KR20130136590A - 외래 핵산 서열의 표적화된 통합 및 발현 - Google Patents

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Abstract

게놈 내의 정해진 표적 부위에 외래 서열을 표적화 통합하기 위한 방법 및 조성물이 본원에 개시되며, 이것은, 예를 들어 단백질 발현 및 유전자 불활성화에 사용된다.
[색인어]
표적화, 재조합, 통합, 유전자, 상동성, 발현, 치료, 유전자, 유전질환, 염색체

Description

외래 핵산 서열의 표적화된 통합 및 발현{TARGETED INTEGRATION AND EXPRESSION OF EXOGENOUS NUCLEIC ACID SEQUENCES}
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2005년 7월 26일자 제출된 미국 가 출원 제60/702,394호 및 2005년 9월 26일자 제출된 미국 가 출원 제60/721,054호의 이익을 주장하며, 이것들의 전문은 모두 본원에 참고자료로 포함된다.
기술분야
본 명세서는 게놈 조작, 유전자 표적화, 표적화된 염색체 통합 및 단백질 발현 분야에 관한 것이다.
게놈 생물학에서, 특히 다수의 게놈의 완전한 뉴클레오티드 서열을 결정하는 것에 있어서 흥미로운 주된 영역은 게놈 서열의 표적화된 변경이다. 한 예를 들자면, 겸상적혈구빈혈증은 인간 β-글로빈 유전자에서 단일 뉴클레오티드 쌍의 돌연변이에 의한 것이다. 따라서, 돌연변이 β-글로빈 유전자를 함유하는 유전자에 기능적 β-글로빈 유전자의 도입하는 것과 같이, 돌연변이 뉴클레오티드 쌍의 내인성 유전자 카피를 안정한 방식으로 야생형 서열로 전환시켜 정상적인 β-글로빈을 만드는 능력이 겸상적혈구빈혈증에 대한 치료법을 제공할 것이다.
상동성 재조합의 자연적인 현상을 이용하여 배양된 세포에서 게놈 서열을 변경하려는 시도가 있었다. 예를 들어, Capecchi (1989) Science 244:1288-1292; 미국특허 제6,528,313호 및 제6,528,314호 참조. 폴리뉴클레오티드가 변경될 서열을 함유하는 게놈 영역에 대해 충분한 상동성을 가진다면, 이 폴리뉴클레오티드 서열의 일부 또는 전체를 상동성 재조합에 의해 게놈 서열로 치환하는 것이 가능하다. 그러나, 이런 환경 하에서의 상동성 재조합 빈도는 극도로 낮다. 더욱이, 서열 상동성이 부족한 게놈 위치에 외래 폴리뉴클레오티드가 삽입되는 빈도는 상동성 재조합 빈도를 몇 배까지 초과한다.
외래 폴리뉴클레오티드에 대한 상동성을 지닌 게놈 영역에서 게놈 DND에 이중-가닥 브레이크를 삽입하는 것은 배양된 세포에서 이 부위에서의 상동성 재조합을 수천 배까지 자극하는 것으로 밝혀졌다. Rouet 등(1994) Mol. Cell. Biol. 14: 8096-8106; Choulika 등 (1995) Mol. Cell. Biol. 15:1968-1973; Donoho 등 (1998) Mol. Cell. Biol. 18:4070-4078. 또한, Johnson 등 (2001) Biochem. Soc. Trans. 29:196-201; 및 Yanez 등 (1998) Gene Therapy 5:149-159 참조. 이들 방법에서 원하는 게놈 영역에서의 DNA 절단은 원하는 게놈 영역에 메가뉴클레아제(즉, 해당 게놈에서는 인식 서열이 발생하지 않거나, 또는 아주 드물게 발생하는 정도의 거대한 엔도뉴클레아제) 인식부위를 삽입함으로써 달성되었다.
그렇지만, 메가뉴클레아제 절단-자극 상동성 재조합에서는 변경될 게놈 영역 근처에 적합한 메가뉴클레아제 인식부위가 우연히 존재하거나, 아니면 그것을 직접 삽입해야 한다. 전형적인 포유류 게놈에서는 메가뉴클레아제 인식부위가 드물고(또는 존재하지 않고), 적합한 메가뉴클레아제 인식부위를 삽입하는데 있어서도 다른 게놈 변경에 관련된 것과 동일한 어려움이 있기 때문에, 이들 방법은 널리 적용되지 않고 있다.
따라서, 어떤 게놈에서 서열의 표적화된 변경을 위한 조성물 및 방법, 그리고 게놈에 외래 서열의 표적화된 도입을 위한 조성물 및 방법에 대한 필요성이 남아 있다.
발명의 개요
본 명세서는 세포에서 외래 핵산 서열(즉, 단백질 또는 RNA 분자)의 산물을 발현시키기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 외래 핵산 서열은, 예를 들어 하나 이상의 유전자 또는 cDNA 분자, 또는 어떤 종류의 코딩 또는 논코딩 서열을 포함할 수 있으며, 세포에 도입되어 정해진 관심 영역에서 세포의 게놈에 통합된다. 외래 핵산 서열의 통합은 관심 영역에서 게놈의 표적화된 이중-가닥 절단에 의해 촉진된다. 절단은 관심 영역에서 어떤 선택된 서열에 결합하도록 조작될 수 있는 징크핑거 결합 도메인, 및 절단 도메인 또는 절단 하프-도메인을 포함하는 융합 단백질의 사용에 의해 특정 부위에 표적화된다. 이러한 절단은 절단 부위 또는 그 근처에서 외래 폴리뉴클레오티드 서열의 통합을 자극한다. 외래 서열의 상기 통합은 상동성-의존적 및 상동성-독립적 메커니즘을 통해 진행될 수 있다.
또한, 하나 이상의 외래 서열의 표적화된 통합(상동성-의존적 또는 상동성-독립적)에 의해 내인성 세포 유전자의 발현을 조절하기 위한 방법 및 조성물이 제공된다. 이러한 외래 서열은, 예를 들어 프로모터 및 인핸서 같은 전사제어 서열을 포함할 수 있다. 조절은 전사 활성화(예를 들어, 프로모터 및/또는 인핸서 서열의 삽입 등에 의한 전사 증진) 및 전사 억제(예를 들어, 내인성 전사조절 서열에 외래 서열의 삽입, 전사 억제를 촉진하는 서열의 삽입, 또는 코딩 영역을 단절시키는 서열의 삽입 등에 의한 기능적 "녹-아웃")을 포함할 수 있다.
또한, 상동성-의존적 또는 상동성-독립적 메커니즘에 의한 게놈에 외래 서열의 표적화된 삽입을 위한 방법 및 조성물이 제공되며, 이때 외래 서열은 내인성 유전자의 산물을 발현하거나 발현을 조절하지 않는다. 예를 들어, 서열-특이적 DNA-절단 효소에 대한 인식 서열이 게놈의 정해진 위치에 도입될 수 있으며, 이로써 절단 효소에 의한 표적화된 절단이 게놈의 정해진 위치에서 달성될 수 있다. 전형적인 DNA-절단 효소는, 제한되는 것은 아니지만, 제한 효소, 메가뉴클레아제 및 귀소성 엔도뉴클레아제를 포함한다.
한 양태에서, 세포에서 외래 핵산 서열의 산물을 발현시키는 방법이 본원에 개시되며, 이 방법은 (a) 세포에서 제 1 융합 단백질을 발현시키는 단계로서, 제 1 융합 단백질은 제 1 징크핑거 결합 도메인 및 제 1 절단 하프-도메인을 포함하고, 제 1 징크핑거 결합 도메인은 세포 게놈의 관심 영역 내에 있는 제 1 표적 부위에 결합하도록 조작되며; (b) 세포에서 제 2 융합 단백질을 발현시키는 단계로서, 제 2 융합 단백질은 제 2 징크핑거 결합 도메인 및 제 2 절단 하프-도메인을 포함하고, 제 2 징크핑거 결합 도메인은 세포 게놈의 관심 영역 내에 있는 제 2 표적 부위에 결합하며, 제 2 표적 부위는 제 1 표적 부위와는 상이하고; 및 (c) 외래 핵산 서열 및 관심 영역 내의 제 1 서열에 상동성인 제 1 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 세포와 접촉시키는 단계를 포함하며; 제 1 융합 단백질과 제 1 표적 부위의 결합, 및 제 2 융합 단백질과 제 2 표적 부위의 결합에 의해 절단 하프-도메인들이 배치되어 관심 영역 내에서 세포 게놈이 절단됨으로써, 그 결과 관심 영역에서 세포 게놈에 외래 서열이 통합되고 외래 서열의 산물이 발현된다.
외래 핵산 서열은 cDNA 및/또는 프로모터를 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 외래 핵산 서열은 siRNA를 암호화한다. 제 1 뉴클레오티드 서열은 관심 영역에 있는 제 1 서열과 동일할 수 있다.
어떤 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 관심 영역에 있는 제 2 서열에 상동성인 제 2 뉴클레오티드 서열을 더 포함한다. 제 2 뉴클레오티드 서열은 관심 영역에 있는 제 2 서열과 동일할 수 있다. 또한, 제 1 뉴클레오티드 및 제 2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 구체예에서, 제 1 뉴클레오티드 서열은 관심 영역에 있는 제 1 서열과 동일할 수 있고, 제 2 뉴클레오티드 서열은 관심 영역에 있는 제 2 서열과 상동성은 있지만 동일하지는 않을 수 있다. 본원에 설명된 방법들 중 어느 것에서, 제 1 뉴클레오티드 및 제 2 뉴클레오티드 서열은 외래 서열의 측면에 있다.
어떤 구체예에서 폴리뉴클레오티드는 플라스미드이다. 다른 구체예에서 폴리뉴클레오티드는 선형 DNA 분자이다.
본원에 설명된 방법들 중 어느 것에서, 관심 영역은 세포 염색질의 접근가능한 영역, 염색체, 및/또는 유전자(예를 들어, 점 돌연변이, 치환, 결실, 삽입, 중복, 역전, 및/또는 전위와 같은 돌연변이를 포함한 유전자)에 있다. 어떤 구체예에서, 외래 핵산 서열은 유전자의 야생형 서열을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 외래 핵산 서열은 유전자의 전사 산물의 cDNA 카피를 포함한다.
본원에 설명된 방법들 중 어느 것에서, 관심 영역은 생존성에 필수적이지 않은 게놈 영역에 있다. 다른 구체예에서, 관심 영역은 전사 활성인 게놈 영역에 있다. 관심 영역은 전사 활성이면서 생존성에 필수적이지 않은 게놈 영역에 있다(예를 들어, 인간 Rosa26 게놈, 뮤린 Rosa26 유전자의 인간 상동체 또는 CCR5 유전자).
다른 양태로서, 세포 게놈에서 관심 영역에 외래 핵산 서열을 통합시키기 위한 방법이 본원에 제공되며, 이 방법은 (a) 세포에서 제 1 융합 단백질을 발현시키는 단계로서, 제 1 융합 단백질은 제 1 징크핑거 결합 도메인 및 제 1 절단 하프-도메인을 포함하고, 제 1 징크핑거 결합 도메인은 세포 게놈의 관심 영역 내에 있는 제 1 표적 부위에 결합하도록 조작되며; (b) 세포에서 제 2 융합 단백질을 발현시키는 단계로서, 제 2 융합 단백질은 제 2 징크핑거 결합 도메인 및 제 2 절단 하프-도메인을 포함하고, 제 2 징크핑거 결합 도메인은 세포 게놈의 관심 영역 내에 있는 제 2 표적 부위에 결합하며, 제 2 표적 부위는 제 1 표적 부위와는 상이하고; 및 (c) 외래 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 세포와 접촉시키는 단계를 포함하며; 제 1 융합 단백질과 제 1 표적 부위의 결합, 및 제 2 융합 단백질과 제 2 표적 부위의 결합에 의해 절단 하프-도메인들이 배치되어 관심 영역 내에서 세포 게놈이 절단됨으로써, 그 결과 관심 영역 내에서 세포 게놈에 외래 서열이 통합된다. 어떤 구체예에서, 통합은 관심 영역에서의 유전자 발현을 불활성화한다. 외래 핵산 서열은, 예를 들어 1 내지 50개 뉴클레오티드 길이의 서열을 포함할 수 있다. 또한, 외래 핵산 서열은 검출가능한 아미노산 서열을 암호화할 수 있다. 관심 영역은 세포 염색질의 접근가능한 영역에 있을 수 있다.
본원에 설명된 방법들 중 어느 것에서, 제 1 절단 하프-도메인 및 제 2 절단 하프-도메인은 IIS 타입 제한 엔도뉴클레아제로부터 유래되며, 예를 들어 FokI 또는 StsI이다. 또한, 본원에 설명된 방법들 중 어느 것에서, 융합 단백질 중 적어도 하나는 절단 하프-도메인의 이량체화 인터페이스의 아미노산 서열에 변경을 포함할 수 있다.
본원에 설명된 방법들 중 어느 것에서, 세포는 포유류 세포, 예를 들어 인간 세포일 수 있다. 또한, 세포는 세포 사이클의 G2 단계에서 정지될 수 있다.
따라서, 본 발명의 내용은, 제한되는 것은 아니지만, 다음 구체예들을 포함한다:
1. 세포에서 외래 핵산 서열의 산물을 발현시키는 방법으로서, 이 방법은
(a) 세포 게놈의 관심 영역 내에 있는 제 1 표적 부위에 결합하도록 조작된 제 1 징크핑거 결합 도메인 및 제 1 절단 하프-도메인을 포함하는 제 1 융합 단백질을 세포에서 발현시키는 단계;
(b) 세포 게놈의 관심 영역 내에 있는 제 1 표적 부위와는 다른 제 2 표적 부위에 결합하는 제 2 징크핑거 결합 도메인 및 제 2 절단 하프-도메인을 포함하는 제 2 융합 단백질을 세포에서 발현시키는 단계; 및
(c) 외래 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 세포와 접촉시키는 단계를 포함하며;
제 1 융합 단백질과 제 1 표적 부위의 결합, 및 제 2 융합 단백질과 제 2 표적 부위의 결합에 의해 절단 하프-도메인들이 배치되어 관심 영역 내에서 세포 게놈이 절단됨으로써, 그 결과 관심 영역 내에서 세포 게놈에 외래 서열이 통합되고, 외래 서열의 산물이 발현된다.
2. 제 1 항에 있어서, 외래 핵산 서열이 cDNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제 1 항에 있어서, 외래 서열이 프로모터를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제 1 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 관심 영역 내의 제 1 서열과 동일한 제 1 뉴클레오티드 서열을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제 4 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 관심 영역 내의 제 2 서열과 동일한 제 2 뉴클레오티드 서열을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제 1 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 관심 영역 내의 제 1 서열과 상동성이지만 동일하지 않은 제 1 뉴클레오티드 서열을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제 6 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 관심 영역 내의 제 2 서열과 상동성이지만 동일하지 않은 제 2 뉴클레오티드 서열을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제 1 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 관심 영역 내의 제 1 서열과 동일한 제 1 뉴클레오티드 서열 및 관심 영역 내의 제 2 서열과 상동성이지만 동일하지 않은 제 2 뉴클레오티드 서열을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제 5 항에 있어서, 제 1 및 제 2 뉴클레오티드 서열은 외래 서열의 측면에 위치하는 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제 7 항에 있어서, 제 1 및 제 2 뉴클레오티드 서열은 외래 서열의 측면에 위치하는 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제 8 항에 있어서, 제 1 및 제 2 뉴클레오티드 서열은 외래 서열의 측면에 위치하는 것을 특징으로 하는 방법.
12. 제 1 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 플라스미드인 것을 특징으로 하는 방법.
13. 제 1 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 선형 DNA 분자인 것을 특징으로 하는 서열.
14. 제 1 항에 있어서, 관심 영역이 세포 염색질의 접근가능한 영역에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
15. 제 1 항에 있어서, 관심 영역이 생존성에 필수적이지 않은 게놈 영역에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
16. 제 1 항에 있어서, 관심 영역이 전사 활성인 게놈 영역에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
17. 제 1 항에 있어서, 관심 영역이 전사 활성이면서 생존성에 필수적이지 않은 게놈 영역에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
18. 제 17 항에 있어서, 관심 영역이 인간 Rosa26 유전자인 것을 특징으로 하는 방법.
19. 제 17 항에 있어서, 관심 영역이 뮤린 Rosa26 유전자의 인간 상동체인 것을 특징으로 하는 방법.
20. 제 1 항에 있어서, 제 1 및 제 2 절단 하프-도메인은 IIS 타입 제한 엔도뉴클레아제로부터 유래하는 것을 특징으로 하는 방법.
21. 제 20 항에 있어서, IIS 타입 제한 엔도뉴클레아제는 FokI 및 StsI로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
22. 제 1 항에 있어서, 관심 영역이 염색체에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
23. 제 1 항에 있어서, 관심 영역이 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
24. 제 13 항에 있어서, 유전자가 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
25. 제 14 항에 있어서, 돌연변이가 점 돌연변이, 치환, 결실, 삽입, 중복, 역전 및 전위로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
26. 제 24 항에 있어서, 외래 핵산 서열이 유전자의 야생형 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
27. 제 24 항에 있어서, 외래 핵산 서열이 유전자의 야생형 서열의 일부분을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
28. 제 24 항에 있어서, 외래 핵산 서열이 유전자의 전사 산물의 cDNA 카피를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
29. 제 1 항에 있어서, 외래 핵산 서열이 siRNA를 암호화하는 것을 특징으로 하는 방법.
30. 제 1 항에 있어서, 세포가 세포 사이클의 G2 단계에서 정지되는 것을 특징으로 하는 방법.
31. 제 1 항에 있어서, 융합 단백질 중 적어도 하나가 절단 하프-도메인의 이량체화 인터페이스의 아미노산 서열에 변경을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
32. 제 1 항에 있어서, 세포가 포유류 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
33. 제 32 항에 있어서, 세포가 인간 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
도 1은 단백질의 아미노-말단 부분을 암호화하는 인간 hSMC1L1 유전자 부분의 이중-가닥 형태 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO:1)과 암호화된 아미노산 서열(SEQ ID NO:2)을 나타낸다. hSMC1-특이적 ZFP의 표적 서열을 밑줄로 표시한다(각 DNA 가닥에 하나씩).
도 2는 hSMC1 유전자의 표적화된 절단을 위한 ZFP-FokI 융합체를 암호화하는 플라스미드의 구성도를 나타낸다.
도 3 A-D는 hSMC1 유전자의 구성도를 나타낸다. 도 3A는 hSMC1 유전자를 포함하는 인간 X 염색체 부분의 도해를 나타낸다. 도 3B는 상류 영역(+1의 좌측)을 포함하는 hSMC1 유전자 부분, 제 1 엑손(+1과 "SMC1 코딩 서열"이라고 표시된 화살표의 우측 끝 사이) 및 제 1 인트론 부분의 도해를 나타낸다. 또한, 초기 증폭 프라이머와 염색체-특이적 프라이머에 상동성인 서열의 위치(표 3 참조)가 제공된다. 도 3C는 SMC1 개시 코돈의 영역에 있는 인간 X 염색체의 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO:3), 암호화된 아미노산 서열(SEQ ID NO:4), 및 SMC1-특이적 징크핑거 단백질의 표적 부위를 나타낸다. 3D는 도너 분자의 상응하는 영역의 서열(SEQ ID NO:5)을 나타내며, 밑줄친 도너 서열과 염색체 서열 사이에는 차이가 있다. 도너-특이적 증폭 프라이머에 함유된 서열(표 3)을 이중 밑줄로 표시한다.
도 4는 hSMC1 도너 구성체의 구성도를 나타낸다.
도 5는 트랜스펙션된 HEK293 세포로부터의 DNA에 대한 PCR 분석을 나타낸다. 좌측에서부터 레인은 GFP(대조군 플라스미드)를 암호화하는 플라스미드로 트랜스펙션된 세포, 각각 2개의 hSMC1-특이적 ZFP-FokI 융합 단백질 중 하나를 암호화하는 2개 플라스미드로 트랜스펙션된 세포(ZFP만), hSMC1 도너 플라스미드의 2개 농축물로 트랜스펙션된 세포(도너만), 및 ZFP-암호화 플라스미드와 도너 플라스미드 2개로 트랜스펙션된 세포(ZFP + 도너)로부터의 결과를 나타낸다. 상세한 내용은 실시예 1을 참조한다.
도 6은 표적화 상동성 재조합에 의해서 생성된 돌연변이 hSMC1 유전자로부터 유도된 증폭 산물의 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO:6)을 나타낸다. 증폭 산물이 클로닝된 벡터로부터 유래한 서열은 한 줄의 밑줄로 표시하고, 도너 분자에 존재하지 않는 염색체 서열은 점선 밑줄(뉴클레오티드 32-97)로 표시하고, 도너와 염색체에 공통된 서열은 밑줄을 치지 않고(뉴클레오티드 98-394 및 402-417), 도너에만 특유한 서열은 이중 밑줄(뉴클레오티드 395-401)로 표시한다. 소문자는 염색체 서열과 도너 서열 사이에 차이가 있는 것을 나타낸다.
도 7은 제 2 인트론의 3' 단부와 제 3 엑손의 5' 단부를 포함하는 인간 IL2Rγ 유전자 부분의 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO:7) 및 제 3 엑손의 표시된 부분에 의해 암호화된 아미노산 서열(SEQ ID NO:8)을 나타낸다. IL2Rγ-특이적 ZFP의 두 번째 쌍의 표적 서열을 밑줄로 표시한다. 상세한 내용은 실시예 2를 참조한다.
도 8은 IL2Rγ 유전자의 표적화된 절단을 위한 ZFP-FokI 융합체를 암호화하는 플라스미드의 구성도를 나타낸다.
도 9 A-D는 IL2Rγ 유전자의 구성도를 나타낸다. 도 9A는 IL2Rγ 유전자를 포함하는 인간 X 염색체 부분의 도해를 나타낸다. 도 9B는 제 2 인트론 부분, 제 3 엑손 및 제 3 인트론 부분을 포함하는 IL2Rγ 유전자 부분의 도해를 나타낸다. 또한, 초기 증폭 프라이머와 염색체-특이적 프라이머에 상동성인 서열의 위치(표 5 참조)가 제공된다. 도 9C는 IL2Rγ 유전자의 제 3 엑손 영역에서의 인간 X 염색체의 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO:9), 암호화된 아미노산 서열(SEQ ID NO:10), 및 IL2Rγ-특이적 징크핑거 단백질의 첫 번째 쌍의 표적 부위를 나타낸다. 도 9D는 도너 분자의 상응하는 영역의 서열(SEQ ID NO:11)을 나타내며, 밑줄친 도너 서열과 염색체 서열 사이에는 차이가 있다. 도너-특이적 증폭 프라이머에 함유된 서열(표 5)은 이중 선으로 표시된다.
도 10은 IL2Rγ 도너 구성체의 구성도를 나타낸다.
도 11은 트랜스펙션된 K652 세포로부터의 DNA에 대한 PCR 분석을 나타낸다. 좌측에서부터 레인은 각각 IL2Rγ-특이적 ZFP-FokI 융합 단백질 쌍 중 하나를 암호화하는 2개 플라스미드로 트랜스펙션된 세포(ZFP만, 1번 레인), IL2Rγ 도너 플라스미드의 2개 농축물로 트랜스펙션된 세포(도너만, 2번 및 3번 레인), 및 ZFP-암호화 플라스미드와 도너 플라스미드 2개로 트랜스펙션된 세포(ZFP + 도너, 4번~7번 레인)로부터의 결과를 나타낸다. IL2Rγ-특이적 ZFP-FokI 융합체 쌍을 각각 2개 사용했으며("1번 쌍" 및 "2번 쌍"으로 확인), 두 쌍을 사용함으로써 특징적 증폭 산물이 생산되었다(도면에서 "예상 키메라 산물"로 표시됨). 상세한 내용은 실시예 2를 참조한다.
도 12는 표적화 상동성 재조합에 의해서 생성된 돌연변이 IL2Rγ 유전자로부터 유도된 증폭 산물의 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO:12)을 나타낸다. 증폭 산물이 클로닝된 벡터로부터 유래한 서열은 한 줄의 밑줄로 표시하고, 도너 분자에 존재하지 않는 염색체 서열은 점선 밑줄(뉴클레오티드 460-552)로 표시하고, 도너와 염색체에 공통된 서열은 밑줄을 치지 않고(뉴클레오티드 32-42 및 59-459), 도너 서열이 염색체 서열과 구별되는 뉴클레오티드를 함유하는 서열 스트레치는 이중 밑줄(뉴클레오티드 44-58)로 표시한다. 소문자는 염색체 서열과 도너 서열 사이에 차이가 있는 뉴클레오티드를 나타낸다.
도 13은 코어 프로모터, 2개의 제 1 엑손 및 제 1 인트론의 인간 베타-글로빈 유전자 암호화 세그먼트 부분의 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO:13)을 나타낸다. 11번 염색체(BLAT, UCSC 게놈 바이오인포매틱스 사이트) 상의 위치 5212541에 있는 A(볼드체, 밑줄)가 T로 바뀌는 미스센스 돌연변이가 겸상적혈구빈혈증의 원인이다. 제 1 징크핑거/FokI 융합 단백질은 밑줄친 12-뉴클레오티드 서열 AAGGTGAACGTG(SEQ ID NO:13의 뉴클레오티드 305-316)와 1차 접촉하도록 설계되었고, 제 2 징크핑거/FokI 융합 단백질은 밑줄친 12-뉴클레오티드 서열 CCGTTACTGCCC(SEQ ID NO:13의 뉴클레오티드 325-336)의 보체와 1차 접촉하도록 설계되었다.
도 14는 인간 베타 글로빈 유전자의 표적화 절단을 위한 ZFP-FokI 융합체를 암호화하는 플라스미드의 구성도이다.
도 15는 상류 영역, 제 1 및 제 2 엑손, 제 1 인트론 및 프라이머 결합 부위를 나타낸 복제된 인간 베타 글로빈 유전자의 구성도이다.
도 16은 베타 글로빈 도너 구성체, pCR4-TOPO-HBBdonor의 구성도이다.
도 17은 β-글로빈-특이적 ZFP 뉴클레아제와 베타 글로빈 도너 플라스미드의 2개 쌍으로 트랜스펙션된 세포로부터의 DNA에 대한 PCR 분석을 나타낸다. 좌측 패널은 초기 amp 1 및 초기 amp 2 프라이머(표 7)를 사용하여 증폭시킨 로딩 대조군이다. 우측 패널에 나타낸 실험에서는 "염색체-특이적" 및 "도너-특이적" 프라이머(표 7)를 사용하여 증폭시켰다. 각 패널에서 맨 좌측 레인은 분자량 마커를 함유하며, 그 다음 레인은 mock-트랜스펙션 세포로부터 얻어진 증폭 산물을 나타낸다. 나머지 레인들은 좌측에서 우측으로 GFP-암호화 플라스미드, 각 ZFP/FokI-암호화 플라스미드 1OOng, 각 ZFP/FokI-암호화 플라스미드 200ng, 도너 플라스미드 200ng, 도너 플라스미드 600ng, 도너 플라스미드 200ng + 각 ZFP/FokI-암호화 플라스미드 100ng, 및 도너 플라스미드 600ng + 각 ZFP/FokI-암호화 플라스미드 200ng으로 트랜스펙션된 세포들로부터의 증폭 산물을 나타낸다.
도 18은 표적화 상동성 재조합에 의해서 생성된 돌연변이 베타-글로빈 유전자로부터 유도된 증폭 산물의 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO:14)을 나타낸다. 도너 분자에 존재하지 않는 염색체 서열은 점선 밑줄(뉴클레오티드 1-72)로 표시하고, 도너와 염색체에 공통된 서열은 밑줄을 치지 않고(뉴클레오티드 73-376), 도너 서열이 염색체 서열과 구별되는 뉴클레오티드를 함유하는 서열 스트레치는 이중 밑줄(뉴클레오티드 377-408)로 표시한다. 소문자는 염색체 서열과 도너 서열 사이에 차이가 있는 뉴클레오티드를 나타낸다.
도 19는 인터류킨-2 수용체 감마 사슬(IL-2Rγ) 유전자의 제 5 엑손 부분의 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO:15)을 나타낸다. 또한, 5-8 및 5-10 ZFP/FokI 융합 단백질의 표적 서열을 나타낸다(밑줄). 상세한 내용은 실시예 5를 참조한다.
도 20은 인간 IL-2Rγ 유전자의 엑손 5에 표적화된 5-8 ZFP/FokI 융합체의 아미노산 서열(SEQ ID NO:16)을 나타낸다. 아미노산 잔기 1-17은 핵 국지화 서열 (NLS, 밑줄)을 함유하고; 잔기 18-130은 ZFP 부분(징크핑거 구성요소의 인식 영역은 볼드체로 표시)을 함유하며; ZFP-FokI 링커(ZC 링커, 밑줄)는 잔기 131에서 140까지 연장되고, FokI 절단 하프-도메인은 잔기 141에서 시작하여 잔기 336의 단백질 끝까지 연장된다. Q486E 돌연변이를 생성하도록 변경된 잔기를 밑줄, 볼드체로 표시한다.
도 21은 인간 IL-2Rγ 유전자의 엑손 5에 표적화된 5-10 ZFP/FokI 융합체의 아미노산 서열(SEQ ID NO:17)을 나타낸다. 아미노산 잔기 1-17은 핵 국지화 서열 (NLS, 밑줄)을 함유하고; 잔기 18-133은 ZFP 부분(징크핑거 구성요소의 인식 영역은 볼드체로 표시)을 함유하며; ZFP-FokI 링커(ZC 링커, 밑줄)는 잔기 134에서 143까지 연장되고, FokI 절단 하프-도메인은 잔기 144에서 시작하여 잔기 339의 단백질 끝까지 연장된다. E490K 돌연변이를 생성하도록 변경된 잔기를 밑줄, 볼드체로 표시한다.
도 22는 에쿼리아빅토리아(Aequorea victoria) GFP 유전자(Tsien(1998) Ann. Rev. Biochem. 67:509-544)로부터 유래된 강화 녹색 형광 단백질 유전자의 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO:18)을 나타낸다. ATG 개시 코돈과 돌연변이된 영역에 밑줄 표시한다.
도 23은 돌연변이 결함 eGFP 유전자의 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO:19)을 나타낸다. ZFP-뉴클레아제 결합 부위를 밑줄로 표시하며, 결합 부위들 사이의 영역이 변형될 영역에 해당한다.
도 24는 eGFP 유전자에 표적화된 징크핑거 뉴클레아제를 암호화하는 플라스미드의 구조를 나타낸다.
도 25는 징크핑거 엔도뉴클레아제에 의한 돌연변이 eGFP 유전자의 표적화 DNA 절단을 분석하는데 사용된 10% 아크릴아미드 겔의 오토라디오그램을 나타낸다. 상세한 내용은 실시예 8을 참조한다.
도 26은 플라스미드 pcDNA4/TO/GFPmut의 구조를 나타낸다(실시예 9 참조).
도 27은 인간 HEK293 세포의 트랜스펙션으로부터 얻어진 다양한 셀라인에서 GAPDH mRNA에 정규화된 eGFPmut mRNA의 수준을 나타낸다. 흰색 막대는 미처리 세포에서의 수준을 나타내고, 검은색 막대는 2ng/mL 독시시클린으로 처리된 세포에서의 수준을 나타낸다. 상세한 내용은 실시예 9를 참조한다.
도 28은 플라스미드 pCR(R)4-TOPO-GFPdonor5의 구조를 나타낸다. 상세한 내용은 실시예 10을 참조한다.
도 29는 pCR(R)4-TOPO-GFPdonor5에 삽입된 eGFP 삽입체의 뉴클레오티드 서열 (SEQ ID NO:20)을 나타낸다. 이 삽입체는 개시 코돈이 결핍된 비-변형 강화 녹색 형광 단백질 부분을 암호화하는 서열을 함유한다. 상세한 내용은 실시예 10을 참조한다.
도 30은 2개 ZFP 뉴클레아제를 암호화하는 플라스미드와 도너 서열을 암호화하는 플라미스드로 트랜스펙션된 T18 세포의 FACS 흔적을 나타내며, 이것은 48시간 동안 100ng/mL 노코다졸로 트랜스펙션한 24시간 후에 세포 사이클의 G2 단계에서 정지되었다. 배지를 교체하고 세포를 48시간 더 회복시킨 다음, FACS 분석하여 유전자 교정을 측정했다. 상세한 내용은 실시예 11을 참조한다.
도 31은 2개 ZFP 뉴클레아제를 암호화하는 플라스미드와 도너 서열을 암호화하는 플라스미드로 트랜스펙션된 T18 세포의 FACS 흔석을 나타내며, 이것은 48시간 동안 0.2μM 빈블라스틴으로 트랜스펙션한 24시간 후에 세포 사이클의 G2 단계에서 정지되었다. 배지를 교체하고 세포를 48시간 더 회복시킨 다음, FACS 분석하여 유전자 교정을 측정했다. 상세한 내용은 실시예 11을 참조한다.
도 32는 pCR(R)4-TOPO에 삽입된 1,527 뉴클레오티드 eGFP 삽입체의 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO:21)을 나타낸다. 이 서열은 개시 코돈이 결핍된 비-변형 강화 녹색 형광 단백질을 암호화한다. 상세한 내용은 실시예 13을 참조한다.
도 33은 내인성 인간 IL-2Rγ 유전자의 편집 빈도를 측정하는데 사용된 분석의 구성도를 나타낸다. 상세한 내용은 실시예 14를 참조한다.
도 34는 표적화 절단 및 상동성 재조합에 의한 내인성 세포 유전자의 편집 빈도를 측정하기 위한 분석에서 사용된 아크릴아미드 겔의 오토라디오그램을 나타낸다. "GFP"라고 표시된 레인은 eGFP-암호화 벡터로 세포를 트랜스펙션한 대조군의 분석결과를 나타내고; "ZFP만"이라고 표시된 레인은 2개의 ZFP/뉴클레아제-암호화 플라스미드(각 50ng)으로 트랜스펙션했지만 도너 서열로는 세포를 트랜스펙션하지 않은 또 다른 대조군 실험의 결과를 나타낸다. "도너만"이라고 표시된 레인은 세포를 도너 플라스미드 1㎍으로 트랜스펙션하고 ZFP/뉴클레아제-암호화 플라스미드로는 트랜스펙션하지 않은 대조군 실험의 결과를 나타낸다. 실험 레인에서, 50Z는 각 ZFP/뉴클레아제 발현 플라스미드 50ng으로 트랜스펙션한 세포를 말하고, 100Z는 각 ZFP/뉴클레아제 발현 플라스미드 100ng으로 트랜스펙션한 세포를 말하고, 0.5D는 도너 플라스미드 0.5㎍으로 트랜스펙션한 세포를 말하고, 1D는 도너 플라스미드 1.0㎍로 트랜스펙션한 세포를 말한다. "+"는 0.2μM 빈블라스틴에 노출된 세포를, "-"는 빈블라스틴에 노출되지 않은 세포를 말하며; "wt"는 야생형 염색체 IL-2Rγ 유전자를 함유하는 염색체로부터 얻어진 증폭 산물의 BsrBI 분해 후 얻어진 단편을 말하고, "rflp"는 상동성 재조합에 의해 통합된 도너 플라스미드로부터의 서열을 함유하는 염색체로부터 얻어진 증폭 산물의 BsrBI 분해 후 얻어진 2개의 단편(대략 동일한 분자량을 가진다)을 말한다.
도 35는 K562 세포에 있는 인간 IL-2Rγ 유전자좌에서의 표적화 재조합을 측정하기 위한 분석에서 사용된 겔의 4시간 노출에 대한 오토라디오그래프 이미지를 나타내며; "wt"는 천연 K562 IL-2Rγ 서열을 함유하는 염색체 DNA에 특징적인 밴드를 표시하고, "rflp"는 도너 DNA 분자에 존재하는 변경된 IL-2Rγ 서열을 함유하는 염색체 DNA에 특징적인 더블렛을 표시한다. 레인 위의 기호 "+"는 0.2μM 빈블라스틴으로 처리된 세포를 표시하고; 기호 "-"는 빈블라스틴으로 처리되지 않은 세포를 표시한다. "ZFP + 도너" 레인에 있는 숫자는 도너 DNA 분자에 원래 존재하는 서열을 함유하는 총 염색체 DNA의 퍼센트를 표시하는 것으로, 이것은 제조자 매뉴얼 제8장(Molecular Dynamics ImageQuant 사용자 가이드; 파트 218-415)에 설명된 대로 Molecular Dynamics' ImageQuant v. 5.1 소프트웨어의 "피크 탐색, 자동 베이스라인" 기능을 사용하여 계산된 것이다. "Untr"은 트랜스펙션되지 않은 세포를 표시한다. 추가의 상세한 내용은 실시예 15를 참조한다.
도 36는 K562 세포에 있는 인간 IL-2Rγ 유전자좌에서의 표적화 재조합을 측정하기 위한 분석에서 사용된 겔의 4시간 노출에 대한 오토라디오그래프 이미지를 나타내며; "wt"는 천연 K562 IL-2Rγ 서열을 함유하는 염색체 DNA에 특징적인 밴드를 표시하고, "rflp"는 도너 DNA 분자에 존재하는 변경된 IL-2Rγ 서열을 함유하는 염색체 DNA에 특징적인 밴드를 표시한다. 레인 위의 기호 "+"는 0.2μM 빈블라스틴으로 처리된 세포를 표시하고; 기호 "-"는 빈블라스틴으로 처리되지 않은 세포를 표시한다. "ZFP + 도너" 레인 아래의 숫자는 도너 DNA 분자에 원래 존재하는 서열을 함유하는 총 염색체 DNA의 퍼센트를 표시하는 것으로, 이것은 실시예 35에 설명된 대로 계산된 것이다. 추가의 상세한 내용은 실시예 15를 참조한다.
도 37은 인간 IL-2Rγ 유전자에 특이적인 단편으로 프로브된 DNA 블롯의 4시간 노출에 대한 오토라디오그램을 나타낸다. 이 이미지의 우측 화살표는 DNA의 서열이 상동성 재조합에 의해 변경된 게놈 DNA에 상응하는 밴드의 위치를 표시한다. 레인 위의 기호 "+"는 0.2μM 빈블라스틴으로 처리된 세포를 표시하고; 기호 "-"는 빈블라스틴으로 처리되지 않은 세포를 표시한다. "ZFP + 도너" 레인 아래의 숫자는 도너 DNA 분자에 원래 존재하는 서열을 함유하는 총 염색체 DNA의 퍼센트를 표시하는 것으로, 이것은 실시예 35에 설명된 대로 계산된 것이다. 추가의 상세한 내용은 실시예 15를 참조한다.
도 38은 CD34+ 인간 골수세포에 있는 인간 IL-2Rγ 유전자좌에서의 표적화 재조합을 측정하기 위한 분석에서 사용된 겔의 오토라디오그래프 이미지를 나타낸다. 좌측 패널은 기준물질을 나타내며, 여기서는 정해진 퍼센트의 정상 인간 게놈 DNA(MaeII 부위를 함유함)를 Jurkat 세포로부터의 게놈 DNA(MaeII 부위가 결핍됨)에 부가하고, 이 혼합물을 PCR에 의해 증폭시켜 방사선 표지된 증폭 산물을 생성한 다음, 증폭 산물을 MaeII로 분해하였다. "wt"는 분해되지 않은 DNA를 나타내는 밴드를 표시하고, "rflp"는 MaeII 분해로 인해 생긴 밴드를 표시한다.
우측 패널은 BsrBI 부위를 함유하는 도너 DNA와 징크핑거-FokI 융합 엔도뉴클레아제를 암호화하는 플라스미드로 CD34+ 세포를 트랜스펙션한 실험의 결과를 나타낸다. 다음에, 관련된 게놈 영역을 표지하여 증폭시키고, 표지된 증폭 산물을 BsrBI로 분해하였다. "GFP"는 GFP-암호화 플라스미드로 트랜스펙션된 대조군 세포를 표시하고; "도너만"은 도너 DNA로만 트랜스펙션된 대조군 세포를 표시하고; "ZFP + 도너"는 도너 DNA와 징크핑거/FokI 뉴클레아제를 암호화하는 플라스미드로 트랜스펙션된 세포를 표시한다. "wt"는 천연 IL-2Rγ 서열을 함유하는 염색체 DNA에 특징적인 밴드를 표시하고; "rflp"는 도너 DNA 분자에 존재하는 변경된 IL-2Rγ 서열을 함유하는 염색체 DNA에 특징적인 밴드를 표시한다. 맨 우측 레인은 DNA 크기 마커를 함유한다. 추가의 상세한 내용은 실시예 16을 참조한다.
도 39는 Ku70-표적화된 siRNA로 트랜스펙션된 세포에서의 Ku70 단백질 수준을 시험하기 위해 사용된 면역블롯의 이미지를 나타낸다. T7 셀라인(실시예 9, 도 27)이 2개의 상이한 siRNA 풀(실시예 18 참조)로부터의 각 siRNA의 2개 농축물로 트랜스펙션되었다. 1번 레인: siRNA 풀 D 70ng; 2번 레인: siRNA 풀 D의 140ng; 3번 레인: siRNA 풀 E 70ng; 4번 레인: siRNA 풀 E 140ng. "Ku70"은 Ku70 단백질을 나타내는 밴드를 표시하고; "TFIIB"는 대조군으로서 사용된 TFIIB 전사인자를 나타내는 밴드를 표시한다.
도 40은 인간 β-글로빈 유전자에 표적화된 4개의 징크핑거 도메인의 아미노산 사열을 나타낸다: sca-29b(SEQ ID NO:22); sca-36a(SEQ ID NO:23); sca-36b(SEQ ID NO:24) 및 sca-36c(SEQ ID NO:25). sca-29b 도메인의 표적 부위는 한 DNA 가닥에 있고, sca-36a, sca-36b 및 sca-36c의 표적 부위는 반대편 가닥에 있다. 실시예 20을 참조한다.
도 41은 시험관내 분석 결과를 나타내며, 여기서는 상이한 조합의 징크핑거/FokI 융합 뉴클레아제들(ZFNs)을 서열-특이적 DNA 절단에 대해 시험하였다. "U"라고 표시된 레인은 DNA 주형 샘플을 나타낸다. 그 다음 4개 레인은 DNA 주형을 4개의 β-글로빈-표적화 ZFN(이들 ZFN의 특성화는 실시예 20을 참조한다) 각각과 함께 인큐베이션한 결과를 나타낸다. 맨 우측의 3개 레인은 sca-29b ZFN 및 sca-36a, sca-36b 또는 sca-36c ZFN(이것들은 모두 sca-29b가 표적화된 것의 반대편 가닥에 표적화된다) 중 하나와 함께 주형 DNA를 인큐베이션한 결과를 나타낸다.
도 42는 T18 세포 중 eGFP mRNA의 수준(막대)을 독시시클린 농도(횡축에 제공됨)의 함수로서 나타낸다. 각 막대 위의 숫자는 도너 DNA 및 eGFP-표적화 징크핑거 뉴클레아제를 암호화하는 플라스미드로 트랜스펙션된 세포에서 eGFP 돌연변이의 교정 퍼센트를 나타내며, 이것은 독시시클린 농도의 함수이다.
도 43 A-C는 상이한 융합 단백질 구조들의 구성도이다. 도 43A는 5' 단부가 서로 인접해 있는 마주한 가닥들 상의 DNA 표적 부위에 결합된, 징크핑거 도메인이 N-말단 근처에 있고 FokI 절단 하프-도메인이 C-말단 근처에 있는 2개의 융합 단백질을 나타낸다. 도 43B는 3' 단부가 서로 인접해 있는 마주한 가닥들 상의 DNA 표적 부위에 결합된, FokI 절단 하프-도메인이 N-말단 근처에 있고 징크핑거 도메인이 C-말단 근처에 있는 2개의 융합 단백질을 나타낸다. 도 43C는 동일한 가닥 상의 DNA 표적 부위에 결합된, FokI 절단 하프-도메인이 N-말단 근처에 있고 징크핑거 도메인이 C-말단 근처에 있는 제 1 단백질과 징크핑거 도메인이 N-말단 근처에에 있고 FokI 절단 하프-도메인이 C-말단 근처에 있는 제 2 단백질을 나타내며, 여기서 제 1 단백질의 표적 부위는 제 2 단백질 표적 부위 상류(즉, 5' 쪽)에 있다.
모든 예에서 3-핑거 단백질은 9-뉴클레오티드 표적 부위에 결합하는 것으로 나타난다. DNA 가닥의 5' 및 3' 극성이 나타나며, 융합 단백질의 N-말단이 확인된다.
도 44는 징크핑거 엔도뉴클레아제에 의한 모델 기질의 절단을 분석한 아크릴아미드 겔의 오토라디오그램이다. 1번 레인은 미절단 기질의 이동을 나타낸다. 2번 레인은 IL2-1R 징크핑거/FokI 융합 단백질과 함께 인큐베이션한 후의 기질을 나타낸다. 3번 레인은 the5-9DR 징크핑거/FokI 융합 단백질과 함께 인큐베이션한 후의 기질을 나타낸다. 4번 레인은 두 단백질과 함께 인큐베이션한 후의 기질을 나타낸다. 기질 및 그것의 절단 산물의 대략적 크기(염기쌍)를 이미지 우측에 표시한다. 이미지 아래에는 5-9D 및 IL2-1 징크핑거 결합 도메인의 결합 부위를 함유하는 기질 부분의 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO:211)이 표시된다. 결합 부위가 확인되고 밑줄로 표시된다.
도 45는 징크핑거 엔도뉴클레아제에 의한 모델 기질의 절단을 분석한 아크릴아미드 겔의 오토라디오그램이다. 1번 레인은 미절단 기질의 이동을 나타낸다. 2번 레인은 IL2-1C 징크핑거/FokI 융합 단백질과 함께 인큐베이션한 후의 기질을 나타낸다. 3번 레인은 IL2-1R 징크핑거/FokI 융합 단백질과 함께 인큐베이션한 후의 기질을 나타낸다. 4번 레인은 the5-9DR 징크핑거/FokI 융합 단백질과 함께 인큐베이션한 후의 기질을 나타낸다. 5번 레인은 IL2-1R 및 5-9DR 융합 단백질 두 가지와 함께 인큐베이션한 후의 기질을 나타낸다. 6번 레인은 IL2-1C 및 5-9DR 단백질 두 가지와 함께 인큐베이션한 후의 기질을 나타낸다. 기질 및 그것의 절단 산물의 대략적 크기(염기쌍)을 이미지 우측에 표시한다. 이미지 아래에는 5-9D 및 IL2-1 징크핑거 결합 도메인의 결합 부위를 함유하는 기질 부분의 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO:212)이 표시된다. 결합 부위가 확인되고 밑줄로 표시된다.
도 46은 IL-2Rγ 유전자의 엑손 5로부터의 서열의 삽입을 함유하는 돌연변이 eGFP 코딩 서열을 함유하는 플라스미드의 구성도이다. 상세한 내용은 실시예 29를 참조한다.
도 47은 트랜스펙션된 K562 세포로부터의 DNA의 증폭 산물을 제한 효소 StuI와 함께 인큐베이션한 겔의 오토라디오그래프 이미지를 나타낸다. 레인 위의 제목들은 GFP-암호화 플라스미드로 트랜스펙션된 세포로부터의 DNA(GFP); 5-8G 및 5-9D ZFP/FokI 융합 단백질을 암호화하는 벡터로 트랜스펙션된 세포로부터의 DNA(ZFN); IL-2Rγ 유전자의 엑손 5에 상동성인 서열의 750 뉴클레오티드 쌍이 어느 한쪽 측면에 있는 12-뉴클레오티드 쌍 외래 서열(StuI 제한부위 포함)을 함유하는 플라스미드(2개의 엑손 5-상동성 서열이 야생형 IL-2Rγ 유전자에서 서로 인접해 있다)로 트랜스펙션된 세포로부터의 DNA(도너); 및 5-8G 및 5-9D ZFP/FokI 융합 단백질을 암호화하는 벡터 및 IL-2Rγ 유전자의 엑손 5에 상동성인 서열의 750 뉴클레오티드 쌍이 어느 한쪽 측면에 있고 IL-2Rγ 유전자 영역에 인접해 있는 12-뉴클레오티드 쌍 외래 서열(StuI 제한부위 포함)을 함유하는 플라스미드(2개의 엑손 5-상동성 서열이 야생형 IL-2Rγ 유전자에서 서로 인접해 있다)로 트랜스펙션된 세포로부터의 DNA(ZFN + 도너)를 나타낸다. 야생형 IL-2R 서열을 함유하는 염색체로부터 발생한 밴드("WT")와 외래 서열이 통합된 염색체로부터 발생한 밴드("+patch")가 표시된다. 맨 우측 레인은 분자량 마커를 함유한다. 실시예 33을 참조한다.
도 48은 트랜스펙션된 K562 세포로부터의 증폭 DNA를 분석한 겔의 이미지를 나타낸다. 레인 위의 제목은 5-8G 및 5-9D ZFP/FokI 융합 단백질을 암호화하는 벡터로 트랜스펙션된 세포로부터의 DNA(ZFN); eGFP을 암호화하는 720 뉴클레오티드 쌍 오픈 리딩 프레임을 함유하는 플라스미드로 트랜스펙션된 세포로부터의 DNA(도너 1); eGFP 오픈 리딩 프레임과 하류 폴리아데닐화 신호가 포함된 924 뉴클레오티드 쌍 서열을 함유하는 플라스미드로 트랜스펙션된 세포로부터의 DNA(도너 2); 5-8G 및 5-9D ZFP/FokI 융합 단백질을 암호화하는 벡터 및 eGFP를 암호화하는 720 뉴클레오티드 쌍 오픈 리딩 프레임을 함유하는 플라스미드로 트랜스펙션된 세포로부터의 DNA(ZFN + 도너 1); 및 5-8G 및 5-9D 융합 단백질을 암호화하는 벡터 및 eGFP 오픈 리딩 프레임과 하류 폴리아데닐화 신호가 포함된 924 뉴클레오티드 쌍 서열을 함유하는 플라스미드로 트랜스펙션된 세포로부터의 DNA(ZFN + 도너 2)를 표시한다. 위쪽 패널의 맨 좌측 및 맨 우측 레인은 분자량 마커를 함유한다. 위쪽 패널은 에티듐 브로마이드로 염색한 겔의 사진이고; 아래쪽 패널은 표지된 증폭 산물을 분석한 별도의 실험에서의 겔에 대한 오토라디오그램을 나타낸다. 실시예 34를 참조한다.
도 49는 내인성 인간 IL-2Rγ 유전자에 "치료학적 하프-유전자"를 도입한 실험을 설명하는 구성도이다. 윗 라인은 염색체 IL-2Rγ 서열을 나타내고, 중간 라인은 도너 서열을 나타내며, 엑손은 박스로 표시되고, 인트론은 수평선으로 표시된다. 박스 안의 숫자는 IL-2Rγ 유전자의 엑손을 표시하는데, "5"는 염색체 IL-2R 유전자의 제 5 엑손을, "5u"는 제 5 엑손의 상류 부분을, "5d"는 제 5 엑손의 하류 부분을, 그리고 "5d(m)은 몇 개의 사일런트 서열 변화(즉, 암호화된 아미노산 서열을 변경시키지 않는 변화)를 함유한 제 5 엑손의 하류 부분을 나타낸다. 대각선은 도너 서열과 염색체 서열 사이의 상동성 영역을 한정한다. 아래 라인은 상동성 재조합의 예상 산물을 나타내는데, 여기서는 엑손 5d(m), 6, 7, 및 8이 염색체 유전자의 제 5 엑손 내에 삽입된다. 실시예 35를 참조한다.
도 50은 트랜스펙션된 K562 세포로부터의 DNA의 증폭 산물을 분석한 겔의 오토라디오그램을 나타낸다. 레인 위의 제목은 녹색 형광 단백질을 암호화하는 벡터로 트랜스펙션된 대조군 세포("GFP") 및 5-8G 및 5-9D ZFP/FokI 융합 단백질을 암호화하는 벡터와 엑손 5에 상동성인 서열의 750 뉴클레오티드 쌍이 어느 한쪽 측면에 있고 IL-2Rγ 유전자 영역을 둘러싸고 있는 IL-2Rγ 유전자의 엑손 5의 일부와 엑손 6, 7 및 8을 함유하는 720-뉴클레오티드 cDNA 구성체를 함유하는 플라스미드(2개의 엑손 5-상동성 서열이 야생형 IL-2Rγ 유전자에서 서로 인접해 있다)로 트랜스펙션된 실험 세포(ZFN + 도너)로부터의 DNA를 표시한다. 야생형 IL-2R 서열을 함유하는 염색체로부터 발생한 밴드("WT")와 외래 서열이 통합된 염색체로부터 발생한 밴드("+ORF")가 표시된다. 실시예 35를 참조한다.
도 51은 7.7kbp 항체 발현 구성체를 내인성 염색체 IL-2Rγ 유전자에 삽입한 실험 설계 및 결과를 나타낸다. 위쪽 도면은 내인성 염색체 IL-2Rγ 유전자의 엑손 5에 7.7킬로 염기쌍 발현 구성체(음영)를 상동성-의존성 표적화 통합시킨 결과를 나타낸 구성도이다. 화살표는 표적화 통합으로 인해 생긴 외래 서열과 내인성 서열의 접합부를 검출하는데 사용된 증폭 프라이머의 위치 및 극성을 표시한다.
아래쪽 도면은 증폭 산물을 분석한 에티듐 브로마이드로 염색한 겔의 사진이다. 좌측 패널은 상류 접합부를 검출하는 프라이머(프라이머 세트 A)를 사용하여 증폭시킨 세포 DNA 산물을 나타내고, 우측 패널은 하류 접합부를 검출하는 프라이머(프라이머 세트 B)를 사용하여 증폭시킨 세포 DNA 산물을 나타낸다. 증폭 주형으로서 사용된 DNA 샘플은 겔 아래에 표시되며 다음과 같다: 녹색 형광 단백질을 암호화하는 벡터로 트랜스펙션된 세포로부터의 DNA(GFP); 7.7kbp 발현 구성체를 함유하는 도너 DNA 분자로만 트랜스펙션된 세포로부터의 DNA(도너); 5-8G 및 5-9D ZFP/FokI 융합 단백질과 도너 DNA 분자로 트랜스펙션된 세포로부터의 DNA(ZFN + 도너). 도너 DNA의 형태(환형 또는 선형) 또한 표시된다. 실시예 36을 참조한다.
도 52는 Cel-1 분석을 이용하여 CHO DHFR 유전자로부터의 증폭 산물을 미스매치에 대해 분석한 겔의 오토라디오그램이다. 증폭 산물은 야생형 CHO 세포 DNA (W) 또는 징크핑거 뉴클레아제 처리된 CHO 세포로부터의 DNA(Mu)로부터 획득된 다음, Cel-1 뉴클레아제에 노출되거나(+) 노출되지 않았으며(-), 이것을 겔 위에 표시한다. 겔의 우측에 야생형 DHFR 서열(WT) 및 157-뉴클레오티드 삽입체를 함유하는 돌연변이 DHFR 서열(돌연변이)을 나타내는 밴드를 표시한다. 상세한 내용은 실시예 37을 참조한다.
도 53은 CHO 디히드로폴레이트 환원효소(DHFR) 유전자의 뉴클레오티드 서열 부분(윗 라인) 및 외래 서열의 표적화 상동성-독립적 통합에 의해서 생성된 돌연변이 DHFR 유전자의 뉴클레오티드 서열 부분(아래 라인)을 나타낸다. 표 28에 설명된 징크핑거 뉴클레아제의 표적 서열은 박스로 나타낸다. 야생형 서열로부터의 변화는 밑줄로 표시한다. 실시예 37을 참조한다.
도 54는 야생형 FokI 절단 하프-도메인 및 이량체화 인터페이스의 아미노산 서열에 변경을 함유하는 몇몇 돌연변이 절단 하프-도메인의 아미노산 서열을 나타낸다. 서열이 변경된 위치(아미노산 486, 490 및 538)가 밑줄로 표시된다.
발명의 상세한 설명
세포 염색질의 표적화 절단 및, 예를 들어 표적화 절단에 이은 비-상동성 단부 잇기(사이에 외래 서열을 삽입하거나 삽입하지 않고) 또는 표적화 절단에 이은 외래 폴리뉴클레오티드(세포 뉴클레오티드 서열과 상동성인 하나 이상의 영역을 포함하는)와 게놈 서열 사이의 상동성 재조합에 의한, 세포 뉴클레오티드 서열의 표적화 변경에 유용한 조성물 및 방법이 본원에 개시된다. 게놈 서열은 염색체, 에피솜, 세포소기관 게놈(예를 들어, 미토콘드리아, 엽록체), 인공 염색체, 및 예를 들어, 증폭 서열, 이중 미세 염색체 및 내인성 또는 감염된 박테리아 및 바이러스의 게놈과 같은 세포에 존재하는 어떤 다른 종류의 핵산에 존재하는 것들을 포함한다. 게놈 서열은 정상 서열(즉, 야생형)일 수도 있고 돌연변이 서열일 수도 있으며, 돌연변이 서열은, 예를 들어 삽입, 결실, 전위, 재배열, 및/또는 점 돌연변이를 포함할 수 있다. 게놈 서열은 또한 여러 상이한 대립유전자들 중 하나를 포함할 수 있다.
표적화 절단 및 재조합에 유용한 조성물은 절단 도메인(또는 절단 하프-도메인)과 징크핑거 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질, 이 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드와 폴리펩티드-암호화 폴리뉴클레오티드의 조합을 포함한다. 징크핑거 결합 도메인은 1개 이상의 징크핑거(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개 또는 그 이상의 징크핑거)를 포함할 수 있으며, 어떤 게놈 서열에 결합하도록 조작될 수 있다. 따라서, 절단이나 재조합을 원하는 해당 표적 게놈 영역을 확인함으로써, 본원에 개시된 방법에 따라서, 절단 도메인(또는 절단 하프-도메인)과 상기 게놈 영역 안의 표적 서열을 인식하도록 조작된 징크핑거 도메인을 포함하는 하나 이상의 융합 단백질을 구성할 수 있다. 세포 내에 이러한 융합 단백질(또는 단백질)의 존재는 융합 단백질(들)과 그것(그들)의 결합 부위(들)의 결합과 상기 게놈 영역 안이나 근처에서 절단을 가져올 것이다. 더욱이, 게놈 영역에 상동성인 외래 폴리뉴클레오티드가 또한 이러한 세포에 존재할 경우, 게놈 영역과 외래 폴리뉴클레오티드 사이에 높은 비율로 상동성 재조합이 일어난다.
일반적인 내용
본 발명에서 조성물의 제조 및 사용과 더불어 본 방법의 실현은, 달리 지적한 바 없다면, 분자생물학, 생화학, 염색질 구조 및 분석학, 컴퓨터 방식 화학, 세포 배양학, DNA 재조합 및 일반 기술에 속하는 관련 분야 등의 전형적인 기술을 사용한다. 이러한 기술들은 논문의 형식으로 충분히 설명되어 있다. 참고문헌의 예로는, Sambrook et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 and Third edition, 2001; Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, 1987 and periodic updates; the series METHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, San Diego; Wolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, Third edition, Academic Press, San Diego, 1998; METHODS IN ENZYMOLOGY, Vol. 304, "Chromatin" (P. M. Wassarman and A.P. Wolffe, eds.), Academic Press, San Diego, 1999; 및 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol.119, "Chromatin Protocols"(P.B. Becker, ed.) Humana Press, Totowa, 1999 등이 있다.
정의
"핵산", "폴리뉴클레오티드," 및 "올리고뉴클레오티드" 등의 용어는 상호 교환적으로 사용되는데, 선형 또는 원형 배치와 단일-가닥 또는 이중-가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오티드나 리보뉴클레오티드 폴리머를 일컫는다. 본 발명의 목적상, 이러한 용어들은 폴리머의 길이에 따른 제한적인 의미로 파악되어 지지는 않을 것이다. 그 용어들은 염기, 당류 및/또는 포스페이트 부분(예를 들어, 티오인산에스테르 백본)에서 변형된 뉴클레오티드는 물론 잘 알려진 천연 뉴클레오티드의 유사체을 포함할 수 있다. 일반적으로 특정 뉴클레오티드의 유사체는 같은 염기쌍 특이성을 갖는다; 예를 들어, A의 유사체는 T와 염기쌍을 이루게 될 것이다.
"폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질" 등의 용어는 상호 교환적으로 사용되는데, 아미노산 잔기 폴리머를 일컫는다. 또한, 그 용어는 하나 또는 수개의 아미노산이 자연적으로 생기는 해당 아미노산의 유사체이거나 변형된 유도체로 이루어진 아미노산 중합체에도 적용된다.
"결합"이란 서열 특이성, 또는 단백질과 핵산 사이 등과 같은 고분자 간 비-공유 상호작용을 말한다. 상호작용이 전체적으로 보아 서열 특이성을 가지는 한, 상호작용의 모든 성분들이 서열 특이성(예를 들어, DNA 백본에서 인산염 잔기와 접촉하는 것)일 필요는 없다. 이러한 상호작용은 일반적으로 해리 상수(Kd)가 10-6 M-1 이하인 것을 특징으로 한다. "친화도"란 결합력을 의미하는데, 결합 친화도의 증가는 해리 상수(Kd)의 감소와 상관관계를 갖는다.
"결합 단백질"이란 비공유적으로 다른 분자와 결합할 수 있는 단백질을 말한다. 결합 단백질은, 예를 들어 DNA 분자(DNA 결합 단백질), RNA 분자(RNA 결합 단백질) 및/또는 단백질 분자(단백질 결합 단백질)와 결합할 수 있다. 단백질-결합 단백질의 경우, 자신과의 결합도 가능하여 동형이량체 및 동형삼량체 등을 형성하기도 하고 또는 다른 단백질의 하나 또는 수개의 분자와의 결합도 가능하다. 결합 단백질은 하나 이상의 결합 활성 형태를 지닐 수 있다. 예를 들어, 징크핑거 단백질은 DNA 결합, RNA 결합 및 단백질 결합 활성을 지닌다.
"징크핑거 DNA 결합 단백질" (또는 결합 도메인)이란 하나 또는 수개의 징크핑거를 통하여 서열 특이성을 갖는 방식으로 DNA와 결합하는 단백질이나 더 큰 단백질 내부의 도메인을 말하는데, 이때 징크핑거란 아연 이온과 배위결합을 하는 동안에 구조가 안정적인 결합 도메인의 내부에 있는 아미노산 서열 부분을 말한다. 징크핑거 DNA 결합 단백질은 징크핑거 단백질 또는 ZFP로 간략히 표시되기도 한다.
징크핑거 결합 도메인은 미리 정해진 뉴클레오티드 서열에 결합하도록 "가공"될 수 있다. 징크핑거 단백질 설계를 위한 방법의 예로, 이에 한정되지 않지만, 디자인과 선택이 있다. 디자인된 징크핑거 단백질은 자연적으로 발생하는 것이 아니라 합리적인 척도에 따라 순이론적으로 디자인 또는 조성된 것이다. 디자인을 위한 합리적인 척도에는 치환법칙의 응용과 현존하는 ZFP 디자인 및 결합에 관한 데이터베이스의 정보처리를 위한 컴퓨터 알고리즘을 포함한다. 그 예로, 미국특허 제 6,140,081; 6,453,242; 및 6,534, 261호, 또는 WO 98/53058; 98/53059; 98/53060; 02/016536 : 03/016496 등을 참조한다.
"선택된" 징크핑거 단백질이란 자연상태에서 발견되는 단백질이 아니라 주로 위상 표시, 상호작용 트랩 또는 혼성 선택과 같은 실험 과정을 통해 생산된 결과물을 말한다. 그 예로는, 미국특허 제 5,789,538; 5,925,523; 6,007,988; 6,013,453; 6,200,759호; WO 95/19431; WO 96/06166; WO 98/53057; WO 98/54311; WO 00/27878; WO 01/60970; WO 01/88197 및 WO 02/099084 등을 참조한다.
"서열"이란 그 길이와 무관하게 뉴클레오티드 서열을 의미하는데, 이는 직선형, 원형 또는 가지형의 DNA 또는 RNA가 될 수도 있고, 단일 나선형이거나 이중-나선형일 수도 있다. "도너 서열"이란 게놈에 삽입된 뉴클레오티드 서열을 말한다. 도너 서열은 어떠한 길이도 가능하다. 예를 들어, 길이가 2에서 10,000 뉴클레오티드 또는 그 사이의 어떤 정수 값도 가능하고 또한 이를 넘어설 수도 있다. 일반적으로 길이가 약 100에서 1,000 뉴클레오티드 사이(그 범위의 어떠한 정수 값도 가능)가 보통이나, 더 일반적으로는 길이가 약 200에서 500 뉴클레오티드 사이의 값을 가짐이 보통이다.
"상동성이 있으나 동일하지 않은 서열"이란 두번째 서열과 어느 정도의 서열 특이성을 공유하지만 그 서열이 일치하지는 않는 첫 서열을 의미한다. 예를 들어, 변종 유전자의 자연형 서열을 구성하는 폴리뉴클레오티드는 그 변종 유전자의 서열과는 상동성을 지니고 비일치성을 갖는다. 어떤 구체예의 경우, 두 개의 서열간 상동성이, 정상 세포의 메커니즘을 이용하여 그 사이에 상동성 재조합이 가능하도록 함에 충분하다. 두 개의 상동성이 있으나 동일하지 않은 서열 서열은 어떠한 길이도 가능하고, 또 비상동성의 정도가 단일의 뉴클레오티드만큼 작을 수도 있고(예를 들어, 표적화된 상동성 재조합에 의한 게놈의 점돌연변이의 보정을 위한 경우) 또는 10 이상의 킬로베이스 만큼 클 수도 있다(예를 들어, 염색체의 미리 정해진 이소 부위에 유전자를 삽입하는 경우). 상동성, 비일치성 서열을 구성하는 두 개의 폴리뉴클레오티드는 같은 길이를 가질 필요는 없다. 예를 들어, 20에서 10,000 사이의 뉴클레오티드나 뉴클레오티드 쌍으로 이루어진 외래의 폴리뉴클레오티드(즉, 도너 폴리뉴클레오티드)도 사용될 수 있다.
핵산 및 아미노산 서열 특이성을 결정하기 위한 기술들은 이미 알려져 있다. 전형적으로 그러한 기술들은 유전자를 위한 mRNA의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 것, 그리고/또는 그에 의하여 암호화된 아미노산 서열을 결정하는 것, 그리고 이러한 서열을 두 번째 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열과 비교하는 것 등을 포함한다. 이러한 방식으로 또한 게놈 서열도 결정되고 비교될 수 있다. 일반적으로, 일치성이란 두 개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 서로 상응하는 정확한 뉴클레오티드 쌍 또는 아미노산 쌍을 각각 의미한다. 둘 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드나 아미노산 서열은 그 일치성 백분율을 측정하여 비교될 수 있다. 일치성 백분율이란, 핵산이든 아미노산이든 간에, 정렬된 두 개 서열간에 서로 정확히 일치하는 서열수를 짧은 서열의 길이로 나누고 이에 100을 곱한 값을 말한다. 핵산 서열의 근사 정렬은 Advances in Applied Mathematics 2: 482489 (1981)에서 Smith와 Waterman의 국부 상동 알고리즘에 의하여 제공되고 있다. 이 알고리즘은 Atlas of Protain Sequence and Structure, M. O. Dayhoff ed., 5 suppl. 3: 353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D. C. , USA 에서 Dayhoff에의해 개발되고, Nucl. Acids Res. 14 (6): 6745- 6763 (1986)에서 Gribskov에 의해 표준화된 측정 행렬을 이용함으로써 아미노산 서열에도 적용될 수 있다. 서열의 일치성 백분율을 결정하기 위한 이 알고리즘의 실시예가 Gentics Computer Group (Madison, WI)의 "BestFit" 유틸리티 응용 프로그램에 의해 제공되고 있다. 이 방법의 초기설정 변수는 Wisconsin Sequence Analysis Package Program Manual, Version 8 (1995)에 기술되어 있다. 본 발명에 있어서 일치성 백분율을 확립하기 위한 보다 좋은 방법으로는, 에딘버러 대학교에 저작권이 있고, John F. Collins 및 Shane S. Sturrok이 개발하고, IntelliGentics, Inc.(Mountain View, CA)에서 유통하고 있는 MPSRCH 프로그램 패키지를 사용하는 것이다. 이 패키지 모음에 의하면 측정 행렬의 초기설정 변수가 사용되는 경우에 Smith Waterman 알고리즘이 적용될 수 있다. 그러한 변수의 초기설정의 예를 들면, 공백 생성 벌점 12, 공백 연장 벌점 1, 공백 6 등과 같다. "정합"값을 산출한 데이터를 통하여 이는 곧 서열 일치성을 반영한다는 것을 알 수 있다. 일치성 백분율이나 서열간의 유사성을 계산하기 위한 다른 적절한 프로그램은 해당 기술 분야에서 일반적으로 알려져 있는데, 예를 들어, 또 다른 정렬 프로그램으로 초기설정 변수를 이용하는 BLAST가 있다. 예를 들어, BLASTN 및 BLASTP 는 하기의 초기설정 변수를 이용하여 쓰인다. 유전 암호 = 표준, 필터 = 무, 나선 = 두 개, 차단 = 60, 예측 = 10 , 매트릭스 = BLOSUM62, 서술 = 50 서열, 정렬 = HIGH SCORE, 데이터베이스 = 비과잉, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS 전사 + Swiss 단백질 + Spupdate + PIR. 이 프로그램의 상세한 부분은 인터넷상에서 찾을 수 있다. 본 발명에 기술된 서열에 관하여, 서열 일치성의 바람직한 범위는 대략 80%에서 100% 및 그 사이의 정수값이다. 전형적으로는 서열간의 일치성 백분율은 최소 70 ~ 75%, 바람직하게는 80 ~ 82%, 더 바람직하게는 85 ~ 90%, 한층 더 바람직하게는 92%, 더더욱 바람직하게는 95%, 가장 바람직하게는 98% 서열 일치성을 보인다.
또한, 상동성을 지닌 부분 사이에서 안정적인 중복체를 형성할 수 있는 조건에서 폴리뉴클레오티드 혼성체를 만든 후, 단일 나선 특이성 뉴클레아제로 분해한 후, 분해된 단편의 크기를 결정하는 방식을 통하여, 폴리뉴클레오티드 사이의 서열 유사성의 정도를 결정할 수 있다. 상기의 방법을 통하여 결정된 분자의 한정된 길이에 대한 서열 일치성이 최소 약 70%-75%를 나타내거나, 바람직한 결과로서 80% ~ 82%, 더 바람직한 결과로서 85% ~ 90%, 한층 더 바람직한 결과로서 92%, 더 더욱 바람직한 결과로서 95%, 가장 바람직한 결과로서 98%를 나타낸다면, 두 개의 핵산이나 두 개의 폴리펩티드 서열은 실질적으로 서로 상동성을 지닌다. 본 발명에서 사용되듯이, 실질적으로 상동성을 지닌다는 것은 또한 지정된 DNA 또는 폴리펩티드 서열과 완전한 일치성을 보이는 서열도 지칭한다. 실질적으로 상동성을 지닌 DNA 서열은, 예를 들어 엄격한 조건하에서 그 특별한 시스템에 한정되는, 서던 혼성화 실험으로 식별될 수 있다. 여기서 적절한 혼성화 조건의 한정은 일반 기술 분야에 속한다. 그 예로서는, Sambrook et al., supra; Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, editors B. D. Hames and S. J. Higgins, (1985) Oxford; Washington, DC; IRL Press 등을 참조한다.
두 개의 핵산 단편의 표적화된 혼성화는 다음과 같이 측정될 수 있다. 두 개의 핵산 분자 사이의 서열 일치성의 정도는 그러한 분자간의 혼성화 야기의 효율 및 강도에 영향을 미친다. 부분적으로 일치성을 갖는 핵산 서열은 최소한 표적 분자에 대하여 완전히 일치성을 갖는 서열의 혼성화를 억제할 것이다. 완전히 일치성을 갖는 서열의 혼성화 억제 정도는 해당 기술 분야에서 잘 알려진 혼성 분석을 이용하여 평가될 수 있다. (예를 들어, 서던 (DNA) 블롯, 노던 (RNA) 블롯), 용액 혼성화 등, Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, (1989) Cold Spring Harbor, N.Y. 참조). 그러한 분석은 예를 들어, 낮은 엄격도에서 높은 엄격도로 변하는 조건을 이용하는 등으로 선택도를 변화시킴으로써 수행될 수 있다. 낮은 엄격도의 조건이 적용된다면, 예를 들어, 표적 분자와 약 30%의 서열 일치성도 갖지 않는 등 부분적인 서열 일치성도 갖지 않는 두번째의 프로브를 이용하여, 비특이성 결합이 존재하지 않음이 평가될 수 있고, 따라서 비특이성 결합의 부재는 두번째 프로브가 표적과 혼성화가 이루어지지 않는 결과를 낳을 것이다.
혼성화 기반 검출 시스템을 이용하는 경우, 핵산 프로브는 표준 핵산 서열과 보완적인 것을 선택하고, 그리고 나서 적절한 조건을 선택함으로써 프로브와 표준 서열이 선택적으로 서로 혼성화 또는 결합하여 중복체를 형성하게 한다. 적당하게 엄정한 혼성화 조건하에서 표준 서열에 선택적으로 혼성화가 가능한 핵산 분자는, 선택된 핵산 프로브의 서열과 적어도 약 70%의 서열 일치성을 가지고 최소 약 10 ~ 14 뉴클레오티드 길이가 검출되는 조건하에서는, 일반적으로 혼성화가 일어난다. 엄정한 혼성화 조건에서는 일반적으로, 선택된 핵산 프로브의 서열과 약 90 ~ 95% 보다 큰 서열 일치성을 가지고 최소 약 10 ~ 14 뉴클레오티드 길이의 표적 핵산 서열의 검출이 가능하다. 프로브 및 표준 서열이 뚜렷한 정도의 서열 일치성을 가지는 등 프로브/표준 서열 혼성화에 유용한 혼성화 조건은, 해당 기술 분야에서 알려진 바와 같이 결정될 수 있다. (그 예로서는, Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, editors B. D. Hames and S. J. Higgins, (1985) Oxford; Washington, DC; IRL Press를 참조한다).
혼성화의 조건들은 해당 기술 분야에서 잘 알려져 있다. 혼성화 엄격도란 부정합된 뉴클레오티드를 포함하여 혼성물의 형성을 방해하는 혼성화 조건의 정도를 말하는데, 높은 엄격도는 부정합된 혼성물에 대한 낮은 내성과 상관관계를 갖는다. 혼성화 엄격도에 영향을 미치는 요소들은 해당 기술 분야에서 잘 알려져 있는데, 이에 한정되지는 않지만, 온도, pH, 이온 세기, 그리고 포름아미드와 디메틸설폭사이드와 같은 유기 용매의 농도 등을 포함한다. 해당 기술 분야에서 잘 알려져 있듯이, 혼성화 엄격도는 높은 온도에서, 또 낮은 이온 세기에서, 또한 낮은 용매 농도에서 각각 증가한다.
혼성화의 엄격도 조건과 관련하여, 잘 알려져 있듯이, 특수한 엄격도를 형성하기 위하여, 예를 들어, 다음의 요소(조건)들을 변경함에 의하여, 수많은 균등 조건들이 이용될 수 있다: 서열의 길이 및 특성, 다양한 서열의 염기 조성, 염 및 다른 혼성화 용액 구성물의 농도, 혼성화 용액내 차단물 존재여부 (예를 들어, 덱스트란 설페이트, 폴리에틸렌 글리콜 등), 혼성화 반응 온도 및 시간 변수, 세척 조건, 혼성화 조건의 특수한 설정의 선택은 해당 기술 분야의 표준적인 방법에 따라 선택된다 (그 예로, Sambrook, et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Second Edition, (1989) Cold Spring Harbor, N. Y.를 참조한다).
"재조합"이란 두 개의 폴리뉴클레오티드 간에 유전 정보를 교환하는 과정을 말한다. 본 발명의 목적상, "상동성 재조합 (HR)"이란 예를 들어, 세포에서 이중-나선의 말단을 회복하는 동안에 발생하는 그러한 교환의 분화된 형태를 말한다. 이 과정은 뉴클레오티드 서열 상동성이 요구되고, 표적 분자의 주형 회복을 위하여 도너 분자를 이용하는데(예를 들어, 이중-나선 말단의 과정을 거친 분자를 이용), 도너에서 표적으로 유전 정보가 전달되는 점에서 "비교차 유전자 전환" 또는 "쇼트 트렉 유전자 전환"등 다양하게 형식으로 알려져 있다.
어느 특정 이론에 구애됨이 없이, 그러한 전달은 말단된 표적과 도너 사이에서 형성되는 이형중복체 DNA의 부정합 보정을 수반하고, 또는 표적의 일부가 될 유전 정보를 재합성하기 위하여 도너를 이용하는 "합성 의존성 나선 풀림"을 수반하기도 하고, 기타 관련된 과정을 수반하기도 한다. 그러한 분화된 HR은 표적 분자의 서열을 개조시키기도 하여, 도너 폴리뉴클레오티드 서열의 일부 또는 전부가 표적 폴리뉴클레오티드와 일체화되는 결과가 되기도 한다.
"절단"이란 DNA 분자의 공유 골격의 말단을 말한다. 절단은 다양한 방법에 의하여 개시될 수 있는데, 여기에는 포스포디에스테르 결합을 효소에 의한 또는 화학적인 가수분해 등의 방법과 기타 다른 방법이 있다. 단일 나선 절단 및 이중-나선 절단 모두가 가능한데, 이중-나선 절단은 두 개의 서로 다른 단일 나선 절단이 이루어짐으로써 발생될 수 있다. DNA 절단은 그 결과로 동일지점에서 절단 말단이나 엇갈리게 끊긴 엇갈림 말단의 생성물이 나올 수 있다. 어떤 구체예에서는, 표적이 된 이중-나선 DNA 절단을 위하여 융합 폴리펩티드가 이용된다.
"절단 도메인"은 DNA 절단에 대한 촉매 활성을 가지는 하나 또는 수개의 폴리펩티드 서열로 구성된다. 절단 도메인은 하나의 폴리펩티드 사슬에 포함될 수 있고, 또는 두 개 내지 수개의 폴리펩티드의 결합으로부터 절단이 발생할 수도 있다.
"절단 하프-도메인"은 제2의 폴리펩티드(일치하든 불일치하든 간에)와 함께 결합하여 절단 활성(이중-나선 절단 활성)을 지닌 복합체를 형성하는 폴리펩티드 서열을 말한다.
"염색질"은 세포의 게놈을 구성하는 핵단백질 구조를 말한다. 세포의 염색질은 핵산, DNA(주성분), 히스톤 및 비히스톤계 염색체 단백질을 포함한 단백질로 구성된다. 대부분의 진핵 세포 염색질은 뉴클레오솜의 형태로 존재하는데, 뉴클레오솜 코어는, 히스톤 H2A, H2B, H3, H4의 각각 두 개로 구성된 8량체와 결합된 DNA의 대략 150 염기쌍으로 구성되어 있다. 그리고 유기체에 따라서 길이가 다양한 링커 DNA는 그 길이가 뉴클레오솜 코어 사이에 달한다. 히스톤 H1 분자는 일반적으로 링커 DNA와 결합하여 있다. 본 발명의 목적상, 용어 "염색질"은 모든 형태의 세포 핵단백질, 원핵 및 진핵 모두를 포함하는 의미로 쓰인다. 세포의 염색질은 염색체 및 에피솜의 염색질을 포함한다.
"염색체"는 세포의 게놈의 전부 또는 부분을 구성하는 염색질 복합체를 말한다. 세포의 게놈은 그를 구성하는 염색체 전부의 집합인 핵형에 의하여 종종 특징지워 진다. 세포의 게놈은 하나 또는 수개의 염색체로 구성될 수 있다.
"에피솜"은 복제성 핵산, 핵단백질 복합체 또는 세포의 염색체 핵형의 일부가 아닌 핵산으로 구성된 다른 구조체를 말한다. 에피솜의 예로 플라스미드 및 바이러스성 게놈이 있다.
"접근 영역"이란 핵산의 표적 부위가 그 부위를 인식하는 외래 분자와 결합 가능한 세포의 염색질에 있는 영역을 말한다. 어느 특정 이론에 구애됨이 없이, 접근 영역은 뉴클레오솜 구조가 아닌 것으로 여겨진다. 접근 영역의 독특한 구조는 뉴클레아제 등과 같은 화학적 및 효소적 프로브에 대한 감도에 의하여 종종 탐지될 수 있다.
"표적 부위" 또는 "표적 서열"은 결합이 존재하기에 충분한 조건이 주어진다면 결합 분자가 결합할 수 있는 한정된 부분의 핵산 서열을 말한다. 예를 들어, 서열 5'-GAATTC-3'은 Eco RI 제한 엔도뉴클레아제의 표적 부위가 된다.
"외래" 분자란 세포에 존재하지 않는 것이 보통이지만, 하나 또는 수개의 유전적, 생화학적 기타 다른 방법에 의하여 세포에 삽입될 수 있는 분자를 말한다. "세포에 보통 존재한다는 것"은 세포의 특수한 발생 국면 및 환경 조건과 관련하여 결정된다. 따라서, 예를 들어, 근육의 배아기 성장 동안에만 존재하는 분자는 성인의 근육 세포에 대하여 외래 분자가 된다. 동일하게, 열 충격에 의하여 유도된 분자는 그렇지 않은 세포에 대하여 외래 분자가 된다. 외래 분자는, 예를 들어, 기능부전성 내인성 분자의 기능성 형태 또는 정상기능성 내인성 분자의 기능부전성 형태로 구성된다.
외래 분자는, 무엇보다도, 조합 화학 과정에 의하여 생성되는 것처럼 작은 분자가 될 수 있고, 단백질, 핵산, 탄수화물, 지질, 당단백질, 지단백질, 다당류, 기타 이러한 분자들의 변형된 유도체와 같이 고분자가 될 수도 있으며, 또는 그러한 분자들로 구성되는 복합체가 될 수도 있다. 핵산은 DNA 및 RNA를 포함하고, 단일 또는 이중-나선이 될 수 있으며, 직선형, 가지형, 원형도 가능하며, 어떠한 길이도 가능하다. 핵산은 3중체의 핵산은 물론 이중체를 형성할 수 있는 그러한 것을 포함한다. 그 예로 미국특허 제 5,176, 996 및 5,422, 251 호를 참조한다. 단백질은, 이에 한정되지는 않지만, DNA 결합 단백질, 전사 인자, 염색질 리모델링 인자, 메틸화 DNA 결합 단백질, 폴리머라제, 메틸라제, 디메틸라제, 아세틸라제, 디아세틸라제, 키나제, 포스파타제, 인테그라제, 리콤비나제, 리가제, 토포이소머라제, 자이라제 및 헬리카제를 포함한다.
외래 분자는, 예를 들어, 외래 단백질이나 핵산처럼 내인성 분자와 같은 형태가 될 수 있다. 예를 들면, 외래 핵산은 전염성의 바이러스성 게놈, 세포 속으로 주입된 플라스미드 또는 에피솜, 세포에 보통 존재하지 않는 염색체 등으로 구성될 수 있다. 외래 분자를 세포 속으로 주입하는 방법은 해당 기술 분야에서 알려져 있는데, 여기에는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 지질 매개 전사 기법(예를 들어, 중성 및 양 이온성 지질을 포함한 리포솜), 전기 영동법, 직접 주입법, 세포 융합법, 입자 충격법, 칼슘 인산 공침전법, DEAE-덱스트란 매개 전사법, 바이러스 벡터 매개 전사법이 포함된다.
이에 비하여, "내인성" 분자란 특정한 환경적 조건 아래에서 특정한 성장 단계에서 특정한 세포에 보통 존재하는 것을 말한다. 예를 들면, 내인성인 핵산은 염색체, 미토콘드리아의 게놈, 엽록체 또는 다른 세포기관, 또는 자연적으로 생기는 에피솜 핵산으로 구성될 수 있다. 이에 추가한다면 내인성인 분자는 전사 인자 및 효소 등과 같은 단백질을 포함할 수도 있다.
"융합 분자"란 두 개 또는 그 이상의 서브유닛 분자들이 연계되어 있는, 일반적으로 공유결합되어 있는 분자를 말한다. 서브유닛 분자들은 같은 화학 타입이거나, 다른 화학 타입일 수 있다. 전자의 예로는, 이에 한정된 것은 아니지만, 융합 단백질(예를 들어, ZFP DNA 결합 도메인과 절단 도메인 사이의 융합)과 융합 핵산(예를 들어, 상기 기술한 융합 단백질을 암호화하는 핵산이 포함된다. 후자의 예로는, 역시 이에 한정되지는 않지만, 3량체 형성 핵산과 폴리펩티드 사이의 융합, 그리고 마이너 그루브 바인더와 핵산 사이의 융합을 포함한다.
세포에서의 융합 단백질의 발현은 세포에 융합 단백질이 전달됨으로써 가능하고, 또는 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 세포로의 전달을 통해서 가능한데, 여기서는 폴리뉴클레오티드가 전사되고, 전사된 유전 정보가 번역되어, 융합 단백질이 형성되기에 이른다. 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드를 세포로 전달하는 방법은 본 발명의 다른 부분에 기술되어 있다.
"유전자"는, 본 발명의 목적상, 조절 서열이 코딩 서열 및/또는 전사 서열과 인접해 있든 그렇지 않든 간에, 유전자 산물을 조절하는 모든 DNA 영역은 물론 유전자 산물을 암호화하는 DNA 영역을 포함한다. 따라서, 유전자는, 이에 한정되지는 않지만, 프로모터 서열, 터미네이터, 리보솜 결합 부위와 내부 리보솜 점입 부위와 같은 번역 조절 서열, 인핸서, 사일런서, 인슐레이터, 경계 요소, 복제 기원, 매트릭스 부착 부위 및 유전자좌 제어 영역을 포함한다.
"유전자 발현"이란 유전자에 담겨진 정보를 유전자 산물로 전환하는 것을 말한다. 유전자 산물은 유전자(예를 들어, mRNA, tRNA, rRNA, 안티센스 RNA, 리보자임, 구조 RNA 또는 다른 형태의 RNA)의 직접 전사물이거나 mRNA의 전사에 의해 생산된 단백질이 될 수 있다. 유전자 산물은 또한 캡핑, 폴리아데닐화, 메틸화, 편집 등의 과정에 의하여 변형된 RNA와, 메틸화, 아세틸화, 인산화, 유비퀴틴화, ADP-리보스화, 미리스틸화, 글리코실화 등의 방법에 의하여 변형된 단백질을 포함한다.
유전자 발현의 "조절"이란 유전자의 활성의 변화를 말한다. 발현 조절은, 이에 한정되지는 않지만, 유전자 활성화와 유전자 억제를 포함한다.
"진핵" 세포는, 이에 한정되지는 않지만, 진균 세포(효모), 식물 세포, 동물 세포, 포유류 세포, 인간 세포를 포함한다.
"관심 영역"이란, 외래 분자와 결합될 유전자 또는 그 내부나 그에 인접한 비-코딩 서열 등과 같은 세포 염색질의 어느 영역을 말한다. 결합은 표적화된 DNA 절단 및/또는 표적화된 재조합을 위한 목적을 가질 수 있다. 관심 영역은, 예를 들어, 염색체, 에피솜, 세포기관의 게놈(미토콘드리아, 엽록체 등), 또는 감염성의 바이러스성 게놈일 수 있다. 관심 영역은 유전자의 암호 영역 내부이거나, 예를 들어, 리더 서열, 트레일러 서열 또는 인트론 등과 같은 전사된 비-코딩 영역 내부이거나, 또는 비-전사 영역의 내부일 수 있다. 관심 영역은 길이가 하나의 뉴클레오티드 쌍만큼 작을 수도 있고, 또 2,000 뉴클레오티드 쌍까지도 가능하고, 또한 뉴클레오티드 쌍의 가능한 정수 값이 될 수도 있다.
"작동 연결" 및 "작동 연결된"이란 병렬로 놓인 두 개 또는 수개의 성분(서열 구성 요소)와 관련하여 상호 교환적으로 사용되는데, 여기서는 두 성분이 정상적으로 기능하여 최소한 하나의 성분이 적어도 하나의 다른 성분에 가한 기능을 매개하는 것이 가능한 정도로 성분들이 정렬되어야 한다. 예를 들어 설명하자면, 프로모터와 같은 전사 조절 서열의 경우, 하나 또는 수개의 전사 조절 인자의 존부에 감응을 하면서 전사 조절 서열이 코딩 서열의 전사 수준을 제어한다면, 전사 조절 서열은 코딩 서열과 작동 연결되어 있다. 전사 조절 서열은 일반적으로 코딩 서열과 시스(cis) 형태로 작동 연결되어 있지만, 그것과 직접적으로 인접해 있을 필요는 없다. 예를 들면, 심지어 서열들이 접촉하지 않고 있더라도, 코딩 서열과 작동 연결된 전사 조절 서열이 인핸서가 된다.
융합 폴리펩티드와 관련하여, "작동 연결된"이라는 용어는 각 성분이 다른 성분에 연결된 상태에서 연결되지 않은 상태에서의 기능과 똑같은 기능을 하는 것을 의미한다. 예를 들어, ZFP DNA 결합 도메인이 절단 도메인에 융합된 융합 폴리펩티드인 경우, 절단 도메인이 표적 부위의 근처에서 DNA를 절단할 수 있으면서, ZFP DNA 결합 도메인 부분이 그 표적 부위 및/또는 그 결합 부위와 결합할 수 있다면, ZFP DNA 결합 도메인과 절단 도메인은 작동 연결되어 있다.
단백질, 폴리펩티드 또는 핵산의 "기능성 단편"이란 그 서열이 전체 구간에서는 일치하지 않지만 전체 구간의 단백질, 폴리펩티드, 핵산과 같은 기능을 가지는 단백질, 폴리펩티드 또는 핵산을 말한다. 기능성 단편은 해당되는 고유의 분자보다 더 많은, 더 적은, 또는 같은 수의 잔기를 가질 수 있고, 하나 또는 수개의 아미노산이나 뉴클레오티드 치환기를 가질 수 있다. 핵산의 기능(코딩 기능, 다른 핵산과의 혼성화 능력)을 측정하는 방법은 해당 기술 분야에서 잘 알려져 있다. 이와 동일하게, 단백질의 기능을 측정하는 방법도 잘 알려져 있다. 예를 들면, 폴리펩티드의 DNA 결합 기능은 여과 결합법, 전기영동 이동도 이전법, 면역침강법에 의하여 측정될 수 있다. DNA 절단은 겔 전기영동법에 의하여 측정될 수 있다.
참고문헌 Ausubel et al., supra. 참조한다. 단백질의 다른 단백질과의 상호작용 능력은, 예를 들어, 유전학적 및 생화학적 공면역침강법, 이혼성법 또는 상보성법에 의해 측정될 수 있다. 그 예로, Fields et al. (1989) Nature 340: 245-246; 미국특허 제 5,585, 245 호 및 PCT WO 98/44350.를 참조한다.
표적 부위
본 발명의 방법 및 조성물에는 절단 도메인(또는 절단 하프-도메인)과 징크핑거 도메인으로 구성된 융합 단백질을 포함하는데, 여기서 징크핑거 도메인은 표적 부위나 결합 부위와 같은 세포 염색질의 서열에 결합함으로써 절단 도메인(또는 절단 하프-도메인)의 활동을 서열 부근으로 향하게 하고, 표적 서열의 부근에 절단을 유도한다. 본 발명의 다른 부분에서 밝혔듯이, 징크핑거 도메인은 사실상 어떠한 원하는 서열과도 결합할 수 있도록 설계될 수 있다. 따라서, 절단이나 재조합이 일어날 서열을 포함하는 관심 영역을 식별한 후, 하나 또는 수개의 징크핑거 결합 도메인은 관심 영역에 있는 하나 또는 수개의 서열에 결합하도록 설계될 수 있다. 징크핑거 결합 도메인과 절단 도메인으로 구성된 융합 단백질(또는 각각 징크핑거 결합 도메인과 절단 하프-도메인으로 구성된 두 개의 융합 단백질)의 발현은, 세포에서 관심 영역의 절단을 초래한다.
징크핑거 도메인(예를 들어, 표적 부위)의 결합을 위하여 세포 염색질의 서열은, 예를 들면, 공동 특허권을 가진 미국특허 제 6,453, 242 (Sept. 17,2002) 호에서 전개된 방법에 따라서 선택될 수 있는데, 여기에는 또한 선택된 서열에 결합하도록 ZFP를 디자인하는 방법도 전개되어 있다. 표적 부위 선택에 뉴클레오티드 서열의 단순 육안 검사법이 또한 사용될 수 있음이 잘 알려져 있다. 따라서, 청구항에 있어서 표적 부위 선택의 어떠한 방법도 사용될 수 있다.
표적 부위는 일반적으로 다수의 인접한 표적 하위부위로 구성된다. 표적 하위부위란 개개의 징크핑거에 결합한 서열(보통은 뉴클레오티드의 3중 서열이거나, 하나의 뉴클레오티드 서열에 의하여 인접한 4중 서열과 겹쳐질 수 있는 뉴클레오티드의 4중 서열)을 일컫는다. 그 예로, WO 02/077227를 참조한다. 만약에 징크핑거 단백질의 접촉이 가장 많아지는 나선이 표적 나선으로 "제1 인식 나선" 또는 "제1 접촉 나선"으로 지정된다면, 어떤 징크핑거 단백질은 표적 나선의 3중 서열 및 비-표적 나선의 4번째 염기에 결합한다. 표적 부위는 일반적으로 최소 9 뉴클레오티드의 길이를 가지고, 따라서 최소 3개의 징크핑거로 구성된 징크핑거 결합 도메인에 결합한다.
그러나 예를 들어, 4 핑거 결합 도메인이 12 뉴클레오티드 표적 부위에 결합하거나, 5 핑거 결합 도메인이 15 뉴클레오티드 표적 부위에 결합하거나, 6 핑거 결합 도메인이 18 뉴틀레오티드 표적 부위에 결합하는 것도 또한 가능하다. 앞으로 밝혀지겠지만, 더 큰 결합 도메인(예를 들어, 7, 8, 9 핑거 및 그 이상)이 더 긴 표적 부위에 결합하는 것도 또한 가능하다.
표적 부위는 3개 뉴클레오티드의 배수일 필요는 없다. 예를 들어, 교차 나선 상호작용이 발생하는 경우에는(미국특허 제 6,453, 242 호 및 WO 02/077227 참조), 다중 핑거 결합 도메인에 있는 하나 또는 수개의 징크핑거는 4중 서열의 하위부위와 겹치면서 결합할 수 있다. 그 결과, 10번째 뉴클레오티드가 말단 핑거에 결합된 4중 서열의 일부가 되는 식으로 3 핑거 단백질은 10 뉴클레오티드 서열에 결합할 수 있고, 13번째 뉴클레오티드가 말단 핑거에 결합된 4중 서열의 일부가 되는 식으로 4 핑거 단백질은 13 뉴클레오티드 서열에 결합하는 등이 가능하다.
다중 핑거 결합 도메인에 있는 개개의 징크핑거 사이의 아미노산 링커 서열의 길이 및 특성 또한 표적 서열에의 결합에 영향을 미친다. 예를 들어, 다중 핑거 결합 도메인에 있는 인접한 징크핑거 사이의 소위 "비정규 링커", "장 링커", 또는 "구조 링커"는 그러한 핑거들이 바로는 인접하지 않는 하위부위에 결합할 수 있도록 해준다. 그러한 링커의 예로는 미국특허 제6,479,626호 및 WO 01/53480에 기술되어 있다. 따라서, 징크핑거 결합 도메인의 표적 부위에 있는 하나 또는 수개의 하위부위는 1, 2, 3, 4, 5 또는 그 이상의 뉴클레오티드로 서로 분리될 수 있다.
하나만 예를 들어 보면, 4 핑거 결합 도메인은, 차례대로 2개의 접촉한 3 뉴클레오티드 하위부위 및 개재성 뉴클레오티드 및 2개의 접촉한 3중 서열의 하위부위로 구성된, 13 뉴클레오티드 표적 부위에 결합할 수 있다.
서열(예를 들어, 표적 부위) 간의 거리란 두 개의 서열 간에 개재된 뉴클레오티드나 뉴클레오티드 쌍의 개수를 말하는데, 서로 가장 가까운 서열의 가장자리에서 측정한 것을 말한다.
어떤 구체예에서, 절단이 표적 부위의 분리를 위한 두 개의 징크핑거 도메인 및 절단 하프-도메인 융합 분자의 결합에 의존하는데, 이 경우 두 개의 표적 부위는 반대의 DNA 나선에 존재할 수 있다. 다른 구체예에서, 두 개의 표적 부위가 모두 같은 DNA 나선 절단에 존재하게 된다.
징크핑거 결합 도메인
징크핑거 결합 도메인은 하나 또는 수개의 징크핑거로 구성된다. Miller et al. (1985) EMBO J. 4: 1609-1614; Rhodes (1993) Scientific American Feb.: 56-65; 미국특허 제6,453, 242.호를 참조한다. 전형적으로, 하나의 징크핑거 도메인은 길이가 약 30 아미노산이다. 구조분석 연구에 의하면, 각 징크핑거 도메인(주된 기조)은 두 개의 베타 시트구조(고정적인 두 개의 시스틴 잔기를 함유하는 베타형을 형성)와 하나의 알파 나선구조(고정적인 두 개의 히스틴 잔기를 함유)로 되어 있는데, 이는 두 개의 시스틴 및 두 개의 히스틴에 의하여, 징크 원자의 배위 전반에 걸쳐 특정한 배좌를 유지한다.
징크핑거는 정규적인 C2H2 징크핑거(즉, 징크 이온이 두 개의 시스틴과 두 개의 히스틴 잔기와 배위결합)와 C3H 징크핑거(징크 이온이 3개의 시스틴 잔기와 하나의 히스틴 잔기와 배위결합)와 C4 징크핑거(징크 이온이 4개의 시스틴 잔기와 배위결합)와 같은 비정규적인 징크핑거 모두를 포함한다. 또한, WO 02/057293를 참조한다.
징크핑거 결합 도메인은 선택된 서열에 결합하도록 설계될 수 있다. 그 예로, Beerli et al. (2002) Nature Biotechnol. 20: 135-141; Pabo et al. (2001) Ann. Rev. Biochem. 70: 313-340 ; Isalan et al. (2001) Nature Biotechnol. 19: 656-660; Segal et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12: 632637; Choo et al. (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10: 411-416. 을 참조한다. 설계된 징크핑거 결합 도메인은 자연적으로 생성되는 징크핑거 단백질에 비하여 독특한 결합 특이성을 갖는다. 설계 방법으로는, 이에 한정되지 않지만, 합리적 디자인 및 선택가능한 다양한 형태가 포함된다. 합리적 디자인은, 예를 들어, 3중(또는 4중) 뉴클레오티드 서열 및 개개의 징크핑거 아미노산 서열을 구성하는 데이터베이스의 사용을 포함하는데, 이에는 각 3중 또는 4중 뉴클레오티드 서열이, 특정한 3중 또는 4중 서열과 결합하는 징크핑거에 있는 하나 또는 수개의 아미노산 서열과 합쳐진다. 그 예로, 공동 특허권인 미국특허 제6,453,242 및 6,534,261호를 참조한다.
위상 표시 및 이혼성 시스템을 포함하여, 선택 방법의 대표적인 예는, 미국특허 제5,789,538; 5,925,523; 6,007,988; 6,013,453; 6,410,248; 6,140,466; 6,200,759; 6,242,568호 또한 WO 98/37186; WO 98/53057; WO 00/27878; WO 01/ 88197 및 GB 2,338,237에 개시되어 있다.
징크핑거 결합 도메인의 결합 특이성의 촉진은, 예를 들어, 공동 특허권인 WO 02/077227에 기술되어 왔다.
개개의 징크핑거는 3 뉴클레오티드(즉, 3중) 서열(또는 하나의 뉴클레오티드에 의하여 징크핑거에 인접한 4 뉴클레오티드 결합 부위와 겹쳐짐이 가능한 4 뉴클레오티드 서열)에 결합하므로, 징크핑거 결합 도메인이 결합하도록(예, 표적 서열) 설계되는 서열의 길이는, 설계된 징크핑거 결합 도메인에 있는 징크핑거의 개수를 결정한다. 예를 들어, 겹쳐지는 하위부위에는 핑거의 주된 기조가 결합하지 않는 ZFP의 경우, 6 뉴클레오티드 표적 서열은 2 핑거 결합 도메인에 의해 결합되고, 9 뉴클레오티드 표적 서열은 3 핑거 결합 도메인에 의해 결합하는 등이 된다. 본 발명에서 언급되듯이, 표적 부위에 있는 개개의 징크핑거(즉, 하위부위)의 결합 부위는 접촉하여 있을 필요는 없고, 다중 핑거 결합 도메인의 징크핑거(즉, 핑거-간 링커) 사이에 있는 아미노산 서열의 길이와 특성에 의존하여, 그 징크핑거 결합 부위는 하나 또는 수개의 뉴클레오티드로 분리될 수 있다.
다중 핑거형 징크핑거 결합 도메인의 경우, 인접한 징크핑거는 아미노산 링커 서열로 약 5 아미노산으로 분리될 수 있고(이른바, 정규적 핑거-간 링커), 또는 그 대신에, 하나 또는 수개의 비정규적 링커의 형식으로 분리될 수 있다. 그 예로, 공동 특허권인 미국특허 제 6,453,242 및 6,534,261 호를 참조한다. 3개 이상의 핑거들로 구성되는 설계된 징크핑거 결합 도메인의 경우, 보다 긴(비정규적인) 핑거-간 링커를 어떤 징크핑거 사이에 삽입하는 것은, 결합 도메인에 의한 결합 친화도 및/또는 특이성을 증가함에 따라 수월해 진다. 그 예로, 미국특허 제 6,479,626 호 및 WO 01/53480를 참조한다.
따라서, 다중 핑거형 징크핑거 결합 도메인은 비정규적인 핑거-간 링커의 존재나 위치와 관련하여 또한 특징지워 질 수 있다. 예를 들어, 3개의 핑거(2개의 정규적인 핑거-간 링커 합류), 장 링커 및 2개의 추가적 핑거(두 개의 정규적인 핑거-간 링커와 합류)로 구성된 6 핑거 징크핑거 결합 도메인은, 2x3 배좌로 나타낸다. 유사하게, 2개의 핑거(그 사이는 정규적인 링커)와 장 링커 및 2개의 추가적 핑거(정규적인 링커와 합류)로 구성된 결합 도메인은, 2x2 단백질로 나타낸다. 3개의 2 핑거 단위(각각 2개의 핑거들이 정규적인 링커와 합류)로 구성되고, 장 링커에 의하여 각 2 핑거 단위가 인접한 두 개의 핑거 단위와 합류하는 단백질은, 3x2 단백질로 나타낸다.
다중 핑거 결합 도메인의 인접한 두 개의 징크핑거 사이에 길이가 길거나 비정규적인 핑거-간 링커가 존재하는 것은, 표적 서열에서 바로 접촉하지 않는 하위부위들에 두 개의 핑거가 종종 결합하게 한다.
따라서, 표적 부위의 하위부위 사이에는 하나 또는 수개의 뉴클레오티드의 간격이 존재할 수 있다. 즉, 표적 부위는 징크핑거와 접촉하지 않는 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 2x2 징크핑거 결합 도메인은 하나의 뉴클레오티드만큼 분리된 2개의 6 뉴클레오티드 서열에 결합할 수 있다. 즉, 그것은 13 뉴클레오티드 표적 부위에 결합한다. Moore et al. (2001a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 14321436; Moore et al. (2001b) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:1437-1441 및 WO 01/53480를 참조한다.
앞서 언급되었듯이, 표적 하위부위는 하나의 징크핑거와 결합하는 3 또는 4뉴클레오티드 서열을 말한다. 일정한 목적을 위하여, 2 핑거 단위는 결합 조절을 나타내기도 한다. 예를 들어, 특정한 6 뉴클레오티드 표적 서열과 결합하는 다중 핑거 단백질 (일반적으로 3 핑거)에서 두 개의 인접한 핑거의 선택으로 결합 조절이 가능하다. 다른 방도로, 개개의 징크핑거를 집합함으로써 조절이 가능하다. 또한, WO 98/53057 및 WO 01/53480를 참조한다.
절단 도메인
본 발명에서 개시된 융합 단백질의 절단 도메인 부분은 엔도 또는 엑소뉴클레아제로부터 얻을 수 있다. 절단 도메인을 얻어낼 수 있는 엔도뉴클레아제의 예로는, 이에 한정되지는 않지만, 제한 엔도뉴클레아제 및 귀소성 엔도뉴클레아제가 있다. 그 예로서는, 20022003 Catalogue, New England Biolabs, Beverly, MA; 및 Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3379-3388를 참조한다. DNA를 절단하는 또다른 효소는 알려져 있다(예를 들어, S1 뉴클레아제, 녹두 뉴클레아제, 췌장 DNA 분해효소 I, 구균 뉴클레아제, 효모 HO 엔도뉴클레아제, 또한, Linn et al. (eds.) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993를 참조). 이러한 효소들은(또는 효소의 기작 부분) 절단 도메인 및 절단 하프-도메인의 재원으로 사용될 수 있다.
유사하게, 절단 하프-도메인(예를 들어, 징크핑거 결합 도메인 및 절단 하프-도메인으로 구성된 융합 단백질)은, 모든 뉴클레아제 또는 그 부분에서 얻어낼 수 있는데, 위에서 설명하였듯이 이는 절단 활성을 위한 이량체화가 요구된다. 일반적으로, 만약 융합 단백질이 절단 하프-도메인으로 구성된다면, 절단을 위하여 두 개의 융합 단백질이 필요하다. 두 개의 절단 하프-도메인은 같은 엔도뉴클레아제(또는 그 기능 단편)로부터 얻어낼 수 있고, 또는 각 절단 하프-도메인은 다른 엔도뉴클레아제(또는 그 기능 단편)로부터도 얻어낼 수 있다. 또한 두 개의 융합 단백질의 표적 부위는 서로 다음과 같은 기질을 보이는데, 즉 두 개의 융합 단백질의 결합으로 인한 절단 하프-도메인 두 개의 공간적 배치는, 예를 들어, 이량체화를 통하여, 절단 하프-도메인이 작용성 절단 도메인을 형성하게끔 한다. 따라서, 어떤 구체예에서, 표적 부위의 이웃한 가장자리는 5 ~ 8 뉴클레오티드나 15 ~ 18 뉴클레오티드만큼 분리되어 있다. 하지만 모든 정수 값의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 쌍이 두 개 표적 부위 사이에 개재할 수 있다(예, 2 ~ 50 뉴클레오티드 또는 그 이상). 일반적으로, 절단 지점은 표적 부위 사이에 놓여있다.
제한 엔도뉴클레아제(제한 효소)는 많은 부류의 종에 존재하고, DNA(인식 부위)와 서열 특이성 결합이 가능하며, 결합 부위의 근처에서 DNA를 절단할 수 있다. 어떤 제한 효소(예를 들어, IIS 타입)는 인식 부위가 제거된 부위에서도 DNA를 절단하여 분리된 결합 도메인과 절단 도메인을 가진다. 예를 들어, IIS 타입 효소인 FokI는, 하나의 나선에서 인식 부위와 9 뉴클레오티드 떨어진 곳 및 다른 하나의 나선에서 인식 부위에서 13 뉴클레오티드 떨어진 곳에서, DNA의 이중-나선 절단을 촉진한다. 그 예로, 미국특허 제 5,356,802; 5,436,150 및 5,487,994; Li et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4275-4279; Li et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2764- 2768; Kim et al. (1994a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 883-887; Kim et al. (1994b) J. Biol. Chem. 269: 31,978-31, 982를 참조한다. 따라서 하나의 구체예에서, 설계된 것이든 그렇지 않은 것이든 간에, 융합 단백질은 최소한 하나의 IIS 타입 제한 효소로부터의 절단 도메인(또는 절단 하프-도메인)과 하나 이상의 징크핑거 결합 도메인을 구성하게 된다.
절단 도메인이 결합 도메인으로부터 분리할 수 있는 IIS 타입 제한 효소의 예로 FokI 이 있다. 이 특수한 효소는 이량체로서 활성을 갖는다. Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10,570-10, 575를 참조한다. 따라서, 본 발명의 목적상, 전개된 융합 단백질에 사용된 FokI 효소의 일부는 절단 하프-도메인으로 본다. 따라서, 징크핑거 FokI 융합을 이용한 표적화된 이중-나선 절단 및/또는 표적화된 세포 서열 교환의 경우, 촉매작용 활성 절단 도메인을 재구성하기 위하여 FokI 절단 하프-도메인으로 각각 구성된 두 개의 융합 단백질이 사용될 수 있다. 다른 방도로는, 징크핑거 결합 도메인을 포함하는 하나의 폴리펩티드 분자와 두 개의 FokI 절단 하프-도메인이 또한 사용될 수 있다. 징크핑거-FokI 융합을 이용한 표적화된 절단 및 표적화된 서열 변경의 변수들은 본 발명의 다른 부분에서 제공하기로 한다.
절단 도메인 또는 절단 하프-도메인은 절단 활성을 보유한, 또는 다합체화하여(예를 들어, 이량체화) 기능 절단 도메인을 형성하는 능력을 보유한 단백질의 어떤 부분일 수 있다.
IIS 타입 제한 효소의 예는 표 1에 열거되어 있다. 추가적인 제한효소는 또한 분리가능한 결합 및 절단 도메인을 포함하고, 이것들은 본 발명에서 고려의 대상이 될 것이다. 그 예로, Roberts et al. (2003) Nucleic acids Res. 31:418-420를 참조한다.
Figure pat00001
징크핑거 도메인 절단 도메인 융합
융합 단백질(또는 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드)을 디자인하고 구성하는 방법은 당해 기술분야에 널리 알려져 있다. 예를 들면, 징크핑거 단백질(또는 징크핑거 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드)을 포함하는 융합 단백질을 디자인하고 구성하는 방법은 미국특허 제6,453,242호와 제6,534,261호에 공동으로 기재되어 있다. 어떤 구체예에서, 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 구성하였다. 상기 폴리뉴클레오티드는 벡터에 삽입될 수 있으며 삽입된 벡터는 세포 안으로 도입될 수 있다. (하기의 폴리뉴클레오티드를 세포 안으로 도입하는 벡터와 방법에 관한 추가적인 설명 참조)
본원에 설명된 방법의 어떤 구체예에서, 융합 단백질은 징크핑거 결합 단백질 도메인과 FokI 제한효소에 의해 절단된 절단 하프-도메인을 포함하고, 세포 안에서 두 융합 단백질을 발현한다. 세포 내에서 두 융합 단백질의 발현은 두 단백질의 세포 안으로 이동, 한 개의 단백질과 다른 단백질을 암호화하는 한 개의 핵산의 이동, 각각의 단백질을 암호화하는 두 개의 핵산의 이동 또는 두 개의 단백질을 모두 암호화하는 한 개의 핵산의 이동으로 가능하다. 추가적인 구체예에서, 융합 단백질이 두 개의 절단 하프-도메인과 한 개의 징크핑거 결합 도메인을 포함하는 하나의 폴리펩티드 사슬로 구성되어 있다. 이 경우에는 하나의 융합 단백질이 세포 내에서 발현되고 절단 하프-도메인의 분자내 이량체 형성의 결과로 DNA를 절단할 것이라 기대된다.
어떤 구체예에서, 융합 단백질(예, ZFP-FokI 융합체)의 성분들은 징크핑거 도메인이 융합 단백질의 아미노 말단(N 말단) 근처에, 절단 하프-도메인이 카르복시 말단(C 말단) 근처에 위치하도록 배열된다. 이것은 FokI 제한효소에 의해 생성되는 자연적인 절단 도메인 이량체에서 절단 도메인의 상대적 위치를 반영하는데, 여기에서도 DNA 결합 도메인은 아미노 말단 근처에 절단 하프-도메인은 카르복시 말단 근처에 위치한다. 이들 구체예에서, 기능적 뉴클레아제를 형성하기 위한 절단 하프-도메인의 이량체화는 마주한 DNA 가닥들 상의 부위에 융합 단백질이 결합됨으로써 이루어지며, 이때 결합 부위들의 5' 단부는 서로 인접하게 된다. 도 43A 참조.
추가의 구체예에서, 융합 단백질(예를 들어, ZFP-FokI 융합체)의 성분들은 절단 하프-도메인이 융합 단백질의 아미노 말단 근처에, 징크핑거 도메인이 카르복시-말단 근처에 위치하도록 배열된다. 이들 구체예에서, 기능적 뉴클레아제를 형성하기 위한 절단 하프-도메인의 이량체화는 마주한 DNA 가닥들 상의 부위에 융합 단백질이 결합함으로써 이루어지며, 이때 결합 부위들의 3' 단부는 서로 인접하게 된다. 도 43B 참조.
다른 추가의 구체예에서, 제 1 융합 단백질은 융합 단백질의 아미노 말단 근처에 절단 하프-도메인을, 카르복시-말단 근처에 징크핑거 도메인을 함유하고, 제 2 융합 단백질은 징크핑거 도메인이 융합 단백질의 아미노 말단 근처에, 절단 하프-도메인이 카르복시-말단 근처에 위치하도록 배열된다. 이들 구체예에서, 두 융합 단백질은 동일한 DNA 가닥에 결합하며, 이때 제 1 융합 단백질의 결합 부위는 아미노 말단 근처에 징크핑거 도메인을 함유하는 제 2 융합 단백질의 결합 부위의 5' 쪽에 위치된 카르복시 말단 근처에서 징크핑거 도메인을 함유한다. 도 43C 참조.
개시된 융합 단백질에서, 징크핑거 도메인과 절단 도메인(또는 절단 하프-도메인) 사이의 아미노산 서열은 "ZC 링커"로 표시된다. ZC 링커는 상기 논의된 핑거-간 링커와는 구별되어야 한다. ZC 링커의 길이를 측정하기 위해, Pabo et al. (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340에 의해 설명된 징크핑거 구조인 X-X-C-X2-4-C-X12-H-X3-5-H(SEQ ID NO:201)이 사용된다.
이 구조에서, 징크핑거의 제 1 잔기는 첫 번째의 보존된 시스테인 잔기 쪽의 아미노-말단의 2개 잔기에 위치하는 아미노산이다. 대부분의 자연-발생 징크핑거 단백질에서, 이 위치는 소수성 아미노산(보통 페닐알라닌 또는 티로신)에 의해 점유된다. 따라서, 개시된 융합 단백질에서, 징크핑거의 제 1 잔기는 대체로 소수성 잔기이지만, 어떤 아미노산일 수도 있다. 상기 나타낸 대로, 징크핑거의 마지막 아미노산 잔기는 두 번째의 보존된 히스티딘 잔기이다.
따라서, 징크핑거 도메인이 절단 도메인(또는 절단 하프-도메인)에 대해 아미노-말단인 극성을 갖는 개시된 융합 단백질에서, ZC 링커는 징크핑거 C-말단의 두 번째 보존된 히스티딘 잔기와 절단 도메인(또는 절단 하프-도메인)의 N-말단 아미노산 사이의 아미노산 서열이다. 예를 들어, 실시예 부분에서 그 구성이 예시된 어떤 융합 단백질에서, 절단 하프-도메인의 N-말단 아미노산은 Looney et al. (1989) Gene 80:193-208의 FokI 서열의 아미노산 번호 384에 해당하는 글루타민(Q) 잔기이다.
절단 도메인(또는 절단 하프-도메인)이 징크핑거 결합 도메인에 대해 아미노 말단인 극성을 갖는 융합 단백질에서, ZC 링커는 절단 도메인(하프-도메인)의 C-말단 아미노산 잔기와 징크핑거 결합 도메인의 징크핑거 N-말단의 제 1 잔기(즉, 첫 번째 보존된 시스테인 잔기 상류의 2개 잔기에 위치하는 잔기) 사이의 아미노산 서열이다. 어떤 전형적인 융합 단백질에서, 절단 하프-도메인의 C-말단 아미노산은 Looney et al. (1989) Gene 80:193-208의 FokI 서열의 아미노산 번호 579에 해당하는 페닐알라닌(F) 잔기이다.
ZC 링커는 어떤 아미노산 서열일 수 있다. 최적의 절단을 달성하기 위하여, ZC 링커의 길이와 표적 부위들(결합 부위들) 사이의 거리는 상관된다. 예를 들어, Smith et al. (2000) Nucleic Acids Res. 28:3361-3369; Bibikova et al. (2000) Mol. Cell. Biol. 21:289-297을 참조하며, 여기서는 링커 길이에 대한 표시가 본원에서 제공된 것과 다르다는 것을 유의한다. 예를 들어, 징크핑거 결합 도메인이 절단 하프-도메인에 대해 아미노-말단이고, 본원에 정의된 바에 따라 4개 아미노산 길이의 ZC 링커(다른 데서는 L0으로 표시된다)를 갖는 ZFP-FokI 융합체에서는, 융합 단백질의 결합 부위가 6 또는 16개 뉴클레오티드 떨어져서 위치할 때(각 결합 부위의 인접 가장자리에서 측정했을 때) 최적의 절단이 일어난다. 실시예 4를 참조한다.
표적화된 절단 방법
기술된 방법과 조성물로 세포내 염색질에 있는 관심 영역, 예를 들어 게놈, 변종 또는 야생형 유전자의 관심 부위나 미리 계산된 부위의 DNA를 절단할 수 있다. 이와 같이 DNA를 표적화된 절단을 하기 위해서 징크핑거 결합 도메인을 미리 계산된 절단 부위의 표적 부위에 결합할 수 있도록 설계하고 설계된 징크핑거 결합 도메인과 절단 도메인을 포함하는 융합 단백질을 세포내에서 발현시킨다. 융합 단백질의 징크핑거 부분이 표적 부위에 결합하면 절단 도메인에 의해서 DNA가 표적 부위 근처에서 절단된다. 절단될 정확한 부위는 ZC 링커의 길이에 의존한다.
한편, 각각 징크핑거 결합 도메인과 절단 하프-도메인을 포함하는 두 융합 단백질은 세포내에서 발현되고 기능성 절단 도메인이 재구성되고 표적 부위 근처의 DNA가 절단되는 방식으로 병렬된 표적 부위에 결합한다. 한 구체예에서, 두 개의 징크핑거 결합 도메인의 표적 부위들 사이에서 절단이 일어났다. 하나 또는 두 개의 징크핑거 결합 도메인의 설계가 가능하다.
징크핑거 결합 도메인-절단 도메인 융합 폴리펩티드를 이용하여 표적을 절단하려면 결합 부위가 절단 부위를 둘러싸고 있거나 결합 부위의 끝이 절단 부위로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 25, 50 또는 그 이상의 뉴클레오티드(또는 1부터 50 사이의 정수)에 위치하여야 한다. 절단 부위에 대한 결합 부위의 정확한 위치는 절단 도메인의 특이성과 ZC 링커의 길이에 의존한다. 각각 징크핑거 결합 도메인과 절단 하프-도메인을 포함하는 두 융합 단백질을 사용하는 방법에서는 일반적으로 결합 부위가 절단 위치의 양끝에 위치한다. 따라서, 첫 번째 결합 위치의 끝은 절단 부위 한 끝 부분의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 25, 또는 그 이상의 뉴클레오티드에(또는 1부터 50 사이의 정수) 위치할 수 있으며 두 번째 결합 위치의 끝은 절단 부위 다른 끝 부분의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 25, 또는 그 이상의 뉴클레오티드에(또는 1부터 50 사이의 정수) 위치할 수 있다. 생체 외 및 생체 내 상에서 절단 부위를 맵핑하는 방법을 당해 기술분야에서 널리 알려져 있다.
따라서, 다음에 기술되는 방법은 절단 도메인에 결합된 징크핑거 도메인을 설계하는데 이용될 수 있다. 이 경우에 결합 도메인을 절단이 되도록 원하는 부위의 표적 서열에 결합하도록 설계하고 융합 단백질 또는 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 세포 내에 도입한다. 일단 세포 내로 도입되어 발현이 되면 융합 단백질은 표적 서열에 결합하고 그 부위를 절단한다. 절단될 정확한 부위는 절단 도메인의 성질과 결합 도메인과 절단 도메인 사이 링커 서열의 성질과 존재 유무에 의해 결정된다. 각각 절단 하프-도메인을 포함하는 두 융합 단백질이 사용된 경우에는 결합 부위의 끝 사이의 거리가 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 25, 또는 그 이상의 뉴클레오티드가(또는 1부터 50 사이의 정수) 될 수 있다. 절단의 최적 범위는 두 융합 단백질의 결합 부위 사이의 거리 (Smith et al. (2000) Nucleic Acids Res. 28: 3361-3369; Bibikova et al. (2001) Mol. Cell. Biol. 21: 289-297), 그리고 각 융합 단백질의 ZC 링커의 길이에 의존한다.
ZFP FokI 융합 뉴클레아제의 경우, ZFP와 FokI 절단 하프-도메인, 즉 ZC 링커 사이 링커의 길이가 절단 효율에 영향을 미친다. 4 개 아미노산 잔기의 ZC 링커를 가진 ZFP FokI 융합 뉴클레아제를 이용한 한 실험에서 두 개의 ZFP FokI 뉴클레아제의 결합 부위의 끝이 6 개의 염기만큼 떨어져 있을 때 가장 잘 절단되었다. 상기의 특이한 융합 뉴클레아제는 징크핑거 부분과 뉴클레아제 하프-도메인 사이에 다음과 같은 아미노산 서열이 있다.
HQRTHQNKKOLV (SEQ ID NO : 26)
상기 서열에서 밑줄 친 징크핑거 C 말단 부위의 두 개의 히스티딘과 FokI 절단 하프-도메인의 첫 번째 3 개의 잔기는 보존되어 있다. 따라서, 이 구성체에서 ZC 링커 서열은 QNKK이다. (Bibikova et al. (2001) Mol. Cell. Biol. 21: 289-297) 본 발명의 발명자들은 다양한 길이와 서열의 ZC 링커를 가지는 ZFP-FokI 융합 뉴클레아제를 대량으로 구성하였으며 상기 뉴클레아제의 절단 효율을 ZFP 결합 부위 간의 거리가 다른 기질을 사용하여 분석하였다. 실시예 4를 참조한다.
어떤 구체예에서, 절단 도메인은 절단 하프-도메인 두 개와 과 결합 도메인,첫번째 절단 하프-도메인 및 두 번째 절단 하프-도메인을 포함하는 하나의 폴리펩티드 두 개로 구성되어 있다. 절단 하프-도메인은 DNA를 절단하는 기능을 가진다면 동일한 아미노산 서열을 가질 필요는 없다.
서로 분리된 분자들에서 절단 하프-도메인을 제공할 수도 있다. 예를 들면, 각각 결합 도메인과 절단 하프-도메인을 포함하는 두 개의 융합 폴리펩티드가 세포 내로 도입될 수 있다. 절단 하프-도메인은 DNA를 절단하는 기능을 가진다면 동일한 아미노산 서열을 가질 필요는 없다. 또한, 결합 도메인은 융합 폴리펩티드가 결합하자마자 두 개의 절단 하프-도메인이 절단 도메인의 재구성, 예를 들어 하프-도메인의 이량체화를 가능하게 하는 위치에 존재하고, 그로 인해 기능성 절단 도메인을 형성하도록 하프-도메인을 위치시키게 되고, 관심 영역의 세포 염색질을 절단하게 됨으로써 결합 도메인이 표적 부위에 결합한다. 일반적으로 재구성된 절단 도메인에 의한 절단은 두 표적 서열 사이에 위치한 부위에서 일어난다. 표적 부위에 결합하기 위해서 하나 또는 두 개의 단백질을 설계할 수 있다.
두 개의 융합 단백질은 관심 영역에 같거나 또는 다른 극성으로 결합할 수 있고 그 결합 부위, 즉 표적 부위는 몇 개(예를 들어, 0부터 200 사이의 정수)의 뉴클레오티드만큼 떨어져 있을 수 있다. 어떤 구체예에서, 각각 징크핑거 결합 도메인과 절단 도메인을 포함하는 두 개의 융합 단백질의 결합 부위들이 가장 가까운 다른 결합 부위의 끝으로부터 5에서 18 뉴클레오티드만큼, 예를 들면 5-8 뉴클레오티드, 15-18 뉴클레오티드, 6 뉴클레오티드 또는 16 뉴클레오티드 떨어져 위치할 수 있고 절단은 결합 부위 사이에서 일어난다.
일반적으로 DNA가 절단되는 부위는 두 융합 단백질의 결합 부위 사이에 존재한다. DNA 이중-나선의 절단은 두 개의 단일 나선 각각의 절단 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 그 이상의 뉴클레오티드들로 시작하는 "닉"에 기인한다. 예를 들면 자연적인 Fok I 제한효소에 의한 이중-나선 DNA의 절단은 4 개의 뉴클레오티드로 시작된 단일 나선의 절단에 기인한다. 따라서, 절단은 반드시 각 나선의 DNA의 정확히 반대편에서 일어날 필요는 없다. 또한, 융합 단백질의 구조와 표적 부위 사이의 거리가 절단이 하나의 뉴클레오티드 쌍 근처에서, 아니면 여러 부위에서 일어날지에 영향을 미친다. 그러나, 표적화 재조합 및 표적화 돌연변이를 포함한 많은 경우에(아래 내용 참조), 일반적으로 뉴클레오티드 범위 내에서 절단되면 충분하고 특이한 염기 쌍 사이의 절단은 필요하지 않다.
상기에 기술한 바와 같이 융합 단백질은 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드 형태로 도입될 수 있다. 예를 들면, 각각 전술한 폴리펩티드들 중 하나를 암호화하는 서열을 포함하는 두 개의 폴리뉴클레오티드는 세포 내로 도입될 수 있고 절단은 표적 서열 근처에서 일어난다. 한편, 두 개의 폴리펩티드를 암호화하는 서열을 포함하는 하나의 폴리뉴클레오티드도 세포 내로 도입될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 DNA, RNA, 또는 DNA나 RNA의 변형된 형태 및 유사체 모두 가능하다.
절단 특이성을 증가시키기 위해서는 다음에 기술될 추가적인 조성물을 사용할 수 있다. 예를 들면, 하나로 된 절단 하프-도메인들은 이중-나선 절단 활성에 제한을 받는다. 각각 3 개의 핑거를 가진 징크핑거 도메인과 절단 하프-도메인이 세포내로 도입되는 방법에서 한 개의 도메인은 대략 9 개의 뉴클레오티드로 이루어진 표적 부위를 특정화한다. 포유류의 게놈에서는 18개의 뉴클레오티드로 이루어진 집합 표적 서열이 일반적이지만 인간 게놈에서는 평균적으로 약 23,000마다 한번 9개의 뉴클레오티드 표적 부위가 나타난다. 따라서, 하나의 하프-도메인의 특이적 결합에 의한 비특이적인 절단이 일어날 수 있다. 따라서, 다음에 기술될 방법은 두 개의 융합 단백질처럼 세포 내에서 발현되는 절단 하프-도메인,예를 들면 FokI 또는 절단 하프-도메인을 암호화하는 핵산의 우성 음성 돌연변이를 이용하였다. 우성 음성 돌연변이는 이량체는 될 수 있으나 절단은 하지 못하며, 또한 하프-도메인과 이량체를 형성하여 하프-도메인의 절단 활성을 방해한다. 융합 단백질에 우성 음성 돌연변이를 과량으로 투입함으로써 모두 융합 단백질로 결합한 영역에서만 이량체화가 가능할 정도로 충분한 기능성 절단 하프-도메인이 존재하게 되고 절단이 일어난다. 두 개의 융합 단백질 중에 하나만 결합한 부위에서는 절단 하프-도메인은 우성 음성 돌연변이 하프-도메인과 이량체를 형성하여 원하지 않는 비특이적 절단은 일어나지 않는다.
FokI 절단 하프-도메인의 3개의 촉매 아미노산 잔기가 Asp 450, Asp 467 및 Lys 469로 확인되었다. (Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10, 570-10, 575) 따라서, 이들 잔기에 하나 또는 두 개 이상의 돌연변이를 이용하여 우성 음성 돌연변이를 만들 수 있다. 또한, IIS 엔도뉴클레아제의 촉매 아미노산 잔기들이 많이 알려졌고 FokI 서열과 일치시킴으로써 또는 촉매 활성부위의 돌연변이 생성과 활성 시험을 통해 결정할 수도 있다.
절단 하프-도메인의 이량체 도메인 돌연변이
ZFP와 절단 하프-도메인 간의 융합,예를 들어 ZFP/FokI 융합을 통한 표적화된 절단방법은 각각 다른 표적 부위를 지시하는 융합 분자들의 이용이 필수적이다. 상기에 기술한 바처럼 두 융합 단백질은 게놈에서 표적화된 절단이 특정 부위를 지시하도록 선택될 수 있다. 절단 특이성을 감소시키는 중요한 요인은 두 ZFP/절단 하프도메인 융합 단백질들 중 하나의 동형이량체 때문이다. 예를 들어, 게놈에 두 ZFP/절단 하프도메인 융합 단백질들 중 하나에 대한 표적 서열의 역위 반복이 존재하면 같은 융합 단백질 두 개가 방향을 가지고 결합하여 기능성 이량체를 형성하게 되고 절단 특이성이 감소한다.
목적한 표적 부위 이외의 서열에서 비정상적인 절단 가능성을 감소시키는 방법중 하나는 동형이량체화를 방해하거나 최소화시키는 절단 하프-도메인의 변종을 생성하는 것이다. 더욱 좋은 것은 이량체화에 관여하는 하프-도메인 부분의 아미노산들 중 하나 또는 두 개 이상을 치환하는 것이다. FokI 단백질 이량체의 결정 구조에서 절단 하프-도메인의 구조는 FokI에 의해 DNA가 절단되는 동안의 절단 하프-도메인의 정열과 유사하다고 보고되었다. (Wah et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10564-10569) 이 구조에 의하면 483번, 487번 위치의 아마노산이 Fok I 절단 하프-도메인 이량화반응에 중요한 역할을 한다. 또한 446번, 447번, 479번, 483번, 484번, 486번, 487번, 490번, 491번, 496번, 498번, 499번, 500번, 531번, 534번, 537,번 및 538번 위치의 아미노산이 이량체화반응을 영향을 미칠 수 있을 만큼 충분히 가까이 있다. 따라서, 전술한 위치들 중 하나 또는 두 개 이상의 아미노산 서열을 바꿈으로써 절단 하프-도메인의 이량화반응 성질을 변화시킬 수 있다. 예를 들어, 상기 위치들에 다른 아미노산을 가지는 또는 암호화하는 라이브러리의 구성, 원하는 성질을 가진 변종의 선택, 또는 각각의 돌연변이를 합리적으로 설계함으로써 이런 변화를 도입할 수 있다. 상기한 변화들 중 일부는 동형이량체화반응을 방해할 뿐 아니라 두 개의 야생형 절단 하프-도메인보다 절단 효율을 증가시킬 수도 있다.
따라서, FokI 절단 하프-도메인 내의 이량체화에 영향을 줄 수 있는 어떤 아미노산 잔기의 변화도 ZFP/FokI 융합 단백질의 쌍 중 하나가 동형이량체화반응을 하여 원하지 않는 서열에서 절단을 일으키지 않도록 하는데 사용할 수 있다. 따라서, ZFP/FokI 융합 단백질 쌍을 이용하여 표적화된 절단을 하기 위해서는 자체 이량체화반응을 방해하는 아미노산이 하나 또는 두 개 이상 변화된 융합 단백질들 중 하나 또는 두 개로 이루어져야 하고 반면에 원하는 표적 부위를 절단하는 두 개의 융합 단백질의 이형이량체화반응은 이루어져야 한다. 어떤 구체예에서, 변화가 두 개의 융합 단백질에 모두 존재하여 추가적인 영향, 즉 비정상적 절단을 일으키는 동형이량체화반응이 줄어들거나 제거되기도 하는 반면, 두 개의 융합 단백질의 이형이량체화반응은 야생형 절단 하프-도메인의 이형이량체화반응과 비교하여 비슷한 활성을 가진다. 실시예 5를 참조한다.
게놈 서열의 표적화된 변환 방법 및 표적화된 재조합 방법
다음에 기술하는 방법은 게놈 서열을(예를 들어, 세포 염색질 내의 관심 영역) 상동 비일치 서열로(예를 들어, 표적화된 재조합) 치환하는 방법이다. 특별한 서열을 치환하는 기존의 시도는 도너 DNA 분자가 게놈내로 상동성 재조합을 일으키는 세포를 선택한 후, 염색체 영역, 즉 도너 DNA와 유사성을 가지는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드와 세포를 접촉시키는 것이었다. 상동성 재조합의 나쁜 효율과 높은 확률로 표적 부위 이외의 게놈 부위에 도너 DNA가 비특이적으로 삽입되기 때문에 이 방법의 성공확률은 낮다.
본 발명은 표적화된 재조합 효율을 높이고 비특이적인 삽입 빈도를 감소시키는 것을 특징으로 하는 표적 서열 변환 방법을 제공한다. 본 발명은 세포 DNA의 표적 이중-나선의 하나 또는 두 개 이상을 절단하기 위해서 절단 도메인(또는 절단 하프-도메인)과 융합된 설계된 징크핑거 결합 도메인을 생성하거나 사용하는 것을 포함한다. 상동성 재조합은 세포 DNA의 이중-나선 절단에 의해 절단 부위 근처에서 수천 배 정도 증폭되며 이런 표적화된 절단은 실질적으로 게놈의 어떤 부위에서나 상동성 재조합을 통하여 서열의 변경이나 치환(상동성-지정 수선에 의해)을 가능하게 한다.
다음에 기술되는 융합 단백질뿐만 아니라 선택된 게놈 서열의 표적화된 치환도 치환(또는 도너) 서열의 도입을 필요로 한다. 도너 서열은 융합 단백질의 발현 이전이나 동시 또는 이후 언제든 세포 내로 도입될 수 있다. 자신과 유사성을 가진 게놈 서열 사이에 상동성 재조합(또는 상동성-지정 수선)을 하기 위해서 도너 폴리뉴클레오티드는 게놈 서열과 충분한 유사성을 가져야 한다. 도너와 게놈 서열 사이에는 대략 25, 50, 100, 200, 500, 750, 1,000, 1,500, 2,000개의 뉴클레오티드 또는 그 이상의 사열 유사성(또는 10 내지 2000 사이의 정수 또는 그 이상)을 가져야 상동성 재조합을 할 수 있다. 도너 서열의 길이는 10 - 5,000 뉴클레오티드(또는 그 사이 모든 정수)이거나 그 이상으로 되어 있다. 도너 서열은 명백히 치환될 게놈 서열과 전형적으로 일치하지는 않는다. 예를 들어, 염색체 서열과의 충분한 상동성이 존재하는 한, 도너 폴리뉴클레오티드 서열은 게놈 서열에 대하여 하나의 염기 변화, 삽입, 결실, 역전, 또는 재배열 중에서 하나 또는 두 개 이상을 포함할 수 있다. 또는 달리, 도너 서열은 두 상동성 영역이 측면에 위치한 비-상동성 서열을 함유할 수 있다. 또한, 도너 서열은 세포 염색질의 관심 영역과 비-상동성인 서열을 가질 수도 있다. 일반적으로 도너 서열의 상동성 영역은 재조합이 일어나기 원하는 게놈 서열과 적어도 50% 서열 일치를 보여야 한다. 어떤 구체예에는, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, 또는 99.9% 서열 일치가 존재한다. 도너 폴리뉴클레오티드의 길이에 따라 1% - 100% 서열 일치가 가능하다.
도너 분자는 여러 개의 세포 염색질 유사 영역을 비연속적으로 가질 수 있다. 예를 들어, 일반적으로 관심 영역에 존재하지 않는 서열의 표적 삽입에서는 상기 서열이 도너 핵산 분자에 존재하고 관심 영역의 서열과 유사한 영역을 측면에 가질 수 있다.
도너 서열의 삽입을 확인하기 위한 검사(예를 들어, 혼성, PCR, 제한효소절단 등)를 간단히 하기 위해서 게놈 서열과 비교하여 도너 서열에는 특정 서열의 차이가 존재할 수도 있다. 더욱 좋게는, 암호화 영역에 존재하여 뉴클레오티드 서열 차이가 아미노산 서열을 바꾸지 않거나 또는 침묵 아미노산 변화,즉 뉴클레오티드 변화가 단백질의 구조나 기능에는 영향을 미치는 않는 변화시키는 것이다. 도너 폴리뉴클레오티드는 상동성 재조합에 의하여 세포 염색질로 도입되는 도너 서열의 절단을 방지하기 위하여 관심 영역의 징크핑거 도메인 결합 부위에 상응하는 서열을 추가로 가질 수 있다.
도너 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA, 단일 나선 또는 이중-나선 모두 될 수 있고 직선형 또는 원형으로 세포내로 도입될 수 있다. 직선형으로 도입된다면 도너 서열의 끝은 당해 기술분야에서 널리 알려진 방법으로(예를 들면, 엑소뉴클레아제로 분해) 보호될 수 있다. 예를 들어, 직선형 분자의 3' 말단에 디데옥시뉴클레오티드를 하나 또는 두 개 이상 첨가하거나 자체 상보적인 올리고뉴클레오티드를 한쪽 또는 양쪽 끝에 결합시킨다. (Chang et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 4959- 4963; Nehls et al. (1996) Science 272: 886-889) 외래 폴리뉴클레오티드 분해를 보호하는 또 다른 방법은 말단 아미노기를 첨가하거나 포스포로티오에이트, 포스포라미데이트 및 O 메틸 리보스 또는 데옥시리보오스 잔기로 구성된 군에서 선택된 변성 분자 간 뉴클레오티드 링커를 첨가하는 것이지만 여기에 한정되지는 않는다. 폴리뉴클레오티드는 복제 원점, 프로모터, 및 항생제 내성 유전자로 구성된 군에서 선택된 서열을 가진 벡터 분자의 일부로서 세포에 도입될 수 있다. 더구나, 도너 폴리뉴클레오티드는 네이키드 형태로, 리포솜 또는 폴록사머와 결합한 형태로, 또는 바이러스에 의해(예를 들어, 아데노바이러스, AAV, 헤르페스바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스) 세포 내로 도입될 수 있다.
어떤 이론에 결부되지는 않지만, 세포 내 서열에서 절단 부위 근처 또는 둘러싼 영역과 유사성을 가지는 외래 DNA 분자가 존재하면 이중-나선의 절단이 나타나고, 도너 분자에서 세포 서열로(예를 들어, 게놈 또는 염색체 서열) 서열 정보를 전달하는, 즉 "유전자 보존"이라고 알려진 상동성-지정 수선 과정에 의하여 절단을 복구하는 세포 메커니즘이 활성화된다. 사용 방법은 설계된 ZFP의 강력한 표적 능력을 원하는 재조합이 일어나는 게놈 영역에 이중-나선 절단을 특이적으로 선택하는 절단 도메인(또는 절단 하프-도메인)에 결합하는 장점이 있다.
염색체 서열의 변경은 원하는 서열 변경에 영향을 줄 정도로 충분하다면 도너의 모든 서열을 염색체에 복사할 필요는 없다.
상동성 재조합에 의한 도너 서열의 삽입 효율은 세포 DNA에서 이중-나선 절단과 재조합을 원하는 부위의 거리에 반비례 관계가 있다. 다시 말해서, 이중-나선 절단이 재조합을 원하는 부위와 가까울수록 높은 상동성 재조합 효율을 보인다. 재조합의 정확한 부위가 미리 계산되지 않은 경우, 예를 들어 원하는 재조합이 게놈 서열의 전 간격에서 일어날 수 있는 경우에는, 원하는 재조합을 얻기 위해서 절단 부위와 함께 도너 핵산의 길이와 서열을 선택하여야 한다. 원하는 재조합이 게놈 서열의 하나의 뉴클레오티드 쌍의 서열을 변화시키도록 디자인된 경우에는 세포 염색질이 뉴클레오티드 쌍 한편의 10,000개 뉴클레오티드 사이에서 절단된다. 어떤 구체예에서, 서열을 변환시키려는 뉴클레오티드 쌍 한편의 1,000개, 500개, 200개, 100개, 90개, 80개, 70개, 60개, 50개, 40개, 30개, 20개, 10개, 5개 또는 2개 뉴클레오티드 사이에서(또는 2부터 1,000 사이의 정수) 절단이 일어난다.
이상에서 밝힌 바와 같이, 각각 징크핑거 결합 도메인과 절단 하프-도메인을 포함하는 융합 단백질의 결합 부위는 가장 가까운 결합 부위의 끝으로부터 5 ~ 8 또는 15 ~ 18 뉴클레오티드 떨어져 위치하고 결합 부위 사이에서 절단이 일어난다. 절단될 게놈 서열은 도너 서열에 의해 치환되기 때문에 절단이 하나의 부위에서 일어나는가 또는 여러 부위에서 일어나는가는 중요하지 않다. 따라서, 표적화된 재조합에 의한 하나의 뉴클레오티드 쌍 서열을 효율적으로 변환하기 위해서는 결합 주위 사이의 중간 영역이 표적 뉴클레오티드에서 10,000 뉴클레오티드 안에 있어야 한다. 바람직하게는, 1,000 뉴클레오티드, 500 뉴클레오티드, 200 뉴클레오티드, 100 뉴클레오티드, 50 뉴클레오티드, 20 뉴클레오티드, 10 뉴클레오티드, 5 뉴클레오티드, 2 뉴클레오티드, 1 뉴클레오티드, 또는 관심 뉴클레오티드 쌍에 있어야 한다.
어떤 구체예에서, 상동 염색체가 도너 폴리뉴클레오티드로 작용할 수 있다. 따라서, 염색체에 결합하여 돌연변이 서열을 절단하지만 상동 염색체의 야생형 서열은 절단하지 않는 융합 단백질을 설계함으로써 이형접합체의 돌연변이를 교정할 수 있다. 돌연변이를 가진 염색체의 이중-나선 절단은 상동 염색체의 야생형 서열이 절단된 염색체로 복제되는 유사성 기반 "유전자 전환" 프로세스를 자극하여 야생형 서열 두 복제를 회복시킨다.
표적화된 재조합을 향상시키는 방법과 조성물은 또한 상동성 재조합에 관여하는 유전자 발현을 활성화하는 추가적인 ZFP 기능성 도메인 융합을 사용을 포함한다. 상기 유전자들은 RAD52 우세 그룹(예를 들어, RadS0, Rad5l, Rad5lB, Rad5 C, Rad5lD, Rad52, Rad54, Rad54B, Mrell, XRCC2, 및 XRCC3), 전술한 유전자 산물과 작용할 수 있는 산물을 생성하는 유전자(예를 들어, BRCA1 및 BRCA2), 및 NBS1 복합체의 유전자들이다. 비상동성 말단 결합에 관여하는 유전자(예를 들어, Ku70/80, XRCC4, 폴리(ADP 리보스) 폴리머라제, 및 DNA 리가제 4) 발현을 억제하기 위하여 기술하고 있는 방법 및 조성물과 병행하여 ZFP 기능성 도메인 융합을 유사하게 사용할 수 있다.(Yanez et al. (1998) Gene Therapy 5: 149-159; Hoeijmakers (2001) Nature 411: 366-374 ; Johnson et al. (2001) Biochem. Soc. Trans. 29: 196-201; Tauchi et al. (2002) Oncogene 21: 8967-8980) 징크핑거 결합 도메인과 기능성 도메인의 융합을 이용한 유전자 발현의 활성화와 억제 방법은, 예를 들어 공동 소유의 미국특허 제 6,534,261; 6,824,978 및 6,933,113에 명시되어 있다. 또 다른 억제 방법은 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 억제하려는 유전자 서열을 선택하는소형 간섭 RNA(siRNA 또는 RNAi)를 사용하는 것이다.
상동성 재조합에 관여하는 유전자 발현과 기능성 단편과 관심 영역을 선택하는 징크핑거 결합 도메인의 융합을 활성화하는 다른 방법으로 관심 영역에 재조합 단백질을 추가하여 국소적으로 농도를 높임으로써 상동성 재조합 프로세스를 더욱 가속화시킬 수 있다. 한편, 상기에 기술한 것처럼 상동성 재조합에 관여하는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드의 기능성 단편은 징크핑거 결합 도메인, 절단 도메인 또는 절단 하프-도메인, 및 재조합 단백질 또는 재조합 단백질의 기능성 단편을 포함하는 삼쌍 융합 단백질의 부분이 될 수 있다. 전술한 방법과 조성물에 사용할 수 있는 유전자 전환과 재조합 연관 염색질 리모델링에 관여하는 단백질은 히스톤 아세틸트랜스퍼라제(예를 들어, Esalp, Tip60), 히스톤 메틸트랜스퍼라제(예를 들어, Dotlp), 히스톤 키나제, 및 히스톤 포스파타제를 포함한다.
p53 단백질은 상동성 재조합(HR)을 억제하는데 중요한 역할을 한다고 보고되었다. (Valerie et al., (2003) Oncogene 22: 57925812; Janz, et al. (2002) Oncogene 21: 5929-5933) 예를 들면, p53 결핍 인간 종양 라인에서 HR 속도는 인간 섬유아세포에서 10,000 배 이상 크고 기능성 p53을 가진 종양 세포와 비교하여 비기능성 p53을 가진 종양 세포의 HR 속도가 100 배 정도 크다. (Mekeel et al. (1997) Oncogene 14: 1847- 1857) 또한, p53 우성 음성 돌연변이의 과발현은 자발적인 재조합을 20 배 정도 증가시킨다. (Bertrand et al. (1997) Oncogene 14: 1117-1122) 서로 다른 p53 돌연변이 분석을 통해서 p53의 전사 교차활성과 G1 세포 사이클 체크포인트 조절의 역할과 HR 관여 역할과는 별개임이 밝혀졌다. (Saintigny et al. (1999) Oncogene 18: 3553-3563; Boehden et al. (2003) Oncogene 22: 4111-4117) 따라서, p53 활성을 저하는 본 발명에서 기술하고 있는 방법과 조성물을 이용한 표적 상동성 재조합 효율을 증가시킬 수 있다. p53 활성을 저하시키는 방법은 p53 우성 음성 돌연변이의 공동감염 및 과발현 또는 본 발명 및 미국특허 제 6,534,261호에 기재된 방법에 의한 p53 유전자 발현의 억제를 포함하지만 이것으로 제한되는 것은 아니다.
징크핑거/뉴클레아제 융합 분자 및 도너 DNA 분자를 포함하는 세포에서 유사성 유발 회복 프로세스 활성이 최대일 때 세포 사이클의 G2기에 정지시킴으로써 표적화된 재조합 효율을 더욱 높일 수 있다. 이런 정지는 여러 가지 방법으로 수행할 수 있다. 예를 들면, G2기에 세포를 정지시키기 위해서 세포 사이클 진행에 영향을 주는 약물, 화합물, 작은 분자로 세포를 처리할 수 있다. 이런 유형의 대표 분자로는 미세소관 중합반응에 영향을 미치는 화합물(예를 들어, 빈블라스틴, 노코다졸, 및 택솔), DNA와 작용하는 화합물(예를 들어, 시스-플라티늄(II), 디아민 디클로라이드, 시스플라스틴, 및 독소루비신), 및 DNA 합성에 영향을 주는 화합물(예를 들어, 티미딘, 히드록시우레아, L-미모신, 엑토포시드, 및 5-플로로우라실)을 포함하지만 여기에 제한되는 것은 아니다. 염색질 구조를 세포 재조합 기구에 보다 접근이 용이하도록 변화시키는 히스톤 디아세틸라제(HDAC) 억제제(예를 들어, 소디움 부티레이트 및 트리코스타틴 A)를 사용하여 재조합 효율을 증가시킬 수도 있다.
세포 사이클을 정지시키는 방법은 CDK 세포 사이클 키나제의 활성을 억제하는 단백질의 과발현을 포함하는데, 예를 들면 단백질을 암호화하는 cDNA를 세포내로 도입하거나 단백질을 암호화하는 유전자 발현을 활성화하도록 설계된 ZFP를 세포내로 도입하는 것이다. 시클린 및 CDK의 활성을 억제함으로써 세포 사이클을 정지시킬 수 있는데, 예를 들면 RNAi 방법(미국특허 제 6,506,559호), 세포 사이클 진행에 관여하는 유전자 중 하나 또는 두 개 이상의 발현을 억제하도록 설계된 ZFP를 세포 내로 도입하는 것이다. 예를 들어, 미국특허 제 6,534,261호에 명시된 유전자 발현 억제를 위해 설계된 징크핑거 단백질의 합성 방법을 참조한다.
한편, 어떤 경우에는 표적화된 절단이 도너 폴리뉴클레오티드가 없는 상태에서 일어나고(특히 S 단계 또는 G2 단계에서) 재조합이 상동 염색체 사이에서 일어난다.
상동성 재조합을 일으키는 세포 인자를 확인하는 방법
상동성 재조합은 DNA 말단을 변형시키고 단백질 복합체에 여러 세포 인자를 도입하는 다단계 공정이기 때문에 표적 상동성 재조합을 수행하기 위해서는 징크핑거-절단 도메인 융합을 암호화하는 도너 DNA 및 벡터뿐만 아니라 하나 또는 두 개 이상의 외래 인자를 추가하여야 한다.
외래 인자를 확인하는 대표적인 방법은 서로 다른 세포의 mRNA 발현 양상을 비교하는 유전자 칩(예를 들어, Affymetrix Gene Chip® 분석법)을 이용한 유전자 발현 분석이다. 예를 들면, 유전자 보정 수준을 증가시키는 것으로 알려진 조건의 유무에 상관없이 도너 DNA 및 징크핑거 절단 도메인 융합 존재하에서 이중-나선 말단 유발 상동성 재조합을 가속화시키는 능력이 큰 세포의 유전자 발현 양상을 상기 능력이 부족한 세포와 비교하여 분석할 수 있다. 직접 상동성 재조합 수준을 증가시키는 방법으로 조절 받는 유전자는 확인되어 많은 발현 벡터들 중 하나로 클로닝될 수 있다. 상기 발현 구성체는 상동성 재조합 효율을 높이기 위한 방편으로 징크핑거 절단 도메인 융합 및 도너 구성체와 같이 공동 감염될 수 있다. 한편, 상기 유전자 가운데 하나 또는 두 개 이상을 조절하도록(활성화 또는 억제) 설계된 징크핑거 단백질을 이용하여 유전자 발현을 조절할 수 있다. 예를 들어, 미국특허 제6,534,261호에 명시된 유전자 발현 억제를 위해 설계된 징크핑거 단백질의 합성 방법을 참조한다.
예를 들면, 실시예 9와 도 27에 기술된 실험에서 얻어진 서로 다른 클론들은 징크핑거-절단 도메인 융합을 암호화하는 도너 DNA 및 플라스미드를 감염시킬 때 폭넓은 상동성 재조합 빈도를 보인다. 고효율 표적화된 재조합을 가지는 클론의 유전자 발현은 저효율을 보이는 클론의 유전자 발현과 비교될 수 있고 이런 독특한 유전자 발현 양상을 확인에 이용할 수 있다.
또 다른 예를 들면, 세포 사이클 억제제를(예를 들어, 노코다졸 또는 빈블라스틴, 실시예 11, 14, 및 15 참조) 이용한 연구로 세포 사이클의 G2 단계에 정지된 세포의 상동성 재조합 속도가 더욱 높아서 G2기에 발현되거나 활성이 높은 세포 인자가 상동성 재조합애 중요하다는 것을 알 수 있다. 상기 인자를 확인하는 방법은 높은 수준과 낮은 수준으로 유전자 보정을 하는 안정하게 감염된 HEK 293 세포 클론들(예를 들어, T18 클론 대 T7 클론) 사이의 mRNA 발현 양상을 비교하는 것이다. G2기에 세포를 정지시키는 화합물에 대하여 세포 라인들 사이에서 유사한 비교를 할 수 있다. G2기에 세포를 정지시킨다고 알려진 화합물의 유무와 관계없이 높은 속도로 상동성 재조합을 수행하는 세포에서 발현되는 후보 유전자를 확인하고 클로닝하여 향상된 속도를 재현하기에 충분한지를 확인하기 위하여 세포로 재도입한다. 한편, 상술한 바로 설계된 징크핑거 전사 인자를 이용하면 상기 후보 유전자의 발현이 활성화되었다. 예를 들어, 미국특허 제6,534,261호를 참조한다.
발현 벡터
하나 또는 두 개 이상의 ZFP 또는 ZFP 융합 단백질을 암호화하는 핵산은 복제 및 발현을 위해서 원핵세포 또는 진핵세포로 형질전환시키는 벡터로 클로닝될 수 있다. 벡터는 진핵 벡터로 예를 들면, 플라스미드, 셔틀 벡터, 곤충 벡터, 또는 원핵 벡터를 포함한다. 식물 세포, 동물 세포, 바람직하게는 포유류 세포 또는 인간 세포, 균류 세포, 세균 세포, 또는 원생동물 세포에 도입하기 위하여 ZFP를 암호화하는 핵산도 발현 벡터에 클로닝될 수 있다.
클론된 유전자 또는 핵산을 발현시키기 위해 ZFP 또는 ZFP 융합 단백질을 암호화하는 서열은 보통 직접 전사를 위한 프로모터를 가진 벡터에 서브클로닝된다. 적당한 세균 프로모터 또는 원핵 프로모터는 당해 업계에 널리 알려져 있다. (Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd ed. 1989; 3rd ed., 2001); Kriegler, Gene Transfer and Expression. A Laboratory Manual (1990); 상기의 Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al.) ZFP 발현을 위한 세균 발현 시스템은, 예를 들어 E. coli, Bacillus sp., 및 Salmonella가(Palva et al., Gene 22: 229- 235 (1983)) 유용하다. 상기 발현 시스템 키트는 상업적으로 이용 가능하다. 포유류 세포, 효모, 및 곤충 세포 발현을 위한 진핵 발현 시스템은 당해 업계에 널리 알려져 있으며 상업적으로 이용 가능하다.
ZFP를 암호화하는 핵산의 직접 발현에 사용되는 프로모터는 응용분야에 따라 다르다. 예를 들면, ZFP 발현과 정제를 위해서는 보통 강력한 구조 프로모터를 사용한다. 반면, 유전자 조절을 위하여 ZFP를 생체 내 상에 도입할 때는 ZFP의 용도에 따라 구조 프로모터 또는 유도 프로모터를 사용한다. ZFP 도입을 위한 바람직한 프로모터는 약한 프로모터인데 예를 들면, HSV TK 또는 유사한 활성을 가지는 프로모터가 가능하다.
프로모터는 보통 전사 촉진에 관계하는 요소, 예를 들어 저산소증 대응 요소, Gal4 대응 요소, 락 억제자 대응 요소 및 소형 분자 조절 시스템(예를 들어, tet 조절 시스템과 RU 486 시스템)를 포함한다. (Gossen & Bujard, PNAS 89: 5547 (1992); Oligino et al., Gene Ther. 5: 491-496 (1998); Wang et al., Gene Ther. 4: 432441 (1997); Neering et al., Blood 88: 1147-1155 (1996); Rendahl et al., Nat. Biotechnol. 16: 757-761 (1998)) MNDU3 프로모터도 사용 가능한데 특히 CD34+ 조혈 줄기 세포에서 활성이 높다.
프로모터뿐만 아니라, 발현 벡터도 보통 숙주 세포에서(원핵 또는 진핵) 핵산이 발현되는데 필요한 모든 요소를 다 가지고 있는 전사 단위 또는 발현 카세트가 있다. 전형적인 발현 카세트는 전사된 유전정보, 전사 종결, 리보솜 결합 부위 또는 번역 종결의 효율적인 폴리아데닐화를 위하여 ZFP을 암호화하는 핵산 서열과 신호와 작동 연결된 프로모터를 포함한다. 카세트는 또한 인핸서 및 비상동성 스플라이싱 신호를 포함한다.
식물, 동물, 세균, 균류, 원생동물 등에서 ZFP 발현을 위해서는 유전자 정보를 세포로 도입하기 위하여 특별한 발현 벡터를 사용한다. (아래에 기술되는 발현 벡터 참조) 표준 세균 발현 벡터는 pBR322기반 플라스미드, pSKF, pET23D, 및 GST 와 LacZ같은 상업적으로 이용가능한 융합 발현 시스템으로 구성된 군 중에서 선택된 플라스미드를 포함한다. 대표적인 융합 단백질은 말토스 결합 단백질(MBP)이다. 상기 융합 단백질은 ZFP 정제를 위해서 사용된다. 분리를 용이하게 하고 발현 정도 및 세포내 위치를 확인하기 위해서 재조합 단백질에 에피토프 꼬리표, 예를 들어 c-myc 또는 FLAG을 첨가하였다.
진핵 바이러스의 조절 요소를 가진 발현 벡터는 보통 원핵 발현 벡터, 예를 들어 SV40 벡터, papilloma 바이러스 벡터 및 Epstein Barr 바이러스에서 기인한 벡터에 사용된다. 다른 대표적인 진핵 벡터로는 pMSG, pAV009/A+, pMT010/A+, pMAMneo-5, baculovirus pDSVE, 및 SV40 전반부 프로모터, SV40 후반부 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터, 쥐 유선 종양 바이러스 프로모터, 라우스 살코마 바이러스 프로모터, 폴리헤드린 프로모터, 또는 진핵 세포에서 효과적으로 발현되는 프로모터의 지시로 단백질을 발현시킬 수 있는 모든 벡터를 포함한다.
어떤 발현 시스템은 안전하게 감염된 세포 라인을 선택하는 마커, 예를 들어 티미딘 키나제, 히그로마이신 B 포스포트랜스퍼라제 및 다하드로폴레이트 리덕타제를 가지고 있다. 폴리헤드린 프로모터 또는 강력한 발쿨로바이러스 프로모터의 지시로 ZFP 암호화 서열을 고효율 발현시키는 것은 곤충 세포에서 발쿨로바이러스 벡터를 사용하면 된다.
보통 발현 벡터를 구성하는 요소는 E. coli에서 작용하는 복제원점, 삽입된 플라스미드를 가진 세균의 선택을 위한 항생제 내성 유전자 및 재조합 서열의 삽입을 위한 제한 효소 자리를 포함한다.
대량으로 단백질을 발현하는 세균, 포유류, 효모 또는 곤충 세포 라인을 생성하기 위해 표준 감염 방법이 사용된 후 표준 방법에 의해 정제된다. (Colley et al., J. Biol. Chem. 264: 17619- 17622 (1989); Guide to Protein Purification, in Methods in Enzymology, vol. 182 (Deutscher, ed. , 1990)) 진핵 세포 및 원핵 세포의 형질전환은 표준 방법에 의해 수행된다. (Morrison, J. Bact. 132: 349-351 (1977); Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology 101: 347-362 (Wu et al., eds, 1983)
당해 업계에 잘 알려진 어떤 방법으로도 외부 핵산을 숙주 세포로 도입할 수 있다. 상기 방법은 칼슘 포스페이트 감염, 폴리브린, 원형질체 융합, 전기영동법, 초음파 방법(예를 들어, 소노포레이션), 리포솜, 미세주사, 네이키드 DNA, 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터, 에피솜 및 통합 게놈 및 클론된 게놈 DNA, cDNA, 합성 DNA, 또는 외부 유전 물질을 숙주 세포로 도입하는 방법으로 알려진 모든 방법을 포함한다. (상기의 Sambrook et al.참조) 선택된 단백질을 성공적으로 발현할 수 있는 숙주 세포로 하나 또는 두 개 이상의 유전자를 도입할 때만 특별한 유전 공학 공정이 필요하다.
융합 단백질을 암호화하는 핵산 및 세포 전달
설계된 ZFP를 암호화하는 핵산을 세포(예를 들어, 포유류 세포) 및 표적 조직에 도입하기 위해서 통상적인 바이러스 및 비바이러스 기반 유전자 전달 방법을 사용할 수 있다. 생체 외 상에서 ZFP를 암호화하는 핵산을 세포로 도입하는데 상기 방법을 사용할 수 있다. 어떤 구체예에서, 생체 내 또는 생체 외 유전자 치료법으로 ZFP를 암호화하는 핵산을 도입하였다. 비바이러스 벡터 전달 시스템은 DNA 플라스미드, 네이키드 핵산, 및 리포솜 또는 폴록사머 등의 운반체와 결합한 핵산을 포함한다. 바이러스 벡터 전달 시스템은 세포로 전달된 후 에피솜 또는 통합 게놈이 되는 DNA 바이러스와 RNA 바이러스를 포함한다. 유전자 치료 절차를 개관하기 위해서는 Anderson, Science 256: 808-813 (1992); Nabel & Feigne, TIBTECH 11: 211-217 (1993); Mitani & Caskey, TIBTECH 11: 162166 (1993); Dillon, TIBTECH 11: 167-175 (1993); Miller, Nature 357: 455-460 (1992); Van Brunt, Biotechnology 6 (10): 1149-1154 (1988); Vigne, Restorative Neurology and Neuroscience 8: 35-36 (1995); Kremer & Perricaudet, British Medical Bulletin 51 (1) : 31-44 (1995); Haddada et al., Current Topics in Microbiology and Immunology Doerfler & Bohm (eds) (1995); Yu et al., Gene Therapy 1: 13-26 (1994)을 참조할 수 있다.
설계된 ZFP를 암호화하는 핵산의 비바이러스 전달 방법은 전지천공법, 리포펙션, 미세주사, 탄도법, 비로솜, 리포솜, 면역리포솜, 다가 양이온 또는 지질:핵산 접합체, 네이키드 DNA, 인공 바이론 및 화학물질 촉진 DNA 유입을 포함한다. 소소노포레이션, 예를 들어 Sonitron 2000 시스템(Rich-Mar)을 이용한 방법도 핵산의 전달에 사용할 수 있다.
다른 대표적인 핵산 전달 시스템은 Amaxa Biosystems(Cologne, Germany), Maxcyte, Inc.(Rockville, Maryland) 및 BTX Molesular Syetem(Holliston, MA)의 방법을 포함한다.
리포펙션 방법은 미국특허 제 5,049,386호, 4,946,787호 및 4,897,355호에 명시되어 있으며 리포펙션 시약은 상업적으로 시판되고 있다. (예를 들어, TransfectamTM 및 Lipofectin TM) 폴리뉴클레오티드의 효과적인 리셉터-인식 리포펙션에 적당한 양이온 또는 중성 지질은 Felgner의 지질을 포함한다. (WO 91/17424 및 91/16024) 생체 외 도입을 통해 세포로, 생체 내 도입을 통해 표적 조직으로 전달할 수 있다.
면역지질 복합체 등 표적 리포솜을 포함하는 지질:핵산 복합체의 제조 방법은 당해 업계에 잘 알려져 있다. (Crystal, Science 270: 404-410 (1995); Blaese et al., Cancer Gene Ther. 2: 291-297 (1995); Behr et al., Bioconjugate Chem. 5: 382389 (1994); Remy et al., Bioconjugate Chem. 5: 647-654 (1994); Gao et al., Gene Therapy 2: 710-722 (1995); Ahmad et al., Cancer Res. 52: 4817-4820 (1992); 미국특허 제4,186,183호, 제4,217,344호, 제4,235,871호, 제4,261,975호, 제4,485,054호, 제4,501,728호, 제4,774,085호, 제4,837,028호, 및 제4,946,787호)
설계된 ZFP를 암호화하는 핵산 전달을 위한 RNA 또는 DNA 바이러스 기반 시스템을 사용하면 바이러스가 특이 세포를 표적하고 핵내로 잠입하는 장점이 있다. 바이러스 벡터는 환자에게(생체 내) 또는 직접 투여 또는 생체 외 상에서 세포에 직접 처리할 수 있고 변성된 세포를 환자에게(생체 외) 투여할 수도 있다. ZFP 전달을 위한 통상적인 바이러스 기반 시스템은 유전자 전달을 위한 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노 부속 바이러스 벡터, 백시니아 벡터, 및 단순 포진 바이러스 벡터를 포함하지만 여기에 한정되지는 않는다. 아데노 바이러스, 렌티바이러스 및 아데노 부속 바이러스를 이용한 유전자 전달 방법은 숙주 게놈과 통합이 가능하여 종종 삽입된 트랜스젠을 오랜 기간 발현한다. 또한, 많은 다른 세포와 표적 조직에서 고효율 형질도입이 관찰된다.
레트로바이러스의 친화성은 외부 외피 단백질과 일체화함으로써 변할 수 있어 표적 세포의 종류를 확대시킬 수 있다. 렌티바이러스 벡터는 비분열 세포를 형질도입 또는 감염시켜서 고바이러스 역가를 생성하는 레트로바이러스 벡터이다. 표적 조직에 따라 레트로바이러스 유전자 잔달 시스템이 결정된다. 레트로바이러스 벡터는 6-10 kb 외부 서열을 포장할 수 있는 시스 액팅 긴 말단 반복을 포함한다. 벡터의 복제와 포장을 위해 충분한 최소의 시스 액팅 LTR은 영구적인 트랜스젠 발현을 위해 치료 유전자가 표적 세포로 통합되도록 사용할 수 있다. 널리 사용되는 레트로바이러스 벡터는 쥐 백혈병 바이러스(MuLV), 긴팔원숭이 백혈병 바이러스(GaLV), 원숭이 면역결핍 바이러스(SIV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 및 그들의 조합 바이러스를 포함한다. (Buchscher et al., J. Virol. 66: 2731-2739 (1992); Johann et al., J. Virol. 66: 1635-1640 (1992); Sommerfelt et al., Virol. 176: 58-59 (1990); Wilson et al., J. Virol. 63: 2374-2378 (1989); Miller et al., J. Virol. 65: 2220- 2224 (1991); PCT/US94/05700)
ZFP 융합 단백질을 일시적으로 발현하는 경우에는 아데노바이러스 기반 시스템을 더욱 많이 사용한다. 아데노바이러스계 벡터는 많은 세포들에서 고효율로 형질도입을 일으키지만 세포 분열을 필요로 하지 않는다. 상기 벡터를 이용하면 높은 역가와 높은 수준의 발현을 얻을 수 있다. 상기 벡터는 비교적 간단한 시스템에서 대량으로 생산될 수 있다. 또한 아데노 부속 바이러스(AAV) 벡터는 표적 핵산을 가진 세포로 형질도입하는데 이용되는데, 예를 들면 생체 외 상에서 핵산과 펩티드의 생산 및 생체 내 및 생체 외 상에서 유전자 치료에 이용된다. (West et al., Virology 160: 38-47(1987); 미국특허 제4,797,368호; WO 93/24641; Kotin, Human Gene Therapy 5: 793-801 (1994); Muzyczka, J. Clin. Invest. 94: 1351 (1994) 참조) 재조합 AAV 벡터의 구성은 이미 많은 출판물에 명시되어 있다. (미국특허 제 5,173,414호; Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260(1985); Tratschin, et al., Mol. Cell. Biol. 4: 20722081 (1984); Hermonat & Muzyczka, PNAS 81 : 6466-6470 (1984); Samulski et al., J Virol. 63: 038223828 (1989))
임상 실험에서는 적어도 6개의 바이러스 벡터를 이용한 유전자 전달 방법이 이용되고 있는데 형질도입제를 생성하는 도움 세포 라인에 유전자를 삽입함으로써 결함있는 벡터를 보완하는 접근법이다.
pLASN과 MFG-S는 임상 실험에서 사용되고 있는 레트로바이러스의 예이다 (Dunbar et al., Blood 85: 3048-305 (1995); Kohn et al., Nat. Med. 1: 1017-102 (1995); Malech et al., PNAS 94 : 22 12133-12138 (1997)) PA317/pLASN는 유전자 치료에 사용된 최초의 치료 벡터이다. (Blaese et al., Science 270: 475-480 (1995)) MFG-S 포장 벡터의 형질도입 효율은 50% 또는 그 이상을 보였다. (Ellem et al., Immunol Immunother. 44 (1) : 10- 20 (1997); Dranoff et al., Hum. Gene Ther. 1: 111-2 (1997))
재조합 아데노 부속 바이러스 벡터(rAAV)는 결함 있고 비병원성인 제2형 파르보바이러스 아데노 부속 바이러스를 기반으로 하는 유망한 대체 유전자 전달 시스템이다. 모든 벡터는 트랜스젠 발현 카세트 측면에 위치하는 AAV 145 bp 역위 말단 반복을 보유한 플라스미드로부터 유래한다. 형질도입된 세포의 게놈으로 통합에 기인하는 효율적인 유전자 전달 및 안정한 트랜스젠 전달은 상기 벡터 시스템의 큰 장점이다. (Wagner et al., Lancet 351: 9117 17023 (1998); Kearns et al., Gene Ther. 9: 748-55 (1996))
복제 결핍 재조합 아데노바이러스 벡터(Ad)는 고역가로 생산될 수 있으며 많은 세포들을 감염시킬 수 있다. 대부분의 아데노바이러스 벡터는 트랜스젠이 Ad E1a 유전자, Ad E1b 유전자, 및 Ad E3 유전자를 치환하도록 설계되고 실제로 복제 결함 벡터가 트랜스에 제거된 유전자 기능을 제공하는 인간 293 세포에 전달된다. Ad 벡터는 간, 신장 및 근육에서 발견되는 비분열, 분화 세포를 포함하는 많은 형태의 생체 내 조직에 형질도입할 수 있다. 통상적인 Ad 벡터는 큰 운반 능력을 가진다. 임상 실험에서 Ad 벡터의 사용예는 근육주사를 통한 항종양 면역화를 위한 폴리뉴클레오티드 치료를 포함한다. (Sterman et al., Hum. Gene Ther. 7: 1083-9 (1998)) 임상 실험에서 아데노바이러스 벡터를 이용한 유전자 전달의 사용예는 다음과 같다.;Rosenecker et al., Infection 24: 1 5-10 (1996); Sterman et al., Hum. Gene Ther. 9: 7 1083-1089 (1998); Welsh et al., Hum. Gene Ther. 2: 205-18 (1995); Alvarez et al., Hum. Gene Ther. 5: 597-613 (1997); Topf et al., Gene Ther. 5: 507-513 (1998); Sterman et al., Hum. Gene Ther. 7: 1083-1089 (1998)))
포장 세포는 숙주 세포를 감염시킬 수 있는 바이러스 입자를 형성하는데 사용된다. 상기 세포는 아데노바이러스를 포장하는 293 세포와 레트로바이러스를 포장하는 y 2 세포 또는 PA317 세포를 포함한다. 유전자 치료에 사용되는 바이러스 벡터는 보통 핵산 벡터를 바이러스 입자에 포장하는 생산자 세포 라인에 의해 생산된다. 벡터는 보통 포장과 숙주로 통합되기 위해 필요한 최소의 바이러스 서열만 가지며 다른 바이러스 서열은 발현될 단백질을 암호화하는 발현 카세트에 의해 치환된다. 손실된 바이러스 기능은 포장 세포 라인에 의해 트랜스에 공급된다. 예를 들면, 유전자 치료에 사용되는 AAV 벡터는 포장과 숙주 게놈으로 통합되는데 필요한 AAV 게놈의 역위 말단 반복(ITR) 서열만 가지고 있다. 바이러스 DNA는 다른 AAV 유전자를 암호화하는 도움 플라스미드, 즉 rep 및 cap를 가지고 있지만 ITR 서열은 없다. 아데노바이러스에 의한 오염은 AAV보다 열에 더욱 민감하므로 열처리를 하여 줄일 수 있다.
많은 유전자 치료 응용에서, 유전자 치료 벡터가 특별한 조직으로 높은 특이성을 가지고 전달되는 것이 바람직하다. 따라서, 바이러스 표면에 바이러스 외피 단백질을 가진 융합 단백질로서 리간드를 발현함으로써 바이러스 벡터는 주어진 세포에 특이성을 갖도록 변성될 수 있다. 관심 세포에 존재한다고 알려진 리셉터와 친화성을 가지는 리간드를 선택한다. 예를 들어, 생쥐 백혈병 바이러스는 gp70과 융합된 인간 헤레굴린을 발현하도록 변성될 수 있고 재조합 바이러스는 인간 표피 성장 인자 리셉터를 발현하는 특정 인간 유방암 세포를 감염시킬 수 있다. (Han et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 : 9747-9751 (1995)) 이 이론은 표적 세포가 리셉터를 발현하고 바이러스가 세포 표면 리셉터에 대한 리간드를 포함하는 융합 단백질을 발현하는 다른 바이러스 표적 세포 쌍으로 확장될 수 있다. 예를 들면, 세포 리셉터와 특이적인 결합 친화도를 가지는 항체 단편(예를 들어, FAB 또는 Fv)을 나타내도록 섬유상 파지를 설계할 수 있다. 상기에 바이러스 벡터에 관하여 주로 기술했지만 동일한 이론을 비바이러스 벡터에도 적용할 수 있다. 특이한 표적 세포에 의해 잘 유입되는 서열을 가지도록 상기 벡터를 설계할 수 있다.
보통 시스템 투여(예를 들어, 정맥주입, 복막내 주입, 근육 주입, 피하 주입, 또는 두 개 주입) 또는 하기에 기술될 국소 사용법을 이용하여 환자 개인에게 투입함으로써, 생체 내 상에서 유전자 치료 벡터를 전달할 수 있다. 따라서, 환자 개인에서 떼어낸 세포(예를 들어, 림프구, 골수 흡입, 조직 생체검사 등) 또는 기증 조혈 줄기 세포 등 생체 외 세포에 벡터를 전달한 다음 벡터와 일체화한 세포를 선별한 후 환자에게 재이식한다.
진단, 연구, 또는 감염된 세포를 숙주에 재주입을 통한 치료를 위한 생체 외 세포 감염 기술은 당해 업계에 잘 알려져 있다. 바람직한 구체예는 대상 생물체로부터 세포를 분리하고 ZFP 핵산(유전자 또는 cDNA)으로 감염시킨 후 대상 생물체로 재주입하는 것이다. 생체 외 감염에 적합한 세포 유형은 당해 업계에 잘 알려져 있다. (Freshney et al., Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique (3rd ed. 1994) 환자로부터 세포를 분리하고 배양하는 방법은 인용된 참고문헌 참조)
어떤 구체예에서, 세포 감염과 유전자 치료를 위한 생체 외 과정에서 줄기 세포를 사용하고 있다. 줄기 세포를 이용하는 장점은 골수에 이식될 포유류(세포 도너)에 줄기세포를 도입하거나 생체 외 상에서 다른 세포 유형으로 분화할 수 있다는 것이다. GM CSF, IFN y, TNF a 등의 사이토카인을 이용하여 CD34+ 세포를 임상적으로 중요한 면역 세포로 분화시키는 방법은 밝혀졌다. (Inaba et al., J. Exp. Med. 176: 1693-1702 (1992))
형질도입과 분화를 위해 알려진 방법을 이용하여 줄기세포를 분리하였다. 예를 들면, CD4+ 및 CD8+ (T 세포), CD45+ (panB 세포), GR-1 (과립구), lad (분화된 항체 표현 세포) 등 원하지 않는 세포와 결합하는 항체와 함께 골수세포를 회전하여 골수세포로부터 줄기세포를 분리하였다. (Inaba et al., J. Exp. Med. 176:1693 -1702 (1992))
생체 내 상에서 세포의 형질도입을 위하여 치료용 ZFP 핵산을 가지는 벡터(예를 들어, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 리포솜, 등)을 직접 생물체에 투여할 수 있다. 또한, 네이키드 DNA를 투여할 수도 있다. 분자를 도입하기 위해서는 혈액이나 조직과 접촉할 수 있는 어떤 경로도 가능한데 주사, 주입, 국소 사용 및 전기영동법을 포함하지만 여기에 한정되지는 않는다. 핵산을 투여하는 적당한 방법은 당해 업계에 잘 알려져 있고 특정 조성물을 투여하는데 사용할 수 있는 경로가 하나 이상이지만 보통 특별한 경로가 다른 경로보다 더욱 효과적이다.
예를 들면, DNA를 조혈 줄기세포에 도입하는 방법은 미국특허 제5,928,638호에 명시되어 있다. 조혈 줄기세포, 예를 들어 CD34+ 세포에 트랜스젠을 도입하는데 유용한 벡터는 아데노바이러스 Type 35를 포함한다.
면역세포(예를 들어, T-세포)에 트랜스젠을 도입하는데 적합한 벡터는 비-통합 렌티바이러스 벡터를 포함한다. 예를 들어, Ory et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:11382-11388; Dull et al. (1998) J. Virol. 72:8463-8471; Zuffery et al. (1998) J. Virol. 72:9873-9880; Follenzi et al. (2000) Nature Genetics 25:217-222를 참조한다.
약제학적으로 허용가능한 담체는 조성물을 투여하는 방법뿐만 아니라 투여되는 조성물에 좌우된다. 따라서, 가능한 약제학적 조성물의 제형은 다음에 기술되는 것처럼 매우 다양하다. (Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., 1989)
다양한 통상적인 기술을 통하여 원하는 식물 숙주 게놈에 DNA 구성체를 도입할 수 있다. 상기 기술의 개관을 위해서는, 예를 들어 Weissbach & Weissbach Methods for Plant Molecular Biology (1988, Academic Press, N.Y.) Section VIII, pp. 421-463; 그리고 Grierson & Corey, Plant Molecular Biology (1988,2d Ed.), Blackie, London, Ch. 7 ~ 9를 참조할 수 있다. 예를 들면, 전기영동법 및 식물세포 원형질체의 미세주사 기술을 이용하여 DNA 구성체를 식물세포의 게놈 DNA에 도입하거나 DNA 입자 폭격 등 유전자도입(biolistic) 방법을 이용하여 직접 식물조직에 DNA 구성체를 도입할 수 있다. (Klein et al (1987) Nature 327: 70-73)
또한, DNA 구성체는 적당한 T DNA 측면 영역과 결합할 수도 있고 통상적인 Agrobacterium tumefaciens 숙주 벡터에 도입될 수도 있다. 이중 벡터의 무력화 및 사용을 포함하여 Agrobacterium tumefaciens 중재 형질전환기술은 과학논문에 잘 기술되어 있다. (Horsch et al (1984) Science 233 : 496-498, 및 Fraley et al (1983) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 80: 4803) 이중 T DNA 벡터를 이용하여 세포를 세균으로 감염시키거나(Bevan (1984) Nuc. Acid Res. 12: 8711-8721) 또는 공동 배양할 때(Horsch et al (1985) Science 227: 1229-1231)) Agrobacterium tumefaciens 숙주의 발병기능은 식물숙주 안으로 구성체와 마커가 삽입되었음을 직접 지시할 수 있다. 일반적으로, 쌍떡잎식물을 변형하기 위해서 Agrobacterium 형질전환 시스템을 사용한다. (Bevan et al (1982) Ann. Rev. Genet 16: 357-384; Rogers et al (1986) Methods Enzymol. 118: 627-641) 또한 DNA를 외떡잎식물 및 식물세포에 형질전환뿐만 아니라 전달하기 위해서도 Agrobacterium 형질전환 시스템을 사용한다. (Hernalsteen et al (1984) EMBO J 3: 3039-3041; Hooykass-Van Slogteren et al (1984) Nature 311: 763-764; Grimsley et al (1987) Nature 325: 1677-179; Boulton et al (1989) Plant Mol. Biol. 12: 31-40; 그리고 Gould et al (1991) Plant Physiol. 95: 426-434)
대체 유전자 전달 및 형질전환 방법은 칼슘 중재 벌거숭이 DNA의 유입, 폴리에틸렌글리콜(PEG) 중재 벌거숭이 DNA의 유입, 또는 전기영동법 중재 벌거숭이 DNA의 유입(Paszkowski et al. (1984) EMBO J 3: 2717-2722, Potrykus et al. (1985) Molec. Gen. Genet. 199: 169-177; Fromm et al. (1985) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82: 5824-5828; 그리고 Shimamoto (1989) Nature 338: 274-276) 및 식물조직의 전기영동법을(D'Halluin et al. (1992) Plant Cell 4: 1495-1505) 통한 원형질체 형질전환을 포함하지만 여기에 한정되는 것은 아니다. 식물세포 형질전환을 위한 또 다른 방법은 미세 주사, 탄화 규소 중재 DNA 유입(Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Reporter 9: 415-418) 및 고점도 폭격을(Klein et al. (1988) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85: 4305-4309; 그리고 Gordon-Kamm et al. (1990) Plant Cell 2: 603-618) 포함한다.
외래 서열을 식물세포 게놈의 미리 계산된 위치에 삽입하기 위하여 명시된 방법과 조성물을 이용할 수 있다. 식물 게놈에 도입된 트랜스젠의 발현이 통합 부위에 의존하는 한 상기 방법과 조성물은 유용하다. 따라서, 표적화된 재조합에 의하여 영양소, 항생제, 또는 치료 분자를 암호화하는 유전자를 발현하기 용이한 식물 게놈의 영역에 삽입할 수 있다.
형질전환된 유전형을 포함하여 원하는 표현형을 가지는 식물을 재생하기 위해 상기의 형질전환기술을 이용하여 형질전환된 식물세포를 배양할 수 있다. 재생기술은 조직배양 성장 배지에 조작하는 식물호르몬에 영향을 받으며, 보통 원하는 뉴클레오티드 서열과 함께 도입된 살생물제 또는 제초제 마커에 영향을 받는다. 배양된 원형질체로부터 식물재생은 다음에 기술되어 있다; Evans et al., "Protoplasts Isolation and Culture" Handbook of Plant Cell Culture, pp. 124-176, Macmillian Publishing Company, New York, 1983; 그리고 Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, pp. 21-73, CRC Press, Boca Raton, 1985. 식물캘러스, 외식, 기관, 화분, 배, 또는 그들의 일부분에서도 재생될 수 있다. 상기 재생기술은 Klee et al (1987) Ann. Rev. of Plant Phys. 38: 467-486에 기술되어 있다.
식물세포에 도입된 핵산은 원하는 기질을 제공하기 위해 어떤 식물에도 사용될 수 있다. 본 발명에 명시된 핵산 구성체와 상기에 기술한 형질전환 방법을 이용하여 원하는 생리학적 및 작물학적 성질을 가지도록 많은 식물과 식물세포를 설계할 수 있다. 보다 바람직한 양태는, 설계되는 표적 식물과 식물세포가 외떡잎식물 및 쌍떡잎식물을 포함하지만 여기에 한정되지는 않는다. 예를 들면, 곡물(예, 밀, 옥수수, 쌀, 기장, 보리, 등), 과일(예, 토마토, 사과, 배, 딸기, 오렌지, 등), 마초(예, 자주개나리, 등), 근채(예, 당근, 감자, 사탕무, 참마, 등) 및 엽채(예, 상추, 시금치, 등); 종자식물(예, 페튜니아, 장미, 국화, 등), 침엽수 및 소나무(예, 전나무, 가문비나무, 등); 식물치료에 사용되는 식물(예, 중금속 축적 식물,등); 그리고 유지를(예, 해바라기씨, 평지씨, 등) 포함하는 수확물 및 실험 목적으로 사용되는 식물을(예, 아라비돕시스) 포함하지만 여기에 한정되지는 않는다. 따라서, 본 발명에 명시된 방법과 조성물은 아스파라거스 속, 아베나 속, 브라시카 속, 시트러스 속, 시트럴러스 속, 캡시쿰 속, 쿠쿠르비타 속, 다우쿠스 속, 글리신 속, 호르데움 속, 락투카 속, 리코페르시콘 속, 말루스 속, 마니호트 속, 니코티아나 속, 오리자 속, 페르세아 속, 피슘 속, 피러스 속, 프루너스 속, 라파너스 속, ㅅ세칼레 속, 솔라넘 속, 소르검 속, 트리티쿰 속, 비티스 속, 비그나 속, 및 제아 속의 종들을 포함하지만 여기에 한정되지는 않는다.
당해 업계에 알려진 방법에 의하면 발현 카세트가 안전하게 유전자전이식물에 일체화고 작동이 확인된 후 유성 교배에 의해 다른 식물로 도입될 수 있다. 표준 번식 기술은 교배되는 종에 의해 결정된다.
형질전환 DNA에 존재하는 마커 유전자에 의해 암호화되는 기질을 선택하고 검사함으로써 형질전환된 식물세포, 캘러스, 조직 또는 식물을 확인하고 분리할 수 있다. 예를 들면, 내성을 가지는 형질전환 유전자 구성체를 항생제 또는 제초제를 포함하는 배지에서 배양함으로써 선택할 수 있다. 또한, 재조합 핵산 구성체에 존재할 수 있는 가시적 마커 유전자를(예, ß-글루쿠로니다제, 루시퍼라제, B 또는 Cl 유전자, 등) 이용하여 형질전환된 식물 및 식물세포를 확인할 수도 있다. 상기 선택 및 확인 방법은 당해 업계에 잘 알려져 있다.
삽입된 유전자 구성체를 가지는 식물 또는 식물세포 형질전환체를 확인하기 위해 물리적 및 화학적 방법을 사용할 수도 있다. 상기 방법은 1) 재조합 DNA 삽입체 구조를 확인하기 위한 서던분석 또는 PCR 증폭, 2) 유전자 구성체의 RNA 전사체를 확인하기 위한 노던 블롯, SI RNase 보호, 프라이머-확장 또는 역전사효소-PCR 증폭, 3) 유전자 구성체로 암호화된 산물이 효소 또는 리보자임일 때, 그 활성을 확인하기 위한 효소 검사, 그리고 4) 유전자 구성체로 암호화된 산물이 단백질일 때, 단백질 겔 전기영동법, 웨스턴 블롯 기술, 면역침전법, 또는 효소 연관 면역검사법을 포함하지만 여기에 한정되지는 않는다. 또한 특이한 식물 기관과 조직에서 재조합 구성체의 발현 및 존재를 확인하기 위한 다른 방법은 현지내 혼성법, 효소 염색법, 및 면역염색법이 있다. 상기의 모든 검사법은 당해 업계에 널리 알려져 있다.
본 발명에 명시된 유전자 조작의 결과는 관심 조직에서 분리된 RNA(예, mRNA)를 노던 블롯으로 관찰하였다. mRNA 양이 증가하면,상응하는 내인성 유전자 발현의 증가를 의미한다. 유전자 또는 CYP74B 활성을 측정하는 방법을 이용할 수도 있다. 효소 검사법의 종류는 사용되는 기질의 종류 및 반응 산물 또는 부산물의 증감을 확인하는 방법에 따라 결정된다. 또한, 면역화학적, 즉 ELISA, RIA, EIA 및 당해 업계에 알려진 전기영동 확인검사법(염색법 또는 웨스턴 블롯팅)을 이용한 다른 항체 기반 방법에 의하여 CYP74B 단백질 발현 수준을 측정할 수 있다. 트랜스젠은 상당한 발달 단계들에서 몇몇 식물의 조직에서 선택적으로 발현되거나 전 생명주기에 걸쳐 모든 조직에서 발현되기도 한다. 그러나, 어떤 조합적인 발현도 또한 가능하다.
본 발명은 트랜스젠 또는 유전자 구성체를 가진 형질전환 식물의 종자를 포함한다. 본 발명은 또한 트랜스젠 또는 유전자 구성체를 가진 형질전환 식물의 자손, 클론, 세포 라인, 또는 세포를 포함한다.
운반체
ZFP 융합 단백질 등 폴리펩티드 화합물 투여의 중요한 인자는 폴리펩티드가 세포 원형질막 또는 핵 등의 세포내 구성물의 막을 통과하는 능력을 확보하는 것이다. 세포막은 작고 비이온의 지질친화성 화합물은 쉽게 받아들이지만 극성화합물, 거대분자 및 치료제 또는 진단시약은 받아들이지 않는 지질-단백질 이중막으로 구성되어 있다. 그러나, 상기에 기술된 단백질 및 화합물들은(예, 리포솜 등) ZFP 등의 폴리펩티드를 세포막으로 전위시킬 수 있다.
예를 들면, "막 전위 단백질"은 막 전위 담체로 작용할 수 있는 양친성 또는 친수성 아미노산 서열이 있다. 한 구체예에서 호메오도메인 단백질은 세포막을 통과할 수 있다. 호메오도메인 단백질의 최소 펩티드인 안테나페디아의 구조는 아미노산 위치 43 ~ 58에서 세 쌍 나선형태를 가진다. (Prochiantz, Current Opinion in Neurobiology 6: 629-634 (1996)) 다른 서열인 신호 펩티드의 h(친수성) 도메인도 유사한 세포막 전위 성질을 가진다. (Lin et al., J. Biol. Chem. 270: 14255-14258 (1995))
단백질을 세포로 유입하기 위한 단백질과 연결된 펩티드 서열 예는 HIV tat 단백질의 11개 아미노산 펩티드; p16 단백질의 아미노산 84 ~ 103 dp 상응하는 20 잔기 펩티드(Fahraeus et al., Current Biology 6: 84 (1996)); 안테나페디아 60 아미노산 호메오도메인의 세쌍 나선구조(Derossi et al., J. Biol. Chem. 269: 10444 (1994)); Kaposi 섬유아세포 성장인자(K-FGF)의 h 영역 등의 신호 펩티드의 h 영역 (Lin et al., supra); 또는 HSV의 VP22 전위 도메인을(Elliot & O'Hare, Cell 88: 223-233 (1997)) 포함하지만 여기에 한정되지는 않는다. 세포내 유입을 촉진하는 다른 적당한 화학적 구조도 ZFP에 화학적으로 연결될 수 있다. 또한 막 전위 도메인은(즉, 통합 도메인) 무작위 펩티드 서열 라이브러리로부터 선택될 수 있다. (Yeh et al. (2003) Molecular Therapy 7 (5): S461, Abstract #1191)
독소 분자 또한 폴리펩티드를 세포막을 가로질러 전달할 수 있다. 보통 상기 분자는(이중 독소라 불림) 전위/결합 도메인 또는 폴리펩티드 및 분리된 독소 도메인 또는 폴리펩티드 두 부분으로 구성된다. 전위 도메인 또는 폴리펩티드가 세포막 리셉터에 결합하여 독소가 세포로 전위된다. 가스괴저균 아이오타 독소, 디프테리아 독소(DT), 수도수균 외독소 A(PE), 백일해 독소(PT), 탄저균 독소, 및 백일해 아세틸레이트 시클라제(CYA)를 포함하여 많은 세균 독소들이 세포질로 전달하기 위하여 펩티드의 내부 또는 아미노 말단 융합 형태로 사용된다. (Arora et al., J. Biol. Chem., 268: 3334-3341 (1993); Perelle etal., Infect. Immun., 61: 5147-5156 (1993); Stenmark et al., J. Cell Biol. 113: 1025-1032 (1991); Donnelly et al., PNAS 90: 3530-3534 (1993); Carbonetti et al., Abstr. Annu. Meet. Am. Soc. Microbiol. 95: 295 (1995); Sebo et al., Infect. Immun. 63: 3851-3857 (1995); Klimpel et al., PNAS USA 89: 10277-10281 (1992); 그리고 Novak et al., J. Biol. Chem. 267: 17186-17193 1992))
세포막을 가로질러 ZFP를 이동시키는데 상기 펩티드 서열을 사용할 수 있다. ZFP는 상기 서열과 쉽게 융합하거나 유도될 수 있다. 보통 전위 서열은 융합 단백질의 일부분으로 제공된다. ZFP와 전위 서열을 연결하기 위해 추가로 링커를 사용할 수 있다. 적당한 링커로 펩티드 링커를 사용할 수 있다.
리포솜 및 면역리포솜 등의 리포솜 유도체를 통하여 동물 세포 바람직하게는 포유류 세포에 ZFP을 도입할 수 있다. "리포솜"은 구심으로 정렬된 지질 이중막으로 구성된 운반체를 의미하며 수용액층을 포함할 수 있다. 수용액층은 보통 세포로 전달하려는 화합물, 즉 ZFP를 포함한다.
리포솜은 원형질막과 융합함으로써 약물을 세포질로 방출한다. 한편, 리포솜은 운반체 상태로 세포에 의해 유입되거나 식세포작용으로 내포되기도 한다. 먼저 내포나 식포에서 리포솜이 분해되거나 운반체 막과 융합하여 내용물을 방출한다.
최근의 리포솜을 통한 약물 전달 방법은 리포솜이 투과성이 있고 표적 세포나 조직에서 내용물(본 발명의 경우, ZFP)을 방출한다. 전신 또는 조직 특이적인 전달은 몸 전체에서 다양한 분자들의 작용을 통해 장기간에 걸쳐 리포솜 이중막이 분해되는 방식으로 달성될 수 있다. 또한, 리포솜 운반체의 투과능을 향상시키는 물질을 이용하여 활성 약물을 방출할 수 있다. 리포솜 막은 환경이 산성일 때 분해되도록 구성될 수도 있다. (PNAS 84: 7851 (1987); Biochemistry 28: 908 (1989)) 세포에 의해 내포되면 리포솜은 분해되고 내용물을 방출한다. 상기의 분해를 융합분해라 한다. 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE)가 융합분해 시스템의 근간을 이룬다.
상기 리포솜은 ZFP 및 지질 구성성분, 예를 들어 중성 또는 양성 지질을 포함하고, 추가로 미리 계산된 세포표면 리셉터와 결합하는 항체 등의 리셉터-인지 분자 또는 리간드를 포함할 수 있다. 리포솜을 제조하는 유용한 방법들은 Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9: 467 (1980), 미국특허 제4,186,183호, 제4,217,344호, 제4,235,871호, 제4,261,975호, 제4,485,054호, 제4,501,728호, 제4,774,085호, 제4,837,028호, 제4,235,871호, 제4,261,975호, 제4,485,054호, 제4,501,728호, 제4,774,085호, 제4,837,028호, 제4,946,787호, PCT/WO/91/17424, Deamer & Bangham, Biochim. Biophys. Acta 443: 629-634 (1976); Fraley, et al., PNAS 76: 3348-3352 (1979); Hope et al., Biochim. Biophys. Acta 812: 55-65 (1985); Mayer et al., Biochim. Biophys. Acta 858: 161-168 (1986); Williams et al., PNAS 85: 242246 (1988); Liposomes (Ostro (ed. ), 1983, Chapter 1); Hope et al., Chem. Phys. Lip. 40: 89 (1986); Gregoriadis, Liposome Technology (1984) and Lasic, Liposomes : from Physics to Applications (1993)에 기술되어 있다. 예를 들면, 적당한 방법으로 초음파처리법, 압출법, 고압균질화법, 미세유동화법, 투석법, 작은 리포솜의 칼슘 유도 융합법, 에테르 융합법 등을 포함하는데 당해 업계에 잘 알려져 있다.
어떤 구체예에서, 세포유형, 조직 등에 특이적인 표적 부분을 이용하여 리포솜을 원하는 곳에 표적하고 있다. 다양한 표적 잔기를(예, 리간드, 리셉터, 단일클론 항체,등) 이용한 리포솜의 표적은 미국특허 제4,957,773호 및 제4,603,044호에 기술되어 있다.
표적 잔기의 예는 전립선암 특이적 항체 및 MAGE 등의 신생물과 연관된 항원에 특이적인 단일클론 항체들이다. ras 또는 c-erbB2 등의 종양유전자의 활성화나 과발현을 결과 생성되는 유전자 산물을 확인함으로써 암을 진단할 수 있다. 또한 많은 종양은 태아 조직에서 일반적으로 발현되는 항원, 예를 들어 알파펙토프로테인(AFP), 태아 종양성 항원(CEA) 등을 발현한다. 바이러스 감염부위는 B형 간염 코어 및 표면 항원(HBVc, HBVs), C형 감염 항원, 엡스타인-바 바이러스 항원, 제 1형 인간 면역결핍 바이러스(HIVI) 및 파필로마 바이러스 항원을 이용하여 진단한다. 염증은 염증부위에서 발현되는 표면 분자, 예를 들어 인테그린(예, VCAM-1), 셀렉틴 리셉터(예, ELAM 1) 등을 이용하여 확인한다.
리포솜에 표적제를 붙이기 위해 표준 방법을 사용할 수 있다. 상기 방법은 일반적으로 표적제를 붙이도록 활성화될 수 있는 지질 구성성분(예,포스파티딜에탄올아민) 또는 유도된 지질친화성 화합물에(예, 지질 유도체인 블레마이신) 일체화되어 리포솜에 도입된다. 단백질 A 와 일체화된 리포솜을 이용하여 항체 표적 리포솜을 구성할 수 있다. (Renneisen et al., J Biol. Chem., 265: 16337-16342 (1990) 및 Leonetti et al., PNAS 87: 2448-2451 (1990))
용량
치료에 응용하기 위하여 환자 또는 환자에 도입될 세포에 대한 투여 용량은 장시간 유효한 치료반응을 나타낼 만큼 충분하여야 한다. 또한, 기능성 게놈 연구 등의 실험적 조건 및 세포나 동물 모델에서 표현형의 변화를 확인하기 위해서는 특별 용량섭생법이 유용하다. 용량은 환자의 몸무게 또는 표면적 뿐만 아니라 사용된 ZFP의 효능 및 Kd, 표적세포의 핵 부피 및 환자의 상태에 의해 결정된다. 용량은 또한 환자에게 화합물 또는 벡터를 투여할 때 동반하는 부작용의 존재, 특성 및 정도에 의해 결정된다.
표적 세포에 99 % 결합하는 ZFP의 최대 유효 치료용량은 세포당 ZFP 분자 1.5x105 - 1.5x106 을 넘지않는 범위에서 계산된다. 이 결합 수준을 위한 세포당 ZFP 분자수는 헬라 세포 핵의 부피를(대략 1000 mm3 또는 10-12 L; Cell Biology, (Altman & Katz, eds. (1976)) 이용하여 아래와 같이 계산된다. 헬라 핵 크기는 비교적 크기 때문에 표적 세포 핵 부피를 이용하여 용량은 필요에 따라 재계산된다. 이 계산을 다른 부위에 의한 ZFP의 결합은 고려하지 않았다. 이 계산은 또한 모든 ZFP 가 핵내에 존재한다고 가정하였다. 표적 부위와 99 % 결합 계산을 위하여 100x Kd 값을 사용하였고 90 % 결합 계산을 위해서는 lOx Kd 값을 사용하였다. 예를 들어, Kd = 25 nM 라면
ZFP + 표적 부위
Figure pat00002
복합체
즉, DNA + 단백질
Figure pat00003
DNA: 단백질 복합체
Kd= [DNA] [단백질]
[DNA:단백질 복합체]
ZFP가 50% 결합하였을 때 Kd = [단백질]
그래서 [단백질] = 25 nM, 핵 부피가 10-l2 L 일때
[단백질] = (25x10-9 moles/L)(10-12 L/핵)(6x1023 분자/mole)
= 15,000 분자/핵 (50% 결합의 경우)
99% 결합하였을 때; 1OOx Kd = [단백질]
100x Kd = [단백질] = 2.5 mM
(2.5xlO-6moles/L)(10-l2L/핵)(6xlO23분자/mole)
= 약 1,500,000 분자 /핵 (99% 결합의 경우)
ZFP를 암호화하는 발현 벡터의 적당한 용량은 또한 프로모터에서 ZFP 평균발현속도 및 세포에서 ZFP 평균분해속도를 고려하여 계산될 수 있다. 어떤 구체예에서, 상기에서 기술한 바대로 야생형 또는 변종 HSV TK 프로모터 등 약한 프로모터를 사용하였다. ZFP의 분자량을 고려하여 μg의 ZFP용량이 계산되었다.
질병의 치료와 예방을 위한 ZFP 투여량을 결정할 때 전문의는 ZFP 또는 ZFP를 암호화하는 핵산의 순환 원형질 수준, 잠재적 ZFP 독성, 질병의 진행 및 항 ZFP 항체의 생성을 검정하고 한번에 또는 나누어 투여한다.
제약 조성물 및 투여
ZFP와 이를 암호화하는 발현 벡터는 표적화된 절단 및/또는 재조합을 위하여 환자에게 직접 투여될 수 있다. 그리고, 예를 들어, 암, 허혈, 당뇨병성 망막증, 시력감퇴, 류머티즘성 관절염, 건선, HIV 감염, 겸상 적혈구 빈혈증, 노인성 치매, 근위축증, 신경퇴행성 질환, 혈관 질환, 낭포성 섬유증, 뇌졸중, 기타의 치료나 예방을 위해서도 마찬가지다. ZFP 유전자 요법을 방해할 수 있는 미생물의 예로는, 클라미디아, 리케차, 마이코박테리아, 포도구균, 연쇄상구균, 폐렴구균, 메닝고구균과 코노구균, 클레브시엘라, 프로테우스, 세라치아, 슈도모나스, 레지오넬라균, 디프테리아균, 살로넬라균, 바실루스균, 콜레라균, 파상풍균, 보툴리누스균, 탄저균, 페스트균, 렙토스피라균, 라임병 박테리아 등과 같은 병원성 박테리아; 아스페르길루스, 칼럼디다균 등과 같은 전염성 진균류; 포자충류(말라리아 원충), 근족충류(엔트아메바), 편모충류(트리파노소마, 리슈마니아, 트리코모나스, 지아디아 등) 등과 같은 원생동물문; 간염(A, B, C), 헤르페스 바이러스(예, VZV, HSV-1, HSV- 6, HSV-11, CMV, EBV), HIV, 에볼라, 아데노바이러스, 인플루엔자 바이러스, 플라비 바이러스, 에코 바이러스, 감기 바이러스, 콕사키 바이러스, 코로나 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 이하선염 바이러스, 로타바이러스, 홍역 바이러스, 풍진 바이러스, 파보 바이러스, 우두 바이러스, HTLV 바이러스, 뎅기열 바이러스, 유두종 바이러스, 폴리오 바이러스, 공수병 바이러스, 뇌염 바이러스 등과 같은 바이러스병 등이 있다.
치료에 효과적인 투여량은 ZFP가 치료할 생체 조직에 최종적으로 도달하게끔 보통 이용되는 경로에 의해 결정한다. ZFP는 모든 적절한 방식으로 투여되는데, 약학적으로 허용되는 매개체에 의함이 바람직하다. 그러한 조절물을 투여하는 적절한 방법은 이용가능하며 또 해당 기술 분야에서 잘 알려져 있다. 특정한 조성물을 투여하는 방식에는 하나 이상의 투여 경로가 가능하지만, 특정의 투여 경로만이 더 빠르고 더 효과적인 반응을 보이는 경우가 종종 있다.
약학적으로 허용되는 매개체는 상기 조성물을 투여하는데 이용되는 특정한 방법에 의해 결정됨은 물론, 부분적으로는 투여되는 특정한 조성물에 의해서도 결정된다. 그에 따라 이용가능하면서 적절한 제약 조성물의 제형의 종류는 다양하다. (예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed. 1985 참조).
ZFP는, 독자적으로나 아니면 다른 적절한 구성물과의 조합으로, 흡입으로 투여될 수 있는 연무질의 제형으로 만들어져 분무될 수도 있다. 연무질 제형은 디클로로디플루오로메탄, 프로판, 질소 등과 같은 압축된 용인 추진물에 놓여 질 수 있다.
정맥주사, 근육주사, 피내주사, 피하주사와 같은 비경구 투약에 적당한 제형에는, 수성 및 비수성, 등장성 살균 주사 용액이 있는데, 이는 산화방지제, 완충제, 세균발육저지제, 수용체의 피와 등장성을 유지시키는 용매, 수성 및 비수성의 살균 현탁물을 함유하고, 그 현탁물은 현탁화제, 가용화제, 농밀화제, 안정화제, 방부제를 함유한다. 본 발명의 조성물들은, 예를 들어, 정맥 주사, 경구, 국부적, 복막내, 방광내, 경막내 등으로 투여될 수 있다. 화합물의 제형은 1회 복용 또는 수회복용으로 앰풀이나 병과 같은 용기에 밀봉되어 담을 수 있다. 주사 용액과 현탁물은 살균 가루, 미립, 앞서 기술한 정제류 등을 이용하여 준비할 수 있다.
용도
표적화 절단을 위한 개시된 방법 및 조성물은, 예를 들어 두 부위에서 절단하고 그 사이에 서열을 삽입함으로써, 한 부위에서 절단한 후 비-상동성 단부 잇기에 의해, 한 부위 또는 두 부위를 절단하면서 브레이크들 사이에 외래 서열을 삽입함으로써, 및/또는 한 부위를 절단하여 1개 또는 2개 또는 몇 개의 뉴클레오티드를 제거함으로써 게놈 서열에 돌연변이를 유도하는데 사용될 수 있다. 또한, 표적화 절단은 유전자 녹-아웃(예를 들어, 기능적 유전자학 또는 표적 유효화를 위해)을 만들고, 게놈에 서열의 표적화 삽입(즉, 유전자 녹-인)을 용이하게 하는데 사용될 수 있으며, 예를 들어 이것은 세포조작 또는 단백질 과발현을 위해 사용된다. 삽입은 상동성 재조합을 통하거나 표적화 통합에 의한 염색체 서열의 치환에 의해 이루어질 수 있으며, 여기서는 염색체 내 관심 영역에 상동성인 서열이 측면에 존재하는 새 서열(즉, 관심 영역에는 존재하지 않는 서열)이 정해진 표적 부위에 삽입된다.
또한, 동일한 방법이 야생형 서열과 돌연변이 서열을 치환하는데, 또는 하나의 대립유전자를 다른 대립유전자로 전환하는데 사용될 수 있다.
감염된 또는 통합된 바이러스 게놈의 표적화 절단이 숙주에서 바이러스 감염을 치료하는데 사용될 수 있다. 추가하여, 바이러스 수용체를 암호화하는 유전자의 표적화 절단이 이러한 수용체의 발현을 차단하는데 사용될 수 있으며, 이로써 숙주 유기체에서 바이러스 감염 및/또는 바이러스 전파가 방지된다. 바이러스 수용체(예를 들어, HIV의 CCR5 및 CXCR4 수용체)를 암호화하는 유전자의 표적화 돌연변이는 수용체가 바이러스와 결합할 수 없게 만드는데 사용될 수 있으며, 이로써 새로운 감염이 방지되고 기존 감염의 전파가 차단된다. 치료될 수 있는 바이러스 또는 바이러스 수용체의 비-제한적 예는 헤르페스 단순 바이러스(HSV), 예를 들어 HSV-I 및 HSV-2, 대상포진 바이러스(VZV), 엡스타인-바 바이러스(EBV) 및 시토메갈로바이러스(CMV), HHV6 및 HHV7을 포함한다. 간염 군 바이러스는 A형 간염 바이러스(HAV), B형 바이러스(HBV), C형 바이러스(HCV), D형 간염 바이러스(HDV), E형 간염 바이러스(HEV) 및 G형 간염 바이러스(HGV)를 포함한다. 표적화 될 수 있는 다른 바이러스 또는 바이러스 수용체는, 제한되는 것은 아니지만, 피코르나비리다에(예를 들어, 폴리오바이러스 등); 칼리시비리다에; 토가비리다에(예를 들어, 루벨라 바이러스, 뎅그열 바이러스 등); 플라비비리다에; 코로나비리다에; 레오비리다에; 비르나비리다에; 라보도비리다에(예를 들어, 라비에스 바이러스 등); 필로비리다에; 파라믹소비리다에(예를 들어, 유행성이하선염 바이러스, 홍역 바이러스, 호흡기 신시티아 바이러스 등); 오르토믹소비리다에(예를 들어, 인플루엔자 바이러스 A형, B형 및 C형 등); 분야비리다에; 아레나비리다에; 레트로비리다에; 렌티바이러스(예를 들어, HTLV-I; HTLV-II; HIV-I(HTLV-III, LAV, ARV, hTLR, 등으로도 알려짐) HIV-II); 유인원 면역결핍 바이러스(SIV), 인간 유두종 바이러스(HPV), 인플루엔자 바이러스 및 진드기-매개 뇌염 바이러스를 포함한다. 예를 들어, 이들 및 다른 바이러스에 대한 설명은, Virology, 3판(W. K. Joklik ed. 1988); Fundamental Virology, 2판(B. N. Fields and D. M. Knipe, eds. 1991)을 참조한다. HIV 수용체는, 예를 들어, CCR-5 및 CXCR-4를 포함한다.
유사한 방식으로, 감염된 박테리아의 게놈이 표적화 DNA 절단 후 비-상동성 단부 잇기에 의해 돌연변이될 수 있으며, 이로써 박테리아 감염이 차단되거나 개선된다.
표적화 재조합을 위한 개시된 방법은 어떤 게놈 서열을 상동성이지만 동일하지는 않은 서열로 치환하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 돌연변이 게놈 서열이 그것의 야생형 카운터파트로 치환될 수 있으며, 이로써, 예를 들어 유전질환, 유전된 장애, 암, 및 자가면역질환의 치료 방법이 제공된다. 유사한 방식으로, 유전자의 한 대립유전자가 본원에 개시된 표적화 재조합 방법을 사용하여 다른 대립유전자로 치환될 수 있다.
전형적인 유전질환은, 제한되는 것은 아니지만, 연골무형성, 완전색맹, 산 말타제 결핍, 아데노신 데아미나제 결핍(OMIM No. 102700), 부신백질이영양증, 에이카르디 증후군, 알파-1 안티트립신 결핍, 알파-탈라세미아, 안드로겐 무감응 증후군, 에퍼트 증후군, 부정맥성 우심실 심근병증, 이형성증, 혈관확장성 실조증, 바스 증후군, 베타-탈라세미아, 청색고무포말모반 증후군, 카나반병, 만성 육아종병(CGD), 묘성증후군, 낭성섬유증, 더컴병, 외배엽이형성증, 판코니 빈혈, 진행성 골화성 섬유이형성, 취약성 X 염색체 증후군, 갈락토오스혈증, 고셔병, 범발성 강글리오시드증(예를 들어, GM1), 혈색소증, 베타-글로빈의 6번째 코돈에서의 헤모글로빈 C 돌연변이(HbC), 혈우병, 헌팅턴병, 후를러 증후군, 저인산염증, 클라인펠터 증후군, 크라베병, 랑게-기디온 증후군, 백혈구 유착 결핍(LAD, OMIM No. 116920), 백질이영양증, QT 간격연장 증후군, 마르팡 증후군, 뫼비우스 증후군, 뮤코다당증 (MPS), 손톱 무릎뼈 증후군, 신장성 요붕증, 신경섬유종증, 니만-픽 병, 골형성부전증, 포피린증, 프라더-윌리 증후군, 조로증, 프로테우스 증후군, 망막모세포증, 레트 증후군, 루빈스타인-테이비 증후군, 산필립포 증후군, 중증 합병성 면역결핍 (SCID), 슈와크만 증후군, 겸상적혈구질환(겸상적혈구빈혈증), 스미스-마제니스 증후군, 스틱클러 증후군, 테이삭스병, 저혈소판 요골무형성(TAR) 증후군, 트리쳐-콜린스 증후군, 삼염색체증, 결절성 경화증, 터너 증후군, 요소 주기 장애, 본 히펠-란도 병, 바르덴부르크 증후군, 윌리엄스 증후군, 윌슨병, 위스콧-알드리치 증후군, 반성 유전성 림프증식성 증후군(XLP, OMIM No. 308240)을 포함한다.
표적화 DNA 절단 및/또는 상동성 재조합에 의해 치료될 수 있는 추가의 전형적인 질환들은 후천적 면역결핍증, 리소좀 저장병(예를 들어, 고셔병, GM1, 파브리병 및 테이-삭스 병), 뮤코다당증(예를 들어, 헌터병, 후를러병), 혈색소병증(예를 들어, 겸상적혈구질환, HbC, 알파-탈라세미아, 베타-탈라세미아) 및 혈우병을 포함한다.
어떤 사례에서, 다능성 세포(예를 들어, 조혈 줄기세포)의 게놈 서열의 변경이 바람직하다. 조혈 줄기세포의 모집, 부화 및 배양 방법은 본 분야에 잘 공지되어 있다. 예를 들어, U.S. 특허 5,061,620; 5,681,559; 6,335,195; 6,645,489 및 6,667,064를 참조한다. 처치된 줄기세표는, 제한은 아니지만, SCID 및 겸상적혈구빈혈증을 포함하는 여러 질환의 치료를 위해 환자에게 다시 복귀될 수 있다.
이런 사례들의 대부분에서, 관심 영역은 돌연변이를 포함하고, 도너 폴리뉴클레오티드는 상응하는 야생형 서열을 포함한다. 유사하게, 바람직하다면 야생형 게놈 서열이 돌연변이 서열로 치환될 수 있다. 예를 들어, 유전자 돌연변이에 의해서, 또는 유전자 제어 서열을 낮은 비-병원성 수준의 발현을 지원하는 서열로 치환함으로써 종양유전자의 과별현이 반전될 수 있다. 다른 예로서, AopAI 유전자의 야생형 대립유전자가 죽상경화증의 치료를 위해 ApoAI 밀라노 대립유전자로 치환될 수 있다. 사실상, 특정 게놈 서열에 의존하는 어떤 병인은 어떤 방식으로든 본원에 개시된 방법 및 조성물을 사용하여 교정되거나 완화될 수 있다.
또한, 표적화 절단 및 표적화 재조합은 비-코딩 서열(예를 들어, 프로모터, 인핸서, 이니시에이터, 터미네이터, 스플라이스 부위와 같은 조절 서열)을 변경함으로써 유전자 산물의 발현 수준을 변경하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 방법은, 예를 들어 치료 목적, 기능적 유전자학 및/또는 표적 유효화 연구를 위해 사용될 수 있다.
또한, 본원에 설명된 조성물 및 방법은 동종 이식편에 대한 숙주의 면역반응을 다루는 새로운 접근법 및 시스템을 허용한다. 특히, 동종 줄기세포(또는 어떤 종류의 동종 세포)가 숙주 레시피언트에 이식될 때 직면하는 주된 문제는 주로 이식된 세포 표면상의 주 조직적합성 복합체(MHC)의 인식을 통해 매개되는 숙주의 면역 시스템에 의한 높은 거부 위험이다. MHC는 공통 β 서브유닛과 가변적 α 서브유닛으로 이루어진 이종이량체로서 기능하는 HLA I형 단백질(들)을 포함한다. HLA가 없는 줄기세포로부터 유래한 조직 이식편은 숙주의 면역반응으로부터 벗어난다는 것이 증명되었다. 예를 들어, Coffman et al. J Immunol 151, 425-35. (1993); Markmann et al. Transplantation 54, 1085-9. (1992); Koller et al. Science 248, 1227-30. (1990)를 참조한다. 본원에 설명된 조성물 및 방법을 사용하여, 이식편 거부에 연관된 HLA 단백질을 암호화하는 유전자의 코딩 또는 조절 서열이 재조합에 의해 절단, 돌연변이 또는 변경될 수 있으며, 이로써 그 발현이 차단되거나, 이들이 비-기능적 산물을 발현하게 된다. 예를 들어, 본원에 설명된 ZFP 융합 단백질을 사용하여 공통 β 서브유닛 유전자(β2 마이크로글로불린)를 암호화하는 유전자를 불활성화함으로써, I형 HLA가 세포로부터 제거되어 어떤 도너로부터 HLA I형 무표지 세포가 신속하면서도 신뢰할 만하게 생성될 수 있으며, 이로써 줄기세포를 이식하는 동안 아주 일치하는 도너/레시피언트 MHC 일배체형에 대한 필요성이 감소된다.
예를 들어, 단일 절단 사건, 절단 후 비-상동성 단부 잇기, 두 부위의 절단 후 결합시켜 두 절단 부위 사이의 서열을 결실, 코딩 영역 쪽 미스센스 또는 논센스 코돈의 표적화 재조합, 또는 무관한 서열(즉, "스터퍼" 서열)의 표적화 재조합에 의해 어떤 유전자(예를 들어, β2 마이크로글로불린 유전자)의 불활성화가 달성될 수 있다.
공동 소유의 WO 01/83793에 개시된 대로, 염색질 구조의 표적화 변형이 융합 단백질과 세포 염색질의 결합을 촉진하는데 사용될 수 있다.
추가의 구체예에서, 본원에 개시된 징크핑거-절단 도메인 융합체에 더하여, 또는 그 대신에 징크핑거 결합 도메인과 재조합효소(또는 그 기능 단편) 사이의 하나 이상의 융합체를 사용하여 표적화 재조합을 촉진할 수 있다. 예를 들어, 공동 소유의 U.S. 특허 No. 6,534,261 및 Akopian et al. (2003) Proa Natl. Acad. Scl. USA 100:8688-8691를 참조한다.
추가의 구체예에서, 개시된 방법 및 조성물은 활성을 위해 이량체화(동종이량체화 또는 이종이량체화)를 필요로 하는 전사 활성화 또는 억제 도메인과 ZFP 결합 도메인의 융합을 제공하는데 사용된다. 이들 경우에, 융합 폴리펩티드는 징크핑거 결합 도메인과 기능 도메인 단량체(예를 들어, 이량체 전사 활성화 또는 억제 도메인의 단량체)를 포함한다. 적절히 위치한 표적 부위에 이러한 두 융합 폴리펩티드의 결합은 이량체화를 허용함으로써 기능적 전사 활성화 또는 억제 도메인이 복구된다.
표적화 통합
상기 설명된 대로, 본원에 제시된 방법 및 조성물은 세포 게놈의 관심 영역에 외래 서열을 표적화 통합하는데 사용될 수 있다. 게놈의 이중-가닥 브레이크에 외래 서열의 표적화 통합은 상동성-의존적 및 상동성-독립적 메커니즘 모두에 의해 일어날 수 있다.
상기 주지된 대로, 어떤 구체예에서, 상동성-의존적 및 상동성-독립적 메커니즘 모두에 의한 표적화 통합은 절단에 의해 생긴 단부들 사이에 외래 서열을 삽입하는 것을 포함한다. 삽입된 외래 서열은 어떤 길이일 수 있으며, 예를 들어 1 내지 50개 뉴클레오티드 길이(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45 또는 50개 뉴클레오티드 서열)의 비교적 짧은 "패치" 서열일 수 있다.
표적화 통합이 상동성-의존적인 경우, 도너 핵산 또는 도너 서열은 정해진 게놈 서열(즉, 표적 부위)과 동일하거나 또는 상동성이지만 동일하지는 않은 하나 이상의 서열과 함께 외래 서열을 포함한다. 어떤 구체예에서, 2개의 동일한 서열 또는 2개의 상동성이지만 동일하지는 않은 서열(또는 각 하나씩)은 외래 서열의 측면에 존재한다. 외래 서열(또는 외래 핵산 또는 외래 폴리뉴클레오티드)는 정상적으로는 관심 영역에 존재하지 않는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 서열이다.
전형적인 외래 서열은, 제한되는 것은 아니지만, cDNA, 프로모터 서열, 인핸서 서열, 에피토프 택, 마커 유전자, 절단 효소 인식부위 및 여러 종류의 발현 구성체들을 포함한다. 마커 유전자는, 제한되는 것은 아니나, 항생제 내성(예를 들어, 암피실린 내성, 네오마이신 내성, G418 내성, 퓨로마이신 내성)을 매개하는 단백질을 암호화하는 서열, 착색 또는 형광 또는 발광 단백질(예를 들어, 녹색 형광 단백질, 강화 녹색 형광 단백질, 적색 형광 단백질, 루시페라제)을 암호화하는 서열, 및 증진된 세포 성장 및/또는 유전자 증폭을 매개하는 단백질(예를 들어, 디히드로폴레이트 환원효소)을 포함한다. 에피토프 택은, 예를 들어 FLAG, His, myc, Tap, HA 또는 어떤 검출가능한 아미노산 서열의 하나 이상의 카피들을 포함한다.
단백질 발현 구성체는, 제한되는 것은 아니지만, cDNA 및 cDNA 서열과 작동 연결된 전사 제어 서열을 포함한다. 전사 제어 서열은 프로모터, 인핸서 및 인슐레이터를 포함한다. 발현 구성체에 포함될 수 있는 추가의 전사 및 번역 조절 서열은, 예를 들어 내부 리보솜 점입 부위, 2A 펩티드 암호화 서열 및 폴리아데닐화 신호를 포함한다. 전형적인 단백질 발현 구성체는 항체 중쇄 암호화 서열 및 항체 경쇄 암호화 서열을 포함하며, 각 서열은 프로모터(동일하거나 상이한 프로모터)에 작동 연결되고, 어느 한 서열 또는 두 서열 모두는 선택적으로 인핸서에 연결된다(두 코딩 서열이 모두 인핸서에 연결된 경우에 인핸서는 동일하거나 상이할 수 있다).
절단 효소 인식부위는, 예를 들어 제한 엔도뉴클레아제, 귀소성 엔도뉴클레아제 및/또는 메가뉴클레아제에 의해 인식되는 서열을 포함한다. 절단 효소 인식부위의 표적화 통합(상동성-의존적 또는 상동성-독립적 메커니즘에 의한)은 게놈이 특정 효소에 의해서 절단될 수 있는 하나의 부위만을 함유하는 세포를 생성하는데 유용하다. 이러한 세포를 단일 부위를 인식하여 절단하는 효소와 접촉시킴으로써 이후의 외래 서열의 표적화 통합(상동성-의존적 또는 상동성-독립적 메커니즘) 및/또는 절단된 부위에서의 표적화 돌연변이가 용이해진다.
절단 효소 인식부위의 한 예는 귀소성 엔도뉴클레아제 I-SceI에 의해 인식되는 것인데, 이것은 서열: TAGGGATAACAGGGTAAT(SEQ ID NO:213)을 가진다. 예를 들어, U.S. 특허 No. 6,833,252를 참조한다. 추가의 전형적인 귀소성 엔도뉴클레아제는 I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-TevI, I-TevII 및 I-TevIII를 포함한다. 이것들의 인식 서열은 공지되어 있다. 또한, U.S. 특허 No. 5,420,032; Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388; Dujon et al. (1989) Gene 82:115-118; Perler et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 1125-1127; Jasin (1996) Trends Genet. 12:224-228; Gimble et al. (1996) J. Mol. Biol. 263:163-180; Argast et al. (1998) J. Mol. Biol. 280:345-353 및 New England Biolabs 카탈로그를 참조한다.
대부분의 귀소성 엔도뉴클레아제의 절단 특이성은 그것의 인식부위에 대해서 절대적이지는 않지만, 인식부위는 귀소성 엔도뉴클레아제 인식부위의 단일 카피를 함유하는 세포에서 귀소성 엔도뉴클레아제를 발현시킴으로써 포유류-규모 게놈 당 단일 절단 사건이 획득될 수 있을 정도의 충분한 길이를 가진다. 또한, 절단 효소가 비-자연적 표적 부위에 결합하도록 조작될 수 있다는 것도 보고된바 있다. 예를 들어, Chevalier et al. (2002) Molec. Cell 10:895-905; Epinat et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:2952-2962; Ashworth et al. (2006) Nature 441:656-659를 참조한다.
귀소성 엔도뉴클레아제를 사용하여 표적화 재조합 및 통합을 획득하는 이전의 방법은 인식부위의 표적화 삽입이 극도로 비효과적이며, 때문에 원하는 위치에 삽입된 인식부위를 함유한 세포를 확인하기 위한 힘든 스크리닝 과정이 필요하다는 문제가 있었다. 본 방법은 DNA-절단 효소 인식부위의 매우-효율적인 표적화 통합(상동성-의존적 또는 상동성-독립적)을 허용함으로써 이런 문제들을 극복한다.
어떤 구체예에서, 표적화 통합은 RNA 발현 구성체, 예를 들어 마이크로 RNA 또는 siRNA의 조절된 발현을 초래하는 서열을 삽입하는데 유용하다. 상기 설명된 바와 같은 프로모터, 인핸서 및 추가의 전사 조절 서열이 또한 RNA 발현 구성체에 통합될 수 있다.
표적화 통합이 상동성-의존적 메커니즘에 의해 발생하는 구체예에서, 도너 서열은 외래 서열의 측면 영역에서 충분한 상동성을 함유함으로써 게놈 서열에 있는 이중-가닥 브레이크의 상동성-지정 수선을 지원하며, 이로써 게놈 표적 부위에 외래 서열이 삽입된다. 따라서, 도너 핵산은 상동성-의존적 수선 메커니즘(예를 들어, 상동성 재조합)에 의한 외래 서열의 통합을 지원할 만큼 충분한 어떤 크기를 가질 수 있다. 어떤 특정 이론에 결부시키기 원하지 않지만, 외래 서열 측면의 상동성 영역이 이중-가닥 브레이크 부위에 있는 유전 정보의 재합성을 위한 주형을 파괴된 염색체 단부에 제공할 것으로 생각된다.
본원에 개시된 바와 같은 외래 서열의 표적화 통합은 단백질 발현을 위한 세포 및 셀라인을 생성하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 공동 소유의 U.S. 특허출원 공개 No. 2006/0063231(이것의 명세서는 모든 목적을 위하여 그 전문이 본원에 참고자료로 포함된다)를 참조한다. 게놈에 통합된 외래 서열에 의해 암호화된 하나 이상의 단백질의 최적 발현을 위하여, 염색체 통합 부위는, 바람직하게는 광범위한 세포 타입 및 발생 단계에서, 통합된 서열의 높은 수준의 전사와 양립가능해야 한다. 그러나, 여러 가지 중에서도 특히, 통합 부위의 게놈의 염색질 구조 때문에 통합 부위에 따라 통합된 서열의 전사가 변한다는 것이 관찰되었다. 따라서, 통합된 서열의 높은 수준의 전사를 지원하는 게놈 표적 부위가 바람직하다. 어떤 구체예에서는 또한, 외래 서열의 통합이 하나 이상의 세포성 유전자(예를 들어, 종양유전자)의 이소성 활성화를 야기하지 않는 것이 바람직할 것이다. 한편, 프로모터 및/또는 인핸서 서열을 통합시키는 경우에는 이소성 발현이 바람직할 수 있다.
어떤 구체예에서, 필수 유전자(예를 들어, 세포 생존성에 필수적인 유전자)에는 통합 부위가 존재하지 않는 것이 바람직하며, 이로써 외래 유전자의 통합으로 인해서 상기 필수 유전자의 비활성화는 일어나지 않는다. 한편, 유전자 기능을 무력하게 할 목적이라면(즉, 유전자 "녹-아웃"의 생성), 내인성 유전자를 파괴할 수 있는 외래 서열의 표적화 통합이 효과적인 방법이다. 이런 경우, 외래 서열은 내인성 유전자의 전사를 차단하거나, 또는 비-기능적 번역 산물, 예를 들어 선택적으로 검출가능한 아미노산 서열의 짧은 패치(상기 참조)를 생성할 수 있는 어떤 서열일 수 있다. 어떤 구체예에서, 외래 서열은 표적화 통합을 겪은 세포의 선택을 허용하는 마커 유전자(상기 설명된)를 포함할 수 있다.
필수 유전자를 암호화하지 않으면서 거기에 통합된 서열의 높은 수준의 전사를 지원하는 염색체 영역의 비제한적인 예는 Rosa26 및 CCR5 유전자좌를 포함한다.
Rosa26 유전자좌는 뮤린 게놈에서 확인되었다. Zambrowicz et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Scl. ㄹSA 94:3789-3794. 마우스 Rosa26 mRNA의 서열이 인간 cDNA 스크리닝 데이터와 비교되었으며(Strausberg et al.(2002) Proc. Natl. Acad. Scl. USA 99:16899-16903), 본 발명자들에 의해서 상동성 인간 전사체가 검출되었다. 따라서, Rosa26의 인간 상동체가 본원에 설명된 방법 및 조성물을 사용하여 인간 세포 및 셀라인의 게놈에 외래 서열을 통합시키기 위한 표적 부위로서 사용될 수 있다.
CCR5 게놈 서열(CCR5-Δ32와 같은 대립유전자 변이체를 포함하여)은 본 분야에 잘 공지되어 있다. 예를 들어, Liu et al. (1996) Cell 367-377 참조.
통합된 서열의 높은 수준의 전사를 지원하는 추가의 게놈 표적 부위는 개방 염색질 영역 또는, 예를 들어 공동 소유의 U.S. 특허출원 공개 2002/0064802(2002. 5.30) 및 2002/0081603(2002. 6.27)에 설명된 "접근가능한 영역"으로서 확인될 수 있다.
게놈 서열에서 이중-가닥 브레이크의 존재는 외래 서열의 상동성-의존적 통합(즉, 상동성 재조합)을 촉진할 뿐만 아니라 이중-가닥 브레이크 부위에서 게놈에 외래 서열의 상동성-독립적 통합을 촉진한다. 따라서, 본원에 설명된 조성물 및 방법은 게놈 서열의 표적화 절단 후, 표적화 절단 부위에 또는 근처에 외래 서열을 비-상동성-의존적 통합시키는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 설명된 대로, 게놈의 관심 영역에서 절단하도록 조작된 하나 이상의 ZFP-절단 도메인(또는 절단 하프-도메인) 융합 단백질(또는, 이러한 융합 단백질을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드) 및 관심 영역에 대해 상동성이 없는 외래 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 세포와 접촉됨으로써, 관심 영역에 외래 서열 전체 또는 일부가 통합된 세포가 획득될 수 있다.
본원에 설명된 상동성-의존적 및 -독립적 방식의 표적화 통합(즉, 게놈에 외래 서열의 삽입)은 모두 여러 목적에 사용될 수 있다. 이들은, 제한되는 것은 아니지만, 세포의 게놈에 유전자나 cDNA 서열을 통합시킴으로써 상기 세포에 의한 유전자 또는 cDNA의 전사 및/또는 번역 산물의 발현을 가능하게 하는 것을 포함한다. 질환 또는 병인이 다수의 돌연변이(예를 들어, 유전자 서열 전체에 분포된 다중 점 돌연변이) 중 하나에 기인할 수 있는 상황에서는 야생형 유전자의 cDNA 카피의 표적화 통합(상동성-의존적 또는 상동성-독립적)이 특히 효과적이다. 예를 들어, 이러한 야생형 cDNA가 모든 공지된 돌연변이의 미번역 리더 서열 또는 유전자 상류의 제 1 엑손에 삽입된다. 번역 리딩 프레임이 보존되는 어떤 통합체에서, 그 결과는 야생형 cDNA가 발현되고, 그 발현이 적합한 내인성 전사 조절 서열에 의해 조절되는 것이다. 추가의 구체예에서, 이러한 통합된 cDNA 서열은 야생형 cDNA의 하류와 돌연변이 내인성 유전자의 상류에 배치된 전사(및/또는 번역) 종결 신호를 포함할 수 있다. 이 방식에서, 질환-원인 유전자의 야생형 카피가 발현되고, 돌연변이 내인성 유전자는 발현되지 않는다. 다른 구체예에서, 야생형 cDNA 부분이 유전자(예를 ㄷ르어, 질환-원인 돌연변이가 군집되어 있는 유전자)의 적합한 영역에 삽입된다.
실시예 1: 표적화된 재조합에 의한 염색체 hSMClL1 유전자의 편집
hSMC IL1 유전자는 발아 효모의 염색체 1 구조 보존 유전자와 같은 기능을 하는 인간 유전자(오르토로그)이다. Walker ATPase 도메인을 포함하는 단백질의 아미노 말단부분을 암호화하는 영역에서 표적화된 절단 및 재조합에 의해 돌연변이를 유도하였다. 징크핑거 DNA 결합도메인 및 FokI 절단 하프도메인을 포함하는 가공의 뉴클레아제를 설계하여 메티오닌 개시코돈(뉴클레오티드 24~26, 도 1) 부위와 결합시킴으로써, 상기 개시코돈의 표적화된 절단을 하였다. 이렇게 하여, 하나는 뉴클레오티드 23 ~ 34(도 1에 나타냈듯이 상부 나선을 따라 일차적 접촉)를 인지하고 다른 하나는 뉴클레오티드 5 ~ 16(하부 나선을 따라 일차적 접촉)을 인지하는, 두 개의 징크핑거 결합도메인을 설계하였다. 미국특허 제6,453,242호 및 제6,534, 261호에 제시된 방법으로 징크핑거 단백질을 설계하였다. 상기 징크핑거 단백질의 인지영역의 아미노산에 대해서는 표 2를 참조하라.
이들 두 ZFP 결합도메인을 각각 암호화하는 서열을 FokI 절단 하프도메인을 암호화하는 서열(천연 FokI 서열의 아미노산 384~579; Kita et al.(1989) J. Biol. Chem. 264: 5751-5756)과 융합하여, 상기 암호화된 단백질이 카르복시 말단의 FokI 서열 및 아미노 말단의 ZFP 서열을 포함하도록 하였다. 그 후, 상기 융합 서열을 편집된 포유류 pcDNA3 발현 벡터 내에서 복제하였다(도 2).
hSMClL1 유전자에 대한 징크핑거 설계
표적서열 F1 F2 F3 F4
CATGGGGTTCCT
(SEQ ID NO: 27) 		RSHDLIE
(SEQ ID NO: 28) 		TSSSLSR
(SEQ ID NO: 29) 		RSDHLST
(SEQ ID NO: 30) 		TNSNRIT
(SEQ ID NO: 31)
GCGGCGCCGGCG
(SEQ ID NO: 32) 		RSDDLSR
(SEQ ID NO: 33) 		RSDDRKT
(SEQ ID NO: 34) 		RSEDLIR
(SEQ ID NO: 35) 		RSDTLSR
(SEQ ID NO: 36)
주: 위에 제시된 징크핑거 아미노산 서열(한 문자 코드)은 각각의 징크핑거의 알파나선 개시 부분과 관련된 -1 내지 +6의 잔기를 나타낸다. 핑거 F1은 상기 단백질의 아미노 말단에 가장 가깝게, 핑거 F4는 카르복시 말단에 가장 가깝게 위치한다.
도너 DNA 분자는 하기의 방법으로 얻었다. 먼저, HEK293 세포로부터 얻은 게놈 DNA를 주형으로 사용하여, 인간 hSMCIL1 유전자의 제1엑손을 포함하는 X 염색체(2003년 7월에 공개된 UCSC 인간 게놈)의 "-" 나선의 뉴클레오티드 52415936 ~ 52416635로 표시되는 인간 게놈 DNA의 700개 염기쌍 절편을 증폭시켰다. 증폭용으로 사용된 프라이머의 서열은 표 3에 제시하였다("초기 amp 1" 및 "초기 amp 2"). 그 후, 표준 중복 확장 PCR법을 사용(Ho, et al. (1989) 유전자 77: 51-59 참조), 상기 PCR 생성물을 변경하여 서열 ATGGGG(도 1의 뉴클레오티드 24~29)를 ATAAGAAGC로 교체하였다. 상기 변화에 의해서 ATG 코돈(메티오닌)은 ATA 코돈(이소로이신)으로 전환되고 서열 AGAAGC는 GGG(도 1의 뉴클레오티드 27~29)로 교체되어, 재조합을 수반하는 도너 유도 서열 및 내인성 염색체 서열을 식별할 수 있게 되었다. 개시코돈의 특정영역 내의 염색체 DNA의 서열 및 염색체 서열과 다른 도너 DNA의 서열을 포함하는 hSMC 1 유전자의 개요도는 도 3에 제시하였다. 상기 700 개의 염기쌍 도너 절편은 인간 게놈과 상동성이 있는 서열을 전혀 포함하지 않는 pCR4BluntTopo 내에서 복제되었다. 도 4 참조.
염색체 HSMCIL1 유전자의 표적화된 돌연변이를 일으키기 위해 Lipofectamine 2000
Figure pat00004
(Invitrogen)을 사용하여 두 개의 플라스미드를 1 x 106 HEK293 세포 내로 도입하였다. ZFP FokI 융합을 암호화하는 두 개의 플라스미드만에 의해 감염된 세포, 도너 플라스미드만에 의해 감염된 세포 및 대조용 플라스미드(pEGFP N1, Clontech)에 의해 감염된 세포를 대조군으로 하였다. 5% C02 , 37℃ 하에서 세포를 배양하였다. 48시간 동안 감염시킨 후, 세포로부터 게놈 DNA를 분리하였고, 그 중 200 ng을 PCR 증폭용 주형으로 사용하였다. 도너 서열과 상동성이 있는 영역의 유전자의 외부 영역과 상보성인 프라이머(X 염색체의 "-" 나선 상의 뉴클레오티드 52416677 ~ 52416701, 2003년 7월 UCSC) 및 삽입된 돌연변이와 구분되는 도너 분자의 영역과 상보성이 있는 다른 프라이머를 사용하여 증폭하였다. 만일 표적화된 재조합이 발생하지 않는다면, 상기 두 개의 프라이머를 사용하여 400개 염기쌍의 증폭생성물을 게놈 DNA로부터 얻을 수 있다. 프라이머 서열은 표 3과 같다(각각 "염색체 특이성" 및 "도너 특이성"이라고 표시). 증폭조건은 2분 동안 94 ℃, 30초 동안 94 ℃로 40회 순환, 1분 동안 60 ℃, 1분 동안 72 ℃ 및 최종 단계에서 7분 동안 72 ℃로 하였다.
분석결과(도 5)는 400개 염기쌍 증폭생성물(상기 도에서는 "가공의 DNA"로 표시)이 두 개의 플라스미드 및 두 개의 ZFP FokI 플라스미드에 의해 감염된 세포로부터 추출한 DNA만으로 얻어졌음을 보여준다.
hSMClL1 유전자용 증폭 프라이머
초기 amp 1 AGCAACAACTCCTCCGGGGATC (SEQ ID NO: 37)
초기 amp 2 TTCCAGACGCGACTCTTTGGC (SEQ ID NO: 38)
염색체 특이성 CTCAGCAAGCGTGAGCTCAGGTCTC (SEQ ID NO: 39)
도너 특이성 CAATCAGTTTCAGGAAGCTTCTT (SEQ ID NO: 40)
외부 1 CTCAGCAAGCGTGAGCTCAGGTCT (SEQ ID NO: 41)
외부 2 CGGGTCAAGTAAGGCTGGGAAGC (SEQ ID NO: 42)
상기 결과를 확인하기 위하여, 두 개의 추가적인 실험을 실시하였다. 먼저, 상기 증폭생성물을 pCR4Blunt Topo(Invitrogen) 내에서 복제한 후, 뉴클레오티드 서열을 확정하였다. 도 6(SEQ ID NO: 6)에서 보듯이, 두 개의 ZFP FokI 암호화 플라스미드 및 도너 플라스미드에 의해 감염된 세포의 염색체 DNA로부터 얻은 증폭서열은 도너 분자 내에 존재하지 않는 염색체 서열(도 6의 뉴클레오티드 32~97)과 공유결합하는 도너에 특이적인 AAGAAGC 서열(도 6의 뉴클레오티드 395~401)을 포함하고 있으며, 이로부터 상기 도너 서열이 염색체와 재조합하였음을 알 수 있다. 특히, 개시코돈이 이소로이신 코돈으로 전환되는 G→A 돌연변이가 서열의 395 위치에서 관찰된다.
두 번째 실험에서는, 도너 플라스미드만에 의해 감염된 세포, 두 개의 ZFP FokI 융합 플라스미드에 의해 감염된 세포, 도너 플라스미드 및 두 개의 ZFP FokI 융합 플라스미드에 의해 감염된 세포 또는 EGFP 대조용 플라스미드에 의해 감염된 세포로부터 얻은 염색체 DNA를 증폭용 주형으로 사용했다. 도너 서열 및 염색체 서열과 상동성이 있는 700개 뉴클레오티드 영역의 외부 서열(표 3에서 "외부 1" 및 "외부 2"로 표시)과 상보성이 있는 프라이머를 사용하여 증폭하였다. 얻어진 증폭생성물을 정화하여 위에서 서술한 도너 특이성 및 염색체 특이성 프라이머(표 3)를 이용한 증폭반응의 주형으로 사용하였다. 증폭에 의해서 도너 구조 및 두 개의 ZFP FokI 융합 구조에 의해 감염된 세포로부터 400개 뉴클레오티드 생성물만을 얻었으며, 이 생성물은 세포 내의 표적화된 재조합에 의해서 게놈서열을 교체해서 얻은 경우와 일치했다.
실시예 2: 표적화된 재조합에 의한 염색체 IL2Rγ 유전자의 편집
IL 2Rγ 유전자는 "일반 사이토카인 수용체 감마 체인"으로 알려져 있고 몇몇 인터루킨 수용체의 서브유닛으로 기능하는 단백질(IL 2R, IL 4R, IL 7R, IL 9R, IL 15R 및 IL 21R를 포함)을 암호화한다. 제3엑손의 5' 말단(예를 들어, 티로신 91 코돈)을 포함하는 상기 유전자 내의 돌연변이는 X 연관 중증합병 면역결핍증(SCID)의 원인이 될 수 있다(Puck et al. (1997) Blood 89: 1968-1977 참조). 티로신 91 코돈(SEQ ID NO: 7의 뉴클레오티드 23~25, 도 7) 내의 돌연변이를 표적화된 절단 및 재조합에 의해서 IL 2Rγ 유전자 내로 도입하였다. 두 쌍의 징크핑거 단백질을 설계하여 표적화된 절단을 하였다. 첫 번째 쌍(표 4의 처음의 두 칼럼)은 뉴클레오티드 29~40(도 7에 제시된 바와 같이 상부 나선을 따라 일차적으로 접촉)과 결합하도록 설계된 징크핑거 단백질과 뉴클레오티드 8~20(하부 나선을 따라 일차적으로 접촉)과 결합하도록 설계된 징크핑거 단백질을 포함한다. 두 번째 쌍(표 4의 3번째 및 4번째 칼럼)은 뉴클레오티드 23~34(도 7에 제시된 바와 같이 상부 나선을 따라 일차적으로 접촉)을 인지하는 징크핑거 단백질과 뉴클레오티드 8~16(하부 나선을 따라 일차적으로 접촉)을 인지하는 징크핑거 단백질을 포함한다. 미국특허 제6,453,242호 및 제6,534,261호의 방법에 따라서 징크핑거 단백질을 설계했다. 상기 징크핑거 단백질의 인지영역의 아미노산에 대해서는 표 4를 참조하라.
ZFP 결합도메인을 암호화하는 서열을 FokI 절단 하프도메인을 암호화하는 서열(천연 FokI 서열의 아미노산 384~579, Kita et al., supra)과 융합시켜, 암호화된 단백질이 카르복시 말단의 FokI 서열 및 아미노 말단의 ZFP 서열을 포함하도록 하였다. 그 후, 각각의 상기 융합 서열을 편집된 포유류 pcDNA3 발현 벡터 내에서 복제하였다. 상기 구조의 개요도에 대해서는 도 8를 참조하라.
IL2Rγ 유전자에 대한 징크핑거 설계
표적서열 F1 F2 F3 F4
AACTCGGATAAT
(SEQ ID NO: 43) 		DRSTLIE
(SEQ ID NO: 44) 		SSSNLSR
(SEQ ID NO: 45) 		RSDDLSK
(SEQ ID NO: 46) 		DNSNRIK
(SEQ ID NO: 47)
TAGAGGaGAAAGG
(SEQ ID NO: 48) 		RSDNLSN
(SEQ ID NO: 49) 		TSSSRIN
(SEQ ID NO: 50) 		RSDHLSQ
(SEQ ID NO: 51) 		RNADRKT
(SEQ ID NO: 52)
TACAAGAACTCG
(SEQ ID NO: 53) 		RSDDLSK
(SEQ ID NO: 54) 		DNSNRIK
(SEQ ID NO: 55) 		RSDALSV
(SEQ ID NO: 56) 		DNANRTK
(SEQ ID NO: 57)
GGAGAAAGG
(SEQ ID NO: 58) 		RSDHLTQ
(SEQ ID NO: 59) 		QSGNLAR
(SEQ ID NO: 60) 		RSDHLSR
(SEQ ID NO: 61)
주: 위에 제시된 징크핑거 아미노산 서열(한 문자 코드)은 각각의 징크핑거의 알파나선 개시 부분과 관련된 -1 내지 +6의 잔기를 나타낸다. 핑거 F1은 상기 단백질의 아미노 말단과 가장 가깝게 위치한다.
도너 DNA 분자는 하기의 방법으로 얻었다. 먼저, K562 세포로부터 얻은 게놈 DNA를 주형으로 사용하여, IL2Rγ 유전자의 엑손 3을 포함하는 X 염색체(2003년 7월, UCSC)의 "-" 나선 상의 69196910~69197609위치에 일치하는 인간 DNA의 700 개 염기쌍 절편을 증폭시켰다(도 9 참조). 증폭용으로 사용된 프라이머의 서열은 표 5와 같다(초기 amp 1 및 초기 amp 2로 표시). 그 후, 표준 중복 확장 PCR법을 사용하여(Ho, et al., supra) PCR 생성물을 변경, 서열 TACAAGAACTCGGATAAT(SEQ ID NO: 62)를 TAAAAGAATTCCGACAAC(SEQ ID NO: 63)로 교체하였다. 상기 교체에 의해서 뉴클레오티드 25(도 7)에서 점 돌연변이가 발생하여 티로신 91 코돈 TAC가 TAA 말단 코돈으로 전환되며, 코돈 91의 하류 내의 서열이 다르기 때문에 재조합을 수반하는 도너 유도 서열 및 내인성 염색체 서열을 식별할 수 있게 된다. 생성된 700 개의 염기쌍 절편은 인간 게놈과 상동성이 있는 서열을 전혀 포함하지 않는 pCR4BluntTopo 내에서 복제되었다(도 10 참조).
염색체의 IL 2Rγ 유전자의 표적화된 돌연변이를 유발하기 위해, 리포펙션/일렉트로포레이션 혼합물(Amaxa)을 사용하여 한 쌍의 ZFP FokI 융합의 각각을 암호화하는 두 개의 플라스미드 및 도너 플라스미드를 2 x 106 K652 세포 내로 도입하였다. 각 ZFP/FokI 쌍(표 4 참조)을 테스트하였다. ZFP FokI 융합을 암호화하는 두 개의 플라스미드만에 의해 감염된 세포, 도너 플라스미드만에 의해 감염된 세포를 대조군으로 하였다. 5% C02, 37℃에서 세포를 배양하였다. 48시간 동안 감염시킨 후, 세포로부터 게놈 DNA를 분리하였고, 그 중 200 ng을 PCR 증폭용 주형으로 사용하였다. 도너 서열과 상동성이 있는 영역의 유전자의 외부 영역과 상보성이 있는 하나의 프라이머(X 염색체의 "+" 나선 상의 뉴클레오티드 69196839~69196863, 2003년 7월 UCSC) 및 삽입된 돌연변이와 구별(상기 참조)되므로 염색체 DNA의 서열과 다른 서열을 지니는 도너 분자의 영역과 상보성이 있는 다른 프라이머를 사용하여 증폭하였다. 만일 표적화된 재조합이 발생하지 않는다면, 상기 두 개의 프라이머를 사용하여 400개 염기쌍의 증폭생성물을 게놈 DNA로부터 얻을 수 있다. 프라이머 서열은 표 3과 같다(각각 "염색체 특이성" 및 "도너 특이성"이라고 표시). 증폭조건은 2분 동안 94 ℃, 30초 동안 94 ℃로 40회 순환, 1분 동안 60 ℃, 1분 동안 72 ℃ 및 최종 단계에서 7분 동안 72 ℃로 하였다.
분석결과(도 11)는 기대된 크기의 증폭생성물(500 개의 염기쌍)이 상기 ZFP FokI 암호화 플라스미드 중 한 쌍 및 상기 도너 플라스미에 의해 감염된 세포에서 추출한 DNA로부터 얻어졌음을 보여준다. 한 쌍의 ZFP만을 암호화하는 플라스미드에 의해 감염된 세포로부터 얻은 DNA는 물론 상기 도너 플라스미만에 의해 감염된 세포로부터 감염된 DNA에서도도 500개 bp의 생성물이 얻어지지 않았다.
IL 2Rγ 유전자용 증폭 프라이머
초기 amp 1 TGTCGAGTACATGAATTGCACTTGG (SEQ ID NO: 64)
초기 amp 2 TTAGGTTCTCTGGAGCCCAGGG (SEQ ID NO: 65)
염색체 특이성 CTCCAAACAGTGGTTCAAGAATCTG (SEQ ID NO: 66)
도너 특이성 TCCTCTAGGTAAAGAATTCCGACAAC (SEQ ID NO: 67)
위 결과를 확인하기 위해서, 두 쌍의 ZFP/FokI 융합을 사용한 상기 실험으로부터 얻은 증폭생성물을 pCR4Blunt Topo (Invitrogen) 내에서 복제한 후, 생성물의 뉴클레오티드를 확정하였다. 도 12에 제시된 바와 같이(SEQ ID NO: 12), 상기 서열은 염색체 서열 및 도너 플라스미드로부터 얻은 서열의 융합을 포함한다. 특히, 상기 서열의 43 위치에서, 티로신 91을 정지코돈으로 전환하는 G→A 돌연변이가 관찰된다. 위치 43~58은 상기 도너의 특징적인 뉴클레오티드를 포함하며, 뉴클레오티드 32~42 및 59~459는 상기 도너 및 염색체의 공통적인 서열이며, 뉴클레오티드 460~552는 상기 염새체의 특징적인 서열이다. 도너가 아닌 염색체 내에 존재하는 서열과 공유결합하는 도너 특징적 서열이 존재함은 도너 플라스미드로부터 얻은 DNA가 상동 재조합에 의해서 염색체 내로 도입되었을 보여준다.
실시예 3: 표적화된 재조합에 의한 염색체 β 글로빈 유전자의 편집
인간 베타 글로빈 유전자는 성인 인간 적혈구 내의 헤모글로빈의 구조 및 기능을 담당하는 두 가지 유전자 중 하나다. 베타 글로빈 유전자 내의 돌연 변이는 겸상 적혈구 빈혈증의 원인을 제공할 수 있다. 두 개의 징크핑거 단백질은 돌연 변이를 일으킨 경우 겸상 적혈구 빈혈증의 원인이 되는 서열 주변에 위치하는 상기 서열 내에 결합하도록 고안되었다. 도 13은 인간 베타 글로빈 유전자의 뉴클레오티드 서열을 나타내며, 상기 서열 내의 징크핑거 단백질에 대한 표적 부위에는 밑줄이 그어있다. 두 개의 징크핑거 단백질의 인지 영역의 아미노산 서열은 표 6에 나타낸다. 상기 두 개의 ZFP 결합 도메인 각각을 코드화한 서열은 FokI 절단 하프 도메인을 코드화한 서열과 융합되어, 내생적인 베타 글로빈 유전자에 표적화된 가공된 ZFP 뉴클레아제를 생성했다. 그 후, 상기 융합 서열의 각각은 포유류 pcDNA3. 1 발현 벡터 내에서 복제되었다(도 14).
베타 글로빈 유전자에 대한 징크핑거 설계
표적 서열 F1 F2 F3 F4
GGGCAGTAACGG
(SEQ ID NO: 68)		 RSDHLSE
(SEQ ID NO: 69)		 QSANRTK
(SEQ ID NO: 70)		 RSDNLSA
(SEQ ID NO: 71)		 RSQNRTR
(SEQ ID NO: 72)
AAGGTGAACGTG
(SEQ ID NO: 73)		 RSDSLSR
(SEQ ID NO: 74)		 DSSNRKT
(SEQ ID NO:75)		 RSDSLSA
(SEQ ID NO: 76)		 RNDNRKT
(SEQ ID NO: 77)
주: 위에 제시된 징크핑거 아미노산 서열(한 문자 코드)은 징크핑거 각각의 알파 나선 개시 부분과 관련된 -1 내지 +6의 잔기를 나타낸다. 핑거 F1은 상기 단백질의 아미노 말단에 가깝게 위치하며, 핑거 F4는 카르복시 말단에 가깝게 위치한다.
도너 DNA 분자는 하기의 방법으로 얻었다. 먼저, K562 세포로부터 얻은 게놈 DNA를 주형으로 사용하는 PCR에 의해서, 염색체 11(BLAT, UCSC 인간 게놈 부위)의 "-" 나선 상의 뉴클레오티드 5212134 ~ 5212833위치에 일치하는 인간 DNA의 700 개 염기쌍 절편을 증폭시켰다. 증폭용으로 사용된 프라이머의 서열은 표 7에서 나타낸다(초기 증폭 프라이머 1 및 초기 증폭 프라이머 2로 표시). 생성된 증폭 절편은 인간 베타 글로빈 유전자의 프로모터, 두 개의 제1 엑손 및 제1 프로톤에 일치하는 서열을 포함한다. 상기 베타 글로빈 서열 내의 엑손 1 및 2, 제1 인트론 및 프라이머 결합 부위의 위치를 나타내는 개요도에 대해서는 도 15를 참조하라. 그 후, 상기 복제된 생성물을 PCR에 의해서 또 한번 개조해서, 서열
CCGTTACTGCCCTGTGGGGCAAGGTGAACGTG(SEQ ID NO: 78)이
gCGTTAgTGCCCGAATTCCGAtcGTcAACcae(SEQ ID NO: 79)로 교체(볼드체에서 교체)된 뉴클레오티드 305 ~ 336(도 13에 나타낸 대로)의 서열 교체 부위를 삽입시켰다. 상기 교체 부위 중 어떤 부위(소문자로 표시)는 ZFP/FokI 융합단백질이 염색체 내로 융합된 도너 서열을 절단하거나 그 도너 서열에 결합하지 못하도록 특별하게 가공되었다. 또한, 상기 서열 교체 부위는 재조합을 수반하는 도너 및 내생적인 염색체 서열과 구별된다. 생성된 700 개의 염기쌍 절편은 인간 게놈과 상동성을 가지는 어떤 서열도 포함하지 않는 pCR4 TOPO 내에서 복제되었다(도 16).
염색체의 베타 글로빈 유전자의 표적화된 돌연 변이를 일으키기 위해서, Nucleofector™ 용액(Amaxa Biosystems)을 사용하여 감염시킴으로써 ZFP FokI 융합및 도너 플라스미드(pCR4 TOPO HBB 도너)를 코드화한 두 개의 플라스미드를 1 x 106 K652 세포 내로 삽입했다. ZFP FokI 융합을 코드화한 두 개의 플라스미드 100 ng(로) 또는 200 ng(하이)만으로 감염된 세포, 도너 플라스미드 200 ng(로) 또는 600 ng(하이)만으로 감염된 세포, GFP 코드화 플라스미드로 감염된 세포 및 모의 감염 세포를 조절했다. 10% 우태혈청(FBS)(Hyclone) 및 L 글루타민 10 mM를 추가한 RPMI 배지 1640(Invitrogen) 내에서 세포를 배양했다. 5 % CO2의 분위기 하에서 37 ℃로 세포를 유지했다. 72 시간 동안 감염시킨 후, 상기 세포로부터 게놈 DNA를 분리하였고, 그 중 200 ng을 PCR 증폭용 주형으로 사용하였다. 상기 증폭에서, 도너 서열과 상동성을 가지는 영역의 유전자의 바깥 영역과 상보성이 있는 하나의 프라이머(염색체 11의 "-" 나선 상의 뉴클레오티드 5212883 ~ 5212905) 및 상기 도너 서열 내로 삽입된 돌연 변이와 구별 도너 분자의 영역과 상보성이 있는 또 다른 프라이머(상동 참조)를 사용한다. 상기 프라이머 서열은 표 7에서 제시된다(각각 "염색체 특이성 프라이머" 및 "도너 특이성 프라이머"이라고 표시). 만일 표적화된 재조합이 발생하지 않는다면, 상기 두 개의 프라이머를 사용하여 415개 염기쌍의 증폭 생성물을 게놈 DNA로부터 얻을 수 있다. DNA 로딩을 조절하기 위해서, 초기 증폭 프라이머 1 및 초기 증폭 프라이머 2를 사용하여 PCR 반응을 실행했다. 이 경우, PCR 반응 각각에 유사한 량의 게놈 DNA를 첨가했다. 증폭을 위한 조건으로 2분 동안 95 ℃, 30초 동안 95 ℃로 40회 순환, 45초 동안 60 ℃, 2분 동안 68 ℃ 및 최종 단계에서 10분 동안 68 ℃를 순차적으로 가했다.
이 분석의 결과(도 17)는 415개의 염기쌍 증폭 생성물이 "고" 농도의 도너 플라스미드 및 염색체 베타 글로빈 자리 내에서 표적화된 재조합이 된 도너 서열과 일치하는 두 개의 ZFP FokI 플라스미드로 감염된 세포로부터 축출한 DNA로부터 생성되었음을 나타낸다.
인간 베타 글로빈 유전자용 증폭 프라이머
초기 amp 1 TACTGATGGTATGGGGCCAAGAG(SEQ ID NO: 80)
초기 amp 2 CACGTGCAGCTTGTCACAGTGC(SEQ ID NO: 81)
염색체 특이성 TGCTTACCAAGCTGTGATTCCA(SEQ ID NO: 82)
도너 특이성 GGTTGACGATCGGAATTC(SEQ ID NO: 83)
상기 결과를 확인하기 위해서, 얻어진 증폭 생성물을 pCR4 TOPO(Invitrogen) 내에서 복제한 후, 상기 생성물의 뉴클레오티드를 확정했다. 도 18에 제시된 바와 같이(SEQ ID NO: 14), 상기 서열은 도너 플라스미드에서는 존재하지 않는 염색체 서열 및 도너 플라스미드의 특징적인 서열이 융합된 서열을 포함한다. 예를 들어, 상기 서열의 377 및 383 위치에서, ZEP 결합을 깨뜨리는 두 개의 C → G 돌연 변이가 관찰된다. 뉴클레오티드 377 ~ 408은 상기에서 서술된 서열의 교체 부분을 포함하는 도너 플라스미드로부터 얻은 서열이며, 뉴클레오티드 73 ~ 376은 상기 도너 및 염색체의 공통적인 서열이며, 뉴클레오티드 1 ~ 72은 상기 염색체의 특징적인 서열이다. 상기 게놈 내에서의 도너 특이적 서열과 염색체 특이적 서열 간의 공유 결합은 K562 세포의 게놈 내의 편집된 위치에서의 도너 서열을 성공적으로 재조합 하게 한다.
실시예 4: ZFP FokI 링커(ZC 링커)의 최적화.
절단 효율성 면에서의 ZC 링커 길이의 효과를 테스트하기 위해서, 다양한 길이의 ZC 링커를 사용하여 네 개의 핑거 ZFC 결합 도메인을 FokI 절단 하프 도메인과 융합시켰다. ZFP에 대한 표적 부위는 5'-AACTCGGATAAT-3' (SEQ ID NO : 84)이다. 징크핑거 각각의 인지 영역(알파 나선의 개시에 관련되는 -1 내지 +6 위치)의 아미노산 서열은 하기와 같다(여기서 F1은 N이 가장 많은 징크핑거이며, F4는 C가 가장 많은 징크핑거이다).
F1: DRSTLIE (SEQ ID NO:85)
F2: SSSNLSR (SEQ ID NO:86)
F3: RSDDLSK (SEQ ID NO:87)
F4: DNSNRIK (SEQ ID NO:88)
전술한 ZEP 결합 도메인 및 FokI 절단 하프 도메인이 2, 3, 4, 5, 6 또는 10 개 아미노산 잔기에 의해서 분리되는 ZFP FokI 융합을 제조했다. 상기 단백질 각각이 4, 5, 6, 7, 8, 9, 12, 15, 16, 17, 22 또는 26개의 염기쌍에 의해서 분리된 반복부를 지닌 ZEP 표적 부위의 역 반복부를 포함하는 기질을 절단하는지에 대해서 테스트했다.
ZFP FokI 연결(ZC 링커 서열의 밑줄 부분) 영역 내 융합 구조의 아미노산 서열은 하기와 같다.
10개의 잔기 링커 HTKIHLRQKDAARGSQLV (SEQ ID NO: 89)
6개의 잔기 링커 HTKIHLRQKGSQLV (SEQ ID NO : 90)
5개의 잔기 링커 HTKIHLRQGSQLV (SEQ ID NO : 91)
4개의 잔기 링커 HTKIHLRGSQLV(SEQ ID NO: 92)
3개의 잔기 링커 HTKIHLGSQLV(SEQ ID NO : 93)
2개의 잔기 링커 HTKIHGSQLV (SEQ ID NO: 94)
밑줄친 ZEP 표적 부위를 포함하는 다양한 절단 기질의 서열은 하기와 같다.
4bp 분리
CTAGCATTATCCGAGTTACACAACTCGGATAATGCTAGGATCGTAATAGGCTCAATGTGTTGAGCCTATTACGATC (SEQ ID NO : 95)
5bp 분리
CTAGCATTATCCGAGTTCACACAACTCGGATAATGCTAGGATCGTAATAGGCTCAAGTGTGTTGAGCCTATTACGATC (SEQ ID NO : 96)
6bp 분리
CTAGGCATTATCCGAGTTCACCACAACTCGGATAATGACTAGGATCCGTAATAGGCTCAAGTGGTGTTGAGCCTATTACTGATC (SEQ ID NO : 97)
7bp 분리
CTAGCATTATCCGAGTTCACACACAACTCGGATAATGCTAGGATCGTAATAGGCTCAAGTGTGTGTTGAGCCTATTACGATC (SEQ ID NO : 98)
8bp 분리
CTAGCATTATCCGAGTTCACCACACAACTCGGATAATGCTAGGATCGTAATAGGCTCAAGTGGTGTGTTGAGCCTATTACGATC (SEQ ID NO : 99)
9bp 분리
CTAGCATTATCCGAGTTCACACACACAACTCGGATAATGCTAGGATCGTAATAGGCTCAAGTGTGTGTGTTGAGCCTATTACGATC (SEQ ID NO : 100)
12bp 분리
CTAGCATTATCCGAGTTCACCACCAACACAACTCGGATAATGCTAGGATCGTAATAGGCTCAAGTGGTGGTTGTGTTGAGCCTATTACGATC (SEQ ID NO : 101)
15bp 분리
CTAGCATTATCCGAGTTCACCACCAACCACACAACTCGGATAATGCTAGGATCGTAATAGGCTCAAGTGGTGGTTGGTGTGTTGAGCCTATTACGATC (SEQ ID N0 : 102)
16bp 분리
CTAGCATTATCCGAGTTCACCACCAACCACACCAACTCGGATAATGCTAGGATCGTAATAGGCTCAAGTGGTGGTTGGTGTGGTTGAGCCTATTACGATC (SEQ ID N0 : 103)
17bp 분리
CTAGCATTATCCGAGTTCAACCACCAACCACACCAACTCGGATAATGCTAGGATCGTAATAGGCTCAAGTTGGTGGTTGGTGTGGTTGAGCCTATTACGATC (SEQ ID N0 : 104)
22bp 분리
CTAGCATTATCCGAGTTCAACCACCAACCACACCAACACAACTCGGATAATGCTAGGATCGTAATAGGCTCAAGTTGGTGGTTGGTGTGGTTGTGTTGAGCCTATTACGATC (SEQ ID NO : 105)
26bp 분리
CTAGCATTATCCGAGTTCAACCACCAACCACACCAACACCACCAACTCGGATAATGCTAGGATCGTAATAGGCTCAAGTTGGTGGTTGGTGTGGTTGTGGTGGTTGAGCCTATTACGATC (SEQ ID N0 : 106)
표준 분자 생물학적 기술에 의해서 다른 ZFP FokI 융합단백질(상기 참조)을 코드화한 플라스미드를 제조했고, 코드화된 단백질을 발현하기 위해서 생체 외 전사/번역 시스템을 사용했다. 각각의 구조에 있어서, 선형의 플라스미드 DNA 200 ng을 TnT 혼합 20 μM하에서 배양했고, 30 ℃에서 1 시간 또는 45 분 동안 배양했다. TnT 혼합은 T7 RNA 폴리머라제(Promega) 4 μl + 메티오닌(1 mM) 2 μl + ZnCl2 (20 mM) 2.5 μl를 함유하는 TnT 용해물(Promega, Madison, WI) 100 μl를 포함한다.
다른 ZFP FokI 융합에 의한 DNA 절단을 분석하기 위해서, 전사/번역 반응 혼합물 1 μl를 DNA 기질(말단을 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제를 사용하는 32P로 표지) 1 ng과 혼합시킨 후, 상기 혼합물에 FokI 절단 완충액를 가해 최종 부피가 19 μl가 되도록 희석시켰다. FokI 절단 완충액는 pH 8.5 Tris-HCl 20 mM, NaCl 75 mM, ZnCl2 10 μM, DTT 1 mM, 5% 글리세롤, BSA 500 μg/ml를 포함한다. 상기 혼합물을 37 ℃에서 1 시간 동안 배양했다. 그 후, MgCl2 8 mM를 포함하는 FokI 완충액 6.5 μl를 첨가하고, 37 ℃에서 1 시간 동안 계속해서 배양했다. 각 반응에 페놀 클로로포름 10 μl를 첨가한 후, 혼합하고, 상을 분리하기 위해 원심분리시킴으로써 단백질을 축출했다. 10% 폴리아크릴아미드 겔 상에서 전기영동을 실행하여 각 반응으로부터 얻은 수용액 상 10 μl를 분석했다.
상기 겔을 방사선 사진 촬영했다. 절단되거나 절단되지 않은 기질에 상응하는 밴드 내의 방사능을 정량하고, 얻어진 전체 방사능을 합하고, 절단 생성물에 해당하는 밴드 내에 존재하는 전체 방사능의 퍼센트를 결정함으로써, ZFP FokI 융합/기질 쌍 각각에 대한 절단 효율을 계산했다.
이 실험의 결과는 표 8에 나타난다. 이 데이터에 의해서 표적 부위를 분리하기 위한 최적의 절단 효율을 제공하는 ZC 링커를 선택할 수 있다. 또한, 이 데이터에 의해서 표적 부위의 표적화된 절단을 하지만, 원하던 절단 부위와 다른 유사 ZEP 표적 부위를 구별할 수 있다.
다양한 ZC 링커 길이 및 다양한 결합 부위의 분리를 위한 DNA 절단 효율*
2 잔기 3 잔기 4 잔기 5 잔기 6 잔기 10 잔기
4 bp 74 % 81 % 74 % 12 % 6 % 4 %
5 bp 61 % 89 % 92 % 80 % 53 % 40 %
7 bp 15 % 55 % 80 % 80 % 70 % 80 %
8 bp 0 % 0 % 8 % 11 % 22 % 63 %
9 bp 2 % 6 % 23 % 9 % 13 % 51 %
12 bp 8 % 12 % 22 % 40 % 69 % 84 %
15 bp 73 % 78 % 97 % 92 % 95 % 88 %
16 bp 59 % 89 % 100 % 97 % 90 % 86 %
17 bp 5 % 22 % 77 % 71 % 85 % 82 %
22 bp 1 % 3 % 5 % 8 % 18 % 58 %
26 bp 1 % 2 % 35 % 36 % 84 % 78 %
* 칼럼은 ZEP 및 FokI 절단 하프 도메인을 분리하는 잔기의 수를 포함하는 다른 ZFP FokI 융합 구조를 나타낸다. 상기 줄은 ZEP 표적 부위의 역 반복부를 분리하는 염기쌍의 수를 포함하는 다른 DNA 기질을 나타낸다.
4 개의 잔기 링커를 포함하는 ZFP FokI 융합에 있어서, 상기 링커의 아미노산 서열을 변화시켰다. 분리 구조에 있어서, 원형 LRGS 링커 서열(SEQ ID NO : 107)을 LGGS(SEQ ID NO : 108), TGGS(SEQ ID NO : 109), GGGS(SEQ ID NO : 110), LPGS(SEQ ID NO : 111), LRKS(SEQ ID NO : 112) 및 LRWS(SEQ ID NO : 113)로 교체했다. 결합 부위 사이에서 6개의 염기쌍 분리를 포함하는 기질 상에서 얻어진 융합 체를 테스트했다. LGGS(SEQ ID NO : 108) 링커 서열을 포함하는 융합이 원형 LRGS 서열(SEQ ID NO : 107)을 포함하는 융합보다 더 효과적으로 절단함이 관찰되었다. LRKS(SEQ ID NO : 112) 및 LRWS(SEQ ID NO : 113) 서열을 포함하는 융합은 LRGS 서열(SEQ ID NO: 107)을 포함하는 융합보다 덜 효과적으로 절단했지만, 나머지 융합의 절단 효율은 원형 LRGS 서열(SEQ ID NO : 107)을 포함하는 융합의 절단 효율과 비슷했다.
실시예 5: 이량체화 인터페이스 내의 FokI 절단 하프 도메인을 개조함으로써 향상된 절단 특이성
IL 2Rγ 유전자의 제5 엑손 내의 표적 부위에 결합하도록 한 쌍의 ZFP/FokI 융합단백질(5 ~ 8 및 5 ~ 10으로 표시)을 고안하여, 표적 부위 사이 영역 내에서의 절단을 향상시켰다. 두 개의 융합단백질의 표적 서열을 포함하는 유전자와 관련되는 영역은 도 19에 나타낸다. 5 ~ 8 단백질의 아미노산 서열은 도 20에 나타내고, 5 ~ 10 단백질의 아미노산 서열은 도 21 에 나타낸다. 이 두 단백질은 10 개의 아미노산 ZC 링커을 포함한다. 상기 단백질의 징크핑거 부분에 관련하여, 상기 징크핑거 내의 인지 영역의 DNA 표적 서열 및 아미노산 서열은 표 9에 제시된다.
IL 2Rγ 유전자용 징크핑거 설계
융합 표적 서열 F1 F2 F3 F4
5 ~ 8
 ACTCTGTGGAAG
(SEQ ID NO: 114)		 RSDNLSE
(SEQ ID NO: 115)		 RNAHRIN
(SEQ ID NO : 116)		 RSDTLSE
(SEQ ID NO: 117)		 ARSTRTT
(SEQ ID NO : 118)
5 ~ 10 AACACGaAACGTG
(SEQ NO : 119)		 RSDSLSR
(SEQ ID NO : 120)		 DSSNRKT
(SEQ ID NO : 121)		 RSDSLSV
(SEQ ID NO: 122)		 DRSNRIT
(SEQ ID NO : 123)
주: 위에 제시된 징크핑거 아미노산 서열(한 문자 코드)은 징크핑거 각각의 알파 나선 개시 부분과 관련된 -1 내지 +6의 잔기를 나타낸다. 핑거 F1은 상기 단백질의 아미노 말단에 가깝게 위치한다.
표적 서열을 포함하는 표시된 DNA 주형을 사용하고 특징적인 분해 생성물을 분석함으로써, 융합단백질의 표적 서열 사이에서 DNA를 특이적으로 절단하는 것이 촉진된 융합단백질 쌍의 효능(도 19 참조)을 생체 외 테스트했다. 두 개의 단백질을 사용한 경우 특이적인 절단이 가능했다(표 10, 첫 번째 줄). 그러나, 5 ~ 10 융합단백질(야생형 FokI 절단 하프 도메인을 포함)은 자체 이량체화이 가능하기 때문에 5 ~ 8 단백질이 없는 비표적 부위에서의 비정상적인 절단을 실행할 수 있다(표 10, 두 번째 줄).
따라서, 글루탐산(E)을 리신(K)로 아미노산 잔기 490을 전환함으로써, FokI 절단 하프 도메인 내에서 5 ~ 10을 편집했다(FokI 단백질 내의 아미노산 잔기의 번호 매김은 Wah et al., supra.를 따른다). 상기 편집은 이량체화 인터페이스 내의 아미노산 잔기를 개조함으로써 동일 이량체화을 막도록 고안됐다. 모체 5 ~ 10 단백질과 다르게, 5 ~ 10(E490K) 돌연 변이는 5 ~ 8 융합단백질이 없는 비정상적인 부위를 절단할 수 없었다(표 10, 줄 3). 그러나, 5 ~ 8 단백질과 함께 5 ~ 10(E490K) 돌연변이는 기질의 특이적 절단을 촉진했다(표 10, 줄 4). 따라서, 이량체화을 수반하는 5 ~ 10의 절단 하프 도메인 내의 잔기를 개조하여 자체 이량체화에 따른 상기 융합단백질에 의한 비정상적인 절단을 막았다.또한, E490R 돌연 변이는 모체 단백질보다 낮은 수준의 동일 이량체화을 나타낸다.
또한, 486에 위치하는 글루타민(Q)을 글루탐산(E)으로 교체함으로써, 5 ~ 8 단백질은 그것의 이량체화 인터페이스에서 개질 되었다. 야생형 5 ~ 10 단백질 또는 5 ~ 10(E490K) 돌연변이 내에서의 표적화된 절단을 촉진하는 상기 5 ~ 8(Q486E) 돌연변이를 테스트했다. 표시된 기질이 두 5 ~ 8(Q486E) 및 야생형 5 ~ 10 내에서 배양된 경우, DNA의 절단이 관찰되지 않았다(표 10, 줄 5). 그러나, 5 ~ 8(Q486E) 및 5 ~ 10(E490K) 돌연변이를 같이 사용한 경우, 절단이 발생했다(표 10, 줄 6).
이 결과는 하나 또는 두 개의 융합단백질 내의 절단 하프 도메인의 아미노산 서열을 개조함으로써, 두 개의 융합단백질의 표적 서열에 의해서 정의된 것과는 다른 영역에서의 ZFP/FokI 융합단백질 쌍에 의한 DNA의 절단이 최소화되거나 폐지됨을 의미한다.
야생형 및 돌연 변이 절단 하프 도메인을 포함하는 ZFP/FokI 융합단백질 쌍에 의한 DNA 절단
ZFP 5 ~ 8 결합 도메인 ZFP 5 ~ 10 결합 도메인 DNA 절단
1 야생형 FokI 야생형 FokI 특이성
2 비 존재 야생형 FokI 비특이성
3 비 존재 FokI E490K 비 발생
4 야생형 FokI FokI E490K 특이성
5 FokI Q486E 야생형 FokI 비 발생
6 FokI Q486E FokI E490K 특이성
주: 상기 표의 각 줄은 표시된 DNA 기질에 대한 ZFP/FokI 융합단백질을 테스트한 분리 실험의 결과를 보여준다. 하나의 융합단백질은 5 ~ 8 DNA 결합 도메인을 포함했고, 다른 하나의 융합단백질은 5 ~ 10 DNA 결합 도메인을 포함했다(표 9 및 도 19 참조). 융합단백질의 절단 하프 도메인 부분은 상기 표에서 제시했다. 따라서, ZEP 5 ~ 8 칼럼의 내용은 ZEP 5 ~8에 융합된 FokI 절단 도메인의 형태를 나타내며, ZEP 5 ~ 10 칼럼의 내용은 ZEP 5 ~10에 융합된 FokI 절단 도메인의 형태를 나타낸다. FokI 절단 하프 도메인 돌연 변이에 대해서, 상기 수치는 FokI 단백질 내의 아미노산 잔기를 나타내며, 상기 문자 앞의 수치는 야생형 단백질 내에 존재하는 아미노산을 나타내며, 상기 문자 뒤의 수치는 상기 야생형 잔기가 변질하여 개질된 단백질을 만드는 아미노산을 나타낸다. "비존재"는 전체 ZFP/FokI 융합단백질이 상기 특징적인 실험에서 생략되었음을 나타낸다. 이 실험에서 사용된 DNA 기질은 두 개의 ZFP 5 ~ 8 및 ZFP 5 ~ 10에 대한 표적 부위를 포함하는 400 bp PCR 생성물에 가까웠다. 상기 두 개의 표적 부위의 서열 및 상대적인 배열은 도 19를 참조하라.
실시예 6: 불완전하게 강화된 녹색 형광 단백질(eGFP) 유전자의 발생
강화된 녹색 형광 단백질(eGFP)은 아미노산 64(phe 내지 leu) 및 65(ser 내지 thr)를 포함하는 녹색 형광 단백질(GFP, 예를 들어, Tsien (1998) Ann. Rev. Biochem. 67: 509 ~ 544 참조)의 형태로 개질 된다. 이에 대하여는 Heim et al.(1995) Nature 373: 663 ~ 664 및 Cormack et al. (1996) GENE 173: 33 ~ 38를 참조하라. 개시 코돈 및 2 bp 프레임시프트 돌연 변이를 포함하는 eGFP 유전자의 불완전한 형태를 제조함으로써, eGFP계 리포터 시스템을 만들었다. 상기 eGFP 유전자의 서열을 도 22에 나타낸다. Platinum
Figure pat00005
DNA 폴리머라제 High Fidelity 키트 (Invitrogen) 및 프라이머로서의 올리고뉴클레오티드 GFP Bam, GFP Xba, 개시 센스2, 개시 안티2(올리고뉴클레오티드 서열은 하기의 표 11에 제시)를 사용하는 중복 PCR 돌연 변이에 의해서 돌연 변이를 삽입했다. GFP Bam 및 GFP Xba는 외래 프라이머로 작동했으며, 정지 센스2 및 정지 안티2는 뉴클레오티드 교체 부분을 코드화한 내부 프라이머로 작동했다. 두 개의 분리 증폭 실험 내의 DNA 주형으로는 eGFP 유전자 전체 길이를 코드화한 peGFP NI 벡터(BD Biosciences)를 사용했다. 상기 증폭 실험중, 하나는 프라이머로 GFP Bam 및 정지 안티2 올리고뉴클레오티드를 사용했고 다른 하나는 프라이머로 GFP Xba 및 정지 센스2 올리고뉴클레오티드를 사용했다. 그 결과 서열이 중복되는 두 개의 증폭 생성물을 얻었다. 이 생성물을 혼합하여 프라이머로서 GFP Bam 및 GFP Xba 올리고뉴클레오티드를 사용하는 세 번째 증폭 실험에서의 주형으로 사용함으로써, 뉴클레오티드 280 ~ 287에 위치한 서열 GACCACAT(SEQ ID NO: 124)이 서열 TAACAC(SEQ ID NO: 125)로 교체된 eGFP 유전자를 제조했다. 모든 증폭 실험에 대한 PCR 조건은 하기와 같다. 먼저, 상기 주형을 94 ℃에서 2 분 동안 변성시킨 후, 94 ℃에서 30 초 동안, 46 ℃에서 45 초 동안, 68 ℃에서 60 초 동안 반응을 배양시키는 증폭을 25차례 순환했다. 확장의 최종 단계는 68 ℃에서 60 초 동안 실행했다. 최종 증폭 생성물의 서열은 도 23에 나타낸다. TOPO TA 복제 키트(Invitrogen)를 사용하는 pCR(R) 4 TOPO 베터 내에서 상기 795 bp 절편을 복제하여 pCR(R) 4 TOPO GFPmut를 제조했다.
GFP용 올리고뉴클레오티드 서열
올리고 서열 5' ~ 3'
GFP-Bam CGAATTCTGCAGTCGAC (SEQ ID NO : 126)
GFP-Xba GATTATGATCTAGAGTCG (SEQ ID NO: 127)
정지 센스2 AGCCGCTACCCCTAACACGAAGCAG (SEQ ID NO : 128)
정지 안티2 CTGCTTCGTGTTAGGGGTAGCGGCT (SEQ ID NO: 129)
실시예 7: eGFP를 표적화한 징크핑거 뉴클레아제의 설계 및 조립
뉴클레오티드 271 ~ 294(도 23에 따라 번호 매김)에 상응하는 돌연 변이를 일으킨 GFP 유전자(실시예 6) 영역에 결합하도록 두 개의 제3 핑거 ZFP를 고안했다. 상기 단백질에 대한 결합 부위는 두 개의 결합 부위를 분리하는 6 개 염기쌍과 반대 배열을 지닌다. 도 23을 참조하라. ZFP 287A는 비코딩 나선 상의 뉴클레오티드 271 ~ 279와 결합하며, ZFP 296은 코딩 나선 상의 뉴클레오티드 286 ~ 294와 결합한다. ZFP의 인지 영역에 대한 DNA 표적 및 아미노산 서열을 표 12 및 하기에 제시한다.
287A :
F1 (GCGg) RSDDLTR (SEQ ID NO : 130)
F2 (GTA) QSGALAR (SEQ ID NO: 131)
F3 (GGG) RSDHLSR (SEQ ID NO : 132)
296S :
F (GCA) QSGSLTR (SEQ ID NO : 133)
F2 (GCA) QSGDLTR (SEQ ID NO : 134)
F3 (GAA) QSGNLAR (SEQ ID NO: 135)
GFP 유전자용 징크핑거 고안
단백질 표적 서열 F1 F2 F3
287A GGGGTAGCGg
(SEQ ID NO: 136)		 RSDDLTR
(SEQ ID NO : 137)		 QSGALAR
(SEQ ID NO: 138)		 RSDHLSR
(SEQ ID NO: 139)
296S GAAGCAGCA
(SEQ ID NO : 140)		 QSGSLTR
(SEQ ID NO : 141)		 QSGDLTR
(SEQ ID NO : 142)		 QSGNLAR
(SEQ ID NO : 143)
주: 위에 제시된 징크핑거 아미노산 서열(한 문자 코드)은 징크핑거 각각의 알파 나선 개시 부분과 관련된 -1 내지 +6의 잔기를 나타낸다. 핑거 F1은 상기 단백질의 아미노 말단에 가깝게 위치하며, F3는 카르복시 말단에 가깝게 위치한다.
상기 단백질을 코드화한 서열을 PCR 조립(예를 들어, 미국특허 제6,534, 261 호)에 의해서 제조했고, pcDNA3.1 벡터(Invitrogen)의 Kpnl 및 BamHI 부위 사이에서 복제했고, FokI 엔도뉴클레아제의 촉진 도메인을 포함하는 구조 내에서 융합했다(Gene (1989) 80: 193-208 Looney et al.의 서열의 아미노산 384 ~ 579). 얻어진 구조를 pcDNA3.1 GFP287 FokI 및 pcDNA3.1 GFP296 FokI이라고 명했다(도 24).
실시예 8 : 설계된 징크핑거 뉴클레아제에 의한 생체 외에서의 표적화된 DNA 절단
생체 외에서의 개질된 형태의 eGFP를 절단하고 단백질의 표적 부위을 특이적으로 인지하는 287 및 296 단백질의 효능을 테스트하기 위한 주형으로서 상기 pCR(R) 4 TOPO GFPmut 구조를 사용했다.
T4 및 T3 프라이머와 pCR(R) 4 TOPO GFPmut 주형을 사용하는 PCR 증폭에 의해서 불완전하게 eGFP 코드가 삽입된 DNA 절편을 얻었다. 상기 절편의 말단을 γ 32P ATP 및 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제로 표시했다. 미세 스핀 G 50 칼럼 (Amersham)을 사용하여 융합되지 않은 뉴클레오티드를 제거했다.
생체 외에서 전사/번역 조합 시스템을 사용하여 실시예 7에서 서술한 287 및 296 징크핑거 뉴클레아제를 발현했다. 각각의 구조에 있어서, 선형 플라스미드 DNA 200 ng을 TnT 혼합 20 μL에서 배양했고, 30 ℃에서 1 시간 및 45 분 동안 배양했다. TnT 혼합은 메티오닌 2 μl 및 ZnCl2(20 mM) 2.5 μl를 첨가한 TnT 용해물(T7 RNA 폴리머라제, Promega, Madison, WI를 포함) 100 μl를 포함한다.
DNA 절단을 분석하기 위해서, 전사/번역 반응 혼합물의 287 및 296을 소량 취해서 혼합한 후, 절단 완충액로 희석했다. 절단 완충액는 pH 8.5 Tris-HCl 20 mM, NaCl 75 mM, MgCl2 10 mM, ZnCl2 10 μM, DTT 1 mM, 5% 글리세롤, BSA 500 μg/ml를 포함한다. 각 희석물 5 μl를 DNA 기질(위에서 서술한 바와 같이 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제를 이용하는 32P로 말단을 표시) 1 ng과 혼합시킨 후, 각 혼합물을 한 번 더 희석하여 하기의 조성물을 포함하는 절단 반응물 20 μl를 제조했다. pH 8.5 Tris-HCl 20 mM, NaCl 75 mM, MgCl2 10 mM, ZnCl2 10 μM, DTT 1 mM, 5% 글리세롤, BSA 500 μg/ml. 절단 반응물을 37 ℃에서 1 시간 동안 배양했다. 각 반응물에 페놀 클로로포름 용액 10 μl를 첨가한 후, 원심 분리로 상 분리하여, 단백질을 축출했다. 10 % 폴리아크릴아미드 겔 상의 전기 영동에 의해서, 각 반응의 수용액 상의 10 μl를 분석했다.
상기 겔을 방사성 사진 촬영했고, 상기 실험의 결과를 도 25에 나타냈다. 4개의 가장 왼쪽에 있는 레인은 각 전사/번역 반응 혼합의 최종 희석량이 1/156.25, 1/31.25, 1/12.5 및 1/5이므로 각 전사/번역 반응의 유효량이 0.032, 0.16, 0.4 및 1 μl가 되는 반응의 결과를 보여준다. 개시 절편보다 낮은 분자량을 가지는 두 개의 DNA 절편은 반응 혼합물 내의 징크핑거 엔도뉴클레아제 함량 증가와 관련되므로, 기대된 표적 부위에서의 DNA 절단이 얻어졌음을 알 수 있다.
실시예 9: 통합된 불완전 eGFP 유전자를 포함하는 안정된 셀라인의 생성
돌연 변이 eGFP 즉, eGFPmut를 코드화한 DNA 절편이 pCR(R) 4 TOPO GFPmut q벡터의 외부에서 절단됐고(실시예 6), pcDNA4/TO의 HindIII 및 NotI 부위 내에서 복제됐다. 따라서, 상기 유전자는 테트라사이클린 유도 CMV 프로모터의 조절하에서 놓인다. 얻어진 플라스미드를 pcDNA4/TO/GFPmut라 명했다(도 26). 10% 비 Tet 우태혈청(FBS)을 첨부한 (HyClone) 듈베코 변성 이글 배지(DMEM)(Invitrogen) 내에서 T Rex 293 세포(Invitrogen)를 배양했다. 세포를 6 웰 배양 접시 내에서 배양하여 50% 포화하게 했고, 두 개의 세포를 pcDNA4/TO/GFPmut로 감염시켰다. 그 후, 상기 세포를 48 시간 동안 회수하고나서, 두 개의 웰에서 얻은 세포를 혼합한 후, 표적화된 배지 즉, Zeocin(Invitrogen) 400 μg/ml를 첨부한 배지 내의 10 x l5 cm2 배양 접시 내로 분할했다. 상기 배지을 3일 후 교체했고, 10일 후 단일 세포 군집을 격리시켰고 또다시 팽창시켰다. 정량적 RT PCR(TaqMan
Figure pat00006
)에 의해서, 각 클론 라인의 eGFPmut 유전자의 독시시클린(dox) 유도 발현에 대해서 테스트했다.
정량 RT PCR 분석을 위해 고순도 분리 키트(Roche Molecular Biochemicals)를 사용하는 독스 처리하거나 처리하지 않은 세포로부터 전체 RNA를 분리했다. 또한, TaqMan
Figure pat00007
을 사용하여 내인성 유전자 발현을 분석할 수 있도록, 각 샘플로부터 얻은 전체 RNA 25 ng에 대해 실시간 정량적 RT PCR을 실시했다.
프로브 및 프라이머 서열을 표 13에 나타낸다. 반응은 하기의 조건하에서 ABI 7700 SDS 기계(PerkinElmer Life Sciences)를 사용하여 실행했다. 48℃에서 30 분 동안 MultiScribe 역 전사효소(PerkinElmer Life Sciences)를 사용하여 역 전사 반응을 실행한 후, 95℃에서 10분 동안 변성시켰다. AmpliGold DNA 폴리머라제( PerkinElmer Life Sciences)를 사용하여 95 ℃에서 15 초 동안 및 60 ℃에서 1 분 동안 40번 순환하는 폴리머라제 연쇄반응(PCR)을 실행했다. SDS 소프트웨어 버전 1.7을 사용하여 정규화된 eGFPmut 유전자의 발현에서 인간 GAPDH 유전자의 발현에 이르는 결과를 분석하였고, 도 27에 나타냈다. 세포 라인의 수는 eGFP의 독시시클린 의존형 발현을 나타냈다. 또 다른 연구를 위한 모델 세포 라인으로서 라인 18(T18)을 선택했다.
mRNA 분석용 올리고뉴클레오티드
올리고뉴클레오티드 서열
eGFP 프라이머 1 (5T) CTGCTGCCCGACAACCA (SEQ ID NO : 144)
eGFP 프라이머 2 (3T) CCATGTGATCGCGCTTCTC (SEQ ID NO : 145)
eGFP 프로브 CCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGA(SEQ ID NO : 146)
GAPDH 프라이머 1 CCATGTTCGTCATGGGTGTGA (SEQ ID NO : 147)
GAPDH 프라이머 2 CATGGACTGTGGTCATGAGT (SEQ ID NO : 148)
GAPDH 프로브 TCCTGCACCACCAACTGCTTAGCA(SEQ ID NO : 149)
실시예 10: 불완전한 염색체 eGFP 유전자의 편집용 도너 서열의 제조
PCR를 사용하여, 불완전한 eGFP 유전자를 편집하기 위한 유전자 정보를 포함하는 도너 구조를 만들었다. 주형으로서 peGFP NI 벡터를 사용하여, 상기에 서술한 방법으로 PCR 반응을 실행했다. 표적화된 재조합 실험에서 도너 구조의 배경 발현을 막기위해서, 프라이머 GFPnostart 및 GFP Xba(표 14에 제시된 서열)를 사용하는 PCR를 사용하여 제1 12 bp 및 개시 코돈을 상기 도너로부터 제거했다. pCR(R) 4 TOPO GFP 도너 5를 제조하도록 복제되는 TOPO TA에 의해서, 생성된 PCR 절편(734 bp)를 포유류 세포 프로모터를 포함하는 pCR (R) 4 TOPO 벡터 내에서 복제했다(도 28). 상기 구조(도 22에 제시된 서열의 뉴클레오티드 64 ~ 797에 해당)의 eGFP 삽입체의 서열이 도 29에 나타난다(SEQ ID NO : 20).
도너 분자의 구조를 위한 올리고뉴클레오티드
올리고뉴클레오티드 서열 5' ~ 3'
GFPnostart GGCGAGGAGCTGTTCAC(SEQ ID NO: 150)
GFP-Xba GATTATGATCTAGAGTCG(SEQ ID NO: 151)
실시예 11: 표적화된 절단 및 재조합에 의한 통합된 염색체 eGFP 유전자 내의 돌연 변이 편집
하나 또는 두 개의 ZFP FokI 발현 플라스미드(pcDNA3.1 GFP287 FokI 및pcDNA3.1 GFP296 FokI, 실시예 7) 및 제조자 프로토콜에 따라 혈청 배지을 환원한pti-MEM I 내의 LipofectAMINE 2000 Reagent(Invitrogen)를 사용하는 도너 플라스미드 pCR(R)4 TOPO GFP도너5(실시예 10) 300 ng을 사용하여 T18 세포 라인(실시예 9)을 감염시켰다. 배양 배지에 독시시클린 2 ng/ml을 첨가함으로써 감염시킨 후, 5 ~ 6 시간 동안 불완전한 염색체 eGFP 유전자를 발현시켰다. 상기 세포는 24 시간 감염된 후 노코다졸(도 30) 100 ng/ml 또는 빈블라스틴(도 31) 0.2 uM를 첨가함으로써 세포 주기의 G2기에서 고정됐다. G2기 고정을 24 ~ 48 시간 동안 유지시킨 후, 배지을 제거함으로써 풀었다. 세포를 PBS로 세척했고, 배지을 비테트라사이클린 FBS 및 독시시클린 2 ng/ml를 포함하는 DMEM으로 교체했다. 상기 세포를 24 ~ 48 시간 동안 회수했다. 형광 활성 세포 분류(FACS) 분석에 의해서 eGFP 형광성을 나타내는 세포의 수를 모니터함으로써 유전자 편집 효율을 측정했다. Beckman Coulter EPICS XL MCL 장치 및 System II 데이터 획득 및 표시 소프트웨어 버전 2.0을 사용하여 FACS 분석을 실행했다. 아르곤 레이저로 488 nm에서 여기시키고 525 nm(x 축)에서 방사를 모니터함으로써, eGFP 형광을 측정했다. 570 nm(y 축)에서 방사를 모니터함으로써, 배경 및 자가형광을 측정했다. 525 nm에서 높은 형광 방사 및 570 nm(E 영역)에서 낮은 방사를 나타내는 세포는 유전자 편집에 대해서 양의 수치를 기록했다.
상기 결과를 표 15, 도 30 및 도 31에 요약한다. 도 30 및 도 31은 T18 세포가 ZFP 뉴클레아제를 코드화한 pcDNA3.1 GFP287 FokI 및 pcDNA3.1 GFP296 FokI 플라스미드 및 pCR(R)4 TOPO GFP도너5 플라스미드로 감염됐고, eGFP 발현은 독시사이클론으로 실행됐고, 세포가 노코다졸(도 30) 또는 빈블라스틴(도 31)으로 G2기에 고정된 결과를 보여준다. 두 개의 도는 eGFP 형광성을 띠는 세포가 FACS 흔적의 보다 낮은 오른쪽 영역에 존재하는 FACS 흔적을 보여준다(곡선의 4분의 1 밑 부분인 E 영역). 노코다졸로 처리된 세포로 감염 세포에 있어서, 상기 세포의 5.35 %는 돌연 변이를 일으킨 염색체 eGFP 유전자가 편집을 됐음을 보이는 GFP 형광을 나타냈고(도 30), 세포의 6.7 %는 eGFP 유전자 편집된 빈블라스틴으로 처리됐다(도 31). 상기 결과를 또 다른 조절 실험과 더불어 표 15의 1 ~ 8 줄에서 요약한다.
요약하면, 상기 실험은 두 개의 ZFP 뉴클레아제 및 도너 서열의 존재하에서, 처리된 세포의 1 %는 유전자 편집을 실행했고, 상기 편집 수치는 세포 주기의 G2 기에 처리된 세포를 고정함으로써 4 ~ 5 배 증가함을 보인다.
불완전한 염색체 eGFP 유전자의 편집
실험 처리 1 편집된 eGFP를 함유하는 세포의 퍼센트 2
1 300 ng의 도너 단독 0.01
2 100 ng의 ZFP 287 + 300 ng의 도너 0.16
3 100 ng의 ZFP 287 + 300 ng의 도너 0.6
4 50 ng의 ZFP 287 + 50 ng의 ZFP 296 + 300 ng의 도너 1.2
5 실험 4 + 100 ng/ml의 노코다졸 5.35
6 실험 4 + 0.2 uM의 빈블라스틴 6.7
7 도너 비존재, ZFP 비존재, 100 ng/ml의 노코다졸 0.01
8 도너 비존재, ZFP 비존재, 0.2 uM의 빈블라스틴 0.0
9 100 ng의 ZFP287/Q486E + 300 ng의 도너 0.0
10 100 ng의 ZFP296/E490K + 300 ng의 도너 0.01
11 50 ng의 287/Q486E + 50 ng의 296/E490K + 300 ng의 도너 0.62
12 실험 11 + 100 ng/ml의 노코다졸 2.37
13 실험 11 + 0.2 uM의 빈블라스틴 2.56
주:
1 : 하나 또는 두 개의 ZFP 뉴클레아제를 코드화한 플라스미드 및/또는 완전한 eGFP 서열을 코드화한 도너 플라스미드를 사용하여, 불완전한 염색체 eGFP 유전자를 포함하는 T18 세포를 감염했다. 염색체 eGFP의 발현을 독시시클린으로 실행했다. eGFP를 유도한 후, 선택적으로 세포를 세포 주기의 G2기에 고정했다. 감염된 후 5일 동안 FACS 분석을 실행했다.
2: 상기 수치는 525 nm에서 높은 방사를 나타내고 570 nm에서 낮은 방사를 나타내는 전체 형광의 퍼센트이다(FACS 흔적의 E 영역).
실시예 12: 이량체화 인터페이스 내에서 서열이 변경된 징크핑거 뉴클레아제를 사용하는 불완전한 염색체 유전자의 편집
이량체화 인터페이스 내에서 변경된 서열을 포함하는 징크핑거 뉴클레아제의 불완전한 염색체의 eGFP 유전자의 편집을 촉진하는 능력을 테스트했다. ZEP 뉴클레아제의 뉴클레아제 부분(즉, FokI 절단 하프 도메인)을 실시예 5에서 서술한 바와 같이 개조한 것을 제외하고, 실시예 11에서 제시한 프로토콜을 사용했다. 따라서, E490K 절단 하프 도메인을 GFP296 ZFP 도메인과 융합했고(표 12), Q486E 절단 하프 도메인을 GFP287 ZFP과 융합했다(표 12).
얻어진 결과를 표 15의 줄 9 ~ 11에 나타낸다. 상기 결과는 이량체화 인터페이스에서 개조된 두 개의 ZEP 뉴클레아제의 존재시 얻은 유전자 편집의 발생 빈도가 두 개의 뉴클레아제 중 한 개만 존재하는 경우에 비해서 현격히 증가함을 나타낸다. 또 다른 실험에서, T18 세포를 도너 플라스미드 및 287/Q486E 및 296/E490K 징크핑거 뉴클레아제를 코드화한 플라스미드로 감염시킨 후, 노코다졸 또는 빈블라스틴으로 G2기에 고정시켰다. 그 결과 염색체 eGFP유전자가 편집됐음을 나타내는 eGFP 형광을 띠는 세포가 2 %를 웃도는 수준으로 편집의 발생 빈도가 또다시 증가했음을 보였다.
실시예 13: 도너 길이의 유전자 보정 주기에 미치는 영향
실시예 11에서 기술한 것과 유사한 실험에서, 도너 서열의 길이가 표적화된 재조합의 주기에 미치는 영향을 테스트하였다. 실시예 11에서와 같이 두개의 ZFP 뉴클레아제로 T18 세포를 감염시키고, 독시시클린으로 eGFP 발현이 유도되었다. 또한 실시예 11과 같이 734 bp eGFP 삽입체 (도 29)를 포함하는 pCR(R)4-TOPO-GFPdonor5 플라스미드 (도 28)로 세포를 감염시키거나, 변형된 염색체 eGFP 유전자와 상동성을 지닌 1527 bp 서열 삽입체 (도 32)를 포함하는 동일 플라스미드로 세포를 감염시켰다. 또한, 노코다졸에 의한 G2기 고정이 재조합 주기에 미치는 영향도 평가되었다.
두 번째의 실험에서, 0.7, 1.08, 1.5 도너 길이에 대하여 각각 비교하였다. 실시예 11에서 기술한 것과 같이, 50 ng의 287-FokI 과 296-FokI 발현 플라스미드(실시예 7, 표 12) 와 500 ng의 0.7 kbp, 1.08 kbp, 1.5 kbp 도너로, T18 세포를 감염시켰다. 감염후 4일이 지난 후, FACS로 결함있는 eGFP 유전자를 보정하기 위하여 세포를 분석하고, GFP 형광을 관찰하였다.
이러한 두 개의 실험 결과는, 표 16에서 보듯이, 긴 도너 서열은 표적화된 재조합의 주기를 증가시킨다는 사실을 보이고(따라서 유전자 보정의 주기 또한 증가), 세포 주기의 G2 단계에 세포를 고정하는 것은 또한 표적화된 재조합의 주기를 증가시킨다는 사실을 확인해 준다.
도너 길이와 세포 주기 고정이 표적화된 재조합 주기에 미치는 영향

도너 길이 (kb)		 실험 1
노코다졸 농도
0 ng/ml 100ng/ml
실험 2
0.7 1.41 5.84 1.2
1.08 불실시 불실시 2.2
1.5 2.16 8.38 2.3
주: 수치는 FACS 추적의 영역 E에 나타난 전체 형광의 백분율을 나타내며 (실시예 11 참고), 이것은 결함있는 염색체 eGFP 유전자의 보정을 위하여 표적화된 재조합의 과정을 거친 세포의 비율을 나타낸다.
실시예 14: 징크 핑거 뉴클레아제를 이용하여 표적화된 절단에 의한 내인성 인간 IL-2Rγ 유전자의 편집
인간 IL-2Rγ 유전자를 표적으로 하는 ZFP-뉴클레아제를 각각 인코딩하는 두개의 발현 벡터를 만들었다. 각 ZFP-뉴클레아제는 징크 핑거 단백질-기반의 DNA 결합 도메인 (표 17)을 포함하고 있었는데, 이것을 4개의 아미노산 ZC 링커 (실시예 4)를 매개로 하여 IIS 제한 효소 FoKI (Wah et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10564-10569의 서열의 아미노산 384-579) 형태의 뉴클레아제 도메인으로 융합하였다. 뉴클레아제의 설계는, 코돈 228과 229(돌연변이 빈발부위)를 둘러싸고 있는 염색체 IL-2Rγ 유전자의 엑손 5 위치에 결합하고, 그 결합 부위 사이에 있는 DNA의 이중-나선 절단을 유도하도록 하였다.
IL-2Rγ 유전자의 엑손 5를 위한 징크 핑거의 설계
표적 서열 F1 F2 F3 F4
ACTCTGTGGAAG
(SEQ ID NO: 152) 5-8G		 RSDNLSV
(SEQ ID NO : 153)		 RNAHRIN
(SEQ ID NO : 154)		 RSDTLSE
(SEQ ID NO : 155)		 ARSTRTN
(SEQ ID NO : 156)
AAAGCGGCTCCG
(SEQ ID NO: 157) 5-9G		 RSDTLSE
(SEQ ID NO : 158)		 ARSTRTT
(SEQ ID NO : 159)		 RSDSLSK
(SEQ ID NO : 160)		 QRSNLKV
(SEQ ID NO : 161)
주: 하나의 문자 코드로 표시된 징크 핑거 아미노산 서열은, 각 징크 핑거의 알파-나선 부분의 시작점과의 관계에서 잔기 -1에서 +6까지를 각각 나타낸다. 핑거 Fl은 단백질의 아미노 말단에 가장 가까이 있다.
각각의 키메라 엔도뉴클레아제의 상세한 DNA-결합 부분은 하기와 같다:
ACTCTGTGGAAG를 표적으로 하는 뉴클레아제 (SEQ ID NO : 152)
MAERPFQCRICMRNFSRSDNLSVHIRTHTGEKPFACDICGRKFARNAHRINHTKIHTGSQKPFQCRICMRNFSRSDTLSEHIRTHTGEKPFACDICGRKFAARSTRTNHTKIHLRGS (SEQ ID NO : 162)
AAAGCGGCTCCG를 표적으로 하는 뉴클레아제 (SEQ ID NO : 157)
MAERPFQCRICMRNFSRSDTLSEHIRTHTGEKPFACDICGRKFAARSTRTTHTKIHTGSQKPFQCRICMRNFSRSDSLSKHIRTHTGEKPFACDICGRKFAQRSNLKVHTKIHLRGS (SEQ ID NO : 163)
인간의 배아기 신장 293 세포를 2개의 발현 구조체로 감염시켰는데 (리포펙타민 2000; Invitrogen), 각각은 상기 단락에서 기술한 ZFP-뉴클레아제 하나를 코딩화한다. 또한 삽입체로 기능하면서 IL-2Rγ 유전자좌의 1,543 bp 절편을 나르는 도너 구조체를 이용하여, pCR4Blunt Topo (Invitrogen) 벡터에서 상기 세포를 감염시켰는데, 상기 절편은 X 염색체의 마이너스 나선에 있는 위치 69195166-69196708에 해당한다. IL-2Rγ는 엑손 5 서열에 있는 하기의 두개의 점돌연변이를 포함하는 서열을 삽입한다(밑줄부분):
F R V R S R F N P L C G S (SEQ ID NO : 164)
TTTCGTGTTCGGAGCCGGTTTAACCCGCTCTGTGGAAGT (SEQ ID NO : 165)
첫 번째 돌연변이 (CGC->CGG)는 아미노산 서열(윗줄)은 변경시키지 않고, ZFP-뉴클레아제가 도너 DNA에 결합하고 또 이에 이은 재조합에서의 염색체 DNA와 결합하는 능력에 나쁜 영향을 미치게 된다. 두 번째 돌연변이 (CCAoCCG)는 아미노산 서열을 변경하지 않고 제한 효소 BsrBI를 위한 인식 부위를 형성한다.
50 또는 100 ng의 각 ZFP-뉴클레아제 발현 구조체와, 0.5 또는 1 mg의 도너 구조체가 쌍으로 감염에 사용되었다. 또한 하기의 대조 실험 역시 실시되었다: eGFP 단백질을 코드화하는 발현 플라스미드를 이용한 감염, ZFP 뉴클레아제만을 발현하는 플라스미드를 이용한 감염. 감염 후 24시간이 지난 후, 각 쌍의 하나에 빈블라스틴(Sigma)을 첨가하여 0.2μM의 최종 농도를 맞추고 나머지 하나는 그대로 두었다. 빈블라스틴은 세포가 유사분열방추를 모으는 능력에 영향을 미쳐서 마치 강력한 G2기 고정물로 작용한다. 이러한 처리는 표적화의 주기를 향상하기 위하여 이루어졌는데, 왜냐하면 세포 주기의 G2 단계에서는 상동성-직접적 이중 나선 단절 복구 경로가, 비상동성 말단 결합보다 더 활성화되기 때문이다.
0.2μM의 빈블라스틴 처리후 48시간이 지나서, 성장 배지를 교체하고, 추가적으로 24시간 동안 세포가 빈블라스틴 처리를 회복하도록 하였다. DNEasy 조직 키트(Qiagen)를 이용하여 모든 세포 샘플에서 게놈 DNA를 분리하였다. 유전자 표적화의 주기를 구하기 위해 각 샘플에서 500 ng의 게놈 DNA를 분석하였는데, 도 33에서 도식적으로 설명된 분석법을 이용하여 염색체 IL-2Rγ 유전자좌에 있는 새로 형성된 BsrBI를 분석하는 검사방법에 의하였다.
요약하면, 표 18에서 보듯이 프라이머를 이용하여 PCR을 20번 순환 실시하였다. 1.5kb 도너 서열에 상동하는 영역 밖에서 각각 염색체 IL-2Rγ 유전자좌와 즉시 혼성화하게 된다. PCR 생성물의 검출을 위하여 각 PCR 반응마다 20 마이크로퀴리의 α-32P-dCTP와 α-32P-dATP를 함유하게 한다. PCR 반응을 G-50 칼럼(Amersham)에서 탈염 처리하고, 1시간 동안 증해하여 10 단위의 BsrBI를 만들었다. 증해한 생산물을 10%의 비변성 폴리아크릴아미드 겔(BioRad)에 용해하고, 겔을 말린 후 방사능 사진을 촬영하였다 (도 34). IL-2Rγ 유전자좌의 1.55 kb 증폭 절편에 해당되는 주요 PCR 생산물과 더불어(도 34의 wt), 추가적인 밴드가 관찰되었는데 (도 34의 rflp), 이는 도너 DNA 구조체와 두개 전부의 ZFP-뉴클레아제 구조체로 감염된 세포 샘플에 해당한다. 상기의 추가적인 밴드는 대조 레인에는 나타나지 않는 것인데, 이것은 BsrBI RFLP-함유 도너 서열이 염색체에 ZFP 뉴클레아제-조장성 재조합이 본 실험에서 발생하였음을 나타낸다.
추가적인 실험에서는, 극소량의 RFLP 함유 IL-2Rγ DNA 서열을 인간 게놈 DNA (야생형 IL-2Rγ 유전자 함유)에 첨가하고, 그 혼합결과물을 증폭하고 RFLP에서 절단하는 제한 효소로 증해하였는데, 상기의 평가법을 이용하여 0.5%만큼 작은 RFLP 함유 서열도 검출될 수 있음을 보였다.
인간 IL-2Rγ 유전자의 분석을 위한 올리고뉴클레오티드
올리고뉴클레오티드 서열
Ex5_1.5detF1 GATTCAACCAGACAGATAGAAGG (SEQ ID NO : 166)
Ex5_1.5detR1 TTACTGTCTCATCCTTTACTCC (SEQ ID NO : 167)
실시예 15: K562 세포의 IL-2Rγ 유전자좌에 대한 표적화된 재조합
K562는 인간의 만성 골수성 백혈병에서 유래하는 세포계를 말한다. 표적화된 절단을 위해 사용되는 단백질은, 5-8G 및 5-9D 징크 핑거 DNA 결합 도메인에 융합하는 FokI이다(실시예 14, 표 17). 도너 서열은 실시예 14에서 기술하였듯이, 돌연변이에 의한 BsrBI 부위를 포함하는 인간 IL-2Rγ 유전자의 1.5kbp 절편이 된다.
K562 세포는 RPMI 배지 1640(Invitrogen)에서 배양되고, 10%의 소태혈청 (FBS, Hyclone)과 2 mM L-글루타민을 보충한다. 모든 세포들은 5% CO2의 환경에서 37°C를 유지한다. 이러한 세포들은 Nucleofection™(Solution V, Program T16) (Amaxa Biosystems)로 감염되고, 생산자의 규약에 따라서, 샘플마다 2백만개의 세포를 감염시킨다. 감염 DNA는, 하기에 기술한 것과 같이 다양한 조합으로 사용되는데, 5-8G ZFP-FokI 융합 엔도뉴클레아제를 코드화하는 플라스미드, 5-9D ZFP- FokI 융합 엔도뉴클레아제를 코드화하는 플라스미드, 상기 실시예 14에서 기술한 도너 서열과 조절체로 사용되는 peGFP-N1 벡터(BD Biosciences)를 포함하는 플라스미드 등이 있다.
첫 번째 실험에서는, 표 19에서와 같이 세포들은 다양한 플라스미드나 그 조합을 이용하여 감염된다.
샘플 # p-eGFP-N1 p5-8G p5-9D 도너 빈블라스틴
1 5 μg - - - -
2 - - - 50 μg -
3 - - - 50 μg 처리함
4 - 10 μg 10 μg - -
5 - 5 μg 5 μg 25 μg -
6 - 5 μg 5 μg 25 μg 처리함
7 - 7.5 μg 7.5 μg 25 μg -
8 - 7.5 μg 7.5 μg 25 μg 처리함
9 - 7.5 μg 7.5 μg 50 μg -
10 - 7.5 μg 7.5 μg 50 μg 처리함
빈블라스틴 처리는, 감염 24시간 후 세포를 30 시간동안 0.2 uM 빈블라스틴에 노출하는 방식으로 하였다. 세포를 수집한 후, PBS로 두 번 씻은 다음, 다시 성장 배지에 놓았다. 게놈 DNA의 분석을 위하여 감염후 4일이 지나서 세포를 수확하였다.
DNEasy 키트(Qiagen)를 사용하여 세포에서 게놈 DNA를 추출하였다. 하기의 프라이머와의 PCR 반응에는 각 샘플마다 100 ng의 게놈 DNA가 사용되었다:
엑손 5 전방향: GCTAAGGCCAAGAAAGTAGGGCTAAAG (SEQ ID NO : 168)
엑손 5 역방향: TTCCTTCCATCACCAAACCCTCTTG (SEQ ID NO : 169)
이러한 프라이머들은 "마이너스" 나선상 (UCSC 인간 게놈 2003년 7월 공개)의 위치 69195100 ~ 69196768에 해당하는 X 염색체의 1,669 절편을 증폭하는데, 그 나선에는 IL-2Rγ 유전자의 엑손 5가 포함되어 있다. 도너 DNA와 상동성 재조합 과정을 거친 게놈 DNA의 증폭을 통하여 BsrBI 부위를 포함하는 결과물을 얻을 수 있다. 이에 반하여 도너 DNA와 상동성 재조합의 과정을 거치지 않은 게놈 DNA를 증폭하여 얻은 결과물은 상기 제한 부위를 포함하지 않을 것이다.
반응물의 검증을 위해서 각 증폭 반응마다 각각 10 마이크로퀴리의 α-32PdCTP 및 α-32PdATP가 포함되게 하였다. PCR을 20번 순환한 후, Sephadex G-50 칼럼 (Pharmacia)상에서 탈염 처리하고, BsrBI(New England Biolabs) 10 단위를 이용하여 37°C에서 1시간 동안 증해시켰다. 10%의 비변성 PAGE에 용해한 후, 말리고, PhosphorImager 스크린에 노출시켰다.
상기 실험의 결과는 도 35에 나타나 있다. 조절자 GFP 플라스미드, 그리고 도너 플라스미드 하나만 또는 도너 없이 두 개의 ZFP 코드화 플라스미드를 이용하여 세포를 감염하였을 때에는, 도 35에서 샘플에 해당되는 레인상에 "rflp"로 표시된 밴드가 없는 것을 통하여 알 수 있듯이, 증폭 생성물에는 BsrBI 부위가 발견되지 않았다. 그러나, 도너 플라스미드와 두 개의 ZFP 코드화 플라스미드를 모두 이용하여 감염시킨 세포의 경우, 도너 DNA와 상동성 재조합으로 유도된 BsrBI 부위가 그 세포의 게놈 DNA에 존재하였다("rflp"로 표시된 밴드). RFLP 함유 DNA가 나타낸 신호의 백분율 분석은 도 35에 나타나 있는데, 최적의 조건 아래에서는 감염된 세포의 모든 IL-2Rγ 유전자의 18%까지만이 상동성 재조합에 의한 개체수 변화가 있음을 알 수 있다.
상기에서 기술된 형식에 따라서 두 번째 실험을 행하였는데, 다만 세포를 감염 후 10일 동안 확장하여 진행시켰다. 감염에 사용된 DNA는 표 20에 나타나 있다.
샘플 # p-eGFP-N1 p5-8G p5-9D 도너 빈블라스틴
1 50 μg - - - -
2 - - - 50 μg -
3 - - - 50 μg 처리함
4 - 7.5 μg 7.5 μg - -
5 - 5 μg 5 μg 25 μg -
6 - 5 μg 5 μg 25 μg 처리함
7 - 7.5 μg 7.5 μg 50 μg -
8 - 7.5 μg 7.5 μg 50 μg 처리함
도 36의 증폭된 DNA의 BsrBI 분석을 통하여, IL-2Rγ 유전자의 18%가, 세포 분화의 다중 순회 후 상동 재조합을 통하여 서열 변질 과정을 거쳤다는 사실이 다시 증명된다. 따라서 표적화된 재조합 발생은 안정적이다.
또한, 상기 두번째 실험에서 감염된 세포의 DNA를 서던 블로팅으로 분석하였다. 이 분석을 위하여, 각 샘플에서 12mg의 게놈 DNA를, 37℃에서 12시간동안 증해하였는데, 100 단위 EcoRI, 50 단위 BsrBI, 40 단위 DpnI (New England Biolabs)를 이용하였다. BsrBI 부위를 포함하게 하기 위하여 상동성 재조합에 의하여, 상기의 증해를 통하여 천연 IL-2Rγ 유전자(BsrBI 부위 부재)로부터 7.7 kbp의 Eco RI 절편을 얻어내고 그 서열이 변질된 염색체 IL-2Rγ 유전자로부터 6.7 및 1.0 kbp의 절편을 얻어내었다. dam-메틸화 도너 DNA를 파괴하기 위하여 메틸화 의존성 제한 효소인 DpnI를 포함시켰다.
증해한 후, 게놈 DNA를 페놀-클로로포름 추출법과 에탄올 침전법을 이용하여 정화시키고, TE 완충제로 재부유화한 후, 사이즈 마커를 만들기 위해 EcoRI와 SphI로 증해시킨 게놈 DNA 샘플을 함께 0.8%의 아가로스 겔에 용해시켰다. 겔은 표준처리절차에 이어 알칼린 전이 과정을 거치고, DNA는 나일론 멤브레인으로 전이된다(Schleicher and Schuell). 그 후, X 염색체(UCSC 인간 게놈 2003년 7월 공개)의 "-"나선의 69198428 ~ 69198769위치에 있는 IL 2Rγ 자리의 방사능 표시된 절편을 사용하여 블롯을 혼성화했다. 상기 유전자의 영역은 도너 DNA에 상동성을 지니는 영역의 바깥부분이다. 혼성화된 후, 상기 막을 PhosphorImager 플레이트에 노출시켰고, Molecular Dynamics 소프트웨어를 사용하여 상기 데이터를 정량했다. EcoRI-BsrBI 절편에 해당하는 밴드의 강도를 분석함으로써 염색체 IL 2Ry 서열의 개조를 측정했다(방사능 사진 옆의 화살표, BrBI 부위는 방사능 사진 위의 지도에서의 색칠해진 삼각형으로 표시).
도 37에 제시된 결과는 최대 15 %의 염색체 IL 2Ry 서열이 상동 재조합에 의해서 개조되었음을 나타낸다. 따라서, PCR에 의해서 얻은 결과는 다양한 수의 세포 분리를 통해서 표적화된 재조합이 안정적이라는 것을 확인시킨다. 또한, 서던 블롯 결과는 도 36에 제시된 결과가 증폭 생성물로부터 얻은 결과가 아님을 나타낸다.
실시예 16 : CD34 양성 조혈모세포 내 IL 2Ry 자리에서의 표적화된 재조합
유전성 질환(예 : 중증합병 면역결핍증(SCID), 겸상적혈구빈혈증)은 질환의 원인이 되는 DNA 서열변경을 상동 재조합을 통해 편집함으로써 치료가 가능하다. 경우에 따라서는, 만능세포의 유전적 결함을 편집함으로써 치료 효율성 및 안정성을 극대화할 수 있다. 본 실시예에서는 이와 관련하여 인간 CD34 양성 골수세포의 IL-2Ry 유전자 서열 변경을 수행하였다. CD34+ 세포는 적혈구, 골수 및 림프구를 생산하는 만능 조혈모세포이다.
AllCells, LLC에서 냉동상태로 입수한 골수 유래 인간 CD34 세포를 사용하였다. 세포를 해동시켜 37℃의 5% C02 RPMI Medium 1640(Invitrogen)에서 2시간 동안 방치한 후, 10% 우태혈청(FBS, Hyclone) 및 2 mM L-글루타민을 공급하였다. 인간 CD34 세포 뉴클레오펙터 키트를 사용하여 세포 샘플(세포 수: 1xl06 또는 2xl06 개)을 뉴클레오펙션(amaxa biosystems)으로 감염시켰다. 10% FBS, 2 mM L-글루타민, 100ng/ml 과립백혈구군 자극인자(G-CSF), 100ng/ml 줄기세포인자(SCF), 100ng/ml 트롬보포이틴(TPO), 50ng/ml Flt3 리간드 및 20ng/ml 인터류킨-6(IL- 6)를 공급한 후 감염된 세포를 RPMI 배지 1640(Invitrogen)에서 배양하였다. 감염 직후, 카스파제 억제제인 VAD-FMK(Sigma-Aldrich)를 최종농도 40 uM으로 성장배지에 가하여 세포사멸을 억제하였다. 48시간 후에, 카스파제 억제제를 최종농도 20 uM로 추가로 가하였다. 37℃, 5% C02 조건에서 3일 동안 배양한 후 세포를 회수하였다.
감염실험에 사용된 세포 수 및 DNA는 표 21과 같다.
샘플 세포 수 p-eGFP-N1 1 도너 2 p5-8G 3 p5-9D 3
1 l
Figure pat00008
l06 		5 ug - - -
2 2
Figure pat00009
l06 		- 50 ug - -
3 2
Figure pat00010
l06 		- 50 ug 7.5 ug 7.5 ug
1. 강화된 녹색 형광단백질을 암호화하는 대조용 플라스미드.
2. BsrBI 부위가 도입된 IL 2Ry 유전자의 엑손 5 서열을 포함하는 1.5 kbp 절편
(실시예 14 참조).
3. 5-8 G 및 5-9D 징크핑거 DNA 결합도메인과의 FokI 융합을 암호화하는 플라스미드
(표 17 참조).
MasterPure DNA 정제 키트(Epicentre)를 사용하여 세포에서 게놈 DNA를 추출하였다. 침전물에 존재하는 글리코겐 때문에 PCR 반응에 사용되는 DNA 양의 정확한 정량은 불가능하다. 브롬산에티디움으로 염색한 아가로스 겔로 분석한 결과, 각 샘플 당 약 50 ng의 게놈 DNA가 사용된 것으로 추정되었다. 하기의 프라이머를 사용하여 PCR을 30사이클 수행하였다. 각 프라이머는 1.5 kb 도너와 상동성이 있는 부위 바로 바깥쪽의 염색체 IL-2Ry 자리에서 하이브리드된다.
ex5_1.5detF3 GCTAAGGCCAAGAAAGTAGGGCTAAAG (SEQ ID NO : 170)
ex5_1.5detR3 TTCCTTCCATCACCAAACCCTCTTG (SEQ ID NO : 171)
PCR 반응시 a-32PdCTP 및 a-32PdATP 20 마이크로퀴리씩을 가하여 PCR 생성물을 검출하였다. 쥬카르트 세포의 IL- 2R 감마 유전자의 엑손 5에 자발성 SNP가 존재하는지를 확인하여 겔 내 함량을 평가하였다. SNP는 정상적인 인간 DNA에 존재하는 MaeII 부위를 파괴하여 RFLP를 생성한다. 따라서, 정상적인 인간 게놈 DNA(Clontech, Palo Alto, CA) 1 또는 10 ng을 쥬카르트 게놈 DNA 100 또는 90 ng에 각각 가한 후, 위에서 설명한 바와 같이 PCR을 실행하여 참고표준을 만들었다. PCR 생성물을 G-50 칼럼(Amersham)으로 탈염한 후, 제한효소로 1시간 동안 처리하였다. 실험 샘플은 BsrBI(New England Biolabs) 10 유닛으로 처리하였고, "참고표준" 생성물은 MaeII로 처리하였다. 처리 생성물을 10% 비변성 PAGE (BioRad)에 녹인 후, 형성된 겔을 PhosphorImager 플레이트(Molecular Dynamics)에 노출하여 건조, 분석하였다.
결과는 도 38에 도시하였다. 주요 PCR 생성물은 IL2Ry 자리의 1.6 kb 절편(도 38 오른쪽의 "wt")이며, 그 외에 ZFP-뉴클레아제와 도너 DNA 구성체를 암호화하는 플라스미드에 의해 감염된 세포에서 취한 샘플에 해당하는 밴드("rflp")가 관찰되었다. 이 밴드는 대조군에서는 발견되지 않았으며, 이는 ZFP-뉴클레아제가 보조 유전자 표적화 공통 감마사슬 유전자의 엑손 5 표적화를 보조한다는 것을 뒷받침해 준다.
RFLP 밴드가 야생형 밴드와 가깝게 위치하고 있어 표적화 빈도를 정확하게 정량화하기는 어렵지만, 참고표준(왼쪽 패널)과 비교할 때 표적화 빈도는 1~5%로 추정되었다.
실시예 17: 도너 표적 상동성의 효과
도너 DNA와 재조합 염색체 서열 사이의 상동성 정도가 상동 재조합의 빈도에 미치는 효과를 T18 셀라인을 대상으로 실험하였다(실시예 9 참조). 셀라인은 염색체 통합 결함성 eGFP 유전자를 포함하고 있었으며, 도너 DNA는 염색체 유전자의 결함을 편집하는 서열변경을 포함하고 있었다.
따라서, PCR 돌연변이에 의해 실시예 10의 도너 서열이 변경되어, 표적과 다양한 비상동성을 가지는 700 bp 도너 구조체들이 생성되었다. 변경된 도너는 모두 염색체 eGFP 유전자의 결함을 편집하는 서열변경을 포함하고 있었으며 절단부위 주변의 암호화 부위에 삽입되는 침묵 돌연변이(암호화된 단백질의 서열을 변경시키지 않는 DNA 돌연변이)를 포함하고 있었다. 침묵 돌연변이는 징크핑거 절단 도메인 융합에 의한 도너 서열과의 결합 및 도너 서열의 절단을 막아, 염색체 표적과 도너 플라스미드가 경쟁적으로 키메라 뉴클레아제와 결합하는 것을 억제하기 위함이다. 또한, 상동 재조합이 있은 후, 키메라 뉴클레아제가 새로 삽입된 염색체 서열과 결합하였다가 다시 분리되는 현상 역시 최소화된다(새로운 재조합의 촉진이나 비상동성 말단결합 또는 기타 이중사슬의 붕괴에 의한 게놈의 변경 역시 최소화될 수 있다).
4개의 각기 다른 도너 서열을 테스트하였다. 도너 1은 염색체 결함성 eGFP 표적서열과의 미스매치가 8개, 도너 2는 10개, 도너 3은 6개, 도너 5는 4개였다. 도너 5의 서열은 야생형 eGFP 서열과 동일하나, T18 셀라인 내의 염색체 결함 eGFP 서열과 미스매치가 4개이다. 뉴클레오티드 201~242의 각 도너의 서열을 표 22에 제시하였다. T18 셀라인의 게놈 내로 통합된, 결함 eGFP 유전자의 서열과 다른 뉴클레오티드는 볼드체 및 밑줄로 표시하였다. 결함 염색체 eGFP 유전자(GFP mut) 및 정상적인 eGFP 유전자(GFP wt)의 서열도 함께 표시하였다.
도너 서열 SEQ ID NO.
도너 l CTTCAGCCGCTA T CC AG A C CAC AT GAA A CA A CACGACTTCTT 172
도너 2 CTTCAGCCG G TA T CC AG A C CAC AT GAA A CA A CA T GACTTCTT 173
도너 3 CTTCAGCCGCTACCC AG A C CAC AT GAA A CAGCACGACTTCTT 174
도너 5 CTTCAGCCGCTACCCC G A C CAC AT GAAGCAGCACGACTTCTT 175
GFP mut CTTCAGCCGCTACCCCTAACAC--GAAGCAGCACGACTTCTT 176
GFP wt CTTCAGCCGCTACCCC G A C CAC AT GAAGCAGCACGACTTCTT 177
실시예 11에서와 같이, 50 ng의 287-FokI 및 296-FokI 발현 구조체(실시예 7, 표 12)과 500 ng의 각 도너 구조체로 T18 셀라인을 감염시켰다. 실시예 11에서와 같은 방법으로 FACS 분석을 실시하였다.
표 23에 제시된 바와 같이, 도너 서열과 염색체 표적서열 사이에 미스매치가 감소함에 따라(즉 상동성이 증가함에 따라) GFP 기능이 회복되었으며, 따라서 상동 재조합 빈도가 증가하는 것으로 나타났다.
도너 미스매치 수 편집된 eGFP 유전자 도너를 가지는 세포의 비율 2
도너 2 10 0.45%
도너 1 8 0.53%
도너 3 6 0.89%
도너 5 4 1.56%
1 : 결함 염색체 eGFP 유전자를 포함하는 T18 세포를 2개의 ZFP 뉴클레아제를 암호화하는
플라스미드 및 염색체 표적서열과 다양한 수의 서열 미스매치를 가지는 비결함 eGFP
서열을 암호화하는 도너 플라스미드로 감염시켰다. 독시시클린으로 염색체 eGFP 유전자의
발현을 유도하였으며, 5일 후에 FACS 분석을 실시하였다.
2: 수치는 525 nm에서 고발광, 570 nm(FACS의 E 영역)에서 저발광을 보이는 형광발광의
전 전체 비율을 뜻한다.
상기 결과는 표적서열과 도너 서열 사이의 편차를 줄임으로써 상동 재조합 수준을 높일 수 있다는 것을 보여준다. 어떤 특정한 이론 또는 메커니즘에 국한되는 것은 아니지만, 도너와 표적 사이의 상동성이 클수록 세포의 상동 재조합 시스템이 도너분자를 적절한 주형으로 인지하게 되어 상동 재조합이 촉진되는 것으로 생각된다. 또는, 도너와 표적 사이의 상동성이 증가하면 키메라 ZFP 뉴클레아제에 의해 도너가 절단되게 되고, 절단된 도너는 사슬의 침입빈도를 높여 상동 재조합을 촉진하거나 절단된 도너의 말단부를 DNA의 상동부위로 인식하게 함으로써 상동 재조합을 촉진하는 것일 수 있다. 이 두 가지 가능성은 서로 모순되는 것이 아니다.
실시예 18 : siRNA의 제조
비상동성 말단결합(NHEJ)과 관련된 단백질의 세포 내 농도 저하가 표적화된 상동 재조합을 촉진하는지 알아보기 위하여, siRNA 억제를 통해 Ku70 단백질 농도를 낮추는 실험을 실시하였다. Ku70 cDNA를 전사한 후 Dicer 효소로 이중사슬 전사체를 분리하여 Ku70 유전자를 표적으로 하는 siRNA 분자를 생산하였다.
293 및 U20S 세포로부터 얻은 cDNA 풀을 이용하여 5가지 증폭반응을 실시하였다. 각 증폭반응에서 Ku70 유전자에 대해 특이성을 가지는 각기 다른 증폭 프라이머를 사용하여 크기가 500~750 bp인 5가지 cDNA 절편 풀(풀 A~E)을 얻었다. 박테리오파지 T7 RNA 폴리머라제 프로모터 인자를 포함하는 프라이머를 이용하여 5개 풀의 각 절편을 다시 증폭하였다. 이 때에도 각 cDNA 풀에 대해 각기 다른 프라이머를 사용하였다. cDNA 생산 및 PCR 반응에는 Superscript Choice cDNA 시스템과 백금 택 고 충실 폴리머라제(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 사용하였다.
증폭된 각 DNA 풀을 RNAMAXX 생체 외 전사키트(Stratagene, San Diego, CA)를 사용, 박테리오파지 T7 RNA 폴리머라제로 생체 외에서 전사하여 5개의 이중사슬 RNA(dsRNA) 풀(A~E)을 얻었다. 에탄올로 침전시킨 다음, 각 풀의 RNA를 다시 현탁시킨 후 재조합 Dicer 효소(Stratagene, San Diego, CA)를 이용하여 절단하였다. 각 풀의 21-23 bp siRNA 생성물을 Microspin G-25 칼럼(Amershan)과 Microcon YM-100 칼럼(Amicon)을 사용, 2단계 공정을 통해 정화하였다. Lipofectamone 20000을 사용하여 각 siRNA 생성물 풀을 일시적으로 T7 셀라인에 감염시켰다.
siRNA 풀의 상대적인 Ku70 발현 억제효율을 평가하기 위하여 감염 후 약 3일이 지난 뒤 웨스턴블롯을 실시하였다. RIPA 완충액(Santa Cruz Biotechnology)을 사용하여 세포를 용해, 파열한 뒤, QIAshredder(Qiagen, Valencia, CA)를 통과시켜 균질화하였다. 이후, 용해물을 SDS PAGE 샘플 완충액(β 머캅토에탄올을 환원제로 사용)으로 처리한 후 5분 동안 끓였다. 샘플을 농도경사 4-12%의 NUPAGE 겔로 녹인 후 PVDF 막으로 옮겼다. 블롯 상층부는 anti-Ku70 항체(Santa Cruz sc-5309)에, 하층부는 anti-TF IIB 항체(Santa Cruz sc-225, 대조군)에 노출시켰다. 이후에, 2차 항체(양고추냉이 퍼옥시다제-콘쥬게이트 염소 항-마우스 2차 항체)에 노출시키고 Pierce Chemical Co. 제품을 이용하여 전기적 화학발광(ECL) 검출을 실시하였다.
도 39는 2개의 siRNA 풀(D, E)을 T7 세포에 감염시킨 결과를 도시한 것이다. siRNA E 70 ng으로 감염시켰을 때 Ku70 단백질의 농도가 크게 감소하였다(도 39, 레인 3).
실시예 19 : 비상동성 말단결합 관련 단백질의 발현억제를 통한 상동 재조합 빈도의 증가
게놈 DNA에서 손상된 이중사슬의 수선은 상동 재조합(HR)과 비상동성 말단결합(NHEJ)의 두 가지 방법에 의해 수행된다. Ku70은 NHEJ에 관여하는 단백질로서, 게놈 DNA의 이중사슬 손상으로 인해 생겨나는 DNA 유리말단과 결합한다. NHEJ에 관여하는 단백질의 세포 내 농도가 낮아지면 HR 빈도가 증가하는지를 알아보기 위하여, 실시예 18에서 얻은 siRNA를 이용하여 Ku70 mRNA의 발현을 억제함으로써, 세포 도너 DNA 및 키메라 뉴클레아제를 암호화하는 플라스미드로 감염시킨 세포 내의 Ku70 단백질 농도를 낮추었다.
T7 셀라인(실시예 9, 도 27)을 사용하여 실험하였다. 이들 세포는 염색체결합 결함 eGFP 유전자를 포함하고 있으나, 실시예 11~13에서 사용한 T18 셀라인에 비해 표적화된 상동 재조합 정도가 낮은 것으로 확인되었다.
실시예 11에서와 같이, 표적화 Ku70을 표적화하는 다이서 생성물의 두 풀 중 하나 70 ng 또는 140 ng으로 T7 세포를 감염시켰다(실시예 18 참조). 세포를 siRNA로 처리하면 Ku70 단백질의 농도가 낮아지는지 확인하기 위하여 감염된 세포에서 얻은 추출물에 대해 단백질 블롯분석을 실시하였다(실시예 18 참조). 도 39에서 보듯이, 풀 E의 siRNA 70 ng으로 처리한 세포의 Ku70 단백질 농도가 감소하였다.
Ku70 농도를 낮추면 상동 재조합 빈도가 높아지는지 확인하기 위하여 세포 샘플을 siRNA(풀 D 또는 풀 E) 70 또는 140 ng, 287 FokI 및 296 FokI 발현 구조체(실시예 7, 표 12) 각 50 ng, 그리고 1.5 kbp GFP 도너(실시예 13) 500 ng으로 감염시켰다. 실험조건은 표 24와 같이 하였다. 실시예 11에서와 같이 FACS 분석을 통해 상동 재조합에 의한 eGFP 활성의 회복정도를 평가하였다.
실시예 도너 l ZFNs 2 SiRNA 3 편집비율 4
1 500 ng - - 0.05
2 - 각 50 ng - 0.01
3 500 ng 각 50 ng - 0.79
4 500 ng 각 50 ng 풀 D 70 ng 0.68
5 500 ng 각 50 ng 풀 D 140 ng 0.59
6 500 ng 각 50 ng 풀 E 70 ng 1.25
7 500 ng 각 50 ng 풀 E 140 ng 0.92
1. 염색체결합 결함 eGFP 유전자와 상동성이 있는 기능성 eGFP 단백질을 암호화하는
1.5 kbp 서열을 포함하는 플라스미드.
2. eGFP 특이성 287 및 296 징크핑거 단백질/FokI 융합 엔도뉴클레아제를 암호화하는
플라스미드.
3. 실시예 18 참조.
4. 525 nm 고발광 및 570 nm 저발광을 포함한 총형광 비율(FACS 트레이스의 영역 E,
실시예 11 참조).
표 24의 오른쪽에는 감염된 T7 세포의 결함 eGFP 유전자 편집비율(표적화된 상동 재조합의 빈도를 암시)이 표시되어 있다. 도너 DNA, 2개의 eGFP 특이성 융합 뉴클레아제를 암호화하는 플라스미드 및 풀 E의 siRNA 70 ng으로 세포를 감염시킨 실시예 6에서 표적화된 재조합 빈도가 가장 높았다. 실시예 18과 도 39를 참조하면, 풀 E siRNA 70 ng에 의해 Ku70 단백질의 농도가 상당히 억제된 것을 알 수 있다. 따라서, NHEJ에 관여하는 단백질의 세포 내 농도를 낮춤으로써 상동 재조합을 촉진할 수 있다.
실시예 20 : 인간 ß-글로빈 유전자를 표적으로 하는 징크핑거 FokI 융합 뉴클레아제
인간 ß-글로빈 유전자를 표적으로 하는 다수의 4 핑거 징크핑거 DNA 결합도메인을 설계하였으며, FokI 절단 하프도메인과 결합하여 각 징크핑거 도메인을 암호화하는 플라스미드를 생산하였다. 각 징크핑거 도메인은 4개의 징크핑거를 가지고 있었으며, 겸상적혈구빈혈증을 일으키는 돌연변이를 암호화하는 인간 ß-글로빈 유전자 영역의 12 bp 표적부위를 인식하였다. 이들 각 단백질의 표적서열에 대한 결합친화력을 평가하여 친화력이 큰 4개의 단백질(sca-r29b, sca-36a, sca-36b, 및 sca-36c)을 이용, FokI 융합 엔도뉴클레아제를 생산하였다.
ZFP DNA 결합도메인의 표적부위 및 인간 ß-글로빈 유전자의 서열은 아래와 같다. 번역 개시 코돈(ATG)은 볼드체와 밑줄로 표시하였다. A-T 치환에 의해 겸상적혈구빈혈증이 발병한다.
sca-36a GAAGTCTGCCGT (SEQ ID NO : 178)
sca-36b GAAGTCtGCCGTT (SEQ ID NO : 179)
sca-36c GAAGTCtGCCGTT (SEQ ID NO : 180)
CAAACAGACACC ATG GTGCATCTGACTCCTG T GGAGAAGTCTGCCGTTACTGGTTTGTCTGTGGTACCACGTAGACTGAGGAC A CCTCTTCAGACGGCAATGAC (SEQ ID NO : 181)
sca-r29b ACGTAGaCTGAGG (SEQ ID NO : 182)
각 단백질의 징크핑거 인지영역의 아미노산 서열을 표 25에 제시하였다. 이들 징크핑거 도메인의 전체 아미노산 서열은 도 40에 도시하였다. sca-36a 도메인은 12개의 인접 뉴클레오티드(위에서 대문자로 표시)를 가지는 표적부위를 인지하고, 나머지 세 도메인은 2개의 6 뉴클레오티드 표적부위(대문자로 표시)와 하나의 뉴클레오티드(소문자로 표시)로 구성되는 13개의 뉴클레오티드 서열을 인지한다. 따라서, sca-r29b, sca-36b 및 sca-36c 도메인은 두 번째 및 세 번째 핑거 사이에 아미노산 서열 TGGGGSQKP (SEQ ID NO : 183)을 가지는 비정규적인 핑거간 링커를 포함한다.
ZFP F1 F2 F3 F4
sca-r29b QSGDLTR
(SEQ : 184)		 TSANLSR
(SEQ : 185)		 DRSALSR
(SEQ : 186)		 QSGHLSR
(SEQ : 187)
sca-36a RSQTRKT
(SEQ : 188)		 QKRNRTK
(SEQ : 189)		 DRSALSR
(SEQ : 190)		 QSGNLAR
(SEQ : 191)
sca-36b TSGSLSR
(SEQ : 192)		 DRSDLSR
(SEQ : 193)		 DRSALSR
(SEQ : 194)		 QSGNLAR
(SEQ : 195)
sca-36c TSSSLSR
(SEQ : 196)		 DRSDLSR
(SEQ ID : 197)		 DRSALSR
(SEQ : 198)		 QSGNLAR
(SEQ : 199)
실시예 21 : β 글로빈 특이성 ZFPIFokI 융합 엔도뉴클레아제를 이용한 DNA 표적 서열의 생체 외 절단
FokI 절단 하프도메인과 실시예 20의 네 ZFP DNA 결합도메인 중 하나를 포함하는 융합단백질에 대하여 생체 외에서 특정 서열의 DNA 절단능력을 테스트하였다. KpnI 및 BamHI 부위를 통해 이들 ZFP 도메인을 pcDNA3.1 발현벡터로 복제한 후 4 아미노산 ZC 링커를 이용하여 FokI 절단도메인과 융합시켰다. 인간 β-글로빈 유전자 700 bp를 포함하는 DNA 절편을 K562 세포에서 얻은 게놈 DNA로부터 복제하였다. 절편의 분리 및 서열은 실시예 3에서 설명한 것과 동일하다.
생체 외 검정용 융합 엔도뉴클레아제(ZFNs)를 생산하기 위하여, sca-r29b, sca-36a, sca-36b 및 sca-36c 단백질과의 FokI 융합을 암호화하는 원형 플라스미드를 생체 외 전사/번역 시스템에서 배양하였다(실시예 4 참조). 총 2 ul의 TNT 반응액(하나의 단백질을 검정하는 경우 2 ul 사용, 두 개의 단백질을 검정하는 경우 각각 1 ul씩 사용)을 절단 완충혼합액 13 ul 및 표지자 3 ul(~1 ng/ul)에 가하였다. 폴리뉴클레오티드 키나아제를 사용하여 표지자의 끝부분을 32p로 표지하였다. 반응액을 실온에서 1시간 동안 방치하여 ZFNs가 결합되도록 하였다. 최종농도가 약 2.5 mM이 되도록 절단 완충액으로 희석한 8 mM MgCl2 8 ul를 가하여 절단을 유도하였다. 37°C에서 1시간 동안 반응 후, 페놀/클로로포름 혼합용액 11 ul을 가하여 반응을 중지시켰다. 페놀/클로로포름 혼합용액으로 DNA를 추출한 후 실시예 4에서와 같이 겔 전기영동으로 분석하였다. 3 ul의 표지자를 대조군으로 사용하여 절단되지 않은 DNA(도 41에 "U"로 표시)의 겔 상 이동을 분석하였다.
결과를 도 41에 도시하였다. 표적 DNA를 하나의 징크핑거/FokI으로 융합한 경우에는 주형 DNA의 크기에 변화가 없었다. 그러나, sca-r29b 뉴클레아제를 sca-36b 또는 sca- 36c 뉴클레아제와 함께 사용한 경우, 짧은 DNA 절편 2개가 관찰되었는데(도 41의 오른쪽 레인 2개) 이로부터 표적 DNA가 절단되었다는 것을 알 수 있다.
실시예 22 : β 글로빈 유전자를 표적으로 하는 ZFP/FokI 융합 엔도뉴클레아제에 대한 염색체 GFP 리포터 시스템 테스트
실시예 20에서 설명한 바 있는, ZFNs에 의해 표적화되는 인간 β-글로빈 유전자 서열을 포함하는 DNA 절편을 합성하여 eGFP 리포터 유전자의 SpeI 부위 내로 복제함으로써 eGFP 발현을 억제하였다. 절편은 아래의 서열을 포함하고 있었다(겸상적혈구 돌연변이의 원인이 되는 뉴클레오티드는 볼드체 및 밑줄로 표시하였다).
CTAGACACCATGGTGCATCTGACTCCTG T GGAGAAGTCTGCCGTTACTGCCCTAG (SEQ ID NO : 200)
삽입된 β-글로빈 서열을 포함하는 eGFP 유전자를 HindlII 및 NotI 부위를 이용하여 pcDNA4/TO(Invitrogen, Carlsbad, CA) 내로 복제하고, 그로부터 얻어지는 벡터를 HEK293 TRex 세포(Invitrogen)에 감염시켰다. 안정적인 개별 클론을 분리하여 성장시킨 후, sca-36 단백질(sca-36a, sca- 36b, sca-36c) 및 sca-29b으로 감염시켜 표적화된 상동 재조합 여부를 테스트하였다(이들 키메라 뉴클레아제의 서열과 결합부위는 실시예 20 및 표 25 참조). 각 ZFNs를 암호화하는 플라스미드 50 ng과 1.5-kb GFP 도너 500 ng으로 세포를 감염시켰다(실시예 13). 5일 후에, 삽입된 결합 eGFP 자리의 상동 재조합 여부를 테스트하였다. 먼저, 형광현미경을 이용하여 세포의 eGFP 기능을 조사한 후, 형광을 나타내는 세포에 대하여 실시예 11에서와 같은 방법으로 FACS 검정을 이용한 정량분석을 실시하였다.
형광현미경 분석 결과, sca-29b 및 sca-36a에 감염된 모든 셀라인의 eGFP 기능이 음성으로 나타났다. sca-29b와 sca-36b 또는 sca-36c에 감염된 셀라인 중 일부는eGFP 발현에 대해 양성을 나타내었으므로, 추가적으로 FACS 분석을 실시하였다. 이들 셀라인에 대한 FACS 분석결과가 표 26에 제시되어 있다. β-글로빈 서열에 대해 선택성을 보이는 징크핑거 뉴클레아제는 서열-특이성 이중사슬 DNA 절단을 촉진함으로써 살아 있는 세포 내에서 상동 재조합을 촉진하는 능력이 있다는 것을 알 수 있다.
셀라인 감염 DNA
sca-29b sca-36a sca-36b sca-36c 		편집비율 1

#20
 + + 0
+ + 0.08
+ + 0.07

#40
 + + 0
+ + 0.18
+ + 0.12
1. 525 nm 고발광 및 570 nm 저발광을 포함하는 총 형광발광의 비율(FACS 트레이스의 영역 E, 실시예 11 참조).
실시예 23 : 전사 정도가 표적화된 상동 재조합에 미치는 영향
염색체 DNA 서열이 전사되는 과정에서 염색질의 구조변경이 수반되므로(일반적으로 전사된 서열은 접근이 용이해진다), 전사가 활발한 유전자는 표적화된 상동 재조합의 기질로서 유용할 것으로 생각할 수 있다. 독시시클린 유도성 프로모터로 전사를 통제하면서, 결함 eGFP 유전자의 염색체 서열을 포함하는 T18 셀라인(실시예 9)를 이용하여 이를 테스트하였다.
각 T18 세포 샘플을 eGFP 특이성 287 및 296 징크핑거/FokI 융합단백질을 암호화하는 플라스미드(실시예 7) 및 염색체 eGFP 유전자의 결함을 편집하는 서열을 포함하는 1.5 kbp 도너 DNA 분자로 감염시켰다(실시예 9). 5시간 후, 감염된 세포를 여러 농도의 독시시클린으로 처리하고 48시간 후에 eGFP mRNA의 농도를 측정하였다. 감염 후 4일이 지난 뒤에 FACS로 520 nm에서의 eGFP 형광(염색체 내로 도너서열이 표적화된 재조합이 되어 삽입된 β-글로빈 서열을 대체한 것을 보여줌)을 측정하였다.
결과를 도 42에 도시하였다. GAPDH mRNA에 대해 정규화한 eGFP mRNA의 정상상태 농도(결함 염색체 eGFP 유전자의 전사율)가 증가한 것을 알 수 있다. 각 막대 위의 수치는 eGFP 형광을 나타내는 세포의 비율이다. 표적 유전자의 전사율이 증가함에 따라 표적화된 재조합의 빈도가 높아지는 것을 알 수 있다. 따라서, 표적화된 DNA 절단과 더불어 전사의 표적화된 활성화(미국특허 제6,534,261호 및 제6,607,882호 참조)를 통해 표적화된 상동 재조합을 촉진할 수 있음을 알 수 있다.
실시예 24 : IL- 2Rγ 유전자 내에 돌연변이를 포함하는 셀라인의 생산
K562 세포를 5-8GL0 및 5- 9DL0 징크핑거 뉴클레아제(ZFNs)를 암호화하는 플라스미드(실시예 14, 표 17 참조) 및 1.5 kbp DraI 도너 구조체로 감염시켰다. DraI 도너는 IL2Rγ 유전자의 5번째 엑손을 암호화하는 영역과 상동성이 있는 서열을 포함하지만, ZFN 결합부위 사이에 염기가 하나 더 삽입되어 있어 프레임시프트 및 DraI 부위를 제공한다.
24시간이 지난 후, 세포를 30시간 동안 0.2 uM 빈블라스틴(최종농도)으로 처리하였다. PBS로 세포를 3회 세척한 후 배지에 다시 고정시켰다. 세포가 회복되도록 3일 동안 방치한 뒤, 실시예 14에서와 유사한 방법으로 PCR 기반 RFLP 검정을 실시하여 DraI 부위의 존재여부를 확인하였다. 유전자 편집빈도는 약 4%였다.
세포가 회복되도록 2일 동안 더 방치한 뒤, 1600개의 세포를 100 ul 배지 내의 40×96 웰 플레이트에 고정하였다.
세포를 약 3주간 배양한 후, DraI 돌연변이 표현형에 대해 동형접합 관계에 있는 세포를 고립시켰다. 이들 세포에 대해 유전자변형 여부(IL-2Rγ 유전자의 엑손 5에 DraI 부위가 존재하는지 확인)와 IL-2Rγ mRNA 농도(실시간 PCR) 및 단백질 농도(웨스턴블롯)를 테스트하여 돌연변이가 유전자 발현에 미치는 영향을 평가하였다. FACS 분석을 통해 세포기능을 테스트하였다.
IL-2Rγ 유전자 내에 DraI 프레임시프트 돌연변이를 포함하는 세포를 5-8GL0 및 5-9DL0 융합단백질을 암호화하는 플라스미드 및 1.5 kb BsrBI 도너 구조체로 감염시켜(실시예 14) DraI 프레임시프트 돌연변이를 기능성 단백질을 암호화하는 서열로 교체하였다. 실시예 14에서와 같이 BsrBI 존재여부 확인을 통해 측정한 결과, 이들 세포는 상동 재조합 정도가 1% 이상이었다. FACS 분석을 통해 mRNA 및 단백질 농도를 측정한 결과 유전자 기능이 회복되었음을 확인할 수 있었다.
실시예 25: 상이한 극성을 지닌 ZFP / Fok I 융합체 엔도뉴클레아제
ZFP 도메인이 FokI 도메인의 N-말단인 ZFP/FokI 융합체를 암호화하는 벡터를 제조하였다. IL2-1로 표시된 상기 ZFP 도메인은 4개의 징크핑거를 함유하며, IL-2Rγ 유전자의 제3의 엑손에 위치한 서열 AACTCGGATAAT(SEQ TD NO:202)를 표적화한다. 징크핑거의 인식영역의 아미노산 서열을 표 27에 나타내었다.
IL2-1 결합 도메인의 징크핑거 설계
표적 서열 F1(AAT) F2(GAT) F3(TCG) F4(AAC)

AACTCGGATAAT
(SIQ ID NO:203)
DRSTLIE
(SIQ ID NO:204)
SSSNSLR
(SIQ ID NO:205)
RSDDLSK
(SIQ ID NO:206)
DNSNRIK
(SIQ ID NO:207)
참고: DNA 표적 서열을 좌단 칼럼에 나타내었다. 나머지 칼럼은 각 징크핑거의 알파 나선 부분의 시작에 관한, 4개의 징크핑거 각각의 -1 에서 +6까지의 잔기의 아미노산 서열(한 문자 코드)을 나타낸다. 핑거 F1은 단백질의 아미노 말단부에 가장 근접해 있다. 각 핑거에 결합된 3-뉴클레오티드 하부부위를 핑거 지정과 인접한 상부 열에 나타내었다.
이 징크핑거 도메인을 암호화하는 서열은 FokI 제한 엔도뉴클레아제의 절단 하프-도메인을 암호화하는 서열과 결합(Looney et al. (1989) Gene 80:193-208에 의한 아미노산 384-579)하고, 4개의 아미노산 링커가 ZFP 도메인과 절단 하프-도메인(즉, 4개의 아미노산 ZC 링커)의 사이에 존재하게 된다. FokI 절단 하프-도메인은 하기의 프라이머를 사용하여 박테리아 균주 플라노미크로비움 오케아노코이테스 (Planomicrobium okeanokoites (ATCC 33414))로부터 분리된 게놈 DNA의 PCR 증폭을 통하여 획득하였다:
5'-GGATCCCAACTAGTCAAAAGTGAAC(SEQ ID NO:208)
5'-CTCGAGTTAAAAGTTTATCTCGCCG(SEQ ID NO:209).
PCR 산물은 BamHI 및 XhoI로 절단(상기 서열상의 밑줄친 부위)되었으며, BamHI 및 XhoI에 의한 절단 후 플라스미드 pcDNA-nls-ZFP1656-VP16-flag로부터 제조된 벡터 단편에 결찰되었다. 결과 구성체, pcDNA-nls-ZFP1656-FokI는 pcDNA3.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) 벡터 백본 내에서, N-말단에서 C-말단까지, SV40 거대 T 항원-유도 핵위치 신호(NLS, Kalderon et al.(1984) Cell 39:499-509), ZFP1656, 및 FokI 절단 하프-도메인을 함유하는 융합 단백질을 암호화한다. 이 구성체는 KpnI 및 BamHI로 절단되어 ZFP1656-암호화 서열을 방출하며, IL2-1 징크핑거 결합 도메인을 암호화하는 KpnI/BamHI 단편이 결찰에 의하여 삽입되었다. 결과 구성체 (pIL2-1C)는 4개의 아미노산 ZC 링커를 지닌, N- 에서 C-말단까지, 핵 위치 신호, 4-핑거 IL2-1 징크핑거 결합 도메인 및 FokI 절단 하프-도메인을 포함하는 융합 단백질을 암호화한다.
FokI 서열이 ZFP 서열의 N-말단인, ZFP/FokI 융합 단백질을 암호화하는 벡터를 또한 제조하였다. KpnI/BamHI 단편으로서, 상기 IL2-1 4-핑거 징크핑거 도메인을 KpnI 및 BamHI로 이미 절단되어 EGFP-암호화 서열을 방출하는, NLS, KOX-1 억제 도메인, EGFP 및 플래그 에피토프 태그를 함유한 융합 단백질을 암호화하는 벡터에 삽입하였다. 이로써 N-말단에서 C-말단까지, (SV40 거대 T-항원의)NLS, KOX 억제 도메인, IL2-1 징크핑거 도메인 및 플래그 에피토프 태그를 함유한 벡터를 생성하였다. 이 구성체는 EcoRI 및 KpnI로 절단되어 NLS- 및 KOX-암호화 서열을 방출하고, FokI 제한 효소의 아미노산 384-579를 암호화하는, (주형으로, FokI를 암호화하는 벡터를 사용한 PCR로 생성된) EcoRI/KpnI 단편 및 NLS가 삽입되었다. 상기 결과 구성체, pIL2-IR은, N-말단에서 C-말단까지, FokI 절단 하프-도메인, NLS, 및 4-핑거 IL2-1 ZFP 결합 도메인을 함유한 융합 단백질을 암호화한다. 이 구성체 내의 ZC 링커는 21개 아미노산의 길이이며, 7개 아미노산의 핵 위치 서열(PKKKRKV; SEQ ID NO:210)를 포함한다.
5-9D 징크핑거 도메인은 IL-2Rγ 유전자의 5번째 엑손에 위치한 12-뉴클레오티드 표적 서열 AAAGCGGCTCCG(SEQ ID NO:157)과 결합한다. 실시예 14(표 17)을 참조한다. 5-9D 징크핑거 도메인을 암호화하는 서열을 벡터 내로 삽입하여 FokI 서열이 ZFP 서열의 N-말단인 FokI/ZFP 융합체를 생성시켰다. 이러한 구성체를 제조하기 위하여, 이전 문단에서 기술한 pIL2-lR 플라스미드를 KpnI 및 BamHI로 절단하여 IL2-1 징크핑거 결합 도메인을 암호화하는 서열을 함유한 단편을 방출시키고, 5-9D 징크핑거 결합 도메인을 암호화하는 KpnI/BamHI 단편을 그 자리에 삽입하였다. 결과 구성체, p5-9DR은, N-말단에서 C-말단까지, FokI 절단 하프-도메인, NLS, 및 4-핑거 5-9D 징크핑거 결합 도메인을 함유한 융합 단백질을 암호화한다. 이 구성체 내의 ZC 링커는 22개 아미노산 길이이며, 7개 아미노산의 핵 위치 서열(PKKKRKV; SEQ ID NO:210)을 포함한다.
벡터 구조의 더 상세한 설명을 원한다면 공유인 미국 등록특허 제6,453,242호 및 제6,534,261호를 참조할 것.
실시예 26: DNA 절단을 위한 합성 기질의 제조
전술한 IL2-1 및 5-9D 융합 단백질에 결합된 표적 서열을, FokI 도메인이 ZFP 도메인의 N-말단인, 변화된 극성을 지닌 징크핑거/FokI 융합 단백질의 절단능을 시험하기 위하여 이중-가닥 DNA 단편으로 도입하였다. 주형 1 내에서, 5-9D 표적 부위는 한 가닥 내에 존재하고, IL2-1 표적 부위는 서로 인접하거나, 6개의 삽입 뉴클레오티드 쌍에 의하여 분리된 결합 부위의 3' 말단을 지닌 상보 서열에 존재하게 된다. 주형 2에서, 5-9D 및 IL2-1 표적 부위는, 6개의 삽입 뉴클레오티드 쌍에 의하여 분리된 5-9D 결합 부위의 3' 말단에서부터 IL2-1 결합 부위의 5' 말단까지를 지닌 동일한 DNA 가닥 상에 존재한다.
전술한 서열을 함유한 약 442 염기 쌍의 DNA 단편은 주형이 클론된 플라스미드의 증폭 산물로서 획득하였다. IL2-1 및 5-9D 표적 부위는 이러한 단편 내로 위치되고, 두 표적 부위 간의 이중-가닥 DNA 절단에 의하여 약 278 내지 164 염기 쌍의 DNA 단편을 생성하게 된다. 증폭 산물은 T4 폴리뉴클레오티드 키나제를 사용하여 γ-32P-ATP로부터 오르토인산염을 전이시켜 방사성 표지를 하였다
실시예 27: 변화된 극성을 지닌 징크핑거/ Fok I 융합체에 의한 표적화된 DNA 절단
TNT 결합 망상적혈구 용해질(Promega, Madison, WI) 내에서 이러한 단백질을 암호화하는 플라스미드를 배양하여 IL2-1C, IL2-1R 및 5-9DR 융합 단백질을 획득한다. 절단 반응은 각 융합 단백질을 위한 1 ㎕의 TNT 반응물, 1 ㎕의 표지된 절단 기질 및 20 ㎕ 절단 버퍼를 함유하는 23 ㎕의 혼합물에서 수행된다. 절단 버퍼는 1 ㎕의 1M 디티오트레이톨 및 50 ㎕의 소 혈청 알부민(10 mg/㎖)을 1 ㎖의 20 mM Tris-CL pH 8.5, 75 mM의 NaCl, 10 μM의 ZnCl2, 5%(v/v) 글리세롤에 첨가하여 제조한다. 절단 반응은 37℃에서 2 시간 동안 배양되었으며, 그 다음 13 ㎕의 페놀/클로로포름/이소아밀 알콜(25:24:1)과 함께 진탕하였다. 원심분리 후, 10 ㎕의 수성 액상을 10% 폴리아크릴아미드 겔 상에서 분석하였다. 상기 겔 내의 방사성을 포스포러이미저(Phosphorimager)(Molecular Dynamics)로 검출하였으며, ImageQuant 소프트웨어(Molecular Dynamics)를 사용하여 정량하였다.
도 44는 NH2-FokI 도메인-징크핑거 도메인-COOH 극성을 지닌 두 키메라 뉴클레아제를 사용하여 얻은, 두 키메라 뉴클레아제의 결합 부위가 반대 가닥에 위치하고, 상기 결합 부위의 3' 말단이 서로 인접하고, 6 뉴클레오티드 쌍에 의하여 분리된 기질을 분리하는 결과를 나타낸다. IL2-1R 또는 5-9DR 뉴클레아제를 단독으로 함유한 기질의 배양에 의하여 기질이 절단되지는 않으나(2 및 3 열과 1열의 비교), 반면 두 뉴클레아제를 배양한 결과 의도한 표적 부위 내의 DNA 기질의 거의 전부가 절단되었다(4 열).
도 45는 NH2-징크핑거 도메인-FokI 도메인-COOH 극성을 지닌 제1 키메라 뉴클레아제, 및 NH2-FokI 도메인-징크핑거 도메인-COOH 극성을 지닌 제2 키메라 뉴클레아제가, 키메라 뉴클레아제의 결합 부위가 동일한 가닥 내 상에 존재하고, 제1 결합 부위의 3' 말단은 제2 결합 부위의 5'말단에 인접하고 6 뉴클레오티드 쌍에 의하여 분리된 기질를 절단하는 능력을 나타낸다. 5-9DR 및 IL2-1C 뉴클레아제(즉, 서로 다른 극성을 지닌 각각의 뉴클레아제)의 조합만이 동일한 가닥에 두 표적 부위를 지닌 기질의 분리에 성공적이었다(6 열과 1-5열을 비교).
실시예 28: 상이한 ZC 링커 길이를 지닌 키메라 뉴클레아제
폴드 도메인이 ZFP 도메인 아미노 말단인, 서로 다른 ZC 링커 길이를 지닌 두 융합 단백질 세트를 설계하였다. 상기 폴드 도메인은 Looney et al. (1989) Gene 80:193-208에 따른 아미노산 384-579이다. 상기 ZFP 도메인은 IL1-2(표 27), 5-8G(표 17) 및 5-9D(표 17) 도메인으로부터 선택된다. 제1 세트는 NH2-NLS-FokI-ZFP-플래그-COOH 구조를 가진다. 이 세트에서, ZC 링커의 길이가 13, 14, 18, 19, 28 및 29 아미노산인 단백질이 설계되었다. 제2 세트는 NH2-FokI-NLS-ZFP-플래그-COOH 구조를 가지며, ZC 링커의 길이가 21, 22, 23, 24, 28, 29, 38 및 39 아미노산인 단백질이 설계되었다. 제2 세트에서, 상기 NLS는 ZC 링커의 일부라는 것을 유념할 것이다. 이러한 융합 단백질을 암호화하는 플라스미드를 또한 제조하였다.
모델 DNA 서열을 설계하여 이러한 융합 단백질의 절단 활성을 시험하고, 두 융합 단백질을 위한 표적 부위 간의 거리의 함수로 최적 ZC 링커 길이를 결정하였다. 다음의 서열이 설계되었다:
1. 반대 가닥 상의 5-9D 표적 부위 및 IL2-1 표적 부위
2. 동일 가닥 상의 5-9D 표적 부위 및 IL2-1 표적 부위
3. 반대 가닥 상의 5-9D 표적 부위 및 5-8G 표적 부위
4. 동일 가닥 상의 5-9D 표적 부위 및 5-8G 표적 부위
표적 부위의 이러한 4개의 쌍은 각각에 대하여, 서열은 두 표적 부위 간의 분리가 4, 5, 6 또는 7 bp로 제조되었다.
이러한 서열은 실시예 26에 기술한 표지된 기질 내로 도입되고, 실시예 27에 기술한 방법에 따라 DNA를 절단하는 이들의 능력을 위한 실시예에 기술한 다양한 융합 단백질을 시험하기 위하여 사용되었다.
실시예 29: 통합된 결함 eGFP 수용체 유전자를 함유하는 안정한 셀라인의 제조
상기 IL-2Rγ 유전자의 프레임시프트 돌연변이 및 엑손 5의 단편을 함유하며, 테트라시클린-조절 CMV 프로모터와 효과적으로 결합한 eGFP(강화 녹색 형광 단백질) 암호 서열을 다음과 같이 제조하였다. 사일런트 돌연변이를 pEGFP-NI 벡터(BD BioSciences) 내의 eGFP 암호 서열 내로 삽입하여 신규의 SpeI 부위를 생성하였다. 그 다음, 일-뉴클레오티드 결함(프레임시프트 돌연변이를 생성)을 새로운 SpeI 부위의 하류에 도입하였다. 5-8G 및 5-9D 징크핑거/FokI 융합 단백질에 대한 표적 부위를 함유한, IL-2Rγ 유전자의 엑손 5로부터의 다음 서열을 새로 도입된 SpeI 부위에 삽입시켰다(상기 실시예 14, 표 17에 기술):
CTAGCTACACGTTTCGTGTTCGGAGCCGCTTTAACCCACTCTGTGGAAGTGCTCCTAG(SEQ IDNO:214)
결과 플라스미드는 IL2Rγ 유전자의 엑손 5로부터의 DNA 서열의 단편을 함유한 변이 eGFP를 암호화하는 서열을 함유한다. 이 플라스미드는 HindIII 및 NotI로 절단되었으며, 변이 eGFP 서열을 함유하는 단편(삽입된 IL-2Rγ의 엑손 5 서열을 포함)을 방출한다. 이 단편은 pcDNA4/TO 벡터(Invitrogen)의 HindIII 및 NotI 부위 내로 삽입되어, eGFP 서열의 발현이 2X tet-작동자-조절 CMV 프로모터에 의하여 조절되는 구성체가 되었다. 이 플라스미드의 개념도를 도 46에 나타내었다.
이 구성체는 HEK293 TRex 세포(Invitrogen)의 형질전환에 사용되었으며, 이 구성체의 통합된 카피를 함유하는 안정한 셀라인이 분리되었다. 이러한 셀라인에서, 상기 eGFP 암호 서열은 독시시클린의 첨가로 전사되었으나, 프레임시프트 돌연변이 및 IL-2Rγ 삽입에 의하여, 어떠한 기능적 단백질도 발현되지 않았다.
실시예 30: 염색체 eGFP 유전자 내로의 퓨로마이신 내성 마커의 표적화된 상동성-의존 통합
본 실험은 퓨로마이신 내성 마커의 상기 실시예에서 기술한 변이 염색체 eGFP 유전자로의 통합을 위한 시험을 위하여 수행하였다.
퓨로마이신 내성("퓨로 서열"로 표시)을 암호화하는 서열을 함유하고, eGFP cDNA 구성체와 상동인 서열이 측면에 위치하는, 프로모터 없는 도너를 다음과 같이 제조하였다. 서열을 pTRE2pur-HA 벡터(BD Bioscience)로부터 PCR 증폭하여, 우회 SpeI 부위 및 ATG 개시 코돈의 상류와 일치하는 Kozak 서열을 지닌 퓨로 서열을 생성하였다. 증폭 프라이머는 다음과 같다:
퓨로-5': ACTAGTGCCGCCACCATGACCGAGTACAAGCCCA(SEQ ID NO:215)
퓨로-3': ACTAGTCAGGCACCGGGCTT(SEQ ID NO:216)
이 PCR 단편은 신규한 SpeI 제한 부위 및 유전자 발현을 차단하는 프레임시프트 돌연변이(실시예 29 참조)를 암호화하는 변형 eGFP 유전자를 함유한 pEGFP-N1 벡터 내로 클론되었다. 이 eGFP/퓨로마이신 유전자는 HindIII 및 NotI 부위를 통하여 pcDNA4/TO 벡터 내로 클론되어, 표적화된 통합에 의하여 퓨로마이신 내성 세포를 얻기 위한 실험에서 양성 대조군으로 제공되는, 벡터 pcDNA4/TO/GFPpuro를 생성하였다. 프로모터 없는 도너를 생성하기 위하여, 상기 pcDNA4/TO/GFPpuro 벡터는 다음의 프라이머와 함께 PCR 증폭되었다:
GFP-Bam CGAATTCTGCAGTCGAC(SEQ ID NO:217)
pcDNA42571 TGCATACTTCTGCCTGC(SEQ ID NO:218)
결과 증폭 산물을 pCR4-TOPO 벡터 내로 Topo 클론하였으며, 이들의 서열을 확인하였다. 이로써 퓨로 서열의 염색체 eGFP 구성체 상류와 상동인 413 bp의 서열 및 퓨로 서열의 염색체 eGFP 구성체 하류와 상동인 1285 bp의 서열을 지닌 도너를 생성하였다.
퓨로 서열의 표적화된 통합을 시험하기 위하여, 실시예 29에서 기술한 셀라인에 본 실시예에서 기술한 도너 구성체의 존재 하에 징크핑거/FokI 융합 단백질에 의하여 표적화된 DNA 절단을 가하고, 트랜스펙션된 세포를 퓨로마이신 내성으로 선택하고, 이들의 염색체 DNA를 분석하였다. eGFP 유전자 (5-8G 및 5-9D) 내로 삽입된 엑손 5 서열 내에서 절단되도록 설계된 두 징크핑거/FokI 융합 단백질(ZFN)을 전술한 실시예 14, 표 17에서 기술하였다. 퓨로마이신 내성은 eGFP 암호 서열 내로 삽입된 IL-2Rγ 서열 내에 위치한 절단 부위의 도너 서열의 상동성-의존 또는 상동성-비의존 통합에 의하여 발생할 수 있다. 도너 구성체의 상동성-의존 통합은 푸로 서열에 의하여 IL-2Rγ 서열을 치환하게 된다
HEK 293 세포를 10% 태아 소 혈청 (FBS)(Hyclone) 및 2 mM L-글루타민을 보충한 듈베코 변형 이글 배지(DMEM)(Invitrogen)에서 37℃로 유지하고 5% CO2 환경하에서 성장시켰다. 퓨로 서열의 표적화된 통합을 시험하기 위하여, 세포를 50 ng의 각 ZFN-암호화 플라스미드 및 500 ng의 도너 플라스미드로 트랜스펙션했다. 음성 대조군 실험으로써, 세포를 50 ng의 각 ZFN-암호화 플라스미드 또는 500 ng의 도너 플라스미드로 각각 트랜스펙션했다. 양성 대조군으로서, 500 ng의 pcDNA4/TO/GFP푸로 벡터를 HEK293 세포로 트랜스펙션했다. 세포는 LipofectAMINE 2000 시약 (Invitrogen)의 Opti-MEM I 환원 혈청 배지 용액을 사용하여 트랜스펙션했다. 퓨로마이신 내성은 독시시클린 2 ng/㎖(통합된 서열의 전사를 활성화하기 위하여) 및 퓨로마이신 2 ug/㎖(최종 농도)를 성장 배지에 첨가하여 측정하였다.
퓨로마이신 내성 집락은 ZFN-암호화 플라스미드 및 도너 플라스미드 둘 다로 트랜스펙션된 세포로부터만 획득한다. 24 집락 개체군을 분리하여, >6-주간의 선택을 하였으며, 그 다음 표적화된 통합 결과를 위한 PCR로 분석하였다. 다음의 PCR 프라이머가 표적화된 통합 결과가 발생하였는지 검출하기 위하여 사용되었다:
CMV퓨로-5' TTTGACCTCCATAGAAGACA(SEQ ID NO:219)
CMV퓨로-3' GCGCACCGTGGGCTTGTACT(SEQ ID NO:220)
일 프라이머는 외래 퓨로 서열과 상보적이며, 다른 프라이머는 통합된 수용체 구성체에 존재하는 CMV 프로모터 내의 서열과 상보적이다. 24 집락 중의 21개는 푸로 서열의 표적화된 통합과 일치하는 크기의 증폭 산물을 산출한다. 이러한 단편을 클론하였으며, 이들의 뉴클레오티드 서열을 결정하였다. 서열 분석에서는 24 클론 중 8개가 염색체 eGFP 구성체 내로의 퓨로 서열의 상동성-직접 통합을 겪은 반면에, 13개는 퓨로 서열의 부분적 복제와 함께 염색체 서열 내로 도너 DNA의 상동성-비의존 통합을 겪었다는 것을 적시한다.
실시예 31: IL-2Rγ 유전자의 엑손 5에 표적화된 징크핑거/ Fok I 융합 단백질의 코돈 최적화
4 아미노산 ZC 링커(LO)에 의하여 FokI 절단 하프-도메인에 결합된, 5-8G 및 5-9D 징크핑거 결합 도메인(표 17)를 함유하는 융합 단백질은 전술하였다. 예컨대, 실시예 14 및 실시예 24를 참조할 것. 이러한 두 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 코돈이 포유류 세포에서 발현하기 위하여 최적화되도록 설계하였다. 이러한 두 융합 단백질을 암호화하는 코돈-최적화 뉴클레오티드 서열은 다음과 같다:
Figure pat00011
실시예 32: 표적화된 상동성 통합을 위한 K-562 세포의 성장 및 트랜스펙션
인간 K-562 적백혈병 세포(ATCC)를 37℃로 10% 태아 소 혈청, 페니실린 및 스트렙토마이신으로 보충한 DMEM 내에서 배양하였으며, 내부 IL2Rγ 유전자 내의 아르기닌 226의 코돈을 둘러싼 위치에서 이중-가닥 파열을 유도하도록 설계된 두 징크핑거 뉴클레아제(ZFN)를 암호화하는 2.5 μg의 발현 벡터로 트랜스펙션(뉴클레오펙터(Nucleofector); 아멕사(Amaxa))시켰다. 상기 두 뉴클레아제(5-8G 및 5-9D)는 전술한 실시예 14, 표 17에서 기술하였다. 뉴클레아제를 암호화하는 서열이 2A 펩티드를 암호화하는 서열에 의하여 분리되었다. 예컨대, Szymczak et al. (2004) Nature Biotechnol. 22:589-594를 참조할 것. 이와 동시에, 상기 세포는 엑손 5의 중앙에 위치한 IL2Rγ 염색체 DNA 서열의 1.5 Kb DNA 신장(stretch)을 수반하는 25 또는 50 μg의 도너 DNA 플라스미드로 트랜스펙션(Urnov et al. (2005) Nature 435:646-651)되고, 삽입된 DNA 서열에 의하여 중단된다(하기할 실시예 33-36 참조). 트랜스펙션 72 시간 후, 게놈 DNA를 분리하고(디엔이지(DNEasy); 키아젠(Qiagen)), IL2Rγ 유전자좌의 세포 유전형을, 도너 상동성의 1.5 kb 영역 외부를 서냉상동결합하고, 야생형 IL2Rγ 서열의 1.6 kbp의 증폭 산물을 생성(Urnov et al, 전술)하는 프라이머를 사용하여, X 염색체의 엑손 5-함유 신장의 PCR로 결정하였다. PCR 산물은 겔 전기영동하고, 지적된 부분은 제한 절단하여 분석하였다. 대조군 샘플은 다음을 포함한다: (1) GFP-암호화 발현 벡터로 트랜스펙션된 세포, (2) ZFN을 암호화하는 발현 벡터 단독으로 트랜스펙션된 세포, 및 (3) 도너 DNA 분자 단독으로 트랜스펙션된 세포.
실시예 33: 내인성 IL-2Rγ 유전자 내로 12-뉴클레오티드 외래 서열의 표적화된 상동성-의존 통합
세포 성장 및 트랜스펙션은 실시예 32에 기술한 바와 같이 수행하였다. 도너 DNA 분자는 제한 효소 StuI를 위한 신규한 특징적 인식 부위를 함유하는 12 뉴클레오티드 쌍 서열 태그를 포함하도록 조작되었다. 세포 DNA는 분리되었으며, 실시예 32에서 기술한 증폭을 위한 주형으로 사용되었고, 그 다음 StuI로 절단되었다. 도 47에 나타낸 바와 같이, 모든 대조군 샘플은 제한 효소에 의한 절단에 내성이 있는 증폭 산물을 산출하는 염색체를 수반한다. 이에 비하여, 도너 DNA 분자 및 ZFN 발현 구성체 둘 다에 의하여 트랜스펙션된 세포 샘플 내의 15%의 모든 증폭 산물은 도너 DNA의 통합을 나타내는 제한 효소에 민감하다. 염색체-유도 PCR 산물의 직접 뉴클레오티드 서열 결정을 통하여 통합이 상동성-의존성이라는 것을 확인하였다.
실시예 34: 내인성 IL-2Rγ 유전자 내로 외래 오픈 리딩 프레임의 표적화된 상동성-의존 통합
세포 성장 및 트랜스펙션은 실시예 32에 기술한 바와 같이 수행하였다. 본 실험에서, 서로 다른 두개의 도너 DNA 분자가 사용되었다. 도너 DNA 분자 #1은 염색체 IL2Rγ 유전자좌와 상동 서열이 측면에 위치한 강화 녹색 형광 단백질 (eGFP)의 전 720 bp ORF를 함유하도록 조작되었다(실시예 32 참조). 도너 DNA 분자 #2는 폴리아데닐화 신호를 따르는 전 eGFP ORF로 구성된 924 bp 서열을 함유하며; 이 서열은 IL2Rγ-상동 서열이 측면에 위치한다(실시예 32 참조). 다음의 트랜스펙션에서, 세포 DNA를 분리하였으며, 실시예 32에서 기술한 증폭을 위한 주형으로 사용되었다. 도 48에 나타낸 바와 같이, 모든 대조군 샘플은 야생형 크기가 ~1.6 kb인 PCR 산물을 산출하는 염색체를 수반한다. 이에 비하여, ORF-수반 도너 및 ZFN 발현 구성체 둘 다로 트랜스펙션된 세포 샘플 내의 3-6%의 모든 염색체는 야생형-염색체-유도 PCR 산물보다 더 많은 증폭 산물을 산출하였으며, 크기의 차이는 eGFP ORF의 ZFN-유도성 표적화된 통합이 발생하였다는 주장과 일치하였다. 염색체-유도 PCR 산물의 직접 뉴클레오티드 서열 결정은 이러한 관찰 결과를 확인하였으며, 이러한 통합이 상동성-의존성이라는 것을 적시하였다.
실시예 35: 내인성 IL-2Rγ 유전자 내로의 외래 "치료 하프-유전자"의 표적화된 상동성-의존 통합
세포 성장 및 트랜스펙션은 실시예 32에 기술한 바와 같이 수행하였다. 도너 DNA 분자는 엑손 5, 및 엑손 6, 7 및 8의 완전 카피(엑손 8 내의 번역 종결 코돈 및 폴리아데닐화 신호를 포함)의 하방 서열 부분을 함유하는 부분적 IL2Rγ cDNA의 720 뉴클레오티드-쌍으로 구성되어 있다. 이러한 cDNA 서열의 일 측면에는 엑손 5의 상류 부분과 상동인 서열과 인트론 4의 인접 부분이 위치하고, 다른 측면에는 엑손 5의 하류 부분과 상동인 서열 및 인트론 5의 인접 부분이 위치한다(도 49 참조). 엑손 5의 하류 부분의 두 카피는 도너 구성체 내에 존재하여, 재조합이 엑손 8에 인접한 카피 내에서 일어나는 것을 확보하므로, 수개의 사일런트 서열 변화는 엑손 6에 인접한 카피 내로 도입된다. 이러한 변화는 외래 엑손 5 서열의 암호화 능력을 변화시키지 못하나, 이러한 파괴를 수리하는 개시 회귀 작용에 이러한 서열을 사용하는 것을 차단시키기 위하여 염색체 서열과 비-상동성인 서열을 충분히 도입하게 된다. 따라서, 뉴클레아제에 의하여 표적화된 부위의 도너 구성체의 통합은 엑손 6, 7 또는 8 및 도너 구성체 내에 함유된 엑손 5의 하류 부분의 모든 IL2Rγ 돌연변이를 수정하는데 사용될 수 있다.
트랜스펙션 후, 세포 DNA를 분리하였으며, 실시예 32에서 기술한 증폭의 주형으로 사용되었다. 도 50에 나타난 바와 같이, 세포가 GFP-암호화 플라스미드로 트랜스펙션된 대조군 샘플은 야생형 크기(~1.6 kb)의 PCR 산물을 산출하는 염색체를 함유한다. 이에 비하여, 치료 하프-유전자-수반 도너 및 ZFN 발현 구성체 둘 모두로 트랜스펙션된 세포 샘플 내의 6%의 염색체는 야생형- 염색체-유도 PCR 산물보다 더 크며, 크기의 차이는 "치료 하프-유전자"의 ZFN-유도성 표적화된 통합이 발생하였다는 주장과 일치한다. 거대 PCR 산물의 직접 뉴클레오티드 서열 결정에 의하여 도너 구성체의 상동성-의존 통합이 발생하였음을 확인하였다.
실시예 36: 내인성 IL-2Rγ 유전자 내로의 외래 7.7 kbp 발현 구성체의 표적화된 상동성-의존 통합
세포 성장 및 트랜스펙션 실시예 32에 기술한 바와 같이 수행하였다. 도너 DNA 분자는 IL2Rγ 엑손 5 및 인접 서열과 상동인 서열이 측면에 위치하는, 7.7 kbp 항체 발현 구성체를 함유하도록 제조하였다(실시예 32 참조). 이 실험에서, 두 종의 도너의 위상 형태가 사용되었다: 벡터 백본이 발현 구성체("원형")에 의하여 차단되는 두 상동성 가지를 지닌 삽입체에 인접한 플라스미드 도너; 및 발현 구성체("선형")에 의하여 차단되는 두 상동성 가지를 함유하는 선형 도너.
DNA는 실시예 32에서 기술한 트랜스펙션 세포로부터 분리되었다. 상기 DNA는 통합된 외래 서열과 내부 IL-2Rγ 엑손 5 서열간의 접합을 검출하도록 설계된 두 프라이머 쌍을 사용하여 PCR로 분석되었다. 따라서, 각 프라이머 쌍에 있어서, 일 프라이머는 내부 엑손 5 서열에 상보적이고, 및 다른 프라이머는 발현 구성체에 상보적이다(도 51의 상부를 참조). 도 51의 하부에 나타낸 바와 같이, 도너 DNA 만으로 트랜스펙션된 대조군 샘플에서는 PCR 산물이 관찰되지 않았다. 이에 비하여, 기대하는 크기의 PCR 산물은 도너 DNA(선형 또는 원형) 및 ZFN-암호화 플라스미드로 트랜스펙션된 세포 샘플 내에서 관찰되었다. 임계적으로, 발현 구성체의 양 말단에 특이적인 프라이머 세트는 외래 7.7 kb 서열의 ZFN-유도성 표적화된 통합이 발생하였다는 주장과 일치하는 결과를 산출하였다. 증폭 산물의 뉴클레오티드 서열 결정에 의하여 상동성-의존 통합이 발생하였다는 것을 확인하였다.
실시예 37: 내인성 염색체 유전자좌의 외래 서열의 표적화된, 상동성-비의존 통합
징크핑거/FokI 융합 단백질의 쌍은 중국 햄스터 디히드로폴레이트 환원효소(DHFR) 유전자 내의 6 뉴클레오티드 쌍에 의하여 분리된 두 표적 부위에 결합하고, 두 표적 부위 사이의 유전자를 절단하도록 설계되었다. 융합 단백질의 표적 부위의 뉴클레오티드 서열, 및 인식 부위의 아미노산 서열은 표 28에 나타내었다.
CHO DHFR 유전자를 위한 징크핑거 설계
표적 서열 F1 F2 F3 F4

GGAAGGTCTCCG
(SEQ ID NO:223)
RSDTLSE
(SEQ ID NO:224)
NNRDRTK
(SEQ ID NO:225)
RSDHLSA
(SEQ ID NO:226)
QSGHLSR
(SEQ ID NO:227)

AATGCTCAGGTA
(SEQ ID NO:228)
QSGALAR
(SEQ ID NO:229)
RSDNLRE
(SEQ ID NO:230)
QSSDLSR
(SEQ ID NO:231)
TSSNRKT
(SEQ ID NO:232)
참고: DNA 표적 서열을 좌단 칼럼에 나타내었다. 나머지 칼럼은 각 징크핑거의 알파 나선 부분의 시작에 관한, 4개의 징크핑거 각각의 -1 에서 +6까지의 잔기의 아미노산 서열(한 문자 코드)을 나타낸다. 핑거 F1은 단백질의 아미노 말단부에 가장 근접해 있다.
중국 햄스터 난소(CHO) 세포를 고정 배지(DMEM + 10% FBS와 2 mM L-글루타민 + 비필수 아미노산을 보충)에서 37℃로 배양하였다. 12-웰 플레이트 내에서 3 x 105 세포가 성장하여 70% 융합되었으며, 각각 100 ng의 두 융합 단백질-암호화 플라스미드로 임시 트랜스펙션(LipofectAMINE 2000®)시켰다. 트랜스펙션 24 시간 후, 20 μM 빈블라스틴을 성장 배지에 첨가하였다. 배지는 빈블라스틴 첨가 24 시간 후 교체되었다. 배지 교체 24 시간 후, 세포 DNA를 분리(키아젠)하였으며, 표적 부위를 둘러싼 DHFR 유전자 서열을 PCR로 증폭하였다. 프라이머는 야생형 DHFR 유전자를 함유한 세포의 DNA가 뉴클레오티드 쌍 증폭 산물을 산출하도록 설계되었다. 기대치 않게도, 두 증폭 산물을 획득하였는데, 하나는 기대한 크기였으며, 다른 하나는 약 150 뉴클레오티드 쌍보다 더 컸다.
절단 부위에 돌연변이가 유도되었는지 결정하기 위하여, 상기 증폭 산물을, 증폭 산물을 변성시키고 재변성시켜, 불합치-특이성 Cel-1 뉴클레아제로 처리하는 Cel-1 측정법을 사용하여 분석하였다. 예를 들면, Oleykowski et al. (1998) Nucleic Acids res. 26:4597-4602; Qui et al. (2004) BioTechniques 36:702-707; Yeung et al. (2005) BioTechniques 38:749-758를 참조할 것. Cel-1 측정법의 결과(도 52)는 절단 부위에서 비상동성 말단-결합의 결과인 서냉상동결합 산물 내의 작은 불합치가 첨가되어(도 52의 우단 열 내의 저분자량 밴드의 존재에 의하여 적시), 더 큰 삽입이 발생한다는 것을 보여준다(도 52의 3 및 5열 내의 "변이"로 지정된 고분자량 밴드의 존재에 의하여 적시). 더 큰 증폭 산물의 확실한 관찰은 전술하였다.
삽입 특성을 특성화하기 위하여 전술한 두 증폭 산물뉴클레오티드 서열을 측정하였으며 도 53에 나타내었다. 최상행에 나타낸 서열(SEQ ID NO:233)은 야생형 DHFR 서열이며, 하부행에 나타낸 서열(SEQ ID NO:234)은 절단 부위에 157 bp의 삽입체 및 단일 뉴클레오티드 쌍의 결실체를 함유하는 DHFR 서열로 구성되어 있다. 추가의 분석에 의하여, 삽입된 157 염기 쌍이 징크핑거/FokI 융합 단백질을 암호화하는 벡터 플라스미드의 부분과 상응한다는 것을 알아내었다. 더욱이, 형광 메토트렉세이트의 흡수가 측정된 경우, 이러한 돌연변이를 함유한 세포는 야생형 CHO 세포에 비하여 53%의 평균 메토트렉세이트 흡수를 나타내는데 이는 유전자의 일 카피의 기능 상실과 일치한다.
따라서, 외래 벡터 서열의 표적화된 상동성-비의존 통합은 DHFR 유전자 내의 표적화된 절단 부위에서 발생하며, 이는 이형접합 DHFR 변이 셀라인의 발생의 결과이다.
실시예 38: 내인성 유전자의 표적화된 절단 및 상동성-지정 수선을 위한 FokI 이량체 도메인 내의 다중 돌연변이
추가 서열 변경이 실시예 5에서 기술한 돌연변이된 FokI 절단 하프-도메인 내로 도입되었으며, 여기서 잔기 490은 글루탐산에서 라이신(E490K)으로 전환되어, 이들의 절단 특이성을 추가로 향상시키는데 제공된다. 일 실시 태양에서(변이 X2), 아미노산 538은 이소로이신에서 라이신(I538K)으로 전환되었다. 다른 실시 태양에서, X2 변이의 아미노산 486은 글루타민에서 글루탐산(Q486E)으로 전환되어 X3A 변이를 생성하거나, 또는 글루타민에서 이소로이신(Q486I)으로 전환되어 X3B 변이를 생성하였다. E490K, X2, X3A 및 X3B 변이의 아미노산 서열을 야생형 FokI 절단 하프-도메인의 아미노산 서열에 대비하여 도 54에 나타내었다.
이러한 변이 절단 하프-도메인을 암호화하는 서열이 5-8G 및 5-9D 징크핑거 도메인을 암호화하는 서열과 융합된 플라스미드를 제조하였다(실시예 14 참조). 이러한 변이의 다양한 조합이 지닌 BsrBI 부위를 함유한 도너 DNA 서열의 존재 하에 IL-2Rγ 유전자의 엑손 5 내의 이중-가닥 파괴의 상동성-직접 복구를 자극하기 위한 능력에 대하여 측정하였다. 실시예 15에서 기술한 측정시스템 및 절차를 사용하였으며, 세포를 빈블라스틴 처리하지 않는 것을 제외하고, 20 유닛의 BsrBl를 절단을 위하여 사용하였다.
겔에 노출시키고 48시간 후에 포스포러이미저 스크린으로 판독하였고, RFLP-유도형 및 야생형 밴드의 강도를 이미지퀀트 소프트웨어(몰레큘러 다이나믹스)를 사용하여 정량화하였다. RFLP-유도형 밴드의 강도는 야생형 및 RFLP 밴드의 총 방사선의 백분율로 표 29에 나타내었다. 그 결과는 X3 FokI 변이가 자신의 2차 카피와 결합하는 경우에 비하여 Q486E 변이와 결합하는 경우에 현저하게 기능이 향상되었다는 사실을 나타낸다.
Fok I 이량체 인터페이스 * 내의 돌연변이를 함유한 징크핑거/ Fok I 융합 단백질을 사용한 내부 유전자의 상동성-직접 변형
샘플 5-8 5-9 %CG
1 WT(1 ug) WT(1 ug) 2.6
2 WT(2.5 ug) WT(2.5 ug) < 1
3 WT(5 ug) WT(5 ug) 1.5
4 WT(7.5 ug) WT(7.5 ug) < 1
5 X3(1 ug) Q486E(1 ug) 4.1
6 X3(2.5 ug) Q486E(2.5 ug) 4.3
7 X3(5 ug) Q486E(5 ug) 8.6
8 X3(7.5 ug) Q486E(7.5 ug) 3.6
9 X3(5 ug) X3(5 ug) 0
10 Q486E(5 ug) Q486E(5 ug) 2.3
* K562 세포는 두 징크핑거/FokI 융합 단백질을 암호화하는 플라스미드 및 BsrBI 부위의 존재 결과 서열 변화가 발생한 IL-2Rγ 유전자의 엑손 5와 상동인 도너 DNA 서열을 함유한 플라스미드로 트랜스펙션되었다. 두번째 및 세번째 칼럼은 5-8 및 5-9 징크핑거 융합 단백질 내의 FokI 절단 하프-도메인의 특성을 다음과 같이 동정한다: WT (야생형 FokI 절단 하프-도메인); Q486E 변이 절단 하프-도메인 (실시예 5에서 기술한 야생형에 비하여 단일 아미노산 변화를 함유); X3 변이 절단 하프-도메인 (도 54에 나타낸 야생형에 비하여 3 개의 아미노산 변화를 함유). "%GC"는 총 증폭 산물의 분획을 나타내는데, 이는 BsrBI에 의하여 절단되며, BsrBl 절단 산물 내의 방사성으로 측정된다.
실시예 39: 염색체 GFP 리포터 유전자 분석으로 시험된 Fok I 이량체화 도메인 내에 다중 돌연변이를 가진 징크핑거/FokI 융합 단백질
FokI 절단 하프-도메인의 이량체화 인터페이스에 아미노산 서열 변경을 함유하는 징크핑거/FokI 융합 단백질(ZFN)의 상이한 조합들을 시험하기 위한 실험에서는 테트라시클린-조절 CMV 프로모터에 작동 연결된 염색체 통합된 돌연변이 eGFP 코딩 서열을 함유하는 실시예 29에 설명된 셀라인을 사용했다. 실시예 38 및 도 54를 참조한다. 실시예 13 및 도 32에서 이미 설명된 외래 도너 DNA 구성체는 야생형 eGFP 코딩 서열에 상동성인 1527 뉴클레오티드 쌍 삽입체를 함유했다. 이것은 하기 프라이머를 사용하여 eGFP 서열을 증폭시켜 구성하였다:
GFPnostart GGCGAGGAGCTGTTCAC (SEQ ID NO:235)
pcDNA42571 TGCATACTTCTGCCTGC (SEQ ID NO:236)
증폭 산물을 pCR4-TOPO 벡터로 토포 클로닝하여 도더 구성체를 생성하고, 이것을 pCR4-TOPO_GFPDonor_1.5KB로 표시했다. 이 도너 서열의 표적화 상동성-지정 통합은 돌연변이 염색체 eGFP 서열의 야생형 eGFP 서열로의 치환 및 기능적 eGFP의 독시시클린-유도성 발현을 가져올 것이다.
염색체 통합된 돌연변이 eGFP 서열(상기 설명된)을 함유하는 세포를 10% 우태혈청(FBS)(Hyclone) 및 2mM L-글루타민으로 보충되고 5% 이산화탄소 분위기 하에 37℃에서 유지된 듈베코 변성 이글 배지(DMEM)(Invitrogen)에서 성장시켰다. Opti -MEM I 감소 혈청 배지에서 LipofectAMINE 2000 시약(Invitrogen)을 사용하여 세포를 트랜스펙션했다. 세포를 ZFN만(각 5ng), 도너 플라스미드만(500ng)을 암호화하는 플라스미드, 또는 ZFN(각 5ng) + 도너 플라스미드(500ng)를 암호화하는로 트랜스펙션했다. 트랜스펙션 5시간 후에 성장배지에 2ng/mL 독시시클린(최종 농도)를 첨가하여 염색체 eGFP 코딩 서열의 발현을 활성화시켰다. 트랜스펙션 3일 후에 세포를 수집하고, 유세포분석에 의해 eGFP 발현을 분석했다. 표 30에 나타낸 결과는 이량체화 인터페이스에 돌연변이를 함유하는 융합 단백질이 상이한 절단 하프-도메인의 존재하에 상동성-지정 수선을 더욱 효과적으로 촉진하는 기능을 한다는 것을 나타내며, 이것은 이들의 동종이량체화의 경향이 더 적다는 것을 암시한다.
Fok I 이량체화 인터페이스에 돌연변이를 함유하는 징크핑거/ Fok I 융합 단백질을 사용한 돌연변이 염색체 eGFP 유전자의 상동성-지정 변경*

5-9↓		 5-8:
WT Q486E E490K X2 X3A X3B
WT 0.66 0.38 0.61 0.40 0.70 0.18
Q486E 0.26 0.14 0.54 0.53 0.50 0.23
E490K 0.58 0.42 0.30 0.01 0.02 0.03
X2 0.14 0.55 0.07 0.01 0.01 0.01
X3A 0.43 0.43 0.02 0.01 0.03 0.01
X3B 0.19 0.33 0.06 0.02 0.03 0.02
* 세포는 도너 구성체 및 2개의 ZFN 발현 구성체로 트랜스펙션되었다: 하나는 FokI 절단 하프-도메인에 융합된 5-8 징크핑거 결합 도메인을 발현하고, 나머지 하나는 FokI 절단 하프-도메인에 융합된 5-9 징크핑거 결합 도메인을 발현한다. 5-8 징크핑거 결합 도메인에 융합된 절단 하프-도메인의 성질은 윗줄에 제공된다: 5-9 징크핑거 결합 도메인에 융합된 절단 하프-도메인의 성질은 맨 좌측 칼럼에 제공된다. 숫자는 시험된 각 ZFN 쌍에 대해 eGFP 형광을 나타내는 세포의 퍼센트를 표시한다.
실시예 40: 내인성 CCR-5 유전자에 41-뉴클레오티드 외래 서열의 표적화 상동성-의존적 통합
K562 세포의 성장 및 트랜스펙션을 실시예 32에 설명된 대로 수행했다. 세포를 2개의 징크핑거/FokI 융합 단백질(2A 펩티드 서열에 의해 분리된)을 암호화하는 구성체 2.5㎍ 및 도너 구성체(하기 참조) 50㎍으로 트랜스펙션했는데, 융합 단백질의 징크핑거 도메인(7568 및 7296)은 인간 CCR-5 유전자 내의 표적 부위와 결합하도록 디자인하였다. 징크핑거 도메인의 표적 부위(박스 표시)는 하기 나타낸 대로 5개의 뉴클레오티드 쌍에 의해 분리된다.
Figure pat00012
표적 부위의 뉴클레오티드 서열, 및 징크핑거 도메인 인식 영역의 아미노산 서열을 표 31에 나타낸다.
인간 CCR-5 유전자를 위한 징크핑거 디자인
표적 서열 F1 F2 F3 F4
GATGAGGATGAC
(SEQ ID NO:238)		 DRSNLSR
(SEQ ID NO:239)		 TSANLSR
(SEQ ID NO:240)		 RSDNLAR
(SEQ ID NO:241)		 TSANLSR
(SEQ ID NO:242)
AAACTGCAAAAG
(SEQ ID NO:243)		 RSDHLSE
(SEQ ID NO:244)		 QNANRIT
(SEQ ID NO:245)		 RSDVLSE
(SEQ ID NO:246)		 QRNHRTT
(SEQ ID NO:247
주: DNA 표적 서열은 맨 좌측 칼럼에 나타낸다. 나머지 칼럼은 각 징크핑거의 알파-나선 부분의 시작과 관련하여, 4개의 징크핑거 각각의 잔기 -1에서 +6까지의 아미노산 서열(한 문자 코드로)을 나타낸다. 핑거 F1은 단백질의 아미노 말단에 가장 가까이 있다.
도너 DNA 분자는 제한효소 BglI에 대한 신규의 특징적 인식부위를 함유하는 41개 뉴클레오티드 쌍 서열 택을 함유하도록 조작된 인간 CDR-5 유전자의 약 2킬로 염기쌍 부분을 포함했다. 도너 분자는 XbaI 부위를 만들도록 CCR-5 유전자 단편을 돌연변이시키고, 이 XbaI 부위에 41-뉴클레오티드 택을 도입함으로써 구성하였다. 그 결과, 41-뉴클레오티드 택의 한쪽 측면에는 CCR-5 서열의 약 0.5킬로 염기쌍이, 그리고 다른 한쪽 측면에는 CCR-5 서열의 약 1.5킬로 염기쌍이 위치하게 되었다. 이 서열을 하기에 나타내며, 여기서 41-뉴클레오티드 쌍 택은 대문자로 표시하고, BglI 부위는 밑줄로 표시한다.
Figure pat00013
트랜스펙션 6일 후에 세포 DNA를 분리하여 실시예 32에 설명된 대로 증폭 주형으로서 사용한 다음 BglI로 분해하였다. 도너 구성체와 2개의 징크핑거/FokI 융합 단백질을 암호화하는 구성체로 트랜스펙션된 세포로부터의 DNA에서 증폭 산물의 약 1%가 BglI에 의해 절단되었는데, 이것이 바로 CCR-5 유전자에 서열 택이 삽입된 표시이다. 트랜스펙션되지 않은 세포로부터의 DNA, 도너 구성체로만 트랜스펙션된 세포, 및 2개의 징크핑거/FokI 융합 단백질을 암호화하는 구성체로만 트랜스펙션된 세포는 BglI에 의해 절단되는 증폭 산물을 산출하지 않았다. 이것은 이 41-뉴클레오티드 서열의 표적화 삽입이 CCR-5 유전자 내에 프레임시프트 돌연변이를 발생시키고, 이로써 HIV 수용체로서의 기능을 포함하여 그것의 유전자 기능을 불활성화한다는 것을 의미한다.
본 명세서에서 인용한 특허, 특허출원 및 간행물들은 모두 모든 목적을 위하여 그 전문이 본원에 참고자료로 포함된다.
이상에서 실시예를 들어 본 발명에 대해 상세하게 설명하였으나, 상기 실시예들은 본 발명의 이해를 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 사상 및 범위에서 벗어남이 없이 다양한 수정 및 변형이 가능하다. 따라서, 상기 실시예는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석하지 않아야 한다.

Claims (10)

  1. DNA-결합 도메인은 N- 말단에서 C 말단으로 F1에서 F4로 나열된 4개의 징크핑거 인식 영역을 포함하고, F1, F2, F3 및 F4는 각각
    F1: QSGALAR (SEQ ID NO:229)
    F2: RSDNLRE (SEQ ID NO: 230)
    F3: QSSDLSR (SEQ ID NO:231) 및
    F4: TSSNRKT (SEQ ID NO: 232)의 아미노산 서열을 포함하거나,
    F1: RSDTLSE (SEQ ID NO: 224)
    F2: NNRDRTK (SEQ ID NO: 225)
    F3: RSDHLSA (SEQ ID NO: 226) 및
    F4: QSGHLSR (SEQ ID NO: 227)의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 조작된 징크핑거 단백질 DNA-결합 도메인을 포함하는 단백질.
  2. 제 1항에 있어서, 절단 도메인 또는 절단 하프-도메인을 추가로 포함하는 단백질.
  3. 제 2항에 있어서, 절단 하프-도메인은 야생형 FokI 절단 하프-도메인 또는 E490K, E490R 및 Q486E로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 돌연변이를 포함하는 조작된 FokI 절단 하프-도메인인 것을 특징으로 하는 단백질.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  5. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 단백질 또는 제 4항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리된 세포.
  6. 제 4항에 따른 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 도입시킴으로써, 제 1 폴리뉴클레오티드가 세포에서 단백질을 발현시키고 상기 단백질이 표적 부위에 결합하여 dhfr 유전자를 절단하는 단계를 포함하는 세포에서 내인성 dhfr 유전자를 불활성화시키는 방법.
  7. (a) 내인성 dhfr 유전자를 포함하는 숙주 세포를 제공하는 단계;
    (b) 제 6항의 방법에 의해 숙주 세포의 내인성 dhfr 유전자를 불활성화시키는 단계;
    (c) dhfr 유전자 및 관심 단백질을 코딩하는 서열을 포함하는 트랜스젠을 포함하는 발현 벡터를 숙주 세포 내로 도입하는 단계; 및
    (d) 트랜스젠이 숙주 세포로 안전하게 통합되어 발현되는 세포를 선택하고, 이에 따라 재조합 단백질을 생산하는 단계를 포함하는 숙주 세포에서 관심 재조합 단백질을 생산하는 방법.
  8. 제 6항 또는 제 7항에 있어서, 숙주 세포는 CHO 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 4항에 따르는 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 도입하여 세포 집단에서 내인성 dhfr 유전자를 불활성화시킴으로써, 단백질이 표적 부위에 결합하여 dhfr 유전자를 절단하고, 상기 세포를 배양함으로써 얻어지는 dhfr-결핍된 세포주.
  10. 제 9항에 있어서, 세포주는 CHO 세포주인 것을 특징으로 하는 dhfr-결핍된 세포주.
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