KR101774272B1 - Ｗｎｔ 길항약 및 치료와 스크리닝 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 Wnt 길항약을 포함하는 조성물 및 Wnt-연관된 질환과 장애, 예를 들면, 암을 치료하고, 분화를 유도하고, 그리고 암 줄기 세포의 빈도를 감소시키는 방법뿐만 아니라 이런 Wnt 길항약을 스크리닝하는 신규한 방법에 관계한다. 특히, 본 발명에서는 가용성 FZD, SFRP와 Ror 수용체, 그리고 이들의 용도를 개시한다.

Description

ＷＮＴ 길항약 및 치료와 스크리닝 방법{WNT ANTAGONISTS AND METHODS OF TREATMENT AND SCREENING}
관련된 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2010년 1월 12일자 제출된 U.S. 가출원 No. 61/294,270, 2010년 10월 15일자 제출된 U.S. 가출원 No. 61/393,675, 그리고 2010년 12월 17일자 제출된 U.S. 가출원 No. 61/424,408에 우선권을 주장하고, 이들 각각은 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다.
본 발명의 기술 분야
본 발명에서는 암 및 기타 Wnt-연관된 질환 또는 장애를 치료하기 위한 신규한 조성물과 방법을 제시하고, 그리고 추가의 신규한 치료제를 확인하기 위한 신규한 스크리닝 방법을 제시한다. 특히, 본 발명에서는 고형 종양 및 기타 Wnt-연관된 질환과 장애의 치료에 유용한 가용성 수용체 단백질을 비롯한 Wnt 길항약을 제시한다.
본 발명의 배경 기술
암은 선진국에서 사망의 주요 원인 중의 하나인데, 미국에서만 매년 백만 명 이상이 암으로 진단되고 오십 만 명이 사망한다. 전체적으로, 3명중 1명 이상이 그들의 일생 동안 일정한 형태의 암이 발생할 것으로 추정된다. 200가지 이상의 상이한 유형의 암이 있는데, 이들 중에서 4가지 - 유방, 폐, 결장직장, 그리고 전립선 -가 모든 새로운 증례의 절반 이상을 차지한다 (Jemal et al., 2009, Cancer J. Clin., 58:225-249).
Wnt 신호전달 경로는 암 요법에 대한 잠재적인 표적으로서 확인되었다. Wnt 신호전달 경로는 배아 패턴 형성 (embryonic pattern formation), 후배 조직 유지 (post-embryonic tissue maintenance), 그리고 줄기 세포 생물학의 몇몇 중요한 조절자 중의 하나이다. 더욱 구체적으로, Wnt 신호전달은 세포 극성 (cell polarity)의 발생 및 줄기 세포 집단에 의한 자기 재생 (self-renewal)을 비롯한 세포 운명 결정 (cell fate specification)에서 중요한 역할을 수행한다. Wnt 경로의 조절되지 않은 활성화는 다수의 인간 암과 연관되고, 여기서 이것은 종양 세포가 분화되지 않은 증식 상태에 유지되도록 이들 종양 세포의 발달 운명을 변화시킬 수 있다. 따라서 발암 (carcinogenesis)은 정상적인 발달 및 줄기 세포에 의해 조직 복원을 제어하는 항상성 기전 (homeostatic mechanism)을 침범함으로써 진행될 수 있다 (Reya & Clevers, 2005, Nature , 434:843-50; Beachy et al., 2004, Nature , 432:324-31에서 검토됨).
Wnt 신호전달 경로는 날개없는 발달 돌연변이 초파리 (wg)에서, 그리고 뮤린 원발암 유전자 (proto-oncogene) int-1, 현재 Wnt1로부터 최초로 밝혀졌다 (Nusse & Varmus, 1982, Cell , 31:99-109; Van Ooyen & Nusse, 1984, Cell , 39:233-40; Cabrera et al., 1987, Cell , 50:659-63; Rijsewijk et al., 1987, Cell , 50:649-57). Wnt 유전자는 분비된 지질-변형된 당단백질을 인코딩하는데, 이들 중에서 19가지가 포유동물에서 확인되었다. 이들 분비된 리간드는 Frizzled (FZD) 수용체 패밀리 구성원 및 저밀도 지단백 (LDL) 수용체-관련된 단백질 5 또는 6 (LRP5/6)으로 구성되는 수용체 복합체를 활성화시킨다. FZD 수용체는 G-단백질 결합된 수용체 (GPCR) 슈퍼패밀리의 7개 막통과 도메인 단백질이고, 그리고 시스테인-풍부 도메인 (CRD) 또는 Fri 도메인으로 알려져 있는, 10개의 보존된 시스테인을 갖는 큰 세포외 N-말단 리간드 결합 도메인을 내포한다. 10가지 인간 FZD 수용체, FZD1, FZD2, FZD3, FZD4, FZD5, FZD6, FZD7, FZD8, FZD9 및 FZD10이 존재한다. 상이한 FZD CRD는 특정 Wnt에 대한 상이한 결합 친화성을 갖고 (Wu & Nusse, 2002, J. Biol . Chem ., 277:41762-9), 그리고 FZD 수용체는 정준 β-카테닌 경로를 활성화시키는 것들 및 하기에 기술된 비-정준 경로를 활성화시키는 것들로 분류된다 (Miller et al., 1999, Oncogene , 18:7860-72). FZD 리간드에 결합하는 수용체 복합체를 형성하기 위해, FZD 수용체는 4개의 세포외 EGF-유사 도메인이 6개의 YWTD 아미노산 반복부 (repeat)에 의해 분리되는 단일 통로 막통과 단백질, LRP5/6과 상호작용한다 (Johnson et al., 2004, J. Bone Mineral Res ., 19:1749).
수용체 결합 시에 활성화된 정준 Wnt 신호전달 경로는 FZD 수용체와 직접적으로 상호작용하는 세포질 단백질 Dishevelled (Dsh)에 의해 매개되고, 그리고 β-카테닌의 세포질 안정화와 축적을 유발한다. Wnt 신호의 부재에서, β-카테닌은 종양 억제자 단백질 샘종성 결장 폴립증 (adenomatous polyposis coli, APC)과 액신 (Axin)을 포함하는 세포질 파괴 복합체에 국지화된다. 이들 단백질은 글리코겐 합성 키나아제 (glycogen synthase kinase)-3β (GSK3β)가 β-카테닌에 결합하여 이를 인산화시킬 수 있도록 중요한 뼈대로서 기능하고, 유비퀴틴/단백질분해효소복합체 경로를 경유한 분해에 대하여 이를 표시한다. Dsh의 활성화는 GSK3β의 인산화 및 파괴 복합체의 해리를 유발한다. 축적된 세포질 β-카테닌은 이후, 핵 내로 운반되고, 여기서 이것은 TCF/LEF 패밀리의 DNA-결합 단백질과 상호작용하여 전사를 활성화시킨다. 정준 신호전달 경로에 더하여, Wnt 리간드는 β-카테닌-독립성 경로 역시 활성화시킨다(Veeman et al., 2003, Dev . Cell , 5:367-77). 비-정준 Wnt 신호전달은 다수의 과정에 관여하긴 하지만 가장 확실하게는, 초파리 (Drosophila planar) 세포 극성 (PCP) 경로와 유사한 기전을 거쳐 장배형성 움직임 (gastrulation movement)에 관여한다. 비-정준 Wnt 신호전달의 다른 잠재적인 기전에는 칼슘 플럭스 (calcium flux), JNK, 그리고 소형과 이형삼량체 (heterotrimeric) G-단백질이 포함된다. 길항 (antagonism)은 종종, 정준과 비-정준 경로 사이에 관찰되고, 그리고 일부 증거는 비-정준 신호전달이 암 형성을 억제할 수 있다는 것을 지시한다 (Olson & Gibo, 1998, Exp . Cell Res ., 241:134; Topol et al., 2003, J. Cell Biol ., 162:899-908). 따라서 일정한 배경에서, FZD 수용체는 정준 Wnt 신호전달 경로의 음성 조절자로서 기능한다. 가령, FZD6은 TAK1-NLK 경로를 거쳐 FZD1와 공동-발현될 때, Wnt3a-유도된 정준 신호전달을 억제한다 (Golan et al., 2004, JBC , 279:14879-88). 유사하게, FZD2는 TAK1-NLK MAPK 캐스케이드를 거쳐 Wnt5a의 존재에서 정준 Wnt 신호전달을 길항하는 것으로 밝혀졌다 (Ishitani et al., 2003, Mol . Cell . Biol ., 23:131-39).
정준 Wnt 신호전달 경로는 또한, 소장과 대장에서 줄기 세포 집단의 유지에서 중심적인 역할을 수행하고, 그리고 이러한 경로의 부적절한 활성화는 결장직장 암에서 현저한 역할을 수행한다 (Reya & Clevers, 2005, Nature , 434:843). 장의 흡수 상피 (absorptive epithelium)는 융모 (villus)와 여포선 (crypt) 내로 배열된다. 줄기 세포는 여포선 내에 존재하고, 그리고 천천히 분열하여 빠르게 증식하는 세포를 생산하고, 이들 세포는 여포선 외부로 이동하여 장 융모를 점유하는 모든 분화된 세포 집단을 산출한다. Wnt 신호전달 캐스케이드는 여포선-융모 축을 따라서 세포 운명을 제어하는데 지배적인 역할을 수행하고 줄기 세포 집단의 유지에 필수적이다. 상동성 재조합 (homologous recombination)에 의한 TCF7/2의 유전자 상실 (genetic loss) (Korinek et al., 1998, Nat . Genet ., 19:379), 또는 강력한 분비된 Wnt 길항약, Dickkopf-1 (Dkk1)의 과다발현 (Pinto et al., 2003, Genes Dev., 17:1709-13; Kuhnert et al., 2004, PNAS , 101:266-71)에 의한 Wnt 신호전달의 교란은 장 줄기 세포 집단의 고갈을 유발한다.
암에서 Wnt 신호전달의 역할은 먼저, 뮤린 바이러스의 인근 삽입에 의해 형질전환된 유방 종양에서 종양유전자로서 Wnt1 (최초 int1)의 확인으로 밝혀졌다 (Nusse & Varmus, 1982, Cell , 31:99-109). 그 이후, 유방 암에서 Wnt 신호전달의 역할에 대한 추가의 증거가 축적되었다. 가령, 유선에서 β-카테닌의 유전자도입 과다발현은 과형성 (hyperplasias)과 선암종 (adenocarcinomas)을 유발하고 (Imbert et al., 2001, J. Cell Biol ., 153:555-68; Michaelson & Leder, 2001, Oncogene, 20:5093-9), 반면 Wnt 신호전달의 상실은 정상적인 유선 발달을 교란시킨다 (Tepera et al., 2003, J. Cell Sci ., 116:1137-49; Hatsell et al., 2003, J. Mammary Gland Biol . Neoplasia , 8:145-58). 더욱 최근에, 유방 줄기 세포는 Wnt 신호전달에 의해 활성화되는 것으로 밝혀졌다 (Liu et al., 2004, PNAS , 101:4158-4163). 인간 유방 암에서, β-카테닌 축척은 50% 이상의 암종에서 활성화된 Wnt 신호전달을 암시하고, 그리고 비록 특정 돌연변이가 확인되지는 않았지만, Frizzled 수용체 발현의 상향 조절이 관찰되었다 (Brennan & Brown, 2004, J. Mammary Gland Neoplasia , 9:119-31; Malovanovic et al., 2004, Int . J. Oncol ., 25:1337-42).
결장직장 암은 가장 일반적으로, Wnt 신호전달 캐스케이드에서 돌연변이를 활성화시킴으로써 시작된다. 모든 결장직장 암의 대략 5-10%는 유전성인데, 주요 형태 중에서 한 가지는 병든 개체의 대략 80%가 선종성 결장 용종증 (adenomatous polyposis coli, APC) 유전자에서 생식계 돌연변이를 내포하는 상염색체 우성 질환 (autosomal dominant disease)인 가족성 선종성 용종증 (familial adenomatous polyposis, FAP)이다. 돌연변이는 또한, 액신과 β-카테닌을 비롯한 다른 Wnt 경로 성분에서 확인되었다. 개별 선종은 두 번째 비활성화된 대립유전자를 내포하는 상피 세포의 클론 증식물 (clonal outgrowth)이고, 그리고 FAP 선종의 다수가 필연적으로, 종양유전자 및/또는 종양 억제자 유전자에서 추가 돌연변이를 통해 선암종의 발생을 유발한다. 게다가, APC와 β-카테닌에서 기능 획득 돌연변이 (gain-of-function mutation)을 비롯한, Wnt 신호전달 경로의 활성화는 생쥐 모형에서 과형성성 발생과 종양 성장을 유도할 수 있다 (Oshima et al., 1997, Cancer Res,. 57:1644-9; Harada et al., 1999, EMBO J., 18:5931-42).
본 발명의 간단한 요약
본 발명에서는 가용성 FZD 수용체가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 하나 또는 그 이상의 인간 Wnt 단백질에 결합하는 다양한 작용제 및 Fri 도메인을 포함하는 기타 작용제, 그리고 이들 작용제를 이용하는 신규한 방법을 제시한다. 또한, 본 발명에서는 병든 개체에 이들 작용제를 투여함으로써 암의 치료에서 이들 작용제를 이용하는 방법을 제시한다. 일부 구체예에서, 이들 방법은 암 세포의 성장을 저해하는 단계를 포함한다. 일정한 구체예에서, Wnt-결합 작용제는 Wnt 길항약이다. 이런 Wnt-결합 작용제를 스크리닝하는 신규한 방법 역시 제시된다. 이들 작용제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 이들 작용제를 만드는 방법, 그리고 이들 작용제를 포함하는 다양한 조성물 역시 제시된다.
따라서 한 측면에서, 본 발명에서는 종양의 성장을 저해하는 방법을 제시한다. 일정한 구체예에서, 상기 방법은 종양을 하나 또는 그 이상의 Wnt 단백질 (가령, 인간 Wnt 단백질)에 결합하는 작용제의 효과량과 접촉시키는 단계를 포함한다. 상기 방법은 생체내 또는 시험관내 방법일 수 있다. 일정한 구체예에서, 종양은 개체 내에 있고, 그리고 종양과 작용제의 접촉은 Wnt-결합 작용제의 치료 효과량을 개체에 투여하는 것을 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명에서는 암 줄기 세포를 포함하는 종양 내에서 암 줄기 세포의 빈도를 감소시키는 방법을 제시한다. 따라서 본 발명에서는 또한, 종양의 종양원성을 감소시키는 방법을 제시한다. 일부 구체예에서, 이들 방법은 종양을 하나 또는 그 이상의 Wnt 단백질 (가령, 인간 Wnt 단백질)에 결합하는 작용제의 효과량과 접촉시키는 단계를 포함한다. 상기 방법은 생체내 또는 시험관내 방법일 수 있다. 가령, 접촉은 Wnt-결합 작용제의 효과량을 종양을 앓는 인간에 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명에서는 종양 내에서 세포가 분화하도록 유도하거나, 또는 종양 내에서 분화 마커의 발현을 유도하는 방법을 제시한다. 일정한 구체예에서, 상기 방법은 종양을 하나 또는 그 이상의 Wnt 단백질 (가령, 인간 Wnt 단백질)에 결합하는 작용제의 효과량과 접촉시키는 단계를 포함한다. 상기 방법은 생체내 또는 시험관내 방법일 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명에서는 개체에서 암을 치료하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 Wnt-결합 작용제의 치료 효과량을 개체에 투여하는 단계를 포함한다.
추가의 측면에서, 본 발명에서는 개체에서 Wnt 신호전달 활성화와 연관된 질환을 치료하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 Wnt-결합 작용제의 치료 효과량을 개체에 투여하는 단계를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명에서는 개체에서 장애를 치료하는 방법을 제시하고, 여기서 장애는 증가된 수준의 줄기 세포 및/또는 전구 세포로 특징되고, 상기 방법은 Wnt-결합 작용제의 치료 효과량을 개체에 투여하는 단계를 포함한다.
전술한 각 측면, 그리고 본 명세서에 제시된 다른 측면의 일정한 구체예에서, Wnt-결합 작용제는 폴리펩티드이다. 일정한 구체예에서, 작용제는 가용성 수용체이다.
전술한 각 측면, 그리고 본 명세서에 제시된 다른 측면의 일정한 구체예에서, 작용제는 FZD 수용체의 Fri 도메인, 또는 하나 또는 그 이상의 Wnt 단백질에 결합하는 FZD Fri 도메인의 단편을 포함한다. 일정한 구체예에서, FZD 수용체는 인간 FZD 수용체이다. 가령, Fri 도메인은 인간 FZD4 또는 인간 FZD5로부터 유래될 수 있다. 일정한 대안적 구체예에서, 작용제는 인간 FZD8 수용체의 Fri 도메인, 또는 하나 또는 그 이상의 Wnt 단백질에 결합하는 이러한 Fri 도메인의 단편을 포함할 수 있다. 일정한 구체예에서, Wnt-결합 작용제는 가용성 FZD 수용체이다. 대안적 구체예에서, Wnt-결합 작용제는 FZD 수용체의 Fri 도메인을 포함하지 않는다.
전술한 각 측면, 그리고 본 명세서에 제시된 다른 측면의 일정한 구체예에서, 작용제는 가용성 Frizzled-관련된 단백질 (SFRP)의 Fri 도메인, 또는 하나 또는 그 이상의 Wnt 단백질에 결합하는 SFRP Fri 도메인의 단편을 포함한다. 일정한 구체예에서, SFRP는 인간 SFRP이다.
전술한 각 측면, 그리고 본 명세서에 제시된 다른 측면의 일정한 구체예에서, 작용제는 Ror 단백질의 Fri 도메인, 또는 하나 또는 그 이상의 Wnt 단백질에 결합하는 Ror Fri 도메인의 단편을 포함한다. 일정한 구체예에서, Ror 단백질은 인간 Ror 단백질이다.
전술한 각 측면, 그리고 본 명세서에 제시된 다른 측면의 일정한 구체예에서, 작용제는 인간 Fc 영역을 더욱 포함한다. 일정한 구체예에서, Wnt-결합 작용제는 융합 단백질이다. 일정한 구체예에서, Wnt-결합 작용제는 서열 번호:1을 포함한다. 일정한 구체예에서, Wnt-결합 작용제는 서열 번호:46을 포함한다. 일정한 구체예에서, Wnt-결합 작용제는 서열 번호:48을 포함한다. 일정한 구체예에서, Wnt-결합 작용제는 서열 번호:50을 포함한다. 일정한 구체예에서, Wnt-결합 작용제는 서열 번호:53을 포함한다. 일부 구체예에서, Wnt-결합 작용제 (신호 서열 절단 이전에)는 서열 번호:50, 그리고 서열 번호:67, 서열 번호:68, 서열 번호:69, 서열 번호:70, 서열 번호:71, 서열 번호:72, 서열 번호:73 및 서열 번호:74로 구성되는 군에서 선택되는 신호 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, Wnt-결합 작용제 (신호 서열 절단 이전에)는 서열 번호:50, 그리고 서열 번호:70, 서열 번호:71, 서열 번호:72, 서열 번호:73 및 서열 번호:74로 구성되는 군에서 선택되는 신호 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, Wnt-결합 작용제 (신호 서열 절단 이전에)는 서열 번호:50 및 서열 번호:71을 포함한다. 일부 구체예에서, Wnt-결합 작용제 (신호 서열 절단 이전에)는 서열 번호:53, 그리고 서열 번호:67, 서열 번호:68, 서열 번호:69, 서열 번호:70, 서열 번호:71, 서열 번호:72, 서열 번호:73 및 서열 번호:74로 구성되는 군에서 선택되는 신호 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, Wnt-결합 작용제 (신호 서열 절단 이전에)는 서열 번호:53, 그리고 서열 번호:70, 서열 번호:71, 서열 번호:72, 서열 번호:73 및 서열 번호:74로 구성되는 군에서 선택되는 신호 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, Wnt-결합 작용제 (신호 서열 절단 이전에)는 서열 번호:53 및 서열 번호:71을 포함한다.
전술한 각 측면, 그리고 본 명세서에 제시된 다른 측면의 일정한 구체예에서, Wnt-결합 작용제는 Wnt1, Wnt2, Wnt2b, Wnt3, Wnt3a, Wnt7a, Wnt7b, Wnt8a, Wnt8b, Wnt10a, 그리고 Wnt10b로 구성되는 군에서 선택되는 하나 또는 그 이상, 2개 또는 그 이상, 3개 또는 그 이상, 또는 4개 또는 그 이상의 인간 Wnt 단백질에 결합한다. 일정한 구체예에서, 작용제는 Wnt1, Wnt2, Wnt3, Wnt3a, 그리고 Wnt7b에 결합한다.
전술한 각 측면, 그리고 본 명세서에 제시된 다른 측면의 일정한 구체예에서, 작용제는 Wnt 길항약이다. 일정한 구체예에서, 작용제는 Wnt 신호전달을 저해한다. 일정한 구체예에서, 작용제는 Wnt 정준 Wnt 신호전달을 저해한다.
전술한 각 측면, 그리고 본 명세서에 제시된 다른 측면의 일정한 구체예에서, 종양 또는 암은 결장직장 종양/암, 췌장 종양/암, 폐 종양/암, 난소 종양/암, 간 종양/암, 유방 종양/암, 신장 종양/암, 전립선 종양/암, 위장 종양/암, 흑색종, 자궁경부 종양/암, 방광 종양/암, 아교모세포종, 그리고 두경부 종양/암으로 구성되는 군에서 선택되는 종양/암이다.
전술한 각 측면, 그리고 본 명세서에 제시된 다른 측면의 일정한 구체예에서, 이들 방법은 종양을 두 번째 치료제와 접촉시키거나, 또는 두 번째 치료제를 개체에 투여하는 단계를 더욱 포함한다. 일정한 구체예에서, 두 번째 치료제는 화학치료제이다. 일정한 구체예에서, 두 번째 화학치료제는 대사길항물질 (가령, 젬시타빈) 또는 유사분열제 (가령, 파클리탁셀과 같은 탁산)이다.
또 다른 측면에서, 본 발명에서는 서열 번호:1, 서열 번호:45, 서열 번호:46, 서열 번호:47, 서열 번호:48, 서열 번호:49, 서열 번호:50, 서열 번호:51, 서열 번호:53, 서열 번호:54, 서열 번호:55, 서열 번호:65 및 서열 번호:66으로 구성되는 군에서 선택되는 서열을 포함하는 폴리펩티드, 그리고 이러한 폴리펩티드를 생산하는 세포 및 이러한 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 제시한다. 이러한 폴리펩티드 및 제약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 제약학적 조성물 역시 제시된다. 이에 더하여, 서열 번호:1, 서열 번호:45, 서열 번호:46, 서열 번호:47, 서열 번호:48, 서열 번호:49, 서열 번호:50, 서열 번호:51, 서열 번호:53, 서열 번호:54, 서열 번호:55, 서열 번호:65 및 서열 번호:66의 폴리펩티드를 인코딩하거나, 또는 서열 번호:2의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 역시 제시된다. 이러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터와 세포 역시 제시된다.
추가의 측면에서, 본 발명에서는 항-종양 활성 및/또는 암 줄기 세포에 저항하는 활성에 대하여 작용제를 스크리닝하는 방법을 제시한다. 일정한 구체예에서, 상기 방법은 작용제에 노출된 첫 번째 고형 종양 (가령, 암 줄기 세포를 포함하는 고형 종양)에서 하나 또는 그 이상의 분화 마커 및/또는 하나 또는 그 이상의 줄기성 마커의 수준을 작용제에 노출되지 않은 두 번째 고형 종양에서 하나 또는 그 이상의 분화 마커의 수준과 비교하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 (a) 첫 번째 고형 종양을 작용제에 노출시키지만 두 번째 고형 종양을 상기 작용제에 노출시키지 않는 단계; (b) 첫 번째와 두 번째 고형 종양에서 하나 또는 그 이상의 분화 마커 및/또는 하나 또는 그 이상의 줄기성 마커의 수준을 평가하는 단계; 그리고 (c) 첫 번째 종양에서 하나 또는 그 이상의 분화 마커의 수준을 두 번째 고형 종양에서 하나 또는 그 이상의 분화 마커의 수준과 비교하는 단계를 포함한다. 일정한 구체예에서, (a) 두 번째 고형 종양에 비하여 첫 번째 고형 종양에서 하나 또는 그 이상의 분화 마커의 증가된 수준은 작용제의 항-종양 또는 항암 줄기 세포 활성을 지시하고; 및/또는 (b) 하나 또는 그 이상의 줄기성 마커의 감소된 수준은 작용제의 항-종양 또는 항암 줄기 세포 활성을 지시한다. 일정한 구체예에서, 작용제는 하나 또는 그 이상의 Wnt 단백질에 결합한다. 일정한 구체예에서, 작용제는 가용성 FZD 수용체이다. 일정한 방법에서, 상기 작용제는 항체, 예를 들면, 항-FZD 또는 항-Wnt 항체이다. 일정한 대안적 구체예에서, 작용제는 소형 분자이다.
본 발명의 측면 또는 구체예가 Markush 그룹 또는 다른 대안적 그룹의 관점에서 기술되긴 하지만, 본 발명은 포괄적으로 열거된 전체 그룹뿐만 아니라 개별적으로 그룹의 각 구성원 및 주요 그룹의 모든 가능한 하위그룹을 포함하고, 또한 주요 군은 이들 그룹 구성원 중에서 하나 또는 그 이상이 부재한다. 본 발명은 또한, 청구된 발명에서 임의의 그룹 구성원 중에서 하나 또는 그 이상의 명백한 배제를 구상한다.
본 발명의 상세한 설명
본 발명에서는 인간 Frizzled (FZD) 수용체의 Fri 도메인을 포함하는 폴리펩티드, 인간 분비된 Frizzled-관련된 단백질 (SFRP), 또는 하나 또는 그 이상의 인간 Wnt에 결합하는 Ror 단백질이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 신규한 작용제를 제시한다. 관련된 폴리펩티드와 폴리뉴클레오티드, Wnt-결합 작용제를 포함하는 조성물, 그리고 Wnt-결합 작용제를 만드는 방법 역시 제시된다. Wnt-결합 작용제를 이용하는 방법, 예를 들면, 종양 성장을 저해하고, 암을 치료하고, 분화를 유도하고, 그리고 종양원성을 감소시키는 방법이 더욱 제시된다. 항-종양 활성 및/또는 항암 줄기 세포 활성을 갖는 신규한 Wnt-결합 작용제를 확인하기 위해 작용제를 스크리닝하는 방법 역시 제시된다.
인간 FZD8의 Fri 도메인 및 Fc 도메인을 포함하는 Wnt-결합 작용제가 생산되고 본 명세서에서 FZD8-Fc 또는 FZD8-Fc (54F03)로서 지칭되었다 (실시예 1). FZD8-Fc 단백질의 다수의 변이체가 산출되었다 (실시예 10). N-말단에서 대략 95% 또는 그 이상 상동한 것으로 밝혀진 FZD8-Fc 단백질이 생산되었다 (실시예 16). 몇몇 FZD8-Fc 변이체를 이용한 약물동력학적 연구는 쥐에서 수행되고 FZD8-Fc 변이체의 반감기가 적어도 100시간이라는 것을 증명하였다 (실시예 2와 12; 도 1과 표 4). 약물동력학적 연구가 원숭이에서 FZD8-Fc 변이체 54F15와 54F16으로 수행되었는데, 이것은 이들 단백질이 적어도 100시간의 반감기를 갖는다는 것을 증명하였다 (실시예 13과 표 5). 단독으로 또는 화학치료제와 공동으로 FZD8-Fc (54F03)로 처리는 췌장 종양, 유방 종양 및 결장 종양의 성장을 감소시키는 것으로 밝혀졌다 (실시예 3, 5, 6과 8, 그리고 도 2, 10, 11B와 13A). 게다가, 이러한 처리는 췌장 모형에서 CD44+ 세포의 백분율을 감소시키고 암 줄기 세포의 빈도를 감소시키는 것으로 밝혀졌다 (실시예 3과 8, 그리고 도 3, 4와 13B). 단독으로 또는 화학치료제와 공동으로 FZD8-Fc (54F03)로 처리는 췌장 종양 세포와 결장 종양 세포의 세포 분화를 증가시키는 것으로 밝혀졌다 (실시예 4, 7과 9, 그리고 도 5-9, 12, 14와 15). FZD8-Fc 변이체로 처리는 결장과 췌장 종양에서 종양 성장의 저해를 보였는데, 저해의 정도가 변이체에 좌우되었다 (실시예 14, 15와 17, 그리고 도 17, 18과 21). FZD8-Fc 변이체 54F03과 변이체 54F16로 처리는 췌장 종양에서 CD44+CD202+ 세포뿐만 아니라 CD44hi 세포의 백분율을 감소시키는 것으로 밝혀졌다 (실시예 15와 도 19).
I. 정의
본 명세서에서, 용어 "길항약"은 단백질 (가령, 암 줄기 세포 마커)의 발현 또는 생물학적 활성을 부분적으로 또는 완전하게 차단하는, 저해하는, 또는 중화시키는 임의의 분자를 포함하는데 이용된다. 생물학적 활성의 차단, 저해 및/또는 중화에는 종양 성장의 저해가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 용어 "길항약"은 Wnt 경로의 생물학적 활성을 부분적으로 또는 완전하게 차단하는, 저해하는, 또는 중화시키는 임의의 분자를 포함한다. 적절한 길항약 분자에는 가용성 FZD 수용체, SFRP의 유도체 및 Ror 단백질의 유도체를 비롯하여, 고유 FZD 수용체 단백질의 단편 및/또는 아미노산 서열 변이체가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
"단리된" 폴리펩티드, 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포, 또는 조성물은 자연에서 발견되지 않는 형태의 폴리펩티드, 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포, 또는 조성물이다. 단리된 폴리펩티드, 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포 또는 조성물에는 그들이 자연에서 발견되는 형태로 더 이상 있지 못하는 정도까지 정제된 것들이 포함된다. 일부 구체예에서, 단리된 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포, 또는 조성물은 실질적으로 순수하다.
본 명세서에서, "실질적으로 순수한"은 적어도 50% 순수한 (즉, 오염물질이 없는), 더욱 바람직하게는 적어도 90% 순수한, 더욱 바람직하게는 적어도 95% 순수한, 더욱 바람직하게는 적어도 98% 순수한, 더욱 바람직하게는 적어도 99% 순수한 물질을 지칭한다.
본 명세서에서, 용어 "가용성 수용체"는 가용성 형태로 세포로부터 분비될 수 있는 수용체의 첫 번째 막통과 도메인을 선행하는 수용체 단백질의 N-말단 세포외 단편을 지칭한다. 일부 구체예에서, 수용체 단백질은 FZD 수용체이다. 일부 구체예에서, 수용체 단백질은 Ror 수용체이다.
본 명세서에서, 용어 "FZD 가용성 수용체"는 가용성 형태로 세포로부터 분비될 수 있는 수용체의 첫 번째 막통과 도메인을 선행하는 인간 FZD 수용체 단백질의 N-말단 세포외 단편을 지칭한다. 완전한 N-말단 세포외 도메인 (ECD)을 포함하는 양쪽 FZD 가용성 수용체 ("FZD ECD"로 지칭됨), 그리고 더욱 작은 단편이 구상된다. Fri 도메인을 포함하는 FZD 가용성 수용체 (본 명세서에서, "FZD Fri"로 지칭됨) 역시 개시된다. FZD Fri 가용성 수용체는 완전한 FZD ECD를 포함하는 가용성 수용체와 비교하여, 변화된 생물학적 활성 (가령, 증가된 단백질 반감기)을 나타낼 수 있다. 단백질 반감기는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 또는 폴리에틸렌 산화물 (PEO)로 공유 변형에 의해 더욱 증가될 수 있다. FZD 가용성 수용체에는 인간 Fc 영역 (가령, 면역글로불린 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE, 또는 IgM으로부터 유래된 인간 Fc); 단백질 태그 (가령, myc, FLAG, GST); 기타 내인성 단백질 또는 단백질 단편; 또는 FZD ECD 또는 Fri 도메인 및 연결된 단백질 사이에 임의의 링커 영역을 포함하는 임의의 기타 유용한 단백질 서열이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 다른 기능적 및 구조적 단백질에 인-프레임 (in-frame) 연결된 FZD ECD 또는 Fri 도메인이 포함된다. 일정한 구체예에서, FZD 수용체의 Fri 도메인은 인간 Fc 영역에 직접적으로 연결된다. 일정한 구체예에서, FZD 수용체의 Fri 도메인은 인간 IgG1 Fc에 연결된다 (본 명세서에서, "FZD Fri.Fc"로 지칭됨). 일부 구체예에서, FZD 수용체의 Fri 도메인은 펩티드 링커로 인간 Fc 영역에 연결된다. FZD 가용성 수용체에는 또한, 아미노산 삽입, 결실, 치환, 및/또는 보존성 치환을 포함하는 변이체 단백질이 포함된다.
본 명세서에서, 용어 "링커" 또는 "링커 영역"은 첫 번째 폴리펩티드 (가령, FZD 성분)와 두 번째 폴리펩티드 (가령, Fc 영역) 사이에 삽입된 링커를 지칭한다. 일부 구체예에서, 링커는 펩티드 링커이다. 링커는 폴리펩티드의 발현, 분비, 또는 생물활성에 부정적인 영향을 주지 않아야 한다. 바람직하게는, 링커는 항원성이 아니고 면역 반응을 유발하지 않는다.
본 명세서에서, 용어 "암" 및 "암성"은 포유동물에서, 세포 집단이 통제되지 않은 세포 성장으로 특징되는 생리학적 상태를 지칭하거나 기술한다. 용어 암은 Wnt-의존성 암을 포함하는 것으로 이해된다. 암의 실례에는 암종, 림프종, 아세포종, 육종, 그리고 백혈병이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 이런 암의 더욱 구체적인 실례에는 편평 세포 암, 소세포 폐 암, 비-소세포 폐 암, 폐의 선암종, 폐의 편평 암종, 복막의 암, 간세포 암, 위장 암, 췌장 암, 아교모세포종, 자궁경부 암, 난소 암, 간 암, 방광 암, 간 암, 유방 암, 결장 암, 결장직장 암, 피부 암, 흑색종, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장 암, 간 암, 전립선 암, 음문 암, 갑상선 암, 간 암종 및 다양한 유형의 두경부 암이 포함된다.
용어 "증식성 장애" 및 "증식성 질환"은 비정상적 세포 증식과 연관된 장애, 예를 들면, 암을 지칭한다.
본 명세서에서, "종양" 및 "신생물"은 전-암성 병소를 비롯하여, 양성 (비-암성) 또는 악성 (암성)인 과도한 세포 성장 또는 증식에 기인하는 임의의 조직 덩어리를 지칭한다. 일정한 구체예에서, 종양은 상피 종양이다. 일정한 구체예에서, 종양은 Wnt-의존성 종양이다.
본 명세서에서, 용어 "개체"는 특정한 치료의 수용자인, 인간, 비-인간 영장류, 개과, 고양잇과, 설치류 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 임의의 동물 (가령, 포유동물)을 지칭한다. 전형적으로, 용어 "개체" 및 "환자"는 본 명세서에서, 인간 개체와 관련하여 동의어로서 이용된다.
본 명세서에서, 용어 "암 줄기 세포", "CSC", "종양 줄기 세포" 및 "고형 종양 줄기 세포"는 동의어로서 이용되고, 그리고 (1) 광범위한 증식 능력을 갖고; (2) 감소된 증식 또는 발달 잠재력을 갖는 하나 또는 그 이상의 종류의 분화된 자손을 산출하는 비대칭 세포 분열 (asymmetric cell division)이 가능하고; 그리고 (3) 자기 재생 (self-renewal) 또는 자기 유지 (self-maintenance)를 위한 대칭 세포 분열 (symmetric cell division)이 가능한 고형 종양으로부터 세포 집단을 지칭한다. "암 줄기 세포", "CSC", "종양 줄기 세포", 또는 "고형 종양 줄기 세포"의 이들 성질은 종양 형성에 실패하는 대부분의 종양 세포와 비교하여, 면역약화된 숙주 (가령, 생쥐) 내로 연속 이식 (serial transplantation) 시에 촉진가능한 종양을 형성하는 능력을 이들 암 줄기 세포에 공여한다. 암 줄기 세포는 무질서한 방식으로 자기 재생 대(對) 분화를 겪고, 돌연변이가 발생하는 시간의 추이에서 변할 수 있는 비정상적 세포 유형을 갖는 종양을 형성한다.
용어 "암 세포", "종양 세포" 및 문법적 등가물은 양쪽 비-발암성 세포를 비롯한 종양으로부터 유래된 전체 세포 집단을 지칭하고, 이것은 대부분의 종양 세포 집단, 그리고 본 명세서에서 암 줄기 세포로 지칭되는 발암성 줄기 세포를 포함한다.
용어 "발암성"은 고형 종양 줄기 세포가 종양을 형성할 수 있도록 하는 모든 다른 종양 세포 (분화된, 따라서 비-발암성 종양 세포 발생)를 산출하는 자기 재생 (추가의 발암성 암 줄기 세포 발생)과 증식의 성질을 비롯한, 고형 종양 줄기 세포의 기능적 특징을 지칭한다. 모든 다른 종양 세포를 산출하는 자기 재생과 증식의 이들 성질은 연속 이식 시에 종양을 형성할 수 없는 비-발암성 종양 세포와 비교하여, 면역약화된 숙주 (가령, 생쥐) 내로 연속 이식 시에 촉진가능한 종양을 형성하는 능력을 암 줄기 세포에 공여한다. 비-발암성 종양 세포는 고형 종양으로부터 종양 세포를 획득한 이후에 면역약화된 숙주 (가령, 생쥐) 내로 일차 이식 시에 종양을 형성할 지도 모르지만, 이들 비-발암성 종양 세포는 연속 이식 시에 종양을 발생시키지 않는 것으로 관찰되었다.
본 명세서에서, "허용되는 제약학적 담체" 또는 "제약학적으로 허용되는 담체"는 제약학적 조성물의 활성 성분, 예를 들면, 치료 폴리펩티드와 복합될 때, 이러한 치료 폴리펩티드가 예로써, 생물학적 활성을 보전할 수 있도록 하는 임의의 물질을 지칭한다. 이에 더하여, "허용되는 제약학적 담체"는 수용자 개체에서 면역 반응을 유발하지 않는다. 일부 구체예에서, 용어 "제약학적 운반체"는 "제약학적 담체"와 동의어로 이용된다. 실례에는 임의의 표준 제약학적 담체, 예를 들면, 인산염 완충된 염수 용액, 물, 그리고 다양한 오일/물 에멀젼이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 에어로졸 또는 비경구 투여를 위한 희석제의 실례는 인산염 완충된 염수 또는 정상 (0.9%) 염수이다.
용어 "치료 효과량"은 개체 또는 포유동물에서 질환 또는 장애를 "치료"하는데 효과적인 작용제 (가령, 가용성 수용체 또는 기타 약물)의 양을 지칭한다. 암의 경우에, 작용제 (가령, 가용성 수용체)의 치료 효과량은 암 세포의 숫자를 감소시키고; 종양 크기를 감소시키고; 암 줄기 세포의 빈도를 감소시키고; 말초 기관 (peripheral organ) 내로 암 세포 침윤을 저해하고 및/또는 정지시키고; 종양 전이를 저해하고 및/또는 정지시키고; 종양 성장을 저해하고 및/또는 정지시키고; 및/또는 암과 연관된 증상 중에서 하나 또는 그 이상을 어느 정도 경감시킬 수 있다. 작용제 (가령, 가용성 수용체)가 성장을 예방하고 및/또는 현재하는 암 세포를 사멸시키는 정도까지, 상기 작용제는 세포증식억제성 (cytostatic) 및/또는 세포독성 (cytotoxic)으로 지칭될 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "종양 성장을 저해한다"는 종양 세포 성장이 저해될 수 있는 임의의 기전을 지칭한다. 일정한 구체예에서, 종양 세포 성장은 종양 세포의 증식을 늦춤으로써 저해된다. 일정한 구체예에서, 종양 세포 성장은 종양 세포의 증식을 정지시킴으로써 저해된다. 일정한 구체예에서, 종양 세포 성장은 종양 세포를 사멸시킴으로써 저해된다. 일정한 구체예에서, 종양 세포 성장은 종양 세포의 아폽토시스를 유도함으로써 저해된다. 일정한 구체예에서, 종양 세포 성장은 종양 세포의 분화를 유도함으로써 저해된다. 일정한 구체예에서, 종양 세포 성장은 종양 세포에서 영양소를 박탈함으로써 저해된다. 일정한 구체예에서, 종양 세포 성장은 종양 세포의 이동을 예방함으로써 저해된다. 일정한 구체예에서, 종양 세포 성장은 종양 세포의 침입을 예방함으로써 저해된다.
"치료하는", "치료" 및 "치료한다", 그리고 "경감하고" 및 "경감한다"와 같은 용어는 1) 진단된 병리학적 상태 또는 장애를 치료하고, 늦추고, 이의 증상을 줄이고 및/또는 이의 진행을 정지시키는 치료 조처, 그리고 2) 표적된 병리학적 상태 또는 장애의 발생을 예방하거나 늦추는 예방적 조처 둘 모두를 지칭한다. 따라서 치료가 필요한 개체에는 장애를 이미 앓고 있는 개체; 장애를 앓을 소인이 있는 개체; 그리고 장애가 예방되는 개체가 포함된다. 일정한 구체예에서, 개체는 환자가 하기 중에서 하나 또는 그 이상을 나타내면, 본 발명의 방법에 따라 암에 대하여 성공적으로 "치료된다": 암 또는 종양 세포의 숫자에서 감소, 또는 암 또는 종양 세포의 완전한 부재; 종양 크기에서 감소; 예로써, 연조직과 뼈 내로 암의 확산을 비롯한 말초 기관 내로 암 또는 종양 세포 침윤의 저해 또는 부재; 종양 전이의 저해 또는 부재; 종양 또는 암 성장의 저해 또는 부재; 특정 암과 연관된 하나 또는 그 이상의 증상의 경감; 감소된 이환율 (morbidity)과 사망률 (mortality); 삶의 질에서 향상; 종양의 종양원성, 종양원성 빈도, 또는 종양원성 능력에서 감소; 종양 내에서 암 줄기 세포의 숫자 또는 빈도에서 감소; 발암성 세포의 비-발암성 상태로의 분화; 또는 이들 효과의 일부 조합.
본 명세서에서, 용어 "폴리뉴클레오티드" 및 "핵산"은 DNA 또는 RNA가 포함되지만 이들에 국한되지 않는, 포스포디에스테르 결합을 거쳐 연결된 다중의 뉴클레오티드 단위 (리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 관련된 구조적 변이체)로 구성된 중합체를 지칭한다. 상기 용어는 4-아세틸시토신, 8-히드록시-N6-메틸아데노신, 아지리디닐시토신, 슈도이소시토신, 5-(카르복시히드록실-메틸) 우라실, 5-플루오르우라실, 5-브로모우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오우라실, 5-카르복시메틸-아미노메틸우라실, 디히드로우라실, 이노신, N6-이소펜테닐아데닌, 1-메틸아데닌, 1-메틸슈도-우라실, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸-구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸-시토신, 5-메틸시토신, N6-메틸아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시-아미노-메틸-2-티오우라실, 베타 D-만노실퀘우오신, 5'-메톡시카르보닐메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데닌, 우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우라실-5-옥시아세트산, 옥시부톡소신, 슈도우라실, 퀘우오신, 2-티오시토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, N-우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우라실-5-옥시아세트산, 슈도우라실, 퀘우오신, 2-티오시토신, 그리고 2,6-디아미노퓨린이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 DNA와 RNA의 공지된 염기 유사체 중에서 한 가지를 포함하는 서열을 포함한다. 뉴클레오티드의 서열은 비-뉴클레오티드 성분이 끼어들 수도 있다. 폴리뉴클레오티드는 중합화 이후에, 예로써 라벨링 성분과의 접합 (conjugation)에 의해 더욱 변형될 수 있다. 다른 유형의 변형에는 예로써, "캡 (cap)"; 유사체로 하나 또는 그 이상의 자연 발생 뉴클레오티드의 치환; 뉴클레오티드간 변형, 예를 들면, 비전하성 연쇄 (가령, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포아미데이트, 카바메이트 등) 및 전하성 연쇄 (가령, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등); 펜던트 (pendant) 모이어티, 예를 들면, 단백질 (가령, 뉴클레아제, 독소, 항체, 신호 펩티드, 폴리-L-리신 등); 삽입물 (가령, 아크리딘, 프소랄렌 등); 킬레이터 (가령, 금속, 방사성 금속, 붕소, 산화 금속 등); 알킬레이터; 변형된 연쇄 (가령, 알파 아노머 핵산 등); 그리고 이러한 폴리뉴클레오티드(들)의 변형되지 않은 형태가 포함된다. 게다가, 당 내에 통상적으로 존재하는 임의의 히드록실 기는 예로써, 포스포네이트 기, 포스페이트 기에 의해 대체되거나, 표준 보호기 (standard protecting group)에 의해 보호되거나, 또는 추가의 뉴클레오티드에 추가의 연쇄가 만들어지도록 활성화되거나, 또는 고형 서포트 (solid support)에 접합될 수 있다. 5'와 3' 말단 OH는 인산화되거나, 또는 1개 내지 20개 탄소 원자의 아민 또는 유기 캡핑 기 모이어티로 치환될 수 있다. 다른 히드록실 역시 표준 보호 기로 유도체화될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 또한, 예로써 2'-O-메틸-, 2'-O-알릴, 2'-플루오르- 또는 2'-아지도-리보오스, 탄소환 (carbocyclic) 당 유사체, 알파-아노머 당, 에피머 당 (epimeric sugar), 예를 들면, 아라비노오스, 자일로오스 또는 릭소오스, 피라노오스 당, 푸라노오스 당, 헵툴로오스, 비환 (acyclic) 유사체 및 무염기 (abasic) 뉴클레오시드 유사체, 예를 들면, 메틸 리보시드를 비롯하여, 당분야에 전반적으로 공지된 리보오스 또는 데옥시리보오스 당의 유사한 형태를 내포한다. 하나 또는 그 이상의 포스포디에스테르 연쇄는 대안적 연결 기에 의해 대체될 수 있다. 이들 대안적 연결 기에는 포스페이트가 P(O)S ("티오에이트"), P(S)S ("디티오에이트"), (O)NR2 ("아미데이트"), P(O)R, P(O)OR', CO 또는 CH2 ("포름아세탈")에 의해 대체되는 구체예가 포함되지만 이들에 국한되지 않고, 여기서 각 R 또는 R'는 독립적으로 H 또는, 에테르 (--O--) 연쇄, 아릴, 알케닐, 시클로알킬, 시클로알케닐 또는 아르알킬을 선택적으로 내포하는 치환된 또는 치환되지 않은 알킬 (1-20 C)이다. 폴리뉴클레오티드 내에서 모든 연쇄가 동일할 필요는 없다.
본 명세서에서, 용어 "벡터"는 한 세포로부터 다른 세포로 DNA 분절(들)을 이전하는 핵산 분자에 관련하여 이용된다. 용어 "벡터"는 목적되는 하나 또는 그 이상의 유전자(들) 또는 서열(들)을 숙주 세포에 전달하고, 바람직하게는 이를 발현할 수 있는 구조체 (construct)를 의미한다. 벡터의 실례에는 바이러스 벡터, 나신 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 플라스미드, 파지미드, 코스미드 또는 파지 벡터, 양이온성 축합제 (cationic condensing agent)와 결합된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 그리고 리포좀 내에 캡슐화된 DNA 또는 RNA 발현 벡터가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
본 명세서에서, 용어 "폴리펩티드", "펩티드", "단백질" 및 "단백질 단편"은 동의어로서 이용되고, 임의의 길이의 아미노산 잔기의 중합체를 지칭한다. 상기 용어는 자연 발생 아미노산 중합체 및 비-자연 발생 아미노산 중합체뿐만 아니라, 중합체 내에 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 자연 발생 아미노산의 인공 화학 모방체 (artificial chemical mimetic)인 아미노산 중합체에 적용된다. 중합체는 선형 또는 가지형일 수 있고, 변형된 아미노산을 포함할 수 있고, 그리고 비-아미노산이 끼어들 수 있다. 상기 용어는 또한, 자연적으로 또는 개입에 의해; 예를 들면, 이황화 결합 형성, 당화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 임의의 다른 조작 또는 변형, 예를 들면, 라벨링 성분과의 접합에 의해 변형된 아미노산 중합체를 포함한다. 또한, 이러한 정의에는 예로써, 아미노산의 하나 또는 그 이상의 유사체 (예로써, 비자연 아미노산 등), 그리고 당분야에 공지된 기타 변형을 내포하는 폴리펩티드가 포함된다. 본 발명의 폴리펩티드가 적어도 부분적으로, 항체에 기초하기 때문에, 일정한 구체예에서, 이들 폴리펩티드는 단일 사슬 또는 결합된 사슬로서 발생할 수 있는 것으로 이해된다.
용어 "아미노산"은 자연 발생과 합성 아미노산, 그리고 자연 발생 아미노산과 유사하게 기능하는 아미노산 유사체와 아미노산 모방체를 지칭한다. 자연 발생 아미노산은 유전자 코드 (genetic code)에 의해 인코딩된 아미노산, 그리고 이후에 변형된 아미노산, 예를 들면, 히드록시프롤린, 감마-카르복시글루타메이트, 그리고 O-포스포세린이다. 아미노산 유사체는 자연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조, 예를 들면, 수소에 결합된 알파 탄소, 카르복실 기, 아미노 기, 그리고 R 기를 갖는 화합물, 예를 들면, 호모세린, 노르류신, 메티오닌설폭시드, 메티오닌메틸 설포늄을 지칭한다. 이런 유사체는 변형된 R 기 (가령, 노르류신) 또는 변형된 펩티드 골격을 가질 수 있지만, 자연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 보전한다. 아미노산 모방체는 아미노산의 일반적인 화학 구조와 상이한 구조를 갖지만, 자연 발생 아미노산과 유사하게 기능하는 화학적 화합물을 지칭한다.
폴리펩티드 또는 다른 작용제가 단백질에 "특이적으로 결합한다"라는 것은 폴리펩티드 또는 다른 작용제가 관련 없는 단백질을 비롯한 대안적 물질에서보다 상기 단백질에 대하여 더욱 빈번하게, 더욱 빠르게, 더욱 오랜 기간 동안, 더욱 높은 친화성으로, 또는 이들의 일부 조합으로 반응하거나 결합한다는 것을 의미한다. 일정한 구체예에서, "특이적으로 결합한다"는 예로써, 작용제가 대략 0.1mM 또는 그 이하, 더욱 일반적으로 대략 1μM보다 낮은 KD로 단백질에 결합한다는 것을 의미한다. 일정한 구체예에서, "특이적으로 결합한다"는 작용제가 때때로 적어도 대략 0.1μM 또는 그 이하, 적어도 대략 0.01μM 또는 그 이하, 그리고 다른 때에 적어도 대략 1nM 또는 그 이하의 KD로 단백질에 결합한다는 것을 의미한다. 상이한 종에서 상동성 단백질 간에 서열 동일성으로 인하여, 특이적 결합은 한 가지 이상의 종에서 특정 단백질, 예를 들면, Wnt 단백질을 인식하는 작용제를 포함할 수 있다. 유사하게, Wnt의 서열의 일정한 영역 내에서 상이한 Wnt 단백질 간에 상동성으로 인하여, 특이적 결합은 한 가지 이상의 Wnt 단백질을 인식하는 폴리펩티드 (또는 다른 작용제)를 포함할 수 있다. 첫 번째 표적에 특이적으로 결합하는 작용제는 두 번째 표적에 특이적으로 결합하거나 결합하지 않을 수 있는 것으로 이해된다. 따라서 "특이적 결합"은 배타적 결합, 다시 말하면, 단일 표적에 결합을 반드시 필요로 하지는 않는다 (비록 이러한 배타적 결합을 포함할 수 있긴 하지만). 따라서 작용제는 일정한 구체예에서, 하나 이상의 표적 (가령, 복수의 상이한 인간 Wnt)에 특이적으로 결합할 수 있다. 일반적으로, 그러나 반드시 그러한 것으로 아니지만, 결합에 대한 언급은 특이적 결합을 의미한다.
2개 또는 그 이상의 핵산 또는 폴리펩티드의 배경에서, 용어 "동일한" 또는 "동일성 퍼센트"는 임의의 보존성 아미노산 치환을 서열 동일성의 일부로서 간주하지 않고 최대 일치 (maximum correspondence)를 위해 비교되고 정렬될 때 (필요하면, 갭을 도입), 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기이거나, 또는 특정된 백분율의 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기를 갖는 2개 또는 그 이상의 서열 또는 하위서열을 지칭한다. 동일성 퍼센트는 서열 비교 소프트웨어 또는 알고리즘을 이용하여, 또는 시각적 검사에 측정될 수 있다. 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열의 정렬을 획득하는데 이용될 수 있는 다양한 알고리즘과 소프트웨어는 당분야에 공지되어 있다. 서열 정렬 알고리즘의 이와 같은 한 가지 무제한적 실례는 Karlin et al, 1990, Proc . Natl . Acad . Sci ., 87:2264-2268에서 기술되고 Karlin et al., 1993, PNAS , 90:5873-5877에서와 같이 변형된 알고리즘이고, 그리고 NBLAST와 XBLAST 프로그램 (Altschul et al., 1991, Nucleic Acids Res ., 25:3389-3402) 내로 통합된다. 서열을 정렬하는데 이용될 수 있는 추가의 공개적으로 가용한 소프트웨어 프로그램에는 Gapped BLAST, BLAST-2, WU-BLAST-2 (Altschul et al., 1996, Methods in Enzymology, 266:460-480), ALIGN, ALIGN-2 (Genentech, South San Francisco, California), Megalign (DNASTAR), 그리고 Bestfit 프로그램 (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
일부 구체예에서, 본 발명의 2개의 핵산 또는 폴리펩티드는 실질적으로 동일하고, 이것은 최대 일치 (maximum correspondence)를 위해 비교되고 정렬될 때, 서열 비교 알고리즘을 이용한 또는 시각적 검사에 의한 측정에서 이들이 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 그리고 일부 구체예에서 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기 동일성을 갖는다는 것을 의미한다. 일부 구체예에서, 동일성은 적어도 대략 10개, 적어도 대략 20개, 적어도 대략 40-60개, 적어도 대략 60-80개 잔기 길이 또는 이들 사이에 임의의 정수 값을 갖는 서열의 영역 위에 존재한다. 일부 구체예에서, 동일성은 60-80개 잔기, 예를 들면, 적어도 대략 90-100개 잔기보다 긴 영역 위에 존재한다. 일부 구체예에서, 이들 서열은 비교되는 서열, 예를 들면, 뉴클레오티드 서열의 코딩 영역의 전장 위에서 실질적으로 동일하다.
"보존성 아미노산 치환"은 한 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 다른 아미노산 잔기로 대체되는 치환이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 염기성 측쇄 (가령, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (가령, 아스파르트산, 글루타민산), 비전하성 극성 측쇄 (가령, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄 (가령, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-가지형 측쇄 (가령, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄 (가령, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 비롯하여, 당분야에서 정의되었다. 가령, 티로신에 대한 페닐알라닌의 치환은 보존성 치환이다. 바람직하게는, 본 발명의 폴리펩티드와 다른 작용제의 서열에서 보존성 치환은 표적(들), 다시 말하면, 폴리펩티드 또는 다른 작용제가 결합하는 하나 또는 그 이상의 Wnt에 대한, 아미노산 서열을 내포하는 폴리펩티드의 결합을 파괴하지 않는다. 표적 결합을 제거하지 않는 뉴클레오티드와 아미노산 보존성 치환을 확인하는 방법은 당분야에 널리 공지되어 있다 (참조: Brummell et al., 1993, Biochem., 32: 1180-87; Kobayashi et al., 1999, Protein Eng . 12:879-84; 그리고 Burks et al., 1997, PNAS , 94:412-17).
본 명세서에서, "대략"은 지시된 숫자의 플러스 또는 마이너스 10%를 지칭한다. 가령, "대략 10%"는 9% 내지 11%의 범위를 지시한다.
본 발명의 명세서와 특허청구범위에서, 단수 형태는 문맥에서 달리 명시되지 않으면, 복수 형태를 포함한다. 구체예가 본 명세서에서 용어 "포함하는"으로 기술되는 경우에, "구성되는" 및/또는 "본질적으로 구성되는"의 관점에서 기술된 다른 모든 점에서 유사한 구체예 역시 제공되는 것으로 이해된다.
구(句)에서 이용되는 용어 "및/또는", 예를 들면, "A 및/또는 B"는 A와 B 둘 모두; A 또는 B; A (단독으로), 그리고 B (단독으로)를 포함하는 것으로 의도된다. 유사하게, 구(句)에서 이용되는 용어 "및/또는", 예를 들면, "A, B, 및/또는 C"는 하기 구체예 각각을 포함하는 것으로 의도된다: A, B, 그리고 C; A, B, 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A와 C; A와 B; B와 C; A (단독으로); B (단독으로); 그리고 C (단독으로).
II. Wnt-결합 작용제
본 발명에서는 하나 또는 그 이상의 인간 Wnt 단백질 (Wnt)에 결합하는 (가령, 특이적으로 결합하는) 작용제를 제시한다. 이들 작용제는 본 명세서에서, "Wnt-결합 작용제(들)"로 지칭된다. 일정한 구체예에서, 작용제는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 또는 그 이상의 Wnt 단백질에 특이적으로 결합한다. 무제한적 실례로써, Wnt-결합 작용제는 Wnt1, Wnt2, Wnt2b, Wnt3, Wnt3a, Wnt7a, Wnt7b, Wnt8a, Wnt8b, Wnt10a, 및/또는 Wnt10b에 결합할 수 있다. 일정한 구체예에서, Wnt-결합 작용제는 Wnt1, Wnt2, Wnt3, Wnt3a, 그리고 Wnt7b에 결합한다.
일정한 구체예에서, Wnt-결합 작용제는 Wnt 길항약이다. 일정한 구체예에서, 작용제는 Wnt-신호전달을 저해한다. 일부 구체예에서, 작용제는 정준 Wnt 신호전달을 저해한다.
일정한 구체예에서, Wnt-결합 작용제는 폴리펩티드이다. 일정한 구체예에서, Wnt-결합 작용제는 가용성 수용체이다.
일정한 구체예에서, Wnt-결합 작용제는 FZD 수용체의 세포외 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, Wnt-결합 작용제는 FZD 수용체의 Fri 도메인을 포함한다. 일정한 구체예에서, FZD 수용체는 인간 FZD 수용체이다. 일정한 구체예에서, 인간 FZD 수용체는 FZD1, FZD2, FZD3, FZD4, FZD5, FZD6, FZD7, FZD8, FZD9, 또는 FZD10이다. 일부 대안적 구체예에서, Wnt-결합 작용제는 SFRP의 일부분을 포함한다. 일부 구체예에서, Wnt-결합 작용제는 SFRP의 Fri 도메인을 포함한다. 일정한 구체예에서, SFRP는 인간 SFRP이다. 일부 구체예에서, 인간 SFRP는 SFRP1, SFRP2, SFRP3, SFRP4, 또는 SFRP5이다. 다른 대안적 구체예에서, Wnt-결합 작용제는 Ror 단백질의 세포외 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, Wnt-결합 작용제는 Ror 단백질의 Fri 도메인을 포함한다. 일정한 구체예에서, Ror은 인간 Ror이다. 일부 구체예에서, 인간 Ror은 Ror1 또는 Ror2이다.
일정한 구체예에서, Wnt-결합 작용제는 가용성 수용체이다. 일부 구체예에서, Wnt-결합 작용제는 가용성 단백질이다. 일정한 구체예에서, Wnt-결합 작용제는 가용성 FZD 수용체이다. 가용성 FZD 수용체의 무제한적 실례는 본 발명에 순전히 참조로서 편입되는 U.S. Patent No. 7,723,477에서 찾아볼 수 있다. 일정한 구체예에서, Wnt-결합 작용제는 가용성 SFRP 또는 가용성 Ror 수용체이다.
FZD1의 Fri 도메인은 서열 번호:27의 대략 아미노산 87-237을 포함한다. FZD2의 Fri 도메인은 서열 번호:28의 대략 아미노산 24-159를 포함한다. FZD3의 Fri 도메인은 서열 번호:29의 대략 아미노산 23-143을 포함한다. FZD4의 Fri 도메인은 서열 번호:22의 대략 아미노산 40-170을 포함한다. FZD5의 Fri 도메인은 서열 번호:23의 대략 아미노산 27-157을 포함한다. FZD6의 Fri 도메인은 서열 번호:24의 대략 아미노산 19-146을 포함한다. FZD7의 Fri 도메인은 서열 번호:25의 대략 아미노산 33-170을 포함한다. FZD8의 Fri 도메인은 아미노산 28-158의 대략 서열 번호:30을 포함한다. FZD9의 Fri 도메인은 서열 번호:31의 대략 아미노산 23-159를 포함한다. FZD10의 Fri 도메인은 서열 번호:26의 대략 아미노산 21-154를 포함한다. 각각의 인간 FZD 수용체에 대한 상응하는 예측된 Fri 도메인은 서열 번호:32-41로서 제공된다. 각각의 인간 FZD 수용체 (FZD1-10)에 대한 최소 코어 Fri 도메인 서열은 서열 번호:3 내지 12로서 제공된다. 각각의 인간 SFRP (SFRP1-5)에 대한 최소 코어 Fri 도메인 서열은 서열 번호:13 내지 17로서 제공된다. 인간 Ror1과 Ror2의 최소 코어 Fri 도메인 서열은 서열 번호:58 및 서열 번호:59로서 제공된다. 당업자는 다양한 Fri 도메인에 상응하는 정확한 아미노산을 이해함에 있어서 상이할 수도 있다. 따라서 상기 및 본 명세서에서 개설된 이들 도메인의 N-말단 또는 C-말단은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 심지어 10개 아미노산에 의해 확장되거나, 또는 단축될 수 있다.
일정한 구체예에서, Wnt-결합 작용제는 인간 FZD 수용체의 Fri 도메인, 또는 하나 또는 그 이상의 인간 Wnt 단백질에 결합하는 Fri 도메인의 단편 또는 변이체를 포함한다. 일정한 구체예에서, 인간 FZD 수용체는 FZD1, FZD2, FZD3, FZD4, FZD5, FZD6, FZD7, FZD8, FZD9, 또는 FZD10이다. 일정한 구체예에서, 인간 FZD 수용체는 FZD4이다. 일정한 대안적 구체예에서, 인간 FZD 수용체는 FZD5이다. 일정한 추가의 대안적 구체예에서, 인간 FZD 수용체는 FZD8이다. 일정한 구체예에서, FZD는 FZD4이고, 그리고 Wnt-결합 작용제는 서열 번호:6을 포함하거나, 또는 서열 번호:19의 대략 아미노산 40 내지 170을 포함한다. 일정한 구체예에서, FZD는 FZD5이고, 그리고 Wnt-결합 작용제는 서열 번호:7을 포함하거나, 또는 서열 번호:20의 대략 아미노산 27-157을 포함한다. 일정한 구체예에서, FZD는 FZD7이고, 그리고 Wnt-결합 작용제는 서열 번호:9를 포함하거나, 또는 서열 번호:25의 대략 아미노산 33 내지 170을 포함한다. 일정한 구체예에서, FZD는 FZD8이고, 그리고 Wnt-결합 작용제는 서열 번호:10을 포함하거나, 또는 서열 번호:21의 대략 아미노산 28-158을 포함한다. 일정한 구체예에서, FZD는 FZD10이고, 그리고 Wnt-결합 작용제는 서열 번호:12를 포함하거나, 또는 서열 번호:26의 대략 아미노산 21-154를 포함한다.
일정한 구체예에서, Wnt-결합 작용제는 서열 번호:3 내지 12로 구성되는 군에서 선택되는 최소 Fri 도메인 서열을 포함한다. 일정한 구체예에서, Wnt-결합 작용제는 서열 번호:13 내지 17로 구성되는 군에서 선택되는 최소 Fri 도메인 서열을 포함한다. 일정한 구체예에서, Wnt-결합 작용제는 서열 번호:58 및 서열 번호:59로 구성되는 군에서 선택되는 최소 Fri 도메인 서열을 포함한다.
일정한 구체예에서, Wnt-결합 작용제는 하나 또는 그 이상 (가령, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 등)의 보존성 치환을 포함하고 Wnt(들)에 결합할 수 있는 전술한 FZD Fri 도메인 서열 중에서 임의의 한 가지의 변이체를 포함한다.
일정한 대안적 구체예에서, Wnt-결합 작용제는 인간 SFRP의 Fri 도메인, 또는 하나 또는 그 이상의 인간 Wnt 단백질에 결합하는 이런 Fri 도메인의 단편 또는 변이체를 포함한다. 가령, 일정한 구체예에서, 작용제는 서열 번호:13 내지 17로 구성되는 군에서 선택되는 최소 SFRP Fri 도메인 서열을 포함한다. 일정한 구체예에서, Wnt-결합 작용제는 하나 또는 그 이상 (가령, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 등)의 보존성 치환을 포함하고 Wnt(들)에 결합하는 능력을 유지하는 전술한 SFRP Fri 도메인 서열 중에서 임의의 한 가지의 변이체를 포함한다.
일정한 대안적 구체예에서, Wnt-결합 작용제는 인간 Ror 단백질의 Fri 도메인, 또는 하나 또는 그 이상의 인간 Wnt 단백질에 결합하는 이런 Fri 도메인의 단편 또는 변이체를 포함한다. 가령, 일정한 구체예에서, 작용제는 서열 번호:58 및 서열 번호:59로 구성되는 군에서 선택되는 최소 Ror Fri 도메인 서열을 포함한다. 일정한 구체예에서, Wnt-결합 작용제는 하나 또는 그 이상 (가령, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 등)의 보존성 치환을 포함하고 Wnt(들)에 결합하는 능력을 유지하는 전술한 Ror Fri 도메인 서열 중에서 임의의 한 가지의 변이체를 포함한다.
일정한 구체예에서, Wnt-결합 작용제, 예를 들면, 인간 FZD 수용체 또는 다른 가용성 FZD 수용체의 최소 Fri 도메인을 포함하는 작용제는 인간 Fc 영역 (가령, 인간 IgG1 Fc 영역)을 더욱 포함한다. Fc 영역은 임의의 부류의 면역글로불린, IgG, IgA, IgM, IgD와 IgE로부터 획득될 수 있다. 일부 구체예에서, Fc 영역은 야생형 Fc 영역이다. 일부 구체예에서, Fc 영역은 돌연변이된 Fc 영역이다. 일부 구체예에서, Fc 영역은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 아미노산에 의해 N-말단 단부에서 절두된다 (가령, 힌지 도메인 내에서). 일부 구체예에서, 힌지 도메인 내에서 아미노산은 바람직하지 않은 이황화 결합 형성을 방지하기 위해 변경된다. 일부 구체예에서, 시스테인은 바람직하지 않은 이황화 결합 형성을 방지하기 위해 세린으로 대체된다. 일정한 구체예에서, Fc 영역은 서열 번호:18, 서열 번호:42, 또는 서열 번호:43을 포함하거나, 또는 이러한 서열로 구성된다.
일정한 구체예에서, Wnt-결합 작용제는 적어도 FZD 수용체의 최소 Fri 도메인, SFRP 또는 Ror 단백질 및 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질이다. 본 명세서에서, "융합 단백질"은 적어도 2가지 유전자의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자에 의해 발현되는 하이브리드 단백질이다. 일부 구체예에서, 첫 번째 폴리펩티드의 C-말단이 면역글로불린 Fc 영역의 N-말단에 연결된다. 일부 구체예에서, 첫 번째 폴리펩티드 (가령, FZD Fri 도메인)는 Fc 영역에 직접적으로 (즉, 개재성 펩티드 링커 없이) 연결된다. 일부 구체예에서, 첫 번째 폴리펩티드는 펩티드 링커를 거쳐 Fc 영역에 연결된다.
본 명세서에서, 용어 "링커"는 첫 번째 폴리펩티드 (가령, FZD 성분) 및 두 번째 폴리펩티드 (가령, Fc 영역) 사이에 삽입된 링커를 지칭한다. 일부 구체예에서, 링커는 펩티드 링커이다. 링커는 폴리펩티드의 발현, 분비, 또는 생물활성에 부정적인 영향을 주지 않아야 한다. 링커는 항원성이 아니어야 하고 면역 반응을 유발하지 않아야 한다. 적절한 링커는 당업자에게 공지되어 있고, 그리고 종종, 글리신과 세린 잔기의 혼합물을 포함하고, 그리고 종종, 공간적으로 제약받지 않는 아미노산을 포함한다. 유용한 링커 내로 함입될 수 있는 다른 아미노산에는 트레오닌과 알라닌 잔기가 포함된다. 링커는 예로써, 1-50개 아미노산, 1-22개 아미노산, 1-10개 아미노산, 1-5개 아미노산, 또는 1-3개 아미노산 범위에서 변하는 길이를 가질 수 있다. 링커에는 SerGly, GGSG, GSGS, GGGS, S(GGS)n (여기서 n은 1-7), GRA, 폴리(Gly), 폴리(Ala), ESGGGGVT (서열 번호:60), LESGGGGVT (서열 번호:61), GRAQVT (서열 번호:62), WRAQVT (서열 번호:63), 그리고 ARGRAQVT (서열 번호:64)가 포함될 수 있지만 이들에 국한되지 않는다. 본 명세서에서, 링커는 첫 번째 폴리펩티드 (가령, FZD Fri 도메인)의 C-말단 또는 두 번째 폴리펩티드 (가령, Fc 영역)의 N-말단으로부터 아미노산 잔기를 포함하지 않는 개재성 펩티드 서열이다.
FZD 수용체, SFRP 및 Ror 단백질은 이들 단백질의 수송을 주동하는 신호 서열을 내포한다. 신호 서열 (일명, 신호 펩티드 또는 리더 서열)은 미성숙 폴리펩티드의 N-말단에 위치한다. 이들은 폴리펩티드를 소포체 (endoplasmic reticulum)로 표적화시키고, 그리고 이들 단백질은 그들의 목적지, 예를 들면, 세포소기관의 내부 공간, 내부 막, 세포의 외부 막, 또는 분비를 통해 세포 외부로 분급된다. 대부분의 신호 서열은 단백질이 소포체로 운반된 이후에, 신호 펩티다아제에 의해 단백질로부터 절단된다. 폴리펩티드로부터 신호 서열의 절단은 일반적으로, 아미노산 서열 내에 특정 위치에서 일어나고 신호 서열 내에서 아미노산 잔기에 의존한다. 비록 일반적으로, 하나의 특정한 절단 부위가 존재하지만, 하나 이상의 절단 부위가 신호 펩티다아제에 의해 인식되고 및/또는 이용되어 폴리펩티드의 비-상동성 N-말단이 산출될 수 있다. 가령, 신호 서열 내에서 상이한 절단 부위의 이용은 상이한 N-말단 아미노산을 갖는 발현된 폴리펩티드를 산출할 수 있다. 따라서 일부 구체예에서, 본 명세서에서 기술된 폴리펩티드는 상이한 N-말단을 갖는 폴리펩티드의 혼합물을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, N-말단은 1, 2, 3, 4, 또는 5개 아미노산에 의해 길이가 상이하다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드는 실질적으로 상동성이다, 다시 말하면, 폴리펩티드는 동일한 N-말단을 갖는다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드의 신호 서열은 하나 또는 그 이상 (가령, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 등)의 아미노산 치환 및/또는 결실을 포함한다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드의 신호 서열은 하나의 절단 부위가 우세하도록 하여 하나의 N-말단을 갖는 실질적으로 상동성 폴리펩티드를 산출하는 아미노산 치환 및/또는 결실을 포함한다. 일부 구체예에서, 신호 서열은 서열 번호:67 (서열 번호:30의 아미노산 1-27)이다. 일부 구체예에서, 서열 번호:67의 아미노산 25 및/또는 26은 상이한 아미노산으로 치환된다. 일부 구체예에서, 서열 번호:67의 아미노산 17, 18, 19, 23, 24, 25, 및/또는 26은 상이한 아미노산으로 치환된다. 일부 구체예에서, 서열 번호:67의 아미노산 17, 23, 24, 25, 그리고 26은 상이한 아미노산으로 치환된다. 일부 구체예에서, 서열 번호:67의 아미노산 17은 페닐알라닌 또는 류신으로 치환된다. 일부 구체예에서, 서열 번호:67의 아미노산 23은 프롤린으로 치환된다. 일부 구체예에서, 서열 번호:67의 아미노산 24는 이소류신 또는 페닐알라닌으로 치환된다. 일부 구체예에서, 서열 번호:67의 아미노산 25는 발린, 이소류신, 또는 알라닌으로 치환된다. 일부 구체예에서, 서열 번호:67의 아미노산 26은 히스티딘, 티로신, 또는 히스티딘으로 치환된다. 일부 구체예에서, 서열 번호:67의 아미노산 25는 발린으로 치환된다. 일부 구체예에서, 서열 번호:67의 아미노산 26은 류신으로 치환된다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드의 신호 서열은 표 1에 열거된 그룹에서 선택되는 서열을 포함하거나, 또는 이러한 서열로 구성된다.
MEWGYLLEVTSLLAALALLQRSSGAAA 서열 번호:67
MEWGYLLEVTSLLAALALLQRSSGALA 서열 번호:68
MEWGYLLEVTSLLAALALLQRSSGVLA 서열 번호:69
MEWGYLLEVTSLLAALLLLQRSPIVHA 서열 번호:70
MEWGYLLEVTSLLAALFLLQRSPIVHA 서열 번호:71
MEWGYLLEVTSLLAALLLLQRSPFVHA 서열 번호:72
MEWGYLLEVTSLLAALLLLQRSPIIYA 서열 번호:73
MEWGYLLEVTSLLAALLLLQRSPIAHA 서열 번호:74
일정한 구체예에서, Wnt-결합 작용제는 FZD 도메인 성분 및 Fc 영역을 포함하는 첫 번째 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구체예에서, FZD 도메인 성분은 FZD1, FZD2, FZD3, FZD4, FZD5, FZD6, FZD7, FZD8, FZD9, 또는 FZD10으로부터 유래된다. 일부 구체예에서, Fc 영역은 IgG1 면역글로불린으로부터 유래된다. 일부 구체예에서, Wnt-결합 작용제는 하기를 포함한다:
(a) 서열 번호:27의 X1 내지 Y1, 서열 번호:28의 X2 내지 Y2, 서열 번호:29의 X3 내지 Y3, 서열 번호:22의 X4 내지 Y4, 서열 번호:23의 X5 내지 Y5, 서열 번호:24의 X6 내지 Y6, 서열 번호:25의 X7 내지 Y7, 서열 번호:30의 X8 내지 Y8, 서열 번호:31의 X9 내지 Y9, 그리고 서열 번호:26의 X10 내지 Y10으로 구성되는 군에서 선택되는 아미노산으로 본질적으로 구성되는 첫 번째 폴리펩티드; 그리고
(b) 서열 번호:43의 아미노산 A 내지 B로 본질적으로 구성되는 두 번째 폴리펩티드; 여기서
X1 = 아미노산 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 또는 76
Y1 = 아미노산 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 또는 243
X2 = 아미노산 22, 23, 24, 25, 26, 27 또는 28
Y2 = 아미노산 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171 또는 172
X3 = 아미노산 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25
Y3 = 아미노산 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 또는 149
X4 = 아미노산 38, 39, 40, 41, 또는 42
Y4 = 아미노산 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175 또는 176
X5 = 아미노산 25, 26, 27, 28 또는 29
Y5 = 아미노산 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 또는 164
X6 = 아미노산 19, 20, 21, 22, 23, 또는 24
Y6 = 아미노산 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151 또는 152
X7 = 아미노산 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 또는 34
Y7 = 아미노산 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 또는 186
X8 = 아미노산 25, 26, 27, 28, 29, 30, 또는 31
Y8 = 아미노산 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 또는 164
X9 = 아미노산 21, 22, 23, 또는 24
Y9 = 아미노산 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 또는 146
X10 = 아미노산 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25
Y10 = 아미노산 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 또는 160
A = 아미노산 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6
B = 아미노산 231 또는 232.
일부 구체예에서, 첫 번째 폴리펩티드는 두 번째 폴리펩티드에 직접적으로 연결된다. 일부 구체예에서, 첫 번째 폴리펩티드는 펩티드 링커를 거쳐 두 번째 폴리펩티드에 연결된다. 일부 구체예에서, 첫 번째 폴리펩티드는 펩티드 링커 GRA를 거쳐 두 번째 폴리펩티드에 연결된다. 일정한 아미노산으로 "본질적으로 구성되는" 또는 일정한 아미노산으로 "본질적으로 구성"되는 폴리펩티드 (가령, 첫 번째 또는 두 번째 폴리펩티드)는 일부 구체예에서, 추가 아미노산이 Wnt-결합 작용제의 기능에 실질적으로 영향을 주지 않는다면, 한쪽 또는 양쪽 단부에서 하나 또는 그 이상 (가령, 1개, 2개, 3개, 4개 또는 그 이상)의 추가 아미노산을 포함할 수 있다.
일정한 구체예에서, Wnt-결합 작용제는 하기를 포함한다:
(a) 서열 번호:30의 아미노산 X 내지 Y로 본질적으로 구성되는 첫 번째 폴리펩티드; 그리고
(b) 서열 번호:43의 아미노산 A 내지 B로 본질적으로 구성되는 두 번째 폴리펩티드;
여기서 첫 번째 폴리펩티드는 두 번째 폴리펩티드에 직접적으로 연결되고; 그리고
X = 아미노산 25, 26, 27, 28, 29, 30, 또는 31
Y = 아미노산 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 또는 164
A = 아미노산 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6
B = 아미노산 231 또는 232
일부 구체예에서, 첫 번째 폴리펩티드는 서열 번호:30의 아미노산 25-158로 본질적으로 구성된다. 다른 구체예에서, 첫 번째 폴리펩티드는 서열 번호:30의 아미노산 25-158로 구성된다. 일부 구체예에서, 첫 번째 폴리펩티드는 서열 번호:30의 아미노산 28-158로 본질적으로 구성된다. 다른 구체예에서, 첫 번째 폴리펩티드는 서열 번호:30의 아미노산 28-158로 구성된다. 일부 구체예에서, 첫 번째 폴리펩티드는 서열 번호:30의 아미노산 31-158로 구성된다. 일부 구체예에서, 두 번째 폴리펩티드는 서열 번호:43의 아미노산 1-232로 구성된다. 일부 구체예에서, 두 번째 폴리펩티드는 서열 번호:43의 아미노산 3-232로 구성된다. 일부 구체예에서, 두 번째 폴리펩티드는 서열 번호:43의 아미노산 6-232로 구성된다. 일부 구체예에서, 첫 번째 폴리펩티드는 서열 번호:39이고, 그리고 두 번째 폴리펩티드는 서열 번호:43이다. 일부 구체예에서, 첫 번째 폴리펩티드는 서열 번호:39이고, 그리고 두 번째 폴리펩티드는 서열 번호:42이다. 일부 구체예에서, 첫 번째 폴리펩티드는 서열 번호:39이고, 그리고 두 번째 폴리펩티드는 서열 번호:18이다.
일부 구체예에서, Wnt-결합 작용제는 첫 번째 폴리펩티드 및 두 번째 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드이고, 여기서 이들 폴리펩티드는 표 2에서 선택된다.
Figure 112012064117118-pct00001
Figure 112012064117118-pct00002
Figure 112012064117118-pct00003
일부 구체예에서, Wnt-결합 작용제는 서열 번호:1, 서열 번호:45, 서열 번호:46, 서열 번호:47, 서열 번호:48, 서열 번호:49, 서열 번호:50, 서열 번호:51, 서열 번호:53, 서열 번호:54, 서열 번호:55, 서열 번호:65, 그리고 서열 번호:66으로 구성되는 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
일정한 구체예에서, Wnt-결합 작용제는 서열 번호:1의 서열을 포함한다. 일정한 대안적 구체예에서, 작용제는 하나 또는 그 이상 (가령, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 등)의 보존성 치환을 포함하는, 서열 번호:1의 서열을 포함한다. 일정한 구체예에서, 작용제는 서열 번호:1과 적어도 대략 90%, 대략 95%, 또는 대략 98% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일정한 구체예에서, 서열 번호:1의 변이체는 하나 또는 그 이상의 인간 Wnt에 결합하는 능력을 유지한다.
일정한 구체예에서, Wnt-결합 작용제는 서열 번호:46의 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, Wnt-결합 작용제는 서열 번호:46이다. 일정한 대안적 구체예에서, 작용제는 하나 또는 그 이상 (가령, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 등)의 보존성 치환을 포함하는, 서열 번호:46의 서열을 포함한다. 일정한 구체예에서, 작용제는 서열 번호:46과 적어도 대략 90%, 대략 95%, 또는 대략 98% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일정한 구체예에서, 서열 번호:46의 변이체는 하나 또는 그 이상의 인간 Wnt에 결합하는 능력을 유지한다.
일정한 구체예에서, Wnt-결합 작용제는 서열 번호:48의 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, Wnt-결합 작용제는 서열 번호:48이다. 일정한 대안적 구체예에서, 작용제는 하나 또는 그 이상 (가령, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 등)의 보존성 치환을 포함하는, 서열 번호:48의 서열을 포함한다. 일정한 구체예에서, 작용제는 서열 번호:48과 적어도 대략 90%, 대략 95%, 또는 대략 98% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일정한 구체예에서, 서열 번호:48의 변이체는 하나 또는 그 이상의 인간 Wnt에 결합하는 능력을 유지한다.
일정한 구체예에서, Wnt-결합 작용제는 서열 번호:50의 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, Wnt-결합 작용제는 서열 번호:50이다. 일정한 대안적 구체예에서, 작용제는 하나 또는 그 이상 (가령, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 등)의 보존성 치환을 포함하는, 서열 번호:50의 서열을 포함한다. 일정한 구체예에서, 작용제는 서열 번호:50과 적어도 대략 90%, 대략 95%, 또는 대략 98% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일정한 구체예에서, 서열 번호:50의 변이체는 하나 또는 그 이상의 인간 Wnt에 결합하는 능력을 유지한다.
일정한 구체예에서, Wnt-결합 작용제는 서열 번호:53의 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, Wnt-결합 작용제는 서열 번호:53이다. 일정한 대안적 구체예에서, 작용제는 하나 또는 그 이상 (가령, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 등)의 보존성 치환을 포함하는, 서열 번호:53의 서열을 포함한다. 일정한 구체예에서, 작용제는 서열 번호:53과 적어도 대략 90%, 대략 95%, 또는 대략 98% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일정한 구체예에서, 서열 번호:53의 변이체는 하나 또는 그 이상의 인간 Wnt에 결합하는 능력을 유지한다.
일부 구체예에서, 본 명세서에서 기술된 Wnt-결합 작용제는 종양 또는 종양 세포의 성장을 저해한다. 일부 구체예에서, Wnt-결합 작용제는 종양 내에 세포가 분화하도록 유도한다. 일부 구체예에서, Wnt-결합 작용제는 종양 또는 종양 세포 상에서 분화 마커의 발현을 유도한다. 일정한 구체예에서, Wnt-결합 작용제는 종양 내에서 암 줄기 세포의 빈도를 감소시킨다. 일부 구체예에서, 서열 번호:46을 포함하는 Wnt-결합 작용제는 서열 번호:1을 포함하는 Wnt-결합 작용제보다 종양 성장을 훨씬 크게 저해한다. 일부 구체예에서, 서열 번호:48을 포함하는 Wnt-결합 작용제는 서열 번호:1을 포함하는 Wnt-결합 작용제보다 종양 성장을 훨씬 크게 저해한다. 일부 구체예에서, 서열 번호:50을 포함하는 Wnt-결합 작용제는 서열 번호:1을 포함하는 Wnt-결합 작용제보다 종양 성장을 훨씬 크게 저해한다. 일부 구체예에서, 서열 번호:53을 포함하는 Wnt-결합 작용제는 서열 번호:1을 포함하는 Wnt-결합 작용제보다 종양 성장을 훨씬 크게 저해한다. 일부 구체예에서, 본 명세서에서 기술된 Wnt-결합 작용제는 FZD 도메인 성분, Fc 도메인 및 FZD 도메인 성분과 Fc 도메인을 연결하는 링커 성분을 포함하는 Wnt-결합 작용제보다 종양 성장을 훨씬 크게 저해한다. 일부 구체예에서, 링커 성분은 개재성 펩티드 링커이다.
일정한 구체예에서, 본 명세서에서 기술된 Wnt-결합 작용제는 Wnt-의존성 종양의 성장을 저해한다. 일부 구체예에서, 종양은 결장직장 종양, 결장 종양, 췌장 종양, 폐 종양, 난소 종양, 간 종양, 유방 종양, 신장 종양, 전립선 종양, 위장 종양, 흑색종, 자궁경부 종양, 방광 종양, 아교모세포종, 그리고 두경부 종양으로 구성되는 군에서 선택되는 종양이다. 일정한 구체예에서, 종양은 결장직장 종양이다. 일정한 구체예에서, 종양은 췌장 종양이다. 일정한 구체예에서, 종양은 유방 종양이다.
일정한 구체예에서, 서열 번호:1, 서열 번호:45, 서열 번호:46, 서열 번호:47, 서열 번호:48, 서열 번호:49, 서열 번호:50, 서열 번호:51, 서열 번호:53, 서열 번호:54, 서열 번호:55, 서열 번호:65 및 서열 번호:66으로 구성되는 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드가 제시된다. 일정한 구체예에서, 폴리펩티드는 서열 번호:1, 서열 번호:46, 서열 번호:48, 서열 번호:50, 그리고 서열 번호:53으로 구성되는 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드는 서열 번호:1, 서열 번호:46, 서열 번호:48, 서열 번호:50, 그리고 서열 번호:53으로 구성되는 군에서 선택되는 아미노산 서열로 구성된다. 일정한 구체예에서, 폴리펩티드는 서열 번호:50의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드는 서열 번호:50이다. 일정한 구체예에서, 폴리펩티드는 서열 번호:53의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드는 서열 번호:53이다.
일정한 구체예에서, 폴리펩티드 (신호 서열 절단 이전에)는 서열 번호:50, 그리고 서열 번호:67, 서열 번호:68, 서열 번호:69, 서열 번호:70, 서열 번호:71, 서열 번호:72, 서열 번호:73 및 서열 번호:74로 구성되는 군에서 선택되는 신호 서열을 포함한다. 일정한 구체예에서, 폴리펩티드 (신호 서열 절단 이전에)는 서열 번호:50, 그리고 서열 번호:70, 서열 번호:71, 서열 번호:72, 서열 번호:73 및 서열 번호:74로 구성되는 군에서 선택되는 신호 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드 (신호 서열 절단 이전에)는 서열 번호:53, 그리고 서열 번호:67, 서열 번호:68, 서열 번호:69, 서열 번호:70, 서열 번호:71, 서열 번호:72, 서열 번호:73 및 서열 번호:74로 구성되는 군에서 선택되는 신호 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드 (신호 서열 절단 이전에)는 서열 번호:53, 그리고 서열 번호:70, 서열 번호:71, 서열 번호:72, 서열 번호:73 및 서열 번호:74로 구성되는 군에서 선택되는 신호 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드는 서열 번호:71 및 서열 번호:50을 포함한다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드는 서열 번호:71 및 서열 번호:53을 포함한다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드는 서열 번호:75를 포함한다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드는 서열 번호:75로 본질적으로 구성된다.
일부 구체예에서, 폴리펩티드는 서열 번호:1, 서열 번호:46, 서열 번호:48, 서열 번호:50, 그리고 서열 번호:53으로 구성되는 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 실질적으로 정제된 폴리펩티드이다. 일정한 구체예에서, 실질적으로 정제된 폴리펩티드는 ASA의 N-말단 서열을 갖는 폴리펩티드 중에서 적어도 90%로 구성된다. 일부 구체예에서, 미성숙 폴리펩티드는 서열 번호:67-74로 구성되는 군에서 선택되는 신호 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 미성숙 폴리펩티드는 서열 번호:71의 신호 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 미성숙 폴리펩티드는 하나의 N-말단 서열을 갖는 실질적으로 상동성 폴리펩티드 산물을 산출하는 신호 서열을 포함한다.
일정한 대안적 구체예에서, 작용제는 FZD 수용체의 Fri 도메인을 포함하지 않는다.
일정한 구체예에서, Wnt-결합 작용제는 항체 (가령, 하나 또는 그 이상의 Wnt 단백질에 특이적으로 결합하는 항체)이다.
일정한 구체예에서, Wnt-결합 작용제는 면역글로불린의 Fc 영역을 포함한다. 당업자는 본 발명의 결합제가 고유 또는 변경되지 않은 불변 영역을 포함하는 거의 동일한 면역원성 (immunogenicity)의 융합 단백질과 비교할 때, 바람직한 생화학적 특성, 예를 들면, 증가된 암 세포 국지화, 증가된 종양 침투, 감소된 혈청 반감기, 또는 증가된 혈청 반감기를 제공하기 위해 Fc 영역의 적어도 일부분이 결실되거나, 또는 달리 변화된 융합 단백질을 포함할 것이라는 것을 인지할 것이다. Fc 영역에 대한 변형에는 하나 또는 그 이상의 도메인에서 하나 또는 그 이상의 아미노산의 부가, 결실, 또는 치환이 포함될 수 있다. 본 발명에서 개시된 변형된 융합 단백질은 2개의 중쇄 불변 도메인 (CH2 또는 CH3) 중에서 하나 또는 그 이상에 또는 힌지 영역에 변경 또는 변형을 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 전체 CH2 도메인이 제거된다 (△CH2 구조체). 일부 구체예에서, 제외된 불변 영역 도메인은 이러한 부재하는 불변 영역 도메인에 의해 전형적으로 부여되는 분자 유연성 (molecular flexibility) 중에서 일부를 제공하는 짧은 아미노산 스페이서 (가령, 10개 aa 잔기)에 의해 대체된다.
일부 구체예에서, 변형된 융합 단백질은 CH3 도메인을 항체의 힌지 영역에 직접적으로 연결하도록 조작된다. 다른 구체예에서, 펩티드 스페이서는 힌지 영역 및 변형된 CH2 및/또는 CH3 도메인 사이에 삽입된다. 가령, CH2 도메인이 결실되고, 그리고 남아있는 CH3 도메인 (변형된 또는 변형되지 않은)이 5-20개 아미노산 스페이서로 힌지 영역에 연결되는 구조체가 발현될 수 있다. 이런 스페이서는 불변 도메인의 조절 요소가 자유롭고 접근가능한 상태로 남아있거나, 또는 힌지 영역이 유연한 상태로 남아있도록 담보하기 위해 부가될 수 있다. 하지만, 주의할 점은 아미노산 스페이서가 일부 경우에, 면역원성인 것으로 증명되고 이러한 구조체에 대한 원치 않는 면역 반응을 유발할 수도 있다는 것이다. 따라서 일정한 구체예에서, 구조체에 부가된 임의의 스페이서는 변형된 항체의 원하는 생물학적 품질을 유지하기 위해 상대적으로 비-면역원성일 것이다.
일부 구체예에서, 변형된 융합 단백질은 불변 도메인의 단지 부분적인 결실 또는 소수 또는 심지어 단일 아미노산의 치환을 가질 수 있다. 가령, CH2 도메인의 선택된 구역 내에서 단일 아미노산의 돌연변이는 Fc 결합을 실질적으로 감소시키고, 따라서 암 세포 국지화 및/또는 종양 침투를 증가시킬 만큼 충분할 수 있다. 유사하게, 조정되는 특정 효과기 기능 (가령, 보체 C1q 결합)을 제어하는 하나 또는 그 이상의 불변 영역 도메인의 부분을 단순히 결실시키는 것이 바람직할 수 있다. 불변 영역의 이런 부분적인 결실은 주요 불변 영역 도메인과 연관된 다른 바람직한 기능을 본래대로 남겨두면서, 항체의 선택된 특성 (가령, 혈청 반감기)을 향상시킬 수 있다. 게다가, 앞서 언급된 바와 같이, 이들 개시된 융합 단백질의 불변 영역은 결과 구조체의 프로필을 증강시키는 하나 또는 그 이상의 아미노산의 돌연변이 또는 치환을 통해 변형될 수 있다. 이와 관련하여, 변형된 항체의 배치 (configuration)와 면역원성 프로필 (immunogenic profile)을 실질적으로 유지하면서, 보존된 결합 부위에 의해 제공된 활성 (가령, Fc 결합)을 파괴하는 것이 가능할 수도 있다. 일정한 구체예에서, 변형된 융합 단백질은 바람직한 특성, 예를 들면, 감소하는 또는 증가하는 효과기 기능을 증강시키거나, 또는 더욱 많은 세포독소 또는 탄수화물 부착을 제공하기 위해 불변 영역에 하나 또는 그 이상의 아미노산의 부가를 포함한다.
불변 영역은 여러 효과기 기능을 매개하는 것으로 당분야에 공지되어 있다. 가령, IgG 또는 IgM 항체 (항원에 결합됨)의 Fc 영역에 보체의 C1 성분의 결합은 보체계 (complement system)를 활성화시킨다. 보체의 활성화는 세포 병원체의 옵소닌화 (opsonization)와 용해 (lysis)에서 중요하다. 보체의 활성화는 또한, 염증 반응 (inflammatory response)을 자극하고, 그리고 자가면역 과민증 (autoimmune hypersensitivity)에도 관련될 수 있다. 이에 더하여, 항체의 Fc 영역은 Fc 수용체 (FcR)를 발현하는 세포에 결합할 수 있다. IgG (감마 수용체), IgE (엡실론 수용체), IgA (알파 수용체) 및 IgM (뮤 수용체)를 비롯한 상이한 부류의 항체에 특이적인 다수의 Fc 수용체가 존재한다. 세포 표면 상에서 Fc 수용체에 항체의 결합은 항체-코팅된 입자의 탐식 (engulfment)과 파괴, 면역 복합체의 제거, 킬러 세포에 의한 항체-코팅된 표적 세포의 용해 (항체-의존성 세포-매개된 세포독성 또는 ADCC), 염증성 매개인자의 방출, 태반 통과 (placental transfer), 그리고 면역글로불린 생산의 제어를 비롯한 다수의 중요하고 다양한 생물학적 반응을 유인한다.
일부 구체예에서, Wnt-결합 작용제는 변화된 효과기 기능을 제공하고, 이들은 차례로, 투여된 작용제의 생물학적 프로필에 영향을 준다. 가령, 일부 구체예에서, 불변 영역 도메인의 결실 또는 비활성화 (점 돌연변이 또는 다른 수단을 통해)는 순환하는 변형된 작용제 (가령, Wnt-결합 작용제)의 Fc 수용체 결합을 감소시킬 수 있고, 따라서 암 세포 국지화 및/또는 종양 침투를 증가시킨다. 다른 구체예에서, 이들 불변 영역 변형은 작용제의 혈청 반감기를 증가시키거나 감소시킨다. 일부 구체예에서, 불변 영역은 이황화 연쇄 또는 올리고당류 모이어티가 제거되도록 변형된다.
일정한 구체예에서, Wnt-결합 작용제는 Fc 영역과 정상적으로 연관되는 한 가지 또는 그 이상의 효과기 기능을 갖지 않는다. 일부 구체예에서, 작용제는 ADCC 활성을 갖지 않고, 및/또는 보체-의존성 세포독성 (CDC) 활성을 갖지 않는다. 일정한 구체예에서, 작용제는 Fc 수용체 및/또는 보체 인자에 결합하지 않는다. 일정한 구체예에서, 작용제는 효과기 기능을 갖지 않는다.
일부 구체예에서, 본 명세서에서 기술된 Wnt-결합 작용제는 면역원성을 감소시키기 위해 변형된다. 일반적으로, 완전한 정상 인간 단백질에 대한 면역 반응은 이들 단백질이 치료제로서 이용될 때 드물게 나타난다. 하지만, 비록 많은 융합 단백질이 자연에서 발견되는 서열과 동일한 폴리펩티드 서열을 포함하긴 하지만, 몇몇 치료 융합 단백질은 포유동물에서 면역원성인 것으로 밝혀졌다. 일부 연구에서, 링커를 포함하는 융합 단백질은 링커를 내포하지 않는 융합 단백질보다 더욱 강한 면역원성을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 따라서 일부 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 면역원성을 예측하는 계산 방법에 의해 분석된다. 일부 구체예에서, 이들 폴리펩티드는 T-세포 및/또는 B-세포 에피토프의 존재에 대하여 분석된다. 임의의 T-세포 또는 B-세포 에피토프가 확인되고 및/또는 예측되면, 이들 에피토프를 교란시키거나 파괴하기 위해 이들 영역에 대한 변형 (가령, 아미노산 치환)이 만들어질 수도 있다. T-세포 및/또는 B-세포 에피토프를 예측하는데 이용될 수 있는 다양한 알고리즘과 소프트웨어는 당분야에 공지되어 있다. 가령, 소프트웨어 프로그램 SYFPEITHI, HLA Bind, PEPVAC, RANKPEP, DiscoTope, ElliPro 및 항체 에피토프 Prediction은 모두 공개적으로 가용하다.
일부 구체예에서, 본 명세서에서 기술된 임의의 Wnt-결합 작용제 또는 폴리펩티드를 생산하는 세포가 제시된다. 일부 구체예에서, 본 명세서에서 기술된 임의의 Wnt-결합 작용제 또는 폴리펩티드를 포함하는 조성물이 제시된다. 일부 구체예에서, 조성물은 폴리펩티드 중에서 적어도 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99%가 ASA의 N-말단 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물은 폴리펩티드 중에서 100%가 ASA의 N-말단 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물은 폴리펩티드 중에서 적어도 80%가 ASA의 N-말단 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물은 폴리펩티드 중에서 적어도 90%가 ASA의 N-말단 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물은 폴리펩티드 중에서 적어도 95%가 ASA의 N-말단 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.
본 발명의 폴리펩티드는 재조합 폴리펩티드, 자연 폴리펩티드, 또는 합성 폴리펩티드일 수 있다. 본 발명의 일부 아미노산 서열은 단백질의 구조 또는 기능에 대한 유의미한 효과 없이 변경될 수 있는 것으로 당분야에서 인식될 것이다. 서열에서 이런 차이가 예기되면, 단백질 상에서 활성을 결정하는 중요한 영역이 존재할 것으로 기억되어야 한다. 따라서 본 발명은 실질적인 활성을 보이거나, 또는 FZD 단백질, SFRP 단백질 또는 Ror 단백질의 영역, 예를 들면, 본 명세서에서 논의된 단백질 부분을 포함하는 폴리펩티드의 변형을 더욱 포함한다. 이런 돌연변이체는 결실, 삽입, 역전, 반복, 그리고 타입 치환을 포함한다. 하기에 지시된 바와 같이, 어떤 아미노산 변화가 표현형적으로 침묵할 가능성이 높은 지에 관한 보도는 Bowie, et al., 1990, Science , 247:1306-10에서 찾아볼 수 있다.
당연히, 당업자가 만드는 아미노산 치환의 숫자는 앞서 기술된 것을 비롯한 다수의 인자에 좌우된다. 일정한 구체예에서, 소정의 가용성 수용체 폴리펩티드에 대한 치환의 숫자는 50, 40, 30, 25, 20, 15, 10, 5 또는 3개 이하일 것이다.
본 발명의 폴리펩티드의 단편 또는 부분은 펩티드 합성에 의해 상응하는 전장 폴리펩티드를 생산하는데 이용될 수 있다; 이런 이유로, 이들 단편은 전장 폴리펩티드를 생산하기 위한 중간물로서 이용될 수 있다. 폴리펩티드의 이들 단편 또는 부분 역시 "단백질 단편" 또는 "폴리펩티드 단편"으로 지칭될 수 있다.
본 발명의 단백질 단편은 하나 또는 그 이상의 인간 Wnt 단백질 (가령, 인간 FZD 수용체, 인간 SFRP 또는 Ror 단백질)에 결합할 수 있는 단백질의 부분, 또는 전부이다. 일부 구체예에서, 단편은 하나 또는 그 이상의 인간 Wnt 단백질에 대한 높은 친화성을 갖는다. 본 명세서에서 기술된 융합 단백질의 일부 단편은 FZD 수용체의 세포외 부분, SFRP, 또는 면역글로불린의 불변 영역 (가령, Fc 영역)의 적어도 일부에 연결된 결합 도메인을 내포하는 Ror 단백질의 세포외 부분의 적어도 일부를 포함하는 단백질 단편이다. 단백질 단편의 결합 친화성은 비록 친화성이 상이한 크기의 단편에서 10-7 내지 10-13 M 범위에서 상당히 변할 수 있긴 하지만, 대략 10-11 내지 10-12 M의 범위 내에 있을 수 있다. 일부 구체예에서, 단편은 대략 100개 내지 대략 200개 아미노산 길이를 갖고, 그리고 면역글로불린의 불변 영역의 적어도 일부에 연결된 결합 도메인을 포함한다.
본 발명의 Wnt-결합 작용제는 당분야에 공지된 임의의 방법에 의해 특이적 결합에 대하여 평가될 수 있다. 이용될 수 있는 면역측정법 (immunoassay)에는 BIAcore 분석, FACS 분석, 면역형광, 면역세포화학, 웨스턴 블롯, 방사성면역측정법, ELISA, "샌드위치" 면역측정법, 면역침전 측정법, 침전 반응, 겔 확산 침강소 반응, 면역확산 측정법, 응집 측정법, 보체-고정 측정법, 면역방사계측 측정법, 형광 면역측정법, 그리고 단백질 A 면역측정법과 같은 기술을 이용한 경쟁적 및 비-경쟁적 측정법 시스템이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 이런 측정법은 일과적이고 당분야에 널리 공지되어 있다 (참조: Ausubel et al, eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York, 이것은 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다).
가령, 인간 Wnt에 폴리펩티드의 특이적 결합은 ELISA를 이용하여 측정될 수 있다. ELISA 측정법은 항원을 준비하고, 96 웰 마이크로역가 평판의 웰을 항원으로 코팅하고, 검출가능 화합물, 예를 들면, 효소 기질 (enzymatic substrate) (가령, 양고추냉이 과산화효소 또는 알칼리성 포스파타아제)에 접합된 폴리펩티드 (가령, Wnt-결합 작용제)를 웰에 첨가하고, 일정한 기간 동안 항온처리하고, 그리고 상기 작용제의 존재를 검출하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드 (가령, Wnt-결합 작용제)는 검출가능 화합물에 접합되지 않고, 그 대신에 상기 폴리펩티드를 인식하는 두 번째 접합된 항체가 웰에 첨가된다. 일부 구체예에서, 항원으로 웰을 코팅하는 대신에, 폴리펩티드 (가령, Wnt-결합 작용제)가 웰에 코팅될 수 있고, 그리고 검출가능 화합물에 접합된 두 번째 항체가 코팅된 웰에 항원의 첨가 이후에 첨가될 수 있다. 당업자는 당분야에 공지된 ELISA의 다른 변형뿐만 아니라 검출되는 신호를 증가시키기 위해 변경될 수 있는 파라미터에 대해 알 수 있을 것이다 (참조: Ausubel et al, eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York at 11.2.1).
Wnt에 대한 작용제의 결합 친화성 및 결합제-항원 상호작용의 오프-레이트 (off-rate)는 경쟁적 결합 측정법에 의해 측정될 수 있다. 경쟁적 결합 측정법의 한 가지 실례는 증가하는 양의 표지되지 않은 항원의 존재에서 목적되는 결합제와 함께, 표지된 항원 (가령, 3H 또는 125I), 또는 이의 단편 또는 변이체의 항온처리, 그 이후에 표지된 항원에 결합된 항체의 검출을 포함하는 방사성면역측정법이다. Wnt에 대한 결합제의 친화성 및 결합 오프-레이트는 스캐차드 플롯 (Scatchard plot) 분석에 의해 데이터로부터 측정될 수 있다. 일부 구체예에서, BIAcore 동역학 분석은 하나 또는 그 이상의 인간 Wnt에 결합하는 작용제의 결합 온 레이트 (on rate)와 오프 레이트 (off rate)를 측정하는데 이용된다. BIAcore 동역학 분석은 표면 상에 고정된 Wnt 항원을 갖는 칩으로부터 항체의 결합과 해리를 분석하는 것을 포함한다.
일정한 구체예에서, Wnt-결합 작용제는 대략 1μM 또는 그 이하, 대략 100nM 또는 그 이하, 대략 40nM 또는 그 이하, 대략 20nM 또는 그 이하, 또는 대략 10nM 또는 그 이하의 해리 상수 (KD)로 적어도 하나의 Wnt에 결합한다.
일정한 구체예에서, Wnt-결합 작용제 (가령, FZD8-Fc)는 상기 작용제에 의해 결합되는 적어도 하나의 Wnt (즉, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 Wnt)의 길항약이다. 일정한 구체예에서, 상기 작용제는 결합된 인간 Wnt(들)의 하나 또는 그 이상의 활성의 적어도 대략 10%, 적어도 대략 20%, 적어도 대략 30%, 적어도 대략 50%, 적어도 대략 75%, 적어도 대략 90%, 또는 대략 100%를 저해한다.
Wnt-결합 작용제 (또는 후보 Wnt-결합 작용제)가 Wnt 신호전달을 저해하는 지를 결정하기 위한 생체내와 시험관내 측정법은 당분야에 공지되어 있다. 가령, 개똥벌레 루시페라아제 리포터 유전자의 상류에 TCF-결합 도메인의 복수 사본을 내포하는 TCF/Luc 리포터 벡터를 이용하는 세포-기초된, 루시페라아제 리포터 측정법은 시험관내에서 정준 Wnt 신호전달 수준을 측정하는데 이용될 수 있다 (Gazit et al., 1999, oncogene 18; 5959-66). Wnt-결합 작용제가 존재할 때 하나 또는 그 이상의 Wnt (가령, 형질감염된 세포에 의해 발현되거나, 또는 Wnt-조건 배지에 의해 제공되는 Wnt(들))의 존재에서 Wnt 신호전달의 수준은 Wnt-결합 작용제가 존재하지 않을 때 신호전달의 수준과 비교된다. TCF/Luc 리포터 측정법 이외에, 정준 Wnt 신호전달에 대한 Wnt-결합 작용제 (또는 후보 작용제)의 효과는 β-카테닌 조절된 유전자, 예를 들면, c-myc (He et al., Science, 281:1509-12 (1998)), 사이클린 D1 (Tetsu et al., Nature, 398:422-6 (1999)) 및/또는 피브로넥틴 (Gradl et al. Mol. Cell Biol ., 19:5576-87 (1999))의 발현 수준에 대한 상기 작용제의 효과를 측정함으로써 시험관내에서 또는 생체내에서 측정될 수 있다. 일정한 구체예에서, Wnt 신호전달에 대한 작용제의 효과는 또한, Dishevelled-1, Dishevelled-2, Dishevelled-3, LRP5, LRP6, 및/또는 β-카테닌의 인산화 상태에 대한 상기 작용제의 효과를 측정함으로써 평가될 수도 있다.
본 명세서에서 기술된 폴리펩티드는 당분야에 공지된 임의의 적절한 방법에 의해 생산될 수 있다. 이런 방법에는 직접적인 단백질 합성 방법에서부터 폴리펩티드 서열을 인코딩하는 DNA 서열의 작제 및 적절한 숙주 내에서 이들 서열의 발현까지 포함된다. 일부 구체예에서, DNA 서열은 목적되는 야생형 단백질을 인코딩하는 DNA 서열을 단리하거나 합성함으로써, 재조합 기술을 이용하여 작제된다. 선택적으로, 상기 서열은 기능적 유사체를 제공하기 위해 특정 부위 돌연변이유발 (site-specific mutagenesis)에 의해 돌연변이될 수 있다. 예로써, Zoeller et al., 1984, PNAS, 81:5662-66 및 U.S. Pat. No. 4,588,585를 참조한다. 일부 구체예에서, DNA 서열은 목적되는 2개의 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 DNA 서열을 단리하고 이들 DNA 서열을 함께 결찰시켜 융합 단백질을 산출함으로써, 재조합 기술을 이용하여 작제된다. 일부 구체예에서, 2개 폴리펩티드의 융합은 이들 2개 폴리펩티드 사이의 접합점 (즉, 이들 DNA 서열에 대한 결찰 부위)에 추가의 아미노산을 부가한다. 이들 추가의 아미노산은 링커로 간주된다. 일부 구체예에서, 펩티드 링커는 융합 단백질의 2개 폴리펩티드 사이에 삽입된다.
일부 구체예에서, 목적되는 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA 서열은 올리고뉴클레오티드 합성장치를 이용한 화학적 합성에 의해 작제될 수 있다. 이런 올리고뉴클레오티드는 원하는 폴리펩티드의 아미노산 서열에 기초하여 설계될 수 있다. 일부 구체예에서, 이들 올리고뉴클레오티드는 목적되는 재조합 폴리펩티드가 생산되는 숙주 세포에서 유리한 코돈이 선택되도록 설계된다. 표준 방법은 목적되는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 합성하는데 적용될 수 있다. 가령, 역번역 (back-translation)된 유전자를 작제하기 위해 완전한 아미노산 서열이 이용될 수 있다. 게다가, 특정 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 내포하는 DNA 올리고머가 합성될 수 있다. 가령, 원하는 폴리펩티드의 일부분을 코딩하는 몇몇 작은 올리고뉴클레오티드가 합성되고, 이후 결찰될 수 있다. 개별 올리고뉴클레오티드는 전형적으로, 상보적 집합 (complementary assembly)을 위한 5' 또는 3' 오버행 (overhang)을 내포한다. 일부 구체예에서, 원하는 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 2개의 폴리펩티드가 개재성 펩티드 링커 없이 직접적으로 연결되도록 합성된다.
일단 집합되면 (합성, 특정 부위 돌연변이유발, 재조합 기술, 또는 기타 방법에 의해), 목적되는 특정 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 발현 벡터 내로 삽입되고 원하는 숙주에서 상기 폴리펩티드의 발현에 적합한 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 적절한 집합은 뉴클레오티드 염기서열분석, 제한 맵핑 (restriction mapping), 및/또는 적절한 숙주에서 생물학적 활성 폴리펩티드의 발현에 의해 확증될 수 있다. 당분야에 널리 공지된 바와 같이, 숙주에서 형질감염된 유전자의 높은 발현 수준을 획득하기 위해, 유전자는 선택된 발현 숙주에서 기능적인 전사와 번역 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결되어야 한다.
일정한 구체예에서, 재조합 발현 벡터는 본 명세서에서 기술된 Wnt-결합 작용제와 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA를 증폭하고 발현하는데 이용된다. 가령, 재조합 발현 벡터는 포유동물, 미생물, 바이러스 또는 곤충 유전자로부터 유래된 적절한 전사 또는 번역 조절 요소에 작동가능하게 연결된, FZD Fri 도메인과 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질을 인코딩하는 합성 또는 cDNA-유래된 DNA 단편을 갖는 복제가능한 DNA 구조체일 수 있다. 전사 단위는 일반적으로, (1) 유전자 발현에서 조절 역할을 갖는 유전자 요소 또는 요소들, 예를 들면, 전사 프로모터 및/또는 인핸서, (2) mRNA로 전사되고 단백질로 번역되는 구조적 또는 코딩 서열, 그리고 (3) 적절한 전사와 번역 시작과 종결 서열의 집합을 포함한다. 조절 요소는 전사를 제어하는 오퍼레이터 서열을 포함할 수 있다. 복제 기점 (origin of replication), 그리고 형질전환체의 인식을 용이하게 하는 선별 유전자에 의해 통상적으로 공여되는 숙주에서 복제하는 능력이 부가적으로 합동될 수 있다. DNA 영역은 그들이 서로에 기능적으로 관련될 때, "작동가능하게 연결된다". 가령, 신호 펩티드 (분비 리더)에 대한 DNA는 폴리펩티드의 분비에 관여하는 전구체로서 발현되면, 상기 폴리펩티드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결된다; 프로모터는 코딩 서열의 전사를 제어하면, 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다; 또는 리보솜 결합 부위는 번역이 가능하도록 배치되면, 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 인접을 의미하고, 그리고 분비 리더의 경우에, 해독 틀 (reading frame) 내에서 인접을 의미한다. 일부 구체예에서, 효모 발현 시스템에서 이용에 의도되는 구조적 요소는 숙주 세포에 의한 번역된 단백질의 세포외 분비를 가능하게 하는 리더 서열을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 재조합 단백질이 리더 또는 수송 서열 없이 발현되는 경우에, 이것은 N-말단 메티오닌잔기를 포함할 수 있다. 이러한 잔기는 선택적으로, 최종 산물을 제공하기 위해 발현된 재조합 단백질로부터 차후에 절단되었다.
발현 제어 서열과 발현 벡터의 선택은 숙주의 선택에 좌우된다. 매우 다양한 발현 숙주/벡터 조합이 이용될 수 있다. 진핵 숙주에 유용한 발현 벡터에는 예로써, SV40, 소 유두종 바이러스, 아데노바이러스 및 사이토메갈로바이러스로부터 발현 제어 서열을 포함하는 벡터가 포함된다. 세균 숙주에 유용한 발현 벡터에는 공지된 세균 플라스미드, 예를 들면, pCR1, pBR322, pMB9 및 이들의 유도체를 비롯한 대장균 (E. coli)으로부터 플라스미드, 그리고 더욱 넓은 숙주 범위 벡터, 예를 들면, M13 및 기타 섬유상 단일 가닥 DNA 파지가 포함된다.
Wnt-결합 작용제의 발현에 적합한 숙주 세포에는 적절한 프로모터의 제어 하에 원핵생물, 효모, 곤충, 또는 고등 진핵 세포가 포함된다. 원핵생물에는 그람 음성 (gram-negative) 또는 그람 양성 (gram-positive) 미생물, 예를 들면, 대장균 (E. coli) 또는 간상균 (Bacillus)이 포함된다. 고등 진핵 세포에는 하기에 기술된 바와 같은 포유동물 기원의 확립된 세포주가 포함된다. 세포-없는 번역 시스템 역시 이용될 수 있다. 세균, 진균, 효모, 그리고 포유동물 세포 숙주에서 이용하기 적합한 클로닝과 발현 벡터는 Pouwels et al., 1985, Cloning Vectors : A Laboratory Manual, Elsevier, N.Y.에 의해 기술되고, 이의 관련 내용은 본 발명에 참조로서 편입된다.
다양한 포유동물 또는 곤충 세포 배양 시스템이 재조합 폴리펩티드를 발현하는데 이용된다. 일부 구체예에서, 포유동물 세포에서 재조합 단백질의 발현이 바람직한데, 그 이유는 이런 단백질이 일반적으로, 적절하게 접힘되고, 적절하게 변형되고, 완전하게 기능적이기 때문이다. 적절한 포유동물 숙주 세포주의 실례에는 COS-7 (원숭이 신장-유래됨), L-929 (뮤린 섬유아세포-유래됨), C127 (뮤린 유방 종양-유래됨), 3T3 (뮤린 섬유아세포-유래됨), CHO (중국 햄스터 난소-유래됨), HeLa (인간 자궁경부 암-유래됨) 및 BHK (햄스터 신장 섬유아세포-유래됨) 세포주가 포함된다. 포유동물 발현 벡터는 비-전사된 요소, 예를 들면, 복제 기점, 발현되는 유전자에 연결된 적절한 프로모터와 인핸서, 그리고 기타 5' 또는 3' 측면 비-전사된 서열, 그리고 5' 또는 3' 비-번역된 서열, 예를 들면, 필수 리보솜 결합 부위, 폴리아데닐화 부위, 스플라이스 (splice) 공여자와 수용자 부위, 그리고 전사 종결 서열을 포함할 수 있다. 곤충 세포에서 이질성 단백질의 생산을 위한 배큘로바이러스 시스템은 당업자에게 공지되어 있고 Luckow and Summers, 1988, Bio / Technology , 6:47에 의해 검토된다.
형질전환된 숙주에 의해 생산된 단백질은 임의의 적절한 방법에 따라 정제될 수 있다. 이런 표준 방법에는 크로마토그래피 (가령, 이온 교환, 친화성, 그리고 사이징 칼럼 크로마토그래피), 원심분리, 차등적 용해도 (differential solubility), 또는 단백질 정제를 위한 임의의 다른 표준 기술이 포함된다. 적절한 친화성 칼럼에서 통과에 의한 용이한 정제를 가능하게 하기 위해, 친화성 태그, 예를 들면, 헥사히스티딘, 말토오스 결합 도메인, 인플루엔자 외피 서열, 그리고 글루타티온-S-전이효소가 단백질에 부착될 수 있다. 단리된 단백질은 또한, 단백분해, 질량 분석법 (MS), 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 핵 자기 공명 (NMR), 그리고 x-선 결정학과 같은 기술을 이용하여 물리적으로 특징될 수 있다.
일부 구체예에서, 배양 배지 내로 재조합 단백질을 분비하는 발현 시스템으로부터 상층액은 먼저, 상업적으로 구입가능한 단백질 농축 필터, 예를 들면, Amicon 또는 Millipore Pellicon 한외여과 단위를 이용하여 농축될 수 있다. 농축 단계 이후에, 농축물은 적절한 정제 매트릭스에 적용될 수 있다. 일부 구체예에서, 음이온 교환 수지 (anion exchange resin), 예를 들면, 펜던트 (pendant) 디에틸아미노에틸 (DEAE) 기를 갖는 매트릭스 또는 기질이 이용될 수 있다. 이들 매트릭스는 아크릴아미드, 아가로오스, 덱스트란, 셀룰로오스, 또는 단백질 정제에 통상적으로 이용되는 기타 유형일 수 있다. 일부 구체예에서, 양이온 교환 단계가 이용될 수 있다. 적절한 양이온 교환체에는 설포프로필 또는 카르복시메틸 기를 포함하는 다양한 불용성 매트릭스가 포함된다. 일부 구체예에서, 세라믹 히드록시아파티트가 포함되지만 이에 국한되지 않는 히드록시아파티트 (CHT) 매체가 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 소수성 RP-HPLC 매체, 예를 들면, 펜던트 메틸 또는 기타 지방족 기를 갖는 실리카 겔을 이용하는 하나 또는 그 이상의 역상 HPLC 단계가 융합 단백질을 더욱 정제하기 위해 이용될 수 있다. 전술한 정제 단계의 일부 또는 전부는 또한, 상동성 재조합 단백질을 제공하기 위해 다양한 조합으로 이용될 수 있다.
일부 구체예에서, 세균 배양 동안 생산된 재조합 단백질은 예로써, 세포 펠릿으로부터 초기 추출, 그 이후에 하나 또는 그 이상의 농축, 염석 (salting-out), 수성 이온 교환 (aqueous ion exchange), 및/또는 크기 배제 크로마토그래피 단계에 의해 단리될 수 있다. HPLC는 최종 정제 단계에 이용될 수 있다. 재조합 단백질의 발현에서 이용된 미생물 세포는 냉동-해동 사이클링, 초음파처리, 기계적 교란, 또는 세포 용해제의 이용을 비롯한 임의의 편의한 방법에 의해 파괴될 수 있다.
항체와 기타 단백질을 정제하기 위한 당분야에 공지된 방법에는 예로써, U.S. Patent Appl. No. 2008/0312425; 2008/0177048; 그리고 2009/0187005에서 기술된 것들 역시 포함된다.
본 명세서에서 기술된 폴리펩티드는 정상적으로 단백질의 일부가 아닌 추가의 화학적 모이어티를 내포하도록 더욱 변형될 수 있다. 이들 유도체화된 모이어티는 단백질의 용해도, 생물학적 반감기, 또는 흡수도를 향상시킬 수 있다. 이들 모이어티는 또한, 단백질의 임의의 바람직하지 않은 부작용 등을 감소시키거나 제거할 수 있다. 이들 모이어티에 대한 개관은 Remington : The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, University of the Sciences, Philadelphia, 2005에서 찾아볼 수 있다.
유도체화 (derivatization)에 가장 적합한 화학적 모이어티에는 물 가용성 중합체가 포함된다. 물 가용성 중합체는 그가 부착된 단백질이 수성 환경, 예를 들면, 생리학적 환경에서 침전되지 않는다는 점에서 바람직하다. 일부 구체예에서, 중합체는 치료 산물 또는 조성물의 제조에 제약학적으로 허용가능할 것이다. 당업자는 중합체/단백질 접합체가 치료적으로 이용될 것인지, 그리고 만약 그렇다면, 원하는 용량, 순환 시간, 단백분해에 대한 내성, 그리고 기타 고려 대상과 같은 고려 대상에 기초하여 원하는 중합체를 선택할 수 있을 것이다. 유도체화의 유효성은 유도체를 원하는 형태로 투여하고 (즉, 삼투압 펌프 (osmotic pump)에 의해, 또는 주사 또는 주입에 의해, 또는 경구, 폐 또는 기타 전달 루트를 위해 더욱 조제됨), 그리고 이의 유효성을 결정함으로써 확인될 수 있다. 적절한 물 가용성 중합체에는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸셀룰로오스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산 (동종중합체 또는 무작위 공중합체), 덱스트란, 폴리(n-비닐 피롤리돈)-폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 동종중합체, 프롤릴프로필렌 산화물/에틸렌 산화물 공중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올 (가령, 글리세롤), 폴리비닐 알코올, 그리고 이들의 혼합물이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드는 물에서 안정성으로 인하여, 제조에서 이점을 가질 수 있다. 이렇게 부착되는 중합체 분자의 숫자는 변할 수 있고, 그리고 당업자는 기능에 대한 효과를 확인할 수 있을 것이다. 동일한 또는 상이한 화학적 모이어티 (가령, 중합체, 예를 들면, 상이한 중량의 폴리에틸렌 글리콜)로, 단일-유도체화, 또는 유도체화의 이중-, 삼중-, 사중- 또는 일부 조합이 제공될 수 있다. 중합체 분자 대(對) 단백질 (또는 펩티드) 분자의 비율은 반응 혼합물에서 그들의 농도가 변함에 따라서 변할 것이다. 일반적으로, 최적 비율 (과잉의 반응하지 않은 단백질 또는 중합체가 없다는 점에서 반응 효율의 관점에서)은 유도체화의 원하는 정도 (가령, 단일-, 이중-, 삼중- 등), 선택된 중합체의 분자량, 중합체가 분기되거나 분기되지 않는 지의 여부, 그리고 반응 조건과 같은 인자에 의해 결정될 것이다.
폴리에틸렌 글리콜 분자 (또는 다른 화학적 모이어티)는 단백질의 기능적 또는 항원성 도메인에 대한 효과를 고려하여 단백질에 부착되어야 한다. 당업자에게 가용한 다수의 부착 방법이 있다. 예로써, 본 발명에 참조로서 편입되는 EP 0401384 (G-CSF에 PEG의 결합)를 참조하고, 또한 Malik et al., 1992, Exp . Hematol., 20:1028-35 (트레실 염화물을 이용한 GM-CSF의 페길화 (pegylation)를 보고)를 참조한다. 가령, 폴리에틸렌 글리콜은 반응 기, 예를 들면, 유리 아미노 또는 카르복실 기를 거쳐 아미노산 잔기를 통해 공유 결합될 수 있다. 반응 기는 활성화된 폴리에틸렌 글리콜 분자가 결합될 수 있는 것들이다. 유리 아미노 기를 갖는 아미노산 잔기에는 리신 잔기 및 N-말단 아미노산 잔기가 포함될 수 있다. 유리 카르복실 기를 갖는 것들에는 아스파르트산 잔기, 글루타민산 잔기, 그리고 C-말단 아미노산 잔기가 포함될 수 있다. 설프히드릴 기 역시 폴리에틸렌 글리콜 분자(들)를 부착하기 위한 반응 기로서 이용될 수 있다. 치료 목적으로, 아미노 기에서 부착, 예를 들면, N-말단 또는 리신 기에서 부착이 수행될 수 있다. 수용체 결합에 중요한 잔기에서 부착은 수용체 결합이 요망되면 피해야 한다.
아미노-말단 화학적으로 변형된 단백질이 특이적으로 설계될 수 있다. 폴리에틸렌 글리콜을 본 발명의 조성물의 예시로서 이용하여, 다양한 폴리에틸렌 글리콜 분자 (분자량, 분기 등에 의해), 반응 혼합물 내에서 폴리에틸렌 글리콜 분자 대(對) 단백질 (또는 펩티드) 분자의 비율, 수행되는 페길화 반응의 유형, 그리고 선택된 N-말단 페길화된 단백질을 획득하는 방법에서 선택할 수 있다. N-말단 페길화된 제조물을 획득하는 (즉, 필요하면, 다른 단일페길화된 모이어티로부터 이러한 모이어티를 분리하는) 방법은 페길화된 단백질 분자의 집단으로부터 N-말단 페길화된 물질의 정제에 의해 달성될 수 있다. 선택성 N-말단 화학적 변형은 특정 단백질에서 유도체화에 가용한 상이한 유형의 일차 아미노 기의 차등적 반응성 (리신 대(對) N-말단)을 이용하는 환원성 알킬화에 의해 달성될 수 있다. 적절한 반응 조건 하에, N-말단에서 카르보닐 기 내포 중합체로 단백질의 실질적으로 선택성 유도체화가 달성된다. 가령, 단백질의 리신 잔기의 엡실론 아미노 기 및 N-말단 잔기의 알파 아미노 기 사이에 pKa 차이의 이용을 가능하게 하는 pH에서 반응을 수행함으로써 단백질의 선택성 N-말단 페길화가 달성될 수 있다. 이런 선별성 유도체화에 의해, 단백질에 물 가용성 중합체의 부착이 제어된다, 예를 들면, 중합체와 접합 (conjugation)이 단백질의 N-말단에서 주로 발생하고, 그리고 다른 반응 기, 예를 들면, 리신 측쇄 아미노 기의 유의미한 변형이 전혀 일어나지 않는다. 환원성 알킬화를 이용하여, 물 가용성 중합체는 앞서 기술된 유형일 수 있고, 그리고 단백질에 결합을 위한 단일 반응성 알데히드를 가질 것이다. 단일 반응성 알데히드를 내포하는 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드가 이용될 수 있다.
페길화는 당분야에 공지된 임의의 페길화 반응에 의해 수행될 수 있다. 예로써, Focus on Growth Factors, 1992, 3: 4-10; EP 0154316, 이의 내용은 본 발명에 참조로서 편입된다; EP 0401384; 그리고 페길화에 관계하는 본 명세서에서 인용된 다른 간행물을 참조한다. 페길화는 반응성 폴리에틸렌 글리콜 분자 (또는 유사한 반응성 물 가용성 중합체)로 아실화 반응 또는 알킬화 반응을 거쳐 수행될 수 있다.
따라서 본 발명에 따라서 이용되는 가용성 수용체 폴리펩티드는 페길화된 가용성 수용체 단백질 또는 변이체를 포함할 수 있는 것으로 예기되고, 여기서 PEG 기(들)는 아실 또는 알킬 기를 거쳐 부착된다. 이런 산물은 단일-페길화 또는 다중-페길화될 수 있다. PEG 기는 일반적으로, 아미노산의 α 또는 ε 아미노 기에서 단백질에 부착되지만, PEG 기는 또한, 적절한 반응 조건 하에 PEG 기에 부착될 만큼 충분히 반응성인, 단백질에 부착된 임의의 아미노 기에 부착될 수 있을 것으로 예기된다.
아실화와 알킬화 접근법 둘 모두에 이용되는 중합체 분자는 앞서 기술된 바와 같은 물 가용성 중합체 중에서 선택될 수 있다. 선택된 중합체는 중합화의 정도가 본 발명의 방법에서 제시된 바와 같이 제어될 수 있도록 하기 위해, 단일 반응 기, 예를 들면, 아실화를 위한 활성 에스테르 또는 알킬화를 위한 알데히드를 갖도록 변형되어야 한다. 예시적인 반응성 PEG 알데히드는 물 안정성인 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드, 또는 이들의 단일 C1-C10 알콕시 또는 아릴옥시 유도체이다 (참조: U.S. Pat. No. 5,252,714). 중합체는 분기되거나 분기되지 않을 수 있다. 아실화 반응의 경우에, 선택된 중합체(들)는 단일 반응성 에스테르 기를 가져야 한다. 환원성 알킬화의 경우에, 선택된 중합체(들)는 단일 반응성 알데히드 기를 가져야 한다. 일반적으로, 물 가용성 중합체는 자연 발생 글리코실 잔기에서 선택되지 않는데, 그 이유는 이들이 통상적으로, 포유동물 재조합 발현 시스템에 의해 더욱 편의하게 만들어지기 때문이다. 중합체는 임의의 분자량을 가질 수 있고, 그리고 분기되거나 분기되지 않을 수 있다. 본 발명에 이용되는 한 가지 물 가용성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜이다. 본 명세서에서, 폴리에틸렌 글리콜은 다른 단백질을 유도체화시키는데 이용되는 임의의 형태의 PEG, 예를 들면, 단일 (C1-C10) 알콕시- 또는 아릴옥시-폴리에틸렌 글리콜을 포함하는 것으로 의도된다.
다른 반응 파라미터, 예를 들면, 용매, 반응 시간, 온도 등, 그리고 산물의 정제 수단은 물 가용성 중합체로 단백질의 유도체화와 관련된 공개된 정보 (본 명세서에서 인용된 간행물 참조)에 기초하여 사례별로 결정될 수 있다. 일정한 구체예에서, Wnt-결합 작용제는 인간 FZD 또는 SFRP로부터 유래되지 않은 폴리펩티드이다. 단백질 표적에 높은 친화성으로 결합하는 폴리펩티드를 확인하고 생산하기 위한 다양한 방법은 당분야에 공지되어 있다. 예로써, Skerra, 2007, Curr . Opin . Biotechnol., 18:295-304; Hosse et al., 2006, Protein Science, 15:14-27; Gill et al., 2006, Curr . Opin . Biotechnol ., 17:653-58; Nygren, 2008, FEBS J., 275:2668-76; 그리고 Skerra, 2008, FEBS J., 275:2677-83을 참조하고, 이들 각각은 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다. 일정한 구체예에서, Wnt-결합 폴리펩티드를 확인하고/생산하는데 파지 전시 기술이 이용된다. 일정한 구체예에서, 폴리펩티드는 단백질 A, 리포칼린, 피브로넥틴 도메인, 안키린 공통 반복 도메인, 그리고 티오레독신으로 구성되는 군에서 선택되는 유형의 단백질 뼈대를 포함한다.
일부 구체예에서, Wnt-결합 작용제는 비-단백질 분자이다. 일정한 구체예에서, 작용제는 소형 분자이다. 비-단백질 Wnt-결합 작용제의 확인에서 유용한 조합 화학 라이브러리 (combinatorial chemistry library)와 기술은 당업자에게 공지되어 있다. 예로써, Kennedy et al., 2008, J. Comb . Chem ., 10:345-54; Dolle et al, 2007, J. Comb . Chem ., 9:855-902; 그리고 Bhattacharyya, 2001, Curr . Med . Chem., 8:1383-404를 참조하고, 이들 각각은 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다. 일정한 추가의 구체예에서, 상기 작용제는 탄수화물, 글리코사미노글리칸, 당단백질, 또는 프로테오글리칸 (proteoglycan)이다.
일정한 구체예에서, 작용제는 핵산 앱타머 (aptamer)이다. 앱타머는 다른 분자에 결합하는 그들의 능력에 기초하여 선택되는 (가령, 무작위 또는 돌연변이 풀 (pool)로부터) 폴리뉴클레오티드 분자이다. 일부 구체예에서, 앱타머는 DNA 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일정한 대안적 구체예에서, 앱타머는 RNA 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일정한 구체예에서, 앱타머는 하나 또는 그 이상의 변형된 핵산 잔기를 포함한다. 단백질에 결합을 위한 핵산 앱타머를 산출하고 스크리닝하는 방법은 당분야에 널리 공지되어 있다. 예로써, U.S. Patent No. 5,270,163; 5,683,867; 5,763,595; 6,344,321; 7,368,236; 5,582,981; 5,756,291; 5,840,867; 7,312,325; 그리고 7,329,742, International Patent Publication No. WO 02/077262와 WO 03/070984, U.S. Patent Application Publication No. 2005/0239134; 2005/0124565; 그리고 2008/0227735를 참조하고, 이들 각각은 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다.
일정한 구체예에서, Wnt-결합 작용제는 생쥐, 게먹이 원숭이, 또는 인간에서 적어도 대략 5시간, 적어도 대략 10시간, 적어도 대략 24시간, 적어도 대략 3일, 적어도 대략 1주, 또는 적어도 대략 2주의 순환 반감기를 갖는다. 일정한 구체예에서, Wnt-결합 작용제는 생쥐, 게먹이 원숭이, 또는 인간에서 적어도 대략 10시간, 적어도 대략 24시간, 적어도 대략 3일, 적어도 대략 1주, 또는 적어도 대략 2주의 순환 반감기를 갖는 IgG (가령, IgG1 또는 IgG2) 항체이다. 작용제, 예를 들면, 폴리펩티드와 항체의 반감기를 증가시키는 방법은 당분야에 공지되어 있다. 가령, IgG 항체의 순환 반감기를 증가시키는 공지된 방법에는 pH 6.0에서 신생아 Fc 수용체 (FcRn)에 항체의 pH-의존성 결합을 증가시키는, Fc 영역 내에 돌연변이의 도입이 포함된다 (참조: U.S. Pat. Pub. No. 2005/0276799, 2007/0148164, 그리고 2007/0122403). Fc 영역이 없는 항체 단편의 순환 반감기를 증가시키는 공지된 방법에는 페길화와 같은 기술이 포함된다.
일정한 구체예에서, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 Wnt-결합 작용제와 폴리펩티드는 쥐에서 대략 2㎎/㎏ 내지 대략 10㎎/㎏ 범위에서 변하는 용량에서 꼬리 정맥을 통해 투여될 때, 적어도 대략 50시간의 반감기를 갖는다. 일정한 구체예에서, Wnt-결합 작용제 또는 폴리펩티드는 쥐에서 대략 10㎎/㎏의 용량에서 꼬리 정맥을 통해 투여될 때, 적어도 대략 50시간의 반감기를 갖는다. 일정한 구체예에서, Wnt-결합 작용제 또는 폴리펩티드는 쥐에서 대략 2㎎/㎏ 내지 대략 10㎎/㎏ 범위에서 변하는 용량에서 꼬리 정맥을 통해 투여될 때, 적어도 대략 100시간의 반감기를 갖는다. 일정한 구체예에서, Wnt-결합 작용제 또는 폴리펩티드는 쥐에서 대략 10㎎/㎏의 용량에서 꼬리 정맥을 통해 투여될 때, 적어도 대략 100시간의 반감기를 갖는다. 일정한 구체예에서, Wnt-결합 작용제는 쥐에서 대략 2㎎/㎏ 내지 대략 10㎎/㎏ 범위에서 변하는 용량에서 꼬리 정맥을 통해 투여될 때, 적어도 대략 120시간의 반감기를 갖는다. 일정한 구체예에서, Wnt-결합 작용제는 쥐에서 대략 2㎎/㎏ 내지 대략 10㎎/㎏ 범위에서 변하는 용량에서 꼬리 정맥을 통해 투여될 때, 적어도 대략 150시간의 반감기를 갖는다.
일정한 구체예에서, 작용제는 인간 FZD 수용체의 Fri 도메인 (또는 하나 또는 그 이상의 Wnt에 결합하는 Fri 도메인의 단편 또는 변이체) 및 인간 Fc 영역을 포함하고, 그리고 FZD 수용체의 세포외 도메인 및 인간 Fc 영역을 포함하는 가용성 FZD 수용체보다 긴 생체내 반감기 (가령, 생쥐 또는 쥐에서)를 갖는 가용성 FZD 수용체이다. 본 명세서에서 기술된 Wnt-결합 작용제 또는 폴리펩티드를 생산하는 세포가 제시된다. 일부 구체예에서, 세포는 인간 FZD8의 Fri 도메인을 포함하는 가용성 Wnt-결합 작용제를 생산하고, 여기서 Wnt-결합 작용제 중에서 적어도 대략 80%는 ASA의 N-말단 서열을 갖는다. 일부 구체예에서, 세포는 인간 FZD8의 Fri 도메인을 포함하는 가용성 Wnt-결합 작용제를 생산하고, 여기서 Wnt-결합 작용제 중에서 적어도 대략 85%, 적어도 대략 90%, 적어도 대략 95%, 또는 적어도 대략 98%는 ASA의 N-말단 서열을 갖는다. 일부 구체예에서, 세포는 포유동물 세포이다. 일부 구체예에서, 세포는 인간 Fc 영역을 포함하는 Wnt-결합 작용제를 생산한다. 일부 구체예에서, 세포는 서열 번호:53, 서열 번호:50, 서열 번호:46, 서열 번호:48, 그리고 서열 번호:1로 구성되는 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 Wnt-결합 작용제를 생산한다. 일부 구체예에서, 세포는 서열 번호:53의 아미노산 서열을 포함하는 Wnt-결합 작용제를 생산한다. 일부 구체예에서, 세포는 서열 번호:50의 아미노산 서열을 포함하는 Wnt-결합 작용제를 생산한다.
본 명세서에서 기술된 세포에 의해 생산된 Wnt-결합 작용제가 제시된다.
본 명세서에서 기술된 Wnt-결합 작용제 또는 폴리펩티드를 포함하는 조성물 역시 제시된다. 일부 구체예에서, 조성물은 인간 FZD8의 Fri 도메인을 포함하는 가용성 Wnt-결합 작용제를 포함하고, 여기서 Wnt-결합 작용제 중에서 적어도 대략 80%는 ASA의 N-말단 서열을 갖는다. 일부 구체예에서, 조성물은 인간 FZD8의 Fri 도메인을 포함하는 가용성 Wnt-결합 작용제를 포함하고, 여기서 Wnt-결합 작용제 중에서 적어도 대략 85%, 적어도 대략 90%, 적어도 대략 95%, 또는 적어도 대략 98%는 ASA의 N-말단 서열을 갖는다. 일부 구체예에서, 조성물은 인간 Fc 영역을 포함하는 Wnt-결합 작용제를 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물은 서열 번호:53, 서열 번호:50, 서열 번호:46, 서열 번호:48, 그리고 서열 번호:1로 구성되는 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 Wnt-결합 작용제를 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물은 서열 번호:53의 아미노산 서열을 포함하는 Wnt-결합 작용제를 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물은 서열 번호:50의 아미노산 서열을 포함하는 Wnt-결합 작용제를 포함한다. 일부 구체예에서, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 조성물은 제약학적으로 허용되는 담체를 더욱 포함한다.
본 명세서에서 기술된 Wnt-결합 작용제 또는 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 이용하는 방법 역시 제시된다.
III. 폴리뉴클레오티드
일정한 구체예에서, 본 발명은 인간 Wnt 단백질 또는 이런 폴리펩티드의 단편에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 가령, 본 발명에서는 가용성 FZD 수용체를 인코딩하거나, 또는 이런 가용성 수용체의 단편을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제시한다. 일부 구체예에서, 본 발명에서는 가용성 SFRP, 가용성 Ror 단백질, 또는 이런 가용성 단백질의 단편을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제시한다. 일부 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 본 명세서에서 기술된 임의의 Wnt-결합 작용제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 RNA의 형태 또는 DNA의 형태일 수 있다. DNA에는 cDNA, 게놈 DNA, 그리고 합성 DNA가 포함되고; 그리고 이중 가닥 또는 단일 가닥일 수 있고, 그리고 단일 가닥이면, 코딩 가닥 또는 비-코딩 (항-센스) 가닥일 수 있다.
일정한 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 단리된다. 일정한 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 실질적으로 순수하다.
본 발명에서는 서열 번호:1, 서열 번호:45, 서열 번호:46, 서열 번호:47, 서열 번호:48, 서열 번호:49, 서열 번호:50, 서열 번호:51, 서열 번호:52, 서열 번호:53, 서열 번호:54, 서열 번호:55, 서열 번호:65, 서열 번호:66 및 서열 번호:75의 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제시한다. 일부 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 번호:67, 서열 번호:68, 서열 번호:69, 서열 번호:70, 서열 번호:71, 서열 번호:72, 서열 번호:73, 그리고 서열 번호:74로 구성되는 군에서 선택되는 폴리펩티드 신호 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 더욱 포함한다. 일부 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 번호:70, 서열 번호:71, 서열 번호:72, 서열 번호:73, 그리고 서열 번호:74로 구성되는 군에서 선택되는 폴리펩티드 신호 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 더욱 포함한다. 일부 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 번호:71 및 서열 번호:50의 서열을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 번호:71 및 서열 번호:53의 서열을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 번호:75의 서열을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 본 발명에서는 서열 번호:2의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 더욱 제시한다.
본 발명에서는 서열 번호:71, 서열 번호:70, 서열 번호:72, 서열 번호:73 및 서열 번호:74로 구성되는 군에서 선택되는 신호 서열; 인간 FZD8의 Fri 도메인; 그리고 인간 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제시한다. 일부 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 번호:71의 신호 서열; 인간 FZD8의 Fri 도메인; 그리고 인간 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
또한, 서열 번호:2의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및/또는 서열 번호:1, 서열 번호:45, 서열 번호:46, 서열 번호:47, 서열 번호:48, 서열 번호:49, 서열 번호:50, 서열 번호:51, 서열 번호:52, 서열 번호:53, 서열 번호:54, 서열 번호:55, 서열 번호:65, 서열 번호:66 및 서열 번호:75의 서열을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 혼성화되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드가 제시된다. 일정한 구체예에서, 혼성화는 높은 엄밀도의 조건 하에 있다.
일정한 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 동일한 해독 틀 내에서, 예로써 숙주 세포로부터 폴리펩티드의 발현과 분비를 보조하는 폴리뉴클레오티드 (가령, 세포로부터 폴리펩티드의 수송을 제어하기 위한 분비 서열로서 기능하는 리더 서열 또는 신호 서열)에 연결된 성숙 폴리펩티드에 대한 코딩 서열을 포함한다. 리더 서열을 갖는 폴리펩티드는 전단백질 (preprotein)이고, 그리고 성숙 형태의 폴리펩티드를 형성하기 위해 숙주 세포에 의해 절단되는 리더 서열을 가질 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 또한, 성숙 단백질 + 추가의 5' 아미노산 잔기인 전구단백질 (proprotein)을 인코딩할 수 있다. 전구서열 (presequence)을 갖는 성숙 단백질은 전구단백질이고, 그리고 비활성 형태의 단백질이다. 일단 전구서열이 절단되면, 활성 성숙 단백질이 남게 된다.
일정한 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 동일한 해독 틀 내에서, 예로써 인코딩된 폴리펩티드의 정제를 가능하게 하는 마커 서열에 연결된 성숙 폴리펩티드에 대한 코딩 서열을 포함한다. 가령, 마커 서열은 세균 숙주의 경우에 마커에 연결된 성숙 폴리펩티드의 정제를 제공하기 위해 pQE-9 벡터에 의해 공급된 헥사히스티딘 태그일 수 있거나, 또는 마커 서열은 포유동물 숙주 (가령, COS-7 세포)가 이용될 때, 인플루엔자 적혈구응집소 단백질로부터 유래된 적혈구응집소 (HA) 태그일 수 있다.
더 나아가, 본 발명은 예로써, 단편, 유사체, 그리고 유도체를 인코딩하는 앞서 기술된 폴리뉴클레오티드의 변이체에 관계한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 단편 또는 부분은 본 발명의 전장 폴리뉴클레오티드를 합성하는데 이용될 수 있다.
일정한 구체예에서, 본 발명에서는 가용성 FZD 수용체 또는 본 명세서에서 기술된 다른 Wnt-결합 작용제를 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 적어도 80% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 95% 동일한, 그리고 일부 구체예에서, 적어도 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제시한다.
참고 뉴클레오티드 서열에 예로써, 적어도 95% "동일한" 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해, 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열은 이러한 폴리뉴클레오티드 서열이 참고 뉴클레오티드 서열의 각 100개 뉴클레오티드당 최대 5개의 점 돌연변이 (point mutation)을 포함할 수 있다는 것을 제외하고, 참고 서열에 동일한 것으로 의도된다. 다시 말하면, 참고 뉴클레오티드 서열에 적어도 95% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 획득하기 위해, 참고 서열 내에서 최대 5%의 뉴클레오티드가 결실되거나, 또는 다른 뉴클레오티드로 치환되거나, 또는 참고 서열 내에서 전체 뉴클레오티드의 최대 5% 숫자의 뉴클레오티드가 참고 서열 내로 삽입될 수 있다. 참고 서열의 이들 돌연변이는 참고 뉴클레오티드 서열의 아미노- 또는 카르복시-말단 위치에서, 또는 이들 말단 위치 사이에 임의의 위치에서 일어날 수 있고, 참고 서열 내에 뉴클레오티드 사이에 또는 참고 서열 내에 하나 또는 그 이상의 인접 기에서 개별적으로 산재된다.
폴리뉴클레오티드 변이체는 코딩 영역, 비-코딩 영역, 또는 둘 모두에서 변형을 내포할 수 있다. 일부 구체예에서, 폴리뉴클레오티드 변이체는 침묵 아미노산 치환, 부가, 또는 결실을 유발하지만, 인코딩된 폴리펩티드의 성질 또는 활성을 변화시키지 않는 변형을 내포한다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드 변이체는 유전자 코드의 축중성 (degeneracy)으로 인한 침묵 치환에 의해 생산된다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드 변이체는 비록 아미노산 서열이 변하진 않지만, 발현 차이 (가령, 증가된 또는 감소된 발현)을 유발하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 폴리뉴클레오티드 변이체는 다양한 이유로, 예를 들면, 특정 숙주에 대한 코돈 발현을 최적화 (인간 mRNA에서 코돈을 세균 숙주, 예를 들면, 대장균 (E. coli)에 의해 선호되는 코돈으로 변경)시키기 위해 생산될 수 있다.
본 명세서에서 기술된 폴리뉴클레오티드는 당분야에 공지된 임의의 적절한 방법에 의해 생산될 수 있다. 본 명세서에서 기술된 바와 같이 일부 구체예에서, DNA 서열은 목적되는 야생형 단백질을 인코딩하는 DNA 서열을 단리하거나 합성함으로써 재조합 기술을 이용하여 작제된다. 일부 구체예에서, DNA 서열은 목적되는 2개의 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 DNA 서열을 단리하고 이들 DNA 서열을 함께 결찰시켜 융합 단백질을 산출함으로써, 재조합 기술을 이용하여 작제된다.
일부 구체예에서, DNA 서열은 올리고뉴클레오티드 합성장치를 이용한 화학적 합성에 의해 작제될 수 있다. 이런 올리고뉴클레오티드는 원하는 폴리펩티드의 아미노산 서열에 기초하여 설계될 수 있다. 표준 방법은 목적되는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 합성하는데 적용될 수 있다. 가령, 역번역 (back-translation)된 유전자를 작제하기 위해 완전한 아미노산 서열이 이용될 수 있다. 게다가, 특정 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 내포하는 DNA 올리고머가 합성될 수 있다. 가령, 원하는 폴리펩티드의 일부분을 코딩하는 몇몇 작은 올리고뉴클레오티드가 합성되고, 이후 결찰될 수 있다. 개별 올리고뉴클레오티드는 전형적으로, 상보적 집합 (complementary assembly)을 위한 5' 또는 3' 오버행 (overhang)을 내포한다. 일부 구체예에서, 원하는 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 2개 폴리펩티드가 개재성 펩티드 링커 없이 직접적으로 연결되도록 합성된다.
일단 집합되면 (합성, 특정 부위 돌연변이유발, 재조합 기술, 또는 기타 방법에 의해), 목적되는 특정 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 발현 벡터 내로 삽입되고 원하는 숙주에서 상기 폴리펩티드의 발현에 적합한 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 적절한 집합은 뉴클레오티드 염기서열분석, 제한 맵핑 (restriction mapping), 및/또는 적절한 숙주에서 생물학적 활성 폴리펩티드의 발현에 의해 확증될 수 있다. 당분야에 널리 공지된 바와 같이, 숙주에서 형질감염된 유전자의 높은 발현 수준을 획득하기 위해, 유전자는 선택된 발현 숙주에서 기능적인 전사와 번역 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결되어야 한다.
본 명세서에서 기술된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 제시된다. 본 명세서에서 기술된 벡터 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포 역시 제시된다.
IV. 제약학적 조성물
더 나아가, 본 발명에서는 하나 또는 그 이상의 Wnt 단백질에 결합하고 및/또는 Wnt 길항약인 작용제 (가령, 가용성 FZD 수용체)를 포함하는 제약학적 조성물을 제시한다. 일부 구체예에서, 제약학적 조성물은 본 명세서에서 기술된 바와 같은 Wnt-결합 작용제와 폴리펩티드를 포함한다. 이들 제약학적 조성물은 인간 환자에서 종양 세포 성장을 저해하고 암을 치료하는데 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 본 명세서에서 기술된 Wnt-결합 작용제는 암의 치료를 위한 약제의 제조에 이용될 수 있다.
제제 (formulation)는 본 발명의 정제된 작용제 또는 길항약을 무균 동결 건조된 분말, 수성 용액 등으로서 제약학적으로 허용되는 담체, 부형제, 및/또는 안정제와 화합시킴으로써 보관과 이용을 위해 제조된다 (Remington : The Science and Practice of Pharmacy , 21 st Edition, University of the Sciences, Philadelphia, 2005). 적절한 담체, 부형제, 또는 안정제는 비독성 완충제, 예를 들면, 포스페이트, 시트레이트, 그리고 기타 유기 산; 염, 예를 들면, 염화나트륨; 아스코르브산과 메티오닌을 비롯한 항산화제; 보존제 (가령, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 염화물; 헥사메토늄 염화물; 벤잘코늄 염화물; 벤제토늄 염화물; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예를 들면, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥사놀; 3-펜타놀; 그리고 m-크레졸); 저분자량 폴리펩티드 (가령, 대략 10개 이하의 아미노산 잔기); 단백질, 예를 들면, 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들면, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들면, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 리신; 탄수화물, 예를 들면, 단당류, 이당류, 글루코오스, 만노오스, 또는 덱스트린; 킬레이트화 작용제, 예를 들면, EDTA; 당, 예를 들면, 수크로오스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대 이온, 예를 들면, 나트륨; 금속 복합체 (가령, Zn-단백질 복합체); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예를 들면, TWEEN 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함한다.
본 발명의 제약학적 조성물은 국소 또는 전신 치료를 위한 다양한 방식으로 투여될 수 있다. 투여는 국소 (가령, 질과 직장 전달을 비롯한 점막에), 예를 들면, 경피 패치, 연고, 로션, 크림, 겔, 점안약, 좌약, 스프레이, 액체와 분말; 폐 (가령, 분무기에 의해; 기관내, 비내, 표피와 경피를 비롯하여, 분말 또는 에어로졸의 흡입 또는 호흡에 의해); 경구; 또는 정맥내, 동맥내, 피하, 복막내 또는 근육내 주사 또는 주입을 비롯한 비경구; 또는 두개내 (가령, 척추강내 또는 뇌실내) 투여일 수 있다.
치료 제제는 단위 제형 (unit dosage form)일 수 있다. 이런 제제에는 경구, 비경구, 또는 직장 투여를 위한, 또는 흡입에 의한 투여를 위한 정제, 알약, 캡슐, 분말, 과립, 물 또는 비-수성 매체에서 용액 또는 현탁액, 또는 좌약이 포함된다. 고형 조성물, 예를 들면, 정제에서 주요 활성 성분은 제약학적 담체와 혼합된다. 전통적인 정제화 (tableting) 성분은 본 발명의 화합물, 또는 이의 비-독성 제약학적으로 허용되는 염의 상동성 혼합물을 내포하는 고형 전제제 (performulation) 조성물을 형성하기 위해 옥수수 전분, 락토오스, 수크로오스, 소르비톨, 활석, 스테아르산, 마그네슘 스테아레이트, 이칼슘 포스페이트 또는 검, 그리고 기타 희석제 (가령, 물)를 포함한다. 고형 전제제 조성물은 이후, 앞서 기술된 유형의 단위 제형으로 세분된다. 신규한 조성물의 정제, 알약 등은 연장된 작용의 이점을 제공하는 제형을 산출하기 위해 코팅되거나, 또는 달리 화합될 수 있다. 가령, 정제 또는 알약은 외부 성분에 의해 감춰진 내부 조성물을 포함할 수 있다. 게다가, 이들 두 성분은 분해에 저항하고, 그리고 내부 성분이 본래대로 장을 통과하도록, 또는 지연 방출될 수 있도록 기능하는 장용 층 (enteric layer)에 의해 격리될 수 있다. 다수의 고분자산 (polymeric acid) 및 고분자산과 셸락, 세틸 알코올과 셀룰로오스 아세테이트와 같은 물질의 혼합물을 비롯한 다양한 물질이 이런 장용 층 또는 코팅에 이용될 수 있다.
제약학적 제제는 리포좀과 복합된 본 발명의 길항약 (가령, Wnt-결합 작용제)을 포함한다 (Epstein et al., 1985, PNAS , 82:3688; Hwang et al.,1980, PNAS, 77:4030; 그리고 U.S. Patent No. 4,485,045와 4,544,545). 증강된 순환 시간을 갖는 리포좀은 U.S. Patent 5,013,556에서 개시된다. 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤, 그리고 PEG-유도체화된 포스파티딜에탄올아민 (PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물에서 역상 증발 (reverse phase evaporation)에 의해 산출될 수 있다. 리포좀은 원하는 직경을 갖는 리포좀을 산출하기 위해 규정된 구멍 크기의 필터를 통해 사출 성형된다.
길항약 (가령, Wnt-결합 작용제)은 또한, 마이크로캡슐 내에 포집될 수 있다. 이런 마이크로캡슐은 Remington : The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, University of the Sciences, Philadelphia, 2005에서 기술된 바와 같이, 각각, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (가령, 리포좀, 알부민 마이크로구체, 마이크로에멀젼, 나노-입자 및 나노캡슐)에서 또는 마크로에멀젼에서, 예로써 코아세르베이션 (coacervation) 기술 또는 계면 중합화 (interfacial polymerization)에 의해, 예를 들면, 히드록시메틸셀룰로오스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐에 의해 제조된다.
이에 더하여, 서방 제조물이 제조될 수 있다. 서방 제조물의 적절한 실례에는 본 발명의 작용제를 내포하는 고형 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되고, 상기 매트릭스는 성형된 물품 (shaped article) (가령, 필름 또는 마이크로캡슐)의 형태이다. 서방 매트릭스의 실례에는 폴리에스테르, 히드로겔, 예를 들면, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알코올), 폴리락티드 (U.S. Patent No. 3,773,919), L-글루타민산과 7 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예를 들면, LUPRON DEPOT™ (락트산-글리콜산 공중합체와 류프롤리드 아세테이트로 구성되는 주사가능 마이크로구체), 수크로오스 아세테이트 이소부티레이트, 그리고 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산이 포함된다.
V. 이용 방법
본 발명의 Wnt-결합 작용제 (가용성 수용체 포함)는 치료적 처리 방법, 예를 들면, 암의 치료가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 다양한 적용에 유용하다. 일정한 구체예에서, 이들 작용제는 Wnt 신호전달 (가령, 정준 Wnt 신호전달)을 저해하고, 종양 성장을 저해하고, 분화를 유도하고, 종양 체적을 감소시키고, 암 줄기 세포 빈도를 감소시키고, 및/또는 종양의 종양원성을 감소시키는데 유용하다. 이들 이용 방법은 시험관내, 탈체, 또는 생체내 방법일 수 있다. 일정한 구체예에서, Wnt-결합 작용제 또는 폴리펩티드는 그가 결합하는 하나 또는 그 이상의 인간 Wnt 단백질의 길항약이다.
일정한 구체예에서, Wnt-결합 작용제 또는 길항약은 Wnt 신호전달 활성화와 연관된 질환의 치료에 이용된다. 특정 구체예에서, 질환은 Wnt 신호전달에 의존하는 질환이다. 특정 구체예에서, Wnt 신호전달은 정준 Wnt 신호전달이다. 일정한 구체예에서, Wnt-결합 작용제 또는 길항약은 줄기 세포 및/또는 전구 세포의 증가된 수준으로 특징되는 장애의 치료에 이용된다.
일정한 구체예에서, Wnt-결합 작용제 또는 길항약 (가령, 가용성 FZD 수용체, SFRP-유래된 단백질, 또는 가용성 Ror 수용체)으로 치료되는 질환은 암이다. 일정한 구체예에서, 암은 Wnt-의존성 종양으로 특징된다. 일정한 구체예에서, 암은 Wnt-결합 작용제 (가령, 가용성 수용체)가 결합하는 하나 또는 그 이상의 Wnt을 발현하는 종양으로 특징된다.
일정한 구체예에서, Wnt-결합 작용제 또는 길항약으로 치료되는 질환은 암이 아니다. 가령, 질환은 대사 장애, 예를 들면, 비만 또는 당뇨병 (가령, II형 당뇨병)일 수 있다 (Jin T., 2008, Diabetologia, 51:1771-80). 대안으로, 질환은 골 장애, 예를 들면, 골다공증, 골관절염, 또는 류머티스성 관절염일 수 있다 (Corr M., 2008, Nat . Clin . Pract . Rheumatol., 4:550-6; Day et al., 2008, Bone Joint Surg. Am ., 90 Suppl 1:19-24). 질환은 또한, 신장 장애, 예를 들면, 다낭성 신장 질환일 수도 있다 (Harris et al., 2009, Ann . Rev . Med ., 60:321-37; Schmidt-Ott et al., 2008, Kidney Int ., 74:1004-8; Benzing et al., 2007, J. Am . Soc . Nephrol., 18:1389-98). 대안으로, 황반 변성 (macular degeneration) 및 가족성 삼출성 초자체망막증 (familial exudative vitreoretinopathy)이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 눈 장애가 치료될 수 있다 (Lad et al., 2009, Stem Cells Dev ., 18:7-16). 심근경색, 죽상경화증, 그리고 판막 장애를 비롯한 심혈관 장애 역시 치료될 수 있다 (Al-Aly Z., 2008, Transl . Res ., 151:233-9; Kobayashi et al., 2009, Nat . Cell Biol ., 11:46-55; van Gijn et al., 2002, Cardiovasc . Res ., 55:16-24; Christman et al., 2008, Am . J. Physiol . Heart Circ . Physiol ., 294:H2864-70). 일부 구체예에서, 질환은 폐 장애, 예를 들면, 특발성 폐 동맥 고혈압 또는 폐 섬유증이다 (Laumanns et al., 2008, Am . J. Respir . Cell Mol . Biol., 2009, 40:683-91; Konigshoff et al., 2008 PLoS ONE, 3:e2142). 일부 구체예에서, Wnt-결합 작용제로 치료되는 질환은 간 질환, 예를 들면, 간경변 또는 간 섬유증이다 (Cheng et al., 2008, Am . J. Physiol . Gastrointest . Liver Physiol ., 294:G39-49).
본 발명에서는 암을 치료하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 Wnt-결합 작용제의 치료 효과량을 개체 (가령, 치료가 필요한 개체)에 투여하는 단계를 포함한다. 일정한 구체예에서, 암은 결장직장 암, 췌장 암, 폐 암, 난소 암, 간 암, 유방 암, 신장 암, 전립선 암, 위장 암, 흑색종, 자궁경부 암, 방광 암, 아교모세포종, 그리고 두경부 암으로 구성되는 군에서 선택되는 암이다. 일정한 구체예에서, 암은 췌장 암이다. 일정한 구체예에서, 암은 결장직장 암이다. 일정한 구체예에서, 암은 유방 암이다. 일정한 구체예에서, 개체는 인간이다.
더 나아가, 본 발명에서는 본 명세서에서 기술된 Wnt-결합 작용제를 이용하여 종양 성장을 저해하는 방법을 제시한다. 일정한 구체예에서, 종양 성장을 저해하는 방법은 시험관내에서 종양 또는 종양 세포를 Wnt-결합 작용제와 접촉시키는 단계를 포함한다. 가령, 표적화된 Wnt(들)를 발현하는 영속화된 세포주 또는 암 세포주는 종양 세포 성장을 저해하기 위해 Wnt-결합 작용제가 첨가되는 배지에서 배양된다. 일부 구체예에서, 종양 세포는 환자 샘플, 예를 들면, 조직 생검, 흉막 삼출액 (pleural effusion), 또는 혈액 샘플로부터 단리되고, 그리고 종양 세포 성장을 저해하기 위해 Wnt-결합 작용제가 첨가되는 배지에서 배양된다.
일부 구체예에서, 종양 성장을 저해하는 방법은 생체내에서 종양 또는 종양 세포를 Wnt-결합 작용제 (가령, FZD 가용성 수용체)와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일정한 구체예에서, 종양 또는 종양 세포와 Wnt-결합 작용제의 접촉은 동물 모형에서 수행된다. 가령, Wnt-결합 작용제는 종양 성장을 저해하기 위해 면역약화된 생쥐 (가령, NOD/SCID 생쥐)에서 성장된, 하나 또는 그 이상의 Wnt를 발현하는 이종이식편에 투여될 수 있다. 일정한 구체예에서, 암 줄기 세포는 환자 샘플, 예를 들면, 조직 생검, 흉막 삼출액, 또는 혈액 샘플로부터 단리되고 면역약화된 생쥐 내로 주입되고, 이들 생쥐는 그 이후에, 종양 세포 성장을 저해하는 Wnt-결합 작용제가 투여된다. 일부 구체예에서, Wnt-결합 작용제는 종양 성장을 예방하기 위해 동물 내로 발암성 세포의 도입과 동시에 또는 도입 직후에 투여된다. 일부 구체예에서, Wnt-결합 작용제는 발암성 세포가 특정된 크기의 종양으로 성장한 이후에, 치료제로서 투여된다.
일정한 구체예에서, 종양의 성장을 저해하는 방법은 Wnt-결합 작용제의 치료 효과량을 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 일정한 구체예에서, 개체는 인간이다. 일정한 구체예에서, 개체는 종양을 앓거나, 또는 종양이 제거되었다.
본 발명에서는 또한, 암 줄기 세포를 포함하는 종양 내에서 암 줄기 세포 빈도를 감소시키는 방법을 제시하고, 상기 방법은 Wnt-결합 작용제의 치료 효과량를 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 이에 더하여, 개체에서 종양 세포의 분화를 유도하는 방법이 제시되고, 상기 방법은 Wnt-결합 작용제의 치료 효과량을 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 종양 내에서 분화 마커의 발현을 유도하는 방법은 Wnt-결합 작용제의 치료 효과량을 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 일정한 구체예에서, 개체는 인간이다.
일정한 구체예에서, 종양은 Wnt 신호전달이 활동성인 종양이다. 일정한 구체예에서, 활동성인 Wnt 신호전달은 정준 Wnt 신호전달이다. 일정한 구체예에서, 종양은 Wnt-의존성 종양이다. 가령, 일부 구체예에서, 종양은 액신 과다발현에 민감하다. 일정한 구체예에서, 종양은 선종성 결장 용종증 (APC) 종양 억제자 유전자에서 비활성화 돌연변이 (가령, 절두 돌연변이) 또는 베타-카테닌 유전자에서 활성화 돌연변이를 포함하지 않는다. 일정한 구체예에서, 종양은 Wnt 유전자 서명에서 하나 또는 그 이상의 유전자를 발현한다. 일정한 구체예에서, 개체에서 치료되는 암은 이런 종양을 수반한다.
일정한 구체예에서, 종양은 Wnt-결합 작용제가 결합하는 하나 또는 그 이상의 인간 Wnt 단백질을 발현한다. 일정한 구체예에서, 종양은 인간 Wnt(들)를 과다발현한다.
일정한 구체예에서, 종양은 결장직장 종양, 췌장 종양, 폐 종양, 난소 종양, 간 종양, 유방 종양, 신장 종양, 전립선 종양, 위장 종양, 흑색종, 자궁경부 종양, 방광 종양, 아교모세포종, 그리고 두경부 종양으로 구성되는 군에서 선택되는 종양이다. 일정한 구체예에서, 종양은 결장직장 종양이다. 일정한 구체예에서, 종양은 췌장 종양이다. 일정한 구체예에서, 종양은 유방 종양이다.
본 발명에서는 또한, 세포에서 Wnt 신호전달을 저해하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 세포를 효과량의 Wnt-결합 작용제와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일정한 구체예에서, 세포는 종양 세포이다. 일정한 구체예에서, 이러한 방법은 생체내 방법이고, 여기서 세포를 작용제와 접촉시키는 단계는 치료 효과량의 작용제를 개체에 투여하는 것을 포함한다. 일부 대안적 구체예에서, 이러한 방법은 시험관내 또는 탈체 방법이다. 일정한 구체예에서, 저해되는 Wnt 신호전달은 정준 Wnt 신호전달이다. 일정한 구체예에서, Wnt 신호전달은 Wnt1, Wnt2, Wnt3, Wnt3a, Wnt7a, Wnt7b, 및/또는 Wnt10b에 의한 신호전달이다. 일정한 구체예에서, Wnt 신호전달은 Wnt1, Wnt3a, Wnt7b, 및/또는 Wnt10b에 의한 신호전달이다.
이에 더하여, 본 발명에서는 개체에서 종양의 종양원성을 감소시키는 방법을 제시하고, 상기 방법은 Wnt-결합 작용제의 치료 효과량을 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 일정한 구체예에서, 종양은 암 줄기 세포를 포함한다. 일부 구체예에서, 종양의 종양원성은 종양 내에서 암 줄기 세포의 빈도를 감소시킴으로써 감소된다. 일정한 구체예에서, 종양 내에서 암 줄기 세포의 빈도는 Wnt-결합 작용제의 투여에 의해 감소된다. 일정한 구체예에서, 작용제 또는 항체는 동물 모형, 예를 들면, 생쥐 이종이식편 모형에서 암 줄기 세포를 포함하는 종양의 종양원성을 감소시킬 수 있다. 일정한 구체예에서, 종양 내에서 암 줄기 세포의 숫자 또는 빈도는 적어도 대략 2-배, 대략 3-배, 대략 5-배, 대략 10-배, 대략 50-배, 대략 100-배, 또는 대략 1000-배 감소된다. 일정한 구체예에서, 암 줄기 세포의 숫자 또는 빈도에서 감소는 동물 모형을 이용한 제한 희석 측정법에 의해 측정된다. 종양 내에서 암 줄기 세포의 숫자 또는 빈도에서 감소를 측정하는 제한 희석 측정법의 이용에 관한 추가의 실례와 보도는 예로써, International Publication Number WO 2008/042236, U.S. Patent Application Publication No. 2008/0064049, 그리고 U.S. Patent Application Publication No. 2008/0178305에서 찾아볼 수 있고, 이들 각각은 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다.
따라서 본 발명에서는 또한, 암 줄기 세포를 포함하는 종양 내에서 암 줄기 세포의 빈도를 감소시키는 방법을 제시하고, 상기 방법은 종양을 효과량의 Wnt-결합 작용제 (가령, 가용성 FZD 수용체, 가용성 Ror 수용체 또는 SFRP-Fc 융합체)와 접촉시키는 단계를 포함한다.
더 나아가, 본 발명에서는 발암성 세포를 비-발암성 세포로 분화시키는 방법을 제시하고, 상기 방법은 발암성 세포를 Wnt-결합 작용제와 접촉시키는 단계 (가령, 발암성 세포를 포함하는 종양을 앓거나, 또는 이런 종양이 제거된 개체에 Wnt-결합 작용제를 투여함으로써)를 포함한다. 일정한 구체예에서, 발암성 세포는 췌장 종양 세포이다. 일정한 대안적 구체예에서, 발암성 세포는 결장 종양 세포이다.
종양 세포가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 세포의 분화를 유도하기 위한 본 명세서에서 기술된 Wnt-결합 작용제의 용도 역시 제시된다. 가령, 세포를 본 명세서에서 기술된 효과량의 Wnt-결합 작용제 (가령, 가용성 FZD 수용체, 가용성 Ror 수용체, 또는 SFRP-Fc 융합체)와 접촉시키는 단계를 포함하는, 세포의 분화를 유도하는 방법이 예기된다. Wnt-결합 작용제의 치료 효과량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 종양 내에서 세포의 분화를 유도하는 방법 역시 제시된다. 일정한 구체예에서, 종양은 췌장 종양이다. 일정한 다른 구체예에서, 종양은 결장 종양이다.
개체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법이 더욱 제시되고, 여기서 상기 질환 또는 장애는 Wnt 신호전달 활성화와 연관되고 및/또는 증가된 수준의 줄기 세포 및/또는 전구 세포로 특징된다. 일부 구체예에서, 이러한 치료 방법은 Wnt-결합 작용제의 치료 효과량을 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 일정한 구체예에서, Wnt 신호전달은 정준 Wnt 신호전달이다.
Wnt-결합 작용제 또는 길항약은 공지된 방법에 따라, 적절한 제약학적 조성물로서 인간 환자에 투여된다. 적절한 투여 방법에는 정맥내 (일시주사로서 또는 일정한 기간 동안 연속 주입에 의한 투여), 근육내, 복막내, 뇌척수내, 피하, 관절내, 활막내, 척추강내, 경구, 국소, 또는 흡입 루트가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
일정한 구체예에서, Wnt-결합 작용제의 투여에 추가하여, 상기 방법 또는 치료는 Wnt-결합 작용제의 투여에 앞서, 투여와 동시에, 및/또는 투여 이후에 두 번째 치료제 (가령, 항암제)를 투여하는 단계를 더욱 포함한다. Wnt-결합 작용제와 두 번째 치료제를 포함하는 제약학적 조성물 역시 제시된다.
Wnt-결합 작용제와 두 번째 치료제의 조합은 임의의 순서로 또는 동시에 투여될 수 있는 것으로 인지될 것이다. 선택된 구체예에서, Wnt-결합 작용제는 두 번째 치료제로 이전에 치료를 받았던 환자에 투여될 것이다. 일정한 다른 구체예에서, Wnt-결합 작용제와 두 번째 치료제는 실질적으로 동시에 또는 동시에 투여될 것이다. 가령, 개체는 두 번째 치료제 (가령, 화학요법)로 치료 과정을 받는 동안 Wnt-결합 작용제가 제공될 수 있다. 일정한 구체예에서, Wnt-결합 작용제는 두 번째 치료제로 치료의 1년 이내에 투여될 것이다. 일정한 대안적 구체예에서, Wnt-결합 작용제는 두 번째 치료제로 치료의 10, 8, 6, 4, 또는 2개월 이내에 투여될 것이다. 일정한 다른 구체예에서, Wnt-결합 작용제는 두 번째 치료제로 치료의 4, 3, 2, 또는 1주 이내에 투여될 것이다. 일부 구체예에서, Wnt-결합제는 두 번째 치료제로 치료의 5, 4, 3, 2, 또는 1일 이내에 투여될 것이다. 이들 2가지 작용제 또는 치료는 수시간 또는 수분 이내에 (즉, 실질적으로 동시에) 개체에 투여될 수 있는 것으로 더욱 인지될 것이다.
적어도 2가지 치료제로 복합 요법은 종종, 상이한 작용 기전으로 작용하는 작용제를 이용하지만, 이것이 반드시 필요한 것은 아니다. 상이한 작용 기전을 갖는 작용제를 이용한 복합 요법은 부가적인 또는 상승적인 효과를 유발할 수 있다. 복합 요법은 단독요법에서 이용되는 것보다 각 작용제의 적은 용량을 가능하게 하고, 따라서 독성 부작용을 감소시킬 수 있다. 복합 요법은 내성 암 세포가 발생하는 가능성을 감소시킬 수 있다. 일부 구체예에서, 복합 요법은 비-발암성 세포에 영향을 주는 (가령, 이들 세포를 저해하거나 사멸시키는) 치료제 및 발암성 CSC에 영향을 주는 (가령, 이들을 저해하거나 사멸시키는) 치료제를 포함한다.
유용한 부류의 치료 (가령, 항암) 작용제에는 예로써, 항튜불린 작용제, 아우리스타틴, DNA 작은 홈 결합제, DNA 복제 저해제, 알킬화 작용제 (가령, 플라티늄 복합체, 예를 들면, 시스-플라틴, 모노(플라티늄), 비스(플라티늄)과 삼핵 플라티늄 복합체 및 카보플라틴), 안트라사이클린, 항생제, 엽산길항제, 대사길항물질, 화학요법 증감제, 듀오카마이신, 에토포시드, 불화 피리미딘, 이온 투과 담체, 렉시트롭신 (lexitropsin), 니트로스우레아 (nitrosurea), 플라티놀, 이행 화합물 (performing compound), 퓨린 대사길항물질, 퓨로마이신, 방사선 증감제, 스테로이드, 탁산, 국소이성화효소 저해제, 빈카 알칼로이드 등이 포함된다. 일정한 구체예에서, 두 번째 치료제는 대사길항물질, 세포 분열 억제제, 국소이성화효소 저해제, 또는 혈관형성 저해제이다.
Wnt-결합 작용제와 공동으로 투여될 수 있는 치료제에는 화학치료제가 포함된다. 따라서 일부 구체예에서, 상기 방법 또는 치료는 본 발명의 Wnt-결합 작용제 및 화학치료제 또는 복수의 상이한 화학치료제의 칵테일의 병용 투여를 수반한다. Wnt-결합 작용제로 치료는 화학요법의 투여 이전에, 투여와 동시에, 또는 투여 이후에 일어날 수 있다. 본 발명에서 예기되는 화학요법은 당분야에 공지되고 상업적으로 구입가능한 화학적 물질 또는 약물, 예를 들면, 젬시타빈, 이리노테칸, 독소루비신, 5-플루오르우라실, 시토신 아라비노시드 ("Ara-C"), 시클로포스파미드, 티오테파, 부설판, 시톡신, 파클리탁셀, 메토트렉사트, 시스플라틴, 멜팔란, 빈블라스틴, 그리고 카보플라틴을 포함한다. 병용 투여는 단일 제약학적 제제에서 또는 별개의 제제를 이용한 공동-투여, 또는 어느 한쪽 순서로, 하지만 일반적으로, 모든 활성 작용제가 그들의 생물학적 활성을 동시에 발휘할 수 있도록 하는 기간 내에 연속 투여를 포함할 수 있다. 이런 화학치료제에 대한 제조와 투약 일정 (dosing schedule)은 제조업체의 지시에 따라, 또는 숙련된 전문가에 의해 경험적으로 결정되는 바와 같이 이용될 수 있다. 이런 화학요법에 대한 제조와 투약 일정은 또한, Chemotherapy Service Ed., M. C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, Md. (1992)에서 기술된다.
본 발명에 유용한 화학치료제에는 또한, 알킬화 작용제, 예를 들면, 티오테파와 시클로포스파미드; 알킬 설포네이트, 예를 들면, 부설판, 임프로설판, 그리고 피포설판; 아지리딘, 예를 들면, 벤조도파, 카르보쿠온, 메투레도파, 그리고 우레도파; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포라미드, 트리에틸렌티오포스포라미드 및 트리메틸로멜라민을 비롯한 에틸렌이민과 메틸아멜라민; 질소 겨자, 예를 들면, 클로람부실, 클로르나파진, 클로로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥시드 히드로클로라이드, 멜팔란, 노멥비신, 펜에스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 겨자; 니트로스우레아, 예를 들면, 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 라미무스틴; 항생제, 예를 들면, 아클라시노마이신, 악티노마이신, 안트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 칼리키아마이신, 카라비신, 카미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신, 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 퓨로마이신, 퀘라라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 튜베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 대사길항물질, 예를 들면, 메토트렉사트와 5-플루오르우라실 (5-FU); 엽산 유사체, 예를 들면, 데노프테린, 메토트렉사트, 프테로프테린, 트리메트렉사테; 퓨린 유사체, 예를 들면, 플루다라빈, 6-메르캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예를 들면, 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘, 5-FU; 안드로겐, 예를 들면, 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스탄올, 메피티오스탄, 테스톨락톤; 항-부신제, 예를 들면, 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 엽산 보충물, 예를 들면, 폴린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락사테; 데포파민; 데메콜친; 디아지쿠온; 엘포르미틴; 엘립티늄 아세테이트; 에토글루시드; 갈륨 니트레이트; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다민; 미토구아존; 미톡산트론; 모피다몰; 니트라크린; 펜토스타틴; 페나메트 (phenamet); 피라루비신; 포도필린산 (podophyllinic acid); 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK.; 라족산; 시조푸란; 스피로게르마늄; 테누아존산 (tenuazonic acid); 트리아지쿠온; 2,2',2''-트리클로로트리에틸아민; 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미톨락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 시클로포스파미드; 티오테파; 톡소이드, 예를 들면, 파클리탁셀 (TAXOL)과 도세탁셀 (TAXOTERE), 클로람부실; 젬시타빈; 6-티오구아닌; 메르캅토퓨린; 메토트렉사트; 플라티늄 유사체, 예를 들면, 시스플라틴과 카보플라틴; 빈블라스틴; 플라티늄; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미토마이신 C; 미톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 나벨빈; 노반트론; 테니포시드; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다; 이반드로네이트; CPT11; 국소이성화효소 저해제 RFS 2000; 디플루오르메틸로오르니틴 (DMFO); 레티노산; 에스페라마이신; 카페시타빈; 그리고 이들 중에서 한 가지의 제약학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 화학치료제에는 또한, 종양에 대한 호르몬 작용을 조절하거나 저해하는 기능을 하는 항-호르몬 작용제, 예를 들면, 타목시펜, 랄록시펜, 방향화효소 저해 4(5)-이미다졸, 4-히드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤, 그리고 토레미펜 (Fareston)과 같은 항-에스트로겐; 그리고 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 류프롤리드, 그리고 고세렐린과 같은 항-안드로겐; 그리고 이들 중에서 한 가지의 제약학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체가 포함된다.
일정한 구체예에서, 화학치료제는 국소이성화효소 저해제이다. 국소이성화효소 저해제는 국소이성화효소 (가령, 국소이성화효소 I 또는 II)의 작용을 간섭하는 화학요법 작용제이다. 국소이성화효소 저해제에는 독소루비신 HCl, 다우노루비신 시트레이트, 미톡산트론 HCl, 악티노마이신 D, 에토포시드, 토포테칸 HCl, 테니포시드 (VM-26), 그리고 이리노테칸이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 일정한 구체예에서, 두 번째 치료제는 이리노테칸이다. 일정한 구체예에서, 치료되는 종양은 결장직장 종양이고, 그리고 두 번째 치료제는 국소이성화효소 저해제, 예를 들면, 이리노테칸이다. 일부 구체예에서, Wnt-결합 작용제는 서열 번호:53을 포함하고, 그리고 두 번째 치료제는 이리노테칸이다. 일부 구체예에서, Wnt-결합 작용제는 서열 번호:75를 포함하고, 그리고 두 번째 치료제는 이리노테칸이다.
일정한 구체예에서, 화학치료제는 대사길항물질이다. 대사길항물질은 정상적인 생화학적 반응에 요구되는 대사산물과 유사하지만, 세포의 하나 또는 그 이상의 정상적인 기능, 예를 들면, 세포 분열을 간섭할 만큼 충분히 상이한 구조를 갖는 화학물질이다. 대사길항물질에는 젬시타빈, 플루오르우라실, 카페시타빈, 메토트렉사트 나트륨, 랄티트렉시드, 페메트렉시드, 테가푸르, 시토신 아라비노시드, 티오구아닌, 5-아자시티딘, 6-메르캅토퓨린, 아자티오프린, 6-티오구아닌, 펜토스타틴, 플루다라빈 포스페이트, 그리고 클라드리빈, 그리고 이들 중에서 한 가지의 제약학적으로 허용되는 염, 산, 또는 유도체가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 일정한 구체예에서, 두 번째 치료제는 젬시타빈이다. 일정한 구체예에서, 치료되는 종양은 췌장 종양이고, 그리고 두 번째 치료제는 대사길항물질 (가령, 젬시타빈)이다. 일부 구체예에서, Wnt-결합 작용제는 서열 번호:53을 포함하고, 그리고 두 번째 치료제는 젬시타빈이다. 일부 구체예에서, Wnt-결합 작용제는 서열 번호:75를 포함하고, 그리고 두 번째 치료제는 젬시타빈이다.
일정한 구체예에서, 화학치료제는 튜불린에 결합하는 작용제가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 유사분열제이다. 무제한적 실례로써, 작용제는 탁산을 포함한다. 일정한 구체예에서, 작용제는 파클리탁셀 또는 도세탁셀, 또는 파클리탁셀 또는 도세탁셀의 제약학적으로 허용되는 염, 산, 또는 유도체를 포함한다. 일정한 구체예에서, 작용제는 파클리탁셀 (TAXOL), 도세탁셀 (TAXOTERE), 알부민-결합된 파클리탁셀 (ABRAXANE), DHA-파클리탁셀, 또는 PG-파클리탁셀이다. 일정한 대안적 구체예에서, 유사분열제는 빈카 알칼로이드, 예를 들면, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 비노렐빈, 또는 빈데신, 또는 이들의 제약학적으로 허용되는 염, 산, 또는 유도체를 포함한다. 일부 구체예에서, 유사분열제는 Eg5 키네신의 저해제, 또는 오로라 A 또는 Plk1과 같은 유사분열 키나아제 (mitotic kinase)의 저해제이다. Wnt-결합 작용제 또는 폴리펩티드와 공동으로 투여된 화학치료제가 유사분열제를 포함하는 일정한 구체예에서, 치료되는 암 또는 종양은 유방 암 또는 유방 종양이다. 일정한 구체예에서, 치료되는 종양은 유방 종양이고, 그리고 두 번째 치료제는 파클리탁셀이다. 일부 구체예에서, Wnt-결합 작용제는 서열 번호:53을 포함하고, 그리고 두 번째 치료제는 파클리탁셀이다. 일부 구체예에서, Wnt-결합 작용제는 서열 번호:75를 포함하고, 그리고 두 번째 치료제는 파클리탁셀이다.
일정한 구체예에서, 치료는 본 발명의 Wnt-결합 작용제 및 방사선 요법의 병용 투여를 수반한다. Wnt-결합 작용제로 치료는 방사선 요법의 투여 이전에, 투여와 동시에, 또는 투여 이후에 일어날 수 있다. 이런 방사선 요법에 대한 투약 일정은 숙련된 전문가에 의해 경험적으로 결정되는 바와 같이 이용될 수 있다.
일부 구체예에서, 두 번째 치료제는 항체를 포함한다. 따라서 치료는 EGFR, ErbB2, HER2, DLL4, Notch, 및/또는 VEGF에 결합하는 항체가 포함되지만 이들에 국한되지 않는, 종양-연관된 항원에 대한 항체와 본 발명의 Wnt-결합 작용제의 병용 투여를 수반할 수 있다. 예시적인 항-DLL4 항체는 예로써, 본 발명에 순전히 참조로서 편입되는 U.S. Patent No. 7,750,124에서 기술된다. 추가의 항-DLL4 항체는 예로써, International Patent Publication No. WO 2008/091222와 WO 2008/0793326, 그리고 U.S. Patent Application Publication No. US 2008/0014196, US 2008/0175847, US 2008/0181899, 그리고 US 2008/0107648에서 기술되고, 이들 각각은 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다. 일정한 구체예에서, 두 번째 치료제는 혈관형성 저해제인 항체 (가령, 항-VEGF 항체)이다. 일부 구체예에서, Wnt-결합 작용제는 서열 번호:53을 포함하고, 그리고 두 번째 치료제는 항-VEGF 항체이다. 일부 구체예에서, Wnt-결합 작용제는 서열 번호:75를 포함하고, 그리고 두 번째 치료제는 항-VEGF 항체이다. 일정한 구체예에서, 두 번째 치료제는 Notch 신호전달의 저해제이다. 일부 구체예에서, 두 번째 치료제는 항-Notch 항체이다. 예시적인 항-Notch 항체는 예로써, 본 발명에 순전히 참조로서 편입되는 U.S. Patent Application Publication No. US 2008/0131434에서 기술된다. 일정한 구체예에서, 두 번째 치료제는 베바시주맙 (AVASTIN), 트라스투주맙 (HERCEPTIN), 파니투무맙 (VECTIBIX), 또는 세툭시맙 (ERBITUX)이다. 병용 투여는 단일 제약학적 제제에서 또는 별개의 제제를 이용한 공동-투여, 또는 어느 한쪽 순서로, 하지만 일반적으로, 모든 활성 작용제가 그들의 생물학적 활성을 동시에 발휘할 수 있도록 하는 기간 내에 연속 투여를 포함할 수 있다.
더 나아가, 치료는 하나 또는 그 이상의 사이토킨 (가령, 림포카인, 인터류킨, 종양 괴사 인자, 및/또는 성장 인자)의 투여를 포함할 수 있거나, 또는 종양 또는 암 세포의 외과적 제거, 또는 치료 의사에 의해 필요한 것으로 판단되는 임의의 다른 요법을 동반할 수 있다.
질환의 치료를 위해, 본 발명의 작용제의 적절한 용량은 치료되는 질환의 유형, 질환의 심각도와 경과, 질환의 반응성, 상기 작용제가 치료적 또는 예방적 목적으로 투여되는 지의 여부, 이전 요법, 환자의 병력, 그리고 치료 의사의 판단에서 기타 사항에 좌우된다. 작용제는 한 번에 또는 수일 내지 수개월 동안 지속되는 일련의 치료에 걸쳐 투여되거나, 또는 치료가 달성되거나 질환 상태의 감소 (가령, 종양 크기에서 감소)가 달성될 때까지 투여될 수 있다. 최적 투약 일정은 환자의 체내에서 약물 축척의 척도로부터 계산될 수 있고, 그리고 개별 작용제의 상대적인 효능에 따라 달라질 것이다. 투여 의사는 최적 용량, 투약 방법 및 반복 속도를 용이하게 결정할 수 있다. 일정한 구체예에서, 용량은 체중 ㎏당 0.01 ㎍ 내지 100 mg이고, 그리고 매일, 매주, 매월 또는 매년 1회 또는 그 이상 제공될 수 있다. 일정한 구체예에서, 가용성 수용체 또는 다른 Wnt-결합 작용제의 용량은 체중 ㎏당 대략 0.1 mg 내지 대략 20 mg 범위에서 변한다. 일정한 구체예에서, Wnt-결합 작용제는 매주 1회 제공된다. 일정한 구체예에서, Wnt-결합 작용제는 2주마다 1회 또는 3주마다 1회 제공된다. 치료 의사는 체액 또는 조직 내에서 약물의 측정된 체류 시간과 농도에 기초하여, 투약을 위한 반복 속도를 산정할 수 있다.
더 나아가, 본 발명에서는 항-종양 활성, 및/또는 암 줄기 세포에 저항하는 활성을 위한, Wnt 신호전달을 저해하는 효능에 대하여 작용제를 스크리닝하는 방법을 제시한다. 일정한 구체예에서, 상기 방법은 작용제에 노출된 첫 번째 고형 종양 (가령, 암 줄기 세포를 포함하는 고형 종양)에서 하나 또는 그 이상의 분화 마커 및/또는 하나 또는 그 이상의 줄기성 (stemness) 마커의 수준을 작용제에 노출되지 않은 두 번째 고형 종양에서 하나 또는 그 이상의 분화 마커의 수준과 비교하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 (a) 첫 번째 고형 종양을 작용제를 노출시키지만 두 번째 고형 종양을 작용제에 노출시키지 않는 단계; (b) 첫 번째와 두 번째 고형 종양에서 하나 또는 그 이상의 분화 마커 및/또는 하나 또는 그 이상의 줄기성 마커의 수준을 평가하는 단계; 그리고 (c) 첫 번째 종양에서 하나 또는 그 이상의 분화 마커의 수준을 두 번째 고형 종양에서 하나 또는 그 이상의 분화 마커의 수준과 비교하는 단계를 포함한다. 일정한 구체예에서, (a) 두 번째 고형 종양에서 하나 또는 그 이상의 분화 마커의 수준에 비하여 첫 번째 고형 종양에서 하나 또는 그 이상의 분화 마커의 증가된 수준은 항-종양 (또는 항암 줄기 세포) 활성을 지시하고; 그리고 (b) 하나 또는 그 이상의 줄기성 마커의 감소된 수준은 항-종양 (또는 항암 줄기 세포) 활성을 지시한다. 일정한 구체예에서, 작용제는 하나 또는 그 이상의 Wnt 단백질에 결합한다. 일정한 구체예에서, 작용제는 FZD 가용성 수용체이다. 일정한 방법에서, 상기 작용제는 항체, 예를 들면, 항-Wnt 항체이다.
작용제를 스크리닝하는 추가의 방법에는 작용제에 노출된 첫 번째 고형 종양에서 하나 또는 그 이상의 분화 마커의 수준을 작용제에 노출되지 않은 두 번째 고형 종양에서 하나 또는 그 이상의 분화 마커의 수준과 비교하는 단계를 포함하는 방법이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 일정한 구체예에서, 상기 방법은 (a) 첫 번째 고형 종양을 작용제에 노출시키지만 두 번째 고형 종양을 작용제에 노출시키지 않는 단계; (b) 첫 번째와 두 번째 고형 종양에서 하나 또는 그 이상의 분화 마커의 수준을 평가하는 단계; 그리고 (c) 첫 번째 종양에서 하나 또는 그 이상의 분화 마커의 수준을 두 번째 고형 종양에서 하나 또는 그 이상의 분화 마커의 수준과 비교하는 단계를 포함한다. 일정한 구체예에서, 작용제는 Wnt-결합 작용제이다. 일정한 구체예에서, 작용제는 정준 Wnt 신호전달 경로의 저해제이다. 일정한 구체예에서, 작용제는 하나 또는 그 이상의 인간 FZD 수용체에 하나 또는 그 이상의 인간 Wnt 단백질의 결합을 저해한다. 일정한 구체예에서, 두 번째 고형 종양에서 하나 또는 그 이상의 분화 마커의 수준에 비하여 첫 번째 고형 종양에서 하나 또는 그 이상의 분화 마커의 증가된 수준은 고형 종양 줄기 세포 (CSC)에 저항하는 효능을 지시한다. 일정한 대안적 구체예에서, 두 번째 고형 종양에서 하나 또는 그 이상의 분화 마커의 수준에 비하여 첫 번째 고형 종양에서 하나 또는 그 이상의 분화 마커 (즉, 분화에 대한 음성 마커)의 감소된 수준은 고형 종양 줄기 세포에 저항하는 효능을 지시한다.
일정한 구체예에서, 이러한 스크리닝 방법에서 고형 종양은 췌장 종양이다. 일정한 구체예에서, 고형 종양은 췌장 종양이고, 그리고 하나 또는 그 이상의 분화 마커는 하나 또는 그 이상의 뮤신 (가령, Muc16), 하나 또는 그 이상의 시토케라틴 (가령, CK20) 및/또는 크로모그라닌 A (CHGA)를 포함할 수 있다.
일정한 대안적 구체예에서, 이러한 스크리닝 방법에서 고형 종양은 결장 종양이다. 일부 구체예에서, 고형 종양은 결장 종양이고, 그리고 하나 또는 그 이상의 분화 마커는 하나 또는 그 이상의 시토케라틴 (가령, 시토케라틴 7 또는 CK20)을 포함할 수 있다.
일정한 구체예에서, 본 명세서에서 기술된 스크리닝 방법에 이용되는 하나 또는 그 이상의 줄기성 마커는 ALDH1A1, APC, 액신2, BMI1, CD44, FGF1, GJB1, GJB2, HES1, JAG1, LGR5, LHX8, MYC, NANOG, NEUROD1, NEUROG2, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCH4, PROCR, RARRES1, RARRES3, RBP2, SOX1, SOX2, ASCL2,TDGF1, OLFM4, MSI1, DASH1, EPHB3 및/또는 EPHB4를 포함한다. 일정한 구체예에서, 2개 또는 그 이상의 줄기성 마커, 3개 또는 그 이상의 줄기성 마커, 4개 또는 그 이상의 줄기성 마커, 5개 또는 그 이상의 줄기성 마커, 6개 또는 그 이상의 줄기성 마커, 또는 10개 또는 그 이상의 줄기성 마커는 ALDH1A1, APC, 액신2, BMI1, CD44, FGF1, GJB1, GJB2, HES1, JAG1, LGR5, LHX8, MYC, NANOG, NEUROD1, NEUROG2, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCH4, PROCR, RARRES1, RARRES3, RBP2, SOX1, SOX2, ASCL2,TDGF1, OLFM4, MSI1, DASH1, EPHB3 및 EPHB4로 구성되는 군에서 선택된다.
일정한 구체예에서, 이러한 스크리닝 방법에 이용되는 하나 또는 그 이상의 분화 마커는 ALDOB, BMP2, BMP7, BMPR1B, CEACAM5, CEACAM6, CDX1, CDX2, CLCA2, COL1A2, COL6A1, CHGA, CSTA, CST4, CK20, DAB2, FABP4, GST1, KRT4, KRT7, KRT15, KRT17, KRT20, LAMA1, MUC3A, MUC4, MUC5AC, MUC5B, MUC13, MUC15, MUC16, MUC17, NDRG2, PIP, PLUNC, SPRR1A, REG4, VSIG1, 및/또는 XAF1을 포함한다. 일정한 구체예에서, 이러한 스크리닝 방법에 이용되는 2개 또는 그 이상, 3개 또는 그 이상, 4개 또는 그 이상, 5개 또는 그 이상, 6개 또는 그 이상, 또는 10개 또는 그 이상의 분화 마커는 ALDOB, BMP2, BMP7, BMPR1B, CEACAM5, CEACAM6, CDX1, CDX2, CLCA2, COL1A2, COL6A1, CHGA, CSTA, CST4, CK20, DAB2, FABP4, GST1, KRT4, KRT7, KRT15, KRT17, KRT20, LAMA1, MUC3A, MUC4, MUC5AC, MUC5B, MUC13, MUC15, MUC16, MUC17, NDRG2, PIP, PLUNC, SPRR1A, REG4, VSIG1, 그리고 XAF1로 구성되는 군에서 선택된다.
다른 종양 유형뿐만 아니라 췌장과 결장에 대한 다른 잠재적인 분화 마커는 당업자에게 공지되어 있다. 이에 더하여, 스크리닝 방법에서 잠재적인 분화 마커의 유용성은 원하는 종양 유형을 본 명세서에서 기술된 하나 또는 그 이상의 가용성 FZD 수용체, 예를 들면, FZD8-Fc로 처리하고, 이후 대조에 비하여 처리된 종양에 의한 마커의 발현에서 변화를 평가함으로써 당업자에 의해 쉽게 평가될 수 있다. 이런 방법의 무제한적 실례는 예로써, 하기 특정 실시예에서 찾아볼 수 있다.
더 나아가, 본 발명에서는 가용성 Wnt-결합 작용제를 생산하는 방법을 제시한다. 일정한 구체예에서, 상기 방법은 세포에서 인간 FZD8의 Fri 도메인을 포함하는 가용성 Wnt-결합 작용제를 생산하는 단계를 포함하고, 여기서 Wnt-결합 작용제 중에서 적어도 80%는 ASA의 N-말단 서열을 갖고, 상기 방법은 Wnt-결합 작용제의 생산을 위한 서열 번호:71, 서열 번호:70, 서열 번호:72, 서열 번호:73 및 서열 번호:74로 구성되는 군에서 선택되는 신호 서열을 이용하는 것을 포함한다. 이러한 방법의 일부 구체예에서, 신호 서열은 서열 번호:71이다. 일부 구체예에서, Wnt-결합 작용제 중에서 적어도 대략 90%, 적어도 대략 95%, 또는 적어도 대략 98%는 ASA의 N-말단 서열을 갖는다. 일부 구체예에서, 세포는 포유동물 세포이다. 일부 구체예에서, Wnt-결합 작용제는 인간 Fc 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, Wnt-결합 작용제는 서열 번호:53, 서열 번호:50, 서열 번호:46, 서열 번호:48, 그리고 서열 번호:1로 구성되는 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, Wnt-결합 작용제는 서열 번호:53을 포함한다. 일부 구체예에서, Wnt-결합 작용제는 서열 번호:50을 포함한다. 일부 구체예에서, 세포는 서열 번호:75의 서열을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
도면의 간단한 설명
도 1. 쥐에서 FZD8-Fc (54F03)의 약물동력학. 단일 용량 (10㎎/㎏)의 FZD8-Fc 투여 이후에, FZD8-Fc의 약물동력학적 성질이 평가되었다. FZD8-Fc의 혈청 농도가 투여후 1, 24, 48, 72, 96, 168, 240과 336시간에 측정되었다.
도 2. FZD8-Fc (54F03) 처리에 의한 PN4 췌장 종양 성장의 저해. PN4 췌장 종양 세포는 NOD/SCID 생쥐 내로 피하 주입되었다. 생쥐는 FZD8-Fc (-▲-), 젬시타빈 (-■-), FZD8-Fc와 젬시타빈의 조합 (-△-), 또는 대조 항체 (-●-)로 처리되었다. 데이터는 처리후 일자 동안, 종양 체적 (mm3)으로서 도시된다.
도 3. FZD8-Fc (54F03)로 처리된 PN4 종양에서 CD44hi 세포 집단의 감소. 대조 항체, FZD8-Fc, 젬시타빈, 또는 FZD8-Fc와 젬시타빈의 조합으로 처리된 종양 세포에서 ESA와 CD44에 대한 세포 표면 염색이 수행되었다. 각 처리 군에 대하여, 5가지 종양으로부터 단일 세포 현탁액은 염색에 앞서 혼주되었다.
도 4. FZD8-Fc (54F03)-처리된 PN4 췌장 종양의 생체내 제한 희석 측정법.
도 5. FZD8-Fc (54F03)로 처리된 PN4 췌장 종양의 증가된 세포 분화. 대조 항체, FZD8-Fc, 젬시타빈, 또는 FZD8-Fc와 젬시타빈의 조합으로 처리된 PN4 종양의 파라핀 포매된 박편은 뮤신-발현 세포를 검출하기 위해 알시안 블루로 염색되었다.
도 6. FZD8-Fc (54F03)로 처리된 PN8 췌장 종양의 증가된 세포 분화. 대조 항체, FZD8-Fc, 젬시타빈, 또는 FZD8-Fc와 젬시타빈의 조합으로 처리된 PN8 종양의 파라핀 포매된 박편은 뮤신-발현 세포를 검출하기 위해 알시안 블루로 염색되었다.
도 7. FZD8-Fc (54F03)로 처리 이후에 PN13 췌장 종양에서 증가된 세포 분화와 감소된 증식. 대조 항체 또는 FZD8-Fc로 처리된 PN13 종양의 파라핀 포매된 박편은 뮤신-발현 세포를 검출하기 위해 알시안 블루로 염색되었다. 이에 더하여, 이들 박편은 활발하게 증식하는 세포의 마커인 Ki67에 대하여 염색되었다.
도 8. FZD8-Fc (54F03)로 처리 이후에 PN13 췌장 종양에서 증가된 Muc16 염색. 대조 항체 또는 FZD8-Fc로 처리된 PN13 종양의 파라핀 포매된 박편은 Muc16 단백질에 대하여 염색되었다.
도 9. FZD8-Fc (54F03)로 처리 이후에 PN13 췌장 종양에서 증가된 CK20 염색. 대조 항체 또는 FZD8-Fc로 처리된 PN13 종양의 파라핀 포매된 박편은 CK20 단백질에 대하여 염색되었다.
도 10. 파클리탁셀과 공동으로 FZD8-Fc (54F03)로 처리 이후에 PE13 유방 종양 성장의 저해. PE13 유방 종양 세포는 NOD/SCID 생쥐 내로 피하 주입되었다. 생쥐는 대조 항체 (-●-), FZD8-Fc (□), 파클리탁셀 (-▲-), 또는 FZD8-Fc와 파클리탁셀의 조합 (-○-)으로 처리되었다. 데이터는 처리후 일자 동안, 종양 체적 (mm3)으로서 도시된다.
도 11. FZD8-Fc (54F03)로 C28 결장 종양 성장의 용량-의존성 저해. C28 결장 종양 세포는 NOD/SCID 생쥐 내로 피하 주입되었다. 생쥐는 FZD8-Fc 1.5㎎/㎏ 주2회 (-▲-), 5㎎/㎏ 주1회 (-▼-), 5㎎/㎏ 주2회 (-○-), 15㎎/㎏ 주1회 (-□-) 또는 15㎎/㎏ 주2회 (-△-) 또는 대조 항체 (-■-)로 처리되었다. 데이터는 처리후 일자 동안, 종양 체적 (mm3)으로서 도시된다 (도 11A). 이리노테칸과 공동으로 FZD8-Fc로 결장 종양 성장의 저해. 생쥐는 FZD8-Fc (-▲-), 이리노테칸 (-▼-), FZD8-Fc와 이리노테칸의 조합 (-●-), 또는 대조 항체 (-■-)로 처리되었다. 데이터는 처리후 일자 동안, 종양 체적 (mm3)으로서 도시된다 (도 11B).
도 12. FZD8-Fc (54F03)로 처리 이후에 C28 종양에서 증가된 CK20 염색. 대조 항체 또는 FZD8-Fc로 처리된 C28 종양의 파라핀 포매된 박편은 CK20 단백질에 대하여 염색되었다.
도 13. FZD8-Fc (54F03) 처리에 의한 PN21 췌장 종양 성장의 저해 및 암 줄기 세포 빈도에서 감소. PN21 췌장 종양 세포는 NOD/SCID 생쥐 내로 피하 주입되었다. 생쥐는 FZD8-Fc (-▼-), 젬시타빈 (-▲-), FZD8-Fc와 젬시타빈의 조합 (-■-), 또는 대조 항체 (-●-)로 처리되었다. 데이터는 처리후 일자 동안, 종양 체적 (mm3)으로서 도시된다 (도 13A). FZD8-Fc 처리된 PN21 췌장 종양의 생체내 제한 희석 측정법 (도 13B).
도 14. FZD8-Fc (54F03)로 처리 이후에 PN21 췌장 종양의 증가된 세포 분화. 대조 항체 또는 FZD8-Fc로 처리된 PN21 종양의 파라핀 포매된 박편은 뮤신을 검출하기 위해 알시안 블루로 염색되었다.
도 15. FZD8-Fc (54F03)로 처리 이후에 PN21 췌장 종양에서 증가된 세포 분화와 감소된 증식. 대조 항체, FZD8-Fc, 젬시타빈, 또는 FZD8-Fc와 젬시타빈의 조합으로 처리된 PN21 종양의 파라핀 포매된 박편은 뮤신을 검출하기 위해 알시안 블루로 염색되었다. 이에 더하여, 이들 박편은 활발하게 증식하는 세포의 마커인 Ki67에 대하여 염색되었다.
도 16. 원숭이에서 FZD8-Fc 변이체의 약물동력학. 단일 용량 (30㎎/㎏)의 FZD8-Fc 변이체 54F15와 54F16의 투여 이후에, 이들 변이체의 약물동력학적 성질이 평가되었다. 54F15 (-○-)와 54F16 (-◆-)의 혈청 농도는 투여후 1, 6, 12, 24, 48, 72, 96, 168, 240과 336시간에 측정되었다.
도 17. FZD8-Fc 변이체로 처리 이후에 C28 결장 종양 성장의 저해. C28 결장 종양 세포는 NOD/SCID 생쥐 내로 피하 주입되었다. 생쥐는 대조 항체 (-X-), 54F03 (-□-), 54F09 (-▲-), 54F12 (-▼-), 54F13 (-◆-), 54F15 (-○-) 또는 54F16 (-△-)로 처리되었다. 데이터는 처리후 일자 동안, 종양 체적 (mm3)으로서 도시된다.
도 18. FZD8-Fc 변이체로 처리 이후에 PN4 췌장 종양 성장의 저해. PN4 결장 종양 세포는 NOD/SCID 생쥐 내로 피하 주입되었다. 생쥐는 대조 항체 (-●-), 54F03 (-■-), 54F09 (-▼-), 54F12 (-○-), 54F13 (-▲-), 54F15 (-□-) 또는 54F16 (-◆-)으로 처리되었다. 데이터는 처리후 일자 동안, 종양 체적 (mm3)으로서 도시된다.
도 19. FZD8-Fc 변이체 54F03과 54F16으로 처리된 PN4 종양에서 CD44hi와 CD44+CD201+ 세포의 감소. 대조 항체, FZD8-Fc 변이체 54F03 또는 변이체 54F16으로 처리된 종양 세포 상에서 ESA, CD44와 CD201에 대한 세포 표면 염색이 수행되고 FACS에 의해 분석되었다.
도 20. FZD8-Fc 단백질의 N-말단의 특성화. FZD8-Fc 변이체는 질량 분석법에 의해 분석되고, 그리고 54F16 (도 20A), 54F26 (도 20B), 54F28 (도 20C), 54F30 (도 20D), 그리고 54F32 (도 20E)에 대한 결과가 도시된다.
도 21. FZD8-Fc 변이체로 처리 이후에 C28 결장 종양 성장의 저해. C28 결장 종양 세포는 NOD/SCID 생쥐 내로 피하 주입되었다. 생쥐는 대조 항체 (-■-), 54F03 (-△-), 54F23 (-▼-), 또는 54F26 (-○-)으로 처리되었다. 데이터는 처리후 일자 동안, 종양 체적 (mm3)으로서 도시된다.
실시예
본 명세서에서 기술된 실시예와 구체예는 단지 예시를 목적으로 하고, 그리고 이들에 비추어 다양한 개변이 당업자에게 암시될 것이고, 따라서 본 출원의 기술적 사상과 범위 내에 포함되는 것으로 이해된다.
실시예 1
FZD8-Fc의 생산
FZD8-Fc (54F03)를 인코딩하는 cDNA는 HindIII과 EcoRI로 절단된 pEE14.4 발현 벡터 (Lonza) 내로 서브클로닝되었다. 클로닝후, pEE14.4-FZD8-Fc DNA는 PvuI로 절단에 의해 선형화되고, 그 이후 표준 절차를 이용한 전기천공에 의해 GS-CHOK1 세포 내로 도입되었다. FZD8-Fc를 발현하는 안정된 클론이 획득되고, 그리고 혈청 없는 배지에서 확대되었다. FZD8-Fc는 단백질 A-접합된 수지를 이용한 친화성 포획 (affinity capture)에 의해 정제되었다. SDS-PAGE 분석은 98% 이상의 순도 및 내독소 수준이 1 EU/mg 단백질보다 낮다는 것을 드러냈다.
FZD8-Fc의 아미노산 서열은 서열 번호:1이고, 그리고 FZD8-Fc를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호:2이다.
실시예 2
쥐에서 FZD8-Fc의 약물동력학
FZD8-Fc (54F03)의 약물동력학은 2㎎/㎏과 10㎎/㎏의 용량을 이용한 2주 약물동력학 (PK) 연구 동안 쥐에서 평가되었다. 각 군에서 5마리씩 수컷 Sprague Dawley 쥐는 꼬리 정맥을 통해 2㎎/㎏ 또는 10㎎/㎏의 FZD8-Fc가 투약되고 2주 동안 추적되었는데, 샘플이 1, 24, 48, 72, 96, 168, 240, 그리고 336시간 시점에서 수집되었다. 각 시점에서, 1 ㎖의 혈액이 칼륨-EDTA 튜브 내로 수집되고 원심분리되었다. 혈장 상층액은 수집되고, 그리고 샘플이 분석될 때까지 동결되었다.
각 시점에서 혈장 내에 존재하는 FZD8-Fc 융합 단백질의 수준이 정량되고, 그리고 FZD8-Fc의 반감기가 이들 2가지 용량에 대하여 계산되었다. 도 1에 도시된 바와 같이, FZD8-Fc의 반감기는 2㎎/㎏에서 163시간 및 10㎎/㎏에서 157시간인 것으로 산정되었다.
실시예 3
췌장 종양 모형에서 FZD8-Fc의 항-종양 활성
췌장 종양 모형에서 FZD8 - Fc 에 의한 종양 성장의 저해. FZD8-Fc (54F03)의 항-종양 활성은 PN4 췌장 종양 이종이식편 모형에서 평가되었다. 분리된 OMP-PN4 세포 (동물당 50,000)는 6-8주령 수컷 NOD/SCID 생쥐 내로 피하 주입되었다. 종양 성장은 주1회 모니터링되고, 그리고 종양 측정은 종양이 촉진가능하면 시작되었다. 50일자에, 137mm3의 평균 종양 체적을 갖는 생쥐는 각각 10마리 동물의 4개 군으로 무작위화되었다. 동물은 대조 항체, FZD8-Fc (15 ㎎/㎏), 젬시타빈 (2 ㎎/㎏) 또는 FZD8-Fc와 젬시타빈의 조합이 주사되었다. FZD8-Fc와 젬시타빈의 투여는 주1회 (젬시타빈) 또는 주2회 (FZD8-Fc) 복막내 강 내로 주사에 의해 실행되었다. 종양은 주2회 측정되고, 그리고 종양 체적은 공식 1/2(a x b2) (여기서 a = 길이, 그리고 b = 폭)을 이용하여 측정되었다. 데이터는 평균 및 평균 ± S.E.M으로 표시된다. 군 평균은 스튜던트 (Student)의 양측 독립표본 t-검정 (two-tailed, unpaired t-test)을 이용하여 비교되었다. < 0.05의 확률 (p) 값은 유의미하게 상이한 것으로 해석되었다.
FZD8-Fc로 처리는 도 2에 도시된 바와 같이, 종양 성장에서 66% 감소를 유발하였다 (p < 0.001). 게다가, FZD8-Fc와 젬시타빈으로 치료는 FZD8-Fc 단독으로 치료에 비하여 종양 성장의 29% 감소를 유발하였다 (FZD8-Fc 단독과 비교하여 p = 0.04) (도 2). 따라서 FZD8-Fc는 단독 작용제로서 및 젬시타빈과 공동으로, PN4 췌장 종양 모형에서 항-종양 성장 활성을 보였다.
FZD8 - Fc 로 처리된 PN4 종양에서 CD44hi 집단의 감소. 앞서 기술된 OMP-PN4 이종이식편 연구로부터 대조와 처리된 종양은 연구의 종결 시점 (85일자)에서 수확되었다. 이들 종양은 처리되고 단일 세포로 분리되었다. 각 치료 군의 5개 종양으로부터 유래된 단일 세포 현탁액은 모아지고, 그리고 모아진 샘플은 이후, 생쥐 세포에 선택성으로 결합하는 항체 (α-생쥐 CD45-비오틴 1:200 희석도 및 쥐 α-생쥐 H2Kd-비오틴 1:100 희석도, BioLegend, San Diego, CA)와 함께 얼음 위에서 30분 동안 배양되고, 그 이후에 스트렙타비딘-표지된 자성 구슬 (Invitrogen, Carlsbad, CA)이 첨가되었다. 이들 생쥐 세포는 자석의 도움으로 이전되었다. 인간 세포 표면 마커의 분석을 위해, 이들 단일 종양 세포 현탁액은 형광색소에 직접적으로 접합된 항-ESA (Biomeda, Hayward, CA) 항체 및 항-CD44 (BD Biosciences, San Jose, CA) 항체로 염색되었다. 죽은 세포는 생존능 염료 (viability dye) DAPI를 이용하여 배제되었다. 유세포분석법은 FACS Aria 기구 (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)를 이용하여 실행되었다. 세포 덩어리를 제거하기 위해 빛의 굴절 (side scatter)과 전방 산란 (forward scatter) 프로필이 이용되었다.
대조 항체로 처리된 종양의 분석은 주요 종양 집단 중에서 12.7%가 ESA와 CD44 둘 모두를 높은 수준에서 발현한다는 것을 드러냈다. 이러한 이중 양성 집단은 도 3에 도시된 바와 같이 젬시타빈 단독 (13.9%)으로 처리에 의해 유의미하게 영향을 받지 않았지만, FZD8-Fc, 또는 FZD8-Fc와 젬시타빈의 조합으로 처리는 이중 양성 집단을 감소시켰다 (각각, 1.9%와 1.7%).
제한 희석 측정법에 의한 FZD8 - Fc -처리된 PN4 종양의 분석. 고형 종양 암 줄기 세포에 대한, 그리고 암 줄기 세포를 포함하는 종양의 종양원성에 대한 치료제의 효과를 평가하는데 제한 희석 측정법 (LDA)이 이용될 수 있다. 이런 측정법은 FZD8-Fc 융합 단백질 또는 다른 작용제로 치료된 동물로부터 종양에서 암 줄기 세포의 빈도를 측정하고, 그리고 상기 빈도를 대조 동물로부터 종양에서 암 줄기 세포의 빈도와 비교하는데 이용될 수 있다.
앞서 기술된 PN4 이종이식편 연구로부터 대조와 처리된 종양은 연구의 종결 시점 (85일자)에서 수확되었다. 이들 종양은 처리되고 단일 세포로 분리되었다. 각 치료 군의 5개 종양으로부터 유래된 단일 세포 현탁액은 모아지고, 그리고 모아진 샘플은 이후, 생쥐 세포에 선택성으로 결합하는 항체 (α-생쥐 CD45-비오틴 1:200 희석도 및 쥐 α-생쥐 H2Kd-비오틴 1:100 희석도, BioLegend, San Diego, CA)와 함께 얼음 위에서 30분 동안 배양되고, 그 이후에 스트렙타비딘-표지된 자성 구슬 (Invitrogen, Carlsbad, CA)이 첨가되었다. 이들 생쥐 세포는 자석의 도움으로 이전되었다. 현탁액에서 인간 세포는 수확되고, 계수되고, 그리고 세포 표면 마커에 대하여 염색되고, 그리고 FACS 완충액에서 적절한 세포 용량 (30, 90, 그리고 270개 세포)은 Matrigel과의 1:1 혼합물에서 혼합되고 NOD/SCID 생쥐 (치료 군당 세포 용량마다 10마리 생쥐)에 피하 주입되었다. 종양은 최대 4개월 동안 성장되었다.
원하는 시점에서, 검출가능 종양을 갖는 생쥐의 백분율이 FZD8-Fc-처리된 종양 세포가 주입된 모든 군에서 측정되고, 그리고 대조에서 검출가능 종양을 갖는 생쥐의 백분율에 비교되었다. 가령, 검출가능 종양을 갖는 125개 대조 항체-처리된 종양 세포가 주입된 생쥐의 숫자가 측정되고, 그리고 검출가능 종양을 갖는 125개 FZD8-Fc 처리된 종양 세포가 주입된 생쥐의 숫자에 비교된다.
이들 세포의 주입후 75일자에, 다양한 군에서 종양 취입률 (take rate)은 아래와 같았다: 대조 - 30마리 생쥐 중에서 7마리 생쥐; FZD8-Fc - 30마리 생쥐 중에서 3마리 생쥐; 젬시타빈 - 30마리 생쥐 중에서 7마리 생쥐; FZD8-Fc와 젬시타빈 - 30마리 생쥐 중에서 0마리 생쥐 (도 4). FZD8-Fc 치료된 군 및 조합 치료된 군에서 감소된 종양 취입률은 암 줄기 세포 빈도가 PN4 췌장 종양에서 FZD8-Fc에 의해 감소된다는 것을 암시하였다. CD44 발현과 제한 용량 희석 분석 둘 모두의 평가로부터 증거는 FZD8-Fc 치료가 PN4 췌장 종양에서 암 줄기 세포 빈도를 감소시킨다는 것을 드러냈다.
암 줄기 세포 (CSC) 빈도는 L-CalcTM 소프트웨어 (StemCell Technologies Inc.; www.stemcell.com)를 이용하여 계산될 수 있다. 간단히 말하면, Poisson 통계에 기초하여, 동물 중에서 37%에서 종양이 발생하지 않으면 공지된 숫자의 주입된 세포 사이에 정확하게 하나의 암 줄기 세포가 존재한다. 대조 항체 치료된 군에 대한 CSC 빈도는 1:280이고, 젬시타빈 치료된 군에 대한 CSC 빈도는 1:476이고, FZD8-Fc 치료된 군에 대한 CSC 빈도는 1:881이고, 그리고 FZD8-Fc와 젬시타빈의 조합으로 치료된 군에 대한 CSC 빈도는 1:3763보다 낮은 것으로 계산되었다. 이러한 숫자는 상기 군에서 종양 취입률이 최대 세포 용량에서도 0이었기 때문에, 정확하게 측정될 수 없었다.
실시예 4
FZD8-Fc에 의한 췌장 종양의 증가된 세포 분화
FZD8 - Fc 처리로 PN4 와 PN8 종양의 증가된 세포 분화. 앞서 기술된 OMP-PN4 이종이식편 연구 (실시예 3)로부터 대조와 처리된 종양은 연구의 종결 시점 (85일자)에서 수확되었다. 종양은 포르말린에서 고정되고, 파라핀에서 포매되고, 그리고 4㎛ 두께의 종양 박편으로 절단되었다. 탈파라핀화 및 수화후, 이들 박편은 실온에서 5분 동안 수성 아세트산으로 처리되었다. 이들 박편은 이후, 3% 수성 아세트산에서 1% 알시안 블루로 30분 동안 처리되고 물로 세척되었다. 박편은 뉴트럴 패스트 레드 (neutral fast red)에서 대조-염색되고, 탈수되고, 적재되었다. 이러한 방법을 이용하여, 조직 샘플 내에서 시알로뮤신은 푸른색으로 염색되고, 그리고 배경은 핑크색 또는 적색으로 나타난다.
FZD8-Fc로 PN4 종양의 처리는 대조 항체 또는 젬시타빈으로 처리된 종양과 비교하여 시알로뮤신을 발현하는 세포에서 증가를 유발하였다 (도 5, 여기서 시알로뮤신은 짙은 회색으로 나타난다). FZD8-Fc와 젬시타빈의 조합 처리 역시 PN4 췌장 종양에서 시알로뮤신의 발현을 증가시켰다. 이런 이유로, PN4 종양의 FZD8-Fc 처리는 뮤신-발현 분화된 세포의 빈도를 증가시켰다. PN8 췌장 종양 이종이식편 모형에서 유사한 결과가 관찰되었다 (도 6).
FZD8 - Fc 처리로 PN13 종양의 증가된 세포 분화. FZD8-Fc의 세포 분화 능력 역시 OMP-PN13 췌장 종양 이종이식편 모형에서 평가되었다. 분리된 OMP-PN13 세포 (동물당 50,000)는 6-8주령 수컷 NOD/SCID 생쥐 내로 피하 주입되었다. 종양 성장은 주1회 모니터링되고, 그리고 종양 측정은 종양이 촉진가능하면 시작되었다. 40일자에, 114mm3의 평균 종양 체적을 갖는 생쥐는 각각 10마리 동물의 4개 군으로 무작위화되었다. 동물은 대조 항체 또는 FZD8-Fc (15㎎/㎏)가 주사되었다. FZD8-Fc와 대조 항체의 투여는 주2회 복막내 강 내로 주사에 의해 실행되었다. 19일간 치료후, 종양은 절제되고 표준 기술을 이용한 면역조직화학 분석이 실행되었다. 간단히 말하면, 종양은 포르말린에 고정되고, 파라핀에서 포매되고, 그리고 4 ㎛ 두께의 종양 박편으로 절단되었다. 탈파라핀화 및 수화후, 종양 박편은 Tris 완충액 (pH 9.5)에서 항원 회수 과정 (antigen retrieval process)에 종속되었다. 박편은 내인성 과산화효소를 차단하기 위해 과산화수소 (Sigma-Aldrich, St Louis, MO)와 함께 10분 동안 배양되었다. 차단 완충액 (3% NHS, 1% BSA, 0.1% Tween-20, PBS에서)에서 1:200 희석도에서 항-Ki67 항체 (Dako, 클론 MIB-1)가 각 박편에 첨가되고 1시간 동안 배양되었다. 슬라이드는 PBST에서 각 5분 동안 3회 헹굼되었다. HRP (ImmPRESS™ 항-생쥐, Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA)와 접합된 항-생쥐 이차 항체가 이들 슬라이드에 첨가되고 30분 동안 배양되었다. PBST로 복수 세척후, Vector Nova Red 기질 (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA)이 Ki67 항원의 국지화를 위해 첨가되었다. 이들 박편은 실온에서 5분 동안 수성 아세트산으로 처리되었다. 이들 박편은 이후, 3% 수성 아세트산에서 1% 알시안 블루로 30분 동안 처리되고 물로 세척되었다. 박편은 뉴트럴 패스트 레드 (neutral fast red)에서 대조-염색되고, 탈수되고, 적재되었다. 이러한 방법을 이용하여, 조직 샘플 내에서 시알로뮤신은 푸른색으로 염색되고, 그리고 증식하는 세포는 짙은 적색으로 표시된다.
FZD8-Fc로 PN13 종양의 처리는 대조 항체로 처리된 종양과 비교하여 시알로뮤신을 발현하는 세포에서 증가를 유발하였다. FZD8-Fc로 PN13 종양의 처리는 또한, Ki67의 발현에 의해 확인되는 바와 같이, 증식하는 세포에서 감소를 유발하였다. 도 7에서는 FZD8-Fc 처리된 종양으로부터 조직에서 증식하는 세포 (검은색 반점에 의해 확인됨)의 숫자에서 분명한 감소를 보여준다. 이런 이유로, FZD8-Fc로 PN13 종양의 처리는 세포 증식을 감소시키고, 그리고 뮤신 발현 분화된 세포의 빈도를 증가시켰다.
FZD8 - Fc 로 Pn13 종양에서 증가된 Muc16 염색. 대조 항체 또는 FZD8-Fc로 처리된 PN13 종양으로부터 종양 박편은 앞서 기술된 바와 같이 획득되고 처리되었다. 본 실시예에서, 차단 완충액 (3% NHS, 1% BSA, 0.1% Tween-20, PBS에서)에서 1:200 희석도에서 항-Muc16 (Abcam, Cambridge, MA) 항체가 각 박편에 첨가되고 1시간 동안 배양되었다. 결합된 항체는 앞서 기술된 면역조직화학 프로토콜을 이용하여 검출되었다.
FZD8-Fc로 PN13 종양의 처리는 대조 항체로 처리된 종양과 비교하여 Muc16을 발현하는 세포에서 증가를 유발하였다 (도 8, 검은색 염색).
FZD8 - Fc 로 Pn13 종양에서 증가된 CK20 염색. 종양 박편은 앞서 기술된 바와 같이 획득되고 처리되었다. 본 실시예에서, 차단 완충액 (3% NHS, 1% BSA, 0.1% Tween-20, PBS에서)에서 1:200 희석도에서 항-CK20 (클론 Ks20.8, Dako, Carpinteria, CA) 항체가 각 박편에 첨가되고 1시간 동안 배양되었다. 결합된 항체는 앞서 기술된 면역조직화학 프로토콜을 이용하여 검출되었다.
FZD8-Fc로 PN13 종양의 처리는 대조 항체로 처리된 종양과 비교하여 CK20을 발현하는 세포에서 증가를 유발하였다 (도 9, 검은색 염색).
실시예 5
생체내에서 FZD8-Fc에 의한 유방 종양 성장의 저해
분리된 PE13 유방 종양 세포 (50,000 per 동물)가 NOD/SCID 생쥐의 유방 지방체 (fat pad) 내로 피하 주입되었다. 생쥐는 주1회 모니터링되고, 그리고 종양이 대략 106mm3까지 성장되었다. 세포 주입후 27일자에, 생쥐는 4개 치료 군 (n = 10마리 생쥐/군)으로 무작위화되고 대조 항체, FZD8-Fc (54F03), 탁솔, 또는 FZD8-Fc와 탁솔의 조합으로 치료되었다. 탁솔은 주1회 7.5㎎/㎏의 용량으로 복막내 투여되고, 그리고 FZD8-Fc는 주2회 5㎎/㎏의 용량에서 복막내 투여되었다. 종양은 도 10에서 지정된 일자에 측정되었다.
FZD8-Fc로 치료는 대조 항체 군에 비하여 단독 작용제로서, 종양 성장을 20% (p = 0.002) 감소시키는 것으로 관찰되었다. 이에 더하여, FZD8-Fc와 탁솔의 조합으로 치료는 탁솔 치료 단독과 비교하여 종양 성장을 55% (p = 0.003) 감소시켰다 (도 10).
실시예 6
생체내에서 FZD8-Fc에 의한 결장 종양 성장의 저해
C28 결장 종양 이종이식편의 성장에 대한 FZD8-Fc (54F03)의 복수 용량과 투약 섭생 (dosing regimen)의 효과가 분석되었다. 분리된 C28 세포 (동물당 10,000)가 6-8주령 수컷 NOD/SCID 생쥐 내로 피하 주입되었다. 2일자에, 생쥐는 각각 10마리 동물의 6개 군으로 무작위화되었다. 동물은 1.5㎎/㎏ (주2회), 5㎎/㎏ (주1회와 주2회) 및 15㎎/㎏ (주1회와 주2회)의 용량에서 대조 항체 또는 FZD8-Fc가 주사되었다. 상기 항체와 FZD8-Fc의 투여는 복막내 강 내로 주사에 의해 실행되었다. 종양 성장은 주1회 모니터링되고, 그리고 종양 측정은 종양이 촉진가능하면 시작되었다. 종양은 주2회 측정되고, 그리고 종양 체적은 본 명세서에서 기술된 바와 같이 결정되었다.
15㎎/㎏의 FZD8-Fc (주2회)로 치료는 도 11A에 도시된 바와 같이, 대조 항체로 치료에 비하여 종양 성장에서 83% 감소를 유발하였다 (p < 0.001). 게다가, 평가된 가장 낮은 용량에서 FZD8-Fc (주2회 1.5㎎/㎏ 투여됨)로 치료 역시 대조 항체 치료 군에 비하여 성장의 52% 감소를 유발하였다 (도 11A). 따라서 FZD8-Fc는 OMP-C28 결장 종양 모형에서 단독 작용제로서 용량 의존성 방식으로 항-종양 성장 활성을 보였다.
C28 결장 종양 이종이식편의 성장에 대한 화학치료제와 공동으로 FZD8-Fc의 효과가 분석되었다. 분리된 C28 결장 종양 세포 (10,000개 세포)가 6-8주령 수컷 NOD/SCID 생쥐 내로 피하 주입되었다. 종양은 128mm3의 평균 체적에 도달할 때까지 21일 동안 성장되었다. 생쥐는 무작위화되고 (군당 n = 10), 그리고 FZD8-Fc (54F03) (15㎎/㎏ 주1회), 이리노테칸 (15㎎/㎏ 주1회), FZD8-Fc와 이리노테칸의 조합 또는 대조 항체로 치료되었다. FZD8-Fc, 이리노테칸 및 대조 항체의 투여는 복막내 강 내로 주사에 의해 실행되었다. 종양 성장은 모니터링되고, 그리고 종양 체적은 지정된 시점에서 전자 캘리퍼스로 측정되었다. 데이터는 평균 ± S.E.M으로서 표시된다.
도 11B에 도시된 바와 같이, 단독 치료제로서 FZD8-Fc로 치료 (-▲-)는 대조 항체로 치료 (-■-)에 비하여 종양 성장에서 66% 감소를 유발하였다 (p < 0.001). 게다가, 이리노테칸과 공동으로 FZD8-Fc로 치료 (-●-)는 대조 항체 치료 군에 비하여 성장의 76% 감소 (p < 0.001)를 유발하였는데, 이것은 어느 한쪽 작용제 단독에서보다 컸다. 따라서 FZD8-Fc는 OMP-C28 결장 종양 모형에서, 화학치료제와 공동으로 뿐만 아니라 단독 치료제로서 항-종양 성장 활성을 보였다.
실시예 7
FZD8-Fc에 의한 결장 종양의 증가된 세포 분화
FZD8 - Fc 로 C28 종양에서 증가된 CK20 염색. 앞서 기술된 C28 이종이식편 연구 (실시예 6)로부터 대조와 처리된 종양은 연구의 종결 시점에서 수확되었다. 종양은 절제되고 표준 기술을 이용한 면역조직화학 분석이 실행되었다. 간단히 말하면, 종양은 포르말린에 고정되고, 파라핀에서 포매되고, 그리고 4 ㎛ 두께의 종양 박편으로 절단되었다. 탈파라핀화 및 수화후, 종양 박편은 Tris 완충액 (pH 9.5)에서 항원 회수 과정 (antigen retrieval process)에 종속되었다. 박편은 내인성 과산화효소를 차단하기 위해 과산화수소 (Sigma-Aldrich, St Louis, MO)와 함께 10분 동안 배양되었다. 차단 완충액 (3% NHS, 1% BSA, 0.1% Tween-20, PBS에서)에서 1:200 희석도에서 항-CK20 (클론 Ks20.8, Dako, Carpinteria, CA) 항체가 각 박편에 첨가되고 1시간 동안 배양되었다. 슬라이드는 PBST에서 각 5분 동안 3회 헹굼되었다. HRP (ImmPRESS™ 항-생쥐 Ig, Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA)와 접합된 항-생쥐 이차 항체가 이들 슬라이드에 첨가되고 30분 동안 배양되었다. PBST로 복수 세척후, Vector Nova Red 기질 (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA)이 CK20 항원의 국지화를 위해 첨가되었다.
FZD8-Fc로 C28 종양의 처리는 대조 항체로 처리된 종양과 비교하여 CK20을 발현하는 세포에서 증가를 유발하였다 (도 12, 검은색 염색).
실시예 8
췌장 종양 모형에서 FZD8-Fc의 항-종양 활성
PN21 췌장 종양 모형에서 FZD8 - Fc 에 의한 종양 성장의 저해. FZD8-Fc (54F03)의 항-종양 활성은 PN21 췌장 종양 이종이식편 모형에서 평가되었다. 분리된 OMP-PN21 세포 (동물당 50,000)는 6-8주령 수컷 NOD/SCID 생쥐 내로 피하 주입되었다. 종양 성장은 주1회 모니터링되고, 그리고 종양 측정은 종양이 촉진가능하면 시작되었다. 36일자에, 144mm3의 평균 종양 체적을 갖는 생쥐는 각각 9마리 동물의 4개 군으로 무작위화되었다. 동물은 대조 항체, FZD8-Fc (15 ㎎/㎏), 젬시타빈 (2 ㎎/㎏) 또는 FZD8-Fc와 젬시타빈의 조합이 주사되었다. FZD8-Fc와 젬시타빈의 투여는 주1회 복막내 강 내로 주사에 의해 실행되었다. 종양은 주2회 측정되고, 그리고 종양 체적은 본 명세서에서 기술된 바와 같이 결정되었다.
FZD8-Fc로 처리는 도 13A에 도시된 바와 같이, 대조와 비교하여 종양 성장에서 66% 감소를 유발하였다 (p < 0.001). 게다가, FZD8-Fc와 젬시타빈의 조합으로 처리는 어느 한쪽 작용제 단독과 비교하여 종양 성장의 더욱 큰 감소를 유발하였다 (p = 0.001 대(對) 젬시타빈). 따라서 FZD8-Fc는 PN21 췌장 종양 모형에서, 젬시타빈과 공동으로 뿐만 아니라 단독 치료제로서 항-종양 성장 활성을 보였다.
제한 희석 측정법에 의한 FZD8 - Fc -처리된 PN21 종양의 분석. 상기 실시예 3에서 기술된 바와 같이, PN21 췌장 종양 모형에서 고형 종양 암 줄기 세포에 대한 단독으로 또는 젬시타빈과 공동으로 FZD8-Fc로 처리의 효과를 평가하기 위해 제한 희석 측정법이 이용되었다.
앞서 기술된 PN21 이종이식편 연구로부터 대조와 처리된 종양은 연구의 종결 시점에서 수확되었다. 종양은 처리되고 단일 세포로 분리되었다. 각 치료 군의 5개 종양으로부터 유래된 단일 세포 현탁액은 모아지고, 그리고 모아진 샘플은 이후, 생쥐 세포에 선택성으로 결합하는 항체 (α-생쥐 CD45-비오틴 1:200 희석도 및 쥐 α-생쥐 H2Kd-비오틴 1:100 희석도, BioLegend, San Diego, CA)와 함께 얼음 위에서 30분 동안 배양되고, 그 이후에 스트렙타비딘-표지된 자성 구슬 (Invitrogen, Carlsbad, CA)이 첨가되었다. 이들 생쥐 세포는 자석의 도움으로 이전되었다. 현탁액 내에 인간 세포는 수확되고, 계산되고, 세포 표면 마커에 대해 염색되고, 그리고 FACS 완충액에서 적절한 세포 용량 (30, 90, 그리고 270개 세포)이 Matrigel과 1:1 혼합물로 혼합되고 NOD/SCID 생쥐 (치료 군당 세포 용량마다 10마리 생쥐)에서 피하 주입되었다. 종양은 최대 4개월 동안 성장된다.
원하는 시점에서, 검출가능 종양을 갖는 생쥐의 백분율이 처리된 종양 세포가 주입된 모든 군에서 결정되고, 그리고 대조 처리된 세포에서 검출가능 종양을 갖는 생쥐의 백분율과 비교되었다. 가령, 검출가능 종양을 갖는 125개 대조 항체-처리된 종양 세포가 주입된 생쥐의 숫자가 결정되고, 그리고 검출가능 종양을 갖는 125개 FZD8-Fc 처리된 종양 세포가 주입된 생쥐의 숫자와 비교되었다.
세포의 주입후 72일자에, 다양한 군에서 종양 취입률이 결정되고, 그리고 L-CalcTM 소프트웨어 (StemCell Technologies Inc.; www.stemcell.com)를 이용하여 암 줄기 세포 빈도가 계산되었다. 도 13B에 도시된 바와 같이, FZD8-Fc로 처리는 대조 항체로 처리와 비교하여 암 줄기 세포 빈도를 1:976로 감소 (대략 4-배 감소)시켰다. 대조적으로, 젬시타빈으로 처리는 암 줄기 세포 빈도를 약간 증가시켰다. 유의미하게는, FZD8-Fc와 젬시타빈의 조합으로 처리는 대조로 처리와 비교하여 암 줄기 세포 빈도를 1:5472로 감소 (거의 25-배 감소)시켰다. 놀랍게도, FZD8-Fc와 젬시타빈의 조합으로 처리는 젬시타빈이 암 줄기 세포 빈도를 실제로 증가시키는 것으로 보인다는 사실에도 불구하고, 암 줄기 세포 빈도를 FZD8-Fc 처리 단독보다 대략 5.5-배 크게 감소시켰다.
실시예 9
FZD8 - Fc 로 PN21 종양의 증가된 세포 분화. FZD8-Fc의 세포 분화 능력 역시 OMP-PN21 췌장 종양 이종이식편 모형에서 평가되었다. 실시예 8에서 기술된 연구로부터 PN21 종양은 수확되고, 포르말린에 고정되고, 파라핀에서 포매되고, 그리고 4 ㎛ 두께의 종양 박편으로 절단되었다. 탈파라핀화 및 수화후, 종양 박편은 Tris 완충액 (pH 9.5)에서 항원 회수 과정 (antigen retrieval process)에 종속되었다. 박편은 내인성 과산화효소를 차단하기 위해 과산화수소 (Sigma-Aldrich, St Louis, MO)와 함께 10분 동안 배양되었다. 차단 완충액 (3% NHS, 1% BSA, 0.1% Tween-20, PBS에서)에서 1:200 희석도에서 항-Ki67 항체 (클론 MIB-1, Dako, Carpinteria, CA)가 각 박편에 첨가되고 1시간 동안 배양되었다. 슬라이드는 PBST에서 각 5분 동안 3회 헹굼되었다. HRP (ImmPRESS™ 항-생쥐, Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA)와 접합된 항-생쥐 이차 항체가 이들 슬라이드에 첨가되고 30분 동안 배양되었다. PBST로 복수 세척후, Vector Nova Red 기질 (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA)이 Ki67 항원의 국지화를 위해 첨가되었다. 이들 박편은 실온에서 5분 동안 수성 아세트산으로 처리되었다. 이들 박편은 이후, 3% 수성 아세트산에서 1% 알시안 블루로 30분 동안 처리되고 물로 세척되었다. 박편은 뉴트럴 패스트 레드 (neutral fast red)에서 대조-염색되고, 탈수되고, 적재되었다. 이러한 방법을 이용하여, 조직 샘플 내에서 시알로뮤신은 푸른색으로 염색되고, 그리고 배경은 핑크색 또는 적색으로 나타난다.
FZD8-Fc로 PN21 종양의 처리는 대조 항체로 처리된 종양과 비교하여 시알로뮤신을 발현하는 세포에서 증가를 유발하였다 (도 14, 짙은 회색 염색). FZD8-Fc 또는 젬시타빈과 공동으로 FZD-Fc로 PN21 종양의 처리는 대조 항체 또는 젬시타빈 단독으로 처리된 종양과 비교하여 시알로뮤신을 발현하는 세포에서 증가를 유발하였다 (도 15). FZD8-Fc 또는 FZD8-Fc와 젬시타빈의 조합으로 PN21 종양의 처리는 또한, Ki67의 발현에 의해 표시되는 증식하는 세포에서 감소를 유발하였다. 이런 이유로, 단독으로 또는 젬시타빈과 공동으로 FZD8-Fc로 PN21 종양의 처리는 세포 증식을 감소시키고, 그리고 뮤신-발현 분화된 세포의 빈도를 증가시켰다.
실시예 10
FZD8-Fc 변이체의 생산
FZD8 - Fc 변이체의 생산. FZD8-Fc 변이체는 DNA2.0 (Menlo Park, CA)에서 생산되었다. DNA2.0은 짧은 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 합성하고 집합시켜 상이한 FZD8-Fc 변이체 단백질, 54F05, 54F08, 54F09, 54F12, 54F13, 54F14, 54F15, 54F16, 54F17, 54F18, 54F19, 54F20, 54F21 및 54F22를 생산하였다. 이들 집합된 올리고뉴클레오티드는 차후에 클로닝되고 서열 검증되었다.
실시예 11
FZD8-Fc 변이체에 의한 Wnt 신호전달의 저해
Wnt 신호전달 경로의 활성화를 차단하거나 저해하는 FZD8-Fc 변이체의 능력이 시험관내에서 루시페라아제 리포터 측정법을 이용하여 결정되었다. STF293 세포는 항생제와 10% FCS로 보충된 DMEM에서 배양되었다. 이들 STF293 세포는 개똥벌레 루시페라아제 리포터 유전자의 상류에서 프로모터에 연결된 TCF 전사 반응 요소의 7개 사본을 내포하는 리포터 벡터로 안정적으로 형질감염된다. 이러한 구조체는 정준 Wnt 신호전달 경로의 활성을 측정한다. 이들 세포는 웰당 10,000개 세포로 배양 평판에 첨가되었다. 하룻밤 배양후, FZD8-Fc 변이체 또는 대조 생쥐 JAG1-Fc가 Wnt3a-조건 배지와 공동으로 첨가되었다. FZD8-Fc 변이체와 JAG1-Fc는 20, 4, 0.8, 0.16, 0.03, 0.006, 0.0012, 그리고 0.0003 ㎍/㎖의 농도에서 이용되었다. 이들 세포는 Wnt3a를 안정적으로 발현하는 L 세포로부터 만들어진 25% Wnt3A-조건 배지에서 배양되었다. 하룻밤 (대략 18시간) 배양후, Steady-Glo® 루시페라아제 측정 키트 (Promega, Madison, WI)를 이용하여 루시페라아제 수준이 측정되었다.
FZD8-Fc 변이체의 차단 활성이 측정되었고, 그리고 100%로 설정된 각 측정에서 동일한 참고 표준 작업과 비교하여 상대적인 활성으로서 표 3에 제시된다.
FZD8 - Fc 변이체 상대적인 활성 %
54F03 107, 143
54F05 167
54F08 137
54F09 156, 157
54F12 52
54F13 103
54F14 125
54F15 128
54F16 125
실시예 12
쥐에서 FZD8-Fc 변이체의 약물동력학
몇몇 FZD8-Fc 변이체의 약물동력학이 쥐에서 2주 약물동력학 (PK) 연구에서 평가되었다. 평가된 FZD8-Fc 변이체는 54F03, 54F09, 54F12, 54F13, 54F15 및 54F16이었다. 각 군에서 5마리 Sprague Dawley 수컷 쥐는 꼬리 정맥을 거쳐 10㎎/㎏의 FZD8-Fc 변이체가 투약되고, 그 이후에 2주 동안 1, 24, 48, 72, 96, 168, 240, 그리고 336시간 시점에 샘플이 수집되었다. 각 시점에서, 1 ㎖의 혈액이 칼륨-EDTA 튜브 내로 수집되고 원심분리되었다. 혈장 상층액은 수집되고, 그리고 샘플이 분석될 때까지 동결되었다.
각 시점에서 혈장 내에 존재하는 FZD8-Fc 변이체 단백질의 수준이 정량되고, 그리고 각 FZD8-Fc 변이체의 반감기가 계산되었다. 이들 FZD8-Fc 변이체의 반감기는 표 4에 제시된다.
FZD8-Fc 변이체 t1 /2 (hr) Fc 영역
54F03 162 IgG1
54F09 136 IgG1
54F12 152 IgG2
54F13 268 IgG2
54F15 109 IgG1
54F16 154 IgG1
실시예 13
게먹이 원숭이에서 FZD8-Fc 변이체의 약물동력학
4마리 어린 성체/성체 수컷 무경험 게먹이 원숭이는 2마리씩 2개 군으로 무작위로 분할되고, 그리고 30㎎/㎏의 용량에서 FZD-Fc 변이체 54F15 또는 변이체 54F16의 정맥내 (IV) 일시주사가 투여되었다. 하루 2회 (a.m. 및 p.m.) 동물은 폐사 및 통증과 고통의 징후에 대해 관찰되었다. 전반적인 건강과 외관에 대한 케이지사이드 관찰 (cageside observation)이 하루 1회 실시되었다. 투약 당일에, 각 동물은 투약후 대략 1시간과 4시간 시점에, 폐사 및 통증과 고통의 징후에 대해 관찰되었다. 연구의 지속 기간 동안 관찰된 임의의 특이 사항이 기록되었다. 체중은 투약 당일 및 혈액 수집의 종결 시점에서 측정되었다. 혈액 (대략 0.5 ㎖)은 주사기와 바늘을 통해 대퇴정맥 (femoral vein)으로부터 수집되고, 그리고 PK 분석을 위해 투약전 및 투약후 1, 6, 12, 24, 48, 72, 96, 168, 240, 그리고 336시간 시점에 EDTA K3 항응혈약을 내포하는 튜브 내로 이전되었다. 이에 더하여, 혈액 (대략 0.5 ㎖)은 주사기와 바늘을 통해 대퇴정맥 (femoral vein)으로부터 수집되고, 그리고 항-약물 항체 (ADA) 분석을 위해 투약전 및 투약후 336시간 시점에 항응혈약을 내포하지 않는 튜브 내로 이전되었다. 혈장 상층액은 수집되고 샘플이 분석될 때까지 동결되었다. PK 분석의 경우에 동물 혈장 샘플에서 FZD-Fc 농도 및 혈청에서 항-약물 항체의 농도를 측정하기 위해, HTRF (균질 시간 해결 형광, homogeneous time resolved fluorescence) 면역측정법이 수행되었다. 혈장에서 FZD-Fc 농도 대(對) 시간은 일시주사 IV 투여 모형을 이용하여, Phoenix™ WinNonlin® Version 6.0으로 비-구획 분석 (non-compartmental analysis, NCA)에 의해 분석되었다.
각 시점에서 혈장 내에 존재하는 FZD8-Fc 변이체의 수준이 정량되고 (도 16), 그리고 FZD8-Fc 변이체 54F15와 54F16의 반감기가 계산되었다. 표 5에 도시된 바와 같이, FZD8-Fc 변이체 54F15의 반감기는 30㎎/㎏에서 102시간인 것으로 산정되고, 그리고 FZD-Fc8 변이체 54F16의 반감기는 30㎎/㎏에서 137시간인 것으로 산정되었다.
동물 ID T1/2λz(hr) AUC0 -최종(ng*hr/ml) AUC0 -∞(ng*hr/ml) AUC % 포획 Vz(ml) Cl(ml/hr)
FZD8-Fc 54F15
C43064 102.3 28642771.4 31231858.7 8.3 141.7 0.960
C43061 102.5 31904918.2 34846234.1 8.4 127.3 0.861
평균 102.4 30273845 33039046 8.35 134.5 0.9105
FZD8-Fc 54F16
C43066 139.0 29088083.0 35470395.6 18.0 169.6 0.846
C43076 134.1 35934159.0 43449944.6 17.3 133.6 0.690
평균 136.6 32511121 39460170 17.65 151.6 0.768
실시예 14
생체내에서 FZD8-Fc 변이체에 의한 결장 종양 성장의 저해
분리된 C28 결장 종양 세포 (10,000개 세포)는 6-8주령 수컷 NOD/SCID 생쥐 내로 피하 주입되었다. 종양은 145mm3의 평균 체적에 도달할 때까지 28일 동안 성장되었다. 생쥐는 무작위화되고 (군당 n = 9), 그리고 15㎎/㎏의 용량에서 FZD8-Fc 변이체 또는 대조 항체로 주2회 치료되었다. FZD8-Fc 변이체와 대조 항체의 투여는 복막내 강 내로 주사에 의해 실행되었다. 종양 성장은 모니터링되고, 그리고 종양 체적은 지정된 시점에서 전자 캘리퍼스로 측정되었다. 데이터는 평균 ± S.E.M으로서 표시된다.
변이체 54F12와 54F13는 종양 성장에 대한 겉보기 효과 (apparent effect)가 없었고, 종양 체적이 대조 항체로 치료된 생쥐에서 종양과 실질적으로 동일하였다. 대조적으로, 변이체 54F03, 54F09, 54F15와 54F16로 치료는 도 17에 도시된 바와 같이, 대조 항체로 치료와 비교하여 종양 성장에서 대략 56%, 70%, 64%와 70% 감소 (각각)를 유발하였다. 따라서 FZD8-Fc 변이체의 항-종양 성장 활성은 FZD8 부분과 Fc 부분 사이의 접합점에서 아미노산 서열에 의해 영향을 받는 것으로 나타났다. 이에 더하여, 항-종양 성장 활성은 Fc 영역의 출처에 의해 영향을 받는 것으로 나타났는데, 그 이유는 IgG2 융합 단백질인 양쪽 변이체 (54F12와 54F13)가 이러한 모형에서 종양 성장을 저해하지 못하였기 때문이다.
실시예 15
생체내에서 FZD8-Fc 변이체에 의한 췌장 종양 성장의 저해
분리된 PN4 췌장 종양 세포 (10,000개 세포)는 6-8주령 수컷 NOD/SCID 생쥐 내로 피하 주입되었다. 종양은 112mm3의 평균 체적에 도달할 때까지 36일 동안 성장되었다. 생쥐는 무작위화되고 (군당 n = 10), 그리고 15㎎/㎏의 용량에서 FZD8-Fc 변이체 또는 대조 항체로 주2회 치료되었다. FZD8-Fc 변이체와 대조 항체의 투여는 복막내 강 내로 주사에 의해 실행되었다. 종양 성장은 모니터링되고, 그리고 종양 체적은 지정된 시점에서 전자 캘리퍼스로 측정되었다. 데이터는 평균 ± S.E.M으로서 표시된다.
변이체 54F12와 54F13은 대조 항체로 치료된 생쥐에서 종양과 비교하여 종양 성장을 20% 이하로 감소시켰다. FZD8-Fc 변이체 54F03, 54F09, 54F15와 54F16로 치료는 대조 항체로 치료와 비교하여 종양 성장을 대략 20% 내지 60% 감소시켰다. 도 18에 도시된 바와 같이, 변이체 54F09와 54F16은 종양 성장을 각각, 최대량, 45% (p < 0.001) 및 60% (p < 0.001) 감소시켰다. 따라서 FZD8-Fc 변이체의 항-종양 성장 활성은 FZD8 부분과 Fc 부분 사이의 접합점에서 아미노산 서열에 의해 영향을 받는 것으로 나타났다. 실시예 14에서 확인되는 바와 같이, 항-종양 성장 활성은 또한, Fc 영역의 출처에 의해 영향을 받는 것으로 나타났는데, 그 이유는 IgG2 융합 단백질인 양쪽 변이체 (54F12와 54F13)가 IgG1 융합 단백질인 FZD8-Fc 변이체보다 약한 항-종양 활성을 보였기 때문이다.
앞서 기술된 종양-보유 생쥐로부터 췌장 종양 세포는 수확되고, 대략 1mm3 단편으로 절단되고, 그 이후에 세포를 분산시키기 위한 10㎖ 피펫으로 간헐적 혼합과 함께 37℃/5% CO2에서 2시간 동안 10 ㎖당 1 그램의 300 ㎍/㎖ 교원질분해효소와 200 U/ml DNase I에서 효소적 절단 (enzymatic digestion)이 수행되었다. 절단은 동등 부피의 FACS 완충액 (1x Hanks 완충된 염수 용액 (HBSS), 2% 열-비활성화된 소 태아 혈청 (FCS) 및 2mM HEPES pH 7.4)을 첨가함으로써 중단되었다. 세포는 40㎛ 나일론 필터를 통해 여과되고 150 xg에서 5분 동안 원심분리에 의해 수집되었다. 적혈구 세포는 얼음 위에서 2분 동안 염화암모늄을 내포하는 저장성 완충액 (hypotonic buffer)에서 용해되고, 그리고 이들 세포는 과잉의 FACS 완충액으로 다시 한 번 세척되고, 그리고 1x107개 세포/㎖에서 FACS 완충액으로 재현탁되었다.
새로 준비된 단일 세포 현탁액은 얼음 위에서 20분 동안, 5㎍/㎖에서 비오틴화된 항-생쥐 H-2Kd (클론 SF1-1.1, Biolegend, San Diego, CA), 2.5㎍/㎖에서 비오틴화된 항-생쥐 CD45 (30-F11, Biolegend), 그리고 1:200 희석도에서 스트렙타비딘-PerCP-Cy5.5 (eBioscience, San Diego, CA)로 염색되었다. 결합되지 않은 항체는 10 볼륨 (volume)의 FACS 완충액으로 2회 세척에 의해 제거되었다. 인간 세포 표면 마커의 분석의 경우에, 단일 종양 세포 현탁액은 1:50 희석도에서 항-ESA-FITC (Miltenyi Biotec, Auburn, CA), 1:100 희석도에서 항-인간 CD44-PE-Cy7 (eBioscience, San Diego, CA), 그리고 1:5 희석도에서 항-인간 CD201-PE (BD Biosciences)로 염색되었다. 이들 세포는 세척되고, 그리고 2.5 ㎍/㎖의 4'-6-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI)을 내포하는 FACS 완충액에서 재현탁되었다. 단일 형광색으로 염색된 세포는 기기 보정 (instrument calibration)에 이용되었다. 임의의 남아있는 생쥐 세포 (H-2Kd와 CD45에 대하여 양성) 및 사멸 세포 (DAPI-양성)는 세포 선별 (cell sorting) 동안 배제되었다. 세포 더블릿 (doublet)과 덩어리는 이중 식별 게이팅 (doublet discrimination gating)을 이용하여 배제되었다.
도 19에 도시된 바와 같이, FZD8-Fc 변이체 54F03과 54F16으로 종양-보유 생쥐의 치료는 대조 항체로 치료된 생쥐와 비교하여 CD44hi 세포의 백분율을 감소시켰다. 비록 CD201+CD44+ 세포의 백분율이 작긴 하지만, FZD8-Fc 변이체 54F03과 54F16으로 종양-보유 생쥐의 치료는 대조 항체로 치료된 생쥐와 비교하여 CD201+CD44+ 세포의 백분율을 감소시켰다. CD44는 발암성 세포 (가령, 암 줄기 세포)의 마커인 것으로 밝혀졌다. 이에 더하여, 일부 구체예에서, CD44hiCD201+인 세포는 CD44hiCD201- 세포보다 더욱 발암성인 것으로 밝혀졌다. 따라서 FZD8-Fc 변이체가 CD44hi와 CD44hiCD201+ 세포 집단 둘 모두의 백분율을 감소시키고, 따라서 치료된 생쥐에서 발암성 세포의 백분율 또는 숫자를 감소시킬 수 있었다는 것은 중요하다.
실시예 16
N-말단의 특성화
FZD8 단백질 내에서 정확한 신호 서열 절단 부위는 아미노산 25 (알라닌)와 아미노산 26 (알라닌) 사이에 있는 것으로 예측된다; 이 부위에서 절단은 ASA의 N-말단을 남긴다. 상기 예측된 부위에서 절단된 FZD8-Fc 단백질의 이론적 질량 (theoretical mass)과 비교하여 FZD8-Fc 단백질의 질량을 측정하기 위해 질량 분석법에 의한 분석이 이용되었다.
변형된 신호 서열을 갖는 추가의 FZD8-Fc 변이체가 앞서 기술된 바와 같이 DNA2.0 (Menlo Park, CA)에서 생산되었다. DNA2.0는 FZD8-Fc 변이체 단백질, 54F23 내지 54F35를 생산하기 위해 짧은 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 합성하고 집합시켰다. 집합된 올리고뉴클레오티드는 차후에 클로닝되고 서열 검증되었다.
각 FZD8-Fc 변이체의 플라스미드 DNA는 제조업체의 프로토콜에 따라 QIAGEN maxi-prep 키트를 이용하여 제조되었다. 각 변이체의 발현은 FreeStyle™ MAX 시제 (Life Technologies) 및 293FS 세포를 이용하여 수행되었다. 세포는 로그 기 (log phase)로 성장되고 1x106개 세포/㎖로 희석되었다. 각 반응에서, 315 ㎍의 플라스미드 DNA는 5 ㎖의 OptiMEM Pro로 희석되었다. 상이한 튜브에서, 315 ㎕의 FreeStyle™ MAX 시제가 5 ㎖의 OptiMem Pro에 희석되었다. 플라스미드 DNA는 이러한 DNA에 희석된 FreeStyle™ MAX 시제를 방울방울 첨가함으로써 FreeStyle™ MAX 시제와 복합되고, 그 이후에 실온에서 15분 동안 배양되었다. DNA-시제 복합체는 이후, 250 ㎖의 293FS 세포에 첨가되었다. 발현 반응물은 7-10일 동안 성장되고, 이 시점에서 이들은 원심분리와 여과에 의해 수확되었다. 각 Fzd8-Fc 변이체는 5㎖ HiTrap MAbSelect SURE 칼럼을 이용한 친화성 정제에 의해 정제되었다. 간단히 말하면, 수확된 배지는 결합 완충액으로 평형화된 칼럼에 통과되었다. 이들 칼럼은 결합되지 않은 물질을 제거하기 위해 결합 완충액으로 세척되고, 그리고 이후, FZD8-Fc 단백질은 용출 완충액으로 용출되었다. 용출된 샘플은 이후, 질량 분석법에 적합한 완충액에 투석되었다.
대략 250 ㎍의 각 FZD8-Fc 샘플은 항체의 중쇄와 경쇄를 분리하기 위해 37℃에서 30분 동안 Tris (2-카르복시에틸) 포스핀 (TCEP)으로 환원되었다. 환원된 샘플은 이후, 37℃에서 30분 동안 요오드아세트아미드로 처리에 의해 알킬화되었다. 샘플은 NAP-5 칼럼 (GE Health Care)에 통과되어 완충액이 10 mM Tris-HCL (pH 7.4)로 교체되었다. 완충액 교환은 내생글리코시드가수분해효소 PNGase F로 탈당화가 뒤이었다. 샘플은 37℃에서 1:200 (효소:샘플)의 비율에서 하룻밤동안 배양되었다. 반응은 산의 첨가에 의해 중단되었다. 환원된, 알킬화된, 그리고 탈당화된 FZD8-Fc 샘플은 Waters UPLC™ 및 전기분무-QToF 질량 분석계를 이용한 액체 크로마토그래피-질량 분석 (LC/MS)을 위해 바이알 내로 적하되었다. 세슘 트리플루오르아세트산 이온 클러스터를 이용한 각 샘플 분석의 질량 검정 (mass calibration)은 Waters LockSpray™ 이중 전기분무 이온 공급원으로 수행되었다.
도 20A에 도시된 바와 같이, 고유 서열과 동일한 서열인 신호 서열을 갖는 FZD8-Fc 단백질 (54F16)은 N-말단 서열과 관련하여 이종성 혼합물로서 생산되었다. 샘플 내에 존재하는 단백질의 비례 (proportional)는 ASA의 N-말단 서열을 갖는, 아미노산 25와 26에서 절단된 단백질에서 질량에서 동등하였다 (41704.0에서 피크). 하지만, 상기 단백질 중에서 50% 이상이 상이한 질량 (41918.2에서 피크)을 갖는 형태로 존재하였다. 이러한 피크는 아미노산 22와 23에서 절단된 단백질을 가장 유력하게 대표한다; 이 부위에서 절단은 AAAASA (서열 번호:76)의 N-말단 서열을 남긴다.
신호 서열 서열 번호:68 내지 서열 번호:74를 갖는 FZD8-Fc 변이체가 산출되고, 세포 배양액으로부터 정제되고, 그리고 앞서 기술된 바와 같이 질량 분석법에 의해 분석되었다. 신호 서열 서열 번호:70 내지 서열 번호:74를 갖는 변이체는 거의 완전한 상동성 단백질 샘플 (몇몇 대표적인 결과가 도 20B-20E에 도시된다)을 생산하는 것으로 관찰되었다. 신호 서열 서열 번호:71을 갖는 서열 번호:53을 포함하는 FZD8-Fc 변이체 54F26은 ASA의 N-말단 서열을 갖는, 아미노산 25와 26에서 절단된 단백질 (피크 41930.1)로서 주로 (95% 이상) 존재하였다 (도 20B). 유사한 결과가 서열 번호:53 및 신호 서열 서열 번호:72를 포함하는 변이체 (54F28, 도 20C), 서열 번호:53 및 신호 서열 서열 번호:73을 포함하는 변이체 (54F30, 도 20D), 그리고 서열 번호:53 및 신호 서열 서열 번호:74를 포함하는 변이체 (54F32, 도 20E)에서도 관찰되었다. 유사한 결과가 일시적 형질감염 및 안정된 형질감염으로부터 생산된 단백질에서 관찰되었다.
실시예 17
생체내에서 FZD8-Fc 변이체에 의한 결장 종양 성장의 저해
분리된 C28 결장 종양 세포 (10,000개 세포)는 6-8주령 수컷 NOD/SCID 생쥐 내로 피하 주입되었다. 종양은 175mm3의 평균 체적에 도달할 때까지 56일 동안 성장되었다. 생쥐는 무작위화되고 (군당 n = 10), 그리고 15㎎/㎏의 용량에서 FZD8-Fc 구조체 54F03, 54F23, 54F26, 또는 대조 항체로 주2회 치료되었다. FZD8-Fc 변이체와 대조 항체의 투여는 복막내 강 내로 주사에 의해 실행되었다. 종양 성장은 모니터링되고, 그리고 종양 체적은 지정된 시점에서 전자 캘리퍼스로 측정되었다. 데이터는 평균 ± S.E.M으로서 표시된다.
FZD8-Fc 변이체 54F23과 54F26은 아미노산 ASA의 N-말단을 갖는 주로 균질성 단백질로서 생산되고, 반면 54F03은 아미노산 ASA와 AAAASA의 N-말단을 갖는 이질성 단백질 혼합물로서 생산된다. 도 21에 도시된 바와 같이, FZD8-Fc 변이체 54F03, 54F23, 그리고 54F26로 치료는 3주간 치료후, 대조 항체로 치료와 비교하여 종양 성장을 각각, 48%, 57% 및 52% 감소시켰다.
본 명세서에서 인용된 모든 간행물, 특허, 특허 출원, 인터넷 사이트, 그리고 접근 번호/데이터베이스 서열 (폴리뉴클레오티드와 폴리펩티드 서열 둘 모두 포함)은 마치 각 개별 간행물, 특허, 특허 출원, 인터넷 사이트, 그리고 접근 번호/데이터베이스 서열이 참조로서 편입되는 것으로 명백하게 및 개별적으로 지시된 것처럼 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다.
서열
FZD8-Fc 아미노산 서열-변이체 54F03 (예측된 신호 서열 없음; 융합 단백질의 FZD8 서열과 Fc 서열 사이에 "GRA" 링커 서열은 밑줄로 표시된다) (서열 번호:1)
ASAKELACQEITVPLCKGIGYNYTYMPNQFNHDTQDEAGLEVHQFWPLVEIQCSPDLKFF
LCSMYTPICLEDYKKPLPPCRSVCERAKAGCAPLMRQYGFAWPDRMRCDRLPEQGNPDTL
CMDYNRTDLTTGRADKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV
SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK
ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ
PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
K
FZD8-Fc 코딩 서열 (FZD8-유래된 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드는 밑줄로 표시된다) (서열 번호:2)
ATGGAGTGGGGTTACCTGTTGGAAGTGACCTCGCTGCTGGCCGCCTTGGCGCTGCTGCAG
CGCTCTAGCGGCGCTGCGGCCGCCTCGGCCAAGGAGCTGGCATGCCAAGAGATCACCGTG
CCGCTGTGTAAGGGCATCGGCTACAACTACACCTACATGCCCAATCAGTTCAACCACGAC
ACGCAAGACGAGGCGGGCCTGGAGGTGCACCAGTTCTGGCCGCTGGTGGAGATCCAGTGC
TCGCCCGATCTCAAGTTCTTCCTGTGCAGCATGTACACGCCCATCTGCCTAGAGGACTAC
AAGAAGCCGCTGCCGCCCTGCCGCTCGGTGTGCGAGCGCGCCAAGGCCGGCTGCGCGCCG
CTCATGCGCCAGTACGGCTTCGCCTGGCCCGACCGCATGCGCTGCGACCGGCTGCCCGAG
CAAGGCAACCCTGACACGCTGTGCATGGACTACAACCGCACCGACCTAACCACCGGGCGC
GCCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCA
GTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTC
ACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTG
GACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACG
TACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTAC
AAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCC
AAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACC
AAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTG
GAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGAC
TCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAG
GGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAG
AGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
최소 FZD 와 SFRP Fri 도메인 서열
h-FZD1 아미노산 116-227 (서열 번호:3)
CQPISIPLCTDIAYNQTIMPNLLGHTNQEDAGLEVHQFYPLVKVQCSAELKFFLCSMYAP
VCTVLEQALPPCRSLCERARQGCEALMNKFGFQWPDTLKCEKFPVHGAGELC
h-FZD2 아미노산 39-150 (서열 번호:4)
CQPISIPLCTDIAYNQTIMPNLLGHTNQEDAGLEVHQFYPLVKVQCSPELRFFLCSMYAP
VCTVLEQAIPPCRSICERARQGCEALMNKFGFQWPERLRCEHFPRHGAEQIC
h-FZD3 아미노산 28-133 (서열 번호:5)
CEPITLRMCQDLPYNTTFMPNLLNHYDQQTAALAMEPFHPMVNLDCSRDFRPFLCALYAP
ICMEYGRVTLPCRRLCQRAYSECSKLMEMFGVPWPEDMECSRFPDC
h-FZD4 아미노산 48-161 (서열 번호:6)
CDPIRISMCQNLGYNVTKMPNLVGHELQTDAELQLTTFTPLIQYGCSSQLQFFLCSVYVP
MCTEKINIPIGPCGGMCLSVKRRCEPVLKEFGFAWPESLNCSKFPPQNDHNHMC
h-FZD5 아미노산 33-147 (서열 번호:7)
CQEITVPMCRGIGYNLTHMPNQFNHDTQDEAGLEVHQFWPLVEIQCSPDLRFFLCSMYTP
ICLPDYHKPLPPCRSVCERAKAGCSPLMRQYGFAWPERMSCDRLPVLGRDAEVLC
h-FZD6 아미노산 24-129 (서열 번호:8)
CEPITVPRCMKMAYNMTFFPNLMGHYDQSIAAVEMEHFLPLANLECSPNIETFLCKAFVP
TCIEQIHVVPPCRKLCEKVYSDCKKLIDTFGIRWPEELECDRLQYC
h-FZD7 아미노산 49-160 (서열 번호:9)
CQPISIPLCTDIAYNQTILPNLLGHTNQEDAGLEVHQFYPLVKVQCSPELRFFLCSMYAP
VCTVLDQAIPPCRSLCERARQGCEALMNKFGFQWPERLRCENFPVHGAGEIC
h-FZD8 아미노산 35-148 (서열 번호:10)
CQEITVPLCKGIGYNYTYMPNQFNHDTQDEAGLEVHQFWPLVEIQCSPDLKFFLCSMYTP
ICLEDYKKPLPPCRSVCERAKAGCAPLMRQYGFAWPDRMRCDRLPEQGNPDTLC
h-FZD9 아미노산 39-152 (서열 번호:11)
CQAVEIPMCRGIGYNLTRMPNLLGHTSQGEAAAELAEFAPLVQYGCHSHLRFFLCSLYAP
MCTDQVSTPIPACRPMCEQARLRCAPIMEQFNFGWPDSLDCARLPTRNDPHALC
h-FZD10 아미노산 34-147 (서열 번호:12)
CQPIEIPMCKDIGYNMTRMPNLMGHENQREAAIQLHEFAPLVEYGCHGHLRFFLCSLYAP
MCTEQVSTPIPACRVMCEQARLKCSPIMEQFNFKWPDSLDCRKLPNKNDPNYLC
h-SFRP1 아미노산 57-165 (서열 번호:13)
CVDIPADLRLCHNVGYKKMVLPNLLEHETMAEVKQQASSWVPLLNKNCHAGTQVFLCSLF
APVCLDRPIYPCRWLCEAVRDSCEPVMQFFGFYWPEMLKCDKFPEGDVC
h-SFRP2 아미노산 40-152 (서열 번호:14)
CKPIPANLQLCHGIEYQNMRLPNLLGHETMKEVLEQAGAWIPLVMKQCHPDTKKFLCSLF
APVCLDDLDETIQPCHSLCVQVKDRCAPVMSAFGFPWPDMLECDRFPQDNDLC
h-SFRP3 아미노산 35-147 (서열 번호:15)
CEPVRIPLCKSLPWNMTKMPNHLHHSTQANAILAIEQFEGLLGTHCSPDLLFFLCAMYAP
ICTIDFQHEPIKPCKSVCERARQGCEPILIKYRHSWPENLACEELPVYDRGVC
h-SFRP4 아미노산 24-136 (서열 번호:16)
CEAVRIPMCRHMPWNITRMPNHLHHSTQENAILAIEQYEELVDVNCSAVLRFFFCAMYAP
ICTLEFLHDPIKPCKSVCQRARDDCEPLMKMYNHSWPESLACDELPVYDRGVC
h-SFRP5 아미노산 53-162 (서열 번호:17)
CLDIPADLPLCHTVGYKRMRLPNLLEHESLAEVKQQASSWLPLLAKRCHSDTQVFLCSLF
APVCLDRPIYPCRSLCEAVRAGCAPLMEAYGFPWPEMLHCHKFPLDNDLC
Fc 서열
인간 IgG1 Fc 영역 (서열 번호:18)
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD
GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK
GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS
DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
인간 IgG1 Fc 영역 (서열 번호:42)
KSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNW
YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS
KAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV
LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
인간 IgG1 Fc 영역 (서열 번호:43)
EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKF
NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT
ISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP
PVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
인간 IgG2 Fc 영역 (서열 번호:44)
CVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVE
VHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQP
REPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGS
FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
FZD Fri 도메인 서열
인간 FZD4 Fri 도메인 (밑줄로 표시된 예측된 신호 서열) (서열 번호:19)
MLAMAWRGAGPSVPGAPGGVGLSLGLLLQLLLLLGPARGFGDEEERRCDPIRISMCQNLG
YNVTKMPNLVGHELQTDAELQLTTFTPLIQYGCSSQLQFFLCSVYVPMCTEKINIPIGPC
GGMCLSVKRRCEPVLKEFGFAWPESLNCSKFPPQNDHNHMCMEGPGDEEV
인간 FZD5 Fri 도메인 (밑줄로 표시된 예측된 신호 서열) (서열 번호:20)
MARPDPSAPPSLLLLLLAQLVGRAAAASKAPVCQEITVPMCRGIGYNLTHMPNQFNHDTQ
DEAGLEVHQFWPLVEIQCSPDLRFFLCSMYTPICLPDYHKPLPPCRSVCERAKAGCSPLM
RQYGFAWPERMSCDRLPVLGRDAEVLCMDYNRSEATT
인간 FZD8 Fri 도메인 (밑줄로 표시된 예측된 신호 서열) (서열 번호:21)
MEWGYLLEVTSLLAALALLQRSSGAAAASAKELACQEITVPLCKGIGYNYTYMPNQFNHD
TQDEAGLEVHQFWPLVEIQCSPDLKFFLCSMYTPICLEDYKKPLPPCRSVCERAKAGCAP
LMRQYGFAWPDRMRCDRLPEQGNPDTLCMDYNRTDLTT
예측된 신호 서열이 없는 인간 FZD1 Fri 도메인 아미노산 서열 (서열 번호:32; 서열 번호:27의 아미노산 87-237)
QQPPPPPQQQQSGQQYNGERGISVPDHGYCQPISIPLCTDIAYNQTIMPNLLGHTNQEDA
GLEVHQFYPLVKVQCSAELKFFLCSMYAPVCTVLEQALPPCRSLCERARQGCEALMNKFG
FQWPDTLKCEKFPVHGAGELCVGQNTSDKGT
예측된 신호 서열이 없는 인간 FZD2 Fri 도메인 아미노산 서열 (서열 번호:33; 서열 번호:28의 아미노산 24-159)
QFHGEKGISIPDHGFCQPISIPLCTDIAYNQTIMPNLLGHTNQEDAGLEVHQFYPLVKVQ
CSPELRFFLCSMYAPVCTVLEQAIPPCRSICERARQGCEALMNKFGFQWPERLRCEHFPR
HGAEQICVGQNHSEDG
예측된 신호 서열이 없는 인간 FZD3 Fri 도메인 아미노산 서열 (서열 번호:34; 서열 번호:29의 아미노산 23-143)
HSLFSCEPITLRMCQDLPYNTTFMPNLLNHYDQQTAALAMEPFHPMVNLDCSRDF
RPFLCALYAPICMEYGRVTLPCRRLCQRAYSECSKLMEMFGVPWPEDMECSRFPDCDEPY
PRLVDL
예측된 신호 서열이 없는 인간 FZD4 Fri 도메인 아미노산 서열 (서열 번호:35; 서열 번호:22의 아미노산 40-170)
FGDEEERRCDPIRISMCQNLGYNVTKMPNLVGHELQTDAELQLTTFTPLIQYGCSSQLQF
FLCSVYVPMCTEKINIPIGPCGGMCLSVKRRCEPVLKEFGFAWPESLNCSKFPPQNDHNH
MCMEGPGDEEV
예측된 신호 서열이 없는 인간 FZD5 Fri 도메인 아미노산 서열 (서열 번호:36; 서열 번호:23의 아미노산 27-157)
ASKAPVCQEITVPMCRGIGYNLTHMPNQFNHDTQDEAGLEVHQFWPLVEIQCSPDLRFFL
CSMYTPICLPDYHKPLPPCRSVCERAKAGCSPLMRQYGFAWPERMSCDRLPVLGRDAEVL
CMDYNRSEATT
예측된 신호 서열이 없는 인간 FZD6 Fri 도메인 아미노산 서열 (서열 번호:37; 서열 번호:24의 아미노산 19-146)
HSLFTCEPITVPRCMKMAYNMTFFPNLMGHYDQSIAAVEMEHFLPLANLECSPNIETFLC
KAFVPTCIEQIHVVPPCRKLCEKVYSDCKKLIDTFGIRWPEELECDRLQYCDETVPVTFD
PHTEFLG
예측된 신호 서열이 없는 인간 FZD7 Fri 도메인 아미노산 서열 (서열 번호:38; 서열 번호:25의 아미노산 33-170)
QPYHGEKGISVPDHGFCQPISIPLCTDIAYNQTILPNLLGHTNQEDAGLEVHQFYPLVKV
QCSPELRFFLCSMYAPVCTVLDQAIPPCRSLCERARQGCEALMNKFGFQWPERLRCENFP
VHGAGEICVGQNTSDGSG
예측된 신호 서열이 없는 인간 FZD8 Fri 도메인 아미노산 서열 (서열 번호:39; 서열 번호:30의 아미노산 28-158)
ASAKELACQEITVPLCKGIGYNYTYMPNQFNHDTQDEAGLEVHQFWPLVEIQCSPDLKFF
LCSMYTPICLEDYKKPLPPCRSVCERAKAGCAPLMRQYGFAWPDRMRCDRLPEQGNPDTL
CMDYNRTDLTT
예측된 신호 서열이 없는 인간 FZD9 Fri 도메인 아미노산 서열 (서열 번호:40; 서열 번호:31의 아미노산 23-159)
LEIGRFDPERGRGAAPCQAVEIPMCRGIGYNLTRMPNLLGHTSQGEAAAELAEFAPLVQY
GCHSHLRFFLCSLYAPMCTDQVSTPIPACRPMCEQARLRCAPIMEQFNFGWPDSLDCARL
PTRNDPHALCMEAPENA
예측된 신호 서열이 없는 인간 FZD10 Fri 도메인 아미노산 서열 (서열 번호:41; 서열 번호:26의 아미노산 21-154)
ISSMDMERPGDGKCQPIEIPMCKDIGYNMTRMPNLMGHENQREAAIQLHEFAPLVEYGCH
GHLRFFLCSLYAPMCTEQVSTPIPACRVMCEQARLKCSPIMEQFNFKWPDSLDCRKLPNK
NDPNYLCMEAPNNG
FZD 세포외 도메인 ( ECD ) 서열
신호 서열이 있는 인간 FZD1 ECD (서열 번호:27)
MAEEEAPKKSRAAGGGASWELCAGALSARLAEEGSGDAGGRRRPPVDPRRLARQLLLLLW
LLEAPLLLGVRAQAAGQGPGQGPGPGQQPPPPPQQQQSGQQYNGERGISVPDHGYCQPIS
IPLCTDIAYNQTIMPNLLGHTNQEDAGLEVHQFYPLVKVQCSAELKFFLCSMYAPVCTVL
EQALPPCRSLCERARQGCEALMNKFGFQWPDTLKCEKFPVHGAGELCVGQNTSDKGTPTP
SLLPEFWTSNPQHGGGGHRGGFPGGAGASERGKFSCPRALKVPSYLNYHFLGEKDCGAPC
EPTKVYGLMYFGPEELRFSRT
신호 서열이 있는 인간 FZD2 ECD (서열 번호:28)
MRPRSALPRLLLPLLLLPAAGPAQFHGEKGISIPDHGFCQPISIPLCTDIAYNQTIMPNL
LGHTNQEDAGLEVHQFYPLVKVQCSPELRFFLCSMYAPVCTVLEQAIPPCRSICERARQG
CEALMNKFGFQWPERLRCEHFPRHGAEQICVGQNHSEDGAPALLTTAPPPGLQPGAGGTP
GGPGGGGAPPRYATLEHPFHCPRVLKVPSYLSYKFLGERDCAAPCEPARPDGSMFFSQEE
TRFARLWILT
신호 서열이 있는 인간 FZD3 ECD (서열 번호:29)
MAMTWIVFSLWPLTVFMGHIGGHSLFSCEPITLRMCQDLPYNTTFMPNLLNHYDQQTAAL
AMEPFHPMVNLDCSRDFRPFLCALYAPICMEYGRVTLPCRRLCQRAYSECSKLMEMFGVP
WPEDMECSRFPDCDEPYPRLVDLNLAGEPTEGAPVAVQRDYGFWCPRELKIDPDLGYSFL
HVRDCSPPCPNMYFRREELSFARY
신호 서열이 있는 인간 FZD4 ECD (서열 번호:22)
MLAMAWRGAGPSVPGAPGGVGLSLGLLLQLLLLLGPARGFGDEEERRCDPIRISMCQNLG
YNVTKMPNLVGHELQTDAELQLTTFTPLIQYGCSSQLQFFLCSVYVPMCTEKINIPIGPC
GGMCLSVKRRCEPVLKEFGFAWPESLNCSKFPPQNDHNHMCMEGPGDEEVPLPHKTPIQP
GEECHSVGTNSDQYIWVKRSLNCVLKCGYDAGLYSRSAKEFTDI
신호 서열이 있는 인간 FZD5 ECD (서열 번호:23)
MARPDPSAPPSLLLLLLAQLVGRAAAASKAPVCQEITVPMCRGIGYNLTHMPNQFNHDTQ
DEAGLEVHQFWPLVEIQCSPDLRFFLCSMYTPICLPDYHKPLPPCRSVCERAKAGCSPLM
RQYGFAWPERMSCDRLPVLGRDAEVLCMDYNRSEATTAPPRPFPAKPTLPGPPGAPASGG
ECPAGGPFVCKCREPFVPILKESHPLYNKVRTGQVPNCAVPCYQPSFSADERT
신호 서열이 있는 인간 FZD6 ECD (서열 번호:24)
MEMFTFLLTCIFLPLLRGHSLFTCEPITVPRCMKMAYNMTFFPNLMGHYDQSIAAVEMEH
FLPLANLECSPNIETFLCKAFVPTCIEQIHVVPPCRKLCEKVYSDCKKLIDTFGIRWPEE
LECDRLQYCDETVPVTFDPHTEFLGPQKKTEQVQRDIGFWCPRHLKTSGGQGYKFLGIDQ
CAPPCPNMYFKSDELEFAKSFIGTVSI
신호 서열이 있는 인간 FZD7 ECD (서열 번호:25)
MRDPGAAAPLSSLGLCALVLALLGALSAGAGAQPYHGEKGISVPDHGFCQPISIPLCTDI
AYNQTILPNLLGHTNQEDAGLEVHQFYPLVKVQCSPELRFFLCSMYAPVCTVLDQAIPPC
RSLCERARQGCEALMNKFGFQWPERLRCENFPVHGAGEICVGQNTSDGSGGPGGGPTAYP
TAPYLPDLPFTALPPGASDGRGRPAFPFSCPRQLKVPPYLGYRFLGERDCGAPCEPGRAN
GLMYFKEEERRFARL
신호 서열이 있는 인간 FZD8 ECD (서열 번호:30)
MEWGYLLEVTSLLAALALLQRSSGAAAASAKELACQEITVPLCKGIGYNYTYMPNQFNHD
TQDEAGLEVHQFWPLVEIQCSPDLKFFLCSMYTPICLEDYKKPLPPCRSVCERAKAGCAP
LMRQYGFAWPDRMRCDRLPEQGNPDTLCMDYNRTDLTTAAPSPPRRLPPPPPGEQPPSGS
GHGRPPGARPPHRGGGRGGGGGDAAAPPARGGGGGGKARPPGGGAAPCEPGCQCRAPMVS
VSSERHPLYNRVKTGQIANCALPCHNPFFSQDERAFT
신호 서열이 있는 인간 FZD9 ECD (서열 번호:31)
MAVAPLRGALLLWQLLAAGGAALEIGRFDPERGRGAAPCQAVEIPMCRGIGYNLTRMPNL
LGHTSQGEAAAELAEFAPLVQYGCHSHLRFFLCSLYAPMCTDQVSTPIPACRPMCEQARL
RCAPIMEQFNFGWPDSLDCARLPTRNDPHALCMEAPENATAGPAEPHKGLGMLPVAPRPA
RPPGDLGPGAGGSGTCENPEKFQYVEKSRSCAPRCGPGVEVFWSRRDKDF
신호 서열이 있는 인간 FZD10 ECD (서열 번호:26)
MQRPGPRLWLVLQVMGSCAAISSMDMERPGDGKCQPIEIPMCKDIGYNMTRMPNLMGHEN
QREAAIQLHEFAPLVEYGCHGHLRFFLCSLYAPMCTEQVSTPIPACRVMCEQARLKCSPI
MEQFNFKWPDSLDCRKLPNKNDPNYLCMEAPNNGSDEPTRGSGLFPPLFRPQRPHSAQEH
PLKDGGPGRGGCDNPGKFHHVEKSASCAPLCTPGVDVYWSREDKRFA
FZD8 - Fc 변이체
FZD8-Fc 변이체 54F03 아미노산 서열 (예측된 신호 서열 없음; 대안적 절단) (서열 번호:45)
AAAASAKELACQEITVPLCKGIGYNYTYMPNQFNHDTQDEAGLEVHQFWPLVEIQCSPDL
KFFLCSMYTPICLEDYKKPLPPCRSVCERAKAGCAPLMRQYGFAWPDRMRCDRLPEQGNP
DTLCMDYNRTDLTTGRADKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVV
VDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV
SNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES
NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL
SPGK
FZD8-Fc 변이체 54F09 아미노산 서열 (예측된 신호 서열 없음) (서열 번호:46)
ASAKELACQEITVPLCKGIGYNYTYMPNQFNHDTQDEAGLEVHQFWPLVEIQCSPDLKFF
LCSMYTPICLEDYKKPLPPCRSVCERAKAGCAPLMRQYGFAWPDRMRCDRLPEQGNPDTL
CMDYNRTDLTTAAPSPPDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVV
VDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV
SNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES
NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL
SPGK
FZD8-Fc 변이체 54F09 아미노산 서열 (예측된 신호 서열 없음; 대안적 절단) (서열 번호:47)
AAAASAKELACQEITVPLCKGIGYNYTYMPNQFNHDTQDEAGLEVHQFWPLVEIQCSPDL
KFFLCSMYTPICLEDYKKPLPPCRSVCERAKAGCAPLMRQYGFAWPDRMRCDRLPEQGNP
DTLCMDYNRTDLTTAAPSPPDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT
CVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYK
CKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE
WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS
LSLSPGK
FZD8-Fc 변이체 54F15 아미노산 서열 (예측된 신호 서열 없음) (서열 번호:48)
ASAKELACQEITVPLCKGIGYNYTYMPNQFNHDTQDEAGLEVHQFWPLVEIQCSPDLKFF
LCSMYTPICLEDYKKPLPPCRSVCERAKAGCAPLMRQYGFAWPDRMRCDRLPEQGNPDTL
CMDYNRTDLTTAAPDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV
SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK
ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ
PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
K
FZD8-Fc 변이체 54F15 아미노산 서열 (예측된 신호 서열 없음; 대안적 절단) (서열 번호:49)
AAAASAKELACQEITVPLCKGIGYNYTYMPNQFNHDTQDEAGLEVHQFWPLVEIQCSPDL
KFFLCSMYTPICLEDYKKPLPPCRSVCERAKAGCAPLMRQYGFAWPDRMRCDRLPEQGNP
DTLCMDYNRTDLTTAAPDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVV
VDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV
SNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES
NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL
SPGK
FZD8-Fc 변이체 54F16, 54F17, 54F18, 54F23, 54F25, 54F27, 54F29, 54F31, 그리고 54F34 아미노산 서열 (예측된 신호 서열 없음) (서열 번호:50)
ASAKELACQEITVPLCKGIGYNYTYMPNQFNHDTQDEAGLEVHQFWPLVEIQCSPDLKFF
LCSMYTPICLEDYKKPLPPCRSVCERAKAGCAPLMRQYGFAWPDRMRCDRLPEQGNPDTL
CMDYNRTDLTTKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV
SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK
ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ
PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
K
FZD8-Fc 변이체 54F16 아미노산 서열 (예측된 신호 서열 없음; 대안적 절단)(서열 번호:51)
AAAASAKELACQEITVPLCKGIGYNYTYMPNQFNHDTQDEAGLEVHQFWPLVEIQCSPDL
KFFLCSMYTPICLEDYKKPLPPCRSVCERAKAGCAPLMRQYGFAWPDRMRCDRLPEQGNP
DTLCMDYNRTDLTTKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVV
VDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV
SNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES
NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL
SPG
FZD8-Fc 변이체 54F16 아미노산 서열 (신호 서열 있음) (서열 번호:52)
MEWGYLLEVTSLLAALALLQRSSGAAAASAKELACQEITVPLCKGIGYNYTYMPNQFNHD
TQDEAGLEVHQFWPLVEIQCSPDLKFFLCSMYTPICLEDYKKPLPPCRSVCERAKAGCAP
LMRQYGFAWPDRMRCDRLPEQGNPDTLCMDYNRTDLTTKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPS
VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST
YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELT
KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ
GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
FZD8-Fc 변이체 54F19, 54F20, 54F24, 54F26, 54F28, 54F30, 54F32, 54F34, 그리고 54F35 아미노산 서열 (예측된 신호 서열 없음) (서열 번호:53)
ASAKELACQEITVPLCKGIGYNYTYMPNQFNHDTQDEAGLEVHQFWPLVEIQCSPDLKFF
LCSMYTPICLEDYKKPLPPCRSVCERAKAGCAPLMRQYGFAWPDRMRCDRLPEQGNPDTL
CMDYNRTDLTTEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV
DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS
NKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN
GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLS
PGK
FZD8-Fc 변이체 54F19 아미노산 서열 (예측된 신호 서열 없음; 대안적 절단) (서열 번호:54)
ALAASAKELACQEITVPLCKGIGYNYTYMPNQFNHDTQDEAGLEVHQFWPLVEIQCSPDL
KFFLCSMYTPICLEDYKKPLPPCRSVCERAKAGCAPLMRQYGFAWPDRMRCDRLPEQGNP
DTLCMDYNRTDLTTEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTC
VVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKC
KVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW
ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL
SLSPGK
FZD8-Fc 변이체 54F20 아미노산 서열 (예측된 신호 서열 없음; 대안적 절단) (서열 번호:55)
VLAASAKELACQEITVPLCKGIGYNYTYMPNQFNHDTQDEAGLEVHQFWPLVEIQCSPDL
KFFLCSMYTPICLEDYKKPLPPCRSVCERAKAGCAPLMRQYGFAWPDRMRCDRLPEQGNP
DTLCMDYNRTDLTTEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTC
VVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKC
KVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW
ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL
SLSPGK
FZD8-Fc 변이체 54F34 아미노산 서열 (예측된 신호 서열 없음) (서열 번호:65)
KELACQEITVPLCKGIGYNYTYMPNQFNHDTQDEAGLEVHQFWPLVEIQCSPDLKFFLCS
MYTPICLEDYKKPLPPCRSVCERAKAGCAPLMRQYGFAWPDRMRCDRLPEQGNPDTLCMD
YNRTDLTTEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKA
LPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQP
ENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
FZD8-Fc 변이체 54F33 아미노산 서열 (예측된 신호 서열 없음) (서열 번호:66)
KELACQEITVPLCKGIGYNYTYMPNQFNHDTQDEAGLEVHQFWPLVEIQCSPDLKFFLCS
MYTPICLEDYKKPLPPCRSVCERAKAGCAPLMRQYGFAWPDRMRCDRLPEQGNPDTLCMD
YNRTDLTTKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE
DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP
APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN
NYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
신호 서열이 있는 인간 ROR1 ECD (서열 번호:56)
MHRPRRRGTRPPLLALLAALLLAARGAAAQETELSVSAELVPTSSWNISSELNKDSYLTL
DEPMNNITTSLGQTAELHCKVSGNPPPTIRWFKNDAPVVQEPRRLSFRSTIYGSRLRIRN
LDTTDTGYFQCVATNGKEVVSSTGVLFVKFGPPPTASPGYSDEYEEDGFCQPYRGIACAR
FIGNRTVYMESLHMQGEIENQITAAFTMIGTSSHLSDKCSQFAIPSLCHYAFPYCDETSS
VPKPRDLCRDECEILENVLCQTEYIFARSNPMILMRLKLPNCEDLPQPESPEAANCIRIG
IPMADPINKNHKCYNSTGVDYRGTVSVTKSGRQCQPWNSQYPHTHTFTALRFPELNGGHS
YCRNPGNQKEAPWCFTLDENFKSDLCDIPACDSKDSKEKNKMEILY
신호 서열이 있는 인간 ROR2 ECD (서열 번호:57)
MARGSALPRRPLLCIPAVWAAAALLLSVSRTSGEVEVLDPNDPLGPLDGQDGPIPTLKGY
FLNFLEPVNNITIVQGQTAILHCKVAGNPPPNVRWLKNDAPVVQEPRRIIIRKTEYGSRL
RIQDLDTTDTGYYQCVATNGMKTITATGVLFVRLGPTHSPNHNFQDDYHEDGFCQPYRGI
ACARFIGNRTIYVDSLQMQGEIENRITAAFTMIGTSTHLSDQCSQFAIPSFCHFVFPLCD
ARSRTPKPRELCRDECEVLESDLCRQEYTIARSNPLILMRLQLPKCEALPMPESPDAANC
MRIGIPAERLGRYHQCYNGSGMDYRGTASTTKSGHQCQPWALQHPHSHHLSSTDFPELGG
GHAYCRNPGGQMEGPWCFTQNKNVRMELCDVPSCSPRDSSKMG
h-ROR1 최소 Fri 도메인 (서열 번호:58)
CQPYRGIACARFIGNRTVYMESLHMQGEIENQITAAFTMIGTSSHLSDKCSQFAIPSLCH
YAFPYCDETSSVPKPRDLCRDECEILENVLCQTEYIFARSNPMILMRLKLPNCEDLPQPE
SPEAANC
h-ROR2 최소 Fri 도메인 (서열 번호:59)
CQPYRGIACARFIGNRTIYVDSLQMQGEIENRITAAFTMIGTSTHLSDQCSQFAIPSFCH
FVFPLCDARSRTPKPRELCRDECEVLESDLCRQEYTIARSNPLILMRLQLPKCEALPMPE
SPDAANC
링커 (서열 번호:60)
ESGGGGVT
링커 (서열 번호:61)
LESGGGGVT
링커 (서열 번호:62)
GRAQVT
링커 (서열 번호:63)
WRAQVT
링커 (서열 번호:64)
ARGRAQVT
신호 서열 (서열 번호:67)
MEWGYLLEVTSLLAALALLQRSSGAAA
신호 서열 (서열 번호:68)
MEWGYLLEVTSLLAALALLQRSSGALA
신호 서열 (서열 번호:69)
MEWGYLLEVTSLLAALALLQRSSGVLA
신호 서열 (서열 번호:70)
MEWGYLLEVTSLLAALLLLQRSPIVHA
신호 서열 (서열 번호:71)
MEWGYLLEVTSLLAALFLLQRSPIVHA
신호 서열 (서열 번호:72)
MEWGYLLEVTSLLAALLLLQRSPFVHA
신호 서열 (서열 번호:73)
MEWGYLLEVTSLLAALLLLQRSPIIYA
신호 서열 (서열 번호:74)
MEWGYLLEVTSLLAALLLLQRSPIAHA
신호 서열이 있는 FZD8-Fc 변이체 54F26 (서열 번호:75)
MEWGYLLEVTSLLAALFLLQRSPIVHAASAKELACQEITVPLCKGIGYNYTYMPNQFNHD
TQDEAGLEVHQFWPLVEIQCSPDLKFFLCSMYTPICLEDYKKPLPPCRSVCERAKAGCAP
LMRQYGFAWPDRMRCDRLPEQGNPDTLCMDYNRTDLTTEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGG
PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN
STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDE
LTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW
QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
N-말단 서열 (서열 번호:76)
AAAASA
SEQUENCE LISTING <110> OncoMed Pharmaceuticals, Inc. SATYAL, Sanjeev H. MITRA, Satyajit Sujit Kumar GURNEY, Austin L. <120> Wnt Antagonists and Methods of Treatment and Screening <130> 2293.064PC03 <140> P110100098 <141> 2011-01-12 <150> 61/424,408 <151> 2010-12-17 <150> 61/393,675 <151> 2010-10-15 <150> 61/294,270 <151> 2010-01-12 <160> 76 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 361 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FZD8-Fc amino acid sequence-variant 54F03 (without predicted signal) <220> <221> MISC_FEATURE <223> GRA linker sequence between the FZD8 sequence and the Fc sequence of the fusion protein <400> 1 Ala Ser Ala Lys Glu Leu Ala Cys Gln Glu Ile Thr Val Pro Leu Cys 1 5 10 15 Lys Gly Ile Gly Tyr Asn Tyr Thr Tyr Met Pro Asn Gln Phe Asn His 20 25 30 Asp Thr Gln Asp Glu Ala Gly Leu Glu Val His Gln Phe Trp Pro Leu 35 40 45 Val Glu Ile Gln Cys Ser Pro Asp Leu Lys Phe Phe Leu Cys Ser Met 50 55 60 Tyr Thr Pro Ile Cys Leu Glu Asp Tyr Lys Lys Pro Leu Pro Pro Cys 65 70 75 80 Arg Ser Val Cys Glu Arg Ala Lys Ala Gly Cys Ala Pro Leu Met Arg 85 90 95 Gln Tyr Gly Phe Ala Trp Pro Asp Arg Met Arg Cys Asp Arg Leu Pro 100 105 110 Glu Gln Gly Asn Pro Asp Thr Leu Cys Met Asp Tyr Asn Arg Thr Asp 115 120 125 Leu Thr Thr Gly Arg Ala Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 130 135 140 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 145 150 155 160 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 165 170 175 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 180 185 190 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 195 200 205 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 210 215 220 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 225 230 235 240 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 245 250 255 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu 260 265 270 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 275 280 285 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 290 295 300 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Gln Asp Glu Ala Gly Leu Glu Val His Gln Phe 35 40 45 Trp Pro Leu Val Glu Ile Gln Cys Ser Pro Asp Leu Lys Phe Phe Leu 50 55 60 Cys Ser Met Tyr Thr Pro Ile Cys Leu Glu Asp Tyr Lys Lys Pro Leu 65 70 75 80 Pro Pro Cys Arg Ser Val Cys Glu Arg Ala Lys Ala Gly Cys Ala Pro 85 90 95 Leu Met Arg Gln Tyr Gly Phe Ala Trp Pro Asp Arg Met Arg Cys Asp 100 105 110 Arg Leu Pro Glu Gln Gly Asn Pro Asp Thr Leu Cys Met Asp Tyr Asn 115 120 125 Arg Thr Asp Leu Thr Thr Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr 130 135 140 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 145 150 155 160 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 165 170 175 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 180 185 190 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 195 200 205 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 210 215 220 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 225 230 235 240 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 245 250 255 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 260 265 270 Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 275 280 285 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 290 295 300 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 305 310 315 320 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 325 330 335 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 340 345 350 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 355 360 365 <210> 56 <211> 406 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human ROR1 ECD with signal <400> 56 Met His Arg Pro Arg Arg Arg Gly Thr Arg Pro Pro Leu Leu Ala Leu 1 5 10 15 Leu Ala Ala Leu Leu Leu Ala Ala Arg Gly Ala Ala Ala Gln Glu Thr 20 25 30 Glu Leu Ser Val Ser Ala Glu Leu Val Pro Thr Ser Ser Trp Asn Ile 35 40 45 Ser Ser Glu Leu Asn Lys Asp Ser Tyr Leu Thr Leu Asp Glu Pro Met 50 55 60 Asn Asn Ile Thr Thr Ser Leu Gly 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Pro Leu Ile Leu Met Arg Leu Gln Leu Pro Lys Cys Glu Ala 275 280 285 Leu Pro Met Pro Glu Ser Pro Asp Ala Ala Asn Cys Met Arg Ile Gly 290 295 300 Ile Pro Ala Glu Arg Leu Gly Arg Tyr His Gln Cys Tyr Asn Gly Ser 305 310 315 320 Gly Met Asp Tyr Arg Gly Thr Ala Ser Thr Thr Lys Ser Gly His Gln 325 330 335 Cys Gln Pro Trp Ala Leu Gln His Pro His Ser His His Leu Ser Ser 340 345 350 Thr Asp Phe Pro Glu Leu Gly Gly Gly His Ala Tyr Cys Arg Asn Pro 355 360 365 Gly Gly Gln Met Glu Gly Pro Trp Cys Phe Thr Gln Asn Lys Asn Val 370 375 380 Arg Met Glu Leu Cys Asp Val Pro Ser Cys Ser Pro Arg Asp Ser Ser 385 390 395 400 Lys Met Gly <210> 58 <211> 127 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> h-ROR1 minimal Fri domain <400> 58 Cys Gln Pro Tyr Arg Gly Ile Ala Cys Ala Arg Phe Ile Gly Asn Arg 1 5 10 15 Thr Val Tyr Met Glu Ser Leu His Met Gln Gly Glu Ile Glu Asn Gln 20 25 30 Ile Thr Ala Ala Phe Thr Met Ile Gly Thr Ser Ser His Leu Ser Asp 35 40 45 Lys Cys Ser Gln Phe Ala Ile Pro Ser Leu Cys His Tyr Ala 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120 125 <210> 60 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 60 Glu Ser Gly Gly Gly Gly Val Thr 1 5 <210> 61 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 61 Leu Glu Ser Gly Gly Gly Gly Val Thr 1 5 <210> 62 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 62 Gly Arg Ala Gln Val Thr 1 5 <210> 63 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 63 Trp Arg Ala Gln Val Thr 1 5 <210> 64 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 64 Ala Arg Gly Arg Ala Gln Val Thr 1 5 <210> 65 <211> 360 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FZD8-Fc variant 54F34 (without signal) <400> 65 Lys Glu Leu Ala Cys Gln Glu Ile Thr Val Pro Leu Cys Lys Gly Ile 1 5 10 15 Gly Tyr Asn Tyr Thr Tyr Met Pro Asn Gln Phe Asn His Asp Thr Gln 20 25 30 Asp Glu Ala Gly Leu Glu Val His Gln Phe Trp Pro Leu Val Glu Ile 35 40 45 Gln Cys Ser Pro Asp Leu Lys Phe Phe Leu Cys Ser Met Tyr Thr Pro 50 55 60 Ile Cys Leu Glu Asp Tyr Lys Lys Pro Leu Pro Pro Cys Arg Ser Val 65 70 75 80 Cys Glu Arg Ala Lys Ala Gly Cys Ala Pro Leu Met Arg Gln Tyr Gly 85 90 95 Phe Ala Trp Pro Asp Arg Met Arg Cys Asp Arg Leu Pro Glu Gln Gly 100 105 110 Asn Pro Asp Thr Leu Cys Met Asp Tyr Asn Arg Thr Asp Leu Thr Thr 115 120 125 Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 130 135 140 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 145 150 155 160 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 165 170 175 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 180 185 190 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 195 200 205 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 210 215 220 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 225 230 235 240 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 245 250 255 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 260 265 270 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 275 280 285 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 290 295 300 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 305 310 315 320 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 325 330 335 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 340 345 350 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 355 360 <210> 66 <211> 358 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FZD8-Fc variant 54F33 (without signal) <400> 66 Lys Glu Leu Ala Cys Gln Glu Ile Thr Val Pro Leu Cys Lys Gly Ile 1 5 10 15 Gly Tyr Asn Tyr Thr Tyr Met Pro Asn Gln Phe Asn His Asp Thr Gln 20 25 30 Asp Glu Ala Gly Leu Glu Val His Gln Phe Trp Pro Leu Val Glu Ile 35 40 45 Gln Cys Ser Pro Asp Leu Lys Phe Phe Leu Cys Ser Met Tyr Thr Pro 50 55 60 Ile Cys Leu Glu Asp Tyr Lys Lys Pro Leu Pro Pro Cys Arg Ser Val 65 70 75 80 Cys Glu Arg Ala Lys Ala Gly Cys Ala Pro Leu Met Arg Gln Tyr Gly 85 90 95 Phe Ala Trp Pro Asp Arg Met Arg Cys Asp Arg Leu Pro Glu Gln Gly 100 105 110 Asn Pro Asp Thr Leu Cys Met Asp Tyr Asn Arg Thr Asp Leu Thr Thr 115 120 125 Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 130 135 140 Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 145 150 155 160 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 165 170 175 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 180 185 190 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn 195 200 205 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 210 215 220 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 225 230 235 240 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 245 250 255 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn 260 265 270 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 275 280 285 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 290 295 300 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 305 310 315 320 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 325 330 335 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 340 345 350 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 355 <210> 67 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Signal <400> 67 Met Glu Trp Gly Tyr Leu Leu Glu Val Thr Ser Leu Leu Ala Ala Leu 1 5 10 15 Ala Leu Leu Gln Arg Ser Ser Gly Ala Ala Ala 20 25 <210> 68 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Signal <400> 68 Met Glu Trp Gly Tyr Leu Leu Glu Val Thr Ser Leu Leu Ala Ala Leu 1 5 10 15 Ala Leu Leu Gln Arg Ser Ser Gly Ala Leu Ala 20 25 <210> 69 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Signal <400> 69 Met Glu Trp Gly Tyr Leu Leu Glu Val Thr Ser Leu Leu Ala Ala Leu 1 5 10 15 Ala Leu Leu Gln Arg Ser Ser Gly Val Leu Ala 20 25 <210> 70 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Signal <400> 70 Met Glu Trp Gly Tyr Leu Leu Glu Val Thr Ser Leu Leu Ala Ala Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Gln Arg Ser Pro Ile Val His Ala 20 25 <210> 71 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Signal <400> 71 Met Glu Trp Gly Tyr Leu Leu Glu Val Thr Ser Leu Leu Ala Ala Leu 1 5 10 15 Phe Leu Leu Gln Arg Ser Pro Ile Val His Ala 20 25 <210> 72 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Signal <400> 72 Met Glu Trp Gly Tyr Leu Leu Glu Val Thr Ser Leu Leu Ala Ala Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Gln Arg Ser Pro Phe Val His Ala 20 25 <210> 73 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Signal <400> 73 Met Glu Trp Gly Tyr Leu Leu Glu Val Thr Ser Leu Leu Ala Ala Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Gln Arg Ser Pro Ile Ile Tyr Ala 20 25 <210> 74 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Signal <400> 74 Met Glu Trp Gly Tyr Leu Leu Glu Val Thr Ser Leu Leu Ala Ala Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Gln Arg Ser Pro Ile Ala His Ala 20 25 <210> 75 <211> 390 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FZD8-Fc variant 54F26 (with signal) <400> 75 Met Glu Trp Gly Tyr Leu Leu Glu Val Thr Ser Leu Leu Ala Ala Leu 1 5 10 15 Phe Leu Leu Gln Arg Ser Pro Ile Val His Ala Ala Ser Ala Lys Glu 20 25 30 Leu Ala Cys Gln Glu Ile Thr Val Pro Leu Cys Lys Gly Ile Gly Tyr 35 40 45 Asn Tyr Thr Tyr Met Pro Asn Gln Phe Asn His Asp Thr Gln Asp Glu 50 55 60 Ala Gly Leu Glu Val His Gln Phe Trp Pro Leu Val Glu Ile Gln Cys 65 70 75 80 Ser Pro Asp Leu Lys Phe Phe Leu Cys Ser Met Tyr Thr Pro Ile Cys 85 90 95 Leu Glu Asp Tyr Lys Lys Pro Leu Pro Pro Cys Arg Ser Val Cys Glu 100 105 110 Arg Ala Lys Ala Gly Cys Ala Pro Leu Met Arg Gln Tyr Gly Phe Ala 115 120 125 Trp Pro Asp Arg Met Arg Cys Asp Arg Leu Pro Glu Gln Gly Asn Pro 130 135 140 Asp Thr Leu Cys Met Asp Tyr Asn Arg Thr Asp Leu Thr Thr Glu Pro 145 150 155 160 Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 165 170 175 Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 180 185 190 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 195 200 205 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 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Claims (184)

  1. (a) 서열 번호:39를 갖는 첫 번째 폴리펩티드; 및
    (b) 서열 번호:43을 갖는 두 번째 폴리펩티드
    를 포함하며, 여기서 첫 번째 폴리펩티드는 두 번째 폴리펩티드에 직접적으로 연결되는 것인 Wnt-결합 작용제.
  2. 서열 번호:53의 아미노산 서열을 포함하는 Wnt-결합 작용제.
  3. 서열 번호:53으로 구성되는 Wnt-결합 작용제.
  4. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항의 Wnt-결합 작용제를 포함하며, 서열 번호:72, 서열 번호:67, 서열 번호:68, 서열 번호:69, 서열 번호:70, 서열 번호:71, 서열 번호:73 및 서열 번호:74로 구성되는 군에서 선택되는 아미노산 서열을 추가로 포함하는 폴리펩티드.
  5. 서열 번호:72 및 서열 번호:53을 포함하는 폴리펩티드.
  6. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항의 Wnt-결합 작용제를 생산하는 세포.
  7. 청구항 4의 폴리펩티드를 포함하는 세포.
  8. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항의 Wnt-결합 작용제를 포함하며, 여기서 Wnt-결합 작용제 중에서 적어도 80%는 알라닌-세린-알라닌 (ASA)의 N-말단 아미노산 서열을 갖는 것인 조성물.
  9. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항의 Wnt-결합 작용제를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  10. 청구항 4의 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  11. 청구항 9의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포.
  12. 청구항 10의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포.
  13. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항의 Wnt-결합 작용제를 생산하는 방법으로서, 여기서 Wnt-결합 작용제 중에서 적어도 80%는 알라닌-세린-알라닌 (ASA)의 N-말단 아미노산 서열을 갖고, 상기 방법은 Wnt-결합 작용제의 생산을 위해 서열 번호:72, 서열 번호:67, 서열 번호:68, 서열 번호:69, 서열 번호:70, 서열 번호:71, 서열 번호:73 및 서열 번호:74로 구성되는 군에서 선택되는 신호 서열을 이용하는 단계를 포함하는 방법.
  14. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항의 Wnt-결합 작용제를 포함하는, 암을 치료하기 위한 제약학적 조성물.
  15. 청구항 14에 있어서, Wnt-결합 작용제가 서열 번호:53의 아미노산 서열으로 구성되는 폴리펩티드를 포함하는 것인 제약학적 조성물.
  16. Wnt-결합 작용제를 포함하는, 암을 치료하기 위한 제약학적 조성물로서, 여기서 Wnt-결합 작용제는 서열 번호:53의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하며, 상기 조성물 중의 Wnt-결합 작용제 중에서 적어도 80%는 알라닌-세린-알라닌 (ASA)의 N-말단 아미노산 서열을 갖는, 제약학적 조성물.
  17. 청구항 14에 있어서, 암은 결장직장 암, 췌장 암, 유방 암, 폐 암, 난소 암, 간 암, 신장 암, 전립선 암, 위장 암, 흑색종, 자궁경부 암, 방광 암, 아교모세포종 및 두경부 암으로 구성되는 군에서 선택되는 것인 제약학적 조성물.
  18. 청구항 17에 있어서, 암은 췌장 암, 난소 암 또는 간 암인 제약학적 조성물.
  19. 청구항 18에 있어서, 간 암은 간세포 암인 제약학적 조성물.
  20. 청구항 19에 있어서, 폴리펩티드는 서열 번호:53의 아미노산 서열로 구성되는 것인 제약학적 조성물.
  21. 청구항 14에 있어서, 치료는 두 번째 치료제의 투여를 포함하는 것인 제약학적 조성물.
  22. 청구항 21에 있어서, 두 번째 치료제는 화학치료제인 제약학적 조성물.
  23. 청구항 22에 있어서, 암은 췌장 암이고, 화학치료제는 대사길항물질인 제약학적 조성물.
  24. 청구항 23에 있어서, 폴리펩티드는 서열 번호:53의 아미노산 서열로 구성되는 것인 제약학적 조성물.
  25. 청구항 23에 있어서, 대사길항물질은 젬시타빈, 플루오르우라실, 카페시타빈, 메토트렉사트 나트륨, 랄티트렉시드, 페메트렉시드, 테가푸르, 시토신 아라비노시드, 티오구아닌, 5-아자시티딘, 6-메르캅토퓨린, 아자티오프린, 6-티오구아닌, 펜토스타틴, 플루다라빈 포스페이트 및 클라드리빈으로 구성되는 군에서 선택되는 것인 제약학적 조성물.
  26. 청구항 25에 있어서, 대사길항물질은 젬시타빈인 제약학적 조성물.
  27. 청구항 22에 있어서, 암은 췌장 암이고, 화학치료제는 탁산인 제약학적 조성물.
  28. 청구항 27에 있어서, 탁산은 파클리탁셀, nab-파클리탁셀, 도세탁셀, DHA-파클리탁셀 및 PG-파클리탁셀로 구성되는 군에서 선택되는 것인 제약학적 조성물.
  29. 청구항 28에 있어서, 탁산은 nab-파클리탁셀인 제약학적 조성물.
  30. 청구항 29에 있어서, 치료는 젬시타빈의 투여를 추가로 포함하는 것인 제약학적 조성물.
  31. 청구항 22에 있어서, 암은 난소 암이고, 화학치료제는 탁산인 제약학적 조성물.
  32. 청구항 31에 있어서, 폴리펩티드는 서열 번호:53의 아미노산 서열로 구성되는 것인 제약학적 조성물.
  33. 청구항 31에 있어서, 탁산은 파클리탁셀, nab-파클리탁셀, 도세탁셀, DHA-파클리탁셀 또는 PG-파클리탁셀인 제약학적 조성물.
  34. 청구항 33에 있어서, 탁산은 파클리탁셀인 제약학적 조성물.
  35. 청구항 22에 있어서, 암은 난소 암이고, 화학치료제는 플라티늄 복합체인 제약학적 조성물.
  36. 청구항 35에 있어서, 폴리펩티드는 서열 번호:53의 아미노산 서열로 구성되는 것인 제약학적 조성물.
  37. 청구항 35에 있어서, 플라티늄 복합체는 시스플라틴 또는 카보플라틴인 제약학적 조성물.
  38. 청구항 37에 있어서, 플라티늄 복합체는 카보플라틴인 제약학적 조성물.
  39. 청구항 38에 있어서, 치료는 파클리탁셀의 투여를 추가로 포함하는 것인 제약학적 조성물.
  40. (a) 서열 번호:72, 서열 번호:67, 서열 번호:68, 서열 번호:69, 서열 번호:70, 서열 번호:71, 서열 번호:73 및 서열 번호:74로 구성되는 군에서 선택되는 신호 서열;
    (b) 인간 FZD8의 Fri 도메인; 및
    (c) 인간 Fc 영역
    을 포함하는 폴리펩티드.
  41. 청구항 40의 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  42. 청구항 41의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포.
  43. 청구항 40의 폴리펩티드를 포함하는 세포.
  44. 세포에서 인간 FZD8의 Fri 도메인을 포함하는 가용성 Wnt-결합 작용제를 생산하는 방법으로서, 여기서 Wnt-결합 작용제 중에서 적어도 80%는 알라닌-세린-알라닌 (ASA)의 N-말단 아미노산 서열을 갖고, 상기 방법은 Wnt-결합 작용제의 생산을 위해 서열 번호:72, 서열 번호:67, 서열 번호:68, 서열 번호:69, 서열 번호:70, 서열 번호:71, 서열 번호:73 및 서열 번호:74로 구성되는 군에서 선택되는 신호 서열을 이용하는 단계를 포함하는 방법.
  45. 청구항 44의 방법에 의해 생산된 가용성 Wnt-결합 작용제.
  46. 인간 FZD8의 Fri 도메인을 포함하는 가용성 Wnt-결합 작용제를 포함하는 조성물로서, 여기서 Wnt-결합 작용제 중에서 적어도 80%는 알라닌-세린-알라닌 (ASA)의 N-말단 서열을 갖는 것인 조성물.
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