KR20150039212A - 낮은 ｈｅｒ３ 발현을 기초로 한 ｈｅｒ 이량체화 억제제에 대한 반응 예측 - Google Patents

낮은 ｈｅｒ３ 발현을 기초로 한 ｈｅｒ 이량체화 억제제에 대한 반응 예측 Download PDF

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루카스 씨. 암러
메릴 버크너
친-유 린
요아힘 모엑스
안드레아스 스트라우스
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제넨테크, 인크.
에프. 호프만-라 로슈 아게
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Abstract

본원은 페르투주맙과 같은 HER 억제제를 사용하여 환자를 치료하기 위한 선택 기준으로서 저 HER3의 사용을 설명한다. 페르투주맙과 같은 HER 억제제를 사용하여 난소암 환자와 같은 암 환자를 치료하기 위한 선택 기준으로서 고 HER2:HER3 비의 사용을 또한 설명한다. 또한, 본원은 화학요법제, 예를 들어 겜시타빈을 사용하여 암 환자를 치료하기 위한 선택 기준으로서 고 HER3의 사용을 설명한다.

Description

낮은 ＨＥＲ３ 발현을 기초로 한 ＨＥＲ 이량체화 억제제에 대한 반응 예측 {PREDICTING RESPONSE TO A HER DIMERISATION INHIBITOR BASED ON LOW HER3 EXPRESSION}
본 발명은 페르투주맙과 같은 HER 억제제를 사용하여 난소암 환자와 같은 암 환자를 치료하기 위한 선택 기준으로서 저 HER3의 사용에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 페르투주맙과 같은 HER 억제제를 사용하여 난소암 환자와 같은 암 환자를 치료하기 위한 선택 기준으로서 고 HER2:HER3 비의 사용에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 화학요법제, 예를 들어 겜시타빈을 사용하여 암 환자를 치료하기 위한 선택 기준으로서 고 HER3의 사용에 관한 것이다.
HER 수용체 및 그에 대한 항체
수용체 티로신 키나제의 HER 패밀리는 세포 성장, 분화 및 생존의 중요한 매개자이다. 수용체 패밀리는 표피 성장인자 수용체 (EGFR, ErbB1 또는 HER1), HER2 (ErbB2 또는 p185neu), HER3 (ErbB3) 및 HER4 (ErbB4 또는 tyro2)를 포함하는 4개의 특유한 멤버를 포함한다.
erbB1 유전자에 의해 코딩되는 EGFR은 인간 악성 종양의 원인으로서 관련되었다. 특히, EGFR의 발현 증가는 유방, 방광, 폐, 두부, 경부 및 위의 암 및 아교모세포종에서 관찰되었다. 증가된 EGFR 수용체 발현은 동일한 종양 세포에 의한 EGFR 리간드인 형질전환 성장 인자 알파 (TGF-α)의 생산 증가와 종종 연관되어, 자가분비 자극 경로에 의한 수용체 활성화를 야기한다 (Baselga and Mendelsohn, Pharmac. Ther. 64:127-154 (1994)). EGFR 또는 그의 리간드인 TGF-α 및 EGF에 대해 작용하는 모노클로날 항체가 상기 악성 종양의 치료시의 치료제로서 평가되었다 (예를 들어 [Baselga and Mendelsohn, 상기 문헌]; [Masui et al. Cancer Research 44:1002-1007 (1984)]; 및 [Wu et al. J. Clin. Invest. 95:1897-1905 (1995)] 참조).
HER 패밀리의 제2 멤버인 p185neu는 화학적으로 처리된 래트의 신경모세포종으로부터의 형질전환 유전자의 산물로서 처음 확인되었다. neu 원발암유전자의 활성화 형태는 코딩된 단백질의 막횡단 영역에서의 점 돌연변이 (발린에서 글루탐산으로)로부터 기인한다. neu의 인간 상동체의 증폭이 유방암 및 난소암에서 관찰되고, 이것은 불량한 예후과 상호관련된다 ([Slamon et al., Science, 235:177-182 (1987)]; [Slamon et al., Science, 244:707-712 (1989)]; 및 미국 특허 4,968,603). 현재까지, neu 원발암유전자와 유사한 점 돌연변이는 인간 종양에서 보고되지 않았다. HER2의 과다발현 (빈번하지만 유전자 증폭에 의해 일정하지 않음)이 또한 위, 자궁내막, 타액선, 폐, 신장, 결장, 갑상선, 췌장 및 방광의 암종을 포함한 다른 암종에서 관찰되었다 (특히 [King et al., Science, 229:974 (1985)]; [Yokota et al., Lancet 1:765-767 (1986)]; [Fukushige et al., Mol Cell Biol, 6:955-958 (1986)]; [Guerin et al., Oncogene Res., 3:21-31 (1988)]; [Cohen et al., Oncogene, 4:81-88 (1989)]; [Yonemura et al., Cancer Res., 51:1034 (1991)]; [Borst et al., Gynecol Oncol, 38:364(1990)]; [Weiner et al., Cancer Res., 50:421-425 (1990)]; [Kern et al., Cancer Res., 50:5184 (1990)]; [Park et al., Cancer Res., 49:6605 (1989)]; [Zhau et al., Mol. Carcinog., 3:254-257 (1990)]; [Aasland et al. Br. J. Cancer 57:358-363 (1988)]; [Williams et al. Pathobiology 59:46-52 (1991)]; 및 [McCann et al., Cancer, 65:88-92 (1990)] 참조). HER2는 전립선암에서 과다발현될 수 있다 ([Gu et al. Cancer Lett. 99:185-9 (1996)]; [Ross et al. Hum. Pathol. 28:827-33 (1997)]; [Ross et al. Cancer 79:2162-70 (1997)]; 및 [Sadasivan et al. J. Urol. 150:126-31 (1993)]).
래트 p185neu 및 인간 HER2 단백질 산물에 대해 작용하는 항체가 문헌에서 설명되었다.
드레빈 (Drebin)과 그의 동료는 래트 neu 유전자 산물인 p185neu에 대해 항체를 생성시켰다 (예를 들어 [Drebin et al., Cell 41:695-706 (1985)]; [Myers et al., Meth. Enzym. 198:277-290 (1991)]; 및 WO94/22478 참조). 문헌 [Drebin et al. Oncogene 2:273-277 (1988)]에는 p185neu의 2개의 특유한 영역과 반응하는 항체의 혼합물이 누드 마우스 내로 이식된 neu-형질전환된 NIH-3T3 세포에 대한 상승적인 항-종양 효과를 야기한다고 보고되었다 (또한 1998년 10월 20일 등록된 미국 특허 5,824,311 참조).
문헌 [Hudziak et al., Mol. Cell. Biol. 9(3): 1165-1172 (1989)]에서는 인간 유방 종양 세포주 SK-BR-3을 사용하여 특성화된 HER2 항체 패널의 생성을 기재하고 있다. 항체에 노출된 후에 SK-BR-3 세포의 상대적 세포 증식은 72시간 후에 단일층의 크리스탈 바이올렛 염색에 의해 결정하였다. 상기 분석을 사용하여, 최대 억제는 세포 증식을 56％ 억제한 4D5로 불리는 항체를 사용하여 얻었다. 패널 내의 다른 항체는 상기 분석보다 더 낮은 수준으로 세포 증식을 감소시켰다. 항체 4D5는 HER2 과다발현 유방 종양 세포주를 TNF-α의 세포독성 효과에 대해 감수성으로 만드는 것으로 추가로 밝혀졌다 (1997년 10월 14일 등록된 미국 특허 5,677,171 참조). 상기 문헌 [Hudziak et al.]에서 논의된 HER2 항체는 다음 문헌에서 추가로 특성화되었다 ([Fendly et al. Cancer Research 50: 1550-1558 (1990)]; [Kotts et al. In Vitro 26(3):59A (1990)]; [Sarup et al. Growth Regulation 1:72-82 (1991)]; [Shepard et al. J. Clin. Immunol. 11(3):117-127 (1991)]; [Kumar et al. Mol. Cell. Biol. 11(2):979-986 (1991)]; [Lewis et al. Cancer Immunol. Immunother. 37:255-263 (1993)]; [Pietras et al. Oncogene 9:1829-1838 (1994)]; [Vitetta et al. Cancer Research 54:5301-5309 (1994)]; [Sliwkowski et al. J. Biol. Chem. 269(20):14661-14665 (1994)]; [Scott et al. J. Biol. Chem. 266:14300-5 (1991)]; [D'souza et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 91:7202-7206 (1994)]; [Lewis et al. Cancer Research 56:1457-1465 (1996)]; 및 [Schaefer et al. Oncogene 15:1385-1394 (1997)]).
뮤린 HER2 항체 4D5의 재조합 인간화 형태 (huMAb4D5-8, rhuMAb HER2, 트라스투주맙 또는 헤르셉틴 (HERCEPTIN)(등록상표); 미국 특허 5,821,337)는 이전의 항암 요법을 광범위하게 받은 HER2 과다발현 전이성 유방암 환자에서 임상적으로 활성을 보였다 (Baselga et al., J. Clin. Oncol. 14:737-744 (1996)). 트라스투주맙은 그의 종양이 HER2 단백질을 과다발현하는 전이성 유방암 환자의 치료를 위해 1998년 9월 25일자로 FDA에서 시판을 승인받았다.
다양한 특성을 갖는 다른 HER2 항체가 다음 문헌에 기재되어 있다 ([Tagliabue et al. Int. J. Cancer 47:933-937 (1991)]; [McKenzie et al. Oncogene 4:543-548 (1989)]; [Maier et al. Cancer Res. 51:5361-5369 (1991)]; [Bacus et al. Molecular Carcinogenesis 3:350-362 (1990)]; [Stancovski et al. PNAS (USA) 88:8691-8695 (1991)]; [Bacus et al. Cancer Research 52:2580-2589 (1992)]; [Xu et al. Int. J. Cancer 53:401-408 (1993)]; WO94/00136; [Kasprzyk et al. Cancer Research 52:2771-2776 (1992)]; [Hancock et al. Cancer Res. 51:4575-4580 (1991)]; [Shawver et al. Cancer Res. 54:1367-1373 (1994)]; [Arteaga et al. Cancer Res. 54:3758-3765 (1994)]; [Harwerth et al. J. Biol. Chem. 267:15160-15167 (1992)]; 미국 특허 5,783,186; 및 [Klapper et al. Oncogene 14:2099-2109 (1997)]).
상동성 스크리닝을 통해 2개의 다른 HER 수용체 패밀리 멤버인 HER3 (미국 특허 5,183,884 및 5,480,968과 [Kraus et al. PNAS (USA) 86:9193-9197 (1989)]) 및 HER4 (유럽 특허 출원 599,274; [Plowman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:1746-1750 (1993)]; 및 [Plowman et al., Nature, 366:473-475 (1993)])를 확인하였다. 이들 두 수용체는 모두 적어도 몇몇 유방암 세포주에서 증가된 발현을 보인다.
HER 수용체는 일반적으로 세포에서 상이한 조합으로 발견되고, 이종이량체화가 다양한 HER 리간드에 대한 세포 반응의 다양성을 증가시키는 것으로 생각된다 (Earp et al. Breast Cancer Research and Treatment 35: 115-132 (1995)). EGFR에는 6개의 상이한 리간드인 표피 성장인자 (EGF), 형질전환 성장 인자 알파 (TGF-α), 암피레굴린, 헤파린 결합 표피 성장인자 (HB-EGF), 베타셀룰린 및 에피레굴린이 결합한다 (Groenen et al. Growth Factors 11:235-257 (1994)). 단일 유전자의 선택적 스플라이싱에 의해 생성된 헤레굴린 단백질의 패밀리는 HER3 및 HER4에 대한 리간드이다. 헤레굴린 패밀리는 알파, 베타 및 감마 헤레굴린 ([Holmes et al., Science, 256:1205-1210 (1992)]; 미국 특허 5,641,869; 및 [Schaefer et al. Oncogene 15:1385-1394 (1997)]); neu 분화 인자 (NDF), 아교세포 성장인자 (GGF); 아세틸콜린 수용체 유도 활성 (ARIA); 및 감각 및 운동 뉴런 유도 인자 (SMDF)를 포함한다. 검토를 위해 다음 문헌을 참고한다 ([Groenen et al. Growth Factors 11:235-257 (1994)]; [Lemke, G. Molec. & Cell. Neurosci. 7:247-262 (1996)] 및 [Lee et al. Pharm. Rev. 47:51-85 (1995)]). 최근에 3개의 추가의 HER 리간드; 즉, HER3 또는 HER4에 결합하는 것으로 보고된 뉴레굴린-2 (NRG-2) ([Chang et al. Nature 387:509-512 (1997)] 및 [Carraway et al. Nature 387:512-516 (1997)]); HER4에 결합하는 뉴레굴린-3 (Zhang et al. PNAS (USA) 94(18):9562-7 (1997)); 및 HER4에 결합하는 뉴레굴린-4 (Harari et al. Oncogene 18:2681-89 (1999))가 확인되었다. HB-EGF, 베타셀룰린 및 에피레굴린도 HER4에 결합한다.
EGF 및 TGFα는 HER2에 결합하지 않는 한편, EGF는 EGFR 및 HER2를 자극하여 이종이량체를 형성하고, 이것은 EGFR을 활성화시켜 이종이량체에서 HER2의 인산전달을 야기한다. 이량체화 및/또는 인산전달은 HER2 티로신 키나제를 활성화시키는 것으로 보인다 ([Earp et al., 상기 문헌] 참조). 마찬가지로, HER3이 HER2와 동시발현될 때, 활성 신호전달 복합체가 형성되고, HER2에 대해 작용하는 항체는 상기 복합체를 붕괴시킬 수 있다 (Sliwkowski et al., J. Biol. Chem., 269(20):14661-14665 (1994)). 추가로, HER3의 헤레굴린 (HRG)에 대한 친화도는 HER2와 동시발현될 때 더 높은 친화도 상태로 증가한다. 또한, HER2-HER3 단백질 복합체에 관해서는 문헌 ([Levi et al., Journal of Neuroscience 15: 1329-1340 (1995)]; [Morrissey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 1431-1435 (1995)]; 및 [Lewis et al., Cancer Res., 56:1457-1465 (1996)])을 참고한다. HER3과 유사하게, HER4는 HER2와 활성 신호전달 복합체를 형성한다 (Carraway and Cantley, Cell 78:5-8 (1994)).
HER 항체에 관련된 특허 공개는 US 5,677,171, US 5,720,937, US 5,720,954, US 5,725,856, US 5,770,195, US 5,772,997, US 6,165,464, US 6,387,371, US 6,399,063, US2002/0192211A1, US 6,015,567, US 6,333,169, US 4,968,603, US 5,821,337, US 6,054,297, US 6,407,213, US 6,719,971, US 6,800,738, US2004/0236078A1, US 5,648,237, US 6,267,958, US 6,685,940, US 6,821,515, WO98/17797, US 6,127,526, US 6,333,398, US 6,797,814, US 6,339,142, US 6,417,335, US 6,489,447, WO99/31140, US2003/0147884A1, US2003/0170234A1, US2005/0002928A1, US 6,573,043, US2003/0152987A1, WO99/48527, US2002/0141993A1, WO01/00245, US2003/0086924, US2004/0013667A1, WO00/69460, WO01/00238, WO01/15730, US 6,627,196B1, US6.632.979B1, WO01/00244, US2002/0090662A1, WO01/89566, US2002/0064785, US2003/0134344, WO 04/24866, US2004/0082047, US2003/0175845A1, WO03/087131, US2003/0228663, WO2004/008099A2, US2004/0106161, WO2004/048525, US2004/0258685A1, US 5,985,553, US 5,747,261, US 4,935,341, US 5,401,638, US 5,604,107, WO 87/07646, WO 89/10412, WO 91/05264, EP 412,116 B1, EP 494,135 B1, US 5,824,311, EP 444,181 B1, EP 1,006,194 A2, US 2002/0155527A1, WO 91/02062, US 5,571,894, US 5,939,531, EP 502,812 B1, WO 93/03741, EP 554,441 B1, EP 656,367 A1, US 5,288,477, US 5,514,554, US 5,587,458, WO 93/12220, WO 93/16185, US 5,877,305, WO 93/21319, WO 93/21232, US 5,856,089, WO 94/22478, US 5,910,486, US 6,028,059, WO 96/07321, US 5,804,396, US 5,846,749, EP 711,565, WO 96/16673, US 5,783,404, US 5,977,322, US 6,512,097, WO 97/00271, US 6,270,765, US 6,395,272, US 5,837,243, WO 96/40789, US 5,783,186, US 6,458,356, WO 97/20858, WO 97/38731, US 6,214,388, US 5,925,519, WO 98/02463, US 5,922,845, WO 98/18489, WO 98/33914, US 5,994,071, WO 98/45479, US 6,358,682 B1, US 2003/0059790, WO 99/55367, WO 01/20033, US 2002/0076695 A1, WO 00/78347, WO 01/09187, WO 01/21192, WO 01/32155, WO 01/53354, WO 01/56604, WO 01/76630, WO02/05791, WO 02/11677, US 6,582,919, US2002/0192652A1, US 2003/0211530A1, WO 02/44413, US 2002/0142328, US 6,602,670 B2, WO 02/45653, WO 02/055106, US 2003/0152572, US 2003/0165840, WO 02/087619, WO 03/006509, WO03/012072, WO 03/028638, US 2003/0068318, WO 03/041736, EP 1,357,132, US 2003/0202973, US 2004/0138160, US 5,705,157, US 6,123,939, EP 616,812 B1, US 2003/0103973, US 2003/0108545, US 6,403,630 B1, WO 00/61145, WO 00/61185, US 6,333,348 B1, WO 01/05425, WO 01/64246, US 2003/0022918, US 2002/0051785 A1, US 6,767,541, WO 01/76586, US 2003/0144252, WO 01/87336, US 2002/0031515 A1, WO 01/87334, WO 02/05791, WO 02/09754, US 2003/0157097, US 2002/0076408, WO 02/055106, WO 02/070008, WO 02/089842 및 WO 03/86467을 포함한다.
진단
HER2 항체 트라스투주맙으로 치료한 환자를 HER2 과다발현/증폭을 기초로 한 요법을 위해 선택한다 (예를 들어, WO99/31140 (Paton et al.), US2003/0170234A1 (Hellmann, S.), 및 US2003/0147884 (Paton et al.)과 WO01/89566, US2002/0064785 및 US2003/0134344 (Mass et al.) 참조). 또한, HER2 과다발현 및 증폭을 검출하기 위한 면역조직화학 (IHC) 및 형광 계내 (in situ) 혼성화 (FISH)에 관해서는 US2003/0152987 (Cohen et al.)을 참고한다.
WO2004/053497 및 US2004/024815A1 (Bacus et al.)과 US 2003/0190689 (Crosby 및 Smith)에서는 트라스투주맙 요법에 대한 반응을 결정 또는 예측하는 것을 언급하고 있다. US2004/013297A1 (Bacus et al.)은 ABX0303 EGFR 항체 요법에 대한 반응을 결정 또는 예측하는 것에 관한 것이다. WO2004/000094 (Bacus et al.)은 GW572016, 소분자, EGFR-HER2 티로신 키나제 억제제에 대한 반응을 결정하는 것에 관한 것이다. WO2004/063709 (Amler et al.)은 EGFR 억제제인 에를로티닙 HCl에 대한 감수성을 결정하기 위한 바이오마커 (biomarker) 및 방법을 언급하고 있다. US2004/0209290 (Cobleigh et al.)은 유방암 예후에 대한 유전자 발현 마커에 관한 것이다.
페르투주맙으로 치료한 환자를 HER 활성화 또는 이량체화를 기초로 한 요법을 위해 선택할 수 있다. 페르투주맙 및 그를 사용한 요법을 위한 환자의 선택에 관한 특허 공개는 WO01/00245 (Adams et al.); US2003/0086924 (Sliwkowski, M.); US2004/0013667A1 (Sliwkowski, M.)과 WO2004/008099A2 및 US2004/0106161 (Bossenmaier et al.)을 포함한다.
문헌 [Cronin et al. Am. J. Path. 164(1): 35-42 (2004)]에서는 보관 파라핀-포매 조직에서 유전자 발현의 측정을 설명한다. 문헌 [Ma et al. Cancer Cell 5:607-616 (2004)]에서는 보관된 일차 생검으로부터 취한 종양-조직 절편으로부터의 단리된 RNA를 사용한 유전자 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이에 의한 유전자 프로파일링 (profiling)을 설명한다.
페르투주맙 (재조합 인간 모노클로날 항체 2C4로도 알려짐; 옴니타그 (OMNITARG)™, 제넨테크, 인크. (Genentech, Inc, 미국 사우쓰 샌프란시스코))은 HER 이량체화 억제제 (HDI)로서 알려진 새로운 클래스의 물질 중 첫 번째이고, 다른 HER 수용체 (예를 들어 EGFR/HER1, HER3 및 HER4)와 활성 이종이량체를 형성하는 HER2의 능력을 억제하는 기능을 수행하고, HER2 발현 수준과 무관하게 활성을 보인다 (예를 들어, [Harari and Yarden, Oncogene 19:6102-14 (2000)]; [Yarden and Sliwkowski Nat Rev Mol Cell Biol, 2:127-37 (2001)]; [Sliwkowski Nat Strcut Biol 10:158-9 (2003)]; [Cho, et al., Nature 421:756-60 (2003)]; 및 [Malik, et al. Pro Am Soc Cancer Res 44:176-7 (2003)] 참조).
종양 세포에서 HER2-HER3 이종이량체의 형성의 페르투주맙 차단은 중요한 세포 신호전달을 억제하는 것으로 입증되었고, 이는 종양 증식 및 생존을 감소시킨다 (Agus et al. Cancer Cell 2:127-37 (2002)).
페르투주맙은 단일제로서 진행암 환자에서 Ia상 임상시험으로, 및 난소암 및 유방암과 폐 및 전립선암 환자에서 II상 임상시험으로 시험되고 있다. I상 연구에서, 표준 요법 동안 또는 표준 요법 후에 진행한 불치의 국소 진행성, 재발성 또는 전이성 고체 종양의 환자를 3주마다 정맥내로 제공한 페르투주맙으로 치료하였다. 페르투주맙은 일반적으로 잘 관용되었다. 종양 퇴화는 반응에 대해 평가가능한 20명의 환자 중에 3명에서 달성되었다. 2명의 환자에서는 부분 반응이 확인되었다. 2.5개월 넘게 지속하는 안정한 질병은 21명의 환자 중 6명에서 관찰되었다 (Agus et al. Pro Am Soc Clin Oncol 22: 192 (2003)). 2.0-15 mg/kg의 투여량에서, 페르투주맙의 약동학은 선형이었고, 평균 청소율은 2.69 내지 3.74 mL/day/kg이고, 평균 말기 제거 반감기는 15.3 내지 27.6일이었다. 페르투주맙에 대한 항체는 검출되지 않았다 (Allison et al. Pro Am Soc Clin Oncol 22:197 (2003)).
세르기나 (Sergina) 등은 HER 티로신 키나제 억제제 (TKI)의 효능을 평가하기 위해 사용되는 생물학적 마커가 자가인산화보다는 HER3의 인산 전달일 것임을 보고하였다 (Sergina et al. Nature 445(7126): 437-441 (2007)).
자자에리 (Jazaeri) 등은 상피 난소암에서 화학요법에 대한 반응과 연관된 유전자 발현 프로필을 평가하였다 (Jazaeri et al. Clin. Cancer Res. 11(17): 6300-6310 (2005)).
태너 (Tanner) 등은 HER3이 난소암에서 생존을 예측함을 보고하였다 (Tanner et al. J. Clin. Oncol. 24(26):4317-4323 (2006)).
본원은 적어도 부분적으로, 그의 암이 HER3을 낮은 수준으로 발현하는 암 환자 (예를 들어 난소암 환자)가 인간 임상 시험에서 그의 암이 HER3을 높은 수준으로 발현하는 환자보다 HER 이량체화 억제제에 더 잘 반응한다는 놀라운 관찰에 관한 것이다. 일반적으로, 그러한 환자는 고 HER2:HER3 비 (낮은 수준의 HER3으로 인한)을 가져서, HER2 및 HER3의 상대적인 수준의 평가는 HER 이량체화 억제제를 사용한 요법을 위한 환자를 선택하는 추가의 수단 또는 대체 수단을 제공한다.
따라서, 본 발명은 제1 측면에서 HER 억제제에 반응할 수 있는 종류의 암에 걸린 환자에게 치료상 유효량의 HER 억제제를 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자를 치료하는 방법에 관한 것이고, 여기서 환자의 암은 그 암 종류에서의 HER3 발현에 대해 중앙 수준 미만의 수준으로 HER3을 발현한다. 고려되는 HER 억제제의 예는 HER 항체 또는 소분자 억제제; HER2 항체 또는 소분자 억제제; 비제한적으로 라파티닙, 티케르브 (Tykerb)를 포함하는 티로신 키나제 억제제 등을 포함한다. 가장 바람직하게는, HER 억제제는 HER 이량체화 억제제이다. 따라서, 본 발명은 HER 이량체화 억제제에 반응할 수 있는 종류의 암에 걸린 환자에게 치료상 유효량의 HER 이량체화 억제제를 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자를 치료하는 방법을 제공하고, 여기서 환자의 암은 그 암 종류에서의 HER3 발현에 대해 중앙 수준 미만의 수준으로 HER3을 발현한다.
본 실시태양에 따르면, 바람직하게는 환자의 암은 그 암 종류에서의 HER3 발현에 대해 제25 백분위 (percentile) 미만의 수준으로 HER3을 발현한다. 임의로, 상기 환자의 암은 그 암 종류에서의 HER2:HER3 발현에 대해 제25 백분위를 초과하는, 바람직하게는 중앙 수준을 초과하는, 가장 바람직하게는 제75 백분위를 초과하는 수준으로 HER2:HER3을 발현한다. HER3 (및 HER2) 발현을 측정하기 위한 바람직한 분석은 중합효소 연쇄 반응 (PCR), 가장 바람직하게는 정량적 실시간 중합효소 연쇄 반응 (qRT-PCR)을 포함한다.
바람직하게는, HER 이량체화 억제제는 항체, 가장 바람직하게는 HER2 항체, 예를 들어 페르투주맙이다.
바람직하게는, 본원에서 치료하거나 진단될 암 종류는 난소암, 복막암, 난관암, 전이성 유방암 (MBC), 비-소세포 폐암 (NSCLC), 전립선암 및 결장직장암으로 이루어지는 군 중에서 선택된다. 가장 바람직하게는, 본원에서 치료하거나 진단된 암 종류는 난소암, 복막암 또는 난관암이다. 암 종류는 화학요법 내성, 백금 내성, 진행성, 불응성 및/또는 재발성일 수 있다. 방법은 환자에서 무진행 생존 (PFS) 및 전체 생존 (OS)을 포함한 생존을 연장할 수 있다.
HER 억제제는 단일 항종양제로서 투여될 수 있거나, 하나 이상의 다른 요법과 조합될 수 있다. 한 실시태양에서, HER 억제제는 하나 이상의 화학요법제, 예를 들어 겜시타빈, 카르보플라틴, 파클리탁셀, 도세탁셀, 토포테칸 및 리포좀 독소루비신, 바람직하게는 항대사물질, 예를 들어 겜시타빈과 함께 투여된다. HER 억제제는 또한 트라스투주맙, 에를로티닙 또는 베바시주맙과 조합될 수 있다.
추가의 측면에서, 본 발명은 난소암, 복막암 또는 난관암의 환자에게 치료상 유효량의 페르투주맙을 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자를 치료하는 방법에 관한 것이고, 여기서 환자의 암은 난소암, 복막암 또는 난관암에서의 HER3 발현에 대해 중앙 수준 미만의 수준으로 HER3을 발현한다.
본 발명은 추가로 HER3 발현을 HER 억제제 (예를 들어, HER 이량체화 억제제)에 반응할 수 있는 종류의 암에 걸린 환자로부터의 암 샘플에서 결정하는 것, 및 암 샘플이 그 암 종류에서의 HER3 발현에 대해 중앙 수준 미만의 수준으로 HER3을 발현하는 경우 요법으로서 HER 억제제 (예를 들어, HER 이량체화 억제제)를 선택하는 것을 포함하는, HER 억제제 (예를 들어, HER 이량체화 억제제)에 반응할 수 있는 종류의 암에 걸린 환자를 위한 요법을 선택하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 제약상 허용되는 담체 내에 HER 이량체화 억제제를 포함하는 제약 조성물, 및 상기 억제제 또는 제약 조성물이 HER 이량체화 억제제에 반응할 수 있는 종류의 암에 걸린 환자의 치료에 사용되도록 지시되었음을 언급한 라벨 (label)을 함께 포장하여 포함하는 제조품을 제공하고, 여기서 환자의 암은 그 암 종류에서의 HER3 발현에 대해 중앙 수준 미만의 수준으로 HER3을 발현한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 HER 이량체화 억제제 또는 그의 제약 조성물, 및 상기 억제제 또는 제약 조성물이 HER 이량체화 억제제에 반응할 수 있는 종류의 암에 걸린 환자의 치료에 사용되도록 지시되었음을 언급한 라벨을 패키지 (package) 내에 합하는 것을 포함하는, HER 이량체화 억제제 또는 그의 제약 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이고, 여기서 환자의 암은 그 암 종류에서의 HER3 발현에 대해 중앙 수준 미만의 수준으로 HER3을 발현한다.
또다른 실시태양에서, 본 발명은 표적 청중 (target audience)에게 어느 한 종류의 암에 걸린 환자 집단을 치료하기 위한 HER 이량체화 억제제 또는 그의 제약 조성물의 사용을 장려하는 것을 포함하는, HER 이량체화 억제제 또는 제약상 허용되는 그의 조성물을 광고하는 방법을 제공하고, 여기서 환자의 암은 그 암 종류에서의 HER3 발현에 대해 중앙 수준 미만의 수준으로 HER3을 발현한다.
상기 발명 이외에, 본원에 제공된 인간 임상 데이타는 그의 암이 HER3을 높은 수준으로 발현하는 암 환자 (예를 들어 난소암 환자)가 그의 암이 HER3을 낮은 수준으로 발현하는 환자보다 화학요법제, 예를 들어 겜시타빈에 대해 더 우수한 임상 반응을 가짐을 입증하였다.
본 발명의 상기 추가의 측면에 따라, 본 발명은 HER3 발현을 화학요법제에 반응할 것으로 보이는 종류의 암에 걸린 환자로부터의 암 샘플에서 결정하는 것, 및 암 샘플이 그 암 종류에서의 HER3 발현에 대해 중앙 수준을 초과하는 수준으로 HER3을 발현하는 경우 요법으로서 화학요법제를 선택하는 것을 포함하는, 화학요법제에 반응할 것으로 보이는 종류의 암에 걸린 환자를 위한 요법을 선택하는 방법을 제공한다. 바람직하게는 암 종류는 난소암, 복막암 또는 난관암, 예를 들어 백금 내성 난소암, 복막암 또는 난관암뿐만 아니라 진행성, 불응성 또는 재발성 난소암이다. 바람직하게는, 선택된 화학요법제는 항대사물질, 예를 들어 겜시타빈이다.
본 발명은 또한 화학요법제에 반응할 수 있는 종류의 암에 걸린 환자에게 치료상 유효량의 화학요법제를 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자를 치료하는 방법에 관한 것이고, 여기서 환자의 암은 그 암 종류에서의 HER3 발현에 대해 중앙 수준을 초과하는 수준으로 HER3을 발현한다. 바람직하게는, 환자의 암은 그 암 종류에서의 HER3 발현에 대해 제25 백분위를 초과하는 수준으로 HER3을 발현한다. HER3 발현을 측정하기 위한 바람직한 분석은 중합효소 연쇄 반응 (PCR), 가장 바람직하게는 정량적 실시간 중합효소 연쇄 반응 (qRT-PCR)을 포함한다.
바람직하게는 화학요법제는 항대사물질, 가장 바람직하게는 겜시타빈이다.
바람직하게는, 본 발명의 상기 추가의 측면에 따라 치료되거나 진단될 암 종류는 난소암, 복막암 또는 난관암이다. 암 종류는 화학요법 내성, 백금 내성, 진행성, 불응성 및/또는 재발성일 수 있다. 방법은 환자에서 무진행 생존 (PFS) 및 전체 생존 (OS)을 포함한 생존을 연장할 수 있다.
추가의 측면에서, 본 발명은 난소암, 복막암 또는 난관암의 환자에게 치료상 유효량의 겜시타빈을 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자를 치료하는 방법에 관한 것이고, 여기서 환자의 암은 난소암, 복막암 또는 난관암에서의 HER3 발현에 대해 중앙 수준을 초과하는 수준으로 HER3을 발현한다.
본 발명은 또한 제약상 허용되는 담체 내에 화학요법제 (예를 들어 겜시타빈)를 포함하는 제약 조성물, 및 상기 화학요법제 또는 제약 조성물이 어느 한 종류의 암에 걸린 환자의 치료에 사용되도록 지시되었음을 언급한 라벨을 함께 포장하여 포함하는 제조품을 제공하고, 여기서 환자의 암은 그 암 종류에서의 HER3 발현에 대해 중앙 수준을 초과하는 수준으로 HER3을 발현한다.
다른 추가의 측면에서, 본 발명은 화학요법제 또는 제약 조성물, 및 상기 화학요법제 또는 제약 조성물이 어느 한 종류의 암에 걸린 환자의 치료에 사용되도록 지시되었음을 언급한 라벨을 패키지 내에 합하는 것을 포함하는, 화학요법제 (예를 들어 겜시타빈) 또는 그의 제약 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이고, 여기서 환자의 암은 그 암 종류에서의 HER3 발현에 대해 중앙 수준을 초과하는 수준으로 HER3을 발현한다.
또다른 실시태양에서, 본 발명은 표적 대상에게 어느 한 종류의 암에 걸린 환자 집단을 치료하기 위한 화학요법제 또는 그의 제약 조성물의 사용을 장려하는 것을 포함하는, 상기 화학요법제 또는 제약상 허용되는 그의 조성물을 광고하는 방법을 제공하고, 여기서 환자의 암은 그 암 종류에서의 HER3 발현에 대해 중앙 수준을 초과하는 수준으로 HER3을 발현한다.
본원은 고 HER2:HER3 발현을 갖는 환자가 HER 억제제, 예를 들어 페르투주맙에 보다 유망하게 반응함을 입증하는 인간 임상 데이타를 제공한다. 따라서, 본 발명은 또다른 측면에서, HER2 및 HER3 발현 수준을 평가하고, 요법으로부터 그의 암이 HER2:HER3을 낮은 수준으로 발현하는 환자를 배제함으로써 환자를 선택하는 수단을 제공한다.
따라서, 본 발명은 또한 HER 억제제에 반응할 수 있는 종류의 암에 걸린 환자에게 치료상 유효량의 HER 억제제를 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자를 치료하는 방법에 관한 것이고, 여기서 환자의 암은 그 암 종류에서의 HER2:HER3 발현에 대해 제25 백분위를 초과하는 수준으로 HER2:HER3을 발현한다. 바람직하게는, 환자의 암은 그 암 종류에서의 HER2:HER3 발현에 대해 중앙 수준을 초과하는 수준, 가장 바람직하게는 제75 백분위를 초과하는 수준으로 HER2:HER3을 발현한다.
또한, 난소암, 복막암 또는 난관암의 환자에게 치료상 유효량의 페르투주맙을 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자를 치료하는 방법을 제공하고, 여기서 환자의 암은 난소암, 복막암 또는 난관암에서의 HER2:HER3 발현에 대해 제25 백분위를 초과하는 수준으로 HER2:HER3을 발현한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 HER2 및 HER3 발현을 HER 억제제에 반응할 수 있는 종류의 암에 걸린 환자로부터의 암 샘플에서 결정하는 것, 및 암 샘플이 그 암 종류에서의 HER2:HER3 발현에 대해 제25 백분위를 초과하는 수준으로 HER2:HER3을 발현하는 경우 요법으로서 HER 억제제를 선택하는 것을 포함하는, HER 억제제에 반응할 수 있는 종류의 암에 걸린 환자를 위한 요법을 선택하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 제약상 허용되는 담체 내에 HER 억제제를 포함하는 제약 조성물, 및 상기 억제제 또는 제약 조성물이 HER 억제제에 반응할 수 있는 종류의 암에 걸린 환자의 치료에 사용되도록 지시되었음을 언급한 라벨을 함께 포장하여 포함하는 제조품에 관한 것이고, 여기서 환자의 암은 그 암 종류에서의 HER2:HER3 발현에 대해 제25 백분위를 초과하는 수준으로 HER2:HER3을 발현한다.
또한, 본 발명은 HER 억제제 또는 그의 제약 조성물, 및 상기 억제제 또는 제약 조성물이 HER 억제제에 반응할 수 있는 종류의 암에 걸린 환자의 치료에 사용되도록 지시되었음을 언급한 라벨을 패키지 내에 합하는 것을 포함하는, HER 억제제 또는 그의 제약 조성물을 제조하는 방법을 제공하고, 여기서 환자의 암은 그 암 종류에서의 HER2:HER3 발현에 대해 제25 백분위를 초과하는 수준으로 HER2:HER3을 발현한다.
또한, 본 발명은 표적 대상에게 어느 한 종류의 암에 걸린 환자 집단을 치료하기 위한 HER 억제제 또는 그의 제약 조성물의 사용을 장려하는 것을 포함하는, HER 억제제 또는 제약상 허용되는 그의 조성물을 광고하는 방법에 관한 것이고, 여기서 환자의 암은 그 암 종류에서의 HER2:HER3 발현에 대해 제25 백분위를 초과하는 수준으로 HER2:HER3을 발현한다.
본원은 적어도 부분적으로, 그의 암이 HER3을 낮은 수준으로 발현하는 암 환자 (예를 들어 난소암 환자)가 인간 임상 시험에서 그의 암이 HER3을 높은 수준으로 발현하는 환자보다 HER 이량체화 억제제에 더 잘 반응한다는 놀라운 관찰에 관한 것으로, 그러한 환자는 고 HER2:HER3 비 (낮은 수준의 HER3으로 인한)을 가져서, HER2 및 HER3의 상대적인 수준의 평가는 HER 이량체화 억제제를 사용한 요법을 위한 환자를 선택하는 추가의 수단 또는 대체 수단을 제공한다.
도 1은 HER2 단백질 구조의 개략도, 및 그의 세포외 도메인의 도메인 I-IV에 대한 아미노산 서열 (각각 서열 19-22)을 제시한다.
도 2a 및 2b는 뮤린 모노클로날 항체 2C4의 가변 경쇄 (VL) (도 2a) 및 가변 중쇄 (VH) (도 2b) 도메인의 아미노산 서열 (각각 서열 1 및 2); 변이체 574/페르투주맙의 VL 및 VH 도메인 (각각 서열 3 및 4), 및 인간 VL 및 VH 컨센서스 프레임워크 (hum κ1, 경쇄 카파 하위군 I; humIII, 중쇄 하위군 III) (각각 서열 5 및 6)의 정렬을 도시한 것이다. 별표는 페르투주맙 및 뮤린 모노클로날 항체 2C4의 가변 도메인들 사이 또는 페르투주맙 및 인간 프레임워크의 가변 도메인들 사이의 차이를 나타낸다. 상보성 결정 구역 (CDR)은 각괄호 내에 표시한다.
도 3a 및 3b는 페르투주맙 경쇄 (도 3a; 서열 13) 및 중쇄 (도 3b; 서열 14)의 아미노산 서열을 도시한 것이다. CDR은 굵은 글씨로 나타낸다. 경쇄 및 중쇄의 계산된 분자 질량은 23,526.22 Da 및 49,216.56 Da (시스테인은 환원된 형태임)이다. 탄수화물 모이어티는 중쇄의 Asn 299에 부착된다.
도 4는 HER2의 이종이량체 결합 부위에서 2C4의 결합, 그에 의한 활성화된 EGFR 또는 HER3과의 이종이량체화 방지의 개략도이다.
도 5는 MAPK 및 Akt 경로에 대한 HER2/HER3의 커플링을 도시한 것이다.
도 6은 트라스투주맙 및 페르투주맙의 다양한 활성을 비교한 것이다.
도 7a 및 7b는 각각 트라스투주맙 경쇄 (도 7a; 서열 15) 및 중쇄 (도 7b; 서열 16)의 아미노산 서열을 도시한 것이다.
도 8a 및 8b는 각각 변이체 페르투주맙 경쇄 서열 (도 8a; 서열 17) 및 변이체 페르투주맙 중쇄 서열 (도 8b; 서열 18)을 도시한 것이다.
도 9는 겜시타빈과 위약 또는 겜시타빈과 페르투주맙으로 치료한 백금 내성 난소, 원발성 복막 또는 난관 암종의 환자를 포함하는 실시예 1에서의 임상 시험을 위한 연구 디자인/계획도를 도시한 것이다.
도 10a는 실시예 1의 연구로부터의 모든 환자에 대한 무진행 생존 (PFS)을 도시한 것이다.
도 10b는 도 10a의 업데이트 (updated) 버전이다. PFS는 랜덤화 계층화 (stratification) 인자 (ECOG PS, 백금 내성 질병에 대한 선행 요법의 수, 및 질병 측정가능성)에 의한 계층화 Cox 모델 및 계층화 로그 순위 검정 (log rank test)을 사용하여 추정하였다.
도 11a는 예측된 pHER2 상태에 의한 PFS를 나타낸다.
도 11b는 도 11a의 업데이트 버전이다.
도 12a는 qRT-PCR EGFR (HER1) 컷오프 (cutoff)에 의한 PFS를 나타낸다.
도 12b는 qRT-PCR EGFR (HER1) 컷오프에 의한 PFS의 다른 표현 형태이고, 이는 또한 다양한 EGFR 컷오프 값에서 HER1 (고) 및 HER1 (저)군 내의 대상의 수를 나타낸다.
도 13a는 qRT-PCR HER2 컷오프에 의한 PFS를 나타낸다.
도 13b는 qRT-PCR HER2 컷오프에 의한 PFS의 다른 표현 형태이고, 이는 또한 다양한 HER2 컷오프 값에서 HER1 (고) 및 HER1 (저)군 내의 대상의 수를 나타낸다.
도 14a는 qRT-PCR HER3 컷오프에 의한 PFS를 나타낸다.
도 14b는 qRT-PCR HER3 컷오프에 의한 PFS의 다른 표현 형태이고, 이는 또한 다양한 HER3 컷오프 값에서 HER3 (고) 및 HER3 (저)군 내의 대상의 수를 나타낸다.
도 15a는 HER3 하위군에 의한 PFS를 도시한 것이다. 페르투주맙 활성은 저 HER3 발현 종양의 환자에서 최대이고, HER3 유전자 발현 수준이 감소함에 따라 증가하는 경향이 있다.
도 15b는 qRT-PCR HER3 수준에 의한 PFS의 다른 표현 형태이다.
도 16a는 HER3 하위군에 의한 PFS를 나타낸다. 데이타는 HER3 고 발현 종양을 갖는 환자에서 페르투주맙과 겜시타빈 사이에 네가티브 상호작용이 존재할 수 있음을 보여준다.
도 16b는 qRT-PCR HER3 수준에 의한 PFS의 또다른 표현 형태이다. 데이타는 HER3 고 발현 종양을 갖는 환자에서 페르투주맙과 겜시타빈 사이에 네가티브 상호작용이 존재할 수 있음을 추가로 확인한다.
도 17a는 HER3 하위군; 고 HER3 발현 하위군, 및 저 HER3 발현 하위군에 의한 PFS를 요약한 것이다.
도 17b는 도 17b에 도시된 qRT-PCR HER3 수준에 의한 PFS의 업데이트 버전이다.
도 18a는 HER3 하위군에 의한 PFS를 추가로 나타낸다.
도 18b는 도 18a에 도시된 HER3 발현 4분위 (quartile)에 의한 PFS 분석의 업데이트 버전이다.
도 19a는 50/50 스플릿 (split)을 갖는 HER3 qRT-PCR에 의한 PFS를 도시한 것이고; 여기서 저 HER3 발현은 제50 백분위 미만이고, 고 HER3 발현은 제50 백분위를 초과하거나 같다.
도 19b는 도 19a에 도시된, 50/50 스플릿을 갖는 HER3 qRT-PCR에 의한 PFS의 업데이트 버전이다.
도 20a는 25/75 스플릿을 갖는 HER3 qRT-PCR에 의한 PFS를 도시한 것이고; 여기서 저 HER3 발현은 제25 백분위 미만이고, 고 HER3 발현은 제25 백분위를 초과하거나 같다.
도 20b는 도 20a에 도시된, 25/75 스플릿을 갖는 HER3 qRT-PCR에 의한 PFS의 업데이트 버전이다.
도 21a는 모든 환자에서 전체 생존 (OS)에 대한 예비 데이타를 보여준다. 46/130 사건에 기초한 데이타.
도 21b는 랜덤화 계층화 인자 (ECOG PS, 백금 내성 질병에 대한 선행 요법의 수, 및 질병 측정가능성)에 의한 계층화 Cox 모델 및 계층화 로그 순위 검정을 이용하여 추정된 OS 데이타의 업데이트 차트이다.
도 22a는 HER3 qRT-PCR에 의한 OS에 대한 예비 데이타를 보여준다. 43/119 사건에 기초한 데이타.
도 22b는 50/50 스플릿을 갖는 HER3 qRT-PCR에 의한 OS 데이타의 업데이트 차트이고, 여기서 저 HER3 발현은 제50 백분위 미만이고, 고 HER3 발현은 제25 백분위를 초과하거나 같다.
도 23a는 고 대 저 위험비 (hazard ratio; HR)를 비교하는 HER3 qRT-PCR에 의한 PFS를 나타낸다.
도 23b는 고 대 저 위험비 (HR)를 비교하는 HER3 qRT-PCR에 의한 PFS의 업데이트 차트이다.
도 24a는 qRT-PCR HER3에 의한 PFS를 갖는, 실시예 1에서 페르투주맙 백금 내성 난소암에 대한 데이타의 전체 세트를 도시한 것이다. 주: HR 및 로그 순위 p-값은 다수 비교를 위해 조정되지 않았다.
도 24b는 qRT-PCR HER3에 의한 PFS를 갖는, 페르투주맙 백금 내성 난소암에 대한 다른 데이타 세트이다. 도 24a에서와 같이, HR 및 로그 순위 p-값은 다수 비교를 위해 조정되지 않았다.
도 25는 단일제 페르투주맙으로 실시예 2에서와 같이 치료한 환자에 대한 HER3 qRT-PCR에 의한 PFS 및 OS를 보여준다. 고 HER3은 제75 백분위를 초과하거나 같은 환자이고; 저 HER3의 환자는 제75 백분위 미만이었다. 저 발현 환자에 대한 중앙 생존은 3.31년 (95％ CI, 1.93-4.69)이고; 고 HER3 발현 환자에 대한 중앙 생존은 1.80년 (95％ CI, 0.83 내지 2.78)이었다.
도 26a은 HER3 보정된 표준화 비를 보여주고; 발현 범위는 약 20-80배이다. CP는 대부분의 샘플에 대해 약 23 내지 30이다.
도 26b는 HER3 보정된 표준화 비를 보여준 다른 도면이고; 발현 범위는 약 20-80배이다. CP는 대부분의 샘플에 대해 약 23 내지 30이다.
도 27은 LIGHTCYCLER(등록상표) 2.0 페르투주맙 qRT-PCR 시험관내 진단 (IVD) 분석 흐름도 (workflow)이다.
도 28은 하나의 마커 및 참조물을 사용한 페르투주맙 IVD 분석 흐름도 및 분석을 도시한 것이다.
도 29a는 실시예 1에서 치료된 환자에 대한 HER2:HER3 백분위에 의한 PFS를 제공한다.
도 29b는 실시예 1에서 치료된 환자에 대한 HER2:HER3 백분위에 의한 PFS를 보여주는 또다른 도면이다. 주: HR 및 로그 순위 p-값은 다수 비교를 위해 조정되지 않았다.
도 30a는 구체적으로 HER2 대 HER3 비가 중앙보다 더 높거나 제75 백분위보다 더 높은 환자에 대한 카플란 마이어 (Kaplan Meyer) 플롯을 사용하여 실시예 1에 대한 HER2:HER3 비에 의한 PFS를 평가한다.
도 30b는 구체적으로 HER2 대 HER3 비가 중앙보다 더 높거나 제75 백분위보다 더 높은 환자에 대해 카플란 마이어 플롯을 사용하는 실시예 1에 대한 HER2:HER3 비에 의한 PFS의 업데이트 도면이다.
도 31a는 또한 실시예 1로부터의 HER2:HER3 비 4분위 하위군에 의한 PFS를 평가한다.
도 31b는 HER2/HER3 4분위 재발성 난소암에 의한 PFS 분석의 다른 요약도이다.
도 32는 실시예 3에 설명된 바와 같이 치료된 각각 HER3 수준이 중앙 미만인 및 중앙과 같거나 이를 초과하는 난소암의 대상에 대한 PFS에 대한 카플란-마이어 플롯을 보여준다.
도 33은 HER3 수준이 중앙 미만인 및 중앙과 같거나 이를 초과하는 환자군에서 화학요법 또는 페르투주맙으로 치료한, 난소암의 대상에 대한 PFS 카플란 마이어 플롯을 보여준다.
도 34는 각각 중앙 미만인 및 중앙과 같거나 이를 초과하는 HER2/HER3 비에 대해 페르투주맙 및 화학요법으로 또는 페르투주맙 단독으로 치료한 난소암의 대상에 대한 PFS 카플란 마이어 플롯을 보여준다.
도 35는 각각 중앙 미만인 및 중앙과 같거나 이를 초과하는 HER2/HER3 비에 대해 화학요법 또는 페르투주맙으로 치료한, 난소암의 대상에 대한 PFS 카플란 마이어 플롯을 보여준다.
I. 정의
"HER 수용체"는 HER 수용체 패밀리에 속하는 수용체 단백질 티로신 키나제이고, EGFR, HER2, HER3 및 HER4 수용체를 포함한다. HER 수용체는 일반적으로 HER 리간드에 결합할 수 있고/있거나 다른 HER 수용체 분자와 이량체화할 수 있는 세포외 도메인; 친지질 막횡단 도메인; 보존된 세포내 티로신 키나제 도메인; 및 인산화될 수 있는 복수의 티로신 잔기를 갖는 카르복실 말단 신호전달 도메인을 포함할 것이다. HER 수용체는 "천연 서열" HER 수용체 또는 그의 "아미노산 서열 변이체"일 수 있다. 바람직하게는, HER 수용체는 천연 서열 인간 HER 수용체이다.
용어 "ErbB1", "HER1", "표피 성장인자 수용체" 및 "EGFR"은 본원에서 상호 교환가능하게 사용되고, 그의 자연 발생 돌연변이체 형태 (예를 들어 [Humphrey et al. PNAS (USA) 87:4207-4211 (1990)]에 제시된 결실 돌연변이체 EGFR)를 포함하여 예를 들어 문헌 [Carpenter et al. Ann. Rev. Biochem. 56:881-914 (1987)]에 개시된 EGFR을 나타낸다. erbB1은 EGFR 단백질 산물을 코딩하는 유전자를 나타낸다.
표현 "ErbB2" 및 "HER2"는 본원에서 상호 교환가능하게 사용되고, 예를 들어 문헌 ([Semba et al., PNAS (USA) 82:6497-6501 (1985)] 및 [Yamamoto et al. Nature 319:230-234 (1986)]에 기재된 인간 HER2 단백질 (Genebank 기탁 번호 X03363)을 나타낸다. 용어 "erbB2"는 인간 ErbB2를 코딩하는 유전자를 나타내고, "neu"는 래트 p185neu를 코딩하는 유전자를 나타낸다. 바람직한 HER2는 천연 서열 인간 HER2이다.
본원에서, "HER2 세포외 도메인" 또는 "HER2 ECD"는 그의 단편을 포함하여, 세포막에 앵커링되거나 순환되는 세포 외부에 존재하는 HER2의 도메인을 나타낸다. 한 실시태양에서, HER2의 세포외 도메인은 4개의 도메인: 즉, "도메인 I" (약 1-195의 아미노산 잔기; 서열 19), "도메인 II" (약 196-319의 아미노산 잔기; 서열 20), "도메인 III" (약 320-488의 아미노산 잔기; 서열 21) 및 "도메인 IV" (약 489-630의 아미노산 잔기; 서열 22) (잔기 넘버링은 신호 펩티드를 제외함)를 포함할 수 있다 ([Garrett et al. Mol. Cell. 11: 495-505 (2003)], [Cho et al. Nature 421: 756-760 (2003)], [Franklin et al. Cancer cell 5:317-328 (2004)], 및 [Plowman et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 90:1746-1750 (1993)]과 본원의 도 1 참조).
"ErbB3" 및 "HER3"은 예를 들어 미국 특허 5,183,884 및 5,480,968과 문헌 [Kraus et al. PNAS (USA) 86:9193-9197 (1989)]에 기재된 수용체 폴리펩티드를 나타낸다.
용어 "ErbB4" 및 "HER4"는 본원에서 예를 들어 1999년 4월 22일 공개된 WO99/19488에 개시된 그의 이소형을 포함한, 예를 들어 유럽 특허 출원 599,274; 문헌 ([Plowman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:1746-1750 (1993)]; 및 [Plowman et al., Nature, 366:473-475 (1993)])에 개시된 수용체 폴리펩티드를 나타낸다.
"HER 리간드"는 HER 수용체에 결합하고/하거나 활성화시키는 폴리펩티드를 의미한다. 본원에서 특히 중요한 HER 리간드는 천연 서열 인간 HER 리간드, 예를 들어 표피 성장인자 (EGF) (Savage et al., J. Biol. Chem. 247:7612-7621 (1972)); 형질전환 성장 인자 알파 (TGF-α) (Marquardt et al., Science 223:1079-1082 (1984)); 신경초종 또는 각질세포 자가분비 성장인자로도 알려진 암피레굴린 ([Shoyab et al. Science 243: 1074-1076 (1989)]; [Kimura et al. Nature 348:257-260 (1990)]; 및 [Cook et al. Mol Cell Biol 11:2547-2557 (1991)]); 베타셀룰린 ([Shing et al., Science 259:1604-1607 (1993)]; 및 [Sasada et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 190:1173 (1993)]); 헤파린 결합 표피 성장인자 (HB-EGF) (Higashiyama et al., Science 251:936-939 (1991)); 에피레굴린 ([Toyoda et al., J. Biol. Chem. 270:7495-7500 (1995)]; 및 [Komurasaki et al. Oncogene 15:2841-2848 (1997)]); 헤레굴린 (아래 참조); 뉴레굴린-2 (NRG-2) (Carraway et al., Nature 387:512-516 (1997)); 뉴레굴린-3 (NRG-3) (Zhang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 94:9562-9567 (1997)); 뉴레굴린-4 (NRG-4) (Harari et al. Oncogene 18:2681-89 (1999)) 또는 크립토 (CR-1) (Kannan et al. J. Biol Chem. 272(6):3330-3335 (1997))이다. EGFR에 결합하는 HER 리간드는 EGF, TGF-α, 암피레굴린, 베타셀룰린, HB-EGF 및 에피레굴린을 포함한다. HER3에 결합하는 HER 리간드는 헤레굴린을 포함한다. HER4에 결합할 수 있는 HER 리간드는 베타셀룰린, 에피레굴린, HB-EGF, NRG-2, NRG-3, NRG-4 및 헤레굴린을 포함한다.
본원에서 사용되는 "헤레굴린" (HRG)은 미국 특허 5,641,869 또는 문헌 [Marchionni et al., Nature, 362:312-318 (1993)]에 개시된 바와 같은 헤레굴린 유전자 산물에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 의미한다. 헤레굴린의 예는 헤레굴린-α, 헤레굴린-β1, 헤레굴린-β2 및 헤레굴린-β3 (Holmes et al., Science, 256:1205-1210 (1992); 및 미국 특허 5,641,869); neu 분화 인자 (NDF) (Peles et al. Cell 69: 205-216 (1992)); 아세틸콜린 수용체-유도 활성 (ARIA) (Falls et al. Cell 72:801-815 (1993)); 아교세포 성장인자 (GGF) (Marchionni et al., Nature, 362:312-318 (1993)); 감각 및 운동 뉴런 유도 인자 (SMDF) (Ho et al. J. Biol Chem. 270:14523-14532 (1995)); γ-헤레굴린 (Schaefer et al. Oncogene 15:1385-1394 (1997))를 포함한다.
본원에서 "HER 이량체"는 적어도 2개의 HER 수용체를 포함하는 비공유 회합된 이량체이다. 그러한 복합체는 2개 이상의 HER 수용체를 발현하는 세포가 HER 리간드에 노출될 때 형성될 수 있고, 면역침전에 의해 분리되고 예를 들어 문헌 [Sliwkowski et al., J. Biol. Chem., 269(20): 14661-14665 (1994)]에 기재된 바와 같이 SDS-PAGE에 의해 분석될 수 있다. 다른 단백질, 예를 들어 시토킨 수용체 서브유닛 (예를 들어 gp130)이 이량체와 회합할 수 있다. 바람직하게는, HER 이량체는 HER2를 포함한다.
본원에서 "HER 이종이량체"는 적어도 2개의 상이한 HER 수용체를 포함하는 비공유 회합된 이종이량체, 예를 들어 EGFR-HER2, HER2-HER3 또는 HER2-HER4 이종이량체이다.
"HER 억제제"는 HER 활성화 또는 기능을 저해하는 물질이다. HER 억제제의 예는 HER 항체 (예를 들어 EGFR, HER2, HER3 또는 HER4 항체); EGFR-표적화 약물; 소분자 HER 길항제; HER 티로신 키나제 억제제; HER2 및 EGFR 이중 티로신 키나제 억제제, 예를 들어 라파티닙/GW572016; 안티센스 분자 (예를 들어, WO2004/87207 참조); 및/또는 하류의 신호전달 분자, 예를 들어 MAPK 또는 Akt에 결합하거나 그의 기능을 저해하는 물질 (도 5 참조)을 포함한다. 바람직하게는, HER 억제제는 HER 수용체에 결합하는 항체 또는 소분자이다.
"HER 이량체화 억제제"는 HER 이량체 또는 HER 이종이량체의 형성을 억제하는 물질이다. 바람직하게는, HER 이량체화 억제제는 HER2 이량체화 억제제이고/이거나 HER 이종이량체화를 억제한다. 바람직하게는, HER 이량체화 억제제는 항체, 예를 들어 그의 이종이량체 결합 부위에서 HER2에 결합하는 항체이다. 본원에서 가장 바람직한 HER 이량체화 억제제는 페르투주맙 또는 MAb 2C4이다. HER2의 이종이량체 결합 부위에 대한 2C4의 결합을 도 4에 예시한다. HER 이량체화 억제제의 다른 예는 EGFR에 결합하고 하나 이상의 다른 HER 수용체와 그의 이량체화를 억제하는 항체 (예를 들어, 활성화되거나 "매이지 않은 (untethered)" EGFR에 결합하는 EGFR 모노클로날 항체 806, MAb 806 (Johns et al., J. Biol. Chem. 279(29):30375-30384 (2004) 참조)); HER3에 결합하고 하나 이상의 다른 HER 수용체와 그의 이량체화를 억제하는 항체; HER4에 결합하고 하나 이상의 다른 HER 수용체와 그의 이량체화를 억제하는 항체; 펩티드 이량체화 억제제 (미국 특허 6,417,168); 안티센스 이량체화 억제제 등을 포함한다.
"HER2 이량체화 억제제"는 HER2를 포함하는 이량체 또는 이종이량체의 형성을 억제하는 물질이다.
"HER 항체"는 HER 수용체에 결합하는 항체이다. 임의로, HER 항체는 HER 활성화 또는 기능을 추가로 저해한다. 바람직하게는, HER 항체는 HER2 수용체에 결합한다. 본원에서 특히 중요한 HER2 항체는 페르투주맙이다. HER2 항체의 다른 예는 트라스투주맙이다. EGFR 항체의 예는 세툭시맙 및 ABX0303을 포함한다.
"HER 활성화"는 임의의 하나 이상의 HER 수용체의 활성화 또는 인산화를 나타낸다. 일반적으로, HER 활성화는 신호 전달 (예를 들어 HER 수용체 또는 기질 폴리펩티드 내의 티로신 잔기를 인산화시키는 HER 수용체의 세포내 키나제 도메인에 의해 유도되는)을 야기한다. HER 활성화는 관심있는 HER 수용체를 포함하는 HER 이량체에 대한 HER 리간드 결합에 의해 매개될 수 있다. HER 이량체에 대한 HER 리간드 결합은 이량체 내의 하나 이상의 HER 수용체의 키나제 도메인을 활성화시킬 수 있고, 이에 의해 하나 이상의 HER 수용체 내의 티로신 잔기의 인산화 및/또는 추가의 기질 폴리펩티드(들), 예를 들어 Akt 또는 MAPK 세포내 키나제 내의 티로신 잔기의 인산화를 야기한다 (예를 들어 도 5 참조).
"인산화"는 단백질, 예를 들어 HER 수용체, 또는 그의 기질에 대한 하나 이상의 포스페이트기(들)의 첨가를 나타낸다.
"HER 이량체화를 억제하는" 항체는 HER 이량체의 형성을 억제하거나 저해하는 항체이다. 바람직하게는, 그러한 항체는 HER2에 그의 이종이량체 결합 부위에서 결합한다. 본원에서 가장 바람직한 이량체화 억제 항체는 페르투주맙 또는 MAb 2C4이다. HER2의 이종이량체 결합 부위에 대한 2C4의 결합을 도 4에 예시한다. HER 이량체화를 억제하는 항체의 다른 예는 EGFR에 결합하고 하나 이상의 다른 HER 수용체와 그의 이량체화를 억제하는 항체 (예를 들어, 활성화되거나 "매이지 않은" EGFR에 결합하는 EGFR 모노클로날 항체 806, MAb 806 (Johns et al., J. Biol. Chem. 279(29):30375-30384 (2004) 참조)); HER3에 결합하고 하나 이상의 다른 HER 수용체와 그의 이량체화를 억제하는 항체; 및 HER4에 결합하고 하나 이상의 다른 HER 수용체와 그의 이량체화를 억제하는 항체를 포함한다.
"트라스투주맙보다 더 효과적으로 HER 수용체의 리간드 활성화를 차단하는" 항체는 트라스투주맙보다 더 효과적으로 (예를 들어, 적어도 약 2배 더 효과적으로) HER 수용체(들) 또는 HER 이량체(들)의 HER 리간드 활성화를 감소 또는 제거하는 것이다. 바람직하게는, 그러한 항체는 적어도 뮤린 모노클로날 항체 2C4 또는 그의 Fab 단편만큼, 또는 페르투주맙 또는 그의 Fab 단편만큼 효과적으로 HER 수용체의 HER 리간드 활성화를 차단한다. HER 수용체의 리간드 활성화를 차단하는 항체의 능력은 HER 이량체의 직접 연구에 의해, 또는 HER 이량체화에 기인한 HER 활성화 또는 하류 신호전달의 평가에 의해, 및/또는 항체-HER2 결합 부위의 평가 등에 의해 평가할 수 있다. 트라스투주맙보다 더 효과적으로 HER 수용체의 리간드 활성화를 억제하는 능력을 갖는 항체에 대한 스크리닝을 위한 분석은 문헌 [Agus et al. Cancer Cell 2: 127-137 (2002)]과 WOO1/00245 (Adams et al.)에 기재되어 있다. 단지 예로서, 예를 들어 HER 이량체 형성의 억제 (예를 들어, 문헌 [Agus et al. Cancer Cell 2: 127-137 (2002)]의 도 1A-B; 및 WOO1/00245 참조); HER 이량체를 발현하는 세포의 HER 리간드 활성화의 감소 (예를 들어, WOO1/00245 및 문헌 [Agus et al. Cancer Cell 2: 127-137 (2002)]의 도 2A-B); HER 이량체를 발현하는 세포에 대한 HER 리간드 결합의 차단 (예를 들어, WOO1/00245 및 문헌 [Agus et al. Cancer Cell 2: 127-137 (2002)]의 도 2E); HER 리간드의 존재 (또는 부재) 하에 HER 이량체를 발현하는 암세포 (예를 들어 MCF7, MDA-MD-134, ZR-75-1, MD-MB-175, T-47D 세포)의 세포 성장 억제 (예를 들어, WOO1/00245 및 문헌 [Agus et al. Cancer Cell 2: 127-137 (2002)]의 도 3A-D); 하류 신호전달의 억제 (예를 들어, HRG-의존성 AKT 인산화의 억제 또는 HRG- 또는 TGF-α-의존성 MAPK 인산화의 억제) (WOO1/00245 및 문헌 [Agus et al. Cancer Cell 2: 127-137 (2002)]의 도 2C-D 참조)에 대해 평가할 수 있다. 또한, 항체-HER2 결합 부위의 연구, 예를 들어 HER2에 결합된 항체의 구조 또는 모델, 예를 들어 결정 구조의 평가에 의해 항체가 HER 이량체화를 억제하는지를 평가할 수 있다 (예를 들어, [Franklin et al. Cancer Cell 5:317-328 (2004)] 참조).
HER2 상의 "이종이량체 결합 부위"는 그와의 이량체 형성시에 EGFR, HER3 또는 HER4의 세포외 도메인 내의 구역에 접촉하거나 그 구역과 접속되는 HER2의 세포외 도메인 내의 구역을 의미한다. 상기 구역은 HER2의 도메인 II에서 발견된다 (Franklin et al. Cancer Cell 5:317-328 (2004)).
HER2 항체는 트라스투주맙보다 더 효과적으로 (예를 들어 적어도 2배 더 효과적으로) "HRG-의존성 AKT 인산화"를 억제하고/하거나 "HRG- 또는 TGF-α-의존성 MAPK 인산화"를 억제할 수 있다 (예로서 문헌 [Agus et al. Cancer Cell 2: 127-137 (2002)] 및 WO01/00245 참조).
HER2 항체는 페르투주맙처럼 "HER2 외측 도메인 (ectodomain) 절단을 억제하지 않는" 것일 수 있다 (Molina et al. Cancer Res. 61:4744-4749 (2001)). 그 반면에 트라스투주맙은 HER2 외측 도메인 절단을 억제할 수 있다.
HER2의 "이종이량체 결합 부위에 결합하는" HER2 항체는 도메인 II의 잔기에 결합하고 (임의로 또한 HER2 세포외 도메인의 다른 도메인, 예를 들어 도메인 I 및 III의 잔기에도 결합하고), HER2-EGFR, HER2-HER3 또는 HER2-HER4 이종이량체의 형성을 적어도 일정 정도로 입체적으로 방해할 수 있다. 문헌 [Franklin et al. Cancer Cell 5:317-328 (2004)]에서는 RCSB 단백질 데이타 뱅크 (ID 코드 IS78)에 기탁된 HER2-페르투주맙 결정 구조를 특성화하였고, 이는 HER2의 이종이량체 결합 부위에 결합하는 예시적인 항체를 제시하고 있다.
HER2의 "도메인 II에 결합하는" 항체는 도메인 II의 잔기 및 임의로 HER2의 다른 도메인(들), 예를 들어 도메인 I 및 III의 잔기에 결합한다. 바람직하게는, 도메인 II에 결합하는 항체는 HER2의 도메인 I, II 및 III 사이의 연결부에 결합한다.
단백질 "발현"은 유전자 내에 코딩된 정보가 메신저 RNA (mRNA)로, 이어서 단백질로 전환되는 것을 나타낸다.
본원에서, 관심있는 단백질 (예를 들어 HER3 및/또는 HER2)을 "발현하는" 샘플 또는 세포는 단백질을 코딩하는 mRNA 또는 그의 단편을 포함한 단백질이 샘플 또는 세포 내에 존재하는 것으로 결정된 것이다.
암의 종류에서 "HER3 발현에 대한 중앙 수준 미만의 수준으로 HER3을 발현하는" 샘플, 세포, 종양 또는 암은 HER3 발현의 수준이 그 종류의 암에 대해 당업자가 "저 HER3 수준"으로 간주하는 것이다. 일반적으로, 그러한 수준은 동일한 암 종류의 샘플, 세포, 종양 또는 암의 집단에서 HER3 수준에 비해 약 0 내지 약 50％ 미만일 것이다. 예를 들어, 중앙 발현 수준에 도달하도록 사용되는 집단은 전반적으로 난소암 샘플, 또는 그의 하위군, 예를 들어 화학요법 내성 난소암, 백금 내성 난소암과 진행성, 불응성 또는 재발성 난소암일 수 있다. 본원에서 실시예는 중앙 발현 수준이 결정될 수 있는 방식을 입증한다. 이는 발현의 절대값을 구성할 수 있다. 따라서, 본원의 도 17을 참고하여, 낮은 수준으로 HER3을 발현하는 것으로 간주되는 백금 내성 난소암 환자에 대한 컷오프는 약 2.8 이하 (제60 백분위 미만); 약 2.41 이하 (제55 백분위 미만); 약 2.28 이하 (제50 백분위 미만); 약 1.88 이하 (제45 백분위 미만); 약 1.71 이하 (제40 백분위 미만); 약 1.57 이하 (제35 백분위 미만); 약 1.4 이하 (제30 백분위 미만); 약 1.19 이하 (제25 백분위 미만); 약 0.99 이하 (제20 백분위 미만) 등일 수 있다. 상기 절대값은 명시된 분석 조건 하의 분석, 예를 들어 본원에 개시된 qRT-PCR, 가장 바람직하게는 실시예 1에서와 같은 qRT-PCR 분석으로 정량될 것이다. 바람직하게는, HER3 발현의 수준은 제50 백분위 미만, 가장 바람직하게는 제30 또는 제25 백분위 미만이다.
표현 "HER2:HER3" 또는 "HER2 대 HER3"은 본원에서 샘플, 세포, 종양 또는 암 내의 HER3의 발현 수준과 비교한 HER2의 발현 수준을 나타낸다. 상기 발현 수준(들)은 본원에 개시된 것과 같은 다양한 상이한 기술을 이용하여 정량할 수 있다. 이것은 HER2 발현 대 HER3 발현의 비로서 계산될 수 있지만, 본 발명에서는 본원에서 요법을 위한 환자를 선택하기 위해 HER2 및 HER3의 수준을 평가하는 다양한 다른 방식, 예를 들어 비제한적으로 그들의 HER2 및/또는 HER3의 발현이 특정 컷오프 초과 또는 미만인 경우에 환자가 선택되는 결정 나무 (decision tree)를 사용하는 것 등을 고려한다. HER2 대 HER3을 비교하는 그러한 다양한 다른 수단은 본원에서 구문 "HER2:HER3" 또는 "HER2 대 HER3"에 포함된다.
암의 종류에서 "HER2:HER3 발현에 대해 제25 백분위를 초과하는 수준으로 HER2:HER3을 발현하는" 샘플, 세포, 종양 또는 암은 HER3 발현에 상대적인 HER2 발현의 비가 그 종류의 암에 대해 "저 HER2:HER3 수준"이 아닌 것이다. 바람직하게는, 그러한 수준은 동일한 암 종류의 샘플, 세포, 종양 또는 암의 집단에서의 HER2:HER3 수준에 비해 약 25％ 초과 내지 약 100％일 것이다. 예를 들어, 그러한 발현 수준에 도달하도록 사용되는 집단은 전반적으로 난소암 샘플, 또는 그의 하위군, 예를 들어 화학요법 내성 난소암, 백금 내성 난소암과 진행성, 불응성 또는 재발성 난소암일 수 있다. 본원에서 실시예는 백분위 발현 수준이 결정될 수 있는 방식을 입증한다. 한 실시태양에서, HER2:HER3 수준은 발현의 절대값을 구성한다. 따라서, 본원의 도 29를 참고하면, 상기 수준으로 HER2:HER3을 발현하는 백금 내성 난소암 환자에 대한 컷오프는 약 0.82 이상 (제25 백분위 초과); 약 0.90 이상 (제30 백분위 초과); 약 1.06 이상 (제35 백분위 초과); 약 1.13 이상 (제40 백분위 초과); 약 1.26 이상 (제45 백분위 초과); 약 1.53 이상 (제50 백분위 초과); 약 1.70 이상 (제55 백분위 초과); 약 1.86 이상 (제60 백분위 초과); 약 2.15 이상 (제65 백분위 초과); 약 2.49 이상 (제70 백분위 초과); 약 2.62 이상 (제75 백분위 초과); 약 2.92 이상 (제80 백분위 초과) 등일 수 있다. 그러한 절대값은 명시된 분석 조건 하에 분석, 예를 들어 본원에 개시된 qRT-PCR, 가장 바람직하게는 실시예 1에서와 같이 qRT-PCR 분석으로 정량될 것이다. 한 실시태양에서, HER2:HER3 발현의 수준은 제50 백분위를 초과하고, 바람직하게는 제70 백분위를 초과하고, 가장 바람직하게는 제75 백분위를 초과한다. 그의 암이 본원에서 설명되는 HER2:HER3을 수준으로 발현하는 환자는 HER2를 과다발현할 수 있거나 과다발현하지 않을 수 있다.
"중합효소 연쇄 반응" 또는 "PCR"의 기술은 본원에서 사용될 때 일반적으로 미소량의 핵산, RNA 및/또는 DNA의 특정 조각이 미국 특허 4,683,195 (1987년 7월 28일 등록)에 설명된 바와 같이 증폭되는 절차를 나타낸다. 일반적으로, 올리고뉴클레오티드 프라이머가 설계될 수 있도록 관심있는 구역의 단부들 또는 이를 넘어선 부분으로부터의 서열 정보가 이용가능할 필요가 있고; 이들 프라이머는 서열이 증폭시킬 주형의 반대편 가닥에 동일하거나 유사할 것이다. 2개의 프라이머의 5' 말단 뉴클레오티드는 증폭된 물질의 단부와 일치할 수 있다. PCR은 특정 RNA 서열, 총 게놈 DNA로부터의 특정 DNA 서열, 및 총 세포성 RNA로부터 전사된 cDNA, 박테리오파지 또는 플라스미드 서열 등을 증폭시키기 위해 사용될 수 있다 (일반적으로 [Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol, 51: 263 (1987)]; [Erlich, ed., PCR Technology (Stockton Press, NY, 1989)] 참조). 본원에서 사용될 때, PCR은 프라이머로서 공지의 핵산 (DNA 또는 RNA)을 사용하는 것을 포함하는 핵산 시험 샘플을 증폭시키기 위한 핵산 중합효소 반응 방법의 하나의 예이지만 유일한 예는 아닌 것으로 간주되고, 특정 조각의 핵산을 증폭 또는 생성하기 위해 또는 특정 핵산에 상보성인 특정 조각의 핵산을 증폭 또는 생성하기 위해 핵산 중합효소를 이용한다.
"정량적 실시간 중합효소 연쇄 반응" 또는 "qRT-PCR"은 PCR 산물의 양이 PCR 반응에서 각각의 단계에서 측정되는 PCR의 한 형태를 나타낸다. 상기 기술은 문헌 ([Cronin et al., Am. J. Pathol. 164(1):35-42 (2004)]; 및 [Ma et al., Cancer Cell 5:607-616 (2004)])을 포함한 다양한 문헌에 설명되어 있다.
용어 "마이크로어레이"는 기판 상의 혼성화가능한 어레이 요소, 바람직하게는 폴리뉴클레오티드 프로브의 규칙적인 배열을 나타낸다.
용어 "폴리뉴클레오티드"는 단수 또는 복수로 사용될 때 일반적으로 임의의 폴리리보뉴클레오티드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오티드를 나타내고, 이는 변형되지 않은 RNA 또는 DNA 또는 변형된 RNA 또는 DNA일 수 있다. 따라서, 예를 들어, 본원에서 규정된 폴리뉴클레오티드는 비제한적으로 단일 가닥 및 이중 가닥 DNA, 단일 가닥 및 이중 가닥 구역을 포함하는 DNA, 단일 가닥 및 이중 가닥 RNA, 및 단일 가닥 및 이중 가닥 구역을 포함하는 RNA, 및 단일 가닥 또는 보다 일반적으로, 이중 가닥이거나 단일 가닥 및 이중 가닥 구역을 포함할 수 있는 DNA 및 RNA를 포함하는 하이브리드 (hybrid) 분자를 포함한다. 또한, 용어 "폴리뉴클레오티드"는 본원에서 사용될 때 RNA 또는 DNA 또는 RNA와 DNA를 모두 포함하는 삼중 가닥 구역을 나타낸다. 그러한 구역 내의 가닥은 동일한 분자 또는 상이한 분자로부터 유래할 수 있다. 구역은 하나 이상의 분자 모두를 포함할 수 있지만, 보다 일반적으로 분자의 일부의 구역만을 포함한다. 삼중 나선 구역의 분자는 종종 올리고뉴클레오티드이다. 용어 "폴리뉴클레오티드"는 구체적으로 cDNA를 포함한다. 상기 용어는 하나 이상의 변형된 염기를 함유하는 DNA (cDNA 포함) 및 RNA를 포함한다. 따라서, 안정성 또는 다른 이유로 인해 변형된 백본을 갖는 DNA 또는 RNA는 "폴리뉴클레오티드"이고, 상기 용어는 본원에서 의도된다. 또한, 이노신과 같은 드문 (unusual) 염기 또는 삼중수소화 (tritiated) 염기와 같은 변형된 염기를 포함하는 DNA 또는 RNA가 본원에 규정된 용어 "폴리뉴클레오티드"에 포함된다. 일반적으로, 용어 "폴리뉴클레오티드"는 비변형된 폴리뉴클레오티드의 모든 화학적으로, 효소적으로 및/또는 대사적으로 변형된 형태뿐만 아니라 바이러스 및 세포 (단순 및 복합 세포 포함)의 특징적인 DNA 및 RNA의 화학적 형태를 포함한다.
용어 "올리고뉴클레오티드"는 비교적 짧은 폴리뉴클레오티드, 비제한적인 예를 들어 단일 가닥 데옥시리보뉴클레오티드, 단일 가닥 또는 이중 가닥 리보뉴클레오티드, RNA:DNA 하이브리드 및 이중 가닥 DNA를 나타낸다. 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 단일 가닥 DNA 프로브 올리고뉴클레오티드는 종종 예를 들어 상업적으로 이용가능한 자동화 올리고뉴클레오티드 합성기를 사용하여 화학적 방법에 의해 합성된다. 그러나, 올리고뉴클레오티드는 시험관내 재조합 DNA-매개 기술을 포함한 다양한 다른 방법에 의해 및 세포 및 유기체에서 DNA의 발현에 의해 제조할 수 있다.
구문 "유전자 증폭"은 특정 세포 또는 세포주에서 다수의 카피의 유전자 또는 유전자 단편이 형성되는 과정을 나타낸다. 중복된 구역 (증폭된 DNA의 스트레치)이 종종 "앰플리콘"으로서 바람직하다. 대체로, 생산된 메신저 RNA (mRNA)의 양은 또한 발현된 특정 유전자로 제조된 카피의 수에 비례하여 증가한다.
혼성화 반응의 "엄격성"은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있고, 일반적으로 프로브 길이, 세척 온도 및 염 농도에 따라 실험적으로 계산된다. 일반적으로, 프로브가 길수록 적절한 어닐링을 위해 더 높은 온도가 필요한 반면, 프로브가 짧으면 보다 낮은 온도가 필요하다. 혼성화는 일반적으로 상보성 가닥이 그의 융점 미만의 환경에 존재할 때 변성 DNA가 재어닐링되는 능력에 따라 결정된다. 프로브와 혼성화 서열 사이의 요구되는 동일성 정도가 클수록 사용될 수 있는 상대적 온도가 더 높다. 그 결과, 보다 높은 상대 온도는 반응 조건을 보다 엄격하게 만들고, 보다 낮은 온도는 덜 엄격하게 만드는 경향이 있다. 혼성화 반응의 엄격성의 추가의 상세한 내용 및 설명에 대해서는 문헌 [Ausubel et al.. Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers (1995)]을 참고한다.
본원에서 정의되는 "엄격한 조건" 또는 "고엄격성 조건"은 일반적으로 (1) 세척을 위해 낮은 이온 강도 및 높은 온도, 예를 들어 50℃의 0.015 M 염화나트륨/0.0015 M 시트르산나트륨/0.1％ 나트륨 도데실 술페이트를 사용하거나; (2) 혼성화 동안 변성제, 예를 들어 포름아미드, 예를 들어 50％ (v/v) 포름아미드 + 0.1％ 소 혈청 알부민/0.1％ Ficoll/O.1％ 폴리비닐피롤리돈/50 mM 인산나트륨 버퍼 (pH 6.5) + 750 mM 염화나트륨, 75 mM 시트르산나트륨 (42℃)을 사용하거나; (3) 42℃에서 0.2 x SSC (염화나트륨/시트르산나트륨) 및 55℃에서 50％ 포름아미드로 세척한 후, 55℃에서 EDTA 함유 0.1 x SSC로 이루어진 고엄격성 세척을 하는 50％ 포름아미드, 5 x SSC (0.75 M NaCl, 0.075 M 시트르산나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 6.8), 0.1％ 피로인산나트륨, 5x 덴하르트 (Denhardt) 용액, 초음파 처리된 연어 정자 DNA (50 ㎍/ml), 0.1％ SDS 및 10％ 덱스트란 술페이트 (42℃)를 사용한다.
"중등 엄격성 조건"은 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989]에 기재된 바와 같이 확인할 수 있고, 상기한 것보다 덜 엄격한 세척 용액 및 혼성화 조건 (예를 들어, 온도, 이온 강도 및 ％ SDS)의 사용을 포함한다. 중등 엄격성 조건의 예는 20％ 포름아미드, 5 x SSC (150 mM NaCl, 15 mM 시트르산삼나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 7.6), 5 x 덴하르트 용액, 10％ 덱스트란 술페이트 및 20 mg/ml 변성 전단 처리 연어 정자 DNA를 포함한 용액 중에서 37℃에서 밤새 인큐베이션에 이어, 약 37-50℃에서 1 x SSC를 사용하는 필터의 세척을 포함한다. 당업자는 프로브 길이 등과 같은 인자를 조정하기 위해 필요한 대로 온도, 이온 강도 등을 조정하는 방법을 알 것이다.
*"천연 서열" 폴리펩티드는 자연 발생하는 또는 대립유전자 변이체를 포함한, 자연에서 유도되는 폴리펩티드 (예를 들어, HER 수용체 또는 HER 리간드)와 동일한 아미노산 서열을 갖는 것이다. 그러한 천연 서열 폴리펩티드는 자연으로부터 단리할 수 있거나, 재조합 또는 합성 수단에 의해 제조할 수 있다. 따라서, 천연 서열 폴리펩티드는 자연 발생 인간 폴리펩티드, 뮤린 폴리펩티드, 또는 임의의 다른 포유동물종으로부터의 폴리펩티드의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
본원에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 구체적으로 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 적어도 2개의 무손상 항체로부터 형성된 다중특이적 항체 (예를 들어 이중특이적 항체), 및 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한 항체 단편을 포함한다.
"단리된" 항체는 그의 자연 환경의 성분으로부터 확인하고 분리 및/또는 회수된 것이다. 그의 자연 환경의 오염 성분은 항체의 연구, 진단 또는 치료 용도를 저해하는 물질이고, 효소, 호르몬 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 항체는 (1) 예를 들어 로우리 (Lowry) 방법에 의해 측정시에 항체의 95 중량％ 초과, 일부 실시태양에서 99 중량％ 초과 수준까지, (2) 예를 들어, 스피닝 컵 (spinning cup) 서열분석기를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개 잔기를 얻기 위해 충분한 정도까지, 또는 (3) 예를 들어, 쿠마시 (Coomassie) 블루 또는 은 염색을 사용하여 환원 또는 비환원 조건 하에 SDS-PAGE에 의해 균질할 때까지 정제된다. 단리된 항체는 항체의 자연 환경의 적어도 하나의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문에 재조합 세포 내의 계내 항체를 포함한다. 그러나, 통상적으로, 단리된 항체는 적어도 하나의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
"천연 항체"는 보통 2개의 동일한 경쇄 (L) 및 2개의 동일한 중쇄 (H)로 이루어진 약 150,000 달톤의 이종사량체 당단백질이다. 각각의 경쇄는 하나의 디술피드 공유결합에 의해 중쇄에 연결되는 한편, 디술피드 연결기의 수는 상이한 면역글로불린 이소형의 중쇄마다 상이하다. 또한, 각각의 중쇄 및 경쇄는 일정하게 이격된 사슬내 디술피드 다리를 갖는다. 각각의 중쇄는 한 말단에 가변 도메인 (VH)에 이어서 많은 불변 도메인을 갖는다. 각각의 경쇄는 한 말단에 가변 도메인 (VL)을 갖고, 그의 다른 말단에 불변 도메인을 갖고; 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 정렬되고, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 정렬된다. 특정 아미노산 잔기가 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 사이의 계면을 형성하는 것으로 생각된다.
항체의 "가변 구역" 또는 "가변 도메인"은 항체의 중쇄 또는 경쇄의 아미노-말단 도메인을 나타낸다. 중쇄의 가변 도메인은 "VH"로 언급할 수 있다. 경쇄의 가변 도메인은 "VL"로 언급할 수 있다. 이들 도메인은 일반적으로 항체의 최대 가변 부분이고, 항원 결합 부위를 함유한다.
용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 부분이 항체들 사이에 서열이 크게 상이하다는 사실을 나타내고, 그의 특정 항원에 대한 각각의 특정 항체의 결합 및 특이성에 사용된다. 그러나, 가변성은 항체의 가변 도메인 전체에 걸쳐 균등하게 분포되지 않는다. 가변성은 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 모두에서 초가변 구역 (HVR)으로 불리는 3개의 세그먼트에 집중된다. 가변 도메인의 보다 고도로 보존된 부분은 프레임워크 구역 (FR)으로 불린다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 루프 연결부를 형성하고 일부 경우에 베타-시트 구조의 일부를 형성하는 3개의 HVR에 의해 연결된 주로 베타-시트 입체형태를 취하는 4개의 FR 구역을 각각 포함한다. 각 사슬 내의 HVR은 FR 구역에 의해 매우 근접하게 함께 유지되고, 다른 사슬의 HVR과 함께 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다 (예를 들어 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Ed. National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)] 참조). 불변 도메인은 항원에 대한 항체의 결합에 직접 관여하지 않지만, 항체 의존성 세포 독성에서 항체의 참여와 같은 다양한 효과기 (effector) 기능을 나타낸다.
임의의 척추동물종으로부터의 항체 (면역글로불린)의 "경쇄"는 그들의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기준으로 카파 (κ) 및 람다 (λ)로 불리는 2개의 명백하게 구분되는 종류 중 하나로 분류될 수 있다.
그들의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 항체 (면역글로불린)는 상이한 클래스로 분류될 수 있다. 면역글로불린의 5가지 주요 클래스, 즉 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하고, 이들 중 몇몇은 서브클래스 (이소형), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가로 나누어질 수 있다. 상이한 클래스의 면역글로불린에 대응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 불린다. 상이한 클래스의 면역글로불린의 서브유닛 구조 및 3차원 입체형태는 잘 알려져 있고, 일반적으로 예를 들어 문헌 [Abbas et al. Cellular and Mol. Immunology, 4th ed. (W.B. Saunders, Co., 2000)]에 설명되어 있다. 항체는 항체와 하나 이상의 다른 단백질 또는 펩티드의 공유 또는 비공유 회합에 의해 형성된 보다 큰 융합 분자의 일부일 수 있다.
용어 "전장 항체", "무손상 항체" 및 "전체 항체"는 본원에서 상호 교환가능하게 사용되어 아래에 정의된 항체 단편이 아닌 그의 실질적으로 무손상 형태의 항체를 나타낸다. 상기 용어는 특히 Fc 구역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 나타낸다.
본원의 목적에서 "네이키드 (naked) 항체"는 세포독성 모이어티 또는 방사성 표지에 컨쥬게이팅되지 않은 항체이다.
"항체 단편"은 바람직하게는 그의 항원 결합 구역을 포함하는 무손상 항체의 일부를 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; 디아바디 (diabody); 선형 항체; 단일쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다.
항체를 파파인으로 분해하면 각각 단일 항원 결합 부위를 갖는, "Fab" 단편으로 불리는 2개의 동일한 항원 결합 단편, 및 나머지 "Fc" 단편 (그의 명칭은 쉽게 결정화되는 그의 능력을 반영한다)이 생성된다. 펩신 처리는 2개의 항원 결합 부위를 갖고 여전히 항원에 가교결합할 수 있는 F(ab')2 단편을 생성시킨다.
"Fv"는 완전한 항원 결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 한 실시태양에서, 2-사슬 Fv종은 긴밀한 비공유 회합 상태의 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 이루어진다. 단일쇄 Fv (scFv)종에서, 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인은 경쇄 및 중쇄가 2-사슬 Fv종에서와 유사한 "이량체" 구조로 회합할 수 있도록 가요성 펩티드 링커에 의해 공유 연결될 수 있다. 상기 형태에서, 각각의 가변 도메인의 3개의 HVR은 상호작용하여 VH-VL 이량체의 표면 상의 항원 결합 부위를 규정한다. 종합적으로, 6개의 HVR은 항체에 항원 결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 3개의 HVR만을 포함하는 Fv의 절반)도 전체 결합 부위보다 더 낮은 친화도이지만 항원을 인식하여 결합하는 능력을 갖는다.
Fab 단편은 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 포함하고, 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 또한 포함한다. Fab' 단편은 항체 힌지 구역으로부터 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에 몇개의 잔기가 부가된다는 점에서 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 본원에서 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)이 유리 티올기를 함유하는 Fab'에 대한 명칭이다. F(ab')2 항체 단편은 본래 그들 사이에 힌지 시스테인을 갖는 한 쌍의 Fab' 단편으로서 생성되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링도 당업계에 공지되어 있다.
"단일쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하고, 여기서 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 사슬로 존재한다. 일반적으로, scFv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합을 위한 요구되는 구조를 형성할 수 있도록 하는, VH 도메인과 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. scFv에 대해서는 문헌 [Pluckthuen in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York, 1994), pp. 269-315]을 참고한다. 본원에서 scFv 단편은 구체적으로 트루비온 (Trubion)에 양도된 US2005/0180970 A1과 US2005/0186216 A1에 개시된 바와 같은 "소모듈형 면역약품 (small modular immunopharmaceutical)" (SMIP)을 포함한다.
용어 "디아바디"는 2개의 항원 결합 부위를 갖는 항체 단편을 나타내고, 상기 단편은 동일한 폴리펩티드 사슬 (VH-VL) 내의 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다. 동일한 사슬 상의 2개의 도메인들 사이의 페어링을 허용하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인은 다른 사슬의 상보성 도메인과 페어링하여 2개의 항원 결합 부위를 생성하게 된다. 디아바디는 2가 또는 이중특이적일 수 있다. 디아바디는 예를 들어 EP 404,097; WO93/11161; 및 문헌 ([Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)] 및 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)])에 보다 상세히 기재되어 있다. 트리아바디 및 테트라바디도 문헌 [Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)]에 기재되어 있다.
본원에서 사용되는 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균질한 항체의 집단으로부터 수득한 항체를 나타내고, 즉, 집단을 구성하는 개별 항체들은 소량으로 존재할 수도 있는 가능한 돌연변이, 예를 들어 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 따라서, 변경 표현 "모노클로날"은 별개의 항체들의 혼합물이 아닌 것으로서 항체의 특징을 가리킨다. 특정 실시태양에서, 그러한 모노클로날 항체는 대개 표적에 결합하는 폴리펩티드 서열을 포함하는 항체를 포함하고, 여기서 표적-결합 폴리펩티드 서열은 다수의 폴리펩티드 서열로부터 단일 표적 결합 폴리펩티드 서열의 선택을 포함하는 과정에 의해 수득하였다. 예를 들어, 선택 과정은 복수의 클론, 예를 들어 하이브리도마 클론, 파지 클론 또는 재조합 DNA 클론의 풀 (pool)로부터의 특유한 클론의 선택일 수 있다. 선택된 표적 결합 서열은 예를 들어, 표적에 대한 친화도를 개선하고, 표적 결합 서열을 인간화하고, 세포 배양액에서 그의 생산을 개선하고, 생체 내에서 그의 면역원성을 감소시키고, 다중특이적 항체를 생성하는 등을 위해서 추가로 변경될 수 있고, 변경된 표적 결합 서열을 포함하는 항체도 본 발명의 모노클로날 항체임을 이해해야 한다. 대개 상이한 결정자 (에피토프)에 대해 작용하는 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제에 비해, 모노클로날 항체 제제의 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정자에 대해 작용한다. 그들의 특이성에 추가로, 모노클로날 항체 제제는 일반적으로 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않는 점에서 유리하다.
변경 표현 "모노클로날"은 항체의 실질적으로 균질한 집단으로부터 얻은 것으로서 항체의 특징을 가리키고, 임의의 특정 방법에 의한 항체 생산을 필요로 하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용될 모노클로날 항체는 예를 들어, 하이브리도마 방법 (예를 들어 [Kohler and Milstein, Nature, 256:495-97 (1975)]; [Hongo et al., Hybridoma, 14(3):253-260 (1995)]; [Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)]; [Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)]), 재조합 DNA 방법 (예를 들어 미국 특허 4,816,567 참조), 파지-디스플레이 기술 (예를 들어 [Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991)]; [Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991)]; [Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004)]; [Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004)]; [Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004)]; 및 [Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004)] 참조), 및 인간 면역글로불린 서열을 코딩하는 인간 면역글로불린 로커스 또는 유전자의 일부 또는 전부를 갖는 동물에서 인간 또는 인간-유사 항체를 생산하는 기술 (예를 들어 WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; [Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993)]; [Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993)]; [Bruggemann et al., Year in Immunol. 7:33 (1993)]; 미국 특허 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 및 5,661,016; [Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992)]; [Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994)]; [Morrison, Nature 368: 812-813 (1994)]; [Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996)]; [Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996)]; 및 [Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995)] 참조)을 포함하는 다양한 기술에 의해 제조할 수 있다.
본원에서 모노클로날 항체는 구체적으로 목적하는 생물학적 활성을 보이는 한, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부는 특정 종에서 유래하거나 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이고, 사슬(들)의 나머지는 다른 종에서 유래하거나 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 "키메라 (chimera)" 항체 및 상기 항체의 단편을 포함한다 (예를 들어 미국 특허 4,816,567; 및 [Morrison et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855 (1984)] 참조). 키메라 항체는 항체의 항원 결합 구역이 예를 들어, 짧은 꼬리 원숭이를 관심있는 항원으로 면역처리함으로써 생산된 항체로부터 유래하는 것인 PRIMATIZED(등록상표) 항체를 포함한다.
비인간 (예를 들어 쥐) 항체의 "인간화" 형태는 비인간 면역글로불린으로부터 유래하는 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 한 실시태양에서, 인간화 항체는 수여자의 HVR로부터의 잔기가 목적하는 특이성, 친화도 및/또는 능력을 갖는 비인간종 (공여 항체), 예를 들어 마우스, 래트, 토끼 또는 비인간 영장류의 HVR로부터의 잔기로 교체되는 것인 인간 면역글로불린 (수여 항체)이다. 일부 경우에, 인간 면역글로불린의 FR 잔기는 상응하는 비인간 잔기로 교체된다. 또한, 인간화 항체는 수여 항체 또는 공여 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 성능을 더욱 개선하기 위해 이루어질 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 하나, 일반적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비인간 면역글로불린의 것에 대응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 면역글로불린 서열의 것에 대응한다. 인간화 항체는 또한 임의로 적어도 일부의 면역글로불린 불변 구역 (Fc), 일반적으로 인간 면역글로불린의 Fc를 포함할 것이다. 보다 상세한 내용은 문헌 ([Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)]; [Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988)]; 및 [Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)])을 참고한다. 또한, 예를 들어 문헌 ([Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998)]; [Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995)]; [Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994)]; 및 미국 특허 6,982,321과 7,087,409를 참고한다.
인간화 HER2 항체는 본원에 참고로 명백하게 포함된 미국 특허 5,821,337의 표 3에 기재된 바와 같은 huMAb4D5-1, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 및 huMAb4D5-8 또는 트라스투주맙 (헤르셉틴(등록상표)); 인간화 520C9 (WO93/21319); 및 본원에 설명된 바와 같은 인간화 2C4 항체, 예를 들어 페르투주맙을 포함한다.
본원의 목적에서 "트라스투주맙", "헤르셉틴(등록상표)" 및 "huMAb4D5-8"은 각각 서열 15 및 16의 경쇄 및 중쇄 아미노산 서열을 포함하는 항체를 나타낸다.
본원에서 "페르투주맙" 및 "옴니타그™"는 각각 서열 13 및 14의 경쇄 및 중쇄 아미노산 서열을 포함하는 항체를 나타낸다.
트라스투주맙과 페르투주맙 기능의 차이는 도 6에 예시한다.
"인간 항체"는 인간에 의해 생산되고/되거나 본원에 개시된 임의의 인간 항체 제조 기술을 사용하여 제조된 항체에 대응하는 아미노산 서열을 갖는 항체이다. 상기 인간 항체의 정의는 비-인간 항원 결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 구체적으로 배제한다. 인간 항체는 당업계에 공지된 다양한 기술, 예를 들어 파지-디스플레이 라이브러리를 사용하여 생산할 수 있다 ([Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol, 227:381 (1991)]; [Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)]). 또한 인간 모노클로날 항체의 제조를 위해 문헌 ([Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p.77 (1985)]; [Boerner et al., J. Immunol, 147(1):86-95 (1991)])에 기재된 방법이 이용가능하다. 또한 문헌 [van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol, 5: 368-74 (2001)]을 참고한다. 인간 항체는, 항원 시험접종에 반응하여 항체를 생산하도록 변형되었지만 그의 내인성 로커스의 기능이 억제된 트랜스제닉 (transgenic) 동물, 예를 들어, 면역처리된 제노마우스 (xenomouse)에 항원을 투여함으로써 제조할 수 있다 (예를 들어, XENOMOUSE™ 기술에 관해서는 미국 특허 6,075,181과 6,150,584를 참고한다). 또한, 인간 B-세포 하이브리도마 기술을 통해 생성된 인간 항체에 관해서는 예를 들어 문헌 [Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)]을 참고한다.
"프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 본원에 규정되는 바와 같이 HVR 잔기 이외의 다른 가변 도메인 잔기이다.
용어 "카바트 (Kabat)에서와 같은 가변 도메인 잔기 넘버링" 또는 "카바트에서와 같은 아미노산 위치 넘버링" 및 그의 변형은 카바트 등의 상기 문헌에서 항체 편집 (compilation)의 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인에 사용된 넘버링 시스템을 나타낸다. 상기 넘버링 시스템을 이용하여, 실제 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FR 또는 HVR의 단축 또는 그 내부에 대한 삽입에 대응하는 보다 적은 또는 추가의 아미노산을 함유할 수 있다. 예를 들어, 중쇄 가변 도메인은 H2의 잔기 52 이후에 단일 아미노산 삽입 (카바트에 따른 잔기 52a), 및 중쇄 FR 잔기 82 이후에 삽입된 잔기 (예를 들어 카바트에 따른 잔기 82a, 82b 및 82c 등)를 포함할 수 있다. 잔기의 카바트 넘버링은 항체의 서열의 상동성의 구역을 "표준" 카바트 넘버링된 서열과 정렬시킴으로써 주어진 항체에 대해 결정될 수 있다.
본 명세서와 청구의 범위 전체에서, 가변 도메인 내의 잔기 (대략 경쇄의 잔기 1-107 및 중쇄의 잔기 1-113)를 언급할 때 카바트 넘버링 시스템이 일반적으로 사용된다 (예를 들어 [Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]).
"EU 넘버링 시스템" 또는 "EU 색인 (index)"은 면역글로불린 중쇄 불변 구역 내의 잔기를 언급할 때 일반적으로 사용된다 (예를 들어 명백하게 본원에 참고로 포함된 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]에 보고된 EU 색인 참조). 본원에서 달리 진술하지 않으면, 항체의 가변 도메인 내의 잔기 번호에 대한 언급은 카바트 넘버링 시스템에 의한 잔기 넘버링을 의미한다. 본원에서 달리 진술하지 않으면, 항체의 불변 도메인 내의 잔기 번호에 대한 언급은 EU 넘버링 시스템에 의한 잔기 넘버링을 의미한다 (예를 들어, 미국 특허 가출원 60/640,323, EU 넘버링에 대한 도면 참조).
"친화도 성숙" 항체는 변경(들)을 갖지 않는 모 항체에 비해, 항원에 대한 항체의 친화도를 개선시키는 그의 하나 이상의 CDR 내에 하나 이상의 변경을 갖는 항체이다. 한 실시태양에서, 친화도 성숙 항체는 표적 항원에 대한 나노몰 또는 심지어 피코몰의 친화도를 갖는다. 친화도 성숙 항체는 당업계에 공지된 특정 절차를 이용하여 생산할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992)]에서는 VH 및 VL 도메인 셔플링 (shuffling)에 의한 친화도 성숙을 설명하고 있다. HVR 및/또는 프레임워크 잔기의 무작위 돌연변이 유발이 예를 들어, 문헌 ([Barbas et al., Proc Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813 (1994)]; [Schier et al., Gene 169:147-155 (1995)]; [Yelton et al., J. Immunol. 155:1994-2004 (1995)]; [Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995)]; 및 [Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226:889-896 (1992)])에 기재되어 있다.
항체 "효과기 기능"은 항체의 Fc 구역 (천연 서열 Fc 구역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 구역)에 기인한 생물학적 활성을 나타내고, 항체 이소형에 따라 상이하다. 항체 효과기 기능의 예는 C1q 결합 및 보체 의존성 세포독성 (CDC); Fc 수용체 결합; 항체 의존성 세포 매개 세포독성 (ADCC); 포식작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어 B 세포 수용체)의 하향 조절; 및 B 세포 활성화를 포함한다.
용어 "Fc 구역"은 본원에서 천연 서열 Fc 구역 및 변이체 Fc 구역을 포함하는, 면역글로불린 중쇄의 C-말단 구역을 정의하도록 사용된다. 면역글로불린 중쇄의 Fc 구역의 경계는 변할 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 구역은 대체로 위치 Cys226 또는 Pro230의 아미노산 잔기로부터 그의 카르복실-말단으로 연장되도록 규정된다. Fc 구역의 C-말단 라이신 (EU 넘버링 시스템에 따른 잔기 447)은 예를 들어 항체의 생산 또는 정제 동안, 또는 항체의 중쇄를 코딩하는 핵산의 재조합 공학처리에 의해 제거될 수 있다. 따라서, 무손상 항체의 조성물은 모든 K447 잔기가 제거된 항체 집단, K447 잔기가 제거되지 않은 항체 집단, 및 K447 잔기가 존재하거나 존재하지 않는 항체들의 혼합물을 갖는 항체 집단을 포함할 수 있다.
본원에서 달리 나타내지 않으면, 면역글로불린 중쇄 내의 잔기의 넘버링은 카바트 등의 상기 문헌에서와 같은 EU 색인의 넘버링이다. "카바트에서와 같은 EU 색인"은 인간 IgG1 EU 항체의 잔기 넘버링을 나타낸다.
"기능성 Fc 구역"은 천연 서열 Fc 구역의 "효과기 기능"을 갖는다. 예시적인 "효과기 기능"은 C1q 결합; CDC; Fc 수용체 결합; ADCC; 포식작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어, B 세포 수용체; BCR)의 하향 조절 등을 포함한다. 상기 효과기 기능은 일반적으로 Fc 구역이 결합 도메인 (예를 들어, 항체 가변 도메인)과 결합할 것을 필요로 하고, 예를 들어, 본원의 정의에서 개시된 바와 같은 다양한 분석법을 사용하여 평가할 수 있다.
"천연 서열 Fc 구역"은 자연에서 발견되는 Fc 구역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 천연 서열 인간 Fc 구역은 천연 서열 인간 IgG1 Fc 구역 (비-A 및 A 동종이인자형 (allotype)); 천연 서열 인간 IgG2 Fc 구역; 천연 서열 인간 IgG3 Fc 구역; 및 천연 서열 인간 IgG4 Fc 구역과 그의 천연 발생 변이체를 포함한다.
"변이체 Fc 구역"은 적어도 하나의 아미노산 변형, 바람직하게는 하나 이상의 아미노산 치환(들)에 의해 천연 서열 Fc 구역의 것과 상이한 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 변이체 Fc 구역은 천연 서열 Fc 구역 또는 모 폴리펩티드의 Fc 구역에 비해 적어도 하나의 아미노산 치환, 예를 들어, 천연 서열 Fc 구역에서 또는 모 폴리펩티드의 Fc 구역에서 약 1 내지 약 10개의 아미노산 치환, 바람직하게는 약 1 내지 약 5개의 아미노산 치환을 갖는다. 변이체 Fc 구역은 본원에서 바람직하게는 천연 서열 Fc 구역 및/또는 모 폴리펩티드의 Fc 구역과 적어도 약 80％의 서열 상동성, 가장 바람직하게는 그와 적어도 약 90％ 상동성, 보다 바람직하게는 그와 적어도 약 95％ 상동성을 갖는다.
"Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 구역에 결합하는 수용체를 설명한다. 일부 실시태양에서, FcR은 천연 인간 FcR이다. 일부 실시태양에서, FcR은 IgG 항체 (감마 수용체)에 결합하는 것이고, FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 서브클래스의 수용체 (이들 수용체의 대립 유전자형 변이체 및 선택적 스플라이싱된 형태를 포함)를 포함한다. FcγRII 수용체는 FcγRIIA ("활성화 수용체") 및 FcγRIIB ("억제 수용체")를 포함하고, 이들은 그의 세포질 도메인이 주로 상이한 유사한 아미노산 서열을 갖는다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 그의 세포질 도메인 내에 면역수용체 티로신계 활성화 모티프 (ITAM)를 함유한다. 억제 수용체 FcγRIIB는 그의 세포질 도메인 내에 면역수용체 티로신계 억제 모티프 (ITIM)를 함유한다 (예를 들어 [Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)] 참조). FcR은 예를 들어 문헌 ([Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)]; [Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994)]; 및 [de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)]에 검토되어 있다. 미래에 확인될 것을 포함한 다른 FcR이 본원의 용어 "FcR"에 포함된다.
용어 "Fc 수용체" 또는 "FcR"은 또한 모체 IgG의 태아로의 전달 ([Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976)] 및 [Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)]) 및 면역글로불린의 항상성 조절에 대해 작용하는 신생아의 수용체인 FcRn을 포함한다. FcRn에 대한 결합을 측정하는 방법은 공지되어 있다 (예를 들어 문헌 ([Ghetie and Ward., Immunol. Today 18(12):592-598 (1997)]; [Ghetie et al., Nature Biotechnology, 15(7):637-640 (1997)]; [Hinton et al., J. Biol. Chem. 279(8):6213-6216 (2004)]; WO 2004/92219 (Hinton et al.) 참조).
인간 FcRn 고친화도 결합 폴리펩티드의 생체내 인간 FcRn에 대한 결합 및 혈청 반감기는 예를 들어, 인간 FcRn을 발현하는 트랜스제닉 마우스 또는 형질감염된 인간 세포주에서, 또는 변이체 Fc 구역을 갖는 폴리펩티드를 투여한 영장류에서 분석할 수 있다. WO 00/42072 (Presta)에는 FcR에 대한 결합이 개선되거나 감소된 항체 변이체가 기재되어 있다 (또한 예를 들어 [Shields et al. J. Biol. Chem. 9(2):6591-6604 (2001)] 참조).
"인간 효과기 세포"는 하나 이상의 FcR을 발현하고 효과기 기능을 수행하는 백혈구이다. 특정 실시태양에서, 세포는 적어도 FcγRIII을 발현하고 ADCC 효과기 기능(들)을 수행한다. ADCC를 매개하는 인간 백혈구의 예는 말초혈 단핵 세포 (PBMC), 내추럴 킬러 (NK) 세포, 단핵구, 세포독성 T 세포 및 호중구를 포함한다. 효과기 세포는 천연 공급원, 예를 들어 혈액으로부터 단리할 수 있다.
"항체 의존성 세포 매개 세포독성" 또는 "ADCC"는 특정 세포독성 세포 (예를 들어 NK 세포, 호중구 및 대식세포) 상에 존재하는 Fc 수용체 (FcR) 상에 결합된 분비된 Ig가, 이들 세포독성 효과기 세포가 항원 보유 표적 세포에 특이적으로 결합한 후 세포독소로 표적 세포를 사멸시킬 수 있도록 하는 세포독성의 한 형태를 나타낸다. ADCC를 매개하는 1차 세포인 NK 세포는 FcγRIII만을 발현하는 반면, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다. 조혈세포 상의 FcR 발현은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92 (1991)]의 464 페이지의 표 3에 요약되어 있다. 관심있는 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해, 미국 특허 5,500,362 또는 5,821,337 또는 미국 특허 6,737,056 (Presta)에 기재된 바와 같은 시험관내 ADCC 분석을 수행할 수 있다. 그러한 분석에 유용한 효과기 세포는 PBMC 및 NK 세포를 포함한다. 별법으로 또는 추가로, 관심있는 분자의 ADCC 활성은 생체 내에서, 예를 들어 문헌 [Clynes et al., PNAS (USA) 95:652-656 (1998)]에 개시된 동물 모델에서 평가할 수 있다.
"보체 의존성 세포독성" 또는 "CDC"는 보체의 존재 하에 표적 세포의 용해를 나타낸다. 전통적인 보체 경로의 활성화는 보체 시스템의 제1 성분 (C1q)을 그들의 동족 (cognate) 항원에 결합된 항체 (적절한 서브클래스의)에 결합시킴으로써 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위해, 예를 들어 문헌 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)]에 기재된 CDC 분석을 수행할 수 있다. 변경된 Fc 구역 아미노산 서열 (변이체 Fc 구역을 갖는 폴리펩티드) 및 증가 또는 감소된 C1q 결합 능력을 갖는 폴리펩티드 변이체는 예를 들어 미국 특허 6,194,551 B1 및 WO 1999/51642에 기재되어 있다. 또한, 예를 들어 문헌 [Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)]을 참고한다.
용어 "Fc 구역-포함 항체"는 Fc 구역을 포함하는 항체를 나타낸다. Fc 구역의 C-말단 라이신 (EU 넘버링 시스템에 따른 잔기 447)은 예를 들어 항체의 정제 동안, 또는 항체를 코딩하는 핵산의 재조합 공학처리에 의해 제거될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 Fc 구역을 갖는 항체를 포함하는 조성물은 K447을 갖는 항체, 모든 K447 잔기가 제거된 항체, 또는 K447 잔기가 존재하거나 존재하지 않는 항체들의 혼합물을 포함할 수 있다.
용어 "주요 (main) 종 항체"는 본원에서 조성물 내의 정량적으로 주된 항체 분자인 조성물 내의 항체 구조를 나타낸다. 한 실시태양에서, 주요 종 항체는 HER2 항체, 예를 들어 HER2의 도메인 II에 결합하는 항체, HER 이량체화를 트라스투주맙보다 더 효과적으로 억제하는 항체, 및/또는 HER2의 이종이량체 결합 부위에 결합하는 항체이다. 본원에서 주요 종 항체의 바람직한 실시태양은 서열 3 및 4의 가변 경쇄 및 가변 중쇄 아미노산 서열을 포함하는 것, 가장 바람직하게는 서열 13 및 14의 경쇄 및 중쇄 아미노산 서열을 포함하는 것 (페르투주맙)이다.
"아미노산 서열 변이체" 항체는 본원에서 주요 종 항체와 상이한 아미노산 서열을 갖는 항체이다. 통상적으로, 아미노산 서열 변이체는 주요 종 항체와 적어도 약 70％의 상동성을 가질 것이고, 바람직하게는 이들은 주요 종 항체와 적어도 약 80％, 보다 바람직하게는 적어도 약 90％ 상동성일 것이다. 아미노산 서열 변이체는 주요 종 항체의 천연 아미노산 서열 내의 또는 그에 인접한 특정 위치에서 치환, 결실 및/또는 부가를 갖는다. 본원에서 아미노산 서열 변이체의 예는 산성 변이체 (예를 들어, 탈아미드화 항체 변이체), 염기성 변이체, 그의 하나 또는 2개의 경쇄 상에 아미노-말단 리더 (leader) 연장 (예를 들어 VHS-)을 갖는 항체, 그의 하나 또는 2개의 중쇄 상에 C-말단 라이신 잔기를 갖는 항체 등을 포함하고, 중쇄 및/또는 경쇄의 아미노산 서열에 대한 변이의 조합을 포함한다. 본원에서 특히 중요한 항체 변이체는 그의 하나 또는 2개의 경쇄 상에 아미노-말단 리더 연장을 포함하고, 임의로 주요 종 항체에 비해 다른 아미노산 서열 및/또는 글리코실화 차이를 추가로 포함하는 항체이다.
"글리코실화 변이체" 항체는 본원에서 그에 부착된 하나 이상의 탄수화물 모이어티가 주요 종 항체에 부착된 하나 이상의 탄수화물 모이어티와 상이한 항체이다. 글리코실화 변이체의 예는 본원에서 G0 올리고당 구조 대신에 G1 또는 G2 올리고당 구조가 그의 Fc 구역에 부착된 항체, 그의 1 또는 2개의 경쇄에 1 또는 2개의 탄수화물 모이어티가 부착된 항체, 항체의 1 또는 2개의 중쇄에 탄수화물이 부착되지 않은 항체 등과 글리코실화 변경의 조합을 갖는 항체를 포함한다.
항체가 Fc 구역을 갖는 경우에, 올리고당 구조는 예를 들어 잔기 299 (298, 잔기의 Eu 넘버링)에서 항체의 1 또는 2개의 중쇄에 부착될 수 있다. 페르투주맙에 대해, G0이 주된 올리고당 구조이고, G0-F, G-1, Man5, Man6, G1-1, G1(1-6), G1(1-3) 및 G2와 같은 다른 올리고당 구조는 페르투주맙 조성물에서 보다 적은 양으로 발견된다.
달리 나타내지 않으면, "G1 올리고당 구조"는 본원에서 G-1, G1-1, G1(1-6) 및 G1(1-3) 구조를 포함한다.
"아미노-말단 리더 연장"은 본원에서 항체의 임의의 하나 이상의 중쇄 또는 경쇄의 아미노-말단에서 존재하는 아미노-말단 리더 서열의 하나 이상의 아미노산 잔기를 나타낸다. 예시적인 아미노-말단 리더 연장은 항체 변이체의 하나 또는 두 경쇄 상에 존재하는 3개의 아미노산 잔기, VHS를 포함하거나 그로 이루어진다.
"탈아미드화" 항체는 그의 하나 이상의 아스파라긴 잔기가 예를 들어 아스파르트산, 숙신이미드 또는 이소-아스파르트산으로 유도체화된 항체이다.
용어 "암" 및 "암성"은 일반적으로 조절되지 않는 세포 성장의 특징을 갖는 포유동물의 생리학적 상태를 나타내거나 설명한다. "암 종류"는 본원에서 암의 특정 카테고리 또는 징후를 나타낸다. 그러한 암 종류의 예는 암종, 림프종, 모세포종 (속질모세포종 및 망막모세포종 포함), 육종 (지방육종 및 활막 세포 육종 포함), 신경내분비 종양 (카르시노이드 종양, 가스트린종, 및 섬세포암 포함), 중피종, 슈반세포종 (청신경종 포함), 수막종, 선암종, 흑색종 및 백혈병 또는 림프양 악성종양을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 그러한 암의 보다 특정한 예는 편평세포암 (예를 들어 편평상피 세포암), 소세포 폐암 (SCLC), 비-소세포 폐암 (NSCLC), 폐의 선암종 및 폐의 편평세포 암종을 포함한 폐암, 복막의 암, 간세포암, 위장암을 포함한 위암, 췌장암, 아교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간암, 유방암 (전이성 유방암 포함), 결장암, 직장암, 결장직장암, 자궁내막암 또는 자궁 암종, 침샘 암종, 신장암 또는 신암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종, 항문 암종, 음경 암종, 고환암, 식도암, 담관의 종양 및 두경부암과 임의의 상기 암의 하위형, 예를 들어 비제한적으로 그의 화학요법 내성, 백금 내성, 진행성, 불응성 및/또는 재발성 종류를 포함한다.
"HER 억제제에 반응할 수 있는 암 종류"는 HER 억제제, 예를 들어 HER2 항체 또는 소분자 억제제를 사용하여 치료할 때 그에 걸린 환자에서 본원에 상술한 것을 포함한 숙련된 종양학자에게 공지된 치료 유효성에 대한 임의의 기준에 따라, 그러나 특히 무진행 생존 (PFS) 및/또는 전체 생존 (OS)을 포함한 생존 측면에서 치료상 유효한 잇점을 보이는 암이다. 바람직하게는, 그러한 암은 난소암, 복막암, 난관암, 전이성 유방암 (MBC), 비-소세포 폐암 (NSCLC), 전립선암 및 결장직장암 중에서 선택된다. 가장 바람직하게는, 암은 난소암, 복막암 또는 난관암, 예를 들어 상기 암의 백금 내성 형태, 및 진행성, 불응성 또는 재발성 난소암이다.
"HER 이량체화 억제제에 반응할 수 있는 암 종류"는 HER 이량체화 억제제, 예를 들어 페르투주맙을 사용하여 치료할 때 그에 걸린 환자에서 본원에 상술한 것을 포함한 숙련된 종양학자에게 공지된 치료 유효성에 대한 임의의 기준에 따라, 그러나 특히 무진행 생존 (PFS) 및/또는 전체 생존 (OS)을 포함한 생존 측면에서 치료상 유효한 잇점을 보이는 암이다. 바람직하게는, 그러한 암은 난소암, 복막암, 난관암, 전이성 유방암 (MBC), 비-소세포 폐암 (NSCLC), 전립선암 및 결장직장암 중에서 선택된다. 가장 바람직하게는, 암은 난소암, 복막암 또는 난관암, 예를 들어 상기 암의 백금 내성 형태, 및 진행성, 불응성 또는 재발성 난소암이다.
"유효한 반응" 및 유사한 단어는 지정된 수준으로 HER3을 발현하지 않는 환자로부터의 반응보다 유의하게 더 높은 HER 이량체화 억제제, HER 억제제 또는 화학요법제에 대한 반응을 나타낸다.
"진행성" 암은 국소 침입 또는 전이에 의해 기원 부위 또는 장기 밖으로 확산된 암이다.
"불응성" 암은 항종양제, 예를 들어 화학요법제를 암 환자에게 투여함에도 불구하고 진행하는 암이다. 불응성 암의 예는 백금 불응성인 암이다.
"재발성" 암은 초기 치료에 대한 반응 후에 초기 부위에서 또는 먼 부위에서 재성장한 암이다.
본원에서 "환자"는 인간 환자이다. 환자는 "암 환자", 즉 하나 이상의 암의 증상으로 고통받거나 그러한 위험이 있는 환자일 수 있다.
"종양 샘플"은 본원에서 환자의 종양으로부터 유래하는, 또는 환자의 종양으로부터의 종양 세포를 포함하는 샘플이다. 본원에서 종양 샘플의 예는 종양으로부터 유래하거나 종양 유사 특성을 나타내는 종양 생검, 순환 종양 세포, 순환 혈장 단백질, 복수액, 일차 세포 배양액 또는 세포주, 및 보존된 종양 샘플, 예를 들어 포르말린-고정된, 파라핀-포매 종양 샘플 또는 동결된 종양 샘플을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
"고정된" 종양 샘플은 고정제를 사용하여 조직학상 보존된 것이다.
"포르말린-고정된" 종양 샘플은 고정제로서 포름알데히드를 사용하여 보존된 것이다.
"포매" 종양 샘플은 파라핀, 왁스, 셀로이딘 또는 수지와 같은 견고하고 일반적으로 단단한 매질로 에워싸인 것이다. 포매는 현미경 검사를 위한 또는 조직 마이크로어레이 (TMA)의 생성을 위한 얇은 절편의 절단을 가능하게 한다.
"파라핀-포매" 종양 샘플은 석유 유래의 고체 탄화수소의 정제된 혼합물로 에워싸인 것이다.
본원에서 "동결된" 종양 샘플은 동결되는 또는 동결된 종양 샘플을 나타낸다.
"HER 발현, 증폭 또는 활성화를 보이는" 암 또는 생물학적 샘플은 진단 시험에서, HER 수용체를 발현 (과다발현 포함)하고/하거나, HER 유전자를 증폭시키고/시키거나 HER 수용체의 활성화 또는 인산화를 나타내는 것이다.
"HER 수용체 과다발현 또는 증폭"을 갖는 암세포는 동일한 조직 종류의 비암성 세포에 비해 유의하게 더 높은 수준의 HER 수용체 단백질 또는 유전자를 갖는 것이다. 그러한 과다발현은 유전자 증폭에 의해 또는 증가된 전사 또는 번역에 의해 야기될 수 있다. HER 수용체 과다발현 또는 증폭은 세포의 표면에 존재하는 증가된 수준의 HER 단백질을 (예를 들어, 면역조직화학 분석; IHC을 통해) 평가함으로써 진단 또는 예후 분석에서 결정할 수 있다. 별법으로 또는 추가로, 예를 들어 형광 계내 혼성화 (FISH; 1998년 10월 공개된 WO98/45479 참조), 서던 (southern) 블로팅 또는 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 기술, 예를 들어 정량적 실시간 PCR (qRT-PCR)을 통해 세포에서 HER-코딩 핵산의 수준을 측정할 수 있다. 또한, 혈청과 같은 생물학적 유체에서 탈락된 항원 (예를 들어, HER 세포외 도메인)을 측정함으로써 HER 수용체 과다발현 또는 증폭을 연구할 수 있다 (예를 들어, 1990년 6월 12일 등록된 미국 특허 4,933,294; 1991년 4월 18일 공개된 WO91/05264; 1995년 3월 28일 등록된 미국 특허 5,401,638; 및 [Sias et al. J. Immunol. Methods 132: 73-80 (1990)] 참조). 상기 분석 이외에, 다양한 생체내 분석이 당업계의 숙련인에게 이용가능하다. 예를 들어, 환자 신체 내의 세포를 검출가능한 표지, 예를 들어 방사성 동위원소로 임의로 표지된 항체에 노출시킬 수 있고, 예를 들어 방사성에 대한 외부 스캐닝에 의해 또는 이전에 항체에 노출된 환자로부터 취한 생검을 분석함으로써 환자의 세포에 대한 항체의 결합을 평가할 수 있다.
반대로, "HER2 수용체를 과다발현 또는 증폭하지 않는" 암은 동일한 조직 종류의 비암성 세포에 비해 HER2 수용체 단백질 또는 유전자의 정상 수준보다 더 높은 수준을 갖지 않는 것이다. HER 이량체화를 억제하는 항체, 예를 들어 페르투주맙은 HER2 수용체를 과다발현 또는 증폭하지 않는 암을 치료하기 위해 사용될 수 있다.
본원에서 "항종양제"는 암을 치료하기 위해 사용된 약물을 나타낸다. 본원에서 항종양제의 비제한적인 예는 화학요법제, HER 억제제, HER 이량체화 억제제, HER 항체, 종양 관련 항원에 대해 생성된 항체, 항-호르몬 화합물, 시토킨, EGFR-표적화 약물, 항-혈관신생제, 티로신 키나제 억제제, 성장 억제제 및 항체, 세포독성제, 세포자멸 (apoptosis)을 유도하는 항체, COX 억제제, 파르네실 트랜스퍼라제 억제제, 종양태아성 단백질 CA 125에 결합하는 항체, HER2 백신, Raf 또는 ras 억제제, 리포좀 독소루비신, 토포테칸, 탁산, 이중 티로신 키나제 억제제, TLK286, EMD-7200, 페르투주맙, 트라스투주맙, 에를로티닙 및 베바시주맙을 포함한다.
"승인된 항종양제"는 규제 당국, 예를 들어 미국 FDA (Food and Drug Administration) 또는 동등한 외국 기관에 의해 시판 승인을 받은, 암을 치료하기 위해 사용되는 약물이다.
HER 억제제 또는 HER 이량체화 억제제가 "단일 항종양제"로서 투여되는 경우에, 이는 암을 치료하기 위해 투여되는 유일한 항종양제이고, 즉, 다른 항종양제, 예를 들어 화학요법과 조합하여 투여되지 않는다.
"치료 표준 (standard of care)"은 본원에서 특정 형태의 암을 치료하기 위해 통상적으로 사용되는 항종양제(들)을 의도한다. 예를 들어, 백금 내성 난소암에 대해 치료 표준은 토포테칸 또는 리포좀 독소루비신이다.
"성장 억제제"는 본원에서 사용될 때 시험관 내에서 또는 생체 내에서 세포, 특히 HER 발현 암세포의 성장을 억제하는 화합물 또는 조성물을 나타낸다. 따라서, 성장 억제제는 S기에서 HER 발현의 비율을 유의하게 감소시키는 것일 수 있다. 성장 억제제의 예는 세포 주기 진행을 (S기 이외의 다른 시기에) 차단하는 물질, 예를 들어 G1 정지 및 M기 정지를 유도하는 물질을 포함한다. 전통적인 M기 차단제는 빈카 (빈크리스틴 및 빈블라스틴), 탁산 및 토포 II 억제제, 예를 들어 독소루비신, 에피루비신, 다우노루비신, 에토포시드 및 블레오마이신을 포함한다. G1을 정지시키는 물질, 예를 들어 DNA 알킬화제, 예를 들어 타목시펜, 프레드니손, 다카르바진, 메클로레타민, 시스플라틴, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실 및 아라-C는 또한 S기 정지까지 이어질 수 있다. 추가의 정보는 문헌 [The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., Chapter 1, entitled "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" by Murakami et al., (WB Saunders: Philadelphia, 1995), 특히 p.13]에서 찾을 수 있다.
"성장 억제" 항체의 예는 HER2에 결합하고, HER2를 과다발현하는 암세포의 성장을 억제하는 것이다. 바람직한 성장 억제 HER2 항체는 세포 배양액 내에서 SK-BR-3 유방 종양 세포의 성장을 약 0.5 내지 30 ㎍/ml의 항체 농도에서 20％ 초과, 바람직하게는 50％ 초과 (예를 들어 약 50％ 내지 약 100％)로 억제하고, 여기서 성장 억제는 SK-BR-3 세포를 항체 노출시킨지 6일 후에 결정한다 (1997년 10월 14일 등록된 미국 특허 5,677,171 참조). SK-BR-3 세포 성장 억제 분석은 상기 특허와 본원에서 아래에 보다 상세하게 설명되어 있다. 바람직한 성장 억제 항체는 뮤린 모노클로날 항체 4D5, 예를 들어 트라스투주맙의 인간화 변이체이다.
"세포자멸을 유도하는" 항체는 아넥신 V의 결합, DNA의 단편화, 세포 수축, 소포체의 팽창, 세포 단편화 및/또는 막 베지클 (세포자멸체로 칭함)의 형성에 의해 결정될 때 프로그래밍된 세포 사멸을 유도하는 것이다. 세포는 대체로 HER2 수용체를 과다발현하는 것이다. 바람직하게는, 세포는 종양 세포, 예를 들어 유방, 난소, 위, 자궁내막, 침샘, 폐, 신장, 결장, 갑상선, 췌장 또는 방광 세포이다. 시험관 내에서, 세포는 SK-BR-3, BT474, Calu 3 세포, MDA-MB-453, MDA-MB-361 또는 SKO V3 세포일 수 있다. 세포자멸과 연관된 세포성 사건을 평가하기 위한 다양한 방법이 이용가능하다. 예를 들어, 포스파티딜 세린 (PS) 전위 (translocation)는 아넥신 결합에 의해 측정할 수 있고; DNA 단편화는 DNA 래더링 (laddering)을 통해 평가할 수 있고; DNA 단편화와 함께 핵/염색질 응축은 저이배체 (hypodiploid) 세포의 임의의 증가에 의해 평가할 수 있다. 바람직하게는, 세포자멸을 유도하는 항체는 BT474 세포를 사용한 아넥신 결합 분석 (아래 참조)에서 비처리 세포에 비해 아넥신 결합을 약 2 내지 50배, 바람직하게는 약 5 내지 50배, 가장 바람직하게는 약 10 내지 50배 유도하는 것이다. 세포자멸을 유도하는 HER2 항체의 예는 7C2 및 7F3이다.
"에피토프 2C4"는 항체 2C4가 결합하는 HER2의 세포외 도메인 내의 구역이다. 2C4 에피토프에 결합하는 항체를 스크리닝하기 위해, 문헌 [Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)]에 기재된 것과 같은 통상적인 교차 차단 분석을 수행할 수 있다. 바람직하게는, 항체는 HER2에 대한 2C4의 결합을 약 50％ 이상 차단한다. 별법으로, 에피토프 맵핑은 항체가 HER2의 2C4 에피토프에 결합하는지를 평가하기 위해 수행할 수 있다. 에피토프 2C4는 HER2의 세포외 도메인 내의 도메인 II로부터의 잔기를 포함한다. 2C4 및 페르투주맙은 도메인 I, II 및 III의 연결부에서 HER2의 세포외 도메인에 결합한다 (Franklin et al. Cancer Cell 5:317-328 (2004)).
"에피토프 4D5"는 항체 4D5 (ATCC CRL 10463) 및 트라스투주맙이 결합하는 HER2의 세포외 도메인 내의 구역이다. 상기 에피토프는 HER2의 막횡단 도메인에 근접하고, HER2의 도메인 IV 내에 존재한다. 4D5 에피토프에 결합하는 항체를 스크리닝하기 위해, 문헌 [Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)]에 기재된 것과 같은 통상적인 교차 차단 분석을 수행할 수 있다. 별법으로, 에피토프 맵핑은 항체가 HER2의 4D5 에피토프 (예를 들어 HER2 ECD의 약 잔기 529 내지 약 잔기 625의 구역 내의 임의의 하나 이상의 잔기, 잔기 넘버링은 신호 펩티드를 포함함)에 결합하는지를 평가하기 위해 수행할 수 있다.
"에피토프 7C2/7F3"은 7C2 및/또는 7F3 항체 (각각 ATCC에 기탁됨, 아래 참조)가 결합하는 HER2의 세포외 도메인의 (도메인 I 내의) N 말단 구역이다. 7C2/7F3 에피토프에 결합하는 항체를 스크리닝하기 위해, 문헌 [Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)]에 기재된 것과 같은 통상적인 교차 차단 분석을 수행할 수 있다. 별법으로, 에피토프 맵핑은 항체가 HER2 상의 7C2/7F3 에피토프 (예를 들어 HER2 ECD의 대략 잔기 22 내지 대략 잔기 53의 구역 내의 임의의 하나 이상의 잔기, 잔기 넘버링은 신호 펩티드를 포함함)에 결합하는지를 확립하기 위해 수행할 수 있다.
"치료"는 치료적 처치 및 예방 또는 보호 조치를 모두 나타낸다. 치료를 필요로 하는 대상은 암이 이미 발생한 대상과 암이 예방되어야 하는 대상을 포함한다. 따라서, 본원에서 치료될 환자는 암에 걸린 것으로 진단될 수 있거나 암에 걸리기 쉽거나 취약할 수 있다.
용어 "치료상 유효량" 또는 "유효량"은 환자에서 암을 치료하기 위해 효과적인 약물의 양을 나타낸다. 약물의 유효량은 암세포의 수를 감소시키고; 종양 크기를 감소시키고; 주변 장기로 암세포 침윤을 억제하고 (즉, 일정 정도로 느리게 하고, 바람직하게는 정지시키고); 종양 전이를 억제하고 (즉, 일정 정도로 느리게 하고, 바람직하게는 정지시키고); 종양 성장을 일정 정도로 억제하고; 및/또는 암과 연관된 하나 이상의 증상을 일정 정도로 감소시킬 수 있다. 약물이 존재하는 암세포의 성장을 억제하고/하거나 치사시킬 수 있는 정도까지, 약물은 세포활동 억제성 및/또는 세포독성일 수 있다. 유효량은 무진행 생존 (예를 들어 고형 종양에 대한 반응 평가 기준인 RECIST 또는 CA-125 변화로 평가시에)을 연장시키고, 객관적인 반응 (부분 반응 PR 또는 완전 반응 CR 포함)을 유도하고, 생존 (전체 생존 및 무진행 생존 포함)을 개선시키고, 및/또는 하나 이상의 암 증상 (예를 들어 FOSI에 의해 평가시에)을 개선시킬 수 있다. 가장 바람직하게는, 치료상 유효량의 약물은 무진행 생존 (PFS) 및/또는 전체 생존 (OS)의 개선에 효과적이다.
"생존"은 환자가 계속 생존해 있음을 의미하고, 전체 생존 및 무진행 생존을 포함한다.
"전체 생존"은 예를 들어 진단 또는 치료시로부터 소정의 기간, 예를 들어 1년, 5년 등의 기간 동안 환자가 생존해 있음을 의미한다.
"무진행 생존"은 암이 진행되거나 악화되지 않으면서 환자가 생존해 있음을 의미한다.
"생존을 연장하는"은 비치료 환자에 비해 (즉, HER 억제제, HER 이량체화 억제제, 예를 들어 페르투주맙으로 치료되지 않은 환자에 비해), 또는 지정된 수준으로 HER3 또는 HER2:HER3을 발현하지 않는 환자에 비해, 및/또는 승인된 항종양제 (예를 들어 암이 난소암인 경우에 토포테칸 또는 리포좀 독소루비신)으로 치료한 환자에 비해, 치료된 환자에서 전체 또는 무진행 생존의 증가를 의미한다.
"객관적인 반응"은 완전 반응 (CR) 또는 부분 반응 (PR)을 포함하여 측정가능한 반응을 의미한다.
"완전 반응" 또는 "CR"은 치료에 반응하여 암의 모든 증상이 사라짐을 의도한다. 이것은 항상 암이 치유되었음을 의미하지는 않는다.
"부분 반응" 또는 "PR"은 치료에 반응하여 하나 이상의 종양 또는 병변의 크기, 또는 신체 내의 암의 정도의 감소를 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "세포독성제"는 세포의 기능의 억제 또는 제한 및/또는 세포의 파괴를 야기하는 물질을 의미한다. 이 용어는 방사성 동위원소 (예를 들어 At21l, Il31, Il25, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi2l2, P32 및 Lu의 방사성 동위원소), 화학요법제, 및 독소, 예를 들어 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 소분자 독소 또는 효소적 활성 독소, 및 그의 단편 및/또는 변이체를 포함하고자 한 것이다.
"화학요법제"는 암 치료에 유용한 화학적 화합물이다. 화학요법제의 예는 알킬화제, 예를 들어 티오테파 및 시클로스포스파미드 (CYTOXAN(등록상표)); 알킬 술포네이트, 예를 들어 부술판, 임프로술판 및 피포술판; 아지리딘, 예를 들어 벤조도파, 카르보쿠온, 메트우레도파 및 우레도파; 에틸렌이민 및 메틸아멜라민, 예를 들어 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포라미드, 트리에틸렌티오포스포라미드 및 트리메틸올로멜라민; 아세토게닌 (특히 불라타신 및 불라타시논); 델타-9-테트라히드로칸나비놀 (드로나비놀, MARINOL(등록상표)); 베타-라파콘; 라파콜; 콜히친; 베툴린산; 캄프토테신 (합성 유사체 토포테칸 (HYCAMTIN(등록상표) 포함), CPT-11 (이리노테칸, CAMPTOSAR(등록상표)), 아세틸캄프토테신, 스코폴렉틴 및 9-아미노캄프토테신); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (그의 아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체 포함); 포도필로톡신; 포도필린산; 테니포시드; 크립토피신 (특히 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴; 듀오카르마이신; (합성 유사체 KW-2189 및 CB1-TM1 포함); 엘류테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕티인; 스폰지스타틴; 질소 머스타드, 예를 들어 클로람부실, 클로르나파진, 클로로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥시드 염산염, 멜팔란, 노벰비친, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로스우레아, 예를 들어 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴 및 라니무스틴; 항생제, 예를 들어 에네디인 항생제 (예를 들어 칼리케아미신, 특히 칼리케아미신 감마1I 및 칼리케아미신 오메가I1 (예를 들어 [Nicolaou et al., Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)] 참조); CDP323, 경구 알파-4 인테그린 억제제; 디네미신, 예를 들어 디네미신 A; 에스페라미신; 및 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련 색단백질 에네디인 항생 발색단), 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신 (아드리아마이신 (ADRIAMYCIN)(등록상표), 모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신, 독소루비신 HCl 리포좀 주사 (독실 (DOXIL)(등록상표)), 리포좀 독소루비신 TLC D-99 (미오체트 (MYOCET)(등록상표)), 페길화 (peglylated) 리포좀 독소루비신 (CAELYX (카엘릭스)(등록상표)), 및 데옥시독소루비신 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 예를 들어 미토마이신 C, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 푸로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 튜베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항-대사물질, 예를 들어 메토트렉세이트, 겜시타빈 (겜자르 (GEMZAR)(등록상표)), 테가푸르 (우프토랄 (UFTORAL)(등록상표)), 카페시타빈 (XELODA(등록상표)), 에포틸론 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 엽산 유사체, 예를 들어 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예를 들어 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예를 들어 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록스우리딘; 항-아드레날, 예를 들어 아미노글루테티미드, 미토탄, 트리로스탄; 엽산 보충제, 예를 들어 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르니틴; 엘립티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 질산갈륨; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다민; 메이탄시노이드, 예를 들어 메이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미토잔트론; 모피다몰; 니트라크린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로소잔트론; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK(등록상표) 다당류 복합체 (JHS 내쳐럴 프로덕츠 (JHS Natural Products, 미국 오레곤주 유진 소재)); 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리콜테센 (특히 T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노사이드 ("Ara-C"); 티오테파; 탁소이드, 예를 들어 파클리탁셀 (탁솔 (TAXOL)(등록상표)), 파클리탁셀 (아브락산 (ABRAXANE)™)의 알부민-공학적으로 처리된 나노입자 제제 및 독세탁셀 (탁소테레 (TAXOTERE)(등록상표)); 클로란부실; 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금제, 예를 들어 시스플라틴, 옥살리플라틴 및 카르보플라틴; 튜불린 중합에 의한 미세관 형성을 억제하는 빈카, 예를 들어 빈블라스틴 (벨반 (VELBAN)(등록상표)), 빈크리스틴 (온코빈 (ONCOVIN)(등록상표)), 빈데신 (엘디신 (ELDISINE)(등록상표), 필데신 (FILDESIN)(등록상표)), 및 비노렐빈 (노벨빈 (NAVELBINE)(등록상표)); 에토포사이드 (VP-16); 이포스파미드; 미토잔트론; 류코보빈; 노반트론; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 이반드로네이트; 토포아이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노이드, 예를 들어 레티노산, 예를 들어 벡사로텐 (타르그레틴 (TARGRETIN)(등록상표)); 비스포스포네이트, 예를 들어 클로드로네이트 (예를 들어, 보네포스 (BONEFOS)(등록상표) 또는 오스타크 (OSTAC)(등록상표)), 에티드로네이트 (디드로칼 (DIDROCAL)(등록상표)), NE-58095, 졸레드론산/졸레드로네이트 (조메타 (ZOMETA)(등록상표)), 알렌드로네이트 (포사막스 (FOSAMAX)(등록상표)), 팔미드로네이트 (아레디아 (AREDIA)(등록상표)), 틸루드로네이트 (스켈리드 (SKELID)(등록상표)), 또는 리세드로네이트 (악토넬 (ACTONEL)(등록상표)); 및 트록사시타빈 (1,3-디옥솔란 뉴클레오시드 시토신 유사체); 안티센스 올리고뉴클레오티드, 특히 비정상적인 세포 증식에 연관되는 신호 전달 경로에서 유전자의 발현을 억제하는 것, 예를 들어 PKC-알파, Raf, H-Ras 및 표피 성장 인자 수용체 (EGF-R); 백신, 예를 들어 THERATOPE(등록상표) 백신 및 유전자 요법 백신, 예를 들어, ALLOVECTIN(등록상표) 백신, LEUVECTIN(등록상표) 백신, 및 VAXID(등록상표) 백신; 토포이소머라제 1 억제제 (LURTOTECAN(등록상표)); rmRH (ABARELIX(등록상표)); BAY439006 (소라페닙; 바이엘 (Bayer)); SU-11248 (화이저 (Pfizer)); 페리포신, COX-2 억제제 (예를 들어 셀레콕시브 또는 에토리콕시브), 프로테오좀 억제제 (예를 들어 PS341); 보르테조밉 (벨케이드 (VELCADE)(등록상표)); CCI-779; 티피파르닙 (R11577); 오라페닙, ABT510; Bcl-2 억제제, 예를 들어 오블리메르센 나트륨 (게나센스 (GENASENSE)(등록상표)); 픽산트론; EGFR 억제제 (아래 정의 참조); 티로신 키나제 억제제 (아래 정의 참조); 및 상기 임의의 물질의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체, 및 상기 물질의 2 이상의 조합물, 예를 들어 CHOP (시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴, 및 플레드니솔론의 조합 요법의 약어) 및 FOLFOX (5-FU 및 류코보빈과 조합한 옥살리플라틴 (엘록사틴 (ELOXATIN)™)을 사용한 치료의 약어)를 포함한다.
본원에서 화학요법제는 암의 성장을 촉진할 수 있는 호르몬의 효과를 조절, 저하, 차단 또는 억제하는 작용을 하는 "항-호르몬제" 또는 "내분비 치료제"를 포함한다. 이들은 호르몬 자체, 예를 들어 혼합된 아고니스트/길항제 프로필을 갖는 항-에스트로겐, 예를 들어 타목시펜 (놀바덱스 (NOLVADEX)(등록상표)), 4-히드록시타목시펜, 토레미펜 (파레스톤 (FARESTON)(등록상표)); 이독시펜, 드롤록시펜, 랄록시펜 (에비스타 (EVISTA)(등록상표)), 트리옥시펜, 케옥시펜, 및 선택적 에스트로겐 수용체 조정자 (SERM), 예를 들어 SERM3; 아고니스트 특성이 없는 순수한 항-에스트로겐, 예를 들어 풀베스트란트 (파스로덱스 (FASLODEX)(등록상표)), 및 EM800 (에스트로겐 수용체 (ER) 이량체화를 차단하고, DNA 결합을 억제하고, ER 전환 (turnover)을 증가시키고, 및/또는 ER 수준을 억제할 수 있는 물질); 아로마타제 억제제, 예를 들어 스테로이드성 아로마타제 억제제, 예를 들어 포르메스탄 및 엑세메스탄 (아로마신 (AROMASIN)(등록상표)), 및 비스테로이드성 아로마타제 억제제, 예를 들어 아나스트라졸 (아리미덱스 (ARIMIDEX)(등록상표)), 레트로졸 (페마라 (FEMARA)(등록상표)) 및 아미노글루테티미드, 및 다른 아로마타제 억제제, 예를 들어 보로졸 (리비소르 (RIVISOR)(등록상표)), 메게스트롤 아세테이트 (메가세 (MEGASE)(등록상표)), 파드로졸, 및 4(5)-이미다졸; 황체 형성 호르몬-방출 호르몬 아고니스트, 예를 들어 류프롤리드 (루프론 (LUPRON)(등록상표) 및 엘리가르드 (ELIGARD)(등록상표)), 고세렐린, 부세렐린 및 트립테렐린; 성 스테로이드, 예를 들어 프로게스틴, 예를 들어 메게스트롤 아세테이트 및 메드록시프로게스테론 아세테이트, 에스트로겐, 예를 들어 디에틸스틸베스트롤 및 프레마린, 및 안드로겐/레티노이드, 예를 들어 플루옥시메스테론, 모든 트랜스레티온산 및 펜레티니드; 오나프리스톤; 항-프로게스테론; 에스트로겐 수용체 하향-조절인자 (ERD); 항-안드로겐, 예를 들어 플루타미드, 닐루타미드 및 비칼루타미드; 및 상기 임의의 물질의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체; 및 상기 2 이상의 물질의 조합물을 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
"항대사물질 화학요법제"는 대사물질에 구조적으로 유사하지만 생산적인 방식으로 신체에 의해 이용될 수 없는 물질이다. 많은 항대사물질 화학요법제는 핵산, RNA 및 DNA의 생산을 방해한다. 항대사물질 화학요법제의 예는 겜시타빈 (겜자르(등록상표)), 5-플루오로우라실 (5-FU), 카페시타빈 (XELODA™), 6-머캅토퓨린, 메토트렉세이트, 6-티오구아닌, 페메트렉세드, 랄티트렉세드, 아라비노실시토신 아라-C 시타라빈 (CYTOSAR-U(등록상표)), 다카르바진 (DTIC-DOME(등록상표)), 아조시토신, 데옥시시토신, 피리드미덴, 플루다라빈 (FLUDARA(등록상표)), 클라드라빈, 2-데옥시-D-글루코스 등을 포함한다. 바람직한 항대사물질 화학요법제는 겜시타빈이다.
"겜시타빈" 또는 "2'-데옥시-2',2'-디플루오로시티딘 모노히드로클로라이드 (b-이성질체)"는 항종양 활성을 보이는 뉴클레오시드 유사체이다. 겜시타빈 HCl에 대한 실험식은 C9H11F2N3O4·HCl이다. 겜시타빈 HCl은 일라이 릴리 (Eli Lilly)에서 상표명 겜자르(등록상표)로 시판되고 있다.
"백금계 화학요법제"는 분자의 필수 부분으로서 백금을 포함하는 유기 화합물을 포함한다. 백금계 화학요법제의 예는 카르보플라틴, 시스플라틴 및 옥살리플래티넘을 포함한다.
"백금계 화학요법"은 임의로 하나 이상의 다른 화학요법제와 조합하여 하나 이상의 백금계 화학요법제를 사용하는 치료법을 의미한다.
"화학요법 내성" 암은 암환자가 화학요법을 받는 동안 암이 진행되거나 (즉, 환자는 "화학요법 불응성"임), 또는 환자가 화학요법 완료 후 12개월 내에 (예를 들어 6개월 내에) 암이 진행됨을 의미한다.
"백금 내성" 암은 암환자가 백금계 화학요법을 받는 동안 암이 진행되거나 (즉, 환자는 "백금 불응성"임), 또는 환자가 백금계 화학요법 완료 후 12개월 내에 (예를 들어 6개월 내에) 암이 진행됨을 의미한다.
"항-혈관신생제"는 혈관 발생을 일정 정도로 차단 또는 방해하는 화합물을 의미한다. 항-혈관신생 인자는 예를 들어 혈관신생 촉진에 관여하는 성장인자 또는 성장인자 수용체에 결합하는 소분자 또는 항체일 수 있다. 본원에서 바람직한 항-혈관신생 인자는 혈관내피 성장인자 (VEGF)에 결합하는 항체, 예를 들어 베바시주맙 (아바스틴 (AVASTIN)(등록상표))이다.
용어 "시토킨"은 세포간 매개자로서 다른 세포에 대해 작용하는 한 세포 집단에 의해 방출되는 단백질에 대한 관용어이다. 상기 시토킨의 예는 림포킨, 모노킨 및 전통적인 폴리펩티드 호르몬이다. 시토킨에는 성장 호르몬, 예를 들어 인간 성장 호르몬, N-메티오닐 인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬; 부갑상선 호르몬; 티록신; 인슐린; 전구인슐린; 릴랙신; 프로릴랙신; 당단백질 호르몬, 예를 들어 난포 자극 호르몬 (FSH), 갑상선 자극 호르몬 (TSH) 및 황체 형성 호르몬 (LH); 간 성장인자; 섬유모세포 성장인자; 프로락틴; 태반 락토겐; 종양 괴사 인자-α 및 -β; 뮬러관 억제 물질; 마우스 고나도트로핀-회합 펩티드; 인히빈; 악티빈; 혈관내피 성장인자; 인테그린; 트롬보포이에틴 (TPO); 신경 성장인자, 예를 들어 NGF-β; 혈소판-성장인자; 형질전환 성장 인자 (TGF), 예를 들어 TGF-α 및 TGF-β; 인슐린 유사 성장인자-I 및 -II; 에리트로포이에틴 (EPO); 골유도 인자; 인터페론, 예를 들어 인터페론-α, -β 및 -γ; 콜로니 자극 인자 (CSF), 예를 들어 대식세포-CSF (M-CSF); 과립구-대식세포-CSF (GM-CSF); 및 과립구-CSF (G-CSF); 인터루킨 (IL), 예를 들어 IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-1O, IL-11, IL-12; 종양 괴사 인자, 예를 들어 TNF-α 또는 TNF-β; 및 LIF 및 kit 리간드 (KL)를 포함하는 다른 폴리펩티드 인자가 포함된다. 본원에서 사용되는 용어 시토킨은 천연 공급원 또는 재조합 세포 배양물로부터의 단백질 및 천연 서열 시토킨의 생물학적 활성 균등물을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "EGFR-표적화 약물"은 EGFR에 결합하고, 임의로 EGFR 활성화를 억제하는 치료제를 의미한다. 상기 치료제의 예는 EGFR에 결합하는 항체 및 소분자를 포함한다. EGFR에 결합하는 항체의 예는 MAb 579 (ATCC CRL HB 8506), MAb 455 (ATCC CRL HB8507), MAb 225 (ATCC CRL 8508), MAb 528 (ATCC CRL 8509) (미국 특허 4,943,533, Mendelsohn et al. 참조) 및 그의 변이체, 예를 들어 키메라화 225 (C225 또는 세툭시맙; ERBUTIX(등록상표)) 및 재형성 (reshaped) 인간 225 (H225) (WO 96/40210, 임클론 시스템즈 인크. (Imclone Systems Inc.) 참조); 완전 인간, EGFR-표적화된 항체인 IMC-11F8 (임클론); 타입 II 돌연변이체 EGFR에 결합하는 항체 (미국 특허 5,212,290); 미국 특허 5,891,996에 설명된 바와 같이 EGFR에 결합하는 인간화 및 키메라 항체; 및 EGFR에 결합하는 인간 항체, 예를 들어 ABX-EGF (WO98/50433, Abgenix); EMD 55900 (Stragliotto et al. Eur. J. Cancer 32A:636-640 (1996)); EGFR 결합을 위해 EGF 및 TGF-알파 모두와 경쟁하는, EGFR에 대해 작용하는 인간화 EGFR 항체인 EMD7200 (마투주맙); 및 mAb 806 또는 인간화 mAb 806 (Johns et al., J. Biol. Chem. 279(29):30375-30384 (2004))을 포함한다. 항-EGFR 항체는 세포독성제에 컨쥬게이팅되어 면역컨쥬게이트를 생성시킬 수 있다 (예를 들어, EP659,439A2, Merck Patent GmbH). EGFR에 결합할 수 있는 소분자의 예는 ZD1839 또는 게피티닙 (이레사 (IRESSA)™; 아스트라제네카 (AstraZeneca)), CP-358774 또는 에를로티닙 (타르체바 (TARCEVA)™; 제넨테크/OSI) 및 AG1478, AG1571 (SU 5271; 수겐 (Sugen)); EMD-7200을 포함한다.
"티로신 키나제 억제제"는 티로신 키나제, 예를 들어 HER 수용체의 티로신 키나제 활성을 억제하는 분자이다. 상기 억제제의 예는 위 문단에서 설명한 EGFR-표적화 약물; 소분자 HER2 티로신 키나제 억제제, 예를 들어 TAK165 (다께다 (Takeda)로부터 입수가능); ErbB2 수용체 티로신 키나제의 경구 선택적 억제제인 CP-724,714 (화이저 및 OSI); EGFR에 우선적으로 결합하지만 HER2 & EGFR-과다발현 세포를 모두 억제하는 이중-HER 억제제, 예를 들어 EKB-569 (와이어쓰 (Wyeth)로부터 입수가능); 경구 HER2 및 EGFR 티로신 키나제 억제제인 GW572016 (글락소 (Glaxo)로부터 입수가능함); PKI-166 (노바티스 (Novartis)로부터 입수가능함); 범용-HER 억제제, 예를 들어 카네르티닙 (CI-1033; 파마시아 (Pharmacia)); Raf-1 신호전달을 억제하는 Raf-1 억제제, 예를 들어 안티센스제 ISIS-5132 (ISIS 파마슈티칼스 (ISIS Pharmaceuticals)로부터 입수가능); 비-HER 표적화 TK 억제제, 예를 들어 글락소로부터 입수가능한 이마티닙 메실레이트 (Gleevac™); MAPK 세포외 조절된 키나제 I 억제제 CI-1040 (파마시아로부터 이용가능함); 퀴나졸린, 예를 들어 PD 153035,4-(3-클로로아닐리노) 퀴나졸린; 피리도피리미딘; 피리미도피리미딘; 피롤로피리미딘, 예를 들어 CGP 59326, CGP 60261 및 CGP 62706; 피라졸로피리미딘, 4-(페닐아미노)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘; 쿠르쿠민 (디페룰로일 메탄, 4,5-비스 (4-플루오로아닐리노)프탈이미드); 니트로티오펜 잔기를 포함하는 티르포스틴; PD-0183805 (워너-램버트 (Warner Lambert)); 안티센스 분자 (예를 들어 HER 코딩 핵산에 결합하는 것); 퀴녹살린 (미국 특허 5,804,396); 트리포스틴 (미국 특허 5,804,396); ZD6474 (아스트라 제네카); PTK-787 (노바티스/쉐링 아게 (Schering AG)); 범용-HER 억제제, 예를 들어 CI-1033 (화이저); 아피니탁 (ISIS 3521; Isis/릴리); 이마티닙 메실레이트 (Gleevac; 노바티스); PKI 166 (노바티스); GW2016 (글락소 스미스클라인 (Glaxo SmithKline)); CI-1033 (화이저); EKB-569 (와이어쓰); 세막시닙 (수겐); ZD6474 (아스트라제네카); PTK-787 (노바티스/쉐링); INC-IC11 (임클론); 또는 미국 특허 5,804,396; WO99/09016 (아메리칸 시아나미드 (American Cyanamid)); WO98/43960 (아메리칸 시아나미드); WO97/38983 (워너-램버트); WO99/06378 (워너-램버트); WO99/06396 (워너-램버트); WO96/30347 (화이저); WO96/33978 (제네카); WO96/3397 (제네카); 및 WO96/33980 (제네카)에 설명된 것을 포함한다.
본원에서 치료제의 "고정된" 또는 "균일" 투여량은 환자의 체중 (WT) 또는 체표면적 (BSA)을 고려하지 않고 인간 환자에게 투여되는 투여량을 의미한다. 고정된 또는 균일 투여량은 따라서 mg/kg 투여량 또는 mg/m2 투여량이 아니라, 치료제의 절대량으로 제시된다.
본원에서 "로딩" 투여량은 일반적으로 환자에게 투여되는 치료제의 초기 투여량을 포함하고, 그의 1회 이상의 유지 투여량(들)이 후속 투여된다. 일반적으로, 단일 로딩 투여량이 투여되지만, 다중 로딩 투여량이 본원에서 고려된다. 대체로, 투여된 로딩 투여량(들)의 양은 투여되는 유지 투여량(들)의 양을 초과하고/하거나, 로딩 투여량(들)은 유지 투여량(들)보다 더 자주 투여되어, 유지 투여량(들)으로 달성될 수 있는 것보다 더 일찍 치료제의 목적하는 항정 (steady-state) 농도를 달성할 수 있다.
본원에서 "유지" 투여량은 치료 기간에 걸쳐 환자에게 투여되는 치료제의 1회 이상의 투여량을 의미한다. 대체로, 유지 투여량은 일정한 치료 시간 간격으로, 예를 들어 대략 매주, 대략 2주마다, 대략 3주마다, 또는 대략 4주마다 투여된다.
"의약"은 암 치료를 위한 활성 약물, 예를 들어 HER 억제제, HER 이량체화 억제제 (예를 들어 페르투주맙) 또는 화학요법제 (예를 들어 겜시타빈)이다.
"표적 청중"은 특히 특정 용도, 치료, 또는 적응증을 위해 마케팅 또는 광고에 의해 특정 의약을 그에 대해 판촉하고 있거나 판촉을 의도하는 일군의 사람 또는 기관, 예를 들어 개별적인 환자, 환자 집단, 신문, 의학 문헌 및 잡지 구독자, 텔레비젼 또는 인터넷 시청자, 라디오 또는 인터넷 청취자, 의사, 제약회사 등이다.
"포장 삽입물"은 치료 제품의 상업적인 패키지 내에 통상적으로 포함되는, 적응증, 용법, 용량, 투여, 금기, 포장된 제품과 조합될 다른 치료 제품, 및/또는 상기 치료 제품의 사용에 관한 경고 등에 대한 정보를 포함하는 사용설명서를 의미하기 위해 사용된다.
II. 항체의 생산
바람직한 실시태양에서, HER 억제제는 항체이기 때문에, 본 발명에 따라 사용되는 HER 항체의 생산을 위한 예시적인 기술을 이어서 설명한다. 항체 생산을 위해 사용되는 HER 항원은 예를 들어 목적하는 에피토프를 포함하는 HER 수용체의 세포외 도메인의 가용성 형태 또는 그의 일부일 수 있다. 별법으로, 그의 세포 표면에서 HER을 발현하는 세포 (예를 들어 HER2를 과다발현하도록 형질전환된 NIH-3T3 세포; 또는 암종 세포주, 예를 들어 SK-BR-3 세포, [Stancovski et al. PNAS (USA) 88:8691-8695 (1991)] 참조)를 사용하여 항체를 생성시킬 수 있다. 항체 생성에 유용한 다른 형태의 HER 수용체를 당업계의 숙련인은 분명하게 알 것이다.
(i) 폴리클로날 항체
폴리클로날 항체는 바람직하게는 관련 항원 및 어쥬번트의 피하 (sc) 또는 복강내 (ip) 다중 주사에 의해 동물에서 생성된다. 2기능성 또는 유도체화제, 예를 들어 말레이미도벤조일 술포숙신이미드 에스테르 (시스테인 잔기를 통한 컨쥬게이션), N-히드록시숙신이미드 (라이신 잔기를 통한), 글루타르알데히드, 숙신산 무수물, SOC12 또는 R1N=C=NR (여기서, R 및 Rl은 상이한 알킬기임)를 사용하여 면역처리되는 종에서 면역원성인 단백질, 예를 들어 키홀 림펫 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소 티로글로불린 또는 대두 트립신 억제제에 관련 항원을 컨쥬게이팅시키는 것이 유용할 수 있다.
동물은 예를 들어 100 ㎍ 또는 5 ㎍의 단백질 또는 컨쥬게이트 (각각 토끼 또는 마우스에 대해)를 3 부피의 프로이트 (Freund) 완전 어쥬번트와 합한 후, 용액을 다중 부위에 피내 주사함으로써 항원, 면역원성 컨쥬게이트, 또는 유도체에 대해 면역처리된다. 1개월 후에, 동물은 프로이트 완전 어쥬번트 중의 펩티드 또는 컨쥬게이트를 처음 양의 1/5 내지 1/10로 다중 부위에 피하 주사하여 부스터된다. 7일 내지 14일 후에, 동물에서 채혈하여 혈청의 항체 역가를 분석한다. 동물은 역가 평탄역까지 부스터한다. 바람직하게는, 동물은 상이한 단백질에 및/또는 상이한 가교결합 시약을 통해 컨쥬게이팅된 동일한 항원의 컨쥬게이트로 부스터된다. 컨쥬게이트는 또한 단백질 융합체로서 재조합 세포 배양으로 제조될 수도 있다. 또한, 면역 반응을 증강시키기 위해 응집제, 예를 들어 명반을 적절하게 사용한다.
(ii) 모노클로날 항체
본원에서 모노클로날 항체를 제조하는 다양한 방법이 당업계에서 이용가능하다. 예를 들어, 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al., Nature 256: 495 (1975)]에 처음 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조할 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법 (미국 특허 4,816,567)에 의해 제조할 수 있다.
하이브리도마 방법에서, 마우스 또는 다른 적절한 숙주 동물, 예를 들어 햄스터는 면역처리를 위해 사용된 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 생성하거나 생성할 수 있는 림프구를 유도하기 위해 상기 설명한 바와 같이 면역처리된다. 별법으로, 림프구는 시험관 내에서 면역처리될 수 있다. 이어서, 림프구는 하이브리도마 세포를 형성하기 위해 적합한 융합제, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 골수종 세포와 융합된다 (Goding, Monoclonal antibody: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)).
이와 같이 제조한 하이브리도마 세포는 바람직하게는 융합되지 않은 모골수종 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 포함하는 적합한 배지에 접종하여 성장시킨다. 예를 들어, 모골수종 세포에 효소 히포잔틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT)가 결핍된 경우, 하이브리도마의 배양 배지는 일반적으로 히포잔틴, 아미노프테린 및 티미딘 (HAT 배지)을 포함할 것이고, 이들 물질은 HGPRT-결핍 세포의 성장을 억제한다.
바람직한 골수종 세포는 효율적으로 융합하고, 선택된 항체 생성 세포에 의한 항체의 안정적인 고수준 생성을 지지하고, 배지, 예를 들어 HAT 배지에 민감한 세포이다. 이 중에서, 바람직한 골수종 세포주는 뮤린 골수종 라인, 예를 들어 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양 (미국 캘리포니아주 샌디에고 소재의 솔크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터 (Salk Institute Cell Distribution Center)) 및 SP-2 또는 X63-Ag8-653 세포 (미국 메릴랜드주 록빌 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (American Type Culture Collection))에서 유도된 것이다. 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주도 인간 모노클로날 항체 생성을 위해 설명된 바 있다 ([Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984)]; 및 [Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker,Inc., New York, 1987)]).
하이브리도마 세포가 성장하는 배지는 항원에 대해 작용하는 모노클로날 항체의 생성에 대해 분석된다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생성되는 모노클로날 항체의 결합 특이성은 면역침전 또는 시험관내 결합 분석, 예를 들어 방사성 면역 분석 (RIA) 또는 효소 결합 면역흡착 분석 (ELISA)에 의해 결정한다.
모노클로날 항체의 결합 친화도는 예를 들어 문헌 [Munson et al., Anal. Biochem., 107: 220 (1980)]의 스캐챠드 (Scatchard) 분석에 의해 결정할 수 있다.
목적하는 특이성, 친화도 및/또는 활성의 항체를 생성하는 하이브리도마 세포가 확인된 후에, 클론은 제한 희석 과정에 의해 서브클로닝하고 표준 방법 (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986))으로 성장시킬 수 있다. 상기 목적에 적합한 배지는 예를 들어 D-MEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 또한, 하이브리도마 세포는 동물에서 복수 종양으로서 생체 내에서 성장시킬 수 있다.
서브클론에서 분비되는 모노클로날 항체는 통상적인 항체 정제 과정, 예를 들어 단백질 A-세파로스, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화도 크로마토그래피에 의해 배지, 복수액 또는 혈청으로부터 적합하게 분리된다.
모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는 쉽게 단리되고, 통상적인 절차를 사용하여 (예를 들어 뮤린 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여) 서열을 결정한다. 하이브리도마 세포는 상기 DNA의 바람직한 공급원으로 작용한다. 일단 단리된 DNA는 발현 벡터에 삽입되고, 이 벡터는 재조합 숙주 세포에서 모노클로날 항체를 합성하기 위해 본래 항체 단백질을 생성하지 않는 숙주 세포, 예를 들어 이. 콜라이 (E. coli) 세포, 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 골수종 세포를 형질감염시킨다. 항체를 코딩하는 DNA의 세균에서의 재조합 발현에 대해서는 문헌 ([Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5: 256-262 (1993) 및 Plueckthun, Immunol. Revs., 130: 151-188 (1992)])을 참조한다.
추가의 실시태양에서, 모노클로날 항체 또는 항체 단편은 문헌 [McCafferty et al., Nature, 348: 552-554 (1990)]에 기재된 기술을 이용하여 항체 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 문헌 ([Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991)] 및 [Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)])에서는 파지 라이브러리를 사용하여 각각 뮤린 및 인간 항체의 단리를 설명하고 있다. 후속 문헌은 사슬 셔플링에 의한 고친화도 (nM 범위) 인간 항체의 생성 (Marks et al., Bio/Technology, 10: 779-783 (1992)), 및 매우 큰 파지 라이브러리 제조를 위한 전략으로서 조합 감염 및 생체내 재조합 (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21: 2265-2266 (1993))을 설명하고 있다. 따라서, 이들 기술은 모노클로날 항체의 단리를 위한 전통적인 모노클로날 항체 하이브리도마 기술의 실행가능한 대안이다.
또한, DNA는 예를 들어 상동성 뮤린 서열 대신에 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인 코딩 서열을 치환시키거나 (미국 특허 4,816,567; [Morrison, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851 (1984)]), 비-면역글로불린 폴리펩티드 코팅 서열의 전부 또는 일부를 면역글로불린 코딩 서열에 공유결합시킴으로써 변형시킬 수 있다.
대체로, 상기 비-면역글로불린 폴리펩티드는 항체의 불변 도메인을 대체하거나, 항체의 한 항원 결합 부위의 가변 도메인을 대체하여 항원에 대한 특이성을 갖는 하나의 항원 결합 부위 및 상이한 항원에 대한 특이성을 갖는 다른 항원 결합 부위를 포함하는 키메라 2가 항체를 생성시킨다.
(iii) 인간화 항체
비-인간 항체를 인간화하기 위한 방법은 당업계에 기술되어 있다. 바람직하게는, 인간화 항체는 비-인간 공급원으로부터 그에 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는 일반적으로 "도입 (import)" 가변 도메인으로부터 취한 "도입" 잔기로서 종종 언급된다. 인간화는 본질적으로 인간 항체의 대응하는 서열을 초가변 구역 서열로 대체함으로써 윈터 (Winter) 등의 방법 ([Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986)]; [Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988)]; [Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)])을 따라 수행할 수 있다. 따라서, 상기 "인간화" 항체는 무손상 인간 가변 도메인보다 실질적으로 더 작은 도메인이 비-인간종의 대응하는 서열로 대체된 키메라 항체 (미국 특허 4,816,567)이다. 실제로, 인간화 항체는 일반적으로 일부 초가변 구역 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체의 유사 부위로부터의 잔기로 대체된 인간 항체이다.
인간화 항체 제조에 사용되는 경쇄 및 중쇄 모두의 인간 가변 도메인의 선택은 항원성 감소에 매우 중요하다. 소위 "최적 맞춤 (best-fit)" 방법에 따르면, 설치류 항체의 가변 도메인 서열은 공지의 인간 가변-도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝된다. 설치류와 가장 근접한 인간 서열은 이어서 인간화 항체의 인간 프레임워크 영역 (FR)으로서 허용된다 ([Sims et al., J. Immunol., 151: 2296 (1993)]; [Chothia et al., J. Mol. Biol, 196: 901 (1987)]). 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정 하위군의 모든 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래한 특정 프레임워크 구역을 이용한다. 동일한 프레임워크가 복수개의 상이한 인간화 항체에 대해 사용될 수 있다 ([Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4285 (1992)]; [Presta et al., J. Immunol., 151: 2623 (1993)]).
항체가 항원에 대한 높은 친화도 및 다른 바람직한 생물학적 특성을 보유하도록 인간화되는 것이 더욱 중요하다. 이를 달성하기 위해서, 바람직한 방법에 따르면, 인간화 항체는 모서열 및 인간화 서열의 3차원 모델을 이용하여 모서열 및 상이한 개념적 인간화 생성물의 분석 과정에 의해 제조된다. 3차원 면역글로불린 모델은 통상 입수가능하고, 당업계의 숙련인에게 잘 알려져 있다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 3차원 입체형태 구조를 그려 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램이 이용가능하다. 상기 디스플레이의 조사를 통해 후보 면역글로불린 서열의 기능에서 잔기의 가능한 역할의 분석, 즉 후보 면역글로불린이 그의 항원에 결합하는 능력에 영향을 끼치는 잔기의 분석이 가능하다. 이러한 방식으로, FR 잔기는 수여자 서열 및 도입 서열로부터 선택 및 조합되어 목적하는 항체 특성, 예를 들어 표적 항원(들)에 대한 친화도 증가를 달성할 수 있다. 일반적으로, 초가변 구역 잔기는 항원 결합에 대한 영향에 직접적으로 가장 실질적으로 관련된다.
WOO1/00245는 HER2에 결합하여 HER 수용체의 리간드 활성화를 차단하는 예시적인 인간화 HER2 항체의 생산을 설명한다. 본원에서 특히 목적하는 인간화 항체는 본질적으로 뮤린 모노클로날 항체 2C4 (또는 그의 Fab 단편)만큼 효과적으로 MAPK의 EGF, TGF-α 및/또는 HRG 매개 활성화를 차단하고/하거나 본질적으로 뮤린 모노클로날 항체 2C4 (또는 그의 Fab 단편)만큼 효과적으로 HER2에 결합한다. 본원에서 인간화 항체는 예를 들어 인간 가변 중쇄 도메인에 도입된 비인간 초가변구역 잔기를 포함할 수 있고, 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]에 제시된 가변 도메인 넘버링 시스템을 사용하여 69H, 71H 및 73H로 이루어지는 군 중에서 선택된 위치에서의 프레임워크 구역 (FR) 치환을 추가로 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, 인간화 항체는 위치 69H, 71H 및 73H 중의 둘 또는 모든 위치에서의 FR 치환을 포함한다.
본원에서 목적하는 예시적인 인간화 항체는 예를 들어 변형이 본질적으로 항체의 친화도를 유지 또는 개선시키는 CDR 잔기의 아미노산 변형을 임의로 포함하는, 가변 중쇄 도메인 상보성 결정 잔기 GFTFTD YTMX (여기서 X는 바람직하게는 D 또는 S임) (서열 7); DVNPNSGGSIYNQRFKG (서열 8); 및/또는 NLGPSFYFDY (서열 9)를 포함한다. 예를 들어, 목적하는 항체 변이체는 상기 가변 중쇄 CDR 서열에 약 1 내지 약 7개 또는 약 5개의 아미노산 치환을 가질 수 있다. 상기 항체 변이체는 예를 들어 하기 설명되는 바와 같이 친화도 성숙에 의해 제조할 수 있다. 가장 바람직한 인간화 항체는 서열 4의 가변 중쇄 도메인 아미노산 서열을 포함한다.
인간화 항체는 예를 들어 상기 문단의 가변 중쇄 도메인 CDR 잔기 이외에 가변 경쇄 도메인 상보성 결정 잔기 KASQDVSIGVA (서열 10); SASYX1X2X3 (여기서 X1은 바람직하게는 R 또는 L이고, X2는 바람직하게는 Y 또는 E이고, X3은 바람직하게는 T 또는 S임) (서열 11); 및/또는 QQYYIYPYT (서열 12)를 포함할 수 있다. 상기 인간화 항체는 변형이 본질적으로 항체의 친화도를 유지 또는 개선시키는 상기 CDR 잔기의 아미노산 변형을 임의로 포함한다. 예를 들어, 목적하는 항체 변이체는 상기 가변 경쇄 CDR 서열에 약 1 내지 약 7개 또는 약 5개의 아미노산 치환을 가질 수 있다. 상기 항체 변이체는 예를 들어 하기 설명되는 바와 같이 친화도 성숙에 의해 제조할 수 있다. 가장 바람직한 인간화 항체는 서열 3의 가변 경쇄 도메인 아미노산 서열을 포함한다.
또한, 본원은 HER2에 결합하고 HER 수용체의 리간드 활성화를 차단하는 친화도 성숙 항체를 고려한다. 모 항체는 인간 항체 또는 인간화 항체, 예를 들어 각각 서열 3 및 4의 가변 경쇄 및/또는 중쇄 서열을 포함하는 항체 (즉, 페르투주맙의 VL 및/또는 VH를 포함하는)일 수 있다. 친화도 성숙 항체는 바람직하게는 뮤린 2C4 또는 페르투주맙보다 훨씬 우수한 친화도 (예를 들어 HER2-세포외 도메인 (ECD) ELISA로 평가시에, 예를 들어 약 2배 또는 약 4배, 약 100배 또는 약 1000배 개선된 친화도)로 HER2 수용체에 결합한다. 치환을 위한 예시적인 가변 중쇄 CDR 잔기는 H28, H30, H34, H35, H64, H96, H99, 또는 2 이상의 잔기 (예를 들어 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 상기 잔기)의 조합을 포함한다. 변형을 위한 가변 경쇄 CDR 잔기의 예는 L28, L50, L53, L56, L91, L92, L93, L94, L96, L97 또는 2 이상의 잔기 (예를 들어 2 내지 3, 4, 5 또는 약 10개 이하의 상기 잔기)의 조합을 포함한다.
인간화 항체 또는 친화도 성숙 항체의 다양한 형태도 포함된다. 예를 들어, 인간화 항체 또는 친화도 성숙 항체는 면역컨쥬게이트를 생성시키기 위해서 하나 이상의 세포독성제(들)과 임의로 컨쥬게이팅된 항체 단편, 예를 들어 Fab일 수 있다. 별법으로, 인간화 항체 또는 친화도 성숙 항체는 무손상 항체, 예를 들어 무손상 IgG1 항체일 수 있다. 바람직한 무손상 IgG1 항체는 서열 13의 경쇄 서열을, 서열 14의 중쇄 서열을 포함한다.
(iv) 인간 항체
인간화에 대한 대안으로서, 인간 항체가 생성될 수 있다. 예를 들어, 면역처리시에 내인성 면역글로불린 생성의 부재시에 인간 항체의 전체 레퍼토리를 생성시킬 수 있는 트랜스제닉 동물 (예를 들어, 마우스)을 현재 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 키메라 및 생식세포 돌연변이체 마우스의 항체 중쇄 연결 영역 (JH) 유전자의 동종 접합성 결실이 내인성 항체 생성을 완전히 억제한다고 설명되었다. 상기 생식세포 돌연변이체 마우스에서 인간 생식세포 면역글로불린 유전자 어레이의 전이는 항원 시험 접종시에 인간 항체의 생성을 야기할 것이다. 예를 들어, 문헌 ([Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993)]; [Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993)]; [Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993)]) 및 미국 특허 5,591,669, 5,589,369 및 5,545,807을 참조한다. 별법으로, 파지 디스플레이 기술 (McCafferty et al., Nature 348: 552-553 (1990))을 사용하여 비면역처리된 공여자로부터 면역글로불린 가변 (V) 도메인 유전자 레퍼토리로부터 인간 항체 및 항체 단편을 시험관 내에서 생성시킬 수 있다. 이 기술에 따라, 항체 V 도메인 유전자는 섬유상 박테리오파지, 예를 들어 M13 또는 fd의 주요 또는 마이너 코트 단백질 유전자 내로 인 프레임으로 (in-frame) 클로닝되어 파지 입자의 표면 상에 기능적 항체 단편으로 디스플레이된다. 섬유상 입자는 파지 게놈의 단일가닥 DNA 카피를 포함하기 때문에, 항체의 기능성 특성에 기초한 선택을 통해 또한 상기 특성을 보이는 항체를 코딩하는 유전자의 선택이 가능하다. 따라서, 파지는 B 세포의 특성 일부를 모방한다. 파지 디스플레이는 다양한 포맷으로 수행할 수 있다. 이에 대해서는, 예를 들어 문헌 [Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993)]을 참조한다. V-유전자 세그먼트의 복수의 공급원이 파지 디스플레이에 사용될 수 있다. 문헌 [Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)]에서는 면역처리된 마우스의 비장으로부터 유래된 V 유전자의 작은 랜덤한 조합 라이브러리로부터 항-옥사졸론 항체의 다양한 어레이를 단리하였다. 비면역처리된 인간 공여자로부터의 V 유전자 레퍼토리를 제조할 수 있고, 다양한 항원 어레이 (자가항원 포함)에 대한 항체는 본질적으로 문헌 ([Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)], 또는 [Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993)])에 기재된 기술에 따라 단리될 수 있다. 또한 미국 특허 5,565,332 및 5,573,905를 참조한다.
상기 논의한 바와 같이, 인간 항체는 또한 시험관 내에서 활성화된 B 세포에 의해 생성될 수 있다 (미국 특허 5,567,610 및 5,229,275 참조).
인간 HER2 항체는 1998년 6월 3일 등록된 미국 특허 5,772,997 및 1997년 1월 3일 공개된 WO 97/00271에 기재되어 있다.
(v) 항체 단편
하나 이상의 항원 결합 구역을 포함하는 항체 단편의 생산을 위해 다양한 기술이 개발되었다. 전통적으로, 이들 단편은 무손상 항체의 단백분해성 소화를 통해 유도되었다 (예를 들어, 문헌 [Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)] 및 [Brennan et al., Science, 229:81 (1985)] 참조). 그러나, 이들 단편은 현재 재조합 숙주 세포에 의해 직접 생산될 수 있다. 예를 들어, 항체 단편은 상기 논의된 항체 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 별법으로, Fab'-SH 단편은 이. 콜라이로부터 직접 회수되고 화학적으로 커플링되어 F(ab')2 단편을 형성할 수 있다 (Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). 다른 방법에 따라, F(ab')2 단편은 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접 단리될 수 있다. 항체 단편의 생산을 위한 다른 기술은 숙련된 실무자에게 명백할 것이다. 다른 실시태양에서, 선택되는 항체는 단일쇄 Fv 단편 (scFv)이다. WO93/16185; 미국 특허 5,571,894; 및 미국 특허 5,587,458을 참조한다. 항체 단편은 또한 예를 들어 미국 특허 5,641,870에 기재된 바와 같이 "선형 항체"일 수 있다. 상기 선형 항체 단편은 단일특이적 또는 이중특이적일 수 있다.
(vi) 이중특이적 항체
이중특이적 항체는 적어도 2개의 상이한 에피토프에 결합 특이성을 갖는 항체이다. 예시적인 이중특이적 항체는 HER2 단백질의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 다른 상기 항체는 HER2 결합 부위를 EGFR, HER3 및/또는 HER4에 대한 결합 부위(들)와 조합할 수 있다. 별법으로, HER2 결합 아암 (arm)은 세포 방어 메카니즘을 HER2 발현 세포에 집중시키도록 백혈구 상의 촉발 (triggering) 분자, 예를 들어 T-세포 수용체 분자 (예, CD2 또는 CD3), 또는 IgG에 대한 Fc 수용체 (FcγR), 예를 들어 FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) 및 FcγRIII (CD16)에 결합하는 아암과 조합될 수 있다. 이중특이적 항체는 또한 세포독성제를 HER2 발현 세포에 편재하도록 사용될 수 있다. 이들 항체는 HER2 결합 아암 및 세포독성제 (예를 들어, 사포린, 항-인터페론-α, 빈카 알칼로이드, 리신 (ricin) A 사슬, 메토트렉세이트 또는 방사성 동위원소 합텐)에 결합하는 아암을 갖는다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편 (예, F(ab')2 이중특이적 항체)로서 제조될 수 있다.
WO 96/16673은 이중특이적 HER2/FcγRIII 항체를 기재하고 있고, 미국 특허 5,837,234는 이중특이적 HER2/FcγRI 항체 IDM1 (Osidem)를 개시하고 있다. 이중특이적 HER2/Fcα 항체는 WO98/02463에 제시되어 있다. 미국 특허 5,821,337에는 이중특이적 HER2/CD3 항체가 교시되어 있다. MDX-210은 이중특이적 HER2-FcγRIII Ab이다.
이중특이적 항체를 제조하기 위한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 전장 이중특이적 항체의 전통적인 제조는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 동시발현에 기초하고, 여기서 2개의 사슬은 상이한 특이성을 갖는다 (Millstein et al., Nature, 305: 537-539 (1983)). 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 랜덤 분류 때문에, 이들 하이브리도마 (콰드로마 (quadroma))는 하나만 정확한 이중특이적 구조를 갖는 10개의 상이한 항체 분자의 잠재적인 혼합물을 생산한다. 보통 친화도 크로마토그래피 단계에 의해 수행되는 정확한 분자의 정제는 다소 성가시고, 생성물 수율은 낮다. 유사한 절차가 WO93/08829 및 문헌 [Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991)]에 개시되어 있다.
상이한 방법에 따라, 목적하는 결합 특이성 (항체-항원 결합 부위)를 갖는 항체 가변 도메인이 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합된다. 융합은 바람직하게는 힌지의 적어도 일부, CH2 및 CH3 구역을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 사용한다. 융합체의 적어도 하나에 존재하는, 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 구역 (CH1)을 갖는 것이 바람직하다. 면역글로불린 중쇄 융합체 및, 필요한 경우 면역글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA를 별개의 발현 벡터 내에 삽입하고, 적합한 숙주 유기체 내로 동시형질감염시킨다. 이는 제작에 사용된 3개의 폴리펩티드 사슬의 불균등한 비율이 최적 수율을 제공하는 실시태양에서 3개의 폴리펩티드 단편의 상호 비율을 조정하는데 큰 탄력성을 제공한다. 그러나, 균등한 비율의 적어도 2개의 폴리펩티드 사슬의 발현이 고수율을 나타낼 때 또는 상기 비가 특히 중요하지 않을 때 하나의 발현 벡터 내에 2개 또는 3개 모두의 폴리펩티드 사슬의 코딩 서열을 삽입하는 것이 가능하다.
상기 방법의 바람직한 실시태양에서, 이중특이적 항체는 한쪽 아암에 제1 결합 특이성을 갖는 하이브리드 면역글로불린 중쇄, 및 다른 쪽 아암에 하이브리드 면역글로불린 중쇄-경쇄쌍 (제2 결합 특이성을 제공하는)으로 이루어진다. 이중특이적 분자의 반쪽에만 면역글로불린 경쇄가 존재하면 분리 방법이 용이하기 때문에, 상기 비대칭 구조는 원치 않는 면역글로불린 사슬 조합물로부터 목적하는 이중특이적 화합물의 분리를 용이하게 하는 것으로 밝혀졌다. 이 방법은 WO 94/04690에 개시되어 있다. 이중특이적 항체를 생성하는 추가의 상세한 내용에 대해서는 예를 들어 문헌 [Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986)]을 참조한다.
미국 특허 5,731,168에 기재된 다른 방법에 따라, 한쌍의 항체 분자들 사이의 계면은 재조합 세포 배양물로부터 회수되는 이종이량체의 비율을 최대화하도록 공학적으로 처리될 수 있다. 바람직한 계면은 항체 불변 도메인의 CH3 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 상기 방법에서, 제1 항체 분자의 계면으로부터 하나 이상의 작은 아미노산 측쇄가 보다 큰 측쇄 (예, 티로신 또는 트립토판)로 교체된다. 큰 아미노산 측쇄를 보다 작은 것 (예, 알라닌 또는 트레오닌)으로 교체함으로써 큰 측쇄(들)에 동일하거나 유사한 크기의 보상적 "캐비티 (cavity)"가 제2 항체 분자의 계면 상에 생성된다. 이는 다른 원치 않는 최종 생성물, 예를 들어 동종이량체에 비해 이종이량체의 수율을 증가시키기 위한 메카니즘을 제공한다.
이중특이적 항체는 가교결합된 또는 "이종컨쥬게이트" 항체를 포함한다. 예를 들어, 이종컨쥬게이트 내의 항체 중 하나는 아비딘에 커플링되고, 다른 하나는 비오틴에 커플링될 수 있다. 그러한 항체는 예를 들어, 면역계 세포를 원치 않는 세포에 표적화시키기 위해 (미국 특허 4,676,980), 및 HIV 감염의 치료를 위해 (WO 91/00360, WO 92/200373 및 EP 03089) 제안되었다. 이종컨쥬게이트 항체는 임의의 편리한 가교결합 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 적합한 가교결합제는 당업계에 잘 알려져 있고, 많은 가교결합 기술과 함께 미국 특허 4,676,980에 개시되어 있다.
항체 단편으로부터 이중특이적 항체를 생성하기 위한 기술은 또한 문헌에서 설명되었다. 예를 들어, 이중특이적 항체는 화학적 결합을 이용하여 제조될 수 있다. 문헌 [Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)]에서는 무손상 항체가 단백분해적으로 절단되어 F(ab')2 단편을 생성하는 절차를 기술하고 있다. 이들 단편은 인접 디티올을 안정화시키고 분자간 디술피드 형성을 방지하기 위해 디티올 복합체화제인 아비소산나트륨의 존재 하에 환원된다. 이어서 생성된 Fab' 단편은 티오니트로벤조에이트 (TNB) 유도체로 전환된다. 이어서 Fab'-TNB 유도체 중 하나는 머캅토에틸아민으로 환원시켜 Fab'-티올로 재전환되고, 등몰량의 다른 Fab'-TNB 유도체와 혼합되어 이중특이적 항체를 형성한다. 생산된 이중특이적 항체는 효소의 선택적 고정화를 위한 물질로서 사용될 수 있다.
최근의 진보는 이중특이적 항체를 형성하도록 화학적으로 커플링될 수 있는 이. 콜라이로부터 Fab'-SH 단편의 직접 회수를 용이하게 하였다. 문헌 [Shalaby et al., J. Exp. Med., 175:217-225 (1992)]에서는 완전 인간화 이중특이적 항체 F(ab')2 분자의 생산을 기술하고 있다. 각각의 Fab' 단편은 이. 콜라이로부터 개별적으로 분비되었고, 이중특이적 항체를 형성하도록 시험관 내에서 화학 커플링되었다. 이렇게 형성된 이중특이적 항체는 HER2 수용체를 과다발현하는 세포 및 정상 인간 T 세포에 결합할 뿐만 아니라 인간 유방 종양 표적에 대한 인간 세포독성 림프구의 용해 활성을 촉발시킬 수 있었다.
이중특이적 항체 단편을 재조합 세포 배양액으로부터 직접 제조하고 단리시키기 위한 다양한 기술이 또한 설명되었다. 예를 들어, 이중특이적 항체는 류신 지퍼 (zipper)를 사용하여 생산되었다 (Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)). Fos 및 Jun 단백질로부터의 류신 지퍼 펩티드가 유전자 융합에 의해 2개의 상이한 항체의 Fab' 부분에 연결되었다. 항체 동종이량체는 힌지 구역에서 환원되어 단량체를 형성한 다음, 재산화되어 항체 이종이량체를 형성하였다. 본 방법은 또한 항체 동종이량체의 생산에 이용될 수 있다. 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)]에 기재된 "디아바디" 기술은 이중특이적 항체 단편 제조를 위한 다른 메카니즘을 제공하였다. 이 단편은 동일한 사슬 상의 두개의 도메인 사이의 페어링을 허용하기에는 너무 짧은 링커에 의해 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다. 따라서, 한 단편의 VH 및 VL 도메인은 다른 단편의 상보성 VL 및 VH 도메인과 페어링하고, 이에 의해 2개의 항원 결합 부위를 형성한다. 단일쇄 Fv (sFv) 이량체를 사용한 이중특이적 항체 단편의 다른 제조 전략도 보고된 바 있다 ([Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)] 참조).
3가 이상의 항체가 고려된다. 예를 들어, 삼중특이적 항체를 제조할 수 있다 (Tutt et al. J. Immunol. 147:60 (1991)).
(vii) 다른 아미노산 서열 변형
본원에서 설명되는 항체의 아미노산 서열 변형(들)이 고려된다. 예를 들어, 항체의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 적절한 뉴클레오티드 변경을 항체 핵산 내로 도입하거나, 펩티드 합성에 의해 제조된다. 상기 변형은 예를 들어 항체의 아미노산 서열로부터의 결실 및/또는 서열 내로의 삽입 및/또는 내부 잔기의 치환을 포함한다. 최종 구성체가 목적하는 특성을 갖는다면, 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합을 수행하여 최종 구성체를 생성시킨다. 아미노산 변경은 또한 항체의 번역후 프로세싱, 예를 들어 글리코실화 부위의 수 또는 위치를 변경시킬 수 있다.
돌연변이 유발에 대해 바람직한 위치인 항체의 특정 잔기 또는 구역의 확인에 유용한 방법은 문헌 [Cunningham and Wells Science, 244:1081-1085 (1989)]에 기재된 바와 같이 "알라닌 스캐닝 돌연변이 유발"로 불린다. 여기서, 표적 잔기들의 잔기 또는 기가 확인되고 (예, arg, asp, his, lys 및 glu과 같은 대전된 잔기), 항원과의 아미노산의 상호작용에 영향을 주도록 중성 또는 음으로 대전된 아미노산 (가장 바람직하게는 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 교체된다. 이어서, 치환에 대한 기능적 감수성을 나타내는 이들 아미노산 위치는 치환 부위에 또는 치환 부위 대신에 추가의 또는 다른 변이체를 도입함으로써 개량된다. 따라서, 아미노산 서열 변이를 도입하기 위한 부위는 미리 결정되지만, 돌연변이 자체의 성질은 미리 결정할 필요가 없다. 예를 들어, 주어진 부위에서 돌연변이의 성능을 분석하기 위해 ala 스캐닝 또는 무작위 돌연변이 유발이 표적 코돈 또는 구역에서 수행되고, 발현된 항체 변이체는 목적하는 활성에 대해 스크리닝된다.
아미노산 서열 삽입은 길이가 하나의 잔기 내지 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드까지인 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합체 및 단일 또는 다수 아미노산 잔기의 서열 내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체 또는 세포독성 폴리펩티드에 융합된 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 항체의 N- 또는 C-말단의 효소 (예를 들어 ADEPT를 위한), 또는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드에 대한 융합을 포함한다.
다른 종류의 변이체는 아미노산 치환 변이체이다. 이들 변이체는 항체 분자의 적어도 하나의 아미노산 잔기가 상이한 잔기로 치환된다. 치환 돌연변이 유발을 위한 가장 흥미로운 부위는 초가변 구역을 포함하지만, FR 변이도 고려된다. 보존적 치환은 "바람직한 치환"의 표제 하에 표 1에 나타낸다. 상기 치환이 생물학적 활성을 변경시키면, 하기 표 1에 "예시적인 치환"으로 명명된 또는 아미노산 클래스에 대해 아래에서 상세히 설명하는 보다 큰 변화가 도입되고, 생성물을 스크리닝할 수 있다.
Figure pat00001
항체의 생물학적 특성의 실질적인 변형은 (a) 예를 들어, 시트 또는 나선 입체형태로서의 치환 구역 내의 폴리펩티드 백본의 구조, (b) 표적 부위의 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 대부분의 측쇄를 유지하는 것에 대한 그의 효과가 크게 상이한 치환을 선택함으로써 달성한다. 아미노산은 그의 측쇄의 특성의 유사성에 따라 다음 군으로 분류할 수 있다 (A. L. Lehninger, in Biochemistry, second ed., pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975)).
(1) 비극성: Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M)
(2) 비하전 극성: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q)
(3) 산성: Asp (D), Glu (E)
(4) 염기성: Lys (K), Arg (R), His (H)
별법으로, 자연 발생 잔기는 공통 측쇄 특성을 기초로 다음 집단으로 나누어질 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 사슬 배향에 영향을 주는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향성: Trp, Tyr, Phe.
비보존적 치환은 상기 클래스의 하나의 멤버를 다른 클래스와 교환하는 것을 수반할 것이다.
항체의 적절한 입체형태를 유지하는데 관여하지 않는 임의의 시스테인 잔기가 또한 분자의 산화적 안정성을 개선시키고 비정상적 가교결합을 방지하기 위해 일반적으로 세린으로 치환될 수 있다. 반대로, 그의 안정성을 개선시키기 위해 시스테인 결합(들)이 항체에 부가될 수 있다 (특히 항체가 항체 단편, 예를 들어 Fv 단편인 경우).
특히 바람직한 종류의 치환 변이체는 모 항체 (예를 들어 인간화 또는 인간 항체)의 하나 이상의 초가변 구역 잔기를 치환하는 것을 포함한다. 일반적으로, 추가 개발을 위해 선택된 생성되는 변이체(들)은 이들이 생성되는 모 항체에 비해 개선된 생물학적 특성을 가질 것이다. 그러한 치환 변이체를 생성하기 위한 간편한 방법은 파지 디스플레이를 사용하는 친화도 성숙이다. 간단히 설명하면, 몇몇 초가변 구역 부위 (예를 들어 6-7개의 부위)가 각 부위에서 모든 가능한 아미노 치환을 생성하도록 돌연변이된다. 이렇게 생성된 항체 변이체는 각 입자 내에 패키지된 M13의 유전자 III 산물에 대한 융합체로서 섬유상 파지 입자로부터 1가 양식으로 디스플레이된다. 이어서 파지-디스플레이된 변이체를 본원에 개시된 바와 같이 그들의 생물학적 활성 (예를 들어 결합 친화도)에 대해 스크리닝한다. 변형을 위한 후보 초가변 구역 부위를 확인하기 위해, 항원 결합에 유의하게 기여하는 초가변 구역 잔기를 확인하도록 알라닌 스캐닝 돌연변이를 수행할 수 있다. 별법으로 또는 추가로, 항체와 인간 HER2 사이의 접촉점을 확인하기 위해 항원-항체 복합체의 결정 구조를 분석하는 것이 유익할 수 있다. 상기 접촉 잔기 및 이웃 잔기가 본원에서 설명된 기술에 따른 치환을 위한 후보이다. 일단 상기 변이체가 생성되면, 변이체의 패널을 본원에 기재된 바와 같이 스크리닝시키고, 하나 이상의 관련 분석에서 우수한 특성을 갖는 항체를 추가 개발을 위해 선택할 수 있다.
항체의 다른 종류의 아미노산 변이체는 항체의 원래 글리코실화 패턴을 변경시킨다. 이러한 변경은 항체에서 발견되는 하나 이상의 탄수화물 모이어티의 결실 및/또는 항체 내에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 부위의 부가를 의미한다.
항체의 글리코실화는 대개 N-연결되거나 또는 0-연결된다. N-연결된은 아스파라긴 잔기의 측쇄에 탄수화물 모이어티의 부착을 나타낸다. 트리펩티드 서열, 즉 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌 (여기서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)이 아스파라긴 측쇄에 탄수화물 모이어티의 효소에 의한 부착을 위한 인식 서열이다. 따라서, 폴리펩티드 내의 이들 트리펩티드 서열 중 하나의 존재는 잠재적인 글리코실화 부위를 생성한다. 0-연결된 글리코실화는 히드록시아미노산, 가장 일반적으로 세린 또는 트레오닌에 당, 즉 N-아세일갈락토사민, 갈락토스 또는 크실로스 중의 하나의 부착을 나타내지만, 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록시라이신이 또한 사용될 수 있다.
항체에 대한 글리코실화 부위의 부가는 하나 이상의 상기한 트리펩티드 서열을 갖도록 아미노산 서열을 변경시킴으로써 간편하게 달성된다 (N-연결된 글리코실화 부위의 경우). 변경은 또한 본래의 항체의 서열에 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기를 부가하거나 치환시켜 이루어질 수 있다 (0-연결된 글리코실화 부위의 경우).
항체가 Fc 구역을 포함하는 경우, 여기에 부착된 탄수화물은 변경될 수 있다. 예를 들어, 항체의 Fc 구역에 부착된 푸코스가 결핍된 성숙 탄수화물 구조를 갖는 항체는 미국 특허 출원 공개 2003/0157108 A1 (Presta, L.)에 기재되어 있다. 또한, US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd)을 참조한다. 항체의 Fc 구역에 부착된 탄수화물에 이등분 (bisecting) N-아세틸글루코사민 (GlcNAc)을 갖는 항체는 WO 2003/011878 (Jean-Mairet 등)과 미국 특허 6,602,684 (Umana 등)에 언급되어 있다. 항체의 Fc 구역에 부착된 올리고당 내에 적어도 하나의 갈락토스 잔기를 갖는 항체는 WO 1997/30087 (Patel 등)에 보고되어 있다. 또한, 그의 Fc 구역에 부착된 변경된 탄수화물을 갖는 항체에 관하여 WO 1998/58964 (Raju, S.)와 WO 1999/22764 (Raju, S.)를 참조한다.
예를 들어, 항체의 항원-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC) 및/또는 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 향상시키도록 효과기 기능에 관하여 본 발명의 항체를 변형시키는 것이 바람직할 수 있다. 이는 항체의 Fc 구역에 하나 이상의 아미노산 치환을 도입함으로써 달성할 수 있다. 별법으로 또는 추가로, 시스테인 잔기(들)이 Fc 구역에 도입되어, 이 구역에서 사슬간 디술피드 결합이 형성될 수 있다. 이렇게 생성된 동종이량체 항체는 개선된 내재화 능력 및/또는 증가된 보체 매개 세포 치사 및 항체-의존성 세포독성 (ADCC)을 가질 수 있다. 문헌 ([Caron et al., J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992)] 및 [Shopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992)])을 참조한다. 향상된 항-종양 활성을 갖는 동종이량체 항체는 또한 문헌 [Wolff et al. Cancer Research 53:2560-2565 (1993)]에 기재된 바와 같이 이종2기능성 가교결합제를 사용하여 제조될 수 있다. 별법으로, 이중 Fc 구역을 가져서 향상된 보체 용해 및 ADCC 능력을 가질 수 있는 항체가 공학적으로 처리될 수 있다. 문헌 [Stevenson et al. Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989)]을 참조한다.
WO00/42072 (Presta, L.)에는 인간 효과기 세포의 존재 하에 개선된 ADCC 기능을 갖는 항체가 기재되어 있고, 여기서 항체는 그의 Fc 구역 내에 아미노산 치환을 포함한다. 바람직하게는, 개선된 ADCC를 갖는 항체는 Fc 구역의 위치 298, 333, 및/또는 334 (잔기의 Eu 넘버링)의 치환을 포함한다. 바람직하게는, 변경된 Fc 구역은 1, 2 또는 3개의 상기 위치에 치환을 포함하거나 상기 치환으로 이루어진 인간 IgG1 Fc 구역이다. 상기 치환은 임의로 증가된 C1q 결합 및/또는 CDC를 갖는 치환(들)과 조합된다.
변경된 C1q 결합 및/또는 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 갖는 항체는 WO99/51642, 미국 특허 6,194,551Bl, 미국 특허 6,242,195B1, 미국 특허 6,528,624Bl 및 미국 특허 6,538,124 (Idusogie et al.)에 기재되어 있다. 항체는 그의 Fc 구역의 아미노산 위치 270, 322, 326, 327, 329, 313, 333 및/또는 334 (잔기의 Eu 넘버링) 중의 하나 이상의 위치에서의 아미노산 치환을 포함한다.
항체의 혈청 반감기를 증가시키기 위해, 예를 들어 미국 특허 5,739,277에 기재된 바와 같이 샐비지 (salvage) 수용체 결합 에피토프를 항체 (특히, 항체 단편) 내로 포함시킬 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "샐비지 수용체 결합 에피토프"는 IgG 분자의 생체내 혈청 반감기를 증가시키는 IgG 분자 (예, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4)의 Fc 구역의 에피토프를 나타낸다.
신생아 Fc 수용체 (FcRn)에 대한 개선된 결합 및 증가된 반감기를 갖는 항체는 WO00/42072 (Presta, L.) 및 US2005/0014934A1 (Hinton 등)에 기재되어 있다. 상기 항체는 Fc 구역의 FcRn에 대한 결합을 개선시키는 하나 이상의 치환이 그 내부에 존재하는 Fc 구역을 포함한다. 예를 들어, Fc 구역은 위치 238, 250, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 314, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424, 428 및 434 (잔기의 Eu 넘버링) 중의 하나 이상의 위치에 치환을 가질 수 있다. FcRn 결합이 개선된, 바람직한 Fc 구역을 포함하는 항체 변이체는 그의 Fc 구역의 위치 307, 380 및 434 (잔기의 Eu 넘버링) 중의 1, 2 또는 3개의 위치에 아미노산 치환을 포함한다.
3개 이상 (바람직하게는 4개)의 기능적 항원 결합 부위가 존재하는 공학적으로 처리된 항체도 고려된다 (US 특허 출원 US2002/0004587 A1, Miller 등).
항체의 아미노산 서열 변이체를 코딩하는 핵산 분자는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 제조한다. 상기 방법은 천연 공급원으로부터의 단리 (자연 발생 아미노산 서열 변이체의 경우) 또는 항체의 초기 제조된 변이체 또는 비-변이체 버젼의 올리고뉴클레오티드-매개 (또는 부위 지정) 돌연변이 유발, PCR 돌연변이 유발, 및 카세트 돌연변이 유발에 의한 제조를 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
(viii) 목적하는 특성을 갖는 항체에 대한 스크리닝
항체를 생산하는 기술을 상기 설명하였다. 요구되는 특정 생물학적 특성을 갖는 항체를 추가로 선택할 수 있다.
HER 수용체의 리간드 활성화를 차단하는 항체를 확인하기 위해서, (예를 들어 목적하는 HER 수용체가 그와 함께 HER 이종올리고머를 형성하는 다른 HER 수용체와 함께) HER 수용체를 발현하는 세포에 대한 HER 리간드 결합을 차단하는 항체의 능력을 결정할 수 있다. 예를 들어, HER 이종올리고머의 HER 수용체를 천연적으로 발현하거나 발현하도록 형질감염된 세포를 항체와 함께 인큐베이팅한 후, 표지된 HER 리간드에 노출시킬 수 있다. 이어서, HER 이종올리고머의 HER 수용체에 대한 리간드 결합을 차단하는 항체의 능력을 평가할 수 있다.
예를 들어, HER2 항체에 의한 MCF7 유방 종양 세포주에 대한 HRG 결합의 억제는 본질적으로 WOO1/00245에 설명된 바와 같이 24웰-플레이트 포맷으로 빙상에서 단층 MCF7 배양액을 사용하여 수행할 수 있다. HER2 모노클로날 항체는 각각의 웰에 첨가하여 30분 동안 인큐베이팅할 수 있다. 125I-표지된 rHRGβ1177-224 (25 pm)를 이어서 첨가하고, 4 내지 16시간 동안 계속 인큐베이션할 수 있다. 투여량 반응 곡선은 작성하여 IC50 값을 목적하는 항체에 대해 계산할 수 있다. 한 실시태양에서, HER 수용체의 리간드 활성화를 차단하는 항체는 상기 분석에서 MCF7 세포에 대한 HRG 결합을 억제하기 위한 IC50이 약 5O nM 이하, 보다 바람직하게는 1O nM 이하일 것이다. 항체가 항체 단편, 예를 들어 Fab 단편일 경우, 상기 분석에서 MCF7 세포에 대한 HRG 결합을 억제하기 위한 IC50은 예를 들어 약 10O nM 이하, 보다 바람직하게는 5O nM 이하일 수 있다.
별법으로 또는 추가로, HER 이종올리고머에 존재하는 HER 수용체의 HER 리간드-자극된 티로신 인산화를 차단하는 항체의 능력을 평가할 수 있다. 예를 들어, HER 수용체를 내인성으로 발현하거나 발현하도록 형질감염된 세포를 항체와 함께 인큐베이팅한 후, 항-포스포티로신 모노클로날 항체 (검출가능한 표지로 임의로 컨쥬게이팅된)를 사용하여 HER 리간드-의존성 티로신 인산화 활성에 대해 분석할 수 있다. 또한, 미국 특허 5,766,863에 기재된 키나제 수용체 활성화 분석을 HER 수용체 활성화 및 항체에 의한 상기 활성의 차단을 결정하기 위해 이용할 수 있다.
한 실시태양에서, 본질적으로 WOO1/00245에 설명된 바와 같이 MCF7 세포에서 p180 티로신 인산화의 HRG 자극을 억제하는 항체를 스크리닝할 수 있다. 예를 들어, MCF7 세포는 24웰 플레이트에 플레이팅할 수 있고, HER2에 대한 모노클로날 항체를 각각의 웰에 첨가하여 실온에서 30분 동안 인큐베이팅한 후, rHRGβ1177-244를 0.2 nM의 최종 농도로 각각의 웰에 첨가할 수 있고, 8분 동안 계속 인큐베이션할 수 있다. 배지를 각각의 웰로부터 흡인하고, 100 ㎕의 SDS 샘플 버퍼 (5％ SDS, 25 mM DTT, 및 25 mM Tris-HCl, pH 6.8)을 첨가하여 반응을 정지시킬 수 있다. 각각의 샘플 (25 ㎕)을 4-12％ 구배 겔 (Novex) 상에서 전기영동시킨 후, 폴리비닐리덴 디플루오라이드 막에 전기이동에 의해 이송할 수 있다. 항포스포티로신 (1 ㎍/ml) 면역블롯을 현상할 수 있고, Mr ~180,000에서 우세한 반응성 밴드의 강도를 반사 밀도계에 의해 정량할 수 있다. 선택된 항체는 바람직하게는 상기 분석에서 p180 티로신 인산화의 HRG 자극을 대조군의 약 0-35％까지 유의하게 억제할 것이다. 반사 밀도계에 의해 측정된 p180 티로신 인산화의 HRG 자극의 억제에 대한 투여량-반응 곡선은 작성할 수 있고, 목적하는 항체에 대한 IC50을 계산할 수 있다. 한 실시태양에서, HER 수용체의 리간드 활성화를 차단하는 항체는 상기 분석에서 p180 티로신 인산화의 HRG 자극을 억제하기 위한 IC50이 약 5O nM 이하, 보다 바람직하게는 1O nM 이하일 것이다. 항체가 항체 단편, 예를 들어 Fab 단편일 경우, 상기 분석에서 p180 티로신 인산화의 HRG 자극을 억제하기 위한 IC50은 예를 들어 약 10O nM 이하, 보다 바람직하게는 5O nM 이하일 수 있다.
또한, 예를 들어 본질적으로 문헌 [Schaefer et al. Oncogene 15:1385-1394 (1997)]에 기재된 바와 같이 MDA-MB-175 세포에 대한 항체의 성장 억제 효과를 평가할 수 있다. 상기 분석에 따르면, MDA-MB-175 세포는 HER2 모노클로날 항체 (1O ㎍/mL)로 4일 동안 처리하여 크리스탈 바이올렛으로 염색할 수 있다. HER2 항체와의 인큐베이션은 모노클로날 항체 2C4에 의해 제시된 것과 유사한, 상기 세포주에 대한 성장 억제 효과를 보일 수 있다. 추가의 실시태양에서, 외인성 HRG는 상기 억제를 유의하게 역전시키지 않을 것이다. 바람직하게는, 항체는 외인성 HRG의 존재 및 부재 하에 모노클로날 항체 4D5보다 더 큰 정도로 (및 임의로 모노클로날 항체 7F3보다 더 큰 정도로) MDA-MB-175 세포의 세포 증식을 억제할 수 있을 것이다.
한 실시태양에서, 목적하는 HER2 항체는 WOO1/00245에 기재된 바와 같은 동시면역침전 실험에서 측정시에 MCF7 및 SK-BR-3 세포 모두에서 모노클로날 항체 4D5보다 실질적으로 더 효과적으로, 바람직하게는 모노클로날 항체 7F3보다 실질적으로 더 효과적으로 HER2와 HER3의 헤레굴린 의존성 회합을 차단할 수 있다.
성장 억제성 HER2 항체를 확인하기 위해, HER2를 과다발현하는 암세포의 성장을 억제하는 항체를 스크리닝할 수 있다. 한 실시태양에서, 선택되는 성장 억제 항체는 약 0.5 내지 30 ㎍/ml의 항체 농도에서 세포 배양액에서 SK-BR-3 세포의 성장을 약 20-100％, 바람직하게는 약 50-100％ 억제할 수 있다. 상기 항체를 확인하기 위해, 미국 특허 5,677,171에 기재된 SK-BR-3 분석을 수행할 수 있다. 상기 분석에 따르면, SK-BR-3 세포는 F12와 10％ 소 태아 혈청, 글루타민 및 페니실린 스트렙토마이신으로 보충된 DMEM 배지의 1:1 혼합물 중에서 성장한다. SK-BR-3 세포는 35 mm 세포 배양 접시 (2 ml/35 mm 접시)에 20,000 세포로 플레이팅한다. 접시당 0.5 내지 30 ㎍/ml의 HER2 항체를 첨가한다. 6일 후에, 비처리 세포에 비교한 상기 세포의 수를 전자 COULTER™ 세포 계수기로 계수한다. SK-BR-3 세포의 성장을 약 20-100％ 또는 약 50-100％ 억제하는 상기 항체를 성장 억제 항체로서 선택할 수 있다. 성장 억제 항체, 예를 들어 4D5 및 3E8의 스크리닝을 위한 분석에 대해서는 미국 특허 5,677,171을 참조한다.
세포자멸을 유도하는 항체를 선택하기 위해서, BT474 세포를 사용한 아넥신 결합 분석을 이용할 수 있다. BT474 세포를 배양하여 상기 문단에서 논의한 접시에 씨딩한다. 이어서, 배지를 제거하고, 신선한 배지 단독으로 또는 1O ㎍/ml의 모노클로날 항체를 포함하는 배지로 교체한다. 3일 인큐베이션 기간 후, 단층을 PBS로 세척하고 트립신 처리에 의해 분리시켰다. 이어서, 세포를 원심분리하고, Ca2+ 결합 버퍼에 재현탁시키고, 세포 사멸 분석에 대해 상기한 튜브 내로 분취한다. 이어서, 튜브에 표지된 아넥신 (예를 들어 아넥신 V-FTIC) (1 ㎍/ml)을 넣는다. 샘플은 FACSCAN™ 유동 세포계 및 FACSCONVERT™ CellQuest 소프트웨어 (벡톤 디킨슨 (Becton Dickinson))을 사용하여 분석할 수 있다. 대조군에 비해 통계적으로 유의한 수준의 아넥신 결합을 유도하는 상기 항체를 세포자멸 유도 항체로 선택한다. 아넥신 결합 분석 이외에, BT474 세포를 사용한 DNA 염색 분석을 이용할 수 있다. 이 분석을 수행하기 위해서, 위의 두 문단에 기재된 목적하는 항체로 처리된 BT474 세포를 9 ㎍/ml HOECHST 33342™과 함께 2 hr 동안 37℃에서 인큐베이팅한 후, MODFIT LT™ 소프트웨어 (베리티 소프트웨어 하우스 (Verity Software House))를 사용하여 EPICS ELITE™ 유동 세포계 (쿨터 코포레이션 (Coulter Corporation))로 분석한다. 비처리 세포 (100％ 이하의 세포자멸성 세포)보다 2배 이상 (바람직하게는 3배 이상)의 세포자멸성 세포의 비율 변화를 유도하는 항체를 상기 분석을 사용하여 세포자멸 유도 (pro-apoptotic) 항체로 선택할 수 있다. 세포자멸을 유도하는 항체, 예를 들어 7C2 및 7F3의 스크리닝을 위한 분석에 대해서는 WO98/17797을 참조한다.
목적하는 항체에 의해 결합된 HER2 상의 에피토프에 결합하는 항체를 스크리닝하기 위해서, 예를 들어 문헌 [Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)]에 기재된 통상적인 교차 차단 분석을 수행하여 항체가 항체, 예를 들어 2C4 또는 페르투주맙의 HER2에 대한 결합을 교차 차단하는 지를 평가할 수 있다. 별법으로 또는 추가로, HER2의 어느 도메인(들)이 항체에 의해 결합되는 지를 조사하기 위해 에피토프 매핑 (mapping)을 당업계에 공지된 방법에 의해 수행할 수 있고/있거나, 항체-HER2 구조를 조사할 수 있다 (Franklin et al. Cancer Cell 5:317-328 (2004)).
(ix) 페르투주맙 조성물
HER2 항체 조성물의 한 실시태양에서, 조성물은 주요 종 페르투주맙 항체 및 그의 하나 이상의 변이체의 혼합물을 포함한다. 페르투주맙 주요 종 항체의 본원의 바람직한 실시태양은 서열 3 및 4의 가변 경쇄 및 가변 중쇄 아미노산 서열, 가장 바람직하게는 서열 13 및 17로부터 선택된 경쇄 아미노산 서열, 및 서열 14 및 18로부터 선택된 중쇄 아미노산 서열 (이들 서열의 탈아미드화 및/또는 산화 변이체 포함)을 포함하는 것이다. 한 실시태양에서, 조성물은 주요 종 페르투주맙 항체 및 아미노-말단 리더 연장부를 포함하는 그의 아미노산 서열 변이체의 혼합물을 포함한다. 바람직하게는, 아미노-말단 리더 연장부는 항체 변이체의 경쇄 상에 (예를 들어 항체 변이체의 1 또는 2개의 경쇄 상에) 존재한다. 주요 종 HER2 항체 또는 항체 변이체는 전장 항체 또는 항체 단편 (예를 들어 F(ab')2 단편의 Fab)일 수 있지만, 바람직하게는 둘 모두 전장 항체이다. 항체 변이체는 본원에서 임의의 하나 이상의 그의 중쇄 또는 경쇄 상에 아미노-말단 리더 연장부를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 아미노-말단 리더 연장부는 항체의 1 또는 2개의 경쇄 상에 존재한다. 아미노-말단 리더 연장부는 바람직하게는 VHS-를 포함하거나 이로 이루어진다. 조성물 내의 아미노-말단 리더 연장부의 존재는 N-말단 서열 분석, 전하 불균일성 (charge heterogeneity) 분석 (예를 들어, 양이온 교환 크로마토그래피 또는 모세관 대역 전기영동), 질량분광법 등을 포함하고 이로 제한되지 않는 다양한 분석 기술에 의해 검출할 수 있다. 조성물 내의 항체 변이체의 양은 일반적으로 변이체를 검출하기 위해 사용된 임의의 분석 (바람직하게는 N-말단 서열 분석)의 검출 한계를 구성하는 양 내지 주요 종 항체의 양 미만의 양이다. 일반적으로, 조성물 내의 약 20％ 이하 (예를 들어 약 1％ 내지 약 15％, 예를 들어 5％ 내지 약 15％)의 항체 분자가 아미노-말단 리더 연장부를 포함한다. 상기 비율의 양은 바람직하게는 정량적 N-말단 서열 분석 또는 양이온 교환 분석 (바람직하게는 고해상도, 약한 양이온-교환 컬럼, 예를 들어 PROPAC WCX-10™ 양이온 교환 컬럼 사용)을 사용하여 결정한다. 아미노-말단 리더 연장부 변이체 이외에, 그의 중쇄의 하나 또는 둘 모두 상에 C-말단 라이신 잔기를 포함하는 항체, 탈아미드화 항체 변이체 등을 포함하고 이로 제한되지 않는 주요 종 항체의 추가의 아미노산 서열 변경 및/또는 변이체가 고려된다.
또한, 주요 종 항체 또는 변이체는 글리코실화 변이를 추가로 포함할 수 있고, 그의 비제한적인 예는 G1 또는 G2 올리고당 구조가 그의 Fc 구역에 부착된 항체, 탄수화물 모이어티가 그의 경쇄에 부착된 항체 (예를 들어 1 또는 2개의 탄수화물 모이어티, 예를 들어 글루코스 또는 갈락토스가 항체의 1 또는 2개의 경쇄에, 예를 들어 하나 이상의 라이신 잔기에 부착된 항체), 1 또는 2개의 비-글리코실화된 중쇄를 포함하는 항체 또는 시알산화 (sialidated) 올리고당이 그의 1 또는 2개의 중쇄에 부착된 항체 등을 포함한다.
조성물은 유전공학적으로 처리된 세포주, 예를 들어 HER2 항체를 발현하는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포주로부터 회수할 수 있거나, 또는 펩티드 합성에 의해 제조할 수 있다.
(x) 면역컨쥬게이트
본 발명은 또한 화학요법제, 독소 (예를 들어 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 소분자 독소 또는 효소 활성의 독소 및 그의 단편 및 변이체 포함), 또는 방사성 동위원소 (즉, 방사성 컨쥬게이트)와 같은 세포독성제에 컨쥬게이팅된 항체를 포함하는 면역컨쥬게이트에 관한 것이다.
상기 면역컨쥬게이트 생성에 유용한 화학요법제는 상기 설명한 바 있다. 항체 및 하나 이상의 작은 분자 독소, 예를 들어 칼리케아미신, 메이탄신 (미국 특허 5,208,020), 트리코텐 및 CC1065의 컨쥬게이트도 또한 본원에서 고려된다.
본 발명의 한 바람직한 실시태양에서, 항체는 하나 이상의 메이탄신 분자에 컨쥬게이팅된다 (예를 들어, 항체 1분자 당 약 1 내지 약 10개의 메이탄신 분자). 메이탄신은 예를 들어 May-SS-Me로 전환될 수 있고, 이는 May-SH3으로 환원되고 변형된 항체와 반응하여 (Chari et al. Cancer Research 52:127-131 (1992)) 메이탄시노이드-항체 면역컨쥬게이트를 생성할 수 있다.
목적하는 다른 면역컨쥬게이트는 하나 이상의 칼리케아미신 분자에 컨쥬게이팅된 항체를 포함한다. 칼리케아미신 패밀리의 항생제는 피코몰 미만 농도에서 이중가닥 DNA 파단을 생성시킬 수 있다. 사용될 수 있는 칼리케아미신의 구조 유사체는 γ1 I, α2 I, α3 I, N-아세틸-γ1 I, PSAG 및 θI 1을 포함하지만 이에 제한되지 않는다 ([Hinman et al. Cancer Research 53:3336-3342 (1993)] 및 [Lode et al. Cancer Research 58:2925-2928 (1998)]). 또한, 본원에 참고로 포함된 미국 특허 5,714,586; 5,712,374; 5,264,586; 및 5,773,001을 참조한다.
사용될 수 있는 효소 활성 독소 및 그의 단편은 디프테리아 A 사슬, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 사슬 (슈도모나스 애루기노사 (Pseudomonas aeruginosa)로부터), 리신 A 사슬, 아브린 A 사슬, 모데신 A 사슬, 알파-사르신, 알류리테스 포르디이 (Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 파이톨라카 아메리카나 (Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아 (momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 (sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센을 포함한다. 예를 들어, WO 93/21232 (1993년 10월 28일 공개)를 참조한다.
본 발명은 핵산 분해 활성을 갖는 화합물 (예를 들어, 리보뉴클레아제 또는 DNA 엔도뉴클레아제, 예를 들어 데옥시리보뉴클레아제; DNase)과 항체 사이에 형성된 면역컨쥬게이트를 추가로 고려한다.
다양한 방사성 동위원소가 방사성 컨쥬게이팅된 HER2 항체의 제조에 이용가능하다. 그 예는 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 및 Lu의 방사성 동위원소를 포함한다.
항체 및 세포독성제의 컨쥬게이트는 다양한 2관능성 단백질 커플링제, 예를 들어 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올) 프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트, 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 2관능성 유도체 (예를 들어 디메틸 아디피미데이트 HCL), 활성 에스테르 (예를 들어 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예를 들어 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예를 들어 비스(p-아지도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예를 들어 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예를 들어 톨리엔 2,6-디이소시아네이트) 및 비스-활성 불소 화합물 (예를 들어 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독소는 문헌 [Vitetta et al. Science 238: 1098 (1987)]에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아나토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)이 항체에 방사성 뉴클레오티드의 컨쥬게이션을 위한 예시적인 킬레이팅제이다. WO94/11026을 참조한다. 링커는 세포에서 세포독성 약물의 방출을 촉진시키는 "절단가능한 링커"일 수 있다. 예를 들어, 산-불안정성 링커, 펩티다제-감수성 링커, 디메틸 링커 또는 디술피드 함유 링커 (Chari et al. Cancer Research 52: 127-131 (1992))를 사용할 수 있다.
별법으로, 항체 및 세포독성제를 포함하는 융합 단백질은 예를 들어 재조합 기술 또는 펩티드 합성에 의해 제조할 수 있다.
다른 면역컨쥬게이트가 본원에서 고려된다. 예를 들어, 항체는 다양한 비단백질성 중합체, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시알킬렌, 또는 폴리에틸렌 글리콜과 폴리프로필렌 글리콜의 공중합체 중 하나에 연결될 수 있다. 또한, 항체는 예를 들어 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포좀, 알부민 미세구, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐)에서 또는 마크로에멀젼에서 액적 형성 기술 또는 계면 중합에 의해 제조되는 마이크로캡슐 (예를 들어 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐) 내에 봉입될 수 있다. 이러한 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.
본원에 개시된 항체는 또한 면역리포좀으로서 제형화될 수 있다. 항체를 함유하는 리포좀은 예를 들어 문헌 ([Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688 (1985)]; [Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980)]; 미국 특허 4,485,045 및 4,544,545; 및 WO97/38731 (1997년 10월 23일 공개)]에 기재된 것과 같은 당업계에 공지된 방법에 의해 제조된다. 향상된 순환 시간을 갖는 리포좀은 미국 특허 5,013,556에 개시되어 있다.
특히 유용한 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화된 포스파티딜에탄올아민 (PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물을 사용하는 역상 증발법에 의해 생성할 수 있다. 리포좀은 목적하는 직경을 갖는 리포좀을 수득하도록 규정된 공극 크기의 필터를 통해 압출된다. 본 발명의 항체의 Fab' 단편은 디술피드 상호교환 반응을 통해 문헌 [Martin et al. J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982)]에 기재된 바와 같이 리포좀에 컨쥬게이팅될 수 있다. 화학요법제는 임의로 리포좀 내에 함유된다 ([Gabizon et al. J. National Gancer Inst. 81(19)1484 (1989)] 참조).
III. 진단 방법
제1 측면에서, 본 발명은 HER3 발현을 HER 억제제 또는 HER 이량체화 억제제 (예를 들어 페르투주맙)제 반응할 수 있는 종류의 암 (예를 들어 난소암)에 걸린 환자로부터의 암 샘플에서 결정하는 것, 및 암 샘플이 그 암 종류에서의 HER3 발현에 대해 중앙 수준 미만의 수준으로 HER3을 발현하는 경우 및/또는 암 샘플이 그 암 종류에서의 HER2:HER3 발현에 대해 제25 백분위를 초과하는 (또는 중앙 수준을 초과하는 수준으로) 수준으로 HER2:HER3을 발현하는 경우 요법으로서 HER 억제제 또는 HER 이량체화 억제제를 선택하는 것을 포함하는, HER 억제제 또는 HER 이량체화 억제제 (예를 들어 페르투주맙)제 반응할 수 있는 종류의 암 (예를 들어 난소암)에 걸린 환자를 위한 요법을 선택하기 위한 방법을 제공한다.
제2 측면에서, 본 발명은 HER3 발현을 화학요법제에 반응할 수 있는 종류의 암 (예를 들어 난소암)에 걸린 환자로부터의 암 샘플에서 결정하는 것, 및 암 샘플이 그 암 종류에서의 HER3 발현에 대해 중앙 수준을 초과하는 수준으로 HER3을 발현하는 경우 요법으로서 화학요법제 (예를 들어 겜시타빈)를 선택하는 것을 포함하는, 화학요법제에 반응할 수 있는 종류의 암 (예를 들어 난소암)에 걸린 환자를 위한 요법을 선택하기 위한 방법을 제공한다.
중앙 또는 백분위 발현 수준은 본질적으로 HER3 발현 (또는 HER2 및 HER3 발현)의 측정과 동시에 결정될 수 있거나, 또는 사전에 결정될 수 있다.
아래에서 설명하는 치료 방법 전에, 환자의 암에서 HER3 발현 수준(들), 및 임의로 HER2 발현 수준(들)이 평가된다. 일반적으로, 생물학적 샘플은 요법을 필요로 하는 환자로부터 얻고, 이 샘플에 대해 하나 이상의 진단 분석(들), 일반적으로 적어도 하나의 시험관내 진단 (IVD) 분석을 수행한다. 그러나, HER3 및/또는 HER2 발현에 대한 다른 형태의 평가, 예를 들어 생체 내에서 진단이 분명히 본원에서 고려된다. 생물학적 샘플은 일반적으로 종양 샘플, 바람직하게는 난소암, 복막암, 난관암, 전이성 유방암 (MBC), 비-소세포 폐암 (NSCLC), 전립선암, 또는 결장직장암 종양 샘플이다.
본원에서 생물학적 샘플은 고정된 샘플, 예를 들어 포르말린 고정된, 파라핀-포매 (FFPE) 샘플, 또는 동결된 샘플일 수 있다.
mRNA 또는 단백질의 발현을 결정하기 위한 다양한 방법은 유전자 발현 프로파일링, 중합효소 연쇄 반응 (PCR), 예를 들어 정량적 실시간 PCR (qRT-PCR), 마이크로어레이 분석, 유전자 발현의 연속 분석 (SAGE), MassARRAY, 초병렬 시그너쳐 서열결정 (Massively Parallel Signature Sequencing (MPSS))에 의한 유전자 발현 분석, 단백체학 (proteomics), 면역조직화학 (IHC) 등을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 바람직하게는 mRNA가 정량된다. 상기 mRNA 분석은 바람직하게는 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 기술을 사용하여, 또는 마이크로어레이 분석에 의해 수행된다. PCR을 사용하는 경우, 바람직한 형태의 PCR은 정량적 실시간 PCR (qRT-PCR)이다. 바람직한 qRT-PCR 분석은 하기 실시예 1에서 설명되는 분석이다.
mRNA 단리, 정제, 프라이머 연장 및 증폭을 포함하는, RNA 공급원으로서 고정된 파라핀-포매 조직을 사용하여 유전자 발현을 프로파일링하기 위한 대표적인 프로토콜의 단계가 발표된 다양한 학회지 논문에 제시되어 있다 (예를 들어, [Godfrey et al. J. Molec. Diagnostics 2: 84-91 (2000)]; [Specht et al., Am. J. Pathol. 158: 419-29 (2001)] 참조). 간단히 설명하면, 대표적인 방법은 파라핀-포매 종양 조직 샘플을 약 10 마이크로그램 두께의 절편으로 절단하는 것으로 출발한다. 이어서, RNA를 추출하고, 단백질 및 DNA를 제거한다. RNA의 농도 분석 후에, 필요한 경우 RNA 복구 및/또는 증폭 단계가 포함될 수 있고, RNA는 유전자 특이적 프로모터를 사용하여 역전사되고, 이어서 PCR을 수행한다. 마지막으로, 조사된 종양 샘플에서 확인된 특징적인 유전자 발현 패턴을 기초로 하여 환자에게 이용가능한 최상의 치료 방법(들)을 확인하기 위해 데이타를 분석한다.
유전자 발현을 결정하기 위한 다양한 예시적인 방법을 이제 보다 상세히 설명할 것이다.
(i) 유전자 발현 프로파일링
유전자 발현 프로파일링의 방법은 2개의 큰 군, 즉 폴리뉴클레오티드의 혼성화 분석을 기초로 한 방법 및 폴리뉴클레오티드의 서열결정을 기초로 한 방법으로 나뉠 수 있다. 샘플 내의 mRNA 발현의 정량에 가장 일반적으로 사용되는 당업계에 공지된 방법은 노던 (northern) 블로팅 및 계내 혼성화 (Parker and Barnes, Methods in Molecular Biology, 106:247-283 (1999)); RNAse 보호 분석 (Hod, Biotechniques, 13:852-854 (1992)); 및 중합효소 연쇄 반응 (PCR) (Weis et al., Trends in Genetics, 8:263-264 (1992))을 포함한다. 별법으로, DNA 이중체, RNA 이중체, 및 DNA-RNA 하이브리드 이중체 또는 DNA-단백질 이중체를 포함하는 특이적인 이중체를 인식할 수 있는 항체를 사용할 수 있다. 서열결정-기반 유전자 발현 분석을 위한 대표적인 방법은 유전자 발현의 연속 분석 (SAGE), 및 초병렬 시그너쳐 서열결정 (MPSS))에 의한 유전자 발현 분석을 포함한다.
(ii) 중합효소 연쇄 반응 ( PCR )
상기 나열된 기술 중에서, 민감하고 탄력적으로 적용가능한 정량적 방법은 PCR이고, 이것은 상이한 샘플 집단에서, 정상 및 종양 조직에서, 약물 치료를 실시하거나 실시하지 않으면서 mRNA 수준을 비교하고, 유전자 발현 패턴을 특성화하고, 밀접하게 관련된 mRNA를 서로 구별하고, RNA 구조를 분석하기 위해서 사용될 수 있다.
제1 단계는 표적 샘플로부터 mRNA의 단리이다. 출발 물질은 일반적으로 각각 인간 종양 또는 종양 세포주, 및 대응하는 정상 조직 또는 세포주로부터 단리된 총 RNA이다. 따라서, RNA는 건강한 공여자로부터 모은 (pooled) DNA와 함께 유방, 폐, 결장, 전립선, 뇌, 간, 신장, 췌장, 비장, 흉선, 정소, 난소, 자궁 등을 포함하는 다양한 원발성 종양, 종양, 또는 종양 세포주으로부터 단리될 수 있다. mRNA의 공급원이 원발성 종양일 경우, mRNA는 예를 들어 냉동 또는 보관된 파라핀-포매 및 고정된 (예를 들어 포르말린-고정된) 조직 샘플로부터 추출될 수 있다. mRNA 추출을 위한 일반적인 방법은 당업계에 잘 알려져 있고, 문헌 [Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, John Wiley and Sons (1997)]을 포함하여 분자생물학의 표준 교재에 개시되어 있다. 파라핀 포매 조직으로부터 RNA를 추출하는 방법은 예를 들어 문헌 ([Rupp and Locker, Lab Invest. 56:A67 (1987)], 및 [De Andres et al., BioTechniques 18:42044 (1995)])에 개시되어 있다. 특히, RNA 단리는 상업적인 제조사, 예를 들어 퀴아겐 (Qiagen)의 정제 키트, 버퍼 세트 및 프로테아제를 제조사의 지시에 따라 사용하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 배양액 중의 세포로부터의 총 RNA는 퀴아겐 RNeasy 미니-컬럼을 사용하여 단리할 수 있다. 다른 상업적으로 이용가능한 RNA 단리 키트는 MASTERPURE(등록상표) 완전 DNA 및 RNA 정제 키트 (EPICENTRE(등록상표), 미국 위스콘신주 매디슨), 및 파라핀 블록 RNA 단리 키트 (앰비온, 인크. (Ambion, Inc.))를 포함한다. 조직 샘플로부터 총 RNA를 RNA Stat-60 (Tel-Test)을 사용하여 단리할 수 있다. 종양으로부터 제조된 RNA는 예를 들어 염화세슘 밀도 구배 원심분리에 의해 단리할 수 있다.
RNA는 PCR을 위한 주형으로서 기능할 수 없기 때문에, PCR에 의한 유전자 발현 프로파일링의 제1 단계는 RNA 주형의 cDNA로의 역전사, 이어서 PCR 반응에서 그의 기하급수적 증폭이다. 2개의 가장 흔히 사용되는 역전사효소는 아빌로 미엘로블라스토시스 (avilo myeloblastosis) 바이러스 역전사효소 (AMV-RT) 및 몰로니 (Moloney) 뮤린 백혈병 바이러스 역전사효소 (MMLV-RT)이다. 역전사 단계는 일반적으로 발현 프로파일링의 환경 및 목적에 따라 특이적인 프라이머, 랜덤한 헥사머, 또는 올리고-dT 프라이머를 사용하여 프라이밍된다. 예를 들어, 추출된 RNA는 GENEAMP™ RNA PCR 키트 (퍼킨 엘머 (Perkin Elmer, 미국 캘리포니아주))를 제조자의 지시에 따라 사용하여 역전사될 수 있다. 이어서, 유도된 cDNA는 후속적인 PCR 반응에서 주형으로서 사용될 수 있다. PCR 단계는 다양한 열안정성 DNA-의존성 DNA 중합효소를 이용할 수 있지만, 일반적으로 5'-3' 뉴클레아제 활성을 갖지만 3'-5' 프루프리딩 (proofreading) 엔도뉴클레아제 활성은 결여된 Taq DNA 중합효소를 이용한다. 따라서, TAQMAN(등록상표) PCR은 일반적으로 그의 표적 앰플리콘에 결합된 혼성화 프로브를 가수분해하기 위해 Taq 또는 Tth 중합효소의 5'-뉴클레아제 활성을 이용하지만, 동등한 5' 뉴클레아제 활성을 갖는 임의의 효소를 사용할 수 있다. PCR 반응에 전형적인 앰플리콘을 생성시키기 위해서 2개의 올리고뉴클레오티드 프라이머가 사용된다. 제3 올리고뉴클레오티드, 또는 프로브는 2개의 PCR 프라이머 사이에 위치하는 뉴클레오티드 서열을 검출하도록 설계된다. 프로브는 Taq DNA 중합효소 효소에 의해 연장될 수 없고, 리포터 형광 염료 및 켄쳐 (quencher) 형광 염료로 표지된다. 리포터 염료로부터의 임의의 레이저-유도 방출은, 프로브 상에 있기 때문에 두 염료가 함께 근접하여 위치할 때 켄칭 염료에 의해 켄칭된다. 증폭 반응 동안, Taq DNA 중합효소 효소는 주형-의존 방식으로 프로브를 절단한다. 생성되는 프로브 단편은 용액에서 해리되고, 방출된 리포터 염료로부터의 신호에는 제2 형광단의 켄칭 효과가 존재하지 않는다. 리포터 염료의 하나의 분자가 합성된 각각의 새로운 분자에 대해 유리되고, 비켄칭된 리포터 염료의 검출은 데이터의 정량적 해석을 위한 데이타를 제공한다.
TAQMAN(등록상표) PCR은 상업적으로 이용가능한 기기, 예를 들어, 예를 들어, ABI PRISM 7700(등록상표) 서열 검출 시스템(등록상표) (퍼킨 엘머-어플라이드 바이오시스템즈 (Perkin-Elmer-Applied Biosystems, 미국 캘리포니아주 포스터 시티), 또는 Lightcycler (로슈 몰레큘라 바이오케미칼스 (Roche Molecular Biochemicals, 독일 만하임))를 사용하여 수행할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 5' 뉴클레아제 절차는 실시간 정량적 PCR 장치, 예를 들어 ABI PRISM 7700(등록상표) 서열 검출 시스템에서 실시된다. 이 시스템은 열순환기, 레이저, 전하 결합 소자 (CCD), 카메라 및 컴퓨터로 이루어진다. 시스템은 열순환기에서 96-웰 포맷으로 샘플을 증폭한다. 증폭 동안, 레이저-유도된 형광 신호가 모든 96웰에 대해 광섬유 케이블을 통해 실시간으로 수집되고, CCD에서 검출된다. 시스템은, 기구를 작동시키고 데이타를 분석하기 위한 소프트웨어를 포함한다.
5'-뉴클레아제 분석 데이타는 초기에 Ct, 또는 역치 사이클로서 표현된다. 상기 논의한 바와 같이, 형광 값은 모든 사이클 동안 기록되고, 증폭 반응에서 그 지점까지 증폭된 산물의 양을 나타낸다. 형광 신호가 처음으로 통계적으로 유의한 것으로 기록되는 지점이 역치 사이클 (Ct)이다.
오류 및 샘플 대 샘플 편차의 효과를 최소화하기 위해서, PCR은 일반적으로 내부 표준품을 사용하여 수행된다. 이상적인 내부 표준품은 상이한 조직 중에서 일정한 수준으로 발현되고, 실험 처리에 의해 영향받지 않는다. 유전자 발현 패턴을 정규화하기 위해 가장 빈번하게 사용되는 RNA는 하우스키핑 (housekeeping) 유전자 글리세르알데히드-3-포스페이트-데히드로게나제 (GAPDH) 및 P-액틴에 대한 mRNA이다.
PCR 기술에 대한 보다 최근의 변형은 정량적 실시간 PCR (qRT-PCR)로서, 이 기술은 이중-표지된 형광 프로브 (즉, TAQMAN(등록상표) 프로브)를 통해 PCR 산물의 축적을 측정한다. 실시간 PCR은 각각의 표적 서열에 대한 내부 경쟁자가 정규화를 위해 사용되는 정량적 경쟁 PCR, 및 샘플 내에 함유된 정규화 유전자 또는 PCR을 위한 하우스키핑 유전자를 사용하는 정량적 경쟁적 PCR 모두와 상용성이다. 보다 상세한 내용에 대해서는, 예를 들어 문헌 [Held et al., Genome Research 6:986-994 (1996)]을 참고한다.
mRNA 단리, 정제, 프라이머 연장 및 증폭을 포함하는, RNA 공급원으로서 고정된 파라핀-포매 조직을 사용하여 유전자 발현을 프로파일링하기 위한 대표적인 프로토콜의 단계가 발표된 다양한 학회지 논문에 제시되어 있다 (예를 들어, [Godfrey et al. J. Molec. Diagnostics 2: 84-91 (2000)]; [Specht et al., Am. J. Pathol. 158: 419-29 (2001)] 참조). 간단히 설명하면, 대표적인 방법은 파라핀-포매 종양 조직 샘플을 약 10 마이크로그램 두께의 절편으로 절단하는 것으로 출발한다. 이어서, RNA를 추출하고, 단백질 및 DNA를 제거한다. RNA의 농도 분석 후에, 필요한 경우 RNA 복구 및/또는 증폭 단계가 포함될 수 있고, RNA는 유전자 특이적 프로모터를 사용하여 역전사되고, 이어서 PCR을 수행한다.
본 발명의 한 측면에 따라, PCR 프라이머 및 프로브는 증폭시킬 유전자에 존재하는 인트론 서열을 기초로 하여 설계된다. 본 실시태양에서, 프라이머/프로브 디자인의 제1 단계는 유전자 내의 인트론 서열의 묘사 (delineation)이다. 이것은 공개적으로 입수가능한 소프트웨어, 예를 들어 문헌 [Kent, W., Genome Res. 12(4):656-64 (2002)]에서 개발된 DNA BLAT 소프트웨어, 또는 그의 변형을 포함하는 BLAST 소프트웨어에 의해 수행될 수 있다. 후속적인 단계는 PCR 프라이머 및 프로브 디자인의 잘 확립된 방법을 따라 실시한다.
비-특이적 신호를 피하기 위해, 프라이머 및 프로브를 설계할 때 인트론 내의 반복 서열을 마스킹하는 것이 중요하다. 이것은 반복 요소의 라이브러리에 대해 DNA 서열을 스크리닝하고 반복 요소가 마스킹되는 질의 서열에 대해 응답하는, 베일러 의과대학 (Baylor College of Medicine)을 통해 온-라인 (on-line)으로 이용가능한 Repeat Masker 프로그램을 사용하여 쉽게 달성될 수 있다. 이어서, 마스킹된 인트론 서열은 임의의 상업적으로 또는 공개적으로 입수가능한 프라이머/프로브 디자인 패키지, 예를 들어 Primer Express (어플라이드 바이오시스템즈); MGB 애세이-바이-디자인 (assay-by-design) (어플라이드 바이오시스템즈); Primer3 (Rozen and Skaletsky (2000) Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. In: Krawetz S, Misener S (eds) Bioinformatics Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology. Humana Press, Totowa, N.J., pp 365-386)을 이용하여 프라이머 및 프로브 서열을 설계하기 위해 사용될 수 있다.
PCR 프라이머 설계시에 고려되는 인자는 프라이머 길이, 융점 (Tm), 및 G/C 함량, 특이성, 상보성 프라이머 서열, 및 3'-말단 서열을 포함한다. 일반적으로, 최적 PCR 프라이머는 길이가 일반적으로 17-30개 염기이고, 약 20-80％, 예를 들어 약 50-60％의 G+C 염기를 함유한다. 50 내지 80℃, 예를 들어 약 50 내지 70℃의 Tm이 일반적으로 바람직하다.
PCR 프라이머 및 프로브 디자인에 대한 추가의 지침에 대해서는, 예를 들어 그 전체 개시내용이 본원에 참고로 포함된 문헌 ([Dieffenbach et al., "General Concepts for PCR Primer Design" in PCR Primer, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1995, pp. 133-155]; [Innis and Gelfand, "Optimization of PCRs" in PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, CRC Press, London, 1994, pp. 5-11]; 및 [Plasterer, T. N. Primerselect: Primer and probe design. Methods Mol. Biol. 70:520-527 (1997)])을 참고한다.
바람직한 조건, 프라이머, 프로브, 및 내부 참조물 (G6PDH)은 하기 실시예 1에 기재되어 있다.
(iii) 마이크로어레이
또한, 차별적인 유전자 발현은 마이크로어레이 기술을 사용하여 확인하거나 확증될 수 있다. 따라서, 유방암-연관 유전자의 발현 프로필은 마이크로어레이 기술을 사용하여 신선한 또는 파라핀-포매 종양 조직에서 측정될 수 있다. 이 방법에서, 목적하는 폴리뉴클레오티드 서열 (cDNA 및 올리고뉴클레오티드 포함)이 마이크로칩 기판 상에 플레이팅되거나 어레이된다. 이어서, 어레이된 서열은 목적하는 세포 또는 조직으로부터의 특이적인 DNA 프로브와 혼성화된다. PCR 방법에서처럼, mRNA의 공급원은 일반적으로 인간 종양 또는 종양 세포주, 및 대응하는 정상 조직 또는 세포주로부터 단리된 총 RNA이다. 따라서, RNA는 다양한 원발성 종양 또는 종양 세포주로부터 단리될 수 있다. mRNA의 공급원이 원발성 종양이면, mRNA는 통상적으로 제조되고 일상적인 임상 실무 하에 보존된, 예를 들어 냉동 또는 보관된 파라핀-포매되고 고정된 (예를 들어 포르말린-고정된) 조직 샘플로부터 추출될 수 있다.
마이크로어레이 기술의 특정 실시태양에서, cDNA 클론의 PCR 증폭된 삽입물은 조밀한 어레이의 기판에 적용된다. 바람직하게는 적어도 10,000개의 뉴클레오티드 서열이 기판에 적용된다. 각각 10,000개의 요소로 마이크로칩 상에 고정된 마이크로어레이된 유전자가 엄격한 조건 하에서의 혼성화에 적합하다. 형광 표지된 cDNA 프로브는 목적하는 조직으로부터 추출된 RNA의 역전사에 의한 형광 뉴클레오티드의 혼입을 통해 생성시킬 수 있다. 칩에 적용된 표지된 cDNA 프로브는 어레이 상의 DNA의 각각의 지점 (spot)에 특이적으로 혼성화한다. 비-특이적으로 결합된 프로브를 제거하기 위해 엄격하게 세척한 후에, 칩을 공초점 레이저 현미경 또는 다른 검출 방법, 예를 들어 CCD 카메라에 의해 스캐닝한다. 각각의 어레이된 요소의 혼성화를 정량함으로써 대응하는 mRNA의 풍부도를 평가할 수 있다. 이중 색상 형광을 갖는, RNA의 2개의 공급원으로부터 생성된 별개로 표지된 cDNA 프로브는 어레이에 쌍을 이루는 방식으로 혼성화된다. 따라서, 각각의 명시된 유전자에 대응하는 2개의 공급원으로부터의 전사체의 상대적인 풍부도가 동시에 결정된다. 소규모의 혼성화는 매우 많은 유전자의 발현 패턴에 대한 편리하고 신속한 평가를 가능하게 한다. 상기 방법은 세포당 몇몇 카피에서 발현되는 희귀 전사체를 검출하고 적어도 약 2배의 발현 수준 차이를 재현가능하게 검출하기 위해 필요한 감수성을 갖는 것으로 밝혀졌다 (Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(2):106-149 (1996)). 마이크로어레이 분석은 상업적으로 이용가능한 기기에 의해 제조사의 프로토콜에 따라, 예를 들어 Affymetrix GENCHIP™ 기술, 또는 인사이트 (Incyte)의 마이크로어레이 기술을 사용하여 수행할 수 있다.
유전자 발현의 대규모 분석을 위한 마이크로어레이 방법이 개발되면, 암 분류 및 다양한 종양 종류에서의 결과 예측을 위한 분자 마커를 체계적으로 탐색할 수 있다.
(iv) 유전자 발현의 연속 분석 (SAGE)
유전자 발현의 연속 분석 (SAGE)은 각각의 전사체에 대한 개개의 혼성화 프로브를 제공할 필요성 없이 매우 많은 유전자 전사체에 대한 동시의 정량적 분석을 가능하게 하는 방법이다. 먼저, 태그를 각각의 전사체 내의 특유한 위치로부터 얻게 된다면, 전사체를 특유하게 확인하기에 충분한 정보를 함유하는 짧은 서열 태그 (약 10-14 bp)를 생성시킨다. 이어서, 많은 전사체를 함께 연결하여 긴 연속 분자를 형성시키고, 이 분자의 서열을 결정하여 다수의 태그의 본질을 동시에 밝혀낼 수 있다. 전사체의 임의의 집단의 발현 패턴은 개별적인 태그의 풍부도를 결정하고 각각의 태그에 대응하는 유전자를 확인함으로써 정량적으로 평가될 수 있다. 보다 상세한 내용에 대해서는, 예를 들어 문헌 ([Velculescu et al., Science 270:484-487 (1995)]; 및 [Velculescu et al., Cell 88:243-51 (1997)])을 참고한다.
(v) MassARRAY 기술
MassARRAY (시퀘놈 (Sequenom, 미국 캘리포니아주 샌디에고)) 기술은 검출을 위해 질량분광법 (MS)을 사용하는, 유전자 발현 분석을 위한 자동화된 고속 (high-throughput) 방법이다. 이 방법에 따르면, RNA의 단리, 역전사 및 PCR 증폭 후에, cDNA에 대해 프라이머 연장을 수행한다. cDNA-유도 프라이머 연장 산물을 정제하고, MALTI-TOF MS 샘플 제조에 필요한 성분이 예비 로딩된 칩 어레이 상에 분배한다. 반응물 내에 존재하는 다양한 cDNA는 얻어진 질량 스펙트럼에서 피크 영역을 분석함으로써 정량된다.
(vi) 초병렬 시그너쳐 서열결정 ( MPSS )에 의한 유전자 발현 분석
문헌 [Brenner et al., Nature Biotechnology 18:630-634 (2000)]에 기재된 이 방법은 비-겔 기반 시그너쳐 서열결정을 별개의 5 마이크로그램 직경의 마이크로비드 상에서 수백만 개의 주형의 시험관 내 클로닝과 조합하는 서열결정 방법이다. 먼저, DNA 주형의 마이크로비드 라이브러리를 시험관 내 클로닝에 의해 제조한다. 이어서, 고 밀도 (일반적으로 3X106 마이크로비드/cm2 초과)의 유동 세포에서 주형-함유 마이크로비드의 평면 어레이의 조립을 수행한다. 각각의 마이크로비드 상의 클로닝된 주형의 자유 말단을, DNA 단편 분리를 필요로 하지 않는 형광-기반 시그너쳐 서열결정 방법을 사용하여 동시에 분석한다. 이 방법은 단일 작업시에 효모 cDNA 라이브러리로부터 수십만 개의 유전자 시그너쳐를 동시에 정확하게 제공하는 것으로 밝혀졌다.
(vii) 면역조직화학
면역조직화학 방법은 또한 본 발명의 예후 마커의 발현 수준 검출에 적합하다. 따라서, 각각의 마커에 특이적인 항체 또는 항혈청, 바람직하게는 폴리클로날 항혈청, 가장 바람직하게는 모노클로날 항체가 발현을 검출하기 위해 사용된다. 항체는 예를 들어 방사성 표지, 형광 표지, 합텐 표지, 예를 들어 비오틴, 또는 효소, 예를 들어 양고추냉이 퍼옥시다제 또는 알칼린 포스파타제를 사용한 항체 자체의 직접적인 표지에 의해 검출될 수 있다. 별법으로, 비표지된 1차 항체는 1차 항체에 특이적인 항혈청, 폴리클로날 항혈청 또는 모노클로날 항체를 포함하는 표지된 2차 항체와 함께 사용된다. 면연조직화학 프로토콜 및 키트는 당업계에 잘 알려져 있고, 상업적으로 이용가능하다.
(viii) 단백체학
용어 "단백체 (proteome)"는 특정 시점에 샘플 (예를 들어 조직, 유기체, 또는 세포 배양액)에 존재하는 단백질의 총체로서 규정된다. 단백체학은 특히 샘플에서 단백질 발현의 전반적인 변화에 대한 연구를 포함한다 ("발현 단백체학"으로도 불림). 단백체학은 일반적으로 다음 단계를 포함한다: (1) 2-D 겔 전기영동 (2-D PAGE)에 의한 샘플 내의 개별적인 단백질의 분리; (2) 겔로부터 회수된 개별적인 단백질의 확인, 예를 들어 my 질량분광법 또는 N-말단 서열결정, 및 (3) 생물정보학 (bioinformatics)을 사용한 데이타의 분석. 단백체학 방법은 유전자 발현 프로파일링의 다른 방법에 대한 가치있는 보충 방법이고, 본 발명의 예후 마커의 산물을 검출하기 위해 단독으로 또는 다른 방법과 조합되어 사용될 수 있다.
(ix) mRNA 단리, 정제 및 증폭에 대한 일반적인 설명
mRNA 단리, 정제, 프라이머 연장 및 증폭을 포함하는, RNA 공급원으로서 고정된 파라핀-포매 조직을 사용하여 유전자 발현을 프로파일링하기 위한 대표적인 프로토콜의 단계가 발표된 다양한 학회지 논문에 제시되어 있다 (예를 들어, [Godfrey et al. J. Molec. Diagnostics 2: 84-91 (2000)]; [Specht et al., Am. J. Pathol. 158: 419-29 (2001)] 참조). 간단히 설명하면, 대표적인 방법은 파라핀-포매 종양 조직 샘플을 약 10 마이크로그램 두께의 절편으로 절단하는 것으로 출발한다. 이어서, RNA를 추출하고, 단백질 및 DNA를 제거한다. RNA의 농도 분석 후에, 필요한 경우 RNA 복구 및/또는 증폭 단계가 포함될 수 있고, RNA는 유전자 특이적 프로모터를 사용하여 역전사되고, 이어서 PCR을 수행한다. 마지막으로, 조사된 종양 샘플에서 확인된 특징적인 유전자 발현 패턴을 기초로 하여 환자에게 이용가능한 최상의 치료 방법(들)을 확인하기 위해 데이타를 분석한다.
한 실시태양에서, 특정 수준으로 HER3을 발현하고/하거나 특정 수준으로 HER2:HER3을 발현하는 것을 제외하고, 본원에서 치료된 환자는 추가로 HER2를 과다발현하지 않는다. HER2 과다발현은 예를 들어 HERCEPTEST(등록상표) (다코 (Dako))를 사용하여 IHC에 의해 분석할 수 있다. 종양 생검으로부터의 파라핀 포매 조직 절편을 IHC 분석에 적용하고 다음과 같은 HER2 단백질 염색 강도 기준을 부여할 수 있다.
스코어 0: 어떠한 염색도 관찰되지 않거나 막 염색이 10％ 미만의 종양 세포에서 관찰된다.
스코어 1+: 희미한/거의 감지할 수 없는 막 염색이 10％ 초과의 종양 세포에서 검출된다. 세포는 그의 막의 일부에서만 염색된다.
스코어 2+: 약한 수준 내지 중등도의 완전한 막 염색이 10％ 초과의 종양 세포에서 관찰된다.
스코어 3+: 중등도 내지 강한 수준의 완전한 막 염색이 10％ 초과의 종양 세포에서 관찰된다.
HER2 과다발현 평가에 대해 0 또는 1+ 스코어를 갖는 종양은 HER2를 과다발현하지 않는 것으로 특성화할 수 있는 반면, 2+ 또는 3+ 스코어를 갖는 종양은 HER2를 과다발현하는 것으로 특성화할 수 있다.
HER2를 과다발현하는 종양은 세포당 발현된 HER2 분자의 카피수에 대응하는 면역조직화학적 스코어로 등급을 매길 수 있고, 생화학적으로 결정할 수 있다:
0 = 0 - 10,000 카피/세포,
1+ = 적어도 약 200,000 카피/세포,
2+ = 적어도 약 500,000 카피/세포,
3+ = 적어도 약 2,000,000 카피/세포.
티로신 키나제의 리간드-비의존 활성화를 일으키는 3+ 수준에서의 HER2의 과다발현 (Hudziak et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:7159-7163 (1987))이 약 30％의 유방암에서 발생하고, 이들 환자에서 비재발 생존 및 전체 생존은 감소한다 ([Slamon et al., Science, 244:707-712 (1989)]; [Slamon et al., Science, 235:177-182 (1987)]). 별법으로 또는 추가로, 종양에서 HER2 증폭의 정도 (존재하는 경우에)를 결정하기 위해 FISH 분석, 예를 들어 INFORM™ (벤타나 (Ventana, 미국 애리조나주)) 또는 PATHVISION™ (비시스 (Vysis, 미국 일리노이주))을 포르말린-고정된 파라핀-포매 종양 조직에 대해 수행할 수 있다.
HER3 및/또는 HER2 발현은 또한 생체내 진단 분석을 이용하여, 예를 들어 검출할 분자에 결합하고 검출가능한 표지 (예를 들어 방사성 동위원소)로 태깅된 분자 (예를 들어 항체)를 투여하고, 표지의 위치에 대해 환자를 외부에서 스캐닝함으로써 평가할 수 있다.
IV. 제약 제형
본 발명에 따라 사용되는 HER 억제제, HER 이량체화 억제제 또는 화학요법제의 치료 제형은 저장을 위해, 목적하는 정도의 순도를 갖는 항체를 선택적인 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제 (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))와 혼합함으로써, 일반적으로 동결건조 제형 또는 수용액의 형태로 제조된다. 항체 결정이 또한 고려된다 (US 특허 출원 2002/0136719). 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용된 용량 및 농도에서 수여자에게 무독성이고, 버퍼, 예를 들어 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제 (예를 들어, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예를 들어 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레솔시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 단당류, 이당류 및 다른 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 만노스 또는 덱스트린; 킬레이팅제, 예를 들어 EDTA; 당류, 예를 들어 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염 형성 반대 이온, 예를 들어 나트륨; 금속 착물 (예, Zn-단백질 착물); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예를 들어 TWEEN™, PLURONICS™ 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)를 포함한다. 동결건조된 항체 제형은 본원에 명백하게 참고로 포함된 WO 97/04801에 기재되어 있다.
치료 용도에 바람직한 페르투주맙 제형은 20 mM 히스티딘 아세테이트, 120 mM 수크로스, 0.02％ 폴리소르베이트 20 (pH 6.0) 내에 30 mg/mL 페르투주맙을 포함한다. 별법의 페르투주맙 제형은 25 mg/mL 페르투주맙, 10 mM 히스티딘-HCl 버퍼, 240 mM 수크로스, 0.02％ 폴리소르베이트 20 (pH 6.0)을 포함한다.
본원에서 제형은 또한 치료되는 특정 적응증에 필요한 경우에 하나 이상의 활성 화합물, 바람직하게는 서로 불리한 영향을 미치지 않는 상보성 활성을 갖는 것을 함유할 수 있다. HER 억제제 또는 HER 이량체화 억제제와 조합될 수 있는 다양한 약물은 아래 치료 섹션에 설명되어 있다. 그러한 분자는 적합하게는 의도되는 목적에 효과적인 양으로 조합으로 존재한다.
활성 성분은 또한 예를 들어 콜로이드성 약물 전달계 (예를 들어, 리포좀, 알부민 미세구, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐)에서 또는 마크로에멀젼에서 각각 액적 형성 기술 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어 히드록시메틸셀룰로즈 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 내에 봉입될 수 있다. 그러한 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.
지속 방출 제제를 제조할 수 있다. 지속 방출 제제의 적합한 예는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하고, 상기 매트릭스는 성형된 용품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 지속 방출 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 하이드로겔 (예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락타이드 (미국 특허 3,773,919), L-글루탐산과 γ 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예를 들어 LUPRON DEPOT™ (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프로라이드 아세테이트로 이루어진 주사가능 미세구) 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산을 포함한다.
생체내 투여에 사용될 제형은 멸균되어야 한다. 이는 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성된다.
따라서, 패키지 내에 HER 억제제 또는 HER 이량체화 억제제 또는 그의 제약 조성물, 및 상기 억제제 또는 제약 조성물이 상기 억제제에 반응할 수 있는 종류의 암 (예를 들어 난소암)에 걸린 환자의 치료에 사용되도록 지시되었음을 언급한 라벨을 합하는 것을 포함하는, HER 억제제 또는 HER 이량체화 억제제 (예를 들어 페르투주맙), 또는 그의 제약 조성물을 제조하는 방법을 제공하고, 여기서 환자의 암은 그 암 종류에서의 HER3 발현에 대해 중앙 수준 미만의 수준으로 HER3을 발현하고/하거나 환자의 암 샘플은 그 암 종류에서의 HER2:HER3 발현에 대해 제25 백분위를 초과하는 수준으로 HER2:HER3을 발현한다.
또한, 패키지 내에 화학요법제 또는 그의 제약 조성물, 및 상기 화학요법제 또는 제약 조성물이 어느 한 종류의 암 (예를 들어 난소암)에 걸린 환자의 치료에 사용되도록 지시되었음을 언급한 라벨을 합하는 것을 포함하는, 화학요법제 (예를 들어 겜시타빈) 또는 그의 제약 조성물을 제조하는 방법을 제공하고, 여기서 환자의 암은 그 암 종류에서의 HER3 발현에 대해 중앙 수준을 초과하는 수준으로 HER3을 발현한다.
V. HER 억제제를 사용한 치료
본 발명은 HER 억제제 또는 HER 이량체화 억제제에 반응할 수 있는 종류의 암에 걸린 환자에게 치료상 유효량의 상기 억제제를 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자를 치료하기 위한 방법을 제공하고, 여기서 환자의 암은 그 암 종류에서의 HER3 발현에 대해 중앙 수준 미만의 수준으로 HER3을 발현하고/하거나 암 샘플은 그 암 종류에서의 HER2:HER3 발현에 대해 제25 백분위를 초과하는 수준으로 HER2:HER3을 발현한다. 바람직하게는, 환자의 암은 그 암 종류에서의 HER3 발현에 대해 제25 백분위 미만의 수준으로 HER3을 발현하고/하거나 그 암 종류에서 중앙 수준을 초과하는 (가장 바람직하게는 HER2:HER3 발현에 대해 제75 백분위를 초과하는) 수준으로 HER2:HER3을 발현한다.
특히 바람직한 실시태양에서, 본 발명은 난소암, 복막암 또는 난관암의 환자에게 치료상 유효량의 페르투주맙을 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자를 치료하는 방법을 제공하고, 여기서 환자의 암은 난소암, 복막암 또는 난관암에서의 HER3 발현에 대해 중앙 수준 미만의 수준으로 HER3을 발현하고/하거나 환자의 암 샘플은 난소암, 복막암 또는 난관암에서의 HER2:HER3 발현에 대해 제25 백분위를 초과하는 수준으로 HER2:HER3을 발현한다. 이 실시태양에서, 바람직하게는 환자의 암은 난소암, 복막암 또는 난관암에서의 HER3 발현에 대해 제25 백분위 미만의 수준으로 HER3을 발현하고/하거나 난소암, 복막암 또는 난관암에서 중앙 수준을 초과하는 (가장 바람직하게는 HER2:HER3 발현에 대해 제75 백분위를 초과하는) 수준으로 HER2:HER3을 발현한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 HER3 발현을 화학요법제에 반응할 수 있는 종류의 암에 걸린 환자로부터의 암 샘플에서 결정하는 것, 및 암 샘플이 그 암 종류에서의 HER3 발현에 대해 중앙 수준을 초과하는 수준으로 HER3을 발현하는 경우 요법으로서 화학요법제를 선택하는 것을 포함하는, 화학요법제에 반응할 수 있는 종류의 암에 걸린 환자를 위한 요법을 선택하는 방법을 제공한다. 본 실시태양에서, 바람직하게는 암 종류는 난소암, 복막암 또는 난관암, 예를 들어 백금 내성 난소암, 복막암 또는 난관암뿐만 아니라 진행성, 불응성 및/또는 재발성 난소암이다. 화학요법제는 바람직하게는 항대사물질, 예를 들어 겜시타빈이다. 따라서, 이 실시태양에서, 고 HER3은 화학요법제, 예를 들어 겜시타빈을 사용한 요법에 대한 개선된 반응과 상호관련된다.
HER 억제제 또는 HER 이량체화 억제제를 사용하여 치료할 수 있는 다양한 암 종류의 예는 상기 정의 섹션에 나열한 바 있다. 바람직한 암 종류는 난소암; 복막암; 난관암; 유방암, 예를 들어 전이성 유방암 (MBC); 폐암, 예를 들어 비-소세포 폐암 (NSCLC); 전립선암; 및 결장직장암을 포함한다. 한 실시태양에서, 치료할 암은 진행성, 불응성, 재발성, 화학요법 내성 및/또는 백금 내성 암이다.
HER 억제제, HER 이량체화 억제제 및/또는 화학요법제를 사용하는 요법은 바람직하게는 생존, 예를 들어 무진행 생존 (PFS) 및/또는 전체 생존 (OS)을 연장시킨다. 한 실시태양에서, HER 억제제 또는 HER 이량체화 억제제를 사용하는 요법은 생존을 치료하는 암에 대한 승인된 항종양제, 또는 치료 표준을 투여함으로써 달성되는 생존보다 적어도 약 20％ 더 연장시킨다.
바람직한 실시태양에서, 방법은 난소암, 복막암 또는 난관암의 환자를 치료하는 것을 포함한다. 환자는 진행성, 불응성, 재발성, 화학요법 내성 및/또는 백금 내성 난소암, 복막암 또는 난관암에 걸린 환자일 수 있다. 환자에게 페르투주맙을 투여하면, 예를 들어 생존을 상기 환자에게 토포테칸 또는 리포좀 독소루비신을 투여하여 달성한 생존보다 적어도 약 20％ 더 연장할 수 있다.
HER 억제제 또는 HER 이량체화 억제제 및/또는 화학요법제는 공지의 방법에 따라, 예를 들어 볼러스로서 또는 일정 시간에 걸친 연속 주입에 의한 정맥내 투여, 근육내, 복강내, 뇌척수내, 피하, 관절내, 활액내, 경막내, 경구, 국소 또는 흡입 경로에 의해 인간 환자에게 투여된다. 항체의 정맥내 투여가 바람직하다.
암의 예방 또는 치료를 위해, HER 억제제, HER 이량체화 억제제 및/또는 화학요법제의 투여량은 상기 정의된 바와 같은 치료될 암의 종류, 질병의 심도 및 경과, 항체가 예방 또는 치료 목적으로 투여되는 지의 여부, 선행 요법, 환자의 임상력 및 약물에 대한 반응, 및 의사의 판단에 따라 결정될 것이다.
한 실시태양에서, 고정 투여량의 억제제가 투여된다. 고정 투여량은 적합하게는 환자에게 1회에 또는 일련의 치료에 걸쳐 투여된다. 1회의 고정 투여량이 투여되는 경우에, 바람직하게는 약 20 mg 내지 약 2000 mg의 억제제의 범위이다. 예를 들어, 고정 투여량은 약 420 mg, 약 525 mg, 약 840 mg, 또는 약 1050 mg의 억제제, 예를 들어 페르투주맙일 수 있다.
일련의 투여량이 투여되는 경우에, 이들은 예를 들어 대략 매주, 대략 2주 마다, 대략 3주 마다, 또는 대략 4주 마다 투여될 수 있지만, 바람직하게는 대략 3주 마다 투여된다. 고정 투여량은 예를 들어 질병 진행, 이상 사건, 또는 의사가 결정하는 다른 시간까지 계속 투여될 수 있다. 예를 들어 약 2, 3 또는 4 내지 약 17회 이상의 고정 투여량이 투여될 수 있다.
한 실시태양에서, 항체의 하나 이상의 로딩 투여량(들)이 투여된 후, 항체의 하나 이상의 유지 투여량(들)이 투여된다. 또다른 실시태양에서, 복수의 동일한 투여량이 환자에게 투여된다.
본 발명의 하나의 바람직한 실시태양에 따라, 약 840 mg의 HER 이량체화 억제제 (예를 들어 페르투주맙)의 고정 투여량 (로딩 투여량)이 투여된 후, 항체의 약 420 mg의 하나 이상의 투여량 (유지 투여량(들))이 투여된다. 유지 투여량은 바람직하게는 총 적어도 2회의 투여량에 대해 17회 이상의 투여량까지 약 3주 마다 투여된다.
본 발명의 다른 바람직한 실시태양에 따라, 약 1050 mg의 HER 이량체화 억제제 (예를 들어 페르투주맙)의 하나 이상의 고정 투여량(들)이 예를 들어 3주 마다 투여된다. 본 실시태양에 따라, 1, 2회 이상의 고정 투여량이 예를 들어 1년까지 (17 사이클) 및 원하는 만큼 더 오랫동안 투여된다.
또다른 실시태양에서, 약 1050 mg의 HER 이량체화 억제제 (예를 들어 페르투주맙)의 고정 투여량이 로딩 투여량으로서 투여된 후, 약 525 mg의 하나 이상의 유지 투여량(들)이 투여된다. 약 1, 2회 이상의 유지 투여량이 본 실시태양에 따라 환자에게 3주마다 투여될 수 있다.
HER 억제제, HER 이량체화 억제제 또는 화학요법제가 단일 항종양제로서 투여될 수 있는 반면, 환자는 임의로 억제제 (또는 화학요법제) 및 하나 이상의 (추가의) 화학요법제(들)의 조합으로 치료된다. 본원에서 예시적인 화학요법제는 겜시타빈, 카르보플라틴, 파클리탁셀, 도세탁셀, 토포테칸 및/또는 리포좀 독소루비신을 포함한다. 바람직하게는 적어도 하나의 화학요법제는 항대사물질 화학요법제, 예를 들어 겜시타빈이다. 조합 투여는 별개의 제형 또는 단일 제약 제형을 사용한 병합 투여 또는 동시 투여, 및 임의의 순서의 연속 투여를 포함하고, 여기서 바람직하게는 2개의 (또는 모든) 활성제가 그들의 생물학적 활성을 동시에 발휘하는 시간 간격이 존재한다. 따라서, 항대사물질 화학요법제는 억제제의 투여 전에 또는 투여 후에 투여될 수 있다. 본 실시태양에서, 항대사물질 화학요법제의 적어도 하나의 투여와 억제제의 적어도 하나의 투여 사이의 시간 간격은 바람직하게는 약 1개월 이내, 가장 바람직하게는 약 2주 이내이다. 별법으로, 항대사물질 화학요법제 및 억제제는 단일 제형 또는 별개 제형으로 환자에게 동시에 투여된다. 또한, 화학요법제 (예를 들어 항대사물질 화학요법제, 예를 들어 겜시타빈)과 억제제 (예를 들어 페르투주맙)의 조합물을 사용한 치료는 환자에게 상승적 또는 상가적인 잇점을 초과하는 치료상의 잇점을 줄 수 있다.
예를 들어 난소암의 치료를 위해 억제제와 조합하기 위해 특히 바람직한 화학요법제는 항대사물질 화학요법제, 예를 들어 겜시타빈; 백금 화합물, 예를 들어 카르보플라틴; 탁소이드, 예를 들어 파클리탁셀 또는 도세탁셀; 토포테칸; 또는 리포좀 독소루비신을 포함한다.
항대사물질 화학요법제는 투여되는 경우에 대체로 그에 대해 공지된 용량으로 투여되거나, 약물의 조합 작용 또는 항대사물질 화학요법제의 투여에 의한 부정적인 부작용 때문에 선택적으로 감소된다. 그러한 화학요법제에 대한 제제 및 투여 계획은 제조자의 지시에 따라 사용되거나 숙련의에 의해 경험적으로 결정될 수 있다. 항대사물질 화학요법제가 겜시타빈인 경우, 바람직하게는 예를 들어 3주 사이클의 1일 및 8일에 약 600 mg/m2 내지 1250 mg/m2 (예를 들어 약 1000 mg/m2)의 투여량으로 투여된다.
억제제 및 항대사물질 화학요법제 이외에, 다른 치료법이 또한 그와 조합될 수 있다. 예를 들어, 제2 (제3, 제4 등)의 화학요법제(들)을 투여할 수 있고, 여기서 제2 화학요법제는 다른 상이한 항대사물질 화학요법제, 또는 항대사물질이 아닌 화학요법제이다. 예를 들어, 제2 화학요법제는 탁산 (예를 들어 파클리탁셀 또는 도세탁셀), 카페시타빈, 또는 백금계 화학요법제 (예를 들어 카르보플라틴, 시스플라틴, 또는 옥살리플라틴), 안트라사이클린 (예를 들어 독소루비신, 예를 들어 리포좀 독소루비신), 토포테칸, 페메트렉세드, 빈카 알칼로이드 (예를 들어 비노렐빈) 및 TLK 286일 수 있다. 상이한 화학요법제의 "칵테일 (cocktail)"을 투여할 수 있다.
억제제 및/또는 화학요법제와 조합할 수 있는 다른 치료제는 제2의 상이한 HER 억제제, HER 이량체화 억제제 (예를 들어, 성장 억제 HER2 항체, 예를 들어 트라스투주맙, 또는 HER2-과다발현 세포의 세포자멸을 유도하는 HER2 항체, 예를 들어 7C2, 7F3 또는 그의 인간화 변이체); 상이한 종양 회합 항원, 예를 들어 EGFR, HER3, HER4에 대해 작용하는 항체; 항-호르몬 화합물, 예를 들어 항-에스트로겐 화합물, 예를 들어 타목시펜, 또는 아로마타제 억제제; 심보호제 (요법과 관련된 임의의 심근 기능부전의 예방 또는 감소를 위해); 시토킨; EGFR-표적화 약물 (예를 들어 타르체바(등록상표), 이레사(등록상표) 또는 세툭시맙); 항혈관신생제 (특히 제넨테크에서 상표명 아바스틴™으로 시판하는 베바시주맙); 티로신 키나제 억제제; COX 억제제 (예를 들어 COX-1 또는 COX-2 억제제); 비스테로이드성 소염 약물, 셀레콕시브 (셀레브렉스 (CELEBREX)(등록상표)); 파르네실 트랜스퍼라제 억제제 (예를 들어 티피파르닙/자르네스트라 (ZARNESTRA)(등록상표) R115777 (존슨 앤 존슨 (Johnson and Johnson)) 또는 로나파르닙 SCH66336 (쉐링-프라우 (Schering-Plough)); 종양태아성 단백질 CA 125에 결합하는 항체, 예를 들어 오레고보맙 (MoAb B43.13); HER2 백신 (예를 들어 HER2 AutoVac 백신 (파르멕시아 (Pharmexia)), 또는 APC8024 단백질 백신 (덴드레온 (Dendreon)), 또는 HER2 펩티드 백신 (GSK/코릭사 (Corixa)); 다른 HER 표적화 요법제 (예를 들어 트라스투주맙, 세툭시맙, ABX-EGF, EMD7200, 게피티닙, 에를로티닙, CP724714, CI1033, GW572016, IMC-11F8, TAK165 등); Raf 및/또는 ras 억제제 (예를 들어 WO2003/86467 참조); 독소루비신 HCl 리포좀 주사 (독실(등록상표)); 토포아이소머라제 I 억제제, 예를 들어 토포테칸; 탁산; HER2 및 EGFR 이중 티로신 키나제 억제제, 예를 들어 라파티닙/GW572016; TLK286 (텔시타 (TELCYTA)(등록상표)); EMD-7200; 오심 치료용 의약, 예를 들어 세로토닌 길항제, 스테로이드 또는 벤조디아제핀; 피부 발진의 예방 또는 치료 또는 표준 여드름 요법용 의약, 예를 들어 국소 또는 경구 항생제; 설사의 치료 또는 예방용 의약; 체온 감소 의약, 예를 들어 아세트아미노펜, 디펜히드라민 또는 메페리딘; 조혈 성장인자 등 중의 임의의 하나 이상을 포함한다.
임의의 상기 병합 투여되는 물질에 대한 적합한 용량은 현재 사용되는 양이고, 물질과 억제제의 조합 작용 (상승작용)으로 인해 감소시킬 수 있다.
상기 치료 요법에 추가로, 환자를 암세포의 수술적 제거 및/또는 방사선 요법에 적용할 수 있다.
억제제가 항체인 경우에, 바람직하게는 투여되는 항체는 네이키드 항체이다. 그러나, 투여되는 억제제는 세포독성제와 컨쥬게이팅될 수 있다. 바람직하게는, 그가 결합하는 컨쥬게이팅된 억제제 및/또는 항원은 세포에 의해 내재화되어, 그가 결합하는 암 세포를 치사시키는 컨쥬게이트의 치료 효능을 증가시킨다. 바람직한 실시태양에서, 세포독성제는 암 세포 내의 핵산을 표적으로 하거나 저해한다. 그러한 세포독성제의 예는 메이탄시노이드, 칼리케아미신, 리보뉴클레아제 및 DNA 엔도뉴클레아제를 포함한다.
본원은 유전자 요법에 의한 억제제의 투여를 고려한다. 세포내 항체를 생성하기 위한 유전자 요법의 사용에 관해서는 예를 들어, 1996년 3월 14일 공개된 WO96/07321을 참조한다.
핵산 (임의로 벡터 내에 포함됨)을 환자의 세포 내로 도입하는 2가지 주요한 방법, 즉 생체내 및 생체외 전달이 존재한다. 생체내 전달을 위해, 핵산은 대체로 항체가 필요한 부위에서 환자에게 직접 주사된다. 생체외 치료를 위해, 환자의 세포를 분리하고, 핵산을 이들 단리된 세포 내로 도입하고, 변형된 세포를 환자에게 직접 투여하거나, 예를 들어 다공성 막 내에 봉입시켜 환자에게 이식한다 (예를 들어 미국 특허 4,892,538 및 5,283,187 참조). 핵산을 생존가능 세포 내로 도입하기 위해 이용가능한 다양한 기술이 존재한다. 상기 기술은 핵산이 시험관 내에서 배양된 세포 내로 전달되는지 또는 의도하는 숙주의 세포에 생체 내에서 전달되는지에 따라 다르다. 핵산을 포유동물 세포 내로 시험관 내에서 전달하기에 적합한 기술은 리포좀의 사용, 전기천공, 미세주사, 세포 융합, DEAE-덱스트란, 인산칼슘 침전 방법 등을 포함한다. 유전자의 생체외 전달을 위해 일반적으로 사용되는 벡터는 레트로바이러스이다.
현재 바람직한 생체내 핵산 전달 기술은 바이러스 벡터 (예를 들어 아데노바이러스, 제1형 단순 포진 바이러스 또는 아데노-관련 바이러스) 및 지질계 시스템 (유전자의 지질-매개 전달에 유용한 지질은 예를 들어 DOTMA, DOPE 및 DC-Chol임)을 사용한 형질감염을 포함한다. 일부 상황에서, 핵산 공급원에 표적 세포를 표적화하는 물질, 예를 들어 세포 표면 막 단백질 또는 표적 세포에 특이적인 항체, 표적 세포 상의 수용체에 대한 리간드 등을 제공하는 것이 바람직하다. 리포좀이 사용될 경우, 표적화 및/또는 흡수 촉진을 위해 세포내 이입 (endocytosis)과 연관된 세포 표면 막 단백질에 결합하는 단백질, 예를 들어 특정 세포 종류에 대해 작용하는 캡시드 단백질 또는 그의 단편, 세포 주기에서 내재화를 하는 단백질에 대한 항체, 및 세포내 국재화를 표적화하고 세포내 반감기를 향상시키는 단백질을 이용할 수 있다. 수용체-매개 세포내 이입의 기술은 예를 들어 문헌 ([Wu et al., J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)]; 및 [Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:3410-3414 (1990)]에 설명되어 있다. 현재 공지된 유전자 표지 및 유전자 요법 프로토콜에 관한 검토는 문헌 [Anderson et al., Science 256:808-813 (1992)]을 참조한다. 또한, WO 93/25673과 여기에 인용된 참조문을 참조한다.
VI. 제조품
본 발명의 또다른 실시태양에서, 상기 설명된 질병 또는 병태의 치료에 유용한 물질을 함유하는 제조품을 제공한다. 제조품은 용기, 및 용기 상에 존재하거나 용기와 연결된 라벨 또는 포장 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는 예를 들어, 병, 바이알, 시린지 등을 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로부터 형성될 수 있다. 용기는 선택된 질병 또는 병태를 치료하기 위해 효과적인 조성물을 보유하거나 함유하고, 멸균 접근 포트 (access port)를 가질 수 있다 (예를 들어, 용기는 피하 주사 바늘로 관통가능한 스토퍼 (stopper)가 존재하는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있다). 조성물 내의 적어도 하나의 활성제는 HER 이량체화 억제제, 예를 들어 페르투주맙, 또는 화학요법제, 예를 들어 겜시타빈이다.
제조품은 제약상 허용되는 희석제 버퍼, 예를 들어 정균처리 주사용수 (BWFI), 포스페이트-완충 염수, 링거 (Ringer) 용액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 제조품은 상업 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질, 예를 들어 다른 버퍼, 희석제, 필터, 바늘 및 시린지를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 키트 및 제조품은 또한 조성물이 환자의 암이 HER3 및/또는 HER2:HER3을 약물에 따라 규정된 수준으로 발현하는 암을 치료하기 위해 사용되는 것을 나타내는 정보를, 예를 들어 포장 삽입물 또는 라벨의 형태로 포함한다. 삽입물 또는 라벨은 임의의 형태, 예를 들어 종이 또는 전자 매체, 예를 들어 자기 기록 매체 (예를 들어, 플로피 디스크) 또는 CD-ROM 상에 존재할 수 있다. 라벨 또는 삽입물은 또한 키트 또는 제조품 내의 제약 조성물 및 투여형에 관한 다른 정보를 포함할 수 있다.
일반적으로, 그러한 정보는 환자 및 의사가 동봉된 제약 조성물 및 투여형을 효과적이고 안전하게 사용하는 것을 돕는다. 예를 들어, HER 이량체화 억제제 또는 화학요법제에 관한 다음 정보가 삽입물 내에 제공될 수 있다: 약동학, 약역학, 임상 연구, 효능 파라미터, 적응증 및 용법, 금기, 경고, 주의, 이상 반응, 과용 투여, 적합한 용량 및 투여, 공급 방법, 적합한 저장 조건, 참조문 및 특허 정보.
본 발명의 특정한 실시태양에서, 함께 포장된, 제약상 허용되는 담체 내에 HER 억제제 또는 HER 이량체화 억제제를 포함하는 제약 조성물, 및 상기 억제제 또는 제약 조성물이 HER 억제제 또는 HER 이량체화 억제제에 반응할 수 있는 종류의 암에 걸린 환자의 치료에 사용되도록 지시되었음을 언급한 라벨을 포함하는 제조품을 제공하고, 여기서 환자의 암은 그 암 종류에서의 HER3 발현에 대해 중앙 수준 미만의 수준으로 HER3을 발현하고/하거나 환자의 암 샘플은 그 암 종류에서의 HER2:HER3 발현에 대해 제25 백분위를 초과하는 수준으로 HER2:HER3을 발현한다.
본 발명의 측면의 선택적인 실시태양에서, 본원의 제조품은 제2 의약을 포함하는 용기를 추가로 포함하고, 여기서 HER 억제제 또는 HER 이량체화 억제제가 제1 의약이고, 상기 물품은 제2 의약을 유효량으로 사용하여 환자를 치료하기 위한 포장 삽입물 상의 사용설명서를 추가로 포함한다. 제2 의약은 상기 기재된 임의의 것일 수 있고, 예시적인 제2 의약은 다른 HER2 항체 또는 화학요법제이다.
또다른 측면에서, 함께 포장된, 제약상 허용되는 담체 내에 화학요법제 (예를 들어 겜시타빈)를 포함하는 제약 조성물, 및 상기 화학요법제 또는 제약 조성물이 어느 한 종류의 암에 걸린 환자의 치료에 사용되도록 지시되었음을 언급한 라벨을 포함하는 제조품을 제공하고, 여기서 환자의 암은 그 암 종류에서의 HER3 발현에 대해 중앙 수준을 초과하는 수준으로 HER3을 발현한다.
포장 삽입물은 용기 상에 존재하거나 용기와 연결된다. 적합한 용기는 예를 들어 병, 바이알, 시린지 등을 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로부터 형성될 수 있다. 용기는 암 종류를 치료하기 위해 효과적인 조성물을 보유하거나 함유하고, 멸균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 용기는 피하 주사 바늘로 관통가능한 스토퍼가 존재하는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있다). 조성물 내의 적어도 하나의 활성제는 HER 억제제, HER 이량체화 억제제, 또는 화학요법제이다. 라벨 또는 포장 삽입물은 억제제 및 임의의 다른 의약의 투약 양 및 간격에 관한 특정한 지침이 제공되면 조성물이 치료에 적합한 대상에서 암을 치료하기 위해 사용되는 것을 나타낸다. 제조품은 제약상 허용되는 희석제 버퍼, 예를 들어 정균처리 주사용수 (BWFI), 포스페이트-완충 염수, 링거 용액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 추가의 용기를 추가로 포함할 수 있다. 제조품은 상업 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질, 예를 들어 다른 버퍼, 희석제, 필터, 바늘 및 시린지를 추가로 포함할 수 있다.
예를 들어 본 발명에 관련된 기술 영역에서 이용가능한 많은 뛰어난 매뉴얼 및 교과서에 설명된 것과 같은 (예를 들어 [Using Antibodies, A Laboratory Manual, edited by Harlow, E. and Lane, D., 1999, Cold Spring Harbor Laboratory Press], (예를 들어 ISBN 0-87969-544-7); [Roe B.A. et. al. 1996, DNA Isolation and Sequencing (Essential Techniques Series), John Wiley & Sons.] (예를 들어 ISBN 0-471-97324-0); [Methods in Enzymology: Chimeric Genes and Proteins, 2000, ed. J. Abelson, M. Simon, S. Emr, J. Thomer. Academic Press; Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2001, 3rd Edition, by Joseph Sambrook and Peter MacCallum] (전자는 Maniatis Cloning manual) (예를 들어 ISBN 0-87969-577-3); [Current Protocols in Molecular Biology, Ed. Fred M. Ausubel, et. al. John Wiley & Sons] (예를 들어 ISBN 0-471-50338-X); [Current Protocols in Protein Science, Ed. John E. Coligan, John Wiley & Sons] (예를 들어 ISBN 0-471-11184-8); 및 [Methods in Enzymology: Guide to protein Purification, 1990, Vol. 182, Ed. Deutscher, M.P., Acedemic Press, Inc.] (예를 들어 ISBN 0-12-213585-7)), 또는 분자 생물학에서 실험 방법을 설명하는 것을 다루는 많은 대학 및 상업적 웹사이트에 설명된 바와 같이 당업계에 공지된 많은 대안적인 실험 방법이 본 발명의 실시에서 본원에 구체적으로 설명된 것을 성공적으로 대체할 수 있다.
VII. 광고 방법
*본 발명은 또한 표적 대상에게 어느 한 종류의 암 (예를 들어 난소암)에 걸린 환자 집단을 치료하기 위한 억제제 또는 그의 제약 조성물의 사용을 장려하는 것을 포함하는, HER 억제제, HER 이량체화 억제제 (예를 들어 페르투주맙) 또는 제약상 허용되는 그의 조성물을 광고하는 방법을 포함하고, 여기서 환자의 암은 그 암 종류에서의 HER3 발현에 대해 중앙 수준 미만의 수준으로 HER3을 발현하고/하거나 환자의 암 샘플은 그 암 종류에서의 HER2:HER3 발현에 대해 제25 백분위를 초과하는 수준으로 HER2:HER3을 발현한다.
또다른 실시태양에서, 본 발명은 표적 대상에게 어느 한 종류의 암 (예를 들어 난소암)에 걸린 환자 집단을 치료하기 위한 화학요법제 또는 그의 제약 조성물의 사용을 장려하는 것을 포함하는, 상기 화학요법제 (예를 들어 겜시타빈) 또는 제약상 허용되는 그의 조성물을 광고하는 방법을 제공하고, 여기서 환자의 암은 그 암 종류에서의 HER3 발현에 대해 중앙 수준을 초과하는 수준으로 HER3을 발현한다.
광고는 일반적으로 광고주가 확인하고 메세지가 통제되는 비-개인적인 매체를 통한 유료 커뮤니케이션 (communication)이다. 본원의 목적에서 광고는 홍보, 공공관계 활동 (PR), 간접 광고 (PPL), 후원, 서명운동 (underwriting) 및 판촉을 포함한다. 상기 용어는 또한 일반 (mass) 청중에게 본 발명을 구매하거나, 지지하거나, 승인하는 유리한 패턴으로 설득하거나, 고지하거나, 촉진하거나, 동기를 부여하거나, 행동을 변경시키기 위해 호소하도록 디자인된 임의의 인쇄 커뮤니케이션 매체 내에 제시되는, 광고주의 후원을 받은 정보 공지문을 포함한다.
본원에서 진단 방법의 광고 및 판촉은 임의의 수단에 의해 달성할 수 있다. 이들 메세지를 전달하기 위해 사용되는 광고 매체의 예는 방송 매체에서 나타나는 메세지인 상업방송을 포함한 텔레비젼, 라디오, 영화, 잡지, 신문, 인터넷 및 광고판을 포함한다. 광고는 또한 식품점 카트의 시트, 공항 보도의 벽 및 버스 측면 상의 광고를 포함하거나, 전화기 저장 메세지 또는 점포내 PA 시스템에서 들리거나, 시각적 또는 청각적 커뮤니케이션이 존재할 수 있는 임의의 것을 포함한다.
*판촉 또는 광고 수단의 보다 구체적인 예는 텔레비젼, 라디오, 영화, 인터넷, 예를 들어 웹캐스트 (webcast) 및 웨비너 (webinar), 동시 사용자에게 도달하도록 의도된 쌍방향 컴퓨터 네트워크, 고정 또는 전자 광고판 및 다른 공공 사인 (sign), 포스터, 전통적 또는 전자 문헌, 예를 들어 잡지 및 신문, 다른 언론 매체 (media outlet), 발표물, 또는 예를 들어, e-메일, 전화, 인스턴트 메세지, 우체국, 택배 (courier), 대량 또는 배달 우편물, 직접 (in-person) 방문에 의한 개인 접촉 등을 포함한다.
사용되는 광고의 종류는 많은 인자, 예를 들어, 도달할 표적 청중의 성격, 예를 들어, 병원, 보험 회사, 클리닉, 의사, 간호사 및 환자, 및 비용 고려사항 및 의약 및 진단 광고를 규제하는 관련 관할 법률 및 규칙에 따라 결정될 것이다. 광고는 서비스 상호작용 및/또는 사용자 인구학 및 지리학적 위치와 같은 다른 데이타에 의해 규정된 사용자 특성에 기초하여 개별화되거나 사용자 지정될 수 있다.
VIII. 물질의 기탁
다음 하이브리도마 세포주를 미국 20110-2209 버지니아주 매나사스 유니버시티 불러바드 10801 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (ATCC)에 기탁하였다:
항체 명칭 ATCC 기탁 번호 기탁일
7C2 ATCC HB-12215 1996년 10월 17일
7F3 ATCC HB-12216 1996년 10월 17일
4D5 ATCC CRL 10463 1990년 5월 24일
2C4 ATCC HB-12697 1999년 4월 8일
[실시예]
본 발명의 추가의 상세한 설명은 하기 비제한적인 실시예로 제시된다. 명세서에서 모든 인용문의 개시내용은 명백하게 본원에 참고로 포함된다.
실시예 1
백금 내성 난소암, 원발성 복막 암종 또는 난관 암종의 치료를 위한
페르투주맙 및 겜시타빈
본 실시예는 백금 내성 난소암, 원발성 복막 암종 또는 난관 암종의 환자에서 겜시타빈과 조합한 페르투주맙의 안전성, 내약성 및 효능을 평가하는 III상 임상 시험에 대한 결과를 제공한다. 페르투주맙은 MAP 및 P13 키나제를 통한 신호전달을 억제하고 HER2와 EGFR, HER3 및 HER4의 이량체화를 억제하는 HER 이량체화 억제제 (HDI)로서 불리는 새로운 클래스의 표적화제이다. 페르투주맙은 이량체-이량체 상호작용 부위에서 결합하고, 공동수용체로서 HER2의 역할에 주요 효과를 갖고, EGFR/HER2 및 HER3/HER2 이량체화를 방지하고, 다수의 HER-매개 신호전달 경로를 억제한다.
무진행 생존 (PFS) 및 전체 생존 (OS)에 대한 페르투주맙 및 겜시타빈의 효과를 모든 환자에서, 및 그의 종양이 HER2의 활성화를 표시하는 마커를 함유하는 환자의 하위세트에서 평가하였다. 연구 디자인/계획도를 도 9에 도시한다.
백금계 화학요법 치료를 받는 동안 또는 치료를 받은 지 6개월 이내에 진행된 환자가 본 연구에 적합하였다. 환자를 겜시타빈을 페르투주맙과 조합으로 또는 겜시타빈을 위약과 조합으로 투여하도록 무작위로 분류하였다. 본원에서 치료된 환자는 연구에 참여하기 전에 백금 내성 질병에 대한 선행 구제 요법 치료를 받지 않은 환자, 및 백금 내성 질병에 대한 사전 치료를 받은 환자를 포함하였다.
겜시타빈을 각각 21일 사이클의 1일 및 8일에 1000 mg/m2으로 투여하였다. 겜시타빈을 먼저 30분에 걸쳐 주입하였다. 독성으로 인해 투여량 감소가 허용되었다. 위약 또는 페르투주맙은 21일 사이클의 1일에 투여하였다. 페르투주맙을 투여하기 위해 무작위로 분류된 대상에게 840 mg (사이클 1)의 초기 로딩 투여량, 이어서 사이클 2와 이후의 사이클에서 420 mg을 투여하였다. 위약을 투여하기 위해 무작위로 분류된 대상에게 사이클 1, 사이클 2 및 이후의 사이클에 대한 페르투주맙 아암과 동일한 부피로 위약을 투여하였다. 진행성 질병이 없는 대상에게 17 사이클 또는 1년까지 치료제를 투여하였다. 혈구감소증 때문에, 환자에게 표준 겜시타빈 투여량을 감소시키고, 유지 투여량을 제공하였다. 페르투주맙도 또한 임의의 유지 1일 겜시타빈 투여량에 대해 유지하였다. 후속 투여량은 감소된 투여량이고, 증가시키지 않았다. 투여량 감소 또는 투여량 유지가 4회 초과로 필요하거나, 투여량이 3주 초과 동안 유지되면, 겜시타빈을 중단하고, 담당의의 승인 및 의료 모니터에 따라 질병 진행시까지 맹검 (blinded) 약물을 계속 투여하였다. 8일 겜시타빈 투여량이 유지되면, 8일 투여량은 생략하고, 후속 치료를 다음 사이클 (선행 사이클의 22일)에 개시하였다.
겜시타빈을 유지하였고 투여량을 다음 표에 권장된 바와 같이 감소시켰다:
절대 과립구 수
(x106/L)		 혈소판 수
(x106/L)		 전체 투여량의 ％
>1000 및 >100,000 100
500-999 또는 50,000-99,000 75
<500 또는 <50,000 유지
투여량 감소를 필요로 하는 임의의 환자에 대한 후속 투여량은 감소된 투여량이었다. 혈구감소증의 결과로서 투여량이 3주 초과 동안 유지되면, 환자가 허용되지 않는 독성을 갖는 것으로 가정하여 겜시타빈을 중단하였다. 다른 추가 등급 III 또는 IV 독성이 없으면, 맹검 약물의 투여 지속은 의사 및 의료 모니터링에 의해 판단하였다. 겜시타빈의 혈액학적 독성은 투여량 투여 속도에 관련된다. 겜시타빈은 총 투여량에 상관없이 30분에 걸쳐 투여하였다. NCI-CTC 등급 2 혈구감소증에 대한 콜로니-자극제는 치료의의 판단에 따라 사용하였다.
단일제 페르투주맙으로의 전환에 대한 선택이 제안되었다. 840 mg의 로딩 투여량을 다음 사이클 기일에 투여하였고, 21일마다 후속 사이클에서 420 mg을 계속 투여하였다.
반응은 사이클 2, 4, 6, 8, 12 및 17의 종료시에 평가하였다. 측정가능한 질병은 임상 평가 및 CT 스캐닝 또는 동등한 평가에 의해 고형 종양에 대한 반응 평가 기준 (RECIST)을 사용하여 평가하였다. 평가가능한 질병을 갖는 대상에 대한 반응은 CA-125로의 변화와 질병의 임상 및 방사선 증거에 따라 평가하였다. 반응은 반응의 초기 기록 4-8주 후에 확인하였다. 다음 결과 지표를 평가하였다.
일차 효능 종말점
무진행 생존: 각각의 아암에서 모든 대상의 배정된 연구 처리의 개시 후에 RECIST 또는 CA-125 변화를 이용하여 연구자 평가에 의해 결정함.
무진행 생존: 다음 하위군에서 각각의 아암에서 배정된 연구 처리의 개시 후에 RECIST 또는 CA-125 변화를 이용하여 연구자 평가에 의해 결정함:
HER2 활성화의 검출가능 마커를 갖는 대상.
HER2 활성화의 검출가능 마커를 갖지 않는 대상.
이차 효능 종말점
객관적인 반응 (PR 또는 CR)
반응의 지속 기간
생존 시간
4개월에서 진행 부재
이들 종말점은 다음 하위군에서 각각의 아암에서 모든 대상에서 평가하였다:
HER2 활성화의 검출가능 마커를 갖는 대상.
HER2 활성화의 검출가능 마커를 갖지 않는 대상.
가능한 오심 및 구토를 예방 또는 치료하기 위해, 환자에게 세로토닌 길항제, 스테로이드 및/또는 벤조디아제핀을 예비투약하였다. 가능한 발진을 예방 또는 치료하기 위해, 국소 및/또는 경구 항생제를 포함한 표준 여드름 요법을 사용하였다. 다른 가능한 동시 투여 의약은 제1일의 7일 이전에 시작하여 다음 기간의 마지막 날까지 계속되는 간격에서 대상이 사용하는 임의의 전문의약품 또는 OTC 제제이다. 38.5℃ 초과의 주입 관련 체온 상승 또는 다른 주입 관련 증상을 경험한 대상은 대증적으로 아세트아미노펜, 디펜히드라민 또는 메페리딘으로 치료하였다. 비-실험적 조혈 성장인자를 NCI-CTC 등급 2 혈구감소증에 대해 투여하였다.
본 임상 시험에서 환자로부터 얻은 포르말린-고정 파라핀 포매 조직 (FFPET) 샘플을 qRT-PCR에 의해 EGFR, HER2, HER3, 2개의 HER 리간드 (암피레굴린 및 베타셀룰린), 및 G6PDH (하우스키핑 유전자)에 대해 분석하였다. qRT-PCR 분석은 타르코스 몰레큘라 패쏠로지 게엠베하 (TARGOS Molecular Pathology GmbH, 독일 카셀)에서 로슈 다이아그노스틱 (Roche Diagnostic)의 실험실 로트 키트를 사용하여 수행하였다. 임상 샘플에 대해 qRT-PCR 분석을 수행하기 위한 흐름도 및 분석을 본원의 도 27 및 28에 도시한다.
EGFR, HER2, HER3, 암피레굴린 및 베타셀룰린의 mRNA 분석을 2중으로 수행하였다. 정량적 데이타 분석을 허용하기 위해, 내부 참조물로서 G6PDH를 또한 분석하였다. 프라이머 및 프로브는 DNA가 아니라 mRNA만을 증폭시키기 위해 설계하였다. qRT-PCR은 2-단계 절차로서 각각의 마커 및 G6PDH에 대해 따로 실시하였다.
제1 단계에서, AMV 역전사효소와 각각의 마커 및 G6PDH에 대한 특이적 프라이밍을 사용하여 5 ㎕의 총 RNA로부터 cDNA를 역전사시켰다. 온도 프로필은 어닐링을 위해 10 min./25℃, 역전사를 위해 60 min./42℃ 및 효소 불활성화를 위해 5 min./94℃이었다.
제2 단계에서, LIGHTCYCLER(등록상표) 기구 (로슈 어플라이드 사이언스 (Roche Applied Science, 독일 만하임))를 사용하여 5 ㎕의 cDNA로부터 마커 및 G6PDH mRNA의 100-120 bp 단편을 증폭시켰다. 앰플리콘은 특이적 쌍의 표지된 혼성화 프로브 (형광 공명 에너지 전달의 원리)를 이용하여 형광에 의해 검출하였다. qRT-PCR에 사용된 모든 시약은 로슈 어플라이드 사이언스의 제품이었다. 온도 프로필은 초기 변성을 위해 10 min./95℃, 및 (어닐링을 위해 10 sec./62℃, 연장을 위해 9 sec./72℃, 변성을 위해 10 sec./95℃)의 45 사이클이었다. 사용된 프라이머/프로브 서열에 대해서는 아래 표를 참조한다.
Figure pat00002
상대적 정량을 허용하기 위해 캘리브레이터 (calibrator) RNA (HT29 세포주로부터 정제된 RNA)를 각각의 실행에 포함시키고, 흐름도 및 시약을 검토하기 위해 양성 및 음성 대조군을 사용하였다.
데이타 분석은 LIGHTCYCLER(등록상표) 상대적 정량 소프트웨어 (로슈 어플라이드 사이언스)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 수행하였다. 결과는 각각의 환자 샘플에 대한 각각의 마커의 "캘리브레이터 표준화 비"이었다.
119/130 환자 (92％)에 대한 qRT-PCR 값이 이용가능하였다. 동적 범위는 EGFR - 약 10배, HER2 - 약 10배, HER3 - 약 20배이었다. "상대적 정량"의 원리를 이용하였다. 샘플 내의 유전자 발현 (mRNA 수준)을 동일한 샘플의 하우스키핑 유전자의 발현을 참조하여 (참조물 = G6PDH) 상대적으로 정량하였다. 이어서, 상기 상대적 유전자 발현을 캘리브레이터 내의 상대적 유전자 발현에 대해 표준화한다. 각각의 마커에 대해, "캘리브레이터 표준화 비"는 아래와 같이 계산된다:
캘리브레이터 표준화 비 = [표적의 농도/참조물의 농도 (샘플)]/[표적의 농도/참조물의 농도 (캘리브레이터)]
표적 = 관심있는 유전자
참조물 = 하우스키핑 유전자 (G6PDH)
캘리브레이터 = HT29 결장직장 암 세포주 RNA
효능 결과를 7.1개월 중앙 추적조사에서 평가하였다 (범위 1.3-20.3). 이 시점에 101 무진행 생존 (PFS) 사건이 존재하였다. 도 10a 및 b는 겜시타빈과 위약, 또는 겜시타빈과 페르투주맙으로 치료한 모든 환자에서 PFS를 나타낸다. P-값은 랜덤화 계층화 인자 (ECOG PS, 백금 내성 질병에 대한 선행 요법의 수, 및 질병 측정가능성)에 의한 계층화 Cox 모델 및 계층화 로그 순위 검정을 사용하여 추정하였다.
예측된 pHER2 상태에 의한 PFS를 도 11a 및 b에 도시하고, 여기서 pHER2에 대해 음성으로 예측된 환자 및 pHER2에 대해 양성으로 예측된 환자에서의 PFS를 비교한다. 예측 알고리즘은 80개의 상업적으로 얻은 난소암 샘플을 사용하여 개발하였다. HER2, HER3 및 암피레굴린 발현의 조합은 80％의 정확도로 30％ 최고 pHER 샘플을 예측한다. 암피레굴린, HER2 및 HER3이 제70 백분위를 초과하거나 같은 경우에 환자는 pHER2에 대해 양성으로 예측되었고, 그렇지 않은 환자는 pHER2에 대해 음성으로 예측되었다.
도 12a 및 b는 qRT-PCR EGFR 컷오프에 기반한 PFS를 나타내고; 도 13a 및 b는 qRT-PCR HER2 컷오프에 기반한 PFS를 나타내고; 도 14a 및 b는 qRT-PCR HER3 컷오프에 의한 PFS를 나타낸다. 저 HER3의 환자가 PFS의 면에서 보다 우수한 결과를 가졌다. 이들 데이타를 도 15a 및 b에 보다 상세히 도시하였다. 이들 도면에 도시된 바와 같이, 페르투주맙 활성은 HER3 저 발현 종양을 갖는 환자에서 최대이고, HER3 유전자 발현 수준이 감소함에 따라 증가하는 경향이 있다. 이들 도면은 qRT-PCR 분석으로 정량된 HER3 발현에 대한 절대값을 포함한다.
도 16a 및 b는 HER3 하위군에 의한 PFS를 도시한 것이다. 이들 데이타는 고 HER3 발현 종양을 갖는 환자에서 페르투주맙과 겜시타빈 사이에 네가티브 상호작용이 존재할 수 있음을 보여준다.
도 17a 및 b는 고 HER3 발현 및 저 HER3 발현에 대한 HER3 하위군에 의한 PFS에 대한 데이타를 요약한 추가의 표이다. 도 18a 및 b는 4개의 상이한 백분위에 기반한 HER3 하위군에 의한 PFS를 나타낸다. HER3 발현에 대해 0 내지 제50 백분위 미만, 특히 0 내지 제25 백분위 내의 환자는 PFS에 대한 위험비 (HR)가 개선되었다. (보다 낮은 HR은 PFS에 의해 측정될 때 개선된 결과와 상호관련된다.)
도 19a 및 b는 50/50 스플릿을 갖는 HER3 qRT-PCR에 의한 PFS를 보여주는 데이타를 제공한다. 저 HER3 발현 환자 (제50 백분위 미만)는 고 HER3 발현 환자 (제50 백분위 초과 및 같은)에 비해 개월 단위로 측정한 PFS의 지속기간이 증가하였다. 상기 상관관계는 저 HER3 발현 환자가 제25 백분위 미만의 환자, 고 HER3 발현 환자가 제25 백분위를 초과하거나 또는 동일한 환자로서 특성화되는 도 20a 및 b에서 보다 두드러진다. 2개의 진단적 하위군 사이의 HR의 차이에 대한 P-값은 0.0007이었다. 제25 백분위는 1.19 CNR과 동일하다.
전체 생존 (OS)에 대한 예비 데이타가 이용가능하다. 모든 환자에 대한 그러한 데이타를 도 21a 및 b에 제공한다. 도 22a 및 b는 저 HER3 발현 (제50 백분위 미만) 및 고 HER3 발현 (제50 백분위 초과 또는 동일)을 비교하는, HER3 qRT-PCR에 의한 OS를 비교한다.
도 23a 및 b는 50/50 스플릿, 고 대 저 위험비 (HR)를 갖는 HER3 qRT-PCR에 의한 PFS를 예시한다. 5％ 내지 95％의 백분위를 포함한 PFS 데이타의 전체 세트를 도 24a 및 b에 도시한다.
HER3 보정된 표준화 비 발현 범위를 도 26에 도시한다. 상기 범위는 약 20-80배이다.
PFS 결과를 HER2:HER3 비에 관하여 추가로 평가하였다. 이들 추가의 분석 결과를 도 29 내지 31에 도시한다. 이들 도면에서 보이는 바와 같이, 페르투주맙 활성은 고 HER2:HER3 비를 갖는 환자에서 최대이다.
결론
페르투주맙 활성은 HER3 저 발현 암의 환자에서 최대이고, HER3 유전자 발현 수준이 감소함에 따라 증가하는 경향이 있다. 페르투주맙 활성은 또한 고 HER2:HER3 발현 암의 환자에서 최대이고, HER2:HER3 유전자 발현 수준이 증가함에 따라 증가하는 경향이 있다. 페르투주맙 요법에 반응한 저 HER3 발현 수준의 대부분의 환자는 또한 고 HER2:HER3 비를 가졌다.
HER3 고 발현 종양을 갖는 환자에서 페르투주맙과 겜시타빈 사이에 네가티브 상호작용이 존재할 수 있다.
HER3 발현은 화학요법의 배경 상에서 예후가 될 수 있고, 고 발현 종양의 경우에 더 우수하다.
이 결과는 놀랍고 예기치 않은 것이었다.
실시예 2
진행성, 불응성 또는 재발성 난소암의 치료를 위한 페르투주맙
본 실시예는 난소암 환자의 단일 아암, 개방 라벨, 다기관 II상 임상 시험에 관한 것이다. 진행성, 불응성 또는 재발성 난소암의 환자를 페르투주맙, 인간화 HER2 항체로 치료하였다.
재발된 난소암을 갖는 환자를 "저 투여량" 단일제 페르투주맙을 사용한 치료를 받도록 포함시키고; 페르투주맙은 840 mg의 로딩 투여량에 이어 3주마다 420 mg을 정맥내 (IV) 투여하였다.
제2 코호트 (cohort)의 환자를 "고 투여량" 페르투주맙으로 치료하였고; 3주마다 1050 mg을 단일제로서 투여하였다.
종양 평가는 2, 4, 6, 8, 12 및 16 사이클 후에 얻었다. RECIST에 의한 반응률 (RR)이 1차 종말점이었다. 안전성 및 내약성을 추가로 평가하였다. 2차 종말점은 TTP, 반응의 지속시간, 생존의 지속시간, 약동학 (PK) 및 FOSI (코호트 2)이었다.
보관된 포르말린 고정된 파라핀 포매 조직에 대해 qRT-PCR 분석을 수행하였다. 46/117 환자에 대한 분석 데이타가 이용가능하다. 25/75를 최선의 스플릿으로서 선택한 HER3 qRT-PCR에 의한 PFS 및 OS를 도 25에 도시한다. 여기서, 고 HER3 발현자는 제75 백분위를 초과하거나 같은 범위 내에 있는 한편, 저 HER3 발현자는 제75 백분위 미만의 범위에 있었다.
다시, 페르투주맙으로 치료한 저 HER3 발현을 갖는 환자가 PFS 및 OS의 면에서 더 우수한 결과를 보였다.
실시예 3
백금 내성 재발성 난소암의 치료를 위한 페르투주맙
본 실시예의 무작위화된 개방-라벨 II상 임상 연구에서, 카르보플라틴-기반 표준 화학요법과 조합한 페르투주맙 치료의 효능 및 안전성을 백금-감수성 재발 난소암의 환자에서 조사하였다. 표적 샘플 크기는 100-500 개인이다. 표적 샘플 크기는 148이다.
포함 기준:
- 조직학상 확인된 난소, 원발성 복막 또는 난관암;
- 단지 하나의 선행 요법, 이는 백금계이어야 한다;
- 백금계 화학요법의 완료 후 6개월을 초과하는 무진행 간격으로 정의된 백금-감수성 질병.
배제 기준:
- 선행 방사선요법;
- 항암 백신 또는 임의의 표적화 요법을 사용한 선행 치료;
- 연구 4주 이내에 대수술 또는 외상성 손상;
- 중추신경계 전이의 병력 또는 증거.
결과를 도 32-35에 도시한다. 본 시험의 결과는 페르투주맙 활성이 HER3 저 발현암의 환자에서 최대이고 HER3 유전자 발현 수준이 감소함에 따라 증가하는 경향이 있음을 확인한다. 페르투주맙 활성은 고 HER2:HER3 발현암의 환자에서 또한 최대이고, HER2:HER3 유전자 발현 수준이 증가함에 따라 증가하는 경향이 있다. 페르투주맙 요법에 반응한 저 HER3 발현 수준의 대부분의 환자는 또한 고 HER2:HER3 비를 가졌다.
HER3 고 발현 종양을 갖는 환자에서 페르투주맙과 겜시타빈 사이에 네가티브 상호작용이 존재할 수 있다.
HER3 발현은 화학요법의 배경 상에서 예후가 될 수 있고, 고 발현 종양의 경우에 더 우수하다.
실시예 4
백금 내성 상피 난소암 환자에서 페르투주맙 + 겜시타빈 대 겜시타빈 + 위약의
II상 연구에서 HER 경로 유전자 발현 분석
배경: 백금 내성 (CDDP-R) 상피 난소암 (EOC)의 환자에서 페르투주맙 + 겜시타빈 대 겜시타빈 대 위약의 무작위화 II상 시험 (N=130)에서는 페르투주맙이 PFS를 연장할 수 있고 (HR 0.66, 95％ CI 0.43, 1.03), PFS의 지속기간은 HER3 유전자 발현과 연관될 수 있음을 제안하였다 (실시예 2 및 3 참조).
방법: CDDP-R EOC의 환자를 G+P 또는 G+위약에 무작위로 배정하였다. 진행까지 또는 허용되지 않는 독성이 있을 때까지 치료제를 투여하였다. 1차 종말점은 PFS이었다. 2차 목적은 HER2 활성화-관련 발현 프로필을 갖는 환자에서 효능 결과를 평가하는 것이다. 상기한 바와 같이 수행한 보관된 포르말린-고정된 파라핀-포매 조직 (FFPET)을 사용한 qRT-PCR 분석은 HER 경로 유전자, 예를 들어 HER1, HER2, HER3, 암피레굴린 및 베타셀룰린의 mRNA 발현 분석을 허용하였다. 결과를 저 유전자 발현 (< 중앙) 및 고 유전자 발현 (≥중앙)으로 설명하였다.
결과: 시험한 5개 바이오마커 중에서, HER3 유전자 발현만이 저 결과 대 고 결과에 기반한 차별적 PFS 및 OS 결과를 갖는 환자 하위군을 제안하였다. qRT-PCR HER3 결과에 의한 모든 환자에 대한 최종 PFS 및 OS 결과는 다음과 같다:
G + P G + 위약 위험비 (95％ CI)
PFS (중앙 개월수)
모든 환자 (n=130) 2.9 2.6 0.66* (0.43, 1.03)
저 HER3 (N=61) 5.3 1.4 0.34 (0.18, 0.63)
고 HER3 (N=61) 2.8 5.5 1.48 (0.83, 2.63)
OS (중앙 개월수)
모든 환자 (n=130) 13.0 13.1 0.91* (0.58, 1.41)
저 HER3 (N=61) 11.8 8.4 0.61 (0.35, 1.11)
고 HER3 (N=61) 16.1 18.2 1.59 (0.8, 3.2)
* 모든 환자 분석치를 ECOG 상태, 질병 측정가능성 및 CDDP-R 질병에 대한 선행 치료의 수에 의해 계층화하였다
결론: 상기 예비 분석은 저 종양 HER3 유전자 발현 수준이 CDDP-R EOC의 환자에서 예후 표시자로서 사용될 수 있음을 제안한다. 페르투주맙 치료는, 그의 종양이 저 HER3 유전자 발현을 보이는 환자에서 겜시타빈의 임상 활성을 증가시킬 수 있다. 이들 데이타는 HER3 mRNA 발현 수준이 예후 및 예측 진단 바이오마커로서 사용될 수 있음을 제안한다.
SEQUENCE LISTING <110> GENENTECH, INC. F. Hoffmann - La Roche, AG Amler, Lukas C. Birkner, Merrill Lin, Chin-Yu Moecks, Joachim Strauss, Andreas <120> PREDICTING RESPONSE TO A HER DIMERISATION INHIBITOR BASED ON LOW HER3 EXPRESSION <130> GNE-0300PCT <140> PCT/US2008/055502 <141> 2008-29-02 <150> 60/892,640 <151> 2007-03-02 <150> 60/912,053 <151> 2007-04-16 <150> 61/029,748 <151> 2008-02-19 <160> 52 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Asp Thr Val Met Thr Gln Ser His Lys Ile Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 2 <211> 119 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val 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Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys Lys Ile Phe Gly Ser 20 25 30 Leu Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp Pro Ala Ser Asn Thr 35 40 45 Ala Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe Glu Thr Leu Glu Glu 50 55 60 Ile Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro Asp Ser Leu Pro Asp 65 70 75 80 Leu Ser Val Phe Gln Asn Leu Gln Val Ile Arg Gly Arg Ile Leu His 85 90 95 Asn Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln Gly Leu Gly Ile Ser Trp Leu 100 105 110 Gly Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly Leu Ala Leu Ile His 115 120 125 His Asn Thr His Leu Cys Phe Val His Thr Val Pro Trp Asp Gln Leu 130 135 140 Phe Arg Asn Pro His Gln Ala Leu Leu His Thr Ala Asn Arg Pro Glu 145 150 155 160 Asp Glu Cys Val Gly Glu Gly Leu Ala 165 <210> 22 <211> 142 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Cys His Gln Leu Cys Ala Arg Gly His Cys Trp Gly Pro Gly Pro Thr 1 5 10 15 Gln Cys Val Asn Cys Ser Gln Phe Leu Arg Gly Gln Glu Cys Val Glu 20 25 30 Glu Cys Arg Val Leu Gln Gly Leu Pro Arg Glu Tyr Val Asn Ala Arg 35 40 45 His Cys Leu Pro Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Gln Asn Gly Ser Val 50 55 60 Thr Cys Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gln Cys Val Ala Cys Ala His Tyr 65 70 75 80 Lys Asp Pro Pro Phe Cys Val Ala Arg Cys Pro Ser Gly Val Lys Pro 85 90 95 Asp Leu Ser Tyr Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala 100 105 110 Cys Gln Pro Cys Pro Ile Asn Cys Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp 115 120 125 Asp Lys Gly Cys Pro Ala Glu Gln Arg Ala Ser Pro Leu Thr 130 135 140 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 23 tgcggatgtc agccactgtg 20 <210> 24 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 24 gggtgcatcg ggtgacctg 19 <210> 25 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 25 agccactgtg aggcggga 18 <210> 26 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 26 ggtgttttcg ggcagaaggc catcc 25 <210> 27 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 27 aacagccacc agatggtggg gtagatctt 29 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> 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Sequence <220> <223> Probe <400> 37 tatccaggag gtgcagggct acgtgc 26 <210> 38 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 38 gtgtccatgt gacaaagctt atcg 24 <210> 39 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 39 gatgggaagt ttgccatctt cg 22 <210> 40 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 40 tctcaatata aacaccccct gacag 25 <210> 41 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 41 aacaccaact ccagccacgc tctg 24 <210> 42 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 42 agctccgctt gactcagctc accg 24 <210> 43 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 43 cttgtcgaag tttc 14 <210> 44 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 44 ccatagctgc ctttatgtct gc 22 <210> 45 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 45 ctttcgttcc tcagcttctc cttc 24 <210> 46 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 46 tgatcctcac agctgttgct gtta 24 <210> 47 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 47 tacagtccag cttagaagac aatacgtcag gaa 33 <210> 48 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 48 gtcaactctc tcacac 16 <210> 49 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 49 tctaggtgcc ccaagc 16 <210> 50 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 50 tagccttcat cacagacaca g 21 <210> 51 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 51 gcattactgc atcaaaggga gatgccg 27 <210> 52 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 52 tcgtggtggc cgagcagacg 20

Claims (105)

  1. 치료상 유효량의 HER 이량체화 억제제를 포함하는 암 환자 치료용 조성물이며, 여기서 환자의 암은 그 암 종류에서의 HER3 발현에 대해 중앙 수준 미만의 수준으로 HER3을 발현하는 것인, HER 이량체화 억제제에 반응할 수 있는 종류의 암에 걸린 환자를 치료하기 위한 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 환자의 암이 그 암 종류에서의 HER3 발현에 대해 제25 백분위 미만의 수준으로 HER3을 발현하는 것인 조성물.
  3. 제1항 또는 2항에 있어서, HER3 발현이 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 사용하여 결정된 것인 조성물.
  4. 제3항에 있어서, PCR이 정량적 실시간 중합효소 연쇄 반응 (qRT-PCR)인 조성물.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, HER 이량체화 억제제가 HER2 이량체화 억제제인 조성물.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, HER 이량체화 억제제가 HER 이종이량체화를 억제하는 것인 조성물.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, HER 이량체화 억제제가 항체인 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 항체가 EGFR, HER2 및 HER3으로 이루어지는 군 중에서 선택된 HER 수용체에 결합하는 것인 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 항체가 HER2에 결합하는 것인 조성물.
  10. 제9항에 있어서, HER2 항체가 HER2 세포외 도메인의 도메인 II에 결합하는 것인 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 항체가 HER2 세포외 도메인의 도메인 I, II 및 III 사이의 연결부에 결합하는 것인 조성물.
  12. 제10항에 있어서, HER2 항체가 각각 서열 3 및 4의 가변 경쇄 및 가변 중쇄 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
  13. 제12항에 있어서, HER2 항체가 페르투주맙인 조성물.
  14. 제7항에 있어서, HER 항체가 네이키드 항체, 무손상 항체, 또는 항원 결합 구역을 포함하는 항체 단편인 조성물.
  15. 제1항 또는 제2항에 있어서, 암 종류가 난소암, 복막암, 난관암, 전이성 유방암 (MBC), 비-소세포 폐암 (NSCLC), 전립선암 및 결장직장암으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 암 종류가 난소암, 복막암 또는 난관암인 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 암 종류가 백금 내성암인 조성물.
  18. 제16항에 있어서, 암 종류가 진행성, 불응성 또는 재발성 난소암인 조성물.
  19. 제1항 또는 제2항에 있어서, 환자의 무진행 생존 (PFS) 또는 전체 생존 (OS)을 연장시키는 조성물.
  20. 제1항 또는 제2항에 있어서, HER 이량체화 억제제가 단일 항종양제로서 투여되는 것인 조성물.
  21. 제1항 또는 제2항에 있어서, 치료가 제2 치료제를 환자에게 투여하는 것을 포함하는 것인 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 제2 치료제가 화학요법제, HER 항체, 종양 관련 항원에 대해 지시된 항체, 항-호르몬 화합물, 심보호제, 시토킨, EGFR-표적화 약물, 항-혈관신생제, 티로신 키나제 억제제, COX 억제제, 비-스테로이드성 소염 약물, 파르네실 트랜스퍼라제 억제제, 종양태아성 단백질 CA 125에 결합하는 항체, HER2 백신, HER 표적화 요법제, Raf 또는 ras 억제제, 리포좀 독소루비신, 토포테칸, 탁산, 이중 티로신 키나제 억제제, TLK286, EMD-7200, 오심 치료용 의약, 피부 발진의 예방 또는 치료 또는 표준 여드름 요법용 의약, 설사의 치료 또는 예방용 의약, 체온 감소 의약 및 조혈 성장 인자로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 제2 치료제가 화학요법제인 조성물.
  24. 제23항에 있어서, 화학요법제가 겜시타빈, 카르보플라틴, 파클리탁셀, 도세탁셀, 토포테칸 및 리포좀 독소루비신으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 조성물.
  25. 제22항에 있어서, 화학요법제가 항대사물질인 조성물.
  26. 제25항에 있어서, 항대사물질 화학요법제가 겜시타빈인 조성물.
  27. 제21항에 있어서, 제2 치료제가 트라스투주맙, 에를로티닙 또는 베바시주맙인 조성물.
  28. 제1항 또는 제2항에 있어서, 환자의 암이 그 암 종류에서의 HER2:HER3 발현에 대해 제25 백분위를 초과하는 수준으로 HER2:HER3을 발현하는 것인 조성물.
  29. 제28항에 있어서, 환자의 암이 그 암 종류에서의 HER2:HER3 발현에 대해 중앙 수준을 초과하는 수준으로 HER2:HER3을 발현하는 것인 조성물.
  30. 제29항에 있어서, 환자의 암이 그 암 종류에서의 HER2:HER3 발현에 대해 제75 백분위를 초과하는 수준으로 HER2:HER3을 발현하는 것인 조성물.
  31. 치료상 유효량의 페르투주맙을 포함하는 난소암, 복막암 또는 난관암 환자 치료용 조성물이며, 여기서 환자의 암은 난소암, 복막암 또는 난관암에서의 HER3 발현에 대해 중앙 수준 미만의 수준으로 HER3을 발현하는 것인, 난소암, 복막암 또는 난관암에 걸린 환자를 치료하기 위한 조성물.
  32. 제31항에 있어서, 환자의 암이 난소암, 복막암 또는 난관암에서의 HER3 발현에 대해 제25 백분위 미만의 수준으로 HER3을 발현하는 것인 조성물.
  33. 제31항 또는 제32항에 있어서, HER3 발현이 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 사용하여 결정된 것인 조성물.
  34. 제33항에 있어서, PCR이 정량적 실시간 중합효소 연쇄 반응 (qRT-PCR)인 조성물.
  35. 제31항 또는 제32항에 있어서, 무진행 생존 (PFS) 또는 전체 생존 (OS)을 연장시키는 조성물.
  36. 제31항 또는 제32항에 있어서, 환자가 난소암 환자인 조성물.
  37. 제36항에 있어서, 난소암이 백금 내성 난소암인 조성물.
  38. 제36항에 있어서, 환자가 진행성, 불응성 또는 재발성 난소암 환자인 조성물.
  39. 제31항 또는 제32항에 있어서, 화학요법제를 추가로 포함하는 조성물.
  40. 제39항에 있어서, 화학요법제가 겜시타빈, 카르보플라틴, 파클리탁셀, 도세탁셀, 토포테칸 및 리포좀 독소루비신으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 조성물.
  41. 제40항에 있어서, 화학요법제가 항대사물질 화학요법제인 조성물.
  42. 제41항에 있어서, 항대사물질 화학요법제가 겜시타빈인 조성물.
  43. 제31항 또는 제32항에 있어서, 환자의 암이 그 암 종류에서의 HER2:HER3 발현에 대해 제25 백분위를 초과하는 수준으로 HER2:HER3을 발현하는 것인 조성물.
  44. 제43항에 있어서, 환자의 암이 그 암 종류에서의 HER2:HER3 발현에 대해 중앙 수준을 초과하는 수준으로 HER2:HER3을 발현하는 것인 조성물.
  45. 제44항에 있어서, 환자의 암이 난소암, 복막암 또는 난관암에서의 HER2:HER3 발현에 대해 제75 백분위를 초과하는 수준으로 HER2:HER3을 발현하는 것인 조성물.
  46. HER3 발현을 HER 이량체화 억제제에 반응할 수 있는 종류의 암에 걸린 환자로부터의 암 샘플에서 시험관내에서 결정하는 것, 및 암 샘플이 그 암 종류에서의 HER3 발현에 대해 중앙 수준 미만의 수준으로 HER3을 발현하는 경우 요법으로서 HER 이량체화 억제제를 선택하는 것을 포함하는, HER 이량체화 억제제에 반응할 수 있는 종류의 암에 걸린 환자를 위한 요법을 선택하는 시험관내 방법.
  47. 제약상 허용되는 담체 내에 HER 이량체화 억제제를 포함하는 제약 조성물, 및 상기 억제제 또는 제약 조성물이 HER 이량체화 억제제에 반응할 수 있는 종류의 암에 걸린 환자의 치료에 사용되도록 지시되었음을 언급한 라벨을 함께 포장하여 포함하고, 여기서 환자의 암은 그 암 종류에서의 HER3 발현에 대해 중앙 수준 미만의 수준으로 HER3을 발현하는 것인 제조품.
  48. HER 이량체화 억제제 또는 그의 제약 조성물, 및 상기 억제제 또는 제약 조성물이 HER 이량체화 억제제에 반응할 수 있는 종류의 암에 걸린 환자의 치료에 사용되도록 지시되었음을 언급한 라벨을 패키지 (package) 내에 합하는 것을 포함하고, 여기서 환자의 암은 그 암 종류에서의 HER3 발현에 대해 중앙 수준 미만의 수준으로 HER3을 발현하는 것인, HER 이량체화 억제제 또는 그의 제약 조성물을 제조하는 방법.
  49. 표적 대상에게 어느 한 종류의 암에 걸린 환자 집단을 치료하기 위한 HER 이량체화 억제제 또는 그의 제약 조성물의 사용을 장려하는 것을 포함하고, 여기서 환자의 암은 그 암 종류에서의 HER3 발현에 대해 중앙 수준 미만의 수준으로 HER3을 발현하는 것인, HER 이량체화 억제제 또는 제약상 허용되는 그의 조성물을 광고하는 방법.
  50. HER3 발현을 화학요법제에 반응할 수 있는 종류의 암에 걸린 환자로부터의 암 샘플에서 시험관내에서 결정하는 것, 및 암 샘플이 그 암 종류에서의 HER3 발현에 대해 중앙 수준을 초과하는 수준으로 HER3을 발현하는 경우 요법으로서 화학요법제를 선택하는 것을 포함하는, 화학요법제에 반응할 수 있는 종류의 암에 걸린 환자를 위한 요법을 선택하는 시험관내 방법.
  51. 제50항에 있어서, 암 종류가 난소암, 복막암 또는 난관암인 방법.
  52. 제51항에 있어서, 암 종류가 백금 내성 난소암, 복막암 또는 난관암인 방법.
  53. 제51항에 있어서, 암 종류가 진행성, 불응성 또는 재발성 난소암인 방법.
  54. 제50항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 화학요법제가 항대사물질인 방법.
  55. 제54항에 있어서, 항대사물질 화학요법제가 겜시타빈인 방법.
  56. 치료상 유효량의 HER 억제제를 포함하는 암 환자 치료용 조성물이며, 여기서 환자의 암은 그 암 종류에서의 HER2:HER3 발현에 대해 제25 백분위를 초과하는 수준으로 HER2:HER3을 발현하는 것인, HER 억제제에 반응할 수 있는 종류의 암에 걸린 환자를 치료하기 위한 조성물.
  57. 제56항에 있어서, 환자의 암이 그 암 종류에서의 HER2:HER3 발현에 대해 중앙 수준을 초과하는 수준으로 HER2:HER3을 발현하는 것인 조성물.
  58. 제57항에 있어서, 환자의 암이 그 암 종류에서의 HER2:HER3 발현에 대해 제75 백분위를 초과하는 수준으로 HER2:HER3을 발현하는 것인 조성물.
  59. 제56항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, HER2 및 HER3 발현이 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 사용하여 결정된 것인 조성물.
  60. 제59항에 있어서, PCR이 정량적 실시간 중합효소 연쇄 반응 (qRT-PCR)인 조성물.
  61. 제56항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, HER 억제제가 HER 이량체화 억제제인 조성물.
  62. 제56항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, HER 억제제가 HER2 억제제인 조성물.
  63. 제61항에 있어서, HER 이량체화 억제제가 HER2 이량체화 억제제인 조성물.
  64. 제61항에 있어서, HER 억제제가 HER 이종이량체화를 억제하는 것인 조성물.
  65. 제56항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, HER 억제제가 항체인 조성물.
  66. 제65항에 있어서, 항체가 EGFR, HER2 및 HER3으로 이루어지는 군 중에서 선택된 HER 수용체에 결합하는 것인 조성물.
  67. 제66항에 있어서, 항체가 HER2에 결합하는 것인 조성물.
  68. 제67항에 있어서, HER2 항체가 HER2 세포외 도메인의 도메인 II에 결합하는 것인 조성물.
  69. 제67항에 있어서, 항체가 HER2 세포외 도메인의 도메인 I, II 및 III 사이의 연결부에 결합하는 것인 조성물.
  70. 제69항에 있어서, HER2 항체가 각각 서열 3 및 4의 가변 경쇄 및 가변 중쇄 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
  71. 제70항에 있어서, HER2 항체가 페르투주맙인 조성물.
  72. 제65항에 있어서, HER 항체가 네이키드 항체, 무손상 항체, 또는 항원 결합 구역을 포함하는 항체 단편인 조성물.
  73. 제56항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 암 종류가 난소암, 복막암, 난관암, 전이성 유방암 (MBC), 비-소세포 폐암 (NSCLC), 전립선암 및 결장직장암으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 조성물.
  74. 제73항에 있어서, 암 종류가 난소암, 복막암 또는 난관암인 조성물.
  75. 제74항에 있어서, 암 종류가 백금 내성암인 조성물.
  76. 제74항에 있어서, 암 종류가 진행성, 불응성 또는 재발성 난소암인 조성물.
  77. 제56항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 환자의 무진행 생존 (PFS) 또는 전체 생존 (OS)을 연장시키는 조성물.
  78. 제56항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, HER 억제제가 단일 항종양제로서 투여되는 것인 조성물.
  79. 제56항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 치료제를 포함하는 조성물.
  80. 제79항에 있어서, 제2 치료제가 화학요법제, HER 항체, 종양 관련 항원에 대해 지시된 항체, 항-호르몬 화합물, 심보호제, 시토킨, EGFR-표적화 약물, 항-혈관신생제, 티로신 키나제 억제제, COX 억제제, 비-스테로이드성 소염 약물, 파르네실 트랜스퍼라제 억제제, 종양태아성 단백질 CA 125에 결합하는 항체, HER2 백신, HER 표적화 요법제, Raf 또는 ras 억제제, 리포좀 독소루비신, 토포테칸, 탁산, 이중 티로신 키나제 억제제, TLK286, EMD-7200, 오심 치료용 의약, 피부 발진의 예방 또는 치료 또는 표준 여드름 요법용 의약, 설사의 치료 또는 예방용 의약, 체온 감소 의약 및 조혈 성장 인자로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 조성물.
  81. 제80항에 있어서, 제2 치료제가 화학요법제인 조성물.
  82. 제81항에 있어서, 화학요법제가 겜시타빈, 카르보플라틴, 파클리탁셀, 도세탁셀, 토포테칸 및 리포좀 독소루비신으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 조성물.
  83. 제81항에 있어서, 화학요법제가 항대사물질인 조성물.
  84. 제83항에 있어서, 항대사물질 화학요법제가 겜시타빈인 조성물.
  85. 제80항에 있어서, 제2 치료제가 트라스투주맙, 에를로티닙 또는 베바시주맙인 조성물.
  86. 치료상 유효량의 페르투주맙을 포함하는 난소암, 복막암 또는 난관암 환자 치료용 조성물이며, 여기서 환자의 암이 난소암, 복막암 또는 난관암에서의 HER2:HER3 발현에 대해 제25 백분위를 초과하는 수준으로 HER2:HER3을 발현하는 것인, 난소암, 복막암 또는 난관암에 걸린 환자를 치료하기 위한 조성물.
  87. 제86항에 있어서, 환자의 암이 난소암, 복막암 또는 난관암에서의 HER2:HER3 발현에 대해 중앙 수준을 초과하는 수준으로 HER2:HER3을 발현하는 것인 조성물.
  88. 제87항에 있어서, 환자의 암이 난소암, 복막암 또는 난관암에서의 HER2:HER3 발현에 대해 제75 백분위를 초과하는 수준으로 HER2:HER3을 발현하는 것인 조성물.
  89. 제86항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, HER2 및 HER3 발현이 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 사용하여 결정된 것인 조성물.
  90. 제89항에 있어서, PCR이 정량적 실시간 중합효소 연쇄 반응 (qRT-PCR)인 조성물.
  91. 제86항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 무진행 생존 (PFS) 또는 전체 생존 (OS)을 연장시키는 조성물.
  92. 제86항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 환자가 난소암 환자인 조성물.
  93. 제92항에 있어서, 난소암이 백금 내성 난소암인 조성물.
  94. 제92항에 있어서, 환자가 진행성, 불응성 또는 재발성 난소암 환자인 조성물.
  95. 제86항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 화학요법제를 추가로 포함하는 조성물.
  96. 제95항에 있어서, 화학요법제가 겜시타빈, 카르보플라틴, 파클리탁셀, 도세탁셀, 토포테칸 및 리포좀 독소루비신으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 조성물.
  97. 제95항에 있어서, 화학요법제가 항대사물질 화학요법제인 조성물.
  98. 제97항에 있어서, 항대사물질 화학요법제가 겜시타빈인 조성물.
  99. HER2 및 HER3 발현을 HER 억제제에 반응할 수 있는 종류의 암에 걸린 환자로부터의 암 샘플에서 시험관내에서 결정하는 것, 및 암 샘플이 그 암 종류에서의 HER2:HER3 발현에 대해 제25 백분위를 초과하는 수준으로 HER2:HER3을 발현하는 경우 요법으로서 HER 억제제를 선택하는 것을 포함하는, HER 억제제에 반응할 수 있는 종류의 암에 걸린 환자를 위한 요법을 선택하는 시험관내 방법.
  100. 제약상 허용되는 담체 내에 HER 억제제를 포함하는 제약 조성물, 및 상기 억제제 또는 제약 조성물이 HER 억제제에 반응할 수 있는 종류의 암에 걸린 환자의 치료에 사용되도록 지시되었음을 언급한 라벨을 함께 포장하여 포함하고, 여기서 환자의 암은 그 암 종류에서의 HER2:HER3 발현에 대해 제25 백분위를 초과하는 수준으로 HER2:HER3을 발현하는 것인 제조품.
  101. HER 억제제 또는 그의 제약 조성물, 및 상기 억제제 또는 제약 조성물이 HER 억제제에 반응할 수 있는 종류의 암에 걸린 환자의 치료에 사용되도록 지시되었음을 언급한 라벨을 패키지 내에 합하는 것을 포함하고, 여기서 환자의 암은 그 암 종류에서의 HER2:HER3 발현에 대해 제25 백분위를 초과하는 수준으로 HER2:HER3을 발현하는 것인, HER 억제제 또는 그의 제약 조성물을 제조하는 방법.
  102. 표적 대상에게 어느 한 종류의 암에 걸린 환자 집단을 치료하기 위한 HER 억제제 또는 그의 제약 조성물의 사용을 장려하는 것을 포함하고, 여기서 환자의 암은 그 암 종류에서의 HER2:HER3 발현에 대해 제25 백분위를 초과하는 수준으로 HER2:HER3을 발현하는 것인, HER 억제제 또는 제약상 허용되는 그의 조성물을 광고하는 방법.
  103. 치료상 유효량의 HER 억제제를 포함하는 암 환자 치료용 조성물이며, 여기서 환자의 암은 그 암 종류에서의 HER3 발현에 대해 중앙 수준 미만의 수준으로 HER3을 발현하는 것인, HER 억제제에 반응할 수 있는 종류의 암에 걸린 환자를 치료하기 위한 조성물.
  104. HER3 발현을 HER 억제제에 반응할 수 있는 종류의 암에 걸린 환자로부터의 암 샘플에서 시험관내에서 결정하는 것, 및 암 샘플이 그 암 종류에서의 HER3 발현에 대해 중앙 수준 미만의 수준으로 HER3을 발현하는 경우 요법으로서 HER 억제제를 선택하는 것을 포함하는, HER 억제제에 반응할 수 있는 종류의 암에 걸린 환자를 위한 요법을 선택하는 시험관내 방법.
  105. 제104항에 있어서, HER 억제제가 HER2 억제제인 방법.
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