EA041588B1

EA041588B1 - Расщепляемый тромбином линкер, содержащий xten, и его применение

Info

Publication number: EA041588B1
Application number: EA201592022
Authority: EA
Inventors: Экта Сет Чхабра; Джон Кулман; Тунгуао Лю
Original assignee: Биовератив Терапьютикс Инк.
Priority date: 2013-06-28
Filing date: 2014-06-27
Publication date: 2022-11-09

Description

Уровень техники

Гемофилия А представляет собой нарушение, сопровождающееся повышенной кровоточивостью, вызываемое дефектами кодирования гена коагулирующего фактора VIII (FVIII), и поражает 1-2 из 10000 родившихся мальчиков. Graw et al., Nat. Rev. Genet. 6(6): 488-501 (2005). Пациентов, страдающих гемофилией А, можно лечить инфузией очищенного или рекомбинантно полученного FVIII. Однако известно, что все коммерчески доступные продукты FVIII имеют период полувыведения, равный около 8-12 часов, что требует частого внутривенного введения пациентам. См. Weiner M.A. and Cairo, M.S., Pediatric Hematology Secrets, Lee, M.T., 12. Disorders of Coagulation, Elsevier Health Sciences, 2001; Lillicrap, D. Thromb. Res. 122 Suppl 4:S2-8 (2008). Кроме того, был опробован ряд подходов, направленных на увеличение периода полувыведения FVIII. Например, подходы, используемые для увеличения периода полувыведения факторов свертывания крови, включают пегилирование, гликопегилирование и конъюгацию с альбумином. See Dumont et al., Blood. 119(13): 3024-3030 (интернет-публикация 13 января 2012 г.). Независимо от используемой белковой инженерии, однако, разрабатываемые в настоящее время продукты FVIII пролонгированного действия имеют улучшенные значения периода полувыведения, но величины периодов полувыведения, как сообщается, ограничены всего лишь около 1,5-2-кратным увеличением в доклинических животных моделях. См. там же. Непротиворечивые результаты были продемонстрированы на людях, например, сообщалось, что rFVIIIFc улучшает период полувыведения до около 1,7-кратной величины по сравнению с ADVATE® у пациентов с гемофилией А. См. там же. Таким образом, увеличение периода полувыведения, несмотря на незначительные улучшения, может указывать на существование других факторов, ограничивающих t_1/2.

Вследствие частого введения доз и неудобств, причиняемых графиком введения, существует потребность в разработке продуктов FVIII, требующих меньшей частоты введения, т.е. продукта FVIII, имеющего период полувыведения, превышающий 1,5-2-кратный предел периода полувыведения.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение касается химерной молекулы, содержащей белок фактора фон Виллебранда (VWF), гетерологичный фрагмент (H1), последовательность XTEN и линкер VWF, соединяющий белок VWF с гетерологичным фрагментом, при этом линкер VWF содержит полипептид, выбранный из: (i) области а2 из фактора VIII (FVIII); (ii) области a1 из FVIII; (iii) области а3 из FVIII; (iv) сайта расщепления тромбином, содержащего X-V-P-R (SEQ ID NO: 3) и мотив экзосайта взаимодействия PAR1, где X представляет собой алифатическую аминокислоту; или (v) любой их комбинации, и при этом последовательность XTEN соединена с белком VWF, гетерологичным фрагментом (H1), линкером VWF или любой их комбинацией. В одном варианте реализации изобретения последовательность XTEN соединяет белок VWF с линкером VWF или линкер VWF с гетерологичным фрагментом. В другом варианте реализации изобретения химерная молекула дополнительно включает вторую полипептидную цепь, которая содержит белок FVIII, при этом первая полипептидная цепь и вторая полипептидная цепь ассоциированы друг с другом. В других вариантах реализации изобретения белок FVIII в химерной молекуле дополнительно содержит дополнительную последовательность XTEN. Дополнительная последовательность XTEN может быть связана с N-концом или С-концом белка FVIII или вставлена между двумя соседними аминокислотами FVIII. В еще одних вариантах реализации изобретения вторая полипептидная цепь дополнительно содержит второй гетерологичный фрагмент (Н2).

Настоящее описание также включает химерную молекулу, содержащую первую полипептидную цепь, которая содержит белок VWF, гетерологичный фрагмент (H1) и линкер VWF, соединяющий белок VWF и гетерологичный фрагмент (H1), и вторую полипептидную цепь, содержащую белок FVIII и последовательность XTEN, при этом линкер VWF в первой полипептидной цепи содержит: (i) область а2 из FVIII; (ii) область a1 из FVIII; (iii) область а3 из FVIII; (iv) сайт расщепления тромбином, содержащий XV-P-R (SEQ ID NO: 3) и мотив экзосайта взаимодействия PAR1, где X представляет собой алифатическую аминокислоту; или (v) любую их комбинацию, и при этом первая полипептидная цепь и вторая полипептидная цепь ассоциированы друг с другом. В одном варианте реализации изобретения последовательность XTEN присоединена к N-концу или С-концу белка FVIII или вставлена между двумя соседними аминокислотами FVIII. В другом варианте реализации изобретения химерная молекула дополнительно содержит дополнительную последовательность XTEN, которая связана с белком VWF, гетерологичным фрагментом, линкером VWF или любой их комбинацией. В других вариантах реализации изобретения химерная молекула дополнительно содержит второй гетерологичный фрагмент (Н2). В еще одних вариантах реализации изобретения второй гетерологичный фрагмент соединен с белком FVIII, последовательностью XTEN или обоими.

Для химерных молекул, в соответствии с настоящим изобретением, последовательность XTEN, соединенная с белком VWF, линкером VWF, белком FVIII или любыми другими компонентами в химерных молекулах, содержит около 42 аминокислот, около 72 аминокислот, около 108 аминокислот, около 144 аминокислот, около 180 аминокислот, около 216 аминокислот, около 252 аминокислот, около 288 аминокислот, около 324 аминокислот, около 360 аминокислот, около 396 аминокислот, около 432 аминокислот, около 468 аминокислот, около 504 аминокислот, около 540 аминокислот, около 576 аминокислот, около 612 аминокислот, около 624 аминокислот, около 648 аминокислот, около 684 аминокислот, около 720 ами

- 1 041588 нокислот, около 756 аминокислот, около 792 аминокислот, около 828 аминокислот, около 836 аминокислот, около 864 аминокислот, около 875 аминокислот, около 912 аминокислот, около 923 аминокислот, около 948 аминокислот, около 1044 аминокислот, около 1140 аминокислот, около 1236 аминокислот, около 1318 аминокислот, около 1332 аминокислот, около 1428 аминокислот, около 1524 аминокислот, около 1620 аминокислот, около 1716 аминокислот, около 1812 аминокислот, около 1908 аминокислот или около 2004 аминокислот. В некоторых вариантах реализации изобретения полипептид XTEN выбирают из АЕ42, АЕ72, АЕ864, АЕ576, АЕ288, АЕ144, AG864, AG576, AG288 или AG144. В других вариантах реализации изобретения полипептид XTEN выбирают из SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 47; SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 48; SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 44 или SEQ ID NO: 42.

В других аспектах дополнительная последовательность XTEN в химерных молекулах содержит около 42 аминокислот, около 72 аминокислот, около 108 аминокислот, около 144 аминокислот, около 180 аминокислот, около 216 аминокислот, около 252 аминокислот, около 288 аминокислот, около 324 аминокислот, около 360 аминокислот, около 396 аминокислот, около 432 аминокислоты, около 468 аминокислот, около 504 аминокислоты, около 540 аминокислот, около 576 аминокислот, около 612 аминокислот, около 624 аминокислот, около 648 аминокислот, около 684 аминокислот, около 720 аминокислот, около 756 аминокислот, около 792 аминокислот, около 828 аминокислот, около 836 аминокислот, около 864 аминокислоты, около 875 аминокислот, около 912 аминокислот, около 923 аминокислот, около 948 аминокислот, около 1044 аминокислот, около 1140 аминокислот, около 1236 аминокислот, около 1318 аминокислот, около 1332 аминокислот, около 1428 аминокислот, около 1524 аминокислот, около 1620 аминокислот, около 1716 аминокислот, около 1812 аминокислот, около 1908 аминокислот или около 2004 аминокислот. В некоторых вариантах реализации изобретения дополнительный полипептид XTEN выбирают из АЕ42, АЕ72, АЕ864, АЕ576, АЕ288, АЕ144, AG864, AG576, AG288, или AG144. В определенных вариантах реализации изобретения дополнительный полипептид XTEN выбирают из SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 47; SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 43; SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 48; SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 44 или SEQ ID NO: 42.

В одном варианте реализации изобретения линкер VWF, пригодный для соединяющего белка VWF и гетерологичного фрагмента в химерных молекулах, содержит область а2, которая содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на около 80, около 85, около 90, около 95 или 100% идентичную участку от Glu720 до Arg740, соответствующему полноразмерному FVIII, при этом область а2 способна расщепляться тромбином. В конкретном варианте реализации изобретения область а2 содержит ISDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 4). В другом варианте реализации изобретения линкер VWF, пригодный для соединяющего белка VWF и гетерологичного фрагмента, содержит область a1, которая содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на около 80, около 85, около 90, около 95 или 100% идентичную участку от Met337 до Arg372, соответствующему полноразмерному FVIII, при этом область a1 способна расщепляться тромбином. В некоторых вариантах реализации изобретения область a1 содержит ISMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSV (SEQ ID NO: 5). В других вариантах реализации изобретения линкер VWF, пригодный для соединяющего белка VWF и гетерологичного фрагмента, содержит область а3, которая содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на около 80, около 85, около 90, около 95 или 100% идентичную участку от Glu1649 до Arg1689, соответствующему полноразмерному FVIII, при этом область а3 способна расщепляться тромбином. В конкретном варианте реализации изобретения область а3 содержит ISEITRTTLQSDQEEroYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQ (SEQ ID NO: 6). В еще одних вариантах реализации изобретения линкер VWF, пригодный для соединяющего белка VWF и гетерологичного фрагмента, содержит сайт расщепления тромбином, содержащий X-V-P-R (SEQ ID NO: 3) и мотив экзосайта взаимодействия PAR1, при этом мотив экзосайта взаимодействия PAR1 содержит S-F-LL-R-N (SEQ ID NO: 7). В одном варианте реализации изобретения мотив экзосайта взаимодействия PAR1 дополнительно содержит последовательность, выбранную из Р, P-N, P-N-D, P-N-D-K (SEQ ID NO: 8), PN-D-K-Y (SEQ ID NO: 9), P-N-D-K-Y-E (SEQ ID NO: 10), P-N-D-K-Y-E-P (SEQ ID NO: 11), P-N-D-K-Y-EP-F (SEQ ID NO: 12), P-N-D-K-Y-E-P-F-W (SEQ ID NO: 13), P-N-D-K-Y-E-P-F-W-E (SEQ ID NO: 14), PN-D-K-Y-E-P-F-W-E-D (SEQ ID NO: 20), P-N-D-K-Y-E-P-F-W-E-D-E (SEQ ID NO: 21), P-N-D-K-Y-E-P-FW-E-D-E-E (SEQ ID NO: 22), P-N-D-K-Y-E-P-F-W-E-D-E-E-S (SEQ ID NO: 23) или любой их комбинации. В другом варианте реализации изобретения алифатическую аминокислоту выбирают из глицина, аланина, валина, лейцина или изолейцина. В конкретном варианте реализации изобретения линкер VWF содержит GGLVPRSFLLRNPNDKYEPFWEDEES (SEQ ID NO: 24). В определенных вариантах реализации изобретения тромбин расщепляет линкер VWF быстрее, чем тромбин расщеплял бы сайт расщепления тромбином, если бы сайт расщепления тромбином замещал линкер VWF в химерной молекуле. В других вариантах реализации изобретения тромбин расщепляет линкер VWF по меньшей мере в около 10 раз, по меньшей мере в около 20 раз, по меньшей мере в около 30 раз, по меньшей мере в около 40 раз, по меньшей мере в около 50 раз, по меньшей мере в около 60 раз, по меньшей мере в около 70 раз, по меньшей мере в около 80 раз, по меньшей мере в около 90 раз или по меньшей мере в около 100 раз быстрее, чем тромбин расщеплял бы сайт расщепления тромбином, если бы сайт расщепления тромбином замещал линкер VWF в химерной молекуле.

- 2 041588

В некоторых вариантах реализации изобретения линкер VWF дополнительно содержит одну или более аминокислот и имеет длину по меньшей мере около 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800 или 2000 аминокислот. В одном примере одна или более аминокислот содержат пептид gly. В другом примере одна или более аминокислот содержат GlyGly. В других примерах одна или более аминокислот содержат пептид gly/ser. В некоторых примерах пептид gly/ser имеет формулу (Gly₄Ser)n или S(Gly₄Ser)n, где n обозначает положительное целое число, выбранное из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 или 100. В определенных примерах линкер (Gly4Ser)n представляет собой (Gly₄Ser)₃ (SEQ ID NO: 89) или (Gly₄Ser)₄(SEQ ID NO: 90).

Белок VWF, пригодный для химерной молекулы по изобретению, может содержать домен D' и домен D3 VWF, где домен D' и домен D3 способны связываться с белком FVIII. В одном варианте реализации изобретения домен D' белка VWF содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на около 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичную аминокислотам 764-866 SEQ ID NO: 2. В другом варианте реализации изобретения домен D3 белка VWF содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на около 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичную аминокислотам 867-1240 SEQ ID NO: 2. В других вариантах реализации изобретения белок VWF содержит по меньшей мере одно аминокислотное замещение в остатке, соответствующем остатку 1099, остатку 1142, или обоим остаткам 1099 и 1142 SEQ ID NO: 2. В еще одних вариантах реализации изобретения в последовательности белка VWF, аминокислота, отличная от цистеина, замещает остаток, соответствующий остатку 1099, остатку 1142 или обоим остаткам 1099 и 1142 SEQ ID NO: 2. В других вариантах реализации изобретения последовательность белка VWF содержит аминокислоты 764-1240 SEQ ID NO: 2. В определенных вариантах реализации изобретения белок VWF дополнительно содержит домен D1, домен D2, или домены D1 и D2 VWF. В некоторых вариантах реализации изобретения белок VWF дополнительно содержит домен VWF, выбранный из домена А1, домена А2, домена A3, домена D4, домена В1, домена В2, домена В3, домена С1, домена С2, домена CK, одного или более их фрагментов, или любых их комбинаций. В других вариантах реализации изобретения белок VWF состоит, по существу, из или состоит из: (1) доменов D' и D3 VWF или их фрагментов; (2) доменов D1, D' и D3 VWF или их фрагментов; (3) доменов D2, D' и D3 VWF или их фрагментов; (4) доменов D1, D2, D' и D3 VWF или их фрагментов; или (5) доменов D1, D2, D', D3 и A1 VWF или их фрагментов. В еще одних вариантах реализации изобретения белок VWF дополнительно содержит сигнальный пептид VWF. В других вариантах реализации изобретения белок VWF является пегилированным, гликозилированным, гэкилированным (гидроксиэтилкрохмалконъюгированным) или полисиалилированным. Термин пегилированный относится к наличию полиэтиленгликоля (ПЭГ), присоединенного к белку; термин гликозилированный относится к наличию гликозилирования белка; термин гэкилированный относится к наличию гидроксиэтилкрахмала (ГЭК), присоединенного к белку; и термин полисиалилированный относится к наличию полисиаловой кислоты (ПСК), присоединенной к белку. Примеры ПЭГ, ГЭК и ПСК приведены в других разделах данного документа.

В некоторых аспектах гетерологичный фрагмент (H1), соединенный с белком VWF с помощью линкера VWF, способен увеличивать период полувыведения химерной молекулы. В одном варианте реализации изобретения гетерологичный фрагмент (H1) содержит константную область иммуноглобулина или ее участок, альбумин, альбуминсвязывающий фрагмент, PAS, HAP, трансферрин или его фрагмент, полиэтиленгликоль (ПЭГ), гидроксиэтилкрахмал (ГЭК), ПСК, С-концевой пептид (СТР) β-субъединицы хорионического гонадотропина человека, или любую их комбинацию. В другом варианте реализации изобретения гетерологичный фрагмент содержит партнера связывания FcRn. В других вариантах реализации изобретения гетерологичный фрагмент содержит Fc-область. В других вариантах реализации изобретения гетерологичный фрагмент (H1) содержит клиренс-рецептор, или его фрагмент, причем клиренс-рецептор блокирует связывание белка FVIII с клиренс-рецепторами FVIII. В некоторых вариантах реализации изобретения клиренс-рецептор представляет собой рецептор липоппротеинов низкой плотности - связанный белок 1 (LRP1) или его FVШ-связывающий фрагмент. В некоторых аспектах второй гетерологичный фрагмент, соединенный с белком FVIII через необязательный линкер FVIII, содержит константную область иммуноглобулина или ее участок, альбумин, альбумин-связывающий полипептид, PAS, C-концевой пептид (СТР) β-субъединицы хорионического гонадотропина человека, полиэтиленгликоль (ПЭГ), гидроксиэтилкрахмал (ГЭК), альбумин-связывающие малые молекулы, или любые их комбинации. В одном варианте реализации изобретения второй гетерологичный фрагмент (Н2) способен увеличивать период полувыведения белка FVIII. В другом варианте реализации изобретения второй гетерологичный фрагмент (Н2) содержит полипептид, неполипептидный фрагмент, или оба. В другом варианте реализации изобретения второй гетерологичный фрагмент (Н2) содержит константную область иммуноглобулина или ее участок. В еще одних вариантах реализации изобретения второй гетерологичный фрагмент содержит партнер связывания FcRn. В других вариантах реализации изобретения второй гетерологичный фрагмент содержит вторую Fc-область. В некоторых вариантах реализации изобретения

- 3 041588 первый гетерологичный фрагмент, соединенный с белком VWF с помощью линкера VWF, и второй гетерологичный фрагмент, соединенный с белком FVIII с помощью необязательного линкера, в котором последовательность XTEN связана с любым из компонентов, ассоциированы друг с другом. В одном варианте реализации изобретения ассоциация между первой полипептидной цепью и вторым полипептидом обозначает ковалентную связь. В другом варианте реализации изобретения ассоциация между первым гетерологичным фрагментом и вторым гетерологичным фрагментом представляет собой дисульфидную связь. В других вариантах реализации изобретения первый гетерологичный фрагмент является партнером связывания FcRn и второй гетерологичный фрагмент является партнером связывания FcRn. В еще одних вариантах реализации изобретения первый гетерологичный фрагмент является Fc-областью и второй гетерологичный фрагмент является Fc-областью.

В определенных вариантах реализации изобретения белок FVIII соединен со вторым гетерологичным фрагментом с помощью линкера FVIII. В одном варианте реализации изобретения второй линкер представляет собой расщепляемый линкер. В другом варианте реализации изобретения линкер FVIII идентичен линкеру VWF. В других вариантах реализации изобретения линкер FVIII отличается от линкера VWF. В некоторых аспектах химерная молекула по изобретению имеет формулу, выбранную из: (a) V-L1-X1-H1:H2-L2-X2-C; (b) V-X1-L1-H1:H2-L2-X2-C; (с) V-L1-X1-H1:H2-X2-L2-C; (d) V-X1-L1-H1:H2X2-L2-C; (e) V-L1-X1-H1: H2-L2-C(X2); (f) V-X1-L1-H1:H2-L2-C(X2); (g) C-X2-L2-H2:H1-X1-L1-V; (h) C-X2-L2-H2:H1-L1-X1-V; (i) C-L2-X2-H2:H1-L1-X1-V; (j) C-L2-X2-H2:H1-L1-X1-V; (k) C(X2)-L2-H2:H1X1-L1-V; или (1) C(X2)-L2-H2:H1-L1-X1-V; где V обозначает белок VWF; L1 обозначает линкер VWF; L2 обозначает необязательный линкер FVIII; H1 представляет собой первый гетерологичный фрагмент; Н2 обозначает второй гетерологичный фрагмент; X1 обозначает последовательность XTEN; X2 обозначает необязательную последовательность XTEN; С обозначает белок FVIII; С(Х2) обозначает белок FVIII, слитый с последовательностью XTEN, причем последовательность XTEN вставлена между двумя соседними аминокислотами FVIII; (-) обозначает пептидную связь или одну или более аминокислот; и (:) обозначает ковалентную связь между H1 и Н2.

В других аспектах химерная молекула имеет формулу, выбранную из: (а) V-L1-X1-H1: H2-L2-X2-C; (b) V-X1-L1-H1: H2-L2-X2-C; (с) V-L1-X1-H1: H2-X2-L2-C; (d) V-X1-L1-H1: H2-X2-L2-C; (е) V-L1-X1H1: H2-L2-C(X2); (f) V-X1-L1-H1: H2-L2-C(X2); (g) C-X2-L2-H2: H1-X1-L1-V; (h) C-X2-L2-H2: H1-L1X1-V; (i) C-L2-X2-H2:H1-L1-X1-V; (j) C-L2-X2-H2:H1-L1-X1-V; (k) C(X2)-L2-H2:H1-X1-L1-V; или (1) C(X2)-L2-H2:H1-L1-X1-V; где V обозначает белок VWF; L1 обозначает линкер VWF; L2 обозначает необязательный линкер FVIII; H1 обозначает первый гетерологичный фрагмент; Н2 обозначает второй гетерологичный фрагмент; X1 обозначает необязательную последовательность XTEN; X2 обозначает последовательность XTEN; С обозначает белок FVIII; C(X2) обозначает белок FVIII, слитый с последовательностью XTEN, причем последовательность XTEN вставлена между двумя соседними аминокислотами FVIII; (-) обозначает пептидную связь или одну или более аминокислот; и (:) обозначает ковалентную связь между H1 и Н2. В химерных молекулах по изобретению белок VWF может ингибировать или предотвращать связывание эндогенного VWF с белком FVIII.

В определенных аспектах белок FVIII в химерных молекулах может содержать третий гетерологичный фрагмент (Н3). Третий гетерологичный фрагмент (Н3) может быть последовательностью XTEN. В других аспектах белок FVIII содержит четвертый гетерологичный фрагмент (Н4). Четвертый гетерологичный фрагмент (Н4) может быть последовательностью XTEN. В некоторых аспектах, белок FVIII содержит пятый гетерологичный фрагмент (Н5). Пятый гетерологичный фрагмент может быть последовательностью XTEN. В других аспектах, белок FVIII содержит шестой гетерологичный фрагмент (Н6). Шестой гетерологичный фрагмент может быть последовательностью XTEN. В определенных аспектах, один или более из третьего гетерологичного фрагмента (Н3), четвертого гетерологичного фрагмента (Н4), пятого гетерологичного фрагмента (Н5) и шестого гетерологичного фрагмента (Н6) способны увеличивать период полувыведения химерной молекулы. В других аспектах, третий гетерологичный фрагмент (Н3), четвертый гетерологичный фрагмент (Н4), пятый гетерологичный фрагмент (Н5) и шестой гетерологичный фрагмент (Н6) присоединены к С-концу или N-концу FVIII или вставлены между двумя аминокислотами белка FVIII. В других аспектах один или более из третьего гетерологичного фрагмента, четвертого гетерологичного фрагмента, пятого гетерологичного фрагмента и шестого гетерологичного фрагмента содержат отрезок, выбранный из одного или более из около 42 аминокислот, около 72 аминокислот, около 108 аминокислот, около 144 аминокислот, около 180 аминокислот, около 216 аминокислот, около 252 аминокислот, около 288 аминокислот, около 324 аминокислот, около 360 аминокислот, около 396 аминокислот, около 432 аминокислот, около 468 аминокислот, около 504 аминокислот, около 540 аминокислот, около 576 аминокислот, около 612 аминокислот, около 624 аминокислот, около 648 аминокислот, около 684 аминокислот, около 720 аминокислот, около 756 аминокислот, около 792 аминокислот, около 828 аминокислот, около 836 аминокислот, около 864 аминокислот, около 875 аминокислот, около 912 аминокислот, около 923 аминокислот, около 948 аминокислот, около 1044 аминокислот, около 1140 аминокислот, около 1236 аминокислот, около 1318 аминокислот, около 1332 аминокислот, около 1428 аминокислот, около 1524 аминокислот, около 1620 аминокислот, около 1716 аминокислот, около 1812 аминокислот, около 1908 аминокислот или около 2004 аминокислот. Например, последовательность

- 4 041588

XTEN третьего гетерологичного фрагмента, четвертого гетерологичного фрагмента, пятого гетерологичного фрагмента или шестого гетерологичного фрагмента может быть выбрана из АЕ42, АЕ72, АЕ864, АЕ576, АЕ288, АЕ144, AG864, AG576, AG288 или AG144. В частности последовательность XTEN может быть выбрана из SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 47; SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 43; SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 48; SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 44 или SEQ ID NO: 42. В определенных вариантах реализации изобретения период полувыведения химерной молекулы увеличивается по меньшей мере в около 1,5 раза, по меньшей мере в около 2 раза, по меньшей мере в около 2,5 раза, по меньшей мере в около 3 раза, по меньшей мере в около 4 раза, по меньшей мере в около 5 раз, по меньшей мере в около 6 раз, по меньшей мере в около 7 раз, по меньшей мере в около 8 раз, по меньшей мере в около 9 раз, по меньшей мере в около 10 раз, по меньшей мере в около 11 раз или по меньшей мере в около 12 раз по сравнению с FVIII дикого типа.

Настоящее описание также предусматривает полинуклеотид или набор полинуклеотидов, кодирующих химерную молекулу или ее комплементарную последовательность. Полинуклеотид или набор полинуклеотидов может дополнительно содержать полинуклеотидную цепь, которая кодирует РС5 или РС7.

Также включен вектор или набор векторов, содержащих полинуклеотид или набор полинуклеотидов и один или более промоторов, функционально связанных с полинуклеотидом или набором полинуклеотидов. В некоторых вариантах реализации изобретения вектор или набор векторов могут дополнительно содержать дополнительную полинуклеотидную цепь, кодирующую РС5 или РС7.

Настоящее изобретение также включает клетку-хозяина, содержащую полинуклеотид или набор полинуклеотидов или вектор или набор векторов. В одном варианте реализации изобретения клеткахозяин представляет собой клетку млекопитающего. В другом варианте реализации изобретения клеткухозяина выбирают из клетки HEK293, клетки СНО или клетки ВНК.

В некоторых аспектах изобретение включает фармацевтическую композицию, содержащую химерную молекулу, раскрытую в данном документе, полинуклеотид или набор полинуклеотидов, кодирующих химерную молекулу, вектор или набор векторов, содержащих полинуклеотид или набор полинуклеотидов, или клетку-хозяина, раскрытую в данном документе, и фармацевтически приемлемый носитель. В одном варианте реализации изобретения химерная молекула в композиции имеет увеличенный период полувыведения по сравнению с белком FVIII дикого типа. В другом варианте реализации изобретения период полувыведения химерной молекулы в композиции увеличен по меньшей мере в около 1,5 раза, по меньшей мере в около 2 раза, по меньшей мере в около 2,5 раза, по меньшей мере в около 3 раза, по меньшей мере в около 4 раза, по меньшей мере в около 5 раз, по меньшей мере в около 6 раз, по меньшей мере в около 7 раз, по меньшей мере в около 8 раз, по меньшей мере в около 9 раз, по меньшей мере в около 10 раз, по меньшей мере в около 11 раз или по меньшей мере в около 12 раз по сравнению с FVIII дикого типа.

Также включен способ снижения частоты или тяжести эпизода кровотечения у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение эффективного количества химерной молекулы, раскрытой в данном документе, полинуклеотида или набора полинуклеотидов, кодирующих химерную молекулу, вектора или набора векторов, раскрытых в данном документе, клетки-хозяина, раскрытой в данном документе, или композиции, раскрытой в данном документе. Изобретение также включает способ предотвращения возникновения эпизода кровотечения у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение эффективного количества химерной молекулы, раскрытой в данном документе, полинуклеотида или набора полинуклеотидов, кодирующих химерную молекулу, вектора или набора векторов, раскрытых в данном документе, клетки-хозяина, раскрытой в данном документе, или композиции, раскрытой в данном документе. В одном варианте реализации изобретения эпизод кровотечения выбирают из нарушения свертываемости крови, гемартроза, мышечного кровотечения, кровотечения в ротовой полости, кровоизлияния, кровоизлияния в мышцы, кровоизлияния в полости рта, травмы, повреждения черепа (trauma capitis), желудочно-кишечного кровотечения, внутричерепного кровоизлияния, внутрибрюшного кровоизлияния, внутригрудного кровоизлияния, перелома кости, кровотечения в центральной нервной системе, кровотечения в заглоточном пространстве, кровотечения в забрюшинном пространстве, кровоизлияния во влагалище подвздошно-поясничной мышцы, или любых их комбинаций. В другом варианте реализации изобретения химерная молекула, раскрытая в данном документе, полинуклеотид или набор полинуклеотидов, кодирующих химерную молекулу, вектор или набор векторов, раскрытых в данном документе, клетка-хозяин, раскрытая в данном документе, или композиция, раскрытая в данном документе, могут быть введены путем, выбранным из местного введения, внутриглазного введения, парентерального введения, интратекального введения, субдурального введения, перорального введения или любых их комбинаций.

Настоящее описание также включает способ получения химерной молекулы, включающий трансфекцию одной или более клеток-хозяев полинуклеотидом, раскрытым в данном документе, или вектором, раскрытым в данном документе, и экспрессию химерной молекулы в клетке-хозяине. Способ дополнительно включает выделение химерной молекулы. В некоторых вариантах реализации изобретения активность химерной молекулы по отношению к FVIII может быть измерена путем анализа активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ) или методом ротационной тромбоэластометрии (ROTEM).

- 5 041588

Краткое описание графических материалов

Фиг. 1 иллюстрирует примерную схему химерной молекулы (FVIII-XTEN/remepoguMep VWF), содержащей две полипептидные цепи - первую цепь, содержащую белок VWF (например, домен D' и домен D3 VWF) соединенный с Fc-областью с помощью расщепляемого тромбином линкера VWF, и вторую цепь, содержащую белок FVIII, соединенный со второй Fc-областью с помощью линкера FVIII. Белок FVIII содержит один или более XTEN в разных доменах FVIII.

Фиг. 2 иллюстрирует разные конструкты VWF, причем каждый конструкт содержит домен D' и домен D3, соединенные с Fc-областью с помощью расщепляемого тромбином линкера VWF, за исключением контроля (т.е. VWF-052). VWF-031 содержит линкер из 48 аминокислот, включающий сайт расщепления тромбином L-V-P-R (SEQ ID NO: 25). VWF-034 содержит последовательность XTEN, состоящую из 288 аминокислот, и линкер из 35 аминокислот, включающий сайт расщепления тромбином L-V-P-R (SEQ ID NO: 25). VWF-035 содержит линкер из 73 аминокислот, включающий сайт расщепления тромбином L-V-P-R (SEQ ID NO: 25). VWF-036 содержит линкер из 98 аминокислот, включающий сайт расщепления тромбином L-V-P-R (SEQ ID NO: 25). VWF-039 содержит линкер VWF из 26 аминокислот, включающий сайт расщепления тромбином L-V-P-R (SEQ ID NO: 25) и мотив экзосайта взаимодействия PAR1. VWF-051 содержит линкер из 54 аминокислот, включающий сайт расщепления тромбином A-L-RP-R-V-V (SEQ ID NO: 26). VWF-052 содержит линкер из 48 аминокислоты без какого-либо сайта расщепления тромбином (контроль). VWF-054 содержит линкер VWF из 40 аминокислот, включающий область a1 FVIII. VWF-055 содержит линкер VWF из 34 аминокислот, включающий область а2 FVIII. VWF-056 содержит линкер VWF из 46 аминокислот, включающий область а3 FVIII.

Фиг. 3А иллюстрирует скорость тромбин-медиируемого расщепления в единицах сдвига положения резонанса за секунду (RU/s) как функцию плотности захвата в единицах RU для слитых конструктов VWF-Fc, т.е. VWF-031, VWF-034, VWF-036, VWF-039, VWF-051 и VWF-052.

Фиг. 3В иллюстрирует скорость тромбин-медиируемого расщепления в единицах сдвига положения резонанса за секунду (RU/s) как функцию плотности захвата в единицах RU для слитых конструктов VWF-Fc, т.е. VWF-031, VWF-034, VWF-036, VWF-051 и VWF-052. В этих экспериментах, каждый слитый конструкт VWF-Fc захватывался при разных плотностях и затем подвергался воздействию фиксированной концентрации альфа-тромбина человека. Наклон каждой кривой на фиг. 3A и 3В непосредственно отображает восприимчивость каждого конструкта к расщеплению тромбином.

Фиг. 4А иллюстрирует скорость тромбин-медиируемого расщепления в единицах сдвига положения резонанса за секунду (RU/s) как функцию плотности захвата в единицах RU для слитых конструктов VWF-Fc, т.е. VWF-054, VWF-055 и VWF-056.

Фиг. 4В иллюстрирует скорость тромбин-медиируемого расщепления в единицах сдвига положения резонанса за секунду (RU/s) как функцию плотности захвата в единицах RU для слитых конструктов VWF-Fc, т.е. VWF-031, VWF-039, VWF-054, VWF-055 и VWF-056. В этих экспериментах каждый слитый конструкт VWF-Fc захватывался при разных плотностях и затем подвергался воздействию фиксированной концентрации альфа-тромбина человека. Наклон каждой кривой на фиг. 4А и 4В непосредственно отображает восприимчивость каждого конструкта к расщеплению тромбином.

Фиг. 5 иллюстрирует результаты линейного регрессионного анализа с целью определения восприимчивости различных конструктов VWF-Fc - VWF-031, VWF-034, VWF-036, VWF-039, VWF-051, VWF052, VWF-054, VWF-055 и VWF-056 - к тромбин-медиируемому расщеплению. Значения величин выражены в обратных секундах и отображают наклоны кривых, проиллюстрированных на фиг. 3 и 4. Относительную восприимчивость двух разных конструктов определяют как частное от деления значений их соответствующих наклонов. Отношение наклонvw_F-₀₃₉/наклонvw_F-₀₃₁ равно 71, указывая на то, что слитый конструкт VWF-Fc VWF-039 является в 71 раз более чувствительным к тромбин-медиируемому расщеплению, чем VWF-031. Отношение наклонvw_F-₀55/наклонvw_F-₀₃₁ равно 65, и отношение наклонvw_F-₀5₁/наклонvw_F-₀₃₁ равно 1,8.

Фиг. 6 иллюстрирует время свертывания для различных химерных молекул у HemA-пациента, измеренное путем анализа цельной крови методом ROTEM. FVII155/VWF-031 содержит две полипептидные цепи - первую цепь, содержащую BDD FVIII, соединенный с Fc-областью, и вторую цепь, содержащую домен D' и домен D3 VWF, соединенные с Fc-областью через минимальный сайт расщепления тромбином (т.е. L-V-P-R (SEQ ID NO: 25)). FVII155/VWF-039 содержит две полипептидные цепи - первую цепь, содержащую BDD FVIII, соединенный с Fc-областью, и вторую цепь, содержащую домен D' и домен D3 VWF, соединенные с Fc-областью с помощью линкера VWF, содержащего L-V-P-R (SEQ ID NO: 25) и мотив экзосайта взаимодействия PAR1. FVII155/VWF-055 содержит две полипептидные цепи первую цепь, содержащую BDD FVIII, соединенный с Fc-областью, и вторую цепь, содержащую домен D' и домен D3 VWF, соединенные с Fc-областью с помощью линкера VWF, содержащего область а2 из FVIII.

Фиг. 7 иллюстрирует схему типичного гетеродимера FVIII-VWF и конструктов FVIII169, FVIII286, VWF057, VWF059 и VWF062. Например, конструкт FVIII169 содержит белок FVIII с делецией В-домена с замещением R1648A, соединенный с Fc-областью, в котором последовательность XTEN (например, АЕ288) вставлена в положении аминокислоты 745, что соответствует зрелому полноразмерному FVIII

- 6 041588 (A1-a1-A2-a2-288XTEN-a3-A3-C1-C2-Fc). Конструкт FVIII286 содержит белок FVIII с делецией Вдомена с замещением R1648, соединенный с Fc-областью, в котором последовательность XTEN (например, АЕ288) вставлена в положении аминокислоты 745, что соответствует зрелому полноразмерному FVIII, с дополнительной областью а2 между FVIII и Fc (A1-a1-A2-a2-288XTEN-a3-A3-C1-C2-a2-Fc). VWF057 представляет собой слитый конструкт VWF-Fc, содержащий домен D'D3 белка VWF (с двумя аминокислотными замещениями в домене D'D3, т.е. C336A и С379А), связанный с Fc-областью с помощью линкера VWF, который содержит тромбиновый сайт LVPR (LVPR) и GS-линкер (GS), при этом последовательность XTEN (т.е. 144XTEN) вставлена между доменом D'D3 и линкером VWF (D'D3144XTEN-GS+LVPR-Fc). VWF059 представляет собой слитый конструкт VWF-Fc, содержащий домен D'D3 белка VWF (с двумя аминокислотными замещениями в домене D'D3, т.е. С336А и С379А), связанный с Fc-областью с помощью участка кислотной области 2 (а2) в качестве линкера VWF, при этом последовательность XTEN вставлена между доменом D'D3 и линкером VWF. VWF062 представляет собой слитый конструкт VWF-Fc, содержащий содержит домен D'D3 белка VWF (с двумя аминокислотными замещениями в домене D'D3, т.е. С336А и С379А), связанный с Fc-областью, при этом последовательность XTEN вставлена между доменом D'D3 и Fc-областью (D'D3-144XTEN-Fc).

Фиг. 8 иллюстрирует острую эффективность гетеродимеров FVШ-XTEN-Fc/D'D3-линкер-Fc (т.е. FVIII169/VWF034, FVIII169/VWF059 и FVIII169/VWF057), по сравнению с FVIII с делецией В-домена (SQ BDD FVIII или BDD-rFVIII) или контрольным носителем в модели HemA-мышей со срезанным кончиком хвоста. BDD-rFVIII обозначен кружками, и FVIII169/VWF034 обозначен квадратами, FVIII169/VWF059 обозначен треугольниками, FVIII169/VWF057 обозначен незакрашенными кружками, и носитель обозначен перевернутыми треугольниками. VWF034 представляет собой слитый конструкт VWF-Fc, который содержит Fc-область, соединенную с доменом D' и доменом D3 VWF с помощью линкера VWF, содержащий LVPR, при этом последовательность XTEN (т.е. 288XTEN) вставлена между доменом D'D3 и линкером VWF (D'D3-288XTEN-LVPR-Fc). Подробное описание конструктов FVIII169, VWF059 и VWF057 приведено в других разделах данного документа. Медианная потеря крови (мкл) у мышей после введения дозы 75 МЕ/кг конструкта в каждой экспериментальной группе показана горизонтальными линиями.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение касается химерной молекулы, содержащей последовательность XTEN и расщепляемый тромбином линкер, соединяющий белок VWF или белок FVIII с гетерологичным фрагментом, например фрагментом, увеличивающим период полувыведения. Изобретение также предусматривает химерную молекулу, содержащую две полипептидные цепи - первую цепь, содержащую белок VWF, связанный с гетерологичным фрагментом, и вторую цепь, содержащую белок FVIII и второй гетерологичный фрагмент, причем химерная молекула содержит последовательность XTEN в первой или второй полипептидных цепях, и или белок VWF, или белок FVIII (или оба) связанны с гетерологичным фрагментом с помощью линкера VWF или линкера FVIII (или обоих). Расщепляемый тромбином линкер (линкер VWF или линкер FVIII) может эффективно расщепляться тромбином в месте повреждения, где тромбин является легкодоступным. Типичные примеры химерных молекул проиллюстрированы в настоящем описании и фигурах. В некоторых вариантах реализации изобретения изобретение относится к химерным молекулам, имеющим структуры, представленные, например, на фиг. 1-7. В других вариантах реализации изобретения изобретение относится к полинуклеотиду, кодирующему конструкты химерных молекул, раскрытые в данном документе.

Для обеспечения четкого понимания описания и формулы изобретения, ниже приводятся следующие определения.

I. Определения.

Следует отметить, что объекты, описываемые в единственном числе, относятся к одному или более указанным объектам; например, подразумевается, что нуклеотидная последовательность обозначает одну или более нуклеотидных последовательностей. По существу, термины в единственном числе, один или более, и по меньшей мере один могут использоваться в данном документе взаимозаменяемо. Термин около используется в данном документе в значениях приблизительно, ориентировочно, около или близко к. Когда термин около используется в сочетании с диапазоном числовых значений, он модифицирует этот диапазон путем расширения его границ до значений выше и ниже указанных числовых величин. В общем, термин около используется в данном документе для модификации числовой величины за счет отклонения ее на 10 процентов от указанного значения в большую или меньшую сторону (выше или ниже).

Термин полинуклеотид или нуклеотид рассматривается как охватывающий отдельно взятую нуклеиновую кислоту, а также множество нуклеиновых кислот, и относится к выделенной молекуле или конструкту нуклеиновой кислоты, например матричной РНК (мРПК) или плазмидной ДНК (пДНК). В определенных вариантах реализации изобретения полинуклеотид содержит обычную фосфодиэфирную связь или необычную связь (например, амидную связь, такую как присутствующую в пептидных нуклеиновых кислотах (ПНК)). Термин нуклеиновая кислота относится к любому одному или более сегментам нуклеиновой кислоты, например фрагментам ДНК или РНК, присутствующим в полинуклеотиде.

- 7 041588

Под выделенной нуклеиновой кислотой или полинуклеотидом подразумевается молекула нуклеиновой кислоты, ДНК или РНК, извлеченная из ее естественного окружения. Например, рекомбинантный полинуклеотид, кодирующий полипептид фактора VIII, содержащийся в векторе, считается выделенным в целях настоящего изобретения. Дополнительные примеры выделенного полинуклеотида включают рекомбинантные полинуклеотиды, поддерживаемые в гетерологичных клетках-хозяевах или очищенные (частично или в значительной степени) от других полинуклеотидов в растворе. Выделенные молекулы РНК включают in vivo или in vitro РНК-транскрипты полинуклеотидов по настоящему изобретению. Выделенные полинуклеотиды или нуклеиновые кислоты в соответствии с настоящим изобретением дополнительно включают такие молекулы, полученные путем синтеза. Кроме того, полинуклеотид или нуклеиновая кислота могут включать регуляторные элементы, такие как промоторы, энхансеры, сайты связывания рибосом или сигналы терминации транскрипции.

В используемом в данном документе значении кодирующая область или кодирующая последовательность представляет собой участок полинуклеотида, который состоит из кодонов, транслируемых в аминокислоты. Хотя стоп-кодон (TAG, TGA или ТАА) типично не транслируется в аминокислоту, он может считаться частью кодирующей области, но любые фланкирующие последовательности, например промоторы, сайты связывания рибосом, терминаторы транскрипции, интроны и т.п., не являются частью кодирующей области. Границы кодирующей области типично определяются старт-кодоном на 5'-конце, кодирующим амино-конец образующегося полипептида, и кодоном терминации трансляции на 3'-конце, кодирующим карбоксильный конец образующегося полипептида. Две или больше кодирующих областей по настоящему изобретению может присутствовать в одном полинуклеотидном конструкте, например в одном векторе или в отдельных полинуклеотидных конструктах, например в отдельных (разных) векторах. Отсюда следует, что один вектор может содержать только одну кодирующую область, или могут содержать две или больше кодирующих областей, например один вектор может отдельно кодировать первую полипептидную цепь и вторую полипептидную цепь химерной молекулы, как описано ниже. Кроме того, вектор, полинуклеотид, или нуклеиновая кислота по изобретению могут кодировать гетерологичные кодирующие области, слитые или неслитые с нуклеиновой кислотой, кодирующей химерную молекулу по изобретению. Гетерологичные кодирующие области включают, без ограничений, специализированные элементы или мотивы, такие как секреторный сигнальный пептид или гетерологичный функциональный домен.

Определенные белки, секретируемые клетками млекопитающего, ассоциированы с секреторным сигнальным пептидом, который отщепляется от зрелого белка после инициации экспорта растущей белковой цепи через шероховатую эндоплазматическую сеть. Рядовые специалисты в данной области техники знают, что сигнальные пептиды обычно присоединены к N-концу полипептида и отщепляются от полного или полноразмерного полипептида с образованием секретируемой или зрелой формы полипептида. В определенных вариантах реализации используется нативный сигнальный пептид, например сигнальный пептид FVIII или сигнальный пептид VWF, или функциональное производное такой последовательности, которое сохраняет способность направлять секрецию полипептида, функционально ассоциированного с ним. Альтернативно, может быть использован гетерологичный сигнальный пептид млекопитающего, например тканевый активатор плазминогена (ТРА) человека или сигнальный пептид βглюкуронидазы мыши, или их функциональное производное. Термин ниже по ходу транскрипции относится к нуклеотидной последовательности, которая расположена по направлению к 3'-концу от референтной нуклеотидной последовательности. В определенных вариантах реализации изобретения ниже по ходу транскрипции нуклеотидной последовательности относится к последовательности, следующей за точкой начала транскрипции. Например, кодон инициации трансляции гена расположен ниже по ходу транскрипции от сайта начала транскрипции.

Термин против хода транскрипции относится к нуклеотидной последовательности, которая расположена по направлению к 5'-концу от референтной нуклеотидной последовательности. В определенных вариантах реализации изобретения расположенные против хода транскрипции нуклеотидные последовательности относятся к последовательностям, находящимся со стороны 5'-конца от кодирующей области или точки начала транскрипции. Например, большинство промоторов расположены в направлении против хода транскрипции от сайта начала транскрипции.

В используемом в данном документе значении термин регуляторная область относится к нуклеотидным последовательностям, которые расположены в направлении против хода транскрипции (5'некодирующие последовательности), внутри, или ниже по ходу транскрипции (3'-некодирующие последовательности) от кодирующей области, и которые оказывают влияние на транскрипцию, процессинг РНК, стабильность, или трансляция ассоциированной кодирующей области. Регуляторные области могут включать промоторы, лидерные последовательности трансляции, интроны, последовательности распознавания полиаденилирования, сайты процессинга РНК, эффекторные сайты связывания и структуры стебель-петля. Если кодирующая область предназначена для экспрессии в эукариотической клетке, то сигнал полиаденилирования и последовательность терминации транскрипции будут обычно расположены по направлению к 3'-концу от кодирующей последовательности.

Полинуклеотид, который кодирует генный продукт, например полипептид, может включать промо

- 8 041588 тор и/или другие контрольные элементы транскрипции или трансляции, функционально ассоциированные с одной или более кодирующими областями. При функциональной ассоциации кодирующая область генного продукта, например полипептида, ассоциирована с одной или более регуляторными областями таким образом, чтобы поставить экспрессию генного продукта под влияние или контроль регуляторной области (областей). Например, кодирующая область и промотор являются функционально ассоциированными, если индуцирование функции промотора приводит к транскрипции мРНК, кодирующей генный продукт, кодируемый кодирующей областью, и если природа связи между промотором и кодирующей областью не препятствует способности промотора направлять экспрессию генного продукта или не препятствует способности к транскрипции ДНК-матрицы. Другие контрольные элементы транскрипции, кроме промотора, например энхансеры, операторы, репрессоры и сигналы терминации транскрипции, также могут быть функционально ассоциированы с кодирующей областью для направления экспрессии генного продукта.

Различные контрольные области транскрипции известны квалифицированным специалистам в данной области техники. Они включают, без ограничений, контрольные области транскрипции, которые функционируют в клетках позвоночных, такие как, без ограничений, промоторные и энхансерные сегменты цитомегаловирусов (непосредственный ранний промотор, в сочетании с интроном-А), вирус обезьян 40 (ранний промотор) и ретровирусы (такие как вирус саркомы Рауса). Другие контрольные области транскрипции включают области, выделенные из генов позвоночных, такие как актин, белок теплового шока, бычий гормон роста и β-глобин кролика, а также другие последовательности, способные контролировать экспрессию генов в эукариотических клетках. Дополнительне пригодные контрольные области транскрипции включают тканеспецифичные промоторы и энхансеры, а также лимфокин-индуцируемые промоторы (например, промоторы, индуцируемые интерферонами или интерлейкинами). Аналогично, различные контрольные элементы трансляции известны рядовым специалистам в данной области техники. Они включают, без ограничений, сайты связывания рибосом, кодоны инициации и терминации трансляции и элементы, выделенные из пикорнавирусов (в частности, внутренний рибосомосвязывающий сайт, или IRES, также называемый последовательностью CITE).

Термин экспрессия в используемом в данном документе значении относится к процессу, в котором полинуклеотид продуцирует генный продукт, например РНК или полипептид. Он включает, без ограничений, транскрипцию полинуклеотида в матричную РНК (мРНК), транспортную РНК (тРНК), малую шпилечную РНК (shPHK), малую интерферирующую РНК (siPHK) или любой другой РНК-продукт, и трансляцию мРНК в полипептид. Экспрессия дает генный продукт. В используемом в данном документе значении генный продукт может быть или нуклеиновой кислотой, например матричной РНК, полученной в результате транскрипции гена или полипептида, который транслируется из транскрипта. Генные продукты, описанные в данном документе, дополнительно включают нуклеиновые кислоты с посттранскрипционными модификациями, например полиаденилированием или сплайсингом, или полипептиды с посттрансляционными модификациями, например метилированием, гликозилированием, добавлением липидов, ассоциацией с другими белковыми субъединицами или протеолитическим расщеплением.

Вектор относится к любому носителю для клонирования и/или переноса нуклеиновой кислоты в клетку-хозяина. Вектор может быть репликоном, к которому может быть присоединен другой сегмент нуклеиновой кислоты для осуществления репликации присоединенного сегмента. Репликон относится к любому генетическому элементу (например, плазмиде, фагу, космиде, хромосоме, вирусу), который функционирует в качестве автономной единицы репликации in vivo, т.е. способной к репликации под своим собственным контролем. Термин вектор включает как вирусные, так и невирусные носители для введения нуклеиновой кислоты в клетку in vitro, ex vivo или in vivo. В данной области техники известно и используется большое число векторов, включая, например, плазмиды, модифицированные эукариотические вирусы, или модифицированные бактериальные вирусы. Вставка полинуклеотида в пригодный вектор может быть осуществлена путем лигирования соответствующих полинуклеотидных фрагментов в выбранный вектор, имеющий комплементарные липкие концы.

Векторы могут быть подвергнуты генетическим модификациям с целью кодирования селектируемых маркеров или репортеров, которые обеспечивают селекцию или идентификацию клеток со включенным вектором. Экспрессия селектируемых маркеров или репортеров обеспечивает возможность идентификации и/или селекции клеток-хозяев, которые включают и экспрессируют другие кодирующие области, содержащиеся в векторе. Примеры генов селектируемых маркеров, известных и используемых в данной области техники, включают: гены, обеспечивающие стойкость к ампициллину, стрептомицину, гентамицину, канамицин, гигромицин, гербициду биалафосу, сульфонамиду и т.п.; и гены, которые используют в качестве фенотипических маркеров, т.е. регуляторные гены антоцианина, ген изопентанилтрансферазы и т.п. Примеры репортеров, известных и используемых в данной области техники, включают: люциферазу (Luc), зеленый флуоресцентный белок (GFP), хлорамфениколацетилтрансферазу (CAT), -галактозидазу (LacZ), -глюкуронидазу (Gus) и т.п. Селектируемые маркеры могут также считаться репортерами.

Термин плазмида относится к внехромосомальному элементу, часто несущему ген, не являющий

- 9 041588 ся частью центрального метаболизма клетки и обычно имеющий форму кольцевой двухцепочечной молекулы ДНК. Такие элементы могут быть автономно реплицирующими последовательностями, геноминтегрирующими последовательностями, фагом или нуклеотидными последовательностями, линейной, кольцевой или сверхспиральной, одно- или двухцепочечной ДНК или РНК, выделенными из любого источника, в котором ряд нуклеотидных последовательностей был соединен или рекомбинирован в уникальную конструкцию, способную вводить промоторный фрагмент и последовательность ДНК выбранного генного продукта вместе с соответствующей 3'-нетранслированной последовательностью в клетку.

Эукариотические вирусные векторы, которые могут быть использованы, включают, без ограничений, аденовирусные векторы, ретровирусные векторы, адено-ассоциированные вирусные векторы, поксвирус, например векторы на основе вируса коровьей оспы, бакуловирусные векторы или векторы на основе вируса герпеса. Невирусные векторы включают плазмиды, липосомы, электрически заряженные липиды (цитофектины), комплексы ДНК-белок и биополимеры.

Клонирующий вектор относится к репликону, представляющему собой единичный отрезок нуклеиновой кислоты, который реплицируется последовательно, и который содержит точку начала репликации, такой как плазмида, фаг или космида, к которому может быть присоединен другой сегмент нуклеиновой кислоты для осуществления репликации присоединенного сегмента. Определенные клонирующие векторы способны к репликации в одном типе клеток, например бактериях, и экспрессии в другом, например эукариотических клетках. Клонирующие векторы типично содержат одну или более последовательностей, которые могут быть использованы для селекции клеток, содержащих вектор, и/или один или более множественных сайтов клонирования для вставки последовательностей нуклеиновой кислоты, представляющих интерес.

Термин экспрессионный вектор относится к носителю, сконструированному для обеспечения возможности экспрессии вставленной последовательности нуклеиновой кислоты после введения в клетку-хозяина. Вставленная последовательность нуклеиновой кислоты функционально ассоциируется с регуляторными областями, как описано выше.

Векторы вводятся в клетки-хозяева способами, хорошо известными в данной области техники, например трансфекцией, электропорацией, микроинъекцией, трансдукцией, слиянием клеток, с помощью DEAE-декстрана, осаждением фосфата кальция, липофекцией (слияние с лизосомами), с использованием генной пушки или вектора-переносчика ДНК.

Культура, культивировать и культивация, в используемом в данном документе значении, означают инкубирование клеток в условиях in vitro, обеспечивающих возможность роста или деления клеток или поддержание клеток в жизнеспособном состоянии. Культивируемые клетки, в используемом в данном документе значении, означает клетки, размножающиеся in vitro.

В используемом в данном документе значении, термин полипептид рассматривается как охватывающий форму единственного числа полипептид, а также форму множественного числа полипептиды, и относится к молекуле, состоящей из мономеров (аминокислоы), линейно соединенных амидными связями (также известными как пептидные связи). Термин полипептид относится к любой цепи или цепям, состоящим из двух или более аминокислот, и не указывает на определенную длину продукта. Таким образом, пептиды, дипептиды, трипептиды, олигопептиды, белок, аминокислотная цепь или любой другой термин, используемый для обозначения цепи или цепей, состоящих из двух или больше аминокислот, включены в определение полипептида, и термин полипептид может быть использован вместо или взаимозаменяемо с любым из этих терминов. Также предусматривается, что термин полипептид относится к продуктам постэкспрессионной модификации полипептида, включая, без ограничений гликозилирование, ацетилирование, фосфорилирование, амидирование, дериватизацию с помощью известных защитных/блокирующих групп, протеолитическое расщепление, или модификация неприродными аминокислотами. Полипептид может быть выделен из природного биологического источника или получен с использованием рекомбинантной технологии, но не обязательно транслирован из указанной последовательности нуклеиновой кислоты. Он может быть получен любым способом, включая химический синтез.

Выделенный полипептид или его фрагмент, вариант или производное относится к полипептиду, не находящемуся в его природном окружении. Никакой конкретной степени очистки не требуется. Например, выделенный полипептид может быть просто извлечен из его нативного или природного окружения. Рекомбинантно полученные полипептиды и белки, экспрессируемые в клетках-хозяевах, считаются выделенными в целях изобретения, так же, как и нативные или рекомбинантные полипептиды, которые были отделены, фракционированы, или частично или в значительной степени очищены любым пригодным методом.

Настоящее изобретение также включает фрагменты или варианты полипептидов и любую их комбинацию. Термины фрагмент или вариант по отношению к полипептид-связывающим доменам или связывающим молекулам по настоящему изобретению включают любые полипептиды, которые сохраняют, по меньшей мере, некоторые свойства (например, аффинность связывания FcRn по отношению к FcRn-связывающему домену или варианту Fc, коагулирующую активность по отношению к варианту FVIII, или активность связывания FVIII по отношению к белку VWF) референтного полипептид. Фраг

- 10 041588 менты полипептидов включают протеолитические фрагменты, а также фрагменты с делециями, в дополнение к специфическим фрагментам антител, описанным в других разделах данного документа, но не включают природный полноразмерный полипептид (или зрелый полипептид). Варианты полипептидсвязывающих доменов или связывающих молекул по настоящему изобретению включают фрагменты, как описано выше, а также полипептиды с измененными аминокислотными последовательностями в результате аминокислотных замещений, делеций или вставок. Варианты могут встречаться или не встречаться в природных условиях. Неприродные варианты могут быть получены с использованием известных в данной области техники методов мутагенеза. Варианты полипептидов могут содержать консервативные или неконсервативные аминокислотные замещения, делеций или добавления. Термин фрагмент VWF или фрагменты VWF, используемый в данном документе, означает любые фрагменты VWF, которые взаимодействуют с FVIII и сохраняют по меньшей мере одно или более свойств, нормально обеспечиваемых для FVIII полноразмерным VWF, например предотвращение преждевременной активации к FVIIIa, предотвращение преждевременного протеолиза, предотвращение ассоциации с фосфолипидными мембранами, что может приводить к преждевременному клиренсу, предотвращение связывания с клиренс-рецепторами FVIII, которые могут свяывать голый FVIII, но не связанный с VWF FVIII, и/или стабилизацию взаимодействий тяжелой цепи и легкой цепи FVIII. В конкретном варианте реализации изобретения фрагмент VWF, в используемом в данном документе значении, содержит домен D' и домен D3 белка VWF, но не включает домен А1, домен А2, домен A3, домен D4, домен В1, домен В2, домен В3, домен С1, домен С2 и домен CK белка VWF.

Термин фактор, ограничивающий период полувыведения или фактор, ограничивающий период полувыведения FVIII, в используемом в данном документе значении, обозначает фактор, который препятствует увеличению период полувыведения белка FVIII более чем в 1,5 или в 2 раза по сравнению с FVIII дикого типа (например, ADVATE® или REFACTO®). Например, полноразмерный или зрелый VWF может действовать как фактор, ограничивающий период полувыведения FVIII, путем индуцирования выведения комплекса FVIII и VWF из системы по одному или более путям клиренса VWF. В одном примере эндогенный VWF представляет собой фактор, ограничивающий период полувыведения FVIII. В другом примере полноразмерная рекомбинантная молекула VWF, нековалентно связанная с белком FVIII, представляет собой фактор, ограничивающий период полувыведения FVIII.

Термин эндогенный VWF, в используемом в данном документе значении, обозначает молекулы VWF, в природных условиях присутствующие в плазме. Эндогенная молекула VWF может быть мультимером, но может быть мономером или димером. Эндогенный VWF в плазме связывается с FVIII и образует нековалентный комплекс с FVIII. Консервативное аминокислотное замещение представляет собой замещение, при котором аминокислотный остаток замещается на аминокислотный остаток, имеющий схожую боковую цепь. Семейства аминокислотных остатков, имеющих схожие боковые цепи, были определены в данной области техники, включая основные боковые цепи (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотные боковые цепи (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженные полярные боковые цепи (например, глицин, аспарагин, глутамин, серии, треонин, тирозин, цистеин), неполярные боковые цепи (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-разветвленные боковые цепи (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматические боковые цепи (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Таким образом, если аминокислота в полипептиде замещена на другую аминокислоту из того же семейства боковых цепей, такое замещение считается консервативным. В другом варианте реализации изобретения цепочка аминокислот может быть консервативно замещена на структурно схожую цепочку, отличающуюся по порядку и/или по составу членов семейств боковых цепей.

Как известно в данной области техники, идентичность последовательностей между двумя полипептидами определяется путем сравнения аминокислотной последовательности одного полипептида с последовательностью второго полипептида. При обсуждении в данном документе, вопрос о том, является ли какой-либо конкретный полипептид на по меньшей мере около 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 или 100% идентичным другому полипептиду, может быть определен с использованием способов и компьютерных программ/прикладного программного обеспечения, известных в данной области техники, таких как, без ограничений, программа BESTFIT (Wisconsin Sequence Analysis Package (программный пакет для анализа последовательностей, Университет Висконсина), версия 8 для операционной системы Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711). BESTFIT использует алгоритм локальной гомологии Смита и Уотермана (Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981)), для нахождения сегмента с наилучшей гомологией между двумя последовательностями. При использовании BESTFIT или любой другой программы для выравнивания последовательностей с целью определения того, является ли определенная последовательность, например, идентичной на 95% референтной последовательности в соответствии с настоящим изобретением, параметры задаются, конечно, таким образом, чтобы процент идентичности рассчитывался по полной длине референтной полипептидной последовательности, и чтобы были дозволены пробелы в гомологии, составляющие до 5% от общего числа аминокислот в референтной последовательности.

В используемом в данном документе значении аминокислота, соответствующая или эквивалент

- 11 041588 ная аминокислота в последовательности VWF или последовательности белка FVIII определяентся путем выравнивания для максимального увеличения идентичности или подобия между первой последовательностью VWF или FVIII и второй последовательностью VWF или FVIII. Число, используемое для идентификации эквивалентной аминокислоты во второй последовательности VWF или FVIII, основано на числе, используемом для идентификации соответствующей аминокислоты в первой последовательности VWF или FVIII.

Слитая или химерная молекула содержит первую аминокислотную последовательность, связанную со второй аминокислотной последовательностью, с которой она обычно не соединена в природных условиях. Аминокислотные последовательности, нормально присутствующие в разных белках, могут быть объединены в слитом полипептиде, или аминокислотные последовательности, нормально присутствующие в одном и том же белке, могут быть размещены в другом порядке в слитом полипептиде, например, в результате слияния домена фактора VIII по изобретению с доменом иммуноглобулина Fc. Слитый белок получают, например, путем химического синтеза, или путем создания и трансляции полинуклеотида, в котором пептидные области кодируются с желательным взаимным расположением. Химерный белок может дополнительно содержать вторую аминокислотную последовательность, ассоциированную с первой аминокислотной последовательностью с помощью ковалентной непептидной связи или нековалентной связи.

В используемом в данном документе значении термин период полувыведения относится к биологическому периоду полувыведения конкретного полипептида in vivo. Период полувыведения может быть представлен как время, необходимое для выведения половины количества, введенного субъекту, из циркуляции и/или других тканей животного. Если кривая клиренса для данного полипептида строится как функция времени, то эта кривая обычно является двухфазной, с быстрой а-фазой и более длительной Рфазой. а-Фаза типично соответствует равновесию введенного полипептида между внутри- и внесосудистым пространством и, частично, определяется размером полипептида. β-Фаза типично соответствует катаболизму полипептида во внутрисосудистом пространстве. В некоторых вариантах реализации изобретения химерная молекула по изобретению является монофазной и, таким образом, не имеет альфафазы, а только одну бета-фазу. Таким образом, в определенных вариантах реализации изобретения термин период полувыведения в используемом в данном документе значении относится к периоду полувыведения полипептида в β-фазе. Типичный β-фазовый период полувыведения человеческого антитела у людей составляет 21 день.

Термин гетерологичный по отношению к полинуклеотиду или полипептиду означает, что полинуклеотид или полипептид выделены из объекта, отличного от того объекта, с которым он сравнивается. Таким образом, гетерологичный полипептид, связанный с белком VWF, означает полипептидную цепь, которая соединена с белком VWF и не является встречающейся в природе частью белка VWF. Например, гетерологичный полинуклеотид или антиген может быть получен от разных видов, из разных типов клеток индивидуума, или из одних и тех же или разных типов клеток разных индивидуумов. Термин связанный, слитый или соединенный в используемом в данном документе значении, относится к первой аминокислотной последовательности или нуклеотидной последовательности, присоединенной ко второй аминокислотной последовательности или нуклеотидной последовательности (например, с помощью пептидной связи или фосфодиэфирной связи, соответственно). Термин ковалентно связанный или ковалентное соединение относится к ковалентной связи, например дисульфидной связи, пептидной связи, или к одной или более аминокислотам, например линкеру, между двумя фрагментами, связанными вместе. Первая аминокислота или нуклеотидная последовательность может быть непосредственно присоединена ко второй аминокислотной или нуклеотидной последовательности, или, альтернативно, промежуточная последовательность может связывать первую последовательность со второй последовательностью. Термин связанный, слитый, или соединенный означает не только слияние первой аминокислотной последовательности со второй аминокислотной последовательностью на С-конце или Nконце, но также включает вставку целой первой аминокислотной последовательности (или второй аминокислотной последовательности) между любыми двумя аминокислотами второй аминокислотной последовательности (или первой аминокислотной последовательности, соответственно). В одном варианте реализации изобретения первая аминокислотная последовательность может быть присоединена ко второй аминокислотной последовательности с помощью пептидной связи или линкера. Первая нуклеотидная последовательность может быть присоединена ко второй нуклеотидной последовательности с помощью фосфодиэфирной связи или линкера. Линкер может быть пептидом или полипептидом (для полипептидных цепей) или нуклеотидом или нуклеотидной цепью (для нуклеотидных цепей) или любым химическим фрагментом (как для полипептидных, так и для полинуклеотидных цепей). Ковалентная связь иногда обозначается как (-) или черточка.

В используемом в данном документе значении термин ассоциированный с относится к ковалентной или нековалентной связи, образованной между первой аминокислотной цепью и второй аминокислотной цепью. В одном варианте реализации изобретения термин ассоциированный с означает ковалентную непептидную связь или нековалентную связь. В некоторых вариантах реализации такая связь

- 12 041588 обозначается двоеточием, т.е. (:). В другом варианте реализации изобретения он означает ковалентную связь, за исключением пептидной связи. В других вариантах реализации изобретения термин ковалентно ассоциированный, в используемом в данном документе значении, означает ассоциацию между двумя фрагментами с помощью ковалентной связи, например дисульфидной связи, пептидной связи, или одной или более аминокислот (например, линкера). Например, аминокислота цистеин содержит тиольную группу, которая может образовывать дисульфидную связь или мостик с тиольной группой второго цистеинового остатка. У большинства природных молекул IgG, области СН1 и CL соединены дисульфидной связью, и две тяжелые цепи соединены двумя дисульфидными связями в положениях, соответствующих 239 и 242 по системе нумерации Кабат (положения 226 или 229, система нумерации EU). Примеры ковалентных связей включают, без ограничений, пептидную связь, металлическую связь, водородную связь, дисульфидную связь, сигма-связь, пи-связь, дельта-связь, гликозидную связь, агностическую связь, изогнутую связь, диполярную связь, пи-дативное взаимодействие, двойную связь, тройную связь, четверную связь, пятикратную связь, шестикратную связь, конъюгацию, гиперконъюгацию, ароматичность, гаптность или антисвязывание. Неограничивающие примеры нековалентных связей включают ионную связь (например, катион-пи-связь или солевую связь), металлическую связь, водородную связь (например, диводородную связь, диводородный комплекс, низкобарьерную водородную связь, или симметричную водородную связь), вандерваальсовы силы, лондоновские дисперсионные силы, механическую связь, галогенную связь, аурофильность, интеркаляцию, стекинг (stacking), энтропийные силы или химическую полярность.

В используемом в данном документе значении, термин сайт расщепления или сайт ферментативного расщепления относится к сайту, распознаваемому ферментом. В одном варианте реализации изобретения полипептид имеет сайт ферментативного расщепления, расщепляемый ферментом, который активируется в каскаде свертывания, так, чтобы расщепление таких сайтов происходило в месте образования сгустка. В другом варианте реализации изобретения линкер FVIII соединяющий белок FVIII и второй гетерологичный фрагмент, может содержать сайт расщепления. Типичные примеры таких сайтов включают, например, сайты, распознаваемые тромбином, фактором XIa или фактором Ха. Типичные примеры сайтов расщепления FXIa включают, например, TQSFNDFTR (SEQ ID NO: 27) и SVSQTSKLTR (SEQ ID NO: 28). Типичные примеры сайтов расщепления тромбином включают, например, DFLAEGGGVR (SEQ ID NO: 29), TTKTKPR (SEQ ID NO: 30), LVPRG (SEQ ID NO: 31) и ALRPR (аминокислоты 1-5 SEQ ID NO: 26). Другие сайты ферментативного расщепления известны в данной области техники. Сайт расщепления, который может расщепляться тромбином, называется в данном документе сайт расщепления тромбином.

В используемом в данном документе значении, термин сайт процессинга или внутриклеточный сайт процессинга относится к типу сайта ферментативного расщепления в полипептиде, являющегося мишенью для ферментов, которые функционируют после трансляции полипептида. В одном варианте реализации изобретения такие ферменты функционируют во время транспортировки из полости Гольджи в транс-Гольджи компартмент. Ферменты внутриклеточного процессинга расщепляют полипептиды перед секрецией белка из клетки. Примеры таких сайтов процессинга включают, например, сайты, являющиеся мишенями для семейства эндопептидаз РАСЕ/фурин (где РАСЕ является акронимом от Paired basic Amino acid Cleaving Enzyme (фермент, расщепляющий спаренные основные аминокислоты)). Эти ферменты локализованы в мембране Гольджи и расщепляют белки со стороны карбоксильного конца от мотива последовательности Arg-[любой остаток]-(Lys или Arg)-Arg. В используемом в данном документе значении семейство фуриновых ферментов включает, например, PCSK1 (также известен как РС1/РсЗ), PCSK2 (также известен как РС2), PCSK3 (также известен как фурин или РАСЕ), PCSK4 (также известен как РС4), PCSK5 (также известен как РС5 или РС6), PCSK6 (также известен как РАСЕ4) или PCSK7 (также известен как PC7/LPC, РС8 или SPC7). Другие сайты процессинга известны в данной области техники. Термин процессируемый линкер, упоминаемый в данном документе, означает линкер, содержащий сайт внутриклеточного процессинга.

Термин фурин относится к ферментам, классифицированным в соответствии с ЕС (классификация ферментов) как № 3.4.21.75. Фурин представляет собой субтилизин-подобную пропротеинконвертазу, которая также известна как РАСЕ (Paired basic Amino acid Cleaving Enzyme (фермент, расщепляющий спаренные основные аминокислоты)). Фурин делетирует участки неактивных прекурсорных белков, превращая их в биологически активные белки. Во время внутриклеточной транспортировки, пропептид отщепляется от зрелой молекулы VWF ферментом фурином в (аппарате) Гольджи.

Следует понимать, что в конструктах, содержащих несколько сайтов процессинга или расщепления, такие сайты могут быть одинаковыми или разными. Нарушение гемостаза, в используемом в данном документе значении, означает генетически унаследованное или приобретенное состояние, характеризующееся склонностью к кровоизлиянию, спонтанно или в результате травмы, вследствие нарушенной способности или неспособности образовывать фибриновый сгусток. Примеры таких расстройств включают гемофилии. Тремя основными формами являются гемофилия А (дефицит фактора VIII), гемофилия В (дефицит фактора IX или болезнь Кристмаса) и гемофилия С (дефицит фактора XI, слабая склонность к кровотечению). Другие расстройства гемостаза включают, например, болезнь фон Виллебранда, дефицит

- 13 041588 фактора XI (дефицит РТА), дефицит фактора XII, недостаточности или структурные аномалии фибриногена, протромбина, фактора V, фактора VII, фактора X или фактора XIII, синдром Бернара-Сулье, который представляет собой дефект или дефицит GPIb. GPIb, представляющий собой рецептор VWF, может быть дефектным и приводить к недостаточности первичного образования сгустка (первичный гемостаз) и повышенной склонности к кровотечениям) и тромбастении Гланцманна-Негели (тромбастения Гланцманна). При печеночной недостаточности (острая и хроническая формы) наблюдается недостаточное продуцирование коагулирующих факторов печенью; это может увеличивать риск кровотечения.

Химерные молекулы по изобретению могут быть использованы профилактично. В используемом в данном документе значении термин профилактическое лечение относится к введению молекулы до эпизода кровотечения. В одном варианте реализации изобретения субъект, нуждающийся в гемостатическом средстве общего действия, подвергается, или должен быть подвергнут, хирургии. Химерный белок по изобретению может быть введен до или после хирургии в качестве профилактики. Химерный белок по изобретению может быть введен во время или после хирургии для остановки острого эпизода кровотечения. Хирургия может включать, без ограничений, трансплантацию печени, резекцию печени, зубоврачебные процедуры или трансплантацию стволовых клеток.

Химерная молекула по изобретению также используется для лечения по требованию (также называемого эпизодическим). Термин лечение по требованию или эпизодическое лечение относится к введению химерной молекулы в ответ на симптомы эпизода кровотечения или перед активностью, которая может вызвать кровотечение. В одном аспекте лечение по требованию (эпизодическое) может быть предоставлено субъекту при начале кровотечения, например после травмы, или при ожидаемом кровотечении, например перед хирургией. В другом аспекте лечение по требованию может быть предоставлено до активностей, которые увеличивают риск кровотечения, таких как контактные виды спорта.

В используемом в данном документе значении термин острое кровотечение относится к эпизоду кровотечения независимо от вызвавшей его причины. Например, субъект может иметь травму, уремию, наследственное нарушение, сопровождающееся повышенной кровоточивостью (например, дефицит фактора VII), тромбоцитарное расстройство или резистентность вследствие выработки антител к факторам свертывания крови.

Лечить, лечение, лечащий, в используемом в данном документе значении, относятся, например, к снижению тяжести болезни или состояния; уменьшению продолжительности течения болезни; облегчению одного или более симптомов, ассоциированных с болезнью или состоянием; обеспечению полезных эффектов для субъекта с болезнью или состоянием, без обязательного исцеления болезни или состояния, или профилактике одного или более симптомов, ассоциированных с болезнью или состоянием. В одном варианте реализации изобретения термин лечить или лечение означает поддержание у субъекта минимального уровня перед введением очередной дозы FVIII, равного по меньшей мере около 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 МЕ/дл путем введения химерной молекулы по изобретению. В другом варианте реализации изобретения лечить или лечение означает поддержание минимального уровня FVIII перед введением очередной дозы, имеющего значение между около 1 и около 20 МЕ/дл, около 2 и около 20 МЕ/дл, около 3 и около 20 МЕ/дл, около 4 и около 20 МЕ/дл, около 5 и около 20 МЕ/дл, около 6 и около 20 МЕ/дл, около 7 и около 20 МЕ/дл, около 8 и около 20 МЕ/дл, около 9 и около 20 МЕ/дл или около 10 и около 20 МЕ/дл. Лечение или терапия болезни или состояния может также включать поддержание у субъекта активности FVIII на уровне, сопоставимом с по меньшей мере около 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20% активности FVIII у субъекта без гемофилии. Минимальный уровень перед введением очередной дозы, необходимый для лечения, может быть измерен одним или более известными способами и может быть отрегулирован (увеличен или уменьшен) для каждого субъекта.

II. Химерные молекулы.

Химерные молекулы по изобретению предназначены для улучшения высвобождения белка VWF или белка FVIII от другого фрагмента, с которым связан белок VWF или белок FVIII. Изобретение обеспечивает расщепляемый тромбином линкер, который может быстро и эффективно расщепляться в месте повреждения. В одном аспекте изобретения химерная молекула может содержать белок фактора фон Виллебранда (VWF), гетерологичный фрагмент (H1), последовательность XTEN и линкер VWF, соединяющий белок VWF с гетерологичным фрагментом, причем линкер VWF содержит полипептид, выбранный из: (i) области а2 из фактора VIII (FVIII); (ii) области a1 из FVIII; (iii) области а3 из FVIII; (iv) сайта расщепления тромбином, содержащего X-V-P-R (SEQ ID NO: 3) и мотив экзосайта взаимодействия PAR1, где X представляет собой алифатическую аминокислоту; или (v) любую их комбинацию, и последовательность XTEN соединена с белком VWF, гетерологичным фрагментом (H1), линкером VWF или любой их комбинацией. В другом аспекте изобретения химерная молекула может содержать первую полипептидную цепь, которая содержит белок VWF, гетерологичный фрагмент (H1) и линкер VWF, соединяющий белок VWF и гетерологичный фрагмент (H1), и вторую полипептидную цепь, содержащую белок FVIII и последовательность XTEN, причем линкер VWF в первой полипептидной цепи содержит: (i) область а2 из FVIII; (ii) область a1 из FVIII; (iii) область а3 из FVIII; (iv) сайт расщепления тромбином, содержащий X-V-P-R (SEQ ID NO: 3) и мотив экзосайта взаимодействия PAR1, где X представляет собой

- 14 041588 алифатическую аминокислоту; или (v) любую их комбинацию, и первая полипептидная цепь и вторая полипептидная цепь ассоциированы друг с другом.

В других аспектах изобретения химерная молекула содержит полипептидную цепь, содержащую белок FVIII, соединенный с гетерологичным фрагментом с помощью линкера FVIII, причем линкер FVIII содержит: (i) область а2 из FVIII; (ii) область a1 из FVIII; (iii) область а3 из FVIII; (iv) сайт расщепления тромбином, содержащий X-V-P-R (SEQ ID NO: 3) и мотив экзосайта взаимодействия PAR1, где X представляет собой алифатическую аминокислоту; или (v) любую их комбинацию.

П.А. Химерные молекулы с VWF, XTEN, линкером VWF.

Настоящее изобретение предусматривает химерную молекулу, содержащую белок VWF, слитый с последовательностью XTEN с помощью линкера VWF, причем линкер VWF содержит полипептид, выбранный из: (i) области а2 из FVIII; (ii) области a1 из FVIII; (iii) области а3 из FVIII; (iv) сайта расщепления тромбином, содержащего X-V-P-R (SEQ ID NO: 3) и мотива экзосайта взаимодействия PAR1, где X представляет собой алифатическую аминокислоту; или (v) любой их комбинации.

В одном варианте реализации изобретения химерная молекула содержит белок VWF, гетерологичный фрагмент (H1), последовательность XTEN и линкер VWF, соединяющий белок VWF с гетерологичным фрагментом, причем последовательность XTEN расположена между белком VWF и линкером VWF, и линкер VWF содержит полипептид, выбранный из: (i) области а2 из фактора VIII (FVIII); (ii) области a1 из FVIII; (iii) области а3 из FVIII; (iv) сайта расщепления тромбином, содержащего X-V-P-R (SEQ ID NO: 3) и мотив экзосайта взаимодействия PAR1, где X представляет собой алифатическую аминокислоту; или (v) любой их комбинации. В другом варианте реализации изобретения химерная молекула содержит белок VWF, гетерологичный фрагмент (H1), последовательность XTEN и линкер VWF, соединяющий белок VWF с гетерологичным фрагментом, причем последовательность XTEN расположена между линкером VWF и гетерологичным фрагментом, и линкер VWF содержит полипептид, выбранный из: (i) области а2 из FVIII; (ii) области a1 из FVIII; (iii) области а3 из FVIII; (iv) сайта расщепления тромбином, содержащего X-V-P-R (SEQ ID NO: 3) и мотив экзосайта взаимодействия PAR1, где X представляет собой алифатическую аминокислоту; или (v) любой их комбинации. В других вариантах реализации изобретения химерная молекула дополнительно содержит полипептидную цепь, содержащую белок FVIII, причем первая цепь, содержащая белок VWF, и вторая цепь, содержащая белок FVIII, ассоциированы друг с другом. В одном примере ассоциация может быть ковалентной ассоциацией, например, дисульфидной связью. В еще одних вариантах реализации изобретения полипептидная цепь, содержащая белок FVIII дополнительно содержит дополнительную последовательность XTEN. Дополнительная последовательность XTEN может быть связана с N-концом или С-концом белка FVIII или вставлена между двумя соседними аминокислотами FVIII. В других вариантах реализации изобретения цепь, содержащая белок FVIII, дополнительно содержит второй гетерологичный фрагмент (Н2). В некоторых вариантах реализации изобретения белок FVIII соединен со вторым гетерологичным фрагментом с помощью линкера FVIII. В определенных вариантах реализации изобретения линкер FVIII идентичен линкеру VWF, соединяющему белок VWF и гетерологичный фрагмент. В других вариантах реализации изобретения линкер FVIII отличается от линкера VWF, соединяющего белок VWF и гетерологичный фрагмент.

В определенных вариантах реализации изобретения химерная молекула имеет формулу, выбранную из: (i) V-L1-X1-H1:H2-L2-X2-C; (ii) V-X1-L1-H1:H2-L2-X2-C; (iii) V-L1-X1-H1:H2-X2-L2-C; (iv) V-X1L1-H1:H2-X2-L2-C; (v) V-L1-X1-H1:H2-L2-C(X2); (vi) V-X1-L1-H1:H2-L2-C(X2); (vii) C-X2-L2-H2:H1X1-L1-V; (viii) C-X2-L2-H2:H1-L1-X1-V; (ix) C-L2-X2-H2:H1-L1-X1-V; (x) C-L2-X2-H2:H1-L1-X1-V; (xi) C(X2)-L2-H2:H1-X1-L1-V; или (xii) C(X2)-L2-H2:H1-L1-X1-V; где V обозначает белок VWF; L1 обозначает линкер VWF; L2 обозначает необязательный линкер FVIII; H1 представляет собой первый гетерологичный фрагмент; Н2 обозначает второй гетерологичный фрагмент; X1 обозначает последовательность XTEN; X2 обозначает необязательную последовательность XTEN; С обозначает белок FVIII; C(X2) обозначает белок FVIII, слитый с последовательностью XTEN, причем последовательность XTEN вставлена между двумя соседними аминокислотами FVIII; (-) обозначает пептидную связь или одну или более аминокислот; и (:) обозначает ковалентную связь между H1 и Н2.

В некоторых вариантах реализации изобретения белок FVIII в химерной молекуле содержит третий гетерологичный фрагмент (Н3), который может быть последовательностью XTEN. В других вариантах реализации изобретения белок FVIII химерной молекулы содержит четвертый гетерологичный фрагмент (Н4), который может быть последовательностью XTEN. В еще одних вариантах реализации изобретения белок FVIII химерной молекулы содержит пятый гетерологичный фрагмент (Н5), который может быть последовательностью XTEN. В других вариантах реализации изобретения белок FVIII химерной молекулы содержит шестой гетерологичный фрагмент (Н6), который может быть последовательностью XTEN. В определенных вариантах реализации изобретения один или более из третьего гетерологичного фрагмента (Н3), четвертого гетерологичного фрагмента (Н4), пятого гетерологичного фрагмента (Н5) и шестого гетерологичного фрагмента (Н6) способны увеличивать период полувыведения химерной молекулы. В некоторых вариантах реализации изобретения третий гетерологичный фрагмент (Н3), четвертый гетерологичный фрагмент (Н4), пятый гетерологичный фрагмент (Н5) и шестой гетерологичный фрагмент (Н6) присоединены к С-концу или N-концу FVIII или вставлены между двумя аминокислотами белка FVIII.

- 15 041588

II.B. Химерные молекулы с FVIII, XTEN, белком VWF, линкером VWF.

Настоящее изобретение также предусматривает химерную молекулу, содержащую первую полипептидную цепь, которая содержит белок VWF, гетерологичный фрагмент (H1) и линкер VWF, соединяющий белок VWF и гетерологичный фрагмент (H1), и вторую полипептидную цепь, содержащую белок FVIII и последовательность XTEN, причем линкер VWF в первой полипептидной цепи содержит: (i) область а2 из FVIII; (ii) область a1 из FVIII; (iii) область а3 из FVIII; (iv) сайт расщепления тромбином, содержащий X-V-P-R (SEQ ID NO: 3) и мотив экзосайта взаимодействия PAR1, где X представляет собой алифатическую аминокислоту; или (v) любую их комбинацию, и первая полипептидная цепь и вторая полипептидная цепь ассоциированы друг с другом. В одном варианте реализации последовательность XTEN присоединена к N-концу или С-концу белка FVIII или вставлена между двумя соседними аминокислотами FVIII. В другом варианте реализации изобретения химерная молекула дополнительно содержит дополнительную последовательность XTEN, которая связана с белком VWF, гетерологичным фрагментом, линкером VWF, или любой их комбинацией. В других вариантах реализации изобретения химерная молекула дополнительно содержит второй гетерологичный фрагмент (Н2). В других вариантах реализации изобретения второй гетерологичный фрагмент химерной молекулы соединен с белком FVIII, последовательностью XTEN или обоими. В других вариантах реализации изобретения второй гетерологичный фрагмент химерной молекулы соединен с белком FVIII или последовательностью XTEN с помощью линкера FVIII. В других вариантах реализации изобретения линкер FVIII идентичен линкеру VWF. В некоторых вариантах реализации изобретения линкер FVIII отличается от линкера VWF. В определенных вариантах реализации изобретения химерная молекула имеет формулу, выбранную из: (i) V-L1-X1H1:H2-L2-X2-C; (ii) V-X1-L1-H1:H2-L2-X2-C; (iii) V-L1-X1-H1:H2-X2-L2-C; (iv) V-X1-L1-H1:H2-X2-L2C; (v) V-L1-X1-H1:H2-L2-C(X2); (vi) V-X1-L1-H1:H2-L2-C(X2); (vii) C-X2-L2-H2:H1-X1-L1-V; (viii) CX2-L2-H2:H1-L1-X1-V; (ix) C-L2-X2-H2:H1-L1-X1-V; (x) C-L2-X2-H2:H1-L1-X1-V; (xi) C(X2)-L2-H2:H1X1-L1-V; или (xii) C(X2)-L2-H2:H1-L1-X1-V; где V обозначает белок VWF; L1 обозначает линкер VWF; L2 обозначает необязательный линкер FVIII; H1 представляет собой первый гетерологичный фрагмент; Н2 обозначает второй гетерологичный фрагмент; X1 обозначает необязательную последовательность XTEN; X2 обозначает последовательность XTEN; С обозначает белок FVIII; С(Х2) обозначает белок FVIII, слитый с последовательностью XTEN, причем последовательность XTEN вставлена между двумя соседними аминокислотами FVIII; (-) обозначает пептидную связь или одну или более аминокислот; и (:) обозначает ковалентную связь между H1 и Н2. В одном варианте реализации изобретения линкер VWF и линкер FVIII могут быть одинаковыми. В другом варианте реализации изобретения линкер VWF и линкер FVIII являются разными. В определенных вариантах реализации изобретения белок FVIII химерной молекулы содержит третий гетерологичный фрагмент (Н3), который может быть последовательностью XTEN. В других вариантах реализации изобретения белок FVIII химерной молекулы содержит четвертый гетерологичный фрагмент (Н4), который является последовательностью XTEN. В еще одних вариантах реализации изобретения белок FVIII химерной молекулы содержит пятый гетерологичный фрагмент (Н5), который может быть последовательностью XTEN. В других вариантах реализации изобретения белок FVIII содержит шестой гетерологичный фрагмент (Н6), который может быть последовательностью XTEN. В определенных вариантах реализации изобретения один или более из третьего гетерологичного фрагмента (Н3), четвертого гетерологичного фрагмента (Н4), пятого гетерологичного фрагмента (Н5) и шестого гетерологичного фрагмента (Н6) способны увеличивать период полувыведения химерной молекулы. В некоторых вариантах реализации изобретения третий гетерологичный фрагмент (Н3), четвертый гетерологичный фрагмент (Н4), пятый гетерологичный фрагмент (Н5) и/или шестой гетерологичный фрагмент (Н6) присоединены к С-концу или N-концу FVIII или вставлены между двумя аминокислотами белка FVIII.

П.С. Химерные молекулы с FVIII, XTEN и линкером FVIII.

Химерная молекула по изобретению может содержать белок FVIII, последовательность XTEN и гетерологичный фрагмент, присоединенный с помощью линкера FVIII, который содержит (i) область а2 из FVIII; (ii) область a1 из FVIII; (iii) область а3 из FVIII; (iv) сайт расщепления тромбином, содержащий XV-P-R (SEQ ID NO: 3) и мотив экзосайта взаимодействия PAR1, где X представляет собой алифатическую аминокислоту; или (v) любую их комбинацию. В определенных вариантах реализации изобретения химерная молекула содержит две полипептидные цепи - первую цепь, содержащую белок FVIII, соединенный с первой Fc-областью с помощью линкера FVIII, и вторую цепь, содержащую белок VWF (например, домен D' и домен D3 VWF), соединенную с Fc-областью, причем линкер FVIII в первой полипептидной цепи содержит: (i) область а2 из FVIII; (ii) область a1 из FVIII; (iii) область а3 из FVIII; (iv) сайт расщепления тромбином, содержащий X-V-P-R (SEQ ID NO: 3) и мотив экзосайта взаимодействия PAR1, где X представляет собой алифатическую аминокислоту; или (v) любую их комбинацию, и первая полипептидная цепь и вторая полипептидная цепь ассоциированы друг с другом, и последовательность XTEN присоединена к первому полипептиду (например, к N-концу или С-концу белка FVIII, линкеру или первой Fc-области или внутри белка FVIII), ко второму полипептиду (например, к N-концу или Сконцу белка VWF или Fc-области или внутри белка FVIII) или к обоим. В конкретном варианте реализации линкер в первой полипептидной цепи содержит область а2 из FVIII.

- 16 041588

В определенных вариантах реализации изобретения химерная молекула имеет формулу, выбранную из: (i) V-L2-X2-H2: H1-L1-X1-C; (ii) V-X2-L2-H2: H1-L1-X1-C; (iii) V-L2-X2-H2: H1-X1-L1-C; (iv) V-X2L2-H2: H1-X1-L1-C; (v) V-L2-X2-H2: H1-L1-C(X1); (vi) V-X2-L2-H2: Hl-Ll-C(X1); (vii) C-X1-L1-H1: H2X2-L2-V; (viii) C-X1-L1-H1: H2-L2-X2-V; (ix) C-L1-X1-H1:H2-L2-X2-V; (x) C-L1-X1-H1:H2-L2-X2-V; (xi) C(X1)-L1-H1:H2-X2-L2-V; или (xii) C(X1)-L1-H1:H2-L2-X2-V, где V обозначает белок VWF; L1 представляет собой линкер FVIII; L2 обозначает необязательный линкер VWF; H1 представляет собой первый гетерологичный фрагмент; Н2 обозначает второй гетерологичный фрагмент; X1 обозначает необязательную последовательность XTEN; X2 обозначает необязательную последовательность XTEN; С обозначает белок FVIII; C(X1) обозначает белок FVIII, слитый с последовательностью XTEN, причем последовательность XTEN вставлена между двумя соседними аминокислотами FVIII; (-) обозначает пептидную связь или одну или более аминокислот; и (:) обозначает ковалентную связь между H1 и Н2, и где в химерной молекуле присутствует по меньшей мере одна последовательность XTEN. В одном варианте реализации изобретения линкер VWF и линкер FVIII являются одинаковыми. В другом варианте реализации изобретения линкер VWF и линкер FVIII являются разными.

II.D. Компоненты химерных молекул.

П.С.1. Линкер VWF или линкер FVIII.

Линкер VWF или линкер FVIII, пригодный для химерной молекулы по изобретению, представляет собой расщепляемый тромбином линкер, соединяющий белок VWF с гетерологичным фрагментом или белок FVIII с гетерологичным фрагментом. В одном варианте реализации изобретения линкер VWF или линкер FVIII содержит область a1 FVIII. В другом варианте реализации изобретения линкер VWF или линкер FVIII содержит область а2 FVIII. В других вариантах реализации изобретения линкер VWF или линкер FVIII содержит область а3 FVIII. В других вариантах реализации изобретения линкер VWF или линкер FVIII содержит сайт расщепления тромбином, содержащий X-V-P-R (SEQ ID NO: 3) и мотив экзосайта взаимодействия PAR1, где X представляет собой алифатическую аминокислоту.

В одном варианте реализации изобретения линкер VWF или линкер FVIII содержит область a1, которая содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на около 80, около 85, около 90, около 95, около 96, около 97, около 98, около 99 или 100% идентичную участку от Met337 до Arg372, соответствующему полноразмерному зрелому FVIII, где область a1 способна расщепляться тромбином. В другом варианте реализации изобретения линкер VWF или линкер FVIII содержит область a1, которая содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на около 80, около 85, около 90, около 95, около 96, около 97, около 98, около 99 или 100% идентичную аминокислотам 337-374, соответствующим полноразмерному зрелому FVIII, где область a1 способна расщепляться тромбином. В других вариантах реализации изобретения линкер VWF или линкер FVIII дополнительно содержит дополнительные аминокислоты, например одну, две, три, четыре, пять, десять или больше. В конкретном варианте реализации изобретения линкер VWF или линкер FVIII содержит ISMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSV (SEQ ID NO: 5). В некоторых вариантах реализации изобретения линкер VWF или линкер FVIII содержит область а2, которая содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на около 80, около 85, около 90, около 95, около 96, около 97, около 98, около 99 или 100% идентичную участку от Glu720 до Arg740, соответствующему полноразмерному зрелому FVIII, где область а2 способна расщепляться тромбином. В других вариантах реализации изобретения линкер VWF или линкер FVIII содержит область а2, которая содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на около 80, около 85, около 90, около 95, около 96, около 97, около 98, около 99% или 100% идентичную аминокислотам 712-743, соответствующим полноразмерному зрелому FVIII. В еще одних вариантах реализации изобретения линкер VWF или линкер FVIII дополнительно содержит дополнительные аминокислоты, например одну, две, три, четыре, пять, десять или больше. В конкретном варианте реализации изобретения линкер VWF содержит ISDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 4).

В определенных вариантах реализации изобретения линкер VWF или линкер FVIII содержит область а3, которая содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на около 80, около 85, около 90, около 95, около 96, около 97, около 98, около 99 или 100% идентичную участку от Glu1649 до Arg1689, соответствующему полноразмерному зрелому FVIII, где область а3 способна расщепляться тромбином. В некоторых вариантах реализации изобретения линкер VWF или линкер FVIII содержит область а3, которая содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на около 80%, около 85, около 90, около 95, около 96, около 97, около 98, около 99 или 100% идентичную аминокислотам 1649-1692, соответствующим полноразмерному зрелому FVIII, где область а3 способна расщепляться тромбином. В других вариантах реализации изобретения линкер VWF или линкер FVIII дополнительно содержит дополнительные аминокислоты, например одну, две, три, четыре, пять, десять или больше. В конкретном варианте реализации изобретения линкер VWF или линкер FVIII содержит ISEITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQ (SEQ ID NO: 6).

В других вариантах реализации изобретения линкер VWF или линкер FVIII содержит сайт расщепления тромбином, содержащий X-V-P-R (SEQ ID NO: 3) и мотив экзосайта взаимодействия PAR1, где мотив экзосайта взаимодействия PAR1 содержит S-F-L-L-R-N (SEQ ID NO: 7). В некоторых вариантах

- 17 041588 реализации изобретения мотив экзосайта взаимодействия PAR1 дополнительно содержит аминокислотную последовательность, выбранную из Р, P-N, P-N-D, P-N-D-K (SEQ ID NO: 8), P-N-D-K-Y (SEQ ID NO: 9), P-N-D-K-Y-E (SEQ ID NO: 10), P-N-D-K-Y-E-P (SEQ ID NO: 11), P-N-D-K-Y-E-P-F (SEQ ID NO: 12), P-N-D-K-Y-E-P-F-W (SEQ ID NO: 13), P-N-D-K-Y-E-P-F-W-E (SEQ ID NO: 14), P-N-D-K-Y-E-P-F-W-E-D (SEQ ID NO: 20), P-N-D-K-Y-E-P-F-W-E-D-E (SEQ ID NO: 21), P-N-D-K-Y-E-P-F-W-E-D-E-E (SEQ ID NO: 22), P-N-D-K-Y-E-P-F-W-E-D-E-E-S (SEQ ID NO: 23) или любой их комбинации. В других вариантах реализации изобретения алифатическую аминокислоту для сайта расщепления тромбином, содержащего X-V-P-R, выбирают из глицина, аланина, валина, лейцина или изолейцина. В конкретном варианте реализации изобретения сайт расщепления тромбином содержит L-V-P-R. В некоторых вариантах реализации изобретения тромбин расщепляет линкер VWF или линкер FVIII быстрее, чем тромбин расщеплял бы сайт расщепления тромбином (например, L-V-P-R), если бы сайт расщепления тромбином (L-V-P-R) замещал линкер VWF или линкер FVIII, соответственно (т.е. без мотива экзосайта взаимодействия PAR1). В некоторых вариантах реализации изобретения тромбин расщепляет линкер VWF или линкер FVIII по меньшей мере в около 10 раз, по меньшей мере в около 20 раз, по меньшей мере в около 30 раз, по меньшей мере в около 40 раз, по меньшей мере в около 50 раз, по меньшей мере в около 60 раз, по меньшей мере в около 70 раз, по меньшей мере в около 80 раз, по меньшей мере в около 90 раз или по меньшей мере в около 100 раз быстрее, чем тромбин расщеплял бы сайт расщепления тромбином (например, L-V-P-R), если бы сайт расщепления тромбином (например, L-V-P-R) замещал линкер VWF или линкер FVIII.

В некоторых вариантах реализации изобретения линкер VWF или линкер FVIII, содержащий (i) область a1, (ii) область а2, (iii) область а3 или (iv) сайт расщепления тромбином X-V-P-R и мотив экзосайта взаимодействия PAR1, дополнительно содержит одну или более аминокислот, имеющих длину по меньшей мере около 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800 или 2000 аминокислот. В одном варианте реализации изобретения одна или более аминокислот содержат пептид gly. В другом варианте реализации изобретения одна или более аминокислот содержат GlyGly. В других вариантах реализации изобретения одна или более аминокислот содержат IleSer. В еще одних вариантах реализации изобретения одна или более аминокислот содержат пептид gly/ser. В других вариантах реализации изобретения одна или более аминокислот содержат пептид gly/ser, имеющий формулу (Gly4Ser)n или S(Gly4Ser)n, где n обозначает положительное целое число, выбранное из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 или 100. В некоторых вариантах реализации изобретения одна или более аминокислот содержат (Gly₄Ser)₃ (SEQ ID NO: 89) или (Gly₄Ser)₄ (SEQ ID NO: 90).

И.С.2. Белок VWF.

VWF (также известен как F8VWF) представляет собой большой мультимерный гликопротеин, присутствующий в плазме крови и продуцируемый конститутивно в эндотелии (в тельцах Вейбеля-Паладе), мегакариоцитах (а-гранулах тромбоцитов) и субэндотелиальной соединительной ткани. Основной мономер VWF представляет собой белок, состоящий из 2813 аминокислот. Каждый мономер содержит ряд специфических доменов со специфическими функциями - домен D'/D3 (который связывается с фактором VIII), домен А1 (который связывается с рецептором GPIb тромбоцитов, гепарином, и/или возможно коллагеном), домен A3 (который связывается с коллагеном), домен С1 (в котором домен RGD связывается с интегрином тромбоцитов aIIbe3 при его активации) и домен цистеинового узла на С-конце белка (который VWF делит с фактором роста тромбоцитов (PDGF), трансформирующим фактором роста-β (TGFe) и β-хорионическим гонадотропином человека (eHCG)).

Термин белок VWF в используемом в данном документе значении включает, без ограничений, полноразмерный белок VWF или функциональные фрагменты VWF, содержащие домен D' и домен D3, способные ингибировать связывание эндогенного VWF с FVIII. В одном варианте реализации изобретения белок VWF связывается с FVIII. В другом варианте реализации изобретения белок VWF блокирует сайт связывания VWF на FVIII, тем самым ингибируя взаимодействие FVIII с эндогенным VWF. В других вариантах реализации изобретения белок VWF не выводится путями клиренса VWF. Белки VWF включают производные, варианты, мутанты или аналоги, сохраняющие такие активности VWF.

Мономерная последовательность человеческого VWF из 2813 аминокислот депонирована в Genbank под номером доступа _NP_000543.2__. Нуклеотидная последовательность, кодирующая человеческий VWF, депонирована в Genbank под номером доступа_NM_000552.3_. Нуклеотидная последовательность человеческого VWF обозначена как SEQ ID NO: 1. SEQ ID NO: 2 представляет собой аминокислотную последовательность, кодируемую SEQ ID NO: 1. Все домены VWF перечислены в табл. 1.

- 18 041588

Таблица 1. Последовательности VWF

Домены VWF	Аминокислотная последовательность
Сигнальный пептид VWF (аминокислоты 1-22 SEQ ГО NO: 2)	1 MIPARFAGVL LALALILPGT LC 22
Область D1D2 VWF (аминокислоты 23-763 SEQ ГО NO: 2)	23 AEGTRGRS STARCSLFGS DFVNTFDGSM 51 YSFAGYCSYL LAGGCQKRSF SIIGDFQNGK RVSLSVYLGE FFDIHLFVNG 101 TVTQGDQRVS MPYASKGLYL ETEAGYYKLS GEAYGFVARI DGSGNFQVLL 151 SDRYFNKTCG LCGNFNIFAE DDFMTQEGTL TSDPYDFANS WALSSGEQWC 201 ERASPPSSSC NISSGEMQKG LWEQCQLLKS TSVFARCHPL VDPEPFVALC 251 EKTLCECAGG LECACPALLE YARTCAQEGM VLYGWTDHSA CSPVCPAGME 301 YRQCVSPCAR TCQSLHINEM CQERCVDGCS CPEGQLLDEG LCVESTECPC 351 VHSGKRYPPG TSLSRDCNTC ICRNSQWICS NEECPGECLV TGQSHFKSFD 401 NRYFTFSGIC QYLLARDCQD HSFSIVIETV QCADDRDAVC TRSVTVRLPG 451 LHNSLVKLKH GAGVAMDGQD IQLPLLKGDL RIQHTVTASV RLSYGEDLQM 501 DWDGRGRLLV KLSPVYAGKT CGLCGNYNGN QGDDFLTPSG LAEPRVEDFG

- 19 041588

	551 NAWKLHGDCQ DLQKQHSDPC ALNPRMTRFS EEACAVLTSP TFEACHRAVS 601 PLPYLRNCRY DVCSCSDGRE CLCGALASYA AACAGRGVRV AWREPGRCEL 651 NCPKGQVYLQ CGTPCNLTCR SLSYPDEECN EACLEGCFCP PGLYMDERGD 701 CVPKAQCPCY YDGEIFQPED IFSDHHTMCY CEDGFMHCTM SGVPGSLLPD 751 AVLSSPLSHR SKR 763
Домен D’ VWF	764 SLSCRPP MVKLVCPADN LRAEGLECTK TCQNYDLECM 801 SMGCVSGCLC PPGMVRHENR CVALERCPCF HQGKEYAPGE TVKIGCNTCV 851 CRDRKWNCTD HVCDAT 866
Домен D3 VWF	⁸⁶⁷ C S T I_ GMAH YL T_F_D_G_ ДДХДДДДЕ CQ YyLyQDYCGS ⁹⁰¹ NPGT FRI LVG_ Д KGCJ HJ_S VK ДАKRVTILVE _GGEI ELFDGE VNVKRPMKDE 951 thfevvesgr_ ууудддбКАД ДДУУршуд⁷ vvlkqt yqe KVCGLCGNFp 10 01 GIQNNDLT S S_ ДД QVEEDyДД A^N_SWKVS SQ _CADT RKVP LD ЗЗРАТСНДД! 1051 MKQTMVDSS C_ ДДДT_S_DVF_Q_D _CNKLVD PE PY _LDVC IYDT C S CESIGDCACF 1101 GDTIAAYAHy_ CAQHGJVVTW ATATLCPQSC _EERNLRENGY ECEWRYNSCA 1151 PACQyTCQHP_ А^РДА^САА^С_УАУДНАНСР PG _KILDELLQTC ypPEDCPyCE 12 01 VAGRRFASGK_ КуТДДРЗДРД_HCQ АДСруу_NLTCEACQEP 1240
Домен Al VWF	12 41 GGLWPPTDA 1251 PVSPTTLYVE DISEPPLHDF YCSRLLDLVF LLDGSSRLSE AEFEVLKAFV 1301 VDMMERLRIS QKWVRVAWE YHDGSHAYIG LKDRKRPSEL RRIASQVKYA 1351 GSQVASTSEV LKYTLFQIFS KIDRPEASRI ALLLMASQEP QRMSRNFVRY 1401 VQGLKKKKVI VIPVGIGPHA NLKQIRLIEK QAPENKAFVL SSVDELEQQR 1451 DEIVSYLCDL APEAPPPTLP PDMAQVTVG 1479
	Нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 1)
Полноразмерный VWF	1 ATGATTCCTG CCAGATTTGC CGGGGTGCTG CTTGCTCTGG CCCTCATTTT 51 GCCAGGGACC CTTTGTGCAG AAGGAACTCG CGGCAGGTCA TCCACGGCCC 101 GATGCAGCCT TTTCGGAAGT GACTTCGTCA ACACCTTTGA TGGGAGCATG 151 TACAGCTTTG CGGGATACTG CAGTTACCTC CTGGCAGGGG GCTGCCAGAA 201 ACGCTCCTTC TCGATTATTG GGGACTTCCA GAATGGCAAG AGAGTGAGCC 251 TCTCCGTGTA TCTTGGGGAA TTTTTTGACA TCCATTTGTT TGTCAATGGT 301 ACCGTGACAC AGGGGGACCA AAGAGTCTCC ATGCCCTATG CCTCCAAAGG 351 GCTGTATCTA GAAACTGAGG CTGGGTACTA CAAGCTGTCC GGTGAGGCCT 401 ATGGCTTTGT GGCCAGGATC GATGGCAGCG GCAACTTTCA AGTCCTGCTG

- 20 041588

451 TCAGACAGAT ACTTCAACAA GACCTGCGGG CTGTGTGGCA ACTTTAACAT 501 CTTTGCTGAA GATGACTTTA TGACCCAAGA AGGGACCTTG ACCTCGGACC 551 CTTATGACTT TGCCAACTCA TGGGCTCTGA GCAGTGGAGA ACAGTGGTGT 601 GAACGGGCAT CTCCTCCCAG CAGCTCATGC AACATCTCCT CTGGGGAAAT 651 GCAGAAGGGC CTGTGGGAGC AGTGCCAGCT TCTGAAGAGC ACCTCGGTGT 701 TTGCCCGCTG CCACCCTCTG GTGGACCCCG AGCCTTTTGT GGCCCTGTGT 751 GAGAAGACTT TGTGTGAGTG TGCTGGGGGG CTGGAGTGCG CCTGCCCTGC 801 CCTCCTGGAG TACGCCCGGA CCTGTGCCCA GGAGGGAATG GTGCTGTACG 851 GCTGGACCGA CCACAGCGCG TGCAGCCCAG TGTGCCCTGC TGGTATGGAG 901 TATAGGCAGT GTGTGTCCCC TTGCGCCAGG ACCTGCCAGA GCCTGCACAT 951 CAATGAAATG TGTCAGGAGC GATGCGTGGA TGGCTGCAGC TGCCCTGAGG 1001 GACAGCTCCT GGATGAAGGC CTCTGCGTGG AGAGCACCGA GTGTCCCTGC 1051 GTGCATTCCG GAAAGCGCTA CCCTCCCGGC ACCTCCCTCT CTCGAGACTG 1101 CAACACCTGC ATTTGCCGAA ACAGCCAGTG GATCTGCAGC AATGAAGAAT 1151 GTCCAGGGGA GTGCCTTGTC ACTGGTCAAT CCCACTTCAA GAGCTTTGAC 1201 AACAGATACT TCACCTTCAG TGGGATCTGC CAGTACCTGC TGGCCCGGGA 1251 TTGCCAGGAC CACTCCTTCT CCATTGTCAT TGAGACTGTC CAGTGTGCTG 1301 ATGACCGCGA CGCTGTGTGC ACCCGCTCCG TCACCGTCCG GCTGCCTGGC 1351 CTGCACAACA GCCTTGTGAA ACTGAAGCAT GGGGCAGGAG TTGCCATGGA 1401 TGGCCAGGAC ATCCAGCTCC CCCTCCTGAA AGGTGACCTC CGCATCCAGC 1451 ATACAGTGAC GGCCTCCGTG CGCCTCAGCT ACGGGGAGGA CCTGCAGATG 1501 GACTGGGATG GCCGCGGGAG GCTGCTGGTG AAGCTGTCCC CCGTCTATGC 1551 CGGGAAGACC TGCGGCCTGT GTGGGAATTA CAATGGCAAC CAGGGCGACG 1601 ACTTCCTTAC CCCCTCTGGG CTGGCRGAGC CCCGGGTGGA GGACTTCGGG 1651 AACGCCTGGA AGCTGCACGG GGACTGCCAG GACCTGCAGA AGCAGCACAG 1701 CGATCCCTGC GCCCTCAACC CGCGCATGAC CAGGTTCTCC GAGGAGGCGT 1751 GCGCGGTCCT GACGTCCCCC ACATTCGAGG CCTGCCATCG TGCCGTCAGC 1801 CCGCTGCCCT ACCTGCGGAA CTGCCGCTAC GACGTGTGCT CCTGCTCGGA 1851 CGGCCGCGAG TGCCTGTGCG GCGCCCTGGC CAGCTATGCC GCGGCCTGCG 1901 CGGGGAGAGG CGTGCGCGTC GCGTGGCGCG AGCCAGGCCG CTGTGAGCTG 1951 AACTGCCCGA AAGGCCAGGT GTACCTGCAG TGCGGGACCC CCTGCAACCT 2001 GACCTGCCGC TCTCTCTCTT ACCCGGATGA GGAATGCAAT GAGGCCTGCC

- 21 041588

2051 TGGAGGGCTG CTTCTGCCCC CCAGGGCTCT ACATGGATGA GAGGGGGGAC 2101 TGCGTGCCCA AGGCCCAGTG CCCCTGTTAC TATGACGGTG AGATCTTCCA 2151 GCCAGAAGAC ATCTTCTCAG ACCATCACAC CATGTGCTAC TGTGAGGATG 2201 GCTTCATGCA CTGTACCATG AGTGGAGTCC CCGGAAGCTT GCTGCCTGAC 2251 GCTGTCCTCA GCAGTCCCCT GTCTCATCGC AGCAAAAGGA GCCTATCCTG 2301 TCGGCCCCCC ATGGTCAAGC TGGTGTGTCC CGCTGACAAC CTGCGGGCTG 2351 AAGGGCTCGA GTGTACCAAA ACGTGCCAGA ACTATGACCT GGAGTGCATG 2401 AGCATGGGCT GTGTCTCTGG CTGCCTCTGC CCCCCGGGCA TGGTCCGGCA 2451 TGAGAACAGA TGTGTGGCCC TGGAAAGGTG TCCCTGCTTC CATCAGGGCA 2501 AGGAGTATGC CCCTGGAGAA ACAGTGAAGA TTGGCTGCAA CACTTGTGTC 2551 TGTCGGGACC GGAAGTGGAA CTGCACAGAC CATGTGTGTG ATGCCACGTG 2601 CTCCACGATC GGCATGGCCC ACTACCTCAC CTTCGACGGG CTCAAATACC 2651 TGTTCCCCGG GGAGTGCCAG TACGTTCTGG TGCAGGATTA CTGCGGCAGT 2701 AACCCTGGGA CCTTTCGGAT CCTAGTGGGG AATAAGGGAT GCAGCCACCC 2751 CTCAGTGAAA TGCAAGAAAC GGGTCACCAT CCTGGTGGAG GGAGGAGAGA 2801 TTGAGCTGTT TGACGGGGAG GTGAATGTGA AGAGGCCCAT GAAGGATGAG 2851 ACTCACTTTG AGGTGGTGGA GTCTGGCCGG TACATCATTC TGCTGCTGGG 2901 CAAAGCCCTC TCCGTGGTCT GGGACCGCCA CCTGAGCATC TCCGTGGTCC 2951 TGAAGCAGAC ATACCAGGAG AAAGTGTGTG GCCTGTGTGG GAATTTTGAT 3001 GGCATCCAGA ACAATGACCT CACCAGCAGC AACCTCCAAG TGGAGGAAGA 3051 CCCTGTGGAC TTTGGGAACT CCTGGAAAGT GAGCTCGCAG TGTGCTGACA 3101 CCAGAAAAGT GCCTCTGGAC TCATCCCCTG CCACCTGCCA TAACAACATC 3151 ATGAAGCAGA CGATGGTGGA TTCCTCCTGT AGAATCCTTA CCAGTGACGT 3201 CTTCCAGGAC TGCAACAAGC TGGTGGACCC CGAGCCATAT CTGGATGTCT 3251 GCATTTACGA CACCTGCTCC TGTGAGTCCA TTGGGGACTG CGCCTGCTTC 3301 TGCGACACCA TTGCTGCCTA TGCCCACGTG TGTGCCCAGC ATGGCAAGGT 3351 GGTGACCTGG AGGACGGCCA CATTGTGCCC CCAGAGCTGC GAGGAGAGGA 3401 ATCTCCGGGA GAACGGGTAT GAGTGTGAGT GGCGCTATAA CAGCTGTGCA 3451 CCTGCCTGTC AAGTCACGTG TCAGCACCCT GAGCCACTGG CCTGCCCTGT 3501 GCAGTGTGTG GAGGGCTGCC ATGCCCACTG CCCTCCAGGG AAAATCCTGG 3551 ATGAGCTTTT GCAGACCTGC GTTGACCCTG AAGACTGTCC AGTGTGTGAG 3601 GTGGCTGGCC GGCGTTTTGC CTCAGGAAAG AAAGTCACCT TGAATCCCAG

- 22 041588

3651 TGACCCTGAG CACTGCCAGA TTTGCCACTG TGATGTTGTC AACCTCACCT 3701 GTGAAGCCTG CCAGGAGCCG GGAGGCCTGG TGGTGCCTCC CACAGATGCC 3751 CCGGTGAGCC CCACCACTCT GTATGTGGAG GACATCTCGG AACCGCCGTT 3801 GCACGATTTC TACTGCAGCA GGCTACTGGA CCTGGTCTTC CTGCTGGATG 3851 GCTCCTCCAG GCTGTCCGAG GCTGAGTTTG AAGTGCTGAA GGCCTTTGTG 3901 GTGGACATGA TGGAGCGGCT GCGCATCTCC CAGAAGTGGG TCCGCGTGGC 3951 CGTGGTGGAG TACCACGACG GCTCCCACGC CTACATCGGG CTCAAGGACC 4001 GGAAGCGACC GTCAGAGCTG CGGCGCATTG CCAGCCAGGT GAAGTATGCG 4051 GGCAGCCAGG TGGCCTCCAC CAGCGAGGTC TTGAAATACA CACTGTTCCA 4101 AATCTTCAGC AAGATCGACC GCCCTGAAGC CTCCCGCATC GCCCTGCTCC 4151 TGATGGCCAG CCAGGAGCCG CAACGGATGT CCCGGAACTT TGTCCGCTAC 4201 GTCCAGGGCC TGAAGAAGAA GAAGGTCATT GTGATCCCGG TGGGCATTGG 4251 GCCCCATGCC AACCTCAAGC AGATCCGCCT CATCGAGAAG CAGGCCCCTG 4301 AGAACAAGGC CTTCGTGCTG AGCAGTGTGG ATGAGCTGGA GCAGCAAAGG 4351 GACGAGATCG TTAGCTACCT CTGTGACCTT GCCCCTGAAG CCCCTCCTCC 4401 TACTCTGCCC CCCGACATGG CACAAGTCAC TGTGGGCCCG GGGCTCTTGG 4451 GGGTTTCGAC CCTGGGGCCC AAGAGGAACT CCATGGTTCT GGATGTGGCG 4501 TTCGTCCTGG AAGGATCGGA CAAAATTGGT GAAGCCGACT TCAACAGGAG 4551 CAAGGAGTTC ATGGAGGAGG TGATTCAGCG GATGGATGTG GGCCAGGACA 4601 GCATCCACGT CACGGTGCTG CAGTACTCCT ACATGGTGAC CGTGGAGTAC 4651 CCCTTCAGCG AGGCACAGTC CAAAGGGGAC ATCCTGCAGC GGGTGCGAGA 4701 GATCCGCTAC CAGGGCGGCA ACAGGACCAA CACTGGGCTG GCCCTGCGGT 4751 ACCTCTCTGA CCACAGCTTC TTGGTCAGCC AGGGTGACCG GGAGCAGGCG 4801 CCCAACCTGG TCTACATGGT CACCGGAAAT CCTGCCTCTG ATGAGATCAA 4851 GAGGCTGCCT GGAGACATCC AGGTGGTGCC CATTGGAGTG GGCCCTAATG 4901 CCAACGTGCA GGAGCTGGAG AGGATTGGCT GGCCCAATGC CCCTATCCTC 4951 ATCCAGGACT TTGAGACGCT CCCCCGAGAG GCTCCTGACC TGGTGCTGCA 5001 GAGGTGCTGC TCCGGAGAGG GGCTGCAGAT CCCCACCCTC TCCCCTGCAC 5051 CTGACTGCAG CCAGCCCCTG GACGTGATCC TTCTCCTGGA TGGCTCCTCC 5101 AGTTTCCCAG CTTCTTATTT TGATGAAATG AAGAGTTTCG CCAAGGCTTT 5151 CATTTCAAAA GCCAATATAG GGCCTCGTCT CACTCAGGTG TCAGTGCTGC 5201 AGTATGGAAG CATCACCACC ATTGACGTGC CATGGAACGT GGTCCCGGAG

- 23 041588

5251 AAAGCCCATT TGCTGAGCCT TGTGGACGTC ATGCAGCGGG AGGGAGGCCC 5301 CAGCCAAATC GGGGATGCCT TGGGCTTTGC TGTGCGATAC TTGACTTCAG 5351 AAATGCATGG TGCCAGGCCG GGAGCCTCAA AGGCGGTGGT CATCCTGGTC 5401 ACGGACGTCT CTGTGGATTC AGTGGATGCA GCAGCTGATG CCGCCAGGTC 5451 CAACAGAGTG ACAGTGTTCC CTATTGGAAT TGGAGATCGC TACGATGCAG 5501 CCCAGCTACG GATCTTGGCA GGCCCAGCAG GCGACTCCAA CGTGGTGAAG 5551 CTCCAGCGAA TCGAAGACCT CCCTACCATG GTCACCTTGG GCAATTCCTT 5601 CCTCCACAAA CTGTGCTCTG GATTTGTTAG GATTTGCATG GATGAGGATG 5651 GGAATGAGAA GAGGCCCGGG GACGTCTGGA CCTTGCCAGA CCAGTGCCAC 5701 ACCGTGACTT GCCAGCCAGA TGGCCAGACC TTGCTGAAGA GTCATCGGGT 5751 CAACTGTGAC CGGGGGCTGA GGCCTTCGTG CCCTAACAGC CAGTCCCCTG 5801 TTAAAGTGGA AGAGACCTGT GGCTGCCGCT GGACCTGCCC CTGYGTGTGC 5851 ACAGGCAGCT CCACTCGGCA CATCGTGACC TTTGATGGGC AGAATTTCAA 5901 GCTGACTGGC AGCTGTTCTT ATGTCCTATT TCAAAACAAG GAGCAGGACC 5951 TGGAGGTGAT TCTCCATAAT GGTGCCTGCA GCCCTGGAGC AAGGCAGGGC 6001 TGCATGAAAT CCATCGAGGT GAAGCACAGT GCCCTCTCCG TCGAGSTGCA 6051 CAGTGACATG GAGGTGACGG TGAATGGGAG ACTGGTCTCT GTTCCTTACG 6101 TGGGTGGGAA CATGGAAGTC AACGTTTATG GTGCCATCAT GCATGAGGTC 6151 AGATTCAATC ACCTTGGTCA CATCTTCACA TTCACTCCAC AAAACAATGA 6201 GTTCCAACTG CAGCTCAGCC CCAAGACTTT TGCTTCAAAG ACGTATGGTC 6251 TGTGTGGGAT CTGTGATGAG AACGGAGCCA ATGACTTCAT GCTGAGGGAT 6301 GGCACAGTCA CCACAGACTG GAAAACACTT GTTCAGGAAT GGACTGTGCA 6351 GCGGCCAGGG CAGACGTGCC AGCCCATCCT GGAGGAGCAG TGTCTTGTCC 6401 CCGACAGCTC CCACTGCCAG GTCCTCCTCT TACCACTGTT TGCTGAATGC 6451 CACAAGGTCC TGGCTCCAGC CACATTCTAT GCCATCTGCC AGCAGGACAG 6501 TTGCCACCAG GAGCAAGTGT GTGAGGTGAT CGCCTCTTAT GCCCACCTCT 6551 GTCGGACCAA CGGGGTCTGC GTTGACTGGA GGACACCTGA TTTCTGTGCT 6601 ATGTCATGCC CACCATCTCT GGTCTACAAC CACTGTGAGC ATGGCTGTCC 6651 CCGGCACTGT GATGGCAACG TGAGCTCCTG TGGGGACCAT CCCTCCGAAG 6701 GCTGTTTCTG CCCTCCAGAT AAAGTCATGT TGGAAGGCAG CTGTGTCCCT 6751 GAAGAGGCCT GCACTCAGTG CATTGGTGAG GATGGAGTCC AGCACCAGTT 6801 CCTGGAAGCC TGGGTCCCGG ACCACCAGCC CTGTCAGATC TGCACATGCC

- 24 041588

6851 TCAGCGGGCG GAAGGTCAAC TGCACAACGC AGCCCTGCCC CACGGCCAAA 6901 GCTCCCACGT GTGGCCTGTG TGAAGTAGCC CGCCTCCGCC AGAATGCAGA 6951 CCAGTGCTGC CCCGAGTATG AGTGTGTGTG TGACCCAGTG AGCTGTGACC 7001 TGCCCCCAGT GCCTCACTGT GAACGTGGCC TCCAGCCCAC ACTGACCAAC 7051 CCTGGCGAGT GCAGACCCAA CTTCACCTGC GCCTGCAGGA AGGAGGAGTG 7101 CAAAAGAGTG ТССССАСССТ CCTGCCCCCC GCACCGTTTG СССАСССТТС 7151 GGAAGACCCA GTGCTGTGAT GAGTATGAGT GTGCCTGCAA CTGTGTCAAC 7201 TCCACAGTGA GCTGTCCCCT TGGGTACTTG GCCTCAACCG CCACCAATGA 7251 CTGTGGCTGT АССАСААССА CCTGCCTTCC CGACAAGGTG TGTGTCCACC 7301 GAAGCACCAT CTACCCTGTG GGCCAGTTCT GGGAGGAGGG CTGCGATGTG 7351 TGCACCTGCA CCGACATGGA GGATGCCGTG ATGGGCCTCC GCGTGGCCCA 7401 GTGCTCCCAG AAGCCCTGTG AGGACAGCTG TCGGTCGGGC TTCACTTACG 7451 TTCTGCATGA AGGCGAGTGC TGTGGAAGGT GCCTGCCATC TGCCTGTGAG 7501 GTGGTGACTG GCTCACCGCG GGGGGACTCC CAGTCTTCCT GGAAGAGTGT 7551 CGGCTCCCAG TGGGCCTCCC CGGAGAACCC CTGCCTCATC AATGAGTGTG 7601 TCCGAGTGAA GGAGGAGGTC ТТТАТАСААС AAAGGAACGT CTCCTGCCCC 7651 CAGCTGGAGG TCCCTGTCTG CCCCTCGGGC TTTCAGCTGA GCTGTAAGAC 7701 CTCAGCGTGC TGCCCAAGCT GTCGCTGTGA GCGCATGGAG GCCTGCATGC 7751 TCAATGGCAC TGTCATTGGG CCCGGGAAGA CTGTGATGAT CGATGTGTGC 7801 ACGACCTGCC GCTGCATGGT GCAGGTGGGG GTCATCTCTG GATTCAAGCT 7851 GGAGTGCAGG AAGACCACCT GCAACCCCTG CCCCCTGGGT TACAAGGAAG 7901 ААААТААСАС AGGTGAATGT TGTGGGAGAT GTTTGCCTAC GGCTTGCACC 7951 ATTCAGCTAA GAGGAGGACA GATCATGACA CTGAAGCGTG ATGAGACGCT 8001 CCAGGATGGC TGTGATACTC ACTTCTGCAA GGTCAATGAG AGAGGAGAGT 8051 ACTTCTGGGA GAAGAGGGTC ACAGGCTGCC CACCCTTTGA TGAACACAAG 8101 TGTCTTGCTG AGGGAGGTAA AATTATGAAA ATTCCAGGCA CCTGCTGTGA 8151 CACATGTGAG GAGCCTGAGT GCAACGACAT CACTGCCAGG CTGCAGTATG 8201 TCAAGGTGGG AAGCTGTAAG TCTGAAGTAG AGGTGGATAT CCACTACTGC 8251 CAGGGCAAAT GTGCCAGCAA AGCCATGTAC TCCATTGACA TCAACGATGT 8301 GCAGGACCAG TGCTCCTGCT GCTCTCCGAC ACGGACGGAG CCCATGCAGG 8351 TGGCCCTGCA CTGCACCAAT GGCTCTGTTG TGTACCATGA GGTTCTCAAT 8401 GCCATGGAGT GCAAATGCTC CCCCAGGAAG TGCAGCAAGT GA

Белок VWF, в используемом в данном документе значении, может содержать домен D' и домен D3 VWF, причем белок VWF связывается с FVIII и ингибирует связывание эндогенного VWF (полноразмерного VWF) с FVIII. Белок VWF, содержащий домен D' и домен D3, может дополнительно содержать домен VWF, выбранный из домена А1, домена А2, домена A3, домена D1, домена D2, домена D4, домена В1, домена В2, домена В3, домена С1, домена С2, домена CK, одного или более их фрагментов, или любую их комбинацию. В одном варианте реализации изобретения белок VWF содержит, состоит, по существу, из, или состоит из: (1) доменов D' и D3 VWF или их фрагментов; (2) доменов D1, D' и D3 VWF или их фрагментов; (3) доменов D2, D' и D3 VWF или их фрагментов; (4) доменов D1, D2, D' и D3 VWF или их фрагментов; или (5) доменов D1, D2, D', D3 или А1 VWF или их фрагментов. Белок VWF, описанный в данном документе, не содержит сайта связывания рецептора клиренса VWF. Белок VWF по настоящему изобретению может содержать любые другие последовательности, связанные с или слитые с белком VWF. Например, белок VWF, описанный в данном документе, может дополнительно содержать сигнальный пептид.

В одном варианте реализации изобретения белок VWF связывается с или ассоциирован с белком FVIII. Благодаря связыванию с или ассоциации с белком FVIII, белок VWF по изобретению может защищать FVIII от расщепления протеазами и активации FVIII, стабилизирует тяжелую цепь и легкую

- 25 041588 цепь FVIII и предотвращает клиренс FVIII фагоцитарными рецепторами. В другом варианте реализации изобретения белок VWF связывается с или ассоциирует с белком FVIII и блокирует или предотвращает связывание белка FVIII с фосфолипидом и активированным белком С. В результате предотвращения или ингибирования связывания белка FVIII с эндогенным полноразмерным VWF, белок VWF по изобретению уменьшает клиренс FVIII рецепторами клиренса эндогенного VWF и, таким образом, увеличивает период полувыведения белка FVIII. Увеличение периода полувыведения белка FVIII, таким образом, вызвано ассоциацией белка FVIII с белком VWF с отсутствующим сайтом связывания рецептора клиренса VWF и, тем самым, экранирования и/или защиты белка FVIII от эндогенного VWF, который содержит сайт связывания рецептора клиренса VWF. Белок FVIII, связанный с или защищенный белком VWF, может также обеспечить возможность рециркуляции белка FVIII. Благодаря устранению сайтов связывания рецепторов пути клиренса VWF в полноразмерной молекуле VWF, гетеродимеры FVIII/VWF по изобретению защищены от пути клиренса VWF, что дополнительно увеличиает период полувыведения FVIII.

В одном варианте реализации изобретения белок VWF по настоящему изобретению содержит домен D' и домен D3 VWF, причем домен D' является по меньшей мере на около 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичным аминокислотам 764-866 SEQ ID NO: 2, и белок VWF предотвращает связывание эндогенного VWF с FVIII. В другом варианте реализации изобретения белок VWF содержит домен D' и домен D3 VWF, причем домен D3 является по меньшей мере на 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичным аминокислотам 867-1240 SEQ ID NO: 2, и белок VWF предотвращает связывание эндогенного VWF с FVIII. В некоторых вариантах реализации изобретения белок VWF, описанный в данном документе, содержит, состоит по существу из, или состоит из домена D' и домена D3 VWF, которые являются по меньшей мере на 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичными аминокислотам 764-1240 SEQ ID NO: 2, и белок VWF предотвращает связывание эндогенного VWF с FVIII. В других вариантах реализации изобретения белок VWF содержит, состоит, по существу, из, или состоит из доменов D1, D2, D' и D3, по меньшей мере на 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичных аминокислотам 23-1240 SEQ ID NO: 2, и белок VWF предотвращает связывание эндогенного VWF с FVIII. В еще одних вариантах реализации изобретения белок VWF дополнительно содержит функционально связанный с ним сигнальный пептид. В некоторых вариантах реализации изобретения белок VWF по изобретению состоит, по существу, из или состоит из (1) домена D'D3, домена D1D'D3, домена D2D'D3 или домена D1D2D'D3, и (2) дополнительной последовательности VWF, содержащей до около 10 аминокислот (например, любых последовательностей от аминокислоты 764-1240 SEQ ID NO: 2 до аминокислоты 764-1250 SEQ ID NO: 2), до около 15 аминокислот (например, любых последовательностей от аминокислоты 764-1240 SEQ ID NO: 2 до аминокислоты 764-1255 SEQ ID NO: 2), до около 20 аминокислот (например, любых последовательностей от аминокислоты 764-1240 SEQ ID NO: 2 до аминокислоты 764-1260 SEQ ID NO: 2), до около 25 аминокислот (например, любых последовательностей от аминокислоты 764-1240 SEQ ID NO: 2 до аминокислоты 764-1265 SEQ ID NO: 2), или до около 30 аминокислот (например, любых последовательностей от аминокислоты 764-1240 SEQ ID NO: 2 до аминокислоты 764-1260 SEQ ID NO: 2). В конкретном варианте реализации изобретения белок VWF, содержащий или состоящий по существу из домена D' и домена D3, не является аминокислотами 764-1274 SEQ ID NO: 2 или полноразмерным зрелым VWF. В некоторых вариантах реализации изобретения домен D1D2 экспрессируется в транс-конфигурации с доменом D'D3. В некоторых вариантах реализации изобретения домен D1D2 экспрессируется в цис-конфигурации с доменом D'D3.

В других вариантах реализации изобретения белок VWF, содержащий домены D'D3, связанные с доменами D1D2, дополнительно содержит внутриклеточный сайт процессинга, например, (сайт процессинга РАСЕ (фурина) или РС5), что обеспечивает возможность отщепления доменов D1D2 от доменов D'D3 после экспрессии. Неограничивающие примеры внутриклеточных сайтов процессинга раскрыты в других разделах данного документа.

В других вариантах реализации изобретения белок VWF содержит домен D' и домен D3, но не содержит аминокислотной последовательности, выбранной из (1) аминокислот 1241-2813 SEQ ID NO: 2, (2) от аминокислоты 1270 до аминокислоты 2813 SEQ ID NO: 2, (3) от аминокислоты 1271 до аминокислоты 2813 SEQ ID NO: 2, (4) от аминокислоты 1272 до аминокислоты 2813 SEQ ID NO: 2, (5) от аминокислоты 1273 до аминокислоты 2813 SEQ ID NO: 2, (6) от аминокислоты 1274 до аминокислоты 2813 SEQ ID NO: 2, или любую их комбинацию.

В еще одних вариантах реализации изобретения белок VWF по настоящему изобретению содержит, состоит, по существу, из, или состоит из аминокислотной последовательности, соответствующей домену D', домену D3 и домену А1, причем аминокислотная последовательность является по меньшей мере на 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичной аминокислотам 764-1479 SEQ ID NO: 2, и белок VWF предотвращает связывание эндогенного VWF с FVIII. В конкретном варианте реализации изобретения белок VWF не является аминокислотами 764-1274 SEQ ID NO: 2.

В некоторых вариантах реализации изобретения белок VWF по изобретению содержит домен D' и домен D3, но не содержит по меньшей мере одного домена VWF, выбранного из (1) домена А1, (2) домена А2, (3) домена A3, (4) домена D4, (5) домена В1, (6) домена В2, (7) домена В3, (8) домена С1, (9) домена С2, (10) домена CK, (11) домена CK и домена С2, (12) домена CK, домена С2 и домена С1, (13) до

- 26 041588 мена CK, домена С2, домена С1, домена В3, (14) домена CK, домена С2, домена С1, домена В3, домена В2, (15) домена CK, домена С2, домена С1, домена В3, домена В2 и домена В1, (16) домена CK, домена С2, домена С1, домена В3, домена В2, домена В1 и домена D4, (17) домена CK, домена С2, домена С1, домена В3, домена В2, домена В1, домена D4 и домена A3, (18) домена CK, домена С2, домена С1, домена В3, домена В2, домена В1, домена D4, домена A3 и домена А2, (19) домена CK, домена С2, домена С1, домена В3, домена В2, домена В1, домена D4, домена A3, домена А2 и домена А1, или (20) любую их комбинацию.

В других вариантах реализации изобретения белок VWF содержит домены D'D3 и один или более доменов или модулей. Примеры таких доменов или модулей включают, без ограничений, домены и модули, раскрытые в Zhour et al., Blood, интернет-публикация 6 апреля 2012 г: DOI 10.1182/blood-2012-01405134. Например, белок VWF, может содержать домен D'D3 и один или более доменов или модулей, выбранных из домена А1, домена А2, домена A3, модуля D4N, модуля VWD4, модуля С8-4, модуля TIL4, модуля С1, модуля С2, модуля С3, модуля С4, модуля С5, модуля С5, модуля С6 или любую их комбинацию.

В определенных вариантах реализации изобретения белок VWF по изобретению образует мультимер, например димер, тример, тетрамер, пентамер, гексамер, гептамер или мультимеры более высокого порядка. В других вариантах реализации изобретения белок VWF представляет собой мономер, содержащий только один белок VWF. В некоторых вариантах реализации изобретения белок VWF по настоящему изобретению может иметь одно или более аминокислотных замещений, делеций, добавлений или модификаций. В одном варианте реализации изобретения белок VWF может включать аминокислотные замещения, делеций, добавления или модификации, так чтобы белок VWF был неспособен образовывать дисульфидную связь или образовывать димер или мультимер. В другом варианте реализации изобретения аминокислотное замещение находится внутри домена D' и домена D3. В конкретном варианте реализации изобретения белок VWF по изобретению содержит по меньшей мере одно аминокислотное замещение в остатке, соответствующем остатку 1099, остатку 1142, или обоим остаткам 1099 и 1142 SEQ ID NO: 2. По меньшей мере одно аминокислотное замещение может быть любыми аминокислотами, которые не встречаются в природных условиях в VWF дикого типа. Например, аминокислотное замещение может быть любыми аминокислотами, отличными от цистеина, например изолейцином, аланином, лейцином, аспарагином, лизином, аспарагиновой кислотой, метионином, фенилаланином, глутаминовой кислотой, треонином, глутамином, триптофаном, глицином, валином, пролином, серином, тирозином, аргинином или гистидином. В другом примере, аминокислотное замещение содержит одну или более аминокислот, препятствующих или ингибирующих образование мультимеров белками VWF.

В некоторых вариантах реализации изобретения белок VWF содержит аминокислотное замещение цистеина на аланин в положении остатка 336, соответствующего домену D'D3 VWF (остаток 1099 SEQ ID NO: 2) и аминокислотное замещение цистеина на аланин в положении остатка 379, соответствующего домену D'D3 VWF (остаток 1142 SEQ ID NO: 2), или оба.

В определенных вариантах реализации изобретения белок VWF, пригодный для использования по данному документу, может быть дополнительно модифицирован с целью улучшения его взаимодействия с FVIII, например для улучшения аффинности связывания с FVIII. В качестве неограничивающего примера, белок VWF содержит остаток серина в положении остатка, соответствующего аминокислоте 764 SEQ ID NO: 2 и остаток лизина в положении остатка, соответствующего аминокислоте 773 SEQ ID NO: 2. Остатки 764 и/или 773 могут вносить свой вклад в аффинность связывания белков VWF с FVIII. В других вариантах реализации изобретения белок VWF, пригодный для использования по изобретению, может иметь другие модификации, например белок может быть пегилированным, гликозилированным, гэкилированным или полисиалилированным.

П.С.3. Гетерологичный фрагмент.

Гетерологичный фрагмент, который может быть связан с белком VWF с помощью линкера VWF или с белком FVIII с помощью линкера FVIII, может быть гетерологичным полипептидом или гетерологичным неполипептидным фрагментом. В определенных вариантах реализации изобретения гетерологичный фрагмент представляет собой молекулу, увеличивающую период полувыведения, которая известна в данной области техники и содержит полипептид, неполипептидный фрагмент, или комбинацию их обоих. Гетерологичный полипептидный фрагмент может содержать белок FVIII, константную область иммуноглобулина или ее участок, альбумин или его фрагмент, альбуминсвязывающий фрагмент, трансферрин или его фрагмент, последовательность PAS, последовательность НАР, их производное или вариант, С-концевой пептид (СТР) β-субъединицы хорионического гонадотропина человека, или любую их комбинацию. В некоторых вариантах реализации изобретения неполипептидный связывающий фрагмент содержит полиэтиленгликоль (ПЭГ), полисиаловую кислоту, гидроксиэтилкрахмал (ГЭК), их производное, или любую их комбинацию. В определенных вариантах реализации изобретения могут присутствовать один, два, три или больше гетерологичных фрагментов, которые могут быть все одинаковыми или разными молекулами.

П.С.3.а Константная область иммуноглобулина или ее часть.

Константная область иммуноглобулина состоит из доменов, обозначенных как домены СН (Con- 27 041588 stant Heavy - константные тяжелые) (CH1, CH2 и т.д.). В зависимости от изотипа, (т.е. IgG, IgM, IgA IgD или IgE), константная область может состоять из трех или четырех доменов СН. Константные области некоторых изотипов (например, IgG) также содержат шарнирную область. См. Janeway et al. 2001, Immunobiology, Garland Publishing, N.Y., N.Y.

Константная область иммуноглобулина или ее участок для получения химерного белка по настоящему изобретению могут быть получены из ряда разных источников. В некоторых вариантах реализации изобретения константную область иммуноглобулина или ее участок выделяют из человеческого иммуноглобулина. Следует понимать, однако, что константная область иммуноглобулина или ее часть может быть выделены из иммуноглобулина другого вида млекопитающих, включая, например, грызуна (например, мышь, крысу, кролика, морскую свинку) или вида не являющегося человеком примата (например, шимпанзе, макак). Кроме того, константная область иммуноглобулина или ее часть могут быть выделены из иммуноглобулина любого класса, включая IgM, IgG, IgD, IgA и IgE, и любого изотипа иммуноглобулина, включая IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. В одном варианте реализации изобретения используется человеческий изотип IgG1. Различные генные последовательности константной области иммуноглобулина (например, генные последовательности человеческой константной области) являются доступными в форме публично доступных депозитариев. Могут быть выбраны последовательности доменов константной области, имеющие конкретную эффекторную функцию (или с отсутствующей конкретной эффекторной функцией), или с конкретной модификацией для снижения иммуногенности. Было опубликовано большое количество последовательностей антител и антитело-кодирующих генов, и пригодные последовательности константной области Ig (например, последовательности шарнира, СН2 и/или СН3, или их частей) могут быть выделены из таких последовательностей с использованием общепризнанных в данной области техники методов. Генетический материал, полученный с использованием любых из вышеописанных способов, может быть затем изменен или синтезирован для получения полипептидов по настоящему изобретению. Дополнительно следует понимать, что объем данного изобретения охватывает аллели, варианты и мутации последовательностей ДНК константной области. Последовательности константной области иммуноглобулина или ее части могут быть клонированы, например, с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) и праймеров, выбранных для амплификации домена, представляющего интерес. Для клонирования последовательности константной области иммуноглобулина или ее части из антитела, мРНК может быть выделена из гибридомы, селезенки или лимфатических клеток, подвергнута обратной транскрипции в ДНК, и гены антитела могут быть амплифицированы методом ПНР. Способы амплификации с использованием ПЦР описаны подробно в патентах США № 4683195; 4683202; 4800159; 4965188; и, например, в PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications Innis et al. eds., Academic Press, San Diego, CA (1990); Ho et al. 1989. Gene 77:51; Horton et al. 1993. Methods Enzymol. 217:270). Константная область иммуноглобулина, используемая в данном документе, может включать все домены и шарнирную область или их части. В одном варианте реализации изобретения константная область иммуноглобулина или ее часть содержит домен СН2, домен СН3 и шарнирную область, т.е. Fcобласть или партнер связывания FcRn. В используемом в данном документе значении термин Fcобласть определен как часть полипептида, соответствующая Fc-области нативного иммуноглобулина, т.е. образующаяся в результате димерной ассоциации соответствующих Fc-доменов ее двух тяжелых цепей. Нативная Fc-область образует гомодимер с другой Fc- областью. В одном варианте реализации изобретения Fc-область относится к части одной тяжелой цепи иммуноглобулина, начинающейся в шарнирной области сразу за сайтом расщепления папаином против хода транскрипции (т.е. остатком 216 в IgG, считая 114 первым остатком константной области тяжелой цепи), и заканчивающейся на С-конце антитела. Соответственно, полный домен Fc содержит, по меньшей мере, шарнирный домен, домен СН2 и домен СН3. Fc-область константной области иммуноглобулина, в зависимости от изотипа иммуноглобулина, может включать домены СН2, СН3 и СН4, а также шарнирную область. Химерные белки, содержащие Fc-область иммуноглобулина, обладают несколькими желательными для химерных белков свойствами, включая повышенную стабильность, увеличенный период полувыведения из сыворотки (см. Capon et al., 1989, Nature 337:525), а также связывание с Fc-рецепторами, такими как неонатальный Fcрецептор (FcRn) (патенты США № 6086875, 6485726, 6030613; WO 03/077834; US2003-0235536A1), которые включены в данный документ в качестве ссылок в полном объеме. Константная область иммуноглобулина или ее часть может быть партнером связывания FcRn. FcRn является активным в эпителиальных тканях взрослых и экспрессируется в полости кишечника, дыхательных путях легких, на носовых поверхностях, влагалищных поверхностях, поверхностях ободочной и прямой кишки (патент США № 6485726). Партнер связывания FcRn представляет собой часть иммуноглобулина, которая связывается с FcRn. Рецептор FcRn был выделен у нескольких видов млекопитающих, включая человека. Последовательности FcRn человека, FcRn обезьяны, FcRn крысы и FcRn мыщи являются известными (Story et al. 1994, J. Exp. Med. 180:2377). Рецептор FcRn связывает IgG (но не другие классы иммуноглобулина, такие как IgA, IgM, IgD и IgE) при относительно низких рН, активно транспортирует IgG трансцеллюлярно в направлении от полости к сыворотке и затем высвобождает IgG при относительно более высоком рН, наблюдающемся во внутритканевых жидкостях. Он экспрессируется в эпителиальной ткани взрослых особей (патенты США № 6485726, 6030613, 6086875; WO 03/077834; US2003-0235536A1), включая эпи- 28 041588 телий легкого и кишечника (Israel et al. 1997, Immunology 92:69), эпителий проксимальных почечных канальцев (Kobayashi et al. 2002, Am. J. Physiol. Renal Physiol. 282:F358), а также назальный эпителий, вагинальные поверхности и поверхности желчных протоков.

Партнеры связывания FcRn, пригодные для использования по настоящему изобретению, охватывают молекулы, которые могут специфически связываться FcRn-рецептором, включая цельный IgG, Fcфрагмент IgG и другие фрагменты, которые включают полную область связывания рецептора FcRn. Область Fc-участка IgG, которая связывается с FcRn-рецептором, была описана на основе данных рентгеновской кристаллографии (Burmeister et al. 1994, Nature 372:379). Основной участок контакта Fc с FcRn находится возле места соединения доменов СН2 и СН3. Все контакты Fc-FcRn находятся на одной тяжелой цепи Ig. Партнеры связывания FcRn включают цельный IgG, Fc-фрагмент IgG и другие фрагменты IgG, которые включают полную область связывания FcRn. Основные контактные сайты включают аминокислотные остатки 248, 250-257, 272, 285, 288, 290-291, 308-311 и 314 домена СН2 и аминокислотные остатки 385-387, 428 и 433-436 домена СН3. Все приведенные указания нумерации аминокислот иммуноглобулинов или фрагментов или областей иммуноглобулинов основаны на системе Kabat et al. 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Public Health, Bethesda, Md.

Fc-области или партнеры связывания FcRn, связанные с FcRn, могут быть эффективно перемещены через эпителиальные барьеры с помощью FcRn, тем самым обеспечивая неинвазивные средства для системного введения желательной терапевтической молекулы. Дополнительно, слитые белки, содержащие Fc-область или партнера связывания FcRn, подвергаются эндоцитозу клетками, экспрессирующими FcRn. Но вместо того, чтобы служить метками для деградации, такие слитые белки снова высвобождаются в циркуляцию, тем самым увеличивая in vivo период полувыведения таких белков. В определенных вариантах реализации изобретения частями константной области иммуноглобулинов являются Fcобласть или партнер связывания FcRn, которые типично ассоциируются, с помощью дисульфидных связей и других неспецифических взаимодействий, с другой Fc-областью или другим партнером связывания FcRn с образованием димеров и мультимеров более высокого порядка.

Область партнера связывания FcRn представляет собой молекулу или ее часть, которая может специфически связываться рецептором FcRn с последующим активным транспортом рецептором FcRn Fcобласти. Специфически связанный относится к двум молекулам, образующим комплекс, являющийся относительно стабильным в физиологических условиях. Специфическое связывание характеризуется высокой аффинностью и от низкой до умеренной емкостью, в отличие от неспецифического связывания, которое обычно имеет низкую аффинность с емкостью от умеренной до высокой. Типично, связывание считается специфическим, если консстанта аффинности KA имеет значение выше 106 М^-1, или выше 108 М^-1. При необходимости, неспецифическое связывание может быть снижено без существенного влияния на специфическое связывание путем изменения условий связывания. Соответствующие условия связывания, такие как концентрация молекул, ионная сила раствора, температура, время связывания, концентрация блокирующего агента (например, сывороточный альбумин, казеин молока) и т.д., могут быть оптимизированы квалифицированным специалистом с использованием обычных методик.

Множество мутантов, фрагментов, вариантов и производных описаны, например, в публикациях РСТ № WO 2011/069164 А2, WO 2012/006623 А2, WO 2012/006635 А2 или WO 2012/006633 А2, которые все включены в данный документ в качестве ссылок в полном объеме.

II.C.3.b. Альбумин или его фрагмент или вариант.

В определенных вариантах реализации изобретения гетерологичный фрагмент, связанный с белком VWF с помощью линкера VWF или связанный с белком FVIII с помощью линкера FVIII, представляет собой альбумин или его функциональный фрагмент. В некоторых вариантах реализации изобретения альбумин, слитый с белком VWF, ковалентно ассоциирован с альбумином, слитым с белком FVIII. Человеческий сывороточный альбумин (HSA или НА), белок, состоящий из 609 аминокислот в его полноразмерной форме, отвечает за значительную часть осмотического давления сыворотки, а также выполняет функции носителя эндогенных и экзогенных лигандов. Термин альбумин, в используемом в данном документе значении, включает полноразмерный альбумин или его функциональный фрагмент, вариант, производное или аналог. Примеры альбумина или его фрагментов или вариантов раскрыты в публикациях патентов США № 2008/0194481 А1, 2008/0004206 А1, 2008/0161243 А1, 2008/0261877 А1 или 2008/0153751 A1 или публикациях заявок РСТ № 2008/033413 А2, 2009/058322 А1 или 2007/021494 А2, которые включены в данный документ в качестве ссылок в полном объеме.

П.С.3.с. Альбуминсвязывающий фрагмент.

В определенных вариантах реализации изобретения гетерологичный фрагмент, связанный с белком VWF с помощью линкера VWF или с белком FVIII с помощью линкера FVIII, представляет собой альбуминсвязывающий фрагмент, который содержит альбуминсвязывающий пептид, бактериальный альбуминсвязывающий домен, альбуминсвязывающий фрагмент антитела, или любую их комбинацию. Например, альбуминсвязывающий белок может быть бактериальным альбуминсвязывающим белком, антителом или фрагментом антитела, включая домен антитела (см. патент США № 6696245). Альбуминсвязывающий белок, например, может быть бактериальным альбуминсвязывающим доменом, таким как принадлежащий стрептококковому белку G (Konig, Т. and Skerra, A. (1998) J. Immunol. Methods 218, 73- 29 041588

83) . Другими примерами альбуминсвязывающих пептидов, которые могут быть использованы в качестве партнера конъюгации, являются, например, пептиды, имеющие консенсусную последовательность CysXaa1 -Хаа2 -Хаа₃ -Хаа₄ -Cys, где Xaa1 обозначает Asp, Asn, Ser, Thr или Trp; Xaa2 обозначает Asn, Gln, His, Ile, Leu или Lys; Хаа3 обозначает Ala, Asp, Phe, Trp или Tyr; и Хаа4 обозначает Asp, Gly, Leu, Phe, Ser или Thr, как описано в патентной заявке США 2003/0069395 или Dennis et al. (Dennis et al. (2002) J. Biol. Chem. 277, 35035-35043).

II.C.3.d. Последовательность PAS.

В других вариантах реализации изобретения гетерологичный фрагмент, связанный с белком VWF с помощью линкера VWF или с белком FVIII с помощью линкера FVIII, представляет собой последовательность PAS. В одном варианте реализации изобретения химерная молекула содержит белок VWF, описанный в данном документе, слитый с последовательностью PAS с помощью линкера VWF. В другом варианте реализации изобретения химерная молекула по изобретению содержит первую цепь, содержащую белок VWF, слитый с последовательностью PAS с помощью линкера VWF, и вторую цепь, содержащую белок FVIII и дополнительную необязательную последовательность PAS, причем последовательность PAS экранирует или зашишает сайт связывания VWF белка FVIII, тем самым ингибируя или предотвращение взаимодействие белка FVIII с эндогенным VWF. Две последовательности PAS могут быть ковалентно ассоциированы друг с другом.

Последовательность PAS, в используемом в данном документе значении, означает аминокислотную последовательность, содержащую преимущественно остатки аланина и серина, или содержащую преимущественно остатки аланина, серина и пролина, причем аминокислотная последовательность имеет в физиологических условиях конформацию случайного клубка. Соответственно, последовательность PAS представляет собой функциональный блок, аминокислотный полимер, или кассету последовательностей, содержащие, состоящие по существу из, или состоящие из аланина, серина и пролина, которые могут быть использованы как часть гетерологичного фрагмента в химерном белке. При этом, квалифицированный специалист понимает, что аминокислотный полимер также может принимать конформацию случайного клубка, если в последовательность PAS добавить остатки, отличные от аланина, серина и пролина в качестве неосновного компонента. Термин неосновной компонент, в используемом в данном документе значении, означает, что аминокислоты, отличные от аланина, серина и пролина, могут быть добавлены в последовательность PAS до определенной степени, например до около 12%, т.е. около 12 из 100 аминокислот последовательности PAS, до около 10%, т.е. около 10 из 100 аминокислот последовательности PAS, до около 9%, т.е. около 9 из 100 аминокислот, до около 8%, т.е. около 8 из 100 аминокислот, около 6%, т.е. около 6 из 100 аминокислот, около 5%, т.е. около 5 из 100 аминокислот, около 4%, т.е. около 4 из 100 аминокислот, около 3%, т.е. около 3 из 100 аминокислот, около 2%, т.е. около 2 из 100 аминокислот, около 1%, т.е. около 1 из 100 аминокислот. Аминокислоты, отличные от аланина, серина и пролина, могут быть выбраны из группы, состоящей из Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Thr, Trp, Tyr и Val.

В физиологических условиях, отрезок последовательности PAS образует конформацию случайного клубка и, тем самым, может медиировать повышенную in vivo и/или in vitro стабильность VWF фактора или белка, проявляющего активность при коагуляции. Поскольку домен случайного клубка сам по себе не образует стабильной структуры или не проявляет функции, то биологическая активность, медиируемая белком VWF или белком FVIII, с которым он связан, в значительной степени сохраняется. В других вариантах реализации изобретения последовательности PAS, которые образуют домен случайного клубка, являются биологически инертными, особенно по отношению к протеолизу в плазме крови, иммуногенности, изоэлектрической точке/электростатическим свойствам, связыванию с рецепторами клеточной поверхности или интернализации изобретения, но остаются биодеградируемыми, что обеспечивает явные преимущества по сравнению с синтетическими полимерами, такими как ПЭГ.

Неограничивающи примеры последовательностей PAS, образующих конформацию случайного клубка, включают аминокислотные последовательности, выбранные из группы, состоящей из ASPAAPAPASPAAPAPSAPA (SEQ ID NO: 32), AAPASPAPAAPSAPAPAAPS (SEQ ID NO: 33), APSSPSPSAPSSPSPASPSS (SEQ ID NO: 34), APSSPSPSAPSSPSPASPS (SEQ ID NO: 35), SSPSAPSPSSPASPSPSSPA (SEQ ID NO: 36), AASPAAPSAPPAAASPAAPSAPPA (SEQ ID NO: 37) и ASAAAPAAASAAASAPSAAA (SEQ ID NO: 38) или любую их комбинацию. Дополнительные примеры последовательностей PAS известны, например, из публикации патента США № 2010/0292130 А1 и публикации заявки РСТ № WO 2008/155134 А1.

П.С.3.е. Последовательность НАР.

В определенных вариантах реализации изобретения гетерологичный фрагмент, связанный с белком VWF с помощью линкера VWF или с белком FVIII с помощью линкера FVIII, представляет собой глицин-богатый гомоаминокислотный полимер (НАР). Последовательность НАР может содержать повторяющуюся последовательность глицина, имеющую длину по меньшей мере 50 аминокислот, по меньшей мере 100 аминокислот, 120 аминокислот, 140 аминокислот, 160 аминокислот, 180 аминокислот, 200 аминокислот, 250 аминокислот, 300 аминокислот, 350 аминокислот, 400 аминокислот, 450 аминокислот или 500 аминокислот. В одном варианте реализации изобретения последовательность НАР способна увели

- 30 041588 чивать период полувыведения фрагмента, слитого с или связанного с последовательностью НАР. Неограничивающие примеры последовательности НАР включают, без ограничений, (Gly)n, (Gly₄Ser)_n или S(Gly₄Ser)n, где n равен 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20. В одном варианте реализации изобретения n равен 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 26, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40. В другом варианте реализации изобретения n равен 50, 60, 70, 80, 90, 100, 11, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 или 200. См., например, Schlapschy M et al, Protein Eng. Design Selection, 20: 273-284 (2007).

II.C.3.f. Трансферрин или его фрагмент.

В определенных вариантах реализации изобретения гетерологичный фрагмент, связанный с белком VWF с помощью линкера VWF или с белком FVIII с помощью линкера FVIII, представляет собой трансферрин или его фрагмент. Любой трансферрин может быть использован для получения химерных молекул по изобретению. В качестве примера, человеческий Tf (Tf) дикого типа представляет собой белок из 679 аминокислот, около 75 кДа (без учета гликозилирования), с двумя основными доменами - N (около 330 аминокислот) и С (около 340 аминокислот), который, по-видимому, образуется в результате дупликации гена. См. GenBank, номера доступа NM001063, ХМ002793, М12530, ХМ039845, ХМ 039847 и S95936 (www.ncbi.nlm.nih.gov/), которые все включены в данный документ в качестве ссылок в полном объеме. Трансферрин содержит два домена - N-домен и С-домен. N-домен содержит два субдомена - домен N1 и домен N2, и С-домен содержит два субдомена - домен С1 и домен С2.

В одном варианте реализации изобретения трансферриновая часть химерной молекулы включает сплайсинговый вариант трансферрина. В одном примере, сплайсинговый вариант трансферрина может быть сплайсинговым вариантом человеческого трансферрина, например Genbank, номер доступа ААА61140. В другом варианте реализации изобретения трансферриновая часть химерной молекулы включает один или более доменов последовательности трансферрина, например N-домен, С-домен, домен N1, домен N2, домен С1, домен С2 или любую их комбинацию.

II.C.3.g. Полимер, например полиэтиленгликоль (ПЭГ).

В других вариантах реализации изобретения гетерологичный фрагмент, соединенный с белком VWF с помощью линкера VWF или с белком FVIII с помощью линкера FVIII, представляет собой растворимый полимер, известный в данной области техники, включая, без ограничений, полиэтиленгликоль, сополимеры этиленгликоль/пропиленгликоль, карбоксиметилцеллюлозу, декстран или поливиниловый спирт. Гетерологичный фрагмент, такой как растворимый полимер, может быть присоединен к любому положению в химерной молекуле.

В определенных вариантах реализации изобретения химерная молекула содержит белок VWF, связанный с гетерологичным фрагментом (например, Fc-областью) с помощью линкера VWF, причем белок VWF дополнительно связан с ПЭГ. В другом варианте реализации изобретения химерная молекула содержит белок VWF, соединенный с Fc-областью с помощью линкера VWF, и белок FVIII, которые ассоциированы друг с другом, причем белок FVIII соединен с ПЭГ.

Изобретение также предусматривает химически модифицированные производные химерной молекулы по изобретению, которые могут обеспечивать дополнительные преимущества, такие как повышенная растворимость, стабильность и время циркуляции полипептида, или пониженная иммуногенность (см. патент США № 4179337). Химические фрагменты для модификации могут быть выбраны из водорастворимых полимеров, включая, без ограничений, полиэтиленгликоль, сополимеры этиленгликоля/пропиленгликоля, карбоксиметилцеллюлозу, декстран или поливиниловый спирт. Химерная молекула может быть модифицирована в случайных положениях внутри молекулы или на N- или С-конце, или в предварительно определенных положениях внутри молекулы, и могут включать один, два, три или больше присоединенных химических фрагментов.

Полимер может иметь любой молекулярный вес и могут быть разветвленным или неразветвленным. Для полиэтиленгликоля, в одном варианте реализации изобретения молекулярный вес имеет значение между около 1 кДа и около 100 кДа для простоты обращения и производства. Могут быть использованы другие размеры, в зависимости от желательного профиля (например, продолжительности желательного пролонгированного высвобождения, влияния, если оно наблюдается, на биологическую активность, простоты обращения, степени антигенности или ее отсутствия и других известных эффектов воздействия полиэтиленгликоля на белок или аналог). Например, полиэтиленгликоль может иметь средний молекулярный вес около 200, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500, 10000, 10500, 11000, 11500, 12000, 12500, 13000, 13500, 14000, 14500, 15000, 15500, 16000, 16500, 17000, 17500, 18000, 18500, 19000, 19500, 20000, 25000, 30000, 35000, 40000, 45000, 50000, 55000, 60000, 65000, 70000, 75000, 80000, 85000, 90000, 95000 или 100000 кДа.

В некоторых вариантах реализации изобретения полиэтиленгликоль может иметь разветвленное строение. Разветвленные полиэтиленгликоли описаны, например, в патенте США № 5643575; Morpurgo et al, Appl. Biochem. Biotechnol. 56:59-72 (1996); Vorobjev et al., Nucleosides Nucleotides 18:2745-2750 (1999); и Caliceti et al, Bioconjug. Chem. 10:638-646 (1999), которые все включены в данный документ в качестве ссылок в полном объеме.

Число фрагментов полиэтиленгликоля, присоединенных к каждой химерной молекуле (т.е. степень

- 31 041588 замещения) также может меняться. Например, пегилированные белки по изобретению могут быть связаны в среднем с 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 17, 20 или больше молекулами полиэтиленгликоля. Аналогично, средняя степень замещения (может иметь значение) в диапазоне, таком как 1-3, 2-4, 3-5, 4-6, 57, 6-8, 7-9, 8-10, 9-11, 10-12, 11-13, 12-14, 13-15, 14-16, 15-17, 16-18, 17-19, или 18-20 фрагментов полиэтиленгликоль на молекулу белка. Способы определения степени замещения описаны, например, в Delgado et al, Crit. Rev. Them. Drug Carrier Sys. 9:249-304 (1992).

В других вариантах реализации изобретения белок FVIII, используемый в изобретении, конъюгирован с одним или более полимерами. Полимер может быть водорастворимым и ковалентно или нековалентно присоединенным к фактору VIII или другим фрагментам, конъюгированным с фактором VIII. Неограничивающими примерами полимера могут быть полиалкиленоксид, поливинилпирролидон, поливиниловый спирт, полиоксазолин или полиакрилоилморфолин. Дополнительные типы полимерконъюгированного FVIII раскрыты в патенте США № 7199223.

П.С.3.К Гидроксиэтилкрахмал (ГЭК).

В определенных вариантах реализации изобретения гетерологичный фрагмент, связанный с белком VWF с помощью линкера VWF или с белком FVIII с помощью линкера FVIII, представляет собой полимер, например гидроксиэтилкрахмал (ГЭК) или его производное.

Гидроксиэтилкрахмал (ГЭК) представляет собой производное природного амилопектина и деградируется в организме альфа-амилазой. ГЭК представляет собой замещенное производное углеводного полимера амилопектина, который присутствует в кукурузном крахмале в концентрации до 95 мас.%. ГЭК проявляет полезные биологические свойства и используется как объемный кровезаменитель и в гемодилюционной терапии в клинических условиях (Sommermeyer et al., Krankenhauspharmazie, 8(8), 271-278 (1987); и Weidler et al., Arzneim.-Forschung/Drug Res., 41, 494-498 (1991)).

Амилопектин содержит фрагменты глюкозы, причем в основной цепи присутствуют альфа-1,4гликозидные связи, а в узлах ветвления находятся альфа-1,6-гликозидные связи. Физико-химические свойства этой молекулы преимущественно определяются типом гликозидных связей. Вследствие одноцепочечных разрывов альфа-1,4-гликозидных связей образуются спиральные структуры с около шестью глюкозными мономерами на виток. Физико-химические, а также биохимические свойства полимера могут быть модифицированы путем замещения. Введение гидроксиэтильной группы может быть осуществлено путем щелочного гидроксиэтилирования. Изменяя реакционные условия, можно использовать разную реакционную способность соответствующей гидроксильной группы в незамещенном глюкозном мономере по отношению к гидроксиэтилированию. Благодаря этому, квалифицированный специалист способен, в ограниченной степени, влиять на характер замещения.

ГЭК преимущественно характеризуется распределением молекулярного веса и степенью замещения. Степень замещения, обозначаемая как DS, относится к молярному замещению, как известно квалифицированным специалистам. См. Sommermeyer et al., Krankenhauspharmazie, 8(8), 271-278 (1987), указанный выше, особенно на с. 273. В одном варианте реализации изобретения гидроксиэтилкрахмал имеет средний молекулярный вес (средневзвешенный) от 1 до 300 кДа, от 2 до 200 кДа, от 3 до 100 кДа, или от 4 до 70 кДа. Гидроксиэтилкрахмал может дополнительно обладать молярной степенью замещения от 0,1 до 3, предпочтительно от 0,1 до 2, более предпочтительно от 0,1 до 0,9, предпочтительно от 0,1 до 0,8, и соотношением между С2:С6 замещением в диапазоне значений от 2 до 20 по отношению к гидроксиэтильным группам. Неограничивающим примером ГЭК, имеющего средний молекулярный вес около 130 кДа, является ГЭК со степенью замещения от 0,2 до 0,8, такой как 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 или 0,8, предпочтительно от 0,4 до 0,7, такой как 0,4, 0,5, 0,6 или 0,7. В конкретном варианте реализации изобретения ГЭК со средним молекулярным весом около 130 кДа является продуктом VOLUVEN® фирмы Fresenius. VOLUVEN® представляет собой искусственный коллоид, применяемый, например, для объемного замещения, используемый по терапевтическим показаниям в терапии и профилактике гиповолемии. VOLUVEN характеризуется средним молекулярным весом 130000+/-20000 Да, молярным замещением 0,4 и соотношением С2:С6, равным около 9:1. В других вариантах реализации изобретения диапазоны значений среднего молекулярного веса гидроксиэтилкрахмала составляют, например, от 4 до 70 кДа, или от 10 до 70 кДа, или от 12 до 70 кДа, или от 18 до 70 кДа, или от 50 до 70 кДа, или от 4 до 50 кДа, или от 10 до 50 кДа, или от 12 до 50 кДа, или от 18 до 50 кДа, или от 4 до 18 кДа, или от 10 до 18 кДа, или от 12 до 18 кДа, или от 4 до 12 кДа, или от 10 до 12 кДа, или от 4 до 10 кДа. В еще одних вариантах реализации изобретения средний молекулярный вес используемого гидроксиэтилкрахмала находится в диапазоне значений от более чем 4 кДа до менее чем 70 кДа, например около 10 кДа, или в диапазоне значений от 9 до 10 кДа или от 10 до 11 кДа или от 9 до 11 кДа, или около 12 кДа, или в диапазоне значений от 11 до 12 кДа) или от 12 до 13 кДа или от 11 до 13 кДа, или около 18 кДа, или в диапазоне значений от 17 до 18 кДа или от 18 до 19 кДа или от 17 до 19 кДа, или около 30 кДа, или в диапазоне значений от 29 до 30 или от 30 до 31 кДа, или около 50 кДа, или в диапазоне значений от 49 до 50 кДа или от 50 до 51 кДа или от 49 до 51 кДа. В определенных вариантах реализации изобретения гетерологичный фрагмент может быть смесями гидроксиэтилкрахмалов, имеющих разные средние молекулярные веса и/или разные степени замещения и/или разные соотношения С2:С6 замещения. Таким образом, могут быть использованы сме

- 32 041588 си гидроксиэтилкрахмалов, имеющих разные средние молекулярные веса и разные степени замещения и разные соотношения С2:С6 замещения, или имеющих имеющих разные средние молекулярные веса и разные степени замещения и одинаковые или примерно одинаковые соотношения С2:С6 замещения, или имеющих разные средние молекулярные веса и одинаковые или примерно одинаковые степени замещения и разные соотношения С2:С6 замещения, или имеющих одинаковый или примерно одинаковый средний молекулярный вес и разные степени замещения и разные соотношения С2:С6 замещения, или имеющих разные средние молекулярные веса и одинаковые или примерно одинаковые степени замещения и одинаковые или примерно одинаковые соотношения С2:С6 замещения, или имеющих одинаковые или примерно одинаковые средние молекулярные веса и разные степени замещения и одинаковые или примерно одинаковые соотношения С2:С6 замещения, или имеющих одинаковый или примерно одинаковый средний молекулярный вес и одинаковые или примерно одинаковые степени замещения и разные соотношения С2:С6 замещения, или имеющих примерно одинаковый средний молекулярный вес и примерно одинаковую степень замещения и примерно одинаковое соотношение С2:С6 замещения.

ILC3.i. Полисиаловые кислоты (ПСК).

В определенных вариантах реализации изобретения неполипептидный гетерологичный фрагмент, связанный с белком VWF с помощью линкера VWF или с белком FVIII с помощью линкера FVIII, представляет собой полимер, например полисиаловые кислоты (ПСК) или их производное. Полисиаловые кислоты (ПСК) являются природными неразветвленными полимерами сиаловой кислоты, продуцируемыми определенными бактериальными штаммами и у млекопитающих в определенных клетках. Roth J., et al. (1993) in Polysialic Acid: From Microbes to Man, eds. Roth J., Rutishauser U., Troy F. A. (Birkhauser Verlag, Basel, Switzerland), pp 335-348. Они могут быть получены с различными степенями полимеризации от п=около 80 или больше остатков сиаловой кислоты и в меньшую сторону до n=2, путем ограниченного кислотного гидролиза, или путем ферментативного разложения нейраминидазами, или фракционированием природных бактериально вырабатываемых форм полимера. Композиция разных полисиаловых кислот также меняется таким образом, что существуют гомополимерные формы, т.е. альфа-2,8связанная полисиаловая кислота, содержащая капсульный полисахарид штамма K1 E. coli и менингококков группы В, который также присутствует в эмбриональной форме молекулы адгезии нервных клеток (N-CAM). Существуют также гетерополимерные формы - такие как чередующаяся альфа-2,8 альфа-2,9 полисиаловая кислота штамма K92 Е. coli и полисахариды группы С N. meningitidis. Сиаловая кислота может также присутствовать в чередующихся сополимерах с мономерами, отличными от сиаловой кислоты, такими как группа W135 или группа Y N. meningitidis. Полисиаловые кислоты обладают важными биологическими функциями, включая избежание воздействия иммунной системы и системы комплемента патогенными бактериями и регуляцию глиальной адгезивности незрелых нейронов во время развития плода (в которой полимер выполняет антиадгезивную функцию) Cho and Troy, P.N.A.S., USA, 91 (1994) 11427-11431, хотя рецепторы полисиаловой кислоты у млекопитающих неизвестны. Альфа-2,8-связанная полисиаловая кислота штамма K1 E. coli также известна как коломиновая кислота и используется (с различными длинами) для иллюстрации настоящего изобретения. Были описаны различные способы присоединения или конъюгации полисиаловых кислот к полипептиду (например, см. патент США № 5846951; WO-A-0187922 и US 2007/0191597 А1, которые включены в данный документ в качестве ссылок в полном объеме.

И.С.4. Последовательность XTEN.

В используемом в данном документе значении, последовательность XTEN относится к полипептидам увеличенной длины с неприродными, по существу неповторяющимися последовательностями, которые состоят преимущественно из малых гидрофильных аминокислот, с последовательностью, имеющей низкую степень или не имеющей вторичной или третичной структуры в физиологических условиях. В качестве партнера химерного белка, XTEN может служить носителем, обеспечивая определенные желательные фармакокинетические, физико-химические и фармацевтические свойства при связывании с белком VWF или белком FVIII по изобретению для получения химерного белка. Такие желательные свойства включают, без ограничений, улучшенные фармакокинетические параметры и характеристики растворимости. В используемом в данном документе значении, XTEN определенно исключает антитела или фрагменты антител, такие как одноцепочечные антитела или Fc-фрагменты легкой цепи или тяжелой цепи.

В некоторых вариантах реализации изобретения последовательность XTEN по изобретению представляет собой пептид или полипептид, содержащий более чем около 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800 или 2000 аминокислотных остатков. В определенных вариантах реализации изобретения XTEN представляет собой пептид или полипептид, содержащий от более чем около 20 до около 3000 аминокислотных остатков, от более чем 30 до около 2500 остатков, от более чем 40 до около 2000 остатков, от более чем 50 до около 1500 остатков, от более чем 60 до около 1000 остатков, от более чем 70 до около 900 остатков, от более чем 80 до около 800 остатков, от более чем 90 до около 700 остатков, от более чем 100 до около 600 остатков, от более чем 110 до около 500 остатки, или от более чем 120 до около 400 остатков.

- 33 041588

Последовательность XTEN по изобретению, может содержать один или более мотивов последовательности, состоящих из от 9 до 14 аминокислотных остатков, или аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичную мотиву последовательности, причем мотив содержит, состоит, по существу, из, или состоит из 4-6 типов аминокислот, выбранных из группы, состоящей из глицина (G), аланина (А), серина (S), треонина (Т), глутамата (Е) и пролина (Р). См. US 2010-0239554 А1.

В некоторых вариантах реализации изобретения XTEN содержит неперекрывающиеся мотивы последовательности, в которых около 80%, или по меньшей мере около 85%, или по меньшей мере около 90, или около 91, или около 92, или около 93, или около 94, или около 95, или около 96, или около 97, или около 98, или около 99 или около 100% последовательности состоит из множества звеньев неперекрывающихся последовательностей, выбранных из одного семейства мотивов, выбранных из табл. 2А, с образованием последовательности семейства. В используемом в данном документе значении, семейство означает, что XTEN имеет мотивы, выбранные только из одной категории мотивов из табл. 2А; т.е. XTEN AD, AE, AF, AG, AM, AQ, ВС или BD, и что любые другие аминокислоты в XTEN, не принадлежащие к мотивам семейства, выбирают для достижения требуемого свойства, такого как обеспечение возможности включение сайта рестрикции с помощью кодирующих нуклеотидов, включения расщепляемой последовательности, или достижение лучшей связи с FVIII или VWF. В некоторых вариантах реализации семейств XTEN, последовательность XTEN содержит множество звеньев неперекрывающиеся мотивов последовательности семейства мотивов AD, или семейства мотивов АЕ, или семейства мотивов AF, или семейства мотивов AG, или семейства мотивов AM, или семейства мотивов AQ, или семейства ВС, или семейства BD, причем полученный XTEN демонстрирует диапазон значений гомологии, описанный выше. В других вариантах реализации изобретения XTEN содержит множество звеньев последовательностей мотива из двух или больше семейств мотивов из табл. 2А. Такие последовательности могут быть выбраны для достижения желательных физических/химических характеристик, включая такие свойства, как суммарный заряд, гидрофильность, отсутствие вторичной структуры, или отсутствие повторяемости, которые обеспечиваются аминокислотным составом мотивов, описанных более подробно ниже. В вариантах реализации изобретения описанных выше в данном абзаце, мотивы, включенные в XTEN, могут быть выбраны и собраны с использованием способов, описанных в данном документе, для получения XTEN, состоящего из от около 36 до около 3000 аминокислотных остатков.

Таблица 2А. Мотивы последовательности

XTEN, состоящие из 12 аминокислот, и семейства мотивов

Семейство мотива*	Последовательность мотива
AD	GESPGGSSGSES (SEQ Ш NO: 49)
AD	GSEGSSGPGESS (SEQ Ш NO: 50)
AD	GSSESGSSEGGP (SEQ Ш NO: 51)
AD	GSGGEPSESGSS (SEQ Ш NO: 52)
АЕ, АМ	GSPAGSPTSTEE (SEQ Ш NO: 53)
AE, AM, AQ	GSEPATSGSETP (SEQ Ш NO: 54)
АЕ, AM, AQ	GTSESATPESGP (SEQ Ш NO: 55)
AE, AM, AQ	GTSTEPSEGSAP (SEQ Ш NO: 56)
AF, АМ	GSTSESPSGTAP (SEQ ГО NO: 57)
AF, АМ	GTSTPESGSASP (SEQ ГО NO: 58)
AF, АМ	GTSPSGESSTAP (SEQ ГО NO: 59)
AF, АМ	GSTSSTAESPGP (SEQ ГО NO: 60)
AG, АМ	GTPGSGTASSSP (SEQ ГО NO: 61)
AG, АМ	GSSTPSGATGSP (SEQ ГО NO: 62)
AG, АМ	GSSPSASTGTGP (SEQ ГО NO: 63)
AG, АМ	GASPGTSSTGSP (SEQ ГО NO: 64)
AQ	GEPAGSPTSTSE (SEQ ГО NO: 65)
AQ	GTGEPSSTPASE (SEQ ГО NO: 66)
AQ	GSGPSTESAPTE (SEQ ГО NO: 67)
AQ	GSETPSGPSETA (SEQ ГО NO: 68)
AQ	GPSETSTSEPGA (SEQ ГО NO: 69)
AQ	GSPSEPTEGTSA (SEQ ГО NO: 70)
ВС	GSGASEPTSTEP (SEQ ГО NO: 71)
ВС	GSEPATSGTEPS (SEQ ГО NO: 72)
ВС	GTSEPSTSEPGA (SEQ ГО NO: 73)
ВС	GTSTEPSEPGSA (SEQ ГО NO: 74)
BD	GSTAGSETSTEA (SEQ ГО NO: 75)
BD	GSETATSGSETA (SEQ ГО NO: 76)
BD	GTSESATSESGA (SEQ ГО NO: 77)
BD	GTSTEASEGSAS (SEQ ГО NO: 78)

- 34 041588

Обозначает последовательности индивидуальных мотивов, которые, при использовании вместе с различными перестановками, приводят к последовательности семейства XTEN могут также иметь различную длину для вставки в или связывания с FVIII или VWF, или любыми другими компонентами химерной молекулы. В одном варианте реализации изобретения длину последовательности (последовательностей) XTEN выбирают на основании свойства или функции, которые должны быть достигнуты у слитого белка. В зависимости от предполагаемого свойства или функции, XTEN может быть последовательностью короткой или промежуточной длины или более длинной последовательностью, которые могут служить носителями. В определенных вариантах реализации изобретения XTEN включает короткие сегменты, состоящие из от около 6 до около 99 аминокислотных остатков, с промежуточной длиной от около 100 до около 399 аминокислотных остатков, и с еще большими длинами от около 400 до около 1000 и до около 3000 аминокислотных остатков. Таким образом, XTEN, вставленный в или связанный с FVIII или VWF, может иметь длину около 6, около 12, около 36, около 40, около 42, около 72, около 96, около 144, около 288, около 400, около 500, около 576, около 600, около 700, около 800, около 864, около 900, около 1000, около 1500, около 2000, около 2500 или до около 3000 аминокислотных остатков. В других вариантах реализации изобретения последовательности XTEN имеют длину от около 6 до около 50, около от 50 до 100, около от 100 до 150, около от 150 до 250, около от 250 до 400, от около 400 до около 500, от около 500 до около 900, около от 900 до 1500, около от 1500 до 2000 или от около 2000 до около 3000 аминокислотных остатков. Точная длина XTEN, вставленного в или связанного с FVIII или VWF, может меняться без нежелательного влияния на активность FVIII или VWF. В одном варианте реализации изобретения один или более из XTEN, используемых в данном документе, имеет длину 36 аминокислот, 42 аминокислоты, 72 аминокислоты, 144 аминокислоты, 288 аминокислот, 576 аминокислот или 864 аминокислоты, и может быть выбран из одной или более из последовательностей семейства XTEN; т.е. AD, AE, AF, AG, AM, AQ, ВС или BD.

В некоторых вариантах реализации изобретения последовательность XTEN, используемая в изобретении, является по меньшей мере на 60, 70, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичной последовательности, выбранной из группы, состоящей из АЕ42, AG42, АЕ48, АМ48, АЕ72, AG72, АЕ108, AG108, АЕ144, AF144, AG144, АЕ180, AG180, АЕ216, AG216, АЕ252, AG252, АЕ288, AG288,

АЕ324, AG324, АЕ360, AG360, АЕ396, AG396, АЕ432, AG432, АЕ468, AG468, АЕ504, AG504, AF504,

АЕ540, AG540, AF540, AD576, АЕ576, AF576, AG576, АЕ612, AG612, АЕ624, АЕ648, AG648, AG684,

АЕ720, AG720, АЕ756, AG756, АЕ792, AG792, АЕ828, AG828, AD836, АЕ864, AF864, AG864, АМ875,

АЕ912, АМ923, АМ1318, ВС864, BD864, АЕ948, АЕ1044, АЕ1140, АЕ1236, АЕ1332, АЕ1428, АЕ1524, АЕ1620, АЕ1716, АЕ1812, АЕ1908, АЕ2004А, AG948, AG1044, AG1140, AG1236, AG1332, AG1428, AG1524, AG1620, AG1716, AG1812, AG1908 и AG2004. См. US 2010-0239554 А1. В одном варианте реализации изобретения последовательность XTEN является по меньшей мере на 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичной аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из АЕ42, АЕ864, АЕ576, АЕ288, АЕ144, AG864, AG576, AG288, AG144 и любых их комбинаций. В другом варианте реализации изобретения последовательность XTEN выбирают из группы, состоящей из АЕ42, АЕ864, АЕ576, АЕ288, АЕ144, AG864, AG576, AG288, AG144 и любых их комбинаций. В конкретном варианте реализации изобретения последовательность XTEN представляет собой АЕ288. Аминокислотные последовательности для определенных последовательностей XTEN по изобретению приведены в табл. 2В.

- 35 041588

Таблица 2В. Последовательности XTEN

XTEN	Аминокислотная последовательность
АЕ42 SEQ ID NO: 39	GAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPASS
АЕ72 SEQ ID NO: 40	GAP TSESATPESG PGSEPATSGS ETPGTSESAT PESGPGSEPA TSGSETPGTS ESATPESGPG TSTEPSEGSA PGASS
AE144 SEQ ID NO: 41	GSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEG SAPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGTSTEPSEGSAPGTSESA PESGPGSEPATSGSETPGTSTEPSEGSAP
AG144 SEQ ID NO: 42	GTPGSGTASSSPGSSTPSGATGSPGSSPSASTGTGPGSSPSASTGTGPGASPGTSST GSPGASPGTSSTGSPGSSTPSGATGSPGSSPSASTGTGPGASPGTSSTGSPGSSPSA STGTGPGTPGSGTASSSPGSSTPSGATGSP
AE288 SEQ ID NO: 43	GTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESG PGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPES GPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPE SGPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSE GSAPGTSTEPSEGSAPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAP
AG288 SEQ ID NO: 44	PGASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGTPGSGTASSSPGSSTPSGATGSPGTPGSGTASS SPGSSTPSGATGSPGTPGSGTASSSPGSSTPSGATGSPGSSTPSGATGSPGSSPSASTG TGPGSSPSASTGTGPGASPGTSSTGSPGTPGSGTASSSPGSSTPSGATGSPGSSPSAST GTGPGSSPSASTGTGPGASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGSSTPSGATGSPGSSPSAS TGTGPGASPGTSSTGSPGSSPSASTGTGPGTPGSGTASSSPGSSTPSGATGS
AE576 SEQ ID NO: 45	GSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSA PGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTST EEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEG SAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSG SETPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSPAGSP TSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEP SEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAG SPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEP ATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSP AGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAP
AG576 SEQ ID NO: 46	PGTPGSGTASSSPGSSTPSGATGSPGSSPSASTGTGPGSSPSASTGTGPGSSTPSGATG SPGSSTPSGATGSPGASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGTPGSGTAS SSPGASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGSSPSASTGTGPGTPGSGTA SSSPGASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGSSTPSGATGSPGSSTPSG ATGSPGASPGTSSTGSPGTPGSGTASSSPGSSTPSGATGSPGSSTPSGATGSPGSSTPS GATGSPGSSPSASTGTGPGASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGTPGSGTASSSPGASPG TSSTGSPGASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGTPGSGTASSSPGSST PSGATGSPGTPGSGTASSSPGSSTPSGATGSPGTPGSGTASSSPGSSTPSGATGSPGSS TPSGATGSPGSSPSASTGTGPGSSPSASTGTGPGASPGTSSTGSPGTPGSGTASSSPGS
	STPSGATGSPGSSPSASTGTGPGSSPSASTGTGPGASPGTSSTGS
AE864 SEQ ID NO: 47	GSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSA PGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTST EEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEG SAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSG SETPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSPAGSP TSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEP SEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAG SPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEP ATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSP AGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGS EPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPG SPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEE GSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGTSESATPESG PGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGS APGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAP
AG864 SEQ ID NO: 48	GASPGTSSTGSPGSSPSASTGTGPGSSPSASTGTGPGTPGSGTASSSPGSSTPSGATGS PGSSPSASTGTGPGASPGTSSTGSPGTPGSGTASSSPGSSTPSGATGSPGTPGSGTASS SPGASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGTPGSGTASSSPGSSTPSGATGSPGASPGTSST GSPGTPGSGTASSSPGSSTPSGATGSPGSSPSASTGTGPGSSPSASTGTGPGSSTPSGA TGSPGSSTPSGATGSPGASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGTPGSGT ASSSPGASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGSSPSASTGTGPGTPGSG TASSSPGASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGSSTPSGATGSPGSSTP SGATGSPGASPGTSSTGSPGTPGSGTASSSPGSSTPSGATGSPGSSTPSGATGSPGSST PSGATGSPGSSPSASTGTGPGASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGTPGSGTASSSPGAS PGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGTPGSGTASSSPGS STPSGATGSPGTPGSGTASSSPGSSTPSGATGSPGTPGSGTASSSPGSSTPSGATGSPG SSTPSGATGSPGSSPSASTGTGPGSSPSASTGTGPGASPGTSSTGSPGTPGSGTASSSP GSSTPSGATGSPGSSPSASTGTGPGSSPSASTGTGPGASPGTSSTGSPGASPGTSSTGS PGSSTPSGATGSPGSSPSASTGTGPGASPGTSSTGSPGSSPSASTGTGPGTPGSGTASS SPGSSTPSGATGSPGSSTPSGATGSPGASPGTSSTGSP

- 36 041588

В тех вариантах реализации изобретения, где в используемом компоненте XTEN менее 100% аминокислот состоит из 4, 5 или 6 типов аминокислот, выбранных из глицина (G), аланина (А), серина (S), треонина (Т), глутамата (Е) и пролина (Р), или менее 100% последовательностей, состоящих из последовательностей мотивов из табл. 2А или последовательностей XTEN табл. 2В, а другие аминокислотные остатки XTEN выбраны из любых других 14 природных L-аминокислот, но предпочтительно выбраны из гидрофильных аминокислот таким образом, чтобы последовательность XTEN содержала по меньшей мере около 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98% или по меньшей мере около 99% гидрофильных аминокислот. Аминокислоты XTEN, не являющиеся глицином (G), аланином (А), серином (S), треонином (Т), глутаматом (Е) и пролином (Р) или разбросаны по последовательности XTEN, или расположены внутри или между мотивами последовательностей, или сконцентрированы в одном или более коротких отрезках последовательности XTEN, например, для создания линкера между XTEN и другими компонентами; например белком VWF. В тех случаях, когда компонент XTEN содержит аминокислоты, отличные от глицина (G), аланина (А), серина (S), треонина (Т), глутамата (Е) и пролина (Р), предпочтительно менее чем около 2% или менее около 1% аминокислот являются гидрофобными остатками так, чтобы полученные последовательности в общем не имели вторичной структуры, например имели не более 2% альфаспиралей или 2% бета-листов, при определении способами, раскрытыми в данном документе. Гидрофобные остатки, являющиеся менее благоприятными для конструирования XTEN, включают триптофан, фенилаланин, тирозин, лейцин, изолейцин, валин и метионин. Дополнительно, можно спроектировать последовательности XTEN, которая содержит менее 5, или менее 4, или менее 3, или менее 2, или менее 1%, или вообще не содержит следующие аминокислоты: цистеин (чтобы избежать образования дисульфидных связей и окисления), метионин (во избежание окисления), аспарагин и глутамин (во избежание дезамидирования). Таким образом, в некоторых вариантах реализации изобретения XTEN, содержащий другие аминокислоты помимо глицина (G), аланина (А), серина (S), треонина (Т), глутамата (Е) и пролина (Р), имеет последовательность с менее чем 5% остатков, участвующих в образовании альфа-спиралей и бета-листов, при измерении по алгоритму Чоу-Фасмана, и на по меньшей мере 90%, или по меньшей мере около 95% или больше образуют случайный клубок, при измерении по алгоритму GOR.

В дополнительных вариантах реализации изобретения последовательность XTEN, используемая в изобретении, влияет на физическое или химическое свойство, например фармакокинетическу, химерного белка по настоящему изобретению. Последовательность XTEN, используемая в настоящем изобретении, может проявлять одно или более из следующих предпочтительных свойств: конформационная гибкость, повышенная растворимость в воде, высокая степень стойкости к протеазе, низкая иммуногенность, низкое связывание с рецепторами млекопитающего, или увеличенные гидродинамические (или стоксовы) радиусы. В конкретном варианте реализации изобретения последовательность XTEN, связанная с белком FVIII в данном изобретении улучшает фармакокинетические свойства, такие как более длительный период полувыведения в конечной фазе или увеличенная площадь под кривой (AUC), так чтобы химерный белок, описанный в данном документе, оставался in vivo в течение более длительного периода времени по сравнению с FVIII дикого типа. В дополнительных вариантах реализации изобретения последовательность XTEN, используемая в данном изобретении, улучшает фармакокинетические свойства, такие как более длительный период полувыведения в конечной фазе или увеличенная площадь под кривой (AUC), так чтобы белок FVIII оставался in vivo в течение более длительного периода времени по сравнению с FVIII дикого типа.

Различные способы и методы анализа могут применяться для определения физических/химических свойств белков, содержащих последовательность XTEN. Такие способы включают, без ограничений, аналитическое центрифугирование, ЭПР, ВЭЖХ-ионный обмен, ВЭЖХ-эксклюзионную хроматографию, ВЭЖХ-обращенная фаза, светорассеяние, капиллярный электрофорез, круговой дихроизм, дифференциальную сканирующую калориметрию, флуоресценцию, ВЭЖХ-ионный обмен, ВЭЖХ-эксклюзионную хроматографию, ИК, ЯМР, рамановскую спектроскопию, рефрактометрию и УФ/видимую спектроскопию. Дополнительные способы раскрыты в Amau et al, Prot Expr and Purif 48, 1-13 (2006).

Дополнительные примеры последовательностей XTEN, которые могут быть использованы в соответствии с настоящим изобретением, раскрыты в публикациях патентов США № 2010/0239554 А1, 2010/0323956 А1, 2011/0046060 А1, 2011/0046061 А1, 2011/0077199 А1 или 2011/0172146 А1, или международных патентных публикациях № WO 2010091122 Al, WO 2010144502 А2, WO 2010144508 Al, WO 2011028228 Al, WO 2011028229 Al, WO 2011028344 А2 или WO2013123457 А1, или международных заявках № PCT/US2013/049989.

И.С.5. Белок FVIII.

Белок FVIII, в используемом в данном документе значении, означает функциональный полипептид FVIII в его нормальной роли в коагуляции, если не указано иное. Термин белок FVIII включает его функциональный фрагмент, вариант, аналог или производное, которые сохраняют функцию полноразмерного фактора VIII дикого типа в пути коагуляции. Белок FVIII используется взаимозаменяемо с полипептидом (или протеином) FVIII или FVIII. Примеры функций FVIII включают, без ограничений, способность активировать коагуляцию, способность выступать в роли кофактора для фактора IX, или способность образовывать теназный комплекс с фактором IX в присутствии Са²⁺ и фосфолипидов, кото- 37 041588 рый затем превращает фактор X в активированную форму Ха. Белок FVIII может быть человеческим, свиным, собачьим, крысиным или мышиным белком FVIII. Кроме того, сравнения между FVIII, полученным от людей и от других видов, позволили идентифицировать консервативные остатки, которые вероятно необходимы для обеспечения его функции (Cameron et al., Thromb. Haemost. 79:317-22 (1998);

US 6251632).

Имеется ряд тестов для оценки функции системы коагуляции: тест на активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ), хромогенный анализ, анализ методом ротационной тромбоэластометрии (ROTEM), тест на протромбиновое время (РТ) (также используемый для определения INR), тестирование на фибриноген (часто по методу Клауса), подсчет тромбоцитов, тестирование функции тромбоцитов (часто методом PFA-100), ТСТ, время кровотечения, тест на смешение (исправляется ли аномалия, если плазму пациента смешивают с нормальной плазмой), анализы коагулирующего фактора, антифосфолипидные антитела, D-димер, генетические тесты (например, фактор V Лейдена, мутация протромбина G20210A), время разбавленного яда гадюки Рассела (dRWT), различные тесты функции тромбоцитов, тромбоэластография (ТЭГ или Sonoclot), тромбоэластометрия (ТЭМ®, например, ROTEM®), или эуглобулиновое время лизиса (ELT).

Тест АЧТВ представляет собой показатель эффективности, измеряющий эффективность как внутреннего (также называемого контактным путем активации), так и общего путей коагуляции. Этот тест обычно используется для измерения активности свертывания коммерчески доступных рекомбинантных факторов свертывания крови, например FVIII или FIX. Он используется в сочетании с протромбиновым временем (РТ), которое измеряет внешний путь.

Анализ ROTEM дает информацию о кинетике гемостаза в целом: время свертывания, образование сгустка, стабильность сгустка и лизис. Разные параметры в тромбоэластометрии зависят от активности системы плазматической коагуляции, функции тромбоцитов, фибринолиза или большого количества факторов, влияющих на эти взаимодействия. Этот анализ может обеспечить целостную картину вторичного гемостаза. Полипептид FVIII и полинуклеотидные последовательности известны, как и многие функциональные фрагменты, мутанты и модифицированные варианты. Примеры человеческих последовательностей FVIII (полноразмерных) приведены как субпоследовательности в SEQ ID NO: 16 или 18.

Таблица 3. Полноразмерный FVIII (сигнальный пептид FVIII подчеркнут;

тяжелая цепь FVIII подчеркнута двойной линией; В-домен выделен наклонным шрифтом; и легкая цепь FVIII представлена обычным шрифтом) Сигнальный пептид: (SEQ ID NO: 15) MQIELSTCFFLCLLRFCFS

Зрелый фактор VIII (SEQ ID NO: 16)*

ATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSWYKKTLFVEFTDHLFNIAKPRPPWMGLLGPTIQ AEVYDTWITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDOTSOREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLKENGPMASDPLCL TYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTOTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETKNSLMQDRDAASARAWPKM HTWGYWRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHROASLEISPITFLTAOTLLMDLGQFLL FCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDWRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHY IAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFMAYTDETFKTREAIQHESGILGPLLYGEVGDTLL IIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKWTVTVEDGPTKSDPRCLTRYYSSFVNM ERDLASGLIGPLLICYKESVDORGNOIMSDKRNVILFSVFDENRSWYLTENIORFLPNPAGVOLEDPEFQASNIMHS

- 38 041588

INGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLSVFFSGYTFKHKMVYEDTLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCH NSDFRNRGMTALLKVSSCDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSQTVSRHPSTRQKQFNATTIPENDIEKTD PWFAHRTPMPKIQNVSSSDLLMLLRQSPTPHGLSLSDLQEAKYETFSDDPSPGAIDSNNSLSEMTHFRPQLHHSGDM VFTPESGLQLRLNEKLGTTAATELKKLDFKVSSTSNNLISTIPSDNLAAGTDNTSSLGPPSMPVHYDSQLDTTLFGK KSSPLTESGGPLSLSEENNDSKLLESGLMNSQESSWGKNVSSTESGRLFKGKRAHGPALLTKDNALFKVSISLLKTN KTSNNSATNRKTHIDGPSLLIENSPSVWQNILESDTEFKKVTPLIHDRMLMDKNATALRLNHMSNKTTSSKNMEMVQ QKKEGPIPPDAQNPDMSFFKMLFLPESARWIQRTHGKNSLNSGQGPSPKQLVSLGPEKSVEGQNFLSEKNKWVGKG EFTKDVGLKEMVFPSSRNLFLTNLDNLHENNTHNQEKKIQEEIEKKETLIQENWLPQIHTVTGTKNFMKNLFLLST RQNVEGSYDGAYAPVLQDFRSLNDSTNRTKKHTAHFSKKGEEENLEGLGNQTKQIVEKYACTTRISPNTSQQNFVTQ RSKRALKQFRLPLEETELEKRIIVDDTSTQWSKNMKHLTPSTLTQIDYNEKEKGAITQSPLSDCLTRSHSIPQANRS PLPIAKVSSFPSIRPIYLTRVLFQDNSSHLPAASYRKKDSGVQESSHFLQGAKKNNLSLAILTLEMTGDQREVGSLG TSATNSVTYKKVENTVLPKPDLPKTSGKVELLPKVHIYQKDLFPTETSNGSPGHLDLVEGSLLQGTEGAIKWNEANR PGKVPFLRVATESSAKTPSKLLDPLAWDNHYGTQIPKEEWKSQEKSPEKTAFKKKDTILSLNACESNHAIAAINEGQ WRETEVWAA0GRFERI,CS0WPVI,ARH0REITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQKK TRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKWFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAEVEDNI MVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSDVDLEKDVH SGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYI MDTLPGLVMAQDQRIRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWRVECLI GEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSINAWSTKEPFSWIKVDLLAPM IIHGIKTQGARQKFSSLYISQFIIMYSLDGKKWQTYRGNSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHY SIRSTLRMELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNNPKEWLQVD FQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPWNSLDPPLLTRYLRIHP QSWVHQIALRMEVLGCEAQDLY

Таблица 4. Нуклеотидная последовательность, кодирующая полноразмерный FVIII (SEQ ID NO: 17)*

661 ATG CAAATAGAGC TCTCCACCTG

721 CTTCTTTCTG TGCCTTTTGC GATTCTGCTT TAGTGCCACC AGAAGATACT ACCTGGGTGC

781 AGTGGAACTG TCATGGGACT ATATGCAAAG TGATCTCGGT GAGCTGCCTG TGGACGCAAG

841 ATTTCCTCCT AGAGTGCCAA AATCTTTTCC ATTCAACACC TCAGTCGTGT ACAAAAAGAC

901 TCTGTTTGTA GAATTCACGG ATCACCTTTT CAACATCGCT AAGCCAAGGC CACCCTGGAT

961 GGGTCTGCTA GGTCCTACCA TCCAGGCTGA GGTTTATGAT ACAGTGGTCA TTACACTTAA

1021 GAACATGGCT TCCCATCCTG TCAGTCTTCA TGCTGTTGGT GTATCCTACT GGAAAGCTTC

1081 TGAGGGAGCT GAATATGATG ATCAGACCAG TCAAAGGGAG AAAGAAGATG ATAAAGTCTT

1141 CCCTGGTGGA AGCCATACAT ATGTCTGGCA GGTCCTGAAA GAGAATGGTC CAATGGCCTC

1201 TGACCCACTG TGCCTTACCT ACTCATATCT TTCTCATGTG GACCTGGTAA AAGACTTGAA

1261 TTCAGGCCTC ATTGGAGCCC TACTAGTATG TAGAGAAGGG AGTCTGGCCA AGGAAAAGAC

1321 ACAGACCTTG CACAAATTTA TACTACTTTT TGCTGTATTT GATGAAGGGA AAAGTTGGCA

1381 CTCAGAAACA AAGAACTCCT TGATGCAGGA TAGGGATGCT GCATCTGCTC GGGCCTGGCC

1441 TAAAATGCAC ACAGTCAATG GTTATGTAAA CAGGTCTCTG CCAGGTCTGA TTGGATGCCA

1501 CAGGAAATCA GTCTATTGGC ATGTGATTGG AATGGGCACC ACTCCTGAAG TGCACTCAAT

1561 ATTCCTCGAA GGTCACACAT TTCTTGTGAG GAACCATCGC CAGGCGTCCT TGGAAATCTC

1621 GCCAATAACT TTCCTTACTG CTCAAACACT CTTGATGGAC CTTGGACAGT TTCTACTGTT

1681 TTGTCATATC TCTTCCCACC AACATGATGG CATGGAAGCT TATGTCAAAG TAGACAGCTG

1741 TCCAGAGGAA CCCCAACTAC GAATGAAAAA TAATGAAGAA GCGGAAGACT ATGATGATGA

1801 TCTTACTGAT TCTGAAATGG ATGTGGTCAG GTTTGATGAT GACAACTCTC CTTCCTTTAT

1861 CCAAATTCGC TCAGTTGCCA AGAAGCATCC TAAAACTTGG GTACATTACA TTGCTGCTGA

1921 AGAGGAGGAC TGGGACTATG CTCCCTTAGT CCTCGCCCCC GATGACAGAA GTTATAAAAG

1981 TCAATATTTG AACAATGGCC CTCAGCGGAT TGGTAGGAAG TACAAAAAAG TCCGATTTAT

2041 GGCATACACA GATGAAACCT TTAAGACTCG TGAAGCTATT CAGCATGAAT CAGGAATCTT

2101 GGGACCTTTA CTTTATGGGG AAGTTGGAGA CACACTGTTG ATTATATTTA AGAATCAAGC

2161 AAGCAGACCA TATAACATCT ACCCTCACGG AATCACTGAT GTCCGTCCTT TGTATTCAAG

- 39 041588

2221 GAGATTACCA AAAGGTGTAA AACATTTGAA GGATTTTCCA ATTCTGCCAG GAGAAATATT 2281 CAAATATAAA TGGACAGTGA CTGTAGAAGA TGGGCCAACT AAATCAGATC CTCGGTGCCT 2341 GACCCGCTAT TACTCTAGTT TCGTTAATAT GGAGAGAGAT CTAGCTTCAG GACTCATTGG 2401 CCCTCTCCTC ATCTGCTACA AAGAATCTGT AGATCAAAGA GGAAACCAGA TAATGTCAGA 2461 CAAGAGGAAT GTCATCCTGT TTTCTGTATT TGATGAGAAC CGAAGCTGGT ACCTCACAGA 2521 GAATATACAA CGCTTTCTCC CCAATCCAGC TGGAGTGCAG CTTGAGGATC CAGAGTTCCA 2581 AGCCTCCAAC ATCATGCACA GCATCAATGG CTATGTTTTT GATAGTTTGC AGTTGTCAGT 2641 TTGTTTGCAT GAGGTGGCAT ACTGGTACAT TCTAAGCATT GGAGCACAGA CTGACTTCCT 2701 TTCTGTCTTC TTCTCTGGAT ATACCTTCAA ACACAAAATG GTCTATGAAG ACACACTCAC 2761 CCTATTCCCA TTCTCAGGAG AAACTGTCTT CATGTCGATG GAAAACCCAG GTCTATGGAT 2821 TCTGGGGTGC CACAACTCAG ACTTTCGGAA CAGAGGCATG ACCGCCTTAC TGAAGGTTTC 2881 TAGTTGTGAC AAGAACACTG GTGATTATTA CGAGGACAGT TATGAAGATA TTTCAGCATA 2941 CTTGCTGAGT AAAAACAATG CCATTGAACC AAGAAGCTTC TCCCAGAATT CAAGACACCC 3001 TAGCACTAGG CAAAAGCAAT TTAATGCCAC CACAATTCCA GAAAATGACA TAGAGAAGAC 3061 TGACCCTTGG TTTGCACACA GAACACCTAT GCCTAAAATA CAAAATGTCT CCTCTAGTGA 3121 TTTGTTGATG CTCTTGCGAC AGAGTCCTAC TCCACATGGG CTATCCTTAT CTGATCTCCA 3181 AGAAGCCAAA TATGAGACTT TTTCTGATGA TCCATCACCT GGAGCAATAG ACAGTAATAA 3241 CAGCCTGTCT GAAATGACAC ACTTCAGGCC ACAGCTCCAT CACAGTGGGG ACATGGTATT 3301 TACCCCTGAG TCAGGCCTCC AATTAAGATT AAATGAGAAA CTGGGGACAA CTGCAGCAAC 3361 AGAGTTGAAG AAACTTGATT TCAAAGTTTC TAGTACATCA AATAATCTGA TTTCAACAAT 3421 TCCATCAGAC AATTTGGCAG CAGGTACTGA TAATACAAGT TCCTTAGGAC CCCCAAGTAT 3481 GCCAGTTCAT TATGATAGTC AATTAGATAC CACTCTATTT GGCAAAAAGT CATCTCCCCT 3541 TACTGAGTCT GGTGGACCTC TGAGCTTGAG TGAAGAAAAT AATGATTCAA AGTTGTTAGA 3601 ATCAGGTTTA ATGAATAGCC AAGAAAGTTC ATGGGGAAAA AATGTATCGT CAACAGAGAG 3661 TGGTAGGTTA TTTAAAGGGA AAAGAGCTCA TGGACCTGCT TTGTTGACTA AAGATAATGC 3721 CTTATTCAAA GTTAGCATCT CTTTGTTAAA GACAAACAAA ACTTCCAATA ATTCAGCAAC 3781 TAATAGAAAG ACTCACATTG ATGGCCCATC ATTATTAATT GAGAATAGTC CATCAGTCTG 3841 GCAAAATATA TTAGAAAGTG ACACTGAGTT TAAAAAAGTG ACACCTTTGA TTCATGACAG 3901 AATGCTTATG GACAAAAATG CTACAGCTTT GAGGCTAAAT CATATGTCAA ATAAAACTAC 3961 TTCATCAAAA AACATGGAAA TGGTCCAACA GAAAAAAGAG GGCCCCATTC CACCAGATGC 4021 ACAAAATCCA GATATGTCGT TCTTTAAGAT GCTATTCTTG CCAGAATCAG CAAGGTGGAT 4081 ACAAAGGACT CATGGAAAGA ACTCTCTGAA CTCTGGGCAA GGCCCCAGTC CAAAGCAATT 4141 AGTATCCTTA GGACCAGAAA AATCTGTGGA AGGTCAGAAT TTCTTGTCTG AGAAAAACAA 4201 AGTGGTAGTA GGAAAGGGTG AATTTACAAA GGACGTAGGA CTCAAAGAGA TGGTTTTTCC 4261 AAGCAGCAGA AACCTATTTC TTACTAACTT GGATAATTTA CATGAAAATA ATACACACAA 4321 TCAAGAAAAA AAAATTCAGG AAGAAATAGA AAAGAAGGAA ACATTAATCC AAGAGAATGT 4381 AGTTTTGCCT CAGATACATA CAGTGACTGG CACTAAGAAT TTCATGAAGA ACCTTTTCTT 4441 ACTGAGCACT AGGCAAAATG TAGAAGGTTC ATATGACGGG GCATATGCTC CAGTACTTCA 4501 AGATTTTAGG TCATTAAATG ATTCAACAAA TAGAACAAAG AAACACACAG CTCATTTCTC 4561 AAAAAAAGGG GAGGAAGAAA ACTTGGAAGG CTTGGGAAAT CAAACCAAGC AAATTGTAGA 4621 GAAATATGCA TGCACCACAA GGATATCTCC TAATACAAGC CAGCAGAATT TTGTCACGCA 4681 ACGTAGTAAG AGAGCTTTGA AACAATTCAG ACTCCCACTA GAAGAAACAG AACTTGAAAA 4741 AAGGATAATT GTGGATGACA CCTCAACCCA GTGGTCCAAA AACATGAAAC ATTTGACCCC 4801 GAGCACCCTC ACACAGATAG ACTACAATGA GAAGGAGAAA GGGGCCATTA CTCAGTCTCC 4861 CTTATCAGAT TGCCTTACGA GGAGTCATAG CATCCCTCAA GCAAATAGAT CTCCATTACC 4921 CATTGCAAAG GTATCATCAT TTCCATCTAT TAGACCTATA TATCTGACCA GGGTCCTATT 4981 CCAAGACAAC TCTTCTCATC TTCCAGCAGC ATCTTATAGA AAGAAAGATT CTGGGGTCCA 5041 AGAAAGCAGT CATTTCTTAC AAGGAGCCAA AAAAAATAAC CTTTCTTTAG CCATTCTAAC 5101 CTTGGAGATG ACTGGTGATC AAAGAGAGGT TGGCTCCCTG GGGACAAGTG CCACAAATTC 5161 AGTCACATAC AAGAAAGTTG AGAACACTGT TCTCCCGAAA CCAGACTTGC CCAAAACATC 5221 TGGCAAAGTT GAATTGCTTC CAAAAGTTCA CATTTATCAG AAGGACCTAT TCCCTACGGA 5281 AACTAGCAAT GGGTCTCCTG GCCATCTGGA TCTCGTGGAA GGGAGCCTTC TTCAGGGAAC 5341 AGAGGGAGCG ATTAAGTGGA ATGAAGCAAA CAGACCTGGA AAAGTTCCCT TTCTGAGAGT 5401 AGCAACAGAA AGCTCTGCAA AGACTCCCTC CAAGCTATTG GATCCTCTTG CTTGGGATAA 5461 CCACTATGGT ACTCAGATAC CAAAAGAAGA GTGGAAATCC CAAGAGAAGT CACCAGAAAA 5521 AACAGCTTTT AAGAAAAAGG ATACCATTTT GTCCCTGAAC GCTTGTGAAA GCAATCATGC 5581 AATAGCAGCA ATAAATGAGG GACAAAATAA GCCCGAAATA GAAGTCACCT GGGCAAAGCA 5641 AGGTAGGACT GAAAGGCTGT GCTCTCAAAA CCCACCAGTC TTGAAACGCC ATCAACGGGA 5701 AATAACTCGT ACTACTCTTC AGTCAGATCA AGAGGAAATT GACTATGATG ATACCATATC 5761 AGTTGAAATG AAGAAGGAAG ATTTTGACAT TTATGATGAG GATGAAAATC AGAGCCCCCG 5821 CAGCTTTCAA AAGAAAACAC GACACTATTT TATTGCTGCA GTGGAGAGGC TCTGGGATTA 5881 TGGGATGAGT AGCTCCCCAC ATGTTCTAAG AAACAGGGCT CAGAGTGGCA GTGTCCCTCA 5941 GTTCAAGAAA GTTGTTTTCC AGGAATTTAC TGATGGCTCC TTTACTCAGC CCTTATACCG 6001 TGGAGAACTA AATGAACATT TGGGACTCCT GGGGCCATAT ATAAGAGCAG AAGTTGAAGA

- 40 041588

6061 TAATATCATG GTAACTTTCA GAAATCAGGC CTCTCGTCCC TATTCCTTCT ATTCTAGCCT

6121 TATTTCTTAT GAGGAAGATC AGAGGCAAGG AGCAGAACCT AGAAAAAACT TTGTCAAGCC

6181 TAATGAAACC AAAACTTACT TTTGGAAAGT GCAACATCAT ATGGCACCCA CTAAAGATGA

6241 GTTTGACTGC AAAGCCTGGG CTTATTTCTC TGATGTTGAC CTGGAAAAAG ATGTGCACTC

6301 AGGCCTGATT GGACCCCTTC TGGTCTGCCA CACTAACACA CTGAACCCTG CTCATGGGAG

6361 ACAAGTGACA GTACAGGAAT TTGCTCTGTT TTTCACCATC TTTGATGAGA CCAAAAGCTG

6421 GTACTTCACT GAAAATATGG AAAGAAACTG CAGGGCTCCC TGCAATATCC AGATGGAAGA

6481 TCCCACTTTT AAAGAGAATT ATCGCTTCCA TGCAATCAAT GGCTACATAA TGGATACACT

6541 ACCTGGCTTA GTAATGGCTC AGGATCAAAG GATTCGATGG TATCTGCTCA GCATGGGCAG

6601 CAATGAAAAC ATCCATTCTA TTCATTTCAG TGGACATGTG TTCACTGTAC GAAAAAAAGA

6661 GGAGTATAAA ATGGCACTGT ACAATCTCTA TCCAGGTGTT TTTGAGACAG TGGAAATGTT

6721 ACCATCCAAA GCTGGAATTT GGCGGGTGGA ATGCCTTATT GGCGAGCATC TACATGCTGG

6781 GATGAGCACA CTTTTTCTGG TGTACAGCAA TAAGTGTCAG ACTCCCCTGG GAATGGCTTC

6841 TGGACACATT AGAGATTTTC AGATTACAGC TTCAGGACAA TATGGACAGT GGGCCCCAAA

6901 GCTGGCCAGA CTTCATTATT CCGGATCAAT CAATGCCTGG AGCACCAAGG AGCCCTTTTC

6961 TTGGATCAAG GTGGATCTGT TGGCACCAAT GATTATTCAC GGCATCAAGA CCCAGGGTGC

7021 CCGTCAGAAG TTCTCCAGCC TCTACATCTC TCAGTTTATC ATCATGTATA GTCTTGATGG

7081 GAAGAAGTGG CAGACTTATC GAGGAAATTC CACTGGAACC TTAATGGTCT TCTTTGGCAA

7141 TGTGGATTCA TCTGGGATAA AACACAATAT TTTTAACCCT CCAATTATTG CTCGATACAT

7201 CCGTTTGCAC CCAACTCATT ATAGCATTCG CAGCACTCTT CGCATGGAGT TGATGGGCTG

7261 TGATTTAAAT AGTTGCAGCA TGCCATTGGG AATGGAGAGT AAAGCAATAT CAGATGCACA

7321 GATTACTGCT TCATCCTACT TTACCAATAT GTTTGCCACC TGGTCTCCTT CAAAAGCTCG

7381 ACTTCACCTC CAAGGGAGGA GTAATGCCTG GAGACCTCAG GTGAATAATC CAAAAGAGTG

7441 GCTGCAAGTG GACTTCCAGA AGACAATGAA AGTCACAGGA GTAACTACTC AGGGAGTAAA

7501 ATCTCTGCTT ACCAGCATGT ATGTGAAGGA GTTCCTCATC TCCAGCAGTC AAGATGGCCA

7561 TCAGTGGACT CTCTTTTTTC AGAATGGCAA AGTAAAGGTT TTTCAGGGAA ATCAAGACTC

7621 CTTCACACCT GTGGTGAACT CTCTAGACCC ACCGTTACTG ACTCGCTACC TTCGAATTCA

7681 CCCCCAGAGT TGGGTGCACC AGATTGCCCT GAGGATGGAG GTTCTGGGCT GCGAGGCACA

7741 GGACCTCTAC * подчеркнутые нуклеиновые кислоты кодируют сигнальный пептид.

Полипептиды FVIII включают полноразмерный FVIII, полноразмерный FVIII минус Met на Nконце, зрелый FVIII (минус сигнальная последовательность), зрелый FVIII с дополнительным Met на Nконце и/или FVIII с полной или частичной делецией В-домена. В определенных вариантах реализации изобретения варианты FVIII включают делеции В-домена, которые могут быть частичными или полными делециями.

Человеческий ген FVIII был выделен и экспрессирован в клетках млекопитающих (Toole, J. J., et al., Nature 312:342-347 (1984); Gitschier, J., et al, Nature 312:326-330 (1984); Wood, W. I, et al, Nature 312:330337 (1984); Vehar, G. A., et al, Nature 312:337-342 (1984); WO 87/04187; WO 88/08035; WO 88/03558; и патент США № 4757006). Аминокислотная последовательность FVIII была определена по кДНК, как показано в патенте США № 4965199. Кроме того, FVIII с частичной или полной делецией В-домена представлена в патентах США № 4994371 и 4868112. В некоторых вариантах реализации изобретения Вдомен человеческого FVIII замещен на В-домен человеческого фактора V, как описано в патенте США № 5004803. Последовательность кДНК, кодирующая человеческий фактор VIII, и его аминокислотная последовательность приведены в SEQ ID NO: 1 и 2, соответственно, в патенте США № 7211559.

Свинная последовательность FVIII опубликована в Toole, J. J., et al, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 83:5939-5942 (1986). Дополнительно, полная последовательность свиной кДНК, полученной в результате ПЦР-амплификации последовательности FVIII из библиотеки кДНК свиной селезенки была описана у Healey, J. F., et al, Blood 88:4209-4214 (1996). Гибридный человеческий/свиной FVIII, имеющий замещения во всех доменах, всех субъединицах, и специфические аминокислотные последовательности были раскрыты в патенте США № 5364771, на имя Lollar и Runge, и в WO 93/20093. Недавно, нуклеотидные и соответствующие аминокислотные последовательности доменов А1 и А2 свиного FVIII и химерного FVIII со свинными доменами А1 и/или А2, замещающими соответствующие человеческие домены, были описаны в WO 94/11503. Патент США № 5859204, на имя Lollar, J. S., также раскрывает свиную кДНК и расшифрованные аминокислотные последовательности. Патент США № 6458563 раскрывает свиной FVIII с делецией В-домена.

Патент США № 5859204, на имя Lollar, J. S., описывает функциональные мутанты FVIII, имеющие пониженную антигенность и пониженную иммунореактивность. Патент США № 6376463, на имя Lollar, J. S., также описывает мутанты FVIII, имеющие пониженную иммунореактивность. Публикация заявки США № 2005/0100990, на имя Saenko et al., описывает функциональные мутации в домене А2 FVIII. В одном варианте реализации изобретения белок FVIII (или относящаяся к FVIII часть химерного белка) может быть по меньшей мере на 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичным аминокислотной последовательности FVIII, представленной аминокислотами 1-1438 SEQ ID NO: 18 или аминокислотами 1-2332 SEQ ID NO: 16 (без сигнальной последовательности), причем FVIII обладает свертывающей активностью, например активирует фактор IX в качестве кофактора для превращения фактора X в активированный фактор X. FVIII (или относящаяся к FVIII часть химерного белка) может быть идентичным аминокислотной последовательности FVIII, представленной аминокислотами 1-1438 SEQ ID NO: 18 или аминокислотами 1-2332 SEQ ID NO: 16 (без сигнальной последовательности). Белок FVIII может дополнительно содержать сигнальную последовательность.

- 41 041588

В-домен FVIII, в используемом в данном документе значении, является таким же, как и В-домен, известный в данной области техники, определенный по идентичности внутренних аминокислотных последовательностей и сайтов протеолитического расщепления, например остатков Ser741-Arg1648 полноразмерного человеческого FVIII. Другие домены человеческого FVIII определяются по следующим аминокислотным остаткам: А1 - остатки Ala1-Arg372; A2 - остатки Ser373-Arg740; A3-остαтки Ser1690Asn2019; C1 - остатки Lys2020-Asn2172; C2 - остатки Ser2173-Tyr2332. Последовательность А3-С1-С2 включает остатки Ser1690-Tyr2332. Оставшаяся часть последовательности, остатки Glu1649-Arg1689, обычно называется кислотной областью а3. Положения границ всех доменов, включая В-домены, для свиной, мышиной и собачьей FVIII также известны в данной области техники. В одном варианте реализации изобретения В-домен FVIII делетирован (фактор VIII с делецией В-домена или BDD FVIII). Примером BDD FVIII является REFACTO® (рекомбинантный BDD FVIII), имеющий такую же последовательность, как и относящаяся к фактору VIII часть последовательности в табл. 5. (тяжелая цепь BDD FVIII подчеркнута двойной линией; В-домен выделен наклонным шрифтом; и легкая цепь BDD FVIII представлена обычным шрифтом).

Таблица 5. BDD FVIII (SEQ ID NO: 18)

ATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSWYKKTLFVEFTDHLFNIAKPRPPWMGLLGPTIQ AEVYDTWITL·KNMΆSHPVSL·HAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPGGSHTYVWQVL·KENGPMASDPL·CL· TYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTOTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETKNSLMQDRDAASARAWPKM HTVNGYVNRLHjPGLIGCHRKYjyYW^ FCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDWRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHY lAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFMAYTDETFKTREAIQHESGILGPLLYGEVGDTLL IIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKWTVTVEDGPTKSDPRCLTRYYSSFVNM ERDLASGLIGPLLICYKESVDORGNOIMSDKRNVILFSVFDENRSWYLTENIORFLPNPAGVOLEDPEFQASNIMHS INGYVFDSLOLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLSVFFSGYTFKHKMVYEDTLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCH NaDFRNRGMITU^LKySSCDKNTGDYYEDimLD^^ DDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKWFQEFTDG SFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAEVEDNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWK VQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWYFTENM ERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYK MALYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWRVECLIGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPK LARLHYSGSINAWSTKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQFIIMYSLDGKKWQTYRGNSTGTLMVF FGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFATW SPSKARLHLQGRSNAWRPQWNPKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKV KVFQGNQDSFTPWNSLDPPLLTRYLRIHPQSWVHQIALRMEVLGCEAQDLY

Таблица 6. Нуклеотидная последовательность, кодирующая BDD FVIII (SEQ ID NO: 19)*

661 A TGCAAATAGA GCTCTCCACC TGCTTCTTTC

721 TGTGCCTTTT GCGATTCTGC TTTAGTGCCA CCAGAAGATA CTACCTGGGT GCAGTGGAAC

781 TGTCATGGGA CTATATGCAA AGTGATCTCG GTGAGCTGCC TGTGGACGCA AGATTTCCTC

841 CTAGAGTGCC AAAATCTTTT CCATTCAACA CCTCAGTCGT GTACAAAAAG ACTCTGTTTG

901 TAGAATTCAC GGATCACCTT TTCAACATCG CTAAGCCAAG GCCACCCTGG ATGGGTCTGC

961 TAGGTCCTAC CATCCAGGCT GAGGTTTATG ATACAGTGGT CATTACACTT AAGAACATGG

1021 CTTCCCATCC TGTCAGTCTT CATGCTGTTG GTGTATCCTA CTGGAAAGCT TCTGAGGGAG

1081 CTGAATATGA TGATCAGACC AGTCAAAGGG AGAAAGAAGA TGATAAAGTC TTCCCTGGTG

1141 GAAGCCATAC ATATGTCTGG CAGGTCCTGA AAGAGAATGG TCCAATGGCC TCTGACCCAC

1201 TGTGCCTTAC CTACTCATAT CTTTCTCATG TGGACCTGGT AAAAGACTTG AATTCAGGCC

1261 TCATTGGAGC CCTACTAGTA TGTAGAGAAG GGAGTCTGGC CAAGGAAAAG ACACAGACCT

1321 TGCACAAATT TATACTACTT TTTGCTGTAT TTGATGAAGG GAAAAGTTGG CACTCAGAAA

- 42 041588

1381 CAAAGAACTC CTTGATGCAG GATAGGGATG CTGCATCTGC TCGGGCCTGG CCTAAAATGC 1441 ACACAGTCAA TGGTTATGTA AACAGGTCTC TGCCAGGTCT GATTGGATGC CACAGGAAAT 1501 CAGTCTATTG GCATGTGATT GGAATGGGCA CCACTCCTGA AGTGCACTCA ATATTCCTCG 1561 AAGGTCACAC ATTTCTTGTG AGGAACCATC GCCAGGCGTC CTTGGAAATC TCGCCAATAA 1621 CTTTCCTTAC TGCTCAAACA CTCTTGATGG ACCTTGGACA GTTTCTACTG TTTTGTCATA 1681 TCTCTTCCCA CCAACATGAT GGCATGGAAG CTTATGTCAA AGTAGACAGC TGTCCAGAGG 1741 AACCCCAACT ACGAATGAAA AATAATGAAG AAGCGGAAGA CTATGATGAT GATCTTACTG 1801 ATTCTGAAAT GGATGTGGTC AGGTTTGATG ATGACAACTC TCCTTCCTTT ATCCAAATTC 1861 GCTCAGTTGC CAAGAAGCAT CCTAAAACTT GGGTACATTA CATTGCTGCT GAAGAGGAGG 1921 ACTGGGACTA TGCTCCCTTA GTCCTCGCCC CCGATGACAG AAGTTATAAA AGTCAATATT 1981 TGAACAATGG CCCTCAGCGG ATTGGTAGGA AGTACAAAAA AGTCCGATTT ATGGCATACA 2041 CAGATGAAAC CTTTAAGACT CGTGAAGCTA TTCAGCATGA ATCAGGAATC TTGGGACCTT 2101 TACTTTATGG GGAAGTTGGA GACACACTGT TGATTATATT TAAGAATCAA GCAAGCAGAC 2161 CATATAACAT CTACCCTCAC GGAATCACTG ATGTCCGTCC TTTGTATTCA AGGAGATTAC 2221 CAAAAGGTGT AAAACATTTG AAGGATTTTC CAATTCTGCC AGGAGAAATA TTCAAATATA 2281 AATGGACAGT GACTGTAGAA GATGGGCCAA CTAAATCAGA TCCTCGGTGC CTGACCCGCT 2341 ATTACTCTAG TTTCGTTAAT ATGGAGAGAG ATCTAGCTTC AGGACTCATT GGCCCTCTCC 2401 TCATCTGCTA CAAAGAATCT GTAGATCAAA GAGGAAACCA GATAATGTCA GACAAGAGGA 2461 ATGTCATCCT GTTTTCTGTA TTTGATGAGA ACCGAAGCTG GTACCTCACA GAGAATATAC 2521 AACGCTTTCT CCCCAATCCA GCTGGAGTGC AGCTTGAGGA TCCAGAGTTC CAAGCCTCCA 2581 ACATCATGCA CAGCATCAAT GGCTATGTTT TTGATAGTTT GCAGTTGTCA GTTTGTTTGC 2641 ATGAGGTGGC ATACTGGTAC ATTCTAAGCA TTGGAGCACA GACTGACTTC CTTTCTGTCT 2701 TCTTCTCTGG ATATACCTTC AAACACAAAA TGGTCTATGA AGACACACTC ACCCTATTCC 2761 CATTCTCAGG AGAAACTGTC TTCATGTCGA TGGAAAACCC AGGTCTATGG ATTCTGGGGT 2821 GCCACAACTC AGACTTTCGG AACAGAGGCA TGACCGCCTT ACTGAAGGTT TCTAGTTGTG 2881 ACAAGAACAC TGGTGATTAT TACGAGGACA GTTATGAAGA TATTTCAGCA TACTTGCTGA 2941 GTAAAAACAA TGCCATTGAA CCAAGAAGCT TCTCTCAAAA CCCACCAGTC TTGAAACGCC 3001 ATCAACGGGA AATAACTCGT ACTACTCTTC AGTCAGATCA AGAGGAAATT GACTATGATG 3061 ATACCATATC AGTTGAAATG AAGAAGGAAG ATTTTGACAT TTATGATGAG GATGAAAATC 3121 AGAGCCCCCG CAGCTTTCAA AAGAAAACAC GACACTATTT TATTGCTGCA GTGGAGAGGC 3181 TCTGGGATTA TGGGATGAGT AGCTCCCCAC ATGTTCTAAG AAACAGGGCT CAGAGTGGCA 3241 GTGTCCCTCA GTTCAAGAAA GTTGTTTTCC AGGAATTTAC TGATGGCTCC TTTACTCAGC 3301 CCTTATACCG TGGAGAACTA AATGAACATT TGGGACTCCT GGGGCCATAT ATAAGAGCAG 3361 AAGTTGAAGA TAATATCATG GTAACTTTCA GAAATCAGGC CTCTCGTCCC TATTCCTTCT 3421 ATTCTAGCCT TATTTCTTAT GAGGAAGATC AGAGGCAAGG AGCAGAACCT AGAAAAAACT 3481 TTGTCAAGCC TAATGAAACC AAAACTTACT TTTGGAAAGT GCAACATCAT ATGGCACCCA 3541 CTAAAGATGA GTTTGACTGC AAAGCCTGGG CTTATTTCTC TGATGTTGAC CTGGAAAAAG 3601 ATGTGCACTC AGGCCTGATT GGACCCCTTC TGGTCTGCCA CACTAACACA CTGAACCCTG 3661 CTCATGGGAG ACAAGTGACA GTACAGGAAT TTGCTCTGTT TTTCACCATC TTTGATGAGA 3721 CCAAAAGCTG GTACTTCACT GAAAATATGG AAAGAAACTG CAGGGCTCCC TGCAATATCC 3781 AGATGGAAGA TCCCACTTTT AAAGAGAATT ATCGCTTCCA TGCAATCAAT GGCTACATAA 3841 TGGATACACT ACCTGGCTTA GTAATGGCTC AGGATCAAAG GATTCGATGG TATCTGCTCA 3901 GCATGGGCAG CAATGAAAAC ATCCATTCTA TTCATTTCAG TGGACATGTG TTCACTGTAC 3961 GAAAAAAAGA GGAGTATAAA ATGGCACTGT ACAATCTCTA TCCAGGTGTT TTTGAGACAG 4021 TGGAAATGTT ACCATCCAAA GCTGGAATTT GGCGGGTGGA ATGCCTTATT GGCGAGCATC 4081 TACATGCTGG GATGAGCACA CTTTTTCTGG TGTACAGCAA TAAGTGTCAG ACTCCCCTGG 4141 GAATGGCTTC TGGACACATT AGAGATTTTC AGATTACAGC TTCAGGACAA TATGGACAGT 4201 GGGCCCCAAA GCTGGCCAGA CTTCATTATT CCGGATCAAT CAATGCCTGG AGCACCAAGG 4261 AGCCCTTTTC TTGGATCAAG GTGGATCTGT TGGCACCAAT GATTATTCAC GGCATCAAGA 4321 CCCAGGGTGC CCGTCAGAAG TTCTCCAGCC TCTACATCTC TCAGTTTATC ATCATGTATA 4381 GTCTTGATGG GAAGAAGTGG CAGACTTATC GAGGAAATTC CACTGGAACC TTAATGGTCT 4441 TCTTTGGCAA TGTGGATTCA TCTGGGATAA AACACAATAT TTTTAACCCT CCAATTATTG 4501 CTCGATACAT CCGTTTGCAC CCAACTCATT ATAGCATTCG CAGCACTCTT CGCATGGAGT 4561 TGATGGGCTG TGATTTAAAT AGTTGCAGCA TGCCATTGGG AATGGAGAGT AAAGCAATAT 4621 CAGATGCACA GATTACTGCT TCATCCTACT TTACCAATAT GTTTGCCACC TGGTCTCCTT 4681 CAAAAGCTCG ACTTCACCTC CAAGGGAGGA GTAATGCCTG GAGACCTCAG GTGAATAATC 4741 CAAAAGAGTG GCTGCAAGTG GACTTCCAGA AGACAATGAA AGTCACAGGA GTAACTACTC 4801 AGGGAGTAAA ATCTCTGCTT ACCAGCATGT ATGTGAAGGA GTTCCTCATC TCCAGCAGTC 4861 AAGATGGCCA TCAGTGGACT CTCTTTTTTC AGAATGGCAA AGTAAAGGTT TTTCAGGGAA 4921 ATCAAGACTC CTTCACACCT GTGGTGAACT CTCTAGACCC ACCGTTACTG ACTCGCTACC 4981 TTCGAATTCA CCCCCAGAGT TGGGTGCACC AGATTGCCCT GAGGATGGAG GTTCTGGGCT 5041 GCGAGGCACA GGACCTCTAC * подчеркнутые нуклеиновые кислоты кодируют сигнальный пептид.

FVIII с делецией В-домена может иметь полные или частичные делеции, раскрытые в патентах США № 6316226, 6346513, 7041635, 5789203, 6060447, 5595886, 6228620, 5972885, 6048720, 5543502, 5610278, 5171844, 5112950, 4868112 и 6458563. В некоторых вариантах реализации изобретения последовательность FVIII с делецией В-домена по настоящему изобретению содержит любую из делеций, раскрытых от колонки 4, строка 4, до колонки 5, строка 28, и в примерах 1-5 патента США № 6316226 (также в US 6346513). В другом варианте реализации изобретения фактор VIII с делецией В-домена представляет собой фактор VIII с делецией В-домена S743/Q1638 (SQ BDD FVIII) (например, фактор VIII, имеющий делецию от аминокислоты 744 до аминокислоты 1637, например, фактор VIII, содержащий аминокислоты 1-743 и аминокислоты 1638-2332 SEQ ID NO: 16, т.е. SEQ ID NO: 18). В некоторых вариантах реализации изобретения FVIII с делецией В-домена по настоящему изобретению имеет делецию, раскрытую в колонке 2, строки 26-51, и примерах 5-8 патента США № 5789203 (также US 6060447, US 5595886 и US 6228620). В некоторых вариантах реализации изобретения фактор VIII с делецией Вдомена имеет делецию, описанную от колонки 1, строка 25, до колонки 2, строка 40 патента США № 5972885; в колонке 6, строки 1-22, и примере 1 патента США № 6048720; в колонке 2, строки 17-46,

- 43 041588 патента США № 5543502; от колонки 4, строка 22, до колонки 5, строка 36, патента США № 5171844; в колонке 2, строки 55-68, на фигуре 2 и в примере 1 патента США № 5112950; от колонки 2, строка 2, до колонки 19, строка 21, и в таблице 2 патента США № 4868112; от колонки 2, строка 1, до колонки 3, строка 19, от колонки 3, строка 40, до колонки 4, строка 67, от колонки 7, строка 43, до колонки 8, строка 26, и от колонки 11, строка 5, до колонки 13, строка 39, патента США № 7041635; или в колонке 4, строки 25-53, патента США № 6458563.

В некоторых вариантах реализации изобретения FVIII с делецией В-домена имеет делецию большей части В-домена, но при этом содержит аминоконцевые последовательности В-домена, являющиеся существенными для in vivo протеолитического процессинга первичного продукта трансляции в две полипептидные цепи, как раскрыто в WO 91/09122. В некоторых вариантах реализации изобретения FVIII с делецией В-домена сконструирован с делецией аминокислот 747-1638, т.е. по существу, с полной делецией В-домена. Hoeben R.C., et al. J. Biol. Chem. 265 (13): 7318-7323 (1990). Фактор VIII с делецией Вдомена может также содержать делецию аминокислот 771-1666 или аминокислот 868-1562 FVIII. Meulien P., et al. Protein Eng. 2(4): 301-6 (1988). Дополнительные делеции В-домена, являющиеся частью изобретения, включают: делеция аминокислот 982-1562 или 760-1639 (Toole et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1986) 83, 5939-5942)), 797-1562 (Eaton, et al. Biochemistry (1986) 25:8343-8347)), 741-1646 (Kaufman (опубликованная заявка РСТ № WO 87/04187)), 747-1560 (Sarver, et al, DNA (1987) 6:553-564)), 741-1648 (Pasek (заявка РСТ № 88/00831)), или 816-1598 или 741-1648 (Lagner (Behring Inst. Mitt. (1988) No 82:1625, EP 295597)). В других вариантах реализации изобретения BDD FVIII включает полипептид FVIII, содержащий фрагменты В-домена, сохраняющие один или более N-связанных сайтов гликозилирования, например остатки 757, 784, 828, 900, 963 или, необязательно, 943, которые соответствуют аминокислотной последовательности полноразмерной последовательности FVIII. Примеры фрагментов В-домена включают 226 аминокислот или 163 аминокислоты В-домена, как раскрыто в Miao, H.Z., et al, Blood 103(a): 3412-3419 (2004), Kasuda, A, et al, J. Thromb. Haemost. 6: 1352-1359 (2008) и Pipe, S.W., et al., J. Thromb. Haemost. 9: 2235-2242 (2011) (т.е. сохраняются первые 226 аминокислот или 163 аминокислоты В-домена). В некоторых вариантах реализации изобретения FVIII с частичным В-доменом представляет собой FVIII198. FVIII198 представляет собой одноцепочечную молекулу FVIIIFc-226N6, содержащую частичный В-домен. 226 обозначает N-концевую аминокислоту 226 В-домена FVIII, и N6 обозначает шесть сайтов N-гликозилирования в В-домене. В еще одних вариантах реализации изобретения BDD FVIII дополнительно содержит точковую мутацию в положении остатка 309 (от Phe до Ser) для улучшения экспрессии BDD-белка FVIII. См. Miao, H.Z., et al., Blood 103(a): 3412-3419 (2004). В еще одних вариантах реализации изобретения BDD FVIII включает полипептид FVIII, содержащий часть В-домена, но не содержащий одного или более фуриновых сайтов расщепления (например, Arg1313 и Arg 1648). См. Pipe, S.W., et al., J. Thromb. Haemost. 9: 2235-2242 (2011). Каждая из вышеупомянутых делеций может быть выполнена в любой последовательности FVIII.

Белок FVIII, пригодный для использования по настоящему изобретению, может включать FVIII, имеющий одну или более дополнительных гетерологичных последовательностей или химических или физических модификаций в нем, которые не влияют на коагулирующую активность FVIII. Такие гетерологичные последовательности или химические или физические модификации могут быть слиты с Сконцом или N-концом белка FVIII или вставлены между одной или более парами аминокислотных остатков в белке FVIII. Такие вставки в белке FVIII не влияют на коагулирующую активность FVIII или функцию FVIII. В одном варианте реализации изобретения вставки улучшают фармакокинетические свойства белка FVIII (например, период полувыведения). В другом варианте реализации изобретения вставки могут быть сделаны в более чем двух, трех, четырех, пяти или шести сайтах.

В одном варианте реализации изобретения FVIII расщепляется сразу за аргинином в положении аминокислоты 1648 (в полноразмерном факторе VIII или SEQ ID NO: 16), аминокислоты 754 (в факторе VIII с делецией В-домена S743/Q1638 или SEQ ID NO: 16), или соответствующим аргининовым остатком (в других вариантах), с образованием в результате тяжелой цепи и легкой цепи. В другом варианте реализации изобретения FVIII содержит тяжелую цепь и легкую цепь, которые связаны или ассоциированы с помощью медиируемой ионом металла нековалентной связи. В других вариантах реализации изобретения FVIII представляет собой одноцепочечный FVIII, который не был расщеплен сразу за аргинином в положении аминокислоты 1648 (в полноразмерном FVIII или SEQ ID NO: 16), аминокислоты 754 (в FVIII с делецией В-домена S743/Q1638 или SEQ ID NO: 18), или соответствующим аргининовым остатком (в других вариантах). Одноцепочечный FVIII может содержать одно или более аминокислотных замещений. В одном варианте реализации изобретения аминокислотное замещение находится в остатке, соответствующем остатку 1648, остатку 1645, или обоим, полноразмерного зрелого полипептида фактора VIII (SEQ ID NO: 16) или остатку 754, остатку 751, или обоим, SQ BDD фактора VIII (SEQ ID NO: 18). Аминокислотное замещение может быть любыми аминокислотами, отличными от аргинина, например изолейцином, лейцином, лизином, метионином, фенилаланином, треонином, триптофаном, валином, аланином, аспарагином, аспарагиновой кислотой, цистеином, глутаминовой кислотой, глутамином, глицином, пролином, селеноцистеином, серином, тирозином, гистидином, орнитином, пирролизином или таурином. FVIII дополнительно может быть расщеплен тромбином и затем активирован как FVIIIa, слу

- 44 041588 жащий кофактором для активированного фактора IX (FIXa). Активированный FIX вместе с активированным FVIII образует комплекс Xase и превращает фактор X в активированный фактор X (FXa). Для активации, FVIII расщепляется тромбином после трех аргининовых остатков, в положениях аминокислот 372, 740 и 1689 (соответствующих аминокислотам 372, 740 и 795 в последовательности FVIII с делецией Вдомена), образуя в результате расщепления FVIIIa, имеющий цепи 50 кДа А1, 43 кДа А2 и 73 кДа А3-С1С2. В одном варианте реализации изобретения белок FVIII, пригодный для использования в настоящем изобретении, представляет собой неактивный FVIII. В другом варианте реализации изобретения белок FVIII представляет собой активированный FVIII. Белок, имеющий полипептид FVIII, связанный с или ассоциированный с белком VWF, может содержать последовательность, по меньшей мере на 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичную SEQ ID NO: 16 или 18, причем последовательность обладает свертывающей активностью FVIII, например, активирует фактор IX в качестве кофактора для превращения фактора X в активированный фактор X (FXa).

В некоторых вариантах реализации изобретения белок FVIII дополнительно содержит один или более гетерологичных фрагментов, слитых с С-концом или N-концом белка FVIII или вставленных между двумя соседними аминокислотами в белок FVIII. В других вариантах реализации изобретения гетерологичные фрагменты содержат аминокислотную последовательность, состоящую из по меньшей мере около 50 аминокислот, по меньшей мере около 100 аминокислот, по меньшей мере около 150 аминокислот, по меньшей мере около 200 аминокислот, по меньшей мере около 250 аминокислот, по меньшей мере около 300 аминокислот, по меньшей мере около 350 аминокислот, по меньшей мере около 400 аминокислот, по меньшей мере около 450 аминокислот, по меньшей мере около 500 аминокислот, по меньшей мере около 550 аминокислот, по меньшей мере около 600 аминокислот, по меньшей мере около 650 аминокислот, по меньшей мере около 700 аминокислот, по меньшей мере около 750 аминокислот, по меньшей мере около 800 аминокислот, по меньшей мере около 850 аминокислот, по меньшей мере около 900 аминокислот, по меньшей мере около 950 аминокислот или по меньшей мере около 1000 аминокислот. В некоторых вариантах реализации изобретения период полувыведения химерной молекулы увеличивается по меньшей мере в около 1,5 раза, по меньшей мере в около 2 раз, по меньшей мере в около 2,5 раза, по меньшей мере в около 3 раз, по меньшей мере в около 4 раз, по меньшей мере в около 5 раз, по меньшей мере в около 6 раз, по меньшей мере в около 7 раз, по меньшей мере в около 8 раз, по меньшей мере в около 9 раз, по меньшей мере в около 10 раз, по меньшей мере в около 11 раз или по меньшей мере в около 12 раз, по сравнению с FVIII дикого типа.

Другие типичные примеры вариантов FVIII также раскрыты в публикации США № US2013/0017997, опубликованной 17 января 2013 г., международной публикации № WO 2013/122617, опубликованной 22 августа 2013 г., или международной публикации № WO 2014/011819, опубликованной 16 января 2014 г., или международной публикации № WO2013123457 А1, или международной заявке № PCT/US2013/049989.

III. Полинуклеотиды, векторы и способы получения.

Изобретение также предусматривает полинуклеотид, кодирующий химерную молекулу, описанную в данном документе. В тех случаях, когда белок VWF соединен с гетерологичным фрагментом с помощью линкера VWF и с белком FVIII и последовательностью XTEN в химерном белке в виде одной полипептидной цепи, изобретение относится к одному полинуклеотиду, кодирующему одну полипептидную цепь. В тех случаях, когда химерный белок содержит первую и вторую полипептидные цепи, первая полипептидная цепь, содержащая белок VWF, последовательность XTEN и первый гетерологичный фрагмент (например, первую Fc-область), присоединенный с помощью линкера VWF, и вторая полипептидная цепь, содержащая белок FVIII и второй гетерологичный фрагмент (например, вторую Fc-область), полинуклеотид может содержать первую нуклеотидную область и вторую нуклеотидную область. В одном варианте реализации изобретения первая нуклеотидная область и вторая нуклеотидная область находятся в одном и том же полинуклеотиде. В другом варианте реализации изобретения первая нуклеотидная область и вторая нуклеотидная область находятся в двух разных полинуклеотидах (например, разных векторах). В определенных вариантах реализации изобретения настоящее изобретение касается набора полинуклеотидов, содержащих первую нуклеотидную цепь и вторую нуклеотидную цепь, причем первая нуклеотидная цепь кодирует белок VWF, последовательность XTEN, линкер VWF и гетерологичный фрагмент химерного белка, и вторая нуклеотидная цепь кодирует белок FVIII и второй гетерологичный фрагмент. В некоторых вариантах реализации изобретения настоящее изобретение касается набора полинуклеотидов, содержащих первую нуклеотидную цепь и вторую нуклеотидную цепь, причем первая нуклеотидная цепь кодирует белок VWF и гетерологичный фрагмент химерного белка, и вторая нуклеотидная цепь кодирует белок FVIII, соединенный со вторым гетерологичным фрагментом с помощью линкера FVIII, причем по меньшей мере одна последовательность XTEN слита с химерным белком. В других вариантах реализации изобретения настоящее изобретение касается набора полинуклеотидов, содержащих первую нуклеотидную цепь и вторую нуклеотидную цепь, причем первая нуклеотидная цепь кодирует белок VWF, линкер VWF и гетерологичный фрагмент химерного белка, и вторая нуклеотидная цепь кодирует белок FVIII, линкер FVIII и второй гетерологичный фрагмент, причем по меньшей мере одна последовательность XTEN слита с химерным белком.

- 45 041588

В других вариантах реализации изобретения набор полинуклеотидов дополнительно содержит дополнительную нуклеотидную цепь (например, вторую нуклеотидную цепь, когда химерный полипептид кодируется одной полинуклеотидной цепью, или третью нуклеотидную цепь, когда химерный белок кодируется двумя полинуклеотидными цепями), которые кодируют протеинконвертазу. Протеинконвертаза может быть выбрана из пропротеинконвертазы субтилизин/кексин типа 5 (PCSK5 или РС5), пропротеинконвертазы субтилизин/кексин типа 7 (PCSK7 или РС5), Kex 2 дрожжей, пропротеинконвертазы субтилизин/кексин типа 3 (РАСЕ или PCSK3), или комбинаций двух или больше из них. В некоторых вариантах реализации изобретения протеинконвертаза представляет собой РАСЕ, РС5 или РС7. В конкретном варианте реализации изобретения протеинконвертаза представляет собой РС5 или РС7. См. международную заявку № PCT/US2011/043568, которая включена в данный документ в качестве ссылки. В другом варианте реализации изобретения протеинконвертаза представляет собой РАСЕ/фурин.

В определенных вариантах реализации изобретения изобретение включает набор полинуклеотидов, содержащий первую нуклеотидную последовательность, кодирующую белок VWF, содержащий домен D' и домен D3 VWF, слитый с первым гетерологичным фрагментом с помощью линкера VWF, вторую нуклеотидную последовательность, кодирующую белок FVIII и второй гетерологичный фрагмент, и третью нуклеотидную последовательность, кодирующую домен D1 и домен D2 VWF, где последовательность XTEN присутствует в первой цепи или во второй цепи. В этом варианте реализации изобретения домен D1 и домен D2 экспрессируются раздельно (не связаны с доменом D'D3 белка VWF) для обеспечения надлежащего образования дисульфидной связи и укладки доменов D'D3. Экспрессия домена D1D2 может происходить в цис- или трансконфигурации.

В используемом в данном документе значении экспрессионный вектор относится к любому конструкту нуклеиновой кислоты, который содержит элементы, необходимые для транскрипции и трансляции вставленной кодирующей последовательности или, в случае вирусного РНК-вектора, необходимые элементы для репликации и трансляции, при введении в пригодную клетку-хозяина. Экспрессионные векторы могут включать плазмиды, фагмиды, вирусы и их производные.

Экспрессионные векторы по изобретению будут включать полинуклеотиды, кодирующие химерную молекулу.

В одном варианте реализации изобретения кодирующая последовательность химерной молекулы функционально связана с контрольной последовательностью экспрессии. В используемом в данном документе значении, две последовательности нуклеиновой кислоты функционально связаны, когда они ковалентно связаны таким образом, чтобы позволить каждой составляющей последовательности нуклеиновой кислоты сохранять свою функциональность. Говорят, что кодирующая последовательность и контрольная последовательность генной экспрессии функционально связаны, когда они ковалентно связаны таким образом, чтобы поместить экспрессию или транскрипцию и/или трансляцию кодирующей последовательности под влияние или контроль контрольной последовательности генной экспрессии. Говорят, что две ДНК-последовательности функционально связаны, если индукция промотора в 5'-последовательности генной экспрессии приводит к транскрипции кодирующей последовательности, и если природа связи между двумя последовательностями ДНК (1) не приводит к введению мутации со сдвигом рамки, (2) не влияет на способность промоторной области направлять транскрипцию кодирующей последовательности, или (3) не влияет на способность соответствующего РНК-транскрипта транслироваться в белок. Таким образом, последовательность генной экспрессии будет функционально связана с кодирующей последовательностью нуклеиновой кислоты, если последовательность генной экспрессии будет способна вызывать транскрипцию этой кодирующей последовательности нуклеиновой кислоты таким образом, чтобы полученный транскрипт транслировался в желательный белок или полипептид.

Контрольная последовательность генной экспрессии, в используемом в данном документе значении, представляет собой любую регуляторную нуклеотидную последовательность, такую как промоторная последовательность или комбинация промотор-энхансер, которая способствует эффективной транскрипции и трансляции кодирующей нуклеиновой кислоты, с которой она функционально связана. Контрольная последовательность генной экспрессии может, например, быть промотором млекопитающего или вирусным промотором, таким как конститутивный или индуцируемый промотор. Конститутивные промоторы млекопитающих включают, без ограничений, промоторы следующих генов: гипоксантинфосфорибозилтрансфераза (HPRT), аденозиндеаминаза, пируваткиназа, промотор бета-актина и другие конститутивные промоторы. Типичные примеры вирусных промоторов, которые конститутивно функционируют в эукариотических клетках, включают, например, промоторы цитомегаловируса (CMV), обезьяньего вируса (например, SV40), папилломавируса, аденовируса, вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), вируса саркомы Рауса, цитомегаловируса, длинные концевые повторы (LTR) вируса лейкоза Молони и других ретровирусов, и промотор тимидинкиназы вируса простого герпеса. Другие конститутивные промоторы известны рядовым специалистам в данной области техники. Промоторы, пригодные для использования в качестве последовательностей генной экспрессии по изобретению, также включают индуцируемые промоторы. Индуцируемые промоторы экспрессируются в присутствии индуцирующего агента. Например, промотор металлотионеина индуцируется для промотирования транскрипции и транс- 46 041588 ляции в присутствии определенных ионов металлов. Другие индуцируемые промоторы известны рядовым специалистам в данной области техники.

В общем, контрольная последовательность генной экспрессии будет включать, по мере необходимости, 5'-нетранскрибируемые и 5'-нетранслируемые последовательности, принимающие участие в инициации транскрипции и трансляции, соответственно, такие как ТАТА-бокс, кэпирующая последовательность, последовательность СААТ и т.п. В частности, такие 5' нетранскрибируемые последовательности будут включать промоторную область, которая включает промоторную последовательность для контроля транскрипции функционально присоединенной кодирующей нуклеиновой кислоты. Последовательности генной экспрессии необязательно включают энхансерные последовательности или, при необходимости, расположенную против хода транскрипции активаторные последовательности.

Вирусные векторы включают, без ограничений, нуклеиновые последовательности следующих вирусов: ретровируса, такого как вирус мышиного лейкоза Молони, вирус мышиной саркомы Харви, мышиный фактор опухоли молочных желез и вирус саркомы Рауса; аденовируса, аденоассоциированного вируса; вирусов типа SV40; полиомавирусов; вирусов Эпштейна-Барр; папилломавирусов; вируса герпеса; вируса коровьей оспы; вируса полиомиелита; и РНК-вируса, такого как ретровирус. Могут быть легко использованы другие векторы, хорошо известные в данной области техники. Определенные вирусные векторы основаны на нецитопатических эукариотических вирусах, в которых несущественные гены были замещены на ген, представляющий интерес. Нецитопатические вирусы включают ретровирусы, жизненный цикл которых включает обратную транскрипцию геномной вирусной РНК в ДНК с последующей провирусной интеграцией в ДНК клетки-хозяина. Ретровирусы были разрешены для проведения испытаний генной терапии человека. Наиболее пригодными являются ретровирусы, дефицитные по репликации (т.е. способные направлять синтез желательных белков, но неспособные производить инфекционные частицы). Такие генетически измененные ретровирусные экспрессионные векторы находят широкое применение в высокоэффективной трансдукции генов in vivo. Стандартные протоколы получения дефицитных по репликации ретровирусов (включая стадии включения экзогенного генетического материала в плазмиду, трансфекции упаковывающей клеточной линии плазмидой, продуцирования рекомбинантных ретровирусов упаковывающей клеточной линией, сбор вирусных частиц из среды тканевой культуры и инфицирование клеток-мишеней вирусными частицами) приведены в Kriegler, M., Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, W.H. Freeman Co., New York (1990) и Murry, E. J., Methods in Molecular Biology, Vol. 7, Humana Press, Inc., Cliffton, N.J. (1991).

В одном варианте реализации изобретения вирус представляет собой аденоассоциированный вирус, являющийся двухцепочечным ДНК-вирусом. Аденоассоциированный вирус может быть методами генной инженерии сделан дефицитным по репликации и способен инфицировать широкий спектр клеточных типов и видов. Дополнительно, он обладает такими преимуществами, как теплостойкость и стойкость к действию липидного растворителя; высокая частота трансдукции в клетках различной генеалогии, включая гемопоэтические клетки; и отсутствие ингибирования суперинфекции, тем самым обеспечивая возможность множественных серий трансдукции. Как сообщается, аденоассоциированный вирус может сайт-специфически интегрироваться в клеточную ДНК человека, тем самым минимизируя возможность инсерционного мутагенеза и вариабельность характеристик экспрессии вставленных генов ретровирусной инфекции. Кроме того, инфекции аденоассоциированных вирусов дикого типа прослеживались в тканевых культурах на протяжении более чем 100 пассажей в отсутствие давления отбора, что говорит о том, что геномнная интеграция аденоассоциированного вируса представляет собой относительно стабильное явление. Аденоассоциированный вирус может также функционировать внехромосомально.

Другие векторы включают плазмидные векторы. Плазмидные векторы подробно описаны в данной области техники и хорошо известны квалифицированным специалистам в данной области техники. См., например, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. В последние несколько лет было обнаружено, что плазмидные векторы являются особенно предпочтительными для доставки генов в клетки in vivo благодаря их неспособности к репликации внутри хозяина и интеграции в его геном. Такие плазмиды, однако, имеющие промотор, совместимый с клеткой-хозяином, могут экспрессировать пептид из гена, функционально кодируемого в плазмиде. Некоторые широко используемые плазмиды, доступные от коммерческих поставщиков, включают pBR322, pUC18, pUC19, различные pcDNA-плазмиды, pRC/CMV, различные pCMV-плазмиды, pSV40 и pBlueScript. Дополнительные примеры конкретных плазмид включают pcDNA3.1, номер по каталогу V79020; pcDNA3.1/hygro, номер по каталогу V87020; pcDNA4/myc-His, номер по каталогу V86320; и pBudCE4.1, номер по каталогу V53220, все от фирмы Invitrogen (Carlsbad, CA.). Другие плазмиды хорошо известны рядовым специалистам в данной области техники. Дополнительно, плазмиды могут быть сконструированы на заказ с использованием стандартных методов молекулярной биологии для удаления и/или добавления конкретных фрагментов ДНК.

В одной системе экспрессии на основе насекомых, которая может быть использована для получения белков по изобретению, вирус ядерного полиэдроза (polyhidrosis) Autographa californica (AcNPV) используется в качестве вектора для экспрессии чужеродных генов. Вирус выращивается в клетках Spodoptera frugiperda.

- 47 041588

Кодирующая последовательность может быть клонирована в несущественные области (например, ген полиэдрона) вируса и помещен под контроль промотора ACNPV (например, промотор полиэдрона). Успешная вставка кодирующей последовательности будет приводить к инактивации гена полиэдрона и продуцированию неокклюдированного рекомбинантного вируса (т.е. вируса, не имеющего белковой оболочки, кодируемой геном полиэдрона). Такие рекомбинантные вирусы затем используются для инфицирования клеток Spodoptera frugiperda, в которых экспрессируется вставленный ген. (см., например, Smith et al. (1983) J Virol 46:584; патент США № 4215051). Дополнительные примеры этой системы экспрессии можно найти в Ausubel et al., eds. (1989) Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience.

Другая система, которая может быть использована для экспрессии белков по изобретению, представляет собой систему экспрессии гена глутаминсинтетазы, также называемую экспрессионной системой GS (Lonza Biologies PLC, Berkshire UK). Эта система экспрессии описана подробно в патенте США № 5981216.

В клетках-хозяевах млекопитающих может быть использован ряд систем экспрессии на основе вирусов. В тех случаях, когда в качестве экспрессионного вектора используется аденовирус, кодирующая последовательность может быть лигирована с комплексом контроля транскрипции/трансляции аденовируса, например поздним промотором и тройственной лидерной последовательностью. Этот химерный ген может быть затем вставлен в геном аденовируса путем in vitro или in vivo рекомбинации. Вставка в несущественную область вирусного генома (например, область Е1 или Е3) будет приводить к получению рекомбинантного вируса, который является жизнеспособным и способен экспрессировать пептид в инфицированных хозяевах. См., например, Logan & Shenk (1984) Proc Natl Acad Sci USA 81:3655). Альтернативно, может быть использован промотор 7,5 K коровьей оспы. См., например, Mackett et al. (1982) Proc Natl Acad Sci USA 79:7415; Mackett et al. (1984) J Virol 49:857; Panicali et al. (1982) Proc Natl Acad Sci USA 79:4927.

Для повышения эффективности продуцирования, полинуклеотиды могут быть сконструированы таким образом, чтобы они кодировали множество звеньев белка по изобретению, разделенных сайтами ферментативного расщепления. Полученный полипептид может быть расщеплен (например, путем обработки пригодным ферментом) для выделения полипептидных звеньев. Это может увеличивать выход полипептидов, управляемый одним промотором. В случае использования в пригодных системах вирусной экспрессии, управление трансляцией каждого полипептида, кодируемого мРНК, осуществляется внутри транскрипта; например, внутренним рибосомо-связывающим сайтом, IRES. Таким образом, полицистронный конструкт направляет транскрипцию отдельной большой полицистронной мРНК, которая, в свою очередь, управляет трансляцией множества индивидуальных полипептидов. Этот подход устраняет продуцирование и ферментативный процессинг полипротеинов и может значительно увеличить выход полипептидов, управляемый одним промотором.

Векторы, используемые для трансформации, будут обычно содержать селектируемый маркер, используемый для идентификации трансформантов. В бактериальных системах, они могут включать ген резистентности к антибиотику, такому как ампициллин или канамицин. Селектируемые маркеры для использования в культивируемых клетках млекопитающего включают гены, придающие резистентность к лекарственным средствам, таким как неомицин, гигромицин и метотрексат. Селектируемый маркер может быть амплифициуемым селектируемым маркером. Одним из амплифициуемых селектируемых маркеров является ген дигидрофолатредуктазы (DHFR). Simonsen С С et al. (1983) Proc Natl Acad Sci USA 80:2495-9. Обзор селектируемых маркеров выполнен Thilly (1986) Mammalian Cell Technology, Butterworth Publishers, Stoneham, Mass, и выбор селектируемых маркеров легко доступен рядовому специалисту в данной области техники.

Селектируемые маркеры могут быть введены в клетку на отдельной плазмиде в то же время, что и ген, представляющий интерес, или они могут быть введены на той же самой плазмиде. При использовании одной и той же самой плазмиды, селектируемый маркер и ген, представляющий интерес, могут находиться под контролем разных промоторов или одного и того же промотора, причем в последнем случае продуцируется дицистронная мРНК. Конструкты этого типа известны в данной области техники (например, патент США № 4713339).

Экспрессионные векторы могут кодировать метки, позволяющие легко очищать рекомбинантно полученный белок. Примеры включают, без ограничений, вектор pUR278 (Ruther et al. (1983) EMBO J 2:1791), в котором кодирующие последовательности белка, который должен экспрессироваться, могут быть лигированы в вектор в рамке с кодирующей областью lac z, так чтобы был получен меченый слитый белок; векторы pGEX могут быть использованы для экспрессии белков по изобретению с меткой глутатион-Sтрансферазы (GST). Такие белки обычно являются растворимыми и могут быть легко очищены от клеток путем адсорбции на глутатион-агарозных бусинах с последующей элюцией в присутствии свободного глутатиона. Векторы включают сайты расщепления (тромбином или протеазой фактора Ха или PRESCISSION PRONEASE™ (Pharmacia, Peapack, N. J.)) для простоты удаления метки после очистки.

Экспрессионный вектор или векторы затем трансфицируют или котрансфицируют в пригодную клетку-мишень, которая экспрессирует полипептиды. Методы трансфекции, известные в данной области

- 48 041588 техники, включают, без ограничений, осаждение фосфата кальция (Wigler et al. (1978) Cell 14:725), электропорацию (Neumann et al. (1982) EMBO J 1:841) и использование реагентов на основе липосом. Различные системы хозяин-экспрессионный вектор могут быть использованы для экспрессии белков, описанных в данном документе, включая как прокариотические, так и эукариотические клетки. Они включают, без ограничений, микроорганизмы, такие как бактерии (например, Е. coli), трансформированные экспрессионными векторами на основе ДНК рекомбинантного бактериофага или плазмидной ДНК, содержащими пригодную кодирующую последовательность; дрожжи или нитчатые грибы, трансформированные экспрессионными векторами рекомбинантных дрожжей или грибов, содержащими пригодную кодирующую последовательность; системы на основе клеток насекомых, инфицированных экспрессионными векторами на основе рекомбинантного вируса (например, бакуловируса) содержащими пригодную кодирующую последовательность; системы растительных клеток, инфицированных экспрессионными векторами на основе рекомбинантного вируса (например, вируса мозаики цветной капусты или вируса мозаики табака), или трансформированных экспрессионными векторами на основе рекомбинантной плазмиды (например, Ti-плазмиды), содержащими пригодную кодирующую последовательность; или системы клеток животных, включая клетки млекопитающего (например, клетки HEK 293, СНО, Cos, HeLa, HKB11 и BHK).

В одном варианте реализации изобретения клетка-хозяин представляет собой эукариотическую клетку. В используемом в данном документе значении, эукариотическая клетка относится к любой животной или растительной клетке, имеющей определенное ядро. Эукариотические клетки животных включают клетки позвоночных, например млекопитающих и клетки беспозвоночных, например насекомых. Эукариотически клетки растений могут включать, в частности, без ограничений, дрожжевые клетки. Эукариотическая клетка отличается от прокариотической клетки, например, бактерий. В определенных вариантах реализации изобретения эукариотическая клетка представляет собой клетку млекопитающего. Клетка млекопитающего является любой клеткой, полученной от млекопитающего. Клетки млекопитающего конкретно включают, без ограничений, клеточные линии млекопитающих. В одном варианте реализации изобретения клетка млекопитающего представляет собой человеческую клетку. В другом варианте реализации изобретения клетка млекопитающего представляет собой клетку HEK 293, которая является клеточной линией почки эмбриона человека. Клетки HEK 293 доступны как CRL-1533 из Американской коллекции типовых культур (American Type Culture Collection, Manassas, VA) и как клетки 293-Н, № кат. 11631-017, или клетки 293-F, № кат. 11625-019, от фирмы Invitrogen (Carlsbad, Calif.). В некоторых вариантах реализации изобретения клетка млекопитающего представляет собой клетку PER.C6 , которая является человеческую клеточную линию, выделенную из сетчатки. Клетки PER.C6 доступны от фирмы Crucell (Leiden, Netherlands). В других вариантах реализации изобретения клетка млекопитающего представляет собой клетку яичника китайского хомячка (СНО). Клетки СНО доступны от Американской коллекции типовых культур (Manassas, VA) (например, СНО-Ki; CCL-61). В еще одних вариантах реализации изобретения клетка млекопитающего представляет собой клетку почки детеныша хомяка (BHK). Клетки BHK доступны от Американской коллекции типовых культур (Manassas, Va.) (например, CRL-1632). В некоторых вариантах реализации изобретения клетка млекопитающего представляет собой клетку HKB11, которая является гибридной клеточной линией клетки HEK293 и человеческой В-клеточной линии. Mei et al, Mol. Biotechnol. 34(2): 165-78 (2006). В одном варианте реализации изобретения плазмида, кодирующая белок VWF, линкер VWF, гетерологичный фрагмент или химерный белок по изобретению, дополнительно включает селектируемый маркер, например, резистентности к зеоцину, и трансфицируется в клетки HEK 293 для продуцирования химерного белка. В еще одних вариантах реализации изобретения трансфицированные клетки являются стабильно трансфицированными. Такие клетки могут быть селектированы и поддерживаться в виде стабильной клеточной лини с использованием обычных методик, известных квалифицированным специалистам в данной области техники. Клетки-хозяева, содержаще ДНК-конструкты белка, выращивают в пригодной питательной среде. В используемом в данном документе значении, термин пригодная питательная среда означает среду, содержащую питательные вещества, требующиеся для роста клеток. Питательные вещества, необходимые для роста клеток, могут включать источник углерода, источник азота, незаменимые аминокислоты, витамины, минеральные вещества и факторы роста. Необязательно, среды могут содержать один или более факторов селекции. Необязательно, среды могут содержать сыворотку теленка или сыворотку плода коровы (FCS). В одном варианте реализации изобретения среды по существу не содержат IgG. Питательную среду обычно подвергают селектированию на клетки, содержащие ДНК-конструкт, например, с помощью лекарственного средства или дефицита необходимого питательного вещества, которые дополняются селектируемым маркером на ДНК-конструкте, или ко-трансфицированные ДНКконструктом. Культивируемые клетки млекопитающих обычно выращивают в коммерчески доступных содержащих сыворотку или бессывороточных средах (например, MEM, DMEM, DMEM/F12). В одном варианте реализации изобретения среда представляет собой CD293 (Invitrogen, Carlsbad, CA.). В другом варианте реализации изобретения среда представляет собой CD17 (Invitrogen, Carlsbad, CA.). Выбор среды, пригодной для конкретной используемой клеточной линии, легко доступен рядовым специалистам в данной области техники.

- 49 041588

Для коэкспрессии двух полипептидных цепей химерной молекулы, как описано в данном документе, клетки-хозяева культивируют в условиях, обеспечивающих возможность экспрессии обоих цепей. В используемом в данном документе значении, культивация относится к поддержанию жизнеспособности клеток in vitro в течение, по меньшей мере, определенного времени. Поддержание может необязательно включать увеличение популяции живых клеток. Например, клетки, поддерживаемые в культуре, могут быть статичными по популяции, но при этом жизнеспособными и способными продуцировать желательный продукт, например рекомбинантный белок или рекомбинантный слитый белок. Пригодные условия для культивации эукариотических клеток хорошо известны в данной области техники и включают надлежащий выбор культуральных сред, добавок для сред, температуры, рН, кислородного насыщения и т.п. Для коммерческих целей, культивация может включать использование любой из различных типов систем масштабирования, включая встряхиваемые колбы, роллер-флаконы, биореакторы на основе полых волокон, биореакторы с перемешиваемой емкостью, эрлифтные биореакторы, биореакторы Wave и другие.

Условия клеточных культур также выбирают таким образом, чтобы обеспечить возможность ассоциации первой цепи и второй цепи химерной молекулы. Условия, позволяющие осуществлять экспрессию химерной молекулы, могут включать присутствие источника витамина K. Например, в одном варианте реализации изобретения стабильно трансфицированные клетки HEK 293 культивируют в среде CD293 (Invitrogen, Carlsbad, CA) или среде OptiCHO (Invitrogen, Carlsbad, CA) с добавкой 4 мМ глутамина. В одном аспекте настоящее изобретение касается способа экспрессии, получения или продуцирования химерного белка, включающего: а) трансфекцию клетки-хозяина полинуклеотидом, кодирующим химерную молекулу, и b) культивацию клетки-хозяина в культуральной среде в условиях, пригодных для экспрессии химерной молекулы, в котором осуществляется экспрессия химерной молекулы.

В дополнительных вариантах реализации изобретения белковый продукт, содержащий химерную молекулу, секретируется в среду. Среда отделяется от клеток, концентрируется, фильтруется и затем пропускается через две или три колонки для аффинной хроматографии, например колонку с белком А и одну или две анионнообменные колонки.

В определенных аспектах настоящее изобретение относится к химерному полипептиду, полученному способами, описанными в данном документе.

In vitro продуцирование позволяет осуществлять масштабирование для получения больших количеств желательных измененных полипептидов по изобретению. Методики культивации клеток млекопитающих в условиях для тканевых культур известны в данной области техники и включают гомогенную суспензионную культуру, например, в эрлифтном реакторе или в реакторе с непрерывным перемешиванием, или иммобилизованную или удерживаемую клеточную культуру, например, в пустотелых волокнах, микрокапсулах, на агарозных микробусинах или керамических картриджах. При необходимости и/или желании, растворы полипептидов могут быть очищены обычными хроматографическими способами, например гель-фильтрацией, ионообменной хроматографией, хроматографией гидрофобных взаимодействий (HIC), хроматографией на DEAE-целлюлозе или аффинной хроматографией.

Изобретение также включает способ улучшения F VШ-активности химерного белка FVIII, содержащего белок VWF, слитый с первым гетерологичным фрагментом и последовательностью XTEN, и белок FVIII, соединенный со вторым гетерологичным фрагментом, включающий вставку линкера VWF между белком VWF и первым гетерологичным фрагментом, причем линкер VWF содержит полипептид, выбранный из: (i) области а2 из фактора VIII (FVIII); (ii) области a1 из FVIII; (iii) области а3 из FVIII; (iv) сайта расщепления тромбином, содержащего X-V-P-R (SEQ ID NO: 3) и мотив экзосайта взаимодействия PAR1, где X представляет собой алифатическую аминокислоту; или (v) любой их комбинации. В некоторых вариантах реализации изобретения FVIII-активность измеряют путем анализа активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ) или методом ротационной тромбозластометрии (ROTEM).

IV. Фармацевтическая композиция.

Композиции, содержащие химерную молекулу по настоящему изобретению, могут содержать пригодный фармацевтически приемлемый носитель. Например, они могут содержать эксципиенты и/или вспомогательные вещества, облегчающие переработку активных соединений в препараты, предназначенные для доставки к месту действия.

Фармацевтическая композиция может быть составлена для парентерального введения (т.е. внутривенного, подкожного, или внутримышечного) путем болюсной инъекции. Композиции для инъекций могут быть представлены в дозированных лекарственных формах, например в ампулах или в многодозовых контейнерах с добавленным консервантом. Композиции могут иметь такие формы, как суспензии, растворы или эмульсии в масляных или водных носителях, и содержать вспомогательные вещества, такие как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие агенты. Альтернативно, активный ингредиент может находиться в форме порошка для восстановления пригодным носителем, например апирогенной водой.

Пригодные композиции для парентерального введения также включают водные растворы активных соединений в водорастворимой форме, например, водорастворимых солей. Кроме того, суспензии активных соединений могут быть введены в виде соответствующих масляных суспензий для инъекции. Пригодные липофильные растворители или носители включают жирные масла, например кунжутное масло,

- 50 041588 или сложные эфиры синтетических жирных кислот, например этилолеат или триглицериды. Водные суспензии для инъекции могут содержать вещества, которые увеличивают вязкость суспензии, включая, например, натрия карбоксиметилцеллюлозу, сорбит и декстран. Необязательно, суспензия может также содержать стабилизаторы. Липосомы также могут быть использованы для инкапсулирования молекул по изобретению для доставки в клетки или интерстициальное пространство. Типичными примерами фармацевтически приемлемых носителей являются физиологически совместимые растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и замедляющие всасывание агенты, вода, солевой раствор, фосфатно-солевой буфер, декстроза, глицерин, этанол и т.п. В некоторых вариантах реализации изобретения композиция содержит изотонические агенты, например сахара, многоатомные спирты, такие как маннит, сорбит, или хлорид натрия. В других вариантах реализации изобретения композиции содержат фармацевтически приемлемые вещества, такие как смачивающие агенты или небольшие количества вспомогательных веществ, таких как смачивающие или эмульгирующие агенты, консерванты или буферы, которые увеличивают срок хранения или эффективность активных ингредиентов.

Композиции по изобретению могут находиться в различных формах, включая, например, жидкости (например, растворы для инъекций и инфузий), дисперсии, суспензии, полутвердые и твердые лекарственные формы. Предпочтительная форма зависит от способа введения и терапевтического применения.

Композиция может быть составлена в виде раствора, микроэмульсии, дисперсии, липосом или других упорядоченных структур, пригодных для обеспечения высоких концентраций лекарственного средства. Стерильные растворы для инъекций могут быть приготовлены путем включения активного ингредиента в требуемом количестве в пригодный растворитель с одним из или комбинацией ингредиентов, перечисленных выше, в зависимости от потребности, с последующей стерилизацией фильтрованием. В общем, дисперсии готовят путем включения активного ингредиента в стерильный носитель, содержащий основную дисперсионную среду и другие необходимые ингредиенты из перечисленных выше. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных растворов для инъекций, предпочтительными способами получения являются вакуумная сушка и лиофилизация, позволяющие получить порошок активного ингредиента плюс любой дополнительный желательный ингредиент из предварительно стерильно профильтрованного раствора. Надлежащая текучесть раствора может поддерживаться, например, путем использования покрытия, такого как лецитин, путем поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсии, и путем использования поверхностно-активных веществ. Пролонгированное всасывание композиций для инъекций может быть обеспечено путем включения в композиции агента, замедляющего всасывание, например моностеаратных солей и желатина.

Композиция активного ингредиента может быть приготовлена с использованием рецептуры композиции или устройства с пролонгированным высвобождением. Примеры таких композиций и устройств включают имплантаты, трансдермальные пластыри и микроинкапсулированные системы доставки. Могут быть использованы биодеградируемые биосовместимые полимеры, например этилен-винилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, полиортоэфиры и полимолочная кислота. Способы получения таких композиций и устройств известны в данной области техники. См., например, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.

Композиции депо для инъекций могут быть изготовлены путем формирования микроинкапсулированных матриц лекарственного средства в биодеградируемых полимерах, таких как полилактидполигликолид. В зависимости от соотношения лекарственного средства и полимера, и природы используемого полимера, можно контролировать скорость высвобождения лекарственного средства. Другими типичными примерами биодеградируемых полимеров являются полиортоэфиры и полиангидриды. Композиции депо для инъекций также могут быть приготовлены путем захвата лекарственного средства в липосомы или микроэмульсии.

В композиции могут быть включены дополнительные активные соединения. В одном варианте реализации изобретения составляется композиция химерной молекулы по изобретению с другим фактором свертывания крови, или его вариантом, фрагментом, аналогом или производным. Например, фактор свертывания крови включает, без ограничений, фактор V, фактор VII, фактор VIII, фактор IX, фактор X, фактор XI, фактор XII, фактор XIII, протромбин, фибриноген, фактор фон Виллебранда или рекомбинантный растворимый тканевый фактор (rsTF) или активированные формы любых вышеперечисленных материалов. Фактор свертывания крови гемостатического средства может также включать антифибринолитические лекарственные средства, например эпсилон-аминокапроновую кислоту, транексамовую кислоту.

Схемы дозирования могут быть отрегулированы для обеспечения оптимальных желательных ответов. Например, может быть введен разовый болюс, может быть введено несколько дробных доз на протяжении определенного периода времени, или доза может быть пропорционально снижена или увеличена в зависимости от требований терапевтической ситуации. Композиции для парентерального введения предпочтительно составляют в виде дозированных лекарственных форм для простоты введения и равномерности дозировки. См., например, Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., Easton, Pa. 1980).

- 51 041588

Помимо активного соединения, жидкая лекарственная форма может содержать инертные ингредиенты, такие как вода, этиловый спирт, этилкарбонат, этилацетат, бензиловый спирт, бензилбензоат, пропиленгликоль, 1,3-бутиленгликоль, диметилформамид, масла, глицерин, тетрагидрофурфуриловый спирт, полиэтиленгликоли и сложные эфиры жирных кислот и сорбитана.

Неограничивающие примеры пригодных фармацевтических носителей также описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences by E. W. Martin. Некоторые примеры эксципиентов включают крахмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рис, муку, мел, силикагель, стеарат натрия, глицеринмоностеарат, тальк, хлорид натрия, сухое снятое молоко, глицерин, пропиленгликоль, воду, этанол и т.п. Композиция может также содержать буферные реагенты для регулирования рН и смачивающие или эмульгирующие агенты.

Для перорального введения фармацевтическая композиция может находиться в форме таблеток или капсул, приготовленных обычными способами. Композиция также может быть приготовлена в виде жидкости, например сиропа или суспензии. Жидкость может включать суспендирующие агенты (например, сироп сорбит, производные целлюлозы или гидрированные пищевые жиры), эмульгирующие агенты (лецитин или гуммиарабик), неводные носители (например, миндальное масло, масляные сложные эфиры, этиловый спирт или фракционированные растительные масла) и консерванты (например, метил- или пропил-п-гидроксибензоаты или сорбиновую кислоту). Препараты могут также включать вкусовые вещества, красящие вещества и подсластители.

Альтернативно, композиция может представлять собой сухой продукт для восстановления водой или другим пригодным носителем.

Для буккального введения композиция может иметь форму таблеток или пастилок в соответствии с обычными протоколами.

Для введения путем ингаляции соединения для использования в соответствии с настоящим изобретением обычно доставляются в виде распыленного аэрозоля с эксципиентами или без них, или в виде распыляемого аэрозоля из упаковки под давлением или небулайзера, необязательно, с пропеллентом, например дихлордифторметаном, трихлорфторметаном, дихлортетрафторметаном, двуокисью углерода или другим пригодным газом. В случае аэрозоля под давлением дозтрующее устройство может быть получено путем обеспечения клапана для доставки дозируемого количества. Могут быть изготовлены композиции для капсул и картриджей, например, изготовленных из желатина, для использования ингаляторе или инсуфляторе, содержащие порошкообразную смесь соединения и пригодной порошкообразной основы, такой как лактоза или крахмал. Фармацевтическая композиция также может быть приготовлена для ректального введения в виде суппозитория или удерживающей клизмы, например, содержащих обычные основы для суппозиториев, такие как какао-масло или другие глицериды.

V. Генная терапия.

Химерная молекула по изобретению может быть получена in vivo у млекопитающего, например пациента, (для которого) использование генно-терапевтического подхода к лечению связанной с кровотечением болезни или расстройства, выбранных из нарушения свертываемости крови, гемартроза, мышечного кровотечения, кровотечения в ротовой полости, кровоизлияния, кровоизлияния в мышцы, кровоизлияния в полости рта, травмы, повреждения черепа, желудочно-кишечного кровотечения, внутричерепного кровоизлияния, внутрибрюшного кровоизлияния, внутригрудного кровоизлияния, перелома кости, кровотечения в центральной нервной системе, кровотечения в заглоточном пространстве, кровотечения в забрюшинном пространстве, или кровоизлияния во влагалище подвздошно-поясничной мышцы будет терапевтически полезным. В одном варианте реализации изобретения связанная с кровотечением болезнь или расстройство представляют собой гемофилию. В другом варианте реализации изобретения связанная с кровотечением болезнь или расстройство представляют собой гемофилию А. При этом предусматривается введение пригодной химерной молекулы, кодирующей нуклеиновую кислоту, функционально связанную с пригодными контрольными последовательностями экспрессии. В определенных вариантах реализации изобретения такие последовательности включены в вирусный вектор. Пригодные вирусные векторы для такой генной терапии включают аденовирусные векторы, лентивирусные векторы, бакуловирусные векторы, векторы на основе вируса Эпштейна-Барр, паповавирусные векторы, векторы на основе вируса коровьей оспы, векторы на основе вируса простого герпеса и аденоассоциированные вирусные (AAV) векторы. Вирусный вектор может быть вирусным вектором с дефектом репликации. В других вариантах реализации изобретения аденовирусный вектор имеет делецию в его гене Е1 ген или гене Е3. В тех случаях, когда используется аденовирусный вектор, млекопитающее может не подвергаться воздействию нуклеиновой кислоты, кодирующей ген селектируемого маркера. В других вариантах реализации изобретения последовательности включены в невирусный вектор, известный квалифицированным специалистам в данной области техники.

VI. Способы применения химерного белка.

Настоящее изобретение дополнительно предусматривает способ снижения частоты или тяжести эпизода кровотечения у субъекта, нуждающегося в этом, с использованием химерной молекулы по изобретению. Типичный способ включает введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества химерной молекулы по изобретению. В других аспектах изобретение включает

- 52 041588 способ предотвращения возникновения эпизода кровотечения у субъекта, нуждающегося в этом, с использованием химерной молекулы по изобретению. В других аспектах композиция, содержащая ДНК, кодирующую рекомбинантный белок по изобретению, может быть введена субъекту, нуждающемуся в этом. В определенных аспектах изобретения, клетка, экспрессирующая химерную молекулу по изобретению, может быть введена субъекту, нуждающемуся в этом. В определенных аспектах изобретения фармацевтическая композиция содержит (i) химерную молекулу, (ii) выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую химерную молекулу, (iii) вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую химерную молекулу, (iv) клетку, содержащую выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую химерную молекулу и/или вектор, содержащий нуклеиновую (кислоту), кодирующую химерную молекулу, или (v) их комбинацию, и фармацевтические композиции дополнительно содержат приемлемый эксципиент или носитель. Эпизод кровотечения может быть вызван или возникнуть вследствие расстройства свертывания крови. Расстройство свертывания крови также может быть названо коагулопатией. В одном примере, расстройство свертывания крови, которое можно лечить фармацевтической композицией в соответствии с данным описанием, представляет собой гемофилию или болезнь фон Виллебранда (vWD). В другом примере, расстройство свертывания крови, которое можно лечить фармацевтической композицией в соответствии с настоящим изобретением, представляет собой гемофилию А. В некоторых вариантах реализации изобретения тип кровотечения, ассоциированного с состоянием кровотечения, выбирают из гемартроза, мышечного кровотечения, кровотечения в ротовой полости, кровоизлияния, кровоизлияния в мышцы, кровоизлияния в полости рта, травмы, повреждения черепа, желудочно-кишечного кровотечения, внутричерепного кровоизлияния, внутрибрюшного кровоизлияния, внутригрудного кровоизлияния, перелома кости, кровотечения в центральной нервной системе, кровотечения в заглоточном пространстве, кровотечения в забрюшинном пространстве, кровоизлияния во влагалище подвздошно-поясничной мышцы или любой их комбинации. В других вариантах реализации изобретения субъект, страдающий от состояния кровотечения, нуждается в хирургическом лечении, включая, например, хирургическую профилактику или периоперационную медицинскую помощь. В одном примере, хирургию выбирают из малого хирургического вмешательства и обширного хирургического вмешательства. Типичные примеры хирургических процедур включают удаление зуба, тонзиллэктомию, паховое грыжесечение, синовэктомию, краниотомию, остеосинтез, травматологическую хирургию, интракраниальную хирургию, интраабдоминальную хирургию, интраторакальную хирургию, хирургию замены суставов (например, полное протезирование коленного сустава, протезирование тазобедренного сустава и т.п.), сердечную хирургию и кесарево сечение. В другом примере субъект получает сопутствующее лечение фактором IX. Поскольку соединения по изобретению способны активировать FIXa, они могут быть использованы для предварительной активации полипептида FIXa перед введением FIXa субъекту. Способы по изобретению могут практиковаться на субъекте, нуждающемся в профилактическом лечении или лечении по требованию. Фармацевтические композиции, содержащие химерную молекулу по изобретению, могут быть составлены для любого пригодного способа введения, включая, например, местное (например, трансдермальное или глазное), пероральное, буккальное, назальное, вагинальное, ректальное или парентеральное введение. Термин парентеральный, в используемом в данном документе значении, включает подкожную, интрадермальную, интраваскулярную (например, внутривенную), внутримышечную, спинальную, внутричерепную, интратекальную, внутриглазную, периокулярную, интраорбитальную, интрасиновиальную и интраперитонеальную инъекцию, а также любую подобную методику инъекции или инфузии. Композиция может быть также, например, суспензией, эмульсией, композицией с пролонгированным высвобождением, кремом, гелем или порошком. Композиция может быть составлена в виде суппозитория, с традиционными связующими и носителями, такими как триглицериды. После подробного описания настоящего изобретения его можно будет лучше понять со ссылкой на приведенные далее примеры, приведенные в данном документе только для иллюстрации и не ограничивающие изобретение. Все патенты и публикации, указанные в данном документе, положительным образом включены в данный документ в качестве ссылок.

Примеры

В примерах были использованы следующие материалы и способы, если не указано иное. Материалы и способы.

В общем, в практике настоящего изобретения используются, если не указано иное, обычные методики химии, биофизики, молекулярной биологии, технологии рекомбинантных ДНК, иммунологии (особенно, например, технологии антител) и стандартные методы электрофореза. См., например, Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Antibody Engineering Protocols (Methods in Molecular Biology), 510, Paul, S., Humana Pr (1996); Antibody Engineering: A Practical Approach (Practical Approach Series, 169), McCafferty, Ed., Irl Pr (1996); Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow et al., CS.H.L. Press, Pub. (1999); и Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons (1992).

Пример 1. Оценка тромбин-медиируемого высвобождения D'D3 различными конструктами VWF.

Этот пример оценивает кинетику тромбин-медиируемого высвобождения D'D3 при 37°С различными конструктами VWF, проиллюстрированными на фиг. 2. Эксперименты Biocore проводились с кон

- 53 041588 структами VWF-Fc, содержащими разные расщепляемые тромбином линкеры между доменом D'D3 VWF и Fc. Конечной целью является использование информации, полученной при гидролизе тромбином VWF-Fc, по отношению к гетеродимерам FVIII-VWF, описанным в данном документе. Все конструкты VWF-D'D3 пропускались над чипом для достижения плотностей связывания белка в диапазоне значений 100-700 RU. После связывания конструкта VWF с чипом, 5 ед./мл тромбина вводят в объем нал поверхностью на 5 мин. Fc остается связанным с чипом, в то время как D'D3 в расщепляемых конструктах высвобождается. Строили график зависимости скорости (RU/c) от плотности захвата (RU), как проиллюстрировано на фиг. 3 и 4. Скорость расщепления пропорциональна начальной плотности захвата, а наклон кривой является мерой восприимчивости каждого конструкта к расщеплению тромбином.

Фиг. 3 иллюстрирует, что VWF-052 (не имеющий сайта расщепления тромбином в линкерной области), как ожидалось, не расщепляется тромбином. Величина скорости для VWF-039 (LVPR с сайтом PAR1) сопоставима со скоростью расщепления FVIII (данные не приведены). Таким образом, VWF-039 служит точкой отсчета для полного высвобождения D'D3 от Fc. Соотношения величин наклона для различных конструктов VWF-Fc по отношению к VWF-039 использовали для определения эффективности расщепления тромбином. VWF-039 (LVPR с сайтом PAR1) расщепляется тромбин в около 70-80 раз быстрее, чем VWF-031 (LVPR). VWF-51 (ALRPRVV) расщепляется в 1,8 раза быстрее, чем VWF-031 (LVPR). VWF-034, содержащий 288 XTEN рядом с (along) сайтом LVPR, демонстрировал более медленное расщепление по сравнению с VWF-031. Были также получены конструкты VWF-Fc путем введения разных кислотных областей (a1, a2 и а3) белка FVIII в линкерную область. VWF-055, содержащий область а2 между D'D3 и областью Fc, демонстрирует расщепление тромбином, близкое к конструкту VWF-039. Как проиллюстрировано на фиг. 4, VWF-054 (область a1) и VWF-056 (область а3) продемонстрировали в около 5 раз более медленное расщепление тромбином.

Фиг. 5 иллюстрирует величины наклона кривых расщепления тромбином для разных конструктов VWF. Из этих результатов следует, что кислотная область 2 (а2) FVIII является высокоэффективным сайтом расщепления тромбином, и она была включена в гетеродимеры FVIII-VWF, как описано в данном документе.

Пример 2. Оценка гемостатической способности гетеродимеров FVIII/VWFD'D3 с помощью анализа методом ROTEM цельной крови пациента с гемофилией А (HemA).

Гетеродимеры FVIII/VWFD'D3, содержащие разные расщепляемые тромбином линкеры, оценивали с помощью анализа методом ROTEM (ротационной тромбоэластометрии) цельной крови донора с гемофилией А (HemA) на их способность влиять на гемостаз. Образец цельной крови брали у донора с тяжелой гемофилией А, сопровождающейся повышенной кровоточивостью, с использованием цитрата натрия в качестве антикоагулянта. Через 40 мин после взятия образца крови, варианты гетеродимера FVIII/VWFD'D3, содержащие разные расщепляемые тромбином линкеры -FVIII155/VWF031 (48 аминокислот, сайт LVPR), FVIII155/VWF039 (26 аминокислот, сайт LVPR+PAR1), FVIII155/VWF055 (34 аминокислоты, а2 из FVIII) разводили в образце цельной крови до конечной концентрации, составляющей 100, 30, 10 и 3% от нормальной, при измерении методом хромогенного анализа FVIII. Немедленно после прибавления гетеродимеров FVIII/VWFD'D3, реакцию ROTEM запускали путем прибавления CaCl₂. Время свертывания (время до достижения амплитуды 2 мм от начала теста) регистрировали с помощью инструмента и строили график зависимости от концентрации FVIII в образцах (фиг. 6). Было выдвинуто предположение, что более сильнодействующий гетеродимер FVIII/VWFD'D3 будет индуцировать более быстрый процесс свертывания, приводя, таким образом, к более коротким временам свертывания по сравнению с менее активным гетеродимером FVIII/VWFD'D3. Как показано на фиг. 6, образцы с добавлением гетеродимера FVIII/VWF039 имели самое коротикое время свертывания при всех протестированных концентрациях, а образцы с добавлением гетеродимера FVIII/VWF031 имели самое большое время свертывания при всех концентрациях. Время свертывания образцов с добавлением гетеродимера FVIII155/VWF055 имеет промежуточные значения. Таким образом, гемостатическая способность изменяется в порядке FVIII155/VWF039>FVIII155/VWF055>FVIII155/VWF031. Поскольку единственным отличием между этими тремя молекулами являются расщепляемые тромбином линкеры между белком VWF и Fc-областью, результаты указывают, что линкер, содержащий сайт LVPR и мотив экзосайта взаимодействия PAR1 и область а2 FVIII, функционирует лучше, чем один лишь сайт LVPR.

Пример 3. Оценка активности гетеродимеров FVIII/VWF.

Гетеродимерные конструкты FVIII-XTEN/VWF трансфицировали в клетки HEK293F с использованием трех плазмид: первая экспрессировала FVIII-XTEN-Fc, вторая экспрессировала VWF-XTEN-Fc и третья экспрессировала РАСЕ. Для трансфекции использовали стандартный протокол с полиэтиленимином (PEI) и после 5 дней трансфекции собирали среду тканевых культур. Из сред были выделены различные комбинации гетеродимеров FVIII-VWF. Активность очищенного белка тестировали с использованием как хромогенного (двухстадийный), так и АЧТВ (одностадийный) анализов свертывания с использованием стандартных протоколов. Введение кислотной области 2 (а2) FVIII или между FVIII и Fc, или между D'D3 и Fc (как указано в табл. 7А и на фиг. 7) улучшает АЧТВ-активность гетеродимера FVIII-VWF, как показано в табл. 7С. Например, гетеродимер FVIII169/VWF059 имеет сайт расщепления тромбином а2 в линкерной области D'D3-Fc и имеет лучшую АЧТВ-активность, чем FVIII169/VWF057,

- 54 041588 который содержит тромбиновый сайт LVPR в линкере D'D3Fc, как показано в табл. 7С. Аналогично, включение области а2 между FVIII и Fc увеличивает одностадийную свертывающую активность гетеродимера, как видно по улучшенному соотношению результатов хромогенного и АЧТВ-анализов для

FVIII286/VWF059 и FVIII286/VWF062, как показано в табл. 7В.

Таблица 7А

Последовательность №	Конструкт	Длина линкера между FVIII и Fc (аминокислот)	Тромбиновый сайт в линкере
1	FVIII169	-	отсутствует
2	FVIII286	32	FVin-a2

Последовательность №	Конструкт	Длина линкера между D'D3 и Fc (аминокислот)	Тромбиновый сайт в линкере
1	VWF057	144АЕ XTEN+ 35+ LVPR	LVPR
2	VWF059	144АЕ XTEN+ 32	FVin-a2
3	VWF062	144АЕ XTEN	отсутствует

Таблица 7В

Конструкты	Отношение хромогенный/АЧТВ
FVIII169/VWF057	2,51
FVIII169/VWF059	1,67
FVIII169/VWF062	2,7
FVIII286/VWF059	0,69
FVIII286/VWF062	0,83

Таблица 7С

Конструкты	Хромо-специфическая активность (МЕ/пмоль)	АЧТВ-специфическая активность (МЕ/пмоль)
FVIII169/VWF057	1,60	0,65
FVIII169/VWF059	1,60	0,90
FVIII169/VWF062	0,87	0,32
FVIII286/VWF059	1,35	1,96
FVIII286/VWF062	1,08	1,33

Пример 4. Острая эффективность гетеродимеров FVIII-XTEN-Fc/D'D3-XTEN-Fc в модели кровотечения HemA-мышей с обрезанным кончиком хвоста.

Острую эффективность гетеродимеров, содержащих разные расщепляемые тромбином линкеры, оценивали с использованием модели кровотечения HemA-мышей с обрезанным кончиком хвоста.

Самцов HemA-мышей в возрасте 8-12 недель рандомизировали на 5 экспериментальных групп и проводили им однократное внутривенное введение SQ BDD-FVIII, rFVIII169/VWF034, rFVIII169/VWF057, rFVIII169/VWF059 или раствора носителя, соответственно. Для имитации эпизодического лечения с помощью FVIII (для восстановления до 50-100% нормального уровня FVIII в плазме), выбранная лечебная доза FVIII составляла 75 МЕ/кг при измерении по АЧТВ-активности FVIII. При таком уровне дозировки, все тестируемые варианты FVIII будут восстанавливать ок. 70% от нормальной FVIII-активности в плазме мышей через 5 мин после введения дозы.

Процедуру обрезания кончика хвоста проводили следующим образом. Вкратце, мышей анестезировали коктейлем 50 мг/кг кетамина/0,5 мг/кг дексмедетомидина до травмы хвоста и помещали на грелкуподушку при 37°С для поддержания температуры тела. Хвосты мышей затем погружали в нагретый до 37°С солевой раствор на 10 мин для расширения латеральной вены. После расширения вены, варианты FVIII или раствор носителя вводили инъекцией через хвостовую вену и кончик хвоста затем отрезали на расстоянии 5 мм от конца с помощью скальпеля № 11 с прямым лезвием через 5 мин после введения дозы. Вытекающую кровь собирали в 13 мл солевого раствора с температурой 37 С в течение 30 мин, и объем потери крови определяли по изменению веса пробирки с собранной кровью: объем потери крови=(вес пробирки в конце определения-начальный вес+0,10) мл. Проводят статистический анализ с использованием t-критерия (тест Колмогорова-Смирнова) и однофакторный дисперсионный анализ (тест Крускал-Уоллис, апостериорный анализ: критерий Данна с многократным сравнением). Строили график объема потери крови для каждого индивидуального животного в исследованиях, приведенный на фиг. 8. Значительное снижение объема потери крови наблюдалось для всех экспериментальных групп FVIII по сравнению с животными, получавшими носитель (р<0,05, табл. 8). Аналогичное снижение потери крови наблюдалось для всех экспериментальных групп гетеродимеров по сравнению с введением BDD-FVIII (р>0,5, табл. 8), что позволяет предположить, что молекулы гетеродимера могут потенциально быть такими же эффективными, как и SQ BDD-FVIII при лечении по необходимости.

- 55 041588

Таблица 8. β-значение для теста Колмогорова-Смирнова

	FVIII169/VWF034	FVIII169/VWF057	FVIII169/VWF059
BDD-FVIII	0,7591	0,9883	0,5176
Носитель	0,0006	0,0006	0,0266

Нуклеотидная последовательность pSYN VWF057 (D’D3-Fc VWF с тромбиновым сайтом LVPR в линкере) (SEQ ID NO: 79)

1	ATGATTCCTG	CCAGATTTGC	CGGGGTGCTG	CTTGCTCTGG	CCCTCATTTT
51	GCCAGGGACC	CTTTGTGCAG	AAGGAACTCG	CGGCAGGTCA	TCCACGGCCC
101	GATGCAGCCT	TTTCGGAAGT	GACTTCGTCA	ACACCTTTGA	TGGGAGCATG
151	TACAGCTTTG	CGGGATACTG	CAGTTACCTC	CTGGCAGGGG	GCTGCCAGAA
201	ACGCTCCTTC	TCGATTATTG	GGGACTTCCA	GAATGGCAAG	AGAGTGAGCC
251	TCTCCGTGTA	TCTTGGGGAA	TTTTTTGACA	TCCATTTGTT	TGTCAATGGT
301	ACCGTGACAC	AGGGGGACCA	AAGAGTCTCC	ATGCCCTATG	CCTCCAAAGG
351	GOTGTATСТА	GAAACTGAGG	CTGGGTACTA	CAAGCTGTCC	GGTGAGGCCT
401	ATGGCTTTGT	GGCCAGGATC	GATGGCAGCG	GCAACTTTCA	AGTCCTGCTG
451	TCAGACAGAT	ACTTCAACAA	GACCTGCGGG	CTGTGTGGCA	ACTTTAACAT
501	CTTTGCTGAA	GATGACTTTA	TGACCCAAGA	AGGGACCTTG	ACCTCGGACC
551	CTTATGACTT	TGCCAACTCA	TGGGCTCTGA	GCAGTGGAGA	ACAGTGGTGT
601	GAACGGGCAT	CTCCTCCCAG	CAGCTCATGC	AACATCTCCT	CTGGGGAAAT
651	GCAGAAGGGC	CTGTGGGAGC	AGTGCCAGCT	TCTGAAGAGC	ACCTCGGTGT
701	TTGCCCGCTG	CCACCCTCTG	GTGGACCCCG	AGCCTTTTGT	GGCCCTGTGT
751	GAGAAGACTT	TGTGTGAGTG	TGCTGGGGGG	CTGGAGTGCG	CCTGCCCTGC
801	CCTCCTGGAG	TACGCCCGGA	CCTGTGCCCA	GGAGGGAATG	GTGCTGTACG
851	GCTGGACCGA	CCACAGCGCG	TGCAGCCCAG	TGTGCCCTGC	TGGTATGGAG
901	TATAGGCAGT	GTGTGTCCCC	TTGCGCCAGG	ACCTGCCAGA	GCCTGCACAT
951	CAATGAAATG	TGTCAGGAGC	GATGCGTGGA	TGGCTGCAGC	TGCCCTGAGG
1001	GACAGCTCCT	GGATGAAGGC	CTCTGCGTGG	AGAGCACCGA	GTGTCCCTGC
1051	GTGCATTCCG	GAAAGCGCTA	CCCTCCCGGC	ACCTCCCTCT	CTCGAGACTG
1101	CAACACCTGC	ATTTGCCGAA	ACAGCCAGTG	GATCTGCAGC	AATGAAGAAT
1151	GTCCAGGGGA	GTGCCTTGTC	ACTGGTCAAT	CCCACTTCAA	GAGCTTTGAC
1201	AACAGATACT	TCACCTTCAG	TGGGATCTGC	CAGTACCTGC	TGGCCCGGGA
1251	TTGCCAGGAC	CACTCCTTCT	C CATT GT CAT	TGAGACTGTC	CAGTGTGCTG
1301	ATGACCGCGA	CGCTGTGTGC	ACCCGCTCCG	TCACCGTCCG	GCTGCCTGGC
1351	CTGCACAACA	GCCTTGTGAA	ACTGAAGCAT	GGGGCAGGAG	TTGCCATGGA
1401	TGGCCAGGAC	ATCCAGCTCC	CCCTCCTGAA	AGGTGACCTC	CGCATCCAGC
1451	ATACAGTGAC	GGCCTCCGTG	CGCCTCAGCT	ACGGGGAGGA	CCTGCAGATG
1501	GACTGGGATG	GCCGCGGGAG	GCTGCTGGTG	AAGCTGTCCC	CCGTCTATGC
1551	CGGGAAGACC	TGCGGCCTGT	GTGGGAATTA	CAATGGCAAC	CAGGGCGACG
1601	ACTTCCTTAG	CCCCTCTGGG	CTGGCGGAGC	CCCGGGTGGA	GGACTTCGGG
1651	AACGCCTGGA	AGCTGCACGG	GGACTGCCAG	GACCTGCAGA	AGCAGCACAG
1701	CGATCCCTGC	GCCCTCAACC	CGCGCATGAC	CAGGTTCTCC	GAGGAGGCGT
1751	GCGCGGTCCT	GACGTCCCCC	ACATTCGAGG	CCTGCCATCG	TGCCGTCAGC
1801	CCGCTGCCCT	ACCTGCGGAA	CTGCCGCTAC	GACGTGTGCT	CCTGCTCGGA
1851	CGGCCGCGAG	TGCCTGTGCG	GCGCCCTGGC	CAGCTATGCC	GCGGCCTGCG

- 56 041588

1901	CGGGGAGAGG	CGTGCGCGTC	GCGTGGCGCG	AGCCAGGCCG	CTGTGAGCTG
1951	AACTGCCCGA	AAGGCCAGGT	GTACCTGCAG	TGCGGGACCC	CCTGCAACCT
2001	GACCTGCCGC	TCTCTCTCTT	ACCCGGATGA	GGAATGCAAT	GAGGGCTGCC
2051	TGGAGGGCTG	CTTCTGCCCC	CCAGGGCTCT	ACATGGATGA	GAGGGGGGAC
2101	TGCGTGCCCA	AGGCCCAGTG	CCCCTGTTAC	TATGACGGTG	AGATCTTCCA
2151	GCCAGAAGAC	ATCTTCTCAG	ACCATCACAC	CATGTGCTAC	TGTGAGGATG
2201	GCTTCATGCA	CTGTACCATG	AGTGGAGTCC	CCGGAAGCTT	GCTGCCTGAC
2251	GCTGTCCTCA	GCAGTCCCCT	GTCTCATCGC	AGCAAAAGGA	GCCTATCCTG
2301	TCGGCCCCCC	ATGGTCAAGC	TGGTGTGTCC	CGCTGACAAC	CTGCGGGCTG
2351	AAGGGCTCGA	GTGTACCAAA	ACGTGCCAGA	ACTATGACCT	GGAGTGCATG
2401	AGCATGGGCT	GTGTCTCTGG	CTGCCTCTGC	CCCCCGGGCA	TGGTCCGGCA
2451	TGAGAACAGA	TGTGTGGCCC	TGGAAAGGTG	TCCCTGCTTC	CATCAGGGCA
2501	AGGAGTATGC	CCCTGGAGAA	ACAGTGAAGA	TTGGCTGCAA	CACTTGTGTC
2551	TGTCGGGACC	GGAAGTGGAA	CTGCACAGAC	CAT GT GT GT G	ATGCCACGTG
2601	CTCCACGATC	GGCATGGCCC	ACTACCTCAC	CTTCGACGGG	CTCAAATACC
2651	TGTTCCCCGG	GGAGTGCCAG	TACGTTCTGG	TGCAGGATTA	CTGCGGCAGT
2701	AACCCTGGGA	CCTTTCGGAT	CCTAGTGGGG	AATAAGGGAT	GCAGCCACCC
2751	CTCAGTGAAA	TGCAAGAAAC	GGGTCACCAT	CCTGGTGGAG	GGAGGAGAGA
2801	TTGAGCTGTT	TGACGGGGAG	GTGAATGTGA	AGAGGCCCAT	GAAGGATGAG
2851	ACTCACTTTG	AGGTGGTGGA	GTCTGGCCGG	TACATCATTC	TGCTGCTGGG
2901	CAAAGCCCTC	TCCGTGGTCT	GGGACCGCCA	CCTGAGCATC	TCCGTGGTCC
2951	TGAAGCAGAC	ATACCAGGAG	AAAGTGTGTG	GCCTGTGTGG	GAATTTTGAT
3001	GGCATCCAGA	ACAATGACCT	CACCAGCAGC	AACCTCCAAG	TGGAGGAAGA
3051	CCCTGTGGAC	TTTGGGAACT	CCTGGAAAGT	GAGCTCGCAG	TGTGCTGACA
3101	CCAGAAAAGT	GCCTCTGGAC	TCATCCCCTG	CCACCTGCCA	TAACAACATC
3151	ATGAAGCAGA	CGATGGTGGA	TTCCTCCTGT	AGAATCCTTA	CCAGTGACGT
3201	CTTCCAGGAC	TGCAACAAGC	TGGTGGACCC	CGAGCCATAT	CTGGATGTCT
3251	GCATTTACGA	CACCTGCTCC	TGTGAGTCCA	TTGGGGACTG	CGCCGCATTC
3301	TGCGACACCA	TTGCTGCCTA	TGCCCACGTG	TGTGCCCAGC	ATGGCAAGGT
3351	GGTGACCTGG	AGGACGGCCA	CATTGTGCCC	CCAGAGCTGC	GAGGAGAGGA
3401	ATCTCCGGGA	GAACGGGTAT	GAGGCTGAGT	GGCGCTATAA	CAGCTGTGCA
3451	CCTGCCTGTC	AAGTCACGTG	TCAGCACCCT	GAGCCACTGG	CCTGCCCTGT
3501	GCAGTGTGTG	GAGGGCTGCC	ATGCCCACTG	CCCTCCAGGG	AAAATCCTGG
3551	ATGAGCTTTT	GCAGACCTGC	GTTGACCCTG	AAGACTGTCC	AGTGTGTGAG
3601	GTGGCTGGCC	GGCGTTTTGC	CTCAGGAAAG	AAAGTCACCT	TGAATCCCAG
3651	TGACCCTGAG	CACTGCCAGA	TTTGCCACTG	TGATGTTGTC	AACCTCACCT
3701	GTGAAGCCTG	CCAGGAGCCG	ATATCGGGCG	CGCCAACATC	AGAGAGCGCC
3751	ACCCCTGAAA	GTGGTCCCGG	GAGCGAGCCA	GCCACATCTG	GGTCGGAAAC
3801	GCCAGGCACA	AGTGAGTCTG	CAACTCCCGA	GTCCGGACCT	GGCTCCGAGC
3851	CTGCCACTAG	CGGCTCCGAG	ACTCCGGGAA	CTTCCGAGAG	CGCTACACCA
3901	GAAAGCGGAC	CCGGAACCAG	TACCGAACCT	AGCGAGGGCT	CTGCTCCGGG
3951	CAGCCCAGCC	GGCTCTCCTA	CATCCACGGA	GGAGGGCACT	TCCGAATCCG
4001	CCACCCCGGA	GTCAGGGCCA	GGATCTGAAC	CCGCTACCTC	AGGCAGTGAG
4051	ACGCCAGGAA	CGAGCGAGTC	CGCTACACCG	GAGAGTGGGC	CAGGGAGCCC
4101	TGCTGGATCT	CCTACGTCCA	CTGAGGAAGG	GTCACCAGCG	GGCTCGCCCA
4151	CCAGCACTGA	AGAAGGTGCC	TCGAGCGGCG	GTGGAGGATC	CGGTGGCGGG
4201	GGATCCGGTG	GCGGGGGATC	CGGTGGCGGG	GGATCCGGTG	GCGGGGGATC
4251	CGGTGGCGGG	GGATCCCTGG	TCCCCCGGGG	CAGCGGAGGC	GACAAAACTC
4301	ACACATGCCC	ACCGTGCCCA	GCTCCAGAAC	TCCTGGGCGG	ACCGTCAGTC
4351	TTCCTCTTCC	CCCCAAAACC	CAAGGACACC	CTCATGATCT	CCCGGACCCC
4401	TGAGGTCACA	TGCGTGGTGG	TGGACGTGAG	CCACGAAGAC	CCTGAGGTCA
4451	AGTTCAACTG	GTACGTGGAC	GGCGTGGAGG	TGCATAATGC	CAAGACAAAG
4501	CCGCGGGAGG	AGCAGTACAA	CAGCACGTAC	CGTGTGGTCA	GCGTCCTCAC
4551	CGTCCTGCAC	CAGGACTGGC	TGAATGGCAA	GGAGTACAAG	TGCAAGGTCT
4601	CCAACAAAGC	CCTCCCAGCC	CCCATCGAGA	AAACCATCTC	CAAAGCCAAA
4651	GGGCAGCCCC	GAGAACCACA	GGTGTACACC	CTGCCCCCAT	CCCGGGATGA
4701	GCTGACCAAG	AACCAGGTCA	GCCTGACCTG	CCTGGTCAAA	GGCTTCTATC
4751	CCAGCGACAT	CGCCGTGGAG	TGGGAGAGCA	ATGGGCAGCC	GGAGAACAAC
4801	TACAAGACCA	CGCCTCCCGT	GTTGGACTCC	GACGGCTCCT	TCTTCCTCTA
4851	CAGCAAGCTC	ACCGTGGACA	AGAGCAGGTG	GCAGCAGGGG	AACGTCTTCT
4901 4951	CATGCTCCGT CTCTCCCTGT	GATGCATGAG CTCCGGGTAA	GCTCTGCACA AT GA	ACCACTACAC	GCAGAAGAGC

- 57 041588

Белковая последовательность pSYN VWF057 (D’D3-Fc VWF с тромбиновым сайтом LVPR в линкере): подчеркнутый жирной линией участок показывает линкерную область, содержащую расщепляемый тромбином LVPR (SEP ID NO: 80)

1 51	MIPARFAGVL YSFAGYCSYL	LALALILPGT LAGGCQKRSF	LCAEGTRGRS SIIGDFQNGK	STARCSLFGS RVSLSVYLGE	DFVNTFDGSM FFDIHLFVNG
101	TVTQGDQRVS	MPYASKGLYL	ETEAGYYKLS	GEAYGFVARI	DGSGNFQVLL
151	SDRYFNKTCG	LCGNFNIFAE	DDFMTQEGTL	TSDPYDFANS	WALSSGEQWC
201	ERASPPSSSC	NISSGEMQKG	LWEQCQLLKS	TSVFARCHPL	VDPEPFVALC
251	EKTLCECAGG	LECACPALLE	YARTCAQEGM	VLYGWTDHSA	CSPVCPAGME
301	YRQCVSPCAR	TCQSLHINEM	CQERCVDGCS	CPEGQLLDEG	LCVESTECPC
351	VHSGKRYPPG	TSLSRDCNTC	ICRNSQWICS	NEECPGECLV	TGQSHFKSFD
401	NRYFTFSGIC	QYLLARDCQD	HSFSIVIETV	QCADDRDAVC	TRSVTVRLPG
451	LHNSLVKLKH	GAGVAMDGQD	IQLPLLKGDL	RIQHTVTASV	RLSYGEDLQM
501	DWDGRGRLLV	KLSPVYAGKT	CGLCGNYNGN	QGDDFLTPSG	LAEPRVEDFG
551	NAWKLHGDCQ	DLQKQHSDPC	ALNPRMTRFS	EEACAVLTSP	TFEACHRAVS
601	PLPYLRNCRY	DVCSCSDGRE	CLCGALASYA	AACAGRGVRV	AWREPGRCEL
651	NCPKGQVYLQ	CGTPCNLTCR	SLSYPDEECN	EACLEGCFCP	PGLYMDERGD
701	CVPKAQCPCY	YDGEIFQPED	IFSDHHTMCY	CEDGFMHCTM	SGVPGSLLPD
751	AVLSSPLSHR	SKRSLSCRPP	MVKLVCPADN	LRAEGLECTK	TCQNYDLECM
801	SMGCVSGCLC	PPGMVRHENR	CVALERCPCF	HQGKEYAPGE	TVKIGCNTCV
851	CRDRKWNCTD	HVCDATCSTI	GMAHYLTFDG	LKYLFPGECQ	YVLVQDYCGS
901	NPGTFRILVG	NKGCSHPSVK	CKKRVTILVE	GGEIELFDGE	VNVKRPMKDE
951	THFEWESGR	YIILLLGKAL	SWWDRHLSI	SWLKQTYQE	KVCGLCGNFD
1001	GIQNNDLTSS	NLQVEEDPVD	FGNSWKVSSQ	CADTRKVPLD	SSPATCHNNI
1051	MKQTMVDSSC	RILTSDVFQD	CNKLVDPEPY	LDVCIYDTCS	CESIGDCAAF
1101	CDTIAAYAHV	CAQHGKWTW	RTATLCPQSC	EERNLRENGY	EAEWRYNSCA
1151	PACQVTCQHP	EPLACPVQCV	EGCHAHCPPG	KILDELLQTC	VDPEDCPVCE
1201	VAGRRFASGK	KVTLNPSDPE	HCQICHCDW	NLTCEACQEP	ISGAPTSESA
1251	TPESGPGSEP	ATSGSETPGT	SESATPESGP	GSEPATSGSE	TPGTSESATP
1301	ESGPGTSTEP	SEGSAPGSPA	GSPTSTEEGT	SESATPESGP	GSEPATSGSE
1351	TPGTSESATP	ESGPGSPAGS	PTSTEEGSPA	GSPTSTEEGA	SSGGGGSGGG
1401	GSGGGGSGGG	GSGGGGSGGG	GSGGGGSLVP	RGSGGDKTHT	CPPCPAPELL
1451	GGPSVFLFPP	KPKDTLMISR	TPEVTCVWD	VSHEDPEVKF	NWYVDGVEVH
1501	NAKTKPREEQ	YNSTYRWSV	LTVLHQDWLN	GKEYKCKVSN	KALPAPIEKT
1551	ISKAKGQPRE	PQVYTLPPSR	DELTKNQVSL	TCLVKGFYPS	DIAVEWESNG
1601	QPENNYKTTP	PVLDSDGSFF	LYSKLTVDKS	RWQQGNVFSC	SVMHEALHNH
1651	YTQKSLSLSP	GK*

Нуклеотидная последовательность pSYN VWF059 (D’D3-Fc VWF с кислотной областью 2 (а2) тромбиновый сайт в линкере) (SEQ ID NO: 81)

ATGATTCCTG CCAGATTTGC CGGGGTGCTG CTTGCTCTGG CCCTCATTTT

GCCAGGGACC CTTTGTGCAG AAGGAACTCG CGGCAGGTCA TCCACGGCCC

101 GATGCAGCCT TTTCGGAAGT GACTTCGTCA ACACCTTTGA TGGGAGCATG

151 TACAGCTTTG CGGGATACTG CAGTTACCTC CTGGCAGGGG GCTGCCAGAA

201 ACGCTCCTTC TCGATTATTG GGGACTTCCA GAATGGCAAG AGAGTGAGCC

251 TCTCCGTGTA TCTTGGGGAA TTTTTTGACA TCCATTTGTT TGTCAATGGT

301 ACCGTGACAC AGGGGGACCA AAGAGTCTCC ATGCCCTATG CCTCCAAAGG

351 GCTGTATCTA GAAACTGAGG CTGGGTACTA CAAGCTGTCC GGTGAGGCCT

401 ATGGCTTTGT GGCCAGGATC GATGGCAGCG GCAACTTTCA AGTCCTGCTG

451 TCAGACAGAT ACTTCAACAA GACCTGCGGG CTGTGTGGCA ACTTTAACAT

501 CTTTGCTGAA GATGACTTTA TGACCCAAGA AGGGACCTTG ACCTCGGACC

551 CTTATGACTT TGCCAACTCA TGGGCTCTGA GCAGTGGAGA ACAGTGGTGT

601 GAACGGGCAT CTCCTCCCAG CAGCTCATGC AACATCTCCT CTGGGGAAAT

651 GCAGAAGGGC CTGTGGGAGC AGTGCCAGCT TCTGAAGAGC ACCTCGGTGT

701 TTGCCCGCTG CCACCCTCTG GTGGACCCCG AGCCTTTTGT GGCCCTGTGT

751 GAGAAGACTT TGTGTGAGTG TGCTGGGGGG CTGGAGTGCG CCTGCCCTGC

801 CCTCCTGGAG TACGCCCGGA CCTGTGCCCA GGAGGGAATG GTGCTGTACG

851 GCTGGACCGA CCACAGCGCG TGCAGCCCAG TGTGCCCTGC TGGTATGGAG

901 TATAGGCAGT GTGTGTCCCC TTGCGCCAGG ACCTGCCAGA GCCTGCACAT

951 CAATGAAATG TGTCAGGAGC GATGCGTGGA TGGCTGCAGC TGCCCTGAGG

1001 GACAGCTCCT GGATGAAGGC CTCTGCGTGG AGAGCACCGA GTGTCCCTGC

1051 GTGCATTCCG GAAAGCGCTA CCCTCCCGGC ACCTCCCTCT CTCGAGACTG

- 58 041588

1101 CAACACCTGC ATTTGCCGAA ACAGCCAGTG GATCTGCAGC AATGAAGAAT 1151 GTCCAGGGGA GTGCCTTGTC ACTGGTCAAT CCCACTTCAA GAGCTTTGAC 1201 AACAGATACT TCACCTTCAG TGGGATCTGC CAGTACCTGC TGGCCCGGGA 1251 TTGCCAGGAC CACTCCTTCT CCATTGTCAT TGAGACTGTC CAGTGTGCTG 1301 ATGACCGCGA CGCTGTGTGC ACCCGCTCCG TCACCGTCCG GCTGCCTGGC 1351 CTGCACAACA GCCTTGTGAA ACTGAAGCAT GGGGCAGGAG TTGCCATGGA 1401 TGGCCAGGAC ATCCAGCTCC CCCTCCTGAA AGGTGACCTC CGCATCCAGC 1451 ATACAGTGAC GGCCTCCGTG CGCCTCAGCT ACGGGGAGGA CCTGCAGATG 1501 GACTGGGATG GCCGCGGGAG GCTGCTGGTG AAGCTGTCCC CCGTCTATGC 1551 CGGGAAGACC TGCGGCCTGT GTGGGAATTA CAATGGCAAC CAGGGCGACG 1601 ACTTCCTTAC CCCCTCTGGG CTGGCGGAGC CCCGGGTGGA GGACTTCGGG 1651 AACGCCTGGA AGCTGCACGG GGACTGCCAG GACCTGCAGA AGCAGCACAG 1701 CGATCCCTGC GCCCTCAACC CGCGCATGAC CAGGTTCTCC GAGGAGGCGT 1751 GCGCGGTCCT GACGTCCCCC ACATTCGAGG CCTGCCATCG TGCCGTCAGC 1801 CCGCTGCCCT ACCTGCGGAA CTGCCGCTAC GACGTGTGCT CCTGCTCGGA 1851 CGGCCGCGAG TGCCTGTGCG GCGCCCTGGC CAGCTATGCC GCGGCCTGCG 1901 CGGGGAGAGG CGTGCGCGTC GCGTGGCGCG AGCCAGGCCG CTGTGAGCTG 1951 AACTGCCCGA AAGGCCAGGT GTACCTGCAG TGCGGGACCC CCTGCAACCT 2001 GACCTGCCGC TCTCTCTCTT ACCCGGATGA GGAATGCAAT GAGGCCTGCC 2051 TGGAGGGCTG CTTCTGCCCC CCAGGGCTCT ACATGGATGA GAGGGGGGAC 2101 TGCGTGCCCA AGGCCCAGTG CCCCTGTTAC TATGACGGTG AGATCTTCCA 2151 GCCAGAAGAC ATCTTCTCAG ACCATCACAC CATGTGCTAC TGTGAGGATG 2201 GCTTCATGCA CTGTACCATG AGTGGAGTCC CCGGAAGCTT GCTGCCTGAC 2251 GCTGTCCTCA GCAGTCCCCT GTCTCATCGC AGCAAAAGGA GCCTATCCTG 2301 TCGGCCCCCC ATGGTCAAGC TGGTGTGTCC CGCTGACAAC CTGCGGGCTG 2351 AAGGGCTCGA GTGTACCAAA ACGTGCCAGA ACTATGACCT GGAGTGCATG 2401 AGCATGGGCT GTGTCTCTGG CTGCCTCTGC CCCCCGGGCA TGGTCCGGCA 2451 TGAGAACAGA TGTGTGGCCC TGGAAAGGTG TCCCTGCTTC CATCAGGGCA 2501 AGGAGTATGC CCCTGGAGAA ACAGTGAAGA TTGGCTGCAA CACTTGTGTC 2551 TGTCGGGACC GGAAGTGGAA CTGCACAGAC CATGTGTGTG ATGCCACGTG 2601 CTCCACGATC GGCATGGCCC ACTACCTCAC CTTCGACGGG CTCAAATACC 2651 TGTTCCCCGG GGAGTGCCAG TACGTTCTGG TGCAGGATTA CTGCGGCAGT 2701 AACCCTGGGA CCTTTCGGAT CCTAGTGGGG AATAAGGGAT GCAGCCACCC 2751 CTCAGTGAAA TGCAAGAAAC GGGTCACCAT CCTGGTGGAG GGAGGAGAGA 2801 TTGAGCTGTT TGACGGGGAG GTGAATGTGA AGAGGCCCAT GAAGGATGAG 2851 ACTCACTTTG AGGTGGTGGA GTCTGGCCGG TACATCATTC TGCTGCTGGG 2901 CAAAGCCCTC TCCGTGGTCT GGGACCGCCA CCTGAGCATC TCCGTGGTCC 2951 TGAAGCAGAC ATACCAGGAG AAAGTGTGTG GCCTGTGTGG GAATTTTGAT 3001 GGCATCCAGA ACAATGACCT CACCAGCAGC AACCTCCAAG TGGAGGAAGA 3051 CCCTGTGGAC TTTGGGAACT CCTGGAAAGT GAGCTCGCAG TGTGCTGACA 3101 CCAGAAAAGT GCCTCTGGAC TCATCCCCTG CCACCTGCCA TAACAACATC 3151 ATGAAGCAGA CGATGGTGGA TTCCTCCTGT AGAATCCTTA CCAGTGACGT 3201 CTTCCAGGAC TGCAACAAGC TGGTGGACCC CGAGCCATAT CTGGATGTCT 3251 GCATTTACGA CACCTGCTCC TGTGAGTCCA TTGGGGACTG CGCCGCATTC 3301 TGCGACACCA TTGCTGCCTA TGCCCACGTG TGTGCCCAGC ATGGCAAGGT 3351 GGTGACCTGG AGGACGGCCA CATTGTGCCC CCAGAGCTGC GAGGAGAGGA 3401 ATCTCCGGGA GAACGGGTAT GAGGCTGAGT GGCGCTATAA CAGCTGTGCA 3451 CCTGCCTGTC AAGTCACGTG TCAGCACCCT GAGCCACTGG CCTGCCCTGT 3501 GCAGTGTGTG GAGGGCTGCC ATGCCCACTG CCCTCCAGGG AAAATCCTGG 3551 ATGAGCTTTT GCAGACCTGC GTTGACCCTG AAGACTGTCC AGTGTGTGAG 3601 GTGGCTGGCC GGCGTTTTGC CTCAGGAAAG AAAGTCACCT TGAATCCCAG 3651 TGACCCTGAG CACTGCCAGA TTTGCCACTG TGATGTTGTC AACCTCACCT 3701 GTGAAGCCTG CCAGGAGCCG ATATCGGGCG CGCCAACATC AGAGAGCGCC 3751 ACCCCTGAAA GTGGTCCCGG GAGCGAGCCA GCCACATCTG GGTCGGAAAC 3801 GCCAGGCACA AGTGAGTCTG CAACTCCCGA GTCCGGACCT GGCTCCGAGC 3851 CTGCCACTAG CGGCTCCGAG ACTCCGGGAA CTTCCGAGAG CGCTACACCA 3901 GAAAGCGGAC CCGGAACCAG TACCGAACCT AGCGAGGGCT CTGCTCCGGG 3951 CAGCCCAGCC GGCTCTCCTA CATCCACGGA GGAGGGCACT TCCGAATCCG 4001 CCACCCCGGA GTCAGGGCCA GGATCTGAAC CCGCTACCTC AGGCAGTGAG 4051 ACGCCAGGAA CGAGCGAGTC CGCTACACCG GAGAGTGGGC CAGGGAGCCC 4101 TGCTGGATCT CCTACGTCCA CTGAGGAAGG GTCACCAGCG GGCTCGCCCA 4151 CCAGCACTGA AGAAGGTGCC TCGATATCTG ACAAGAACAC TGGTGATTAT 4201 TACGAGGACA GTTATGAAGA TATTTCAGCA TACTTGCTGA GTAAAAACAA 4251 TGCCATTGAA CCAAGAAGCT TCTCTGACAA AACTCACACA TGCCCACCGT

- 59 041588

4301 GCCCAGCTCC AGAACTCCTG GGCGGACCGT CAGTCTTCCT CTTCCCCCCA

4351 AAACCCAAGG ACACCCTCAT GATCTCCCGG ACCCCTGAGG TCACATGCGT

4401 GGTGGTGGAC GTGAGCCACG AAGACCCTGA GGTCAAGTTC AACTGGTACG

4451 TGGACGGCGT GGAGGTGCAT AATGCCAAGA CAAAGCCGCG GGAGGAGCAG

4501 TACAACAGCA CGTACCGTGT GGTCAGCGTC CTCACCGTCC TGCACCAGGA

4551 CTGGCTGAAT GGCAAGGAGT ACAAGTGCAA GGTCTCCAAC AAAGCCCTCC

4601 CAGCCCCCAT CGAGAAAACC ATCTCCAAAG CCAAAGGGCA GCCCCGAGAA

4651 CCACAGGTGT ACACCCTGCC CCCATCCCGG GATGAGCTGA CCAAGAACCA

4701 GGTCAGCCTG ACCTGCCTGG TCAAAGGCTT CTATCCCAGC GACATCGCCG

4751 TGGAGTGGGA GAGCAATGGG CAGCCGGAGA ACAACTACAA GACCACGCCT

4801 CCCGTGTTGG ACTCCGACGG CTCCTTCTTC CTCTACAGCA AGCTCACCGT

4851 GGACAAGAGC AGGTGGCAGC AGGGGAACGT CTTCTCATGC TCCGTGATGC

4901 ATGAGGCTCT GCACAACCAC TACACGCAGA AGAGCCTCTC CCTGTCTCCG

4951 GGTAAATGA

Белковая последовательность pSYN VWF059 (D’D3-Fc VWF с тромбиновым сайтом LVPR в линкере) - подчеркнутый жирной линией участок показывает область а2 (SEQ ID NO: 82)

1 51	MIPARFAGVL YSFAGYCSYL	LALALILPGT LAGGCQKRSF	LCAEGTRGRS SIIGDFQNGK	STARCSLFGS RVSLSVYLGE	DFVNTFDGSM FFDIHLFVNG
101	TVTQGDQRVS	MPYASKGLYL	ETEAGYYKLS	GEAYGFVARI	DGSGNFQVLL
151	SDRYFNKTCG	LCGNFNIFAE	DDFMTQEGTL	TSDPYDFANS	WALSSGEQWC
201	ERASPPSSSC	NISSGEMQKG	LWEQCQLLKS	TSVFARCHPL	VDPEPFVALC
251	EKTLCECAGG	LECACPALLE	YARTCAQEGM	VLYGWTDHSA	CSPVCPAGME
301	YRQCVSPCAR	TCQSLHINEM	CQERCVDGCS	CPEGQLLDEG	LCVESTECPC
351	VHSGKRYPPG	TSLSRDCNTC	ICRNSQWICS	NEECPGECLV	TGQSHFKSFD
401	NRYFTFSGIC	QYLLARDCQD	HSFSIVIETV	QCADDRDAVC	TRSVTVRLPG
451	LHNSLVKLKH	GAGVAMDGQD	IQLPLLKGDL	RIQHTVTASV	RLSYGEDLQM
501	DWDGRGRLLV	KLSPVYAGKT	CGLCGNYNGN	QGDDFLTPSG	LAEPRVEDFG
551	NAWKLHGDCQ	DLQKQHSDPC	ALNPRMTRFS	EEACAVLTSP	TFEACHRAVS
601	PLPYLRNCRY	DVCSCSDGRE	CLCGALASYA	AACAGRGVRV	AWREPGRCEL
651	NCPKGQVYLQ	CGTPCNLTCR	SLSYPDEECN	EACLEGCFCP	PGLYMDERGD
701	CVPKAQCPCY	YDGEIFQPED	IFSDHHTMCY	CEDGFMHCTM	SGVPGSLLPD
751	AVLSSPLSHR	SKRSLSCRPP	MVKLVCPADN	LRAEGLECTK	TCQNYDLECM
801	SMGCVSGCLC	PPGMVRHENR	CVALERCPCF	HQGKEYAPGE	TVKIGCNTCV
851	CRDRKWNCTD	HVCDATCSTI	GMAHYLTFDG	LKYLFPGECQ	YVLVQDYCGS
901	NPGTFRILVG	NKGCSHPSVK	CKKRVTILVE	GGEIELFDGE	VNVKRPMKDE
951	THFEWESGR	YIILLLGKAL	SWWDRHLSI	SWLKQTYQE	KVCGLCGNFD
1001	GIQNNDLTSS	NLQVEEDPVD	FGNSWKVSSQ	CADTRKVPLD	SSPATCHNNI
1051	MKQTMVDSSC	RILTSDVFQD	CNKLVDPEPY	LDVCIYDTCS	CESIGDCAAF
1101	CDTIAAYAHV	CAQHGKWTW	RTATLCPQSC	EERNLRENGY	EAEWRYNSCA
1151	PACQVTCQHP	EPLACPVQCV	EGCHAHCPPG	KILDELLQTC	VDPEDCPVCE
1201	VAGRRFASGK	KVTLNPSDPE	HCQICHCDW	NLTCEACQEP	ISGAPTSESA
1251	TPESGPGSEP	ATSGSETPGT	SESATPESGP	GSEPATSGSE	TPGTSESATP
1301	ESGPGTSTEP	SEGSAPGSPA	GSPTSTEEGT	SESATPESGP	GSEPATSGSE
1351	TPGTSESATP	ESGPGSPAGS	PTSTEEGSPA	GSPTSTEEGA	SISDKNTGDY
1401	YEDSYEDISA	YLLSKNNAIE	PRSFSDKTHT	CPPCPAPELL	GGPSVFLFPP
1451	KPKDTLMISR	TPEVTCVWD	VSHEDPEVKF	NWYVDGVEVH	NAKTKPREEQ
1501	YNSTYRWSV	LTVLHQDWLN	GKEYKCKVSN	KALPAPIEKT	ISKAKGQPRE
1551	PQVYTLPPSR	DELTKNQVSL	TCLVKGFYPS	DIAVEWESNG	QPENNYKTTP
1601	PVLDSDGSFF	LYSKLTVDKS	RWQQGNVFSC	SVMHEALHNH	YTQKSLSLSP
1651	GK*

Нуклеотидная последовательность pSYN VWF062 (D’D3-Fc VWF без тромбинового сайта в линкере) (SEQ ID NO: 83)

ATGATTCCTG CCAGATTTGC CGGGGTGCTG CTTGCTCTGG CCCTCATTTT

GCCAGGGACC CTTTGTGCAG AAGGAACTCG CGGCAGGTCA TCCACGGCCC

101 GATGCAGCCT TTTCGGAAGT GACTTCGTCA ACACCTTTGA TGGGAGCATG

151 TACAGCTTTG CGGGATACTG CAGTTACCTC CTGGCAGGGG GCTGCCAGAA

201 ACGCTCCTTC TCGATTATTG GGGACTTCCA GAATGGCAAG AGAGTGAGCC

251 TCTCCGTGTA TCTTGGGGAA TTTTTTGACA TCCATTTGTT TGTCAATGGT

301 ACCGTGACAC AGGGGGACCA AAGAGTCTCC ATGCCCTATG CCTCCAAAGG

- 60 041588

351	GCTGTATCTA	GAAACTGAGG	CTGGGTACTA	CAAGCTGTCC	GGTGAGGCCT
401	ATGGCTTTGT	GGCCAGGATC	GATGGCAGCG	GCAACTTTCA	AGTCCTGCTG
451	TCAGACAGAT	ACTTCAACAA	GACCTGCGGG	CTGTGTGGCA	ACTTTAACAT
501	CTTTGCTGAA	GATGACTTTA	TGACCCAAGA	AGGGACCTTG	ACCTCGGACC
551	CTTATGACTT	TGCCAACTCA	TGGGCTCTGA	GCAGTGGAGA	ACAGTGGTGT
601	GAACGGGCAT	CTCCTCCCAG	CAGCTCATGC	AACATCTCCT	CTGGGGAAAT
651	GCAGAAGGGC	CTGTGGGAGC	AGTGCCAGCT	TCTGAAGAGC	ACCTCGGTGT
701	TTGCCCGCTG	CCACCCTCTG	GTGGACCCCG	AGCCTTTTGT	GGCCCTGTGT
751	GAGAAGACTT	TGTGTGAGTG	TGCTGGGGGG	CTGGAGTGCG	CCTGCCCTGC
801	CCTCCTGGAG	TACGCCCGGA	CCTGTGCCCA	GGAGGGAATG	GTGCTGTACG
851	GCTGGACCGA	CCACAGCGCG	TGCAGCCCAG	TGTGCCCTGC	TGGTATGGAG
901	TATAGGCAGT	GTGTGTCCCC	TTGCGCCAGG	ACGTGCCAGA	GCCTGCACAT
951	CAATGAAATG	TGTCAGGAGC	GATGCGTGGA	TGGCTGCAGC	TGCCCTGAGG
1001	GACAGCTCCT	GGATGAAGGC	CTCTGCGTGG	AGAGCACCGA	GTGTCCCTGC
1051	GTGCATTCCG	GAAAGCGCTA	CCCTCCCGGC	ACCTCCCTCT	CTCGAGACTG
1101	CAACACCTGC	ATTTGCCGAA	ACAGCCAGTG	GATCTGCAGC	AATGAAGAAT
1151	GTCCAGGGGA	GTGCCTTGTC	ACTGGTCAAT	CCCACTTCAA	GAGCTTTGAC
1201	AACAGATACT	TCACCTTCAG	TGGGATCTGC	CAGTACCTGC	TGGCCCGGGA
1251	TTGCCAGGAC	CACTCCTTCT	CCATT GT CAT	TGAGACTGTC	CAGTGTGCTG
1301	ATGACCGCGA	CGCTGTGTGC	ACCCGCTCCG	TCACCGTCCG	GCTGCCTGGC
1351	CTGCACAACA	GCCTTGTGAA	ACTGAAGCAT	GGGGCAGGAG	TTGCCATGGA
1401	TGGCCAGGAC	ATCCAGCTCC	CCCTCCTGAA	AGGTGACCTC	CGCATCCAGC
1451	ATACAGTGAC	GGCCTCCGTG	CGCCTCAGCT	ACGGGGAGGA	CCTGCAGATG
1501	GACTGGGATG	GCCGCGGGAG	GCTGCTGGTG	AAGCTGTCCC	CCGTCTATGC
1551	CGGGAAGACC	TGCGGCCTGT	GTGGGAATTA	CAATGGCAAC	CAGGGCGACG
1601	ACTTCCTTAC	CCCCTCTGGG	CTGGCGGAGC	CCCGGGTGGA	GGACTTCGGG
1651	AACGCCTGGA	AGCTGCACGG	GGAGTGCCAG	GACCTGCAGA	AGCAGCACAG
1701	CGATCCCTGC	GCCCTCAACC	CGCGCATGAC	CAGGTTCTCC	GAGGAGGCGT
1751	GCGCGGTCCT	GACGTCCCCC	ACATTCGAGG	CCTGCCATCG	TGCCGTCAGC
1801	CCGCTGCCCT	ACCTGCGGAA	CTGCCGCTAC	GACGTGTGCT	CCTGCTCGGA
1851	CGGCCGCGAG	TGCCTGTGCG	GCGCCCTGGC	CAGCTATGCC	GCGGCCTGCG
1901	CGGGGAGAGG	CGTGCGCGTC	GCGTGGCGCG	AGCCAGGCCG	CTGTGAGCTG
1951	AACTGCCCGA	AAGGCCAGGT	GTACCTGCAG	TGCGGGACCC	CCTGCAACCT
2001	GACCTGCCGC	TCTCTCTCTT	ACCCGGATGA	GGAATGCAAT	GAGGGCTGCC
2051	TGGAGGGCTG	CTTCTGCCCC	CCAGGGCTCT	ACATGGATGA	GAGGGGGGAC
2101	TGCGTGCCCA	AGGCCCAGTG	CCCCTGTTAC	TATGACGGTG	AGATCTTCCA
2151	GCCAGAAGAC	ATCTTCTCAG	ACCATCACAC	CATGTGCTAC	TGTGAGGATG
2201	GCTTCATGCA	CTGTACCATG	AGTGGAGTCC	CCGGAAGCTT	GCTGCCTGAC
2251	GCTGTCCTCA	GCAGTCCCCT	GTCTCATCGC	AGCAAAAGGA	GCCTATCCTG
2301	TCGGCCCCCC	ATGGTCAAGC	TGGTGTGTCC	CGCTGACAAC	CTGCGGGCTG
2351	AAGGGCTCGA	GTGTACCAAA	ACGTGCCAGA	ACTATGACCT	GGAGTGCATG
2401	AGCATGGGCT	GTGTCTCTGG	CTGCCTCTGC	CCCCCGGGCA	TGGTCCGGCA
2451	TGAGAACAGA	TGTGTGGCCC	TGGAAAGGTG	TCCCTGCTTC	CATCAGGGCA
2501	AGGAGTATGC	CCCTGGAGAA	ACAGTGAAGA	TTGGCTGCAA	CACTTGTGTC
2551	TGTCGGGACC	GGAAGTGGAA	CTGCACAGAC	CAT GT GT GT G	ATGCCACGTG
2601	CTCCACGATC	GGCATGGCCC	ACTACCTCAC	CTTCGACGGG	CTCAAATACC
2651	TGTTCCCCGG	GGAGTGCCAG	TACGTTCTGG	TGCAGGATTA	CTGCGGCAGT
2701	AACCCTGGGA	CCTTTCGGAT	CCTAGTGGGG	AATAAGGGAT	GCAGCCACCC
2751	CTCAGTGAAA	TGCAAGAAAC	GGGTCACCAT	CCTGGTGGAG	GGAGGAGAGA
2801	TTGAGCTGTT	TGACGGGGAG	GTGAATGTGA	AGAGGCCCAT	GAAGGATGAG
2851	ACTCACTTTG	AGGTGGTGGA	GTCTGGCCGG	TACATCATTC	TGCTGCTGGG
2901	CAAAGCCCTC	TCCGTGGTCT	GGGACCGCCA	CCTGAGCATC	TCCGTGGTCC
2951	TGAAGCAGAC	ATACCAGGAG	AAAGTGTGTG	GCCTGTGTGG	GAATTTTGAT
3001	GGCATCCAGA	ACAATGACCT	CACCAGCAGC	AACCTCCAAG	TGGAGGAAGA
3051	CCCTGTGGAC	TTTGGGAACT	CCTGGAAAGT	GAGCTCGCAG	TGTGCTGACA
3101	CCAGAAAAGT	GCCTCTGGAC	TCATCCCCTG	CCACCTGCCA	TAACAACATC
3151	ATGAAGCAGA	CGATGGTGGA	TTCCTCCTGT	AGAATCCTTA	CCAGTGACGT
3201	CTTCCAGGAC	TGCAACAAGC	TGGTGGACCC	CGAGCCATAT	CTGGATGTCT
3251	GCATTTACGA	CACCTGCTCC	TGTGAGTCCA	TTGGGGACTG	CGCCGCATTC
3301	TGCGACACCA	TTGCTGCCTA	TGCCCACGTG	TGTGCCCAGC	ATGGCAAGGT
3351	GGTGACCTGG	AGGACGGCCA	CATTGTGCCC	CCAGAGCTGC	GAGGAGAGGA
3401	ATCTCCGGGA	GAACGGGTAT	GAGGCTGAGT	GGCGCTATAA	CAGCTGTGCA
3451	CCTGCCTGTC	AAGTCACGTG	TCAGCACCCT	GAGCCACTGG	CCTGCCCTGT
3501	GCAGTGTGTG	GAGGGCTGCC	ATGCCCACTG	CCCTCCAGGG	AAAATCCTGG

- 61 041588

3551	ATGAGCTTTT	GCAGACCTGC	GTTGACCCTG	AAGACTGTCC	AGTGTGTGAG
3601	GTGGCTGGCC	GGCGTTTTGC	CTCAGGAAAG	AAAGTCACCT	TGAATCCCAG
3651	TGACCCTGAG	CACTGCCAGA	TTTGCCACTG	TGATGTTGTC	AACCTCACCT
3701	GTGAAGCCTG	CCAGGAGCCG	ATATCGGGCG	CGCCAACATC	AGAGAGCGCC
3751	ACCCCTGAAA	GTGGTCCCGG	GAGCGAGCCA	GCCACATCTG	GGTCGGAAAC
3801	GCCAGGCACA	AGTGAGTCTG	CAACTCCCGA	GTCCGGACCT	GGCTCCGAGC
3851	CTGCCACTAG	CGGCTCCGAG	ACTCCGGGAA	CTTCCGAGAG	CGCTACACCA
3901	GAAAGCGGAC	CCGGAACCAG	TACCGAACCT	AGCGAGGGCT	CTGCTCCGGG
3951	CAGCCCAGCC	GGCTCTCCTA	CATCCACGGA	GGAGGGCACT	TCCGAATCCG
4001	CCACCCCGGA	GTCAGGGCCA	GGATCTGAAC	CCGCTACCTC	AGGCAGTGAG
4051	ACGCCAGGAA	CGAGCGAGTC	CGCTACACCG	GAGAGTGGGC	CAGGGAGCCC
4101	TGCTGGATCT	CCTACGTCCA	CTGAGGAAGG	GTCACCAGCG	GGCTCGCCCA
4151	CCAGCACTGA	AGAAGGTGCC	TCGAGCGACA	AAACTCACAC	ATGCCCACCG
4201	TGCCCAGCTC	CAGAACTCCT	GGGCGGACCG	TCAGTCTTCC	TCTTCCCCCC
4251	AAAACCCAAG	GACACCCTCA	TGATCTCCCG	GACCCCTGAG	GTCACATGCG
4301	TGGTGGTGGA	CGTGAGCCAC	GAAGACCCTG	AGGTCAAGTT	CAACTGGTAC
4351	GTGGACGGCG	TGGAGGTGCA	TAATGCCAAG	ACAAAGCCGC	GGGAGGAGCA
4401	GTACAACAGC	ACGTACCGTG	TGGTCAGCGT	CCTCACCGTC	CTGCACCAGG
4451	ACTGGCTGAA	TGGCAAGGAG	TACAAGTGCA	AGGTCTCCAA	CAAAGCCCTC
4501	CCAGCCCCCA	TCGAGAAAAC	CATCTCCAAA	GCCAAAGGGC	AGCCCCGAGA
4551	ACCACAGGTG	TACACCCTGC	CCCCATCCCG	GGATGAGCTG	ACCAAGAACC
4601	AGGTCAGCCT	GACCTGCCTG	GTCAAAGGCT	TCTATCCCAG	CGACATCGCC
4651	GTGGAGTGGG	AGAGCAATGG	GCAGCCGGAG	AACAACTACA	AGACCACGCC
4701	TCCCGTGTTG	GACTCCGACG	GCTCCTTCTT	CCTCTACAGC	AAGCTCACCG
4751	TGGACAAGAG	CAGGTGGCAG	CAGGGGAACG	TCTTCTCATG	CTCCGTGATG
4801	CATGAGGCTC	TGCACAACCA	CTACACGCAG	AAGAGCCTCT	CCCTGTCTCC
4851	GGGTAAATGA

Белковая последовательность pSYN VWF062 (D’D3-Fc VWF без тромбинового сайта в линкере) (SEQ ID NO: 84)

1	MIPARFAGVL	LALALILPGT	LCAEGTRGRS	STARCSLFGS	DFVNTFDGSM
51	YSFAGYCSYL	LAGGCQKRSF	SIIGDFQNGK	RVSLSVYLGE	FFDIHLFVNG
101	TVTQGDQRVS	MPYASKGLYL	ETEAGYYKLS	GEAYGFVARI	DGSGNFQVLL
151	SDRYFNKTCG	LCGNFNIFAE	DDFMTQEGTL	TSDPYDFANS	WALSSGEQWC
201	ERASPPSSSC	NISSGEMQKG	LWEQCQLLKS	TSVFARCHPL	VDPEPFVALC
251	EKTLCECAGG	LECACPALLE	YARTCAQEGM	VLYGWTDHSA	CSPVCPAGME
301	YRQCVSPCAR	TCQSLHINEM	CQERCVDGCS	CPEGQLLDEG	LCVESTECPC
351	VHSGKRYPPG	TSLSRDCNTC	ICRNSQWICS	NEECPGECLV	TGQSHFKSFD
401	NRYFTFSGIC	QYLLARDCQD	HSFSIVIETV	QCADDRDAVC	TRSVTVRLPG
451	LHNSLVKLKH	GAGVAMDGQD	IQLPLLKGDL	RIQHTVTASV	RLSYGEDLQM
501	DWDGRGRLLV	KLSPVYAGKT	CGLCGNYNGN	QGDDFLTPSG	LAEPRVEDFG
551	NAWKLHGDCQ	DLQKQHSDPC	ALNPRMTRFS	EEACAVLTSP	TFEACHRAVS
601	PLPYLRNCRY	DVCSCSDGRE	CLCGALASYA	AACAGRGVRV	AWREPGRCEL
651	NCPKGQVYLQ	CGTPCNLTCR	SLSYPDEECN	EACLEGCFCP	PGLYMDERGD
701	CVPKAQCPCY	YDGEIFQPED	IFSDHHTMCY	CEDGFMHCTM	SGVPGSLLPD
751	AVLSSPLSHR	SKRSLSCRPP	MVKLVCPADN	LRAEGLECTK	TCQNYDLECM
801	SMGCVSGCLC	PPGMVRHENR	CVALERCPCF	HQGKEYAPGE	TVKIGCNTCV
851	CRDRKWNCTD	HVCDATCSTI	GMAHYLTFDG	LKYLFPGECQ	YVLVQDYCGS
901	NPGTFRILVG	NKGCSHPSVK	CKKRVTILVE	GGEIELFDGE	VNVKRPMKDE
951	THFEWESGR	YIILLLGKAL	SWWDRHLSI	SWLKQTYQE	KVCGLCGNFD
1001	GIQNNDLTSS	NLQVEEDPVD	FGNSWKVSSQ	CADTRKVPLD	SSPATCHNNI
1051	MKQTMVDSSC	RILTSDVFQD	CNKLVDPEPY	LDVCIYDTCS	CESIGDCAAF
1101	CDTIAAYAHV	CAQHGKWTW	RTATLCPQSC	EERNLRENGY	EAEWRYNSCA
1151	PACQVTCQHP	EPLACPVQCV	EGCHAHCPPG	KILDELLQTC	VDPEDCPVCE
1201	VAGRRFASGK	KVTLNPSDPE	HCQICHCDW	NLTCEACQEP	ISGAPTSESA
1251	TPESGPGSEP	ATSGSETPGT	SESATPESGP	GSEPATSGSE	TPGTSESATP
1301	ESGPGTSTEP	SEGSAPGSPA	GSPTSTEEGT	SESATPESGP	GSEPATSGSE
1351	TPGTSESATP	ESGPGSPAGS	PTSTEEGSPA	GSPTSTEEGA	SSDKTHTCPP
1401	CPAPELLGGP	SVFLFPPKPK	DTLMISRTPE	VTCVWDVSH	EDPEVKFNWY
1451	VDGVEVHNAK	TKPREEQYNS	TYRWSVLTV	LHQDWLNGKE	YKCKVSNKAL
1501	PAPIEKTISK	AKGQPREPQV	YTLPPSRDEL	TKNQVSLTCL	VKGFYPSDIA
1551	VEWESNGQPE	NNYKTTPPVL	DSDGSFFLYS	KLTVDKSRWQ	QGNVFSCSVM

- 62 041588

1601 HEALHNHYTQ KSLSLSPGK*

Нуклеотидная последовательность pSYN FVIII 286 (FVIII-Fc с дополнительной областью a2 между FVIII и Fc) (SEQ ID NO: 85)

ATGCAAATAG AGCTCTCCAC CTGCTTCTTT CTGTGCCTTT TGCGATTCTG

CTTTAGTGCC ACCAGAAGAT ACTACCTGGG TGCAGTGGAA CTGTCATGGG

101 ACTATATGCA AAGTGATCTC GGTGAGCTGC CTGTGGACGC AAGATTTCCT

151 CCTAGAGTGC CAAAATCTTT TCCATTCAAC ACCTCAGTCG TGTACAAAAA

201 GACTCTGTTT GTAGAATTCA CGGATCACCT TTTCAACATC GCTAAGCCAA

251 GGCCACCCTG GATGGGTCTG CTAGGTCCTA CCATCCAGGC TGAGGTTTAT

301 GATACAGTGG TCATTACACT TAAGAACATG GCTTCCCATC CTGTCAGTCT

351 TCATGCTGTT GGTGTATCCT ACTGGAAAGC TTCTGAGGGA GCTGAATATG

401 ATGATCAGAC CAGTCAAAGG GAGAAAGAAG ATGATAAAGT CTTCCCTGGT

451 GGAAGCCATA CATATGTCTG GCAGGTCCTG AAAGAGAATG GTCCAATGGC

501 CTCTGACCCA CTGTGCCTTA CCTACTCATA TCTTTCTCAT GTGGACCTGG

551 TAAAAGACTT GAATTCAGGC CTCATTGGAG CCCTACTAGT ATGTAGAGAA

601 GGGAGTCTGG CCAAGGAAAA GACACAGACC TTGCACAAAT TTATACTACT

651 TTTTGCTGTA TTTGATGAAG GGAAAAGTTG GCACTCAGAA ACAAAGAACT

701 CCTTGATGCA GGATAGGGAT GCTGCATCTG CTCGGGCCTG GCCTAAAATG

751 CACACAGTCA ATGGTTATGT AAACAGGTCT CTGCCAGGTC TGATTGGATG

801 CCACAGGAAA TCAGTCTATT GGCATGTGAT TGGAATGGGC ACCACTCCTG

851 AAGTGCACTC AATATTCCTC GAAGGTCACA CATTTCTTGT GAGGAACCAT

901 CGCCAGGCTA GCTTGGAAAT CTCGCCAATA ACTTTCCTTA CTGCTCAAAC

951 ACTCTTGATG GACCTTGGAC AGTTTCTACT GTTTTGTCAT ATCTCTTCCC

1001 ACCAACATGA TGGCATGGAA GCTTATGTCA AAGTAGACAG CTGTCCAGAG

1051 GAACCCCAAC TACGAATGAA ΑΑΑΎΑΆΎΰΑΆ GAAGCGGAAG ACTATGATGA

1101 TGATCTTACT GATTCTGAAA TGGATGTGGT CAGGTTTGAT GATGACAACT

1151 CTCCTTCCTT TATCCAAATT CGCTCAGTTG CCAAGAAGCA TCCTAAAACT

1201 TGGGTACATT ACATTGCTGC TGAAGAGGAG GACTGGGACT ATGCTCCCTT

1251 AGTCCTCGCC CCCGATGACA GAAGTTATAA AAGTCAATAT TTGAACAATG

1301 GCCCTCAGCG GATTGGTAGG AAGTACAAAA AAGTCCGATT TATGGCATAC

1351 ACAGATGAAA CCTTTAAGAC TCGTGAAGCT ATTCAGCATG AATCAGGAAT

1401 CTTGGGACCT TTACTTTATG GGGAAGTTGG AGACACACTG TTGATTATAT

1451 TTAAGAATCA AGCAAGCAGA CCATATAACA TCTACCCTCA CGGAATCACT

1501 GATGTCCGTC CTTTGTATTC AAGGAGATTA CCAAAAGGTG TAAAACATTT

1551 GAAGGATTTT CCAATTCTGC CAGGAGAAAT ATTCAAATAT AAATGGACAG

1601 TGACTGTAGA AGATGGGCCA ACTAAATCAG ATCCTCGGTG CCTGACCCGC

1651 TATTACTCTA GTTTCGTTAA TATGGAGAGA GATCTAGCTT CAGGACTCAT

1701 TGGCCCTCTC CTCATCTGCT ACAAAGAATC TGTAGATCAA AGAGGAAACC

1751 AGATAATGTC AGACAAGAGG AATGTCATCC TGTTTTCTGT ATTTGATGAG

1801 AACCGAAGCT GGTACCTCAC AGAGAATATA CAACGCTTTC TCCCCAATCC

1851 AGCTGGAGTG CAGCTTGAGG ATCCAGAGTT CCAAGCCTCC AACATCATGC

1901 ACAGCATCAA TGGCTATGTT TTTGATAGTT TGCAGTTGTC AGTTTGTTTG

1951 CATGAGGTGG CATACTGGTA CATTCTAAGC ATTGGAGCAC AGACTGACTT

2001 CCTTTCTGTC TTCTTCTCTG GATATACCTT CAAACACAAA ATGGTCTATG

2051 AAGACACACT CACCCTATTC CCATTCTCAG GAGAAACTGT CTTCATGTCG

2101 ATGGAAAACC CAGGTCTATG GATTCTGGGG TGCCACAACT CAGACTTTCG

2151 GAACAGAGGC ATGACCGCCT TACTGAAGGT TTCTAGTTGT GACAAGAACA

2201 CTGGTGATTA TTACGAGGAC AGTTATGAAG ATATTTCAGC ATACTTGCTG

2251 AGTAAAAACA ATGCCATTGA ACCAAGAAGC TTCTCTCAAA ACGGCGCGCC

2301 AGGTACCTCA GAGTCTGCTA CCCCCGAGTC AGGGCCAGGA TCAGAGCCAG

2351 CCACCTCCGG GTCTGAGACA CCCGGGACTT CCGAGAGTGC CACCCCTGAG

2401 TCCGGACCCG GGTCCGAGCC CGCCACTTCC GGCTCCGAAA CTCCCGGCAC

2451 AAGCGAGAGC GCTACCCCAG AGTCAGGACC AGGAACATCT ACAGAGCCCT

2501 CTGAAGGCTC CGCTCCAGGG TCCCCAGCCG GCAGTCCCAC TAGCACCGAG

2551 GAGGGAACCT CTGAAAGCGC CACACCCGAA TCAGGGCCAG GGTCTGAGCC

2601 TGCTACCAGC GGCAGCGAGA CACCAGGCAC CTCTGAGTCC GCCACACCAG

2651 AGTCCGGACC CGGATCTCCC GCTGGGAGCC CCACCTCCAC TGAGGAGGGA

2701 TCTCCTGCTG GCTCTCCAAC ATCTACTGAG GAAGGTACCT CAACCGAGCC

2751 ATCCGAGGGA TCAGCTCCCG GCACCTCAGA GTCGGCAACC CCGGAGTCTG

2801 GACCCGGAAC TTCCGAAAGT GCCACACCAG AGTCCGGTCC CGGGACTTCA

2851 GAATCAGCAA CACCCGAGTC CGGCCCTGGG TCTGAACCCG CCACAAGTGG

- 63 041588

2901 TAGTGAGACA CCAGGATCAG AACCTGCTAC CTCAGGGTCA GAGACACCCG 2951 GATCTCCGGC AGGCTCACCA ACCTCCACTG AGGAGGGCAC CAGCACAGAA 3001 CCAAGCGAGG GCTCCGCACC CGGAACAAGC ACTGAACCCA GTGAGGGTTC 3051 AGCACCCGGC TCTGAGCCGG CCACAAGTGG CAGTGAGACA CCCGGCACTT 3101 CAGAGAGTGC CACCCCCGAG AGTGGCCCAG GCACTAGTAC CGAGCCCTCT 3151 GAAGGCAGTG CGCCAGCCTC GAGCCCACCA GTCTTGAAAC GCCATCAAGC 3201 TGAAATAACT CGTACTACTC TTCAGTCAGA TCAAGAGGAA ATCGATTATG 3251 ATGATACCAT ATCAGTTGAA ATGAAGAAGG AAGATTTTGA CATTTATGAT 3301 GAGGATGAAA ATCAGAGCCC CCGCAGCTTT CAAAAGAAAA CACGACACTA 3351 TTTTATTGCT GCAGTGGAGA GGCTCTGGGA TTATGGGATG AGTAGCTCCC 3401 CACATGTTCT AAGAAACAGG GCTCAGAGTG GCAGTGTCCC TCAGTTCAAG 3451 AAAGTTGTTT TCCAGGAATT TACTGATGGC TCCTTTACTC AGCCCTTATA 3501 CCGTGGAGAA CTAAATGAAC ATTTGGGACT CCTGGGGCCA TATATAAGAG 3551 CAGAAGTTGA AGATAATATC ATGGTAACTT TCAGAAATCA GGCCTCTCGT 3601 CCCTATTCCT TCTATTCTAG CCTTATTTCT TATGAGGAAG ATCAGAGGCA 3651 AGGAGCAGAA CCTAGAAAAA ACTTTGTCAA GCCTAATGAA ACCAAAACTT 3701 ACTTTTGGAA AGTGCAACAT CATATGGCAC CCACTAAAGA TGAGTTTGAC 3751 TGCAAAGCCT GGGCTTATTT CTCTGATGTT GACCTGGAAA AAGATGTGCA 3801 CTCAGGCCTG ATTGGACCCC TTCTGGTCTG CCACACTAAC ACACTGAACC 3851 CTGCTCATGG GAGACAAGTG ACAGTACAGG AATTTGCTCT GTTTTTCACC 3901 ATCTTTGATG AGACCAAAAG CTGGTACTTC ACTGAAAATA TGGAAAGAAA 3951 CTGCAGGGCT CCCTGCAATA TCCAGATGGA AGATCCCACT TTTAAAGAGA 4001 ATTATCGCTT CCATGCAATC AATGGCTACA TAATGGATAC ACTACCTGGC 4051 TTAGTAATGG CTCAGGATCA AAGGATTCGA TGGTATCTGC TCAGCATGGG 4101 CAGCAATGAA AACATCCATT CTATTCATTT CAGTGGACAT GTGTTCACTG 4151 TACGAAAAAA AGAGGAGTAT AAAATGGCAC TGTACAATCT CTATCCAGGT 4201 GTTTTTGAGA CAGTGGAAAT GTTACCATCC AAAGCTGGAA TTTGGCGGGT 4251 GGAATGCCTT ATTGGCGAGC ATCTACATGC TGGGATGAGC ACACTTTTTC 4301 TGGTGTACAG CAATAAGTGT CAGACTCCCC TGGGAATGGC TTCTGGACAC 4351 ATTAGAGATT TTCAGATTAC AGCTTCAGGA CAATATGGAC AGTGGGCCCC 4401 AAAGCTGGCC AGACTTCATT ATTCCGGATC AATCAATGCC TGGAGCACCA 4451 AGGAGCCCTT TTCTTGGATC AAGGTGGATC TGTTGGCACC AATGATTATT 4501 CACGGCATCA AGACCCAGGG TGCCCGTCAG AAGTTCTCCA GCCTCTACAT 4551 CTCTCAGTTT ATCATCATGT ATAGTCTTGA TGGGAAGAAG TGGCAGACTT 4601 ATCGAGGAAA TTCCACTGGA ACCTTAATGG TCTTCTTTGG CAATGTGGAT 4651 TCATCTGGGA TAAAACACAA TATTTTTAAC CCTCCAATTA TTGCTCGATA 4701 CATCCGTTTG CACCCAACTC ATTATAGCAT TCGCAGCACT CTTCGCATGG 4751 AGTTGATGGG CTGTGATTTA AATAGTTGCA GCATGCCATT GGGAATGGAG 4801 AGTAAAGCAA TATCAGATGC ACAGATTACT GCTTCATCCT ACTTTACCAA 4851 TATGTTTGCC ACCTGGTCTC CTTCAAAAGC TCGACTTCAC CTCCAAGGGA 4901 GGAGTAATGC CTGGAGACCT CAGGTGAATA ATCCAAAAGA GTGGCTGCAA 4951 GTGGACTTCC AGAAGACAAT GAAAGTCACA GGAGTAACTA CTCAGGGAGT 5001 AAAATCTCTG CTTACCAGCA TGTATGTGAA GGAGTTCCTC ATCTCCAGCA 5051 GTCAAGATGG CCATCAGTGG ACTCTCTTTT TTCAGAATGG CAAAGTAAAG 5101 GTTTTTCAGG GAAATCAAGA CTCCTTCACA CCTGTGGTGA ACTCTCTAGA 5151 CCCACCGTTA CTGACTCGCT ACCTTCGAAT TCACCCCCAG AGTTGGGTGC 5201 ACCAGATTGC CCTGAGGATG GAGGTTCTGG GCTGCGAGGC ACAGGACCTC 5251 TACGACAAGA ACACTGGTGA TTATTACGAG GACAGTTATG AAGATATTTC 5301 AGCATACTTG CTGAGTAAAA ACAATGCCAT TGAACCAAGA AGCTTCTCTG 5351 ACAAAACTCA CACATGCCCA CCGTGCCCAG CTCCAGAACT CCTGGGCGGA 5401 CCGTCAGTCT TCCTCTTCCC CCCAAAACCC AAGGACACCC TCATGATCTC 5451 CCGGACCCCT GAGGTCACAT GCGTGGTGGT GGACGTGAGC CACGAAGACC 5501 CTGAGGTCAA GTTCAACTGG TACGTGGACG GCGTGGAGGT GCATAATGCC 5551 AAGACAAAGC CGCGGGAGGA GCAGTACAAC AGCACGTACC GTGTGGTCAG 5601 CGTCCTCACC GTCCTGCACC AGGACTGGCT GAATGGCAAG GAGTACAAGT 5651 GCAAGGTCTC CAACAAAGCC CTCCCAGCCC CCATCGAGAA AACCATCTCC 5701 AAAGCCAAAG GGCAGCCCCG AGAACCACAG GTGTACACCC TGCCCCCATC 5751 CCGGGATGAG CTGACCAAGA ACCAGGTCAG CCTGACCTGC CTGGTCAAAG 5801 GCTTCTATCC CAGCGACATC GCCGTGGAGT GGGAGAGCAA TGGGCAGCCG 5851 GAGAACAACT ACAAGACCAC GCCTCCCGTG TTGGACTCCG ACGGCTCCTT 5901 CTTCCTCTAC AGCAAGCTCA CCGTGGAGAA GAGCAGGTGG CAGCAGGGGA 5951 ACGTCTTCTC ATGCTCCGTG ATGCATGAGG CTCTGCACAA CCACTACACG 6001 CAGAAGAGCC TCTCCCTGTC TCCGGGTAAA TGA

- 64 041588

Белковая последовательность pSYN FVIII 286 (FVIII-Fc с дополнительной областью а2 между FVIII и Fc; выделена жирным шрифтом и подчеркиванием) (SEQ ID NO: 86)

ATRRYYLGAV ELSWDYMQSD LGELPVDARF PPRVPKSFPF NTSWYKKTL

FVEFTDHLFN IAKPRPPWMG LLGPTIQAEV YDTWITLKN MASHPVSLHA

101 VGVSYWKASE GAEYDDQTSQ REKEDDKVFP GGSHTYVWQV LKENGPMASD

151 PLCLTYSYLS HVDLVKDLNS GLIGALLVCR EGSLAKEKTQ TLHKFILLFA

201 VFDEGKSWHS ETKNSLMQDR DAASARAWPK MHTVNGYVNR SLPGLIGCHR

251 KSVYWHVIGM GTTPEVHSIF LEGHTFLVRN HRQASLEISP ITFLTAQTLL

301 MDLGQFLLFC HISSHQHDGM EAYVKVDSCP EEPQLRMKNN EEAEDYDDDL

351 TDSEMDWRF DDDNSPSFIQ IRSVAKKHPK TWVHYIAAEE EDWDYAPLVL

401 APDDRSYKSQ YLNNGPQRIG RKYKKVRFMA YTDETFKTRE AIQHESGILG

451 PLLYGEVGDT LLIIFKNQAS RPYNIYPHGI TDVRPLYSRR LPKGVKHLKD

501 FPILPGEIFK YKWTVTVEDG PTKSDPRCLT RYYSSFVNME RDLASGLIGP

551 LLICYKESVD QRGNQIMSDK RNVILFSVFD ENRSWYLTEN IQRFLPNPAG

601 VQLEDPEFQA SNIMHSINGY VFDSLQLSVC LHEVAYWYIL SIGAQTDFLS

651 VFFSGYTFKH KMVYEDTLTL FPFSGETVFM SMENPGLWIL GCHNSDFRNR

701 GMTALLKVSS CDKNTGDYYE DSYEDISAYL LSKNNAIEPR SFSQNGAPGT

751 SESATPESGP GSEPATSGSE TPGTSESATP ESGPGSEPAT SGSETPGTSE

801 SATPESGPGT STEPSEGSAP GSPAGSPTST EEGTSESATP ESGPGSEPAT

851 SGSETPGTSE SATPESGPGS PAGSPTSTEE GSPAGSPTST EEGTSTEPSE

901 GSAPGTSESA TPESGPGTSE SATPESGPGT SESATPESGP GSEPATSGSE

951 TPGSEPATSG SETPGSPAGS PTSTEEGTST EPSEGSAPGT STEPSEGSAP

1001 GSEPATSGSE TPGTSESATP ESGPGTSTEP SEGSAPASSP PVLKRHQAEI

1051 TRTTLQSDQE EIDYDDTISV EMKKEDFDIY DEDENQSPRS FQKKTRHYFI

1101 AAVERLWDYG MSSSPHVLRN RAQSGSVPQF KKWFQEFTD GSFTQPLYRG

1151 ELNEHLGLLG PYIRAEVEDN IMVTFRNQAS RPYSFYSSLI SYEEDQRQGA

1201 EPRKNFVKPN ETKTYFWKVQ HHMAPTKDEF DCKAWAYFSD VDLEKDVHSG

1251 LIGPLLVCHT NTLNPAHGRQ VTVQEFALFF TIFDETKSWY FTENMERNCR

1301 APCNIQMEDP TFKENYRFHA INGYIMDTLP GLVMAQDQRI RWYLLSMGSN

1351 ENIHSIHFSG HVFTVRKKEE YKMALYNLYP GVFETVEMLP SKAGIWRVEC

1401 LIGEHLHAGM STLFLVYSNK CQTPLGMASG HIRDFQITAS GQYGQWAPKL

1451 ARLHYSGSIN AWSTKEPFSW IKVDLLAPMI IHGIKTQGAR QKFSSLYISQ

1501 FIIMYSLDGK KWQTYRGNST GTLMVFFGNV DSSGIKHNIF NPPIIARYIR

1551 LHPTHYSIRS TLRMELMGCD LNSCSMPLGM ESKAISDAQI TASSYFTNMF

1601 ATWSPSKARL HLQGRSNAWR PQVNNPKEWL QVDFQKTMKV TGVTTQGVKS

1651 LLTSMYVKEF LISSSQDGHQ WTLFFQNGKV KVFQGNQDSF TPWNSLDPP

1701 LLTRYLRIHP QSWVHQIALR MEVLGCEAQD LYDKNTGDYY EDSYEDISAY

1751 LLSKNNAIEP RSFSDKTHTC PPCPAPELLG GPSVFLFPPK PKDTLMISRT

01 PEVTCVWDV SHEDPEVKFN WYVDGVEVHN AKTKPREEQY NSTYRWSVL

1851 TVLHQDWLNG KEYKCKVSNK ALPAPIEKTI SKAKGQPREP QVYTLPPSRD

1901 ELTKNQVSLT CLVKGFYPSD IAVEWESNGQ PENNYKTTPP VLDSDGSFFL

1951 YSKLTVDKSR WQQGNVFSCS VMHEALHNHY TQKSLSLSPG K*

Нуклеотидная последовательность FVIII 169 (SEQ ID NO: 87)

ATGCA AATAG AGCTC TCCAC CTGCT TCTTT CTGTG CCTTT TGCGA TTCTG

CTTTA GTGCC ACCAG AAGAT ACTAC CTGGG TGCAG TGGAA CTGTG ATGGG

101 АСТАТ ATGCA AAGTG ATCTC GGTGA GCTGC CTGTG GACGC AAGAT TTCCT

151 CCTAG AGTGC CAAAA TCTTT TCCAT TCAAC ACCTC AGTCG TGTAC AAAAA

201 GACTC TGTTT GTAGA ATTCA CGGAT CACCT TTTCA ACATC GCTAA GCCAA

251 GGCCA CCCTG GATGG GTCTG CTAGG TCCTA CCATC CAGGC TGAGG TTTAT

301 GATAC AGTGG TCATT ACACT TAAGA ACATG GCTTC CCATC CTGTC AGTCT

351 TCATG CTGTT GGTGT ATCCT ACTGG AAAGC TTCTG AGGGA GCTGA ATATG

401 ATGAT CAGAC CAGTC AAAGG GAGAA AGAAG ATGAT AAAGT CTTCC CTGGT

451 GGAAG CCATA CATAT GTCTG GCAGG TCCTG AAAGA GAATG GTCCA ATGGC

501 CTCTG ACCCA CTGTG CCTTA CCTAC TCATA TCTTT CTCAT GTGGA CCTGG

551 TAAAA GACTT GAATT CAGGC CTCAT TGGAG CCCTA CTAGT ATGTA GAGAA

601 GGGAG TCTGG CCAAG GAAAA GACAC AGACC TTGCA CAAAT TTATA CTACT

651 TTTTG CTGTA TTTGA TGAAG GGAAA AGTTG GCACT CAGAA ACAAA GAACT

701 CCTTG ATGCA GGATA GGGAT GCTGC ATCTG CTCGG GCCTG GCCTA AAATG

751 CACAC AGTCA ATGGT TATGT AAACA GGTCT CTGCC AGGTC TGATT GGATG

801 CCACA GGAAA TCAGT CTATT GGCAT GTGAT TGGAA TGGGC ACCAC TCCTG

851 AAGTG CACTC AATAT TCCTC GAAGG TCACA CATTT CTTGT GAGGA АССАТ

- 65 041588

901 CGCCA GGCTA GCTTG GAAAT CTCGC CAATA ACTTT CCTTA CTGCT CAAAC

951 ACTCT TGATG GACCT TGGAC AGTTT CTACT GTTTT GTCAT ATCTC TTCCC

1001 ACCAA CATGA TGGCA TGGAA GCTTA TGTCA AAGTA GACAG CTGTC CAGAG

1051 GAACC CCAAC TACGA ATGAA AAATA ATGAA GAAGC GGAAG АСТАТ GATGA

1101 TGATC TTACT GATTC TGAAA TGGAT GTGGT CAGGT TTGAT GATGA CAACT

1151 CTCCT TCCTT TATCC AAATT CGCTC AGTTG CCAAG AAGCA TCCTA AAACT

1201 TGGGT АСАТТ ACATT GCTGC TGAAG AGGAG GACTG GGACT ATGCT CCCTT

1251 AGTCC TCGCC CCCGA TGACA GAAGT TATAA AAGTC AATAT TTGAA CAATG

1301 GCCCT CAGCG GATTG GTAGG AAGTA CAAAA AAGTC CGATT TATGG CATAC

1351 ACAGA TGAAA CCTTT AAGAC TCGTG AAGCT ATTCA GCATG AATCA GGAAT

1401 CTTGG GACCT TTACT TTATG GGGAA GTTGG AGACA CACTG TTGAT TATAT

1451 TTAAG AATCA AGCAA GCAGA CCATA TAACA TCTAC CCTCA CGGAA TCACT

1501 GATGT CCGTC CTTTG TATTC AAGGA GATTA CCAAA AGGTG TAAAA CATTT

1551 GAAGG ATTTT CCAAT TCTGC CAGGA GAAAT ATTCA AATAT AAATG GACAG

1601 TGACT GTAGA AGATG GGCCA ACTAA ATCAG ATCCT CGGTG CCTGA CCCGC

1651 ТАТТА CTCTA GTTTC GTTAA TATGG AGAGA GATCT AGCTT CAGGA CTCAT

1701 TGGCC CTCTC CTCAT CTGCT ACAAA GAATC TGTAG ATCAA AGAGG AAACC

1751 AGATA ATGTC AGACA AGAGG AATGT CATCC TGTTT TCTGT ATTTG ATGAG

1801 AACCG AAGCT GGTAC CTCAC AGAGA ATATA CAACG CTTTC TCCCC AATCC

1851 AGCTG GAGTG CAGCT TGAGG ATCCA GAGTT CCAAG CCTCC AACAT CATGC

1901 ACAGC ATCAA TGGCT ATGTT TTTGA TAGTT TGCAG TTGTC AGTTT GTTTG

1951 CATGA GGTGG CATAC TGGTA CATTC TAAGC ATTGG AGCAC AGACT GACTT

2001 CCTTT CTGTC TTCTT CTCTG GATAT ACCTT CAAAC ACAAA ATGGT CTATG

2051 AAGAC ACACT CACCC TATTC CCATT CTCAG GAGAA ACTGT CTTCA TGTCG

2101 ATGGA AAACC CAGGT CTATG GATTC TGGGG TGCCA CAACT CAGAC TTTCG

2151 GAACA GAGGC ATGAC CGCCT TACTG AAGGT TTCTA GTTGT GACAA GAACA

2201 CTGGT GATTA TTACG AGGAC AGTTA TGAAG ATATT TCAGC ATACT TGCTG

2251 AGTAA AAACA ATGCC ATTGA ACCAA GAAGC TTCTC TCAAA ACGGC GCGCC

2301 AGGTA CCTCA GAGTC TGCTA CCCCC GAGTC AGGGC CAGGA TCAGA GCCAG

2351 CCACC TCCGG GTCTG AGACA CCCGG GACTT CCGAG AGTGC CACCC CTGAG

2401 TCCGG ACCCG GGTCC GAGCC CGCCA CTTCC GGCTC CGAAA CTCCC GGCAC

2451 AAGCG AGAGC GCTAC CCCAG AGTCA GGACC AGGAA CATCT ACAGA GCCCT

2501 CTGAA GGCTC CGCTC CAGGG TCCCC AGCCG GCAGT CCCAC TAGCA CCGAG

2551 GAGGG AACCT CTGAA AGCGC CACAC CCGAA TCAGG GCCAG GGTCT GAGCC

2601 TGCTA CCAGC GGCAG CGAGA САССА GGCAC CTCTG AGTCC GCCAC ACCAG

2651 AGTCC GGACC CGGAT CTCCC GCTGG GAGCC CCACC TCCAC TGAGG AGGGA

2701 TCTCC TGCTG GCTCT CCAAC ATCTA CTGAG GAAGG TACCT CAACC GAGCC

2751 ATCCG AGGGA TCAGC TCCCG GCACC TCAGA GTCGG CAACC CCGGA GTCTG

2801 GACCC GGAAC TTCCG AAAGT GCCAC ACCAG AGTCC GGTCC CGGGA CTTCA

2851 GAATC AGCAA CACCC GAGTC CGGCC CTGGG TCTGA ACCCG CCACA AGTGG

2901 TAGTG AGACA CCAGG ATCAG AACCT GCTAC CTCAG GGTCA GAGAC ACCCG

2951 GATCT CCGGC AGGCT САССА ACCTC CACTG AGGAG GGCAC CAGCA CAGAA

3001 CCAAG CGAGG GCTCC GCACC CGGAA CAAGC ACTGA ACCCA GTGAG GGTTC

3051 AGCAC CCGGC TCTGA GCCGG CCACA AGTGG CAGTG AGACA CCCGG CACTT

3101 CAGAG AGTGC CACCC CCGAG AGTGG CCCAG GCACT AGTAC CGAGC CCTCT

3151 GAAGG CAGTG CGCCA GCCTC GAGCC САССА GTCTT GAAAC GCCAT CAAGC

3201 TGAAA TAACT CGTAC TACTC TTCAG TCAGA TCAAG AGGAA ATCGA TTATG

3251 ATGAT АССАТ ATCAG TTGAA ATGAA GAAGG AAGAT TTTGA CATTT ATGAT

3301 GAGGA TGAAA ATCAG AGCCC CCGCA GCTTT CAAAA GAAAA CACGA CACTA

3351 TTTTA TTGCT GCAGT GGAGA GGCTC TGGGA TTATG GGATG AGTAG CTCCC

3401 CACAT GTTCT AAGAA ACAGG GCTCA GAGTG GCAGT GTCCC TCAGT TCAAG

3451 AAAGT TGTTT TCCAG GAATT TACTG ATGGC TCCTT TACTC AGCCC TTATA

3501 CCGTG GAGAA CTAAA TGAAC ATTTG GGACT CCTGG GGCCA TATAT AAGAG

3551 CAGAA GTTGA AGATA ATATC ATGGT AACTT TCAGA AATCA GGCCT CTCGT

3601 CCCTA TTCCT TCTAT TCTAG CCTTA TTTCT TATGA GGAAG ATCAG AGGCA

3651 AGGAG CAGAA CCTAG AAAAA ACTTT GTCAA GCCTA ATGAA ACCAA AACTT

3701 ACTTT TGGAA AGTGC AACAT CATAT GGCAC CCACT AAAGA TGAGT TTGAC

3751 TGCAA AGCCT GGGCT TATTT CTCTG ATGTT GACCT GGAAA AAGAT GTGCA

3801 CTCAG GCCTG ATTGG ACCCC TTCTG GTCTG CCACA CTAAC ACACT GAACC

3851 CTGCT CATGG GAGAC AAGTG ACAGT ACAGG AATTT GCTCT GTTTT TCACC

3901 ATCTT TGATG AGACC AAAAG CTGGT ACTTC ACTGA AAATA TGGAA AGAAA

3951 CTGCA GGGCT CCCTG CAATA TCCAG ATGGA AGATC CCACT TTTAA AGAGA

4001 ATTAT CGCTT CCATG CAATC AATGG СТАСА TAATG GATAC ACTAC CTGGC

4051 TTAGT AATGG CTCAG GATCA AAGGA TTCGA TGGTA TCTGC TCAGC ATGGG

- 66 041588

4101	CAGCA	ATGAA	AACAT	CCATT	CTATT	CATTT	CAGTG	GACAT	GTGTT	CACTG
4151	TAG GA	AAAAA	AGAGG	AGTAT	AAAAT	GGCAC	TGTAC	AATCT	CTATC	CAGGT
4201	GTTTT	TGAGA	CAGTG	GAAAT	GT TAG	CATCC	AAAGC	TGGAA	TTTGG	CGGGT
4251	GGAAT	GCCTT	ATTGG	CGAGC	AT СТА	CATGC	TGGGA	TGAGC	ACACT	TTTTC
4301	TGGTG	TACAG	CAATA	AGTGT	CAGAC	TCCCC	TGGGA	ATGGC	TTCTG	GACAC
4351	AT TAG	AGATT	TTCAG	AT TAG	AGCTT	CAGGA	CAATA	TGGAC	AGTGG	GCCCC
4401	AAAGC	TGGCC	AGACT	TCATT	ATTCC	GGATC	AATCA	ATGCC	TGGAG	САССА
4451	AGGAG	CCCTT	TTCTT	GGATC	AAGGT	GGATC	TGTTG	GCACC	AATGA	TTATT
4501	CACGG	CATC A	AGACC	CAGGG	TGCCC	GTCAG	AAGTT	CTCCA	GCCTC	TACAT
4551	CTCTC	AGTTT	AT CAT	CAT GT	ATAGT	CTTGA	TGGGA	AGAAG	TGGCA	GACTT
4601	АТС GA	GGAAA	TTCCA	CTGGA	ACCTT	AATGG	TCTTC	TTTGG	CAATG	TGGAT
4651	TCATC	TGGGA	TAAAA	CACAA	TATTT	TTAAC	CCTCC	AATTA	TTGCT	CGATA
4701	CATCC	GTTTG	CACCC	AACTC	AT TAT	AGCAT	TCGCA	GCACT	CTTCG	CATGG
4751	AGTTG	ATGGG	CTGTG	ATTTA	AATAG	TTGCA	GCATG	CCATT	GGGAA	TGGAG
4801	AGTAA	AGCAA	TATCA	GATGC	ACAGA	TTACT	GCTTC	ATCCT	ACTTT	ACCAA
4851	TAT GT	TTGCC	ACCTG	GTCTC	CTTCA	AAAGC	TCGAC	TTCAC	CTCCA	AGGGA
4901	GGAGT	AATGC	CTGGA	GACCT	CAGGT	GAATA	AT CCA	AAAGA	GTGGC	TGCAA
4951	GTGGA	CTTCC	AGAAG	ACAAT	GAAAG	TCACA	GGAGT	AACTA	CTCAG	GGAGT
5001	AAAAT	CTCTG	CTTAC	CAGCA	TGTAT	GTGAA	GGAGT	TCCTC	ATCTC	CAGCA
5051	GTCAA	GATGG	CCATC	AGTGG	ACTCT	CTTTT	TTCAG	AATGG	CAAAG	TAAAG
5101	GTTTT	TCAGG	GAAAT	CAAGA	CTCCT	TCACA	CCTGT	GGTGA	ACTCT	CTAGA
5151	CCCAC	CGTTA	CTGAC	TCGCT	ACCTT	CGAAT	TCACC	CCCAG	AGTTG	GGTGC
5201	ACC AG	ATTGC	CCTGA	GGATG	GAGGT	TCTGG	GCTGC	GAGGC	ACAGG	ACCTC
5251	TAG GA	CAAAA	CTCAC	ACATG	CCCAC	CGTGC	CCAGC	TCCAG	AACTC	CTGGG
5301	CGGAC	CGTCA	GTCTT	CCTCT	TCCCC	CCAAA	AC CCA	AGGAC	ACCCT	CAT GA
5351	TCTCC	CGGAC	CCCTG	AGGTC	ACATG	CGTGG	TGGTG	GACGT	GAGCC	ACGAA
5401	GACCC	TGAGG	TCAAG	TTCAA	CTGGT	ACGTG	GACGG	CGTGG	AGGTG	CATAA
5451	TGCCA	AGACA	AAGCC	GCGGG	AGGAG	CAGTA	CAACA	GCACG	TACCG	TGTGG
5501	TCAGC	GTCCT	CACCG	TCCTG	САССА	GGACT	GGCTG	AATGG	CAAGG	AGTAC
5551	AAGTG	CAAGG	TCTCC	AACAA	AGCCC	TCCCA	GCCCC	CATCG	AGAAA	АССАТ
5601	CTCCA	AAGCC	AAAGG	GCAGC	CCCGA	GAACC	ACAGG	TGTAC	ACCCT	GCCCC
5651	CATCC	CGGGA	TGAGC	TGACC	AAGAA	CCAGG	TCAGC	CTGAC	CTGCC	TGGTC
5701	AAAGG	CTTCT	ATCCC	AGCGA	CATCG	CCGTG	GAGTG	GGAGA	GCAAT	GGGCA
5751	GCCGG	AGAAC	AACTA	CAAGA	CCACG	CCTCC	CGTGT	TGGAC	TCCGA	CGGCT
5801	CCTTC	TTCCT	СТАСА	GCAAG	CTCAC	CGTGG	ACAAG	AGCAG	GTGGC	AGCAG
5851 5901	GGGAA CACGC	CGTCT AGAAG	TCTCA AGCCT	TGCTC CTCCC	CGTGA TGTCT	TGCAT CCGGG	GAGGC TAAAT	TCTGC GA	ACAAC	CACTA

Белковая последовательность FVIII 169 (SEQ ID NO: 88)

101

151

201

251

301

351

401

451

501

551

601

651

701

751

801

851

901

951

1001

1051

MQIELSTCFF PRVPKSFPFN DTWITLKNM GSHTYVWQVL GSLAKEKTQT HTVNGYVNRS RQASLEISPI EPQLRMKNNE WVHYIAAEEE TDETFKTREA DVRPLYSRRL YYSSFVNMER NRSWYLTENI HEVAYWYILS MENPGLWILG SKNNAIEPRS SGPGSEPATS EGTSESATPE SPAGSPTSTE ESATPESGPG PSEGSAPGTS EGSAPASSPP

LCLLRFCFSA TSWYKKTLF ASHPVSLHAV KENGPMASDP LHKFILLFAV LPGLIGCHRK TFLTAQTLLM EAEDYDDDLT DWDYAPLVLA IQHESGILGP PKGVKHLKDF DLASGLIGPL QRFLPNPAGV IGAQTDFLSV CHNSDFRNRG FSQNGAPGTS GSETPGTSES SGPGSEPATS EGTSTEPSEG SEPATSGSET TEPSEGSAPG VLKRHQAEIT

TRRYYLGAVE VEFTDHLFNI GVSYWKASEG LCLTYSYLSH FDEGKSWHSE SVYWHVIGMG DLGQFLLFCH DSEMDWRFD PDDRSYKSQY LLYGEVGDTL PILPGEIFKY LICYKESVDQ QLEDPEFQAS FFSGYTFKHK MTALLKVSSC ESATPESGPG ATPESGPGTS GSETPGTSES SAPGTSESAT PGSEPATSGS SEPATSGSET RTTLQSDQEE

LSWDYMQSDL AKPRPPWMGL AEYDDQTSQR VDLVKDLNSG TKNSLMQDRD TTPEVHSIFL ISSHQHDGME DDNSPSFIQI LNNGPQRIGR LIIFKNQASR KWTVTVEDGP RGNQIMSDKR NIMHSINGYV MVYEDTLTLF DKNTGDYYED SEPATSGSET TEPSEGSAPG ATPESGPGSP PESGPGTSES ETPGSPAGSP PGTSESATPE IDYDDTISVE

GELPVDARFP LGPTIQAEVY EKEDDKVFPG LIGALLVCRE AASARAWPKM EGHTFLVRNH AYVKVDSCPE RSVAKKHPKT KYKKVRFMAY PYNIYPHGIT TKSDPRCLTR NVILFSVFDE FDSLQLSVCL PFSGETVFMS SYEDISAYLL PGTSESATPE SPAGSPTSTE AGSPTSTEEG ATPESGPGTS TSTEEGTSTE SGPGTSTEPS MKKEDFDIYD

- 67 041588

1101 EDENQSPRSF QKKTRHYFIA AVERLWDYGM SSSPHVLRNR AQSGSVPQFK

1151 KWFQEFTDG SFTQPLYRGE LNEHLGLLGP YIRAEVEDNI MVTFRNQASR

1201 PYSFYSSLIS YEEDQRQGAE PRKNFVKPNE TKTYFWKVQH HMAPTKDEFD

1251 CKAWAYFSDV DLEKDVHSGL IGPLLVCHTN TLNPAHGRQV TVQEFALFFT

1301 IFDETKSWYF TENMERNCRA PCNIQMEDPT FKENYRFHAI NGYIMDTLPG

1351 LVMAQDQRIR WYLLSMGSNE NIHSIHFSGH VFTVRKKEEY KMALYNLYPG

1401 VFETVEMLPS KAGIWRVECL IGEHLHAGMS TLFLVYSNKC QTPLGMASGH

1451 IRDFQITASG QYGQWAPKLA RLHYSGSINA WSTKEPFSWI KVDLLAPMII

1501 HGIKTQGARQ KFSSLYISQF IIMYSLDGKK WQTYRGNSTG TLMVFFGNVD

1551 SSGIKHNIFN PPIIARYIRL HPTHYSIRST LRMELMGCDL NSCSMPLGME

1601 SKAISDAQIT ASSYFTNMFA TWSPSKARLH LQGRSNAWRP QVNNPKEWLQ

1651 VDFQKTMKVT GVTTQGVKSL LTSMYVKEFL ISSSQDGHQW TLFFQNGKVK

1701 VFQGNQDSFT PWNSLDPPL LTRYLRIHPQ SWVHQIALRM EVLGCEAQDL

1751 YDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVWDVSHE

1801 DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRWSVLTVL HQDWLNGKEY

1851 KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSRDELT KNQVSLTCLV

1901 KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ

1951 GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK*

Нуклеотидная последовательность VWF034 (SEQ ID NO: 91)

ATGAT TCCTG CCAGA TTTGC CGGGG TGCTG CTTGC TCTGG CCCTC ATTTT

GCCAG GGACC CTTTG TGCAG AAGGA ACTCG CGGCA GGTCA TCCAC GGCCC

101 GATGC AGCCT TTTCG GAAGT GACTT CGTCA ACACC TTTGA TGGGA GCATG

151 TACAG CTTTG CGGGA TACTG CAGTT ACCTC CTGGC AGGGG GCTGC CAGAA

201 ACGCT CCTTC TCGAT TATTG GGGAC TTCCA GAATG GCAAG AGAGT GAGCC

251 TCTCC GTGTA TCTTG GGGAA TTTTT TGACA TCGAT TTGTT TGTCA ATGGT

301 ACCGT GACAC AGGGG GACCA AAGAG TCTCC ATGCC CTATG CCTCC AAAGG

351 GCTGT ATCTA GAAAC TGAGG CTGGG TACTA CAAGC TGTCC GGTGA GGCCT

401 ATGGC TTTGT GGCCA GGATC GATGG CAGCG GCAAC TTTCA AGTCC TGCTG

451 TCAGA CAGAT ACTTC AACAA GACCT GCGGG CTGTG TGGCA ACTTT AACAT

501 CTTTG CTGAA GATGA CTTTA TGACC CAAGA AGGGA CCTTG ACCTC GGACC

551 CTTAT GACTT TGCCA ACTCA TGGGC TCTGA GCAGT GGAGA ACAGT GGTGT

601 GAACG GGCAT CTCCT CCCAG CAGCT CATGC AACAT CTCCT CTGGG GAAAT

651 GCAGA AGGGC CTGTG GGAGC AGTGC CAGCT TCTGA AGAGC ACCTC GGTGT

701 TTGCC CGCTG CCACC CTCTG GTGGA CCCCG AGCCT TTTGT GGCCC TGTGT

751 GAGAA GACTT TGTGT GAGTG TGCTG GGGGG CTGGA GTGCG CCTGC CCTGC

801 CCTCC TGGAG TACGC CCGGA CCTGT GCCCA GGAGG GAATG GTGCT GTACG

851 GCTGG ACCGA CCACA GCGCG TGCAG CCCAG TGTGC CCTGC TGGTA TGGAG

901 TATAG GCAGT GTGTG TCCCC TTGCG CCAGG ACCTG CCAGA GCCTG CACAT

951 CAATG AAATG TGTCA GGAGC GATGC GTGGA TGGCT GCAGC TGCCC TGAGG

1001 GACAG CTCCT GGATG AAGGC CTCTG CGTGG AGAGC ACCGA GTGTC CCTGC

1051 GTGCA TTCCG GAAAG CGCTA CCCTC CCGGC ACCTC CCTCT CTCGA GACTG

1101 CAACA CCTGC ATTTG CCGAA ACAGC CAGTG GATCT GCAGC AATGA AGAAT

1151 GTCCA GGGGA GTGCC TTGTC ACTGG TCAAT CCCAC TTCAA GAGCT TTGAC

1201 AACAG ATACT TCACC TTCAG TGGGA TCTGC CAGTA CCTGC TGGCC CGGGA

1251 TTGCC AGGAC CACTC CTTCT CCATT GTCAT TGAGA CTGTC CAGTG TGCTG

1301 ATGAC CGCGA CGCTG TGTGC ACCCG CTCCG TCACC GTCCG GCTGC CTGGC

1351 CTGCA CAACA GCCTT GTGAA ACTGA AGCAT GGGGC AGGAG TTGCC ATGGA

1401 TGGCC AGGAC ATCCA GCTCC CCCTC CTGAA AGGTG ACCTC CGCAT CCAGC

1451 АТАСА GTGAC GGCCT CCGTG CGCCT CAGCT ACGGG GAGGA CCTGC AGATG

1501 GACTG GGATG GCCGC GGGAG GCTGC TGGTG AAGCT GTCCC CCGTC TATGC

1551 CGGGA AGACC TGCGG CCTGT GTGGG AATTA CAATG GCAAC CAGGG CGACG

1601 ACTTC CTTAC CCCCT CTGGG CTGGC GGAGC CCCGG GTGGA GGACT TCGGG

1651 AACGC CTGGA AGCTG CACGG GGACT GCCAG GACCT GCAGA AGCAG CACAG

1701 CGATC CCTGC GCCCT CAACC CGCGC ATGAC CAGGT TCTCC GAGGA GGCGT

1751 GCGCG GTCCT GACGT CCCCC ACATT CGAGG CCTGC CATCG TGCCG TCAGC

1801 CCGCT GCCCT ACCTG CGGAA CTGCC GCTAC GACGT GTGCT CCTGC TCGGA

1851 CGGCC GCGAG TGCCT GTGCG GCGCC CTGGC CAGCT ATGCC GCGGC CTGCG

1901 CGGGG AGAGG CGTGC GCGTC GCGTG GCGCG AGCCA GGCCG CTGTG AGCTG

1951 AACTG CCCGA AAGGC CAGGT GTACC TGCAG TGCGG GACCC CCTGC AACCT

2001 GACCT GCCGC TCTCT CTCTT ACCCG GATGA GGAAT GCAAT GAGGC CTGCC

2051 TGGAG GGCTG CTTCT GCCCC CCAGG GCTCT ACATG GATGA GAGGG GGGAC

2101 TGCGT GCCCA AGGCC CAGTG CCCCT GTTAC TATGA CGGTG AGATC TTCCA

- 68 041588

2151 GCCAG AAGAC ATCTT CTCAG АССАТ CACAC CATGT GCTAC TGTGA GGATG 2201 GCTTC ATGCA CTGTA GGATG AGTGG AGTCC CCGGA AGCTT GCTGC CTGAC 2251 GCTGT CCTCA GCAGT CCCCT GTCTC ATCGC AGCAA AAGGA GCCTA TCCTG 2301 TCGGC CCCCC ATGGT CAAGC TGGTG TGTCC CGCTG ACAAC CTGCG GGCTG 2351 AAGGG CTCGA GTGTA CCAAA ACGTG CCAGA АСТАТ GACCT GGAGT GGATG 2401 AGCAT GGGCT GTGTC TCTGG CTGCG TCTGC CCCCC GGGCA TGGTG CGGCA 2451 TGAGA ACAGA TGTGT GGCCC TGGAA AGGTG TCCCT GCTTC CATCA GGGCA 2501 AGGAG TATGC CGCTG GAGAA ACAGT GAAGA TTGGC TGGAA CACTT GTGTC 2551 TGTCG GGACC GGAAG TGGAA CTGCA CAGAC CATGT GTGTG ATGCC ACGTG 2601 CTCGA GGATG GGCAT GGCCC ACTAC CTGAC CTTCG ACGGG CTCAA ATACC 2651 TGTTC CCCGG GGAGT GCCAG TACGT TCTGG TGCAG GATTA CTGCG GCAGT 2701 AACCC TGGGA CCTTT CGGAT CCTAG TGGGG AATAA GGGAT GCAGC CACCC 2751 CTCAG TGAAA TGCAA GAAAC GGGTC АССАТ CCTGG TGGAG GGAGG AGAGA 2801 TTGAG CTGTT TGACG GGGAG GTGAA TGTGA AGAGG CCCAT GAAGG ATGAG 2851 ACTCA CTTTG AGGTG GTGGA GTCTG GCCGG TACAT CATTC TGCTG CTGGG 2901 CAAAG CCCTC TCCGT GGTCT GGGAC CGCCA CCTGA GCATC TCCGT GGTCC 2951 TGAAG CAGAC ATACC AGGAG AAAGT GTGTG GCCTG TGTGG GAATT TTGAT 3001 GGCAT CCAGA ACAAT GACCT САССА GCAGC AACCT CCAAG TGGAG GAAGA 3051 CGCTG TGGAG TTTGG GAACT CCTGG AAAGT GAGCT CGCAG TGTGG TGAGA 3101 CCAGA AAAGT GCCTC TGGAC TCATC CCCTG CCACC TGCCA TAACA ACATC 3151 ATGAA GCAGA CGATG GTGGA TTCCT CCTGT AGAAT CCTTA CCAGT GACGT 3201 CTTCC AGGAC TGCAA CAAGC TGGTG GACCC CGAGC CATAT CTGGA TGTCT 3251 GCATT TACGA CACCT GCTCC TGTGA GTCCA TTGGG GACTG CGCCG CATTC 3301 TGCGA САССА TTGCT GCCTA TGCCC ACGTG TGTGC CCAGC ATGGC AAGGT 3351 GGTGA CCTGG AGGAC GGCCA CATTG TGCCC CCAGA GCTGC GAGGA GAGGA 3401 ATCTC CGGGA GAACG GGTAT GAGGC TGAGT GGCGC TATAA CAGCT GTGCA 3451 CCTGC CTGTC AAGTC ACGTG TCAGC ACCCT GAGCC ACTGG CCTGC CCTGT 3501 GCAGT GTGTG GAGGG CTGCC ATGCC CACTG CCCTC CAGGG AAAAT CCTGG 3551 ATGAG CTTTT GCAGA CCTGC GTTGA CCCTG AAGAC TGTCC AGTGT GTGAG 3601 GTGGC TGGCC GGCGT TTTGC CTCAG GAAAG AAAGT CACCT TGAAT CCCAG 3651 TGACC CTGAG CACTG CCAGA TTTGC CACTG TGATG TTGTC AACCT CACCT 3701 GTGAA GCCTG CCAGG AGCCG ATATC GGGTA CCTCA GAGTC TGCTA CCCCC 3751 GAGTC AGGGC CAGGA TCAGA GCCAG CCACC TCCGG GTCTG AGACA CCCGG 3801 GACTT CCGAG AGTGC CACCC CTGAG TCCGG ACCCG GGTCC GAGCC CGCCA 3851 CTTCC GGCTC CGAAA CTCCC GGCAC AAGCG AGAGC GCTAC CCCAG AGTCA 3901 GGACC AGGAA CATCT ACAGA GCCCT CTGAA GGCTC CGCTC CAGGG TCCCC 3951 AGCCG GCAGT CCCAC TAGCA CCGAG GAGGG AACCT CTGAA AGCGC CACAC 4001 CCGAA TCAGG GCCAG GGTCT GAGCC TGCTA CCAGC GGCAG CGAGA САССА 4051 GGCAC CTCTG AGTCC GCCAC ACCAG AGTCC GGACC CGGAT CTCCC GCTGG 4101 GAGCC CCACC TCCAC TGAGG AGGGA TCTCC TGCTG GCTCT CCAAC ATCTA 4151 CTGAG GAAGG TACCT CAACC GAGCC ATCCG AGGGA TCAGC TCCCG GCACC 4201 TCAGA GTCGG CAACC CCGGA GTCTG GACCC GGAAC TTCCG AAAGT GCCAC 4251 ACCAG AGTCC GGTCC CGGGA CTTCA GAATC AGCAA CACCC GAGTC CGGCC 4301 CTGGG TCTGA ACCCG CCACA AGTGG TAGTG AGACA CCAGG ATCAG AACCT 4351 GCTAC CTCAG GGTCA GAGAC ACCCG GATCT CCGGC AGGCT САССА ACCTC 4401 CACTG AGGAG GGCAC GAGGA GAGAA CCAAG GGAGG GCTCC GCACC CGGAA 4451 CAAGC ACTGA ACCCA GTGAG GGTTC AGCAC CCGGC TCTGA GCCGG CCACA 4501 AGTGG CAGTG AGACA CCCGG CACTT CAGAG AGTGC CACCC CCGAG AGTGG 4551 CCCAG GCACT AGTAC CGAGC CCTCT GAAGG CAGTG CGCCA GATTC TGGCG 4601 GTGGA GGTTC CGGTG GCGGG GGATC CGGTG GCGGG GGATC CGGTG GCGGG 4651 GGATC CGGTG GCGGG GGATC CCTGG TCCCC CGGGG CAGCG GAGGC GACAA 4701 AACTC ACACA TGCCC ACCGT GCCCA GCTCC AGAAC TCCTG GGCGG ACCGT 4751 CAGTC TTCCT CTTCC CCCCA AAACC CAAGG ACACC CTCAT GATCT CCCGG 4801 ACCCC TGAGG TCACA TGCGT GGTGG TGGAC GTGAG CCACG AAGAC CCTGA 4851 GGTCA AGTTC AACTG GTACG TGGAC GGCGT GGAGG TGCAT AATGC CAAGA 4901 CAAAG CCGCG GGAGG AGCAG TACAA CAGCA CGTAC CGTGT GGTCA GCGTC 4951 CTCAC CGTCC TGCAC CAGGA CTGGC TGAAT GGCAA GGAGT ACAAG TGCAA 5001 GGTCT CCAAC AAAGC CCTCC CAGCC CCCAT CGAGA AAACC ATCTC CAAAG 5051 CCAAA GGGCA GCCCC GAGAA CCACA GGTGT ACACC CTGCC CCCAT CCCGG 5101 GATGA GCTGA CCAAG AACCA GGTCA GCCTG ACCTG CCTGG TCAAA GGCTT 5151 CTATC CCAGC GACAT CGCCG TGGAG TGGGA GAGCA ATGGG CAGCC GGAGA 5201 ACAAC TACAA GACCA CGCCT CCCGT GTTGG ACTCC GACGG CTCCT TCTTC 5251 CTCTA CAGCA AGCTC ACCGT GGACA AGAGC AGGTG GCAGC AGGGG AACGT 5301 CTTCT CATGC TCCGT GATGC ATGAG GCTCT GCACA ACCAC TACAC GCAGA

-

Claims

5351 AGAGC CTCTC CCTGT CTCCG GGTAA ATGA

Белковая последовательность VWF034 (SEQ ID NO: 92)

1 MIPARFAGVL LALALILPGT LCAEGTRGRS STARCSLFGS DFVNTFDGSM

51 YSFAGYCSYL LAGGCQKRSF SIIGDFQNGK RVSLSVYLGE FFDIHLFVNG

101 TVTQGDQRVS MPYASKGLYL ETEAGYYKLS GEAYGFVARI DGSGNFQVLL

151 SDRYFNKTCG LCGNFNIFAE DDFMTQEGTL TSDPYDFANS WALSSGEQWC

201 ERASPPSSSC NISSGEMQKG LWEQCQLLKS TSVFARCHPL VDPEPFVALC

251 EKTLCECAGG LECACPALLE YARTCAQEGM VLYGWTDHSA CSPVCPAGME

301 YRQCVSPCAR TCQSLHINEM CQERCVDGCS CPEGQLLDEG LCVESTECPC

351 VHSGKRYPPG TSLSRDCNTC ICRNSQWICS NEECPGECLV TGQSHFKSFD

401 NRYFTFSGIC QYLLARDCQD HSFSIVIETV QCADDRDAVC TRSVTVRLPG

451 LHNSLVKLKH GAGVAMDGQD IQLPLLKGDL RIQHTVTASV RLSYGEDLQM

501 DWDGRGRLLV KLSPVYAGKT CGLCGNYNGN QGDDFLTPSG LAEPRVEDFG

551 NAWKLHGDCQ DLQKQHSDPC ALNPRMTRFS EEACAVLTSP TFEACHRAVS

601 PLPYLRNCRY DVCSCSDGRE CLCGALASYA AACAGRGVRV AWREPGRCEL

651 NCPKGQVYLQ CGTPCNLTCR SLSYPDEECN EACLEGCFCP PGLYMDERGD

701 CVPKAQCPCY YDGEIFQPED IFSDHHTMCY CEDGFMHCTM SGVPGSLLPD

751 AVLSSPLSHR SKRSLSCRPP MVKLVCPADN LRAEGLECTK TCQNYDLECM

801 SMGCVSGCLC PPGMVRHENR CVALERCPCF HQGKEYAPGE TVKIGCNTCV

851 CRDRKWNCTD HVCDATCSTI GMAHYLTFDG LKYLFPGECQ YVLVQDYCGS

901 NPGTFRILVG NKGCSHPSVK CKKRVTILVE GGEIELFDGE VNVKRPMKDE

951 THFEWESGR YIILLLGKAL SWWDRHLSI SWLKQTYQE KVCGLCGNFD

1001 GIQNNDLTSS NLQVEEDPVD FGNSWKVSSQ CADTRKVPLD SSPATCHNNI

1051 MKQTMVDSSC RILTSDVFQD CNKLVDPEPY LDVCIYDTCS CESIGDCAAF

1101 CDTIAAYAHV CAQHGKWTW RTATLCPQSC EERNLRENGY EAEWRYNSCA

1151 PACQVTCQHP EPLACPVQCV EGCHAHCPPG KILDELLQTC VDPEDCPVCE

1201 VAGRRFASGK KVTLNPSDPE HCQICHCDW NLTCEACQEP ISGTSESATP

1251 ESGPGSEPAT SGSETPGTSE SATPESGPGS EPATSGSETP GTSESATPES

1301 GPGTSTEPSE GSAPGSPAGS PTSTEEGTSE SATPESGPGS EPATSGSETP

1351 GTSESATPES GPGSPAGSPT STEEGSPAGS PTSTEEGTST EPSEGSAPGT

1401 SESATPESGP GTSESATPES GPGTSESATP ESGPGSEPAT SGSETPGSEP

1451 ATSGSETPGS PAGSPTSTEE GTSTEPSEGS APGTSTEPSE GSAPGSEPAT

1501 SGSETPGTSE SATPESGPGT STEPSEGSAP DIGGGGGSGG GGSLVPRGSG

1551 GDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVWDVSHE

1601 DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRWSVLTVL HQDWLNGKEY

1651 KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSRDELT KNQVSLTCLV

1701 KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ

1751 GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK*

Приведенное выше описание конкретных вариантов реализации настолько полно раскрывает общий смысл изобретения, что посторонние лица смогут, используя знания, доступные специалистам в данной области техники, легко модифицировать и/или адаптировать для различных применений такие конкретные варианты реализации изобретения без ненадлежащего экспериментирования, не отходя от общей идеи настоящего изобретения. Таким образом, такие адаптации и модификации рассматриваются как не выходящие за пределы значений и объема эквивалентов раскрытых вариантов реализации изобретения на основании описания и рекомендаций, приведенных в данном документе. Следует понимать, что фразеология или терминология в данном документе используются в целях описания, а не ограничения, так что терминология или фразеология данного описания заявки должны рассматриваться квалифицированным специалистом в свете описания и рекомендаций.

Другие варианты реализации изобретения будут очевидны квалифицированным специалистам в данной области техники из описания заявки и практики изобретения, раскрытых в данном документе. Следует понимать, что описание заявки и примеры должны рассматриваться только как иллюстративные, а действительные объем и сущность изобретения определяются приведенной далее формулой изобретения. Все патенты и публикации, приведенный в данном документе, включены в него в качестве ссылок в полном объеме.

Данная заявка заявляет приоритет по предварительной заявке на патент США № 61/840872, поданной 28 июня 2013 г. Содержание вышеуказанной заявки включено в данный документ в качестве ссылки в полном объеме.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Химерная молекула, способная связываться с белком FVIII и содержащая белок фактора фон Виллебранда (VWF), гетерологичный фрагмент (H1), последовательность удлиненного рекомбинантного полипептида (XTEN) и линкер VWF, соединяющий белок VWF с гетерологичным фрагментом, причем белок VWF содержит домен D' и домен D3 VWF; причем линкер VWF содержит область а2 из фактора VIII (FVIII); причем последовательность XTEN соединена с белком VWF, гетерологичным фрагментом (H1), линкером VWF или любой их комбинацией.
2. Химерная молекула по п.1, отличающаяся тем, что последовательность XTEN соединяет белок VWF с линкером VWF или линкер VWF с гетерологичным фрагментом.
3. Химерная молекула по п.1 или 2, дополнительно содержащая вторую полипептидную цепь, которая содержит белок FVIII, причем первая полипептидная цепь представляет собой химерную молекулу, состоящую из белка VWF, гетерологичного фрагмента (H1), и обе цепи ассоциированы друг с другом.
4. Химерная молекула по п.3, отличающаяся тем, что белок FVIII дополнительно содержит дополнительную последовательность XTEN.

- 70 041588
5. Химерная молекула по п.3 или 4, отличающаяся тем, что вторая полипептидная цепь дополнительно содержит второй гетерологичный фрагмент (Н2).
6. Химерная молекула, способная связываться с белком FVIII и содержащая первую полипептидную цепь, которая содержит белок VWF, гетерологичный фрагмент (H1) и линкер VWF, соединяющий белок VWF и гетерологичный фрагмент (H1), и вторую полипептидную цепь, содержащую белок FVIII и последовательность XTEN, причем белок VWF содержит домен D' и домен D3 VWF;

причем линкер VWF в первой полипептидной цепи содержит область а2 из фактора VIII (FVIII); причем первая полипептидная цепь и вторая полипептидная цепь ассоциированы друг с другом.
7. Химерная молекула по п.6, содержащая дополнительную последовательность XTEN, которая соединена с белком VWF, гетерологичным фрагментом, линкером VWF или любой их комбинацией.
8. Химерная молекула по п.6 или 7, содержащая второй гетерологичный фрагмент (Н2), соединенный с белком FVIII, последовательностью XTEN или обоими.
9. Химерная молекула по любому из пп.1-8, отличающаяся тем, что по меньшей одна из последовательностей XTEN содержит около 42 аминокислот, около 72 аминокислот, около 108 аминокислот, около 144 аминокислот, около 180 аминокислот, около 216 аминокислот, около 252 аминокислот, около 288 аминокислот, около 324 аминокислот, около 360 аминокислот, около 396 аминокислот, около 432 аминокислот, около 468 аминокислот, около 504 аминокислот, около 540 аминокислот, около 576 аминокислот, около 612 аминокислот, около 624 аминокислот, около 648 аминокислот, около 684 аминокислот, около 720 аминокислот, около 756 аминокислот, около 792 аминокислот, около 828 аминокислот, около 836 аминокислот, около 864 аминокислот, около 875 аминокислот, около 912 аминокислот, около 923 аминокислот, около 948 аминокислот, около 1044 аминокислот, около 1140 аминокислот, около 1236 аминокислот, около 1318 аминокислот, около 1332 аминокислоты, около 1428 аминокислот, около 1524 аминокислот, около 1620 аминокислот, около 1716 аминокислот, около 1812 аминокислот, около 1908 аминокислот или около 2004 аминокислот.
10. Химерная молекула по любому из пп.1-9, отличающаяся тем, что по меньшей мере одна последовательность XTEN выбрана из АЕ42, АЕ72, АЕ864, АЕ576, АЕ288, АЕ144, AG864, AG576, AG288, AG144, SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 47; SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 48; SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 44 и SEQ ID NO: 42.
11. Химерная молекула по любому из пп.1-10, отличающаяся тем, что линкер VWF содержит указанную область а2, которая содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на около 90, около 95 или на 100% идентичную участку от Glu720 по Arg740, соответствующим полноразмерному FVIII, причем область а2 способна расщепляться тромбином.
12. Химерная молекула по п.11, отличающаяся тем, что линкер VWF содержит область а2, содержащую SEQ ID NO: 4.
13. Химерная молекула по любому из пп.1-12, отличающаяся тем, что (а) домен D' белка VWF содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на около 90, около 95, около 96, около 97, около 98, около 99 или на 100% идентичную аминокислотам 764-866 последовательности SEQ ID NO: 2; (b) домен D3 белка VWF содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на около 90, около 95, около 96, около 97, около 98, около 99 или на 100% идентичную аминокислотам 8671240 последовательности SEQ ID NO: 2; или как (а), так и (b).
14. Химерная молекула по любому из пп.1-13, отличающаяся тем, что последовательность белка VWF содержит аминокислоты 764-1240 последовательности SEQ ID NO: 2.
15. Химерная молекула по п.14, отличающаяся тем, что белок VWF дополнительно содержит домен VWF, выбранный из группы, состоящей из домена D1, домена D2, доменов D1 и D2, домена А1, домена А2, домена A3, домена D4, домена В1, домена В2, домена В3, домена С1, домена С2, домена CK, одного или более их фрагментов и любых их комбинаций.
16. Химерная молекула по любому из пп.1-15, отличающаяся тем, что белок VWF состоит из: (1) доменов D' и D3 VWF или их фрагментов; (2) доменов D1, D' и D3 VWF или их фрагментов; (3) доменов D2, D' и D3 VWF или их фрагментов; (4) доменов D1, D2, D' и D3 VWF или их фрагментов; или (5) доменов D1, D2, D', D3 и A1 VWF или их фрагментов.
17. Химерная молекула по любому из пп.1-16, отличающаяся тем, что гетерологичный фрагмент (H1) содержит константную область иммуноглобулина или ее участок; тем, что второй гетерологичный фрагмент (Н2) содержит константную область иммуноглобулина или ее участок; или тем, что H1 и Н2 оба содержат константную область иммуноглобулина.
18. Химерная молекула по п.16, отличающаяся тем, что первый гетерологичный фрагмент (H1) содержит Fc-область; тем, что второй гетерологичный фрагмент (Н2) содержит Fc-область; или тем, что H1 и Н2 оба содержат Fc-область.
19. Химерная молекула по любому из пп.5 и 8-18, отличающаяся тем, что первый гетерологичный фрагмент (H1) представляет собой Fc-область и второй гетерологичный фрагмент (Н2) представляет собой Fc-область, причем H1 и Н2 ассоциированы друг с другом с помощью ковалентной связи.
20. Полинуклеотид, кодирующий химерную молекулу по любому из пп.1-19 или комплементарную ей последовательность.

-