JP5956349B2 - Ｗｎｔアンタゴニスト、並びに治療及びスクリーニングの方法 - Google Patents

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Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１０年１月１２日に提出した米国特許仮出願第６１／２９４，２７０号、２０１０年１０月１５日に提出した米国特許仮出願第６１／３９３，６７５号、及び、２０１０年１２月１７日に提出した米国特許仮出願第６１／４２４，４０８号の優先権を主張するものである。これらの各文献の全体を参照により本明細書に組み込まれる。
発明の分野
本発明は、癌、及び、他のＷｎｔ関連疾病又は疾患の治療のための新規組成物及び方法、並びに、付加的な新規治療薬剤を同定する為の新規スクリーニング法を提供する。詳細には、固形癌、並びに、他のＷｎｔ関連疾病、及び、疾患の治療に有効な可溶性受容体タンパク質を含むＷｎｔアンタゴニストを提供する。
発明の背景
癌は先進国において主要な死因のひとつであり、アメリカ合衆国のみで、１年に１００万人が癌と診断され、５０万人が死亡する。概して、３人に１人以上が、その生涯において、ある種の癌になるであろうと見積もられている。２００を超える異なる種類の癌が存在し、その内の４種である乳癌、肺癌、大腸癌、及び、前立腺癌が全ての新患の半分以上を占める（Ｊｅｍａｌ ｅｔ ａｌ， ２００９， Ｃａｎｃｅｒ Ｊ． Ｃｌｉｎ．， ５８：２２５−２４９）。
Ｗｎｔシグナル伝達経路は癌治療の潜在的な標的として特定されてきた。Ｗｎｔシグナル伝達経路は、胚パターン形成、後胚期組織維持、及び、幹細胞生物学の数個の重要な制御因子のひとつである。より具体的には、Ｗｎｔシグナル伝達は細胞極性と幹細胞集団による自己再生を含む細胞運命特定に重要な役割を果たす。Ｗｎｔ経路の無秩序な活性化はヒトの多くの癌に関連し、腫瘍細胞の発生運命を変え、それらを未分化増殖状態に維持することができる。このように、発癌現象は、幹細胞による正常な発生と組織修復を制御する恒常性維持機構を乗っ取ることで進行することができる（Ｒｅｙａ ＆ Ｃｌｅｖｅｒｓ， ２００５， Ｎａｔｕｒｅ， ４３４：８４３−５０、Ｂｅａｃｈｙ ｅｔ ａｌ．， ２００４， Ｎａｔｕｒｅ， ４３２：３２４−３１で概説される）。
Ｗｎｔシグナル伝達経路は、最初、ショウジョウバエの発生変異体ｗｉｎｇｌｅｓｓ（ｗｇ）とマウス癌原遺伝子ｉｎｔ−１、現在のＷｎｔ１から解明された（Ｎｕｓｓｅ ＆ Ｖａｒｍｕｓ， １９８２， Ｃｅｌｌ， ３ １ ：９９−１０９、Ｖａｎ Ｏｏｙｅｎ ＆ Ｎｕｓｓｅ， １９８４， Ｃｅｌｌ， ３９：２３３−４０、Ｃａｂｒｅｒａ ｅｔ ａｌ， １９８７， Ｃｅｌｌ， ５０：６５９−６３、Ｒｉｊｓｅｗｉｊｋ ｅｔ ａｌ， １９８７， Ｃｅｌｌ， ５０：６４９−５７）。Ｗｎｔ遺伝子は分泌型脂質修飾糖タンパク質をコードし、その内の１９種が哺乳動物で同定されてきた。これら分泌されたリガンドはＦｒｉｚｚｌｅｄ（ＦＺＤ）受容体ファミリー及び低密度リポプロテイン（ＬＤＬ）関連タンパク質５、又は、６（ＬＲＰ５／６）からなる受容体複合体を活性化する。ＦＺＤ受容体はＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）スーパーファミリーに属する７回膜貫通型ドメインタンパク質であり、システイン−リッチ−ドメイン（ＣＲＤ）又はＦｒｉドメインとして知られる１０個の保存されたシステインを有する細胞外Ｎ末端リガンド結合ドメインを含む。ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ５、ＦＺＤ６、ＦＺＤ１、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９、及び、ＦＺＤ１０の１０種のヒトＦＺＤ受容体が存在する。異なるＦＺＤ ＣＲＤは特定のＷｎｔに対して異なる結合親和性を持ち（Ｗｕ ＆ Ｎｕｓｓｅ， ２００２， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７７：４１７６２−９）、ＦＺＤ受容体は、以下に述べるように、標準的β−カテニン経路を活性化するグループと非標準的経路を活性化するグループに分けられてきた（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ， １８：７８６０−７２）。ＦＺＤリガンドと結合する受容体複合体を形成する為に、ＦＺＤ受容体は、６回のチロシン、トリプトファン、トレオニン、アスパラギン酸（ＹＷＴＤ）のリピートで分割される４個の細胞外上皮成長因子（ＥＧＦ）様ドメインを有する１回膜貫通型タンパク質であるＬＲＰ５／６と相互作用する（Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２００４， Ｊ． Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒａｌ Ｒｅｓ．， １９：１７４９）。
受容体結合で活性化される標準的Ｗｎｔシグナル伝達経路は、ＦＺＤ受容体と直接的に相互作用する細胞質タンパク質であるＤｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ（Ｄｓｈ）によって媒介され、細胞質で安定化し、β−カテニンを蓄積することとなる。Ｗｎｔシグナルがない場合、β−カテニンは、腫瘍抑制タンパク質である大腸腺腫性ポリポーシス（ＡＰＣ）及びＡｘｉｎを含む細胞質分解複合体に局在化される。これらのタンパク質は、グリコーゲン合成キナーゼ３ｐ（ＧＳＫ３Ｐ）がβ−カテニンに結合し、ユビキチン／プロテアソーム経路を介した分解の為にβ−カテニンをリン酸化して印をつけられるようにするのに重要な足場として機能する。Ｄｓｈの活性化はＧＳＫ３Ｐをリン酸化することとなり、分解複合体の解離となる。蓄積した細胞質β−カテニンは、それから、細胞核に移送され、ＴＣＦ／ＬＥＦファミリーのＤＮＡタンパク質と相互作用して転写を活性化する。
標準的なシグナル伝達経路に加え、Ｗｎｔリガンドはβ−カテニン非依存性経路をも活性化する（Ｖｅｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．， ２００３， Ｄｅｖ． Ｃｅｌｌ， ５ ：３６７−７７）。非標準的Ｗｎｔシグナル伝達は様々なプロセスと、しかし、ショウジョウバエの平面内細胞極性経路（ＰＣＰ）に類似した機構による原腸陥入活動と、最も説得力をもって、結び付けられてきた。非標準的Ｗｎｔシグナル伝達のその他の潜在的な機構はカルシウム流入、ＪＮＫ、並びに、小Ｇタンパク質、及び、ヘテロ三量体Ｇタンパク質の両方を含む。標準的Ｗｎｔシグナル経路と非標準的Ｗｎｔシグナル経路の間の拮抗がしばしば観察され、そして、非標準的シグナル伝達が癌化を抑制することができることを示す証拠もある（Ｏｌｓｏｎ ＆ Ｇｉｂｏ， １９９８， Ｅｘｐ． Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．， ２４１ ： １３４、Ｔｏｐｏｌ ｅｔ ａｌ．， ２００３， Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， １６２：８９９−９０８）。従って、ある状況では、ＦＺＤ受容体は標準的Ｗｎｔシグナル伝達経路の負の調節因子として作用する。例えば、ＴＡＫ１−ＮＬＫ 経路を介してＦＺＤ１と共発現する場合、ＦＺＤ６はＷｎｔ３ａ誘導標準的シグナル伝達を抑制する（Ｇｏｌａｎ ｅｔ ａｌ．， ２００４， ＪＢＣ， ２７９： １４８７９−８８）。同様に、ＦＺＤ２は、Ｗｎｔ５ａが存在するとき、ＴＡＫ１−ＮＬＫ ＭＡＰＫカスケードを介して標準的Ｗｎｔシグナル伝達に拮抗することが示された（Ｉｓｈｉｔａｎｉ ｅｔ ａｌ．， ２００３， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， ２３： １３１−３９）。
標準的Ｗｎｔシグナル伝達はまた小腸及び大腸において幹細胞集団の維持に中心的な役割を果たし、この経路の不適当な活性化は直腸結腸癌において顕著な役割を果たす（Ｒｅｙａ ＆ Ｃｌｅｖｅｒｓ， ２００５， Ｎａｔｕｒｅ， ４３４：８４３）。腸の吸収上皮は絨毛と陰窩へと配置される。幹細胞は陰窩に存在し、陰窩外へ移動して腸絨毛を占めるあらゆる分化細胞集団を生じる急速に増殖する細胞を生成するために、徐々に分裂する。Ｗｎｔシグナル伝達カスケードは陰窩−絨毛軸で細胞運命を制御する優先的な役割を果たし、幹細胞集団の維持に必須である。相同組換えによるＴＣＦ７／２の遺伝的喪失（Ｋｏｒｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｎａｔ， Ｇｅｎｅｔ．， １９：３７９）、又は、潜在的な分泌型ＷｎｔアンタゴニストであるＤｉｃｋｋｏｐｆ−１（Ｄｋｋ１）の過剰発現（Ｐｉｎｔｏ ｅｔ ａｌ．， ２００３， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．， １７： １７０９−１３、Ｋｕｈｎｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， ２００４， ＰＮＡＳ， １０１ ：２６６−７１）のどちらかによるＷｎｔシグナル伝達の破壊は腸幹細胞集団の喪失という結果になる。
癌におけるＷｎｔシグナル伝達の役割は、マウスウィルスの近傍への挿入によって癌化した乳腺腫瘍において癌遺伝子としてＷｎｔ１（元々はｉｎｔ１）が同定されたことによって初めて発見された（Ｎｕｓｓｅ ＆ Ｖａｒｍｕｓ， １９８２， Ｃｅｌｌ， ３１ ：９９−１０９）。Ｗｎｔシグナル伝達の乳癌における役割のさらなる証拠が、それ以来蓄積してきている。例えば、Ｗｎｔシグナル伝達の喪失は正常な乳腺発生を乱すが（Ｔｅｐｅｒａ ｅｔ ａｌ．， ２００３， Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｓｅｔ， １１６： １１３７−４９、Ｈａｔｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， ２００３， Ｊ． Ｍａｍｍａｒｙ Ｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌ． Ｎｅｏｐｌａｓｉａ， ８： １４５−５８）、一方、乳腺でのβ−カテニンのトランスジーンによる過剰発現は過形成と腺癌という結果になる（Ｉｍｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， ２００１ ， Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ， １５３ ：５５５−６８、Ｍｉｃｈａｅｌｓｏｎ ＆ Ｌｅｄｅｒ， ２００１ ， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ， ２０：５０９３−９）。つい最近、乳腺幹細胞はＷｎｔシグナル伝達により活性化されることが示された（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．， ２００４， ＰＮＡＳ， １０１ ：４１５８−４１６３）。ヒト乳腺において、β−カテニンの蓄積は５０％を超える癌腫において活性化されたＷｎｔシグナル伝達と結び付けられており、そして、特異的な変異は同定されていないけれども、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体発現の増加が観察されてきた（Ｂｒｅｎｎａｎ ＆ Ｂｒｏｗｎ， ２００４， Ｊ． Ｍａｍｍａｒｙ Ｇｌａｎｄ Ｎｅｏｐｌａｓｉａ， ９： １１９−３１、Ｍａｌｏｖａｎｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．， ２００４， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｏｎｃｏｌ， ２５ ： １３３７−４２）。
直腸結腸癌はＷｎｔシグナル伝達カスケード内での活性化変異によって最も一般的に惹起される癌である。全ての直腸結腸癌のおおよそ５〜１０％は遺伝性であり、患者の約８０％が大腸腺腫性ポリポーシス（ＡＰＣ）遺伝子に生殖細胞系列変異を包含する常染色体優性疾病である家族性腺腫性ポリポーシス（ＦＡＰ）であるマム（ｍａｍ）形態の１つである。Ａｘｉｎ及びβ−カテニンを含むその他のＷｎｔ経路の構成要素においてまた変異が同定されてきている。個々の腺腫は第２の不活性化対立遺伝子を含む上皮細胞のクローン性増殖物であり、大多数のＦＡＰ腺腫は必然的に癌遺伝子、及び／又は、腫瘍抑制遺伝子の付加的な変異を介した腺腫の発生という結果になる。さらに、ＡＰＣ及びβ−カテニン内のゲイン−オブ−ファンクション変異を含むＷｎｔシグナル伝達経路の活性化がマウスモデルにおける過形成発生及び腫瘍増殖を誘導することができる（Ｏｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， ． ５７： １６４４−９、Ｈａｒａｄａ ｅｔ ａｌ．， １９９９， ＥＭＢＯ Ｊ．， １８：５９３１−４２）。
発明の簡単な概要
本発明は、これらに限定されないが、可溶性ＦＺＤ受容体、及び、Ｆｒｉドメインを含むその他の薬剤を含む、１つ以上のヒトＷｎｔタンパク質に結合する多様な薬剤、並びに、これらの薬剤を使用する新規の方法を提供する。本発明は、さらに、その必要に応じて対象に薬剤を投与することによる癌の治療において薬剤を使用する方法を提供する。ある実施形態において、方法は癌細胞の成長を抑制することを含む。ある実施形態において、Ｗｎｔ結合剤はＷｎｔアンタゴニストである。そのようなＷｎｔ結合剤をスクリーニングする方法もまた提供される。薬剤をコードするポリヌクレオチド、薬剤を生成する方法、及び、薬剤を含む多様な組成物も同様に提供される。
従って、ある態様において、本発明は腫瘍の成長を抑制する方法を提供する。ある実施形態において、方法は１つ以上のＷｎｔタンパク質（例えば、ヒトＷｎｔタンパク質）に結合する有効量の薬剤に腫瘍を接触させることを含む。方法はインビボ、又は、インビトロでありうる。ある実施形態において、腫瘍は対象の体内にあり、薬剤との腫瘍の接触は治療上有効量のＷｎｔ結合剤の対象への投与を含む。
別の態様において、本発明は癌幹細胞を含む腫瘍中の癌幹細胞の頻度を下げる方法を提供する。従って、本発明は腫瘍の腫瘍形成能を減少させる方法も提供する。ある実施形態において、方法は１つ以上のＷｎｔタンパク質（例えば、ヒトＷｎｔタンパク質）に結合する有効量の薬剤に腫瘍を接触させることを含む。この方法はインビボ、又は、インビトロでありうる。例えば、接触には、腫瘍を持つヒトへの有効量のＷｎｔ結合剤の投与を含みうる。
別の態様において、本発明は、腫瘍において細胞の分化を誘導する、又は、腫瘍において細胞分化マーカーの発現を誘導する方法を提供する。ある実施形態において、この方法は１つ以上のＷｎｔタンパク質（例えば、ヒトＷｎｔタンパク質）に結合する有効量の薬剤に腫瘍を接触させることを含む。この方法はインビボ、又は、インビトロでありうる。
なお更なる態様において、本発明は、治療上有効量のＷｎｔ結合剤の対象への投与を含む、対象における癌を治療する方法を提供する。
付加的な態様において、本発明は、治療上有効量のＷｎｔ結合剤の対象への投与を含む、Ｗｎｔシグナル伝達活性化に関連する疾病を治療する方法を提供する。
さらに別の態様において、本発明は、治療上有効量のＷｎｔ結合剤の対象への投与を含む、幹細胞、及び／又は、前駆細胞のレベルの増加で特徴づけられる疾患を治療する方法を提供する。
前述の各態様、並びに、本明細書で提供されるその他の態様のある実施形態において、Ｗｎｔ結合剤はポリペプチドである。ある実施形態において、薬剤は可溶性受容体である。
前述の各態様、並びに、本明細書で提供されるその他の態様のある実施形態において、薬剤は、１つ以上のＷｎｔタンパク質に結合するＦＺＤ受容体のＦｒｉドメイン、又は、ＦＺＤ Ｆｒｉドメインの断片を含む。ある実施形態において、ＦＺＤ受容体はヒトＦＺＤ受容体である。例えば、ＦｒｉドメインはヒトＦＺＤ４又はＦＺＤ５由来であってよい。ある別の実施形態において、薬剤は、１つ以上のＷｎｔタンパク質に結合するヒトＦＺＤ８受容体のＦｒｉドメイン、又は、該Ｆｒｉドメインの断片を含んでもよい。ある実施形態において、Ｗｎｔ結合剤は可溶性ＦＺＤ受容体である。別の実施形態において、Ｗｎｔ結合剤はＦＺＤ受容体のＦｒｉドメインを含まない。
前述の各態様、並びに、本明細書で提供されるその他の態様のある実施形態において、薬剤は、１つ以上のＷｎｔタンパク質に結合する可溶性Ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質（ＳＦＲＰ）のＦｒｉドメイン、又は、ＳＦＲＰ Ｆｒｉドメインの断片を含む。ある実施形態において、ＳＦＲＰはヒトＳＦＲＰである。
前述の各態様、並びに、本明細書で提供されるその他の態様のある実施形態において、薬剤は、１つ以上のＷｎｔタンパク質に結合するＲｏｒタンパク質のＦｒｉドメイン、又は、Ｒｏｒ Ｆｒｉドメインの断片を含む。ある実施形態において、Ｒｏｒタンパク質はヒトＲｏｒタンパク質である。
前述の各態様、並びに、本明細書で提供されるその他の態様のある実施形態において、薬剤はヒトＦｃ領域をさらに含む。ある実施形態において、Ｗｎｔ結合剤は配列番号：１を含む。ある実施形態において、Ｗｎｔ結合剤は配列番号：４６を含む。ある実施形態において、Ｗｎｔ結合剤は配列番号：４８を含む。ある実施形態において、Ｗｎｔ結合剤は配列番号：５０を含む。ある実施形態において、Ｗｎｔ結合剤は配列番号：５３を含む。ある実施形態において、（シグナル配列切断前、）Ｗｎｔ結合剤は配列番号：５０、及び、配列番号：６７、配列番号：６８、配列番号：６９、配列番号：７０、配列番号：７１、配列番号：７２、配列番号：７３、及び、配列番号：７４からなる群より選択されるシグナル配列を含む。ある実施形態において、（シグナル配列切断前、）Ｗｎｔ結合剤は配列番号：５０、及び、配列番号：７０、配列番号：７１、配列番号：７２、配列番号：７３、及び、配列番号：７４からなる群より選択されるシグナル配列を含む。ある実施形態において、（シグナル配列切断前、）Ｗｎｔ結合剤は配列番号：５０、及び、配列番号：７１を含む。ある実施形態において、（シグナル配列切断前、）Ｗｎｔ結合剤は配列番号：５３、及び、配列番号：６７、配列番号：６８、配列番号：６９、配列番号：７０、配列番号：７１、配列番号：７２、配列番号：７３、及び、配列番号：７４からなる群より選択されるシグナル配列を含む。ある実施形態において、（シグナル配列切断前、）Ｗｎｔ結合剤は配列番号：５３、及び、配列番号：７０、配列番号：７１、配列番号：７２、配列番号：７３、及び、配列番号：７４からなる群より選択されるシグナル配列を含む。ある実施形態において、（シグナル配列切断前、）Ｗｎｔ結合剤は配列番号：５３、及び、配列番号：７１を含む。
前述の各態様、並びに、本明細書で提供されるその他の態様のある実施形態において、Ｗｎｔ結合剤は、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ１０ａ、及び、Ｗｎｔ１０ｂからなる群より選択される、１つ以上の、２個以上の、３個以上の、又は、４個以上のヒトＷｎｔタンパク質に結合する。ある実施形態において、薬剤はＷｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、及び、Ｗｎｔ７ｂに結合する。
前述の各態様、並びに、本明細書で提供されるその他の態様のある実施形態において、薬剤はＷｎｔアンタゴニストである。ある実施形態において、薬剤はＷｎｔシグナル伝達を阻害する。ある実施形態において、薬剤はＷｎｔ標準的Ｗｎｔシグナル伝達を阻害する。
前述の各態様、並びに、本明細書で提供されるその他の態様のある実施形態において、腫瘍、又は、癌は、直腸結腸腫瘍／癌、膵臓腫瘍／癌、肺腫瘍／癌、卵巣腫瘍／癌、肝臓腫瘍／癌、乳腺腫瘍／癌、腎臓腫瘍／癌、前立腺腫瘍／癌、胃腸腫瘍／癌、黒色腫、子宮頸部腫瘍／癌、膀胱腫瘍／癌、神経膠芽腫、及び、頭頸部腫瘍／癌からなる群より選択される腫瘍／癌である。
前述の各態様、並びに、本明細書で提供されるその他の態様のある実施形態において、方法は、さらに、第２の治療剤と腫瘍を接触させること、又は、対象に第２の治療剤を投与することを含む。ある実施形態において、第２の化学療法剤は抗代謝剤（例えば、ゲムシタビン）、又は、抗有糸分裂薬（例えば、パクリタキセルのようなタキサン）である。
なお更なる態様において、本発明は、配列番号：１、配列番号：４５、配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：４８、配列番号：４９、配列番号：５０、配列番号：５１、配列番号：５３、配列番号：５４、配列番号：５５、配列番号：６５、及び、配列番号：６６からなる群より選択される配列を含むポリペプチド、並びに、ポリペプチドを生成する細胞及びポリペプチドを含む組成物を提供する。ポリペプチドを含む医薬組成物及び薬学的に許容される担体もまた提供される。さらに、配列番号：１、配列番号：４５、配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：４８、配列番号：４９、配列番号：５０、配列番号：５１、配列番号：５３、配列番号：５４、配列番号：５５、配列番号：６５、及び、配列番号：６６のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は、配列番号：２の配列を持つポリヌクレオチドもまた提供される。ポリヌクレオチドを含むベクター及び細胞も同様に提供される。
付加的な態様において、本発明は、抗腫瘍活性、及び／又は、癌幹細胞に対する活性について薬剤をスクリーニングする方法を提供する。ある実施形態において、方法は、薬剤に曝露された第１固形腫瘍（例えば、癌幹細胞を含む固形腫瘍）における１つ以上の分化マーカー、及び／又は、１つ以上の幹細胞性マーカー（ｓｔｅｍｎｅｓｓ ｍａｒｋｅｒ）のレベルを薬剤に曝露されなかった第２固形腫瘍における１つ以上の分化マーカーのレベルと比較することを含む。ある実施形態において、方法は、（ａ）第２固形腫瘍ではなく第１固形腫瘍を薬剤に曝露すること、（ｂ）第１と第２の固形腫瘍における１つ以上の分化マーカー、及び／又は、１つ以上の幹細胞性マーカーのレベルを評価すること、（ｃ）第１腫瘍における１つ以上の分化マーカーのレベルを第２固形腫瘍における１つ以上の分化マーカーのレベルと比較することを含む。ある実施形態において、（ａ）第２固形腫瘍に比べて第１固形腫瘍において増加した１つ以上の分化マーカーのレベル、及び／又は、（ｂ）１つ以上の幹細胞性マーカーの減少したレベルは薬剤の抗腫瘍、又は、抗癌幹細胞活性を示す。ある実施形態において、薬剤は１つ以上のＷｎｔタンパク質に結合する。ある実施形態において、薬剤は可溶性ＦＺＤ受容体である。ある方法において、薬剤は抗ＦＺＤ抗体、又は、抗Ｗｎｔ抗体のような抗体である。ある別の実施形態において、薬剤は小分子である。
[本発明1001]
（ａ）配列番号：27のＸ1〜Ｙ1、配列番号：28のＸ2〜Ｙ2、 配列番号：29のＸ3〜Ｙ3、配列番号：22のＸ4〜Ｙ4、配列番号：23のＸ5〜Ｙ5、配列番号：24のＸ6〜Ｙ6、配列番号：25のＸ7〜Ｙ7、配列番号：30のＸ8〜Ｙ8、配列番号：31のＸ9〜Ｙ9、及び配列番号：26のＸ10〜Ｙ10からなる群より選択されるアミノ酸から実質的になる第1ポリペプチド；及び
（ｂ）配列番号：43のアミノ酸Ａ〜Ｂから実質的になる第2ポリペプチド
を含む、Ｗｎｔ結合剤であって、
前記第1ポリペプチドは前記第2ポリペプチドと直接連結されており；かつ
Ｘ1＝アミノ酸69、70、71、72、73、74、75、又は76
Ｙ1＝アミノ酸236、237、238、239、240、241、242、又は243
Ｘ2＝アミノ酸22、23、24、25、26、27又は28
Ｙ2＝アミノ酸158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171又は172
Ｘ3＝アミノ酸18、19、20、21、22、23、24、又は25
Ｙ3＝アミノ酸141、142、143、144、145、146、147、148、又は149
Ｘ4＝アミノ酸38、39、40、41、又は42
Ｙ4＝アミノ酸168、169、170、171、172、173、174、175又は176
Ｘ5＝アミノ酸25、26、27、28又は29
Ｙ5＝アミノ酸155、156、157、158、159、160、161、162、163、又は164
Ｘ6＝アミノ酸19、20、21、22、23、又は24
Ｙ6＝アミノ酸144、145、146、147、148、149、150、151又は152
Ｘ7＝アミノ酸22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、又は34
Ｙ7＝アミノ酸178、179、180、181、182、183、184、185、又は186
Ｘ8＝アミノ酸25、26、27、28、29、30、又は31
Ｙ8＝アミノ酸156、157、158、159、160、161、162、163、又は164
Ｘ9＝アミノ酸21、22、23、又は24
Ｙ9＝アミノ酸137、138、139、140、141、142、143、144、145、又は146
Ｘ10＝アミノ酸20、21、22、23、24、又は25
Ｙ10＝アミノ酸152、153、154、155、156、157、158、159、又は160
Ａ＝アミノ酸1、2、3、4、5、又は6
Ｂ＝アミノ酸231又は232である、
前記Ｗｎｔ結合剤。
[本発明1002]
（ａ）配列番号：30のアミノ酸Ｘ〜Ｙから実質的になる第1ポリペプチド；及び
（ｂ）配列番号：43のアミノ酸Ａ〜Ｂから実質的になる第2ポリペプチド
を含む、Ｗｎｔ結合剤であって、
前記第1ポリペプチドは前記第2ポリペプチドと直接連結されており；かつ
Ｘ＝アミノ酸25、26、27、28、29、30、又は31
Ｙ＝アミノ酸156、157、158、159、160、161、162、163、又は164
Ａ＝アミノ酸1、2、3、4、5、又は6
Ｂ＝アミノ酸231又は232である、
前記Ｗｎｔ結合剤。
[本発明1003]
前記第1ポリペプチドのＣ末端が前記第2ポリペプチドのＮ末端と連結されている、本発明1001又は1002のＷｎｔ結合剤。
[本発明1004]
前記第1ポリペプチドが配列番号：30のアミノ酸25〜158から実質的になる、本発明1001〜1003のいずれかのＷｎｔ結合剤。
[本発明1005]
前記第1ポリペプチドが配列番号：30のアミノ酸28〜158から実質的になる、本発明1001〜1003のいずれかのＷｎｔ結合剤。
[本発明1006]
前記第2ポリペプチドが配列番号：43のアミノ酸1〜232から実質的になる、本発明1001〜1005のいずれかのＷｎｔ結合剤。
[本発明1007]
前記第2ポリペプチドが配列番号：43のアミノ酸3〜232から実質的になる、本発明1001〜1005のいずれかのＷｎｔ結合剤。
[本発明1008]
前記第2ポリペプチドが配列番号：43のアミノ酸6〜232から実質的になる、本発明1001〜1005のいずれかのＷｎｔ結合剤。
[本発明1009]
前記第1ポリペプチドが配列番号：39であり；及び／又は前記第2ポリペプチドが配列番号：43である、本発明1001〜1003のいずれかのＷｎｔ結合剤。
[本発明1010]
前記第1ポリペプチドが配列番号：39であり；及び／又は前記第2ポリペプチドが配列番号：42である、本発明1001〜1003のいずれかのＷｎｔ結合剤。
[本発明1011]
配列番号：53、配列番号：50、配列番号：45、配列番号：46、配列番号：47、配列番号：48、配列番号：49、配列番号：51、及び配列番号：1からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＷｎｔ結合剤。
[本発明1012]
配列番号：50を含むＷｎｔ結合剤。
[本発明1013]
配列番号：53を含むＷｎｔ結合剤。
[本発明1014]
可溶性の受容体である、本発明1001〜1013のいずれかのＷｎｔ結合剤。
[本発明1015]
Ｗｎｔのアンタゴニストである、本発明1001〜1014のいずれかのＷｎｔ結合剤。
[本発明1016]
Ｗｎｔ1、Ｗｎｔ2、Ｗｎｔ2ｂ、Ｗｎｔ3、Ｗｎｔ3ａ、Ｗｎｔ7ａ、Ｗｎｔ7ｂ、Ｗｎｔ8ａ、Ｗｎｔ8ｂ、Ｗｎｔ10ａ、及びＷｎｔ10ｂからなる群より選択される1つ以上のヒトＷｎｔタンパク質に結合する、本発明1001〜1015のいずれかのＷｎｔ結合剤。
[本発明1017]
Ｗｎｔ1、Ｗｎｔ2、Ｗｎｔ2ｂ、Ｗｎｔ3、Ｗｎｔ3ａ、Ｗｎｔ7ａ、Ｗｎｔ7ｂ、Ｗｎｔ8ａ、Ｗｎｔ8ｂ、Ｗｎｔ10ａ、及びＷｎｔ10ｂからなる群より選択される2つ以上のヒトＷｎｔタンパク質に結合する、本発明1016のＷｎｔ結合剤。
[本発明1018]
Ｗｎｔ1、Ｗｎｔ2、Ｗｎｔ3、Ｗｎｔ3ａ、及びＷｎｔ7ｂに結合する、本発明1017のＷｎｔ結合剤。
[本発明1019]
Ｗｎｔシグナル伝達を抑制する、本発明1001〜1018のいずれかのＷｎｔ結合剤。
[本発明1020]
Ｗｎｔシグナル伝達が標準的なＷｎｔシグナル伝達である、本発明1019のＷｎｔ結合剤。
[本発明1021]
尾静脈を介して約10ｍｇ／ｋｇの投与量で投与された場合に、ラットにおいて少なくとも約100時間の半減期を有する、本発明1001〜1020のいずれかのＷｎｔ結合剤。
[本発明1022]
腫瘍又は腫瘍細胞の増殖を抑制する、本発明1001〜1021のいずれかのＷｎｔ結合剤。
[本発明1023]
腫瘍における分化マーカーの発現を誘導する、本発明1001〜1022のいずれかのＷｎｔ結合剤。
[本発明1024]
腫瘍における細胞の分化を誘導する、本発明1001〜1023のいずれかのＷｎｔ結合剤。
[本発明1025]
腫瘍における癌幹細胞の頻度を減少させる、本発明1001〜1024のいずれかのＷｎｔ結合剤。
[本発明1026]
配列番号：46を含む薬剤が、配列番号：1を含む薬剤よりも強力に腫瘍増殖を抑制する、本発明1001〜1011又は1014〜1025のいずれかのＷｎｔ結合剤。
[本発明1027]
配列番号：48を含む薬剤が、配列番号：1を含む薬剤よりも強力に腫瘍増殖を抑制する、本発明1001〜1011又は1014〜1025のいずれかのＷｎｔ結合剤。
[本発明1028]
配列番号：50を含む薬剤が、配列番号：1を含む薬剤よりも強力に腫瘍増殖を抑制する、本発明1001〜1011又は1014〜1025のいずれかのＷｎｔ結合剤。
[本発明1029]
配列番号：53を含む薬剤が、配列番号：1を含む薬剤よりも強力に腫瘍増殖を抑制する、本発明1001〜1011又は1014〜1025のいずれかのＷｎｔ結合剤。
[本発明1030]
ＦＺＤドメイン要素、Ｆｃドメイン要素、及び介在性のペプチドリンカーであるリンカー要素を含む第2Ｗｎｔ結合剤よりも強力に腫瘍増殖を抑制する、本発明1001〜1029のいずれかのＷｎｔ結合剤。
[本発明1031]
前記腫瘍がＷｎｔ依存性である、本発明1022〜1030のいずれかのＷｎｔ結合剤。
[本発明1032]
前記腫瘍が直腸結腸腫瘍、結腸腫瘍、膵臓腫瘍、肺腫瘍、卵巣腫瘍、肝臓腫瘍、乳腺腫瘍、腎臓腫瘍、前立腺腫瘍、胃腸腫瘍、メラノーマ、子宮頸部腫瘍、膀胱腫瘍、神経膠芽腫、及び頭頸部腫瘍からなる群より選択される腫瘍である、本発明1022〜1031のいずれかのＷｎｔ結合剤。
[本発明1033]
前記腫瘍が直腸結腸腫瘍である、本発明1032のＷｎｔ結合剤。
[本発明1034]
前記腫瘍が乳腺腫瘍である、本発明1032のＷｎｔ結合剤。
[本発明1035]
前記腫瘍が膵臓腫瘍である、本発明1032のＷｎｔ結合剤。
[本発明1036]
配列番号：53、配列番号：50、配列番号：45、配列番号：46、配列番号：47、配列番号：48、配列番号：49、配列番号：51、及び配列番号：1からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
[本発明1037]
配列番号：53、配列番号：50、配列番号：46、配列番号：48、及び配列番号：1からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
[本発明1038]
配列番号：50のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
[本発明1039]
配列番号：53のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
[本発明1040]
配列番号：53、配列番号：50、配列番号：46、配列番号：48、及び配列番号：1からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む実質的に精製されたポリペプチドであって、該ポリペプチドの少なくとも90％がＡＳＡのＮ末端配列を有する、該ポリペプチド。
[本発明1041]
配列番号：53、配列番号：50、配列番号：46、配列番号：48、及び配列番号：1からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
[本発明1042]
配列番号：50からなるポリペプチド。
[本発明1043]
配列番号：53からなるポリペプチド。
[本発明1044]
本発明1001〜1043のいずれかのＷｎｔ結合剤又はポリペプチドを生成する、細胞。
[本発明1045]
本発明1001〜1043のいずれかのＷｎｔ結合剤又はポリペプチドを含む、組成物。
[本発明1046]
本発明1001〜1043のいずれかのＷｎｔ結合剤又はポリペプチドを含む、組成物であって、該Ｗｎｔ結合剤又は該ポリペプチドの少なくとも80％がＡＳＡのＮ末端配列を有する、前記組成物。
[本発明1047]
本発明1001〜1043のいずれかのＷｎｔ結合剤又はポリペプチドと、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
[本発明1048]
本発明1001〜1043のいずれかのＷｎｔ結合剤又はポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチド。
[本発明1049]
本発明1048のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
[本発明1050]
本発明1048のポリヌクレオチド又は本発明1049のベクターを含む、単離された細胞。
[本発明1051]
本発明1001〜1043のいずれかのＷｎｔ結合剤又はポリペプチドの治療上有効量を対象に投与することを含む、対象における腫瘍の増殖を抑制する方法。
[本発明1052]
本発明1001〜1043のいずれかのＷｎｔ結合剤又はポリペプチドの治療上有効量を対象に投与することを含む、対象における腫瘍細胞の分化を誘導する方法。
[本発明1053]
本発明1001〜1043のいずれかのＷｎｔ結合剤又はポリペプチドの治療上有効量を対象に投与することを含む、腫瘍における癌幹細胞の頻度を減少させる方法。
[本発明1054]
前記腫瘍が直腸結腸腫瘍、膵臓腫瘍、肺腫瘍、卵巣腫瘍、肝臓腫瘍、乳腺腫瘍、腎臓腫瘍、前立腺腫瘍、胃腸腫瘍、メラノーマ、子宮頸部腫瘍、膀胱腫瘍、神経膠芽腫、及び頭頸部腫瘍からなる群より選択される腫瘍である、本発明1051〜1053のいずれかの方法。
[本発明1055]
前記腫瘍が直腸結腸腫瘍である、本発明1054の方法。
[本発明1056]
前記腫瘍が膵臓腫瘍である、本発明1054の方法。
[本発明1057]
前記腫瘍が乳腺腫瘍である、本発明1054の方法。
[本発明1058]
本発明1001〜1043のいずれかのＷｎｔ結合剤又はポリペプチドの治療上有効量を対象に投与することを含む、対象における癌を治療する方法。
[本発明1059]
本発明1001〜1043のいずれかのＷｎｔ結合剤又はポリペプチドの治療上有効量を対象に投与することを含む、対象における、Ｗｎｔシグナル伝達活性化に関連する疾患を治療する方法。
[本発明1060]
本発明1001〜1043のいずれかのＷｎｔ結合剤又はポリペプチドの治療上有効量を対象に投与することを含む、対象における、幹細胞及び／又は前駆細胞の増加したレベルにより特徴づけられる障害を治療する方法。
[本発明1061]
対象に第2治療薬を投与することをさらに含む、本発明1051〜1060のいずれかの方法。
[本発明1062]
第2治療薬が化学療法薬である、本発明1061の方法。
[本発明1063]
第2治療薬が血管新生抑制剤である、本発明1061の方法。
[本発明1064]
腫瘍を、1つ以上のヒトＷｎｔタンパク質に結合する薬剤の有効量と接触させることを含む、癌幹細胞を含む腫瘍における癌幹細胞の頻度を減少させる方法。
[本発明1065]
腫瘍を、1つ以上のヒトＷｎｔタンパク質に結合する薬剤の有効量と接触させることを含む、腫瘍における細胞の分化を誘導する方法。
[本発明1066]
前記薬剤がＷｎｔのアンタゴニストである、本発明1064又は1065の方法。
[本発明1067]
前記薬剤が、ヒトＦＺＤ受容体のＦｒｉドメイン、又は1つ以上のヒトＷｎｔタンパク質に結合する該Ｆｒｉドメインの断片を含む、本発明1064又は1065の方法。
[本発明1068]
前記ヒトＦＺＤ受容体がＦＺＤ4である、本発明1067の方法。
[本発明1069]
前記ヒトＦＺＤ受容体がＦＺＤ5である、本発明1067の方法。
[本発明1070]
前記ヒトＦＺＤ受容体がＦＺＤ8である、本発明1067の方法。
[本発明1071]
前記薬剤が、配列番号：3〜12からなる群より選択される配列を含む、本発明1064〜1070のいずれかの方法。
[本発明1072]
前記薬剤が配列番号：10の配列を含む、本発明1071の方法。
[本発明1073]
前記薬剤が配列番号：21のアミノ酸28〜158を含む、本発明1064〜1066のいずれかの方法。
[本発明1074]
前記薬剤が、ヒトＳＦＲＰのＦｒｉドメイン、又は1つ以上のヒトＷｎｔタンパク質に結合する該Ｆｒｉドメインの断片を含む、本発明1064〜1066のいずれかの方法。
[本発明1075]
前記薬剤が、配列番号：13〜17からなる群より選択される配列を含む、本発明1074の方法。
[本発明1076]
前記薬剤がヒトＦｃ領域をさらに含む、本発明1064〜1075のいずれかの方法。
[本発明1077]
前記ＦｒｉドメインがＦｃ領域と直接連結されている、本発明1076の方法。
[本発明1078]
前記ＦｒｉドメインとヒトＦｃ領域との接合部の配列が介在性のペプチドリンカーを含まない、本発明1076の方法。
[本発明1079]
前記ヒトＦｃ領域がヒトＩｇＧ1Ｆｃ領域である、本発明1076〜1078のいずれかの方法。
[本発明1080]
前記Ｆｃ領域が配列番号：18、配列番号：42、又は配列番号：43からなる群より選択される、本発明1079の方法。
[本発明1081]
前記薬剤がＦＺＤ受容体のＦｒｉドメインを含まない、本発明1064〜1066のいずれかの方法。
[本発明1082]
前記薬剤が、Ｗｎｔ1、Ｗｎｔ2、Ｗｎｔ2ｂ、Ｗｎｔ3、Ｗｎｔ3ａ、Ｗｎｔ7ａ、Ｗｎｔ7ｂ、Ｗｎｔ8ａ、Ｗｎｔ8ｂ、Ｗｎｔ10ａ、及びＷｎｔ10ｂからなる群より選択される1つ以上のヒトＷｎｔタンパク質と結合する、本発明1064〜1081のいずれかの方法。
[本発明1083]
前記薬剤が、Ｗｎｔ1、Ｗｎｔ2、Ｗｎｔ2ｂ、Ｗｎｔ3、Ｗｎｔ3ａ、Ｗｎｔ7ａ、Ｗｎｔ7ｂ、Ｗｎｔ8ａ、Ｗｎｔ8ｂ、Ｗｎｔ10ａ、及びＷｎｔ10ｂからなる群より選択される2つ以上のヒトＷｎｔタンパク質と結合する、本発明1082の方法。
[本発明1084]
前記薬剤がＷｎｔ1、Ｗｎｔ2、Ｗｎｔ3、Ｗｎｔ3ａ、及びＷｎｔ7ｂと結合する、本発明1082の方法。
[本発明1085]
前記薬剤がＷｎｔシグナル伝達を抑制する、本発明1064〜1084のいずれかの方法。
[本発明1086]
前記Ｗｎｔシグナル伝達が標準的な Ｗｎｔシグナル伝達である、本発明1085の方法。
[本発明1087]
前記薬剤が、配列番号：1、配列番号：45、配列番号：46、配列番号：47、配列番号：48、配列番号：49、配列番号：50、配列番号：51、及び配列番号：53からなる群より選択される配列を含む、本発明1064〜1067、1070又は1076〜1086のいずれかの方法。
[本発明1088]
前記薬剤が、配列番号：1、配列番号：46、配列番号：48、配列番号：50、及び配列番号：53からなる群より選択される配列を含む、本発明1064〜1067、1070又は1076〜1086のいずれかの方法。
[本発明1089]
インビボの方法である、本発明1064〜1088のいずれかの方法。
[本発明1090]
前記接触させることが、腫瘍を有するヒトに薬剤の有効量を投与することを含む、本発明1089の方法。
[本発明1091]
前記薬剤が、尾静脈を介して約10ｍｇ／ｋｇの投与量で投与された場合に、ラットにおいて少なくとも約100時間の半減期を有する、本発明1064〜1090のいずれかの方法。
[本発明1092]
インビトロの方法である、本発明1064〜1088のいずれかの方法。
[本発明1093]
前記腫瘍がＷｎｔ依存性である、本発明1064〜1092のいずれかの方法。
[本発明1094]
前記腫瘍が直腸結腸腫瘍、膵臓腫瘍、肺腫瘍、卵巣腫瘍、肝臓腫瘍、乳腺腫瘍、腎臓腫瘍、前立腺腫瘍、胃腸腫瘍、メラノーマ、子宮頸部腫瘍、膀胱腫瘍、神経膠芽腫、及び頭頸部腫瘍からなる群より選択される腫瘍である、本発明1064〜1093のいずれかの方法。
[本発明1095]
前記腫瘍が直腸結腸腫瘍である、本発明1094の方法。
[本発明1096]
前記腫瘍が乳腺腫瘍である、本発明1094の方法。
[本発明1097]
前記腫瘍が膵臓腫瘍である、本発明1094の方法。
[本発明1098]
前記腫瘍を化学療法薬と接触させることをさらに含む、本発明1064〜1097のいずれかの方法。
[本発明1099]
ヒトＦＺＤ8受容体のＦｒｉドメインを含む薬剤の治療上有効量を対象に投与することを含む、対象における膵臓腫瘍又は直腸結腸腫瘍の増殖を抑制する方法。
[本発明1100]
ヒトＦＺＤ8受容体のＦｒｉドメインを含む薬剤の治療上有効量を対象に投与することを含む、対象における膵臓癌又は直腸結腸癌を治療する方法。
[本発明1101]
ヒトＦＺＤ8受容体のＦｒｉドメインを含む薬剤の治療上有効量を対象に投与すること；及び
化学療法薬を対象に投与すること
を含む、対象における膵臓腫瘍の増殖を抑制する又は膵臓癌を治療する方法。
[本発明1102]
前記化学療法薬が代謝拮抗薬である、本発明1101の方法。
[本発明1103]
前記化学療法薬がゲムシタビンである、本発明1101の方法。
[本発明1104]
ヒトＦＺＤ8受容体のＦｒｉドメインを含む薬剤の治療上有効量を対象に投与すること、及び
化学療法薬を対象に投与すること
を含む、対象における結腸腫瘍の増殖を抑制する又は結腸癌を治療する方法。
[本発明1105]
前記化学療法薬がイリノテカンである、本発明1104の方法。
[本発明1106]
ヒトＦＺＤ8受容体のＦｒｉドメインを含む薬剤の治療上有効量を対象に投与すること、及び
有糸分裂阻害薬を対象に投与すること
を含む、対象における乳腺腫瘍の増殖を抑制する又は乳癌を治療する方法。
[本発明1107]
前記有糸分裂阻害薬がタキサンである、本発明1106の方法。
[本発明1108]
前記タキサンがパクリタキセルである、本発明1107の方法。
[本発明1109]
前記薬剤がヒトＦｃドメインをさらに含む、本発明1099〜1108のいずれかの方法。
[本発明1110]
前記薬剤が、配列番号：1、配列番号：45、配列番号：46、配列番号：47、配列番号：48、配列番号：49、配列番号：50、配列番号：51、及び配列番号：53からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、本発明1099〜1109のいずれかの方法。
[本発明1111]
1つ以上のＷｎｔタンパク質と結合する薬剤を抗腫瘍活性についてスクリーニングする方法であって、
前記薬剤に曝露された第1固形腫瘍における1つ以上の分化マーカー及び／又は1つ以上の幹細胞性マーカー（ｓｔｅｍｎｅｓｓ ｍａｒｋｅｒ）のレベルを、前記薬剤に曝露されていない第2固形腫瘍における1つ以上の分化マーカーのレベルと比較することを含む、前記方法。
[本発明1112]
1つ以上のＷｎｔタンパク質と結合する薬剤を抗腫瘍活性についてスクリーニングする方法であって、
（ａ）第2固形腫瘍は前記薬剤に曝露しないが、第1固形腫瘍を前記薬剤に曝露すること；
（ｂ）第1及び第2固形腫瘍における1つ以上の分化マーカー及び／又は1つ以上の幹細胞性マーカーのレベルを評価すること；及び
（ｃ）第1腫瘍における1つ以上の分化マーカーのレベルを第2固形腫瘍における1つ以上の分化マーカーのレベルと比較すること
を含む、前記方法。
[本発明1113]
（ａ）第2固形腫瘍における1つ以上の分化マーカーのレベルに対する第1固形腫瘍における1つ以上の分化マーカーの増加したレベルが、前記薬剤の抗腫瘍活性を示し；かつ
（ｂ）1つ以上の幹細胞性マーカーの減少したレベルが、前記薬剤の抗腫瘍活性を示す、
本発明1112の方法。
[本発明1114]
1つ以上のＷｎｔタンパク質と結合する薬剤を抗癌幹細胞活性についてスクリーニングする方法であって、
前記薬剤に曝露された第1固形腫瘍における1つ以上の分化マーカー及び／又は1つ以上の幹細胞性マーカーのレベルを、前記薬剤に曝露されていない第2固形腫瘍における1つ以上の分化マーカーのレベルと比較することを含む、前記方法。
[本発明1115]
1つ以上のＷｎｔタンパク質と結合する薬剤を抗癌幹細胞活性についてスクリーニングする方法であって、
（ａ）癌幹細胞を含む第2固形腫瘍は前記薬剤に曝露しないが、癌幹細胞を含む第1固形腫瘍を前記薬剤に曝露すること；
（ｂ）第1及び第2固形腫瘍における1つ以上の分化マーカー及び／又は1つ以上の幹細胞性マーカーのレベルを評価すること；及び
（ｃ）第1腫瘍における1つ以上の分化マーカーのレベルを第2固形腫瘍における1つ以上の分化マーカーのレベルと比較すること
を含む、前記方法。
[本発明1116]
（ａ）第2固形腫瘍における1つ以上の分化マーカーのレベルに対する第1固形腫瘍における1つ以上の分化マーカーの増加したレベルが、前記薬剤の抗腫瘍活性を示し；かつ
（ｂ）1つ以上の幹細胞性マーカーの減少したレベルが、前記薬剤の抗腫瘍活性を示す、
本発明1115の方法。
[本発明1117]
前記固形腫瘍が膵臓腫瘍である、本発明1111〜1116のいずれかの方法。
[本発明1118]
1つ以上の分化マーカーが（ａ）1つ以上のムチン又は（ｂ）クロモグラニンＡ（ＣＨＧＡ）を含む、本発明1117の方法。
[本発明1119]
1つ以上の分化マーカーがムチン16（Ｍｕｃ16）を含む、本発明1118の方法。
[本発明1120]
前記固形腫瘍が結腸腫瘍である、本発明1111〜1116のいずれかの方法。
[本発明1121]
1つ以上の分化マーカーがサイトケラチン7を含む、本発明1120の方法。
[本発明1122]
前記薬剤が抗体である、本発明1111〜1121のいずれかの方法。
[本発明1123]
前記薬剤が抗体ではない、本発明1111〜1121のいずれかの方法。
[本発明1124]
前記薬剤がヒトＦＺＤ8受容体のＦｒｉドメインを含む、本発明1111〜1121のいずれかの方法。
[本発明1125]
前記薬剤が、配列番号：1、配列番号：45、配列番号：46、配列番号：47、配列番号：48、配列番号：49、配列番号：50、配列番号：51、及び配列番号：53からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、本発明1111〜1121のいずれかの方法。
[本発明1126]
前記薬剤が配列番号：51を含む、本発明1125の方法。
[本発明1127]
前記薬剤が配列番号：53を含む、本発明1125の方法。
[本発明1128]
配列番号：67、配列番号：68、配列番号：69、配列番号：70、配列番号：71、配列番号：72、配列番号：73、及び配列番号：74からなる群より選択されるアミノ酸配列をさらに含む、本発明1001〜1013のいずれかのＷｎｔ結合剤。
[本発明1129]
配列番号：70、配列番号：71、配列番号：72、配列番号：73、及び配列番号：74からなる群より選択されるアミノ酸配列をさらに含む、本発明1001〜1013のいずれかのＷｎｔ結合剤。
[本発明1130]
配列番号：67、配列番号：68、配列番号：69、配列番号：70、配列番号：71、配列番号：72、配列番号：73、及び配列番号：74からなる群より選択されるアミノ酸配列をさらに含む、本発明1036〜1039のいずれかのポリペプチド。
[本発明1131]
配列番号：70、配列番号：71、配列番号：72、配列番号：73、及び配列番号：74からなる群より選択されるアミノ酸配列をさらに含む、本発明1036〜1039のいずれかのポリペプチド。
[本発明1132]
本発明1128〜1131のいずれかのＷｎｔ結合剤又はポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、単離されたポリヌクレオチド。
[本発明1133]
配列番号：75の配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、単離されたポリヌクレオチド。
[本発明1134]
（ａ）配列番号：71、配列番号：70、配列番号：72、配列番号：73、及び配列番号：74からなる群より選択されるシグナル配列；
（ｂ）ヒトＦＺＤ8のＦｒｉドメイン；及び
（ｃ）ヒトＦｃ領域
を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、単離されたポリヌクレオチド。
[本発明1135]
本発明1132〜1134のいずれかのポリヌクレオチドを含む、ベクター。
[本発明1136]
本発明1132〜1134のいずれかのポリヌクレオチド又は本発明1135のベクターを含む、細胞。
[本発明1137]
本発明1044又は本発明1136の細胞により生成される、Ｗｎｔ結合剤。
[本発明1138]
ヒトＦＺＤ8のＦｒｉドメインを含む可溶性のＷｎｔ結合剤を含む組成物であって、該Ｗｎｔ結合剤の少なくとも約80％がＡＳＡのＮ末端配列を有する、前記組成物。
[本発明1139]
前記Ｗｎｔ結合剤の少なくとも約90％がＡＳＡのＮ末端配列を有する、本発明1138の組成物。
[本発明1140]
前記Ｗｎｔ結合剤の少なくとも約95％がＡＳＡのＮ末端配列を有する、本発明1138の組成物。
[本発明1141]
前記Ｗｎｔ結合剤がヒトＦｃ領域を含む、本発明1138〜1140のいずれかの組成物。
[本発明1142]
前記Ｗｎｔ結合剤が、配列番号：53、配列番号：50、配列番号：46、配列番号：48、及び配列番号：1からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、本発明1138〜1141のいずれかの組成物。
[本発明1143]
前記Ｗｎｔ結合剤が配列番号：53を含む、本発明1138〜1141のいずれかの組成物。
[本発明1144]
前記Ｗｎｔ結合剤が配列番号：50を含む、本発明1138〜1141のいずれかの組成物。
[本発明1145]
薬学的に許容される担体をさらに含む、本発明1138〜1144のいずれかの組成物。
[本発明1146]
本発明1138〜1145のいずれかの組成物の治療上有効量を投与することを含む、対象における腫瘍の増殖を抑制する方法。
[本発明1147]
本発明1138〜1145のいずれかの組成物の治療上有効量を投与することを含む、対象における腫瘍細胞の分化を誘導する方法。
[本発明1148]
本発明1138〜1145のいずれかの組成物の治療上有効量を投与することを含む、腫瘍における癌幹細胞の頻度を減少させる方法。
[本発明1149]
前記腫瘍が直腸結腸腫瘍、膵臓腫瘍、肺腫瘍、卵巣腫瘍、肝臓腫瘍、乳腺腫瘍、腎臓腫瘍、前立腺腫瘍、胃腸腫瘍、メラノーマ、子宮頸部腫瘍、膀胱腫瘍、神経膠芽腫、及び頭頸部腫瘍からなる群より選択される腫瘍である、本発明1146〜1148のいずれかの方法。
[本発明1150]
前記腫瘍が直腸結腸腫瘍である、本発明1149の方法。
[本発明1151]
前記腫瘍が膵臓腫瘍である、本発明1149の方法。
[本発明1152]
前記腫瘍が乳腺腫瘍である、本発明1149の方法。
[本発明1153]
本発明1138〜1145のいずれかの組成物の治療上有効量を投与することを含む、対象における癌を治療する方法。
[本発明1154]
前記癌が、直腸結腸癌、膵臓癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、肝臓癌、腎臓癌、前立腺癌、胃腸癌、メラノーマ、子宮頸癌、膀胱癌、神経膠芽腫、及び頭頸部癌からなる群より選択される、本発明1153の方法。
[本発明1155]
本発明1138〜1145のいずれかの組成物の治療上有効量を投与することを含む、対象における、Ｗｎｔシグナル伝達活性化に関連する疾患を治療する方法。
[本発明1156]
本発明1138〜1145のいずれかの組成物の治療上有効量を投与することを含む、対象における、幹細胞及び／又は前駆細胞の増加したレベルにより特徴づけられる障害を治療する方法。
[本発明1157]
対象に第2治療薬を投与することをさらに含む、本発明1146〜1156のいずれかの方法。
[本発明1158]
前記第2治療薬が化学療法薬である、本発明1157の方法。
[本発明1159]
前記化学療法薬がパクリタキセルである、本発明1062又は本発明1158の方法。
[本発明1160]
前記化学療法薬がイリノテカンである、本発明1062又は本発明1158の方法。
[本発明1161]
前記化学療法薬がゲムシタビンである、本発明1062又は本発明1158の方法。
[本発明1162]
前記第2治療薬が血管新生抑制剤である、本発明1157の方法。
[本発明1163]
前記血管新生抑制剤が抗ＶＥＧＦ抗体である、本発明1063又は本発明1162の方法。
[本発明1164]
ヒトＦＺＤ8のＦｒｉドメインを含む可溶性のＷｎｔ結合剤を生成する細胞であって、該Ｗｎｔ結合剤の少なくとも約80％がＡＳＡのＮ末端配列を有する、前記細胞。
[本発明1165]
前記Ｗｎｔ結合剤の少なくとも約90％がＡＳＡのＮ末端配列を有する、本発明1164の細胞。
[本発明1166]
前記Ｗｎｔ結合剤の少なくとも約95％がＡＳＡのＮ末端配列を有する、本発明1164の細胞。
[本発明1167]
前記Ｗｎｔ結合剤の少なくとも約98％がＡＳＡのＮ末端配列を有する、本発明1164の細胞。
[本発明1168]
哺乳類細胞である、本発明1164〜1166のいずれかの細胞。
[本発明1169]
前記Ｗｎｔ結合剤がヒトＦｃ領域を含む、本発明1164〜1168のいずれかの細胞。
[本発明1170]
前記Ｗｎｔ結合剤が、配列番号：53、配列番号：50、配列番号：46、配列番号：48、及び配列番号：1からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、本発明1164〜1169のいずれかの細胞。
[本発明1171]
前記Ｗｎｔ結合剤が配列番号：53を含む、本発明1164〜1169のいずれかの細胞。
[本発明1172]
前記Ｗｎｔ結合剤が配列番号：50を含む、本発明1164〜1169のいずれかの細胞。
[本発明1173]
配列番号：75の配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含む、本発明1164の細胞。
[本発明1174]
Ｗｎｔ結合剤を生成するために配列番号：71、配列番号：70、配列番号：72、配列番号：73、及び配列番号：74からなる群より選択されるシグナル配列を用いることを含む、細胞における、ヒトＦＺＤ8のＦｒｉドメインを含む可溶性のＷｎｔ結合剤を生成する方法であって、該Ｗｎｔ結合剤の少なくとも約80％がＡＳＡのＮ末端配列を有する、前記方法。
[本発明1175]
前記シグナル配列が配列番号：71である、本発明1174の方法。
[本発明1176]
前記Ｗｎｔ結合剤の少なくとも約90％がＡＳＡのＮ末端配列を有する、本発明1174又は本発明1175の方法。
[本発明1177]
前記Ｗｎｔ結合剤の少なくとも約95％がＡＳＡのＮ末端配列を有する、本発明1174又は本発明1175の方法。
[本発明1178]
前記Ｗｎｔ結合剤の少なくとも約98％がＡＳＡのＮ末端配列を有する、本発明1174又は本発明1175の方法。
[本発明1179]
前記細胞が哺乳類細胞である、本発明1174〜1178のいずれかの方法。
[本発明1180]
前記Ｗｎｔ結合剤がヒトＦｃ領域を含む、本発明1174〜1179のいずれかの方法。
[本発明1181]
前記Ｗｎｔ結合剤が、配列番号：53、配列番号：50、配列番号：46、配列番号：48、及び配列番号：1からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、本発明1174〜1180のいずれかの方法。
[本発明1182]
前記Ｗｎｔ結合剤が配列番号：53を含む、本発明1174〜1180のいずれかの方法。
[本発明1183]
前記Ｗｎｔ結合剤が配列番号：50を含む、本発明1174〜1180のいずれかの方法。
[本発明1184]
前記細胞が、配列番号：75の配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含む、本発明1174の方法。
本発明の態様、又は、実施形態がマーカッシュ群又は、その他の代替の分類によって記載される場合、本発明は列挙された全群全体を包含するのみならず、独立して群の各要素、及び、主要群のあらゆる可能な下位群、１つ以上の群要素が無い主要群をも包含する。本発明はまた、特許請求された発明において、どれか１つ以上の群要素の明白な除外も予見するものである。
ラットのＦＺＤ８−Ｆｃ（５４Ｆ０３）の薬物動態。ＦＺＤ８−Ｆｃの単一容量（１０ｍｇ／ｋｇ）の投与に次いでＦＺＤ８−Ｆｃの薬物動態学的な特徴を評価する。ＦＺＤ８−Ｆｃの血清濃度を投与後１，２４，４８，７２，９６，１６８，２４０及び３３６時間ごとに測定した。 ＦＺＤ８−Ｆｃ（５４Ｆ０３）の治療によるＰＮ４膵臓腫瘍増殖の抑制。ＰＮ４膵臓腫瘍細胞をＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに皮下注射した。ＦＺＤ８−Ｆｃ（−▲−）、ゲムシタビン（−■−）、ＦＺＤ８−Ｆｃとゲムシタビンの併用（−△−）、又は対照抗体（−●−）でマウスを治療した。データは治療後に数日、腫瘍量（ｍｍ３）として表す。 ＦＺＤ８−Ｆｃ（５４Ｆ０３）で治療したＰＮ４腫瘍内のＣＤ４４ｈｉ細胞集団の減少。対照抗体、ＦＺＤ８−Ｆｃ、ゲムシタビン、及びＦＺＤ８−Ｆｃとゲムシタビンの併用で治療した腫瘍細胞上で、ＥＳＡ及びＣＤ４４のために細胞表面染色が行われた。各治療群で、５個の腫瘍から単一の細胞懸濁液を染色に先立ってプールした。 ＦＺＤ８−Ｆｃ（５４Ｆ０３）で治療したＰＮ４膵臓腫瘍のインビボの限界希釈アッセイ。 ＦＺＤ８−Ｆｃ（５４Ｆ０３）で治療したＰＮ４膵臓腫瘍の増加した細胞分化。ムチン発現細胞を検出するために、対照抗体、ＦＺＤ８−Ｆｃ、ゲムシタビン又はＦＺＤ８−Ｆｃとゲムシタビンの併用で治療したＰＮ４腫瘍のパラフィン包埋切片を、アルシアンブルーで染色した。 ＦＺＤ８−Ｆｃ（５４Ｆ０３）で治療したＰＮ８膵臓腫瘍の増加した細胞分化。ムチン発現細胞を検出するために、対照抗体、ＦＺＤ８−Ｆｃ、ゲムシタビン、又はＦＺＤ８−Ｆｃとゲムシタビンの併用で治療したＰＮ８腫瘍のパラフィン包埋切片を、アルシアンブルーで染色した。 ＦＺＤ８−Ｆｃ（５４Ｆ０３）での治療後のＰＮ１３膵臓腫瘍における増加した細胞分化及び減少した増殖。ムチン発現細胞を検出するために、対照抗体又はＦＺＤ８−Ｆｃで治療したＰＮ１３腫瘍のパラフィン包埋切片を、アルシアンブルーで染色した。加えて、切片をＫｉ６７、活発に増殖した細胞のマーカーのために染色した。 ＦＺＤ８−Ｆｃ（５４Ｆ０３）での治療後のＰＮ１３膵臓腫瘍における増加したＭｕｃ１６染色。対照抗体又はＦＺＤ８−Ｆｃで治療したＰＮ１３腫瘍のパラフィン包埋切片は、Ｍｕｃ１６タンパク質のために染色された。 ＦＺＤ８−Ｆｃ（５４Ｆ０３）での治療後のＰＮ１３膵臓腫瘍における増加したＣＫ２０染色。対照抗体又はＦＺＤ８−Ｆｃで治療したＰＮ１３腫瘍のパラフィン包埋切片はＣＫ２０タンパク質のために染色された。 パクリタキセルと併用したＦＺＤ８−Ｆｃ（５４Ｆ０３）での治療後のＰＥ１３乳腺腫瘍増殖の抑制。ＰＥ１３乳腺腫瘍細胞をＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに皮下注射した。対照抗体（−●−）、ＦＺＤ８−Ｆｃ（□）、パクリタキセル（−▲−）、又はＦＺＤ８−Ｆｃとパクリタキセルの併用（−○−）でマウスを治療した。データは治療後に数日、腫瘍量（ｍｍ３）として表す。 ＦＺＤ８−Ｆｃ（５４Ｆ０３）でのＣ２８結腸腫瘍増殖の用量依存の抑制。Ｃ２８結腸腫瘍をＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに皮下注射した。ＦＺＤ８−Ｆｃを週に２回１．５ｍｇ／ｋｇ（−▲−）、週に１回５ｍｇ／ｋｇ（−▼−）、週に２回５ｍｇ／ｋｇ（−○−）、週に１回１５ｍｇ／ｋｇ（−□−）、又は週に２回１５ｍｇ／ｋｇ（−△−）、又は対照抗体（−■−）でマウスを治療した。データは治療後に数日、腫瘍量（ｍｍ３）として表す（図１１Ａ）。イリノテカンとの併用でＦＺＤ８−Ｆｃでの結腸腫瘍増殖の抑制。ＦＺＤＳ−Ｆｃ（−▲−）、イリノテカン（−▼−）、ＦＺＤＳ−Ｆｃとイリノテカンの併用（−●−）、又は対照抗体（−■−）でマウスを治療した。データは治療後に数日、腫瘍量（ｍｍ３）として表す（図１１Ｂ）。 ＦＺＤ８−Ｆｃ（５４Ｆ０３）での治療後のＣ２８腫瘍における増加したＣＫ２０染色。対照抗体又はＦＺＤ８−Ｆｃで治療したＣ２８腫瘍のパラフィン包埋切片はＣＫ２０タンパク質のために染色された。 ＦＺＤ８−Ｆｃ（５４Ｆ０３）治療によるＰＮ２１膵臓腫瘍増殖の抑制及び癌幹細胞の減少。ＰＮ２１膵臓腫瘍をＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに皮下注射した。ＦＺＤ８−Ｆｃ（−▼−）、ゲムシタビン（−▲−）、ＦＺＤ８−Ｆｃとゲムシタビン野併用（−■−）、又は対照抗体（−●−）でマウスを治療した。データは治療後に数日、腫瘍量（ｍｍ３）として表す（図１３Ａ）。ＦＺＤ８−Ｆｃで治療したＰＮ２１膵臓腫瘍のインビボの限界希釈アッセイ（図１３Ｂ）。 ＦＺＤ８−Ｆｃ（５４Ｆ０３）での治療後のＰＮ２１膵臓腫瘍の増加した細胞分化。ムチンを検出するために、対照抗体又はＦＺＤ８−Ｆｃで治療したＰＮ２１腫瘍のパラフィン包埋切片を、アルシアンブルーで染色した。 ＦＺＤ８−Ｆｃ（５４Ｆ０３）での治療後のＰＮ２１膵臓腫瘍における増加した細胞分化及び減少した増殖。ムチンを検出するために、対照抗体、ＦＺＤ８−Ｆｃ、ゲムシタビン、又はＦＺＤ８−Ｆｃとゲムシタビンの併用で治療したＰＮ２１腫瘍のパラフィン包埋切片を、アルシアンブルーで染色した。加えて、切片をＫｉ６７、活発に増殖した細胞のマーカーのために染色した。 サルにおけるＦＺＤ８−Ｆｃ変異体の薬物動態。ＦＺＤ８−Ｆｃ変異体５４Ｆ１５及び５４Ｆ１６の単一用量（３０ｍｇ／ｋｇ）を投与し、次いで変異体の薬物動態学的な特徴を評価した。５４Ｆ１５（−○−）及び５４Ｆ１６（−◆−）の血清濃度を投与後１，６，１２，２４，４８，７２，９６，１６８，２４０及び３３６時間ごとに測定した。 ＦＺＤ８−Ｆｃ変異体での治療後のＣ２８結腸腫瘍増殖の抑制。Ｃ２８結腸腫瘍をＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに皮下注射した。対照抗体（−×−）、５４Ｆ０３（−□−）、５４Ｆ０９（−▲−）、５４Ｆ１２（−▼−）、５４Ｆ１３（−◆−）、５４Ｆ１５（−○−）、又は５４Ｆ１６（−△−）でマウスを治療した。データは治療後に数日、腫瘍量（ｍｍ３）として表す。 ＦＺＤ８−Ｆｃ変異体での治療後のＰＮ４膵臓腫瘍増殖の抑制。ＰＮ４結腸腫瘍細胞をＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに皮下注射した。対照抗体（−●−）、５４Ｆ０３（−■−）、５４Ｆ０９（−▼−）、５４Ｆ１２（−○−）、５４Ｆ１３（−▲−）、５４Ｆ１５（−□−）又は５４Ｆ１６（−◆−）でマウスを治療した。データは治療後に数日、腫瘍量（ｍｍ３）として表す。 ＦＺＤ８−Ｆｃ変異体、５４Ｆ０３及び５４Ｆ１６で治療したＰＮ４腫瘍におけるＣＤ４４ｈｉ及びＣＤ４４＋ＣＤ２０１＋細胞の減少。対照抗体、ＦＺＤ８−Ｆｃ変異体５４Ｆ０３、又は変異体５４Ｆ１６で治療した腫瘍細胞上で、ＥＳＡ、ＣＤ４４及びＣＤ２０１のために細胞表面染色が行われ、及びＦＡＣＳにより分析された。 ＦＺＤ８−Ｆｃタンパク質のＮ末端の特徴づけ。ＦＺＤ８−Ｆｃ変異体を質量分析法により分析した。５４Ｆ１６の結果を表す。 ＦＺＤ８−Ｆｃタンパク質のＮ末端の特徴づけ。ＦＺＤ８−Ｆｃ変異体を質量分析法により分析した。５４Ｆ２６の結果を表す。 ＦＺＤ８−Ｆｃタンパク質のＮ末端の特徴づけ。ＦＺＤ８−Ｆｃ変異体を質量分析法により分析した。５４Ｆ２８の結果を表す。 ＦＺＤ８−Ｆｃタンパク質のＮ末端の特徴づけ。ＦＺＤ８−Ｆｃ変異体を質量分析法により分析した。５４Ｆ３０の結果を表す。 ＦＺＤ８−Ｆｃタンパク質のＮ末端の特徴づけ。ＦＺＤ８−Ｆｃ変異体を質量分析法により分析した。５４Ｆ３２の結果を表す。 ＦＺＤ８−Ｆｃ変異体での治療後のＣ２８結腸腫瘍増殖の抑制。Ｃ２８結腸腫瘍細胞をＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに皮下注射した。対照抗体（−■−）、５４Ｆ０３（−△−）、５４Ｆ２３（−▼−）、又は５４Ｆ２６（−○−）でマウスを治療した。データは治療後に数日、腫瘍量（ｍｍ３）として表す。
発明の詳細な説明
本発明は、これらに限定されないが、１つ以上のヒトＷｎｔに結合する、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ（ＦＺＤ）受容体のＦｒｉドメイン、ヒト分泌型Ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質（ＳＦＲＰ）、又は、Ｒｏｒタンパク質を含むポリペプチドを含有する新規薬剤を提供する。関連するポリペプチド、及び、ポリヌクレオチド、Ｗｎｔ結合剤を含む組成物、及び、Ｗｎｔ結合剤を作成する方法もまた提供される。腫瘍成長を抑制する方法、癌を治療する方法、細胞分化を誘導する方法、腫瘍形成能を低下させる方法のようなＷｎｔ結合剤を使用することの方法がさらに提供される。抗腫瘍活性、及び／又は、抗癌幹細胞活性を有する新規Ｗｎｔ結合剤を同定するための薬剤をスクリーニングする方法もまた提供される。
ヒトＦＺＤ８のＦｒｉドメイン、及び、Ｆｃドメインを含むＷｎｔ結合剤が生成された。それは、本明細書においてＦＺＤ８−Ｆｃ、又は、ＦＺＤ８−Ｆｃ（５４Ｆ０３）として称される（実施例１）。ＦＺＤ８−Ｆｃタンパク質の多種多様な変異体が生成された（実施例１０）。Ｎ末端側で凡そ９５％以上相同であるＦＺＤ８−Ｆｃタンパク質が生成された（実施例１６）。いくつかのＦＺＤ８−Ｆｃタンパク質変異体を用いた薬物動態研究がラットでなされ、ＦＺＤ８−Ｆｃタンパク質変異体の半減期が少なくとも１００時間であると示された（実施例２、及び、１２、並びに、図１、及び、表４）。薬物動態研究がサルでＦＺＤ８−Ｆｃタンパク質変異体５４Ｆ１５、及び、５４Ｆ１６を用いて着手され、これらのタンパク質は少なくとも１００時間の半減期を持つことが示された（実施例１３、及び、表５）。ＦＺＤ８−Ｆｃ（５４Ｆ０３）単体、若しくは、化学療法剤との組合せにおける治療が膵臓腫瘍、乳腺腫瘍、及び、大腸腫瘍の成長を低下させることが示された（実施例３、５、６、及び、８、並びに、図２、１０、１１Ｂ、及び、１３Ａ）。さらに、治療は、膵臓モデルにおいて、ＣＤ４４＋細胞のパーセンテージを減少させ、そして、癌幹細胞の頻度を減少させることが示された（実施例３、及び、８、並びに、図３、４、及び、１３Ｂ）。ＦＺＤ８−Ｆｃ（５４Ｆ０３）単体、若しくは、化学療法剤との組合せでの治療が膵臓腫瘍細胞、及び、大腸腫瘍細胞の細胞分化を増進させることが示された（実施例４、７、及び、９、並びに、図５から９、１２、１４、及び、１５）。ＦＺＤ８−Ｆｃ変異体を用いた治療は、大腸腫瘍と膵臓腫瘍において、変異体に応じた程度で腫瘍の成長を抑制することを示した（実施例１４、１５、及び、１７、並びに、図１７、１８、及び、２１）。ＦＺＤ８−Ｆｃ変異体５４Ｆ０３、及び、変異体５４Ｆ１６を用いた治療は膵臓腫瘍においてＣＤ４４＋ＣＤ２０２＋細胞ばかりかＣＤ４４ｈｉ細胞のパーセンテージを減少させることが示された（実施例１５、及び、図１９）。
Ｉ．定義
「アンタゴニスト」という用語は、本明細書において、タンパク質（例えば、癌幹細胞性マーカー）の発現、あるいは、生物学的活性を部分的に、又は、完全に妨害し、抑制し、又は、中和する任意の分子をも含むように使用される。生物学的活性を妨害すること、抑制すること、及び／又は、中和することは、これに限定されないが、腫瘍成長の抑制を含む。「アンタゴニスト」という用語はＷｎｔ経路の生物学的活性を部分的に、又は、完全に妨害し、抑制し、又は、中和する任意の分子をも含む。適切なアンタゴニスト分子は、これらに限定されないが、可溶性ＦＺＤ受容体を含む天然のＦＺＤ受容体タンパク質の断片、及び／又は、アミノ酸配列変異体、並びに、ＳＦＲＰの派生物、及び、Ｒｏｒタンパク質の派生物を含む。
「単離された」ポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、又は、組成物は自然で見つからない形状をとるポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、組成物である。単離されたポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、又は、組成物は、それらが自然で見つかる形状ではもはやない程度にまで生成されたものを含む。ある実施形態において、単離された抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、又は、組成物は実質的に純粋である。
本明細書において使用される場合、「実質的に純粋」は、少なくとも５０％純粋（すなわち、混在物が無い）、より好ましくは少なくとも９０％純粋、より好ましくは少なくとも９５％純粋、より好ましくは少なくとも９８％純粋、より好ましくは少なくとも９９％純粋である物質に当てはまる。
本明細書において使用される場合、「可溶性受容体」という用語は、細胞から可溶性形状で分泌されることができる受容体の一番目の膜貫通ドメインの前に位置する受容体タンパク質の細胞外断片に当てはまる。ある実施形態において、受容体タンパク質はＦＺＤ受容体である。ある実施形態において、受容体タンパク質はＲｏｒ受容体である。
本明細書において使用される場合、「ＦＺＤ可溶性受容体」という用語は、細胞から可溶性形状で分泌されることができる受容体の一番目の膜貫通ドメインの前に位置するヒトＦＺＤ受容体タンパク質の細胞外断片に当てはまる。Ｎ末端細胞外ドメイン（ＥＣＤ）（本明細書でＦＺＤ ＥＣＤと称する）の全長、及び、より小さい断片を含む両方のＦＺＤ可溶性受容体が考えられる。Ｆｒｉドメインを含むＦＺＤ可溶性受容体（本明細書でＦＺＤ Ｆｒｉと称する。）もまた開示される。ＦＺＤ Ｆｒｉ可溶性受容体はＦＺＤ ＥＣＤの全長を含む可溶性受容体と比較して、改変された生物学的活性（例えば、増加したタンパク質半減期）を示すことができる。タンパク質半減期はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、又は、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）との共有結合修飾によりさらに増加されることができる。ＦＺＤ可溶性受容体は、これらに限定されないが、ヒトＦｃ領域（例えば、免疫グロブリンＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、又は、ＩｇＭ由来のヒトＦｃ）、タグタンパク質（例えば、ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、ＧＳＴ）、その他の内在性タンパク質、若しくは、タンパク質断片、又は、ＦＺＤ ＥＣＤ若しくはＦｒｉドメインと連結されたタンパク質の間にある任意のリンカー領域をも含むその他の任意の有益なタンパク質配列を包含するその他の機能性タンパク質、及び、構造性タンパク質にイン・フレームで連結されたＦＺＤ ＥＣＤ、又は、Ｆｒｉドメインを含む。ある実施形態において、ＦＺＤ受容体のＦｒｉドメインはヒトＦｃ領域と直接連結されている。ある実施形態において、ＦＺＤ受容体のＦｒｉドメインはヒトＩｇＧ１ Ｆｃに連結されている（本明細書でＦＺＤ Ｆｒｉ Ｆｃと称する。）。ある実施形態において、ＦＺＤ受容体のＦｒｉドメインはペプチドリンカーによりヒトＦｃ領域と連結されている。ＦＺＤ可溶性受容体はまたアミノ酸挿入、アミノ酸欠質、アミノ酸置換、及び／又は、保存的アミノ酸置換を含むタンパク質変異体を包含する。
本明細書において使用される場合、「リンカー」又は「リンカー領域」という用語は第１ポリペプチド（例えば、ＦＺＤ要素）と第２ポリペプチド（例えば、Ｆｃ領域）の間に挿入されたリンカーに当てはまる。ある実施形態において、リンカーはペプチドリンカーである。リンカーはポリペプチドの発現、分泌、又は、生物学活性に不利に影響してはならない。リンカーは抗原性ではなく、免疫反応を誘起しないことが好ましい。
本明細書において使用される場合、「癌」及び「癌性の」という用語は、細胞の集団が無秩序な細胞成長で特徴づけられる哺乳動物での生理学的状態に当てはまる、又は、その状態を説明する。「癌」という用語はＷｎｔ依存性癌を包含すると理解される。癌の例として、これらに限定されないが、癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫、及び、白血病が挙げられる。そのような癌のより詳細な例として、扁平上皮癌、肺小細胞癌、肺非小細胞癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃腸癌、膵臓癌、神経膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、大腸癌、直腸結腸癌、皮膚癌、黒色腫、子宮内膜癌、又は、子宮癌腫、唾腺ン癌腫、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、陰門癌、甲状腺癌、肝癌腫、及び、様々な種類の頭頸部癌が挙げられる。
「増殖性疾患」及び「増殖性疾病」という用語は癌のような異常な細胞増殖に関連した疾患に当てはまる。
本明細書において使用される場合、「腫瘍」及び「新生物」は、前癌病変を含む良性の（非癌性の）又は悪性の（癌性の）どちらかの過剰な細胞成長、又は、細胞増殖に起因する組織塊の任意のものにも当てはまる。ある実施形態において、腫瘍は上皮性腫瘍である。ある実施形態において、腫瘍はＷｎｔ依存性腫瘍である。
本明細書において使用される場合、「対象」という用語は、ある特定の処置を受ける、これらに限定されないが、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ科動物、ネコ科動物、げっ歯類動物などを含む任意の動物（例えば、哺乳動物）にも当てはまる。概して、本明細書においてヒトの対象を参照する場合、「対象」という用語は「患者」という用語と互換的に使用される。
「癌幹細胞」及び「ＣＳＣ」及び「腫瘍幹細胞」及び「固形腫瘍幹細胞」という用語は、本明細書において、互換的に使用され、（１）大規模な増殖能を持ち、（２）低下した増殖能、又は、発生能を有する１つ以上の分化子孫細胞を生成するために非対称的な細胞分裂を行うことができ、（３）自己新生、又は、自己維持のために対照的な細胞分裂を行うことができる固形腫瘍由来の細胞集団に当てはまる。「癌幹細胞」、「ＣＳＣｓ」、「腫瘍幹細胞」、又は、「固形腫瘍幹細胞」の性質が、腫瘍形成に失敗する大部分の腫瘍細胞と比較して、免疫不全状態の宿主（例えば、マウス）への累代移植に基づき触知できる腫瘍を形成する能力をそれら癌幹細胞に与える。癌幹細胞は分化に対する自己新生を無秩序に行い、変異が起こるため、時間とともに変化することができる異常な細胞種を有する腫瘍を形成する。
「癌細胞」及び「腫瘍細胞」という用語、並びに、文法上の同義語は、腫瘍細胞の大部分を含む非腫瘍原性細胞、及び、本明細書において、癌幹細胞とも称される腫瘍原性幹細胞の両方を含む腫瘍に由来する細胞集団に当てはまる。
「腫瘍原性」という用語は、固形腫瘍幹細胞に腫瘍形成を可能にする、（更なる腫瘍原性癌幹細胞を生ずる）自己新生、及び、（分化した、従って、非腫瘍原性である腫瘍細胞を生ずる）あらゆる他の腫瘍細胞を生成するための細胞増殖の性質を含む固形腫瘍幹細胞の機能上の特徴に当てはまる。これらの自己新生とあらゆる他の腫瘍細胞を生成するための細胞増殖の性質は、累代移植に基づき腫瘍を形成することができない非腫瘍原性腫瘍細胞と比較して、免疫不全状態の宿主（例えば、マウス）への累代移植に基づき触知できる腫瘍を形成する能力を癌幹細胞に与える。癌幹細胞は分化に対する自己新生を無秩序に行い、変異が起こるため、時間とともに変化することができる異常な細胞種を有する腫瘍を形成する。非腫瘍原性腫瘍細胞は、固形腫瘍より腫瘍細胞を入手したのち、免疫不全状態の宿主（例えば、マウス）への初回移植に基づく腫瘍形成を行うことができるが、それら非腫瘍原性腫瘍細胞は、累代移植に基づく腫瘍を生じないことが観察されてきている。
本明細書において使用される場合、「許容される薬学的担体」、又は、「薬学的に許容される担体」は、ポリペプチド製剤のような医薬組成物といった活性成分と組み合わされるとき、ポリペプチド製剤が、例えば、その生物学的活性を保持することを可能にする任意の物質にも当てはまる。さらに、「許容される薬学的担体」はレシピエント対象において、免疫反応を引き起こさない。ある実施形態において、「賦形薬」という用語は「医薬的担体」と互換的に使用される。これらに限定されないが、リン酸緩衝生理食塩水溶液、水、及び、様々な油／水乳剤のような任意の標準的な薬学的担体のどれかも、例として挙げられる。エアロゾル投与、又は、非経口投与のための希釈剤の例として、リン酸緩衝生理食塩水、又は、通常の（０．９％）生理食塩水が挙げられる。
「治療上有効量」という用語は、対象、又は、哺乳動物において疾病又は疾患を「治療する」のに有効な薬剤（例えば、可溶性受容体、又は、その他の薬剤）の量に当てはまる。癌の場合、治療上有効量の薬剤（例えば、可溶性受容体）は、癌細胞の数を減少させることができ、癌の大きさを減少させることができ、癌幹細胞の頻度を減少させることができ、及び／又は、末梢器官への癌細胞の浸潤を止めることができ、腫瘍転移を抑制する、及び／又は、止めることができ、１つ以上の癌に関連する症状をある程度軽減することができる。薬剤（例えば、可溶性受容体）が既存の癌細胞の成長を妨げ、及び／又は、既存の癌細胞を殺す程度、は細胞増殖抑制性、及び／又は、細胞傷害性と称されうる。
本明細書において使用される場合、「腫瘍の成長を抑制する」は、腫瘍細胞の成長が抑制されうる任意の機構にも当てはまる。ある実施形態において、腫瘍細胞の成長は腫瘍細胞の増殖を遅くすることにより抑制される。ある実施形態において、腫瘍細胞の成長は腫瘍細胞の増殖を止めることにより抑制される。ある実施形態において、腫瘍細胞の成長は腫瘍細胞を殺すことにより抑制される。ある実施形態において、腫瘍細胞の成長は腫瘍細胞のプログラム細胞死を誘導することにより抑制される。ある実施形態において、腫瘍細胞の成長は腫瘍細胞の分化を誘導することにより抑制される。ある実施形態において、腫瘍細胞の成長は腫瘍細胞から栄養を取り除くことにより抑制される。ある実施形態において、腫瘍細胞の成長は腫瘍細胞の遊走を妨げることにより抑制される。ある実施形態において、腫瘍細胞の成長は腫瘍細胞の浸潤を妨げることにより抑制される。
「治療すること」、及び、「治療」、及び、「治療する」、及び、「緩和すること」、及び、「緩和する」のような用語は、（１）診断された病的状態、又は、疾患の症状を治療し、鈍化させ、和らげ、及び／又は、その進行を止める治療的手段、及び、（２）目標の病的状態、又は、疾患の発生を妨げ、又は、遅らせる防護的、又は、予防的手段に当てはまる。従って、治療を必要とする者は、すでに疾患を持つ者、疾患を持ちやすい者、及び、疾患から防がれねばならない者を含む。ある実施形態において、対象は、もし、患者が次にあげる１つ以上の項目を示す場合、本発明の方法に従って、首尾よく、癌の治療を施されている。癌細胞、若しくは、腫瘍細胞の数の減少、若しくは、完全な欠如、腫瘍の大きさの減少、例えば、軟部組織及び骨への癌の拡張を含む癌細胞、若しくは、腫瘍細胞の末梢危険への浸潤の抑制、若しくは、欠如、腫瘍転移の抑制、若しくは、欠如、腫瘍成長、若しくは、癌成長の抑制、若しくは、欠如、特定の癌に関連する１つ以上の症状の軽減、発病率、及び、死亡率の減少、生活の質（クオリティ・オブ・ライフ）の改善、腫瘍の腫瘍原性、腫瘍原性頻度、若しくは、腫瘍原性能の低下、腫瘍内の癌幹細胞の数、若しくは、頻度の減少、腫瘍原性細胞の非腫瘍原性状態への分化、又は、これらの効果のある組み合わせ。
本明細書において使用される場合、「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語は、これらに限定されないが、ＤＮＡ、又は、ＲＮＡを含む、ホスホジエステル結合を介して連結された多数のヌクレオチド単位（リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、又は、同族の構造変異体）からなるポリマーに当てはまる。用語は、これらに限定されないが、４−アセチルシトシン、８−ヒドロキシ−Ｎ６−メチルアデノシン、アジリジニルシトシン、シュードイソシトシン、５−（カルボキシヒドロキシル−メチル）ウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチル−アミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルアデニン、１−メチルシュード−ウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチル−グアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチル−シトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシ−アミノ−メチル−２−チオウラシル、βＤ−マンノシルキューオシン、５'−メトキシカルボニルメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、オキシブトキソシン、シュードウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、Ｎ−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、シュードウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、及び、２，６−ジアミノプリンを含むＤＮＡ及びＲＮＡの公知の塩基類似体のいずれかを含有する配列を包含する。ヌクレオチドからなる配列は非ヌクレオチド要素によって分断されうる。ポリヌクレオチドは、重合の後、例えば、標識要素との結合によりさらに修飾されうる。その他の様式の修飾は、例えば、「キャップ」、１つ以上の天然ヌクレオチドの類似体との置換、無電荷結合（例えば、メチルホスホン酸類、ホスホトリエステル類、ホスホラミダイト類、カルバミン酸類、など）、及び、有電荷結合（例えば、ホスホチオリン酸類、ホスホジチオリン酸類、など）のようなヌクレオチド間修飾、タンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リシン、など）のようなペンダント部分、インターカレーター（例えば、アクリジン、ソラーレン、など）、キレート剤（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属、など）、アルキル化剤、改変結合（例えば、αアノマー核酸、など）、並びに、ポリヌクレオチドの非改変形状を含む。さらに、通常、糖に存在するヒドロキシ基のどれかが、例えば、ホスホン酸基、リン酸基と置換されることができるし、標準的な保護基により保護されることができ、若しくは、付加的な結合を用意するために活性化されることもでき、又は、固体支持体に結合されることができる。５'末端ＯＨ及び３'末端ＯＨはリン酸化されるか、又は、１個から２０個の炭素原子を含むアミン類、若しくは、有機キャッピング基部分と置換されうる。その他のハイドロキシ基はまた標準的な保護基に誘導体化されることもできる。ポリヌクレオチドはまた、例えば、２'−Ｏ−メチル−リボース、２'−Ｏ−アリル−リボース、２'−フルオロ−リボース、若しくは、２'−アジド−リボース、炭素環糖類似体、α−アノマー糖類、アラビノース、キシロース類、若しくは、リキソース類のようなエピ異性体糖、ピラノース糖類、フラノース糖類、ヘプツロース類、非環式類似体、及び、メチルリボース配糖体のような塩基脱落類似体を含む、本技術分野で一般的に知られているリボース糖、又は、デオキシリボース糖の類似体を含むこともできる。１つ以上のホスホジエステル結合が代わりの結合基で置き換えられてもよい。これらの代わりの結合基は、これらに限定されないが、リン酸基がＰ（Ｏ）Ｓ（チオ基）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（ジチオ基）、（Ｏ）ＮＲ２（アミド基）、Ｒ及びＲ'が、各々、互いに独立して水素原子である、又は、場合によってはエステル結合（−Ｏ−）を含む炭素数が１〜２０である置換アルキル基、若しくは、非置換アルキル基、アリル基、アルケニル基、シクロアルキル基、又は、アラルジル基であるＰ（Ｏ）Ｒ基、Ｐ（Ｏ）Ｒ'基、ＣＯ（カルボニル基）、又は、ＣＨ２（ホルムアセタール基）で置換される実施形態を含む。ポリヌクレオチド内の全ての結合が同一である必要はない。
本明細書において使用される場合、「ベクター」という用語は、ＤＮＡ部分をある細胞から別の細胞に移動させる核酸分子に関して使用される。「ベクター」という用語は、１つ以上の遺伝子、又は、目的の配列を宿主細胞に伝達し、好ましくは、発現させることができるコンストラクトを意味する。ベクターの例として、これらに限定されないが、ウィルスベクター、裸のＤＮＡ、若しくは、ＲＮＡ発現ベクター、プラスミド、ファージミド、コスミド、若しくは、ファージベクター、陽イオン性縮合剤と結合したＤＮＡ、若しくは、ＲＮＡ発現ベクター、及び、リポソームに被包されたＤＮＡ、若しくは、ＲＮＡ発現ベクターが挙げられる。
「ポリペプチド」、及び、「ペプチド」、及び、「タンパク質」、及び、「タンパク質断片」という用語は、本明細書において、任意の長さのものでも、アミノ酸残基のポリマーに言及するために互換的に使用される。用語は、ポリマー内の１つ以上のアミノ酸残基が、相当する天然アミノ酸を模した人工化学物質であるアミノ酸ポリマー、並びに、天然アミノ酸ポリマー、及び、非天然アミノ酸ポリマーに当てられる。ポリマーは直鎖状でも分枝状でもよく、修飾型アミノ酸を含んでよく、非アミノ酸によって分断されてもよい。用語はまた、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質付加、アセチル化、リン酸化、又は、標識要素との結合のような他の任意の操作、若しくは、修飾によっても、自然に、又は、人為的介入により修飾されたアミノ酸ポリマーを包含する。例えば、１つ以上の（例えば、非天然アミノ酸などを含む）アミノ酸類似体、並びに、本分野において公知のその他の修飾を含むポリペプチドもまた定義に含まれる。本発明のポリペプチドは、少なくとも部分的に、抗体に基づくので、ある実施形態において、ポリペプチドは単鎖として、又は、随伴鎖として生ずることができる。
「アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸、及び、合成アミノ酸、並びに、天然アミノ酸、と同様に機能するアミノ酸類似体、及び、アミノ酸模倣体に当てはまる。天然アミノ酸は、遺伝暗号によってコードされるものであり、並びに、後に修飾されるアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン、及び、Ｏ−ホスホセリンである。アミノ酸類似体は天然アミノ酸と同じ基本化学構造、例えば、水素原子に結合するα炭素原子、アミノ基、及び、Ｒ基を持つ化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムに当てはまる。そのような類似体は、修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）、又は、修飾されたペプチド骨格を持つことができ、しかし、天然アミノ酸と同じ基本的な化学構造を保持する。アミノ酸模倣体は、アミノ酸の一般的な化学構造と異なる構造を持つが、天然アミノ酸と同様に機能する化合物に当てはまる。
ポリペプチド、又は、その他の薬剤がタンパク質に「特異的に結合する」ということは、ポリペプチド、又は、その他の薬剤が関連のないタンパク質を含む別の物質よりもタンパク質と、頻繁に、急速に、長時間、高親和性で、又は、上述のある組み合わせで反応する、又は、結合することである。ある実施形態において、「特異的に結合する」は、例えば、ある薬剤が、約０．１ｍＭ以下のＫＤでタンパク質と、しかし、より一般的には約１μＭ以下のＫＤでタンパク質と結合することを意味する。ある実施形態において、「特異的に結合する」は、ある薬剤が、時には、少なくとも約０．１μＭ以下、少なくとも約０．０１μＭ以下、及び、別の時には、少なくとも約１ｎＭ以下のＫＤでタンパク質と結合することを意味する。異なる種の相同なタンパク質の間の配列同一性のため、特異的結合は、１つ以上の種のＷｎｔタンパク質のような特定のタンパク質を認識する薬剤を含むことができる。同様に、異なるＷｎｔタンパク質間のＷｎｔ配列の特定の領域の相同性のため、特異的結合は１つ以上のＷｎｔタンパク質を認識するポリペプチド（又は、その他の薬剤）を含むことができる。第１標的に特異的に結合する薬剤が第２標的に特異的に結合してもよく、又は、結合しなくてもよいことが理解されている。このように、「特異的結合」は必ずしも排除的な結合、すなわち、単一の標的への結合を（含むことができるけれども）要求しない。従って、ある実施形態において、薬剤は１つ以上の標的（例えば、多数の異なるヒトＷｎｔ）に特異的に結合することができる。一般的に、しかし、必ずしもそうではないが、結合に言及するとき、それは特異的結合を意味する。
２つ以上の核酸、又は、ポリペプチドに関して「同一である」又は「パーセント同一性」という用語は、任意の保存的なアミノ酸置換も配列同一性の一部として考慮することなく、（必要に応じてギャップを導入して）最大の一致を得るように比較したとき、若しくは、整列させたとき、同じであるか、又は、特定のパーセンテージが同じであるヌクレオチド、若しくは、アミノ酸残基を持つ２つ以上の配列、若しくは、サブ配列に当てはまる。パーセント同一性は配列比較ソフトウェア、又は、アルゴリズム、又は、目視検査によって測定されうる。アミノ酸配列、若しくは、ヌクレオチド配列の整列を得るために用いられうる様々なアルゴリズム、若しくは、ソフトウェアは分野において公知である。配列整列アルゴリズムのそのような非限定的な例の１つは、Ｋａｒｌｉｎ ｅｔ ａｌ， １９９０， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ８７：２２６４−２２６８において記載され、Ｋａｒｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９９３， ＰＮＡＳ， ９０：５８７３−５８７７において改変され、ＮＢＬＡＳＴプログラム 及びＸＢＬＡＳＴプログラムに組み入れられたアルゴリズムである（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ， １９９１ ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ， ２５：３３８９−３４０２）。配列を整列させるために使用されうる一般に入手可能なその他ソフトウェアとして、これらに限定されないが、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， ２６６：４６０−４８０）、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ， Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、Ｍｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）、及び、ｔｈｅ Ｂｅｓｔｆｉｔ ｐｒｏｇｒａｍ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ， Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ， ５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ ５３７１１）が含まれる。
ある実施形態において、本発明の２つの核酸、又は、ポリペプチドは実質的に同一であり、そのことは、配列比較アルゴリズムを用いて、又は、目視検査によって測定して、最大の一致を得るように比較し、及び、整列させるとき、それらが少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、ある実施形態において少なくとも９５％未満、９６％、９７％、９８％、９９％ヌクレオチド、又は、アミノ酸残基同一性を持つことを意味する。ある実施形態において、同一性は、少なくとも１０残基長、少なくとも２０残基長、少なくとも４０から６０残基長、少なくとも６０から８０残基長、又は、それらの間の任意の整数値の長さを持つ配列の一領域上に存在する。ある実施形態において、同一性は、６０から８０残基よりも長い領域に、例えば、少なくとも約９０〜１００残基の領域に存在する。ある実施形態において、配列は、ヌクレオチド配列のコーディング領域のような比較される配列の全長にわたって実質的に同一である。
「保存的アミノ酸置換」はあるアミノ酸残基が類似した側鎖を持つ別のアミノ酸に置換されることである。類似した側鎖を持つアミノ酸残基のファミリーは本分野で定義されてきたものであり、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分枝側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、及び、芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。例えば、チロシンをフェニルアラニンに置換することは保存的置換である。本発明のポリペプチド、及び、その他の薬剤の配列における保存的置換は、アミノ酸配列を含むポリペプチドの標的、すなわち、ポリペプチド、及び、その他の薬剤が結合する１つ以上のＷｎｔへの結合を抑止しないことが好ましい。標的への結合を取り除かないヌクレオチドとアミノ酸の保存的置換を同定する方法は本分野で周知である（例えば、Ｂｒｕｍｍｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， １９９３， Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ３２： １１８０−８７、Ｋｏｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． １２：８７９−８４、及び、Ｂｕｒｋｓ ｅｔ ａｌ．， １９９７， ＰＮＡＳ， ９４：４１２−１７を参照のこと）。
本明細書において使用される場合、「約」は示された数値の±１０％に当てはまる。例えば、「約１０％」は９％〜１１％の範囲を示す。
本開示及び特許請求において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び、「ｔｈｅ」は、文脈で明確に指示されない限り、複数形を含む。
実施形態が、本明細書において、「含む」という言葉で記載される場合、「からなる」、及び／又は、「基本的にからなる」という文脈で記載される類似の実施形態もまた提供される。
本明細書において、「Ａ、及び／又は、Ｂ」のような句で使用される場合、「及び／又は」という用語は、ＡとＢの両方、Ａ又はＢ、Ａ（のみ）、及び、Ｂ（のみ）を含むことを意図されている。同様に、「Ａ、Ｂ、及び／又は、Ｃ」のような句で使用される場合、「及び／又は」という用語は、次にあげる各形態を抱合する。「Ａ、Ｂ、及び、Ｃ」、「Ａ、Ｂ、又は、Ｃ」、「Ａ、又は、Ｃ」、「Ａ、又は、Ｂ」、「Ｂ、又は、Ｃ」、「Ａ、及び、Ｃ」、「Ａ、及び、Ｂ」、「Ｂ、及び、Ｃ」、「Ａ（のみ）」、「Ｂ（のみ）」、及び、「Ｃ（のみ）」。
ＩＩ．Ｗｎｔ結合剤
本発明は、１つ以上のヒトＷｎｔタンパク質（Ｗｎｔ）に結合する（例えば、特異的に結合する）薬剤を提供する。これらの薬剤は本明細書において、「Ｗｎｔ結合剤」と称される。ある実施形態において、薬剤は１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、又は、それ以上のＷｎｔタンパク質と特異的に結合する。非限定的な例として挙げると、Ｗｎｔ結合剤はＷｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ１０ａ、及び／又は、Ｗｎｔ１０ｂと結合する。ある実施形態において、Ｗｎｔ結合剤はＷｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、及び、Ｗｎｔ７ｂと結合する。
ある実施形態において、Ｗｎｔ結合剤はＷｎｔアンタゴニストである。ある実施形態において、薬剤はＷｎｔシグナル伝達を抑制する。ある実施形態において、薬剤は標準的Ｗｎｔシグナル伝達を抑制する。
ある実施形態において、Ｗｎｔ結合剤はポリペプチドである。ある実施形態において、Ｗｎｔ結合剤は可溶性受容体である。
ある実施形態において、Ｗｎｔ結合剤はＦＺＤ受容体の細胞外ドメインを含む。ある実施形態において、Ｗｎｔ結合剤はＦＺＤ受容体のＦｒｉドメインを含む。ある実施形態において、ＦＺＤ受容体はヒトＦＺＤ受容体である。ある実施形態において、ヒトＦＺＤ受容体はＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ５、ＦＺＤ６、ＦＺＤ７、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９、又は、ＦＺＤ１０である。ある別の実施形態において、Ｗｎｔ結合剤はＳＦＲＰの一部を含む。ある実施形態において、Ｗｎｔ結合剤はＳＦＲＰのＦｒｉドメインを含む。ある実施形態において、ＳＦＲＰはヒトＳＦＲＰである。ある実施形態において、ヒトＳＦＲＰはＳＦＲＰ１、ＳＦＲＰ２、ＳＦＲＰ３、ＳＦＲＰ４、又は、ＳＦＲＰ５である。別の代わりの実施形態において、Ｗｎｔ結合剤はＲｏｒタンパク質の細胞外ドメインを含む。ある実施形態において、Ｗｎｔ結合剤はＲｏｒタンパク質のＦｒｉドメインを含む。ある実施形態において、ＲｏｒはヒトＲｏｒである。ある実施形態において、ヒトＲｏｒはＲｏｒ１、又は、Ｒｏｒ２である。
ある実施形態において、Ｗｎｔ結合剤は可溶性受容体である。ある実施形態において、Ｗｎｔ結合剤は可溶性タンパク質である。ある実施形態において、Ｗｎｔ結合剤は可溶性ＦＺＤ受容体である。可溶性ＦＺＤ受容体の非限定的な例として、米国特許第７，７２３，４７７号が見受けられる。その文献の全体を参照により本明細書に組み込まれる。ある実施形態において、Ｗｎｔ結合剤は可溶性ＳＦＲＰ、又は、可溶性Ｒｏｒ受容体である。
ＦＺＤ１のＦｒｉドメインは配列番号：２７記載の凡そアミノ酸８７からアミノ酸２３７までを含む。ＦＺＤ２のＦｒｉドメインは配列番号：２８記載の凡そアミノ酸２４からアミノ酸１５９までを含む。ＦＺＤ３のＦｒｉドメインは配列番号：２９記載の凡そアミノ酸２３からアミノ酸１４３までを含む。ＦＺＤ４のＦｒｉドメインは配列番号：２２記載の凡そアミノ酸４０からアミノ酸１７０までを含む。ＦＺＤ５のＦｒｉドメインは配列番号：２３記載の凡そアミノ酸２７からアミノ酸１５７までを含む。ＦＺＤ６のＦｒｉドメインは配列番号：２４記載の凡そアミノ酸１９からアミノ酸１４６までを含む。ＦＺＤ７のＦｒｉドメインは配列番号：２５記載の凡そアミノ酸３３からアミノ酸１７０までを含む。ＦＺＤ８のＦｒｉドメインは配列番号：３０記載の凡そアミノ酸２８からアミノ酸１５８までを含む。ＦＺＤ９のＦｒｉドメインは配列番号：３１記載の凡そアミノ酸２３からアミノ酸１５９までを含む。ＦＺＤ１０のＦｒｉドメインは配列番号：２６記載の凡そアミノ酸２１からアミノ酸１５４までを含む。ヒトＦＺＤ受容体の各々について、対応する予測上のＦｒｉドメインは配列番号：３２から配列番号：４１までとして提供される。ヒトＦＺＤ受容体（ＦＺＤ１からＦＺＤ１０）の各々について、最小コアＦｒｉドメイン配列は配列番号：３から配列番号：１２までとして提供される。ヒトＳＦＲＰ（ＳＦＲＰ１からＳＦＲＰ５）の各々について、最小コアＦｒｉドメイン配列は配列番号：１３から配列番号：１７までとして提供される。ヒトＲｏｒ１、及び、Ｒｏｒ２の最小コアＦｒｉドメイン配列は配列番号：５８、及び、配列番号：５９として提供される。当業者は、様々なＦｒｉドメインに対応する適切なアミノ酸についての理解の点で異なってよい。従って、本明細書において上述したドメインのＮ末端、又は、Ｃ末端は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は、１０アミノ酸でも拡がってよく、又は、縮められてよい。
ある実施形態において、Ｗｎｔ結合剤は、ヒトＦＺＤ受容体のＦｒｉドメイン、又は、１つ以上のヒトＷｎｔタンパク質に結合する該Ｆｒｉドメインの断片、若しくは、変異体を含む。ある実施形態において、ヒトＦＺＤ受容体はＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ５、ＦＺＤ６、ＦＺＤ７、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９、又は、ＦＺＤ１０である。ある実施形態において、ヒトＦＺＤ受容体はＦＺＤ４である。ある別の実施形態において、ヒトＦＺＤ受容体はＦＺＤ５である。あるさらに別の実施形態において、ヒトＦＺＤ受容体はＦＺＤ８である。ある実施形態において、ＦＺＤはＦＺＤ４であり、Ｗｎｔ結合剤は配列番号：６を含み、又は、配列番号：１９の凡そアミノ酸４０からアミノ酸１７０までを含む。ある実施形態において、ＦＺＤはＦＺＤ５であり、Ｗｎｔ結合剤は配列番号：７を含み、又は、配列番号：２０の凡そアミノ酸２７からアミノ酸１５７までを含む。ある実施形態において、ＦＺＤはＦＺＤ７であり、Ｗｎｔ結合剤は配列番号：９を含み、又は、配列番号：２５の凡そアミノ酸３３からアミノ酸１７０までを含む。ある実施形態において、ＦＺＤはＦＺＤ８であり、Ｗｎｔ結合剤は配列番号：１０を含み、又は、配列番号：２１の凡そアミノ酸２８からアミノ酸１５８までを含む。ある実施形態において、ＦＺＤはＦＺＤ１０であり、Ｗｎｔ結合剤は配列番号：１２を含み、又は、配列番号：２６の凡そアミノ酸２１からアミノ酸１５４までを含む。
ある実施形態において、Ｗｎｔ結合剤は、配列番号：３から配列番号：１２までよりなる群より選択される最小Ｆｒｉドメイン配列を含む。ある実施形態において、Ｗｎｔ結合剤は、配列番号：１３から配列番号：１７までよりなる群より選択される最小Ｆｒｉドメイン配列を含む。ある実施形態において、Ｗｎｔ結合剤は、配列番号：５８、及び、配列番号：５９からなる群より選択される最小Ｆｒｉドメイン配列を含む。
ある実施形態において、Ｗｎｔ結合剤は、１つ以上の（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、など）保存的置換を含み、Ｗｎｔに結合することができる、前述のＦＺＤ Ｆｒｉドメイン配列のいずれか１つの変異体を含む。
ある別の実施形態において、Ｗｎｔ結合剤は、ヒトＳＦＲＰのＦｒｉドメイン、又は、１つ以上のヒトＷｎｔタンパク質に結合するそのようなＦｒｉドメインの断片、若しくは、変異体を含む。例えば、ある実施形態において、薬剤は、配列番号：１３から配列番号：１７までよりなる群より選択される最小ＳＦＲＰ Ｆｒｉドメイン配列を含む。ある実施形態において、Ｗｎｔ結合剤は、１つ以上の（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、など）保存的置換を含み、Ｗｎｔに結合する能力を保持する、前述のＳＦＲＰ Ｆｒｉドメイン配列のいずれか１つの変異体を含む。
ある別の実施形態において、Ｗｎｔ結合剤は、ヒトＲｏｒタンパク質のＦｒｉドメイン、又は、１つ以上のヒトＷｎｔタンパク質に結合するそのようなＦｒｉドメインの断片、若しくは、変異体を含む。例えば、ある実施形態において、薬剤は、配列番号：５８、及び、配列番号：５９からなる群より選択される最小Ｒｏｒ Ｆｒｉドメイン配列を含む。ある実施形態において、Ｗｎｔ結合剤は、１つ以上の（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、など）保存的置換を含み、Ｗｎｔに結合する能力を保持する、前述のＲｏｒ Ｆｒｉドメイン配列のいずれか１つの変異体を含む。
ある実施形態において、ヒトＦＺＤ受容体、又は、その他の可溶性ＦＺＤ受容体の最小Ｆｒｉドメインを含む薬剤のようなＷｎｔ結合剤は、ヒトＦｃ領域（例えば、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域）をさらに含む。Ｆｃ領域は、免疫グロブリン、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、及び、ＩｇＥというクラスのいずれかより獲得されうる。ある実施形態において、Ｆｃ領域は野生型Ｆｃ領域である。ある実施形態において、Ｆｃ領域は変異型Ｆｃ領域である。ある実施形態において、Ｆｃ領域はアミノ末端側で、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は、１０アミノ酸だけ切り詰められている（例えば、ヒンジドメイン内で）。ある実施形態において、ヒンジドメインのアミノ酸は望ましくないジスルフィド結合の形成を妨げるために変えられる。ある実施形態において、望ましくないジスルフィド結合の形成を妨げるためにシステインがセリンに置換される。ある実施形態において、Ｆｃ領域は、配列番号：１８、配列番号：４２、又は、配列番号：４３を含む、又は、これらからなる。
ある実施形態において、Ｗｎｔ結合剤は、少なくとも、ＦＺＤ受容体、ＳＦＲＰ、又は、Ｒｏｒタンパク質の最小ＦｒｉドメインとＦｃ領域を含む融合タンパク質である。本明細書において使用される場合、「融合タンパク質」は少なくとも２つの遺伝子のヌクレオチド配列を含む核酸分子によって発現されるハイブリッドタンパク質である。ある実施形態において、第１ポリペプチドのＣ末端は免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端に連結される。ある実施形態において、第１ポリペプチド（例えば、ＦＺＤ Ｆｒｉドメイン）は直接的にＦｃ領域に連結される（すなわち、介在性ペプチドリンカーなしで）。ある実施形態において、第１ポリペプチドはペプチドリンカーを介してＦｃ領域に連結される。
本明細書において使用される場合、「リンカー」という用語は、第１ポリペプチド（例えば、ＦＺＤドメイン）と第２ポリペプチド（例えば、Ｆｃ領域）の間に挿入されたリンカーに当てはまる。ある実施形態において、リンカーはペプチドリンカーである。リンカーはポリペプチドの発現、分泌、又は、生物学的活性に不利に影響してはならない。リンカーは抗原性であってはならず、免疫反応を誘起してはならない。適切なリンカーは当業者に公知であり、しばしば、グリシン残基とセリン残基の混合物を含み、そして、しばしば、立体的に障害のないアミノ酸を含む。有効なリンカーに取り込まれうるその他のアミノ酸はトレオニン残基、及び、アラニン残基を含む。リンカーは、例えば、１から５０アミノ酸長、１から２２アミノ酸長、１から１０アミノ酸長、１から５アミノ酸長、又は、１から３アミノ酸長の範囲にありうる。リンカーは、これらに限定されないが、セリン・グリシン、グリシン・グリシン・セリン・グリシン（ＧＧＳＧ）、グリシン・セリン・グリシン・セリン（ＧＳＧＳ）、グリシン・グリシン・グリシン・セリン（ＧＧＧＳ）、ｎが１から７のセリン（グリシン・グリシン・セリン）ｎ（Ｓ（ＧＧＳ）ｎ）、グリシン・アルギニン・アラニン（ＧＲＡ）、ポリグリシン、ポリアラニン、グルタミン酸・セリン・グリシン・グリシン・グリシン・グリシン・バリン・トレオニン（ＥＳＧＧＧＧＶＴ）（配列番号：６０）、ロイシン・グルタミン酸・セリン・グリシン・グリシン・グリシン・グリシン・バリン・トレオニン（ＬＥＳＧＧＧＧＶＴ）（配列番号：６１）、グリシン・アルギニン・アラニン・グルタミン・バリン・トレオニン（ＧＲＡＱＶＴ）（配列番号：６２）、トリプトファン・アルギニン・アラニン・グルタミン・バリン・トレオニン（ＷＲＡＱＶＴ）（配列番号：６３）、及び、アラニン・アルギニン・グリシン・アルギニン・アラニン・グルタミン・バリン・トレオニン（ＡＲＧＲＡＱＶＴ）（配列番号：６４）を含んでよい。本明細書で使用される場合、リンカーは第１ポリペプチド（例えば、ＦＺＤ Ｆｒｉドメイン）のＣ末端、又は、第２ポリペプチド（例えば、Ｆｃ領域）のＮ末端のどちらかに由来するアミノ酸残基を含まない介在性ペプチド配列である。
ＦＺＤ受容体、ＳＦＲＰ、及び、Ｒｏｒタンパク質はタンパク質の輸送を管理するシグナル配列を含む。シグナル配列（シグナルペプチド、又は、リーダー配列とも称される）は新生のポリペプチドのＮ末端に位置する。それらはポリペプチドを小胞体に向け、そして、タンパク質はその行き先、例えば、オルガネラの内空、内膜、細胞の外膜、又は、分泌を介して細胞の外部で分別される。ほとんどのシグナル配列は、タンパク質が小胞体に輸送された後に、シグナルペプチダーゼによってタンパク質から切断される。タンパク質からのシグナル配列の切断は、通常、アミノ酸配列中の特異的な部位で起こり、そして、それはシグナル配列内のアミノ酸残基に依存する。通常、１つの特異的な切断部位が存在するが、シグナルペプチダーゼによって１つ以上の切断部位が認識されてもよく、及び／又は、使用されてもよく、結果、ポリペプチドに非均一なＮ末端が生じることとなる。例えば、シグナル配列内の異なる切断部位の使用は異なるＮ末端アミノ酸を有する発現ポリペプチドを生ずることとなる。従って、ある実施形態において、本明細書において記載されるポリペプチドは異なるＮ末端アミノ酸を有するポリペプチドの混合物を含んでよい。ある実施形態において、Ｎ末端は長さで１、２、３、４、又は、５アミノ酸だけ異なっている。ある実施形態において、ポリペプチドは実質的に均一である、すなわち、ポリペプチドは同じＮ末端を持つ。ある実施形態において、ポリペプチドのシグナル配列は１つ以上の（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、など）アミノ酸置換、及び／又は、欠失を含む。ある実施形態において、ポリペプチドのシグナル配列は、１つの切断部位が優勢となることを可能にするアミノ酸置換、及び／又は、欠失を含み、それによって１つのＮ末端を持つ実質的に均一なポリペプチドを生じることとなる。ある実施形態において、シグナル配列は配列番号：６７（配列番号：３０のアミノ酸１から２７まで）である。ある実施形態において、配列番号：６７のアミノ酸２５、及び／又は、アミノ酸２６は異なるアミノ酸と置換される。ある実施形態において、配列番号：６７のアミノ酸１７、アミノ酸１８、アミノ酸１９、アミノ酸２３、アミノ酸２４、アミノ酸２５、及び／又は、アミノ酸２６は異なるアミノ酸と置換される。ある実施形態において、配列番号：６７のアミノ酸１７、アミノ酸２３、アミノ酸２４、アミノ酸２５、及び、アミノ酸２６は異なるアミノ酸と置換される。ある実施形態において、配列番号：６７のアミノ酸１７はフェニルアラニン、又は、ロイシンと置換される。ある実施形態において、配列番号：６７のアミノ酸２３はプロリンと置換される。ある実施形態において、配列番号：６７のアミノ酸２４はイソロイシン、又は、フェニルアラニンと置換される。ある実施形態において、配列番号：６７のアミノ酸２５はバリン、イソロイシン、又は、アラニンと置換される。ある実施形態において、配列番号：６７のアミノ酸２６はヒスチジン、チロシン、又は、ヒスチジンと置換される。ある実施形態において、配列番号：６７のアミノ酸２５はバリンと置換される。ある実施形態において、配列番号：６７のアミノ酸２６はロイシンと置換される。ある実施形態において、ポリペプチドのシグナル配列は表１に記載の群より選択される配列を含む、又は、配列からなる。
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ある実施形態において、Ｗｎｔ結合剤は、ＦＺＤドメイン要素、及び、Ｆｃ領域を含む第１ポリペプチドを含有する。ある実施形態において、ＦＺＤドメイン要素はＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ５、ＦＺＤ６、ＦＺＤ７、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９、又は、ＦＺＤ１０に由来する。ある実施形態において、Ｆｃ領域はＩｇＧ１免疫グロブリンに由来する。ある実施形態において、Ｗｎｔ結合剤は、（ａ）配列番号：２７のＸ１からＹ１まで、配列番号：２８のＸ２からＹ２まで、配列番号：２９のＸ３からＹ３まで、配列番号：２２のＸ４からＹ４まで、配列番号：２３のＸ５からＹ５まで、配列番号：２４のＸ６からＹ６まで、配列番号：２５のＸ７からＹ７まで、配列番号：３０のＸ８からＹ８まで、配列番号：３１のＸ９からＹ９まで、及び配列番号：２６のＸ１０からＹ１０までよりなる群より選択されるアミノ酸から基本的に構成される第１ポリペプチド、及び、（ｂ）配列番号：４３のアミノ酸Ａからアミノ酸Ｂまでより基本的に構成される第２ポリペプチドを含み、
Ｘ１ ＝ アミノ酸６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、又は、７６
Ｙ１ ＝ アミノ酸２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、又は、２４３
Ｘ２ ＝ アミノ酸 ２２、２３、２４、２５、２６、２７、又は、２８
Ｙ２ ＝ アミノ酸 １５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、又は、１７２
Ｘ３ ＝ アミノ酸 １８、１９、２０、２１ 、２２、２３、２４、又は、２５
Ｙ３ ＝ アミノ酸 １４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、又は、１４９
Ｘ４ ＝ アミノ酸 ３８、３９、４０、４１、又は、４２
Ｙ４ ＝ アミノ酸 １６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、又は、１７６
Ｘ５ ＝ アミノ酸 ２５、２６、２７、２８、又は、２９
Ｙ５ ＝ アミノ酸 １５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、又は、１６４
Ｘ６ ＝ アミノ酸 １９、２０、２１、２２、２３、又は、２４
Ｙ６ ＝ アミノ酸 １４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、又は、１５２
Ｘ７ ＝ アミノ酸 ２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、又は、３４
Ｙ７ ＝ アミノ酸 １７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、又は、１８６
Ｘ８ ＝ アミノ酸 ２５、２６、２７、２８、２９、３０、又は、３１
Ｙ８ ＝ アミノ酸 １５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、又は、１６４
Ｘ９ ＝ アミノ酸 ２１、２２、２３、又は、２４
Ｙ９ ＝ アミノ酸 １３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、又は、１４６
Ｘ１０ ＝ アミノ酸 ２０、２１、２２、２３、２４、又は、２５
Ｙ１０ ＝ アミノ酸 １５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、又は、１６０
Ａ ＝ アミノ酸 １、２、３、４、５、又は、６
Ｂ ＝ アミノ酸 ２３１、又は、２３２である。ある実施形態において、第１ポリペプチドは第２ポリペプチドと直接連結されている。ある実施形態において、第１ポリペプチドは第２ポリペプチドにペプチドリンカーを介して連結される。ある実施形態において、第１ポリペプチドは第２ポリペプチドにグリシン・アルギニン・アラニン（ＧＲＡ）ペプチドリンカーを介して連結される。あるアミノ酸「から基本的に構成される」、又は、あるアミノ酸「から基本的に構成されている」ポリペプチド（例えば、第１ポリペプチド、又は、第２ポリペプチド）は、ある実施形態において、１つ以上の（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、又は、それ以上の）付加的アミノ酸を、付加的アミノ酸がＷｎｔ結合剤の機能に著しく影響しない限り、一端に、又は、両端に含んでもよい。
ある実施形態において、Ｗｎｔ結合剤は、（ａ）配列番号：３０のアミノ酸Ｘからアミノ酸Ｙまでより基本的に構成される第１ポリペプチド、及び、（ｂ）配列番号：４３のアミノ酸Ａからアミノ酸Ｂまでより基本的に構成される第２ポリペプチドを含み、
Ｘ ＝ アミノ酸 ２５、２６、２７、２８、２９、３０、又は、３１
Ｙ ＝ アミノ酸 １５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、又は、１６４
Ａ ＝ アミノ酸 １、２、３、４、５、又は、６
Ｂ ＝ アミノ酸 ２３１、又は、２３２である。ある実施形態において、第１ポリペプチドは、配列番号：３０のアミノ酸２５からアミノ酸１５８までより基本的に構成される。別の実施形態において、第１ポリペプチドは配列番号：３０のアミノ酸２５からアミノ酸１５８までより構成される。ある実施形態において、第１ポリペプチドは、配列番号：３０のアミノ酸２８からアミノ酸１５８までより基本的に構成される。別の実施形態において、第１ポリペプチドは配列番号：３０のアミノ酸２８からアミノ酸１５８までより構成される。ある実施形態において、第１ポリペプチドは、配列番号：３０のアミノ酸３１からアミノ酸１５８までより構成される。ある実施形態において、第２ポリペプチドは配列番号：４３のアミノ酸１からアミノ酸２３２までより構成される。ある実施形態において、第２ポリペプチドは配列番号：４３のアミノ酸３からアミノ酸２３２までより構成される。ある実施形態において、第２ポリペプチドは配列番号：４３のアミノ酸６からアミノ酸２３２までより構成される。ある実施形態において、第１ポリペプチドは配列番号：３９であり、第２ポリペプチドは配列番号：４３である。ある実施形態において、第１ポリペプチドは配列番号：３９であり、第２ポリペプチドは配列番号：４２である。ある実施形態において、第１ポリペプチドは配列番号：３９であり、第２ポリペプチドは配列番号：１８である。
ある実施形態において、Ｗｎｔ結合剤は、表２から選択されるポリペプチドである、第１ポリペプチド、及び、第２ポリペプチドを含むポリペプチドである。
Figure 0005956349
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ある実施形態において、Ｗｎｔ結合剤は、配列番号：１、配列番号：４５、配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：４８、配列番号：４９、配列番号：５０、配列番号：５１、配列番号：５３、配列番号：５４、配列番号：５５、配列番号：６５、及び、配列番号：６６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
ある実施形態において、Ｗｎｔ結合剤は配列番号：１の配列を含む。ある実施形態において、薬剤は、１つ以上の（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、など）保存的置換を含む配列番号：１の配列を含有する。ある実施形態において、薬剤は配列番号：１と少なくとも約９０％、約９５％、又は、約９８％の配列同一性を持つ配列を含む。ある実施形態において、配列番号：１の変異体は１つ以上のヒトＷｎｔに結合する能力を保持する。
ある実施形態において、Ｗｎｔ結合剤は配列番号：４６の配列を含む。ある実施形態において、Ｗｎｔ結合剤は配列番号：４６である。ある別の実施形態において、薬剤は、１つ以上の（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、など）保存的置換を含む配列番号：４６の配列を含有する。ある実施形態において、薬剤は配列番号：４６と少なくとも約９０％、約９５％、又は、約９８％の配列同一性を持つ配列を含む。ある実施形態において、配列番号：４６の変異体は１つ以上のヒトＷｎｔに結合する能力を保持する。
ある実施形態において、Ｗｎｔ結合剤は配列番号：４８の配列を含む。ある実施形態において、Ｗｎｔ結合剤は配列番号：４８である。ある別の実施形態において、薬剤は、１つ以上の（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、など）保存的置換を含む配列番号：４８の配列を含有する。ある実施形態において、薬剤は配列番号：４８と少なくとも約９０％、約９５％、又は、約９８％の配列同一性を持つ配列を含む。ある実施形態において、配列番号：４８の変異体は１つ以上のヒトＷｎｔに結合する能力を保持する。
ある実施形態において、Ｗｎｔ結合剤は配列番号：５０の配列を含む。ある実施形態において、Ｗｎｔ結合剤は配列番号：５０である。ある別の実施形態において、薬剤は、１つ以上の（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、など）保存的置換を含む配列番号：５０の配列を含有する。ある実施形態において、薬剤は配列番号：５０と少なくとも約９０％、約９５％、又は、約９８％の配列同一性を持つ配列を含む。ある実施形態において、配列番号：５０の変異体は１つ以上のヒトＷｎｔに結合する能力を保持する。
ある実施形態において、Ｗｎｔ結合剤は配列番号：５３の配列を含む。ある実施形態において、Ｗｎｔ結合剤は配列番号：５３である。ある別の実施形態において、薬剤は、１つ以上の（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、など）保存的置換を含む配列番号：５３の配列を含有する。ある実施形態において、薬剤は配列番号：５３と少なくとも約９０％、約９５％、又は、約９８％の配列同一性を持つ配列を含む。ある実施形態において、配列番号：５３の変異体は１つ以上のヒトＷｎｔに結合する能力を保持する。
ある実施形態において、本明細書において記載されるＷｎｔ結合剤は腫瘍、又は、腫瘍細胞の成長を抑制する。ある実施形態において、Ｗｎｔ結合剤は腫瘍内の細胞の分化を誘導する。ある実施形態において、Ｗｎｔ結合剤は腫瘍、又は、腫瘍細胞で分化マーカーの発現を誘導する。ある実施形態において、Ｗｎｔ結合剤は腫瘍内で癌幹細胞の頻度を減少させる。ある実施形態において、配列番号：４６を含むＷｎｔ結合剤は、配列番号：１を含むＷｎｔ結合剤よりも強力に腫瘍成長を抑制する。ある実施形態において、配列番号：４８を含むＷｎｔ結合剤は、配列番号：１を含むＷｎｔ結合剤よりも強力に腫瘍成長を抑制する。ある実施形態において、配列番号：５０を含むＷｎｔ結合剤は、配列番号：１を含むＷｎｔ結合剤よりも強力に腫瘍成長を抑制する。ある実施形態において、配列番号：５３を含むＷｎｔ結合剤は、配列番号：１を含むＷｎｔ結合剤よりも強力に腫瘍成長を抑制する。ある実施形態において、本明細書において記載されるＷｎｔ結合剤は、ＦＺＤドメイン要素、Ｆｃ領域、及び、ＦＺＤドメイン要素とＦｃ領域とを連結しているリンカー要素を含むＷｎｔ結合剤よりも強力に腫瘍成長を抑制する。ある実施形態において、リンカー要素は介在性ペプチドリンカーである。
ある実施形態において、本明細書において記載されるＷｎｔ結合剤はＷｎｔ依存性腫瘍の成長を抑制する。ある実施形態において、腫瘍は、直腸結腸腫瘍、大腸腫瘍、膵臓腫瘍、肺腫瘍、卵巣腫瘍、肝臓腫瘍、乳腺腫瘍、腎臓腫瘍、前立腺腫瘍、胃腸腫瘍、黒色腫、子宮頸部腫瘍、膀胱腫瘍、神経膠芽腫、及び、頭頸部腫瘍からなる群より選択される腫瘍である。ある実施形態において、腫瘍は直腸結腸腫瘍である。ある実施形態において、腫瘍は膵臓腫瘍である。ある実施形態において、腫瘍は乳腺腫瘍である。
ある実施形態において、配列番号：１、配列番号：４５、配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：４８、配列番号：４９、配列番号：５０、配列番号：５１、配列番号：５３、配列番号：５４、配列番号：５５、配列番号：６５、及び、配列番号：６６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドが提供される。ある実施形態において、ポリペプチドは、配列番号：１、配列番号：４６、配列番号：４８、配列番号：５０、及び、配列番号：５３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。ある実施形態において、ポリペプチドは、配列番号：１、配列番号：４６、配列番号：４８、配列番号：５０、及び、配列番号：５３からなる群より選択されるアミノ酸配列から構成される。ある実施形態において、ポリペプチドは配列番号：５０のアミノ酸配列を含む。ある実施形態において、ポリペプチドは配列番号：５０である。ある実施形態において、ポリペプチドは配列番号：５３のアミノ酸配列を含む。ある実施形態において、ポリペプチドは配列番号：５３である。
ある実施形態において、（シグナル配列切断の前、）ポリペプチドは、配列番号：５０、並びに、配列番号：６７、配列番号：６８、配列番号：６９、配列番号：７０、配列番号：７１、配列番号：７２、配列番号：７３、及び、配列番号：７４からなる群より選択されるシグナル配列を含む。ある実施形態において、（シグナル配列切断の前、）ポリペプチドは、配列番号：５０、並びに、配列番号：７０、配列番号：７１、配列番号：７２、配列番号：７３、及び、配列番号：７４からなる群より選択されるシグナル配列を含む。ある実施形態において、（シグナル配列切断の前、）ポリペプチドは、配列番号：５３、並びに、配列番号：６７、配列番号：６８、配列番号：６９、配列番号：７０、配列番号：７１、配列番号：７２、配列番号：７３、及び、配列番号：７４からなる群より選択されるシグナル配列を含む。ある実施形態において、（シグナル配列切断の前、）ポリペプチドは、配列番号：５３、並びに、配列番号：７０、配列番号：７１、配列番号：７２、配列番号：７３、及び、配列番号：７４からなる群より選択されるシグナル配列を含む。ある実施形態において、ポリペプチドは配列番号：７１、及び、配列番号：５０を含む。ある実施形態において、ポリペプチドは配列番号：７１、及び、配列番号：５３を含む。ある実施形態において、ポリペプチドは配列番号：７５を含む。ある実施形態において、ポリペプチドは配列番号：７５から基本的に構成される。
ある実施形態において、ポリペプチドは、配列番号：１、配列番号：４６、配列番号：４８、配列番号：５０、及び、配列番号：５３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む実質的に精製されたポリペプチドである。ある実施形態において、実質的に精製されたポリペプチドは、ＡＳＡのＮ末端配列を持つポリペプチドの少なくとも９０％から構成される。ある実施形態において、新生ポリペプチドは、配列番号：６７から配列番号：７４までよりなる群から選択されるシグナル配列を含む。ある実施形態において、新生ポリペプチドは配列番号：７１のシグナル配列を含む。ある実施形態において、新生ポリペプチドは、１つのＮ末端配列を有する実質的に均一なポリペプチド産物を生ずることとなるシグナル配列を含む。
ある実施形態において、薬剤はＦＺＤ受容体のＦｒｉドメインを含まない。
ある実施形態において、Ｗｎｔ結合剤は抗体（例えば、１つ以上のＷｎｔタンパク質に特異的に結合する抗体）である。
ある実施形態において、Ｗｎｔ結合剤は免疫グロブリンのＦｃ領域を含む。当業者は、本発明の結合剤は、ほぼ同じ免疫原性をもつ、自然の、又は、未改変の定常領域を含む融合タンパク質と比較するとき、癌細胞の局在の増加、腫瘍浸透の増加、血清半減期の減少、又は、血清半減期の増加のような望ましい生化学的特徴を提供するように、Ｆｃ領域の少なくとも一部が削られた、又はそうでなければ、改変された融合タンパク質を含むことを理解するであろう。Ｆｃ領域に対する改変は、１つ以上のドメインにおいて、１つ以上のアミノ酸の付加、欠質、又は、置換を含むことができる。本明細書において開示される改変された融合タンパク質は２つの重鎖定常ドメイン（ＣＨ２、若しくは、ＣＨ３）のうちの１つ以上、又は、ヒンジ領域に対する改変、又は、修飾を含むことができる。別の実施形態において、ＣＨ２ドメイン全体は除去される（ＡＣＨ２コンストラクト）。ある実施形態において、前記の除去された定常領域ドメインは、欠けた定常領域ドメインによってきまって与えられるある程度の分子的柔軟性を提供する、短いアミノ酸スペーサー（例えば、１０アミノ酸残基）と置換される。
ある実施形態において、改変融合タンパク質は、抗体のＣＨ３ドメインが直接的にヒンジ領域に連結するように設計される。別の実施形態において、ペプチドスペーサーがヒンジ領域と前記の改変ＣＨ２ドメイン、及び／又は、改変ＣＨ３ドメインの間に挿入される。例えば、ＣＨ２ドメインが削除され、残りのＣＨ３ドメインが５から２０アミノ酸のスペーサーを介してヒンジ領域に結合しているコンストラクトが発現されうる。定常ドメインの調節配列に障害物がなく接近しやすいままでいる、又は、ヒンジ領域が柔軟なままでいることを確実にするために、そのようなスペーサーが挿入されてよい。しかしながら、ある場合、アミノ酸スペーサーは免疫原性であり、コンストラクトに対する望まれない免疫反応を引き起こす可能性があることは注目されるべきである。従って、ある実施形態において、コンストラクトに付加される任意のスペーサーも、前記の改変抗体の望ましい生物学的性質を保持するように相対的に非免疫原性であるであろう。
ある実施形態において、改変融合タンパク質は定常ドメインの部分的な欠質、又は、数個の、若しくは、ちょうど１個のアミノ酸の置換を持ちうる。例えば、ＣＨ２ドメインの選択された領域にある一アミノ酸の変異は、Ｆｃ結合を実質的に低下させ、それによって癌細胞の局在、及び／又は、腫瘍浸透を増加するのに充分でありうる。同様に、調節を受ける特異的なエフェクター機能（例えば、補体Ｃ１ｑ結合）を制御する１つ以上の定常領域ドメインのその部分を単に削除することが望ましくもある。そのような定常領域の部分的な欠質が、対象に関するその他の望ましい機能を残したまま、抗体の選択的特徴（例えば、血清半減期）を改善することができる。さらに、前述したように、開示される融合タンパク質の定常領域は、変異、又は、結果生じるコンストラクトの特性を強化する１つ以上のアミノ酸置換を通して改変されうる。この点において、改変抗体の立体配置と免疫原性特質を実質的に保持しつつ、保存された結合部位によって与えられえる活性（例えば、Ｆｃ結合）を破壊することが可能でありうる。ある実施形態において、改変融合タンパク質は、エフェクター機能の増減のような望ましい特質を強化するために、又は、より強力に細胞毒、若しくは、炭水化物付加を供給するために定常領域への１つ以上のアミノ酸の付加を含む。
定常領域がいくつかのエフェクター機能を仲介することは、本分野において、公知である。例えば、補体のＣ１成分のＩｇＧ抗体、又は、ＩｇＭ抗体の（抗原に結合する）Ｆｃ領域への結合は補体システムを活性化する。補体の活性化はオプソニン作用や細胞性病原体の溶解に重要である。補体の活性化はまた炎症反応を刺激し、そして、それはまた自己免疫過感受性に関連しうる。さらに、抗体のＦｃ領域はＦｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する細胞に結合できる。ＩｇＧ（γ受容体）、ＩｇＥ（ε受容体）、ＩｇＡ（α受容体）、及び、ＩｇＭ（μ受容体）を含む様々なクラスの抗体に特異的な多数のＦｃ受容体が存在する。抗体の細胞表面上のＦｃ受容体への結合は、抗体被覆粒子の貪食と破壊、免疫複合体の解消、キラー細胞による抗体被覆標的細胞の溶解（抗体依存性細胞介在性細胞傷害、すなわち、ＡＤＣＣ）、炎症メディエーターの放出、胎盤移動、及び、免疫グロブリン産生の制御を含む重要で多様な生物学的反応を誘発する。
ある実施形態において、Ｗｎｔ結合剤は、投与された薬剤の生物学的特質に順番に作用するエフェクター機能をもたらす。例えば、ある実施形態において、定常ドメインの欠質、又は、（点突然変異、若しくは、その他の手段による）不活性化は、前記の循環する改変された薬剤（例えば、Ｗｎｔ結合剤）のＦｃ受容体結合を低下させることができ、それによって癌細胞局在、及び／又は、腫瘍浸透が増加する。別の実施形態において、前記の定常領域の改変は薬剤の血清半減期を増加、又は、減少させる。ある実施形態において、定常領域はジスルフィド結合、又は、オリゴ糖部分を除去するために改変される。
ある実施形態において、Ｗｎｔ結合剤は、Ｆｃ領域に通常関連する１つ以上のエフェクター機能を持たない。ある実施形態において、薬剤はＡＤＣＣ活性を持たず、及び／又は、補体依存的細胞傷害性（ＣＤＣ）を持たない。ある実施形態において、薬剤はＦｃ受容体、及び／又は、補体と結合しない。ある実施形態において、薬剤はエフェクター機能を持たない。
ある実施形態において、本明細書において記載されるＷｎｔ結合剤は、免疫原性を低下させるために改変される。一般に、完全に正常なヒトタンパク質に対する免疫反応は、これらのタンパク質が治療薬として使用されるとき、まれである。しかしながら、多くの融合タンパク質が自然で見られる配列と同じポリペプチド配列を持つにも関わらず、いくつかの治療上の融合タンパク質は哺乳動物において免疫原性であることが示されてきた。ある研究において、リンカーを含む融合タンパク質は、リンカーを含まない融合タンパク質よりも免疫原性があることがわかってきた。従って、ある実施形態において、本発明におけるポリペプチドは、免疫原性を予測するためにコンピューターを使用する方法で解析される。ある実施形態において、ポリペプチドは、Ｔ−細胞のエピトープ、及び／又は、Ｂ−細胞のエピトープについて解析される。任意のＴ−細胞のエピトープ、又は、任意のＢ−細胞のエピトープでも同定され、及び／又は、予測された場合、これらの領域への修飾（例えば、アミノ酸置換）が、エピトープを乱し、又は、破壊するためになされうる。Ｔ−細胞のエピトープ、及び／又は、Ｂ−細胞のエピトープを予測するために用いられうる様々なアルゴリズム、及び、ソフトウェアが、本分野において、公知である。例えば、ソフトウェアプログラムＳＹＦＰＥＩＴＨＩ、ＨＬＡ Ｂｉｎｄ、ＰＥＰＶＡＣ、ＲＡＮＫＰＥＰ、ＤｉｓｃｏＴｏｐｅ、ＥｌｌｉＰｒｏ、及び、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎは全て一般に入手可能である。
ある実施形態において、Ｗｎｔ結合剤、又は、本明細書において記載されるポリペプチドのどれかを産生する細胞が提供される。ある実施形態において、Ｗｎｔ結合剤、又は、本明細書において記載されるポリペプチドのどれかを含む組成物が提供される。ある実施形態において、組成物は、ポリペプチドの少なくとも８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は、９９％がＡＳＡのＮ末端配列を持つポリペプチドを含む。ある実施形態において、組成物はポリペプチドの１００％がＡＳＡのＮ末端配列を持つポリペプチドを含む。ある実施形態において、組成物は、ポリペプチドの少なくとも８０％がＡＳＡのＮ末端配列を持つポリペプチドを含む。ある実施形態において、組成物は、ポリペプチドの少なくとも９０％がＡＳＡのＮ末端配列を持つポリペプチドを含む。ある実施形態において、組成物は、ポリペプチドの少なくとも９５％がＡＳＡのＮ末端配列を持つポリペプチドを含む。
本発明のポリペプチドは組換えポリペプチド、天然ポリペプチド、又は、合成ポリペプチドでありうる。本発明のあるアミノ酸配列は、タンパク質の構造、又は、機能に重要な影響を与えることなく変えられうることが認められるであろう。配列におけるそのような差異が熟慮されるのなら、活性を決定するタンパク質上の重要な領域が存在するであろうことは記憶されねばならない。従って、本発明は、実質的な活性を示す、又は、本明細書において考察されるタンパク質部分のようなＦＺＤタンパク質、ＳＦＲＰ、又は、Ｒｏｒタンパク質の領域を含むポリペプチドの様々な変異体をさらに含む。そのような変異は、欠質、挿入、逆位、重複、及び、アミノ酸の種類の置換を含む。以下に示すように、表現型的に無変化でありそうなアミノ酸変化に関する指針がＢｏｗｉｅ， ｅｔ ａｌ， １９９０， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４７： １３０６−１０に見ることができる。
もちろん、当業者なら作り出すであろうアミノ酸置換の数は、上述したものを含む、多くの因子に依存する。ある実施形態において、いかなる可溶性受容体ポリペプチドに対する置換の数は５０、４０、３０、２５、２０、１５、１０、５、又は、３以上ではないであろう。
本発明のポリペプチドの断片又は部分は、ペプチド合成によって、対応する全長を持つポリペプチドを産生するのに使用されうる。それ故、断片は全長を持つポリペプチドを産生するための中間体として使用されうる。ポリペプチドのこれらの断片又は部分は、「タンパク質断片」又は「ポリペプチド断片」と称されることもできる。
本発明のタンパク質断片は、１つ以上のヒトＷｎｔタンパク質に結合することができるタンパク質（例えば、ヒトＦＺＤ受容体、ヒトＳＦＲＰ、又は、Ｒｏｒタンパク質）の一部、又は、全体である。ある実施形態において、断片は、１つ以上のヒトＷｎｔタンパク質に対する高い親和性をもつ。本明細書において記載される融合タンパク質の断片には、免疫グロブリンの定常領域（例えば、Ｆｃ領域）の少なくとも一部に連結した結合ドメインを含む、ＦＺＤ受容体の細胞外部分、ＳＦＲＰ、又は、Ｒｏｒタンパク質の細胞外部分の少なくとも一部を含むタンパク質断片であるものもある。タンパク質断片の結合親和力は、１０−１１Ｍから１０−１２Ｍの範囲でありうるが、親和力は、断片の様々な大きさによって変化することができ、１０−７Ｍから１０−１３Ｍの範囲にある。ある実施形態において、断片は約１００アミノ酸から約２００アミノ酸の長さであり、免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部に連結する結合ドメインを含む。
本発明のＷｎｔ結合剤は、当該技術分野で既知のいずれかの方法により、特異的結合を検定されうる。使用されうる免疫検定は、これらに限定されないが、ＢＩＡｃｏｒｅ解析のような手法を用いた競合的、及び、非競合的検定システム、ＦＡＣＳ（蛍光活性化セルソーター）解析、免疫蛍光、免疫細胞化学、ウェスタンブロット、放射免疫検定、ＥＬＩＳＡ（酵素標識免疫吸着検定）、「サンドウィッチ」免疫検定、免疫沈降検定、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散検定、凝集アッセイ、補体結合検定、免疫放射線アッセイ、蛍光免疫アッセイ、及び、プロテインＡ免疫アッセイを含む。このような検定は本分野においてきまりきったものであり周知である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ， ｅｄｓ， １９９４， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． １， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと。本文献の全体を参照により本明細書に組み込まれる。）。
例えば、ポリペプチドのヒトＷｎｔへの特異的結合はＥＬＩＳＡを用いて決定されうる。ＥＬＩＳＡ検定は、抗原を調製すること、抗原を用いて９６穴マイクロタイタープレートの穴をコーティングすること、酵素的な基質（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、又は、アルカリフォスファターゼ）のような検出可能な化合物に結合したペプチド（例えば、Ｗｎｔ結合剤）をプレートの穴へ加えること、しばらく保温し、薬剤の存在を検出することを含む。ある実施形態において、ポリペプチド（例えば、Ｗｎｔ結合剤）は検出可能な化合物に結合していないが、代わりに、ポリペプチドを認識する第２の標識抗体がプレートの穴へ加えられる。ある実施形態において、プレートの穴を抗原でコートする代わりに、ポリペプチド（例えば、Ｗｎｔ結合剤）でプレートの穴をコーでき、コートされた穴に抗原を加えた次に、検出可能な化合物に結合した第２抗体が加えられうる。当業者なら、検出されるシグナルを増強するために改変されうるパラメーター、並びに、当該技術分野で既知のその他のＥＬＩＳＡの変法について詳しいであろう（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ， ｅｄｓ， １９９４， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． １， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ａｔ １１．２．１を参照のこと）。
薬剤のＷｎｔへの結合親和力と結合剤−抗原相互作用の解離速度は競合的結合アッセイによって決定されうる。競合的結合アッセイの一例は、（例えば、トリチウム、又は、１２５Ｉ）標識された抗原、若しくは、その断片、若しくは、その変異体を未標識の抗原を増やしながら目的の結合剤と保温し、次に標識された抗原に結合した抗体を検出することを含む放射免疫検定である。結合剤のＷｎｔに対する親和力と結合の解離速度はＳｃａｔｃｈａｒｄプロット解析によるデータから決定されうる。ある実施形態において、ＢＩＡｃｏｒｅカイネティクス解析が、１つ以上のヒトＷｎｔに結合する薬剤の結合速度と解離速度を決定するために使用される。ＢＩＡｃｏｒｅカイネティクス解析は、表面にＷｎｔ抗原を固定化したチップからの抗体の結合と解離を解析することを含む。
ある実施形態において、Ｗｎｔ結合剤は約１μＭ以下、約１００ｎＭ以下、約４０ｎＭ以下、約２０ｎＭ以下、又は、約１０ｎＭ以下の解離定数（ＫＤ）で少なくとも１つのＷｎｔと結合する。
ある実施形態において、Ｗｎｔ結合剤（例えば、ＦＺＤ８−Ｆｃ）は、薬剤と結合する少なくとも１つのＷｎｔ（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は、１０個のＷｎｔ）のアンタゴニストである。ある実施形態において、薬剤は、結合したヒトＷｎｔの１つ以上の活性の少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約５０％、約７５％、約９０％、又は、約１００％を阻害する。
Ｗｎｔ結合剤が（又は、Ｗｎｔ結合剤の候補が）Ｗｎｔシグナル伝達を抑制するかどうか決定するインビボ検定、及び、インビトロ検定は本分野で公知である。例えば、ホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子の上流に多コピーのＴＣＦ結合ドメインを含むＴＣＦ／Ｌｕｃレポーターベクターを利用する細胞ベースのルシフェラーレポーターアッセイはインビトロで標準的Ｗｎｔシグナル伝達を測定するために使用されうる（Ｇａｚｉｔ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １８； ５９５９−６６）。Ｗｎｔ結合剤とともに１つ以上のＷｎｔ（例えば、形質移入された細胞によって発現されるＷｎｔ，又は、Ｗｎｔならし培地により供給されるＷｎｔ）が存在するときのＷｎｔシグナル伝達レベルはＷｎｔ結合剤が存在しないときのシグナル伝達レベルと比較される。ＴＣＦ／Ｌｕｃレポーターアッセイに加えて、Ｗｎｔ結合剤の標準的Ｗｎｔシグナル伝達への効果は、ｃ−ｍｙｃ（Ｈｅ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２８１ ： １５０９−１２（１９９８））、サイクリンＤ１（Ｔｅｔｓｕ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３９８：４２２−６（１９９９））、及び／又は、フィブロネクチン（Ｇｒａｄｌ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ， １９：５５７６−８７（１９９９））のようなβ−カテニンに制御される遺伝子の発現レベルへの薬剤の効果を測定することにより、インビトロで、又は、インビボで測定されうる。ある実施形態において、薬剤のＷｎｔシグナル伝達への効果はまた、Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ−１、Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ−２、Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ−３、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、及び／又は、β−カテニンのリン酸化状態に与える薬剤の効果を測定することにより検定されうる。
本明細書において記載されるポリペプチドは当該技術分野で既知の、いずれかの適切な方法で産生されうる。そのような方法は、直接的なタンパク質合成方法からポリペプチド配列をコードするＤＮＡ配列を構築し、それらの配列を適切な宿主の中で発現させることまでに及ぶ。ある実施形態において、ＤＮＡ配列は、組換えテクノロジーを用い、目的の野生型タンパク質をコードするＤＮＡ配列を単離、又は、合成することにより構築される。配列は、その機能上の類似体を提供するために、部位特異的突然変異誘発によって変異誘発されてもよい。例えば、Ｚｏｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ， １９８４， ＰＮＡＳ， ８１ ：５６６２−６６、及び、米国特許第４，５８８，５８５号を参照のこと。ある実施形態において、ＤＮＡ配列は、組換えテクノロジーを用い、目的の２つのポリペプチドをコードする１つ以上のＤＮＡ配列を単離し、そして、融合タンパク質を作成するためにこれらのＤＮＡ配列を１つに連結することにより構築される。ある実施形態において、前記の２つのポリペプチドの融合は、２つのポリペプチドの間の接合部（すなわち、ＤＮＡ配列のライゲーション部位）に付加的なアミノ酸を付け加える。これらの付加的なアミノ酸はリンカーと考えられる。ある実施形態において、ペプチドリンカーは融合タンパクの２つのポリペプチドの間に挿入される。
ある実施形態において、目的のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列はオリゴヌクレオチド合成機を用いた化学合成により構築されうる。そのようなオリゴヌクレオチドは望みのポリペプチドのアミノ酸配列に基づいてデザインされうる。ある実施形態において、オリゴヌクレオチドは、目的の組換えポリペプチドが産生されるであろう宿主細胞において好ましいコドンを選択するようにデザインされる。標準的な方法が、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成するために応用されうる。例えば、完全なアミノ酸配列が、ヌクレオチドへと逆に訳された遺伝子を構築するために使用されうる。さらに、特定のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡオリゴマーが合成されうる。例えば、望みのポリペプチドの部分をコードするいくつかの小さなオリゴヌクレオチドが合成され、そして次に、連結されうる。前記の個々のオリゴヌクレオチドは相補的集合のため５'突出部分、又は、３'突出部分を典型的に含む。ある実施形態において、前記の望みの融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、介在性ペプチドリンカーなしで直接的に２つのポリペプチドが連結するように合成される。
いったん、（合成、部位特異的変異誘発、組換え技術、又は、別の方法により）組み立てられると、目的の特定のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は発現ベクターに挿入され、望みの宿主でのポリペプチドの発現に適切な発現制御配列に機能的に連結されうる。ヌクレオチドシークエンシング、制限マッピング、及び／又は、適切な宿主での生物学的に活性のあるポリペプチドの発現により、組み立てが適切であったか確認されうる。本分野で周知であるように、宿主における形質移入した遺伝子の高レベルの発現を得るために、遺伝子は、選んだ発現宿主で働く転写発現制御配列、及び、翻訳発現制御配列に機能的に連結されねばならない。
ある実施形態において、組換え発現ベクターはＷｎｔ結合剤、及び、本明細書において記載のポリペプチドをコードするＤＮＡを増幅し、発現させるために使用される。例えば、組換え発現ベクターは、哺乳動物遺伝子、未生物遺伝し、ウィルス遺伝子、又は、昆虫遺伝子由来の適切な転写制御配列、又は、翻訳制御配列に機能的に連結したＦＺＤ Ｆｒｉドメイン、及び、Ｆｃ領域を含む融合タンパク質をコードする合成ＤＮＡ断片、又は、ｃＤＮＡ由来ＤＮＡ断片を持つ複製可能なＤＮＡコンストラクトでありうる。転写単位は、（１）例えば、転写プロモーター、及び／又は、転写エンハンサーのような、遺伝子発現において制御的役割を持つ遺伝的配列、又は、遺伝的配列たち、（２）ｍＲＮＡに転写され、タンパク質に翻訳される構造性配列、又は、コーディング配列、並びに、（３）適切な転写開始配列、転写終結配列、翻訳開始配列、及び、翻訳終結配列を一般的に含む。制御的配列は転写を制御する為のオペレーター配列を含みうる。通常、複製の起点により付与される宿主内で複製する能力、及び、形質転換体の認識を容易にする選択遺伝子が、付加的に、組み入れられうる。ＤＮＡ領域が機能的に互いに関係するとき、ＤＮＡ領域は「機能的に連結している。」例えば、ポリペプチドの分泌に関与する前駆体として発現されるとき、シグナルペプチド（分泌性リーダー）のＤＮＡはポリペプチドのＤＮＡに機能的に連結している。例えば、プロモーターが配列の転写を制御するとき、プロモーターはコーディング配列に機能的に連結している。又は、例えば、リボソーム結合配列が翻訳を可能にするように位置するとき、リボソーム結合配列はコーディング配列に機能的に連結している。一般的に、機能的に連結するとは切れ目がないという意味であり、分泌性リーダーの場合、切れ目がなくリーディングフレームに収まっているという意味である。ある実施形態において、酵母発現システムでの使用を意図された構造性配列は、宿主細胞により翻訳されたタンパク質の細胞外分泌を可能にするリーダー配列を含むことができる。ある実施形態において、組換えタンパク質がリーダー配列、又は、輸送配列なしで発現される場合、構造性配列は、Ｎ末端開始メチオニン残基を含むことができる。この残基は、発現された組換えタンパク質から最終産物を提供する為に、後に分断されてもよい。
発現制御配列と発現ベクターの選択は宿主の選択に依る。多様な発現宿主／ベクターの組み合わせが用いられうる。真核生物宿主に有効な発現ベクターは、例えば、シミアンウィルス４０（ＳＶ４０）、ウシパピローマウィルス、アデノウィルス、及び、サイトメガロウィルスの発現制御配列を含むベクターを含む。細菌宿主に有効な発現ベクターは、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、及び、その派生物を含む大腸菌由来のプラスミドのような既知の細菌のプラスミド、及び、Ｍ１３やその他の繊維状一本鎖ＤＮＡファージのようなより広い宿主域を持つベクターを含む。
Ｗｎｔ結合剤の発現に適切な宿主は、適切なプロモーターの制御下にある原核生物、酵母原核生物、昆虫細胞、又は、高等真核細胞を含む。原核生物は、例えば、大腸菌、又は、バチルス属のような、グラム陰性生物、又は、グラム陽性生物を含む。高等真核細胞は、以下に説明するように、哺乳類動物を起源とする確立された培養細胞系列を含む。無細胞翻訳システムもまた使用されうる。細菌宿主、真菌宿主、酵母宿主、及び、哺乳動物細胞宿主での適切なクローニング、及び、発現ベクターはＰｏｕｗｅｌｓ ｅｔ ａｌ．， １９８５， Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， Ｎ．Ｙ．によって説明される。この文献の関連開示は参照によって本明細書に組み込まれる。
様々な哺乳類動物細胞培養システム、又は、昆虫細胞培養システムが組換えポリペプチドを発現させるために使用される。ある実施形態において、哺乳類動物細胞での組換えタンパク質の発現が好ましい。なぜなら、そのようなタンパク質は、一般的に、正しく折りたたまれ、適切に修飾され、完全に機能的であるからである。適切な哺乳類動物宿主細胞系列の例として、ＣＯＳ−７（サル腎臓由来細胞系列）、Ｌ−９２９（マウス繊維芽細胞由来細胞系列、Ｃ１２７（マウス乳腺腫瘍由来細胞系列）、３Ｔ３（マウス繊維芽細胞由来）細胞系列、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣由来）細胞系列、ＨｅＬａ（ヒト子宮頸癌由来）細胞系列、及び、ＢＨＫ（ハムスター腎臓繊維芽細胞由来）細胞系列が挙げられる。哺乳類動物発現ベクターは複製起点のような非転写配列、発現させられる遺伝子に連結する適切なプロモーター及びエンハンサー、並びに、その他の５'隣接配列、若しくは、３'隣接配列、並びに、必須リボソーム結合部位のような５'非翻訳配列、若しくは、３'非翻訳配列、並びに、転写終結配列を含みうる。異種タンパク質を昆虫細胞で産生するためのバキュロウイルスシステムは当業者に公知であり、Ｌｕｃｋｏｗ ａｎｄ Ｓｕｍｍｅｒｓ， １９８８， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ６：４７で概観される。
形質転換された宿主によって産生されるタンパク質はいずれかの適切な方法にしたがって精製されうる。そのような標準的な方法は、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィニティーカラムクロマトグラフィー、及び、サイズ処理カラムクロマトグラフィー）、遠心分離、示差溶解度、又は、その他のタンパク質精製の標準的な技法のいずれかを含む。ヘキサヒスチジン、マルトース結合ドメイン、インフルエンザコートタンパク質配列、及び、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼのようなアフィニティータグは、適切なアフィニティーカラムに通すことによる簡便な精製を可能にするために前記タンパク質に取り付けられうる。単離されたタンパク質はまた、タンパク質分解、マススペクトロメトリー（ＭＳ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、及び、Ｘ線結晶構造解析のような技法を用いて物理的に特徴づけられうる。
ある実施形態において、培養液に組換えタンパク質を分泌する発現システムに由来する上清は、例えば、Ａｍｉｃｏｎ、又は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットのような市販のタンパク質濃縮フィルターを用いて、まず、濃縮されうる。濃縮工程の次に、濃縮物は適切な精製用マトリックスにアプライされうる。ある実施形態において、例えば、ペンダントジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基を持つマトリックス、又は、基質のような陰イオン交換レジンが使用されうる。マトリックスはアクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロース、又は、タンパク質精製に一般に使用されるその他の種類のマトリックスでありうる。ある実施形態において、陽イオン交換工程が用いられうる。適切な陽イオン交換体はスルホプロピル基、又は、カルボキシメチル基を含む不溶性マトリックスを含む。ある実施形態において、これに限定されないが、セラミックハイドロキシアパタイトを含むハイドロキシアパタイト（ＣＨＴ）媒体が用いられうる。ある実施形態において、例えば、ペンダントメチル基、又は、その他の脂肪族基を持つシリカゲルのような疎水性ＲＰ−ＨＰＬＣ媒体を使用する１回以上の逆相ＨＰＬＣ工程が、融合タンパク質をさらに精製するために用いられうる。均一な組換えタンパク質を提供するために、前述の精製工程のあるもの、又は、全てがまた様々な組み合わせで用いられうる。
ある実施形態において、細菌の培養物で産生された組換えタンパク質は、例えば、細胞ペレットから最初、抽出され、１回以上の濃縮工程、塩析工程、水相イオン交換クロマトグラフィー工程、及び／又は、サイズ排除クロマトグラフィー工程によって単離されうる。ＨＰＬＣが最終的な精製工程に用いられうる。組換えタンパク質の発現に用いられる微生物細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破砕、又は、細胞融解薬剤の使用を含むいずれか簡便な方法により破壊されうる。
本分野において公知の抗体、及び、その他のタンパク質の精製方法はまた、例えば、米国特許出願第２００８／０３１２４２５号、米国特許出願第２００８／０１７７０４８号、及び、米国特許出願第２００９／０１８７００５号で説明される方法を含む。
本明細書で記載されるポリペプチドは、通常はタンパク質の一部ではない付加的な化学物質部分を含むようさらに修飾されうる。それら誘導体化された部分はタンパク質の可溶性、生物学的半減期、又は、吸収を改善することができる。部分はまたタンパク質などの任意の望ましくない副作用をも低減させる、又は、取り除くことができる。それらの部分の概観はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ， ２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， ２００５に見つけだされうる。
誘導体化に最も適した化学物質部分は水溶性ポリマーを含む。水溶性ポリマーは、それが結合するタンパク質は生理的環境のような水性環境において沈殿しないので、好ましい。ある実施形態において、治療上の製作物、又は、治療上の組成物の調製にとりポリマーは薬学的に許容されるであろう。当業者は、ポリマー／タンパク質結合体が治療の上で使用されるかどうか、そうならば、望ましい用量、循環時間、タンパク質分解に対する抵抗性、及び、その他のことを考慮して望ましいポリマーを選択することができる。誘導体化の有効性は、望ましい形状で誘導体を投与し（すなわち、浸透圧ポンプにより、又は、注射、若しくは、点滴、又は、口、肺、若しくは、その他の配送経路向けのさらなる処方により）、その有効性を決定することにより確かめることができる。適切な水溶性ポリマーは、これらに限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストランポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸共重合体、ポリアミノ酸（ホモ重合体、又は、ランダム共重合体のどちらでも）、デキストラン、ポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマー、プロリプロピレンオキシド／エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチレ化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、及び、それらの混合物を含む。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水におけるその安定性のために製造において利点を持つことができる。
結合するポリマー分子の数は可変であり、当業者は機能への効果を確かめることができるであろう。モノ誘導体化でき、又は、同じ、若しくは、異なる化学物質部分（例えば、異なる重量のポリエチレングリコールのようなポリマー）によるジ誘導体化、トリ誘導体化、テトラ誘導体化、又は、ある組合せの誘導体化をもたらすことができる。ポリマー分子のタンパク質（又は、ペプチド）分子に対する割合は、反応混合物におけるそれらの濃度が変わるに応じて、変化するであろう。一般的に、（過剰に未反応のタンパク質、又は、ポリマーが存在しないという反応効率の点で）最適な割合は、誘導体化の望ましい程度（例えば、モノ−、ジ−、トリ−、など）、選択されたポリマーの分子量、ポリマーが分枝状であるか、若しくは、非分枝状であるか、及び、反応条件などの因子によって決定されるであろう。
ポリエチレングリコール分子（又は、その他の化学物質部分）は、前記タンパク質の機能ドメイン、又は、抗原性ドメインへの効果を考慮して、前記タンパク質に結合されるべきである。当業者にとり利用できる多数の結合のための方法が存在する。例えば、欧州特許第０４０１３８４号を参照のこと。この文献の開示を参照（Ｇ−ＣＳＦへのＰＥＧのカップリング）して本明細書に組み入れる。（塩化２，２，２−トリフルオロエタンスルホニルを用いたＧＭ−ＣＳＦのＰＥＧ化を報告する）Ｍａｌｉｋ ｅｔ ａｌ．， １９９２， Ｅｘｐ． Ｈｅｍａｔｏｌ．， ２０： １０２８−３５も参照のこと。例えば、ポリエチレングリコールは自由アミノ基、又は、自由カルボキシ基のような反応基を介してアミノ酸残基に共有結合することができる。反応基は、活性化ポリエチレングリコールが結合できる基である。自由アミノ基を持つアミノ酸残基はリシン残基、及び、Ｎ末端アミノ酸残基を含むことができる。自由カルボキシ基を持つアミノ酸残基はアスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、及び、Ｃ末端アミノ酸残基を含むことができる。スルフヒドリル基（ＳＨ基）はまた、ポリエチレングリコール分子を結合させる反応基として用いられうる。治療上の目的で、Ｎ末端残基、又は、リシン残基での結合のような、アミノ基での結合がなされうる。受容体結合が望ましい場合、受容体結合に重要な残基での結合は避けられるべきである。
アミノ末端を化学的に修飾したタンパク質を特にデザインすることができる。ポリエチレングリコールを本組成物の実例として用いると、（分子量、分枝などで）様々なポリエチレングリコール分子から、反応混合物におけるタンパク質（又は、ポリペプチド）分子に対するポリエチレングリコール分子の割合、行われるＰＥＧ化反応の種類、及び、選択されたＮ末端ＰＥＧ化タンパク質を得る方法を選ぶことができる。Ｎ末端ＰＥＧ化製剤を得る方法（すなわち、必要に応じ、この部分をその他のモノＰＥＧ化部分から分離すること）は、ＰＥＧ化タンパク質分子の集団よりＮ末端ＰＥＧ化物質を精製することによるものでありうる。選択的なＮ末端化学修飾は、ある特定のタンパク質において誘導体化に利用できる様々な種類の第１アミノ基（リシン対Ｎ末端）の異なる反応性を利用する還元的アルキル化によって遂行されうる。適切な反応条件のもと、タンパク質のポリマーを含むカルボニル基とのＮ末端での実質的な選択的誘導体化が成し遂げられる。例えば、タンパク質のリシン残基のεアミノ基とＮ末端残基のαアミノ基の間のｐＫａの違いを利用できるようにするｐＨで反応を行うことにより、選択的なＮ末端ＰＥＧ化をタンパク質に行うことができる。そのような選択的誘導体化によって、水溶性ポリマーのタンパク質への結合が制御される。例えば、ポリマーとの結合が圧倒的にタンパク質のＮ末端に起こり、リシン側鎖アミノ基のようなその他の反応基の有意な修飾は起こらない。還元的アルキル化を用いると、水溶性ポリマーは上述した性質であることができ、タンパク質にカップリングする単一の反応性アルデヒドを持つであろう。単一の反応性アルデヒドを含むので、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドが使用されうる。
ＰＥＧ化は当該技術分野で既知のＰＥＧ化反応のいずれかによって実行されうる。例えば、Ｆｏｃｕｓ ｏｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ， １９９２， ３： ４−１０、欧州特許第０１５４３１６号、欧州特許第０４０１３８４号、及び、ＰＥＧ化に関する本明細書で引用したその他の出版物を参照のこと。欧州特許第０１５４３１６号について、その開示を参照により本明細書に組み込まれる。ＰＥＧ化は、反応性ポリエチレングリコール分子（又は、類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応、又は、アルキル化反応を介して実行されうる。
従って、本発明にしたがって使用される可溶性受容体ポリペプチドはＰＥＧ化可溶性受容体ポリペプチド及びその変異体を含むことができ、ＰＥＧ基はアシル基、又は、アルキル基を介して結合されると考えられる。そのような産物はモノＰＥＧ化、又は、ポリＰＥＧ化されている可能性がある。ＰＥＧ基は一般にアミノ酸のαアミノ基、又は、εアミノ基でタンパク質に結合する。しかし、ＰＥＧ基は、適切な反応条件下では、ＰＥＧ基に結合するほど充分反応的である、タンパク質にあるどのアミノ基にも結合されうるとも考えられる。
アシル化法、及び、アルキル化法の両方で使用されるポリマー分子は以下に述べる水溶性ポリマーより選択されうる。選択される前記ポリマーは、本方法において示されるように重合度が制御されることが可能になるように、アシル化のための活性エステル、又は、アルキル化のためのアルデヒドのような１つの反応基を持つように修飾されねばならない。反応性ＰＥＧアルデヒドの一例はポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドであり、それは水中で安定であり、又は、炭素数１から１０のモノアルコキシ基、若しくは、そのアリールオキシ誘導体である（米国特許第５，２５２，７１４号を参照のこと）。ポリマーは分枝状、又は、非分枝状でありうる。アシル化反応のために、選択されるポリマーは、単一の反応的エステル基を持たねばならない。本還元的アルキル化のために、選択されるポリマーは単一の反応的アルデヒド基を持たねばならない。天然グリコシル基は、通常、哺乳類組換え発現システムによって、より簡便に作られるので、一般に、水溶性ポリマーは天然グリコシル基から選択されないであろう。ポリマーは任意の分子量であってもよく、分枝状、又は、非分枝状でありうる。本明細書で用いられる一水溶性ポリマーはポリエチレングリコールである。本明細書で用いられるように、ポリエチレングリコールには、（炭素数１から１０の）モノアルコキシポリエチレングリコール、又は、アリールオキシポリエチレングリコールのような、その他のタンパク質を誘導体化するために使用された様々な種類のＰＥＧの任意のものをも包含する意味がある。
溶剤、反応時間、温度などのその他の反応パラメーター、及び、産物を精製する手段は、水溶性ポリマーでのタンパク質の誘導体化に関する発表情報に基づき、個々の場合に応じて決定されうる（本明細書で引用する出版物を参照のこと）。ある実施形態において、Ｗｎｔ結合剤はヒトＦＺＤ、又は、ＳＦＲＰに由来しないポリペプチドである。標的タンパク質に高い親和性をもって結合するポリペプチドを同定し、産生する様々な方法が、本分野において公知である。例えば、Ｓｋｅｒｒａ， ２００７， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ， １８：２９５−３０４、 Ｈｏｓｓｅ ｅｔ ａｌ， ２００６， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ， １５： １４−２７、Ｇｉｌｌ ｅｔ ａｌ．， ２００６， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ， １７：６５３−５８、Ｎｙｇｒｅｎ， ２００８， ＦＥＥＳ Ｊ．， ２７５：２６６８−７６、及び、Ｓｋｅｒｒａ， ２００８， ＦＥＢＳＪ．， ２７５：２６７７−８３を参照のこと。これらの文献の各々は、全体が参照により本明細書に組み込まれる。ある実施形態において、ファージディスプレイ技法がＷｎｔ結合ポリペプチドを同定／産生するのに使用されてきた。ある実施形態において、ポリペプチドは、プロテインＡ、リポカリン、フィブロネクチンドメイン、アンキリンコンセンサス反復ドメイン、及び、チオレドキシンからなる群より選択される種類の足場タンパク質を含む。
ある実施形態において、Ｗｎｔ結合剤は非タンパク質分子である。ある実施形態において、薬剤は小分子である。非タンパク質性Ｗｎｔ結合剤を同定するのに有効なコンビナトリアルケミカルライブラリーとコンビナトリアルケミカル技法は当業者に公知である。例えば、Ｋｅｎｎｅｄｙ ｅｔ ａｌ， ２００８， Ｊ． Ｃｏｍｂ． Ｃｈｅｍ．， １０：３４５−５４、Ｄｏｌｌｅ ｅｔ ａｌ， ２００７， Ｊ． Ｃｏｍｂ． Ｃｈｅｍ．， ９：８５５−９０２、及び、 Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙｙａ， ２００１ ， Ｃｕｒｒ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．， ８： １３８３−４０４を参照のこと。これらの文献の各々は、全体が参照により本明細書に組み込まれる。あるさらなる実施形態において、薬剤は炭水化物、グリコサミノグリカン、糖タンパク質、又は、プロテオグリカンである。
ある実施形態において、薬剤は核酸アプタマーである。アプタマーは、別の分子に結合するそれら能力に基づき、（例えば、ランダムなポリヌクレオチドプール、又は、変異誘発されたポリヌクレオチドプールから）選択されるポリヌクレオチド分子である。ある実施形態において、アプタマーはＤＮＡポリヌクレオチドを含む。ある別の実施形態において、アプタマーはＲＮＡポリヌクレオチドを含む。ある実施形態において、アプタマーは１つ以上の改変核酸残基を含む。タンパク質への結合について核酸アプタマーを作成し、スクリーニングする方法は本分野において周知である。例えば、米国特許第５，２７０，１６３号、米国特許第５，６８３，８６７号、米国特許第５，７６３，５９５号、米国特許第６，３４４，３２１号、米国特許第７，３６８，２３６号、米国特許第５，５８２，９８１号、米国特許第５，７５６，２９１号、米国特許第５，８４０，８６７号、米国特許第７，３１２，３２５号、及び、米国特許第７，３２９，７４２号、並びに、国際公開第０２／０７７２６２号、及び、国際公開第０３／０７０９８４号、並びに、米国特許出願第２００５／０２３９１３４号、米国特許出願第２００５／０１２４５６５号、及び、米国特許出願第２００８／０２２７７３５号を参照のこと。これらの文献の各々は、全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ある実施形態において、Ｗｎｔ結合剤は、マウス、カニクイザル、又は、ヒトにおいて少なくとも約５時間の、少なくとも約１０時間の、少なくとも約２４時間の、少なくとも約３日の、少なくとも約１週間の、又は、少なくとも約２週間の循環半減期を持つ。ある実施形態において、Ｗｎｔ結合剤は、マウス、カニクイザル、又は、ヒトにおいて少なくとも約１０時間の、少なくとも約２４時間の、少なくとも約３日の、少なくとも約１週間の、又は、少なくとも約２週間の循環半減期を持つＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、又は、ＩｇＧ２）である。ポリペプチド、及び、抗体のような薬剤の半減期を長くする方法は本分野で公知である。例えば、ＩｇＧ抗体の循環半減期を長くする公知の方法は、ｐＨ６．０での新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する抗体のｐＨ依存的結合を増加させるＦｃ領域内の変異導入を含む（例えば、米国特許公開公報第２００５／０２７６７９９号、米国特許公開公報第２００７／０１４８１６４号、及び、米国特許公開公報第２００７／０１２２４０３号を参照のこと）。Ｆｃ領域を欠く抗体断片の循環半減期を長くする公知の方法は、ＰＥＧ化のような技法を含む。
ある実施形態において、Ｗｎｔ結合剤、及び、本明細書で記載されるポリペプチドは、約２ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇの範囲で尾静脈を介して投与されると、ラットで少なくとも約５０時間の半減期を持つ。ある実施形態において、Ｗｎｔ結合剤、又は、ポリペプチドは、約１０ｍｇ／ｋｇで尾静脈を介して投与されると、ラットで少なくとも約５０時間の半減期を持つ。ある実施形態において、Ｗｎｔ結合剤、又は、ポリペプチドは、約２ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇの範囲で尾静脈を介して投与されると、ラットで少なくとも約１００時間の半減期を持つ。ある実施形態において、Ｗｎｔ結合剤、又は、ポリペプチドは、約１０ｍｇ／ｋｇで尾静脈を介して投与されると、ラットで少なくとも約１００時間の半減期を持つ。ある実施形態において、Ｗｎｔ結合剤、又は、ポリペプチドは、約２ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇの範囲で尾静脈を介して投与されると、ラットで少なくとも約１２０時間の半減期を持つ。ある実施形態において、Ｗｎｔ結合剤、又は、ポリペプチドは、約２ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇの範囲で尾静脈を介して投与されると、ラットで少なくとも約１５０時間の半減期を持つ。
ある実施形態において、薬剤は、ヒトＦＺＤ受容体のＦｒｉドメイン（又は、１つ以上のＷｎｔに結合する該Ｆｒｉドメインの断片、若しくは、変異体）とヒトＦｃ領域を含む可溶性ＦＺＤ受容体であり、ＦＺＤ受容体の細胞外ドメインとヒトＦｃ領域を含む可溶性ＦＺＤ受容体よりも長いインビボの（例えば、マウス、又は、ラットで）半減期を持つ。
Ｗｎｔ結合剤、又は、本明細書で記載されるポリペプチドを産生する細胞が提供される。ある実施形態において、細胞はヒトＦＺＤ８のＦｒｉドメインを含む可溶性Ｗｎｔ結合剤を産生し、Ｗｎｔ結合剤の少なくとも約８０％がＡＳＡのＮ末端配列を持つ。ある実施形態において、細胞はヒトＦＺＤ８のＦｒｉドメインを含む可溶性Ｗｎｔ結合剤を産生し、Ｗｎｔ結合剤の少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は、少なくとも約９８％がＡＳＡのＮ末端配列を持つ。ある実施形態において、細胞は哺乳類動物細胞である。ある実施形態において、細胞はヒトＦｃ領域を含むＷｎｔ結合剤を産生する。ある実施形態において、細胞は、配列番号：５３、配列番号：５０、配列番号：４６、配列番号：４８、及び、配列番号：１からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＷｎｔ結合剤を産生する。ある実施形態において、細胞は配列番号：５３のアミノ酸配列を含むＷｎｔ結合剤を産生する。ある実施形態において、細胞は配列番号：５０のアミノ酸配列を含むＷｎｔ結合剤を産生する。
本明細書で記載される細胞によって産生されるＷｎｔ結合剤が提供される。
Ｗｎｔ結合、又は、本明細書で記載されるポリペプチドを含む組成物がまた提供される。ある実施形態において、組成物はヒトＦＺＤ８のＦｒｉドメインを含む可溶性Ｗｎｔ結合剤を含有し、Ｗｎｔ結合剤の少なくとも約８０％がＡＳＡのＮ末端配列を持つ。ある実施形態において、組成物はヒトＦＺＤ８のＦｒｉドメインを含む可溶性Ｗｎｔ結合剤を含有し、Ｗｎｔ結合剤の少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は、少なくとも約９８％がＡＳＡのＮ末端配列を持つ。ある実施形態において、組成物はヒトＦｃ領域を含むＷｎｔ結合剤を含有する。ある実施形態において、組成物は、配列番号：５３、配列番号：５０、配列番号：４６、配列番号：４８、及び、配列番号：１からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＷｎｔ結合剤を含有する。ある実施形態において、組成物は配列番号：５３のアミノ酸配列を含むＷｎｔ結合剤を含有する。ある実施形態において、組成物は配列番号：５０のアミノ酸配列を含むＷｎｔ結合剤を含有する。ある実施形態において、本明細書で記載される組成物は薬学的に許容される担体をさらに含む。
Ｗｎｔ結合、又は、本明細書で記載されるポリペプチドを含む組成物を使用することの方法がまた提供される。
ＩＩＩ．ポリヌクレオチド
ある実施形態において、本発明はヒトＷｎｔタンパク質に特異的に結合するポリペプチド、又は、そのようなポリペプチドの断片をコードするポリヌクレオチドを包含する。例えば、本発明は、可溶性ＦＺＤ受容体をコードする核酸、又は、そのような可溶性受容体の断片をコードする核酸を含むポリヌクレオチドを提供する。ある実施形態において、本発明は、可溶性ＳＦＲＰをコードする核酸、可溶性Ｒｏｒタンパク質をコードする核酸、又は、そのような可溶性タンパク質の断片をコードする核酸を含むポリヌクレオチドを提供する。ある実施形態において、ポリヌクレオチドは、本明細書で記載されるＷｎｔ結合剤のいずれかをコードするポリヌクレオチドを含む。本発明のポリヌクレオチドはＲＮＡの形状、又は、ＤＮＡの形状でありうる。ＤＮＡはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び、合成ＤＮＡを含み、並びに、二本鎖ＤＮＡ、又は、一本鎖ＤＮＡでありうる。一本鎖ＤＮＡの場合、それはコード鎖、又は、非コード鎖（アンチセンス鎖）でありうる。
ある実施形態において、ポリヌクレオチドは単離される。ある実施形態において、ポリヌクレオチドは実質的に純粋である。
本発明は、配列番号：１、配列番号：４５、配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：４８、配列番号：４９、配列番号：５０、配列番号：５１、配列番号：５２、配列番号：５３、配列番号：５４、配列番号：５５、配列番号：６５、配列番号：６６、及び、配列番号：７５の配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを提供する。ある実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号：６７、配列番号：６８、配列番号：６９、配列番号：７０、配列番号：７１、配列番号：７２、配列番号：７３、及び、配列番号：７４からなる群より選択されるポリペプチドシグナル配列をコードするポリヌクレオチドをさらに含む。ある実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号：７０、配列番号：７１、配列番号：７２、配列番号：７３、及び、配列番号：７４からなる群より選択されるポリペプチドシグナル配列をコードするポリヌクレオチドをさらに含む。ある実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号：７１、及び、配列番号：５０の配列を持つポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。ある実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号：７１、及び、配列番号：５３の配列を持つポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。ある実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号：７５の配列を持つポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。本発明は、配列番号：２の配列を含むポリヌクレオチドをさらに提供する。
本発明は、配列番号：７１、配列番号：７０、配列番号：７２、配列番号：７３、及び、配列番号：７４からなる群より選択されるシグナル配列、ヒトＦＺＤ８のＦｒｉドメイン、及び、ヒトＦｃ領域を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを提供する。ある実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号：７１のシグナル配列、ヒトＦＺＤ８のＦｒｉドメイン、及び、ヒトＦｃ領域を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
配列番号：２の配列を持つポリヌクレオチドに対して、及び／又は、配列番号：１、配列番号：４５、配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：４８、配列番号：４９、配列番号：５０、配列番号：５１、配列番号：５２、配列番号：５３、配列番号：５４、配列番号：５５、配列番号：６５、配列番号：６６、及び、配列番号：７５の配列を持つポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対してハイブリダイズするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドがまた提供される。ある実施形態において、ハイブリダイゼーションは高ストリンジェントな条件下である。
ある実施形態において、ポリヌクレオチドは、例えば、発現とポリペプチドの宿主細胞からの分泌を助けるポリヌクレオチド（例えば、細胞からのポリペプチドの輸送を制御する分泌配列として機能するリーダー配列、又は、シグナル配列）に同じ読み枠で結合した、成熟したポリペプチドのコーディング配列を含む。リーダー配列を持つポリペプチドはタンパク質前駆体であり、ポリペプチドの成熟体を形成するために、宿主細胞にリーダー配列を切断させることができる。ポリヌクレオチドはまた成熟タンパク質に５アミノ酸残基が付加したタンパク質前駆体をコードすることができる。プロ配列を持つ成熟タンパク質はタンパク質前駆体であり、タンパク質の不活性型である。プロ配列がいったん切断されると、活性型成熟タンパク質があとに残る。
ある実施形態において、ポリヌクレオチドは、例えば、コードされるポリペプチドの精製を可能にするマーカー配列に同じ読み枠で結合した成熟したポリペプチドのコーディング配列を含む。例えば、細菌性宿主の場合、マーカー配列は、マーカーに結合した成熟ポリペプチドの精製をもたらすｐＱＥ−９ベクターによって供給されるヘキサヒスチジンタグでありうる。又は、哺乳類動物の宿主（例えば、ＣＯＳ−７細胞）が用いられるとき、マーカー配列はインフルエンザ・ヘマグルチニンタンパク質に由来するヘマグルチニン（ＨＡ）タグでありうる。
本発明は、例えば、断片、類似体、及び、派生物をコードする上述のポリヌクレオチドの変異体にさらに関係する。本発明のポリヌクレオチドの断片又は部分は、本発明の完全長のポリペプチドを合成するために使用されうる。
ある実施形態において、本発明は、可溶性ＦＺＤ受容体、又は、本発明で記載されるその他のＷｎｔ結合剤を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチドを提供し、ある実施形態においては、少なくとも９６％、９７％、９８％、又は、９９％同一であるヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。
基準ヌクレオチド配列に、例えば、少なくとも９５％「同一」であるヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドによって、基準ヌクレオチド配列の１００ヌクレオチド毎に５点突然変異までをポリヌクレオチド配列が含むことができるということを除けば、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は基準配列と同一であるということが言える。換言すると、基準ヌクレオチド配列に少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドを得るために、基準ヌクレオチド配列のヌクレオチドの５％までは欠質されてよく、若しくは、別のヌクレオチドと置換されてよく、又は、基準ヌクレオチド配列の総ヌクレオチドの５％までの数のヌクレオチドが基準ヌクレオチド配列に挿入されてよい。基準配列のこれらの変異は基準ヌクレオチド配列のアミノ末端部位、又は、カルボキシ末端部位、又は、これらの末端部位の間のどこにでも起きてよく、基準配列のヌクレオチドの間に個々に点在していても、基準配列内で１つ以上の連続した群で点在していてもよい。
ポリヌクレオチド変異体はコーディング領域、非コーディング領域、又は、その両方に変化を含むことができる。ある実施形態において、ポリヌクレオチド変異体は無変化のアミノ酸置換、付加、又は、欠質を作り出すが、コードされるポリペプチドの性質、又は、活性を変えない変化を含む。ある実施形態において、ポリヌクレオチド変異体は、アミノ酸配列は変えられていないが、発現の差異（例えば、発現上昇、又は、発現低下）が生じることとなるヌクレオチド配列を含む。例えば、特定の宿主でのコドン発現を最適化するために（ヒトｍＲＮＡのコドンを大腸菌のような細菌性宿主に好ましいコドンに変えるため）、様々な理由のため、ポリヌクレオチド変異体が作成されうる。
本明細書で記載されるポリヌクレオチドは、当該技術分野で既知の任意の適切な方法によっても産生されうる。本明細書で述べられるように、ある実施形態において、ＤＮＡ配列は組換えテクノロジーを用い、目的の野生型タンパク質をコードするＤＮＡ配列を単離、又は、合成することにより構築される。ある実施形態において、ＤＮＡ配列は、組換えテクノロジーを用い、目的の２つのポリペプチドをコードする１つ以上のＤＮＡ配列を単離し、そして、融合タンパク質を作成するためにこれらのＤＮＡ配列を１つに連結することにより構築される。
ある実施形態において、ＤＮＡ配列はオリゴヌクレオチド合成機を用いた化学合成により構築されうる。そのようなオリゴヌクレオチドは望みのポリペプチドのアミノ酸配列に基づいてデザインされうる。標準的な方法が、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成するために応用されうる。例えば、完全なアミノ酸配列が、ヌクレオチドへと逆に訳された遺伝子を構築するために使用されうる。さらに、特定のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡオリゴマーが合成されうる。例えば、望みのポリペプチドの部分をコードするいくつかの小さなオリゴヌクレオチドが合成され、そして次に、連結されうる。前記の個々のオリゴヌクレオチドは相補的集合のため５' 突出部分、又は、３'突出部分を典型的に含む。ある実施形態において、前記の望みの融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、介在性ペプチドリンカーなしで直接的に２つのポリペプチドが連結するように合成される。
いったん、（合成、部位特異的変異誘発、組換え技術、又は、別の方法により）組み立てられると、目的の特定のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は発現ベクターに挿入され、望みの宿主でのポリペプチドの発現に適切な発現制御配列に機能的に連結されうる。ヌクレオチドシークエンシング、制限マッピング、及び／又は、適切な宿主での生物学的に活性のあるポリペプチドの発現により、組み立てが適切であったか確認されうる。本分野で周知であるように、宿主における形質移入した遺伝子の高レベルの発現を得るために、遺伝子は、選んだ発現宿主で働く転写発現制御配列、及び、翻訳発現制御配列に機能的に連結されねばならない。
本明細書において記載されるポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。ベクター、又は、本明細書において記載されるポリヌクレオチドを含む細胞がまた提供される。
ＩＶ．医薬組成物
本発明は、１つ以上のＷｎｔタンパク質に結合する、及び／又は、Ｗｎｔアンタゴニストである薬剤（例えば、可溶性ＦＺＤ受容体）を含む医薬組成物を提供する。ある実施形態において、医薬組成物はＷｎｔ結合剤、及び、本明細書において記載されるポリペプチドを含む。ヒトの患者での腫瘍細胞成長の抑制、及び、癌の治療でのこれらの医薬組成物の使用が見られる。ある実施形態において、癌の治療のための薬剤の製造において、本明細書において記載されるＷｎｔ結合剤の使用が見られる。
本発明の精製された薬剤、又は、アンタゴニストを薬学的に許容される担体、賦形剤、及び／又は、安定化剤と組み合わせ、無菌的な凍結乾燥粉薬、又は、水溶液として保存し、使用する為の製剤が調製される（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ， ２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， ２００５）。適切な担体、賦形剤、及び／又は、安定化剤は、リン酸、クエン酸、及び、その他の有機酸のような無毒の緩衝液、塩化ナトリウムのような塩、アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤、保存剤（例えば、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノールアルコール、ブチルアルコール、若しくは、ベンジルアルコール、メチルパラベン、若しくは、プロピルパラベンのようなアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール、及び、ｍ−クレゾール）、（約１０アミノ酸残基以下のような）低分子量ポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン、又は、免疫グロブリンのようなタンパク質、ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又は、リシンのようなアミノ酸、単糖類、二糖類、グルコース、マンノース、又は、デキストランのような炭水化物、ＥＤＴＡのようなキレート剤、ショ糖、マンニトール、トレハロース、又は、ソルビトールのような糖類、ナトリウムの様な対イオン、金属錯体（例えば、亜鉛タンパク質錯体）、及び／又は、ＴＷＥＥＮ、若しくは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような非イオン性界面活性剤を含む。
本発明の医薬組成物は、局所的処置、又は、全身的処置のどちらかで、いずれかの方法によっても投与されうる。投薬は、経皮パッチ、軟膏、外用水薬、クリーム剤、ゲル剤、滴剤、座剤、スプレー剤、液剤、及び、粉剤のような（膣直腸内投与を含む粘膜への）局所的投薬でありうるし、（例えば、噴霧器によるものを含む、粉剤、又は、エアロゾル剤の吸入法による、又は、吹送法による、気管支内、鼻腔内、表皮性、及び、経皮性のような）肺性投薬でありうるし、経口投薬でありうるし、又は、静脈内注射、若しくは、点滴、動脈内注射、若しくは、点滴、皮下注射、若しくは、点滴、腹腔内注射、若しくは、点滴、筋肉内注射、若しくは、点滴を含む非経口投薬でありうるし、又は、頭蓋内（例えば、髄腔内、又は、脳室内）投薬でありうる。
治療的製剤は単位剤形をとる。そのような製剤は、経口投薬、非経口投薬、又は、直腸内投薬のため、又は、吸入による投薬のため、錠剤、丸剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤、水、若しくは、非水系溶媒内の溶液、若しくは、懸濁液、又は、座剤を含む。錠剤の様な固形組成物において、前記の主要な活性成分は薬学的担体と混合される。従来の錠剤化成分は、コーンスターチ、乳糖、ショ糖、ソルビトール、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、リン酸二カルシウム、若しくは、ゴム類、及び、本発明の化合物、若しくは、無毒性の薬学的に許容されるその塩の均一な混合物を含む固形前製剤組成物を形成するためのその他の希釈剤（例えば、水）を含む。固形前製剤組成物はそれから、上述した種類の単位剤形に細分化される。新規組成物の錠剤、及び、丸剤などは、長期にわたり作用できるような剤形を提供する為に、被覆されるか、又はそうでなければ、調合されうる。例えば、前記の錠剤、又は、丸剤は外側の構成要素で覆われた内部組成物を含むことができる。さらに、前記の２つの要素は、製剤の崩壊に抗し、内部組成物が完全なまま胃を通過することを可能にする、若しくは、内部組成物の放出が遅れることを可能にするように働く腸溶層で分けられうる。様々な高分子酸、及び、高分子酸のシェラック、セチルアルコール、酢酸セルロースのような物質との混合物を含む様々な物質がそのような腸溶層、又は、コーティング剤に用いられうる。
治療製剤は、リポソーム（Ｅｐｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９８５， ＰＮＡＳ， ８２：３６８８、Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９８０， ＰＮＡＳ， ７７：４０３０、並びに、米国特許第４，４８５，０４５号、及び、米国特許第４，５４４，５４５号）と複合体化された本発明のアンタゴニスト（例えば、Ｗｎｔ結合剤）を含む。循環時間が向上したリポソームは米国特許第５，０１３，５５６号で開示される。リポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、及び、ＰＥＧ−誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いた逆相蒸発法により作製されうる。リポソームは、孔径が限定されたフィルターを通して押し出され、望みの直径を持つリポソームを生じる。
前記アンタゴニスト（例えば、Ｗｎｔ結合剤）はまたマイクロカプセルに封入されうる。そのようなマイクロカプセルは、コロイド薬物輸送システム（例えば、リポソーム法、アルブミン微小球法、ミクロエマルジョン法、ナノ粒子法、及び、ナノカプセル法）、又は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ， ２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， ２００５に記載されるようなマクロエマルジョン法において、コアセルベート法（例えば、ヒドロキシメチルセルロース）、又は、界面重合法（例えば、ゼラチンマイクロカプセル、及び、ポリ（メチルメタシレート）マイクロカプセル）により調製される。
さらに、徐放性製剤が調製されうる。徐放性製剤の適切な例として、造形品の形状をとる、薬剤を含む固形疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられる。徐放性製剤の例は、ポリエステル類、ポリ（メタクリル酸２−ヒドロキシエチル）、若しくは、ポリビニルアルコールのようなヒドロゲル類、ポリ乳酸類（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とＬ−グルタミン酸−７エチルの共重合体、非分解性エチレン酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸グリコール酸共重合体と酢酸リュープロリドからなる注射用微小球）のような分解性乳酸グリコール酸共重合体、ショ糖酢酸イソ酪酸エステル、及び、ポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸を含む。
Ｖ．使用法
本発明の（可溶性受容体を含む）Ｗｎｔ結合剤は、これらに限定されないが、癌の治療のような治療法を含む様々な用途で有効である。ある実施形態において、薬剤はＷｎｔシグナル伝達（例えば、標準的Ｗｎｔシグナル伝達）の抑制、腫瘍成長の抑制、分化の誘導、腫瘍容量の減少、癌幹細胞頻度の低下、及び／又は、腫瘍の腫瘍原性の低下に有効である。使用法は、インビトロ法、エクスビボ法、インビボ法でありうる。ある実施形態において、Ｗｎｔ結合剤、又は、ポリペプチドは、それが結合する１つ以上のヒトＷｎｔタンパク質のアンタゴニストである。
ある実施形態において、Ｗｎｔ結合剤、又は、アンタゴニストはＷｎｔシグナル伝達活性化に関連する疾病の治療に使用される。特定の実施形態において、疾病はＷｎｔシグナル伝達に依存的な疾病である。特定の実施形態において、Ｗｎｔシグナル伝達は標準的Ｗｎｔシグナル伝達である。ある実施形態において、Ｗｎｔ結合剤、又は、アンタゴニストは、幹細胞、及び／又は、前駆細胞のレベルの増加で特徴づけられる疾患の治療に用いられる。
ある実施形態において、Ｗｎｔ結合剤、又は、アンタゴニスト（例えば、可溶性ＦＺＤ受容体、ＳＦＲＰ由来タンパク質、又は、可溶性Ｒｏｒ受容体）によって治療される疾病は癌である。ある実施形態において、癌は、Ｗｎｔ結合剤（例えば、可溶性受容体）と結合する１つ以上のＷｎｔを発現する腫瘍によって特徴づけられる。
ある実施形態において、Ｗｎｔ結合剤、又は、アンタゴニストによって治療される疾病は癌ではない。例えば、疾病は肥満、又は、糖尿病（例えば、タイプＩＩ糖尿病）のような代謝性疾患でありうる（Ｊｉｎ Ｔ．， ２００８， Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ， ５１ ： １７７１−８０）。あるいは、疾病は骨粗鬆症、骨関節炎、又は、リウマチ性関節炎のような骨疾患でありうる（Ｃｏｒｒ Ｍ．， ２００８， Ｎａｔ． Ｃｌｉｎ． Ｐｒａｃｔ． Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．， ４：５５０−６、Ｄａｙ ｅｔ ａｌ．， ２００８， Ｂｏｎｅ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇ． Ａｍ．， ９０ Ｓｕｐｐｌ １ ： １９−２４）。疾病は多発性嚢胞腎疾患のような腎疾患でもありうる（Ｈａｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．， ２００９， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｍｅｄ． ， ６０：３２１−３７、Ｓｃｈｍｉｄｔ−Ｏｔｔ ｅｔ ａｌ．， ２００８， Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．， ７４： １００４−８、Ｂｅｎｚｍｇ ｅｔ ａｌ．， ２００７， Ｊ． Ａｍ． Ｓｏｃ． Ｎｅｐｈｒｏｌ ， １８： １３８９−９８）。Ｗｎｔ結合剤（例えば、可溶性受容体）と結合する１つ以上のＷｎｔを発現する腫瘍によって特徴づけられる。あるいは、これらに限定されないが、黄斑変性、及び、家族性滲出性硝子体網膜症を含む眼疾患が治療されうる（Ｌａｄ ｅｔ ａｌ．， ２００９， Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｄｅｖ．， １８：７−１６）。心筋梗塞、アテローム性動脈硬化症、及び、弁疾患を含む循環器系疾患もまた治療されうる（Ａｌ−Ａｌｙ Ｚ．， ２００８， Ｔｒａｎｓｌ． Ｒｅｓ．， １５１ ：２３３−９、Ｋｏｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， ２００９， Ｎａｔ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， １１ ：４６−５５、ｖａｎ Ｇｉｊｎ ｅｔ ａｌ．， ２００２， Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ． Ｒｅｓ．， ５５： １６−２４、Ｃｈｎｓｔｍａｎ ｅｔ ａｌ， ２００８， Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ． Ｐｈｙｓｉｏｌ， ２９４：Ｈ２８６４−７０）。ある実施形態において、疾病は特発性肺動脈高血圧症、又は、肺線維症のような肺疾患である（Ｌａｕｍａｎｎｓ ｅｔ ａｌ．， ２００８， Ａｍ． Ｊ． Ｒｅｓｐｉｒ． Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ， ２００９， ４０：６８３−９１、Ｋｏｎｉｇｓｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．， ２００８ ＰＬｏＳ ＯＮＥ， ３：ｅ２１４２）。ある実施形態において、Ｗｎｔ結合剤によって治療される疾病は肝硬変、又は、肝線維症のような肝臓疾患である（Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２００８， Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ． Ｌｉｖｅｒ Ｐｈｙｓｉｏｌ， ２９４：Ｇ３９−４９）。
本発明は、治療上有効量のＷｎｔ結合剤を対象（例えば、治療が必要な対象）に投与することを含む癌治療方法を提供する。ある実施形態において、癌は、直腸結腸癌、膵臓癌、肺癌、卵巣癌、肝癌、乳癌、腎臓癌、前立腺癌、胃腸癌、黒色腫、子宮頸癌、膀胱癌、神経膠芽腫、及び、頭頸部癌からなる群より選択される癌である。ある実施形態において、癌は、膵臓癌である。ある実施形態において、癌は、直腸結腸癌である。ある実施形態において、癌は、乳癌である。ある実施形態において、対象はヒトである。
本発明は、本明細書で述べるＷｎｔ結合剤を使用して腫瘍の成長を抑制する方法を提供する。ある実施形態において、腫瘍の成長を抑制する方法は腫瘍、又は、腫瘍細胞をＷｎｔ結合剤とインビトロで接触させることを含む。例えば、標的Ｗｎｔを発現する不死化細胞系列、又は、癌細胞系列は、腫瘍細胞の成長を抑制するため、Ｗｎｔ結合剤が添加された培地で培養される。ある実施形態において、腫瘍細胞は、例えば、生体組織検査材料、胸水、又は、血液試料のような患者の試料から単離され、腫瘍細胞の成長を抑制するため、Ｗｎｔ結合剤が添加された培地で培養される。
ある実施形態において、腫瘍の成長を抑制する方法は腫瘍、又は、腫瘍細胞をＷｎｔ結合剤（例えば、可溶性ＦＺＤ受容体）とインビボで接触させることを含む。ある実施形態において、腫瘍、又は、腫瘍細胞をＷｎｔ結合剤とインビボで接触させることは、動物モデルで着手される。例えば、Ｗｎｔ結合剤は、腫瘍の成長を抑制するために、免疫不全マウス（例えば、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス）で成長した１つ以上のＷｎｔを発現する異種移植組織に投与されうる。ある実施形態において、癌幹細胞は、例えば、生体組織検査材料、胸水、又は、血液試料のような患者の試料から単離され、免疫不全マウスに注入され、そのあとで、腫瘍細胞の成長を抑制するためにそのマウスにＷｎｔ結合剤が投与される。ある実施形態において、Ｗｎｔ結合剤は、腫瘍細胞の成長を抑制するために、動物への腫瘍原性細胞の導入と同時に、又は、少し後で投与される。ある実施形態において、腫瘍原性細胞がある特定のサイズの腫瘍に成長した後に、Ｗｎｔ結合剤が治療薬として投与される。
ある実施形態において、腫瘍の成長を抑制する方法は対象に治療上有効量のＷｎｔ結合剤を投与することを含む。ある実施形態において、対象はヒトである。ある実施形態において、対象は腫瘍を持つ、又は、腫瘍を除去した。
本発明はまた、対象に治療上有効量のＷｎｔ結合剤を投与することを含む方法である、癌幹細胞を含む腫瘍内の癌幹細胞の頻度を減少させる方法を提供する。さらに、対象に治療上有効量のＷｎｔ結合剤を投与することを含む方法である、対象において腫瘍細胞の分化を誘導する方法を提供する。ある実施形態において、腫瘍において分化マーカーの発現を誘導する方法は対象に治療上有効量のＷｎｔ結合剤を投与することを含む。ある実施形態において、対象はヒトである。
ある実施形態において、腫瘍は、Ｗｎｔシグナル伝達が活発である腫瘍である。ある実施形態において、活発であるＷｎｔシグナル伝達は標準的Ｗｎｔシグナル伝達である。ある実施形態において、腫瘍は、Ｗｎｔ依存的腫瘍である。例えば、ある実施形態において、腫瘍はＡｘｉｎの過剰発現に感受性である。ある実施形態において、腫瘍は大腸腺腫性ポリポーシス（ＡＰＣ）腫瘍抑制遺伝子内の不活性化変異（例えば、短縮型変異）、又は、β−カテニン遺伝子内の活性化変異を含まない。ある実施形態において、腫瘍はＷｎｔ遺伝子サインにおいて１つ以上の遺伝子を発現する。ある実施形態において、対象が治療を受けるその癌はそのような腫瘍を含む。
ある実施形態において、腫瘍は、Ｗｎｔ結合剤が結合する１つ以上のヒトＷｎｔタンパク質を発現する。ある実施形態において、腫瘍はヒトＷｎｔを過剰発現する。
ある実施形態において、腫瘍は、直腸結腸腫瘍、膵臓腫瘍、肺腫瘍、卵巣腫瘍、肝臓腫瘍、乳腺腫瘍、腎臓腫瘍、前立腺腫瘍、胃腸腫瘍、黒色腫、子宮頸部腫瘍、膀胱腫瘍、神経膠芽腫、及び、頭頸部腫瘍からなる群より選択される腫瘍である。ある実施形態において、腫瘍は、直腸結腸腫瘍である。ある実施形態において、腫瘍は、膵臓腫瘍である。ある実施形態において、腫瘍は、乳腺腫瘍である。
本発明はまた、治療上有効量のＷｎｔ結合剤を細胞と接触させることを含む細胞内のＷｎｔシグナル伝達を抑制する方法を提供する。ある実施形態において、細胞は腫瘍細胞である。ある実施形態において、方法は、細胞を薬剤と接触させる工程が治療上有効量の薬剤を対象に投与することを含むインビボ法である。ある別の実施形態において、方法はインビトロ法、又は、エクスビボ法である。ある実施形態において、抑制されるＷｎｔシグナル伝達は標準的Ｗｎｔシグナル伝達である。ある実施形態において、Ｗｎｔシグナル伝達は、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ３ｂ、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、及び／又は、Ｗｎｔ１０ｂによるシグナル伝達である。ある実施形態において、Ｗｎｔシグナル伝達は、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ７ｂ、及び／又は、Ｗｎｔ１０ｂによるシグナル伝達である。
さらに、本発明は、対象に治療上有効量のＷｎｔ結合剤を投与することを含む、対象において腫瘍の腫瘍原性を低下させる方法を提供する。ある実施形態において、腫瘍は癌幹細胞を含む。ある実施形態において、腫瘍の腫瘍原性は腫瘍内の癌幹細胞の頻度を減少させることにより低下する。ある実施形態において、腫瘍における癌幹細胞の頻度はＷｎｔ結合剤の投与によって減少する。ある実施形態において、薬剤、又は、抗体は、マウス異種移植片モデルのような動物モデルにおいて癌幹細胞を含む腫瘍の腫瘍原性を低下させることができる。ある実施形態において、腫瘍における癌幹細胞の数、又は、頻度は少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、又は、少なくとも約１０００倍に減少する。ある実施形態において、癌幹細胞の数、又は、頻度の減少は動物モデルを用いた限界希釈法により決定される。腫瘍における癌幹細胞の数、又は、頻度の減少を決定する限界希釈法の使用に関する追加的な例、及び、指針は、例えば、国際公開第２００８／０４２２３６号、米国特許出願第２００８／００６４０４９号、及び、米国特許出願第２００８／０１７８３０５号に見つけ出されうる。これらの各文献の全体を参照により本明細書に組み込まれる。
従って、本発明はまた、腫瘍を有効量のＷｎｔ結合剤（例えば、可溶性ＦＺＤ受容体、可溶性Ｒｏｒ受容体、又は、ＳＦＲＰ−Ｆｃ融合タンパク質）と接触させることを含む方法である癌幹細胞を含む腫瘍内の癌幹細胞の頻度を減少させる方法を提供する。
本発明はさらに、腫瘍原性細胞をＷｎｔ結合剤と接触させることを含む、（例えば、腫瘍原性細胞を含む腫瘍を持つ対象、又は、そのような腫瘍を除去した対象にＷｎｔ結合剤を投与することにより、）腫瘍原性細胞を非腫瘍原性細胞へ分化させる方法を提供する。ある実施形態において、腫瘍原性細胞は膵臓腫瘍細胞である。ある別の実施形態において、腫瘍原性細胞は大腸癌細胞である。
本明細書で記載されるＷｎｔ結合剤の、これらに限定されないが、腫瘍細胞を含む細胞の分化を誘導するための使用もまた提供される。例えば、本明細書で記載される、有効量のＷｎｔ結合剤（例えば、可溶性ＦＺＤ受容体、可溶性Ｒｏｒ受容体、又は、ＳＦＲＰ−Ｆｃ融合タンパク質）と接触させることを含む細胞の分化を誘導する方法が考えられる。治療上有効量のＷｎｔ結合剤を対象に投与することを含む対象における腫瘍中の細胞が分化するように誘導する方法がまた提供される。ある実施形態において、腫瘍は膵臓腫瘍である。ある別の実施形態において、腫瘍は大腸腫瘍である。
Ｗｎｔシグナル伝達活性化に関連し、並びに／又は、幹細胞、及び／若しくは、前駆細胞レベルの増加で特徴づけられる疾病、又は、疾患を治療する方法がさらに提供される。ある実施形態において、治療法は治療上有効量のＷｎｔ結合剤を対象に投与することを含む。ある実施形態において、Ｗｎｔシグナル伝達は標準的Ｗｎｔシグナル伝達である。
Ｗｎｔ結合剤、又は、アンタゴニストは適切な医薬組成物として公知の方法にしたがってヒトの患者に投与される。投薬の適切な方法は、これらに限定されないが、経静脈投与経路、筋肉内投与経路、腹腔内投与経路、脳脊髄内投与経路、皮下投与経路、関節内投与経路、関節滑液嚢内投与経路、髄腔内投与経路、経口投与経路、局所的投与経路、又は、吸入投与経路を含む。
ある実施形態において、Ｗｎｔ結合剤の投与に加えて、方法、又は、治療は、Ｗｎｔ結合剤の投与の前、Ｗｎｔ結合剤と同時に、及び／又は、Ｗｎｔ結合剤のあとに第２の治療剤（例えば、抗癌剤）を投与することをさらに含む。Ｗｎｔ結合剤、及び、第２治療剤を含む医薬組成物がまた提供される。
Ｗｎｔ結合剤、及び、第２治療剤の組み合わせはどのような順序で投与されてよい、又は、同時に投与されてよいと理解されるであろう。選択された実施形態において、前記の第２治療剤で以前治療を受けた患者にＷｎｔ結合剤が投与されるであろう。ある別の実施形態において、前記のＷｎｔ結合剤と第２治療剤は実質的に同時に、又は、同時に投与されるであろう。例えば、前記の第２治療剤での一連の治療（例えば、化学療法）を受けている間、対象は前記のＷｎｔ結合剤を与えられてよい。ある実施形態において、前記Ｗｎｔ結合剤は第２治療剤を用いた治療の１年以内に投与されるであろう。ある別の実施形態において、前記Ｗｎｔ結合剤は第２治療剤を用いた任意の治療の１０か月以内、８か月以内、６か月以内、４か月以内、又は、２か月以内に投与されるであろう。ある別の実施形態において、前記Ｗｎｔ結合剤は第２治療剤を用いた治療の４週間以内、３週間以内、２週間以内、又は、１週間以内に投与されるであろう。ある実施形態において、前記Ｗｎｔ結合剤は第２治療剤を用いた任意の治療の５日以内、４日以内、３日以内、２日以内、又は、１日以内に投与されるであろう。前記の２つの治療剤、又は、治療は数時間、又は、数分（すなわち、実質的に同時に）対象に施されてもよいとさらに理解されるであろう。
少なくとも２つの治療剤を用いる併用療法は、しばしば、異なる作用機序により働く薬剤を用いるが、これは必須ではない。異なる作用機序により働く薬剤を用いる併用療法は、相加効果、又は、相乗効果という結果になりうる。併用療法では、各薬剤について単剤療法で用いられる用量よりも低用量の薬剤が許容され、それによって、毒性副作用を減ずることができる。併用療法は、耐性癌細胞が発生するであろう可能性を減ずることができる。ある実施形態において、併用療法は非腫瘍原性細胞に作用する（例えば、抑制する、又は、殺す）治療剤、及び、腫瘍原性ＣＳＣ（癌幹細胞）に作用する（例えば、抑制する、又は、殺す）治療剤を含む。
有効な治療剤（例えば、抗癌剤）の種類は、例えば、抗チューブリン剤、オーリスタチン類、ＤＮＡ小溝結合剤類、ＤＮＡ複製阻害剤類、アルキル化剤類（例えば、シスプラチン、モノ（プラチナ）複合体、ビス（プラチナ）複合体、及び、三核プラチナ複合体、並びに、カルボプラチンのようなプラチナ複合体）、アントラサイクリン類、抗生物質、抗葉酸剤類、抗代謝剤類、化学療法増感剤類、デュオカルマイシン類、エトポシド類、フッ化ピリミジン類、イオノフォア類、 レキシトロプシン類、ニトロソウレア類、プラティノール類、実行化合物（ｐｅｒｆｏｒｍｉｎｇ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）、プリン抗代謝剤、ピューロマイシン類、放射線増感剤類、ステロイド類、タキサン類、トポイソメラーゼ阻害剤類、ビンカアルカロイド類などを含む。ある実施形態において、前記第２治療剤は抗代謝剤、抗有糸分裂剤、トポイソメラーゼ阻害剤、又は、血管新生阻害剤である。
前記Ｗｎｔ結合剤との組み合わせで投与されうる治療剤は化学療法剤を含む。したがって、ある実施形態において、前記の方法、又は、治療は本発明のＷｎｔ結合剤及び一種類の化学療法剤、若しくは、多種類の化学療法剤の混合物との併用投与を含む。Ｗｎｔ結合剤を用いる治療は、化学療法剤の投与前、化学療法剤の投与と同時に、及び／又は、化学療法剤の投与のあとに行われうる。本発明によって考慮される化学療法剤は、ゲムシタビン、イリノテカン、ドキソルビシン、５−フルオロウラシル、シトシンアラビノシド（Ａｒａ−Ｃ）、シクロホスファミド、チオテパ、ブスルファン、シトキサン、パクリタキセル、メトトレキサート、シスプラチン、メルファラン、ビンブラスチン、及び、カルボプラチンのような本分野において公知で市販の化学物質、又は、薬物を含む。併用投与は、単一医薬製剤での、若しくは、別々の製剤を用いた同時投与、又は、どちらかの順番で、しかし、一般に、すべての活性薬剤がその生物学的活性を同時に及ぼすことができるような時間内に投与される連続投与を含みうる。そのような化学療法の製剤と投与計画は、製造業者の説明書にしたがって用いられうるし、又は、当業者によって経験的に決定されうる。そのような化学療法の製剤と投与計画はまた、Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｅｄ．， Ｍ． Ｃ． Ｐｅｒｒｙ， Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ， Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ， Ｍｄ．（１９９２）において説明される。
本発明において有効な化学療法剤はまた、これらに限定されないが、チオテパ、及び、シクロホスファミドのようなアルキル化剤類、ブスルファン、イムプロスルファン、及び、ピポスルファンのようなスルホン酸アルキル類、ベンゾドパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン、メツレドパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）、及び、ウレドパ（ｕｒｅｄｏｐａ）のようなアジリジン類、アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド（ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈａｏｒａｍｉｄｅ）、及び、トリメチルロロメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｍｅ）を含むエチレンイミン類、及び、メチラメラミン類（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅｓ）、クロラムブチル、クロルナファジン、コロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベムビチン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン、プレドニムスチン、トロフォスファミド、ウラシルマスタードのようなナイトロジェンマスタード類、カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンのようなニトロソウレア類、アクラシノマイシン類、アクチノマイシン、オートラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリケアマイシン、カラビシン、カミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン類、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン類、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン類、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、ケラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメックス、ジノスタチン、ゾルビシンのような抗生物質、メトトレキサート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）のような抗代謝剤類、デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートのような葉酸類似体、フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンのようなプリン類似体、アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルウリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、５−ＦＵのようなピリミジン類似体、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンのようなアンドロゲン類、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンのような抗副腎剤類、フォリン酸のような葉酸補液、アセグラトン、アルドホスファミドグリコシド、アミノレブリン酸、アムサクリン、ベストラブシル、ビサントレン、エダトラキサート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）、デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）、デメコルシン、ジアジコン、エルフォルミチン（ｅｌｆｏｒｍｉｔｈｉｎｅ）、酢酸エリプチニウム、エトグルシド、硝酸ガリウム、ハイドロキシウレア、レンチナン、ロニダミン、ミトグアゾン、ミトキサントロン、モピダモール、ニトラクリン、ペントスタチン、フェナメト（ｐｈｅｎａｍｅｔ）、ピラルビシン、ポドフィリン酸、２−エチルヒドラジン、プロカルバジン、クレスチン（ＰＳＫ）、ラゾキサン、シゾフラン（ｓｉｚｏｆｕｒａｎ）、スピロゲルマニウム、テヌアゾン酸、トリアジコン、２，２'，２''−トリクロロトリエチルアミン、ウレタン、ビンデシン、ダカルバジン、マンノムスチン、ミトブロニトール、ミトラクトール、ピポブロマン、ガシトシン、アラビノシド（Ａｒａ−Ｃ）シクロホスファミド、チオテパ、例えば、パクリタキセルクロラムブシル（ＴＡＸＯＬ）やドセタキセルクロラムブシル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ）のタキソイド類、ゲムシタビン、６−チオグアニン、メルカプトプリン、メトトレキサート、シスプラチンやカルボプラチンのようなプラチナ類似体、ビンブラスチン、プラチナ、エトポシド（ＶＰ−１６）、イホスアミド、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、ビンクリスチン、ビノレルビン、ナベルビン、ノバントロン、テニポシド、ダウノマイシン、アミノプテリン、ゼローダ、イバンドロネート、カンプトテシン１１（ＣＰＴ１１）、トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００、ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）、レチノイン酸、エスペラマイシン類、カペシタビン、及び、上述した物質のいずれかの薬学的に許容できる塩、酸、又は、誘導体を含む。化学療法剤はまた、例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害４（５）−イミダゾール類、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、及び、トレミフェンを含む抗エストロゲン剤類、並びに、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、及び、ゴセレリンのような抗アンドロゲン剤類、並びに、上述の物質のいずれかの薬学的に許容できる塩、酸、又は、誘導体のような、ホルモンの腫瘍への作用を制御、又は、抑制するように働く抗ホルモン剤類を含む。
ある実施形態において、化学療法剤はトポイソメラーゼ阻害剤である。トポイソメラーゼ阻害剤はトポイソメラーゼ酵素（例えばトポイソメラーゼＩ、又は、トポイソメラーゼＩＩ）の作用に干渉する化学療法剤である。トポイソメラーゼ阻害剤は、これらに限定されないが、塩酸ドキソルビシン、クエン酸ダウノルビシン、塩酸ミトキサントロン、アクチノマイシンＤ、エトポシド、塩酸トポテカン、テニポシド（ＶＭ−２６）、及び、イリノテカンを含む。ある実施形態において、第２化学療法剤はイリノテカンである。ある実施形態において、治療される腫瘍は直腸結腸腫瘍であり、第２化学療法剤はトポイソメラーゼ阻害剤である。ある実施形態において、前記のＷｎｔ結合剤は配列番号：５３を含み、第２化学療法剤はイリノテカンである。ある実施形態において、前記のＷｎｔ結合剤は配列番号：７５を含み、第２化学療法剤はイリノテカンである。
ある実施形態において、前記の化学療法剤は抗代謝剤である。抗代謝剤は、正常な生化学的反応に必要な代謝物に類似しているが、細胞分裂の様な細胞の１つ以上の機能に干渉するほど充分に異なる化学物質である。抗代謝剤は、これらに限定されないが、ゲムシタビン、フルオロウラシル、カペシタビン、メトトレキサートナトリウム、ラリトレキセド、ペメトレキセド、テガフール、シトシンアラブモシド、チオグアニン、５−アザシチジン、６−メルカプトプリン、アザチオプリン、６−チオグアニン、ペントスタチン、リン酸フルダラビン、及び、クラドリビン、並びに、これらの物質のいずれかの薬学的に許容できる塩、酸、又は、誘導体を含む。ある実施形態において、前記の第２化学療法剤はゲムシタビンである。ある実施形態において、治療される腫瘍は膵臓腫瘍であり、第２化学療法剤は抗代謝剤（例えば、ゲムシタビン）である。ある実施形態において、前記のＷｎｔ結合剤は配列番号：５３を含み、第２化学療法剤はゲムシタビンである。ある実施形態において、前記のＷｎｔ結合剤は配列番号：７５を含み、第２化学療法剤はイリノテカンである。
ある実施形態において、前記の化学療法剤は、これらに限定されないが、チューブリンに結合する薬剤を含む抗有糸分裂剤である。非限定的な例として挙げると、薬剤はタキサンを含む。ある実施形態において、薬剤はパクリタキセル、若しくは、ドセタキセル、又は、パクリタキセル、若しくは、ドセタキセルの薬学的に許容できる塩、酸、若しくは、誘導体を含む。ある実施形態において、薬剤はパクリタキセル（ＴＡＸＯＬ）、又は、ドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ）、アルブミン結合パクリタキセル（ＡＢＲＡＸＡＮＥ）、ＤＨＡ−パクリタキセル、又は、ＰＧ−パクリタキセルである。ある実施形態において、抗有糸分裂剤は、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、若しくは、ビンデシン、又は、それらの薬学的に許容できる塩、酸、若しくは、誘導体のようなビンカアルカロイドを含む。ある実施形態において、抗有糸分裂剤は、Ｅｇ５キネシンの阻害剤、又は、Ａｕｒｏｒａ Ａ、若しくは、Ｐｌｋ１のような有糸分裂キナーゼの阻害剤である。前記のＷｎｔ結合剤、又は、ポリペプチドと組み合わせて投与される化学療法が抗有糸分裂剤である、ある実施形態において、治療される癌、又は、腫瘍は、乳癌、又は、乳腺腫瘍である。ある実施形態において、治療される腫瘍は乳腺腫瘍であり、第２化学療法剤はパクリタキセルである。ある実施形態において、前記のＷｎｔ結合剤は配列番号：５３を含み、第２化学療法剤はパクリタキセルである。ある実施形態において、前記のＷｎｔ結合剤は配列番号：７５を含み、第２化学療法剤はパクリタキセルである。
ある実施形態において、前記の治療は本発明のＷｎｔ結合剤の投与と放射線療法の併用を含む。前記のＷｎｔ結合剤を用いる治療は、放射線療法の執行前、放射線療法の執行と同時に、及び／又は、放射線療法の執行のあとに行われうる。そのような放射線療法の任意の投与計画も当業者により決定されたように用いられうる。
ある実施形態において、前記の第２化学療法剤は抗体を含む。従って、治療は本発明のＷｎｔ結合剤と、これらに限定されないが、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２、ＨＥＲ２、ＤＬＬ４、Ｎｏｔｃｈ、及び／又は、ＶＥＧＦを含む腫瘍関連抗原に対する抗体の併用投与を含むことができる。抗ＤＬＬ４抗体は、一例であるが、例えば、米国特許第７，７５０，１２４号において説明される。この文献の全体を参照により本明細書に組み込まれる。その他の抗ＤＬＬ４抗体は、例えば、国際公開第２００８／０９１２２２号、国際公開第２００８／０７９３３２６号、米国特許出願公開第２００８／００１４１９６号、米国特許出願公開第２００８／０１７５８４７号、米国特許出願公開第２００８／０１８１８９９号、及び、米国特許出願公開第２００８／０１０７６４８号において説明される。これらの各文献の全体を参照により本明細書に組み込まれる。ある実施形態において、前記の第２化学療法剤は血管新生阻害剤（例えば、抗ＶＥＧＦ抗体）である抗体である。ある実施形態において、前記のＷｎｔ結合剤は配列番号：５３を含み、第２化学療法剤は抗ＶＥＧＦ抗体である。ある実施形態において、前記のＷｎｔ結合剤は配列番号：７５を含み、第２化学療法剤は抗ＶＥＧＦ抗体である。ある実施形態において、前記の第２化学療法剤はＮｏｔｃｈシグナル伝達阻害剤である。ある実施形態において、前記の第２化学療法剤は抗Ｎｏｔｃｈ抗体である。抗Ｎｏｔｃｈ抗体の一例は、例えば、米国特許出願第ＵＳ２００８／０１３１４３４号において説明される。この文献の全体を参照により本明細書に組み込まれる。ある実施形態において、前記の第２化学療法剤はベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ）、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ）、パニツムマブ（ＶＥＣＴＩＢＩＸ）、又は、セツキシマブ（ＥＲＢＩＴＵＸ）である。併用投与は、単一医薬製剤での、若しくは、別々の製剤を用いた同時投与、又は、どちらかの順番で、しかし、一般に、すべての活性薬剤がその生物学的活性を同時に及ぼすことができるような時間内に投与される連続投与を含みうる。
さらに、治療は、異種以上のサイトカイン（例えば、リンホカイン、インターロイキン、腫瘍壊死因子、及び／又は、成長因子）の投与を含むことができ、又は、腫瘍、若しくは、癌細胞の外科的除去、又は、治療にあたる医師によって必要と思われるその他の任意の治療とも併用されうる。
前記の疾病の治療で、本発明の薬剤の適切な用量は、すべて治療にあたる医師の裁量で、治療される疾病の種類、疾病の重症度と経過、疾病の応答性、薬剤が治療目的で投与されるか、又は、予防目的で投与されるかということ、以前の治療内容、患者の病歴などに依存する。薬剤は、１回、若しくは、数日から数か月にわたる一連の治療で、又は、治癒が果たされるまで、若しくは、疾病状態の減退（例えば、腫瘍サイズの減少）が達成されるまで投与されうる。適切な投与計画は、患者の体内における薬物の蓄積を測定することから見積もられることができ、個々の薬剤の相対的な効力に応じて変わるであろう。治療にあたる医師は、適切な用量、投与方法論、繰返し率を容易に決定することができる。ある実施形態において、用量は体重に対し０．０１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇであり、１日１回以上、１週間に１回以上、１か月に１回以上、又は、１年に１回以上与えられうる。ある実施形態において、可溶性受容体、又は、その他のＷｎｔ結合剤の用量は体重に対し０．１ｍｇ／ｋｇから２０ｍｇ／ｋｇである。ある実施形態において、Ｗｎｔ結合剤は２週間毎に１回、又は、３週間毎に１回与えられる。前記の治療に当たる医師は、身体の液体部分、又は、組織内の薬物の滞留時間と濃度の測定値に基づき処方の繰返し率を推定することができる。
本発明は、さらに、Ｗｎｔシグナル伝達の抑制での効能について、抗癌活性について、及び／又は、癌幹細胞に対する活性について薬剤をスクリーニングする方法を提供する。ある実施形態において、方法は、薬剤に曝露された第１の固形腫瘍（例えば、癌幹細胞を含む固形腫瘍）内の１つ以上の分化マーカー、及び／又は、１つ以上の幹細胞性マーカーのレベルを薬剤に曝露されなかった第２の固形腫瘍内の１つ以上の分化マーカーのレベルと比較することを含む。ある実施形態において、方法は、（ａ）第２固形腫瘍ではなく第１固形腫瘍を薬剤に曝露すること、（ｂ）第１と第２の固形腫瘍における１つ以上の分化マーカー、及び／又は、１つ以上の幹細胞性マーカーのレベルを評価すること、（ｃ）第１腫瘍における１つ以上の分化マーカーのレベルを第２固形腫瘍における１つ以上の分化マーカーのレベルと比較することを含む。ある実施形態において、（ａ）第２固形腫瘍における１つ以上の分化マーカーのレベルと比べて第１固形腫瘍において増加した１つ以上の分化マーカーのレベルは抗腫瘍活性（又は、抗癌幹細胞活性）を示す、及び／又は、（ｂ）１つ以上の幹細胞性マーカーの減少したレベルは抗腫瘍活性（又は、抗癌幹細胞活性）を示す。ある実施形態において、薬剤は１つ以上のＷｎｔタンパク質に結合する。ある実施形態において、薬剤はＦＺＤ可溶性受容体である。ある方法において、薬剤は抗Ｗｎｔ抗体のような抗体である。
薬剤をスクリーニングするその他の方法は、これらに限定されないが、薬剤に曝露された第１固形腫瘍内の１つ以上の分化マーカーのレベルを薬剤に曝露されなかった第２固形腫瘍内の１つ以上の分化マーカーのレベルと比較することを含む。ある実施形態において、方法は、（ａ）第２固形腫瘍ではなく第１固形腫瘍を薬剤に曝露すること、（ｂ）第１と第２の固形腫瘍における１つ以上の分化マーカーのレベルを評価すること、（ｃ）第１腫瘍における１つ以上の分化マーカーのレベルを第２固形腫瘍における１つ以上の分化マーカーのレベルと比較することを含む。ある実施形態において、薬剤はＷｎｔ結合剤である。ある実施形態において、薬剤は標準的Ｗｎｔシグナル伝達経路の阻害剤である。ある実施形態において、薬剤は１つ以上のヒトＷｎｔタンパク質の１つ以上のヒトＦＺＤ受容体への結合を抑制する。ある実施形態において、第２固形腫瘍における１つ以上の分化マーカーのレベルと比べて第１固形腫瘍において増加した１つ以上の分化マーカーのレベルは固形腫瘍幹細胞（ＣＳＣ）に対する効能を示す。ある別の実施形態において、第２固形腫瘍における１つ以上の分化マーカーのレベルと比べて第１固形腫瘍において減少した１つ以上の分化マーカー（例えば、分化に対する負のマーカー）のレベルは固形腫瘍幹細胞に対する効能を示す。
ある実施形態において、スクリーニング法における固形腫瘍は膵臓腫瘍である。ある実施形態において、固形腫瘍は膵臓腫瘍であり、前記の１つ以上の分化マーカーは１つ以上のムチン（例えば、Ｍｕｃ１６）、１つ以上のサイトケラチン（例えば、ＣＫ２０）、及び／又はクロモグラニンＡ（ＣＨＧＡ）を含みうる。
ある別の実施形態において、スクリーニング法における固形腫瘍は大腸腫瘍である。ある実施形態において、固形腫瘍は大腸腫瘍であり、前記の１つ以上の分化マーカーは１つ以上のサイトケラチン（例えば、サイトケラチン７、又は、ＣＫ２０）を含みうる。
ある実施形態において、本明細書において記載されるスクリーニング法で用いられる１つ以上の幹細胞性マーカーはＡＬＤＨ１Ａ１、ＡＰＣ、ΑΧＩΝ２、ＢＭＩ１、ＣＤ４４、ＦＧＦ１、ＧＪＢ１、ＧＪＢ２、ＨＥＳ１、ＪＡＧ１、ＬＧＲ５、ＬＨＸ８、ＭＹＣ、ＮＡＮＯＧ、ＮＥＵＲＯＤ１、ＮＥＵＲＯＧ２、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＯＴＣＨ３、ＮＯＴＣＨ４、ＰＲＯＣＲ、ＲＡＲＲＥＳ１、ＲＡＲＲＥＳ３、ＲＢＰ２、ＳＯＸ１、ＳＯＸ２、ＡＳＣＬ２、ＴＤＧＦ１、ＯＬＦＭ４、ＭＳＩ１、ＤＡＳＨ１、ＥＰＨＢ３、及び／又は、ＥＰＨＢ４を含む。ある実施形態において、２個以上の幹細胞性マーカー、３個以上の幹細胞性マーカー、４個以上の幹細胞性マーカー、５個以上の幹細胞性マーカー、６個以上の幹細胞性マーカー、又は、１０個以上の幹細胞性マーカーは、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＡＰＣ、ΑΧＩΝ２、ＢＭＩ１、ＣＤ４４、ＦＧＦ１、ＧＪＢ１、ＧＪＢ２、ＨＥＳ１、ＪＡＧ１、ＬＧＲ５、ＬＨＸ８、ＭＹＣ、ＮＡＮＯＧ、ＮＥＵＲＯＤ１、ＮＥＵＲＯＧ２、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＯＴＣＨ３、ＮＯＴＣＨ４、ＰＲＯＣＲ、ＲＡＲＲＥＳ１、ＲＡＲＲＥＳ３、ＲＢＰ２、ＳＯＸ１、ＳＯＸ２、ＡＳＣＬ２、ＴＤＧＦ１、ＯＬＦＭ４、ＭＳＩ１、ＤＡＳＨ１、ＥＰＨＢ３、及び、ＥＰＨＢ４からなる群より選択される幹細胞性マーカーである。
ある実施形態において、前記のスクリーニング法において使用される１つ以上の分化マーカーはＡＬＤＯＢ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ７、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＤＸ１、ＣＤＸ２、ＣＬＣＡ２、ＣＯＬ１Ａ２、ＣＯＬ６Ａ１、ＣＨＧＡ、ＣＳＴＡ、ＣＳＴ４、ＣＫ２０、ＤＡＢ２、ＦＡＢＰ４、ＧＳＴ１、ＫＲＴ４、ＫＲＴ７、ＫＲＴ１５、ＫＲＴ１７、ＫＲＴ２０、ＬＡＭＡ１、ＭＵＣ３Ａ、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ５Ｂ、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ１５、ＭＵＣ１６、ＭＵＣ１７、ＮＤＲＧ２、ＰＩＰ、ＰＬＵＮＣ、ＳＰＲＲ１Ａ、ＲＥＧ４、ＶＳＩＧ１、及び／又は、ＸＡＦ１を含む。ある実施形態において、２個以上の分化マーカー、３個以上の分化マーカー、４個以上の分化マーカー、５個以上の分化マーカー、６個以上の分化マーカー、又は、１０個以上の分化マーカーは、ＡＬＤＯＢ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ７、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＤＸ１、ＣＤＸ２、ＣＬＣＡ２、ＣＯＬ１Ａ２、ＣＯＬ６Ａ１、ＣＨＧＡ、ＣＳＴＡ、ＣＳＴ４、ＣＫ２０、ＤＡＢ２、ＦＡＢＰ４、ＧＳＴ１、ＫＲＴ４、ＫＲＴ７、ＫＲＴ１５、ＫＲＴ１７、ＫＲＴ２０、ＬＡＭＡ１、ＭＵＣ３Ａ、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ５Ｂ、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ１５、ＭＵＣ１６、ＭＵＣ１７、ＮＤＲＧ２、ＰＩＰ、ＰＬＵＮＣ、ＳＰＲＲ１Ａ、ＲＥＧ４、ＶＳＩＧ１、及びＸＡＦ１からなる群より選択され分化マーカーである。
膵臓腫瘍、及び、大腸腫瘍、並びに、その他の種類の腫瘍でのその他の潜在的な分化マーカーは当業者に公知である。さらに、スクリーニング法における潜在的な分化マーカーの有効性は、当業者により、望みの種類の腫瘍をＦＺＤ８−Ｆｃのような本明細書で述べた１つ以上の可溶性ＦＺＤ受容体で処理し、それから、対照に対して処理した腫瘍での前記のマーカーの発現の変化を査定することにより簡便に評価されうる。そのような方法の非限定的な例は、例えば、以下の具体例において見出されることができる。
本発明はさらに、可溶性Ｗｎｔ結合剤を産生する方法を提供する。ある実施形態において、方法は、ヒトＦＺＤ８のＦｒｉドメインを含む可溶性Ｗｎｔ結合剤で、Ｗｎｔ結合剤の少なくとも８０％がＡＳＡのＮ末端配列を持つものを生産することを含み、Ｗｎｔ結合剤を生産するために、配列番号：７１、配列番号：７０、配列番号：７２、配列番号：７３、及び、配列番号：７４からなる群より選択されるシグナル配列を使用することを含む。ある実施形態において、シグナル配列は配列番号：７１である。ある実施形態において、Ｗｎｔ結合剤の少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は、少なくとも９８％がＡＳＡのＮ末端配列を持つ。ある実施形態において、Ｗｎｔ結合剤はヒトＦｃ領域を含む。ある実施形態において、Ｗｎｔ結合剤は、配列番号：５３、配列番号：５０、配列番号：４６、配列番号：４８、及び、配列番号：１からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。ある実施形態において、Ｗｎｔ結合剤は配列番号：５３を含む。ある実施形態において、Ｗｎｔ結合剤は配列番号：５０を含む。ある実施形態において、前記の細胞は配列番号：７５の配列を持つポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含有する。
本明細書記載の実施例及び実施形態は、あくまで例示を目的にしたものであること、並びにこの観点から、様々な修正若しくは変化は当業者に示され、及び本明細書の精神及び範囲に含まれることを理解されたい。
実施例１
ＦＺＤ８−Ｆｃの生成
ＦＺＤ８−Ｆｃ（５４Ｆ０３）をコードするｃＤＮＡを、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩで消化されたｐＥＥ１４．４発現ベクター（Ｌｏｎｚａ）にサブクローニングした。クローニング後、ｐＥＥ１４．４−ＦＺＤ８−Ｆｃ ＤＮＡをＰｖｕＩでの消化により直線化し、及び、その後、標準的な手順を用いて電気穿孔法によりＧＳ−ＣＨＯＫ１細胞に導入した。ＦＺＤ８−Ｆｃを発現する安定したクローンを得て、及び無血清培地に拡大した。タンパク質Ａ結合レジンを用いる親和性捕捉によりＦＺＤ８−Ｆｃを精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により９８％以上の純度が明らかになり、及び、エンドトキシンレベルが１ＥＵ／ｍｇ以下のタンパク質であった。
ＦＺＤ８−Ｆｃのアミノ酸配列は配列番号：１であり、及びＦＺＤ８−Ｆｃをコードするポリヌクレオチド配列は配列番号：２である。
実施例２
ラットにおけるＦＺＤ８−Ｆｃの薬物動態
２ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇの投与量を用いて、２週間の薬物動態学的な（ＰＫ）研究で、ＦＺＤ８−Ｆｃ（５４Ｆ０３）の薬物動態をラットで評価した。各群にＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ系のラット雄の５個体に２ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇの投与量で、尾静脈経由で投与し、次いで２週間、１，２４，４８，７２，９６，１６８，２４０，及び３３６時間の時点でサンプルを回収した。各時点で、血液１ｍｌをエチレンジアミン四酢酸の管に回収し、遠心分離した。サンプルを分析するまで、血漿の上清を回収し及び凍結した。
各時点での血漿中に存在するＦＺＤ８−Ｆｃ融合タンパク質のレベルを定量化し、及びＦＺＤ８−Ｆｃの半減期を２つの投与量について計算した。図１で示すように、ＦＺＤ８−Ｆｃの半減期を２ｍｇ／ｋｇの場合は１６３時間、及び１０ｍｇ／ｋｇの場合は１５７時間と概算した。
実施例３
膵臓腫瘍モデルにおけるＦＺＤ８−Ｆｃの抗癌活性
膵臓腫瘍モデルにおけるＦＺＤ８−Ｆｃによる抑制。ＦＺＤ８−Ｆｃ（５４Ｆ０３）の抗癌活性をＰＮ４膵臓腫瘍の異種移植モデルで評価した。分離されたＯＭＰ−ＰＮ４細胞（動物あたり５０，０００個）を６〜８週齢の雄のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに皮下注射した。腫瘍の成長を週ごとに検査し及び腫瘍が触知できたら腫瘍の計測を開始した。５０日目に、の平均腫瘍量が１３７ｍｍ３のマウス各１０個体を４群に無作為に割り付けた。マウスに対照抗体、ＦＺＤ８−Ｆｃ（１５ｍｇ／ｋｇ）、ゲムシタビン（２ｍｇ／ｋｇ）又はＦＺＤ８−Ｆｃとゲムシタビンの併用のいずれかを注射した。ＦＺＤ８−Ｆｃ及びゲムシタビンの投与は、腹膜内腔への投与を経由して、週に１回（ゲムシタビン）又は週に２回（ＦＺＤ８−Ｆｃ）行った。腫瘍を週に２回測定し、腫瘍量を公式１／２（ａｘｂ２）；ａ＝長さ、及びｂ＝横幅、を用いて測定した。データは平均及び平均±平均値の標準誤差（ｍｅａｎ±Ｓ．Ｅ．Ｍ．）で表した。群の平均はスチューデント両側、独立ｔ検定（Ｓｔｕｄｅｎｔ'ｓ ｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ， ｕｎｐａｉｒｅｄ ｔ ｔｅｓｔ）を用いて比較した。ｐ値は＜０．０５で有意差があるとした。
ＦＺＤ８−Ｆｃでの治療では、図２（ｐ＜０．００１）に表されるように、腫瘍増殖が６６％減少した。さらに、ＦＺＤ８−Ｆｃとゲムシタビンでの治療では、ＦＺＤ８−Ｆｃ単独の治療に対して、腫瘍増殖が２９％減少した（ｐ＝０．０４対ＦＺＤ８−Ｆｃ単独）。従って、ＦＺＤ８−Ｆｃは、単独の薬剤のみならずゲムシタビンの併用として、ＰＮ４膵臓腫瘍モデルにおける抗腫瘍増殖活性を実証した。
ＦＺＤ８−Ｆｃで治療されたＰＮ４腫瘍におけるＣＤ４４Ｍ集団の減少。上述のＯＭＰ−ＰＮ４異種移植研究からの対照及び治療された腫瘍は、研究の最後（８５日目）に回収された。前記腫瘍を処理し、単一の細胞に分離した。各治療群の５個の腫瘍に由来する単一の細胞懸濁液をプールし、プールされたサンプルを、マウスの細胞（α−マウスＣＤ４５−ビオチン １：２００希釈及びラットα−マウス Ｈ２Ｋｄ−ビオチン １：１００希釈，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，サンディエゴ，カリフォルニア州）と選択的に結合する抗体と共に、３０分間氷上でインキュベートされ、次いでストレプトアビジン標識された磁気ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カールスバッド，カリフォルニア州）を添加した。磁石を用いてマウスの細胞を除去した。ヒト細胞表面マーカーを分析するために、単一の腫瘍細胞懸濁液を、蛍光色素と直接結合された抗ＥＳＡ（Ｂｉｏｍｅｄａ，ヘイワード，カリフォルニア州）及び抗ＣＤ４４（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，サンホセ，カリフォルニア州）抗体で染色した。死細胞は生体染色ＤＡＰＩを用いて除外した。ＦＡＣＳ Ａｒｉａ機器（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，フランクリンレイク，ニュージャージー州）を用いてフローサイトメトリーを行った。細胞集塊を除去するために、側方散乱及び前方散乱プロファイルを用いた。
対照抗体で治療した腫瘍の分析により、前記の大量の腫瘍集団の１２．７％がＥＳＡとＣＤ４４の双方を高いレベルで発現したことを明らかにした。ダブルポジティブな集団では、図３で示されるようにゲムシタビン単独の治療によって有意な影響を受けなかった（１３．９％）が、ＦＺＤ８−Ｆｃ又はＦＺＤ８−Ｆｃとゲムシタビンの併用での治療ではダブルポジティブな集団が減少した（それぞれ１．９％及び１．７％）。
限界希釈アッセイによるＦＺＤ８−Ｆｃで治療されたＰＮ４腫瘍の分析。前記癌幹細胞を含む腫瘍の固形腫瘍癌幹細胞及び腫瘍形成能に対する影響を評価するために、限界希釈アッセイ（ＬＤＡ）を用いることができる。ＦＺＤ８−Ｆｃ融合タンパク質又は他の薬剤で治療された動物からの腫瘍内の癌幹細胞の頻度を測定するために、及び前記頻度を対照動物からの腫瘍内の癌幹細胞の頻度と比較するために、このようなアッセイを用いることができる。
上述のＰＮ４異種移植研究からの対照及び治療された腫瘍は、研究の最後（８５日目）に回収された。前記腫瘍は処理され単一の細胞に分離された。各治療群の５個の腫瘍に由来する単一の細胞懸濁液をプールし、プールされたサンプルを、マウスの細胞（α−マウスＣＤ４５−ビオチン １：２００希釈及びラットα−マウス Ｈ２Ｋｄ−ビオチン １：１００希釈，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，サンディエゴ，カリフォルニア州）と選択的に結合する抗体と共に、３０分間氷上でインキュベートされ、次いでストレプトアビジン標識された磁気ビーズを添加した。磁石を用いてマウスの細胞を除去した。懸濁液中のヒト細胞を回収し、数を数え、及び細胞表面マーカーのために染色し、及びＦＡＣＳバッファー内の適当な投与細胞数（３０，９０，並びに２７０個の細胞）を１：１混合で、マトリゲルで混合し、及びＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（各治療群で投与細胞数ごとに１０個体のマウス）に皮下注射した。腫瘍は４ヶ月までの間成長する。
望ましい時点で、ＦＺＤ８−Ｆｃで治療された腫瘍細胞を注射した全ての群において、検知可能な腫瘍を有するマウスの割合を測定し、及び対照での検知可能な腫瘍を有するマウスの割合と比較した。例えば、１２５個の対照抗体で治療された腫瘍細胞を注射された、検知可能な腫瘍を有するマウスの数を測定し、及び１２５個のＦＺＤ８−Ｆｃで治療された腫瘍細胞を注射された、検知可能な腫瘍を有するマウスの数と比較する。
前記細胞を注射した後７５日目に、個々の群における腫瘍を有する割合は以下だった。対照の場合、マウス３０個体中７個体；ＦＺＤ８−Ｆｃの場合、マウス３０個体中３個体；ゲムシタビンの場合、マウス３０個体中７個体；ＦＺＤ８−Ｆｃとゲムシタビンの併用の場合、マウス３０個体中０個体（図４）。ＦＺＤ８−Ｆｃ及びＦＺＤ８−Ｆｃとゲムシタビンの併用で治療された場合の腫瘍を有する割合が減少していることにより、癌幹細胞の頻度がＰＮ４膵臓腫瘍において、ＦＺＤ８−Ｆｃにより減少することが示された。ＣＤ４４発現及び用量制限希釈分析により、ＦＺＤ８−Ｆｃ治療は、ＰＮ４膵臓腫瘍において、癌幹細胞の頻度を減少させることを明らかにした。
癌幹細胞（ＣＳＣ）はＬ−ＣａｌｃＴＭソフトウェア（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．；ｗｗｗ．ｓｔｅｍｃｅｌｌ．ｃｏｍ）により計算することができる。端的には、ポアゾン統計を基本として、前記動物の３７％が腫瘍を発生できない場合、注射された細胞の既知の数のうち、厳密には１個の癌幹細胞が存在する。前記対照抗体治療群についてのＣＳＣ頻度は１：２８０であり、前記ゲムシタビン治療群についてのＣＳＣ頻度は１：４７６であり、前記ＦＺＤ８−Ｆｃ治療群についてのＣＳＣ頻度は１：８８１であり、並びにＦＺＤ８−Ｆｃとゲムシタビンの併用治療群についてのＣＳＣ頻度は１：３７６３より低かった。群の腫瘍を有する割合は、最も多い投与数でもゼロであったので、群における数を正確に測定することができなかった。
実施例４
ＦＺＤ８−Ｆｃによる膵臓腫瘍の増加した細胞分化
ＦＺＤ８−Ｆｃ治療でのＰＮ４及びＰＮ８腫瘍の増加した細胞分化。上述のＯＭＰ−ＰＮ４異種移植研究（実施例３）からの対照及び治療された腫瘍は、研究の最後（８５日目）に回収された。腫瘍をホルマリンに固定し、パラフィンに埋め込み、厚さ４μｍの腫瘍切片を切り取った。脱パラフィンと水和作用後、室温で５分間、切片を酢酸水溶液で処理した。切片を３％の酢酸水溶液中で３０分間１％のアルシアンブルーで処理し、及び水で洗浄した。切片をニュートラルファーストレッド（ｎｅｕｔｒａｌ ｆａｓｔ ｒｅｄ）で対比染色し、脱水し並びにマウントした。方法を用いて、細胞サンプル内のシアロムチンを青色に染色し、背景はピンク又は赤色に見える。
ＦＺＤ８−Ｆｃで治療したＰＮ４腫瘍では、対照抗体又はゲムシタビンで治療した腫瘍と比較すると、シアロムチンを発現する細胞が増加した（図５、シアロムチンはダークグレーに見える）。ＦＺＤ８−Ｆｃ及びゲムシタビンの併用治療では、ＰＮ４膵臓腫瘍内のシアロムチンの発現が増加した。従って、ＦＺＤ８−ＦｃによるＰＮ４腫瘍の治療では、また、ムチン発現分化細胞の頻度が増加した。類似の結果がＰＮ８膵臓腫瘍異種移植で確認された（図６）。
ＦＺＤ８−Ｆｃ治療でのＰＮ１３腫瘍の増加した細胞分化。ＦＺＤ８−Ｆｃの細胞分化能をＯＭＰ−ＰＮ１３膵臓腫瘍異種移植モデルにおいても評価した。分化されたＯＭＰ−ＰＮ１３細胞（動物につき５０，０００個）を６〜８週齢の雄のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに皮下注射した。腫瘍の成長を週ごとに検査し及び腫瘍が触知できたら腫瘍の計測を開始した。４０日目に、平均１１４ｍｍ３の腫瘍量のマウスを各１０個体の４群に無作為に割り付けた。動物に対照抗体又はＦＺＤ８−Ｆｃ（１５ｍｇ／ｋｇ）のいずれかを注射した。ＦＺＤ８−Ｆｃ及び対照抗体を腹膜内腔への投与を経由して、週２回行った。治療から１９日後に、前記腫瘍は切除され、標準的な技術を用いて免疫組織化学的分析を行った。端的には、腫瘍をホルマリンに固定し、パラフィンに埋め込み、厚さ４μｍの腫瘍切片を切り取った。脱パラフィンと水和作用後、腫瘍切片はＴｒｉｓバッファー（ｐＨ９．５）中で抗原修復処理に供した。内在性のペルオキシダーゼをブロックするために、切片を過酸化水素（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，セントルイス，ミズーリ州）で１０分間インキュベートした。ブロッキングバッファー（ＰＢＳ中３％ＮＨＳ，１％ＢＳＡ，０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）中に１：２００希釈で、抗Ｋｉ６７抗体（Ｄａｋｏ，クローンＭＩＢ−１）を各切片に加えて、及び１時間インキュベートした。スライドを各５分間ＰＢＣＴで３回リンスした。ＨＲＰ（ＩｍｍＰＲＥＳＳ（商標）抗マウス，Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．，バーリンゲーム，カリフォルニア州）で結合された抗マウス第２抗体を、スライドに加え、及び３０分間インキュベートした。ＰＢＳＴで複数回洗浄した後、Ｋｉ６７抗原の局在について、Ｖｅｃｔｏｒ Ｎｏｖａ Ｒｅｄ基質（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．，バーリンゲーム，カリフォルニア州）を加えた。切片を酢酸水溶液で、室温で５分間処理した。切片を３％の酢酸水溶液中で３０分間１％のアルシアンブルーで処理し、及び水で洗浄した。切片をニュートラルファーストレッド（ｎｅｕｔｒａｌ ｆａｓｔ ｒｅｄ）で対比染色し、脱水し並びにマウントした。方法を用いて、細胞サンプル内のシアロムチンを青色に染色し、増殖性の細胞を暗赤色に標識した。
ＦＺＤ８−ＦｃでのＰＮ１３腫瘍の治療では、対照抗体で治療した腫瘍と比較すると、シアロムチンを発現する細胞が増加した。ＦＺＤ８−Ｆｃで治療されたＰＮ１３腫瘍では、また、Ｋｉ６７の発現により示されるように、増殖性の細胞が減少した。図７では、ＦＺＤ８−Ｆｃで治療されたＰＮ１３腫瘍からの細胞内の、増殖性の細胞（黒いスポットで同定される）の数が明確に減少していることを示す。従って、ＦＺＤ８−Ｆｃで治療されたＰＮ１３腫瘍により、細胞の増殖が低下し、ムチン発現分化細胞の頻度が増加した。
ＦＺＤ８−ＦｃでのＰＮ１３腫瘍内で増加したＭｕｃ１６染色。上述のように、対照抗体又はＦＺＤ８−Ｆｃで治療されたＰＮ１３腫瘍からの腫瘍切片を得、及び治療した。実施例では、ブロッキングバッファー（ＰＢＳ中３％ＮＨＳ，１％ＢＳＡ，０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）中に１：２００希釈で、抗Ｍｕｃ１６（Ａｂｅａｍ，ケンブリッジ，マサチューセッツ州）抗体を各切片に加え、及び１時間インキュベートした。結合抗体を上述の免疫組織化学プロトコルを用いて検出した。
ＦＺＤ８−ＦｃでのＰＮ１３腫瘍の治療では、対照抗体で治療された腫瘍と比較すると（図８、暗い染色）、Ｍｕｃ１６を発現する細胞が増加した。
ＦＺＤ８−ＦｃでのＰＮ１３腫瘍内で増加したＣＫ２０染色。上述のように、腫瘍切片を得、及び治療した。実施例では、ブロッキングバッファー（ＰＢＳ中３％ＮＨＳ，１％ＢＳＡ，０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）中に１：２００希釈で、抗ＣＫ２０（クローンＫｓ２０．８，Ｄａｋｏ，カーピンテリア，カリフォルニア州）抗体を各切片に加え、及び１時間インキュベートした。結合抗体を上述の免疫組織化学プロトコルを用いて検出した。
ＦＺＤ８−ＦｃでのＰＮ１３腫瘍の治療では、対照抗体で治療された腫瘍と比較すると（図９、暗い染色）、ＣＫ２０を発現する細胞が増加した。
実施例５
ＦＺＤ８−Ｆｃによるインビボでの乳腺腫瘍増殖の抑制
分離したＰＥ１３乳腺腫瘍細胞（動物あたり５０，０００個）をＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの乳腺脂肪帯に皮下注射した。マウスを週ごとに検査し及び腫瘍をほぼ１０６ｍｍ３になるまで成長させた。細胞注射の後２７日目に、マウスを４つの治療群（ｎ＝１０マウス／群）に無作為に割り付け、及び、対照抗体、ＦＺＤ８−Ｆｃ（５４Ｆ０３）、タキソール又はＦＺＤ８−Ｆｃとタキソールの併用で治療した。タキソールを週に１回７．５ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内に投与し、及びＦＺＤ８−Ｆｃを週２回５ｍｇ／ｋｇの用量で投与した。腫瘍は図１０で示される日に計測した。
ＦＺＤ８−Ｆｃでの治療では、対照抗体群に対して、単一の薬剤で腫瘍増殖が２０％（ｐ＝０．００２）減少したことが認められた。加えて、ＦＺＤ８−Ｆｃとタキソールの併用での治療では、タキソール単体での治療と比較すると、腫瘍増殖が５５％（ｐ＝０．００３）減少した（図１０）。
実施例６
ＦＺＤ８−Ｆｃによるインビボでの結腸腫瘍増殖の抑制
Ｃ２８結腸腫瘍異種移植の成長において、ＦＺＤ８−Ｆｃ（５４Ｆ０３）の複数の用量及び用量レジメンの効果を分析した。分離したＣ２８（動物あたり１０，０００個）を６〜８週齢の雄のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに皮下注射した。２日目に、マウス各１０個体を６群に無作為に割り付けた。動物に、対照抗体又はＦＺＤ８−Ｆｃのいずれかを、１．５ｍｇ／ｋｇ（週２回），５ｍｇ／ｋｇ（週１回及び２回）及び１５ｍｇ／ｋｇ（週１回及び２回）の用量で注射した。抗体及びＦＺＤ８−Ｆｃの投与は腹膜内腔での注射を経由して行われた。腫瘍の成長を週ごとに検査し及び腫瘍が触知できたら腫瘍の計測を開始した。腫瘍を週に２回計測し及び腫瘍量を本明細書記載のとおりに測定した。
ＦＺＤ８−Ｆｃの１５ｍｇ／ｋｇ（週２回）の治療では、図１１Ａ（ｐ＜０．００１）に示されるように、対照抗体での治療に対して、腫瘍増殖が８３％減少した。さらに、評価された最も少ない容量（週２回１．５ｍｇ／ｋｇの投与）でのＦＺＤ８−Ｆｃでの治療では、対照抗体での治療に対して、腫瘍の成長が５２％減少した（図１１Ａ）。従って、ＦＺＤ８−Ｆｃは、用量依存的様式における単一の薬剤として、ＯＭＰ−Ｃ２８結腸腫瘍における抗腫瘍増殖を実証した。
Ｃ２８結腸腫瘍異種移植の成長において、化学療法薬と併用した場合のＦＺＤ８−Ｆｃの効果を分析した。分離したＣ２８（動物あたり１０，０００個の細胞）を６〜８週齢の雄のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに皮下注射した。腫瘍は平均容量が１２８ｍｍ３に達するまで２１日間成長させた。マウスを無作為に割り付け（各群ｎ＝１０）、ＦＺＤ８−Ｆｃ（５４Ｆ０３）（週１回１５ｍｇ／ｋｇ），イリノテカン（週１回１５ｍｇ／ｋｇ），ＦＺＤ８−Ｆｃとイリノテカンの併用、又は対照抗体で治療した。ＦＺＤ８−Ｆｃ、イリノテカン及び対照抗体の投与は、腹膜内腔での注射を経由して行われた。腫瘍の成長を検査し、及び腫瘍量は指示された時点で、電気ノギスで計測した。データは平均±平均値の標準誤差（ｍｅａｎ±Ｓ．Ｅ．Ｍ．）で表した。
図１１Ｂで示されるように、単一の薬剤としてのＦＺＤ８−Ｆｃでの治療（−▲−）では、対照抗体での治療（−■−）（ｐ＜０．００１）に対して、腫瘍増殖が６６％減少した。さらに、イリノテカンと併用のＦＺＤ８−Ｆｃでの治療（−●−）では、対照抗体での治療（ｐ＜０．００１）に対して、腫瘍の成長が７６％減少し、割合はいずれの薬剤単独の場合より大きかった。従って、ＦＺＤ８−Ｆｃは、単一の薬剤としてのＯＭＰ−Ｃ２８結腸腫瘍モデルにおいても、化学療法薬との併用においても抗腫瘍増殖活性を実証した。
実施例７
ＦＺＤ８−Ｆｃによる結腸腫瘍の増加した細胞分化
ＦＺＤ８−ＦｃでのＣ２８腫瘍内で増加したＣＫ２０染色。上述（実施例６）のＣ２８異種移植からの対照及び治療された腫瘍を研究の最後に回収した。腫瘍を切除し、及び標準的な技術を用いて免疫組織化学的分析を行った。端的には、腫瘍をホルマリンに固定し、パラフィンに埋め込み、厚さ４μｍの腫瘍切片を切り取った。脱パラフィンと水和作用後、腫瘍切片はＴｒｉｓバッファー（ｐＨ９．５）中で抗原修復処理に供した。内在性のペルオキシダーゼをブロックするために、切片を過酸化水素（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，セントルイス，ミズーリ州）で１０分間インキュベートした。ブロッキングバッファー（ＰＢＳ中３％ＮＨＳ，１％ＢＳＡ，０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）中に１：２００希釈で、抗ＣＫ２０（クローンＫｓ２０．８，Ｄａｋｏ，カーピンテリア，カリフォルニア州）抗体を各切片に加えて、及び１時間インキュベートした。スライドを各５分間ＰＢＣＴで３回リンスした。ＨＲＰ（ＩｍｍＰＲＥＳＳ（商標）抗マウス，Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．，バーリンゲーム，カリフォルニア州）で結合された抗マウス第２抗体を、前記スライドに加え、及び３０分間インキュベートした。ＰＢＳＴで複数回洗浄した後、ＣＫ２０抗原の局在について、Ｖｅｃｔｏｒ Ｎｏｖａ Ｒｅｄ基質（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．，バーリンゲーム，カリフォルニア州）を加えた。
ＦＺＤ８−ＦｃでのＣ２８腫瘍の治療では、対照抗体で治療された腫瘍と比較して、ＣＫ２０を発現する細胞が増加した（図１２、暗い染色）。
実施例８
膵臓腫瘍モデルにおけるＦＺＤ８−Ｆｃの抗癌活性
ＰＮ２１膵臓腫瘍モデルにおけるＦＺＤ８−Ｆｃによる腫瘍増殖の抑制。ＦＺＤ８−Ｆｃ（５４Ｆ０３）の抗癌活性をＰＮ２１膵臓腫瘍異種移植モデルにおいて評価した。分離されたＯＭＰ−ＰＮ２１細胞（動物あたり５０，０００個）を６〜８週齢の雄のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに皮下注射した。腫瘍の成長を週ごとに検査し及び腫瘍が触知できたら腫瘍の計測を開始した。３６日目に、の平均腫瘍量が１４４ｍｍ３のマウス各９個体を４群に無作為に割り付けた。動物に対照抗体，ＦＺＤ８−Ｆｃ（１５ｍｇ／ｋｇ），ゲムシタビン（２ｍｇ／ｋｇ）又は ＦＺＤ８−Ｆｃとゲムシタビンの併用を注射した。ＦＺＤ８−Ｆｃ及びゲムシタビンの投与は、週１回腹膜内腔への注射を経由して行った。腫瘍を週２回計測し、及び腫瘍量は本明細書記載のとおりに測定した。
ＦＺＤ８−Ｆｃでの治療では、図１３Ａに表されるように、対照と比較して腫瘍増殖は６６％減少した（ｐ＜０．００１）。さらに、ＦＺＤ８−Ｆｃとゲムシタビンの併用での治療では、いずれの薬剤単独と比較して、腫瘍増殖が非常に減少した（ｐ＝０．００１対ゲムシタビン）。従って、ＦＺＤ８−Ｆｃは、単一の薬剤としてのＰＮ２１膵臓腫瘍モデルにおいても、ゲムシタビンとの併用においても抗腫瘍増殖活性を実証した。
限界希釈アッセイによるＦＺＤ８−Ｆｃで治療されたＰＮ２１腫瘍の分析。実施例３で上述されたように、ＰＮ２１膵臓腫瘍モデルにおいて、固形腫瘍癌幹細胞に対するＦＺＤ８−Ｆｃ単独又はゲムシタビンの併用での効果を評価するために、限界希釈アッセイを用いた。
上述のＰＮ２１異種移植研究からの対照及び治療された腫瘍を、研究の最後に回収した。腫瘍を処理し、及び単一の細胞に分離した。各治療群の５個の腫瘍に由来する単一細胞懸濁液をプールし、及びプールされたサンプルを、マウスの細胞（α−マウスＣＤ４５−ビオチン１：２００希釈及びラットα−マウス Ｈ２Ｋｄ−ビオチン１：１００希釈，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ， サンディエゴ，カリフォルニア州）と選択的に結合する抗体と共に、３０分間氷上でインキュベートされ、次いでストレプトアビジン標識された磁気ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カールスバッド，カリフォルニア州）を添加した。磁石を用いてマウスの細胞を除去した。懸濁液中のヒト細胞を回収し、数を数え、及び細胞表面マーカーのために染色し、及びＦＡＣＳバッファー内の適当な投与細胞数（３０，９０，並びに２７０個の細胞）を１：１混合で、マトリゲルで混合し、及びＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（各治療群で投与細胞数ごとに１０個体のマウス）に皮下注射した。腫瘍は４ヶ月までの間増殖する。
望ましい時点で、腫瘍細胞を注射した全ての群において、検知可能な腫瘍を有するマウスの割合を測定し、及び対照の治療された細胞中の検知可能な腫瘍を有するマウスの割合と比較した。例えば、１２５個の対照抗体で治療された腫瘍細胞を注射された、検知可能な腫瘍を有するマウスの数を測定し、及び１２５個のＦＺＤ８−Ｆｃで治療された腫瘍細胞を注射された、検知可能な腫瘍を有するマウスの数と比較する。
前記細胞を注射した後７２日目に、個々の群における腫瘍を有する割合を測定し、及び癌幹細胞の頻度をＬ−ＣａｌｃＴＭソフトウェア（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．；ｗｗｗ．ｓｔｅｍｃｅｌｌ．ｃｏｍ）を用いて計算した。図１３Ｂに表されるように、ＦＺＤ８−Ｆｃでの治療では、癌幹細胞の頻度が１：９７６にまで減少し、対照抗体での治療と比較して、ほぼ４倍の減少であった。逆に、ゲムシタビンでの治療では、幹細胞の頻度が若干増加した。重要なこととして、ＦＺＤ８−Ｆｃとゲムシタビン併用での治療では、癌幹細胞の頻度が１：５４７２にまで減少し、対照抗体での治療と比較して、２５倍の減少であった。驚くべきことに、ＦＺＤ８−Ｆｃとゲムシタビン併用での治療では、癌幹細胞の頻度が、ＦＺＤ８−Ｆｃ単独での治療と比べて、及びゲムシタビンが実際に癌幹細胞の頻度を増加させているように見えるにもかかわらず、ほぼ５．５倍の減少であった。
実施例９
ＦＺＤ８−ＦｃによるＰＮ２１腫瘍の増加した細胞分化
ＦＺＤ８−Ｆｃの細胞分化能を、ＯＭＰ−ＰＮ２１膵臓腫瘍異種移植モデルにおいても評価した。実施例８において記載した研究からＰＮ２１腫瘍を回収し、ホルマリンに固定し、パラフィンに埋め込み、厚さ４μｍの腫瘍切片を切り取った。脱パラフィンと水和作用後、腫瘍切片をＴｒｉｓバッファー（ｐＨ９．５）中で抗原修復処理に供した。内在性のペルオキシダーゼをブロックするために、切片を過酸化水素（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，セントルイス，ミズーリ州）で１０分間インキュベートした。ブロッキングバッファー（ＰＢＳ中３％ＮＨＳ，１％ＢＳＡ，０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）中に１：２００希釈で、抗Ｋｉ６７（クローンＭＩＢ−１，Ｄａｋｏ，カーピンテリア，カリフォルニア州）抗体を各切片に加えて、及び１時間インキュベートした。スライドを各５分間ＰＢＣＴで３回リンスした。ＨＲＰ（ＩｍｍＰＲＥＳＳ（商標）抗マウス，Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．，バーリンゲーム，カリフォルニア州）で結合された抗マウス第２抗体を、スライドに加え、及び３０分間インキュベートした。ブロッキングバッファー（ＰＢＳ中３％ＮＨＳ，１％ＢＳＡ，０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）中に１：２００希釈で、抗Ｋｉ６７抗体（Ｄａｋｏ，クローンＭＩＢ−１）を各切片に加えて、及び１時間インキュベートした。スライドを各５分間ＰＢＣＴで３回リンスした。ＨＲＰ（ＩｍｍＰＲＥＳＳ（商標）抗マウス，Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．，バーリンゲーム，カリフォルニア州）で結合された抗マウス第２抗体を、スライドに加え、及び３０分間インキュベートした。ＰＢＳＴで複数回洗浄した後、Ｋｉ６７抗原の局在について、Ｖｅｃｔｏｒ Ｎｏｖａ Ｒｅｄ基質（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．，バーリンゲーム，カリフォルニア州）を加えた。切片を酢酸水溶液で、室温で５分間処理した。切片を３％の酢酸水溶液中で３０分間１％のアルシアンブルーで処理し、及び水で洗浄した。切片をニュートラルファーストレッド（ｎｅｕｔｒａｌ ｆａｓｔ ｒｅｄ）で対比染色し、脱水し並びにマウントした。方法を用いて、細胞サンプル内のシアロムチンを青色に染色し、背景はピンク又は赤色に見える。
ＦＺＤ８−ＦｃでのＰＮ２１腫瘍の治療では、対照抗体で治療された腫瘍と比較して（図１４、ダークグレーの染色）、シアロムチンを発現する細胞が増加した。ＦＺＤ８−Ｆｃでの、又はゲムシタビンを併用するＦＺＤ８−ＦｃでのＰＮ２１腫瘍の治療では、対照抗体又はゲムシタビン単独で治療された腫瘍と比較して、シアロムチンを発現する細胞が増加した（図１５）。ＦＺＤ８−Ｆｃ又は、ＦＺＤ８−Ｆｃとゲムシタビンの併用でのＰＮ２１腫瘍の治療では、また、Ｋｉ６７の発現によって表される細胞の増殖が減少した。従って、ＦＺＤ８−ＦｃでのＰＮ２１腫瘍の治療では、単独又はゲムシタビンを併用した場合であっても、細胞増殖が低下し、ムチン発現分化細胞の頻度が増加した。
実施例１０
ＦＺＤ８−Ｆｃ変異体の生成
ＦＺＤ８−Ｆｃ変異体の生成。ＦＺＤ８−Ｆｃ変異体をＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，カリフォルニア州）で生成した。異なるＦＺＤ８−Ｆｃ変異体タンパク質、５４Ｆ０５，５４Ｆ０８，５４Ｆ０９，５４Ｆ１２，５４Ｆ１３，５４Ｆ１４，５４Ｆ１５，５４Ｆ１６，５４Ｆ１７，５４Ｆ１８，５４Ｆ１９，５４Ｆ２０，５４Ｆ２１及び５４Ｆ２２、を生成するために、ＤＮＡ２．０は短い単鎖オリゴヌクレオチドを合成し及び構築した。構築されたオリゴヌクレオチドをその後クローンし、及び配列検証した。
実施例１１
ＦＺＤ８−Ｆｃ変異体によるＷｎｔシグナルの抑制
Ｗｎｔシグナルの活性をブロック又は抑制するＦＺＤ８−Ｆｃ変異体の能力を、ルシフェラーゼレポーターアッセイを用いて、インビトロで測定した。ＳＴＦ２９３を抗生物質及び１０％のＦＣＳを追加したＤＭＥＭ内で培養した。ＳＴＦ２９３細胞は、ホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子のプロモーター上流に接合されるＴＣＦ転写反応要素の７つのコピーを含むレポーターベクターで安定的に形質移入される。この構築物は標準的なＷｎｔシグナル経路の活性を計測する。前記細胞をウェルにつき１０，０００個の細胞で、培養プレートに加えた。一晩インキュベーションした後、Ｗｎｔ３ａ条件下の培地と組み合わせて、ＦＺＤ８−Ｆｃ変異体又は対照マウスのＪＡＧ１−Ｆｃを加えた。前記ＦＺＤ８−Ｆｃ変異体及びＪＡＧ１−Ｆｃを、２０，４，０．８，０．１６，０．０３，０．００６，０．００１２，及び０．０００３μｇ／ｍｌの濃度で用いた。前記細胞を、Ｗｎｔ３ａを安定的に発現するＬ細胞から調製された２５％のＷｎｔ３Ａ条件下の培地でインキュベートした。一晩インキュベーションした後（ほぼ１８時間）、ルシフェラーゼのレベルをＳｔｅａｄｙ−Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ，マディソン，ウイスコンシン州）を用いて計測した。
ＦＺＤ８−Ｆｃ変異体のブロッキング活性が決定され、各アッセイで同じ標準試料と比較した、標準試料の活性を１００％とした相対活性として表３に表された。
Figure 0005956349
実施例１２
ラットにおけるＦＺＤ８−Ｆｃ変異体の薬物動態
いくつかのＦＺＤ８−Ｆｃ変異体の薬物動態をラットにおいて２週間の薬物動態学的（ＰＫ）研究で評価した。評価されたＦＺＤ８−Ｆｃ変異体は５４Ｆ０３，５４Ｆ０９，５４Ｆ１２，５４Ｆ１３，５４Ｆ１５及び５４Ｆ１６であった。Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ系のラット、各群５個体の雄に１０ｍｇ／ｋｇの投与量で、尾静脈経由で投与し、次いで２週間、１，２４，４８，７２，９６，１６８，２４０，及び３３６時間の時点でサンプルを回収した。各時点で、血液１ｍｌをエチレンジアミン四酢酸の管に回収し、遠心分離した。サンプルを分析するまで、血漿の上清を回収し及び凍結した。
各時点での血漿中に存在するＦＺＤ８−Ｆｃ変異体タンパク質のレベルを定量化し、及び、各ＦＺＤ８−Ｆｃ変異体の半減期を計算した。ＦＺＤ８−Ｆｃ変異体の半減期を表４に示した。
Figure 0005956349
実施例１３
カニクイザルにおけるＦＺＤ８−Ｆｃ変異体の薬物動態
若い成体／成体の雄の未処理のカニクイザル４個体を２個体ずつ２つの群に無作為に割り付け、及びＦＺＤ８−Ｆｃ変異体５４Ｆ１５又は５４Ｆ１６を３０ｍｇ／ｋｇの容量で静脈内へのボーラス投与を行った。１日２回（午前と午後）、死亡、及び痛みや苦痛のサインについて動物を観察した。通常の健康や様子について、症状観察を１日１回行った。投与の日に、死亡、及び痛みや苦痛のサインについて投与後おおよそ１〜４時間、各動物を観察した。研究の継続期間を通して注目されたいかなる異常な所見も記録した。体重を投与の日及び血液採取の最後に計測した。血液（おおよそ０．５ｍｌ）を大腿静脈から注射器や注射針を経由して採取し、及び、ＰＫ分析のために、投与前、及び投与後１，６，１２，２４，４８，７２，９６，１６８，２４０，及び３３６時間ごとに、ＥＤＴＡ Ｋ３抗凝血剤を含む管に移した。加えて、血液（おおよそ０．５ｍｌ）を大腿静脈から注射器及び注射針を経由して採取し、及び抗薬物抗体（ＡＤＡ）分析のために、投与前及び投与後３３６時間で抗凝血剤を含まない管に移した。サンプルを分析するまで、血漿の上清を回収し及び凍結した。ＰＫ分析及び血清中の抗薬物抗体の濃度について、動物の血漿サンプル中のＦＺＤ−Ｆｃ濃度を測定するために、ＨＴＲＥ（均質な時間分解蛍光）免疫測定法を行った。非コンパートメント解析（ＮＣＡ）により、Ｐｈｏｅｎｉｘ（商標）ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（登録商標）Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．０１で、ボーラスＩＶ投与モデルを用いて、対時間の血漿中のＦＺＤ−Ｆｃ濃度を分析した。
各時点での血漿中に存在するＦＺＤ８−Ｆｃ変異体のレベルを定量化し、及びＦＺＤ８−Ｆｃ変異体５４Ｆ１５及び５４Ｆ１６の半減期を計算した。表５に表されるように、ＦＺＤ８−Ｆｃ変異体５４Ｆ１５の半減期を３０ｍｇ／ｋｇで１０２時間と概算し、及びＦＺＤ８−Ｆｃ変異体５４Ｆ１６の半減期を３０ｍｇ／ｋｇで１３７時間と概算した。
Figure 0005956349
実施例１４
ＦＺＤ８−Ｆｃ変異体によるインビボでの結腸腫瘍増殖の抑制
分離されたＣ２８結腸腫瘍細胞（１０，０００個の細胞）を６〜８週齢の雄のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに皮下注射した。腫瘍は平均容量が１４５ｍｍ３に達するまで２８日間成長させた。マウスを無作為に割り付け（各群ｎ＝９）、及び週に２回、１５ｍｇ／ｋｇの容量でＦＺＤ８−Ｆｃ変異体又は対照抗体で治療した。ＦＺＤ８−Ｆｃ変異体及び対照抗体の投与は腹膜内腔内への注射を経由して行われた。腫瘍の成長を検査し、及び腫瘍量は指示された時点で、電気ノギスで計測した。データは平均±平均値の標準誤差（ｍｅａｎ±Ｓ．Ｅ．Ｍ．）で表した。
変異体５４Ｆ１２及び５４Ｆ１３は腫瘍増殖に明確な影響を持たなく、腫瘍量は対照抗体で治療されたマウスの腫瘍と実質的に同じだった。対照的に、図１７に表されるように、変異体５４Ｆ０３，５４Ｆ０９，５４Ｆ１５及び５４Ｆ１６での治療では、対照抗体での治療と比較して、腫瘍増殖においておおよそ５６％，７０％，６４％及び７０％（各々）減少した。従って、ＦＺＤ８−Ｆｃ変異体の抗腫瘍増殖活性はＦＺＤ８部とＦｃ部との接合部でアミノ酸配列により影響を受けるように見えた。加えて、ＩｇＧ２融合タンパク質である双方の変異体（５４Ｆ１２及び５４Ｆ１３）は前記モデルにおいて腫瘍増殖を抑制しなかったので、抗腫瘍増殖活性はＦｃ領域のソースにより影響を受けるように見えた。
実施例１５
ＦＺＤ８−Ｆｃ変異体によるインビボでの膵臓腫瘍の成長の抑制
分離されたＰＮ４膵臓腫瘍細胞（１０，０００個の細胞）を６〜８週齢の雄のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに皮下注射した。腫瘍は平均容量が１１２ｍｍ３に達するまで３６日間成長させた。マウスを無作為に割り付け（各群ｎ＝１０）、及び週に２回、１５ｍｇ／ｋｇの容量でＦＺＤ８−Ｆｃ変異体又は対照抗体で治療した。ＦＺＤ８−Ｆｃ変異体及び対照抗体の投与は腹膜内腔内への注射を経由して行われた。腫瘍の成長を検査し、及び腫瘍量は指示された時点で、電気ノギスで計測した。データは平均±平均値の標準誤差（ｍｅａｎ±Ｓ．Ｅ．Ｍ．）で表した。
変異体５４Ｆ１２及び５４Ｆ１３では、対照抗体で治療されたマウスの体内の腫瘍と比較して、腫瘍増殖が２０％未満の減少であった。ＦＺＤ８−Ｆｃ変異体５４Ｆ０３，５４Ｆ０９，５４Ｆ１５及び５４Ｆ１６では、対照抗体での治療と比較して、腫瘍増殖がおおよそ２０％から６０％減少した。図１８に表されるように、変異体５４Ｆ０９及び５４Ｆ１６では、最も大きな量で、腫瘍増殖が各々４５％（ｐ＜０．００１）及び６０％（ｐ＜０．００１）減少した。従って、ＦＺＤ８−Ｆｃ変異体の抗腫瘍増殖活性はＦＺＤ８部とＦｃ部との接合部でアミノ酸配列により影響を受けるように見えた。実施例１４に見られるように、ＩｇＧ２融合タンパク質である双方の変異体（５４Ｆ１２及び５４Ｆ１３）は、ＩｇＧ１融合タンパク質であるＦＺＤ８−Ｆｃ変異体より弱い抗腫瘍活性を有しているので、抗腫瘍増殖活性はＦｃ領域のソースにより影響を受けているようにも見えた。
上述の腫瘍を持つマウスからの膵臓腫瘍細胞を回収し、おおよそ１ｍｍ３の切片に細かく刻み、次いで３００個のコラゲナーゼの１０ｍｌあたり１グラム及び２００Ｕ／ｍｌのＤＮＡ分解酵素Ｉで、３７℃／二酸化炭素５％で２時間、酵素消化行い、断続的に、細胞を分散させるために１０ｍｌのピペットで撹拌した。同量のＦＡＣＳバッファー（１×のハンクス緩衝液（Ｈａｎｋｓ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（ＨＢＳＳ）、２％の熱不活性ウシ胎児血清（ＦＣＳ）及び２ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４］を加えることにより、消化を停止した。細胞を４０μｍのナイロンフィルターを通して濾過し、及び１５０ｘｇで５分間の遠心分離により回収した。塩化アンモニウムを含む低浸透圧バッファーで、氷上で２分間、赤血球細胞を溶解し、及び細胞を超過のＦＡＣＳバッファーで、再度洗浄し、１ｘ１０７細胞／ｍｌのＦＡＣＳバッファーで再懸濁した。
５μｇ／ｍｌの濃度のビオチン標識化抗マウスＨ−２Ｋｄ（クローン ＳＦ１−１．１，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，サンディエゴ，カリフォルニア州）を、２．５μｇ／ｍｌの濃度のビオチン標識化抗マウスＣＤ４５（３０−Ｆ１１，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を、２００倍希釈したストレプトアビジン−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，サンディエゴ，カリフォルニア州）を用いて、新鮮に調製された単一細胞懸濁液を、氷上で２０分間染色した。１０倍量のＦＡＣＳバッファーで２回洗浄することにより、未結合の抗体を除去した。ヒト細胞表面マーカーを分析するために、５０倍希釈した抗ＥＳ Ａ−ＦＩＴＣ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，オーバーン，カリフォルニア州）を、１００倍希釈した抗ヒトＣＤ４４−ＰＥ−Ｃｙ７（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，サンディエゴ，カリフォルニア州）を、及び、５倍希釈した抗ヒトＣＤ２０１−ＰＥ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、単一の腫瘍細胞懸濁液を染色した。細胞を洗浄し、２．５μｇ／ｍｌの４'，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）を含むＦＡＣＳバッファー中で再懸濁した。単一の蛍光色で染色された細胞を機器の較正のために用いた。いかなる残りのマウスの細胞（Ｈ−２Ｋｄ及びＣＤ４５にポジティブ）及び死細胞（ＤＡＰＩポジティブ）も細胞分別の間に除去した。ダブレット除去ゲーティングを用いてダブレット細胞及び凝集塊を除去した。
図１９に表されるように、ＦＺＤ８−Ｆｃ変異体５４Ｆ０３及び５４Ｆ１６での腫瘍を有するマウスの治療では、対照抗体で治療されたマウスと比較して、ＣＤ４４ｈｉ細胞の割合が低下した。ＣＤ２０１＋ＣＤ４４＋細胞の割合が低かったが、ＦＺＤ８−Ｆｃ変異体５４Ｆ０３及び５４Ｆ１６での腫瘍を有するマウスの治療では、対照抗体で治療されたマウスと比較して、ＣＤ２０１＋ＣＤ４４＋細胞の割合が低かった。ＣＤ４４は腫瘍化細胞（例えば癌幹細胞）のマーカーであることが示されている。加えて、いくつかの実施形態では、ＣＤ４４ｈｉＣＤ２０１＋である細胞はＣＤ４４ｈｉＣＤ２０１−細胞より腫瘍化されていると思われている。従って、重要なことは、ＦＺＤ８−Ｆｃ変異体はＣＤ４４ｈｉ及びＣＤ４４ｈｉＣＤ２０１＋細胞集団を減少させることができ、それにより、治療されたマウスの体内の腫瘍化細胞の割合又は数が減少したことである。
実施例１６
Ｎ末端の特徴づけ
ＦＺＤ８タンパク質中の正しいシグナル配列切断部位をアミノ酸２５（アラニン）及びアミノ酸２６（アラニン）の間に予想し；前記部位での切断ではＡＳＡのＮ末端を残した。予想した部位で切断されたＦＺＤ８−Ｆｃタンパク質の理論的質量と比較して、ＦＺＤ８−Ｆｃタンパク質の質量を測定するために、質量分析による分析を用いた。
修正されたシグナル配列と共に追加のＦＺＤ８−Ｆｃ変異体を、上述のようにＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，カリフォルニア州）で生成した。ＦＺＤ８−Ｆｃタンパク質変異体、５４Ｆ２３から５４Ｆ３５を生成するために、ＤＮＡ２．０は短い単鎖オリゴヌクレオチドを合成し及び構築した。構築されたオリゴヌクレオチドをその後クローンし、及び配列検証した。
製造者の手順書に従ってＱＩＡＧＥＮ ｍａｘｉ−ｐｒｅｐ ｋｉｔを用いて、各ＦＺＤ８−Ｆｃ変異体のプラスミドＤＮＡを調製した。各変異体の発現をＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＭＡＸ試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び２９３ＦＳ細胞を用いて行った。細胞は対数期で成長し、及び１ｘ１０６細胞／ｍｌにまで希釈した。各反応について、３１５μｇのプラスミドＤＮＡを５ｍｌのＯｐｔｉＭＥＭ Ｐｒｏに希釈した。異なる管の中で、３１５μｌのＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＭＡＸ試薬を５ｍｌのＯｐｔｉＭｅｍ Ｐｒｏにまで希釈した。希釈された試薬をＤＮＡに滴下することにより、プラスミドＤＮＡをＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＭＡＸ試薬と複合体を形成し、次いで室温で１５分間インキュベーションをおこなった。その後、前記ＤＮＡと試薬の複合体を２５０ｍｌの２９３ＦＳ細胞に加えた。発現反応は７〜１０日間で成長し、その間に、遠心分離及び濾過により回収した。５ｍｌのＨｉＴｒａｐ ＭＡｂＳｅｌｅｃｔ ＳＵＲＥカラムを用いて、各ＦＺＤ８−Ｆｃ変異体を親和性精製により精製した。端的には、回収された培地を結合バッファーで平衡化されたカラムを通過させた。前記カラムを非結合の物質を除去するために、結合バッファーで洗浄し、及び、その後ＦＺＤ８−Ｆｃタンパク質を溶出液で溶出した。溶出されたサンプルを、質量分析に適したバッファーに透析した。
抗体の重鎖及び軽鎖を分離するために、３０分間３７℃でトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）で、約２５０μｇのＦＺＤ８−Ｆｃタンパク質を還元した。その後、ヨードアセトアミドで３０分間、３７℃で処理することにより、還元されたサンプルをアルキル化した。緩衝液を１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ７．４）に交換するために、サンプルをＮＡＰ−５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ）に通した。次いでバッファーの交換は、エンドグリコシダーゼ ＰＮＧａｓｅ Ｆで脱グリコシル化した。サンプルを１：２００（酵素：サンプル）の比で３７℃で一晩インキュベートした。前記反応は酸を加えることにより停止した。エレクトロスプレイＱＴｏＦ質量分析計を用いて、Ｗａｔｅｒｓ ＵＰＬＣ（商標）及び液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ／ＭＳ）のために、還元され、アルキル化され、及び脱グリコシル化されたＦＺＤ８−Ｆｃサンプルをバイアルに添加した。セシウムトリフルオル酢酸イオンクラスターを用いて、Ｗａｔｅｒｓ ＬｏｃｋＳｐｒａｙ（商標）二重エレクトロスプレイイオン源で各サンプルの分析の質量較正を行った。
図２０Ａに表されるように、野生の配列と同じ配列であるシグナル配列を有するＦＺＤ８−Ｆｃタンパク質（５４Ｆ１６）を、Ｎ末端配列に関して不均一混合物として調製した。サンプルに存在する前記タンパク質の比率は、質量についてアミノ酸２５及び２６（ピーク時４１７０４．０）で切断されたタンパク質と同一である。しかしながら、タンパク質の５０％以上は異なる質量（ピーク時４１９１８．２）での形態で存在する。前記ピークはアミノ酸２２及び２３で切断されたタンパク質をほぼ表し；前記部位での切断はＡＡＡＡＳＡ（配列番号：７６）のＮ末端配列を残す。
シグナル配列 配列番号：６８から配列番号：７４を有するＦＺＤ８−Ｆｃ変異体を細胞培地から生成し、精製し、及び上述の質量分析により分析した。シグナル配列 配列番号：７０から配列番号：７４を有する変異体は、完全に均一のタンパク質サンプルを生成する（いくつかの代表的な結果を図２０Ｂ〜図２０Ｅに示す）。ＡＳＡの配列のＮ末端を有する、アミノ酸２５及び２６（ピーク時４１９３０．１）で切断されたタンパク質として、シグナル配列 配列番号：７１とともに配列番号：５３を含むＦＺＤ８−Ｆｃ変異体５４Ｆ２６が主に存在する（図２０Ａ）。同じ結果は配列番号：５３及びシグナル配列 配列番号：７２（５４Ｆ２８，図２０Ｃ）を含む変異体、配列番号：５３及びシグナル配列 配列番号：７３（５４Ｆ３０，図２０Ｄ）を含む変異体、及び配列番号：５３及びシグナル配列 配列番号：７４（５４Ｆ３２，図２０Ｅ） を含む変異体でも認められた。同じ結果は一過性の安定的な形質移入で観察された。
実施例１７
ＦＺＤ８−Ｆｃ変異体によるインビボでの結腸腫瘍増殖の抑制
分離したＣ２８結腸腫瘍細胞（１０，０００個の細胞）を６〜８週齢の雄のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに皮下注射した。腫瘍を平均質量が１７５ｍｍ３になるまで５６日間成長させた。マウスを無作為に割り付け（１群につきｎ＝１０）、ＦＺＤ８−Ｆｃ構築物である５４Ｆ０３，５４Ｆ２３，５４Ｆ２６、又は対照抗体で、週２回１５ｍｇ／ｋｇの容量で、治療した。ＦＺＤ８−Ｆｃ変異体の投与は腹膜内腔への投与を経由して行った。指示された時点で、腫瘍の成長を検査し及び腫瘍量を電気ノギスで計測した。データは平均及び平均±平均値の標準誤差（ｍｅａｎ±Ｓ．Ｅ．Ｍ．）で表した。
５４Ｆ０３をアミノ酸ＡＳＡ及びＡＡＡＡＳＡのＮ末端での不均一タンパク質混合物として生成する一方で、ＦＺＤ８−Ｆｃ変異体５４Ｆ２３及び５４Ｆ２６を、主にアミノ酸ＡＳＡのＮ末端での同種のタンパク質として生成する。図２１で表されるように、ＦＺＤ８−Ｆｃ変異体５４Ｆ０３，５４Ｆ２３，及び５４Ｆ２６では、３週間の治療後、対照抗体での治療と比較して、各々、腫瘍増殖が４８％，５７％及び５２％減少した。
本明細書において引用された全ての出版物、特許、特許出願、インターネットサイト、及び寄託番号／配列データベース（ポリヌクレオチド配列とポリペプチド配列の双方を含む）は、引用により組み込まれるものとして各個々の出版物、特許、特許出願、インターネットサイト、又は寄託番号／配列データベースが具体的及び個々に参照によって組み込まれるように、全ての目的のために同じ範囲で、それら全体で参照として本明細書に組み込まれる。
配列
Figure 0005956349
Figure 0005956349
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Claims (21)

  1. （ａ）配列番号：３９からなる第１ポリペプチド；及び
    （ｂ）配列番号：４３からなる第２ポリペプチド
    を含むＷｎｔ結合剤であって、
    前記第１ポリペプチドは前記第２ポリペプチドと直接連結されている、
    前記Ｗｎｔ結合剤。
  2. 配列番号：５３のアミノ酸配列を含む、Ｗｎｔ結合剤。
  3. 配列番号：５３からなるＷｎｔ結合剤。
  4. 請求項１〜３のいずれか一項に記載のＷｎｔ結合剤を含み、かつ配列番号：７２、配列番号：６８、配列番号：６９、配列番号：７０、配列番号：７１、配列番号：７３、及び配列番号：７４からなる群より選択されるアミノ酸配列をさらに含む、ポリペプチド。
  5. 配列番号：７２および配列番号：５３を含む、ポリペプチド。
  6. 請求項１〜３のいずれか一項に記載のＷｎｔ結合剤を生成する、細胞。
  7. 請求項４又は請求項５に記載のポリペプチドを含む、細胞。
  8. 請求項１〜３のいずれか一項に記載のＷｎｔ結合剤を含む組成物であって、該Ｗｎｔ結合剤の少なくとも８０％がアラニン-セリン-アラニン（ＡＳＡ）のＮ末端アミノ酸配列を有する、前記組成物。
  9. 請求項１〜３のいずれか一項に記載のＷｎｔ結合剤と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
  10. 請求項１〜３のいずれか一項に記載のＷｎｔ結合剤をコードするヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。
  11. 請求項４又は請求項５に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。
  12. 請求項１０又は請求項１１に記載のポリヌクレオチドを含む、細胞。
  13. 癌を治療するための医薬の製造における、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＷｎｔ結合剤の使用。
  14. Ｗｎｔシグナル伝達活性化に関連する疾患を治療するための医薬の製造における、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＷｎｔ結合剤の使用。
  15. 前記医薬が第２治療薬と組み合わせて用いられる、請求項１３又は請求項１４に記載の使用。
  16. Ｗｎｔ結合剤を生成するために配列番号：７２、配列番号：６８、配列番号：６９、配列番号：７０、配列番号：７１、配列番号：７３、及び配列番号：７４からなる群より選択されるシグナル配列を用いることを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＷｎｔ結合剤を生成する方法であって、該Ｗｎｔ結合剤の少なくとも８０％がＡＳＡのＮ末端アミノ酸配列を有する、前記方法。
  17. （ａ）配列番号：７２、配列番号：７０、配列番号：７１、配列番号：７３、及び配列番号：７４からなる群より選択されるシグナル配列；
    （ｂ）ヒトＦＺＤ８のＦｒｉドメイン；及び
    （ｃ）ヒトＦｃ領域
    を含む、ポリペプチド。
  18. 請求項１７に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチド。
  19. 請求項１８に記載のポリヌクレオチドを含む、細胞。
  20. 請求項１７に記載のポリペプチドを含む、細胞。
  21. Ｗｎｔ結合剤を生成するために配列番号：７２、配列番号：７０、配列番号：７１、配列番号：７３、及び配列番号：７４からなる群より選択されるシグナル配列を用いることを含む、細胞における、ヒトＦＺＤ８のＦｒｉドメインを含む可溶性のＷｎｔ結合剤を生成する方法であって、該Ｗｎｔ結合剤の少なくとも８０％がＡＳＡのＮ末端アミノ酸配列を有する、前記方法。
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