYSRRL PKGVKHLKDF PILPGEIFKY KWTVTVEDGP TKSDPRCLTR 551 YYSSFVNMER DLASGLIGPL LICYKESVDQ RGNQIMSDKR NVILFSVFDE 601 NRSWYLTENI QRFLPNPAGV QLEDPEFQAS NIMHSINGYV FDSLQLSVCL 651 HEVAYWYILS IGAQTDFLSV FFSGYTFKHK MVYEDTLTLF PFSGETVFMS 701 MENPGLWILG CHNSDFRNRG MTALLKVSSC DKNTGDYYED SYEDISAYLL 751 SKNNAIEPRS FSQNGAPGTS ESATPESGPG SEPATSGSET PGTSESATPE 801 SGPGSEPATS GSETPGTSES ATPESGPGTS TEPSEGSAPG SPAGSPTSTE 851 EGTSESATPE SGPGSEPATS GSETPGTSES ATPESGPGSP AGSPTSTEEG 901 SPAGSPTSTE EGTSTEPSEG SAPGTSESAT PESGPGTSES ATPESGPGTS 951 ESATPESGPG SEPATSGSET PGSEPATSGS ETPGSPAGSP TSTEEGTSTE 1001 PSEGSAPGTS TEPSEGSAPG SEPATSGSET PGTSESATPE SGPGTSTEPS 1051 EGSAPASSPP VLKRHQAEIT RTTLQSDQEE IDYDDTISVE MKKEDFDIYD 1101 EDENQSPRSF QKKTRHYFIA AVERLWDYGM SSSPHVLRNR AQSGSVPQFK 1151 KWFQEFTDG SFTQPLYRGE LNEHLGLLGP YIRAEVEDNI MVTFRNQASR 1201 PYSFYSSLIS YEEDQRQGAE PRKNFVKPNE TKTYFWKVQH HMAPTKDEFD 1251 CKAWAYFSDV DLEKDVHSGL IGPLLVCHTN TLNPAHGRQV TVQEFALFFT 1301 IFDETKSWYF TENMERNCRA PCNIQMEDPT FKENYRFHAI NGYIMDTLPG 1351 LVMAQDQRIR WYLLSMGSNE NIHSIHFSGH VFTVRKKEEY KMALYNLYPG 1401 VFETVEMLPS KAGIWRVECL IGEHLHAGMS TLFLVYSNKC QTPLGMASGH 1451 IRDFQITASG QYGQWAPKLA RLHYSGSINA WSTKEPFSWI KVDLLAPMII 1501 HGIKTQGARQ KFSSLYISQF IIMYSLDGKK WQTYRGNSTG TLMVFFGNVD 1551 SSGIKHNIFN PPIIARYIRL HPTHYSIRST LRMELMGCDL NSCSMPLGME 1601 SKAISDAQIT ASSYFTNMFA TWSPSKARLH LQGRSNAWRP QVNNPKEWLQ 1651 VDFQKTMKVT GVTTQGVKSL LTSMYVKEFL ISSSQDGHQW TLFFQNGKVK 1701 VFQGNQDSFT PWNSLDPPL LTRYLRIHPQ SWVHQIALRM EVLGCEAQDL 1751 YDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVWDVSHE 1801 DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRWSVLTVL HQDWLNGKEY 1851 KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSRDELT KNQVSLTCLV 1901 KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ 1951 GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK*

Secuencia de nucleótidos de FVIII 263 (triple mutante IHH) (SEQ ID NO: 156)

1 ATGCA AATAG AGCTC TCCAC CTGCT TCTTT CTGTG CCTTT TGCGA TTCTG 51 CTTTA GTGCC ACCAG AAGAT ACTAC CTGGG TGCAG TGGAA CTGTC ATGGG 101 ACTAT ATGCA AGGCG CGCCA ACATC AGAGA GCGCC ACCCC TGAAA GTGGT 151 CCCGG GAGCG AGCCA GCCAC ATCTG GGTCG GAAAC GCCAG GCACA AGTGA 201 GTCTG CAACT CCCGA GTCCG GACCT GGCTC CGAGC CTGCC ACTAG CGGCT 251 CCGAG ACTCC GGGAA CTTCC GAGAG CGCTA CACCA GAAAG CGGAC CCGGA 301 ACCAG TACCG AACCT AGCGA GGGCT CTGCT CCGGG CAGCC CAGCC GGCTC 351 TCCTA CATCC ACGGA GGAGG GCACT TCCGA ATCCG CCACC CCGGA GTCAG 401 GGCCA GGATC TGAAC CCGCT ACCTC AGGCA GTGAG ACGCC AGGAA CGAGC 451 GAGTC CGCTA CACCG GAGAG TGGGC CAGGG AGCCC TGCTG GATCT CCTAC 501 GTCCA CTGAG GAAGG GTCAC CAGCG GGCTC GCCCA CCAGC ACTGA AGAAG 551 GTGCC TCGAG CAGTG ATCTC GGTGA GCTGC CTGTG GACGC AAGAT TTCCT 601 CCTAG AGTGC CAAAA TCTTT TCCAT TCAAC ACCTC AGTCG TGTAC AAAAA 651 GACTC TGTTT GTAGA ATTCA CGGAT CACCT TTTCA ACATC GCTAA GCCAA 701 GGCCA CCCTG GATGG GTCTG CTAGG TCCTA CCATC CAGGC TGAGG TTTAT 751 GATAC AGTGG TCATT ACACT TAAGA ACATG GCTTC CCATC CTGTC AGTCT 801 TCATG CTGTT GGTGT ATCCT ACTGG AAAGC TTCTG AGGGA GCTGA ATATG 851 ATGAT CAGAC CAGTC AAAGG GAGAA AGAAG ATGAT AAAGT CTTCC CTGGT 901 GGAAG CCATA CATAT GTCTG GCAGG TCCTG AAAGA GAATG GTCCA ATGGC 951 CTCTG ACCCA CTGTG CCTTA CCTAC TCATA TCTTT CTCAT GTGGA CCTGG 1001 TAAAA GACTT GAATT CAGGC CTCAT TGGAG CCCTA CTAGT ATGTA GAGAA 1051 GGGAG TCTGG CCAAG GAAAA GACAC AGACC TTGCA CAAAT TTATA CTACT 1101 TTTTG CTGTA TTTGA TGAAG GGAAA AGTTG GCACT CAGAA ACAAA GAACT 1151 CCTTG ATGCA GGATA GGGAT GCTGC ATCTG CTCGG GCCTG GCCTA AAATG 1201 CACAC AGTCA ATGGT TATGT AAACA GGTCT CTGCC AGGTC TGATT GGATG 1251 CCACA GGAAA TCAGT CTATT GGCAT GTGAT TGGAA TGGGC ACCAC TCCTG 1301 AAGTG CACTC AATAT TCCTC GAAGG TCACA CATTT CTTGT GAGGA ACCAT 1351 CGCCA GGCTA GCTTG GAAAT CTCGC CAATA ACTTT CCTTA CTGCT CAAAC 1401 ACTCT TGATG GACCT TGGAC AGTTT CTACT GTTTT GTCAT ATCTC TTCCC 1451 ACCAA CATGA TGGCA TGGAA GCTTA TGTCA AAGTA GACAG CTGTC CAGAG 1501 GAACC CCAAC TACGA ATGAA AAATA ATGAA GAAGC GGAAG ACTAT GATGA 1551 TGATC TTACT GATTC TGAAA TGGAT GTGGT CAGGT TTGAT GATGA CAACT 1601 CTCCT TCCTT TATCC AAATT CGCTC AGTTG CCAAG AAGCA TCCTA AAACT 1651 TGGGT ACATT ACATT GCTGC TGAAG AGGAG GACTG GGACT ATGCT CCCTT 1701 AGTCC TCGCC CCCGA TGACA GAAGT TATAA AAGTC AATAT TTGAA CAATG 1751 GCCCT CAGCG GATTG GTAGG AAGTA CAAAA AAGTC CGATT TATGG CATAC 1801 ACAGA TGAAA CCTTT AAGAC TCGTG AAGCT ATTCA GCATG AATCA GGAAT 1851 CTTGG GACCT TTACT TTATG GGGAA GTTGG AGACA CACTG TTGAT TATAT 1901 TTAAG AATCA AGCAA GCAGA CCATA TAACA TCTAC CCTCA CGGAA TCACT 1951 GATGT CCGTC CTTTG TATTC AAGGA GATTA CCAAA AGGTG TAAAA CATTT 2001 GAAGG ATTTT CCAAT TCTGC CAGGA GAAAT ATTCA AATAT AAATG GACAG 2051 TGACT GTAGA AGATG GGCCA ACTAA ATCAG ATCCT CGGTG CCTGA CCCGC 2101 TATTA CTCTA GTTTC GTTAA TATGG AGAGA GATCT AGCTT CAGGA CTCAT 2151 TGGCC CTCTC CTCAT CTGCT ACAAA GAATC TGTAG ATCAA AGAGG AAACC 2201 AGATA ATGTC AGACA AGAGG AATGT CATCC TGTTT TCTGT ATTTG ATGAG 2251 AACCG AAGCT GGTAC CTCAC AGAGA ATATA CAACG CTTTC TCCCC AATCC 2301 AGCTG GAGTG CAGCT TGAGG ATCCA GAGTT CCAAG CCTCC AACAT CATGC 2351 ACAGC ATCAA TGGCT ATGTT TTTGA TAGTT TGCAG TTGTC AGTTT GTTTG 2401 CATGA GGTGG CATAC TGGTA CATTC TAAGC ATTGG AGCAC AGACT GACTT 2451 CCTTT CTGTC TTCTT CTCTG GATAT ACCTT CAAAC ACAAA ATGGT CTATG 2501 AAGAC ACACT CACCC TATTC CCATT CTCAG GAGAA ACTGT CTTCA TGTCG 2551 ATGGA AAACC CAGGT CTATG GATTC TGGGG TGCCA CAACT CAGAC TTTCG 2601 GAACA GAGGC ATGAC CGCCT TACTG AAGGT TTCTA GTTGT GACAA GAACA 2651 CTGGT GATTA TTACG AGGAC AGTTA TGAAG ATATT TCAGC ATACT TGCTG 2701 AGTAA AAACA ATGCC ATTGA ACCAA GAAGC TTCTC TCAAA ACGGC GCGCC 2751 AGGTA CCTCA GAGTC TGCTA CCCCC GAGTC AGGGC CAGGA TCAGA GCCAG 2801 CCACC TCCGG GTCTG AGACA CCCGG GACTT CCGAG AGTGC CACCC CTGAG 2851 TCCGG ACCCG GGTCC GAGCC CGCCA CTTCC GGCTC CGAAA CTCCC GGCAC 2901 AAGCG AGAGC GCTAC CCCAG AGTCA GGACC AGGAA CATCT ACAGA GCCCT 2951 CTGAA GGCTC CGCTC CAGGG TCCCC AGCCG GCAGT CCCAC TAGCA CCGAG 3001 GAGGG AACCT CTGAA AGCGC CACAC CCGAA TCAGG GCCAG GGTCT GAGCC 3051 TGCTA CCAGC GGCAG CGAGA CACCA GGCAC CTCTG AGTCC GCCAC ACCAG 3101 AGTCC GGACC CGGAT CTCCC GCTGG GAGCC CCACC TCCAC TGAGG AGGGA 3151 TCTCC TGCTG GCTCT CCAAC ATCTA CTGAG GAAGG TACCT CAACC GAGCC 3201 ATCCG AGGGA TCAGC TCCCG GCACC TCAGA GTCGG CAACC CCGGA GTCTG 3251 GACCC GGAAC TTCCG AAAGT GCCAC ACCAG AGTCC GGTCC CGGGA CTTCA 3301 GAATC AGCAA CACCC GAGTC CGGCC CTGGG TCTGA ACCCG CCACA AGTGG 3351 TAGTG AGACA CCAGG ATCAG AACCT GCTAC CTCAG GGTCA GAGAC ACCCG 3401 GATCT CCGGC AGGCT CACCA ACCTC CACTG AGGAG GGCAC CAGCA CAGAA 3451 CCAAG CGAGG GCTCC GCACC CGGAA CAAGC ACTGA ACCCA GTGAG GGTTC 3501 AGCAC CCGGC TCTGA GCCGG CCACA AGTGG CAGTG AGACA CCCGG CACTT 3551 CAGAG AGTGC CACCC CCGAG AGTGG CCCAG GCACT AGTAC CGAGC CCTCT 3601 GAAGG CAGTG CGCCA GCCTC GAGCC CACCA GTCTT GAAAC GCCAT CAAGC 3651 TGAAA TAACT CGTAC TACTC TTCAG TCAGA TCAAG AGGAA ATCGA TTATG 3701 ATGAT ACCAT ATCAG TTGAA ATGAA GAAGG AAGAT TTTGA CATTT ATGAT 3751 GAGGA TGAAA ATCAG AGCCC CCGCA GCTTT CAAAA GAAAA CACGA CACTA 3801 TTTTA TTGCT GCAGT GGAGA GGCTC TGGGA TTATG GGATG AGTAG CTCCC 3851 CACAT GTTCT AAGAA ACAGG GCTCA GAGTG GCAGT GTCCC TCAGT TCAAG 3901 AAAGT TGTTT TCCAG GAATT TACTG ATGGC TCCTT TACTC AGCCC TTATA 3951 CCGTG GAGAA CTAAA TGAAC ATTTG GGACT CCTGG GGCCA TATAT AAGAG 4001 CAGAA GTTGA AGATA ATATC ATGGT AACTT TCAGA AATCA GGCCT CTCGT 4051 CCCTA TTCCT TCTAT TCTAG CCTTA TTTCT TATGA GGAAG ATCAG AGGCA 4101 AGGAG CAGAA CCTAG AAAAA ACTTT GTCAA GCCTA ATGAA ACCAA AACTT 4151 ACTTT TGGAA AGTGC AACAT CATAT GGCAC CCACT AAAGA TGAGT TTGAC 4201 TGCAA AGCCT GGGCT TATTT CTCTG ATGTT GACCT GGAAA AAGAT GTGCA 4251 CTCAG GCCTG ATTGG ACCCC TTCTG GTCTG CCACA CTAAC ACACT GAACC 4301 CTGCT CATGG GAGAC AAGTG ACAGT ACAGG AATTT GCTCT GTTTT TCACC 4351 ATCTT TGATG AGACC AAAAG CTGGT ACTTC ACTGA AAATA TGGAA AGAAA 4401 CTGCA GGGCT CCCTG CAATA TCCAG ATGGA AGATC CCACT TTTAA AGAGA 4451 ATTAT CGCTT CCATG CAATC AATGG CTACA TAATG GATAC ACTAC CTGGC 4501 TTAGT AATGG CTCAG GATCA AAGGA TTCGA TGGTA TCTGC TCAGC ATGGG 4551 CAGCA ATGAA AACAT CCATT CTATT CATTT CAGTG GACAT GTGTT CACTG 4601 TACGA AAAAA AGAGG AGTAT AAAAT GGCAC TGTAC AATCT CTATC CAGGT 4651 GTTTT TGAGA CAGTG GAAAT GTTAC CATCC AAAGC TGGAA TTTGG CGGGT 4701 GGAAT GCCTT ATTGG CGAGC ATCTA CATGC TGGGA TGAGC ACACT TTTTC 4751 TGGTG TACAG CAATA AGTGT CAGAC TCCCC TGGGA ATGGC TTCTG GACAC 4801 ATTAG AGATT TTCAG ATTAC AGCTT CAGGA CAATA TGGAC AGTGG GCCCC 4851 AAAGC TGGCC AGACT TCATT ATTCC GGATC AATCA ATGCC TGGAG CACCA 4901 AGGAG CCCTT TTCTT GGATC AAGGT GGATC TGTTG GCACC AATGA TTATT 4951 CACGG CATCA AGACC CAGGG TGCCC GTCAG AAGTT CTCCA GCCTC TACAT 5001 CTCTC AGTTT ATCAT CATGT ATAGT CTTGA TGGGA AGAAG TGGCA GACTT 5051 ATCGA GGAAA TTCCA CTGGA ACCTT AATGG TCTTC TTTGG CAATG TGGAT 5101 TCATC TGGGA TAAAA CACAA TATTT TTAAC CCTCC AATTA TTGCT CGATA 5151 CATCC GTTTG CACCC AACTC ATTAT AGCAT TCGCA GCACT CTTCG CATGG 5201 AGTTG ATGGG CTGTG ATTTA AATAG TTGCA GCATG CCATT GGGAA TGGAG 5251 AGTAA AGCAA TATCA GATGC ACAGA TTACT GCTTC ATCCT ACTTT ACCAA 5301 TATGT TTGCC ACCTG GTCTC CTTCA AAAGC TCGAC TTCAC CTCCA AGGGA 5351 GGAGT AATGC CTGGA GACCT CAGGT GAATA ATCCA AAAGA GTGGC TGCAA 5401 GTGGA CTTCC AGAAG ACAAT GAAAG TCACA GGAGT AACTA CTCAG GGAGT 5451 AAAAT CTCTG CTTAC CAGCA TGTAT GTGAA GGAGT TCCTC ATCTC CAGCA 5501 GTCAA GATGG CCATC AGTGG ACTCT CTTTT TTCAG AATGG CAAAG TAAAG 5551 GTTTT TCAGG GAAAT CAAGA CTCCT TCACA CCTGT GGTGA ACTCT CTAGA 5601 CCCAC CGTTA CTGAC TCGCT ACCTT CGAAT TCACC CCCAG AGTTG GGTGC 5651 ACCAG ATTGC CCTGA GGATG GAGGT TCTGG GCTGC GAGGC ACAGG ACCTC 5701 TACGA CAAAA CTCAC ACATG CCCAC CGTGC CCAGC TCCAG AACTC CTGGG 5751 CGGAC CGTCA GTCTT CCTCT TCCCC CCAAA ACCCA AGGAC ACCCT CATGG 5801 CCTCC CGGAC CCCTG AGGTC ACATG CGTGG TGGTG GACGT GAGCC ACGAA 5851 GACCC TGAGG TCAAG TTCAA CTGGT ACGTG GACGG CGTGG AGGTG CATAA 5901 TGCCA AGACA AAGCC GCGGG AGGAG CAGTA CAACA GCACG TACCG TGTGG 5951 TCAGC GTCCT CACCG TCCTG GCCCA GGACT GGCTG AATGG CAAGG AGTAC 6001 AAGTG CAAGG TCTCC AACAA AGCCC TCCCA GCCCC CATCG AGAAA ACCAT 6051 CTCCA AAGCC AAAGG GCAGC CCCGA GAACC ACAGG TGTAC ACCCT GCCCC 6101 CATCC CGCGA TGAGC TGACC AAGAA CCAGG TCAGC CTGAC CTGCC TGGTC 6151 AAAGG CTTCT ATCCC AGCGA CATCG CCGTG GAGTG GGAGA GCAAT GGGCA 6201 GCCGG AGAAC AACTA CAAGA CCACG CCTCC CGTGT TGGAC TCCGA CGGCT 6251 CCTTC TTCCT CTACA GCAAG CTCAC CGTGG ACAAG AGCAG GTGGC AGCAG 6301 GGGAA CGTCT TCTCA TGCTC CGTGA TGCAT GAGGC TCTGC ACAAC GCCTA 6351 CACGC AGAAG AGCCT CTCCC TGTCT CCGGG TAAAT GA

Secuencia proteínica de FVIII 263 (triple mutante IHH) (SEQ ID NO: 157)

1 MQIELSTCFF LCLLRFCFSA TRRYYLGAVE LSWDYMQGAP TSESATPESG 51 PGSEPATSGS ETPGTSESAT PESGPGSEPA TSGSETPGTS ESATPESGPG 101 TSTEPSEGSA PGSPAGSPTS TEEGTSESAT PESGPGSEPA TSGSETPGTS 151 ESATPESGPG SPAGSPTSTE EGSPAGSPTS TEEGASSSDL GELPVDARFP 201 PRVPKSFPFN TSWYKKTLF VEFTDHLFNI AKPRPPWMGL LGPTIQAEVY 251 DTWITLKNM ASHPVSLHAV GVSYWKASEG AEYDDQTSQR EKEDDKVFPG 301 GSHTYVWQVL KENGPMASDP LCLTYSYLSH VDLVKDLNSG LIGALLVCRE 351 GSLAKEKTQT LHKFILLFAV FDEGKSWHSE TKNSLMQDRD AASARAWPKM 401 HTVNGYVNRS LPGLIGCHRK SVYWHVIGMG TTPEVHSIFL EGHTFLVRNH 451 RQASLEISPI TFLTAQTLLM DLGQFLLFCH ISSHQHDGME AYVKVDSCPE 501 EPQLRMKNNE EAEDYDDDLT DSEMDWRFD DDNSPSFIQI RSVAKKHPKT 551 WVHYIAAEEE DWDYAPLVLA PDDRSYKSQY LNNGPQRIGR KYKKVRFMAY 601 TDETFKTREA IQHESGILGP LLYGEVGDTL LIIFKNQASR PYNIYPHGIT 651 DVRPLYSRRL PKGVKHLKDF PILPGEIFKY KWTVTVEDGP TKSDPRCLTR 701 YYSSFVNMER DLASGLIGPL LICYKESVDQ RGNQIMSDKR NVILFSVFDE 751 NRSWYLTENI QRFLPNPAGV QLEDPEFQAS NIMHSINGYV FDSLQLSVCL 801 HEVAYWYILS IGAQTDFLSV FFSGYTFKHK MVYEDTLTLF PFSGETVFMS 851 MENPGLWILG CHNSDFRNRG MTALLKVSSC DKNTGDYYED SYEDISAYLL 901 SKNNAIEPRS FSQNGAPGTS ESATPESGPG SEPATSGSET PGTSESATPE 951 SGPGSEPATS GSETPGTSES ATPESGPGTS TEPSEGSAPG SPAGSPTSTE 1001 EGTSESATPE SGPGSEPATS GSETPGTSES ATPESGPGSP AGSPTSTEEG 1051 SPAGSPTSTE EGTSTEPSEG SAPGTSESAT PESGPGTSES ATPESGPGTS 1101 ESATPESGPG SEPATSGSET PGSEPATSGS ETPGSPAGSP TSTEEGTSTE 1151 PSEGSAPGTS TEPSEGSAPG SEPATSGSET PGTSESATPE SGPGTSTEPS 1201 EGSAPASSPP VLKRHQAEIT RTTLQSDQEE IDYDDTISVE MKKEDFDIYD 1251 EDENQSPRSF QKKTRHYFIA AVERLWDYGM SSSPHVLRNR AQSGSVPQFK 1301 KWFQEFTDG SFTQPLYRGE LNEHLGLLGP YIRAEVEDNI MVTFRNQASR 1351 PYSFYSSLIS YEEDQRQGAE PRKNFVKPNE TKTYFWKVQH HMAPTKDEFD 1401 CKAWAYFSDV DLEKDVHSGL IGPLLVCHTN TLNPAHGRQV TVQEFALFFT 1451 IFDETKSWYF TENMERNCRA PCNIQMEDPT FKENYRFHAI NGYIMDTLPG 1501 LVMAQDQRIR WYLLSMGSNE NIHSIHFSGH VFTVRKKEEY KMALYNLYPG 1551 VFETVEMLPS KAGIWRVECL IGEHLHAGMS TLFLVYSNKC QTPLGMASGH 1601 IRDFQITASG QYGQWAPKLA RLHYSGSINA WSTKEPFSWI KVDLLAPMII 1651 HGIKTQGARQ KFSSLYISQF IIMYSLDGKK WQTYRGNSTG TLMVFFGNVD 1701 SSGIKHNIFN PPIIARYIRL HPTHYSIRST LRMELMGCDL NSCSMPLGME 1751 SKAISDAQIT ASSYFTNMFA TWSPSKARLH LQGRSNAWRP QVNNPKEWLQ 1801 VDFQKTMKVT GVTTQGVKSL LTSMYVKEFL ISSSQDGHQW TLFFQNGKVK 1851 VFQGNQDSFT PWNSLDPPL LTRYLRIHPQ SWVHQIALRM EVLGCEAQDL 1901 YDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMASRTPEV TCVWDVSHE 1951 DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRWSVLTVL AQDWLNGKEY 2001 KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSRDELT KNQVSLTCLV 2051 KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ 2101 GNVFSCSVMH EALHNAYTQK SLSLSPGK*

Secuencia de nucleótidos de FVIII 282 (SEQ ID NO: 158)

1 ATGCA AATAG AGCTC TCCAC CTGCT TCTTT CTGTG CCTTT TGCGA TTCTG 51 CTTTA GTGCC ACCAG AAGAT ACTAC CTGGG TGCAG TGGAA CTGTC ATGGG 101 ACTAT ATGCA AAGTG ATCTC GGTGA GCTGC CTGTG GACGC AAGAT TTCCT 151 CCTAG AGTGC CAAAA TCTTT TCCAT TCAAC ACCTC AGTCG TGTAC AAAAA 201 GACTC TGTTT GTAGA ATTCA CGGAT CACCT TTTCA ACATC GCTAA GCCAA 251 GGCCA CCCTG GATGG GTCTG CTAGG TCCTA CCATC CAGGC TGAGG TTTAT 301 GATAC AGTGG TCATT ACACT TAAGA ACATG GCTTC CCATC CTGTC AGTCT 351 TCATG CTGTT GGTGT ATCCT ACTGG AAAGC TTCTG AGGGA GCTGA ATATG 401 ATGAT CAGAC CAGTC AAAGG GAGAA AGAAG ATGAT AAAGT CTTCC CTGGT 451 GGAAG CCATA CATAT GTCTG GCAGG TCCTG AAAGA GAATG GTCCA ATGGC 501 CTCTG ACCCA CTGTG CCTTA CCTAC TCATA TCTTT CTCAT GTGGA CCTGG 551 TAAAA GACTT GAATT CAGGC CTCAT TGGAG CCCTA CTAGT ATGTA GAGAA 601 GGGAG TCTGG CCAAG GAAAA GACAC AGACC TTGCA CAAAT TTATA CTACT 651 TTTTG CTGTA TTTGA TGAAG GGAAA AGTTG GCACT CAGAA ACAAA GAACT 701 CCTTG ATGCA GGATA GGGAT GCTGC ATCTG CTCGG GCCTG GCCTA AAATG 751 CACAC AGTCA ATGGT TATGT AAACA GGTCT CTGCC AGGTC TGATT GGATG 801 CCACA GGAAA TCAGT CTATT GGCAT GTGAT TGGAA TGGGC ACCAC TCCTG 851 AAGTG CACTC AATAT TCCTC GAAGG TCACA CATTT CTTGT GAGGA ACCAT 901 CGCCA GGCTA GCTTG GAAAT CTCGC CAATA ACTTT CCTTA CTGCT CAAAC 951 ACTCT TGATG GACCT TGGAC AGTTT CTACT GTTTT GTCAT ATCTC TTCCC 1001 ACCAA CATGA TGGCA TGGAA GCTTA TGTCA AAGTA GACAG CTGTC CAGAG 1051 GAACC CCAAC TACGA ATGAA AAATA ATGAA GAAGC GGAAG ACTAT GATGA 1101 TGATC TTACT GATTC TGAAA TGGAT GTGGT CAGGT TTGAT GATGA CAACT 1151 CTCCT TCCTT TATCC AAATT CGCTC AGTTG CCAAG AAGCA TCCTA AAACT 1201 TGGGT ACATT ACATT GCTGC TGAAG AGGAG GACTG GGACT ATGCT CCCTT 1251 AGTCC TCGCC CCCGA TGACA GAAGT TATAA AAGTC AATAT TTGAA CAATG 1301 GCCCT CAGCG GATTG GTAGG AAGTA CAAAA AAGTC CGATT TATGG CATAC 1351 ACAGA TGAAA CCTTT AAGAC TCGTG AAGCT ATTCA GCATG AATCA GGAAT 1401 CTTGG GACCT TTACT TTATG GGGAA GTTGG AGACA CACTG TTGAT TATAT 1451 TTAAG AATCA AGCAA GCAGA CCATA TAACA TCTAC CCTCA CGGAA TCACT 1501 GATGT CCGTC CTTTG TATTC AAGGA GATTA CCAAA AGGTG TAAAA CATTT 1551 GAAGG ATTTT CCAAT TCTGC CAGGA GAAAT ATTCA AATAT AAATG GACAG 1601 TGACT GTAGA AGATG GGCCA ACTAA ATCAG ATCCT CGGTG CCTGA CCCGC 1651 TATTA CTCTA GTTTC GTTAA TATGG AGAGA GATCT AGCTT CAGGA CTCAT 1701 TGGCC CTCTC CTCAT CTGCT ACAAA GAATC TGTAG ATCAA AGAGG AAACC 1751 AGATA ATGTC AGACA AGAGG AATGT CATCC TGTTT TCTGT ATTTG ATGAG 1801 AACCG AAGCT GGTAC CTCAC AGAGA ATATA CAACG CTTTC TCCCC AATCC 1851 AGCTG GAGTG CAGCT TGAGG ATCCA GAGTT CCAAG CCTCC AACAT CATGC 1901 ACAGC ATCAA TGGCT ATGTT TTTGA TAGTT TGCAG TTGTC AGTTT GTTTG 1951 CATGA GGTGG CATAC TGGTA CATTC TAAGC ATTGG AGCAC AGACT GACTT 2001 CCTTT CTGTC TTCTT CTCTG GATAT ACCTT CAAAC ACAAA ATGGT CTATG 2051 AAGAC ACACT CACCC TATTC CCATT CTCAG GAGAA ACTGT CTTCA TGTCG 2101 ATGGA AAACC CAGGT CTATG GATTC TGGGG TGCCA CAACT CAGAC TTTCG 2151 GAACA GAGGC ATGAC CGCCT TACTG AAGGT TTCTA GTTGT GACAA GAACA 2201 CTGGT GATTA TTACG AGGAC AGTTA TGAAG ATATT TCAGC ATACT TGCTG 2251 AGTAA AAACA ATGCC ATTGA ACCAA GAAGC TTCTC TCAAA ACGGC GCGCC 2301 AACAT CAGAG AGCGC CACCC CTGAA AGTGG TCCCG GGAGC GAGCC AGCCA 2351 CATCT GGGTC GGAAA CGCCA GGCAC AAGTG AGTCT GCAAC TCCCG AGTCC 2401 GGACC TGGCT CCGAG CCTGC CACTA GCGGC TCCGA GACTC CGGGA ACTTC 2451 CGAGA GCGCT ACACC AGAAA GCGGA CCCGG AACCA GTACC GAACC TAGCG 2501 AGGGC TCTGC TCCGG GCAGC CCAGC CGGCT CTCCT ACATC CACGG AGGAG 2551 GGCAC TTCCG AATCC GCCAC CCCGG AGTCA GGGCC AGGAT CTGAA CCCGC 2601 TACCT CAGGC AGTGA GACGC CAGGA ACGAG CGAGT CCGCT ACACC GGAGA 2651 GTGGG CCAGG GAGCC CTGCT GGATC TCCTA CGTCC ACTGA GGAAG GGTCA 2701 CCAGC GGGCT CGCCC ACCAG CACTG AAGAA GGTGC CTCGA GCCCA CCAGT 2751 CTTGA AACGC CATCA AGCTG AAATA ACTCG TACTA CTCTT CAGTC AGATC 2801 AAGAG GAAAT CGATT ATGAT GATAC CATAT CAGTT GAAAT GAAGA AGGAA 2851 GATTT TGACA TTTAT GATGA GGATG AAAAT CAGAG CCCCC GCAGC TTTCA 2901 AAAGA AAACA CGACA CTATT TTATT GCTGC AGTGG AGAGG CTCTG GGATT 2951 ATGGG ATGAG TAGCT CCCCA CATGT TCTAA GAAAC AGGGC TCAGA GTGGC 3001 AGTGT CCCTC AGTTC AAGAA AGTTG TTTTC CAGGA ATTTA CTGAT GGCTC 3051 CTTTA CTCAG CCCTT ATACC GTGGA GAACT AAATG AACAT TTGGG ACTCC 3101 TGGGG CCATA TATAA GAGCA GAAGT TGAAG ATAAT ATCAT GGTAA CTTTC 3151 AGAAA TCAGG CCTCT CGTCC CTATT CCTTC TATTC TAGCC TTATT TCTTA 3201 TGAGG AAGAT CAGAG GCAAG GAGCA GAACC TAGAA AAAAC TTTGT CAAGC 3251 CTAAT GAAAC CAAAA CTTAC TTTTG GAAAG TGCAA CATCA TATGG CACCC 3301 ACTAA AGATG AGTTT GACTG CAAAG CCTGG GCTTA TTTCT CTGAT GTTGA 3351 CCTGG AAAAA GATGT GCACT CAGGC CTGAT TGGAC CCCTT CTGGT CTGCC 3401 ACACT AACAC ACTGA ACCCT GCTCA TGGGA GACAA GTGAC AGTAC AGGAA 3451 TTTGC TCTGT TTTTC ACCAT CTTTG ATGAG ACCAA AAGCT GGTAC TTCAC 3501 TGAAA ATATG GAAAG AAACT GCAGG GCTCC CTGCA ATATC CAGAT GGAAG 3551 ATCCC ACTTT TAAAG AGAAT TATCG CTTCC ATGCA ATCAA TGGCT ACATA 3601 ATGGA TACAC TACCT GGCTT AGTAA TGGCT CAGGA TCAAA GGATT CGATG 3651 GTATC TGCTC AGCAT GGGCA GCAAT GAAAA CATCC ATTCT ATTCA TTTCA 3701 GTGGA CATGT GTTCA CTGTA CGAAA AAAAG AGGAG TATAA AATGG CACTG 3751 TACAA TCTCT ATCCA GGTGT TTTTG AGACA GTGGA AATGT TACCA TCCAA 3801 AGCTG GAATT TGGCG GGTGG AATGC CTTAT TGGCG AGCAT CTACA TGCTG 3851 GGATG AGCAC ACTTT TTCTG GTGTA CAGCA ATAAG TGTCA GACTC CCCTG 3901 GGAAT GGCTT CTGGA CACAT TAGAG ATTTT CAGAT TACAG CTTCA GGACA 3951 ATATG GACAG TGGGC CCCAA AGCTG GCCAG ACTTC ATTAT TCCGG ATCAA 4001 TCAAT GCCTG GAGCA CCAAG GAGCC CTTTT CTTGG ATCAA GGTGG ATCTG 4051 TTGGC ACCAA TGATT ATTCA CGGCA TCAAG ACCCA GGGTG CCCGT CAGAA 4101 GTTCT CCAGC CTCTA CATCT CTCAG TTTAT CATCA TGTAT AGTCT TGATG 4151 GGAAG AAGTG GCAGA CTTAT CGAGG AAATT CCACT GGAAC CTTAA TGGTC 4201 TTCTT TGGCA ATGTG GATTC ATCTG GGATA AAACA CAATA TTTTT AACCC 4251 TCCAA TTATT GCTCG ATACA TCCGT TTGCA CCCAA CTCAT TATAG CATTC 4301 GCAGC ACTCT TCGCA TGGAG TTGAT GGGCT GTGAT TTAAA TAGTT GCAGC 4351 ATGCC ATTGG GAATG GAGAG TAAAG CAATA TCAGA TGCAC AGATT ACTGC 4401 TTCAT CCTAC TTTAC CAATA TGTTT GCCAC CTGGT CTCCT TCAAA AGCTC 4451 GACTT CACCT CCAAG GGAGG AGTAA TGCCT GGAGA CCTCA GGTGA ATAAT 4501 CCAAA AGAGT GGCTG CAAGT GGACT TCCAG AAGAC AATGA AAGTC ACAGG 4551 AGTAA CTACT CAGGG AGTAA AATCT CTGCT TACCA GCATG TATGT GAAGG 4601 AGTTC CTCAT CTCCA GCAGT CAAGA TGGCC ATCAG TGGAC TCTCT TTTTT 4651 CAGAA TGGCA AAGTA AAGGT TTTTC AGGGA AATCA AGACT CCTTC ACACC 4701 TGTGG TGAAC TCTCT AGACC CACCG TTACT GACTC GCTAC CTTCG AATTC 4751 ACCCC CAGAG TTGGG TGCAC CAGAT TGCCC TGAGG ATGGA GGTTC TGGGC 4801 TGCGA GGCAC AGGAC CTCTA CGACA AAACT CACAC ATGCC CACCG TGCCC 4851 AGCTC CAGAA CTCCT GGGCG GACCG TCAGT CTTCC TCTTC CCCCC AAAAC 4901 CCAAG GACAC CCTCA TGATC TCCCG GACCC CTGAG GTCAC ATGCG TGGTG 4951 GTGGA CGTGA GCCAC GAAGA CCCTG AGGTC AAGTT CAACT GGTAC GTGGA 5001 CGGCG TGGAG GTGCA TAATG CCAAG ACAAA GCCGC GGGAG GAGCA GTACA 5051 ACAGC ACGTA CCGTG TGGTC AGCGT CCTCA CCGTC CTGCA CCAGG ACTGG 5101 CTGAA TGGCA AGGAG TACAA GTGCA AGGTC TCCAA CAAAG CCCTC CCAGC 5151 CCCCA TCGAG AAAAC CATCT CCAAA GCCAA AGGGC AGCCC CGAGA ACCAC 5201 AGGTG TACAC CCTGC CCCCA TCCCG GGATG AGCTG ACCAA GAACC AGGTC 5251 AGCCT GACCT GCCTG GTCAA AGGCT TCTAT CCCAG CGACA TCGCC GTGGA 5301 GTGGG AGAGC AATGG GCAGC CGGAG AACAA CTACA AGACC ACGCC TCCCG 5351 TGTTG GACTC CGACG GCTCC TTCTT CCTCT ACAGC AAGCT CACCG TGGAC 5401 AAGAG CAGGT GGCAG CAGGG GAACG TCTTC TCATG CTCCG TGATG CATGA 5451 GGCTC TGCAC AACCA CTACA CGCAG AAGAG CCTCT CCCTG TCTCC GGGTA 5501 AATGA

Secuencia proteínica de FVIII 282 (SEQ ID NO: 159)

1 MQIELSTCFF LCLLRFCFSA TRRYYLGAVE LSWDYMQSDL GELPVDARFP 51 PRVPKSFPFN TSWYKKTLF VEFTDHLFNIAKPRPPWMGL LGPTIQAEVY 101 DTWITLKNM ASHPVSLHAV GVSYWKASEGAEYDDQTSQR EKEDDKVFPG 151 GSHTYVWQVL KENGPMASDP LCLTYSYLSH VDLVKDLNSG LIGALLVCRE 201 GSLAKEKTQT LHKFILLFAV FDEGKSWHSE TKNSLMQDRD AASARAWPKM 251 HTVNGYVNRS LPGLIGCHRK SVYWHVIGMG TTPEVHSIFL EGHTFLVRNH 301 RQASLEISPI TFLTAQTLLM DLGQFLLFCH ISSHQHDGME AYVKVDSCPE 351 EPQLRMKNNE EAEDYDDDLT DSEMDWRFD DDNSPSFIQI RSVAKKHPKT 401 WVHYIAAEEE DWDYAPLVLA PDDRSYKSQY LNNGPQRIGR KYKKVRFMAY 451 TDETFKTREA IQHESGILGP LLYGEVGDTL LIIFKNQASR PYNIYPHGIT 501 DVRPLYSRRL PKGVKHLKDF PILPGEIFKY KWTVTVEDGP TKSDPRCLTR 551 YYSSFVNMER DLASGLIGPL LICYKESVDQ RGNQIMSDKR NVILFSVFDE 601 NRSWYLTENI QRFLPNPAGV QLEDPEFQAS NIMHSINGYV FDSLQLSVCL 651 HEVAYWYILS IGAQTDFLSV FFSGYTFKHK MVYEDTLTLF PFSGETVFMS 701 MENPGLWILG CHNSDFRNRG MTALLKVSSC DKNTGDYYED SYEDISAYLL 751 SKNNAIEPRS FSQNGAPTSE SATPESGPGS EPATSGSETP GTSESATPES 801 GPGSEPATSG SETPGTSESA TPESGPGTST EPSEGSAPGS PAGSPTSTEE 851 GTSESATPES GPGSEPATSG SETPGTSESA TPESGPGSPA GSPTSTEEGS 901 PAGSPTSTEE GASSPPVLKR HQAEITRTTL QSDQEEIDYD DTISVEMKKE 951 DFDIYDEDEN QSPRSFQKKT RHYFIAAVER LWDYGMSSSP HVLRNRAQSG

1001 SVPQFKKWF QEFTDGSFTQ PLYRGELNEH LGLLGPYIRA EVEDNIMVTF

1051 RNQASRPYSF YSSLISYEED QRQGAEPRKN FVKPNETKTY FWKVQHHMAP

1101 TKDEFDCKAW AYFSDVDLEK DVHSGLIGPL LVCHTNTLNP AHGRQVTVQE

1151 FALFFTIFDE TKSWYFTENM ERNCRAPCNI QMEDPTFKEN YRFHAINGYI

1201 MDTLPGLVMA QDQRIRWYLL SMGSNENIHS IHFSGHVFTV RKKEEYKMAL

1251 YNLYPGVFET VEMLPSKAGI WRVECLIGEH LHAGMSTLFL VYSNKCQTPL

1301 GMASGHIRDF QITASGQYGQ WAPKLARLHY SGSINAWSTK EPFSWIKVDL

1351 LAPMIIHGIK TQGARQKFSS LYISQFIIMY SLDGKKWQTY RGNSTGTLMV

1401 FFGNVDSSGI KHNIFNPPII ARYIRLHPTH YSIRSTLRME LMGCDLNSCS

1451 MPLGMESKAI SDAQITASSY FTNMFATWSP SKARLHLQGR SNAWRPQVNN

1501 PKEWLQVDFQ KTMKVTGVTT QGVKSLLTSM YVKEFLISSS QDGHQWTLFF

1551 QNGKVKVFQG NQDSFTPWN SLDPPLLTRY LRIHPQSWVH QIALRMEVLG

1601 CEAQDLYDKT HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCW

1651 VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRW SVLTVLHQDW

1701 LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SRDELTKNQV

1751 SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD

1801 KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK*

Secuencia de nucleótidos de FVIII 283 (FVIII 169 con triple mutación IHH) (SEQ ID NO: 160)

1 ATGCA AATAG AGCTC TCCAC CTGCT TCTTT CTGTG CCTTT TGCGA TTCTG 51 CTTTA GTGCC ACCAG AAGAT ACTAC CTGGG TGCAG TGGAA CTGTC ATGGG 101 ACTAT ATGCA AAGTG ATCTC GGTGA GCTGC CTGTG GACGC AAGAT TTCCT 151 CCTAG AGTGC CAAAA TCTTT TCCAT TCAAC ACCTC AGTCG TGTAC AAAAA 201 GACTC TGTTT GTAGA ATTCA CGGAT CACCT TTTCA ACATC GCTAA GCCAA 251 GGCCA CCCTG GATGG GTCTG CTAGG TCCTA CCATC CAGGC TGAGG TTTAT 301 GATAC AGTGG TCATT ACACT TAAGA ACATG GCTTC CCATC CTGTC AGTCT 351 TCATG CTGTT GGTGT ATCCT ACTGG AAAGC TTCTG AGGGA GCTGA ATATG 401 ATGAT CAGAC CAGTC AAAGG GAGAA AGAAG ATGAT AAAGT CTTCC CTGGT 451 GGAAG CCATA CATAT GTCTG GCAGG TCCTG AAAGA GAATG GTCCA ATGGC 501 CTCTG ACCCA CTGTG CCTTA CCTAC TCATA TCTTT CTCAT GTGGA CCTGG 551 TAAAA GACTT GAATT CAGGC CTCAT TGGAG CCCTA CTAGT ATGTA GAGAA 601 GGGAG TCTGG CCAAG GAAAA GACAC AGACC TTGCA CAAAT TTATA CTACT 651 TTTTG CTGTA TTTGA TGAAG GGAAA AGTTG GCACT CAGAA ACAAA GAACT 701 CCTTG ATGCA GGATA GGGAT GCTGC ATCTG CTCGG GCCTG GCCTA AAATG 751 CACAC AGTCA ATGGT TATGT AAACA GGTCT CTGCC AGGTC TGATT GGATG 801 CCACA GGAAA TCAGT CTATT GGCAT GTGAT TGGAA TGGGC ACCAC TCCTG 851 AAGTG CACTC AATAT TCCTC GAAGG TCACA CATTT CTTGT GAGGA ACCAT 901 CGCCA GGCTA GCTTG GAAAT CTCGC CAATA ACTTT CCTTA CTGCT CAAAC 951 ACTCT TGATG GACCT TGGAC AGTTT CTACT GTTTT GTCAT ATCTC TTCCC 1001 ACCAA CATGA TGGCA TGGAA GCTTA TGTCA AAGTA GACAG CTGTC CAGAG 1051 GAACC CCAAC TACGA ATGAA AAATA ATGAA GAAGC GGAAG ACTAT GATGA 1101 TGATC TTACT GATTC TGAAA TGGAT GTGGT CAGGT TTGAT GATGA CAACT 1151 CTCCT TCCTT TATCC AAATT CGCTC AGTTG CCAAG AAGCA TCCTA AAACT 1201 TGGGT ACATT ACATT GCTGC TGAAG AGGAG GACTG GGACT ATGCT CCCTT 1251 AGTCC TCGCC CCCGA TGACA GAAGT TATAA AAGTC AATAT TTGAA CAATG 1301 GCCCT CAGCG GATTG GTAGG AAGTA CAAAA AAGTC CGATT TATGG CATAC 1351 ACAGA TGAAA CCTTT AAGAC TCGTG AAGCT ATTCA GCATG AATCA GGAAT 1401 CTTGG GACCT TTACT TTATG GGGAA GTTGG AGACA CACTG TTGAT TATAT 1451 TTAAG AATCA AGCAA GCAGA CCATA TAACA TCTAC CCTCA CGGAA TCACT 1501 GATGT CCGTC CTTTG TATTC AAGGA GATTA CCAAA AGGTG TAAAA CATTT 1551 GAAGG ATTTT CCAAT TCTGC CAGGA GAAAT ATTCA AATAT AAATG GACAG 1601 TGACT GTAGA AGATG GGCCA ACTAA ATCAG ATCCT CGGTG CCTGA CCCGC 1651 TATTA CTCTA GTTTC GTTAA TATGG AGAGA GATCT AGCTT CAGGA CTCAT 1701 TGGCC CTCTC CTCAT CTGCT ACAAA GAATC TGTAG ATCAA AGAGG AAACC 1751 AGATA ATGTC AGACA AGAGG AATGT CATCC TGTTT TCTGT ATTTG ATGAG 1801 AACCG AAGCT GGTAC CTCAC AGAGA ATATA CAACG CTTTC TCCCC AATCC 1851 AGCTG GAGTG CAGCT TGAGG ATCCA GAGTT CCAAG CCTCC AACAT CATGC 1901 ACAGC ATCAA TGGCT ATGTT TTTGA TAGTT TGCAG TTGTC AGTTT GTTTG 1951 CATGA GGTGG CATAC TGGTA CATTC TAAGC ATTGG AGCAC AGACT GACTT 2001 CCTTT CTGTC TTCTT CTCTG GATAT ACCTT CAAAC ACAAA ATGGT CTATG 2051 AAGAC ACACT CACCC TATTC CCATT CTCAG GAGAA ACTGT CTTCA TGTCG 2101 ATGGA AAACC CAGGT CTATG GATTC TGGGG TGCCA CAACT CAGAC TTTCG 2151 GAACA GAGGC ATGAC CGCCT TACTG AAGGT TTCTA GTTGT GACAA GAACA 2201 CTGGT GATTA TTACG AGGAC AGTTA TGAAG ATATT TCAGC ATACT TGCTG 2251 AGTAA AAACA ATGCC ATTGA ACCAA GAAGC TTCTC TCAAA ACGGC GCGCC 2301 AGGTA CCTCA GAGTC TGCTA CCCCC GAGTC AGGGC CAGGA TCAGA GCCAG 2351 CCACC TCCGG GTCTG AGACA CCCGG GACTT CCGAG AGTGC CACCC CTGAG 2401 TCCGG ACCCG GGTCC GAGCC CGCCA CTTCC GGCTC CGAAA CTCCC GGCAC 2451 AAGCG AGAGC GCTAC CCCAG AGTCA GGACC AGGAA CATCT ACAGA GCCCT 2501 CTGAA GGCTC CGCTC CAGGG TCCCC AGCCG GCAGT CCCAC TAGCA CCGAG 2551 GAGGG AACCT CTGAA AGCGC CACAC CCGAA TCAGG GCCAG GGTCT GAGCC 2601 TGCTA CCAGC GGCAG CGAGA CACCA GGCAC CTCTG AGTCC GCCAC ACCAG 2651 AGTCC GGACC CGGAT CTCCC GCTGG GAGCC CCACC TCCAC TGAGG AGGGA 2701 TCTCC TGCTG GCTCT CCAAC ATCTA CTGAG GAAGG TACCT CAACC GAGCC 2751 ATCCG AGGGA TCAGC TCCCG GCACC TCAGA GTCGG CAACC CCGGA GTCTG 2801 GACCC GGAAC TTCCG AAAGT GCCAC ACCAG AGTCC GGTCC CGGGA CTTCA 2851 GAATC AGCAA CACCC GAGTC CGGCC CTGGG TCTGA ACCCG CCACA AGTGG 2901 TAGTG AGACA CCAGG ATCAG AACCT GCTAC CTCAG GGTCA GAGAC ACCCG 2951 GATCT CCGGC AGGCT CACCA ACCTC CACTG AGGAG GGCAC CAGCA CAGAA 3001 CCAAG CGAGG GCTCC GCACC CGGAA CAAGC ACTGA ACCCA GTGAG GGTTC 3051 AGCAC CCGGC TCTGA GCCGG CCACA AGTGG CAGTG AGACA CCCGG CACTT 3101 CAGAG AGTGC CACCC CCGAG AGTGG CCCAG GCACT AGTAC CGAGC CCTCT 3151 GAAGG CAGTG CGCCA GCCTC GAGCC CACCA GTCTT GAAAC GCCAT CAAGC 3201 TGAAA TAACT CGTAC TACTC TTCAG TCAGA TCAAG AGGAA ATCGA TTATG 3251 ATGAT ACCAT ATCAG TTGAA ATGAA GAAGG AAGAT TTTGA CATTT ATGAT 3301 GAGGA TGAAA ATCAG AGCCC CCGCA GCTTT CAAAA GAAAA CACGA CACTA 3351 TTTTA TTGCT GCAGT GGAGA GGCTC TGGGA TTATG GGATG AGTAG CTCCC 3401 CACAT GTTCT AAGAA ACAGG GCTCA GAGTG GCAGT GTCCC TCAGT TCAAG 3451 AAAGT TGTTT TCCAG GAATT TACTG ATGGC TCCTT TACTC AGCCC TTATA 3501 CCGTG GAGAA CTAAA TGAAC ATTTG GGACT CCTGG GGCCA TATAT AAGAG 3551 CAGAA GTTGA AGATA ATATC ATGGT AACTT TCAGA AATCA GGCCT CTCGT 3601 CCCTA TTCCT TCTAT TCTAG CCTTA TTTCT TATGA GGAAG ATCAG AGGCA 3651 AGGAG CAGAA CCTAG AAAAA ACTTT GTCAA GCCTA ATGAA ACCAA AACTT 3701 ACTTT TGGAA AGTGC AACAT CATAT GGCAC CCACT AAAGA TGAGT TTGAC 3751 TGCAA AGCCT GGGCT TATTT CTCTG ATGTT GACCT GGAAA AAGAT GTGCA 3801 CTCAG GCCTG ATTGG ACCCC TTCTG GTCTG CCACA CTAAC ACACT GAACC 3851 CTGCT CATGG GAGAC AAGTG ACAGT ACAGG AATTT GCTCT GTTTT TCACC 3901 ATCTT TGATG AGACC AAAAG CTGGT ACTTC ACTGA AAATA TGGAA AGAAA 3951 CTGCA GGGCT CCCTG CAATA TCCAG ATGGA AGATC CCACT TTTAA AGAGA 4001 ATTAT CGCTT CCATG CAATC AATGG CTACA TAATG GATAC ACTAC CTGGC 4051 TTAGT AATGG CTCAG GATCA AAGGA TTCGA TGGTA TCTGC TCAGC ATGGG 4101 CAGCA ATGAA AACAT CCATT CTATT CATTT CAGTG GACAT GTGTT CACTG 4151 TACGA AAAAA AGAGG AGTAT AAAAT GGCAC TGTAC AATCT CTATC CAGGT 4201 GTTTT TGAGA CAGTG GAAAT GTTAC CATCC AAAGC TGGAA TTTGG CGGGT 4251 GGAAT GCCTT ATTGG CGAGC ATCTA CATGC TGGGA TGAGC ACACT TTTTC 4301 TGGTG TACAG CAATA AGTGT CAGAC TCCCC TGGGA ATGGC TTCTG GACAC 4351 ATTAG AGATT TTCAG ATTAC AGCTT CAGGA CAATA TGGAC AGTGG GCCCC 4401 AAAGC TGGCC AGACT TCATT ATTCC GGATC AATCA ATGCC TGGAG CACCA 4451 AGGAG CCCTT TTCTT GGATC AAGGT GGATC TGTTG GCACC AATGA TTATT 4501 CACGG CATCA AGACC CAGGG TGCCC GTCAG AAGTT CTCCA GCCTC TACAT 4551 CTCTC AGTTT ATCAT CATGT ATAGT CTTGA TGGGA AGAAG TGGCA GACTT 4601 ATCGA GGAAA TTCCA CTGGA ACCTT AATGG TCTTC TTTGG CAATG TGGAT 4651 TCATC TGGGA TAAAA CACAA TATTT TTAAC CCTCC AATTA TTGCT CGATA 4701 CATCC GTTTG CACCC AACTC ATTAT AGCAT TCGCA GCACT CTTCG CATGG 4751 AGTTG ATGGG CTGTG ATTTA AATAG TTGCA GCATG CCATT GGGAA TGGAG 4801 AGTAA AGCAA TATCA GATGC ACAGA TTACT GCTTC ATCCT ACTTT ACCAA 4851 TATGT TTGCC ACCTG GTCTC CTTCA AAAGC TCGAC TTCAC CTCCA AGGGA 4901 GGAGT AATGC CTGGA GACCT CAGGT GAATA ATCCA AAAGA GTGGC TGCAA 4951 GTGGA CTTCC AGAAG ACAAT GAAAG TCACA GGAGT AACTA CTCAG GGAGT 5001 AAAAT CTCTG CTTAC CAGCA TGTAT GTGAA GGAGT TCCTC ATCTC CAGCA 5051 GTCAA GATGG CCATC AGTGG ACTCT CTTTT TTCAG AATGG CAAAG TAAAG 5101 GTTTT TCAGG GAAAT CAAGA CTCCT TCACA CCTGT GGTGA ACTCT CTAGA 5151 CCCAC CGTTA CTGAC TCGCT ACCTT CGAAT TCACC CCCAG AGTTG GGTGC 5201 ACCAG ATTGC CCTGA GGATG GAGGT TCTGG GCTGC GAGGC ACAGG ACCTC 5251 TACGA CAAAA CTCAC ACATG CCCAC CGTGC CCAGC TCCAG AACTC CTGGG 5301 CGGAC CGTCA GTCTT CCTCT TCCCC CCAAA ACCCA AGGAC ACCCT CATGG 5351 CCTCC CGGAC CCCTG AGGTC ACATG CGTGG TGGTG GACGT GAGCC ACGAA 5401 GACCC TGAGG TCAAG TTCAA CTGGT ACGTG GACGG CGTGG AGGTG CATAA 5451 TGCCA AGACA AAGCC GCGGG AGGAG CAGTA CAACA GCACG TACCG TGTGG 5501 TCAGC GTCCT CACCG TCCTG GCCCA GGACT GGCTG AATGG CAAGG AGTAC 5551 AAGTG CAAGG TCTCC AACAA AGCCC TCCCA GCCCC CATCG AGAAA ACCAT 5601 CTCCA AAGCC AAAGG GCAGC CCCGA GAACC ACAGG TGTAC ACCCT GCCCC 5651 CATCC CGGGA TGAGC TGACC AAGAA CCAGG TCAGC CTGAC CTGCC TGGTC 5701 AAAGG CTTCT ATCCC AGCGA CATCG CCGTG GAGTG GGAGA GCAAT GGGCA 5751 GCCGG AGAAC AACTA CAAGA CCACG CCTCC CGTGT TGGAC TCCGA CGGCT 5801 CCTTC TTCCT CTACA GCAAG CTCAC CGTGG ACAAG AGCAG GTGGC AGCAG 5851 GGGAA CGTCT TCTCA TGCTC CGTGA TGCAT GAGGC TCTGC ACAAC GCCTA 5901 CACGC AGAAG AGCCT CTCCC TGTCT CCGGG TAAAT GA

Secuencia proteínica de FVIII 283 (FVIII 169 con triple mutación IHH) (SEQ ID NO: 161)

i MQIELSTCFF LCLLRFCFSA TRRYYLGAVE LSWDYMQSDL GELPVDARFP 51 PRVPKSFPFN TSWYKKTLF VEFTDHLFNI AKPRPPWMGL LGPTIQAEVY 101 DTWITLKN M ASHPVSLHAV GVSYWKASEG AEYDDQTSQR EKEDDKVFPG 151 GSHTYVWQVL KENGPMASDP LCLTYSYLSH VDLVKDLNSG LIGALLVCRE 201 GSLAKEKTQT LHKFILLFAV FDEGKSWHSE TKNSLMQDRD AASARAWPKM 251 HTVNGYVNRS LPGLIGCHRK SVYWHVIGMG TTPEVHSIFL EGHTFLVRNH 301 RQASLEISPI TFLTAQTLLM DLGQFLLFCH ISSHQHDGME AYVKVDSCPE 351 EPQLRMKNNE EAEDYDDDLT DSEMDWRFD DDNSPSFIQI RSVAKKHPKT 401 WVHYIAAEEE DWDYAPLVLA PDDRSYKSQY LNNGPQRIGR KYKKVRFMAY 451 TDETFKTREA IQHESGILGP LLYGEVGDTL LIIFKNQASR PYNIYPHGIT 501 DVRPLYSRRL PKGVKHLKDF PILPGEIFKY KWTVTVEDGP TKSDPRCLTR 551 YYSSFVNMER DLASGLIGPL LICYKESVDQ RGNQIMSDKR NVILFSVFDE 601 NRSWYLTENI QRFLPNPAGV QLEDPEFQAS NIMHSINGYV FDSLQLSVCL 651 HEVAYWYILS IGAQTDFLSV FFSGYTFKHK MVYEDTLTLF PFSGETVFMS 701 MENPGLWILG CHNSDFRNRG MTALLKVSSC DKNTGDYYED SYEDISAYLL 751 SKNNAIEPRS FSQNGAPGTS ESATPESGPG SEPATSGSET PGTSESATPE 801 SGPGSEPATS GSETPGTSES ATPESGPGTS TEPSEGSAPG SPAGSPTSTE 851 EGTSESATPE SGPGSEPATS GSETPGTSES ATPESGPGSP AGSPTSTEEG 901 SPAGSPTSTE EGTSTEPSEG SAPGTSESAT PESGPGTSES ATPESGPGTS 951 ESATPESGPG SEPATSGSET PGSEPATSGS ETPGSPAGSP TSTEEGTSTE 1001 PSEGSAPGTS TEPSEGSAPG SEPATSGSET PGTSESATPE SGPGTSTEPS 1051 EGSAPASSPP VLKRHQAEIT RTTLQSDQEE IDYDDTISVE MKKEDFDIYD 1101 EDENQSPRSF QKKTRHYFIA AVERLWDYGM SSSPHVLRNR AQSGSVPQFK 1151 KWFQEFTDG SFTQPLYRGE LNEHLGLLGP YIRAEVEDNI MVTFRNQASR 1201 PYSFYSSLIS YEEDQRQGAE PRKNFVKPNE TKTYFWKVQH HMAPTKDEFD 1251 CKAWAYFSDV DLEKDVHSGL IGPLLVCHTN TLNPAHGRQV TVQEFALFFT 1301 IFDETKSWYF TENMERNCRA PCNIQMEDPT FKENYRFHAI NGYIMDTLPG 1351 LVMAQDQRIR WYLLSMGSNE NIHSIHFSGH VFTVRKKEEY KMALYNLYPG

1401 VFETVEMLPS KAGIWRVECL IGEHLHAGMS TLFLVYSNKC QTPLGMASGH 1451 IRDFQITASG QYGQWAPKLA RLHYSGSINA WSTKEPFSWI KVDLLAPMII 1501 HGIKTQGARQ KFSSLYISQF IIMYSLDGKK WQTYRGNSTG TLMVFFGNVD 1551 SSGIKHNIFN PPIIARYIRL HPTHYSIRST LRMELMGCDL NSCSMPLGME 1601 SKAISDAQIT ASSYFTNMFA TWSPSKARLH LQGRSNAWRP QVNNPKEWLQ 1651 VDFQKTMKVT GVTTQGVKSL LTSMYVKEFL ISSSQDGHQW TLFFQNGKVK 1701 VFQGNQDSFT PWNSLDPPL LTRYLRIHPQ SWVHQIALRM EVLGCEAQDL 1751 YDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMASRTPEV TCVWDVSHE 1801 DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRWSVLTVL AQDWLNGKEY 1851 KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSRDELT KNQVSLTCLV 1901 KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ 1951 GNVFSCSVMH EALHNAYTQK SLSLSPGK*

Secuencia de nucleótidos de pSYNFVIII 010-(FVIIIFc de doble cadena) (SEQ ID NO: 162)

1 ATGCAAATAG AGCTCTCCAC CTGCTTCTTT CTGTGCCTTT TGCGATTCTG 51 CTTTAGTGCC ACCAGAAGAT ACTACCTGGG TGCAGTGGAA CTGTCATGGG 101 ACTATATGCA AAGTGATCTC GGTGAGCTGC CTGTGGACGCAAGATTTCCT 151 CCTAGAGTGC CAAAATCTTT TCCATTCAAC ACCTCAGTCG TGTACAAAAA 201 GACTCTGTTT GTAGAATTCA CGGATCACCT TTTCAACATC GCTAAGCCAA 251 GGCCACCCTG GATGGGTCTG CTAGGTCCTA CCATCCAGGC TGAGGTTTAT 301 GATACAGTGG TCATTACACT TAAGAACATG GCTTCCCATC CTGTCAGTCT 351 TCATGCTGTT GGTGTATCCT ACTGGAAAGC TTCTGAGGGA GCTGAATATG 401 ATGATCAGAC CAGTCAAAGG GAGAAAGAAG ATGATAAAGT CTTCCCTGGT 451 GGAAGCCATA CATATGTCTG GCAGGTCCTG AAAGAGAATG GTCCAATGGC 501 CTCTGACCCA CTGTGCCTTA CCTACTCATA TCTTTCTCAT GTGGACCTGG 551 TAAAAGACTT GAATTCAGGC CTCATTGGAG CCCTACTAGTATGTAGAGAA 601 GGGAGTCTGG CCAAGGAAAA GACACAGACC TTGCACAAAT TTATACTACT 651 TTTTGCTGTA TTTGATGAAG GGAAAAGTTG GCACTCAGAAACAAAGAACT 701 CCTTGATGCA GGATAGGGAT GCTGCATCTG CTCGGGCCTG GCCTAAAATG 751 CACACAGTCA ATGGTTATGT AAACAGGTCT CTGCCAGGTC TGATTGGATG 801 CCACAGGAAA TCAGTCTATT GGCATGTGAT TGGAATGGGCACCACTCCTG 851 AAGTGCACTC AATATTCCTC GAAGGTCACA CATTTCTTGT GAGGAACCAT 901 CGCCAGGCGT CCTTGGAAAT CTCGCCAATA ACTTTCCTTA CTGCTCAAAC 951 ACTCTTGATG GACCTTGGAC AGTTTCTACT GTTTTGTCATATCTCTTCCC 1001 ACCAACATGA TGGCATGGAA GCTTATGTCA AAGTAGACAG CTGTCCAGAG 1051 GAACCCCAAC TACGAATGAA AAATAATGAA GAAGCGGAAGACTATGATGA 1101 TGATCTTACT GATTCTGAAA TGGATGTGGT CAGGTTTGAT GATGACAACT 1151 CTCCTTCCTT TATCCAAATT CGCTCAGTTG CCAAGAAGCA TCCTAAAACT 1201 TGGGTACATT ACATTGCTGC TGAAGAGGAG GACTGGGACTATGCTCCCTT 1251 AGTCCTCGCC CCCGATGACA GAAGTTATAA AAGTCAATAT TTGAACAATG 1301 GCCCTCAGCG GATTGGTAGG AAGTACAAAA AAGTCCGATT TATGGCATAC 1351 ACAGATGAAA CCTTTAAGAC TCGTGAAGCT ATTCAGCATGAATCAGGAAT 1401 CTTGGGACCT TTACTTTATG GGGAAGTTGG AGACACACTG TTGATTATAT 1451 TTAAGAATCA AGCAAGCAGA CCATATAACA TCTACCCTCA CGGAATCACT 1501 GATGTCCGTC CTTTGTATTC AAGGAGATTA CCAAAAGGTG TAAAACATTT 1551 GAAGGATTTT CCAATTCTGC CAGGAGAAAT ATTCAAATATAAATGGACAG 1601 TGACTGTAGA AGATGGGCCA ACTAAATCAG ATCCTCGGTG CCTGACCCGC 1651 TATTACTCTA GTTTCGTTAA TATGGAGAGA GATCTAGCTT CAGGACTCAT 1701 TGGCCCTCTC CTCATCTGCT ACAAAGAATC TGTAGATCAAAGAGGAAACC 1751 AGATAATGTC AGACAAGAGG AATGTCATCC TGTTTTCTGTATTTGATGAG 1801 AACCGAAGCT GGTACCTCAC AGAGAATATA CAACGCTTTC TCCCCAATCC 1851 AGCTGGAGTG CAGCTTGAGG ATCCAGAGTT CCAAGCCTCCAACATCATGC 1901 ACAGCATCAA TGGCTATGTT TTTGATAGTT TGCAGTTGTCAGTTTGTTTG 1951 CATGAGGTGG CATACTGGTA CATTCTAAGC ATTGGAGCACAGACTGACTT 2001 CCTTTCTGTC TTCTTCTCTG GATATACCTT CAAACACAAAATGGTCTATG 2051 AAGACACACT CACCCTATTC CCATTCTCAG GAGAAACTGT CTTCATGTCG 2101 ATGGAAAACC CAGGTCTATG GATTCTGGGG TGCCACAACT CAGACTTTCG 2151 GAACAGAGGC ATGACCGCCT TACTGAAGGT TTCTAGTTGT GACAAGAACA 2201 CTGGTGATTA TTACGAGGAC AGTTATGAAG ATATTTCAGC ATACTTGCTG 2251 AGTAAAAACA ATGCCATTGA ACCAAGAAGC TTCTCTCAAA ACCCACCAGT 2301 CTTGAAACGC CATCAACGGG AAATAACTCG TACTACTCTT CAGTCAGATC 2351 AAGAGGAAAT TGACTATGAT GATACCATAT CAGTTGAAAT GAAGAAGGAA 2401 GATTTTGACA TTTATGATGA GGATGAAAAT CAGAGCCCCC GCAGCTTTCA 2451 AAAGAAAACA CGACACTATT TTATTGCTGC AGTGGAGAGG CTCTGGGATT 2501 ATGGGATGAG TAGCTCCCCA CATGTTCTAA GAAACAGGGC TCAGAGTGGC 2551 AGTGTCCCTC AGTTCAAGAA AGTTGTTTTC CAGGAATTTA CTGATGGCTC 2601 CTTTACTCAG CCCTTATACC GTGGAGAACT AAATGAACAT TTGGGACTCC 2651 TGGGGCCATA TATAAGAGCA GAAGTTGAAG ATAATATCAT GGTAACTTTC 2701 AGAAATCAGG CCTCTCGTCC CTATTCCTTC TATTCTAGCC TTATTTCTTA 2751 TGAGGAAGAT CAGAGGCAAG GAGCAGAACC TAGAAAAAAC TTTGTCAAGC 2801 CTAATGAAAC CAAAACTTAC TTTTGGAAAG TGCAACATCA TATGGCACCC 2851 ACTAAAGATG AGTTTGACTG CAAAGCCTGG GCTTATTTCT CTGATGTTGA 2901 CCTGGAAAAA GATGTGCACT CAGGCCTGAT TGGACCCCTT CTGGTCTGCC 2951 ACACTAACAC ACTGAACCCT GCTCATGGGA GACAAGTGAC AGTACAGGAA 3001 TTTGCTCTGT TTTTCACCAT CTTTGATGAG ACCAAAAGCT GGTACTTCAC 3051 TGAAAATATG GAAAGAAACT GCAGGGCTCC CTGCAATATC CAGATGGAAG 3101 ATCCCACTTT TAAAGAGAAT TATCGCTTCC ATGCAATCAA TGGCTACATA 3151 ATGGATACAC TACCTGGCTT AGTAATGGCT CAGGATCAAA GGATTCGATG 3201 GTATCTGCTC AGCATGGGCA GCAATGAAAA CATCCATTCT ATTCATTTCA 3251 GTGGACATGT GTTCACTGTA CGAAAAAAAG AGGAGTATAA AATGGCACTG 3301 TACAATCTCT ATCCAGGTGT TTTTGAGACA GTGGAAATGT TACCATCCAA 3351 AGCTGGAATT TGGCGGGTGG AATGCCTTAT TGGCGAGCAT CTACATGCTG 3401 GGATGAGCAC ACTTTTTCTG GTGTACAGCA ATAAGTGTCA GACTCCCCTG 3451 GGAATGGCTT CTGGACACAT TAGAGATTTT CAGATTACAG CTTCAGGACA 3501 ATATGGACAG TGGGCCCCAA AGCTGGCCAG ACTTCATTAT TCCGGATCAA 3551 TCAATGCCTG GAGCACCAAG GAGCCCTTTT CTTGGATCAA GGTGGATCTG 3601 TTGGCACCAA TGATTATTCA CGGCATCAAG ACCCAGGGTG CCCGTCAGAA 3651 GTTCTCCAGC CTCTACATCT CTCAGTTTAT CATCATGTAT AGTCTTGATG 3701 GGAAGAAGTG GCAGACTTAT CGAGGAAATT CCACTGGAAC CTTAATGGTC 3751 TTCTTTGGCA ATGTGGATTC ATCTGGGATA AAACACAATA TTTTTAACCC 3801 TCCAATTATT GCTCGATACA TCCGTTTGCA CCCAACTCAT TATAGCATTC 3851 GCAGCACTCT TCGCATGGAG TTGATGGGCT GTGATTTAAA TAGTTGCAGC 3901 ATGCCATTGG GAATGGAGAG TAAAGCAATA TCAGATGCAC AGATTACTGC 3951 TTCATCCTAC TTTACCAATA TGTTTGCCAC CTGGTCTCCT TCAAAAGCTC 4001 GACTTCACCT CCAAGGGAGG AGTAATGCCT GGAGACCTCA GGTGAATAAT 4051 CCAAAAGAGT GGCTGCAAGT GGACTTCCAG AAGACAATGA AAGTCACAGG 4101 AGTAACTACT CAGGGAGTAA AATCTCTGCT TACCAGCATG TATGTGAAGG 4151 AGTTCCTCAT CTCCAGCAGT CAAGATGGCC ATCAGTGGAC TCTCTTTTTT 4201 CAGAATGGCA AAGTAAAGGT TTTTCAGGGA AATCAAGACT CCTTCACACC 4251 TGTGGTGAAC TCTCTAGACC CACCGTTACT GACTCGCTAC CTTCGAATTC 4301 ACCCCCAGAG TTGGGTGCAC CAGATTGCCC TGAGGATGGA GGTTCTGGGC 4351 TGCGAGGCAC AGGACCTCTA CGACAAAACT CACACATGCC CACCGTGCCC 4401 AGCTCCAGAA CTCCTGGGCG GACCGTCAGT CTTCCTCTTC CCCCCAAAAC 4451 CCAAGGACAC CCTCATGATC TCCCGGACCC CTGAGGTCAC ATGCGTGGTG 4501 GTGGACGTGA GCCACGAAGA CCCTGAGGTC AAGTTCAACT GGTACGTGGA 4551 CGGCGTGGAG GTGCATAATG CCAAGACAAA GCCGCGGGAG GAGCAGTACA 4601 ACAGCACGTA CCGTGTGGTC AGCGTCCTCA CCGTCCTGCA CCAGGACTGG 4651 CTGAATGGCA AGGAGTACAA GTGCAAGGTC TCCAACAAAG CCCTCCCAGC 4701 CCCCATCGAG AAAACCATCT CCAAAGCCAA AGGGCAGCCC CGAGAACCAC 4751 AGGTGTACAC CCTGCCCCCA TCCCGGGATG AGCTGACCAA GAACCAGGTC 4801 AGCCTGACCT GCCTGGTCAA AGGCTTCTAT CCCAGCGACA TCGCCGTGGA 4851 GTGGGAGAGC AATGGGCAGC CGGAGAACAA CTACAAGACC ACGCCTCCCG 4901 TGTTGGACTC CGACGGCTCC TTCTTCCTCT ACAGCAAGCT CACCGTGGAC 4951 AAGAGCAGGT GGCAGCAGGG GAACGTCTTC TCATGCTCCG TGATGCATGA 5001 GGCTCTGCAC AACCACTACA CGCAGAAGAG CCTCTCCCTG TCTCCGGGTA 5051 AATGA

Secuencia proteínica de pSYNFVIII 010-(FVIIIFc de doble cadena) (SEQ ID NO: 163) i MQIELSTCFF LCLLRFCFSA TRRYYLGAVE LSWDYMQSDL GELPVDARFP

51 PRVPKSFPFN TSWYKKTLF VEFTDHLFNI AKPRPPWMGL LGPTIQAEVY

101 DTWITLKNM ASHPVSLHAV GVSYWKASEG AEYDDQTSQR EKEDDKVFPG

151 GSHTYVWQVL KENGPMASDP LCLTYSYLSH VDLVKDLNSG LIGALLVCRE

201 GSLAKEKTQT LHKFILLFAV FDEGKSWHSE TKNSLMQDRD AASARAWPKM

251 HTVNGYVNRS LPGLIGCHRK SVYWHVIGMG TTPEVHSIFL EGHTFLVRNH

301 RQASLEISPI TFLTAQTLLM DLGQFLLFCH ISSHQHDGME AYVKVDSCPE

351 EPQLRMKNNE EAEDYDDDLT DSEMDWRFD DDNSPSFIQI RSVAKKHPKT

401 WVHYIAAEEE DWDYAPLVLA PDDRSYKSQY LNNGPQRIGR KYKKVRFMAY

451 TDETFKTREA IQHESGILGP LLYGEVGDTL LIIFKNQASR PYNIYPHGIT

501 DVRPLYSRRL PKGVKHLKDF PILPGEIFKY KWTVTVEDGP TKSDPRCLTR

551 YYSSFVNMER DLASGLIGPL LICYKESVDQ RGNQIMSDKR NVILFSVFDE

601 NRSWYLTENI QRFLPNPAGV QLEDPEFQAS NIMHSINGYV FDSLQLSVCL

651 HEVAYWYILS IGAQTDFLSV FFSGYTFKHK MVYEDTLTLF PFSGETVFMS

701 MENPGLWILG CHNSDFRNRG MTALLKVSSC DKNTGDYYED SYEDISAYLL

751 SKNNAIEPRS FSQNPPVLKR HQREITRTTL QSDQEEIDYD DTISVEMKKE

801 DFDIYDEDEN QSPRSFQKKT RHYFIAAVER LWDYGMSSSP HVLRNRAQSG

851 SVPQFKKWF QEFTDGSFTQ PLYRGELNEH LGLLGPYIRA EVEDNIMVTF

901 RNQASRPYSF YSSLISYEED QRQGAEPRKN FVKPNETKTY FWKVQHHMAP

951 TKDEFDCKAW AYFSDVDLEK DVHSGLIGPL LVCHTNTLNP AHGRQVTVQE

1001 FALFFTIFDE TKSWYFTENM ERNCRAPCNI QMEDPTFKEN YRFHAINGYI

1051 MDTLPGLVMA QDQRIRWYLL SMGSNENIHS IHFSGHVFTV RKKEEYKMAL

1101 YNLYPGVFET VEMLPSKAGI WRVECLIGEH LHAGMSTLFL VYSNKCQTPL

1151 GMASGHIRDF QITASGQYGQ WAPKLARLHY SGSINAWSTK EPFSWIKVDL

1201 LAPMIIHGIK TQGARQKFSS LYISQFIIMY SLDGKKWQTY RGNSTGTLMV

1251 FFGNVDSSGI KHNIFNPPII ARYIRLHPTH YSIRSTLRME LMGCDLNSCS

1301 MPLGMESKAI SDAQITASSY FTNMFATWSP SKARLHLQGR SNAWRPQVNN

1351 PKEWLQVDFQ KTMKVTGVTT QGVKSLLTSM YVKEFLISSS QDGHQWTLFF

1401 QNGKVKVFQG NQDSFTPWN SLDPPLLTRY LRIHPQSWVH QIALRMEVLG

1451 CEAQDLYDKT HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCW

1501 VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRW SVLTVLHQDW

1551 LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SRDELTKNQV

1601 SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD

1651 KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK*

Secuencia proteínica de FVIII 195 (FVIIIFc de doble cadena con dos XTEN AE144 en el aminoácido 1656 y 1900) (SEQ ID NO: 73)

1 MQIELSTCFF LCLLRFCFSA TRRYYLGAVE LSWDYMQSDL GELPVDARFP

51 PRVPKSFPFN TSWYKKTLF VEFTDHLFNI AKPRPPWMGL LGPTIQAEVY

101 DTWITLKNM ASHPVSLHAV GVSYWKASEG AEYDDQTSQR EKEDDKVFPG

151 GSHTYVWQVL KENGPMASDP LCLTYSYLSH VDLVKDLNSG LIGALLVCRE

201 GSLAKEKTQT LHKFILLFAV FDEGKSWHSE TKNSLMQDRD AASARAWPKM

251 HTVNGYVNRS LPGLIGCHRK SVYWHVIGMG TTPEVHSIFL EGHTFLVRNH

301 RQASLEISPI TFLTAQTLLM DLGQFLLFCH ISSHQHDGME AYVKVDSCPE

351 EPQLRMKNNE EAEDYDDDLT DSEMDWRFD DDNSPSFIQI RSVAKKHPKT

401 WVHYIAAEEE DWDYAPLVLA PDDRSYKSQY LNNGPQRIGR KYKKVRFMAY

451 TDETFKTREA IQHESGILGP LLYGEVGDTL LIIFKNQASR PYNIYPHGIT

501 DVRPLYSRRL PKGVKHLKDF PILPGEIFKY KWTVTVEDGP TKSDPRCLTR

551 YYSSFVNMER DLASGLIGPL LICYKESVDQ RGNQIMSDKR NVILFSVFDE

601 NRSWYLTENI QRFLPNPAGV QLEDPEFQAS NIMHSINGYV FDSLQLSVCL

651 HEVAYWYILS IGAQTDFLSV FFSGYTFKHK MVYEDTLTLF PFSGETVFMS

701 MENPGLWILG CHNSDFRNRG MTALLKVSSC DKNTGDYYED SYEDISAYLL

751 SKNNAIEPRS FSQNPPVLKR HQREITRTTL QGAPGTPGSG TASSSPGASP

801 GTSSTGSPGA SPGTSSTGSP GASPGTSSTG SPGSSPSAST GTGPGTPGSG

851 TASSSPGASP GTSSTGSPGA SPGTSSTGSP GASPGTSSTG SPGSSTPSGA

901 TGSPGSSTPS GATGSPGASP GTSSTGSPAS SSDQEEIDYD DTISVEMKKE

951 DFDIYDEDEN QSPRSFQKKT RHYFIAAVER LWDYGMSSSP HVLRNRAQSG

1001 SVPQFKKWF QEFTDGSFTQ PLYRGELNEH LGLLGPYIRA EVEDNIMVTF

1051 RNQASRPYSF YSSLISYEED QRQGAEPRKN FVKPNETKTY FWKVQHHMAP

1101 TKDEFDCKAW AYFSDVDLEK DVHSGLIGPL LVCHTNTLNP AHGRQVTVQE

1151 FALFFTIFDE TKSWYFTENM ERNCRGAPTS ESATPESGPG SEPATSGSET

1201 PGTSESATPE SGPGSEPATS GSETPGTSES ATPESGPGTS TEPSEGSAPG

1251 TSESATPESG PGSPAGSPTS TEEGSPAGSP TSTEEGSPAG SPTSTEEGTS

1301 ESATPESGPG TSTEPSEGSA PGASSAPCNI QMEDPTFKEN YRFHAINGYI

1351 MDTLPGLVMA QDQRIRWYLL SMGSNENIHS IHFSGHVFTV RKKEEYKMAL

1401 YNLYPGVFET VEMLPSKAGI WRVECLIGEH LHAGMSTLFL VYSNKCQTPL

1451 GMASGHIRDF QITASGQYGQ WAPKLARLHY SGSINAWSTK EPFSWIKVDL

1501 LAPMIIHGIK TQGARQKFSS LYISQFIIMY SLDGKKWQTY RGNSTGTLMV

1551 FFGNVDSSGI KHNIFNPPII ARYIRLHPTH YSIRSTLRME LMGCDLNSCS

1601 MPLGMESKAI SDAQITASSY FTNMFATWSP SKARLHLQGR SNAWRPQVNN

1651 PKEWLQVDFQ KTMKVTGVTT QGVKSLLTSM YVKEFLISSS QDGHQWTLFF

1701 QNGKVKVFQG NQDSFTPWN SLDPPLLTRY LRIHPQSWVH QIALRMEVLG

1751 CEAQDLYDKT HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCW

1801 VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRW SVLTVLHQDW

1851 LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SRDELTKNQV

1901 SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD

1951 KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK*

Secuencia proteínica madura de pSYN -FVIII-173 (SEQ ID NO: 72)

1 ATRRYYLGAV ELSWDYMQSD LGELPVDARF PPRVPKSFPF NTSWYKKTL

51 FVEFTDHLFN IAKPRPPWMG LLGPTIQAEV YDTWITLKN MASHPVSLHA

101 VGVSYWKASE GAEYDDQTSQ REKEDDKVFP GGSHTYVWQV LKENGPMASD

151 PLCLTYSYLS HVDLVKDLNS GLIGALLVCR EGSLAKEKTQ TLHKFILLFA

201 VFDEGKSWHS ETKNSLMQDR DAASARAWPK MHTVNGYVNR SLPGLIGCHR

251 KSVYWHVIGM GTTPEVHSIF LEGHTFLVRN HRQASLEISP ITFLTAQTLL

301 MDLGQFLLFC HISSHQHDGM EAYVKVDSCP EEPQLRMKNN EEAEDYDDDL

351 TDSEMDWRF DDDNSPSFIQ IRSVAKKHPK TWVHYIAAEE EDWDYAPLVL

401 APDDRSYKSQ YLNNGPQRIG RKYKKVRFMA YTDETFKTRE AIQHESGILG

451 PLLYGEVGDT LLIIFKNQAS RPYNIYPHGI TDVRPLYSRR LPKGVKHLKD

501 FPILPGEIFK YKWTVTVEDG PTKSDPRCLT RYYSSFVNME RDLASGLIGP

551 LLICYKESVD QRGNQIMSDK RNVILFSVFD ENRSWYLTEN IQRFLPNPAG

601 VQLEDPEFQA SNIMHSINGY VFDSLQLSVC LHEVAYWYIL SIGAQTDFLS

651 VFFSGYTFKH KMVYEDTLTL FPFSGETVFM SMENPGLWIL GCHNSDFRNR

701 GMTALLKVSS CDKNTGDYYE DSYEDISAYL LSKNNAIEPR SFSQNGAPGT

751 SESATPESGP GSEPATSGSE TPGTSESATP ESGPGSEPAT SGSETPGTSE

801 SATPESGPGT STEPSEGSAP GSPAGSPTST EEGTSESATP ESGPGSEPAT

851 SGSETPGTSE SATPESGPGS PAGSPTSTEE GSPAGSPTST EEGTSTEPSE

901 GSAPGTSESA TPESGPGTSE SATPESGPGT SESATPESGP GSEPATSGSE

951 TPGSEPATSG SETPGSPAGS PTSTEEGTST EPSEGSAPGT STEPSEGSAP

1001 GSEPATSGSE TPGTSESATP ESGPGTSTEP SEGSAPASSP PVLKRHQREI

1051 TRTTLQSDQE EIDYDDTISV EMKKEDFDIY DEDENQSPRS FQKKTRHYFI

1101 AAVERLWDYG MSSSPHVLRN PAQSGSVPQF KKWFQEFTD GSFTQPLYRG

1151 ELNEHLGLLG PYIRAEVEDN IMVTFRNQAS RPYSFYSSLI SYEEDQRQGA

1201 EPRKNFVKPN ETKTYFWKVQ HHMAPTKDEF DCKAWAYFSD VDLEKDVHSG

1251 LIGPLLVCHT NTLNPAHGRQ VTVQEFALFF TIFDETKSWY FTENMERNCR

1301 APCNIQMEDP TFKENYRFHA INGYIMDTLP GLVMAQDQRI RWYLLSMGSN

1351 ENIHSIHFSG HVFTVRKKEE YKMALYNLYP GVFETVEMLP SKAGIWRVEC

1401 LIGEHLHAGM STLFLVYSNK CQTPLGMASG HIRDFQITAS GQYGQWAPKL

1451 ARLHYSGSIN AWSTKEPFSW IKVDLLAPMI IHGIKTQGAR QKFSSLYISQ

1501 FIIMYSLDGK KWQTYRGNST GTLMVFFGNV DSSGIKHNIF NPPIIARYIR

1551 LHPTHYSIRS TLRMELMGCD LNSCSMPLGM ESKAISDAQI TASSYFTNMF

1601 ATWSPSKARL HLQGRSNAWR PQVNNPKEWL QVDFQKTMKV TGVTTQGVKS

1651 LLTSMYVKEF LISSSQDGHQ WTLFFQNGKV KVFQGNQDSF TPWNSLDPP

1701 LLTRYLRIHP QSWVHQIALR MEVLGCEAQD LYDKTHTCPP CPAPELLGGP

1751 SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVWDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK

1801 TKPREEQYNS TYRWSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK

1851 AKGQPREPQV YTLPPSRDEL TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE

1901 NNYKTTPPVL DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ

1951 KSLSLSPGK

Secuencia proteínica de FVIII 196 (FVIIIFc de doble cadena con tres XTEN AE144 en el aminoácido 26,1656 y 1900) (SEQ ID NO: 74)

1 MQIELSTCFF LCLLRFCFSA TRRYYLGAVE LSWDYMQSDL GELPVGAPGS

51 SPSASTGTGP GSSPSASTGT GPGASPGTSS TGSPGASPGT SSTGSPGSST

101 PSGATGSPGS SPSASTGTGP GASPGTSSTG SPGSSPSAST GTGPGTPGSG

151 TASSSPGSST PSGATGSPGS STPSGATGSP GASPGTSSTG SPASSDARFP

201 PRVPKSFPFN TSWYKKTLF VEFTDHLFNI AKPRPPWMGL LGPTIQAEVY

251 DTWITLKNM ASHPVSLHAV GVSYWKASEG AEYDDQTSQR EKEDDKVFPG

301 GSHTYVWQVL KENGPMASDP LCLTYSYLSH VDLVKDLNSG LIGALLVCRE

351 GSLAKEKTQT LHKFILLFAV FDEGKSWHSE TKNSLMQDRD AASARAWPKM

401 HTVNGYVNRS LPGLIGCHRK SVYWHVIGMG TTPEVHSIFL EGHTFLVRNH

451 RQASLEISPI TFLTAQTLLM DLGQFLLFCH ISSHQHDGME AYVKVDSCPE

501 EPQLRMKNNE EAEDYDDDLT DSEMDWRFD DDNSPSFIQI RSVAKKHPKT

551 WVHYIAAEEE DWDYAPLVLA PDDRSYKSQY LNNGPQRIGR KYKKVRFMAY

601 TDETFKTREA IQHESGILGP LLYGEVGDTL LIIFKNQASR PYNIYPHGIT

651 DVRPLYSRRL PKGVKHLKDF PILPGEIFKY KWTVTVEDGP TKSDPRCLTR

701 YYSSFVNMER DLASGLIGPL LICYKESVDQ RGNQIMSDKR NVILFSVFDE

751 NRSWYLTENI QRFLPNPAGV QLEDPEFQAS NIMHSINGYV FDSLQLSVCL

801 HEVAYWYILS IGAQTDFLSV FFSGYTFKHK MVYEDTLTLF PFSGETVFMS

851 MENPGLWILG CHNSDFRNRG MTALLKVSSC DKNTGDYYED SYEDISAYLL

901 SKNNAIEPRS FSQNPPVLKR HQREITRTTL QGAPGTPGSG TASSSPGASP

951 GTSSTGSPGA SPGTSSTGSP GASPGTSSTG SPGSSPSAST GTGPGTPGSG

1001 TASSSPGASP GTSSTGSPGA SPGTSSTGSP GASPGTSSTG SPGSSTPSGA

1051 TGSPGSSTPS GATGSPGASP GTSSTGSPAS SSDQEEIDYD DTISVEMKKE

1101 DFDIYDEDEN QSPRSFQKKT RHYFIAAVER LWDYGMSSSP HVLRNRAQSG

1151 SVPQFKKWF QEFTDGSFTQ PLYRGELNEH LGLLGPYIRA EVEDNIMVTF

1201 RNQASRPYSF YSSLISYEED QRQGAEPRKN FVKPNETKTY FWKVQHHMAP

1251 TKDEFDCKAW AYFSDVDLEK DVHSGLIGPL LVCHTNTLNP AHGRQVTVQE

1301 FALFFTIFDE TKSWYFTENM ERNCRGAPTS ESATPESGPG SEPATSGSET

1351 PGTSESATPE SGPGSEPATS GSETPGTSES ATPESGPGTS TEPSEGSAPG

1401 TSESATPESG PGSPAGSPTS TEEGSPAGSP TSTEEGSPAG SPTSTEEGTS

1451 ESATPESGPG TSTEPSEGSA PGASSAPCNI QMEDPTFKEN YRFHAINGYI

1501 MDTLPGLVMA QDQRIRWYLL SMGSNENIHS IHFSGHVFTV RKKEEYKMAL

1551 YNLYPGVFET VEMLPSKAGI WRVECLIGEH LHAGMSTLFL VYSNKCQTPL

1601 GMASGHIRDF QITASGQYGQ WAPKLARLHY SGSINAWSTK EPFSWIKVDL

1651 LAPMIIHGIK TQGARQKFSS LYISQFIIMY SLDGKKWQTY RGNSTGTLMV

1701 FFGNVDSSGI KHNIFNPPII ARYIRLHPTH YSIRSTLRME LMGCDLNSCS

1751 MPLGMESKAI SDAQITASSY FTNMFATWSP SKARLHLQGR SNAWRPQVNN

1801 PKEWLQVDFQ KTMKVTGVTT QGVKSLLTSM YVKEFLISSS QDGHQWTLFF

1851 QNGKVKVFQG NQDSFTPWN SLDPPLLTRY LRIHPQSWVH QIALRMEVLG

1901 CEAQDLYDKT HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCW

1951 VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRW SVLTVLHQDW

2001 LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SRDELTKNQV

2051 SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD

2101 KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK*

Secuencia proteínica de FVIII 199 (FVIIIFc de cadena sencilla con tres XTEN AE144 en el aminoácido 1656 y 1900) (SEQ ID NO: 75)

i MQIELSTCFF LCLLRFCFSA TRRYYLGAVE LSWDYMQSDL GELPVDARFP

51 PRVPKSFPFN TSWYKKTLF VEFTDHLFNI AKPRPPWMGL LGPTIQAEVY

101 DTWITLKNM ASHPVSLHAV GVSYWKASEG AEYDDQTSQR EKEDDKVFPG

151 GSHTYVWQVL KENGPMASDP LCLTYSYLSH VDLVKDLNSG LIGALLVCRE

201 GSLAKEKTQT LHKFILLFAV FDEGKSWHSE TKNSLMQDRD AASARAWPKM

251 HTVNGYVNRS LPGLIGCHRK SVYWHVIGMG TTPEVHSIFL EGHTFLVRNH

301 RQASLEISPI TFLTAQTLLM DLGQFLLFCH ISSHQHDGME AYVKVDSCPE

351 EPQLRMKNNE EAEDYDDDLT DSEMDWRFD DDNSPSFIQI RSVAKKHPKT

401 WVHYIAAEEE DWDYAPLVLA PDDRSYKSQY LNNGPQRIGR KYKKVRFMAY

451 TDETFKTREA IQHESGILGP LLYGEVGDTL LIIFKNQASR PYNIYPHGIT

501 DVRPLYSRRL PKGVKHLKDF PILPGEIFKY KWTVTVEDGP TKSDPRCLTR

551 YYSSFVNMER DLASGLIGPL LICYKESVDQ RGNQIMSDKR NVILFSVFDE

601 NRSWYLTENI QRFLPNPAGV QLEDPEFQAS NIMHSINGYV FDSLQLSVCL

651 HEVAYWYILS IGAQTDFLSV FFSGYTFKHK MVYEDTLTLF PFSGETVFMS

701 MENPGLWILG CHNSDFRNRG MTALLKVSSC DKNTGDYYED SYEDISAYLL

751 SKNNAIEPRS FSQNPPVLKR HQAEITRTTL QGAPGTPGSG TASSSPGASP

801 GTSSTGSPGA SPGTSSTGSP GASPGTSSTG SPGSSPSAST GTGPGTPGSG

851 TASSSPGASP GTSSTGSPGA SPGTSSTGSP GASPGTSSTG SPGSSTPSGA

901 TGSPGSSTPS GATGSPGASP GTSSTGSPAS SSDQEEIDYD DTISVEMKKE

951 DFDIYDEDEN QSPRSFQKKT RHYFIAAVER LWDYGMSSSP HVLRNRAQSG

1001 SVPQFKKWF QEFTDGSFTQ PLYRGELNEH LGLLGPYIRA EVEDNIMVTF

1051 RNQASRPYSF YSSLISYEED QRQGAEPRKN FVKPNETKTY FWKVQHHMAP

1101 TKDEFDCKAW AYFSDVDLEK DVHSGLIGPL LVCHTNTLNP AHGRQVTVQE

1151 FALFFTIFDE TKSWYFTENM ERNCRGAPTS ESATPESGPG SEPATSGSET

1201 PGTSESATPE SGPGSEPATS GSETPGTSES ATPESGPGTS TEPSEGSAPG

1251 TSESATPESG PGSPAGSPTS TEEGSPAGSP TSTEEGSPAG SPTSTEEGTS

1301 ESATPESGPG TSTEPSEGSA PGASSAPCNI QMEDPTFKEN YRFHAINGYI

1351 MDTLPGLVMA QDQRIRWYLL SMGSNENIHS IHFSGHVFTV RKKEEYKMAL

1401 YNLYPGVFET VEMLPSKAGI WRVECLIGEH LHAGMSTLFL VYSNKCQTPL

1451 GMASGHIRDF QITASGQYGQ WAPKLARLHY SGSINAWSTK EPFSWIKVDL

1501 LAPMIIHGIK TQGARQKFSS LYISQFIIMY SLDGKKWQTY RGNSTGTLMV

1551 FFGNVDSSGI KHNIFNPPII ARYIRLHPTH YSIRSTLRME LMGCDLNSCS

1601 MPLGMESKAI SDAQITASSY FTNMFATWSP SKARLHLQGR SNAWRPQVNN

1651 PKEWLQVDFQ KTMKVTGVTT QGVKSLLTSM YVKEFLISSS QDGHQWTLFF

1701 QNGKVKVFQG NQDSFTPWN SLDPPLLTRY LRIHPQSWVH QIALRMEVLG

1751 CEAQDLYDKT HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCW

1801 VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRW SVLTVLHQDW

1851 LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SRDELTKNQV

1901 SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD

1951 KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK*

Secuencia proteínica de FVIII 201 (FVIIIFc de cadena sencilla con tres XTEN AE144 en el aminoácido 26,1656 y 1900) (SEQ ID NO: 76)

l MQIELSTCFF LCLLRFCFSA TRRYYLGAVE LSWDYMQSDL GELPVGAPGS

51 SPSASTGTGP GSSPSASTGT GPGASPGTSS TGSPGASPGT SSTGSPGSST

101 PSGATGSPGS SPSASTGTGP GASPGTSSTG SPGSSPSAST GTGPGTPGSG

151 TASSSPGSST PSGATGSPGS STPSGATGSP GASPGTSSTG SPASSDARFP

201 PRVPKSFPFN TSWYKKTLF VEFTDHLFNI AKPRPPWMGL LGPTIQAEVY

251 DTWITLKNM ASHPVSLHAV GVSYWKASEG AEYDDQTSQR EKEDDKVFPG

301 GSHTYVWQVL KENGPMASDP LCLTYSYLSH VDLVKDLNSG LIGALLVCRE

351 GSLAKEKTQT LHKFILLFAV FDEGKSWHSE TKNSLMQDRD AASARAWPKM

401 HTVNGYVNRS LPGLIGCHRK SVYWHVIGMG TTPEVHSIFL EGHTFLVRNH

451 RQASLEISPI TFLTAQTLLM DLGQFLLFCH ISSHQHDGME AYVKVDSCPE

501 EPQLRMKNNE EAEDYDDDLT DSEMDWRFD DDNSPSFIQI RSVAKKHPKT

551 WVHYIAAEEE DWDYAPLVLA PDDRSYKSQY LNNGPQRIGR KYKKVRFMAY

601 TDETFKTREA IQHESGILGP LLYGEVGDTL LIIFKNQASR PYNIYPHGIT

651 DVRPLYSRRL PKGVKHLKDF PILPGEIFKY KWTVTVEDGP TKSDPRCLTR

701 YYSSFVNMER DLASGLIGPL LICYKESVDQ RGNQIMSDKR NVILFSVFDE

751 NRSWYLTENI QRFLPNPAGV QLEDPEFQAS NIMHSINGYV FDSLQLSVCL

801 HEVAYWYILS IGAQTDFLSV FFSGYTFKHK MVYEDTLTLF PFSGETVFMS

851 MENPGLWILG CHNSDFRNRG MTALLKVSSC DKNTGDYYED SYEDISAYLL

901 SKNNAIEPRS FSQNPPVLKR HQAEITRTTL QGAPGTPGSG TASSSPGASP

951 GTSSTGSPGA SPGTSSTGSP GASPGTSSTG SPGSSPSAST GTGPGTPGSG

1001 TASSSPGASP GTSSTGSPGA SPGTSSTGSP GASPGTSSTG SPGSSTPSGA

1051 TGSPGSSTPS GATGSPGASP GTSSTGSPAS SSDQEEIDYD DTISVEMKKE

1101 DFDIYDEDEN QSPRSFQKKT RHYFIAAVER LWDYGMSSSP HVLRNRAQSG

1151 SVPQFKKWF QEFTDGSFTQ PLYRGELNEH LGLLGPYIRA EVEDNIMVTF

1201 RNQASRPYSF YSSLISYEED QRQGAEPRKN FVKPNETKTY FWKVQHHMAP

1251 TKDEFDCKAW AYFSDVDLEK DVHSGLIGPL LVCHTNTLNP AHGRQVTVQE

1301 FALFFTIFDE TKSWYFTENM ERNCRGAPTS ESATPESGPG SEPATSGSET

1351 PGTSESATPE SGPGSEPATS GSETPGTSES ATPESGPGTS TEPSEGSAPG

1401 TSESATPESG PGSPAGSPTS TEEGSPAGSP TSTEEGSPAG SPTSTEEGTS

1451 ESATPESGPG TSTEPSEGSA PGASSAPCNI QMEDPTFKEN YRFHAINGYI

1501 MDTLPGLVMA QDQRIRWYLL SMGSNENIHS IHFSGHVFTV RKKEEYKMAL

1551 YNLYPGVFET VEMLPSKAGI WRVECLIGEH LHAGMSTLFL VYSNKCQTPL

1601 GMASGHIRDF QITASGQYGQ WAPKLARLHY SGSINAWSTK EPFSWIKVDL

1651 LAPMIIHGIK TQGARQKFSS LYISQFIIMY SLDGKKWQTY RGNSTGTLMV

1701 FFGNVDSSGI KHNIFNPPII ARYIRLHPTH YSIRSTLRME LMGCDLNSCS

1751 MPLGMESKAI SDAQITASSY FTNMFATWSP SKARLHLQGR SNAWRPQVNN

1801 PKEWLQVDFQ KTMKVTGVTT QGVKSLLTSM YVKEFLISSS QDGHQWTLFF

1851 QNGKVKVFQG NQDSFTPWN SLDPPLLTRY LRIHPQSWVH QIALRMEVLG

1901 CEAQDLYDKT HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCW

1951 VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRW SVLTVLHQDW

2001 LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SRDELTKNQV

2051 SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD

2101 KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK*

Secuencia proteínica de FVIII 203 (FVIIIFc de cadena sencilla con dos XTEN AE; un XTEN AE288 en dominio B y un XTEN AE144 en el aminoácido 1900) (SEQ ID NO: 77)

i MQIELSTCFF LCLLRFCFSA TRRYYLGAVE LSWDYMQSDL GELPVDARFP

51 PRVPKSFPFN TSWYKKTLF VEFTDHLFNI AKPRPPWMGL LGPTIQAEVY

101 DTWITLKNM ASHPVSLHAV GVSYWKASEG AEYDDQTSQR EKEDDKVFPG

151 GSHTYVWQVL KENGPMASDP LCLTYSYLSH VDLVKDLNSG LIGALLVCRE

201 GSLAKEKTQT LHKFILLFAV FDEGKSWHSE TKNSLMQDRD AASARAWPKM

251 HTVNGYVNRS LPGLIGCHRK SVYWHVIGMG TTPEVHSIFL EGHTFLVRNH

301 RQASLEISPI TFLTAQTLLM DLGQFLLFCH ISSHQHDGME AYVKVDSCPE

351 EPQLRMKNNE EAEDYDDDLT DSEMDWRFD DDNSPSFIQI RSVAKKHPKT

401 WVHYIAAEEE DWDYAPLVLA PDDRSYKSQY LNNGPQRIGR KYKKVRFMAY

451 TDETFKTREA IQHESGILGP LLYGEVGDTL LIIFKNQASR PYNIYPHGIT

501 DVRPLYSRRL PKGVKHLKDF PILPGEIFKY KWTVTVEDGP TKSDPRCLTR

551 YYSSFVNMER DLASGLIGPL LICYKESVDQ RGNQIMSDKR NVILFSVFDE

601 NRSWYLTENI QRFLPNPAGV QLEDPEFQAS NIMHSINGYV FDSLQLSVCL

651 HEVAYWYILS IGAQTDFLSV FFSGYTFKHK MVYEDTLTLF PFSGETVFMS

701 MENPGLWILG CHNSDFRNRG MTALLKVSSC DKNTGDYYED SYEDISAYLL

751 SKNNAIEPRS FSQNGAPGTS ESATPESGPG SEPATSGSET PGTSESATPE

801 SGPGSEPATS GSETPGTSES ATPESGPGTS TEPSEGSAPG SPAGSPTSTE

851 EGTSESATPE SGPGSEPATS GSETPGTSES ATPESGPGSP AGSPTSTEEG

901 SPAGSPTSTE EGTSTEPSEG SAPGTSESAT PESGPGTSES ATPESGPGTS

951 ESATPESGPG SEPATSGSET PGSEPATSGS ETPGSPAGSP TSTEEGTSTE

1001 PSEGSAPGTS TEPSEGSAPG SEPATSGSET PGTSESATPE SGPGTSTEPS

1051 EGSAPASSPP VLKRHQAEIT RTTLQSDQEE IDYDDTISVE MKKEDFDIYD

1101 EDENQSPRSF QKKTRHYFIA AVERLWDYGM SSSPHVLRNR AQSGSVPQFK

1151 KWFQEFTDG SFTQPLYRGE LNEHLGLLGP YIRAEVEDNI MVTFRNQASR

1201 PYSFYSSLIS YEEDQRQGAE PRKNFVKPNE TKTYFWKVQH HMAPTKDEFD

1251 CKAWAYFSDV DLEKDVHSGL IGPLLVCHTN TLNPAHGRQV TVQEFALFFT

1301 IFDETKSWYF TENMERNCRG APTSESATPE SGPGSEPATS GSETPGTSES

1351 ATPESGPGSE PATSGSETPG TSESATPESG PGTSTEPSEG SAPGTSESAT

1401 PESGPGSPAG SPTSTEEGSP AGSPTSTEEG SPAGSPTSTE EGTSESATPE

1451 SGPGTSTEPS EGSAPGASSA PCNIQMEDPT FKENYRFHAI NGYIMDTLPG

1501 LVMAQDQRIR WYLLSMGSNE NIHSIHFSGH VFTVRKKEEY KMALYNLYPG

1551 VFETVEMLPS KAGIWRVECL IGEHLHAGMS TLFLVYSNKC QTPLGMASGH

1601 IRDFQITASG QYGQWAPKLA RLHYSGSINA WSTKEPFSWI KVDLLAPMII

1651 HGIKTQGARQ KFSSLYISQF IIMYSLDGKK WQTYRGNSTG TLMVFFGNVD

1701 SSGIKHNIFN PPIIARYIRL HPTHYSIRST LRMELMGCDL NSCSMPLGME

1751 SKAISDAQIT ASSYFTNMFA TWSPSKARLH LQGRSNAWRP QVNNPKEWLQ

1801 VDFQKTMKVT GVTTQGVKSL LTSMYVKEFL ISSSQDGHQW TLFFQNGKVK

1851 VFQGNQDSFT PWNSLDPPL LTRYLRIHPQ SWVHQIALRM EVLGCEAQDL

1901 YDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVWDVSHE

1951 DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRWSVLTVL HQDWLNGKEY

2001 KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSRDELT KNQVSLTCLV

2051 KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ

2101 GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK*

Secuencia proteínica de FVIII 204 (FVIIIFc de cadena sencilla con dos XTEN AE; un XTEN AE288 en dominio B y un XTEN AE144 en el aminoácido 403) (SEQ ID NO: 78)

i MQIELSTCFF LCLLRFCFSA TRRYYLGAVE LSWDYMQSDL GELPVDARFP

51 PRVPKSFPFN TSWYKKTLF VEFTDHLFNI AKPRPPWMGL LGPTIQAEVY

101 DTWITLKNM ASHPVSLHAV GVSYWKASEG AEYDDQTSQR EKEDDKVFPG

151 GSHTYVWQVL KENGPMASDP LCLTYSYLSH VDLVKDLNSG LIGALLVCRE

201 GSLAKEKTQT LHKFILLFAV FDEGKSWHSE TKNSLMQDRD AASARAWPKM

251 HTVNGYVNRS LPGLIGCHRK SVYWHVIGMG TTPEVHSIFL EGHTFLVRNH

301 RQASLEISPI TFLTAQTLLM DLGQFLLFCH ISSHQHDGME AYVKVDSCPE

351 EPQLRMKNNE EAEDYDDDLT DSEMDWRFD DDNSPSFIQI RSVAKKHPKT

401 WVHYIAAEEE DWDYAPLVLA PDGAPTSTEP SEGSAPGSPA GSPTSTEEGT

451 STEPSEGSAP GTSTEPSEGS APGTSESATP ESGPGTSTEP SEGSAPGTSE

501 SATPESGPGS EPATSGSETP GTSTEPSEGS APGTSTEPSE GSAPGTSESA

551 TPESGPGTSE SATPESGPGA SSDRSYKSQY LNNGPQRIGR KYKKVRFMAY

601 TDETFKTREA IQHESGILGP LLYGEVGDTL LIIFKNQASR PYNIYPHGIT

651 DVRPLYSRRL PKGVKHLKDF PILPGEIFKY KWTVTVEDGP TKSDPRCLTR

701 YYSSFVNMER DLASGLIGPL LICYKESVDQ RGNQIMSDKR NVILFSVFDE

751 NRSWYLTENI QRFLPNPAGV QLEDPEFQAS NIMHSINGYV FDSLQLSVCL

801 HEVAYWYILS IGAQTDFLSV FFSGYTFKHK MVYEDTLTLF PFSGETVFMS

851 MENPGLWILG CHNSDFRNRG MTALLKVSSC DKNTGDYYED SYEDISAYLL

901 SKNNAIEPRS FSQNGAPGTS ESATPESGPG SEPATSGSET PGTSESATPE

951 SGPGSEPATS GSETPGTSES ATPESGPGTS TEPSEGSAPG SPAGSPTSTE

1001 EGTSESATPE SGPGSEPATS GSETPGTSES ATPESGPGSP AGSPTSTEEG

1051 SPAGSPTSTE EGTSTEPSEG SAPGTSESAT PESGPGTSES ATPESGPGTS

1101 ESATPESGPG SEPATSGSET PGSEPATSGS ETPGSPAGSP TSTEEGTSTE

1151 PSEGSAPGTS TEPSEGSAPG SEPATSGSET PGTSESATPE SGPGTSTEPS

1201 EGSAPASSPP VLKRHQAEIT RTTLQSDQEE IDYDDTISVE MKKEDFDIYD

1251 EDENQSPRSF QKKTRHYFIA AVERLWDYGM SSSPHVLRNR AQSGSVPQFK

1301 KWFQEFTDG SFTQPLYRGE LNEHLGLLGP YIRAEVEDNI MVTFRNQASR

1351 PYSFYSSLIS YEEDQRQGAE PRKNFVKPNE TKTYFWKVQH HMAPTKDEFD

1401 CKAWAYFSDV DLEKDVHSGL IGPLLVCHTN TLNPAHGRQV TVQEFALFFT

1451 IFDETKSWYF TENMERNCRA PCNIQMEDPT FKENYRFHAI NGYIMDTLPG

1501 LVMAQDQRIR WYLLSMGSNE NIHSIHFSGH VFTVRKKEEY KMALYNLYPG

1551 VFETVEMLPS KAGIWRVECL IGEHLHAGMS TLFLVYSNKC QTPLGMASGH

1601 IRDFQITASG QYGQWAPKLA RLHYSGSINA WSTKEPFSWI KVDLLAPMII

1651 HGIKTQGARQ KFSSLYISQF IIMYSLDGKK WQTYRGNSTG TLMVFFGNVD

1701 SSGIKHNIFN PPIIARYIRL HPTHYSIRST LRMELMGCDL NSCSMPLGME

1751 SKAISDAQIT ASSYFTNMFA TWSPSKARLH LQGRSNAWRP QVNNPKEWLQ

1801 VDFQKTMKVT GVTTQGVKSL LTSMYVKEFL ISSSQDGHQW TLFFQNGKVK

1851 VFQGNQDSFT PWNSLDPPL LTRYLRIHPQ SWVHQIALRM EVLGCEAQDL

1901 YDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVWDVSHE

1951 DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRWSVLTVL HQDWLNGKEY

2001 KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSRDELT KNQVSLTCLV

2051 KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ

2101 GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK*

Secuencia proteínica de FVIII 205 (FVIIIFc de cadena sencilla con dos XTEN AE; un XTEN AE288 en dominio B y un XTEN AE144 en el aminoácido 18) (SEQ ID NO: 79)

1 MQIELSTCFF LCLLRFCFSA TRRYYLGAVE LSWDYMQGAP TSESATPESG

51 PGSEPATSGS ETPGTSESAT PESGPGSEPA TSGSETPGTS ESATPESGPG

101 TSTEPSEGSA PGSPAGSPTS TEEGTSESAT PESGPGSEPA TSGSETPGTS

151 ESATPESGPG SPAGSPTSTE EGSPAGSPTS TEEGASSSDL GELPVDARFP

201 PRVPKSFPFN TSWYKKTLF VEFTDHLFNI AKPRPPWMGL LGPTIQAEVY

251 DTWITLKNM ASHPVSLHAV GVSYWKASEG AEYDDQTSQR EKEDDKVFPG

301 GSHTYVWQVL KENGPMASDP LCLTYSYLSH VDLVKDLNSG LIGALLVCRE

351 GSLAKEKTQT LHKFILLFAV FDEGKSWHSE TKNSLMQDRD AASARAWPKM

401 HTVNGYVNRS LPGLIGCHRK SVYWHVIGMG TTPEVHSIFL EGHTFLVRNH

451 RQASLEISPI TFLTAQTLLM DLGQFLLFCH ISSHQHDGME AYVKVDSCPE

501 EPQLRMKNNE EAEDYDDDLT DSEMDWRFD DDNSPSFIQI RSVAKKHPKT

551 WVHYIAAEEE DWDYAPLVLA PDDRSYKSQY LNNGPQRIGR KYKKVRFMAY

601 TDETFKTREA IQHESGILGP LLYGEVGDTL LIIFKNQASR PYNIYPHGIT

651 DVRPLYSRRL PKGVKHLKDF PILPGEIFKY KWTVTVEDGP TKSDPRCLTR

701 YYSSFVNMER DLASGLIGPL LICYKESVDQ RGNQIMSDKR NVILFSVFDE

751 NRSWYLTENI QRFLPNPAGV QLEDPEFQAS NIMHSINGYV FDSLQLSVCL

801 HEVAYWYILS IGAQTDFLSV FFSGYTFKHK MVYEDTLTLF PFSGETVFMS

851 MENPGLWILG CHNSDFRNRG MTALLKVSSC DKNTGDYYED SYEDISAYLL

901 SKNNAIEPRS FSQNGAPGTS ESATPESGPG SEPATSGSET PGTSESATPE

951 SGPGSEPATS GSETPGTSES ATPESGPGTS TEPSEGSAPG SPAGSPTSTE

1001 EGTSESATPE SGPGSEPATS GSETPGTSES ATPESGPGSP AGSPTSTEEG

1051 SPAGSPTSTE EGTSTEPSEG SAPGTSESAT PESGPGTSES ATPESGPGTS

1101 ESATPESGPG SEPATSGSET PGSEPATSGS ETPGSPAGSP TSTEEGTSTE

1151 PSEGSAPGTS TEPSEGSAPG SEPATSGSET PGTSESATPE SGPGTSTEPS

1201 EGSAPASSPP VLKRHQAEIT RTTLQSDQEE IDYDDTISVE MKKEDFDIYD

1251 EDENQSPRSF QKKTRHYFIA AVERLWDYGM SSSPHVLRNR AQSGSVPQFK

1301 KWFQEFTDG SFTQPLYRGE LNEHLGLLGP YIRAEVEDNI MVTFRNQASR

1351 PYSFYSSLIS YEEDQRQGAE PRKNFVKPNE TKTYFWKVQH HMAPTKDEFD

1401 CKAWAYFSDV DLEKDVHSGL IGPLLVCHTN TLNPAHGRQV TVQEFALFFT

1451 IFDETKSWYF TENMERNCRA PCNIQMEDPT FKENYRFHAI NGYIMDTLPG

1501 LVMAQDQRIR WYLLSMGSNE NIHSIHFSGH VFTVRKKEEY KMALYNLYPG

1551 VFETVEMLPS KAGIWRVECL IGEHLHAGMS TLFLVYSNKC QTPLGMASGH

1601 IRDFQITASG QYGQWAPKLA RLHYSGSINA WSTKEPFSWI KVDLLAPMII

1651 HGIKTQGARQ KFSSLYISQF IIMYSLDGKK WQTYRGNSTG TLMVFFGNVD

1701 SSGIKHNIFN PPIIARYIRL HPTHYSIRST LRMELMGCDL NSCSMPLGME

1751 SKAISDAQIT ASSYFTNMFA TWSPSKARLH LQGRSNAWRP QVNNPKEWLQ

1801 VDFQKTMKVT GVTTQGVKSL LTSMYVKEFL ISSSQDGHQW TLFFQNGKVK

1851 VFQGNQDSFT PWNSLDPPL LTRYLRIHPQ SWVHQIALRM EVLGCEAQDL

1901 YDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVWDVSHE

1951 DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRWSVLTVL HQDWLNGKEY

2001 KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSRDELT KNQVSLTCLV

2051 KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ

2101 GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK*

Secuencia proteínica de pSYN FVIII 266 (FVIII Fc con XTEN AE42 en el aminoácido 18 y XTEN AE288 en dominio B) SEQ ID NO: 80)

i MQIELSTCFF LCLLRFCFSA TRRYYLGAVE LSWDYMQGAP GSPAGSPTST

51 EEGTSESATP ESGPGSEPAT SGSETPASSS DLGELPVDAR FPPRVPKSFP

101 FNTSWYKKT LFVEFTDHLF NIAKPRPPWM GLLGPTIQAE VYDTWITLK

151 NMASHPVSLH AVGVSYWKAS EGAEYDDQTS QREKEDDKVF PGGSHTYVWQ

201 VLKENGPMAS DPLCLTYSYL SHVDLVKDLN SGLIGALLVC REGSLAKEKT

251 QTLHKFILLF AVFDEGKSWH SETKNSLMQD RDAASARAWP KMHTVNGYVN

301 RSLPGLIGCH RKSVYWHVIG MGTTPEVHSI FLEGHTFLVR NHRQASLEIS

351 PITFLTAQTL LMDLGQFLLF CHISSHQHDG MEAYVKVDSC PEEPQLRMKN

401 NEEAEDYDDD LTDSEMDWR FDDDNSPSFI QIRSVAKKHP KTWVHYIAAE

451 EEDWDYAPLV LAPDDRSYKS QYLNNGPQRI GRKYKKVRFM AYTDETFKTR

501 EAIQHESGIL GPLLYGEVGD TLLIIFKNQA SRPYNIYPHG ITDVRPLYSR

551 RLPKGVKHLK DFPILPGEIF KYKWTVTVED GPTKSDPRCL TRYYSSFVNM

601 ERDLASGLIG PLLICYKESV DQRGNQIMSD KRNVILFSVF DENRSWYLTE

651 NIQRFLPNPA GVQLEDPEFQ ASNIMHSING YVFDSLQLSV CLHEVAYWYI

701 LSIGAQTDFL SVFFSGYTFK HKMVYEDTLT LFPFSGETVF MSMENPGLWI

751 LGCHNSDFRN RGMTALLKVS SCDKNTGDYY EDSYEDISAY LLSKNNAIEP

801 RSFSQNGAPG TSESATPESG PGSEPATSGS ETPGTSESAT PESGPGSEPA

851 TSGSETPGTS ESATPESGPG TSTEPSEGSA PGSPAGSPTS TEEGTSESAT

901 PESGPGSEPA TSGSETPGTS ESATPESGPG SPAGSPTSTE EGSPAGSPTS

951 TEEGTSTEPS EGSAPGTSES ATPESGPGTS ESATPESGPG TSESATPESG

1001 PGSEPATSGS ETPGSEPATS GSETPGSPAG SPTSTEEGTS TEPSEGSAPG

1051 TSTEPSEGSA PGSEPATSGS ETPGTSESAT PESGPGTSTE PSEGSAPASS

1101 PPVLKRHQAE ITRTTLQSDQ EEIDYDDTIS VEMKKEDFDI YDEDENQSPR

1151 SFQKKTRHYF IAAVERLWDY GMSSSPHVLR NRAQSGSVPQ FKKWFQEFT

1201 DGSFTQPLYR GELNEHLGLL GPYIRAEVED NIMVTFRNQA SRPYSFYSSL

1251 ISYEEDQRQG AEPRKNFVKP NETKTYFWKV QHHMAPTKDE FDCKAWAYFS

1301 DVDLEKDVHS GLIGPLLVCH TNTLNPAHGR QVTVQEFALF FTIFDETKSW

1351 YFTENMERNC RAPCNIQMED PTFKENYRFH AINGYIMDTL PGLVMAQDQR

1401 IRWYLLSMGS NENIHSIHFS GHVFTVRKKE EYKMALYNLY PGVFETVEML

1451 PSKAGIWRVE CLIGEHLHAG MSTLFLVYSN KCQTPLGMAS GHIRDFQITA

1501 SGQYGQWAPK LARLHYSGSI NAWSTKEPFS WIKVDLLAPM IIHGIKTQGA

1551 RQKFSSLYIS QFIIMYSLDG KKWQTYRGNS TGTLMVFFGN VDSSGIKHNI

1601 FNPPIIARYI RLHPTHYSIR STLRMELMGC DLNSCSMPLG MESKAISDAQ

1651 ITASSYFTNM FATWSPSKAR LHLQGRSNAW RPQVNNPKEW LQVDFQKTMK

1701 VTGVTTQGVK SLLTSMYVKE FLISSSQDGH QWTLFFQNGK VKVFQGNQDS

1751 FTPWNSLDP PLLTRYLRIH PQSWVHQIAL RMEVLGCEAQ DLYDKTHTCP

1801 PCPAPELLGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVWDVS HEDPEVKFNW

1851 YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRWSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA

1901 LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSRDE LTKNQVSLTC LVKGFYPSDI

1951 AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV

2001 MHEALHNHYT QKSLSLSPGK

Secuencia proteínica de pSYN FVIII 267 (FVIII Fc con XTEN AE72 en el aminoácido 18 y XTEN AE288 en dominio B) SEQ ID NO: 81)

l MQIELSTCFF LCLLRFCFSA TRRYYLGAVE LSWDYMQGAP TSESATPESG

51 PGSEPATSGS ETPGTSESAT PESGPGSEPA TSGSETPGTS ESATPESGPG

101 TSTEPSEGSA PGASSSDLGE LPVDARFPPR VPKSFPFNTS WYKKTLFVE

151 FTDHLFNIAK PRPPWMGLLG PTIQAEVYDT WITLKNMAS HPVSLHAVGV

201 SYWKASEGAE YDDQTSQREK EDDKVFPGGS HTYVWQVLKE NGPMASDPLC

251 LTYSYLSHVD LVKDLNSGLI GALLVCREGS LAKEKTQTLH KFILLFAVFD

301 EGKSWHSETK NSLMQDRDAA SARAWPKMHT VNGYVNRSLP GLIGCHRKSV

351 YWHVIGMGTT PEVHSIFLEG HTFLVRNHRQ ASLEISPITF LTAQTLLMDL

401 GQFLLFCHIS SHQHDGMEAY VKVDSCPEEP QLRMKNNEEA EDYDDDLTDS

451 EMDWRFDDD NSPSFIQIRS VAKKHPKTWV HYIAAEEEDW DYAPLVLAPD

501 DRSYKSQYLN NGPQRIGRKY KKVRFMAYTD ETFKTREAIQ HESGILGPLL

551 YGEVGDTLLI IFKNQASRPY NIYPHGITDV RPLYSRRLPK GVKHLKDFPI

601 LPGEIFKYKW TVTVEDGPTK SDPRCLTRYY SSFVNMERDL ASGLIGPLLI

651 CYKESVDQRG NQIMSDKRNV ILFSVFDENR SWYLTENIQR FLPNPAGVQL

701 EDPEFQASNI MHSINGYVFD SLQLSVCLHE VAYWYILSIG AQTDFLSVFF

751 SGYTFKHKMV YEDTLTLFPF SGETVFMSME NPGLWILGCH NSDFRNRGMT

801 ALLKVSSCDK NTGDYYEDSY EDISAYLLSK NNAIEPRSFS QNGAPGTSES

851 ATPESGPGSE PATSGSETPG TSESATPESG PGSEPATSGS ETPGTSESAT

901 PESGPGTSTE PSEGSAPGSP AGSPTSTEEG TSESATPESG PGSEPATSGS

951 ETPGTSESAT PESGPGSPAG SPTSTEEGSP AGSPTSTEEG TSTEPSEGSA

1001 PGTSESATPE SGPGTSESAT PESGPGTSES ATPESGPGSE PATSGSETPG

1051 SEPATSGSET PGSPAGSPTS TEEGTSTEPS EGSAPGTSTE PSEGSAPGSE

1101 PATSGSETPG TSESATPESG PGTSTEPSEG SAPASSPPVL KRHQAEITRT

1151 TLQSDQEEID YDDTISVEMK KEDFDIYDED ENQSPRSFQK KTRHYFIAAV

1201 ERLWDYGMSS SPHVLRNRAQ SGSVPQFKKV VFQEFTDGSF TQPLYRGELN

1251 EHLGLLGPYI RAEVEDNIMV TFRNQASRPY SFYSSLISYE EDQRQGAEPR

1301 KNFVKPNETK TYFWKVQHHM APTKDEFDCK AWAYFSDVDL EKDVHSGLIG

1351 PLLVCHTNTL NPAHGRQVTV QEFALFFTIF DETKSWYFTE NMERNCRAPC

1401 NIQMEDPTFK ENYRFHAING YIMDTLPGLV MAQDQRIRWY LLSMGSNENI

1451 HSIHFSGHVF TVRKKEEYKM ALYNLYPGVF ETVEMLPSKA GIWRVECLIG

1501 EHLHAGMSTL FLVYSNKCQT PLGMASGHIR DFQITASGQY GQWAPKLARL

1551 HYSGSINAWS TKEPFSWIKV DLLAPMIIHG IKTQGARQKF SSLYISQFII

1601 MYSLDGKKWQ TYRGNSTGTL MVFFGNVDSS GIKHNIFNPP IIARYIRLHP

1651 THYSIRSTLR MELMGCDLNS CSMPLGMESK AISDAQITAS SYFTNMFATW

1701 SPSKARLHLQ GRSNAWRPQV NNPKEWLQVD FQKTMKVTGV TTQGVKSLLT

1751 SMYVKEFLIS SSQDGHQWTL FFQNGKVKVF QGNQDSFTPV VNSLDPPLLT

1801 RYLRIHPQSW VHQIALRMEV LGCEAQDLYD KTHTCPPCPA PELLGGPSVF

1851 LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VWDVSHEDP EVKFNWYVDG VEVHNAKTKP

1901 REEQYNSTYR WSVLTVLHQ DWLNGKEYKC KVSNKALPAP IEKTISKAKG

1951 QPREPQVYTL PPSRDELTKN QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY

2001 KTTPPVLDSD GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL

2051 SLSPGK*

Secuencia proteínica de pSYN FVIII 268 (FVIII Fc con XTEN AE144 en el aminoácido 18) SEQ ID NO: 82)

i MQIELSTCFF LCLLRFCFSA TRRYYLGAVE LSWDYMQGAP TSESATPESG

51 PGSEPATSGS ETPGTSESAT PESGPGSEPA TSGSETPGTS ESATPESGPG

101 TSTEPSEGSA PGSPAGSPTS TEEGTSESAT PESGPGSEPA TSGSETPGTS

151 ESATPESGPG SPAGSPTSTE EGSPAGSPTS TEEGASSSDL GELPVDARFP

201 PRVPKSFPFN TSWYKKTLF VEFTDHLFNI AKPRPPWMGL LGPTIQAEVY

251 DTWITLKNM ASHPVSLHAV GVSYWKASEG AEYDDQTSQR EKEDDKVFPG

301 GSHTYVWQVL KENGPMASDP LCLTYSYLSH VDLVKDLNSG LIGALLVCRE

351 GSLAKEKTQT LHKFILLFAV FDEGKSWHSE TKNSLMQDRD AASARAWPKM

401 HTVNGYVNRS LPGLIGCHRK SVYWHVIGMG TTPEVHSIFL EGHTFLVRNH

451 RQASLEISPI TFLTAQTLLM DLGQFLLFCH ISSHQHDGME AYVKVDSCPE

501 EPQLRMKNNE EAEDYDDDLT DSEMDWRFD DDNSPSFIQI RSVAKKHPKT

551 WVHYIAAEEE DWDYAPLVLA PDDRSYKSQY LNNGPQRIGR KYKKVRFMAY

601 TDETFKTREA IQHESGILGP LLYGEVGDTL LIIFKNQASR PYNIYPHGIT

651 DVRPLYSRRL PKGVKHLKDF PILPGEIFKY KWTVTVEDGP TKSDPRCLTR

701 YYSSFVNMER DLASGLIGPL LICYKESVDQ RGNQIMSDKR NVILFSVFDE

751 NRSWYLTENI QRFLPNPAGV QLEDPEFQAS NIMHSINGYV FDSLQLSVCL

801 HEVAYWYILS IGAQTDFLSV FFSGYTFKHK MVYEDTLTLF PFSGETVFMS

851 MENPGLWILG CHNSDFRNRG MTALLKVSSC DKNTGDYYED SYEDISAYLL

901 SKNNAIEPRS FSQNPPVLKR HQAEITRTTL QSDQEEIDYD DTISVEMKKE

951 DFDIYDEDEN QSPRSFQKKT RHYFIAAVER LWDYGMSSSP HVLRNRAQSG

1001 SVPQFKKWF QEFTDGSFTQ PLYRGELNEH LGLLGPYIRA EVEDNIMVTF

1051 RNQASRPYSF YSSLISYEED QRQGAEPRKN FVKPNETKTY FWKVQHHMAP

1101 TKDEFDCKAW AYFSDVDLEK DVHSGLIGPL LVCHTNTLNP AHGRQVTVQE

1151 FALFFTIFDE TKSWYFTENM ERNCRAPCNI QMEDPTFKEN YRFHAINGYI

1201 MDTLPGLVMA QDQRIRWYLL SMGSNENIHS IHFSGHVFTV RKKEEYKMAL

1251 YNLYPGVFET VEMLPSKAGI WRVECLIGEH LHAGMSTLFL VYSNKCQTPL

1301 GMASGHIRDF QITASGQYGQ WAPKLARLHY SGSINAWSTK EPFSWIKVDL

1351 LAPMIIHGIK TQGARQKFSS LYISQFIIMY SLDGKKWQTY RGNSTGTLMV

1401 FFGNVDSSGI KHNIFNPPII ARYIRLHPTH YSIRSTLRME LMGCDLNSCS

1451 MPLGMESKAI SDAQITASSY FTNMFATWSP SKARLHLQGR SNAWRPQVNN

1501 PKEWLQVDFQ KTMKVTGVTT QGVKSLLTSM YVKEFLISSS QDGHQWTLFF

1551 QNGKVKVFQG NQDSFTPWN SLDPPLLTRY LRIHPQSWVH QIALRMEVLG

1601 CEAQDLYDKT HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCW

1651 VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRW SVLTVLHQDW

1701 LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SRDELTKNQV

1751 SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD

1801 KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK*

Secuencia proteínica de pSYN FVIII 269 (FVIII Fc con XTEN AE72 en el aminoácido 18) SEQ ID NO: 83)

1 MQIELSTCFF LCLLRFCFSA TRRYYLGAVE LSWDYMQGAP TSESATPESG

51 PGSEPATSGS ETPGTSESAT PESGPGSEPA TSGSETPGTS ESATPESGPG

101 TSTEPSEGSA PGASSSDLGE LPVDARFPPR VPKSFPFNTS WYKKTLFVE

151 FTDHLFNIAK PRPPWMGLLG PTIQAEVYDT WITLKNMAS HPVSLHAVGV

201 SYWKASEGAE YDDQTSQREK EDDKVFPGGS HTYVWQVLKE NGPMASDPLC

251 LTYSYLSHVD LVKDLNSGLI GALLVCREGS LAKEKTQTLH KFILLFAVFD

301 EGKSWHSETK NSLMQDRDAA SARAWPKMHT VNGYVNRSLP GLIGCHRKSV

351 YWHVIGMGTT PEVHSIFLEG HTFLVRNHRQ ASLEISPITF LTAQTLLMDL

401 GQFLLFCHIS SHQHDGMEAY VKVDSCPEEP QLRMKNNEEA EDYDDDLTDS

451 EMDWRFDDD NSPSFIQIRS VAKKHPKTWV HYIAAEEEDW DYAPLVLAPD

501 DRSYKSQYLN NGPQRIGRKY KKVRFMAYTD ETFKTREAIQ HESGILGPLL

551 YGEVGDTLLI IFKNQASRPY NIYPHGITDV RPLYSRRLPK GVKHLKDFPI

601 LPGEIFKYKW TVTVEDGPTK SDPRCLTRYY SSFVNMERDL ASGLIGPLLI

651 CYKESVDQRG NQIMSDKRNV ILFSVFDENR SWYLTENIQR FLPNPAGVQL

701 EDPEFQASNI MHSINGYVFD SLQLSVCLHE VAYWYILSIG AQTDFLSVFF

751 SGYTFKHKMV YEDTLTLFPF SGETVFMSME NPGLWILGCH NSDFRNRGMT

801 ALLKVSSCDK NTGDYYEDSY EDISAYLLSK NNAIEPRSFS QNPPVLKRHQ

851 AEITRTTLQS DQEEIDYDDT ISVEMKKEDF DIYDEDENQS PRSFQKKTRH

901 YFIAAVERLW DYGMSSSPHV LRNRAQSGSV PQFKKWFQE FTDGSFTQPL

951 YRGELNEHLG LLGPYIRAEV EDNIMVTFRN QASRPYSFYS SLISYEEDQR

1001 QGAEPRKNFV KPNETKTYFW KVQHHMAPTK DEFDCKAWAY FSDVDLEKDV

1051 HSGLIGPLLV CHTNTLNPAH GRQVTVQEFA LFFTIFDETK SWYFTENMER

1101 NCRAPCNIQM EDPTFKENYR FHAINGYIMD TLPGLVMAQD QRIRWYLLSM

1151 GSNENIHSIH FSGHVFTVRK KEEYKMALYN LYPGVFETVE MLPSKAGIWR

1201 VECLIGEHLH AGMSTLFLVY SNKCQTPLGM ASGHIRDFQI TASGQYGQWA

1251 PKLARLHYSG SINAWSTKEP FSWIKVDLLA PMIIHGIKTQ GARQKFSSLY

1301 ISQFIIMYSL DGKKWQTYRG NSTGTLMVFF GNVDSSGIKH NIFNPPIIAR

1351 YIRLHPTHYS IRSTLRMELM GCDLNSCSMP LGMESKAISD AQITASSYFT

1401 NMFATWSPSK ARLHLQGRSN AWRPQVNNPK EWLQVDFQKT MKVTGVTTQG

1451 VKSLLTSMYV KEFLISSSQD GHQWTLFFQN GKVKVFQGNQ DSFTPWNSL

1501 DPPLLTRYLR IHPQSWVHQI ALRMEVLGCE AQDLYDKTHT CPPCPAPELL

1551 GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVWD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH

1601 NAKTKPREEQ YNSTYRWSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT

1651 ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG

1701 QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH

1751 YTQKSLSLSP GK*

Secuencia proteínica de pSYNFVIII 271 (FVIII Fc con XTEN AE42 en el aminoácido 18) SEQ ID NO: 84)

1 MQIELSTCFF LCLLRFCFSA TRRYYLGAVE LSWDYMQGAP GSPAGSPTST

51 EEGTSESATP ESGPGSEPAT SGSETPASSS DLGELPVDAR FPPRVPKSFP

101 FNTSWYKKT LFVEFTDHLF NIAKPRPPWM GLLGPTIQAE VYDTWITLK

151 NMASHPVSLH AVGVSYWKAS EGAEYDDQTS QREKEDDKVF PGGSHTYVWQ

201 VLKENGPMAS DPLCLTYSYL SHVDLVKDLN SGLIGALLVC REGSLAKEKT

251 QTLHKFILLF AVFDEGKSWH SETKNSLMQD RDAASARAWP KMHTVNGYVN

301 RSLPGLIGCH RKSVYWHVIG MGTTPEVHSI FLEGHTFLVR NHRQASLEIS

351 PITFLTAQTL LMDLGQFLLF CHISSHQHDG MEAYVKVDSC PEEPQLRMKN

401 NEEAEDYDDD LTDSEMDWR FDDDNSPSFI QIRSVAKKHP KTWVHYIAAE

451 EEDWDYAPLV LAPDDRSYKS QYLNNGPQRI GRKYKKVRFM AYTDETFKTR

501 EAIQHESGIL GPLLYGEVGD TLLIIFKNQA SRPYNIYPHG ITDVRPLYSR

551 RLPKGVKHLK DFPILPGEIF KYKWTVTVED GPTKSDPRCL TRYYSSFVNM

601 ERDLASGLIG PLLICYKESV DQRGNQIMSD KRNVILFSVF DENRSWYLTE

651 NIQRFLPNPA GVQLEDPEFQ ASNIMHSING YVFDSLQLSV CLHEVAYWYI

701 LSIGAQTDFL SVFFSGYTFK HKMVYEDTLT LFPFSGETVF MSMENPGLWI

751 LGCHNSDFRN RGMTALLKVS SCDKNTGDYY EDSYEDISAY LLSKNNAIEP

801 RSFSQNPPVL KRHQAEITRT TLQSDQEEID YDDTISVEMK KEDFDIYDED

851 ENQSPRSFQK KTRHYFIAAV ERLWDYGMSS SPHVLRNRAQ SGSVPQFKKV

901 VFQEFTDGSF TQPLYRGELN EHLGLLGPYI RAEVEDNIMV TFRNQASRPY

951 SFYSSLISYE EDQRQGAEPR KNFVKPNETK TYFWKVQHHM APTKDEFDCK

1001 AWAYFSDVDL EKDVHSGLIG PLLVCHTNTL NPAHGRQVTV QEFALFFTIF

1051 DETKSWYFTE NMERNCRAPC NIQMEDPTFK ENYRFHAING YIMDTLPGLV

1101 MAQDQRIRWY LLSMGSNENI HSIHFSGHVF TVRKKEEYKM ALYNLYPGVF

1151 ETVEMLPSKA GIWRVECLIG EHLHAGMSTL FLVYSNKCQT PLGMASGHIR

1201 DFQITASGQY GQWAPKLARL HYSGSINAWS TKEPFSWIKV DLLAPMIIHG

1251 IKTQGARQKF SSLYISQFII MYSLDGKKWQ TYRGNSTGTL MVFFGNVDSS

1301 GIKHNIFNPP IIARYIRLHP THYSIRSTLR MELMGCDLNS CSMPLGMESK

1351 AISDAQITAS SYFTNMFATW SPSKARLHLQ GRSNAWRPQV NNPKEWLQVD

1401 FQKTMKVTGV TTQGVKSLLT SMYVKEFLIS SSQDGHQWTL FFQNGKVKVF

1451 QGNQDSFTPV VNSLDPPLLT RYLRIHPQSW VHQIALRMEV LGCEAQDLYD

1501 KTHTCPPCPA PELLGGPSVF LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VWDVSHEDP

1551 EVKFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQYNSTYR WSVLTVLHQ DWLNGKEYKC

1601 KVSNKALPAP IEKTISKAKG QPREPQVYTL PPSRDELTKN QVSLTCLVKG

1651 FYPSDIAVEW ESNGQPENNY KTTPPVLDSD GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN

1701 VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL SLSPGK*

Secuencia proteínica de pSYN FVIII 272 (FVIII con XTEN AE144 en el aminoácido 18 y XTEN AE244 en dominio B-sin Fc) SEQ ID NO: 85)

l MQIELSTCFF LCLLRFCFSA TRRYYLGAVE LSWDYMQGAP TSESATPESG

51 PGSEPATSGS ETPGTSESAT PESGPGSEPA TSGSETPGTS ESATPESGPG

101 TSTEPSEGSA PGSPAGSPTS TEEGTSESAT PESGPGSEPA TSGSETPGTS

151 ESATPESGPG SPAGSPTSTE EGSPAGSPTS TEEGASSSDL GELPVDARFP

201 PRVPKSFPFN TSWYKKTLF VEFTDHLFNI AKPRPPWMGL LGPTIQAEVY

251 DTWITLKNM ASHPVSLHAV GVSYWKASEG AEYDDQTSQR EKEDDKVFPG

301 GSHTYVWQVL KENGPMASDP LCLTYSYLSH VDLVKDLNSG LIGALLVCRE

351 GSLAKEKTQT LHKFILLFAV FDEGKSWHSE TKNSLMQDRD AASARAWPKM

401 HTVNGYVNRS LPGLIGCHRK SVYWHVIGMG TTPEVHSIFL EGHTFLVRNH

451 RQASLEISPI TFLTAQTLLM DLGQFLLFCH ISSHQHDGME AYVKVDSCPE

501 EPQLRMKNNE EAEDYDDDLT DSEMDWRFD DDNSPSFIQI RSVAKKHPKT

551 WVHYIAAEEE DWDYAPLVLA PDDRSYKSQY LNNGPQRIGR KYKKVRFMAY

601 TDETFKTREA IQHESGILGP LLYGEVGDTL LIIFKNQASR PYNIYPHGIT

651 DVRPLYSRRL PKGVKHLKDF PILPGEIFKY KWTVTVEDGP TKSDPRCLTR

701 YYSSFVNMER DLASGLIGPL LICYKESVDQ RGNQIMSDKR NVILFSVFDE

751 NRSWYLTENI QRFLPNPAGV QLEDPEFQAS NIMHSINGYV FDSLQLSVCL

801 HEVAYWYILS IGAQTDFLSV FFSGYTFKHK MVYEDTLTLF PFSGETVFMS

851 MENPGLWILG CHNSDFRNRG MTALLKVSSC DKNTGDYYED SYEDISAYLL

901 SKNNAIEPRS FSQNGAPGTS ESATPESGPG SEPATSGSET PGTSESATPE

951 SGPGSEPATS GSETPGTSES ATPESGPGTS TEPSEGSAPG SPAGSPTSTE

1001 EGTSESATPE SGPGSEPATS GSETPGTSES ATPESGPGSP AGSPTSTEEG

1051 SPAGSPTSTE EGTSTEPSEG SAPGTSESAT PESGPGTSES ATPESGPGTS

1101 ESATPESGPG SEPATSGSET PGSEPATSGS ETPGSPAGSP TSTEEGTSTE

1151 PSEGSAPGTS TEPSEGSAPG SEPATSGSET PGTSESATPE SGPGTSTEPS

1201 EGSAPASSPP VLKRHQAEIT RTTLQSDQEE IDYDDTISVE MKKEDFDIYD

1251 EDENQSPRSF QKKTRHYFIA AVERLWDYGM SSSPHVLRNR AQSGSVPQFK

1301 KWFQEFTDG SFTQPLYRGE LNEHLGLLGP YIRAEVEDNI MVTFRNQASR

1351 PYSFYSSLIS YEEDQRQGAE PRKNFVKPNE TKTYFWKVQH HMAPTKDEFD

1401 CKAWAYFSDV DLEKDVHSGL IGPLLVCHTN TLNPAHGRQV TVQEFALFFT

1 ₁₄ A _J C. ₁ 1 IFDETKSWYF TENMERNCRA PCNIQMEDPT FKENYRFHAI NGYIMDTLPG

1501 LVMAQDQRIR WYLLSMGSNE NIHSIHFSGH VFTVRKKEEY KMALYNLYPG

1551 VFETVEMLPS KAGIWRVECL IGEHLHAGMS TLFLVYSNKC QTPLGMASGH

1601 IRDFQITASG QYGQWAPKLA RLHYSGSINA WSTKEPFSWI KVDLLAPMII

1651 HGIKTQGARQ KFSSLYISQF IIMYSLDGKK WQTYRGNSTG TLMVFFGNVD

1701 SSGIKHNIFN PPIIARYIRL HPTHYSIRST LRMELMGCDL NSCSMPLGME

1751 SKAISDAQIT ASSYFTNMFA TWSPSKARLH LQGRSNAWRP QVNNPKEWLQ

1801 VDFQKTMKVT GVTTQGVKSL LTSMYVKEFL ISSSQDGHQW TLFFQNGKVK

1851 VFQGNQDSFT PWNSLDPPL LTRYLRIHPQ SWVHQIALRM EVLGCEAQDL

1901 Y*

Secuencia proteínica de pSYN-FVIII-161 (SEQ ID NO: 69) (secuencia de FVIII en la posición aminoacídica 1-1457; la región subrayada representa la región Fc; el subrayado curvo representa el conector escindible entre el primer Fc y el fragmento de VWF; la región con subrayado doble representa el fragmento de VWF; la región en negrita representa el conector escindible entre el fragmento de VWF y Fc).

i MQIELSTCFF LCLLRFCFSA TRRYYLGAVE LSWDYMQSDL GELPVDARFP

51 PRVPKSFPFN TSWYKKTLF VEFTDHLFNI AKPRPPWMGL LGPTIQAEVY

101 DTWITLKNM ASHPVSLHAV GVSYWKASEG AEYDDQTSQR EKEDDKVFPG

151 GSHTYVWQVL KENGPMASDP LCLTYSYLSH VDLVKDLNSG LIGALLVCRE

201 GSLAKEKTQT LHKFILLFAV FDEGKSWHSE TKNSLMQDRD AASARAWPKM

251 HTVNGYVNRS LPGLIGCHRK SVYWHVIGMG TTPEVHSIFL EGHTFLVRNH

301 RQASLEISPI TFLTAQTLLM DLGQFLLFCH ISSHQHDGME AYVKVDSCPE

351 EPQLRMKNNE EAEDYDDDLT DSEMDWRFD DDNSPSFIQI RSVAKKHPKT

401 WVHYIAAEEE DWDYAPLVLA PDDRSYKSQY LNNGPQRIGR KYKKVRFMAY

451 TDETFKTREA IQHESGILGP LLYGEVGDTL LIIFKNQASR PYNIYPHGIT

501 DVRPLYSRRL PKGVKHLKDF PILPGEIFKY KWTVTVEDGP TKSDPRCLTR

551 YYSSFVNMER DLASGLIGPL LICYKESVDQ RGNQIMSDKR NVILFSVFDE

601 NRSWYLTENI QRFLPNPAGV QLEDPEFQAS NIMHSINGYV FDSLQLSVCL

651 HEVAYWYILS IGAQTDFLSV FFSGYTFKHK MVYEDTLTLF PFSGETVFMS

701 MENPGLWILG CHNSDFRNRG MTALLKVSSC DKNTGDYYED SYEDISAYLL

751 SKNNAIEPRS FSQNPPVLKR HQREITRTTL QSDQEEIDYD DTISVEMKKE

801 DFDIYDEDEN QSPRSFQKKT RHYFIAAVER LWDYGMSSSP HVLRNRAQSG

851 SVPQFKKWF QEFTDGSFTQ PLYRGELNEH LGLLGPYIRA EVEDNIMVTF

901 RNQASRPYSF YSSLISYEED QRQGAEPRKN FVKPNETKTY FWKVQHHMAP

951 TKDEFDCKAW AYFSDVDLEK DVHSGLIGPL LVCHTNTLNP AHGRQVTVQE

1001 FALFFTIFDE TKSWYFTENM ERNCRAPCNI QMEDPTFKEN YRFHAINGYI

1051 MDTLPGLVMA QDQRIRWYLL SMGSNENIHS IHFSGHVFTV RKKEEYKMAL

1101 YNLYPGVFET VEMLPSKAGI WRVECLIGEH LHAGMSTLFL VYSNKCQTPL

1151 GMASGHIRDF QITASGQYGQ WAPKLARLHY SGSINAWSTK EPFSWIKVDL

1201 LAPMIIHGIK TQGARQKFSS LYISQFIIMY SLDGKKWQTY RGNSTGTLMV

1251 FFGNVDSSGI KHNIFNPPII ARYIRLHPTH YSIRSTLRME LMGCDLNSCS

1301 MPLGMESKAI SDAQITASSY FTNMFATWSP SKARLHLQGR SNAWRPQVNN

1351 PKEWLQVDFQ KTMKVTGVTT QGVKSLLTSM YVKEFLISSS QDGHQWTLFF

1401 QNGKVKVFQG NQDSFTPWN SLDPPLLTRY LRIHPQSWVH QIALRMEVLG

1451 CEAQDLYDKT HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCW 1501 VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRW SVLTVLHQDW 1551 LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SRDELTKNQV 1601 SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD 1651 KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGKRRRRSG GGGSGGGGSG 1701 GGGSGGGGSG GGGSGGGGSR KRRKRSLSCR PPMVKLVCPA DNLRAEGLEC 1751 TKTCQNYDLE CMSMGCVSGC LCPPGMVRHE NRCVALERCP CFHQGKEYAP 1801 GETVKIGCNT CVCRDRKWNC TDHVCDATCS TIGMAHYLTF DGLKYLFPGE 1851 CQYVLVQDYC GSNPGTFRIL VGNKGCSHPS VKCKKRVTIL VEGGEIELFD 1901 GEVNVKRPMK DETHFEWES GRYIILLLGK ALSWWDRHL SISWLKQTY 1951 QEKVCGLCGN FDGIQNNDLT SSNLQVEEDP VDFGNSWKVS SQCADTRKVP 2001 LDSSPATCHN NIMKQTMVDS SCRILTSDVF QDCNKLVDPE PYLDVCIYDT 2051 CSCESIGDCA AFCDTIAAYA HVCAQHGKW TWRTATLCPQ SCEERNLREN 2101 GYEAEWRYNS CAPACQVTCQ HPEPLACPVQ CVEGCHAHCP PGKILDELLQ 2151 TCVDPEDCPV CEVAGRRFAS GKKVTLNPSD PEHCQICHCD VWLTCEACQ 2201 H^ISGTSESA TPESGPGSEP ATSGSETPGT SESATPESGP GSEPATSGSE 2251 TPGTSESATP ESGPGTSTEP SEGSAPGSPA GSPTSTEEGT SESATPESGP 2301 GSEPATSGSE TPGTSESATP ESGPGSPAGS PTSTEEGSPA GSPTSTEEGT 2351 STEPSEGSAP GTSESATPES GPGTSESATP ESGPGTSESA TPESGPGSEP 2401 ATSGSETPGS EPATSGSETP GSPAGSPTST EEGTSTEPSE GSAPGTSTEP 2451 SEGSAPGSEP ATSGSETPGT SESATPESGP GTSTEPSEGS APDSGGGGSG 2501 GGGSGGGGSG GGGSGGGGSL VPRGSGGDKT HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF 2551 PPKPKDTLMI SRTPEVTCW VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE 2601 EQYNSTYRW SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP 2651 REPQVYTLPP SRDELTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT 2701 TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL 2751 SPGK

Secuencia proteínica de pSYN-FVIII-170 (SEQ ID NO: 71)

i SLSCRPPMVK LVCPADNLRA EGLECTKTCQ NYDLECMSMG CVSGCLCPPG 51 MVRHENRCVA LERCPCFHQG KEYAPGETVK IGCNTCVCRD RKWNCTDHVC 101 DATCSTIGMA HYLTFDGLKY LFPGECQYVL VQDYCGSNPG TFRILVGNKG 151 CSHPSVKCKK RVTILVEGGE IELFDGEVNV KRPMKDETHF EWESGRYII 201 LLLGKALSW WDRHLSISW LKQTYQEKVC GLCGNFDGIQ NNDLTSSNLQ 251 VEEDPVDFGN SWKVSSQCAD TRKVPLDSSP ATCHNNIMKQ TMVDSSCRIL 301 TSDVFQDCNK LVDPEPYLDV CIYDTCSCES IGDCAAFCDT IAAYAHVCAQ 351 HGKWTWRTA TLCPQSCEER NLRENGYEAE WRYNSCAPAC QVTCQHPEPL 401 ACPVQCVEGC HAHCPPGKIL DELLQTCVDP EDCPVCEVAG RRFASGKKVT 451 LNPSDPEHCQ ICHCDWNLT CEACQEPISG TSESATPESG PGSEPATSGS 501 ETPGTSESAT PESGPGSEPA TSGSETPGTS ESATPESGPG TSTEPSEGSA 551 PGSPAGSPTS TEEGTSESAT PESGPGSEPA TSGSETPGTS ESATPESGPG 601 SPAGSPTSTE EGSPAGSPTS TEEGTSTEPS EGSAPGTSES ATPESGPGTS 651 ESATPESGPG TSESATPESG PGSEPATSGS ETPGSEPATS GSETPGSPAG 701 SPTSTEEGTS TEPSEGSAPG TSTEPSEGSA PGSEPATSGS ETPGTSESAT 751 PESGPGTSTE PSEGSAPDSG GGGSGGGGSG GGGSGGGGSG GGGSLVPRGS 801 GGASATRRYY LGAVELSWDY MQSDLGELPV DARFPPRVPK SFPFNTSWY 851 KKTLFVEFTD HLFNIAKPRP PWMGLLGPTI QAEVYDTWI TLKNMASHPV 901 SLHAVGVSYW KASEGAEYDD QTSQREKEDD KVFPGGSHTY VWQVLKENGP 951 MASDPLCLTY SYLSHVDLVK DLNSGLIGAL LVCREGSLAK EKTQTLHKFI 1001 LLFAVFDEGK SWHSETKNSL MQDRDAASAR AWPKMHTVNG YVNRSLPGLI 1051 GCHRKSVYWH VIGMGTTPEV HSIFLEGHTF LVRNHRQASL EISPITFLTA 1101 QTLLMDLGQF LLFCHISSHQ HDGMEAYVKV DSCPEEPQLR MKNNEEAEDY 1151 DDDLTDSEMD WRFDDDNSP SFIQIRSVAK KHPKTWVHYI AAEEEDWDYA 1201 PLVLAPDDRS YKSQYLNNGP QRIGRKYKKV RFMAYTDETF KTREAIQHES 1251 GILGPLLYGE VGDTLLIIFK NQASRPYNIY PHGITDVRPL YSRRLPKGVK 1301 HLKDFPILPG EIFKYKWTVT VEDGPTKSDP RCLTRYYSSF VNMERDLASG 1351 LIGPLLICYK ESVDQRGNQI MSDKRNVILF SVFDENRSWY LTENIQRFLP 1401 NPAGVQLEDP EFQASNIMHS INGYVFDSLQ LSVCLHEVAY WYILSIGAQT 1451 DFLSVFFSGY TFKHKMVYED TLTLFPFSGE TVFMSMENPG LWILGCHNSD

1501 FRNRGMTALL KVSSCDKNTG DYYEDSYEDI SAYLLSKNNA IEPRSFSQNP

1551 PVLKRHQREI TRTTLQSDQE EIDYDDTISV EMKKEDFDIY DEDENQSPRS

1601 FQKKTRHYFI AAVERLWDYG MSSSPHVLRN RAQSGSVPQF KKWFQEFTD

1651 GSFTQPLYRG ELNEHLGLLG PYIRAEVEDN IMVTFRNQAS RPYSFYSSLI

1701 SYEEDQRQGA EPRKNFVKPN ETKTYFWKVQ HHMAPTKDEF DCKAWAYFSD

1751 VDLEKDVHSG LIGPLLVCHT NTLNPAHGRQ VTVQEFALFF TIFDETKSWY

1801 FTENMERNCR APCNIQMEDP TFKENYRFHA INGYIMDTLP GLVMAQDQRI

1851 RWYLLSMGSN ENIHSIHFSG HVFTVRKKEE YKMALYNLYP GVFETVEMLP

1901 SKAGIWRVEC LIGEHLHAGM STLFLVYSNK CQTPLGMASG HIRDFQITAS

1951 GQYGQWAPKL ARLHYSGSIN AWSTKEPFSW IKVDLLAPMI IHGIKTQGAR

2001 QKFSSLYISQ FIIMYSLDGK KWQTYRGNST GTLMVFFGNV DSSGIKHNIF

2051 NPPIIARYIR LHPTHYSIRS TLRMELMGCD LNSCSMPLGM ESKAISDAQI

2101 TASSYFTNMF ATWSPSKARL HLQGRSNAWR PQVNNPKEWL QVDFQKTMKV

2151 TGVTTQGVKS LLTSMYVKEF LISSSQDGHQ WTLFFQNGKV KVFQGNQDSF

2201 TPWNSLDPP LLTRYLRIHP QSWVHQIALR MEVLGCEAQD LY

Secuencia de nucleótidos de pSYN FVIII 310 (que codifica FVIII con eliminación completa del dominio B excepto 2 residuos aminoacídicos y XTEN AE288 insertado después del aa 742) (SEQ ID NO:170)

1 ATGCAAATAG AGCTCTCCAC CTGCTTCTTT CTGTGCCTTT TGCGATTCTG

51 CTTTAGTGCC ACCAGAAGAT ACTACCTGGG TGCAGTGGAA CTGTCATGGG

101 ACTATATGCA AAGTGATCTC GGTGAGCTGC CTGTGGACGC AAGATTTCCT

151 CCTAGAGTGC CAAAATCTTT TCCATTCAAC ACCTCAGTCG TGTACAAAAA

201 GACTCTGTTT GTAGAATTCA CGGATCACCT TTTCAACATC GCTAAGCCAA

251 GGCCACCCTG GATGGGTCTG CTAGGTCCTA CCATCCAGGC TGAGGTTTAT

301 GATACAGTGG TCATTACACT TAAGAACATG GCTTCCCATC CTGTCAGTCT

351 TCATGCTGTT GGTGTATCCT ACTGGAAAGC TTCTGAGGGA GCTGAATATG

401 ATGATCAGAC CAGTCAAAGG GAGAAAGAAG ATGATAAAGT CTTCCCTGGT

451 GGAAGCCATA CATATGTCTG GCAGGTCCTG AAAGAGAATG GTCCAATGGC

501 CTCTGACCCA CTGTGCCTTA CCTACTCATA TCTTTCTCAT GTGGACCTGG

551 TAAAAGACTT GAATTCAGGC CTCATTGGAG CCCTACTAGT ATGTAGAGAA

601 GGGAGTCTGG CCAAGGAAAA GACACAGACC TTGCACAAAT TTATACTACT

651 TTTTGCTGTA TTTGATGAAG GGAAAAGTTG GCACTCAGAA ACAAAGAACT

701 CCTTGATGCA GGATAGGGAT GCTGCATCTG CTCGGGCCTG GCCTAAAATG

751 CACACAGTCA ATGGTTATGT AAACAGGTCT CTGCCAGGTC TGATTGGATG

801 CCACAGGAAA TCAGTCTATT GGCATGTGAT TGGAATGGGC ACCACTCCTG

851 AAGTGCACTC AATATTCCTC GAAGGTCACA CATTTCTTGT GAGGAACCAT

901 CGCCAGGCGT CCTTGGAAAT CTCGCCAATA ACTTTCCTTA CTGCTCAAAC

951 ACTCTTGATG GACCTTGGAC AGTTTCTACT GTTTTGTCAT ATCTCTTCCC

1001 ACCAACATGA TGGCATGGAA GCTTATGTCA AAGTAGACAG CTGTCCAGAG

1051 GAACCCCAAC TACGAATGAA AAATAATGAA GAAGCGGAAG ACTATGATGA

1101 TGATCTTACT GATTCTGAAA TGGATGTGGT CAGGTTTGAT GATGACAACT

1151 CTCCTTCCTT TATCCAAATT CGCTCAGTTG CCAAGAAGCA TCCTAAAACT

1201 TGGGTACATT ACATTGCTGC TGAAGAGGAG GACTGGGACT ATGCTCCCTT

1251 AGTCCTCGCC CCCGATGACA GAAGTTATAA AAGTCAATAT TTGAACAATG

1301 GCCCTCAGCG GATTGGTAGG AAGTACAAAA AAGTCCGATT TATGGCATAC

1351 ACAGATGAAA CCTTTAAGAC TCGTGAAGCT ATTCAGCATG AATCAGGAAT

1401 CTTGGGACCT TTACTTTATG GGGAAGTTGG AGACACACTG TTGATTATAT

1451 TTAAGAATCA AGCAAGCAGA CCATATAACA TCTACCCTCA CGGAATCACT

1501 GATGTCCGTC CTTTGTATTC AAGGAGATTA CCAAAAGGTG TAAAACATTT

1551 GAAGGATTTT CCAATTCTGC CAGGAGAAAT ATTCAAATAT AAATGGACAG

1601 TGACTGTAGA AGATGGGCCA ACTAAATCAG ATCCTCGGTG CCTGACCCGC

1651 TATTACTCTA GTTTCGTTAA TATGGAGAGA GATCTAGCTT CAGGACTCAT

1701 TGGCCCTCTC CTCATCTGCT ACAAAGAATC TGTAGATCAA AGAGGAAACC

1751 AGATAATGTC AGACAAGAGG AATGTCATCC TGTTTTCTGT ATTTGATGAG

1801 AACCGAAGCT GGTACCTCAC AGAGAATATA CAACGCTTTC TCCCCAATCC

1851 AGCTGGAGTG CAGCTTGAGG ATCCAGAGTT CCAAGCCTCC AACATCATGC 1901 ACAGCATCAA TGGCTATGTT TTTGATAGTT TGCAGTTGTC AGTTTGTTTG 1951 CATGAGGTGG CATACTGGTA CATTCTAAGC ATTGGAGCAC AGACTGACTT 2001 CCTTTCTGTC TTCTTCTCTG GATATACCTT CAAACACAAA ATGGTCTATG 2051 AAGACACACT CACCCTATTC CCATTCTCAG GAGAAACTGT CTTCATGTCG 2101 ATGGAAAACC CAGGTCTATG GATTCTGGGG TGCCACAACT CAGACTTTCG 2151 GAACAGAGGC ATGACCGCCT TACTGAAGGT TTCTAGTTGT GACAAGAACA 2201 CTGGTGATTA TTACGAGGAC AGTTATGAAG ATATTTCAGC ATACTTGCTG 2251 AGTAAAAACA ATGCCATTGA ACCAAGAAGC TTCGGTACCT CAGAGTCTGC 2301 TACCCCCGAG TCAGGGCCAG GATCAGAGCC AGCCACCTCC GGGTCTGAGA 2351 CACCCGGGAC TTCCGAGAGT GCCACCCCTG AGTCCGGACC CGGGTCCGAG 2401 CCCGCCACTT CCGGCTCCGA AACTCCCGGC ACAAGCGAGA GCGCTACCCC 2451 AGAGTCAGGA CCAGGAACAT CTACAGAGCC CTCTGAAGGC TCCGCTCCAG 2501 GGTCCCCAGC CGGCAGTCCC ACTAGCACCG AGGAGGGAAC CTCTGAAAGC 2551 GCCACACCCG AATCAGGGCC AGGGTCTGAG CCTGCTACCA GCGGCAGCGA 2601 GACACCAGGC ACCTCTGAGT CCGCCACACC AGAGTCCGGA CCCGGATCTC 2651 CCGCTGGGAG CCCCACCTCC ACTGAGGAGG GATCTCCTGC TGGCTCTCCA 2701 ACATCTACTG AGGAAGGTAC CTCAACCGAG CCATCCGAGG GATCAGCTCC 2751 CGGCACCTCA GAGTCGGCAA CCCCGGAGTC TGGACCCGGA ACTTCCGAAA 2801 GTGCCACACC AGAGTCCGGT CCCGGGACTT CAGAATCAGC AACACCCGAG 2851 TCCGGCCCTG GGTCTGAACC CGCCACAAGT GGTAGTGAGA CACCAGGATC 2901 AGAACCTGCT ACCTCAGGGT CAGAGACACC CGGATCTCCG GCAGGCTCAC 2951 CAACCTCCAC TGAGGAGGGC ACCAGCACAG AACCAAGCGA GGGCTCCGCA 3001 CCCGGAACAA GCACTGAACC CAGTGAGGGT TCAGCACCCG GCTCTGAGCC 3051 GGCCACAAGT GGCAGTGAGA CACCCGGCAC TTCAGAGAGT GCCACCCCCG 3101 AGAGTGGCCC AGGCACTAGT ACCGAGCCCT CTGAAGGCAG TGCGCCAGCC 3151 TCGAGCGAAA TAACTCGTAC TACTCTTCAG TCAGATCAAG AGGAAATCGA 3201 TTATGATGAT ACCATATCAG TTGAAATGAA GAAGGAAGAT TTTGACATTT 3251 ATGATGAGGA TGAAAATCAG AGCCCCCGCA GCTTTCAAAA GAAAACACGA 3301 CACTATTTTA TTGCTGCAGT GGAGAGGCTC TGGGATTATG GGATGAGTAG 3351 CTCCCCACAT GTTCTAAGAA ACAGGGCTCA GAGTGGCAGT GTCCCTCAGT 3401 TCAAGAAAGT TGTTTTCCAG GAATTTACTG ATGGCTCCTT TACTCAGCCC 3451 TTATACCGTG GAGAACTAAA TGAACATTTG GGACTCCTGG GGCCATATAT 3501 AAGAGCAGAA GTTGAAGATA ATATCATGGT AACTTTCAGA AATCAGGCCT 3551 CTCGTCCCTA TTCCTTCTAT TCTAGCCTTA TTTCTTATGA GGAAGATCAG 3601 AGGCAAGGAG CAGAACCTAG AAAAAACTTT GTCAAGCCTA ATGAAACCAA 3651 AACTTACTTT TGGAAAGTGC AACATCATAT GGCACCCACT AAAGATGAGT 3701 TTGACTGCAA AGCCTGGGCT TATTTCTCTG ATGTTGACCT GGAAAAAGAT 3751 GTGCACTCAG GCCTGATTGG ACCCCTTCTG GTCTGCCACA CTAACACACT 3801 GAACCCTGCT CATGGGAGAC AAGTGACAGT ACAGGAATTT GCTCTGTTTT 3851 TCACCATCTT TGATGAGACC AAAAGCTGGT ACTTCACTGA AAATATGGAA 3901 AGAAACTGCA GGGCTCCCTG CAATATCCAG ATGGAAGATC CCACTTTTAA 3951 AGAGAATTAT CGCTTCCATG CAATCAATGG CTACATAATG GATACACTAC 4001 CTGGCTTAGT AATGGCTCAG GATCAAAGGA TTCGATGGTA TCTGCTCAGC 4051 ATGGGCAGCA ATGAAAACAT CCATTCTATT CATTTCAGTG GACATGTGTT 4101 CACTGTACGA AAAAAAGAGG AGTATAAAAT GGCACTGTAC AATCTCTATC 4151 CAGGTGTTTT TGAGACAGTG GAAATGTTAC CATCCAAAGC TGGAATTTGG 4201 CGGGTGGAAT GCCTTATTGG CGAGCATCTA CATGCTGGGA TGAGCACACT 4251 TTTTCTGGTG TACAGCAATA AGTGTCAGAC TCCCCTGGGA ATGGCTTCTG 4301 GACACATTAG AGATTTTCAG ATTACAGCTT CAGGACAATA TGGACAGTGG 4351 GCCCCAAAGC TGGCCAGACT TCATTATTCC GGATCAATCA ATGCCTGGAG 4401 CACCAAGGAG CCCTTTTCTT GGATCAAGGT GGATCTGTTG GCACCAATGA 4451 TTATTCACGG CATCAAGACC CAGGGTGCCC GTCAGAAGTT CTCCAGCCTC 4501 TACATCTCTC AGTTTATCAT CATGTATAGT CTTGATGGGA AGAAGTGGCA 4551 GACTTATCGA GGAAATTCCA CTGGAACCTT AATGGTCTTC TTTGGCAATG 4601 TGGATTCATC TGGGATAAAA CACAATATTT TTAACCCTCC AATTATTGCT 4651 CGATACATCC GTTTGCACCC AACTCATTAT AGCATTCGCA GCACTCTTCG 4701 CATGGAGTTG ATGGGCTGTG ATTTAAATAG TTGCAGCATG CCATTGGGAA 4751 TGGAGAGTAA AGCAATATCA GATGCACAGA TTACTGCTTC ATCCTACTTT 4801 ACCAATATGT TTGCCACCTG GTCTCCTTCA AAAGCTCGAC TTCACCTCCA

4851 AGGGAGGAGT AATGCCTGGA GACCTCAGGT GAATAATCCA AAAGAGTGGC

4901 TGCAAGTGGA CTTCCAGAAG ACAATGAAAG TCACAGGAGT AACTACTCAG

4951 GGAGTAAAAT CTCTGCTTAC CAGCATGTAT GTGAAGGAGT TCCTCATCTC

5001 CAGCAGTCAA GATGGCCATC AGTGGACTCT CTTTTTTCAG AATGGCAAAG

5051 TAAAGGTTTT TCAGGGAAAT CAAGACTCCT TCACACCTGT GGTGAACTCT

5101 CTAGACCCAC CGTTACTGAC TCGCTACCTT CGAATTCACC CCCAGAGTTG

5151 GGTGCACCAG ATTGCCCTGA GGATGGAGGT TCTGGGCTGC GAGGCACAGG

5201 ACCTCTACGA CAAAACTCAC ACATGCCCAC CGTGCCCAGC TCCAGAACTC

5251 CTGGGCGGAC CGTCAGTCTT CCTCTTCCCC CCAAAACCCA AGGACACCCT

5301 CATGATCTCC CGGACCCCTG AGGTCACATG CGTGGTGGTG GACGTGAGCC

5351 ACGAAGACCC TGAGGTCAAG TTCAACTGGT ACGTGGACGG CGTGGAGGTG

5401 CATAATGCCA AGACAAAGCC GCGGGAGGAG CAGTACAACA GCACGTACCG

5451 TGTGGTCAGC GTCCTCACCG TCCTGCACCA GGACTGGCTG AATGGCAAGG

5501 AGTACAAGTG CAAGGTCTCC AACAAAGCCC TCCCAGCCCC CATCGAGAAA

5551 ACCATCTCCA AAGCCAAAGG GCAGCCCCGA GAACCACAGG TGTACACCCT

5601 GCCCCCATCC CGGGATGAGC TGACCAAGAA CCAGGTCAGC CTGACCTGCC

5651 TGGTCAAAGG CTTCTATCCC AGCGACATCG CCGTGGAGTG GGAGAGCAAT

5701 GGGCAGCCGG AGAACAACTA CAAGACCACG CCTCCCGTGT TGGACTCCGA

5751 CGGCTCCTTC TTCCTCTACA GCAAGCTCAC CGTGGACAAG AGCAGGTGGC

5801 AGCAGGGGAA CGTCTTCTCA TGCTCCGTGA TGCATGAGGC TCTGCACAAC

5851 CACTACACGC AGAAGAGCCT CTCCCTGTCT CCGGGTAAAT GA

Secuencia proteínica de pSYN FVIII 310 (FVIII con eliminación completa del dominio B excepto 2 residuos aminoacídicos y XTEN AE288 insertado después del aa 742) (SEQ ID NO:171)

i ATRRYYLGAV ELSWDYMQSD LGELPVDARF PPRVPKSFPF NTSWYKKTL

51 FVEFTDHLFN IAKPRPPWMG LLGPTIQAEV YDTWITLKN MASHPVSLHA

101 VGVSYWKASE GAEYDDQTSQ REKEDDKVFP GGSHTYVWQV LKENGPMASD

151 PLCLTYSYLS HVDLVKDLNS GLIGALLVCR EGSLAKEKTQ TLHKFILLFA

201 VFDEGKSWHS ETKNSLMQDR DAASARAWPK MHTVNGYVNR SLPGLIGCHR

251 KSVYWHVIGM GTTPEVHSIF LEGHTFLVRN HRQASLEISP ITFLTAQTLL

301 MDLGQFLLFC HISSHQHDGM EAYVKVDSCP EEPQLRMKNN EEAEDYDDDL

351 TDSEMDWRF DDDNSPSFIQ IRSVAKKHPK TWVHYIAAEE EDWDYAPLVL

401 APDDRSYKSQ YLNNGPQRIG RKYKKVRFMA YTDETFKTRE AIQHESGILG

451 PLLYGEVGDT LLIIFKNQAS RPYNIYPHGI TDVRPLYSRR LPKGVKHLKD

501 FPILPGEIFK YKWTVTVEDG PTKSDPRCLT RYYSSFVNME RDLASGLIGP

551 LLICYKESVD QRGNQIMSDK RNVILFSVFD ENRSWYLTEN IQRFLPNPAG

601 VQLEDPEFQA SNIMHSINGY VFDSLQLSVC LHEVAYWYIL SIGAQTDFLS

651 VFFSGYTFKH KMVYEDTLTL FPFSGETVFM SMENPGLWIL GCHNSDFRNR

701 GMTALLKVSS CDKNTGDYYE DSYEDISAYL LSKNNAIEPR SFGTSESATP

751 ESGPGSEPAT SGSETPGTSE SATPESGPGS EPATSGSETP GTSESATPES

801 GPGTSTEPSE GSAPGSPAGS PTSTEEGTSE SATPESGPGS EPATSGSETP

851 GTSESATPES GPGSPAGSPT STEEGSPAGS PTSTEEGTST EPSEGSAPGT

901 SESATPESGP GTSESATPES GPGTSESATP ESGPGSEPAT SGSETPGSEP

951 ATSGSETPGS PAGSPTSTEE GTSTEPSEGS APGTSTEPSE GSAPGSEPAT

1001 SGSETPGTSE SATPESGPGT STEPSEGSAP ASSEITRTTL QSDQEEIDYD

1051 DTISVEMKKE DFDIYDEDEN QSPRSFQKKT RHYFIAAVER LWDYGMSSSP

1101 HVLRNRAQSG SVPQFKKWF QEFTDGSFTQ PLYRGELNEH LGLLGPYIRA

1151 EVEDNIMVTF RNQASRPYSF YSSLISYEED QRQGAEPRKN FVKPNETKTY

1201 FWKVQHHMAP TKDEFDCKAW AYFSDVDLEK DVHSGLIGPL LVCHTNTLNP

1251 AHGRQVTVQE FALFFTIFDE TKSWYFTENM ERNCRAPCNI QMEDPTFKEN

1301 YRFHAINGYI MDTLPGLVMA QDQRIRWYLL SMGSNENIHS IHFSGHVFTV

1351 RKKEEYKMAL YNLYPGVFET VEMLPSKAGI WRVECLIGEH LHAGMSTLFL

1401 VYSNKCQTPL GMASGHIRDF QITASGQYGQ WAPKLARLHY SGSINAWSTK

1451 EPFSWIKVDL LAPMIIHGIK TQGARQKFSS LYISQFIIMY SLDGKKWQTY

1501 RGNSTGTLMV FFGNVDSSGI KHNIFNPPII ARYIRLHPTH YSIRSTLRME

1551 LMGCDLNSCS MPLGMESKAI SDAQITASSY FTNMFATWSP SKARLHLQGR

1601 SNAWRPQVNN PKEWLQVDFQ KTMKVTGVTT QGVKSLLTSM YVKEFLISSS

1651 QDGHQWTLFF QNGKVKVFQG NQDSFTPWN SLDPPLLTRY LRIHPQSWVH

1701 QIALRMEVLG CEAQDLYDKT HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI

1751 SRTPEVTCW VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRW

1801 SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP

1851 SRDELTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS

1901 FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK*

Secuencia de nucleótidos de pSYN FVIII 312 (que codifica FVIII con eliminación completa del dominio B excepto 5 residuos aminoacídicos y XTEN AE288 insertado después del aa 745-versión B5) (S^eQ ID NO:172)

1 ATGCAAATAG AGCTCTCCAC CTGCTTCTTT CTGTGCCTTT TGCGATTCTG 51 CTTTAGTGCC ACCAGAAGAT ACTACCTGGG TGCAGTGGAA CTGTCATGGG 101 ACTATATGCA AAGTGATCTC GGTGAGCTGC CTGTGGACGCAAGATTTCCT 151 CCTAGAGTGC CAAAATCTTT TCCATTCAAC ACCTCAGTCG TGTACAAAAA 201 GACTCTGTTT GTAGAATTCA CGGATCACCT TTTCAACATC GCTAAGCCAA 251 GGCCACCCTG GATGGGTCTG CTAGGTCCTA CCATCCAGGC TGAGGTTTAT 301 GATACAGTGG TCATTACACT TAAGAACATG GCTTCCCATC CTGTCAGTCT 351 TCATGCTGTT GGTGTATCCT ACTGGAAAGC TTCTGAGGGA GCTGAATATG 401 ATGATCAGAC CAGTCAAAGG GAGAAAGAAG ATGATAAAGT CTTCCCTGGT 451 GGAAGCCATA CATATGTCTG GCAGGTCCTG AAAGAGAATG GTCCAATGGC 501 CTCTGACCCA CTGTGCCTTA CCTACTCATA TCTTTCTCAT GTGGACCTGG 551 TAAAAGACTT GAATTCAGGC CTCATTGGAG CCCTACTAGTATGTAGAGAA 601 GGGAGTCTGG CCAAGGAAAA GACACAGACC TTGCACAAAT TTATACTACT 651 TTTTGCTGTA TTTGATGAAG GGAAAAGTTG GCACTCAGAAACAAAGAACT 701 CCTTGATGCA GGATAGGGAT GCTGCATCTG CTCGGGCCTG GCCTAAAATG 751 CACACAGTCA ATGGTTATGT AAACAGGTCT CTGCCAGGTC TGATTGGATG 801 CCACAGGAAA TCAGTCTATT GGCATGTGAT TGGAATGGGCACCACTCCTG 851 AAGTGCACTC AATATTCCTC GAAGGTCACA CATTTCTTGT GAGGAACCAT 901 CGCCAGGCGT CCTTGGAAAT CTCGCCAATA ACTTTCCTTA CTGCTCAAAC 951 ACTCTTGATG GACCTTGGAC AGTTTCTACT GTTTTGTCATATCTCTTCCC 1001 ACCAACATGA TGGCATGGAA GCTTATGTCA AAGTAGACAG CTGTCCAGAG 1051 GAACCCCAAC TACGAATGAA AAATAATGAA GAAGCGGAAGACTATGATGA 1101 TGATCTTACT GATTCTGAAA TGGATGTGGT CAGGTTTGAT GATGACAACT 1151 CTCCTTCCTT TATCCAAATT CGCTCAGTTG CCAAGAAGCA TCCTAAAACT 1201 TGGGTACATT ACATTGCTGC TGAAGAGGAG GACTGGGACTATGCTCCCTT 1251 AGTCCTCGCC CCCGATGACA GAAGTTATAA AAGTCAATAT TTGAACAATG 1301 GCCCTCAGCG GATTGGTAGG AAGTACAAAA AAGTCCGATT TATGGCATAC 1351 ACAGATGAAA CCTTTAAGAC TCGTGAAGCT ATTCAGCATGAATCAGGAAT 1401 CTTGGGACCT TTACTTTATG GGGAAGTTGG AGACACACTG TTGATTATAT 1451 TTAAGAATCA AGCAAGCAGA CCATATAACA TCTACCCTCA CGGAATCACT 1501 GATGTCCGTC CTTTGTATTC AAGGAGATTA CCAAAAGGTG TAAAACATTT 1551 GAAGGATTTT CCAATTCTGC CAGGAGAAAT ATTCAAATATAAATGGACAG 1601 TGACTGTAGA AGATGGGCCA ACTAAATCAG ATCCTCGGTG CCTGACCCGC 1651 TATTACTCTA GTTTCGTTAA TATGGAGAGA GATCTAGCTT CAGGACTCAT 1701 TGGCCCTCTC CTCATCTGCT ACAAAGAATC TGTAGATCAAAGAGGAAACC 1751 AGATAATGTC AGACAAGAGG AATGTCATCC TGTTTTCTGTATTTGATGAG 1801 AACCGAAGCT GGTACCTCAC AGAGAATATA CAACGCTTTC TCCCCAATCC 1851 AGCTGGAGTG CAGCTTGAGG ATCCAGAGTT CCAAGCCTCCAACATCATGC 1901 ACAGCATCAA TGGCTATGTT TTTGATAGTT TGCAGTTGTCAGTTTGTTTG 1951 CATGAGGTGG CATACTGGTA CATTCTAAGC ATTGGAGCACAGACTGACTT 2001 CCTTTCTGTC TTCTTCTCTG GATATACCTT CAAACACAAAATGGTCTATG 2051 AAGACACACT CACCCTATTC CCATTCTCAG GAGAAACTGT CTTCATGTCG 2101 ATGGAAAACC CAGGTCTATG GATTCTGGGG TGCCACAACT CAGACTTTCG 2151 GAACAGAGGC ATGACCGCCT TACTGAAGGT TTCTAGTTGT GACAAGAACA 2201 CTGGTGATTA TTACGAGGAC AGTTATGAAG ATATTTCAGC ATACTTGCTG 2251 AGTAAAAACA ATGCCATTGA ACCAAGAAGC TTCTCTCAAA ACGGTACCTC 2301 AGAGTCTGCT ACCCCCGAGT CAGGGCCAGG ATCAGAGCCA GCCACCTCCG 2351 GGTCTGAGAC ACCCGGGACT TCCGAGAGTG CCACCCCTGA GTCCGGACCC 2401 GGGTCCGAGC CCGCCACTTC CGGCTCCGAA ACTCCCGGCA CAAGCGAGAG 2451 CGCTACCCCA GAGTCAGGAC CAGGAACATC TACAGAGCCC TCTGAAGGCT 2501 CCGCTCCAGG GTCCCCAGCC GGCAGTCCCA CTAGCACCGA GGAGGGAACC 2551 TCTGAAAGCG CCACACCCGA ATCAGGGCCA GGGTCTGAGC CTGCTACCAG 2601 CGGCAGCGAG ACACCAGGCA CCTCTGAGTC CGCCACACCA GAGTCCGGAC 2651 CCGGATCTCC CGCTGGGAGC CCCACCTCCA CTGAGGAGGG ATCTCCTGCT 2701 GGCTCTCCAA CATCTACTGA GGAAGGTACC TCAACCGAGC CATCCGAGGG 2751 ATCAGCTCCC GGCACCTCAG AGTCGGCAAC CCCGGAGTCT GGACCCGGAA 2801 CTTCCGAAAG TGCCACACCA GAGTCCGGTC CCGGGACTTC AGAATCAGCA 2851 ACACCCGAGT CCGGCCCTGG GTCTGAACCC GCCACAAGTG GTAGTGAGAC 2901 ACCAGGATCA GAACCTGCTA CCTCAGGGTC AGAGACACCC GGATCTCCGG 2951 CAGGCTCACC AACCTCCACT GAGGAGGGCA CCAGCACAGA ACCAAGCGAG 3001 GGCTCCGCAC CCGGAACAAG CACTGAACCC AGTGAGGGTT CAGCACCCGG 3051 CTCTGAGCCG GCCACAAGTG GCAGTGAGAC ACCCGGCACT TCAGAGAGTG 3101 CCACCCCCGA GAGTGGCCCA GGCACTAGTA CCGAGCCCTC TGAAGGCAGT 3151 GCGCCAGCCT CGAGCGAAAT AACTCGTACT ACTCTTCAGT CAGATCAAGA 3201 GGAAATCGAT TATGATGATA CCATATCAGT TGAAATGAAG AAGGAAGATT 3251 TTGACATTTA TGATGAGGAT GAAAATCAGA GCCCCCGCAG CTTTCAAAAG 3301 AAAACACGAC ACTATTTTAT TGCTGCAGTG GAGAGGCTCT GGGATTATGG 3351 GATGAGTAGC TCCCCACATG TTCTAAGAAA CAGGGCTCAG AGTGGCAGTG 3401 TCCCTCAGTT CAAGAAAGTT GTTTTCCAGG AATTTACTGA TGGCTCCTTT 3451 ACTCAGCCCT TATACCGTGG AGAACTAAAT GAACATTTGG GACTCCTGGG 3501 GCCATATATA AGAGCAGAAG TTGAAGATAA TATCATGGTA ACTTTCAGAA 3551 ATCAGGCCTC TCGTCCCTAT TCCTTCTATT CTAGCCTTAT TTCTTATGAG 3601 GAAGATCAGA GGCAAGGAGC AGAACCTAGA AAAAACTTTG TCAAGCCTAA 3651 TGAAACCAAA ACTTACTTTT GGAAAGTGCA ACATCATATG GCACCCACTA 3701 AAGATGAGTT TGACTGCAAA GCCTGGGCTT ATTTCTCTGA TGTTGACCTG 3751 GAAAAAGATG TGCACTCAGG CCTGATTGGA CCCCTTCTGG TCTGCCACAC 3801 TAACACACTG AACCCTGCTC ATGGGAGACA AGTGACAGTA CAGGAATTTG 3851 CTCTGTTTTT CACCATCTTT GATGAGACCA AAAGCTGGTA CTTCACTGAA 3901 AATATGGAAA GAAACTGCAG GGCTCCCTGC AATATCCAGA TGGAAGATCC 3951 CACTTTTAAA GAGAATTATC GCTTCCATGC AATCAATGGC TACATAATGG 4001 ATACACTACC TGGCTTAGTA ATGGCTCAGG ATCAAAGGAT TCGATGGTAT 4051 CTGCTCAGCA TGGGCAGCAA TGAAAACATC CATTCTATTC ATTTCAGTGG 4101 ACATGTGTTC ACTGTACGAA AAAAAGAGGA GTATAAAATG GCACTGTACA 4151 ATCTCTATCC AGGTGTTTTT GAGACAGTGG AAATGTTACC ATCCAAAGCT 4201 GGAATTTGGC GGGTGGAATG CCTTATTGGC GAGCATCTAC ATGCTGGGAT 4251 GAGCACACTT TTTCTGGTGT ACAGCAATAA GTGTCAGACT CCCCTGGGAA 4301 TGGCTTCTGG ACACATTAGA GATTTTCAGA TTACAGCTTC AGGACAATAT 4351 GGACAGTGGG CCCCAAAGCT GGCCAGACTT CATTATTCCG GATCAATCAA 4401 TGCCTGGAGC ACCAAGGAGC CCTTTTCTTG GATCAAGGTG GATCTGTTGG 4451 CACCAATGAT TATTCACGGC ATCAAGACCC AGGGTGCCCG TCAGAAGTTC 4501 TCCAGCCTCT ACATCTCTCA GTTTATCATC ATGTATAGTC TTGATGGGAA 4551 GAAGTGGCAG ACTTATCGAG GAAATTCCAC TGGAACCTTA ATGGTCTTCT 4601 TTGGCAATGT GGATTCATCT GGGATAAAAC ACAATATTTT TAACCCTCCA 4651 ATTATTGCTC GATACATCCG TTTGCACCCA ACTCATTATA GCATTCGCAG 4701 CACTCTTCGC ATGGAGTTGA TGGGCTGTGA TTTAAATAGT TGCAGCATGC 4751 CATTGGGAAT GGAGAGTAAA GCAATATCAG ATGCACAGAT TACTGCTTCA 4801 TCCTACTTTA CCAATATGTT TGCCACCTGG TCTCCTTCAA AAGCTCGACT 4851 TCACCTCCAA GGGAGGAGTA ATGCCTGGAG ACCTCAGGTG AATAATCCAA 4901 AAGAGTGGCT GCAAGTGGAC TTCCAGAAGA CAATGAAAGT CACAGGAGTA 4951 ACTACTCAGG GAGTAAAATC TCTGCTTACC AGCATGTATG TGAAGGAGTT 5001 CCTCATCTCC AGCAGTCAAG ATGGCCATCA GTGGACTCTC TTTTTTCAGA 5051 ATGGCAAAGT AAAGGTTTTT CAGGGAAATC AAGACTCCTT CACACCTGTG 5101 GTGAACTCTC TAGACCCACC GTTACTGACT CGCTACCTTC GAATTCACCC

5151 CCAGAGTTGG GTGCACCAGA TTGCCCTGAG GATGGAGGTT CTGGGCTGCG

5201 AGGCACAGGA CCTCTACGAC AAAACTCACA CATGCCCACC GTGCCCAGCT

5251 CCAGAACTCC TGGGCGGACC GTCAGTCTTC CTCTTCCCCC CAAAACCCAA

5301 GGACACCCTC ATGATCTCCC GGACCCCTGA GGTCACATGC GTGGTGGTGG

5351 ACGTGAGCCA CGAAGACCCT GAGGTCAAGT TCAACTGGTA CGTGGACGGC

5401 GTGGAGGTGC ATAATGCCAA GACAAAGCCG CGGGAGGAGC AGTACAACAG

5451 CACGTACCGT GTGGTCAGCG TCCTCACCGT CCTGCACCAG GACTGGCTGA

5501 ATGGCAAGGA GTACAAGTGC AAGGTCTCCA ACAAAGCCCT CCCAGCCCCC

5551 ATCGAGAAAA CCATCTCCAA AGCCAAAGGG CAGCCCCGAG AACCACAGGT

5601 GTACACCCTG CCCCCATCCC GGGATGAGCT GACCAAGAAC CAGGTCAGCC

5651 TGACCTGCCT GGTCAAAGGC TTCTATCCCA GCGACATCGC CGTGGAGTGG

5701 GAGAGCAATG GGCAGCCGGA GAACAACTAC AAGACCACGC CTCCCGTGTT

5751 GGACTCCGAC GGCTCCTTCT TCCTCTACAG CAAGCTCACC GTGGACAAGA

5801 GCAGGTGGCA GCAGGGGAAC GTCTTCTCAT GCTCCGTGAT GCATGAGGCT

5851 CTGCACAACC ACTACACGCA GAAGAGCCTC TCCCTGTCTC CGGGTAAATG

Secuencia proteínica de pSYN FVIII 312 (FVIII con eliminación completa del dominio B excepto 5 residuos aminoacídicos y XTEN AE288 insertado después del aa 745-versión B5) (SEQ ID NO:173)

i ATRRYYLGAV ELSWDYMQSD LGELPVDARF PPRVPKSFPF NTSWYKKTL

51 FVEFTDHLFN IAKPRPPWMG LLGPTIQAEV YDTWITLKN MASHPVSLHA

101 VGVSYWKASE GAEYDDQTSQ REKEDDKVFP GGSHTYVWQV LKENGPMASD

151 PLCLTYSYLS HVDLVKDLNS GLIGALLVCR EGSLAKEKTQ TLHKFILLFA

201 VFDEGKSWHS ETKNSLMQDR DAASARAWPK MHTVNGYVNR SLPGLIGCHR

251 KSVYWHVIGM GTTPEVHSIF LEGHTFLVRN HRQASLEISP ITFLTAQTLL

301 MDLGQFLLFC HISSHQHDGM EAYVKVDSCP EEPQLRMKNN EEAEDYDDDL

351 TDSEMDWRF DDDNSPSFIQ IRSVAKKHPK TWVHYIAAEE EDWDYAPLVL

401 APDDRSYKSQ YLNNGPQRIG RKYKKVRFMA YTDETFKTRE AIQHESGILG

451 PLLYGEVGDT LLIIFKNQAS RPYNIYPHGI TDVRPLYSRR LPKGVKHLKD

501 FPILPGEIFK YKWTVTVEDG PTKSDPRCLT RYYSSFVNME RDLASGLIGP

551 LLICYKESVD QRGNQIMSDK RNVILFSVFD ENRSWYLTEN IQRFLPNPAG

601 VQLEDPEFQA SNIMHSINGY VFDSLQLSVC LHEVAYWYIL SIGAQTDFLS

651 VFFSGYTFKH KMVYEDTLTL FPFSGETVFM SMENPGLWIL GCHNSDFRNR

701 GMTALLKVSS CDKNTGDYYE DSYEDISAYL LSKNNAIEPR SFSQNGTSES

751 ATPESGPGSE PATSGSETPG TSESATPESG PGSEPATSGS ETPGTSESAT

801 PESGPGTSTE PSEGSAPGSP AGSPTSTEEG TSESATPESG PGSEPATSGS

851 ETPGTSESAT PESGPGSPAG SPTSTEEGSP AGSPTSTEEG TSTEPSEGSA

901 PGTSESATPE SGPGTSESAT PESGPGTSES ATPESGPGSE PATSGSETPG

951 SEPATSGSET PGSPAGSPTS TEEGTSTEPS EGSAPGTSTE PSEGSAPGSE

1001 PATSGSETPG TSESATPESG PGTSTEPSEG SAPASSEITR TTLQSDQEEI

1051 DYDDTISVEM KKEDFDIYDE DENQSPRSFQ KKTRHYFIAA VERLWDYGMS

1101 SSPHVLRNRA QSGSVPQFKK WFQEFTDGS FTQPLYRGEL NEHLGLLGPY

1151 IRAEVEDNIM VTFRNQASRP YSFYSSLISY EEDQRQGAEP RKNFVKPNET

1201 KTYFWKVQHH MAPTKDEFDC KAWAYFSDVD LEKDVHSGLI GPLLVCHTNT

1251 LNPAHGRQVT VQEFALFFTI FDETKSWYFT ENMERNCRAP CNIQMEDPTF

1301 KENYRFHAIN GYIMDTLPGL VMAQDQRIRW YLLSMGSNEN IHSIHFSGHV

1351 FTVRKKEEYK MALYNLYPGV FETVEMLPSK AGIWRVECLI GEHLHAGMST

1401 LFLVYSNKCQ TPLGMASGHI RDFQITASGQ YGQWAPKLAR LHYSGSINAW

1451 STKEPFSWIK VDLLAPMIIH GIKTQGARQK FSSLYISQFI IMYSLDGKKW

1501 QTYRGNSTGT LMVFFGNVDS SGIKHNIFNP PIIARYIRLH PTHYSIRSTL

1551 RMELMGCDLN SCSMPLGMES KAISDAQITA SSYFTNMFAT WSPSKARLHL

1601 QGRSNAWRPQ VNNPKEWLQV DFQKTMKVTG VTTQGVKSLL TSMYVKEFLI

1651 SSSQDGHQWT LFFQNGKVKV FQGNQDSFTP WNSLDPPLL TRYLRIHPQS

1701 WVHQIALRME VLGCEAQDLY DKTHTCPPCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT

1751 LMISRTPEVT CVWDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY

1801 RWSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT

1851 LPPSRDELTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS

1901 ^{DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK*}

Secuencia de nucleótidos de pSYN VWF059 (que codifica VWF D'D3-Fc con sitio para trombina de región ácida 2 (a2) en el conector ) (SEQ ID NO: 196)

1 ATGATTCCTG CCAGATTTGC CGGGGTGCTG CTTGCTCTGG CCCTCATTTT 51 GCCAGGGACC CTTTGTGCAG AAGGAACTCG CGGCAGGTCA TCCACGGCCC 101 GATGCAGCCT TTTCGGAAGT GACTTCGTCA ACACCTTTGA TGGGAGCATG 151 TACAGCTTTG CGGGATACTG CAGTTACCTC CTGGCAGGGG GCTGCCAGAA 201 ACGCTCCTTC TCGATTATTG GGGACTTCCA GAATGGCAAGAGAGTGAGCC 251 TCTCCGTGTA TCTTGGGGAA TTTTTTGACA TCCATTTGTT TGTCAATGGT 301 ACCGTGACAC AGGGGGACCA AAGAGTCTCC ATGCCCTATG CCTCCAAAGG 351 GCTGTATCTA GAAACTGAGG CTGGGTACTA CAAGCTGTCC GGTGAGGCCT 401 ATGGCTTTGT GGCCAGGATC GATGGCAGCG GCAACTTTCAAGTCCTGCTG 451 TCAGACAGAT ACTTCAACAA GACCTGCGGG CTGTGTGGCAACTTTAACAT 501 CTTTGCTGAA GATGACTTTA TGACCCAAGA AGGGACCTTGACCTCGGACC 551 CTTATGACTT TGCCAACTCA TGGGCTCTGA GCAGTGGAGAACAGTGGTGT 601 GAACGGGCAT CTCCTCCCAG CAGCTCATGC AACATCTCCT CTGGGGAAAT 651 GCAGAAGGGC CTGTGGGAGC AGTGCCAGCT TCTGAAGAGCACCTCGGTGT 701 TTGCCCGCTG CCACCCTCTG GTGGACCCCG AGCCTTTTGT GGCCCTGTGT 751 GAGAAGACTT TGTGTGAGTG TGCTGGGGGG CTGGAGTGCG CCTGCCCTGC 801 CCTCCTGGAG TACGCCCGGA CCTGTGCCCA GGAGGGAATG GTGCTGTACG 851 GCTGGACCGA CCACAGCGCG TGCAGCCCAG TGTGCCCTGC TGGTATGGAG 901 TATAGGCAGT GTGTGTCCCC TTGCGCCAGG ACCTGCCAGA GCCTGCACAT 951 CAATGAAATG TGTCAGGAGC GATGCGTGGA TGGCTGCAGC TGCCCTGAGG 1001 GACAGCTCCT GGATGAAGGC CTCTGCGTGG AGAGCACCGA GTGTCCCTGC 1051 GTGCATTCCG GAAAGCGCTA CCCTCCCGGC ACCTCCCTCT CTCGAGACTG 1101 CAACACCTGC ATTTGCCGAA ACAGCCAGTG GATCTGCAGCAATGAAGAAT 1151 GTCCAGGGGA GTGCCTTGTC ACTGGTCAAT CCCACTTCAA GAGCTTTGAC 1201 AACAGATACT TCACCTTCAG TGGGATCTGC CAGTACCTGC TGGCCCGGGA 1251 TTGCCAGGAC CACTCCTTCT CCATTGTCAT TGAGACTGTC CAGTGTGCTG 1301 ATGACCGCGA CGCTGTGTGC ACCCGCTCCG TCACCGTCCG GCTGCCTGGC 1351 CTGCACAACA GCCTTGTGAA ACTGAAGCAT GGGGCAGGAG TTGCCATGGA 1401 TGGCCAGGAC ATCCAGCTCC CCCTCCTGAA AGGTGACCTC CGCATCCAGC 1451 ATACAGTGAC GGCCTCCGTG CGCCTCAGCT ACGGGGAGGA CCTGCAGATG 1501 GACTGGGATG GCCGCGGGAG GCTGCTGGTG AAGCTGTCCC CCGTCTATGC 1551 CGGGAAGACC TGCGGCCTGT GTGGGAATTA CAATGGCAAC CAGGGCGACG 1601 ACTTCCTTAC CCCCTCTGGG CTGGCGGAGC CCCGGGTGGA GGACTTCGGG 1651 AACGCCTGGA AGCTGCACGG GGACTGCCAG GACCTGCAGAAGCAGCACAG 1701 CGATCCCTGC GCCCTCAACC CGCGCATGAC CAGGTTCTCC GAGGAGGCGT 1751 GCGCGGTCCT GACGTCCCCC ACATTCGAGG CCTGCCATCG TGCCGTCAGC 1801 CCGCTGCCCT ACCTGCGGAA CTGCCGCTAC GACGTGTGCT CCTGCTCGGA 1851 CGGCCGCGAG TGCCTGTGCG GCGCCCTGGC CAGCTATGCC GCGGCCTGCG 1901 CGGGGAGAGG CGTGCGCGTC GCGTGGCGCG AGCCAGGCCG CTGTGAGCTG 1951 AACTGCCCGA AAGGCCAGGT GTACCTGCAG TGCGGGACCC CCTGCAACCT 2001 GACCTGCCGC TCTCTCTCTT ACCCGGATGA GGAATGCAAT GAGGCCTGCC 2051 TGGAGGGCTG CTTCTGCCCC CCAGGGCTCT ACATGGATGA GAGGGGGGAC 2101 TGCGTGCCCA AGGCCCAGTG CCCCTGTTAC TATGACGGTGAGATCTTCCA 2151 GCCAGAAGAC ATCTTCTCAG ACCATCACAC CATGTGCTAC TGTGAGGATG 2201 GCTTCATGCA CTGTACCATG AGTGGAGTCC CCGGAAGCTT GCTGCCTGAC 2251 GCTGTCCTCA GCAGTCCCCT GTCTCATCGC AGCAAAAGGA GCCTATCCTG 2301 TCGGCCCCCC ATGGTCAAGC TGGTGTGTCC CGCTGACAAC CTGCGGGCTG 2351 AAGGGCTCGA GTGTACCAAA ACGTGCCAGA ACTATGACCT GGAGTGCATG 2401 AGCATGGGCT GTGTCTCTGG CTGCCTCTGC CCCCCGGGCA TGGTCCGGCA 2451 TGAGAACAGA TGTGTGGCCC TGGAAAGGTG TCCCTGCTTC CATCAGGGCA 2501 AGGAGTATGC CCCTGGAGAA ACAGTGAAGA TTGGCTGCAA CACTTGTGTC 2551 TGTCGGGACC GGAAGTGGAA CTGCACAGAC CATGTGTGTGATGCCACGTG 2601 CTCCACGATC GGCATGGCCC ACTACCTCAC CTTCGACGGG CTCAAATACC 2651 TGTTCCCCGG GGAGTGCCAG TACGTTCTGG TGCAGGATTA CTGCGGCAGT

2701 AACCCTGGGA CCTTTCGGAT CCTAGTGGGG AATAAGGGAT GCAGCCACCC

2751 CTCAGTGAAA TGCAAGAAAC GGGTCACCAT CCTGGTGGAG GGAGGAGAGA

2801 TTGAGCTGTT TGACGGGGAG GTGAATGTGA AGAGGCCCAT GAAGGATGAG

2851 ACTCACTTTG AGGTGGTGGA GTCTGGCCGG TACATCATTC TGCTGCTGGG

2901 CAAAGCCCTC TCCGTGGTCT GGGACCGCCA CCTGAGCATC TCCGTGGTCC

2951 TGAAGCAGAC ATACCAGGAG AAAGTGTGTG GCCTGTGTGG GAATTTTGAT

3001 GGCATCCAGA ACAATGACCT CACCAGCAGC AACCTCCAAG TGGAGGAAGA

3051 CCCTGTGGAC TTTGGGAACT CCTGGAAAGT GAGCTCGCAG TGTGCTGACA

3101 CCAGAAAAGT GCCTCTGGAC TCATCCCCTG CCACCTGCCA TAACAACATC

3151 ATGAAGCAGA CGATGGTGGA TTCCTCCTGT AGAATCCTTA CCAGTGACGT

3201 CTTCCAGGAC TGCAACAAGC TGGTGGACCC CGAGCCATAT CTGGATGTCT

3251 GCATTTACGA CACCTGCTCC TGTGAGTCCA TTGGGGACTG CGCCGCATTC

3301 TGCGACACCA TTGCTGCCTA TGCCCACGTG TGTGCCCAGC ATGGCAAGGT

3351 GGTGACCTGG AGGACGGCCA CATTGTGCCC CCAGAGCTGC GAGGAGAGGA

3401 ATCTCCGGGA GAACGGGTAT GAGGCTGAGT GGCGCTATAA CAGCTGTGCA

3451 CCTGCCTGTC AAGTCACGTG TCAGCACCCT GAGCCACTGG CCTGCCCTGT

3501 GCAGTGTGTG GAGGGCTGCC ATGCCCACTG CCCTCCAGGG AAAATCCTGG

3551 ATGAGCTTTT GCAGACCTGC GTTGACCCTG AAGACTGTCC AGTGTGTGAG

3601 GTGGCTGGCC GGCGTTTTGC CTCAGGAAAG AAAGTCACCT TGAATCCCAG

3651 TGACCCTGAG CACTGCCAGA TTTGCCACTG TGATGTTGTC AACCTCACCT

3701 GTGAAGCCTG CCAGGAGCCG ATATCGGGCG CGCCAACATC AGAGAGCGCC

3751 ACCCCTGAAA GTGGTCCCGG GAGCGAGCCA GCCACATCTG GGTCGGAAAC

3801 GCCAGGCACA AGTGAGTCTG CAACTCCCGA GTCCGGACCT GGCTCCGAGC

3851 CTGCCACTAG CGGCTCCGAG ACTCCGGGAA CTTCCGAGAG CGCTACACCA

3901 GAAAGCGGAC CCGGAACCAG TACCGAACCT AGCGAGGGCT CTGCTCCGGG

3951 CAGCCCAGCC GGCTCTCCTA CATCCACGGA GGAGGGCACT TCCGAATCCG

4001 CCACCCCGGA GTCAGGGCCA GGATCTGAAC CCGCTACCTC AGGCAGTGAG

4051 ACGCCAGGAA CGAGCGAGTC CGCTACACCG GAGAGTGGGC CAGGGAGCCC

4101 TGCTGGATCT CCTACGTCCA CTGAGGAAGG GTCACCAGCG GGCTCGCCCA

4151 CCAGCACTGA AGAAGGTGCC TCGATATCTG ACAAGAACAC TGGTGATTAT

4201 TACGAGGACA GTTATGAAGA TATTTCAGCA TACTTGCTGA GTAAAAACAA

4251 TGCCATTGAA CCAAGAAGCT TCTCTGACAA AACTCACACA TGCCCACCGT

4301 GCCCAGCTCC AGAACTCCTG GGCGGACCGT CAGTCTTCCT CTTCCCCCCA

4351 AAACCCAAGG ACACCCTCAT GATCTCCCGG ACCCCTGAGG TCACATGCGT

4401 GGTGGTGGAC GTGAGCCACG AAGACCCTGA GGTCAAGTTC AACTGGTACG

4451 TGGACGGCGT GGAGGTGCAT AATGCCAAGA CAAAGCCGCG GGAGGAGCAG

4501 TACAACAGCA CGTACCGTGT GGTCAGCGTC CTCACCGTCC TGCACCAGGA

4551 CTGGCTGAAT GGCAAGGAGT ACAAGTGCAA GGTCTCCAAC AAAGCCCTCC

4601 CAGCCCCCAT CGAGAAAACC ATCTCCAAAG CCAAAGGGCA GCCCCGAGAA

4651 CCACAGGTGT ACACCCTGCC CCCATCCCGG GATGAGCTGA CCAAGAACCA

4701 GGTCAGCCTG ACCTGCCTGG TCAAAGGCTT CTATCCCAGC GACATCGCCG

4751 TGGAGTGGGA GAGCAATGGG CAGCCGGAGA ACAACTACAA GACCACGCCT

4801 CCCGTGTTGG ACTCCGACGG CTCCTTCTTC CTCTACAGCA AGCTCACCGT

4851 GGACAAGAGC AGGTGGCAGC AGGGGAACGT CTTCTCATGC TCCGTGATGC

4901 ATGAGGCTCT GCACAACCAC TACACGCAGA AGAGCCTCTC CCTGTCTCCG

4951 GGTAAATGA

Secuencia proteínica de pSYN VWF059 (VWF D'D3-Fc con sitio para trombina de región a2 de FVIII en el conector) -la zona subrayada en negrita muestra la región a2 (SEQ ID NO: 197)

i MIPARFAGVL LALALILPGT LCAEGTRGRS STARCSLFGS DFVNTFDGSM

51 YSFAGYCSYL LAGGCQKRSF SIIGDFQNGK RVSLSVYLGE FFDIHLFVNG

101 TVTQGDQRVS MPYASKGLYL ETEAGYYKLS GEAYGFVARI DGSGNFQVLL

151 SDRYFNKTCG LCGNFNIFAE DDFMTQEGTL TSDPYDFANS WALSSGEQWC

201 ERASPPSSSC NISSGEMQKG LWEQCQLLKS TSVFARCHPL VDPEPFVALC

251 EKTLCECAGG LECACPALLE YARTCAQEGM VLYGWTDHSA CSPVCPAGME

301 YRQCVSPCAR TCQSLHINEM CQERCVDGCS CPEGQLLDEG LCVESTECPC

351 VHSGKRYPPG TSLSRDCNTC ICRNSQWICS NEECPGECLV TGQSHFKSFD

401 NRYFTFSGIC QYLLARDCQD HSFSIVIETV QCADDRDAVC TRSVTVRLPG

451 LHNSLVKLKH GAGVAMDGQD IQLPLLKGDL RIQHTVTASV RLSYGEDLQM

501 DWDGRGRLLV KLSPVYAGKT CGLCGNYNGN QGDDFLTPSG LAEPRVEDFG

551 NAWKLHGDCQ DLQKQHSDPC ALNPRMTRFS EEACAVLTSP TFEACHRAVS

601 PLPYLRNCRY DVCSCSDGRE CLCGALASYA AACAGRGVRV AWREPGRCEL

651 NCPKGQVYLQ CGTPCNLTCR SLSYPDEECN EACLEGCFCP PGLYMDERGD

701 CVPKAQCPCY YDGEIFQPED IFSDHHTMCY CEDGFMHCTM SGVPGSLLPD

751 AVLSSPLSHR SKRSLSCRPP MVKLVCPADN LRAEGLECTK TCQNYDLECM

801 SMGCVSGCLC PPGMVRHENR CVALERCPCF HQGKEYAPGE TVKIGCNTCV

851 CRDRKWNCTD HVCDATCSTI GMAHYLTFDG LKYLFPGECQ YVLVQDYCGS

901 NPGTFRILVG NKGCSHPSVK CKKRVTILVE GGEIELFDGE VNVKRPMKDE

951 THFEWESGR YIILLLGKAL SWWDRHLSI SWLKQTYQE KVCGLCGNFD

1001 GIQNNDLTSS NLQVEEDPVD FGNSWKVSSQ CADTRKVPLD SSPATCHNNI

1051 MKQTMVDSSC RILTSDVFQD CNKLVDPEPY LDVCIYDTCS CESIGDCAAF

1101 CDTIAAYAHV CAQHGKWTW RTATLCPQSC EERNLRENGY EAEWRYNSCA

1151 PACQVTCQHP EPLACPVQCV EGCHAHCPPG KILDELLQTC VDPEDCPVCE

1201 VAGRRFASGK KVTLNPSDPE HCQICHCDW NLTCEACQEP ISGAPTSESA

1251 TPESGPGSEP ATSGSETPGT SESATPESGP GSEPATSGSE TPGTSESATP

1301 ESGPGTSTEP SEGSAPGSPA GSPTSTEEGT SESATPESGP GSEPATSGSE

1351 TPGTSESATP ESGPGSPAGS PTSTEEGSPA GSPTSTEEGA SISDKNTGDY

1401 YEDSYEDISA YLLSKNNAIE PRSFSDKTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP

1451 KPKDTLMISR TPEVTCVWD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ

1501 YNSTYRWSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE

1551 PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP

1601 PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP

1651 GK*

Secuencia de nucleótidos de pSYN VWF062 (que codifica VWF D'D3-Fc sin sitio para trombina en el conector) (SEQ ID NO: 198)

1 ATGATTCCTG CCAGATTTGC CGGGGTGCTG CTTGCTCTGG CCCTCATTTT

51 GCCAGGGACC CTTTGTGCAG AAGGAACTCG CGGCAGGTCA TCCACGGCCC

101 GATGCAGCCT TTTCGGAAGT GACTTCGTCA ACACCTTTGA TGGGAGCATG

151 TACAGCTTTG CGGGATACTG CAGTTACCTC CTGGCAGGGG GCTGCCAGAA

201 ACGCTCCTTC TCGATTATTG GGGACTTCCA GAATGGCAAG AGAGTGAGCC

251 TCTCCGTGTA TCTTGGGGAA TTTTTTGACA TCCATTTGTT TGTCAATGGT

301 ACCGTGACAC AGGGGGACCA AAGAGTCTCC ATGCCCTATG CCTCCAAAGG

351 GCTGTATCTA GAAACTGAGG CTGGGTACTA CAAGCTGTCC GGTGAGGCCT

401 ATGGCTTTGT GGCCAGGATC GATGGCAGCG GCAACTTTCA AGTCCTGCTG

451 TCAGACAGAT ACTTCAACAA GACCTGCGGG CTGTGTGGCA ACTTTAACAT

501 CTTTGCTGAA GATGACTTTA TGACCCAAGA AGGGACCTTG ACCTCGGACC

551 CTTATGACTT TGCCAACTCA TGGGCTCTGA GCAGTGGAGA ACAGTGGTGT

601 GAACGGGCAT CTCCTCCCAG CAGCTCATGC AACATCTCCT CTGGGGAAAT

651 GCAGAAGGGC CTGTGGGAGC AGTGCCAGCT TCTGAAGAGC ACCTCGGTGT

701 TTGCCCGCTG CCACCCTCTG GTGGACCCCG AGCCTTTTGT GGCCCTGTGT

751 GAGAAGACTT TGTGTGAGTG TGCTGGGGGG CTGGAGTGCG CCTGCCCTGC

801 CCTCCTGGAG TACGCCCGGA CCTGTGCCCA GGAGGGAATG GTGCTGTACG

851 GCTGGACCGA CCACAGCGCG TGCAGCCCAG TGTGCCCTGC TGGTATGGAG

901 TATAGGCAGT GTGTGTCCCC TTGCGCCAGG ACCTGCCAGA GCCTGCACAT

951 CAATGAAATG TGTCAGGAGC GATGCGTGGA TGGCTGCAGC TGCCCTGAGG

1001 GACAGCTCCT GGATGAAGGC CTCTGCGTGG AGAGCACCGA GTGTCCCTGC

1051 GTGCATTCCG GAAAGCGCTA CCCTCCCGGC ACCTCCCTCT CTCGAGACTG

1101 CAACACCTGC ATTTGCCGAA ACAGCCAGTG GATCTGCAGC AATGAAGAAT

1151 GTCCAGGGGA GTGCCTTGTC ACTGGTCAAT CCCACTTCAA GAGCTTTGAC

1201 AACAGATACT TCACCTTCAG TGGGATCTGC CAGTACCTGC TGGCCCGGGA

1251 TTGCCAGGAC CACTCCTTCT CCATTGTCAT TGAGACTGTC CAGTGTGCTG

1301 ATGACCGCGA CGCTGTGTGC ACCCGCTCCG TCACCGTCCG GCTGCCTGGC

1351 CTGCACAACA GCCTTGTGAA ACTGAAGCAT GGGGCAGGAG TTGCCATGGA

1401 TGGCCAGGAC ATCCAGCTCC CCCTCCTGAA AGGTGACCTC CGCATCCAGC

1451 ATACAGTGAC GGCCTCCGTG CGCCTCAGCT ACGGGGAGGA CCTGCAGATG 1501 GACTGGGATG GCCGCGGGAG GCTGCTGGTG AAGCTGTCCC CCGTCTATGC 1551 CGGGAAGACC TGCGGCCTGT GTGGGAATTA CAATGGCAAC CAGGGCGACG 1601 ACTTCCTTAC CCCCTCTGGG CTGGCGGAGC CCCGGGTGGA GGACTTCGGG 1651 AACGCCTGGA AGCTGCACGG GGACTGCCAG GACCTGCAGA AGCAGCACAG 1701 CGATCCCTGC GCCCTCAACC CGCGCATGAC CAGGTTCTCC GAGGAGGCGT 1751 GCGCGGTCCT GACGTCCCCC ACATTCGAGG CCTGCCATCG TGCCGTCAGC 1801 CCGCTGCCCT ACCTGCGGAA CTGCCGCTAC GACGTGTGCT CCTGCTCGGA 1851 CGGCCGCGAG TGCCTGTGCG GCGCCCTGGC CAGCTATGCC GCGGCCTGCG 1901 CGGGGAGAGG CGTGCGCGTC GCGTGGCGCG AGCCAGGCCG CTGTGAGCTG 1951 AACTGCCCGA AAGGCCAGGT GTACCTGCAG TGCGGGACCC CCTGCAACCT 2001 GACCTGCCGC TCTCTCTCTT ACCCGGATGA GGAATGCAAT GAGGCCTGCC 2051 TGGAGGGCTG CTTCTGCCCC CCAGGGCTCT ACATGGATGA GAGGGGGGAC 2101 TGCGTGCCCA AGGCCCAGTG CCCCTGTTAC TATGACGGTG AGATCTTCCA 2151 GCCAGAAGAC ATCTTCTCAG ACCATCACAC CATGTGCTAC TGTGAGGATG 2201 GCTTCATGCA CTGTACCATG AGTGGAGTCC CCGGAAGCTT GCTGCCTGAC 2251 GCTGTCCTCA GCAGTCCCCT GTCTCATCGC AGCAAAAGGA GCCTATCCTG 2301 TCGGCCCCCC ATGGTCAAGC TGGTGTGTCC CGCTGACAAC CTGCGGGCTG 2351 AAGGGCTCGA GTGTACCAAA ACGTGCCAGA ACTATGACCT GGAGTGCATG 2401 AGCATGGGCT GTGTCTCTGG CTGCCTCTGC CCCCCGGGCA TGGTCCGGCA 2451 TGAGAACAGA TGTGTGGCCC TGGAAAGGTG TCCCTGCTTC CATCAGGGCA 2501 AGGAGTATGC CCCTGGAGAA ACAGTGAAGA TTGGCTGCAA CACTTGTGTC 2551 TGTCGGGACC GGAAGTGGAA CTGCACAGAC CATGTGTGTG ATGCCACGTG 2601 CTCCACGATC GGCATGGCCC ACTACCTCAC CTTCGACGGG CTCAAATACC 2651 TGTTCCCCGG GGAGTGCCAG TACGTTCTGG TGCAGGATTA CTGCGGCAGT 2701 AACCCTGGGA CCTTTCGGAT CCTAGTGGGG AATAAGGGAT GCAGCCACCC 2751 CTCAGTGAAA TGCAAGAAAC GGGTCACCAT CCTGGTGGAG GGAGGAGAGA 2801 TTGAGCTGTT TGACGGGGAG GTGAATGTGA AGAGGCCCAT GAAGGATGAG 2851 ACTCACTTTG AGGTGGTGGA GTCTGGCCGG TACATCATTC TGCTGCTGGG 2901 CAAAGCCCTC TCCGTGGTCT GGGACCGCCA CCTGAGCATC TCCGTGGTCC 2951 TGAAGCAGAC ATACCAGGAG AAAGTGTGTG GCCTGTGTGG GAATTTTGAT 3001 GGCATCCAGA ACAATGACCT CACCAGCAGC AACCTCCAAG TGGAGGAAGA 3051 CCCTGTGGAC TTTGGGAACT CCTGGAAAGT GAGCTCGCAG TGTGCTGACA 3101 CCAGAAAAGT GCCTCTGGAC TCATCCCCTG CCACCTGCCA TAACAACATC 3151 ATGAAGCAGA CGATGGTGGA TTCCTCCTGT AGAATCCTTA CCAGTGACGT 3201 CTTCCAGGAC TGCAACAAGC TGGTGGACCC CGAGCCATAT CTGGATGTCT 3251 GCATTTACGA CACCTGCTCC TGTGAGTCCA TTGGGGACTG CGCCGCATTC 3301 TGCGACACCA TTGCTGCCTA TGCCCACGTG TGTGCCCAGC ATGGCAAGGT 3351 GGTGACCTGG AGGACGGCCA CATTGTGCCC CCAGAGCTGC GAGGAGAGGA 3401 ATCTCCGGGA GAACGGGTAT GAGGCTGAGT GGCGCTATAA CAGCTGTGCA 3451 CCTGCCTGTC AAGTCACGTG TCAGCACCCT GAGCCACTGG CCTGCCCTGT 3501 GCAGTGTGTG GAGGGCTGCC ATGCCCACTG CCCTCCAGGG AAAATCCTGG 3551 ATGAGCTTTT GCAGACCTGC GTTGACCCTG AAGACTGTCC AGTGTGTGAG 3601 GTGGCTGGCC GGCGTTTTGC CTCAGGAAAG AAAGTCACCT TGAATCCCAG 3651 TGACCCTGAG CACTGCCAGA TTTGCCACTG TGATGTTGTC AACCTCACCT 3701 GTGAAGCCTG CCAGGAGCCG ATATCGGGCG CGCCAACATC AGAGAGCGCC 3751 ACCCCTGAAA GTGGTCCCGG GAGCGAGCCA GCCACATCTG GGTCGGAAAC 3801 GCCAGGCACA AGTGAGTCTG CAACTCCCGA GTCCGGACCT GGCTCCGAGC 3851 CTGCCACTAG CGGCTCCGAG ACTCCGGGAA CTTCCGAGAG CGCTACACCA 3901 GAAAGCGGAC CCGGAACCAG TACCGAACCT AGCGAGGGCT CTGCTCCGGG 3951 CAGCCCAGCC GGCTCTCCTA CATCCACGGA GGAGGGCACT TCCGAATCCG 4001 CCACCCCGGA GTCAGGGCCA GGATCTGAAC CCGCTACCTC AGGCAGTGAG 4051 ACGCCAGGAA CGAGCGAGTC CGCTACACCG GAGAGTGGGC CAGGGAGCCC 4101 TGCTGGATCT CCTACGTCCA CTGAGGAAGG GTCACCAGCG GGCTCGCCCA 4151 CCAGCACTGA AGAAGGTGCC TCGAGCGACA AAACTCACAC ATGCCCACCG 4201 TGCCCAGCTC CAGAACTCCT GGGCGGACCG TCAGTCTTCC TCTTCCCCCC 4251 AAAACCCAAG GACACCCTCA TGATCTCCCG GACCCCTGAG GTCACATGCG 4301 TGGTGGTGGA CGTGAGCCAC GAAGACCCTG AGGTCAAGTT CAACTGGTAC 4351 GTGGACGGCG TGGAGGTGCA TAATGCCAAG ACAAAGCCGC GGGAGGAGCA

4401 GTACAACAGC ACGTACCGTG TGGTCAGCGT CCTCACCGTC CTGCACCAGG 4451 ACTGGCTGAA TGGCAAGGAG TACAAGTGCA AGGTCTCCAA CAAAGCCCTC 4501 CCAGCCCCCA TCGAGAAAAC CATCTCCAAA GCCAAAGGGC AGCCCCGAGA 4551 ACCACAGGTG TACACCCTGC CCCCATCCCG GGATGAGCTG ACCAAGAACC 4601 AGGTCAGCCT GACCTGCCTG GTCAAAGGCT TCTATCCCAG CGACATCGCC 4651 GTGGAGTGGG AGAGCAATGG GCAGCCGGAG AACAACTACA AGACCACGCC 4701 TCCCGTGTTG GACTCCGACG GCTCCTTCTT CCTCTACAGC AAGCTCACCG 4751 TGGACAAGAG CAGGTGGCAG CAGGGGAACG TCTTCTCATG CTCCGTGATG 4801 CATGAGGCTC TGCACAACCA CTACACGCAG AAGAGCCTCT CCCTGTCTCC 4851 GGGTAAATGA

Secuencia proteínica de pSYN VWF062 (VWF D'D3-Fc sin sitio para trombina en el conector) (SEQ ID NO: 199)

1 MIPARFAGVL LALALILPGT LCAEGTRGRS STARCSLFGS DFVNTFDGSM

51 YSFAGYCSYL LAGGCQKRSF SIIGDFQNGK RVSLSVYLGE FFDIHLFVNG

101 TVTQGDQRVS MPYASKGLYL ETEAGYYKLS GEAYGFVARI DGSGNFQVLL

151 SDRYFNKTCG LCGNFNIFAE DDFMTQEGTL TSDPYDFANS WALSSGEQWC

201 ERASPPSSSC NISSGEMQKG LWEQCQLLKS TSVFARCHPL VDPEPFVALC

251 EKTLCECAGG LECACPALLE YARTCAQEGM VLYGWTDHSA CSPVCPAGME

301 YRQCVSPCAR TCQSLHINEM CQERCVDGCS CPEGQLLDEG LCVESTECPC

351 VHSGKRYPPG TSLSRDCNTC ICRNSQWICS NEECPGECLV TGQSHFKSFD

401 NRYFTFSGIC QYLLARDCQD HSFSIVIETV QCADDRDAVC TRSVTVRLPG

451 LHNSLVKLKH GAGVAMDGQD IQLPLLKGDL RIQHTVTASV RLSYGEDLQM

501 DWDGRGRLLV KLSPVYAGKT CGLCGNYNGN QGDDFLTPSG LAEPRVEDFG

551 NAWKLHGDCQ DLQKQHSDPC ALNPRMTRFS EEACAVLTSP TFEACHRAVS

601 PLPYLRNCRY DVCSCSDGRE CLCGALASYA AACAGRGVRV AWREPGRCEL

651 NCPKGQVYLQ CGTPCNLTCR SLSYPDEECN EACLEGCFCP PGLYMDERGD

701 CVPKAQCPCY YDGEIFQPED IFSDHHTMCY CEDGFMHCTM SGVPGSLLPD

751 AVLSSPLSHR SKRSLSCRPP MVKLVCPADN LRAEGLECTK TCQNYDLECM

801 SMGCVSGCLC PPGMVRHENR CVALERCPCF HQGKEYAPGE TVKIGCNTCV

851 CRDRKWNCTD HVCDATCSTI GMAHYLTFDG LKYLFPGECQ YVLVQDYCGS

901 NPGTFRILVG NKGCSHPSVK CKKRVTILVE GGEIELFDGE VNVKRPMKDE

951 THFEWESGR YIILLLGKAL SWWDRHLSI SWLKQTYQE KVCGLCGNFD

1001 GIQNNDLTSS NLQVEEDPVD FGNSWKVSSQ CADTRKVPLD SSPATCHNNI

1051 MKQTMVDSSC RILTSDVFQD CNKLVDPEPY LDVCIYDTCS CESIGDCAAF

1101 CDTIAAYAHV CAQHGKWTW RTATLCPQSC EERNLRENGY EAEWRYNSCA

1151 PACQVTCQHP EPLACPVQCV EGCHAHCPPG KILDELLQTC VDPEDCPVCE

1201 VAGRRFASGK KVTLNPSDPE HCQICHCDW NLTCEACQEP ISGAPTSESA

1251 TPESGPGSEP ATSGSETPGT SESATPESGP GSEPATSGSE TPGTSESATP

1301 ESGPGTSTEP SEGSAPGSPA GSPTSTEEGT SESATPESGP GSEPATSGSE

1351 TPGTSESATP ESGPGSPAGS PTSTEEGSPA GSPTSTEEGA SSDKTHTCPP

1401 CPAPELLGGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVWDVSH EDPEVKFNWY

1451 VDGVEVHNAK TKPREEQYNS TYRWSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL

1501 PAPIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPSRDEL TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA

1551 VEWESNGQPE NNYKTTPPVL DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM

1601 HEALHNHYTQ KSLSLSPGK*

Secuencia de nucleótidos de pSYN VWF073 (que codifica VWFD1D2D'D3-XTEN AE144-sitio para trombina a2 truncado de FVIII-Fc) (SEQ ID NO:174)

1 ATGATTCCTG CCAGATTTGC CGGGGTGCTG CTTGCTCTGG CCCTCATTTT

51 GCCAGGGACC CTTTGTGCAG AAGGAACTCG CGGCAGGTCA TCCACGGCCC

101 GATGCAGCCT TTTCGGAAGT GACTTCGTCA ACACCTTTGA TGGGAGCATG

151 TACAGCTTTG CGGGATACTG CAGTTACCTC CTGGCAGGGG GCTGCCAGAA

201 ACGCTCCTTC TCGATTATTG GGGACTTCCA GAATGGCAAG AGAGTGAGCC 251 TCTCCGTGTA TCTTGGGGAA TTTTTTGACA TCCATTTGTT TGTCAATGGT 301 ACCGTGACAC AGGGGGACCA AAGAGTCTCC ATGCCCTATG CCTCCAAAGG 351 GCTGTATCTA GAAACTGAGG CTGGGTACTA CAAGCTGTCC GGTGAGGCCT 401 ATGGCTTTGT GGCCAGGATC GATGGCAGCG GCAACTTTCA AGTCCTGCTG 451 TCAGACAGAT ACTTCAACAA GACCTGCGGG CTGTGTGGCA ACTTTAACAT 501 CTTTGCTGAA GATGACTTTA TGACCCAAGA AGGGACCTTG ACCTCGGACC 551 CTTATGACTT TGCCAACTCA TGGGCTCTGA GCAGTGGAGA ACAGTGGTGT 601 GAACGGGCAT CTCCTCCCAG CAGCTCATGC AACATCTCCT CTGGGGAAAT 651 GCAGAAGGGC CTGTGGGAGC AGTGCCAGCT TCTGAAGAGC ACCTCGGTGT 701 TTGCCCGCTG CCACCCTCTG GTGGACCCCG AGCCTTTTGT GGCCCTGTGT 751 GAGAAGACTT TGTGTGAGTG TGCTGGGGGG CTGGAGTGCG CCTGCCCTGC 801 CCTCCTGGAG TACGCCCGGA CCTGTGCCCA GGAGGGAATG GTGCTGTACG 851 GCTGGACCGA CCACAGCGCG TGCAGCCCAG TGTGCCCTGC TGGTATGGAG 901 TATAGGCAGT GTGTGTCCCC TTGCGCCAGG ACCTGCCAGA GCCTGCACAT 951 CAATGAAATG TGTCAGGAGC GATGCGTGGA TGGCTGCAGC TGCCCTGAGG 1001 GACAGCTCCT GGATGAAGGC CTCTGCGTGG AGAGCACCGA GTGTCCCTGC 1051 GTGCATTCCG GAAAGCGCTA CCCTCCCGGC ACCTCCCTCT CTCGAGACTG 1101 CAACACCTGC ATTTGCCGAA ACAGCCAGTG GATCTGCAGC AATGAAGAAT 1151 GTCCAGGGGA GTGCCTTGTC ACTGGTCAAT CCCACTTCAA GAGCTTTGAC 1201 AACAGATACT TCACCTTCAG TGGGATCTGC CAGTACCTGC TGGCCCGGGA 1251 TTGCCAGGAC CACTCCTTCT CCATTGTCAT TGAGACTGTC CAGTGTGCTG 1301 ATGACCGCGA CGCTGTGTGC ACCCGCTCCG TCACCGTCCG GCTGCCTGGC 1351 CTGCACAACA GCCTTGTGAA ACTGAAGCAT GGGGCAGGAG TTGCCATGGA 1401 TGGCCAGGAC ATCCAGCTCC CCCTCCTGAA AGGTGACCTC CGCATCCAGC 1451 ATACAGTGAC GGCCTCCGTG CGCCTCAGCT ACGGGGAGGA CCTGCAGATG 1501 GACTGGGATG GCCGCGGGAG GCTGCTGGTG AAGCTGTCCC CCGTCTATGC 1551 CGGGAAGACC TGCGGCCTGT GTGGGAATTA CAATGGCAAC CAGGGCGACG 1601 ACTTCCTTAC CCCCTCTGGG CTGGCGGAGC CCCGGGTGGA GGACTTCGGG 1651 AACGCCTGGA AGCTGCACGG GGACTGCCAG GACCTGCAGA AGCAGCACAG 1701 CGATCCCTGC GCCCTCAACC CGCGCATGAC CAGGTTCTCC GAGGAGGCGT 1751 GCGCGGTCCT GACGTCCCCC ACATTCGAGG CCTGCCATCG TGCCGTCAGC 1801 CCGCTGCCCT ACCTGCGGAA CTGCCGCTAC GACGTGTGCT CCTGCTCGGA 1851 CGGCCGCGAG TGCCTGTGCG GCGCCCTGGC CAGCTATGCC GCGGCCTGCG 1901 CGGGGAGAGG CGTGCGCGTC GCGTGGCGCG AGCCAGGCCG CTGTGAGCTG 1951 AACTGCCCGA AAGGCCAGGT GTACCTGCAG TGCGGGACCC CCTGCAACCT 2001 GACCTGCCGC TCTCTCTCTT ACCCGGATGA GGAATGCAAT GAGGCCTGCC 2051 TGGAGGGCTG CTTCTGCCCC CCAGGGCTCT ACATGGATGA GAGGGGGGAC 2101 TGCGTGCCCA AGGCCCAGTG CCCCTGTTAC TATGACGGTG AGATCTTCCA 2151 GCCAGAAGAC ATCTTCTCAG ACCATCACAC CATGTGCTAC TGTGAGGATG 2201 GCTTCATGCA CTGTACCATG AGTGGAGTCC CCGGAAGCTT GCTGCCTGAC 2251 GCTGTCCTCA GCAGTCCCCT GTCTCATCGC AGCAAAAGGA GCCTATCCTG 2301 TCGGCCCCCC ATGGTCAAGC TGGTGTGTCC CGCTGACAAC CTGCGGGCTG 2351 AAGGGCTCGA GTGTACCAAA ACGTGCCAGA ACTATGACCT GGAGTGCATG 2401 AGCATGGGCT GTGTCTCTGG CTGCCTCTGC CCCCCGGGCA TGGTCCGGCA 2451 TGAGAACAGA TGTGTGGCCC TGGAAAGGTG TCCCTGCTTC CATCAGGGCA 2501 AGGAGTATGC CCCTGGAGAA ACAGTGAAGA TTGGCTGCAA CACTTGTGTC 2551 TGTCGGGACC GGAAGTGGAA CTGCACAGAC CATGTGTGTG ATGCCACGTG 2601 CTCCACGATC GGCATGGCCC ACTACCTCAC CTTCGACGGG CTCAAATACC 2651 TGTTCCCCGG GGAGTGCCAG TACGTTCTGG TGCAGGATTA CTGCGGCAGT 2701 AACCCTGGGA CCTTTCGGAT CCTAGTGGGG AATAAGGGAT GCAGCCACCC 2751 CTCAGTGAAA TGCAAGAAAC GGGTCACCAT CCTGGTGGAG GGAGGAGAGA 2801 TTGAGCTGTT TGACGGGGAG GTGAATGTGA AGAGGCCCAT GAAGGATGAG 2851 ACTCACTTTG AGGTGGTGGA GTCTGGCCGG TACATCATTC TGCTGCTGGG 2901 CAAAGCCCTC TCCGTGGTCT GGGACCGCCA CCTGAGCATC TCCGTGGTCC 2951 TGAAGCAGAC ATACCAGGAG AAAGTGTGTG GCCTGTGTGG GAATTTTGAT 3001 GGCATCCAGA ACAATGACCT CACCAGCAGC AACCTCCAAG TGGAGGAAGA 3051 CCCTGTGGAC TTTGGGAACT CCTGGAAAGT GAGCTCGCAG TGTGCTGACA 3101 CCAGAAAAGT GCCTCTGGAC TCATCCCCTG CCACCTGCCA TAACAACATC 3151 ATGAAGCAGA CGATGGTGGA TTCCTCCTGT AGAATCCTTA CCAGTGACGT

3201 CTTCCAGGAC TGCAACAAGC TGGTGGACCC CGAGCCATAT CTGGATGTCT

3251 GCATTTACGA CACCTGCTCC TGTGAGTCCA TTGGGGACTG CGCCGCATTC

3301 TGCGACACCA TTGCTGCCTA TGCCCACGTG TGTGCCCAGC ATGGCAAGGT

3351 GGTGACCTGG AGGACGGCCA CATTGTGCCC CCAGAGCTGC GAGGAGAGGA

3401 ATCTCCGGGA GAACGGGTAT GAGGCTGAGT GGCGCTATAA CAGCTGTGCA

3451 CCTGCCTGTC AAGTCACGTG TCAGCACCCT GAGCCACTGG CCTGCCCTGT

3501 GCAGTGTGTG GAGGGCTGCC ATGCCCACTG CCCTCCAGGG AAAATCCTGG

3551 ATGAGCTTTT GCAGACCTGC GTTGACCCTG AAGACTGTCC AGTGTGTGAG

3601 GTGGCTGGCC GGCGTTTTGC CTCAGGAAAG AAAGTCACCT TGAATCCCAG

3651 TGACCCTGAG CACTGCCAGA TTTGCCACTG TGATGTTGTC AACCTCACCT

3701 GTGAAGCCTG CCAGGAGCCG GGCGCGCCAA CATCAGAGAG CGCCACCCCT

3751 GAAAGTGGTC CCGGGAGCGA GCCAGCCACA TCTGGGTCGG AAACGCCAGG

3801 CACAAGTGAG TCTGCAACTC CCGAGTCCGG ACCTGGCTCC GAGCCTGCCA

3851 CTAGCGGCTC CGAGACTCCG GGAACTTCCG AGAGCGCTAC ACCAGAAAGC

3901 GGACCCGGAA CCAGTACCGA ACCTAGCGAG GGCTCTGCTC CGGGCAGCCC

3951 AGCCGGCTCT CCTACATCCA CGGAGGAGGG CACTTCCGAA TCCGCCACCC

4001 CGGAGTCAGG GCCAGGATCT GAACCCGCTA CCTCAGGCAG TGAGACGCCA

4051 GGAACGAGCG AGTCCGCTAC ACCGGAGAGT GGGCCAGGGA GCCCTGCTGG

4101 ATCTCCTACG TCCACTGAGG AAGGGTCACC AGCGGGCTCG CCCACCAGCA

4151 CTGAAGAAGG TGCCTCGAGC GGCGGTGGAG GATCCGGTGG CGGGGGATCC

4201 GGTGGCGGGG GATCCGGTGG CGGGGGATCC GGTGGCGGGG GATCCGGTGG

4251 CGGGGGATCC ATTGAACCAA GAAGCTTCTC TGGCAGCGGA GGCGACAAAA

4301 CTCACACATG CCCACCGTGC CCAGCTCCAG AACTCCTGGG CGGACCGTCA

4351 GTCTTCCTCT TCCCCCCAAA ACCCAAGGAC ACCCTCATGA TCTCCCGGAC

4401 CCCTGAGGTC ACATGCGTGG TGGTGGACGT GAGCCACGAA GACCCTGAGG

4451 TCAAGTTCAA CTGGTACGTG GACGGCGTGG AGGTGCATAA TGCCAAGACA

4501 AAGCCGCGGG AGGAGCAGTA CAACAGCACG TACCGTGTGG TCAGCGTCCT

4551 CACCGTCCTG CACCAGGACT GGCTGAATGG CAAGGAGTAC AAGTGCAAGG

4601 TCTCCAACAA AGCCCTCCCA GCCCCCATCG AGAAAACCAT CTCCAAAGCC

4651 AAAGGGCAGC CCCGAGAACC ACAGGTGTAC ACCCTGCCCC CATCCCGGGA

4701 TGAGCTGACC AAGAACCAGG TCAGCCTGAC CTGCCTGGTC AAAGGCTTCT

4751 ATCCCAGCGA CATCGCCGTG GAGTGGGAGA GCAATGGGCA GCCGGAGAAC

4801 AACTACAAGA CCACGCCTCC CGTGTTGGAC TCCGACGGCT CCTTCTTCCT

4851 CTACAGCAAG CTCACCGTGG ACAAGAGCAG GTGGCAGCAG GGGAACGTCT

4901 TCTCATGCTC CGTGATGCAT GAGGCTCTGC ACAACCACTA CACGCAGAAG

4951 AGCCTCTCCC TGTCTCCGGG TAAATGA

Secuencia proteínica de pSYN VWF073 (VWFD1D2D'D3-XTEN AE144-sitio para trombina a2 truncado-Fc) (SEQ ID NO: 175)

1 MIPARFAGVL LALALILPGT LCAEGTRGRS STARCSLFGS DFVNTFDGSM

51 YSFAGYCSYL LAGGCQKRSF SIIGDFQNGK RVSLSVYLGE FFDIHLFVNG

101 TVTQGDQRVS MPYASKGLYL ETEAGYYKLS GEAYGFVARI DGSGNFQVLL

151 SDRYFNKTCG LCGNFNIFAE DDFMTQEGTL TSDPYDFANS WALSSGEQWC

201 ERASPPSSSC NISSGEMQKG LWEQCQLLKS TSVFARCHPL VDPEPFVALC

251 EKTLCECAGG LECACPALLE YARTCAQEGMVLYGWTDHSA CSPVCPAGME

301 YRQCVSPCAR TCQSLHINEM CQERCVDGCS CPEGQLLDEG LCVESTECPC

351 VHSGKRYPPG TSLSRDCNTC ICRNSQWICSNEECPGECLV TGQSHFKSFD

401 NRYFTFSGIC QYLLARDCQD HSFSIVIETV QCADDRDAVC TRSVTVRLPG

451 LHNSLVKLKH GAGVAMDGQD IQLPLLKGDL RIQHTVTASV RLSYGEDLQM

501 DWDGRGRLLV KLSPVYAGKT CGLCGNYNGN QGDDFLTPSG LAEPRVEDFG

551 NAWKLHGDCQ DLQKQHSDPC ALNPRMTRFS EEACAVLTSP TFEACHRAVS

601 PLPYLRNCRY DVCSCSDGRE CLCGALASYAAACAGRGVRV AWREPGRCEL

651 NCPKGQVYLQ CGTPCNLTCR SLSYPDEECN EACLEGCFCP PGLYMDERGD

701 CVPKAQCPCY YDGEIFQPED IFSDHHTMCY CEDGFMHCTM SGVPGSLLPD

751 AVLSSPLSHR SKRSLSCRPP MVKLVCPADN LRAEGLECTK TCQNYDLECM

801 SMGCVSGCLC PPGMVRHENR CVALERCPCF HQGKEYAPGE TVKIGCNTCV 851 CRDRKWNCTD HVCDATCSTI GMAHYLTFDG LKYLFPGECQ YVLVQDYCGS 901 NPGTFRILVG NKGCSHPSVK CKKRVTILVE GGEIELFDGEVNVKRPMKDE 951 THFEWESGR YIILLLGKAL SVWDRHLSI SWLKQTYQE KVCGLCGNFD 1001 GIQNNDLTSS NLQVEEDPVD FGNSWKVSSQ CADTRKVPLD SSPATCHNNI 1051 MKQTMVDSSC RILTSDVFQD CNKLVDPEPY LDVCIYDTCS CESIGDCAAF 1101 CDTIAAYAHV CAQHGKWTW RTATLCPQSC EERNLRENGY EAEWRYNSCA 1151 PACQVTCQHP EPLACPVQCV EGCHAHCPPG KILDELLQTCVDPEDCPVCE 1201 VAGRRFASGK KVTLNPSDPE HCQICHCDW NLTCEACQEP GAPTSESATP 1251 ESGPGSEPAT SGSETPGTSE SATPESGPGS EPATSGSETP GTSESATPES 1301 GPGTSTEPSE GSAPGSPAGS PTSTEEGTSE SATPESGPGS EPATSGSETP 1351 GTSESATPES GPGSPAGSPT STEEGSPAGS PTSTEEGASS GGGGSGGGGS 1401 GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS IEPRSFSGSG GDKTHTCPPC PAPELLGGPS 1451 VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVWDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT 1501 KPREEQYNST YRWSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALPAPIEKTISKA 1551 KGQPREPQVY TLPPSRDELT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN 1601 NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK 1651 SLSLSPGK*

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una proteína quimérica que comprende

(i) un primer polipéptido, que comprende

(a) una proteína de factor VIII ("FVIII"),

(b) un XTEN del primer polipéptido, y

(c) una primera región Fc,

en la que la proteína FVIII tiene una actividad de FVIII; y

(ii) un segundo polipéptido, que comprende

(a) un fragmento de factor de Von Willebrand ("VWF'') que comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en los aminoácidos 764 a 1240 de SEQ ID NO: 21, (b) un XTEN del segundo polipéptido,

(c) un conector escindible de 10-50 aminoácidos que comprende una región a2 de FVIII que comprende la secuencia de aminoácidos de Glu720 a Arg740 del FVIII correspondiente a SEQ ID NO: 65, en la que la región a2 puede escindirse por trombina, y

(d) una segunda región Fc,

en la que el fragmento de VWF se une a la proteína FVIII;

en la que el XTEN del segundo polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 58; en la que el XTEN del primer polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 8; en la que la primera región Fc está asociada con la segunda región Fc mediante un enlace disulfuro; y

en la que la semivida de la proteína quimérica está prolongada en comparación con una proteína FVIII sin el fragmento de VWF.

2. Una proteína quimérica que comprende

(i) un primer polipéptido, que comprende

(a) una proteína de factor VIII ("FVIII"),

(b) un XTEN del primer polipéptido, y

(c) una primera región Fc,

en la que la proteína FVIII tiene una actividad de FVIII; y

(ii) un segundo polipéptido, que comprende

(a) un fragmento de factor de Von Willebrand ("VWF") que comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en los aminoácidos 764 a 1240 de SEQ ID NO: 21, (b) un XTEN del segundo polipéptido,

(d) una segunda región Fc,

en la que el fragmento de VWF se une a la proteína FVIII,

3. La proteína quimérica de la reivindicación 1 o 2, en la que la proteína FVIII es una isoforma de FVIII de cadena doble.

4. La proteína quimérica de la reivindicación 3, en la que la isoforma de FVIII de cadena doble comprende una primera cadena que comprende una cadena pesada de FVIII y una segunda cadena que comprende una cadena ligera de FVIII, en la que la cadena pesada y la cadena ligera se asocian entre sí mediante un enlace metálico.

5. La proteína quimérica de la reivindicación 1 o 2, en la que la proteína FVIII es una isoforma de FVIII de cadena sencilla.

6. La proteína quimérica de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 5, en la que la proteína FVIII tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 99 % idéntica a los aminoácidos 1 a 1438 de SEQ ID NO: 67, y en la que la proteína FVIII tiene actividad coagulante.

7. La proteína quimérica de la reivindicación 6, en la que el XTEN del primer polipéptido se inserta inmediatamente posterior del residuo correspondiente al residuo 745 de SEQ ID NO: 67.

8. La proteína quimérica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en la que el segundo polipéptido comprende un dominio D' y un dominio D3 de VWF fusionado a la segunda región Fc por el XTEN del segundo polipéptido entremedias,

en la que la secuencia de XTEN contiene menos de 288 residuos aminoacídicos, y

en la que el XTEN del segundo polipéptido está fusionado a la segunda región Fc por el conector escindible.

9. La proteína quimérica de la reivindicación 2, en la que el fragmento de VWF contiene un residuo de alanina sustituido en los residuos correspondientes a los residuos 1099 y 1142 de SEQ ID NO: 21.

10. La proteína quimérica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en la que la primera región Fc y la segunda región Fc son idénticas.

11. La proteína quimérica de la reivindicación 10, en la que la primera región Fc y la segunda región Fc se obtienen de IgG1 humana.

12. La proteína quimérica de la reivindicación 8, en la que el fragmento de VWF comprende además el dominio D1, el dominio D2 o los dominios D1 y D2 de VWF.

13. La proteína quimérica de la reivindicación 12, en la que:

(i) el primer polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 70; y

(ii) el segundo polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de ^sE^qID NO: 197.

14. La proteína quimérica de la reivindicación 13, en la que:

(i) el primer polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 70; y

(ii) el segundo polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de ^sE^qID NO: 197.

15. La proteína quimérica de cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en la que la proteína quimérica se puede obtener por un método de preparación de la proteína quimérica que comprende

(a) transfectar una célula hospedadora que comprende un polinucleótido o un conjunto de polinucleótidos que codifica la proteína quimérica, y

(b) cultivar la célula hospedadora en un medio de cultivo en condiciones adecuadas para expresar la proteína quimérica, en la que se expresa la proteína quimérica,

en la que el polinucleótido o el conjunto de polinucleótidos comprende la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID NO: 172 que codifica el primer polipéptido.

16. La proteína quimérica de cualquiera de las reivindicaciones 1-15, en la que el primer polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 173.

17. La proteína quimérica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en la que el fragmento de VWF consiste en el dominio D' y el dominio D3.

18. Un polinucleótido o un conjunto de polinucleótidos que codifica la proteína quimérica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 y 17.

19. Un vector o un conjunto de vectores que comprende el polinucleótido o el conjunto de polinucleótidos de la reivindicación 18 y uno o más promotores unidos de forma funcional al polinucleótido o el conjunto de polinucleótidos.

20. Una célula hospedadora que comprende el polinucleótido o el conjunto de polinucleótidos de la reivindicación 18 o el vector o el conjunto de vectores de la reivindicación 19.

21. Una línea celular estable que comprende la célula hospedadora de la reivindicación 20.

22. Una composición farmacéutica que comprende la proteína quimérica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 y 15 a 17 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

23. La proteína quimérica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 y 15 a 17 para su uso en el tratamiento de una enfermedad o afección hemorrágica en un sujeto que lo necesita.

24. La composición farmacéutica de la reivindicación 22 para su uso en el tratamiento de una enfermedad o afección hemorrágica en un sujeto que lo necesita.

25. La proteína quimérica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 y 15 a 17 para su uso en el tratamiento de hemofilia A en un sujeto que lo necesita.

26. La composición farmacéutica de la reivindicación 22 para su uso en el tratamiento de hemofilia A en un sujeto que lo necesita.