BR122023020301B1

BR122023020301B1 - Uso de uma proteína quimérica compreendendo uma proteína fviii

Info

Publication number: BR122023020301B1
Application number: BR122023020301-1A
Authority: BR
Inventors: Ekta SETH CHHABRA; Tongyao Liu; Robert T. Peters; John Kulman
Original assignee: Bioverativ Therapeutics Inc
Priority date: 2014-01-10
Filing date: 2015-01-09
Publication date: 2024-05-21

Abstract

USO DE UMA PROTEÍNA QUIMÉRICA COMPREENDENDO UMA PROTEÍNA FVIII. A presente invenção proporciona uma proteína quimérica compreendendo um primeiro polipeptídeo que compreende uma proteína FVIII e uma primeira região constante de Ig, ou uma porção sua, e um segundo polipeptídeo que compreende uma proteína VWF que compreende os domínios D' e D3 de VWF, uma sequência XTEN com menos do que 288 aminoácidos de comprimento e uma segunda região constante de Ig, ou uma porção sua, onde o primeiro polipeptídeo e o segundo polipeptídeo estão associados entre si. A invenção inclui também nucleotídeos, vetores, células hospedeiras e métodos de uso de proteínas quiméricas.

Description

REFERÊNCIA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIA ENVIADA ELETRONICAMENTE

[0001] O conteúdo da sequência submetido eletronicamente lista gem no arquivo de texto ASCII (Nome: 2159_441PC02_SequenceLis- ting_ST25.txt; Tamanho: 823.500 bytes e Data de criação: 09 de janeiro de 2015) é aqui incorporado por referência na sua totalidade.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0002] Hemofilia A é um distúrbio hemorrágico causado por defeitos no gene da codificação do fator VIII (de FVIII) de coagulação e afeta 12 em 10.000 nascimentos do sexo masculino. Graw et al, Nat. Rev. Genet. 6(6): 488-501 (2005). Pacientes afetados com hemofilia do tipo A podem ser tratados com infusão de FVIII purificado ou produzido de forma recombinante. Todos os produtos de FVIII comercialmente disponíveis, no entanto, são conhecidos por terem uma meia-vida de aproximadamente 8-12 horas, que exige a administração intravenosa frequente para os pacientes. Ver Weiner M.A. e Cairo, M.S, Pediatric Hematology Secrets, Lee, M.T, 12. Disorders of Coagulation Elsevier Health Sciences, 2001; Lillicrap, D. Thromb. Res. 122 Suppl 4:S2-8 (2008). Além disso, uma série de abordagens têm sido tentada a fim de ampliar a meia vida de FVIII. Por exemplo, as abordagens em desen-volvimento para estender a meia-vida dos fatores de coagulação incluem peguilação, glicopeguilação e conjugação com albumina. Ver Dumont et al, Blood. 119 (13): 3024-3030 (Publicado on-line em janeiro 13, 2012). Independentemente da engenharia de proteína usada, no entanto, os produtos de FVIII agindo por muito tempo atualmente em de- senvolvimento têm meias-vidas melhoradas -, mas apenas a aproximadamente 1,5 a 2 horas nos modelos animais pré-clínicos. Veja id. Os resultados consistentes foram demonstrados em humanos, por exemplo, rFVIIIFc foi relatado como melhorando meia-vida em até 1,7 vezes em comparação a ADVATE® em pacientes com hemofilia A Veja Id. Portanto, os aumentos da meia-vida, apesar de melhorias pequenas, podem indicar a presença de outros fatores limitantes de T1/2. Ver Liu, T. et al, 2007 ISTH meeting, abstract #P-M-035; Henrik, A. et al, 2011 ISTH meeting, abstract #P=MO-181; Liu, T. et al, 2011 ISTH meeting abstract #P-WE-131.

[0003] Fator de plasma de von Willebrand (VWF) tem uma meia- vida de aproximadamente 16 horas (variando de 13 a 18 horas) Goude- mand J et al. J Thromb Haemost 2005;3:2219-27. A meia-vida do VWF pode ser afetada por uma série de fatores: padrão de glicosilação, A- DAMTS-13 (uma desintegrina e metaloprotease com motivo trombos- pondina -13) e várias mutações no VWF.

[0004] No plasma, 95-98% de FVIII circula em um complexo não covalente apertado com VWF completo. A formação deste complexo é importante para a manutenção dos níveis plasmáticos adequados de FVIII in vivo. Lenting et al, Blood. 92(11): 3983-96 (1998); Lenting et al, J. Thromb. Haemost. 5 (7): 1353-1360 (2007). O de FVIII completo do tipo selvagem principalmente está presente como um heterodímero tendo uma cadeia pesada (200kd MW) e uma cadeia leve (73kd MW). Quando de FVIII é ativado devido à proteólise em posições 372 e 740 da cadeia pesada e na posição 1689 na cadeia leve, o VWF ligado ao de FVIII é removido do de FVIII ativado. O de FVIII ativado, juntamente com o fator IX ativado, cálcio e fosfolipídios ("complexo tenase"), induz a ativação do fator X, gerando grandes quantidades de trombina. A trombina, por sua vez então cliva fibrinogênio para formar os monôme- ros de fibrina solúvel, que então espontaneamente polimerizam para formar o polímero solúvel em fibrina. Trombina também ativa o fator XIII, que, juntamente com o cálcio, serve para reticular e estabilizar o polímero solúvel em fibrina, formando fibrina (insolúvel) reticulada. O de FVIII ativado é limpo rapidamente da circulação por proteólise.

[0005] Devido à frequente dosagem e inconveniência causada pelo esquema posológico, ainda há uma necessidade de desenvolver produtos de FVIII exigindo administração menos frequente, ou seja, um produto de FVIII que tem uma meia-vida mais longa do que a limitação de meia-vida de 1,5 a 2 vezes.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0006] A presente invenção fornece proteína quimérica, que com preende (i) um primeiro polipeptídio que compreende uma proteína Fator VIII ("FVIII") fundida a uma primeira região constante de imunoglo- bulina ("Ig") ou uma porção desta e (ii) um segundo polipeptídio que compreende uma proteína de fator de von Willebrand ("VWF") que compreende um domínio D' e um domínio D3 da VWF fundido a uma segunda região constante de Ig ou uma porção desta por uma sequência de XTEN entre elas, onde a sequência de XTEN contém menos do que 288 resíduos de aminoácidos e o primeiro polipeptídio está ligado ou associado ao segundo polipeptídio. Certas modalidades incluem a proteína quimérica, como aqui descrita em que a sequência de XTEN no segundo polipeptídio consiste em uma sequência de aminoácidos com um comprimento entre 12 aminoácidos e 287 aminoácidos.

[0007] Também é divulgada a proteína quimérica, como aqui des crita em que a proteína quimérica apresenta uma meia-vida maior em comparação a uma proteína de fusão correspondente que compreende o primeiro polipeptídio e o segundo polipeptídio, onde o segundo poli- peptídio da proteína de fusão compreende uma sequência de XTEN contendo pelo menos 288 aminoácidos. Algumas modalidades incluem a sequência de XTEN AE288, contendo pelo menos 288 aminoácidos. Em algumas modalidades AE288 é a SEQ ID N°: 8.

[0008] Também é divulgada a proteína quimérica como aqui des crita em que a sequência de XTEN do segundo polipeptídio contém cerca de 36, cerca de 42, cerca de 72 ou cerca de 144 aminoácidos. Em algumas modalidades a sequência de XTEN do segundo polipeptídio é selecionada dentre AE42, AE72, AE144, AG42, AG72 ou AG144.

[0009] Algumas modalidades incluem a proteína quimérica como a qui descrita em que a sequência de XTEN do segundo polipeptídio é selecionada aa partir de SEQ ID N°: 9, SEQ ID N°: 10, SEQ ID N°: 11, SEQ ID N°: 55; SEQ ID N°: 56; SEQ ID N°: 57; SEQ ID N°: 58; SEQ ID N°: 58; SEQ ID N°: 59; SEQ ID N°: 14; SEQ ID N°: 60; SEQ ID N°: 61; SEQ ID N°: 62; ou SEQ ID N°: 63.

[00010] Em certas modalidades o primeiro polipeptídio compreende ainda uma segunda sequência de XTEN que liga a proteína de FVIII com a primeira região constante de Ig ou uma sua porção. Também é divulgada a proteína quimérica como aqui descrita em que o primeiro polipeptídio compreende uma terceira sequência de XTEN que é inserida em um ou mais sítios de inserção na proteína de FVIII. Em algumas modalidades o primeiro polipeptídio compreende ainda uma segunda sequência de XTEN que é inserida em um ou mais sítios de inserção no interior da proteína de FVIII. Em certas modalidades o primeiro polipep- tídio compreende uma terceira sequência de XTEN que liga a proteína de FVIII com a primeira região constante de Ig ou uma sua porção.

[00011] Também é divulgada a proteína quimérica, como aqui descrita, em que a segunda sequência de XTEN, a terceira sequência de XTEN ou a segunda e terceira sequência de XTEN, são, cada, selecionadas independentemente selecionadas dentre AE42, AE72, AE864, AE576, AE288, AE144, AG864, AG576, AG288 e AG144. Em algumas modalidades a segunda sequência de XTEN, a terceira sequência de XTEN ou as segunda e terceira sequências XTEN são cada uma inde-pendentemente selecionadas a partir de SEQ ID N°: 8; SEQ ID N°: 9, SEQ ID N°: 10, SEQ ID N°: 11, SEQ ID N°: 17; SEQ ID N°: 54; SEQ ID N°: 19; SEQ ID N°: 16; SEQ ID N°: 18; SEQ ID N°: 15; SEQ ID N°: 55; SEQ ID N°: 56; SEQ ID N°: 57; SEQ ID N°: 58; SEQ ID N°: 59; SEQ ID N°: 14; SEQ ID N°: 60; SEQ ID N°: 61; SEQ ID N°: 62; ou SEQ ID N°: 63. Em certas modalidades a segunda sequência de XTEN, a terceira sequência de XTEN ou ambas as segunda e terceira sequências XTEN são cada uma independentemente AE288 ou AG288. Em algumas modalidades a sequência de XTEN no segundo polipeptídio é fundida com a segunda região constante de Ig ou uma porção da mesma através de um ligante. Em certas modalidades o ligante é um ligante clivável.

[00012] Algumas modalidades incluem a proteína quimérica, como aqui descrita em que o ligante é clivável a partir de uma protease selecionada dentre um fator XIa, fator XIIa, calicreína, fator VIIa, fator IXa, fator Xa, fator IIa (trombina) elastase 2, Granzima B, TEV enteroqui- nase, Protease 3C, Sortase A, MMP-12, MMP-13, MMP-17 e MMP-20. Em algumas modalidades o ligante é clivável por fator IIa (trombina).

[00013] Também divulgada é a proteína quimérica como aqui descrita em que o ligante compreende um ou mais sítios de clivagem que compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de RRRR (SEQ ID N°: 102), RKRRKR (SEQ ID N°: 103), RRRRS (SEQ ID N°: 104), TQSFNDFTR (SEQ ID N°: 1), SVSQTSKLTR (SEQ ID N°: 3), DFLAEGGGVR (SEQ ID N°: 4), TTKIKPR (SEQ ID N°: 5), LVPRG (SEQ ID N°: 6), ALRPR (SEQ ID N°: 7), KLTRAET (SEQ ID N°: 121), DFTRVVG (SEQ ID N°: 122), TMTRIVGG (SEQ ID N°: 123), SPFRS- TGG (SEQ ID N°: 124), LQVRIVGG (SEQ ID N°: 125), PLGRIVGG (SEQ ID N°: 126), IEGRTVGG (SEQ ID N°: 127), LTPRSLLV (SEQ ID N°: 128), LGPVSGVP (SEQ ID N°: 129), VAGDSLEE (SEQ ID N°: 130), GPAGL- GGA (SEQ ID N°: 131), GPAGLRGA (SEQ ID N°: 132), APLGLRLR (SEQ ID N°: 133), PALPLVAQ (SEQ ID N°: 134) ENLYFQG (SEQ ID N°: 135), DDDKIVGG (SEQ ID N°: 136), LEVLFQGP (SEQ ID N°: 137), LPKTGSES (SEQ ID N°: 138), DKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIE- PRSFS (SEQ ID N°: 88) e IEPRSFS (SEQ ID N°: 194). Em algumas modalidades o ligante compreende TLDPRSFLLRNPNDKYEPFWE- DEEK (SEQ ID N°: 146). Em certas modalidades os sítios de clivagem compreendem uma sequência de aminoácidos LVPRG (SEQ ID N°: 6). Em outras modalidades o sítio de clivagem compreende uma sequência de aminoácidos IEPRSFS (SEQ ID N°: 194). Em ainda outras modalidades, o sítio de clivagem compreende uma sequência de aminoácidos IEPRSFS (SEQ ID N°: 194) em que o sítio de clivagem não é a região A2 de FVIII de comprimento total. Em algumas modalidades, o sítio de clivagem compreende um fragmento de uma região A2 de FVIII que compreende pelo menos a sequência IEPR (SEQ ID N°: 200). Em outras modalidades, o sítio de clivagem compreende um fragmento de uma re-gião A2 de FVIII que compreende pelo menos a sequência IEPR (SEQ ID N°: 200) em que o sítio de clivagem não é a região A2 de comprimento total. Em certas modalidades o sítio clivável é clivável em um ensaio de clivagem de trombina, como aqui proporcionados ou como conhecido na técnica.

[00014] Algumas modalidades incluem a proteína quimérica como aqui descrita em que a primeira região constante de Ig ou uma porção da mesma compreende uma região Fc primeira e/ou a segunda região constante de Ig ou uma porção da mesma compreende uma região Fc segunda. Em algumas modalidades a primeira região constante de Ig ou uma sua porção e a segunda região constante de Ig ou uma porção da mesma estendem a meia-vida da proteína quimérica. Em algumas modalidades o primeiro polipeptídio e o segundo polipeptídio são fundidos através de um ligante. Em algumas modalidades o primeiro polipep- tídio e o segundo polipeptídio são fundidos através de um ligante pro- cessável. Em algumas modalidades a primeira região constante de Ig ou uma sua porção está associada com a segunda região constante de Ig ou uma sua porção. Em certas modalidades a primeira região constante de Ig ou uma sua porção está associada com a segunda região constante de Ig ou uma porção da mesma por uma ligação covalente. Em algumas modalidades a ligação covalente é uma ligação de dissul- fureto.

[00015] Também é divulgada a proteína quimérica compreendendo cada uma das seguintes fórmulas (a)-(hh): (a) FVIII-F1:F2-L2-X-L1-V; (b) FVIII-F1:V-L1-X-L2-F2; (c) F1-FVIII:F2-L2-X-L1-V; (d) F1-FVIII:V-L1-X-L2-F2; (e) FVIII-X2-F1:F2-L2-X1-L1-V; (f) FVIII-X2-F1:V-L1-X1-L2-F2; (g) FVIII(X2)-F1:F2-L2-X1-L1-V; (h) FVIII(X2)-F1:V-L1-X1-L2-F2; (i) F1-X2-F1:F2-L2-X1-L1-V; (j) F1-X2-F1:V-L1-X1-L2-F2; (k) V-L1-X-L2-F2-L3-FVIII-L4-F1; (l) V-L1-X-L2-F2-L3-F1-L4-FVIII; (m) F1-L4-FVIII-L3-F2-L2-X-L1-V; (n) FVIII-L4-F1-L3-F2-L2-X-L1-V; (o) FVIII-L4-F1-L3-V-L1-X-L2-F2; (p) FVIII-L4-F1-L3-F2-L2-X-L1-V; (q) F2-L2-X-L1-V-L3-F1-L4-FVIII; (r) F2-L2-X-L1-V-L3-FVIII-L4-F1; (s) V-L1-X1-L2-F2-L3-FVIII(X2)-L4-F1; (t) V-L1-X1-L2-F2-L3-F1-L4-FVIII(X2); (u) F1-L4-FVIII(X2)-L3-F2-L2-X1-L1-V; (v) F-L4-FVIII(X2)-L3-V-L1-X1-L2-F2; (w) FVIII(X2)-L4-F1-L3-V-L1-X1-L2-F2; (x) FVIII(X2)-L4-F1-L3-F2-L2-X1-L1-V; (y) F2-L2-X1-L1-V-L3-F1-L4-FVIII(X2); (z) F2-L2-X1-L1-V-L3-FVIII(X2)-L4-F1; (aa) V-L1-X2-L2-F2-L3-FVIII-L4-X2-L5-F1; (bb) V-L1-X2-L2-F2-L3-F1-L5-X2-L4-FVIII; (cc) F1-L5-X2-L4-FVIII-L3-F2-L2-X2-L1-V; (dd) F1-L5-X2-L4-FVIII-L3-V-L1-X2-L2-F2; (ee) FVIII-L5-X2-L4-F2-L3-V-L1-X1-L2-F1; (ff) FVIII-L5-X2-L4-F2-L3-F1-L2-X1-L1-V; (gg) F1-L2-X1-L1-V-L3-F2-L4-X2-L5-FVIII; ou (hh) F1-L2-X1-L1-V-L3-FVIII-L5-X2-L4-F2; em que V é uma proteína VWF, que compreende um domínio D' e um domínio D3, X ou X1 é uma primeira sequência de XTEN que contém menos 288 aminoácidos, X2 é uma segunda sequência de XTEN, FVIII compreende uma proteína de FVIII, FVIII(X2) compreende uma proteína de FVIII com uma segunda sequência de XTEN inserida em um ou mais sítios de inserção no interior da proteína de FVIII, F1 é uma primeira região constante de Ig ou uma sua porção, F2 é uma segunda região constante de Ig ou uma porção da mesma, L1, L2, L3, L4 ou L5 é um ligante opcional, (-) é uma ligação peptídica; e (:) é uma ligação covalente ou uma ligação não covalente.

[00016] Algumas modalidades incluem a proteína quimérica como aqui descrita em que o X ou X1 consiste em uma sequência de aminoá- cidos de comprimento compreendido entre 12 aminoácidos e 287 ami- noácidos.

[00017] Em certas modalidades a proteína quimérica como aqui descrita apresenta uma meia-vida mais longa em comparação com uma proteína quimérica correspondente compreendendo a fórmula exceto que X ou X1 é AE288. Em algumas modalidades AE288 é a SEQ ID N°: 8.

[00018] Algumas modalidades incluem a proteína quimérica como aqui descrita em que o X ou X1 na fórmula contém cerca de 36, cerca de 42, cerca de 72 ou cerca de 144 aminoácidos. Em certos enquadramentos, o X ou X1 na fórmula é selecionado a partir de AE42, AE72, AE144, AG42, AG72 ou AG144. Em algumas modalidades o X ou X1 na fórmula é selecionado a partir de SEQ ID N°: 9, SEQ ID N°: 10, SEQ ID N°: 11, SEQ ID N°: 55; SEQ ID N°: 56; SEQ ID N°: 57; SEQ ID N°: 58; SEQ ID N°: 59; SEQ ID N°: 14; SEQ ID N°: 60; SEQ ID N°: 61; SEQ ID N°: 62; ou SEQ ID N°: 63. Em certas modalidades o X2 compreende uma sequência de aminoácidos com um comprimento de pelo menos cerca de 36 aminoácidos, pelo menos cerca de 42 aminoácidos, pelo menos cerca de 144 aminoácidos, pelo menos cerca de 288 aminoácidos, pelo menos cerca de 576 aminoácidos ou pelo menos cerca de 864 aminoá- cidos. Em certas modalidades X2 é selecionado a partir de AE42, AE72, AE864, AE576, AE288, AE144, AG864, AG576, AG288 e AG144. Em algumas modalidades X2 é selecionado a partir de SEQ ID N°: 8; SEQ ID N°: 9; SEQ ID N°: 10; SEQ ID N°: 11; SEQ ID N°: 17; SEQ ID N°: 54; SEQ ID N°: 19; SEQ ID N°: 16; SEQ ID N°: 18; SEQ ID N°: 15; SEQ ID N°: 55; SEQ ID N°: 56; SEQ ID N°: 57; SEQ ID N°: 58; SEQ ID N°: 59; SEQ ID N°: 14; SEQ ID N°: 60; SEQ ID N°: 61; SEQ ID N°: 62; ou SEQ ID N°: 63. Em certas modalidades X2 é AE288 ou AG288.

[00019] Também é divulgada a proteína quimérica como aqui descrita, compreendendo X ou X1 e/ou X2 que apresenta uma meia-vida mais longa em comparação com a proteína quimérica que não compreende X ou X1 e/ou X2. Em algumas modalidades, o L1 e/ou L2 é um ligante clivável. Em certas modalidades, L4 e/ou L5 é um ligante clivável. Em algumas modalidades o ligante é clivável a partir de uma protease selecionada dentre um fator XIa, fator XIIa, calicreína, fator VIIa, fator IXa, fator Xa, fator IIa (trombina) elastase 2, Granzima B, TEV entero- quinase, Protease 3C, Sortase A, MMP-12, MMP-13, MMP-17 e MMP- 20. Em algumas modalidades o ligante é clivável por fator IIa (trombina).

[00020] Algumas modalidades incluem a proteína quimérica como aqui descrita em que o ligante compreende um ou mais sítios de clivagem que compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de RRRR (SEQ ID N°: 102), RKRRKR (SEQ ID N°: 103), RRRRS (SEQ ID N°: 104), TQSFNDFTR (SEQ ID N°: 2), SVSQTSKLTR (SEQ ID N°: 3), DFLAEGGGVR (SEQ ID N°: 4), TTKIKPR (SEQ ID N°: 5), LVPRG (SEQ ID N°: 6), ALRPR (SEQ ID N°: 7), KLTRAET (SEQ ID N°: 121), DFTRVVG (SEQ ID N°: 122), TMTRIVGG (SEQ ID N°: 123), SPFRS- TGG (SEQ ID N°: 124), LQVRIVGG (SEQ ID N°: 125), PLGRIVGG (SEQ ID N°: 126), IEGRTVGG (SEQ ID N°: 127), LTPRSLLV (SEQ ID N°: 128), LGPVSGVP (SEQ ID N°: 129), VAGDSLEE (SEQ ID N°: 130), GPAGL- GGA (SEQ ID N°: 131), GPAGLRGA (SEQ ID N°: 132), APLGLRLR (SEQ ID N°: 133), PALPLVAQ (SEQ ID N°: 134) eNLYFQG (SEQ ID N°: 135), DDDKIVGG (SEQ ID N°: 136), LEVLFQGP (SEQ ID N°: 137) e LPKTGSES (SEQ ID N°: 138). Em algumas modalidades o ligante compreende TLDPRSFLLRNPNDKYEPFWEDEEK (SEQ ID N°: 146). Em certas modalidades o ligante compreende uma sequência de aminoáci- dos LVPRG (SEQ ID N°: 6). Em algumas modalidades o ligante compreende uma região A1 de FVIII, uma região A2 de FVIII, uma região A3 de FVIII ou qualquer combinação das mesmas. Em certas modalidades o ligante compreende um fragmento da região A2 de FVIII. O fragmento da região A2 pode em alguns casos, compreender a sequência DKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID N°: 88). Em ainda outras modalidades, um fragmento menor da região A2 de FVIII pode ser utilizado, incluindo um fragmento possuindo a sequência IE- PRSFS (SEQ ID N°: 194). Em uma modalidade particular, o ligante com-preende a sequência de aminoácidos IEPRSFS (SEQ ID N°: 194). Em uma outra modalidade, o ligante compreende a sequência de aminoáci- dos IEPRSFS (SEQ ID N°: 194) em que o ligante não é a região A2 de comprimento total de FVIII.

[00021] Também é divulgada a proteína quimérica como aqui descrita em que a região A2 de FVIII compreende uma sequência de ami- noácidos pelo menos cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95% ou 100% idêntica a qualquer ISDKNTGDYYEDSYEDISAYLL- SKNNAIEPRSFS (SEQ ID N°: 106) ou DKNTGDYYEDSYEDISAYLL- SKNNAIEPRSFS (SEQ ID N°: 88). Em algumas modalidades a região A1 compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95% ou 100% idêntica a ISMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSV (SEQ ID N°: 107). Em certas modalidades a região A3 compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95% ou 100% idêntica a ISEITRTTLQSDQEE- IDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQ (SEQ ID N°: 108). Em algumas modalidades F1 compreende uma região Fc primeira e/ou F2 compreende uma região Fc segunda.

[00022] Algumas modalidades incluem a proteína quimérica como aqui descrita em que a proteína quimérica que compreende F1 e F2 apresenta uma meia-vida mais longa em comparação com a proteína quimérica não comparando o F1 e F2. Em certos enquadramentos, L3 representa um ligante processável. Em algumas modalidades a proteína VWF está associada com a proteína de FVIII por uma ligação não covalente. Em algumas modalidades a meia-vida da proteína quimérica é alargada em relação a uma proteína de FVIII sem a proteína VWF e/ou a sequência de XTEN ou em comparação com FVIII do tipo selvagem. Em certas modalidades a meia-vida da proteína quimérica é estendida pelo menos aproximadamente 1,5 vezes, pelo menos aproximadamente 2 vezes, pelo menos aproximadamente 2,5 vezes, pelo menos aproximadamente 3 vezes, pelo menos aproximadamente 4 vezes, pelo menos aproximadamente 5 vezes, pelo menos aproximadamente 6 vezes, pelo menos aproximadamente 7 vezes, pelo menos aproximadamente 8 vezes, pelo menos aproximadamente 9 vezes, pelo menos aproximadamente 10 vezes, pelo menos aproximadamente 11 vezes ou pelo menos aproximadamente 12 vezes mais do que a proteína de FVIII sem a proteína VWF ou a sequência de XTEN ou do que a FVIII de tipo selvagem.

[00023] Também é divulgada a proteína quimérica como aqui descrita em que a meia-vida da proteína quimérica é de pelo menos cerca de 17 horas, pelo menos cerca de 18 horas, pelo menos cerca de 19 horas, pelo menos cerca de 20 horas, pelo menos cerca de 21 horas, pelo menos, cerca de 22 horas, pelo menos cerca de 23 horas, pelo menos cerca de 24 horas, pelo menos, cerca de 25 horas, pelo menos cerca de 26 horas, pelo menos cerca de 27 horas, pelo menos cerca de 28 horas, pelo menos cerca de 29 horas, pelo menos aproximadamente 30 horas, pelo menos cerca de 31 horas, pelo menos, cerca de 32 horas, pelo menos cerca de 33 horas, pelo menos, cerca de 34 horas, pelo menos cerca de 35 horas, pelo menos cerca de 36 horas, pelo menos cerca de 48 horas, pelo menos cerca de 60 horas, pelo menos cerca de 72 horas, pelo menos cerca de 84 horas, pelo menos cerca de 96 horas ou pelo menos cerca de 108 horas. Em algumas modalidades da meia- vida da proteína quimérica é cerca de 40 horas em camundongos HemA. Em certas modalidades, a proteína VWF não se liga substancialmente a um receptor de depuração de VWF. Em algumas modalidades a proteína de VWF é capaz de proteger a proteína de FVIII a partir de um ou mais clivagens de protease, proteger a proteína de FVIII da ativação, estabilizar a cadeia pesada e/ou a cadeia leve da proteína de FVIII ou prevenir a eliminação da proteína de FVIII por um ou mais receptores removedores.

[00024] Algumas modalidades incluem a proteína quimérica como aqui descrita em que as proteínas VWF inibem ou impede VWF endógeno de se ligar à proteína de FVIII pela blindagem ou bloqueando um sítio de ligação de VWF na proteína de FVIII. Em algumas modalidades o sítio de ligação de VWF está localizado no domínio A3 ou o domínio C2 da proteína de FVIII ou ambos os domínios A3 e C2. Em algumas modalidades o sítio de ligação de VWF compreende a sequência de a- minoácidos correspondente aos aminoácidos 1669 a 1689 e 2303-2332 da SEQ ID N°: 65. Em algumas modalidades a primeira região constante de Ig ou uma sua porção e a segunda região constante de Ig ou uma porção da mesma são idênticas ou diferentes. Em certas modalidades a proteína de FVIII está ligada a e/ou inserido com pelo menos duas sequências XTen, pelo menos três sequências de XTen, pelo menos quatro sequências XTen, pelo menos cinco sequências XTen ou, pelo menos, seis sequências XTen.

[00025] Também é divulgada a proteína quimérica aqui descrita em que a proteína de FVIII compreende um ou mais domínios de FVIII selecionados dentre um domínio A1, região acídica a1, um domínio A2, região acídica A2, domínio B, domínio A3, região acídica A3, domínio C1, domínio C2, um ou mais de seus fragmentos e combinações.

[00026] Também é divulgada a proteína quimérica como descrita neste documento em que os um ou mais sítios de inserção da proteína de FVIII estão localizados dentro de um ou mais domínios da proteína de FVIII selecionados dentre domínio A1, região ácida a1, o domínio A2, região ácida a2, o domínio A3, o domínio B, o domínio C1, o domínio C2 e quaisquer combinações destes ou entre um ou mais domínios da proteína de FVIII selecionados do grupo constituído por domínio a1 e região ácida a1, região ácida a1 e domínio A2, domínio A2 e região ácida a2, região ácida a2 e domínio B, domínio B e domínio A3, domínio A3 e domínio C1, domínio C1 e domínio C2 e quaisquer combinações destes ou entre dois domínios da proteína de FVIII selecionados na região ácida A1 e domínio a1, região ácida a1 e domínio A2, domínio A2 e região ácida a2, região ácida a2 e domínio B, domínio B e domínio A3, o domínio A3 e domínio C1, domínio C1 e domínio C2 e quaisquer combinações. Em algumas modalidades um ou mais sítios de inserção na proteína de FVIII são um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo dos resíduos de aminoácido na Tabela 7, Tabela 8, Tabela 9 e na Tabela 10. Em certas modalidades os sítios de inserção na proteína de FVIII estão localizados imediatamente a jusante do aminoácido 745 correspondente à proteína madura FVIII (SEQ ID N°: 65). Em algumas modalidades os sítios de inserção na proteína de FVIII estão loca-lizados imediatamente a jusante do resíduo 1656 e resíduo 1900 cor-respondente à proteína madura FVIII (SEQ ID N°: 65). Em algumas mo-dalidades os sítios de inserção na proteína de FVIII são imediatamente a jusante de resíduos 26, 1656 e 1900 correspondentes à proteína madura de FVIII (SEQ ID N°: 65). Em certas modalidades os sítios de inserção na proteína de FVIII são imediatamente a jusante dos resíduos 403 e 745 correspondentes à proteína madura FVIII (SEQ ID N°: 65). Em algumas modalidades os sítios de inserção na proteína de FVIII são imediatamente a jusante dos resíduos 745 e 1900 correspondentes à proteína madura FVIII (SEQ ID N°: 65). Em certas modalidades os sítios de inserção na proteína de FVIII são imediatamente a jusante dos resíduos 18 e 745 correspondentes à proteína madura FVIII (SEQ ID N°: 65). Em algumas modalidades a proteína de FVIII é uma isoforma de FVIII de cadeia dupla. Em algumas modalidades a proteína de FVIII é uma isoforma de cadeia única de FVIII. Em certas modalidades a proteína de FVIII compreende o domínio B ou uma porção do mesmo. Em algumas modalidades, a proteína de FVIII é o FVIII de domínio B dele- tado de SQ.

[00027] Algumas modalidades incluem a proteína quimérica como aqui descrita em que a isoforma de cadeia única de FVIII contém substituição de pelo menos um aminoácido em um resíduo correspondente ao resíduo 1648, resíduo 1645 ou ambos os resíduos correspondentes ao polipeptídio de Fator VIII de comprimento total madura (SEQ ID N°: 65) ou resíduo 754, resíduo 751 ou ambos os resíduos de fator VIII de BDD de SQ (SEQ ID N°: 67). Em certas modalidades, a substituição de aminoácido é um aminoácido diferente de arginina. Em algumas modalidades a isoforma de FVIII de cadeia dupla compreende uma primeira cadeia que compreende uma cadeia pesada de FVIII e uma segunda cadeia que compreende uma cadeia leve de FVIII, onde a cadeia pesada e a cadeia leve estão associadas entre si por uma ligação metálica. Em certas modalidades o domínio D' compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica aos aminoácidos 764-866 da SEQ ID N°: 21. Em algumas modalidades o domínio D3 compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica aos a- minoácidos 867-1240 da SEQ ID N°: 21. Em certas modalidades a proteína de VWF é um monômero.

[00028] Também é divulgada a proteína quimérica como aqui descrita, a qual compreende pelo menos duas proteínas VWF, pelo menos três proteínas VWF, pelo menos quatro proteínas VWF, pelo menos cinco VWF proteínas ou pelo menos seis proteínas VWF. Em certas modalidades a proteína VWF compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica aos a- minoácidos 764-1240 da SEQ ID N°: 21. Em algumas modalidades a proteína VWF consiste essencialmente de ou consiste em aminoácidos 764-1240 da SEQ ID N°: 21. Em determinadas modalidades, a proteína VWF contém pelo menos uma substituição do aminoácido em um resíduo correspondente ao resíduo 1099, resíduo 1142 ou ambos os resíduos 1099 e 1142 da SEQ ID N°: 21. Em algumas modalidades a proteína VWF contém um aminoácido diferente de cisteína substituído por um resíduo correspondente ao resíduo 1099, resíduo 1142 ou ambos os resíduos 1099 e 1142 de SEQ ID N°: 21. Em certas modalidades, a proteína VWF compreende ainda o domínio D1, o domínio D2 ou os domínios D1 e D2 de VWF.

[00029] Algumas modalidades incluem a proteína quimérica como aqui descrita em que a proteína VWF compreende, adicionalmente, um domínio VWF selecionado do grupo que consiste no domínio A1, o domínio A2, o domínio A3, o domínio D4, o domínio B1, o domínio B2, o domínio B3, o domínio C1, o domínio C2, o domínio CK, um ou mais fragmentos destes e quaisquer combinações destes.

[00030] Também é divulgada a proteína quimérica como aqui descrita em que a proteína VWF consiste essencialmente de ou consiste de: (1) os domínios D' e D3 de VWF ou seus fragmentos; (2) os domínios D1, D' e D3 de VWF ou seus fragmentos; (3) os domínios D2, D' e D3 de VWF ou seus fragmentos; (4) os domínios D1, D2, D' e D3 de VWF ou seus fragmentos; ou (5) os domínios D1, D2, D', D3 e A1 de VWF ou seus fragmentos.

[00031] Algumas modalidades incluem a proteína quimérica como aqui descrita em que a proteína VWF compreende ainda um peptídeo de sinal de VWF ou FVIII, que está ligado operacionalmente à proteína VWF.

[00032] Também é divulgada uma proteína quimérica como aqui descrita em que um ou mais dos ligantes têm um comprimento de pelo menos cerca de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800 ou 2000 resíduos de aminoácidos. Em algumas modalidades um ou mais dos ligantes tem um comprimento de cerca de 1 a cerca de 2000 resíduos de aminoácidos. Em certas modalidades um ou mais dos ligantes compreendem um peptídeo gly/ser. Em algumas modalidades o peptídeo Gly/Ser tem uma fórmula de (Gli4Ser)n (SEQ ID N°: 94) ou S(Gly4Ser)n (SEQ ID N°: 164) em que n é um número inteiro positivo selecionado a partir do grupo que consiste em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 e 10. Em certas modalidades o ligante de (Gly4Ser)n é (Gly4Ser)3 (SEQ ID N°: 100) ou (Gli4Ser)4 (SEQ ID N°: 165). Em algumas modalidades o ligante compreende 20 aminoácidos, 35 aminoácidos, 48 aminoácidos, 73 aminoácidos ou 95 aminoácidos. Em certas modalidades o agente de ligação clivável é SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSLV- PRGSGG (SEQ ID N°: 166).

[00033] Em algumas modalidades, a proteína quimérica como aqui descrita é polissialilada, peguilada ou hesilada.

[00034] Também divulgada é a proteína quimérica como aqui descrita em que o primeiro polipeptídio compreende ser pelo menos cerca de 80%, 90%, 95%, 99% ou 100% idêntico a FVIII161 (SEQ ID N°: 69), FVIII169 (SEQ ID N°: 70), FVIII173 (SEQ ID N°: 72), FVIII195 (SEQ ID N°: 73), FVIII196 (SEQ ID N°: 74), FVIII199 (SEQ ID N°: 75), FVIII201 (SEQ ID N°: 76), FVIII203 ( SEQ ID N°: 77), FVIII204 (SEQ ID N°: 78), FVIII205 (SEQ ID N°: 79), FVIII266 (SEQ ID N°: 80), FVIII267 (SEQ ID N°: 81), FVIII268 (SEQ ID N°: 82 ), FVIII269 (SEQ ID N°: 83), FVIII271 (SEQ ID N°: 84), FVIII272 (SEQ ID N°: 85) ou FVIII282 (SEQ ID N°: 159) e o segundo polipeptídio compreende ser pelo menos cerca de 80%, 90%, 95%, 99% ou 100% idêntico a qualquer VWF057 (SEQ ID N°: 152) ou VWF059 (SEQ ID N°: 197). Em algumas modalidades, o primeiro poli-peptídio compreende FVIII169 (SEQ ID N°: 70) e o segundo polipeptídio compreende VWF057 (SEQ ID N°: 152). Em outras modalidades, o primeiro polipeptídio compreende FVIII169 (SEQ ID N°: 70) e o segundo polipeptídio compreende VWF059 (SEQ ID N°: 197). Em ainda outra modalidade, o primeiro polipeptídio compreende FVIII169 (SEQ ID N°: 70) e o segundo polipeptídio compreende VWF062 (SEQ ID N°: 199). Em algumas modalidades, a proteína quimérica é eficaz na prevenção e/ou paragem de hemorragias de um sujeito com essa necessidade.

[00035] Também é divulgado um polinucleotídeo ou um conjunto de polinucleotídeos que codificam a proteína quimérica, como aqui descrito. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo como aqui descrito compreende ainda uma cadeia de polinucleotídeo, que codifica PC5 ou PC7.

[00036] Algumas modalidades incluem um vector que compreende o polinucleotídeo, tal como aqui descrito e um ou mais promotores opera-cionalmente ligados ao polinucleotídeo ou o conjunto de polinucleotí- deos.

[00037] Em algumas modalidades o vector como aqui descrito compreende ainda um vector adicional, o qual compreende uma cadeia de polinucleotídeo codificando PC5 ou PC7.

[00038] Também é divulgada uma célula hospedeira que compreende o polinucleotídeo ou o vector como aqui descritos. Em algumas modalidades a célula hospedeira é uma célula de mamífero. Em certas modalidades a célula de mamífero é selecionada a partir de células HEK293, células CHO e células BHK.

[00039] Também é divulgada uma composição farmacêutica compreendendo a proteína quimérica, o polinucleotídeo, vector ou a célula hospedeira, como aqui descritos e um carreador farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades a proteína quimérica alargou meia-vida em comparação com a proteína de FVIII de tipo selvagem. Em certas modalidades a meia-vida da proteína quimérica é estendida pelo menos aproximadamente 1,5 vezes, pelo menos aproximadamente 2 vezes, pelo menos aproximadamente 2,5 vezes, pelo menos aproximadamente 3 vezes, pelo menos aproximadamente 4 vezes, pelo menos aproximadamente 5 vezes, pelo menos aproximadamente 6 vezes, pelo menos aproximadamente 7 vezes, pelo menos aproximadamente 8 vezes, pelo menos aproximadamente 9 vezes, pelo menos aproximadamente 10 vezes, pelo menos aproximadamente 11 vezes ou pelo menos aproximadamente 12 vezes mais do que a FVIII de tipo selvagem.

[00040] Algumas modalidades incluem a composição tal como aqui descrita em que a meia-vida da proteína quimérica é, pelo menos, de cerca de 17 horas, pelo menos cerca de 18 horas, pelo menos cerca de 19 horas, pelo menos cerca de 20 horas, pelo menos cerca de 21 horas, a menos cerca de 22 horas, pelo menos, cerca de 23 horas, pelo menos cerca de 24 horas, pelo menos, cerca de 25 horas, pelo menos cerca de 26 horas, pelo menos cerca de 27 horas, pelo menos cerca de 28 horas, pelo menos cerca de 29 horas, de pelo menos cerca de 30 horas, pelo menos cerca de 31 horas, pelo menos cerca de 32 horas, pelo menos cerca de 33 horas, pelo menos cerca de 34 horas, pelo menos cerca de 35 horas, pelo menos cerca de 36 horas, pelo menos cerca de 48 horas, pelo menos aproximadamente 60 horas, pelo menos cerca de 72 horas, pelo menos cerca de 84 horas, pelo menos cerca de 96 horas ou pelo menos cerca de 108 horas. Em algumas modalidades da meia-vida da proteína quimérica é cerca de 40 horas em camundongos HemA. Em algumas modalidades a composição tal como aqui descrita é administrada por uma via selecionada a partir do grupo consistindo de administração tópica, administração intraocular, administração parentérica, administração intratecal, administração subdural e administração oral. Em certas modalidades, a administração parentérica é administração intravenosa ou subcutânea.

[00041] Em algumas modalidades a composição tal como aqui descrita é utilizada para tratar uma doença ou condição de sangramento em um sujeito com necessidade disso. Em certas modalidades a doença ou condição de sangramento é selecionada a partir do grupo que consiste em um distúrbio de coagulação de sangramento, hemartrose, sangra- mento muscular, sangramento oral, hemorragia, hemorragia nos músculos, hemorragia oral, trauma, trauma capitis, sangramento gastrointestinal, hemorragia intracraniana, hemorragia intra-abdominal, hemorragia intratorácica, fratura óssea, sangramento do sistema nervoso central, sangramento no espaço retrofaríngeo, sangramento no espaço retroperitoneal e sangramento na bainha do iliopsoas e quaisquer de suas combinações. Em algumas modalidades é agendado que o sujeito se submeta a uma cirurgia. Em certas modalidades, o tratamento é profilático ou sob demanda.

[00042] É também revelado um método de prolongar ou aumentar a meia-vida da proteína quimérica em que o método compreende a adição de uma quantidade eficaz da proteína quimérica, o polinucleotídeo, vector, a célula hospedeira ou composição como aqui descrita a um sujeito em necessidade respectiva em que a proteína VWF, a sequência de XTEN, a primeira região constante de Ig ou uma porção respectiva e a segunda região constante de Ig ou uma porção respectiva aumentam a meia-vida da proteína quimérica.

[00043] Algumas modalidades incluem um método para tratar uma doença ou condição de sangramento em um sujeito com essa necessidade compreendendo a administração de uma quantidade eficaz da proteína quimérica, do polinucleotídeo, vetor, célula hospedeira ou composição como aqui descrito em que a doença ou distúrbio de sangramento é selecionado a partir do grupo que consiste em um distúrbio de coagulação de sangramento, hemartrose, sangramento muscular, sangra- mento oral, hemorragia, hemorragia nos músculos, hemorragia oral, trauma, trauma capitis, sangramento gastrointestinal, hemorragia intracranial, hemorragia intra-abdominal, hemorragia intratorácica, fratura óssea, sangramento de sistema nervoso central, sangramento no espaço retrofaríngeo, sangramento no espaço retroperitoneal e sangra- mento na bainha do iliopsoas. Em algumas modalidades o indivíduo é um animal. Em determinadas modalidades, o animal é um ser humano. Em algumas modalidades o indivíduo sofre de hemofilia A. Em certas modalidades, o tratamento é profiláctico ou sob demanda. Em algumas modalidades, a quantidade eficaz é de 0,1 μg/kg a 500 mg/kg.

[00044] Também é divulgado um método tal como aqui descrito em que a proteína quimérica, o polinucleotídeo, vector, a célula hospedeira ou a composição, como aqui descrito, é administrada por uma via selecionada a partir do grupo consistindo de administração tópica, administração intraocular, administração parentérica, administração intratecal, administração subdural e administração oral. Em certas modalidades, a administração parentérica é selecionada a partir do grupo constituído por administração intravenosa, administração subcutânea, administração intramuscular e administração intradérmica.

[00045] Algumas modalidades incluem um método de produção de uma proteína quimérica, que compreende transfectar uma ou mais células hospedeiras com o polinucleotídeo ou o vector, como aqui descrito e expressando a proteína quimérica na célula hospedeira. Em algumas modalidades, o método tal como aqui descrito compreende ainda o isolamento da proteína quimérica. Em certas modalidades a proteína quimérica é eficaz em parar e/ou prevenção de sangramento no sujeito.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS/FIGURAS

[00046] A Figura 1 mostra um diagrama esquemático de uma proteína quimérica compreendendo um primeiro polipeptídio que compreende uma proteína de FVIII (A1-A2-parcial ou B-A3-C1-C2 completo) fundida com uma região Fc em que uma XTEN é inserida em um sítio de inserção dentro da proteína de FVIII e um segundo polipeptídio que compreende uma proteína VWF compreendendo domínios D'D3, uma XTEN possuindo menos de 288 aminoácidos, um ligante clivável, trom- bina e uma segunda região Fc. Inserções XTEN na proteína de FVIII e/ou fusões com a proteína VWF estendem uma meia-vida da proteína quimérica através do aumento do raio hidrodinâmico e por bloqueio da depuração mediada pelo receptor. Os domínios D'D3 de VWF bloqueiam interação de FVIII endógeno com VWF estabilizam a proteína de FVIII e estendem uma meia-vida da proteína quimérica. Os domínios de Fc podem ligar covalentemente os domínios D'D3 com a proteína de FVIII e estender uma meia-vida da proteína quimérica através da via de reciclagem mediada por FcRn. O ligante de trombina clivável permite a liberação dos domínios D'D3 mediante a ativação de FVIII e garante o alinhamento correto entre o FVIII e os domínios D'D3 de VWF.

[00047] A Figura 2 mostra o sistema de expressão para os heterodí- meros FVIII-XTEN-Fc:D’D3-XTEN-Fc: um primeiro plasmídeo que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica cadeia simples FVIII-XTEN-Fc em que uma XTEN é inserida no domínio B; um segundo plasmídeo compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica D1D2D'D3-XTEN-Fc em que a sequência de XTEN compreende menos de 288 aminoácidos; e um terceiro plasmídeo que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica PACE, uma enzima de processamento de propeptídio. Quando os três polipeptídios são expressos a partir dos três plasmídeos, os domínios de propeptídio D1D2 de VWF podem ser processados a partir dos domínios D'D3 por processamento intracelular. O complexo resultante contém três produtos, sendo a primeira molécula heterodímeros de FVIII-XTEN/D'D3, a segunda molécula sendo um subproduto, homodímero de D'D3-XTEN-Fc e a terceira molécula sendo um outro subproduto, isto é, FVIII(XTEN)-Fc.

[00048] A Figura 3 mostra os efeitos aditivos de inserções XTEN sobre a extensão de meia-vida dos heterodímeros. FVIII169 compreende uma proteína de FVIII de domínio B deletado fundida com uma região Fc em que uma sequência de XTEN (por exemplo, AE288) é inserida no aminoácido 745 correspondente a FVIII de comprimento total madura. FVIII205 compreende uma proteína de FVIII de domínio B dele- tado fundida com uma região Fc em que uma sequência de XTEN (por exemplo, AE144) é inserida no aminoácido 18 correspondente para FVIII de comprimento total madura e uma outra sequência de XTEN (por exemplo, AE288) é inserida no aminoácido 745 correspondente a FVIII de comprimento total madura. VWF031 compreende um domínio D' e um domínio D3 de VWF fundido com uma região Fc por um ligante cli- vável de trombina (não XTEN). VWF034 compreende um domínio D' e um domínio D3 de VWF fundido com AE288 e uma região Fc. A meia- vida de FVIII169/VWF031 (triângulo invertido) é de 16,7 horas em camundongos HemA; a meia-vida de FVIII205/VWF031 (círculo) é 29,4 horas em camundongos HemA; e a meia-vida de FVIII169/VWF034 (quadrado) é 31,1 horas em camundongos HemA.

[00049] A Figura 4 mostra que XTEN de AE144 confere melhor extensão da meia-vida do que XTEN de AE288 quando inserida entre os domínios D'D3 de VWF e domínios de Fc. Por exemplo, enquanto que a meia-vida de VWF169/VWF034 (quadrado) é 31,1. horas em camundongos HemA, a meia-vida de FVIII169/VWF057 (círculo) é de 42 horas em camundongos HemA. VWF057 compreende domínios D'D3 de VWF fundidos com AE144 e uma região Fc.

[00050] A Figura 5 mostra que os domínios de Fc são necessários para a extensão de meia-vida dos heterodímeros de proteínas quiméricas. Quando a meia-vida de FVIII205/VWF031 (círculo) foi comparada em camundongos HemA com a de FVIII263/VWF050 (quadrado), que contém as mutações nos sítios de ligação de FcRn (IHH tripla mutação Fc) e, portanto, não pode ser reciclada através de via de FcRn, a meia- vida de FVIII263/VWF050 (23 horas) é mais curta do que a de VWF205/VWF031 (29,4 horas). Isto indica que as regiões Fc são necessárias para a extensão de uma meia-vida.

[00051] A Figura 6A mostra eficácia aguda semelhante de heterodí- meros FVIII-XTEN-Fc/D'D3-XTEN-FC comparativamente ao FVIII de domínio B deletado (SQ BDD FVIII) em modelo de clipe de cauda dos camundongos HemA. Os camundongos foram doseados a 75 IU/kg e a atividade foi medida pelo ensaio de aPTT. FVIII de SQ BDD de é mostrado como círculo enquanto FVIII169/VWF034 é mostrado como quadrado, FVIII169/VWF057 é mostrado como diamante e o veículo é mostrado como triângulo invertido. Os detalhes de construto de FVIII169, VWF034 e VWF057 são apresentados neste documento. A Figura 6B mostra uma comparação da eficácia aguda de FVIII169/VWF034 com FVIII de domínio B deletado (SQ BDD de FVIII) em camundongos HemA na dose de 37,5 IU/kg e a atividade foi medida pelo ensaio de TTPA. A perda de sangue mediana (uL) de camundongos em cada grupo de tratamento são indicadas pelas linhas horizontais, a perda de sangue (uL) em camundongos C57/BL6 é mostrada como triângulo oco; a perda de sangue (uL) após a dosagem de 37,5 IU/kg de rBDD-FVIII é mostrada como círculo oco; a perda de sangue (uL) após a dosagem de 37,5 IU/kg FVIII169/VWF034 é mostrada como um quadrado oco e a perda de sangue (uL) após a administração do veículo é mostrada como triângulo invertido.

[00052] As figuras 7A-B mostram que heterodímero rFVIII169/ VWF057 proporciona maior proteção aos camundongos HemA no Modelo de Sangramento de Transecção de Veia da Cauda. A Figura 7A mostra os dados de ressangramento em camundongos que receberam rFVIII169/VWF057 72 horas antes da lesão da cauda (quadrado), SQ BDD-FVIII 48 horas antes da lesão da cauda (diamante), FVIII de SQ BDD 24 horas antes da lesão da cauda (triângulo invertido) e veículo (círculo). A atividade foi medida pelo ensaio de TTPA. Eixo X mostra o tempo em horas e o eixo Y mostra a porcentagem dos Não Sangrado- res. A Figura 7B mostra os dados de sobrevivência correspondentes das quatro categorias dos camundongos mostrados na Figura 7A. Os camundongos que receberam 12 IU/kg de FVIII169/VWF057 72 horas antes da lesão da cauda demonstraram uma proteção semelhante em res- sangramento e sobrevivência em comparação com os camundongos que receberam tratamento FVIII de SQ BDD 24 horas antes da lesão da cauda.

[00053] A Figura 8A mostra os dados de ressangramento comparáveis em camundongos que receberam heterodímeros rFVIII-XTEN- Fc/D'D3-XTEN-Fc em 96 horas versus rBDD-FVIII em 24 horas antes da lesão. Os quadrados cheios mostram os dados de ressangramento em camundongos que receberam FVIII169/VWF034 24 horas antes da lesão; quadrados vazios mostram os dados de ressangramento em camundongos que recebera, FVIII169/VWF034 96 horas antes da lesão; diamantes cheios mostram os dados de ressangramento em camundongos que receberam FVIII169/VWF057 24 horas antes da lesão; diamante oco mostra os dados de ressangramento em camundongos que receberam FVIII169/VWF057 96 horas antes da lesão; círculos cheios mostram os dados de ressangramento em camundongos que receberam rBDD-FVIII 24 horas antes da lesão; círculos ocos mostram os da-dos de ressangramento em camundongos que receberam rBDD-FVIII 48 horas antes da lesão; e triângulo cheio mostra os dados de ressan- gramento em camundongos que receberam veículo. Eixo X mostra o tempo em horas e o eixo Y mostra a porcentagem dos Não Sangrado- res.

[00054] A Figura 8B mostra a curva de sobrevivência em camundongos que receberam heterodímeros rFVIII-XTEN-Fc/D'D3-XTEN-Fc em 96 horas versus rBDD-FVIII em 24 horas antes da lesão. Eixo X mostra o tempo em horas e o eixo y mostra a percentagem de sobrevivência. Os símbolos são os mesmos que a Figura 8A.

[00055] A Figura 9 mostra um diagrama de heterodímeros representativos de FVIII-VWF e construtos FVIII169, FVIII286, VWF057, VWF059 e VWF062. Por exemplo, construto de FVIII169 compreende uma proteína de FVIII de domínio B deletado com substituição de R1648A fundida com uma região Fc em que uma sequência de XTEN (por exemplo, AE288) é inserida no aminoácido 745 correspondente a FVIII de comprimento total madura (A1-A1-A2-A3-a2-288XTEN-A3-C1- C2-Fc). Construto de FVIII286 compreende uma proteína de FVIII de domínio B deletado com substituição de R1648 fundida com uma região Fc em que uma sequência de XTEN (por exemplo, AE288) é inserida no aminoácido 745 correspondente a FVIII de comprimento total madura, com a região a2 adicional no meio de FVIII e Fc (A1-A1-A2-A3-a2- 288XTEN-A3-C1-C2-A2-Fc). VWF057 é um construto de fusão de Fc- VWF que compreende um domínio D'D3 da proteína de VWF (com duas substituições de aminoácidos no domínio D’D3, ou seja, C336A e C379A) ligadas à região Fc através de um ligante de VWF, o qual compreende sítio de trombina de LVPRG ("LVPRG"; SEQ ID N°: 6) e ligante de GS ("GS") em que uma sequência de XTEN (ou seja, AE144) é inserida entre o domínio D'D3 e o ligante de VWF (D'D3-144XTEN- GS+LVPRG-Fc). VWF059 é um construto de fusão de Fc-VWF que compreende um domínio D'D3 da proteína de VWF (com duas substituições de aminoácidos no domínio D’D3, ou seja, C336A e C379A) ligado à região Fc por meio de uma região de ácido 2 (a2) de FVIII como um ligante de VWF em que uma sequência de XTEN (ou seja, AE144) é inserida entre o domínio D'D3 e o ligante de VWF. VWF062 é um construto de fusão de Fc-VWF, que compreende um domínio D'D3 da proteína de VWF (com duas substituições de aminoácidos no domínio D’D3, ou seja, C336A e C379A) ligado à região Fc em que uma sequência de XTEN (e, AE144) é inserida entre o domínio D'D3 e a região Fc (D'D3-144XTEN-Fc).

[00056] A Figura 10 mostra um diagrama esquemático representando construtos de heterodímero FVIII/VWF, por exemplo, FVIII169/ VWF057, FVIII169/VWF059, FVIII169/VWF059A e FVIII169/VWF073. A seta mostra o sítio onde um ligante opcional é adicionado para introduzir um sítio de clivagem de trombina. FVIII169/VWF057 tem um ligante compreendendo LVPRG (SEQ ID N°: 6). FVIII169/VWF059 tem um li- gante compreendendo a região a2 de FVIII (ou seja, ÉDKNTGDYYE- DSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSDKTH (SEQ ID N°: 106)). FVIII169/VWF059A tem um ligante compreendendo uma região A2 de FVIII truncada (ou seja, DKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS- DKTH (SEQ ID N°: 88)). FVIII169/VWF073 tem um ligante dentro do construto VWF073 (SEQ ID N°: 175) que compreende um fragmento da região a2 de FVIII que consiste em IEPRSFS (SEQ ID N°: 194).

[00057] As figuras 11A-C mostram imagens SDS-PAGE seguintes a digestão da trombina de FVIII169/VWF057 e um controle de FVIII-Fc. A Figura 11A mostra a coloração do gel de SDS-PAGE com um anticorpo anti-D3 (AB 96340). Setas destacam "LCFC:D'D3-XTEN-Fc", que é a FVIII169/VWF057 não clivada de comprimento total; e "D'D3-144 XTEN", que é o fragmento resultante após a clivagem pela trombina. A Figura 11B mostra a coloração do gel de SDS-PAGE com um anticorpo anti-HC (GMA012). Setas destacam a cadeia pesada de FVIII ("HC") e de domínio a2 de FVIII. A Figura 11C mostra a sobreposição dos painéis A e B. As amostras foram colhidas nos pontos de tempo indicados no topo de cada painel. Setas apontam para as proteínas relevantes.

[00058] As Figuras 12A-C mostram imagens de SDS-PAGE seguintes à digestão de trombina de FVIII169/VWF059. A Figura 12A mostra a coloração do gel de SDS-PAGE com um anticorpo anti-D3 (AB 96340). Setas destacam "LCFc:D'D3-XTEN-Fc", que é a FVIII169/ VWF059 não clivada de comprimento total; e "D'D3-144 XTEN", que é o fragmento resultante após a clivagem pela trombina. A Figura 12B mostra a coloração do gel de SDS-PAGE com um anticorpo anti-HC (GMA012). Setas destacam a FVIII169/VWF059 não clivada de comprimento total; D'D3- 144 XTEN-a3, que é o fragmento resultante após a clivagem pela trom- bina; e "A2", que é o domínio A2 de FVIII. A Figura 12C mostra a sobreposição dos painéis A e B. As amostras foram colhidas nos pontos de tempo indicados no topo de cada painel.

[00059] A Figura 13 mostra dados de eficácia aguda de camundongos HemA tratados com FVIII169/VWF059 (círculo) em comparação aos ratos HemA tratados com um controle BDD-FVIII (quadrado). Valor de perda de sangue foi medido seguinte a clipe de cauda. p = 0,9883.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[00060] A presente invenção é dirigida a uma proteína quimérica compreendendo dois polipeptídios, um primeiro polipeptídio que compreende uma proteína de FVIII fundida com uma primeira região constante de Ig e um segundo polipeptídio que compreende uma proteína de VWF fundida com uma segunda região constante de Ig ou uma porção da mesma por uma sequência de XTEN em que a sequência de XTEN contém menos de 288 aminoácidos.

I. Definições

[00061] Deve ser observado que a entidade do termo "um" ou "uma" refere-se a uma ou mais dessas entidades; por exemplo, "uma sequência de nucleotídeo" entende-se por representar um ou mais sequências de nucleotídeo. Como tal, os termos "um" (ou "uma"), "um ou mais" e "pelo menos um" podem ser usados de forma permutável neste documento.

[00062] Além disso, "e/ou", onde aqui utilizado, deve ser tomado como a divulgação específica de cada uma das duas características especificadas ou componentes com ou sem o outro. Assim, o termo "e/ou" como usado em uma frase como "A e/ou B" é aqui destinado a incluir "A e B", "A ou B", "A" (por si só) e "B " (sozinho). Da mesma forma, o termo "e/ou" como usado em uma frase como "A, B e/ou C" pretende abranger cada um dos seguintes aspectos: A, B e C; A, B ou C; A ou C; A ou B; B ou C; A e C; A e B; B e C; A (sozinho); B (sozinho); e C (sozinho).

[00063] Entende-se que onde quer que os aspectos sejam descritos neste documento com a linguagem "compreendendo", de outro modo, aspectos análogos descritos em termos de "consistindo em" e/ou "consistindo essencialmente em" também são fornecidos.

[00064] A menos que definido o contrário, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado como comumente compreendido por um versado na técnica ao qual é relatada esta divulgação. Por exemplo, o Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2a ed, 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3a ed, 1999, Academic Press. e o Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revisto, 2000, Oxford University Press, fornecem àquele versado na técnica um dicionário geral de muitos dos termos usados nesta divulgação.

[00065] Unidades, prefixos e símbolos são indicados em sua forma aceitada pelo Système International de Unites (SI). Os intervalos numéricos são inclusivos dos números que definem a faixa. A menos que indicado de outra forma, as sequências de aminoácidos são escritas da esquerda para a direita em orientação amino para carboxi. Os cabeçalhos aqui apresentados não são limitações dos vários aspectos da presente descrição, que pode ser obtida por referência da especificação como um todo. Assim, os termos definidos imediatamente abaixo estão mais completamente definidos por referência à especificação na sua totalidade.

[00066] O termo "cerca de" é aqui utilizado para significar aproximadamente, mais ou menos em torno de ou na região de. Quando o termo "aproximadamente" é usado em conjunto com um intervalo numérico ele modifica essa escala estendendo os limites acima ou abaixo dos valores numéricos estabelecidos. Em geral, o termo "cerca de" pode modificar um valor numérico acima e abaixo do valor estabelecido por uma variação de, por exemplo, 10 por cento, para cima ou para baixo (maior ou menor).

[00067] O termo "polinucleotídeo" ou nucleotídeo destina-se a abranger um ácido nucleico no singular, bem como os ácidos nucleicos no plural e se refere a uma molécula de ácido nucleico isolada ou construto, por exemplo, RNA mensageiro (mRNA) ou DNA plasmidial (pDNA). Em determinadas modalidades, um polinucleotídeo pode compreender uma ligação fosfodiéster convencional ou uma ligação não convencional (por exemplo, uma ligação de amida, como a encontrada em ácidos nuclei- cos de peptídeo (PNA)). O termo "ácido nucleico" refere-se a qualquer um ou mais segmentos de ácido nucleico, por exemplo, fragmentos de DNA ou de RNA, presentes em um polinucleotídeo. Por ácido nucleico ou polinucleotídeo "isolado" pretende-se uma molécula de ácido nu- cleico, DNA ou RNA, que foi removida de seu ambiente nativo. Por exemplo, um polinucleotídeo recombinante que codifica um polipeptídio de Fator VIII contido em um vetor é considerado isolado para as finalidades da presente invenção. Outros exemplos de um polinucleotídeo isolado incluem polinucleotídeos recombinantes mantidos em células hospedeiras heterólogas ou polinucleotídeos purificados (parcialmente ou substancialmente) de outros polinucleotídeos em solução. As moléculas de RNA isoladas incluem transcritos de RNA in vivo ou in vitro de polinucleotídeos da presente invenção. Os polinucleotídeos ou ácidos nucleicos isolados, de acordo com a presente invenção, incluem ainda essas moléculas produzidas sinteticamente. Além disso, um polinucleo- tídeo ou um ácido nucleico pode ser ou pode incluir um elemento regu- latório, como um promotor, sítio de ligação ao ribossomo ou sinais ter- minadores de transcrição.

[00068] Como usado aqui, uma "região de codificação" ou "sequência de código" é uma porção de polinucleotídeo que consiste em códons traduzíveis em aminoácidos. Embora um "códon de parada" (TAG, TGA ou TAA) não seja traduzido em um aminoácido ele pode ser considerado ser parte de uma região de codificação, mas quaisquer sequências flan- queadoras, por exemplo, promotores, sítios de ligação ao ribossomo, terminadores transcricionais, íntrons e similares, não são parte de uma região de codificação. Os limites de uma região da codificação normalmente são determinados por um códon de início no terminal 5', o terminal amino do polipeptídio resultante, de codificação e um códon de parada de tradução no terminal 3', codificando o terminal carboxil do poli- peptídio resultante. Duas ou mais regiões de codificação da presente invenção podem estar presentes em um único construto de polinucleo- tídeo, por exemplo, em um único vetor ou em construtos de polinucleo- tídeos separados, por exemplo em vetores separados (diferentes). Segue-se então, que um único vetor pode conter apenas uma única região de codificação ou compreendem duas ou mais regiões de codificação ex, um único vetor separadamente pode codificar uma ligação de um domínio e uma ligação de domínio -B como descrito abaixo. Além disso, um vetor, polinucleotídeo ou ácido nucleico da invenção pode codificar regiões de codificação heterólogas, fundidas ou não fundidas a um ácido nucleico que codifica uma molécula de ligação, um anticorpo ou fragmento, variante ou derivativo deste. As regiões de codificação hete- rólogas incluem, sem limitação elementos ou motivos especializados, tais como um peptídeo sinal secretor ou um domínio funcional heteró- logo.

[00069] Certas proteínas secretadas por células de mamíferos são associadas a um peptídeo sinal secretor que é clivado a partir da proteína madura, uma vez que a exportação da cadeia da proteína em cres- cimento pelo retículo endoplasmático rugoso foi iniciada. Aqueles versados na técnica estão cientes que peptídeos de sinal são geralmente fundidos ao N-terminal do polipeptídio, o qual é clivado a partir do poli- peptídio de "comprimento total" ou completo para produzir uma forma secretada ou "madura" do polipeptídio. Em determinadas modalidades, o peptídeo de sinal nativo ou um derivativo funcional dessa sequência que mantém a capacidade de direcionar a secreção do polipeptídio que está operacionalmente associado a ele. Alternativamente, um peptídeo sinal de mamífero heterólogo, por exemplo, um ativador de plasminogê- nio tecidual humano (TPA) ou peptídeo de sinal do camundongo β-glu- curonidase ou um derivado funcional, podem ser usados.

[00070] O termo "a jusante", quando se refere a uma sequência nu- cleotídica, significa que um ácido nucleico ou uma sequência de nucle- otídeos está localizado a 3' de uma sequência de nucleotídeos de referência. Em determinadas modalidades, sequências nucleotídicas a jusante se relacionam sequências que seguem o ponto de partida da transcrição. Por exemplo, o códon de iniciação de tradução de um gene está localizado a jusante do sítio de início da transcrição. O termo "a jusante", quando se refere a uma sequência de polipeptídio, significa que o aminoácido ou um sítio de inserção do aminoácido está localizado na extremidade C-terminal de aminoácidos de referência. Por exemplo, um sítio de inserção imediatamente a jusante do aminoácido 745 correspondente à proteína de FVIII de tipo selvagem madura significa que o sítio de inserção é entre o aminoácido 745 e aminoácido 746 correspondendo à proteína de FVIII de tipo selvagem madura.

[00071] O termo "a montante" refere-se a uma sequência de nucleo- tídeos que está localizada 5' a uma sequência de nucleotídeos de referência. Em determinadas modalidades, sequências de nucleotídeos a montante se relacionam a sequências que estão localizadas no lado 5' de uma região de codificação ou ponto de partida de transcrição. Por exemplo, a maioria dos promotores estão localizados a jusante do sítio de início da transcrição.

[00072] Como usado aqui, o termo "região reguladora" refere-se a sequências de nucleotídeo localizadas a montante (sequências não co- dificantes de 5'), dentro ou a jusante (sequências não codificantes 3') de uma região da codificação e que influenciam a transcrição, processamento do RNA estabilidade ou tradução da região codificante associada. Regiões reguladoras podem incluir promotores, sequências de líder de tradução, íntrons, sequências de reconhecimento de poliadenila- ção, sítios de processamento de RNA, sítios de ligação efetores e estruturas de Hairpin loop. Se uma região da codificação se destina a expressão em uma célula eucariótica, um sinal de poliadenilação e sequência de terminação de transcrição geralmente será localizado a 3' à sequência de codificação.

[00073] Um polinucleotídeo que codifica um produto do gene, por exemplo, um polipeptídio pode incluir um promotor e/ou outros elementos de controle de transcrição ou de tradução operacionalmente associados a uma ou mais regiões de codificação. Em uma associação operável uma região de codificação para um produto de gene, por exemplo, um polipeptídio está associado a uma ou mais regiões regulatórias de tal forma a colocar a expressão do produto de gene sob a influência ou controle das regiões regulatórias. Por exemplo, uma região de codificação e um promotor estão "operacionalmente associados" se a indução da função do promotor resulta na transcrição de mRNA que codifica o produto do gene codificado pela região de codificação e se a natureza da ligação entre o promotor e a região de codificação não interfere com a capacidade de o promotor dirigir a expressão do produto do gene ou interferir com a capacidade do molde de DNA a ser transcrito. Outros elementos de controle de transcrição, além de um promotor, por exemplo, sinais potenciadores, operadores, repressores e de terminação da transcrição, podem também ser operacionalmente associados ao poli- nucleotídeo para direcionar a expressão de produto de gene.

[00074] Uma variedade de regiões de controle de transcrição é conhecida por aqueles versados na técnica. Estas incluem, sem limitação, regiões de controle de transcrição que funcionam nas células de vertebrados, tais como, mas não limitado a, promotor e segmentos potencia- dores de citomegalovírus (o primeiro promotor imediato em conjunto com o íntron-A), vírus símio 40 (o primeiro promotor) e retrovírus (como o vírus do sarcoma de Rous). Outras regiões de controle de transcrição incluem aquelas derivadas de genes de vertebrados, tais como a actina, proteínas de choque térmico, hormônio de crescimento bovino e β-glo- bina de coelho, bem como outras sequências capazes de controlar a expressão gênica em células eucarióticas. As regiões de controle de transcrição adicionais adequadas incluem promotores tecido-específi- cos e potenciadores, bem como promotores induzíveis por linfocinas (por exemplo, promotores induzíveis por interferons ou interleucinas).

[00075] De forma semelhante, uma variedade de elementos de controle de tradução é conhecida por aqueles versados na técnica. Estes incluem, mas não estão limitados aos sítios de ligação ao ribossomo, códons de iniciação e de terminação da tradução e elementos derivados de picornavírus (particularmente um sítio interno de entrada do ribos- somo ou IRES, também referido como uma sequência CITE).

[00076] O termo "expressão", conforme usado neste documento, se refere a um processo pelo qual um polinucleotídeo produz um produto de gene, por exemplo, um RNA ou polipeptídio. Este inclui, sem limitação, a transcrição do polinucleotídeo em RNA mensageiro (mRNA), RNA transportador (tRNA), RNA hairpin pequeno (shRNA), RNA de interferência pequeno (siRNA) ou qualquer outro produto de RNA e a tradução desse mRNA em polipeptídio(s). A expressão produz um "produto de gene". Conforme usado neste documento, um produto de gene pode ser tanto um ácido nucleico, por exemplo, um RNA mensageiro produzido pela transcrição de um gene ou um polipeptídio que é traduzido a partir de um transcrito. Os produtos de gene descritos neste documento incluem ainda ácidos nucleicos com modificações pós transcri- cionais, por exemplo, poliadenilação ou polipeptídios com modificações pós traducionais, por exemplo, metilação, glicosilação, a adição de lipídios, associação com outras subunidades de proteína, clivagem prote- olítica e similares.

[00077] Um "vetor" refere-se a qualquer veículo para a clonagem de e/ou transferência de ácidos nucléicos em uma célula hospedeira. Um vetor pode ser um replicon ao qual outro segmento de ácidos nucleicos pode ser ligado a fim de fazer a replicação do segmento anexado. Um "replicon" refere-se a qualquer elemento genético (por exemplo, plasmí- deo, fago, cosmidico, cromossomo, vírus) que funciona como uma unidade autônoma de replicação in vivo, ou seja, capaz de replicação sob seu próprio controle. O termo "vetor" inclui veículos virais e não virais para a introdução do ácido nucleico em uma célula in vitro ex vivo ou in vivo. Um grande número de vetores é conhecido e utilizado na técnica incluindo, por exemplo, plasmídeos, vírus eucariótico modificado ou vírus bacteriano modificado. Inserção de um polinucleotídeo em um vetor apropriado pode ser realizada ligando os fragmentos de polinucleotí- deos apropriados a um vetor escolhido que tem termini coesos comple-mentares.

[00078] Vetores podem ser projetados para codificar marcadores selecionáveis ou repórteres que fornecem para a seleção ou a identificação de células que incorporaram o vetor. Expressão de marcadores selecionáveis ou repórteres permite a identificação e/ou seleção de células hospedeiras que incorporam e expressam outras regiões de codificação contidas no vetor. Exemplos de genes marcadores selecionáveis conhecidos e usado na técnica: genes proporcionando resistência à ampicilina estreptomicina, gentamicina, canamicina, hptII, herbicida bialaphos, sul- fonamida e semelhantes; e os genes que são utilizados como marcadores fenotípicos, ou seja, genes regulatórios de antocianina, gene de isopentanil transferase e afins. Exemplos de repórteres conhecidos e utilizados na técnica: luciferase (Luc), proteína fluorescente verde (GFP), cloranfenicol acetiltransferase (CAT), galactosidase (LacZ), glucuronidase (Gus) e afins. Marcadores selecionáveis também podem ser considerados repórteres.

[00079] O termo "plasmídeo" refere-se a um elemento extra cromos- sômico, muitas vezes carregando um gene que não faz parte do metabolismo central da célula e geralmente na forma de moléculas de DNA de cadeia dupla circulares. Tais elementos podem ser sequências de replicação autônomas, sequências integrantes de genoma, sequências do fago ou nucleotídeo, lineares, circulares ou superenrolados de um DNA ou RNA de cadeia única ou cadeia dupla, derivado de qualquer fonte em que um número de sequências nucleotídicas foram juntadas ou recombinadas em um construto original, que é capaz de introduzir um fragmento de promotor e sequência de DNA para um produto de gene selecionado juntamente com a sequência não traduzida de 3' apropriada em uma célula.

[00080] Vetores eucarióticos virais que podem ser usados incluem, mas não estão limitados a vetores adenovírus, vetores de retrovírus, vetores de vírus adenoassociado, poxvírus, por exemplo, vetores de vírus vaccinia, vetores baculovirus ou vetores de herpesvírus. Vetores não virais incluem plasmídeos, lipossomas, lipídios eletricamente carregados (citofectinas), complexos de proteína de DNA e biopolímeros.

[00081] Um "vetor de clonagem" refere-se a um "replicon," que é uma unidade de comprimento de um ácido nucleico que replica sequencialmente e que compreende uma origem de replicação, como um plasmí- deo, fago ou cosmidico, para que outro segmento de ácidos nucleicos possa ser ligado a fim de fazer a replicação do segmento anexado. De-terminados vectores de clonagem são capazes de replicação em um tipo de célula, por exemplo, bactérias e expressão na outra, por exemplo, as células eucarióticas. Vetores de clonagem incluem tipicamente uma ou mais sequências que podem ser usadas para a seleção de células, compreendendo o vetor e/ou um ou mais sítios de clonagem múltipla para inserção de sequências de ácidos nucleicos de interesse.

[00082] O termo "vetor de expressão" refere-se a um veículo projetado para permitir a expressão de uma sequência do ácido nucleico inserida após a inserção em uma célula hospedeira. A sequência do ácido nucleico inserida é colocada na associação operável com regiões reguladoras como descrito acima.

[00083] Vetores são introduzidos em células hospedeiras por métodos conhecidos na técnica, por exemplo, transfecção eletroporação, mi- croinjeção, transdução, fusão celular, DEAE dextrano, precipitação de fosfato de cálcio, lipofecção (fusão do lisossomo), uso de uma arma de gene ou um transportador de vetor do DNA.

[00084] "Cultura", "cultivar" e "cultivo", conforme usado neste documento, significa incubar células em condições in vitro que permitam o crescimento ou divisão celular ou mantenham as células em um estado vivo. "Células cultivadas", conforme usado neste documento, significa células que são propagadas in vitro.

[00085] Conforme usado neste documento, o termo "polipeptídio" destina-se a abranger um "polipeptídio" no singular bem como no plural "polipeptídios" e refere-se a uma molécula composta de monômeros (a- minoácidos) linearmente ligados por ligações amida (também conhecidas como ligações peptídicas). O termo "polipeptídio" refere-se a qualquer cadeia ou cadeias de dois ou mais aminoácidos e não se refere a um comprimento específico do produto. Assim, peptídeos, dipeptídeos, tripeptídeos, oligopeptídeos, "proteína", "cadeia de aminoácido" ou qualquer outro termo usado para se referir a uma cadeia ou cadeias de dois ou mais aminoácidos estão incluídos dentro da definição de "polipeptí- dio" e o termo "polipeptídio" pode ser usado em vez de ou de forma permutável, com qualquer um desses termos. O termo "polipeptídio" destina-se também a se referir aos produtos das modificações pós-ex- pressão do polipeptídio, incluindo, sem limitação, a glicosilação, acetila- ção, fosforilação, amidação, derivatização pelos grupos de prote- ção/bloqueio conhecidos, clivagem proteolítica ou modificação por ami- noácidos de ocorrência não natural. Um polipeptídio pode ser derivado de uma fonte biológica natural ou produzido por tecnologia recombi- nante, mas não é necessariamente traduzido a partir de uma sequência de ácido nucleico designada. Ele pode ser gerado de qualquer forma, incluindo por síntese química.

[00086] Por um polipeptídio "isolado" ou fragmento, variante ou derivado deste, pretende-se um polipeptídio que não está em seu meio natural. Nenhum nível específico de purificação é necessário. Por exemplo, um polipeptídio isolado pode ser removido de seu ambiente nativo ou natural. Os polipeptídios produzidos de forma recombinante e as proteínas expressas em células hospedeiras são considerados isolados para a finalidade da invenção, como são os polipeptídios nativos ou re- combinantes que foram separados, fracionados ou parcialmente ou substancialmente, purificados por qualquer técnica adequada.

[00087] Também incluídos na presente invenção fragmentos ou variantes de polipeptídios e qualquer combinação destes. O termo "fragmento" ou "variante" quando se referindo a domínios de ligação ou moléculas de ligação da presente invenção do polipeptídio incluem quaisquer polipeptídios que mantém pelo menos algumas das propriedades (por exemplo, afinidade de ligação de FcRn a um domínio ligação FcRn ou variante de Fc, atividade de coagulação para uma variante de FVIII ou atividade de ligação de FVIII para o fragmento VWF) do polipeptídio em referência. Fragmentos de polipeptídios incluem fragmentos proteo- líticas, bem como fragmentos de exclusão, além de fragmentos de anticorpos específicos discutidos em outro lugar aqui, mas não incluem o polipeptídio completo que ocorrem naturalmente (ou polipeptídio maduro). As variantes dos domínios de ligação ou moléculas de ligação de polipeptídios da presente invenção incluem fragmentos, conforme descrito acima e também polipeptídios com sequências de aminoácidos alteradas devido a substituições, deleções ou inserções de aminoácidos. As variantes podem ocorrer naturalmente ou ser de ocorrência não natural. As variantes de ocorrência não natural podem ser produzidas, usando técnicas de mutagênese conhecidas na técnica. Os polipeptídios variantes podem compreender substituições, deleções ou adições de aminoácidos conservativas ou não conservativas.

[00088] O termo "proteína VWF" ou "fragmentos de VWF" usado aqui significa quaisquer fragmentos VWF que interajam com de FVIII e mantenham pelo menos uma ou mais propriedades que normalmente são fornecidas para de FVIII pelo VWF completo, por exemplo, impedindo a ativação prematura de FVIIIa evitando proteólise prematura evitando a associação com membranas fosfolipídicas o que pode levar ao eliminação prematuro, impedindo a ligação a receptores de eliminação de FVIII que pode ligar de FVIII puro, mas não de FVIII ligado a VWF e/ou estabilizando as interações de cadeia pesada e cadeia leve de FVIII.

[00089] Uma "substituição de aminoácido conservativa" é aquela na qual o resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoá- cido tendo uma cadeia lateral semelhante. Famílias de resíduos de ami- noácidos com cadeias laterais semelhantes foram definidas na técnica, incluindo cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histi- dina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glu- tâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais apolares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais beta-ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Assim, se um aminoácido em um polipeptídio é substituído por outro aminoácido da mesma família da cadeia lateral, a substituição é considerada conservadora. Em outra modalidade, uma sequência de aminoácidos pode ser substituída conservadoramente com uma sequência estruturalmente semelhante que difere em ordem e/ou composição dos membros da família da cadeia lateral.

[00090] Como conhecido na técnica, a "identidade da sequência" entre dois polipeptídios é determinada, comparando-se a sequência de a- minoácido ou um polipeptídio à sequência de um segundo polipeptídio. Quando discutido neste documento, se qualquer polipeptídio específico for pelo menos aproximadamente 50%, 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% ou 100% idêntico a outro polipeptídio, pode ser determinado, usando métodos e programas de computador/software conhecidos na técnica, tais como, mas não se limitando a, o programa BESTFIT (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 para Unix, Genetics Computer Group, UniversityResearch Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711). O BESTFIT usa o algoPACE de homologia sítio de Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2 (1981), 482-489, para encontrar o melhor segmento de homologia entre duas sequências. Ao usar o BESTFIT ou qualquer outro programa de alinhamento de sequência para determinar se uma sequência específica é, por exemplo, 95% idêntica a uma sequência de referência, de acordo com a presente invenção, os parâmetros são definidos, é claro, tal que a porcentagem de identidade é calculada ao longo do comprimento total da sequência polipeptídica de referência e as lacunas na homologia de até 5% do número total de aminoácidos na sequência de referência são permitidas.

[00091] Como usado neste documento, um "aminoácido correspondente a" ou um "aminoácido equivalente" em uma sequência VWF ou uma sequência de proteína de FVIII é identificado pelo alinhamento para maximizar a identidade ou semelhança entre uma primeira sequência VWF ou de FVIII e uma segunda sequência VWF ou de FVIII. O número usado para identificar um aminoácido equivalente em uma segunda sequência VWF ou de FVIII baseia-se no número usado para identificar o aminoácido correspondente na primeira sequência VWF ou de FVIII.

[00092] Tal como aqui utilizado, o termo "sítio de inserção" refere-se a uma posição em um polipeptídio de FVIII ou um seu fragmento, variante ou derivado, que está imediatamente a montante da posição em que uma porção heteróloga pode ser inserida. Um "sítio de inserção" é especificado como um número, o número sendo o número do aminoá- cido em FVIII nativa madura (SEQ ID N°: 65) a que o sítio de inserção corresponde, que é imediatamente N-terminal para a posição da inserção. Por exemplo, a frase "A3 compreende uma XTEN em um sítio de inserção que corresponde ao aminoácido 1656 da SEQ ID N°: 65" indica que a porção heteróloga está localizada entre dois aminoácidos correspondentes ao aminoácido 1656 e o aminoácido 1657 da SEQ ID N°: 65.

[00093] A frase "imediatamente a jusante de um aminoácido" como aqui utilizada refere-se à posição correta ao lado do grupo carboxil ter-minal do aminoácido. Da mesma forma, a frase "imediatamente a montante de um aminoácido" refere-se à posição ao lado direito do grupo amina terminal do aminoácido. Portanto, a frase "entre dois aminoácidos de um sítio de inserção" tal como aqui utilizada refere-se a uma posição em que XTEN ou qualquer outro polipeptídio é inserido entre dois ami- noácidos adjacentes. Assim, as frases "inserido imediatamente a jusante de um aminoácido" e "inserido entre dois aminoácidos de um sítio de inserção" são utilizadas como sinônimos com "inserido em um sítio de inserção."

[00094] Os termos "inserido", "é inserido," "inserido em" ou termos gramaticalmente relacionados, tal como aqui utilizados, referem-se à posição de uma XTEN em um polipeptídio quimérico em relação à posição análoga na FVIII humana madura nativa. Como aqui utilizados, os termos referem-se as características do polipeptídio recombinante de FVIII em relação à FVIII humana madura nativa e não indicam, implicam ou inferem quaisquer métodos ou processos pelos quais o polipeptídio quimérico foi feito. Por exemplo em referência a um polipeptídio quimérico aqui proporcionado, a frase "uma XTEN é inserida imediatamente a jusante do resíduo 745 do polipeptídio de FVIII" significa que o polipep- tídio quimérico compreende uma XTEN imediatamente a jusante de um aminoácido que corresponde ao aminoácido 745 em FVIII humana madura nativa, por exemplo, delimitada pelos aminoácidos correspondentes aos aminoácidos 745 e 746 de FVIII humana madura nativa.

[00095] Uma proteína de "fusão" ou "quimérica" compreende uma primeira sequência de aminoácidos ligada a uma segunda sequência de aminoácidos à qual ela não é naturalmente ligada na natureza. As sequências de aminoácidos que normalmente existem em proteínas separadas podem ser reunidas no polipeptídio de fusão ou as sequências de aminoácidos que normalmente existem na mesma proteína podem ser colocadas em um novo arranjo no polipeptídio de fusão, por exemplo, fusão de um domínio de fator VIII da invenção com um domínio Fc de lg. A proteína de fusão é criada, por exemplo, por síntese química ou por criação e tradução de um polinucleotídeo no qual as regiões peptí- dicas são codificadas na relação desejada. Uma proteína quimérica pode também compreender uma segunda sequência de aminoácidos associada com a primeira sequência de aminoácidos por uma ligação covalente, não peptídica ou uma ligação não covalente.

[00096] Como usado neste documento, o termo "meia-vida" refere- se uma meia-vida biológica de um polipeptídio particular in vivo. Meia- vida pode ser representada pelo tempo necessário para metade da quantidade administrada a um sujeito seja liberada da circulação e/ou outros tecidos do animal. Quando uma curva de eliminação de um determinado polipeptídio é construída em função do tempo, a curva geralmente é bifásica com uma rápida fase α e fase β mais longa. A fase α normalmente representa um equilíbrio do polipeptídio Fc administrado entre o espaço intra e extra vascular e é em parte, determinado pelo tamanho do polipeptídio. Fase β normalmente representa o catabolismo do polipeptídio no espaço intravascular. Em algumas modalidades, de FVIII e proteína quimérica compreendendo de FVIII são monofásicas e, portanto, não têm uma fase alfa, mas apenas a fase beta única. Portanto em determinadas modalidades, o termo meia-vida neste documento refere-se a meia-vida do polipeptídio na fase β. A fase meia-vida β típica de um anticorpo humano nos seres humanos é de 21 dias.

[00097] O termo "ligado" neste documento refere-se a uma primeira sequência de aminoácidos ou sequência nucleotídica ligada covalente- mente ou não covalentemente juntada a uma segunda sequência de aminoácidos ou sequência nucleotídica, respectivamente. O primeiro a- minoácido ou sequência nucleotídica pode ser diretamente unido ou justaposto à segunda sequência de aminoácido ou nucleotídica ou, alternativamente, uma sequência interveniente pode ser covalentemente unida à primeira sequência para a segunda sequência. O termo "ligado" significa não apenas uma fusão de uma primeira sequência de aminoá- cido a uma segunda sequência de aminoácidos no C-terminal ou N-ter- minal, mas também inclui a inserção de toda a primeira sequência de aminoácidos (ou a segunda sequência de aminoácidos) em quaisquer dois aminoácidos na segunda sequência de aminoácidos (ou a primeira sequência de aminoácido, respectivamente). Em uma modalidade, a primeira sequência de aminoácidos pode ser ligada a uma segunda sequência de aminoácidos por uma ligação peptídica ou um ligante. A primeira sequência de nucleotídeos pode ser ligada a uma segunda sequência de nucleotídeo por uma ligação fosfodiéster ou um ligante. O ligante pode ser um peptídeo ou um polipeptídio (para cadeias polipep- tídicas) ou um nucleotídeo ou uma cadeia de nucleotídeos (para cadeias de nucleotídeos) ou qualquer unidade química (para cadeias do polipep- tídio e polinucleotídeo). O termo "ligado" também é indicado por um hífen (-).

[00098] Como usado aqui, o termo "associado com" refere-se a uma ligação covalente ou não covalente formada entre uma primeira cadeia de aminoácidos e uma segunda cadeia de aminoácidos. Em uma modalidade, o termo "associado com" significa uma ligação covalente, ligação não peptídica ou uma ligação não covalente. Esta associação pode ser indicada por dois pontos, isto é, (:). Em outra modalidade, significa uma ligação covalente exceto uma ligação peptídica. Por exemplo, o aminoá- cido cisteína compreende um grupo tiol que pode formar uma ligação ou ponte dissulfeto com um grupo tiol em um segundo resíduo de cisteína. Na maioria das moléculas de IgG de ocorrência natural, as regiões CH1 e CL estão associadas por uma ligação dissulfeto e as duas cadeias pesadas estão associadas por duas ligações dissulfeto nas posições correspondentes a 239 e 242, usando o sistema de numeração de Kabat (posição 226 ou 229, sistema de numeração da UE). Exemplos de ligações covalentes incluem, mas não estão limitados a, uma ligação peptí- dica, uma ligação de metal, uma ligação de hidrogênio, uma ligação dis- sulfeto, uma ligação sigma, uma ligação pi, uma ligação delta, uma ligação glicosídica, um ligação agnóstica, uma ligação dobrada, uma ligação dativa, um ligação Pi, uma ligação dupla, uma ligação tripla, uma ligação quádrupla, uma ligação quíntupla, uma ligação sêxtupla, conjugação, hi- perconjugação, aromaticidade, hapaticidade ou antiligação. exemplos não limitantes de ligação não covalente incluem uma ligação iônica (por exemplo, ligação cation-pi ou ligação de sal), uma ligação de metal, uma ligação de hidrogênio (por exemplo, ligação de dihidrogênio, complexo de dihidrogênio, ligação de hidrogênio de baixa-barreira ou ligação de hidrogênio simétrica), força de van der Walls, força de dispersão de London, uma ligação mecânica, uma ligação de halogênio, aurofilicidade, intercalação, força entrópica empilhamento ou polaridade química.

[00099] O termo "híbrido monômero-dímero" usado neste documento refere-se a uma proteína quimérica, que compreende uma primeira cadeia de polipeptídio e uma segunda cadeia do polipeptídio, que são associados com o outro por uma ligação dissulfeto, onde a primeira cadeia é composta por um fator de coagulação, por exemplo, fator VIII e uma primeira região Fc e a segunda cadeia compreende essencialmente consiste ou consiste em uma segunda região Fc sem o fator de coagulação. O construto de híbrido monômero-dímero, portanto, é um híbrido composto por um aspecto monômero, tendo apenas um fator de coagulação e um aspecto dímero tendo duas regiões Fc.

[000100] Tal como aqui utilizado, o termo "sítio de clivagem" ou "sítio de clivagem enzimática" refere-se a um sítio reconhecido por uma enzima. Alguns sítios de clivagem enzimática compreendem um sítio de processamento intracelular. Em uma modalidade, um polipeptídio tem um sítio de clivagem enzimática clivado por uma enzima que é ativada durante a cascata de coagulação, tal que a clivagem de tais sítios ocorre no sítio de formação de coágulos. Exemplares de tais sítios incluem, por exemplo, aqueles reconhecidos pela trombina, fator XIa ou fator Xa. Os sítios de clivagem de FXIa exemplificativos incluem, por exemplo, TQS- FNDFTR (SEQ ID N°: 1) e SVSQTSKLTR (SEQ ID N°: 3). Os sítios de clivagem de trombina exemplificativos incluem, por exemplo, DFLAE- GGGVR (SEQ ID N°: 4), TTKIKPR (SEQ ID N°: 5), LVPRG (SEQ ID N°: 6), ALRPR (SEQ ID N°: 7), ISDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIE- PRSFS (SEQ ID N°: 106), DKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIE- PRSFS (SEQ ID NO : 88) e IEPRSFS (SEQ ID N°: 194). Outros sítios de clivagem enzimática são conhecidos na técnica e aqui descritos em outro lugar.

[000101] Tal como aqui utilizado, o termo "sítio de processamento" ou "sítio de processamento intracelular" refere-se a um tipo de sítio de clivagem enzimática em um polipeptídio que é um alvo para as enzimas que funcionam após a tradução do polipeptídio. Em uma modalidade, tal enzimas funcionam durante o transporte do lúmen de Golgi para o compartimento de trans-Golgi. Enzimas de processamento intracelular clivam polipeptídios antes da secreção da proteína da célula. Exemplos de tais sítios de processamento incluem, por exemplo, os dirigidos pela família PACE/furina (onde PACE é um acrônimo para Enzima de Clivagem de Aminoácido Básica) de endopeptidases. Estas enzimas são localizadas na membrana de Golgi e clivam proteínas no lado do carboxi terminal do motivo de sequência Arg-[qualquer resíduo]-(Lys ou Arg)- Arg. Neste documento a família "furina" de enzimas inclui, por exemplo, PCSK1 (também conhecido como PC1/Pc3), PCSK2 (também conhecido como PC2), PCSK3 (também conhecido como furina ou PACE), PCSK4 (também conhecido como PC4), PCSK5 (também conhecido como PC5 ou PC6), PCSK6 (também conhecido como PACE4) ou PCSK7 (também conhecido como PC7/LPC, PC8 ou SPC7). Outros sítios de processamento são conhecidos na técnica.

[000102] Em constructos que incluem mais de um processamento ou clivagem, será entendido que tais sítios podem ser iguais ou diferentes.

[000103] O termo "Furina" refere-se a enzimas correspondente à CE n. ° 3.4.21.75. Furina é convertase de proproteína tipo subtilisina, que é também conhecida como PACE (Enzima de Clivagem de Aminoácido Básica). Furina exclui seções de proteínas precursoras inativas para convertê-las em proteínas biologicamente ativas. Durante o seu transporte intracelular, pró-peptídio de VWF pode ser clivado a partir da molécula de VWF madura por uma enzima de furina. Em algumas modalidades, a furina cliva D1D2 do D'D3 de VWF. Em outras modalidades, uma sequência de nucleotídeos que codifica furina pode ser expressa juntamente com a sequência de nucleotídeos que codifica um fragmento de VWF de modo que os domínios D1D2 podem ser clivados intracelularmente por furina.

[000104] Em constructos que incluem mais de um processamento ou clivagem, será entendido que tais sítios podem ser iguais ou diferentes.

[000105] Um "ligante processável", tal como aqui utilizado, refere-se a um ligante que compreende pelo menos um sítio de processamento intracelular, que é aqui descrito noutro lugar.

[000106] Distúrbio hemostático, como usado aqui, significa uma condição geneticamente herdada ou adquirida, caracterizada por uma tendência a hemorragia espontaneamente ou como resultado de trauma, devido a uma capacidade deficiente ou incapacidade para formar um coágulo de fibrina. Exemplos de tais transtornos incluem hemofilias. As três principais formas são a Hemofilia A (deficiência de fator VIII), a Hemofilia B (deficiência do fator IX ou "Doença do Natal") e a hemofilia C (deficiência de fator XI, tendência de sangramento suave). Outros transtornos hemostáticos incluem ex, doença de Von Willebrand, deficiência de fator XI (deficiência de PTA), deficiência do fator XII, deficiências ou anomalias estruturais em fibrinogênio, protrombina, fator V, fator VII, fator X ou fator XIII, síndrome de Bernard-Soulier, que é um defeito ou deficiência em GPIb. GPIb, receptor para VWF, pode ser defeituoso e levar à falta de formação do coágulo primário (hemostasia primária) e tendência aumentada de sangramento) e trombastenia de Glanzmann de Glanzman e Naegeli (trombastenia de Glanzmann). Na insuficiência hepática (formas agudas e crônicas), há insuficiente produção de fatores de coagulação pelo fígado; isto pode aumentar o risco de sangra- mento.

[000107] As moléculas quiméricas da invenção podem ser usadas profilaticamente. Como usado aqui, a termo "profilaxia" refere-se à ad-ministração de uma molécula antes de um episódio de sangramento. Em uma modalidade, o sujeito em necessidade de um agente hemostá- tico geral está submetendo-se ou está a ponto de submeter-se, a cirurgia. A proteína quimérica da invenção pode ser administrada antes ou após a cirurgia como profilático. A proteína quimérica da invenção pode ser administrada durante ou após a cirurgia para controlar um episódio de hemorragia agudo. A cirurgia pode incluir, mas não está limitada a transplante hepático, ressecção hepática, procedimentos odontológicos ou transplante de células-tronco.

[000108] A proteína quimérica da invenção é também usada para o tratamento sob demanda. O termo "tratamento sob demanda" refere-se à administração de uma molécula quimérica em resposta a sintomas de um episódio de sangramento ou antes de uma atividade que pode provocar sangramento. Em um aspecto, o tratamento sob demanda pode ser dado a um sujeito quando a hemorragia começa, como após uma lesão ou quando o sangramento é esperado, como antes da cirurgia. Em outro aspecto, o tratamento sob demanda pode ser dado antes de atividades que aumentam o risco de sangramento, como esportes de contato.

[000109] Como usado aqui o termo "sangramento agudo" refere-se a um episódio de sangramento independentemente da causa subjacente. Por exemplo, um sujeito pode ter trauma, uremia, uma hemorragia hereditária (por exemplo, deficiência do fator VII) um transtorno de plaque- tas ou resistência devido ao desenvolvimento de anticorpos contra fatores de coagulação.

[000110] Tratamento, tratar, tratando como usado aqui refere-se, por exemplo, a redução na severidade de uma doença ou condição; a redução da duração de um curso de doença; a melhoria de um ou mais sintomas associados com uma doença ou condição; o fornecimento de efeitos benéficos a um sujeito com uma doença ou condição, sem necessariamente curar a doença ou condição ou a profilaxia de um ou mais sintomas associados com uma doença ou condição. Em uma modalidade, o termo "tratamento" ou "tratando" significa manter um nível de FVIII pelo menos 1 IU/dL, 2 IU/dL, 3 IU/dL, 4 IU/dL, 5 IU/dL, 6 IU/dL, 7 IU/dL, 8UL/dL, 9 IU/dL, 10 IU/dL, 11 IU/dL, 12 IU/dL, 13 IU/dL, 14 IU/dL, 15 IU/dL 16 IU/dL, 17 IU/dL, 18 IU/dL, 19 IU/dL ou 20 IU/dL em um sujeito através da administração de uma proteína quimérica ou um fragmento VWF da invenção. Em outra modalidade, tratamento ou tratando significa manter um nível de FVIII entre aproximadamente 1 e aproximadamente 20 IU/dL, aproximadamente 2 e aproximadamente 20 IU/dL, aproximadamente 3 e aproximadamente 20 IU/dL, aproximadamente 4 e aproximadamente 20 IU/dL, aproximadamente 5 e aproximadamente 20 IU/dL, aproximadamente 6 e aproximadamente 20 IU/dL, aproximadamente 7 e aproximadamente 20 IU/dL, aproximadamente 8 e aproximadamente 20 IU/dL, aproximadamente 9 e aproximadamente 20 IU/dL ou aproximadamente 10 e aproximadamente 20 IU/dL. Tratamento ou tratando uma doença ou condição também pode incluir a manutenção da atividade do de FVIII em um sujeito em um nível comparável de pelo menos aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% ou 20% da atividade FVIII em um sujeito não hemofílico. O nível mínimo necessário para tra-tamento pode ser medido por um ou mais métodos conhecidos e pode ser ajustado (aumentado ou diminuído) para cada pessoa.

II. Proteínas Quiméricas

[000111] A presente invenção é dirigida a estender uma meia-vida de uma proteína quimérica, utilizando uma proteína de VWF fundida com uma sequência de XTEN por prevenção ou inibição de um fator limitante de meia-vida de FVIII, isto é, VWF endógeno, de se associar com a proteína de FVIII. VWF endógeno associa-se com aproximadamente 95% a aproximadamente 98% de FVIII em complexos não covalentes. Embora VWF endógeno seja um fator limitante da meia-vida de FVIII, VWF endógeno ligado a uma proteína de FVIII é também conhecido por proteger FVIII de várias maneiras. Por exemplo, VWF de comprimento total (como um multímero tendo aproximadamente 250 kDa) pode proteger de FVIII de clivagem de protease e ativação de FVIII estabilizar a cadeia pesada e/ou cadeia leve de FVIII e evitar a eliminação de FVIII por receptores scavenger. No entanto, ao mesmo tempo, VWF endógeno limita a meia-vida de FVIII impedindo pinocitose e liberando o complexo de FVIII-VWF do sistema através da via de eliminação do VWF. Acredita-se embora sem a limitação de uma teoria, que o VWF endógeno é um fator limitante de meia-vida que impede a meia-vida de uma proteína quimérica fundida com um extensor de meia-vida de ser mais do que cerca de duas vezes a de FVIII de tipo selvagem. Por conseguinte, a presente invenção é dirigida para prevenir ou inibir a interação entre VWF endógeno e uma proteína de FVIII utilizando uma proteína de VWF que compreende um domínio D' e um domínio D3 (por exemplo, um fragmento de VWF) e ao mesmo tempo aumentando da meia-vida de proteína resultante(s) de FVIII utilizando uma sequência de XTEN em combinação com uma região constante de Ig ou uma sua porção. Em particular, a presente invenção mostra que uma sequência de XTEN mais curta (ou seja, XTEN que contém menos de 288 aminoácidos de comprimento ou seja, XTEN que é mais curta do que 288 aminoácidos) é melhor em estender uma meia-vida da proteína quimérica.

[000112] Em uma modalidade, a invenção é dirigida a uma proteína quimérica que compreende (i) um primeiro polipeptídio que compreende uma proteína de FVIII fundida com uma primeira região constante de Ig ou uma porção da mesma e (ii) um segundo polipeptídio que compreende uma proteína de VWF que compreende um domínio D' e um domínio D3 de VWF fundido com uma segunda região constante de Ig ou uma porção da mesma por uma sequência de XTEN no meio em que a sequência de XTEN contém menos do que 288 resíduos de aminoáci- dos e em que o primeiro polipeptídio é ligado a ou associado com o segundo polipeptídio. Em uma outra modalidade, a sequência de XTEN no segundo polipeptídio é composta por uma sequência de aminoácidos que tem um comprimento dentre 12 aminoácidos e 287 aminoácidos. Em outras modalidades, a proteína quimérica apresenta uma meia-vida mais longa em comparação com uma proteína de fusão compreendendo o correspondente primeiro polipeptídio e o segundo polipeptídio em que o segundo polipeptídio compreende uma sequência de XTEN contendo pelo menos 288 aminoácidos, por exemplo, AE288, por exemplo, SEQ ID N°: 8. Em ainda outras modalidades, a sequência de XTEN no segundo polipeptídio contém, pelo menos, cerca de 36, pelo menos cerca de 42, pelo menos cerca de 72 ou pelo menos cerca de 144 aminoáci- dos, mas menos do que 288 aminoácidos, por exemplo, AE42, AE72, AE144 (AE144, AE144_2A, AE144_3B, AE144_4A, AE144_5A, AE144_6B), AG42, AG72, ou AG144 (AG144, AG144_A, AG144_B, AG144_C, AG144_F), por exemplo, SEQ ID N°: 9, SEQ ID N°: 10, SEQ ID N°: 11, SEQ ID N°: 55; SEQ ID N°: 56; SEQ ID N°: 57; SEQ ID N°: 58; SEQ ID N°: 59; SEQ ID N°: 14; SEQ ID N°: 60; SEQ ID N°: 61; SEQ ID N°: 62; ou SEQ ID N°: 63.

[000113] A proteína quimérica da invenção pode ainda compreender uma segunda sequência de XTEN que liga a proteína de FVIII com a primeira região constante de Ig ou uma sua porção.

[000114] Em certas modalidades, a invenção é dirigida a uma proteína quimérica que compreende (i) um primeiro polipeptídio que compreende uma proteína de FVIII fundida com uma primeira região constante de Ig ou uma porção da mesma e (ii) um segundo polipeptídio que compreende uma proteína de VWF que compreende um domínio D' e um domínio D3 de VWF fundido com uma segunda região constante de Ig ou uma porção da mesma por uma primeira sequência de XTEN no meio em que a sequência de XTEN contém menos do que 288 resíduos de aminoácidos e em que o primeiro polipeptídio está ligado a ou associado com o segundo polipeptídio e em que o primeiro polipeptídio compreende ainda uma segunda sequência de XTEN que é inserida em um ou mais sítios de inserção no interior da proteína de FVIII ou que é fundido com a proteína de FVIII e/ou a primeira região constante de Ig ou uma sua porção. Portanto, em uma modalidade, uma segunda sequência de XTEN é inserida em um ou mais sítios de inserção no interior da proteína de FVIII. Em uma outra modalidade, uma segunda sequência de XTEN é fundida com a proteína de FVIII e/ou a primeira região constante de Ig ou uma sua porção. Em outras modalidades, uma segunda sequência de XTEN é inserida em um ou mais sítios de inserção no interior da proteína de FVIII e uma terceira sequência de XTEN é fundida com a proteína de FVIII e/ou a primeira região constante de Ig ou uma sua porção.

[000115] A segunda e/ou terceira sequência XTen pode ser de qualquer comprimento de aminoácidos de XTen. Por exemplo, a segunda e/ou terceira sequência de XTen é divulgada aqui noutro local, por exemplo, AE42, AE72, AE864, AE576, AE288, AE144, AG864, AG576, AG288 e AG144, por exemplo, SEQ ID N°: 8; SEQ ID N°: 9, SEQ ID N°: 10, SEQ ID N°: 11, SEQ ID N°: 17; SEQ ID N°: 54; SEQ ID N°: 19; SEQ ID N°: 16; SEQ ID N°: 18; SEQ ID N°: 15; SEQ ID N°: 55; SEQ ID N°: 56; SEQ ID N°: 57; SEQ ID N°: 58; SEQ ID N°: 59; SEQ ID N°: 14; SEQ ID N°: 60; SEQ ID N°: 61; SEQ ID N°: 62; ou SEQ ID N°: 63. Em uma modalidade particular, a segunda e/ou terceira sequência de XTEN é AE288 ou AG288, por exemplo, SEQ ID N°: 8 ou 19.

[000116] Em certas modalidades, a invenção é dirigida a uma proteína quimérica que compreende (i) um primeiro polipeptídio que compreende uma proteína de FVIII fundida com uma primeira região constante de Ig ou uma porção da mesma por um ligante opcional em que é inserida uma sequência de XTEN opcional (X2) em um ou mais sítios de inserção no interior da proteína de FVIII ou está fundida à proteína de FVIII ou à primeira região constante de Ig ou uma porção da mesma e (ii) um segundo polipeptídio que compreende uma proteína de VWF que compreende um domínio de D ' e um domínio D3 de VWF fundido com uma segunda região de Ig constante ou uma porção da mesma por uma sequência de XTEN (X1) entre a proteína de VWF e a segunda região constante de Ig ou uma sua porção em que a sequência de XTEN (X1) contém menos do que 288 resíduos de aminoácidos e está fundida com a proteína de VWF por um ligante e em que o primeiro polipeptídio e o segundo polipeptídio estão associados. Em algumas modalidades, a invenção é dirigida a uma proteína quimérica que compreende (i) um primeiro polipeptídio que compreende uma proteína de FVIII fundida com uma primeira região constante de Ig ou uma porção da mesma por um ligante opcional em que é inserida uma sequência de XTEN opcional (X2) em um ou mais sítios de inserção no interior da proteína de FVIII ou está fundida à proteína de FVIII ou à primeira região constante de Ig ou uma porção da mesma e (ii) um segundo polipeptídio que compreende uma proteína de VWF que compreende um domínio de D ' e um domínio D3 de VWF fundido com uma segunda região de Ig constante ou uma porção da mesma por uma sequência de XTEN (X1) entre a proteína de VWF e a segunda região constante de Ig ou uma sua porção em que a sequência de XTEN (X1) contém menos do que 288 resíduos de aminoácidos e está fundida com a segunda região constante de lg ou uma sua porção por um ligante e em que o primeiro polipeptídio e o segundo polipeptídio estão associados. Em outras modalidades, o li- gante de fusão da sequência de XTEN (X1) com a proteína de VWF ou a segunda região constante de Ig ou uma sua porção é um ligante cli- vável. Os exemplos não limitativos de ligantes cliváveis são apresentados noutras partes deste documento. Em uma modalidade particular, o ligante é um ligante clivável de trombina.

[000117] Em algumas modalidades, a proteína quimérica é duas cadeias polipeptídicas, a primeira cadeia compreendendo o primeiro poli- peptídio acima descrito e a segunda cadeia compreendendo o segundo polipeptídio descrito acima. Por exemplo, as duas cadeias de polipeptí- dios compreendem (i) uma primeira cadeia compreendendo uma proteína de cadeia simples de FVIII, uma primeira região constante de Ig ou uma porção da mesma e uma sequência de XTEN opcional que é inserida em um ou mais sítios de inserção no interior da proteína de FVIII ou está fundida com a proteína de FVIII ou com a primeira região constante de Ig ou uma porção da mesma e (ii) uma segunda cadeia compreendendo uma proteína de VWF fundida com uma segunda região constante de Ig ou uma porção da mesma por uma sequência de XTEN (X1) no meio em que a sequência de XTEN (X1) contém menos de 288 ami- noácidos.

[000118] Em certas modalidades, a proteína quimérica é de duas cadeias polipeptídicas, uma primeira cadeia compreendendo uma cadeia pesada de uma proteína de FVIII e uma segunda cadeia compreendendo, de N-terminal para C-terminal, uma cadeia leve de uma proteína de FVIII, uma sequência de XTEN opcional que é inserida em um ou mais sítios de inserção no interior da proteína de FVIII ou está fundida à proteína de FVIII ou primeira região de Ig constante ou uma porção da mesma e uma primeira região constante de Ig ou uma sua porção, um ligante opcional (por exemplo, um ligante processável), uma proteína de VWF, uma sequência de XTEN (X1), um segundo ligante opcional (por exemplo, um ligante clivável) e uma segunda região constante de Ig ou uma sua porção.

[000119] Em outras modalidades, a proteína quimérica é três cadeias polipeptídicas, (i) uma primeira corrente compreendendo uma cadeia pesada de uma proteína de FVIII, (ii) uma segunda cadeia compreendendo uma cadeia leve de uma proteína de FVIII, uma primeira região constante de Ig ou uma porção da mesma e uma sequência de XTEN opcional que é inserida em um ou mais sítios de inserção no interior da cadeia leve ou pesada da proteína de FVIII ou é fundida com a proteína de FVIII ou primeira região constante de Ig ou uma porção da mesma e (iii) uma terceira cadeia compreendendo uma proteína de VWF fundida com uma segunda região constante de Ig ou uma porção da mesma por uma sequência de XTEN (X1) no meio em que a primeira cadeia e a segunda cadeia estão associadas por uma ligação não covalente, por exemplo, uma ligação de metal e a segunda cadeia e a terceira cadeia estão associadas por uma ligação covalente, por exemplo, uma ligação de dissulfureto.

[000120] Em ainda outras modalidades, a proteína quimérica é uma cadeia simples que compreende, de N-terminal para C-terminal, uma proteína de FVIII de cadeia única, uma sequência de XTEN opcional que é inserida em um ou mais sítios de inserção no interior da proteína de FVIII ou está fundida com a proteína de FVIII ou a primeira região de Ig constante ou uma porção da mesma e uma primeira região constante de Ig ou uma sua porção, um ligante opcional (por exemplo, um ligante processável), uma proteína de VWF, uma sequência de XTEN (X1), um segundo ligante opcional (por exemplo, um ligante clivável) e uma segunda região constante de Ig ou uma sua porção.

[000121] Em certas modalidades, uma proteína quimérica compreende uma das seguintes fórmulas (a)-(hh): (a) FVIII-F1:F2-L2-X-L1-V; (b) FVIII-F1:V-L1-X-L2-F2; (c) F1-FVIII:F2-L2-X-L1-V; (d) F1-FVIII:V-L1-X-L2-F2; (e) FVIII-X2-F1:F2-L2-X1-L1-V; (f) FVIII-X2-F1:V-L1-X1-L2-F2; (g) FVIII(X2)-F1:F2-L2-X1-L1-V; (h) FVIII(X2)-F1:V-L1-X1-L2-F2; (i) F1-X2-F1:F2-L2-X1-L1-V; (j) F1-X2-F1:V-L1-X1-L2-F2; (k) V-L1-X-L2-F2-L3-FVIII-L4-F1; (l) V-L1-X-L2-F2-L3-F1-L4-FVIII; (m) F1-L4-FVIII-L3-F2-L2-X-L1-V; (n) FVIII-L4-F1-L3-F2-L2-X-L1-V; (o) FVIII-L4-F1-L3-V-L1-X-L2-F2; (p) FVIII-L4-F1-L3-F2-L2-X-L1-V; (q) F2-L2-X-L1-V-L3-F1-L4-FVIII; (r) F2-L2-X-L1-V-L3-FVIII-L4-F1; (s) V-L1-X1-L2-F2-L3-FVIII(X2)-L4-F1; (t) V-L1-X1-L2-F2-L3-F1-L4-FVIII(X2); (u) F1-L4-FVIII(X2)-L3-F2-L2-X1-L1-V; (v) F-L4-FVIII(X2)-L3-V-L1-X1-L2-F2; (w) FVIII(X2)-L4-F1-L3-V-L1-X1-L2-F2; (x) FVIII(X2)-L4-F1-L3-F2-L2-X1-L1-V; (y) F2-L2-X1-L1-V-L3-F1-L4-FVIII(X2); (z) F2-L2-X1-L1-V-L3-FVIII(X2)-L4-F1; (aa) V-L1-X2-L2-F2-L3-FVIII-L4-X2-L5-F1; (bb) V-L1-X2-L2-F2-L3-F1-L5-X2-L4-FVIII; (cc) F1-L5-X2-L4-FVIII-L3-F2-L2-X2-L1-V; (dd) F1-L5-X2-L4-FVIII-L3-V-L1-X2-L2-F2; (ee) FVIII-L5-X2-L4-F2-L3-V-L1-X1-L2-F1; (ff) FVIII-L5-X2-L4-F2-L3-F1-L2-X1-L1-V; (gg) F1-L2-X1-L1-V-L3-F2-L4-X2-L5-FVIII; ou (hh) F1-L2-X1-L1-V-L3-FVIII-L5-X2-L4-F2; onde V é uma proteína de VWF, a qual compreende um domínio D' e um domínio D3, X ou X1 é uma primeira sequência de XTEN que contém menos 288 aminoácidos, X2 é uma segunda sequência de XTEN, FVIII compreende uma proteína de FVIII, FVIII(X2) compreende uma proteína de FVIII com uma se-gunda sequência de XTEN inserida em um ou mais sítios de inserção na proteína de FVIII, F1 é uma primeira região constante de Ig ou uma porção desta, F2 é uma segunda região constante de Ig ou uma porção desta, L1, L2, L3, L4 ou L5 são um ligante opcional, (-) é uma ligação peptídica. (:) é uma ligação covalente ou uma ligação não covalente.

[000122] Em uma modalidade, X ou X1 é composto por uma sequência de aminoácidos que tem um comprimento dentre 12 aminoácidos e 287 aminoácidos. Em uma outra modalidade, a proteína quimérica apresenta uma meia-vida mais longa em comparação com uma proteína de fusão que compreende uma fórmula correspondente em que X ou X1 é AE288, por exemplo, SEQ ID N°: 8.

[000123] Em outras modalidades, o X ou X1 na fórmula contém pelo menos cerca de 36, pelo menos cerca de 42, pelo menos cerca de 72 ou pelo menos cerca de 144 aminoácidos, mas menos do que 288 amino- ácidos, por exemplo, AE42, AE72, AE144 (AE144, AE144_2A, AE144_3B, AE144_4A, AE144_5A, AE144_6B), AG42, AG72 ou AG144 (AG144, AG144_A, AG144_B, AG144_C, AG144_F), por exemplo, SEQ ID N°: 9, SEQ ID N°: 10, SEQ ID N°: 11, SEQ ID N°: 55; SEQ ID N°: 56; SEQ ID N°: 57; SEQ ID N°: 58; SEQ ID N°: 59; SEQ ID N°: 14; SEQ ID N°: 60; SEQ ID N°: 61; SEQ ID N°: 62; ou SEQ ID N°: 63.

[000124] Em ainda outras modalidades, o X2 compreende uma sequência de aminoácidos que tem um comprimento de pelo menos cerca de 36 aminoácidos, pelo menos 42 amino ácidos, pelo menos 144 ami- noácidos, pelo menos 288 aminoácidos, pelo menos 576 aminoácidos ou pelo menos 864 aminoácidos, por exemplo, AE42, AE72, AE864, AE576, AE288, AE144, AG864, AG576, AG288 ou AG144, por exemplo, SEQ ID N°: 9; SEQ ID N°: 10; SEQ ID N°: 15; SEQ ID N°: 16; SEQ ID N°: 8; SEQ ID N°: 11; SEQ ID N°: 17; SEQ ID N°: 18, SEQ ID N°: 19 ou SEQ ID N°: 14. Em uma modalidade particular, o X2 é AE288 ou AG288, por exemplo, SEQ ID N°: 8 ou 19.

[000125] Em certas modalidades, a proteína quimérica que compreende o X ou X1 e/ou X2 tem uma meia-vida prolongada em comparação com uma proteína quimérica sem o X ou X1 e/ou X2. Em outras modalidades, o L1 e/ou L2 é um ligante clivável. Em ainda outras modalidades, o L4 e/ou L5 é um ligante clivável.

II.A. Proteínas de Fator de von Willebrand (VWF)

[000126] VWF (também conhecido como F8VWF) é uma glicoproteína multimérica grande presente no plasma sanguíneo e constitutivamente produzido no endotélio (nos corpos de Weibel-Palade), megacariócitos (a-grânulos de plaquetas) e subendotélio do tecido conjuntivo. O monô- mero básico de VWF é uma proteína do aminoácido 2813. Cada monô- mero contém um número de domínios específicos, com uma função específica, o domínio D'/D3 (que juntos ligar-se ao fator VIII), o domínio A1 (que liga a plaquetária receptores GPIb, heparina ou possivelmente co- lágeno), o domínio A3 (que liga a colágeno), o domínio C1 (em que o domínio RGD liga a plaqueta integrina αIIbβ3 quando este é ativado) e o domínio do "nó de cisteína" na extremidade C-terminal da proteína (que VWF compartilha com fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), transformando o fator de crescimento-β (TGFβ) e β-gonadotro- fina coriônica humana (βHCG)).

[000127] Em uma modalidade, a proteína de VWF é um fragmento de VWF. O termo "um fragmento de VWF", tal como aqui utilizado, inclui, mas não está limitado a fragmentos de VWF funcionais compreendendo um domínio D' e um domínio D3, que são capazes de inibir a ligação de VWF a FVIII endógeno. Em uma modalidade, o fragmento de VWF ligase à proteína de FVIII. Em uma outra modalidade, o fragmento de VWF bloqueia o sítio de ligação de VWF na proteína de FVIII, inibindo assim a interação da proteína de FVIII com VWF endógeno. Os fragmentos de VWF incluem derivados, variantes, mutantes ou análogos que retêm estas atividades de VWF.

[000128] A sequência de aminoácidos do monômero 2813 para VWF humano é relatado como número de adesão _NP_000543.2__ no Genbank. A sequência de nucleotídeos codificando o VWF humano é relatada como número de adesão __NM_000552.3_ no Genbank. Uma sequência de nucleotídeos de VWF humano é designada como SEQ ID N°: 20. SEQ ID N°: 21 é a sequência de aminoácido de VWF de comprimento total. Cada domínio de VWF é listado na tabela 1. TABELA 1. Sequências de VWF

[000129] A proteína de VWF como aqui utilizada pode ser um fragmento de VWF que compreende um domínio D' e um domínio D3 de VWF em que o fragmento de VWF liga-se ao fator VIII (FVIII) e inibe a ligação do VWF endógeno (VWF de comprimento total) para o FVIII. O fragmento de VWF compreendendo o domínio D' e o domínio D3 também pode incluir um domínio VWF selecionado do grupo constituído por um domínio A1, um domínio A2, um domínio A3, um domínio D1, um domínio D2, um domínio D4, um domínio B1, um domínio B2, um domínio B3, um domínio C1, um domínio C2, um domínio CK, um ou mais fragmentos e qualquer combinação das mesmas. Em uma modalidade, um fragmento de VWF compreende, consiste essencialmente em ou consiste em: (1) os domínios D' e D3 de VWF ou seus fragmentos; (2) os domínios D1, D' e D3 de VWF ou seus fragmentos; (3) os domínios D2, D' e D3 de VWF ou seus fragmentos; (4) os domínios D1, D2, D' e D3 de VWF ou seus fragmentos; ou (5) os domínios D1, D2, D', D3 e A1 de VWF ou seus fragmentos. O fragmento VWF descrito neste documento não contém um sítio de ligação a um receptor de eliminação do VWF. Em uma modalidade, o fragmento VWF da invenção não é ami- noácidos 764 a 1274 da SEQ ID N°: 21. O fragmento de VWF da presente invenção pode compreender quaisquer outras sequências ligadas a ou fundidas ao fragmento de VWF. Por exemplo, um fragmento VWF aqui descrito também pode compreender um peptídeo sinal.

[000130] Em uma modalidade, o fragmento de VWF que compreende um domínio D' e um domínio D3 liga-se ou está associado com uma proteína de FVIII. Por ligação a ou associando-se com uma proteína de FVIII, um fragmento VWF da invenção protege de FVIII de clivagem de protease e ativação de FVIII estabiliza a cadeia pesada e a cadeia leve de FVIII e impede a liberação de FVIII por receptores scavenger. Em outra modalidade, o fragmento VWF liga ou associa a uma proteína de FVIII e bloqueia ou impede a ligação da proteína de FVIII a fosfolipídios e proteína C ativada. Prevenir ou inibir a ligação da proteína de FVIII com VWF endógeno, completo, o fragmento VWF da invenção reduz a eliminação de FVIII por receptores de eliminação VWF e estende-se, assim, a meia-vida da proteína quimérica. A extensão de meia-vida de uma proteína quimérica é devido a ligação de ou associando-se com o fragmento VWF falta um sítio de ligação do VWF autorização do receptor para a proteína de FVIII e blindagem ou protegendo da proteína de FVIII por fragmento de VWF do VWF endógeno que contém o sítio de ligação do receptor de VWF. A proteína de FVIII ligada a ou protegida por fragmento de VWF também pode permitir a reciclagem de uma proteína de FVIII. Eliminando os sítios de ligação do receptor da via de eliminação de VWF contidos na molécula de VWF de comprimento total, os heterodímeros de FVIII/VWF da invenção são protegidos da via de eliminação VWF estendendo a meia-vida de FVIII.

[000131] Em uma modalidade, uma proteína de VWF útil para a presente invenção compreende um domínio D' e um domínio D3 de VWF em que o domínio D' é, pelo menos, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntico aos aminoácidos 764-866 da SEQ ID N°: 21 em que a proteína de VWF impede ou inibe de a ligação de VWF endógeno a FVIII. Em uma outra modalidade, uma proteína de VWF compreende um domínio D' e o domínio D3 de VWF em que o domínio D3 é, pelo menos, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntico aos aminoácidos 867-1240 da SEQ ID N°: 21 em que a proteína de VWF impede ou inibe a ligação de VWF endógeno a FVIII. Em algumas modalidades, uma proteína de VWF aqui descrita compreende, consiste essencialmente de ou consiste no domínio D' e domínio D3 de VWF, que são, pelo menos, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idênticos aos aminoácidos 764-1240 da SEQ ID N°: 21 em que a proteína de VWF impede de ou inibe a ligação de VWF endógeno a FVIII. Em outras modalidades, uma proteína de VWF compreende, consiste essencialmente em ou consiste nos domínios D1, D2, D' e D3 pelo menos 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idênticos aos aminoácidos 231240 de SEQ ID N°: 21 em que a proteína de VWF impede ou inibe a ligação de VWF endógeno a FVIII. Em ainda outras modalidades, a proteína de VWF também compreende um peptídeo sinal operacionalmente ligado aos mesmos.

[000132] Em algumas modalidades, uma proteína de VWF útil para a invenção consiste essencialmente de ou consiste (1) no domínio D'D3, o domínio D1D'D3, domínio D2D'D3 ou domínio D1D2D'D3 e (2) uma sequência de VWF adicional até cerca de 10 aminoácidos (por exemplo, quaisquer sequências de aminoácidos 764 a 1240 da SEQ ID N°: 21 para aminoácidos 764-1250 da SEQ ID N°: 21), até cerca de 15 amino- ácidos (por exemplo, quaisquer sequências de aminoácidos 764 a 1240 da SEQ ID N°: 21 para aminoácidos 764-1255 da SEQ ID N°: 21), até cerca de 20 aminoácidos (por exemplo, quaisquer sequências de ami- noácidos 764 a 1240 da SEQ ID N°: 21 para aminoácidos 764-1260 da SEQ ID N°: 21), até cerca de 25 aminoácidos (por exemplo, quaisquer sequências de aminoácidos 764 a 1240 da SEQ ID N°: 21 para aminoácidos 764-1265 da SEQ ID N°: 21) ou até cerca de 30 aminoácidos (por exemplo, quaisquer sequências de aminoácidos 764 a 1240 da SEQ ID N°: 21 para aminoácidos 764-1260 da SEQ ID N°: 21). Em uma modali- dade particular, a proteína de VWF que compreende ou consiste essen-cialmente no domínio D' e o domínio D3 não é nem os aminoácidos 764 a 1274 da SEQ ID N°: 21, nem o VWF maduro de comprimento total. Em algumas modalidades, o domínio D1D2 é expresso em trans com o domínio D'D3. Em algumas modalidades, o domínio D1D2 é expresso em cis com o domínio D'D3.

[000133] Em outras modalidades, a proteína de VWF que compreende os domínios D'D3 ligados aos domínios D1D2 compreende ainda um sítio de clivagem intracelular, por exemplo, (um sítio de clivagem por PACE (furina) ou PC5), permitindo a clivagem dos domínios de D1D2 os domínios D'D3 quando de expressão. Exemplos não limitantes do sítio de clivagem intracelular são divulgados aqui em outro lugar.

[000134] Em ainda outras modalidades, uma proteína de VWF compreende um domínio de D' e um domínio D3, mas não compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste (1) nos aminoácidos 1241 a 2813 correspondentes a SEQ ID N°: 21, (2) os aminoácidos 1270 a aminoácidos 2813 correspondentes a SEQ ID N°: 21, (3) os aminoácidos 1271 a aminoácidos 2813 correspondentes a SEQ ID N°: 21, (4) os aminoácidos 1272 a aminoácidos 2813 correspondentes a SEQ ID N°: 21, (5) os aminoácidos 1273 a aminoácidos 2813 correspondendo a SEQ ID N°: 21, (6) os aminoácidos 1274 a 2813 correspondendo à SEQ ID N°: 21 e quaisquer combinações dos mesmos.

[000135] Em ainda outras modalidades, uma proteína de VWF da presente invenção compreende, consiste essencialmente de ou consiste em uma sequência de aminoácidos correspondente ao domínio D', domínio D3 e domínio A1 em que a sequência de aminoácidos é pelo menos 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica aos aminoácidos 764-1479 da SEQ ID N°: 21 em que a proteína de VWF impede a ligação do VWF endógeno a FVIII. Em uma modalidade, a proteína de VWF da invenção não é aminoácidos 764 a 1274 da SEQ ID N°: 21.

[000136] Em algumas encarnações, uma proteína VWF da invenção compreende um domínio D' e um domínio D3, mas não compreende pelo menos um domínio VWF selecionado do grupo constituído por (1) um domínio A1, (2) um domínio A2, (3) um domínio A3, (4) um domínio D4, (5) um domínio B1, (6) um domínio B2, (7) um domínio B3, (8) um domínio C1, (9) um domínio C2, (10) um domínio CK, (11) um domínio CK e domínio C2, (12) um domínio CK, um domínio C2 e um domínio C1, (13) um domínio CK, um domínio C2, um domínio C1, um domínio B3, (14) um domínio CK, um domínio C2, um domínio C1, um domínio B3, um domínio B2, (15) um domínio CK, um domínio C2, um domínio C1, um domínio B3, um domínio B2 e um domínio B1, (16) um domínio CK, um domínio C2, um domínio C1, um domínio B3, um domínio B2, um domínio B1 e um domínio D4, (17) um domínio CK, um domínio C2, um domínio C1, um domínio B3, um domínio B2, um domínio B1, um domínio D4 e um domínio A3, (18) um domínio CK, um domínio C2, um domínio C1, um domínio B3, um domínio B2, um domínio B1, um domínio D4, um domínio A3 e um domínio A2, (19) um domínio CK, um domínio C2, um domínio C1, um domínio B3, um domínio B2, um domínio B1, um domínio D4, um domínio A3, um domínio A2 e um domínio A1 e (20) qualquer combinação dos mesmos.

[000137] Em ainda outras modalidades, a proteína de VWF compreende os domínios D'D3 e um ou mais domínios ou módulos. Exemplos de tais domínios ou módulos incluem, mas não estão limitados aos domínios e módulos descritos em Zhour et al Blood publicado online em 06 de abril de 2012:. DOI 10.1182/blood-2012-01-405134, que é aqui incorporado por referência na sua totalidade. Por exemplo, a proteína de VWF pode compreender o domínio D'D3 e um ou mais domínios ou módulos selecionados do grupo constituído por domínio A1, domínio A2, domínio A3, módulo D4N, módulo VWD4, módulo C8-4, módulo TIL-4, módulo C1, módulo C2, módulo C3, módulo C4, módulo C5, módulo C5, módulo C6 e quaisquer combinações.

[000138] Em ainda outras modalidades, a proteína de VWF está ligada a uma porção heteróloga em que a porção heteróloga está ligada ao N- terminal ou o C-terminal da proteína de VWF ou inserida imediatamente a jusante de um ou mais aminoácidos (por exemplo, um ou mais sítios de inserção de XTEN) na proteína de VWF. Por exemplo, os sítios de inserção para a unidade heteróloga na proteína de VWF podem ser no domínio D', domínio D3 ou ambos. A segunda unidade heteróloga (H2) pode ser um extensor de meia-vida.

[000139] Em determinadas modalidades, uma proteína de VWF da invenção forma um multímero, por exemplo, dímero, trímero, tetrâmero, pentâmero, hexâmero, heptâmero ou os multímeros de ordem superior. Em outras modalidades, a proteína de VWF é um monômero que possui apenas uma proteína de VWF. Em algumas modalidades, a proteína de VWF da presente invenção pode ter uma ou mais substituições exclusões, adições ou modificações de aminoácidos. Em uma modalidade, a proteína de VWF pode incluir substituições de aminoácidos, as exclusões, adições ou modificações tais que a proteína de VWF não é capaz de formar uma ligação dissulfeto ou formar um dímero ou um multímero. Em outra modalidade, a substituição de aminoácidos é dentro do domínio D' e do domínio D3. Em determinadas modalidades, a proteína de VWF contém pelo menos uma substituição do aminoácido em um resíduo correspondente ao resíduo 1099, resíduo 1142 ou ambos resíduos 1099 e 1142 correspondentes a SEQ ID N°: 21. Pelo menos uma substituição do aminoácido pode ser quaisquer aminoácidos que não ocorrem naturalmente no VWF de tipo selvagem. Por exemplo, a substituição do aminoácido pode ser qualquer aminoácidos além de cisteína, por exemplo, isoleucina, alanina, leucina, asparagina, lisina, ácido aspár- tico, metionina, fenilalanina, ácido glutâmico, treonina, glutamina, tripto- fano, glicina, valina, prolina, serina, tirosina, arginina ou histidina. Em outro exemplo, a substituição de aminoácido tem um ou mais aminoáci- dos que previnem ou inibem as proteínas de VWF de formar multímeros.

[000140] Em determinadas modalidades, a proteína de VWF útil neste documento pode ser ainda modificado para melhorar sua interação com de FVIII, por exemplo, para melhorar a afinidade de ligação de FVIII. Como um exemplo não limitativo, a proteína de VWF compreende um resíduo de serina no resíduo correspondente ao aminoácido 764 de SEQ ID N°: 21 e um resíduo de lisina no resíduo correspondente ao aminoácido 773 de SEQ ID N°: 21. Resíduos 764 e/ou 773 podem contribuir para a afinidade de ligação das proteínas de VWF a FVIII. Em outras modalidades, as proteínas de VWF úteis para a invenção podem ter outras modificações, por exemplo, a proteína pode ser peguilada, glicosilada, hesilada ou polissialilada.

II. B. As sequências XTEN

[000141] Tal como aqui utilizado, "sequência de XTEN" refere-se a po- lipeptídios de comprimento estendido com sequências substancialmente não repetitivas que não ocorrem naturalmente, que são compostos principalmente por aminoácidos hidrofílicos pequenos, com a sequência possuindo um baixo grau de ou nenhuma estrutura secundária ou terciária sob condições fisiológicas. Como parceiros da proteína quimérica, XTENs podem servir como um carreador, que confere certas propriedades farmacocinéticas desejáveis e físico-químicas e farmacêuticas, quando está ligado a uma proteína de VWF ou uma sequência de FVIII da invenção para criar uma proteína quimérica. Tais propriedades desejáveis incluem, mas não estão limitadas a parâmetros farmacoci- néticos melhorados e características de solubilidade. Tal como aqui uti- lizado, "XTEN" exclui especificamente anticorpos ou fragmentos de anticorpos, tais como anticorpos de cadeia simples ou fragmentos Fc de uma cadeia leve ou uma cadeia pesada.

[000142] A presente invenção proporciona que uma sequência que XTEN mais curta forneça uma propriedade que estende meia-vida melhorada em comparação com uma sequência de XTEN mais longa quando a sequência de XTEN é fundida a uma proteína de VWF e/ou a segunda região constante de Ig ou uma sua porção. Portanto, a sequência de XTEN fundida com uma proteína de VWF e/ou a segunda região constante de Ig ou uma porção da mesma contém menos de 288 ami- noácidos de comprimento, ou seja, é mais curta do que 288 aminoáci- dos. Em uma modalidade, a sequência de XTEN fundida com uma proteína de VWF e/ou a segunda região constante de Ig ou uma sua porção é constituída por uma sequência de aminoácidos que tem um compri-mento dentre 12 aminoácidos e 287 aminoácidos. Em uma outra modalidade, a sequência de XTEN fundida com uma proteína de VWF e/ou a segunda região constante de Ig ou uma sua porção compreende pelo menos cerca de 36 aminoácidos, pelo menos cerca de 42 aminoácidos, pelo menos cerca de 72 aminoácidos ou pelo menos cerca de 144 ami- noácidos, mas menos de 288 aminoácidos. Em outras modalidades, a sequência de XTEN fundida com uma proteína de VWF e/ou a segunda região constante de Ig ou uma sua porção é selecionada a partir de AE36, AG36, AE42, AG42, AE72, AG72, AE144 ou AG144. Em uma modalidade, a sequência de XTEN fundida com uma proteína de VWF e/ou a segunda região constante de Ig ou uma sua porção é uma se-quência de aminoácidos pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98 %, 99% ou 100% idêntica à SEQ ID N°: 9, SEQ ID N°: 10, SEQ ID N°: 11 ou SEQ ID N°: 14 em que a proteína quimérica apresenta uma meia-vida melhorada em comparação com uma proteína quimérica sem a sequência de XTEN.

[000143] A proteína quimérica da invenção pode ainda compreender sequências XTEN adicionais (segunda, terceira ou mais). A sequência de XTEN adicional pode ainda ser fundida com a proteína de FVIII ou a primeira região constante de Ig ou uma sua porção. As sequências XTEN adicionais podem ser de qualquer comprimento. Por exemplo, a sequência de XTEN adicional fundida com a proteína de FVIII ou a primeira região constante de Ig ou uma sua porção é um peptídio ou um polipeptídio tendo mais do que cerca de 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800 ou 2000 resíduos de aminoácidos. Em certas modalidades, a sequência de XTEN adicional é um peptídio ou um polipeptídio possuindo mais de cerca de 20 a cerca de 3000 resíduos de aminoácidos, maior do que cerca de 30 a cerca de 2500 resíduos, maior do que cerca de 40 a cerca de 2000 resíduos, maior do que cerca de 50 a cerca de 1500 resíduos, maior do que cerca de 60 a cerca de 1000 resíduos, maior do que cerca de 70 a cerca de 900 resíduos, maior do que cerca de 80 a cerca de 800 resíduos, maior do que cerca de 90 a cerca de 700 resíduos, maior do que cerca de 100 a cerca de 600 resíduos, maiores do que cerca de 110 a cerca de 500 resíduos ou maior do que cerca de 120 a cerca de 400 resíduos.

[000144] As sequências XTEN (isto é, a sequência de XTEN fundida com a proteína de VWF e/ou a segunda região constante de Ig ou uma sua porção ou a sequência de XTEN fundida com a proteína de FVIII e/ou a primeira região constante de Ig ou uma sua porção ou inserida nos um ou mais sítios de inserção no interior da proteína de FVIII) podem compreender um ou mais motivos de sequência de 9 a 14 resíduos de aminoácidos ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95 %, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ao motivo de sequência em que o motivo compreende, consiste essencial- mente de ou consiste em quatro a seis tipos de aminoácidos selecionados a partir do grupo que consiste em glicina (G), alanina (A), serina (S), treonina (T), glutamato (e) e prolina (P). Veja US 2010-0239554 A1.

[000145] Em algumas modalidades, a sequência de XTEN compreende motivos de sequências não sobrepostos em que pelo menos cerca de 80% ou pelo menos cerca de 85% ou pelo menos cerca de 90% ou pelo menos cerca de 91% ou pelo menos cerca de 92% ou pelo menos cerca de 93% ou pelo menos cerca de 94% ou pelo menos cerca de 95% ou pelo menos cerca de 96% ou pelo menos cerca de 97% ou pelo menos cerca de 98% ou pelo menos cerca de 99% ou cerca de 100 % da sequência consiste em várias unidades de sequências não sobrepostas selecionadas a partir de uma única família de motivo selecionada a partir da Tabela 2A, resultando em uma sequência de família. Tal como aqui utilizado, "família" significa que XTEN tem motivos selecionados apenas a partir de uma única categoria de motivo da Tabela 2A; isto é, XTEN de AD, AE, AF, AG, AM, AQ, BC ou BD e que quaisquer outros aminoácidos em XTEN não a partir de um motivo de família são selecionados para se conseguir uma propriedade necessária, como para permitir a incorporação de um sítio de restrição pelos nucleotídeos de codificação, incorporação de uma sequência de clivagem ou para alcançar uma melhor ligação a FVIII ou VWF. Em algumas modalidades de famílias XTEN, uma sequência de XTEN compreende várias unidades de motivos de sequência não sobreposta da família de motivo AD ou da família de motivo AE ou da família de motivo AF ou da família de motivo AG ou da família de motivo AM ou da família de motivo AQ ou da família BC ou da família BD, com a XTEN resultante expondo a variedade de homologia descrita acima. Em outras modalidades, o XTEN compreende várias unidades de sequências de motivo de duas ou mais famílias de motivo da Tabela 2A. Essas sequências podem ser selecio- nadas para alcançar características físico-químicas desejadas, incluindo propriedades como carga líquida, hidrofilia, falta de estrutura secundária ou falta de repetitividade que são conferidas pela composição de aminoácidos dos motivos, descritos mais detalhadamente abaixo. Nas modalidades descritas acima neste parágrafo, os motivos incorporados ao XTEN podem ser selecionados e montados usando os métodos descritos neste documento para conseguir uma XTEN de cerca de 36 até cerca de 3000 resíduos de aminoácidos. Tabela 2A. Motivos de sequência de XTEN de 12 Aminoácidos e Famílias de Motivo • Denota sequência de motivo individual que, quando usados em conjunto em várias permutações, resulta em uma "sequência de família".

[000146] Em algumas modalidades, a sequência de XTEN usada na invenção é, pelo menos, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em AE42, AG42, AE48, AM48, AE72, AG72, AE108, AG108, AE144, AF144, AG144, AE180, AG180, AE216, AG216, AE252, AG252, AE288, AG288, AE324, AG324, AE360, AG360, AE396, AG396, AE432, AG432, AE468, AG468, AE504, AG504, AF504, AE540, AG540, AF540, AD576, AE576, AF576, AG576, AE612, AG612, AE624, AE648, AG648, AG684, AE720, AG720, AE756, AG756, AE792, AG792, AE828, AG828, AD836, AE864, AF864, AG864, AM875, AE912, AM923, AM1318, BC864, BD864, AE948, AE1044, AE1140, AE1236, AE1332, AE1428, AE1524, AE1620, AE1716, AE1812, AE1908, AE2004A, AG948, AG1044, AG1140, AG1236, AG1332, AG1428, AG1524, AG1620, AG1716, AG1812, AG1908 e AG2004. Veja US 2010-0239554 A1.

[000147] Em uma modalidade, a sequência de XTEN é, pelo menos, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em AE42 (SEQ ID N°: 9), AE72 (SEQ ID N°: 10), AE144_2A (SEQ IDNO: 55), AE144_3B (SEQ ID N°: 56), AE144_4A (SEQ ID N°: 57), AE144_5A (SEQ ID NO : 58), AE144_6B (SEQ ID N°: 59), AG144_A (SEQ ID N°: 60), AG144_B (SEQ ID N°: 61), AG144_C (SEQ ID N°: 62), AG144_F (SEQ IDNO: 63), AE864 ( SEQ ID N°: 15), AE576 (SEQ ID N°: 16), AE288 (SEQ ID N°: 8), AE288_2 (SEQ ID N°: 54), AE144 (SEQ ID N°: 11), AG864 (SEQ ID N°: 17 ), AG576 (SEQ ID N°: 18), AG288 (SEQ ID N°: 19), AG144 (SEQ ID N°: 14) e quaisquer combinações dos mesmos. Em uma outra modalidade, a sequência de XTEN é selecionada a partir do grupo que consiste em AE42 (SEQ ID N°: 9), AE72 (SEQ ID N°: 10), AE144_2A (SEQ IDNO: 55), AE144_3B (SEQ ID N°: 56), AE144_4A (SEQ ID N°: 57), AE144_5A (SEQ IDNO: 58), AE144_6B (SEQ ID N°: 59), AG144_A (SEQ ID N°: 60), AG144_B (SEQ ID N°: 61), AG144_C (SEQ ID N°: 62 ), AG144_F (SEQ IDNO: 63), AE864 (SEQ ID N°: 15), AE576 (SEQ ID N°: 16), AE288 (SEQ ID N°: 8), AE288_2 (SEQ ID N°: 54), AE144 (SEQ ID N°: 11), AG864 (SEQ ID N°: 17), AG576 (SEQ ID N°: 18), AG288 (SEQ ID N°: 19), AG144 (SEQ ID N°: 14) e quaisquer combinações dos mesmos. Em uma modalidade específica, a sequência de XTEN é AE288. As sequências de aminoácidos para certas sequências XTEN da invenção são mostradas na Tabela 2B. Tabela 2B. Sequências de XTEN

[000148] Nas modalidades em que o componente(s) XTEN tem me- nos de 100% dos seus aminoácidos consistindo de 4, 5 ou 6 tipos de aminoácidos selecionados a partir de glicina (G), alanina (A), serina (S), treonina (T), glutamato (E) e prolina (P) ou menos de 100% da sequência consistindo dos motivos de sequência da Tabela 3 ou sequências XTEN da tabela 4 e 13-17, os outros resíduos de aminoácidos do XTEN são selecionados a partir de qualquer um dos outros 14 L-aminoácidos naturais, mas são preferencialmente selecionados de aminoácidos hi- drofílicos, de forma que a sequência de XTEN contenha pelo menos uns 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou pelo menos cerca de 99% de aminoácidos hidrofílicos. Os aminoácidos XTEN que não são glicina (G), alanina (A), serina (S), treonina (T), glutamato (E) e prolina (P) ou são intercalados por toda a sequência de XTEN, localizados dentro ou entre os motivos de sequência ou estão concentrados em um ou mais trechos curtos da sequência de XTEN, por exemplo, para criar um vinculador entre o XTEN e os componentes de VWF e FVIII. Nestes casos em que o componente XTEN compreende aminoácidos diferentes de glicina (G), alanina (A), serina (S), treonina (T), glutamato (E) e prolina (P), é preferível que menos de cerca de 2% ou menos de cerca de 1% dos aminoácidos sejam resíduos hidrofóbicos de forma que as sequências resultantes geralmente tenham falta de estrutura secundária, por exemplo, não tendo mais do que 2% de alfa-hélices ou 2% de beta- folhas, conforme determinado pelos métodos divulgados neste documento. Resíduos hidrofóbicos que são menos favorecidos no construto de XTEN incluem triptofano, fenilalanina, tirosina, leucina, isoleucina, valina e metionina. Além disso, pode-se projetar as sequências XTEN que contêm menos de 5% ou menos de 4% ou menos de 3% ou menos de 2% ou menos de 1% ou nenhum dos seguintes aminoácidos: cisteína (para evitar a formação de bissulfeto e oxidação), metionina (para evitar a oxidação), asparagina e glutamina (para evitar desamidação). Desta forma em algumas modalidades, o componente XTEN compreende outros aminoáci- dos além de glicina (G), alanina (A), serina (S), treonina (T), glutamato (E) e prolina (P) têm uma sequência com menos de 5% dos resíduos contribuindo para alfa-hélices e folhas-beta como medido pelo algoritmo Chou-Fasman e tem pelo menos 90% ou pelo menos cerca de 95% ou uma formação espiralada mais aleatória, medida pelo algoritmo GOR.

[000149] Noutras modalidades, a sequência de XTEN utilizada na invenção afeta a propriedade física ou química, por exemplo, farmacoci- nética, da proteína quimérica da presente invenção. A sequência de XTEN utilizada na presente invenção pode exibir uma ou mais das seguintes propriedades vantajosas: flexibilidade conformacional, solubilidade aquosa melhorada e grau elevado de resistência à protease, baixa imunogenicidade, baixa ligação a receptores de mamífero ou raios aumentados hidrodinâmicos (ou Stokes). Em uma modalidade específica, a sequência de XTEN ligada a uma proteína de FVIII na presente invenção aumenta as propriedades farmacocinéticas tais como a meia-vida mais longa ou aumento da área sob a curva (AUC), de modo que a proteína quimérica aqui descrita permanece in vivo para um aumento do período de tempo em relação ao FVIII de tipo selvagem. Noutras modalidades, a sequência de XTEN utilizada na presente invenção aumenta as propriedades farmacocinéticas tais como a meia-vida mais longa ou aumento da área sob a curva (AUC), de modo que fica a proteína de FVIII in vivo para um aumento do período de tempo em relação ao FVIII de tipo selvagem.

[000150] Uma modalidade da presente invenção é uma proteína de fusão FVIII/VWF compreendendo uma porção de FVIII fundida com uma região Fc de VWF e uma porção fundida com uma região Fc em que uma sequência de XTEN (por exemplo, AE288) é inserida dentro da porção de FVIII e em que uma sequência de XTEN tendo menos de 288 aminoácidos (por exemplo, AE144) é inserida entre a porção de VWF e a porção de Fc. Como descrito nos exemplos, a inserção de uma XTEN tendo menos do que 288 aminoácidos entre a porção de VWF e a porção de Fc tem um maior efeito sobre a farmacocinética da proteína quimérica que a inserção de uma XTEN tendo 288 aminoácidos entre a porção de VWF e a porção de Fc. Por exemplo, a inserção de uma sequência de XTEN tendo menos do que 288 aminoácidos entre a porção de VWF e a porção de Fc de proteína de fusão FVIII/VWF pode aumentar a meia-vida terminal da proteína quimérica em comparação com uma XTEN tendo 288 aminoácidos. Em algumas modalidades, a meia-vida terminal é aumentada pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25% ou pelo menos cerca de 30%, relativa à inserção de uma sequência de XTEN tendo 288 aminoácidos. Em uma modalidade particular, a meia-vida terminal é aumentada pelo menos cerca de 35% em relação à inserção de uma XTEN tendo 288 aminoácidos. A inserção de uma sequência de XTEN tendo menos de 288 aminoácidos também pode aumentar o valor de AUC da proteína quimérica. Em algumas mo-dalidades, a AUC é aumentada pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 100% ou pelo menos cerca de 200% em relação à inserção de uma XTEN tendo 288 aminoácidos. Em uma modalidade particular, a AUC é aumentada em cerca de duas vezes. A inserção de uma sequência de XTEN tendo menos de 288 aminoácidos também pode reduzir a depuração da proteína quimérica. Por exemplo, a depuração pode ser reduzida em pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25% ou pelo menos cerca de 30% em relação à inserção de uma sequência de XTEN tendo 288 aminoácidos. A inserção de uma sequência de XTEN tendo menos do que 288 aminoácidos pode aumentar o tempo médio de residência (MRT) e/ou diminuir o volume aparente da distribui-ção no estado estacionário (Vss) em relação à inserção de uma XTEN tendo 288 aminoácidos.

[000151] Uma variedade de métodos e ensaios pode ser utilizada para determinar as propriedades físicas/químicas das proteínas que compreendem a sequência de XTEN. Tais métodos incluem, mas não estão limitados a centrifugação analítica ePR, HPLC de troca de íon, HPLC de exclusão de tamanho, HPLC do inversor da fase espalhamento de luz eletroforese capilar, dicroísmo circular, calorimetria exploratória diferencial, fluorescência, HPLC de troca de íon, HPLC de exclusão de tamanho, IR, NMR espectroscopia Raman, refratometria e UV/espectrosco- pia visível. Métodos adicionais são divulgados em Amau et al, Prot Expr and Purif 48, 1-13 (2006).

[000152] Exemplos adicionais de sequências de XTEN podem ser utilizados de acordo com a presente invenção e são descritos na Publicação de Patente US Nos. 2010/0239554 A1, 2010/0323956 A1, 2011/0046060 A1, 2011/0046061 A1, 2011/0077199 A1, 2011/ 0172146 ou A1 ou publicação de Patente Internacional Nos. WO 2010091122 A1, WO 2010144502 A2, WO 2010144508 A1, WO 2011028228 A1, WO 2011028229 A1, WO 2011028344 A2 ou WO 20130122617 A1.

II.C. Proteína de Fator VIII (FVIII)

[000153] "Uma proteína de FVIII" como usado aqui significa um po- lipeptídio de FVIII funcional em seu papel normal da coagulação, a menos que especificado de outra forma. O termo de FVIII proteína inclui um fragmento funcional, variante, analógico ou derivados dele que retém a função do tipo selvagem completos no fator VIII na via da coagulação. "Uma proteína de FVIII" é usada permutavelmente com polipeptídio de FVIII (ou proteínas) ou de FVIII. Exemplos das funções de FVIII incluem, mas não limitados a uma capacidade de ativar a coagulação, uma capacidade de agir como um cofator para o fator IX ou uma capacidade de formar um complexo com o fator IX na presença de Ca2+ e fosfolipídios, que em seguida, convertem o fator X para a forma ativada Xa. As proteínas de FVIII podem ser proteínas de FVIII humanas, suínas, caninas e murinas. Além disso, as comparações entre o de FVIII de humanos e de outras espécies identificaram resíduos conservados que são prováveis de serem necessários para a função (Cameron et al, Thromb. Haemost. 79:317-22 (1998); US 6.251.632).

[000154] A série de testes estão disponíveis para avaliar a função do sistema de coagulação: ativado teste parcial de tromboplastina (TTPA) ensaio cromogênico ensaio ROTEM, teste de protrombina tempo (PT) (também usado para determinar o INR), fibrinogênio teste (muitas vezes pelo método de Clauss), contagem de plaquetas, função plaquetária teste (muitas vezes por PFA-100), TCT, sangrando o tempo, teste de mistura (se uma anormalidade corrige se plasma do paciente é misturado com plasma normal) ensaios de fator de coagu- lação, anticorpos antifosfolipídio, testes D-dímero, genéticos (por exemplo, fator V de Leiden, mutação da protrombina G20210A), diluir o tempo de veneno de víbora de Russell de (dRVVT), testes de função plaquetária diversos, tromboelastografia (TEG ou Sonoclot), trombo- elastrometria (TEM®, por exemplo, ROTEM®) ou tempo de lise de eu- globulina (ELT).

[000155] O teste de TTPa é um indicador de desempenho medindo a eficácia de ambas vias "intrínsecas" (também referida como via de ativação de contato) e as vias de coagulação comuns. Este teste é comumente usado para medir a atividade de coagulação de comercialmente disponível recombinante de coagulação fatores, por exemplo, FVIII ou FIX. É usado em conjunto com o tempo de protrombina (PT), que mede a via extrínseca.

[000156] Análise ROTEM fornece informação sobre a cinética de toda da hemostase: coagulação do tempo, a formação de coágulos, a estabilidade do coágulo e Lise. Os diferentes parâmetros no tromboelasto- metria são dependentes da atividade do sistema de coagulação plas- mática, função plaquetária, fibrinólise ou muitos fatores que influenciam essas interações. Este ensaio pode fornecer uma visão completa da he- mostase secundária.

[000157] As sequências do polinucleotídeo e polipeptídio FVIII de comprimento total são conhecidas, assim como muitos fragmentos funcionais, mutantes e versões modificadas. Exemplos de sequências de FVIII humanas (de comprimento total) são mostradas abaixo. TABELA 3. Sequência de Aminoácidos de Fator VIII de Comprimento Total FVIII completo (de FVIII peptídeo sinal sublinhado; Cadeia pesada de FVIII é dupla sublinhado; Domínio B está em itálico; e cadeia leve de FVIII é em texto sem formatação) TABELA 4. Sequência nucleotídica codificação de FVIII completo (SEQ ID Nº: 66)* *Os ácidos nucleicos sublinhados codificam um peptídeo de sinal.

[000158] Os polipeptídios de FVIII incluem, por exemplo, FVIII de comprimento total, FVIII de comprimento total menos Met no terminal N, FVIII maduro (menos a sequência de sinal), FVIII maduro com um Met adicional no terminal N e/ou FVIII com uma deleção total ou parcial do domínio B. As variantes de FVIII incluem deleções do domínio B, tanto deleções parciais quanto totais.

[000159] A sequência de FVIII humana madura nativa é apresentada como SEQ ID N°: 65. Uma proteína de FVIII nativa tem a seguinte fórmula: A1-a1-A2-a2-B-a3-A3-C1-C2, onde A1, A2 e A3 são os estruturalmente relacionados com "domínios A," B é o "domínio B," C1 e C2 são estruturalmente relacionados "domínios C" e a1, a2 e a3 são regiões a- cídicas espaçadoras. Referindo-se à posição de sequência primária de aminoácidos em SEQ ID N°: 65, o domínio a1 de FVIII humano estende- se desde Ala1 a cerca de Arg336, a região espaçadora de a1 estende-se desde cerca de Met337 a cerca de Val374, o domínio a2 estende-se desde cerca de Ala375 a cerca de Tyr719, a região de a2 espaçadora se estende de cerca de Glu720 para cerca de Arg740, o domínio B estende- se desde cerca de Ser741 a cerca Arg 1648, a região a3 espaçadora se estende de cerca de Glu1649 a cerca de Arg1689, o domínio A3 se estende de cerca de Ser1690 a cerca de Leu2025, o domínio C1 estende- se desde cerca de Gly2026 a cerca de Asn2072 e o domínio C2 estende- se desde cerca de Ser2073 para Tyr2332. Além do sítio de clivagem pro- teolítica específica, designação das localizações dos limites entre os domínios e regiões de FVIII podem variar em referências literárias diferentes. Os limites, observado neste documento, portanto, são designados como aproximado pelo uso do termo "cerca de."

[000160] O gene do de FVIII humano foi isolado e expresso em células de mamífero (Toole, J. J. et al, Nature 312:342-347 (1984); Gitschier, J. et al, Nature 312:326-330 (1984); Wood, W. I. et al, Nature 312:330-337 (1984); Vehar, G. A. et al, Nature 312:337-342 (1984); WO 87/04187; WO 88/08035; WO 88/03558; e Pat. U.S. No. 4.757.006). A sequência de aminoácidos de FVIII foi deduzida do cDNA, conforme mostrado no U.S. Pat. No. 4.965.199. Além disso, FVIII de domínio B deletado parcial ou totalmente é mostrado em Pat. U.S. Nos. 4.994.371 e 4.868.112. Em algumas modalidades, o FVIII de domínio B humano é substituído com o domínio B de fator V humano como mostrado em Pat. U.S. No. 5.004.803. A sequência de cDNA que codifica o Fator FVIII humano e a sequência de aminoácido são mostrados na SEQ ID NOs: 1 e 2, respectivamente, da Publicação de Pedido U.S. No. 2005/0100990.

[000161] A sequência do de FVIII suíno está publicada, (Toole, J. J. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5939-5942 (1986). Além disso, a sequência completa do cDNA de suínos Obtida de amplificação por PCR de sequências de FVIII de uma biblioteca de cDNA de baço de porco tem sido relatada em Healey, J. F. et al, Blood 88:4209-4214 (1996). Os FVIII humanos/suínos híbridos tendo substituições de todos os domínios, todas as subunidades e sequências de aminoácidos específicas foram divulgados na Pat. U.S. No. 5.364.771 por Lollar e Runge e em WO 93/20093. Mais recentemente, as sequências de aminoácidos e nu- cleotídica correspondentes dos domínios A1 e A2 do de FVIII suíno e um FVIII quimérico com os domínios A1 e/ou A2 substituídos pelos domínios humanos correspondentes foram relatadas em WO 94/11503, incorporado neste documento em sua totalidade por referência. Pat. U.S. No. 5.859.204, Lollar, J. S, também divulga o cDNA suíno e as sequências de aminoácidos deduzidas. Pat. U.S. No. 6.458.563 divulga um FVIII porcino de domínio B deletado.

[000162] Pat. U.S. No. 5.859.204, Lollar, J. S, incorporada neste documento em sua totalidade por referência, relata mutantes funcionais de FVIII tendo antigenicidade reduzida e imunorreatividade reduzida. Pat. U.S. No. 6.376.463 de Lollar, J. S. relata também mutantes de FVIII tendo reduzida imunorreatividade. Pedido US Publ. No. 2005/0100990 para Saenko et al. relata mutações funcionais no domínio A2 de FVIII.

[000163] Em uma modalidade, FVIII (ou porção de FVIII de uma proteína quimérica) pode ser, pelo menos, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos de FVIII de aminoácidos 1-1438 da SEQ ID N°: 67 ou os aminoácidos 1-2332 da SEQ ID N°: 65 (sem uma sequência de sinal) ou uma sequência de FVIII de aminoácido dos aminoácidos 1 a 19 da SEQ ID N°: 64 e 1-1438 de SEQ ID N°: 67 ou os aminoácidos 1 a 19 da SEQ ID N°: 64 e aminoácidos 1 a 2332 da SEQ ID N°: 65 (com uma sequência de sinal) em que o FVIII tem uma atividade de coagulação, por exemplo, ativa o Fator IX como um cofator para converter fator X ativado para o fator X. FVIII (FVIII ou porção de uma proteína quimérica) pode ser idêntico a uma sequência de aminoácidos de FVIII de aminoácidos 1-1438 da SEQ ID N°: 67 ou aminoácidos 1-2332 da SEQ ID N°: 65 (sem uma sequência de sinal). O FVIII pode incluir ainda uma sequência de sinal.

[000164] Um "domínio B" do de FVIII, conforme usado neste documento, é igual ao domínio B conhecido na técnica que é definido pela identidade de sequência de aminoácidos interna e sítios de clivagem proteolítica pela trombina, por exemplo, resíduos Ser741-Arg1648 do de FVIII humano de comprimento total. Os outros domínios de FVIII humanos são definidos pelos seguintes resíduos de aminoácidos: A1, resíduos Ala1-Arg372; A2, resíduos Ser373-Arg740; A3, resíduos Ser1690- Asn2019; C1, resíduos Lys2020-Asn2172; C2, resíduos Ser2173- Tyr2332. Sequência A3-C1-C2 incluem os resíduos Ser1690-Tyr2332. A sequência restante, resíduos Glu1649-Arg1689, é geralmente referida como região ácida a3. As localizações dos limites para todos os domínios, incluindo os domínios B, para o FVIII suíno, de camundongo e canino também são conhecidas na técnica. Em uma modalidade, o domínio B de FVIII é deletado ("FVIII de domínio B deletado" ou "BDD de FVIII"). Um exemplo de um FVIII de BDD é REFACTO® (FVIII de BDD recombinante), que tem a mesma sequência que a porção de FVIII da sequência na TABELA 5. (Cadeia pesada de FVIII de BDD é duplamente sublinhada; domínio B está em itálico; e cadeia leve de FVIII de BDD é em texto sem formatação). Uma sequência de nucleotídeos que codifica Tabela 6 (SEQ ID N°: 68) é mostrada na Tabela 6. TABELA 5. Sequência de Aminoácidos de Fator VIII de domínio dele- tado (BDD de FVIII) TABELA 6. Sequência de Nucleotídeo que codifica BDD FVIII (SEQ ID N°: 68)* *Os ácidos nucleicos sublinhados codificam um peptídeo de sinal.

[000165] Um " FVIII de domínio B deletado" pode ter as deleções totais ou parciais divulgadas nas Pat. U.S. Nos. 6.316.226, 6.346.513, 7.041.635, 5.789.203, 6.060.447, 5.595.886, 6.228.620, 5.972.885, 6.048.720, 5.543.502, 5.610.278, 5.171.844, 5.112.950, 4.868.112 e 6.458.563. Em algumas modalidades, uma sequência de FVIII de domínio B deletado compreende qualquer uma das deleções divulgadas na coluna 4, linha 4 para coluna 5, linha 28 e exemplos 1-5 da Pat. U.S. No. 6.316.226 (também em U.S. 6.346.513). Em outra modalidade, um domínio B excluído o fator VIII é eliminado e o domínio B S743/Q1638 fator VIII (de FVIII de BDD SQ) (por exemplo, fator VIII, tendo uma de- leção de aminoácido 744 de aminoácido 1637, por exemplo, fator VIII, tendo 1-743 de aminoácidos e aminoácidos 1638-2332 de SEQ ID N°: 65, por exemplo, SEQ ID N°: 67). Em algumas modalidades, uma sequência de FVIII de domínio B deletado compreende qualquer uma das deleções divulgadas na coluna 2, linhas 26-51 e exemplos 5-8 da Patente U.S. N°. 5.789.203 (também US 6.060.447, US 5.595.886 e US 6.228.620). Em algumas modalidades, um fator VIII de domínio B dele- tado tem uma exclusão descrita na col. 1, linhas 25 para coluna 2, linha 40 da Patente US No. 5.972.885; col. 6, linhas 1-22 e exemplo 1 da Patente U.S. No. 2, linhas 17-46 da Patente U.S. No. 5.543.502; coluna 4, linha 22 para coluna 5, linha 36 da patente U.S. no. 5.171.844; col. 2, linhas 55-68, figura 2 e exemplo 1 da Patente U.S. No. 5.112.950; coluna 2, linha 2 para coluna 19, linha 21 e tabela 2 da Patente U.S. No. 4.868.112; coluna 2, linha 1 para coluna 3, linha 19, coluna 3, linha 40 para coluna 4, linha 67, coluna 7, linha 43 para coluna 8, linha 26 e col. 11, linha 5 para coluna 13, linha 39 da patente US NO. 7.041.635; ou col. 4, linhas 25-53 da Patente U.S. No. 6.458.563. Em algumas modalidades, um de FVIII de domínio B deletado tem uma deleção da maior parte do domínio B, mas ainda contém as sequências aminoterminais do domínio B que são essenciais para o processamento proteolítico in vivo do produto de tradução primário em duas cadeias polipeptídicas (isto é, sítio de processamento intracelular), conforme divulgado na WO 91/09122. Em algumas modalidades, um de FVIII de domínio B deletado é construído com uma deleção dos aminoácidos 747-1638, isto é, virtualmente, uma deleção completa do domínio B. Hoeben R.C. et al. J. Biol. Chem. 265 (13): 7318-7323 (1990). Um fator VIII de domínio B deletado pode conter também uma deleção de aminoácidos 771-1666 ou amino- ácidos 868-1562 de FVIII. Meulien P. et al. Protein Eng. 2(4): 301-6 (1988). Deleções do domínio B adicionais que são parte da divulgação incluem, por exemplo, deleção dos aminoácidos 982 até 1562 ou 760 até 1639 (Toole et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1986) 83, 59395942)), 797 até 1562 (Eaton et al. Biochemistry (1986) 25:8343-8347)), 741 até 1646 (Kaufman (Pedido PCT publicado No. WO 87/04187)), 747-1560 (Sarver et al, DNA (1987) 6:553-564)), 741 até 1648 (Pasek (pedido PCT No.88/00831)) ou 816 até 1598 ou 741 até 1648 (Lagner (Behring Inst. Mitt. (1988) No 82:16-EP 25, 295597)). Em outras modalidades, BDD de FVIII inclui um polipeptídio de FVIII contendo fragmentos do domínio B que mantêm um ou mais sítios de glicosilação N-liga- dos, por exemplo, resíduos de 757, 784, 828, 900, 963 ou, opcionalmente, 943, que correspondem à sequência de aminoácidos da sequência de FVIII completa. Exemplos de fragmentos de domínio B incluem 226 aminoácidos ou 163 aminoácidos do domínio B como foi descrito em Miao, H.Z. et al, Blood 103(a): 3412-3419 (2004), Kasuda, A et al, J. Thromb. Haemost. 6: 1352-1359 (2008) e Pipe, S.W. et al, J. Thromb. Haemost. 9: 2235-2242 (2011) (ou seja, os primeiros 226 aminoácidos ou 163 aminoácidos do domínio B são retidos). Em ainda outras modalidades, BDD de FVIII ainda compreende uma mutação pontual no resíduo 309 (de Phe para Ser) para melhorar a expressão da proteína do BDD de FVIII. Ver Miao, H.Z. et al, Blood 103(a): 3412-3419 (2004). Em outras modalidades, ainda, o de FVIII de BDD inclui um polipeptídio de FVIII contendo uma porção do domínio B, mas não contendo um ou mais sítios da clivagem de furina (por exemplo, Arg1313 e Arg-1648). Ver Pipe, S.W. et al, J. Thromb. Haemost. 9: 2235-2242 (2011). Cada uma das deleções anteriores pode ser feita em qualquer sequência de FVIII.

[000166] Em algumas modalidades, o FVIII tem um domínio B parcial. Em algumas modalidades, a proteína de FVIII com um domínio B parcial é FVIII198. FVIII198 é um domínio B parcial que contém a molécula de cadeia única de FVIIIFc-226N6. O número 226 representa o aminoácido 226 do N-terminal de domínio B de FVIII e N6 representa seis sítios de N-glicosilação no domínio B.

[000167] Em uma modalidade, FVIII é clivado logo após arginina no aminoácido 1648 (no Fator VIII de comprimento total ou SEQ ID N°: 65), aminoácido 754 (no Fator VIII de domínio B deletado S743/Q1638 ou SEQ ID N°: 67) ou o correspondente resíduo de arginina (ou variantes), resultando assim em uma cadeia pesada e uma cadeia leve. Em outra modalidade, o FVIII é composto por uma cadeia pesada e uma cadeia leve, que são ligadas ou associadas por um metal mediado por íon não covalente.

[000168] Em outras modalidades, o FVIII é um FVIII de cadeia única que não foi clivado logo após arginina no aminoácido 1648 (em FVIII de comprimento total ou SEQ ID N°: 65), aminoácido 754 (no FVIII de domínio B deletado S743/Q1638 ou SEQ ID N°: 67) ou o resíduo de argi- nina correspondente (em outras variantes). Um FVIII de cadeia única pode incluir uma ou mais substituições de aminoácidos. Em uma modalidade, a substituição de aminoácidos está em um resíduo correspondente ao resíduo 1648, resíduo 1645 ou ambos polipeptídios de Fator VIII de comprimento total madura(SEQ ID N°: 65) ou resíduo 754, resíduo 751 ou ambos de Fator VIII de SQ BDD (SEQ ID N°: 67). A substi tuição de aminoácidos pode ser quaisquer aminoácidos excepto a argi- nina, por exemplo, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, tre- onina, triptofano, valina, alanina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutâmico, glutamina, glicina, prolina, selenocisteína, serina, tiro- sina, histidina, ornitina, pirrolisina ou taurina.

[000169] FVIII pode ainda ser clivado pela trombina e então ativado como FVIIIa, servindo como um cofator para fator IX ativado (FIXa). E FIX ativado juntamente com FVIII forma um complexo de Xase e converte o fator X em fator X ativado (FXa). Para a ativação, o FVIII é clivado pela trombina após três resíduos de arginina em aminoácidos 372, 740 e 1689 (correspondentes a aminoácidos 372, 740 e 795 na sequência de FVIII de domínio B deletado), a clivagem gerando FVIIIa tendo 50kDa A1, A2 43kDa e cadeias de 73kDa A3-C1-C2. Em uma modalidade, a proteína de FVIII útil para a presente invenção é FVIII inativo. Em outra modalidade, a proteína de FVIII é uma de FVIII ativado.

[000170] A proteína tendo polipeptídio de FVIII ligado ou associado com a proteína de VWF pode compreender uma sequência pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à SEQ ID N°: 65 ou 67 em que a sequência tem a atividade de coagulação de FVIII, por exemplo, s ativação do Fator IX como um co- fator para converter Fator X em Fator X ativado (FXa).

[000171] Proteínas e polipeptídios "híbridos" ou "quiméricos", tal como aqui utilizados, incluem uma combinação de uma primeira cadeia de po- lipeptídios, por exemplo, a proteína de VWF fundida com uma sequência de XTEN tendo menos de 288 aminoácidos e uma primeira região constante de Ig ou uma sua porção, com uma segunda cadeia de polipeptí- dios, por exemplo, uma proteína de FVIII fundida com uma segunda região constante de Ig ou uma porção da mesma, formando deste modo um heterodímero. O polipeptídio quimérico e o segundo polipeptídio em um híbrido podem estar associados um ao outro através de interações proteína-proteína, tais como interações hidrofóbicas ou carga-carga. Em uma outra modalidade, um primeiro polipeptídio compreende uma proteína de fusão proteína de VWF-XTEN-Fc e um segundo polipeptídio de fusão compreende a proteína de FVIII-Fc, fazendo do híbrido um he- terodímero em que XTEN contém menos de 288 aminoácidos. Em outras modalidades, o primeiro polipeptídio compreende uma proteína de fusão de VWF-XTEN-Fc e o segundo polipeptídio compreende proteína de fusão FVIII(X)-Fc, fazendo com do híbrido um heterodímero em que XTEN contém menos de 288 aminoácidos. O primeiro polipeptídio e o segundo polipeptídio podem ser associados através de uma ligação covalente, por exemplo, uma ligação de dissulfureto entre a região Fc primeira e a segunda região Fc. O primeiro polipeptídio e o segundo poli- peptídio também podem ser associados com os outros através da ligação entre o fragmento de VWF e a proteína de FVIII.

[000172] Uma proteína de FVIII útil na presente invenção pode incluir FVIII tendo uma ou mais sequências de XTEN, que não afetam a atividade de coagulação de FVIII. Tais sequências XTen pode ser fundida com a extremidade C-terminal ou N-terminal da proteína de FVIII ou inseridas entre um ou mais dos dois resíduos de aminoácidos na proteína de FVIII enquanto as inserções não afetam a atividade de FVIII de coagulação ou a função de FVIII. Em uma modalidade, as inserções melhoram propriedades farmacocinéticas da proteína de FVIII (por exemplo, meia-vida). Em uma outra modalidade, as inserções podem ser múltiplas inserções, por exemplo, mais do que duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez inserções. Exemplos de sítios de inserção incluem, mas não estão limitados aos sítios listados nas Tabelas 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou quaisquer combinações dos mesmos.

[000173] A proteína de FVIII ligada a uma ou mais sequências de XTEN pode ser representada como FVIII(X2) ou FVIII(abi-X- FVIII(c^d),onde FVIII^b compreende, consiste essencialmente de ou consiste em uma primeira porção de uma proteína de FVIII de resíduo de aminoácido "a" para o resíduo de aminoácido "b"; X2 compreende, consiste essencialmente de ou consiste em uma ou mais sequências de XTEN, FVIII(cd compreende, consiste essencialmente de ou consiste em uma segunda porção de uma proteína de FVIII de resíduo de ami- noácido "c" para o resíduo de aminoácido "d"; a é o resíduo de aminoácido de N-terminal da primeira porção da proteína de FVIII, b é o resíduo de aminoácido de C-terminal da primeira porção da proteína de FVIII, mas também é o resíduo de aminoácido de N- terminal dos dois aminoácidos de um sítio de inserção em que se insere a sequência de XTEN, c é o resíduo de aminoácido de N-terminal da segunda porção da proteína de FVIII, mas é também o resíduo de aminoácido de C- terminal dos dois aminoácidos de um sítio de inserção em que se insere a sequência de XTEN e d é o resíduo de aminoácido de C-terminal da proteína de FVIII e em que a primeira porção da proteína de FVIII e a segunda porção da proteína de FVIII não são idênticas umas com as outras e são de comprimento suficiente em conjunto de tal modo que a proteína de FVIII tem uma atividade de FVIII de coagulação.

[000174] Em uma modalidade, a primeira porção da proteína de FVIII e a segunda porção da proteína de FVIII são fragmentos de SEQ ID N°: 65 [comprimento da sequência completa madura de FVIII] ou SEQ ID N°: 67 [FVIII de domínio B deletado], por exemplo, porção N-terminal e a porção C-terminal, respectivamente. Em certas modalidades, a primeira porção da proteína de FVIII compreende o domínio A1 e o domínio A2 da proteína de FVIII. A segunda porção da proteína de FVIII compreende o domínio A3, domínio C1 e, opcionalmente, o domínio C2. Em ainda outras modalidades, a primeira porção da proteína de FVIII compreende o domínio A1 e domínio A2 e a segunda porção da proteína de FVIII compreende uma parte do domínio B, o domínio A3, domínio C1 e, opcionalmente, o domínio C2. Em ainda outras modalidades, a primeira porção da proteína de FVIII compreende o domínio A1, domínio A2 e uma porção do domínio B da proteína de FVIII e a segunda porção da proteína de FVIII compreende o domínio A3, domínio C1 e opcionalmente o domínio C2. Em ainda outras modalidades, a primeira porção da proteína de FVIII compreende o domínio A1, domínio A2 e uma primeira porção do domínio B da proteína de FVIII. A segunda porção da proteína de FVIII compreende uma segunda porção do domínio B, o domínio A3, domínio C1 e, opcionalmente, o domínio C2. Em algumas modalidades, os dois amino- ácidos ("b" e "c") podem ser qualquer um ou mais dos resíduos de ami- noácidos sítios de inserção apresentados nas Tabelas 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 e 15. Por exemplo, "b" pode ser o resíduo de aminoácido imediatamente a montante do sítio em que são inseridos ou ligadas uma ou mais sequências de XTen e "c" pode ser o resíduo de aminoácido imediatamente a jusante do sítio em que uma ou mais sequências de XTEN são inseridas ou ligadas. Em algumas modalidades, "a" é a primeira sequência de aminoácidos madura de uma proteína de FVIII e "d" é a última sequência de aminoácidos de uma proteína de FVIII. Por exemplo, o FVIII(A^b) pode ser uma sequência de aminoácidos pelo menos 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a aminoácidos 1 a 745 da SEQ ID N°: 67 [sequência de aminoácido de FVIII de domínio B deletado] ou SEQ ID N°: 65 [FVIII de comprimento total] e FVIII (c^d pode ser aminoácidos 746-1438 da SEQ ID N°: 67 ou os aminoácidos 1641-2332 de SEQ ID N°: 65, respectivamente.

[000175] Em alguns aspectos, o sítio de inserção na proteína de FVIII está localizado em um ou mais domínios da proteína de FVIII, que é a extremidade N-terminal, o domínio A1, o domínio A2, domínio A3, domínio B, o domínio C1, o domínio C2, o C-terminal ou duas ou mais combinações dos mesmos ou entre dois domínios da proteína de FVIII, que são o domínio A1 e região acídica a1 e a região acídica a1 e domínio A2, o domínio A2 e a região ácida a2, a região B e domínio acídico a2, o domínio B e o domínio A3 e o domínio A3 e domínio C1, o domínio C1 e o domínio C2 ou quaisquer combinações dos mesmos. Por exemplo, os locais de inserção no qual a sequência XTEN pode ser inserida são selecionados a partir do grupo que consiste no terminal N e o domínio A1, o terminal N e o domínio A2, o terminal N e o domínio A3, o terminal N e domínio B, o terminal N e o domínio C1, o terminal N e o domínio C2, o terminal N e o terminal C, os domínios A1 e A2, os domínios A1 e A3, os domínios A1 e B, a A1 e domínios C1, os domínios A1 e C2, o domínio A1 e o terminal C, os domínios A2 e A3, os domínios A2 e B, os domínios A2 e C1, os domínios A2 e C2, o domínio A2 e o terminal C, os domínios A3 e B, os domínios A3 e C1, os domínios A3 e C2, o domínio A3 e o terminal C, os domínios B e C1, os domínios B e C2, o domínio B e da extremidade do terminal C, o domínios C1 e C2, o C1 e o terminal C, o domínio C2, e o terminal C, e duas ou mais combinações. Exemplos não limitantes dos locais de inserção estão listados nas Tabelas 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 e 15.

[000176] A proteína FVIII, na qual é inserida a sequência XTEN imediatamente a jusante de um ou mais aminoácidos (por exemplo, um ou mais locais de inserção XTEN) na proteína FVIII ou ligados no terminal C ou terminal N, retém a atividade de FVIII após a ligação ou inserção pela sequência XTEN. A sequência XTEN pode ser inserida na proteína FVIII, uma vez ou mais do que uma vez, duas vezes, três vezes, quatro vezes, cinco vezes ou seis vezes de modo a que as inserções não afetam a atividade de FVIII (isto é, a proteína FVIII ainda mantém a propriedade de coagulação).

[000177] A proteína FVIII útil na presente invenção pode ser ligada a um ou mais polipeptídeos XTEN na extremidade do terminal N ou terminal C da proteína FVIII por um ligante opcional ou inserido imediatamente a jusante de um ou mais aminoácidos (por exemplo, um ou mais locais de inserção XTEN) na proteína FVIII por um ou mais ligantes opcionais. Em uma modalidade, os dois resíduos de aminoácidos no qual estão inseridos a sequência XTEN ou o resíduo de aminoácido em que a sequência XTEN está ligada correspondem aos dois ou um dos resíduos de aminoácidos de SEQ ID N°: 65 [comprimento completo maduro FVIII] selecionado a partir do grupo que consiste dos resíduos na Tabela 7, Tabela 8, Tabela 9 e na Tabela 10, e quaisquer combinações dos mesmos.

[000178] Em outras modalidades, pelo menos uma sequência XTEN é inserida em um ou mais locais de inserção XTEN aqui descritos ou quaisquer combinações dos mesmos. Em um aspecto, pelo menos uma sequência XTEN é inserida em um ou mais locais de inserção XTEN revelados em um ou mais aminoácidos apresentados na Tabela 7. TABELA 7: Locais de Inserção Exemplar XTEN * Indica um ponto de inserção para XTEN com base no número de aminoácidos de um FVIII humano completo e maduro, em que a inserção pode ser no lado do Terminal N ou C do aminoácido indicado.

[000179] Em algumas modalidades, uma ou mais sequências de XTEN são inseridas dentro de cerca de seis aminoácidos para cima ou para baixo a partir de aminoácidos 32, 220, 224, 336, 339, 399, 416, 603, 1656, 1711, 1725, 1905, ou 1910, correspondendo com a SEQ ID N°: 65 ou quaisquer combinações dos mesmos. TABELA 8. Exemplos de intervalos de inserção XTEN

[000180] A distância do resíduo de inserção refere-se ao número relativo de aminoácidos longe do terminal N (números negativos) ou do terminal C (números positivos) do resíduo de inserção designado (resíduo "0") onde uma inserção pode ser feita. A designação "-x" refere-se a um local de inserção, que é x aminoácidos longe do lado do terminal N do resíduo de inserção designado. Da mesma forma, a designação "+x" refere-se a um local de inserção, que é x aminoácidos longe do lado do terminal C do resíduo de inserção designado.

[000181] Por exemplo, "-1,+2" indica que a inserção é feita no terminal N ou terminal C de resíduos de aminoácidos indicado -1, 0, +1 ou +2.

[000182] Em outras modalidades, uma ou mais sequências XTEN são inseridas imediatamente a jusante de um ou mais aminoácidos corres-pondentes para o FVIII humano maduro de comprimento completo selecionado a partir do grupo que consiste em um ou mais locais de inserção na Tabela 9. TABELA 9. Intervalos ou Locais de Inserção Exemplares XTEN *indica o intervalo de locais de inserção em umerados em relação ao número de aminoácidos do FVIII humano maduro

[000183] Em ainda outras modalidades, um ou mais XTENs são inseridos no domínio B de FVIII. Em um exemplo, um XTEN é inserido entre os aminoácidos 740 e 1640 correspondentes à SEQ ID N°: 65, em que a sequência de FVIII entre os aminoácidos 740 e 1640 não estão opcionalmente presentes. Em um outro exemplo, um XTEN é inserido entre os aminoácidos 741 e 1690 correspondentes à SEQ ID N°: 65, em que a sequência de FVIII entre os aminoácidos 740 e 1690 não estão opcionalmente presentes. Em outros exemplos, um XTEN é inserido entre os aminoácidos 741 e 1648 correspondentes à SEQ ID N°: 65, em que a sequência de FVIII entre os aminoácidos 741 e 1648 não estão opcionalmente presentes. Em ainda outros exemplos, um XTEN é inserido entre os aminoácidos 743 e 1638 correspondente à SEQ ID N°: 65, em que a sequência de FVIII entre os aminoácidos 743 e 1638 não está opcionalmente presente. Em ainda outros exemplos, um XTEN é inserido entre os aminoácidos 745 e 1656 correspondentes à SEQ ID N°: 65, em que a sequência de FVIII entre os aminoácidos 745 e 1656 não estão opcionalmente presentes. Em alguns exemplos, um XTEN é inserido entre os aminoácidos 745 e 1657 correspondentes à SEQ ID N°: 65, em que a sequência de FVIII entre os aminoácidos 745 e 1657 não estão opcionalmente presentes. Em certos exemplos, um XTEN é inserido entre os aminoácidos 745 e 1667 correspondentes à SEQ ID N°: 65, em que a sequência de FVIII entre os aminoácidos 745 e 1667 não estão opcionalmente presentes. Em ainda outros exemplos, um XTEN é inserido entre os aminoácidos 745 e 1686 correspondentes à SEQ ID N°: 65, em que a sequência de FVIII entre os aminoácidos 745 e 1686 não estão opcionalmente presentes. Em outros exemplos, um XTEN é inserido entre os amino- ácidos 747 e 1642 correspondentes à SEQ ID N°: 65, em que a sequência de FVIII entre os aminoácidos 747 e 1642 não estão opcionalmente presentes. Em ainda outros exemplos, um XTEN é inserido entre os aminoácidos 751 e 1667 correspondentes à SEQ ID N°: 65, em que a sequência de FVIII entre os aminoácidos 751 e 1667 não estão opcionalmente presentes.

[000184] Em algumas modalidades, um ou mais XTENs são inseridos em um ou mais aminoácidos imediatamente a jusante de um aminoá- cido de um local de inserção selecionado a partir do grupo que consiste dos resíduos de aminoácidos na Tabela 10. TABELA 10: Locais de inserção FVIII de XTEN e designações do cons- truto * Indica o número de aminoácidos da proteína madura de FVIII

[000185] Em uma modalidade, um ou mais locais de inserção XTEN estão localizados dentro de um ou mais estrutura de loop flexível exposta na superfície da proteína FVIII (por exemplo, um loop permissivo). Por exemplo, pelo menos uma sequência XTEN pode ser inserida em cada domínio FVIII "A" que compreende pelo menos dois "loops permissivos" em que pelo menos um polipeptídeo XTEN pode ser inserido sem eliminar a atividade pró-coagulante da proteína recombinante, ou a capacidade de as proteínas recombinantes serem expressas in vivo ou in vitro em uma célula hospedeira. Os loops permissivos são regiões que permitem a inserção de pelo menos uma sequência de XTEN com, entre outros atributos, superfície elevada ou a exposição a solventes e uma elevada flexibilidade conformacional. O domínio A1 compreende uma região de loop permissivo-1 (A1-1) e uma região de loop permissivo-2 (A1-2), o domínio do A2 compreende uma região de loop permissivo-1 (A2-1) e uma região de loop permissivo-2 (A2-2), o domínio A3 é composto por uma região de loop permissivo-1 (A3-1) e uma região de loop permissivo-2 (A3-2).

[000186] Em um aspecto, um primeiro circuito permissivo no domínio A1 de FVIII (A1-1) está localizado entre a cadeia beta 1 e cadeia beta 2, e um segundo circuito permissivo no domínio A2 de FVIII (A1-2) está localizado entre a cadeia beta 11 e cadeia beta 12. Um primeiro circuito permissivo no domínio A2 de FVIII (A2-1) está localizado entre cadeia beta 22 e cadeia beta 23, e um segundo circuito permissivo no domínio A2 de FVIII (A2-2) está localizado entre a cadeia beta 32 e cadeia beta 33. Um primeiro circuito permissivo no domínio A3 de FVIII (A3-1) está localizado entre cadeia beta 38 e cadeia beta 39, e um segundo circuito permissivo no A3 de FVIII (A3-2) está localizado entre a cadeia beta 45 e cadeia beta 46. Em certos aspectos, a estrutura de loop flexível exposto na superfície, compreendendo A1-1 corresponde a uma região em FVIII humana madura nativa de cerca do aminoácido 15 a cerca do aminoácido 45 de SEQ ID N°: 65, por exemplo, desde cerca do aminoácido 18 até cerca do aminoácido 41 da SEQ ID N°: 65. Em outros aspectos, a, estrutura de loop flexível exposto na superfície, compreendendo A1-2 corresponde a uma região em FVIII humana madura nativa de cerca do aminoácido 201 a cerca do aminoácido 232 de SEQ ID N°: 65, por exemplo, desde cerca do aminoácido 218 a cerca do aminoácido 229 da SEQ ID N°: 65. Em ainda outros aspectos, a estrutura de loop flexível exposta na superfície, compreendendo A2-1 corresponde a uma região em FVIII humana madura nativa de cerca do aminoácido 395 a cerca do aminoácido 421 da SEQ ID N°: 65, por exemplo, desde cerca do aminoácido 397 a cerca do aminoácido 418 da SEQ ID N°: 65. Em ainda outras modalidades, a estrutura de loop flexível exposta na superfície, compreendendo A2-2 corresponde a uma região em FVIII humana madura nativa de cerca do aminoácido 577 a cerca do aminoácido 635 da SEQ ID N°: 65, por exemplo, desde cerca do aminoácido 595 a cerca do aminoácido 607 da SEQ ID N°: 65. Em certos aspectos, a estrutura de loop flexível exposto na superfície, compreendendo A3-1 corresponde a uma região em FVIII humana madura nativa de cerca do ami- noácido 1705 a cerca do aminoácido 1732 da SEQ ID N°: 65, por exemplo, desde cerca do aminoácido 1711 até cerca do aminoácido 1725 da SEQ ID N°: 65. Em ainda outros aspectos, a, estrutura de loop flexível exposto na superfície, compreendendo A3-2 corresponde a uma região em FVIII humana madura nativa de cerca do aminoácido 1884 a cerca do aminoácido 1917 da SEQ ID N°: 65, por exemplo, desde cerca do aminoácido 1899 a cerca do aminoácido 1911 da SEQ ID N°: 65.

[000187] Em uma outra modalidade, o um ou mais aminoácidos, em que pelo menos uma sequência de XTEN está inserida está localizado dentro do domínio A3, por exemplo, aminoácidos 1649 a 1689, correspondendo ao polipeptídeo FVIII maduro de comprimento total. Em uma modalidade particular, uma sequência de XTEN é inserida entre os ami- noácidos 1656 e 1657 da SEQ ID N°: 65 (FVIII maduro de comprimento total). Em uma modalidade específica, uma proteína FVIII compreendendo uma sequência de XTEN inserida imediatamente a jusante do aminoácido 1656 correspondente à SEQ ID N°: 65 compreende adicionalmente uma deleção desde o aminoácido 745 até ao aminoácido 1656 correspondente à SEQ ID N°: 65.

[000188] Em algumas modalidades, um ou mais locais de inserção para uma ou mais inserções XTEN são imediatamente a jusante de um ou mais aminoácidos correspondentes para FVIII maduro de comprimento total, selecionado a partir do grupo consistindo de:

[000189] Em uma modalidade, uma proteína FVIII útil para a invenção compreende duas sequências XTEN, uma primeira sequência XTEN in-serida em um primeiro local de inserção XTEN e uma segunda XTEN inserida em um segundo local de inserção XTEN. Exemplos do primeiro local de inserção XTEN e o segundo local de inserção XTEN não limita-tivos estão listados na Tabela 11.

[000190] TABELA 11. Locais de inserção exemplares para Dois XTENs

[000191] Os dois XT ENs inseridos ou ligados à proteína FVIII podem ser idênticos ou diferentes. Em algumas modalidades, uma proteína FVIII útil para a invenção compreende duas sequências XTEN inseridas na prote-ína FVIII, uma primeira sequência XTEN inserida imediatamente a jusante do aminoácido 745 correspondente à SEQ ID N°: 65, e uma segunda se-quência de XTEN inserida imediatamente a jusante do aminoácido 2332 correspondente à SEQ ID N°: 65 (terminal C). Em outras modalidades, a primeira sequência XTEN é inserida imediatamente a jusante do aminoá- cido 18, 26, 40, 1656, ou 1720 correspondente à SEQ ID N°: 65, e uma segunda sequência de XTEN inserida imediatamente a jusante do amino- ácido 403 correspondente à SEQ ID N°:65. Em ainda outras modalidades, a primeira sequência XTEN é inserida imediatamente a jusante do amino- ácido 18, 26, ou 40 correspondente à SEQ ID N°: 65, e uma segunda se-quência de XTEN inserida imediatamente a jusante do aminoácido 599 correspondente à SEQ ID N°:65. Em ainda outras modalidades, a primeira sequência XTEN é inserida imediatamente a jusante do aminoácido 1656 correspondente à SEQ ID N°: 65, e uma segunda sequência de XTEN in-serida imediatamente a jusante do aminoácido 18, 26, 40, 399, 403, 1725, 1720, 1900, 1905, ou 2332 correspondente à SEQ ID N°:65. Em determi-nadas modalidades, a primeira sequência XTEN é inserida imediatamente a jusante do aminoácido 1900 correspondente à SEQ ID N°: 65, e uma segunda sequência de XTEN inserida imediatamente a jusante do amino- ácido 18, 26, ou 40 correspondente à SEQ ID N°:65. Em algumas modali-dades, a primeira sequência XTEN é inserida imediatamente a jusante do aminoácido 18, 26, ou 40 correspondente à SEQ ID N°: 65, e uma segunda sequência de XTEN inserida imediatamente a jusante do aminoácido 399 correspondente à SEQ ID N°:65. Em outras modalidades, a primeira sequência XTEN é inserida imediatamente a jusante do aminoácido 1720 correspondente à SEQ ID N°: 65, e uma segunda sequência de XTEN inserida imediatamente a jusante do aminoácido 18, 26, ou 40 correspondente à SEQ ID N°:65. Em ainda outras modalidades, a primeira sequência XTEN é inserida imediatamente a jusante do aminoácido 1720 correspondente à SEQ ID N°: 65, e uma segunda sequência de XTEN inserida imediatamente a jusante do aminoácido 18 correspondente à SEQ ID N°:65. Em uma modalidade particular, a proteína FVIII compreendendo duas sequências XTEN, uma primeira sequência XTEN inserida imediatamente a jusante do aminoácido 745 correspondente à SEQ ID N°: 65 e uma segunda sequência de XTEN inserida imediatamente a jusante do aminoá- cido 2332 correspondente à SEQ ID N°: 65, em que a proteína FVIII ainda tem uma deleção desde o aminoácido 745 corresponde a SEQ ID N°: 65 até ao aminoácido 1685 correspondente à SEQ ID N°: 65, ou uma mutação de substituição no aminoácido 1680 correspondente à SEQ ID N°: 65, por exemplo, Y1680F, ou uma mutação de substituição no aminoácido 1648 correspondente à SEQ ID N°: 65, por exemplo, R1648A, ou, pelo menos, duas mutações ou substituições no aminoácido 1648 correspondente à SEQ ID N°: 65, por exemplo, R1648A, e o aminoácido 1680 correspondente à SEQ ID N°: 65, por exemplo, Y1680F. Em uma modalidade específica, a proteína FVIII compreende duas sequências XTEN, um primeiro XTEN inserido imediatamente a jusante do aminoácido 1656 correspon-dente à SEQ ID N°: 65 e uma segunda sequência de XTEN inserida ime-diatamente a jusante do aminoácido 2332 da SEQ ID N°: 65, em que a proteína FVIII ainda tem uma deleção desde o aminoácido 745 até ao a- minoácido 1656 correspondente à SEQ ID N°: 65.

[000192] Em certas modalidades, uma proteína FVIII compreende três sequências XTEN, uma primeira sequência XTEN inserida em um primeiro local de inserção XTEN, uma segunda sequência de XTEN inserida em uma segunda sequência XTEN, e uma terceira sequência XTEN inserida em um local de inserção do terceiro XTEN. A primeira, segunda ou terceira sequências XTEN podem ser iguais ou diferentes. O primeiro, segundo, e terceiro locais de inserção podem ser selecionados a partir do grupo de qualquer um dos locais de inserção aqui divulgados. Em algumas modalidades, a proteína FVIII que compreende três sequências XTEN pode ainda compreender uma mutação ou substituição, por exemplo, 1648 ami- noácidos que correspondem a SEQ ID N°: 65, por exemplo, R1648A. Por exemplo, os exemplos não limitativos do primeiro, segundo, e terceiros locais de inserção XTEN estão listados na Tabela 12. TABELA 12. Locais de inserção exemplares para Três XTENs

[000193] Em algumas modalidades, uma proteína FVIII compreende três sequências XTEN, uma primeira sequência XTEN inserida imediatamente a jusante do aminoácido 26, correspondente à SEQ ID N°: 65, uma segunda sequência de XTEN inserida a jusante do aminoácido 403 cor-respondente à SEQ ID N°: 65, e uma terceira sequência XTEN inserida a jusante do aminoácido 1656, 1720, 1900 ou correspondendo à SEQ ID N°: 65. Em outras modalidades, a primeira sequência XTEN é inserida imedi-atamente a jusante do aminoácido 26, correspondente à SEQ ID N°: 65, uma segunda sequência de XTEN é inserida a jusante do aminoácido 1656 correspondente à SEQ ID N°: 65, e uma terceira sequência XTEN é inserida a jusante do aminoácido 1720 ou 1900 correspondente à SEQ ID N°: 65. Em ainda outras modalidades, a primeira sequência XTEN é inse-rida imediatamente a jusante do aminoácido 26, correspondente à SEQ ID N°: 65, uma segunda sequência de XTEN é inserida a jusante do aminoá-cido 1720 correspondente à SEQ ID N°: 65, e uma terceira sequência XTEN é inserida a jusante do aminoácido 1900 correspondente à SEQ ID N°: 65. Em ainda outras modalidades, a primeira sequência XTEN é inse-rida imediatamente a jusante do aminoácido 403, correspondente à SEQ ID N°: 65, uma segunda sequência de XTEN é inserida a jusante do ami-noácido 1656 correspondente à SEQ ID N°: 65, e uma terceira sequência XTEN é inserida a jusante do aminoácido 1720 ou 1900 correspondente à SEQ ID N°: 65. Em outras modalidades, a primeira sequência XTEN é in-serida imediatamente a jusante do aminoácido 403 ou 1656, correspon-dente à SEQ ID N°: 65, uma segunda sequência de XTEN é inserida a jusante do aminoácido 1720 correspondente à SEQ ID N°: 65, e uma ter-ceira sequência XTEN é inserida a jusante do aminoácido 1900 correspondente à SEQ ID N°: 65. Em outras modalidades, a primeira sequência XTEN é inserida imediatamente a jusante do aminoácido 18, 26, 40, 399, 403, 1711, 1720, 1725, 1900, 1905, ou 1910, correspondente à SEQ ID N°: 65, uma segunda sequência de XTEN é inserida a jusante do aminoácido 745 correspondente à SEQ ID N°: 65, e uma terceira sequência XTEN é inserida a jusante do aminoácido 2332 correspondente à SEQ ID N°: 65.

[000194] Em outras modalidades, uma proteína de FVIII na presente invenção compreende quatro sequências XTEN, uma primeira sequência XTEN inserida em um primeiro local de inserção, uma segunda sequência de XTEN inserida em um segundo local de inserção, uma terceira sequência XTEN inserida em um terceiro local de inserção, e uma quarta sequência XTEN inserida em um quarto local de inserção. A primeira, segunda, terceira, e quarta sequências XTEN podem ser idênticas, diferentes, ou combinações das mesmas. Em algumas modalidades, a proteína FVIII que compreende quatro sequências XTEN pode ainda compreender uma mutação ou substituição, por exemplo, 1648 aminoácidos que correspondem a SEQ ID N°: 65, por exemplo, R1648A. Os exemplos não limitativos do primeiro, segundo, terceiro e quarto locais de inserção XTEN estão listados na Tabela 13. TABELA 13. Locais de inserção exemplares para Quatro XTENs

[000195] Em algumas modalidades, uma proteína FVIII compreende cinco sequências XTEN, uma primeira sequência XTEN inserida em um primeiro local de inserção, uma segunda sequência de XTEN inserida em um segundo local de inserção, uma terceira sequência XTEN inserida em um terceiro local de inserção XTEN, uma quarta sequência de XTEN inserida em um quarto local de inserção XTEN, e uma quinta sequência XTEN inserida em um quinto local de inserção XTEN. A primeira, segunda, terceira, quarta, e quinta sequências XTEN podem ser idênticas, diferentes, ou combinações das mesmas. Os exemplos não limitativos do primeiro, segundo, terceiro, quarto, e quinto locais de inserção estão listados na Tabela 14. TABELA 14. Locais de inserção exemplares para Cinco XTENs

[000196] Em certas modalidades, uma proteína FVIII compreende seis sequências XTEN, uma primeira sequência XTEN inserida em um pri-meiro local de inserção XTEN, uma segunda sequência XTEN inserida em um segundo local de inserção XTEN, uma terceira sequência XTEN inserida em um terceiro local de inserção XTEN, uma quarta sequência XTEN inserida em um quarto local de inserção XTEN, uma quinta se-quência de XTEN inserida em um quinto local de inserção XTEN, e uma sexta sequência XTEN inserida em um sexta local de inserção XTEN. A primeira, segunda, terceira, quarta, quinta, ou sexta sequências XTEN podem ser idênticas, diferentes, ou combinações das mesmas. Exemplos dos seis locais de inserção XTEN incluem, mas não estão limitados aos locais de inserção listados na Tabela 15. TABELA 15. Locais de inserção XTEN exemplares para Seis XTENs

[000197] Em um exemplo particular, um primeiro XTEN é inserido entre os aminoácidos 26 e 27, correspondentes a SEQ ID N°: 65, e um segundo XTEN é inserido entre os aminoácidos 1720 e 1721 que correspondem a SEQ ID N°: 65 (FVIII de comprimento total maduro) . Em um outro exemplo, um primeiro XTEN é inserido entre os aminoácidos 403 e 404 que correspondem a SEQ ID N°: 65, e um segundo XTEN é inserido entre os aminoácidos 1720 e 1721 correspondem à SEQ ID N°: 65. Em alguns e-xemplos, um primeiro XTEN é inserido entre os aminoácidos 1656 e 1657 que correspondem a SEQ ID N°: 65, e um segundo XTEN é inserido entre os aminoácidos 1720 e 1721 correspondem à SEQ ID N°: 65. Em outros exemplos, um primeiro XTEN é inserido entre os aminoácidos 26 e 27, correspondentes a SEQ ID N°: 65, um segundo XTEN é inserido entre os aminoácidos 1656 e 1657 que correspondem a SEQ ID N°: 65, e um ter-ceiro XTEN é inserido entre aminoácidos 1720 e 1721 que correspondem a SEQ ID N°: 65. Em ainda outras modalidades, um primeiro XTEN é in-serido entre os aminoácidos 403 e 404, correspondentes a SEQ ID N°: 65, um segundo XTEN é inserido entre os aminoácidos 1656 e 1657 que correspondem a SEQ ID N°: 65, e um terceiro XTEN é inserido entre aminoácidos 1720 e 1721 que correspondem a SEQ ID N°: 65. Em ainda outras modalidades, um primeiro XTEN é inserido entre os aminoácidos 403 e 404, correspondentes a SEQ ID N°: 65, um segundo XTEN é inserido entre os aminoácidos 1656 e 1657 que correspondem a SEQ ID N°: 65, e um terceiro XTEN é inserido entre aminoácidos 1720 e 1721 que correspondem a SEQ ID N°: 65. Em determinadas modalidades, um primeiro XTEN é inserido entre os aminoácidos 26 e 27, correspondentes a SEQ ID N°: 65, um segundo XTEN é inserido entre os aminoácidos 1720 e 1721 que correspondem a SEQ ID N°: 65, e um terceiro XTEN é inserido entre aminoácidos 1900 e 1901 que correspondem a SEQ ID N°: 65. Em algumas modalidades, um primeiro XTEN é inserido entre os aminoácidos 26 e 27, correspondentes a SEQ ID N°: 65, um segundo XTEN é inserido entre os aminoácidos 1656 e 1657 que correspondem a SEQ ID N°: 65, um terceiro XTEN é inserido entre os aminoácidos 1720 e 1721 que correspondem a SEQ ID N°: 65, e um quarto XTEN é inserido entre 1900 e 1901 que corresponde a SEQ ID N°: 65.

[000198] Em uma modalidade particular, uma sequência de XTEN é inserida entre os aminoácidos 745 e 746 de um comprimento total do VIII ou o local de inserção correspondente do domínio B eliminado do Fator VIII.

[000199] Em algumas modalidades, uma proteína quimérica da invenção compreende duas sequências de polipeptídeo, uma primeira sequência de polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos de pelo menos cerca de 80%, 90%, 95%, ou 100% idêntica a uma sequência selecionada a partir do FVIII-161 (SEQ ID N°: 69), FVIII-169 (SEQ ID N°: 70), FVIII-170 (SEQ ID N°: 71), FVIII-173 (SEQ ID N°: 72); FVIII-195 (SEQ ID N°: 73); FVIII-196 (SEQ ID N°: 74), FVIII199 (SEQ ID N°: 75), FVIII- 201 (SEQ ID N°: 76); FVIII-203 (SEQ ID N°: 77), FVIII-204 (SEQ ID N°: 78), FVIII-205 (SEQ ID N°: 79), FVIII-266 (SEQ ID N°: 80), FVIII-267 (SEQ ID N°: 81), FVIII-268 (SEQ ID N°: 82), FVIII-269 (SEQ ID N°: 83), FVIII- 271 (SEQ ID N°: 84) ou FVIII-272 (SEQ ID N°: 85) e um segunda sequência de polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos de pelo menos cerca de 80%, 90%, 95%, ou 100% idêntica a uma sequência selecionada a partir VWF031 (SEQ ID N°: 86), VWF034 (SEQ ID N°: 87), ou VWF-036.

II.D. Região constante de Ig ou uma porção da mesma

[000200] A proteína quimérica da invenção também inclui duas regiões constantes de Ig ou uma porção da mesma, uma primeira região constante de Ig ou desta porção fundida com uma proteína FVIII por um ligante opcional e uma segunda região constante de Ig ou de uma sua porção fundida com uma proteína de VWF através da sequência XTEN tendo menos de 288 aminoácidos. A região constante de Ig ou uma por-ção da mesma pode melhorar as propriedades farmacocinéticas ou far- macodinâmicas da proteína quimérica em combinação com a sequência de XTEN e a proteína de VWF. Em certas modalidades, a região cons-tante de Ig ou de uma porção da mesma se estende uma meia-vida de uma molécula fundida com a região constante de Ig ou de uma porção da mesma.

[000201] Uma região constante de lg é composta por domínios denotados domínios CH (constante pesado) (CH1, CH2, etc.). Dependendo do isotipo, (isto é, IgG, IgM, IgA IgD ou IgE), a região constante pode ser composta por três ou quatro domínios CH. Algumas regiões de constante de isotipos (por exemplo, IgG) também contém uma região de dobradiça. Ver Janeway et al. 2001, Immunobiology, Garland Publishing, N.Y., N.Y.

[000202] Uma região constante de lg ou de uma parte para produzir a proteína quimérica da presente invenção pode ser obtida de diferentes fontes. Em algumas modalidades, uma região constante de Ig ou de uma sua porção é derivada de uma Ig humana. Entende-se, no entanto, que a região constante da lg ou uma parte dele pode ser derivada de uma lg de uma outra espécie de mamíferos, incluindo por exemplo, um roedor (por exemplo, um camundongo, rato, coelho, cobaia) ou espécies de primatas não humanos (por exemplo, o chimpanzé, macaco). Além disso, a região constante de lg ou uma parte dela pode ser derivada de qualquer classe de lg, incluindo IgM, IgG, IgD, IgA, e IgE e qualquer isotipo de Ig, incluindo IgGl, IgG2, IgG3, e IgG4. Em uma modalidade, o isotipo humano IgG1 é usado.

[000203] Uma variedade de sequências de genes de região constante da lg (por exemplo, sequências de genes humanos da região constante) estão disponíveis sob a forma de depósitos publicamente acessíveis. Sequência de domínios da região constante pode ser selecionada tendo uma função particular (ou na falta de uma função particular) ou com uma modificação particular para reduzir a imunogenicidade. Muitas sequências de anticorpos e genes de codificação de anticorpo têm sido publicadas e sequências de região constante de Ig adequadas (por exemplo, sequências dobradiça, CH2 ou CH3, ou partes delas) podem ser deri-vadas dessas sequências usando técnicas de técnica reconhecidas. O material genético obtido usando qualquer um dos métodos acima então podem ser alterados ou sintetizados para obter polipeptídeos da presente invenção. Será também apreciado que o âmbito da presente invenção abarca alelos, variantes e mutações constantes da região de sequências de DNA.

[000204] As sequências da região constante da lg ou uma parte dele podem ser clonadas, por exemplo, usando a reação em cadeia da poli- merase e primers que são selecionadas para amplificar o domínio inte-resse. Para clonar uma sequência de região constante da lg ou uma parte dela, em um anticorpo, o mRNA pode ser isolado de hibridoma, baço ou linfonodos células, reversos transcritas em DNA e genes de anticorpo amplificados por PCR. Métodos de amplificação do PCR são descritos detalhadamente na U.S. Pat. Nos 4.683.195.; 4.683.202; 4.800.159; 4.965.188; e em, por exemplo, "PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications" Innis et al. eds., Academic Press, San Diego, CA (1990); Ho et al. 1989. Gene 77:51; Horton et al. 1993. Methods Enzymol. 217:270). A PCR pode ser iniciada por iniciadores consenso de região constante ou iniciadores mais específicos baseados no DNA da cadeia pesada e leve e nas sequências aminoácidos publicadas. Conforme discutido acima, a PCR também pode ser usada para isolar os clones de DNA que codificam as cadeias leve e pesada do anticorpo. Neste caso, as bibliotecas podem ser triadas por iniciadores consenso ou sondas homólogas maiores, tais como sondas da região constante humana. numerosos conjuntos apropriados para amplificação de genes de anticorpo são conhecidos na técnica (por exemplo, primers 5' com base na seqüência N-terminal de anticorpos purificados (Benhar e Pas- tan. 1994. Protein Engineering 7:1509); rapid amplification of cDNA ends (Ruberti, F. et al. 1994. J. Immunol. Methods 173:33); antibody leader sequences (Larrick et al. 1989 Biochem. Biophys. Res. Commun. 160: 1250). A clonagem de sequências de anticorpo é também descrita em Newman et al., U.S. Pat. No. 5.658.570, depositada em 25 de janeiro de 1995, que está incorporada por referência neste documento.

[000205] Uma região constante de ig utilizada neste documento pode incluir todos os domínios e a região de dobradiça ou partes deles. Em uma modalidade, a região constante da ig ou uma parte compreende domínio CH2, domínio CH3 e uma região de dobradiça, isto é, uma região Fc ou um parceiro de ligação FcRn.

[000206] Como usado neste documento, o termo "região Fc" é definido como a porção de um polipeptídeo que corresponde à região Fc de ig nativa, isto é, como formada pela associação dimérica dos respectivos domínios Fc (ou frações Fc) de suas duas cadeias pesadas. Uma região Fc nativa forma um homodímero com outra região Fc. Em contraste, o termo "região Fc geneticamente fundida" ou "região Fc de cadeia única" (região scFc), como usado neste documento, refere-se a uma região Fc sintética dimérica compreendida por domínios Fc (ou frações Fc) gene-ticamente ligados dentro de uma única cadeia polipeptídica (isto é, co-dificados em uma única sequência genética contígua).

[000207] Em uma modalidade, o termo "domínio Fc" se refere à porção de uma única cadeia pesada de lg que se inicia na região de dobradiça logo a montante do local de clivagem da papaína (isto é, resíduo 216 em IgG, desde que o primeiro resíduo da região constante da cadeia pesada seja 114) e termina no lado C-terminal do anticorpo. Consequentemente, um domínio Fc completo compreende pelo menos um domínio dobradiça, um domínio CH2 e um domínio CH3.

[000208] A região Fc de uma região constante de lg, dependendo do isotipo de lg pode incluir os domínios CH2 e CH3 CH4, bem como a região de dobradiça. Proteínas quiméricas que constituem uma região Fc de uma lg conferem várias propriedades desejáveis em uma proteína quimérica, incluindo aumento da estabilidade, aumentou o meia-vida de soro (ver Capon et al., 1989, Nature 337:525) assim como a ligação a receptores Fc como o receptor Fc neonatal (FcRn) (U.S. Pat. Nos. 6.086.875, 6.485.726, 6.030.613; WO 03/077834; US2003-0235536A1), que estão incorporados em sua totalidade neste documento para refe-rência.

[000209] Uma região constante de lg ou uma parte dele pode ser um parceiro de ligação FcRn. FcRn é ativo em tecidos epiteliais adultos e ex-pressos no lúmen do intestino, airways pulmonares, nasais superfícies, superfícies vaginais, cólon e retais superfícies (U.S. Pat. No. 6.485.726). Um parceiro de ligação FcRn é uma porção de uma lg que liga à FcRn.

[000210] O receptor FcRn foi isolado de várias espécies de mamíferos incluindo humanos. As sequências do FcRn humano, FcRn de macado, FcRn de rato, e FcRn de camundongo são conhecidas (Story et al., J. Exp. 1994, J. Exp. Med. 180:2377). O receptor FcRn liga IgG (mas não a outras classes de lg como IgA, IgM, IgD e IgE) em pH relativamente baixo, ativamente transporta o IgG transcelularmente de em um luminal para direção serosas e então libera a IgG em pH relativamente maior encontrado nos fluidos intersticiais. É expressado em tecido epitelial a-dulto (U.S. Pat. Nos. 6.485.726, 6.030.613, 6.086.875; WO 03/077834; US2003-0235536A1) incluindo o pulmão e o epitélio intestinal (Israel et al. 1997, Immunology 92:69) renal proximal tubular epithelium (Kobayashi et al. 2002, am. J. Physiol. Renal Physiol. 282: F358) bem como o epitélio nasal, vaginais superfícies e superfícies da árvore biliar.

[000211] Parceiros de ligação FcRn da presente invenção englobam moléculas que podem ser ligadas especificamente pelo receptor FcRn incluindo IgG inteira, o fragmento Fc de IgG e outros fragmentos que incluem a região de ligação completa do receptor FcRn. A região da porção Fc de IgG que se liga ao receptor FcRn foi descrita com base em cristalografia por raios X (Burmeister et al. 1994, Nature 372:379). A maior área de contato do Fc com o FcRn é próxima à junção dos domí-nios CH2 e CH3. Contatos Fc-FcRn estão todos dentro de uma única cadeia pesada de Ig. Os parceiros de ligação FcRn incluem IgG inteira, o fragmento Fc de IgG e outros fragmentos de IgG que incluem a região de ligação completa de FcRn. Os locais de contato principais incluem resíduos de aminoácidos 248, 250-257, 272, 285, 288, 290-291, 308311 e 314 do domínio CH2 e resíduos de aminoácidos 385-387, 428 e 433-436 do domínio CH3. Referências feitas à numeração de aminoáci- dos de lg ou fragmentos de lg, ou regiões, são todas baseadas em Kabat et al. 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Public Health, Bethesda, Md.

[000212] Regiões Fc ou parceiros de ligação FcRn ligados a FcRn podem ser efetivamente transportados através das barreiras epiteliais por FcRn, proporcionando assim um meio nãoinvasivo para sistêmicamente administrar uma molécula terapêutica desejada. Além disso, proteínas da fusão que engloba uma região Fc ou um parceiro de ligação FcRn são endocytosed por células expressando o FcRn. Mas em vez de serem marcadas pela degradação, estas proteínas da fusão são recicladas para fora em circulação novamente, aumentando assim a em meia- vida in vivo destas proteínas. Em determinadas modalidades, as porções das regiões constante de lg são uma região Fc ou por um parceiro de ligação FcRn que geralmente associa, através de ligações de bissul- feto e outras interações não específicas, com outra região Fc ou outro parceiro de ligação FcRn para formar dímeros e oriundas de ordem superiores.

[000213] Dois receptores FcRn podem ligar uma única molécula de Fc. Dados cristalográficos sugerem que cada molécula FcRn liga um único polipeptídeo do homodímero de Fc. Em uma modalidade, ligando o parceiro de ligação FcRn, por exemplo, um fragmento Fc de uma IgG, para uma molécula biologicamente ativa fornece um meio de entregar a molécula biologicamente ativa por via oral, bucal, sublingual, retal, vagi-nal, como um aerossol, administrado por via nasal ou através da rota pulmonar ou através de uma rota de ocular. Em outra modalidade, a proteína quimérica pode ser administrada de forma invasiva, por exem-plo, por via subcutânea, por via intravenosa.

[000214] Uma região de parceiro de ligação FcRn é uma molécula ou porção da mesma que pode ser especificamente ligada pelo receptor FcRn com consequente transporte ativo pelo receptor FcRn da região Fc. Especificamente ligado se refere a duas moléculas que formam um complexo que é relativamente estável sob condições fisiológicas. Liga-ção específica é caracterizada por uma alta afinidade e uma capacidade de baixa a moderada em distinção de ligação inespecífica que geralmente tem uma baixa afinidade com uma capacidade de moderada a alta. Tipicamente, a ligação é considerada específica quando a constante de afinidade KA é maior do que 106 M-1, ou mais preferencialmente maior do que 108 M-1. Se necessário, ligação inespecífica pode ser reduzida sem afetar substancialmente a ligação específica através de variação das condições de ligação. As condições de ligação apropriadas, tais como concentração das moléculas, força iônica da solução, temperatura, tempo permitido para ligação, concentração de um agente de bloqueio (por exemplo, albumina sérica, caseína do leite), etc., podem ser otimizadas por alguém versado na técnica usando técnicas de rotina.

[000215] Em determinadas modalidades, uma proteína quimérica da invenção compreende um ou mais regiões Fc truncadas que, no entanto, são suficientes para conferir propriedades de ligação de receptor (FcR) Fc para a região Fc. Por exemplo, a porção de uma região Fc que liga FcRn (isto é, a parte de ligação FcRn) do formado sobre aminoáci- dos 282-438 de IgG1, EU numeração (com os locais de contato primários sendo aminoácidos, 248, 250-257, 272, 285, 288, 290-291, 308-311 e 314 dos CH2 domínio e amino-ácido resíduos 385-387, 428 e 433-436 do domínio do CH3. Assim, uma região Fc da invenção pode incluir ou consistem de uma porção de ligação FcRn. FcRn porções de ligação podem ser derivadas de cadeias pesadas de qualquer isotipo, incluindo IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4. Em uma modalidade, uma porção de ligação FcRn de um anticorpo do isotipo humano IgG1 é usada. Em outra mo-dalidade, uma porção de ligação FcRn de um anticorpo do isotipo humano IgG4 é usada.

[000216] Em outra modalidade, a "região Fc" inclui uma sequência de aminoácidos de um domínio Fc ou derivado de um domínio Fc. Em de-terminadas modalidades, uma região Fc compreende pelo menos um dos: um domínio dobradiça (por exemplo, região de dobradiça superior, médio e/ou inferior) (sobre aminoácidos 216-230 de uma região Fc do anticorpo de acordo com a numeração EU), um domínio CH2 (sobre aminoácidos 231-340 de uma região Fc do anticorpo de acordo com a numeração EU), um domínio CH3 (sobre aminoácidos 341-438 de uma região Fc do anticorpo de acordo com a numeração EU), um domínio CH4, ou uma variante, porção ou fragmento. Em outras modalidades, uma região Fc compreende um domínio Fc completo (isto é, um domínio dobradiça, um domínio CH2 e um domínio CH3). Em algumas modalidades, uma região Fc compreende, consiste essencialmente de ou consiste em um domínio dobradiça (ou uma parte dele) fundiram-se para um domínio CH3 (ou uma parte dele), um domínio dobradiça (ou uma parte dele) fundido a um domínio CH2 (ou uma parte dele), um CH2 domínio (ou uma parte dele) fundiu-se para um domínio CH3 (ou uma parte dele), um domínio CH2 (ou uma parte dele) fundiu-se para tanto um domínio dobradiça (ou uma parte dele) e um domínio CH3 (ou uma parte dele). Em outras modalidades, ainda, uma região Fc não possui pelo menos uma parte de um domínio CH2 (por exemplo, todo ou parte de um domínio CH2). Em uma determinada modalidade, uma região Fc compreende ou consiste em aminoácidos correspondentes aos números EU 221 para 447.

[000217] As regiões Fc denotadas como F, F1 ou F2 neste documento podem ser obtidas um número de diferentes fontes. Em uma modalidade, uma região Fc do polipeptídeo é derivado de uma lg. Entende-se, no entanto, que a região Fc pode ser derivada de uma lg de uma outra espécie de mamíferos, incluindo por exemplo, um roedor (por exemplo, um camundongo, rato, coelho, cobaia) ou espécies de primatas não hu-manos (por exemplo, o chimpanzé, macaco). Além disso, a região cons-tante de imunoglobulina ou uma parte dela pode ser derivada de qualquer classe de lg, incluindo IgM, IgD, IgG, IgA e IgE e qualquer isotipo de lg, incluindo IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4. Em uma modalidade, o isotipo humano IgG1 é usado.

[000218] Em determinadas modalidades, a variante de Fc confere uma mudança na função de pelo menos um efetor transmitida por uma região Fc compreendendo disse tipo selvagem Fc domínio (por exemplo, uma melhoria ou redução na capacidade da região Fc para ligar aos re- ceptores Fc (por exemplo, FCYRI, FCYRII ou FCYRIII) ou complementar as proteínas (por exemplo, C1q), ou para acionar a citotoxicidade dependente de anticorpo (ADCC), fagocitose ou citotoxicidade complemento-dependente (CDCC)). Em outras modalidades, a variante de Fc fornece um re- síduo de cisteína de engenharia. As regiões Fc da invenção podem empregar reconhecida técnica Fc variantes que são conhecidas por conferir uma mudança (por exemplo, um aprimoramento ou redução) na função efetora e/ou ligação de FcR ou FcRn. Especificamente, uma molécula de ligação da invenção pode incluir, por exemplo, uma alteração (por exem-plo, uma substituição) em uma ou mais das posições de aminoácidos descritas nas Publicações Internationais PCT WO96/14339A1, WO98/05787A1, WO98/23289A1, WO99/58572A1, WO00/09560A2, WO00/32767A1, WO02/44215A2, WO04/016750A2, WO04/063351A2, WO05/040217A2, WO04/044859, WO05/070963A1, WO05/077981A2, WO05/092925A2, WO05/123780A2, WO06/019447A1, WO06/047350A2, e WO06/085967A2; Publicação de Patente US Nos. US2007/0231329, US2007/0231329, US2007/0237765, US2007/0237766, US2007/0237767, US2007/0243188, US20070248603, US20070286859, US20080057056 ; ou Patentes US 5.648.260; 5.739.277; 5.834.250; 5.869.046; 6.096.871; 6.121.022; 6.194.551; 6.242.195; 6.277.375; 6.528.624; 6.538.124; 6.737.056; 6.821.505; 6.998.253; 7.083.784; 7.404.956, e 7.317.091,cada uma das quais é aqui incorporada por referência. Uma modalidade, a alteração específica (por exemplo, a substituição de um ou mais aminoácidos di-vulgadas na técnica específica) pode ser estabelecida em um ou mais das posições divulgadas de aminoácido. Uma modalidade, a alteração específica (por exemplo, a substituição de um ou mais aminoácidos di-vulgadas na técnica específica) pode ser estabelecid.

[000219] A região Fc de IgG pode ser modificada de acordo com pro-cedimentos bem reconhecidos, tais como mutagênese direcionada a local e semelhantes para render fragmentos modificados de IgG ou Fc ou porções dos mesmos que serão ligados por FcRn. Tais modificações incluem modificações remotas dos locals de contato FcRn, assim como modificações dentro dos locals de contato que preservam ou mesmo potencializam a ligação ao FcRn. Por exemplo, os seguintes resíduos de aminoácidos individuais em IgGI humana Fc (Fc ai) podem ser substituídos sem perda significativa de afinidade de ligação de Fc para FcRn: P238A, S239A, K246A, K248A, D249A, M252A, T256A, E258A, T260A, D265A, S267A, H268A, E269A, D270A, E272A, L274A, N276A, Y278A, D280A, V282A, E283A, H285A, N286A, T289A, K290A, R292A, E293A, E294A, Q295A, Y296F, N297A, S298A, Y300F, r30ia, V303A, V305A, T307A, L309A, Q3iiA, D3i2A, N3i5A, K3i7A, E3i8A, K320A, K322A, S324A, K326A, A327Q, P329A, A330Q, P33iA, E333A, K334A, T335A, S337A, K338A, K340A, Q342A, R344A, E345A, Q347A, R355A, E356A, M358A, T359A, K360A, N361A, Q362A, Y373A, S375A, D376A, A378Q, E380A, E382A, S383A, N384A, Q386A, E388A, N389A, N390A, Y391F, K392A, L398A, S400A, D401A, D413A, K414A, R416A, Q418A, Q419A, N421A, V422A, S424A, E430A, N434A, T437A, Q438A, K439A, S440A, S444A, e K447A, onde, por exemplo P238A representa prolina do tipo selvagem substituída por alanina na posição de número 238. Como um exemplo, uma modalidade específica incorpora a mutação N297A, removendo um local de glicosilação N altamente conservado. Adicionalmente à alanina, outros aminoácidos podem ser substituídos pelos aminoácidos do tipo selvagem nas posições especificadas acima. Mutações podem ser introduzidas individualmente em Fc, dando origem a mais de cem regiões Fc distintas de Fc nativa. Adicionalmente, com-binações de duas, três ou mais dessas mutações individuais podem ser introduzidas juntas, dando origem a mais centenas de regiões Fc em potencial. Além disso, uma das regiões Fc de um construto da invenção pode ser mutada e a outra região Fc de um construto não mutada de forma alguma, ou ambas podem ser mutadas, mas com diferentes mu-tações.

[000220] Algumas dessas mutações podem conferir nova funcionalidade à região Fc ou ao parceiro de ligação de FcRn. Por exemplo, uma modalidade incorpora N297A, removendo um local de glicosilação N al-tamente conservado. O efeito desta mutação é reduzir a imunogenici- dade, aumentando, desse modo, a meia-vida da região Fc, e para tornar a região Fc incapaz de se ligar ao FcαRI, FcRIIA, FcRIIB, e FcRIIIA, sem comprometer a afinidade para o FcRn (Routledge et al. 1995, Transplantation 60:847; Friend et al. 1999, Transplantation 68:1632; Shields et al. 1995, J. Biol. Chem. 276:6591). Como um exemplo adicional de nova funcionalidade decadeia de mutações descritas acima, afinidade por FcRn pode ser aumentada além daquela do tipo selvagem em alguns casos. Essa afinidade aumentada pode refletir em uma taxa "ligada" aumentada, em uma taxa "desligada" diminuída ou tanto em uma taxa "ligada" aumentada quanto em uma taxa "desligada" diminuída. Exemplos de mutações, acredita-se que lhes conferem uma maior afinidade para FcRn incluem, mas não se limitando a, T256A, T307A, E380A e N434A (Shields et al. 2001, J. Biol. Chem. 276:6591).

[000221] Adicionalmente, pelo menos três receptores gama Fc humanos parecem reconhecer um local de ligação na IgG dentro da região de dobradiça mais baixa, geralmente os aminoácidos 234-237. Portanto, outro exemplo da nova funcionalidade e de imunogenicidade potencial diminuída pode surgir de mutações desta região, como, por exemplo, substituindo os aminoácidos 233-236 de "ELLG" da IgG1 humana para a sequência correspondente de "PVA" da IgG2 (com uma deleção de aminoácido). Tem sido demonstrado que FcaRI, FcnRII, e FcdRIII, que medeiam várias funções efetoras não se ligará a IgG1 quando tais mutações foram introduzidas. Ward and Ghetie 1995, Therapeutic Immunology 2:77 and Armour et al. 1999, Eur. J. Immunol. 29:2613.

[000222] Em uma modalidade, a região constante de Ig ou de uma sua porção, por exemplo, uma região Fc, é um polipeptídeo incluindo a se-quência de PKNSSMISNTP (SEQ ID N°: 89 ou SEQ ID N°: 3 de Pat. U.S. No. 5.739.277) e, opcionalmente, incluindo ainda uma sequência selecionada de HQSLGTQ (SEQ ID N°: 90), HQNLSDGK (SEQ ID N°: 91), HQNISDGK (SEQ ID N°: 92), ou VISSHLGQ (SEQ ID N°: 93) (ou SEQ ID NOs: 11, 1, 2, e 31, respectivamente, de Pat. U.S. No. 5.739.277).

[000223] Em outra modalidade, a região de constante de imunoglobu- lina ou uma parte dele é composto por uma sequência de aminoácidos na região da dobradiça ou uma parte da mesma que forma uma ou mais ligações de bissulfeto com outra região constante de imunoglobulina ou uma parte dele. A ligação dissulfeto por região constante da imunoglo- bulina ou uma porção respectivos lugares o primeiro polipeptídeo com-preendendo de FVIII e o polipeptídeo segundo compreendendo o VWF fragmentam juntos para que VWF endógeno não substitui o VWF frag-mentar e não ligar para o de FVIII. Portanto, a ligação dissulfeto entre região constante da primeira imunoglobulina ou uma parte dele e uma segunda região constante de imunoglobulina ou uma parte impede a interação entre VWF endógeno e a proteína de FVIII. Esta inibição da interação entre o VWF e a proteína de FVIII permite o meia-vida da pro-teína quimérica para ir além do limite de duas vezes. A região de dobra-diça ou uma parte também pode ser ligada a um ou mais domínios de CH1, CH2, CH3, um fragmento e qualquer combinação das mesmas. Em uma modalidade particular, a região constante de imunoglobulina ou uma sua porção é uma região de dobradiça e CH2.

[000224] Em determinadas modalidades, região constante da lg ou uma parte é hemi-glicosilada. Por exemplo, a proteína quimérica com-preendendo duas regiões Fc ou parceiros de ligação FcRn pode conter uma primeira região Fc (por exemplo, uma região CH2 glicosilada) ou parceiro de ligação FcRn glicosilado e uma segunda região Fc (por e-xemplo, um aglicosilado CH2) ou parceiro de ligação FcRn aglicosilado. Em uma modalidade, um ligante pode ser interposto entre as regiões Fc glicosiladas e aglicosilado. Em outra modalidade, a região Fc ou parceiro de ligação FcRn é totalmente glicosilados, isto é, todas as regiões Fc são glicosiladas. Em outras modalidades, região Fc pode ser aglico- silada, isto é, nenhuma das partes Fc são glicosiladas.

[000225] Em determinadas modalidades, uma proteína quimérica da invenção compreende uma substituição do aminoácido para uma região constante de lg ou de uma parte (por exemplo, variantes de Fc), que altera as funções efetoras antígeno-independente da região constante do Ig, em particular a meia-vida circulante da proteína.

[000226] Essas Proteínas Apresentam Ligação Aumentada Ou Diminuída A Para Fcrn Quando Comparadas Às Proteínas Faltando Essas Substituições E, Portanto, Ter Um Aumento Ou Diminuição Da Meia-vida No Soro, Respectivamente. Variantes De Fc Com Maior Afinidade Para Fcrn São Antecipadas Para Ter Meia-vida Mais Longa Do Soro, E Tais Moléculas Tem Aplicações Úteis Em Métodos De Tratamento De Mamíferos Onde Longa Meia-vida Do Polipeptídeo Administrado É Desejada, Por Exemplo, Para Tratar Uma Doença Crônica Ou Distúrbio (Ver, Por Exemplo, Patentes Nos 7.348.004, 7.404.956 E 7.862.820). Em Contraste, Variantes De Fc Com Diminuição Da Afinidade De Ligação Fcrn Deverão Ter Meias-vidas Mais Curtas, E Tais Moléculas Também São Úteis, Por Exemplo, Para A Administração De Um Mamífero, Onde Um Tempo De Circulação Encurtado Pode Ser Vantajoso, Por Exemplo, Para O Diagnóstico In Vivo De Imagens Ou Em Situações Onde O Polipeptídeo Partido Tem Efeitos Secundários Tóxicos Quando Presente Na Circulação Por Períodos Prolongados. Vari-antes De Fc Com Diminuição Da Afinidade De Ligação Fcrn Também São Menos Propensas A Atravessar A Placenta E, Assim, Também São Úteis No Tratamento De Doenças Ou Distúrbios Em Mulheres Grávidas. Além Disso, Outras Aplicações Em Que Reduziram Fcrn Afinidade De Ligação Pode Ser Desejada Incluem Aquelas Aplicações Em Qual Localização O Cérebro, Rim, E/Ou Fígado É Desejada. Em Uma Modalidade Exemplar, A Proteína Quimérica Da Exposição Invenção Reduzido Transporte Através Do Epitélio Do Glomérulo Renal Da Vasculatura. Em Outra Modalidade, A Proteína Quimérica Da Invenção Tem Transporte Reduzido Através Da Barreira Hemato-encefálica (Bbb) Do Cérebro, Para O Espaço Vascular. Em Uma Modalidade, Uma Proteína Com Alterado Fcrn Ligação Compreende Pelo Menos Uma Região Fc Ou Parceiro De Ligação Fcrn (Por Exemplo, Uma Ou Duas Regiões Fc Ou Parceiros De Ligação Fcrn) Tendo Uma Ou Mais Substituições De Aminoácidos Dentro Do "Loop De Ligação Fcrn" De Uma Região Constante Do Ig. O Laço De Ligação Fcrn É Composto De A- Minoácidos Resíduos 280-299 (De Acordo Com A Numeração Eu) De Uma Região Fc Do Tipo Selvagem De Comprimento Total. Em Uma Modalidade, Uma Região Constante De Ig Ou Parte Dela Em Uma Proteína Quimérica Da Invenção Com Afinidade De Ligação Fcrn Alterada Compreende Pelo Me-nos Uma Região Fc Ou Parceiro De Ligação Fcrn (Por Exemplo, Uma Ou Duas Regiões Fc Ou Parceiros De Ligação Fcrn) Tendo Uma Ou Mais Subs-tituições De Aminoácidos Dentro De 15 Á Fcrn "Zona De Contato". Tal Como Aqui Utilizado, O Termo 15 Á Fcrn "Zona De Contato" Inclui Resíduos Nas Posições Seguintes De Um Tipo Selvagem, De Uma Fração De Compri-mento Total Fc: 243-261, 275-280, 282-293, 302-319, 336- 348, 367, 369, 372-389, 391, 393, 408, 424, 425-440 (Numeração Eu). Em Outras Modalidades, Uma Região Constante De Ig Ou De Uma Sua Porção Da In-venção Tendo Alterado A Afinidade De Ligação De Fcrn Compreende, Pelo Menos, Uma Região Fc Ou Parceiro De Ligação Ao Fcrn Tendo Uma Ou Mais Substituições De Aminoácidos Em Uma Posição De Aminoácido Cor-respondente A Qualquer Uma Das Seguintes Posições Eu: 256, 277-281, 283-288, 303-309, 313, 338, 342, 376, 381, 384, 385, 387, 434 (Por E-xemplo, N434a Ou N434k), E 438. Exemplos De Substituições De Ami- Noácidos Que Alteraram A Atividade De Ligação Ao Fcrn São Revelados Na Publicação Internacional Pct No. Wo05/047327 Que É Aqui Incorporado Por Referência.

[000227] Uma região Fc ou parceiro de ligação FcRn usado na invenção também pode incluir uma substituição de aminoácido reconhecida na técnica que altera a glicosilação da proteína quimérica. Por exemplo, a região Fc ou FcRn parceiro de ligação da proteína quimérica ligados a um fragmento VWF ou uma proteína de FVIII pode incluir uma região Fc tendo uma mutação levando a glicosilação reduzida (por exemplo, glicosilação ligada a N - ou O-) ou pode incluir uma alteração de glico- forma da unidade Fc do tipo selvagem (por exemplo, uma baixa fucose ou livre de fucose glicano).

[000228] Em uma modalidade, uma proteína quimérica não transformada da invenção pode incluir uma região Fc geneticamente fundida (isto é, região scFc), tendo dois ou mais dos seu constituinte da região constante de Ig ou uma porção selecionada independentemente da região constante de Ig ou uma parte dela aqui descrita. Em uma modalidade, as regiões Fc de uma região Fc dimérica são as mesmas. Em outra modalidade, pelo menos, duas das regiões Fc são diferentes. Por exemplo, as regiões Fc ou parceiros de ligação FcRn das proteínas da invenção compreendem o mesmo número de resíduos de aminoácidos ou podem ser diferentes de comprimento por um ou mais resíduos de aminoácidos (por exemplo, por aproximadamente 5 resíduos de aminoácidos (por exemplo, 1, 2, 3, 4 ou 5 resíduos de aminoácidos), aproximadamente 10 resíduos, aproximadamente 15 resíduos, aproximadamente 20 resíduos, aproxima-damente 30 resíduos, aproximadamente 40 resíduos ou aproximadamente 50 resíduos). Em ainda outras modalidades, regiões Fc ou parceiros de ligação FcRn da proteína da invenção podem diferir em sequência em uma ou mais posições de aminoácidos. Por exemplo, pelo menos duas das regiões Fc ou parceiros de ligação FcRn podem ser diferentes em posições de aproximadamente 5 aminoácidos (por exemplo, 1, 2, 3, 4 ou 5 posições de aminoácidos), aproximadamente 10 posições, aproximada-mente 15 posições, aproximadamente 20 posições, aproximadamente 30 posições, aproximadamente 40 vagas ou aproximadamente 50 posições).

II. E. Ligantes

[000229] A proteína quimérica da presente invenção compreende ainda um ou mais ligantes. Um tipo dos ligantes é um ligante clivável, que pode ser clivado por várias proteases, quando administrados a um sujeito in vivo, por exemplo, em um local de coagulação. Em uma modalidade, o agente de ligação clivável permite a clivagem da porção, por exemplo, uma proteína de VWF, a partir da sequência XTEN, assim, a partir da proteína quimérica no local da cascata de coagulação, permi-tindo assim que o FVIII ativado (FVIIIa) tem a sua atividade FVIIIa. Outro tipo dos ligantes é um ligante processável, que contém um local de cli-vagem intracelular e, assim, pode ser clivada por uma enzima de pro-cessamento intracelular em uma célula hospedeira, permitindo a ex-pressão de um polipeptídeo conveniente e formação de uma proteína quimérica.

[000230] Um ou mais ligantes podem estar presentes entre quaisquer duas proteínas na proteína quimérica. Em uma modalidade, uma proteína quimérica compreende um primeiro polipeptídeo que compreende (i) uma proteína FVIII e (ii) uma primeira região de Ig constante ou uma porção da mesma, e um segundo polipeptídeo que compreende: (iii) uma proteína de VWF, (iv) um ligante (por exemplo, um ligante clivável), (v) uma sequência de XTEN, e (vi) uma segunda região constante de Ig ou de uma porção da mesma. Em uma outra modalidade, uma proteína quimérica compreende um primeiro polipeptídeo que compreende (i) uma proteína FVIII e (ii) uma primeira região de Ig constante ou uma porção da mesma, e um segundo polipeptídeo que compreende: (iii) uma proteína de VWF, (iv) uma sequência XTEN, (v) um ligante (por exemplo, um ligante clivável), e (vi) uma segunda região constante de Ig ou de uma porção da mesma. Em uma outra modalidade, uma proteína quimérica compreende um primeiro polipeptídeo que compreende (i) uma proteína FVIII e (ii) uma primeira região de Ig constante ou uma porção da mesma, e um segundo polipeptídeo que compreende: (iii) uma proteína de VWF, (iv) um primeiro ligante (por exemplo, um ligante clivável), (v) uma sequência de XTEN, (vi) um segundo ligante (por e-xemplo, um ligante clivável), e (vii) uma segunda região constante de Ig ou de uma porção da mesma. Em algumas modalidades, o primeiro po- lipeptídeo compreende ainda um ligante, por exemplo, um agente de ligação clivável entre a proteína FVIII e a primeira região constante de Ig.

[000231] Em certas modalidades, uma proteína quimérica compreende uma cadeia simples que compreende (i) uma proteína FVIII, (ii) uma primeira região constante de Ig ou uma porção da mesma, (iii) um ligante (por exemplo, um ligante processável), (iv) uma proteína VWF, (v) uma sequência de XTEN, e (vi) uma segunda região constante de Ig ou de uma porção da mesma. Em outras modalidades, uma proteína quimérica compreende uma cadeia simples que compreende (i) uma proteína FVIII, (ii) uma primeira região constante de Ig ou uma porção da mesma, (iii) um primeiro ligante (por exemplo, um ligante processá- vel), (iv) uma proteína VWF, (v) um segundo ligante (por exemplo, um ligante clivável), (vi) uma sequência de XTEN, e (vii) uma segunda região constante de Ig ou de uma porção da mesma. O ligante processá- vel pode ser processado após a proteína quimérica é expressa na célula hospedeira; assim, a proteína quimérica produzida na célula hospedeira pode estar na forma final que compreende dois ou três cadeias polipep- tídicas.

[000232] O ligante útil na presente invenção pode abranger qualquer molécula orgânica. Em uma modalidade, o ligante compreende um po-límero, por exemplo, polietilenoglicol (PEG) ou amido hidroxietil (HES). Em uma outra modalidade, o ligante compreende uma sequência de a- minoácidos. O ligante pode compreender pelo menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900 ou 2000 amino- ácidos. O ligante pode compreender 1-5 aminoácidos, 1-10 aminoáci- dos, 1-20 aminoácidos, 10-50 aminoácidos, 50-100 aminoácidos, 100200 aminoácidos, 200-300 aminoácidos, aminoácidos 300-400, 400-500 aminoácidos, 500-600 aminoácidos, 600-700 aminoácidos, 700-800 a- minoácidos, 800-900 aminoácidos ou 900-1000 aminoácidos. Em uma modalidade, o ligante compreende uma sequência de XTEN. Exemplos adicionais de XTEN podem ser utilizados de acordo com a presente in-venção e são descritos na Publicação de Patente US Nos. 2010/0239554 A1, 2010/0323956 A1, 2011/0046060 A1, 2011/0046061 A1, 2011/0077199 A1, 2011/0172146 ou A1, ou publicação de Patente Internacional Nos. WO 2010091122 A1, WO 2010144502 A2, WO 2010144508 A1, WO 2011028228 A1, WO 2011028229 A1, ou WO 2011028344 A2. Em uma outra modalidade, o ligante é uma sequência de PAS.

[000233] Em uma modalidade, o ligante é um polímero, por exemplo, polietilenoglicol (PEG) ou amido hidroxietil (HES). Em uma outra moda-lidade, o ligante é uma sequência de aminoácido. O ligante pode com-preender pelo menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900 ou 2000 aminoácidos. O ligante pode compre-ender 1-5 aminoácidos, 1-10 aminoácidos, 1-20 aminoácidos, 10-50 a- minoácidos, 50-100 aminoácidos, 100-200 aminoácidos, 200-300 ami- noácidos, aminoácidos 300-400, 400-500 aminoácidos, 500-600 amino- ácidos, 600-700 aminoácidos, 700-800 aminoácidos, 800-900 aminoá- cidos ou 900-1000 aminoácidos.

[000234] Exemplos de ligantes são bem conhecidos na técnica. Em uma modalidade, o ligante compreende a sequência de Gn. O ligante pode compreender a sequência (GA)n. O ligante pode compreender a sequência (GGS)n. Em outras modalidades, o ligante compreende (GGGS)n (SEQ ID N°: 101). Em outras modalidades, ainda, o ligante compreende a sequência (GGS)n(GGGGS)n (SEQ ID N°: 95). Nestes casos, n pode ser um número inteiro de 1 a 100. Em outros casos, n pode ser um número inteiro de 1 a 20, isto é, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20. Exemplos de ligantes incluem, mas não estão limitados a, GGG, SGGSGGS (SEQ ID N°: 96), GGSGGSGGSGGSGGG (SEQ ID N°: 97), GGSGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID N°: 98), GGSGGSGGSGGSGGSGGS (SEQ ID N°: 99), ou GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID N°: 100). O ligante não elimina ou diminui a atividade do fragmento VWF ou a atividade de coagulação do Fator VIII. Opcionalmente, o ligante aumenta a atividade de proteína VWF ou a atividade de coagulação da proteína do fator VIII, por exemplo, diminuindo também os efeitos do impedimento estérico e tornando a proteína VWF ou fator VIII parte mais acessível ao seu local de ligação de destino.

[000235] Em uma modalidade, o ligante útil para a proteína quimérica é 15-25 aminoácidos longos. Em outra modalidade, o ligante útil para a proteína quimérica é 15-20 aminoácidos longos. Em algumas modalida-des, o ligante para a proteína quimérica é 10-25 aminoácidos longos. Em outras modalidades, o ligante para a proteína quimérica é 15 ami- noácidos longos. Em ainda outras modalidades, o ligante para a proteína quimérica é (GGGGS)n (SEQ ID N°: 94) em que G representa glicina, S representa serina e n é um número inteiro de 1-20.

II. F. Locais de clivagem

[000236] O ligante clivável também pode incorporar um fração capaz de ser clivada tanto quimicamente (por exemplo, a hidrólise de uma ligação éster), como enzimaticamente (isto é, a modalidade de uma sequência de clivagem de protease), ou fotoliticamente (por exemplo, um cromóforo como ácido 3-amino-3-(2-nitrofenil)proprionico (ANP)) para liberação de uma molécula do outro.

[000237] Em uma modalidade, um ligante clivável compreende um ou mais locais de clivagem na extremidade do terminal N ou terminal C ou em ambos. Em outra modalidade, o ligante clivável consiste essencial-mente que consiste em um ou mais locais passíveis de clivagem. Em outras modalidades, o ligante clivável compreende sequências ligantes de aminoácidos heterólogos aqui descritas ou polímeros e um ou mais locais cliváveis.

[000238] Em determinadas modalidades, um ligante clivável compreende um ou mais locais de clivagem podendo ser clivados em uma célula hospedeira (isto é, locais de processamento intracelular). Exemplos não limitativos do local de clivagem incluem RRRR (SEQ ID N°: 102), RKRRKR (SEQ ID N°: 103), e RRRRS (SEQ ID N°: 104).

[000239] Em algumas modalidades, um ligante clivável compreende uma região a1 de FVIII, uma região a2 de FVIII, uma região a3 de FVIII, um local clivável de trombina que compreende X-V-P-R (SEQ ID N°: 105) e um motivo de interação PAR1 exosítio, em que X é um aminoá- cido alifático, ou quaisquer combinações dos mesmos. Compreende a região a2, que compreende uma sequência de aminoácidos de pelo menos cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95%, ou 100% idêntica à Glu720 para Arg740 correspondente a de comprimento completo de FVIII, em que a região a2 é capaz de ser clivado pela trombina. Em uma modalidade particular, um ligante clivável útil para a invenção compreende uma região a2 que compreende ISDKNTGDYYEDSYE- DISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID N°: 106). Em outras modalidades, um ligante clivável para a invenção compreende a região a1 que compreende uma sequência de aminoácidos de pelo menos cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95%, ou 100% idêntica à Met337 para Arg372 correspondente ao FVIII comprimento total, em que a região a1 é capaz de ser clivado pela trombina. Em uma modalidade particular, a região a1 compreende ISMKNNEEAE- DYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSV (SEQ ID N°: 107). Em al-gumas modalidades, um ligante clivável da invenção compreende a re-gião a3, que compreende uma sequência de aminoácidos de pelo menos cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95%, ou 100% idêntica à Glu1649 para Arg1689 correspondente ao FVIII comprimento total, em que a região a3 é capaz de ser clivado pela trombina. Em uma modalidade específica, um ligante clivável para a presente invenção compreende uma região de a3 compreende ISEITRTTLQSDQE- EIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQ (SEQ ID N°: 108).

[000240] Em outras modalidades, um ligante clivável compreende o local de clivagem de trombina, que compreende XVPR (SEQ ID N°: 105) e o motivo de interação PAR1 exosítio e em que o motivo de interação PAR1 exosítio compreende S-F-L-L-R-N (SEQ ID N°: 109). O motivo de interação PAR1 exosítio pode ainda compreender uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de P, P-N, P-N-D, P-N-D-K (SEQ ID N°: 110), P-N-D-K-Y (SEQ ID N°: 111), P-N-D-K-Y-E (SEQ ID N°: 112), P-N-D-K-Y-E-P (SEQ ID N°: 113), P-N-D-K-Y-E-P-F (SEQ ID N°: 114), P-N-D-K-Y-E-P-F-W (SEQ ID N°: 115), P-N-D-K-Y-E-P-F-W-E (SEQ ID N°: 116), P-N-D-K-Y-E-P-F-W-E-D (SEQ ID N°: 117), P-N-D-K-Y-E-P-F- W-E-D-E (SEQ ID N°: 118), P-N-D-K-Y-E-P-F-W-E-D-E-E (SEQ ID N°: 119), P-N-D-K-Y-E-P-F-W-E-D-E-E-S (SEQ ID N°: 120), ou qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, o aminoácido ali- fático é selecionado de entre glicina, alanina, valina, leucina ou isoleu- cina.

[000241] Em outras modalidades, um ligante clivável compreende um ou mais locais de clivagem que são clivados por uma protease, depois que uma proteína quimérica compreendendo o ligante clivável é administrada a um sujeito. Em uma modalidade, o local clivável é clivado pela protease selecionado do grupo consistindo do fator XIa, fator XIIa, cali- creína, fator VIIa, fator IXa, fator Xa, fator IIa (trombina), Elastase-2, MMP-12, MMP-13, MMP-17 e MMP-20. Em outra modalidade, o local de clivagem é selecionado do grupo consistindo do local de clivagem FXla (por exemplo, KLTR^AET (SEQ ID N°: 121)), um local clivável FXIa (por exemplo, DFTR^VVG (SEQ ID N°: 122)), um local clivável FXIIa (por exemplo, TMTR^IVGG (SEQ ID N°: 123)), um local clivável Kal- likrein (por exemplo, SPFR^STGG (SEQ ID N°: 124)), um local clivável FVIIa (por exemplo, LQVR^IVGG (SEQ ID N°: 125)), um local clivável FIXa (por exemplo, PLGR^IVGG (SEQ ID N°: 126)), um local clivável FXa (por exemplo, IEGR^TVGG (SEQ ID N°: 127)), um local clivável FIIa (thrombin) (por exemplo, LTPR^SLLV (SEQ ID N°: 128)), um local clivável Elastase-2 (por exemplo, LGPV^SGVP (SEQ ID N°: 129)), um clivável Granzyme-B (por exemplo, VAGD^SLEE (SEQ ID N°: 130)), um local clivável MMP-12 (por exemplo, GPAG^LGGA (SEQ ID N°: 131)), um local clivável MMP-13 (por exemplo, GPAG^LRGA (SEQ ID N°: 132)), um local clivável MMP-17 (por exemplo, APLG^LRLR (SEQ ID N°: 133)), um local clivável MMP-20 (por exemplo, PALP^LVAQ (SEQ ID N°: 134)), um local clivável TEV (por exemplo, ENLYFQ^G (SEQ ID N°: 135)), um local clivável Enterokinase (por exemplo, DDDK^IVGG (SEQ ID N°: 136)), um local clivável Protease 3C (PRESCISSION™) sitclea (por exemplo, LEVLFQ^GP (SEQ ID N°: 137)), e um local clivável Sortase A (por exemplo, LPKT^GSES) (SEQ ID N°: 138). Em certas modalidades, os locais de clivagem FXIa incluem, mas não estão limitados a, por exemplo, TQSFNDFTR (SEQ ID N°: 1) e SVSQTSKLTR (SEQ ID N°: 3). Locais de clivagem de trombina exemplares não limitativos incluem, por exemplo, DFLAEGGGVR (SEQ ID N°: 4), TTKIKPR (SEQ ID N°: 5), LVPRG (SEQ ID N°: 6), DKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIE- PRSFS (SEQ ID N°: 88), ou IEPRSFS (SEQ ID N°: 194), e uma sequência que compreende, que consiste essencialmente em, ou que consiste em ALRPR (SEQ ID N°: 7) (por exemplo, ALRPRVVGGA (SEQ ID N°: 145)).

[000242] Em uma modalidade específica, o local de clivagem é TLD- PRSFLLRNPNDKYEPFWEDEEK (SEQ ID N°: 146). Em uma outra mo-dalidade, o local de clivagem compreende DKNTGDYYEDSYEDISAY- LLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID N°: 88) ou um fragmento deste. Em uma modalidade particular, o local de clivagem compreende IEPRSFS (SEQ ID N°: 194). Em uma outra modalidade, o local de clivagem compreende EPRSFS (SEQ ID N°: 195), em que o local de clivagem não é a região a2 de FVIII comprimento total. Em ainda outra modalidade, o local de clivagem compreende IEPR (SEQ ID N°: 200). Em uma outra modalidade, o local de clivagem compreende IEPR (SEQ ID N°: 200), em que o local de clivagem não é a região a2 de FVIII do comprimento total ou não compreende a região a2 de FVIII comprimento total. Em outras mo-dalidades, o local de clivagem compreende DKNTGDYYEDSYEDISAY- LLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID N°: 88), KNTGDYYEDSYEDISAYLLSKN- NAIEPRSFS (SEQ ID N°: 139), NTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIE- PRSFS (SEQ ID N°: 140), TGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID N°: 141), GDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID N°: 142), DYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID N°: 143), Y- YEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID N°: 144), YEDSYEDISAY- LLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID N°: 176), EDSYEDISAYLLSKNNAIE- PRSFS (SEQ ID N°: 177), DSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID N°: 178), SYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID N°: 179), YEDISAY- LLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID N°: 180), EDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID N°: 181), DISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID N°: 182), ISAY- LLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID N°: 183), SAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID N°: 184), AYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID N°: 185), YLLSKNNAIE- PRSFS (SEQ ID N°: 186), LLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID N°: 187), LSKN- NAIEPRSFS (SEQ ID N°: 188), SKNNAIEPRSFS (SEQ ID N°: 189), KNNAIEPRSFS (SEQ ID N°: 190), NNAIEPRSFS (SEQ ID N°: 191), NAIEPRSFS (SEQ ID N°: 192), AIEPRSFS (SEQ ID N°: 193), ou IE- PRSFS (SEQ ID N°: 194). Em outras modalidades, o local de clivagem compreende DKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID N°: 88), KNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID N°: 139), NTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID N°: 140), TGDY-YEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID N°: 141), GDYYEDSYE-DISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID N°: 142), DYYEDSYEDISAY- LLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID N°: 143), YYEDSYEDISAYLLSKNNAIE- PRSFS (SEQ ID N°: 144), YEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID N°: 176), EDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID N°: 177), DSYE- DISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID N°: 178), SYEDISAYLLSKNNAIE- PRSFS (SEQ ID N°: 179), YEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID N°: 180), EDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID N°: 181), DISAYLLSKNNAI- EPRSFS (SEQ ID N°: 182), ISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID N°: 183), SAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID N°: 184), AYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID N°: 185), YLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID N°: 186), LLSKNNAI-EPRSFS (SEQ ID N°: 187), LSKNNAIEPRSFS (SEQ ID N°: 188), SKN- NAIEPRSFS (SEQ ID N°: 189), KNNAIEPRSFS (SEQ ID N°: 190), NNAIEPRSFS (SEQ ID N°: 191), NAIEPRSFS (SEQ ID N°: 192), AIE- PRSFS (SEQ ID N°: 193), ou IEPRSFS (SEQ ID N°:194), em que o local de clivagem não é a região a2 de FVIII de comprimento total. Em certas modalidades o agente ligante clivável é clivável em um ensaio de cliva-gem de trombina, como aqui proporcionados ou como conhecido na téc-nica.

III. Os Polinucleotídeos, Vetores e Células hospedeiras

[000243] É também proporcionado na presente invenção um polinu- cleotídeo que codifica uma proteína quimérica da invenção. Em uma modalidade, a primeira cadeia de polipeptídeos e a segunda cadeia de polipeptídeo podem ser codificadas por um polinucleotídeo de cadeia simples. Em uma outra modalidade, a primeira cadeia de polipeptídeos e a segunda cadeia de polipeptídeos são codificadas por dois polinucle- otídeos diferentes, isto é, uma primeira sequência de nucleotídeos e uma segunda sequência de nucleotídeos. Em outra modalidade, a sequência de nucleotídeos a primeira e a segunda sequência de núcleotí- deos estão dois polinucleotídeos diferentes (por exemplo, diferentes vetores).

[000244] A invenção inclui um polinucleotídeo que codifica um poli- peptídeo de cadeia única (por exemplo, FVIII (X2)-F1-L3-F2-L2-X1-L1- V), em que o FVIII (X2) compreende uma proteína FVIII no qual uma sequência de XTEN é inserida em um ou mais locais de inserção, F1 compreende uma primeira região constante de Ig ou uma porção desta, por exemplo, uma primeira região Fc, um primeiro ligante compreende L1, V compreende uma proteína de VWF, X1 compreende uma sequência de XTEN tendo menos de 288 aminoácidos de comprimento, L2 compreende um segundo ligante, L3 compreende um terceiro ligante, e F2 compreende uma segunda região constante de Ig ou sua porção, por exemplo, uma segunda região Fc. A invenção também inclui dois poli- nucleotídeos, uma primeira sequência de polinucleotídeo que codifica um primeiro polipeptídeo que compreende uma proteína FVIII fundida com uma primeira região constante de Ig ou de sua porção e uma segunda sequência de polinucleotídeo que codifica um segundo polipeptí- deo que compreende uma proteína de VWF, uma sequência de XTEN possuindo menos de 288 aminoácidos de comprimento, e uma segunda região constante de Ig ou de sua porção. Em algumas modalidades, uma proteína quimérica que compreende duas cadeias de polipeptídeo ou três cadeias de polipeptídeo pode ser codificado por um polinucleo- tídeo de cadeia simples, e, em seguida, transformada em duas ou três (ou mais) cadeias polipeptídicas. Em ainda outras modalidades, uma proteína quimérica compreendendo estas cadeias de polipeptídeos podem ser codificados por duas ou três cadeias polinucleotídicas.

[000245] Em outras modalidades, o conjunto dos polinucleotídeos ainda compreende uma cadeia de nucleotídeos adicionais (por exemplo, um segundo nucleotídeo da cadeia quando o polipeptídeo quimérico é codificado por uma cadeia polinucleotídica único ou uma cadeia de nucleotídeos a terceiros quando a proteína quimérica é codificada por duas cadeias polinucleotídeo) que codifica uma proteína conver- tase. A proteína convertase pode ser selecionada no grupo consistindo de pró-convertase subtilisina/kexin tipo 5 (PCSK5 ou PC5), pró-conver- tase subtilisina/kexin tipo 7 (PCSK7 ou PC5), uma levedura 2 Kex, pró- convertase subtilisina/kexin tipo 3 (PACE ou PCSK3) e duas ou mais combinações. Em algumas modalidades, a proteína convertase é PACE, PC5 ou PC7. Em uma modalidade específica, a proteína conver- tase é PC5 ou PC7. Consulte pedido Internacional No. PCT/US2011/043568.

[000246] Como usados aqui, um vetor de expressão refere-se a qualquer construto de ácido nucleico que contém os elementos necessários para a transcrição e tradução de uma sequência de código inserida, ou no caso de um vetor viral de RNA, os elementos necessários para a replicação e tradução, quando introduzidos em uma célula hospedeira adequada. Vetores de expressão podem incluir fagemídeos, plasmí- deos, vírus e seus derivados.

[000247] Os vetores de expressão da presente invenção incluirão po- linucleotídeos que codificam a proteína quimérica aqui descrita. Em uma modalidade, uma ou mais das sequências de codificação para o primeiro polipeptídeo que compreende uma proteína FVIII e uma primeira região constante de Ig, o segundo polipeptídeo que compreende uma proteína de VWF, uma sequência de XTEN tendo menos de 288 amino- ácidos, e uma segunda região constante de Ig ou uma porção da mesma, ou ambos estão ligados operativamente a uma sequência de controle de expressão. Como usados aqui, duas sequências de ácidos nucleicos operacionalmente são ligadas quando estão covalentemente ligadas de modo a permitir a cada sequência de ácido nucleico do componente para reter sua funcionalidade. A sequência de código e uma sequência de controle de expressão do gene são ditos operacionalmente ligado quando estão covalentemente ligados de forma a colocar a expressão ou transcrição ou tradução da sequência de codificação sob a influência ou controle da sequência de controle da expressão de gene. Duas sequências de DNA são referidas a serem ligadas operaci-onalmente se a indução de um promotor na sequência de expressão gene 5' resultando na transcrição da sequência de codificação, e se a natureza da ligação entre as duas sequências de DNA não (1) resultam na introdução de uma mutação do frame-shift, (2) interferem com a ca-pacidade da região promotora para direcionar a transcrição da sequência de codificação, ou (3) interferem com a capacidade da correspondente transcrição de RNA para ser traduzida em uma proteína. Assim, uma sequência de expressão do gene teria operacionalmente ligado à codificação da sequência de ácido nucleico se a sequência de expressão do gene era capaz de efetuar transcrição dessa codificação da sequência de ácido nucleico, tal que a transcrição resultante é traduzida para a proteína desejada ou polipeptídeo.

[000248] Uma sequência de controle da expressão do gene como usada aqui é qualquer sequência de nucleotídeos reguladoras, tais como uma combinação da sequência de promotor, ou combinação do promo- tor-potenciador, que facilita a transcrição eficiente e tradução da codificação do ácido nucleico ao qual ele está ligado, operacionalmente. A sequência de controle de expressão do gene pode, por exemplo, ser um promotor de mamíferos ou viral, tais como um promotor constitutivo ou induzível. Promotores constitutivos de mamíferos incluem, mas não estão limitados aos promotores para os seguintes genes: hipoxantina fos- forribosil transferase (HPRT), deaminase da adenosina, piruvato qui- nase, promotor da beta-actina e outros promotores constitutivos. Exemplares promotores virais que funcionam constitutivamente em células eucariótica incluem, por exemplo, promotores do citomegalovírus (CMV), vírus simian (por exemplo, SV40), vírus do papiloma, adenoví- rus, vírus de imunodeficiência humana (HIV), vírus do sarcoma de Rous, citomegalovírus, as repetições tempo terminais (LTR) do vírus da leuce-mia de Moloney e outros retrovírus e promotor timidina quinase do vírus herpes simplex. Outros promotores constitutivos são conhecidos por a-queles versados na técnica. Os promotores úteis como sequências de expressão do gene da invenção também incluem promotores induzíveis. Promotores induzíveis exprimem-se na presença de um agente de in-dução. Por exemplo, o promotor de metalotioneína é induzido para pro-mover a transcrição e tradução na presença de certos íons metálicos. Outros promotores constitutivos são conhecidos por aqueles versados na técnica.

[000249] Em geral, a sequência de controle de expressão do gene deve incluir, conforme necessário, sequências não transcrevendo de 5' e não traduzindo de 5' envolvidas com a iniciação da transcrição e tradução, respectivamente, como uma caixa TATA, tampando a sequência, se-quência CAAT e afins. Especialmente, tais sequências não transcrevendo de 5' incluirão uma região de promotor que inclui uma sequência de promotor para controle transcricional do ácido nucleico de codificação operacionalmente conjunta. As sequências de expressão do gene opcionalmente incluem sequências do potenciador ou sequências do ativador a montante como desejado.

[000250] Vetores virais incluem, mas não estão limitados a sequências de ácidos nucleicos dos seguintes vírus: retrovírus, como o vírus da leucemia murino Moloney, Harvey sarcoma murino vírus, vírus do tumor mamário murino e vírus do sarcoma de Rous; adenovírus, vírus adeno-associado; Vírus SV40-tipo; polyomaviruses; Vírus de Epstein- Barr; vírus do papiloma; vírus herpes; vírus vaccinia; vírus da poliomielite; e vírus de RNA como um retrovírus. Prontamente, um pode empregar outros vetores conhecidos na técnica. Certos vetores virais são ba-seados em vírus eucariotas não citopáticos em que os genes não es- senciais foram substituídos com o gene de interesse. Vírus não citopá- ticos incluem retrovírus, o ciclo de vida dos quais envolve a transcrição reversa do genoma RNA viral em DNA, com subsequente integração proviral no DNA celular hospedeiro. Retrovírus foram aprovados para ensaios de terapia do gene humano. Mais úteis são os retrovírus que são deficientes em replicação (isto é, capaz de dirigir a síntese de proteínas desejadas, mas incapaz de manufaturar uma partícula infecciosa). Tais vetores de expressão retroviral genéticamente modificados têm utilidade geral para a transdução de alta eficiência de genes in vivo. Protocolos padrão para a produção de replicação deficiente retrovírus (incluindo as etapas de modalidade de material genético exógeno em um plasmídeo, transfecção de uma linhagem de células de embalagens com plasmídeo, produção de retrovírus recombinantes pela linha celular embalagens, coleta de partículas virais de meios de cultura de tecidos e infecção das células alvo com partículas virais) são fornecidos em Kri- egler, M., Gene transferência e expressão Um laboratório Manual, W.H. Freeman co., New York (1990) e Murry, E. J., métodos em Biologia Molecular, Vol. 7, Humana Press, Inc., Cliffton, N.J. (1991).

[000251] Em uma modalidade, o vírus é um vírus adeno-associado, um vírus de DNA de cadeia dupla. O vírus adeno-associado pode ser projetado para ser deficiente em replicação e é capaz de infectar uma grande variedade de tipos de células e espécies. Tem também vantagens como estabilidade solvente calor e lipídios; frequências de trans- dução alta nas células de diversas linhagens, incluindo células hemato- poiéticas; e falta de inibição de superinfecção, permitindo várias séries de transduções. Alegadamente, o vírus adeno-associado pode integrar no DNA celular humano de forma específica, minimizando assim a pos-sibilidade de mutagênese insercional e variabilidade da expressão do gene inserido característico de infecção retroviral. Além disso, infecções de vírus adeno-associado do tipo selvagem foram seguidas em cultura de tecidos para maior que 100 passagens na ausência de pressão se-letiva, implicando que a integração de genômica do vírus adeno-associ- ado é um evento relativamente estável. O vírus adeno-associado também pode funcionar de forma extracromossômico.

[000252] Outros vetores incluem vetores do plasmídeo. Vetores do plasmídeo têm sido amplamente descritos na técnica e são bem conhe-cidos para os versados na técnica. Ver, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. Nos últimos anos, verificou-se ser par-ticularmente vantajoso para entrega de genes para células in vivo por causa de sua incapacidade de se replicar dentro e integrar em um ge- noma hospedeiro vetores do plasmídeo. Estes plasmídeos, no entanto, têm um promotor compatível com a célula hospedeira, podem expressar um peptídeo de um gene operacionalmente codificado dentro do plas- mídeo. Alguns plasmídeos comumente usados disponíveis de fornece-dores comerciais incluem pBR322, pUC18, pUC19, vários plasmídeos de pcdna, pRC/CMV, vários plasmídeos pCMV, pSV40 e pBlueScript. Exemplos adicionais de plasmídeos específicos incluem pcDNA3.1, nú-mero de catálogo V79020; pcDNA3.1/higrômetro, número de catálogo V87020; número de catálogo pcDNA4/myc-His, V86320; e pBudCE4.1, número de catálogo V53220, todos da Invitrogen (Carlsbad, CA.). Esses métodos são bem conhecidos para aqueles versados na técnica. Adici-onalmente, plasmídeos podem ser personalizados projetado usando técnicas padrão de biologia molecular para remover e/ou adicionar fra-gmentos específicos de DNA.

[000253] Em um sistema de expressão de insetos que pode ser usado para produzir as proteínas da invenção, Autographa californica nuclear polyhidrosis vírus (AcNPV) é usado como um vetor para expressar os genes estrangeiros. O vírus cresce nas células deSpodoptera frugi- perda. A sequência de codificação de anticorpos pode ser clonada indi-vidualmente em regiões não essenciais (por exemplo, o gene poliedrina) do vírus e colocado sob controle de um promotor de AcNPV (por exem-plo, o promotor de poliedrina). Inserção bem-sucedida de uma sequência de codificação resultará em inativação do gene do poliedro e produção de vírus recombinantes não obstruída (isto é, vírus, falta o casaco proteicos codificado para pelo gene poliedro). Estes vírus recombinan- tes são então utilizados para infectar Spodoptera frugiperda as células nas quais o gene inserido é expresso. (Ver, por exemplo, Smith et al. (1983) J Virol 46:584; U.S. Pat. No. 4.215.051). Outros exemplos deste sistema de expressão podem ser encontrados em Ausubel et al., eds. (1989) Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience.

[000254] Outro sistema que pode ser usado para expressar as proteínas da invenção é o sistema de expressão do gene da sintetase gluta- mina, também conhecido como o sistema de expressão"GS" (Lonza Biologics PLC, Berkshire UK). Este sistema de expressão é descrito em detalhes na Pat. U.S. No. 5.981.216.

[000255] Nas células hospedeiras de mamíferos, um número de sistemas de expressão com base viral pode ser utilizado. Em casos onde um adenovírus é usado como um vetor de expressão, a sequência de código pode ser ligada a um controle de transcrição e tradução de adeno- vírus complexo, por exemplo, o promotor atrasado e sequência líder tripartido. Este gene quimérico pode então ser inserido no genoma de adenovírus pela recombinação in vitro ou in vivo. Inserção em uma região nãoessenciais do genoma viral (por exemplo, região E1 ou E3) resultará em um vírus recombinante que é viável e capaz de expressar o peptídeo em hospedeiros infectados. Ver, por exemplo, Logan & Shenk (1984) Proc Natl Acad Sci USA 81:3655). Alternativamente, o promotor vaccinia 7.5 K pode ser usado. Ver, por exemplo, Mackett et al. (1982) Proc Natl Acad Sci USA 79:7415; Mackett et al. (1984) J Virol 49:857; Panicali et al. (1982) Proc Natl Acad Sci USA 79:4927.

[000256] Para aumentar a eficiência da produção, os polinucleotídeos podem ser projetados para codificar várias unidades da proteína da in-venção separada por locais de clivagem enzimática. O polipeptídeo re-sultante pode ser clivada (por exemplo, pelo tratamento com a enzima apropriada) para recuperar as unidades do polipeptídeo. Isto pode au-mentar o rendimento de polipeptídeos, impulsionado por um único pro-motor. Quando usado em sistemas adequados de expressão viral, a tra-dução de cada polipeptídeo codificado pelo mRNA é dirigida internamente na transcrição; por exemplo, por um local de entrada interno Ri- bossoma, IRES. Assim, o construto de policistrônico direciona a trans-crição de um único e grande mRNA policistrônico que, por sua vez, di-reciona a tradução de múltiplos, polipeptídeos individuais. Essa aborda-gem elimina a produção e transformação enzimática de poliproteínas e pode aumentar significativamente o rendimento de polipeptídeos, impul-sionado por um único promotor.

[000257] Vetores utilizados na transformação geralmente contêm um marcador selecionável, usado para identificar os transformantes. Nos sistemas bacterianos, isso pode incluir um gene de resistência a anti-bióticos como ampicilina ou canamicina. Marcadores selecionáveis para uso em culturas de células de mamíferos incluem genes que conferem resistência a drogas, como a neomicina, higromicina e metotrexato. O marcador selecionável pode ser um marcador selecionável ampliáveis. Um marcador selecionável ampliável é gene redutase dihidrofolato (DHFR). Simonsen C C et al. (1983) Proc Natl Acad Sci USA 80:24959. Marcadores selecionáveis são revistos por hilly (1986) Mammalian Cell Technology, Butterworth Publishers, Stoneham, Mass., e a escolha dos marcadores selecionáveis é bem dentro do nível de habilidade ordinária na técnica.

[000258] Marcadores selecionáveis podem ser introduzidos na célula em um plasmídeo separado ao mesmo tempo como o gene de interesse, ou eles podem ser introduzidos no mesmo plasmídeo. Se o mesmo plasmídeo, o marcador selecionável e o gene de interesse podem estar sob o controle de diferentes promotores ou o promotor do mesmo, o último arranjo produzindo uma mensagem bicistrônica. Cons- trutos deste tipo são conhecidos na técnica (por exemplo, Pat. U.S. No. 4.713.339).

[000259] Vetores de expressão podem codificar para marcações que permitem fácil purificação ou identificação do polipeptídeo recombinante produzido. Os exemplos incluem, mas não estão limitados ao vetor pUR278 (Ruther et al. (1983) EMBO J 2:1791), no qual o polipeptídeo descrito neste documento codificando, a sequência de código pode ser ligada ao vetor no frame como a região de codificação lac z de codifica-ção para que uma proteína híbrida seja produzida; vetores pGEX podem ser usados para expressar proteínas com uma glutationa marca trans-ferase S (GST). Tais proteínas são normalmente solúveis e podem ser facilmente purificadas a partir de células pela adsorção em grânulos de glutationa-agarose seguida pela eluição na presença de glutationa livre. Os vetores incluem locais de clivagem (protease trombina ou fator Xa ouPROTEASE PRESCISSIONTM (Pharmacia, Peapack and, NJ)) para facilitar a remoção da marca após a purificação.

[000260] O vetor de expressão é então transfectado em uma célula alvo apropriada que expressará o polipeptídeo. Técnicas de transfecção conhecidas na técnica incluem, mas não estão limitadas à precipitação de fosfato de cálcio (Wigler et al. (1978) Cell 14:725) e eletroporação (Neumann et al. (1982) EMBO J 1:841), e reagentes baseado em lipos- somas. Uma variedade de sistemas vetoriais de expressão de hospe-deiros pode ser utilizada para expressar as proteínas descritas neste documento, incluindo células procariotas e eucariotas. Estes incluem, mas não se limitando a, micro-organismos tais como bactérias (por e-xemplo, E. coli) transformado com bacteriófago recombinante DNA ou plasmídeo DNA expressão vetores contendo um apropriado codificar seqüência; leveduras ou fungos filamentosos transformam com levedura recombinante ou fungos vetores da expressão que contém uma sequência de codificação apropriada; sistemas de células de inseto in-fectados com vetores de expressão de vírus recombinante (por exemplo, baculovirus) contendo uma codificação apropriada sequência; planta de sistemas de células infectadas com vetores de expressão de vírus recombinante (por exemplo, vírus do mosaico da couve-flor ou vírus do mosaico do tabaco) ou transformada com vetores de expressão de plasmídeo recombinante (por exemplo, plasmídeo Ti) contendo uma codificação apropriada sequência; ou sistemas de células de animais, incluindo células de mamíferos (por exemplo, HEK 293, CHO, Cos, cé-lulas HeLa, HKB11 e BHK).

[000261] Em uma modalidade, a célula hospedeira é uma célula eu- cariótica. Como usado aqui, uma célula eucariótica refere-se a qualquer célula animal ou vegetal, tendo um núcleo definitivo. Células eucarióti- cas de animais incluem células de células de invertebrados, por exemplo, mamíferos, e células dos invertebrados, e.g., insetos. As células eucarióticas das plantas especificamente incluem, sem limitação, as cé-lulas de levedura. Uma célula eucariótica é distinta de uma célula pro- cariótica, por exemplo, bactéria.

[000262] Em determinadas modalidades, a célula eucariótica é uma célula mamífera. Uma célula mamífera é qualquer célula derivada de um mamífero. Células de mamíferos, especificamente, incluem, mas não estão limitadas às linhas de células de mamíferos. Em uma modalidade, a célula mamífera é uma célula humana. Em outra modalidade, a célula mamífera é uma célula de HEK 293, que é uma linhagem de células de rim humano embrionário. Células HEK 293 estão disponíveis como CRL-1533 da American Type Culture Collection, Manassas, VA e como células de 293-H, Catálogo No. 11631-017 ou células 293-F, Ca-tálogo No. 11625-019 da Invitrogen (Carlsbad, Califórnia). Em algumas modalidades, as células de mamíferos é um PER.C6® célula, que é uma linha de celular humana derivada da retina. Células PER.C6® estão dis-poníveis a partir Crucell (Leiden, The Netherlands). Em outras modali-dades, a célula mamífera é uma célula do ovário de hamster chinês (CHO). As células CHO são disponíveis da American Type Culture Collection, Manassas, VA. (por exemplo, CHO-K1; CCL-61). Em outras modalidades, ainda, a célula mamífera é uma célula de rim de hamster bebê (BHK). Células BHK estão disponíveis da American Type Culture Collection, Manassas, VA (por exemplo, CRL-1632). Em algumas mo-dalidades, as células de mamíferos é uma célula HKB11, que é uma linha celular híbrida de uma célula de HEK293 e uma linhagem de células humanas de B. Mei et al., Mol. Biotechnol. 34(2): 165-78 (2006).

[000263] Em uma modalidade, um plasmídeo que inclui uma sequência de fusão de codificação de FVIII(X2)-Fc, uma sequência de proteína de codificação de VWF-L1-L2-X1-Fc, ou ambos, e um marcador selecionável, por exemplo, resistência Zeocina, são transfectados para células HEK 293, para a produção de uma proteína quimérica.

[000264] Em uma outra modalidade, um plasmídeo que inclui uma se-quência de fusão de codificação de FVIII-Fc, uma sequência de proteína de codificação de VWF-L1-X-L2-Fc, ou ambos, e um marcador selecio- nável, por exemplo, resistência Zeocina, são transfectados para células HEK 293, para a produção de uma proteína quimérica.

[000265] Em algumas modalidades, um primeiro plasmídeo que inclui uma sequência de fusão de decodificação de FVIII(X2)-Fc e um primeiro marcador selecionável, por exemplo, um gene de resistência à zeocina, e um segundo plasmídeo que inclui uma sequência de proteína de co- dificação de VWF-L1-L2-X1-Fc e de um segundo marcador selecioná- vel, por exemplo, um gene de resistência à neomicina, e um terceiro plasmídeo que inclui uma sequência de codificação de proteína conver- tase e um terceiro marcador selecionável, por exemplo, um gene de re-sistência à higromicina, são co-transfectados em células HEK 293, para a produção da proteína quimérica. Os primeiros e o segundo plasmí- deos podem ser introduzidos em quantidades iguais (isto é, proporção molar de 1:1), ou eles podem ser introduzidos em quantidades desiguais.

[000266] Em ainda outras modalidades, um primeiro plasmídeo que inclui uma sequência de fusão de decodificação de FVIII-Fc e um primeiro marcador selecionável, por exemplo, um gene de resistência à zeocina, e um segundo plasmídeo que inclui uma sequência de proteína de codificação de VWF-L1-X-L2-Fc e de um segundo marcador seleci- onável, por exemplo, um gene de resistência à neomicina, e um terceiro plasmídeo que inclui uma sequência de codificação de proteína conver- tase e um terceiro marcador selecionável, por exemplo, um gene de re-sistência à higromicina, são co-transfectados em células HEK 293, para a produção da proteína quimérica. Os primeiros e o segundo plasmí- deos podem ser introduzidos em quantidades iguais (isto é, proporção molar de 1:1), ou eles podem ser introduzidos em quantidades desiguais.

[000267] Em ainda outras modalidades, um primeiro plasmídeo que inclui uma sequência de fusão de decodificação de FVIII(X2)-Fc e um primeiro marcador selecionável, por exemplo, um gene de resistência à zeocina, e um segundo plasmídeo que inclui uma sequência de proteína de fusão de codificação de VWF-L1-L2-X1-Fc e de um segundo marcador selecionável, por exemplo, um gene de resistência à neomicina, e um terceiro plasmídeo que inclui uma sequência de codificação de proteína convertase e um terceiro marcador selecionável, por exemplo, um gene de resistência à higromicina, são co-transfectados em células HEK 293, para a produção da proteína quimérica. Os primeiros e o segundo plasmídeos podem ser introduzidos em quantidades iguais (isto é, pro-porção molar de 1:1), ou eles podem ser introduzidos em quantidades desiguais.

[000268] Em certas modalidades, um primeiro plasmídeo, incluindo uma proteína quimérica de codificação para FVIII (com ou sem XTEN) da sequência de codificação de-F1-L3-F2-L2-X-L1-V e um primeiro marcador selecionável, por exemplo, um gene de resistência à zeocina, e um segundo plasmídeo que inclui uma sequência de codificação de proteína convertase e um segundo marcador selecionável, por exemplo, um gene de resistência à higromicina, são co-transfectados em células HEK 293, para a produção da proteína quimérica. Os promotores para a sequência de codificação FVIII(X)-F1 e a sequência de codificação de V-L2-X-L1-F2 podem ser diferentes ou podem ser iguais.

[000269] Em ainda outras modalidades, células transfectadas são es- tavelmente transfectadas. Estas células podem ser selecionadas e man-tidas como uma linha de celular estável, usando técnicas convencionais conhecidas por aqueles versados na técnica.

[000270] Células hospedeiras contendo construtos de DNA da proteína são cultivadas em meio do crescimento adequado. Como usado aqui, o termo "meio de cultura apropriado" significa um meio que contenha os nutrientes necessários para o crescimento das células. Nutrientes necessários para o crescimento celular podem incluir uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio, aminoácidos essenciais, vitaminas, minerais e fatores de crescimento. Opcionalmente, o meio pode conter um ou mais fatores de seleção. Opcionalmente, o meio pode conter soro bovino bezerro ou soro fetal bezerro (FCS). Em uma modalidade, o meio contém substancialmente sem IgG. O meio de crescimento geralmente irá selecionar para células que contêm o construto de DNA por, por e-xemplo, a seleção de drogas ou a deficiência de um nutriente essencial, que é complementado com o marcador selecionável no construto de DNA ou co transfectada com o construto de DNA. Células de mamíferos cultivadas geralmente são cultivadas comercialmente disponível con-tendo soro ou soro livre meio (por exemplo, MEM, DMEM, DMEM/F12). Em uma modalidade, o meio é CD293 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Em outra modalidade, o meio é CD17 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Seleção de um meio adequado para a linha celular particular usada está dentro do nível daqueles versados na técnica.

[000271] A fim de co-expressar as duas cadeias de polipeptídeos da proteína quimérica, as células hospedeiras são cultivadas sob condições que permitem a expressão de ambas as cadeias. Como usado aqui, cultivo refere-se a manter vivas as célulasin vitro pelo menos um tempo definido. Manutenção pode, mas precisa de não incluir, um aumento na população de células vivas. Por exemplo, as células mantidas em cultura podem ser estático em população, mas ainda viável e capaz de produzir um produto desejado, por exemplo, uma proteína recombi- nante ou proteínas recombinantes de fusão. Condições adequadas para o cultivo de células eucarióticas são bem conhecidas na técnica e incluem a seleção apropriada de meios de cultura, meio, suplementos, temperatura, pH, saturação de oxigênio e afins. Para fins comerciais, o cultivo pode incluir o uso de qualquer um dos vários tipos de sistemas de escala incluindo frascos de agitador, garrafas de rolo, biorreatores de fibra oca, biorreatores tanque agitado, biorreatores de transporte aéreo, biorreatores de onda e outros.

[000272] As condições de cultura celular também são selecionadas para permitir que a associação do fragmento do VWF com a proteína de FVIII. As condições que permitem a expressão do fragmento de VWF e/ou a proteína de FVIII, podem incluir a presença de uma fonte de vi-tamina K. Por exemplo, em uma modalidade, estàvel transfected células HEK 293 são cultivadas em meios CD293 (Invitrogen, Carlsbad, CA) ou meios de OptiCHO (Invitrogen, Carlsbad, CA) suplementados com glu- tamina de 4 mM.

[000273] Em um aspecto, a presente invenção é direcionada a um método de expressão, tornando, ou produzindo a proteína quimérica da invenção compreendendo: a) transfecção de uma célula hospedeira compreendendo um polinucleotídeo que codifica a proteína quimérica e b) cultivar a célula hospedeira em um meio de cultura sob condições adequadas para a expressão da proteína quimérica, em que a proteína quimérica seja expressa.

[000274] Noutras modalidades, o produto de proteína contendo a proteína FVIII ligada a uma primeira região constante de Ig ou a uma porção das mesmas e/ou a proteína de VWF fundida com uma segunda região constante de Ig ou uma porção da mesma por uma sequência de XTEN é segregada para o meio. O meio é separado das celas, concentrado, filtrado e então passou duas ou três colunas de afinidade, por exemplo, uma coluna de A proteína e uma ou duas colunas de troca de ânion.

[000275] Em certos aspectos, a presente invenção refere-se a proteína quimérica produzida pelos métodos aqui descritos.

[000276] A produção in vitro permite aumentar proporcionalmente para gerar grandes quantidades dos polipeptídeos desejados. As técnicas para o cultivo de células de mamíferos em condições de cultura de tecidos são conhecidas na técnica e incluem cultura de suspensão homogênea, por exemplo, em um reator de transporte aéreo ou em um reator de agitador contínuo, ou cultura de célula imobilizada ou aprisionada, por exemplo, em fibras ocas, microcápsulas, em microgrânulos de agarose ou cartuchos de cerâmica. Se necessário e/ou desejado, as soluções de polipeptídeos podem ser purificadas pelos métodos de cro- matografia habituais, por exemplo, filtração de gel, cromatografia de troca iônica, cromatografia sobre celulose DEAE ou cromatografia de imunoafinidade, por exemplo, após a biossíntese preferencial de um po- lipeptídeo de região de dobradiça sintética ou antes ou subsequente à etapa de cromatografia HIC descrita neste documento.

IV. Composição Farmacêutica

[000277] Composições contendo a proteína quimérica da presente in-venção podem conter uma transportadora farmaceuticamente aceitável adequada. Por exemplo, eles podem conter excipientes e/ou auxiliares que facilitam a transformação dos compostos ativos em preparações projetado para entrega para o local de ação.

[000278] A composição farmacêutica pode ser formulado para admi-nistração parenteral (isto é, por via intravenosa, subcutânea ou intra-muscular) por injeção em bolus. As formulações para injeção podem ser apresentadas sob forma de dosagem de unidade, por exemplo, em am-polas ou em recipientes de doses múltiplas, com um conservante adici-onado. As composições podem tomar essas formas, como suspensões, soluções ou emulsões em veículos oleosos ou aquosos, e podem conter agentes formulatórios, como agentes de suspensão, estabilização e/ou de dispersão. Alternativamente, o ingrediente ativo pode estar na forma de pó para a reconstituição antes do uso com um veículo adequado, por exemplo, água estéril livre de pirogênio.

[000279] Formulações adequadas para a administração parenteral tam-bém incluem soluções aquosas de compostos ativos na forma solúvel em água, por exemplo, sais solúveis em água. Adicionalmente, as suspensões dos compostos ativos podem ser preparadas como suspensões de injeção oleosa apropriadas. Os solventes ou veículos lipofílicos adequados incluem óleos graxos, tais como o óleo de gergelim, ou ésteres de ácido graxo sintéticos, tais como oleato de etil ou triglicerídeos. As suspensões aquosas podem conter ainda substâncias que aumentam a viscosidade da suspensão incluindo, por exemplo, carboximetilcelulose de sódio, sorbitol e dextrano. A suspensão pode conter também estabilizadores. Liposso- mas também podem ser usados para encapsular as moléculas da invenção para entrega em células ou espaços intersticiais. Exemplares transportadores farmaceuticamente aceitáveis são fisiologicamente compatíveis solventes, meio de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, isotônicos e absorção atrasando agentes, água, solução salina fosfato tamponado soro fisiológico, glicose, glicerol, etanol e similares. Em algumas modalidades, a composição compreende agentes isotô- nicos, por exemplo, açúcares, polialcoóis como cloreto de sódio, sorbitol ou manitol. Em outras modalidades, as composições compreendem substâncias farmaceuticamente aceitáveis como agentes umectantes ou pequenas quantidades de substâncias auxiliares como umectantes ou emul- sionantes, agentes, conservantes ou tampões, que reforçam a validade ou a eficácia dos ingredientes ativos.

[000280] Composições da invenção podem estar em uma variedade de formas, incluindo, por exemplo, líquido (por exemplo, soluções injetáveis e infusíveis), dispersões, suspensões, formas farmacêuticas semi-sólidas e sólidas. A forma pode depender do modo pretendido da administração e da aplicação terapêutica.

[000281] A composição pode ser formulada como uma solução, mi- croemulsão, dispersão, lipossoma ou outra estrutura encomendada a-dequada para uma concentração alta de droga. As soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas, incorporando o ingrediente ativo na quantidade necessária em um solvente apropriado com um ou uma combinação dos ingredientes eem umerados acima, conforme necessá-rio, seguido pela esterilização do filtrado. Geralmente, as dispersões são preparadas, incorporando o ingrediente ativo em um excipiente estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes ne-cessários daqueles acima eem umerados. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos de preparação preferenciais são secagem a vácuo e de liofilização que produz um pó de um ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado a partir de uma solução deste previamente filtrada esterilizada. A fluidez apropriada de uma solução pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula necessário no caso da dispersão e pelo uso de surfactantes. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser provocada pela inclusão, na composição, de um agente que retarda a absorção, por e-xemplo, sais de monoestearato e gelatina.

[000282] O ingrediente ativo pode ser formulado com uma formulação de liberação controlada ou dispositivo. Exemplos de tais formulações e dispositivos incluem implantes, adesivos transdérmicos e sistemas de entrega microencapsulados. Polímeros biodegradáveis, biocompatíveis podem ser usados, tais como etileno vinil acetato, polianidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres e ácido polilático. Métodos para a preparação de tais formulações e dispositivos são conhecidos na técnica. Vide, e.g., Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., 1978, Marcel Dekker, Inc., New York.

[000283] As formulações de depósito injetáveis podem ser preparadas por formação de matrizes microencapsuladas da droga em polímeros biodegradáveis tais como polilactídeo-poliglicolídeo. Dependendo da proporção de droga de polímero e a natureza do polímero utilizado a taxa de liberação de drogas pode ser controlada. Outros exemplares polímeros biodegradáveis e polianidridos. As formulações injetáveis de depósito também podem ser preparadas aprisionando a droga em lipos- somas ou microemulsões.

[000284] Compostos ativos complementares podem ser incorporados nas composições. Em uma modalidade, a proteína quimérica da invenção é formulada com um outro fator de coagulação, ou uma variante, fragmento, analógico ou derivados. Por exemplo, o fator de coagulação inclui, mas não está limitado ao fator V, fator VII, fator VIII, fator IX, fator X, fator XI, fator XII, fator XIII, protrombina, fibrinogênio, fator de von Willebrand ou fator recombinante tecido solúvel (rsTF) ou formas ativa-das de qualquer um dos anteriores. O fator de coagulação de agente hemostático também pode incluir drogas anti-fibrinolíticos, por exemplo, ácido épsilon-amino-caproico, ácido tranexâmico.

[000285] Os regimes de dosagem são ajustados para fornecer a resposta desejada ideal (por exemplo, uma resposta terapêutica). Por exemplo, um bolus único pode ser administrado, várias doses divididas podem ser administradas ao longo do tempo ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada, conforme indicado pelas exigências da situação terapêutica. É especialmente vantajoso formular composições parenterais em forma de unidade de dosagem para facilitar a administração e a uniformidade da dosagem. Veja, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., Easton, Pa. 1980).

[000286] Além do composto ativo, a forma de dosagem de líquidos pode conter ingredientes inertes tais como água, álcool etílico, carbonato de etil, acetato de etil, álcool benzílico, benzoato de benzil, propi- leno glicol, 1.3-butileno glicol, dimetilformamida, óleos, glicerol, álcool tetrahidrofurfurílico, polietilenoglicóis e ácidos graxos ésteres de sorbi- tano.

[000287] Exemplos não limitantes das transportadoras farmacêuticas adequadas também são descritos em Remington's Pharmaceutical Sci-ences by E. W. Martin. Alguns exemplos de excipientes, amido, glicose, lactose, sacarose, gelatina, malte, arroz, farinha, giz, gel de sílica, este- arato de sódio, monoestearato de glicerol, talco, cloreto de sódio, leite seco, glicerol, propileno, glicol, água, etanol e similares. A composição também pode conter reagentes de tamponamento do pH e umectantes ou agentes emulsionantes.

[000288] Para administração oral, a composição farmacêutica pode as-sumir a forma de comprimidos ou cápsulas preparadas pelos meios con-vencionais. A composição também pode ser preparada como um líquido por exemplo um xarope ou suspensão. O líquido pode incluir a suspensão de agentes (por exemplo, xarope de sorbitol, derivados de celulose ou gorduras hidrogenadas comestíveis), veículos aquosos (lecitina ou a-cácia), de agentes de emulsão (por exemplo, óleo de amêndoa, ésteres oleosas, álcool etílico ou fraccionado de óleos vegetais) e conservantes (por exemplo, metil ou propil-p-hidroxibenzoatos ou ácido sórbico). Os preparativos podem incluir também agentes flavorizantes, coloração e e- dulcorantes. Alternativamente, a composição pode ser apresentada como um produto seco para constituição com água ou outro veículo adequado.

[000289] Para a administração bucal, as composições podem assumir a forma de comprimidos ou pastilhas formuladas de forma convencional.

[000290] Para a administração por inalação, os compostos para uso, de acordo com a presente invenção, são convenientemente distribuídos sob a forma de uma apresentação de spray em aerossol de pacotes pressurizados ou de um nebulizador, com o uso de um propulsor ade-quado, por exemplo, diclorodifluorometano, tricloromonofluoro-metano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono ou outro gás adequado. No caso de um aerossol pressurizado, a unidade de dosagem pode ser de-terminada fornecendo uma válvula para distribuir uma quantidade medida. Cápsulas e cartuchos, por exemplo, de gelatina para uso em um inalador ou insuflador podem ser formulados contendo uma mistura de pó do composto e uma base de pó adequada, tal como a lactose ou o amido.

[000291] As composições farmacêuticas também podem ser formuladas em administração retal, tais como supositórios ou enemas de retenção, por exemplo, contendo bases de supositório convencionais, tais como a manteiga de cacau ou outros glicerídeos.

[000292] Em uma modalidade, uma composição farmacêutica que compreende uma proteína quimérica, o polinucleotídeo que codifica a proteína quimérica, o vetor que compreende o polinucleotídeo, ou a célula hospedeira que compreende o vetor, e um veículo farmaceutica- mente aceitável. A proteína FVIII em uma proteína quimérica alargou meia-vida em relação a proteína de FVIII de tipo selvagem ou a proteína de FVIII correspondente sem o fragmento de VWF. Em uma modalidade, em que a meia-vida da proteína quimérica é estendida pelo menos aproximadamente 1,5 vezes, pelo menos aproximadamente 2 vezes, pelo menos aproximadamente 2,5 vezes, pelo menos aproximadamente 3 vezes, pelo menos aproximadamente 4 vezes, pelo menos a-proximadamente 5 vezes, pelo menos aproximadamente 6 vezes, pelo menos aproximadamente 7 vezes, pelo menos aproximadamente 8 vezes, pelo menos aproximadamente 9 vezes, pelo menos aproximadamente 10 vezes, pelo menos aproximadamente 11 vezes ou pelo menos aproximadamente 12 vezes mais do que a FVIII de tipo selvagem. Noutra modalidade, a meia-vida do Fator VIII é de pelo menos cerca de 17 horas, pelo menos cerca de 18 horas, pelo menos cerca de 19 horas, pelo menos cerca de 20 horas, pelo menos cerca de 21 horas, pelo menos cerca de 22 horas, pelo menos cerca de 23 horas, pelo menos cerca de 24 horas, pelo menos, cerca de 25 horas, pelo menos cerca de 26 horas, pelo menos cerca de 27 horas, pelo menos cerca de 28 horas, pelo menos cerca de 29 horas, pelo menos cerca de 30 horas, de pelo menos cerca de 31 horas, pelo menos cerca de 32 horas, pelo menos cerca de 33 horas, pelo menos, cerca de 34 horas, pelo menos cerca de 35 horas, pelo menos cerca de 36 horas, pelo menos cerca de 48 horas, pelo menos aproximadamente 60 horas, pelo menos aproxima-damente 72 horas, pelo menos cerca de 84 horas, pelo menos cerca de 96 horas, ou pelo menos cerca de 108 horas.

[000293] Em algumas modalidades, a composição é administrada por uma via selecionada a partir do grupo consistindo de administração tó-pica, administração intra-ocular, administração parentérica, administração intratecal, administração subdural e administração oral. A administração parentérica pode ser a administração intravenosa ou subcutânea.

[000294] Em outras modalidades, a composição é utilizada para tratar uma doença ou condição de sangramento em um sujeito com necessi-dade disso. A doença ou condição de sangramento é selecionada a partir do grupo que consiste em um distúrbio de coagulação de sangra- mento, hemartrose, sangramento muscular, sangramento oral, hemorragia, hemorragia nos músculos, hemorragia oral, trauma, trauma capitis, sangramento gastrointestinal, hemorragia intracraniana, hemorragia intra-abdominal, hemorragia intratorácica, fratura óssea, sangramento do sistema nervoso central, sangramento no espaço retrofaríngeo, san- gramento no espaço retroperitoneal, e sangramento na bainha do iliop-soas e quaisquer de suas combinações. Em ainda outras modalidades, o sujeito é programado para submeter a uma cirurgia. Em ainda outras modalidades, o tratamento é profilático ou sob demanda.

V. Terapia genética

[000295] Uma proteína quimérica da invenção da mesma pode ser produzida in vivo em um mamífero, por exemplo, um paciente humano, usando uma abordagem de terapia gênica para o tratamento de um san- gramento doença ou distúrbio selecionado a partir do grupo que consiste em uma doença de coagulação hemorrágica, hemartrose, sangra- mento muscular, sangramento oral, hemorragia, hemorragia nos músculos, hemorragia oral, trauma, Tinea trauma, hemorragia gastrointestinal, hemorragia intracraniana, hemorragia intra-abdominal, hemorragia intratorácica, fratura óssea, hemorragia do sistema nervoso central, san- gramento no espaço retrofaríngeo, sangramento no espaço retroperito-neal, e sangramento na bainha ileopsoas seria terapeuticamente benéfica. Em uma modalidade específica, a doença ou distúrbio é a hemofilia A. Em outra modalidade, a doença ou distúrbio do sangramento é Hemofilia A. Isso envolve a administração do ácido nucleico de uma codificação quimérica da proteína operavelmente ligados às sequências de controle de expressão adequado. Em certas modalidades, estas sequências são incorporadas em um vetor viral. Vetores virais adequados para tal terapia genética incluem vetores adenovírus, vetores de Lenti- virus, vetores baculoviral, vetores virais de Epstein-Barr, vetores papo- vaviral, vetores virais vaccinia, vetores virais herpes simplex e vetores de vírus adeno-associado (AAV). O vetor viral pode ser um vetor viral de replicação com defeito. Em outras modalidades, um vetor de adeno- vírus tem uma exclusão em seu gene E1 ou gene E3. Quando é utilizado um vetor de adenovírus, o mamífero não pode ser exposto a um codificação de um gene marcador selecionável de ácidos nucleicos. Em outras modalidades, as sequências são incorporadas em um vetor não virais conhecidas por aqueles versados na técnica.

VI. Métodos de Uso da Proteína quimérica

[000296] A presente invenção é direcionada a um método de uso de uma proteína quimérica aqui descritas para prevenir ou inibir ligação VWF endógena a uma proteína FVIII. A presente invenção é também direcionada a um método de uso de uma proteína quimérica possuindo uma proteína FVIII ligada a XTEN e uma região constante de Ig ou de uma porção da mesma.

[000297] Um aspecto da presente invenção é direcionado para prevenir ou inibir a interação de FVIII com endógeno VWF através do bloqueio ou a blindagem do local de ligação de VWF na FVIII de VWF endógeno e, ao mesmo tempo que se estende a meia-vida da proteína quimérica utilizando uma sequência XTEN em combinação com uma região cons-tante de Ig ou de uma porção da mesma, que também pode ser um extensor de meia-vida. Em uma modalidade, a invenção é direcionada para um método de construção de uma proteína FVIII possuindo uma meia-vida mais longa do que o FVIII de tipo selvagem. A proteína qui-mérica útil no método inclui uma ou mais proteína quimérica aqui des-critas.

[000298] Outro aspecto da invenção inclui um método de administração a um sujeito em necessidade do mesmo de uma proteína quimérica com-preendendo uma proteína FVIII possuindo uma meia-vida mais longa do que o FVIII de tipo selvagem, em que o método compreende a administração da proteína quimérica aqui descrita para o sujeito.

[000299] Em uma modalidade, a invenção é direcionada a um método de uso de uma sequência de XTEN e uma região constante de Ig ou uma porção da mesma para melhorar a meia-vida de uma proteína quimérica compreendendo proteína FVIII e uma proteína de VWF, que impede ou inibe a interação VWF endógena com uma proteína FVIII. Uma proteína FVIII ligada a uma sequência XTEN (por exemplo, FVIII(X)) e, em seguida, ligada a ou associada com uma proteína fundida de VWF com um XTEN e uma região constante de Ig ou uma porção da mesma se encontra blindada ou protegida contra a via de depuração do VWF e, assim, tem uma depuração reduzida comparada com a proteína FVIII não ligada para a proteína de VWF. A proteína FVIII blindada tem, então, a extensão máxima de uma meia-vida, em comparação com uma proteína FVIII não ligada ou associada com a sequência de XTEN e a proteína de VWF. Em certas modalidades, a proteína FVIII associada com ou protegida por uma proteína de VWF e ligada a uma sequência XTEN não é eliminada por um receptor de eliminação de VWF. Em outras modalidades, a proteína FVIII associada com ou protegida por uma proteína de VWF e ligada a uma sequência XTEN é eliminada do sistema mais lento do que a proteína FVIII que não está associada com ou protegidas com a proteína de VWF e ligada à sequência de XTEN.

[000300] Em um aspecto, a proteína quimérica que compreende a pro-teína FVIII ligada a uma sequência XTEN ou a proteína FVIII ligada ou associada a uma proteína de VWF ligada a XTEN reduziu a depuração da circulação como a proteína de VWF não contém um local de ligação ao receptor de eliminação de VWF. A proteína VWF impede ou inibe a liberação de FVIII ligada a ou associada com a proteína VWF do sistema através da via de eliminação do VWF. As proteínas VWF úteis para a presente invenção também podem fornecer pelo menos uma ou mais propriedades de proteção de FVIII como VWF fornecidos pelo VWF en-dógeno. Em determinadas modalidades, a proteína VWF ou a sequência XTEN também podem mascarar um ou mais local de ligação do receptor de eliminação de FVIII, evitando assim a eliminação de FVIII por sua própria via de eliminação.

[000301] Em algumas modalidades, a prevenção ou a inibição de uma ligação de proteína de FVIII de VWF endógeno pelo fragmento VWF ou proteína quimérica pode serin vitro ou in vivo.

[000302] Também fornecido é um método de aumentar a meia-vida de uma proteína quimérica, compreendendo a administração da proteína quimérica aqui descrita a um sujeito em necessidade do mesmo. A meia-vida de FVIII não ativado ligado a ou associados ao VWF de comprimento total é aproximadamente 12 a 14 horas no plasma. No VWD do tipo 3, onde não há quase nenhuma VWF em circulação, a meia-vida de FVIII é apenas aproximadamente seis horas, levando aos sintomas de leve a moderada a Hemofilia A em tais pacientes devido à diminuição da concentração de FVIII. A meia-vida da proteína quimérica ligada ou associada com o fragmento VWF ou a sequência XTEN da presente invenção pode aumentar pelo menos cerca 1,5 vezes, 1.6 vezes, 1,7 vezes, 1.8 vezes, 1.9 vezes, 2.0 vezes, 2.1 vezes, 2.2 vezes, 2.3 vezes, 2.4 vezes, 2.6 vezes, 2.7. vezes, 2.8 vezes, 2.9 vezes, 3.0 vezes, 3.1 vezes, 3.2 vezes, 3.3 vezes, 3.4 vezes, 3,5 vezes, 3.6 vezes, 3,7 vezes, 3.8 vezes, 3.9 vezes, ou 4.0 vezes maior do que a meia-vida de FVII não ativado ligada a ou associada a VWF de comprimento total.

[000303] Em uma modalidade, uma proteína quimérica compreendendo um primeiro polipeptídeo que compreende uma proteína FVIII e uma primeira região constante de Ig ou de uma porção da mesma e um segundo polipeptídeo que compreende uma proteína de VWF, um XTEN tendo menos de 288 aminoácidos, e uma região constante de Ig ou um porção da mesma apresenta uma meia-vida de pelo menos cerca de 2 vezes, 2,5 vezes, 3.0 vezes, 3,5 vezes, 4.0 vezes, 4,5 vezes, 5.0 vezes, 5,5 vezes, 6.0 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, ou 10 vezes maior do que uma proteína quimérica correspondente compreendendo o mesmo primeiro polipeptídeo e o segundo polipeptídeo, sem a sequência XTEN ou FVIII de tipo selvagem. Em uma outra modalidade, uma proteína quimérica compreendendo um primeiro polipeptídeo que compreende uma proteína FVIII e uma primeira região constante de Ig ou de uma sua porção e um segundo polipeptídeo que compreende uma proteína de VWF, um XTEN tendo menos de 288 aminoácidos, e uma região constante de Ig ou uma porção da mesma apresenta uma meia- vida de cerca de 2 a cerca de 5 vezes, cerca de 3 a cerca de 10 vezes, cerca de 5 a cerca de 15 vezes, cerca de 10 a cerca de 20 vezes, cerca de 15 a cerca de 25 vezes, cerca de 20 a cerca de 30 vezes, cerca de de 25 a cerca de 35 vezes, cerca de 30 a cerca de 40 vezes, cerca de 35 a cerca de 45 vezes mais elevada do que uma proteína quimérica correspondente compreendendo o mesmo primeiro polipeptídeo e o se-gundo polipeptídeo, sem a sequência XTEN ou do tipo selvagem FVIII. Em uma modalidade específica, a meia-vida de uma proteína quimérica da invenção aumenta, pelo menos, cerca de 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, ou 40 vezes maior do que a meia-vida do tipo selvagem de FVIII em um camundongo de duplo nocaute FVIII e VWF.

[000304] Em certas modalidades, uma proteína quimérica, apresenta uma semi-vida de cerca de 40 horas em camundongos.

[000305] Em algumas modalidades, a meia-vida de uma proteína qui-mérica é mais longa do que a meia-vida do FVIII associado com um VWF endógeno. Em outras modalidades, a meia-vida da proteína quimérica é, pelo menos, cerca de 1,5 vezes, 2 vezes, 2,5 vezes, 3,5 vezes, 3.6 vezes, 3,7 vezes, 3.8 vezes, 3.9 vezes, 4.0 vezes, 4,5 vezes ou de 5.0 vezes as meia-vidas do FVIII de tipo selvagem ou uma proteína FVIII associada ao VWF endógeno.

[000306] Em algumas modalidades, em virtude da invenção, a meia- vida da proteína quimérica é estendida em comparação com uma proteína de FVIII sem a proteína VWF ou FVIII do tipo selvagem. A meia- vida da proteína quimérica é estendida pelo menos aproximadamente 1,5 vezes, pelo menos aproximadamente 2 vezes, pelo menos aproximadamente 2,5 vezes, pelo menos aproximadamente 3 vezes, pelo menos aproximadamente 4 vezes, pelo menos aproximadamente 5 vezes, pelo menos aproximadamente 6 vezes, pelo menos aproximadamente 7 vezes, pelo menos aproximadamente 8 vezes, pelo menos aproximadamente 9 vezes, pelo menos aproximadamente 10 vezes, pelo menos aproximadamente 11 vezes ou pelo menos aproximadamente 12 vezes mais do que a proteína quimérica sem a proteína VWF ou FVIII de tipo selvagem. Em uma modalidade, a meia-vida de FVIII é de aproximada-mente 1,5 vezes a cerca 20 vezes, aproximadamente 1,5 vezes a apro-ximadamente 15 vezes, ou aproximadamente 1,5 vezes a cerca 10 vezes mais do que a meia-vida de FVIII do tipo selvagem. Noutra modalidade, a meia-vida do FVIII é estendida a cerca de 2 vezes a cerca de 10 vezes, cerca de 2 vezes a cerca de 9 vezes, a cerca de 2 vezes a cerca de 8 vezes, cerca de 2 vezes a cerca de 7 vezes, cerca de 2 vezes a cerca de 6 vezes, cerca de 2 vezes a cerca de 5 vezes, cerca de 2 vezes a cerca de 4 vezes, cerca de 2 vezes a cerca de 3 vezes, cerca de 2,5 vezes a cerca de 10 vezes, cerca de 2,5 vezes a cerca de 9 vezes, cerca de 2,5 vezes a cerca de 8 vezes, cerca de 2,5 vezes a cerca de 7 vezes, cerca de 2,5 vezes a cerca de 6 vezes, cerca de 2,5 vezes a cerca de 5 vezes, cerca de 2,5 vezes a cerca de 4 vezes, cerca de 2,5 vezes a cerca de 3 vezes, cerca de 3 vezes a cerca de 10 vezes, cerca de 3 vezes a cerca de 9 vezes, cerca de 3 vezes a cerca de 8 vezes, cerca de 3 vezes a cerca de 7 vezes, cerca de 3 vezes a cerca de 6 vezes, cerca de 3 vezes para cerca de 5 vezes, cerca de 3 vezes a cerca de 4 vezes, cerca de 4 vezes a cerca de 6 vezes, cerca de 5 vezes a cerca de 7 vezes, ou cerca de 6 vezes a cerca de 8 vezes em comparação com FVIII de tipo selvagem ou uma proteína FVIII, sem a proteína de VWF. Em outras modalidades, a meia-vida da proteína qui-mérica da invenção é, pelo menos, de cerca de 17 horas, pelo menos cerca de 18 horas, pelo menos cerca de 19 horas, pelo menos cerca de 20 horas, pelo menos cerca de 21 horas, a menos cerca de 22 horas, pelo menos, cerca de 23 horas, pelo menos cerca de 24 horas, pelo menos, cerca de 25 horas, pelo menos cerca de 26 horas, pelo menos cerca de 27 horas, pelo menos cerca de 28 horas, pelo menos cerca de 29 horas, de pelo menos cerca de 30 horas, pelo menos cerca de 31 horas, pelo menos cerca de 32 horas, pelo menos cerca de 33 horas, pelo menos cerca de 34 horas, pelo menos cerca de 35 horas, pelo menos cerca de 36 horas, pelo menos cerca de 40 horas, pelo menos cerca de 48 horas, pelo menos aproximadamente 60 horas, pelo menos cerca de 72 horas, pelo menos cerca de 84 horas, pelo menos cerca de 96 horas, ou pelo menos cerca de 108 horas. Em ainda outras modalidades, a meia-vida da proteína quimérica da invenção é cerca de 15 horas a cerca de duas semanas, cerca de 16 horas a cerca de uma semana, cerca de 17 horas a cerca de uma semana, cerca de 18 horas a cerca de uma semana, cerca de 19 horas a cerca de uma semana, cerca de 20 horas até cerca de uma semana, cerca de 21 horas a cerca de uma semana, cerca de 22 horas a cerca de uma semana, cerca de 23 horas a cerca de uma semana, cerca de 24 horas a cerca de uma semana, cerca de 36 horas a cerca de uma semana, cerca de 48 horas a cerca de uma semana, cerca de 60 horas a cerca de uma semana, cerca de 24 horas a cerca de seis dias, cerca de 24 horas a cerca de cinco dias, cerca de 24 horas a cerca de quatro dias, cerca de 24 horas a cerca de três dias, ou cerca de 24 horas a cerca de dois dias.

[000307] Em algumas modalidades, a meia-vida média da proteína quimérica por sujeito é aproximadamente 15 horas, aproximadamente 16 horas, aproximadamente 17 horas, aproximadamente 18 horas, a-proximadamente 19 horas, aproximadamente 20 horas, aproximadamente 21 horas, aproximadamente 22 horas, aproximadamente 23 horas, aproximadamente 24 horas (1 dia), aproximadamente 25 horas, a-proximadamente 26 horas, aproximadamente 27 horas, aproximadamente 28 horas, aproximadamente 29 horas, aproximadamente 30 horas, aproximadamente 31 horas, aproximadamente 32 horas, aproxima-damente 33 horas, aproximadamente 34 horas, aproximadamente 35 horas, aproximadamente 36 horas, aproximadamente 40 horas, aproxi-madamente 44 horas, aproximadamente 48 horas (2 dias), aproximada-mente 54 horas, aproximadamente 60 horas, aproximadamente 72 horas (3 dias), aproximadamente 84 horas, aproximadamente 96 horas (4 dias), aproximadamente 108 horas, aproximadamente 120 horas (5 dias), aproximadamente seis dias, aproximadamente sete dias (uma semana), aproximadamente oito dias, aproximadamente nove dias, apro-ximadamente 10 dias, aproximadamente 11 dias, aproximadamente 12 dias, aproximadamente 13 dias ou aproximadamente 14 dias.

[000308] Além disso, a invenção proporciona um método de tratamen- to ou prevenção de uma doença ou distúrbio de sangramento compre-endendo a administração de uma quantidade eficaz de uma proteína quimérica. Em uma modalidade, o distúrbio ou doença de sangramento selecionado do grupo consistindo em um distúrbio hemorrágico de coa-gulação, hemartrose, sangramento muscular, sangramento oral, hemor-ragia, hemorragia nos músculos, hemorragia oral, trauma, trauma capitis, sangramento gastrointestinal, hemorragia intracraniana, hemorragia intra-abdominal, hemorragia intratorácica, fratura óssea, sangramento do sistema nervoso central, sangramento no espaço retrofaríngeo, san- gramento no espaço retroperitoneal, e sangramento na bainha do iliop-soas. Em uma modalidade específica, a doença ou distúrbio é a hemofilia A.

[000309] A proteína quimérica compreendendo uma sequência de XTEN e uma região constante de Ig ou uma porção da mesma, em combinação com uma proteína de VWF aqui descrita, que impede ou inibe a interação da proteína FVIII com VWF endógena preparadas pela invenção, tem muitas usos, como será reconhecido pelos versados na técnica, incluindo, mas não se limitando a métodos de tratamento de um sujeito com um distúrbio e métodos de tratamento de um sujeito em necessidade de um agente hemostático geral. Em uma modalidade, a invenção relaciona-se a um método de tratar um sujeito que tem uma condição hemostática compreendendo administrar uma quantidade tera- peuticamente eficaz da proteína quimérica.

[000310] A parte da proteína FVIII na proteína quimérica trata ou impede uma condição hemostática servindo como um cofator ao Fator IX em uma superfície negativamente carregada do fosfolipídio, formando desse modo um complexo Xase. A ligação de fatores de coagulação ativados a uma superfície de fosfolipídio localiza este processo aos sítios de dano vascular. Em uma superfície de fosfolipídio, o Fator VIIIa aumenta a velocidade máxima da ativação do Fator X pelo Fator IXa, por aproximadamente 200.000 vezes, conduzindo à segunda grande li-beração de geração de trombina.

[000311] A proteína quimérica da invenção pode ser usada para tratar qualquer distúrbio hemostático. Os distúrbios hemostáticos que podem ser tratados pela administração da proteína quimérica da invenção in-cluem, mas não são limitados a hemofilia A, bem como as deficiências ou anormalidades estruturais que se relacionam ao Fator VIII. Em uma modalidade, o distúrbio hemostático é a hemofilia A.

[000312] A proteína quimérica da invenção pode ser utilizada profilati- camente para tratar um sujeito com um distúrbio hemostático. A proteína quimérica da invenção pode ser usada para tratar um episódio de san- gramento em um sujeito com um distúrbio hemostático. Em uma outra incorporação, o distúrbio hemostático pode ser o resultado de um fator de coagulação defeituoso, por exemplo, fator de von Willebrand. Em uma modalidade, o distúrbio hemostático é um distúrbio herdado. Em uma outra modalidade, o distúrbio hemostático é um distúrbio adquirido. O distúrbio adquirido pode resultar de uma doença ou de uma condição secundária subjacente. A condição não relacionada pode ser, como um exemplo, mas não como uma limitação, câncer, uma doença auto-imune, ou gravidez. O distúrbio adquirido pode resultar de velhice ou da medicação para tratar um distúrbio secundário subjacente (por exemplo, quimioterapia do câncer).

[000313] A invenção se relaciona também aos métodos de tratar um su-jeito que não tenha um distúrbio hemostático congênito, mas tem uma do-ença ou uma condição secundária tendo por resultado a aquisição de um distúrbio hemostático, por exemplo, devido ao desenvolvimento de um an-ticorpo anti-FVIII ou de uma cirurgia. A invenção relaciona-se assim a um método de tratar um sujeito em necessidade de um agente hemostático geral que compreende administrar uma quantidade terapeuticamente efi-caz da proteína quimérica preparada pelos métodos atuais.

[000314] A invenção atual é relacionada também aos métodos de reduzir a imunogenicidade de FVIII ou de induzir menos imunogenicidade contra FVIII que compreende administrar uma quantidade eficaz das proteínas quiméricas descritas neste documento, ou dos polinucleotí- deos que codificam o mesmo.

[000315] Em uma modalidade, o sujeito em necessidade de um agente hemostático geral está submetendo-se, ou está a ponto de submeter-se, a cirurgia. A proteína quimérica da invenção pode ser administrada antes, durante, ou após a cirurgia como regime profilático. A proteína quimérica da invenção pode ser administrada antes, durante ou após a cirurgia para controlar um episódio de hemorragia aguda.

[000316] A proteína quimérica da invenção pode ser utilizada para tratar um sujeito tendo um episódio de sangramento agudo que não tem um distúrbio hemostático. O episódio de sangramento agudo pode resultar de trauma severo, por exemplo, cirurgia, um acidente de automóvel, ferida, laceração causada por tiro, ou todo o outro evento traumático tendo por resultado sangramento descontrolado. Exemplos não limitan- tes de episódios de sangramento incluem um distúrbio de coagulação de sangramento, hemartrose, sangramento muscular, sangramento oral, hemorragia, hemorragia nos músculos, hemorragia oral, trauma, trauma capitis, sangramento gastrointestinal, hemorragia intracraniana, hemorragia intra-abdominal, hemorragia intratorácica, fratura óssea, san- gramento do sistema nervoso central, sangramento no espaço retrofarín- geo, sangramento no espaço retroperitoneal, e sangramento na bainha do iliopsoas e quaisquer de suas combinações.

[000317] Em aplicações profiláticas, uma ou mais composições que contêm a proteína quimérica da invenção ou um coquetel dos mesmos são administradas a um paciente não já no estado da doença para au-mentar a resistência do paciente ou para reduzir os sintomas associados com uma doença ou um distúrbio. Tal quantidade é definida como uma "dose profilática eficaz." Em aplicações terapêuticas, uma dosagem relativamente elevada (por exemplo, de aproximadamente 1 a 400 mg/kg do polipeptídeo por dose, com dosages de magnésio de 5 a 25 sendo usado mais geralmente para radioimunoconjugdos e doses mais elevadas para polypeptides modificados por cytotoxin-droga) em intervalos relativamente curtos é requerido às vezes até que a progressão da doença esteja reduzida ou terminada, e até que o paciente mostre a melhora parcial ou completa dos sintomas da doença. Depois disso, ao paciente pode ser administrado um regime profilático.

[000318] Em algumas modalidades, uma proteína quimérica ou uma composição da invenção é usada para tratamento sob demanda, que inclui o tratamento para um episódio de sangramento, hemartrose, sangramento muscular, sangramento oral, hemorragia, hemorragia nos músculos, hemorragia oral, trauma, trauma capitis, sangramento gastrointestinal, hemorragia intracraniana, hemorragia intra-abdominal, hemorragia intratorácica, fratura óssea, sangramento do sistema nervoso central, sangramento no espaço retrofaríngeo, sangramento no espaço retroperitoneal ou san- gramento na bainha do iliopsoas. O sujeito pode ter necessidade de profilaxia cirúrgica, manutenção peri-operativa, ou tratamento para cirurgia. Essas cirurgias incluem, por exemplo, cirurgia pequena, cirurgia grande, extração dentária, amigdalectomia, herniotomia inguinal, sinovectomia, substituição total do joelho, craniotomia, osteossíntese, cirurgia de trauma, cirurgia intracraniana, cirurgia intra-abdominal, cirurgia intratorácica, ou cirurgia de substituição articular.

[000319] Em uma modalidade, a proteína quimérica da presente invenção é administrada por via intravenosa, por via subcutânea, por via intramuscular, ou por meio de qualquer superfície mucosa, por exemplo, por via oral, sublingual, bucal, nasal, retal, vaginal ou por via pulmonar. A proteína quimérica que compreende um fragmento do VWF e uma proteína de FVIII da presente invenção podem ser implantadas dentro ou ligadas a um suporte sólido de biopolímero que permita a liberação lenta da proteína quimérica ao local do sangramento ou implantados em bandagem/curativo. A dose da proteína quimérica irá variar dependendo do sujeito e da via particular de administração utilizada. Dosagens podem variar de 0.1 a 100.000 μg/kg de peso corporal. Em uma modalidade, o intervalo de dosagem é 0.1-1.000 μg/kg. Em uma outra modalidade, a escala de dosagem é 0.1-500 μg/kg. A proteína pode ser administrada continuamente ou em intervalos programados específicos. Ensaios in vitro podem ser empregados para determinar intervalos e/ou agendas de dose otimizadas para a administração. Os ensaios in vitro que medem a atividade do fator de coagulação são conhecidos na técnica, por exemplo, ensaio de coagulação STA-CLOT VIIa-rTF ou ensaio de coagulação ROTEM. Adicionalmente, as doses eficazes podem ser extrapoladas das curvas de dose-resposta obtidas dos modelos animais, por exemplo, um cão hemofílico (Mount et al. 2002, Blood 99(8):2670).

[000320] Tendo agora descrito a presente invenção em detalhes, a mesma se tornará mais claramente compreendida pela referência aos seguintes exemplos, que estão incluídos neste para fins de ilustração apenas e não se pretendem ser limitantes da invenção. Todas as paten-tes, publicações, e os artigos aqui referidos são expressamente e espe-cificamente aqui incorporados por referência.

Exemplos

[000321] Ao longo de todos os exemplos, os seguintes materiais e mé-todos foram usados a menos que indicado de outra maneira.

Materiais e Métodos

[000322] No general, a prática da invenção atual emprega, a menos que indicado de outra maneira, técnicas convencionais de química, biofísica, biologia molecular, tecnologia de DNA recombinante, imunologia (especialmente, por exemplo, tecnologia do anticorpo), e técnicas padrão em eletroforese. Ver, por exemplo, Sambrook, Fritsch and Mania- tis, Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Antibody Engineering Protocols (Methods in Molecular Biology), 510, Paul, S., Humana Pr (1996); Antibody Engineering: A Practical Approach (Practical Approach Series, 169), McCafferty, Ed., Irl Pr (1996); Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow et al., CS.H.L. Press, Pub. (1999); and Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons (1992).

Exemplo 1: FVIII-XTEN-Fc/heterodímeros D'D3-XTEN-Fc

[000323] A presente invenção é direcionada a gerar uma molécula de FVIII quimérica que é acoplada ao domínio D'D3 do Fator de von Wille-brand (FVW) da proteína através do domínio Fc da IgG. Domínio D'D3 ligado evita a interação de FVIII com multímeros de VWF endógenos. Esta molécula serve como uma plataforma para incorporar outras tec-nologias de meia-vida de extensão, a fim de melhorar a farmacocinética da proteína quimérica. Sequências XTEN foram incorporadas no domínio B de FVIII e entre D'D3 e região Fc para aumentar a meia-vida do FVIII/heterodímero VWF.

[000324] Local de clivagem de trombina no meio D'D3 e Fc permite a libertação do domínio D'D3 aquando da ativação da molécula de FVIII pela trombina.

Exemplo 2: Construto do plasmídeo de FVIII-XTEN-Fc/heterodímeros D'D3-Fc Clonagem de VWF050-IHH mutação tripla em VWF031

[000325] Mutação tripla IHH em Fc impede interação com FcRn, portanto, não há reciclagem de Fc contendo molécula pela via FcRn. As 3 mutações em Fc são I253A, H310A, H435A.

[000326] VWF050 foi gerado trocando a região Fc de plasmídeo VWF031 com o fragmento Fc contendo mutação tripla IHH entre o RsrII e locais de restrição Not 1.

[000327] Clonagem de VWF057- Clonagem VWF-Fc com 144 AE XTEN+ligante clivável trombina 35aa. Oligos ESC 155- Oligo para 144 AE XTEN em VWF034-rev CCCCGCCACCGGATCCCCCGCCACCGGATCCCCCGCCACCGGA- TCCCCCGCCACCGGAAC- CTCCACCGCCGCTCGAGGCACCTTCTTCAGTGCTGGTGGGCGAG CCCGCTGGTGACCCTTCCTC ESC 156-Oligo para 144 AE XTEN- GS ligante no VWF034-rev GGGGAAGAGGAAGACTGACGGTCCGCCCAGGAGTTCTGGAG- CTGGGCACGGTGGGCATGTG- TGAGTTTTGTCGCCTCCGCTGCCCCGGGGGACCAGGGATCCCCC GCCACCGGATCCCCCGCCACCGGATCCCCCGCCACCGGA- TCCCCCGCC ESC 157-Oligo para 144 AE XTEN em VWF031-Fwd GTGAAGCCTGCCAGGAGCCGATATCGGGCGCGCCAACATCA- GAGAGCGCCACCCCTGAAAGTGGTCCCGGGAGCGAGCCAGC

[000328] PCR foi feito duas vezes para obter o 144 AE-XTEN + 35 aa GS ligante com o local de clivagem da trombina.

[000329] Primeira reação de PCR foi feita usando 144- AE XTEN de DNA que codifica como molde e ESC 157/ESC155 par de primers. Cerca de 550 pb, produto de PCR longo obtido a partir desta reação foi utilizado como molde para a segunda reação de PCR e foi amplificada utilizando CES 157/156 par de primers. Esta reação deu ~ 700 pb de comprimento do produto. Este produto de PCR de 700 pb e o plasmídeo VWF034 foi então digerido com EcoRV-IC e RsrII. Plasmídeo da estrutura principal do digerido.

[000330] VWF034 foi então usado para ligar produto de PCR 700 pb.

Clonagem de VWF058- mutação tripla IHH em VWF034

[000331] Mutação tripla IHH em Fc impede interação com FcRn, portanto, não há reciclagem de Fc contendo molécula pela via FcRn. As 3 mutações em Fc são I253A, H310A, H435A.

[000332] VWF058 foi gerado trocando a região Fc de plasmídeo VWF034 com o fragmento Fc contendo mutação tripla IHH entre o RsrII e locais de restrição Not 1.

Clonagem de FVIII FVIII-263- 205 com IHH mutação tripla

[000333] Mutação tripla IHH em Fc impede interação com FcRn, portanto, não há reciclagem de Fc contendo molécula pela via FcRn. As 3 mutações em Fc são I253A, H310A, H435A.

[000334] FVIII-263 foi gerado trocando a região Fc de plasmídeo FVIII 205 com o fragmento Fc contendo mutação tripla IHH entre o RsrII e locais de restrição Not 1. Clonagem de FVIII-282- FVIII-Fc com 144 AE XTEN no domínio B ESC 158-Oligo para 144 AE XTEN no domínio-B fwd AAGAAGCTT- CTCTCAAAACGGCGCGCCAACATCAGAGAGCGCCAC- CCCTGAAAGTGG- TCCCGGGAGCGAGCCAGCCACATCTGGGTCGGAAACGCCAGGC ESC 159-Oligo para 144 AE XTEN no domínio-B-rev GGTATCATCA- TAATCGATTTCCTCTTGATCTGACTGAAGAGTAGTACGAGTTATTT- CAG- CTTGATGGCGTTTCAAGACTGGTGGGCTCGAGGCACCTTCTTCAG TGCTGGTGGGCGAGCCCGCTGGTGACCCTTCCTCAGTGGACG- TAGG

[000335] Primeira reação de PCR foi feita usando 144- AE XTEN de DNA que codifica como molde e ESC 158/ESC159 par de primers. Cerca de 550 pb de comprimento do produto de PCR obtido a partir desta reação e o FVIII 169 plasmídeo foi então digerido com AscI e Cla1. Estrutura principal do plasmídeo a partir de FVIII digerido 169 foi então utilizado para ligar 550 pb produto de PCR, a fim de obter 282 FVIII.

Clonagem de FVIII-283- FVIII 169 com mutação tripla IHH

[000336] Mutação tripla IHH em Fc impede interação com FcRn, portanto, não há reciclagem de Fc contendo molécula pela via FcRn. As 3 mutações em Fc são I253A, H310A, H435A.

[000337] FVIII-283 foi gerado trocando a região Fc de plasmídeo FVIII 169 com o fragmento Fc contendo mutação tripla IHH entre o RsrII e locais de restrição Not 1.

Exemplo 3: Produção de FVIII-XTEN-Fc/D'D3-XTEN-Fc nas células HEK293

[000338] Figura 2. Diagrama esquemático que mostra a expressão do construto FVIII-XTEN-Fc/D'D3-XTEN-Fc. Três plasmídeos de co-trans- fecção foi realizado em células HEK293 usando polietilenimina (PEI). Primeiro plasmídeo deriva a expressão de FVIII-XTEN-Fc, segundo plasmídeo expressa D1D2D'D3-XTEN-Fc e o terceiro plasmídeo de ex-pressão de PACE/furina, o que é necessário para remover enzimatica- mente pró-peptídeo, isto é, o domínio de D1D2 D1D2D'D3-XTEN- Fc. Produtos deste sistema de expressão de três plasmídeos incluem de FVIII-XTEN-Fc/D'D3-XTEN-Fc heterodímero, D'D3-XTEN-Fc homodí- mero e vestígios de espécies similares hemizigóticas FVIII-XTEN-Fc.

Exemplo 4: Purificação de FVIII-XTEN-Fc/heterodímeros D'D3-XTEN-Fc

[000339] Para purificar os heterodímeros de FVIII-XTEN-Fc/D'D3- XTEN-Fc, uma etapa de filtração de fluxo tangencial (TFF), foi usada para concentrar primeiro o meio condicionado por 10 vezes. Os produtos do filtrado foram, em seguida, adicionalmente purificados utilizando cromatografia de afinidade de acompanhamento por uma coluna de dessalinização. Pureza da molécula era aceitável por HPLC-SEC e foi ainda confirmada por Western blotting. A atividade específica da molécula era comparável ao domínio B eliminado FVIII, como medido pelo ensaio de atividade de FVIII (exemplo 5) e medição de OD280.

Exemplo 5: A atividade específica de heterodímeros FVIII-XTEN- Fc/D'D3-XTEN-Fc

[000340] A atividade de heterodímeros FVIII-XTEN-Fc/D'D3-XTEN-Fc foi medida por ensaio cromogênico de FVIII ativado e ensaio de Tempo de Tromboplastina Parcial (aPTT). A atividade cromogênica específica e a atividade aPTT específica de SQ BDD-FVIII, rFVIII169/VWF034 e rFVIII169/VWF057 foram listadas na Tabela 16. Em comparação com SQ BDD-FVIII, temos observado atividades cromogênicas específicas comparáveis e redução de 60% na atividade aPTT específica para rFVIII169/VWF034 e rFVIII169/VWF057. Tabela 16: Atividade específica de variantes heterodímeros

Ensaio cromogênico FVIII

[000341] A atividade de FVIII foi medida utilizando o kit COATEST SP FVIII da DiaPharma (produzir # K824086) e todas as incubações foram realizadas em um aquecedor de placa de 37°C com agitação.

[000342] O Padrão Internacional da OMS 8 para Blood Coagulation Factor VIII: C, concentrado, codificado 07/350 foi utilizado como padrão de ensaio, a gama do padrão foi de 100 mIU/ml a 0.78 mIU/mL. Um controle de ensaio agrupado (em pool) de plasma humano normal e amostras de ensaios (diluídas com tampão 1 X Coatest) foram adicionadas em placas de 96 poços Immulon 2HB em duplicado (25 μL/poço). Mistura IXa/FX/Fosfolipídio recém-preparada (50 μL), 25 μL de 25mM de CaCl2, e 50 μL de substrato de FXa foram adicionados sequencialmente em cada poço, com incubação de 5 minutos entre cada adição. Após incubar com o substrato, 25 μL de ácido acético 20% foram adicionados para terminar a reação de cor, e a absorvência de OD405 foi medida com um instrumento SpectraMAX plus (Molecular Devices). Os dados foram analisados usando o software SoftMax Pro (versão 5.2). O nível mais baixo de quantificação (LLOQ) é 7.8 mIU/mL.

Ensaio de FVIII aPTT

[000343] O ensaio FVIII aPTT foi realizado no analisador de coagulação Sysmex CA-1500 como se segue: Em primeiro lugar, 50 uL de amostras diluídas manualmente, padrões e controles em tampão aPTT (Tris 50 mM, NaCl 100 mM, 1% de HSA, pH 7.4) foram adicionados pelo instrumento na cuvete de reação, seguido por adição de 50 uL de plasma deficiente em FVIII (George king Bio-Medical, produto # 0800). Após incubação a 37°C durante 1 minuto, 50 uL de reagente aPTT (FSL Actin® reagente cephaloplastin ativada - Dade Behring, referência # B4219-2) foi adicionada à mistura reacional, e incubada a 37 ° C durante 4 minutos. Subsequentemente, 50 uL de 20 mM CaCl2 (Dade Behring, referência # ORFO37) foi adicionado, e a cuvete de reação foi imediatamente transferida para uma das quatro posições de canal espectrofo- tômetro para medir a quantidade de luz refratada na mistura, a qual foi convertida para o início da coagulação pelo algoritmo de software do instrumento. Tempo de coagulação relatado foi o período de tempo a partir da adição de CaCl2 até o início da formação do coágulo. Ensaio padrão foi gerado por diluição da OMS 8 Padrão Internacional FVIII em tampão de aPTT em uma gama de 100 mIU/ml a 0.78 mIU/ml. A curva padrão foi representada graficamente como o tempo de coagulação (em segundos) como do eixo Y na função do logaritmo (base 10) da atividade de FVIII (mIU/mL) como o eixo X em Microsoft Excel, e a atividade das amostras individuais foi calculada utilizando a fórmula para a linha de regressão linear da curva padrão. Com base na performance do ensaio, o limite inferior de quantização (LIQ) foi de 7.8 mIU/mL.

Exemplo 6: Efeito aditivo de inserções XTEN na extensão de meia-vida de heterodímero

[000344] Inserções XTEN foram incorporadas nos heterodímeros de extensão de meia-vida. A inserção de um único aminoácido 288 (aa) AE-XTEN em FVIII de domínio B resultou em 16.7 horas de meia-vida do heterodímero em camundongos HemA, como demonstrado por rFVIII169/VWF031 na Figura 3. Para melhorar ainda mais a meia-vida do heterodímero, uma segunda inserção XTEN em 144 AA ou 288 AA comprimento foi incorporada FVIII169/VWF031 quer no domínio A1 FVIII ou a jusante imediato do fragmento de D'D3, respectivamente, as variantes heterodiméricas foram nomeadas como FVIII205/VWF031 e FVIII169/VWF034.

[000345] A meia-vida de rFVIII169/VWF031, rFVIII205/VWF031 e rFVIII169/VWF034 foram avaliadas em camundongos FVIII deficientes (HemA) por uma única administração intravenosa de moléculas de teste em doses de 200 IU/kg. As amostras de plasma foram recolhidas em pontos no tempo designados como indicado na Figura 3, a atividade de FVIII das amostras foram determinadas por ensaio cromogênico de FVIII, os parâmetros farmacocinéticos foram calculados utilizando o programa WinNonlin-Phoenix e listados na Tabela 17.

[000346] Como mostrado na Figura 3 e na Tabela 17, a adição da se-gunda inserção XTEN quer no domínio A1 de FVIII ou para baixo fluxo de D'D3 melhora ainda mais a meia-vida de heterodímero de 29.45 ou 31.10 respectivamente. Além disso, as melhorias mais de 2 vezes na depuração e AUC foram também observadas de ambas inserções XTEN. Tabela 17: Parâmetro PK de heterodímeros em camundongos HemA

Exemplo 7: 144 aa AE-XTEN confere melhor benefício meia-vida, em seguida, 288 aa AE-XTEN quando inserido entre domínios D'D3 e Fc.

[000347] Outro heterodímero-FVIII169/VWF057 foi construído no esforço de identificar o comprimento ótimo da inserção dentro da cadeia XTEN D'D3-XTEN-Fc, em que o comprimento da inserção XTEN foi reduzido a 144aa a partir de 288aa. Como mostrado na Figura 4, em comparação com rFVIII169/VWF034, a meia-vida de rFVIII169/VWF057 foi aumentada de 31 horas para 42 horas. Apuramento melhorado e AUC também foram observados para rFVIII169/VWF057, os dados foram listadas na Tabela 18. Assim, 144aa da inserção AE-XTEN é mais ideal do que XTEN AE-288aa quando inserido entre D'D3 e o domínio Fc dos heterodímeros FVIII-XTEN-Fc/D'D3-XTEN-Fc. Tabela 18: Parâmetros PK de rFVIII169/VWF034 e rFVIII169/VWF057 em camundongos HemA

Exemplo 8: Extensões do domínio Fc a meia-vida de heterodímero

[000348] Domínios Fc estende-se a meia-vida da sua proteína de fusão através da via de reciclagem FcRn mediada. Para confirmar a necessidade de o domínio Fc sobre o prolongamento da meia-vida do heterodímero, os domínios de Fc de tipo selvagem foram substituídos por um mutante triplo (I253A/H310A/H435A; IHH) em rFVIII205/VWF031 para formar rFVIII263/VWF050, e a eliminação completa de ligação de FcRn foi confirmada pela Surface Plasmon Resonance (Biacore) ensaio para rFVIII263/VWF050. A meia-vida de FVIII263/VWF050 foi avaliada em ca-mundongos em comparação com HEMA rFVIII205/VWF031. Foram ob-servadas aumento da velocidade de eliminação, bem como uma meia- vida e AUC reduzida para rFVIII263/VWF050 como mostrado na Figura 5 e na Tabela 19. Este resultado demonstrou que, para além de asse-gurar a ligação do FVIII e D'D3 covalente, os domínios de Fc também é necessário para a melhoria meia-vida do heterodímero. Tabela 19: Parâmetros PK de rFVIII205/VWF031 e rFVIII263/VWF040 em camundongos HemA

Exemplo 9: Eficácia aguda de heterodímeros FVIII-XTEN-Fc/D'D3- XTEN-Fc em camundongo HemA do modelo de sangramento clipe da cauda

[000349] A eficácia aguda de candidatos heterodímeros de chumbo foram avaliados utilizando camundongo HemA do modelo de sangra- mento clipe da cauda.

[000350] Camundongos HemA de 8-12 semanas de idade do sexo masculino foram divididos aleatoriamente em 4 grupos de tratamento, e tratados com uma única administração intravenosa de SQ BDD-FVIII, rFVIII169/VWF034, rFVIII169/VWF057 ou solução de veículo, respecti-vamente. A fim de imitar o tratamento episódico de FVIII (para reconstituir 50-100% do nível de plasma normal de FVIII), a dose de tratamento de FVIII selecionada é de 75 IU/kg, como medido pela atividade de FVIII aPTT. A este nível de dose, todas as variantes de testes de FVIII irá reconstituir ~ 70% da atividade de FVIII no plasma do murino normal 5min após a dosagem.

[000351] Volume de perda de sangue de cada animal no estudo foi representado graficamente na Figura 6. Foi observada redução signifi-cativa no volume de perda de sangue para todos os grupos de tratamento de FVIII em comparação com animais tratados com veículo. Dentro dos três grupos de tratamento de FVIII, nenhuma estatística significativa diferente foi encontrada na redução da perda de sangue, o que sugere que as moléculas heterodiméricas poderiam potencialmente se-rem tão eficazes quanto SQ BDD-FVIII para o tratamento da demanda.

[000352] Volume de perda de sangue de cada animal no estudo foi representado graficamente na Figura 6. Foi observada redução signifi-cativa no volume de perda de sangue para todos os grupos de tratamento de FVIII em comparação com animais tratados com veículo. Dentro dos três grupos de tratamento de FVIII, nenhuma estatística significativa diferente foi encontrada na redução da perda de sangue, o que sugere que as moléculas heterodiméricas poderiam potencialmente serem tão eficazes quanto SQ BDD-FVIII para o tratamento da demanda.

[000353] Além disso, os camundongos HemA foram tratados com uma dose mais baixa (37,5 IU/kg) de rBDD-FVIII ou rFVIII169/VWF034, e os resultados são apresentados na Figura 6B. Mesmo que a 75 IU/kg da dose, rFVIII169/VWF034 forneceu proteção semelhante como BDD- FVIII para camundongos HemA após a lesão clipe de cauda, indicando a molécula ainda foi eficaz no tratamento de episódios hemorrágicos graves em ~ 35% dos murino normal, circulando nível de FVIII em camundongos HemA.

[000354] O procedimento clip de cauda foi realizado como se segue. Resumidamente, os camundongos foram anestesiados com 50 mg/kg de cetamina/0.5 mg/kg de coquetel dexmedetomidina antes da lesão da cauda e colocado sobre uma 37°C almofada de aquecimento para ajudar a manter a temperatura do corpo. As caudas dos camundongos foram, em seguida, ser imerso em 37°C de salina por 10 minutos para dilatar a veia lateral. Após a dilatação venosa, variantes ou solução veículo FVIII foram injetadas através da veia da cauda e o distal 5 mm da cauda foi então cortado utilizando um bisturi straight edge # 11 5 min após a dosagem. O sangue derramado foi recolhido em 13 ml de 37°C salina por 30 minutos e volume de perda de sangue foi determinado pela mudança de peso do tubo de coleta de sangue: volume de perda de sangue= (peso final da coleta do tubo - peso inicial + 0.10)ml. As análises estatísticas foram realizadas utilizando o teste t (Mann Whitney) e ANOVA de uma via (Teste de KRUSKAL-Wallis, pós-teste: teste de comparações múltiplas de Dunns).

Exemplo 10: A eficácia profilática de heterodímero FVIII-XTEN-Fc/D'D3- XTEN-Fc no camundongo HemA no modelo de sangramento de tran- secção da veia da cauda

[000355] A eficácia profilática de FVIII169/VWF057 foi testada no modelo de transecção da veia caudal (TVT) do camundongo HemA. O modelo TVT induz a sangramento através da introdução de lesão da veia lateral da cauda do camundongo, que imita os episódios de sangra- mento espontâneo em pacientes com distúrbio de sangramento hemofílico.

[000356] Camundongos HemA de 8-10 semanas de idade do sexo masculino foram divididos aleatoriamente em quatro grupos de trata-mento e tratados com FVIII169/VWF057 em 72hr antes da lesão da veia da cauda, ou o BDD-FVIII SQ em 24 horas ou de 48 horas antes da lesão. Veículo animal tratado foram utilizados como controle negativo. Eventos de re-sangramento ou a eutanásia devido à perda excessiva de sangue dentro de 24 horas após a lesão foram plotados na Figura 7.

[000357] Como mostrado na Figura 7, ao contrário dos camundongos tratados com SQ do BDD-FVIII em 48 h antes da TVT, das quais apenas uma proteção limitada foi observada após a lesão, os camundongos que receberam rFVIII169/VWF057 em 72h antes da lesão caudal tinha uma proteção semelhante em re-sangramento e sobrevivência em comparação com os camundongos que receberam o tratamento SQ BDD-FVIII 24 horas antes TVT, indicando rFVIII169/VWF057 que pode fornecer, pelo menos, 3 vezes ou mais (por exemplo, 4 vezes) mais longo para a proteção no modelo de camundongos HemA TVT. Mesmo rFVIII169/VWF057 pode reduzir significativamente a frequência de tra-tamento da profilaxia FVIII atual.

[000358] De modo semelhante, os camundongos foram tratados com heterodímeros HEMA-FVIII XTEN-Fc/D'D3-XTEN-Fc: rFVIII169/VWF034 e rFVIII169/VWF057. a 24 ou 96 horas antes da lesão da veia da cauda. Os dados de sobrevivência e de re-sangramento dos tratamentos foram comparados com os dados pelo rBDD-FVIII em 24 ou 48 horas antes da lesão e do veículo. Enquanto a nova hemorragia em camundongos trata-dos com rBDD-FVIII em 24 horas antes da lesão da veia da cauda ser semelhante ao dos camundongos tratados com veículo, os dados recidi-vam hemorrágicos de camundongos tratados com os heterodímeros em 24 horas antes da lesão são significativamente melhores do que o grupo de tratamento de veículo. Além disso, os dados de ressangramento dos camundongos tratados com os heterodímeros em 96h antes da lesão fo-ram comparáveis para os camundongos receberam rBDD-FVIII em 24 ho-ras antes da lesão. Como para a taxa de sobrevivência em 24 horas pós a lesão TVT, ao contrário da taxa de sobrevivência inferior a 50% dos ca-mundongos tratados com rBDD-FVIII, mais do que 90% dos camundongos sobreviveram à lesão TVT com tratamento de heterodímeros FVIII-XTEN- Fc/D ' D3-XTEN-Fc quando as moléculas de FVIII foram administradas a 24 horas antes da lesão. Além disso, a sobrevivência em camundongos tratados com os heterodímeros de FVIII-XTEN-Fc/D'D3-XTEN-Fc a 96 horas antes da lesão da veia da cauda foi melhor (no caso de rFVIII169/VWF034) ou comparável (no caso de rFVIII169/VWF057) quando comparado com os camundongos que receberam tratamento rBDD-FVIII em 24 horas antes da lesão. Ambos os dados de ressangra- mento e sobrevivência tinham indicado um prolongamento da eficácia 4 vezes de tratamento heterodímero FVIII-XTEN-Fc/D'D3-XTEN-Fc vs. tratamento rBDD-FVIII.

Modelo de transecção da veia caudal do camundongo HemA

[000359] O procedimento de transecção da veia da cauda foi realizado como se segue. Os camundongos foram anestesiados com um coquetel contendo 50 mg/kg de cetamina, 0.125 mg/kg de dexmedetomidina, e 0.1 mg/kg de Buprenex. A uma profundidade de anestesia adequada, a veia lateral da cauda dos camundongos foi seccionada da lâmina cirúrgica straight edged de número 11 para uma área em que o diâmetro da cauda é aproximadamente 2.7 mm. O sangue derramando foi lavado com solução salina morna para assegurar a observação clara da ferida. Os camundongos tratados foram então alojados sozinhos em uma gaiola limpa com leito de papel branco para as próximas 24 horas. Cauda de re-sangramento e atividade física do camundongo foram observados e registrados a cada hora até 12 horas após a lesão cauda. Camundongos moribundos foram sacrificados imediatamente, e uma observação final foi realizada a 24 horas após a lesão caudal. Para mimetizar a situação da hemorragia em pacientes com hemofilia e completamente para assegurar a recuperação do animal a partir de anestesia, 1 mg/kg de solução de atipamezol foi dado efeito para reverter a dexmedetomi- dina no início da Transecção da Veia da Cauda. Uma dose adicional de 0.1 mg/kg de Buprenex foi administrada no final do período de observação de 12 horas durante a noite para a gestão da dor. A curva de sobrevivência do tempo para voltar a sangrar e tempo de eutanásia foi gerado para análise de dados e teste Log-rank (Mantel-Cox) foi utilizado para avaliação estatística.

Exemplo 11: Preparação de FVIII169/VWF059 e outros construtos Clonagem pSYN FVIII 310:

[000360] Um fragmento de DNA sintético com o local BamH1 flanqueado na extremidade do terminal N e um local Cla 1 no terminal C foi feito comercialmente. Este DNA sintético foi utilizado para substituir a região de BamH1 para Cla1 NO construto pSYN FVIII 169 (SEQ ID N°: 155). Tanto o DNa sintético e pSYN FVIII 169 DNA foram duplamente digeridos com BamH1 e Cla1, DNA sintético digeridos foi inserido pSYN FVIII 169 digerido para criar pSYN FVIII 310 (SEQ ID N°: 168; Tabela 20).

Clonagem pSYN FVIII 312:

[000361] Um fragmento de DNA sintético com o local BamH1 flanqueado na extremidade do terminal N e um local Afe 1 no terminal C foi feito comercialmente. Este DNA sintético foi utilizado para substituir a região de BamH1 para Afe1 no construto pSYN FVIII 169 (SEQ ID N°: 155). Tanto o DNA sintético e pSYN FVIII 169 DNA foram duplamente digeridos com BamH1 e Afe1, DNA sintético digerido foi inserido no pSYN FVIII 169 digerido para criar pSYN FVIII 312 (SEQ ID N°: 169; Tabela 20). pSYN FVIII 312A (SEQ ID N°: 2; Tabela 20) foi produzido a partir pSYN FVIII312 para remover o local AscI que codifica para os resíduos de aminoácido GAP na junção de FVIII e XTEN. Tabela 20: Construtos sintéticos FVIII.

Clonagem pSYN VWF059 e VWF073:

[000362] Vários fragmentos de DNA sintéticos que codificam para di-ferentes regiões ligantes entre D'D3 e Fc-XTEN foram feitos. Estes fra-gmentos de DNA sintéticos foram flanqueados com local Asc1 no termi-nal N e local Not 1 no terminal C. Estes DNAs sintéticos foram usados para substituir a região de Asc1 Not1 no construtopSYN VWF057 (SEQ ID N°: 152). O construto pSYN VWF059 (Tabela 21) compreende uma região ligante (SEQ ID N°: 13), que inclui toda a região acídica de FVIII 2 (a2). Este local é relatado para ser clivado por trombina, e mediante a ativação de FVIII D'D3XTEN é libertado. O construto pSYN VWF073 (Tabela 21) contém apenas o local de clivagem da trombina da região ácida FVIII 2 (a2) (isto é, IEPRSFS) (SEQ ID N°: 23). Tanto o DNA sin-tético e DNA VWF057 pSYN foram duplamente digeridos com Asc1 e Not1. DNA sintético digerido foi inserido no pSYN VWF057 digerido para criar pSYN VWF059 e pSYN VWF073. O construto pSYN VWF59A (Ta-bela 21), foi gerado a partir de pSYN VWF059 através da remoção do local de restrição EcoRV. Proteínas heterodiméricas FVIII169/VWF057 e FVIII169/VWF059 foram geradas por co-expressão de FVIII169 e VWF057 ou VWF059 nas células HEK293. Tabela 21: Construtos VWF sintéticos - Regiões de Ligantes Cliváveis.

Exemplo 12: Digestão da trombina de heterodímero FVIII para analisar a liberação de D'D3 de Fc

[000363] Duas proteínas heterodiméricas de FVIII foram testadas em experiências de digestão da trombina e a sua taxa de clivagem pela trombina foi examinada. Os dois construtos heterodímeros utilizados neste experimento foram heterodímero FVIII169/VWF057 e heterodí- mero FVIII169/VWF059 juntamente com FVIIIFc. O FVIII169/VWF057 e heterodímeros FVIII169/VWF059 são descritos acima. Três reações de digestão foram levadas a cabo: i) FVIIIFc ii) FVIII169/VWF057 (FIG. 11), e iii) o FVIII 169/VWF059 (FIG. 12). As amostras de teste foram tratadas com trombina α- humana a uma razão molar se FVIII: trombina de cerca de 22: 1. Cada reação foi incubada em um banho de água a 37 ° C. Em cada ponto de tempo indicado (t = 5, 15, 30, 45, 60 minutos), uma a-mostra de 22.5 mL foi retirada, parada com 22.5 uL não redutor de co-rante de carga DSS 2X e aquecido durante 3 minutos. A proteína digerida foi então executada em um gel de SDS-PAGE. Western blot foi efetuado utilizando anticorpos anti-VWF-D3 (Ab96340) e anti-FVIII de cadeia pesada (GMA012) utilizando um sistema LICOR.

[000364] Como se mostra na figura 11, a exposição de FVIII169/VWF057 à trombina resultou em um decréscimo gradual do nível detectado de D'D3-XTEN-Fc, correlacionando-se com um aumento no nível de D'D3-144 XTEN, o produto clivado. FVIII169/VWF057 não clivada permaneceu após 15 minutos. Por outro lado, a figura 12 mostra que o FVIII 169/VWF059 é clivado mais rapidamente pela trombina, como evidenciado por pouca ou nenhum detectável não clivado FVIII 169/VWF059 após 5 minutos. Assim, FVIII 169/VWF059 apresentaram melhor lançamento de D'D3 de Fc após a ativação da trombina, em com-paração ou FVIII169/VWF057.

[000365] Experiências paralelas foram realizadas para investigar a cli-vagem de trombina utilizando espectroscopia de massa (MS). Por MS, FVIII 169/VWF059 novamente apresentou melhor lançamento de D'D3 de Fc, em comparação com VWF057.

Exemplo 13: Avaliação in Vivo de FVIII169/VWF059 em camundongos HemA

[000366] Para avaliar ainda mais o perfil farmacocinético e potênciain Vivo de FVIII169/VWF059, camundongos HemA foram tratados com FVIII169/VWF059 através da administração intravenosa a 150 IU/kg da dose. As amostras de plasma foram coletadas por meio de coleta de san-gue da veia cava em 5 minutos, 24, 48, 72, 96 e 120 horas após a injeção. Atividade FVIII em amostras de plasma foram medidas por ensaio cromo- gênico FVIII e parâmetros farmacocinéticos foram calculados usando o programa Phoenix. Observou-se um perfil de PK semelhante de FVIII169/VWF059 em comparação com FVIII169/VWF057, como mos-trado na Tabela 22, indicando que o ligante de clivagem de trombina a2 não tem efeito negativo sobre o perfil farmacocinético do heterodímero. Tabela 22: Perfil de PK FVIII169/VWF057 e FVIII169/VWF059 em ca-mundongos HemA

[000367] A eficácia aguda de FVIII169/VWF059 foi avaliada em um modelo de camundongo HemA de clipe da cauda (descrito no Exemplo 9), em comparação com o tipo selvagem do BDD-FVIII. Camundongos HemA foram tratados com 75 IU/kg de quer FVIII169/VWF059 ou o BDD-FVIII, e o volume de perda de sangue de cada camundongo experimental foi representado graficamente na Figura 13. Em comparação com BDD-FVIII, FVIII169/VWF059 desde que o mesmo grau de proteção para camundongos HemA (p = 0.9883), indicando que FVIII169/VWF059 é totalmente funcional in Vivo. Construção do plasmídeo de FVIII-XTEN-Fc/heterodímeros D'D3-Fc Sequência de nucleotídeos VWF031 (SEQ ID N°: 147) 1 ATGAT TCCTG CCAGA TTTGC CGGGG TGCTG CTTGC TCTGG CCCTC ATTTT 51 GCCAG GGACC CTTTG TGCAG AAGGA ACTCG CGGCA GGTCA TCCAC GGCCC 101 GATGC AGCCT TTTCG GAAGT GACTT CGTCA ACACC TTTGA TGGGA GCATG 151 TACAG CTTTG CGGGA TACTG CAGTT ACCTC CTGGC AGGGG GCTGC CAGAA 201 ACGCT CCTTC TCGAT TATTG GGGAC TTCCA GAATG GCAAG AGAGT GAGCC 251 TCTCC GTGTA TCTTG GGGAA TTTTT TGACA TCCAT TTGTT TGTCA ATGGT 301 ACCGT GACAC AGGGG GACCA AAGAG TCTCC ATGCC CTATG CCTCC AAAGG 351 GCTGT ATCTA GAAAC TGAGG CTGGG TACTA CAAGC TGTCC GGTGA GGCCT 401 ATGGC TTTGT GGCCA GGATC GATGG CAGCG GCAAC TTTCA AGTCC TGCTG 451 TCAGA CAGAT ACTTC AACAA GACCT GCGGG CTGTG TGGCA ACTTT AACAT 501 CTTTG CTGAA GATGA CTTTA TGACC CAAGA AGGGA CCTTG ACCTC GGACC 551 CTTAT GACTT TGCCA ACTCA TGGGC TCTGA GCAGT GGAGA ACAGT GGTGT 601 GAACG GGCAT CTCCT CCCAG CAGCT CATGC AACAT CTCCT CTGGG GAAAT 651 GCAGA AGGGC CTGTG GGAGC AGTGC CAGCT TCTGA AGAGC ACCTC GGTGT 701 TTGCC CGCTG CCACC CTCTG GTGGA CCCCG AGCCT TTTGT GGCCC TGTGT 751 GAGAA GACTT TGTGT GAGTG TGCTG GGGGG CTGGA GTGCG CCTGC CCTGC 801 CCTCC TGGAG TACGC CCGGA CCTGT GCCCA GGAGG GAATG GTGCT GTACG 851 GCTGG ACCGA CCACA GCGCG TGCAG CCCAG TGTGC CCTGC TGGTA TGGAG 901 TATAG GCAGT GTGTG TCCCC TTGCG CCAGG ACCTG CCAGA GCCTG CACAT 951 CAATG AAATG TGTCA GGAGC GATGC GTGGA TGGCT GCAGC TGCCC TGAGG 1001 GACAG CTCCT GGATG AAGGC CTCTG CGTGG AGAGC ACCGA GTGTC CCTGC 1051 GTGCA TTCCG GAAAG CGCTA CCCTC CCGGC ACCTC CCTCT CTCGA GACTG 1101 CAACA CCTGC ATTTG CCGAA ACAGC CAGTG GATCT GCAGC AATGA AGAAT 1151 GTCCA GGGGA GTGCC TTGTC ACTGG TCAAT CCCAC TTCAA GAGCT TTGAC 1201 AACAG ATACT TCACC TTCAG TGGGA TCTGC CAGTA CCTGC TGGCC CGGGA 1251 TTGCC AGGAC CACTC CTTCT CCATT GTCAT TGAGA CTGTC CAGTG TGCTG 1301 ATGAC CGCGA CGCTG TGTGC ACCCG CTCCG TCACC GTCCG GCTGC CTGGC 1351 CTGCA CAACA GCCTT GTGAA ACTGA AGCAT GGGGC AGGAG TTGCC ATGGA 1401 TGGCC AGGAC ATCCA GCTCC CCCTC CTGAA AGGTG ACCTC CGCAT CCAGC 1451 ATACA GTGAC GGCCT CCGTG CGCCT CAGCT ACGGG GAGGA CCTGC AGATG 1501 GACTG GGATG GCCGC GGGAG GCTGC TGGTG AAGCT GTCCC CCGTC TATGC 1551 CGGGA AGACC TGCGG CCTGT GTGGG AATTA CAATG GCAAC CAGGG CGACG 1601 ACTTC CTTAC CCCCT CTGGG CTGGC GGAGC CCCGG GTGGA GGACT TCGGG 1651 AACGC CTGGA AGCTG CACGG GGACT GCCAG GACCT GCAGA AGCAG CACAG 1701 CGATC CCTGC GCCCT CAACC CGCGC ATGAC CAGGT TCTCC GAGGA GGCGT 1751 GCGCG GTCCT GACGT CCCCC ACATT CGAGG CCTGC CATCG TGCCG TCAGC 1801 CCGCT GCCCT ACCTG CGGAA CTGCC GCTAC GACGT GTGCT CCTGC TCGGA 1851 CGGCC GCGAG TGCCT GTGCG GCGCC CTGGC CAGCT ATGCC GCGGC CTGCG 1901 CGGGG AGAGG CGTGC GCGTC GCGTG GCGCG AGCCA GGCCG CTGTG AGCTG 1951 AACTG CCCGA AAGGC CAGGT GTACC TGCAG TGCGG GACCC CCTGC AACCT 2001 GACCT GCCGC TCTCT CTCTT ACCCG GATGA GGAAT GCAAT GAGGC CTGCC 2051 TGGAG GGCTG CTTCT GCCCC CCAGG GCTCT ACATG GATGA GAGGG GGGAC 2101 TGCGT GCCCA AGGCC CAGTG CCCCT GTTAC TATGA CGGTG AGATC TTCCA 2151 GCCAG AAGAC ATCTT CTCAG ACCAT CACAC CATGT GCTAC TGTGA GGATG 2201 GCTTC ATGCA CTGTA CCATG AGTGG AGTCC CCGGA AGCTT GCTGC CTGAC 2251 GCTGT CCTCA GCAGT CCCCT GTCTC ATCGC AGCAA AAGGA GCCTA TCCTG 2301 TCGGC CCCCC ATGGT CAAGC TGGTG TGTCC CGCTG ACAAC CTGCG GGCTG 2351 AAGGG CTCGA GTGTA CCAAA ACGTG CCAGA ACTAT GACCT GGAGT GCATG 2401 AGCAT GGGCT GTGTC TCTGG CTGCC TCTGC CCCCC GGGCA TGGTC CGGCA 2451 TGAGA ACAGA TGTGT GGCCC TGGAA AGGTG TCCCT GCTTC CATCA GGGCA 2501 AGGAG TATGC CCCTG GAGAA ACAGT GAAGA TTGGC TGCAA CACTT GTGTC 2551 TGTCG GGACC GGAAG TGGAA CTGCA CAGAC CATGT GTGTG ATGCC ACGTG 2601 CTCCA CGATC GGCAT GGCCC ACTAC CTCAC CTTCG ACGGG CTCAA ATACC 2651 TGTTC CCCGG GGAGT GCCAG TACGT TCTGG TGCAG GATTA CTGCG GCAGT 2701 AACCC TGGGA CCTTT CGGAT CCTAG TGGGG AATAA GGGAT GCAGC CACCC 2751 CTCAG TGAAA TGCAA GAAAC GGGTC ACCAT CCTGG TGGAG GGAGG AGAGA 2801 TTGAG CTGTT TGACG GGGAG GTGAA TGTGA AGAGG CCCAT GAAGG ATGAG 2851 ACTCA CTTTG AGGTG GTGGA GTCTG GCCGG TACAT CATTC TGCTG CTGGG 2901 CAAAG CCCTC TCCGT GGTCT GGGAC CGCCA CCTGA GCATC TCCGT GGTCC 2951 TGAAG CAGAC ATACC AGGAG AAAGT GTGTG GCCTG TGTGG GAATT TTGAT 3001 GGCAT CCAGA ACAAT GACCT CACCA GCAGC AACCT CCAAG TGGAG GAAGA 3051 CCCTG TGGAC TTTGG GAACT CCTGG AAAGT GAGCT CGCAG TGTGC TGACA 3101 CCAGA AAAGT GCCTC TGGAC TCATC CCCTG CCACC TGCCA TAACA ACATC 3151 ATGAA GCAGA CGATG GTGGA TTCCT CCTGT AGAAT CCTTA CCAGT GACGT 3201 CTTCC AGGAC TGCAA CAAGC TGGTG GACCC CGAGC CATAT CTGGA TGTCT 3251 GCATT TACGA CACCT GCTCC TGTGA GTCCA TTGGG GACTG CGCCG CATTC 3301 TGCGA CACCA TTGCT GCCTA TGCCC ACGTG TGTGC CCAGC ATGGC AAGGT 3351 GGTGA CCTGG AGGAC GGCCA CATTG TGCCC CCAGA GCTGC GAGGA GAGGA 3401 ATCTC CGGGA GAACG GGTAT GAGGC TGAGT GGCGC TATAA CAGCT GTGCA 3451 CCTGC CTGTC AAGTC ACGTG TCAGC ACCCT GAGCC ACTGG CCTGC CCTGT 3501 GCAGT GTGTG GAGGG CTGCC ATGCC CACTG CCCTC CAGGG AAAAT CCTGG 3551 ATGAG CTTTT GCAGA CCTGC GTTGA CCCTG AAGAC TGTCC AGTGT GTGAG 3601 GTGGC TGGCC GGCGT TTTGC CTCAG GAAAG AAAGT CACCT TGAAT CCCAG 3651 TGACC CTGAG CACTG CCAGA TTTGC CACTG TGATG TTGTC AACCT CACCT 3701 GTGAA GCCTG CCAGG AGCCG ATATC TGGCG GTGGA GGTTC CGGTG GCGGG 3751 GGATC CGGCG GTGGA GGTTC CGGCG GTGGA GGTTC CGGTG GCGGG GGATC 3801 CGGTG GCGGG GGATC CCTGG TCCCC CGGGG CAGCG GCGGT GGAGG TTCCG 3851 GTGGC GGGGG ATCCG ACAAA ACTCA CACAT GCCCA CCGTG CCCAG CTCCA 3901 GAACT CCTGG GCGGA CCGTC AGTCT TCCTC TTCCC CCCAA AACCC AAGGA 3951 CACCC TCATG ATCTC CCGGA CCCCT GAGGT CACAT GCGTG GTGGT GGACG 4001 TGAGC CACGA AGACC CTGAG GTCAA GTTCA ACTGG TACGT GGACG GCGTG 4051 GAGGT GCATA ATGCC AAGAC AAAGC CGCGG GAGGA GCAGT ACAAC AGCAC 4101 GTACC GTGTG GTCAG CGTCC TCACC GTCCT GCACC AGGAC TGGCT GAATG 4151 GCAAG GAGTA CAAGT GCAAG GTCTC CAACA AAGCC CTCCC AGCCC CCATC 4201 GAGAA AACCA TCTCC AAAGC CAAAG GGCAG CCCCG AGAAC CACAG GTGTA 4251 CACCC TGCCC CCATC CCGCG ATGAG CTGAC CAAGA ACCAG GTCAG CCTGA 4301 CCTGC CTGGT CAAAG GCTTC TATCC CAGCG ACATC GCCGT GGAGT GGGAG 4351 AGCAA TGGGC AGCCG GAGAA CAACT ACAAG ACCAC GCCTC CCGTG TTGGA 4401 CTCCG ACGGC TCCTT CTTCC TCTAC AGCAA GCTCA CCGTG GACAA GAGCA 4451 GGTGG CAGCA GGGGA ACGTC TTCTC ATGCT CCGTG ATGCA TGAGG CTCTG 4501 CACAA CCACT ACACG CAGAA GAGCC TCTCC CTGTC TCCGG GTAAA TGA Sequência da proteína VWF031 (SEQ ID N°: 86) 1 MIPARFAGVL LALALILPGT LCAEGTRGRS STARCSLFGS DFVNTFDGSM 51 YSFAGYCSYL LAGGCQKRSF SIIGDFQNGK RVSLSVYLGE FFDIHLFVNG 101 TVTQGDQRVS MPYASKGLYL ETEAGYYKLS GEAYGFVARI DGSGNFQVLL 151 SDRYFNKTCG LCGNFNIFAE DDFMTQEGTL TSDPYDFANS WALSSGEQWC 201 ERASPPSSSC NISSGEMQKG LWEQCQLLKS TSVFARCHPL VDPEPFVALC 251 EKTLCECAGG LECACPALLE YARTCAQEGM VLYGWTDHSA CSPVCPAGME 301 YRQCVSPCAR TCQSLHINEM CQERCVDGCS CPEGQLLDEG LCVESTECPC 351 VHSGKRYPPG TSLSRDCNTC ICRNSQWICS NEECPGECLV TGQSHFKSFD 401 NRYFTFSGIC QYLLARDCQD HSFSIVIETV QCADDRDAVC TRSVTVRLPG 451 LHNSLVKLKH GAGVAMDGQD IQLPLLKGDL RIQHTVTASV RLSYGEDLQM 501 DWDGRGRLLV KLSPVYAGKT CGLCGNYNGN QGDDFLTPSG LAEPRVEDFG 551 NAWKLHGDCQ DLQKQHSDPC ALNPRMTRFS EEACAVLTSP TFEACHRAVS 601 PLPYLRNCRY DVCSCSDGRE CLCGALASYA AACAGRGVRV AWREPGRCEL 651 NCPKGQVYLQ CGTPCNLTCR SLSYPDEECN EACLEGCFCP PGLYMDERGD 701 CVPKAQCPCY YDGEIFQPED IFSDHHTMCY CEDGFMHCTM SGVPGSLLPD 751 AVLSSPLSHR SKRSLSCRPP MVKLVCPADN LRAEGLECTK TCQNYDLECM 801 SMGCVSGCLC PPGMVRHENR CVALERCPCF HQGKEYAPGE TVKIGCNTCV 851 CRDRKWNCTD HVCDATCSTI GMAHYLTFDG LKYLFPGECQ YVLVQDYCGS 901 NPGTFRILVG NKGCSHPSVK CKKRVTILVE GGEIELFDGE VNVKRPMKDE 951 THFEVVESGR YIILLLGKAL SVVWDRHLSI SVVLKQTYQE KVCGLCGNFD 1001 GIQNNDLTSS NLQVEEDPVD FGNSWKVSSQ CADTRKVPLD SSPATCHNNI 1051 MKQTMVDSSC RILTSDVFQD CNKLVDPEPY LDVCIYDTCS CESIGDCAAF 1101 CDTIAAYAHV CAQHGKVVTW RTATLCPQSC EERNLRENGY EAEWRYNSCA 1151 PACQVTCQHP EPLACPVQCV EGCHAHCPPG KILDELLQTC VDPEDCPVCE 1201 VAGRRFASGK KVTLNPSDPE HCQICHCDVV NLTCEACQEP ISGGGGSGGG 1251 GSGGGGSGGG GSGGGGSGGG GSLVPRGSGG GGSGGGGSDK THTCPPCPAP 1301 ELLGGPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV VVDVSHEDPE VKFNWYVDGV 1351 EVHNAKTKPR EEQYNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKALPAPI 1401 EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSRDELTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE 1451 SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSKLTV DKSRWQQGNV FSCSVMHEAL 1501 HNHYTQKSLS LSPGK* Sequência de nucleotídeos VWF034 (SEQ ID N°: 148) 1 ATGAT TCCTG CCAGA TTTGC CGGGG TGCTG CTTGC TCTGG CCCTC ATTTT 51 GCCAG GGACC CTTTG TGCAG AAGGA ACTCG CGGCA GGTCA TCCAC GGCCC 101 GATGC AGCCT TTTCG GAAGT GACTT CGTCA ACACC TTTGA TGGGA GCATG 151 TACAG CTTTG CGGGA TACTG CAGTT ACCTC CTGGC AGGGG GCTGC CAGAA 201 ACGCT CCTTC TCGAT TATTG GGGAC TTCCA GAATG GCAAG AGAGT GAGCC 251 TCTCC GTGTA TCTTG GGGAA TTTTT TGACA TCCAT TTGTT TGTCA ATGGT 301 ACCGT GACAC AGGGG GACCA AAGAG TCTCC ATGCC CTATG CCTCC AAAGG 351 GCTGT ATCTA GAAAC TGAGG CTGGG TACTA CAAGC TGTCC GGTGA GGCCT 401 ATGGC TTTGT GGCCA GGATC GATGG CAGCG GCAAC TTTCA AGTCC TGCTG 451 TCAGA CAGAT ACTTC AACAA GACCT GCGGG CTGTG TGGCA ACTTT AACAT 501 CTTTG CTGAA GATGA CTTTA TGACC CAAGA AGGGA CCTTG ACCTC GGACC 551 CTTAT GACTT TGCCA ACTCA TGGGC TCTGA GCAGT GGAGA ACAGT GGTGT 601 GAACG GGCAT CTCCT CCCAG CAGCT CATGC AACAT CTCCT CTGGG GAAAT 651 GCAGA AGGGC CTGTG GGAGC AGTGC CAGCT TCTGA AGAGC ACCTC GGTGT 701 TTGCC CGCTG CCACC CTCTG GTGGA CCCCG AGCCT TTTGT GGCCC TGTGT 751 GAGAA GACTT TGTGT GAGTG TGCTG GGGGG CTGGA GTGCG CCTGC CCTGC 801 CCTCC TGGAG TACGC CCGGA CCTGT GCCCA GGAGG GAATG GTGCT GTACG 851 GCTGG ACCGA CCACA GCGCG TGCAG CCCAG TGTGC CCTGC TGGTA TGGAG 901 TATAG GCAGT GTGTG TCCCC TTGCG CCAGG ACCTG CCAGA GCCTG CACAT 951 CAATG AAATG TGTCA GGAGC GATGC GTGGA TGGCT GCAGC TGCCC TGAGG 1001 GACAG CTCCT GGATG AAGGC CTCTG CGTGG AGAGC ACCGA GTGTC CCTGC 1051 GTGCA TTCCG GAAAG CGCTA CCCTC CCGGC ACCTC CCTCT CTCGA GACTG 1101 CAACA CCTGC ATTTG CCGAA ACAGC CAGTG GATCT GCAGC AATGA AGAAT 1151 GTCCA GGGGA GTGCC TTGTC ACTGG TCAAT CCCAC TTCAA GAGCT TTGAC 1201 AACAG ATACT TCACC TTCAG TGGGA TCTGC CAGTA CCTGC TGGCC CGGGA 1251 TTGCC AGGAC CACTC CTTCT CCATT GTCAT TGAGA CTGTC CAGTG TGCTG 1301 ATGAC CGCGA CGCTG TGTGC ACCCG CTCCG TCACC GTCCG GCTGC CTGGC 1351 CTGCA CAACA GCCTT GTGAA ACTGA AGCAT GGGGC AGGAG TTGCC ATGGA 1401 TGGCC AGGAC ATCCA GCTCC CCCTC CTGAA AGGTG ACCTC CGCAT CCAGC 1451 ATACA GTGAC GGCCT CCGTG CGCCT CAGCT ACGGG GAGGA CCTGC AGATG 1501 GACTG GGATG GCCGC GGGAG GCTGC TGGTG AAGCT GTCCC CCGTC TATGC 1551 CGGGA AGACC TGCGG CCTGT GTGGG AATTA CAATG GCAAC CAGGG CGACG 1601 ACTTC CTTAC CCCCT CTGGG CTGGC GGAGC CCCGG GTGGA GGACT TCGGG 1651 AACGC CTGGA AGCTG CACGG GGACT GCCAG GACCT GCAGA AGCAG CACAG 1701 CGATC CCTGC GCCCT CAACC CGCGC ATGAC CAGGT TCTCC GAGGA GGCGT 1751 GCGCG GTCCT GACGT CCCCC ACATT CGAGG CCTGC CATCG TGCCG TCAGC 1801 CCGCT GCCCT ACCTG CGGAA CTGCC GCTAC GACGT GTGCT CCTGC TCGGA 1851 CGGCC GCGAG TGCCT GTGCG GCGCC CTGGC CAGCT ATGCC GCGGC CTGCG 1901 CGGGG AGAGG CGTGC GCGTC GCGTG GCGCG AGCCA GGCCG CTGTG AGCTG 1951 AACTG CCCGA AAGGC CAGGT GTACC TGCAG TGCGG GACCC CCTGC AACCT 2001 GACCT GCCGC TCTCT CTCTT ACCCG GATGA GGAAT GCAAT GAGGC CTGCC 2051 TGGAG GGCTG CTTCT GCCCC CCAGG GCTCT ACATG GATGA GAGGG GGGAC 2101 TGCGT GCCCA AGGCC CAGTG CCCCT GTTAC TATGA CGGTG AGATC TTCCA 2151 GCCAG AAGAC ATCTT CTCAG ACCAT CACAC CATGT GCTAC TGTGA GGATG 2201 GCTTC ATGCA CTGTA CCATG AGTGG AGTCC CCGGA AGCTT GCTGC CTGAC 2251 GCTGT CCTCA GCAGT CCCCT GTCTC ATCGC AGCAA AAGGA GCCTA TCCTG 2301 TCGGC CCCCC ATGGT CAAGC TGGTG TGTCC CGCTG ACAAC CTGCG GGCTG 2351 AAGGG CTCGA GTGTA CCAAA ACGTG CCAGA ACTAT GACCT GGAGT GCATG 2401 AGCAT GGGCT GTGTC TCTGG CTGCC TCTGC CCCCC GGGCA TGGTC CGGCA 2451 TGAGA ACAGA TGTGT GGCCC TGGAA AGGTG TCCCT GCTTC CATCA GGGCA 2501 AGGAG TATGC CCCTG GAGAA ACAGT GAAGA TTGGC TGCAA CACTT GTGTC 2551 TGTCG GGACC GGAAG TGGAA CTGCA CAGAC CATGT GTGTG ATGCC ACGTG 2601 CTCCA CGATC GGCAT GGCCC ACTAC CTCAC CTTCG ACGGG CTCAA ATACC 2651 TGTTC CCCGG GGAGT GCCAG TACGT TCTGG TGCAG GATTA CTGCG GCAGT 2701 AACCC TGGGA CCTTT CGGAT CCTAG TGGGG AATAA GGGAT GCAGC CACCC 2751 CTCAG TGAAA TGCAA GAAAC GGGTC ACCAT CCTGG TGGAG GGAGG AGAGA 2801 TTGAG CTGTT TGACG GGGAG GTGAA TGTGA AGAGG CCCAT GAAGG ATGAG 2851 ACTCA CTTTG AGGTG GTGGA GTCTG GCCGG TACAT CATTC TGCTG CTGGG 2901 CAAAG CCCTC TCCGT GGTCT GGGAC CGCCA CCTGA GCATC TCCGT GGTCC 2951 TGAAG CAGAC ATACC AGGAG AAAGT GTGTG GCCTG TGTGG GAATT TTGAT 3001 GGCAT CCAGA ACAAT GACCT CACCA GCAGC AACCT CCAAG TGGAG GAAGA 3051 CCCTG TGGAC TTTGG GAACT CCTGG AAAGT GAGCT CGCAG TGTGC TGACA 3101 CCAGA AAAGT GCCTC TGGAC TCATC CCCTG CCACC TGCCA TAACA ACATC 3151 ATGAA GCAGA 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CGGCG GTGGA GGTTC CGGCG GTGGA GGTTC CGGTG GCGGG GGATC 3801 CGGTG GCGGG GGATC CCTGG TCCCC CGGGG CAGCG GCGGT GGAGG TTCCG 3851 GTGGC GGGGG ATCCG ACAAA ACTCA CACAT GCCCA CCGTG CCCAG CTCCA 3901 GAACT CCTGG GCGGA CCGTC AGTCT TCCTC TTCCC CCCAA AACCC AAGGA 3951 CACCC TCATG GCCTC CCGGA CCCCT GAGGT CACAT GCGTG GTGGT GGACG 4001 TGAGC CACGA AGACC CTGAG GTCAA GTTCA ACTGG TACGT GGACG GCGTG 4051 GAGGT GCATA ATGCC AAGAC AAAGC CGCGG GAGGA GCAGT ACAAC AGCAC 4101 GTACC GTGTG GTCAG CGTCC TCACC GTCCT GGCCC AGGAC TGGCT GAATG 4151 GCAAG GAGTA CAAGT GCAAG GTCTC CAACA AAGCC CTCCC AGCCC CCATC 4201 GAGAA AACCA TCTCC AAAGC CAAAG GGCAG CCCCG AGAAC CACAG GTGTA 4251 CACCC TGCCC CCATC CCGCG ATGAG CTGAC CAAGA ACCAG GTCAG CCTGA 4301 CCTGC CTGGT CAAAG GCTTC TATCC CAGCG ACATC GCCGT GGAGT GGGAG 4351 AGCAA TGGGC AGCCG GAGAA CAACT ACAAG ACCAC GCCTC CCGTG TTGGA 4401 CTCCG ACGGC TCCTT CTTCC TCTAC AGCAA GCTCA CCGTG GACAA GAGCA 4451 GGTGG CAGCA GGGGA ACGTC TTCTC ATGCT CCGTG ATGCA TGAGG CTCTG 4501 CACAA CGCCT ACACG CAGAA GAGCC 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GCCCA GGAGG GAATG GTGCT GTACG 851 GCTGG ACCGA CCACA GCGCG TGCAG CCCAG TGTGC CCTGC TGGTA TGGAG 901 TATAG GCAGT GTGTG TCCCC TTGCG CCAGG ACCTG CCAGA GCCTG CACAT 951 CAATG AAATG TGTCA GGAGC GATGC GTGGA TGGCT GCAGC TGCCC TGAGG 1001 GACAG CTCCT GGATG AAGGC CTCTG CGTGG AGAGC ACCGA GTGTC CCTGC 1051 GTGCA TTCCG GAAAG CGCTA CCCTC CCGGC ACCTC CCTCT CTCGA GACTG 1101 CAACA CCTGC ATTTG CCGAA ACAGC CAGTG GATCT GCAGC AATGA AGAAT 1151 GTCCA GGGGA GTGCC TTGTC ACTGG TCAAT CCCAC TTCAA GAGCT TTGAC 1201 AACAG ATACT TCACC TTCAG TGGGA TCTGC CAGTA CCTGC TGGCC CGGGA 1251 TTGCC AGGAC CACTC CTTCT CCATT GTCAT TGAGA CTGTC CAGTG TGCTG 1301 ATGAC CGCGA CGCTG TGTGC ACCCG CTCCG TCACC GTCCG GCTGC CTGGC 1351 CTGCA CAACA GCCTT GTGAA ACTGA AGCAT GGGGC AGGAG TTGCC ATGGA 1401 TGGCC AGGAC ATCCA GCTCC CCCTC CTGAA AGGTG ACCTC CGCAT CCAGC 1451 ATACA GTGAC GGCCT CCGTG CGCCT CAGCT ACGGG GAGGA CCTGC AGATG 1501 GACTG GGATG GCCGC GGGAG GCTGC TGGTG AAGCT GTCCC CCGTC TATGC 1551 CGGGA AGACC TGCGG CCTGT GTGGG AATTA CAATG GCAAC CAGGG 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ATGCA AAGTG ATCTC GGTGA GCTGC CTGTG GACGC AAGAT TTCCT 151 CCTAG AGTGC CAAAA TCTTT TCCAT TCAAC ACCTC AGTCG TGTAC AAAAA 201 GACTC TGTTT GTAGA ATTCA CGGAT CACCT TTTCA ACATC GCTAA GCCAA 251 GGCCA CCCTG GATGG GTCTG CTAGG TCCTA CCATC CAGGC TGAGG TTTAT 301 GATAC AGTGG TCATT ACACT TAAGA ACATG GCTTC CCATC CTGTC AGTCT 351 TCATG CTGTT GGTGT ATCCT ACTGG AAAGC TTCTG AGGGA GCTGA ATATG 401 ATGAT CAGAC CAGTC AAAGG GAGAA AGAAG ATGAT AAAGT CTTCC CTGGT 451 GGAAG CCATA CATAT GTCTG GCAGG TCCTG AAAGA GAATG GTCCA ATGGC 501 CTCTG ACCCA CTGTG CCTTA CCTAC TCATA TCTTT CTCAT GTGGA CCTGG 551 TAAAA GACTT GAATT CAGGC CTCAT TGGAG CCCTA CTAGT ATGTA GAGAA 601 GGGAG TCTGG CCAAG GAAAA GACAC AGACC TTGCA CAAAT TTATA CTACT 651 TTTTG CTGTA TTTGA TGAAG GGAAA AGTTG GCACT CAGAA ACAAA GAACT 701 CCTTG ATGCA GGATA GGGAT GCTGC ATCTG CTCGG GCCTG GCCTA AAATG 751 CACAC AGTCA ATGGT TATGT AAACA GGTCT CTGCC AGGTC TGATT GGATG 801 CCACA GGAAA TCAGT CTATT GGCAT GTGAT TGGAA TGGGC ACCAC TCCTG 851 AAGTG CACTC AATAT TCCTC GAAGG TCACA CATTT 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TATTA CTCTA GTTTC GTTAA TATGG AGAGA GATCT AGCTT CAGGA CTCAT 1701 TGGCC CTCTC CTCAT CTGCT ACAAA GAATC TGTAG ATCAA AGAGG AAACC 1751 AGATA ATGTC AGACA AGAGG AATGT CATCC TGTTT TCTGT ATTTG ATGAG 1801 AACCG AAGCT GGTAC CTCAC AGAGA ATATA CAACG CTTTC TCCCC AATCC 1851 AGCTG GAGTG CAGCT TGAGG ATCCA GAGTT CCAAG CCTCC AACAT CATGC 1901 ACAGC ATCAA TGGCT ATGTT TTTGA TAGTT TGCAG TTGTC AGTTT GTTTG 1951 CATGA GGTGG CATAC TGGTA CATTC TAAGC ATTGG AGCAC AGACT GACTT 2001 CCTTT CTGTC TTCTT CTCTG GATAT ACCTT CAAAC ACAAA ATGGT CTATG 2051 AAGAC ACACT CACCC TATTC CCATT CTCAG GAGAA ACTGT CTTCA TGTCG 2101 ATGGA AAACC CAGGT CTATG GATTC TGGGG TGCCA CAACT CAGAC TTTCG 2151 GAACA GAGGC ATGAC CGCCT TACTG AAGGT TTCTA GTTGT GACAA GAACA 2201 CTGGT GATTA TTACG AGGAC AGTTA TGAAG ATATT TCAGC ATACT TGCTG 2251 AGTAA AAACA ATGCC ATTGA ACCAA GAAGC TTCTC TCAAA ACGGC GCGCC 2301 AACAT CAGAG AGCGC CACCC CTGAA AGTGG TCCCG GGAGC GAGCC AGCCA 2351 CATCT GGGTC GGAAA CGCCA GGCAC AAGTG AGTCT GCAAC TCCCG AGTCC 2401 GGACC TGGCT CCGAG CCTGC 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GVSYWKASEG AEYDDQTSQR EKEDDKVFPG 151 GSHTYVWQVL KENGPMASDP LCLTYSYLSH VDLVKDLNSG LIGALLVCRE 201 GSLAKEKTQT LHKFILLFAV FDEGKSWHSE TKNSLMQDRD AASARAWPKM 251 HTVNGYVNRS LPGLIGCHRK SVYWHVIGMG TTPEVHSIFL EGHTFLVRNH 301 RQASLEISPI TFLTAQTLLM DLGQFLLFCH ISSHQHDGME AYVKVDSCPE 351 EPQLRMKNNE EAEDYDDDLT DSEMDVVRFD DDNSPSFIQI RSVAKKHPKT 401 WVHYIAAEEE DWDYAPLVLA PDDRSYKSQY LNNGPQRIGR KYKKVRFMAY 451 TDETFKTREA IQHESGILGP LLYGEVGDTL LIIFKNQASR PYNIYPHGIT 501 DVRPLYSRRL PKGVKHLKDF PILPGEIFKY KWTVTVEDGP TKSDPRCLTR 551 YYSSFVNMER DLASGLIGPL LICYKESVDQ RGNQIMSDKR NVILFSVFDE 601 NRSWYLTENI QRFLPNPAGV QLEDPEFQAS NIMHSINGYV FDSLQLSVCL 651 HEVAYWYILS IGAQTDFLSV FFSGYTFKHK MVYEDTLTLF PFSGETVFMS 701 MENPGLWILG CHNSDFRNRG MTALLKVSSC DKNTGDYYED SYEDISAYLL 751 SKNNAIEPRS FSQNPPVLKR HQREITRTTL QGAPGTPGSG TASSSPGASP 801 GTSSTGSPGA SPGTSSTGSP GASPGTSSTG SPGSSPSAST GTGPGTPGSG 851 TASSSPGASP GTSSTGSPGA SPGTSSTGSP GASPGTSSTG SPGSSTPSGA 901 TGSPGSSTPS GATGSPGASP GTSSTGSPAS SSDQEEIDYD DTISVEMKKE 951 DFDIYDEDEN QSPRSFQKKT RHYFIAAVER LWDYGMSSSP HVLRNRAQSG 1001 SVPQFKKVVF QEFTDGSFTQ PLYRGELNEH LGLLGPYIRA EVEDNIMVTF 1051 RNQASRPYSF YSSLISYEED QRQGAEPRKN FVKPNETKTY FWKVQHHMAP 1101 TKDEFDCKAW AYFSDVDLEK DVHSGLIGPL LVCHTNTLNP AHGRQVTVQE 1151 FALFFTIFDE TKSWYFTENM ERNCRGAPTS ESATPESGPG SEPATSGSET 1201 PGTSESATPE SGPGSEPATS GSETPGTSES ATPESGPGTS TEPSEGSAPG 1251 TSESATPESG PGSPAGSPTS TEEGSPAGSP TSTEEGSPAG SPTSTEEGTS 1301 ESATPESGPG TSTEPSEGSA PGASSAPCNI QMEDPTFKEN YRFHAINGYI 1351 MDTLPGLVMA QDQRIRWYLL SMGSNENIHS IHFSGHVFTV RKKEEYKMAL 1401 YNLYPGVFET VEMLPSKAGI WRVECLIGEH LHAGMSTLFL VYSNKCQTPL 1451 GMASGHIRDF QITASGQYGQ WAPKLARLHY SGSINAWSTK EPFSWIKVDL 1501 LAPMIIHGIK TQGARQKFSS LYISQFIIMY SLDGKKWQTY RGNSTGTLMV 1551 FFGNVDSSGI KHNIFNPPII ARYIRLHPTH YSIRSTLRME LMGCDLNSCS 1601 MPLGMESKAI SDAQITASSY FTNMFATWSP SKARLHLQGR SNAWRPQVNN 1651 PKEWLQVDFQ KTMKVTGVTT QGVKSLLTSM YVKEFLISSS QDGHQWTLFF 1701 QNGKVKVFQG NQDSFTPVVN SLDPPLLTRY LRIHPQSWVH QIALRMEVLG 1751 CEAQDLYDKT HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV 1801 VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW 1851 LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SRDELTKNQV 1901 SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD 1951 KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK* Sequenciamento de proteína madura pSYN-FVIII-173 (SEQ ID N°: 72): 1 ATRRYYLGAV ELSWDYMQSD LGELPVDARF PPRVPKSFPF NTSVVYKKTL 51 FVEFTDHLFN IAKPRPPWMG LLGPTIQAEV YDTVVITLKN MASHPVSLHA 101 VGVSYWKASE GAEYDDQTSQ REKEDDKVFP GGSHTYVWQV LKENGPMASD 151 PLCLTYSYLS HVDLVKDLNS GLIGALLVCR EGSLAKEKTQ TLHKFILLFA 201 VFDEGKSWHS ETKNSLMQDR DAASARAWPK MHTVNGYVNR SLPGLIGCHR 251 KSVYWHVIGM GTTPEVHSIF LEGHTFLVRN HRQASLEISP ITFLTAQTLL 301 MDLGQFLLFC HISSHQHDGM EAYVKVDSCP EEPQLRMKNN EEAEDYDDDL 351 TDSEMDVVRF DDDNSPSFIQ IRSVAKKHPK TWVHYIAAEE EDWDYAPLVL 401 APDDRSYKSQ YLNNGPQRIG RKYKKVRFMA YTDETFKTRE AIQHESGILG 451 PLLYGEVGDT LLIIFKNQAS RPYNIYPHGI TDVRPLYSRR LPKGVKHLKD 501 FPILPGEIFK YKWTVTVEDG PTKSDPRCLT RYYSSFVNME RDLASGLIGP 551 LLICYKESVD QRGNQIMSDK RNVILFSVFD ENRSWYLTEN IQRFLPNPAG 601 VQLEDPEFQA SNIMHSINGY VFDSLQLSVC LHEVAYWYIL SIGAQTDFLS 651 VFFSGYTFKH KMVYEDTLTL FPFSGETVFM SMENPGLWIL GCHNSDFRNR 701 GMTALLKVSS CDKNTGDYYE DSYEDISAYL LSKNNAIEPR SFSQNGAPGT 751 SESATPESGP GSEPATSGSE TPGTSESATP ESGPGSEPAT SGSETPGTSE 801 SATPESGPGT STEPSEGSAP GSPAGSPTST EEGTSESATP ESGPGSEPAT 851 SGSETPGTSE SATPESGPGS PAGSPTSTEE GSPAGSPTST EEGTSTEPSE 901 GSAPGTSESA TPESGPGTSE SATPESGPGT SESATPESGP GSEPATSGSE 951 TPGSEPATSG SETPGSPAGS PTSTEEGTST EPSEGSAPGT STEPSEGSAP 1001 GSEPATSGSE TPGTSESATP ESGPGTSTEP SEGSAPASSP PVLKRHQREI 1051 TRTTLQSDQE EIDYDDTISV EMKKEDFDIY DEDENQSPRS FQKKTRHYFI 1101 AAVERLWDYG MSSSPHVLRN RAQSGSVPQF KKVVFQEFTD GSFTQPLYRG 1151 ELNEHLGLLG PYIRAEVEDN IMVTFRNQAS RPYSFYSSLI SYEEDQRQGA 1201 EPRKNFVKPN ETKTYFWKVQ HHMAPTKDEF DCKAWAYFSD VDLEKDVHSG 1251 LIGPLLVCHT NTLNPAHGRQ VTVQEFALFF TIFDETKSWY FTENMERNCR 1301 APCNIQMEDP TFKENYRFHA INGYIMDTLP GLVMAQDQRI RWYLLSMGSN 1351 ENIHSIHFSG HVFTVRKKEE YKMALYNLYP GVFETVEMLP SKAGIWRVEC 1401 LIGEHLHAGM STLFLVYSNK CQTPLGMASG HIRDFQITAS GQYGQWAPKL 1451 ARLHYSGSIN AWSTKEPFSW IKVDLLAPMI IHGIKTQGAR QKFSSLYISQ 1501 FIIMYSLDGK KWQTYRGNST GTLMVFFGNV DSSGIKHNIF NPPIIARYIR 1551 LHPTHYSIRS TLRMELMGCD LNSCSMPLGM ESKAISDAQI TASSYFTNMF 1601 ATWSPSKARL HLQGRSNAWR PQVNNPKEWL QVDFQKTMKV TGVTTQGVKS 1651 LLTSMYVKEF LISSSQDGHQ WTLFFQNGKV KVFQGNQDSF TPVVNSLDPP 1701 LLTRYLRIHP QSWVHQIALR MEVLGCEAQD LYDKTHTCPP CPAPELLGGP 1751 SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK 1801 TKPREEQYNS TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK 1851 AKGQPREPQV YTLPPSRDEL TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE 1901 NNYKTTPPVL DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ 1951 KSLSLSPGK Sequência de proteína FVIII 196 (cadeia dupla com três FVIIIFc 144 AE XTENs no aminoácido 26, 1656 e 1900) (SEQ ID N° : 74) 51 1MQIELSTCFF SPSASTGTGP LCLLRFCFSA GSSPSASTGT TRRYYLGAVE GPGASPGTSS LSWDYMQSDL TGSPGASPGT GELPVGAPGS SSTGSPGSST 101 PSGATGSPGS SPSASTGTGP GASPGTSSTG SPGSSPSAST GTGPGTPGSG 151 TASSSPGSST PSGATGSPGS STPSGATGSP GASPGTSSTG SPASSDARFP 201 PRVPKSFPFN TSVVYKKTLF VEFTDHLFNI AKPRPPWMGL LGPTIQAEVY 251 DTVVITLKNM ASHPVSLHAV GVSYWKASEG AEYDDQTSQR EKEDDKVFPG 301 GSHTYVWQVL KENGPMASDP LCLTYSYLSH VDLVKDLNSG LIGALLVCRE 351 GSLAKEKTQT LHKFILLFAV FDEGKSWHSE TKNSLMQDRD AASARAWPKM 401 HTVNGYVNRS LPGLIGCHRK SVYWHVIGMG TTPEVHSIFL EGHTFLVRNH 451 RQASLEISPI TFLTAQTLLM DLGQFLLFCH ISSHQHDGME AYVKVDSCPE 501 EPQLRMKNNE EAEDYDDDLT DSEMDVVRFD DDNSPSFIQI RSVAKKHPKT 551 WVHYIAAEEE DWDYAPLVLA PDDRSYKSQY LNNGPQRIGR KYKKVRFMAY 601 TDETFKTREA IQHESGILGP LLYGEVGDTL LIIFKNQASR PYNIYPHGIT 651 DVRPLYSRRL PKGVKHLKDF PILPGEIFKY KWTVTVEDGP TKSDPRCLTR 701 YYSSFVNMER DLASGLIGPL LICYKESVDQ RGNQIMSDKR NVILFSVFDE 751 NRSWYLTENI QRFLPNPAGV QLEDPEFQAS NIMHSINGYV FDSLQLSVCL 801 HEVAYWYILS IGAQTDFLSV FFSGYTFKHK MVYEDTLTLF PFSGETVFMS 851 MENPGLWILG CHNSDFRNRG MTALLKVSSC DKNTGDYYED SYEDISAYLL 901 SKNNAIEPRS FSQNPPVLKR HQREITRTTL QGAPGTPGSG TASSSPGASP 951 GTSSTGSPGA SPGTSSTGSP GASPGTSSTG SPGSSPSAST GTGPGTPGSG 1001 TASSSPGASP GTSSTGSPGA SPGTSSTGSP GASPGTSSTG SPGSSTPSGA 1051 TGSPGSSTPS GATGSPGASP GTSSTGSPAS SSDQEEIDYD DTISVEMKKE 1101 DFDIYDEDEN QSPRSFQKKT RHYFIAAVER LWDYGMSSSP HVLRNRAQSG 1151 SVPQFKKVVF QEFTDGSFTQ PLYRGELNEH LGLLGPYIRA EVEDNIMVTF 1201 RNQASRPYSF YSSLISYEED QRQGAEPRKN FVKPNETKTY FWKVQHHMAP 1251 TKDEFDCKAW AYFSDVDLEK DVHSGLIGPL LVCHTNTLNP AHGRQVTVQE 1301 FALFFTIFDE TKSWYFTENM ERNCRGAPTS ESATPESGPG SEPATSGSET 1351 PGTSESATPE SGPGSEPATS GSETPGTSES ATPESGPGTS TEPSEGSAPG 1401 TSESATPESG PGSPAGSPTS TEEGSPAGSP TSTEEGSPAG SPTSTEEGTS 1451 ESATPESGPG TSTEPSEGSA PGASSAPCNI QMEDPTFKEN YRFHAINGYI 1501 MDTLPGLVMA QDQRIRWYLL SMGSNENIHS IHFSGHVFTV RKKEEYKMAL 1551 YNLYPGVFET VEMLPSKAGI WRVECLIGEH LHAGMSTLFL VYSNKCQTPL 1601 GMASGHIRDF QITASGQYGQ WAPKLARLHY SGSINAWSTK EPFSWIKVDL 1651 LAPMIIHGIK TQGARQKFSS LYISQFIIMY SLDGKKWQTY RGNSTGTLMV 1701 FFGNVDSSGI KHNIFNPPII ARYIRLHPTH YSIRSTLRME LMGCDLNSCS 1751 MPLGMESKAI SDAQITASSY FTNMFATWSP SKARLHLQGR SNAWRPQVNN 1801 PKEWLQVDFQ KTMKVTGVTT QGVKSLLTSM YVKEFLISSS QDGHQWTLFF 1851 QNGKVKVFQG NQDSFTPVVN SLDPPLLTRY LRIHPQSWVH QIALRMEVLG 1901 CEAQDLYDKT HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV 1951 VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW 2001 LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SRDELTKNQV 2051 SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD 2101 KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK* Sequência da proteína FVIII 199 (cadeia única FVIIIFc com três XTENs 144 AE no aminoácido 1656 e 1900) (SEQ ID N°: 75) 1 MQIELSTCFF LCLLRFCFSA TRRYYLGAVE LSWDYMQSDL GELPVDARFP 51 PRVPKSFPFN TSVVYKKTLF VEFTDHLFNI AKPRPPWMGL LGPTIQAEVY 101 DTVVITLKNM ASHPVSLHAV GVSYWKASEG AEYDDQTSQR EKEDDKVFPG 151 GSHTYVWQVL KENGPMASDP LCLTYSYLSH VDLVKDLNSG LIGALLVCRE 201 GSLAKEKTQT LHKFILLFAV FDEGKSWHSE TKNSLMQDRD AASARAWPKM 251 HTVNGYVNRS LPGLIGCHRK SVYWHVIGMG TTPEVHSIFL EGHTFLVRNH 301 RQASLEISPI TFLTAQTLLM DLGQFLLFCH ISSHQHDGME AYVKVDSCPE 351 EPQLRMKNNE EAEDYDDDLT DSEMDVVRFD DDNSPSFIQI RSVAKKHPKT 401 WVHYIAAEEE DWDYAPLVLA PDDRSYKSQY LNNGPQRIGR KYKKVRFMAY 451 TDETFKTREA IQHESGILGP LLYGEVGDTL LIIFKNQASR PYNIYPHGIT 501 DVRPLYSRRL PKGVKHLKDF PILPGEIFKY KWTVTVEDGP TKSDPRCLTR 551 YYSSFVNMER DLASGLIGPL LICYKESVDQ RGNQIMSDKR NVILFSVFDE 601 NRSWYLTENI QRFLPNPAGV QLEDPEFQAS NIMHSINGYV FDSLQLSVCL 651 HEVAYWYILS IGAQTDFLSV FFSGYTFKHK MVYEDTLTLF PFSGETVFMS 701 MENPGLWILG CHNSDFRNRG MTALLKVSSC DKNTGDYYED SYEDISAYLL 751 SKNNAIEPRS FSQNPPVLKR HQAEITRTTL QGAPGTPGSG TASSSPGASP 801 GTSSTGSPGA SPGTSSTGSP GASPGTSSTG SPGSSPSAST GTGPGTPGSG 851 TASSSPGASP GTSSTGSPGA SPGTSSTGSP GASPGTSSTG SPGSSTPSGA 901 TGSPGSSTPS GATGSPGASP GTSSTGSPAS SSDQEEIDYD DTISVEMKKE 951 DFDIYDEDEN QSPRSFQKKT RHYFIAAVER LWDYGMSSSP HVLRNRAQSG 1001 SVPQFKKVVF QEFTDGSFTQ PLYRGELNEH LGLLGPYIRA EVEDNIMVTF 1051 RNQASRPYSF YSSLISYEED QRQGAEPRKN FVKPNETKTY FWKVQHHMAP 1101 TKDEFDCKAW AYFSDVDLEK DVHSGLIGPL LVCHTNTLNP AHGRQVTVQE 1151 FALFFTIFDE TKSWYFTENM ERNCRGAPTS ESATPESGPG SEPATSGSET 1201 PGTSESATPE SGPGSEPATS GSETPGTSES ATPESGPGTS TEPSEGSAPG 1251 TSESATPESG PGSPAGSPTS TEEGSPAGSP TSTEEGSPAG SPTSTEEGTS 1301 ESATPESGPG TSTEPSEGSA PGASSAPCNI QMEDPTFKEN YRFHAINGYI 1351 MDTLPGLVMA QDQRIRWYLL SMGSNENIHS IHFSGHVFTV RKKEEYKMAL 1401 YNLYPGVFET VEMLPSKAGI WRVECLIGEH LHAGMSTLFL VYSNKCQTPL 1451 GMASGHIRDF QITASGQYGQ WAPKLARLHY SGSINAWSTK EPFSWIKVDL 1501 LAPMIIHGIK TQGARQKFSS LYISQFIIMY SLDGKKWQTY RGNSTGTLMV 1551 FFGNVDSSGI KHNIFNPPII ARYIRLHPTH YSIRSTLRME LMGCDLNSCS 1601 MPLGMESKAI SDAQITASSY FTNMFATWSP SKARLHLQGR SNAWRPQVNN 1651 PKEWLQVDFQ KTMKVTGVTT QGVKSLLTSM YVKEFLISSS QDGHQWTLFF 1701 QNGKVKVFQG NQDSFTPVVN SLDPPLLTRY LRIHPQSWVH QIALRMEVLG 1751 CEAQDLYDKT HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV 1801 VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW 1851 LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SRDELTKNQV 1901 SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD 1951 KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK* Sequência de proteína FVIII 201 (cadeia única FVIIIFc com três 144 AE XTENs no aminoácido 26, 1656&1900) (SEQ ID N°: 76) 1 MQIELSTCFF LCLLRFCFSA TRRYYLGAVE LSWDYMQSDL GELPVGAPGS 51 SPSASTGTGP GSSPSASTGT GPGASPGTSS TGSPGASPGT SSTGSPGSST 101 PSGATGSPGS SPSASTGTGP GASPGTSSTG SPGSSPSAST GTGPGTPGSG 151 TASSSPGSST PSGATGSPGS STPSGATGSP GASPGTSSTG SPASSDARFP 201 PRVPKSFPFN TSVVYKKTLF VEFTDHLFNI AKPRPPWMGL LGPTIQAEVY 251 DTVVITLKNM ASHPVSLHAV GVSYWKASEG AEYDDQTSQR EKEDDKVFPG 301 GSHTYVWQVL KENGPMASDP LCLTYSYLSH VDLVKDLNSG LIGALLVCRE 351 GSLAKEKTQT LHKFILLFAV FDEGKSWHSE TKNSLMQDRD AASARAWPKM 401 HTVNGYVNRS LPGLIGCHRK SVYWHVIGMG TTPEVHSIFL EGHTFLVRNH 451 RQASLEISPI TFLTAQTLLM DLGQFLLFCH ISSHQHDGME AYVKVDSCPE 501 EPQLRMKNNE EAEDYDDDLT DSEMDVVRFD DDNSPSFIQI RSVAKKHPKT 551 WVHYIAAEEE DWDYAPLVLA PDDRSYKSQY LNNGPQRIGR KYKKVRFMAY 601 TDETFKTREA IQHESGILGP LLYGEVGDTL LIIFKNQASR PYNIYPHGIT 651 DVRPLYSRRL PKGVKHLKDF PILPGEIFKY KWTVTVEDGP TKSDPRCLTR 701 YYSSFVNMER DLASGLIGPL LICYKESVDQ RGNQIMSDKR NVILFSVFDE 751 NRSWYLTENI QRFLPNPAGV QLEDPEFQAS NIMHSINGYV FDSLQLSVCL 801 HEVAYWYILS IGAQTDFLSV FFSGYTFKHK MVYEDTLTLF PFSGETVFMS 851 MENPGLWILG CHNSDFRNRG MTALLKVSSC DKNTGDYYED SYEDISAYLL 901 SKNNAIEPRS FSQNPPVLKR HQAEITRTTL QGAPGTPGSG TASSSPGASP 951 GTSSTGSPGA SPGTSSTGSP GASPGTSSTG SPGSSPSAST GTGPGTPGSG 1001 TASSSPGASP GTSSTGSPGA SPGTSSTGSP GASPGTSSTG SPGSSTPSGA 1051 TGSPGSSTPS GATGSPGASP GTSSTGSPAS SSDQEEIDYD DTISVEMKKE 1101 DFDIYDEDEN QSPRSFQKKT RHYFIAAVER LWDYGMSSSP HVLRNRAQSG 1151 SVPQFKKVVF QEFTDGSFTQ PLYRGELNEH LGLLGPYIRA EVEDNIMVTF 1201 RNQASRPYSF YSSLISYEED QRQGAEPRKN FVKPNETKTY FWKVQHHMAP 1251 TKDEFDCKAW AYFSDVDLEK DVHSGLIGPL LVCHTNTLNP AHGRQVTVQE 1301 FALFFTIFDE TKSWYFTENM ERNCRGAPTS ESATPESGPG SEPATSGSET 1351 PGTSESATPE SGPGSEPATS GSETPGTSES ATPESGPGTS TEPSEGSAPG 1401 TSESATPESG PGSPAGSPTS TEEGSPAGSP TSTEEGSPAG SPTSTEEGTS 1451 ESATPESGPG TSTEPSEGSA PGASSAPCNI QMEDPTFKEN YRFHAINGYI 1501 MDTLPGLVMA QDQRIRWYLL SMGSNENIHS IHFSGHVFTV RKKEEYKMAL 1551 YNLYPGVFET VEMLPSKAGI WRVECLIGEH LHAGMSTLFL VYSNKCQTPL 1601 GMASGHIRDF QITASGQYGQ WAPKLARLHY SGSINAWSTK EPFSWIKVDL 1651 LAPMIIHGIK TQGARQKFSS LYISQFIIMY SLDGKKWQTY RGNSTGTLMV 1701 FFGNVDSSGI KHNIFNPPII ARYIRLHPTH YSIRSTLRME LMGCDLNSCS 1751 MPLGMESKAI SDAQITASSY FTNMFATWSP SKARLHLQGR SNAWRPQVNN 1801 PKEWLQVDFQ KTMKVTGVTT QGVKSLLTSM YVKEFLISSS QDGHQWTLFF 1851 QNGKVKVFQG NQDSFTPVVN SLDPPLLTRY LRIHPQSWVH QIALRMEVLG 1901 CEAQDLYDKT HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV 1951 VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW 2001 LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SRDELTKNQV 2051 2101 SLTCLVKGFY KSRWQQGNVF PSDIAVEWES SCSVMHEALH NGQPENNYKT NHYTQKSLSL TPPVLDSDGS SPGK* FFLYSKLTVD Sequênci a de proteína FVIII 203 (cadeia única FVIIIFc com dois XTENs AE, um 288AE XTEN no domínio B e um AE 144 XTEN no aminoácido 1900) (SEQ ID N°: 77) 1 MQIELSTCFF LCLLRFCFSA TRRYYLGAVE LSWDYMQSDL GELPVDARFP 51 PRVPKSFPFN TSVVYKKTLF VEFTDHLFNI AKPRPPWMGL LGPTIQAEVY 101 DTVVITLKNM ASHPVSLHAV GVSYWKASEG AEYDDQTSQR EKEDDKVFPG 151 GSHTYVWQVL KENGPMASDP LCLTYSYLSH VDLVKDLNSG LIGALLVCRE 201 GSLAKEKTQT LHKFILLFAV FDEGKSWHSE TKNSLMQDRD AASARAWPKM 251 HTVNGYVNRS LPGLIGCHRK SVYWHVIGMG TTPEVHSIFL EGHTFLVRNH 301 RQASLEISPI TFLTAQTLLM DLGQFLLFCH ISSHQHDGME AYVKVDSCPE 351 EPQLRMKNNE EAEDYDDDLT DSEMDVVRFD DDNSPSFIQI RSVAKKHPKT 401 WVHYIAAEEE DWDYAPLVLA PDDRSYKSQY LNNGPQRIGR KYKKVRFMAY 451 TDETFKTREA IQHESGILGP LLYGEVGDTL LIIFKNQASR PYNIYPHGIT 501 DVRPLYSRRL PKGVKHLKDF PILPGEIFKY KWTVTVEDGP TKSDPRCLTR 551 YYSSFVNMER DLASGLIGPL LICYKESVDQ RGNQIMSDKR NVILFSVFDE 601 NRSWYLTENI QRFLPNPAGV QLEDPEFQAS NIMHSINGYV FDSLQLSVCL 651 HEVAYWYILS IGAQTDFLSV FFSGYTFKHK MVYEDTLTLF PFSGETVFMS 701 MENPGLWILG CHNSDFRNRG MTALLKVSSC DKNTGDYYED SYEDISAYLL 751 SKNNAIEPRS FSQNGAPGTS ESATPESGPG SEPATSGSET PGTSESATPE 801 SGPGSEPATS GSETPGTSES ATPESGPGTS TEPSEGSAPG SPAGSPTSTE 851 EGTSESATPE SGPGSEPATS GSETPGTSES ATPESGPGSP AGSPTSTEEG 901 SPAGSPTSTE EGTSTEPSEG SAPGTSESAT PESGPGTSES ATPESGPGTS 951 ESATPESGPG SEPATSGSET PGSEPATSGS ETPGSPAGSP TSTEEGTSTE 1001 PSEGSAPGTS TEPSEGSAPG SEPATSGSET PGTSESATPE SGPGTSTEPS 1051 EGSAPASSPP VLKRHQAEIT RTTLQSDQEE IDYDDTISVE MKKEDFDIYD 1101 EDENQSPRSF QKKTRHYFIA AVERLWDYGM SSSPHVLRNR AQSGSVPQFK 1151 KVVFQEFTDG SFTQPLYRGE LNEHLGLLGP YIRAEVEDNI MVTFRNQASR 1201 PYSFYSSLIS YEEDQRQGAE PRKNFVKPNE TKTYFWKVQH HMAPTKDEFD 1251 CKAWAYFSDV DLEKDVHSGL IGPLLVCHTN TLNPAHGRQV TVQEFALFFT 1301 IFDETKSWYF TENMERNCRG APTSESATPE SGPGSEPATS GSETPGTSES 1351 ATPESGPGSE PATSGSETPG TSESATPESG PGTSTEPSEG SAPGTSESAT 1401 PESGPGSPAG SPTSTEEGSP AGSPTSTEEG SPAGSPTSTE EGTSESATPE 1451 SGPGTSTEPS EGSAPGASSA PCNIQMEDPT FKENYRFHAI NGYIMDTLPG 1501 LVMAQDQRIR WYLLSMGSNE NIHSIHFSGH VFTVRKKEEY KMALYNLYPG 1551 VFETVEMLPS KAGIWRVECL IGEHLHAGMS TLFLVYSNKC QTPLGMASGH 1601 IRDFQITASG QYGQWAPKLA RLHYSGSINA WSTKEPFSWI KVDLLAPMII 1651 HGIKTQGARQ KFSSLYISQF IIMYSLDGKK WQTYRGNSTG TLMVFFGNVD 1701 SSGIKHNIFN PPIIARYIRL HPTHYSIRST LRMELMGCDL NSCSMPLGME 1751 SKAISDAQIT ASSYFTNMFA TWSPSKARLH LQGRSNAWRP QVNNPKEWLQ 1801 VDFQKTMKVT GVTTQGVKSL LTSMYVKEFL ISSSQDGHQW TLFFQNGKVK 1851 VFQGNQDSFT PVVNSLDPPL LTRYLRIHPQ SWVHQIALRM EVLGCEAQDL 1901 YDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE 1951 DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY 2001 KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSRDELT KNQVSLTCLV 2051 KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ 2101 GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK* Sequênci a de proteína FVIII 204 (cadeia única FVIIIFc com dois AE XTENs, um 288AE XTEN no domínio B e um AE 144 XTEN no aminoácido 403) (SEQ ID N°: 78) 1 MQIELSTCFF LCLLRFCFSA TRRYYLGAVE LSWDYMQSDL GELPVDARFP 51 PRVPKSFPFN TSVVYKKTLF VEFTDHLFNI AKPRPPWMGL LGPTIQAEVY 101 DTVVITLKNM ASHPVSLHAV GVSYWKASEG AEYDDQTSQR EKEDDKVFPG 151 GSHTYVWQVL KENGPMASDP LCLTYSYLSH VDLVKDLNSG LIGALLVCRE 201 GSLAKEKTQT LHKFILLFAV FDEGKSWHSE TKNSLMQDRD AASARAWPKM 251 HTVNGYVNRS LPGLIGCHRK SVYWHVIGMG TTPEVHSIFL EGHTFLVRNH 301 RQASLEISPI TFLTAQTLLM DLGQFLLFCH ISSHQHDGME AYVKVDSCPE 351 EPQLRMKNNE EAEDYDDDLT DSEMDVVRFD DDNSPSFIQI RSVAKKHPKT 401 WVHYIAAEEE DWDYAPLVLA PDGAPTSTEP SEGSAPGSPA GSPTSTEEGT 451 STEPSEGSAP GTSTEPSEGS APGTSESATP ESGPGTSTEP SEGSAPGTSE 501 SATPESGPGS EPATSGSETP GTSTEPSEGS APGTSTEPSE GSAPGTSESA 551 TPESGPGTSE SATPESGPGA SSDRSYKSQY LNNGPQRIGR KYKKVRFMAY 601 TDETFKTREA IQHESGILGP LLYGEVGDTL LIIFKNQASR PYNIYPHGIT 651 DVRPLYSRRL PKGVKHLKDF PILPGEIFKY KWTVTVEDGP TKSDPRCLTR 701 YYSSFVNMER DLASGLIGPL LICYKESVDQ RGNQIMSDKR NVILFSVFDE 751 NRSWYLTENI QRFLPNPAGV QLEDPEFQAS NIMHSINGYV FDSLQLSVCL 801 HEVAYWYILS IGAQTDFLSV FFSGYTFKHK MVYEDTLTLF PFSGETVFMS 851 MENPGLWILG CHNSDFRNRG MTALLKVSSC DKNTGDYYED SYEDISAYLL 901 SKNNAIEPRS FSQNGAPGTS ESATPESGPG SEPATSGSET PGTSESATPE 951 SGPGSEPATS GSETPGTSES ATPESGPGTS TEPSEGSAPG SPAGSPTSTE 1001 EGTSESATPE SGPGSEPATS GSETPGTSES ATPESGPGSP AGSPTSTEEG 1051 SPAGSPTSTE EGTSTEPSEG SAPGTSESAT PESGPGTSES ATPESGPGTS 1101 ESATPESGPG SEPATSGSET PGSEPATSGS ETPGSPAGSP TSTEEGTSTE 1151 PSEGSAPGTS TEPSEGSAPG SEPATSGSET PGTSESATPE SGPGTSTEPS 1201 EGSAPASSPP VLKRHQAEIT RTTLQSDQEE IDYDDTISVE MKKEDFDIYD 1251 EDENQSPRSF QKKTRHYFIA AVERLWDYGM SSSPHVLRNR AQSGSVPQFK 1301 KVVFQEFTDG SFTQPLYRGE LNEHLGLLGP YIRAEVEDNI MVTFRNQASR 1351 PYSFYSSLIS YEEDQRQGAE PRKNFVKPNE TKTYFWKVQH HMAPTKDEFD 1401 CKAWAYFSDV DLEKDVHSGL IGPLLVCHTN TLNPAHGRQV TVQEFALFFT 1451 IFDETKSWYF TENMERNCRA PCNIQMEDPT FKENYRFHAI NGYIMDTLPG 1501 LVMAQDQRIR WYLLSMGSNE NIHSIHFSGH VFTVRKKEEY KMALYNLYPG 1551 VFETVEMLPS KAGIWRVECL IGEHLHAGMS TLFLVYSNKC QTPLGMASGH 1601 IRDFQITASG QYGQWAPKLA RLHYSGSINA WSTKEPFSWI KVDLLAPMII 1651 HGIKTQGARQ KFSSLYISQF IIMYSLDGKK WQTYRGNSTG TLMVFFGNVD 1701 SSGIKHNIFN PPIIARYIRL HPTHYSIRST LRMELMGCDL NSCSMPLGME 1751 SKAISDAQIT ASSYFTNMFA TWSPSKARLH LQGRSNAWRP QVNNPKEWLQ 1801 VDFQKTMKVT GVTTQGVKSL LTSMYVKEFL ISSSQDGHQW TLFFQNGKVK 1851 VFQGNQDSFT PVVNSLDPPL LTRYLRIHPQ SWVHQIALRM EVLGCEAQDL 1901 YDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE 1951 DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY 2001 KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSRDELT KNQVSLTCLV 2051 KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ 2101 GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK* Sequência de proteína FVIII 205 (de cadeia simples com duas FVIIIFc AE XTENs; um 288AE XTEN no domínio B e um 144 AE XTEN no aminoácido 18) (SEQ ID N°: 79) 1 MQIELSTCFF LCLLRFCFSA TRRYYLGAVE LSWDYMQGAP TSESATPESG 51 PGSEPATSGS ETPGTSESAT PESGPGSEPA TSGSETPGTS ESATPESGPG 101 TSTEPSEGSA PGSPAGSPTS TEEGTSESAT PESGPGSEPA TSGSETPGTS 151 ESATPESGPG SPAGSPTSTE EGSPAGSPTS TEEGASSSDL GELPVDARFP 201 PRVPKSFPFN TSVVYKKTLF VEFTDHLFNI AKPRPPWMGL LGPTIQAEVY 251 DTVVITLKNM ASHPVSLHAV GVSYWKASEG AEYDDQTSQR EKEDDKVFPG 301 GSHTYVWQVL KENGPMASDP LCLTYSYLSH VDLVKDLNSG LIGALLVCRE 351 GSLAKEKTQT LHKFILLFAV FDEGKSWHSE TKNSLMQDRD AASARAWPKM 401 HTVNGYVNRS LPGLIGCHRK SVYWHVIGMG TTPEVHSIFL EGHTFLVRNH 451 RQASLEISPI TFLTAQTLLM DLGQFLLFCH ISSHQHDGME AYVKVDSCPE 501 EPQLRMKNNE EAEDYDDDLT DSEMDVVRFD DDNSPSFIQI RSVAKKHPKT 551 WVHYIAAEEE DWDYAPLVLA PDDRSYKSQY LNNGPQRIGR KYKKVRFMAY 601 TDETFKTREA IQHESGILGP LLYGEVGDTL LIIFKNQASR PYNIYPHGIT 651 DVRPLYSRRL PKGVKHLKDF PILPGEIFKY KWTVTVEDGP TKSDPRCLTR 701 YYSSFVNMER DLASGLIGPL LICYKESVDQ RGNQIMSDKR NVILFSVFDE 751 NRSWYLTENI QRFLPNPAGV QLEDPEFQAS NIMHSINGYV FDSLQLSVCL 801 HEVAYWYILS IGAQTDFLSV FFSGYTFKHK MVYEDTLTLF PFSGETVFMS 851 MENPGLWILG CHNSDFRNRG MTALLKVSSC DKNTGDYYED SYEDISAYLL 901 SKNNAIEPRS FSQNGAPGTS ESATPESGPG SEPATSGSET PGTSESATPE 951 SGPGSEPATS GSETPGTSES ATPESGPGTS TEPSEGSAPG SPAGSPTSTE 1001 EGTSESATPE SGPGSEPATS GSETPGTSES ATPESGPGSP AGSPTSTEEG 1051 SPAGSPTSTE EGTSTEPSEG SAPGTSESAT PESGPGTSES ATPESGPGTS 1101 ESATPESGPG SEPATSGSET PGSEPATSGS ETPGSPAGSP TSTEEGTSTE 1151 PSEGSAPGTS TEPSEGSAPG SEPATSGSET PGTSESATPE SGPGTSTEPS 1201 EGSAPASSPP VLKRHQAEIT RTTLQSDQEE IDYDDTISVE MKKEDFDIYD 1251 EDENQSPRSF QKKTRHYFIA AVERLWDYGM SSSPHVLRNR AQSGSVPQFK 1301 KVVFQEFTDG SFTQPLYRGE LNEHLGLLGP YIRAEVEDNI MVTFRNQASR 1351 PYSFYSSLIS YEEDQRQGAE PRKNFVKPNE TKTYFWKVQH HMAPTKDEFD 1401 CKAWAYFSDV DLEKDVHSGL IGPLLVCHTN TLNPAHGRQV TVQEFALFFT 1451 IFDETKSWYF TENMERNCRA PCNIQMEDPT FKENYRFHAI NGYIMDTLPG 1501 LVMAQDQRIR WYLLSMGSNE NIHSIHFSGH VFTVRKKEEY KMALYNLYPG 1551 VFETVEMLPS KAGIWRVECL IGEHLHAGMS TLFLVYSNKC QTPLGMASGH 1601 IRDFQITASG QYGQWAPKLA RLHYSGSINA WSTKEPFSWI KVDLLAPMII 1651 HGIKTQGARQ KFSSLYISQF IIMYSLDGKK WQTYRGNSTG TLMVFFGNVD 1701 SSGIKHNIFN PPIIARYIRL HPTHYSIRST LRMELMGCDL NSCSMPLGME 1751 SKAISDAQIT ASSYFTNMFA TWSPSKARLH LQGRSNAWRP QVNNPKEWLQ 1801 VDFQKTMKVT GVTTQGVKSL LTSMYVKEFL ISSSQDGHQW TLFFQNGKVK 1851 VFQGNQDSFT PVVNSLDPPL LTRYLRIHPQ SWVHQIALRM EVLGCEAQDL 1901 YDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE 1951 DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY 2001 KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSRDELT KNQVSLTCLV 2051 KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ 2101 GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK* Sequência de proteína pSYN FVIII 266 (FVIII Fc com 42 AE-XTEN no aminoácido 18 e 288 AE XTEN no domínio B) SEQ ID N°: 80) 1 MQIELSTCFF LCLLRFCFSA TRRYYLGAVE LSWDYMQGAP GSPAGSPTST 51 EEGTSESATP ESGPGSEPAT SGSETPASSS DLGELPVDAR FPPRVPKSFP 101 FNTSVVYKKT LFVEFTDHLF NIAKPRPPWM GLLGPTIQAE VYDTVVITLK 151 NMASHPVSLH AVGVSYWKAS EGAEYDDQTS QREKEDDKVF PGGSHTYVWQ 201 VLKENGPMAS DPLCLTYSYL SHVDLVKDLN SGLIGALLVC REGSLAKEKT 251 QTLHKFILLF AVFDEGKSWH SETKNSLMQD RDAASARAWP KMHTVNGYVN 301 RSLPGLIGCH RKSVYWHVIG MGTTPEVHSI FLEGHTFLVR NHRQASLEIS 351 PITFLTAQTL LMDLGQFLLF CHISSHQHDG MEAYVKVDSC PEEPQLRMKN 401 NEEAEDYDDD LTDSEMDVVR FDDDNSPSFI QIRSVAKKHP KTWVHYIAAE 451 EEDWDYAPLV LAPDDRSYKS QYLNNGPQRI GRKYKKVRFM AYTDETFKTR 501 EAIQHESGIL GPLLYGEVGD TLLIIFKNQA SRPYNIYPHG ITDVRPLYSR 551 RLPKGVKHLK DFPILPGEIF KYKWTVTVED GPTKSDPRCL TRYYSSFVNM 601 ERDLASGLIG PLLICYKESV DQRGNQIMSD KRNVILFSVF DENRSWYLTE 651 NIQRFLPNPA GVQLEDPEFQ ASNIMHSING YVFDSLQLSV CLHEVAYWYI 701 LSIGAQTDFL SVFFSGYTFK HKMVYEDTLT LFPFSGETVF MSMENPGLWI 751 LGCHNSDFRN RGMTALLKVS SCDKNTGDYY EDSYEDISAY LLSKNNAIEP 801 RSFSQNGAPG TSESATPESG PGSEPATSGS ETPGTSESAT PESGPGSEPA 851 TSGSETPGTS ESATPESGPG TSTEPSEGSA PGSPAGSPTS TEEGTSESAT 901 PESGPGSEPA TSGSETPGTS ESATPESGPG SPAGSPTSTE EGSPAGSPTS 951 TEEGTSTEPS EGSAPGTSES ATPESGPGTS ESATPESGPG TSESATPESG 1001 PGSEPATSGS ETPGSEPATS GSETPGSPAG SPTSTEEGTS TEPSEGSAPG 1051 TSTEPSEGSA PGSEPATSGS ETPGTSESAT PESGPGTSTE PSEGSAPASS 1101 PPVLKRHQAE ITRTTLQSDQ EEIDYDDTIS VEMKKEDFDI YDEDENQSPR 1151 SFQKKTRHYF IAAVERLWDY GMSSSPHVLR NRAQSGSVPQ FKKVVFQEFT 1201 DGSFTQPLYR GELNEHLGLL GPYIRAEVED NIMVTFRNQA SRPYSFYSSL 1251 ISYEEDQRQG AEPRKNFVKP NETKTYFWKV QHHMAPTKDE FDCKAWAYFS 1301 DVDLEKDVHS GLIGPLLVCH TNTLNPAHGR QVTVQEFALF FTIFDETKSW 1351 YFTENMERNC RAPCNIQMED PTFKENYRFH AINGYIMDTL PGLVMAQDQR 1401 IRWYLLSMGS NENIHSIHFS GHVFTVRKKE EYKMALYNLY PGVFETVEML 1451 PSKAGIWRVE CLIGEHLHAG MSTLFLVYSN KCQTPLGMAS GHIRDFQITA 1501 SGQYGQWAPK LARLHYSGSI NAWSTKEPFS WIKVDLLAPM IIHGIKTQGA 1551 RQKFSSLYIS QFIIMYSLDG KKWQTYRGNS TGTLMVFFGN VDSSGIKHNI 1601 FNPPIIARYI RLHPTHYSIR STLRMELMGC DLNSCSMPLG MESKAISDAQ 1651 ITASSYFTNM FATWSPSKAR LHLQGRSNAW RPQVNNPKEW LQVDFQKTMK 1701 VTGVTTQGVK SLLTSMYVKE FLISSSQDGH QWTLFFQNGK VKVFQGNQDS 1751 FTPVVNSLDP PLLTRYLRIH PQSWVHQIAL RMEVLGCEAQ DLYDKTHTCP 1801 PCPAPELLGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW 1851 YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA 1901 LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSRDE LTKNQVSLTC LVKGFYPSDI 1951 AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV 2001 MHEALHNHYT QKSLSLSPGK * Sequência de proteína pSYN FVIII 267 (FVIII Fc com 72 AE-XTEN no 18 e 288 AE XTEN no domínio B) SEQ ID N°: 81) 1 MQIELSTCFF LCLLRFCFSA TRRYYLGAVE LSWDYMQGAP TSESATPESG 51 PGSEPATSGS ETPGTSESAT PESGPGSEPA TSGSETPGTS ESATPESGPG 101 TSTEPSEGSA PGASSSDLGE LPVDARFPPR VPKSFPFNTS VVYKKTLFVE 151 FTDHLFNIAK PRPPWMGLLG PTIQAEVYDT VVITLKNMAS HPVSLHAVGV 201 SYWKASEGAE YDDQTSQREK EDDKVFPGGS HTYVWQVLKE NGPMASDPLC 251 LTYSYLSHVD LVKDLNSGLI GALLVCREGS LAKEKTQTLH KFILLFAVFD 301 EGKSWHSETK NSLMQDRDAA SARAWPKMHT VNGYVNRSLP GLIGCHRKSV 351 YWHVIGMGTT PEVHSIFLEG HTFLVRNHRQ ASLEISPITF LTAQTLLMDL 401 GQFLLFCHIS SHQHDGMEAY VKVDSCPEEP QLRMKNNEEA EDYDDDLTDS 451 EMDVVRFDDD NSPSFIQIRS VAKKHPKTWV HYIAAEEEDW DYAPLVLAPD 501 DRSYKSQYLN NGPQRIGRKY KKVRFMAYTD ETFKTREAIQ HESGILGPLL 551 YGEVGDTLLI IFKNQASRPY NIYPHGITDV RPLYSRRLPK GVKHLKDFPI 601 LPGEIFKYKW TVTVEDGPTK SDPRCLTRYY SSFVNMERDL ASGLIGPLLI 651 CYKESVDQRG NQIMSDKRNV ILFSVFDENR SWYLTENIQR FLPNPAGVQL 701 EDPEFQASNI MHSINGYVFD SLQLSVCLHE VAYWYILSIG AQTDFLSVFF 751 SGYTFKHKMV YEDTLTLFPF SGETVFMSME NPGLWILGCH NSDFRNRGMT 801 ALLKVSSCDK NTGDYYEDSY EDISAYLLSK NNAIEPRSFS QNGAPGTSES 851 ATPESGPGSE PATSGSETPG TSESATPESG PGSEPATSGS ETPGTSESAT 901 PESGPGTSTE PSEGSAPGSP AGSPTSTEEG TSESATPESG PGSEPATSGS 951 ETPGTSESAT PESGPGSPAG SPTSTEEGSP AGSPTSTEEG TSTEPSEGSA 1001 PGTSESATPE SGPGTSESAT PESGPGTSES ATPESGPGSE PATSGSETPG 1051 SEPATSGSET PGSPAGSPTS TEEGTSTEPS EGSAPGTSTE PSEGSAPGSE 1101 PATSGSETPG TSESATPESG PGTSTEPSEG SAPASSPPVL KRHQAEITRT 1151 TLQSDQEEID YDDTISVEMK KEDFDIYDED ENQSPRSFQK KTRHYFIAAV 1201 ERLWDYGMSS SPHVLRNRAQ SGSVPQFKKV VFQEFTDGSF TQPLYRGELN 1251 EHLGLLGPYI RAEVEDNIMV TFRNQASRPY SFYSSLISYE EDQRQGAEPR 1301 KNFVKPNETK TYFWKVQHHM APTKDEFDCK AWAYFSDVDL EKDVHSGLIG 1351 PLLVCHTNTL NPAHGRQVTV QEFALFFTIF DETKSWYFTE NMERNCRAPC 1401 NIQMEDPTFK ENYRFHAING YIMDTLPGLV MAQDQRIRWY LLSMGSNENI 1451 HSIHFSGHVF TVRKKEEYKM ALYNLYPGVF ETVEMLPSKA GIWRVECLIG 1501 EHLHAGMSTL FLVYSNKCQT PLGMASGHIR DFQITASGQY GQWAPKLARL 1551 HYSGSINAWS TKEPFSWIKV DLLAPMIIHG IKTQGARQKF SSLYISQFII 1601 MYSLDGKKWQ TYRGNSTGTL MVFFGNVDSS GIKHNIFNPP IIARYIRLHP 1651 THYSIRSTLR MELMGCDLNS CSMPLGMESK AISDAQITAS SYFTNMFATW 1701 SPSKARLHLQ GRSNAWRPQV NNPKEWLQVD FQKTMKVTGV TTQGVKSLLT 1751 SMYVKEFLIS SSQDGHQWTL FFQNGKVKVF QGNQDSFTPV VNSLDPPLLT 1801 RYLRIHPQSW VHQIALRMEV LGCEAQDLYD KTHTCPPCPA PELLGGPSVF 1851 LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP EVKFNWYVDG VEVHNAKTKP 1901 REEQYNSTYR VVSVLTVLHQ DWLNGKEYKC KVSNKALPAP IEKTISKAKG 1951 QPREPQVYTL PPSRDELTKN QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY 2001 KTTPPVLDSD GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL 2051 SLSPGK* Sequência de proteína pSYN FVIII 268 (FVIII Fc com 144 AE-XTEN no aminoácido 18) SEQ ID N°: 82) 1 MQIELSTCFF LCLLRFCFSA TRRYYLGAVE LSWDYMQGAP TSESATPESG 51 PGSEPATSGS ETPGTSESAT PESGPGSEPA TSGSETPGTS ESATPESGPG 101 TSTEPSEGSA PGSPAGSPTS TEEGTSESAT PESGPGSEPA TSGSETPGTS 151 ESATPESGPG SPAGSPTSTE EGSPAGSPTS TEEGASSSDL GELPVDARFP 201 PRVPKSFPFN TSVVYKKTLF VEFTDHLFNI AKPRPPWMGL LGPTIQAEVY 251 DTVVITLKNM ASHPVSLHAV GVSYWKASEG AEYDDQTSQR EKEDDKVFPG 301 GSHTYVWQVL KENGPMASDP LCLTYSYLSH VDLVKDLNSG LIGALLVCRE 351 GSLAKEKTQT LHKFILLFAV FDEGKSWHSE TKNSLMQDRD AASARAWPKM 401 HTVNGYVNRS LPGLIGCHRK SVYWHVIGMG TTPEVHSIFL EGHTFLVRNH 451 RQASLEISPI TFLTAQTLLM DLGQFLLFCH ISSHQHDGME AYVKVDSCPE 501 EPQLRMKNNE EAEDYDDDLT DSEMDVVRFD DDNSPSFIQI RSVAKKHPKT 551 WVHYIAAEEE DWDYAPLVLA PDDRSYKSQY LNNGPQRIGR KYKKVRFMAY 601 TDETFKTREA IQHESGILGP LLYGEVGDTL LIIFKNQASR PYNIYPHGIT 651 DVRPLYSRRL PKGVKHLKDF PILPGEIFKY KWTVTVEDGP TKSDPRCLTR 701 YYSSFVNMER DLASGLIGPL LICYKESVDQ RGNQIMSDKR NVILFSVFDE 751 NRSWYLTENI QRFLPNPAGV QLEDPEFQAS NIMHSINGYV FDSLQLSVCL 801 HEVAYWYILS IGAQTDFLSV FFSGYTFKHK MVYEDTLTLF PFSGETVFMS 851 MENPGLWILG CHNSDFRNRG MTALLKVSSC DKNTGDYYED SYEDISAYLL 901 SKNNAIEPRS FSQNPPVLKR HQAEITRTTL QSDQEEIDYD DTISVEMKKE 951 DFDIYDEDEN QSPRSFQKKT RHYFIAAVER LWDYGMSSSP HVLRNRAQSG 1001 SVPQFKKVVF QEFTDGSFTQ PLYRGELNEH LGLLGPYIRA EVEDNIMVTF 1051 RNQASRPYSF YSSLISYEED QRQGAEPRKN FVKPNETKTY FWKVQHHMAP 1101 TKDEFDCKAW AYFSDVDLEK DVHSGLIGPL LVCHTNTLNP AHGRQVTVQE 1151 FALFFTIFDE TKSWYFTENM ERNCRAPCNI QMEDPTFKEN YRFHAINGYI 1201 MDTLPGLVMA QDQRIRWYLL SMGSNENIHS IHFSGHVFTV RKKEEYKMAL 1251 YNLYPGVFET VEMLPSKAGI WRVECLIGEH LHAGMSTLFL VYSNKCQTPL 1301 GMASGHIRDF QITASGQYGQ WAPKLARLHY SGSINAWSTK EPFSWIKVDL 1351 LAPMIIHGIK TQGARQKFSS LYISQFIIMY SLDGKKWQTY RGNSTGTLMV 1401 FFGNVDSSGI KHNIFNPPII ARYIRLHPTH YSIRSTLRME LMGCDLNSCS 1451 MPLGMESKAI SDAQITASSY FTNMFATWSP SKARLHLQGR SNAWRPQVNN 1501 PKEWLQVDFQ KTMKVTGVTT QGVKSLLTSM YVKEFLISSS QDGHQWTLFF 1551 QNGKVKVFQG NQDSFTPVVN SLDPPLLTRY LRIHPQSWVH QIALRMEVLG 1601 CEAQDLYDKT HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV 1651 VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW 1701 LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SRDELTKNQV 1751 SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD 1801 KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK* Sequência de proteína pSYN FVIII 269 (FVIII Fc com 72 AE-XTEN no aminoácido 18) SEQ ID N°: 83) 1 MQIELSTCFF LCLLRFCFSA TRRYYLGAVE LSWDYMQGAP TSESATPESG 51 PGSEPATSGS ETPGTSESAT PESGPGSEPA TSGSETPGTS ESATPESGPG 101 TSTEPSEGSA PGASSSDLGE LPVDARFPPR VPKSFPFNTS VVYKKTLFVE 151 FTDHLFNIAK PRPPWMGLLG PTIQAEVYDT VVITLKNMAS HPVSLHAVGV 201 SYWKASEGAE YDDQTSQREK EDDKVFPGGS HTYVWQVLKE NGPMASDPLC 251 LTYSYLSHVD LVKDLNSGLI GALLVCREGS LAKEKTQTLH KFILLFAVFD 301 EGKSWHSETK NSLMQDRDAA SARAWPKMHT VNGYVNRSLP GLIGCHRKSV 351 YWHVIGMGTT PEVHSIFLEG HTFLVRNHRQ ASLEISPITF LTAQTLLMDL 401 GQFLLFCHIS SHQHDGMEAY VKVDSCPEEP QLRMKNNEEA EDYDDDLTDS 451 EMDVVRFDDD NSPSFIQIRS VAKKHPKTWV HYIAAEEEDW DYAPLVLAPD 501 DRSYKSQYLN NGPQRIGRKY KKVRFMAYTD ETFKTREAIQ HESGILGPLL 551 YGEVGDTLLI IFKNQASRPY NIYPHGITDV RPLYSRRLPK GVKHLKDFPI 601 LPGEIFKYKW TVTVEDGPTK SDPRCLTRYY SSFVNMERDL ASGLIGPLLI 651 CYKESVDQRG NQIMSDKRNV ILFSVFDENR SWYLTENIQR FLPNPAGVQL 701 EDPEFQASNI MHSINGYVFD SLQLSVCLHE VAYWYILSIG AQTDFLSVFF 751 SGYTFKHKMV YEDTLTLFPF SGETVFMSME NPGLWILGCH NSDFRNRGMT 801 ALLKVSSCDK NTGDYYEDSY EDISAYLLSK NNAIEPRSFS QNPPVLKRHQ 851 AEITRTTLQS DQEEIDYDDT ISVEMKKEDF DIYDEDENQS PRSFQKKTRH 901 YFIAAVERLW DYGMSSSPHV LRNRAQSGSV PQFKKVVFQE FTDGSFTQPL 951 YRGELNEHLG LLGPYIRAEV EDNIMVTFRN QASRPYSFYS SLISYEEDQR 1001 QGAEPRKNFV KPNETKTYFW KVQHHMAPTK DEFDCKAWAY FSDVDLEKDV 1051 HSGLIGPLLV CHTNTLNPAH GRQVTVQEFA LFFTIFDETK SWYFTENMER 1101 NCRAPCNIQM EDPTFKENYR FHAINGYIMD TLPGLVMAQD QRIRWYLLSM 1151 GSNENIHSIH FSGHVFTVRK KEEYKMALYN LYPGVFETVE MLPSKAGIWR 1201 VECLIGEHLH AGMSTLFLVY SNKCQTPLGM ASGHIRDFQI TASGQYGQWA 1251 PKLARLHYSG SINAWSTKEP FSWIKVDLLA PMIIHGIKTQ GARQKFSSLY 1301 ISQFIIMYSL DGKKWQTYRG NSTGTLMVFF GNVDSSGIKH NIFNPPIIAR 1351 YIRLHPTHYS IRSTLRMELM GCDLNSCSMP LGMESKAISD AQITASSYFT 1401 NMFATWSPSK ARLHLQGRSN AWRPQVNNPK EWLQVDFQKT MKVTGVTTQG 1451 VKSLLTSMYV KEFLISSSQD GHQWTLFFQN GKVKVFQGNQ DSFTPVVNSL 1501 DPPLLTRYLR IHPQSWVHQI ALRMEVLGCE AQDLYDKTHT CPPCPAPELL 1551 GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH 1601 NAKTKPREEQ YNSTYRVVSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT 1651 ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG 1701 QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH 1751 YTQKSLSLSP GK* Sequência de proteína pSYNFVIII 271 (FVIII Fc com 42 AE-XTEN no 18) SEQ ID N°: 84) 1 MQIELSTCFF LCLLRFCFSA TRRYYLGAVE LSWDYMQGAP GSPAGSPTST 51 EEGTSESATP ESGPGSEPAT SGSETPASSS DLGELPVDAR FPPRVPKSFP 101 FNTSVVYKKT LFVEFTDHLF NIAKPRPPWM GLLGPTIQAE VYDTVVITLK 151 NMASHPVSLH AVGVSYWKAS EGAEYDDQTS QREKEDDKVF PGGSHTYVWQ 201 VLKENGPMAS DPLCLTYSYL SHVDLVKDLN SGLIGALLVC REGSLAKEKT 251 QTLHKFILLF AVFDEGKSWH SETKNSLMQD RDAASARAWP KMHTVNGYVN 301 RSLPGLIGCH RKSVYWHVIG MGTTPEVHSI FLEGHTFLVR NHRQASLEIS 351 PITFLTAQTL LMDLGQFLLF CHISSHQHDG MEAYVKVDSC PEEPQLRMKN 401 NEEAEDYDDD LTDSEMDVVR FDDDNSPSFI QIRSVAKKHP KTWVHYIAAE 451 EEDWDYAPLV LAPDDRSYKS QYLNNGPQRI GRKYKKVRFM AYTDETFKTR 501 EAIQHESGIL GPLLYGEVGD TLLIIFKNQA SRPYNIYPHG ITDVRPLYSR 551 RLPKGVKHLK DFPILPGEIF KYKWTVTVED GPTKSDPRCL TRYYSSFVNM 601 ERDLASGLIG PLLICYKESV DQRGNQIMSD KRNVILFSVF DENRSWYLTE 651 NIQRFLPNPA GVQLEDPEFQ ASNIMHSING YVFDSLQLSV CLHEVAYWYI 701 LSIGAQTDFL SVFFSGYTFK HKMVYEDTLT LFPFSGETVF MSMENPGLWI 751 LGCHNSDFRN RGMTALLKVS SCDKNTGDYY EDSYEDISAY LLSKNNAIEP 801 RSFSQNPPVL KRHQAEITRT TLQSDQEEID YDDTISVEMK KEDFDIYDED 851 ENQSPRSFQK KTRHYFIAAV ERLWDYGMSS SPHVLRNRAQ SGSVPQFKKV 901 VFQEFTDGSF TQPLYRGELN EHLGLLGPYI RAEVEDNIMV TFRNQASRPY 951 SFYSSLISYE EDQRQGAEPR KNFVKPNETK TYFWKVQHHM APTKDEFDCK 1001 AWAYFSDVDL EKDVHSGLIG PLLVCHTNTL NPAHGRQVTV QEFALFFTIF 1051 DETKSWYFTE NMERNCRAPC NIQMEDPTFK ENYRFHAING YIMDTLPGLV 1101 MAQDQRIRWY LLSMGSNENI HSIHFSGHVF TVRKKEEYKM ALYNLYPGVF 1151 ETVEMLPSKA GIWRVECLIG EHLHAGMSTL FLVYSNKCQT PLGMASGHIR 1201 DFQITASGQY GQWAPKLARL HYSGSINAWS TKEPFSWIKV DLLAPMIIHG 1251 IKTQGARQKF SSLYISQFII MYSLDGKKWQ TYRGNSTGTL MVFFGNVDSS 1301 GIKHNIFNPP IIARYIRLHP THYSIRSTLR MELMGCDLNS CSMPLGMESK 1351 AISDAQITAS SYFTNMFATW SPSKARLHLQ GRSNAWRPQV NNPKEWLQVD 1401 FQKTMKVTGV TTQGVKSLLT SMYVKEFLIS SSQDGHQWTL FFQNGKVKVF 1451 QGNQDSFTPV VNSLDPPLLT RYLRIHPQSW VHQIALRMEV LGCEAQDLYD 1501 KTHTCPPCPA PELLGGPSVF LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP 1551 EVKFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQYNSTYR VVSVLTVLHQ DWLNGKEYKC 1601 KVSNKALPAP IEKTISKAKG QPREPQVYTL PPSRDELTKN QVSLTCLVKG 1651 FYPSDIAVEW ESNGQPENNY KTTPPVLDSD GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN 1701 VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL SLSPGK* Sequência da proteína FVIII pSYN 272 (FVIII com 144 AE XTEN no aminoácido 18 e 244 AE XTEN no domínio B- sem Fc) SEQ ID N°: 85) 1 MQIELSTCFF LCLLRFCFSA TRRYYLGAVE LSWDYMQGAP TSESATPESG 51 PGSEPATSGS ETPGTSESAT PESGPGSEPA TSGSETPGTS ESATPESGPG 101 TSTEPSEGSA PGSPAGSPTS TEEGTSESAT PESGPGSEPA TSGSETPGTS 151 ESATPESGPG SPAGSPTSTE EGSPAGSPTS TEEGASSSDL GELPVDARFP 201 PRVPKSFPFN TSVVYKKTLF VEFTDHLFNI AKPRPPWMGL LGPTIQAEVY 251 DTVVITLKNM ASHPVSLHAV GVSYWKASEG AEYDDQTSQR EKEDDKVFPG 301 GSHTYVWQVL KENGPMASDP LCLTYSYLSH VDLVKDLNSG LIGALLVCRE 351 GSLAKEKTQT LHKFILLFAV FDEGKSWHSE TKNSLMQDRD AASARAWPKM 401 HTVNGYVNRS LPGLIGCHRK SVYWHVIGMG TTPEVHSIFL EGHTFLVRNH 451 RQASLEISPI TFLTAQTLLM DLGQFLLFCH ISSHQHDGME AYVKVDSCPE 501 EPQLRMKNNE EAEDYDDDLT DSEMDVVRFD DDNSPSFIQI RSVAKKHPKT 551 WVHYIAAEEE DWDYAPLVLA PDDRSYKSQY LNNGPQRIGR KYKKVRFMAY 601 TDETFKTREA IQHESGILGP LLYGEVGDTL LIIFKNQASR PYNIYPHGIT 651 DVRPLYSRRL PKGVKHLKDF PILPGEIFKY KWTVTVEDGP TKSDPRCLTR 701 YYSSFVNMER DLASGLIGPL LICYKESVDQ RGNQIMSDKR NVILFSVFDE 751 NRSWYLTENI QRFLPNPAGV QLEDPEFQAS NIMHSINGYV FDSLQLSVCL 801 HEVAYWYILS IGAQTDFLSV FFSGYTFKHK MVYEDTLTLF PFSGETVFMS 851 MENPGLWILG CHNSDFRNRG MTALLKVSSC DKNTGDYYED SYEDISAYLL 901 SKNNAIEPRS FSQNGAPGTS ESATPESGPG SEPATSGSET PGTSESATPE 951 SGPGSEPATS GSETPGTSES ATPESGPGTS TEPSEGSAPG SPAGSPTSTE 1001 EGTSESATPE SGPGSEPATS GSETPGTSES ATPESGPGSP AGSPTSTEEG 1051 SPAGSPTSTE EGTSTEPSEG SAPGTSESAT PESGPGTSES ATPESGPGTS 1101 ESATPESGPG SEPATSGSET PGSEPATSGS ETPGSPAGSP TSTEEGTSTE 1151 PSEGSAPGTS TEPSEGSAPG SEPATSGSET PGTSESATPE SGPGTSTEPS 1201 EGSAPASSPP VLKRHQAEIT RTTLQSDQEE IDYDDTISVE MKKEDFDIYD 1251 EDENQSPRSF QKKTRHYFIA AVERLWDYGM SSSPHVLRNR AQSGSVPQFK 1301 KVVFQEFTDG SFTQPLYRGE LNEHLGLLGP YIRAEVEDNI MVTFRNQASR 1351 PYSFYSSLIS YEEDQRQGAE PRKNFVKPNE TKTYFWKVQH HMAPTKDEFD 1401 CKAWAYFSDV DLEKDVHSGL IGPLLVCHTN TLNPAHGRQV TVQEFALFFT 1451 IFDETKSWYF TENMERNCRA PCNIQMEDPT FKENYRFHAI NGYIMDTLPG 1501 LVMAQDQRIR WYLLSMGSNE NIHSIHFSGH VFTVRKKEEY KMALYNLYPG 1551 VFETVEMLPS KAGIWRVECL IGEHLHAGMS TLFLVYSNKC QTPLGMASGH 1601 IRDFQITASG QYGQWAPKLA RLHYSGSINA WSTKEPFSWI KVDLLAPMII 1651 HGIKTQGARQ KFSSLYISQF IIMYSLDGKK WQTYRGNSTG TLMVFFGNVD 1701 SSGIKHNIFN PPIIARYIRL HPTHYSIRST LRMELMGCDL NSCSMPLGME 1751 SKAISDAQIT ASSYFTNMFA TWSPSKARLH LQGRSNAWRP QVNNPKEWLQ 1801 VDFQKTMKVT GVTTQGVKSL LTSMYVKEFL ISSSQDGHQW TLFFQNGKVK 1851 VFQGNQDSFT PVVNSLDPPL LTRYLRIHPQ SWVHQIALRM EVLGCEAQDL 1901 Y* Sequência proteica pSYN-FVIII-161 (SEQ ID N°: 69) (Posição de sequência de aminoácido de FVIII 1-1457 região sublinhada representa região Fc; sublinhado curvilíneo representa ligante clivável entre fragmento VWF e primeiro Fc; duplo sublinhado região representa o fragmento VWF; região em negrito repre-senta ligante clivável entre fragmento VWF e Fc). 1MQIELSTCFF LCLLRFCFSA TRRYYLGAVE LSWDYMQSDL GELPVDARFP 51 PRVPKSFPFN TSVVYKKTLF VEFTDHLFNI AKPRPPWMGL LGPTIQAEVY 101 DTVVITLKNM ASHPVSLHAV GVSYWKASEG AEYDDQTSQR EKEDDKVFPG 151 GSHTYVWQVL KENGPMASDP LCLTYSYLSH VDLVKDLNSG LIGALLVCRE 201 GSLAKEKTQT LHKFILLFAV FDEGKSWHSE TKNSLMQDRD AASARAWPKM 251 HTVNGYVNRS LPGLIGCHRK SVYWHVIGMG TTPEVHSIFL EGHTFLVRNH 301 RQASLEISPI TFLTAQTLLM DLGQFLLFCH ISSHQHDGME AYVKVDSCPE 351 EPQLRMKNNE EAEDYDDDLT DSEMDVVRFD DDNSPSFIQI RSVAKKHPKT 401 WVHYIAAEEE DWDYAPLVLA PDDRSYKSQY LNNGPQRIGR KYKKVRFMAY 451 TDETFKTREA IQHESGILGP LLYGEVGDTL LIIFKNQASR PYNIYPHGIT 501 DVRPLYSRRL PKGVKHLKDF PILPGEIFKY KWTVTVEDGP TKSDPRCLTR 551 YYSSFVNMER DLASGLIGPL LICYKESVDQ RGNQIMSDKR NVILFSVFDE 601 NRSWYLTENI QRFLPNPAGV QLEDPEFQAS NIMHSINGYV FDSLQLSVCL 651 HEVAYWYILS IGAQTDFLSV FFSGYTFKHK MVYEDTLTLF PFSGETVFMS 701 MENPGLWILG CHNSDFRNRG MTALLKVSSC DKNTGDYYED SYEDISAYLL 751 SKNNAIEPRS FSQNPPVLKR HQREITRTTL QSDQEEIDYD DTISVEMKKE 801 DFDIYDEDEN QSPRSFQKKT RHYFIAAVER LWDYGMSSSP HVLRNRAQSG 851 SVPQFKKVVF QEFTDGSFTQ PLYRGELNEH LGLLGPYIRA EVEDNIMVTF 901 RNQASRPYSF YSSLISYEED QRQGAEPRKN FVKPNETKTY FWKVQHHMAP 951 TKDEFDCKAW AYFSDVDLEK DVHSGLIGPL LVCHTNTLNP AHGRQVTVQE 1001 FALFFTIFDE TKSWYFTENM ERNCRAPCNI QMEDPTFKEN YRFHAINGYI 1051 MDTLPGLVMA QDQRIRWYLL SMGSNENIHS IHFSGHVFTV RKKEEYKMAL 1101 YNLYPGVFET VEMLPSKAGI WRVECLIGEH LHAGMSTLFL VYSNKCQTPL 1151 GMASGHIRDF QITASGQYGQ WAPKLARLHY SGSINAWSTK EPFSWIKVDL 1201 LAPMIIHGIK TQGARQKFSS LYISQFIIMY SLDGKKWQTY RGNSTGTLMV 1251 FFGNVDSSGI KHNIFNPPII ARYIRLHPTH YSIRSTLRME LMGCDLNSCS 1301 MPLGMESKAI SDAQITASSY FTNMFATWSP SKARLHLQGR SNAWRPQVNN 1351 PKEWLQVDFQ KTMKVTGVTT QGVKSLLTSM YVKEFLISSS QDGHQWTLFF 1401 QNGKVKVFQG NQDSFTPVVN SLDPPLLTRY LRIHPQSWVH QIALRMEVLG 1451 CEAQDLYDKT HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV 1501 VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW 1551 LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SRDELTKNQV 1601 SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD 1651 KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGKRRRRSG GGGSGGGGSG 1701 GGGSGGGGSG GGGSGGGGSR KRRKRSLSCR PPMVKLVCPA DNLRAEGLEC 1751 TKTCQNYDLE CMSMGCVSGC LCPPGMVRHE NRCVALERCP CFHQGKEYAP 1801 GETVKIGCNT CVCRDRKWNC TDHVCDATCS TIGMAHYLTF DGLKYLFPGE 1851 CQYVLVQDYC GSNPGTFRIL VGNKGCSHPS VKCKKRVTIL VEGGEIELFD 1901 GEVNVKRPMK DETHFEVVES GRYIILLLGK ALSVVWDRHL SISVVLKQTY 1951 QEKVCGLCGN FDGIQNNDLT SSNLQVEEDP VDFGNSWKVS SQCADTRKVP 2001 LDSSPATCHN NIMKQTMVDS SCRILTSDVF QDCNKLVDPE PYLDVCIYDT 2051 CSCESIGDCA AFCDTIAAYA HVCAQHGKVV TWRTATLCPQ SCEERNLREN 2101 GYEAEWRYNS CAPACQVTCQ HPEPLACPVQ CVEGCHAHCP PGKILDELLQ 2151 TCVDPEDCPV CEVAGRRFAS GKKVTLNPSD PEHCQICHCD VVNLTCEACQ 2201 EPISGTSESA TPESGPGSEP ATSGSETPGT SESATPESGP GSEPATSGSE 2251 TPGTSESATP ESGPGTSTEP SEGSAPGSPA GSPTSTEEGT SESATPESGP 2301 GSEPATSGSE TPGTSESATP ESGPGSPAGS PTSTEEGSPA GSPTSTEEGT 2351 STEPSEGSAP GTSESATPES GPGTSESATP ESGPGTSESA TPESGPGSEP 2401 ATSGSETPGS EPATSGSETP GSPAGSPTST EEGTSTEPSE GSAPGTSTEP 2451 SEGSAPGSEP ATSGSETPGT SESATPESGP GTSTEPSEGS APDSGGGGSG 2501 GGGSGGGGSG GGGSGGGGSL VPRGSGGDKT HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF 2551 PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV ' VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE ' VHNAKTKPRE 2601 EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP 2651 REPQVYTLPP SRDELTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT 2701 TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL 2751 SPGK Sequênci La proteica pSYN-FVIII- 170 (SEQ ID N°: 71) 1 SLSCRPPMVK LVCPADNLRA EGLECTKTCQ NYDLECMSMG CVSGCLCPPG 51 MVRHENRCVA LERCPCFHQG KEYAPGETVK IGCNTCVCRD RKWNCTDHVC 101 DATCSTIGMA HYLTFDGLKY LFPGECQYVL VQDYCGSNPG TFRILVGNKG 151 CSHPSVKCKK RVTILVEGGE IELFDGEVNV KRPMKDETHF EVVESGRYII 201 LLLGKALSVV WDRHLSISVV LKQTYQEKVC GLCGNFDGIQ NNDLTSSNLQ 251 VEEDPVDFGN SWKVSSQCAD TRKVPLDSSP ATCHNNIMKQ TMVDSSCRIL 301 TSDVFQDCNK LVDPEPYLDV CIYDTCSCES IGDCAAFCDT IAAYAHVCAQ 351 HGKVVTWRTA TLCPQSCEER NLRENGYEAE WRYNSCAPAC QVTCQHPEPL 401 ACPVQCVEGC HAHCPPGKIL DELLQTCVDP EDCPVCEVAG RRFASGKKVT 451 LNPSDPEHCQ ICHCDVVNLT CEACQEPISG TSESATPESG PGSEPATSGS 501 ETPGTSESAT PESGPGSEPA TSGSETPGTS ESATPESGPG TSTEPSEGSA 551 PGSPAGSPTS TEEGTSESAT PESGPGSEPA TSGSETPGTS ESATPESGPG 601 SPAGSPTSTE EGSPAGSPTS TEEGTSTEPS EGSAPGTSES ATPESGPGTS 651 ESATPESGPG TSESATPESG PGSEPATSGS ETPGSEPATS GSETPGSPAG 701 SPTSTEEGTS TEPSEGSAPG TSTEPSEGSA PGSEPATSGS ETPGTSESAT 751 PESGPGTSTE PSEGSAPDSG GGGSGGGGSG GGGSGGGGSG GGGSLVPRGS 801 GGASATRRYY LGAVELSWDY MQSDLGELPV DARFPPRVPK SFPFNTSVVY 851 KKTLFVEFTD HLFNIAKPRP PWMGLLGPTI QAEVYDTVVI TLKNMASHPV 901 SLHAVGVSYW KASEGAEYDD QTSQREKEDD KVFPGGSHTY VWQVLKENGP 951 MASDPLCLTY SYLSHVDLVK DLNSGLIGAL LVCREGSLAK EKTQTLHKFI 1001 LLFAVFDEGK SWHSETKNSL MQDRDAASAR AWPKMHTVNG YVNRSLPGLI 1051 GCHRKSVYWH VIGMGTTPEV HSIFLEGHTF LVRNHRQASL EISPITFLTA 1101 QTLLMDLGQF LLFCHISSHQ HDGMEAYVKV DSCPEEPQLR MKNNEEAEDY 1151 DDDLTDSEMD VVRFDDDNSP SFIQIRSVAK KHPKTWVHYI AAEEEDWDYA 1201 PLVLAPDDRS YKSQYLNNGP QRIGRKYKKV RFMAYTDETF KTREAIQHES 1251 GILGPLLYGE VGDTLLIIFK NQASRPYNIY PHGITDVRPL YSRRLPKGVK 1301 HLKDFPILPG EIFKYKWTVT VEDGPTKSDP RCLTRYYSSF VNMERDLASG 1351 LIGPLLICYK ESVDQRGNQI MSDKRNVILF SVFDENRSWY LTENIQRFLP 1401 NPAGVQLEDP EFQASNIMHS INGYVFDSLQ LSVCLHEVAY WYILSIGAQT 1451 DFLSVFFSGY TFKHKMVYED TLTLFPFSGE TVFMSMENPG LWILGCHNSD 1501 FRNRGMTALL KVSSCDKNTG DYYEDSYEDI SAYLLSKNNA IEPRSFSQNP 1551 PVLKRHQREI TRTTLQSDQE EIDYDDTISV EMKKEDFDIY DEDENQSPRS 1601 FQKKTRHYFI AAVERLWDYG MSSSPHVLRN RAQSGSVPQF KKVVFQEFTD 1651 GSFTQPLYRG ELNEHLGLLG PYIRAEVEDN IMVTFRNQAS RPYSFYSSLI 1701 SYEEDQRQGA EPRKNFVKPN ETKTYFWKVQ HHMAPTKDEF DCKAWAYFSD 1751 VDLEKDVHSG LIGPLLVCHT NTLNPAHGRQ VTVQEFALFF TIFDETKSWY 1801 FTENMERNCR APCNIQMEDP TFKENYRFHA INGYIMDTLP GLVMAQDQRI 1851 RWYLLSMGSN ENIHSIHFSG HVFTVRKKEE YKMALYNLYP GVFETVEMLP 1901 SKAGIWRVEC LIGEHLHAGM STLFLVYSNK CQTPLGMASG HIRDFQITAS 1951 GQYGQWAPKL ARLHYSGSIN AWSTKEPFSW IKVDLLAPMI IHGIKTQGAR 2001 QKFSSLYISQ FIIMYSLDGK KWQTYRGNST GTLMVFFGNV DSSGIKHNIF 2051 NPPIIARYIR LHPTHYSIRS TLRMELMGCD LNSCSMPLGM ESKAISDAQI 2101 TASSYFTNMF ATWSPSKARL HLQGRSNAWR PQVNNPKEWL QVDFQKTMKV 2151 TGVTTQGVKS LLTSMYVKEF LISSSQDGHQ WTLFFQNGKV KVFQGNQDSF 2201 TPVVNSLDPP LLTRYLRIHP QSWVHQIALR MEVLGCEAQD LY Sequência de nucleotídeos pSYN FVIII 310 (que codificam FVIII com eliminação completa domínio B exceto resíduos de 2 ácidos aminados e 288 AE-XTEN inserido após aa 742) (SEQ II N N°: 170) 1 ATGCAAATAG AGCTCTCCAC CTGCTTCTTT CTGTGCCTTT TGCGATTCTG 51 CTTTAGTGCC ACCAGAAGAT ACTACCTGGG TGCAGTGGAA CTGTCATGGG 101 ACTATATGCA AAGTGATCTC GGTGAGCTGC CTGTGGACGC AAGATTTCCT 151 CCTAGAGTGC CAAAATCTTT TCCATTCAAC ACCTCAGTCG TGTACAAAAA 201 GACTCTGTTT GTAGAATTCA CGGATCACCT TTTCAACATC GCTAAGCCAA 251 GGCCACCCTG GATGGGTCTG CTAGGTCCTA CCATCCAGGC TGAGGTTTAT 301 GATACAGTGG TCATTACACT TAAGAACATG GCTTCCCATC CTGTCAGTCT 351 TCATGCTGTT GGTGTATCCT ACTGGAAAGC TTCTGAGGGA GCTGAATATG 401 ATGATCAGAC CAGTCAAAGG GAGAAAGAAG ATGATAAAGT CTTCCCTGGT 451 GGAAGCCATA CATATGTCTG GCAGGTCCTG AAAGAGAATG GTCCAATGGC 501 CTCTGACCCA CTGTGCCTTA CCTACTCATA TCTTTCTCAT GTGGACCTGG 551 TAAAAGACTT GAATTCAGGC CTCATTGGAG CCCTACTAGT ATGTAGAGAA 601 GGGAGTCTGG CCAAGGAAAA 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versão B5) (SEQ ID N°: 172) 1 ATGCAAATAG AGCTCTCCAC CTGCTTCTTT CTGTGCCTTT TGCGATTCTG 51 CTTTAGTGCC ACCAGAAGAT ACTACCTGGG TGCAGTGGAA CTGTCATGGG 101 ACTATATGCA AAGTGATCTC GGTGAGCTGC CTGTGGACGC AAGATTTCCT 151 CCTAGAGTGC CAAAATCTTT TCCATTCAAC ACCTCAGTCG TGTACAAAAA 201 GACTCTGTTT GTAGAATTCA CGGATCACCT TTTCAACATC GCTAAGCCAA 251 GGCCACCCTG GATGGGTCTG CTAGGTCCTA CCATCCAGGC TGAGGTTTAT 301 GATACAGTGG TCATTACACT TAAGAACATG GCTTCCCATC CTGTCAGTCT 351 TCATGCTGTT GGTGTATCCT ACTGGAAAGC TTCTGAGGGA GCTGAATATG 401 ATGATCAGAC CAGTCAAAGG GAGAAAGAAG ATGATAAAGT CTTCCCTGGT 451 GGAAGCCATA CATATGTCTG GCAGGTCCTG AAAGAGAATG GTCCAATGGC 501 CTCTGACCCA CTGTGCCTTA CCTACTCATA TCTTTCTCAT GTGGACCTGG 551 TAAAAGACTT GAATTCAGGC CTCATTGGAG CCCTACTAGT ATGTAGAGAA 601 GGGAGTCTGG CCAAGGAAAA GACACAGACC TTGCACAAAT TTATACTACT 651 TTTTGCTGTA TTTGATGAAG GGAAAAGTTG GCACTCAGAA ACAAAGAACT 701 CCTTGATGCA GGATAGGGAT GCTGCATCTG CTCGGGCCTG GCCTAAAATG 751 CACACAGTCA ATGGTTATGT AAACAGGTCT CTGCCAGGTC TGATTGGATG 801 CCACAGGAAA TCAGTCTATT 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TGCAGCCCAG TGTGCCCTGC TGGTATGGAG 901 TATAGGCAGT GTGTGTCCCC TTGCGCCAGG ACCTGCCAGA GCCTGCACAT 951 CAATGAAATG TGTCAGGAGC GATGCGTGGA TGGCTGCAGC TGCCCTGAGG 1001 GACAGCTCCT GGATGAAGGC CTCTGCGTGG AGAGCACCGA GTGTCCCTGC 1051 GTGCATTCCG GAAAGCGCTA CCCTCCCGGC ACCTCCCTCT CTCGAGACTG 1101 CAACACCTGC ATTTGCCGAA ACAGCCAGTG GATCTGCAGC AATGAAGAAT 1151 GTCCAGGGGA GTGCCTTGTC ACTGGTCAAT CCCACTTCAA GAGCTTTGAC 1201 AACAGATACT TCACCTTCAG TGGGATCTGC CAGTACCTGC TGGCCCGGGA 1251 TTGCCAGGAC CACTCCTTCT CCATTGTCAT TGAGACTGTC CAGTGTGCTG 1301 ATGACCGCGA CGCTGTGTGC ACCCGCTCCG TCACCGTCCG GCTGCCTGGC 1351 CTGCACAACA GCCTTGTGAA ACTGAAGCAT GGGGCAGGAG TTGCCATGGA 1401 TGGCCAGGAC ATCCAGCTCC CCCTCCTGAA AGGTGACCTC CGCATCCAGC 1451 ATACAGTGAC GGCCTCCGTG CGCCTCAGCT ACGGGGAGGA CCTGCAGATG 1501 GACTGGGATG GCCGCGGGAG GCTGCTGGTG AAGCTGTCCC CCGTCTATGC 1551 CGGGAAGACC TGCGGCCTGT GTGGGAATTA CAATGGCAAC CAGGGCGACG 1601 ACTTCCTTAC CCCCTCTGGG CTGGCGGAGC CCCGGGTGGA GGACTTCGGG 1651 AACGCCTGGA AGCTGCACGG GGACTGCCAG GACCTGCAGA AGCAGCACAG 1701 CGATCCCTGC GCCCTCAACC CGCGCATGAC CAGGTTCTCC GAGGAGGCGT 1751 GCGCGGTCCT GACGTCCCCC ACATTCGAGG CCTGCCATCG TGCCGTCAGC 1801 CCGCTGCCCT ACCTGCGGAA CTGCCGCTAC GACGTGTGCT CCTGCTCGGA 1851 CGGCCGCGAG TGCCTGTGCG GCGCCCTGGC CAGCTATGCC GCGGCCTGCG 1901 CGGGGAGAGG CGTGCGCGTC GCGTGGCGCG AGCCAGGCCG CTGTGAGCTG 1951 AACTGCCCGA AAGGCCAGGT GTACCTGCAG TGCGGGACCC CCTGCAACCT 2001 GACCTGCCGC TCTCTCTCTT ACCCGGATGA GGAATGCAAT GAGGCCTGCC 2051 TGGAGGGCTG CTTCTGCCCC CCAGGGCTCT ACATGGATGA GAGGGGGGAC 2101 TGCGTGCCCA AGGCCCAGTG CCCCTGTTAC TATGACGGTG AGATCTTCCA 2151 GCCAGAAGAC ATCTTCTCAG ACCATCACAC CATGTGCTAC TGTGAGGATG 2201 GCTTCATGCA CTGTACCATG AGTGGAGTCC CCGGAAGCTT GCTGCCTGAC 2251 GCTGTCCTCA GCAGTCCCCT GTCTCATCGC AGCAAAAGGA GCCTATCCTG 2301 TCGGCCCCCC ATGGTCAAGC TGGTGTGTCC CGCTGACAAC CTGCGGGCTG 2351 AAGGGCTCGA GTGTACCAAA ACGTGCCAGA ACTATGACCT GGAGTGCATG 2401 AGCATGGGCT GTGTCTCTGG CTGCCTCTGC CCCCCGGGCA TGGTCCGGCA 2451 TGAGAACAGA TGTGTGGCCC TGGAAAGGTG TCCCTGCTTC CATCAGGGCA 2501 AGGAGTATGC CCCTGGAGAA ACAGTGAAGA TTGGCTGCAA CACTTGTGTC 2551 TGTCGGGACC GGAAGTGGAA CTGCACAGAC CATGTGTGTG ATGCCACGTG 2601 CTCCACGATC GGCATGGCCC ACTACCTCAC CTTCGACGGG CTCAAATACC 2651 TGTTCCCCGG GGAGTGCCAG TACGTTCTGG TGCAGGATTA CTGCGGCAGT 2701 AACCCTGGGA CCTTTCGGAT CCTAGTGGGG AATAAGGGAT GCAGCCACCC 2751 CTCAGTGAAA TGCAAGAAAC GGGTCACCAT CCTGGTGGAG GGAGGAGAGA 2801 TTGAGCTGTT TGACGGGGAG GTGAATGTGA AGAGGCCCAT GAAGGATGAG 2851 ACTCACTTTG AGGTGGTGGA GTCTGGCCGG TACATCATTC TGCTGCTGGG 2901 CAAAGCCCTC TCCGTGGTCT GGGACCGCCA CCTGAGCATC TCCGTGGTCC 2951 TGAAGCAGAC ATACCAGGAG AAAGTGTGTG GCCTGTGTGG GAATTTTGAT 3001 GGCATCCAGA ACAATGACCT CACCAGCAGC AACCTCCAAG TGGAGGAAGA 3051 CCCTGTGGAC TTTGGGAACT CCTGGAAAGT GAGCTCGCAG TGTGCTGACA 3101 CCAGAAAAGT GCCTCTGGAC TCATCCCCTG CCACCTGCCA TAACAACATC 3151 ATGAAGCAGA CGATGGTGGA TTCCTCCTGT AGAATCCTTA CCAGTGACGT 3201 CTTCCAGGAC TGCAACAAGC TGGTGGACCC CGAGCCATAT CTGGATGTCT 3251 GCATTTACGA CACCTGCTCC TGTGAGTCCA TTGGGGACTG CGCCGCATTC 3301 TGCGACACCA TTGCTGCCTA TGCCCACGTG TGTGCCCAGC ATGGCAAGGT 3351 GGTGACCTGG AGGACGGCCA CATTGTGCCC CCAGAGCTGC GAGGAGAGGA 3401 ATCTCCGGGA GAACGGGTAT GAGGCTGAGT GGCGCTATAA CAGCTGTGCA 3451 CCTGCCTGTC AAGTCACGTG TCAGCACCCT GAGCCACTGG CCTGCCCTGT 3501 GCAGTGTGTG GAGGGCTGCC ATGCCCACTG CCCTCCAGGG AAAATCCTGG 3551 ATGAGCTTTT GCAGACCTGC GTTGACCCTG AAGACTGTCC AGTGTGTGAG 3601 GTGGCTGGCC GGCGTTTTGC CTCAGGAAAG AAAGTCACCT TGAATCCCAG 3651 TGACCCTGAG CACTGCCAGA TTTGCCACTG TGATGTTGTC AACCTCACCT 3701 GTGAAGCCTG CCAGGAGCCG ATATCGGGCG CGCCAACATC AGAGAGCGCC 3751 ACCCCTGAAA GTGGTCCCGG GAGCGAGCCA GCCACATCTG GGTCGGAAAC 3801 GCCAGGCACA AGTGAGTCTG CAACTCCCGA GTCCGGACCT GGCTCCGAGC 3851 CTGCCACTAG CGGCTCCGAG ACTCCGGGAA CTTCCGAGAG CGCTACACCA 3901 GAAAGCGGAC CCGGAACCAG TACCGAACCT AGCGAGGGCT CTGCTCCGGG 3951 CAGCCCAGCC GGCTCTCCTA CATCCACGGA GGAGGGCACT TCCGAATCCG 4001 CCACCCCGGA GTCAGGGCCA GGATCTGAAC CCGCTACCTC AGGCAGTGAG 4051 ACGCCAGGAA CGAGCGAGTC CGCTACACCG GAGAGTGGGC CAGGGAGCCC 4101 TGCTGGATCT CCTACGTCCA CTGAGGAAGG GTCACCAGCG GGCTCGCCCA 4151 CCAGCACTGA AGAAGGTGCC TCGAGCGACA AAACTCACAC ATGCCCACCG 4201 TGCCCAGCTC CAGAACTCCT GGGCGGACCG TCAGTCTTCC TCTTCCCCCC 4251 AAAACCCAAG GACACCCTCA TGATCTCCCG GACCCCTGAG GTCACATGCG 4301 TGGTGGTGGA CGTGAGCCAC GAAGACCCTG AGGTCAAGTT CAACTGGTAC 4351 GTGGACGGCG TGGAGGTGCA TAATGCCAAG ACAAAGCCGC GGGAGGAGCA 4401 GTACAACAGC ACGTACCGTG TGGTCAGCGT CCTCACCGTC CTGCACCAGG 4451 ACTGGCTGAA TGGCAAGGAG TACAAGTGCA AGGTCTCCAA CAAAGCCCTC 4501 CCAGCCCCCA TCGAGAAAAC CATCTCCAAA GCCAAAGGGC AGCCCCGAGA 4551 ACCACAGGTG TACACCCTGC CCCCATCCCG GGATGAGCTG ACCAAGAACC 4601 AGGTCAGCCT GACCTGCCTG GTCAAAGGCT TCTATCCCAG CGACATCGCC 4651 GTGGAGTGGG AGAGCAATGG GCAGCCGGAG AACAACTACA AGACCACGCC 4701 TCCCGTGTTG GACTCCGACG GCTCCTTCTT CCTCTACAGC AAGCTCACCG 4751 TGGACAAGAG CAGGTGGCAG CAGGGGAACG TCTTCTCATG CTCCGTGATG 4801 CATGAGGCTC TGCACAACCA CTACACGCAG AAGAGCCTCT CCCTGTCTCC 4851 GGGTAAATGA Sequência de proteína pSYN VWF062 (VWF D'D3-Fc sem local de trombina no ligante) (SEQ ID N°: 199) 1 MIPARFAGVL LALALILPGT LCAEGTRGRS STARCSLFGS DFVNTFDGSM 51 YSFAGYCSYL LAGGCQKRSF SIIGDFQNGK RVSLSVYLGE FFDIHLFVNG 101 TVTQGDQRVS MPYASKGLYL ETEAGYYKLS GEAYGFVARI DGSGNFQVLL 151 SDRYFNKTCG LCGNFNIFAE DDFMTQEGTL TSDPYDFANS WALSSGEQWC 201 ERASPPSSSC NISSGEMQKG LWEQCQLLKS TSVFARCHPL VDPEPFVALC 251 EKTLCECAGG LECACPALLE YARTCAQEGM VLYGWTDHSA CSPVCPAGME 301 YRQCVSPCAR TCQSLHINEM CQERCVDGCS CPEGQLLDEG LCVESTECPC 351 VHSGKRYPPG TSLSRDCNTC ICRNSQWICS NEECPGECLV TGQSHFKSFD 401 NRYFTFSGIC QYLLARDCQD HSFSIVIETV QCADDRDAVC TRSVTVRLPG 451 LHNSLVKLKH GAGVAMDGQD IQLPLLKGDL RIQHTVTASV RLSYGEDLQM 501 DWDGRGRLLV KLSPVYAGKT CGLCGNYNGN QGDDFLTPSG LAEPRVEDFG 551 NAWKLHGDCQ DLQKQHSDPC ALNPRMTRFS EEACAVLTSP TFEACHRAVS 601 PLPYLRNCRY DVCSCSDGRE CLCGALASYA AACAGRGVRV AWREPGRCEL 651 NCPKGQVYLQ CGTPCNLTCR SLSYPDEECN EACLEGCFCP PGLYMDERGD 701 CVPKAQCPCY YDGEIFQPED IFSDHHTMCY CEDGFMHCTM SGVPGSLLPD 751 AVLSSPLSHR SKRSLSCRPP MVKLVCPADN LRAEGLECTK TCQNYDLECM 801 SMGCVSGCLC PPGMVRHENR CVALERCPCF HQGKEYAPGE TVKIGCNTCV 851 CRDRKWNCTD HVCDATCSTI GMAHYLTFDG LKYLFPGECQ YVLVQDYCGS 901 NPGTFRILVG NKGCSHPSVK CKKRVTILVE GGEIELFDGE VNVKRPMKDE 951 THFEVVESGR YIILLLGKAL SVVWDRHLSI SVVLKQTYQE KVCGLCGNFD 1001 GIQNNDLTSS NLQVEEDPVD FGNSWKVSSQ CADTRKVPLD SSPATCHNNI 1051 MKQTMVDSSC RILTSDVFQD CNKLVDPEPY LDVCIYDTCS CESIGDCAAF 1101 CDTIAAYAHV CAQHGKVVTW RTATLCPQSC EERNLRENGY EAEWRYNSCA 1151 PACQVTCQHP EPLACPVQCV EGCHAHCPPG KILDELLQTC VDPEDCPVCE 1201 VAGRRFASGK KVTLNPSDPE HCQICHCDVV NLTCEACQEP ISGAPTSESA 1251 TPESGPGSEP ATSGSETPGT SESATPESGP GSEPATSGSE TPGTSESATP 1301 ESGPGTSTEP SEGSAPGSPA GSPTSTEEGT SESATPESGP GSEPATSGSE 1351 TPGTSESATP ESGPGSPAGS PTSTEEGSPA GSPTSTEEGA SSDKTHTCPP 1401 CPAPELLGGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY 1451 VDGVEVHNAK TKPREEQYNS TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL 1501 PAPIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPSRDEL TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA 1551 VEWESNGQPE NNYKTTPPVL DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM 1601 HEALHNHYTQ KSLSLSPGK* Sequência de nucleotídeos pSYN VWF073-(que codificam 144 VWFD1D2D'D3- AE XTEN- local de trombina a2 truncado FVIII) (SEQ ID N°: 174) 1 ATGATTCCTG CCAGATTTGC CGGGGTGCTG CTTGCTCTGG CCCTCATTTT 51 GCCAGGGACC CTTTGTGCAG AAGGAACTCG CGGCAGGTCA TCCACGGCCC 101 GATGCAGCCT TTTCGGAAGT GACTTCGTCA ACACCTTTGA TGGGAGCATG 151 TACAGCTTTG CGGGATACTG CAGTTACCTC CTGGCAGGGG GCTGCCAGAA 201 ACGCTCCTTC TCGATTATTG GGGACTTCCA GAATGGCAAG AGAGTGAGCC 251 TCTCCGTGTA TCTTGGGGAA TTTTTTGACA TCCATTTGTT TGTCAATGGT 301 ACCGTGACAC AGGGGGACCA AAGAGTCTCC ATGCCCTATG CCTCCAAAGG 351 GCTGTATCTA GAAACTGAGG CTGGGTACTA CAAGCTGTCC GGTGAGGCCT 401 ATGGCTTTGT GGCCAGGATC GATGGCAGCG GCAACTTTCA AGTCCTGCTG 451 TCAGACAGAT ACTTCAACAA GACCTGCGGG CTGTGTGGCA ACTTTAACAT 501 CTTTGCTGAA GATGACTTTA TGACCCAAGA AGGGACCTTG ACCTCGGACC 551 CTTATGACTT TGCCAACTCA TGGGCTCTGA GCAGTGGAGA ACAGTGGTGT 601 GAACGGGCAT CTCCTCCCAG CAGCTCATGC AACATCTCCT CTGGGGAAAT 651 GCAGAAGGGC CTGTGGGAGC AGTGCCAGCT TCTGAAGAGC ACCTCGGTGT 701 TTGCCCGCTG CCACCCTCTG GTGGACCCCG AGCCTTTTGT GGCCCTGTGT 751 GAGAAGACTT TGTGTGAGTG TGCTGGGGGG CTGGAGTGCG CCTGCCCTGC 801 CCTCCTGGAG TACGCCCGGA CCTGTGCCCA GGAGGGAATG GTGCTGTACG 851 GCTGGACCGA CCACAGCGCG TGCAGCCCAG TGTGCCCTGC TGGTATGGAG 901 TATAGGCAGT GTGTGTCCCC TTGCGCCAGG ACCTGCCAGA GCCTGCACAT 951 CAATGAAATG TGTCAGGAGC GATGCGTGGA TGGCTGCAGC TGCCCTGAGG 1001 GACAGCTCCT GGATGAAGGC CTCTGCGTGG AGAGCACCGA GTGTCCCTGC 1051 GTGCATTCCG GAAAGCGCTA CCCTCCCGGC ACCTCCCTCT CTCGAGACTG 1101 CAACACCTGC ATTTGCCGAA ACAGCCAGTG GATCTGCAGC AATGAAGAAT 1151 GTCCAGGGGA GTGCCTTGTC ACTGGTCAAT CCCACTTCAA GAGCTTTGAC 1201 AACAGATACT TCACCTTCAG TGGGATCTGC CAGTACCTGC TGGCCCGGGA 1251 TTGCCAGGAC CACTCCTTCT CCATTGTCAT TGAGACTGTC CAGTGTGCTG 1301 ATGACCGCGA CGCTGTGTGC ACCCGCTCCG TCACCGTCCG GCTGCCTGGC 1351 CTGCACAACA GCCTTGTGAA ACTGAAGCAT GGGGCAGGAG TTGCCATGGA 1401 TGGCCAGGAC ATCCAGCTCC CCCTCCTGAA AGGTGACCTC CGCATCCAGC 1451 ATACAGTGAC GGCCTCCGTG CGCCTCAGCT ACGGGGAGGA CCTGCAGATG 1501 GACTGGGATG GCCGCGGGAG GCTGCTGGTG AAGCTGTCCC CCGTCTATGC 1551 CGGGAAGACC TGCGGCCTGT GTGGGAATTA CAATGGCAAC CAGGGCGACG 1601 ACTTCCTTAC CCCCTCTGGG CTGGCGGAGC CCCGGGTGGA GGACTTCGGG 1651 AACGCCTGGA AGCTGCACGG GGACTGCCAG GACCTGCAGA AGCAGCACAG 1701 CGATCCCTGC GCCCTCAACC CGCGCATGAC CAGGTTCTCC GAGGAGGCGT 1751 GCGCGGTCCT GACGTCCCCC ACATTCGAGG CCTGCCATCG TGCCGTCAGC 1801 CCGCTGCCCT ACCTGCGGAA CTGCCGCTAC GACGTGTGCT CCTGCTCGGA 1851 CGGCCGCGAG TGCCTGTGCG GCGCCCTGGC CAGCTATGCC GCGGCCTGCG 1901 CGGGGAGAGG CGTGCGCGTC GCGTGGCGCG AGCCAGGCCG CTGTGAGCTG 1951 AACTGCCCGA AAGGCCAGGT GTACCTGCAG TGCGGGACCC CCTGCAACCT 2001 GACCTGCCGC TCTCTCTCTT ACCCGGATGA GGAATGCAAT GAGGCCTGCC 2051 TGGAGGGCTG CTTCTGCCCC CCAGGGCTCT ACATGGATGA GAGGGGGGAC 2101 TGCGTGCCCA AGGCCCAGTG CCCCTGTTAC TATGACGGTG AGATCTTCCA 2151 GCCAGAAGAC ATCTTCTCAG ACCATCACAC CATGTGCTAC TGTGAGGATG 2201 GCTTCATGCA CTGTACCATG AGTGGAGTCC CCGGAAGCTT GCTGCCTGAC 2251 GCTGTCCTCA GCAGTCCCCT GTCTCATCGC AGCAAAAGGA GCCTATCCTG 2301 TCGGCCCCCC ATGGTCAAGC TGGTGTGTCC CGCTGACAAC CTGCGGGCTG 2351 AAGGGCTCGA GTGTACCAAA ACGTGCCAGA ACTATGACCT GGAGTGCATG 2401 AGCATGGGCT GTGTCTCTGG CTGCCTCTGC CCCCCGGGCA TGGTCCGGCA 2451 TGAGAACAGA TGTGTGGCCC TGGAAAGGTG TCCCTGCTTC CATCAGGGCA 2501 AGGAGTATGC CCCTGGAGAA ACAGTGAAGA TTGGCTGCAA CACTTGTGTC 2551 TGTCGGGACC GGAAGTGGAA CTGCACAGAC CATGTGTGTG ATGCCACGTG 2601 CTCCACGATC GGCATGGCCC ACTACCTCAC CTTCGACGGG CTCAAATACC 2651 TGTTCCCCGG GGAGTGCCAG TACGTTCTGG TGCAGGATTA CTGCGGCAGT 2701 AACCCTGGGA CCTTTCGGAT CCTAGTGGGG AATAAGGGAT GCAGCCACCC 2751 CTCAGTGAAA TGCAAGAAAC GGGTCACCAT CCTGGTGGAG GGAGGAGAGA 2801 TTGAGCTGTT TGACGGGGAG GTGAATGTGA AGAGGCCCAT GAAGGATGAG 2851 ACTCACTTTG AGGTGGTGGA GTCTGGCCGG TACATCATTC TGCTGCTGGG 2901 CAAAGCCCTC TCCGTGGTCT GGGACCGCCA CCTGAGCATC TCCGTGGTCC 2951 TGAAGCAGAC ATACCAGGAG AAAGTGTGTG GCCTGTGTGG GAATTTTGAT 3001 GGCATCCAGA ACAATGACCT CACCAGCAGC AACCTCCAAG TGGAGGAAGA 3051 CCCTGTGGAC TTTGGGAACT CCTGGAAAGT GAGCTCGCAG TGTGCTGACA 3101 CCAGAAAAGT GCCTCTGGAC TCATCCCCTG CCACCTGCCA TAACAACATC 3151 ATGAAGCAGA CGATGGTGGA TTCCTCCTGT AGAATCCTTA CCAGTGACGT 3201 CTTCCAGGAC TGCAACAAGC TGGTGGACCC CGAGCCATAT CTGGATGTCT 3251 GCATTTACGA CACCTGCTCC TGTGAGTCCA TTGGGGACTG CGCCGCATTC 3301 TGCGACACCA TTGCTGCCTA TGCCCACGTG TGTGCCCAGC ATGGCAAGGT 3351 GGTGACCTGG AGGACGGCCA CATTGTGCCC CCAGAGCTGC GAGGAGAGGA 3401 ATCTCCGGGA GAACGGGTAT GAGGCTGAGT GGCGCTATAA CAGCTGTGCA 3451 CCTGCCTGTC AAGTCACGTG TCAGCACCCT GAGCCACTGG CCTGCCCTGT 3501 GCAGTGTGTG GAGGGCTGCC ATGCCCACTG CCCTCCAGGG AAAATCCTGG 3551 ATGAGCTTTT GCAGACCTGC GTTGACCCTG AAGACTGTCC AGTGTGTGAG 3601 GTGGCTGGCC GGCGTTTTGC CTCAGGAAAG AAAGTCACCT TGAATCCCAG 3651 TGACCCTGAG CACTGCCAGA TTTGCCACTG TGATGTTGTC AACCTCACCT 3701 GTGAAGCCTG CCAGGAGCCG GGCGCGCCAA CATCAGAGAG CGCCACCCCT 3751 GAAAGTGGTC CCGGGAGCGA GCCAGCCACA TCTGGGTCGG AAACGCCAGG 3801 CACAAGTGAG TCTGCAACTC CCGAGTCCGG ACCTGGCTCC GAGCCTGCCA 3851 CTAGCGGCTC CGAGACTCCG GGAACTTCCG AGAGCGCTAC ACCAGAAAGC 3901 GGACCCGGAA CCAGTACCGA ACCTAGCGAG GGCTCTGCTC CGGGCAGCCC 3951 AGCCGGCTCT CCTACATCCA CGGAGGAGGG CACTTCCGAA TCCGCCACCC 4001 CGGAGTCAGG GCCAGGATCT GAACCCGCTA CCTCAGGCAG TGAGACGCCA 4051 GGAACGAGCG AGTCCGCTAC ACCGGAGAGT GGGCCAGGGA GCCCTGCTGG 4101 ATCTCCTACG TCCACTGAGG AAGGGTCACC AGCGGGCTCG CCCACCAGCA 4151 CTGAAGAAGG TGCCTCGAGC GGCGGTGGAG GATCCGGTGG CGGGGGATCC 4201 GGTGGCGGGG GATCCGGTGG CGGGGGATCC GGTGGCGGGG GATCCGGTGG 4251 CGGGGGATCC ATTGAACCAA GAAGCTTCTC TGGCAGCGGA GGCGACAAAA 4301 CTCACACATG CCCACCGTGC CCAGCTCCAG AACTCCTGGG CGGACCGTCA 4351 GTCTTCCTCT TCCCCCCAAA ACCCAAGGAC ACCCTCATGA TCTCCCGGAC 4401 CCCTGAGGTC ACATGCGTGG TGGTGGACGT GAGCCACGAA GACCCTGAGG 4451 TCAAGTTCAA CTGGTACGTG GACGGCGTGG AGGTGCATAA TGCCAAGACA 4501 AAGCCGCGGG AGGAGCAGTA CAACAGCACG TACCGTGTGG TCAGCGTCCT 4551 CACCGTCCTG CACCAGGACT GGCTGAATGG CAAGGAGTAC AAGTGCAAGG 4601 TCTCCAACAA AGCCCTCCCA GCCCCCATCG AGAAAACCAT CTCCAAAGCC 4651 AAAGGGCAGC CCCGAGAACC ACAGGTGTAC ACCCTGCCCC CATCCCGGGA 4701 TGAGCTGACC AAGAACCAGG TCAGCCTGAC CTGCCTGGTC AAAGGCTTCT 4751 ATCCCAGCGA CATCGCCGTG GAGTGGGAGA GCAATGGGCA GCCGGAGAAC 4801 AACTACAAGA CCACGCCTCC CGTGTTGGAC TCCGACGGCT CCTTCTTCCT 4851 CTACAGCAAG CTCACCGTGG ACAAGAGCAG GTGGCAGCAG GGGAACGTCT 4901 TCTCATGCTC CGTGATGCAT GAGGCTCTGC ACAACCACTA CACGCAGAAG 4951 AGCCTCTCCC TGTCTCCGGG TAAATGA Sequência de proteína pSYN VWF073-(que codificam 144 VWFD1D2D'D3- AE XTEN- local de trombina a2 truncado) (SEQ ID N°: 175) 1 MIPARFAGVL LALALILPGT LCAEGTRGRS STARCSLFGS DFVNTFDGSM 51 YSFAGYCSYL LAGGCQKRSF SIIGDFQNGK RVSLSVYLGE FFDIHLFVNG 101 TVTQGDQRVS MPYASKGLYL ETEAGYYKLS GEAYGFVARI DGSGNFQVLL 151 SDRYFNKTCG LCGNFNIFAE DDFMTQEGTL TSDPYDFANS WALSSGEQWC 201 ERASPPSSSC NISSGEMQKG LWEQCQLLKS TSVFARCHPL VDPEPFVALC 251 EKTLCECAGG LECACPALLE YARTCAQEGM VLYGWTDHSA CSPVCPAGME 301 YRQCVSPCAR TCQSLHINEM CQERCVDGCS CPEGQLLDEG LCVESTECPC 351 VHSGKRYPPG TSLSRDCNTC ICRNSQWICS NEECPGECLV TGQSHFKSFD 401 NRYFTFSGIC QYLLARDCQD HSFSIVIETV QCADDRDAVC TRSVTVRLPG 451 LHNSLVKLKH GAGVAMDGQD IQLPLLKGDL RIQHTVTASV RLSYGEDLQM 501 DWDGRGRLLV KLSPVYAGKT CGLCGNYNGN QGDDFLTPSG LAEPRVEDFG 551 NAWKLHGDCQ DLQKQHSDPC ALNPRMTRFS EEACAVLTSP TFEACHRAVS 601 PLPYLRNCRY DVCSCSDGRE CLCGALASYA AACAGRGVRV AWREPGRCEL 651 NCPKGQVYLQ CGTPCNLTCR SLSYPDEECN EACLEGCFCP PGLYMDERGD 701 CVPKAQCPCY YDGEIFQPED IFSDHHTMCY CEDGFMHCTM SGVPGSLLPD 751 AVLSSPLSHR SKRSLSCRPP MVKLVCPADN LRAEGLECTK TCQNYDLECM 801 SMGCVSGCLC PPGMVRHENR CVALERCPCF HQGKEYAPGE TVKIGCNTCV 851 CRDRKWNCTD HVCDATCSTI GMAHYLTFDG LKYLFPGECQ YVLVQDYCGS 901 NPGTFRILVG NKGCSHPSVK CKKRVTILVE GGEIELFDGE VNVKRPMKDE 951 THFEVVESGR YIILLLGKAL SVVWDRHLSI SVVLKQTYQE KVCGLCGNFD 1001 GIQNNDLTSS NLQVEEDPVD FGNSWKVSSQ CADTRKVPLD SSPATCHNNI 1051 MKQTMVDSSC RILTSDVFQD CNKLVDPEPY LDVCIYDTCS CESIGDCAAF 1101 CDTIAAYAHV CAQHGKVVTW RTATLCPQSC EERNLRENGY EAEWRYNSCA 1151 PACQVTCQHP EPLACPVQCV EGCHAHCPPG KILDELLQTC VDPEDCPVCE 1201 VAGRRFASGK KVTLNPSDPE HCQICHCDVV NLTCEACQEP GAPTSESATP 1251 ESGPGSEPAT SGSETPGTSE SATPESGPGS EPATSGSETP GTSESATPES 1301 GPGTSTEPSE GSAPGSPAGS PTSTEEGTSE SATPESGPGS EPATSGSETP 1351 GTSESATPES GPGSPAGSPT STEEGSPAGS PTSTEEGASS GGGGSGGGGS 1401 GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS IEPRSFSGSG GDKTHTCPPC PAPELLGGPS 1451 VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT 1501 KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA 1551 KGQPREPQVY TLPPSRDELT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN 1601 NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK 1651 SLSLSPGK*

[000368] A descrição anterior das modalidades específicas dos dispo-sitivos e os métodos descritos com referência às Figuras irão revelar totalmente a natureza geral da invenção que os outros podem, através da aplicação do conhecimento de um versado na técnica, prontamente modificar e/ou adaptar para várias aplicações, como as modalidades es-pecíficas, sem experimentação indevida, sem se desviar do conceito geral da presente invenção. Portanto, tais adaptações e modificações são destinadas a estarem dentro do significado e alcance dos equiva-lentes das modalidades divulgadas, com base no ensinamento e orien-tação apresentados neste documento. Deve ser entendido que a frase-ologia ou a terminologia neste documento é para fins de descrição e não de limitação, tal que a terminologia ou fraseologia da presente especifi-cação deve ser interpretada pela pessoa versada na técnica à luz dos ensinamentos e orientação.

[000369] Outras modalidades da invenção serão evidentes para as pessoas versadas na técnica considerando a especificação e prática da invenção divulgada neste documento. Pretende-se que a especificação e os exemplos sejam considerados como exemplos apenas, com um verdadeiro escopo do espírito da invenção sendo indicado pelas seguin-tes reivindicações.

[000370] Todas as patentes e publicações citadas neste documento são incorporadas por referência neste documento na sua totalidade.

Claims

1. Uso de uma proteína quimérica, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de uma composição ou medicamento para o tratamento de uma doença ou condição hemorrágica em um indivíduo em necessidade do mesmo, em que a referida proteína quimérica compreende: (i) uma primeira cadeia polipeptídica que compreende, do N- terminal ao C-terminal da mesma: (a) uma proteína do Fator VIII ("FVIII") compreendendo uma porção N-terminal e uma porção C-terminal; em que a porção N-terminal da proteína FVIII compreende o domínio A1, o domínio A2 e um domínio B parcial do FVIII maduro de comprimento total (SEQ ID N°: 65); em que a porção N-terminal compreende a sequência de a- minoácidos dos resíduos 1 a 745 da SEQ ID N°: 65 e é fundida a uma primeira sequência XTEN inserida imediatamente a jusante do aminoá- cido 745 da SEQ ID N°: 65; e em que a primeira sequência XTEN compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID N°: 8; em que a porção C-terminal compreende o domínio A3, o domínio C1 e o domínio C2, de modo que a porção C-terminal compre-ende os resíduos 1690-2332 da SEQ ID N°: 65, e (b) uma primeira região Fc, e (ii) uma segunda cadeia polipeptídica que compreende, do N-terminal ao C-terminal da mesma: (a) uma proteína do Fator de von Willebrand ("VWF") que compreende um domínio D’ e um domínio D3 de VWF, em que a proteína VWF contém uma substituição de alanina nos resíduos correspondentes aos resíduos 1099 e 1142 da SEQ ID N°: 21; e (b) uma sequência XTEN intermediária compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 58, em que a segunda se-quência XTEN contém menos de 288 resíduos de aminoácidos, (c) um ligante clivável compreendendo uma região a2 de FVIII que compreende a sequência de aminoácidos de Glu720 a Arg740 correspondente à SEQ ID N°: 65, em que a região a2 é capaz de ser clivada pela trombina; e (d) uma segunda região Fc, em que a primeira cadeia polipeptídica está associada ao se-gundo polipeptídeo através da primeira região Fc e da segunda região Fc.

2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a segunda sequência XTEN liga a proteína VWF ao ligante clivável conforme mostrado na SEQ ID N°: 22.

3. Uso, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a primeira sequência XTEN é inserida na proteína FVIII conforme mostrado na SEQ ID N°: 2.

4. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a primeira região Fc está associada à segunda região Fc por uma ligação covalente.

5. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a primeira região Fc está associada à segunda região Fc por uma ligação dissulfeto.

6. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a primeira região Fc e a segunda região Fc são iguais.

7. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a primeira região Fc e a segunda região Fc são derivadas de IgG1 humana.

8. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o ligante clivável possui de 10 a 50 resíduos de aminoácidos.

9. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a proteína VWF consiste no domínio D' e no domínio D3.