EA044115B1 - Химерные белки фактора viii и их применение - Google Patents

Химерные белки фактора viii и их применение Download PDF

Info

Publication number
EA044115B1
EA044115B1 EA201691111 EA044115B1 EA 044115 B1 EA044115 B1 EA 044115B1 EA 201691111 EA201691111 EA 201691111 EA 044115 B1 EA044115 B1 EA 044115B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
seq
fviii
domain
amino acid
vwf
Prior art date
Application number
EA201691111
Other languages
English (en)
Inventor
Экта Сет Чхабра
Туньяо Лю
Original Assignee
Биовератив Терапьютикс Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Биовератив Терапьютикс Инк. filed Critical Биовератив Терапьютикс Инк.
Publication of EA044115B1 publication Critical patent/EA044115B1/ru

Links

Description

Ссылка на перечень последовательностей, поданный в электронном виде
Полное содержание списка последовательностей, поданного в электронном виде в текстовом файле формата ASCII (название: 2159_441PC02_SequenceListing_ST25.txt; размер: 823500 байт; дата создания: 9
Января, 2015, включено в настоящий документ посредством ссылки.
Уровень техники
Гемофилия А - это нарушение свертываемости крови, вызываемое дефектами гена, кодирующего фактор свертывания крови VIII (FVIII), и поражающее 1-2 из 10000 новорожденных мальчиков. Graw et al., Nat. Rev. Genet. 6(6): 488-501 (2005). Пациентов с гемофилией А можно лечить путем инфузий очищенного или рекомбинантного FVIII. Все коммерчески доступные продукты FVIII, однако, как известно, имеют период полураспада около 8-12 ч, что требует частого внутривенного введения пациентам. См. Weiner M.A. и Cairo, M.S., Pediatric Hematology Secrets, Lee, M.T., 12. Disorders of Coagulation, Elsevier Health Sciences, 2001; Lillicrap, D. Thromb. Res. 122 Suppl 4:S2-8 (2008). Кроме того, был испробован ряд подходов, с целью продлить период полувыведения FVIII. Например, разрабатываемые подходы к продлению периода полувыведения факторов свертывания крови включают пегилирование, гликопегилирование и конъюгации с альбумином. См. Dumont et al., Blood. 119(13): 3024-3030 (опубликовано онлайн 13 января 2012 года). Тем не менее, по данным литературы, разрабатываемые в настоящее время препараты FVIII длительного действия, независимо от использованного метода белковой инженерии, имеют ограниченные периоды полувыведения - всего лишь до около 1,5-2 ч в доклинических исследованиях на животных моделях. См. там же. Согласующиеся результаты получены и у людей; например, сообщалось, что использование rFVIIIFc увеличивает период полувыведения максимум в около 1,7 раза по сравнению с таковым препарата ADVATE® у пациентов с гемофилией А. См. там же. Таким образом, несмотря на незначительные улучшения, увеличение периода полувыведения может указывать на наличие других ограничивающих факторов Т1/2. См. Liu, Т. et al., 2007 ISTH meeting, abstract #P-M-035; Henrik, A. et al., 2011 ISTH meeting, abstract #P=MO-181; Liu, T. et al., 2011 ISTH meeting abstract #P-WE-131.
Период полувыведения плазменного фактора фон Виллебранда (ФВ) составляет около 16 часов (варьируя от 13 до 18 ч). Goudemand J, et al., J Thromb Haemost 2005;3:2219-27. На период полувыведения ФВ может влиять ряд факторов: профиль гликозилирования, ADAMTS-13 (дезинтегрин и металлопротеаза с тромбоспондиновым мотивом-13) и различные мутации в гене ФВ.
В плазме 95-98% FVIII циркулирует в тесном нековалентном комплексе с полноразмерным ФВ. Образование этого комплекса важно для поддержания надлежащих плазменных уровней FVIII in vivo. Lenting et al., Blood. 92(11): 3983-96 (1998); Lenting et al., J. Thromb. Haemost. 5(7): 1353-60 (2007). Полноразмерный FVIII дикого типа в основном представлен в виде гетеродимера, состоящего из тяжелой цепи (молекулярная масса - 200 кД) и легкой цепи (молекулярная масса - 73 кДа). При активации FVIII путем протеолиза в позициях 372 и 740 тяжелой цепи и позиции 1689 легкой цепи ФВ, связанный с FVIII, отщепляется от активированного FVIII. Активированный FVIII вместе с активированным фактором IX, кальцием и фосфолипидом (теназный комплекс) индуцирует активацию фактора X, образуя тромбин в больших количествах. Тромбин, в свою очередь, расщепляет фибриноген с образованием растворимых мономеров, которые затем спонтанно полимеризуются, образуя растворимый фибриновый полимер. Тромбин также активирует фактор XIII, который совместно с кальцием перекрестно сшивает и стабилизирует растворимый фибриновый полимер, образуя перекрестно-связанный (нерастворимый) фибрин. Активированный FVIII быстро выводится из кровообращения путем протеолиза.
В связи с необходимостью частого введения и неудобствами, обусловленными схемой введения, все еще существует потребность в разработке препаратов FVIII, требующих менее частого введения, т.е. препарата FVIII, период полувыведения которого превышает вышеупомянутое 1,5-2-разовое ограничение.
Краткое изложение сущности изобретения
В настоящем изобретении предложен химерный белок, включающий (i) первый полипептид, состоящий из белка фактора VIII (FVIII), слитого с первой константной областью иммуноглобулина (ИГ) или ее частью, и (ii) второй полипептид, состоящий из белка фактора фон Виллебранда (ФВ), который включает домен D' и домен D3 ФВ, слитого со второй константной областью ИГ или ее частью посредством расположенной между ними последовательности XTEN, отличающийся тем, что последовательность XTEN содержит менее 288 аминокислотных остатков, и отличающийся тем, что первый полипептид связан или соединен со вторым полипептидом. Определенные варианты реализации изобретения включают химерный белок согласно описанию в настоящем документе, отличающийся тем, что последовательность XTEN во втором полипептиде состоит из аминокислотной последовательности длиной от 12 до 287 аминокислот.
Также раскрыт химерный белок согласно описанию в настоящем документе, отличающийся тем, что химерный белок демонстрирует более продолжительный период полувыведения по сравнению с соответствующим слитым белком, содержащим первый полипептид и второй полипептид, в котором второй полипептид в составе слитого белка включает последовательность XTEN, содержащую по меньшей мере 288 аминокислот. Некоторые варианты реализации изобретения включают последовательность XTEN AE288, содержащую по меньшей мере 288 аминокислот. В некоторых вариантах реализации изобретения AE288 представляет собой последовательность SEQ ID NO: 8.
- 1 044115
Также раскрыт химерный белок согласно описанию в настоящем документе, отличающийся тем, что последовательность XTEN второго полипептида содержит около 36, около 42, около 72 или около
144 аминокислот. В некоторых вариантах реализации изобретения последовательность XTEN второго полипептида выбрана из АЕ42, АЕ72, АЕ144, AG42, AG72 или AG144.
Некоторые варианты реализации изобретения включают химерный белок согласно описанию в настоящем документе, отличающийся тем, что последовательность XTEN второго полипептида выбрана из
SEQ ГО NO: 9, SEQ ГО NO: 10, SEQ ГО NO: И,
SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 56; SEQ ID NO: 57; SEQ ID NO: 58; SEQ ID NO: 58; SEQ ID
NO: 59; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 60; SEQ ID NO: 61; SEQ ID NO: 62; или SEQ ID NO: 63.
В определенных вариантах реализации изобретения первый полипептид дополнительно содержит вторую последовательность XTEN, которая связывает белок FVIII с первой константной областью ИГ или ее частью. Также раскрыт химерный белок согласно описанию в настоящем документе, отличающийся тем, что первый полипептид содержит третью последовательность XTEN, встроенную в один или более сайтов встраивания в пределах белка FVIII. В некоторых вариантах реализации изобретения первый полипептид дополнительно содержит вторую последовательность XTEN, встроенную в один или более сайтов встраивания в пределах белка FVIII. В определенных вариантах реализации изобретения первый полипептид содержит третью последовательность XTEN, которая связывает белок FVIII с первой константной областью ИГ или ее частью.
Также раскрыт химерный белок согласно описанию в настоящем документе, отличающийся тем, что вторая последовательность XTEN, третья последовательность XTEN или вторая и третья последовательности XTEN, каждая независимо от других, выбраны из АЕ42, АЕ72, АЕ864, АЕ576, AE288, АЕ144, AG864, AG576, AG288 и AG144. В некоторых вариантах реализации изобретения вторая последовательность XTEN, третья последовательность XTEN или вторая и третья последовательности XTEN, каждая независимо от других, выбраны из
SEQ ГО NO: 8; SEQ ГО NO: 9, SEQ ГО NO: 10, SEQ ГО
NO: 11, SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 54; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 16; SEQ ГО NO: 18;
SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 56; SEQ ID NO: 57; SEQ ID NO: 58; SEQ ID
NO: 59; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 60; SEQ ID NO: 61; SEQ ID NO: 62; или SEQ ID NO:
63.
В определенных вариантах реализации изобретения вторая последовательность XTEN, третья последовательность XTEN или и вторая, и третья последовательности XTEN, каждая независимо от других, представляют собой AE288 или AG288. В некоторых вариантах реализации изобретения последовательность XTEN во втором полипептиде слита со второй константной областью ИГ или ее частью посредством линкера. В определенных вариантах реализации изобретения линкер представляет собой расщепляемый линкер.
Некоторые варианты реализации изобретения включают химерный белок согласно описанию в настоящем документе, отличающийся тем, что линкер поддается расщеплению протеазой, выбранной из фактора XIa, фактора XIIa, калликреина, фактора VIIa, фактора IXa, фактора Ха, фактора IIa (тромбина), эластазы 2, гранзима В, протеазы вируса табачной гравировки (TEV), энтерокиназы, протеазы 3С, сортазы А, матриксной металлопротеазы-12 (ММР-12), ММР-13, ММР-17 и ММР-20. В некоторых вариантах реализации изобретения линкер поддается расщеплению фактором IIa (тромбином).
Также раскрыт химерный белок согласно описанию в настоящем документе, отличающийся тем, что линкер содержит один или более сайтов расщепления, содержащих аминокислотную последовательность, выбранную из
- 2 044115
RRRR (SEQ ID NO:
102), RKRRKR (SEQ ID NO: 103), RRRRS (SEQ ID NO: 104), TQSFNDFTR (SEQ ID NO:
1), SVSQTSKLTR (SEQ ID NO: 3), DFLAEGGGVR (SEQ ID NO: 4), TTKIKPR (SEQ ID NO: 5), LVPRG (SEQ ID NO: 6), ALRPR (SEQ ID NO: 7), KLTRAET (SEQ ID NO: 121), DFTRVVG (SEQ ID NO: 122), TMTRIVGG (SEQ ID NO: 123), SPFRSTGG (SEQ ID NO: 124), LQVRIVGG (SEQ ID NO: 125), PLGRIVGG (SEQ ID NO: 126), IEGRTVGG (SEQ ID NO: 127), LTPRSLLV (SEQ ID NO: 128), LGPVSGVP (SEQ ID NO: 129), VAGDSLEE (SEQ ID NO: 130), GPAGLGGA (SEQ ID NO: 131), GPAGLRGA (SEQ ID NO: 132), APLGLRLR (SEQ ID NO: 133), PALPLVAQ (SEQ ID NO: 134), ENLYFQG (SEQ ID NO: 135), DDDKIVGG (SEQ ID NO: 136), LEVLFQGP (SEQ ID NO: 137), LPKTGSES (SEQ ID NO: 138), DKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 88) и IEPRSFS (SEQ ID NO: 194).
В некоторых вариантах реализации изобретения линкер содержит последовательность TLDPRSFLLRNPNDKYEPFWEDEEK (SEQ ID NO. 146). в некоторых вариантах реализации изобретения сайты расщепления содержат аминокислотную последовательность LVPRG (SEQ ID NO.6). в других вариантах реализации изобретения сайт расщепления содержит аминокислотную последовательность IEPRSFS (SEQ ID NO: 194). в еще одних вариантах реализации изобретения сайт расщепления содержит аминокислотную последовательность IEPRSFS (SEQ ID NO. 194), причем сайт расщепления не представляет собой полноразмерную область a2 белка FVIII. В некоторых вариантах реализации изобретения сайт расщепления содержит фрагмент области a2 белка FVIII, содержащий по меньшей мере последовательность IEPR (SEQ ID NO. 200). в других вариантах реализации изобретения сайт расщепления содержит фрагмент области a2 белка FVIII, содержащий по меньшей мере последовательность IEPR (SEQ ID NO. 200), причем сайт расщепления не представляет собой полноразмерную область a2. В определенных вариантах реализации изобретения сайт расщепления поддается расщеплению в тесте на гидролиз тромбином, как предложено в настоящем документе или известно в данной области техники.
Некоторые варианты реализации изобретения включают химерный белок согласно описанию в настоящем документе, в котором первая константная область ИГ или ее часть содержит первый фрагмент Fc и/или вторая константная область ИГ или ее часть содержит второй фрагмент Fc. В некоторых вариантах реализации изобретения первая константная область ИГ или ее часть и вторая константная область ИГ или ее часть продлевают период полувыведения химерного белка. В некоторых вариантах реализации изобретения первый полипептид и второй полипептид слиты посредством линкера. В определенных вариантах реализации изобретения первый полипептид и второй полипептид слиты посредством процессируемого линкера. В некоторых вариантах реализации изобретения первая константная область ИГ или ее часть соединена со второй константной областью ИГ или ее частью. В определенных вариантах реализации изобретения первая константная область ИГ или ее часть соединена со второй константной областью ИГ или ее частью ковалентной связью. В некоторых вариантах реализации изобретения ковалентная связь представляет собой дисульфидную связь.
- 3 044115
Также описан химерный белок, включающий каждую из нижеприведенных формул (a)-(hh):
(a) FVin-Fl:F2-L2-X-Ll-V;
(b) FVin-Fl:V-Ll-X-L2-F2;
(с) Fl-FVni:F2-L2-X-Ll-V;
(d) Fl-FVni:V-Ll-X-L2-F2;
(е) FVin-X2-Fl:F2-L2-Xl-Ll-V;
(f) FVin-X2-Fl:V-Ll-Xl-L2-F2;
(g) FVin(X2)-Fl:F2-L2-Xl-Ll-V;
(h) FVin(X2)-Fl:V-Ll-Xl-L2-F2;
(i) F1-X2-F1:F2-L2-X1-L1-V;
(j) F1-X2-F1:V-L1-X1-L2-F2;
(k) V-L1-X-L2-F2-L3-FVIII-L4-F1;
(1) V-L1-X-L2-F2-L3-F1-L4-FVIII;
(m) F1-L4-FVDI-L3-F2-L2-X-L1-V;
(n) FVIII-L4-F1-L3-F2-L2-X-L1-V;
(o) FVIII-L4-F1-L3-V-L1-X-L2-F2;
(p) FVIII-L4-F1-L3-F2-L2-X-L1-V;
(q) F2-L2-X-Ll-V-L3-Fl-L4-FVin;
(r) F2-L2-X-L1-V-L3-FVIII-L4-F1;
(s) V-Ll-Xl-L2-F2-L3-FVni(X2)-L4-Fl;
(t) V-Ll-Xl-L2-F2-L3-Fl-L4-FVni(X2);
(u) Fl -L4-FVIII(X2)-L3 -F2-L2-X1 -L1 - V;
(v) F-L4-FVIII(X2)-L3 - V-L1 -X1-L2-F2;
(w) FVIII(X2)-L4-F 1-L3 - V-L 1 -X1-L2-F2;
(x) FVIII(X2)-L4-F 1-L3 -F2-L2-X1 -L1 - V;
(y) F2-L2-X1-L1-V-L3-F1-L4-FVIII(X2);
(z) F2-L2-X1-L1-V-L3-FVIII(X2)-L4-F1;
(aa) V-Ll-X2-L2-F2-L3-FVni-L4-X2-L5-Fl;
(bb) V-L 1-X2-L2-F2-L3-F1-L5-X2-L4-F VIII;
(cc) Fl -L5-X2-L4-FVni-L3 -F2-L2-X2-L1 -V;
(dd) F1-L5-X2-L4-FVIII-L3 - V-L 1-X2-L2-F2;
(ее) FVID-L5-X2-L4-F2-L3 - V-L 1 -X1-L2-F1;
(ff) FVID-L5-X2-L4-F2-L3 -Fl -L2-X1 -L1 - V;
(gg) F1-L2-X1-L1-V-L3-F2-L4-X2-L5-FVIII; или (hh) F1-L2-X1 -L1 - V-L3 -FVIII-L5-X2-L4-F2;
где V представляет собой белок ФВ, содержащий домен D' и домен D3, X или X1 представляет собой первую последовательность XTEN, содержащую менее 288 аминокислот, Х2 представляет собой вторую последовательность XTEN, FVIII содержит белок FVIII, FVIII(X2) включает белок FVIII со второй последовательностью XTEN, встроенной в один или более сайтов встраивания в пределах белка FVIII, F1 представляет собой первую константную область ИГ или ее часть, F2 представляет собой вторую константную область ИГ или ее часть, L1, L2, L3, L4 или L5 представляет собой необязательный линкер, (-) представляет собой пептидную связь и (:) представляет собой ковалентную или нековалентную связь.
Некоторые варианты реализации изобретения включают химерный белок согласно описанию в на- 4 044115 стоящем документе, отличающийся тем, что X или X1 состоит из аминокислотной последовательности длиной от 12 до 287 аминокислот.
В определенных вариантах реализации изобретения химерный белок согласно описанию в настоящем документе демонстрирует более продолжительный период полувыведения по сравнению с соответствующим химерным белком, включающим в себя приведенную формулу, с тем исключением, что X или X1 представляет собой AE288. В некоторых вариантах реализации изобретения AE288 представляет собой SEQ ID NO: 8.
Некоторые варианты реализации изобретения включают химерный белок согласно описанию в настоящем документе, отличающийся тем, что X или X1 в формуле содержит около 36, около 42, около 72 или около 144 аминокислот. В определенных вариантах реализации изобретения X или X1 в формуле выбрана из AE42, AE72, AE144, AG42, AG72 или AG144. В некоторых вариантах реализации изобретения X или X1 в формуле выбрана из
SEQ ID NO: 9, SEQ Ш NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 55; SEQ
ID NO: 56; SEQ ID NO: 57; SEQ ID NO: 58; SEQ ID NO: 59; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO:
60; SEQ ID NO: 61; SEQ ID NO: 62; или SEQ ID NO: 63.
В определенных вариантах реализации изобретения Х2 содержит аминокислотную последовательность длиной по меньшей мере около 36 аминокислот, по меньшей мере около 42 аминокислот, по меньшей мере около 144 аминокислот, по меньшей мере около 288 аминокислот, по меньшей мере около 576 аминокислот, по меньшей мере около 864 аминокислот. В определенных вариантах реализации изобретения Х2 выбрана из AE42, AE72, AE864, AE576, AE288, AE144, AG864, AG576, AG288 и AG144. В некоторых вариантах реализации изобретения Х2 выбрана из
SEQ Ш NO: 8; SEQ Ш NO: 9; SEQ ГО NO: 10; SEQ
ID NO: 11; SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 54; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 56; SEQ ID NO: 57; SEQ ID NO: 58; SEQ
ID NO: 59; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 60; SEQ ID NO: 61; SEQ ID NO: 62; или SEQ ID
NO: 63.
В определенных вариантах реализации изобретения Х2 представляет собой AE288 или AG288.
Также раскрыт химерный белок согласно описанию в настоящем документе, содержащий X или X1 и/или Х2, который демонстрирует более продолжительный период полувыведения по сравнению с химерным белком, не содержащим X или X1 и/или Х2. В некоторых вариантах реализации изобретения L1 и/или L2 представляет собой расщепляемый линкер. В определенных вариантах реализации изобретения L4 и/или L5 представляет собой расщепляемый линкер. В определенных вариантах реализации изобретения линкер поддается расщеплению протеазой, выбранной из фактора XIa, фактора XIIa, калликреина, фактора VIIa, фактора IXa, фактора Ха, фактора IIa (тромбина), эластазы 2, гранзима В, протеазы TEV, энтерокиназы, протеазы 3С, сортазы А, ММР-12, ММР-13, ММР-17 и ММР-20. В некоторых вариантах реализации изобретения линкер поддается расщеплению фактором IIa (тромбином).
Некоторые варианты реализации изобретения включают химерный белок согласно описанию в настоящем документе, отличающийся тем, что линкер содержит один или более сайтов расщепления, содержащих аминокислотную последовательность, выбранную из
RRRR (SEQ ГО NO: 102), RKRRKR (SEQ ГО NO: 103), RRRRS (SEQ ГО NO:
104), TQSFNDFTR (SEQ ID NO: 2), SVSQTSKLTR (SEQ ID NO: 3), DFLAEGGGVR (SEQ ID NO: 4), TTKIKPR (SEQ ID NO: 5), LVPRG (SEQ ID NO: 6), ALRPR (SEQ ID NO: 7), KLTRAET (SEQ ID NO: 121), DFTRVVG (SEQ ID NO: 122), TMTRIVGG (SEQ ID NO:
123), SPFRSTGG (SEQ ID NO: 124), LQVRIVGG (SEQ ID NO: 125), PLGRIVGG (SEQ ID NO: 126), IEGRTVGG (SEQ ID NO: 127), LTPRSLLV (SEQ ID NO: 128), LGPVSGVP (SEQ ID NO: 129), VAGDSLEE (SEQ ID NO: 130), GPAGLGGA (SEQ ID NO: 131), GPAGLRGA (SEQ ID NO: 132), APLGLRLR (SEQ ID NO: 133), PALPLVAQ (SEQ ID NO: 134), ENLYFQG (SEQ ID NO: 135), DDDKIVGG (SEQ ID NO: 136), LEVLFQGP (SEQ ID NO:
137) и LPKTGSES (SEQ ID NO: 138).
В некоторых вариантах реализации изобретения линкер содержит последовательность TLDPRSFLLRNPNDKYEPFWEDEEK (SEQ ID NO: 146). в определенных вариантах реализации изобретения линкер содержит аминокислотную последовательность LVPRG (SEQ ID NO: 6). в некоторых вариантах реализации изобретения линкер содержит область a1 FVIII, область а2 FVIII, область а3 FVIII или любое их сочетание. В определенных вариантах реализации изобретения линкер содержит фрагмент области а2 FVIII. В некоторых случаях фрагмент области а2 может содержать последовательность DKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 88). в еще одних вариантах реали- 5 044115 зации изобретения может быть использован меньший фрагмент области а2 FVIII, включая фрагмент с последовательностью IEPRSFS (SEQ ID NO: 194). в одном конкретном варианте реализации изобретения линкер содержит аминокислотную последовательность IEPRSFS (SEQ ID NO. 194). в другом варианте реализации изобретения линкер содержит аминокислотную последовательность
IEPRSFS (SEQ ID NO. 194), причем линкер не представляет собой полноразмерную область а2 FVIII.
Также раскрыт химерный белок согласно описанию в настоящем документе, отличающийся тем, что область а2 FVIII содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере около на 80%, около на 85%, около на 90%, около на 95% или 100% идентичную либо последовательности ISDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (seq id no: 106) либо последовательности DKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 88). в некоторых вариантах реализации изобретения область a1 содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на около 80%, около 85%, около 90%, около 95% или 100% идентичную последовательности ISMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSV (SEQ ID NO: 107).
В определенных вариантах реализации изобретения область a3 содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере около на 80%, около на 85%, около на 90%, около на 95% или 100% идентичную последовательности
ISEITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQ (SEQ Ш NO: 108).
В некоторых вариантах реализации изобретения F1 содержит первый фрагмент Fc и/или F2 содержит второй фрагмент Fc.
Некоторые варианты реализации изобретения включают химерный белок согласно описанию в настоящем документе, отличающийся тем, что химерный белок, содержащий F1 и F2, демонстрирует более продолжительный период полувыведения по сравнению с химерным белком, не содержащим F1 или F2. В определенных вариантах реализации изобретения L3 представляет собой расщепляемый линкер. В некоторых вариантах реализации изобретения белок ФВ соединен с белком FVIII нековалентной связью. В некоторых вариантах реализации изобретения период полувыведения химерного белка является продленным по сравнению с белком FVIII без белка ФВ и/или последовательности XTEN или по сравнению с FVIII дикого типа. В некоторых вариантах реализации изобретения период полувыведения химерного белка по меньшей мере в около 1,5 раза, по меньшей мере в около 2 раза, по меньшей мере в около 2,5 раза, по меньшей мере в около 3 раза, по меньшей мере в около 4 раза, по меньшей мере в около 5 раз, по меньшей мере в около 6 раз, по меньшей мере в около 7 раз, по меньшей мере в около 8 раз, по меньшей мере в около 9 раз, по меньшей мере в около 10 раз, по меньшей мере в около 11 раз или по меньшей мере в около 12 раз более продолжителен, чем таковой белка FVIII без белка ФВ или последовательности XTEN или чем таковой белка FVIII дикого типа.
Также раскрыт химерный белок согласно описанию в настоящем документе, отличающийся тем, что период полувыведения химерного белка составляет по меньшей мере около 17 ч, по меньшей мере около 18 ч, по меньшей мере около 19 ч, по меньшей мере около 20 ч, по меньшей мере около 21 ч, по меньшей мере около 22 ч, по меньшей мере около 23 ч, по меньшей мере около 24 ч, по меньшей мере около 25 ч, по меньшей мере около 26 ч, по меньшей мере около 27 ч, по меньшей мере около 28 ч, по меньшей мере около 29 ч, по меньшей мере около 30 ч, по меньшей мере около 31 ч, по меньшей мере около 32 ч, по меньшей мере около 33 ч, по меньшей мере около 34 ч, по меньшей мере около 35 ч, по меньшей мере около 36 ч, по меньшей мере около 48 ч, по меньшей мере около 60 ч, по меньшей мере около 72 ч, по меньшей мере около 84 ч, по меньшей мере около 96 ч или по меньшей мере около 108 ч. В некоторых вариантах реализации изобретения период полувыведения химерного белка составляет около 40 ч у мышей с гемофилией А. В некоторых вариантах реализации изобретения белок ФВ по существу не связывается с рецептором клиренса ФВ. В некоторых вариантах реализации изобретения белок ФВ способен защищать белок FVIII от расщепления одной или более протеазами, защищая белок FVIII от активации, стабилизируя тяжелую цепь и/или легкую цепь белка FVIII или предотвращая клиренс белка FVIII одним или более фагоцитарными рецепторами.
Некоторые варианты реализации изобретения включают химерный белок согласно описанию в настоящем документе, отличающийся тем, что белок ФВ ингибирует или предотвращает связывание эндогенного ФВ с белком FVIII, экранируя или блокируя сайт связывания ФВ на белке FVIII. В некоторых вариантах реализации изобретения сайт связывания ФВ расположен в домене A3 или домене С2 белка FVIII, или и в домене A3, и в домене С2. В некоторых вариантах реализации изобретения сайт связывания ФВ содержит аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотам 1669-1689 и 2303-2332 последовательности SEQ ID NO: 65. В некоторых вариантах реализации изобретения первая константная область ИГ или ее часть и вторая константная область ИГ или ее часть одинаковы или отличаются. В определенных вариантах реализации изобретения к белку FVIII присоединены и/или в белок FVIII встроены по меньшей мере две последовательности XTEN, по меньшей мере три последовательности XTEN, по меньшей мере четыре последовательности XTEN, по меньшей мере пять последовательностей XTEN или по меньшей мере шесть последовательностей XTEN.
Также раскрыт химерный белок согласно описанию в настоящем документе, отличающийся тем,
- 6 044115 что белок FVIII содержит один или более доменов FVIII, выбранных из домена А1, кислой области al, домена А2, кислой области а2, домена В, домена A3, кислой области а3, домена С1, домена С2, одного или более их фрагментов и любых их сочетаний.
Также раскрыт химерный белок согласно описанию в настоящем документе, отличающийся тем, что один или более сайтов встраивания в белке FVIII расположены в пределах одного или более доменов белка FVIII, выбранных из домена А1, кислой области a1, домена А2, кислой области а2, домена A3, домена В, домена С1, домена С2 и любых их сочетаний или между одним или более доменами белка FVIII, выбранными из группы, состоящей из домена А1 и кислой области a1, кислой области a1 и домена А2, домена А2 и кислой области а2, кислой области а2 и домена В, домена В и домена A3, домена A3 и домена С1, домена С1 и домена С2 и любых их сочетаний, или между двумя доменами белка FVIII, выбранными из домена А1 и кислой области a1, кислой области a1 и домена А2, домена А2 и кислой области а2, кислой области а2 и домена В, домена В и домена A3, домена A3 и домена С1, домена С1 и домена С2 и любых их сочетаний. В некоторых вариантах реализации изобретения один или более сайтов встраивания в белке FVIII представляют собой одну или более аминокислот, выбранных из группы, состоящей из аминокислотных остатков в табл. 7, табл. 8, табл. 9 и табл. 10. В определенных вариантах реализации изобретения сайты встраивания в белке FVIII расположены непосредственно ниже аминокислоты, соответствующей аминокислоте 745 в зрелом белке FVIII (SEQ ID NO: 65). В определенных вариантах реализации изобретения сайты встраивания в белке FVIII расположены непосредственно ниже аминокислотных остатков, соответствующих остаткам 1656 и 1900 в зрелом белке FVIII (SEQ ID NO: 65). В определенных вариантах реализации изобретения сайты встраивания в белке FVIII расположены непосредственно ниже аминокислотных остатков, соответствующих остаткам 26, 1656 и 1900 в зрелом белке FVIII (SEQ ID NO: 65). В определенных вариантах реализации изобретения сайты встраивания в белке FVIII расположены непосредственно ниже аминокислотных остатков, соответствующих остаткам 403 и 745 в зрелом белке FVIII (SEQ ID NO: 65). В определенных вариантах реализации изобретения сайты встраивания в белке FVIII расположены непосредственно ниже аминокислотных остатков, соответствующих остаткам 745 и 1900 в зрелом белке FVIII (SEQ ID NO: 65). В определенных вариантах реализации изобретения сайты встраивания в белке FVIII расположены непосредственно ниже аминокислотных остатков, соответствующих остаткам 18 и 745 в зрелом белке FVIII (SEQ ID NO: 65). В некоторых вариантах реализации изобретения белок FVIII представляет собой двухцепочечную изоформу FVIII. В некоторых вариантах реализации изобретения белок FVIII представляет собой одноцепочечную изоформу FVIII. В определенных вариантах реализации изобретения белок FVIII содержит домен В или его часть. В некоторых вариантах реализации изобретения белок FVIII представляет собой FVIII с удаленным доменом SQ В.
Некоторые варианты реализации изобретения включают химерный белок согласно описанию в настоящем документе, отличающийся тем, что одноцепочечная изоформа FVIII содержит по меньшей мере одну аминокислотную замену в позиции, соответствующей остатку 1648, остатку 1645 или обоим остаткам в полноразмерном зрелом полипептиде фактора FVIII (SEQ ID NO: 65) либо остатку 754, остатку 751 или обоим остаткам в факторе VIII с удаленным доменом SQ В (SEQ ID NO: 67). В определенных вариантах реализации изобретения аминокислотная замена представляет собой аминокислоту, отличную от аргинина. В некоторых вариантах реализации изобретения двухцепочечная изоформа FVIII состоит из первой цепи, содержащей тяжелую цепь FVIII, и второй цепи, содержащей легкую цепь FVIII, причем тяжелая цепь и легкая цепь соединены между собой металлической связью. В определенных вариантах реализации изобретения домен D' содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную аминокислотам 764-866 последовательности SEQ ID NO: 21. В некоторых вариантах реализации изобретения домен D3 содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную аминокислотам 867-1240 последовательности SEQ ID NO: 21. В некоторых вариантах реализации изобретения белок ФВ представляет собой мономер.
Также раскрыт химерный белок согласно описанию в настоящем документе, содержащий по меньшей мере два белка ФВ, по меньшей мере три белка ФВ, по меньшей мере четыре белка ФВ, по меньшей мере пять белков ФВ или по меньшей мере шесть белков ФВ. В определенных вариантах реализации изобретения белок ФВ содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную аминокислотам 764-1240 последовательности SEQ ID NO: 21. В некоторых вариантах реализации изобретения белок ФВ по существу состоит или состоит из аминокислот 764-1240 последовательности SEQ ID NO: 21. В определенных вариантах реализации изобретения белок ФВ содержит по меньшей мере одну аминокислотную замену в позиции, соответствующей остатку 1099, остатку 1142 или обоим остаткам 1099 и 1142 последовательности SEQ ID NO: 21. В некоторых вариантах реализации изобретения белок ФВ содержит аминокислоту, отличную от цистеина, которая замещает остаток, соответствующий остатку 1099, остатку 1142 или обоим остаткам (1099 и 1142) последовательности SEQ ID NO: 21. В определенных вариантах реализации изобретения белок ФВ дополнительно содержит домен D1, домен D2 или домены D1 и D2 белка ФВ.
Некоторые варианты реализации изобретения включают химерный белок согласно описанию в на- 7 044115 стоящем документе, отличающийся тем, что белок ФВ дополнительно содержит домен ФВ, выбранный из домена А1, домена А2, домена A3, домена D4, домена В1, домена В2, домена В3, домена С1, домена
С2, домена CK, одного или более их фрагментов и любых их сочетаний.
Также раскрыт химерный белок согласно описанию в настоящем документе, отличающийся тем, что белок ФВ состоит или по существу состоит из: (1) доменов D' и D3 ФВ или их фрагментов; (2) доменов D1, D' и D3 ФВ или их фрагментов; (3) доменов D2, D' и D3 ФВ или их фрагментов; (4) доменов D1, D2, D' и D3 ФВ или их фрагментов; (5) доменов D1, D2, D', D3 и А1 ФВ или их фрагментов.
Некоторые варианты реализации изобретения включают химерный белок согласно описанию в настоящем документе, отличающийся тем, что белок ФВ дополнительно содержит сигнальный пептид ФВ или FVIII, функционально связанный с белком ФВ.
Также раскрыт химерный белок согласно описанию в настоящем документе, отличающийся тем, что один или более линкеров имеют длину по меньшей мере около 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800 или 2000 аминокислотных остатков. В некоторых вариантах реализации изобретения один или более линкеров имеют длину от около 1 до около 2000 аминокислотных остатков. В определенных вариантах реализации изобретения один или более линкеров содержат пептид gly/ser. В некоторых вариантах реализации изобретения пептид gly/ser имеет формулу (Gly4Ser)n (SEQ ID NO: 94) или S(Gly4Ser)n (SEQ ID NO: 164), где n представляет собой положительное целое число, выбранное из группы, состоящей из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 и 10. В определенных вариантах реализации изобретения линкер (Gly4Ser)n представляет собой (Gly4Ser)3 (SEQ ID NO: 100) или (Gly4Ser)4 (SEQ ID NO: 165). В некоторых вариантах реализации изобретения линкер содержит 20 аминокислот, 35 аминокислот, 48 аминокислот, 73 аминокислоты или 95 аминокислот. В определенных вариантах реализации изобретения расщепляемый линкер представляет собой последовательность SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSLVPRGSGG (SEQ ID NO: 166).
В некоторых вариантах реализации изобретения химерный белок согласно описанию в настоящем документе полисиалилирован, ПЭГилирован или ГЭКилирован.
Также раскрыт химерный белок согласно описанию в настоящем документе, отличающийся тем, что первый полипептид содержит последовательность, по меньшей мере на около 80%, 90%, 95%, 99% или 100% идентичную
FVIII161 (SEQ Ш NO: 69),
FVIII169 (SEQ ID NO: 70), FVIII173 (SEQ ID NO: 72), FVIII195 (SEQ ID NO: 73), FVIII196 (SEQ ID NO: 74), FVIII199 (SEQ ID NO: 75), FVIII201 (SEQ ID NO: 76), FVIII203 (SEQ ID NO: 77), FVIII204 (SEQ ID NO: 78), FVIII205 (SEQ ID NO: 79), FVIII266 (SEQ ID NO: 80), FVIII267 (SEQ ID NO: 81), FVIII268 (SEQ ID NO: 82), FVIII269 (SEQ ID NO: 83), FVIII271 (SEQ ID NO: 84), FVIII272 (SEQ ID NO: 85) или FVIII282 (SEQ ID NO: 159), и второй полипептид содержит последовательность, по меньшей мере на около 80%, 90%, 95%, 99% или 100% идентичную либо ФВ057 (SEQ ID NO: 152), либо ФВ059 (SEQ ID NO: 197). В некоторых вариантах реализации изобретения первый полипептид содержит FVIII169 (SEQ ID NO: 70) и второй полипептид содержит ФВ057 (SEQ ID NO: 152). В других вариантах реализации изобретения первый полипептид содержит FVIII169 (SEQ ID NO: 70) и второй полипептид содержит ФВ059 (SEQ ID NO: 197). В еще одном варианте реализации изобретения первый полипептид содержит FVIII169 (SEQ ID NO: 70) и второй полипептид содержит ФВ062 (SEQ ID NO: 199). В некоторых вариантах реализации изобретения химерный белок эффективен в предотвращении и/или остановке кровотечения у субъекта, имеющего для этого показания.
Также раскрыт полинуклеотид или набор полинуклеотидов, кодирующих химерный белок согласно описанию в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид согласно описанию в настоящем документе дополнительно содержит полинуклеотидную цепь, кодирующую РС5 или РС7.
Некоторые варианты реализации изобретения включают вектор, содержащий полинуклеотид согласно описанию в настоящем документе и один или более промоторов, функционально связанных с полинуклеотидом или набором полинуклеотидов.
В некоторых вариантах реализации изобретения вектор согласно описанию в настоящем документе дополнительно содержит дополнительный вектор, содержащий полинуклеотидную цепь, кодирующую РС5 или РС7.
Также раскрыта клетка-хозяин, содержащая полинуклеотид или вектор согласно описанию в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации изобретения клетка-хозяин представляет собой клетку млекопитающего. В определенных вариантах реализации изобретения клетка млекопитающего выбрана из клетки HEK293 (human embryonic kidney 293; линия эмбриональных клеток почки человека), клетки СНО (chinese hamster ovary; линия клеток яичника китайского хомячка) и клетки ВНК (baby ham- 8 044115 ster kidney; линия клеток почки новорожденного сирийского хомячка).
Также раскрыта фармацевтическая композиция, содержащая химерный белок, полинуклеотид, вектор или клетку-хозяина согласно описанию в настоящем документе и фармацевтически приемлемый носитель. В некоторых вариантах реализации изобретения химерный белок имеет более продолжительный период полувыведения по сравнению с белком FVIII дикого типа. В определенных вариантах реализации изобретения период полувыведения химерного белка по меньшей мере в около 1,5 раза, по меньшей мере в около 2 раз, по меньшей мере в около 2,5 раза, по меньшей мере в около 3 раз, по меньшей мере в около 4 раз, по меньшей мере в около 5 раз, по меньшей мере в около 6 раз, по меньшей мере в около 7 раз, по меньшей мере в около 8 раз, по меньшей мере в около 9 раз, по меньшей мере в около 10 раз, по меньшей мере в около 11 раз или по меньшей мере в около 12 раз более продолжителен, чем таковой белка FVIII дикого типа.
Некоторые варианты реализации изобретения включают композицию согласно описанию в настоящем документе, отличающуюся тем, что период полувыведения химерного белка составляет по меньшей мере около 17 ч, по меньшей мере около 18 ч, по меньшей мере около 19 ч, по меньшей мере около 20 ч, по меньшей мере около 21 ч, по меньшей мере около 22 ч, по меньшей мере около 23 ч, по меньшей мере около 24 ч, по меньшей мере около 25 ч, по меньшей мере около 26 ч, по меньшей мере около 27 ч, по меньшей мере около 28 ч, по меньшей мере около 29 ч, по меньшей мере около 30 ч, по меньшей мере около 31 ч, по меньшей мере около 32 ч, по меньшей мере около 33 ч, по меньшей мере около 34 ч, по меньшей мере около 35 ч, по меньшей мере около 36 ч, по меньшей мере около 48 ч, по меньшей мере около 60 ч, по меньшей мере около 72 ч, по меньшей мере около 84 ч, по меньшей мере около 96 ч или по меньшей мере около 108 ч. В определенных вариантах реализации изобретения период полувыведения химерного белка составляет около 40 ч у мышей с гемофилией А. В некоторых вариантах реализации изобретения композиция согласно описанию в настоящем документе вводится путем, выбранным из группы, состоящей из местного применения, внутриглазного введения, парентерального введения, интратекального введения, субдурального введения и перорального приема. В определенных вариантах реализации изобретения парентеральное введение может представлять собой внутривенное или подкожное введение.
В некоторых вариантах реализации изобретения композиция согласно описанию в настоящем документе используется для лечения геморрагического заболевания или состояния у субъекта, нуждающегося в этом. В определенных вариантах реализации изобретения геморрагическое заболевание или состояние выбрано из группы, состоящей из нарушения свертываемости крови, гемартроза, мышечного кровотечения, кровоточивости полости рта, кровоизлияния, кровоизлияния в мышцы, кровоизлияния в полости рта, травмы, травмы головы, желудочно-кишечного кровотечения, внутричерепного кровоизлияния, внутрибрюшного кровоизлияния, кровоизлияния в грудную полость, перелома кости, кровотечения органов центральной нервной системы, кровоизлияния в заглоточном пространстве, кровоизлияния в забрюшинное пространство, кровоизлияния во влагалище подвздошно-поясничной мышцы и любых их комбинаций. В некоторых вариантах реализации изобретения субъекту назначено хирургическое вмешательство. В определенных вариантах реализации изобретения лечение является профилактическим или по требованию.
Также раскрыт способ продления или увеличения периода полувыведения химерного белка, который включает введение эффективного количества химерного белка, полинуклеотида, вектора, клеткихозяина или композиции согласно описанию в настоящем документе субъекту, имеющему для этого показания, причем белок ФВ, последовательность XTEN, первая константная область ИГ или ее часть и вторая константная область ИГ или ее часть увеличивают период полувыведения химерного белка.
Некоторые варианты реализации изобретения включают способ лечения геморрагического заболевания или расстройства у субъекта, имеющего для этого показания, который включает введение эффективного количества химерного белка, полинуклеотида, вектора, клетки-хозяина или композиции согласно описанию в настоящем документе, причем геморрагическое заболевание или расстройство выбрано из группы, состоящей из нарушения свертываемости крови, гемартроза, мышечного кровотечения, кровоточивости полости рта, кровоизлияния, кровоизлияния в мышцы, кровоизлияния в полости рта, травмы, травмы головы, желудочно-кишечного кровотечения, внутричерепного кровоизлияния, внутрибрюшного кровоизлияния, кровоизлияния в грудную полость, перелома кости, кровотечения органов центральной нервной системы, кровоизлияния в заглоточном пространстве, кровоизлияния в забрюшинное пространство и кровоизлияния во влагалище подвздошно-поясничной мышцы. В некоторых вариантах реализации изобретения субъект представляет собой животное. В некоторых вариантах реализации изобретения животное представляет собой человека. В некоторых вариантах реализации изобретения субъект страдает гемофилией А. В определенных вариантах реализации изобретения лечение является профилактическим или по требованию. В некоторых вариантах реализации изобретения эффективное количество составляет от 0,1 мкг/кг до 500 мг/кг.
Также раскрыт способ согласно описанию в настоящем документе, отличающийся тем, что химерный белок, полинуклеотид, вектор, клетка-хозяин или композиция согласно описанию в настоящем документе вводится путем, выбранным из группы, состоящей из местного применения, внутриглазного
- 9 044115 введения, парентерального введения, интратекального введения, субдурального введения и перорального приема. В определенных вариантах реализации изобретения парентеральное введение выбрано из группы, состоящей из внутривенного введения, подкожного введения, внутримышечного введения и внутрикожного введения.
Некоторые варианты реализации изобретения включают способ изготовления химерного белка, включающий трансфекцию одной или более клеток-хозяев полинуклеотидом или вектором согласно описанию в настоящем документе и экспрессию химерного белка в клетке-хозяине. В некоторых вариантах реализации изобретения способ согласно описанию в настоящем документе дополнительно включает выделение химерного белка. В определенных вариантах реализации изобретения химерный белок эффективен в остановке и/или предотвращении кровотечения у субъекта.
Краткое описание графических материалов/фигур
На фиг. 1 представлено схематическое изображение химерного белка, состоящего из первого полипептида, который содержит белок FVIII (А1-А2-частичный или полный домен В-А3-С1-С2), слитый с фрагментом Fc, причем в сайт встраивания в пределах белка FVIII встроена последовательность XTEN, и второго полипептида, который содержит белок ФВ, содержащий домены D'D3, последовательность XTEN из менее чем 288 аминокислот, расщепляемый тромбином линкер и второй фрагмент Fc. Вставки последовательности XTEN в белок FVIII и/или слияния последовательности XTEN с белком ФВ продлевают период полувыведения химерного белка, увеличивая гидродинамический радиус и блокируя опосредованный рецепторами клиренс. Домены D'D3 белка ФВ блокируют взаимодействие FVIII с эндогенным ФВ, стабилизируют белок FVIII и продлевают полувыведения химерного белка. Домены Fc могут ковалентно связывать домены D'D3 с белком FVIII и продлевать период полувыведения химерного белка через FcRn-опосредованный метаболический путь. Расщепляемый тромбином линкер делает возможным высвобождение доменов D'D3 при активации FVIII и обеспечивает правильное выравнивание между FVIII и доменами D'D3 ФВ.
На фиг. 2 представлена трехплазмидная система экспрессии для гетеродимеров FVIII-XTENFc:D'D3-XTEN-Fc: первая плазмида, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую одноцепочечный белок FVIII-XTEN-Fc, в котором последовательность XTEN встроена в домен В; вторая плазмида, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую белок D1D2D'D3-XTEN-Fc, в котором последовательность XTEN содержит менее 288 аминокислот; и третья плазмида, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую РАСЕ - фермент процессинга пропептида. Когда три полипептида экспрессируются с трех плазмид, полипептидные домены D1D2 белка ФВ могут отщепляться от доменов D'D3 путем внутриклеточного процессинга. Полученный в результате комплекс содержит три продукта: первая молекула представляет собой гетеродимеры FVnI-XTEN/D'D3, вторая молекула представляет собой побочный продукт - гомодимер D'D3-XTEN-Fc, и третья молекула представляет собой еще один побочный продукт, то есть FVIII(XTEN)-Fc.
На фиг. 3 представлены аддитивные эффекты вставок XTEN на продление периода полувыведения гетеродимеров. FVIII169 содержит слитый с фрагментом Fc белок FVIII с удаленным доменом В, в котором последовательность XTEN (например, AE288) встроена в позицию, соответствующую аминокислоте 745 зрелого полноразмерного FVIII. FVIII205 содержит слитый с фрагментом Fc белок FVIII с удаленным доменом В, в котором последовательность XTEN (например, AE144) встроена в позицию, соответствующую аминокислоте 18 зрелого полноразмерного FVIII, и еще одна последовательность XTEN (например, AE288) встроена в позицию, соответствующую аминокислоте 745 зрелого полноразмерного FVIII. ФВ031 содержит домен D' и домен D3 ФВ, слитые с фрагментом Fc с помощью расщепляемого тромбином линкера (без XTEN). ФВ034 содержит домен D' и домен D3 ФВ, слитые с AE288 и фрагментом Fc. Период полувыведения FVIШ69/ФВ031 (перевернутый треугольник) составляет 16,7 ч у мышей с гемофилией А; период полувыведения FVIII205/ФВ031 (круг) составляет 29,4 ч у мышей с гемофилией А; и период полувыведения FVIШ69/ФВ034 (квадрат) составляет 31,1 ч у мышей с гемофилией А.
На фиг. 4 показано, что в случае встраивания между доменами D'D3 ФВ и доменами Fc последовательность AE144 XTEN обеспечивает большее продление периода полувыведения, чем AE288 XTEN. Например, в то время как период полувыведения FVIШ69/ФВ034 (квадрат) у мышей с гемофилией А составляет 31,1 ч, период полувыведения FVIШ69//ФВ057 (круг) у мышей с гемофилией А составляет 42 ч. ФВ057 содержит домены D'D3 ФВ, слитые с AE144 и фрагментом Fc.
На фиг. 5 показано, что для продления периода полувыведения гетеродимеров химерного белка необходимы домены Fc. При сравнении периода полувыведения FVIII205/ФВ031 (круг) у мышей с гемофилией А с таковым белка FVIII263/ФВ050 (квадрат), содержащего мутации в сайтах связывания FcRn (тройная мутация IHH (Indian Hedgehog Homolog) в Fc) и, следовательно, не поддающегося рециркуляции в пути FcRn, период полувыведения FVIII263/ФВ050 (23 ч) короче периода полувыведения FVIII205/ФВ031 (29,4 ч). Это говорит о том, что фрагменты Fc необходимы для продления периода полувыведения.
На фиг. 6А представлена аналогичная мгновенная эффективность гетеродимеров FVIII-XTENFc/D'D3-XTEN-Fc по сравнению с белком FVIII с удаленным доменом В (SQ BDD FVIII) на модели кровотечения, вызванного отрезанием хвоста, у мышей с гемофилией А. Мышам вводили дозу 75 МЕ/кг и
- 10 044115 измеряли активность в анализе АЧТВ. SQ BDD FVIII показан в форме круга, FVШ169/ФВ034 - в форме квадрата, FVШ169/ФВ057 - в форме ромба, а носитель - в форме перевернутого треугольника. Подробное описание конструкций FVIII169, ФВ034 и ФВ057 приведено в другом месте в настоящем документе. На фиг. 6В показано сравнение мгновенной эффективности FVШ169/ФВ034 и FVIII с удаленным доменом В (SQ BDD FVIII) у мышей с гемофилией А при использовании дозы 37,5 МЕ/кг и измерении активности в анализе АЧТВ. Медианы потери крови (мкл) у мышей в каждой экспериментальной группе обозначены горизонтальными линиями, потери крови (мкл) у мышей линии C57/BL6 обозначены незакрашенными треугольниками; потери крови (мкл) после введения rBDD-FVIII в дозе 37,5 МЕ/кг обозначены незакрашенными кругами; потери крови (мкл) после введения FVШ169/ФВ034 в дозе 37,5 МЕ/кг обозначены незакрашенными квадратами и потери крови (мкл) после введения носителя обозначены перевернутыми треугольниками.
На фиг. 7А, В показано, что гетеродимер rFVШ169/ФВ057 обеспечивает более длительную защиту у мышей с гемофилией А в модели кровотечения, вызванного рассечением хвостовой вены. На фиг. 7А представлены данные о повторных кровотечениях у мышей, получавших rFVШ169/ФВ057 за 72 ч до повреждения хвоста (квадрат), SQ BDD-FVIII за 48 ч до повреждения хвоста (ромб), SQ BDD-FVIII за 24 ч до повреждения хвоста (перевернутый треугольник) и носитель (круг). Активность измеряли с помощью анализа АЧТВ. По оси абсцисс отложено время в часах, а по оси ординат - процент особей, у которых не наблюдалось кровотечения. На фиг. 7В представлены соответствующие данные по выживанию для четырех категорий мышей, показанных на фиг. 7А. У мышей, получавших rFVIШ69/ФВ057 в дозе 12 МЕ/кг за 72 ч до повреждения хвоста, отмечались аналогичные показатели защиты от повторного кровотечения и выживаемости по сравнению с мышами, получавшими SQ BDD-FVIII за 24 ч до повреждения хвоста.
На фиг. 8А представлены сопоставимые показатели повторных кровотечений у мышей, получавших гетеродимеры FVIII-XTEN-Fc/D'D3-XTEN-Fc за 96 ч до повреждения, и мышей, получавших rBDD-FVIII за 24 ч до повреждения. Закрашенные квадраты иллюстрируют данные о повторных кровотечениях у мышей, получавших FVIШ69/ФВ034 за 24 ч до повреждения; незакрашенные квадраты иллюстрируют данные о повторных кровотечениях у мышей, получавших FVIШ69/ФВ034 за 96 ч до повреждения; закрашенные ромбы иллюстрируют данные о повторных кровотечениях у мышей, получавших FVIШ69/ФВ057 за 24 ч до повреждения; незакрашенные ромбы иллюстрируют данные о повторных кровотечениях у мышей, получавших FVIШ69/ФВ057 за 96 ч до повреждения; закрашенные круги иллюстрируют данные о повторных кровотечениях у мышей, получавших rBDD-FVIII за 24 ч до повреждения; незакрашенные круги иллюстрируют данные о повторных кровотечениях у мышей, получавших rBDD-FVIII за 48 ч до повреждения; и закрашенные треугольники иллюстрируют данные о повторных кровотечениях у мышей, получавших носитель. По оси абсцисс отложено время в часах, а по оси ординат - процент особей, у которых не наблюдалось кровотечения.
На фиг. 8В представлены кривые выживания мышей, получавших гетеродимеры FVIII-XTENFc/D'D3-XTEN-Fc за 96 ч до повреждения, по сравнению с мышами, получавшими rBDD-FVIII за 24 ч до повреждения. По оси абсцисс отложено время в часах, по оси ординат - выживаемость в процентах. Условные обозначения такие же, как на фиг. 8А.
На фиг. 9 представлены схематические изображения типичных гетеродимеров FVIII-ФВ и конструкций FVIII169, FVIII286, ФВ057, ФВ059 и ФВ062. Например, конструкция FVIII169 содержит слитый с фрагментом Fc белок FVIII с удаленным доменом В и заменой R1648A, в котором последовательность XTEN (например, AE288) встроена в позицию, соответствующую аминокислоте 745 зрелого полноразмерного FVIII (A1-a1-A2-a2-288XTEN-a3-A3-C1-C2-Fc). Конструкция FVIII286 содержит слитый с фрагментом Fc белок FVIII с удаленным доменом В и заменой R1648, в котором последовательность XTEN (например, AE288) встроена в позицию, соответствующую аминокислоте 745 зрелого полноразмерного FVIII, с дополнительной областью а2 между FVIII и Fc (A1-a1-A2-a2-288XTEN-a3-A3-C1-C2-a2-Fc). ФВ057 представляет собой слитую конструкцию ФВ-Fc, содержащую домен D'D3 белка ФВ (с двумя аминокислотными заменами в домене D'D3, т.е. С336А и С379А), связанный с фрагментом Fc посредством линкера ФВ, содержащего сайт расщепления тромбином LVPRG (LVPRG; SEQ ID NO: 6) и глицин-сериновый линкер (GS), причем в данной конструкции последовательность XTEN (например, AE144) встроена между доменом D'D3 и линкером ФВ (D'D3-144XTEN-GS+LVPRG-Fc). ФВ059 представляет собой слитую конструкцию ФВ-Fc, содержащую домен D'D3 белка ФВ (с двумя аминокислотными заменами в домене D'D3, т.е. С336А и С379А), связанный с фрагментом Fc посредством кислой области 2 (а2) белка FVIII в качестве линкера ФВ, причем последовательность XTEN (т.е. AE144) встроена между доменом D'D3 и линкером ФВ. ФВ062 представляет собой слитую конструкцию ФВ-Fc, содержащую домен D'D3 белка ФВ (с двумя аминокислотными заменами в домене D'D3, т.е. С336А и С379А), связанный с фрагментом Fc, причем последовательность XTEN (т.е. AE144) встроена между доменом D'D3 и фрагментом Fc (D'D3-144XTEN-Fc).
На фиг. 10 представлено схематическое изображение гетеродимерных конструкций FVIII/ФВ, например FVШ169/ФВ057, FVIШ69/ФВ059, FVIШ69/ФВ059A и FVШ169/ФВ073. Стрелкой показан сайт, в который добавляется необязательный линкер для введения сайта расщепления тромбином. FVIШ69/ФВ057 имеет линкер, содержащий LVPRG (SEQ ID NO: 6). FVIШ69/ФВ059 имеет линкер, со- 11 044115 держащий область а2 белка FVIII (т.е.
ISDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSDKTH (SEQ ID NO: 106),
FVШ169/ФВ059A имеет линкер, содержащий укороченную область а2 белка FVIII (т.е. DKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSDKTH (SEQ ID NO: 88)). FvΠΠ69/φвo73 имеет линкер в пределах конструкции ФВ073 (SEQ ID NO: 175), который содержит фрагмент области а2 белка FVIII, состоящий из IEPRSFS (SEQ ID NO: 194).
На фиг. 11А-С показаны ДСН-ПААГ-электрофореграммы, полученные после расщепления FVIШ69/ФВ057 тромбином, с использованием FVIII-Fc в качестве контроля. На фиг. 11А представлено окрашивание геля для ДСН-ПААГ-электрофореза антителом к D3 (АВ 96340). Стрелками выделено LCFc:D'D3-XTEN-Fc, представляющий собой нерасщепленный, полноразмерный FVIШ69/ФВ057, и D'D3-144 XTEN, представляющий собой фрагмент, полученный в результате расщепления тромбином. На фиг. 11В представлено окрашивание геля для ДСН-ПААГ-электрофореза антителом к тяжелой цепи (heavy chain, НС) (GMA012). Стрелками выделено тяжелую цепь FVIII (НС) и домен А2 FVIII. На фиг. 11С представлено совмещенное изображение тест-панелей А и В. Образцы отбирали в моменты времени, указанные в верхней части каждой тест-панели. Стрелки указывают на соответствующие белки.
На фиг. 12А-С показаны ДСН-ПААГ-электрофореграммы, полученные после расщепления FVIШ69/ФВ059 тромбином. На фиг. 12А представлено окрашивание геля для ДСН-ПААГэлектрофореза антителом к D3 (АВ 96340). Стрелками выделено LCFc:D'D3-XTEN-Fc, представляющий собой нерасщепленный, полноразмерный FVIШ69/ФВ059, и DD3-144 XTEN, представляющий собой фрагмент, полученный в результате расщепления тромбином. На фиг. 12В представлено окрашивание геля для ДСН-ПААГ-электрофореза антителом к НС (GMA012). Стрелками выделено нерасщепленный, полноразмерный FVIШ69/ФВ059, D'D3-144 XTEN-аЗ, представляющий собой фрагмент, полученный в результате расщепления тромбином, и А2, представляющий собой домен А2 белка FVIII. На фиг. 12С представлено совмещенное изображение тест-панелей А и В. Образцы отбирали в моменты времени, указанные в верхней части каждой тест-панели.
На фиг. 13 представлены данные по мгновенной эффективности у мышей с гемофилией А, получавших FVIШ69/ФВ059 (круг), в сравнении с мышами с гемофилией А, получавшими BDD-FVIII в качестве контроля (квадрат). Показатель кровопотери измеряли после отрезания хвоста, р=0.9883.
Подробное описание сущности изобретения
Настоящее изобретение относится к химерному белку, содержащему два полипептида, первый из которых содержит белок FVIII, слитый с первой константной областью ИГ, и второй из которых содержит белок ФВ, слитый со второй константной областью ИГ или ее частью посредством последовательности XTEN, причем последовательность XTEN содержит менее 288 аминокислотных остатков.
I. Определения.
Следует отметить, что существительное в единственном числе подразумевает также и множественное число; например, под определением нуклеотидная последовательность понимают одну или более нуклеотидных последовательностей. Таким образом, термины в единственном числе, термины один или более и по меньшей мере один могут применяться в настоящем документе взаимозаменяемо.
Более того, использование термина и/или в настоящем документе следует принимать за частное описание любого из двух указанных свойств или компонентов отдельно от второго свойства или компонента или вместе с ним. Следовательно, подразумевается, что термин и/или, примененный в настоящем документе в таком выражении, как А и/или В, включает А и В, А или В, только А и только В.
Аналогично, подразумевается, что термин и/или, примененный в таком выражении, как А, В и/или С, охватывает каждый из следующих аспектов: А, В и С; А, В или С; А или С; А или В; В или С; А и С; А и В; В и С; только А; только В; и только С.
Необходимо понимать, что повсюду в настоящем документе, где для описания аспектов применяется формулировка содержит, также подразумеваются в остальном аналогичные аспекты, описываемые понятиями состоит из и/или по существу состоит из.
Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют то же значение, что обычно понимается средним специалистом в области техники, к которой относится настоящее изобретение. Например, the Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2-nd ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3-е изд., 1999 год, Academic Press; и the Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press, предлагают специалисту в данной области техники общий словарь многих терминов, использованных в настоящем описании.
Единицы, приставки и символы указаны в их принятой форме согласно Международной системе единиц (Systeme International de Unites, СИ). Числовые диапазоны включают числа, определяющие диапазон. Если не указано иное, аминокислотные последовательности записаны слева направо в направлении от амино- до карбоксильного конца. Приведенные в настоящем документе заголовки не ограничивают различные аспекты изобретения, которые могут быть доступны при обращении к описанию в целом. Соответственно, термины, определения которых приведены непосредственно далее по тексту, более
- 12 044115 полно определяются посредством ссылки на описание в полном объеме.
Термин около в настоящем документе означает приблизительно, грубо говоря, примерно или порядка. Когда термин около используют в сочетании с диапазоном числовых значений, он изменяет этот диапазон, расширяя границы выше и ниже указанных далее числовых значений. В целом, термин около может отклонять числовое значение выше или ниже указанного значения на величину, например 10%, в сторону увеличения или уменьшения (выше или ниже).
Подразумевается, что термин полинуклеотид или нуклеотид охватывает одну нуклеиновую кислоту и множество нуклеиновых кислот и относится к выделенной молекуле или конструкции нуклеиновой кислоты, например, матричной РНК (мРНК) или плазмидной ДНК (пДНК). В определенных вариантах реализации изобретения полинуклеотид содержит обычную фосфодиэфирную связь или нестандартную связь (например, амидную связь, как в пептидных нуклеиновых кислотах (ПНК)). Термин нуклеиновая кислота относится к одному или более сегментам нуклеиновой кислоты, например, фрагментам ДНК или РНК, присутствующим в полинуклеотиде. Термин выделенная нуклеиновая кислота или выделенный полинуклеотид подразумевает молекулу нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК), которая была удалена из своей нативной среды. Например, рекомбинантный полинуклеотид, кодирующий полипептид фактора VIII и входящий в состав вектора, считается выделенным для целей настоящего изобретения. Дополнительные примеры выделенных полинуклеотидов включают рекомбинантные полинуклеотиды, поддерживаемые в гетерологических клетках-хозяевах или очищенные (частично или существенно) от прочих полинуклеотидов в растворе. Выделенные молекулы РНК включают in vivo или in vitro РНКтранскрипты полинуклеотидов по настоящему изобретению. Выделенные полинуклеотиды или нуклеиновые кислоты согласно настоящему изобретению дополнительно включают таковые молекулы, полученные путем синтеза. К тому же, полинуклеотид или нуклеиновая кислота может включать регуляторные элементы, такие как промоторы, энхансеры, участки связывания рибосом или сигналы терминации транскрипции.
В контексте настоящего документа термин кодирующая область или кодирующая последовательность означает часть полинуклеотида, состоящую из кодонов, поддающихся трансляции в аминокислотную последовательность. Хотя стоп-кодон (TAG, TGA или ТАА), как правило, не транслируется в аминокислоту, он может считаться частью кодирующей области, однако любые фланкирующие последовательности, например промоторы, участки связывания рибосом, терминаторы транскрипции, интроны и тому подобные, не являются частью кодирующей области. Границы кодирующей области, как правило, определяются стартовым кодоном на 5'-конце, кодирующим амино-конец синтезируемого полипептида, и стоп-кодоном трансляции на 3'-конце, кодирующим карбоксильный конец синтезируемого полипептида. Две или более кодирующие области по настоящему изобретению могут присутствовать в одной полинуклеотидной конструкции, например, на одном векторе, или в отдельных полинуклеотидных конструкциях, например, на отдельных (разных) векторах. Отсюда следует, что один вектор может содержать всего одну кодирующую область или две и более кодирующие области, например, один вектор может отдельно кодировать связывающий домен А и связывающий домен В, как описано ниже. К тому же, вектор, полинуклеотид или нуклеиновая кислота по данному изобретению может содержать гетерологические кодирующие области, будь то слитые или не слитые с нуклеиновой кислотой, кодирующей связывающий домен по данному изобретению. Гетерологические кодирующие области включают специализированные элементы или мотивы, такие как секреторный сигнальный пептид или гетерологический функциональный домен, но не ограничиваются ими.
Определенные белки, секретируемые клетками млекопитающих, соединены с секреторным сигнальным пептидом, который отщепляется от зрелого белка после начала переноса растущей полипептидной цепи через шероховатый эндоплазматический ретикулум. Средним специалистам в данной области техники известно, что сигнальные пептиды обычно соединены с N-концом полипептида и отщепляются от готового или полноразмерного полипептида, чтобы образовалась секретируемая или зрелая форма полипептида. В определенных вариантах реализации изобретения нативный сигнальный пептид или функциональное производное той же последовательности сохраняет способность направлять секрецию полипептида, функционально соединенного с этим пептидом или производным. В альтернативном варианте может использоваться гетерологический сигнальный пептид млекопитающих, например, тканевой активатор плазминогена (ТАП) человека или сигнальный пептид мышиной β-глюкуронидазы, либо их функциональное производное.
Термин ниже(лежащий) применительно к нуклеотидной последовательности означает, что нуклеиновая кислота или нуклеотидная последовательность расположена в 3'-направлении относительно нуклеотидной последовательности сравнения. В определенных вариантах реализации изобретения нижележащие нуклеотидные последовательности означают последовательности, лежащие после точки начала транскрипции. Например, кодон инициации трансляции в гене лежит ниже сайта начала транскрипции. Термин ниже(лежащий) применительно к полипептидной последовательности означает, что аминокислота или сайт встраивания аминокислоты расположены с С-конца аминокислотной последовательности сравнения. Например, сайт встраивания непосредственно ниже аминокислоты, соответствующей аминокислоте 745 в зрелом белке FVIII дикого типа, означает, что сайт встраивания расположен между амино- 13 044115 кислотными остатками, соответствующими остаткам 745 и 746 в зрелом белке FVIII дикого типа.
Термин выше(лежащий) означает нуклеотидную последовательность, которая расположена в 5'направлении относительно нуклеотидной последовательности сравнения. В определенных вариантах реализации изобретения вышележащие нуклеотидные последовательности означают последовательности, расположенные с 5'-стороны кодирующей области или точки начала транскрипции. Например, большинство промоторов расположены выше сайта начала транскрипции.
В контексте настоящего документа термин регуляторная область относится к нуклеотидным последовательностям, которые расположены выше (5'-некодирующие последовательности), в пределах или ниже (3'-некодирующие последовательности) кодирующей области и которые влияют на транскрипцию, процессинг РНК, стабильность или трансляцию соответствующей кодирующей области. Регуляторные области могут включать промоторы, лидерные последовательности трансляции, интроны, последовательности распознавания полиаденилирования, участки процессинга РНК, участки связывания эффекторов и структуры типа петля-на-стебле. Если кодирующая область предназначена для экспрессии в эукариотической клетке, сигнал полиаденилирования и последовательность терминации транскрипции обычно расположены в 3'-направлении относительно кодирующей последовательности.
Полинуклеотид, кодирующий продукт гена, например, полипептид, может включать промотор и/или прочие элементы контроля транскрипции или трансляции, функционально соединенные с одной или более кодирующими областями. В случае функционального соединения кодирующая область для продукта гена, например полипептида, соединена с одной или более регуляторными областями таким образом, чтобы экспрессия продукта гена находились под влиянием или контролем регуляторной(ых) области(ей). Например, кодирующая область и промотор являются функционально соединенными, если индукция функции промотора приводит к транскрипции мРНК, кодирующей продукт гена, кодируемый кодирующей областью, и если природа связи между промотором и кодирующей областью не препятствует способности промотора направлять экспрессию данного продукта гена или не препятствует способности ДНК-матрицы транскрибироваться в РНК. Прочие элементы контроля транскрипции, помимо промотора, например энхансеры, репрессоры и сигналы терминации транскрипции, также могут быть функционально соединены с кодирующей областью, чтобы направлять экспрессию продукта гена.
Специалистам в данной области техники известны различные области контроля транскрипции. Они включают области контроля транскрипции, функционирующие в клетках позвоночных, такие как промоторные и энхансерные сегменты из цитомегаловирусов (немедленно-ранний промотор в сочетании с интроном А), вируса обезьян 40 (ранний промотор) и ретровирусов (например, вируса саркомы Рауса), но не ограничиваются перечисленным. Прочие области контроля транскрипции включают области, полученные из генов позвоночных, таких как гены актина, белков теплового шока, гормона роста крупного рогатого скота и кроличьего β-глобина, а также другие последовательности, способные контролировать экспрессию генов в клетках эукариот. Дополнительные пригодные области контроля транскрипции включают тканеспецифичные промоторы и энхансеры, а также промоторы, индуцируемые лимфокинами (например, промоторы, индуцируемые интерферонами или интерлейкинами).
Аналогичным образом, средним специалистам в данной области техники известны различные элементы контроля трансляции. Они включают участки связывания рибосом, кодоны инициации и терминации транскрипции и элементы, полученные из пикорнавирусов (в частности, участок внутренней посадки рибосомы, или IRES [internal ribosome entry site], также именуемый последовательностью CITE [cap independent transcription enhancer, кэп-независимый энхансер транскрипции]), но не ограничиваются перечисленным.
В контексте настоящего документа термин экспрессия относится к процессу, посредством которого полинуклеотид генерирует продукт гена, например РНК или полипептид. Он включает транскрипцию полинуклеотида в матричную РНК (мРНК), транспортную РНК (тРНК), малую шпилечную РНК (мшРНК), малую интерферирующую РНК (миРНК) или любой другой РНК-продукт и трансляцию мРНК в полипептид, но не ограничивается перечисленным. Экспрессия приводит к образованию продукта гена. В контексте настоящего документа продукт гена может представлять собой либо нуклеиновую кислоту, например, матричную РНК, синтезированную посредством транскрипции гена, либо полипептид, транслированный из транскрипта. Продукты генов, описанные в настоящем документе, дополнительно включают нуклеиновые кислоты с посттранскрипционными модификациями, например, полиаденилированием или сплайсингом, либо полипептиды с посттрансляционными модификациями, например, метилированием, гликозилированием, добавлением липидов, объединением с другими белковыми субъединицами или протеолитическим расщеплением.
Вектор означает любой носитель для клонирования и/или переноса нуклеиновой кислоты в клетку-хозяина. Вектор может представлять собой репликон, к которому может быть присоединен другой сегмент нуклеиновой кислоты для осуществления репликации присоединенного сегмента. Термин репликон относится к любому генетическому элементу (например, плазмиде, фагу, космиде, хромосоме, вирусу), который функционирует в качестве автономной единицы репликации in vivo, т.е. способен реплицироваться под собственным контролем. Термин вектор включает как вирусные, так и невирусные носители для введения нуклеиновой кислоты в клетку in vitro, ex vivo или in vivo. В данной области тех- 14 044115 ники известно и используется большое количество векторов, включая, например, плазмиды, модифицированные вирусы эукариот или модифицированные вирусы бактерий. Вставка полинуклеотида в подходящий вектор может достигаться путем лигирования соответствующих полинуклеотидных фрагментов с выбранным вектором, имеющим комплементарные липкие концы.
Вектор может быть сконструирован таким образом, чтобы кодировать селективные маркеры или репортеры, обеспечивающие отбор или идентификацию клеток, содержащих вектор. Экспрессия селективных маркеров или репортеров позволяет выявить и/или отобрать клетки-хозяев, которые содержат и экспрессируют прочие кодирующие области, расположенные на векторе. Примеры генов селективных маркеров, известных и применяемых в данной области техники, включают: гены, обеспечивающие стойкость к ампициллину, стрептомицину, гентамицину, канамицину, гигромицину, гербициду биалафосу, сульфаниламидам и тому подобным; и гены, используемые в качестве фенотипических маркеров, т.е. регуляторные гены биосинтеза антоцианов, ген изопентанилтрансферазы и тому подобные. Примеры репортеров, известных и применяемых в данной области техники, включают: люциферазу (Luc), зеленый флуоресцентный белок (GFP), хлорамфениколацетилтрансферазу (CAT), β-галактозидазу (LacZ), Рглюкуронидазу (Gus) и тому подобные. Селективные маркеры также можно считать репортерами.
Термин плазмида относится к внехромосомному элементу, часто несущему ген, который не является частью основного метаболизма клетки, и обычно имеющему форму кольцевых двухцепочечных молекул ДНК. Такие элементы могут представлять собой автономно реплицирующиеся последовательности, встраивающиеся в геном последовательности, фаговые или нуклеотидные последовательности, линейную, кольцевую или суперспиральную одно- или двухцепочечную ДНК или РНК, полученные из любого источника, в которых ряд нуклеотидных последовательностей соединены или рекомбинированы в уникальную конструкцию, которая способна вводить в клетку фрагмент промотора и последовательность ДНК для выбранного продукта гена вместе с подходящей 3'-нетранслируемой последовательностью.
Векторы на основе эукариотических вирусов, которые можно применять, включают аденовирусные векторы, ретровирусные векторы, векторы на основе аденоассоциированного вируса и поксвирусные векторы, например векторы на основе вируса осповакцины, бакуловирусные векторы или герпесвирусные векторы, но не ограничиваются перечисленными. Невирусные векторы включают плазмиды, липосомы, электрически заряженные липиды (цитофектины), комплексы ДНК-белок и биополимеры.
Термин клонирующий вектор относится к репликону, который представляет собой последовательно реплицирующийся участок нуклеиновой кислоты единичной длины и который содержит точку начала репликации, такому как плазмида, фаг или космида, к которому может быть присоединен другой сегмент нуклеиновой кислоты для осуществления репликации присоединенного сегмента. Определенные клонирующие векторы способны к репликации в клетках одного типа, например, в бактериях, и экспрессии в клетках другого типа, например, в клетках эукариот. Клонирующие векторы, как правило, содержат одну или более последовательностей, которые можно использовать для отбора клеток, содержащих данный вектор, и/или один или более сайтов множественного клонирования для вставки целевых последовательностей нуклеиновой кислоты.
Термин экспрессионный вектор относится к носителю, разработанному таким образом, чтобы обеспечить экспрессию вставленной последовательности нуклеиновой кислоты после ее введения в клетку-хозяина. Вставленная последовательность нуклеиновой кислоты функционально соединяется с регуляторными областями, как описано выше.
Для введения векторов в клетки-хозяев используются способы, хорошо известные в данной области, например, трансфекция, электропорация, микроинъекция, трансдукция, слияние клеток, обработка ДЭАЭ-декстраном, осаждение фосфатом кальция, липофекция (слияние с липосомами), использование генной пушки или переносчика ДНК-векторов.
В контексте настоящего документа термины культура, культивировать и культивирование означают инкубацию клеток в условиях in vitro, обеспечивающих их рост и деление, или поддержание жизнеспособности клеток. В контексте настоящего документа термин культивируемые клетки означает клетки, которые размножают in vitro.
В контексте настоящего документа подразумевается, что термин полипептид охватывает единственное число полипептид и множественное число полипептиды и относится к молекуле, состоящей из мономеров (аминокислот), линейно связанных амидными связями (также известными как пептидные связи). Термин полипептид означает любую цепь или цепи из двух и более аминокислот безотносительно к конкретной длине продукта. Таким образом, под определение полипептид подпадают пептиды, дипептиды, трипептиды, олигопептиды, белки, аминокислотные цепи или любой другой термин, используемый для обозначения цепи или цепей из двух и более аминокислот, и термин полипептид можно использовать вместо любого из этих терминов или взаимозаменяемо с ними. Подразумевается, что термин полипептид также относится к продуктам постэкспрессионных модификаций полипептида, включая гликозилирование, ацетилирование, фосфорилирование, амидирование, дериватизацию с помощью известных защитных/блокирующих групп, протеолитическое расщепления или модификацию не встречающимися в природе аминокислотами, но не ограничиваясь перечисленным. Полипептид может быть получен из природного биологического источника или синтезирован с использованием рекомби- 15 044115 нантных технологий, но не обязательно транслирован с определяющей его последовательности нуклеиновой кислоты. Он может быть получен любым способом, в том числе путем химического синтеза.
Выделенный полипептид или его фрагмент, вариант либо производное относится к полипептиду, который находится вне своей естественной среды. Конкретный уровень очистки не требуется. Например, выделенный полипептид может быть просто извлечен из своей нативной или естественной среды. Рекомбинантные полипептиды и белки, экспрессируемые в клетках-хозяевах, считается выделенным для целей настоящего изобретения, как и нативные или рекомбинантные полипептиды, которые были разделены, фракционированы или частично либо существенно очищены любым подходящим способом.
Настоящее изобретение также включает фрагменты или варианты полипептидов и любые их сочетания. Термин фрагмент или вариант применительно к полипептидным связывающим доменам или связывающим молекулам по настоящему изобретению включает любые полипептиды, сохраняющие по меньшей мере некоторые из свойств (например, аффинность связывания с FcRn для FcRn-связывающего домена или варианта Fc, свертывающая активность для варианта FVIII или FVШ-связывающая активность для фрагмента ФВ) полипептида сравнения. Фрагменты полипептидов включают протеолитические фрагменты, делеционные фрагменты, а также фрагменты специфических антител, обсуждаемые в другом месте в настоящем документе, но не включают встречающийся в природе полноразмерный полипептид (или зрелый полипептид). Варианты полипептидных связывающих доменов или связывающих молекул по настоящему изобретению включает фрагменты согласно вышеприведенному описанию, а также полипептиды с аминокислотными последовательностями, измененными вследствие аминокислотных замен, делеций или вставок. Варианты могут встречаться или не встречаться в природе. Не встречающиеся в природе варианты можно получить, применяя методики мутагенеза, известные в данной области техники. Варианты полипептидов могут содержать консервативные или неконсервативные аминокислотные замены, делеций или добавления.
В контексте настоящего документа термин белок ФВ или белки ФВ означает любые фрагменты ФВ, которые взаимодействуют с FVIII и сохраняют по меньшей мере одно или более свойств, обычно проявляемых полноразмерным ФВ в отношении FVIII, например, предотвращение преждевременной активации до FVIIIa, предотвращение преждевременного протеолиза, предотвращение ассоциации с фосфолипидными мембранами, что может привести к преждевременному клиренсу, предотвращение связывания с рецепторами клиренса FVIII, которые могут связывать незащищенный FVIII, но не FVIII, связанный с ФВ, и/или стабилизацию взаимодействий между тяжелой цепью и легкой цепью FVIII.
Консервативная аминокислотная замена представляет собой замену, при которой аминокислотный остаток замещается аминокислотным остатком с аналогичной боковой цепью. В данной области техники определены семейства аминокислотных остатков с аналогичными боковыми цепями, включая основные боковые цепи (например, лизин, аргинин, гистидин), кислые боковые цепи (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), полярные незаряженные боковые цепи (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин), неполярные боковые цепи (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-разветвленные боковые цепи (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматические боковые цепи (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Следовательно, если аминокислота в полипептиде замещается другой аминокислотой с боковой цепью того же семейства, замена считается консервативной. В другом варианте реализации изобретения цепочка аминокислот может быть консервативно замещена структурно аналогичной цепочкой, отличающейся порядком и/или составом представителей одного семейства боковых цепей.
Как известно в данной области техники, идентичность последовательностей двух полипептидов определяется сравнением аминокислотной последовательности одного полипептида с последовательностью второго полипептида. В случаях, рассмотренных в настоящем документе, идентичность какоголибо конкретного полипептида по меньшей мере на около 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% другому полипептиду можно определить с использованием методов и программного обеспечения/компьютерных программ, известных в данной области техники, включая программу BESTFIT (Wisconsin Sequence Analysis Package, версия 8 для Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711), но не ограничиваясь ею. Программа BESTFIT использует алгоритм локальной гомологии Смита и Ватермана (Smith и Waterman), Advances in Applied Mathematics 2 (1981), 482-489, для поиска сегмента с самой высокой степенью сходства между двумя последовательностями. При использовании BESTFIT или другой программы выравнивания последовательностей для определения того, идентична ли конкретная последовательность, например, на 95% последовательности сравнения по настоящему изобретению, разумеется, устанавливают такие параметры, чтобы процент идентичности рассчитывался для всей длины полипептидной последовательности сравнения и чтобы допускались разрывы в гомологии вплоть до 5% от общего количества аминокислот в последовательности сравнения.
В контексте настоящего документа аминокислота, соответствующая аминокислоте или аминокислота, эквивалентная аминокислоте в последовательности белка ФВ или FVIII определяется методом выравнивания, чтобы обеспечить максимальную идентичность или сходность между первой последовательностью ФВ или FVIII и второй последовательностью ФВ или FVIII. Номер, используемый для иден- 16 044115 тификации эквивалентной аминокислоты во второй последовательности ФВ или FVIII, основывается на номере, используемом для идентификации соответствующей аминокислоты в первой последовательности ФВ или FVIII.
В контексте настоящего документа термин сайт встраивания относится к позиции в пределах полипептида FVIII или его фрагмента, варианта либо производного, расположенной непосредственно выше позиции, в которую может встраиваться гетерологический фрагмент. Сайт встраивания указывается в виде числа, представляющего собой номер аминокислоты в зрелом нативном белке FVIII (SEQ ID NO: 65), которой соответствует сайт встраивания, то есть аминокислоты, расположенной непосредственно с N-концевой стороны относительно позиции встраивания. Например, выражение а3 содержит последовательность XTEN в сайте встраивания, отвечающем аминокислоте 1656 последовательности SEQ ID NO: 65, указывает на то, что гетерологический фрагмент расположен между двумя аминокислотами, соответствующими аминокислоте 1656 и аминокислоте 1657 последовательности SEQ ID NO: 65.
Выражение непосредственно ниже аминокислоты в контексте настоящего документа относится к позиции непосредственно рядом с концевой карбоксильной группой аминокислоты. Аналогичным образом, выражение непосредственно выше аминокислоты относится к позиции непосредственно рядом с концевой аминогруппой аминокислоты. Следовательно, выражение между двумя аминокислотами сайта встраивания в контексте настоящего документа относится к позиции между двумя соседними аминокислотами, в которую встраивается последовательность XTEN или любой другой полипептид. Таким образом, выражения встроенный непосредственно ниже аминокислоты и встроенный между двумя аминокислотами сайта встраивания используются синонимично выражению встроенный в сайт встраивания.
Термины встроена, встраивается, встраивается в или грамматически родственные термины в контексте настоящего документа относятся к позиции последовательности XTEN в химерном полипептиде относительно аналогичной позиции в нативном зрелом белке FVIII человека. В контексте настоящего документа указанные термины касаются сравнительных характеристик рекомбинантного полипептида FVIII и нативного зрелого FVIII человека и не указывают, не подразумевают и не предполагают никаких методов или процессов, посредством которых был создан химерный полипептид. Например, в отношении химерного полипептида, предлагаемого в настоящем изобретении, выражение последовательность XTEN встроена непосредственно ниже аминокислотного остатка 745 полипептида FVIII означает, что химерный полипептид содержит последовательность XTEN непосредственно ниже аминокислоты, соответствующей аминокислоте 745 в нативном зрелом FVIII человека, например, последовательность XTEN, ограниченную аминокислотами, соответствующими аминокислотам 745 и 746 нативного зрелого FVIII человека.
Термин слитый или химерный белок включает первую аминокислотную последовательность, связанную со второй аминокислотной последовательностью, с которой она естественным образом не связывается в природе. Аминокислотные последовательности, обычно входящие в состав разных белков, могут быть объединены в слитом полипептиде, или же аминокислотные последовательности, обычно существующие в составе одного белка, могут быть расположены в новой конфигурации в составе слитого полипептида, например, в случае слития домена фактора VIII по настоящему изобретению с доменом Fc иммуноглобулина. Слитый белок создают, например, путем химического синтеза или путем создания и трансляции полинуклеотида, кодирующего пептидные участки в желаемом взаимном расположении. Химерный белок может дополнительно содержать вторую аминокислотную последовательность, соединенную с первой аминокислотной последовательностью ковалентной непептидной связью или нековалентной связью.
В контексте настоящего документа термин период полувыведения относится к биологическому периоду полувыведения конкретного полипептида in vivo. Период полувыведения может быть представлен как время, необходимое для выведения половины введенной субъекту дозы из кровотока и/или из других тканей животного. При построении графика клиренса заданного полипептида как функции времени обычно отмечают двухфазный процесс с быстрой α-фазой и более продолжительной β-фазой. Как правило, α-фаза отображает уравновешивание концентрации введенного полипептида Fc между внутрисосудистым и внесосудистым пространством и частично определяется размером полипептида. β-фаза, как правило, отображает катаболизм полипептида во внутрисосудистом пространстве. В некоторых вариантах реализации изобретения клиренс белка FVIII и химерного белка, содержащего FVIII, подчиняется однофазной модели, следовательно, у них нет альфа-фазы, а только бета-фаза. Таким образом, в определенных вариантах реализации изобретения термин период полувыведения в контексте настоящего документа относится к периоду полувыведения полипептида в β-фазе. Обычный период полувыведения человеческого антитела в фазе β у человека составляет 21 день.
Термин связанный в контексте настоящего документа относится к первой аминокислотной последовательности или нуклеотидной последовательности, ковалентно или нековалентно присоединенной ко второй аминокислотной последовательности или нуклеотидной последовательности соответственно. Первая аминокислотная последовательность или нуклеотидная последовательность может быть непосредственно соединена или помещена рядом со второй аминокислотной последовательностью или нук- 17 044115 леотидной последовательностью, либо же, как альтернативный вариант, первая последовательность может ковалентно соединяться со второй последовательностью посредством вставочной последовательности между ними. Термин связанный означает не только слитие первой аминокислотной последовательности со второй аминокислотной последовательностью на С-конце или N-конце, но также включает вставку целой первой аминокислотной последовательности (или второй аминокислотной последовательности) между любыми двумя аминокислотами второй аминокислотной последовательности (или первой аминокислотной последовательности соответственно). В одном варианте реализации изобретения первая аминокислотная последовательность может быть связана со второй аминокислотной последовательностью посредством пептидной связи или линкера. Первая нуклеотидная последовательность может быть связана со второй нуклеотидной последовательностью посредством фосфодиэфирной связи или линкера. Линкер может представлять собой пептид или полипептид (для полипептидных цепей), либо нуклеотид или нуклеотидную цепь (для нуклеотидный цепей), или любую химическую структуру (как для полипептидов, так и для полинуклеотидных цепей). Термин связанный также обозначен дефисом (-).
В контексте настоящего документа термин соединенный с относится к ковалентной или нековалентной связи между первой аминокислотной цепью и второй аминокислотной цепью. В одном варианте реализации изобретения термин соединенный с означает ковалентную непептидную связь или нековалентную связь. Данное соединение может обозначаться двоеточием, т.е. (:). В другом варианте реализации изобретения данный термин означает ковалентную связь, за исключением пептидной связи. Например, аминокислота цистеин содержит тиольную группу, которая может образовывать дисульфидную связь или мостик с тиольной группой второго остатка цистеина. В большинстве встречающихся в природе молекул IgG области СН1 и CL соединены дисульфидной связью и две тяжелые цепи соединены двумя дисульфидными связями в позициях, соответствующих позициям 239 и 242 согласно системе нумерации по Кабату (позициям 226 или 229 по европейской системе нумерации). Примеры ковалентной связи включают пептидную связь, металлическую связь, водородную связь, дисульфидную связь, сигма-связь, пи-связь, дельта-связь, гликозидную связь, агостическую связь, банановую связь, донорно-акцепторную связь, пи-дативную связь, двойную связь, тройную связь, четверную связь, пятерную связь, шестерную связь, конъюгацию, гиперконъюгацию, ароматичность, гаптность или антисвязывание, но не ограничиваются перечисленным. Неограничивающие примеры нековалентной связи включают ионную связь (например, катион-пи-взаимодействие или солевую связь), металлическую связь, водородную связь (например, диводородную связь, диводородный комплекс, низкобарьерную водородную связь или симметричную водородную связь), силу Ван-дер-Ваальса, лондоновские дисперсионные силы, механическую связь, галогенную связь, аурофильность, интеркаляцию, стэкинг, энтропийную силу или химическую полярность.
Применяемый в настоящем документе термин мономер-димерный гибрид относится к химерному белку, содержащему первую полипептидную цепь и вторую полипептидную цепь, соединенные между собой дисульфидной связью, причем первая цепь содержит фактор свертывания крови, например фактор VIII, и первый фрагмент Fc, a вторая цепь содержит, состоит по существу или состоит из второго фрагмента Fc без фактора свертывания крови. Таким образом, мономер-димерная гибридная конструкция представляет собой гибрид, содержащий мономерную часть со всего лишь одним фактором свертывания крови и димерную часть с двумя фрагментами Fc.
В контексте настоящего документа термин сайт расщепления или сайт ферментативного расщепления относится к сайту, распознаваемому ферментом. Некоторые сайты ферментативного расщепления содержат сайт внутриклеточного процессинга. В одном варианте реализации изобретения полипептид содержит сайт ферментативного расщепления, расщепляемый ферментом, который активируется во время реакции каскада свертывания крови, так что расщепление таких сайтов происходит в месте образования сгустка. Примеры таких сайтов включают, например, сайты, распознаваемые тромбином, фактором XIa или фактором Ха. Примеры сайтов расщепления фактором XIa включают, например, TQSFNDFTR (SEQ ID NO: 1) и SVSQTSKLTR (SEQ ID NO: 3).
Примеры сайтов расщепления тромбином включают, например,
DFLAEGGGVR (SEQ ID NO: 4), TTKIKPR (SEQ ID NO: 5), LVPRG (SEQ ID
NO: 6), ALRPR (SEQ ID NO: 7), ISDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID
NO: 106), DKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 88) и IEPRSFS (SEQ ID NO: 194).
Прочие сайты ферментативного расщепления известны в данной области техники и описаны в других местах настоящего документа.
В контексте настоящего документа термин сайт процессинга или сайт внутриклеточного процессинга относится к типу сайтов ферментативного расщепления в полипептиде, которые являются мишенью ферментов, выполняющих свою функцию после трансляции полипептида. В одном варианте реализации изобретения такие ферменты выполняют свою функцию во время переноса полипептида из полости аппарата Гольджи в транс-отдел аппарата Гольджи. Ферменты внутриклеточного процессинга расще
- 18 044115 пляют полипептиды перед секрецией белка из клетки. Примеры таких сайтов процессинга включают, например, сайты-мишени РАСЕ/фуринового (где РАСЕ представляет собой сокращение от Paired basic Amino acid Cleaving Enzyme - фермент, расщепляющий белок в месте спаренных основных аминокислот) семейства эндопептидаз. Эти ферменты сосредоточены на мембране аппарата Гольджи и расщепляют белки на карбоксильном конце мотива Arg-[любой остаток]-(Lys или Arg)-Arg. В контексте настоящего документа фуриновое семейство ферментов включает, например, PCSK1 (также известный как РС1/РсЗ), PCSK2 (также известный как РС2), PCSK3 (также известный как фурин или РАСЕ), PCSK4 (также известный как РС4), PCSK5 (также известный как РС5 or PC6), PCSK6 (также известный как РАСЕ4) или PCSK7 (также известный как PC7/LPC, РС8 или SPC7). Прочие сайты процессинга известны в данной области техники.
В конструкциях, включающих более одного сайта процессинга или расщепления, следует понимать, что эти сайты могут быть разными или одними и теми же.
Термин фурин относится к ферментам, соответствующим шифру КФ 3.4.21.75. Фурин представляет собой субтилизиноподобную пропротеинконвертазу, также известную как РАСЕ (Paired basic Amino acid Cleaving Enzyme - фермент, расщепляющий белок в месте спаренных основных аминокислот). Фурин удаляет фрагменты неактивных белков-предшественников, чтобы преобразовать их в биологически активные белки. Фурин может отщеплять пропептид ФВ от зрелой молекулы ФВ в процессе внутриклеточного транспорта пропептида ФВ. В некоторых вариантах реализации изобретения фурин отщепляет домен D1D2 от домена D'D3 белка ФВ. В других вариантах реализации изобретения нуклеотидная последовательность, кодирующая фурин, может экспрессироваться вместе с нуклеотидной последовательностью, кодирующей фрагмент ФВ, в результате чего домены D1D2 могут отщепляться фурином внутри клетки.
В конструкциях, включающих более одного сайта процессинга или расщепления, следует понимать, что эти сайты могут быть разными или одними и теми же.
В контексте настоящего документа термин процессируемый линкер относится к линкеру, содержащему по меньшей мере один сайт внутриклеточного процессинга из описанных в другом месте в настоящем документе.
В контексте настоящего документа нарушение гемостаза означает генетически унаследованное или приобретенное состояние, которое характеризуется склонностью к кровотечениям, будь то спонтанным или вызванным травмой, из-за нарушенной или отсутствующей способности к образованию фибринового сгустка. К примерам таких нарушений относятся гемофилии. Тремя основными формами гемофилии являются гемофилия А (недостаточность фактора VIII), гемофилия В (недостаточность фактора IX, или болезнь Кристмаса) и гемофилия С (недостаточность фактора XI, легкая склонность к кровотечениям). Другие нарушения гемостаза включают, например, болезнь Виллебранда, недостаточность фактора XI (недостаточность плазменного предшественника тромбопластина), недостаточность фактора XII, недостаточности или структурные аномалии фибриногена, протромбина, фактора V, фактора VII, фактора X или фактора XIII, синдром Бернара-Сулье, вызванный дефектом или недостаточностью тромбоцитарного гликопротеина 1b (GPIb). GPIb - рецептор ФВ - может быть дефектным и приводить к нарушению образования первичного сгустка (нарушению первичного гемостаза и повышенной склонности к кровотечениям) и к тромбастении Гланцманна-Негели (тромбастении Гланцманна). При печеночной недостаточности (острой и хронической) печень синтезирует факторы свертывания крови в недостаточном количестве, из-за чего может повышаться риск кровотечения.
Химерные молекулы по настоящему изобретению можно использовать в профилактических целях. В контексте настоящего документа термин профилактическое лечение относится к введению молекулы до эпизода кровотечения. В одном варианте реализации изобретения субъект, нуждающийся в общем кровоостанавливающем средстве, подвергается хирургическом вмешательству или собирается перенести хирургическое вмешательство. Химерный белок по данному изобретению может быть введен до или после хирургического вмешательства в качестве профилактического средства. Химерный белок по данному изобретению может быть введен до или после хирургического вмешательства для контроля эпизода острого кровотечения. Хирургическое вмешательство может включать трансплантацию печени, резекцию печени, стоматологические процедуры или трансплантацию стволовых клеток, но не ограничивается перечисленным.
Химерный белок по настоящему изобретению также может использоваться для лечения по требованию. Термин лечение по требованию относится к введению химерной молекулы в ответ на симптомы эпизода кровотечения или перед осуществлением деятельности, которая может привести к кровотечению. В одном аспекте изобретения лечение по требованию может предоставляться субъекту после начала кровотечения, например, после повреждения, или в том случае, когда ожидается кровотечение, например, перед хирургическим вмешательством. В другом аспекте изобретения лечение по требованию может предоставляться перед деятельностью, которая повышает риск кровотечения, например, перед занятием контактным видом спорта.
В контексте настоящего документа термин острое кровотечение относится к эпизоду кровотечения независимо от причины, лежащей в его основе. Например, у субъекта может быть травма, уремия,
- 19 044115 наследственное нарушение свертываемости крови (например, недостаточность фактора VII), заболевание тромбоцитов или резистентность, обусловленная выработкой антител к факторам свертывания крови.
В контексте настоящего документа термины лечить, лечение, лечащий относятся, например, к уменьшению тяжести заболевания или патологического состояния; уменьшению продолжительности течения заболевания; уменьшению одного или более симптомов, связанных с заболеванием или состоянием; оказанию благоприятного эффекта для субъекта с заболеванием или состоянием, не обязательно излечивая это заболевание или состояние, либо профилактике одного или более симптомов, связанных с заболеванием или состоянием. В одном варианте реализации изобретения термин лечить или лечение означает поддержание минимальной концентрации FVIII на уровне по меньшей мере около 1 МЕ/дл, 2 МЕ/дл, 3 МЕ/дл, 4 МЕ/дл, 5 МЕ/дл, 6 МЕ/дл, 7 МЕ/дл, 8 МЕ/дл, 9 МЕ/дл, 10 МЕ/дл, 11 МЕ/дл, 12 МЕ/дл, 13 МЕ/дл, 14 МЕ/дл, 15 МЕ/дл, 16 МЕ/дл, 17 МЕ/дл, 18 МЕ/дл, 19 МЕ/дл или 20 МЕ/дл у субъекта путем введения химерного белка или фрагмента ФВ по данному изобретению. В другом варианте реализации изобретения лечить или лечение означает поддержание минимальной концентрации FVIII на уровне от около 1 до около 20 МЕ/дл, от около 2 до около 20 МЕ/дл, от около 3 до около 20 МЕ/дл, от около 4 до около 20 МЕ/дл, от около 5 до около 20 МЕ/дл, от около 6 до около 20 МЕ/дл, от около 7 до около 20 МЕ/дл, от около 8 до около 20 МЕ/дл, от около 9 до около 20 МЕ/дл или от около 10 до около 20 МЕ/дл. Лечение заболевания или патологического состояния также может включать поддержание активности FVIII у субъекта на уровне, сопоставимом с уровнем по меньшей мере около 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% или 20% от активности FVIII у субъекта, не болеющего гемофилией. Минимальную концентрацию, требуемую для лечения, можно измерять с помощью одного или более известных методов и можно корректировать (повышать или снижать) для каждого конкретного пациента.
II. Химерные белки.
Настоящее изобретение относится к продлению периода полувыведения химерного белка, в котором используется белок ФВ, слитый с последовательностью XTEN, посредством предотвращения или ингибирования ассоциации фактора, ограничивающего период полувыведения FVIII, т.е. эндогенного ФВ, с белком FVIII. Эндогенный ФВ ассоциирован в нековалентных комплексах с около 95-98% FVIII. Хотя эндогенный ФВ представляет собой фактор, ограничивающий период полувыведения FVIII, также известно, что эндогенный ФВ, связанный с белком FVIII, различными способами защищает белок FVIII. Например, полноразмерный ФВ (в виде мультимера массой около 250 кДа) может защищать FVIII от расщепления протеазами и активации FVIII, стабилизировать тяжелую цепь и/или легкую цепь FVIII и предотвращает клиренс FVIII фагоцитарными рецепторами. Однако в то же время эндогенный ФВ ограничивает период полувыведения FVIII, предотвращая пиноцитоз и выводя комплекс FVIII-ФВ из системы через путь клиренса ФВ. Безотносительно к какой-либо теории, считается, что эндогенный ФВ представляет собой фактор, ограничивающий период полувыведения, который не позволяет продлить период полувыведения химерного белка, слитого с компонентом, продлевающим период полувыведения, более чем примерно вдвое по сравнению с FVIII дикого типа. Следовательно, настоящее изобретение направлено на предотвращение или ингибирование взаимодействия между эндогенным ФВ и белком FVIII благодаря использованию белка ФВ, содержащего домен D' и домен D3 (например, фрагмента ФВ), и в то же время на увеличение периода полувыведения полученного(-ых) в результате белка(-ов) FVIII благодаря использованию последовательности XTEN в сочетании с константной областью ИГ или ее частью. В частности, настоящее изобретение показывает, что более короткая последовательность XTEN (т.е. последовательность XTEN длиной менее 288 аминокислот, т.е. последовательность XTEN короче 288 аминокислот) обеспечивает лучшее продление периода полувыведения химерного белка.
В одном варианте реализации изобретение касается химерного белка, содержащего (i) первый полипептид, состоящий из белка FVIII, слитого с первой константной областью ИГ или ее частью, и (ii) второй полипептид, состоящий из белка ФВ, который включает домен D' и домен D3 ФВ, слитого со второй константной областью ИГ или ее частью посредством расположенной между ними последовательности XTEN, причем последовательность XTEN содержит менее 288 аминокислотных остатков и первый полипептид связан или соединен со вторым полипептидом. В другом варианте реализации последовательность XTEN во втором полипептиде состоит из аминокислотной последовательности длиной от 12 аминокислот до 287 аминокислот. В прочих вариантах реализации химерный белок демонстрирует более продолжительный период полувыведения по сравнению с соответствующим слитым белком, содержащим первый полипептид и второй полипептид, в котором второй полипептид включает последовательность XTEN, содержащую по меньшей мере 288 аминокислот, например, AE288, например, SEQ ID NO: 8. В еще одних вариантах реализации изобретения последовательность XTEN второго полипептида содержит по меньшей мере около 36, по меньшей мере около 42, по меньшей мере около 72 или по меньшей мере около 144 аминокислот, но менее 288 аминокислот, например,
- 20 044115
AE42, AE72, AE144 (AE144,
AE144_2A, AE144_3B, AE144_4A, AE144_5A, AE144_6B), AG42, AG72 или AG144 (AG144, AG144 A, AG144_B, AG144 C, AG144 F), например, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO:
10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 56; SEQ ID NO: 57; SEQ ID NO: 58; SEQ ID NO: 59; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 60; SEQ ID NO: 61; SEQ ID NO: 62; или SEQ ID NO: 63.
Химерный белок по настоящему изобретению может дополнительно содержать вторую последовательность XTEN, которая связывает белок FVIII с первой константной областью ИГ или ее частью.
В определенных вариантах реализации изобретение касается химерного белка, содержащего (i) первый полипептид, состоящий из белка FVIII, слитого с первой константной областью ИГ или ее частью, и (ii) второй полипептид, состоящий из белка ФВ, который включает домен D' и домен D3 ФВ, слитого со второй константной областью ИГ или ее частью посредством расположенной между ними первой последовательности XTEN, причем последовательность XTEN содержит менее 288 аминокислотных остатков, первый полипептид связан или соединен со вторым полипептидом и первый полипептид дополнительно содержит вторую последовательность XTEN, встроенную в один или более сайтов встраивания в пределах белка FVIII или слитую с белком FVIII и/или первой константной областью ИГ или ее частью. Таким образом, в одном варианте реализации изобретения вторая последовательность XTEN встроена в один или более сайтов встраивания в пределах белка FVIII. В другом варианте реализации изобретения вторая последовательность XTEN слита с белком FVIII и/или с первой константной областью ИГ или ее частью. В прочих вариантах реализации изобретения вторая последовательность XTEN встроена в один или более сайтов встраивания в пределах белка FVIII и третья последовательность XTEN слита с белком FVIII и/или с первой константной областью ИГ или ее частью.
Вторая и/или третья последовательности XTEN могут представлять собой аминокислотные последовательности XTEN любой длины. Например, вторая и/или третья последовательности XTEN могут представлять собой последовательности, описанные в другом месте настоящего документа, например,
АЕ42, АЕ72, АЕ864, АЕ576,
АЕ288, АЕ144, AG864, AG576, AG288 и AG144, например, SEQ Ш NO: 8; SEQ Ш NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 54; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 56; SEQ ID NO: 57;
SEQ ID NO: 58; SEQ ID NO: 59; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 60; SEQ ID NO: 61; SEQ ID
NO: 62; или SEQ ID NO: 63.
В конкретном варианте реализации изобретения вторая и/или третья последовательности XTEN представляют собой AE288 или AG288, например, SEQ ID NO: 8 или 19.
В определенных вариантах реализации изобретение касается химерного белка, содержащего (i) первый полипептид, состоящий из белка FVIII, слитого с первой константной областью ИГ или ее частью посредством необязательного линкера, причем необязательная последовательность XTEN (X2) встроена в один или более сайтов встраивания в пределах белка FVIII или слита с белком FVIII или первой константной областью ИГ или ее частью, и (ii) второй полипептид, состоящий из белка ФВ, который включает домен D' и домен D3 ФВ, слитого со второй константной областью ИГ или ее частью посредством последовательности XTEN (X1), расположенной между белком ФВ и второй константной областью ИГ или ее частью, причем последовательность XTEN (X1) содержит менее 288 аминокислотных остатков и слита с белком ФВ посредством линкера, и причем первый полипептид соединен со вторым полипептидом. В некоторых вариантах реализации изобретение касается химерного белка, содержащего (i) первый полипептид, состоящий из белка FVIII, слитого с первой константной областью ИГ или ее частью посредством необязательного линкера, причем необязательная последовательность XTEN (Х2) встроена в один или более сайтов встраивания в пределах белка FVIII или слита с белком FVIII или первой константной областью ИГ или ее частью, и (ii) второй полипептид, состоящий из белка ФВ, который включает домен D' и домен D3 ФВ, слитого со второй константной областью ИГ или ее частью посредством последовательности XTEN (X1), расположенной между белком ФВ и второй константной областью ИГ или ее частью, причем последовательность XTEN (X1) содержит менее 288 аминокислотных остатков и слита со второй константной областью ИГ или ее частью посредством линкера, и причем первый полипептид соединен со вторым полипептидом. В других вариантах реализации изобретения линкер, посредством которого последовательность XTEN (X1) слита с белком ФВ или со второй константной областью ИГ или ее частью, представляет собой расщепляемый линкер. Неограничивающие примеры расщепляемых линкеров описаны в других местах в данном документе. В конкретном варианте реализации изобретения линкер представляет собой линкер, расщепляемый тромбином.
В некоторых вариантах реализации изобретения химерный белок представляет собой две полипептидные цепи, первая из которых содержит описанный выше первый полипептид, а вторая содержит опи
- 21 044115 санный выше второй полипептид. Например, две полипептидные цепи включают (i) первую цепь, содержащую одноцепочечный белок FVIII, первую константную область ИГ или ее часть и необязательную последовательность XTEN, встроенную в один или более сайтов встраивания в пределах белка FVIII или слитую с белком FVIII или с первой константной областью ИГ или ее частью, и (ii) вторую цепь, содержащую белок ФВ, слитый со второй константной областью ИГ или ее частью посредством расположенной между ними последовательности XTEN (X1), причем последовательность XTEN (X1) содержит менее 288 аминокислот.
В определенных вариантах реализации изобретения химерный белок представляет собой две полипептидные цепи, первая из которых содержит тяжелую цепь белка FVIII, а вторая содержит, в направлении от N-конца до С-конца, легкую цепь белка FVIII, необязательную последовательность XTEN, встроенную в один или более сайтов встраивания в пределах белка FVIII или слитую с белком FVIII или первой константной областью ИГ или ее частью, первую константную область ИГ или ее часть, необязательный линкер (например, процессируемый линкер), белок ФВ, последовательность XTEN (X1), второй необязательный линкер (например, расщепляемый линкер) и вторую константную область ИГ или ее часть.
В других вариантах реализации изобретения химерный белок представляет собой три полипептидные цепи: (i) первую цепь, содержащую тяжелую цепь белка FVIII, (ii) вторую цепь, содержащую легкую цепь белка FVIII, первую константную область ИГ или ее часть и необязательную последовательность XTEN, встроенную в один или более сайтов встраивания в пределах тяжелой цепи или легкой цепи белка FVIII или слитую с белком FVIII или с первой константной областью ИГ или ее частью, и (iii) третью цепь, содержащую белок ФВ, слитый со второй константной областью ИГ или ее частью посредством расположенной между ними последовательности XTEN (X1), причем первая цепь и вторая цепь соединены посредством нековалентной связи, например, металлической связи, а вторая цепь и третья цепь соединены посредством ковалентной связи, например, дисульфидной связи.
В еще одних вариантах реализации изобретения химерный белок представляет собой одноцепочечный белок, содержащий, в направлении от N-конца к С-концу, одноцепочечный белок FVIII, необязательную последовательность XTEN, встроенную в один или более сайтов встраивания в пределах белка FVIII или слитую с белком FVIII или с первой константной областью ИГ или ее частью, необязательный линкер (например, процессируемый линкер), белок ФВ, последовательность XTEN (X1), второй необязательный линкер (например, расщепляемый линкер) и вторую константную область ИГ или ее часть.
В определенных вариантах реализации изобретения химерный белок содержит одну из нижеприведенных формул (a)-(hh):
(a) FVin-Fl:F2-L2-X-Ll-V;
(b) FVin-Fl:V-Ll-X-L2-F2;
(с) Fl-FVni:F2-L2-X-Ll-V;
(d) Fl-FVni:V-Ll-X-L2-F2;
- 22 044115 (e) FVin-X2-Fl:F2-L2-Xl-Ll-V;
(f) FVin-X2-Fl:V-Ll-Xl-L2-F2;
(g) FVIII(X2)-F1:F2-L2-X1-L1-V;
(h) FVIII(X2)-F1:V-L1-X1-L2-F2;
(i) F1-X2-F1:F2-L2-X1-L1-V;
(j) F1-X2-F1:V-L1-X1-L2-F2;
(k) V-L1-X-L2-F2-L3-FVIII-L4-F1;
(1) V-L1-X-L2-F2-L3-F1-L4-FVIII;
(m) F1-L4-FVIII-L3-F2-L2-X-L1-V;
(n) FVIII-L4-F1-L3-F2-L2-X-L1-V;
(o) FVIII-L4-F1-L3-V-L1-X-L2-F2;
(p) FVIII-L4-F1-L3-F2-L2-X-L1-V;
(q) F2-L2-X-L1-V-L3-F1-L4-FVIII;
(r) F2-L2-X-L1-V-L3-FVIII-L4-F1;
(s) V-Ll-Xl-L2-F2-L3-FVni(X2)-L4-Fl;
(t) V-Ll-Xl-L2-F2-L3-Fl-L4-FVni(X2);
(u) Fl -L4-FVni(X2)-L3-F2-L2-X1 -L1 - V;
(v) F-L4-FVni(X2)-L3-V-Ll-Xl-L2-F2;
(w) FVIII(X2)-L4-F 1-L3 - V-L1 -X1-L2-F2;
(x) FVIII(X2)-L4-F 1-L3 -F2-L2-X1 -L1 - V;
(y) F2-L2-Xl-Ll-V-L3-Fl-L4-FVni(X2);
(z) F2-L2-Xl-Ll-V-L3-FVni(X2)-L4-Fl;
(aa) V-L 1-X2-L2-F2-L3-FVIII-L4-X2-L5-F1;
(bb) V-L1-X2-L2-F2-L3-F1-L5-X2-L4-FVIII;
(cc) Fl -L5-X2-L4-FVIII-L3 -F2-L2-X2-L1 -V;
(dd) F1-L5-X2-L4-FVIII-L3 - V-L 1-X2-L2-F2;
(ее) FVIII-L5-X2-L4-F2-L3 - V-L 1 -X1-L2-F1;
(ff) FVIII-L5-X2-L4-F2-L3 -Fl -L2-X1 -L1 - V;
(gg) Fl-L2-Xl-Ll-V-L3-F2-L4-X2-L5-FVin; или (hh) F1-L2-X1 -L1 - V-L3 -FVIII-L5-X2-L4-F2;
где V представляет собой белок ФВ, который содержит домен D' и домен D3,
X или X1 является первой последовательностью XTEN, имеющей менее чем 288 аминокислот,
Х2 представляет собой вторую последовательность XTEN, FVIII включает белок FVIII,
FVIII(X2), включает белок FVIII, имеющий вторую последовательность XTEN, встроенную в один или более сайтов встраивания в пределах белка FVIII,
F1 представляет собой первую константную область ИГ или ее часть,
F2 представляет собой вторую константную область ИГ или ее часть,
L1, L2, L3, L4, или L5 представляют собой необязательный линкер, (-) представляет собой пептидную связь; и (:) представляет собой ковалентную связь или нековалентную связь.
В одном варианте реализации изобретения последовательность X или
X1 состоит из аминокислотной последовательности длиной от 12 аминокислот до 287 аминокислот. В другом варианте реализации изобретения химерный белок демонстрирует более продолжительный период полувыведения по сравнению с соответствующим химерным белком по формуле, где X или X1 представляет собой AE288, например, SEQ ID NO: 8.
В других вариантах реализации изобретения X или X1 в формуле содержит по меньшей мере около
- 23 044115
36, по меньшей мере около 42, по меньшей мере около 72 или по меньшей мере около 144 аминокислот, но менее 288 аминокислот, например
АЕ42, АЕ72, АЕ144 (АЕ144, АЕ144_2А, АЕ144_ЗВ, АЕ144_4А, АЕ144_5А, АЕ144_6В),
AG42, AG72 или AG144 (AG144, AG144_A, AG144_B, AG144_C, AG144_F), например, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 56; SEQ ID
NO: 57; SEQ ID NO: 58; SEQ ID NO: 59; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 60; SEQ ID NO: 61;
SEQ ID NO: 62; или SEQ ID NO: 63.
Еще в одних вариантах реализации изобретения Х2 содержит аминокислотную последовательность длиной по меньшей мере около 36 аминокислот, по меньшей мере 42 аминокислоты, по меньшей мере 144 аминокислоты, по меньшей мере 288 аминокислот, по меньшей мере 576 аминокислот или по меньшей мере 864 аминокислоты, например
АЕ42, АЕ72, АЕ864, АЕ576, АЕ288, АЕ144, AG864, AG576,
AG288 или AG144, например, SEQ Ш NO: 9; SEQ Ш NO: 10; SEQ Ш NO: 15; SEQ Ш NO:
16; SEQ Ш NO: 8; SEQ Ш NO: И; SEQ Ш NO: 17; SEQ Ш NO: 18; SEQ ID NO: 19; или
SEQ ID NO: 14.
В конкретном варианте реализации изобретения Х2 представляет собой AE288 или AG288, например, SEQ ID NO: 8 или 19.
В определенных вариантах реализации изобретения химерный белок, содержащий X или X1 и/или Х2, демонстрирует более продолжительный период полувыведения по сравнению с химерным белком, не содержащим X или X1 и/или Х2. В других вариантах реализации изобретения L1 и/или L2 представляет собой расщепляемый линкер. Еще в одних вариантах реализации изобретения L4 и/или L5 представляет собой расщепляемый линкер.
И.А. Белки фактора фон Виллебранда (ФВ).
ФВ (также известный как F8ФВ) является большим мультимерным гликопротеином, присутствующим в плазме крови и постоянно производимым в эндотелии (в тельцах Вейбел-Палада), мегакариоцитах (альфа-гранулы тромбоцитов) и субэндотелии соединительной ткани. Основной мономер ФВ является белком, состоящим из 2813 аминокислот. Каждый мономер содержит ряд специфических доменов с определенной функцией, домен D'/D3 (который связывается с фактором VIII), домен А1 (который связывается с тромбоцитарным рецептором GPIb, гепарином, и/или, возможно, коллагеном), домен A3 (который связывается с коллагеном), домен С1 (в котором домен RGD связывается с тромбоцитарным интегрином αΠΕβ3, когда он активирован) и домен цистеиновый узел на С терминальном конце белка (который ФВ разделяет с тромбоцитарным фактором роста (PDGF), трансформирующим фактор роста-бета (TGF-β) и бета-хорионическом гонадотропином человека (PHCG)).
В одном варианте реализации изобретения белок ФВ является фрагментом ФВ. Термин фрагмент ФВ в данном контексте включает в себя, но не ограничивается ими, функциональные фрагменты ФВ, содержащие домен D' и домен D3, которые обладают способностью ингибировать связывание эндогенных ФВ с FVIII. В одном варианте реализации изобретения фрагмент ФВ связывается с белком FVIII. В другом варианте реализации изобретения фрагмент ФВ блокирует сайт связывания белка FVIII, тем самым ингибируя взаимодействие белка FVIII с эндогенными ФВ. Фрагменты ФВ включают в себя производные, варианты, мутанты или аналоги, которые сохраняют эту активность ФВ.
Аминокислотная последовательность мономера ФВ человека (2813 аминокислот) описана под номером доступа _NP_000543.2_ в Genbank. Нуклеотидная последовательность, кодирующая ФВ, описана под номером доступа _NM_000552.3_ в Genbank. Нуклеотидная последовательность ФВ человека обозначена как SEQ ID NO: 20. SEQ ID NO: 21 представляет собой аминокислотную последовательность полноразмерного ФВ. Каждый домен ФВ представлен в табл. 1.
- 24 044115
Таблица 1
Последовательности ФВ
Домены ФВ Аминокислотная последовательность
Сигнальный пептид ФВ (Аминокислоты 1-22 из SEQ ID NO: 21) 1 MIPARFAGVL LALALILPGT LC 22
Область D1D2 ФВ (Аминокислоты 23763 из SEQ ID NO: 21) 23 51 101 151 201 251 301 351 401 451 501 551 601 651 701 751 AEGTRGRS STARCSLFGS DFVNTFDGSM YSFAGYCSYL LAGGCQKRSF SIIGDFQNGK RVSLSVYLGE FFDIHLFVNG TVTQGDQRVS MPYASKGLYL ETEAGYYKLS GEAYGFVARI DGSGNFQVLL SDRYFNKTCG LCGNFNIFAE DDFMTQEGTL TSDPYDFANS WALSSGEQWC ERASPPSSSC NISSGEMQKG LWEQCQLLKS TSVFARCHPL VDPEPFVALC EKTLCECAGG LECACPALLE YARTCAQEGM VLYGWTDHSA CSPVCPAGME YRQCVSPCAR TCQSLHINEM CQERCVDGCS CPEGQLLDEG LCVESTECPC VHSGKRYPPG TSLSRDCNTC ICRNSQWICS NEECPGECLV TGQSHFKSFD NRYFTFSGIC QYLLARDCQD HSFSIVIETV QCADDRDAVC TRSVTVRLPG LHNSLVKLKH GAGVAMDGQDIQLPLLKGDL RIQHTVTASV RLSYGEDLQM DWDGRGRLLV KLSPVYAGKT CGLCGNYNGN QGDDFLTPSG LAEPRVEDFG NAWKLHGDCQ DLQKQHSDPC ALNPRMTRFS EEACAVLTSP TFEACHRAVS PLPYLRNCRY DVCSCSDGRE CLCGALASYA AACAGRGVRV AWREPGRCEL NCPKGQVYLQ CGTPCNLTCR SLSYPDEECN EACLEGCFCP PGLYMDERGD CVPKAQCPCY YDGEIFQPED IFSDHHTMCY CEDGFMHCTM SGVPGSLLPD AVLSSPLSHR SKR 763
Домен D' ФВ 764 801 SLSCRPP MVKLVCPADN LRAEGLECTK TCONYDLECM SMGCVSGCLC PPGMVRHENR CVALERCPCF HOGKEYAPGE
TVKIGCNTCV
- 25 044115
851 CRDRKWNCTD НУСРАТ 866
Домен D3 ФВ 867 CSTI GM AHY_LTFDG_LK Y LFPGECQ
YVLVQPYCGS
901 NPGTFRILVG NKGCSHPSVK CKKRVTILVE GGEIELFDGE
YNVKRPMKDE
951 THFEVVESGR YIILLLGKAL SVVWDRHLSI SVVLKQTYQE
kvcglcgnfd
1001 GIQNNDLTSS NLQVEEDPVD FGNSWKVSSQ.CADTRKVPLD
SSPATCHNNI
1051 MKQTMVDSSC RILTSDVFQD CNKLVDPEPY LDVCIYDTCS
CESIGDCACF
1101 CDTIAAYAHV CAQHGKVVTW RTATLCP^SC EERNLRENGY
ECEWRYNSCA
1151 PACQVTCQHP EPLACPVQCV EGCHAHCPPG KILDELLQTC
YPPEDCPVCE
1201 VAGRRFASGK KVTLNPSDPE HCQICHCDVV NLTCEACQEP
1240
Домен А1 ФВ 1241 GGLVVPPTDA
1251 PVSPTTLYVE DISEPPLHDF YCSRLLDLVF LLDGSSRLSE
AEFEVLKAFV
1301 VDMMERLRIS QKWVRVAVVE YHDGSHAYIG LKDRKRPSEL
RRIASQVKYA
1351 GSQVASTSEV LKYTLFQIFS KIDRPEASRI ALLLMASQEP
QRMSRNFVRY
1401 VQGLKKKKVI VIPVGIGPHA NLKQIRLIEK QAPENKAFVL
SSVDELEQQR
1451 DEIVSYLCDL APEAPPPTLP PDMAQVTVG 1479
1480 P GLLGVSTLGP KRNSMVLDVA
1501 FVLEGSDKIG EADFNRSKEF MEEVIQRMDV GQDSIHVTVL
QYSYMVTVEY
1551 PFSEAQSKGD ILQRVREIRY QGGNRTNTGL ALRYLSDHSF
LVSQGDREQA 1600
1601 PNLVYMVTGN PASDEIKRLP GDIQVVPIGV GPNANVQELE
RIGWPNAPIL
1651 IQDFETLPRE APDLVLQRCC SGEGLQIPTL SPAPDCSQPL
DVILLLDGSS
1701 SFPASYFDEM KSFAKAFISK ANIGPRLTQV SVLQYGSITT
IDVPWNVVPE
1751 KAHLLSLVDV MQREGGPSQI GDALGFAVRY LTSEMHGARP
GASKAVVILV
1801 TDVSVDSVDA AADAARSNRV TVFPIGIGDR YDAAQLRILA
- 26 044115
GPAGDSNVVK
1851 LQRIEDLPTM VTLGNSFLHK LCSGFVRICM DEDGNEKRPG DVWTLPDQCH
1901 TVTCQPDGQT LLKSHRVNCD RGLRPSCPNS QSPVKVEETC GCRWTCPCVC
1951 TGSSTRHIVT FDGQNFKLTG SCSYVLFQNK EQDLEVILHN GACSPGARQG
2001 CMKSIEVKHS ALSVEXHSDM EVTVNGRLVS VPYVGGNMEV NVYGAIMHEV
2051 RFNHLGHIFT FTPQNNEFQL QLSPKTFASK TYGLCGICDE NGANDFMLRD
2101 GTVTTDWKTL VQEWTVQRPG QTCQPILEEQ CLVPDSSHCQ VLLLPLFAEC
2151 HKVLAPATFY AICQQDSCHQ EQVCEVIASY AHLCRTNGVC VDWRTPDFCA
2201 MSCPPSLVYN HCEHGCPRHC DGNVSSCGDH PSEGCFCPPD KVMLEGSCVP
2251 EEACTQCIGE DGVQHQFLEA WVPDHQPCQI CTCLSGRKVN CTTQPCPTAK
2301 APTCGLCEVA RLRQNADQCC PEYECVCDPV SCDLPPVPHC ERGLQPTLTN
2351 PGECRPNFTC ACRKEECKRV SPPSCPPHRL PTLRKTQCCD EYECACNCVN
2401 STVSCPLGYL ASTATNDCGC TTTTCLPDKV CVHRSTIYPV GQFWEEGCDV
2451 CTCTDMEDAV MGLRVAQCSQ KPCEDSCRSG FTYVLHEGEC CGRCLPSACE
2501 VVTGSPRGDS QSSWKSVGSQ WASPENPCLI NECVRVKEEV FIQQRNVSCP
2551 QLEVPVCPSG FQLSCKTSAC CPSCRCERME ACMLNGTVIG PGKTVMIDVC
2601 TTCRCMVQVG VISGFKLECR KTTCNPCPLG YKEENNTGEC CGRCLPTACT
2651 IQLRGGQIMT LKRDETLQDG CDTHFCKVNE RGEYFWEKRV TGCPPFDEHK
2701 CLAEGGKIMKIPGTCCDTCE EPECNDITAR LQYVKVGSCK SEVEVDIHYC
2751 QGKCASKAMY SIDINDVQDQ CSCCSPTRTE PMQVALHCTN GSVVYHEVLN
2801 AMECKCSPRK CSK
Нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 20)
Полоноразмерный 1 ATGATTCCTG CCAGATTTGC CGGGGTGCTG CTTGCTCTGG
- 27 044115
ФВ СССТСАТТТТ 51 GCCAGGGACC CTTTGTGCAG AAGGAACTCG CGGCAGGTCA TCCACGGCCC 101 GATGCAGCCT TTTCGGAAGT GACTTCGTCА ACACCTTTGА TGGGAGCATG 151 ТACAGCTTTG CGGGATACTG СAGTTАССТС CTGGCAGGGG GCTGCCAGAA 201 ACGCTCCTTC TCG ATT ATTG GGG АСТТСС A G A ATGGC А AG AGAGTGAGCC 251 TCTCCGTGTA TCTTGGGGAA TTTTTTGACА ТССATTTGTT TGTCAATGGT 301 ACCGTGACAC AGGGGGACCA AAGAGTCTCC ATGCCCTATG CCTCCAAAGG 351 GCTGTATCTA GAAACTGAGG CTGGGTACTA CAAGCTGTCC GGTGAGGCCT 401 ATGGCTTTGT GGCCAGGATC GATGGCAGCG GCAACTTTCA AGTCCTGCTG 451 TCAGAC AGAT АСТТСААСАА GACCTGCGGG CTGTGTGGCA АСТТТААСАТ 501 CTTTGCTGAA GATGACTTTA TGACCCAAGA AGGGACCTTG ACCTCGGACC 551 CTTATGACTT TGCCAACTCA TGGGCTCTGA GCAGTGGAGA ACAGTGGTGT 601 GAACGGGCAT CTCCTCCCAG CAGCTCATGC ААСАТСТССТ CTGGGGAAAT 651 GCAGAAGGGC CTGTGGGAGC AGTGCCAGCT TCTGAAGAGC ACCTCGGTGT 701 TTGCCCGCTG CCACCCTCTG GTGGACCCCG AGCCTTTTGT GGCCCTGTGT 751 GAGAAGАСТТ TGTGTGAGTG TGCTGGGGGG CTGGAGTGCG CCTGCCCTGC 801 CCTCCTGGAG TACGCCCGGA CCTGTGCCCA GGAGGGAATG GTGCTGTACG 851 GCTGGACCGA ССACAGCGCG TGCAGCCCAG TGTGCCCTGC TGGTATGGAG 901 TATAGGCAGT GTGTGTCCCC TTGCGCCAGG ACCTGCCAGA GCCTGCACAT 951 СAATGAAATG TGTCAGGAGC GATGCGTGGA TGGCTGCAGC TGCCCTGAGG 1001 GACAGCTCCT GGATGAAGGC CTCTGCGTGG AGAGCACCGА GTGTCCCTGC 1051 GTGCATTCCG GAAAGCGCTA CCCTCCCGGC АССТСССТСТ
- 28 044115
CTCGAGACTG
1101 CAACACCTGC ATTTGCCGAA ACAGCCAGTG GATCTGCAGC AATGAAGAAT
1151 GTCC AGGGG A GTGCCTTGTC ACTGGTC A AT ССС ACTTC A A GAGCTTTGAC
1201 A AC AG AT ACT ТС ACCTTC AG TGGG ATCTGC CAGT ACCTGC TGGCCCGGGA
1251 TTGCCAGGAC СACTCCTTCT CCATTGTCAT TGAGACTGTC CAGTGTGCTG
1301 ATGACCGCGA CGCTGTGTGC ACCCGCTCCG TCACCGTCCG GCTGCCTGGC
1351 CTGCACAACA GCCTTGTGAA ACTGAAGCAT GGGGCAGGAG TTGCCATGGA
1401 TGGCCAGGAC ATCCAGCTCC CCCTCCTGAA AGGTGACCTC CGCATCCAGC
1451 ATACAGTGAC GGCCTCCGTG CGCCTCAGCT ACGGGGAGGA CCTGCAGATG
1501 GACTGGGATG GCCGCGGGAG GCTGCTGGTG AAGCTGTCCC CCGTCTATGC
1551 CGGGAAGACC TGCGGCCTGT GTGGGAATTA CAATGGCAAC CAGGGCGACG
1601 ACTTCCTTAC CCCCTCTGGG CTGGCRGAGC CCCGGGTGGA GGACTTCGGG
1651 A ACGCCTGG A AGCTGC ACGG GG ACTGCC AG G ACCTGC AG A AGCAGCACAG
1701 CGATCCCTGC GCCCTCAACC CGCGCATGAC CAGGTTCTCC GAGGAGGCGT
1751 GCGCGGTCCT GACGTCCCCC ACATTCGAGG CCTGCCATCG TGCCGTCAGC
1801 CCGCTGCCCT ACCTGCGGAA CTGCCGCTAC GACGTGTGCT CCTGCTCGGA
1851 CGGCCGCGAG TGCCTGTGCG GCGCCCTGGC CAGCTATGCC GCGGCCTGCG
1901 CGGGGAGAGG CGTGCGCGTC GCGTGGCGCG AGCCAGGCCG CTGTGAGCTG
1951 AACTGCCCGA AAGGCCAGGT GTACCTGCAG TGCGGGACCC CCTGCAACCT
2001 G ACCTGCCGC TCTCTCTCTT ACCCGG ATG A GG A ATGC A AT GAGGCCTGCC
2051 TGGAGGGCTG CTTCTGCCCC CCAGGGCTCT ACATGGATGA GAGGGGGGAC
2101 TGCGTGCCCA AGGCCCAGTG CCCCTGTTAC TATGACGGTG
- 29 044115
AGATCTTCCA
2151 GCC AG A AG AC ATCTTCTC AG ACC АТС AC AC C ATGTGCT AC TGTGAGGATG
2201 GCTTCATGCA CTGTACCATG AGTGGAGTCC CCGGAAGCTT GCTGCCTGAC
2251 GCTGTCCTCA GCAGTCCCCT GTCTCATCGC AGCAAAAGGA GCCTATCCTG
2301 TCGGCCCCCC ATGGTCAAGC TGGTGTGTCC CGCTGACAAC CTGCGGGCTG
2351 AAGGGCTCGA GTGTACCAAA ACGTGCCAGA ACTATGACCT GGAGTGCATG
2401 AGCATGGGCT GTGTCTCTGG CTGCCTCTGC CCCCCGGGCA TGGTCCGGCA
2451 TGAGAAC AG A TGTGTGGCCC TGGAAAGGTG TCCCTGCTTC CATCAGGGCA
2501 AGGAGTATGC CCCTGGAGAA ACAGTGAAGA TTGGCTGCAA CACTTGTGTC
2551 TGTCGGGACC GGAAGTGGAA CTGCACAGAC CATGTGTGTG ATGCCACGTG
2601 CTCCACGATC GGCATGGCCC ACTACCTCAC CTTCGACGGG CTCAAATACC
2651 TGTTCCCCGG GGAGTGCCAG TACGTTCTGG TGCAGGATTA CTGCGGCAGT
2701 A ACCCTGGG A CCTTTCGG AT CCT AGTGGGG A AT A AGGG AT GCAGCCACCC
2751 CTCAGTGAAA TGCAAGAAAC GGGTCACCAT CCTGGTGGAG GGAGGAGAGA
2801 TTGAGCTGTT TGACGGGGAG GTGAATGTGA AGAGGCCC AT GAAGGATGAG
2851 ACTCACTTTG AGGTGGTGGA GTCTGGCCGG TACATCATTC TGCTGCTGGG
2901 C A A AGCCCTC TCCGTGGTCT GGG ACCGCC A CCTG AGC АТС TCCGTGGTCC
2951 TGAAGCAGAC ATACCAGGAG AAAGTGTGTG GCCTGTGTGG GAATTTTGAT
3001 GGC ATCC AG A AC AATG ACCT C ACC AGC AGC AACCTCC AAG TGGAGGAAGA
3051 CCCTGTGGAC TTTGGGAACT CCTGGAAAGT GAGCTCGCAG TGTGCTGACA
3101 CCAGAAAAGT GCCTCTGGAC TCATCCCCTG CCACCTGCCA TAACAACATC
3151 ATG A AGC AG A CG ATGGTGG A TTCCTCCTGT AG A ATCCTT A
- 30 044115
CCAGTGACGT
3201 CTTCCAGGAC TGCAACAAGC TGGTGGACCC CGAGCCATAT CTGGATGTCT
3251 GCATTTACGA CACCTGCTCC TGTGAGTCCA TTGGGGACTG CGCCTGCTTC
3301 TGCGACACCA TTGCTGCCTA TGCCCACGTG TGTGCCCAGC ATGGCAAGGT
3351 GGTGACCTGG AGGACGGCCA CATTGTGCCC CCAGAGCTGC GAGGAGAGGA
3401 ATCTCCGGGA GAACGGGTAT GAGTGTGAGT GGCGCTATAA CAGCTGTGCA
3451 CCTGCCTGTC AAGTCACGTG TCAGCACCCT GAGCCACTGG CCTGCCCTGT
3501 GCAGTGTGTG GAGGGCTGCC ATGCCCACTG CCCTCCAGGG AAAATCCTGG
3551 ATGAGCTTTT GCAGACCTGC GTTGACCCTG AAGACTGTCC AGTGTGTGAG
3601 GTGGCTGGCC GGCGTTTTGC CTCAGGAAAG AAAGTCACCT TGAATCCCAG
3651 TGACCCTGAG CACTGCCAGA TTTGCCACTG TGATGTTGTC AACCTCACCT
3701 GTGAAGCCTG CCAGGAGCCG GGAGGCCTGG TGGTGCCTCC CACAGATGCC
3751 CCGGTGAGCC CCACCACTCT GTATGTGGAG GACATCTCGG AACCGCCGTT
3801 GCACGATTTC TACTGCAGCA GGCTACTGGA CCTGGTCTTC CTGCTGGATG
3851 GCTCCTCCAG GCTGTCCGAG GCTGAGTTTG AAGTGCTGAA GGCCTTTGTG
3901 GTGGACATGA TGGAGCGGCT GCGCATCTCC CAGAAGTGGG TCCGCGTGGC
3951 CGTGGTGGAG TACCACGACG GCTCCCACGC CTACATCGGG CTCAAGGACC
4001 GGAAGCGACC GTCAGAGCTG CGGCGCATTG CCAGCCAGGT GAAGTATGCG
4051 GGCAGCCAGG TGGCCTCCAC CAGCGAGGTC TTGAAATACA CACTGTTCCA
4101 A ATCTTC AGC A AG ATCG ACC GCCCTG A AGC CTCCCGC АТС GCCCTGCTCC
4151 TGATGGCCAG CCAGGAGCCC CAACGGATGT CCCGGAACTT TGTCCGCTAC
4201 GTCC AGGGCC TGA AG A AG A A G A AGGTC ATT GTG ATCCCGG
- 31 044115
TGGGCATTGG
4251 GCCCCATGCC AACCTCAAGC AGATCCGCCT CATCGAGAAG CAGGCCCCTG
4301 AGAACAAGGC CTTCGTGCTG AGCAGTGTGG ATGAGCTGGA GCAGCAAAGG
4351 GACGAGATCG TTAGCTACCT CTGTGACCTT GCCCCTGAAG CCCCTCCTCC
4401 TACTCTGCCC CCCGACATGG CACAAGTCAC TGTGGGCCCG GGGCTCTTGG
4451 GGGTTTCGAC CCTGGGGCCC AAGAGGAACT CCATGGTTCT GGATGTGGCG
4501 TTCGTCCTGG AAGGATCGGA CAAAATTGGT GAAGCCGACT TCAACAGGAG
4551 CAAGGAGTTC ATGGAGGAGG TGATTCAGCG GATGGATGTG GGCCAGGACA
4601 GCATCCACGT CACGGTGCTG CAGTACTCCT AC ATGGTGAC CGTGGAGTAC
4651 CCCTTCAGCG AGGCACAGTC CAAAGGGGAC ATCCTGCAGC GGGTGCGAGA
4701 GATCCGCTAC CAGGGCGGCA ACAGGACCAA CACTGGGCTG GCCCTGCGGT
4751 ACCTCTCTGA CCACAGCTTC TTGGTCAGCC AGGGTGACCG GGAGCAGGCG
4801 CCCAACCTGG TCTACATGGT CACCGGAAAT CCTGCCTCTG ATGAGATCAA
4851 GAGGCTGCCT GGAGACATCC AGGTGGTGCC CATTGGAGTG GGCCCTAATG
4901 CCAACGTGCA GGAGCTGGAG AGGATTGGCT GGCCCAATGC CCCTATCCTC
4951 ATCC AGG ACT TTGAG ACGCT CCCCCGAGAG GCTCCTGACC TGGTGCTGCA
5001 GAGGTGCTGC TCCGGAGAGG GGCTGCAGAT CCCCACCCTC TCCCCTGCAC
5051 CTGACTGCAG CCAGCCCCTG GACGTGATCC TTCTCCTGGA TGGCTCCTCC
5101 AGTTTCCC AG CTTCTT ATTT TG ATGA A ATG A AG AGTTTCG CCAAGGCTTT
5151 С ATTTCAAAA GCC AAT AT AG GGCCTCGTCT С ACTC AGGTG TCAGTGCTGC
5201 AGTATGGAAG CATCACCACC ATTGACGTGC CATGGAACGT GGTCCCGGAG
5251 AAAGCCCATT TGCTGAGCCT TGTGGACGTC ATGCAGCGGG
- 32 044115
AGGGAGGCCC
5301 CAGCCAAATC GGGGATGCCT TGGGCTTTGC TGTGCGATAC TTGACTTCAG
5351 AAATGCATGG TGCCAGGCCG GGAGCCTCAA AGGCGGTGGT CATCCTGGTC
5401 ACGGACGTCT CTGTGGATTC AGTGGATGCA GCAGCTGATG CCGCCAGGTC
5451 СAACAGAGTG ACAGTGTTCC CTATTGGAAT TGGAGATCGC TACGATGCAG
5501 CCCAGCTACG GATCTTGGCA GGCCCAGCAG GCGACTCCAA CGTGGTGAAG
5551 CTCCAGCGAA TCGAAGACCT CCCTACCATG GTCACCTTGG GCAATTCCTT
5601 CCTCC AC AAA CTGTGCTCTG GATTTGTTAG GATTTGC ATG GATGAGGATG
5651 GGAATGAGAA GAGGCCCGGG GACGTCTGGA CCTTGCCAGA CCAGTGCCAC
5701 ACCGTGACTT GCCAGCCAGA TGGCCAGACC TTGCTGAAGA GTCATCGGGT
5751 CAACTGTGAC CGGGGGCTGA GGCCTTCGTG CCCTAACAGC CAGTCCCCTG
5801 TTAAAGTGGA AGAGACCTGT GGCTGCCGCT GGACCTGCCC CTGYGTGTGC
5851 ACAGGCAGCT CCACTCGGCA CATCGTGACC TTTGATGGGC AGAATTTCAA
5901 GCTGACTGGC AGCTGTTCTT ATGTCCTATT ТСААААСAAG GAGCAGGACC
5951 TGGAGGTGAT TCTCCATAAT GGTGCCTGCA GCCCTGGAGC AAGGCAGGGC
6001 TGC ATG A A AT CC ATCG AGGT GA AGC AC AGT GCCCTCTCCG TCGAGSTGCA
6051 CAGTGACATG GAGGTGACGG TGAATGGGAG ACTGGTCTCT GTTCCTTACG
6101 TGGGTGGG AA C ATGGA AGTC A ACGTTT ATG GTGCC АТС AT GCATGAGGTC
6151 AG ATTC AATC ACCTTGGTC A С ATCTTC AC A TTC ACTCC AC AAAACAATGA
6201 GTTCC A ACTG C AGCTC AGCC CC A AG ACTTT TGCTTC A A AG ACGTATGGTC
6251 TGTGTGGGAT CTGTGATGAG AACGGAGCCA ATGACTTCAT GCTGAGGGAT
6301 GGC AC AGTC A CC AC AG ACTG GAAAAC ACTT GTTCAGGAAT
- 33 044115
GGACTGTGCA
6351 GCGGCCAGGG CAGACGTGCC AGCCCATCCT GGAGGAGCAG TGTCTTGTCC
6401 CCGACAGCTC CCACTGCCAG GTCCTCCTCT TACCACTGTT TGCTGAATGC
6451 C AC AAGGTCC TGGCTCC AGC С AC ATTCTAT GCCATCTGCC AGCAGGACAG
6501 TTGCCACC AG G AGC AAGTGT GTGAGGTGAT CGCCTCTTAT GCCCACCTCT
6551 GTCGGACCAA CGGGGTCTGC GTTGACTGGA GGACACCTGA TTTCTGTGCT
6601 ATGTCATGCC CACCATCTCT GGTCTACAAC CACTGTGAGC ATGGCTGTCC
6651 CCGGCACTGT GATGGCAACG TGAGCTCCTG TGGGGACCAT CCCTCCGAAG
6701 GCTGTTTCTG CCCTCC AG AT A A AGTC ATGT TGG A AGGC AG CTGTGTCCCT
6751 GAAGAGGCCT GCACTCAGTG CATTGGTGAG GATGGAGTCC AGCACCAGTT
6801 CCTGGAAGCC TGGGTCCCGG ACCACCAGCC CTGTCAGATC TGCACATGCC
6851 TCAGCGGGCG GAAGGTCAAC TGCACAACGC AGCCCTGCCC CACGGCCAAA
6901 GCTCCCACGT GTGGCCTGTG TGAAGTAGCC CGCCTCCGCC AGAATGCAGA
6951 CCAGTGCTGC CCCGAGTATG AGTGTGTGTG TGACCCAGTG AGCTGTGACC
7001 TGCCCCCAGT GCCTCACTGT GAACGTGGCC TCCAGCCCAC ACTGACCAAC
7051 CCTGGCGAGT GCAGACCCAA CTTCACCTGC GCCTGCAGGA AGGAGGAGTG
7101 C A A A AG AGTG TCCCC ACCCT CCTGCCCCCC GC ACCGTTTG CCCACCCTTC
7151 GG A AG ACCC A GTGCTGTG AT G AGT ATG AGT GTGCCTGC A A CTGTGTCAAC
7201 TCCACAGTGA GCTGTCCCCT TGGGTACTTG GCCTCAACCG CCACCAATGA
7251 CTGTGGCTGT ACC AC AACC A CCTGCCTTCC CG AC AAGGTG TGTGTCCACC
7301 GAAGC ACC AT CT ACCCTGTG GGCC AGTTCT GGG AGG AGGG CTGCGATGTG
7351 TGCACCTGCA CCGACATGGA GGATGCCGTG ATGGGCCTCC
- 34 044115
GCGTGGCCCA
7401 GTGCTCCCAG AAGCCCTGTG AGGACAGCTG TCGGTCGGGC
TTCACTTACG
7451 TTCTGCATGA AGGCGAGTGC TGTGGAAGGT GCCTGCCATC
TGCCTGTGAG
7501 GTGGTGACTG GCTCACCGCG GGGGGACTCC CAGTCTTCCT
GGAAGAGTGT
7551 CGGCTCCCAG TGGGCCTCCC CGGAGAACCC CTGCCTCATC
AATGAGTGTG
7601 TCCG AGTG A A GG AGG AGGTC TTT AT AC A AC A A AGG A ACGT
CTCCTGCCCC
7651 CAGCTGGAGG TCCCTGTCTG CCCCTCGGGC TTTCAGCTGA
GCTGTAAGAC
7701 CTCAGCGTGC TGCCCAAGCT GTCGCTGTGA GCGCATGGAG
GCCTGCATGC
7751 TCAATGGCAC TGTCATTGGG CCCGGGAAGA CTGTGATGAT
CGATGTGTGC
7801 ACGACCTGCC GCTGCATGGT GCAGGTGGGG GTCATCTCTG
GATTCAAGCT
7851 GGAGTGCAGG AAGACCACCT GCAACCCCTG CCCCCTGGGT
TACAAGGAAG
7901 A A A AT A AC AC AGGTG A ATGT TGTGGG AG AT GTTTGCCT AC
GGCTTGCACC
7951 ATTCAGCTAA GAGGAGGАСА GATCATGACA CTGAAGCGTG
ATGAGACGCT
8001 CCAGGATGGC TGTGATACTC ACTTCTGCAA GGTCAATGAG
AGAGGAGAGT
8051 ACTTCTGGGA GAAGAGGGTC ACAGGCTGCC CACCCTTTGA
TGAACACAAG
8101 TGTCTTGCTG AGGG AGGT A A A ATT ATG A A A ATTCC AGGC A
CCTGCTGTGA
8151 C AC ATGTG AG G AGCCTG AGT GCA ACG AC AT C ACTGCC AGG
CTGCAGTATG
8201 TCAAGGTGGG AAGCTGTAAG TCTGAAGTAG AGGTGGATAT
CCACTACTGC
8251 CAGGGCAAAT GTGCCAGCAA AGCCATGTAC TCCATTGACA
TCAACGATGT
8301 GCAGGACCAG TGCTCCTGCT GCTCTCCGAC ACGGACGGAG
CCCATGCAGG
8351 TGGCCCTGCA CTGCACCAAT GGCTCTGTTG TGTACCATGA
GGTTCTCAAT
8401 GCCATGGAGT GCAAATGCTC CCCCAGGAAG TGCAGCAAGT GA
В данном контексте белок ФВ может быть фрагментом ФВ, содержащим домен D' и домен D3 из ФВ, в котором фрагмент ФВ связывается с фактором VIII (FVIII) и ингибирует связывание эндогенного ФВ (полноразмерного ФВ) с FVIII. Фрагмент ФВ, содержащий домен D' и домен D3 может дополнительно содержать домен ФВ, выбранный из группы, состоящей из домена А1, домена А2, домена A3, домена D1, домена D2, домена D4, домена В1, домена В2, домена В3, домена С1, домена С2, домена CK, одного или нескольких их фрагментов и любых их сочетаний. В одном варианте реализации изобретения фрагмент ФВ содержит, по существу состоит или состоит из: (1) доменов D' и D3 ФВ или их фрагментов; (2)
- 35 044115 доменов D1, D' и D3 ФВ или их фрагментов; (3) доменов D2, D' и D3 ФВ или их фрагментов; (4) доменов D1, D2, D' и D3 ФВ или их фрагментов; (5) доменов D1, D2, D', D3 и А1 ФВ или их фрагментов. Фрагмент ФВ, описанные в настоящем документе, не содержит сайта связывания с рецептором клиренса ФВ. В другом варианте реализации изобретения фрагмент ФВ, описанный в настоящем документе, не является аминокислотами 764-1274 из SEQ ID NO: 21. Фрагмент ФВ по настоящему изобретению может включать в себя любые другие последовательности, связанные с или слитые с фрагментом ФВ. Например, фрагмент ФВ, описанный в настоящем документе, может дополнительно содержать сигнальный пептид.
В одном варианте реализации изобретения фрагмент ФВ, содержащий домен D' и домен D3, связывается или соединяется с белком FVIII. Связываясь или соединяясь с белком FVIII, фрагмент ФВ по настоящему изобретению защищает FVIII от расщепления протеазой и активации FVIII, стабилизирует тяжелую цепь и легкую цепь FVIII и предотвращает клиренс FVIII фагоцитарными рецепторами. В другом варианте реализации изобретения фрагмент ФВ связывается или соединяется с белком FVIII и блокирует или предотвращает связывание белка FVIII с фосфолипидом и активированным протеином С. Путем предотвращения или ингибирования связывания белка FVIII с эндогенным полноразмерным ФВ, фрагмент ФВ по настоящему изобретению снижает клиренс FVIII рецепторами клиренса ФВ, таким образом, продлевается период полувыведения химерного белка. Таким образом, увеличение периода полувыведения химерного белка обуславливается связыванием или соединением с фрагментом ФВ, с отсутствующим сайтом связывания рецептора клиренса ФВ, с белком FVIII и экранированием или защитой белка FVIII фрагментом ФВ от эндогенных ФВ, содержащих сайт связывания рецептора клиренса ФВ. Благодаря связыванию или защите белка FVIII фрагментом ФВ может также обеспечиваться рециркуляция белка FVIII. За счет исключения сайтов связывания рецепторов клиренса ФВ, содержащихся в молекуле полноразмерного ФВ, гетеродимеры FVIII/ФВ по настоящему изобретению защищены от клиренса ФВ с дальнейшим увеличением периода полувыведения FVIII.
В одном варианте реализации изобретения белок ФВ, пригодный для использования по настоящему изобретению, содержит домен D' и домен D3 из ФВ, причем домен D' по меньшей мере на 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичен аминокислотам 764-866 из SEQ ID NO: 21, причем белок ФВ предотвращает или ингибирует связывание эндогенного ФВ с FVIII. В другом варианте реализации изобретения белок ФВ содержит домен D' и домен D3 из ФВ, причем домен D3 по меньшей мере на 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичен аминокислотам 867-1240 из SEQ ID NO: 21, причем белок ФВ предотвращает или ингибирует связывание эндогенного ФВ с FVIII. В некоторых вариантах реализации изобретения белок ФВ, описанный в настоящем документе, по существу состоит или состоит из домена D' и домена D3 ФВ, которые по меньшей мере на 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичны аминокислотам 764-1240 SEQ ID NO: 21, причем белок ФВ предотвращает или ингибирует связывание эндогенного ФВ с FVIII. В других вариантах реализации изобретения белок ФВ содержит, по существу состоит или состоит из доменов D1, D2, D' и D3, которые по меньшей мере на 60%, 70%, 80%„ 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичны аминокислотам 23-1240 из SEQ ID NO: 21, причем белок ФВ предотвращает или ингибирует связывание эндогенного ФВ с FVIII. В еще одних вариантах реализации изобретения белок ФВ дополнительно содержит сигнальный пептид, функционально связанный с ним.
В некоторых вариантах реализации изобретения белок ФВ, пригодный для использования по настоящему изобретению, по существу состоит или состоит из (1) домена D'D3, домена D1D'D3, домена D2D'D3 или домена D1D2D'D3 и (2) дополнительной последовательности ФВ, размером до около 10 аминокислот (например, любые последовательности от аминокислот 764-1240 из SEQ ID NO: 21, до аминокислот 764-1250 из SEQ ID NO: 21), до около 15 аминокислот (например, любые последовательности от аминокислот 764-1240 из SEQ ID NO: 21 до аминокислот 764-1255 из SEQ ID NO: 21), до около 20 аминокислот (например, любые последовательности от аминокислот 764-1240 из SEQ ID NO: 21 до аминокислот 764-1260 из SEQ ID NO: 21), до около 25 аминокислот (например, любые последовательности от аминокислот 764-1240 из SEQ ID NO: 21 до аминокислот 764-1265 из SEQ ID NO: 21) или до около 30 аминокислот (например, любые последовательности от аминокислот 764-1240 из SEQ ID NO: 21 до аминокислот 764-1260 из SEQ ID NO: 21). В конкретном варианте реализации изобретения белок ФВ, содержащий или по существу состоящий из домена D' и домена D3, не является ни аминокислотами 7641274 из SEQ ID NO: 21 ни полноразмерным зрелым ФВ. В некоторых вариантах реализации изобретения домен D1D2 экспрессируется в транс положении с доменом D'D3. В некоторых вариантах реализации изобретения домен D1D2 экспрессируется в цис положении с доменом D'D3.
В других вариантах реализации изобретения ФВ белок, содержащий домены D'D3, связанные с доменами D1D2, дополнительно содержит внутриклеточный сайт расщепления, например, (сайт расщепления РАСЕ (фурином) или РС5), позволяющий расщепление доменов D1D2 от доменов D'D3 при экспрессии. Неограничивающие примеры внутриклеточных сайтов расщепления описаны в других местах в настоящем документе.
В еще одних вариантах реализации изобретения белок ФВ содержит домен D' и домен D3, но не содержит аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из (1) аминокислот 12412813, соответствующих SEQ ID NO: 21, (2) аминокислот 1270-2813, соответствующих SEQ ID NO: 21, (3)
- 36 044115 аминокислот 1271-2813, соответствующих SEQ ID NO: 21, (4) аминокислот 1272-2813, соответствующих
SEQ ID NO: 21, (5) аминокислот 1273-2813, соответствующих SEQ ID NO: 21, (6) аминокислот 12742813, соответствующих SEQ ID NO: 21 и любых их комбинаций.
В еще одних вариантах реализации изобретения белок ФВ понастоящему изобретению содержит, по существу состоит или состоит из аминокислотной последовательности, соответствующей домену D', домену D3 и домену А1, причем аминокислотная последовательность по меньшей мере на 60%, 70%, 75% , 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотам 764-1479 из SEQ ID NO: 21, причем белок ФВ предотвращает или ингибирует связывание эндогенного ФВ с FVIII. В конкретном варианте реализации изобретения белок ФВ не является аминокислотами 764-1274 из SEQ ID NO: 21.
В некоторых вариантах реализации изобретения белок ФВ по настоящему изобретению включает в себя домен D' и домен D3, но не включает в себя по меньшей мере один домен ФВ, выбранный из группы, состоящей из (1) домена А1, (2) домена А2, (3) домена A3, (4) домена D4, (5) домена В1, (6) домена В2, (7) домена В3, (8) домена С1, (9) домена С2, (10) домена CK, (11) домена CK и домена С2, (12) домена CK, домена С2 и домена С1, (13) домена CK, домена С2, домена С1, домена В3, (14) домена CK, домена С2, домена С1, домена В3, домена В2, (15) домена CK, домена С2, домена С1, домена В3, домена В2, и домена В1, (16) домена CK, домена С2, домена С1, домена В3, домена В2, домена В1 и домен D4, (17) домена CK, домена С2, домена С1, домена В3, домена В2, домена В1, домена D4 и домена A3, (18) домена CK, домена С2, домена С1, домена В3, домена В2, домена В1, домена D4, домена A3 и домена А2, (19) домена CK, домена С2, домена С1, домена В3, домена В2, домена В1, домена D4, домена A3, домена А2 и домена А1, и (20) любые их комбинации.
В еще одних вариантах реализации изобретения белок ФВ содержит D'D3 домены и один или более доменов или модулей. Примеры таких доменов или модулей включают в себя, но не ограничиваются ими, домены и модули, описанные в Zhou et al., Blood опубликовано онлайн 6 апреля 2012 года: DOI 10.1182/blood-2012-01-405134, полное содержание которой включено в настоящий документ посредством ссылки. Например, белок ФВ может содержать домен D'D3 и один или более доменов или модулей, выбранных из группы, состоящей из домена А1, домена А2, домена A3, модуля D4N, модуля VWD4, модуля С8-4, модуля TIL-4, модуля С1, модуля С2, модуля С3, модуля С4, модуля С5, модуля С5, модуля С6 и любых их сочетаний.
В еще одних вариантах реализации изобретение белок ФВ связан с гетерологичный фрагментом, причем гетерологичный фрагмент присоединен к N-концу или С-концу белка ФВ или встроен непосредственно ниже одной или более аминокислот (например, один или более сайтов встраивания XTEN) в белке ФВ. Например, сайты встраивания для гетерологичного фрагмента в белок ФВ могут находиться в домене D', домене D3 или обоих доменах. Гетерологичный фрагмент может продлевать период полувыведения.
В некоторых вариантах реализации изобретения белок ФВ, пригодный для использования по настоящему изобретению, образует мультимер, например, димер, тример, тетрамер, пентамер, гексамер, гептамер или мультимеры высшего порядка. В других вариантах реализации изобретения белок ФВ представляет собой мономер, содержащий только один белок ФВ. В некоторых вариантах реализации изобретения белок ФВ по настоящему изобретению может иметь одну или более аминокислотных замен, делеций, вставок или модификаций. В одном варианте реализации изобретения белок ФВ может включать в себя аминокислотные замены, делеций, вставки или модификации таким образом, что белок ФВ теряет способность образовывать дисульфидную связь или образовывать димер или мультимер. В другом варианте реализации изобретения аминокислотная замена находится в пределах домена D' и домена D3. В конкретном варианте реализации изобретения белок ФВ, пригодный для использования по настоящему изобретению, содержит по меньшей мере одну аминокислотную замену в позиции, соответствующей остатку 1099, остатку 1142 или обоим остаткам 1099 и 1142 последовательности SEQ ID NO: 21. По меньшей мере одной аминокислотной заменой могут быть любые аминокислоты, которые не встречающиеся в естественных условиях у ФВ дикого типа. Например, аминокислотной заменой может быть любая аминокислота, отличная от цистеина, например, Изолейцин, аланин, лейцин, аспарагин, лизин, аспарагиновая кислота, метионин, фенилаланин, глутаминовая кислота, треонин, глютамин, триптофан, глицин, валин, пролин, серин, тирозин, аргинин или гистидин. В другом примере аминокислотная замена имеет одну или более аминокислот, которые предотвращают или ингибируют формирования мультимеров у белков ФВ.
В некоторых вариантах реализации изобретения белок ФВ, пригодный для использования по настоящему изобретению, может быть дополнительно модифицирован с целью улучшения его взаимодействия с FVIII, например, чтобы повысить аффинность связывания с FVIII. В качестве не ограничивающего примера, белок ФВ содержит остаток серина в положении, соответствующем аминокислоте 764 из SEQ ID NO: 21 и остаток лизина в положении, соответствующем аминокислоте 773 из SEQ ID NO: 21. Остатки 764 и/или 773 могут способствовать аффинности связывания белков ФВ с FVIII. В других вариантах реализации изобретения белки ФВ, пригодные для использования по настоящему изобретению, могут иметь другие модификации, например, белок может быть ПЭГилированный, гликозилированный, ГЭКилированный или полисиалилированный.
- 37 044115
II. В. Последовательности XTEN.
В данном контексте последовательность XTEN означает удлиненные полипептиды с неповторяющимися последовательностями неестественного происхждения, которые в основном состоят из малых гидрофильных аминокислот с последовательностью, имеющей низкий уровень или не имеющей вовсе вторичной или третичной структуры в физиологических условиях. В качестве партнера химерного белка последовательности XTEN могут служить носителем, придавая определенные желательные фармакокинетические, физико-химические и фармацевтические свойства при соединении с белком ФВ или последовательностью FVIII по настоящему изобретению для создания химерного белка. Такие желательные свойства включают в себя, но не ограничиваются ими, улучшенные фармакокинетическе параметры и характеристики растворимости. В данном контексте термин XTEN специально исключает антитела и фрагменты антител, такие как одноцепочечные антитела или фрагменты Fc легкой цепи или тяжелой цепи.
Настоящее изобретение относится к более короткой последовательности XTEN, которая обеспечивает улучшенные свойства, касающиеся увеличения периода полувыведения, по сравнению с более длинной последовательности XTEN, когда последовательность XTEN слита с белком ФВ и/или второй константной областью ИГ или ее частью. Следовательно, последовательность XTEN, слитая с белком ФВ и/или второй константной областью ИГ или ее частью, имеет длину менее 288 аминокислот, то есть короче 288 аминокислот. В одном варианте реализации изобретения последовательность XTEN, слитая с белком ФВ и/или второй константной областью ИГ или ее частью, состоит из аминокислотной последовательности, имеющей длину от 12 до 287 аминокислот. В другом варианте реализации изобретения последовательность XTEN, слитая с белком ФВ и/или второй константной областью ИГ или ее частью, содержит по меньшей около 36 аминокислот, по меньшей мере около 42 аминокислоты, по меньшей мере около 72 аминокислоты или по меньшей мере около 144 аминокислоты, но меньше чем 288 аминокислот. В других вариантах реализации изобретения последовательность XTEN, слитая с белком ФВ и/или второй константной областью ИГ или ее частью, выбирается из АЕ36, AG36, АЕ42, AG42, АЕ72, AG72, AE144 или AG144. В одном варианте реализации изобретения последовательность XTEN, слитая с белком ФВ и/или второй константной областью ИГ или ее частью, является аминокислотной последовательностью, идентичной по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% последовательностям SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 14, в которых химерный белок проявляет улучшенный период полувыведения по сравнению с химерным белком без последовательности XTEN.
Химерный белок по настоящему изобретению может также содержать дополнительную (вторую, третью или больше) последовательность XTEN. Дополнительная последовательность XTEN может также быть слита с белком FVIII или с первой константной областью ИГ или ее частью. Дополнительные последовательности XTEN могут иметь любую длину. Например, дополнительная последовательность XTEN, слитая с белком FVIII или первой константной областью ИГ, представляет собой пептид или полипептид, имеющий примерное число аминокислотных остатков более около 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800 или 2000. В некоторых вариантах реализации изобретения дополнительная последовательность XTEN представляет собой пептид или полипептид с примерным числом аминокислотных остатков от более около 20 до около 3000 аминокислотных остатков, от более около 30 до около 2500 остатков, от более около 40 до около 2000 остатков, от более около 50 до около 1500 остатков, от более около 60 до около 1000 остатков, от более около 70 до около 900 остатков, от более около 80 до около 800 остатков, от более около 90 до около 700 остатков, от более около 100 до около 600 остатков, от более около 110 до около 500 остатков или более около 120 до около 400 остатков.
Последовательности XTEN (т.е. последовательность XTEN, слитая с белком ФВ и/или второй константной областью ИГ или ее частью, или последовательность XTEN, слитая с белком FVIII и/или первой константной областью ИГ или ее частью, или встроена в один или более сайт встраивания в белке FVIII), могут содержать один или более мотивов последовательности от 9 до 14 аминокислотных остатков или аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере на 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% мотиву последовательности, причем мотив включает в себя, по существу состоит или состоит из 4-6 видов аминокислот, выбранных из группы, состоящей из глицина (G), аланина (А), серина (S), треонина (Т), глутамата (Е) и пролина (Р). См. US 2010-0239554 A1.
В некоторых вариантах реализации изобретения последовательность XTEN содержит неперекрывающиеся мотивы последовательности, в которых по меньшей мере около 80% или по меньшей мере около 85%, или по меньшей мере около 90%, или по меньшей мере около 91%, или по меньшей мере около 92%, или по меньшей мере около 93%, или по меньшей мере около 94%, или по меньшей мере около 95%, или по меньшей мере около 96%, или по меньшей мере около 97%, или по меньшей мере около 98% или по меньшей мере около 99%, или около 100% последовательности состоит из множества единиц неперекрывающихся последовательностей, выбранных из семейства с одним мотивом из табл. 2А, что дает в результате последовательность семейства. В данном контексте термин семейство означает, что XTEN имеет мотивы, выбранные только из одной категории мотивов из табл. 2А; т.е. AD, AE, AF, AG, AM, AQ, ВС или BD XTEN, и что любые другие аминокислоты в XTEN не из семейства мотивов
- 38 044115 выбирались для достижения необходимого свойства, например, чтобы обеспечить включение сайта рестрикции посредством кодирующих нуклеотидов, включение последовательности для расщепления или для достижения более эффективной связи с FVIII или ФВ. В некоторых вариантах реализации изобретения XTEN семейств последовательность XTEN включает множество единиц неперекрывающихся мотивов последовательности из семейства мотивов AD, или семейства мотивов АЕ, или семейства мотивов AF, или семейства мотивов AG, или семейства мотивов AM, или семейства мотивов AQ, или семейства мотивов ВС, или семейства мотивов BD, причем выбранная XTEN проявляет диапазон гомологии, описанный выше. В других вариантах реализации изобретения XTEN включает множество единиц мотивов последовательностей из двух или более семейств мотивов из табл. 2А. Эти последовательности могут быть выбраны для достижения желаемых физических/химических свойств, в том числе таких свойств, как суммарный заряд, гидрофильность, отсутствие вторичной структуры или отсутствие повторяемости, которые предоставляются в соответствии с аминокислотным составом мотивов, который более подробно описан ниже. В вариантах реализации изобретения, описанных выше в этом параграфе, мотивы, внедренные в XTEN, могут быть выбраны и собраны с использованием описанных в данном документе способов для достижения размера XTEN от около 36 до около 3000 аминокислотных остатков.
Таблица 2А
Мотивы последовательности XTEN из 12 аминокислот и семейства мотивов
Семене тво мотива* МОТИВ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ
AD GESPGGSSGSES (SEQ ID NO: 24)
AD GSEGSSGPGESS (SEQ ID NO: 25)
AD GSSESGSSEGGP (SEQ ID NO: 26)
AD GSGGEPSESGSS (SEQ ID NO: 27)
АЕ, АМ GSPAGSPTSTEE (SEQ ID NO: 28)
АЕ, AM, AQ GSEPATSGSETP (SEQ ID NO: 29)
АЕ, AM, AQ GTSESATPESGP (SEQ ID NO: 30)
АЕ, AM, AQ GTSTEPSEGSAP (SEQ ID NO: 31)
AF, АМ GSTSESPSGTAP (SEQ ID
- 39 044115
NO: 32)
AF, AM GTSTPESGSASP (SEQ ID NO: 33)
AF, AM GTSPSGESSTAP (SEQ ID NO: 34)
AF, AM GSTSSTAESPGP (SEQ ID NO: 35)
AG, AM GTPGSGTASSSP (SEQ ID NO: 36)
AG, AM GSSTPSGATGSP (SEQ ID NO: 37)
AG, AM GSSPSASTGTGP (SEQ ID NO: 38)
AG, AM GASPGTSSTGSP (SEQ ID NO: 39)
AQ GEPAGSPTSTSE (SEQ ID NO: 40)
AQ GTGEPSSTPASE (SEQ ID NO: 41)
AQ GSGPSTESAPTE (SEQ ID NO: 42)
AQ GSETPSGPSETA (SEQ ID NO: 43)
AQ GPSETSTSEPGA (SEQ ID NO: 44)
AQ GSPSEPTEGTSA (SEQ ID NO: 45)
BC GSGASEPTSTEP (SEQ ID NO: 46)
BC GSEPATSGTEPS (SEQ ID NO: 47)
BC GTSEPSTSEPGA (SEQ ID
- 40 044115
NO: 48)
ВС GTSTEPSEPGSA (SEQ ID NO: 49)
BD GSTAGSETSTEA (SEQ ID NO: 50)
BD GSETATSGSETA (SEQ ID NO: 51)
BD GTSESATSESGA (SEQ ID NO: 52)
BD GTSTEASEGSAS (SEQ ID NO: 53)
Обозначает отдельные последовательности мотивов, которые, при применении совместно с различными перестановками, дают последовательность семейства.
В некоторых вариантах реализации изобретения последовательность XTEN, используемая в настоящем изобретении по меньшей мере на 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности, выбранной из группы, состоящей из АЕ42, AG42, АЕ48, АМ48,
АЕ72, AG72, АЕ108, AG108, АЕ144, AF144, AG144, АЕ180, AG180, АЕ216, AG216, АЕ252 , AG252, АЕ288, AG288, АЕ324, AG324, АЕ360, AG360, АЕ396, AG396, АЕ432, AG432, АЕ468, AG468, АЕ504, AG504, AF504, АЕ540, AG540, AF540, AD576, АЕ576, AF576, AG576, АЕ612, AG612 , АЕ624, АЕ648, AG648, AG684, АЕ720, AG720, АЕ756, AG756, АЕ792, AG792, АЕ828, AG828, AD836, АЕ864, AF864, AG864, АМ875, АЕ912, АМ923, АМ1318, ВС864, BD864, АЕ948, АЕ1044, АЕ1140 , АЕ1236, АЕ1332, АЕ1428, АЕ1524, АЕ1620, АЕ1716, АЕ1812, АЕ1908, АЕ2004А, AG948, AG1044, AG1140, AG1236, AG1332, AG1428, AG1524, AG1620, AG1716, AG1812, AG1908 и AG2004. См. US 20100239554 А1.
В одном варианте реализации изобретения последовательность XTEN по меньшей мере на 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из
АЕ42 (SEQ ID NO: 9), АЕ72 (SEQ ID NO: 10), AE144_2A (SEQ IDNO: 55), AE144_3B (SEQ ID NO: 56), AE144_4A (SEQ ID NO: 57), AE144_5A (SEQ ID NO: 58), AE144_6B (SEQ ID NO: 59), AG144_A (SEQ ID NO: 60), AG144_B (SEQ ID NO: 61), AG144_C (SEQ ID NO: 62), AG144_F (SEQ IDNO: 63), AE864 (SEQ ID NO: 15), AE576 (SEQ ID NO: 16), AE288 (SEQ ID NO: 8), AE288_2 (SEQ ID NO: 54), AE144 (SEQ ID NO: 11), AG864 (SEQ ID NO: 17), AG576 (SEQ ID NO: 18), AG288 (SEQ ID NO: 19), AG144 (SEQ ID NO: 14) и любую их комбинацию. В другом варианте реализации изобретения последовательность XTEN выбрана из группы, состоящей из
АЕ42 (SEQ Ш NO: 9), АЕ72 (SEQ Ш NO: 10), АЕ144_2А (SEQ IDNO: 55), AE144_3B (SEQ ID NO: 56), AE144_4A (SEQ ID NO: 57), AE144_5A (SEQ ID NO: 58), AE144_6B (SEQ ID NO: 59), AG144_A (SEQ ID NO: 60), AG144_B (SEQ ID NO: 61), AG144_C (SEQ ID NO: 62), AG144_F (SEQ IDNO: 63), AE864 (SEQ ID NO: 15), AE576 (SEQ ID NO: 16), AE288 (SEQ ID NO: 8), AE288_2 (SEQ ID NO: 54), AE144 (SEQ ID NO: 11), AG864 (SEQ ID NO: 17), AG576 (SEQ ID NO: 18), AG288 (SEQ ID NO: 19), AG144 (SEQ ID NO: 14) и любую их комбинацию. В конкретном варианте реализации изобретения последовательность XTEN является AE288. Аминокислотные последовательности для определенных последовательностей XTEN по настоящему изобретению приведены в табл. 2В.
- 41 044115
Таблица 2В
Последовательности XTEN
XTEN Аминокислотная последовательность
АЕ42 SEQ ID NO: 9 GAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPASS
AE72 SEQ ID NO: 10 GAP TSESATPESG PGSEPATSGS ETPGTSESAT PESGPGSEPA TSGSETPGTS ESATPESGPG TSTEPSEGSA PGASS
AE144 SEQ ID NO: 11 GSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGT STEPSEG SAPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGTSTEPSEGSA PGTSESA PESGPGSEPATSGSETPGTSTEPSEGSAP
AE144_2A (SEQ ID NO: 55) TSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTS ESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSTE PSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPG
AE144_3B (SEQ ID NO: 56) SPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTS TEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTE PSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPG
AE144_4A TSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTS ESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAG
- 42 044115
(SEQ ID NO: 57) SPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPG
AE144_5A (SEQ ID NO: 58) TSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTS ESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPA TSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEG
AE144_6B (SEQ ID NO: 59) TSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSE PATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTE PSEGSAPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPG
AG144 SEQ ID NO: 14 GTPGSGTASSSPGSSTPSGATGSPGSSPSASTGTGPGSSPSASTGTGPG ASPGTSST GSPGASPGTSSTGSPGSSTPSGATGSPGSSPSASTGTGPGASPGTSSTGS PGSSPSA STGTGPGTPGSGTASSSPGSSTPSGATGSP
AG144_A (SEQ ID NO: 60) GASPGTSSTGSPGSSPSASTGTGPGSSPSASTGTGPGTPGSGTASSSPGS STPSGATGSPGSSPSASTGTGPGASPGTSSTGSPGTPGSGTASSSPGSST PSGATGSPGTPGSGTASSSPGASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSP
AG144_B (SEQ ID NO: 61) GTPGSGTASSSPGSSTPSGATGSPGASPGTSSTGSPGTPGSGTASSSPGS STPSGATGSPGSSPSASTGTGPGSSPSASTGTGPGSSTPSGATGSPGSST PSGATGSPGASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSP
AG144_C (SEQ ID NO: 62) GTPGSGTASSSPGASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGS SPSASTGTGPGTPGSGTASSSPGASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGASP GTSSTGSPGSSTPSGATGSPGSSTPSGATGSPGASPGTSSTGSP
AG144_F (SEQ ID NO: 63) GSSPSASTGTGPGSSPSASTGTGPGASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGS STPSGATGSPGSSPSASTGTGPGASPGTSSTGSPGSSPSASTGTGPGTPG SGTASSSPGSSTPSGATGSPGSSTPSGATGSPGASPGTSSTGSP
AE288 SEQ ID NO: 8 GTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGT SESATPESG PGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPG TSESATPES GPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGP GTSESATPE SGPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTE EGTSTEPSE GSAPGTSTEPSEGSAPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGS
- 43 044115
AP
AE288_2 (SEQ ID NO: 54) GSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGT STEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTST EPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESA TPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATP ESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTST EEGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAP
AG288 SEQ ID NO: 19 PGASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGTPGSGTASSSPGSSTPSGATGSPG TPGSGTASS SPGSSTPSGATGSPGTPGSGTASSSPGSSTPSGATGSPGSSTPSGATGSP GSSPSASTG TGPGSSPSASTGTGPGASPGTSSTGSPGTPGSGTASSSPGSSTPSGATGS PGSSPSAST GTGPGSSPSASTGTGPGASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGSSTPSGAT GSPGSSPSAS TGTGPGASPGTSSTGSPGSSPSASTGTGPGTPGSGTASSSPGSSTPSGA TGS
AE576 SEQ ID NO: 16 GSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGT STEPSEGSA PGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPG SPAGSPTST EEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEE GTSTEPSEG SAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESG PGSEPATSG SETPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPES GPGSPAGSP TSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG SAPGTSTEP SEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSE GSAPGSPAG SPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESAT PESGPGSEP ATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSPAGS PTSTEEGSP AGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAP
AG576 SEQ ID NO: 18 PGTPGSGTASSSPGSSTPSGATGSPGSSPSASTGTGPGSSPSASTGTGPG SSTPSGATG SPGSSTPSGATGSPGASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSP GTPGSGTAS SSPGASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGSSPSASTGTG PGTPGSGTA SSSPGASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGSSTPSGATG SPGSSTPSG ATGSPGASPGTSSTGSPGTPGSGTASSSPGSSTPSGATGSPGSSTPSGAT GSPGSSTPS GATGSPGSSPSASTGTGPGASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGTPGSGT ASSSPGASPG TSSTGSPGASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGTPGSGT ASSSPGSST
- 44 044115
PSGATGSPGTPGSGTASSSPGSSTPSGATGSPGTPGSGTASSSPGSSTPS GATGSPGSS TPSGATGSPGSSPSASTGTGPGSSPSASTGTGPGASPGTSSTGSPGTPGS GTASSSPGS STPSGATGSPGSSPSASTGTGPGSSPSASTGTGPGASPGTSSTGS
АЕ864 SEQ ID NO: 15 AG864 SEQ ID NO: 17 GSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGT STEPSEGSA PGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPG SPAGSPTST EEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEE GTSTEPSEG SAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESG PGSEPATSG SETPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPES GPGSPAGSP TSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG SAPGTSTEP SEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSE GSAPGSPAG SPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESAT PESGPGSEP ATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSPAGS PTSTEEGSP AGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSES ATPESGPGS EPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTST EPSEGSAPG SPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSP AGSPTSTEE GSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGT SESATPESG PGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPG TSTEPSEGS APGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAP GASPGTSSTGSPGSSPSASTGTGPGSSPSASTGTGPGTPGSGTASSSPGS STPSGATGS PGSSPSASTGTGPGASPGTSSTGSPGTPGSGTASSSPGSSTPSGATGSPG TPGSGTASS SPGASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGTPGSGTASSSPGSSTPSGATGSP GASPGTSST GSPGTPGSGTASSSPGSSTPSGATGSPGSSPSASTGTGPGSSPSASTGTG PGSSTPSGA TGSPGSSTPSGATGSPGASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGASPGTSSTG SPGTPGSGT ASSSPGASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGSSPSASTG TGPGTPGSG TASSSPGASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGSSTPSGA TGSPGSSTP SGATGSPGASPGTSSTGSPGTPGSGTASSSPGSSTPSGATGSPGSSTPSG ATGSPGSST PSGATGSPGSSPSASTGTGPGASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGTPGS GTASSSPGAS
PGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGTPGS GTASSSPGS STPSGATGSPGTPGSGTASSSPGSSTPSGATGSPGTPGSGTASSSPGSST PSGATGSPG SSTPSGATGSPGSSPSASTGTGPGSSPSASTGTGPGASPGTSSTGSPGTP GSGTASSSP GSSTPSGATGSPGSSPSASTGTGPGSSPSASTGTGPGASPGTSSTGSPG ASPGTSSTGS PGSSTPSGATGSPGSSPSASTGTGPGASPGTSSTGSPGSSPSASTGTGPG TPGSGTASS SPGSSTPSGATGSPGSSTPSGATGSPGASPGTSSTGSP
В тех вариантах реализации изобретения, в которых компонент(ы) XTEN менее чем на 100% состоят из аминокислот 4, 5 или 6 типов, выбранных из глицина (G), аланина (А), серина (S), треонина (Т),
- 45 044115 глутамата (Е) и пролина (Р), или менее 100% последовательности состоит из мотивов последовательности из табл. 3 или последовательностей XTEN из табл. 4 и 13-17, другие аминокислотные остатки в XTEN могут быть выбраны из любой из остальных 14 природных L-аминокислот, но предпочтительно из гидрофильных аминокислот, таких, чтобы последовательность XTEN содержала по меньшей мере около 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, или по меньшей мере около 99% гидрофильных аминокислот. Аминокислоты XTEN, которые не являются глицином (G), аланином (А), серином (S), треонином (Т), глутаматом (E) и пролином (P) могут быть распределены по всей последовательности XTEN, могут быть расположены внутри или между мотивами последовательности или могут быть сконцентрированы в виде одного или более участков последовательности XTEN, например, чтобы создать линкер между XTEN и компонентами FVIII или ФВ. В тех случаях, когда компонент XTEN содержит аминокислоты, отличные от глицина (G), аланина (A), серина (S), треонина (T), глутамата (E) и пролина (P), предпочтительно, чтобы менее чем около 2% или менее чем около 1% аминокислотных остатков были гидрофобными, так чтобы полученные в результате последовательности в целом были лишены вторичной структуры, например, имели не более 2% альфа-спиралей или 2% бета-листов, как определено способами, описанными в настоящем документе. Гидрофобные остатки, менее предпочтительные в структуре XTEN, включают триптофан, фенилаланин, тирозин, лейцин, изолейцин, валин и метионин. Кроме того, можно спроектировать последовательности XTEN таким образом, чтобы они содержали менее 5% или менее 4%, или менее 3%, или менее 2%, или менее 1% или не содержали ни одну из следующих аминокислот: цистеин (во избежание образования дисульфида и окисления), метионин (во избежание окисления), аспарагин и глутамин (во избежание дезамидирования). Таким образом, в некоторых вариантах реализации изобретения компонент XTEN, содержащий другие аминокислоты в дополнение к глицину (G), аланину (A), серину (S), треонину (T), глутамату (E) и пролину (P), имеет последовательность с менее чем 5% остатков, содействующих образованию альфа-спиралей и бета-листов, согласно алгоритму Чоу-Фасмана, и имеет по меньшей мере 90%, или по меньшей мере около 95%, или больше структур статистического клубка, согласно алгоритму GOR.
В дополнительных вариантах реализации изобретения последовательность XTEN, применяемая в настоящем изобретении, влияет на физическое или химическое свойство, например, фармакокинетику химерного белка по данному изобретению. Последовательность XTEN, применяемая в данном изобретении, может проявлять одно или более из следующих полезных свойств: конформационную гибкость, повышенную растворимость в водной среде, высокую степень устойчивости к протеазам, низкую иммуногенность, низкое сродство с рецепторами клеток млекопитающих и увеличенные гидродинамические (или Стокса) радиусы. В конкретном варианте реализации изобретения последовательность XTEN, связанная с белком FVIII по данному изобретению, улучшает фармакокинетические свойства, такие как увеличение терминального периода полувыведения и увеличение площади под кривой (AUC) таким образом, что химерный белок, описанный в данном документе, остается in vivo увеличенный период времени по сравнению с диким типом FVIII. В дополнительных вариантах реализации изобретения последовательность XTEN, применяемая в настоящем изобретении, улучшает фармакокинетические свойства, такие как увеличение терминального периода полувыведения или увеличение площади под кривой (AUC) таким образом, что белок FVIII остается in vivo увеличенный период времени по сравнению с диким типом FVIII.
Один вариант реализации по данному изобретению представляет собой слитый белок FVIII/ФВ, содержащий часть FVIII, слитую с фрагментом Fc, и часть ФВ, слитую с Fc фрагментом, в котором последовательность XTEN (например, AE288) вставляется в часть FVIII, и в котором последовательность XTEN содержит менее 288 аминокислот (например, AE144) вставляется между частью ФВ и фрагментом Fc. Как описано в примерах, вставка XTEN, имеющая менее 288 аминокислот, между частью ФВ и частью Fc имеет большее влияние на фармакокинетику химерного белка, чем вставка XTEN, имеющей 288 аминокислот, между частью ФВ и частью Fc. Например, вставка последовательности XTEN, имеющая менее 288 аминокислот, между участком ФВ и фрагментом Fc в слитый белок FVIII/ФВ может увеличить конечный период полувыведения химерного белка по сравнению с XTEN, имеющей 288 аминокислот. В некоторых вариантах реализации изобретения конечный период полувыведения увеличивается по меньшей мере на около 5% по меньшей мере на около 10% по меньшей мере на около 15% по меньшей мере на около 20% по меньшей мере на около 25%, или по меньшей мере, на кололо 30%, по сравнению со вставкой последовательности XTEN, имеющей 288 аминокислот. В одном конкретном варианте реализации изобретения конечный период полувыведения увеличивается по меньшей мере на около 35% по сравнению со вставкой XTEN, имеющей 288 аминокислот. Вставка последовательности XTEN, имеющая менее 288 аминокислот, может также увеличить значение AUC химерного белка. В некоторых вариантах реализации изобретения значение AUC увеличивается по меньшей мере на около 50%, по меньшей мере на около 100%, или по меньшей мере на около 200% по сравнению со вставкой XTEN, имеющей 288 аминокислот. В конкретном варианте реализации изобретения значение AUC увеличивается примерно в 2 раза. Вставка последовательности XTEN, имеющая менее 288 аминокислот, может также уменьшить клиренс химерного белка. Например, клиренс может быть уменьшен по меньшей мере на около 5% по меньшей мере на около 10% по меньшей мере на около 15% по меньшей мере на около 20% по меньшей
- 46 044115 мере на около 25%, или по меньшей мере, на кололо 30%, по сравнению со вставкой последовательности
XTEN, имеющей 288 аминокислот. Вставка последовательности XTEN, имеющая менее 288 аминокислот, может увеличить среднее время удержания препарата (MRT) и/или уменьшить кажущийся объем распределения в равновесном состоянии (Vss) по отношению к вставке XTEN, имеющей 288 аминокислот.
Различные способы и анализы могут быть использованы для определения физических/химических свойств белков, содержащих последовательность XTEN. Такие способы включают в себя, но не ограничиваются ими, аналитическое центрифугирование, ЭПР, ионообменную ВЭЖХ, эксклюзионную ВЭЖХ, обращенно-фазовую ВЭЖХ, светорассеяние, капиллярный электрофорез, круговой дихроизм, дифференциальную сканирующую калориметрию, флуоресценцию, ионообменную ВЭЖХ, эксклюзионную ВЭЖХ, ИК, ЯМР, раман-спектроскопию, рефрактометрию и УФ/видимую спектроскопию. Дополнительные способы описаны в Amau et al., Prot Expr and Purif 48, 1-13 (2006 год).
Дополнительные примеры последовательностей XTEN, которые могут быть использованы в соответствии с данным изобретением, и раскрыты в патентных публикациях США № 2010/0239554 A1, 2010/0323956 A1, 2011/0046060 A1, 2011/0046061 A1, 2011/0077199 A1 или 2011/0172146 A1, или международных патентных публикациях № WO 2010091122 A1, WO 2010144502 A2, WO 2010144508 A1, WO 2011028228 A1, WO 2011028229 A1, WO 2011028344 A2 или WO 20130122617 A1.
II.C. Белок фактора VIII (FVIII).
В данном контексте белок FVIII означает функциональный полипептид FVIII в его нормальной роли в процессе коагуляции, если не указано иное. Термин белок FVIII включает в себя функциональный фрагмент, вариант, аналог или его производное, которое сохраняет функцию полоноразмероного фактора VIII дикого типа в каскаде реакций коагуляции. Белок FVIII взаимозаменяемо используется с полипептидом (или белком) FVIII или FVIII. Примеры функций FVIII включают, но не ограничиваются ими, способность активировать коагуляцию, способность выступать в качестве кофактора для фактора ГХ, или способность образовывать теназный комплекс с фактором IX в присутствии Ca2+ и фосфолипидов, которые затем преобразует фактор X в активированную форму Ха. Белок FVIII может быть человеческий, свиной, собачий, крысиный или мышиный белок FVIII. Кроме того, сравнение человеческого FVIII с FVIII других видов выявило наличие консервативных остатков, которые могут быть необходимыми для выполнения функции (Cameron et al., Thromb. Haemost. 79:317-22 (1998 год); US 6,251,632).
Для оценки функции системы свертывания крови имеется ряд тестов: определение активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ), хромогенный анализ, ротационная тромбоэластометрия, определение протромбинового времени (ПТВ) (используется также для определения MHO), определение фибриногена (часто методом Клауса), определение количества тромбоцитов, определение тромбоцитарной функции (часто посредством PFA-100), определение тромбинового времени, определение времени кровотечения, смешанный анализ (исправляется ли отклонение от нормы, если плазму пациента смешать с нормальной плазмой), определение фактора свертывания крови, определение антифосфолипидных антител, определение D-димеров, генетические тесты (например, фактор V Лейдена, протромбиновая мутация G20210A), определение времени разбавленного яда гадюки Рассела (dRVVT), различные функциональные тесты тромбоцитов, тромбоэластография (ТЭГ или Sonoclot), тромбоэластометрия (ТЕМ®, например, ROTEM®) или определение времени лизиса эуглобулина (ELT).
Тест АЧТВ является показателем эффективности измерения эффективности как внутренних (также известный как внутренний путь активации свёртывания крови) так и общих каскадов коагуляции. Этот тест обычно используется для измерения коагулирующей активности коммерчески доступных рекомбинантных факторов свертывания крови, например, FVIII или FIX. Он используется в сочетании с тестом на определение протромбинового времени (ПТВ), который измеряет внешний путь активации свёртывания крови.
Ротационная тромбоэластометрия предоставляет информацию о всей кинетики гемостаза: время свертывания крови, образование сгустков, стабильность сгустков и лизис. Различные параметры тромбоэластометрии зависят от активности плазматической системы свертывания, функции тромбоцитов, фибринолиза или многих факторов, которые влияют на эти взаимодействия. Этот анализ может предоставить полное представление о вторичном гемостазе.
Полипептид FVIII и последовательности полинуклеотидов являются известными, как и многие другие функциональные фрагменты, мутанты и их модифицированные варианты. Примеры последовательностей человеческого FVIII (полноразмерные) приведены ниже.
Табл. 3. Аминокислотная последовательность полноразмерного фактора VIII (Полноразмерный FVIII (сигнальный пептид FVIII подчеркнут; FVIII тяжелой цепи дважды подчеркнут; Домен В выделен курсивом; и FVIII легкой цепи представлен в виде обычного текста).
- 47 044115
Таблица 3
Сигнальный пептид: (SEQ Ш NO: 64)
MQIELSTCFFLCLLRFCFS
Зрелый фактор VIII (SEQ Ш NO: 65)*
ATRRYYLGAVELSWDYMOSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSVVYKKTLFVEF TDHLFNIAKPRPPWMGLLGPTIOAEVYDTVVITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGA EYDDOTSOREKEDDKVFPGGSHTYVWOVLKENGPMASDPLCLTYSYLSHVDLVKDLN SGLIGALLVCREGSLAKEKTOTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETKNSLMODRDAASARA WPKMHTVNGYVNRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQAS LEISPITFLTAOTLLMDLGOFLLFCHISSHOHDGMEAYVKVDSCPEEPOLRMKNNEEAED YDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFIOIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLVLAPD DRSYKSOYLNNGPORIGRKYKKVRFMAYTDETFKTREAIOHESGILGPLLYGEVGDTLLI IFKNOASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKWTVTVEDGPTKS DPRCLTRYYSSFVNMERDLASGLIGPLLICYKESVDORGNOIMSDKRNVILFSVFDENRS WYLTENIORFLPNPAGVOLEDPEFOASNIMHSINGYVFDSLOLSVCLHEVAYWYILSIGA OTDFLSVFFSGYTFKHKMVYEDTLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMT ALLKVSSCDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSQNSRHPSTRQKQFNATTTPEN DIEKTDPWFAHRTPMPKIQNVSSSDLLMLLRQSPTPHGLSLSDLQEAKYETFSDDPSPGAIDS NNSLSEMTHFRPQLHHSGDMVFTPESGLQLRLNEKLGTTAATELKKLDFKVSSTSNNLISTIPS DNLAAGTDNTSSLGPPSMPVHYDSQLDTTLFGKKSSPLTESGGPLSLSEENNDSKLLESGLMN SQESSWGKNVSSTESGRLFKGKRAHGPALLTKDNALFKVSISLLICrNKTSNNSArNRKTHIDGP SLLIENSPSVWQNILESDTEFKKVrPLIHDRMLMDKNATALRLNHMSNKTTSSKNMEMVQQK KEGPIPPDAQNPDMSFFKMLFLPESARWIQRTHGKNSLNSGQGPSPKQLVSLGPEKSVEGQN FLSEKNKVWGKGEFTKDVGLKEMVFPSSRNLFLINLDNLHENNTHNQEKKIQEEIEKKETLI QENWLPQIHTVrGTKNFMKNLFLLSIRQNVEGSYDGAYAPVLQDFRSLNDSTNRTKKHTAH FSKKGEEENLEGLGNQTKQIVEKYACTTRISPNTSQQNFVrQRSKRALKQFRLPLEETELEKRI IVDDTSTQWSKNMKHLTPSTLTQIDYNEKEKGAITQSPLSDCLIRSHSIPQANRSPLPIAKVSSF PSIRPIYLTRVLFQDNSSHLPAASYRKKDSGVQESSHFLQGAKKNNLSLAILTLEMTGDQREVG SLGTSATNSVrYKKVENrVLPKPDLPKTSGKVELLPKVHIYQKDLFPTETSNGSPGHLDLVEGS LLQGTEGAIKWNEANRPGKVPFLRVATESSAKTPSKLLDPLAWDNHYGTQIPKEEWKSQEKS PEKTAFKKKDTILSLNACESNHAIAAINEGQNKPEIEVrWAKQGRTERLCSQNPPVLKRHQREI TRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQKKTRHYFIAAVERLWDY GMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKVVFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAEVE DNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMAPT KDEFDCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDE TKSWYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWY LLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWRVECLI GEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSIN AWSTKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQFIIMYSLDGKKWQTYRGNST GTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLNSCSMPLGME SKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNNPKEWLQVDFQKTMK VTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPVVNSL DPPLLTRYLRIHPQSWVHQIALRMEVLGCEAQDLY
- 48 044115
Таблица 4
Нуклеотидная последовательность, кодирующая полноразмерный FVIII (SEQ ID NO: 66)*
661 ATG CAAATAGAGC TCTCCACCTG
721 CTTCTTTCTG TGCCTTTTGC GATTCTGCTT TAGTGCCACC AGAAGATACT ACCTGGGTGC
781 AGTGGAACTG TCATGGGACT ATATGCAAAG TGATCTCGGT GAGCTGCCTG TGGACGCAAG
841 ATTTCCTCCT AGAGTGCCAA AATCTTTTCC ATTCAACACC TCAGTCGTGT ACAAAAAGAC
901 TCTGTTTGTA GAATTCACGG ATCACCTTTT CAACATCGCT AAGCCAAGGC CACCCTGGAT
961 GGGTCTGCTA GGTCCTACCA TCCAGGCTGA GGTTTATGAT ACAGTGGTCA TTACACTTAA
1021 GAACATGGCT TCCCATCCTG TCAGTCTTCA TGCTGTTGGT GTATCCTACT GGAAAGCTTC
1081 TGAGGGAGCT GAATATGATG ATCAGACCAG TCAAAGGGAG AAAGAAGATG ATAAAGTCTT
1141 CCCTGGTGGA AGCCATACAT ATGTCTGGCA GGTCCTGAAA GAGAATGGTC CAATGGCCTC
1201 TGACCCACTG TGCCTTACCT ACTCATATCT TTCTCATGTG GACCTGGTAA AAGACTTGAA
1261 TTCAGGCCTC ATTGGAGCCC TACTAGTATG TAGAGAAGGG AGTCTGGCCA AGGAAAAGAC
1321 ACAGACCTTG CACAAATTTA TACTACTTTT TGCTGTATTT GATGAAGGGA AAAGTTGGCA
1381 CTCAGAAACA AAGAACTCCT TGATGCAGGA TAGGGATGCT GCATCTGCTC GGGCCTGGCC
1441 TAAAATGCAC ACAGTCAATG GTTATGTAAA CAGGTCTCTG CCAGGTCTGA TTGGATGCCA
1501 CAGGAAATCA GTCTATTGGC ATGTGATTGG AATGGGCACC ACTCCTGAAG TGCACTCAAT
- 49 044115
1561 ATTCCTCGAA GGTCACACAT TTCTTGTGAG GAACCATCGC
CAGGCGTCCT TGGAAATCTC
1621 GCCAATAACT TTCCTTACTG CTCAAACACT CTTGATGGAC CTTGGACAGT TTCTACTGTT
1681 TTGTCATATC TCTTCCCACC AACATGATGG CATGGAAGCT TATGTCAAAG TAGACAGCTG
1741 TCCAGAGGAA CCCCAACTAC GAATGAAAAA TAATGAAGAA GCGGAAGACT ATGATGATGA
1801 TCTTACTGAT TCTGAAATGG ATGTGGTCAG GTTTGATGAT GACAACTCTC CTTCCTTTAT
1861 CCAAATTCGC TCAGTTGCCA AGAAGCATCC TAAAACTTGG GTACATTACA TTGCTGCTGA
1921 AGAGGAGGAC TGGGACTATG CTCCCTTAGT CCTCGCCCCC GATGACAGAA GTTATAAAAG
1981 TCAATATTTG AACAATGGCC CTCAGCGGAT TGGTAGGAAG TACAAAAAAG TCCGATTTAT
2041 GGC AT AC AC A GATGAAACCT TTAAGACTCG TGAAGCTATT CAGCATGAAT CAGGAATCTT
2101 GGGACCTTTA CTTTATGGGG AAGTTGGAGA CACACTGTTG ATTATATTTA AGAATCAAGC
2161 AAGCAGACCA TATAACATCT ACCCTCACGG AATCACTGAT GTCCGTCCTT TGTATTCAAG
2221 GAGATTACCA AAAGGTGTAA AACATTTGAA GGATTTTCCA ATTCTGCCAG GAGAAATATT
2281 CAAATATAAA TGGACAGTGA CTGTAGAAGA TGGGCCAACT AAATCAGATC CTCGGTGCCT
2341 GACCCGCTAT TACTCTAGTT TCGTTAATAT GGAGAGAGAT CTAGCTTCAG GACTCATTGG
2401 CCCTCTCCTC ATCTGCTACA AAGAATCTGT AGATCAAAGA GGAAACCAGA TAATGTCAGA
2461 CAAGAGGAAT GTCATCCTGT TTTCTGTATT TGATGAGAAC CGAAGCTGGT ACCTCACAGA
2521 GAATATACAA CGCTTTCTCC CCAATCCAGC TGGAGTGCAG CTTGAGGATC CAGAGTTCCA
- 50 044115
2581 AGCCTCCAAC ATCATGCACA GCATCAATGG CTATGTTTTT
GATAGTTTGC AGTTGTCAGT
2641 TTGTTTGCAT GAGGTGGCAT ACTGGTACAT TCTAAGCATT GGAGCACAGA CTGACTTCCT
2701 TTCTGTCTTC TTCTCTGGAT ATACCTTCAA ACACAAAATG GTCTATGAAG ACACACTCAC
2761 CCTATTCCCA TTCTCAGGAG AAACTGTCTT CATGTCGATG GAAAACCCAG GTCTATGGAT
2821 TCTGGGGTGC CACAACTCAG ACTTTCGGAA CAGAGGCATG ACCGCCTTAC TGAAGGTTTC
2881 TAGTTGTGAC AAGAACACTG GTGATTATTA CGAGGACAGT TATGAAGATA TTTCAGCATA
2941 CTTGCTGAGT AAAAACAATG CCATTGAACC AAGAAGCTTC TCCCAGAATT CAAGACACCC
3001 TAGCACTAGG CAAAAGCAAT TTAATGCCAC CACAATTCCA GAAAATGACA TAGAGAAGAC
3061 TGACCCTTGG TTTGCACACA GAACACCTAT GCCTAAAATA CAAAATGTCT CCTCTAGTGA
3121 TTTGTTGATG CTCTTGCGAC AGAGTCCTAC TCCACATGGG CTATCCTTAT CTGATCTCCA
3181 AGAAGCCAAA TATGAGACTT TTTCTGATGA TCCATCACCT GGAGCAATAG ACAGTAATAA
3241 CAGCCTGTCT GAAATGACAC ACTTCAGGCC ACAGCTCCAT CACAGTGGGG ACATGGTATT
3301 TACCCCTGAG TCAGGCCTCC AATTAAGATT AAATGAGAAA CTGGGGACAA CTGCAGCAAC
3361 AGAGTTGAAG AAACTTGATT TCAAAGTTTC TAGTACATCA AATAATCTGA TTTCAACAAT
3421 ТССATCAGAC AATTTGGCAG CAGGTACTGA TAATACAAGT TCCTTAGGAC CCCCAAGTAT
3481 GCCAGTTCAT TATGATAGTC AATTAGATAC CACTCTATTT GGCAAAAAGT CATCTCCCCT
3541 TACTGAGTCT GGTGGACCTC TGAGCTTGAG TGAAGAAAAT AATGATTCAA AGTTGTTAGA
- 51 044115
3601 ATCAGGTTTA ATGAATAGCC AAGAAAGTTC ATGGGGAAAA
AATGTATCGT CAACAGAGAG
3661 TGGTAGGTTA TTTAAAGGGA AAAGAGCTCA TGGACCTGCT TTGTTGACTA AAGATAATGC
3721 CTTATTCAAA GTTAGCATCT CTTTGTTAAA GACAAACAAA ACTTCCAATA ATTCAGCAAC
3781 TAATAGAAAG ACTCACATTG ATGGCCCATC ATTATTAATT GAGAATAGTC CATCAGTCTG
3841 GCAAAATATA TTAGAAAGTG ACACTGAGTT TAAAAAAGTG ACACCTTTGA TTCATGACAG
3901 AATGCTTATG GACAAAAATG CTACAGCTTT GAGGCTAAAT CATATGTCAA ATAAAACTAC
3961 TTCATCAAAA AACATGGAAA TGGTCCAACA GAAAAAAGAG GGCCCCATTC CACCAGATGC
4021 ACAAAATCCA GATATGTCGT TCTTTAAGAT GCTATTCTTG CCAGAATCAG CAAGGTGGAT
4081 ACAAAGGACT CATGGAAAGA ACTCTCTGAA CTCTGGGCAA GGCCCCAGTC CAAAGCAATT
4141 AGTATCCTTA GGACCAGAAA AATCTGTGGA AGGTCAGAAT TTCTTGTCTG AGAAAAACAA
4201 AGTGGTAGTA GGAAAGGGTG AATTTACAAA GGACGTAGGA CTCAAAGAGA TGGTTTTTCC
4261 AAGCAGCAGA AACCTATTTC TTACTAACTT GGATAATTTA CATGAAAATA ATACACACAA
4321 TCAAGAAAAA AAAATTCAGG AAGAAATAGA AAAGAAGGAA ACATTAATCC AAGAGAATGT
4381 AGTTTTGCCT C AGAT AC AT A CAGTGACTGG CACTAAGAAT TTCATGAAGA ACCTTTTCTT
4441 ACTGAGCACT AGGCAAAATG TAGAAGGTTC ATATGACGGG GCATATGCTC CAGTACTTCA
4501 AGATTTTAGG TCATTAAATG ATTCAACAAA TAGAACAAAG AAACACACAG CTCATTTCTC
4561 AAAAAAAGGG GAGGAAGAAA ACTTGGAAGG CTTGGGAAAT CAAACCAAGC AAATTGTAGA
- 52 044115
4621 GAAATATGCA TGC ACC AC AA GGATATCTCC TAATACAAGC
CAGCAGAATT TTGTCACGCA
4681 ACGTAGTAAG AGAGCTTTGA AACAATTCAG ACTCCCACTA GAAGAAACAG AACTTGAAAA
4741 AAGGATAATT GTGGATGACA CCTCAACCCA GTGGTCCAAA AACATGAAAC ATTTGACCCC
4801 GAGCACCCTC ACACAGATAG ACTACAATGA GAAGGAGAAA GGGGCCATTA CTCAGTCTCC
4861 CTTATCAGAT TGCCTTACGA GGAGTCATAG CATCCCTCAA GCAAATAGAT CTCCATTACC
4921 CATTGCAAAG GT АТС АТС AT TTCCATCTAT TAGACCTATA TATCTGACCA GGGTCCTATT
4981 CCAAGACAAC TCTTCTCATC TTCCAGCAGC ATCTTATAGA AAGAAAGATT CTGGGGTCCA
5041 AGAAAGCAGT CATTTCTTAC AAGGAGCCAA AAAAAATAAC CTTTCTTTAG CCATTCTAAC
5101 CTTGGAGATG ACTGGTGATC AAAGAGAGGT TGGCTCCCTG GGGACAAGTG CCACAAATTC
5161 AGTCACATAC AAGAAAGTTG AGAACACTGT TCTCCCGAAA CCAGACTTGC CCAAAACATC
5221 TGGCAAAGTT GAATTGCTTC CAAAAGTTCA CATTTATCAG AAGGACCTAT TCCCTACGGA
5281 AACTAGCAAT GGGTCTCCTG GCCATCTGGA TCTCGTGGAA GGGAGCCTTC TTCAGGGAAC
5341 AGAGGGAGCG ATTAAGTGGA ATGAAGCAAA CAGACCTGGA AAAGTTCCCT TTCTGAGAGT
5401 AGCAACAGAA AGCTCTGCAA AGACTCCCTC CAAGCTATTG GATCCTCTTG CTTGGGATAA
5461 CCACTATGGT ACTCAGATAC CAAAAGAAGA GTGGAAATCC CAAGAGAAGT CACCAGAAAA
5521 AACAGCTTTT AAGAAAAAGG ATACCATTTT GTCCCTGAAC GCTTGTGAAA GCAATCATGC
5581 AATAGCAGCA ATAAATGAGG GACAAAATAA GCCCGAAATA GAAGTCACCT GGGCAAAGCA
- 53 044115
5641 AGGTAGGACT GAAAGGCTGT GCTCTCAAAA CCCACCAGTC TTGAAACGCC ATCAACGGGA
5701 AATAACTCGT ACTACTCTTC AGTCAGATCA AGAGGAAATT GACTATGATG AT АССАТ АТС
5761 AGTTGAAATG AAGAAGGAAG ATTTTGACAT TTATGATGAG GATGAAAATC AGAGCCCCCG
5821 CAGCTTTCAA AAGAAAACAC GACACTATTT TATTGCTGCA GTGGAGAGGC TCTGGGATTA
5881 TGGGATGAGT AGCTCCCCAC ATGTTCTAAG AAACAGGGCT CAGAGTGGCA GTGTCCCTCA
5941 GTTCAAGAAA GTTGTTTTCC AGGAATTTAC TGATGGCTCC TTTACTCAGC CCTTATACCG
6001 TGGAGAACTA AATGAACATT TGGGACTCCT GGGGCCATAT ATAAGAGCAG AAGTTGAAGA
6061 TAATATCATG GTAACTTTCA GAAATCAGGC CTCTCGTCCC TATTCCTTCT ATTCTAGCCT
6121 TATTTCTTAT GAGGAAGATC AGAGGCAAGG AGCAGAACCT AGAAAAAACT TTGTCAAGCC
6181 TAATGAAACC AAAACTTACT TTTGGAAAGT GCAACATCAT ATGGCACCCA CTAAAGATGA
6241 GTTTGACTGC AAAGCCTGGG CTTATTTCTC TGATGTTGAC CTGGAAAAAG ATGTGCACTC
6301 AGGCCTGATT GGACCCCTTC TGGTCTGCCA CACTAACACA CTGAACCCTG CTCATGGGAG
6361 ACAAGTGACA GTACAGGAAT TTGCTCTGTT TTTCACCATC TTTGATGAGA CCAAAAGCTG
6421 GTACTTCACT GAAAATATGG AAAGAAACTG CAGGGCTCCC TGCAATATCC AGATGGAAGA
6481 TCCCACTTTT AAAGAGAATT ATCGCTTCCA TGCAATCAAT GGCTACATAA TGGATACACT
6541 ACCTGGCTTA GTAATGGCTC AGGATCAAAG GATTCGATGG TATCTGCTCA GCATGGGCAG
6601 CAATGAAAAC ATCCATTCTA TTCATTTCAG TGGACATGTG TTCACTGTAC GAAAAAAAGA
- 54 044115
6661 GG AGT AT AAA ATGGCACTGT ACAATCTCTA TCCAGGTGTT
TTTGAGACAG TGGAAATGTT
6721 ACCATCCAAA GCTGGAATTT GGCGGGTGGA ATGCCTTATT
GGCGAGCATC TACATGCTGG
6781 GATGAGCACA CTTTTTCTGG TGTACAGCAA TAAGTGTCAG ACTCCCCTGG GAATGGCTTC
6841 TGGACACATT AGAGATTTTC AG ATT AC AGC TTCAGGACAA TATGGACAGT GGGCCCCAAA
6901 GCTGGCCAGA CTTCATTATT CCGGATCAAT CAATGCCTGG AGCACCAAGG AGCCCTTTTC
6961 TTGGATCAAG GTGGATCTGT TGGCACCAAT GATTATTCAC GGCATCAAGA CCCAGGGTGC
7021 CCGTCAGAAG TTCTCCAGCC TCTACATCTC TCAGTTTATC ATCATGTATA GTCTTGATGG
7081 GAAGAAGTGG CAGACTTATC GAGGAAATTC CACTGGAACC TTAATGGTCT TCTTTGGCAA
7141 TGTGGATTCA TCTGGGATAA AACACAATAT TTTTAACCCT CCAATTATTG CTCGATACAT
7201 CCGTTTGCAC CCAACTCATT ATAGCATTCG CAGCACTCTT CGCATGGAGT TGATGGGCTG
7261 TGATTTAAAT AGTTGCAGCA TGCCATTGGG AATGGAGAGT AAAGCAATAT CAGATGCACA
7321 GATTACTGCT TCATCCTACT TTACCAATAT GTTTGCCACC TGGTCTCCTT CAAAAGCTCG
7381 ACTTCACCTC CAAGGGAGGA GTAATGCCTG GAGACCTCAG GTGAATAATC CAAAAGAGTG
7441 GCTGCAAGTG GACTTCCAGA AGACAATGAA AGTCACAGGA GTAACTACTC AGGGAGTAAA
7501 ATCTCTGCTT ACCAGCATGT ATGTGAAGGA GTTCCTCATC TCCAGCAGTC AAGATGGCCA
7561 TCAGTGGACT CTCTTTTTTC AGAATGGCAA AGTAAAGGTT TTTCAGGGAA ATCAAGACTC
7621 CTTCACACCT GTGGTGAACT CTCTAGACCC ACCGTTACTG ACTCGCTACC TTCGAATTCA
7681 CCCCCAGAGT TGGGTGCACC AGATTGCCCT GAGGATGGAG GTTCTGGGCT GCGAGGCACA
7741 GGACCTCTAC ^Подчеркнутые нуклеиновые кислоты кодируют сигнальный пептид
Полипептиды FVIII включают полноразмерный FVIII, полноразмерный FVIII без метионина на Nконце, зрелый FVIII (без сигнальной последовательности), зрелый FVIII с дополнительным метионином на N-конце и/или FVIII с полным или частичным удалением домена В. В определенных вариантах реализации изобретения варианты FVIII включают делеции домена В, будь то частичные или полные делеции.
Последовательность нативного зрелого фактора FVIII человека представлена в SEQ ID NO: 65. Нативный белок FVIII имеет следующую формулу: А1-а1-А2-а2-В-а3-А3-С1-С2, где A1, A2, и A3 - структурно родственные домены А, В -домены В, С1 и С2 - структурно родственные домены С, и a1, a2 и a3 - кислые спейсерные участки. Ссылаясь на первичную аминокислотную позицию в SEQ ID NO:65, домен A1 FVIII человека простирается от Ala1 до около Arg336, спейсерный участок a1 простирается около от Met337 до около Val374, домен А2 простирается около от Ala375 до около Tyr719, спейсерный домен а2 простирается около от Glu720 до около Arg740, домен В простирается около от Ser741 до около
- 55 044115
Arg1648, спейсерный домен a3 простирается около от Glu1649 до около Arg1689, домен A3 простирается около от Ser1690 до около Leu2025, домен С1 простирается от около Gly2026 до около Asn2072, и домен С2 простирается около от Ser2073 до Tyr2332. Помимо специфических сайтов протеолитического расщепления обозначение расположения границ между доменами и участками FVIII может отличаться в различных литературных источниках. Границы, представленные в настоящем документе, обозначены как приблизительные путем использования термина около.
Ген FVIII человека был выделен и экспрессирован в клетках млекопитающих (Toole, J. J., et al., Nature 312:342-347 (1984 год); Gitschier, J., et al., Nature 312:326-330 (1984 год); Wood, W. I, et al., Nature 312:330-337 (1984 год); Vehar, G A, et al., Nature 312:337-342 (1984 год); WO 87/04187; WO 88/08035; WO 88/03558; и патент США № 4,757,006). Аминокислотная последовательность FVIII была предсказана из кДНК, как показано в патенте США № 4,965,199. Кроме того, FVIII с частично или полностью удаленным доменом В, показан в патентах США № 4,994,371 и 4,868,112. В некоторых вариантах реализации изобретения домен В FVIII человека заменяется на домен В фактора V человека, как показано в патенте США № 5,004,803. Последовательность кДНК, кодирующая фактор VIII человека, и аминокислотная последовательность показаны в SEQ ID NOs: 1 и 2 соответственно из публикации заявки США №2005/0100990.
Последовательность свиного FVIII опубликована в Toole, J. J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5939-5942 (1986 год). Кроме того, полная последовательность свиной кДНК, полученная посредством ПЦР амплификации последовательностей FVIII из библиотеки кДНК из свиной селезенки, описана в Healey, J. F., et al., Blood 88:4209-4214 (1996 год). Гибридный FVIII (человеческий/свиной), имеющий замены всех доменов, всех субъединиц и конкретных аминокислотных последовательностей, описан в патенте США № 5,364,771 в Lollar и Runge и в WO 93/20093. Совсем недавно были описаны нуклеотидные и соответствующие аминокислотные последовательности доменов А1 и А2 свиного FVIII и химерного FVIII, имеющего свиные домены А1 и/или А2, замещающие соответствующие человеческие домены, в WO 94/11503. Патент США № 5,859,204, Lollar, J. S., также описывает свиную кДНК и предсказанные аминокислотные последовательности. Патент США № 6458563 описывает свиной FVIII с удаленным доменом В.
Патент США № 5,859,204, Lollar, J. S. описывает функциональные мутанты FVIII с пониженной антигенностью и пониженной иммунореактивностью. Патент США № 6,376,463, Lollar, J. S. описывает мутанты FVIII с пониженной иммунореактивностью. Публикация заявки США № 2005/0100990 Saenko et al. описывают функциональные мутации в домене А2 FVIII.
В одном варианте реализации изобретения FVIII (или часть FVIII химерного белка) может по меньшей мере на 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% быть идентичным аминокислотной последовательности FVIII, представляющей собой аминокислоты 1-1438 из SEQ ID NO: 67 или аминокислоты 1-2332 из SEQ ID NO: 65 (без сигнальной последовательности), или аминокислотной последовательности FVIII, представляющей собой аминокислоты 1-19 из SEQ ID NO: 64, и аминокислоты 1-1438 из SEQ ID NO: 67, или аминокислоты 1-19 из SEQ ID NO: 64, и аминокислоты 1-2332 из SEQ ID NO: 65 (с сигнальной последовательностью), в которой FVIII имеет свертывающую активность, например, активирует фактор IX в качестве кофактора, чтобы преобразовать фактор X в активированный фактор X. FVIII (или часть FVIII химерного белка) может быть идентичным аминокислотной последовательности FVIII, представляющей собой аминокислоты 1-1438 из SEQ ID NO: 67 или аминокислоты 12332 из SEQ ID NO: 65 (без сигнальной последовательности). FVIII может дополнительно включать сигнальную последовательность.
Домен В FVIII в данном контексте является тем же доменом В, известным в данной области техники, который определяется внутренней идентичностью аминокислотной последовательности и сайтов протеолитического расщепления, например, остатки Ser741-Arg1648 полноразмерного FVIII человека. Другие домены FVIII человека определяются следующими аминокислотными остатками: А1, остатки Ala1-Arg372; A2, остатки Ser373-Arg740; A3, остатки Ser1690-Asn2019; C1, остатки Lys2020-Asn2172; C2, остатки Ser2173-Tyr2332. Последовательность А3-С1-С2 включает в себя остатки Ser1690-Tyr2332. Оставшуюся последовательность, остатки Glu1649-Arg1689, обычно называют кислым участком а3. Расположение границ всех доменов, в том числе доменов В свиного, мышиного и собачьего FVIII также известны в данной области техники. В одном варианте реализации изобретения из FVIII удаляется домен В (фактор VIII с удаленным доменом В или FVIII BDD). Примером BDD FVIII является REFACTO® (рекомбинантный BDD FVIII), который имеет ту же последовательность, что и часть фактора VIII из последовательности в табл. 5. (BDD FVIII тяжелой цепи выделен двойным подчеркиванием; домен В выделен курсивом; и BDD FVIII легкой цепи представлен в виде обычного текста). Нуклеотидная последовательность, кодирующая табл. 6 (SEQ ID NO: 68) представлена в табл. 6.
- 56 044115
Таблица 5
Аминокислотная последовательность фактора VIII с удаленным доменом В (BDD FVIII).
BDD FVIII (SEQ ID NO: 67)
ATRRYYLGAVELSWDYMOSDLGEL·PVDARFPPRVPKSFPFNTSVVYKKTLFVEF TDHLFNIAKPRPPWMGLLGPTIOAEVYDTVVITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGA EYDDOTSOREKEDDKVFPGGSHTYVWOVLKENGPMASDPLCLTYSYLSHVDLVKDLN SGLIGALLVCREGSLAKEKTOTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETKNSLMODRDAASARA WPKMHTVNGYVNRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHROAS LEISPITFLTAOTLLMDLGOFLLFCHISSHOHDGMEAYVKVDSCPEEPOLRMKNNEEAED YDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFIOIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLVLAPD DRSYKSOYLNNGPORIGRKYKKVRFMAYTDETFKTREAIOHESGILGPLLYGEVGDTLIJ IFKNOASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKWTVTVEDGPTKS DPRCLTRYYSSFVNMERDLASGLIGPLLICYKESVDORGNOIMSDKRNVILFSVFDENRS WYLTENIORFLPNPAGVOLEDPEFOASNIMHSINGYVFDSLOLSVCLHEVAYWYILSIGA OTDFLSVFFSGYTFKHKMVYEDTLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMT ALLKVSSCDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSONPPVLKRHOREITRTTLOSD QEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHV LRNRAQSGSVPQFKKVVFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAEVEDNIMVTFR NQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKDEFDCKA WAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWYFTE NMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWYLLSMGSNE NIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWRVECLIGEHLHAGM STLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSINAWSTKEPFS WIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQFIIMYSLDGKKWQTYRGNSTGTLMVFFGN VDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQIT ASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNNPKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQG VKSLLTSMYVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPVVNSLDPPLLTRYL RIHPQSWVHQIALRMEVLGCEAQDLY
Таблица 6 Нуклеотидная последовательность, кодирующая
BDD FVIII (SEQ ID NO: 68)*
661 A TGCAAATAGA GCTCTCCACC TGCTTCTTTC
721 TGTGCCTTTT GCGATTCTGC TTTAGTGCCA CCAGAAGATA CTACCTGGGT GCAGTGGAAC
781 TGTCATGGGA CTATATGCAA AGTGATCTCG GTGAGCTGCC TGTGGACGCA AGATTTCCTC
841 CTAGAGTGCC AAAATCTTTT CCATTCAACA CCTCAGTCGT GTACAAAAAG ACTCTGTTTG
901 TAGAATTCAC GGATCACCTT TTCAACATCG CTAAGCCAAG GCCACCCTGG ATGGGTCTGC
961 TAGGTCCTAC CATCCAGGCT GAGGTTTATG ATACAGTGGT CATTACACTT AAGAACATGG
- 57 044115
1021 CTTCCCATCC TGTCAGTCTT CATGCTGTTG GTGTATCCTA CTGGAAAGCT TCTGAGGGAG
1081 CTGAATATGA TGATCAGACC AGTCAAAGGG AGAAAGAAGA TGATAAAGTC TTCCCTGGTG
1141 GAAGCCATAC ATATGTCTGG CAGGTCCTGA AAGAGAATGG TCCAATGGCC TCTGACCCAC
1201 TGTGCCTTAC CTACTCATAT CTTTCTCATG TGGACCTGGT AAAAGACTTG AATTCAGGCC
1261 TCATTGGAGC CCTACTAGTA TGTAGAGAAG GGAGTCTGGC CAAGGAAAAG ACACAGACCT
1321 TGCACAAATT TATACTACTT TTTGCTGTAT TTGATGAAGG GAAAAGTTGG CACTCAGAAA
1381 CAAAGAACTC CTTGATGCAG GATAGGGATG CTGCATCTGC TCGGGCCTGG CCTAAAATGC
1441 ACACAGTCAA TGGTTATGTA AACAGGTCTC TGCCAGGTCT GATTGGATGC CACAGGAAAT
1501 CAGTCTATTG GCATGTGATT GGAATGGGCA CCACTCCTGA AGTGCACTCA ATATTCCTCG
1561 AAGGTCACAC ATTTCTTGTG AGGAACCATC GCCAGGCGTC CTTGGAAATC TCGCCAATAA
1621 CTTTCCTTAC TGCTCAAACA CTCTTGATGG ACCTTGGACA GTTTCTACTG TTTTGTCATA
1681 TCTCTTCCCA CCAACATGAT GGCATGGAAG CTTATGTCAA AGTAGACAGC TGTCCAGAGG
1741 AACCCCAACT ACGAATGAAA AATAATGAAG AAGCGGAAGA CTATGATGAT GATCTTACTG
1801 ATTCTGAAAT GGATGTGGTC AGGTTTGATG ATGACAACTC TCCTTCCTTT ATCCAAATTC
1861 GCTCAGTTGC CAAGAAGCAT CCTAAAACTT GGGTACATTA CATTGCTGCT GAAGAGGAGG
1921 ACTGGGACTA TGCTCCCTTA GTCCTCGCCC CCGATGACAG AAGTTATAAA AGTCAATATT
1981 TGAACAATGG CCCTCAGCGG ATTGGTAGGA AGTACAAAAA AGTCCGATTT ATGGCATACA
- 58 044115
2041 CAGATGAAAC CTTTAAGACT CGTGAAGCTA TTCAGCATGA
ATCAGGAATC TTGGGACCTT
2101 TACTTTATGG GGAAGTTGGA GACACACTGT TGATTATATT TAAGAATCAA GCAAGCAGAC
2161 CATATAACAT CTACCCTCAC GGAATCACTG ATGTCCGTCC TTTGTATTCA AGGAGATTAC
2221 CAAAAGGTGT ААААСATTTG AAGGATTTTC CAATTCTGCC AGGAGAAATA TTCAAATATA
2281 AATGGACAGT GACTGTAGAA GATGGGCCAA CTAAATCAGA TCCTCGGTGC CTGACCCGCT
2341 ATTACTCTAG TTTCGTTAAT ATGGAGAGAG ATCTAGCTTC AGGACTCATT GGCCCTCTCC
2401 TCATCTGCTA CAAAGAATCT GTAGATCAAA GAGGAAACCA GATAATGTCA GACAAGAGGA
2461 ATGTCATCCT GTTTTCTGTA TTTGATGAGA ACCGAAGCTG GTACCTCACA GAGAATATAC
2521 AACGCTTTCT CCCCAATCCA GCTGGAGTGC AGCTTGAGGA TCCAGAGTTC CAAGCCTCCA
2581 ACATCATGCA CAGCATCAAT GGCTATGTTT TTGATAGTTT GCAGTTGTCA GTTTGTTTGC
2641 ATGAGGTGGC ATACTGGTAC ATTCTAAGCA TTGGAGCACA GACTGACTTC CTTTCTGTCT
2701 TCTTCTCTGG ATATACCTTC AAACACAAAA TGGTCTATGA AGACACACTC ACCCTATTCC
2761 CATTCTCAGG AGAAACTGTC TTCATGTCGA TGGAAAACCC AGGTCTATGG ATTCTGGGGT
2821 GCCACAACTC AGACTTTCGG AACAGAGGCA TGACCGCCTT ACTGAAGGTT TCTAGTTGTG
2881 ACAAGAACAC TGGTGATTAT TACGAGGACA GTTATGAAGA TATTTCAGCA TACTTGCTGA
2941 GTAAAAACAA TGCCATTGAA CCAAGAAGCT TCTCTCAAAA CCCACCAGTC TTGAAACGCC
3001 ATCAACGGGA AATAACTCGT ACTACTCTTC AGTCAGATCA AGAGGAAATT GACTATGATG
- 59 044115
3061 ATACCATATC AGTTGAAATG AAGAAGGAAG ATTTTGACAT
TTATGATGAG GATGAAAATC
3121 AGAGCCCCCG CAGCTTTCAA AAGAAAACAC GACACTATTT
TATTGCTGCA GTGGAGAGGC
3181 TCTGGGATTA TGGGATGAGT AGCTCCCCAC ATGTTCTAAG AAACAGGGCT CAGAGTGGCA
3241 GTGTCCCTCA GTTCAAGAAA GTTGTTTTCC AGGAATTTAC TGATGGCTCC TTTACTCAGC
3301 CCTTATACCG TGGAGAACTA AATGAACATT TGGGACTCCT GGGGCCATAT ATAAGAGCAG
3361 AAGTTGAAGA TAATATCATG GTAACTTTCA GAAATCAGGC CTCTCGTCCC TATTCCTTCT
3421 ATTCTAGCCT TATTTCTTAT GAGGAAGATC AGAGGCAAGG AGCAGAACCT AGAAAAAACT
3481 TTGTCAAGCC TAATGAAACC AAAACTTACT TTTGGAAAGT GCAACATCAT ATGGCACCCA
3541 CTAAAGATGA GTTTGACTGC AAAGCCTGGG CTTATTTCTC TGATGTTGAC CTGGAAAAAG
3601 ATGTGCACTC AGGCCTGATT GGACCCCTTC TGGTCTGCCA CACTAACACA CTGAACCCTG
3661 CTCATGGGAG ACAAGTGACA GTACAGGAAT TTGCTCTGTT TTTCACCATC TTTGATGAGA
3721 CCAAAAGCTG GTACTTCACT GAAAATATGG AAAGAAACTG CAGGGCTCCC TGCAATATCC
3781 AGATGGAAGA TCCCACTTTT AAAGAGAATT ATCGCTTCCA TGCAATCAAT GGCTACATAA
3841 TGGATACACT ACCTGGCTTA GTAATGGCTC AGGATCAAAG GATTCGATGG TATCTGCTCA
3901 GCATGGGCAG CAATGAAAAC ATCCATTCTA TTCATTTCAG TGGACATGTG TTCACTGTAC
3961 GAAAAAAAGA GGAGTATAAA ATGGCACTGT ACAATCTCTA TCCAGGTGTT TTTGAGACAG
4021 TGGAAATGTT ACCATCCAAA GCTGGAATTT GGCGGGTGGA ATGCCTTATT GGCGAGCATC
- 60 044115
4081 TACATGCTGG GATGAGCACA CTTTTTCTGG TGTACAGCAA
TAAGTGTCAG ACTCCCCTGG
4141 GAATGGCTTC TGGACACATT AGAGATTTTC AGATTACAGC
TTCAGGACAA TATGGACAGT
4201 GGGCCCCAAA GCTGGCCAGA CTTCATTATT CCGGATCAAT CAATGCCTGG AGCACCAAGG
4261 AGCCCTTTTC TTGGATCAAG GTGGATCTGT TGGCACCAAT GATTATTCAC GGCATCAAGA
4321 CCCAGGGTGC CCGTCAGAAG TTCTCCAGCC TCTACATCTC TCAGTTTATC ATCATGTATA
4381 GTCTTGATGG GAAGAAGTGG CAGACTTATC GAGGAAATTC CACTGGAACC TTAATGGTCT
4441 TCTTTGGCAA TGTGGATTCA TCTGGGATAA AACACAATAT TTTTAACCCT CCAATTATTG
4501 CTCGATACAT CCGTTTGCAC CCAACTCATT ATAGCATTCG CAGCACTCTT CGCATGGAGT
4561 TGATGGGCTG TGATTTAAAT AGTTGCAGCA TGCCATTGGG AATGGAGAGT AAAGCAATAT
4621 CAGATGCACA GATTACTGCT TCATCCTACT TTACCAATAT GTTTGCCACC TGGTCTCCTT
4681 CAAAAGCTCG ACTTCACCTC CAAGGGAGGA GTAATGCCTG GAGACCTCAG GTGAATAATC
4741 CAAAAGAGTG GCTGCAAGTG GACTTCCAGA AGACAATGAA AGTCACAGGA GTAACTACTC
4801 AGGGAGTAAA ATCTCTGCTT ACCAGCATGT ATGTGAAGGA GTTCCTCATC TCCAGCAGTC
4861 AAGATGGCCA TCAGTGGACT CTCTTTTTTC AGAATGGCAA AGTAAAGGTT TTTCAGGGAA
4921 ATCAAGACTC CTTCACACCT GTGGTGAACT CTCTAGACCC ACCGTTACTG ACTCGCTACC
4981 TTCGAATTCA CCCCCAGAGT TGGGTGCACC AGATTGCCCT GAGGATGGAG GTTCTGGGCT
5041 GCGAGGCACA GGACCTCTAC *Подчеркнутые нуклеиновые кислоты кодируют сигнальный пептид
FVIII с удаленным доменом В может иметь полные или частичные делеции, раскрытые в патентах США № 6,316,226, 6,346,513, 7,041,635, 5,789,203, 6,060,447, 5,595,886, 6,228,620, 5,972,885, 6,048,720, 5,543,502, 5,610,278, 5,171,844, 5,112,950, 4,868,112 и 6,458,563. В некоторых вариантах реализации изобретения последовательность FVIII с удаленным доменом В по данному изобретению содержит любую из делеций, описанную в кол. 4, строка 4 до кол. 5, строка 28 и примеры 1-5 патента США № 6,316,226 (также в патенте США 6,346,513). В другом варианте реализации изобретения фактор VIII с удаленным доменом В является S743/Q1638 фактором VIII с удаленным доменом В (SQ BDD FVIII) (например, фактор VIII с делецией от аминокислоты 744 до аминокислоты 1637, например, фактор VIII, имеющий аминокислоты 1-743 и аминокислоты 1638-2332 из SEQ ID NO: 65, т.е. SEQ ID NO: 67). В некоторых вариантах реализации изобретения FVIII с удаленным доменом В по данному изобретению содержит делецию, описанную в кол. 2, строки 26-51 и примеры 5-8 патента США № 5,789,203 (также США 6,060,447, США 5,595,886 и США 6,228,620). В некоторых вариантах реализации изобретения FVIII с удаленным доменом В по данному изобретению содержит делецию, описанную в кол. 1, строки 25 до кол. 2, строка 40 патента США № 5,972,885; кол.6, строки 1-22 и пример 1 патента США № 6,048,720; кол. 2, строки 17-46 патента США № 5 543 502; кол. 4, строка 22 до кол. 5, строка 36 патента США № 5,171,844; кол. 2, строки 55-68, фигуре 2 и пример 1 патента США № 5,112,950; кол. 2, строка 2 до кол. 19, строка 21 и таблица 2 патента США № 4,868,112; кол. 2, строка 1 до кол. 3, строка 19, кол. 3, строка 40 до кол. 4,
- 61 044115 строка 67, кол. 7, строка 43 до кол. 8, строка 26 и кол. 11, строка 5 до кол. 13, строка 39 патента США № 7,041,635; или кол. 4, строки 25-53, патента США № 6,458,563. В некоторых вариантах реализации изобретения FVIII с удаленным доменом В имеет делецию большей части домена В, но по-прежнему содержит аминоконцевые последовательности домена В, которые необходимы для протеолитического процессинга первичного продукта трансляции на две полипептидные цепи in vivo, как описано в WO 91/09122. В некоторых вариантах реализации изобретения FVIII с удаленным доменом В создан с удаленными аминокислотами 747-1638, т.е. практически полное удаление домена В. Hoeben R.C., et al., J. Biol. Chem. 265 (13): 7318-7323 (1990 год). FVIII с удаленным доменом В может также содержать делецию аминокислот 771-1666 или аминокислот 868-1562 из FVIII. Meulien P., et al., Protein Eng. 2(4): 301-6 (1988 год). Дополнительные делеции домена В, являющиеся частью настоящего изобретения, включают в себя: делеции аминокислот от 982 до 1562 или от 760 до 1639 (Toole et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A (1986 год) 83, 5939-5942)), от 797 до 1562 (Eaton, et al., Biochemistry (1986 год) 25:8343-8347)), от 741 до 1646 (Kaufman (опубликованная заявка PCT № WO 87/04187)), 747-1560 (Sarver, et al., DNA(1987) 6:553-564)), от 741 до 1648 (Pasek (заявка PCT №88/00831)), или от 816 до 1598, или от 741 до 1648 (Lagner (Behring Inst. Mitt. (1988 год) No 82:16-25, EP 295597)). В другом варианте реализации изобретения BDD FVIII включает в себя полипепдид FVIII, содержащий фрагменты домена В, которые сохраняют один или более N-связанных сайтов гликозилирования, например остатки 757, 784, 828, 900, 963 или, в некоторых случаях, 943, которые соответствуют аминокислотной последовательности полноразмерной последовательности FVIII. Примеры фрагментов доменом В включают 226 аминокислот или 163 аминокислоты домена В, как описано в Miao, H.Z., et al., Blood 103(a): 3412-3419 (2004 год), Kasuda, A, et al., J. Thromb. Haemost. 6: 1352-1359 (2008 год), и Pipe, S.W., et al., J. Thromb. Haemost. 9: 2235-2242 (2011 год) (т.е. первые 226 аминокислот или 163 аминокислот домена В сохраняются). В еще одних вариантах реализации изобретения BDD FVIII дополнительно содержит точечную мутацию в остатке 309 (от Phe до Ser) для улучшения экспрессии белка BDD FVIII. См. Miao, H.Z., et al., Blood 103(a): 3412-3419 (2004 год). В еще одних вариантах реализации изобретения BDD FVIII включает в себя полипепдид FVIII, содержащий часть домена В, но не содержащий один или более сайтов расщепления фурина (например, Arg1313 и Arg 1648). См. Pipe, S.W., et al., J. Thromb. Haemost. 9: 2235-2242 (2011 год). Каждая из вышеупомянутых делеций может быть сделана в любой последовательности FVIII.
В некоторых вариантах реализации изобретения FVIII имеет частичный домен В. В некоторых вариантах реализации изобретения белком FVIII с частичным доменом В является FVIII 198. FVIII 198 представляет собой частичный домен В, содержащий одноцепочечную FVIIIFc молекулу-226N6. Номер 226 означает N-конец 226 аминокислоты домена В FVIII, и N6 означает шесть сайтов Nгликозилирования в домене В.
В одном варианте реализации изобретения FVIII расщепляется сразу после аргинина - аминокислота 1648 (в полноразмерном факторе VIII или SEQ ID NO: 65), аминокислота 754 (в S743/Q1638 факторе VIII с удаленным доменом В или SEQ ID NO: 67), или соответствующий остаток аргинина (в других вариантах), что приводит к образованию тяжелой цепи и легкой цепи. В других вариантах реализации изобретения FVIII содержит тяжелую цепь и легкую цепь, которые связаны или соединены с помощью металлической ион-опосредованной нековалентной связи.
В другом варианте реализации изобретения FVIII представляет собой одноцепочечный FVIII, который не был расщеплен сразу после аргинина - аминокислота 1648 (в полоноразмерном FVIII или SEQ ID NO: 65), аминокислота 754 (в S743/Q1638 FVIII с удаленным доменом В или SEQ ID NO: 67), или соответствующий остаток аргинина (в других вариантах). Одноцепочечный FVIII может содержать одну или более аминокислотных замен. В одном варианте реализации изобретения аминокислотная замена касается остатка, соответствующего остатку 1648, остатку 1645 или им обоим в полноразмерном полипептиде зрелого фактора VIII (SEQ ID NO: 65), или остатку 754, остатку 751, или им обоим в SQ BDD факторе VIII (SEQ ID NO: 67). Аминокислотной заменой может быть любая аминокислота, кроме аргинина, например, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, фенилаланин, треонин, триптофан, валин, аланин, аспарагин, аспарагиновая кислота, цистеин, глутаминовая кислота, глутамин, глицин, пролин, селеноцистеин, серин, тирозин, гистидин, орнитин, пирролизин или таурин.
FVIII дополнительно может быть расщеплен тромбином, а затем активирован как FVIIIa, выступая в качестве кофактора для активированного фактора IX (FIXa). И активированный FIX вместе с активированным FVIII образует комплекс Xase и преобразует фактор X в активированный фактор X (FXa). Для активации FVIII расщепляется тромбином после трех остатков аргинина - аминокислоты 372, 740 и 1689 (соответствующие аминокислотам 372, 740 и 795 в последовательности FVIII с удаленным доменом В) в результате расщепление образовывается FVIIIa, имеющий цепи А1 - 50 кДа, А2 - 43 кДа и А3-С1-С2 - 73 кДа. В одном варианте реализации изобретения белок FVIII, пригодный для настоящего изобретения, представляет собой неактивный FVIII. В другом варианте реализации изобретения белок FVIII представляет собой активированный FVIII.
Белок, имеющий полипептид FVIII, связанный или соединенный с белком ФВ может содержать последовательность по меньшей мере на 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную последовательности SEQ ID NO: 65 или 67, в котором последовательность имеет FVIII свер- 62 044115 тывающую активность, например, активирующую фактор IX в качестве кофактора для преобразования фактора X в активированный фактор X (FXa).
В данном контексте гибридные или химерные полипептиды и белки включают в себя сочетание первой полипептидной цепи, например, белок ФВ, слитый с последовательностью XTEN, имеющей менее 288 аминокислот, и первой константной областью ИГ или ее частью, и второй полипептидной цепи, например, белок FVIII, слитый со второй константной областью ИГ или ее частью, образуя, таким образом, гетеродимер. В одном варианте реализации изобретения первый полипептид и второй полипептид в гибриде соединены друг с другом посредством белок-белковых взаимодействий, таких как зарядзарядные или гидрофобные взаимодействия. В другом варианте реализации изобретения первый полипептид содержит слитый белок ФВ-XTEN-Fc, и второй полипептид содержит слитый белок FVIII-Fc, образовывая гибридный гетеродимер, в котором XTEN содержит менее 288 аминокислот. В других вариантах реализации изобретения первый полипептид содержит слитый белок ФВ-XTEN-Fc, и второй полипептид содержит слитый белок FVIII(X)-Fc, образовывая гибридный гетеродимер, в котором XTEN содержит менее 288 аминокислот. Первый полипептид и второй полипептид может быть соединен посредством ковалентной связи, например, дисульфидной связи между первым фрагментом Fc и вторым фрагментом Fc. Первый полипептид и второй полипептид дополнительно могут быть соединены друг с другом посредством связывания между фрагментом ФВ и белком FVIII.
Белок FVIII, пригодный к использованию в настоящем изобретении, может включать в себя FVIII, имеющий одну или более дополнительных последовательностей XTEN, которые не влияют на свертывающую активность FVIII. Такие последовательности XTEN могут быть слиты с С-концом или Nконцом белка FVIII или вставляться между одним или более из двух аминокислотных остатков в белке FVIII, причем вставки не влияют на свертывающую активность или функцию FVIII. В одном варианте реализации изобретения вставки улучшают фармакокинетические свойства белка FVIII (например, период полувыведения). В другом варианте реализации изобретения вставки могут быть множественными, например, больше двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти или десяти вставок. Примеры сайтов встраивания включают, но не ограничиваются ими, сайты, перечисленные в таблицах 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или любые их сочетания.
Белок FVIII, связанный с одной или более последовательностями XTEN, может быть представлен в виде FVIII(X2) или FVIII(a^b)-X-FVIII(c^d), причем FVIII(a^b) содержит, по существу состоит или состоит из первой части белка FVIII от аминокислотного остатка а до аминокислотного остатка b; X2 содержит, по существу состоит или состоит из одной или более последовательностей XTEN, FVIII(c^d) содержит, по существу состоит или состоит из второй части белка FVIII от аминокислотного остатка с до аминокислотного остатка d;
а является N-концевым аминокислотным остатком первой части белка FVIII, b является С-концевым аминокислотным остатком первой части белка FVIII, но также является Nконцевым аминокислотным остатком двух аминокислот сайта встраивания, в который вставляется последовательность XTEN, с является N-концевым аминокислотным остатком второй части белка FVIII, но также является Сконцевым аминокислотным остатком двух аминокислот сайта встраивания, в который вставляется последовательность XTEN, и d является С-концевым аминокислотным остатком белка FVIII, и при этом первая часть белка FVIII и вторая часть белка FVIII не совпадают друг с другом и вместе имеют достаточную длину, чтобы белок FVIII имел свертывающую активность FVIII.
В одном варианте реализации изобретения первая часть белка FVIII и вторая часть белка FVIII являются фрагментами SEQ ID NO: 65 (полноразмерная зрелая последовательность FVIII) или SEQ ID NO: 67 (FVIII с удаленным доменом В), например, N-концевая часть и С-концевая часть соответственно. В некоторых вариантах реализации изобретения первая часть белка FVIII содержит домен А1 и домен А2 белка FVIII. Вторая часть белка FVIII содержит домен A3, домен С1 и, в некоторых случаях, домен С2. В еще одних вариантах реализации изобретения первая часть белка FVIII содержит домен А1 и домен А2, и вторая часть белка FVIII содержит часть домена В, домен A3, домен С1 и, в некоторых случаях, домен С2. В еще одних вариантах реализации изобретения первая часть белка FVIII включает домен А1 домен А2 и часть домена В белка FVIII, а вторая часть белка FVIII содержит домен A3, домен С1, и, в некоторых случаях, домен С2. В еще одних вариантах реализации изобретения первая часть белка FVIII содержит домен А1, домен А2 и первую часть домена В белка FVIII. Вторая часть белка FVIII содержит вторую часть домена В, домен A3, домен С1 и, в некоторых случаях, домен С2. В некоторых вариантах реализации изобретения две аминокислоты (b и с) могут представлять собой один или более сайтов встраивания аминокислотных остатков, приведенных в табл. 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 и 15. Например, b может быть аминокислотным остатком, расположенным непосредственно выше сайта, в который одна или более последовательностей XTEN вставлены или связаны, и с может быть аминокислотным остатком, расположенным непосредственно ниже сайта, в который один или более последовательностей XTEN вставлены или связаны. В некоторых вариантах реализации изобретения а является первой зре
- 63 044115 лой аминокислотной последовательностью белка FVIII, и d является последней аминокислотной последовательностью белка FVIII. Например, FVIII,(а^b) может быть аминокислотной последовательностью по меньшей мере на 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной аминокислотам 1-745 из SEQ ID NO: 67 (аминокислотная последовательность FVIII с удаленным доменом В) или SEQ ID NO: 65 (полноразмерный FVIII), и FVIII(C^d) может быть аминокислотами 746-1438 из SEQ ID NO: 67 или аминокислотами 1641-2332 из SEQ ID NO: 65, соответственно.
В некоторых аспектах сайт встраивания в белке FVIII расположен в пределах одного или более доменов белка FVIII, которыми являются N-конец, домен А1, домен А2, домен A3, домен В, домен С1, домен С2, С-конец или два или более их сочетания, или между двумя доменами белка FVIII, которыми являются домен А1 и кислая область a1, и кислая область a1 и домен А2, домен А2 и а2 кислая область, кислая область а2 и домен В, домен В и домен A3, и домен A3 и домен С1, домен С1 и домен С2 или любые их сочетания. Например, сайты встраивания, в которые последовательность XTEN может быть вставлена, выбрана из группы, состоящей из N-конца и домена A1, N-конца и домена А2, N-конца и домена A3, N-конца и домена В, N-конца и домена C1, N-конца и домена С2, N-конца и С-конца, доменов А1 и А2, доменов А1 и A3, доменов А1 и В, доменов А1 и С1, доменов А1 и С2, домена А1 и С-конца, доменов А2 и A3, доменов А2 и В, доменов А2 и С1, доменов А2 и С2, домена А2 и С-конца, доменов A3 и В, доменов A3 и С1, доменов A3 и С2, домена A3 и С-конца, доменов В и С1, доменов В и С2, домена В и С-конца, доменов С1 и С2, домена С1 и С-конца, домена С2, и С-конца, и двух или более их сочетаний. Не ограничивающие примеры сайтов встраивания перечислены в табл. 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 и 15.
Белок FVIII, в котором последовательность XTEN вставляется непосредственно ниже одной или более аминокислот (например, один или более сайтов встраивания XTEN) в белке FVIII или связывается с С-концом или N-концом, сохраняет активность FVIII после связывания или вставки последовательности XTEN. Последовательность XTEN может быть вставлена в белок FVIII один или более одного раза, два раза, три раза, четыре раза, пять раз, или шесть раз таким образом, что вставки не влияют на активность FVIII (т.е. белок FVIII по-прежнему сохраняет коагуляционное свойство).
Белок FVIII, пригодный к использованию в настоящем изобретении, может быть связан с одним или более полипептидом XTEN на N-конце или на С-конце белка FVIII посредством необязательного линкера или вставлен непосредственно ниже одной или более аминокислот (например, один или более сайтов встраивания XTEN) в белке FVIII посредством одного или более необязательных линкеров. В одном варианте реализации изобретения два аминокислотных остатка, в которые вставляется последовательность XTEN, или аминокислотный остаток, с которым последовательность XTEN связывается, соответствуют двум или одному аминокислотному остатку из SEQ ID NO: 65 (полноразмерный зрелый FVIII), выбранный из группы, состоящей из остатков, представленных в табл. 7, табл. 8, табл. 9 и в табл. 10, и любых их сочетаний.
В других вариантах реализации изобретения по меньшей мере одна последовательность XTEN вставляется в любой один или более сайтов встраивания XTEN, описанный в данном документе, или любые их сочетания. В одном аспекте по меньшей мере одна последовательность XTEN встраивается в любой один или более сайтов встраивания XTEN, описанный в табл. 7.
- 64 044115
Таблица 7
Типовые сайты встраивания XTEN
№ Точка встраивания XTEN* Остаток встраивания FVIII BDD нижележащая последовательност ь Домен FVIII
1 0 (N-конец) ATR Al
2 3 R RYY Al
3 17 М QSD Al
4 18 Q SDL Al
5 22 G ELP Al
6 24 L PVD Al
7 26 V DAR Al
8 28 А RFP Al
9 32 Р RVP Al
10 38 F PFN Al
11 40 F NTS Al
12 41 N TSV Al
13 60 N IAK Al
14 61 I АКР Al
15 65 R PPW Al
16 81 Y DTV Al
17 111 G AEY Al
18 116 D QTS Al
19 119 S QRE Al
20 120 Q REK Al
- 65 044115
21 128 V FPG Al
22 129 F PGG Al
23 130 P GGS Al
24 182 G SLA Al
25 185 A KEK Al
26 188 К TQT Al
27 205 G KSW Al
28 210 S ETK Al
29 211 E TKN Al
30 216 L MQD Al
31 220 R DAA Al
32 222 A ASA Al
33 223 A SAR Al
34 224 S ARA Al
35 230 К MHT Al
36 243 P GLI Al
37 244 G LIG Al
38 250 R KSV Al
39 318 D GME Al
40 333 P QLR Al
42 334 Q LRM Al
43 336 R MKN al
44 339 N NEE al
45 345 D YDD al
46 357 V VRF al
47 367 s FIQ al
48 370 s RPY al
49 375 A KKH A2
50 376 К КНР A2
51 378 H PKT A2
- 66 044115
52 399 V LAP A2
53 403 D DRS A2
54 405 R SYK A2
55 409 S QYL A2
56 416 P QRI A2
57 434 E TFK A2
58 438 T REA A2
59 441 A IQH A2
60 442 I QHE A2
61 463 I IFK A2
62 487 Y SRR A2
63 490 R LPK A2
64 492 P KGV A2
65 493 К GVK A2
66 494 G VKH A2
67 500 D FPI A2
68 506 G EIF A2
69 518 E DGP A2
70 556 К ESV A2
71 565 Q IMS A2
72 566 I MSD A2
73 598 P AGV A2
74 599 A GVQ A2
75 603 L EDP A2
76 616 S ING A2
77 686 G LWI A2
78 713 К NTG A2
79 719 Y EDS A2
80 730 L LSK A2
81 733 К NNA A2
- 67 044115
82 745 Ν PPV** В
83 1640 Ρ PVL В
84 1652 R TTL В
85 1656 Q SDQ АЗ
86 1685 Ν QSP АЗ
87 1711 Μ SSS АЗ
88 1713 S SPH АЗ
89 1720 Ν RAQ АЗ
90 1724 S GSV АЗ
91 1725 G SVP АЗ
92 1726 S VPQ АЗ
93 1741 G SFT АЗ
94 1744 Τ QPL АЗ
95 1749 R GEL АЗ
96 1773 V TFR АЗ
97 1792 Υ EED АЗ
98 1793 Ε EDQ АЗ
99 1796 Q RQG АЗ
100 1798 Q GAE АЗ
101 1799 G ΑΕΡ АЗ
102 1802 Ρ RKN АЗ
103 1803 R KNF АЗ
104 1807 V ΚΡΝ АЗ
105 1808 к ΡΝΕ АЗ
106 1827 к DEF АЗ
107 1844 Ε KDV АЗ
108 1861 Ν TLN АЗ
109 1863 L ΝΡΑ АЗ
ПО 1896 Ε RNC АЗ
111 1900 R APC АЗ
- 68 044115
112 1904 N IQM A3
113 1905 I QME A3
114 1910 Р TFK A3
115 1920 А ING A3
116 1937 D QRI A3
117 1981 G VFE A3
118 2019 N KCQ A3
119 2020 К CQT Cl
120 2044 G QWA Cl
121 2068 F SWI Cl
122 2073 V DLL Cl
123 2090 R QKF Cl
124 2092 К FSS Cl
125 2093 F SSL Cl
126 2111 К WQT Cl
127 2115 Y RGN Cl
128 2120 Т GTL Cl
129 2125 V FFG Cl
130 2171 L NSC Cl
131 2173 S CSM C2
132 2188 А QIT C2
133 2223 V NNP C2
134 2224 N NPK C2
135 2227 К EWL C2
136 2268 G HQW C2
137 2277 N GKV C2
138 2278 G KVK C2
139 2290 F TPV C2
140 2332 Y С-конец FVIII CT
^Указывает на точку вставки XTEN, основываясь на количестве аминокислот зрелого полноразмерного FVIII человека, в котором вставка может быть или на N- или на С-концевой стороне указанной аминокислоты
В некоторых вариантах реализации изобретения одна или более последовательность XTEN вставлены в пределах около шести аминокислот, вверх или вниз от аминокислот 32, 220, 224, 336, 339, 399, 416, 603, 1656, 1711, 1725, 1905 или 1910, что соответствует SEQ ID NO: 65 или любых их комбинаций.
- 69 044115
Таблица 8
Типовые диапазоны встраивания XTEN
№ Точка встраива ния XTEN Остаток встраивания FVIII BDD нижележащ ая последовате льность Домен FVIII Расстояние от остатка встраивания *
9 32 Р RVP Al -3,+6
31 220 R DAA Al -
34 224 S ARA Al +5
43 336 R MKN al -1,+6
44 339 N ΝΕΕ al -4, +5
52 399 V LAP A2 -6, +3
56 416 Р QRI A2 +6
75 603 L EDP A2 _6, +6
85 1656 Q SDQ В -3,+6
87 1711 м sss A3 -6,+1
91 1725 G SVP A3 +6
113 1905 I QME A3 +6
114 1910 Р TFK A3 -5,+6
^Расстояние от остатка встраивания означает относительное количество аминокислот, отдаленных от N-конца (отрицательные числа) или С-конца (положительные числа) указанного остатка встраивания (остаток 0), в котором может происходить встраивание. Обозначение -x относится к сайту встраивания, который на х аминокислот отдален от N-концевой стороны указанного остатка встраивания. Аналогичным образом, обозначение +x относится к сайту встраивания, который на х аминокислот отдален от С-концевой стороны указанного остатка встраивания.
Например, -1, +2 указывает на то, что вставка выполнена на N-конце или С-конце аминокислотных остатков, обозначенных -1, 0, +1 или +2.
В других вариантах реализации изобретения одна или более последовательность XTEN встраивается непосредственно ниже одной или более аминокислот, соответствующих полноразмерному зрелому FVIII человека, выбранных из группы, состоящей из одного или более сайтов встраивания в табл. 9.
Таблица 9
Типовые сайты встраивания или диапазоны XTEN
№ Диапазон точки встраивания XTEN* Остаток встраивания Домен FVIII
3 18-32 Q Al
8 40 F Al
18 211-224 Е Al
27 336-403 R Al, A2
43 599 А A2
47 745-1640 N В
50 1656-1728 Q В, аЗ, АЗ
57 1796-1804 R АЗ
65 1900-1912 R АЗ
81 2171-2332 L С1,С2
*означает диапазон сайтов встраивания, пронумерованных согласно числу аминокислот зрелого FVIII человека
В еще одних вариантах реализации изобретения одна или более XTEN встраиваются в домены В FVIII. В одном примере, XTEN встраивается между аминокислот 740-1640, соответствующих SEQ ID NO: 65, в которой последовательность FVIII между аминокислотами 740-1640 в некоторых случаях отсутствует. В другом примере, XTEN встраивается между аминокислотами 741-1690, соответствующих
- 70 044115
SEQ ID NO: 65, в которой последовательность FVIII между аминокислотами 740-1690 в некоторых случаях отсутствует. В других примерах, XTEN встраивается между аминокислотами 741-1648, соответствующих SEQ ID NO: 65, в которой последовательность FVIII между аминокислотами 741-1648 в некоторых случаях отсутствует. В еще одних примерах XTEN встраивается между аминокислот 743-1638, соответствующих SEQ ID NO: 65, в которой последовательность FVIII между аминокислотами 743-1638 в некоторых случаях отсутствует. В еще одних примерах, XTEN встраивается между аминокислотами 7451656, соответствующих SEQ ID NO: 65, в которой последовательность FVIII между аминокислотами 7451656 в некоторых случаях отсутствует. В некоторых примерах, XTEN встраивается между аминокислотами 745-1657, соответствующих SEQ ID NO: 65, в которой последовательность FVIII между аминокислотами 745-1657 в некоторых случаях отсутствует. В отдельных примерах, XTEN встраивается между аминокислотами 745-1667, соответствующих SEQ ID NO: 65, в которой последовательность FVIII между аминокислотами 745-1667 в некоторых случаях отсутствует. В еще одних примерах, XTEN встраивается между аминокислотами 745-1686, соответствующих SEQ ID NO: 65, в которой последовательность FVIII между аминокислотами 745-1686 в некоторых случаях отсутствует. В некоторых других примерах, XTEN встраивается между аминокислотами 747-1642, соответствующих SEQ ID NO: 65, в которой последовательность FVIII между аминокислотами 747-1642 в некоторых случаях отсутствует. В еще одних примерах, XTEN встраивается между аминокислотами 751-1667, соответствующих SEQ ID NO: 65, в которой последовательность FVIII между аминокислотами 751-1667 в некоторых случаях отсутствует.
В некоторых вариантах реализации изобретения одна или более XTEN встраивается в одну или более аминокислоту, расположенную непосредственно ниже аминокислоты сайта встраивания, из группы, состоящей из аминокислотных остатков в табл. 10.
Таблица 10
Сайты встраивания FVIII XTEN и обозначения конструкции
Номер конструкц ни Домен № вышележащ его остатка.* № нижележащ его остатка. * Вышележащая последователь ность Нижележащая последователь ность
F8X-1 А1 3 4 ATR RYY
F8X-2 А1 18 19 YMQ SDL
F8X-3 А1 22 23 DLG ELP
- 71 044115
F8X-4 Al 26 27 LPV DAR
F8X-5 Al 40 41 FPF NTS
F8X-6 Al 60 61 LFN IAK
F8X-7 Al 116 117 YDD QTS
F8X-8 Al 130 131 VFP GGS
F8X-9 Al 188 189 KEK TQT
F8X-10 Al 216 217 NSL MQD
F8X-11 Al 230 231 WPK MHT
F8X-12 Al 333 334 EEP QLR
F8X-13 A2 375 376 SVA KKH
F8X-14 A2 403 404 APD DRS
F8X-15 A2 442 443 EAI QHE
F8X-16 A2 490 491 RRL PKG
F8X-17 A2 518 519 TVE DGP
F8X-18 A2 599 600 NPA GVQ
F8X-19 A2 713 714 CDK NTG
F8X-20 BD 745 746 SQN PPV
F8X-21 BD 745 746 SQN PPV
F8X-22 BD** 745 746 SQN PPV
F8X-23 A3 1720 1721 APT KDE
F8X-24 A3 1796 1797 EDQ RQG
F8X-25 A3 1802 1803 AEP RKN
F8X-26 A3 1827 1828 PTK DEF
F8X-27 A3 1861 1862 HTN TLN
F8X-28 A3 1896 1897 NME RNC
F8X-29 A3 1900 1901 NCR APC
F8X-3O A3 1904 1905 PCN IQM
F8X-31 A3 1937 1938 AQD QRI
F8X-32 Cl 2019 2020 YSN KCQ
F8X-33 Cl 2068 2069 EPF SWI
F8X-34 Cl 2111 2112 GKK WQT
F8X-35 Cl 2120 2121 NST GTL
F8X-36 C2 2171 2172 CDL NSC
F8X-37 C2 2188 2189 SDA QIT
- 72 044115
F8X-38 C2 2227 2228 NPK EWL
F8X-39 C2 2277 2278 FQN GKV
F8X-40 CT 2332 NA DLY NA
F8X-41 CT 2332 NA DLY NA
F8X-42 Al 3 4 ATR ATR
pSDOOOl A2 403 404
pSD0002 A2 599 600
pSD0021 N-конец 0 1
pSD0022 Al 32 33
pSD0023 Al 65 66
pSD0024 Al 81 82
pSD0025 Al 119 120
pSD0026 Al 211 212
pSD0027 Al 220 221
pSD0028 Al 224 225
pSD0029 Al 336 337
pSD0030 Al 339 340
pSD0031 A2 378 379
pSD0032 A2 399 400
pSD0033 A2 409 410
pSD0034 A2 416 417
pSD0035 A2 487 488
pSD0036 A2 494 495
pSD0037 A2 500 501
pSD0038 A2 603 604
pSD0039 A3 1656 1657
pSD0040 A3 1711 1712
pSD0041 A3 1725 1726
pSD0042 A3 1749 1750
pSD0043 A3 1905 1906
pSD0044 A3 1910 1911
pDS0062 A3 1900 1901
*Означает количество аминокислот зрелого белка FVIII
В одном варианте реализации изобретения один или более сайтов встраивания XTEN расположены в пределах одной или более соприкасаемой с поверхностью, гибкой петлевой структурой белка FVIII (например, доступная для встраивания петля). Например, по меньшей мере одна последовательность XTEN может быть встроена в каждый домен A FVIII, содержащий по меньшей мере две доступные для встраивания петли, в которые по меньшей мере один полипептид XTEN может быть встроен без устранения прокоагулирующей активности рекомбинантного белка, или способность рекомбинантных белков должна проявляться in vivo или in vitro в клетке хозяина. Доступные для встраивания петли являются областями, позволяющими встраивание по меньшей мере одной последовательности XTEN, характеризующиеся, среди прочих свойств, высокой доступностью поверхности или доступностью для растворителей и конформационной гибкостью. Домен А1 содержит доступную для встраивания петлю-1 (А1-1) область и доступную для встраивания петлю-2 (А1-2) область, домен А2 содержит доступную для встраивания петлю-1 (А2-1) область и доступную для встраивания петлю-2 (А2-2) область, домен A3 содержит доступную для встраивания петлю-1 (А3-1) область и доступную для встраивания петлю-2 (A3-2) область.
В одном аспекте первая доступная для встраивания петля в домене A1 FVIII (A1-1) располагается
- 73 044115 между бета-тяжем 1 и бета-тяжем 2, и вторая доступная для встраивания петля в домене А2 FVIII (A1-2) располагается между бета-тяжем 11 и бета-тяжем 12. Первая доступная для встраивания петля в домене А2 FVIII (A2-1) располагается между бета-тяжем 22 и бета-тяжем 23, и вторая доступная для встраивания петля в домене А2 FVIII (A2-2) располагается между бета-тяжем 32 и бета-тяжем 33. Первая доступная для встраивания петля в домене A3 FVIII (А3-1) располагается между бета-тяжем 38 и бета-тяжем 39, и вторая доступная для встраивания петля в домене A3 FVIII (A3-2) располагается между бета-тяжем 45 и бета-тяжем 46. В некоторых аспектах гибкая с подвижной поверхностью структура, содержащая А1-1 соответствует области в нативном зрелом FVIII человека от около аминокислоты 15 до около аминокислоты 45 в SEQ ID NO: 65, например, от около аминокислоты 18 до около аминокислоты 41 в SEQ ID NO: 65. В других аспектах гибкая структура, содержащая А1-2, соответствует области в нативном зрелом FVIII человека от около аминокислоты 201 до около аминокислоты 232 в SEQ ID NO: 65, например, от около аминокислоты 218 до около аминокислоты 229 в SEQ ID NO: 65. В еще одних аспектах гибкая с подвижной поверхностью структура, содержащая А2-1, соответствует области в нативном зрелом FVIII человека от около аминокислоты 395 до около аминокислоты 421 в SEQ ID NO: 65, например, от около аминокислоты 397 до около аминокислоты 418 в SEQ ID NO: 65. В еще одних вариантах реализации изобретения гибкая с подвижной поверхностью структура, содержащая А2-2, соответствует области в нативном зрелом FVIII человека от около аминокислоты 577 до около аминокислоты 635 в SEQ ID NO: 65, например, от около аминокислоты 595 до около аминокислоты 607 в SEQ ID NO: 65. В некоторых аспектах гибкая с подвижной поверхностью структура, содержащая А3-1, соответствует области в нативном зрелом FVIII человека от около аминокислоты 1705 до около аминокислоты 1732 в SEQ ID NO: 65, например, от около аминокислоты 1711 до около аминокислоты 1725 в SEQ ID NO: 65. В еще одних аспектах гибкая с подвижной поверхностью структура, содержащая A3-2, соответствует области в нативном зрелом FVIII человека от около аминокислоты 1884 до около аминокислоты 1917 в SEQ ID NO: 65, например, от около аминокислоты 1899 до около аминокислоты 1911 в SEQ ID NO: 65.
В другом варианте реализации изобретения одна или более аминокислота, в которую встроена по меньшей мере одна последовательность XTEN, расположена в пределах домена а3, например, аминокислоты 1649-1689 соответствующие полноразмерному зрелому полипептиду FVIII. В некоторых примерах, XTEN встраивается между аминокислотами 1656-1657, соответствующих SEQ ID NO: 65 (полноразмерный зрелый FVIII). В конкретном варианте реализации изобретения белок FVIII, содержащий последовательность XTEN, встроен непосредственно ниже аминокислоты 1656, соответствующей SEQ ID NO: 65 дополнительно содержит делецию от аминокислоты 745 до аминокислоты 1656, соответствующую SEQ ID NO: 65.
В некоторых вариантах реализации изобретения один или более сайты встраивания для одного или более встраивания XTEN расположены непосредственно ниже одной или более аминокислот, соответствующих полноразмерному зрелому FVIII человека, выбранных из группы, состоящей из: (1) аминокислота 3, (2) аминокислота 18, (3) аминокислота 22, (4) аминокислота 26, (5) аминокислота 32, (6) аминокислота 40, (7) аминокислота 60, (8) аминокислота 65, (9) аминокислота 81, (10) аминокислота 116, (11) аминокислота 119, (12) аминокислота 130, (13) аминокислота 188, (14) аминокислота 211, (15) аминокислота 216, (16) аминокислота 220, (17) аминокислота 224, (18) аминокислота 230, (19) аминокислота 333, (20) аминокислота 336, (21) аминокислота 339, (22) аминокислота 375, (23) аминокислота 399, (24) аминокислота 403, (25) аминокислота 409, (26) аминокислота 416, (26) аминокислота 442, (28) аминокислота 487, (29) аминокислота 490, (30) аминокислота 494, (31) аминокислота 500, (32) аминокислота 518, (33) аминокислота 599, (34) аминокислота 603, (35) аминокислота 713, (36) аминокислота 745, (37) аминокислота 1656, (38) аминокислота 1711, (39) аминокислота 1720, (40) аминокислота 1725, (41) аминокислота 1749, (42) аминокислота 1796, (43) аминокислота 1802, (44) аминокислота 1827, (45) аминокислота 1861, (46) аминокислота 1896, (47) аминокислота 1900, (48) аминокислота 1904, (49) аминокислота 1905, (50) аминокислота 1910, (51) аминокислота 1937, (52) аминокислота 2019, (53) аминокислота 2068, (54) аминокислота 2111, (55) аминокислота 2120, (56) аминокислота 2171, (57) аминокислота 2188, (58) аминокислота 2227, (59) аминокислота 2277, и (60) два или более их сочетания.
В одном варианте реализации изобретения белок FVIII, пригодный для использования в настоящем изобретении, содержит две последовательности XTEN, первая последовательность XTEN встроена в первый сайт встраивания XTEN, и вторая XTEN встроена во второй сайт встраивания XTEN. He ограничивающие примеры первого сайта встраивания XTEN и второго сайта встраивания XTEN перечислены в табл. 11.
- 74 044115
Таблица 11
Типовые сайты встраивания для двух XTEN
Встраив Сайт встраивания 745 26 40 ание 1 Домен В А1 А1 Встраи Сайт встраивания 2332 403 403 вание 2 Домен СТ А2 А2
18 А1 403 А2
26 А1 599 А2
40 А1 599 А2
18 А1 599 А2
1720 АЗ 1900 АЗ
1725 АЗ 1900 АЗ
1711 АЗ 1905 АЗ
1720 АЗ 1905 АЗ
1725 АЗ 1905 АЗ
1656 АЗ 26 А1
1656 АЗ 18 А1
1656 АЗ 40 А1
1656 АЗ 399 А2
1656 АЗ 403 А2
1656 АЗ 1725 АЗ
1656 АЗ 1720 АЗ
1900 АЗ 18 А1
1900 АЗ 26 А1
1900 АЗ 40 А1
1905 АЗ 18 А1
1905 АЗ 40 А1
1905 АЗ 26 А1
1910 АЗ 26 А1
18 А1 399 А2
26 А1 399 А2
40 А1 399 А2
18 А1 403 А2
1656 АЗ 1900 АЗ
1656 АЗ 1905 АЗ
1711 АЗ 40 А1
1711 АЗ 26 А1
1720 АЗ 26 А1
- 75 044115
1720 АЗ 40 А1
1720 АЗ 18 А1
1725 АЗ 26 А1
1725 АЗ 40 А1
1725 АЗ 18 А1
1720 АЗ 403 А2
1720 АЗ 399 А2
1711 АЗ 403 А2
1720 АЗ 403 А2
1725 АЗ 403 А2
1725 АЗ 399 А2
1711 АЗ 403 А2
1900 АЗ 399 А2
1900 АЗ 403 А2
1905 АЗ 403 А2
1905 АЗ 399 А2
1910 АЗ 403 А2
Две XTEN, встроенные или связанные с белком FVIII, могут быть одинаковыми или различными. В некоторых вариантах реализации изобретения белок FVIII, пригодный для использования в настоящем изобретении, содержит две последовательности XTEN, встроенные в белок FVIII, первую последовательность XTEN встроенную непосредственно ниже аминокислоты 745, соответствующие SEQ ID NO: 65, и вторую последовательность XTEN, встроенную непосредственно ниже аминокислоты 2332, соответствующей SEQ ID NO: 65 (С-конец). В другом варианте реализации изобретения первая последовательность XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 18, 26, 40, 1656 или 1720, соответствующей SEQ ID NO: 65, и вторая последовательность XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 403, соответствующей SEQ ID NO: 65. В еще одних вариантах реализации изобретения первая последовательность XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 18, 26 или 40, соответствующей SEQ ID NO: 65, и вторая последовательность XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 599, соответствующей SEQ ID NO: 65. В еще одних вариантах реализации изобретения первая последовательность XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 1656, соответствующей SEQ ID NO: 65, и вторая последовательность XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 18, 26, 40, 399, 403, 1725, 1720, 1900, 1905 или 2332, соответствующей SEQ ID NO: 65. В определенных вариантах реализации изобретения первая последовательность XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 1900, соответствующей SEQ ID NO: 65, и вторая последовательность XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 18, 26 или 40, соответствующей SEQ ID NO: 65. В некоторых вариантах реализации изобретения первая последовательность XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 18, 26 или 40, соответствующей SEQ ID NO: 65, и вторая последовательность XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 399, соответствующей SEQ ID NO: 65. В других вариантах реализации изобретения первая последовательность XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 1720, соответствующей SEQ ID NO: 65, и вторая последовательность XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 18, 26 или 40, соответствующей SEQ ID NO: 65. В еще одних вариантах реализации изобретения первая последовательность XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 1720, соответствующей SEQ ID NO: 65, и вторая последовательность XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 18, соответствующей SEQ ID NO: 65. В конкретном варианте реализации изобретения белок FVIII, содержащий последовательность XTEN, первая последовательность XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 745, соответствующей SEQ ID NO: 65, и вторая последовательность XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 2332, соответствующей SEQ ID NO: 65, в которой белок FVIII дополнительно содержит делецию от аминокислоты 745, соответствующую SEQ ID NO: 65 до аминокислоты 1685, соответствующей SEQ ID NO: 65, мутация или замена аминокислоты 1680, соответствующей SEQ ID NO: 65, например, Y1680F мутация или замена аминокислоты 1648, соответствующей SEQ ID NO: 65, например, R1648A или по меньшей мере две мутации или замены аминокислоты 1648, соответствующей SEQ ID NO: 65, например, R1648A, и аминокислота 1680, соответствующая SEQ ID NO: 65, например, Y1680F. В конкретном варианте реализации изобретения белок FVIII содержит две последовательности XTEN, первая последовательность XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 1656, соответствующей SEQ ID NO: 65, и вторая последовательность XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 2332, соответствующей SEQ ID NO: 65, в которой белок FVIII дополнительно содержит делецию от аминокислоты 745 до аминокислоты 1656, соответствующую SEQ ID NO: 65.
-76044115
В определенных вариантах реализации изобретения белок FVIII содержит три последовательности XTEN, первая последовательность XTEN встроена в первый сайт встраивания XTEN, вторая последовательность XTEN встроена во второй сайт встраивания XTEN, и третья последовательность XTEN встроена в третий сайт встраивания XTEN. Первая, вторая или третья последовательности XTEN могут быть одинаковыми или различными. Первый, второй и третий сайты встраивания могут быть выбраны из группы, включающей любой из сайтов встраивания, раскрытых в данном документе. В некоторых вариантах реализации изобретения белок FVIII, содержащий три последовательности XTEN, может дополнительно нести мутацию или замену, например, аминокислоту 1648, соответствующую SEQ ID NO: 65, например, R1648A. Например, не ограничивающие примеры первого, второго и третьего сайтов встраивания XTEN перечислены в табл. 12.
Таблица 12
Типовые сайты встраивания для трех XTEN
Встраивание 1 Встраивание 2 Встраивание 3
Сайт встраивани я Домен Сайт встраивани я Домен Сайт встраивания Домен
26 А1 403 А2 1656 АЗ
26 А1 403 А2 1720 АЗ
26 А1 403 А2 1900 АЗ
26 А1 1656 АЗ 1720 АЗ
26 А1 1656 АЗ 1900 АЗ
26 А1 1720 АЗ 1900 АЗ
403 А2 1656 АЗ 1720 АЗ
403 А2 1656 АЗ 1900 АЗ
403 А2 1720 АЗ 1900 АЗ
1656 АЗ 1720 АЗ 1900 АЗ
745 В 1900 2332
18 А1 745 В 2332 СТ
26 А1 745 В 2332 ст
40 А1 745 в 2332 ст
18 А1 745 в 2332 ст
40 А1 745 в 2332 ст
403 А2 745 в 2332 ст
399 А2 745 в 2332 ст
1725 АЗ 745 в 2332 ст
1720 АЗ 745 в 2332 ст
1711 АЗ 745 в 2332 ст
1900 АЗ 745 в 2332 ст
1905 АЗ 745 в 2332 ст
1910 АЗ 745 в 2332 ст
В некоторых вариантах реализации изобретения белок FVIII содержит три последовательности XTEN, первая последовательность XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 26, соответствующей SEQ ID NO: 65, вторая последовательность XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 403, соответствующей SEQ ID NO: 65, и третья последовательность XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 1656, 1720 или 1900, соответствующей SEQ ID NO: 65. В других вариантах реализации изобретения первая последовательность XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 26, соответствующей SEQ ID NO: 65, вторая последовательность XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 1656, соответствующей SEQ ID NO: 65, и третья последовательность XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 1720 или 1900, соответствующей SEQ ID NO: 65. В еще одних вари
- 77 044115 антах реализации изобретения первая последовательность XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 26, соответствующей SEQ ID NO: 65, вторая последовательность XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 1720, соответствующей SEQ ID NO: 65, и третья последовательность XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 1900, соответствующей SEQ ID NO: 65. В еще одних вариантах реализации изобретения первая последовательность XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 403, соответствующей SEQ ID NO: 65, вторая последовательность XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 1656, соответствующей SEQ ID NO: 65, и третья последовательность XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 1720 или 1900, соответствующей SEQ ID NO: 65. В других вариантах реализации изобретения первая последовательность XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 403 или 1656, соответствующей SEQ ID NO: 65, вторая последовательность XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 1720, соответствующей SEQ ID NO: 65, и третья последовательность XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 1900, соответствующей SEQ ID NO: 65. В других вариантах реализации изобретения первая последовательность XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 18, 26, 40, 399, 403, 1711, 1720, 1725, 1900, 1905 или 1910, соответствующей SEQ ID NO: 65, вторая последовательность XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 745, соответствующей SEQ ID NO: 65, и третья последовательность XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 2332, соответствующей SEQ ID NO: 65.
В других вариантах реализации изобретения белок FVIII содержит четыре последовательности XTEN, первая последовательность XTEN встроена в первый сайт встраивания XTEN, вторая последовательность XTEN встроена во второй сайт встраивания XTEN, третья последовательность XTEN встроена в третий сайт встраивания XTEN, и четвертая последовательность XTEN встроена в четвертый сайт встраивания XTEN. Первая, вторая, третья или четвертая последовательности XTEN могут быть одинаковыми, различными или их комбинации. В некоторых вариантах реализации изобретения белок FVIII, содержащий четыре последовательности XTEN, может дополнительно нести мутация или замену, например, аминокислоту 1648, соответствующую SEQ ID NO: 65, например, R1648A. Не ограничивающие примеры первого, второго, третьего и четвертого сайтов встраивания XTEN перечислены в табл. 12.
Таблица 13
Типовые сайты встраивания для четырех XTEN
Встраивание 1 Встраивание 2 Встраивание 3 Встраивание 4
Сайт встраивания Домен Сайт встраивания Домен Сайт встраивания Домен Сайт встраивания Домен
26 А1 403 А2 1656 аЗ 1720 АЗ
26 А1 403 А2 1656 аЗ 1900 АЗ
26 А1 403 А2 1720 АЗ 1900 АЗ
26 А1 1656 аЗ 1720 АЗ 1900 АЗ
403 А2 1656 аЗ 1720 АЗ 1900 АЗ
0040 А1 0403 А2 745 В 2332 СТ
0040 А1 0403 А2 745 В 2332 ст
0018 А1 0409 А2 745 в 2332 ст
0040 А1 0409 А2 745 в 2332 ст
0040 А1 0409 А2 745 в 2332 ст
- 78 044115
0018 Al 0409 A2 745 В 2332 СТ
0040 Al 1720 A3 745 В 2332 ст
0026 Al 1720 A3 745 В 2332 ст
0018 Al 1720 A3 745 в 2332 ст
0018 Al 1720 A3 745 в 2332 ст
0018 Al 1720 A3 745 в 2332 ст
0026 Al 1720 A3 745 в 2332 ст
0018 Al 1720 A3 745 в 2332 ст
0018 Al 1900 A3 745 в 2332 ст
0018 Al 1900 A3 745 в 2332 ст
0026 Al 1900 A3 745 в 2332 ст
0040 Al 1900 A3 745 в 2332 ст
0040 Al 1905 A3 745 в 2332 ст
0018 Al 1905 A3 745 в 2332 ст
0040 Al 1905 A3 745 в 2332 ст
0026 Al 1905 A3 745 в 2332 ст
0018 Al 1905 A3 745 в 2332 ст
0018 Al 1905 A3 745 в 2332 ст
0018 Al 1910 A3 745 в 2332 ст
0018 Al 1910 A3 745 в 2332 ст
0040 Al 1910 A3 745 в 2332 ст
0026 Al 1910 A3 745 в 2332 ст
0018 Al 1910 A3 745 в 2332 ст
0026 Al 1910 A3 745 в 2332 ст
0040 Al 1910 A3 745 в 2332 ст
0018 Al 1910 A3 745 в 2332 ст
0409 A2 1720 A3 745 в 2332 ст
0403 A2 1720 A3 745 в 2332 ст
0409 A2 1720 A3 745 в 2332 ст
0403 A2 1720 A3 745 в 2332 ст
- 79 044115
0403 А2 1720 АЗ 745 В 2332 СТ
0403 А2 1900 АЗ 745 В 2332 ст
0403 А2 1900 АЗ 745 В 2332 ст
0409 А2 1900 АЗ 745 в 2332 ст
0403 А2 1900 АЗ 745 в 2332 ст
0403 А2 1900 АЗ 745 в 2332 ст
0409 А2 1900 АЗ 745 в 2332 ст
0409 А2 1905 АЗ 745 в 2332 ст
0403 А2 1905 АЗ 745 в 2332 ст
0403 А2 1905 АЗ 745 в 2332 ст
0403 А2 1905 АЗ 745 в 2332 ст
0409 А2 1905 АЗ 745 в 2332 ст
0403 А2 1905 АЗ 745 в 2332 ст
0409 А2 1910 АЗ 745 в 2332 ст
0403 А2 1910 АЗ 745 в 2332 ст
0403 А2 1910 АЗ 745 в 2332 ст
0403 А2 1910 АЗ 745 в 2332 ст
0403 А2 1910 АЗ 745 в 2332 ст
1720 АЗ 1900 АЗ 745 в 2332 ст
1720 АЗ 1905 АЗ 745 в 2332 ст
1720 АЗ 1910 АЗ 745 в 2332 ст
1720 АЗ 1910 АЗ 745 в 2332 ст
0403 А2 1656 аЗ 1720 АЗ 2332 ст
0403 А2 1656 аЗ 1900 АЗ 2332 ст
0403 А2 1720 АЗ 1900 АЗ 2332 ст
1656 аЗ 1720 АЗ 1900 АЗ 2332 ст
0018 А1 0403 А2 1656 аЗ 2332 ст
0018 А1 0403 А2 1720 АЗ 2332 ст
0018 А1 0403 А2 1900 АЗ 2332 ст
0018 А1 1656 аЗ 1720 АЗ 2332 ст
0018 А1 1656 аЗ 1900 АЗ 2332 ст
0018 А1 1720 АЗ 1900 АЗ 2332 ст
0018 А1 0403 А2 0745 В 2332 ст
0018 А1 0745 В 1720 АЗ 2332 ст
0018 А1 0745 В 1900 АЗ 2332 ст
0403 А2 0745 В 1720 АЗ 2332 ст
0403 А2 0745 в 1900 АЗ 2332 ст
0745 В 1720 АЗ 1900 АЗ 2332 ст
0188 А1 1900 АЗ 0745 В 2332 ст
0599 1900 АЗ 0745 В 2332 ст
2068 1900 АЗ 0745 в 2332 ст
2171 1900 АЗ 0745 в 2332 ст
2227 1900 АЗ 0745 в 2332 ст
2277 1900 АЗ 0745 в 2332 ст
В других вариантах реализации изобретения белок FVIII содержит пять последовательностей
- 80 044115
XTEN, первая последовательность XTEN встроена в первый сайт встраивания XTEN, вторая последовательность XTEN встроена во второй сайт встраивания XTEN, третья последовательность XTEN встроена в третий сайт встраивания XTEN, четвертая последовательность XTEN встроена в четвертый сайт встраивания XTEN, пятая последовательность XTEN встроена в пятый сайт встраивания XTEN. Первая, вторая, третья, четвертая или пятая последовательности XTEN могут быть одинаковыми, различными, или их комбинации. Не ограничивающие примеры первого, второго, третьего, четвертого и пятого сайтов встраивания XTEN перечислены в табл. 14.
Таблица 14
Типовые сайты встраивания для пяти XTEN
Встраивание XTEN 1 Встраивание XTEN 2 Встраивание XTEN3 Встраивание XTEN 4 Встраивание XTEN 5
0403 1656 1720 1900 2332
0018 0403 1656 1720 2332
0018 0403 1656 1900 2332
0018 0403 1720 1900 2332
0018 1656 1720 1900 2332
0018 0403 0745 1720 2332
0018 0403 0745 1900 2332
0018 0745 1720 1900 2332
0403 0745 1720 1900 2332
В определенных вариантах реализации изобретения белок FVIII содержит шесть последовательностей XTEN, первая последовательность XTEN встроена в первый сайт встраивания XTEN, вторая последовательность XTEN встроена во второй сайт встраивания XTEN, третья последовательность XTEN встроена в третий сайт встраивания XTEN, четвертая последовательность XTEN встроена в четвертый сайт встраивания XTEN, пятая последовательность XTEN встроена в пятый сайт встраивания XTEN и шестая последовательность XTEN встроена в шестой сайт встраивания XTEN. Первая, вторая, третья, четвертая, пятая или шестая последовательности XTEN могут быть одинаковыми, различными, или их комбинации. Примеры шести сайтов встраивания XTEN включают, но не ограничиваются сайтами встраивания, перечисленных в табл. 15.
Таблица 15
Типовые XTEN сайты встраивания для шести XTEN
Встраивай ие XTEN 1 Встраивай ие XTEN 2 Встраивани е XTEN 3 Встраивани е XTEN 4 Встраивание XTEN 5 Встраивание XTEN 5
0018 0403 1656 1720 1900 2332
0018 0403 0745 1720 1900 2332
В конкретном примере первая последовательность XTEN встраивается между аминокислотами, соответствующими аминокислотам 26 и 27 последовательности SEQ ID NO: 65, и вторая последовательность XTEN встраивается между аминокислотами, соответствующими аминокислотам 1720 и 1721 последовательности SEQ ID NO: 65 (полноразмерный зрелый FVIII). В другом примере, первая XTEN встраивается между аминокислотами 403 и 404, соответствующих SEQ ID NO: 65, и вторая последовательность XTEN встраивается между аминокислотами, соответствующими аминокислотам 1720 и 1721 последовательности SEQ ID NO: 65. В некоторых примерах, первая XTEN встраивается между аминокислотами 1656 и 1657, соответствующих SEQ ID NO: 65, и вторая последовательность XTEN встраивается между аминокислотами, соответствующими аминокислотам 1720 и 1721 последовательности SEQ ID NO: 65. В других примерах, первая XTEN встраивается между аминокислотами 26 и 27, соответствующих SEQ ID NO: 65, вторая XTEN встраивается между аминокислотами 1656 и 1657, соответствующих SEQ ID NO: 65, и третья XTEN встраивается между аминокислотами 1720 и 1721, соответствующих SEQ ID NO: 65. В еще одних вариантах реализации изобретения первая XTEN встраивается между аминокислотами 403 и 404, соответствующих SEQ ID NO: 65, вторая XTEN встраивается между аминокислотами 1656 и 1657, соответствующих SEQ ID NO: 65, и третья XTEN встраивается между аминокислотами 1720 и 1721, соответствующих SEQ ID NO: 65. В еще одних вариантах реализации изобретения, первая XTEN встраивается между аминокислотами 403 и 404, соответствующих SEQ ID NO: 65, вторая XTEN встраивается между аминокислотами 1656 и 1657, соответствующих SEQ ID NO: 65, и третья XTEN встраивается между аминокислотами 1720 и 1721, соответствующих SEQ ID NO: 65. В некоторых вариантах реализации изобретения первая XTEN встраивается между аминокислотами 26 и 27, соответствующих SEQ ID NO: 65, вторая XTEN встраивается между аминокислотами 1720 и 1721, соответст
- 81 044115 вующих SEQ ID NO: 65, и третья XTEN встраивается между аминокислотами 1900 и 1901, соответствующих SEQ ID NO: 65. В некоторых вариантах реализации изобретения первая XTEN встраивается между аминокислотами 26 и 27, соответствующих SEQ ID NO: 65, вторая XTEN встраивается между аминокислотами 1656 и 1657, соответствующих SEQ ID NO: 65, третья XTEN встраивается между аминокислотами 1720 и 1721, соответствующих SEQ ID NO: 65, и четвертая XTEN встраивается между аминокислотами 1900 и 1901, соответствующих SEQ ID NO: 65.
В конкретных вариантах реализации изобретения последовательность XTEN встраивается между аминокислотами 745-746 полноразмерного фактора VIII или соответствующий сайт встраивания фактора VIII с удаленным доменом В.
В некоторых вариантах реализации изобретения, химерный белок данного изобретения содержит две полипептидные последовательности, первая полипептидная последовательность, содержащая аминокислотную последовательность по меньшей мере на около 80%, 90%, 95% или 100% идентичную последовательности, выбранной из
FVIII-161 (SEQ ID NO: 69), FVIII-169 (SEQ Ш NO: 70), FVIII-170 (SEQ ID
NO: 71), FVni-173 (SEQ ID NO: 72); FVIII-195 (SEQ ID NO: 73); FVIII-196 (SEQ ID NO:
74), FVIII199 (SEQ ID NO: 75), FVIII-201 (SEQ ID NO: 76); FVIII-203 (SEQ ID NO: 77), FVin-204 (SEQ ID NO: 78), FVIII-205 (SEQ ID NO: 79), FVIII-266 (SEQ ID NO: 80), FVIII267 (SEQ ID NO: 81), FVIII-268 (SEQ ID NO: 82), FVIII-269 (SEQ ID NO: 83), FVIII-271 (SEQ ID NO: 84) или FVIII-272 (SEQ ID NO: 85), и вторую полипептидную последовательность, содержащую аминокислотную последовательность по меньшей мере на около 80%, 90%, 95% или 100% идентичную последовательности, выбранной из ФВ031 (SEQ ID NO: 86), ФВ034 (SEQ ID NO: 87), или ФВ-036.
II.D. Константная область ИГ или ее часть.
Химерный белок по данному изобретению также включает в себя две константные области ИГ или их части, первая константная область ИГ или ее часть слита с белком FVIII посредством необязательного линкера, и вторая константная область ИГ или ее часть слита с белком ФВ посредством последовательности XTEN, имеющей менее 288 аминокислот. Константная область ИГ или ее часть может улучшить фармакокинетические или фармакодинамические свойства химерного белка в комбинации с последовательностью XTEN и белком ФВ. В определенных вариантах реализации изобретения первая константная область ИГ или ее часть продлевает период полувыведения молекулы, слитой с константной областью ИГ или ее частью.
Константная область ИГ состоит из доменов, обозначенных как СН (постоянный тяжелый) домены (CH1, CH2 и т.д.). В зависимости от изотипа, (т.е. IgG, IgM, IgA, IgD или IgE), константная область может состоять из трех или четырех доменов СН. Некоторые изотипы (например, IgG) константные области также содержат шарнирную область. See Janeway et al., 2001 год, Immunobiology, Garland Publishing, Нью-Йорк, штат Нью-Йорк
Константная область ИГ или ее часть для получения химерного белка по данному изобретению может быть получена из нескольких различных источников. В некоторых вариантах реализации изобретения константную область ИГ или ее часть получают из ИГ человека. Однако предполагается, что константная область ИГ или ее часть может быть получена из ИГ других видов млекопитающих, включая, например, виды грызунов (например, мышь, крыса, кролик, морская свинка), или виды низших приматов (например, шимпанзе, макака). Кроме того, константная область ИГ или ее часть может быть получена из любого класса ИГ, включая IgM, IgG, IgD, IgA и IgE, и любого изотипа ИГ, в том числе, IgG, IgG2, IgG3 и IgG4. В одном варианте реализации изобретения используется IgG1 человека.
Разнообразие последовательностей генов константной области ИГ (например, последовательности генов константной области человека) являются доступными в открытых для общественности источниках. Последовательности доменов константной области могут быть выбраны таким образом, чтобы они обладали определенной эффекторной функцией (или чтобы эффекторная функция отсутствовала) или определенной модификацией для снижения иммуногенности. Были опубликованы многие последовательности антител и генов, кодирующих антитела, и подходящие последовательности константной области ИГ (например, шарнирная, CH2 и/или CH3 последовательности или их части) могут быть получены из этих последовательностей с использованием методов, известных в данной области техники. Генетический материал, полученный с использованием любого из вышеописанных способов, затем может быть изменен или синтезирован для получения полипептидов по данному изобретению. Следует также иметь в виду, что рамки настоящего изобретения охватывают аллели, варианты и мутации последовательностей ДНК константной области.
Последовательности константной области ИГ или ее части могут быть клонированы, например, с помощью полимеразной цепной реакции и праймеров, которые выбраны для амплификации домена интереса. Для клонирования последовательности константной области ИГ или ее части из антитела мРНК может быть выделена из гибридомы, селезенки или лимфатических клеток, посредством обратной транс
- 82 044115 крипции транскрибирована в ДНК, и гены антител амплифицированы с помощью ПЦР. Методы ПЦР амплификации описаны подробно в патентах США № 4,683,195; 4,683,202; 4,800,159; 4,965,188; и, например, в PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications Innis et al., изд., Academic Press, СанДиего, штат Калифорния (1990 год); Но et al., 1989 год. Gene 77:51; Horton et al., 1993. Methods Enzymol. 217:270). ПЦР может быть инициирована посредством консенсусных праймеров к константной области или более специфическими праймерами на основе опубликованных ДНК и аминокислотных последовательностей тяжелой и легкой цепи. Как было рассмотрено выше, ПЦР также может быть использована для выделения ДНК клонов, кодирующих легкие и тяжелые цепи антител. В этом случае библиотеки могут быть подвергнуты скринингу с помощью консенсусных праймеров или больших гомологичных зондов, таких как зонды константных областей мыши. Многочисленные наборы праймеров, пригодных для амплификации генов антител, известны в данной области техники (например, 5' праймеры на основе Nконцевой последовательности очищенных антител (Benhar и Pastan. 1994 год. Protein Engineering 7:1509); быстрая амплификация концов кДНК (Ruberti, F. et al., 1994 год. J. Immunol. Methods 173:33); лидерные последовательности антител (Larrick et al., 1989 год Biochem. Biophys. Res. Commun. 160:1250). Клонирование последовательностей антител дополнительно описано в Newman et al., Патент США № 5,658,570, поданный 25 января 1995 года, которая включена в настоящий документ посредством ссылки.
Константная область ИГ, используемая в данном документе, может включать все домены и шарнирною область или ее часть. В одном варианте реализации изобретения константная область ИГ или ее часть содержит домен CH2, домен CH3 и шарнирную область, т.е. фрагмент Fc или партнер по связыванию FcRn.
В данном контексте термин фрагмент Fc определяется как часть полипептида, который соответствует фрагменту Fc нативного ИГ, т.е. как образованный посредством димерной ассоциации соответствующих доменов Fc двух его тяжелых цепей. Нативный фрагмент Fc образует гомодимер с другим фрагментом Fc. В противоположность этому, термин генетически слитый фрагмент Fc или одноцепочечный фрагмент Fc (фрагмент scFc) в данном контексте означает синтетический димерный фрагмент Fc, состоящий из доменов Fc, генетически связанных в одной полипептидной цепи (т.е. закодированных в одной непрерывной генетической последовательности).
В одном варианте реализации изобретения фрагмент Fc означает часть одной тяжелой цепи ИГ, начинающуюся в шарнирной области непосредственно перед сайтом расщепления папаином (т.е. остаток 216 в IgG, если принять остаток 114 за первый остаток константной области тяжелой цепи) и заканчивающуюся С-концом антитела. Соответственно, полный домен Fc, содержит по меньшей мере шарнирный домен, домен CH2 и домен CH3.
Фрагмент Fc константной области ИГ, в зависимости от изотипа ИГ может включать домены CH2, CH3 и СН4, а также шарнирную область. Химерные белки, содержащие фрагмент Fc ИГ предоставляют несколько желательных свойств химерному белку, включая повышенную стабильность, увеличение периода полувыведения в сыворотке (см. Capon и соавт, 1989 год, Nature 337:525) а также связывание с рецепторами Fc, таким как неонатальный рецептор Fc (FcRn) (патент США № 6,086,875, 6,485,726, 6,030,613; WO 03/077834; US2003-0235536A1), которые включены в данный документ посредством ссылки.
Константная область ИГ или ее часть может быть партнером по связыванию FcRn. FcRn проявляет активность во взрослых эпителиальных тканях и экспрессируется в просвете кишечника, дыхательных путях, назальных поверхностях, вагинальных поверхностях, толстой кишке и ректальных поверхностях (патент США № 6,485,726). Партнер по связыванию FcRn является частью ИГ, которая связывается с FcRn.
Рецептор FcRn был выделен из нескольких видов млекопитающих, включая человека. Последовательности FcRn человека, FcRn обезьяны, FcRn крысы, и FcRn мыши известны (Story et al., 1994, J. Exp. Med. 180:2377). Рецептор FcRn связывает IgG (но не другие классы ИГ, такие как IgA, IgM, IgD и IgE) при относительно низком значении pH, активно транспортирует IgG трансцеллюлярно от просвета к серозной оболочке, и затем высвобождает IgG при относительно высоком значении pH, которое характерно для интерстициальных жидкостей. Он экспрессируется в зрелой эпителиальной ткани (патенты США № 6,086,875, 6,485,726, 6,030,613; WO 03/077834; US2003-0235536 A1), включая легочный и кишечный эпителий (Israel et al., 1997 год, Immunology 92:69) проксимальный почечный тубулярный эпителий (Kobayashi et al., 2002 год, Am. J. Physiol. Renal Physiol. 282:F358), а также назальный эпителий, поверхности влагалища и поверхности желчных проток.
Партнеры по связыванию FcRn, пригодные к использованию в данном изобретении, включают молекулы, которые могут специфически связываются с рецептором FcRn, включая цельный IgG, фрагмент Fc из IgG и другие фрагменты, которые имеют полную область связывания рецептора FcRn. Область участка Fc IgG, которая связывается с рецептором FcRn была описана на основе рентгеновской кристаллографии (Burmeister et al., 1994 год, Nature 372:379). Основная площадь контакта Fc с FcRn находится рядом с местом соединения доменов CH2 и CH3. Все контакты Fc-FcRn находятся в пределах одной тяжелой цепи IgG. Партнеры по связыванию FcRn включают цельный IgG, фрагмент Fc из IgG и другие фрагменты IgG, которые имеют полную область связывания FcRn. Основные контактные сайты включают аминокислотные остатки 248, 250-257, 272, 285, 288, 290-291, 308-311 и 314 домена CH2 и аминокис- 83 044115 лотные остатки 385-387, 428 и 433-436 домена CH3. Все ссылки на нумерацию аминокислот иммуноглобулинов или фрагментов иммуноглобулинов, или областей иммуноглобулинов основаны на Kabat et al.,
1991 год, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Департамент общественного здравоохранения
США, Бетесда, штат Мэриленд.
Фрагмент Fc или партнер по связыванию FcRn, связанные с FcRn, могут эффективно перемещаться через эпителиальные барьеры посредством FcRn, таким образом, обеспечивая неинвазивные способы для системного введения желаемой терапевтической молекулы. Кроме того, слитые белки, содержащие фрагмент Fc или партнер по связыванию FcRn, подвергаются эндоцитозу клетками, экспрессирующими FcRn. Но вместо того, чтобы быть помеченными для деградации, эти слитые белки вновь возвращаются обратно в кровоток, тем самым увеличивая in vivo период полувыведения этих белков. В определенных вариантах реализации изобретения частями константных областей ИГ являются фрагмент Fc или партнер по связыванию FcRn, которые обычно ассоциируется с помощью дисульфидных связей и других неспецифических взаимодействий с другим фрагментом Fc или другим партнером по связыванию FcRn с образованием димеров и мультимеров высокого порядка.
Два рецептора FcRn могут связывать с одной молекулой Fc.
Кристаллографические данные свидетельствуют о том, что каждая молекула FcRn связывается с одним полипептидом в гомодимере Fc. В одном варианте реализации изобретения связывание партнера по связыванию FcRn, например, фрагмента Fc IgG с биологически активной молекулой обеспечивает средство доставки биологически активной молекулы перорально, буккально, сублингвально, ректально, вагинально, в форме аэрозоля назально или ингаляционно через легочный путь, или через глаза. В другом варианте реализации изобретения химерный белок может быть введен инвазивным способом, например, подкожно, внутривенно.
Партнер по связыванию FcRn представляет собой молекулу или ее часть, которая может специфически связывается с рецептором FcRn с последующей активной транспортировкой посредством рецептора FcRn фрагмента Fc. Специфически связанные означает две молекулы, образующие комплекс, проявляющий относительную стабильность в физиологических условиях. Специфическое связывание характеризуется высокой аффинностью и низкой или средней связывающей способностью, что отличается от неспецифического связывания, которое обычно имеет низкую аффинность и умеренную или высокую связывающую способность. Как правило, связывание считается специфическим, когда константа аффинности KA выше, чем 106 М-1, или выше чем 108 М-1. При необходимости, неспецифическое связывание может быть уменьшено без существенного влияния на специфическое связывание варьированием условий связывания. Соответствующие условия связывания, такие как концентрация молекул, ионная сила раствора, температуры, время, требуемое для связывания, концентрация блокирующего агента (например, сывороточный альбумин, молочный казеин) и т.д., могут быть оптимизированы специалистом в данной области техники с использованием обычных методов.
В некоторых вариантах реализации изобретения химерный белок по настоящему изобретению содержит один или более укороченных фрагментов Fc, которые, тем не менее, являются достаточными для придания рецептору Fc (FcR) связывающих свойств фрагменту Fc. Например, часть фрагмента Fc, который связывается с FcRn (т.е. связывающая часть FcRn) содержит от около 282-438 аминокислот IgG1, нумерация EU (первичные контактные сайты являются аминокислотами 248, 250-257, 272, 285, 288, 290291, 308-311, 314 домена CH2 и аминокислотные остатки 385-387, 428, 433-436 домена CH3. Таким образом, фрагмент Fc по настоящему изобретению может содержать или включать в себя связывающую часть FcRn. Связывающая часть FcRn может быть получена из тяжелых цепей любого изотипа, включая IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. В одном варианте реализации изобретения используется связывающая часть FcRn из антитела изотипа IgG1 человека. В другом варианте реализации изобретения используется связывающая часть FcRn из антитела изотипа IgG4 человека.
В другом варианте реализации изобретения фрагмент Fc включает в себя аминокислотную последовательность домена Fc или полученный из домена Fc. В некоторых вариантах реализации изобретения фрагмент Fc содержит по меньшей мере один(ну): шарнирную область (например, верхнюю, среднюю, и/или нижнюю шарнирную область), домен СН1 (около 216-230 аминокислот фрагмента Fc антитела в соответствии с нумерацией EU), домен CH2 (около 231-340 аминокислот фрагмента Fc антитела в соответствии с нумерацией EU), домен CH3 (около 341-438 аминокислот фрагмента Fc антитела в соответствии с нумерацией EU), домен СН4 или вариант, часть, или его фрагмент. В других вариантах реализации изобретения фрагмент Fc содержит полный домен Fc (т.е. шарнирный домен, домен CH2, и домен CH3) В некоторых вариантах реализации изобретения фрагмент Fc содержит, по существу состоит или состоит из шарнирного домена (или его части), слитого с доменом CH3 (или его частью), шарнирного домена (или его части), слитого с доменом CH2 (или его частью), домена CH2 (или его части), слитого с доменом CH3 (или его частью), домена CH2 (или его части), слитого как с шарнирным доменом (или его частью), так и с доменом CH3 (или его частью). В еще одних вариантах реализации изобретения домен Fc не имеет по меньшей мере части домена CH2 (например, целого или части домена CH2). В конкретном варианте реализации изобретения фрагмент Fc содержит или состоит из аминокислот, соответствующих номерам EU 221-447.
- 84 044115
Фрагменты Fc, обозначенные как F, F1 или F2 в данном документе, могут быть получены из нескольких различных источников. В одном варианте реализации изобретения полипептид фрагмента Fc получают из ИГ человека. Однако предполагается, что фрагмент Fc может быть получен из ИГ других видов млекопитающих, включая, например, виды грызунов (например, мышь, крыса, кролик, морская свинка), или виды низших приматов (например, шимпанзе, макака). Кроме того, полипептид доменов Fc или его частей может быть получена из любого класса ИГ, включая IgM, IgG, IgD, IgA и IgE, и любого изотипа ИГ, в том числе, IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. В другом варианте реализации изобретения используется изотип IgG1 человека.
В определенных вариантах реализации изобретения вариант Fc предоставляет изменение по меньшей мере одной эффекторной функции, которой наделен фрагмент Fc, содержащий указанный домен Fc дикого типа (например, улучшение или ухудшение способности фрагмента Fc к связыванию с рецепторами Fc (например FcyRI, FcyRII или FcyRIII) или белки комплемента (например C1q) или чтобы вызвать антитело-зависимую цитотоксичность (ADCC), фагоцитоз и комплемент-зависимую цитотоксичность (CDCC)). В других вариантах реализации изобретения вариант Fc содержит сконструированный остаток цистеина.
В фрагментах Fc настоящего изобретения могут использоваться принятые в данной области техники варианты Fc с известной способностью вызывать изменения (например, улучшение или ухудшение) эффекторной функции и/или FcR или FcRn связывания. В частности, связывающая молекула по данному изобретению может иметь, например, изменение (например, замену) одной или более аминокислотных позиций, описанных в международных публикациях
РСТ WO88/07089A1, WO96/14339A1, WO98/05787A1, WO98/23289A1, WO99/51642A1, WO99/58572A1, WO00/09560A2, WO00/32767A1, WO00/42072A2, WO02/44215A2, WO02/060919A2, WO03/074569A2, WO04/016750A2, WO04/029207A2, WO04/035752A2, WO04/063351A2, WO04/074455A2, WO04/099249A2, WO05/040217A2, WO04/044859, WO05/070963A1, WO05/077981A2, WO05/092925A2, WO05/123780A2, WO06/019447A1, WO06/047350A2 и WO06/085967A2; публикациях патентов США № US2007/0231329, US2007/0231329, US2007/0237765, US2007/0237766, US2007/0237767, US2007/0243188, US20070248603, US20070286859, US20080057056;
или патентах США 5,648,260; 5,739,277; 5,834,250; 5,869,046; 6,096,871; 6,121,022; 6,194,551; 6,242,195; 6,277,375; 6,528,624; 6,538,124; 6,737,056; 6,821,505; 6,998,253; 7,083,784; 7,404,956 и 7,317,091, каждый из которых включен в настоящее описание посредством ссылки. В одном варианте реализации изобретения специфическое изменение (например, специфическую замену одной или более аминокислот, описанных в данной области техники) может быть сделано в одной или более описанных аминокислотных позициях. В другом варианте реализации изобретения различные изменения в одной или более из описанных аминокислотных позиций (например, различные замены одной или более аминокислотной позиции, описанной в данной области техники), могут быть сделаны.
Фрагмент Fc или партнер по связыванию FcRn IgG может быть изменен в соответствии с хорошо известными процедурами, такими как сайт-направленный мутагенез и тому подобное, чтобы получить модифицированный IgG или фрагменты Fc, или их части, которые будут связываться с FcRn. Такие модификации включают модификации удаленных от FcRn сайтов контакта, а также модификации в сайтах контакта, которые сохраняют или даже усиливают связывание с FcRn. Например, следующие остатки одной аминокислоты в Fc IgG1 человека (Fcy1) могут быть заменены без существенной потери аффинности связывания Fc с FcRn:
Р238А, S239A, К246А,
К248А, D249A, М252А, Т256А, Е258А, Т260А, D265A, S267A, Н268А, Е269А, D270A, Е272А, L274A, N276A, Y278A, D280A, V282A, Е283А, Н285А, N286A, Т289А, К290А,
R292A, Е293А, Е294А, Q295A, Y296F, N297A, S298A, Y300F, R301A, V3O3A, V305A,
Т307А, L309A, Q311A, D312A, N315A, К317А, Е318А, К320А, К322А, S324A, К326А,
A327Q, Р329А, A33OQ, Р331А, ЕЗЗЗА, К334А, Т335А, S337A, К338А, К340А, Q342A,
R344A, Е345А, Q347A, R355A, Е356А, М358А, Т359А, К360А, N361A, Q362A, Y373A,
S375A, D376A, A378Q, Е38ОА, Е382А, S383A, N384A, Q386A, Е388А, N389A, N390A,
Y391F, К392А, L398A, S400A, D401A, D413A, К414А, R416A, Q418A, Q419A, N421A,
V422A, S424A, Е430А, N434A, Т437А, Q438A, К439А, S440A, S444A, и К447А, где, например, Р238А представляет замену пролина дикого типа на аланина в положении номер 238.
В качестве примера, конкретный вариант реализации изобретения включает в себя мутацию N297A, уда
- 85 044115 ляющую высококонсервативный сайт N-гликозилирования. В дополнение к аланину другие аминокислоты могут быть заменены на аминокислоты дикого типа в положениях, указанных выше. Мутации могут быть внесены в Fc по одной, приводя к образованию более ста фрагментов Fc, отличных от нативного Fc. Кроме того, комбинации из двух, трех или более этих отдельных мутаций могут быть введены вместе, приводя к образованию еще сотен фрагментов Fc. Более того, один из фрагментов Fc конструкции по данному изобретению может быть мутирован, и другой фрагмент Fc конструкции не мутирован вообще, или они оба могут быть мутированы, но иметь различные мутации.
Некоторые из указанных выше мутаций могут придавать новые функциональные возможности фрагменту Fc или партнеру по связыванию FcRn. Например, один вариант реализации изобретения включает в себя мутацию N297A, удаляющую высококонсервативный сайт N-гликозилирования Эффектом этой мутации является снижение иммуногенности, тем самым увеличивается период полувыведения из крови фрагмента Fc, и делает фрагмент Fc неспособным к связыванию с FcyRI, FcyRIIA, FcyRIIB, и FcyRIIIA, без ущерба для аффинности FcRn (Routledge et al., 1995, Transplantation 60:847; Friend et al., 1999, Transplantation 68:1632; Shields et al., 1995, J. Biol. Chem. 276:6591). В качестве еще одного примера новых функциональных возможностей, возникающих из-за мутаций, описанных выше, аффинность к FcRn может быть увеличена сверх уровня дикого типа в некоторых случаях. Эта повышенная аффиность может соответствовать увеличенной скорости ассоциации, уменьшенной скорости диссоциации или как увеличенной скорости ассоциации, так и уменьшенной скорости диссоциации. Примеры мутаций, которые, как полагают, придают повышенную аффинность к FcRn, включают, но не ограничиваются ими, Т256А, Т307А, Е380А и N434A (Shields et al., 2001 год, J. Biol. Chem. 276:6591).
Кроме того, по меньшей мере три гамма-рецепторов Fc человека, по-видимому, распознают сайт связывания на IgG в нижней шарнирной области, который, как правило, соответствует аминокислотам 234-237. Таким образом, еще один пример новых функциональных возможностей и потенциального снижения иммуногенности может возникнуть из-за мутаций в этой области, как, например, путем замены аминокислот 233-236 IgG1 человека ELLG в соответствующую последовательность из IgG2 PVA (с удалением одной аминокислоты). Как это было показано, что FcyRI, FcyRII, и FcyRIII, которые опосредуют различные эффекторные функции, не будут связываться с IgG1, когда введены такие мутации. Ward и Ghetie 1995 год, Therapeutic Immunology 2:77 и Armour et al., 1999 год, Eur. J. Immunol. 29:2613.
В одном варианте реализации изобретения константной областью ИГ или ее частью, например, фрагмент Fc, является полипептид, включающий последовательность PKNSSMISNTP (SEQ ID NO: 89 или SEQ ID NO: 3 патента США № 5,739,277) и в некоторых случаях дополнительно включающий в себя последовательность, выбранную из HQLGTQ (SEQ ID NO: 90), HQNLSDGK (SEQ ID NO: 91), HQNTSDGK (SEQ ID NO: 92), или V1SSHLGQ (SEQ ID NO: 93) (или SEQ ID NO: 11, 1, 2 и 31, соответственно из патента США № 5,739,277).
В другом варианте реализации изобретения константная область иммуноглобулина или ее часть содержит аминокислотную последовательность в шарнирной области или ее части, которая образует одну или более дисульфидных связей с другой константной областью иммуноглобулина или ее частью. Дисульфидная связи константной области иммуноглобулина или ее части соединяет первый полипептид, содержащий FVIII и второй полипептид, содержащий фрагмент ФВ, таким образом, что эндогенный ФВ не заменяет фрагмент ФВ и не связывается с FVIII. Таким образом, дисульфидная связь между первой константной области иммуноглобулина или ее частью и константной областью второго иммуноглобулина или ее частью предотвращает взаимодействие между эндогенным ФВ и белком FVIII. Ингибирование взаимодействия между ФВ и белком FVIII позволяет в два раза увеличить лимит периода полувыведения химерного белка. Шарнирная область или ее часть может быть дополнительно связана с одним или более доменами CH1, CH2, CH3, их фрагментами, а также любыми их сочетаниями. В конкретном варианте реализации изобретения константной областью ИГ или ее частью является шарнирная область и домен CH2.
В некоторых вариантах реализации изобретения константная область ИГ или ее часть является геми-гликозилированной. Например, химерный белок, содержащий два фрагмента Fc или партнера по связыванию FcRn, может содержать первый гликозилированный фрагмент Fc (например, гликозилированную область CH2), или партнер по связыванию FcRn и второй агликозилированный фрагмент Fc (например, агликозилированная область CH2) или партнер по связыванию FcRn. В одном варианте реализации изобретения линкер может быть размещен между гликозилированными и агликозилированными фрагментами Fc. В другом варианте реализации изобретения фрагмент Fc или связывающий партнер FcRn полностью гликозилируется, т.е. все фрагменты Fc гликозилированы. В других вариантах реализации изобретения фрагмент Fc может быть агликозилированным, т.е. ни один из фрагментов Fc не гликозилирован.
В некоторых вариантах реализации изобретения химерный белок по данному изобретению содержит аминокислотную замену в константной области ИГ или ее части (например, вариант Fc), которая изменяет антиген-независимые эффекторные функции константной области ИГ, в частности, период полувыведения белка из крови.
Такие белки демонстрируют увеличенную или сниженную способность к связыванию с FcRn по сравнению с белками, в которых отсутствуют эти замены и, следовательно, имеют увеличенный или
- 86 044115 уменьшенный период полувыведения в сыворотке крови, соответственно. Предполагается, что варианты Fc с улучшенной аффинностью к FcRn, имеют более продолжительный период полувыведения в сыворотке, и такие молекулы имеют полезное применение в способах лечения млекопитающих, когда желательным является продолжительный период полувыведения вводимого полипептида, например, для лечения хронического заболевания или расстройства (см., например, патенты США 7,348,004, 7,404,956 и 7,862,820). В отличие от этого, ожидается, что варианты Fc со сниженной аффинностью связывания с FcRn, имеют более короткие периоды полувыведения, и такие молекулы могут быть также использованы, например, для введения млекопитающему, когда сокращенное время пребывания в кровотоке может быть более предпочтительным, например, для диагностической визуализации в естественных условиях или в ситуациях, когда начальный полипептид имеет токсические побочные эффекты, если он присутствует в кровотоке в течение продолжительного периода времени. Также менее вероятной является способность вариантов Fc со сниженной аффинностью связывания с FcRn преодолевать плацентарный барьер и, таким образом, они также является полезными при лечении заболеваний или расстройств у беременных женщин. Кроме того, другие применения, в которых сниженная аффинность связывания с FcRn может быть необходимой, включают те применения, в которых необходима локализация в головном мозге, почках и/или печени. В одном типовом варианте реализации изобретения химерный белок по данному проявляет сниженную способность к прохождению через эпителий почечных клубочков из сосудистой системы. В другом варианте реализации изобретения химерный белок по данному изобретению проявляет сниженную способность к прохождению через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) из головного мозга в сосудистую систему. В одном варианте реализации изобретения белок с модифицированной способностью к связыванию с FcRn содержит по меньшей мере один фрагмент Fc или партнер по связыванию FcRn (например, один или два фрагмента Fc или партнера по связыванию FcRn), имеющий одну или более аминокислотных замен в пределах связывающей петли FcRn константной области ИГ. Связывающая петля FcRn состоит из аминокислотных остатков 280-299 (в соответствии с нумерацией EU) дикого типа, полноразмерного фрагмента Fc. В других вариантах реализации изобретения константная область ИГ или ее часть в химерном белке по данному изобретению, имеющая модифицированную аффинность связывания с FcRn содержит по меньшей мере один фрагмент Fc или связывающий партнер FcRn, имеющий одну или более аминокислотных замен в пределах 15 к зоны контакта FcRn. В данном контексте термин 15 к FcRn зона контакта включает остатки, занимающие следующие позиции в полноразмерном фрагменте Fc дикого типа: 243-261, 275-280, 282-293, 302-319, 336- 348, 367, 369, 372-389, 391, 393, 408, 424, 425-440 (нумерация EU). В других вариантах реализации изобретения константная область ИГ или ее часть по данному изобретению, имеющая модифицированную аффинность связывания с FcRn содержит по меньшей мере один фрагмент Fc или связывающий партнер FcRn, имеющий одну или более аминокислотных замен, соответствующих любой из следующих позиций EU: 256, 277-281, 283-288, 303-309, 313, 338, 342, 376, 381, 384, 385, 387, 434 (например, N434A или N434K), и 438. Типичные замены аминокислот, которые модифицируют связывающую активность с FcRn, описаны в международной публикации PCT № 05/047327, которая в полном объеме включена в данный документ посредством ссылки.
Фрагмент Fc или партнер по связыванию FcRn, используемый по данному изобретению, может также содержать известную в данной области техники аминокислотную замену, которая изменяет уровень гликозилирование химерного белка. Например, фрагмент Fc или партнер по связывания FcRn химерного белка, связанный с фрагментом ФВ или белком FVIII, может содержать фрагмент Fc, имеющий мутацию, что приводит к снижению уровня гликозилирования (например, N- или О-связанное гликозилирование) или может содержать модифицированную гликоформу фрагмента Fc дикого типа (например, низкий уровень фукозы или фукозо-свободного гликана).
В одном варианте реализации изобретения непроцессированный химерный белок по данному изобретению может содержать генетически слитый фрагмент Fc (например, фрагмент scFc), имеющих в его составе две или более константные области ИГ или ее части, независимо выбираемыми из константной области ИГ или ее части, описанной в данном документе. В одном варианте реализации изобретения фрагменты Fc димерных фрагментов Fc являются одним и тем же. В другом варианте реализации изобретения по меньшей мере два фрагмента Fc являются различными. Например, фрагмент Fc или партнер по связывания FcRn белков по данному изобретению содержат одинаковое количество аминокислотных остатков, или они могут отличаться по длине одного или более аминокислотных остатков (например, около 5 аминокислотных остатков (например, 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислотных остатков), около 10 остатков, около 15 остатков, около 20 остатков, около 30 остатков, около 40 остатков или около 50 остатков). В еще одних вариантах реализации изобретения фрагмент Fc или партнер по связыванию FcRn по данному изобретению могут отличаться по одной или более позиции в аминокислотной последовательности. Например, по меньшей мере, два из фрагмента Fc или партнера по связыванию FcRn могут отличаться по около 5 аминокислотным позициям (например, 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислотным позициям), около 10 позициям, около 15 позициям, около 20 позициям, около 30 позициям, около 40 позициям или около 50 позициям).
- 87 044115
II. E. Линкеры.
Химерный белок по данному изобретению дополнительно содержит один или более линкеров. Одним типом линкеров является расщепляемый линкер, который может быть расщеплен с помощью различных протеаз при введении субъекту в естественных условиях, например, в сайте коагуляции. В одном варианте реализации изобретения расщепляемый линкер позволяет отщепить фрагмент, например, белок ФВ, от последовательности XTEN, следовательно, от химерного белка в месте коагуляционного каскада, позволяя тем самым активированному FVIII (FVIIIa) проявлять свою FVIIIa активность. Другой тип линкера представляет собой процессируемый линкер, который содержит внутриклеточный сайт расщепления и, таким образом, может быть расщеплен с помощью процессингового внутриклеточного фермента в клетке-хозяине, что делает удобным процесс экспрессии полипептида и образование химерного белка.
Один или более линкеров могут находиться между любыми двумя белками в химерном белке. В одном варианте реализации изобретения химерный белок содержит первый полипептид, содержащий (I) белок FVIII и (II) первую константную область ИГ или ее часть и второй полипептид, содержащий (III) белок ФВ, (IV) линкер (например, расщепляемый линкер), (V) последовательность XTEN, и (VI) вторую константную область ИГ или ее часть. В другом варианте реализации изобретения химерный белок содержит первый полипептид, содержащий (I) белок FVIII и (II) первую константную область ИГ или ее часть и второй полипептид, содержащий (III) белок ФВ, (IV) последовательность XTEN, (V) линкер (например, расщепляемый линкер) и (VI) вторую константную область ИГ или ее часть. В других вариантах реализации изобретения химерный белок содержит первый полипептид, содержащий (I) белок FVIII и (II) первую константную область ИГ или ее часть и второй полипептид, содержащий (III) белок ФВ, (IV) первый линкер (например, расщепляемый линкер), (V) последовательность XTEN, (VI) второй линкер (например, расщепляемый линкер) и (VII) вторую константную область ИГ или ее часть. В определенных вариантах реализации изобретения первый полипептид дополнительно содержит линкер, например, расщепляемый линкер между белком FVIII и первой константной областью ИГ.
В некоторых вариантах реализации изобретения химерный белок содержит одну цепь, содержащую (I) белок FVIII, (II) первую константную область ИГ или ее часть, (III) линкер (например, процессируемый линкер), (IV) белок ФВ, (V) последовательность XTEN и (VI) вторую константную область ИГ или ее часть. В других вариантах реализации изобретения химерный белок содержит одну цепь, содержащую (I) белок FVIII, (II) первую константную область ИГ или ее часть, (III) первый линкер (например, процессируемый линкер), (IV) белок ФВ, (V) второй линкер (например, расщепляемый линкер), (VI) последовательность XTEN и (VII) вторую константную область ИГ или ее часть. Процессируемый линкер может быть процессирован после того, как химерный белок экспрессируется в клетке-хозяине; таким образом, химерный белок, продуцируемый в клетке-хозяине, может быть в окончательной форме, состоящей из двух или трех полипептидных цепей.
Линкер, пригодный к использованию в настоящем изобретении, может содержать органическую молекулу. В одном варианте реализации изобретения линкер содержит полимер, например, полиэтиленгликоль (ПЭГ) или гидроксиэтилкрахмал (ГЕК). В другом варианте реализации изобретения линкер содержит аминокислотную последовательность. Линкер может содержать по меньшей мере около 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400 ,500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900 или 2000 аминокислот. Линкер может содержать 1-5 аминокислот, 1-10 аминокислот, 1-20 аминокислот, 10-50 аминокислот, 50-100 аминокислот, 100-200 аминокислот, 200-300 аминокислот, 300-400 аминокислот, 400-500 аминокислот, 500-600 аминокислот, 600-700 аминокислот, 700-800 аминокислот, 800-900 аминокислот или 900-1000 аминокислот. В одном варианте реализации изобретения линкер содержит последовательность XTEN. Дополнительные примеры последовательностей XTEN могут быть использованы по данному изобретению и раскрыты в патентных публикациях США № 2010/0239554 A1, 2010/0323956 A1, 2011/0046060 A1, 2011/0046061 A1, 2011/0077199 A1 или 2011/0172146 A1, или международных патентных публикациях № WO 2010091122 Al, WO 2010144502 А2, WO 2010144508 A1, WO 2011028228 A1, WO 2011028229 A1, или WO 2011028344 А2. В другом варианте реализации изобретения линкер является последовательностью PAS.
В одном варианте реализации изобретения линкер является полимером, например, полиэтиленгликолем (ПЭГ) или гидроксиэтилкрахмалом (ГЕК). В другом варианте реализации изобретения линкер является аминокислотной последовательностью. Линкер может содержать по меньшей мере около 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400 ,500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900 или 2000 аминокислот. Линкер может содержать 1-5 аминокислот, 1-10 аминокислот, 1-20 аминокислот, 10-50 аминокислот, 50-100 аминокислот, 100-200 аминокислот, 200-300 аминокислот, 300-400 аминокислот, 400-500 аминокислот, 500-600 аминокислот, 600-700 аминокислот, 700-800 аминокислот, 800-900 аминокислот или 900-1000 аминокислот.
Примеры линкеров хорошо известны в данной области техники. В одном варианте реализации изобретения линкер содержит последовательность Gn. Линкер может содержать последовательность (GA)n. Линкер может содержать последовательность (GGS)n. В других вариантах реализации изобретения линкер содержит (GGGS)n (SEQ ID NO: 101). В еще одних вариантах реализации изобретения линкер содержит последовательность (GGS)n(GGGGS)n (SEQ ID NO: 95). В этих случаях n может быть целым числом
- 88 044115 от 1 до 100. В других случаях n может быть целым числом от 1 до 20, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,
11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20. Примеры линкеров включают, но не ограничиваются ими,
GGG, SGGSGGS (SEQ Ш NO: 96),
GGSGGSGGSGGSGGG (SEQ ID NO: 97), GGSGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 98), GGSGGSGGSGGSGGSGGS (SEQ ID NO: 99), или GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 100).
Линкер не устраняет или не уменьшает активность белка ФВ или свертывающую активность фактора VIII. В некоторых случаях линкер повышает активность белка ФВ или свертывающую активность белка фактора VIII, например, за счет дополнительного уменьшения эффекта стерического несоответствия и делает белок ФВ или часть фактора VIII более доступными для их целевого сайта связывания.
В одном варианте реализации изобретения линкер, полезный для химерного белка, имеет длину 1525 аминокислот. В другом варианте реализации изобретения линкер, полезный для химерного белка, имеет длину 15-20 аминокислот. В некоторых вариантах реализации изобретения линкер для химерного белка имеет длину 10-25 аминокислот. В другом варианте реализации изобретения линкер для химерного белка имеет длину 15 аминокислот. В еще одних вариантах реализации изобретения линкер для химерного белка является (GGGGS)n (SEQ ID NO: 94) где G представляет собой глицин, S представляет собой серии и N представляет собой целое число от 1 до 20.
II. F. Сайты расщепления
Расщепляемые линкеры могут включать в себя фрагмент, способный отщепляться либо химически (например, гидролиз эфирной связи), ферментативно (т.е. включение последовательности для расщепления протеазой) или фотолитически (например, хромофор, такой как 3-амино-3-(2-нитрофенил) пропионовая кислота (ANP)) для того, чтобы освободить одну молекула от другой.
В одном варианте реализации изобретения расщепляемый линкер содержит один или более расщепляемых сайтов на N-конце или С-конце, или обоих. В другом варианте реализации расщепляемый линкер по существу состоит или состоит из одного или более расщепляемых сайтов. В других вариантах реализации изобретения линкер содержит гетерологические линкерные аминокислотные последовательности, описанные в данном документе, или полимеры, и один или более расщепляемых сайтов.
В некоторых вариантах реализации изобретения расщепляемый линкер содержит один или более сайтов расщепления, которые могут быть расщеплены в клетке-хозяине (т.е. внутриклеточные процессинговые сайты). Неограничивающие примеры сайтов расщепления включают: RRRR (SEQ ID NO: 102), RKRRKR (SEQ ID NO: ЮЗ) и RRRRS (SEQ ID NO: 104).
В некоторых вариантах реализации изобретения расщепляемый линкер содержит область a1 FVIII, область а2 FVIII, область a3 FVIII, сайт расщепления тромбином, который содержит X-V-P-R (SEQ ID NO: 105) и мотив взаимодействия с экзосайтом PAR1, в котором X представляет собой алифатическую аминокислоту или любые их комбинации, содержит область а2, содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере около на 80%, около на 85%, около на 90%, около на 95% или на 100% идентичную последовательности от Glu720 до Arg740, соответствующего полноразмерного FVIII, в котором область а2 способна расщепляться тромбином. В конкретном варианте реализации изобретения расщепляемый линкер, полезный по данному изобретению, содержит две области а2, содержащие ISDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 106).
В других вариантах реализации изобретения расщепляемый линкер по данному изобретению содержит область a1, содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере около на 80%, около на 85%, около на 90%, около на 95% или на 100% идентичную последовательности от Met337 до Arg372, соответствующего полноразмерного FVIII, в котором область a1 способна расщепляться тромбином. В конкретном варианте реализации изобретения область a1, содержит ISMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSV (SEQ ID NO: 107).
В некоторых вариантах реализации изобретения расщепляемый линкер по данному изобретению содержит область а3, содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере около на 80%, около на 85%, около на 90%, около на 95% или на 100% идентичную последовательности от Glu1649 до Arg1689, соответствующего полноразмерного FVIII, в котором область a3 способна расщепляться тромбином. В конкретном варианте реализации изобретения расщепляемый линкер, полезный по данному изобретению, содержит две области а3, содержащие
ISDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 108).
В других вариантах реализации изобретения расщепляемый линкер содержит сайт расщепления тромбином, содержащий X-V-P-R (SEQ ID NO: 105) и мотив взаимодействия с экзосайтом PAR1, в котором мотив взаимодействия с экзосайтом PAR1 содержит S-F-L-L-R-N (SEQ ID NO: 109). Мотив взаимодействия с экзосайтом PAR1 может дополнительно содержать аминокислотную последовательность, выбранную из
- 89 044115
Ρ,
Ρ-Ν, P-N-D, P-N-D-K (SEQ ID NO: 110), P-N-D-K-Y (SEQ ID NO: 111), P-N-D-K-Y-E (SEQ ID NO: 112), P-N-D-K-Y-E-P (SEQ ID NO: 113), P-N-D-K-Y-E-P-F (SEQ ID NO: 114), P-ND-K-Y-E-P-F-W (SEQ ID NO: 115), P-N-D-K-Y-E-P-F-W-E (SEQ ID NO: 116), P-N-D-K-YE-P-F-W-E-D (SEQ ID NO: 117), P-N-D-K-Y-E-P-F-W-E-D-E (SEQ ID NO: 118), P-N-D-KY-E-P-F-W-E-D-E-E (SEQ ID NO: 119), P-N-D-K-Y-E-P-F-W-E-D-E-E-S (SEQ ID NO: 120) или любых их комбинации. В некоторых вариантах реалзизации изобретения алифатическая аминокислота выбирается из глицина, аланина, валина, лейцина или изолейцина.
В других вариантах реализации изобретения расщепляемый линкер содержит один или более сайтов расщепления, которые расщепляются посредством протеазы, после того, как химерный белок, содержащий расщепляемый линкер, вводят субъекту. В одном варианте реализации изобретения сайт расщепления поддается расщеплению протеазой, выбранной из гурппы, содержащей фактор XIa, фактор XIIa, калликреин, фактор VIIa, фактор IXa, фактор Ха, фактор IIa (тромбин), эластазу 2, ММР-12, ММР13, ММР-17 и ММР-20. В другом варианте реализации изобретения сайт расщепления выбирается из группы, содержащей сайт расщепления FXIa (например, KLTR^AET (SEQ ID NO: 121)), сайт расщепления FXIa (например, DFTR^VVG (SEQ ID NO: 122)), сайт расщепления FXIIa (например, TMTR^IVGG (SEQ ID NO: 123)), сайт расщепления калликреином (например, SPFR^STGG (SEQ ID NO: 124)), сайт расщепления FVIIa (например, LQVR^IVGG (SEQ ID NO: 125)), сайт расщепления FIXa (например, PLGR^IVGG (SEQ ID NO: 126)), сайт расщепления FXa (например, IEGR^TVGG (SEQ ID NO: 127)), сайт расщепления FIIa (тромбином) сайт расщепления (например, LTPR^SLLV (SEQ ID NO: 128)), сайт расщепления еластазой 2 (например, LGPVkSGVP (SEQ ID NO: 129)), сайт расщепления гранзимом В (например, VAGD^SLEE (SEQ ID NO: 130)), сайт расщепления ММР-12 (например, GPAG^LGGA (SEQ ID NO: 131)), сайт расщепления ММР-13 (например, GPAG^LRGA (SEQ ID NO: 132)), сайт расщепления ММР-17 (например, APLG^LRLR (SEQ ID NO: 133)), сайт расщепления ММР-20 (например, PALP^LVAQ (SEQ ID NO: 134)), сайт расщепления TEV (например, ENLYFQ^G (SEQ ID NO: 135)), сайт расщепления энтерокиназой (например, DDDK^IVGG (SEQ ID NO: 136)), сайт расщепления (PRESCISSION™) протеазой 3С (например, LEVLFQ^GP (SEQ ID NO: 137)), и сайт расщепления сортазой А (например, LPKT^GSES) (SEQ ID NO: 138). В некоторых вариантах реализации изобретения сайт расщепления FXIa включает, но не ограничивается ими, например, TQSFNDFTR (SEQ ID NO: 1) или SVSQTSKLTR (SEQ ID NO: 3).
Неограничивающие примеры сайтов расщепления тромбином включают, например, DFLAEGGGVR (SEQ ID
NO: 4), TTKIKPR (SEQ ID NO: 5), LVPRG (SEQ ID NO: 6), DKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 88), или IEPRSFS (SEQ ID NO: 194) и последовательность, содержащую, по существу состоящую из или состоящую из ALRPR (SEQ ID NO: 7) (например, ALRPRVVGGA (SEQ ID NO: 145)). В типовых вариантах реализации изобретения сайтом расщепления является последовательность
TLDPRSFLLRNPNDKYEPFWEDEEK (SEQ ID NO: 146). в другом варианте реализации изобретения сайт расщепления содержит
DKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ГО NO: 88) или ее фрагмент. В одном конкретном варианте реализации изобретения сайт расщепления содержит IEPRSFS (SEQ ID NO: 194). в другом варианте реализации изобретения сайт расщепления содержит EPRSFS (SEQ ID NO: 195), причем сайт расщепления не представляет собой полноразмерную область а2 белка FVIII. В еще одном варианте реализации изобретения сайт расщепления содержит IEPR (SEQ ID NO: 200). В другом варианте реализации изобретения сайт расщепления содержит IEPR (SEQ ID NO: 200), причем сайт расщепления не представляет собой полноразмерную область а2 белка FVIII или не содержит полноразмерную область а2 FVIII. В других вариантах реализации изобретения сайт расщепления содержит
- 90 044115
DKNTGDYYED SYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ГО NO
88), KNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 139),
NTGDYYEDSYEDISAYLLS KNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 140),
TGDYYEDSYEDISAYLLS KNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 141),
GDYYEDSYEDISAYLLS KNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 142),
DYYEDSYEDISAYLLS KNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 143),
YYEDSYEDISAYLLS KNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 144),
YEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 176), EDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 177), DSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 178), SYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 179), YEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 180), EDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 181), DISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 182), ISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 183), SAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 184), AYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 185), YLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 186), LLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 187), LSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 188), SKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 189), KNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 190), NNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 191), NAIEPRSFS (SEQ ID NO: 192), AIEPRSFS (SEQ ID NO: 193), или IEPRSFS (SEQ ID NO: 194).
В других вариантах реализации изобретения сайт расщепления содержит DKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ГО NO: 88),
KNTGDYYEDSYED ISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 139),
NTGDYYEDSYEDISAYLLS KNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 140),
TGDYYEDSYEDISAYLLS KNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 141),
GDYYEDSYEDISAYLLS KNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 142),
DYYEDSYEDISAYLLS KNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 143),
YYEDSYEDISAYLLS KNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 144),
YEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 176), EDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 177), DSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 178), SYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 179), YEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 180), EDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 181), DISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 182), ISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 183), SAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 184), AYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 185), YLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 186), LLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 187), LSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 188), SKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 189), KNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 190), NNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 191), NAIEPRSFS (SEQ ID NO: 192), AIEPRSFS (SEQ ID NO: 193), или IEPRSFS (SEQ ID NO: 194), причем сайт расщепления не представляет собой полноразмерную область а2 белка FVIII. В определенных вариантах реализации изобретения сайт расщепления поддается расщеплению в тесте на гидролиз тромбином, как предложено в настоящем документе или известно в данной области техники.
III. Полинуклеотиды, векторы и клетки-хозяева.
Также по данному изобретению приводится полинуклеотид, кодирующих химерный белок по данному изобретению. В одном варианте реализации изобретения первая полипептидная цепь и вторая полипептидная цепь могут быть закодированы с помощью одной полинуклеотидной цепи. В другом варианте реализации изобретения первая полипептидная цепь и вторая полипептидная цепь кодируются двумя различными полинуклеотидами, например, первой нуклеотидной последовательностью и второй нуклеотидной последовательностью. В другом варианте реализации изобретения первая нуклеотидная последовательность и вторая нуклеотидная последовательности являются двумя различными полинуклеотидами (например, различные векторы).
Изобретение включает в себя полинуклеотид, кодирующий одну полипептидную цепь (например, FVIII(X2)-F1-L3-F2-L2-X1-L1-V), в котором FVIII(X2), содержит белок FVIII, в котором последователь
- 91 044115 ность XTEN встраивается в один или более сайтов встраивания, F1 содержит первую константную область ИГ или ее часть, например, первый фрагмент Fc, L1 содержит первый линкер, V содержит белок ФВ, X1 содержит последовательность XTEN, имеющую длину менее 288 аминокислот, L2 содержит второй линкер, L3 содержит третий линкер, и F2 содержит вторую константную область ИГ или ее часть, например, второй фрагмент Fc. Изобретение также включает в себя два полинуклеотида, первая полинуклеотидая последовательность кодирует первый полипептид, который содержит белок FVIII, слитый с первой константной областью ИГ или ее частью, и вторая полинуклеотидная последовательность кодирует второй полипептид, который содержит белок ФВ, последовательность XTEN, имеющую длину менее 288 аминокислот, и вторую константную область ИГ или ее часть. В некоторых вариантах реализации изобретения химерный белок, содержащий две полипептидные цепи или три полипептидные цепи, может быть кодирован с помощью одной полинуклеотидной цепи, а затем процессирован в две или три (или более) полипептидные цепи. В еще одних вариантах реализации изобретения химерный белок, содержащий эти полипептидные цепи, может быть кодирован с помощью двух или трех полинуклеотидных цепей.
В других вариантах реализации изобретения набор полинуклеотидов дополнительно содержит дополнительную нуклеотидную цепь (например, вторую нуклеотидную цепь, когда химерный полипептид кодируется первой полинуклеотидной цепью или третьей нуклеотидной цепью, когда химерный белок кодируется двумя полинуклеотидными цепями), которая кодирует белок конвертазу. Белок конвертаза может быть выбран из группы, состоящей из пропротеинконвертазы субтилизин/кексин типа 5 (PCSK5 или РС5), пропротеинконвертазы субтилизин/кексин типа 7 (PCSK7 или РС5), дрожжевого Кех 2, пропротеинконвертазы субтилизин/кексин типа 3 (РАСЕ или PCSK3) и двух или более их сочетаний. В некоторых вариантах реализации изобретения белком конвертазой является PACE, РС5 или РС7. В типовом варианте реализации изобретения белком конвертазой является РС5 или РС7. Смотри международную заявку № PCT/US 2011/043568.
В данном контексте экспрессионный вектор означает любую конструкцию нуклеиновой кислоты, которая содержит элементы, необходимые для транскрипции и трансляции вставленной кодирующей последовательности, или в случае РНК-вирусного вектора, необходимые элементы для репликации и трансляции при интродукции в соответствующую клетку-хозяина. Экспрессионные векторы могут включать в себя плазмиды, фагмиды, вирусы и их производные.
Экспрессионные векторы по данному изобретению будут включать в себя полинуклеотиды, кодирующие химерный белок, описанный в данном документе. В одном варианте реализации изобретения одна или более кодирующих последовательностей для первого полипептида, содержащего белок FVIII и первую константную область ИГ, для второго полипептида, содержащего белок ФВ, последовательность XTEN, имеющую менее 288 аминокислот и вторую константную область ИГ или ее часть, или для обоих полипептидов функционально связаны с последовательностью, контролирующей экспрессию. В данном контексте две последовательности нуклеиновой кислоты функционально связаны, когда они ковалентно связаны таким образом, чтобы обеспечить сохранность функциональных возможностей каждого компонента последовательности нуклеиновой кислоты. О кодирующей последовательности и последовательности контроля экспрессии гена говорят, что они функционально связаны, если они ковалентно связаны таким образом, чтобы экспрессия или транскрипция и/или трансляция кодирующей последовательности находились под влиянием или контролем последовательности контроля экспрессии гена. О двух последовательностях ДНК говорят, что они функционально связаны, если индукция промотора на 5'-конце последовательности экспрессии гена приводит к транскрипции кодирующей последовательности, и если природа связи между двумя последовательностями ДНК (1) не приводит к мутации сдвига рамки считывания, (2) не мешает способности области промотора направлять транскрипцию кодирующей последовательности или (3) не мешает соответствующему РНК-транскрипту транслироваться в белок. Таким образом, последовательность экспрессии гена будет функционально связана с кодирующей последовательностью нуклеиновой кислоты, если последовательность экспрессии гена способна осуществлять транскрипцию последовательности, кодирующую последовательность нуклеиновой кислоты таким образом, чтобы полученный в результате транскрипт транслировался в желаемый белок или полипептид.
В данном контексте, последовательностью контроля экспрессии гена является любая регуляторная нуклеотидная последовательность, например, последовательность промотора или комбинация промоторэнхансер, содействующая эффективной транскрипции и трансляции кодирующей нуклеиновой кислоты, с которой она функционально связана. Последовательность контроля экспрессии гена, может быть, например, промотором млекопитающих или вирусным промотором, таким как конститутивный или индуцируемый промотор. Конститутивные промоторы млекопитающих включают, но не ограничиваются ими, промоторы для следующих генов: гипоксантин фосфорибозилтрансферазы (HPRT), аденозиндезаминазы, пируват-киназы, промотор бета-актина, и другие конститутивные промоторы. Типичные вирусные промоторы, которые функционируют конститутивно в эукариотических клетках, включают, например, промоторы из цитомегаловируса (CMV), вируса обезьян (например, SV40), вирус папилломы, аденовирус, вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), вирус саркомы Рауса, цитомегаловирус, длинные терминальные повторы (LTR) вирус лейкоза Молони и другие ретровирусы, и промотор тимидинкиназы вируса простого герпеса. Другие конститутивные промоторы известны специалистам в данной области
- 92 044115 техники. Промоторы, пригодные в качестве последовательностей экспрессии гена по данному изобретению, также включают в себя индуцируемые промоторы. Индуцируемые промоторы экспрессируются в присутствии индуцирующего агента. Например, промотор металлотионеина индуцирует активацию транскрипции и трансляции в присутствии некоторых ионов металлов. Другие индуцируемые промоторы известны обычным специалистам в данной области техники.
В целом, последовательность контроля экспрессии гена по мере необходимости должна включать в себя 5'-нетранскрибируемую и 5'-нетранслируемую последовательности, участвующие в инициации транскрипции и трансляции соответственно, такие как TATA-бокс, кэпирующая последовательность, последовательность CAAT и т.п. В частности, такие 5'-нетранскрибированные последовательности включает промоторную область, которая включает в себя последовательность промотора для транскрипционного контроля над функционально связанной кодирующей нуклеиновой кислотой. По желанию, в некоторых случаях, последовательность экспрессии гена включает в себя последовательности энхансера или вышележащие активаторные последовательности.
Вирусный вектор включает, но не ограничивается, последовательности нуклеиновых кислот из следующих вирусов: ретровирусы, такие как вирус Молони мышиного лейкоза, вирус саркомы мышей Харви, вирус опухоли молочной железы мышей и вирус саркомы Рауса; аденовирус, аденоассоциированный вирус; вирусы SV40 типа; полиомавирусы; вирусы Эпштейна-Барр; вирусы папилломы; вирус герпеса; вирус коровьей оспы; вирус полиомиелита; и РНК-содержащий вирус, такой как ретровирус. Можно легко использовать и другие векторы, хорошо известные в данной области техники. Некоторые вирусные векторы основаны на нецитопатических эукариотических вирусах, в которых второстепенные гены были заменены на гены интереса. Нецитопатические вирусы включают ретровирусы, жизненный цикл которых включает в себя обратную транскрипцию геномной вирусной РНК в ДНК с последующей провирусной интеграций в ДНК клетки-хозяина. Ретровирусы были одобрены для исследований генной терапии человека. Наиболее полезными являются дефектные по репликации ретровирусы (т.е. способные направлять синтез необходимых белков, но не способные синтезировать инфекционную частицу). Такие генетически измененные ретровирусные экспрессионные векторы имеют полезность для высокоэффективной трансдукции генов in vivo. Стандартные протоколы для получения ретровирусов, дефектных по репликации, (включая этапы введения экзогенного генетического материала в плазмиду, трансфекцию пакующей клеточной линии плазмидой, получения рекомбинантных ретровирусов посредством пакующей клеточной линии, сбор вирусных частиц из тканевой культуральной среды и инфицирование клетокмишеней вирусными частицами) представлены в Kriegler, M., Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, W.H. Freeman Co., Нью-Йорк (1990 год) и Murry, E. J., Methods in Molecular Biology, Vol. 7, Humana Press, Inc., Клифтон, штат Нью-Джерси (1991 год).
В одном варианте реализации изобретения вирусом является аденоассоциированный вирус, вирус двухцепочечной ДНК. Аденоассоциированный вирус может быть сконструирован таким образом, чтобы быть дефектным по репликации и способным инфицировать широкий диапазон типов клеток и видов. Кроме того, он имеет такие преимущества, как термостабильность и липидная устойчивость к растворению; высокие частоты трансдукции в клетках различных линий, включая гемопоэтические клетки; и отсутствие ингибирования суперинфекции, таким образом, что позволяет осуществлять несколько серий трансдукции. Как сообщается, аденоассоциированный вирус может сайт-специфически интегрироваться в клеточную ДНК человека, тем самым сводя к минимуму возможность инсерционного мутагенеза и изменчивости экспрессионной характеристики встроенного гена ретровирусной инфекции. Кроме того, аденоассоциированные вирусные инфекции дикого типа были проведены в культуре ткани более 100 пассажей в отсутствии селективного давления, подразумевая, что геномная интеграция аденоассоциированного вируса является относительно стабильным событием. Аденоассоциированный вирус может также функционировать как внехромосомный фактор.
Другие векторы включают плазмидные векторы. Плазмидные векторы широко описаны в данной области техники и хорошо известны специалистам в данной области техники. См., например, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 год. В последние несколько лет было обнаружено, что плазмидные векторы являются особенно предпочтительным для доставки генов в клетки in vivo из-за их неспособности интегрироваться и реплицироваться внутри генома хозяина. Тем не менее, эти плазмиды имеют промотор, совместимый с клеткойхозяином, могут экспрессировать пептид из гена, функционально закодированного в плазмиде. Некоторые часто используемые плазмиды, доступные от коммерческих поставщиков, включают pBR322, pUC18, pUC19, различные pcDNA плазмиды, PRC/CMV, различные PCMV плазмиды, pSV40 и pBlueScript. Дополнительные примеры конкретных плазмид включают pcDNA3.1, номер по каталогу V79020; pcDNA3.1/hygro, номер по каталогу V87020; pcDNA4/Myc-His, номер по каталогу V86320; и pBudCE4.1, номер по каталогу V53220, все из Инвитроджен (Карлсбад, штат Калифорния). Другие плазмиды хорошо известны обычным специалистам в данной области техники. Кроме того, плазмиды могут быть специально разработаны с использованием стандартных методов молекулярной биологии, чтобы удалить и/или добавить специфические фрагменты ДНК.
В одной системе экспрессии на основе насекомых, которая может быть использована для получения
- 93 044115 белков по данному изобретению, Autographa californica вирус ядерного гипергидроза (AcNPV) используется в качестве вектора для экспрессии чужеродных генов. Вирус растет в клетках Spodoptera frugiperda. Кодирующая последовательность может быть клонирована во второстепенных областях (например, ген полигедрона) вируса и помещена под контроль промотора AcNPV (например, промотор полигедрона). Успешное введение кодирующей последовательности приведет к инактивации гена полигедрона и образования невкрапленного рекомбинантного вируса (т.е. у вируса отсутствует белковый слой, кодируемый геном полигедрона). Эти рекомбинантные вирусы затем используются для инфицирования клеток Spodoptera frugiperda, в которых экспрессируется вставленный ген. (см., например, Smith et al. (1983 год) J Virol 46:584; патент США № 4,215,051). Дополнительные примеры этих систем экспрессии можно найти в Ausubel et al., ред. (1989 год) Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience.
Еще одной системой, которая может быть использована для экспрессии белков по данному изобретению, является система экспрессии гена глутаминсинтетазы, также упоминается как система экспрессии GS (Lonza Biologics PLC, Беркшир Великобритания). Эта система экспрессии подробно описана в патенте США №5,981,216.
В клетках-хозяевах млекопитающих может быть использован ряд систем экспрессии, основанных на вирусах. В тех случаях, когда используют аденовирус в качестве экспрессионного вектора экспрессии, кодирующая последовательность может быть лигирована с контрольным за транскрипцией/трансляцией комплексом аденовируса, например, поздним промотором и трехкомпонентной лидерной последовательностью. Этот химерный ген затем может быть встроен в геном аденовируса с помощью рекомбинации in vitro или in vivo. Встраивание во второстепенную область вирусного генома (например, область Е1 или Е3) приводит к получению рекомбинантного вируса, который является жизнеспособным и способен экспрессировать пептид у инфицированных хозяев. (См., например, Logan & Shenk (1984 год) Proc Natl Acad Sci USA 81:3655). В альтернативном варианте 7.5 К промотор вируса осповакцины может быть использован. (См., например, Mackett et al. (1982 год) Proc Natl Acad Sci USA 79:7415; Mackett et al. (1984 год) J Virol 49:857; Panicali et al. (1982 год) Proc Natl Acad Sci USA 79:4927.
Для повышения эффективности продуцирования полинуклеотиды могут быть созданы, чтобы кодировать множество белковых единиц по данному изобретению, разделенных ферментативными сайтами расщепления. Полученный полипептид может быть расщеплен (например, путем обработки с соответствующим ферментом) для того, чтобы восстановить полипептидные единицы. Это может увеличить выход полипептидов, управляемых одним промотором. При использовании в соответствующих вирусных системах экспрессии, трансляция каждого полипептида, кодируемого мРНК, направлена внутрь транскрипта; например, с помощью участка внутренней посадки рибосомы, IRES. Таким образом, полицистронная конструкция направляет транскрипцию одной большой полицистронной мРНК, которая, в свою очередь, направляет трансляцию нескольких, отдельных полипептидов. Этот подход исключает продуцирование и ферментативную обработку полипротеинов и может значительно увеличить выход полипептидов, управляемых одним промотором.
Векторы, используемые в трансформации, как правило, содержат селективный маркер, используемый для идентификации трансформантов. В бактериальных системах это может включать в себя ген устойчивости к антибиотику, такой как ампициллин или канамицин. Селективные маркеры для использования в культивируемых клетках млекопитающих включают гены, которые придают устойчивость к лекарственным средствам, таким как неомицин, гигромицин и метотрексат. Селективный маркер может быть амплифицируемым селективным маркером. Одним амплифицируемым селективным маркером является ген дигидрофолатредуктазы (DHFR). Simonsen С С et al. (1983 год) Proc Natl Acad Sci USA 80:2495-9. Селективные маркеры были проверенны Thilly (1986 год) Mammalian Cell Technology, Butterworth Publishers, Стоунхэм, штат Массачусетс, и выбор селективных маркеров находится в компетенции среднего специалиста в данной области техники.
Селективные маркеры могут быть введены в клетку посредством отдельной плазмиды одновременно с геном интереса, или же они могут быть введены посредством одной и той же плазмиды. Если на одной и той же плазмиде селектируемый маркер и ген интереса могут находиться под контролем различных промоторов или одного и того же промотора, поздняя расстановка продуцирует бицистронное сообщение. Конструкции такого типа известны в данной области техники (например, патент США № 4,713,339).
Экспрессионные векторы могут кодировать метки, которые позволяют произвести легкую очистку рекомбинантно продуцируемого белка. Примеры включают, но не ограничиваются ими, вектор pUR278 (Ruther et al. (1983 год) EMBO J 2:1791), в котором кодирующие последовательности для экспрессируемого белка могут быть лигированы в вектор в рамке с кодирующей областью lac z, так чтобы продуцировался меченый слитый белок; векторы pGEX могут быть использованы для экспрессии белков по данному изобретению с использованием глутатион S-трансферазы (GST) в качестве метки. Обычно эти белки растворимы и могут быть легко очищены от клеток посредством адсорбции на глутатион-агарозных микроносителях с последующим элюированием в присутствии свободного глутатиона. Векторы включают в себя сайты расщепления (тромбин или фактор Xa протеазы или ПРОТЕАЗА PRESCISSION™
- 94 044115 (Pharmacia, Пипак, штат Нью-Джерси)) для легкого удаления метки после очистки.
Экспрессионный вектор или векторы затем трансфицируются или котрансфицируются в подходящую клетку-мишень, которая будет экспрессировать полипептиды. Способы трансфекции, известные в данной области техники, включают, но не ограничиваются ими, осаждение фосфатом кальция (Wigler et al. (1978 год) Cell 14:725), электропорация (Neumann et al. (1982 год) EMBO J 1:841) и реагенты на основе липосом. Разнообразие векторных систем экспрессии в клетке хозяине могут быть использованы для экспрессии белков, описанных в данном документе, включая как прокариотические и эукариотические клетки. К ним относятся, но не ограничиваются ими, микроорганизмы, такие как бактерии (например, Е. coli) трансформированные с помощью рекомбинантных экспрессионных векторов ДНК бактериофага или плазмидной ДНК, содержащих соответствующую кодирующую последовательность; дрожжи или мицелиальные грибы, трансформированные с помощью рекомбинантных экспрессионных векторов дрожжевых или мицелиальных грибов, содержащих соответствующую кодирующую последовательность; системы клеток насекомых, инфицированные рекомбинаннтными вирусными экспрессионными векторами (например, бакуловирус), содержащих соответствующую кодирующую последовательность; системы клеток растений, инфицированные рекомбинантными вирусными экспрессионными векторами (например, вирус мозаики цветной капусты или вирус мозаики табака) или трансформированные с помощью рекомбинантных плазмидных экспрессионных векторов (например, Ti плазмида), содержащих соответствующую кодирующую последовательность; или системы клеток животных, в том числе клетки млекопитающих (например, HEK293, СНО, Cos, HeLa, HKB11 и ВНК клетки).
В одном варианте реализации изобретения клетка-хозяин является эукариотической клеткой. В данном контексте эукариотическая клетка относится к любой животной или растительной клетки, имеющей точно определенное ядро. Эукариотические клетки животных включают клетки позвоночных, например, млекопитающих и клетки беспозвоночных, например, насекомых. Эукариотические клетки растений, в частности, могут включать дрожжевые клетки, но не ограничиваться ими. Эукариотическая клетка отличается от прокариотической клетки, например, бактерии.
В некоторых вариантах реализации изобретения эукариотическая клетка представляет собой клетку млекопитающего. Клетка млекопитающего представляет собою любую клетку, происходящую от млекопитающего. Клетки млекопитающих, в частности, могут включать клеточные линии млекопитающих, но не ограничиваться ими. В одном варианте реализации изобретения клетка млекопитающего представляет собой человеческую клетку. В другом варианте реализации изобретения клетка млекопитающего представляет собой клетку HEK293, которая является линией эмбриональных клеток человеческой почки. Клетки HEK293, доступны в виде CRL-1533 из Американской коллекции типов культур, Манассас, штат Вирджиния, а также в виде 293-Н клеток, каталожный № 11631-017 или 293-F клеток, каталожный № 11625-019 от Инвитроджен (Карлсбат, штат Калифорния). В некоторых вариантах реализации изобретения клетка млекопитающего представляет собой PER.C6® клетку, которая является линией клеток, происходящей из сетчатки. PER.C6® клетки доступны от Круселл (Лейден, Нидерланды). В других вариантах реализации изобретения клетка млекопитающего представляет собой клетку из линии клеток яичника китайского хомячка (СНО). Клетки СНО доступны из Американской коллекции типов культур, Манассас, штат Вирджиния, (например, СНО-Ki; CCL-61). В еще одних вариантах реализации изобретения клетка млекопитающего представляет собой клетку из линии клеток почки новорожденного сирийского хомячка (ВНК). Клетки ВНК доступны из Американской коллекции типов культур, Манассас, штат Вирджиния, (например, CRL-1632). В некоторых вариантах реализации изобретения клетка млекопитающего представляет собой HKB11 клетку, которая является гибридной клеточной линией от клеток линии HEK293 и линии В-клеток человека. Mei et al., Mol. Biotechnol. 34(2): 165-78 (2006 год).
В одном варианте реализации изобретения плазмиду, содержащую FVIII (X2)-Fc слитую кодирующую последовательность, белок ФВ-L1-X1-L2-Fc кодирующую последовательность или обе эти последовательности и селективный маркер, например, устойчивость к зеоцину, трансфицировали в клетки HEK293 для продуцирования химерного белка.
В другом варианте реализации изобретения плазмиду, содержащую FVIII-Fc слитую кодирующую последовательность, белок ФВ-L1-X-L2-Fc кодирующую последовательность или обе эти последовательности и селективный маркер, например, устойчивость к зеоцину, трансфицировали в клетки HEK293 для продуцирования химерного белка.
В некоторых вариантах реализации изобретения первую плазмиду, содержащую FVIII(X2)-Fc слитую кодирующую последовательность и первый селективный маркер, например, устойчивость к зеоцину, и вторую плазмиду, содержащую белок ФВ-L1-X1-L2-Fc кодирующую последовательность и второй селективный маркер, например, ген устойчивости к неомицину и третью плазмиду, содержащую кодирующую последовательность белка конвертазы и третий селективный маркер, например, ген устойчивости к гигромицину, трансфицировали в клетки HEK293 для получения химерного белка. Первая и вторая плазмиды могут быть введены в равных количествах (например, молярное соотношение 1:1), или они могут быть введены в неравных количествах.
В еще одних вариантах реализации изобретения первую плазмиду, содержащую FVIII-Fc слитую
- 95 044115 кодирующую последовательность и первый селективный маркер, например, устойчивость к зеоцину, и вторую плазмиду, содержащую белок ФВ-L1-X-L2-Fc кодирующую последовательность и второй селективный маркер например, ген устойчивости к неомицину и третью плазмиду, содержащую кодирующую последовательность белка конвертазы и третий селективный маркер, например, ген устойчивости к гигромицину, трансфицировали в клетки HEK293 для получения химерного белка. Первая и вторая плазмиды могут быть введены в равных количествах (например, молярное соотношение 1:1), или они могут быть введены в неравных количествах.
В еще одних вариантах реализации изобретения первую плазмиду, содержащую FVIII(X2)-Fc слитую кодирующую последовательность и первый селективный маркер, например, устойчивость к зеоцину, и вторую плазмиду, содержащую белок ФВ-L1-X1-L2-Fc слитую кодирующую последовательность и второй селективный маркер, например, ген устойчивости к неомицину и третью плазмиду, содержащую кодирующую последовательность белка конвертазы и третий селективный маркер, например, ген устойчивости к гигромицину, трансфицировали в клетки HEK293 для получения химерного белка. Первая и вторая плазмиды могут быть введены в равных количествах (например, молярное соотношение 1:1), или они могут быть введены в неравных количествах.
В некоторых вариантах реализации изобретения первую плазмиду, содержащую FVIII (с или без XTEN)-F1-L3-F2-L2-X-L1-V кодирующую последовательность и первый селективный маркер, например, устойчивость к зеоцину, и вторую плазмиду, содержащую кодирующую последовательность белка конвертазы и второй селективный маркер, например, ген устойчивости к гигромицину, трансфицировали в клетки HEK293 для получения химерного белка. Промоторы для кодирующей последовательности FVIII(X)-F1 и кодирующей последовательности V-L2-X-L1-F2 могут быть различными или они могут быть одинаковыми.
В еще одних вариантах реализации изобретения трансфицированные клетки являются стабильно трансфицированными. Эти клетки могут быть отобраны и поддерживаться в виде стабильной клеточной линии с использованием стандартных методов, известных специалистам в данной области.
Клетки-хозяева, содержащие конструкции ДНК белка, выращивают в подходящей питательной среде. Используемый в данном документе термин соответствующая питательная среда означает среду, содержащую питательные вещества, необходимые для роста клеток. Питательные вещества, необходимые для роста клеток могут включать в себя источник углерода, источник азота, незаменимые аминокислоты, витамины, минералы и факторы роста. В некоторых случаях, среда может содержать один или более факторов выбора. В некоторых случаях, среда может содержать бычью сыворотку или эмбриональную телячью сыворотку (ЭТС). В одном варианте реализации изобретения среда практически не содержит IgG. Питательная среда, как правило, выбирается для клеток, содержащих конструкцию ДНК, через, например, отбор по чувствительности к лекарственному препарату или недостаток необходимого питательного вещества, которое дополняется через селектируемый маркер на конструкции ДНК или котрансфицируется с конструкцией ДНК. Культивируемые клетки млекопитающих обычно выращивают в коммерчески доступной среде, содержащей сыворотку, или бессывороточной среде (например, MEM, DMEM, DMEM/F12). В одном варианте реализации изобретения средой является CD293 (Инвитроджен, Карлсбат, Калифорния). В другом варианте реализации изобретения средой является CD17 (Инвитроджен, Карлсбат, Калифорния). Выбор среды, подходящей для конкретной используемой клеточной линии, определяется уровнем средних специалистов в данной области техники.
Для того, чтобы коэкспрессировать две полипептидные цепи химерного белка, клетки-хозяева культивируют в условиях, которые позволяют экспрессию обеих цепей. В контексте данного документа, культивирование означает поддержание живых клеток in vitro по меньшей мере на протяжении определенного времени. Поддержание может включать в себя, хотя и не обязательно, увеличение популяции живых клеток. Например, клетки, поддерживаемые в культуре, могут быть статическими в популяции, но по-прежнему жизнеспособными и способны производить желаемый продукт, например, рекомбинантный белок или рекомбинантный слитый белок. Подходящие условия для культивирования эукариотических клеток хорошо известны в данной области техники и включают в себя надлежащий выбор питательных сред, добавки к питательным средам, температуру, pH, насыщение кислородом и тому подобное. Для коммерческих целей, культивирование может включать в себя использование любого из различных типов систем промышленного масштаба, в том числе встряхиваемые колбы, вращающиеся флаконы, биореакторы с полыми волокнами, биореакторы с механическим перемешиванием, аэрлифтные биореакторы, волновые биореакторы и другие.
Условия культивирования клеток также подбираются таким образом, чтобы позволить фрагменту ФВ соединиться с белком FVIII. Условия, обеспечивающие экспрессию фрагмента ФВ и/или белка FVIII могут включать в себя наличие источника витамина К. Например, в одном варианте реализации изобретения стабильно трансфицированные клетки HEK293 культивируются в среде CD293 (Инвитроджен, Карлсбат, Калифорния) или среде OptiCHO (Инвитроджен, Карлсбат, Калифорния) с добавлением 4 мМ глутамина.
В одном аспекте, настоящее изобретение относится к способу экспрессии, изготовления или производства химерного белка настоящего изобретения, который включает а) трансфекцию клетки-хозяина,
- 96 044115 содержащей полинуклеотид, кодирующий химерный белок и b) культивирование клетки-хозяина в культуральной среде, в условиях, подходящих для экспрессии химерного белка, причем химерный белок является экспрессированным.
В дополнительных вариантах реализации изобретения в среду секретируется белковый продукт, содержащий белок FVIII, связанный с первой константной областью ИГ или ее частью и/или белок ФВ, слитый со второй константной областью ИГ или ее частью с помощью последовательности XTEN. Среда отделяется от клеток, концентрируется, фильтруется, а затем пропускается через две или три колонки для аффинной хроматографии, например, колонку белка А и одну или две анионообменные колонки.
В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к химерному белку, полученному способами, описанными в данном документе.
Производство in vitro позволяет выход на промышленные масштабы для получения большого количества желаемых измененных полипептидов данного изобретения. Методики культивирования клеток млекопитающих в условиях культивирования тканей известны в данной области техники и включают в себя гомогенную суспензионную культуру, например, в аэролифтном реакторе или в реакторе непрерывного действия с мешалкой, или иммобилизированной или инкапсулированной культуре клеток, например, в полых волокнах, микрокапсулах, на агарозных микрогранулах или керамических картриджах. Хроматография включает в себя, например, аффинную хроматографию, ионообменную хроматографию, гидрофобную хроматографию, гель-фильтрацию, хроматографию с обращенной фазой и адсорбционную хроматографию (Strategies for Protein Purification and Characterization:
IV. Фармацевтическая композиция.
Композиции, содержащие химерный белок настоящего изобретения могут содержать подходящий фармацевтически приемлемый носитель. Например, они могут содержать наполнители и/или вспомогательные вещества, которые облегчают переработку активных соединений в препараты, предназначенные для доставки к месту действия.
Фармацевтическая композиция может быть приготовлена для парентерального введения (т.е. внутривенно, подкожно или внутримышечно) путем болюсной инъекции. Лекарственные формы для инъекции могут быть представлены в единичной лекарственной форме, например, в ампулах или в многодозовых контейнерах с добавленным консервантом. Композиции могут принимать формы суспензий, растворов или эмульсий в масляных или водных жидких носителях, и содержать вспомогательные агенты, такие как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие агенты. В альтернативном варианте, активный ингредиент может быть в форме порошка для разбавления с подходящим носителем, например, апирогенной водой.
Подходящие для парентерального введения лекарственные формы также включают водные растворы активных соединений в водорастворимой форме, например, водорастворимые соли. Кроме того, могут быть введены суспензии активных соединений в виде подходящих масляных суспензий для инъекций. Подходящие липофильные растворители и носители включают жирные масла, например, кунжутное масло или синтетические сложные эфиры жирных кислот, например, этилолеат или триглицериды. Водные суспензии для инъекций могут содержать вещества, которые увеличивают вязкость суспензии, в том числе, например, карбоксиметилцеллюлозу натрия, сорбит и декстран. В некоторых случаях, суспензия может также содержать стабилизаторы. Для инкапсулирования молекул изобретения с целью доставки в клетки или интерстициальные пространства также могут быть использованы липосомы. Примерные фармацевтически приемлемые носители представляют собой физиологически совместимые растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и задерживающие всасывание агенты, воду, физиологический раствор, физиологический раствор с фосфатным буфером, декстрозу, глицерин, этанол и тому подобные. В некоторых вариантах реализации изобретения композиция содержит изотонические агенты, например, сахара, полиспирты, такие как маннит, сорбит или хлорид натрия. В других вариантах реализации изобретения композиции содержат фармацевтически приемлемые вещества, такие как смачивающие агенты или небольшие количества вспомогательных веществ, таких как смачивающие или эмульсифицирующие агенты, консерванты или буферы, которые увеличивают срок хранения или эффективность активных ингредиентов.
Композиции данного изобретения могут быть представлены в различных формах, включая, например, жидкости (например, инъекционные и нерастворимые растворы), дисперсии, суспензии, полутвердые и твердые лекарственные формы. Выбор предпочтительной формы зависит от способа введения и терапевтического применения.
Композиция может быть сформулирована в виде раствора, микроэмульсии, дисперсии, липосомы или другой упорядоченной структуры, подходящей для высокой концентрации лекарственного средства. Стерильные инъекционные растворы могут быть получены путем объединения активного ингредиента в необходимом количестве в подходящем растворителе с одним или комбинацией ингредиентов, перечисленных выше, по необходимости, с последующей стерилизующей фильтрацией. В общем, дисперсии получают введением активного ингредиента в стерильный растворитель, который содержит основную дисперсионную среду и необходимые другие ингредиенты из перечисленных выше. В случае использования стерильных порошков для изготовления стерильных инъекционных растворов предпочтительными
- 97 044115 способами приготовления являются вакуумная сушка и лиофилизация, в результате которых образуется порошкообразное вещество активного ингредиента, а также любой необходимый дополнительный ингредиент из раствора, предварительно стерилизованного путем фильтрации. Надлежащая текучесть раствора может поддерживаться, например, посредством покрытия оболочкой, такой как лецитин, путем поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсии, а также использованием поверхностноактивных веществ. Пролонгированная абсорбция инъекционных композиций может осуществляться путем включения в композицию вещества, которое задерживает абсорбцию, например, солей моностеарата и желатина.
Активный ингредиент может быть приготовлен с лекарственной формой или устройством, которые имеют контролируемое высвобождение. Примеры таких лекарственных форм и устройств включают имплантаты, трансдермальные пластыри и микроинкапсулированные системы доставки. Могут использоваться биоразрушаемые, биосовместимые полимеры, например, этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, полиортоэфиры и полимолочная кислота. Способы получения таких лекарственных форм и устройств известны в данной области техники. См., например, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, изд., Marcel Dekker, Inc., Нью-Йорк, 1978.
Инъекционные лекарственные формы пролонгированного действия могут быть изготовлены путем формирования микроинкапсулированных матриц лекарственного средства в поддающихся биологическому разложению полимерах, таких как полилактид-полигликолид. В зависимости от соотношения лекарственного средства и полимера, а также природы применяемого полимера, скоростью высвобождения лекарственного средства можно управлять. Другими типичными поддающимися биологическому разложению полимерами являются полиортоэфиры и полиангидриды. Инъекционные лекарственные формы пролонгированного действия также могут быть получены включением лекарственного средства в липосомы или микроэмульсии.
Дополнительные активные соединения могут быть введены в состав композиций. В одном варианте реализации изобретения химерный белок изобретения приготовлен с другим фактором свертывания крови или его вариантом, фрагментом, аналогом или производным. Так, например, фактор свертывания крови включает, не ограничиваясь, фактор V, фактор VII, фактор VIII, фактор IX, фактор X, фактор XI, фактор XII, фактор XIII, протромбин, фибриноген, фактор фон Виллебранда или рекомбинантный растворимый тканевый фактор (rsTF) или активированные формы любого из предыдущих факторов. Фактор свертывания крови гемостатического средства также может включать антифибринолитические лекарственные средства, например, аминокапроновую кислоту, транекзамовую кислоту.
Схемы дозирования могут быть подобраны для обеспечения оптимального желаемого ответа. Так, например, может быть введена одноразовая доза, в динамике могут быть введены несколько раздельных доз, или доза может быть пропорционально уменьшена или увеличена, как указывается при остроте терапевтической ситуации. Преимущественным является формулировать парентеральные композиции в одноразовой дозированной форме для простоты введения и однородности дозы. См., например, Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., Истон, штат Пенсильвания. 1980 год).
В дополнение к активным соединениям, жидкая лекарственная форма может содержать инертные разбавители такие как вода, этиловый спирт, этилкарбонат, этилацетат, бензиловый спирт, бензилбензоат, пропиленгликоль, 1,3-бутиленгликоль, диметилформамид, масла, глицерин, тетрагидрофурфуриловый спирт, полиэтиленгликоли и жирнокислотные эфиры сорбитана.
Не ограничивающие изобретение примеры подходящих фармацевтических носителей описаны также в Remington's Pharmaceutical Sciences E. W. Martin. Некоторые примеры наполнителей включают крахмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рис, муку, мел, силикагель, стеарат натрия, моностеарат глицерина, тальк, хлорид натрия, сухое обезжиренное молоко, глицерин, пропилен, гликоль, воду, этанол и тому подобные. Композиция может также содержать pH забуферивающие реагенты и увлажняющие или эмульсирующие агенты.
Для перорального введения фармацевтическая композиция может принимать форму таблеток или капсул, полученных обычными способами. Композиция также может быть приготовлена в виде жидкости, например, сиропа или суспензии. Жидкость может содержать суспендирующие агенты (например, сироп сорбита, производные целлюлозы или гидрогенизированные пищевые жиры), эмульгирующие агенты (лецитин или аравийскую камедь), неводные носители (например, миндальное масло, жирные сложные эфиры, этиловый спирт или фракционированные растительные масла) и консерванты (например, метил или пропил-п-гидроксибензоаты или сорбиновую кислоту). Препараты могут также включать ароматизаторы, красители и подсластители. В альтернативном варианте, композиция может быть представлена в виде сухого продукта для разведения водой или другим подходящим носителем.
Для буккального введения, в соответствии с обычными протоколами, композиция может принимать форму таблеток или пастилок.
Для введения путем ингаляции, соединения, используемые в соответствии с настоящим изобретением, обычно доставляются в виде распыленного аэрозоля с или без вспомогательных веществ или в виде аэрозольного спрея из аэрозольной упаковки или распылителя, в некоторых случаях, с газомвытеснителем, например, дихлордифторметаном, трихлорфторметаном, дихлортетрафторметаном, диок- 98 044115 сидом углерода или другим подходящим газом. В случае аэрозоля под давлением, единица дозы может быть определена с помощью клапана для доставки дозированного количества. Для использования в ингаляторе или инсуффляторе могут быть сформулированы капсулы и картриджи из, например, желатина с содержанием порошкообразной смеси соединения и подходящей порошковой основы, такой как лактоза или крахмал.
Фармацевтическая композиция также может быть приготовлена для ректального введения в виде суппозитория или удерживающей клизмы, например, содержащих обычные суппозиторные основы, такие как масло какао или другие глицериды.
В одном варианте реализации изобретения фармацевтическая композиция содержит химерный белок, полинуклеотид, кодирующий химерный белок, вектор, содержащий полинуклеотид, или клеткухозяина, содержащую вектор и фармацевтически приемлемый носитель. Белок FVIII в химерном белке имеет более продолжительный период полувыведения по сравнению с белком FVIII дикого типа или соответствующим белком FVIII без фрагмента ФВ. В одном варианте реализации изобретения, в котором период полувыведения химерного белка по меньшей мере в около 1,5 раза, по меньшей мере в около 2 раза, по меньшей мере в около 2,5 раза, по меньшей мере в около 3 раза, по меньшей мере в около 4 раза, по меньшей мере в около 5 раз, по меньшей мере в около 6 раз, по меньшей мере в около 7 раз, по меньшей мере в около 8 раз, по меньшей мере в около 9 раз, по меньшей мере в около 10 раз, по меньшей мере в около 11 раз или по меньшей мере в около 12 раз более продолжителен чем таковой у белка FVIII дикого типа. В другом варианте реализации изобретения период полувыведения Фактора VIII составляет по меньшей мере около 17 ч, по меньшей мере около 18 ч, по меньшей мере около 19 ч, по меньшей мере около 20 ч, по меньшей мере около 21 ч, по меньшей мере около 22 ч, по меньшей мере около 23 ч, по меньшей мере около 24 ч, по меньшей мере около 25 ч, по меньшей мере около 26 ч, по меньшей мере около 27 ч, по меньшей мере около 28 ч, по меньшей мере около 29 ч, по меньшей мере около 30 ч, по меньшей мере около 31 ч, по меньшей мере около 32 ч, по меньшей мере около 33 ч, по меньшей мере около 34 ч, по меньшей мере около 35 ч, по меньшей мере около 36 ч, по меньшей мере около 48 ч, по меньшей мере около 60 ч, по меньшей мере около 72 ч, по меньшей мере около 84 ч, по меньшей мере около 96 ч или по меньшей мере около 108 ч.
В некоторых вариантах реализации изобретения композиция вводится путем, выбранным из группы, состоящей из местного введения, интраокулярного введения, парентерального введения, интратекального введения, субдурального введения и перорального введения. Парентеральное введение может быть внутривенным или подкожным введением.
В других вариантах реализации изобретения композиция используется для лечения геморрагического заболевания или состояния, у пациента, имеющего для этого показания. Геморрагическое заболевание или состояние выбрано из группы, состоящей из кровотечения, вызванного нарушением свертываемости крови, гемартроза, мышечного кровотечения, кровотечения полости рта, кровоизлияния, мышечного кровоизлияния, кровоизлияния полости рта, травмы, травмы головы, желудочно-кишечного кровотечения, внутричерепного кровоизлияния, внутрибрюшного кровоизлияния, внутригрудного кровоизлияния, перелома костей, кровотечения центральной нервной системы, кровотечения в заглоточном пространстве, кровотечения в забрюшинном пространстве, кровотечения во влагалище подвздошнопоясничной мышцы и их любых комбинациях. В других вариантах реализации изобретения субъект планирует перенести операцию. В еще одних вариантах реализации изобретения лечение является профилактическим или по требованию.
V. Генная терапия.
Химерный белок настоящего изобретения может быть получен in vivo в организме млекопитающего, например, человеческого пациента, с использованием подходов генной терапии, а также может быть терапевтически полезным для лечения геморрагического заболевания или расстройства, выбранного из группы, состоящей из кровотечения, вызванного нарушением свертываемости крови, гемартроза, мышечного кровотечения, кровотечения полости рта, кровоизлияния, мышечного кровоизлияния, кровоизлияния полости рта, травмы, травмы головы, желудочно-кишечного кровотечения, внутричерепного кровоизлияния, внутрибрюшного кровоизлияния, внутригрудного кровоизлияния, перелома костей, кровотечения центральной нервной системы, кровотечения в заглоточном пространстве, кровотечения в забрюшинном пространстве и кровотечения во влагалище подвздошно-поясничной мышцы. В одном варианте реализации изобретения геморрагическое заболевание или расстройство является гемофилией. В другом варианте реализации изобретения геморрагическое заболевание или расстройство является гемофилией А. Это включает в себя введение подходящей химерной, функционально связанной с подходящими регуляторными последовательностями нуклеиновой кислоты, кодирующей белок. В определенном варианте реализации изобретения эти последовательности входят в состав вирусного вектора. Подходящие для такой генной терапии вирусные векторы включают аденовирусные векторы, лентивирусные векторы, бакуловирусные векторы, векторы на основе вируса Эпштейна-Барра, паповавирусные векторы, векторы на основе вируса коровьей оспы, векторы на основе вируса простого герпеса и векторы на основе аденоассоциированного вируса (AAV). Вирусный вектор может быть вирусным вектором с дефектной репликацией. В других вариантах реализации изобретения аденовирусный вектор имеет делецию в его
- 99 044115
Е1 гене или Е3 гене. Когда используется аденовирусный вектор, млекопитающее может не подвергаться воздействию нуклеиновой кислоты, кодирующей селектируемый маркерный ген. В других вариантах реализации изобретения последовательности включены в невирусный вектор, известный специалистам в данной области техники.
VI. Способы использования химерного белка.
Настоящее изобретение относится к способу использования химерного белка, описанного в настоящем документе, для предотвращения или ингибирования связывания эндогенного ФВ с белком FVIII. Настоящее изобретение относится к способу использования химерного белка, имеющего белок FVIII связанный с XTEN и константную область ИГ или его часть.
Один аспект настоящего изобретения относится к предотвращению или ингибированию взаимодействия FVIII с эндогенным ФВ путем блокирования или экранирования сайта связывания ФВ на FVIII от эндогенного ФВ и в то же время продлевая период полувыведения химерного белка с использованием последовательности XTEN в комбинации с константной областью ИГ или его части, что также может увеличителем периода полувыведения. В одном варианте реализации изобретение относится к способу конструирования белка FVIII, имеющего более длительный период полувыведения, чем FVIII дикого типа. Химерный белок, который является пригодным для использования в способе, включает любой один или более химерный белок, описанный в настоящем документе.
Другой вариант реализации настоящего изобретения включает в себя способ введения субъекту, имеющему для этого показания, химерного белка, содержащего белок FVIII, имеющий более продолжительный период полувыведения, чем такой у дикого типа FVIII, причем способ включает введение химерного белка, описанного в настоящем документе, субъекту.
В одном варианте реализации изобретение относится к способу использования последовательности XTEN и константной области ИГ или его части для продления периода полувыведения химерного белка, содержащего белок FVIII и белок ФВ, что предотвращает или ингибирует взаимодействие эндогенного ФВ с белком FVIII. Белок FVIII связан с последовательностью XTEN (например, FVIII(X)) и затем связан или соединен с белком ФВ, слитым с XTEN и константной областью ИГ или его частью, является экранированным или защищенным от пути клиренса ФВ и поэтому имеет сниженный клиренс по сравнению с белком FVIII, не связанным с белком ФВ. Таким образом экранированный белок FVIII имеет максимальное продление периода полувыведения по сравнению с белком FVIII, не связанным или соединенным с последовательностью XTEN и белком ФВ. В некоторых вариантах реализации изобретения белок FVIII, соединенный с или защищенный белком ФВ и связанный с последовательностью XTEN, не очищается через рецептор клиренса ФВ. В некоторых вариантах реализации изобретения белок FVIII, соединенный с или защищенный белком ФВ и связанный с последовательностью XTEN, выводится из системы медленнее, чем белок FVIII, не соединенный с или защищенный белком ФВ и связанный с последовательностью XTEN.
В одном аспекте химерный белок, содержащий белок FVIII, связанный с последовательностью XTEN, или белок FVIII, связанный или соединенный с белком ФВ, связанным с XTEN, имеет пониженный клиренс из кровотока, так как белок ФВ не содержит сайт связывания с рецептором клиренса ФВ. Белок ФВ предотвращает или ингибирует клиренс FVIII, связанного или соединенного с белком ФВ, из системы через путь клиренса ФВ. Пригодные для настоящего изобретения белки ФВ могут также обеспечить, по меньшей мере одно или более ФВ-подобных FVIII свойств защиты, которые обеспечиваются эндогенными ФВ. В некоторых вариантах реализации изобретения белок ФВ или последовательность XTEN могут также скрывать один или более сайт связывания с рецептором клиренса FVIII, таким образом, предотвращая клиренс FVIII через свой собственный путь клиренса.
В некоторых вариантах реализации изобретения предотвращение или ингибирование связывания белка FVIII с эндогенным ФВ через белок ФВ или последовательность XTEN может происходить in vitro или in vivo.
Также предложен способ продления периода полувыведения химерного белка, включающий введение химерного белка, описанного в настоящем документе, субъекту, имеющему для этого показания. Период полувыведения неактивированного FVIII, связанного или соединенного с полноразмерным ФВ, составляет около 12-14 ч в плазме крови. При БФВ типа 3, при которой ФВ практически отсутствует в кровотоке, период полувыведения FVIII составляет всего около шести часов, что у таких пациентов приводит к появлению симптомов от легкой до умеренной гемофилии А из-за снижения концентрации FVIII. Период полувыведения химерного белка настоящего изобретения, связанного или соединенного с фрагментом ФВ или последовательностью XTEN, может стать по меньшей мере в около 1,5 раза, 1,6 раза, 1,7 раза, 1,8 раза, 1,9 раза, 2,0 раза, 2,1 раза, в 2,2 раза, 2,3 раза, 2,4 раза, 2,6 раза, 2,7 раза, 2,8 раза, 2,9 раза, 3,0 раза, 3,1 раза, 3,2 раза, 3,3 раза, 3,4 раза, 3,5 раза, 3,6 раза, 3,7 раза, 3,8 раза, 3,9 раза, или в 4,0 раза более продолжительным, чем период полувыведения неактивированного FVIII, связанного или соединенного с полноразмерным ФВ.
В одном варианте реализации изобретения химерный белок, содержащий первый полипептид, содержащий белок FVIII и первую константную область ИГ или ее часть, и второй полипептид, содержащий белок ФВ, XTEN, содержащий менее 288 аминокислот, а также константную область ИГ или его
- 100 044115 часть, обладает периодом полувыведения по меньшей мере в около 2 раза, 2,5 раза, 3,0 раза, 3,5 раза, 4,0 раза, 4,5 раза, 5,0 раза, 5,5 раза, 6,0 раза, 7 раз, 8 раз, 9 раз или в 10 раз более продолжительным, чем соответствующий химерный белок, содержащий такой же первый полипептид и второй полипептид без последовательности XTEN или FVIII дикого типа. В другом варианте реализации изобретения химерный белок, содержащий первый полипептид, содержащий белок FVIII и первую константную область ИГ или его часть, и второй полипептид, содержащий белок ФВ, XTEN, содержащий менее 288 аминокислот, и константную область ИГ или его часть, обладает периодом полувыведения в около 2-5 раз, около 3-10 раз, около 5-15 раз, около 10-20 раз, около 15-25 раз, около 20-30 раз, около 25-35 раз, около 30-40 раз, около 35-45 раз более продолжительным, чем соответствующий химерный белок, содержащий такой же первый полипептид и второй полипептид без последовательности XTEN или FVIII дикого типа. В конкретном варианте реализации изобретения, период полувыведения химерного белка данного изобретения становится, по меньшей мере в около 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40 раз более продолжительным, чем период полувыведения FVIII дикого типа в мышах с двойным нокаутом по FVIII и ФВ.
В определенных вариантах реализации изобретения химерный белок демонстрирует период полувыведения около 40 ч у мышей.
В некоторых вариантах реализации изобретения период полувыведения химерного белка является более продолжительным, чем период полувыведения FVIII, соединенного с эндогенным ФВ. В других вариантах реализации изобретения период полувыведения химерного белка является, по меньшей мере в около 1,5 раза, в 2 раза, в 2,5 раза, в 3,5 раза, в 3,6 раза, в 3,7 раза, в 3,8 раза, в 3,9 раза, в 4,0 раза, в 4,5 раза или в 5,0 раза большим чем период полувыведения FVIII дикого типа или белка FVIII, связанного с эндогенным ФВ.
В некоторых вариантах реализации изобретения в результате реализации изобретения период полувыведения химерного белка является продленным по сравнению с белком FVIII без белка ФВ или FVIII дикого типа. Период полувыведения химерного белка изобретения является по меньшей мере в около 1,5 раза, по меньшей мере в около 2 раза, по меньшей мере в около 2,5 раза, по меньшей мере в около 3 раза, по меньшей мере в около 4 раза, по меньшей мере в около 5 раз, по меньшей мере в около 6 раз, по меньшей мере в около 7 раз, по меньшей мере в около 8 раз, по меньшей мере в около 9 раз, по меньшей мере в около 10 раз, по меньшей мере в около 11 раз или по меньшей мере в около 12 раз более продолжительным, чем период полувыведения химерного белка без белка ФВ или FVIII дикого типа. В одном варианте реализации изобретения период полувыведения FVIII является в от около 1,5 раза до около 20 раз, в от около 1,5 раза до около 15 раз или в от около 1,5 раза до около 10 раз более продолжительным, чем период полувыведения FVIII дикого типа. В другом варианте реализации изобретения период полувыведения FVIII продлевается в от около 2 раз до 10 раз, от около 2 раз до около 9 раз, от около 2 раз до около 8 раз, от около 2 раз до около 7 раз, от около 2 раз до около 6 раз, от около 2 раз до около 5 раз, от около 2 раз до около 4 раз, от около 2 раз до около 3 раз, от около 2,5 раз до около 10 раз, от около 2,5 раз до около 9 раз, от около 2,5 раз до около 8 раз, от около 2,5 раз до около 7 раз, от около 2,5 раз до около 6 раз, от около 2,5 раз до около 5 раз, от около 2,5 раз до около 4 раз, от около 2,5 раз до около 3 раз, от около 3 раз до около 10 раз, от около 3 раз до около 9 раз, от около 3 раз до около 8 раз, от около 3 раз до 7 раз, от около 3 раз до около 6 раз, от около 3 раз до около 5 раз, от около 3 раз до около 4 раз, от около 4 раз до около 6 раз, от около 5 раз до около 7 раз или от около 6 раз до около 8 раз по сравнению с FVIII дикого типа или белка FVIII без белка ФВ. В других вариантах реализации изобретения период полувыведения химерного белка изобретения составляет, по меньшей мере около 17 ч, по меньшей мере около 18 ч, по меньшей мере около 19 ч, по меньшей мере около 20 ч, по меньшей мере около 21 ч, по меньшей мере около 22 ч, по меньшей мере около 23 ч, по меньшей мере около 24 ч, по меньшей мере около 25 ч, по меньшей мере около 26 ч, по меньшей мере около 27 ч, по меньшей мере около 28 ч, по меньшей мере около 29 ч, по меньшей мере около 30 ч, по меньшей мере около 31 ч, по меньшей мере около 32 ч, по меньшей мере около 33 ч, по меньшей мере около 34 ч, по меньшей мере около 35 ч, по меньшей мере около 36 ч, по меньшей мере около 40 ч, по меньшей мере около 48 ч, по меньшей мере около 60 ч, по меньшей мере около 72 ч, по меньшей мере около 84 ч, по меньшей мере около 96 ч или по меньшей мере около 108 ч. В еще других вариантах реализации изобретения период полувыведения химерного белка изобретения составляет от около 15 ч до около двух недель, от около 16 ч до около одной недели, от около 17 ч до около одной недели, от около 18 ч до около одной недели, от около 19 ч до около одной недели, от около 20 ч до около одной недели, от около 21 ч до около одной недели, от около 22 ч до около одной недели, от около 23 ч до около одной недели, от около 24 ч до около одной недели, от около 36 ч до около одной недели, от около 48 ч до около одной недели, от около 60 ч до около одной недели, от около 24 ч до около шести дней, от около 24 ч до около пяти дней, от около 24 ч до около четырех дней, от около 24 ч до около трех дней, или от около 24 ч до около двух дней.
В некоторых вариантах реализации изобретения средний период полувыведения химерного белка изобретения на субъект составляет около 15 ч, около 16 ч, около 17 ч, около 18 ч, около 19 ч, около 20 ч, около 21 ч, около 22 ч, около 23 ч, около 24 ч (1 день), около 25 ч, около 26 ч, около 27 ч, около 28 ч, около 29 ч, около 30 ч, около 31 ч, около 32 ч, около 33 ч, около 34 ч, около 35 ч, около 36 ч, около 40 ч, около 44 ч, около 48 ч (2 дня), около 54 ч, около 60 ч, около 72 ч (3 дня), около 84 ч, около 96 ч (4 дня),
- 101 044115 около 108 ч, около 120 ч (5 дней), около шести дней, около семи дней (одну неделю), около восьми дней, около девяти дней, около 10 дней, около 11 дней, около 12 дней, около 13 дней или около 14 дней.
В дополнение, изобретение обеспечивает способ лечения или профилактики геморрагического заболевания или расстройства, включающий введение эффективного количества химерного белка. В одном варианте реализации изобретения геморрагическое заболевание или расстройство выбрано из группы, состоящей из кровотечения, вызванного нарушением свертываемости крови, гемартроза, мышечного кровотечения, кровотечения полости рта, кровоизлияния, мышечного кровоизлияния, кровоизлияния полости рта, травмы, травмы головы, желудочно-кишечного кровотечения, внутричерепного кровоизлияния, внутрибрюшного кровоизлияния, внутригрудного кровоизлияния, перелома костей, кровотечения центральной нервной системы, кровотечения в заглоточном пространстве, кровотечения в забрюшинном пространстве и кровотечения во влагалище подвздошно-поясничной мышцы. В конкретном варианте реализации изобретения геморрагическое заболевание или расстройство является гемофилией А.
Химерный белок, содержащий последовательность XTEN и константную область ИГ или ее часть в комбинации с белком ФВ, описанным в настоящем документе, который предотвращает или ингибирует взаимодействие белка FVIII с эндогенным ФВ, полученным при помощи данного изобретения, имеет множество применений, как будет признано специалистом в данной области техники, в том числе, но не ограничиваясь способами лечения субъекта, имеющего гемостатическое расстройство и способами лечения субъекта, нуждающегося в общем кровоостанавливающем средстве. В одном варианте реализации изобретение относится к способу лечения субъекта, имеющего гемостатическое расстройство, включающему введение эффективного количества химерного белка.
Часть белка фактора FVIII в химерном белке лечит или предотвращает гемостатическое расстройство, выступая в качестве кофактора к фактору IX на отрицательно заряженной поверхности фосфолипида, тем самым формируя комплекс Xase. Связывание активированных факторов свертывания крови на фосфолипидной поверхности локализует этот процесс в местах повреждения сосудов. На фосфолипидной поверхности, фактор VIIa увеличивает максимальную скорость активации фактора X под действием фактора IXa в около 200000 раз, что приводит ко второму большому импульсу образования тромбина.
Химерный белок изобретения может быть использован для лечения любого гемостатического расстройства. Гемостатические расстройства, которые можно лечить с помощью введения химерного белка изобретения включают в себя, но без ограничений, гемофилию А, а также дефициты или структурные аномалии, относящиеся к фактору VIII. В одном варианте реализации изобретения гемостатическое расстройство является гемофилией А.
Химерный белок изобретения может быть использован в профилактических целях для лечения субъекта с гемостатическим расстройством. Химерный белок изобретения может быть использован для лечения острого эпизода кровотечения у субъекта с гемостатическим расстройством. В другом варианте реализации изобретения гемостатическое расстройство может быть результатом дефектного фактора свертывания крови, например, фактора фон Виллебранда. В одном варианте реализации изобретения гемостатическое расстройство представляет собой наследственное расстройство. В другом варианте реализации изобретения гемостатическое расстройство представляет собой приобретенное расстройство. Приобретенное расстройство может возникнуть в результате лежащего в основе вторичного заболевания или состояния. Состоянием, не связанным с заболеванием может быть, в качестве примера, но не в качестве ограничения, рак, аутоиммунное заболевание или беременность. Приобретенное расстройство может возникнуть в результате старости или от лекарств для лечения, лежащего в основе вторичного расстройства (например, химиотерапии рака).
Изобретение также относится к способам лечения субъекта, который не имеет врожденного гемостатического расстройства, но имеет вторичное заболевание или состояние, приводящее к приобретению гемостатического расстройства, например, из-за развития анти-FVIII антитела или хирургического вмешательства. Таким образом, изобретение относится к способу лечения субъекта, нуждающегося в общем кровоостанавливающем средстве, включающем введение терапевтически эффективного количества химерного белка, полученного настоящими способами.
Настоящее изобретение также относится к способам снижения иммуногенности FVIII или индуцирования меньшей иммуногенности против FVIII, включающим введение эффективного количества химерных белков описанных в данном документе, или полинуклеотидов, кодирующие то же самое.
В одном варианте реализации изобретения субъект, нуждающийся в общем кровоостанавливающем средстве, подвергается хирургическом вмешательству или собирается перенести хирургическое вмешательство. Химерный белок изобретения может быть введен до, во время или после операции в качестве профилактического курс лечения. Химерный белок изобретения может быть введен до, во время или после операции для контроля эпизода острого кровотечения.
Химерный белок изобретения может быть использован для лечения субъекта, имеющего эпизод острого кровотечения и не имеющего гемостатическое расстройство. Эпизод острого кровотечения может возникнуть в результате тяжелой травмы, например, операции, автомобильной аварии, раны, рваной раны в результате ружейного выстрела или любого другого травматического события, приводящего к неконтролируемому кровотечению. Не ограничивающие примеры эпизодов кровотечения включают на
- 102 044115 рушение свертываемости крови, гемартроз, мышечное кровотечение, кровотечение полости рта, кровоизлияние, мышечное кровоизлияние, кровоизлияние полости рта, травму, травму головы, желудочнокишечное кровотечение, внутричерепное кровоизлияние, внутрибрюшное кровоизлияние, внутригрудное кровоизлияние, перелом костей, кровотечение центральной нервной системы, кровотечение в заглоточном пространстве, кровотечение в забрюшинном пространстве, кровотечение во влагалище подвздошнопоясничной мышцы и их любые комбинации.
В профилактическом применении одна или более композиций, содержащих химерный белок настоящего изобретения, или их смесь, вводятся пациенту, который еще не находится в болезненном состоянии для повышения сопротивляемости пациента или уменьшения симптомов, связанных с заболеванием или расстройством. Такое количество определяется как профилактически эффективная доза. В терапевтических целях иногда требуются относительно высокие дозы (например, от около 1 до 400 мг/кг полипептида на дозу, при дозах от 5 до 25 мг, являются более широко используемыми для радиоиммуноконьюгатов и более высокие дозы для полипептидов, модифицированных цитотоксическим лекарственным веществом) через относительно короткие промежутки времени до снижения прогрессирования заболевания или его прекращения, и до тех пор, пока пациент не показывает частичное или полное облегчение симптомов заболевания. После этого пациенту может вводиться профилактический режим.
В некоторых вариантах реализации изобретения химерный белок или композицию данного изобретения используют для лечения при необходимости, которое включает лечение острого эпизода кровотечения, гемартроза, мышечного кровотечения, кровотечения из полости рта, кровоизлияния, кровоизлияния в мышцах, внутриротового кровотечения, травмы, травмы головы (черепно-мозговой травмы), желудочно-кишечного кровотечения, внутричерепного кровоизлияния, внутрибрюшного кровоизлияния, внутригрудного кровоизлияния, перелома костей, кровотечения в центральной нервной системе, кровоизлияния в заглоточном пространстве, кровоизлияния в забрюшинном пространстве или кровотечение во влагалище подвздошно-поясничной мышцы. Субъект может, нуждается в хирургической профилактике, периоперационном ведении или уходе для хирургического вмешательства. Такие операции включают в себя, например, небольшие операции, обширное хирургическое вмешательство, удаление зуба, миндалин, паховое грыжесечение, синовэктомию, полную замену коленного сустава, трепанацию черепа, остеосинтез, травматологию, внутричерепную хирургию, внутрибрюшную хирургию, внутригрудную хирургию или операции по протезированию сустава.
В одном варианте реализации изобретения химерный белок настоящего изобретения вводят внутривенно, подкожно, внутримышечно или через любую поверхность слизистой оболочки, например, орально, сублингвально, трансбуккально, назально, ректально, вагинально или ингаляционным путем. Химерный белок, содержащий фрагмент ФВ и белка FVIII настоящего изобретения, может быть внедрен внутрь или связан с биополимерной твердой подложкой, которая позволяет медленное выделение химерного белка к месту кровотечения или внедрение в бандаж/перевязку. Доза химерного белка будет варьировать в зависимости от субъекта и от конкретного способа введения. Дозы могут варьировать от 0,1 до 100000 мкг/кг веса тела. В одном варианте реализации изобретения диапазон дозирования составляет 0,1-1000 мкг/кг. В другом варианте реализации изобретения диапазон дозирования составляет 0,1500 мкг/кг. Белок можно вводить непрерывно или через определенные промежутки времени. In vitro тесты могут быть использованы для определения оптимальных диапазонов доз и/или графиков для введения. In vitro тесты, которые измеряют активность фактора свертывания крови, известны в данной области, например, STA-CLOT VIIa-rTF клоттинговый тест или ROTEM клоттинговый тест. Кроме того, эффективные дозы могут быть экстраполированы из кривых доза-эффект, полученных на животных моделях, например, собаке, больной гемофилией (Mount со соавт. 2002, Blood 99(8):2670).
Теперь, детально описав настоящее изобретение, то же самое будет более четко понято при ссылке на следующие примеры, которые при сем включены только с целью иллюстрации и не предназначены для ограничения данного изобретения. Все патенты, публикации и статьи, упомянутые в данном документе, являются прямо и конкретно включенными в настоящий документ в качестве ссылки.
Примеры
Во всех примерах были использованы следующие материалы и методы, если не указано другое.
Материалы и методы.
В основном, если не указано другое, на практике настоящего изобретения используются обычные методы химии, биофизики, молекулярной биологии, технологии рекомбинантной ДНК, иммунологии (в частности, например, технология антитела), и стандартные методы электрофореза. См., например,
- 103 044115
Sambrook, Fritsch and
Maniatis, Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989 год); Antibody
Engineering Protocols (Methods in Molecular Biology), 510, Paul, S., Humana Pr (1996 год);
Antibody Engineering: A Practical Approach (Practical Approach Series, 169), McCafferty,
Изд., Irl Pr (1996 год); Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow co coaem.., CS.H.L. Press,
Pub. (1999 год); и Current Protocols in Molecular Biology, изд. Ausubel co coaem.., John
Wiley & Sons (1992 год).
Пример 1. Гетеродимеры FVIII-XTEN-Fc/D'D3-XTEN-Fc.
Настоящее изобретение относится к получению химерной молекулы FVIII, соединенной с доменом D'D3 белка фактора фон Виллебранда (ФВ) через Fc-домен IgG. Прикрепленный домен D'D3 предотвращает взаимодействие FVIII с эндогенными ФВ мультимерами. Эта молекула служит платформой для включения других технологий продления полужизни с целью улучшения фармакокинетики химерного белка. Последовательности XTEN были включены в домен В FVIII и между D'D3 и регионом Fc для увеличения периода полувыведения гетеродимера FVIII/ФВ.
Сайт расщепления тромбином между D'D3 и Fc обеспечивает высвобождение домена D'D3 после активации молекулы FVIII тромбином.
Пример 2. Плазмидная конструкция гетеродимеров FVIII-XTEN-Fc/D'D3-Fc Клонирование тройной мутации ФВ050- IHH в ФВ031.
Тройная мутация IHH в Fc препятствует взаимодействию с FcRn, таким образом, молекула, содержащая Fc, не используется повторно по пути FcRn. Тремя мутациями в Fc являются I253 А, Н310А, Н435А.
ФВ050 был создан путем замены региона Fc плазмиды ФВ031 с Fc-фрагментом, содержащим тройную мутацию IHH между сайтами рестрикции RsRII и Not 1.
Клонирование ФВ057- Клонирование ФВ-Fc с 144 АЕ XTEN +35 а.к. расщепляемого тромбином линкера.
Олигонуклеотиды.
ESC 155-Олигонуклеотид для 144 АЕ XTEN в ФВ034-rev
CCCCGCCACCGGATCCCCCGCCACCGGATCCCCCGCCACCGGATCCCCCGCC
ACCGGAACCTCCACCGCCGCTCGAGGCACCTTCTTCAGTGCTGGTGGGCGAGCCCGC
TGGTGACCCTTCCTC
ESC 155-Олигонуклеотид для 144 АЕ XTEN- GS линкер в ФВ034-rev
GGGGAAGAGGAAGACTGACGGTCCGCCCAGGAGTTCTGGAGCTGGGCACGG
TGGGCATGTGTGAGTTTTGTCGCCTCCGCTGCCCCGGGGGACCAGGGATCCCCCGCC
ACCGGATCCCCCGCCACCGGATCCCCCGCCACCGGATCCCCCGCC
ESC 157-Олигонуклеотид для 144 АЕ XTEN в ФВ031-Fwd
GTGAAGCCTGCCAGGAGCCGATATCGGGCGCGCCAACATCAGAGAGCGCCA
CCCCTGAAAGTGGTCCCGGGAGCGAGCCAGC
Для получения 144 AE-XTEN + 35 а.к. GS линкера с сайтом расщепления тромбином была дважды проведена ПЦР.
Первая реакция ПЦР проводилась с использованием кодирующей ДНК 144- АЕ XTEN в качестве матрицы и пары праймеров ESC157/ ESC155. Полученный в результате этой реакции ПЦР-продукт длиной около 550 п. н. использовался в качестве матрицы для второй ПЦР-реакции, и был амплифицирован с помощью пары праймеров ESC 157/156. Эта реакция дала продукт длиной ~ 700 п. н. Этот ПЦРпродукт длиной 700 п. н. и плазмида ФВ034 затем обрабатывались с EcoRV-HF и RsRII. Каркас плазмиды от расщепленного.
ФВ034 затем использовался для лигирования 700 п. н. ПЦР-продукта.
Клонирование тройной мутации ФВ058- IHH в ФВ034.
Тройная мутация IHH в Fc препятствует взаимодействию с FcRn, таким образом, молекула, содержащая Fc, не используется повторно по пути FcRn. Тремя мутациями в Fc являются I253 А, Н310А, Н435 А.
ФВ058 был создан путем замены региона Fc плазмиды ФВ034 с Fc-фрагментом, содержащим тройную мутацию IHH между сайтами рестрикции RsRII и Not 1.
Клонирование FVIII-263- FVIII 205 с тройной мутацией IHH.
Тройная мутация IHH в Fc препятствует взаимодействию с FcRn, таким образом, молекула, содержащая Fc, не используется повторно по пути FcRn. Тремя мутациями в Fc являются I253 А, Н310А, Н435А.
FVIII-263 был создан путем замены региона Fc плазмиды FVIII 205 с Fc-фрагментом, содержащим
- 104 044115 тройную мутацию IHH между сайтами рестрикции RsRII и Not 1.
Клонирование FVIII-282- FVIII-Fc с 144 АЕ XTEN в домене В.
ESC 158-Олигонуклеотид для 144 АЕ XTEN в домене B-fwd
AAGAAGCTTCTCTCAAAACGGCGCGCCAACATCAGAGAGCGCCACCCCTGAAAGTG
GTCCCGGGAGCGAGCCAGCCACATCTGGGTCGGAAACGCCAGGC
ESC 159-Олигонуклеотид для 144 АЕ XTEN в домене В-rev
GGTATCATCATAATCGATTTCCTCTTGATCTGACTGAAGAGTAGTACGAGTTATTTC
AGCTTGATGGCGTTTCAAGACTGGTGGGCTCGAGGCACCTTCTTCAGTGCTGGTGGG
CGAGCCCGCTGGTGACCCTTCCTCAGTGGACGTAGG
Первая реакция ПНР проводилась с использованием кодирующей ДНК 144-АЕ XTEN в качестве матрицы и пары праймеров ESC158/ESC159. Из этой реакции получается ПЦР-продукт длиной около 550 п. н., а плазмида FVIII 169 затем обрабатывается с ASCii и Cla1. Плазмидный каркас от расщепленного FVIII 169 затем используется для лигирования 550 п. н. продукта ПЦР для получения FVIII 282.
Клонирование FVIII-283- FVIII169 с тройной мутацией IHH.
Тройная мутация IHH в Fc препятствует взаимодействию с FcRn, таким образом, молекула, содержащая Fc, не используется повторно по пути FcRn. Тремя мутациями в Fc являются I253 А, Н310А, Н435А.
FVIII-283 был создан путем замены региона Fc плазмиды FVIII 169 с Fc-фрагментом, содержащим тройную мутацию IHH между сайтами рестрикции RsRII и Not 1.
Пример 3. Получение FVIII-XTEN-Fc/D'D3-XTEN-Fc в клетках HEK293.
Фиг. 2. Схематическое изображение, иллюстрирующее экспрессию конструкта FVIII-XTENFc/D'D3-XTEN-Fc. С использованием Полиэтиленимина (ПЭИ) была сделана контрансфекция трех плазмид в клетках HEK293. Первая плазмида получает экспрессию FVIII-XTEN-Fc, вторая плазмида экспрессирует D1D2D'D3-XTEN-Fc, и третья плазмида экспрессирует РАСЕ/фурин, который требуется для ферментативного удаления пропептида, то есть, домена D1D2 из D1D2D'D3-XTEN-Fc. Продукты этой трехплазмидной системы экспрессии включают гетеродимер FVIII-XTEN-Fc/D'D3-XTEN-Fc, гомодимер D'D3-XTEN-Fc и следы гемизиготно выглядящих видов FVIII-XTEN-Fc.
Пример 4. Очистка гетеродимеров FVIII-XTEN-Fc/D'D3-XTEN-Fc.
С целью очистки гетеродимеров FVIII-XTEN-Fc/D'D3-XTEN-Fc для первой концентрации кондиционированной среды в 10 раз, используется стадия тангенциальной поточной фильтрации (ТПФ). Продукты в фильтрате затем дополнительно очищаются с использованием аффинной хроматографии с последующей обессоливающей колонкой. Чистота молекулы является приемлемой по эксклюзионной ВЭЖХ и дополнительно подтверждается с помощью Вестерн-блоттинга. Специфическая активность молекулы сопоставима с доменом В удаленного FVIII, как измеряется с помощью анализа активности FVIII (пример 5) и измерения ОП280.
Пример 5. Специфическая активность гетеродимеров FVIII-XTEN-Fc/D'D3-XTEN-Fc.
Активность гетеродимеров FVIII-XTEN-Fc/D'D3-XTEN-Fc измеряется с помощью хромогенного анализа FVIII и анализа активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ) FVIII. Специфическая хромогенная активность и специфическая активность АЧТВ SQ BDD-FVIII, rFVIШ69/ФВ034 и rFVШ169/ФВ057 изложены в табл. 16. По сравнению с SQ BDD-FVIII, мы наблюдали сопоставимые специфические хромогенные виды деятельности и 60 % сокращение специфической активности АЧТВ для rFVIШ69/ФВ034 и rFVШ169/ФВ057.
Таблица 16
Специфическая активность гетеродимерных вариантов
FVIII SQ BDD-FVIII rFVIII169/OB034 rFVIII160/OB057
Специфическая хромогенная активность (МЕ/пмоль) 0,9 - 2,0 1,1-1,2 0,8-1,6
Специфическая активность АЧТВ (МЕ/пмоль) 0,75-1,7 0,4 0,3-0,6
Хромогенный анализ FVIII.
Активность FVIII измерялась с использованием набора COATEST SP FVIII из DiaPharma (продукция
- 105 044115 #: K824086), все инкубирования были выполнены на 37°С пластинчатом нагревателе при встряхивании.
Восьмой Международный Стандарт Свертывания Крови Фактора VIII:C ВОЗ, Концентрат, с кодовым именем 07/350 используется в качестве анализа стандарта, диапазон стандарта был от 100 мМЕ/мл до 0,78 мМЕ/мл. Контроль объединенного анализа нормальной человеческой плазмы и тестируемые образцы (разведенные буфером 1X Coatest) добавляются в 2HB 96-луночные плашки Immulon в двух повторах (25 мкл/лунка). Свежеприготовленная смесь IXa/FX/Фосфолипид (50 мкл), 25 мкл 25 мМ CaCl2, и 50 мкл субстрата FXa последовательно добавлялись в каждую лунку с 5-минутной инкубацией между каждым добавлением. После инкубирования с субстратом, для окончания цветной реакции добавлялись 25 мкл 20% уксусной кислоты, поглощение OD405 измерялось с помощью прибора SpectraMax плюс (Молекуляр Девайсес). Данные анализировались с помощью программного обеспечения SoftMax Pro (версия 5.2). Нижний предел количественного определения (НПКО) составляет 7,8 мМЕ/мл.
Анализ АЧТВ FVIII.
Анализ АЧТВ FVIII осуществлялся на анализаторе коагуляции Sysmex СА-1500 следующим образом: Сначала 50 мкл вручную разбавленных образцов, стандартов и Контролей в АЧТВ буфере (50 мМ Трис, 100 мМ NaCl, 1% ЧСА, pH 7,4) добавлялись прибором в реакционную кювету, с последующим добавлением 50 мкл FVIII-дефицитной плазмы (Джордж Кинг Био-Медикал, продукт #: 0800). После инкубации при температуре 37°С в течение 1 мин, 50 мкл реагента АЧТВ (активированный реагент цефалопластина Actin® FSL - Дейд Беринг, ссылка # В4219-2) добавлялись к реакционной смеси, и инкубировались при 37°С в течение 4-х мин. Впоследствии, добавлялись 50 мкл 20 мМ CaCl2 (Дейд Беринг, ссылка # ORFO37), и реакционная кювета немедленно переносилась в одну из четырех позиций канала спектрофотометра для измерения количества преломленного света в смеси, которое, с помощью программного алгоритма прибора, конвертировалось в возникновение свертываемости. Зафиксированное время свертывания крови было отрезком времени от добавления CaCl2 до наступления образования сгустка. Анализ стандарта генерируется путем разбавления Восьмого Международного Стандарта FVIII ВОЗ в буфере АЧТВ в диапазоне от 100 мМЕ/мл до 0,78 мМЕ/мл. Калибровочная кривая была построена как время свертывания крови (в секундах) в виде Y-оси в сравнении с логарифмом (база 10) активности FVIII (мМЕ/мл) в виде Х-оси в MS Excel, активность отдельных образцов рассчитывалась с использованием формулы для линейной регрессии этой калибровочной кривой. На основе проведения анализа, нижний предел количественного определения (НПКО) составлял 7,8 мМЕ/мл.
Пример 6. Аддитивный эффект вставок XTEN на продление периода полувыведения гетеродимера.
Вставки XTEN были включены в гетеродимеры для продления периода полувыведения. Вставка одной аминокислоты (а.к.) 288 AE-XTEN в домене В FVIII приводит к периоду полувыведения гетеродимера длительностью 16,7 ч у мышей с гемофилией А, как демонстрируется rFVΠΠ69/ФВ031 на фиг. 3. Для дальнейшего улучшения периода полувыведения гетеродимера, вторая вставка XTEN длиной 144 а.к. или 288 а.к. была включена в FVIII169/OB031 как в домен A1 FVIII, так и непосредственно вниз по течению фрагмента D'D3, соответственно, варианты гетеродимера были названы FVШ205/ФВ031 и FVИI169/ФВ034.
Периоды полувыведения rFVIШ69/ФВ031, rFVШ205/ФВ031 и rFVIШ69/ФВ034 оценивались на FVIII-дефицитных (HemA) мышах путем однократного внутривенного введения тестируемых молекул в дозе 200 МЕ/кг. Образцы плазмы собирались в определенных временных точках, как показано на фиг. 3, FVIII активность образцов определялась с помощью хромогенного анализа FVIII, параметры ФК рассчитывались с использованием программы WinNonlin-Phoenix и перечислены в табл. 17.
Как показано на фиг. 3 и табл. 17, добавление второй вставки XTEN как в домен A1 FVIII, так и вниз по течению D'D3 дополнительно улучшает период полувыведения гетеродимера на 29,45 или 31,10, соответственно. Кроме того, обе вставки XTEN демонстрировали более чем 2-х кратное улучшение клиренса и AUC.
Таблица 17
Параметр ФК гетеродимеров мышей HemA
FVIII Вставки XTEN Т 1/2 (ч) MRT (ч) С1 (мл/ч/кг) Vss (мл/кг) AUC_D (кг*ч/мл)
Встраива ние 1 Встраивай ие 2
rFVIII169/OB031 В*-АЕ288 16,65 18,44 3,57 85,72 0,28
rFVIII205/OB031 В*-АЕ288 А1-АЕ144 29,45 36,02 1,76 63,56 0,57
rFVIII169/OB034 В*-АЕ288 D’D3- АЕ288 31,10 34,57 1,73 59,77 0,58
Пример 7. 144 а.к. AE-XTEN предоставляет лучший период полувыведения чем 288 а.к. AE-XTEN при вставке между доменами D'D3 и Fc.
Другой гетеродимер-FVIШ69/ФВ057 был сконструирован в попытке определения оптимальной
- 106 044115 длины вставки XTEN в цепи D'D3-XTEN-Fc, в которой длина вставки XTEN была уменьшена с 288 а.к. до 144 а.к. Как показано на фиг. 4, по сравнению с rFVШ169/ФВ034, период полувыведения гFVΠΠ69/ФВ057 был увеличен с 31 ч до 42 ч. Улучшенный клиренс и AUC также наблюдаются для гFVΠΠ69/ФВ057, данные приведены в табл. 18. Таким образом, при вставке между D'D3 и доменом Fc гетеродимеров FVIII-XTEN-Fc/D'D3-XTEN-Fc, 144 а.к. вставка AE-XTEN является более оптимальной, чем АЕ-288 а.к. XTEN.
Таблица 18
Параметры ФК гFVШ169/ФВ034 и гFVШ169/ФВ057 в мышах HemA
FVIII Т 1/2 (ч) MRT (ч) С1 (мл/ч/кг) Vss (мл/кг) AUC_D (кг*ч/мл)
гРУШ169/ФВ034 31,10 34,57 1,73 59,77 0,58
rFVIIIl 69/ФВ057 42,23 53,24 0,97 51,44 1,03
Пример 8. Домен Fc продлевает период полувыведения гетеродимера.
Домены Fc продлевают период полувыведения их слитых белков путем FcRn-опосредованного пути рециркуляции. С целью подтверждения необходимости домена Fc для продолжения периода полувыведения гетеродимера, Fc-домены дикого типа были заменены тройным мутантом (I253A/H310A/H435A; IHH) в гFVШ205/ФВ031 с образованием гFVШ263/ФВ050, полное устранение связывания FcRn было подтверждено с помощью анализа Поверхностного Плазмонного Резонанса (Биакор) для гFVШ263/ФВ050. Период полувыведения FVШ263/ФВ050 оценивался у мышей HemA по сравнению с гFVШ205/ФВ031. Как показано на фиг. 5 и в табл. 19, улучшенная скорость клиренса, также как и уменьшенный период полувыведения и AUC, наблюдались для гFVШ263/ФВ050. Этот результат демонстрировал, что в дополнение к обеспечению ковалентного связывания FVIII и D'D3, домены Fc также являются необходимыми для улучшения периода полувыведения гетеродимера.
Таблица 19
Параметры ФК гFVШ205/ФВ031 и гFVШ263/ФВ040 в мышах HemA
FVIII Мутация в домене Fc т 1/2 (ч) MRT (ч) С1 (мл/ч/кг) Vss (мл/кг) AUC_D (кг*ч/мл)
гРУШ205/ФВ031 Отсутствие 29,45 36,02 1,76 63,56 0,57
гРУШ263/ФВ050 IHH 22,96 26,15 2,36 61,69 0,42
Пример 9. Мгновенная эффективность гетеродимеров FVIII-XTEN-Fc/D'D3-XTEN-Fc на модели кровотечения хвоста мышей HemA.
Мгновенная эффективность лидирующих кандидатов гетеродимеров оценивалась с использованием модели кровотечения хвоста мышей HemA.
Самцы мышей HemA в возрасте 8-12 недель рандомизпровались на 4 лечебные группы и подвергались одному внутривенному введению SQ BDD-FVIII, гFVΠΠ69/ФВ034, гFVШ169/ФВ057 или раствора наполнителя, соответственно. В целях имитирования эпизодического лечения FVIII (для воссоздания 50100% от нормального уровня плазматического FVIII), выбранная доза лечения FVIII составляет 75 МЕ/кг, как измерено активностью АЧТВ FVIII. При такой величине дозы, все тестируемые варианты FVIII будут воспроизводить ~70% от нормальной активности мышиного плазматического FVIII, по истечении 5 мин после введения дозы.
Объем потери крови каждого отдельного животного в исследовании отображен на графике, на фиг. 6. Значительное снижение объема потери крови наблюдалось для всех групп лечения FVIII по сравнению с животными, которые обрабатывались наполнителем. В пределах трех групп лечения FVIII, не было обнаружено статистически значимых отличий в снижении потери крови, предполагая что молекулы гетеродимеров могут потенциально быть такими же эффективными как SQ BDD-FVIII для лечения при необходимости.
Объем потери крови каждого отдельного животного в исследовании отображен на графике, на фиг. 6. Значительное снижение объема потери крови наблюдалось для всех групп лечения FVIII по сравнению с животными, которые обрабатывались наполнителем. В пределах трех групп лечения FVIII, не было обнаружено статистически значимых отличий в снижении потери крови, предполагая что молекулы гетеродимеров могут потенциально быть такими же эффективными как SQ BDD-FVIII для лечения при необходимости.
Кроме того, мыши HemA обрабатывались более низкой дозой (37,5 МЕ/кг) rBDD-FVIII или FVШ169/ФВ034, результаты проиллюстрированы на фиг. 6В. Как и при дозе 75 МЕ/кг, гFVΠΠ69/ФВ034 обеспечивали такую же защиту для мышей HemA после повреждения хвоста, что и BDD-FVIII, показывая тем самым, что молекула по-прежнему является эффективной для лечения тяжелых эпизодов кровотечений при ~35% от нормального циркулирующего мышиного уровня FVIII в мышах HemA.
- 107 044115
Процедура повреждения хвоста проводилась следующим образом.
Кратко, мыши анестезировались с помощью коктейля 50 мг/кг кетамина/0,5 мг/кг дексмедетомидина до начала повреждения хвоста и помещались на электрическую грелку 37°С, чтобы помочь поддержать температуру тела. Хвосты мышей затем погружались в 37°С физиологический раствор в течение 10 мин, с целью расширения боковой вены. После того, как вена расширялась, через хвостовую вену вводились варианты FVIII или раствор наполнителя, а по истечении 5 мин после введения дозы, дистальные 5 мм хвоста отрезались с использованием скальпеля с прямым краем #11. Пролитая кровь собиралась в 13 мл 37°С физиологического раствора в течение 30 мин, а объем кровопотери определялся изменением веса трубки для сбора крови: объем потери крови=(конечный вес трубки для сбора крови - начальный вес +0,10) мл. Статистический анализ проводился с использованием t-критерия (критерий Манна-Уитни) и одним из способов дисперсионного анализа (критерий Краскела-Уоллиса, апостериорный: критерий множественного сравнения Данна).
Пример 10. Профилактическая эффективность гетеродимеров FVIII-XTEN-Fc/D'D3-XTEN-Fc на модели кровотечения разрезанной хвостовой вены мыши HemA.
Профилактическая эффективность FVШ169/ФВ057 была проверена на модели разрезанной хвостовой вены (tail vein transection - TVT) мыши HemA. TVT модель индуцирует кровотечение путем повреждения боковой вены хвоста мыши, такое повреждение имитирует спонтанные эпизоды кровотечения у пациентов с гемофилией (нарушением свертываемости крови).
Самцы мышей HemA в возрасте 8-10 недель рандомизировались в 4 лечебные группы, и обрабатывались либо FVШ169/ФВ057 за 72 ч до повреждения хвостовой вены, или SQ BDD-FVIII за 24 ч или 48 ч до повреждения. Животные, которые обрабатывались наполнителем, использовались в качестве отрицательного контроля. На графике, на фиг. 7 отображены случаи повторного кровотечения или эвтаназии изза чрезмерной потери крови в течение 24 ч после повреждения.
Как проиллюстрировано на фиг. 7, в отличие от мышей, которых обрабатывали SQ BDD-FVIII за 48 ч до TVT, у которых после повреждения наблюдалась лишь ограниченная защита, мыши, получавшие rFVШ169/ФВ057 за 72 ч до повреждения хвоста имели аналогичную защиту от повторного кровотечения и выживаемость по сравнению с мышами, получавшими SQ BDD-FVIII лечение за 24 ч до TVT, что означает, что rFVШ169/ФВ057 может обеспечить, по меньшей мере в 3 раза или более (например, в 4 раза) длительную защиту мышей HemA в модели TVT. Таким образом, FVШ169/ФВ057 может значительно снизить частоту лечения текущей профилактики FVIII.
Подобным образом мыши HemA обрабатывались гетеродимерами FVIII-XTEN-Fc/D'D3-XTEN-Fc: rFVШ169/ФВ034 и rFVШ169/ФВ057 за 24 ч или 96 ч до повреждения хвостовой вены. Данные о лечении повторного кровотечения и выживаемости были сопоставлены с данными лечения BDD-FVIII за 24 или 48 ч до повреждения и наполнителя. В то время как повторное кровотечение у мышей, получавших rBDD-FVIII, в течение 24 ч до повреждения хвостовой вены, было похожим на такое у мышей, лечившихся носителем, данные о повторном кровотечении мышей, лечившихся гетеродимерами за 24 ч до повреждения, являются значительно лучшими, чем в группе лечения наполнителем. Кроме того, данные повторного кровотечения мышей, лечившихся гетеродимерами, за 96 ч до повреждения были сопоставимы с мышами, получавшими rBDD-FVIII за 24 ч до повреждения. Что касается коэффициента выживаемости через 24 ч после повреждения TVT, в отличие от потребности менее чем 50% коэффициента выживаемости мышей, лечившихся rBDD-FVIII, более чем 90% мышей выжили после повреждения TVT с лечением гетеродимерами FVIII-XTEN-Fc/D'D3-XTEN-Fc, когда молекулы FVIII вводились за 24 ч до повреждения. Кроме того, выживаемость у мышей, получавших гетеродимеры FVIII-XTEN-Fc/D'D3XTEN-Fc за 96 ч до повреждения хвостовой вены была лучше (в случае rFVШ169/ФВ034) или сопоставимой (в случае с rFVШ169/ФВ057) по сравнению с мышами, получавшими лечение rBDD-FVIII за 24 ч до повреждения. Данные и повторного кровотечения и выживаемости указывали на 4-кратную эффективность пролонгации лечения гетеродимером FVIII-XTEN-Fc/D'D3-XTEN-Fc в сравнении с лечением rBDD-FVIII.
Модель разрезанной хвостовой вены мышей HemA.
Процедура разреза хвостовой вены хвоста проводилась следующим образом. Мышей анестезировали коктейлем, содержащим 50 мг/кг кетамина, 0,125 мг/кг дексмедетомидина и 0,1 мг/кг бупренекса. При адекватной глубине наркоза, боковую хвостовую вену мышей разрезали хирургическим скальпелем с прямым краем номер 11 в области, где диаметр хвоста составляет примерно 2,7 мм. Для обеспечения четкого наблюдения за раной, пролитая кровь смывалась теплым физиологическим раствором. Обработанные мыши затем один раз размещались в чистой клетке с подстилкой из белой бумаги на ближайшие 24 ч. Вплоть до 12 ч после повреждения хвоста, у мышей наблюдалось повторное кровотечение хвоста и физическая активность. Умирающие мыши немедленно подвергались эвтаназии, а окончательное наблюдение проводили через 24 ч после повреждения хвоста. Для имитации ситуации кровотечения у пациентов с гемофилией и обеспечения полного восстановления животного от анестезии, 1 мг/кг раствора атипамезола предоставлялся для отмены эффекта дексмедетомидина в начале процедуры рассечения хвостовой вены. С целью ночного обезболивания в конце 12-часового периода наблюдения вводилась дополнительная доза 0,1 мг/кг бупренекса. Кривая выживаемости времени до повторного кровотечения и
- 108 044115 времени до эвтаназии генерировалась для анализа данных, а для статистической оценки использовался логранговый (Кокса-Мантеля) критерий.
Пример 11. Приготовление FVШ169/ФВ059 и других конструктов Клонирование pSYN FVIII 310.
Синтетический ДНК-фрагмент фланкированный сайтом BamH1 на N-конце и сайтом Cla1 на Сконце был коммерчески изготовлен. Эта синтетическая ДНК использовалась для замены региона BamHl на Cla1 в конструкте pSYN FVIII 169 (SEQ ID NO: 155). И синтетическая ДНК и ДНК pSYN FVIII 169 были дважды расщеплены с использованием BamH1 и Cla1, расщепленная синтетическая ДНК встраивалась в расщепленный pSYN FVIII 169 для создания pSYN FVIII 310 (SEQ ID NO:168; табл. 20).
Клонирование pSYN FVIII 312.
Синтетический ДНК-фрагмент фланкированный сайтом BamH1 на N-конце и сайтом Afe 1 на Сконце был коммерчески изготовлен. Эта синтетическая ДНК использовалась для замены BamH1 на регион Afe1 в конструкте pSYN FVIII 169 (SEQ ID NO: 155). И синтетическая ДНК и ДНК pSYN FVIII 169 были дважды расщеплены с использованием BamH1 и Afe1, расщепленная синтетическая ДНК встраивалась в расщепленный pSYN FVIII 169 для создания pSYN FVIII 312 (SEQ ID NO: 169; табл. 20). pSYN FVIII 312A (SEQ ID NO: 2; табл. 20) был создан из pSYN FVIII312 с целью удаления сайта AscI, кодирующего разрыв аминокислотных остатков на стыке FVIII и XTEN.
Таблица 20
Синтетические конструкты FVIII
Конструкт Последовательность белка
pSYN FVIII 169 PRSFSQNGAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEP ATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESA
TPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTS
TEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGTSESATPESGP
GSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGT
STEPSEGSAPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPASSPP
VLKRHQAEITR (SEQ ID NO: 167) (Подчеркнуты = остатки XTEN; не подчеркнуты = остатки FVIII)
pSYN FVIII 310 PRSFGAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATS GSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPES
GPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEE
GTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGS
EPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTE
PSEGSAPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPASSEITR
(SEQ ID NO: 168) (Подчеркнуты = остатки XTEN; не подчеркнуты = остатки FVIII)
pSYN FVIII 312 PRSFSONGAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEP ATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESA
TPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTS
TEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGTSESATPESGP
GSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGT
STEPSEGSAPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPASSEI
- 109 044115
TR (SEQ ID NO: 169) (Подчеркнуты = остатки XTEN; не подчеркнуты = остатки FVIII)
pSYN FVIII 312А PRSFSONGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATS GSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPES
GPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEE
GTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGS
EPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTE
PSEGSAPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPASSEITR
(SEQ ID NO: 2) (подобная последовательность, что иpSYNFVIII 312, удалены только остатки, соответствующие сайту Asci, т.е. разрыву) (Подчеркнуты = остатки XTEN; не подчеркнуты = остатки FVIII)
Клонирование pSYN ФВ059 и ФВ073.
Были созданы различные синтетические фрагменты ДНК, кодирующие различные линкерные регионы между DD3-XTEN и Fc. Эти синтетические фрагменты ДНК фланкированы сайтом ASC1 на Nконце и сайтом Not 1 на С-конце. Эти синтетические ДНК использовались для замены региона Asc1 на Not1 в конструкте pSYN ФВ057 (SEQ ID NO: 152). Конструкт ФВ059 pSYN (табл. 21) содержит линкерный регион (SEQ ID NO: 13), который включает в себя весь кислый регион 2 (а2) FVIII. Как сообщается, этот сайт расщепляется тромбином и при активации FVIII высвобождается DD3XTEN. Конструкт ФВ073 pSYN (табл. 21) содержит только сайт расщепления тромбином кислого региона 2 (а2) FVIII (т.е. IEPRSFS) (SEQ ID NO: 23). И синтетическая ДНК и ДНК pSYN ФВ057 были дважды расщеплены с использованием Asc1 и Not1. Расщепленная синтетическая ДНК встраивалась в расщепленный pSYN ФВ057 для создания pSYN ФВ059 и pSYN ФВ073. Конструкт ФВ59А pSYN (табл. 21) был сформирован из pSYN ФВ059 путем удаления сайта рестрикции EcoRV. Гетеродимерные белки FVIШ69/ФВ057 и FVIШ69/ФВ059 были созданы путем коэкспрессии FVIII169 и ФВ057 или ФВ059 в клетках HEK293.
- 110 044115
Таблица 21
Синтетические конструкты ФВ - регионы расщепляемого линкера
Конструкт Последовательность белка
pSYN ФВ057 TSTEEGASSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSLVPR GSGGDKTH (SEQ ID NO: 12) Выделенная курсивом и подчеркнутая последовательность показывает GS линкер и сайт расщепления тромбином LVPR (также заштрихован).
pSYN ФВ059 TSTEEGASISDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSDKTH (SEQ ID NO: 13) Выделенная курсивом и подчеркнутая последовательность показывает 32 а.к. из кислого региона 2 FVIII (а2). Заштрихованная последовательность показывает сайт расщепления тромбином, используемый в pSYN ФВ059А.
pSYN ФВ059А TSTEEGASSDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSDKTH (SEQ ID NO: 22) Выделенная курсивом и подчеркнутая последовательность показывает 32 а.к. из кислого региона 2 FVIII (а2). Эта последовательность представляет собой аналогичную последовательность для ФВ059, за исключением того, что остатки соответствующие сайту EcoRV (т.е., IS) удалены.
pSYN ФВ073 TSTEEGASSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSIEPRSFSGSG GDKTH (SEQ ID NO: 23) Выделенная курсивом и подчеркнутая последовательность показывает линкер GS с укороченным сайтом расщепления тромбином из кислого региона 2 FVIII (заштрихованные 7 аминокислот-IEPRSFS).
Пример 12. Расщепление гетеродимера FVIII тромбином для анализа высвобождения D'D3 из Fc.
Два гетеродимерных белка FVIII испытывались в экспериментах расщепления тромбином, а также проверялся их уровень расщепления тромбином. Два гетеродимерных конструкта, используемые в данном эксперименте, являлись гетеродимером FVШ169/ФВ057 и гетеродимером FVIШ69/ФВ059 вместе с FVIIIFc. Гетеродимеры FVIШ69/ФВ057 и FVIIH69/OB059 описаны выше. Проводились три реакции расщепления: i) FVIIIFc ii) FVIII169^B057 (фиг. 11), и iii) FVIII 169/ФВ059 (фиг. 12). Образцы для испытаний обрабатывались человеческим а-тромбином при молярном соотношении, если FVIII:tpom6uh приблизительно 22:1. Каждая реакция инкубировалась в водяной бане при 37°С. В каждый указанный момент времени (t=5, 15, 30, 45, 60 мин), изымался образец 22,5 мкл, останавливался с 22,5 мкл 2хДСН красителя в невосстанавливающих условиях, и нагревался в течение 3-х мин. Расщепленный белок затем запускался на геле ДСН-ПААГ. Вестерн-блоттинг проводился с использованием антител против тяжелой цепи FVIII (GMA012) и антител против ФВ-D3 (Ат 96340) с использованием системы LICOR.
Как показано на фиг. 11, экспозиция FVШ169/ФВ057 с тромбином приводит к постепенному снижению детектируемого уровня D'D3-XTEN-Fc, коррелирующего с увеличением уровня D'D3-144 XTEN расщепленного продукта. После 15 мин остается нерасщепленный FVШ169/ФВ057. С другой стороны, фиг. 12 показывает, что FVIII 169/ФВ059 быстрее расщепляется тромбином, о чем свидетельствует практически не обнаруживаемый через 5 мин нерасщепленный FVIII 169/ФВ059. Соответственно, FVIII 169/ФВ059, по сравнению с FVIII 169/ФВ057, показывает лучшее высвобождение D'D3 из Fc при активации тромбина.
Для исследования расщепления тромбином проводились параллельные эксперименты с использованием масс-спектроскопии (МС). С использованием МС, FVIII 169/ФВ059, по сравнению с ФВ057, вновь показал лучшее высвобождение D'D3 из Fc.
Пример 13. In vivo определение FVШ169/ФВ059 в мышах HemA.
Для дальнейшей оценки фармакокинетического профиля и in vivo эффективности FVШ169/ФВ059,
- 111 044115 мыши HemA обрабатывались FVIII 169/ФВ059 путем внутривенного введения при дозе 150 МЕ/кг. Образцы плазмы собирались с помощью взятия крови полой вены через 5 мин, 24, 48, 72, 96 и 120 ч после инъекции. Активность FVIII в образцах плазмы измерялась с помощью хромогенного анализа FVIII, а параметры ФК рассчитывались с использованием программы Phoenix. Как проиллюстрировано в табл. 22, по сравнению с FVIII169/®B057, у FVIII 169/ФВ059 наблюдался аналогичный профиль ФК, это означает, что линкер расщепления тромбином а2 не оказывает отрицательного влияния на ФК профиль гетеродимера.
Таблица 22
Профиль ФК FVIII 169/ФВ057 и FVIII 169/ФВ059 у мышей HemA
Г етеродимер Tl/2 (ч) AUC/D (ч*кг*мМЕ/мл/мМЕ) Cl (мл/ч/кг) MRT (ч) Vss (мл/кг)
ΡνΐΙΙ169/ΦΒ057 38,53 0,80 1,26 44,92 56,38
ΡνΐΙΙ169/ΦΒ059 40,51 0,74 1,35 49,22 66,26
Мгновенная эффективность FVIII 169/ФВ059 оценивалась на модели хвоста мыши HemA (описана в примере 9), по сравнению с диким типом BDD-FVIII. Мыши HemA обрабатывались 75 МЕ/кг либо FVIII 169/ФВ059 либо BDD-FVIII, объем потери крови каждой экспериментальной мыши был отображен на графике на фиг. 13. По сравнению с BDD-FVIII, FVIII169/®B059 обеспечивал ту же степень защиты мышей HemA (р=0,9883), что свидетельствует о том, что ΡνΐΙΙ169/ΦΒ059 является полностью функциональным in vivo.
Плазмидная конструкция гетеродимеров FVIII-XTEN-Fc/D'D3-Fc.
Нуклеотидная последовательность ФВ031 (SEQ ID NO: 147).
ATGAT TCCTG CCAGA TTTGC CGGGG TGCTG CTTGC TCTGG CCCTC ATTTT
GCCAG GGACC CTTTG TGC AG AAGGA ACTCG CGGCA GGTC A TCC AC GGCCC
101 GATGC AGCCT TTTCG GA AGT GACTT CGTC A AC ACC TTTGA TGGG A GC ATG
151 TACAG CTTTG CGGGA TACTG CAGTT ACCTC CTGGC AGGGG GCTGC CAGAA
201 ACGCT CCTTC TCGAT T ATTG GGGAC TTCC A GA ATG GCA AG AGAGT GAGCC
251 TCTCC GTGTA TCTTG GGGAA TTTTT TGACA TCCAT TTGTT TGTCA ATGGT
301 ACCGT GACAC AGGGG GACCA AAGAG TCTCC ATGCC CTATG CCTCC AAAGG
351 GCTGT ATCTA GAAAC TGAGG CTGGG TACTA CAAGC TGTCC GGTGA GGCCT
401 ATGGC TTTGT GGCCA GGATC GATGG CAGCG GCA AC TTTCA AGTCC TGCTG
451 TCAGA CAGAT ACTTC AACAA GACCT GCGGG CTGTG TGGCA ACTTT AACAT
501 CTTTG CTGAA GATGA CTTTA TGACC CAAGA AGGGA CCTTG ACCTC GGACC
551 CTTAT GACTT TGCCA ACTCA TGGGC TCTGA GCAGT GGAGA ACAGT GGTGT
601 GAACG GGCAT CTCCT CCCAG CAGCT CATGC A AC AT CTCCT CTGGG GA A AT
651 GCAGA AGGGC CTGTG GGAGC AGTGC CAGCT TCTGA AGAGC ACCTC GGTGT
701 TTGCC CGCTG CCACC CTCTG GTGGA CCCCG AGCCT TTTGT GGCCC TGTGT
751 GAGAA GACTT TGTGT GAGTG TGCTG GGGGG CTGGA GTGCG CCTGC CCTGC
801 CCTCC TGGAG TACGC CCGGA CCTGT GCCCA GGAGG GAATG GTGCT GTACG
851 GCTGG ACCGA CCACA GCGCG TGC AG CCCAG TGTGC CCTGC TGGTA TGGAG
901 TAT AG GCAGT GTGTG TCCCC TTGCG CC AGG ACCTG CCAGA GCCTG C AC AT
951 CAATG AAATG TGTCA GGAGC GATGC GTGGA TGGCT GCAGC TGCCC TGAGG
1001 GACAG CTCCT GGATG AAGGC CTCTG CGTGG AGAGC ACCGA GTGTC CCTGC
1051 GTGCA TTCCG GAAAG CGCTA CCCTC CCGGC ACCTC CCTCT CTCGA GACTG
1101 C A AC A CCTGC ATTTG CCGA A AC AGC C AGTG GATCT GCAGC A ATGA AGA AT
1151 GTCCA GGGGA GTGCC TTGTC ACTGG ТСААТ СССAC TTCAA GAGCT TTGAC
- 112 044115
1201 A AC AG AT ACT TC ACC TTC AG TGGGA TCTGC C AGT A CCTGC TGGCC CGGGA
1251 TTGCC AGGAC CACTC CTTCT CCATT GTCAT TGAGA CTGTC CAGTG TGCTG 1301 ATGAC CGCGA CGCTG TGTGC ACCCG CTCCG TCACC GTCCG GCTGC CTGGC 1351 CTGC A C A AC A GCCTT GTGA A ACTGA AGC AT GGGGC AGGAG TTGCC ATGGA 1401 TGGCC AGGAC ATCCA GCTCC CCCTC CTGAA AGGTG ACCTC CGCAT CCAGC 1451 АТАСА GTGAC GGCCT CCGTG CGCCT CAGCT ACGGG GAGGA CCTGC AGATG 1501 GACTG GGATG GCCGC GGGAG GCTGC TGGTG AAGCT GTCCC CCGTC TATGC
1551 CGGGA AGACC TGCGG CCTGT GTGGG A ATT A C A ATG GCA AC C AGGG CGACG 1601 ACTTC CTTAC CCCCT CTGGG CTGGC GGAGC CCCGG GTGGA GGACT TCGGG 1651 AACGC CTGGA AGCTG CACGG GGACT GCCAG GACCT GCAGA AGCAG CACAG 1701 CGATC CCTGC GCCCT CAACC CGCGC ATGAC CAGGT TCTCC GAGGA GGCGT 1751 GCGCG GTCCT GACGT CCCCC ACATT CGAGG CCTGC CATCG TGCCG TCAGC 1801 CCGCT GCCCT ACCTG CGGAA CTGCC GCTAC GACGT GTGCT CCTGC TCGGA 1851 CGGCC GCGAG TGCCT GTGCG GCGCC CTGGC CAGCT ATGCC GCGGC CTGCG 1901 CGGGG AGAGG CGTGC GCGTC GCGTG GCGCG AGCCA GGCCG CTGTG AGCTG 1951 AACTG CCCGA AAGGC CAGGT GT ACC TGCAG TGCGG GACCC CCTGC AACCT 2001 GACCT GCCGC TCTCT CTCTT ACCCG GATGA GGAAT GCA AT GAGGC CTGCC 2051 TGGAG GGCTG CTTCT GCCCC CCAGG GCTCT ACATG GATGA GAGGG GGGAC 2101 TGCGT GCCCA AGGCC CAGTG CCCCT GTTAC TATGA CGGTG AGATC TTCCA 2151 GCCAG A AGAC ATCTT CTC AG АССАТ САС AC C ATGT GCTAC TGTGA GGATG 2201 GCTTC ATGCA CTGTA CCATG AGTGG AGTCC CCGGA AGCTT GCTGC CTGAC 2251 GCTGT CCTCA GCAGT CCCCT GTCTC ATCGC AGCAA AAGGA GCCTA TCCTG 2301 TCGGC CCCCC ATGGT CAAGC TGGTG TGTCC CGCTG ACAAC CTGCG GGCTG 2351 A AGGG CTCGA GTGT A CCA A A ACGTG CC AGA АСТАТ GACCT GGAGT GC ATG 2401 AGCAT GGGCT GTGTC TCTGG CTGCC TCTGC CCCCC GGGCA TGGTC CGGCA 2451 TGAGA ACAGA TGTGT GGCCC TGGAA AGGTG TCCCT GCTTC CATCA GGGCA 2501 AGGAG TATGC CCCTG GAGAA ACAGT GAAGA TTGGC TGCAA CACTT GTGTC 2551 TGTCG GGACC GGAAG TGGAA CTGCA CAGAC CATGT GTGTG ATGCC ACGTG 2601 CTCCA CGATC GGCAT GGCCC ACT AC CTCAC CTTCG ACGGG CTCAA AT ACC 2651 TGTTC CCCGG GGAGT GCCAG TACGT TCTGG TGCAG GATTA CTGCG GCAGT 2701 AACCC TGGGA CCTTT CGGAT CCTAG TGGGG AATAA GGGAT GCAGC CACCC 2751 CTCAG TGAAA TGCAA GAAAC GGGTC АССАТ CCTGG TGGAG GGAGG AGAGA 2801 TTGAG CTGTT TGACG GGGAG GTGAA TGTGA AGAGG CCCAT GAAGG ATGAG 2851 ACTCA CTTTG AGGTG GTGGA GTCTG GCCGG TACAT CATTC TGCTG CTGGG 2901 CAAAG CCCTC TCCGT GGTCT GGGAC CGCCA CCTGA GCATC TCCGT GGTCC 2951 TGAAG CAGAC AT ACC AGGAG AAAGT GTGTG GCCTG TGTGG GAATT TTGAT 3001 GGCAT CCAGA ACAAT GACCT САССА GCAGC AACCT CCAAG TGGAG GAAGA 3051 CCCTG TGGAC TTTGG GAACT CCTGG AAAGT GAGCT CGCAG TGTGC TGACA
- 113 044115
3101 CC AGA A A AGT GCCTC TGGAC ТС АТС CCCTG CC ACC TGCC А ТА AC A AC АТС
3151 ATGAA GCAGA CGATG GTGGA TTCCT CCTGT AGAAT CCTTA CCAGT GACGT
3201 CTTCC AGGAC TGCAA CAAGC TGGTG GACCC CGAGC CAT AT CTGGA TGTCT 3251 GCATT TACGA CACCT GCTCC TGTGA GTCCA TTGGG GACTG CGCCG CATTC 3301 TGCGA САССА TTGCT GCCTA TGCCC ACGTG TGTGC CCAGC ATGGC AAGGT 3351 GGTGA CCTGG AGGAC GGCCA CATTG TGCCC CCAGA GCTGC GAGGA GAGGA 3401 ATCTC CGGGA GAACG GGTAT GAGGC TGAGT GGCGC TATAA CAGCT GTGCA 3451 CCTGC CTGTC AAGTC ACGTG TCAGC ACCCT GAGCC ACTGG CCTGC CCTGT 3501 GCAGT GTGTG GAGGG CTGCC ATGCC CACTG CCCTC CAGGG AAAAT CCTGG 3551 ATGAG CTTTT GCAGA CCTGC GTTGA CCCTG AAGAC TGTCC AGTGT GTGAG 3601 GTGGC TGGCC GGCGT TTTGC CTCAG GAAAG AAAGT CACCT TGAAT CCCAG 3651 TGACC CTGAG CACTG CCAGA TTTGC CACTG TGATG TTGTC AACCT CACCT 3701 GTGAA GCCTG CCAGG AGCCG ATATC TGGCG GTGGA GGTTC CGGTG GCGGG 3751 GGATC CGGCG GTGGA GGTTC CGGCG GTGGA GGTTC CGGTG GCGGG GGATC 3801 CGGTG GCGGG GGATC CCTGG TCCCC CGGGG CAGCG GCGGT GGAGG TTCCG 3851 GTGGC GGGGG ATCCG AC A A A ACTC A C AC AT GCCC A CCGTG CCCAG CTCC A 3901 GAACT CCTGG GCGGA CCGTC AGTCT TCCTC TTCCC CCCAA AACCC AAGGA 3951 CACCC TCATG ATCTC CCGGA CCCCT GAGGT CACAT GCGTG GTGGT GGACG 4001 TGAGC CACGA AGACC CTGAG GTCAA GTTCA ACTGG TACGT GGACG GCGTG 4051 GAGGT GCATA ATGCC AAGAC AAAGC CGCGG GAGGA GCAGT ACAAC AGCAC 4101 GT ACC GTGTG GTC AG CGTCC TC ACC GTCCT GC ACC AGGAC TGGCT GA ATG 4151 GCA AG GAGT A C A AGT GCA AG GTCTC C A AC A A AGCC CTCCC AGCCC CC АТС 4201 GAGA A A ACC A TCTCC AAAGC C A A AG GGC AG CCCCG AG A AC C AC AG GTGT A 4251 CACCC TGCCC CCATC CCGCG ATGAG CTGAC CAAGA ACC AG GTC AG CCTGA 4301 CCTGC CTGGT CAAAG GCTTC TATCC CAGCG ACATC GCCGT GGAGT GGGAG 4351 AGC A A TGGGC AGCCG GAGA A C A ACT AC A AG ACC AC GCCTC CCGTG TTGGA 4401 CTCCG ACGGC TCCTT CTTCC TCT AC AGC A A GCTCA CCGTG GAC A A GAGCA 4451 GGTGG CAGCA GGGGA ACGTC TTCTC ATGCT CCGTG ATGCA TGAGG CTCTG 4501 CACAA CCACT ACACG CAGAA GAGCC TCTCC CTGTC TCCGG GTAAA TGA Последовательность белка ФВ031 (SEQ ID NO: 86).
MIPARFAGVL LALALILPGT LCAEGTRGRS STARCSLFGS DFVNTFDGSM
YSFAGYCSYL LAGGCQKRSF SIIGDFQNGK RVSLSVYLGE FFDIHLFVNG
101 TVTQGDQRVS MPYASKGLYL ETEAGYYKLS GEAYGFVARI DGSGNFQVLL
151 SDRYFNKTCG LCGNFNIFAE DDFMTQEGTL TSDPYDFANS WALSSGEQWC
201 ERASPPSSSC NISSGEMQKG LWEQCQLLKS TSVFARCHPL VDPEPFVALC
251 EKTLCECAGG LECACPALLE YARTCAQEGM VLYGWTDHSA CSPVCPAGME
301 YRQCVSPCAR TCQSLHINEM CQERCVDGCS CPEGQLLDEG LCVESTECPC
- 114 044115
351 VHSGKRYPPG TSLSRDCNTC ICRNSQWICS NEECPGECLV TGQSHFKSFD
401 NRYFTFSGIC QYLLARDCQD HSFSIVIETV QCADDRDAVC TRSVTVRLPG 451 LHNSLVKLKH GAGVAMDGQD IQLPLLKGDL RIQHTVTASV RLSYGEDLQM
501 DWDGRGRLLV KLSPVYAGKT CGLCGNYNGN QGDDFLTPSG LAEPRVEDFG 551 NAWKLHGDCQ DLQKQHSDPC ALNPRMTRFS EEACAVLTSP TFEACHRAVS
601 PLPYLRNCRY DVCSCSDGRE CLCGALASYA AACAGRGVRV AWREPGRCEL
651 NCPKGQVYLQ CGTPCNLTCR SLSYPDEECN EACLEGCFCP PGLYMDERGD
701 CVPKAQCPCY YDGEIFQPED IFSDHHTMCY CEDGFMHCTM SGVPGSLLPD 751 AVLSSPLSHR SKRSLSCRPP MVKLVCPADN LRAEGLECTK TCQNYDLECM
801 SMGCVSGCLC PPGMVRHENR CVALERCPCF HQGKEYAPGE TVKIGCNTCV
851 CRDRKWNCTD HVCDATCSTIGMAHYLTFDG LKYLFPGECQ YVLVQDYCGS
901 NPGTFRILVG NKGCSHPSVK CKKRVTILVE GGEIELFDGE VNVKRPMKDE
951 THFEVVESGR YIILLLGKAL SVVWDRHLSI SVVLKQTYQE KVCGLCGNFD
1001 GIQNNDLTSS NLQVEEDPVD FGNSWKVSSQ CADTRKVPLD SSPATCHNNI 1051 MKQTMVDSSC RILTSDVFQD CNKLVDPEPY LDVCIYDTCS CESIGDCAAF
1101 CDTIAAYAHV CAQHGKVVTW RTATLCPQSC EERNLRENGY EAEWRYNSCA
1151 PACQVTCQHP EPLACPVQCV EGCHAHCPPG KILDELLQTC VDPEDCPVCE
1201 VAGRRFASGK KVTLNPSDPE HCQICHCDVV NLTCEACQEPISGGGGSGGG
1251 GSGGGGSGGG GSGGGGSGGG GSLVPRGSGG GGSGGGGSDK THTCPPCPAP
1301 ELLGGPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV VVDVSHEDPE VKFNWYVDGV
1351 EVHNAKTKPR EEQYNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKALPAPI 1401 EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSRDELTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE
1451 SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSKLTV DKSRWQQGNV FSCSVMHEAL
1501 HNHYTQKSLS LSPGK*
Нуклеотидная последовательность ФВ034 (SEQ ID NO: 148).
ATGAT TCCTG CCAGA TTTGC CGGGG TGCTG CTTGC TCTGG CCCTC ATTTT
GCCAG GGACC CTTTG TGC AG AAGGA ACTCG CGGCA GGTC A TCC AC GGCCC 101 GATGC AGCCT TTTCG GAAGT GACTT CGTCA AC ACC TTTGA TGGGA GCATG 151 TACAG CTTTG CGGGA TACTG CAGTT ACCTC CTGGC AGGGG GCTGC CAGAA 201 ACGCT CCTTC TCGAT TATTG GGGAC TTCCA GAATG GCAAG AGAGT GAGCC 251 TCTCC GTGTA TCTTG GGGAA TTTTT TGACA TCCAT TTGTT TGTCA ATGGT
301 ACCGT GACAC AGGGG GACCA AAGAG TCTCC ATGCC CTATG CCTCC AAAGG 351 GCTGT ATCTA GAAAC TGAGG CTGGG TACTA CAAGC TGTCC GGTGA GGCCT 401 ATGGC TTTGT GGCCA GGATC GATGG CAGCG GCAAC TTTCA AGTCC TGCTG 451 TCAGA CAGAT ACTTC AACAA GACCT GCGGG CTGTG TGGCA ACTTT AACAT 501 CTTTG CTGAA GATGA CTTTA TGACC CAAGA AGGGA CCTTG ACCTC GGACC 551 CTTAT GACTT TGCCA ACTCA TGGGC TCTGA GCAGT GGAGA ACAGT GGTGT
- 115 044115
601 GA ACG GGC AT CTCCT CCC AG C AGCT C ATGC A AC AT CTCCT CTGGG GA A AT
651 GCAGA AGGGC CTGTG GGAGC AGTGC CAGCT TCTGA AGAGC ACCTC GGTGT
701 TTGCC CGCTG CCACC CTCTG GTGGA CCCCG AGCCT TTTGT GGCCC TGTGT
751 GAGAA GACTT TGTGT GAGTG TGCTG GGGGG CTGGA GTGCG CCTGC CCTGC 801 CCTCC TGGAG TACGC CCGGA CCTGT GCCCA GGAGG GAATG GTGCT GTACG
851 GCTGG ACCGA CCACA GCGCG TGCAG CCCAG TGTGC CCTGC TGGTA TGGAG
901 TAT AG GC AGT GTGTG TCCCC TTGCG CC AGG ACCTG CC AGA GCCTG C AC AT
951 CAATG AAATG TGTCA GGAGC GATGC GTGGA TGGCT GCAGC TGCCC TGAGG
1001 GACAG CTCCT GGATG AAGGC CTCTG CGTGG AGAGC ACCGA GTGTC CCTGC 1051 GTGCA TTCCG GAAAG CGCTA CCCTC CCGGC ACCTC CCTCT CTCGA GACTG 1101 C A AC A CCTGC ATTTG CCGA A AC AGC C AGTG GATCT GCAGC A ATGA AGA AT 1151 GTCCA GGGGA GTGCC TTGTC ACTGG TCAAT CCCAC TTCAA GAGCT TTGAC 1201 A AC AG AT ACT TC ACC TTC AG TGGGA TCTGC C AGT A CCTGC TGGCC CGGGA 1251 TTGCC AGGAC CACTC CTTCT CCATT GTCAT TGAGA CTGTC CAGTG TGCTG 1301 ATGAC CGCGA CGCTG TGTGC ACCCG CTCCG TCACC GTCCG GCTGC CTGGC 1351 CTGC A C A AC A GCCTT GTGA A ACTGA AGC AT GGGGC AGGAG TTGCC ATGGA 1401 TGGCC AGGAC ATCCA GCTCC CCCTC CTGAA AGGTG ACCTC CGCAT CCAGC 1451 АТАСА GTGAC GGCCT CCGTG CGCCT CAGCT ACGGG GAGGA CCTGC AGATG 1501 GACTG GGATG GCCGC GGGAG GCTGC TGGTG AAGCT GTCCC CCGTC TATGC 1551 CGGGA AGACC TGCGG CCTGT GTGGG A ATT A CAATG GCA AC C AGGG CGACG 1601 ACTTC CTTAC CCCCT CTGGG CTGGC GGAGC CCCGG GTGGA GGACT TCGGG 1651 AACGC CTGGA AGCTG CACGG GGACT GCCAG GACCT GCAGA AGCAG CACAG 1701 CGATC CCTGC GCCCT CAACC CGCGC ATGAC CAGGT TCTCC GAGGA GGCGT 1751 GCGCG GTCCT GACGT CCCCC ACATT CGAGG CCTGC CATCG TGCCG TCAGC 1801 CCGCT GCCCT ACCTG CGGAA CTGCC GCTAC GACGT GTGCT CCTGC TCGGA 1851 CGGCC GCGAG TGCCT GTGCG GCGCC CTGGC CAGCT ATGCC GCGGC CTGCG 1901 CGGGG AGAGG CGTGC GCGTC GCGTG GCGCG AGCCA GGCCG CTGTG AGCTG 1951 AACTG CCCGA AAGGC CAGGT GT ACC TGCAG TGCGG GACCC CCTGC AACCT 2001 GACCT GCCGC TCTCT CTCTT ACCCG GATGA GGAAT GCA AT GAGGC CTGCC 2051 TGGAG GGCTG CTTCT GCCCC CCAGG GCTCT ACATG GATGA GAGGG GGGAC 2101 TGCGT GCCCA AGGCC CAGTG CCCCT GTTAC TATGA CGGTG AGATC TTCCA 2151 GCCAG A AGAC ATCTT CTC AG АССАТ САС AC C ATGT GCTAC TGTGA GGATG 2201 GCTTC ATGCA CTGTA CCATG AGTGG AGTCC CCGGA AGCTT GCTGC CTGAC 2251 GCTGT CCTCA GCAGT CCCCT GTCTC ATCGC AGCAA AAGGA GCCTA TCCTG 2301 TCGGC CCCCC ATGGT CAAGC TGGTG TGTCC CGCTG ACAAC CTGCG GGCTG 2351 A AGGG CTCGA GTGT A CCA A A ACGTG CC AGA АСТАТ GACCT GGAGT GC ATG 2401 AGCAT GGGCT GTGTC TCTGG CTGCC TCTGC CCCCC GGGCA TGGTC CGGCA 2451 TGAGA ACAGA TGTGT GGCCC TGGAA AGGTG TCCCT GCTTC CATCA GGGCA
- 116 044115
2501 AGGAG TATGC CCCTG GAGAA ACAGT GAAGA TTGGC TGCAA CACTT GTGTC
2551 TGTCG GGACC GGAAG TGGAA CTGCA CAGAC CATGT GTGTG ATGCC ACGTG
2601 CTCCA CGATC GGCAT GGCCC ACT AC CTCAC CTTCG ACGGG CTCAA AT ACC
2651 TGTTC CCCGG GGAGT GCCAG TACGT TCTGG TGCAG GATTA CTGCG GCAGT 2701 AACCC TGGGA CCTTT CGGAT CCTAG TGGGG AATAA GGGAT GCAGC CACCC 2751 CTCAG TGAAA TGCAA GAAAC GGGTC ACCAT CCTGG TGGAG GGAGG AGAGA 2801 TTGAG CTGTT TGACG GGGAG GTGAA TGTGA AGAGG CCCAT GAAGG ATGAG 2851 ACTCA CTTTG AGGTG GTGGA GTCTG GCCGG TACAT CATTC TGCTG CTGGG 2901 CAAAG CCCTC TCCGT GGTCT GGGAC CGCCA CCTGA GCATC TCCGT GGTCC 2951 TGAAG CAGAC AT ACC AGGAG AAAGT GTGTG GCCTG TGTGG GAATT TTGAT 3001 GGCAT CCAGA ACAAT GACCT САССА GCAGC AACCT CCAAG TGGAG GAAGA 3051 CCCTG TGGAC TTTGG GAACT CCTGG AAAGT GAGCT CGCAG TGTGC TGACA 3101 CCAGA AAAGT GCCTC TGGAC ТС АТС CCCTG CC ACC TGCC А ТА AC A AC АТС 3151 ATGAA GCAGA CGATG GTGGA TTCCT CCTGT AGAAT CCTTA CCAGT GACGT 3201 CTTCC AGGAC TGCAA CAAGC TGGTG GACCC CGAGC CAT AT CTGGA TGTCT 3251 GCATT TACGA CACCT GCTCC TGTGA GTCCA TTGGG GACTG CGCCG CATTC 3301 TGCGA САССА TTGCT GCCTA TGCCC ACGTG TGTGC CCAGC ATGGC AAGGT
3351 GGTGA CCTGG AGGAC GGCCA CATTG TGCCC CCAGA GCTGC GAGGA GAGGA 3401 ATCTC CGGGA GAACG GGTAT GAGGC TGAGT GGCGC TATAA CAGCT GTGCA 3451 CCTGC CTGTC AAGTC ACGTG TCAGC ACCCT GAGCC ACTGG CCTGC CCTGT 3501 GCAGT GTGTG GAGGG CTGCC ATGCC CACTG CCCTC CAGGG AAAAT CCTGG 3551 ATGAG CTTTT GCAGA CCTGC GTTGA CCCTG AAGAC TGTCC AGTGT GTGAG 3601 GTGGC TGGCC GGCGT TTTGC CTCAG GAAAG AAAGT CACCT TGAAT CCCAG 3651 TGACC CTGAG CACTG CCAGA TTTGC CACTG TGATG TTGTC AACCT CACCT 3701 GTGAA GCCTG CCAGG AGCCG ATATC GGGTA CCTCA GAGTC TGCTA CCCCC
3751 GAGTC AGGGC CAGGA TCAGA GCCAG CCACC TCCGG GTCTG AGACA CCCGG 3801 GACTT CCGAG AGTGC CACCC CTGAG TCCGG ACCCG GGTCC GAGCC CGCCA 3851 CTTCC GGCTC CGAAA CTCCC GGCAC AAGCG AGAGC GCTAC CCCAG AGTCA 3901 GGACC AGGAA CATCT AC AGA GCCCT CTGAA GGCTC CGCTC CAGGG TCCCC 3951 AGCCG GCAGT CCCAC TAGCA CCGAG GAGGG AACCT CTGAA AGCGC CACAC 4001 CCGAA TCAGG GCCAG GGTCT GAGCC TGCTA CCAGC GGCAG CGAGA САССА 4051 GGCAC CTCTG AGTCC GCC AC ACC AG AGTCC GGACC CGGAT CTCCC GCTGG
4101 GAGCC CCACC TCC AC TGAGG AGGGA TCTCC TGCTG GCTCT CCA AC ATCT A 4151 CTGAG GAAGG T ACCT C A ACC GAGCC ATCCG AGGGA TCAGC TCCCG GC ACC 4201 TCAGA GTCGG C A ACC CCGGA GTCTG GACCC GGA AC TTCCG AAAGT GCC AC 4251 ACC AG AGTCC GGTCC CGGGA CTTCA GAATC AGCAA CACCC GAGTC CGGCC 4301 CTGGG TCTGA ACCCG CCACA AGTGG TAGTG AGACA CCAGG ATCAG AACCT 4351 GCTAC CTCAG GGTCA GAGAC ACCCG GATCT CCGGC AGGCT САССА ACCTC
- 117 044115
4401 C ACTG AGGAG GGC AC C AGC A C AGA A CCA AG CGAGG GCTCC GC ACC CGGA A
4451 CAAGC ACTGA ACCCA GTGAG GGTTC AGCAC CCGGC TCTGA GCCGG CCACA
4501 AGTGG CAGTG AGACA CCCGG CACTT CAGAG AGTGC CACCC CCGAG AGTGG 4551 CCCAG GCACT AGTAC CGAGC CCTCT GAAGG CAGTG CGCCA GATTC TGGCG
4601 GTGGA GGTTC CGGTG GCGGG GGATC CGGTG GCGGG GGATC CGGTG GCGGG
4651 GGATC CGGTG GCGGG GGATC CCTGG TCCCC CGGGG CAGCG GAGGC GACAA
4701 AACTC ACACA TGCCC ACCGT GCCCA GCTCC AGAAC TCCTG GGCGG ACCGT
4751 CAGTC TTCCT CTTCC CCCCA AAACC CAAGG ACACC CTCAT GATCT CCCGG
4801 ACCCC TGAGG TCACA TGCGT GGTGG TGGAC GTGAG CCACG AAGAC CCTGA
4851 GGTC A AGTTC AACTG GT ACG TGGAC GGCGT GGAGG TGC AT AATGC C AAGA
4901 CAAAG CCGCG GGAGG AGCAG TACAA CAGCA CGTAC CGTGT GGTCA GCGTC
4951 CTCAC CGTCC TGC AC CAGGA CTGGC TGAAT GGCAA GGAGT ACAAG TGCAA
5001 GGTCT CCAAC AAAGC CCTCC CAGCC CCCAT CGAGA AAACC ATCTC CAAAG
5051 CCAAA GGGCA GCCCC GAGAA CCACA GGTGT ACACC CTGCC CCCAT CCCGG
5101 GATGA GCTGA CCA AG A ACC A GGTCA GCCTG ACCTG CCTGG TC A A A GGCTT
5151 СТ АТС CC AGC GAC AT CGCCG TGGAG TGGGA GAGCA ATGGG CAGCC GGAGA
5201 ACAAC TACAA GACCA CGCCT CCCGT GTTGG ACTCC GACGG CTCCT TCTTC
5251 CTCTA CAGCA AGCTC ACCGT GGACA AGAGC AGGTG GCAGC AGGGG AACGT
5301 CTTCT CATGC TCCGT GATGC ATGAG GCTCT GCACA ACCAC TACAC GCAGA 5351 AGAGC CTCTC CCTGT CTCCG GGTAA ATGA Последовательность белка ФВ034 (SEQ ID NO: 87).
MIPARFAGVL LALALILPGT LCAEGTRGRS STARCSLFGS DFVNTFDGSM
YSFAGYCSYL LAGGCQKRSF SIIGDFQNGK RVSLSVYLGE FFDIHLFVNG
101 TVTQGDQRVS MPYASKGLYL ETEAGYYKLS GEAYGFVARI DGSGNFQVLL
151 SDRYFNKTCG LCGNFNIFAE DDFMTQEGTL TSDPYDFANS WALSSGEQWC 201 ERASPPSSSC NISSGEMQKG LWEQCQLLKS TSVFARCHPL VDPEPFVALC
251 EKTLCECAGG LECACPALLE YARTCAQEGM VLYGWTDHSA CSPVCPAGME 301 YRQCVSPCAR TCQSLHINEM CQERCVDGCS CPEGQLLDEG LCVESTECPC 351 VHSGKRYPPG TSLSRDCNTC ICRNSQWICS NEECPGECLV TGQSHFKSFD 401 NRYFTFSGIC QYLLARDCQD HSFSIVIETV QCADDRDAVC TRSVTVRLPG
451 LHNSLVKLKH GAGVAMDGQD IQLPLLKGDL RIQHTVTASV RLSYGEDLQM 501 DWDGRGRLLV KLSPVYAGKT CGLCGNYNGN QGDDFLTPSG LAEPRVEDFG 551 NAWKLHGDCQ DLQKQHSDPC ALNPRMTRFS EEACAVLTSP TFEACHRAVS 601 PLPYLRNCRY DVCSCSDGRE CLCGALASYA AACAGRGVRV AWREPGRCEL 651 NCPKGQVYLQ CGTPCNLTCR SLSYPDEECN EACLEGCFCP PGLYMDERGD
- 118 044115
701 CVPKAQCPCY YDGEIFQPED IFSDHHTMCY CEDGFMHCTM SGVPGSLLPD
751 AVLSSPLSHR SKRSLSCRPP MVKLVCPADN LRAEGLECTK TCQNYDLECM
801 SMGCVSGCLC PPGMVRHENR CVALERCPCF HQGKEYAPGE TVKIGCNTCV 851 CRDRKWNCTD HVCDATCSTIGMAHYLTFDG LKYLFPGECQ YVLVQDYCGS 901 NPGTFRILVG NKGCSHPSVK CKKRVTILVE GGEIELFDGE VNVKRPMKDE
951 THFEVVESGR YIILLLGKAL SVVWDRHLSI SVVLKQTYQE KVCGLCGNFD
1001 GIQNNDLTSS NLQVEEDPVD FGNSWKVSSQ CADTRKVPLD SSPATCHNNI 1051 MKQTMVDSSC RILTSDVFQD CNKLVDPEPY LDVCIYDTCS CESIGDCAAF
1101 CDTIAAYAHV CAQHGKVVTW RTATLCPQSC EERNLRENGY EAEWRYNSCA
1151 PACQVTCQHP EPLACPVQCV EGCHAHCPPG KILDELLQTC VDPEDCPVCE 1201 VAGRRFASGK KVTLNPSDPE HCQICHCDVV NLTCEACQEPISGTSESATP 1251 ESGPGSEPAT SGSETPGTSE SATPESGPGS EPATSGSETP GTSESATPES
1301 GPGTSTEPSE GSAPGSPAGS PTSTEEGTSE SATPESGPGS EPATSGSETP 1351 GTSESATPES GPGSPAGSPT STEEGSPAGS PTSTEEGTST EPSEGSAPGT 1401 SESATPESGP GTSESATPES GPGTSESATP ESGPGSEPAT SGSETPGSEP 1451 ATSGSETPGS PAGSPTSTEE GTSTEPSEGS APGTSTEPSE GSAPGSEPAT
1501 SGSETPGTSE SATPESGPGT STEPSEGSAP DIGGGGGSGG GGSLVPRGSG 1551 GDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE
1601 DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY
1651 KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSRDELT KNQVSLTCLV
1701 KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYS К LTVDKSRWQQ
1751 GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK*
Нуклеотидная последовательность ФВ050 (тройной мутант IHH) (SEQ ID NO: 149).
ATGAT TCCTG CCAGA TTTGC CGGGG TGCTG CTTGC TCTGG CCCTC ATTTT
GCCAG GGACC CTTTG TGC AG AAGGA ACTCG CGGCA GGTC A TCC AC GGCCC 101 GATGC AGCCT TTTCG GAAGT GACTT CGTC A AC ACC TTTGA TGGGA GCATG 151 TACAG CTTTG CGGGA TACTG CAGTT ACCTC CTGGC AGGGG GCTGC CAGAA 201 ACGCT CCTTC TCGAT T ATTG GGGAC TTCC A GA ATG GCA AG AGAGT GAGCC 251 TCTCC GTGTA TCTTG GGGAA TTTTT TGACA TCCAT TTGTT TGTCA ATGGT
301 ACCGT GACAC AGGGG GACCA AAGAG TCTCC ATGCC CTATG CCTCC AAAGG 351 GCTGT ATCTA GAAAC TGAGG CTGGG TACTA CAAGC TGTCC GGTGA GGCCT 401 ATGGC TTTGT GGCCA GGATC GATGG CAGCG GCA AC TTTCA AGTCC TGCTG 451 TCAGA CAGAT ACTTC AACAA GACCT GCGGG CTGTG TGGCA ACTTT AACAT 501 CTTTG CTGAA GATGA CTTTA TGACC CAAGA AGGGA CCTTG ACCTC GGACC 551 CTTAT GACTT TGCCA ACTCA TGGGC TCTGA GCAGT GGAGA ACAGT GGTGT 601 GA ACG GGCAT CTCCT CCC AG C AGCT C ATGC A AC AT CTCCT CTGGG GA A AT
- 119 044115
651 GCAGA AGGGC CTGTG GGAGC AGTGC CAGCT TCTGA AGAGC ACCTC GGTGT
701 TTGCC CGCTG CCACC CTCTG GTGGA CCCCG AGCCT TTTGT GGCCC TGTGT 751 GAGAA GACTT TGTGT GAGTG TGCTG GGGGG CTGGA GTGCG CCTGC CCTGC 801 CCTCC TGGAG TACGC CCGGA CCTGT GCCCA GGAGG GAATG GTGCT GTACG
851 GCTGG ACCGA CCACA GCGCG TGCAG CCCAG TGTGC CCTGC TGGTA TGGAG
901 TAT AG GC AGT GTGTG TCCCC TTGCG CC AGG ACCTG CC AGA GCCTG C AC AT
951 CAATG AAATG TGTCA GGAGC GATGC GTGGA TGGCT GCAGC TGCCC TGAGG
1001 GACAG CTCCT GGATG AAGGC CTCTG CGTGG AGAGC ACCGA GTGTC CCTGC 1051 GTGCA TTCCG GAAAG CGCTA CCCTC CCGGC ACCTC CCTCT CTCGA GACTG 1101 C A AC A CCTGC ATTTG CCGA A AC AGC C AGTG GATCT GCAGC A ATGA AGA AT 1151 GTCCA GGGGA GTGCC TTGTC ACTGG TCAAT CCCAC TTCAA GAGCT TTGAC 1201 A AC AG AT ACT TC ACC TTC AG TGGGA TCTGC C AGT A CCTGC TGGCC CGGGA 1251 TTGCC AGGAC CACTC CTTCT CCATT GTCAT TGAGA CTGTC CAGTG TGCTG 1301 ATGAC CGCGA CGCTG TGTGC ACCCG CTCCG TCACC GTCCG GCTGC CTGGC 1351 CTGC A C A AC A GCCTT GTGA A ACTGA AGC AT GGGGC AGGAG TTGCC ATGGA 1401 TGGCC AGGAC ATCCA GCTCC CCCTC CTGAA AGGTG ACCTC CGCAT CCAGC 1451 АТАСА GTGAC GGCCT CCGTG CGCCT CAGCT ACGGG GAGGA CCTGC AGATG 1501 GACTG GGATG GCCGC GGGAG GCTGC TGGTG AAGCT GTCCC CCGTC TATGC 1551 CGGGA AGACC TGCGG CCTGT GTGGG A ATT A CAATG GCA AC C AGGG CGACG 1601 ACTTC CTTAC CCCCT CTGGG CTGGC GGAGC CCCGG GTGGA GGACT TCGGG 1651 AACGC CTGGA AGCTG CACGG GGACT GCCAG GACCT GCAGA AGCAG CACAG 1701 CGATC CCTGC GCCCT CAACC CGCGC ATGAC CAGGT TCTCC GAGGA GGCGT 1751 GCGCG GTCCT GACGT CCCCC ACATT CGAGG CCTGC CATCG TGCCG TCAGC 1801 CCGCT GCCCT ACCTG CGGAA CTGCC GCTAC GACGT GTGCT CCTGC TCGGA 1851 CGGCC GCGAG TGCCT GTGCG GCGCC CTGGC CAGCT ATGCC GCGGC CTGCG 1901 CGGGG AGAGG CGTGC GCGTC GCGTG GCGCG AGCCA GGCCG CTGTG AGCTG 1951 AACTG CCCGA AAGGC CAGGT GT ACC TGCAG TGCGG GACCC CCTGC AACCT 2001 GACCT GCCGC TCTCT CTCTT ACCCG GATGA GGAAT GCA AT GAGGC CTGCC 2051 TGGAG GGCTG CTTCT GCCCC CCAGG GCTCT ACATG GATGA GAGGG GGGAC 2101 TGCGT GCCCA AGGCC CAGTG CCCCT GTTAC TATGA CGGTG AGATC TTCCA 2151 GCCAG A AGAC ATCTT CTC AG АССАТ САС AC C ATGT GCTAC TGTGA GGATG 2201 GCTTC ATGCA CTGTA CCATG AGTGG AGTCC CCGGA AGCTT GCTGC CTGAC 2251 GCTGT CCTCA GCAGT CCCCT GTCTC ATCGC AGCAA AAGGA GCCTA TCCTG 2301 TCGGC CCCCC ATGGT CAAGC TGGTG TGTCC CGCTG ACAAC CTGCG GGCTG 2351 A AGGG CTCGA GTGT A CCA A A ACGTG CC AGA АСТАТ GACCT GGAGT GC ATG 2401 AGCAT GGGCT GTGTC TCTGG CTGCC TCTGC CCCCC GGGCA TGGTC CGGCA 2451 TGAGA ACAGA TGTGT GGCCC TGGAA AGGTG TCCCT GCTTC CATCA GGGCA 2501 AGGAG TATGC CCCTG GAGAA ACAGT GAAGA TTGGC TGCAA CACTT GTGTC
- 120 044115
2551 TGTCG GGACC GGAAG TGGAA CTGCA CAGAC CATGT GTGTG ATGCC ACGTG 2601 CTCCA CGATC GGC AT GGCCC ACT AC CTCAC CTTCG ACGGG CTCAA AT ACC 2651 TGTTC CCCGG GGAGT GCCAG TACGT TCTGG TGCAG GATTA CTGCG GCAGT 2701 AACCC TGGGA CCTTT CGGAT CCTAG TGGGG AATAA GGGAT GCAGC CACCC 2751 CTCAG TGAAA TGCAA GAAAC GGGTC АССАТ CCTGG TGGAG GGAGG AGAGA 2801 TTGAG CTGTT TGACG GGGAG GTGAA TGTGA AGAGG CCCAT GAAGG ATGAG 2851 ACTCA CTTTG AGGTG GTGGA GTCTG GCCGG TACAT CATTC TGCTG CTGGG 2901 CAAAG CCCTC TCCGT GGTCT GGGAC CGCCA CCTGA GCATC TCCGT GGTCC 2951 TGAAG CAGAC AT ACC AGGAG AAAGT GTGTG GCCTG TGTGG GAATT TTGAT 3001 GGCAT CCAGA ACAAT GACCT САССА GCAGC AACCT CCAAG TGGAG GAAGA 3051 CCCTG TGGAC TTTGG GAACT CCTGG AAAGT GAGCT CGCAG TGTGC TGACA 3101 CCAGA AAAGT GCCTC TGGAC ТС АТС CCCTG CC ACC TGCC А ТА AC A AC АТС 3151 ATGAA GCAGA CGATG GTGGA TTCCT CCTGT AGAAT CCTTA CCAGT GACGT 3201 CTTCC AGGAC TGCAA CAAGC TGGTG GACCC CGAGC CAT AT CTGGA TGTCT 3251 GCATT TACGA CACCT GCTCC TGTGA GTCCA TTGGG GACTG CGCCG CATTC 3301 TGCGA САССА TTGCT GCCTA TGCCC ACGTG TGTGC CCAGC ATGGC AAGGT 3351 GGTGA CCTGG AGGAC GGCCA CATTG TGCCC CCAGA GCTGC GAGGA GAGGA 3401 ATCTC CGGGA GAACG GGTAT GAGGC TGAGT GGCGC TATAA CAGCT GTGCA 3451 CCTGC CTGTC AAGTC ACGTG TCAGC ACCCT GAGCC ACTGG CCTGC CCTGT 3501 GCAGT GTGTG GAGGG CTGCC ATGCC CACTG CCCTC CAGGG AAAAT CCTGG 3551 ATGAG CTTTT GCAGA CCTGC GTTGA CCCTG AAGAC TGTCC AGTGT GTGAG 3601 GTGGC TGGCC GGCGT TTTGC CTCAG GAAAG AAAGT CACCT TGAAT CCCAG 3651 TGACC CTGAG CACTG CCAGA TTTGC CACTG TGATG TTGTC AACCT CACCT 3701 GTGAA GCCTG CCAGG AGCCG ATATC TGGCG GTGGA GGTTC CGGTG GCGGG 3751 GGATC CGGCG GTGGA GGTTC CGGCG GTGGA GGTTC CGGTG GCGGG GGATC 3801 CGGTG GCGGG GGATC CCTGG TCCCC CGGGG CAGCG GCGGT GGAGG TTCCG 3851 GTGGC GGGGG ATCCG AC A A A ACTCA C AC AT GCCC A CCGTG CCCAG CTCCA 3901 GAACT CCTGG GCGGA CCGTC AGTCT TCCTC TTCCC CCCAA AACCC AAGGA 3951 CACCC TCATG GCCTC CCGGA CCCCT GAGGT CACAT GCGTG GTGGT GGACG 4001 TGAGC CACGA AGACC CTGAG GTC A A GTTCA ACTGG TACGT GGACG GCGTG 4051 GAGGT GCATA ATGCC AAGAC AAAGC CGCGG GAGGA GCAGT ACAAC AGCAC 4101 GT ACC GTGTG GTC AG CGTCC TC ACC GTCCT GGCCC AGGAC TGGCT GA ATG 4151 GCA AG GAGT A C A AGT GCA AG GTCTC C A AC A A AGCC CTCCC AGCCC CC АТС 4201 GAGA A A ACC A TCTCC AAAGC CAAAG GGC AG CCCCG AG A AC C AC AG GTGT A 4251 CACCC TGCCC CCATC CCGCG ATGAG CTGAC CAAGA ACC AG GTC AG CCTGA 4301 CCTGC CTGGT CAAAG GCTTC TATCC CAGCG ACATC GCCGT GGAGT GGGAG
4351 AGC A A TGGGC AGCCG GAGA A C A ACT AC A AG ACC AC GCCTC CCGTG TTGGA
4401 CTCCG ACGGC TCCTT CTTCC TCT AC AGC A A GCTCA CCGTG GAC A A GAGCA 4451 GGTGG CAGCA GGGGA ACGTC TTCTC ATGCT CCGTG ATGCA TGAGG CTCTG
4501 CACAA CGCCT ACACG CAGAA GAGCC TCTCC CTGTC TCCGG GTAAA TGA
- 121 044115
Последовательность белка ФВ050 (тройной мутант IHH) (SEQ ID NO: 150).
MIPARFAGVL LALALILPGT LCAEGTRGRS STARCSLFGS DFVNTFDGSM
YSFAGYCSYL LAGGCQKRSF SIIGDFQNGK RVSLSVYLGE FFDIHLFVNG
101 TVTQGDQRVS MPYASKGLYL ETEAGYYKLS GEAYGFVARI DGSGNFQVLL
151 SDRYFNKTCG LCGNFNIFAE DDFMTQEGTL TSDPYDFANS WALSSGEQWC
201 ERASPPSSSC NISSGEMQKG LWEQCQLLKS TSVFARCHPL VDPEPFVALC
251 EKTLCECAGG LECACPALLE YARTCAQEGM VLYGWTDHSA CSPVCPAGME
301 YRQCVSPCAR TCQSLHINEM CQERCVDGCS CPEGQLLDEG LCVESTECPC
351 VHSGKRYPPG TSLSRDCNTC ICRNSQWICS NEECPGECLV TGQSHFKSFD 401 NRYFTFSGIC QYLLARDCQD HSFSIVIETV QCADDRDAVC TRSVTVRLPG 451 LHNSLVKLKH GAGVAMDGQD IQLPLLKGDL RIQHTVTASV RLSYGEDLQM 501 DWDGRGRLLV KLSPVYAGKT CGLCGNYNGN QGDDFLTPSG LAEPRVEDFG 551 NAWKLHGDCQ DLQKQHSDPC ALNPRMTRFS EEACAVLTSP TFEACHRAVS 601 PLPYLRNCRY DVCSCSDGRE CLCGALASYA AACAGRGVRV AWREPGRCEL
651 NCPKGQVYLQ CGTPCNLTCR SLSYPDEECN EACLEGCFCP PGLYMDERGD 701 CVPKAQCPCY YDGEIFQPED IFSDHHTMCY CEDGFMHCTM SGVPGSLLPD 751 AVLSSPLSHR SKRSLSCRPP MVKLVCPADN LRAEGLECTK TCQNYDLECM
801 SMGCVSGCLC PPGMVRHENR CVALERCPCF HQGKEYAPGE TVKIGCNTCV
851 CRDRKWNCTD HVCDATCSTI GMAHYLTFDG LKYLFPGECQ YVLVQDYCGS
901 NPGTFRILVG NKGCSHPSVK CKKRVTILVE GGEIELFDGE VNVKRPMKDE 951 THFEVVESGR YIILLLGKAL SVVWDRHLSI SVVLKQTYQE KVCGLCGNFD
1001 GIQNNDLTSS NLQVEEDPVD FGNSWKVSSQ CADTRKVPLD SSPATCHNNI 1051 MKQTMVDSSC RILTSDVFQD CNKLVDPEPY LDVCIYDTCS CESIGDCAAF
1101 CDTIAAYAHV CAQHGKVVTW RTATLCPQSC EERNLRENGY EAEWRYNSCA
1151 PACQVTCQHP EPLACPVQCV EGCHAHCPPG KILDELLQTC VDPEDCPVCE 1201 VAGRRFASGK KVTLNPSDPE HCQICHCDVV NLTCEACQEPISGGGGSGGG
1251 GSGGGGSGGG GSGGGGSGGG GSLVPRGSGG GGSGGGGSDK THTCPPCPAP 1301 ELLGGPSVFL FPPKPKDTLM ASRTPEVTCV VVDVSHEDPE VKFNWYVDGV 1351 EVHNAKTKPR EEQYNSTYRV VSVLTVLAQD WLNGKEYKCK VSNKALPAPI
1401 EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSRDELTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE
1451 SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSKLTV DKSRWQQGNV FSCSVMHEAL
1501 HNAYTQKSLS LSPGK*
- 122 044115
Нуклеотидная последовательность ФВ057 (SEQ ID NO: 151).
ATGAT TCCTG CCAGA TTTGC CGGGG TGCTG CTTGC TCTGG CCCTC ATTTT
GCCAG GGACC CTTTG TGC AG AAGGA ACTCG CGGCA GGTC A TCC AC GGCCC
101 GATGC AGCCT TTTCG GA AGT GACTT CGTC A AC ACC TTTGA TGGG A GC ATG
151 TACAG CTTTG CGGGA TACTG CAGTT ACCTC CTGGC AGGGG GCTGC CAGAA
201 ACGCT CCTTC TCGAT T ATTG GGGAC TTCC A GA ATG GCA AG AGAGT GAGCC
251 TCTCC GTGTA TCTTG GGGAA TTTTT TGACA TCCAT TTGTT TGTCA ATGGT
301 ACCGT GACAC AGGGG GACCA AAGAG TCTCC ATGCC CTATG CCTCC AAAGG
351 GCTGT ATCTA GAAAC TGAGG CTGGG TACTA CAAGC TGTCC GGTGA GGCCT
401 ATGGC TTTGT GGCCA GGATC GATGG CAGCG GCA AC TTTCA AGTCC TGCTG
451 TCAGA CAGAT ACTTC AACAA GACCT GCGGG CTGTG TGGCA ACTTT AACAT
501 CTTTG CTGAA GATGA CTTTA TGACC CAAGA AGGGA CCTTG ACCTC GGACC 551 CTTAT GACTT TGCCA ACTCA TGGGC TCTGA GCAGT GGAGA ACAGT GGTGT
601 GAACG GGCAT CTCCT CCCAG CAGCT CATGC A AC AT CTCCT CTGGG GA A AT
651 GCAGA AGGGC CTGTG GGAGC AGTGC CAGCT TCTGA AGAGC ACCTC GGTGT
701 TTGCC CGCTG CCACC CTCTG GTGGA CCCCG AGCCT TTTGT GGCCC TGTGT
751 GAGAA GACTT TGTGT GAGTG TGCTG GGGGG CTGGA GTGCG CCTGC CCTGC
801 CCTCC TGGAG TACGC CCGGA CCTGT GCCCA GGAGG GAATG GTGCT GTACG
851 GCTGG ACCGA CCACA GCGCG TGCAG CCCAG TGTGC CCTGC TGGTA TGGAG
901 TAT AG GCAGT GTGTG TCCCC TTGCG CC AGG ACCTG CCAGA GCCTG C AC AT
951 CAATG AAATG TGTCA GGAGC GATGC GTGGA TGGCT GCAGC TGCCC TGAGG
1001 GACAG CTCCT GGATG AAGGC CTCTG CGTGG AGAGC ACCGA GTGTC CCTGC
1051 GTGCA TTCCG GAAAG CGCTA CCCTC CCGGC ACCTC CCTCT CTCGA GACTG
1101 C A AC A CCTGC ATTTG CCGA A AC AGC C AGTG GATCT GCAGC A ATGA AGA AT
1151 GTCCA GGGGA GTGCC TTGTC ACTGG TCAAT CCCAC TTCAA GAGCT TTGAC
1201 A AC AG AT ACT TC ACC TTC AG TGGGA TCTGC C AGT A CCTGC TGGCC CGGGA
1251 TTGCC AGGAC CACTC CTTCT CCATT GTCAT TGAGA CTGTC CAGTG TGCTG
1301 ATGAC CGCGA CGCTG TGTGC ACCCG CTCCG TCACC GTCCG GCTGC CTGGC
1351 CTGC A C A AC A GCCTT GTGA A ACTGA AGC AT GGGGC AGGAG TTGCC ATGGA
1401 TGGCC AGGAC ATCCA GCTCC CCCTC CTGAA AGGTG ACCTC CGCAT CCAGC
1451 АТАСА GTGAC GGCCT CCGTG CGCCT CAGCT ACGGG GAGGA CCTGC AGATG
1501 GACTG GGATG GCCGC GGGAG GCTGC TGGTG AAGCT GTCCC CCGTC TATGC
1551 CGGGA AGACC TGCGG CCTGT GTGGG A ATT A CAATG GCA AC C AGGG CGACG
1601 ACTTC CTTAC CCCCT CTGGG CTGGC GGAGC CCCGG GTGGA GGACT TCGGG 1651 AACGC CTGGA AGCTG CACGG GGACT GCCAG GACCT GCAGA AGCAG CACAG
1701 CGATC CCTGC GCCCT CAACC CGCGC ATGAC CAGGT TCTCC GAGGA GGCGT 1751 GCGCG GTCCT GACGT CCCCC ACATT CGAGG CCTGC CATCG TGCCG TCAGC
1801 CCGCT GCCCT ACCTG CGGAA CTGCC GCTAC GACGT GTGCT CCTGC TCGGA
- 123 044115
1851 CGGCC GCGAG TGCCT GTGCG GCGCC CTGGC CAGCT ATGCC GCGGC CTGCG 1901 CGGGG AGAGG CGTGC GCGTC GCGTG GCGCG AGCCA GGCCG CTGTG AGCTG 1951 AACTG CCCGA AAGGC CAGGT GT ACC TGCAG TGCGG GACCC CCTGC AACCT 2001 GACCT GCCGC TCTCT CTCTT ACCCG GATGA GGAAT GCA AT GAGGC CTGCC 2051 TGGAG GGCTG CTTCT GCCCC CCAGG GCTCT ACATG GATGA GAGGG GGGAC 2101 TGCGT GCCCA AGGCC CAGTG CCCCT GTTAC TATGA CGGTG AGATC TTCCA 2151 GCC AG A AGAC ATCTT CTC AG АССАТ САС AC C ATGT GCT AC TGTGA GGATG 2201 GCTTC ATGCA CTGTA CCATG AGTGG AGTCC CCGGA AGCTT GCTGC CTGAC 2251 GCTGT CCTCA GCAGT CCCCT GTCTC ATCGC AGCAA AAGGA GCCTA TCCTG 2301 TCGGC CCCCC ATGGT CAAGC TGGTG TGTCC CGCTG ACAAC CTGCG GGCTG 2351 A AGGG CTCGA GTGT A CCA A A ACGTG CC AGA АСТАТ GACCT GGAGT GC ATG 2401 AGCAT GGGCT GTGTC TCTGG CTGCC TCTGC CCCCC GGGCA TGGTC CGGCA 2451 TGAGA ACAGA TGTGT GGCCC TGGAA AGGTG TCCCT GCTTC CATCA GGGCA 2501 AGGAG TATGC CCCTG GAGAA ACAGT GAAGA TTGGC TGCAA CACTT GTGTC 2551 TGTCG GGACC GGAAG TGGAA CTGCA CAGAC CATGT GTGTG ATGCC ACGTG 2601 CTCCA CGATC GGCAT GGCCC ACT AC CTCAC CTTCG ACGGG CTCAA AT ACC 2651 TGTTC CCCGG GGAGT GCCAG TACGT TCTGG TGCAG GATTA CTGCG GCAGT 2701 AACCC TGGGA CCTTT CGGAT CCTAG TGGGG AATAA GGGAT GCAGC CACCC 2751 CTCAG TGAAA TGCAA GAAAC GGGTC АССАТ CCTGG TGGAG GGAGG AGAGA 2801 TTGAG CTGTT TGACG GGGAG GTGAA TGTGA AGAGG CCCAT GAAGG ATGAG 2851 ACTCA CTTTG AGGTG GTGGA GTCTG GCCGG TACAT CATTC TGCTG CTGGG 2901 CAAAG CCCTC TCCGT GGTCT GGGAC CGCCA CCTGA GCATC TCCGT GGTCC 2951 TGAAG CAGAC AT ACC AGGAG AAAGT GTGTG GCCTG TGTGG GAATT TTGAT 3001 GGCAT CCAGA ACAAT GACCT САССА GCAGC AACCT CCAAG TGGAG GAAGA 3051 CCCTG TGGAC TTTGG GAACT CCTGG AAAGT GAGCT CGCAG TGTGC TGACA 3101 CCAGA AAAGT GCCTC TGGAC ТС АТС CCCTG CC ACC TGCC А ТА AC A AC АТС 3151 ATGAA GCAGA CGATG GTGGA TTCCT CCTGT AGAAT CCTTA CCAGT GACGT 3201 CTTCC AGGAC TGCAA CAAGC TGGTG GACCC CGAGC CAT AT CTGGA TGTCT 3251 GCATT TACGA CACCT GCTCC TGTGA GTCCA TTGGG GACTG CGCCG CATTC 3301 TGCGA САССА TTGCT GCCTA TGCCC ACGTG TGTGC CCAGC ATGGC AAGGT 3351 GGTGA CCTGG AGGAC GGCCA CATTG TGCCC CCAGA GCTGC GAGGA GAGGA 3401 ATCTC CGGGA GAACG GGTAT GAGGC TGAGT GGCGC TATAA CAGCT GTGCA 3451 CCTGC CTGTC AAGTC ACGTG TCAGC ACCCT GAGCC ACTGG CCTGC CCTGT 3501 GCAGT GTGTG GAGGG CTGCC ATGCC CACTG CCCTC CAGGG AAAAT CCTGG 3551 ATGAG CTTTT GCAGA CCTGC GTTGA CCCTG AAGAC TGTCC AGTGT GTGAG 3601 GTGGC TGGCC GGCGT TTTGC CTCAG GAAAG AAAGT CACCT TGAAT CCCAG 3651 TGACC CTGAG CACTG CCAGA TTTGC CACTG TGATG TTGTC AACCT CACCT 3701 GTGAA GCCTG CCAGG AGCCG ATATC GGGCG CGCCA AC АТС AGAGA GCGCC
- 124 044115
3751 ACCCC TGAAA GTGGT CCCGG GAGCG AGCCA GCCAC ATCTG GGTCG GAAAC
3801 GCCAG GCACA AGTGA GTCTG CAACT CCCGA GTCCG GACCT GGCTC CGAGC
3851 CTGCC ACT AG CGGCT CCGAG ACTCC GGGA A CTTCC GAGAG CGCT A САССА
3901 GAAAG CGGAC CCGGA ACCAG TACCG AACCT AGCGA GGGCT CTGCT CCGGG
3951 CAGCC CAGCC GGCTC TCCTA CATCC ACGGA GGAGG GCACT TCCGA ATCCG
4001 CCACC CCGGA GTCAG GGCCA GGATC TGAAC CCGCT ACCTC AGGCA GTGAG
4051 ACGCC AGGAA CGAGC GAGTC CGCTA CACCG GAGAG TGGGC CAGGG AGCCC
4101 TGCTG GATCT CCTAC GTCCA CTGAG GAAGG GTCAC CAGCG GGCTC GCCCA
4151 CC AGC ACTG A AGA AG GTGCC TCGAG CGGCG GTGGA GGTTC CGGTG GCGGG
4201 GGATC CGGTG GCGGG GGATC CGGTG GCGGG GGATC CGGTG GCGGG GGATC 4251 CCTGG TCCCC CGGGG CAGCG GAGGC GACAA AACTC AC АСА TGCCC ACCGT
4301 GCCCA GCTCC AGAAC TCCTG GGCGG ACCGT CAGTC TTCCT CTTCC CCCCA
4351 A A ACC C A AGG AC ACC CTC AT GATCT CCCGG ACCCC TGAGG TC AC A TGCGT
4401 GGTGG TGGAC GTGAG CCACG AAGAC CCTGA GGTCA AGTTC AACTG GTACG
4451 TGGAC GGCGT GGAGG TGCAT AATGC CAAGA CAAAG CCGCG GGAGG AGCAG
4501 TACAA CAGCA CGTAC CGTGT GGTCA GCGTC CTCAC CGTCC TGCAC CAGGA
4551 CTGGC TGA AT GGC A A GGAGT AC A AG TGC A A GGTCT CCA AC A A AGC CCTCC
4601 CAGCC CCCAT CGAGA AAACC ATCTC CAAAG CCAAA GGGCA GCCCC GAGAA
4651 CCACA GGTGT ACACC CTGCC CCCAT CCCGG GATGA GCTGA CCAAG AACCA
4701 GGTCA GCCTG ACCTG CCTGG TCAAA GGCTT СТ АТС CCAGC GAC AT CGCCG
4751 TGGAG TGGGA GAGCA ATGGG CAGCC GGAGA ACAAC TACAA GACCA CGCCT
4801 CCCGT GTTGG ACTCC GACGG CTCCT TCTTC CTCTA CAGCA AGCTC ACCGT
4851 GGACA AGAGC AGGTG GCAGC AGGGG AACGT CTTCT CATGC TCCGT GATGC
4901 ATGAG GCTCT GCACA ACC AC TAC AC GCAGA AGAGC CTCTC CCTGT CTCCG
4951 GGTAAATGA
Последовательность белка ФВ057 (SEQ ID NO: 152).
MIPARFAGVL LALALILPGT LCAEGTRGRS STARCSLFGS DFVNTFDGSM
YSFAGYCSYL LAGGCQKRSF SIIGDFQNGK RVSLSVYLGE FFDIHLFVNG
101 TVTQGDQRVS MPYASKGLYL ETEAGYYKLS GEAYGFVARIDGSGNFQVLL
151 SDRYFNKTCG LCGNFNIFAE DDFMTQEGTL TSDPYDFANS WALSSGEQWC
201 ERASPPSSSC NISSGEMQKG LWEQCQLLKS TSVFARCHPL VDPEPFVALC
251 EKTLCECAGG LECACPALLE YARTCAQEGM VLYGWTDHSA CSPVCPAGME
301 YRQCVSPCAR TCQSLHINEM CQERCVDGCS CPEGQLLDEG LCVESTECPC
351 VHSGKRYPPG TSLSRDCNTC ICRNSQWICS NEECPGECLV TGQSHFKSFD
401 NRYFTFSGIC QYLLARDCQD HSFSIVIETV QCADDRDAVC TRSVTVRLPG
451 LHNSLVKLKH GAGVAMDGQD IQLPLLKGDL RIQHTVTASV RLSYGEDLQM
- 125 044115
501 DWDGRGRLLV KLSPVYAGKT CGLCGNYNGN QGDDFLTPSG LAEPRVEDFG
551 NAWKLHGDCQ DLQKQHSDPC ALNPRMTRFS EEACAVLTSP TFEACHRAVS
601 PLPYLRNCRY DVCSCSDGRE CLCGALASYA AACAGRGVRV AWREPGRCEL
651 NCPKGQVYLQ CGTPCNLTCR SLSYPDEECN EACLEGCFCP PGLYMDERGD
701 CVPKAQCPCY YDGEIFQPED IFSDHHTMCY CEDGFMHCTM SGVPGSLLPD 751 AVLSSPLSHR SKRSLSCRPP MVKLVCPADN LRAEGLECTK TCQNYDLECM
801 SMGCVSGCLC PPGMVRHENR CVALERCPCF HQGKEYAPGE TVKIGCNTCV
851 CRDRKWNCTD HVCDATCSTIGMAHYLTFDG LKYLFPGECQ YVLVQDYCGS
901 NPGTFRILVG NKGCSHPSVK CKKRVTILVE GGEIELFDGE VNVKRPMKDE
951 THFEVVESGR YIILLLGKAL SVVWDRHLSI SVVLKQTYQE KVCGLCGNFD 1001 GIQNNDLTSS NLQVEEDPVD FGNSWKVSSQ CADTRKVPLD SSPATCHNNI 1051 MKQTMVDSSC RILTSDVFQD CNKLVDPEPY LDVCIYDTCS CESIGDCAAF
1101 CDTIAAYAHV CAQHGKVVTW RTATLCPQSC EERNLRENGY EAEWRYNSCA
1151 PACQVTCQHP EPLACPVQCV EGCHAHCPPG KILDELLQTC VDPEDCPVCE 1201 VAGRRFASGK KVTLNPSDPE HCQICHCDVV NLTCEACQEPISGAPTSESA
1251 TPESGPGSEP ATSGSETPGT SESATPESGP GSEPATSGSE TPGTSESATP 1301 ESGPGTSTEP SEGSAPGSPA GSPTSTEEGT SESATPESGP GSEPATSGSE 1351 TPGTSESATP ESGPGSPAGS PTSTEEGSPA GSPTSTEEGA SSGGGGSGGG
1401 GSGGGGSGGG GSGGGGSLVP RGSGGDKTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP
1451 KPKDTLMISR TPEVTCVVVD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ 1501 YNSTYRVVSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE 1551 PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP
1601 PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP
1651 GK*
Нуклеотидная последовательность ФВ058 (ФВ034 с мутацией IHH)(SEQ ID NO: 153).
ATGAT TCCTG CCAGA TTTGC CGGGG TGCTG CTTGC TCTGG CCCTC ATTTT
GCCAG GGACC CTTTG TGC AG AAGGA ACTCG CGGCA GGTC A TCC AC GGCCC 101 GATGC AGCCT TTTCG GA AGT GACTT CGTC A AC ACC TTTGA TGGG A GC ATG
151 TACAG CTTTG CGGGA TACTG CAGTT ACCTC CTGGC AGGGG GCTGC CAGAA
201 ACGCT CCTTC TCGAT T ATTG GGGAC TTCC A GA ATG GCA AG AGAGT GAGCC
251 TCTCC GTGTA TCTTG GGGAA TTTTT TGACA TCCAT TTGTT TGTCA ATGGT
301 ACCGT GACAC AGGGG GACCA AAGAG TCTCC ATGCC CTATG CCTCC AAAGG
351 GCTGT ATCTA GAAAC TGAGG CTGGG TACTA CAAGC TGTCC GGTGA GGCCT
401 ATGGC TTTGT GGCCA GGATC GATGG CAGCG GCA AC TTTCA AGTCC TGCTG
451 TCAGA CAGAT ACTTC AACAA GACCT GCGGG CTGTG TGGCA ACTTT AACAT
501 CTTTG CTGAA GATGA CTTTA TGACC CAAGA AGGGA CCTTG ACCTC GGACC
- 126 044115
551 CTTAT GACTT TGCCA ACTCA TGGGC TCTGA GCAGT GGAGA ACAGT GGTGT
601 GA ACG GGC AT CTCCT CCCAG C AGCT C ATGC A AC AT CTCCT CTGGG GA A AT
651 GCAGA AGGGC CTGTG GGAGC AGTGC CAGCT TCTGA AGAGC ACCTC GGTGT
701 TTGCC CGCTG CCACC CTCTG GTGGA CCCCG AGCCT TTTGT GGCCC TGTGT
751 GAGAA GACTT TGTGT GAGTG TGCTG GGGGG CTGGA GTGCG CCTGC CCTGC 801 CCTCC TGGAG TACGC CCGGA CCTGT GCCCA GGAGG GAATG GTGCT GTACG
851 GCTGG ACCGA CCACA GCGCG TGCAG CCCAG TGTGC CCTGC TGGTA TGGAG
901 TAT AG GCAGT GTGTG TCCCC TTGCG CC AGG ACCTG CCAGA GCCTG C AC AT
951 CAATG AAATG TGTCA GGAGC GATGC GTGGA TGGCT GCAGC TGCCC TGAGG
1001 GACAG CTCCT GGATG AAGGC CTCTG CGTGG AGAGC ACCGA GTGTC CCTGC 1051 GTGCA TTCCG GAAAG CGCTA CCCTC CCGGC ACCTC CCTCT CTCGA GACTG 1101 C A AC A CCTGC ATTTG CCGA A AC AGC C AGTG GATCT GCAGC A ATGA AGA AT 1151 GTCCA GGGGA GTGCC TTGTC ACTGG TCAAT CCCAC TTCAA GAGCT TTGAC 1201 A AC AG AT ACT TC ACC TTC AG TGGGA TCTGC C AGT A CCTGC TGGCC CGGGA 1251 TTGCC AGGAC CACTC CTTCT CCATT GTCAT TGAGA CTGTC CAGTG TGCTG 1301 ATGAC CGCGA CGCTG TGTGC ACCCG CTCCG TCACC GTCCG GCTGC CTGGC 1351 CTGC A C A AC A GCCTT GTGA A ACTGA AGC AT GGGGC AGGAG TTGCC ATGGA 1401 TGGCC AGGAC ATCCA GCTCC CCCTC CTGAA AGGTG ACCTC CGCAT CCAGC 1451 АТАСА GTGAC GGCCT CCGTG CGCCT CAGCT ACGGG GAGGA CCTGC AGATG 1501 GACTG GGATG GCCGC GGGAG GCTGC TGGTG AAGCT GTCCC CCGTC TATGC 1551 CGGGA AGACC TGCGG CCTGT GTGGG A ATT A CAATG GCA AC C AGGG CGACG 1601 ACTTC CTTAC CCCCT CTGGG CTGGC GGAGC CCCGG GTGGA GGACT TCGGG 1651 AACGC CTGGA AGCTG CACGG GGACT GCCAG GACCT GCAGA AGCAG CACAG 1701 CGATC CCTGC GCCCT СAACC CGCGC ATGAC CAGGT TCTCC GAGGA GGCGT 1751 GCGCG GTCCT GACGT CCCCC ACATT CGAGG CCTGC CATCG TGCCG TCAGC 1801 CCGCT GCCCT ACCTG CGGAA CTGCC GCTAC GACGT GTGCT CCTGC TCGGA 1851 CGGCC GCGAG TGCCT GTGCG GCGCC CTGGC CAGCT ATGCC GCGGC CTGCG 1901 CGGGG AGAGG CGTGC GCGTC GCGTG GCGCG AGCCA GGCCG CTGTG AGCTG 1951 AACTG CCCGA AAGGC CAGGT GT ACC TGCAG TGCGG GACCC CCTGC AACCT 2001 GACCT GCCGC TCTCT CTCTT ACCCG GATGA GGAAT GCA AT GAGGC CTGCC 2051 TGGAG GGCTG CTTCT GCCCC CCAGG GCTCT ACATG GATGA GAGGG GGGAC 2101 TGCGT GCCCA AGGCC CAGTG CCCCT GTTAC TATGA CGGTG AG АТС TTCCA 2151 GCCAG AAGAC ATCTT CTC AG АССАТ САС AC C ATGT GCTAC TGTGA GGATG 2201 GCTTC ATGCA CTGTA CCATG AGTGG AGTCC CCGGA AGCTT GCTGC CTGAC 2251 GCTGT CCTCA GCAGT CCCCT GTCTC ATCGC AGCAA AAGGA GCCTA TCCTG 2301 TCGGC CCCCC ATGGT CAAGC TGGTG TGTCC CGCTG ACAAC CTGCG GGCTG 2351 A AGGG CTCGA GTGT A CCA A A ACGTG CCAGA АСТАТ GACCT GGAGT GC ATG 2401 AGCAT GGGCT GTGTC TCTGG CTGCC TCTGC CCCCC GGGCA TGGTC CGGCA
- 127 044115
2451 TGAGA ACAGA TGTGT GGCCC TGGAA AGGTG TCCCT GCTTC CATCA GGGCA
2501 AGGAG TATGC CCCTG GAGAA ACAGT GAAGA TTGGC TGCAA CACTT GTGTC
2551 TGTCG GGACC GGAAG TGGAA CTGCA CAGAC CATGT GTGTG ATGCC ACGTG
2601 CTCCA CGATC GGC AT GGCCC ACT AC CTCAC CTTCG ACGGG CTCAA AT ACC 2651 TGTTC CCCGG GGAGT GCCAG TACGT TCTGG TGCAG GATTA CTGCG GCAGT 2701 AACCC TGGGA CCTTT CGGAT CCTAG TGGGG AATAA GGGAT GCAGC CACCC 2751 CTCAG TGAAA TGCAA GAAAC GGGTC ACCAT CCTGG TGGAG GGAGG AGAGA 2801 TTGAG CTGTT TGACG GGGAG GTGAA TGTGA AGAGG CCCAT GAAGG ATGAG 2851 ACTCA CTTTG AGGTG GTGGA GTCTG GCCGG TACAT CATTC TGCTG CTGGG 2901 CAAAG CCCTC TCCGT GGTCT GGGAC CGCCA CCTGA GCATC TCCGT GGTCC 2951 TGAAG CAGAC AT ACC AGGAG AAAGT GTGTG GCCTG TGTGG GAATT TTGAT 3001 GGCAT CCAGA ACAAT GACCT САССА GCAGC AACCT CCAAG TGGAG GAAGA 3051 CCCTG TGGAC TTTGG GAACT CCTGG AAAGT GAGCT CGCAG TGTGC TGACA 3101 CCAGA AAAGT GCCTC TGGAC ТС АТС CCCTG CC ACC TGCC А ТА AC A AC АТС 3151 ATGAA GCAGA CGATG GTGGA TTCCT CCTGT AGAAT CCTTA CCAGT GACGT 3201 CTTCC AGGAC TGCAA CAAGC TGGTG GACCC CGAGC CAT AT CTGGA TGTCT 3251 GCATT TACGA CACCT GCTCC TGTGA GTCCA TTGGG GACTG CGCCG CATTC 3301 TGCGA САССА TTGCT GCCTA TGCCC ACGTG TGTGC CCAGC ATGGC AAGGT
3351 GGTGA CCTGG AGGAC GGCCA CATTG TGCCC CCAGA GCTGC GAGGA GAGGA 3401 ATCTC CGGGA GAACG GGTAT GAGGC TGAGT GGCGC TATAA CAGCT GTGCA 3451 CCTGC CTGTC AAGTC ACGTG TCAGC ACCCT GAGCC ACTGG CCTGC CCTGT 3501 GCAGT GTGTG GAGGG CTGCC ATGCC CACTG CCCTC CAGGG AAAAT CCTGG 3551 ATGAG CTTTT GCAGA CCTGC GTTGA CCCTG AAGAC TGTCC AGTGT GTGAG 3601 GTGGC TGGCC GGCGT TTTGC CTCAG GAAAG AAAGT CACCT TGAAT CCCAG 3651 TGACC CTGAG CACTG CCAGA TTTGC CACTG TGATG TTGTC AACCT CACCT 3701 GTGAA GCCTG CCAGG AGCCG ATATC GGGTA CCTCA GAGTC TGCTA CCCCC 3751 GAGTC AGGGC CAGGA TCAGA GCCAG CCACC TCCGG GTCTG AGACA CCCGG 3801 GACTT CCGAG AGTGC CACCC CTGAG TCCGG ACCCG GGTCC GAGCC CGCCA 3851 CTTCC GGCTC CGAAA CTCCC GGCAC AAGCG AGAGC GCTAC CCCAG AGTCA 3901 GGACC AGGAA CATCT ACAGA GCCCT CTGAA GGCTC CGCTC CAGGG TCCCC
3951 AGCCG GCAGT CCCAC TAGCA CCGAG GAGGG AACCT CTGAA AGCGC CACAC 4001 CCGAA TCAGG GCCAG GGTCT GAGCC TGCTA CCAGC GGCAG CGAGA САССА 4051 GGCAC CTCTG AGTCC GCC AC ACC AG AGTCC GGACC CGGAT CTCCC GCTGG 4101 GAGCC CCACC TCC AC TGAGG AGGGA TCTCC TGCTG GCTCT CCA AC ATCT A 4151 CTGAG GAAGG T ACCT C A ACC GAGCC ATCCG AGGGA TCAGC TCCCG GC ACC 4201 TCAGA GTCGG C A ACC CCGGA GTCTG GACCC GGA AC TTCCG AAAGT GCC AC 4251 ACC AG AGTCC GGTCC CGGGA CTTCA GAATC AGCAA CACCC GAGTC CGGCC 4301 CTGGG TCTGA ACCCG CCACA AGTGG TAGTG AGACA CCAGG ATCAG AACCT
- 128 044115
4351 GCTAC СТС AG GGTC A GAGAC ACCCG GATCT CCGGC AGGCT САССА ACCTC
4401 C ACTG AGGAG GGC AC C AGC A C AGA A CCA AG CGAGG GCTCC GC ACC CGGA A
4451 CAAGC ACTGA ACCCA GTGAG GGTTC AGCAC CCGGC TCTGA GCCGG CCACA
4501 AGTGG CAGTG AGACA CCCGG CACTT CAGAG AGTGC CACCC CCGAG AGTGG
4551 CCCAG GCACT AGTAC CGAGC CCTCT GAAGG CAGTG CGCCA GATTC TGGCG
4601 GTGGA GGTTC CGGTG GCGGG GGATC CGGTG GCGGG GGATC CGGTG GCGGG
4651 GGATC CGGTG GCGGG GGATC CCTGG TCCCC CGGGG CAGCG GAGGC GACAA
4701 AACTC ACACA TGCCC ACCGT GCCCA GCTCC AGAAC TCCTG GGCGG ACCGT
4751 CAGTC TTCCT CTTCC CCCCA AAACC CAAGG ACACC CTCAT GGCCT CCCGG
4801 ACCCC TGAGG TCACA TGCGT GGTGG TGGAC GTGAG CCACG AAGAC CCTGA
4851 GGTC A AGTTC AACTG GT ACG TGGAC GGCGT GGAGG TGC AT AATGC C AAGA
4901 CAAAG CCGCG GGAGG AGCAG TACAA CAGCA CGTAC CGTGT GGTCA GCGTC
4951 CTCAC CGTCC TGGCC CAGGA CTGGC TGAAT GGCAA GGAGT ACAAG TGCAA
5001 GGTCT CCAAC AAAGC CCTCC CAGCC CCCAT CGAGA AAACC ATCTC CAAAG
5051 CCAAA GGGCA GCCCC GAGAA CCACA GGTGT ACACC CTGCC CCCAT CCCGC
5101 GATGA GCTGA CCA AG A ACC A GGTCA GCCTG ACCTG CCTGG TC A A A GGCTT
5151 СТ АТС CC AGC GAC AT CGCCG TGGAG TGGGA GAGCA ATGGG CAGCC GGAGA
5201 ACAAC TACAA GACCA CGCCT CCCGT GTTGG ACTCC GACGG CTCCT TCTTC
5251 CTCTA CAGCA AGCTC ACCGT GGACA AGAGC AGGTG GCAGC AGGGG AACGT
5301 CTTCT CATGC TCCGT GATGC ATGAG GCTCT GCACA ACGCC TACAC GCAGA
5351 AGAGC CTCTC CCTGT CTCCG GGTAA ATGA
Последовательность белка ФВ058 (ФВ034 с мутацией IHH) (SEQ ID NO: 154).
MIPARFAGVL LALALILPGT LCAEGTRGRS STARCSLFGS DFVNTFDGSM
YSFAGYCSYL LAGGCQKRSF SIIGDFQNGK RVSLSVYLGE FFDIHLFVNG
101 TVTQGDQRVS MPYASKGLYL ETEAGYYKLS GEAYGFVARI DGSGNFQVLL
151 SDRYFNKTCG LCGNFNIFAE DDFMTQEGTL TSDPYDFANS WALSSGEQWC
201 ERASPPSSSC NISSGEMQKG LWEQCQLLKS TSVFARCHPL VDPEPFVALC
251 EKTLCECAGG LECACPALLE YARTCAQEGM VLYGWTDHSA CSPVCPAGME
301 YRQCVSPCAR TCQSLHINEM CQERCVDGCS CPEGQLLDEG LCVESTECPC 351 VHSGKRYPPG TSLSRDCNTC ICRNSQWICS NEECPGECLV TGQSHFKSFD
401 NRYFTFSGIC QYLLARDCQD HSFSIVIETV QCADDRDAVC TRSVTVRLPG
451 LHNSLVKLKH GAGVAMDGQD IQLPLLKGDL RIQHTVTASV RLSYGEDLQM
501 DWDGRGRLLV KLSPVYAGKT CGLCGNYNGN QGDDFLTPSG LAEPRVEDFG 5 51 NAWKLHGDCQ DLQKQHSDPC ALNPRMTRFS EEACAVLTSP TFEACHRAVS 601 PLPYLRNCRY DVCSCSDGRE CLCGALASYA AACAGRGVRV AWREPGRCEL
- 129 044115
651 NCPKGQVYLQ CGTPCNLTCR SLSYPDEECN EACLEGCFCP PGLYMDERGD
701 CVPKAQCPCY YDGEIFQPED IFSDHHTMCY CEDGFMHCTM SGVPGSLLPD
751 AVLSSPLSHR SKRSLSCRPP MVKLVCPADN LRAEGLECTK TCQNYDLECM
801 SMGCVSGCLC PPGMVRHENR CVALERCPCF HQGKEYAPGE TVKIGCNTCV
851 CRDRKWNCTD HVCDATCSTI GMAHYLTFDG LKYLFPGECQ YVLVQDYCGS
901 NPGTFRILVG NKGCSHPSVK CKKRVTILVE GGEIELFDGE VNVKRPMKDE
951 THFEVVESGR YIILLLGKAL SVVWDRHLSI SVVLKQTYQE KVCGLCGNFD
1001 GIQNNDLTSS NLQVEEDPVD FGNSWKVSSQ CADTRKVPLD SSPATCHNNI 1051 MKQTMVDSSC RILTSDVFQD CNKLVDPEPY LDVCIYDTCS CESIGDCAAF 1101 CDTIAAYAHV CAQHGKVVTW RTATLCPQSC EERNLRENGY EAEWRYNSCA
1151 PACQVTCQHP EPLACPVQCV EGCHAHCPPG KILDELLQTC VDPEDCPVCE 1201 VAGRRFASGK KVTLNPSDPE HCQICHCDVV NLTCEACQEPISGTSESATP 1251 ESGPGSEPAT SGSETPGTSE SATPESGPGS EPATSGSETP GTSESATPES
1301 GPGTSTEPSE GSAPGSPAGS PTSTEEGTSE SATPESGPGS EPATSGSETP 1351 GTSESATPES GPGSPAGSPT STEEGSPAGS PTSTEEGTST EPSEGSAPGT
1401 SESATPESGP GTSESATPES GPGTSESATP ESGPGSEPAT SGSETPGSEP 1451 ATSGSETPGS PAGSPTSTEE GTSTEPSEGS APGTSTEPSE GSAPGSEPAT
1501 SGSETPGTSE SATPESGPGT STEPSEGSAP DSGGGGSGGG GSGGGGSGGG 1551 GSGGGGSLVP RGSGGDKTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMASR
1601 TPEVTCVVVD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRVVSV
1651 LTVLAQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR 1701 DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF
1751 LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNA YTQKSLSLSP GK* Нуклеотидная последовательность FVIII 169 (SEQ ID NO: 155).
ATGCA AATAG AGCTC TCCAC CTGCT TCTTT CTGTG CCTTT TGCGA TTCTG
CTTTA GTGCC ACCAG AAGAT ACTAC CTGGG TGCAG TGGAA CTGTC ATGGG
101 АСТАТ ATGCA AAGTG ATCTC GGTGA GCTGC CTGTG GACGC AAGAT TTCCT
151 CCTAG AGTGC CAAAA TCTTT TCCAT TCAAC ACCTC AGTCG TGTAC AAAAA
201 GACTC TGTTT GT AGA ATTCA CGGAT CACCT ТТТСА AC АТС GCT A A GCC A A
251 GGCCA CCCTG GATGG GTCTG CTAGG TCCTA CCАТС CAGGC TGAGG TTTAT
301 GAT AC AGTGG TCATT AC ACT TAAGA AC ATG GCTTC CCATC CTGTC AGTCT
351 TCATG CTGTT GGTGT ATCCT ACTGG AAAGC TTCTG AGGGA GCTGA ATATG
401 ATGAT CAGAC CAGTC A A AGG GAGA A AGA AG ATGAT AAAGT CTTCC CTGGT
451 GGAAG CCATA CAT AT GTCTG GCAGG TCCTG AAAGA GA ATG GTCCA ATGGC
501 CTCTG ACCC A CTGTG CCTTA CCTAC TC AT A TCTTT CTCAT GTGGA CCTGG
- 130 044115
551 TAAAA GACTT GAATT CAGGC CTCAT TGGAG CCCTA CTAGT ATGTA GAGAA
601 GGGAG TCTGG CCA AG GAAAA GACAC AGACC TTGCA CAAAT TTATA CT ACT
651 TTTTG CTGTA TTTGA TGAAG GGAAA AGTTG GCACT CAGAA AC AAA GAACT
701 CCTTG ATGC A GGAT A GGGAT GCTGC ATCTG CTCGG GCCTG GCCT A A A ATG
751 CACAC AGTCA ATGGT TATGT AAACA GGTCT CTGCC AGGTC TGATT GGATG
801 CCACA GGAAA TCAGT CTATT GGCAT GTGAT TGGAA TGGGC ACCAC TCCTG
851 AAGTG CACTC AATAT TCCTC GAAGG TCACA CATTT CTTGT GAGGA АССАТ
901 CGCC A GGCT A GCTTG GA AAT CTCGC C A AT A ACTTT CCTT A CTGCT C A A AC
951 ACTCT TGATG GACCT TGGAC AGTTT CT ACT GTTTT GTCAT ATCTC TTCCC
1001 ACCAA CATGA TGGCA TGGAA GCTTA TGTCA AAGTA GACAG CTGTC CAGAG 1051 GAACC CCAAC TACGA ATGAA AAATA ATGAA GAAGC GGAAG АСТАТ GATGA 1101 TGATC TT ACT GATTC TGA A A TGGAT GTGGT C AGGT TTGAT GATGA C A ACT 1151 CTCCT TCCTT TATCC AAATT CGCTC AGTTG CCAAG AAGCA TCCTA AAACT 1201 TGGGT AC ATT AC ATT GCTGC TGAAG AGGAG GACTG GGACT ATGCT CCCTT 1251 AGTCC TCGCC CCCGA TGACA GAAGT TATAA AAGTC AATAT TTGAA CAATG 1301 GCCCT CAGCG GATTG GTAGG AAGTA CAAAA AAGTC CGATT TATGG CATAC 1351 AC AGA TGA A A CCTTT A AGAC TCGTG A AGCT ATTC A GC ATG А АТС A GGA AT 1401 CTTGG GACCT TT ACT TT ATG GGGA A GTTGG AGAC A C ACTG TTGAT TAT AT 1451 TTAAG А АТС A AGCA A GC AGA CC AT A T AACA TCT AC CCTC A CGGAA TCACT 1501 GATGT CCGTC CTTTG TATTC AAGGA GATTA CCAAA AGGTG TAAAA CATTT 1551 GAAGG ATTTT CCA AT TCTGC C AGGA GA A AT ATTC A AATAT A A ATG GAC AG 1601 TGACT GT AGA AGATG GGCCA ACT AA ATCAG ATCCT CGGTG CCTGA CCCGC 1651 ТАТТА CTCTA GTTTC GTTAA TATGG AGAGA GATCT AGCTT CAGGA CTCAT 1701 TGGCC CTCTC CTCAT CTGCT AC AAA GAATC TGT AG ATCAA AGAGG AAACC 1751 AGATA ATGTC AGACA AGAGG AATGT CATCC TGTTT TCTGT ATTTG ATGAG 1801 AACCG AAGCT GGTAC CTCAC AGAGA AT ATA CAACG CTTTC TCCCC AATCC 1851 AGCTG GAGTG C AGCT TGAGG ATCC A GAGTT CCA AG CCTCC AAC AT C ATGC 1901 ACAGC ATCAA TGGCT ATGTT TTTGA T AGTT TGC AG TTGTC AGTTT GTTTG 1951 CATGA GGTGG CATAC TGGTA CATTC TAAGC ATTGG AGCAC AGACT GACTT 2001 CCTTT CTGTC TTCTT CTCTG GAT AT ACCTT CAAAC AC AAA ATGGT CT ATG 2051 AAGAC AC ACT CACCC TATTC CCATT CTCAG GAGAA ACTGT CTTCA TGTCG 2101 ATGGA AAACC C AGGT CT ATG GATTC TGGGG TGCC A C A ACT C AGAC TTTCG 2151 GA AC A GAGGC ATGAC CGCCT T ACTG A AGGT TTCT A GTTGT GAC A A GA AC A 2201 CTGGT GATTA TT ACG AGGAC AGTT A TGAAG AT ATT TC AGC AT ACT TGCTG 2251 AGTAA AAACA ATGCC ATTGA ACCAA GAAGC TTCTC TCAAA ACGGC GCGCC 2301 AGGTA CCTCA GAGTC TGCTA CCCCC GAGTC AGGGC CAGGA TCAGA GCCAG 2351 CCACC TCCGG GTCTG AGACA CCCGG GACTT CCGAG AGTGC CACCC CTGAG 2401 TCCGG ACCCG GGTCC GAGCC CGCCA CTTCC GGCTC CGAAA CTCCC GGCAC
- 131 044115
2451 AAGCG AGAGC GCT AC CCCAG AGTCA GGACC AGGAA CATCT AC AGA GCCCT 2501 CTGAA GGCTC CGCTC CAGGG TCCCC AGCCG GCAGT CCCAC TAGCA CCGAG 2551 GAGGG AACCT CTGAA AGCGC CACAC CCGAA TCAGG GCCAG GGTCT GAGCC 2601 TGCTA CCAGC GGC AG CGAGA САССА GGCAC CTCTG AGTCC GCCAC ACC AG 2651 AGTCC GGACC CGGAT CTCCC GCTGG GAGCC CCACC TCCAC TGAGG AGGGA 2701 TCTCC TGCTG GCTCT CCAAC ATCTA CTGAG GAAGG TACCT СAACC GAGCC
2751 ATCCG AGGGA TCAGC TCCCG GCACC TCAGA GTCGG CAACC CCGGA GTCTG 2801 GACCC GGAAC TTCCG AAAGT GCCAC ACCAG AGTCC GGTCC CGGGA CTTCA 2851 GAATC AGCAA CACCC GAGTC CGGCC CTGGG TCTGA ACCCG CCACA AGTGG 2901 TAGTG AGACA CCAGG ATCAG AACCT GCTAC CTCAG GGTCA GAGAC ACCCG 2951 GATCT CCGGC AGGCT САССА ACCTC CACTG AGGAG GGCAC CAGCA CAGAA 3001 CCAAG CGAGG GCTCC GCACC CGGAA CAAGC ACTGA ACCCA GTGAG GGTTC 3051 AGCAC CCGGC TCTGA GCCGG CCACA AGTGG CAGTG AGACA CCCGG CACTT 3101 CAGAG AGTGC CACCC CCGAG AGTGG CCCAG GCACT AGTAC CGAGC CCTCT 3151 GAAGG CAGTG CGCCA GCCTC GAGCC САССА GTCTT GAAAC GCCAT CAAGC 3201 TGAAA TAACT CGTAC TACTC TTCAG TCAGA TCAAG AGGAA ATCGA TTATG
3251 ATGAT ACCAT ATCAG TTGAA ATGAA GAAGG AAGAT TTTGA CATTT ATGAT 3301 GAGGA TGAAA ATCAG AGCCC CCGCA GCTTT CAAAA GAAAA CACGA CACTA 3351 TTTTA TTGCT GCAGT GGAGA GGCTC TGGGA TTATG GGATG AGTAG CTCCC 3401 CACAT GTTCT AAGAA ACAGG GCTCA GAGTG GCAGT GTCCC TCAGT TCAAG 3451 AAAGT TGTTT TCCAG GAATT TACTG ATGGC TCCTT TACTC AGCCC TTATA
3501 CCGTG GAGAA СТАЛА TGAAC ATTTG GGACT CCTGG GGCCA TATAT AAGAG 3551 CAGAA GTTGA AGATA ATATC ATGGT AACTT TCAGA AATCA GGCCT CTCGT 3601 CCCTA TTCCT TCTAT TCTAG CCTTA TTTCT TATGA GGAAG ATCAG AGGCA 3651 AGGAG CAGAA CCTAG AAAAA ACTTT GTCAA GCCTA ATGAA ACCAA AACTT 3701 ACTTT TGGAA AGTGC AAC AT CAT AT GGCAC CCACT AAAGA TGAGT TTGAC 3751 TGCAA AGCCT GGGCT TATTT CTCTG ATGTT GACCT GGAAA AAGAT GTGCA 3801 CTCAG GCCTG ATTGG ACCCC TTCTG GTCTG CCACA CTAAC ACACT GAACC 3851 CTGCT CATGG GAGAC AAGTG ACAGT ACAGG AATTT GCTCT GTTTT TCACC 3901 ATCTT TGATG AGACC AAAAG CTGGT ACTTC ACTGA ΑΛΑΤΑ TGGAA AGAAA 3951 CTGCA GGGCT CCCTG CAATA TCCAG ATGGA AGATC CCACT TTTAA AGAGA
4001 ATT AT CGCTT CCATG CAATC A ATGG СТАСА TAATG GAT AC ACT AC CTGGC 4051 TTAGT AATGG CTCAG GATCA AAGGA TTCGA TGGTA TCTGC TCAGC ATGGG 4101 CAGCA ATGAA A AC AT CC ATT CT ATT CATTT CAGTG GAC AT GTGTT CACTG 4151 TACGA AAAAA AGAGG AGT AT AAAAT GGCAC TGT AC A ATCT СТ АТС C AGGT 4201 GTTTT TGAGA CAGTG GAAAT GTTAC CATCC A A AGC TGGAA TTTGG CGGGT 4251 GGAAT GCCTT ATTGG CGAGC ATCTA CATGC TGGGA TGAGC ACACT TTTTC 4301 TGGTG TACAG CAATA AGTGT CAGAC TCCCC TGGGA ATGGC TTCTG GACAC
- 132 044115
4351 ATT AG AGATT TTC AG ATT AC AGCTT C AGGA C A AT A TGGAC AGTGG GCCCC
4401 A A AGC TGGCC AGACT TCATT ATTCC GGATC А АТС A ATGCC TGGAG САССА
4451 AGGAG CCCTT TTCTT GGATC AAGGT GGATC TGTTG GCACC AATGA TTATT 4501 CACGG CATCA AGACC CAGGG TGCCC GTCAG AAGTT CTCCA GCCTC TACAT
4551 CTCTC AGTTT АТС AT C ATGT AT AGT CTTGA TGGGA AGA AG TGGC A GACTT
4601 ATCGA GGAAA TTCCA CTGGA ACCTT AATGG TCTTC TTTGG CAATG TGGAT
4651 TCATC TGGGA TAAAA CACAA TATTT TTAAC CCTCC AATTA TTGCT CGATA
4701 CATCC GTTTG CACCC AACTC ATT AT AGC AT TCGCA GCACT CTTCG CATGG
4751 AGTTG ATGGG CTGTG ATTTA AATAG TTGCA GCATG CCATT GGGAA TGGAG
4801 AGTAA AGCAA TATCA GATGC ACAGA TTACT GCTTC ATCCT ACTTT ACCAA
4851 TATGT TTGCC ACCTG GTCTC CTTCA AAAGC TCGAC TTCAC CTCCA AGGGA
4901 GGAGT AATGC CTGGA GACCT CAGGT GAATA ATCCA AAAGA GTGGC TGCAA
4951 GTGGA CTTCC AGAAG ACAAT GAAAG TCACA GGAGT AACTA CTCAG GGAGT
5001 AAAAT CTCTG CTTAC CAGCA TGTAT GTGAA GGAGT TCCTC ATCTC CAGCA
5051 GTCAA GATGG CCATC AGTGG ACTCT CTTTT TTCAG AATGG CAAAG TAAAG
5101 GTTTT TC AGG GA A AT C A AGA CTCCT TCACA CCTGT GGTGA ACTCT CT AGA
5151 CCCAC CGTTA CTGAC TCGCT ACCTT CGAAT TCACC CCCAG AGTTG GGTGC
5201 ACC AG ATTGC CCTGA GGATG GAGGT TCTGG GCTGC GAGGC AC AGG ACCTC
5251 TACGA CAAAA CTCAC ACATG CCCAC CGTGC CCAGC TCCAG AACTC CTGGG 5301 CGGAC CGTCA GTCTT CCTCT TCCCC CCAAA ACCCA AGGAC ACCCT CATGA 5351 TCTCC CGGAC CCCTG AGGTC ACATG CGTGG TGGTG GACGT GAGCC ACGAA
5401 GACCC TGAGG TCAAG TTCAA CTGGT ACGTG GACGG CGTGG AGGTG CATAA
5451 TGCCA AGACA AAGCC GCGGG AGGAG CAGTA CAACA GCACG TACCG TGTGG
5501 TCAGC GTCCT CACCG TCCTG САССА GGACT GGCTG AATGG CAAGG AGTAC
5551 AAGTG CAAGG TCTCC AACAA AGCCC TCCCA GCCCC CATCG AGAAA АССАТ
5601 CTCCA AAGCC AAAGG GCAGC CCCGA GAACC ACAGG TGTAC ACCCT GCCCC 5651 CATCC CGGGA TGAGC TGACC AAGAA CCAGG TCAGC CTGAC CTGCC TGGTC 5701 AAAGG CTTCT ATCCC AGCGA CATCG CCGTG GAGTG GGAGA GCA AT GGGCA 5751 GCCGG AGAAC AACTA CAAGA CCACG CCTCC CGTGT TGGAC TCCGA CGGCT
5801 ССТТС TTCCT СТАСА GCAAG CTCAC CGTGG ACAAG AGCAG GTGGC AGCAG
5851 GGGAA CGTCT TCTC A TGCTC CGTGA TGC AT GAGGC TCTGC AC A AC C ACT A
5901 CACGC AGAAG AGCCT CTCCC TGTCT CCGGG TAAAT GA
Последовательность белка FVIII169 (SEQ ID NO: 70).
MQIELSTCFF LCLLRFCFSA TRRYYLGAVE LSWDYMQSDL GELPVDARFP
PRVPKSFPFN TSVVYKKTLF VEFTDHLFNIAKPRPPWMGL LGPTIQAEVY
101 DTVVITLKNM ASHPVSLHAV GVSYWKASEG AEYDDQTSQR EKEDDKVFPG
- 133 044115
151 GSHTYVWQVL KENGPMASDP LCLTYSYLSH VDLVKDLNSG LIGALLVCRE
201 GSLAKEKTQT LHKFILLFAV FDEGKSWHSE TKNSLMQDRD AASARAWPKM 251 HTVNGYVNRS LPGLIGCHRK SVYWHVIGMG TTPEVHSIFL EGHTFLVRNH 301 RQASLEISPI TFLTAQTLLM DLGQFLLFCH ISSHQHDGME AYVKVDSCPE 351 EPQLRMKNNE EAEDYDDDLT DSEMDVVRFD DDNSPSFIQI RSVAKKHPKT
401 WVHYIAAEEE DWDYAPLVLA PDDRSYKSQY LNNGPQRIGR KYKKVRFMAY 451 TDETFKTREA IQHESGILGP LLYGEVGDTL LIIFKNQASR PYNIYPHGIT 501 DVRPLYSRRL PKGVKHLKDF PILPGEIFKY KWTVTVEDGP TKSDPRCLTR
551 YYSSFVNMER DLASGLIGPL LICYKESVDQ RGNQIMSDKR NVILFSVFDE
601 NRSWYLTENI QRFLPNPAGV QLEDPEFQAS NIMHSINGYV FDSLQLSVCL 651 HEVAYWYILS IGAQTDFLSV FFSGYTFKHK MVYEDTLTLF PFSGETVFMS
701 MENPGLWILG CHNSDFRNRG MTALLKVSSC DKNTGDYYED SYEDISAYLL 751 SKNNAIEPRS FSQNGAPGTS ESATPESGPG SEPATSGSET PGTSESATPE 801 SGPGSEPATS GSETPGTSES ATPESGPGTS TEPSEGSAPG SPAGSPTSTE 851 EGTSESATPE SGPGSEPATS GSETPGTSES ATPESGPGSP AGSPTSTEEG
901 SPAGSPTSTE EGTSTEPSEG SAPGTSESAT PESGPGTSES ATPESGPGTS 951 ESATPESGPG SEPATSGSET PGSEPATSGS ETPGSPAGSP TSTEEGTSTE 1001 PSEGSAPGTS TEPSEGSAPG SEPATSGSET PGTSESATPE SGPGTSTEPS 1051 EGSAPASSPP VLKRHQAEIT RTTLQSDQEE IDYDDTISVE MKKEDFDIYD
1101 EDENQSPRSF QKKTRHYFIA AVERLWDYGM SSSPHVLRNR AQSGSVPQFK 1151 KVVFQEFTDG SFTQPLYRGE LNEHLGLLGP YIRAEVEDNI MVTFRNQASR
1201 PYSFYSSLIS YEEDQRQGAE PRKNFVKPNE TKTYFWKVQH HMAPTKDEFD
1251 CKAWAYFSDV DLEKDVHSGL IGPLLVCHTN TLNPAHGRQV TVQEFALFFT
1301 IFDETKSWYF TENMERNCRA PCNIQMEDPT FKENYRFHAI NGYIMDTLPG
1351 LVMAQDQRIR WYLLSMGSNE NIHSIHFSGH VFTVRKKEEY KMALYNLYPG
1401 VFETVEMLPS KAGIWRVECLIGEHLHAGMS TLFLVYSNKC QTPLGMASGH 1451 IRDFQITASG QYGQWAPKLA RLHYSGSINA WSTKEPFSWI KVDLLAPMII
1501 HGIKTQGARQ KFSSLYISQF IIMYSLDGKK WQTYRGNSTG TLMVFFGNVD
1551 SSGIKHNIFN PPIIARYIRL HPTHYSIRST LRMELMGCDL NSCSMPLGME 1601 SKAISDAQIT ASSYFTNMFA TWSPSKARLH LQGRSNAWRP QVNNPKEWLQ 1651 VDFQKTMKVT GVTTQGVKSL LTSMYVKEFL ISSSQDGHQW TLFFQNGKVK 1701 VFQGNQDSFT PVVNSLDPPL LTRYLRIHPQ SWVHQIALRM EVLGCEAQDL 1751 YDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE
1801 DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY
1851 KCKVSNKALP APIEKTIS KA KGQPREPQVY TLPPSRDELT KNQVSLTCLV
1901 KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ
1951 GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK*
- 134 044115
Нуклеотидная последовательность FVIII 263 (тройной мутант IHH) (SEQ ID NO: 156).
ATGCA AATAG AGCTC TCCAC CTGCT TCTTT CTGTG CCTTT TGCGA TTCTG
CTTTA GTGCC ACCAG AAGAT ACTAC CTGGG TGC AG TGGAA CTGTC ATGGG
101 АСТАТ ATGCA AGGCG CGCC A AC АТС AGAGA GCGCC ACCCC TGA A A GTGGT
151 CCCGG GAGCG AGCC A GCCAC ATCTG GGTCG GAAAC GCCAG GC AC A AGTGA
201 GTCTG CAACT CCCGA GTCCG GACCT GGCTC CGAGC CTGCC ACT AG CGGCT
251 CCGAG ACTCC GGGAA CTTCC GAGAG CGCTA САССА GAAAG CGGAC CCGGA
301 ACCAG TACCG AACCT AGCGA GGGCT CTGCT CCGGG CAGCC CAGCC GGCTC
351 TCCTA CATCC ACGGA GGAGG GCACT TCCGA ATCCG CCACC CCGGA GTCAG
401 GGCCA GGATC TGAAC CCGCT ACCTC AGGCA GTGAG ACGCC AGGAA CGAGC
451 GAGTC CGCTA CACCG GAGAG TGGGC CAGGG AGCCC TGCTG GATCT CCTAC
501 GTCCA CTGAG GAAGG GTCAC CAGCG GGCTC GCCCA CCAGC ACTGA AGAAG
551 GTGCC TCGAG CAGTG ATCTC GGTGA GCTGC CTGTG GACGC AAGAT TTCCT 601 CCTAG AGTGC CAAAA TCTTT TCCAT TCAAC ACCTC AGTCG TGTAC AAAAA
651 GACTC TGTTT GT AGA ATTCA CGGAT CACCT TTTCA ACATC GCTAA GCCAA
701 GGCCA CCCTG GATGG GTCTG CTAGG TCCTA CCАТС CAGGC TGAGG TTTAT
751 GAT AC AGTGG TCATT ACACT TAAGA ACATG GCTTC CCATC CTGTC AGTCT
801 TCATG CTGTT GGTGT ATCCT ACTGG AAAGC TTCTG AGGGA GCTGA ATATG
851 ATGAT CAGAC CAGTC AAAGG GAGAA AGAAG ATGAT AAAGT CTTCC CTGGT
901 GGA AG CC AT A CAT AT GTCTG GC AGG TCCTG A A AGA GA ATG GTCC A ATGGC
951 CTCTG ACCCA CTGTG CCTTA CCTAC TCATA TCTTT CTCAT GTGGA CCTGG
1001 TAAAA GACTT GA ATT CAGGC CTCAT TGGAG CCCTA CT AGT ATGTA GAGAA
1051 GGGAG TCTGG CC AAG GAAAA GAC AC AGACC TTGC A C AAAT TT ATA CT ACT
1101 TTTTG CTGT A TTTGA TGA AG GGA A A AGTTG GCACT C AGA A AC A A A GA ACT
1151 CCTTG ATGCA GGATA GGGAT GCTGC ATCTG CTCGG GCCTG GCCTA AAATG
1201 CACAC AGTCA ATGGT TATGT A A AC A GGTCT CTGCC AGGTC TGATT GGATG
1251 CCACA GGAAA TCAGT CTATT GGCAT GTGAT TGGAA TGGGC ACCAC TCCTG
1301 AAGTG CACTC AATAT TCCTC GAAGG TCACA CATTT CTTGT GAGGA АССАТ
1351 CGCC A GGCT A GCTTG GA A AT CTCGC C A AT A ACTTT CCTTA CTGCT C A A AC
1401 ACTCT TGATG GACCT TGGAC AGTTT CT ACT GTTTT GTCAT ATCTC TTCCC
1451 ACCAA CATGA TGGCA TGGAA GCTTA TGTCA AAGTA GACAG CTGTC CAGAG
1501 GAACC CCAAC TACGA ATGAA AAATA ATGAA GAAGC GGAAG АСТАТ GATGA 1551 TGATC TT ACT GATTC TGA A A TGGAT GTGGT C AGGT TTGAT GATGA CAACT
1601 CTCCT TCCTT TATCC AAATT CGCTC AGTTG CCAAG AAGCA TCCTA AAACT
1651 TGGGT АСАТТ ACATT GCTGC TGAAG AGGAG GACTG GGACT ATGCT CCCTT
1701 AGTCC TCGCC CCCGA TGACA GAAGT TATAA AAGTC AATAT TTGAA CAATG
1751 GCCCT CAGCG GATTG GTAGG AAGTA CAAAA AAGTC CGATT TATGG CATAC
- 135 044115
1801 ACAGA TGAAA CCTTT AAGAC TCGTG AAGCT ATTCA GCATG AATCA GGAAT
1851 CTTGG GACCT TT ACT TT ATG GGGA A GTTGG AGAC A C ACTG TTGAT TAT AT
1901 TTAAG AATCA AGCA A GCAGA CC AT A T AACA ТСТ AC CCTC A CGGAA TCACT
1951 GATGT CCGTC CTTTG TATTC AAGGA GATTA CCAAA AGGTG TAAAA CATTT
2001 GA AGG ATTTT CCA AT TCTGC CAGGA GA A AT ATTCA A AT AT A A ATG GAC AG
2051 TGACT GT AGA AGATG GGCCA ACTAA ATCAG ATCCT CGGTG CCTGA CCCGC
2101 ТАТТА CTCT A GTTTC GTT A A T ATGG AGAGA GATCT AGCTT CAGGA CTC AT
2151 TGGCC CTCTC CTC AT CTGCT AC A A A GA ATC TGT AG ATC A A AGAGG A A ACC
2201 AGATA ATGTC AGACA AGAGG AATGT CATCC TGTTT TCTGT ATTTG ATGAG
2251 AACCG AAGCT GGT AC CTCAC AGAGA AT ATA CAACG CTTTC TCCCC AATCC
2301 AGCTG GAGTG CAGCT TGAGG ATCCA GAGTT CCAAG CCTCC AACAT CATGC
2351 AC AGC ATC A A TGGCT ATGTT TTTGA T AGTT TGCAG TTGTC AGTTT GTTTG
2401 CATGA GGTGG CAT AC TGGTA CATTC TA AGC ATTGG AGC AC AGACT GACTT
2451 CCTTT CTGTC TTCTT CTCTG GAT AT ACCTT CAAAC AC AAA ATGGT CT ATG
2501 AAGAC ACACT CACCC TATTC CCATT CTCAG GAGAA ACTGT CTTCA TGTCG
2551 ATGGA A AACC CAGGT CT ATG GATTC TGGGG TGCC A C A ACT C AGAC TTTCG
2601 GAACA GAGGC ATGAC CGCCT TACTG AAGGT TTCTA GTTGT GACAA GAACA
2651 CTGGT GATTA TTACG AGGAC AGTTA TGAAG AT ATT TCAGC AT ACT TGCTG
2701 AGTAA AAACA ATGCC ATTGA ACCAA GAAGC TTCTC TCAAA ACGGC GCGCC
2751 AGGTA CCTCA GAGTC TGCTA CCCCC GAGTC AGGGC CAGGA TCAGA GCCAG
2801 CCACC TCCGG GTCTG AGACA CCCGG GACTT CCGAG AGTGC CACCC CTGAG
2851 TCCGG ACCCG GGTCC GAGCC CGCCA CTTCC GGCTC CGAAA CTCCC GGCAC
2901 AAGCG AGAGC GCTAC CCCAG AGTCA GGACC AGGAA CATCT ACAGA GCCCT
2951 CTGAA GGCTC CGCTC CAGGG TCCCC AGCCG GCAGT CCCAC TAGCA CCGAG
3001 GAGGG AACCT CTGAA AGCGC CACAC CCGAA TCAGG GCCAG GGTCT GAGCC
3051 TGCTA CCAGC GGC AG CGAGA САССА GGC AC CTCTG AGTCC GCCAC ACC AG
3101 AGTCC GGACC CGGAT CTCCC GCTGG GAGCC CCACC TCCAC TGAGG AGGGA
3151 TCTCC TGCTG GCTCT CCAAC ATCTA CTGAG GAAGG TACCT CAACC GAGCC
3201 ATCCG AGGGA TCAGC TCCCG GCACC TCAGA GTCGG CAACC CCGGA GTCTG
3251 GACCC GGAAC TTCCG AAAGT GCCAC ACC AG AGTCC GGTCC CGGGA CTTCA
3301 GAATC AGCAA CACCC GAGTC CGGCC CTGGG TCTGA ACCCG CCACA AGTGG
3351 TAGTG AGACA CCAGG ATCAG AACCT GCTAC CTCAG GGTCA GAGAC ACCCG
3401 GATCT CCGGC AGGCT САССА ACCTC CACTG AGGAG GGCAC CAGCA CAGAA 3451 CCAAG CGAGG GCTCC GCACC CGGAA CAAGC ACTGA ACCCA GTGAG GGTTC 3501 AGCAC CCGGC TCTGA GCCGG CCACA AGTGG CAGTG AGACA CCCGG CACTT
3551 CAGAG AGTGC CACCC CCGAG AGTGG CCCAG GCACT AGTAC CGAGC CCTCT
3601 GAAGG CAGTG CGCCA GCCTC GAGCC САССА GTCTT GAAAC GCCAT CAAGC
3651 TGAAA TAACT CGTAC TACTC TTCAG TCAGA TCAAG AGGAA ATCGA TTATG
- 136 044115
3701 ATGAT АССАТ АТС AG TTGAA ATGAA GAAGG AAGAT TTTGA CATTT ATGAT 3751 GAGGA TGAAA АТС AG AGCCC CCGCA GCTTT CAAAA GAAAA CACGA CACTA 3801 TTTTA TTGCT GCAGT GGAGA GGCTC TGGGA TTATG GGATG AGTAG CTCCC 3851 C AC AT GTTCT A AGA A AC AGG GCTC A GAGTG GCAGT GTCCC TC AGT TCA AG 3901 AAAGT TGTTT TCCAG GAATT T ACTG ATGGC TCCTT T ACTC AGCCC TT AT A 3951 CCGTG GAGAA CT AAA TGAAC ATTTG GGACT CCTGG GGCCA TAT AT AAGAG 4001 CAGAA GTTGA AGATA ATATC ATGGT AACTT TCAGA AATCA GGCCT CTCGT 4051 CCCTA TTCCT TCT AT TCTAG CCTTA TTTCT TATGA GGAAG АТС AG AGGCA
4101 AGGAG CAGAA CCT AG A A A A A ACTTT GTC A A GCCT A ATGAA ACC A A AACTT 4151 ACTTT TGGA A AGTGC A AC AT CAT AT GGC AC CC ACT A A AGA TGAGT TTGAC 4201 TGC A A AGCCT GGGCT TATTT CTCTG ATGTT GACCT GGA A A AAGAT GTGCA 4251 CTCAG GCCTG ATTGG ACCCC TTCTG GTCTG CCACA CTAAC ACACT GAACC 4301 CTGCT CATGG GAGAC AAGTG ACAGT ACAGG AATTT GCTCT GTTTT TCACC 4351 ATCTT TGATG AGACC A A AAG CTGGT ACTTC ACTGA A A AT A TGGA A AGA A A 4401 CTGCA GGGCT CCCTG CAATA TCCAG ATGGA AGATC CCACT TTT A A AGAGA 4451 ATT AT CGCTT CCATG CAATC AATGG СТАСА TAATG GAT AC ACTAC CTGGC 4501 TTAGT AATGG CTCAG GATCA AAGGA TTCGA TGGTA TCTGC TCAGC ATGGG 4551 C AGC A ATGAA A AC AT CC ATT CT ATT CATTT C AGTG GAC AT GTGTT C ACTG
4601 TACGA AAAAA AGAGG AGT AT AAAAT GGC AC TGT AC AATCT СТ АТС CAGGT 4651 GTTTT TGAGA CAGTG GAAAT GTTAC CATCC AAAGC TGGAA TTTGG CGGGT 4701 GGAAT GCCTT ATTGG CGAGC ATCTA CATGC TGGGA TGAGC ACACT TTTTC 4751 TGGTG TACAG CAATA AGTGT CAGAC TCCCC TGGGA ATGGC TTCTG GACAC 4801 ATTAG AGATT TTCAG ATTAC AGCTT CAGGA CAATA TGGAC AGTGG GCCCC 4851 AAAGC TGGCC AGACT TCATT ATTCC GGATC AATCA ATGCC TGGAG САССА 4901 AGGAG CCCTT TTCTT GGATC AAGGT GGATC TGTTG GCACC AATGA TTATT 4951 CACGG CATCA AGACC CAGGG TGCCC GTCAG AAGTT CTCCA GCCTC TACAT 5001 CTCTC AGTTT ATCAT CATGT ATAGT CTTGA TGGGA AGAAG TGGCA GACTT 5051 ATCGA GGAAA TTCCA CTGGA ACCTT AATGG TCTTC TTTGG CAATG TGGAT 5101 TC АТС TGGGA TA A A A C AC A A TATTT TTA AC CCTCC A ATT A TTGCT CGAT A 5151 CATCC GTTTG CACCC AACTC ATT AT AGC AT TCGC A GC ACT CTTCG CATGG 5201 AGTTG ATGGG CTGTG ATTTA AATAG TTGCA GCATG CCATT GGGAA TGGAG 5251 AGTAA AGCAA TATCA GATGC AC AGA TTACT GCTTC ATCCT ACTTT ACCAA 5301 TATGT TTGCC ACCTG GTCTC CTTCA AAAGC TCGAC TTCAC CTCCA AGGGA 5351 GGAGT AATGC CTGGA GACCT CAGGT GAATA ATCCA AAAGA GTGGC TGCAA 5401 GTGGA CTTCC AGAAG ACAAT GAAAG TCACA GGAGT AACTA CTCAG GGAGT 5451 AAAAT CTCTG CTTAC CAGCA TGTAT GTGAA GGAGT TCCTC ATCTC CAGCA 5501 GTCAA GATGG CCATC AGTGG ACTCT CTTTT TTCAG AATGG CAAAG TAAAG 5551 GTTTT TCAGG GAAAT CAAGA CTCCT TCACA CCTGT GGTGA ACTCT CTAGA
- 137 044115
5601 CCCAC CGTTA CTGAC TCGCT ACCTT CGAAT TCACC CCCAG AGTTG GGTGC
5651 ACC AG ATTGC CCTGA GGATG GAGGT TCTGG GCTGC GAGGC AC AGG ACCTC
5701 TACGA CAAAA CTCAC ACATG CCCAC CGTGC CCAGC TCCAG AACTC CTGGG
5751 CGGAC CGTCA GTCTT CCTCT TCCCC CCAAA ACCCA AGGAC ACCCT CATGG
5801 CCTCC CGGAC CCCTG AGGTC ACATG CGTGG TGGTG GACGT GAGCC ACGAA
5851 GACCC TGAGG TC AAG TTC A A CTGGT ACGTG GACGG CGTGG AGGTG C AT AA
5901 TGCCA AGACA AAGCC GCGGG AGGAG CAGTA CAACA GCACG TACCG TGTGG 5951 TCAGC GTCCT CACCG TCCTG GCCCA GGACT GGCTG AATGG CAAGG AGTAC
6001 AAGTG CAAGG TCTCC A AC A A AGCCC TCCCA GCCCC CATCG AGA A A АССАТ
6051 CTCCA AAGCC AAAGG GCAGC CCCGA GAACC ACAGG TGTAC ACCCT GCCCC
6101 C ATCC CGCGA TGAGC TGACC A AGA A CC AGG TCAGC CTGAC CTGCC TGGTC
6151 AAAGG CTTCT ATCCC AGCGA CATCG CCGTG GAGTG GGAGA GCA AT GGGCA
6201 GCCGG AGA AC A ACT A CAAGA CCACG CCTCC CGTGT TGGAC TCCGA CGGCT
6251 ССТТС TTCCT СТАСА GCAAG CTCAC CGTGG ACAAG AGCAG GTGGC AGCAG
6301 GGGAA CGTCT TCTCA TGCTC CGTGA TGCAT GAGGC TCTGC ACAAC GCCTA
6351 CACGC AGAAG AGCCT CTCCC TGTCT CCGGG TAAAT GA
Последовательность белка FVIII 263 (тройной мутант IHH) (SEQ ID NO: 157).
MQIELSTCFF LCLLRFCFSA TRRYYLGAVE LSWDYMQGAP TSESATPESG
PGSEPATSGS ETPGTSESAT PESGPGSEPA TSGSETPGTS ESATPESGPG
101 TSTEPSEGSA PGSPAGSPTS TEEGTSESAT PESGPGSEPA TSGSETPGTS
151 ESATPESGPG SPAGSPTSTE EGSPAGSPTS TEEGASSSDL GELPVDARFP
201 PRVPKSFPFN TSVVYKKTLF VEFTDHLFNI AKPRPPWMGL LGPTIQAEVY 251 DTVVITLKNM ASHPVSLHAV GVSYWKASEG AEYDDQTSQR EKEDDKVFPG
301 GSHTYVWQVL KENGPMASDP LCLTYSYLSH VDLVKDLNSG LIGALLVCRE 351 GSLAKEKTQT LHKFILLFAV FDEGKSWHSE TKNSLMQDRD AASARAWPKM
401 HTVNGYVNRS LPGLIGCHRK SVYWHVIGMG TTPEVHSIFL EGHTFLVRNH 451 RQASLEISPI TFLTAQTLLM DLGQFLLFCH ISSHQHDGME AYVKVDSCPE
501 EPQLRMKNNE EAEDYDDDLT DSEMDVVRFD DDNSPSFIQI RSVAKKHPKT 551 WVHYIAAEEE DWDYAPLVLA PDDRSYKSQY LNNGPQRIGR KYKKVRFMAY
601 TDETFKTREA IQHESGILGP LLYGEVGDTL LIIFKNQASR PYNIYPHGIT
651 DVRPLYSRRL PKGVKHLKDF PILPGEIFKY KWTVTVEDGP TKSDPRCLTR
701 YYSSFVNMER DLASGLIGPL LICYKESVDQ RGNQIMSDKR NVILFSVFDE 751 NRSWYLTENI QRFLPNPAGV QLEDPEFQAS NIMHSINGYV FDSLQLSVCL
801 HEVAYWYILS IGAQTDFLSV FFSGYTFKHK MVYEDTLTLF PFSGETVFMS 851 MENPGLWILG CHNSDFRNRG MTALLKVSSC DKNTGDYYED SYEDISAYLL
901 SKNNAIEPRS FSQNGAPGTS ESATPESGPG SEPATSGSET PGTSESATPE
- 138 044115
951 SGPGSEPATS GSETPGTSES ATPESGPGTS TEPSEGSAPG SPAGSPTSTE
1001 EGTSESATPE SGPGSEPATS GSETPGTSES ATPESGPGSP AGSPTSTEEG
1051 SPAGSPTSTE EGTSTEPSEG SAPGTSESAT PESGPGTSES ATPESGPGTS
1101 ESATPESGPG SEPATSGSET PGSEPATSGS ETPGSPAGSP TSTEEGTSTE
1151 PSEGSAPGTS TEPSEGSAPG SEPATSGSET PGTSESATPE SGPGTSTEPS
1201 EGSAPASSPP VLKRHQAEIT RTTLQSDQEE IDYDDTISVE MKKEDFDIYD
1251 EDENQSPRSF QKKTRHYFIA AVERLWDYGM SSSPHVLRNR AQSGSVPQFK
1301 KVVFQEFTDG SFTQPLYRGE LNEHLGLLGP YIRAEVEDNI MVTFRNQASR
1351 PYSFYSSLIS YEEDQRQGAE PRKNFVKPNE TKTYFWKVQH HMAPTKDEFD
1401 CKAWAYFSDV DLEKDVHSGL IGPLLVCHTN TLNPAHGRQV TVQEFALFFT
1451 IFDETKSWYF TENMERNCRA PCNIQMEDPT FKENYRFHAI NGYIMDTLPG
1501 LVMAQDQRIR WYLLSMGSNE NIHSIHFSGH VFTVRKKEEY KMALYNLYPG
1551 VFETVEMLPS KAGIWRVECL IGEHLHAGMS TLFLVYSNKC QTPLGMASGH
1601 IRDFQITASG QYGQWAPKLA RLHYSGSINA WSTKEPFSWI KVDLLAPMII
1651 HGIKTQGARQ KFSSLYISQF IIMYSLDGKK WQTYRGNSTG TLMVFFGNVD
1701 SSGIKHNIFN PPIIARYIRL HPTHYSIRST LRMELMGCDL NSCSMPLGME
1751 SKAISDAQIT ASSYFTNMFA TWSPSKARLH LQGRSNAWRP QVNNPKEWLQ
1801 VDFQKTMKVT GVTTQGVKSL LTSMYVKEFL ISSSQDGHQW TLFFQNGKVK
1851 VFQGNQDSFT PVVNSLDPPL LTRYLRIHPQ SWVHQIALRM EVLGCEAQDL
1901 YDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMASRTPEV TCVVVDVSHE
1951 DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL AQDWLNGKEY
2001 KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSRDELT KNQVSLTCLV
2051 KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ
2101 GNVFSCSVMH EALHNAYTQK SLSLSPGK*
Нуклеотидная последовательность FVIII 282 (SEQ ID NO: 158).
ATGCA AATAG AGCTC TCCAC CTGCT TCTTT CTGTG CCTTT TGCGA TTCTG
CTTTA GTGCC ACCAG AAGAT ACTAC CTGGG TGCAG TGGAA CTGTC ATGGG
101 АСТАТ ATGCA AAGTG ATCTC GGTGA GCTGC CTGTG GACGC AAGAT TTCCT
151 CCTAG AGTGC CAAAA TCTTT TCCAT TCAAC ACCTC AGTCG TGTAC AAAAA 201 GACTC TGTTT GT AGA ATTCA CGGAT CACCT TTTCA ACATC GCT A A GCC A A 251 GGCCA CCCTG GATGG GTCTG CTAGG TCCTA CCATC CAGGC TGAGG TTTAT 301 GATAC AGTGG TCATT ACACT TAAGA ACATG GCTTC CCATC CTGTC AGTCT
51 TCATG CTGTT GGTGT ATCCT ACTGG AAAGC TTCTG AGGGA GCTGA ATATG
401 ATGAT CAGAC CAGTC A A AGG GAGA A AGA AG ATGAT AAAGT CTTCC CTGGT
451 GGAAG CCATA CAT AT GTCTG GCAGG TCCTG AAAGA GA ATG GTCCA ATGGC
501 CTCTG ACCCA CTGTG CCTTA CCTAC TCATA TCTTT CTCAT GTGGA CCTGG
- 139 044115
551 TAAAA GACTT GAATT CAGGC CTCAT TGGAG CCCTA CTAGT ATGTA GAGAA
601 GGGAG TCTGG CCA AG GAAAA GAC AC AGACC TTGCA CAAAT TTATA CT ACT
651 TTTTG CTGTA TTTGA TGAAG GGAAA AGTTG GCACT CAGAA AC AAA GAACT
701 CCTTG ATGC A GGAT A GGGAT GCTGC ATCTG CTCGG GCCTG GCCT A A A ATG
751 CACAC AGTCA ATGGT TATGT AAACA GGTCT CTGCC AGGTC TGATT GGATG
801 CCACA GGAAA TCAGT CTATT GGCAT GTGAT TGGAA TGGGC ACCAC TCCTG
851 AAGTG CACTC AATAT TCCTC GAAGG TCACA CATTT CTTGT GAGGA ACCAT
901 CGCC A GGCT A GCTTG GA AAT CTCGC C A AT A ACTTT CCTT A CTGCT CAA AC
951 ACTCT TGATG GACCT TGGAC AGTTT CT ACT GTTTT GTC AT ATCTC TTCCC
1001 ACCAA CATGA TGGCA TGGAA GCTTA TGTCA AAGTA GACAG CTGTC CAGAG 1051 GAACC CCAAC TACGA ATGAA AAATA ATGAA GAAGC GGAAG АСТАТ GATGA 1101 TGATC TT ACT GATTC TGA A A TGGAT GTGGT C AGGT TTGAT GATGA C A ACT 1151 CTCCT TCCTT TATCC AAATT CGCTC AGTTG CCAAG AAGCA TCCTA AAACT 1201 TGGGT AC ATT AC ATT GCTGC TGAAG AGGAG GACTG GGACT ATGCT CCCTT 1251 AGTCC TCGCC CCCGA TGACA GAAGT TATAA AAGTC AATAT TTGAA CAATG 1301 GCCCT CAGCG GATTG GTAGG AAGTA CAAAA AAGTC CGATT TATGG CATAC 1351 AC AGA TGA A A CCTTT A AGAC TCGTG A AGCT ATTC A GC ATG А АТС A GGA AT 1401 CTTGG GACCT TT ACT TT ATG GGGA A GTTGG AGAC A C ACTG TTGAT TAT AT 1451 TTAAG А АТС A AGCA A GC AGA CC AT A T AACA TCT AC CCTC A CGGAA TCACT 1501 GATGT CCGTC CTTTG TATTC AAGGA GATTA CCAAA AGGTG TAAAA CATTT 1551 GAAGG ATTTT CCA AT TCTGC C AGGA GA A AT ATTC A A AT AT A A ATG GAC AG 1601 TGACT GT AGA AGATG GGCCA ACT AA ATCAG ATCCT CGGTG CCTGA CCCGC 1651 ТАТТА CTCTA GTTTC GTTAA TATGG AGAGA GATCT AGCTT CAGGA CTCAT 1701 TGGCC CTCTC CTCAT CTGCT AC AAA GAATC TGT AG ATCAA AGAGG AAACC 1751 AGATA ATGTC AGACA AGAGG AATGT CATCC TGTTT TCTGT ATTTG ATGAG 1801 AACCG AAGCT GGT AC CTCAC AGAGA AT ATA CAACG CTTTC TCCCC AATCC 1851 AGCTG GAGTG C AGCT TGAGG ATCC A GAGTT CCA AG CCTCC AAC AT C ATGC 1901 AC AGC ATCAA TGGCT ATGTT TTTGA T AGTT TGC AG TTGTC AGTTT GTTTG 1951 CATGA GGTGG CATAC TGGTA CATTC TAAGC ATTGG AGCAC AGACT GACTT 2001 CCTTT CTGTC TTCTT CTCTG GAT AT ACCTT CAAAC AC AAA ATGGT CT ATG 2051 AAGAC AC ACT CACCC TATTC CCATT CTC AG GAGAA ACTGT CTTCA TGTCG 2101 ATGGA AAACC C AGGT CT ATG GATTC TGGGG TGCC A C A ACT C AGAC TTTCG 2151 GA AC A GAGGC ATGAC CGCCT T ACTG A AGGT TTCT A GTTGT GAC A A GA AC A 2201 CTGGT GATTA TT ACG AGGAC AGTT A TGAAG AT ATT TC AGC AT ACT TGCTG 2251 AGTAA AAACA ATGCC ATTGA ACCAA GAAGC TTCTC TCAAA ACGGC GCGCC 2301 AACAT CAGAG AGCGC CACCC CTGAA AGTGG TCCCG GGAGC GAGCC AGCCA 2351 С ATCT GGGTC GGAAA CGCC A GGC AC AAGTG AGTCT GCA AC TCCCG AGTCC 2401 GGACC TGGCT CCGAG CCTGC CACTA GCGGC TCCGA GACTC CGGGA ACTTC
- 140 044115
2451 CGAGA GCGCT ACACC AGAAA GCGGA CCCGG AACCA GT ACC GAACC TAGCG
2501 AGGGC TCTGC TCCGG GCAGC CCAGC CGGCT CTCCT ACATC CACGG AGGAG
2551 GGCAC TTCCG AATCC GCCAC CCCGG AGTCA GGGCC AGGAT CTGAA CCCGC
2601 TACCT CAGGC AGTGA GACGC CAGGA ACGAG CGAGT CCGCT ACACC GGAGA 2651 GTGGG CCAGG GAGCC CTGCT GGATC TCCTA CGTCC ACTGA GGAAG GGTCA 2701 CCAGC GGGCT CGCCC ACC AG CACTG AAGAA GGTGC CTCGA GCCCA CCAGT
2751 CTTGA AACGC CATCA AGCTG AAATA ACTCG TACTA CTCTT CAGTC AGATC
2801 AAGAG GAAAT CGATT ATGAT GATAC CATAT CAGTT GAAAT GAAGA AGGAA
2851 GATTT TGACA TTTAT GATGA GGATG AAAAT CAGAG CCCCC GCAGC TTTCA
2901 AAAGA AAACA CGACA CT ATT TTATT GCTGC AGTGG AGAGG CTCTG GGATT
2951 ATGGG ATGAG TAGCT CCCCA CATGT TCTAA GAAAC AGGGC TCAGA GTGGC
3001 AGTGT CCCTC AGTTC AAGAA AGTTG TTTTC CAGGA ATTTA CTGAT GGCTC
3051 CTTTA CTCAG CCCTT AT ACC GTGGA GAACT AAATG AAC AT TTGGG ACTCC
3101 TGGGG CC AT A TAT A A GAGC A GA AGT TGA AG AT A AT АТС AT GGT A A CTTTC
3151 AGAAA TCAGG CCTCT CGTCC CTATT CCTTC TATTC TAGCC TTATT TCTTA
3201 TGAGG AAGAT CAGAG GCAAG GAGCA GAACC TAGAA AAAAC TTTGT CAAGC 3251 CTAAT GAAAC CAAAA CTTAC TTTTG GAAAG TGCAA CATCA TATGG CACCC 3301 ACTAA AGATG AGTTT GACTG CAAAG CCTGG GCTTA TTTCT CTGAT GTTGA 3351 CCTGG AAAAA GATGT GCACT CAGGC CTGAT TGGAC CCCTT CTGGT CTGCC
3401 AC ACT AAC AC ACTGA ACCCT GCTCA TGGGA GACAA GTGAC AGTAC AGGAA
3451 TTTGC TCTGT TTTTC АССАТ CTTTG ATGAG ACCAA AAGCT GGTAC TTCAC
3501 TGAAA ATATG GAAAG AAACT GCAGG GCTCC CTGCA ATATC CAGAT GGAAG
3551 ATCCC ACTTT TAAAG AGAAT TATCG CTTCC ATGCA ATCAA TGGCT ACATA
3601 ATGGA TACAC TACCT GGCTT AGTAA TGGCT CAGGA TCAAA GGATT CGATG
3651 GT АТС TGCTC AGC AT GGGCA GCAAT GAAAA CATCC ATTCT ATTCA TTTCA
3701 GTGGA CATGT GTTCA CTGTA CGAAA AAAAG AGGAG TATAA AATGG CACTG
3751 TACAA TCTCT ATCCA GGTGT TTTTG AGACA GTGGA AATGT TACCA TCCAA
3801 AGCTG GAATT TGGCG GGTGG AATGC CTTAT TGGCG AGCAT СТАСА TGCTG
3851 GGATG AGC AC ACTTT TTCTG GTGT A C AGC A AT A AG TGTC A GACTC CCCTG
3901 GGAAT GGCTT CTGGA CACAT TAGAG ATTTT CAGAT TACAG CTTCA GGACA
3951 ATATG GACAG TGGGC CCCAA AGCTG GCC AG ACTTC ATT AT TCCGG ATCAA
4001 TCAAT GCCTG GAGCA CCAAG GAGCC CTTTT CTTGG ATCAA GGTGG ATCTG
4051 TTGGC ACCAA TGATT ATTCA CGGCA TCAAG ACCCA GGGTG CCCGT CAGAA
4101 GTTCT CCAGC CTCTA СATCT CTCAG TTTAT CATCA TGTAT AGTCT TGATG
4151 GGAAG A AGTG GC AGA CTTAT CGAGG A A ATT CC ACT GGA AC CTT A A TGGTC
4201 TTCTT TGGC A ATGTG GATTC ATCTG GGAT A AAACA C A AT A TTTTT A ACCC
4251 TCCAA TTATT GCTCG АТАСА TCCGT TTGCA CCCAA CTCAT TAT AG CATTC 4301 GCAGC ACTCT TCGCA TGGAG TTGAT GGGCT GTGAT TTAAA TAGTT GCAGC
- 141 044115
4351 ATGCC ATTGG GA ATG GAGAG TA A AG C A AT A TC AGA TGC AC AGATT ACTGC
4401 TTCAT CCTAC TTTAC CAATA TGTTT GCCAC CTGGT CTCCT TCAAA AGCTC
4451 GACTT CACCT CCAAG GGAGG AGTAA TGCCT GGAGA CCTCA GGTGA ATAAT 4501 CCAAA AGAGT GGCTG CAAGT GGACT TCCAG AAGAC AATGA AAGTC ACAGG
51 AGTAA CT ACT C AGGG AGTAA A ATCT CTGCT T ACC A GC ATG T ATGT GAAGG
4601 AGTTC CTCAT CTCCA GCAGT CAAGA TGGCC АТС AG TGGAC TCTCT TTTTT
4651 CAGAA TGGCA AAGTA AAGGT TTTTC AGGGA AATCA AGACT CCTTC ACACC
4701 TGTGG TGAAC TCTCT AGACC CACCG TTACT GACTC GCTAC CTTCG AATTC
4751 ACCCC CAGAG TTGGG TGCAC CAGAT TGCCC TGAGG ATGGA GGTTC TGGGC
4801 TGCGA GGCAC AGGAC CTCTA CGACA AAACT CACAC ATGCC CACCG TGCCC
4851 AGCTC CAGAA CTCCT GGGCG GACCG TCAGT CTTCC TCTTC CCCCC AAAAC
4901 CCAAG GACAC CCTCA TGATC TCCCG GACCC CTGAG GTCAC ATGCG TGGTG
4951 GTGGA CGTGA GCCAC GAAGA CCCTG AGGTC AAGTT CAACT GGTAC GTGGA
5001 CGGCG TGGAG GTGC A T AATG CCAAG ACAA A GCCGC GGGAG GAGCA GT AC A
5051 ACAGC ACGTA CCGTG TGGTC AGCGT CCTCA CCGTC CTGCA CCAGG ACTGG
5101 CTGAA TGGCA AGGAG TACA A GTGC A AGGTC TCC A A C A A AG CCCTC CC AGC 5151 CCCCA TCGAG AAAAC CATCT CCAAA GCCAA AGGGC AGCCC CGAGA ACC AC 5201 AGGTG TACAC CCTGC CCCCA TCCCG GGATG AGCTG ACCAA GAACC AGGTC 5251 AGCCT GACCT GCCTG GTCAA AGGCT TCTAT CCCAG CGACA TCGCC GTGGA
5301 GTGGG AGAGC AATGG GCAGC CGGAG AACAA СТАСА AGACC ACGCC TCCCG
5351 TGTTG GACTC CGACG GCTCC TTCTT CCTCT ACAGC AAGCT CACCG TGGAC 5401 AAGAG CAGGT GGCAG CAGGG GAACG TCTTC TCATG CTCCG TGATG CATGA
5451 GGCTC TGCAC AACCA СТАСА CGCAG AAGAG CCTCT CCCTG TCTCC GGGTA
5501 AATGA
Последовательность белка FVIII 282 (SEO ID NO: 159).
MQIELSTCFF LCLLRFCFSA TRRYYLGAVE LSWDYMQSDL GELPVDARFP
PRVPKSFPFN TSVVYKKTLF VEFTDHLFNI AKPRPPWMGL LGPTIQAEVY
101 DTVVITLKNM ASHPVSLHAV GVSYWKASEG AEYDDQTSQR EKEDDKVFPG
151 GSHTYVWQVL KENGPMASDP LCLTYSYLSH VDLVKDLNSG LIGALLVCRE
201 GSLAKEKTQT LHKFILLFAV FDEGKSWHSE TKNSLMQDRD AASARAWPKM
251 HTVNGYVNRS LPGLIGCHRK SVYWHVIGMG TTPEVHSIFL EGHTFLVRNH
301 RQASLEISPI TFLTAQTLLM DLGQFLLFCH ISSHQHDGME AYVKVDSCPE
351 EPQLRMKNNE EAEDYDDDLT DSEMDVVRFD DDNSPSFIQI RSVAKKHPKT
401 WVHYIAAEEE DWDYAPLVLA PDDRSYKSQY LNNGPQRIGR KYKKVRFMAY
451 TDETFKTREAIQHESGILGP LLYGEVGDTL LIIFKNQASR PYNIYPHGIT
501 DVRPLYSRRL PKGVKHLKDF PILPGEIFKY KWTVTVEDGP TKSDPRCLTR
- 142 044115
551 YYSSFVNMER DLASGLIGPL LICYKESVDQ RGNQIMSDKR NVILFSVFDE
601 NRSWYLTENI QRFLPNPAGV QLEDPEFQAS NIMHSINGYV FDSLQLSVCL
651 HEVAYWYILS IGAQTDFLSV FFSGYTFKHK MVYEDTLTLF PFSGETVFMS
701 MENPGLWILG CHNSDFRNRG MTALLKVSSC DKNTGDYYED SYEDISAYLL
751 SKNNAIEPRS FSQNGAPTSE SATPESGPGS EPATSGSETP GTSESATPES
801 GPGSEPATSG SETPGTSESA TPESGPGTST EPSEGSAPGS PAGSPTSTEE
851 GTSESATPES GPGSEPATSG SETPGTSESA TPESGPGSPA GSPTSTEEGS
901 PAGSPTSTEE GASSPPVLKR HQAEITRTTL QSDQEEIDYD DTISVEMKKE
951 DFDIYDEDEN QSPRSFQKKT RHYFIAAVER LWDYGMSSSP HVLRNRAQSG
1001 SVPQFKKVVF QEFTDGSFTQ PLYRGELNEH LGLLGPYIRA EVEDNIMVTF
1051 RNQASRPYSF YSSLISYEED QRQGAEPRKN FVKPNETKTY FWKVQHHMAP
1101 TKDEFDCKAW AYFSDVDLEK DVHSGLIGPL LVCHTNTLNP AHGRQVTVQE
1151 FALFFTIFDE TKSWYFTENM ERNCRAPCNI QMEDPTFKEN YRFHAINGYI
1201 MDTLPGLVMA QDQRIRWYLL SMGSNENIHS IHFSGHVFTV RKKEEYKMAL
1251 YNLYPGVFET VEMLPSKAGIWRVECLIGEH LHAGMSTLFL VYSNKCQTPL
1301 GMASGHIRDF QITASGQYGQ WAPKLARLHY SGSINAWSTK EPFSWIKVDL
1351 LAPMIIHGIK TQGARQKFSS LYISQFIIMY SLDGKKWQTY RGNSTGTLMV
1401 FFGNVDSSGI KHNIFNPPII ARYIRLHPTH YSIRSTLRME LMGCDLNSCS
1451 MPLGMESKAI SDAQITASSY FTNMFATWSP SKARLHLQGR SNAWRPQVNN
1501 PKEWLQVDFQ KTMKVTGVTT QGVKSLLTSM YVKEFLISSS QDGHQWTLFF
1551 QNGKVKVFQG NQDSFTPVVN SLDPPLLTRY LRIHPQSWVH QIALRMEVLG
1601 CEAQDLYDKT HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV
1651 VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW
1701 LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SRDELTKNQV
1751 SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD
1801 KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK* Нуклеотидная последовательность FVIII 283 (FVIII169 с тройной мутацией IHH) (SEQ ID NO: 160).
ATGCA AATAG AGCTC TCCAC CTGCT TCTTT CTGTG CCTTT TGCGA TTCTG
CTTTA GTGCC ACCAG AAGAT ACTAC CTGGG TGCAG TGGAA CTGTC ATGGG
101 АСТАТ ATGCA AAGTG ATCTC GGTGA GCTGC CTGTG GACGC AAGAT TTCCT
151 CCTAG AGTGC CAAAA TCTTT TCCAT TCAAC ACCTC AGTCG TGTAC AAAAA
201 GACTC TGTTT GT AGA ATTCA CGGAT CACCT ТТТСА AC АТС GCTAA GCC A A
251 GGCCA CCCTG GATGG GTCTG CTAGG TCCTA CCАТС CAGGC TGAGG TTTAT
301 GAT AC AGTGG TCATT AC ACT TAAGA ACATG GCTTC CCATC CTGTC AGTCT
- 143 044115
351 TCATG CTGTT GGTGT ATCCT ACTGG AAAGC TTCTG AGGGA GCTGA ATATG
401 ATGAT CAGAC CAGTC A A AGG GAGA A AGA AG ATGAT A A AGT CTTCC CTGGT
451 GGAAG CCATA CAT AT GTCTG GCAGG TCCTG AAAGA GA ATG GTCCA ATGGC
501 CTCTG ACCC A CTGTG CCTTA CCTAC TC AT A TCTTT CTCAT GTGGA CCTGG
551 TAAAA GACTT GAATT CAGGC CTCAT TGGAG CCCTA CTAGT ATGTA GAGAA
601 GGGAG TCTGG CCA AG GAAAA GAC AC AGACC TTGCA CAAAT TTATA CT ACT
651 TTTTG CTGTA TTTGA TGAAG GGAAA AGTTG GCACT CAGAA AC AAA GAACT
701 CCTTG ATGC A GGAT A GGGAT GCTGC ATCTG CTCGG GCCTG GCCT A A A ATG
751 CACAC AGTCA ATGGT TATGT AAACA GGTCT CTGCC AGGTC TGATT GGATG
801 CCACA GGAAA TCAGT CTATT GGCAT GTGAT TGGAA TGGGC ACCAC TCCTG
851 AAGTG CACTC AATAT TCCTC GAAGG TCACA CATTT CTTGT GAGGA АССАТ
901 CGCC A GGCT A GCTTG GA AAT CTCGC C A AT A ACTTT CCTTA CTGCT C A A AC
951 ACTCT TGATG GACCT TGGAC AGTTT CT ACT GTTTT GTC AT ATCTC TTCCC
1001 ACCAA CATGA TGGCA TGGAA GCTTA TGTCA AAGTA GACAG CTGTC CAGAG 1051 GAACC CCAAC TACGA ATGAA AAATA ATGAA GAAGC GGAAG АСТАТ GATGA 1101 TGATC TT ACT GATTC TGA A A TGGAT GTGGT C AGGT TTGAT GATGA C A ACT 1151 CTCCT TCCTT TATCC AAATT CGCTC AGTTG CCAAG AAGCA TCCTA AAACT 1201 TGGGT AC ATT AC ATT GCTGC TGAAG AGGAG GACTG GGACT ATGCT CCCTT 1251 AGTCC TCGCC CCCGA TGACA GAAGT TATAA AAGTC AATAT TTGAA CAATG 1301 GCCCT CAGCG GATTG GTAGG AAGTA CAAAA AAGTC CGATT TATGG CATAC 1351 AC AGA TGA A A CCTTT A AGAC TCGTG A AGCT ATTC A GC ATG А АТС A GGA AT 1401 CTTGG GACCT TT ACT TT ATG GGGA A GTTGG AGAC A C ACTG TTGAT TAT AT 1451 TTAAG А АТС A AGCA A GC AGA CCATA T AACA TCT AC CCTC A CGGAA TCACT 1501 GATGT CCGTC CTTTG TATTC AAGGA GATTA CCAAA AGGTG TAAAA CATTT 1551 GAAGG ATTTT CCA AT TCTGC C AGGA GA A AT ATTC A AATAT A A ATG GAC AG 1601 TGACT GT AGA AGATG GGCCA ACT AA ATCAG ATCCT CGGTG CCTGA CCCGC 1651 ТАТТА CTCTA GTTTC GTTAA TATGG AGAGA GATCT AGCTT CAGGA CTCAT 1701 TGGCC CTCTC CTCAT CTGCT AC AAA GAATC TGT AG ATCAA AGAGG AAACC 1751 AGATA ATGTC AGACA AGAGG AATGT CATCC TGTTT TCTGT ATTTG ATGAG 1801 AACCG AAGCT GGTAC CTCAC AGAGA AT ATA CAACG CTTTC TCCCC AATCC 1851 AGCTG GAGTG C AGCT TGAGG ATCC A GAGTT CCA AG CCTCC AAC AT C ATGC 1901 AC AGC ATCAA TGGCT ATGTT TTTGA T AGTT TGC AG TTGTC AGTTT GTTTG 1951 CATGA GGTGG CATAC TGGTA CATTC TAAGC ATTGG AGCAC AGACT GACTT 2001 CCTTT CTGTC TTCTT CTCTG GAT AT ACCTT CAAAC AC AAA ATGGT CT ATG 2051 AAGAC AC ACT CACCC TATTC CCATT CTC AG GAGAA ACTGT CTTCA TGTCG 2101 ATGGA AAACC C AGGT CT ATG GATTC TGGGG TGCC A C A ACT CAGAC TTTCG 2151 GA AC A GAGGC ATGAC CGCCT T ACTG A AGGT TTCT A GTTGT GAC A A GA AC A 2201 CTGGT GATTA TT ACG AGGAC AGTT A TGAAG AT ATT TC AGC AT ACT TGCTG
- 144 044115
2251 AGTAA AAACA ATGCC ATTGA ACCAA GAAGC TTCTC TCAAA ACGGC GCGCC
2301 AGGTA CCTCA GAGTC TGCTA CCCCC GAGTC AGGGC CAGGA TCAGA GCCAG
51 CCACC TCCGG GTCTG AGACA CCCGG GACTT CCGAG AGTGC CACCC CTGAG
2401 TCCGG ACCCG GGTCC GAGCC CGCCA CTTCC GGCTC CGAAA CTCCC GGCAC
2451 AAGCG AGAGC GCTAC CCCAG AGTCA GGACC AGGAA CATCT ACAGA GCCCT 2501 CTGAA GGCTC CGCTC CAGGG TCCCC AGCCG GCAGT CCCAC TAGCA CCGAG
2551 GAGGG AACCT CTGAA AGCGC CACAC CCGAA TCAGG GCCAG GGTCT GAGCC 2601 TGCTA CCAGC GGC AG CGAGA САССА GGCAC CTCTG AGTCC GCCAC ACC AG 2651 AGTCC GGACC CGGAT CTCCC GCTGG GAGCC CCACC TCCAC TGAGG AGGGA
2701 TCTCC TGCTG GCTCT CCAAC ATCTA CTGAG GAAGG TACCT СAACC GAGCC
2751 ATCCG AGGGA TCAGC TCCCG GCACC TCAGA GTCGG CAACC CCGGA GTCTG
2801 GACCC GGAAC TTCCG AAAGT GCCAC ACCAG AGTCC GGTCC CGGGA CTTCA
2851 GAATC AGCAA CACCC GAGTC CGGCC CTGGG TCTGA ACCCG CCACA AGTGG
2901 TAGTG AGACA CCAGG ATCAG AACCT GCTAC CTCAG GGTCA GAGAC ACCCG 2951 GATCT CCGGC AGGCT САССА ACCTC CACTG AGGAG GGCAC CAGCA CAGAA 3001 CCAAG CGAGG GCTCC GCACC CGGAA CAAGC ACTGA ACCCA GTGAG GGTTC
3051 AGCAC CCGGC TCTGA GCCGG CCACA AGTGG CAGTG AGACA CCCGG CACTT
3101 CAGAG AGTGC CACCC CCGAG AGTGG CCCAG GCACT AGTAC CGAGC CCTCT
3151 GAAGG CAGTG CGCCA GCCTC GAGCC САССА GTCTT GAAAC GCCAT CAAGC
3201 TGAAA TAACT CGTAC TACTC TTCAG TCAGA TCAAG AGGAA ATCGA TTATG
3251 ATGAT ACCAT ATCAG TTGAA ATGAA GAAGG AAGAT TTTGA CATTT ATGAT
3301 GAGGA TGAAA ATCAG AGCCC CCGCA GCTTT CAAAA GAAAA CACGA CACTA
3351 TTTTA TTGCT GCAGT GGAGA GGCTC TGGGA TTATG GGATG AGTAG CTCCC
3401 CACAT GTTCT AAGAA ACAGG GCTCA GAGTG GCAGT GTCCC TCAGT TCAAG
3451 AAAGT TGTTT TCCAG GAATT TACTG ATGGC TCCTT TACTC AGCCC TTATA
3501 CCGTG GAGAA CTAAA TGAAC ATTTG GGACT CCTGG GGCCA TATAT AAGAG
3551 CAGAA GTTGA AGATA ATATC ATGGT AACTT TCAGA AATCA GGCCT CTCGT
3601 CCCTA TTCCT TCTAT TCTAG CCTTA TTTCT TATGA GGAAG ATCAG AGGCA
3651 AGGAG CAGAA CCTAG AAAAA ACTTT GTCAA GCCTA ATGAA ACCAA AACTT
3701 ACTTT TGGAA AGTGC AAC AT CAT AT GGCAC CCACT AAAGA TGAGT TTGAC
3751 TGCAA AGCCT GGGCT TATTT CTCTG ATGTT GACCT GGAAA AAGAT GTGCA
3801 CTCAG GCCTG ATTGG ACCCC TTCTG GTCTG CCACA CTAAC ACACT GAACC
3851 CTGCT CATGG GAGAC AAGTG ACAGT ACAGG AATTT GCTCT GTTTT TCACC
3901 ATCTT TGATG AGACC AAAAG CTGGT ACTTC ACTGA AAATA TGGAA AGAAA
3951 CTGCA GGGCT CCCTG CAATA TCCAG ATGGA AGATC CCACT TTTAA AGAGA 4001 ATT AT CGCTT CCATG CAATC AATGG СТАСА TAATG GAT AC ACTAC CTGGC 4051 TTAGT AATGG CTCAG GATCA AAGGA TTCGA TGGTA TCTGC TCAGC ATGGG 4101 CAGCA ATGAA A AC AT CC ATT CT ATT CATTT CAGTG GAC AT GTGTT CACTG
- 145 044115
4151 T ACGA A A A A A AGAGG AGT AT A A A AT GGC AC TGT AC A ATCT СТ АТС CAGGT 4201 GTTTT TGAGA CAGTG GAAAT GTTAC CATCC AAAGC TGGAA TTTGG CGGGT 4251 GGAAT GCCTT ATTGG CGAGC ATCTA CATGC TGGGA TGAGC AC ACT TTTTC 4301 TGGTG TACAG CAATA AGTGT CAGAC TCCCC TGGGA ATGGC TTCTG GACAC 4351 ATT AG AGATT TTC AG ATT AC AGCTT C AGGA CAATA TGGAC AGTGG GCCCC 4401 AAAGC TGGCC AGACT TCATT ATTCC GGATC А АТС A ATGCC TGGAG САССА 4451 AGGAG CCCTT TTCTT GGATC AAGGT GGATC TGTTG GCACC AATGA TTATT 4501 CACGG CATCA AGACC CAGGG TGCCC GTCAG AAGTT CTCCA GCCTC TACAT 4551 CTCTC AGTTT АТС AT C ATGT AT AGT CTTGA TGGGA AGA AG TGGC A GACTT 4601 ATCGA GGAAA TTCCA CTGGA ACCTT AATGG TCTTC TTTGG CAATG TGGAT 4651 TCATC TGGGA TAAAA CACAA TATTT TTAAC CCTCC AATTA TTGCT CGATA 4701 CATCC GTTTG CACCC AACTC ATT AT AGC AT TCGCA GCACT CTTCG CATGG 4751 AGTTG ATGGG CTGTG ATTTA AATAG TTGCA GCATG CCATT GGGAA TGGAG 4801 AGTAA AGCAA TATCA GATGC ACAGA TTACT GCTTC ATCCT ACTTT ACCAA 4851 TATGT TTGCC ACCTG GTCTC CTTCA AAAGC TCGAC TTCAC CTCCA AGGGA 4901 GGAGT AATGC CTGGA GACCT CAGGT GAATA ATCCA AAAGA GTGGC TGCAA 4951 GTGGA CTTCC AGAAG ACAAT GAAAG TCACA GGAGT AACTA CTCAG GGAGT 5001 AAAAT CTCTG CTTAC CAGCA TGTAT GTGAA GGAGT TCCTC ATCTC CAGCA 5051 GTCAA GATGG CCATC AGTGG ACTCT CTTTT TTCAG AATGG CAAAG TAAAG 5101 GTTTT TC AGG GAAAT C A AGA CTCCT TCACA CCTGT GGTGA ACTCT CT AGA 5151 CCCAC CGTTA CTGAC TCGCT ACCTT CGAAT TCACC CCCAG AGTTG GGTGC 5201 ACC AG ATTGC CCTGA GGATG GAGGT TCTGG GCTGC GAGGC AC AGG ACCTC 5251 TACGA CAAAA CTCAC ACATG CCCAC CGTGC CCAGC TCCAG AACTC CTGGG 5301 CGGAC CGTCA GTCTT CCTCT TCCCC CCAAA ACCCA AGGAC ACCCT CATGG 5351 CCTCC CGGAC CCCTG AGGTC ACATG CGTGG TGGTG GACGT GAGCC ACGAA 5401 GACCC TGAGG TCAAG TTCAA CTGGT ACGTG GACGG CGTGG AGGTG CATAA 5451 TGCCA AGACA AAGCC GCGGG AGGAG CAGTA CAACA GCACG TACCG TGTGG 5501 TCAGC GTCCT CACCG TCCTG GCCCA GGACT GGCTG AATGG CAAGG AGTAC 5551 AAGTG CAAGG TCTCC AACAA AGCCC TCCCA GCCCC CATCG AGAAA АССАТ 5601 CTCCA AAGCC AAAGG GCAGC CCCGA GAACC ACAGG TGTAC ACCCT GCCCC 5651 CATCC CGGGA TGAGC TGACC AAGAA CCAGG TCAGC CTGAC CTGCC TGGTC 5701 AAAGG CTTCT ATCCC AGCGA CATCG CCGTG GAGTG GGAGA GCA AT GGGCA 5751 GCCGG AGAAC AACTA CAAGA CCACG CCTCC CGTGT TGGAC TCCGA CGGCT 5801 ССТТС TTCCT СТАСА GCAAG CTCAC CGTGG ACAAG AGCAG GTGGC AGCAG 5851 GGGAA CGTCT TCTC A TGCTC CGTGA TGC AT GAGGC TCTGC AC A AC GCCT A 5901 CACGC AGAAG AGCCT CTCCC TGTCT CCGGG TAAAT GA
- 146 044115
Последовательность белка FVIII 283 (FVIII169 с тройной мутацией IHH)(SEQ ID NO: 161).
MQIELSTCFF LCLLRFCFSA TRRYYLGAVE LSWDYMQSDL GELPVDARFP
PRVPKSFPFN TSVVYKKTLF VEFTDHLFNIAKPRPPWMGL LGPTIQAEVY
101 DTVVITLKNM ASHPVSLHAV GVSYWKASEG AEYDDQTSQR EKEDDKVFPG
151 GSHTYVWQVL KENGPMASDP LCLTYS YLSH VDLVKDLNSG LIGALLVCRE
201 GSLAKEKTQT LHKFILLFAV FDEGKSWHSE TKNSLMQDRD AASARAWPKM
251 HTVNGYVNRS LPGLIGCHRK SVYWHVIGMG TTPEVHSIFL EGHTFLVRNH
301 RQASLEISPI TFLTAQTLLM DLGQFLLFCH ISSHQHDGME AYVKVDSCPE
351 EPQLRMKNNE EAEDYDDDLT DSEMDVVRFD DDNSPSFIQI RSVAKKHPKT
401 WVHYIAAEEE DWDYAPLVLA PDDRSYKSQY LNNGPQRIGR KYKKVRFMAY
451 TDETFKTREAIQHESGILGP LLYGEVGDTL LIIFKNQASR PYNIYPHGIT
501 DVRPLYSRRL PKGVKHLKDF PILPGEIFKY KWTVTVEDGP TKSDPRCLTR
551 YYSSFVNMER DLASGLIGPL LICYKESVDQ RGNQIMSDKR NVILFSVFDE
601 NRSWYLTENI QRFLPNPAGV QLEDPEFQAS NIMHSINGYV FDSLQLSVCL
651 HEVAYWYILS IGAQTDFLSV FFSGYTFKHK MVYEDTLTLF PFSGETVFMS
701 MENPGLWILG CHNSDFRNRG MTALLKVSSC DKNTGDYYED SYEDISAYLL
751 SKNNAIEPRS FSQNGAPGTS ESATPESGPG SEPATSGSET PGTSESATPE
801 SGPGSEPATS GSETPGTSES ATPESGPGTS TEPSEGSAPG SPAGSPTSTE
851 EGTSESATPE SGPGSEPATS GSETPGTSES ATPESGPGSP AGSPTSTEEG
901 SPAGSPTSTE EGTSTEPSEG SAPGTSESAT PESGPGTSES ATPESGPGTS
951 ESATPESGPG SEPATSGSET PGSEPATSGS ETPGSPAGSP TSTEEGTSTE
1001 PSEGSAPGTS TEPSEGSAPG SEPATSGSET PGTSESATPE SGPGTSTEPS
1051 EGSAPASSPP VLKRHQAEIT RTTLQSDQEE IDYDDTISVE MKKEDFDIYD
1101 EDENQSPRSF QKKTRHYFIA AVERLWDYGM SSSPHVLRNR AQSGSVPQFK
1151 KVVFQEFTDG SFTQPLYRGE LNEHLGLLGP YIRAEVEDNI MVTFRNQASR
1201 PYSFYSSLIS YEEDQRQGAE PRKNFVKPNE TKTYFWKVQH HMAPTKDEFD
1251 CKAWAYFSDV DLEKDVHSGL IGPLLVCHTN TLNPAHGRQV TVQEFALFFT
1301 IFDETKSWYF TENMERNCRA PCNIQMEDPT FKENYRFHAI NGYIMDTLPG
1351 LVMAQDQRIR WYLLSMGSNE NIHSIHFSGH VFTVRKKEEY KMALYNLYPG
1401 VFETVEMLPS KAGIWRVECLIGEHLHAGMS TLFLVYSNKC QTPLGMASGH
1451 IRDFQITASG QYGQWAPKLA RLHYSGSINA WSTKEPFSWI KVDLLAPMII
1501 HGIKTQGARQ KFSSLYISQF IIMYSLDGKK WQTYRGNSTG TLMVFFGNVD
1551 SSGIKHNIFN PPIIARYIRL HPTHYSIRST LRMELMGCDL NSCSMPLGME
1601 SKAISDAQIT ASSYFTNMFA TWSPSKARLH LQGRSNAWRP QVNNPKEWLQ
1651 VDFQKTMKVT GVTTQGVKSL LTSMYVKEFLISSSQDGHQW TLFFQNGKVK
1701 VFQGNQDSFT PVVNSLDPPL LTRYLRIHPQ SWVHQIALRM EVLGCEAQDL
1751 YDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMASRTPEV TCVVVDVSHE
1801 DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL AQDWLNGKEY
1851 KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSRDELT KNQVSLTCLV
1901 KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ
1951 GNVFSCSVMH EALHNAYTQK SLSLSPGK*
- 147 044115
Нуклеотидная последовательность pSYNFVIII 010-(двойная цепь FVIIIFc) (SEQ ID NO: 162).
ATGCAAATAG AGCTCTCCAC CTGCTTCTTT CTGTGCCTTT TGCGATTCTG
CTTTAGTGCC ACCAGAAGAT ACTACCTGGG TGCAGTGGAA CTGTCATGGG
101 ACT AT ATGC A AAGTGATCTC GGTGAGCTGC CTGTGGACGC AAGATTTCCT
151 CCTAGAGTGC СAAAATCTTT TCCATTCAAC ACCTCAGTCG TGTACAAAAA
201 GACTCTGTTT GT AGA ATTC A CGGATC ACCT ТТТС A AC АТС GCT A AGCC A A
251 GGCCACCCTG GATGGGTCTG CTAGGTCCTA CCATCCAGGC TGAGGTTTAT
301 GAT AC AGTGG TC ATT AC ACT T AAGAACATG GCTTCCC АТС CTGTCAGTCT
351 TCATGCTGTT GGTGTATCCT ACTGGAAAGC TTCTGAGGGA GCTGAATATG
401 ATGATC AGAC C AGTC A A AGG GAGA A AGA AG ATGAT A A AGT CTTCCCTGGT
451 GGAAGCCATA CATATGTCTG GCAGGTCCTG AAAGAGAATG GTCCAATGGC
501 CTCTGACCCA CTGTGCCTTA CCTACTCATA TCTTTCTCAT GTGGACCTGG
551 TAAAAGACTT GAATTCAGGC CTCATTGGAG CCCTACTAGT ATGTAGAGAA
601 GGGAGTCTGG CC A AGGA A A A GAC AC AGACC TTGC AC A A AT TT AT ACT ACT
651 TTTTGCTGTA TTTGATGAAG GGAAAAGTTG GCACTCAGAA ACAAAGAACT
701 CCTTGATGCA GGATAGGGAT GCTGCATCTG CTCGGGCCTG GCCTAAAATG
751 CACACAGTCA ATGGTTATGT AAACAGGTCT CTGCCAGGTC TGATTGGATG
801 CCACAGGAAA TCAGTCTATT GGCATGTGAT TGGAATGGGC ACCACTCCTG
851 AAGTGCACTC AATATTCCTC GAAGGTCACA CATTTCTTGT GAGGAACCAT
901 CGCC AGGCGT CCTTGGA A AT CTCGCC A AT A ACTTTCCTT A CTGCTC A A AC
951 ACTCTTGATG GACCTTGGAC AGTTTCTACT GTTTTGTCAT ATCTCTTCCC
1001 ACCAACATGA TGGCATGGAA GCTTATGTCA AAGTAGACAG CTGTCCAGAG
1051 GAACCCCAAC TACGAATGAA AAATAATGAA GAAGCGGAAG ACTATGATGA
1101 TGATCTT ACT GATTCTGA A A TGGATGTGGT C AGGTTTGAT GATGAC A ACT
1151 CTCCTTCCTT TATCC AAATT CGCTC AGTTG CCAAGAAGCA TCCT AAA ACT
1201 TGGGT AC ATT AC ATTGCTGC TGA AGAGGAG G ACTGGGACT ATGCTCCCTT
1251 AGTCCTCGCC CCCGATGACA GAAGTTATAA AAGTCAATAT TTGAACAATG
1301 GCCCTCAGCG GATTGGTAGG AAGTACAAAA AAGTCCGATT TATGGCATAC
1351 AC AGATGA AA CCTTT AAGAC TCGTGA AGCT ATTC AGC ATG А АТС AGGA AT
1401 CTTGGGACCT TT ACTTT ATG GGGA AGTTGG AGAC AC ACTG TTGATT AT AT
- 148 044115
1451 TTAAGAATCA AGCAAGCAGA CCATATAACA ТСТACCCTCA CGGAATCACT
1501 GATGTCCGTC CTTTGTATTC AAGGAGATTA CCAAAAGGTG TAAAACATTT 1551 GA AGGATTTT CC A ATTCTGC C AGGAGA A AT ATTC A A AT AT A A ATGGAC AG
1601 TGACTGTAGA AGATGGGCCA ACTAAATCAG ATCCTCGGTG CCTGACCCGC
1651 TATTACTCTA GTTTCGTTAA TATGGAGAGA GATCTAGCTT CAGGACTCAT 1701 TGGCCCTCTC CTCATCTGCT ACAAAGAATC TGTAGATCAA AGAGGAAACC
1751 AGATAATGTC AGACAAGAGG AATGTCATCC TGTTTTCTGT ATTTGATGAG 1801 AACCGAAGCT GGTACCTCAC AGAGAATATA CAACGCTTTC TCCCCAATCC 1851 AGCTGG AGTG C AGCTTGAGG ATCC AGAGTT CC A AGCCTCC A AC АТС ATGC
1901 ACAGCATCAA TGGCTATGTT TTTGATAGTT TGCAGTTGTC AGTTTGTTTG
1951 CATGAGGTGG CATACTGGTA CATTCTAAGC ATTGGAGCAC AGACTGACTT 2001 CCTTTCTGTC TTCTTCTCTG GAT AT ACCTT C A A AC AC A A A ATGGTCT ATG
2051 AAGACACACT CACCCTATTC CCATTCTCAG GAGAAACTGT CTTCATGTCG 2101 ATGGA A A ACC C AGGTCT ATG GATTCTGGGG TGCC AC A ACT C AGACTTTCG
2151 GA AC AGAGGC ATGACCGCCT T ACTGA AGGT TTCT AGTTGT GAC A AG A AC A
2201 CTGGTGATTA TTACGAGGAC AGTTATGAAG ATATTTCAGC ATACTTGCTG
2251 AGTAAAAACA ATGCCATTGA ACCAAGAAGC TTCTCTCAAA ACCCACCAGT
2301 CTTGAAACGC CATCAACGGG AAATAACTCG TACTACTCTT CAGTCAGATC 2351 A AGAGGA A AT TGACTATGAT GAT ACC AT AT C AGTTGA A AT GA AGA AGGA A
2401 GATTTTGACA TTTATGATGA GGATGAAAAT CAGAGCCCCC GCAGCTTTCA 2451 AAAGAAAACA CGACACTATT TTATTGCTGC AGTGGAGAGG CTCTGGGATT
2501 ATGGGATGAG TAGCTCCCCA CATGTTCTAA GAAACAGGGC TCAGAGTGGC
2551 AGTGTCCCTC AGTTC A AG AA AGTTGTTTTC C AGGA ATTT A CTGATGGCTC
2601 CTTTACTCAG CCCTTATACC GTGGAGAACT AAATGAACAT TTGGGACTCC 2651 TGGGGCCATA TATAAGAGCA GAAGTTGAAG ATAATATCAT GGTAACTTTC
2701 AGAAATCAGG CCTCTCGTCC CTATTCCTTC TATTCTAGCC TTATTTCTTA
2751 TGAGGAAGAT CAGAGGCAAG GAGCAGAACC TAGAAAAAAC TTTGTCAAGC 2801 CTAATGAAAC CAAAACTTAC TTTTGGAAAG TGCAACATCA TATGGCACCC 2851 ACTAAAGATG AGTTTGACTG CAAAGCCTGG GCTTATTTCT CTGATGTTGA 2901 CCTGGAAAAA GATGTGCACT CAGGCCTGAT TGGACCCCTT CTGGTCTGCC 2951 ACACTAACAC ACTGAACCCT GCTCATGGGA GACAAGTGAC AGTACAGGAA 3001 TTTGCTCTGT TTTTCACCAT CTTTGATGAG ACCAAAAGCT GGTACTTCAC
3051 TGAAAATATG GAAAGAAACT GCAGGGCTCC CTGCAATATC CAGATGGAAG
3101 ATCCC ACTTT T A A AGAGA AT T ATCGCTTCC ATGC А АТС A A TGGCT AC AT A
3151 ATGGAT AC AC T ACCTGGCTT AGT AATGGCT CAGGATCAAA GGATTCGATG
3201 GTATCTGCTC AGCATGGGCA GCAATGAAAA CATCCATTCT ATTCATTTCA
3251 GTGGACATGT GTTCACTGTA CGAAAAAAAG AGGAGTATAA AATGGCACTG 3301 TACAATCTCT ATCCAGGTGT TTTTGAGACA GTGGAAATGT TACCATCCAA
- 149 044115
3351 AGCTGGAATT TGGCGGGTGG AATGCCTTAT TGGCGAGCAT CTACATGCTG 3401 GGATGAGCAC ACTTTTTCTG GTGTACAGCA ATAAGTGTCA GACTCCCCTG 3451 GGAATGGCTT CTGGACACAT TAGAGATTTT CAGATTACAG CTTCAGGACA 3501 ATATGGACAG TGGGCCCCAA AGCTGGCCAG ACTTCATTAT TCCGGATCAA 3551 TCAATGCCTG GAGCACCAAG GAGCCCTTTT CTTGGATCAA GGTGGATCTG 3601 TTGGCACCAA TGATTATTCA CGGCATCAAG ACCCAGGGTG CCCGTCAGAA 3651 GTTCTCCAGC CTCTACATCT CTCAGTTTAT CATCATGTAT AGTCTTGATG
3701 GGAAGAAGTG GCAGACTTAT CGAGGAAATT CCACTGGAAC CTTAATGGTC 3751 TTCTTTGGCA ATGTGGATTC ATCTGGGATA AAACACAATA TTTTTAACCC 3801 TCCAATTATT GCTCGATACA TCCGTTTGCA CCCAACTCAT TATAGCATTC 3851 GCAGC ACTCT TCGC ATGGAG TTGATGGGCT GTGATTT A A A T AGTTGC AGC 3901 ATGCCATTGG GAATGGAGAG TAAAGCAATA TCAGATGCAC AGATTACTGC
3951 TTCATCCTAC TTTACCAATA TGTTTGCCAC CTGGTCTCCT TCAAAAGCTC
4001 GACTTC ACCT CC A AGGGAGG AGT A ATGCCT GGAGACCTC A GGTGA AT A AT 4051 CCAAAAGAGT GGCTGCAAGT GGACTTCCAG AAGACAATGA AAGTCACAGG
4101 AGT A ACT ACT C AGGG AGT A A A ATCTCTGCT T ACC AGC ATG T ATGTGA AGG 4151 AGTTCCTCAT CTCCAGCAGT CAAGATGGCC АТСAGTGGAC TCTCTTTTTT
4201 C AGA ATGGC A AAGT A A AGGT TTTTC AGGGA А АТС A AGACT CCTTC AC ACC 4251 TGTGGTGAAC TCTCTAGACC CACCGTTACT GACTCGCTAC CTTCGAATTC 4301 ACCCCCAGAG TTGGGTGCAC CAGATTGCCC TGAGGATGGA GGTTCTGGGC
51 TGCGAGGCAC AGGACCTCTA CGACAAAACT CACACATGCC CACCGTGCCC 4401 AGCTCC AGA A CTCCTGGGCG GACCGTC AGT CTTCCTCTTC CCCCC A A A AC 4451 CCAAGGACAC CCTCATGATC TCCCGGACCC CTGAGGTCAC ATGCGTGGTG 4501 GTGGACGTGA GCCACGAAGA CCCTGAGGTC AAGTTCAACT GGTACGTGGA
4551 CGGCGTGG AG GTGC AT A ATG CCA AGAC A A A GCCGCGGG AG GAGC AGT AC A 4601 ACAGCACGTA CCGTGTGGTC AGCGTCCTCA CCGTCCTGCA CCAGGACTGG 4651 CTGAATGGCA AGGAGTACAA GTGCAAGGTC TCCAACAAAG CCCTCCCAGC 4701 CCCCATCGAG AAAACCATCT CC AAAGCC AA AGGGCAGCCC CGAGA ACC AC 4751 AGGTGTACAC CCTGCCCCCA TCCCGGGATG AGCTGACCAA GAACCAGGTC 4801 AGCCTGACCT GCCTGGTCAA AGGCTTCTAT CCCAGCGACA TCGCCGTGGA 4851 GTGGGAGAGC AATGGGCAGC CGGAGAACAA CTACAAGACC ACGCCTCCCG 4901 TGTTGGACTC CGACGGCTCC TTCTTCCTCT ACAGCAAGCT CACCGTGGAC 4951 AAGAGCAGGT GGCAGCAGGG GAACGTCTTC TCATGCTCCG TGATGCATGA 5001 GGCTCTGCAC AACCACTACA CGCAGAAGAG CCTCTCCCTG TCTCCGGGTA 5051 AATGA
- 150 044115
Последовательность белка pSYNFVIII 010-(двойная цепь FVIIIFc) (SEQ ID NO: 163).
MQIELSTCFF LCLLRFCFSA TRRYYLGAVE LSWDYMQSDL GELPVDARFP
PRVPKSFPFN TSVVYKKTLF VEFTDHLFNI AKPRPPWMGL LGPTIQAEVY
101 DTVVITLKNM ASHPVSLHAV GVSYWKASEG AEYDDQTSQR EKEDDKVFPG
151 GSHTYVWQVL KENGPMASDP LCLTYSYLSH VDLVKDLNSG LIGALLVCRE
201 GSLAKEKTQT LHKFILLFAV FDEGKSWHSE TKNSLMQDRD AASARAWPKM
251 HTVNGYVNRS LPGLIGCHRK SVYWHVIGMG TTPEVHSIFL EGHTFLVRNH
301 RQASLEISPI TFLTAQTLLM DLGQFLLFCH ISSHQHDGME AYVKVDSCPE 351 EPQLRMKNNE EAEDYDDDLT DSEMDVVRFD DDNSPSFIQI RSVAKKHPKT 401 WVHYIAAEEE DWDYAPLVLA PDDRSYKSQY LNNGPQRIGR KYKKVRFMAY 451 TDETFKTREA IQHESGILGP LLYGEVGDTL LIIFKNQASR PYNIYPHGIT 501 DVRPLYSRRL PKGVKHLKDF PILPGEIFKY KWTVTVEDGP TKSDPRCLTR
551 YYSSFVNMER DLASGLIGPL LICYKESVDQ RGNQIMSDKR NVILFSVFDE
601 NRSWYLTENI QRFLPNPAGV QLEDPEFQAS NIMHSINGYV FDSLQLSVCL
651 HEVAYWYILS IGAQTDFLSV FFSGYTFKHK MVYEDTLTLF PFSGETVFMS
701 MENPGLWILG CHNSDFRNRG MTALLKVSSC DKNTGDYYED SYEDISAYLL 751 SKNNAIEPRS FSQNPPVLKR HQREITRTTL QSDQEEIDYD DTISVEMKKE 801 DFDIYDEDEN QSPRSFQKKT RHYFIAAVER LWDYGMSSSP HVLRNRAQSG 851 SVPQFKKVVF QEFTDGSFTQ PLYRGELNEH LGLLGPYIRA EVEDNIMVTF
901 RNQASRPYSF YSSLISYEED QRQGAEPRKN FVKPNETKTY FWKVQHHMAP 951 TKDEFDCKAW AYFSDVDLEK DVHSGLIGPL LVCHTNTLNP AHGRQVTVQE 1001 FALFFTIFDE TKSWYFTENM ERNCRAPCNI QMEDPTFKEN YRFHAINGYI
1051 MDTLPGLVMA QDQRIRWYLL SMGSNENIHS IHFSGHVFTV RKKEEYKMAL 1101 YNLYPGVFET VEMLPSKAGIWRVECLIGEH LHAGMSTLFL VYSNKCQTPL
1151 GMASGHIRDF QITASGQYGQ WAPKLARLHY SGSINAWSTK EPFSWIKVDL
1201 LAPMIIHGIK TQGARQKFSS LYISQFIIMY SLDGKKWQTY RGNSTGTLMV 1251 FFGNVDSSGI KHNIFNPPII ARYIRLHPTH YSIRSTLRME LMGCDLNSCS
1301 MPLGMESKAI SDAQITASSY FTNMFATWSP SKARLHLQGR SNAWRPQVNN 1351 PKEWLQVDFQ KTMKVTGVTT QGVKSLLTSM YVKEFLISSS QDGHQWTLFF 1401 QNGKVKVFQG NQDSFTPVVN SLDPPLLTRY LRIHPQSWVH QIALRMEVLG
1451 CEAQDLYDKT HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV
1501 VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW 1551 LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SRDELTKNQV 1601 SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD
1651 KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK*
- 151 044115
Последовательность белка FVIII195 (двойная цепь FVIIIFc с двумя 144 АЕ XTENs в аминокислоте
1656 и 1900) (SEO ID NO: 73).
MQIELSTCFF LCLLRFCFSA TRRYYLGAVE LSWDYMQSDL GELPVDARFP
PRVPKSFPFN TSVVYKKTLF VEFTDHLFNI AKPRPPWMGL LGPTIQAEVY
101 DTVVITLKNM ASHPVSLHAV GVSYWKASEG AEYDDQTSQR EKEDDKVFPG
151 GSHTYVWQVL KENGPMASDP LCLTYSYLSH VDLVKDLNSG LIGALLVCRE
201 GSLAKEKTQT LHKFILLFAV FDEGKSWHSE TKNSLMQDRD AASARAWPKM
251 HTVNGYVNRS LPGLIGCHRK SVYWHVIGMG TTPEVHSIFL EGHTFLVRNH
301 RQASLEISPI TFLTAQTLLM DLGQFLLFCH ISSHQHDGME AYVKVDSCPE
351 EPQLRMKNNE EAEDYDDDLT DSEMDVVRFD DDNSPSFIQI RSVAKKHPKT
401 WVHYIAAEEE DWDYAPLVLA PDDRSYKSQY LNNGPQRIGR KYKKVRFMAY
451 TDETFKTREA IQHESGILGP LLYGEVGDTL LIIFKNQASR PYNIYPHGIT
501 DVRPLYSRRL PKGVKHLKDF PILPGEIFKY KWTVTVEDGP TKSDPRCLTR
551 YYSSFVNMER DLASGLIGPL LICYKESVDQ RGNQIMSDKR NVILFSVFDE
601 NRSWYLTENI QRFLPNPAGV QLEDPEFQAS NIMHSINGYV FDSLQLSVCL
651 HEVAYWYILS IGAQTDFLSV FFSGYTFKHK MVYEDTLTLF PFSGETVFMS
701 MENPGLWILG CHNSDFRNRG MTALLKVSSC DKNTGDYYED SYEDISAYLL
751 SKNNAIEPRS FSQNPPVLKR HQREITRTTL QGAPGTPGSG TASSSPGASP
801 GTSSTGSPGA SPGTSSTGSP GASPGTSSTG SPGSSPSAST GTGPGTPGSG
851 TASSSPGASP GTSSTGSPGA SPGTSSTGSP GASPGTSSTG SPGSSTPSGA
901 TGSPGSSTPS GATGSPGASP GTSSTGSPAS SSDQEEIDYD DTISVEMKKE
951 DFDIYDEDEN QSPRSFQKKT RHYFIAAVER LWDYGMSSSP HVLRNRAQSG
1001 SVPQFKKVVF QEFTDGSFTQ PLYRGELNEH LGLLGPYIRA EVEDNIMVTF
1051 RNQASRPYSF YSSLISYEED QRQGAEPRKN FVKPNETKTY FWKVQHHMAP
1101 TKDEFDCKAW AYFSDVDLEK DVHSGLIGPL LVCHTNTLNP AHGRQVTVQE
1151 FALFFTIFDE TKSWYFTENM ERNCRGAPTS ESATPESGPG SEPATSGSET
1201 PGTSESATPE SGPGSEPATS GSETPGTSES ATPESGPGTS TEPSEGSAPG
1251 TSESATPESG PGSPAGSPTS TEEGSPAGSP TSTEEGSPAG SPTSTEEGTS
1301 ESATPESGPG TSTEPSEGSA PGASSAPCNI QMEDPTFKEN YRFHAINGYI
1351 MDTLPGLVMA QDQRIRWYLL SMGSNENIHS IHFSGHVFTV RKKEEYKMAL
1401 YNLYPGVFET VEMLPSKAGIWRVECLIGEH LHAGMSTLFL VYSNKCQTPL
1451 GMASGHIRDF QITASGQYGQ WAPKLARLHY SGSINAWSTK EPFSWIKVDL
1501 LAPMIIHGIK TQGARQKFSS LYISQFIIMY SLDGKKWQTY RGNSTGTLMV
1551 FFGNVDSSGI KHNIFNPPII ARYIRLHPTH YSIRSTLRME LMGCDLNSCS
1601 MPLGMESKAI SDAQITASSY FTNMFATWSP SKARLHLQGR SNAWRPQVNN
1651 PKEWLQVDFQ KTMKVTGVTT QGVKSLLTSM YVKEFLISSS QDGHQWTLFF
1701 QNGKVKVFQG NQDSFTPVVN SLDPPLLTRY LRIHPQSWVH QIALRMEVLG
1751 CEAQDLYDKT HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV
1801 VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW
1851 LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SRDELTKNQV
1901 SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD
1951 KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK*
- 152 044115
Последовательность зрелого белка pSYN-FVIII-173 (SEQ ID NO: 72).
ATRRYYLGAV ELSWDYMQSD LGELPVDARF PPRVPKSFPF NTSVVYKKTL
FVEFTDHLFN IAKPRPPWMG LLGPTIQAEV YDTVVITLKN MASHPVSLHA
101 VGVSYWKASE GAEYDDQTSQ REKEDDKVFP GGSHTYVWQV LKENGPMASD
151 PLCLTYSYLS HVDLVKDLNS GLIGALLVCR EGSLAKEKTQ TLHKFILLFA
201 VFDEGKSWHS ETKNSLMQDR DAASARAWPK MHTVNGYVNR SLPGLIGCHR
251 KSVYWHVIGM GTTPEVHSIF LEGHTFLVRN HRQASLEISP ITFLTAQTLL
301 MDLGQFLLFC HISSHQHDGM EAYVKVDSCP EEPQLRMKNN EEAEDYDDDL
351 TDSEMDVVRF DDDNSPSFIQ IRSVAKKHPK TWVHYIAAEE EDWDYAPLVL
401 APDDRSYKSQ YLNNGPQRIG RKYKKVRFMA YTDETFKTRE AIQHESGILG
451 PLLYGEVGDT LLIIFKNQAS RPYNIYPHGI TDVRPLYSRR LPKGVKHLKD
501 FPILPGEIFK YKWTVTVEDG PTKSDPRCLT RYYSSFVNME RDLASGLIGP
551 LLICYKESVD QRGNQIMSDK RNVILFSVFD ENRSWYLTEN IQRFLPNPAG
601 VQLEDPEFQA SNIMHSINGY VFDSLQLSVC LHEVAYWYIL SIGAQTDFLS
651 VFFSGYTFKH KMVYEDTLTL FPFSGETVFM SMENPGLWIL GCHNSDFRNR
701 GMTALLKVSS CDKNTGDYYE DSYEDISAYL LSKNNAIEPR SFSQNGAPGT
751 SESATPESGP GSEPATSGSE TPGTSESATP ESGPGSEPAT SGSETPGTSE
801 SATPESGPGT STEPSEGSAP GSPAGSPTST EEGTSESATP ESGPGSEPAT
851 SGSETPGTSE SATPESGPGS PAGSPTSTEE GSPAGSPTST EEGTSTEPSE
901 GSAPGTSESA TPESGPGTSE SATPESGPGT SESATPESGP GSEPATSGSE
951 TPGSEPATSG SETPGSPAGS PTSTEEGTST EPSEGSAPGT STEPSEGSAP
1001 GSEPATSGSE TPGTSESATP ESGPGTSTEP SEGSAPASSP PVLKRHQREI
1051 TRTTLQSDQE EIDYDDTISV EMKKEDFDIY DEDENQSPRS FQKKTRHYFI
1101 AAVERLWDYG MSSSPHVLRN RAQSGSVPQF KKVVFQEFTD GSFTQPLYRG
1151 ELNEHLGLLG PYIRAEVEDN IMVTFRNQAS RPYSFYSSLI SYEEDQRQGA
1201 EPRKNFVKPN ETKTYFWKVQ HHMAPTKDEF DCKAWAYFSD VDLEKDVHSG
1251 LIGPLLVCHT NTLNPAHGRQ VTVQEFALFF TIFDETKSWY FTENMERNCR
1301 APCNIQMEDP TFKENYRFHA INGYIMDTLP GLVMAQDQRI RWYLLSMGSN
1351 ENIHSIHFSG HVFTVRKKEE YKMALYNLYP GVFETVEMLP SKAGIWRVEC
1401 LIGEHLHAGM STLFLVYSNK CQTPLGMASG HIRDFQITAS GQYGQWAPKL
1451 ARLHYSGSIN AWSTKEPFSW IKVDLLAPMIIHGIKTQGAR QKFSSLYISQ
1501 FIIMYSLDGK KWQTYRGNST GTLMVFFGNV DSSGIKHNIF NPPIIARYIR
1551 LHPTHYSIRS TLRMELMGCD LNSCSMPLGM ESKAISDAQI TASSYFTNMF
1601 ATWSPSKARL HLQGRSNAWR PQVNNPKEWL QVDFQKTMKV TGVTTQGVKS
1651 LLTSMYVKEF LISSSQDGHQ WTLFFQNGKV KVFQGNQDSF TPVVNSLDPP
1701 LLTRYLRIHP QSWVHQIALR MEVLGCEAQD LYDKTHTCPP CPAPELLGGP
1751 SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK
1801 TKPREEQYNS TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK
1851 AKGQPREPQV YTLPPSRDEL TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE
1901 NNYKTTPPVL DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ
1951 KSLSLSPGK
- 153 044115
Последовательность белка FVIII196 (двойная цепь FVIIIFc с тремя 144 АЕ XTENs в аминокислоте
26, 1656 и 1900) (SEO ID NO: 74).
MQIELSTCFF LCLLRFCFSA TRRYYLGAVE LSWDYMQSDL GELPVGAPGS
SPSASTGTGP GSSPSASTGT GPGASPGTSS TGSPGASPGT SSTGSPGSST
101 PSGATGSPGS SPSASTGTGP GASPGTSSTG SPGSSPSAST GTGPGTPGSG
151 TASSSPGSST PSGATGSPGS STPSGATGSP GASPGTSSTG SPASSDARFP
201 PRVPKSFPFN TSVVYKKTLF VEFTDHLFNI AKPRPPWMGL LGPTIQAEVY
251 DTVVITLKNM ASHPVSLHAV GVSYWKASEG AEYDDQTSQR EKEDDKVFPG
301 GSHTYVWQVL KENGPMASDP LCLTYSYLSH VDLVKDLNSG LIGALLVCRE
351 GSLAKEKTQT LHKFILLFAV FDEGKSWHSE TKNSLMQDRD AASARAWPKM
401 HTVNGYVNRS LPGLIGCHRK SVYWHVIGMG TTPEVHSIFL EGHTFLVRNH
451 RQASLEISPI TFLTAQTLLM DLGQFLLFCH ISSHQHDGME AYVKVDSCPE
501 EPQLRMKNNE EAEDYDDDLT DSEMDVVRFD DDNSPSFIQI RSVAKKHPKT
551 WVHYIAAEEE DWDYAPLVLA PDDRSYKSQY LNNGPQRIGR KYKKVRFMAY
601 TDETFKTREA IQHESGILGP LLYGEVGDTL LIIFKNQASR PYNIYPHGIT
651 DVRPLYSRRL PKGVKHLKDF PILPGEIFKY KWTVTVEDGP TKSDPRCLTR
701 YYSSFVNMER DLASGLIGPL LICYKESVDQ RGNQIMSDKR NVILFSVFDE
751 NRSWYLTENI QRFLPNPAGV QLEDPEFQAS NIMHSINGYV FDSLQLSVCL
801 HEVAYWYILS IGAQTDFLSV FFSGYTFKHK MVYEDTLTLF PFSGETVFMS
851 MENPGLWILG CHNSDFRNRG MTALLKVSSC DKNTGDYYED SYEDISAYLL
901 SKNNAIEPRS FSQNPPVLKR HQREITRTTL QGAPGTPGSG TASSSPGASP
951 GTSSTGSPGA SPGTSSTGSP GASPGTSSTG SPGSSPSAST GTGPGTPGSG
1001 TASSSPGASP GTSSTGSPGA SPGTSSTGSP GASPGTSSTG SPGSSTPSGA
1051 TGSPGSSTPS GATGSPGASP GTSSTGSPAS SSDQEEIDYD DTISVEMKKE
1101 DFDIYDEDEN QSPRSFQKKT RHYFIAAVER LWDYGMSSSP HVLRNRAQSG
1151 SVPQFKKVVF QEFTDGSFTQ PLYRGELNEH LGLLGPYIRA EVEDNIMVTF
1201 RNQASRPYSF YSSLISYEED QRQGAEPRKN FVKPNETKTY FWKVQHHMAP
1251 TKDEFDCKAW AYFSDVDLEK DVHSGLIGPL LVCHTNTLNP AHGRQVTVQE
1301 FALFFTIFDE TKSWYFTENM ERNCRGAPTS ESATPESGPG SEPATSGSET
1351 PGTSESATPE SGPGSEPATS GSETPGTSES ATPESGPGTS TEPSEGSAPG
1401 TSESATPESG PGSPAGSPTS TEEGSPAGSP TSTEEGSPAG SPTSTEEGTS
1451 ESATPESGPG TSTEPSEGSA PGASSAPCNI QMEDPTFKEN YRFHAINGYI
1501 MDTLPGLVMA QDQRIRWYLL SMGSNENIHS IHFSGHVFTV RKKEEYKMAL
1551 YNLYPGVFET VEMLPSKAGIWRVECLIGEH LHAGMSTLFL VYSNKCQTPL
1601 GMASGHIRDF QITASGQYGQ WAPKLARLHY SGSINAWSTK EPFSWIKVDL
1651 LAPMIIHGIK TQGARQKFSS LYISQFIIMY SLDGKKWQTY RGNSTGTLMV
1701 FFGNVDSSGI KHNIFNPPII ARYIRLHPTH YSIRSTLRME LMGCDLNSCS
1751 MPLGMESKAI SDAQITASSY FTNMFATWSP SKARLHLQGR SNAWRPQVNN
1801 PKEWLQVDFQ KTMKVTGVTT QGVKSLLTSM YVKEFLISSS QDGHQWTLFF
1851 QNGKVKVFQG NQDSFTPVVN SLDPPLLTRY LRIHPQSWVH QIALRMEVLG
1901 CEAQDLYDKT HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV
1951 VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW
2001 LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SRDELTKNQV
2051 SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD
2101 KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK*
- 154 044115
Последовательность белка FVIII199 (одноцепочечный FVIIIFc с тремя 144 АЕ XTENs в аминокислоте 1656 и 1900) (SEQ ID NO: 75).
MQIELSTCFF LCLLRFCFSA TRRYYLGAVE LSWDYMQSDL GELPVDARFP
PRVPKSFPFN TSVVYKKTLF VEFTDHLFNI AKPRPPWMGL LGPTIQAEVY
101 DTVVITLKNM ASHPVSLHAV GVSYWKASEG AEYDDQTSQR EKEDDKVFPG
151 GSHTYVWQVL KENGPMASDP LCLTYSYLSH VDLVKDLNSG LIGALLVCRE
201 GSLAKEKTQT LHKFILLFAV FDEGKSWHSE TKNSLMQDRD AASARAWPKM
251 HTVNGYVNRS LPGLIGCHRK SVYWHVIGMG TTPEVHSIFL EGHTFLVRNH
301 RQASLEISPI TFLTAQTLLM DLGQFLLFCH ISSHQHDGME AYVKVDSCPE
351 EPQLRMKNNE EAEDYDDDLT DSEMDVVRFD DDNSPSFIQI RSVAKKHPKT
401 WVHYIAAEEE DWDYAPLVLA PDDRSYKSQY LNNGPQRIGR KYKKVRFMAY
451 TDETFKTREA IQHESGILGP LLYGEVGDTL LIIFKNQASR PYNIYPHGIT
501 DVRPLYSRRL PKGVKHLKDF PILPGEIFKY KWTVTVEDGP TKSDPRCLTR
551 YYSSFVNMER DLASGLIGPL LICYKESVDQ RGNQIMSDKR NVILFSVFDE
601 NRSWYLTENI QRFLPNPAGV QLEDPEFQAS NIMHSINGYV FDSLQLSVCL
651 HEVAYWYILS IGAQTDFLSV FFSGYTFKHK MVYEDTLTLF PFSGETVFMS
701 MENPGLWILG CHNSDFRNRG MTALLKVSSC DKNTGDYYED SYEDISAYLL
751 SKNNAIEPRS FSQNPPVLKR HQAEITRTTL QGAPGTPGSG TASSSPGASP
801 GTSSTGSPGA SPGTSSTGSP GASPGTSSTG SPGSSPSAST GTGPGTPGSG
851 TASSSPGASP GTSSTGSPGA SPGTSSTGSP GASPGTSSTG SPGSSTPSGA
901 TGSPGSSTPS GATGSPGASP GTSSTGSPAS SSDQEEIDYD DTISVEMKKE
951 DFDIYDEDEN QSPRSFQKKT RHYFIAAVER LWDYGMSSSP HVLRNRAQSG
1001 SVPQFKKVVF QEFTDGSFTQ PLYRGELNEH LGLLGPYIRA EVEDNIMVTF
1051 RNQASRPYSF YSSLISYEED QRQGAEPRKN FVKPNETKTY FWKVQHHMAP
1101 TKDEFDCKAW AYFSDVDLEK DVHSGLIGPL LVCHTNTLNP AHGRQVTVQE
1151 FALFFTIFDE TKSWYFTENM ERNCRGAPTS ESATPESGPG SEPATSGSET
1201 PGTSESATPE SGPGSEPATS GSETPGTSES ATPESGPGTS TEPSEGSAPG
1251 TSESATPESG PGSPAGSPTS TEEGSPAGSP TSTEEGSPAG SPTSTEEGTS
1301 ESATPESGPG TSTEPSEGSA PGASSAPCNI QMEDPTFKEN YRFHAINGYI
1351 MDTLPGLVMA QDQRIRWYLL SMGSNENIHS IHFSGHVFTV RKKEEYKMAL
1401 YNLYPGVFET VEMLPSKAGI WRVECLIGEH LHAGMSTLFL VYSNKCQTPL
1451 GMASGHIRDF QITASGQYGQ WAPKLARLHY SGSINAWSTK EPFSWIKVDL
1501 LAPMIIHGIK TQGARQKFSS LYISQFIIMY SLDGKKWQTY RGNSTGTLMV
1551 FFGNVDSSGI KHNIFNPPII ARYIRLHPTH YSIRSTLRME LMGCDLNSCS
1601 MPLGMESKAI SDAQITASSY FTNMFATWSP SKARLHLQGR SNAWRPQVNN
1651 PKEWLQVDFQ KTMKVTGVTT QGVKSLLTSM YVKEFLISSS QDGHQWTLFF
1701 QNGKVKVFQG NQDSFTPVVN SLDPPLLTRY LRIHPQSWVH QIALRMEVLG
1751 CEAQDLYDKT HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV
1801 VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW
1851 LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SRDELTKNQV
1901 SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD
1951 KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK*
- 155 044115
Последовательность белка FVIII 201 (одноцепочечный FVIIIFc с тремя 144 АЕ XTENs в аминокислоте 26, 1656 &1900) (SEO ID NO: 76).
MQIELSTCFF LCLLRFCFSA TRRYYLGAVE LSWDYMQSDL GELPVGAPGS
SPSASTGTGP GSSPSASTGT GPGASPGTSS TGSPGASPGT SSTGSPGSST
101 PSGATGSPGS SPSASTGTGP GASPGTSSTG SPGSSPSAST GTGPGTPGSG
151 TASSSPGSST PSGATGSPGS STPSGATGSP GASPGTSSTG SPASSDARFP
201 PRVPKSFPFN TSVVYKKTLF VEFTDHLFNI AKPRPPWMGL LGPTIQAEVY
251 DTVVITLKNM ASHPVSLHAV GVSYWKASEG AEYDDQTSQR EKEDDKVFPG
301 GSHTYVWQVL KENGPMASDP LCLTYSYLSH VDLVKDLNSG LIGALLVCRE
351 GSLAKEKTQT LHKFILLFAV FDEGKSWHSE TKNSLMQDRD AASARAWPKM
401 HTVNGYVNRS LPGLIGCHRK SVYWHVIGMG TTPEVHSIFL EGHTFLVRNH
451 RQASLEISPI TFLTAQTLLM DLGQFLLFCH ISSHQHDGME AYVKVDSCPE
501 EPQLRMKNNE EAEDYDDDLT DSEMDVVRFD DDNSPSFIQI RSVAKKHPKT
551 WVHYIAAEEE DWDYAPLVLA PDDRSYKSQY LNNGPQRIGR KYKKVRFMAY
601 TDETFKTREA IQHESGILGP LLYGEVGDTL LIIFKNQASR PYNIYPHGIT
651 DVRPLYSRRL PKGVKHLKDF PILPGEIFKY KWTVTVEDGP TKSDPRCLTR
701 YYSSFVNMER DLASGLIGPL LICYKESVDQ RGNQIMSDKR NVILFSVFDE
751 NRSWYLTENI QRFLPNPAGV QLEDPEFQAS NIMHSINGYV FDSLQLSVCL
801 HEVAYWYILS IGAQTDFLSV FFSGYTFKHK MVYEDTLTLF PFSGETVFMS
851 MENPGLWILG CHNSDFRNRG MTALLKVSSC DKNTGDYYED SYEDISAYLL
901 SKNNAIEPRS FSQNPPVLKR HQAEITRTTL QGAPGTPGSG TASSSPGASP
951 GTSSTGSPGA SPGTSSTGSP GASPGTSSTG SPGSSPSAST GTGPGTPGSG
1001 TASSSPGASP GTSSTGSPGA SPGTSSTGSP GASPGTSSTG SPGSSTPSGA
1051 TGSPGSSTPS GATGSPGASP GTSSTGSPAS SSDQEEIDYD DTISVEMKKE
1101 DFDIYDEDEN QSPRSFQKKT RHYFIAAVER LWDYGMSSSP HVLRNRAQSG
1151 SVPQFKKVVF QEFTDGSFTQ PLYRGELNEH LGLLGPYIRA EVEDNIMVTF
1201 RNQASRPYSF YSSLISYEED QRQGAEPRKN FVKPNETKTY FWKVQHHMAP
1251 TKDEFDCKAW AYFSDVDLEK DVHSGLIGPL LVCHTNTLNP AHGRQVTVQE
1301 FALFFTIFDE TKSWYFTENM ERNCRGAPTS ESATPESGPG SEPATSGSET
1351 PGTSESATPE SGPGSEPATS GSETPGTSES ATPESGPGTS TEPSEGSAPG
1401 TSESATPESG PGSPAGSPTS TEEGSPAGSP TSTEEGSPAG SPTSTEEGTS
1451 ESATPESGPG TSTEPSEGSA PGASSAPCNI QMEDPTFKEN YRFHAINGYI
1501 MDTLPGLVMA QDQRIRWYLL SMGSNENIHS IHFSGHVFTV RKKEEYKMAL
1551 YNLYPGVFET VEMLPSKAGIWRVECLIGEH LHAGMSTLFL VYSNKCQTPL
1601 GMASGHIRDF QITASGQYGQ WAPKLARLHY SGSINAWSTK EPFSWIKVDL
1651 LAPMIIHGIK TQGARQKFSS LYISQFIIMY SLDGKKWQTY RGNSTGTLMV
1701 FFGNVDSSGI KHNIFNPPII ARYIRLHPTH YSIRSTLRME LMGCDLNSCS
1751 MPLGMESKAI SDAQITASSY FTNMFATWSP SKARLHLQGR SNAWRPQVNN
1801 PKEWLQVDFQ KTMKVTGVTT QGVKSLLTSM YVKEFLISSS QDGHQWTLFF
1851 QNGKVKVFQG NQDSFTPVVN SLDPPLLTRY LRIHPQSWVH QIALRMEVLG
1901 CEAQDLYDKT HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV
1951 VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW
2001 LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SRDELTKNQV
2051 SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD
2101 KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK*
- 156 044115
Последовательность белка FVIII 203 (одноцепочечный FVIIIFc с двумя АЕ XTENs; одним 288АЕ
XTEN в домене В и одним 144 AE XTEN в аминокислоте 1900) (SEQ ID NO: 77).
MQIELSTCFF LCLLRFCFSA TRRYYLGAVE LSWDYMQSDL GELPVDARFP
PRVPKSFPFN TSVVYKKTLF VEFTDHLFNI AKPRPPWMGL LGPTIQAEVY
101 DTVVITLKNM ASHPVSLHAV GVSYWKASEG AEYDDQTSQR EKEDDKVFPG
151 GSHTYVWQVL KENGPMASDP LCLTYSYLSH VDLVKDLNSG LIGALLVCRE
201 GSLAKEKTQT LHKFILLFAV FDEGKSWHSE TKNSLMQDRD AASARAWPKM
251 HTVNGYVNRS LPGLIGCHRK SVYWHVIGMG TTPEVHSIFL EGHTFLVRNH
301 RQASLEISPI TFLTAQTLLM DLGQFLLFCH ISSHQHDGME AYVKVDSCPE
351 EPQLRMKNNE EAEDYDDDLT DSEMDVVRFD DDNSPSFIQI RSVAKKHPKT
401 WVHYIAAEEE DWDYAPLVLA PDDRSYKSQY LNNGPQRIGR KYKKVRFMAY
451 TDETFKTREA IQHESGILGP LLYGEVGDTL LIIFKNQASR PYNIYPHGIT
501 DVRPLYSRRL PKGVKHLKDF PILPGEIFKY KWTVTVEDGP TKSDPRCLTR
551 YYSSFVNMER DLASGLIGPL LICYKESVDQ RGNQIMSDKR NVILFSVFDE
601 NRSWYLTENI QRFLPNPAGV QLEDPEFQAS NIMHSINGYV FDSLQLSVCL
651 HEVAYWYILS IGAQTDFLSV FFSGYTFKHK MVYEDTLTLF PFSGETVFMS
701 MENPGLWILG CHNSDFRNRG MTALLKVS SC DKNTGDYYED SYEDISAYLL
751 SKNNAIEPRS FSQNGAPGTS ESATPESGPG SEPATSGSET PGTSESATPE
801 SGPGSEPATS GSETPGTSES ATPESGPGTS TEPSEGSAPG SPAGSPTSTE
851 EGTSESATPE SGPGSEPATS GSETPGTSES ATPESGPGSP AGSPTSTEEG
901 SPAGSPTSTE EGTSTEPSEG SAPGTSESAT PESGPGTSES ATPESGPGTS
951 ESATPESGPG SEPATSGSET PGSEPATSGS ETPGSPAGSP TSTEEGTSTE
1001 PSEGSAPGTS TEPSEGSAPG SEPATSGSET PGTSESATPE SGPGTSTEPS
1051 EGSAPASSPP VLKRHQAEIT RTTLQSDQEE IDYDDTISVE MKKEDFDIYD
1101 EDENQSPRSF QKKTRHYFIA AVERLWDYGM SSSPHVLRNR AQSGSVPQFK
1151 KVVFQEFTDG SFTQPLYRGE LNEHLGLLGP YIRAEVEDNI MVTFRNQASR
1201 PYSFYSSLIS YEEDQRQGAE PRKNFVKPNE TKTYFWKVQH HMAPTKDEFD
1251 CKAWAYFSDV DLEKDVHSGL IGPLLVCHTN TLNPAHGRQV TVQEFALFFT
1301 ^iIFDETKSWYF TENMERNCRG APTSESATPE SGPGSEPATS GSETPGTSES
1351 ATPESGPGSE PATSGSETPG TSESATPESG PGTSTEPSEG SAPGTSESAT
1401 PESGPGSPAG SPTSTEEGSP AGSPTSTEEG SPAGSPTSTE EGTSESATPE
1451 SGPGTSTEPS EGSAPGASSA PCNIQMEDPT FKENYRFHAINGYIMDTLPG
1501 LVMAQDQRIR WYLLSMGSNE NIHSIHFSGH VFTVRKKEEY KMALYNLYPG
1551 VFETVEMLPS KAGIWRVECLIGEHLHAGMS TLFLVYSNKC QTPLGMASGH
1601 IRDFQITASG QYGQWAPKLA RLHYSGSINA WSTKEPFSWI KVDLLAPMII
1651 HGIKTQGARQ KFSSLYISQF IIMYSLDGKK WQTYRGNSTG TLMVFFGNVD
1701 SSGIKHNIFN PPIIARYIRL HPTHYSIRST LRMELMGCDL NSCSMPLGME
1751 SKAISDAQIT ASSYFTNMFA TWSPSKARLH LQGRSNAWRP QVNNPKEWLQ
1801 VDFQKTMKVT GVTTQGVKSL LTSMYVKEFL ISSSQDGHQW TLFFQNGKVK
1851 VFQGNQDSFT PVVNSLDPPL LTRYLRIHPQ SWVHQIALRM EVLGCEAQDL
1901 YDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE
1951 DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY
2001 KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSRDELT KNQVSLTCLV
2051 KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ
2101 GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK*
- 157 044115
Последовательность белка FVIII 204 (одноцепочечный FVIIIFc с двумя АЕ XTENs; одним 288АЕ
XTEN в домене В и одним 144 АЕ XTEN в аминокислоте 403) (SEQ ID NO: 78).
MQIELSTCFF LCLLRFCFSA TRRYYLGAVE LSWDYMQSDL GELPVDARFP
PRVPKSFPFN TSVVYKKTLF VEFTDHLFNIAKPRPPWMGL LGPTIQAEVY
101 DTVVITLKNM ASHPVSLHAV GVSYWKASEG AEYDDQTSQR EKEDDKVFPG
151 GSHTYVWQVL KENGPMASDP LCLTYSYLSH VDLVKDLNSG LIGALLVCRE
201 GSLAKEKTQT LHKFILLFAV FDEGKSWHSE TKNSLMQDRD AASARAWPKM
251 HTVNGYVNRS LPGLIGCHRK SVYWHVIGMG TTPEVHSIFL EGHTFLVRNH
301 RQASLEISPITFLTAQTLLM DLGQFLLFCH ISSHQHDGME AYVKVDSCPE
351 EPQLRMKNNE EAEDYDDDLT DSEMDVVRFD DDNSPSFIQI RSVAKKHPKT
401 WVHYIAAEEE DWDYAPLVLA PDGAPTSTEP SEGSAPGSPA GSPTSTEEGT
451 STEPSEGSAP GTSTEPSEGS APGTSESATP ESGPGTSTEP SEGSAPGTSE
501 SATPESGPGS EPATSGSETP GTSTEPSEGS APGTSTEPSE GSAPGTSESA
551 TPESGPGTSE SATPESGPGA SSDRSYKSQY LNNGPQRIGR KYKKVRFMAY
601 TDETFKTREAIQHESGILGP LLYGEVGDTL LIIFKNQASR PYNIYPHGIT
651 DVRPLYSRRL PKGVKHLKDF PILPGEIFKY KWTVTVEDGP TKSDPRCLTR
701 YYSSFVNMER DLASGLIGPL LICYKESVDQ RGNQIMSDKR NVILFSVFDE
751 NRSWYLTENI QRFLPNPAGV QLEDPEFQAS NIMHSINGYV FDSLQLSVCL
801 HEVAYWYILS IGAQTDFLSV FFSGYTFKHK MVYEDTLTLF PFSGETVFMS
851 MENPGLWILG CHNSDFRNRG MTALLKVSSC DKNTGDYYED SYEDISAYLL
901 SKNNAIEPRS FSQNGAPGTS ESATPESGPG SEPATSGSET PGTSESATPE
951 SGPGSEPATS GSETPGTSES ATPESGPGTS TEPSEGSAPG SPAGSPTSTE
1001 EGTSESATPE SGPGSEPATS GSETPGTSES ATPESGPGSP AGSPTSTEEG
1051 SPAGSPTSTE EGTSTEPSEG SAPGTSESAT PESGPGTSES ATPESGPGTS
1101 ESATPESGPG SEPATSGSET PGSEPATSGS ETPGSPAGSP TSTEEGTSTE
1151 PSEGSAPGTS TEPSEGSAPG SEPATSGSET PGTSESATPE SGPGTSTEPS
1201 EGSAPASSPP VLKRHQAEIT RTTLQSDQEE IDYDDTISVE MKKEDFDIYD
1251 EDENQSPRSF QKKTRHYFIA AVERLWDYGM SSSPHVLRNR AQSGSVPQFK
1301 KVVFQEFTDG SFTQPLYRGE LNEHLGLLGP YIRAEVEDNI MVTFRNQASR
1351 PYSFYSSLIS YEEDQRQGAE PRKNFVKPNE TKTYFWKVQH HMAPTKDEFD
1401 CKAWAYFSDV DLEKDVHSGL IGPLLVCHTN TLNPAHGRQV TVQEFALFFT
1451 IFDETKSWYF TENMERNCRA PCNIQMEDPT FKENYRFHAI NGYIMDTLPG
1501 LVMAQDQRIR WYLLSMGSNE NIHSIHFSGH VFTVRKKEEY KMALYNLYPG
1551 VFETVEMLPS KAGIWRVECL IGEHLHAGMS TLFLVYSNKC QTPLGMASGH
1601 IRDFQITASG QYGQWAPKLA RLHYSGSINA WSTKEPFSWI KVDLLAPMII
1651 HGIKTQGARQ KFSSLYISQF IIMYSLDGKK WQTYRGNSTG TLMVFFGNVD
1701 SSGIKHNIFN PPIIARYIRL HPTHYSIRST LRMELMGCDL NSCSMPLGME
1751 SKAISDAQIT ASSYFTNMFA TWSPSKARLH LQGRSNAWRP QVNNPKEWLQ
1801 VDFQKTMKVT GVTTQGVKSL LTSMYVKEFL ISSSQDGHQW TLFFQNGKVK
1851 VFQGNQDSFT PVVNSLDPPL LTRYLRIHPQ SWVHQIALRM EVLGCEAQDL
1901 YDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE
1951 DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY
2001 KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSRDELT KNQVSLTCLV
2051 KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ
2101 GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK*
- 158 044115
Последовательность белка FVIII 205 (одноцепочечный FVIIIFc с двумя AE XTENs; одним 288АЕ
XTEN в домене В и одним 144 AE XTEN в аминокислоте 18) (SEQ ID NO: 79).
MQIELSTCFF LCLLRFCFSA TRRYYLGAVE LSWDYMQGAP TSESATPESG
PGSEPATSGS ETPGTSESAT PESGPGSEPA TSGSETPGTS ESATPESGPG
101 TSTEPSEGSA PGSPAGSPTS TEEGTSESAT PESGPGSEPA TSGSETPGTS
151 ESATPESGPG SPAGSPTSTE EGSPAGSPTS TEEGASSSDL GELPVDARFP
201 PRVPKSFPFN TSVVYKKTLF VEFTDHLFNI AKPRPPWMGL LGPTIQAEVY
251 DTVVITLKNM ASHPVSLHAV GVSYWKASEG AEYDDQTSQR EKEDDKVFPG
301 GSHTYVWQVL KENGPMASDP LCLTYSYLSH VDLVKDLNSG LIGALLVCRE
351 GSLAKEKTQT LHKFILLFAV FDEGKSWHSE TKNSLMQDRD AASARAWPKM
401 HTVNGYVNRS LPGLIGCHRK SVYWHVIGMG TTPEVHSIFL EGHTFLVRNH
451 RQASLEISPI TFLTAQTLLM DLGQFLLFCH ISSHQHDGME AYVKVDSCPE
501 EPQLRMKNNE EAEDYDDDLT DSEMDVVRFD DDNSPSFIQI RSVAKKHPKT
551 WVHYIAAEEE DWDYAPLVLA PDDRSYKSQY LNNGPQRIGR KYKKVRFMAY
601 TDETFKTREA IQHESGILGP LLYGEVGDTL LIIFKNQASR PYNIYPHGIT
651 DVRPLYSRRL PKGVKHLKDF PILPGEIFKY KWTVTVEDGP TKSDPRCLTR
701 YYSSFVNMER DLASGLIGPL LICYKESVDQ RGNQIMSDKR NVILFSVFDE
751 NRSWYLTENI QRFLPNPAGV QLEDPEFQAS NIMHSINGYV FDSLQLSVCL
801 HEVAYWYILS IGAQTDFLSV FFSGYTFKHK MVYEDTLTLF PFSGETVFMS
851 MENPGLWILG CHNSDFRNRG MTALLKVSSC DKNTGDYYED SYEDISAYLL
901 SKNNAIEPRS FSQNGAPGTS ESATPESGPG SEPATSGSET PGTSESATPE
951 SGPGSEPATS GSETPGTSES ATPESGPGTS TEPSEGSAPG SPAGSPTSTE
1001 EGTSESATPE SGPGSEPATS GSETPGTSES ATPESGPGSP AGSPTSTEEG
1051 SPAGSPTSTE EGTSTEPSEG SAPGTSESAT PESGPGTSES ATPESGPGTS
1101 ESATPESGPG SEPATSGSET PGSEPATSGS ETPGSPAGSP TSTEEGTSTE
1151 PSEGSAPGTS TEPSEGSAPG SEPATSGSET PGTSESATPE SGPGTSTEPS
1201 EGSAPASSPP VLKRHQAEIT RTTLQSDQEE IDYDDTISVE MKKEDFDIYD
1251 EDENQSPRSF QKKTRHYFIA AVERLWDYGM SSSPHVLRNR AQSGSVPQFK
1301 KVVFQEFTDG SFTQPLYRGE LNEHLGLLGP YIRAEVEDNI MVTFRNQASR
1351 PYSFYSSLIS YEEDQRQGAE PRKNFVKPNE TKTYFWKVQH HMAPTKDEFD
1401 CKAWAYFSDV DLEKDVHSGL IGPLLVCHTN TLNPAHGRQV TVQEFALFFT
1451 IFDETKSWYF TENMERNCRA PCNIQMEDPT FKENYRFHAI NGYIMDTLPG
1501 LVMAQDQRIR WYLLSMGSNE NIHSIHFSGH VFTVRKKEEY KMALYNLYPG
1551 VFETVEMLPS KAGIWRVECL IGEHLHAGMS TLFLVYSNKC QTPLGMASGH
1601 IRDFQITASG QYGQWAPKLA RLHYSGSINA WSTKEPFSWI KVDLLAPMII
1651 HGIKTQGARQ KFSSLYISQF IIMYSLDGKK WQTYRGNSTG TLMVFFGNVD
1701 SSGIKHNIFN PPIIARYIRL HPTHYSIRST LRMELMGCDL NSCSMPLGME
1751 SKAISDAQIT ASSYFTNMFA TWSPSKARLH LQGRSNAWRP QVNNPKEWLQ
1801 VDFQKTMKVT GVTTQGVKSL LTSMYVKEFL ISSSQDGHQW TLFFQNGKVK
1851 VFQGNQDSFT PVVNSLDPPL LTRYLRIHPQ SWVHQIALRM EVLGCEAQDL
1901 YDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE
1951 DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY
2001 KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSRDELT KNQVSLTCLV
2051 KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ
2101 GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK*
- 159 044115
Последовательность белка pSYN FVIII 266 (FVIII Fc с 42 AE-XTEN в аминокислоте 18 и 288 AE
XTEN в домене В) SEO ID NO: 80).
MQIELSTCFF LCLLRFCFSA TRRYYLGAVE LSWDYMQGAP GSPAGSPTST
EEGTSESATP ESGPGSEPAT SGSETPASSS DLGELPVDAR FPPRVPKSFP
101 FNTSVVYKKT LFVEFTDHLF NIAKPRPPWM GLLGPTIQAE VYDTVVITLK
151 NMASHPVSLH AVGVSYWKAS EGAEYDDQTS QREKEDDKVF PGGSHTYVWQ
201 VLKENGPMAS DPLCLTYSYL SHVDLVKDLN SGLIGALLVC REGSLAKEKT 251 QTLHKFILLF AVFDEGKSWH SETKNSLMQD RDAASARAWP KMHTVNGYVN
301 RSLPGLIGCH RKSVYWHVIG MGTTPEVHSI FLEGHTFLVR NHRQASLEIS
351 PITFLTAQTL LMDLGQFLLF CHISSHQHDG MEAYVKVDSC PEEPQLRMKN
401 NEEAEDYDDD LTDSEMDVVR FDDDNSPSFI QIRSVAKKHP KTWVHYIAAE 451 EEDWDYAPLV LAPDDRSYKS QYLNNGPQRI GRKYKKVRFM AYTDETFKTR
501 EAIQHESGIL GPLLYGEVGD TLLIIFKNQA SRPYNIYPHG ITDVRPLYSR 551 RLPKGVKHLK DFPILPGEIF KYKWTVTVED GPTKSDPRCL TRYYSSFVNM
601 ERDLASGLIG PLLICYKESV DQRGNQIMSD KRNVILFSVF DENRSWYLTE 651 NIQRFLPNPA GVQLEDPEFQ ASNIMHSING YVFDSLQLSV CLHEVAYWYI 701 LSIGAQTDFL SVFFSGYTFK HKMVYEDTLT LFPFSGETVF MSMENPGLWI
751 LGCHNSDFRN RGMTALLKVS SCDKNTGDYY EDSYEDISAY LLSKNNAIEP
801 RSFSQNGAPG TSESATPESG PGSEPATSGS ETPGTSESAT PESGPGSEPA 851 TSGSETPGTS ESATPESGPG TSTEPSEGSA PGSPAGSPTS TEEGTSESAT
901 PESGPGSEPA TSGSETPGTS ESATPESGPG SPAGSPTSTE EGSPAGSPTS
951 TEEGTSTEPS EGSAPGTSES ATPESGPGTS ESATPESGPG TSESATPESG
1001 PGSEPATSGS ETPGSEPATS GSETPGSPAG SPTSTEEGTS TEPSEGSAPG 1051 TSTEPSEGSA PGSEPATSGS ETPGTSESAT PESGPGTSTE PSEGSAPASS
1101 PPVLKRHQAE ITRTTLQSDQ EEIDYDDTIS VEMKKEDFDI YDEDENQSPR
1151 SFQKKTRHYF IAAVERLWDY GMSSSPHVLR NRAQSGSVPQ FKKVVFQEFT
1201 DGSFTQPLYR GELNEHLGLL GPYIRAEVED NIMVTFRNQA SRPYSFYSSL
1251 ISYEEDQRQG AEPRKNFVKP NETKTYFWKV QHHMAPTKDE FDCKAWAYFS 1301 DVDLEKDVHS GLIGPLLVCH TNTLNPAHGR QVTVQEFALF FTIFDETKSW 1351 YFTENMERNC RAPCNIQMED PTFKENYRFH AINGYIMDTL PGLVMAQDQR
1401 IRWYLLSMGS NENIHSIHFS GHVFTVRKKE EYKMALYNLY PGVFETVEML
1451 PSKAGIWRVE CLIGEHLHAG MSTLFLVYSN KCQTPLGMAS GHIRDFQITA 1501 SGQYGQWAPK LARLHYSGSI NAWSTKEPFS WIKVDLLAPM IIHGIKTQGA 1551 RQKFSSLYIS QFIIMYSLDG KKWQTYRGNS TGTLMVFFGN VDSSGIKHNI 1601 FNPPIIARYI RLHPTHYSIR STLRMELMGC DLNSCSMPLG MESKAISDAQ
1651 ITASSYFTNM FATWSPSKAR LHLQGRSNAW RPQVNNPKEW LQVDFQKTMK 1701 VTGVTTQGVK SLLTSMYVKE FLISSSQDGH QWTLFFQNGK VKVFQGNQDS 1751 FTPVVNSLDP PLLTRYLRIH PQSWVHQIAL RMEVLGCEAQ DLYDKTHTCP 1801 PCPAPELLGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW 1851 YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA 1901 LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSRDE LTKNQVSLTC LVKGFYPSDI 1951 AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV
2001 MHEALHNHYT QKSLSLSPGK *
- 160 044115
Последовательность белка pSYN FVIII 267 (FVIII Fc с 72 AE-XTEN в аминокислоте 18 и 288 AE
XTEN в домене В) SEQ ID NO: 81).
MQIELSTCFF LCLLRFCFSA TRRYYLGAVE LSWDYMQGAP TSESATPESG
PGSEPATSGS ETPGTSESAT PESGPGSEPA TSGSETPGTS ESATPESGPG
101 TSTEPSEGSA PGASSSDLGE LPVDARFPPR VPKSFPFNTS VVYKKTLFVE
151 FTDHLFNIAK PRPPWMGLLG PTIQAEVYDT VVITLKNMAS HPVSLHAVGV
201 SYWKASEGAE YDDQTSQREK EDDKVFPGGS HTYVWQVLKE NGPMASDPLC
251 LTYSYLSHVD LVKDLNSGLI GALLVCREGS LAKEKTQTLH KFILLFAVFD
301 EGKSWHSETK NSLMQDRDAA SARAWPKMHT VNGYVNRSLP GLIGCHRKSV
351 YWHVIGMGTT PEVHSIFLEG HTFLVRNHRQ ASLEISPITF LTAQTLLMDL
401 GQFLLFCHIS SHQHDGMEAY VKVDSCPEEP QLRMKNNEEA EDYDDDLTDS
451 EMDVVRFDDD NSPSFIQIRS VAKKHPKTWV HYIAAEEEDW DYAPLVLAPD
501 DRSYKSQYLN NGPQRIGRKY KKVRFMAYTD ETFKTREAIQ HESGILGPLL
551 YGEVGDTLLIIFKNQASRPY NIYPHGITDV RPLYSRRLPK GVKHLKDFPI
601 LPGEIFKYKW TVTVEDGPTK SDPRCLTRYY SSFVNMERDL ASGLIGPLLI
651 CYKESVDQRG NQIMSDKRNV ILFSVFDENR SWYLTENIQR FLPNPAGVQL
701 EDPEFQASNIMHSINGYVFD SLQLSVCLHE VAYWYILSIG AQTDFLSVFF
751 SGYTFKHKMV YEDTLTLFPF SGETVFMSME NPGLWILGCH NSDFRNRGMT
801 ALLKVSSCDK NTGDYYEDSY EDISAYLLSK NNAIEPRSFS QNGAPGTSES
851 ATPESGPGSE PATSGSETPG TSESATPESG PGSEPATSGS ETPGTSESAT
901 PESGPGTSTE PSEGSAPGSP AGSPTSTEEG TSESATPESG PGSEPATSGS
951 ETPGTSESAT PESGPGSPAG SPTSTEEGSP AGSPTSTEEG TSTEPSEGSA
1001 PGTSESATPE SGPGTSESAT PESGPGTSES ATPESGPGSE PATSGSETPG
1051 SEPATSGSET PGSPAGSPTS TEEGTSTEPS EGSAPGTSTE PSEGSAPGSE
1101 PATSGSETPG TSESATPESG PGTSTEPSEG SAPASSPPVL KRHQAEITRT
1151 TLQSDQEEID YDDTISVEMK KEDFDIYDED ENQSPRSFQK KTRHYFIAAV
1201 ERLWDYGMSS SPHVLRNRAQ SGSVPQFKKV VFQEFTDGSF TQPLYRGELN
1251 EHLGLLGPYIRAEVEDNIMV TFRNQASRPY SFYSSLISYE EDQRQGAEPR
1301 KNFVKPNETK TYFWKVQHHM APTKDEFDCK AWAYFSDVDL EKDVHSGLIG
1351 PLLVCHTNTL NPAHGRQVTV QEFALFFTIF DETKSWYFTE NMERNCRAPC
1401 NIQMEDPTFK ENYRFHAING YIMDTLPGLV MAQDQRIRWY LLSMGSNENI
1451 HSIHFSGHVF TVRKKEEYKM ALYNLYPGVF ETVEMLPSKA GIWRVECLIG
1501 EHLHAGMSTL FLVYSNKCQT PLGMASGHIR DFQITASGQY GQWAPKLARL
1551 HYSGSINAWS TKEPFSWIKV DLLAPMIIHGIKTQGARQKF SSLYISQFII
1601 MYSLDGKKWQ TYRGNSTGTL MVFFGNVDSS GIKHNIFNPP IIARYIRLHP
1651 THYSIRSTLR MELMGCDLNS CSMPLGMESK AISDAQITAS SYFTNMFATW
1701 SPSKARLHLQ GRSNAWRPQV NNPKEWLQVD FQKTMKVTGV TTQGVKSLLT
1751 SMYVKEFLIS SSQDGHQWTL FFQNGKVKVF QGNQDSFTPV VNSLDPPLLT
1801 RYLRIHPQSW VHQIALRMEV LGCEAQDLYD KTHTCPPCPA PELLGGPSVF
1851 LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP EVKFNWYVDG VEVHNAKTKP
1901 REEQYNSTYR VVSVLTVLHQ DWLNGKEYKC KVSNKALPAPIEKTISKAKG
1951 QPREPQVYTL PPSRDELTKN QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY
2001 KTTPPVLDSD GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL
2051 SLSPGK*
- 161 044115
Последовательность белка pSYN FVIII 268 (FVIII Fc с 144 AE-XTEN в аминокислоте 18) SEQ
ID NO: 82).
MQIELSTCFF LCLLRFCFSA TRRYYLGAVE LSWDYMQGAP TSESATPESG
PGSEPATSGS ETPGTSESAT PESGPGSEPA TSGSETPGTS ESATPESGPG
101 TSTEPSEGSA PGSPAGSPTS TEEGTSESAT PESGPGSEPA TSGSETPGTS
151 ESATPESGPG SPAGSPTSTE EGSPAGSPTS TEEGASSSDL GELPVDARFP
201 PRVPKSFPFN TSVVYKKTLF VEFTDHLFNI AKPRPPWMGL LGPTIQAEVY
251 DTVVITLKNM ASHPVSLHAV GVSYWKASEG AEYDDQTSQR EKEDDKVFPG
301 GSHTYVWQVL KENGPMASDP LCLTYSYLSH VDLVKDLNSG LIGALLVCRE
351 GSLAKEKTQT LHKFILLFAV FDEGKSWHSE TKNSLMQDRD AASARAWPKM
401 HTVNGYVNRS LPGLIGCHRK SVYWHVIGMG TTPEVHSIFL EGHTFLVRNH
451 RQASLEISPI TFLTAQTLLM DLGQFLLFCH ISSHQHDGME AYVKVDSCPE
501 EPQLRMKNNE EAEDYDDDLT DSEMDVVRFD DDNSPSFIQI RSVAKKHPKT
551 WVHYIAAEEE DWDYAPLVLA PDDRSYKSQY LNNGPQRIGR KYKKVRFMAY
601 TDETFKTREA IQHESGILGP LLYGEVGDTL LIIFKNQASR PYNIYPHGIT
651 DVRPLYSRRL PKGVKHLKDF PILPGEIFKY KWTVTVEDGP TKSDPRCLTR
701 YYSSFVNMER DLASGLIGPL LICYKESVDQ RGNQIMSDKR NVILFSVFDE
751 NRSWYLTENI QRFLPNPAGV QLEDPEFQAS NIMHSINGYV FDSLQLSVCL
801 HEVAYWYILS IGAQTDFLSV FFSGYTFKHK MVYEDTLTLF PFSGETVFMS
851 MENPGLWILG CHNSDFRNRG MTALLKVSSC DKNTGDYYED SYEDISAYLL
901 SKNNAIEPRS FSQNPPVLKR HQAEITRTTL QSDQEEIDYD DTISVEMKKE
951 DFDIYDEDEN QSPRSFQKKT RHYFIAAVER LWDYGMSSSP HVLRNRAQSG
1001 SVPQFKKVVF QEFTDGSFTQ PLYRGELNEH LGLLGPYIRA EVEDNIMVTF
1051 RNQASRPYSF YSSLISYEED QRQGAEPRKN FVKPNETKTY FWKVQHHMAP
1101 TKDEFDCKAW AYFSDVDLEK DVHSGLIGPL LVCHTNTLNP AHGRQVTVQE
1151 FALFFTIFDE TKSWYFTENM ERNCRAPCNI QMEDPTFKEN YRFHAINGYI
1201 MDTLPGLVMA QDQRIRWYLL SMGSNENIHS IHFSGHVFTV RKKEEYKMAL
1251 YNLYPGVFET VEMLPSKAGIWRVECLIGEH LHAGMSTLFL VYSNKCQTPL
1301 GMASGHIRDF QITASGQYGQ WAPKLARLHY SGSINAWSTK EPFSWIKVDL
1351 LAPMIIHGIK TQGARQKFSS LYISQFIIMY SLDGKKWQTY RGNSTGTLMV
1401 FFGNVDSSGI KHNIFNPPII ARYIRLHPTH YSIRSTLRME LMGCDLNSCS
1451 MPLGMESKAI SDAQITASSY FTNMFATWSP SKARLHLQGR SNAWRPQVNN
1501 PKEWLQVDFQ KTMKVTGVTT QGVKSLLTSM YVKEFLISSS QDGHQWTLFF
1551 QNGKVKVFQG NQDSFTPVVN SLDPPLLTRY LRIHPQSWVH QIALRMEVLG
1601 CEAQDLYDKT HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV
1651 VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW
1701 LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SRDELTKNQV
1751 SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD
1801 KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK*
- 162 044115
Последовательность белка pSYN FVIII 269 (FVIII Fc с 72 AE-XTEN в аминокислоте 18) SEQ ID
NO: 83).
MQIELSTCFF LCLLRFCFSA TRRYYLGAVE LSWDYMQGAP TSESATPESG
PGSEPATSGS ETPGTSESAT PESGPGSEPA TSGSETPGTS ESATPESGPG
101 TSTEPSEGSA PGASSSDLGE LPVDARFPPR VPKSFPFNTS VVYKKTLFVE
151 FTDHLFNIAK PRPPWMGLLG PTIQAEVYDT VVITLKNMAS HPVSLHAVGV
201 SYWKASEGAE YDDQTSQREK EDDKVFPGGS HTYVWQVLKE NGPMASDPLC
251 LTYSYLSHVD LVKDLNSGLIGALLVCREGS LAKEKTQTLH KFILLFAVFD
301 EGKSWHSETK NSLMQDRDAA SARAWPKMHT VNGYVNRSLP GLIGCHRKSV
351 YWHVIGMGTT PEVHSIFLEG HTFLVRNHRQ ASLEISPITF LTAQTLLMDL
401 GQFLLFCHIS SHQHDGMEAY VKVDSCPEEP QLRMKNNEEA EDYDDDLTDS
451 EMDVVRFDDD NSPSFIQIRS VAKKHPKTWV HYIAAEEEDW DYAPLVLAPD
501 DRSYKSQYLN NGPQRIGRKY KKVRFMAYTD ETFKTREAIQ HESGILGPLL
551 YGEVGDTLLIIFKNQASRPY NIYPHGITDV RPLYSRRLPK GVKHLKDFPI
601 LPGEIFKYKW TVTVEDGPTK SDPRCLTRYY SSFVNMERDL ASGLIGPLLI
651 CYKESVDQRG NQIMSDKRNV ILFSVFDENR SWYLTENIQR FLPNPAGVQL
701 EDPEFQASNI MHSINGYVFD SLQLSVCLHE VAYWYILSIG AQTDFLSVFF
751 SGYTFKHKMV YEDTLTLFPF SGETVFMSME NPGLWILGCH NSDFRNRGMT
801 ALLKVSSCDK NTGDYYEDSY EDISAYLLSK NNAIEPRSFS QNPPVLKRHQ
851 AEITRTTLQS DQEEIDYDDT ISVEMKKEDF DIYDEDENQS PRSFQKKTRH
901 YFIAAVERLW DYGMSSSPHV LRNRAQSGSV PQFKKVVFQE FTDGSFTQPL
951 YRGELNEHLG LLGPYIRAEV EDNIMVTFRN QASRPYSFYS SLISYEEDQR
1001 QGAEPRKNFV KPNETKTYFW KVQHHMAPTK DEFDCKAWAY FSDVDLEKDV
1051 HSGLIGPLLV CHTNTLNPAH GRQVTVQEFA LFFTIFDETK SWYFTENMER
1101 NCRAPCNIQM EDPTFKENYR FHAINGYIMD TLPGLVMAQD QRIRWYLLSM
1151 GSNENIHSIH FSGHVFTVRK KEEYKMALYN LYPGVFETVE MLPSKAGIWR
1201 VECLIGEHLH AGMSTLFLVY SNKCQTPLGM ASGHIRDFQI TASGQYGQWA
1251 PKLARLHYSG SINAWSTKEP FSWIKVDLLA PMIIHGIKTQ GARQKFSSLY
1301 ISQFIIMYSL DGKKWQTYRG NSTGTLMVFF GNVDSSGIKH NIFNPPIIAR
1351 YIRLHPTHYS IRSTLRMELM GCDLNSCSMP LGMESKAISD AQITASSYFT
1401 NMFATWSPSK ARLHLQGRSN AWRPQVNNPK EWLQVDFQKT MKVTGVTTQG
1451 VKSLLTSMYV KEFLISSSQD GHQWTLFFQN GKVKVFQGNQ DSFTPVVNSL
1501 DPPLLTRYLR IHPQSWVHQI ALRMEVLGCE AQDLYDKTHT CPPCPAPELL
1551 GGPS VFLFPP KPKDTLMISR TPEVTC VVVD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH
1601 NAKTKPREEQ YNSTYRVVSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT
1651 ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG
1701 QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH
1751 YTQKSLSLSP GK*
- 163 044115
Последовательность белка pSYN FVIII 271 (FVIII Fc с 42 AE-XTEN в аминокислоте 18) SEO ID
NO: 84).
MQIELSTCFF LCLLRFCFSA TRRYYLGAVE LSWDYMQGAP GSPAGSPTST
EEGTSESATP ESGPGSEPAT SGSETPASSS DLGELPVDAR FPPRVPKSFP
101 FNTSVVYKKT LFVEFTDHLF NIAKPRPPWM GLLGPTIQAE VYDTVVITLK
151 NMASHPVSLH AVGVSYWKAS EGAEYDDQTS QREKEDDKVF PGGSHTYVWQ
201 VLKENGPMAS DPLCLTYSYL SHVDLVKDLN SGLIGALLVC REGSLAKEKT
251 QTLHKFILLF AVFDEGKSWH SETKNSLMQD RDAASARAWP KMHTVNGYVN
301 RSLPGLIGCH RKSVYWHVIG MGTTPEVHSI FLEGHTFLVR NHRQASLEIS
351 PITFLTAQTL LMDLGQFLLF CHISSHQHDG MEAYVKVDSC PEEPQLRMKN
401 NEEAEDYDDD LTDSEMDVVR FDDDNSPSFI QIRSVAKKHP KTWVHYIAAE
451 EEDWDYAPLV LAPDDRSYKS QYLNNGPQRI GRKYKKVRFM AYTDETFKTR
501 EAIQHESGIL GPLLYGEVGD TLLIIFKNQA SRPYNIYPHG ITDVRPLYSR
551 RLPKGVKHLK DFPILPGEIF KYKWTVTVED GPTKSDPRCL TRYYSSFVNM
601 ERDLASGLIG PLLICYKESV DQRGNQIMSD KRNVILFSVF DENRSWYLTE
651 NIQRFLPNPA GVQLEDPEFQ ASNIMHSING YVFDSLQLSV CLHEVAYWYI
701 LSIGAQTDFL SVFFSGYTFK HKMVYEDTLT LFPFSGETVF MSMENPGLWI
751 LGCHNSDFRN RGMTALLKVS SCDKNTGDYY EDSYEDISAY LLSKNNAIEP
801 RSFSQNPPVL KRHQAEITRT TLQSDQEEID YDDTISVEMK KEDFDIYDED
851 ENQSPRSFQK KTRHYFIAAV ERLWDYGMSS SPHVLRNRAQ SGSVPQFKKV
901 VFQEFTDGSF TQPLYRGELN EHLGLLGPYI RAEVEDNIMV TFRNQASRPY
951 SFYSSLISYE EDQRQGAEPR KNFVKPNETK TYFWKVQHHM APTKDEFDCK
1001 AWAYFSDVDL EKDVHSGLIG PLLVCHTNTL NPAHGRQVTV QEFALFFTIF
1051 DETKSWYFTE NMERNCRAPC NIQMEDPTFK ENYRFHAING YIMDTLPGLV
1101 MAQDQRIRWY LLSMGSNENI HSIHFSGHVF TVRKKEEYKM ALYNLYPGVF
1151 ETVEMLPSKA GIWRVECLIG EHLHAGMSTL FLVYSNKCQT PLGMASGHIR
1201 DFQITASGQY GQWAPKLARL HYSGSINAWS TKEPFSWIKV DLLAPMIIHG
1251 IKTQGARQKF SSLYISQFII MYSLDGKKWQ TYRGNSTGTL MVFFGNVDSS
1301 GIKHNIFNPP IIARYIRLHP THYSIRSTLR MELMGCDLNS CSMPLGMESK
1351 AISDAQITAS SYFTNMFATW SPSKARLHLQ GRSNAWRPQV NNPKEWLQVD
1401 FQKTMKVTGV TTQGVKSLLT SMYVKEFLIS SSQDGHQWTL FFQNGKVKVF
1451 QGNQDSFTPV VNSLDPPLLT RYLRIHPQSW VHQIALRMEV LGCEAQDLYD
1501 KTHTCPPCPA PELLGGPSVF LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP
1551 EVKFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQYNSTYR VVSVLTVLHQ DWLNGKEYKC
1601 KVSNKALPAP IEKTISKAKG QPREPQVYTL PPSRDELTKN QVSLTCLVKG
1651 FYPSDIAVEW ESNGQPENNY KTTPPVLDSD GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN
1701 VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL SLSPGK*
- 164 044115
Последовательность белка pSYN FVIII 272 (FVIII с 144 AE XTEN в аминокислоте 18 и 244 AE
XTEN в домене В без Fc) SEQ ID NO: 85).
MQIELSTCFF LCLLRFCFSA TRRYYLGAVE LSWDYMQGAP TSESATPESG
PGSEPATSGS ETPGTSESAT PESGPGSEPA TSGSETPGTS ESATPESGPG
101 TSTEPSEGSA PGSPAGSPTS TEEGTSESAT PESGPGSEPA TSGSETPGTS
151 ESATPESGPG SPAGSPTSTE EGSPAGSPTS TEEGASSSDL GELPVDARFP
201 PRVPKSFPFN TSVVYKKTLF VEFTDHLFNI AKPRPPWMGL LGPTIQAEVY
251 DTVVITLKNM ASHPVSLHAV GVSYWKASEG AEYDDQTSQR EKEDDKVFPG
301 GSHTYVWQVL KENGPMASDP LCLTYSYLSH VDLVKDLNSG LIGALLVCRE
351 GSLAKEKTQT LHKFILLFAV FDEGKSWHSE TKNSLMQDRD AASARAWPKM
401 HTVNGYVNRS LPGLIGCHRK SVYWHVIGMG TTPEVHSIFL EGHTFLVRNH
451 RQASLEISPI TFLTAQTLLM DLGQFLLFCH ISSHQHDGME AYVKVDSCPE
501 EPQLRMKNNE EAEDYDDDLT DSEMDVVRFD DDNSPSFIQI RSVAKKHPKT
551 WVHYIAAEEE DWDYAPLVLA PDDRSYKSQY LNNGPQRIGR KYKKVRFMAY
601 TDETFKTREA IQHESGILGP LLYGEVGDTL LIIFKNQASR PYNIYPHGIT
651 DVRPLYSRRL PKGVKHLKDF PILPGEIFKY KWTVTVEDGP TKSDPRCLTR
701 YYSSFVNMER DLASGLIGPL LICYKESVDQ RGNQIMSDKR NVILFSVFDE
751 NRSWYLTENI QRFLPNPAGV QLEDPEFQAS NIMHSINGYV FDSLQLSVCL
801 HEVAYWYILS IGAQTDFLSV FFSGYTFKHK MVYEDTLTLF PFSGETVFMS
851 MENPGLWILG CHNSDFRNRG MTALLKVSSC DKNTGDYYED SYEDISAYLL
901 SKNNAIEPRS FSQNGAPGTS ESATPESGPG SEPATSGSET PGTSESATPE
951 SGPGSEPATS GSETPGTSES ATPESGPGTS TEPSEGSAPG SPAGSPTSTE
1001 EGTSESATPE SGPGSEPATS GSETPGTSES ATPESGPGSP AGSPTSTEEG
1051 SPAGSPTSTE EGTSTEPSEG SAPGTSESAT PESGPGTSES ATPESGPGTS
1101 ESATPESGPG SEPATSGSET PGSEPATSGS ETPGSPAGSP TSTEEGTSTE
1151 PSEGSAPGTS TEPSEGSAPG SEPATSGSET PGTSESATPE SGPGTSTEPS
1201 EGSAPASSPP VLKRHQAEIT RTTLQSDQEE IDYDDTISVE MKKEDFDIYD
1251 EDENQSPRSF QKKTRHYFIA AVERLWDYGM SSSPHVLRNR AQSGSVPQFK
1301 KVVFQEFTDG SFTQPLYRGE LNEHLGLLGP YIRAEVEDNI MVTFRNQASR
1351 PYSFYSSLIS YEEDQRQGAE PRKNFVKPNE TKTYFWKVQH HMAPTKDEFD
1401 CKAWAYFSDV DLEKDVHSGL IGPLLVCHTN TLNPAHGRQV TVQEFALFFT
1451 IFDETKSWYF TENMERNCRA PCNIQMEDPT FKENYRFHAI NGYIMDTLPG
1501 LVMAQDQRIR WYLLSMGSNE NIHSIHFSGH VFTVRKKEEY KMALYNLYPG
1551 VFETVEMLPS KAGIWRVECL IGEHLHAGMS TLFLVYSNKC QTPLGMASGH
1601 IRDFQITASG QYGQWAPKLA RLHYSGSINA WSTKEPFSWI KVDLLAPMII
1651 HGIKTQGARQ KFSSLYISQF IIMYSLDGKK WQTYRGNSTG TLMVFFGNVD
1701 SSGIKHNIFN PPIIARYIRL HPTHYSIRST LRMELMGCDL NSCSMPLGME
1751 SKAISDAQIT ASSYFTNMFA TWSPSKARLH LQGRSNAWRP QVNNPKEWLQ
1801 VDFQKTMKVT GVTTQGVKSL LTSMYVKEFL ISSSQDGHQW TLFFQNGKVK
1851 VFQGNQDSFT PVVNSLDPPL LTRYLRIHPQ SWVHQIALRM EVLGCEAQDL
1901 Y*
Последовательность белка pSYN-FVIII-161 (SEQ ID NO: 69) (1-1457 позиция аминокислотной последовательности FVIII; подчеркнутая область отображает регион Fc; подчеркивание изогнутой линией отображает расщепляемый линкер между первым Fc и фрагментом ФВ; область с двойным подчеркиванием отображает фрагмент ФВ; область жирным шрифтом отображает расщепляемый линкер между фрагментом ФВ и Fc).
- 165 044115
MQIELSTCFF LCLLRFCFSA TRRYYLGAVE LSWDYMQSDL GELPVDARFP
PRVPKSFPFN TSVVYKKTLF VEFTDHLFNIAKPRPPWMGL LGPTIQAEVY
101 DTVVITLKNM ASHPVSLHAV GVSYWKASEG AEYDDQTSQR EKEDDKVFPG
151 GSHTYVWQVL KENGPMASDP LCLTYSYLSH VDLVKDLNSG LIGALLVCRE
201 GSLAKEKTQT LHKFILLFAV FDEGKSWHSE TKNSLMQDRD AASARAWPKM
251 HTVNGYVNRS LPGLIGCHRK SVYWHVIGMG TTPEVHSIFL EGHTFLVRNH
301 RQASLEISPI TFLTAQTLLM DLGQFLLFCH ISSHQHDGME AYVKVDSCPE
351 EPQLRMKNNE EAEDYDDDLT DSEMDVVRFD DDNSPSFIQI RSVAKKHPKT
401 WVHYIAAEEE DWDYAPLVLA PDDRSYKSQY LNNGPQRIGR KYKKVRFMAY
451 TDETFKTREA IQHESGILGP LLYGEVGDTL LIIFKNQASR PYNIYPHGIT
501 DVRPLYSRRL PKGVKHLKDF PILPGEIFKY KWTVTVEDGP TKSDPRCLTR
551 YYSSFVNMER DLASGLIGPL LICYKESVDQ RGNQIMSDKR NVILFSVFDE
601 NRSWYLTENI QRFLPNPAGV QLEDPEFQAS NIMHSINGYV FDSLQLSVCL
- 166 044115
651 HEVAYWYILS IGAQTDFLSV FFSGYTFKHK MVYEDTLTLF PFSGETVFMS
701 MENPGLWILG CHNSDFRNRG MTALLKVSSC DKNTGDYYED SYEDISAYLL
751 SKNNAIEPRS FSQNPPVLKR HQREITRTTL QSDQEEIDYD DTISVEMKKE
801 DFDIYDEDEN QSPRSFQKKT RHYFIAAVER LWDYGMSSSP HVLRNRAQSG
851 SVPQFKKVVF QEFTDGSFTQ PLYRGELNEH LGLLGPYIRA EVEDNIMVTF
901 RNQASRPYSF YSSLISYEED QRQGAEPRKN FVKPNETKTY FWKVQHHMAP
951 TKDEFDCKAW AYFSDVDLEK DVHSGLIGPL LVCHTNTLNP AHGRQVTVQE
1001 FALFFTIFDE TKSWYFTENM ERNCRAPCNI QMEDPTFKEN YRFHAINGYI
1051 MDTLPGLVMA QDQRIRWYLL SMGSNENIHS IHFSGHVFTV RKKEEYKMAL
1101 YNLYPGVFET VEMLPSKAGIWRVECLIGEH LH AGMSTLFL V YSNKCQTPL
1151 GMASGHIRDF QITASGQYGQ WAPKLARLHY SGSINAWSTK EPFSWIKVDL
1201 LAPMIIHGIK TQGARQKFSS LYISQFIIMY SLDGKKWQTY RGNSTGTLMV
1251 FFGNVDSSGI KHNIFNPPII ARYIRLHPTH YSIRSTLRME LMGCDLNSCS
1301 MPLGMESKAI SDAQITASSY FTNMFATWSP SKARLHLQGR SNAWRPQVNN
1351 PKEWLQVDFQ KTMKVTGVTT QGVKSLLTSM YVKEFLISSS QDGHQWTLFF 1401 QNGKVKVFQG NQDSFTPVVN SLDPPLLTRY LRIHPQSWVH QIALRMEVLG 1451 CEAQDLYDKT HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV
1501 VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW
1551 LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SRDELTKNQV
1601 SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD
1651 KSRWOOGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGKRRRRSG GGGSGGGGSG
1701 GGGSGGGGSG GGGSGGGGSR KRRKRSLSCR PPMVKLVCPA DNLRAEGLEC
1751 TKTCONYDLE CMSMGCVSGC LCPPGMVRHE NRCVALERCP CFHOGKEYAP
1801 GETVKIGCNT CVCRDRKWNC TDHVCDATCS TIGMAHYLTF DGLKYLFPGE
1851 COYVLVODYC GSNPGTFRIL VGNKGCSHPS VKCKKRVTIL VEGGEIELFD
1901 GEVNVKRPMK DETHFEVVES GRYIILLLGK ALSVVWDRHL SISVVLKOTY
1951 OEKVCGLCGN FDGIONNDLT SSNLOVEEDP VDFGNSWKVS SOCADTRKVP
2001 LDSSPATCHN NIMKOTMVDS SCR1LTSDVF ODCNKLVDPE PYLDVCIYDT
2051 CSCESIGDCA AFCDTIAAYA HVCAOHGKVV TWRTATLCPO SCEERNLREN
2101 GYEAEWRYNS CAPACOVTCO HPEPLACPVO CVEGCHAHCP PGKILDELLO
2151 TCVDPEDCPV CEVAGRRFAS GKKVTLNPSD PEHCOICHCD VVNLTCEACO
2201 EEISGTSESA TPESGPGSEP ATSGSETPGT SESATPESGP GSEPATSGSE
2251 TPGTSESATP ESGPGTSTEP SEGSAPGSPA GSPTSTEEGT SESATPESGP
2301 GSEPATSGSE TPGTSESATP ESGPGSPAGS PTSTEEGSPA GSPTSTEEGT
2351 STEPSEGSAP GTSESATPES GPGTSESATP ESGPGTSESA TPESGPGSEP
2401 ATSGSETPGS EPATSGSETP GSPAGSPTST EEGTSTEPSE GSAPGTSTEP
2451 SEGSAPGSEP ATSGSETPGT SESATPESGP GTSTEPSEGS APDSGGGGSG
2501 GGGSGGGGSG GGGSGGGGSL VPRGSGGDKT HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF
2551 PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE
2601 EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP 2651 REPQVYTLPP SRDELTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT 2701 TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWOOGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL
SPGK
- 167 044115
Последовательность белка pSYN-FVIII-170 (SEO ID NO: 71).
SLSCRPPMVK LVCPADNLRA EGLECTKTCQ NYDLECMSMG CVSGCLCPPG
MVRHENRCVA LERCPCFHQG KEYAPGETVK IGCNTCVCRD RKWNCTDHVC 101 DATCSTIGMA HYLTFDGLKY LFPGECQYVL VQDYCGSNPG TFRILVGNKG 151 CSHPSVKCKK RVTILVEGGE IELFDGEVNV KRPMKDETHF EVVESGRYII
201 LLLGKALSVV WDRHLSISVV LKQTYQEKVC GLCGNFDGIQ NNDLTSSNLQ 251 VEEDPVDFGN SWKVSSQCAD TRKVPLDSSP ATCHNNIMKQ TMVDSSCRIL 301 TSDVFQDCNK LVDPEPYLDV CIYDTCSCES IGDCAAFCDT IAAYAHVCAQ 351 HGKVVTWRTA TLCPQSCEER NLRENGYEAE WRYNSCAPAC QVTCQHPEPL 401 ACPVQCVEGC HAHCPPGKIL DELLQTCVDP EDCPVCEVAG RRFASGKKVT 451 LNPSDPEHCQ ICHCDVVNLT CEACQEPISG TSESATPESG PGSEPATSGS
501 ETPGTSESAT PESGPGSEPA TSGSETPGTS ESATPESGPG TSTEPSEGSA
551 PGSPAGSPTS TEEGTSESAT PESGPGSEPA TSGSETPGTS ESATPESGPG
601 SPAGSPTSTE EGSPAGSPTS TEEGTSTEPS EGSAPGTSES ATPESGPGTS
651 ESATPESGPG TSESATPESG PGSEPATSGS ETPGSEPATS GSETPGSPAG
701 SPTSTEEGTS TEPSEGSAPG TSTEPSEGSA PGSEPATSGS ETPGTSESAT
751 PESGPGTSTE PSEGSAPDSG GGGSGGGGSG GGGSGGGGSG GGGSLVPRGS
801 GGASATRRYY LGAVELSWDY MQSDLGELPV DARFPPRVPK SFPFNTSVVY 851 KKTLFVEFTD HLFNIAKPRP PWMGLLGPTI QAEVYDTVVI TLKNMASHPV 901 SLHAVGVSYW KASEGAEYDD QTSQREKEDD KVFPGGSHTY VWQVLKENGP 951 MASDPLCLTY SYLSHVDLVK DLNSGLIGAL LVCREGSLAK EKTQTLHKFI 1001 LLFAVFDEGK SWHSETKNSL MQDRDAASAR AWPKMHTVNG YVNRSLPGLI 1051 GCHRKSVYWH VIGMGTTPEV HSIFLEGHTF LVRNHRQASL EISPITFLTA 1101 QTLLMDLGQF LLFCHISSHQ HDGMEAYVKV DSCPEEPQLR MKNNEEAEDY 1151 DDDLTDSEMD VVRFDDDNSP SFIQIRSVAK KHPKTWVHYI AAEEEDWDYA 1201 PLVLAPDDRS YKSQYLNNGP QRIGRKYKKV RFMAYTDETF KTREAIQHES 1251 GILGPLLYGE VGDTLLIIFK NQASRPYNIY PHGITDVRPL YSRRLPKGVK 1301 HLKDFPILPG EIFKYKWTVT VEDGPTKSDP RCLTRYYSSF VNMERDLASG
1351 LIGPLLICYK ESVDQRGNQI MSDKRNVILF SVFDENRSWY LTENIQRFLP
1401 NPAGVQLEDP EFQASNIMHS INGYVFDSLQ LSVCLHEVAY WYILSIGAQT 1451 DFLSVFFSGY TFKHKMVYED TLTLFPFSGE TVFMSMENPG LWILGCHNSD
- 168 044115
1501 FRNRGMTALL KVSSCDKNTG DYYEDSYEDI SAYLLSKNNA IEPRSFSQNP
1551 PVLKRHQREITRTTLQSDQE EIDYDDTISV EMKKEDFDIY DEDENQSPRS
1601 FQKKTRHYFIAAVERLWDYG MSSSPHVLRN RAQSGSVPQF KKVVFQEFTD
1651 GSFTQPLYRG ELNEHLGLLG PYIRAEVEDN IMVTFRNQAS RPYSFYSSLI
1701 SYEEDQRQGA EPRKNFVKPN ETKTYFWKVQ HHMAPTKDEF DCKAWAYFSD
1751 VDLEKDVHSG LIGPLLVCHT NTLNPAHGRQ VTVQEFALFF TIFDETKSWY
1801 FTENMERNCR APCNIQMEDP TFKENYRFHA INGYIMDTLP GLVMAQDQRI
1851 RWYLLSMGSN ENIHSIHFSG HVFTVRKKEE YKMALYNLYP GVFETVEMLP
1901 SKAGIWRVEC LIGEHLHAGM STLFLVYSNK CQTPLGMASG HIRDFQITAS
1951 GQYGQWAPKL ARLHYSGSIN AWSTKEPFSW IKVDLLAPMIIHGIKTQGAR
2001 QKFSSLYISQ FIIMYSLDGK KWQTYRGNST GTLMVFFGNV DSSGIKHNIF
2051 NPPIIARYIR LHPTHYSIRS TLRMELMGCD LNSCSMPLGM ESKAISDAQI
2101 TASSYFTNMF ATWSPSKARL HLQGRSNAWR PQVNNPKEWL QVDFQKTMKV
2151 TGVTTQGVKS LLTSMYVKEF LISSSQDGHQ WTLFFQNGKV KVFQGNQDSF
2201 TPVVNSLDPP LLTRYLRIHP QSWVHQIALR MEVLGCEAQD LY
Нуклеотидная последовательность pSYN FVIII 310 (кодирующая FVIII с полной делецией домена В, за исключением 2 аминокислотных остатков и 288 AE-XTEN, вставленного после 742 а.к.) (SEO ID NO: 170).
ATGCAAATAG AGCTCTCCAC CTGCTTCTTT CTGTGCCTTT TGCGATTCTG
CTTTAGTGCC ACCAGAAGAT ACTACCTGGG TGCAGTGGAA CTGTCATGGG
101 ACTATATGCA AAGTGATCTC GGTGAGCTGC CTGTGGACGC AAGATTTCCT
151 CCTAGAGTGC СAAAATCTTT TCCATTCAAC ACCTCAGTCG TGTACAAAAA
201 GACTCTGTTT GT AGA ATTC A CGGATC ACCT ТТТС A AC АТС GCT A AGCC A A
251 GGCCACCCTG GATGGGTCTG CTAGGTCCTA CCATCCAGGC TGAGGTTTAT
301 GAT AC AGTGG TC ATT AC ACT T AAGAACATG GCTTCCC АТС CTGTCAGTCT
351 TCATGCTGTT GGTGTATCCT ACTGGAAAGC TTCTGAGGGA GCTGAATATG
401 ATGATC AGAC C AGTCA A AGG GAGA A AGA AG ATGAT A A AGT CTTCCCTGGT
451 GGAAGCCATA CATATGTCTG GCAGGTCCTG AAAGAGAATG GTCCAATGGC
501 CTCTGACCCA CTGTGCCTTA CCTACTCATA TCTTTCTCAT GTGGACCTGG
551 TAAAAGACTT GAATTCAGGC CTCATTGGAG CCCTACTAGT ATGTAGAGAA
601 GGGAGTCTGG CCA AGGAA A A GAC AC AGACC TTGC AC A A AT TT AT ACT ACT
651 TTTTGCTGTA TTTGATGAAG GGAAAAGTTG GCACTCAGAA ACAAAGAACT
701 CCTTGATGCA GGATAGGGAT GCTGCATCTG CTCGGGCCTG GCCTAAAATG
751 CACACAGTCA ATGGTTATGT AAACAGGTCT CTGCCAGGTC TGATTGGATG
801 CCACAGGAAA TCAGTCTATT GGCATGTGAT TGGAATGGGC ACCACTCCTG
851 AAGTGCACTC AATATTCCTC GAAGGTCACA CATTTCTTGT GAGGAACCAT
- 169 044115
901 CGCC AGGCGT CCTTGGA A AT CTCGCC A AT A ACTTTCCTT A CTGCTC A A AC
951 ACTCTTGATG GACCTTGGAC AGTTTCTACT GTTTTGTCAT ATCTCTTCCC 1001 ACCAACATGA TGGCATGGAA GCTTATGTCA AAGTAGACAG CTGTCCAGAG 1051 GAACCCCAAC TACGAATGAA AAATAATGAA GAAGCGGAAG ACTATGATGA 1101 TGATCTT ACT GATTCTGA A A TGGATGTGGT C AGGTTTGAT GATGAC A ACT 1151 CTCCTTCCTT TATCC AAATT CGCTC AGTTG CCAAGAAGCA TCCT AAA ACT 1201 TGGGT AC ATT AC ATTGCTGC TGA AGAGGAG G ACTGGGACT ATGCTCCCTT 1251 AGTCCTCGCC CCCGATGACA GAAGTTATAA AAGTCAATAT TTGAACAATG 1301 GCCCTCAGCG GATTGGTAGG AAGTACAAAA AAGTCCGATT TATGGCATAC 1351 AC AGATGA AA CCTTT AAGAC TCGTGA AGCT ATTC AGC ATG А АТС AGGA AT 1401 CTTGGGACCT TT ACTTT ATG GGGA AGTTGG AGAC AC ACTG TTGATT AT AT 1451 TTAAGAATCA AGCAAGCAGA CCATATAACA TCTACCCTCA CGGAATCACT 1501 GATGTCCGTC CTTTGTATTC AAGGAGATTA CCAAAAGGTG TAAAACATTT 1551 GA AGGATTTT CC A ATTCTGC C AGGAGA A AT ATTC A A AT AT A A ATGGAC AG 1601 TGACTGTAGA AGATGGGCCA ACTAAATCAG ATCCTCGGTG CCTGACCCGC 1651 TATTACTCTA GTTTCGTTAA TATGGAGAGA GATCTAGCTT CAGGACTCAT 1701 TGGCCCTCTC CTCATCTGCT ACAAAGAATC TGTAGATCAA AGAGGAAACC 1751 AGATAATGTC AGACAAGAGG AATGTCATCC TGTTTTCTGT ATTTGATGAG 1801 AACCGAAGCT GGTACCTCAC AGAGAATATA CAACGCTTTC TCCCCAATCC 1851 AGCTGG AGTG C AGCTTGAGG ATCC AGAGTT CC A AGCCTCC A AC АТС ATGC 1901 ACAGCATCAA TGGCTATGTT TTTGATAGTT TGCAGTTGTC AGTTTGTTTG 1951 CATGAGGTGG CATACTGGTA CATTCTAAGC ATTGGAGCAC AGACTGACTT 2001 CCTTTCTGTC TTCTTCTCTG GAT AT ACCTT C A A AC AC A A A ATGGTCT ATG 2051 AAGACACACT CACCCTATTC CCATTCTCAG GAGAAACTGT CTTCATGTCG 2101 ATGGA A A ACC C AGGTCT ATG GATTCTGGGG TGCC AC A ACT C AGACTTTCG 2151 GA AC AGAGGC ATGACCGCCT T ACTGA AGGT TTCT AGTTGT GAC A AG A AC A 2201 CTGGTGATTA TTACGAGGAC AGTTATGAAG ATATTTCAGC ATACTTGCTG 2251 AGTAAAAACA ATGCCATTGA ACCAAGAAGC TTCGGTACCT CAGAGTCTGC 2301 TACCCCCGAG TCAGGGCCAG GATCAGAGCC AGCCACCTCC GGGTCTGAGA 2351 CACCCGGGAC TTCCGAGAGT GCCACCCCTG AGTCCGGACC CGGGTCCGAG 2401 CCCGCCACTT CCGGCTCCGA AACTCCCGGC ACAAGCGAGA GCGCTACCCC 2451 AGAGTCAGGA CCAGGAACAT CTACAGAGCC CTCTGAAGGC TCCGCTCCAG 2501 GGTCCCCAGC CGGCAGTCCC ACTAGCACCG AGGAGGGAAC CTCTGAAAGC 2551 GCC AC ACCCG AATC AGGGCC AGGGTCTGAG CCTGCT ACC A GCGGC AGCGA 2601 GACACCAGGC ACCTCTGAGT CCGCCACACC AGAGTCCGGA CCCGGATCTC 2651 CCGCTGGGAG CCCCACCTCC ACTGAGGAGG GATCTCCTGC TGGCTCTCCA 2701 ACATCTACTG AGGAAGGTAC CTCAACCGAG CCATCCGAGG GATCAGCTCC 2751 CGGCACCTCA GAGTCGGCAA CCCCGGAGTC TGGACCCGGA ACTTCCGAAA
- 170 044115
2801 GTGCCACACC AGAGTCCGGT CCCGGGACTT CAGAATCAGC AACACCCGAG 2851 TCCGGCCCTG GGTCTGAACC CGCCACAAGT GGTAGTGAGA CACCAGGATC 2901 AGAACCTGCT ACCTC AGGGT C AG AG AC ACC CGGATCTCCG GC AGGCTCAC 2951 CAACCTCCAC TGAGGAGGGC ACCAGCACAG AACCAAGCGA GGGCTCCGCA 3001 CCCGGAACAA GCACTGAACC CAGTGAGGGT TCAGCACCCG GCTCTGAGCC 3051 GGCCACAAGT GGCAGTGAGA CACCCGGCAC TTCAGAGAGT GCCACCCCCG 3101 AGAGTGGCCC AGGCACTAGT ACCGAGCCCT CTGAAGGCAG TGCGCCAGCC 3151 TCGAGCGAAA TAACTCGTAC TACTCTTCAG TCAGATCAAG AGGAAATCGA 3201 TTATGATGAT ACC AT АТС AG TTGAAATGAA GAAGGAAGAT TTTGACATTT 3251 ATGATGAGGA TGAAAATCAG AGCCCCCGCA GCTTTCAAAA GAAAACACGA 3301 CACTATTTTA TTGCTGCAGT GGAGAGGCTC TGGGATTATG GGATGAGTAG 3351 CTCCCCACAT GTTCTAAGAA ACAGGGCTCA GAGTGGCAGT GTCCCTCAGT 3401 TCAAGAAAGT TGTTTTCCAG GAATTTACTG ATGGCTCCTT TACTCAGCCC 3451 TTATACCGTG GAGAACTAAA TGAACATTTG GGACTCCTGG GGCCATATAT 3501 AAGAGCAGAA GTTGAAGATA ATATCATGGT AACTTTCAGA AATCAGGCCT 3551 CTCGTCCCTA TTCCTTCTAT TCTAGCCTTA TTTCTTATGA GGAAGATCAG
3601 AGGCAAGGAG CAGAACCTAG AAAAAACTTT GTCAAGCCTA ATGAAACCAA 3651 AACTTACTTT TGGAAAGTGC AACATCATAT GGCACCCACT AAAGATGAGT 3701 TTGACTGCAA AGCCTGGGCT TATTTCTCTG ATGTTGACCT GGAAAAAGAT 3751 GTGCACTCAG GCCTGATTGG ACCCCTTCTG GTCTGCCACA CTAACACACT 3801 GAACCCTGCT CATGGGAGAC AAGTGACAGT ACAGGAATTT GCTCTGTTTT 3851 TC ACC ATCTT TGATGAGACC A A AAGCTGGT ACTTC ACTGA A A AT ATGGA A 3901 AGAAACTGCA GGGCTCCCTG СAATATCCAG ATGGAAGATC CCACTTTTAA 3951 AGAGAATTAT CGCTTCCATG CAATCAATGG CTACATAATG GAT AC ACT AC 4001 CTGGCTT AGT A ATGGCTC AG GATC A A AGGA TTCGATGGT A TCTGCTC AGC 4051 ATGGGCAGCA ATGAAAACAT CCATTCTATT CATTTCAGTG GACATGTGTT 4101 C ACTGT ACGA AA AA AAGAGG AGT AT A A A AT GGC ACTGT AC A ATCTCT АТС 4151 C AGGTGTTTT TGAGAC AGTG GA A ATGTT AC CATCC A A AGC TGGA ATTTGG 4201 CGGGTGGA AT GCCTT ATTGG CGAGC ATCT A C ATGCTGGGA TGAGC AC ACT 4251 TTTTCTGGTG TACAGCAATA AGTGTCAGAC TCCCCTGGGA ATGGCTTCTG 4301 GACACATTAG AGATTTTCAG ATTACAGCTT CAGGACAATA TGGACAGTGG 4351 GCCCCAAAGC TGGCCAGACT TCATTATTCC GGATCAATCA ATGCCTGGAG 4401 САССА AGG AG CCCTTTTCTT GGATC A AGGT GGATCTGTTG GC ACC A ATGA 4451 TTATTCACGG CATCAAGACC CAGGGTGCCC GTCAGAAGTT CTCCAGCCTC 4501 TACATCTCTC AGTTTATCAT CATGTATAGT CTTGATGGGA AGAAGTGGCA 4551 GACTTATCGA GGAAATTCCA CTGGAACCTT AATGGTCTTC TTTGGCAATG 4601 TGGATTC АТС TGGGATAAAA С АСА ATATTT TTAACCCTCC AATT ATTGCT 4651 CGATACATCC GTTTGCACCC AACTCATTAT AGCATTCGCA GCACTCTTCG
- 171 044115
4701 CATGGAGTTG ATGGGCTGTG ATTTAAATAG TTGCAGCATG CCATTGGGAA
4751 TGGAGAGTAA AGCAATATCA GATGCACAGA TTACTGCTTC ATCCTACTTT
4801 ACCAATATGT TTGCCACCTG GTCTCCTTCA AAAGCTCGAC TTCACCTCCA
4851 AGGGAGGAGT AATGCCTGGA GACCTCAGGT GAATAATCCA AAAGAGTGGC
4901 TGCAAGTGGA CTTCCAGAAG ACAATGAAAG TCACAGGAGT AACTACTCAG
4951 GGAGTAAAAT CTCTGCTTAC CAGCATGTAT GTGAAGGAGT TCCTCATCTC
5001 CAGCAGTCAA GATGGCCАТС AGTGGACTCT CTTTTTTCAG AATGGCAAAG
5051 TAAAGGTTTT TCAGGGAAAT CAAGACTCCT TCACACCTGT GGTGAACTCT
5101 CTAGACCCAC CGTTACTGAC TCGCTACCTT CGAATTCACC CCCAGAGTTG
5151 GGTGCACCAG ATTGCCCTGA GGATGGAGGT TCTGGGCTGC GAGGCACAGG
5201 ACCTCTACGA СAAAACTCAC ACATGCCCAC CGTGCCCAGC TCCAGAACTC
5251 CTGGGCGGAC CGTCAGTCTT CCTCTTCCCC CCAAAACCCA AGGACACCCT
5301 CATGATCTCC CGGACCCCTG AGGTCACATG CGTGGTGGTG GACGTGAGCC
5351 ACGAAGACCC TGAGGTCAAG TTCAACTGGT ACGTGGACGG CGTGGAGGTG
5401 CATAATGCCA AGACAAAGCC GCGGGAGGAG CAGTACAACA GCACGTACCG
5451 TGTGGTCAGC GTCCTCACCG TCCTGCACCA GGACTGGCTG AATGGCAAGG
5501 AGTACAAGTG CAAGGTCTCC AACAAAGCCC TCCCAGCCCC CATCGAGAAA
5551 ACCATCTCCA AAGCCAAAGG GCAGCCCCGA GAACCACAGG TGTACACCCT
5601 GCCCCCATCC CGGGATGAGC TGACCAAGAA CCAGGTCAGC CTGACCTGCC
5651 TGGTCAAAGG CTTCTATCCC AGCGACATCG CCGTGGAGTG GGAGAGCAAT
5701 GGGCAGCCGG AGAACAACTA CAAGACCACG CCTCCCGTGT TGGACTCCGA
5751 CGGCTCCTTC TTCCTCTACA GCAAGCTCAC CGTGGACAAG AGCAGGTGGC
5801 AGCAGGGGAA CGTCTTCTCA TGCTCCGTGA TGCATGAGGC TCTGCACAAC
5851 C ACT AC ACGC AGA AGAGCCT CTCCCTGTCT CCGGGT A A AT GA
Последовательность белка pSYN FVIII 310 (FVIII с полной делецией домена В, за исключением 2 аминокислотных остатков и 288 AE-XTEN, вставленного после 742 а.к.) (SEQ ID NO: 171).
ATRRYYLGAV ELSWDYMQSD LGELPVDARF PPRVPKSFPF NTSVVYKKTL
FVEFTDHLFN IAKPRPPWMG LLGPTIQAEV YDTVVITLKN MASHPVSLHA
101 VGVSYWKASE GAEYDDQTSQ REKEDDKVFP GGSHTYVWQV LKENGPMASD
151 PLCLTYSYLS HVDLVKDLNS GLIGALLVCR EGSLAKEKTQ TLHKFILLFA
201 VFDEGKSWHS ETKNSLMQDR DAASARAWPK MHTVNGYVNR SLPGLIGCHR
251 KSVYWHVIGM GTTPEVHSIF LEGHTFLVRN HRQASLEISP ITFLTAQTLL
301 MDLGQFLLFC HISSHQHDGM EAYVKVDSCP EEPQLRMKNN EEAEDYDDDL
351 TDSEMDVVRF DDDNSPSFIQ IRSVAKKHPK TWVHYIAAEE EDWDYAPLVL
- 172 044115
401 APDDRSYKSQ YLNNGPQRIG RKYKKVRFMA YTDETFKTRE AIQHESGILG
451 PLLYGEVGDT LLIIFKNQAS RPYNIYPHGI TDVRPLYSRR LPKGVKHLKD
501 FPILPGEIFK YKWTVTVEDG PTKSDPRCLT RYYSSFVNME RDLASGLIGP 551 LLICYKESVD QRGNQIMSDK RNVILFSVFD ENRSWYLTEN IQRFLPNPAG 601 VQLEDPEFQA SNIMHSINGY VFDSLQLSVC LHEVAYWYIL SIGAQTDFLS 651 VFFSGYTFKH KMVYEDTLTL FPFSGETVFM SMENPGLWIL GCHNSDFRNR 701 GMTALLKVSS CDKNTGDYYE DSYED1SAYL LSKNNA1EPR SFGTSESATP 751 ESGPGSEPAT SGSETPGTSE SATPESGPGS EPATSGSETP GTSESATPES
801 GPGTSTEPSE GSAPGSPAGS PTSTEEGTSE SATPESGPGS EPATSGSETP
851 GTSESATPES GPGSPAGSPT STEEGSPAGS PTSTEEGTST EPSEGSAPGT 901 SESATPESGP GTSESATPES GPGTSESATP ESGPGSEPAT SGSETPGSEP 951 ATSGSETPGS PAGSPTSTEE GTSTEPSEGS APGTSTEPSE GSAPGSEPAT
1001 SGSETPGTSE SATPESGPGT STEPSEGSAP ASSEITRTTL QSDQEEIDYD
1051 DTISVEMKKE DFDIYDEDEN QSPRSFQKKT RHYFIAAVER LWDYGMSSSP 1101 HVLRNRAQSG SVPQFKKVVF QEFTDGSFTQ PLYRGELNEH LGLLGPYIRA 1151 EVEDNIMVTF RNQASRPYSF YSSLISYEED QRQGAEPRKN FVKPNETKTY
1201 FWKVQHHMAP TKDEFDCKAW AYFSDVDLEK DVHSGLIGPL LVCHTNTLNP
1251 AHGRQVTVQE FALFFTIFDE TKSWYFTENM ERNCRAPCNI QMEDPTFKEN
1301 YRFHAINGYI MDTLPGLVMA QDQRIRWYLL SMGSNENIHS IHFSGHVFTV 1351 RKKEEYKMAL YNLYPGVFET VEMLPSKAGIWRVECLIGEH LHAGMSTLFL 1401 VYSNKCQTPL GMASGHIRDF QITASGQYGQ WAPKLARLHY SGSINAWSTK
1451 EPFSWIKVDL LAPMIIHGIK TQGARQKFSS LYISQFIIMY SLDGKKWQTY 1501 RGNSTGTLMV FFGNVDSSGI KHNIFNPPII ARYIRLHPTH YSIRSTLRME
1551 LMGCDLNSCS MPLGMESKAI SDAQITASSY FTNMFATWSP SKARLHLQGR 1601 SNAWRPQVNN PKEWLQVDFQ KTMKVTGVTT QGVKSLLTSM YVKEFLISSS 1651 QDGHQWTLFF QNGKVKVFQG NQDSFTPVVN SLDPPLLTRY LRIHPQSWVH 1701 QIALRMEVLG CEAQDLYDKT HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI
1751 SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV 1801 SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP
1851 SRDELTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS 1901 FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK*
- 173 044115
Нуклеотидная последовательность pSYN FVIII 312 (кодирующая FVIII с полной делецией домена
В, за исключением 5 аминокислотных остатков и 288 AE-XTEN, вставленного после а.к. 745- В5 версия) (SEQ ID NO: 172).
ATGCAAATAG AGCTCTCCAC CTGCTTCTTT CTGTGCCTTT TGCGATTCTG
CTTTAGTGCC ACCAGAAGAT ACTACCTGGG TGCAGTGGAA CTGTCATGGG
101 ACTATATGCA AAGTGATCTC GGTGAGCTGC CTGTGGACGC AAGATTTCCT
151 CCT AGAGTGC С A AAATCTTT TCC ATTCA AC ACCTC AGTCG TGTAC A AAA A
201 GACTCTGTTT GT AGA ATTCA CGGATC ACCT TTTC A AC ATC GCT A AGCC A A
251 GGCCACCCTG GATGGGTCTG CTAGGTCCTA CCATCCAGGC TGAGGTTTAT
301 GAT AC AGTGG TC ATT AC ACT T AAG A AC ATG GCTTCCCATC CTGTCAGTCT
351 TCATGCTGTT GGTGTATCCT ACTGGAAAGC TTCTGAGGGA GCTGAATATG
401 ATGATC AGAC C AGTC A A AGG GAGA A AGA AG ATGAT A A AGT CTTCCCTGGT
451 GGAAGCCATA CATATGTCTG GCAGGTCCTG AAAGAGAATG GTCCAATGGC
501 CTCTGACCCA CTGTGCCTTA CCTACTCATA TCTTTCTCAT GTGGACCTGG
551 TAAAAGACTT GAATTCAGGC CTCATTGGAG CCCTACTAGT ATGTAGAGAA
601 GGGAGTCTGG CCAAGGAAAA GAC AC AG ACC TTGCACAAAT TT AT ACT ACT
651 TTTTGCTGTA TTTGATGAAG GGAAAAGTTG GCACTCAGAA ACAAAGAACT
701 CCTTGATGC A GGAT AGGGAT GCTGC ATCTG CTCGGGCCTG GCCT A A A ATG
751 СACACAGTCA ATGGTTATGT AAACAGGTCT CTGCCAGGTC TGATTGGATG
801 CCACAGGAAA TCAGTCTATT GGCATGTGAT TGGAATGGGC ACCACTCCTG
851 AAGTGCACTC AATATTCCTC GAAGGTCACA CATTTCTTGT GAGGAACCAT
901 CGCC AGGCGT CCTTGGA A AT CTCGCC A AT A ACTTTCCTT A CTGCTC A A AC
951 ACTCTTGATG GACCTTGGAC AGTTTCTACT GTTTTGTCAT ATCTCTTCCC
1001 ACC AAC ATG A TGGC ATGG A A GCTT ATGTC A A AGT AGAC AG CTGTCC AGAG
1051 GAACCCC AAC T ACGA ATG AA A A ATA ATGAA GAAGCGGAAG ACTATGATGA
1101 TG ATCTT ACT G ATTCTGA A A TGGATGTGGT C AGGTTTGAT GATGAC A ACT
1151 CTCCTTCCTT TATCC AA ATT CGCTC AGTTG CCA AGAAGC A TCCT AAA ACT
1201 TGGGT AC ATT AC ATTGCTGC TGA AGAGG AG G ACTGGGACT ATGCTCCCTT
1251 AGTCCTCGCC CCCGATGACA GAAGTT ATA A AAGTCAAT AT TTGAAC AATG
1301 GCCCTCAGCG GATTGGTAGG AAGTACAAAA AAGTCCGATT TATGGCATAC
1351 ACAGATGAAA CCTTTAAGAC TCGTGAAGCT ATTCAGCATG AATCAGGAAT
1401 CTTGGGACCT TT ACTTT ATG GGGA AGTTGG AGAC AC ACTG TTGATT AT AT
1451 TT A AGA ATCA AGCAAGC AGA CC AT AT A AC А ТСТ ACCCTC A CGGA ATC ACT
1501 GATGTCCGTC CTTTGTATTC AAGGAGATTA CCAAAAGGTG TAAAACATTT
1551 GA AGGATTTT CC A ATTCTGC C AGGAG A A AT ATTC A A AT AT A A ATGGAC AG
1601 TGACTGTAGA AGATGGGCCA ACTAAATCAG ATCCTCGGTG CCTGACCCGC
1651 TATTACTCTA GTTTCGTTAA TATGGAGAGA GATCTAGCTT CAGGACTCAT
1701 TGGCCCTCTC CTCATCTGCT ACAAAGAATC TGTAGATCAA AGAGGAAACC
1751 AGATAATGTC AGACAAGAGG AATGTCATCC TGTTTTCTGT ATTTGATGAG
1801 AACCGAAGCT GGTACCTCAC AGAGAATATA CAACGCTTTC TCCCCAATCC
1851 AGCTGG AGTG C AGCTTGAGG ATCC AG AGTT CC A AGCCTCC A AC ATC ATGC
1901 AC AGC ATC A A TGGCTATGTT TTTGATAGTT TGCAGTTGTC AGTTTGTTTG
- 174 044115
1951 CATGAGGTGG CATACTGGTA CATTCTAAGC ATTGGAGCAC AGACTGACTT 2001 CCTTTCTGTC TTCTTCTCTG GAT AT ACCTT C A A AC AC A A A ATGGTCT ATG 2051 AAGACACACT CACCCTATTC CCATTCTCAG GAGAAACTGT CTTCATGTCG 2101 ATGGAAAACC CAGGTCTATG GATTCTGGGG TGCCACAACT CAGACTTTCG 2151 GA AC AGAGGC ATGACCGCCT T ACTGA AGGT TTCT AGTTGT GAC A AG A AC A 2201 CTGGTGATTA TTACGAGGAC AGTTATGAAG ATATTTCAGC ATACTTGCTG 2251 AGTAAAAACA ATGCCATTGA ACCAAGAAGC TTCTCTCAAA ACGGTACCTC 2301 AGAGTCTGCT ACCCCCGAGT CAGGGCCAGG ATCAGAGCCA GCCACCTCCG 2351 GGTCTGAGAC ACCCGGGACT TCCGAGAGTG CCACCCCTGA GTCCGGACCC 2401 GGGTCCGAGC CCGCCACTTC CGGCTCCGAA ACTCCCGGCA CAAGCGAGAG 2451 CGCTACCCCA GAGTCAGGAC CAGGAACATC TACAGAGCCC TCTGAAGGCT 2501 CCGCTCCAGG GTCCCCAGCC GGCAGTCCCA CTAGCACCGA GGAGGGAACC 2551 TCTGA AAGCG CC AC ACCCGA АТС AGGGCC A GGGTCTGAGC CTGCT ACC AG 2601 CGGCAGCGAG ACACC AGGC A CCTCTGAGTC CGCCAC ACC A GAGTCCGGAC 2651 CCGGATCTCC CGCTGGGAGC CCCACCTCCA CTGAGGAGGG ATCTCCTGCT 2701 GGCTCTCCAA CATCTACTGA GGAAGGTACC TCAACCGAGC CATCCGAGGG 2751 ATCAGCTCCC GGCACCTCAG AGTCGGCAAC CCCGGAGTCT GGACCCGGAA 2801 CTTCCGAAAG TGCCACACCA GAGTCCGGTC CCGGGACTTC AGAATCAGCA 2851 ACACCCGAGT CCGGCCCTGG GTCTGAACCC GCCACAAGTG GTAGTGAGAC 2901 ACCAGGATCA GAACCTGCTA CCTCAGGGTC AGAGACACCC GGATCTCCGG 2951 CAGGCTCACC AACCTCCACT GAGGAGGGCA CCAGCACAGA ACCAAGCGAG 3001 GGCTCCGCAC CCGGAACAAG CACTGAACCC AGTGAGGGTT CAGCACCCGG 3051 CTCTGAGCCG GCCACAAGTG GCAGTGAGAC ACCCGGCACT TCAGAGAGTG 3101 CCACCCCCGA GAGTGGCCCA GGCACTAGTA CCGAGCCCTC TGAAGGCAGT 3151 GCGCCAGCCT CGAGCGAAAT AACTCGTACT ACTCTTCAGT CAGATCAAGA 3201 GGAAATCGAT TATGATGATA CCATATCAGT TGAAATGAAG AAGGAAGATT 3251 TTGACATTTA TGATGAGGAT GAAAATCAGA GCCCCCGCAG CTTTCAAAAG 3301 AAAACACGAC ACTATTTTAT TGCTGCAGTG GAGAGGCTCT GGGATTATGG 3351 GATGAGTAGC TCCCCACATG TTCTAAGAAA CAGGGCTCAG AGTGGCAGTG 3401 TCCCTCAGTT CAAGAAAGTT GTTTTCCAGG AATTTACTGA TGGCTCCTTT 3451 ACTCAGCCCT TATACCGTGG AGAACTAAAT GAACATTTGG GACTCCTGGG 3501 GCCATATATA AGAGCAGAAG TTGAAGATAA TATCATGGTA ACTTTCAGAA 3551 ATCAGGCCTC TCGTCCCTAT TCCTTCTATT CTAGCCTTAT TTCTTATGAG
3601 GAAGATCAGA GGCAAGGAGC AGAACCTAGA AAAAACTTTG TCAAGCCTAA 3651 TGAAACCAAA ACTTACTTTT GGAAAGTGCA AC АТС AT ATG GCACCCACTA 3701 AAGATGAGTT TGACTGCAAA GCCTGGGCTT ATTTCTCTGA TGTTGACCTG 3751 GAAAAAGATG TGCACTCAGG CCTGATTGGA CCCCTTCTGG TCTGCCACAC 3801 TAACACACTG AACCCTGCTC ATGGGAGACA AGTGACAGTA CAGGAATTTG
- 175 044115
3851 CTCTGTTTTT CACCATCTTT GATGAGACCA AAAGCTGGTA CTTCACTGAA 3901 AATATGGAAA GAAACTGCAG GGCTCCCTGC AATATCCAGA TGGAAGATCC 3951 CACTTTTAAA GAGAATTATC GCTTCCATGC AATCAATGGC TACATAATGG 4001 AT AC ACT ACC TGGCTTAGT A ATGGCTC AGG АТС A AAGG AT TCGATGGT AT 4051 CTGCTCAGCA TGGGCAGCAA TGAAAACATC CATTCTATTC ATTTCAGTGG 4101 AC ATGTGTTC ACTGT ACGA A A A A A AGAGGA GT AT A A A ATG GC ACTGT AC A 4151 ATCTCT ATCC AGGTGTTTTT GAGAC AGTGG A A ATGTT ACC ATCC A A AGCT 4201 GGAATTTGGC GGGTGGAATG CCTTATTGGC GAGCATCTAC ATGCTGGGAT 4251 GAGCACACTT TTTCTGGTGT ACAGCAATAA GTGTCAGACT CCCCTGGGAA 4301 TGGCTTCTGG ACACATTAGA GATTTTCAGA TTACAGCTTC AGGACAATAT 4351 GGAC AGTGGG CCCC A A AGCT GGCC AGACTT C ATT ATTCCG GATC А АТС A A 4401 TGCCTGGAGC ACC A AGG AGC CCTTTTCTTG GATC A AGGTG GATCTGTTGG 4451 CACCAATGAT TATTCACGGC ATCAAGACCC AGGGTGCCCG TCAGAAGTTC 4501 TCCAGCCTCT ACATCTCTCA GTTTATCATC ATGTATAGTC TTGATGGGAA 4551 GA AGTGGC AG ACTT ATCGAG GA A ATTCC AC TGGA ACCTT A ATGGTCTTCT 4601 TTGGCAATGT GGATTCATCT GGGATААААС ACAATATTTT TAACCCTCCA 4651 ATTATTGCTC GATACATCCG TTTGCACCCA ACTCATTATA GCATTCGCAG 4701 CACTCTTCGC ATGGAGTTGA TGGGCTGTGA TTTAAATAGT TGCAGCATGC 4751 CATTGGGAAT GGAGAGTAAA GCAATATCAG ATGCACAGAT TACTGCTTCA 4801 TCCTACTTTA CCAATATGTT TGCCACCTGG TCTCCTTCAA AAGCTCGACT 4851 TCACCTCCAA GGGAGGAGTA ATGCCTGGAG ACCTCAGGTG AATAATCCAA 4901 AAGAGTGGCT GCAAGTGGAC TTCCAGAAGA CAATGAAAGT CACAGGAGTA 4951 ACTACTCAGG GAGTAAAATC TCTGCTTACC AGCATGTATG TGAAGGAGTT 5001 CCTCATCTCC AGCAGTCAAG ATGGCCATCA GTGGACTCTC TTTTTTCAGA 5051 ATGGCAAAGT AAAGGTTTTT CAGGGAAATC AAGACTCCTT CACACCTGTG 5101 GTGAACTCTC TAGACCCACC GTTACTGACT CGCTACCTTC GAATTCACCC 5151 CCAGAGTTGG GTGCACCAGA TTGCCCTGAG GATGGAGGTT CTGGGCTGCG 5201 AGGCACAGGA CCTCTACGAC AAAACTCACA CATGCCCACC GTGCCCAGCT 5251 CCAGAACTCC TGGGCGGACC GTCAGTCTTC CTCTTCCCCC CAAAACCCAA 5301 GGACACCCTC ATGATCTCCC GGACCCCTGA GGTCACATGC GTGGTGGTGG 5351 ACGTGAGCCA CGAAGACCCT GAGGTCAAGT TCAACTGGTA CGTGGACGGC 5401 GTGGAGGTGC ATAATGCCAA GACAAAGCCG CGGGAGGAGC AGTACAACAG 5451 CACGTACCGT GTGGTCAGCG TCCTCACCGT CCTGCACCAG GACTGGCTGA 5501 ATGGCAAGGA GTACAAGTGC AAGGTCTCCA ACAAAGCCCT CCCAGCCCCC 5551 ATCGAGAAAA CCATCTCCAA AGCCAAAGGG CAGCCCCGAG AACCACAGGT 5601 GTACACCCTG CCCCCATCCC GGGATGAGCT GACCAAGAAC CAGGTCAGCC 5651 TGACCTGCCT GGTCAAAGGC TTCTATCCCA GCGACATCGC CGTGGAGTGG 5701 GAGAGCAATG GGCAGCCGGA GAACAACTAC AAGACCACGC CTCCCGTGTT 5751 GGACTCCGAC GGCTCCTTCT TCCTCTACAG CAAGCTCACC GTGGACAAGA
5801 GCAGGTGGCA GCAGGGGAAC GTCTTCTCAT GCTCCGTGAT GCATGAGGCT 5851 CTGC AC A ACC ACT AC ACGC A GA AGAGCCTC TCCCTGTCTC CGGGT A A ATG
- 176 044115
Последовательность белка pSYN FVIII 312 (FVIII с полной делецией домена В, за исключением 5 аминокислотных остатков и 288 AE-XTEN, вставленного после а.к. 745- В5 версия) (SEO ID NO: 173).
ATRRYYLGAV ELSWDYMQSD LGELPVDARF PPRVPKSFPF NTSVVYKKTL
FVEFTDHLFN IAKPRPPWMG LLGPTIQAEV YDTVVITLKN MASHPVSLHA
101 VGVSYWKASE GAEYDDQTSQ REKEDDKVFP GGSHTYVWQV LKENGPMASD
151 PLCLTYSYLS HVDLVKDLNS GLIGALLVCR EGSLAKEKTQ TLHKFILLFA
201 VFDEGKS WHS ETKNSLMQDR D A AS AR AWPK MHT VNGY VNR SLPGLIGCHR
251 KSVYWHVIGM GTTPEVHSIF LEGHTFLVRN HRQASLEISP ITFLTAQTLL
301 MDLGQFLLFC HISSHQHDGM EAYVKVDSCP EEPQLRMKNN EEAEDYDDDL
351 TDSEMDVVRF DDDNSPSFIQ IRSVAKKHPK TWVHYIAAEE EDWDYAPLVL
401 APDDRSYKSQ YLNNGPQRIG RKYKKVRFMA YTDETFKTRE AIQHESGILG
451 PLLYGEVGDT LLIIFKNQAS RPYNIYPHGI TDVRPLYSRR LPKGVKHLKD
501 FPILPGEIFK YKWTVTVEDG PTKSDPRCLT RYYSSFVNME RDLASGLIGP
551 LLICYKESVD QRGNQIMSDK RNVILFSVFD ENRSWYLTEN IQRFLPNPAG
601 VQLEDPEFQA SNIMHSINGY VFDSLQLSVC LHEVAYWYIL SIGAQTDFLS
651 VFFSGYTFKH KMVYEDTLTL FPFSGETVFM SMENPGLWIL GCHNSDFRNR
701 GMTALLKVSS CDKNTGDYYE DSYEDISAYL LSKNNAIEPR SFSQNGTSES
751 ATPESGPGSE PATSGSETPG TSESATPESG PGSEPATSGS ETPGTSESAT
801 PESGPGTSTE PSEGSAPGSP AGSPTSTEEG TSESATPESG PGSEPATSGS
851 ETPGTSESAT PESGPGSPAG SPTSTEEGSP AGSPTSTEEG TSTEPSEGSA
901 PGTSESATPE SGPGTSESAT PESGPGTSES ATPESGPGSE PATSGSETPG
951 SEPATSGSET PGSPAGSPTS TEEGTSTEPS EGSAPGTSTE PSEGSAPGSE
1001 PATSGSETPG TSESATPESG PGTSTEPSEG SAPASSEITR TTLQSDQEEI
1051 DYDDTISVEM KKEDFDIYDE DENQSPRSFQ KKTRHYFIAA VERLWDYGMS
1101 SSPHVLRNRA QSGSVPQFKK VVFQEFTDGS FTQPLYRGEL NEHLGLLGPY
1151 IRAEVEDNIM VTFRNQASRP YSFYSSLISY EEDQRQGAEP RKNFVKPNET
1201 KT YFWK VQHH MAPTKDEFDC К AWA YFSD VD LEKD VHSGLI GPLL VCHTNT
1251 LNPAHGRQVT VQEFALFFTI FDETKSWYFT ENMERNCRAP CNIQMEDPTF
1301 KENYRFHAIN GYIMDTLPGL VMAQDQRIRW YLLSMGSNEN IHSIHFSGHV
1351 FTVRKKEEYK MALYNLYPGV FETVEMLPSK AGIWRVECLI GEHLHAGMST
1401 LFLVYSNKCQ TPLGMASGHI RDFQITASGQ YGQWAPKLAR LHYSGSINAW
1451 STKEPFSWIK VDLLAPMIIH GIKTQGARQK FSSLYISQFI IMYSLDGKKW
1501 QTYRGNSTGT LMVFFGNVDS SGIKHNIFNP PIIARYIRLH PTHYSIRSTL
1551 RMELMGCDLN SCSMPLGMES KAISDAQITA SSYFTNMFAT WSPSKARLHL
1601 QGRSNAWRPQ VNNPKEWLQV DFQKTMKVTG VTTQGVKSLL TSMYVKEFLI
1651 SSSQDGHQWT LFFQNGKVKV FQGNQDSFTP VVNSLDPPLL TRYLRIHPQS
1701 WVHQIALRME VLGCEAQDLY DKTHTCPPCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT
1751 LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY
1801 RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT
1851 LPPSRDELTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS
1901 DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK*
- 177 044115
Нуклеотидная последовательность pSYN ФВ059 (кодирующая ФВ D'D3-Fc с кислотным участком 2 (а2) сайта тромбина в линкере) (SEQ ID NO: 196).
ATGATTCCTG CCAGATTTGC CGGGGTGCTG CTTGCTCTGG CCCTCATTTT
GCCAGGGACC CTTTGTGCAG AAGGAACTCG CGGCAGGTCA TCCACGGCCC
101 GATGCAGCCT TTTCGGAAGT GACTTCGTCA ACACCTTTGA TGGGAGCATG
151 TACAGCTTTG CGGGATACTG CAGTTACCTC CTGGCAGGGG GCTGCCAGAA
201 ACGCTCCTTC TCGATT ATTG GGGACTTCC A GA ATGGC A AG AGAGTG AGCC
251 TCTCCGTGTA TCTTGGGGAA TTTTTTGACA TCCATTTGTT TGTCAATGGT
301 ACCGTGACAC AGGGGGACCA AAGAGTCTCC ATGCCCTATG CCTCCAAAGG
351 GCTGTATCTA GAAACTGAGG CTGGGTACTA CAAGCTGTCC GGTGAGGCCT
401 ATGGCTTTGT GGCCAGGATC GATGGCAGCG GCAACTTTCA AGTCCTGCTG
451 TCAGACAGAT ACTTCAACAA GACCTGCGGG CTGTGTGGCA ACTTTAACAT
501 CTTTGCTGAA GATGACTTT A TGACCC AAGA AGGGACCTTG ACCTCGGACC
551 CTTATGACTT TGCCAACTCA TGGGCTCTGA GCAGTGGAGA ACAGTGGTGT
601 GA ACGGGC AT CTCCTCCC AG C AGCTC ATGC A AC ATCTCCT CTGGGGA A AT
651 GCAGAAGGGC CTGTGGGAGC AGTGCCAGCT TCTGAAGAGC ACCTCGGTGT
701 TTGCCCGCTG CCACCCTCTG GTGGACCCCG AGCCTTTTGT GGCCCTGTGT
751 GAGAAGACTT TGTGTGAGTG TGCTGGGGGG CTGGAGTGCG CCTGCCCTGC
801 CCTCCTGGAG T ACGCCCGGA CCTGTGCCC A GGAGGGAATG GTGCTGT ACG
851 GCTGGACCGA CCACAGCGCG TGCAGCCCAG TGTGCCCTGC TGGTATGGAG
901 T AT AGGC AGT GTGTGTCCCC TTGCGCC AGG ACCTGCC AGA GCCTGC AC AT
951 CAATGAAATG TGTCAGGAGC GATGCGTGGA TGGCTGCAGC TGCCCTGAGG
1001 GACAGCTCCT GGATGAAGGC CTCTGCGTGG AGAGCACCGA GTGTCCCTGC
1051 GTGCATTCCG GAAAGCGCTA CCCTCCCGGC ACCTCCCTCT CTCGAGACTG
1101 C A AC ACCTGC ATTTGCCGA A AC AGCC AGTG GATCTGC AGC A ATGA AGA AT
- 178 044115
1151 GTCCAGGGGA GTGCCTTGTC ACTGGTCAAT CCCACTTCAA GAGCTTTGAC
1201 A AC AGAT ACT TC ACCTTC AG TGGGATCTGC C AGT ACCTGC TGGCCCGGGA 1251 TTGCCAGGAC СACTCCTTCT CCATTGTCAT TGAGACTGTC CAGTGTGCTG 1301 ATGACCGCGA CGCTGTGTGC ACCCGCTCCG TCACCGTCCG GCTGCCTGGC 1351 CTGC AC A AC A GCCTTGTGA A ACTGA AGC AT GGGGC AGG AG TTGCC ATGGA 1401 TGGCCAGGAC ATCCAGCTCC CCCTCCTGAA AGGTGACCTC CGCATCCAGC 1451 ATACAGTGAC GGCCTCCGTG CGCCTCAGCT ACGGGGAGGA CCTGCAGATG 1501 GACTGGGATG GCCGCGGGAG GCTGCTGGTG AAGCTGTCCC CCGTCTATGC 1551 CGGGA AGACC TGCGGCCTGT GTGGGA ATT A C A ATGGC A AC C AGGGCGACG 1601 ACTTCCTTAC CCCCTCTGGG CTGGCGGAGC CCCGGGTGGA GGACTTCGGG 1651 AACGCCTGGA AGCTGCACGG GGACTGCCAG GACCTGCAGA AGCAGCACAG 1701 CGATCCCTGC GCCCTCAACC CGCGCATGAC CAGGTTCTCC GAGGAGGCGT 1751 GCGCGGTCCT GACGTCCCCC ACATTCGAGG CCTGCCATCG TGCCGTCAGC 1801 CCGCTGCCCT ACCTGCGGAA CTGCCGCTAC GACGTGTGCT CCTGCTCGGA 1851 CGGCCGCGAG TGCCTGTGCG GCGCCCTGGC CAGCTATGCC GCGGCCTGCG 1901 CGGGGAGAGG CGTGCGCGTC GCGTGGCGCG AGCCAGGCCG CTGTGAGCTG 1951 AACTGCCCGA AAGGCCAGGT GTACCTGCAG TGCGGGACCC CCTGCAACCT 2001 GACCTGCCGC TCTCTCTCTT ACCCGGATGA GGA ATGC A AT GAGGCCTGCC 2051 TGGAGGGCTG CTTCTGCCCC CCAGGGCTCT ACATGGATGA GAGGGGGGAC 2101 TGCGTGCCCA AGGCCCAGTG CCCCTGTTAC TATGACGGTG AGATCTTCCA 2151 GCCAG AAGAC ATCTTCTC AG ACC АТС AC AC C ATGTGCT AC TGTGAGGATG 2201 GCTTCATGCA CTGTACCATG AGTGGAGTCC CCGGAAGCTT GCTGCCTGAC 2251 GCTGTCCTCA GCAGTCCCCT GTCTCATCGC AGCAAAAGGA GCCTATCCTG 2301 TCGGCCCCCC ATGGTCAAGC TGGTGTGTCC CGCTGACAAC CTGCGGGCTG 2351 A AGGGCTCGA GTGT ACC A A A ACGTGCC AGA ACT ATGACCT GGAGTGC ATG 2401 AGCATGGGCT GTGTCTCTGG CTGCCTCTGC CCCCCGGGCA TGGTCCGGCA 2451 TGAGAACAGA TGTGTGGCCC TGGAAAGGTG TCCCTGCTTC CATCAGGGCA 2501 AGGAGTATGC CCCTGGAGAA ACAGTGAAGA TTGGCTGCAA CACTTGTGTC 2551 TGTCGGGACC GGAAGTGGAA CTGCACAGAC CATGTGTGTG ATGCCACGTG 2601 CTCCACGATC GGCATGGCCC ACTACCTCAC CTTCGACGGG СТСAAATACC 2651 TGTTCCCCGG GGAGTGCCAG TACGTTCTGG TGCAGGATTA CTGCGGCAGT 2701 AACCCTGGGA CCTTTCGGAT CCTAGTGGGG AATAAGGGAT GCAGCCACCC 2751 CTCAGTGAAA TGCAAGAAAC GGGTCACCAT CCTGGTGGAG GGAGGAGAGA 2801 TTGAGCTGTT TGACGGGGAG GTGAATGTGA AGAGGCCCAT GAAGGATGAG 2851 ACTCACTTTG AGGTGGTGGA GTCTGGCCGG TACATCATTC TGCTGCTGGG 2901 CAAAGCCCTC TCCGTGGTCT GGGACCGCCA CCTGAGCАТС TCCGTGGTCC 2951 TGAAGCAGAC ATACCAGGAG AAAGTGTGTG GCCTGTGTGG GAATTTTGAT 3001 GGCATCCAGA АСАATGACCT CACCAGCAGC AACCTCCAAG TGGAGGAAGA
- 179 044115
3051 CCCTGTGGAC TTTGGGAACT CCTGGAAAGT GAGCTCGCAG TGTGCTGACA 3101 CCAGA AAAGT GCCTCTGGAC TC ATCCCCTG CC ACCTGCC А ТА AC A AC АТС 3151 ATGAAGCAGA CGATGGTGGA TTCCTCCTGT AGAATCCTTA CCAGTGACGT 3201 CTTCCAGGAC TGCAACAAGC TGGTGGACCC CGAGCCATAT CTGGATGTCT 3251 GCATTTACGA CACCTGCTCC TGTGAGTCCA TTGGGGACTG CGCCGCATTC 3301 TGCGACACCA TTGCTGCCTA TGCCCACGTG TGTGCCCAGC ATGGCAAGGT 3351 GGTGACCTGG AGGACGGCCA CATTGTGCCC CCAGAGCTGC GAGGAGAGGA 3401 ATCTCCGGGA GAACGGGTAT GAGGCTGAGT GGCGCTATAA CAGCTGTGCA 3451 CCTGCCTGTC AAGTCACGTG TCAGCACCCT GAGCCACTGG CCTGCCCTGT 3501 GCAGTGTGTG GAGGGCTGCC ATGCCCACTG CCCTCCAGGG AAAATCCTGG 3551 ATGAGCTTTT GCAGACCTGC GTTGACCCTG AAGACTGTCC AGTGTGTGAG 3601 GTGGCTGGCC GGCGTTTTGC CTCAGGAAAG AAAGTCACCT TGAATCCCAG 3651 TGACCCTGAG CACTGCCAGA TTTGCCACTG TGATGTTGTC AACCTCACCT 3701 GTGAAGCCTG CCAGGAGCCG ATATCGGGCG CGCCAACАТС AGAGAGCGCC 3751 ACCCCTGAAA GTGGTCCCGG GAGCGAGCCA GCCACATCTG GGTCGGAAAC 3801 GCCAGGCACA AGTGAGTCTG CAACTCCCGA GTCCGGACCT GGCTCCGAGC 3851 CTGCC ACT AG CGGCTCCGAG ACTCCGGGA A CTTCCGAGAG CGCT AC ACC A 3901 GAAAGCGGAC CCGGA ACC AG T ACCGAACCT AGCGAGGGCT CTGCTCCGGG 3951 CAGCCCAGCC GGCTCTCCTA CATCCACGGA GGAGGGCACT TCCGAATCCG 4001 CCACCCCGGA GTCAGGGCCA GGATCTGAAC CCGCTACCTC AGGCAGTGAG 4051 ACGCCAGGAA CGAGCGAGTC CGCTACACCG GAGAGTGGGC CAGGGAGCCC 4101 TGCTGGATCT CCTACGTCCA CTGAGGAAGG GTCACCAGCG GGCTCGCCCA 4151 CCAGC ACTGA AGA AGGTGCC TCGAT ATCTG AC A AGA AC AC TGGTGATT AT 4201 T ACGAGGAC A GTT ATGA AGA T ATTTC AGC A T ACTTGCTGA GT A A A A AC A A 4251 TGCCATTGAA CCAAGAAGCT TCTCTGACAA AACTCACACA TGCCCACCGT 4301 GCCCAGCTCC AGAACTCCTG GGCGGACCGT CAGTCTTCCT CTTCCCCCCA 4351 A A ACCC A AGG AC ACCCTC AT GATCTCCCGG ACCCCTGAGG TC AC ATGCGT 4401 GGTGGTGGAC GTGAGCCACG AAGACCCTGA GGTCAAGTTC AACTGGTACG 4451 TGGACGGCGT GGAGGTGCAT AATGCCAAGA CAAAGCCGCG GGAGGAGCAG 4501 TACAACAGCA CGTACCGTGT GGTCAGCGTC CTCACCGTCC TGCACCAGGA 4551 CTGGCTG A AT GGC AAGG AGT AC A AGTGC A A GGTCTCC A AC A A AGCCCTCC 4601 CAGCCCCCAT CGAGAAAACC ATCTCCAAAG CCAAAGGGCA GCCCCGAGAA 4651 CCACAGGTGT ACACCCTGCC CCCATCCCGG GATGAGCTGA CCAAGAACCA 4701 GGTCAGCCTG ACCTGCCTGG TCAAAGGCTT CTATCCCAGC GACATCGCCG 4751 TGGAGTGGGA GAGCAATGGG CAGCCGGAGA ACAACTACAA GACCACGCCT 4801 CCCGTGTTGG ACTCCGACGG CTCCTTCTTC CTCTACAGCA AGCTCACCGT 4851 GGACAAGAGC AGGTGGCAGC AGGGGAACGT CTTCTCATGC TCCGTGATGC 4901 ATGAGGCTCT GCACAACCAC TACACGCAGA AGAGCCTCTC CCTGTCTCCG 4951 GGTAAATGA
- 180 044115
Последовательность белка pSYN ФВ059 (ФВ D'D3-Fc с а2 участком сайта тромбина FVIII в линкере) - подчеркнутая область жирным шрифтом отображает а2 участок (SEQ ID NO: 197).
MIPARFAGVL LALALILPGT LCAEGTRGRS STARCSLFGS DFVNTFDGSM
YSFAGYCSYL LAGGCQKRSF SIIGDFQNGK RVSLSVYLGE FFDIHLFVNG
101 TVTQGDQRVS MPYASKGLYL ETEAGYYKLS GEAYGFVARI DGSGNFQVLL
151 SDRYFNKTCG LCGNFNIFAE DDFMTQEGTL TSDPYDFANS WALSSGEQWC
201 ERASPPSSSC NISSGEMQKG LWEQCQLLKS TSVFARCHPL VDPEPFVALC
251 EKTLCECAGG LECACPALLE YARTCAQEGM VLYGWTDHSA CSPVCPAGME
301 YRQCVSPCAR TCQSLHINEM CQERCVDGCS CPEGQLLDEG LCVESTECPC
351 VHSGKRYPPG TSLSRDCNTC ICRNSQWICS NEECPGECLV TGQSHFKSFD
401 NRYFTFSGIC QYLLARDCQD HSFSIVIETV QCADDRDAVC TRSVTVRLPG
451 LHNSLVKLKH GAGVAMDGQD IQLPLLKGDL RIQHTVTASV RLSYGEDLQM
501 DWDGRGRLLV KLSPVYAGKT CGLCGNYNGN QGDDFLTPSG LAEPRVEDFG
551 NAWKLHGDCQ DLQKQHSDPC ALNPRMTRFS EEACAVLTSP TFEACHRAVS
601 PLPYLRNCRY DVCSCSDGRE CLCGALASYA AACAGRGVRV AWREPGRCEL
651 NCPKGQVYLQ CGTPCNLTCR SLSYPDEECN EACLEGCFCP PGLYMDERGD
701 CVPKAQCPCY YDGEIFQPED IFSDHHTMCY CEDGFMHCTM SGVPGSLLPD
751 AVLSSPLSHR SKRSLSCRPP MVKLVCPADN LRAEGLECTK TCQNYDLECM
801 SMGCVSGCLC PPGMVRHENR CVALERCPCF HQGKEYAPGE TVKIGCNTCV
851 CRDRKWNCTD HVCDATCSTI GMAHYLTFDG LKYLFPGECQ YVLVQDYCGS
901 NPGTFRILVG NKGCSHPSVK CKKRVTILVE GGEIELFDGE VNVKRPMKDE
951 THFEVVESGR YIILLLGKAL SVVWDRHLSI SVVLKQTYQE KVCGLCGNFD
1001 GIQNNDLTSS NLQVEEDPVD FGNSWKVSSQ CADTRKVPLD SSPATCHNNI
1051 MKQTMVDSSC RILTSDVFQD CNKLVDPEPY LDVCIYDTCS CESIGDCAAF
1101 CDTIAAYAHV CAQHGKVVTW RTATLCPQSC EERNLRENGY EAEWRYNSCA
1151 PACQVTCQHP EPLACPVQCV EGCHAHCPPG KILDELLQTC VDPEDCPVCE
1201 VAGRRFASGK KVTLNPSDPE HCQICHCDVV NLTCEACQEPISGAPTSESA
1251 TPESGPGSEP ATSGSETPGT SESATPESGP GSEPATSGSE TPGTSESATP
1301 ESGPGTSTEP SEGSAPGSPA GSPTSTEEGT SESATPESGP GSEPATSGSE
1351 TPGTSESATP ESGPGSPAGS PTSTEEGSPA GSPTSTEEGA SISDKNTGDY
1401 YEDSYEDISA YLLSKNNAIE PRSFSDKTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP
1451 KPKDTLMISR TPEVTCVVVD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ
1501 YNSTYRVVSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE
1551 PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP
1601 PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP
1651 GK*
- 181 044115
Нуклеотидная последовательность pSYN ФВ062 (кодирующая ФВ D'D3-Fc без сайта тромбина в линкере) (SEQ ID NO: 198).
ATGATTCCTG CCAGATTTGC CGGGGTGCTG CTTGCTCTGG CCCTCATTTT
GCCAGGGACC CTTTGTGCAG AAGGAACTCG CGGCAGGTCA TCCACGGCCC
101 GATGCAGCCT TTTCGGAAGT GACTTCGTCA ACACCTTTGA TGGGAGCATG
151 TACAGCTTTG CGGGATACTG CAGTTACCTC CTGGCAGGGG GCTGCCAGAA
201 ACGCTCCTTC TCGATT ATTG GGGACTTCC A GA ATGGC A AG AGAGTG AGCC
251 TCTCCGTGTA TCTTGGGGAA TTTTTTGACA TCCATTTGTT TGTCAATGGT
301 ACCGTGACAC AGGGGGACCA AAGAGTCTCC ATGCCCTATG CCTCCAAAGG
351 GCTGTATCTA GAAACTGAGG CTGGGTACTA CAAGCTGTCC GGTGAGGCCT
401 ATGGCTTTGT GGCCAGGATC GATGGCAGCG GCAACTTTCA AGTCCTGCTG
451 TCAGACAGAT ACTTCAACAA GACCTGCGGG CTGTGTGGCA ACTTTAACAT
501 CTTTGCTGAA GATGACTTT A TGACCC AAGA AGGGACCTTG ACCTCGGACC
551 CTTATGACTT TGCCAACTCA TGGGCTCTGA GCAGTGGAGA ACAGTGGTGT
601 GA ACGGGC AT CTCCTCCC AG C AGCTC ATGC A AC ATCTCCT CTGGGGA A AT
651 GCAGAAGGGC CTGTGGGAGC AGTGCCAGCT TCTGAAGAGC ACCTCGGTGT
701 TTGCCCGCTG CCACCCTCTG GTGGACCCCG AGCCTTTTGT GGCCCTGTGT
751 GAGAAGACTT TGTGTGAGTG TGCTGGGGGG CTGGAGTGCG CCTGCCCTGC
801 CCTCCTGGAG T ACGCCCGGA CCTGTGCCC A GGAGGGAATG GTGCTGT ACG
851 GCTGGACCGA CCACAGCGCG TGCAGCCCAG TGTGCCCTGC TGGTATGGAG
901 T AT AGGC AGT GTGTGTCCCC TTGCGCC AGG ACCTGCC AGA GCCTGC AC AT
951 CAATGAAATG TGTCAGGAGC GATGCGTGGA TGGCTGCAGC TGCCCTGAGG
1001 GACAGCTCCT GGATGAAGGC CTCTGCGTGG AGAGCACCGA GTGTCCCTGC
1051 GTGCATTCCG GAAAGCGCTA CCCTCCCGGC ACCTCCCTCT CTCGAGACTG
1101 C A AC ACCTGC ATTTGCCGA A AC AGCC AGTG GATCTGC AGC A ATGA AGA AT
1151 GTCCAGGGGA GTGCCTTGTC ACTGGTCAAT CCCACTTCAA GAGCTTTGAC
1201 A AC AGAT ACT TC ACCTTC AG TGGGATCTGC C AGT ACCTGC TGGCCCGGGA
1251 TTGCCAGGAC СACTCCTTCT CCATTGTCAT TGAGACTGTC CAGTGTGCTG
1301 ATGACCGCGA CGCTGTGTGC ACCCGCTCCG TCACCGTCCG GCTGCCTGGC
1351 CTGC AC A AC A GCCTTGTGA A ACTGA AGC AT GGGGC AGG AG TTGCC ATGGA
1401 TGGCCAGGAC ATCCAGCTCC CCCTCCTGAA AGGTGACCTC CGCATCCAGC
1451 ATACAGTGAC GGCCTCCGTG CGCCTCAGCT ACGGGGAGGA CCTGCAGATG
1501 GACTGGGATG GCCGCGGGAG GCTGCTGGTG AAGCTGTCCC CCGTCTATGC
1551 CGGGA AGACC TGCGGCCTGT GTGGGA ATT A C A ATGGC A AC C AGGGCGACG
1601 ACTTCCTTAC CCCCTCTGGG CTGGCGGAGC CCCGGGTGGA GGACTTCGGG
- 182 044115
1651 AACGCCTGGA AGCTGCACGG GGACTGCCAG GACCTGCAGA AGCAGCACAG 1701 CGATCCCTGC GCCCTCAACC CGCGCATGAC CAGGTTCTCC GAGGAGGCGT 1751 GCGCGGTCCT GACGTCCCCC ACATTCGAGG CCTGCCATCG TGCCGTCAGC 1801 CCGCTGCCCT ACCTGCGGAA CTGCCGCTAC GACGTGTGCT CCTGCTCGGA 1851 CGGCCGCGAG TGCCTGTGCG GCGCCCTGGC CAGCTATGCC GCGGCCTGCG 1901 CGGGGAGAGG CGTGCGCGTC GCGTGGCGCG AGCCAGGCCG CTGTGAGCTG 1951 AACTGCCCGA AAGGCCAGGT GTACCTGCAG TGCGGGACCC CCTGCAACCT 2001 GACCTGCCGC TCTCTCTCTT ACCCGGATGA GGA ATGC A AT GAGGCCTGCC 2051 TGGAGGGCTG CTTCTGCCCC CCAGGGCTCT ACATGGATGA GAGGGGGGAC 2101 TGCGTGCCCA AGGCCCAGTG CCCCTGTTAC TATGACGGTG AGATCTTCCA 2151 GCCAG AAGAC ATCTTCTC AG ACC АТС AC AC C ATGTGCT AC TGTGAGGATG 2201 GCTTCATGCA CTGTACCATG AGTGGAGTCC CCGGAAGCTT GCTGCCTGAC 2251 GCTGTCCTCA GCAGTCCCCT GTCTCATCGC AGCAAAAGGA GCCTATCCTG 2301 TCGGCCCCCC ATGGTCAAGC TGGTGTGTCC CGCTGACAAC CTGCGGGCTG 2351 A AGGGCTCGA GTGT ACC A A A ACGTGCC AGA ACT ATGACCT GGAGTGC ATG 2401 AGCATGGGCT GTGTCTCTGG CTGCCTCTGC CCCCCGGGCA TGGTCCGGCA 2451 TGAGAACAGA TGTGTGGCCC TGGAAAGGTG TCCCTGCTTC CATCAGGGCA 2501 AGGAGTATGC CCCTGGAGAA ACAGTGAAGA TTGGCTGCAA CACTTGTGTC 2551 TGTCGGGACC GGAAGTGGAA CTGCACAGAC CATGTGTGTG ATGCCACGTG 2601 CTCCACGATC GGCATGGCCC ACTACCTCAC CTTCGACGGG CTCAAATACC 2651 TGTTCCCCGG GGAGTGCCAG TACGTTCTGG TGCAGGATTA CTGCGGCAGT 2701 AACCCTGGGA CCTTTCGGAT CCTAGTGGGG AATAAGGGAT GCAGCCACCC 2751 CTCAGTGAAA TGCAAGAAAC GGGTCACCAT CCTGGTGGAG GGAGGAGAGA 2801 TTGAGCTGTT TGACGGGGAG GTGAATGTGA AGAGGCCCAT GAAGGATGAG 2851 ACTCACTTTG AGGTGGTGGA GTCTGGCCGG TACATCATTC TGCTGCTGGG 2901 CAAAGCCCTC TCCGTGGTCT GGGACCGCCA CCTGAGCАТС TCCGTGGTCC 2951 TGAAGCAGAC ATACCAGGAG AAAGTGTGTG GCCTGTGTGG GAATTTTGAT 3001 GGCATCCAGA АСАATGACCT CACCAGCAGC AACCTCCAAG TGGAGGAAGA 3051 CCCTGTGGAC TTTGGGAACT CCTGGAAAGT GAGCTCGCAG TGTGCTGACA 3101 CC AGA AA AGT GCCTCTGGAC TC ATCCCCTG CC ACCTGCC А ТА AC A AC АТС 3151 ATGAAGCAGA CGATGGTGGA TTCCTCCTGT AGAATCCTTA CCAGTGACGT 3201 CTTCCAGGAC TGCAACAAGC TGGTGGACCC CGAGCCATAT CTGGATGTCT 3251 GCATTTACGA CACCTGCTCC TGTGAGTCCA TTGGGGACTG CGCCGCATTC 3301 TGCGACACCA TTGCTGCCTA TGCCCACGTG TGTGCCCAGC ATGGCAAGGT 3351 GGTGACCTGG AGGACGGCCA CATTGTGCCC CCAGAGCTGC GAGGAGAGGA 3401 ATCTCCGGGA GAACGGGTAT GAGGCTGAGT GGCGCTATAA CAGCTGTGCA 3451 CCTGCCTGTC AAGTCACGTG TCAGCACCCT GAGCCACTGG CCTGCCCTGT 3501 GCAGTGTGTG GAGGGCTGCC ATGCCCACTG CCCTCCAGGG AAAATCCTGG
- 183 044115
3551 ATGAGCTTTT GCAGACCTGC GTTGACCCTG AAGACTGTCC AGTGTGTGAG
3601 GTGGCTGGCC GGCGTTTTGC CTCAGGAAAG AAAGTCACCT TGAATCCCAG
3651 TGACCCTGAG CACTGCCAGA TTTGCCACTG TGATGTTGTC AACCTCACCT
3701 GTGAAGCCTG CCAGGAGCCG ATATCGGGCG CGCCAACАТС AGAGAGCGCC
3751 ACCCCTGAAA GTGGTCCCGG GAGCGAGCCA GCCACATCTG GGTCGGAAAC
3801 GCCAGGCACA AGTGAGTCTG CAACTCCCGA GTCCGGACCT GGCTCCGAGC
3851 CTGCC ACT AG CGGCTCCGAG ACTCCGGGA A CTTCCGAGAG CGCT AC ACC A
3901 GAAAGCGGAC CCGGA ACC AG T ACCGAACCT AGCGAGGGCT CTGCTCCGGG
3951 CAGCCCAGCC GGCTCTCCTA CATCCACGGA GGAGGGCACT TCCGAATCCG
4001 CCACCCCGGA GTCAGGGCCA GGATCTGAAC CCGCTACCTC AGGCAGTGAG
4051 ACGCCAGGAA CGAGCGAGTC CGCTACACCG GAGAGTGGGC CAGGGAGCCC
4101 TGCTGGATCT CCTACGTCCA CTGAGGAAGG GTCACCAGCG GGCTCGCCCA
4151 CC AGC ACTGA AGA AGGTGCC TCGAGCGAC A A A ACTC AC AC ATGCCC ACCG
4201 TGCCCAGCTC CAGAACTCCT GGGCGGACCG TCAGTCTTCC TCTTCCCCCC
4251 AAAACCCAAG GACACCCTCA TGATCTCCCG GACCCCTGAG GTCACATGCG
4301 TGGTGGTGGA CGTGAGCCAC GAAGACCCTG AGGTCAAGTT CAACTGGTAC
4351 GTGGACGGCG TGGAGGTGC A T A ATGCC A AG AC A A AGCCGC GGGAGGAGC A
4401 GT AC AAC AGC ACGT ACCGTG TGGTC AGCGT CCTC ACCGTC CTGC ACC AGG
4451 ACTGGCTGAA TGGCAAGGAG TACAAGTGCA AGGTCTCCAA CAAAGCCCTC
4501 CCAGCCCCCA TCGAGAAAAC CATCTCCAAA GCCAAAGGGC AGCCCCGAGA
4551 ACC AC AGGTG T AC ACCCTGC CCCC ATCCCG GGATGAGCTG ACC A AGA ACC
4601 AGGTCAGCCT GACCTGCCTG GTCAAAGGCT TCTATCCCAG CGACATCGCC
4651 GTGGAGTGGG AGAGCAATGG GCAGCCGGAG AACAACTACA AGACCACGCC
4701 TCCCGTGTTG GACTCCGACG GCTCCTTCTT CCTCTACAGC AAGCTCACCG
4751 TGGACAAGAG CAGGTGGCAG CAGGGGAACG TCTTCTCATG CTCCGTGATG
4801 CATGAGGCTC TGCACAACCA CTACACGCAG AAGAGCCTCT CCCTGTCTCC
4851 GGGTAAATGA
Последовательность белка pSYN ФВ062 (ФВ D'D3-Fc без сайта тромбина в линкере) (SEQ ID NO: 199).
MIPARFAGVL LALALILPGT LCAEGTRGRS STARCSLFGS DFVNTFDGSM
YSFAGYCSYL LAGGCQKRSF SIIGDFQNGK RVSLSVYLGE FFDIHLFVNG
101 TVTQGDQRVS MPYASKGLYL ETEAGYYKLS GEAYGFVARI DGSGNFQVLL
151 SDRYFNKTCG LCGNFNIFAE DDFMTQEGTL TSDPYDFANS WALSSGEQWC
201 ERASPPSSSC NISSGEMQKG LWEQCQLLKS TSVFARCHPL VDPEPFVALC
251 EKTLCECAGG LECACPALLE YARTCAQEGM VLYGWTDHSA CSPVCPAGME
- 184 044115
301 YRQCVSPCAR TCQSLHINEM CQERCVDGCS CPEGQLLDEG LCVESTECPC
351 VHSGKRYPPG TSLSRDCNTC ICRNSQWICS NEECPGECLV TGQSHFKSFD
401 NRYFTFSGIC QYLLARDCQD HSFSIVIETV QCADDRDAVC TRSVTVRLPG
451 LHNSLVKLKH GAGVAMDGQD IQLPLLKGDL RIQHTVTASV RLSYGEDLQM
501 DWDGRGRLLV KLSPVYAGKT CGLCGNYNGN QGDDFLTPSG LAEPRVEDFG
551 NAWKLHGDCQ DLQKQHSDPC ALNPRMTRFS EEACAVLTSP TFEACHRAVS
601 PLPYLRNCRY DVCSCSDGRE CLCGALASYA AACAGRGVRV AWREPGRCEL
651 NCPKGQVYLQ CGTPCNLTCR SLSYPDEECN EACLEGCFCP PGLYMDERGD
701 CVPKAQCPCY YDGEIFQPED IFSDHHTMCY CEDGFMHCTM SGVPGSLLPD
751 AVLSSPLSHR SKRSLSCRPP MVKLVCPADN LRAEGLECTK TCQNYDLECM
801 SMGCVSGCLC PPGMVRHENR CVALERCPCF HQGKEYAPGE TVKIGCNTCV
851 CRDRKWNCTD HVCDATCSTI GMAHYLTFDG LKYLFPGECQ YVLVQDYCGS
901 NPGTFRILVG NKGCSHPS VK CKKRVTILVE GGEIELFDGE VNVKRPMKDE
951 THFEVVESGR YIILLLGKAL SVVWDRHLSI SVVLKQTYQE KVCGLCGNFD
1001 GIQNNDLTSS NLQVEEDPVD FGNSWKVSSQ CADTRKVPLD SSPATCHNNI
1051 MKQTMVDSSC RILTSDVFQD CNKLVDPEPY LDVCIYDTCS CESIGDCAAF
1101 CDTIAAYAHV CAQHGKVVTW RTATLCPQSC EERNLRENGY EAEWRYNSCA
1151 PACQVTCQHP EPLACPVQCV EGCHAHCPPG KILDELLQTC VDPEDCPVCE
1201 VAGRRFASGK KVTLNPSDPE HCQICHCDVV NLTCEACQEPISGAPTSESA
1251 TPESGPGSEP ATSGSETPGT SESATPESGP GSEPATSGSE TPGTSESATP
1301 ESGPGTSTEP SEGSAPGSPA GSPTSTEEGT SESATPESGP GSEPATSGSE
1351 TPGTSESATP ESGPGSPAGS PTSTEEGSPA GSPTSTEEGA SSDKTHTCPP
1401 CPAPELLGGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY
1451 VDGVEVHNAK TKPREEQYNS TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL
1501 PAPIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPSRDEL TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA
1551 VEWESNGQPE NNYKTTPPVL DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM
1601 HEALHNHYTQ KSLSLSPGK*
Нуклеотидная последовательность pSYN ФВ073 (кодирующая ФВ D1D2D'D3 - 144 AE XTENукороченный а2 сайта тромбина FVIII-Fc) (SEQ ID NO: 174).
ATGATTCCTG CCAGATTTGC CGGGGTGCTG CTTGCTCTGG CCCTCATTTT
151 GCCAGGGACC CTTTGTGCAG AAGGAACTCG CGGCAGGTCA TCCACGGCCC
101 GATGCAGCCT TTTCGGAAGT GACTTCGTCA ACACCTTTGA TGGGAGCATG
151 TACAGCTTTG CGGGATACTG CAGTTACCTC CTGGCAGGGG GCTGCCAGAA
201 ACGCTCCTTC TCGATT ATTG GGGACTTCC A GA ATGGC A AG AGAGTG AGCC
251 TCTCCGTGTA TCTTGGGGAA TTTTTTGACA TCCATTTGTT TGTCAATGGT
- 185 044115
301 ACCGTGACAC AGGGGGACCA AAGAGTCTCC ATGCCCTATG CCTCCAAAGG
351 GCTGTATCTA GAAACTGAGG CTGGGTACTA CAAGCTGTCC GGTGAGGCCT
401 ATGGCTTTGT GGCCAGGATC GATGGCAGCG GCAACTTTCA AGTCCTGCTG
451 TCAGACAGAT ACTTCAACAA GACCTGCGGG CTGTGTGGCA ACTTTAACAT
501 CTTTGCTGAA GATGACTTT A TGACCC AAGA AGGGACCTTG ACCTCGGACC
551 CTTATGACTT TGCCAACTCA TGGGCTCTGA GCAGTGGAGA ACAGTGGTGT 601 GA ACGGGC AT CTCCTCCC AG C AGCTC ATGC A AC ATCTCCT CTGGGGA A AT
651 GCAGAAGGGC CTGTGGGAGC AGTGCCAGCT TCTGAAGAGC ACCTCGGTGT 701 TTGCCCGCTG CCACCCTCTG GTGGACCCCG AGCCTTTTGT GGCCCTGTGT
751 GAGAAGACTT TGTGTGAGTG TGCTGGGGGG CTGGAGTGCG CCTGCCCTGC
801 CCTCCTGGAG T ACGCCCGGA CCTGTGCCC A GGAGGGAATG GTGCTGT ACG
851 GCTGGACCGA CCACAGCGCG TGCAGCCCAG TGTGCCCTGC TGGTATGGAG 901 T AT AGGC AGT GTGTGTCCCC TTGCGCC AGG ACCTGCC AGA GCCTGC AC AT
951 CAATGAAATG TGTCAGGAGC GATGCGTGGA TGGCTGCAGC TGCCCTGAGG 1001 GACAGCTCCT GGATGAAGGC CTCTGCGTGG AGAGCACCGA GTGTCCCTGC 1051 GTGCATTCCG GAAAGCGCTA CCCTCCCGGC ACCTCCCTCT CTCGAGACTG 1101 C A AC ACCTGC ATTTGCCGA A AC AGCC AGTG GATCTGC AGC A ATGA AGA AT 1151 GTCCAGGGGA GTGCCTTGTC ACTGGTCAAT CCCACTTCAA GAGCTTTGAC 1201 A AC AGAT ACT TC ACCTTC AG TGGGATCTGC C AGT ACCTGC TGGCCCGGGA 1251 TTGCCAGGAC СACTCCTTCT CCATTGTCAT TGAGACTGTC CAGTGTGCTG 1301 ATGACCGCGA CGCTGTGTGC ACCCGCTCCG TCACCGTCCG GCTGCCTGGC 1351 CTGC AC A AC A GCCTTGTGA A ACTGA AGC AT GGGGC AGG AG TTGCC ATGGA 1401 TGGCCAGGAC ATCCAGCTCC CCCTCCTGAA AGGTGACCTC CGCATCCAGC 1451 ATACAGTGAC GGCCTCCGTG CGCCTCAGCT ACGGGGAGGA CCTGCAGATG 1501 GACTGGGATG GCCGCGGGAG GCTGCTGGTG AAGCTGTCCC CCGTCTATGC 1551 CGGGA AGACC TGCGGCCTGT GTGGGA ATT A C A ATGGC A AC C AGGGCGACG 1601 ACTTCCTTAC CCCCTCTGGG CTGGCGGAGC CCCGGGTGGA GGACTTCGGG 1651 AACGCCTGGA AGCTGCACGG GGACTGCCAG GACCTGCAGA AGCAGCACAG 1701 CGATCCCTGC GCCCTCAACC CGCGCATGAC CAGGTTCTCC GAGGAGGCGT 1751 GCGCGGTCCT GACGTCCCCC ACATTCGAGG CCTGCCATCG TGCCGTCAGC 1801 CCGCTGCCCT ACCTGCGGAA CTGCCGCTAC GACGTGTGCT CCTGCTCGGA 1851 CGGCCGCGAG TGCCTGTGCG GCGCCCTGGC CAGCTATGCC GCGGCCTGCG 1901 CGGGGAGAGG CGTGCGCGTC GCGTGGCGCG AGCCAGGCCG CTGTGAGCTG 1951 AACTGCCCGA AAGGCCAGGT GTACCTGCAG TGCGGGACCC CCTGCAACCT 2001 GACCTGCCGC TCTCTCTCTT ACCCGGATGA GGA ATGC A AT GAGGCCTGCC 2051 TGGAGGGCTG CTTCTGCCCC CCAGGGCTCT ACATGGATGA GAGGGGGGAC 2101 TGCGTGCCCA AGGCCCAGTG CCCCTGTTAC TATGACGGTG AGATCTTCCA 2151 GCC AG AAGAC ATCTTCTC AG ACC АТС AC AC C ATGTGCT AC TGTGAGGATG
- 186 044115
2201 GCTTCATGCA CTGTACCATG AGTGGAGTCC CCGGAAGCTT GCTGCCTGAC 2251 GCTGTCCTCA GCAGTCCCCT GTCTCATCGC AGCAAAAGGA GCCTATCCTG 2301 TCGGCCCCCC ATGGTCAAGC TGGTGTGTCC CGCTGACAAC CTGCGGGCTG 23 51 AAGGGCTCGA GTGT ACC AAA ACGTGCCAGA ACTATGACCT GGAGTGC ATG 2401 AGCATGGGCT GTGTCTCTGG CTGCCTCTGC CCCCCGGGCA TGGTCCGGCA 2451 TGAGAACAGA TGTGTGGCCC TGGAAAGGTG TCCCTGCTTC CATCAGGGCA 2501 AGGAGTATGC CCCTGGAGAA ACAGTGAAGA TTGGCTGCAA CACTTGTGTC
2551 TGTCGGGACC GGAAGTGGAA CTGCACAGAC CATGTGTGTG ATGCCACGTG 2601 CTCCACGATC GGCATGGCCC ACTACCTCAC CTTCGACGGG CTCAAATACC 2651 TGTTCCCCGG GGAGTGCCAG TACGTTCTGG TGCAGGATTA CTGCGGCAGT 2701 AACCCTGGGA CCTTTCGGAT CCTAGTGGGG AATAAGGGAT GCAGCCACCC 2751 CTCAGTGAAA TGCAAGAAAC GGGTCACCAT CCTGGTGGAG GGAGGAGAGA 2801 TTGAGCTGTT TGACGGGGAG GTGAATGTGA AGAGGCCCAT GAAGGATGAG 2851 ACTCACTTTG AGGTGGTGGA GTCTGGCCGG TACATCATTC TGCTGCTGGG 2901 CAAAGCCCTC TCCGTGGTCT GGGACCGCCA CCTGAGCATC TCCGTGGTCC 2951 TGAAGCAGAC ATACCAGGAG AAAGTGTGTG GCCTGTGTGG GAATTTTGAT
3001 GGCATCCAGA АСАATGACCT CACCAGCAGC AACCTCCAAG TGGAGGAAGA 3051 CCCTGTGGAC TTTGGGAACT CCTGGAAAGT GAGCTCGCAG TGTGCTGACA
3101 CCAGA AAAGT GCCTCTGGAC TC ATCCCCTG CC ACCTGCC А ТА AC A AC АТС 3151 ATGAAGCAGA CGATGGTGGA TTCCTCCTGT AGAATCCTTA CCAGTGACGT 3201 CTTCCAGGAC TGCAACAAGC TGGTGGACCC CGAGCCATAT CTGGATGTCT
3251 GCATTTACGA CACCTGCTCC TGTGAGTCCA TTGGGGACTG CGCCGCATTC 3301 TGCGACACCA TTGCTGCCTA TGCCCACGTG TGTGCCCAGC ATGGCAAGGT
3351 GGTGACCTGG AGGACGGCCA CATTGTGCCC CCAGAGCTGC GAGGAGAGGA 3401 ATCTCCGGGA GAACGGGTAT GAGGCTGAGT GGCGCTATAA CAGCTGTGCA 3451 CCTGCCTGTC AAGTCACGTG TCAGCACCCT GAGCCACTGG CCTGCCCTGT 3501 GCAGTGTGTG GAGGGCTGCC ATGCCCACTG CCCTCCAGGG AAAATCCTGG 3551 ATGAGCTTTT GCAGACCTGC GTTGACCCTG AAGACTGTCC AGTGTGTGAG 3601 GTGGCTGGCC GGCGTTTTGC CTCAGGAAAG AAAGTCACCT TGAATCCCAG 3651 TGACCCTGAG CACTGCCAGA TTTGCCACTG TGATGTTGTC AACCTCACCT
3701 GTGAAGCCTG CC AGGAGCCG GGCGCGCC AA С АТС AGAGAG CGCC ACCCCT 3751 GAAAGTGGTC CCGGGAGCGA GCCAGCCACA TCTGGGTCGG AAACGCCAGG
3801 CACAAGTGAG TCTGCAACTC CCGAGTCCGG ACCTGGCTCC GAGCCTGCCA 3851 CT AGCGGCTC CGAGACTCCG GGA ACTTCCG AGAGCGCT AC ACC AG AA AGC 3901 GGACCCGGAA CCAGTACCGA ACCTAGCGAG GGCTCTGCTC CGGGCAGCCC 3951 AGCCGGCTCT CCTACATCCA CGGAGGAGGG CACTTCCGAA TCCGCCACCC 4001 CGGAGTCAGG GCCAGGATCT GAACCCGCTA CCTCAGGCAG TGAGACGCCA 4051 GGAACGAGCG AGTCCGCTAC ACCGGAGAGT GGGCCAGGGA GCCCTGCTGG
- 187 044115
4101 ATCTCCTACG TCCACTGAGG AAGGGTCACC AGCGGGCTCG CCCACCAGCA
4151 CTG A AG AAGG TGCCTCGAGC GGCGGTGGAG GATCCGGTGG CGGGGGATCC
4201 GGTGGCGGGG GATCCGGTGG CGGGGGATCC GGTGGCGGGG GATCCGGTGG
4251 CGGGGGATCC ATTGAACCAA GAAGCTTCTC TGGCAGCGGA GGCGACAAAA
4301 CTCACACATG CCCACCGTGC CCAGCTCCAG AACTCCTGGG CGGACCGTCA
4351 GTCTTCCTCT TCCCCCC A A A ACCC A AGGAC ACCCTC ATGA TCTCCCGG AC
4401 CCCTGAGGTC ACATGCGTGG TGGTGGACGT GAGCCACGAA GACCCTGAGG
4451 TCAAGTTCAA CTGGTACGTG GACGGCGTGG AGGTGCATAA TGCCAAGACA
4501 AAGCCGCGGG AGGAGCAGTA CAACAGCACG TACCGTGTGG TCAGCGTCCT
4551 CACCGTCCTG CACCAGGACT GGCTGAATGG CAAGGAGTAC AAGTGCAAGG
4601 TCTCCAACAA AGCCCTCCCA GCCCCCATCG AGAAAACCAT CTCCAAAGCC
4651 AAAGGGCAGC CCCGAGAACC ACAGGTGTAC ACCCTGCCCC CATCCCGGGA
4701 TGAGCTGACC AAGAACCAGG TCAGCCTGAC CTGCCTGGTC AAAGGCTTCT
4751 ATCCCAGCGA CATCGCCGTG GAGTGGGAGA GCAATGGGCA GCCGGAGAAC
4801 AACTACAAGA CCACGCCTCC CGTGTTGGAC TCCGACGGCT CCTTCTTCCT
4851 CTACAGC AAG CTC ACCGTGG AC AAGAGCAG GTGGC AGCAG GGGAACGTCT
4901 TCTCATGCTC CGTGATGC AT GAGGCTCTGC AC AACC ACT A C ACGC AGAAG
4951 AGCCTCTCCC TGTCTCCGGG TAAATGA
Последовательность белка pSYN ФВ073 (ФВ D1D2D'D3- 144 AE XTEN- укороченный а2 сайта тромбина-Fc) (SEO ID NO:175).
MIPARFAGVL LALALILPGT LCAEGTRGRS STARCSLFGS DFVNTFDGSM
YSFAGYCSYL LAGGCQKRSF SIIGDFQNGK RVSLSVYLGE FFDIHLFVNG
101 TVTQGDQRVS MPYASKGLYL ETEAGYYKLS GEAYGFVARIDGSGNFQVLL
151 SDRYFNKTCG LCGNFNIFAE DDFMTQEGTL TSDPYDFANS WALSSGEQWC
201 ERASPPSSSC NISSGEMQKG LWEQCQLLKS TSVFARCHPL VDPEPFVALC
251 EKTLCECAGG LECACPALLE YARTCAQEGM VLYGWTDHSA CSPVCPAGME
301 YRQCVSPCAR TCQSLHINEM CQERCVDGCS CPEGQLLDEG LCVESTECPC
351 VHSGKRYPPG TSLSRDCNTC ICRNSQWICS NEECPGECLV TGQSHFKSFD
401 NRYFTFSGIC QYLLARDCQD HSFSIVIETV QCADDRDAVC TRSVTVRLPG
451 LHNSLVKLKH GAGVAMDGQD IQLPLLKGDL RIQHTVTASV RLSYGEDLQM
501 DWDGRGRLLV KLSPVYAGKT CGLCGNYNGN QGDDFLTPSG LAEPRVEDFG
51 NAWKLHGDCQ DLQKQHSDPC ALNPRMTRFS EEACAVLTSP TFEACHRAVS
601 PLPYLRNCRY DVCSCSDGRE CLCGALASYA AACAGRGVRV AWREPGRCEL
651 NCPKGQVYLQ CGTPCNLTCR SLSYPDEECN EACLEGCFCP PGLYMDERGD
701 CVPKAQCPCY YDGEIFQPED IFSDHHTMCY CEDGFMHCTM SGVPGSLLPD
- 188 -

Claims (22)

  1. 751 AVLSSPLSHR SKRSLSCRPP MVKLVCPADN LRAEGLECTK TCQNYDLECM
    801 SMGCVSGCLC PPGMVRHENR CVALERCPCF HQGKEYAPGE TVKIGCNTCV
    851 CRDRKWNCTD HVCDATCSTI GMAHYLTFDG LKYLFPGECQ YVLVQDYCGS
    901 NPGTFRILVG NKGCSHPSVK CKKRVTILVE GGEIELFDGE VNVKRPMKDE
    951 THFEVVESGR YIILLLGKAL SVVWDRHLSI SVVLKQTYQE KVCGLCGNFD
    1001 GIQNNDLTSS NLQVEEDPVD FGNSWKVSSQ CADTRKVPLD SSPATCHNNI
    1051 MKQTMVDSSC RILTSDVFQD CNKLVDPEPY LDVCIYDTCS CESIGDCAAF
    1101 CDTIAAYAHV CAQHGKVVTW RTATLCPQSC EERNLRENGY EAEWRYNSCA
    1151 PACQVTCQHP EPLACPVQCV EGCHAHCPPG KILDELLQTC VDPEDCPVCE
    1201 VAGRRFASGK KVTLNPSDPE HCQICHCDVV NLTCEACQEP GAPTSESATP
    1251 ESGPGSEPAT SGSETPGTSE SATPESGPGS EPATSGSETP GTSESATPES
    1301 GPGTSTEPSE GSAPGSPAGS PTSTEEGTSE SATPESGPGS EPATSGSETP
    1351 GTSESATPES GPGSPAGSPT STEEGSPAGS PTSTEEGASS GGGGSGGGGS
    1401 GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS IEPRSFSGSG GDKTHTCPPC PAPELLGGPS
    1451 VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT
    1501 KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA
    1551 KGQPREPQVY TLPPSRDELT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN
    1601 NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK
    1651 SLSLSPGK*
    Предшествующее описание конкретных вариантов реализации изобретения настолько полно раскрывает общий характер изобретения, что другие могут, применяя знания в данной области техники, легко модифицировать и/или адаптировать для различных применений такие конкретные варианты реализации изобретения, без излишнего экспериментирования, не отступая от общей концепции настоящего изобретения. Таким образом, такие адаптации и модификации предназначены для того, чтобы находиться в пределах смысла и диапазона эквивалентов раскрытых вариантов реализации изобретения, основанных на обучении и руководстве, представленном в данном документе. Следует иметь в виду, что фразеология и терминология используется здесь в целях описания, а не ограничения, таким образом, терминология или фразеология настоящего описания должна интерпретироваться специалистами в данной области техники с учетом представленных указаний и руководства.
    Другие варианты реализации настоящего изобретения понятны специалистам в данной области с учетом настоящего описания и практического осуществления настоящего изобретения, описанного в настоящем документе. Предполагается, что описание и примеры следует рассматривать только как иллюстративные, причем истинный объем и сущность настоящего изобретения указаны в следующей формуле изобретения.
    Все патенты и публикации, цитируемые в данном описании в полном объеме, включены в текст путем ссылки.
    ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Химерный белок, содержащий (i) первую полипептидную цепь, которая содержит в направлении от ее N-конца до ее С-конца (a) белок фактора VIII (FVIII), содержащий N-концевую часть и С-концевую часть;
    причем N-концевая часть белка FVIII содержит домен А1, домен А2 и часть домена В полноразмерного зрелого FVIII (SEQ ID NO: 65);
    причем N-концевая часть содержит аминокислотную последовательность из остатков 1-745 из SEQ ID NO: 65, слитую с первой последовательностью XTEN, встроенной непосредственно ниже аминокислоты 745 из SEQ ID NO: 65; и причем С-концевая часть содержит домен A3, домен С1 и домен С2 таким образом, чтобы Сконцевая часть содержала остатки 1690-2332 из SEQ ID NO: 65;
    (b) первый фрагмент Fc, причем первая последовательность XTEN содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8; и (ii ) вторую полипептидную цепь, которая содержит в направлении от ее N-конца до ее С-конца (a) белок фактора фон Виллебранда (ФВ), содержащий домен D' и домен D3 из ФВ, причем белок ФВ содержит аланиновую замену в остатках, соответствующих остаткам 1099 и 1142 из SEQ ID NO: 21;
    (b) вторую последовательность XTEN, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58, причем вторая последовательность XTEN содержит менее 288 аминокислотных остатков;
    (c) расщепляемый линкер, содержащий область а2 FVIII, которая содержит аминокислотную после-
    - 189 044115 довательность от Glu720 до Arg740, соответствующую SEQ ID NO: 65, причем область а2 поддается расщеплению тромбином; и (d) второй фрагмент Fc, причем первая полипептидная цепь соединена со второй полипептидной цепью через первый фрагмент Fc и второй фрагмент Fc.
  2. 2. Химерный белок по п.1, отличающийся тем, что С-концевая часть белка FVIII содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере на 95% идентичную остаткам 1641-2332 из SEQ ID NO: 65.
  3. 3. Химерный белок по п.2, отличающийся тем, что вторая последовательность XTEN имеет длину около 144 аминокислотных остатков.
  4. 4. Химерный белок по п.3, отличающийся тем, что вторая последовательность XTEN состоит из аминокислотной последовательности, имеющей длину от 144 аминокислотных остатков до 287 аминокислотных остатков.
  5. 5. Химерный белок по п.3, отличающийся тем, что первый фрагмент Fc соединен со вторым фрагментом Fc ковалентной связью.
  6. 6. Химерный белок по п.5, отличающийся тем, что первый фрагмент Fc соединен со вторым фрагментом Fc дисульфидной связью.
  7. 7. Химерный белок по п.1, отличающийся тем, что первый фрагмент Fc и второй фрагмент Fc являются одинаковыми.
  8. 8. Химерный белок по п.7, отличающийся тем, что первый фрагмент Fc и второй фрагмент Fc являются производными от IgG1 человека.
  9. 9. Химерный белок по п.8, отличающийся тем, что белок ФВ состоит из домена D' и домена D3.
  10. 10. Химерный белок по п.8, отличающийся тем, что белок ФВ дополнительно содержит домен D1 и D2 из ФВ.
  11. 11. Химерный белок по п.10, отличающийся тем, что белок ФВ дополнительно содержит сигнальный пептид ФВ.
  12. 12. Химерный белок по п.11, отличающийся тем, что белок FVIII дополнительно содержит сигнальный пептид FVIII.
  13. 13. Химерный белок по п.7, отличающийся тем, что первый фрагмент Fc соединен со вторым фрагментом Fc двумя дисульфидными связями.
  14. 14. Химерный белок по п.1, отличающийся тем, что расщепляемый линкер содержит область а2 FVIII, содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную с SEQ ID NO: 106.
  15. 15. Фармацевтическая композиция, содержащая химерный белок по любому из пп.1-14 и фармацевтически приемлемый носитель.
  16. 16. Химерный белок, содержащий (i) первую полипептидную цепь, которая содержит в направлении от ее N-конца до ее С-конца (a) белок фактора VIII (FVIII), содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 99% идентична с SEQ ID NO: 67, с первой последовательностью XTEN, встроенной непосредственно ниже остатка, соответствующего остатку 745 из SEQ ID NO: 67; и (b) первый фрагмент Fc;
    причем первая последовательность XTEN содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8; и (ii) вторую полипептидную цепь, которая содержит в направлении от ее N-конца до ее С-конца (a) белок фактора фон Виллебранда (ФВ), содержащий домен D' и домен D3 из ФВ, причем белок ФВ содержит аланиновую замену в остатках, соответствующих остаткам 1099 и 1142 из SEQ ID NO: 21;
    (b) вторую последовательность XTEN, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58, причем вторая последовательность XTEN содержит менее 288 аминокислотных остатков;
    (c) расщепляемый линкер, содержащий область а2 FVIII, которая содержит аминокислотную последовательность от Glu720 до Arg740, соответствующую SEQ ID NO: 65, причем область а2 поддается расщеплению тромбином; и (d) второй фрагмент Fc, причем первый фрагмент Fc соединен со вторым фрагментом Fc дисульфидной связью.
  17. 17. Химерный белок по п.16, отличающийся тем, что вторая последовательность XTEN имеет длину около 144 аминокислотных остатков.
  18. 18. Химерный белок по п.16, отличающийся тем, что вторая последовательность XTEN состоит из аминокислотной последовательности, имеющей длину от 144 аминокислотных остатков до 287 аминокислотных остатков.
  19. 19. Химерный белок по п.16, отличающийся тем, что первый фрагмент Fc и второй фрагмент Fc являются одинаковыми.
  20. 20. Химерный белок по п.19, отличающийся тем, что первый фрагмент Fc и второй фрагмент Fc являются производными от IgG1 человека.
  21. 21. Химерный белок по п.20, отличающийся тем, что белок ФВ состоит из домена D' и домена D3.
  22. 22. Химерный белок по п.20, отличающийся тем, что белок ФВ дополнительно содержит домен D1
    - 190 -
EA201691111 2014-01-10 2015-01-09 Химерные белки фактора viii и их применение EA044115B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US61/926,226 2014-01-10
US61/988,104 2014-05-02

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EA044115B1 true EA044115B1 (ru) 2023-07-24

Family

ID=

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20220275057A1 (en) Factor viii chimeric proteins and uses thereof
AU2020203063B2 (en) Thrombin cleavable linker with XTEN and its uses thereof
AU2018203206B2 (en) Factor VIII Complex With XTEN and Von Willebrand Factor Protein, and Uses Thereof
AU2011274423B2 (en) Chimeric clotting factors
US20190375822A1 (en) Methods of treating hemophilia a
US20210261607A1 (en) Purification of chimeric fviii molecules
KR101682496B1 (ko) 혈관형성 유도인자를 길항하는 융합단백질 및 그 용도
RU2812863C2 (ru) Способы лечения гемофилии a
EA044115B1 (ru) Химерные белки фактора viii и их применение
EA041588B1 (ru) Расщепляемый тромбином линкер, содержащий xten, и его применение