PT2523678T - Antagonistas de wnt e métodos de tratamento - Google Patents

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Sujit Kumar Mitra Satyajit
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Description

DESCRIÇÃO
ANTAGONISTAS DE WNT E MÉTODOS DE TRATAMENTO
CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona novas composições e métodos para o tratamento de cancro e outras doenças ou distúrbios associados a Wnt, bem como novos métodos de seleção para a identificação de novos agentes terapêuticos adicionais. Em particular, a presente invenção proporciona antagonistas Wnt incluindo proteínas recetoras solúveis úteis para o tratamento de tumores sólidos e outras doenças e distúrbios associados a Wnt.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 0 cancro é uma das principais causas de mortalidade no mundo desenvolvido, com mais de um milhão de pessoas diagnosticadas com cancro e 500.000 mortes por ano apenas nos Estados Unidos. Globalmente, estima-se que mais de 1 em cada 3 pessoas vão desenvolver algum tipo de cancro durante a vida. Existem mais de 200 tipos diferentes de cancros, dos quais, quatro - pulmão, mama, colorretal e próstata -são responsáveis por mais da metade dos novos casos (Jemal et al, 2009, J. Clin Cancer, 58:225-249). A via de sinalização de Wnt foi identificada como um alvo potencial para a terapêutica do cancro. A via de sinalização de Wnt é um dos vários reguladores críticos de formação de padrão embrionário, manutenção de tecidos pós-embrionãrios e biologia das células estaminais. Mais especificamente, a sinalização de Wnt desempenha um papel importante na geração de polaridade da célula e especificação de destruição celular incluindo autorrenovação por populações de células estaminais. A ativação não regulada da via Wnt está associada com vários cancros humanos, onde pode alterar o destino do desenvolvimento das células tumorais para manter as mesmas num estado indiferenciado e proliferativo.
Consequentemente, a carcinogénese pode continuar usurpando mecanismos homeostáticos que controlam o desenvolvimento normal e reparação tecidual por células estaminais (revisto em Reya ® Clevers, 2005, Mature, 434:843-50Ê. Beachy et al, 2004, Nature, 432:324-31). A via de sinalização de Wnt foi primeiro elucidada no desenvolvimento de Drosophilo wingless (WG) mutante e a partir do proto-oncogene de ratinho int-1, agora Wntl (Nússe e Varmus, 1982, Cell, 3 1 :99-109Ê Van Ooyen e Nússe, 1984, Cell, 39:233-40Ê Cabrera et al, 198μ, Cell, 50:659-63Ê Rijsewijk et al, 198μ, Cell, 50:649-5μ). Os genes Wnt codificam glicoproteínas modificadas por lípidos segregadas das quais 19 foram identificadas em mamíferos. Estes ligandos segregados ativam um complexo recetor constituído por um membro da família Frizzled (FZD) e proteína 5 ou 6 relacionada com recetor de lipoproteína de baixa densidade (LDL) (LRP5Ô6) . Os recetores FZD são sete proteínas de domínio transmembranares da superfamília de recetores acoplados à proteína G (GPCR) e contêm um grande domínio ligando extracelular N-terminal de ligação com 10 cisteínas conservadas, conhecido como um domínio rico em cisteína (CRD) ou domínio Fri. Existem dez recetores humanos FZD, FZD1, FZD2, FZD3, FZD4, FZD5, FZD6, FZD1, FZD8, FZD9 e FZD 10. Diferentes CRDs FZD têm diferentes afinidades de ligação para Wnts específicos (Wu ® Nússe, 2002, J. Biol. Chem., 2μμ:41μ62-9), e os recetores FZD foram agrupados naqueles que ativam a via da β-catenina canónica e aqueles que ativam vias não canónicas descritas abaixo (Miller et al., 1999, Oncogene, 18:μ860-μ2). Para formar o complexo recetor que liga aos ligandos FZD, os recetores FZD interatuam com LRP5Ô6, proteínas transmembranares de passagem única com quatro domínios extracelulares semelhantes a EGF separados por seis aminoãcidos YWTD repetidos (Johnson et al., 2004, J. Bone
Mineral Res., 19: 1μ49). A via de sinalização canónica Wnt ativada após ligação ao recetor é mediada pela proteína citoplasmática Dishevelled (Dsh) interatuando diretamente com o recetor de FZD e resulta na estabilização citoplasmática e acumulação de β catenina. Na ausência de um sinal de Wnt, a β-catenina é localizada a um complexo de destruição citoplasmática que inclui proteínas supressoras de tumor adenomatoso poliposis coli (APC) e Axina. Estas proteínas funcionam como suportes essenciais para permitir que a glicogénio sintase-quinase 3p (GSK3P) ligue e fosforile a β-catenina, marcando-a para a degradação através da via ubiquitinaôproteassoma. A ativação Dsh resulta em fosforilação de GSK3P e na dissociação do complexo de destruição. A β catenina citoplasmática acumulada é então transportada para o núcleo onde interatua com as proteínas de ligação do ADN da família TCFôABL para ativar a transcrição.
Além da via de sinalização canónica, os ligandos Wnt também ativam vias independentes de β-catenina (Veeman et al. , 2003, Dev. Cell, 5 :36μ-μμ). A sinalização não canónica Wnt foi implicada em vários processos, mas de forma mais convincente em movimentos de gastrulação, através de um mecanismo semelhante à via de polaridade celular planar em Drosophilo (PCP). Outros mecanismos potenciais de sinalização de Wnt não-canónica incluem o fluxo de cálcio, proteína JNK e proteínas G tanto pequenas como heterotriméricas. É frequentemente observado antagonismo entre as vias canónicas e não-canónicas, e alguma evidência indica que a sinalização não-canónica pode suprimir a formação do cancro (Res Olson ® GIBO, 1998, Exp. Cell, 241:134Ê Topol et al, 2003, J. Cell Biol., 162:899-908). Consequentemente, em determinados contextos, os recetores FZD atuam como reguladores negativos da via de sinalização canónica Wnt. Por exemplo, FZD6 reprime a sinalização canónica induzida por Wnt3a, quando co-expressa com FZD1, através da via TAK1-NLK (Golan et al, 2004, JBC, 2μ9:148μ9-88). Do mesmo modo, FZD2 foi mostrado como antagonizando a sinalização canónica de Wnt, na presença de Wnt5a através da cascata TAK1-NLK MAPK (Ishitani et al, 2003, Mol. Cell Biol, 23:131-39) . A via de sinalização canónica de Wnt também desempenha um papel central na manutenção de populações de células estaminais no intestino delgado e cólon, e a ativação inadequada desta via desempenha um papel proeminente no cancro colorretal (Reya ® Clevers, 2005, Nature, 434:843). 0 epitélio de absorção dos intestinos é disposto em vilosidades e criptas. As células estaminais residem nas criptas e dividem-se lentamente para produzir células de proliferação rápida que dão origem a todas as populações de células diferenciadas, que se movem para fora das criptas para ocupar as vilosidades intestinais. A cascata de sinalização de Wnt desempenha um papel dominante no controlo da destruição celular ao longo do eixo cripta-vilosidades e é essencial para a manutenção da população de células estaminais. A perturbação de sinalização de Wnt, quer por perda genética de TCFpô2 por recombinação homóloga (Korinek et al. , 1998, Nat, Genet., 19:3μ9) ou super-expressão de Dickkopf-1 (Dkkl) , um potente antagonista de Wnt segregado (Pinto et . al, 2003, Genes Dev, 1μ: 1μ09-13Ε Kuhnert et al, 2004, PNAS, 101 :266-μ1), resulta em esgotamento de populações de células estaminais intestinais.
Um papel para a sinalização de Wnt no cancro foi primeiro descoberto com a identificação de Wntl (originalmente intl) como um oncogene em tumores mamários transformados pela inserção nas proximidades de um vírus de de ratinho (Ntisse e Varmus, 1982, Cell, 31: 99 - 109) . Tem desde então sido acumulada evidência adicional para o papel de sinalização de Wnt em cancro de mama. Por exemplo, a superexpressão transgénica de β-catenina nas glândulas mamárias resulta em hiperplasias e adenocarcinomas (Imbert et al, 2001, J. Cell Biol, 153 :555-68, . Michaelson ® Leder, 2001, Oncogene, 20:5093-9 ) enquanto a perda da sinalização de Wnt interrompe o desenvolvimento da glândula mamária normal (Tepera et al, 2003, J. Set Cell, 116:113μ-49Ê Hatsell et al, 2003, J. Mammary Gland Biol Neoplasia, 8:145 -58). Mais recentemente, as células estaminais mamárias têm sido mostradas como sendo ativadas por sinalização de Wnt (Liu et al., 2004, PNAS, 101 :4158-4163). No cancro de mama humano, a acumulação de β-catenina implica a sinalização de Wnt ativada em mais de 50% dos carcinomas, e embora não tenham sido identificadas mutações específicas, sido observada regulação positiva de expressão do recetor Frizzled tem (Brennan ® Brown, 2004, J. Mammary Gland Biol Neoplasia, 9: 119-31Ê Malovanovic et al, 2004, Int. J. Oncol, 25: 133μ-1342). 0 cancro colorretal é mais comumente iniciado por ativação de mutações na cascata de sinalização de Wnt. Aproximadamente 5 a 10% de todos os cancros colorretais são hereditários com uma das formas principais sendo polipose adenomatosa familiar (FAP), uma doença autossómica dominante em que cerca de 80% dos indivíduos afetados contêm uma mutação de linha germinal no gene de polipose adenomatosa coll (APC). Foram também identificadas mutações noutros componentes da via Wnt incluindo Axin e β catenina. Os adenomas individuais são protuberâncias clonais das células epiteliais, contendo um segundo alelo inativado, e o grande número de adenomas FAP resulta inevitavelmente no desenvolvimento de adenocarcinomas, através de mutações adicionais em oncogenes e/ou genes supressores de tumor. Além disso, a ativação da via de sinalização de Wnt, incluindo mutações de ganho de função em APC e β-catenina pode induzir desenvolvimento hiperplásico e crescimento de tumores em modelos de ratinhos (Oshima et al, 199μ, cancro Res., 5μ: 1644-9Ê Harada et al. , 1999, EMBO J,, 18:5931 - 42). 0 documento WQ2008G31GQ9 descreve um antagonia se Wnt compreendendo um componente de domínio Frizzled a partir de uma proteína Frizzled, um ligante e um domínio Fc, e um método de tratar o canncro utilizando o dito antagonista de Wnt.
BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO A invenção no seu sentido mais amplo é conforme é definida nas reivindicações independentes. Consequentemente a invenção proporciona um polipéptido compreendendo: (i) um agente de ligação a Wnt compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 53Ê e (ii) uma sequência de sinal selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID Ν0:μ2, SEQ ID NO:μΟ, SEQ ID Ν0:μ1, SEQ ID Ν0:μ3, e SEQ ID Ν0:μ4. A invenção proporciona adicionalmente um polinucleótido compreendendo um polinucleótido que codifica o dito polipéptido, e uma célula produzindo o dito polipéptido ou compreendendo o dito polinucleótido. Adicionalmente, a invenção proporciona uma composição compreendendo um agente de ligação a Wnt compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 53, em que pelo menos 80™ do dito agente de ligação a Wnt tem uma sequência de aminoácidos N-terminal Ala Ser Ala (ASA)Ê cuja composição pode ser uma composição farmacêutica compreendendo um portador farmaceuticamente aceitável. A invenção também proporciona a dita composição para utilização no tratamento do cancro ou para utilização no tratamento de uma doença associada com a ativação da sinalização canónica de Wnt. A invenção também proporciona um método in vitro de produzir uma tal composição, o dito método compreendendo expressar numa célula um polipéptido compreendendo a SEQ ID NO: 53 e uma sequência de sinal selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID Ν0:μ2, SEQ ID Ν0:μ0, SEQ ID NO:μ!, SEQ ID Ν0:μ3, e SEQ ID Ν0:μ4, pelo qual pelo menos 80™ do agente de ligação a Wnt produzido pela célula tem a sequência de aminoácidos N-terminal Ala Ser Ala (ASA) . Também é proporcionado pela invenção um método in vitro de produzir um polipéptido de ligação a Wnt compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO :53, o método compreendendo: (i) expressar numa célula hospedeira um polipéptido compreendendo um agente de ligação a Wnt compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 53 e uma sequência de sinal selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID Ν0:μ2, SEQ ID Ν0:μ0, SEQ ID Ν0:μ1, SEQ ID NO:μ3, e SEQ ID Ν0:μ4, sob condições em que a sequência de sinal é clivada pela célula hospedeiraÊ e purificar o polipéptido de ligação a Wnt da SEQ ID NO: 53, bem como um polipéptido de ligação a Wnt compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 53 e produzido através do dito método. A presente divulgação proporciona uma variedade de agentes que ligam a uma ou mais proteínas Wnt humanas, incluindo, mas não limitados a, recetores solúveis FZD e outros agentes que compreendem um domínio Fri, e métodos de utilização destes agentes. A divulgação proporciona ainda métodos de utilização dos agentes no tratamento de cancro, através da administração de agentes a um indivíduo em necessidade do mesmo. Nalguns aspetos, os métodos compreendem a inibição do crescimento das células cancerígenas. 0 agente de ligação a Wnt é um antagonista de Wnt. São também descritos novos métodos de rastreio para tais agentes de ligação a Wnt. São igualmente descritos polinucleótidos que codificam os agentes, os métodos de produção dos agentes e uma variedade de composições que compreendem os agentes.
Consequentemente, num aspeto, a divulgação proporciona um método de inibir o crescimento de um tumor. Em determinados aspetos, o método compreende o contacto do tumor com uma quantidade eficaz de um agente que liga a uma ou mais proteínas Wnt (por exemplo, proteínas Wnt humanas). 0 método pode ser in vivo ou in vitro. Em determinados aspetos, o tumor está num indivíduo, e o contacto do tumor com o agente compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz do agente de ligação a Wnt ao indivíduo.
Noutro aspeto, a divulgação proporciona um método de reduzir a frequência de células estaminais cancerígenas de um tumor compreendendo as células estaminais do cancro. Por conseguinte, a divulgação também proporciona métodos de reduzir a tumorigenicidade de tumores. Nalguns aspetos, os métodos compreendem contactar o tumor com uma quantidade eficaz de um agente que liga a uma ou mais proteínas Wnt (por exemplo, proteínas Wnt humanas). 0 método pode ser in vivo ou in vitro. Por exemplo, o contacto pode compreender a administração da quantidade eficaz do agente de ligação a Wnt a um ser humano tendo o tumor.
Noutro aspeto, a divulgação proporciona um método de induzir células num tumor para diferenciar ou induzir a expressão de marcadores de diferenciação num tumor. Em determinados aspetos, o método compreende o contacto do tumor com uma quantidade eficaz de um agente que liga a uma ou mais proteínas Wnt (por exemplo, proteínas Wnt humanas). 0 método pode ser in vivo ou in vitro.
Num aspeto ainda adicional, a divulgação proporciona um método de tratamento de um cancro num indivíduo, compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz do agente de ligação a Wnt ao indivíduo.
Num aspeto adicional, a divulgação proporciona um método de tratamento de uma doença num indivíduo em que a doença está associada com a ativação da sinalização de Wnt, que compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz do agente de ligação a Wnt ao indivíduo.
Ainda noutro aspeto, a divulgação proporciona um método de tratamento de um distúrbio num indivíduo, em que a distúrbio é caracterizada por um aumento do nível de células estaminais eôou células progenitoras, compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz do agente de ligação a Wnt ao indivíduo. 0 agente de ligação a Wnt é um polipéptido. 0 agente é um recetor solúvel.
Nos aspetos mencionados acima, bem como noutros aspetos proporcionados no presente documento, o agente compreende um domínio Fri de um recetor FZD, ou um fragmento de um domínio Fri FZD que liga uma ou mais proteínas de Wnt. Em determinados aspetos, os recetores FZD são recetores FZD humanos. Por exemplo, o domínio Fri pode ser de FZD4 humano ou FZD5 humano. Em determinados aspetos alternativos, o agente pode compreender um domínio Fri de um recetor FZD8 humano ou um fragmento de domínio Fri que liga a uma ou mais proteínas Wnt. Em determinados aspetos, o agente de ligação a Wnt é um recetor solúvel FZD. Em aspetos alternativos, o agente de ligação a Wnt não compreende um domínio Fri de um recetor FZD. 0 agente de ligação a Wnt (antes da clivagem da sequência de sinal) compreende a SEQ ID NO: 53 e uma sequência de sinal selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: μΟ, SEQ ID NO: μΐ, SEQ ID NO: μ2, SEQ ID NO: μ3 e SEQ ID NO: μ4. Nalgumas formas de realização, o agente de ligação a Wnt (antes da clivagem da sequência de sinal) compreende a SEQ ID NO: 53 e SEQ ID NO: μΐ.
Em determinados aspetos de cada um dos aspetos acima mencionados, bem como outros aspetos proporcionados no presente documento, o agente de ligação a Wnt liga a uma ou mais, duas ou mais, três ou mais, ou quatro ou mais proteínas Wnt humanas selecionadas a partir do grupo consistindo em Wntl, Wnt2, Wnt2b, Wnt.3, Wnt3a, Wntpa, Wntpb, Wnt8a, WntSb, WntlO e WntlOb. Em determinadas formas de realização, o agente liga a Wntl, Wnt2, Wnt3, Wnt3a e Wntpb. 0 agente é um antagonista de Wnt. Em determinadas formas de realização, o agente inibe a sinalização de Wnt. Em determinadas formas de realização, o agente inibe a sinalização canónica Wnt de Wnt.
Em determinadas formas de realização de cada um dos aspetos mencionados acima, bem como outros aspetos proporcionados no presente documento, o tumor ou cancro é um tumorôcancro selecionado a partir do grupo consistindo em tumorôcancro colorretal, tumorôcancro pancreático, tumorôcancro de pulmão, tumorôcancro do ovário, tumorôcancro do fígado, tumorôcancro da mama, tumorôcancro renal, tumorôcancro da próstata, tumorôcancro gastrointestinal, melanoma, tumorôcancro do colo do útero, tumorôcancro da bexiga, glioblastoma e tumorôcancro de cabeça e pescoço.
Em determinadas formas de realização de cada um dos aspetos mencionados acima, bem como outros aspetos proporcionados no presente documento, os métodos compreendem ainda contactar o tumor com um segundo agente terapêutico ou a administração de um segundo agente terapêutico ao indivíduo. Em determinadas formas de realização, o segundo agente terapêutico é um agente quimioterapêutico. Em determinadas formas de realização, o segundo agente quimioterapêutico é um antimetabolito (por exemplo, gencitabina) ou um agente antimitótico (por exemplo, um taxano tal como paclitaxel).
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOSÔFIGURAS
Figura 1. Farmacocinética de FZDS-Fc (54F03) no ratinho. A administração de uma dose única (10 mgôkg) de FZD8-FC foi seguida por avaliação das propriedades farmacocinéticas de FZDS-Fc. As concentrações séricas de FZDS-Fc foram determinadas a 1, 24, 48, μ2, 96, 168, 240 e 336 horas após a administração.
Figura 2. Inibição de crescimento do tumor do pâncreas PN4 por tratamento FZD8-Fc (54F03). Células Pn4 tumorais de pâncreas foram injetadas por via subcutânea em ratinhos NQDôSCID. Os ratinhos foram tratados com FZD8-FC (-A -), gencitabina (- -), uma combinação de FZD8-Fc e gencitabina (-Δ-), ou um anticorpo de controlo (- · -) . Os dados são mostrados como o volume do tumor (3 mm) , ao longo de dias pós-tratamento.
Figura 3. Redução de população de células CD44hl em tumores PN4 tratados com FZD8-FC (54F03). Foi realizada coloração da superfície celular para ESA e CD44 em células tumorais tratadas com anticorpo de controlo, FZD8-Fc, gencitabina ou uma combinação de FZDS-Fc e gencitabina. Para cada grupo de tratamento, foram reunidas suspensões de células únicas de cinco tumores antes da coloração.
Figura 4. Ensaio in vivo de diluição limitante de tumores pancreáticos PN4tratados com FZDS-Fc (54F03).
Figura 5. Diferenciação de células aumentada de tumores pancreáticos PN4 tratados com FZD8-Fc (54F03). Foram coradas secções embebidas em parafina de tumores PN4 tratados com o anticorpo controlo, FZD8-FC, gencitabina ou uma combinação de FZDS-Fc e gencitabina com azul de alciano para detetar células expressando mucina.
Figura 6. Diferenciação de células aumentada de tumores pancreáticos PN8 tratados com FZD8-Fc (54F03). Secções embebidas em parafina de tumores PNS tratados com o anticorpo controlo, FZD8-FC, gencitabina ou uma combinação de FZDS-Fc e gencitabina foram coradas com azul de alciano para detetar células expressando mucinas. Figura μ. Diferenciação celular aumentada e proliferação reduzida em tumores pancreáticos PN13, após o tratamento com FZDS-Fc (54F03) . Foram coradas secções embebidas em parafina de tumores PN13 tratados com anticorpo de controlo ou FZD8-FC com azul de alciano para detetar células expressando mucina. Além disso, as secções foram coradas para Κίβμ, um marcador de células em proliferação at iva.
Figura 8. Coloração em Mucl6 aumentada em tumores pancreãticos PN13 após o tratamento com FZD8-Fc (54F03). Foram coradas secções embebidas em parafina de tumores PN13 tratados com um anticorpo de controlo ou FZD8-FC para proteína Muc 16.
Figura 9. Coloração em CK20 aumentada em tumores pancreãticos PN13 após o tratamento com FZD8-FC (54F03). Foram coradas secções embebidas em parafina de tumores PN13 tratados com um anticorpo de controlo ou FZD8-FC para proteína CK20.
Figura 10. Inibição do crescimento do tumor da mama PE13, após tratamento com FZD8-FC (54F03) em combinação com paclitaxel. Foram injetadas células tumorais PE13 de mama por via subcutânea em ratinhos NODôSCID, Os ratinhos foram tratados com um anticorpo de controlo (- * -), FZDS-Fc (□) , paclitaxel (- A -) ou uma combinação de FZD8-Fc e paclitaxel (-o-). Os dados são mostrados como o volume do tumor (3 mm ) ao longo de dias pós-tratamento. Figura 11. Inibição dependente da dose de crescimento do tumor do cólon C28 com FZDS-Fc (54F03). Foram injetadas células tumorais C28 de cólon por via subcutânea em Ratinhos NODôSCID. Os ratinhos foram tratados com FZD8-Fc 1. Smgôkg duas vezes por semana (- A -), Smgôkg uma vez por semana (- Y -), Smgôkg duas vezes por semana (-o-), ISmgôkg uma vez por semana (- □ - ) ou ISmgôkg duas vezes por semana (-Δ-) ou anticorpos de controlo (- -) . Os dados são mostrados como o volume do tumor (3 mm) ao longo de dias pós-tratamento (Fig. 11 A) . Inibição do crescimento do tumor de cólon com FZDS-Fc em combinação com irinotecano. Os ratinhos foram tratados com FZDS-Fc (-A-), irinotecano (- Y -), uma combinação de FZD8-Fc e irinotecano (- · -) ou um anticorpo de controlo (- -) . Os dados são mostrados como o volume do tumor (3 mm) ao longo de dias pós-tratamento (Fig. 11B).
Figura 12. Coloração CK20 aumentada em tumores C28, após o tratamento com FZD8-FC (54F03). Foram coradas secções embebidas em parafina de tumores C28 tratados com um anticorpo de controlo ou FZDS-Fc para proteína CK20. Figura 13. Inibição do crescimento do tumor pancreãtico PN21 e diminuição da frequência de cancro de células estaminais por tratamento com FZD8-FC (54F03). Foram injetadas células tumorais pancreãticas PN21 por via subcutânea em ratinhos NODôSCID. Os ratinhos foram tratados com FZDS-Fc (- ▼ -) . gencitabina (-A -) , uma combinação de FZDS-Fc e gencitabina (- -) ou um anticorpo de controlo (- · -) . Os dados são mostrados como o volume do tumor (3 mm) , ao longo do dia pós- tratamento (Fig. 13Ά) . Ensaio in vivo de diluição limitante de tumores pancreáticos PN-121 tratados FZD8-FC (Fig. 13B) .
Figura 14. Diferenciação de células aumentada de tumores pancreáticos PN21, após o tratamento com FZD8-Fc (54F03). Foram corados cortes em parafina de tumores PN21 tratados com o anticorpo controlo ou FZDS-Fc com azul de alcian para detetar mucinas.
Figura 15. Diferenciação celular aumentada e proliferação reduzida em tumores pancreáticos PN21, após o tratamento com FZD8-Fc (54F03) . Foram coradas secções embebidas em parafina de tumores tratados PN21 com o anticorpo controlo, FZD8-FC, gencitabina, ou uma combinação de FZDS-Fc e gencitabina com azul de alciano para detetar mucinas. Além disso, as secções foram coradas para Κίβμ, um marcador de células em proliferação ativa.
Figura 16. Farmacocinética de variantes FZDS-Fc em macacos. A administração de uma dose única (30mgôkg) de variantes FZD8-Fc 54F15 e 54F16 foi seguida por avaliação das propriedades farmacocinéticas das variantes. As concentrações séricas de 54F15 (-«-) e 54F16 (- ♦ -) foram determinadas a 1, 6, 12, 24, 48, μ2, 96, 168, 240 e 336 horas após a administração.
Figura 1μ. Inibição de crescimento do tumor do cólon C28, após o tratamento com variantes FZD8-Fc. Foram injetadas Células tumorais de cólon C28 por via subcutânea em ratinhos NODôSCID. Os ratinhos foram tratados com um anticorpo de controlo (-X-), 54F03 (- □ -), 54F09 (-A-), 54F12 (-▼-), 54F13 (-♦-), 54F15 (-o-) OU 54F16 (-Δ-). Os dados são mostrados como o volume do tumor (3 mm) ao longo de dias pós-tratamento.
Figura 18. Inibição do crescimento do tumor pancreãtico PN4, após o tratamento com variantes FZD8-Fc. Foram injetadas células tumorais PN4 de cólon por via subcutânea em ratinhos NODôSCID. Os ratinhos foram tratados com um anticorpo de controlo (- * -), 54F03 (- -), 54F09 (- T -), 54F12 (-o-), 54F13 (-A -), 54F15 (- □ -) ou 54F16 (- ♦ -). Os dados são mostrados como o volume do tumor (3 mm) ao longo de dias pós-tratamento.
Figura 19. Redução de células CD44hl e CD44+CD201+ em tumores PN4 tratados com variantes FZD8-Fc 54F03 e 54F16. Foi realizada coloração da superfície celular para a ESA, CD44 e CD201 em células tumorais tratadas com anticorpo controlo, variante 54F03 ou variante 54F16 de variante FZD8-Fc e analisada por FACS.
Figura 20. Caracterização de terminais N de proteínas FZD8-FC. Foram analisadas variantes FZDS-Fc por espetrometria de massa e são mostrados os resultados para 54F16 (Fig. 2 0A) , 54F26 (Fig. 20B) , 54F28 (Fig. 20C) , 54F30 (Fig. 20D), e 54F32 (Fig. 20E).
Figura 21. Inibição de crescimento do tumor do cólon C28 após o tratamento com variantes FZD8-Fc. Foram injetadas células tumorais de cólon C28 por via subcutânea em ratinhos NODôSCID. Os ratinhos foram tratados com um anticorpo de controlo (- -), 54F03 (-Δ-), 54F23 (- ▼ -), ou 54F26 (-0-) . Os dados são mostrados como o volume do tumor (3 mm) ao longo de dias pós-tratamento.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A invenção no seu sentido mais amplo é conforme definido nas reivindicações independentes. A presente divulgação proporciona novos agentes, incluindo, mas não limitados a, polipéptidos compreendendo recetores Frizzled (FZD) humanos de domínio Fri, proteínas relacionadas com Frizzled segregadas humanas (SFRPs), ou proteínas Ror que ligam a uma ou mais Wnts humanas. São também proporcionados polipéptidos e polinucleótidos relacionados, composições que compreendem os agentes de ligação a Wnt e métodos de fabricar os agentes de ligação a Wnt. São ainda proporcionados métodos de utilização dos agentes de ligação a Wnt, tais como métodos de inibir o crescimento do tumor, tratamento de cancro, induzir a diferenciação, e reduzir a tumorigenicidade. São também proporcionados métodos de seleção para identificar novos agentes de ligação a Wnt com atividade antitumoral eôou atividade de células estaminais anti-cancerígenas.
Um agente de ligação a Wnt compreendendo o domínio Fri de FZD8 humano e um domínio Fc foi produzido e referido no presente documento como FZD8-FC ou FZD8-FC(54F03) (Exemplo 1). Foram geradas uma série de variantes da proteína FZD8-Fc (Exemplo 10) . Foram produzidas proteínas FZD8-Fe que foram mostradas como tendo aproximadamente 95™ ou mais de homogeneidade nos terminais N (Exemplo 16) . foram realizados estudos farmacocinéticos utilizando várias das variantes FZDS-Fc em ratos que mostram que a semivida das variantes FZDS-Fc foi de pelo menos 100 horas (Exemplos 2 e 12, Figura 1 e Quadro 4) . Foi realizado um estudo farmacocinético em macacos com variantes FZDS-Fc 54F15 e 54F16, que demonstrou que estas proteínas tinham uma semivida de pelo menos 100 horas (Exemplo 13 e Quadro 5). 0 tratamento com FZDS-Fc (54F03) , isoladamente ou em combinação com um agente quimioterapêutico foi mostrado como reduzindo o crescimento de tumores pancreãticos, tumores da mama e tumores do cólon (Exemplos 3, 5, 6 e 8 e Figuras 2, 10, 11B, e 13A) . Além disso, o tratamento foi mostrado como diminuindo a percentagem de células CD44+ e reduzindo a frequência de células estaminais cancerígenas no modelo do pâncreas (Exemplos 3 e 8 e Figuras 3, 4, e 13B) . 0 tratamento com FZDS-Fc (54F03), isoladamente ou em combinação com um agente quimioterapêutico foi demonstrado como aumentando a diferenciação celular de células pancreáticas tumorais e células tumorais de cólon (Exemplos 4, μ e 9 e Figuras 5-9, 12, 14, e 15) . 0 tratamento com variantes FZDS-Fc demonstrou a inibição do crescimento do tumor em tumores do cólon e pancreãticos, com a extensão da inibição dependendo da variante (Exemplos 14, 15, e 1μ e Figuras 1μ, 18, e 21) . 0 tratamento com variante FZD8-Fc 54F03 e variante 54F16 foi mostrado como diminuindo a percentagem de células CD44hl, bem como células CD44+ CD202+ em tumores pancreãticos (Exemplo 15 e Figura 19). I. Definições 0 termo "antagonista" é utilizado no presente documento para incluir qualquer molécula que bloqueia parcial ou totalmente, inibe, ou neutraliza a expressão ou a atividade biológica de uma proteína, (por exemplo, um marcador de células estaminais cancerígenas). 0 bloqueio, inibição, eôou neutralização da atividade biológica inclui, mas não está limitado a, inibição do crescimento do tumor. 0 "antagonista" compreende qualquer molécula que bloqueia parcialmente ou totalmente, inibe ou neutraliza a atividade biológica da via de Wnt. Moléculas antagonistas adequadas incluem, mas não estão limitadas a, fragmentos eôou variantes de sequências de aminoácidos de proteínas recetoras nativas solúveis FZD, incluindo recetores FZD, bem como derivados de SFRPs e derivados de proteínas Ror.
Um polipéptido, anticorpo, polinucleõtido, célula, vetor ou composição que é "isolado" é um polipéptido, anticorpo, polinucleõtido, célula, vetor ou composição que está numa forma não encontrada na natureza. Polipéptidos, anticorpos isolados, polinucleõtidos, vetores, células ou composições incluem aqueles que foram purificados a um grau no qual já não estão numa forma na qual são encontrados na natureza. Nalgumas formas de realização, um anticorpo, polinucleõtidos, vetor, célula, ou composição que é isolado é substancialmente puro.
Conforme utilizado no presente documento, "substancialmente puro" refere-se a material que é pelo menos 50™ puro (isto é, livre de contaminantes) , mais preferentemente pelo menos 90™ puro, mais preferentemente pelo menos 95™ puro, mais preferentemente pelo menos 98 ™ puro, mais preferentemente pelo menos 99™ puro.
Conforme utilizado no presente documento, "recetor solúvel" refere-se a um fragmento N-terminal extracelular de uma proteína do recetor que precede o primeiro domínio transmembranar do recetor que pode ser segregado a partir de uma célula na forma solúvel. Nalgumas formas de realização, a proteína recetora é um recetor FZD. Nalgumas formas de realização, a proteína recetora é um recetor Ror.
Conforme utilizado no presente documento, o termo "recetor solúvel FZD" refere-se a um fragmento N-terminal extracelular de uma proteína recetora FZD humana que precede o primeiro domínio transmembranar do recetor que pode ser segregado a partir de uma célula na forma solúvel. São visados ambos os recetores solúveis FZD compreendendo o domínio N-terminal inteiro extracelular (ECD) (referido no presente documento como "FZD ECD"), bem como fragmentos menores. São também divulgados recetores solúveis FZD compreendendo o domínio Fri (referido no presente documento como "FZD Fri"). Recetores FZD Fri solúveis podem demonstrar atividade biológica alterada, (por exemplo, semivida de proteína aumentada) em comparação com os recetores solúveis compreendendo ECD FZD inteiro. A semivida da proteína pode ser ainda aumentada pela modificação covalente com polietilenoglicol (PEG) ou óxido de polietileno (PEO). Recetores FZD solúveis incluem ECD FZD ou domínios Fri ligados em estrutura a outras proteínas funcionais e estruturais, incluindo, mas não limitados a, uma região Fc humana (por exemplo, Fc humana derivada a partir de imunoglobulinas IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl, IgA2, IgD, IgE, ou IgM)Ê proteína marcadora (por exemplo, myc, FLAG, GST)Ê outras proteínas endógenas ou fragmentos de proteína, ou qualquer outra sequência de proteína útil, incluindo qualquer região ligante entre um domínio ECD FZD ou Fri e uma proteína ligada. Em determinadas formas de realização, o domínio Fri de um recetor FZD está diretamente ligado a uma região Fc humana. Em determinadas formas de realização, o domínio Fri de um recetor FZD está ligado ao Fc da IgGl humana (referido no presente documento como "FZD Fri.Fc"). Nalgumas formas de realização, o domínio Fri de um recetor FZD está ligado a uma região Fc humana com um ligando peptídico. Recetores FZD solúveis também incluem proteínas variantes compreendendo inserções, eliminações, substituições eôou substituições conservatives de aminoácidos.
Conforme utilizado no presente documento, o termo "região ligante" ou "ligante" refere-se a um ligante inserido entre um primeiro polipéptido (por exemplo, um componente FZD) e um segundo polipéptido (por exemplo, uma região Fc) . nalgumas formas de realização, o ligante é um ligando peptídico. Os ligantes não devem afetar negativamente a expressão, secreção, ou bioatividade dos polipéptidos. Preferentemente, os ligantes não são antigénicos e não eliciam uma resposta imune.
Conforme utilizado no presente documento, os termos "cancro" e "canceroso" referem-se ou descrevem a condição fisiológica em mamíferos na qual uma população de células é caracterizada por crescimento celular desregulado. 0 termo cancro é entendido como englobando cancros dependentes de
Wnt. Exemplos de cancros incluem, mas não estão limitados a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma e leucemia. Exemplos mais específicos de tais cancros incluem cancro de células escamosas, cancro de pulmão de células pequenas, cancro de pulmão de células não pequenas, adenocarcinoma do pulmão, carcinoma de células escamosas de pulmão, cancro do peritoneu, carcinoma hepatocelular, cancro gastrointestinal, cancro pancreãtico, glioblastoma, cancro do colo do útero, cancro do ovário, cancro do fígado, cancro da bexiga, hepatoma, cancro da mama, cancro do cólon, cancro colorretal, cancro da pele, melanoma, carcinoma endometrial ou uterino, carcinoma das glândulas salivares, cancro renal, cancro do fígado, cancro da próstata, cancro da vulva, cancro da tiroide, carcinoma hepático e vários tipos de cancro de cabeça e pescoço.
Os termos "doença proliferativa" e "distúrbio proliferativa" referem-se a doenças associadas com proliferação celular anormal tal como cancro. "Tumor" e "neoplasia", conforme utilizado no presente documento referem-se a qualquer massa de tecido que resulta em crescimento ou proliferação excessivos de células, quer benignos (não cancerosos) ou malignos (cancerosos), incluindo lesões pré-cancerosas. Em determinadas formas de realização, o tumor é um tumor epitelial. Em determinadas formas de realização, o tumor é um tumor dependente de Wnt.
Conforme utilizado no presente documento, o termo "indivíduo" refere-se a qualquer animal (por exemplo, um mamífero), incluindo, mas não limitado a seres humanos, primatas não humanos, caninos, felinos, roedores, e semelhantes, que se destina a ser o recetor de um tratamento particular. Tipicamente, os termos "indivíduo" e "paciente" são utilizados indistintamente no presente documento em referência a um indivíduo humano.
Os termos "célula estaminal cancerígena" e "CSC" e " célula estaminal tumoral " e "célula estaminal de tumor sólido" são utilizados indistintamente no presente documento e referem-se a uma população de células de um tumor sólido que: (1) têm extensa capacidade proliferativa, (2) são capazes de divisão celular assimétrica para gerar um ou mais tipos de progénie diferenciada com potencial proliferativo ou de desenvolvimento reduzidos, e (3) são capazes de divisões celulares simétricas para autorrenovação ou automanutenção. Estas propriedades de "células estaminais cancerígenas", "CSCs", "Células estaminais tumorais" ou "células estaminais tumorais sólidas" conferem a essas células estaminais cancerígenas a capacidade de formar tumores palpáveis após transplante em série num hospedeiro imunocomprometido (por exemplo, um ratinho) em comparação com a maioria das células tumorais que não conseguem formar tumores. As células estaminais cancerígenas são submetidas a autorrenovação contra a diferenciação de uma maneira caótica para formar tumores com tipos de células anormais que podem mudar com o tempo à medida que ocorrem mutações.
Os termos "célula cancerígena" e "célula tumoral" e equivalentes gramaticais referem-se à população total de células derivadas a partir de um tumor, incluindo tanto células não tumorigénicas, que compreendem a maior parte da população de células tumorais, como células tumorais também referidas no presente documento como células estaminais cancerígenas. 0 termo "tumorigénico" refere-se as características funcionais de uma célula estaminal de tumor sólido, incluindo as propriedades de auto-renovação (dando origem a outras células estaminais tumorais cancerígenas) e proliferação para gerar todas as outras células tumorais (dando origem a células estaminais diferenciadas e consequentemente não tumorigénicas) que permitem que as células estaminais tumorais solidas formem um tumor. Estas propriedades de auto-renovação e proliferação para gerar todos as outras células tumorais conferem às células estaminais cancerígenas a capacidade de formar tumores palpáveis após transplante em série num hospedeiro imunocomprometido (por exemplo, um ratinho) em comparação com células tumorais não tumorigénicas, que são incapazes de formar tumores após transplante em série. Foi observado que as células tumorais não tumorigénicas podem formar um tumor mediante transplante primário num hospedeiro imunocomprometido (por exemplo, um ratinho) após a obtenção das células tumorais a partir de um tumor sólido, mas essas células tumorais não tumorigénicas não dão origem a um tumor após transplante em série.
Conforme utilizado no presente documento um "veículo farmaceuticamente aceitável" ou "veículo aceitável farmaceuticamente" refere-se a qualquer material que, quando combinado com um ingrediente ativo de uma composição farmacêutica, tal como um polipéptido terapêutico, permite que o polipéptido terapêutico, por exemplo, mantenha a sua atividade biológica. Além disso, um "veículo farmaceuticamente aceitável" não desencadeia uma resposta imunitária num indivíduo recetor. Nalgumas formas de realização, o termo "veículo farmacêutico" é utilizado como sinónimo de "portador farmacêutico". Exemplos incluem, mas não estão limitados a, qualquer um dos veículos farmacêuticos padrão tais como uma solução salina tamponada com fosfato, água, e várias emulsões óleoôágua. Exemplos de diluentes para aerossol ou administração parentérica são solução salina tamponada com fosfato ou solução salina normal (0,9™). 0 termo "quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se a uma quantidade de um agente (por exemplo, um recetor solúvel ou outro fármaco) eficaz para "tratar" uma doença ou distúrbio num indivíduo ou mamífero. No caso de cancro, a quantidade terapeuticamente eficaz do agente (por exemplo, um recetor solúvel) pode reduzir o número de células cancerígenasÊ reduzir o tamanho do tumorÊ reduzir a frequência de células estaminais cancerígenasÊ inibir eôou parar a infiltração de células cancerígenas em órgãos periféricosÊ inibir eôou parar a metástase do tumorÊ inibir eôou parar o crescimento do tumor, eôou aliviar em determinada medida um ou mais dos sintomas associados com o cancro. Na medida em que o agente (por exemplo, um recetor solúvel) impede o crescimento eôou mata as células cancerígenas existentes, pode ser referido como citostãtico eôou citotóxico.
Conforme utilizado no presente documento, o termo "inibir o crescimento tumoral" refere-se a qualquer mecanismo pelo qual o crescimento da célula tumoral pode ser inibido. Em determinadas formas de realização, o crescimento de células tumorais é inibido abrandando a proliferação de células tumorais. Em determinadas formas de realização, o crescimento de células tumorais é inibido parando a proliferação de células tumorais. Em determinadas formas de realização, o crescimento de células tumorais é inibido matando células tumorais. Em determinadas formas de realização, o crescimento de células tumorais é inibido pela indução de apoptose das células tumorais. Em determinadas formas de realização, o crescimento de células tumorais é inibida através da indução de diferenciação das células tumorais. Em determinadas formas de realização, o crescimento de células tumorais é inibido privando as células tumorais de nutrientes. Em determinadas formas de realização, o crescimento de células tumorais é inibido pela prevenção da migração das células tumorais. Em determinadas formas de realização, o crescimento de células tumorais é inibido prevenindo a invasão de células tumorais.
Termos como "tratando" e "tratamento" e "tratar" e "aliviando" e "aliviar" referem-se tanto a 1) medidas terapêuticas para curar, retardar, diminuir os sintomas de, eôou parar a progressão de uma condição ou distúrbio patológico diagnosticado, como 2) medidas profiláticas ou preventivas que impedem ou atrasam o desenvolvimento de uma condição ou distúrbio patológicos visados. Consequentemente, aqueles que necessitam tratamento incluem aqueles que já têm o distúrbioÊ aqueles propensos a ter o distúrbio, e aqueles nos quais o distúrbio se destina a ser prevenido. Em determinadas formas de realização, um indivíduo é "tratado" exitosamente do cancro de acordo com os métodos da presente invenção se o paciente mostrar um ou mais dos seguintes: uma redução no número de, ou ausência completa de, cancro ou células tumoraisÊ uma redução do tamanho do tumorÊ inibição de, ou uma ausência de, cancro ou infiltração de células tumorais em órgãos periféricos, incluindo, por exemplo, a propagação do cancro em tecido mole e nos ossosÊ inibição de, ou uma ausência de, metástase de tumorÊ inibição de, ou ausência de, crescimento de um tumor ou cancroÊ alívio de um ou mais sintomas associados ao cancro específicoÊ redução da morbilidade e mortalidadeÊ melhoria da qualidade de vidaÊ redução da tumorigenicidade, frequência tumorigénica ou capacidade tumorigénica de um tumorÊ redução do número ou da frequência de células estaminais cancerígenas no tumorÊ diferenciação de células tumorigénicas a um estado não tumorigénicoÊ ou alguma combinação destes efeitos.
Conforme utilizado no presente documento, os termos "polinucleótido" e "ácido nucleico" referem-se a um polímero composto por uma multiplicidade de unidades de nucleótidos (ribonucleotides ou desoxirribonucleótidos ou variantes estruturais relacionadas) ligados através de ligações fosfodiéster, incluindo, mas não limitados a, ADN ou ARN. 0 termo abrange sequências que incluem qualquer dos análogos de bases conhecidas de ADN e ARN, incluindo, mas não limitados a, 4-acetilcitosina, 8-hidroxi-N6-meti1adenosina, aziridinilcitosina, pseudoisocitosina, 5— (carboxihidroxil-metil) uracilo, 5-fluoruracilo, 5-bromouracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouracilo, 5-aminometiluracilo-carboximetil dihidrouracilo, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metiladenina, 1-metilpseudo-uracilo, 1 ~ γπθ t i lguanina, 1 “ins t. i 1 inos ina, 2,2 - dims t- i X ~ gu.an.iria, 2 -metiladenina, 2-metilguanina, 3-metil-citosina, 5-metil citosina, N6-metiladenina, μ-metilguanina, 5 metilaminometiluracilo, 5-metoxi-amino-metil-2 -tiouracilo, beta D-manosilqueosina, 5'-metoxicarbonilmetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, metil éster de ácido uracilo-5-oxiacético, ácido uracilo-5-oxiacético, oxibutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, metil éster de ácido N-uracilo-5-oxiacético, ácido uracilo-5-oxiacético, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, e 2,6-diaminopurina. A sequência de nucleótidos pode ser interrompida por componentes não nucleotídicos. Um polinucleótido pode ser adicionalmente modificado após a polimerização, tal como por conjugação com um componente de marcação. Outros tipos de modificações incluem, por exemplo, "capas"Ê substituição de um ou mais dos nucleótidos de ocorrência natural com um análogoÊ modificações internucleotídicas, tais como ligações não carregadas (por exemplo, metilo, fosfonatos e fosfotriésteres fosfoamidatos, carbamatos, etc.) e ligações com carga (por exemplo, fosforotioatos e fosforoditiodatos, etc.)Ê frações pendentes, tais como proteínas (por exemplo, nucleases, toxinas, anticorpos, péptidos de sinal, poli-L-lisina, etc.)Ê intercaladores (por exemplo, acridina, psoraleno, etc.)Ê agentes quelantes (por exemplo, metais, metais radioativos, boro, metais oxidativos, etc.)Ê alquilatos, ligações modificadas (por exemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.)Ê bem como formas não modificadas do polinucleótido (s). Além disso, qualquer dos grupos hidroxilo habitualmente presente nos açúcares pode ser substituído, por exemplo, por grupos fosfonato, grupos fosfato, protegidos por grupos protetores padrão, ou por ativação para preparar ligações adicionais a nucleótidos adicionais, ou pode ser conjugado com suportes sólidos. 0 terminal OH a 5 'e 3' pode ser fosforilado ou substituído com aminas orgânicas ou frações de grupo de capeamento de desde 1 até 20 átomos de carbono. Podem também ser derivatizados outros hidroxilos a grupos protetores padrão. Os polinucleótidos também podem conter formas análogas de açúcares de ribose ou desoxirribose que são geralmente conhecidas na técnica, incluindo, por exemplo, 2!-0-metil-, 2-0-alilo, 2'-flúor ou 2'-azido-ribose, análogos de açúcares carbocíclicos, açúcares alfa-anoméricos, açúcares epiméricos, tais como arabinose, xiloses ou lixoses e açúcares de piranose, açúcares de furanose, heptuloses, análogos acíclicos e análogos de nucleõsidos abásicos, tais como ribósido de metilo. Uma ou mais ligações fosfodiéster podem ser substituídas por grupos de ligação alternativos. Estes grupos de ligação alternativos incluem, mas não estão limitados a, formas de realização em que o fosfato é substituído por P(0)S ("tioato"), P(S)S ("ditioato"), (0)NR2 ("amidato"), P(0)R, P(0)0R!, CO ou CH2 ("formacetal"), em que cada R ou R é independentemente H ou alquilo substituído ou não substituído (1 a 20 C) contendo opcionalmente uma ligação éter (--0--), arilo, alcenilo, cicloalquilo, cicloalcenilo ou araldilo. Nem todas as ligações num polinucleõtido necessitam ser idênticas.
Conforme utilizado no presente documento, o termo "vetor" é utilizado em referência a moléculas de ácido nucleico que transferem segmento(s) de ADN a partir de uma célula para outra. 0 termo "vetor" significa uma construção, que é capaz de administrar, e preferentemente expressar, um ou mais gene(s) ou sequência(s) de interesse para uma célula hospedeira. Exemplos de vetores incluem, mas não estão limitados a, vetores virais, vetores de expressão de ADN ou ARM nu, vetores de plasmídeo, fagemídeo, cosmídeo ou fago, vetores de expressão de ADN ou ARN associados com agentes de condensação catiónicos, e ADN ou vetores de expressão de ARN encapsulados em lipossomas.
Os termos "polipéptido" e "péptido" e "proteína" e "fragmento de proteína" são no presente documento utilizados indistintamente no presente documento para referir um polímero de resíduos de aminoãcidos de qualquer comprimento. Os termos aplicam-se a polímeros de aminoãcidos, em que um ou ma is resíduos de aminoãcido no polímero é um produto químico artificial mimético de um aminoãcido correspondente de ocorrência natural, bem como a polímeros aminoãcidos de ocorrência natural e polímeros de aminoãcidos de ocorrência não natural. 0 polímero pode ser linear ou ramificado, pode compreender aminoãcidos modificados, e pode ser interrompido por não aminoãcidos. Os termos também abrangem um polímero de aminoãcido que tenha sido modificado naturalmente ou por intervençãoÊ por exemplo, formação de ligações dissulfureto, lipidação, glicosilação, acetilação, fosforilação, ou qualquer outra manipulação ou modificação, tais como a conjugação com um componente de marcação. Também estão incluídos dentro da definição, por exemplo, polipéptidos contendo um ou mais análogos de um aminoãcido (incluindo, por exemplo, aminoãcidos não naturais, etc.), bem como outras modificações conhecidas na técnica. É entendido que, dado que os polipéptidos da presente invenção são baseados, pelo menos em parte, em anticorpos, em determinadas formas de realização, os polipéptidos podem ocorrer como cadeias simples ou cadeias associadas. 0 termo "aminoãcido" refere-se a aminoãcidos de ocorrência natural e sintéticos, bem como a análogos de aminoácidos e miméticos de aminoãcidos que funcionam de forma semelhante aos aminoãcidos de ocorrência natural. Aminoãcidos de ocorrência natural são aqueles codificados pelo código genético, bem como os aminoácidos que são posteriormente modificados, por exemplo, hidroxiprolina, gama-carboxiglutamato e O-fosfoserina. Análogos de aminoácidos referem-se a compostos que têm a mesma estrutura química básica como um aminoácido de ocorrência natural, por exemplo, um carbono alfa que está ligado a um hidrogénio, um grupo carboxilo, um grupo amino, e um grupo R, por exemplo, homoserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metil sulfõnio de metionina. Tais análogos podem ter grupos R modificados (por exemplo, norleucina) ou cadeias principais de péptidos modificadas, mas mantêm a mesma estrutura química básica como um aminoácido de ocorrência natural. Mimético de aminoácido refere-se a compostos químicos que têm uma estrutura que é diferente da estrutura química geral de um aminoácido, mas que funciona de forma semelhante a um aminoácido de ocorrência natural.
Que um polipéptido ou outro agente "ligue especificamente" a uma proteína significa que o polipéptido ou outro agente reagem ou associa-se com mais frequência, mais rapidamente, com maior duração, com maior afinidade ou com alguma combinação do acima à proteína do que com substâncias alternativas, incluindo proteínas não relacionadas. Em determinadas formas de realização, "liga especificamente" significa, por exemplo, que um agente liga a uma proteína com uma KD de cerca de 0,1 mm ou menos, mas mais habitualmente menos de cerca de 1 μΜ. Em determinadas formas de realização, "liga especificamente" significa que um agente liga a uma proteína por vezes com uma KD de pelo menos cerca de 0,1 μΜ ou menos, pelo menos cerca de 0,01 μΜ ou menos, e outras vezes pelo menos cerca de 1 nM ou menos. Devido à identidade de sequência entre proteínas homólogas em diferentes espécies, as ligações específicas podem incluir um agente que reconhece uma proteína particular tal como uma proteína Wnt em mais de uma espécie. Igualmente, devido à homologia entre as diferentes proteínas Wnt em determinadas regiões das sequências das Wnts, as ligações específicas podem incluir um polipéptido (ou outro agente), que reconhece mais do que uma proteína Wnt. É entendido que um agente que liga especificamente a um primeiro alvo pode ou não ligar especificamente a um segundo alvo. Como tal, "ligação específica" não requer necessariamente (embora possa ser incluída) ligação exclusiva, isto é, ligação a um único alvo. Consequentemente, um agente pode, em determinadas formas de realização, ligar especificamente a mais de um alvo (por exemplo, vários Wnts humanos diferentes). Geralmente, mas não necessariamente, a referência a ligação significa ligação específica.
Os termos "idêntico" ou "percentagem de identidade", no contexto de dois ou mais ácidos nucleicos ou polipéptidos, referem-se a duas ou mais sequências ou subsequências que são as mesmas ou têm uma determinada percentagem de nucleõtidos ou de resíduos de aminoácidos que são os mesmos, quando comparados e alinhados (introduzindo lacunas, se necessário) para máxima correspondência, não considerando quaisquer substituições de aminoácidos conservativos como parte da identidade de sequência. A percentagem de identidade pode ser medida utilizando software de comparação de sequências ou algoritmos ou por inspeção visual. São conhecidos vários algoritmos e programas que podem ser utilizados para obter alinhamentos de aminoácido ou sequências de nucleõtidos na técnica. Um tal exemplo não limitante de um algoritmo de alinhamento de sequências é o algoritmo descrito em Karlin et al, 1990, Proc . Natl. Acad. Sei., 8μ:2264 - 2268 , conforme modificado em Karlin et al. , 19 93, PNAS, 90:58μ3-58μμ, e incorporado nos programas NBLAST e XBlast (Altschul et al, 1991, Nucleic Acids Res., 25:3389 -3402). Programas adicionais de software publicamente disponíveis que podem ser utilizados para alinhar as sequências incluem, mas não estão limitados a, Gapped BLAST, BLAST-2, WU-BLAST-2 (Altschul et ai., 1S96, Methods in Enzymology, 266:460-480), ALIGN, ALIGN-2 (Genentech, South San Francisco, Califórnia), Megalign (DNASTAR), e o programa BestFit (Wisconsin Sequence Analysis, Versão 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 5μ5 Science Drive, Madison, WI 53μ11).
Nalgumas formas de realização, dois ácidos nucleicos ou polipéptidos da invenção são substancialmente idênticos, o que significa que têm pelo menos μ0™ pelo menos μ5™ pelo menos 80™ pelo menos 85™ pelo menos 90™, e nalgumas formas de realização pelo menos 95™, 96™, 9μ™, 98™, 99™ de identidade de nucleótidos ou resíduos de aminoácido, quando comparados e alinhados para correspondência máxima, conforme medido utilizando um algoritmo de comparação de sequências ou por inspeção visual. Nalgumas formas de realização, existe identidade numa região das sequências que tem pelo menos cerca de 10, pelo menos cerca de 20, pelo menos cerca, de 40 - 60 pelo menos cerca de 60 - 80 resíduos de comprimento entre as mesmas, ou qualquer valor inteiro entre os mesmos. Nalgumas formas de realização, a identidade existe numa região mais longa do que 60 - 80 resíduos, tal como pelo menos cerca de 90 - 100 resíduos. Nalgumas formas de realização, as sequências são substancialmente idênticas ao longo de todo o comprimento das sequências sendo comparadas, tais como a região de codificação de uma sequência de nucleótidos.
Uma "substituição conservative de aminoácido" é uma em que um resíduo de aminoácido é substituído por outro resíduo de aminoácido com uma cadeia lateral semelhante. Foram definidas famílias de resíduos de aminoácidos tendo cadeias laterais semelhantes na técnica, incluindo cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico) e cadeias laterais polares sem carga (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, cisterna, tirosina) , cadeias laterais nao polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais beta-ramifiçadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Por exemplo, a substituição de uma fenilalanina com uma tirosina é uma substituição conservativa. Preferentemente, as substituições conservativas nas sequências dos polipéptidos e outros agentes da invenção não anulam a ligação do polipéptido contendo a sequência de aminoácidos ao(s) alvo (s) , isto é, o um ou mais Wnts ao(s) qual(is) o polipéptido ou outro agente liga. São bem conhecidos na técnica métodos de identificação de nucleótidos e substituição conservativa de aminoácidos que não eliminam a ligação do alvo (veja-se, por exemplo, Brummell et al, 1993, Biochem, 32:1180-8μΕ Kobayashi et al, 1999 , Protein Eng 12:8μ9-84Ê. e Burks et al, 199μ, PNAS, 94:412-1μ).
Conforme utilizado no presente documento "cerca de" refere-se a mais ou menos 10™ do número indicado. Por exemplo, "cerca de 10™" indica um intervalo de 9™ a 11™.
Conforme utilizado na divulgação e reivindicações atuais, as formas singulares "um" "uma" e "oôa" incluem formas de plural a menos que o contexto claramente indique o contrário. É entendido que onde quer que sejam descritas no presente documento formas de realização com a linguagem "compreendendo", também são proporcionadas formas de realização de outra forma análogas descritas em termos de "consistindo em" eôou "que consiste essencialmente em". 0 termo "eôou" conforme utilizado numa frase como "A eôou B" no presente documento pretende incluir A e BÊ A ou BÊ A (por si só) e B (por si só) . Igualmente, o termo "eôou", conforme utilizado numa frase como "A, B eôou C" destina-se a abranger cada uma das formas de realização seguintes: A, B e CÊ A, B, ou CÊ A ou CÊ A ou B, B ou CÊ A e CÊ A e BÊ B e CÊ A (por si só)Ê B (por si só) e C (por si só) . II. Agentes de ligação a Wnt A presente invenção proporciona agentes que ligam (por exemplo, ligam especificamente) a uma ou mais proteínas Wnt humanas (Wnts). Estes agentes são referidos no presente documento como "agente(s) de ligação a Wnt". Em determinadas formas de realização, os agentes ligam especificamente a uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez ou mais proteínas Wnt. A título de exemplo não limitante, o agente de ligação a Wnt pode ligar a Wntl, Wnt2, Wnt2b, Wnt3, Wnt3a, Wntpa, Wntpb, Wnt8a, Wnt8b, Wnt10a eôou Wnt10b. Em determinadas formas de realização, o agente de ligação a Wnt liga a Wntl, WNT2, Wnt3, Wnt3a e Wntpb.
Em determinadas formas de realização, o agente de ligação a Wnt é um antagonista de Wnt. Em determinadas formas de realização, o agente inibe a sinalização de Wnt. Nalgumas formas de realização, o agente inibe a sinalização Canónica Wnt.
Em determinadas formas de realização, o agente de ligação a Wnt é um polipéptido. Em determinadas formas de realização, o agente de ligação a Wnt é um recetor solúvel.
Em determinadas formas de realização, o agente de ligação a Wnt compreende o domínio extracelular de um recetor FZD. Nalgumas formas de realização, o agente de ligação a Wnt compreende um domínio Fri de um recetor FZD. Em determinadas formas de realização, o recetor de FZD é um recetor FSZ humano. Em determinadas formas de realização, o recetor humano FZD é FZD1, FZD2, FZD3, FZD4, FZD 5, FZD6, FZDp, FZD 8, FZD9, ou FZD10. Nalgumas formas de realização alternativas, o agente de ligação a Wnt compreende uma porção de um SFRP. Nalgumas formas de realização, o agente de ligação a Wnt compreende um domínio Fri de uma SFRP. Em determinadas formas de realização, o SFRP é um SFRP humano. Nalgumas formas de realização, o SFRP humano é SFRP1, SFRP2, SFRP3, SFRP4 ou SFRP5. Em formas de realização alternativas, o agente de ligação a Wnt compreende o domínio extracelular de uma proteína Ror. Nalgumas formas de realização, o agente de ligação a Wnt compreende um domínio Fri de uma proteína Ror. Em determinadas formas de realização, Ror é uma Ror humana. Nalgumas formas de realização, a Ror humana é Rorl ou Ror2.
Em determinadas formas de realização, o agente de ligação a Wnt é um recetor solúvel. Nalgumas formas de realização, o agente de ligação a Wnt é uma proteína solúvel. Em determinadas formas de realização, o agente de ligação a Wnt é um recetor FZD solúvel. Podem ser encontrados exemplos não limitantes de recetores solúveis FZD na Patente US μ.μ23.4μμ, que é incorporada no presente documento por referência na sua totalidade. Em determinadas formas de realização, o agente de ligação a Wnt é um SFRP solúvel ou um recetor de Ror solúvel. 0 domínio Fri de FZD1 inclui aproximadamente os aminoãcidos 8μ-23μ da SEQ ID NO: 2μ. 0 domínio Fri de FZD2 inclui aproximadamente os aminoãcidos 24-159 da SEQ ID NO: 28. 0 domínio Fri de FZD3 inclui aproximadamente os aminoãcidos 23-143 de SEQ ID NO: 29. 0 domínio Fri de FZD4 inclui aproximadamente os aminoãcidos 40-1μ0 de SEQ ID NO: 22. 0 domínio Fri de FZD5 inclui aproximadamente os aminoãcidos 2μ-15μ de SEQ ID NO: 23. 0 domínio Fri de FZD6 inclui aproximadamente os aminoãcidos 19 - 14 6 da SEQ ID NO: 24. 0 domínio Fri de FZDp inclui aproximadamente os aminoãcidos 33-1μ0 de SEQ ID NO: 25. 0 domínio Fri de FZD8 inclui aproximadamente os aminoãcidos 28-158 de SEQ ID NO: 30. 0 domínio Fri de FZD9 inclui aproximadamente os aminoãcidos 23-159 de SEQ ID NO: 31. 0 domínio de Fri FZD10 inclui aproximadamente os aminoãcidos 21-154 de SEQ ID NO: 26. Os correspondentes domínios Fri visados para cada um dos recetores humanos FZD são proporcionados como SEQ ID NOs: 32-41. As sequências mínimas, de núcleo do domínio Fri para cada um dos recetores humanos FZD (FZD 1 -10) são proporcionadas como SEQ ID NOs: 3 - 12. As sequências mínimas, de núcleo do domínio Fri para cada um dos SFRPs humanos (SFRP1-5) são proporcionados como SEQ ID NOs: 13-1μ. As sequências mínimas, de núcleo do domínio Fri de Rorl e Ror2 humano são proporcionados como SEQ ID NO: 58 e SEQ ID NO: 59. Os peritos na especialidade podem diferir na sua compreensão dos aminoácidos exatos correspondentes para os vários domínios Fri. Consequentemente, o terminal N ou terminal C dos domínios delineados acima e no presente documento pode prolongado ou ser reduzido por 1, 2, 3, 4, 5, β, μ, 8, 9, ou inclusive 10 aminoácidos.
Em determinadas formas de realização, o agente de ligação a Wnt compreende um domínio Fri de um recetor humano FZD, ou um fragmento ou variante do domínio Fri que liga a uma ou mais proteínas Wnt humanas. Em determinadas formas de realização, o recetor humano FZD é FZD1, FZD2, FZD3, FZD4, FZD5, FZD6, FZDp, FZD8, FZD9 OU FZD 10. Em determinadas formas de realização, o recetor humano FZD é FZD4. Em determinadas formas de realização alternativas, o recetor humano FZD é FZD5. Em determinadas formas de realização alternativas adicionais, o recetor humano FZD é FZD8. Em determinadas formas de realização, o FZD é FZD4 e o agente de ligação a Wnt compreende a SEQ ID NO: 6 ou compreende aproximadamente os aminoácidos 40 a 1μ0 da SEQ ID NO: 19. Em determinadas formas de realização, o FZD é FZD5 e o agente de ligação a Wnt compreende a SEQ ID NO: μ ou compreende aproximadamente os aminoácidos 2μ-15μ da SEQ ID NO: 20. Em determinadas formas de realização, o FZD é FZDp e o agente de ligação a Wnt compreende a SEQ ID NO: 9 ou compreende aproximadamente os aminoácidos 33-ΙμΟ da SEQ ID NO: 25. Em determinadas formas de realização, o FZD é FZD8 e o agente de ligação a Wnt compreende a SEQ ID NO: 10 ou compreende aproximadamente os aminoãcidos 28-158 da SEQ ID NO: 21. Em determinadas formas de realização, o FZD é FZD10 e o agente de ligação a Wnt compreende a SEQ ID NO: 12 ou compreende aproximadamente os aminoãcidos 21-154 da SEQ ID NO: 26.
Em determinadas formas de realização, o agente de ligação a Wnt compreende uma sequência mínima de domínio Fri selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs :3-12. Em determinadas formas de realização, o agente de ligação a Wnt compreende uma sequência mínima de domínio Fri selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 13-1μ. Em determinadas formas de realização, o agente de ligação a Wnt compreende uma sequência mínima de domínio Fri selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 58 e SEQ ID NO: 59.
Em determinadas formas de realização, o agente de ligação a Wnt compreende uma variante de qualquer uma das sequências de domínio Fri de FZD mencionadas acima que compreende uma ou mais (por exemplo, uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, 10, etc.) substituições conservatives e é capaz de ligar Wnt(s).
Em determinadas formas de realização alternativas, o agente de ligação a Wnt compreende um domínio Fri de uma SFRP humana ou um fragmento ou variante de um tal domínio Fri que liga a uma ou mais proteínas Wnt humanas. Por exemplo, em determinadas formas de realização, o agente compreende uma sequência mínima de domínio Fri SFRP selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 13-1μ. Em determinadas formas de realização, o agente de ligação a Wnt compreende uma variante de qualquer uma das sequências de domínio Fri de SFRP mencionadas acima que compreende uma ou mais (por exemplo, uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, etc.) substituições conservativas e mantém a capacidade de ligar a Wnt.
Em determinadas formas de realização alternativas, o agente de ligação a Wnt compreende um domínio Fri de uma proteína Ror humana, ou um fragmento ou variante de um tal domínio Fri que liga a uma ou mais proteínas Wnt humanas. Por exemplo, em determinadas formas de realização, o agente compreende uma sequência de domínio Fri Ror mínimo selecionado a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 58 e SEQ ID NO: 59. Em determinadas formas de realização, o agente de ligação a Wnt compreende uma variante de qualquer um das sequências de domínio Fri de Ror mencionadas acima que compreende uma ou mais (por exemplo, uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, etc.) substituições conservatives e mantém a capacidade de ligar a Wnt.
Em determinadas formas de realização, o agente de ligação a Wnt, tal como um agente que compreende um domínio Fri mínimo de um recetor humano FZD ou outro recetor solúvel FZD, compreende ainda uma região Fc humana (por exemplo, uma região Fc IgGl humana) . A região Fc pode ser obtida a partir de qualquer das classes de imunoglobulina, IgG, IgA, IgM, IgD e IgE. Nalgumas formas de realização, a região Fc é uma região Fc de tipo selvagem. Nalgumas formas de realização, a região Fc é uma região Fc mutante. Nalgumas formas de realização, a região Fc é truncada na extremidade N-terminal por 1, 2, 3, 4, 5, 6, μ, 8, 9 ou 10 aminoácidos, (por exemplo, no domínio de dobradiça). Nalgumas formas de realização, um aminoãcido no domínio de dobradiça é alterado para impedir a formação de ligações dissulfureto indesejáveis. Nalgumas formas de realização, uma cisteína é substituída por uma serina para impedir a formação de ligações dissulfureto indesejáveis. Em determinadas formas de realização, a região Fc compreende OU consiste na SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 42, ou SEQ ID NO: 43 .
Em determinadas formas de realização, um agente de ligação a Wnt é uma proteína de fusão compreendendo pelo menos um domínio Fri mínimo de um recetor de FZD, uma proteína SFRP ou Ror e uma região Fc. Conforme utilizado no presente documento, uma "proteína de fusão" é uma proteína híbrida expressada por uma molécula de ácido nucleico compreendendo sequências de nucleótidos de pelo menos dois genes. Nalgumas formas de realização, o terminal C do primeiro polipéptido está ligado ao terminal N da região Fc da imunoglobulina. Nalgumas formas de realização, o primeiro polipéptido (por exemplo, um domínio Fri de FZD) está diretamente ligado à região Fc (isto é, sem um ligante peptídico interveniente). Nalgumas formas de realização, o primeiro polipéptido é ligado à região Fc através de um ligante peptídico.
Conforme utilizado no presente documento, o termo "ligante" refere-se a um ligante inserido entre um primeiro polipéptido (por exemplo, um componente FZD) e um segundo polipéptido (por exemplo, uma região Fc) . Nalgumas formas de realização, o ligante é um ligante peptídico. Os ligantes não devem afetar negativamente a expressão, secreção, ou bioatividade do polipéptido. Os ligantes não devem ser antigénicos e não devem provocar uma resposta imune. São conhecidos ligantes adequados pelos peritos na especialidade e incluem frequentemente misturas de glicina e resíduos de serina e incluem frequentemente aminoácidos que são estericamente desimpedidos. Outros aminoácidos que podem ser incorporados em ligantes úteis incluem resíduos de treonina e alanina. Os ligantes podem variar em comprimento, por exemplo, desde 1-50 aminoácidos de comprimento, 1 - 22 aminoácidos de comprimento, 1 - 10 aminoácidos de comprimento, 1-5 aminoácidos de comprimento, ou 1-3 aminoácidos de comprimento. Os ligantes podem incluir, mas não estão limitados a, SerGly, GGSG, GSGS, GGGS, S(GGS)n, em que n é 1 - μ, GRA, poli(Gly), poli (Ala), ESGGGGVT (SEQ ID NO: 60), LESGGGGVT (SEQ ED NO: 61), GRAQVT (SEQ ID NO: 62), WRAQVT (SEQ ID MO: 63), e ARGRAQVT (SEQ ID NO: 64) . Conforme utilizado no presente documento, um ligante é uma sequência peptídica interveniente que não inclui resíduos de aminoãcidos a partir do terminal C do primeiro polipéptido (por exemplo, um domínio Fri de FZD) ou o terminal N do segundo polipéptido (por exemplo, a região Fc).
Os recetores FZD e SFRPs e proteínas Ror contém uma sequência de sinal que dirige o transporte das proteínas. As sequências de sinal (também referidas como péptidos de sinal ou sequências Irder) estão localizadas no terminal N de polipéptidos nascentes. Dirigem o polipéptido para o retículo endoplasmático e as proteínas são classificadas para os seus destinos, por exemplo, para o espaço interior de um organelo, para uma membrana interna, para a membrana externa da célula ou para o exterior da célula através de secreção. A maioria das sequências de sinal são clivadas a partir da proteína por uma peptidase de sinal após as proteínas serem transportadas para o retículo endoplasmático. A clivagem da sequência de sinal do polipéptido geralmente ocorre num local específico na sequência de aminoãcidos e é dependente de resíduos de aminoãcidos dentro da sequência de sinal. Embora exista geralmente um local de clivagem específico, pode ser reconhecido eôou utilizado mais do que um local de clivagem por uma peptidase sinal, resultando num terminal N não homogéneo do polipéptido. Por exemplo, a utilização de sítios de clivagem diferentes dentro de uma sequência de sinal pode resultar num polipéptido expresso com diferentes aminoãcidos N-terminais. Deste modo, nalgumas formas de realização, os polipéptidos conforme descritos no presente documento podem compreender uma mistura de polipéptidos com diferentes terminais N. Nalgumas formas de realização, o terminal N difere em comprimento por 1, 2, 3, 4 ou 5 aminoãcidos. Nalgumas formas de realização, o polipéptido é substancialmente homogéneo, isto é, os polipéptidos têm o mesmo terminal N. nalgumas formas de realização, a sequência de sinal do polipéptido compreende uma ou mais (por exemplo, uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, etc.) substituições eôou eliminações de aminoãcidos. Nalgumas formas de realização, a sequência de sinal do polipéptido compreende substituições eôou eliminações de aminoãcidos que permitem que um local de clivagem possa ser dominante, resultando consequentemente num polipéptido substancialmente homogéneo com um terminal N. Nalgumas formas de realização, a sequência de sinal é a SEQ ID NO: 6μ (aminoãcidos 1-2μ da SEQ ID NO: 30). Nalgumas formas de realização, os aminoãcidos 25 eôou 26 da SEQ ID NO: 6μ são substituídos com aminoãcidos diferentes. Nalgumas formas de realização, os aminoãcidos 1μ, 18, 19, 23, 24, 25, eôou 26 da SEQ ID NO: 6μ são substituídos com aminoãcidos diferentes. Nalgumas formas de realização, os aminoãcidos 1μ, 23, 24, 25, e 26 da SEQ ID NO: 6μ são substituídos com aminoãcidos diferentes. Nalgumas formas de realização, o aminoácido 1μ de SEQ ID NO: 6μ é substituído com uma fenilalanina ou uma leucina. Nalgumas formas de realização, o aminoácido 23 de SEQ ID NO: 6μ é substituído com uma prolina. Nalgumas formas de realização, o aminoácido 24 da SEQ ID NO: 6μ é substituído com uma isoleucina ou uma fenilalanina. Nalgumas formas de realização, o aminoácido 25 de SEQ ID NO: 6μ é substituído com uma valina, uma isoleucina ou uma alanina. Nalgumas formas de realização, o aminoácido 26 de SEQ ID NO: 6μ é substituído com uma histidina, uma tirosina ou uma histidina. Nalgumas formas de realização, o aminoácido 25 de SEQ ID NO: 6μ é substituído com uma valina. Nalgumas formas de realização, o aminoácido 26 de SEQ ID NO: 6μ é substituído com uma leucina. Nalgumas formas de realização, a sequência de sinal do polipéptido compreende ou é constituído por uma sequência selecionada a partir do grupo listado no Quadro 1.
Quadro 1
Em determinadas formas de realização, o agente de ligação a Wnt compreende um primeiro polipéptido compreendendo um componente de domínio FZD e uma região Fc. Nalgumas formas de realização, o componente de domínio FZD é a partir de FZD1, FZD2, FZD3, FZD4, FZD 5, FZD6, FZDp, FZD8, FZD9 ou FZD10. Nalgumas formas de realização, a região Fc é a partir de uma imunoglobulina IgGl. Nalgumas formas de realização, o agente de ligação a Wnt compreende: (a) um primeiro polipéptido consistindo essencialmente em aminoácidos selecionados a partir do grupo consistindo em: XI a Y1 da SEQ ID NO: 2μ, X2 a Y2 da SEQ ID NO: 28, X3 a Y3 da SEQ ID NO: 29, X4 a Y4 da
SEQ ID NO: 22, X5 a Y5 da SEQ ID NO: 23, X6 a Y6 da SEQ ID NO: 24, Χμ a Υμ da SEQ FD NO: 25, X8 a Y8 da SEQ ID
NO: 30, X9 a Y9 da SEQ ID NO: 31 e X10 a Y10 da SEQ ID NO: 26Ê e (b) um segundo polipéptido consistindo essencialmente nos aminoácidos A a B da SEQ ID NO: 43Ê em que XI = aminoácido 69, μ0, μΐ,μ2, μ3, μ4, μ5 ou μ6 Υ1 = aminoácido 236, 23μ, 238, 239, 240, 241, 242, ou 243 Χ2 = aminoácido 22, 23, 24, 25, 26, 2μ ou 28 Υ2 = aminoácido 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 16μ, 168, 169, ΙμΟ, Ιμΐ ou 1μ2 Χ3 = aminoácido 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ou 25 Υ3 = aminoácido 141, 142, 143, 144, 145, 146, 14μ, 148, ou 14 9 Χ4 = aminoácido 38, 39, 40, 41, ou 42 Υ4 = aminoácido 168, 169, ΙμΟ, Ιμΐ, 1μ2, 1μ3, 1μ4, 1μ5 ou 1μ6 Χ5 = aminoácido 25, 26, 2μ, 28 ou 29 Υ5 = aminoácido 155, 156, 15μ, 158, 159, 160, 161, 162, 163, ou 164 Χ6 = aminoácido 19, 20, 21, 22, 23, ou 24 Υ6 = aminoácidos 144, 145, 146, 14μ, 148, 149, 150, 151 ou 152 Χμ = aminoácido 22, 23, 24, 25, 26, 2μ, 28, 29, 30, 31, 32, 33, ou 3 4 Υμ = aminoácido 1μ8, 1μ9, 180, 181, 182, 183, 184, 185, ou 186 Χ8 = aminoácido 25 de 26 2μ, 28, 29, 30 ou 31 Υ8 = aminoácido 156, 15μ, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164 ou Χ9 = aminoácido 21, 22, 23, ou 24 Υ9 = aminoácido 13μ, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145 ou 146 Χ10 = aminoácido 20, 21, 22, 23, 24, ou 25 Y10 = aminoácido 152, 153, 154, 155, 156, 15μ, 158, 159, ou 16 0 A = aminoácido 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 B = aminoácido 231 ou 232.
Nalgumas formas de realização, o primeiro polipéptido está diretamente relacionado com o segundo polipéptido. Nalgumas formas de realização, o primeiro polipéptido é ligado ao segundo polipéptido através de um ligante peptídico. Nalgumas formas de realização, o primeiro polipéptido é ligado ao segundo polipéptido através do ligante peptídico GRA. Um polipéptido (por exemplo, um primeiro ou segundo polipéptido) que "consiste essencialmente em" determinados aminoãcidos ou é "constituído essencialmente por determinados aminoãcidos" pode, nalgumas formas de realização, incluir um ou mais (por exemplo, um, dois, três, quatro ou mais aminoãcidos adicionais) num ou ambos terminais, contanto que os aminoãcidos adicionais não afetem materialmente a função do agente de ligação a Wnt.
Em determinadas formas de realização, o agente de ligação a Wnt compreende: (a) um primeiro polipéptido consistindo essencialmente nos aminoãcidos X a Y de SEQ ID NO: 30, e (b) um segundo polipéptido consistindo essencialmente nos aminoãcidos A a B da SEQ ID NO: 43Ê em que o primeiro polipéptido está diretamente ligado ao segundo polipéptido, e, em que X = aminoácido 25, 26, 2μ, 28, 29, 30 ou 31 Y = aminoácido 156, 15μ, 158, 159, 160, 161, 162, 163, ou 164 A = aminoácido 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 B = aminoácido 231 ou 232.
Nalgumas formas de realização, o primeiro polipéptido consiste essencialmente nos aminoãcidos 25-158 de SEQ ID NO: 30. Nalgumas formas de realização, o primeiro polipéptido consiste nos aminoãcidos 25-158 da SEQ ID NO: 30. Nalgumas formas de realização, o primeiro polipéptido consiste essencialmente dos aminoãcidos 28-158 da SEQ ID NO: 30. Em outras formas de realização, o primeiro
polipéptido consiste nos aminoãcidos 28-158 da SEQ ID NO: 30. Nalgumas formas de realização, o primeiro polipéptido consiste nos aminoãcidos 31-158 da SEQ ID NO: 30. Nalgumas formas de realização, o segundo polipéptido consiste nos aminoãcidos 1 -232 da SEQ ID NO: 43. Nalgumas formas de realização, o segundo polipéptido consiste nos aminoãcidos 3-232 de SEQ ID NO: 43. Nalgumas formas de realização, o segundo polipéptido consiste nos aminoãcidos 6-232 da SEQ ID NO: 43. Nalgumas formas de realização, o primeiro polipéptido é a SEQ ID NO: 39 e o segundo polipéptido é a SEQ ID NO: 43. Nalgumas formas de realização, o primeiro polipéptido é a SEQ ID NO: 39 e o segundo polipéptido é a SEQ ID NO: 42. Nalgumas formas de realização, o primeiro polipéptido é a SEQ ID NO: 39 e o segundo polipéptido é a SEQ ID NO: 18.
Nalgumas formas de realização, o agente de ligação a Wnt é um polipéptido compreendendo um primeiro polipéptido e um segundo polipéptido, em que os polipéptidos são selecionados a partir do Quadro 2.
Quadro 2
Em algumas formas de realização, o agente de ligação a Wnt compreende uma sequência de aminoãcidos selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 4μ, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 5 1, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 65 e SEQ ID NO: 66.
Em determinadas formas de realização, o agente de ligação a Wnt compreende a sequência de SEQ ID NO: 1. Em determinadas formas de realização alternativas, o agente compreende a sequência de SEQ ID NO: 1, que compreende um ou mais (por exemplo, uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, etc.) substituições conservativas. Em determinadas formas de realização, o agente compreende uma sequência tendo pelo menos cerca de 90™, cerca de 95™ ou cerca de 9 8™ de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1. Em determinadas formas de realização, as variantes da SEQ ID NO: 1 mantém a capacidade de ligar a um ou mais Wnts humanos.
Em determinadas formas de realização, o agente de ligação a Wnt compreende a sequência da SEQ ID NO: 46. Nalgumas formas de realização, o agente de ligação a Wnt é a SEQ ID NO: 46. Em determinadas formas de realização alternativas, o agente compreende a sequência da SEQ ID NO: 46, compreendendo uma ou mais (por exemplo, uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, etc.) substituições conservativas. Em determinadas formas de realização, o agente compreende uma sequência tendo pelo menos cerca de 90™, cerca de 95™ ou cerca de 98™ de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 46. Em determinadas formas de realização, as variantes da SEQ ID NO: 46 mantém a capacidade de ligar a um ou mais Wnts humanos.
Em determinadas formas de realização, o agente de ligação a Wnt compreende a sequência de SEQ ID NO: 48. Nalgumas formas de realização, o agente de ligação a Wnt é a SEQ ID NO: 48. Em determinadas formas de realização alternativas, o agente compreende a sequência da SEQ ID NO: 48, compreendendo uma ou mais (por exemplo, uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, etc.) substituições conservativas. Em determinadas formas de realização, o agente compreende uma sequência tendo pelo menos cerca de 90 ™, cerca de 95 ™ ou cerca de 98 ™ de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48. Em determinadas formas de realização, as variantes da SEQ ID NO: 48 mantém a capacidade de ligar a um ou mais Wnts humanos.
Em determinadas formas de realização, o agente de ligação a Wnt compreende a sequência da SEQ ID NO: 50. Nalgumas formas de realização, o agente de ligação a Wnt é a SEQ ID NO: 50. Em determinadas formas de realização alternativas, o agente compreende a sequência da SEQ ID NO: 50, compreendendo uma ou mais (por exemplo, uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, etc.) substituições conservativas. Em determinadas formas de realização, o agente compreende uma sequência tendo pelo menos cerca de 90 ™, cerca de 95 ™ ou cerca de 98 ™ de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 50. Em determinadas formas de realização, as variantes da SEQ ID NO: 50 mantém a capacidade de ligar a uma ou mais Wnts humanos.
Em determinadas formas de realização, o agente de ligação a Wnt compreende a sequência da SEQ ID NO: 53. Nalgumas formas de realização, o agente de ligação a Wnt é a SEQ ID NO: 53. Em determinadas formas de realização alternativas, o agente compreende a sequência da SEQ ID NO: 53, compreendendo uma ou mais (por exemplo, uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, etc) substituições conservativas. Em determinadas formas de realização, o agente compreende uma sequência tendo pelo menos cerca de 90 ™, cerca de 95 ™ ou cerca de 98 ™ de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 53. Em determinadas formas de realização, as variantes da SEQ ID NO: 53 mantém a capacidade de ligar a um ou mais Wnts humanos.
Em algumas formas de realização, os agentes de ligação a Wnt conforme descritos no presente documento inibem o crescimento de um tumor ou células tumorais. Nalgumas formas de realização, os agentes de ligação a Wnt induzem as células de um tumor a diferenciar-se. Nalgumas formas de realização, os agentes de ligação a Wnt induzem a expressão de marcadores de diferenciação numa célula tumoral ou tumor. Em determinadas formas de realização, os agentes de ligação a Wnt reduzem a frequência de células estaminais cancerígenas num tumor. Nalgumas formas de realização, um agente de ligação a Wnt compreendendo a SEQ ID NO: 46 inibe o crescimento do tumor a um grau maior do que um agente de ligação a Wnt compreendendo a SEQ ID NO: 1. Nalgumas formas de realização, um agente de ligação a Wnt compreendendo a SEQ ID NO: 48 inibe o crescimento do tumor a um grau maior do que um agente de ligação a Wnt compreendendo a SEQ ID NO: 1. Nalgumas formas de realização, um agente de ligação a Wnt compreendendo a SEQ ID NO: 50 inibe o crescimento do tumor a um grau maior do que um agente de ligação a Wnt compreendendo a SEQ ID NO: 1. Nalgumas formas de realização, um agente de ligação a Wnt compreendendo a SEQ ID NO: 53 inibe o crescimento do tumor a um grau maior do que um agente de ligação a Wnt compreendendo a SEQ ID NO: 1. Nalgumas formas de realização, um agente de ligação a Wnt conforme descrito no presente documento inibe o crescimento do tumor a um grau maior do que um agente de ligação a Wnt compreendendo um componente de domínio FZD, um domínio Fc e um componente ligante que liga o componente de domínio FZD e o domínio Fc. Nalgumas formas de realização, o componente ligante é um ligante peptídico interveniente.
Em determinadas formas de realização, os agentes de ligação a Wnt conforme descritos no presente documento inibem o crescimento de um tumor dependente de Wnt. Nalgumas formas de realização, o tumor é um tumor selecionado a partir do grupo consistindo em tumor colorretal, tumor do cólon, tumor do pâncreas, tumor do pulmão, tumor do ovário, tumor do fígado, tumor da mama, tumor renal, tumor da próstata, tumor gastrointestinal, melanoma, tumor cervical, tumor da bexiga, glioblastoma, tumor de cabeça e pescoço. Em determinadas formas de realização, o tumor é um tumor colorretal. Em determinadas formas de realização, o tumor é um tumor pancreãtico. Em determinadas formas de realização, o tumor é um tumor da mama.
Em determinadas formas de realização, é proporcionado um polipéptido compreendendo uma sequência de aminoãcidos selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 4μ, SEQ ID NO: 48, SEQ ID No.-49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 65 e SEQ ID NO: 66. Em determinadas formas de realização, o polipéptido compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50 e SEQ ID NO: 53. Nalgumas formas de realização, um polipéptido consiste numa sequência de aminoãcidos selecionada a partir do grupo consistindo da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50 e SEQ ID NO: 53. Em determinadas formas de realização, o polipéptido compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 50. Nalgumas formas de realização, o polipéptido é a SEQ ID NO: 50. Em determinadas formas de realização, o polipéptido compreende a sequência de aminoãcidos da SEQ ID NO: 53. Nalgumas formas de realização, o polipéptido é a SEQ ID NO: 53.
Em determinadas formas de realização, o polipéptido (antes da clivagem da sequência de sinal) compreende a SEQ ID NO: 50 e uma sequência de sinal selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 6μ, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: μ0, SEQ ID NO: μΐ, SEQ ID NO: μ2, SEQ ID NO: μ3 e SEQ ID NO: μ4. Em determinadas formas de realização, o polipéptido (antes da clivagem sequência de sinal) compreende SEQ ID MO: 50 e uma sequência de sinal selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: μ0, SEQ ID NO: μΐ, SEQ ID NO: μ2, SEQ ID NO: μ3, e SEQ ID NO: μ4. Nalgumas formas de realização, o polipéptido (antes da clivagem da sequência de sinal) compreende a SEQ ID NO: 53 e uma sequência de sinal selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 6μ, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: μ0, SEQ ID NO: μΐ, SEQ ID NO: μ2, SEQ ID NO: μ3 e SEQ ID NO: μ4. Nalgumas formas de realização, o polipéptido (antes da clivagem da sequência de sinal) compreende SEQ ID NO: 53 e uma sequência de sinal selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: μ0, SEQ ID NO: μΐ, SEQ ID NO: μ2, SEQ ID NO: μ3, e SEQ ID NO: μ4. Nalgumas formas de realização, o polipéptido compreende a SEQ ID NO: μΐ e SEQ ID NO: 50. Nalgumas formas de realização, o polipéptido compreende a SEQ ID NO: μΐ e SEQ ID NO: 53. Nalgumas formas de realização, o polipéptido compreende a SEQ ID NO: μ5. Nalgumas formas de realização, o polipéptido consiste essencialmente na SEQ ID NO: μ5.
Nalgumas formas de realização, o polipéptido é um polipéptido substancialmente purificado compreendendo uma sequência de aminoãcidos selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, e SEQ ID NO: 53. Em determinadas formas de realização, o polipéptido substancialmente purificado consiste em pelo menos 90™ de um polipéptido que tem uma sequência N-terminal de ASA. Nalgumas formas de realização, o polipéptido nascente compreende uma sequência de sinal selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs :6μ-μ4. Nalgumas formas de realização, o polipéptido nascente compreende uma sequência de sinal da SEQ ID NO: μΐ. Nalgumas formas de realização, o polipéptido nascente compreende uma sequência de sinal que resulta num produto de polipéptido substancialmente homogéneo com uma sequência N-terminal.
Em determinadas formas de realização alternativas, o agente não compreende um domínio Fri de um recetor FZD.
Em determinadas formas de realização, o agente de ligação a Wnt é um anticorpo (por exemplo, um anticorpo que liga especificamente a uma ou mais proteínas Wnt).
Em determinadas formas de realização, o agente de ligação a Wnt compreende uma região Fc de uma imunoglobulina. Os peritos na especialidade irão apreciar que os agentes de ligação da presente invenção compreendem proteínas de fusão, em que pelo menos uma fração da região Fc foi eliminada ou de outra forma alterada, de modo a proporcionar características bioquímicas desejadas, tais como a localização de células cancerígenas aumentada, penetração do tumor aumentada, semivida sérica reduzida ou semivida sérica aumentada, quando comparado com uma proteína de fusão de aproximadamente a mesma imunogenicidade que compreende uma região nativa ou inalterada constante. As modificações da região Fc podem incluir adições, eliminações ou substituições de um ou mais aminoãcidos num ou mais domínios. As proteínas de fusão modificadas descritas no presente documento podem compreender alterações ou modificações num ou mais dos dois domínios constantes de cadeia pesada (CH2 ou CH3) ou na região de dobradiça. Noutras formas de realização, é removido o domínio CH2 inteiro (construções ACH2). Nalgumas formas de realização, o domínio da região constante omitido é substituído por um espaçador curto de aminoãcidos (por exemplo, de 10 resíduos aa) que proporciona alguma da flexibilidade molecular tipicamente atribuída pelo domínio de região constante ausente.
Nalgumas formas de realização, as proteínas de fusão modificadas são manipuladas para ligar o domínio CH3 diretamente à região de dobradiça do anticorpo. Noutras formas de realização, é inserido um espaçador peptídico entre a região de dobradiça e os domínios CH2 eôou CH3 modificados. Por exemplo, podem ser expressas construções em que o domínio CH2 tenha sido eliminado e o domínio CH3 restante (modificado ou não modificado) é unido à região de dobradiça com um espaçador de 5 - 20 aminoãcidos. Pode ser adicionado um tal espaçador para garantir que os elementos reguladores do domínio constante permanecem livres e acessíveis ou que a região de dobradiça continua a ser flexível. No entanto, deve ser notado que os espaçadores de aminoãcidos podem, nalguns casos, provar ser imunogénicos e eliciar uma resposta imune indesejada contra a construção. Consequentemente, em determinadas formas de realização, qualquer espaçador adicionado à construção será relativamente não imunogénico, de modo a manter as qualidades biológicas desejadas dos anticorpos modificados.
Nalgumas formas de realização, as proteínas de fusão modificadas podem ter apenas uma eliminação parcial de um domínio constante ou substituição de alguns ou inclusive um único aminoãcido. Por exemplo, a mutação de um único aminoãcido em áreas selecionadas do domínio CH2 pode ser suficiente para reduzir substancialmente a ligação a Fc e consequentemente aumentar a localização de células cancerígenas eôou a penetração do tumor. Do mesmo modo, pode ser desejável simplesmente eliminar a parte de um ou mais domínios da região constante que controla uma função específica efetora (por exemplo, a ligação a complemento Clq) a ser modulada. Tais eliminações parciais das regiões constantes podem melhorar as características selecionadas do anticorpo (por exemplo, semivida sérica), deixando outras funções desejáveis associadas com o domínio da região constante em questão intatas. Além disso, conforme mencionado acima, as regiões constantes das proteínas de fusão divulgadas podem ser modificadas através da mutação ou substituição de um ou mais aminoãcidos que melhoram o perfil da construção resultante. A este respeito pode ser possível interromper a atividade proporcionada por um sítio de ligação conservado (por exemplo, ligação a Fc), enquanto substancialmente mantendo o perfil de configuração e imunogénico do anticorpo modificado. Em determinadas formas de realização, as proteínas de fusão modificadas compreendem a adição de um ou mais aminoácidos à região constante para melhorar as características desejáveis, tais como aumentar ou diminuir a função efetora, ou proporcionar uma maior citotoxina ou ligação de hidratos de carbono. É sabido na técnica que a região constante medeia várias funções efetoras. Por exemplo, a ligação do componente Cl do complemento à região Fc de IgG ou IgM (ligado a antigénio) ativa o sistema de complemento. A ativação do complemento é importante na opsonização e lise de organismos patogénicos celulares. A ativação do complemento também estimula a resposta inflamatória e também pode estar envolvida na hipersensibilidade autoimune. Além disso, a região Fc de um anticorpo pode ligar a uma célula que expressa um recetor de Fc (FcR) . Existem uma série de recetores Fc que são específicos para diferentes classes de anticorpos, incluindo IgG (recetores gama), IgE (recetores epsilon), IgA (recetores alfa) e IgM (recetores mu) . A ligação do anticorpo aos recetores Fc nas superfícies das células desencadeia um número de importantes e diversas respostas biológicas, incluindo envolvimento e destruição de partículas revestidas com anticorpo, depuração de complexos imunes, lise de células alvo revestidas com anticorpo por células killer (citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos ou ADCC), libertação de mediadores inflamatórios, transferência placentária, e controlo da produção de imunoglobulinas.
Nalgumas formas de realização, os agentes de ligação a Wnt proporcionam funções efetoras alteradas que, por sua vez, afetam o perfil biológico do agente administrado. Por exemplo, nalgumas formas de realização, a eliminação ou inativação (através de mutações pontuais ou outros meios) de um domínio da região constante pode reduzir a ligação a recetor de Fc do agente de circulação modificado (por exemplo, agente de ligação a Wnt) deste modo aumentando a localização de células cancerígenas eôou penetração do tumor. Noutras formas de realização, as modificações da região constante aumentam ou reduzem a semivida sérica do agente. Nalgumas formas de realização, a região constante é modificada para eliminar ligações dissulfureto ou frações de oligossacarídeos.
Em determinadas formas de realização, um agente de ligação a Wnt não tem uma ou mais funções efetoras normalmente associados com uma região Fc. Nalgumas formas de realização, o agente não tem atividade ADCC, eôou atividade de citotoxicidade dependente do complemento (CDC) . Em determinadas formas de realização, o agente não liga ao recetor Fc eôou fatores de complemento. Em determinadas formas de realização, o agente não tem função efetora.
Nalgumas formas de realização, os agentes de ligação a Wnt descritos no presente documento são modificados para reduzir a imunogenicidade. Em geral, as respostas imunes contra proteínas humanas completamente normais são raras quando estas proteínas são utilizadas como agentes terapêuticos. No entanto, embora muitas proteínas de fusão compreendam sequências de polipéptidos que são as mesmas que as sequências encontradas na natureza, várias proteínas de fusão terapêuticas têm sido mostradas como sendo imunogénicas em mamíferos. Nalguns estudos, uma proteína de fusão compreendendo um ligante foi constatada como sendo mais imunogénica do que uma proteína de fusão que não contém um ligante. Por conseguinte, nalgumas formas de realização, os polipéptidos da invenção são analisados por métodos de cálculo para prever a imunogenicidade. Nalgumas formas de realização, os polipéptidos são analisados para a presença de epítopos de células T eôou de células B. Se forem identificados eôou visados quaisquer epítopos de células T ou células B, podem ser realizadas modificações nestas regiões (por exemplo, substituições de aminoácidos) para romper ou destruir os epítopos. São conhecidos vários algoritmos e software que podem ser utilizados para prever epítopos de células T eôou de células B na técnica. Por exemplo, os programas de software SYFPEITHI, HLA Bind, PEPVAC, RANKPEP, DiscoTope, ElliPro e Antibody Prediction Epitope encontram-se todos publicamente disponíveis.
Nalgumas formas de realização, é proporcionada uma célula de produção de qualquer dos agentes de ligação a Wnt ou polipéptidos descritos no presente documento. Nalgumas formas de realização, é proporcionada uma composição compreendendo qualquer um dos agentes de ligação a Wnt ou polipéptidos no presente documento descritos. Nalgumas formas de realização, a composição compreende um polipéptido no qual pelo menos 80™, 90™, 95™, 9μ™, 98™ ou 99™ do polipéptido tem uma sequência N-terminal de ASA. Nalgumas formas de realização, a composição compreende um polipéptido em que 100™ do polipéptido tem uma sequência N-terminal de ASA. Nalgumas formas de realização, a composição compreende um polipéptido, no qual pelo menos 80™ do polipéptido tem uma sequência N-terminal de ASA. Nalgumas formas de realização, a composição compreende um polipéptido no qual pelo menos 90™ do polipéptido tem uma sequência N-terminal de ASA. Nalgumas formas de realização, a composição compreende um polipéptido no qual pelo menos 95™ do polipéptido tem uma sequência N-terminal de ASA.
Os polipéptidos da presente invenção pode ser polipéptidos recombinantes, polipéptidos naturais ou polipéptidos sintéticos. Será reconhecido na técnica que algumas sequências de aminoácidos da invenção podem ser variadas sem efeito significativo sobre a estrutura ou função da proteína. Se tais diferenças de sequência são contempladas, deve ser recordado que haverá áreas críticas na proteína que determinam a atividade. Consequentemente, a invenção inclui ainda as variantes dos polipéptidos que mostram atividade substancial ou que incluem regiões de proteínas FZD, proteínas SFRP ou proteínas Ror, tais como as frações de proteínas discutidas no presente documento. Tais mutantes incluem eliminações, inserções, inversões, repetições e tipos de substituições. Conforme indicado abaixo, pode ser encontrada orientação relativa a que alterações de aminoácidos são suscetíveis de ser fenotipicamente silenciosa em Bowie, et al, 1990, Science, 24μ: 1306-1310.
Naturalmente, o número de substituições de aminoácidos para um perito na especialidade depende de vários fatores, incluindo aqueles descritos acima. Em determinadas formas de realização, o número de substituições para qualquer determinado polipéptido recetor solúvel não será mais do que 50, 40, 30, 25, 20, 15, 10, 5 ou 3.
Podem ser empregues fragmentos ou frações dos polipéptidos da presente invenção para produzir o polipéptido de comprimento completo correspondente por síntese de péptidos, como tal, os fragmentos podem ser empregues como intermediários para a produção dos polipéptidos de comprimento total. Estes fragmentos ou porção dos polipéptidos também podem ser referidos como "fragmentos de proteína" ou "fragmentos de polipéptidos".
Um fragmento de proteína da presente invenção é uma porção, ou a totalidade, de uma proteína que é capaz de ligar a uma ou mais proteínas Wnt humanas (por exemplo, um recetor humano FZD, um SFRP humano ou uma proteína Ror) . Nalgumas formas de realização, o fragmento tem uma afinidade elevada para uma ou mais proteínas Wnt humanos. Alguns fragmentos de proteínas de fusão descritos no presente documento são fragmentos de proteínas que compreendem pelo menos parte da fração extracelular de um recetor de FZD, um SFRP ou a fração extracelular de uma proteína Ror que contém um domínio de ligação ligada a pelo menos uma parte de uma região constante de uma imunoglobulina (por exemplo, uma região Fc). A afinidade de ligação do fragmento de proteína pode estar no intervalo de cerca de IO"11 a 10“12 M, embora a afinidade possa variar consideravelmente com fragmentos de tamanhos diferentes, variando de 10"μ a IO"11 M. Nalgumas formas de realização, o fragmento tem cerca de 100 até cerca de 200 aminoãcidos de comprimento e compreende um domínio de ligação ligado a pelo menos uma parte de uma região constante de uma imunoglobulina.
Os agentes de ligação a Wnt da presente invenção podem ser analisados para a ligação específica por qualquer método conhecido na técnica. Os imunoensaios que podem ser utilizados incluem, mas não estão limitados a, sistemas de ensaio competitivos e não competitivos, utilizando técnicas tais como BIAcore, análise de FACS, imunofluorescência, imunocitoquímica, Western blots, radioimunoensaios, ELISA, imunoensaios "sanduíche", ensaios de imunoprecipitação, reações de precipitação, reações de precipitação em gel de difusão, ensaios de imunodifusão, ensaios de aglutinação, fixação do complemento, ensaios imunorradiométricos, imunoensaios fluorescentes, e imunoensaios de proteína A. Tais ensaios são de rotina e bem conhecidos na técnica (veja-se, por exemplo, Ausubel et al. , eds, 19 94, Current Protocols in Molecular Biology, vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., Nova Iorque.
Por exemplo, a ligação específica de um polipéptido a um Wnt humano pode ser determinada utilizando ELISA. Um ensaio ELISA compreende preparar um antigénio, revestir poços de uma placa de microtitulação de 96 poços com o antigénio, adicionar o polipéptido (por exemplo, um agente de ligação a Wnt) conjugado com um composto detetável, tal como um substrato enzimãtico (por exemplo, peroxidase de rábano ou fosfatase alcalina) ao poço, incubar durante um período de tempo e detetar a presença do agente. Nalgumas formas de realização, o polipéptido (por exemplo, agente de ligação a Wnt) não é conjugado com um composto detetável, mas em vez disso é adicionado ao poço um segundo anticorpo conjugado que reconhece o polipéptido. Nalgumas formas de realização, em vez de revestir o poço com o antigénio, o polipéptido (por exemplo, agente de Ligação a Wnt) pode ser revestido no poço e pode ser adicionado um segundo anticorpo conjugado com um composto detetável após a adição do antigénio no poço revestido. Um perito na especialidade teria conhecimento sobre os parâmetros que podem ser modificados para aumentar o sinal detetado, bem como outras variações de ELISAs conhecidas na técnica (veja-se, por exemplo, Ausubel et al, eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1., John Wiley ® Sons, Inc., Nova Iorque, item 11.2.1). A afinidade de ligação de um agente a um Wnt e a taxa de consumo de um agente de interação de ligação ao antigénio podem ser determinadas por ensaios de ligação competitiva. Um exemplo de um ensaio de ligação competitiva é um radioimunoensaio compreendendo a incubação de antigénio marcado (por exemplo, 3H ou *25I) , ou fragmento ou variante do mesmo, com o agente de ligação de interesse na presença de quantidades crescentes de antigénio não marcado, seguido pela deteção do anticorpo ligado ao antigénio marcado. A afinidade do agente de ligação contra um Wnt e as taxas de consumo de ligação podem ser determinadas a partir dos dados por análise gráfica de Scatchard. Nalgumas formas de realização, é utilizada análise cinética BIAcore para determinar a ligação e as taxas de consumo de agentes que ligam a um ou mais Wnts humanos. A análise cinética BIAcore compreende analisar a ligação e a dissociação de anticorpos a partir de chips com antigénios Wnt imobilizados na sua superfície.
Em determinadas formas de realização, o agente de ligação a Wnt liga a pelo menos um Wnt com uma constante de dissociação (KD) de cerca de 1 μΜ ou menos, cerca de 100 ηΜ ou menos, cerca de 4 0nm ou menos, cerca de 2 0 nM ou menos, ou cerca de 10 nM ou menos.
Em determinadas formas de realização, o agente de ligação a Wnt (por exemplo, um FZD8-Fc) é um antagonista de pelo menos um Wnt (isto é, 1, 2, 3, 4, 5, 6, μ, 8, 9 ou 10 Wnts) ligado pelo agente. Em determinadas formas de realização, o agente inibe pelo menos cerca de 10™, pelo menos cerca de 2 0™, pelo menos cerca de 3 0™, pelo menos cerca de 50™, pelo menos cerca de μ5™, pelo menos cerca de 90™, ou cerca de 100™ de uma ou mais atividade (s) de ligação de Wnt(s) humano(s). São conhecidos na técnica ensaios in vivo e in vitro para determinar se um agente de ligação a Wnt (ou agente candidato de ligação a Wnt) inibe a sinalização de Wnt. Por exemplo, podem ser utilizados ensaios de repórter de luciferase baseados em células utilizando um vetor repórter TCFôLuc, contendo várias cópias do domínio de ligação TCF a montante de um gene repórter da luciferase de pirilampo para medir os níveis de sinalização de Wnt canónico in vitro (Gazit et al. , 1999, Oncogene 18Ê 5959-66) . 0 nível de sinalização de Wnt, na presença de um ou mais Wnts (por exemplo, Wnt(s) expressos por células transfectadas ou proporcionadas por meios condicionados a Wnt) com o agente de ligação a Wnt presente é comparado com o nível de sinalização sem o agente de ligação a Wnt presente. Para além do ensaio repórter TCFôLuc, o efeito de um agente de ligação a Wnt (ou agente candidato) em sinalização de Wnt canónico pode ser medido in vitro ou in vivo, através da medição do efeito do agente sobre o nível de expressão de genes regulados por β-catenina, tais como c-myc (He et al, Science, 281:. 1509-1512 (1998)), ciclina Dl (Tetsu et al, Nature, 398:422-6 (1999)) eôou fibronectina (Gradl et al. Mol. Cell Biol, 19:55μ6-8μ (1999)) . Em determinadas formas de realização, pode também ser avaliado o efeito de um agente de sinalização de Wnt medindo o efeito do agente no estado de fosforilação de Dishevelled-1, Dishevelled-2, Dishevelled-3, LRP5, LRP6 eôou β-catenina.
Os polipéptidos descritos no presente documento podem ser produzidos por qualquer método adequado conhecido na técnica. Tais métodos variam de métodos de síntese de proteínas diretos a construções de sequências de ADN que codificam as sequências polipeptídicas e expressando as sequências num hospedeiro adequado. Nalgumas formas de realização, é construída uma sequência de ADN utilizando tecnologia de ADN recombinante isolando ou sintetizando uma sequência de ADN que codifica uma proteína de interesse de tipo selvagem. Opcionalmente, a sequência pode ser mutagenizada por mutagénese específica de local para proporcionar análogos funcionais da mesma. Veja-se, por exemplo, Zoeller et al, 1984, PNAS, 81:5662-66 e Patente US 4.588.585. Nalgumas formas de realização, é construída uma sequência de ADN utilizando tecnologia recombinante isolando mais do que uma sequência de ADN que codifica para dois polipéptidos de interesse e ligando estas sequências de ADN para gerar uma proteína de fusão. Nalgumas formas de realização, a fusão dos dois polipéptidos adiciona aminoácidos adicionais à junção entre os dois polipéptidos (isto é, o local de ligação para as sequências de ADN) . Estes aminoácidos adicionais são considerados um ligante. Nalgumas formas de realização, é inserido um ligante peptídico entre os dois polipéptidos da proteína de fusão.
Nalgumas formas de realização, pode ser construída uma sequência de ADN que codifica um polipéptido de interesse por síntese química utilizando um sintetizador de oligonucleótidos. Tais oligonucleotides podem ser manipulados com base na sequência de aminoácidos do polipéptido desejado. Nalgumas formas de realização, os oligonucleótidos são manipulados para selecionar codões que são favorecidos na célula hospedeira na qual o polipéptido recombinante de interesse será produzido. Podem ser aplicados métodos padrão para sintetizar uma sequência polinucleotídica que codifica um polipéptido de interesse. Por exemplo, pode ser utilizada uma sequência completa de aminoãcidos para construir um gene traduzido em sentido reverso. Adicionalmente, pode ser sintetizado um oligómero de ADN contendo uma sequência de nucleótidos que codifica para o polipéptido particular. Por exemplo, podem ser sintetizados vários oligonucleõtidos pequenos que codificam para porções do polipéptido desejado e posteriormente ligados. Os oligonucleõtidos individuais contêm tipicamente saliências a 5 ' ou 3! para montagem complementar. Nalgumas formas de realização, é sintetizada uma sequência de nucleótidos que codifica para a proteína de fusão desejada, de modo que os dois polipéptidos são diretamente ligados sem um ligante peptídico interveniente.
Uma vez montadas (por síntese, mutagénese dirigida ao local, tecnologia recombinante ou outro método), as sequências polinucleotídieas que codificam um polipéptido de interesse particular podem ser inseridas num vetor de expressão e operativamente ligadas a uma sequência de controlo de expressão adequada para a expressão do polipéptido num hospedeiro desejado. A montagem adequada pode ser confirmada por sequenciamento de nucleótidos, mapeamento de restrição, eôou expressão de um polipéptido biologicamente ativo num hospedeiro adequado. Conforme é bem conhecido na técnica, de modo a obter níveis de expressão elevados de um gene transfectado num hospedeiro, o gene deve ser operativamente ligado a sequências de expressão de controlo da transcrição e tradução que são funcionais no hospedeiro de expressão eleito.
Em determinadas formas de realização, são utilizados vetores de expressão recombinantes para amplificar e expressar ADN que codificam agentes de ligação a Wnt e polipéptidos descritos no presente documento. Por exemplo, vetores de expressão recombinantes podem ser construções de ADN replicáveis que têm fragmentos de ADN sintéticos ou derivado de ADNc que codificam uma proteína de fusão compreendendo um domínio FZD Fri e uma região Fc, operativamente ligada a elementos reguladores de transcrição ou tradução adequados derivados de genes de mamífero, microbianos, virais ou de insetos. Uma unidade transcricional compreende geralmente uma montagem de (1) um elemento ou elementos genéticos tendo um papel regulador na expressão do gene, por exemplo, promotores de transcrição eôou potenciadores, (2) uma sequência estrutural ou de codificação que é transcrita em ARNrrt e traduzida em proteína, e (3) sequências de iniciação e terminação da transcrição e da tradução adequadas. Os elementos reguladores podem incluir uma sequência de operador para controlar a transcrição. Pode ser adicionalmente incorporada a capacidade de replicar num hospedeiro, normalmente conferida por uma origem de replicação, e um gene de seleção para facilitar o reconhecimento de transformantes. As regiões de ADN são "operativamente ligadas” quando estão funcionalmente relacionadas entre si. Por exemplo, ADN para um péptido sinal (líder de secreção) está operativamente ligado ao ADN para um polipéptido se for expresso como um precursor que participa na secreção do polipéptidoÊ um promotor está operativamente ligado a uma sequência de codificação se controlar a transcrição da sequênciaÊ ou um sítio de ligação a ribossoma está operativamente ligado a uma sequência de codificação se estiver posicionado de modo a permitir a tradução. Geralmente, operativamente ligado significa contíguo e, no caso de líderes de secreção, significa contíguo e em quadro de leitura. Nalgumas formas de realização, os elementos estruturais destinados a utilização em sistemas de expressão de levedura podem incluir uma sequência líder que permite a secreção extracelular da proteína traduzida por uma célula hospedeira. Nalgumas formas de realização, onde a proteína recombinante é expressa sem uma sequência líder ou de transporte, pode incluir um resíduo de metionina N-terminal. Este resíduo pode opcionalmente ser sobsequentemente clivado a partir da proteína recombinante expressada para proporcionar um produto final. A escolha de uma sequência de controlo da expressão e vetor de expressão depende da escolha do hospedeiro. Pode ser empregue uma grande variedade de combinações da expressão hospedeiroôvetor. Vetores de expressão úteis para hospedeiros eucariõticos incluem, por exemplo, os vetores compreendendo sequências de controlo da expressão de SV40, vírus do papiloma bovino, adenovirus e citomegalovírus. Vetores de expressão úteis para hospedeiros bacterianos incluem plasmídeos bacterianos conhecidos, tais como plasmídeos de E. coli, incluindo pCRl, pBR322, pMB9 e os seus derivados, e vetores de uma gama de hospedeiros mais ampla, tais como M13 e outros fagos filamentosos de ADN de cadeia única. Células hospedeiras adequadas para expressão de um agente de ligação a Wnt incluem células procariotas, leveduras, de insetos ou eucariõticas superiores sob o controlo de promotores adequados. Os procariotas incluem organismos gram-negativos ou Gram-positivos, por exemplo, E. coli ou Bacilli. Células eucariõticas superiores incluem linhas celulares estabelecidas de origem em mamíferos, conforme descrito abaixo. Podem também ser empregues sistemas de tradução isentos de células. São descritos vetores de clonagem e expressão adequados para utilização com hospedeiros celulares bacterianos, leveduras, fungos, e mamíferos por Pouwels et aí, 1985, Cloning Vetors:. A Laboratory Manual, Elsevier, NY. São utilizados vários sistemas de cultura de células de mamífero ou de inseto para expressar polipéptidos recomfoinantes. Nalgumas formas de realização, é preferida a expressão de proteínas recombinantes em células de mamíferos dado que tais proteínas são geralmente corretamente dobradas, adequadamente modificadas e completamente funcionais. Exemplos de linhas celulares hospedeiras de mamífero adequadas incluem as linhas celulares de COS-μ (derivadas de rim de macaco), L-929 (derivadas de fibroblasto de ratinho), Cl 2μ (derivadas de tumor mamário de ratinho), 3T3 (derivado de fibroblasto de ratinho), CEO (derivadas de ovário de hãmster chinês), HeLa (derivadas de cancro cervical humano) e BHK (derivadas de fibroblasto de rim de hámster). Os vetores de expressão de mamífero podem compreender elementos não-transcricionais tais como uma origem de replicação, um promotor e potenciador adequado ligado ao gene a ser expresso e outras sequências de flanqueamento a 5 ! ou 3' não transcritas, e sequências 5' ou 3' não traduzidas, tais como sítios de ligação a ribossoma necessários, um local de poliadenilação, locais dadores e recetores de excisão-união e sequências de terminação da transcrição. São conhecidos sistemas de baculovírus para a produção de proteínas heterõlogas em células de insetos para os peritos na especialidade e são revistos por Luckow e Summers, 1988, BioôTechnology, 6:4μ.
As proteínas produzidas por um hospedeiro transformado podem ser purificadas, de acordo com qualquer método adequado. Tais métodos padrão incluem cromatografia (por exemplo, cromatografia por permuta iónica, afinidade e em coluna de tamanho), centrifugação, solubilidade diferencial ou por qualquer outra técnica padrão para purificação de proteínas. Podem ser ligados marcadores de afinidade, tais como hexahistidina, domínio de ligação à maltose, sequência de revestimento de influenza, e glutationa-S-transferase à proteína para permitir a fácil purificação por passagem sobre uma coluna de afinidade adequada. As proteínas isoladas podem também ser fisicamente caracterizadas utilizando técnicas tais como proteõlise, espectrometria de massa (MS), cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC), ressonância magnética nuclear (RMN) e cristalografia de raios X.
Nalgumas formas de realização, os sobrenadantes a partir de sistemas de expressão que segregam a proteína recombinante em meios de cultura podem ser primeiro concentrados utilizando um filtro de concentração de proteínas comercialmente disponível, por exemplo, uma unidade de ultrafiltração Amicon ou Millipore Pellicon. Após a etapa de concentração, o concentrado pode ser aplicado a uma matriz de purificação adequada. Nalgumas formas de realização, pode ser empregue uma resina de permuta aniónica, por exemplo, uma matriz ou substrato tendo grupos dietilaminoetilo (DEAE) pendentes. As matrizes podem ser acrilamida, agarose, dextrano, celulose ou outros tipos comumente empregues em purificação de proteínas. Nalgumas formas de realização, pode ser empregue uma etapa de permuta catiónica. Permutadores catiónicos adequados incluem várias matrizes insolúveis compreendendo grupos sulfopropilo ou carboximetilo. Nalgumas formas de realização, pode ser empregue um meio de hidroxiapatite (CHT), incluindo mas não limitado a, hidroxiapatite cerâmica. Nalgumas formas de realização, podem ser empregues uma ou mais etapas HPLC de fase inversa empregando meios hidrofóbicos RP-HPLC, por exemplo, gel de sílica tendo grupos metilo ou outros alifáticos pendentes, para purificar adicionalmente uma proteína de fusão. Podem também ser empregues algumas ou todos as etapas de purificação anteriores, em várias combinações, para proporcionar uma proteína recombinante homogénea.
Nalgumas formas de realização, a proteína recombinante produzida em cultura bacteriana pode ser isolada, por exemplo, por extração inicial a partir de sedimentos de células, seguido por uma ou mais etapas de concentração, precipitação por sais, permuta iónica aquosa, eôou cromatografia de exclusão por de tamanho. Pode ser empregue HPLC para obter as etapas finais de purificação. As células microbianas utilizadas na expressão de uma proteína recombinante podem ser rotas por qualquer método conveniente, incluindo ciclos de congelamento-descongelamento, sonicação, rutura mecânica ou utilização de agentes de lise celular. Métodos conhecidos na técnica para a purificação de anticorpos e outras proteínas também incluem, por exemplo, os descritos nos Pedidos de Patente US N.°s 2008Ô0312425Ê 2008ό01μμ048, e 2009ό018μ005.
Os polipéptidos descritos no presente documento podem ser adicionalmente modificados para conter frações químicas adicionais que não fazem parte normalmente da proteína. Essas frações derivatizadas podem melhorar a solubilidade, a semivida biológica ou a absorção da proteína. As frações podem também reduzir ou eliminar quaisquer efeitos secundários indesejáveis das proteínas e semelhantes. Podem ser encontradas uma visão geral para essas frações em Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21a Edição, University of Science, Filadélfia, 2005.
As frações químicas mais adequadas para derivatização incluem polímeros hidrossolúveis. Um polímero solúvel em água é desejável porque a proteína à qual está ligada não precipita num ambiente aquoso, tal como um ambiente fisiológico. Nalgumas formas de realização, o polímero será farmaceuticamente aceitável para a preparação de um produto terapêutico ou composição. Um perito na especialidade será capaz de selecionar o polímero desejado com base em considerações, tais como se o polímeroôproteína conjugado será utilizado terapeuticamente, e em caso afirmativo, a dosagem desejada, tempo de circulação, resistência à proteólise, e outras considerações. A eficácia da derivatização pode ser determinada por administração do derivado, na forma desejada (isto é, por bomba osmõtica, ou por injeção ou infusão, ou, adicionalmente formulada para vias de distribuição oral, pulmonar ou outras), e determinando a sua eficácia. Polímeros hidrossolúveis adequados incluem, mas não estão limitados a, polietilenoglicol (PEG), copolímeros de etilenoglicolôpropilenoglicol, carboximetilcelulose, dextrano, álcool polivinílico, polivinilpirrolidona, poli-1,3-dioxolano, poli-1,3, 6-trioxano, copolímero de anidrido etilenoômaleico, poliaminoãcidos (homopolímeros ou copolímeros aleatórios), dextrano, poli(n-vinilpirrolidona)-polietilenoglicol, homopolímeros de propropilenoglicol, copolímeros de óxido de prolipropilenoooxido de etileno, poliois polioxietiledos (por exemplo, glicerol), álcool polivinílico, e misturas dos mesmos. 0 propionaldeído de polietilenoglicol pode ter vantagens na produção devido à sua estabilidade na água. 0 número de moléculas de polímero ligadas desta forma pode variar, e um perito na especialidade será capaz de determinar o efeito sobre a função. É possível mono-derivatizar, ou proporcionar uma di-, tri-, tetra-ou alguma combinação de derivatização, com as mesmas ou diferentes frações químicas (por exemplo, polímeros, tais como diferentes massas de polietilenoglicóis). A proporção de moléculas de polímero para proteína (ou péptido) irá variar, tal como as suas concentrações na mistura reacional. Em geral, a razão ideal (em termos de eficiência de reação, em que não existe excesso de proteína ou polímero sem reagir) será determinada por fatores tais como o grau desejado de derivatização (por exemplo, mono-, di-, tri-, etc.), a massa molecular do polímero selecionado, se o polímero é ramificado ou não ramificado, e as condições de reação.
As moléculas de polietilenoglicol (ou outras frações químicas) devem ser ligadas à proteína tendo em consideração os efeitos sobre os domínios funcionais ou antigénicos da proteína. Existe uma determinado série de métodos de ligação disponíveis para os peritos na especialidade. Veja-se, por exemplo, o documento EP 0401384 (acoplamento de PEG a G-CSF), veja-se também Malik et al., 1992, Exp. Hematol, 20:. 1028-1035 (relatando peguilação de GM-CSF utilizando cloreto de tresilo). Por exemplo, o polietilenoglico! pode ser covalentemente ligado através de resíduos de aminoãcidos através de um grupo reativo tal como um grupo amino ou carboxilo livre. Os grupos reativos são aqueles aos quais uma molécula de polietilenoglicol ativada pode ser ligada. Os resíduos de aminoãcidos tendo um grupo amino livre podem incluir resíduos de lisina e o resíduo de aminoácido N-t.erminal. Aqueles que têm um grupo carboxil livre podem incluir resíduos de ácido aspãrtico, resíduos de ácido glutâmico e o resíduo de aminoácido C-terminal. Podem também ser utilizados grupos sulfidrilo como um grupo reativo para ligar a molécula(s) de polietilenoglicol. Para fins terapêuticos, pode ser executada ligação a um grupo amino, tal como união no grupo N-terminal ou de lisina. A união em resíduos importantes para a ligação ao recetor deve ser evitada se for desejada ligação ao recetor. É possível conceber especificamente uma proteína quimicamente modificada no terminal amino. Utilizando polietilenoglicol como uma ilustração das presentes composições, é possível selecionar a partir de uma variedade de moléculas de polietilenoglicol (por massa molecular, ramificação, etc.), a proporção de moléculas de polietilenoglicol para proteína (ou péptido) na mistura de reação, o tipo de reação de pegilação a ser executada, e o método de obtenção da proteína com terminal N peguilado selecionada. O método de obtenção da preparação de terminal N peguilado (isto é, separação desta fração a partir de outras frações mono-peguiladas se necessário) pode ser por purificação do material com terminal N pegilado a partir de uma população de moléculas de proteína peguiladas. Pode ser realizado modificação química de terminal N seletiva por alquilação redutora que explora a reatividade diferencial de diferentes tipos de grupos amino primários (lisina contra o terminal N) disponíveis para derivatização numa proteína particular. Sob as condições de reacção adequadas, é obtida derivatização substancialmente seletiva da proteína no terninal N com um grupo carbonilo contendo polímero. Por exemplo, é possível peguilar seletivamente a proteína no terminal N realizando a reação a um pH que permite tirar vantagem das diferenças de pKa entre o grupo amino epsilon dos resíduos de lisina e o do grupo amino alfa do resíduo N-terminal da proteína. Por tal derivatização seletiva, a ligação de um polímero hidrossolúvel a uma proteína é controlada, por exemplo, a conjugação com o polímero ocorre predominantemente no terminal N da proteína e não ocorre modificação significativa de outros grupos reativos, tais como os grupos amino de cadeia lateral da lisina. Utilizando alquilação redutora, o polímero hidrossolúvel pode ser do tipo descrito acima, e deverá ter um único aldeído reativo para acoplamento à proteína. Pode ser utilizado propionaldeído de polietileno glicol, contendo um único aldeído reativo.
Pode ser realizada peguilação por qualquer das reações de peguilação conhecidas na técnica. Veja-se, por exemplo, Focus on Growth Factors, 1992, 3:4-10Ê documentos EPQ154316Ê EP 0.401.384Ê e as outras publicações citadas no presente documento que se referem a peguilação. A peguilação pode ser realizada através de uma reação de acilação ou uma reação de alquilação com uma molécula reativa de polietilenoglicol (ou um polímero análogo reativo hidrossolúvel).
Consequentemente, é contemplado que polipéptidos recetores solúveis a serem utilizados de acordo com a presente invenção possam incluir proteínas recetoras solúveis ou variantes peguiladas, em que o(s) grupo(s) PEG é (são) ligado (s) através de grupos acilo ou alquilo. Tais produtos podem ser mono-pegilados ou poli-peguilados. Os grupos PEG são geralmente ligados à proteína nos grupos amino a e ε dos aminoácidos, mas também é contemplado que os grupos PEG possam ser ligados a qualquer grupo amino ligado à proteína, que seja suficientemente reativo para ligar a um grupo PEG sob condições de reação adequadas.
As moléculas de polímero utilizadas tanto nas abordagens de acilaçâo como de alquilação podem ser selecionadas a partir de polímeros hidrossolúveis, conforme descrito acima. 0 polímero selecionado deverá ser modificado para ter um único grupo reativo, tal como um éster ativo para acilaçâo ou um aldeído para alquilação, de modo a que o grau de polimerização possa ser controlado conforme visado nos presentes métodos. Um aldeído de PEG reativo exemplar é propionaldeído de polietilenoglicol, que é estável em água, ou derivados mono C:1-Ci0 alcóxi ou ariloxi do mesmo (veja-se a Patente US 5.252.μ14). 0 polímero pode ser ramificado ou não ramificado. Para as reações de acilaçâo, o(s) polímero(s) selecionado(s) deverá(ão) ter um único grupo éster reativo. Para a presente alquilação redutora, o(s) polímero(s) selecionado(s) deverá(âo) ter um único grupo aldeído reativo. Geralmente, o polímero hidrossolúvel não será selecionado a partir de resíduos de glicosilo de ocorrência natural dado que estes são habitualmente produzidos mais convenientemente por sistemas de expressão de mamífero recombinante. 0 polímero pode ser de qualquer massa molecular, e pode ser ramificado ou não ramificado. Um polímero hidrossolúvel para utilização no presente documento é polietileno glicol. Conforme utilizado no presente documento, polietilenoglicol destina-se abranger quaisquer das formas de PEG que tenham sido utilizadas para derivatizar outras proteínas, tais como mono (C1-C10) alcoxi ou ariloxi-polietilenoglicol.
Podem ser determinados outros parâmetros da reação, tais como solventes, tempo de reação, temperaturas, etc., e meios de purificação de produtos caso a caso com base na informação publicada relacionada com derivatização de proteínas com polímeros hidrossolúveis (veja-se as publicações citadas no presente documento). Em determinadas formas de realização, o agente de ligação a Wnt é um polipéptido que não é derivado a partir de um FZD ou SFRP humano. São conhecidos uma variedade de métodos para identificar e produzir polipéptidos que ligam com elevada afinidade a um alvo a proteína na técnica. Veja-se, por exemplo, Skerra, 200μ, Curr. Opin. Biotechnol, 18:295-304Ê Hosse et al, 2006, Science Protein, 15: 14-2μΕ Gill et al, 2006, Curr. Opin. Biotechnol, 1μ:653-58Ε Nygren, 2008, FEES J. , 2μ5:2668-μ6Ε. E Skerra, 2008, FEBSJ, 2μ5:26μμ-83. Em determinadas formas de realização, foi utilizada tecnologia de exibição de fagos para identificarôproduzir o polipéptido de ligação a Wnt. Em determinadas formas de realização, o polipéptido compreende uma armação proteica de um tipo selecionado a partir do grupo que consiste em proteína A, uma lipocalina, um domínio de fibronectina, um domínio de repetição de consenso de anquirina e tiorredoxina.
Nalgumas formas de realização, o agente de ligação a Wnt é uma molécula não proteica. Em determinadas formas de realização, o agente é uma molécula pequena. São conhecidas bibliotecas combinatórias químicas e técnicas úteis na identificação de agentes de ligação a Wnt não-proteicos pelos peritos na especialidade. Veja-se, por exemplo, Kennedy et al. , 2008, J. Comb. Chem, 10:345-54Ê. Dolle et al, 200μ, J. Comb. Chem. Em determinadas formas de realização, o agente é um hidrato de carbono, um glicosaminoglicano, uma glicoproteína, ou um proteoglicano.
Em determinadas formas de realização, o agente é um aptãmero de ácido nucleico. Os aptâmeros são moléculas polinucleotídicas que são selecionadas (por exemplo, a partir de agrupamentos aleatórios ou mutagenizados) com base na sua capacidade de ligar a outra molécula. Nalgumas formas de realização, o aptãmero compreende um polinucleótido de ADN. Em determinadas formas de realização alternativas, o aptãmero compreende um polinucleótido de ARN. Em determinadas formas de realização, o aptãmero compreende um ou mais resíduos de ácido nucleico modificado. São bem conhecidos na técnica métodos de gerar e selecionar aptâmeros de ácidos nucleicos para ligação a proteínas. Veja-se, por exemplo, as Patentes US N.°s 5.2μ0.163Ê 5.683.86μΕ 5.μβ 3.5 9 5Ê 6.344.321Ê μ.368.236Ε 5.582.981Ê 5.μ56.291Ε 5.840.86μΕ μ.312.325Ε e μ.329.μ42. Publicações de Patente Internacional N.°s WO 02ό0μμ262 e WO 03ό0μ0,984, Publicações de Pedido de Patente N.°s US 2005Ô0239134Ê US 2005Ô0124565Ê e US 20080022μμ35.
Em determinadas formas de realização, o agente de ligação a Wnt tem uma semivida em circulação em ratinhos, macacos cinomolgos, ou seres humanos de pelo menos cerca de 5 horas, pelo menos cerca de 10 horas, pelo menos cerca de 24 horas, pelo menos cerca de 3 dias, pelo menos cerca de 1 semana, ou pelo menos cerca de 2 semanas. Em determinadas formas de realização, o agente de ligação a Wnt é um anticorpo IgG (por exemplo, IgGl ou IgG2) que tem uma semivida em circulação em ratinhos, macacos cinomolgos, ou seres humanos de pelo menos cerca de 10 horas, pelo menos cerca de 24 horas, pelo menos cerca de 3 dias, pelo menos cerca de 1 semana, ou pelo menos cerca de 2 semanas. São conhecidos na técnica métodos para aumentar a semivida de agentes tais como polipéptidos e anticorpos. Por exemplo, métodos conhecidos para aumentar a circulação de semivida dos anticorpos IgG incluem a introdução de mutações na região Fc que aumentam a ligação dependente de pH do anticorpo ao recetor Fc neonatal (FcRn) a pH 6,0 (veja-se, por exemplo, Publicações de Patente US N.°s 2005ό02μ6μ99, 200μό0148164, e 200μό0122403). Métodos conhecidos de aumentar a circulação de semivida de fragmentos de anticorpo carecendo da região Fc incluem técnicas como peguilação.
Em determinadas formas de realização, os agentes de ligação a Wnt e polipéptidos conforme descritos no presente documento têm uma semivida de pelo menos cerca de 50 horas num rato quando administrados através da veia caudal numa dose variando entre cerca de 2 mgôkg a cerca de 10 mgô. Em determinadas formas de realização, o agente de ligação a Wnt ou polipéptido tem uma semivida de pelo menos cerca de 50 horas num rato quando administrado através da veia caudal a uma dose de cerca de 10 mgôkg. Em determinadas formas de realização, o agente de ligação a Wnt ou polipéptido tem uma semivida de pelo menos cerca de 100 horas, de um rato quando administrado através da veia caudal numa dose variando entre cerca de 2 mgôkg a cerca de 10 mgôkg. Em determinadas formas de realização, o agente de ligação a Wnt ou polipéptido tem uma semivida de pelo menos cerca de 100 horas, de um rato quando administrado através da veia caudal a uma dose de cerca de 10 mgôkg. Em determinadas formas de realização, o agente de ligação a Wnt tem uma semivida de pelo menos cerca de 12 0 horas num rato, quando administrado através da veia caudal numa dose variando entre cerca de 2 mgôkg a cerca de 10 mgôkg. Em determinadas formas de realização, o agente de ligação a Wnt tem uma semivida de pelo menos cerca de 150 horas num rato quando administrado através da veia caudal numa dose variando entre cerca de 2 mgôkg a cerca de 10 mgôkg.
Em determinadas formas de realização, o agente é um recetor solúvel FZD que compreende um domínio Fri de um recetor humano FZD (ou um fragmento ou variante do domínio
Fri que liga a um ou mais Wnts) e uma região Fc humano e tem uma semivida in vivo (por exemplo, num ratinho ou rato) que é mais longa do que um recetor solúvel FZD compreendendo o domínio extracelular do recetor FZD e uma região Fc humana. São proporcionadas células produtoras dos agentes de ligação a Wnt ou polipéptidos descritos no presente documento. Nalgumas formas de realização, a célula produz um agente de ligação a Wnt solúvel que compreende um domínio Fri FZD8 humano, em que pelo menos cerca de 80™ do agente de ligação a Wnt tem uma sequência N-terminal de ASA. Nalgumas formas de realização, a célula produz um agente de ligação a Wnt solúvel que compreende um domínio Fri FZD8 humano, em que pelo menos cerca de 85™ pelo menos cerca de 90™ pelo menos cerca de 95™, ou, pelo menos cerca, de 98™ do agente de ligação a Wnt tem uma sequência N-terminal de ASA. Nalgumas formas de realização, a célula é uma célula de mamífero. Nalgumas formas de realização, a célula produz um agente de ligação a Wnt, que compreende uma região Fc humana. Nalgumas formas de realização, a célula produz um agente de ligação a Wnt, que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48 e SEQ ID NO: 1. Nalgumas formas de realização, a célula produz um agente de ligação a Wnt, que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 53. Nalgumas formas de realização, a célula produz um agente de ligação a Wnt, que compreende uma sequência de aminoãcido da SEQ ID NO: 50. São proporcionados agentes de ligação a Wnt produzidos pelas células descritos no presente documento.
Também são proporcionadas composições que compreendem os agentes de ligação a Wnt ou polipéptidos descritos no presente documento. Nalgumas formas de realização, a composição compreende um agente de ligação a Wnt solúvel, que compreende um domínio de Fri FZD8 humano, em que pelo menos cerca de 80™ do agente de ligação a Wnt tem uma sequência N-terminal de ASA. Nalgumas formas de realização, a composição compreende um agente de ligação a Wnt solúvel que compreende um domínio de Fri FZD8 humano, em que pelo menos, cerca de 85™ pelo menos cerca de 90™ pelo menos cerca de 95™, ou pelo menos, cerca de 98™ do agente de ligação a Wnt tem uma sequência N-terminal de ASA. Nalgumas formas de realização, a composição compreende um agente de ligação a Wnt, que compreende uma região Fc humana. Nalgumas formas de realização, a composição compreende um agente de ligação a Wnt, que compreende uma sequência de aminoãcidos selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48 e SEQ ID NO: 1. Nalgumas formas de realização, a composição compreende um agente de ligação a Wnt, que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 53. Nalgumas formas de realização, a composição compreende um agente de ligação a Wnt, que compreende uma sequência de aminoãcidos de SEQ ID NO: 50. Nalgumas formas de realização, as composições, tais como no presente documento descritas ainda compreendem um veículo farmaceuticamente aceitável. São também proporcionados métodos de utilização das composições que compreendem os agentes de ligação a Wnt ou polipéptidos no presente documento descritos. III. Polinucleõtidos
Em determinadas formas de realização, a invenção abrange polinucleõtidos compreendendo polinucleõtidos que codificam um polipéptido que liga especificamente a uma proteína Wnt humana ou um fragmento de um tal polipéptido. Por exemplo, a invenção proporciona um polinucleótido compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um recetor FZD solúvel ou codifica um fragmento de um tal recetor solúvel. Nalgumas formas de realização, a invenção proporciona um polinucleótido compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um SFRP solúvel, uma proteína Ror solúvel ou codifica um fragmento de tal proteína solúvel. Nalgumas formas de realização, os polinucleótidos compreendem polinucleótidos que codificam quaisquer dos agentes de ligação a Wnt conforme descritos no presente documento. Os polinucleótidos da invenção podem estar na forma de ARN ou na forma de ADN, ADN inclui ADN, ADNc genómico, ADN sintético eÊ e pode ser de cadeia dupla ou de cadeia simples, e se for de cadeia simples pode ser a cadeia de codificação ou cadeia não codificante (sentido reverso).
Em determinadas formas de realização, os polinucleótidos são isolados. Em determinadas formas de realização, os polinucleótidos são substancialmente puros. A invenção proporciona um polinucleótido compreendendo um polinucleótido que codifica um polipéptido compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 4μ, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66 e SEQ ID NO: μ5. Nalgumas formas de realização, o polinucleótido compreende ainda um polinucleótido que codifica uma sequência de sinal do polipéptido selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 6μ, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: μ0, SEQ ID NO: μΐ, SEQ ID NO: μ2, SEQ ID NO: μ3 e SEQ ID NO: μ4. Nalgumas formas de realização, o polinucleótido compreende ainda um polinucleótido que codifica uma sequência de sinal do polipéptido selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: μ0, SEQ ID NO: μΐ, SEQ ID NO: μ2, SEQ ID NO: μ3 e SEQ ID NO: μ4. Nalgumas formas de realização, o polinucleótido compreende um polinucleótido que codifica um polipéptido tendo a sequência de SEQ ID NO: μΐ e SEQ ID NO: 50. Nalgumas formas de realização, o polinucleótido compreende um polinucleótido que codifica um polipéptido tendo a sequência de SEQ ID NO: μΐ e SEQ ID NO: 53. Nalgumas formas de realização, o polinucleõtido compreende um polinucleótido que codifica um polipéptido tendo a sequência de SEQ ID NO: μ5.Α invenção proporciona ainda um polinucleótido compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 2. A invenção proporciona um polinucleótido compreendendo um polinucleótido que codifica um polipéptido compreendendo: uma sequência de sinal selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: μΐ, SEQ ID NO: μΟ, SEQ ID NO: μ2, SEQ ID NO: μ3, e SEQ ID NO: μ4Ε um domínio Fri de FZD8 humano e uma região Fc humana. Nalgumas formas de realização, o polinucleótido compreende um polinucleõtido que codifica um polipéptido compreendendo uma sequência de sinal da SEQ ID NO: μΙΕ um domínio Fri de FZD8 humano e uma região Fc humana.
Também é proporcionado um polinucleótido que compreende um polinucleótido que híbrida com um polinucleótido tendo a sequência de SEQ ID NO: 2 eôou um polinucleótido que codifica um polipéptido tendo a sequência da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 4μ, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 6 6 e SEQ ID NO: μ5. Em determinadas formas de realização, a hibridação é sob condições de elevada restringência.
Em determinadas formas de realização, os polinucleõtidos compreendem a sequência de codificação para o polipéptido maduro ligado ao mesmo quadro de leitura com um polinucleótido que auxilia, por exemplo, na expressão e secreção de um polipéptido a partir de uma célula hospedeira (por exemplo, uma sequência líder ou de sequência de sinal que funciona como uma sequência segregatõria para controlar o transporte de um polipéptido a partir da célula). 0 polipéptido tendo uma sequência líder é uma pré-proteína e pode ter a sequência líder clivada pela célula hospedeira para formar a forma madura do polipéptido. Os polinucleótidos também podem codificar para uma pró-proteína que é a proteína madura mais resíduos de aminoácidos a 5' adicionais. Uma proteína madura tendo uma pró-sequência é uma pró-proteína e é uma forma inativa de proteína. Após a pró-sequencia ser clivada permanece uma proteína madura.
Em determinadas formas de realização, os polinucleótidos compreendem a sequência de codificação para o polipéptido maduro ligado no mesmo quadro de leitura com uma sequência marcadora que permite, por exemplo, a purificação do polipéptido codificado. Por exemplo, a sequência marcadora pode ser um marcador de hexahistidina proporcionado por um vetor pQE-9 para proporcionar a purificação do polipéptido maduro ligado ao marcador no caso de um hospedeiro bacteriano, ou a sequência marcadora pode ser um marcador de hemaglutinina (HA) derivado da proteína hemaglutinina de Influenza quando é utilizado um hospedeiro mamífero (por exemplo, células COS-μ).A presente invenção refere-se adicionalmente a variantes da codificação de polinucleótidos descritos anteriormente no presente documento, por exemplo, fragmentos, análogos e derivados. Podem ser utilizados fragmentos ou frações dos polinucleótidos da presente invenção para sintetizar polinucleótidos de comprimento completo da presente invenção.
Em determinadas formas de realização, a presente invenção proporciona polinucleótidos isolados compreendendo polinucleótidos tendo uma sequência de nucleõtidos pelo menos 80% idêntica pelo menos 85% idêntica pelo menos 90% idêntica pelo menos 95% idêntica, e nalgumas formas de realização, pelo menos 96%, 9μ%, 98% ou 99% idêntica a um polinucleótido que codifica um polipéptido compreendendo um recetor solúvel FZD ou outro agente de ligação a Wnt descrito no presente documento.
Por um polinucleótido tendo uma sequência de nucleótidos pelo menos por exemplo, 95™ "idêntica" a uma sequência de referência de nucleótidos é pretendido que a sequência de nucleótidos do polinucleótido seja idêntica à sequência de referência, exceto que a sequência polinucleotídica possa incluir até cinco mutações pontuais por cada 100 nucleótidos da sequência de nucleótidos de referência. Por outras palavras, para obter um polinucleótido tendo uma sequência de nucleótidos pelo menos 95™ idêntica a uma sequência de nucleótidos de referência, até 5™ dos nucleótidos na sequência de referência podem ser eliminados ou substituídos com um outro nucleõtido, ou podem ser inseridos uma série de nucleótidos até 5™ dos nucleótidos totais na sequência de referência na sequência de referência. Estas mutações da sequência de referência podem ocorrer nas posições amino ou carboxi terminal da sequência de nucleótidos de referência ou em qualquer lugar entre essas posições terminais, intercaladas quer individualmente entre os nucleótidos na sequência de referência quer num ou mais grupos contíguos dentro da sequência de referência.
As variantes de polinucleótidos podem conter alterações nas regiões de codificação, regiões não codificantes, ou ambas. Nalgumas formas de realização as variantes de polinucleótidos contém alterações, que produzem substituições, adições ou eliminações de aminoácidos silenciosas, mas não alteram as propriedades ou atividades do polipéptido codificado. Nalgumas formas de realização, as variantes de nucleótidos são produzidas por substituições silenciosas, devido à degenerescência do código genético. Nalgumas formas de realização, as variantes de nucleótidos compreendem sequências de nucleótidos que resultam em diferenças de expressão (por exemplo, expressão aumentada ou diminuída), muito embora a sequência de aminoácidos não seja alterada Podem ser produzidas variantes de polinucleótidos por uma variedade de razões, por exemplo, para otimizar a expressão do codão para um hospedeiro particular (alterações dos codões de ARNrrt humanos para aqueles preferidos por um hospedeiro bacteriano, tais como E. coli) .
Os polinucleótidos descritos no presente documento podem ser produzidos por qualquer método adequado conhecido na técnica. Conforme descrito no presente documento nalgumas formas de realização, uma sequência de ADN é construída utilizando tecnologia de ADN recombinante isolando ou sintetizando uma sequência de ADN que codifica uma proteína de interesse de tipo selvagem. Nalgumas formas de realização, é construída uma sequência de ADN utilizando tecnologia recombinante, isolando mais do que uma sequência de ADN que codifica para dois polipéptidos de interesse e ligando estas sequências de ADN para gerar uma proteína de fusão.
Nalgumas formas de realização, pode ser construída uma sequência de ADN por síntese química utilizando um sintetizador de oligonucleõtidos. Tais oligonucleótidos podem ser manipulados com base na sequência de aminoãcidos do polipéptido desejado. Podem ser aplicados métodos padrão para sintetizar uma sequência polinucleotídica que codifica um polipéptido de interesse. Por exemplo, pode ser utilizada uma sequência completa de aminoãcidos para construir um gene traduzido em sentido reverso. Além disso, pode ser sintetizado um oligómero de ADN contendo uma sequência de nucleótidos que codifica para o polipéptido particular. Por exemplo, podem ser sintetizados vários oligonucleótidos que codificam para pequenas frações do polipéptido desejado e posteriormente ligados. Os oligonucleótidos individuais contêm tipicamente saliências a 5' ou 3! para montagem complementar. Nalgumas formas de realização, é sintetizada uma sequência de nucleótidos que codifica para a proteína de fusão desejada de modo a que os dois polipéptidos estejam diretamente ligados sem um ligante peptídico interveniente.
Após serem montadas (por síntese, mutagénese dirigida ao local, tecnologia recombinante ou outro método), as sequências polinucleotídicas que codificam um polipéptido de interesse particular podem ser inseridas num vetor de expressão e operativamente ligadas a uma sequência de controlo de expressão adequada para a expressão do polipéptido num hospedeiro desejado. A montagem adequada pode ser confirmada por sequenciamento de nucleótidos, mapeamento de restrição, eôou expressão de um polipéptido biologicamente ativo num hospedeiro adequado. Conforme é bem conhecido na técnica, de modo a obter níveis de expressão elevados de um gene transfectado num hospedeiro, o gene deve ser operativamente ligado a sequências de controlo da expressão de transcrição e tradução que são funcionais na expressão do hospedeiro eleito. São proporcionados vetores compreendendo os polinucleótidos no presente documento descritos. São também proporcionadas células compreendendo os vetores ou polinucleótidos no presente documento descritos. IV. Composições farmacêuticas A presente invenção proporciona adicionalmente composições farmacêuticas compreendendo agentes (por exemplo, recetores solúveis FZD) que ligam a uma ou mais proteínas Wnt eôou são antagonistas de Wnt. Nalgumas formas de realização, as composições farmacêuticas compreendem agentes de ligação a Wnt e polipéptidos conforme descrito no presente documento. Estas composições farmacêuticas têm utilidade para inibir o crescimento de células tumorais e tratar o cancro em pacientes humanos. Nalgumas formas de realização, os agentes de ligação a Wnt conforme descrito no presente documento são úteis na produção de um medicamento para o tratamento do cancro. São preparadas formulações para armazenamento e utilização por combinação de um agente purificado ou antagonista da presente invenção com um veículo, excipiente eôou estabilizador farmaceuticamente aceitável como um põ liofilizado estéril, solução aquosa, etc. (Remington: The Science and Pratice of Pharmacy, 21a Edição, University of Science, Filadélfia, 2005). Veículos adequados, excipientes ou estabilizadores incluem tampões nâo tóxicos, tais como fosfato, citrato, e outros ácidos orgânicosÊ sais, tais como cloreto de sódioÊ antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metioninaÊ conservantes (por exemplo, cloreto de amónio octadecildimetilbenziloÊ cloreto hexametõnioÊ cloreto de benzalcónioÊ cloreto de benzetónioÊ fenol, butilo ou álcool benzilicoÊ alquilparabenos, tais como metil ou propilparabenoÊ catecolÊ resorcinolÊ ciclo-hexanolÊ 3-pentanol, e m-cresol)Ê polipéptidos de baixa massa molecular (tais como de menos de cerca de 10 resíduos de aminoácidos)Ê proteínas, tais como albumina do soro, gelatina ou imunoglobulinasÊ polímeros hidrofílicos, tais como polivinilpirrolidonaÊ aminoácidos, tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisinaÊ hidratos de carbono, tais como monossacãridos, dissacarídeos, glicose, manose, ou dextrinasÊ agentes quelantes, tais como EDTAÊ açúcares, tais como sacarose, manitol, trealose ou sorbitolÊ contraiões formadores de sal, tais como sódio, complexos metálicos (por exemplo, complexos de proteína de Zn), eôou agentes tensioativos não iõnicos, tais como TWEEN ou polietilenoglicol (PEG).
As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser administradas de qualquer número de maneiras para tratamento local ou sistémico A administração pode ser tópica (tais como a membranas mucosas, incluindo distribuição vaginal e retal), tais como adesivos transdérmicos, pomadas, loções, cremes, géis, colírios, supositórios, pulverizações, líquidos e põsÊ pulmonar (por exemplo, por inalação ou insuflação de pós ou aerossóis, incluindo por nebulizadorÊ intratraqueal, intranasal, epidérmica e transdérmica) Ê oralÊ ou parentérica incluindo intravenosa, intra-arterial, subcutânea, injeção ou infusão intraperitoneal ou intramuscular, ou administração intracraniana (por exemplo, intratecal ou intraventricular). A formulação terapêutica pode estar em forma farmacêutica unitária. Tais formulações incluem comprimidos, pílulas, cápsulas, pós, grânulos, soluções ou suspensões em meios aquosos ou não aquosos, ou supositórios para administração oral, parentérica, ou retal ou para administração por inalação. Em composições sólidas, tais como comprimidos, o ingrediente ativo principal é misturado com um veículo farmacêutico. Ingredientes de comprimidos convencionais incluem amido de milho, lactose, sacarose, sorbitol, talco, ácido esteárico, estearato de magnésio, fosfato dicálcico ou gomas, e outros diluentes (por exemplo, água) para formar uma composição pré-formulação sólida contendo uma mistura homogénea de um composto da presente invenção, ou um sal farmaceuticamente aceitável não tóxico da mesma. A composição pré-formulação sólida é então subdividida em formas farmacêuticas unitárias do tipo descrito acima. Os comprimidos, pílulas, etc., da nova composição podem ser revestidos ou de outra forma combinados para proporcionar uma forma farmacêutica proporcionando a vantagem de ação prolongada. Por exemplo, o comprimido ou pílula pode compreender uma composição interior coberta por um componente exterior. Além disso, os dois componentes podem ser separados por uma camada entérica que serve para resistir à desintegração e permite que o componente interior passe intato através do estômago ou tenha libertação atrasada. Podem ser utilizados uma variedade de materiais para tais camadas entéricas ou revestimentos, incluindo um número de ácidos poliméricos e misturas de ácidos poliméricos com materiais, tais como goma-laca, álcool cetílico e acetato de celulose.
As formulações farmacêuticas incluem antagonistas (por exemplo, agentes de ligação a Wnt) da presente invenção complexados com lipossomas (Epstein et al, 1985, PNAS, 82:3688Ê. Hwang et al, 1980, PNAS, μμ:4030Ε e Patentes US 4.485.045 e 4.544.545). São divulgados lipossomas com tempo de circulação melhorado na Patente US 5.013.556. Os lipossomas podem ser gerados pela evaporação de fase inversa com uma composição lipídica compreendendo fosfatidilcolina, colesterol e fosfatidiletanolamina derivatizada a partir de PEG (PEG-PE). Os lipossomas são extrudidos através de filtros de tamanho de poro definido para produzir lipossomas com o diâmetro desejado.
Os antagonistas (por exemplo, agente de ligação a Wnt) também podem ser aprisionados em microcãpsulas. Tais microcãpsulas são preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial, por exemplo, microcãpsulas de hidroximetilcelulose ou microcãpsulas de gelatina e microcãpsulas de poli-(metilmetacilato), respetivamente, em sistemas coloidais de distribuição de fãrmacos (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartícuias e nanocãpsulas) ou em macroemulsões conforme descrito em Remington: The Science and Pratice of Pharmacy, 21a Edição, University of the Sciences, Filadélfia, 2005.
Além disso, podem ser preparadas preparações de libertação sustentada. Exemplos adequados de preparações de libertação sustentada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrófobos sólidos contendo o agente, cujas matrizes estão na forma de artigos moldados (por exemplo, películas ou microcãpsulas). Exemplos de matrizes de libertação sustentada incluem poliésteres, hidrogéis, tais como poli (2-hidroxietil-metacrilato) ou poli (álcool vinílico), polilãctidos (Patente US 3.μμ3.919), copolímeros de ácido L-glutâmico e μ-etil-L-glutamato, acetato de etileno-vinilo não degradãvel, copolímeros degradáveis de ácido láctico-ácido glicólico, tais como o LUPRON DEPOT1” (microesferas injetáveis compostas por copolímero de ácido láctico-ácido glicólico e acetato de leuprólido), isobutirato de acetato de sacarose, e ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. V. Métodos de Utilização
Os agentes de ligação a Wnt (incluindo recetores solúveis) da invenção são úteis numa variedade de aplicações, incluindo, mas não limitadas a, métodos de tratamento terapêutico, tais como o tratamento do cancro. Em determinadas formas de realização, os agentes são úteis para inibir a sinalização de Wnt (por exemplo, sinalização canónica de Wnt), inibir o crescimento tumoral, induzir diferenciação, reduzir o volume tumoral, reduzir a frequência de células estaminais cancerígenas, eôou reduzir a tumorigenicidade de um tumor. Os métodos de utilização podem ser métodos in vitro, ex vivo, ou in vivo, Em determinadas formas de realização, o agente de ligação a Wnt ou polipéptido é um antagonista de uma ou mais proteínas Wnt humanos às quais liga.
Em determinadas formas de realização, os agentes de ligação a Wnt ou antagonistas são utilizados no tratamento de uma doença associada com a ativação da sinalização de Wnt. Em formas de realização particulares, a doença é uma doença dependente da via de sinalização de Wnt. Em formas de realização particulares, a sinalização de Wnt é sinalização canónica de Wnt. Em determinadas formas de realização, os agentes de ligação a Wnt ou antagonistas são utilizados no tratamento de doenças caracterizadas por níveis elevados de células estaminais eôou células progenitoras.
Em determinadas formas de realização, a doença tratada com o agente de ligação a Wnt ou antagonista (por exemplo, um recetor solúvel FZD, proteína derivada de SFRP, ou recetor Ror solúvel) é um cancro. Em determinadas formas de realização, o tumor é caracterizado por tumores dependentes de Wnt. Em determinadas formas de realização, o cancro é caracterizado por tumores que expressam uma ou mais Wnts, à qual o agente de ligação a Wnt (por exemplo, recetor solúvel) liga.
Em determinadas formas de realização, a doença tratada com o agente de ligação a Wnt ou antagonista não é um cancro. Por exemplo, a doença pode ser um distúrbio metabólico, tal como obesidade ou diabetes (por exemplo, diabetes tipo II) (Jin T., 2008, Diabetologia, 51: Ιμμί- 1μ80) . Alternativamente, a doença pode ser um distúrbio ósseo, tal como osteoporose, osteoartrite ou artrite reumatoide (Corr M., 2008, Nat. Clin. Pract. Reumatol, 4:550-6Ê. Day et al, 2008, Bone Joint Surg. Am, 90 Suppl 1:. 19-24). A doença pode também ser uma doença renal, tal como uma doença poliquística do rim (Harris et al. , 2009,
Ann. Rev. Med. , 60:321 -3μΕ Schmidt-Ott et al, 2008, Kidney Int, μ4: . 1004-8Ê Benzmg et al, 200μ, J. Am. Soe.
Nephrol, 18: 1389-1398). Alternativamente, podem ser tratados distúrbios oculares, incluindo, mas não limitados a, degeneração macular e vitreorretinopatia exsudativa familiar (LAD et al., 2009, Stem Cells Dev., 18:μ-16).
Podem também ser tratados distúrbios cardiovasculares, incluindo enfarto do miocãrdio, arteriosclerose e distúrbios das válvulas (Al-Aly Z., 2008, Transi. Res, 151:233-9,. Kobayashi et al, 2009, Nat. Biol Cell, 11:46-55Ê. Van Gijn et al, 2002, CardiovascRes., 55:16-24Ê Chnstman et al, 2008, Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol, 294: Η2864-μ0). Nalgumas formas de realização, a doença é uma doença pulmonar, tal como hipertensão arterial pulmonar idiopática ou fibrose pulmonar (Laumanns et al., 2008, Am. J. Respir. Mol Cell. Biol, 2009, 40:683 - 91Ê Konigshoff et al, 2008 PLoS ONE, 3: e2142) . Nalgumas formas de realização, a doença tratada com o agente de ligação a Wnt é uma doença do fígado, tal como cirrose ou fibrose do fígado (Cheng et al. , 2008, Am. J. Physiol. Gastrointest.
Liver Physiol, 294: G39-49). A presente invenção proporciona métodos de tratamento do cancro compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente de ligação a Wnt a um indivíduo (por exemplo, um indivíduo em necessidade de tratamento). Em determinadas formas de realização, o cancro é um cancro selecionado a partir do grupo consistindo em cancro colorretal, cancro pancreãtico, cancro de pulmão, cancro do ovário, cancro de fígado, cancro da mama, cancro renal, cancro da próstata, cancro gastrointestinal, melanoma, cancro de colo do útero, cancro da bexiga, glioblastoma, cancro da cabeça e pescoço. Em determinadas formas de realização, o cancro é cancro pancreático. Em determinadas formas de realização, o cancro é cancro colorretal. Em determinadas formas de realização, o cancro é cancro da mama. Em determinadas formas de realização, o indivíduo é um ser humano. A presente invenção proporciona ainda métodos para inibir o crescimento tumoral utilizando os agentes de ligação a Wnt descritos no presente documento. Em determinadas formas de realização, o método de inibir o crescimento do tumor compreende o contacto da célula tumoral ou tumor com um agente de ligação a Wnt in vitro. Por exemplo, uma linha celular imortalizada ou uma linha de células de cancro que expressa Wnt-alvo(s) é cultivada em meio ao qual é adicionado o agente de ligação a Wnt para inibir o crescimento de células tumorais. Nalgumas formas de realização, as células tumorais são isoladas, a partir de uma amostra do paciente, tal como, por exemplo, uma biópsia de tecido, efusão pleural ou amostra de sangue e cultivadas em meio ao qual é adicionado um agente de ligação a Wnt para inibir o crescimento de células tumorais.
Nalgumas formas de realização, o método de inibir o crescimento do tumor compreende o contacto das células tumorais ou tumor com o agente de ligação a Wnt (por exemplo, um recetor FZD solúvel) in vivo. Em determinadas formas de realização, o contacto de uma célula tumoral ou tumor com um agente de ligação a Wnt é realizado num modelo animal. Por exemplo, podem ser administrados agentes de ligação a Wnt a xenoenxertos expressando uma ou mais Wnts que foram cultivadas em ratinhos imunocomprometidos (por exemplo, ratinhos NODôSCID) para inibir o crescimento tumoral. Em determinadas formas de realização, as células estaminais cancerígenas são isoladas, a partir de uma amostra do paciente, tal como, por exemplo, uma biópsia de tecido, efusão pleural ou uma amostra de sangue e injetada em ratinhos imunocomprometidos que são posteriormente administrados com um agente de ligação a Wnt para inibir o crescimento de células tumorais. Nalgumas formas de realização, o agente de ligação a Wnt é administrado ao mesmo tempo ou imediatamente após a introdução de células tumorigénicas no animal para evitar o crescimento tumoral. Nalgumas formas de realização, o agente de ligação a Wnt é administrado como uma terapêutica após as células tumorigénicas terem crescido até um tumor de um tamanho especificado.
Em determinadas formas de realização, o método de inibir o crescimento de um tumor compreende a administração a um indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente de ligação a Wnt. Em determinadas formas de realização, o indivíduo é um ser humano. Em determinadas formas de realização, o indivíduo tem um tumor ou teve um tumor removido. A invenção também proporciona métodos de redução da frequência de células estaminais cancerígenas num tumor compreendendo as células estaminais cancerígenas, o método compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente de ligação a Wnt a um indivíduo. Além disso, são proporcionados métodos para induzir a diferenciação de células tumorais num indivíduo, em que o método compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente de ligação a Wnt ao indivíduo. Nalgumas formas de realização, os métodos para a expressão de marcadores de diferenciação de indução de um tumor compreendem a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente de ligação a Wnt a um indivíduo. Em determinadas formas de realização, o indivíduo é um ser humano.
Em determinadas formas de realização, o tumor é um tumor em que a sinalização de Wnt está ativa. Em determinadas formas de realização, a sinalização de Wnt que está ativa é a sinalização canónica de Wnt. Em determinadas formas de realização, o tumor é um tumor dependente de Wnt. Por exemplo, nalgumas formas de realização, o tumor é sensível a superexpressão de axina. Em determinadas formas de realização, o tumor não compreende uma mutação de inativação (por exemplo, uma mutação de truncamento) no gene supressor de tumor de polipose adenomatosa coli (APC) ou uma mutação de ativação do gene da beta-catenina. Em determinadas formas de realização, o tumor expressa um ou mais genes numa assinatura de gene Wnt. Em determinadas formas de realização, o cancro para o qual um indivíduo está a ser tratado envolve um tal tumor.
Em determinadas formas de realização, o tumor expressa uma ou mais proteínas Wnt humanas às quais o agente de ligação liga Wnt. Em determinadas formas de realização, o tumor superexpressa Wnt(s) humana(s).
Em determinadas formas de realização, o tumor é um tumor selecionado a partir do grupo consistindo em tumor colorretal, tumor pancreático, tumor do pulmão, tumor do ovário, tumor do fígado, tumor da mama, tumor renal, tumor da próstata, tumor gastrointestinal, melanoma, tumor cervical, tumor de bexiga, glioblastoma, tumor da cabeça e pescoço. Em determinadas formas de realização, o tumor é um tumor colorretal. Em determinadas formas de realização, o tumor é um tumor pancreãtico. Em determinadas formas de realização, o tumor é um tumor da mama. A invenção também proporciona um método de inibição da sinalização de Wnt numa célula compreendendo o contacto da célula com uma quantidade eficaz de um agente de ligação a Wnt.Em determinadas formas de realização, a célula é uma célula tumoral. Em determinadas formas de realização, o método é um método in vivo, em que a etapa de contacto da célula com o agente compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz do agente ao indivíduo. Nalgumas formas de realização alternativas, o método é um método in vitro ou ex vivo. Em determinadas formas de realizaçao, a sinalização de Wnt que e inibida e a sinalização canónica de Wnt. Em determinadas formas de realização, a sinalização de Wnt é sinalização por Wntl, Wnt2, Wnt.3, Wnt.3a, Wntpa, Wntpb eôou WntlOb. Em determinadas formas de realização, a sinalização de Wnt é sinalização por Wntl, Wnt3a, Wntpb eôou WntlOb.
Além disso, a invenção proporciona um método de reduzir a tumorigenicidade de um tumor num indivíduo, compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente de ligação a Wnt ao indivíduo. Em determinadas formas de realização, o tumor compreende células estaminais cancerígenas. Nalgumas formas de realização, a tumorigenicidade de um tumor é reduzida através da redução da frequência de células estaminais cancerígenas no tumor. Em determinadas formas de realização, a frequência de células estaminais cancerígenas no tumor é reduzida pela administração do agente de ligação a Wnt. Em determinadas formas de realização, o agente ou o anticorpo é capaz de reduzir o tumorigenicidade de um tumor compreendendo células estaminais cancerígenas num modelo animal, tal como um modelo de xenoenxerto de rato. Em determinadas formas de realização, o número ou a frequência de células estaminais cancerígenas de um tumor é reduzido em pelo menos cerca de duas vezes, cerca de três vezes, a cerca de cinco vezes, cerca de 10 vezes, cerca de 50 vezes, cerca de 100 vezes, ou cerca de 1000 vezes. Em determinadas formas de realização, a redução do número ou da frequência de células estaminais cancerígenas é determinada por ensaio de diluição limitante utilizando um modelo animal. Podem ser encontrados exemplos adicionais e orientação em relação à utilização de ensaios de diluição limitantes para determinar uma redução no número ou a frequência de células estaminais cancerígenas de um tumor, por exemplo, na Publicação Internacional N.° WO 2008Ô042236, Publicação de Pedido de Patente US N.° 2008Ô0064049, e Publicação de Pedido de Patente US N.° 2008ό01μ8305.
Consequentemente, a invenção também proporciona um método de reduzir a frequência de células estaminais cancerígenas de um tumor compreendendo células estaminais cancerígenas, o método compreendendo o contacto do tumor com uma quantidade eficaz de um agente de ligação a Wnt (por exemplo, um recetor solúvel FZD, um recetor solúvel Ror ou uma fusão SFRP-Fc). A invenção proporciona ainda métodos de diferenciação de células tumorigénicas em células não tumorigénicas compreendendo o contacto das células tumorigénicas com um agente de ligação a Wnt (por exemplo, administrando o agente de ligação a Wnt a um indivíduo que tem um tumor compreendendo as células tumorigénicas ou que tenha tido um tal tumor removido). Em determinadas formas de realização, as células tumorigénicas são células tumorais pancreãticas. Em determinadas formas de realização alternativas, as células tumorigénicas são células tumorais do cólon.
Também é proporcionada a utilização dos agentes de ligação a Wnt descritos no presente documento para induzir a diferenciação de células, incluindo, mas não limitadas a células tumorais. Por exemplo, são visados métodos de células que induzem a diferenciação compreendendo o contacto das células com uma quantidade eficaz de um agente de ligação a Wnt (por exemplo, um recetor solúvel FZD, um recetor solúvel Ror, ou uma fusão SFRP-Fc) descritos no presente documento. São também proporcionados métodos de induzir a diferenciação de células de um tumor num indivíduo compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente de ligação a Wnt ao indivíduo. Em determinadas formas de realização, o tumor é um tumor pancreãtico. Em determinadas outras formas de realização, o tumor é um tumor do cólon. São adicionalmente proporcionados métodos de tratamento de uma doença ou distúrbio num indivíduo, em que a doença ou distúrbio é associada com a ativação da sinalização de Wnt eôou é caracterizada por um aumento do nível de células estaminais eôou células progenitoras. Nalgumas formas de realização, os métodos de tratamento compreendem a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz do agente de ligação a Wnt ao indivíduo. Em determinadas formas de realização, a sinalização de Wnt é sinalização canónica de Wnt.
Os agentes de ligação ou antagonistas de Wnt são administrados como uma composição farmacêutica adequada para um paciente humano, de acordo com métodos conhecidos. Os métodos adequados de administração incluem, mas não estão limitados a, vias intravenosa (administração como um bolus ou por infusão contínua ao longo de um período de tempo), intramuscular, intraperitoneal, intracerobrospinal, subcutânea, intra-articular, intra-sinovial, intratecal, oral, tópica ou inalaçao.
Em determinadas formas de realização, além da administração do agente de ligação a Wnt, o método ou tratamento adicional compreende a administração de um segundo agente terapêutico (por exemplo, um agente anticancro) antes de, concorrentemente com, eôou subsequentemente à administração do agente de ligação a Wnt. As composições farmacêuticas compreendendo o agente de ligação a Wnt e o segundo agente terapêutico são também proporcionados.
Será apreciado que a combinação de um agente de ligação a Wnt e um segundo agente terapêutico podem ser administrados em qualquer ordem ou simultaneamente. Em formas de realização selecionadas, os agentes de ligação a Wnt serão administrados a pacientes que se submeteram tratamento com o segundo agente terapêutico. Em determinadas outras formas de realização, o agente de ligação a Wnt e o segundo agente terapêutico serão administrados substancialmente simultaneamente ou em simultâneo. Por exemplo, pode ser dado ao indivíduo um agente de ligação a Wnt, enquanto submetido a um curso de tratamento com o segundo agente terapêutico (por exemplo, quimioterapêutica). Em determinadas formas de realização, o agente de ligação a Wnt será administrado dentro de 1 ano de tratamento com o segundo agente terapêutico. Em determinadas formas de realização alternativas, o agente de ligação a Wnt será administrado dentro de 10, 8, 6, 4, ou 2 meses, de qualquer tratamento com o segundo agente terapêutico. Em determinadas outras formas de realização, o agente de ligação a Wnt será administrado dentro de 4, 3, 2, ou 1 semana de qualquer tratamento com o segundo agente terapêutico. Nalgumas formas de realização, o agente de ligação a Wnt será administrado dentro de 5, 4, 3, 2 ou 1 dia de qualquer tratamento com o segundo agente terapêutico. Ainda será apreciado que os dois agentes ou tratamentos podem ser administrados ao indivíduo dentro de uma questão de horas ou minutos (isto é, substancialmente em simultâneo). A terapêutica de combinação com pelo menos dois agentes terapêuticos utiliza frequentemente agentes que funcionam por diferentes mecanismos de ação, embora isto não seja necessário. A terapêutica combinada utilizando agentes com diferentes mecanismos de ação pode resultar em efeitos aditivos ou sinergéticos. Terapêutica de combinação pode permitir uma dose mais baixa de cada agente que é utilizado em monoterapêutica, reduzindo, consequentemente, os efeitos secundários tóxicos. Terapêutica de combinação pode diminuir a probabilidade de que as células cancerígenas resistentes irão se desenvolver. Nalgumas formas de realização, a terapêutica de combinação compreende um agente terapêutico que afeta (por exemplo, inibe ou mata) células não tumorigénicas e um agente terapêutico que afeta (por exemplo, inibe ou mata) CSCs tumorigénico.
Classes úteis de agentes terapêuticos (por exemplo, anticancro) incluem, por exemplo, agentes antitubulina e auristatinas, ligantes do sulco menor do ADN, inibidores de replicação de ADN, agentes alquilantes (por exemplo, complexos de platina, tais como cis-platina, mono (platina), bis (platina) e complexos de tri-nucleares de platina e carboplatina), antraciclinas, antibióticos, antifolatos, antimetabolitos, sensibilizadores de quimioterapêutica, duocarmicinas e etoposidas, pirimidinas fluorados, ionõforos, lexitropsinas e nitrosureias e platinóis, compostos de realização, purinas antimetabólitas, puromicinas, sensibilizadores de radiação, esterõides, taxanos, inibidores de topoisomerase, alcaloides da vinca, ou semelhantes. Em determinadas formas de realização, o segundo agente terapêutico é um antimetabólito, um antimitõtico, um inibidor da topoisomerase ou um inibidor da angiogénese.
Agentes terapêuticos que podem ser administrados em combinação com os agentes de ligação a Wnt incluem agentes quimioterapêuticos. Consequentemente, nalgumas formas de realização, o método ou tratamento envolve a administração combinada de um agente de ligação a Wnt da presente invenção e um agente quimioterapêutico ou um coquetel de vários agentes quimioterapêuticos diferente. 0 tratamento com um agente de ligação a Wnt pode ocorrer antes, simultaneamente com, ou subsequentemente à administração de quimioterapêutica. Quimioterapêuticas contempladas pela invenção incluem substâncias químicas ou drogas que são conhecidos na técnica e estão comercialmente disponíveis, tais como gencitabina, irinotecano, doxorrubicina, 5-fluoruraciloo, citosina arabinósido ("Ara-C"), ciclofosfamida, tiotepa, bussulfano, citoxina, metotrexato paclitaxel, cisplatina, melfalano, vinblastina e carboplatina. Administração combinada pode incluir coadministraçâo, quer numa única formulação farmacêutica ou utilizando formulações separadas, ou a administração consecutiva em qualquer ordem, mas geralmente dentro de um período de tempo, tal que todos os agentes ativos possam exercer as suas atividades biológicas simultaneamente. Preparação e dosagem de programações para tais agentes quimioterapêuticos podem ser utilizados, de acordo com as instruções dos fabricantes ou conforme determinado empiricamente pelo profissional especializado. Tais preparações e regimes posolõgicos para quimioterapêutica são também descritos em Chemotherapy service Ed., MC Perry, Williams e Wilkins, Baltimore, Maryland (1992) .
Os agentes quimioterapêuticos úteis na presente invenção incluem também, mas não estão limitados a, agentes alquilantes, tais como tiotepa e ciclofosfamidaÊ sulfonatos de alquil, tais como busulfano, improsulfan, e piposulfanÊ aziridinas, tais como benzodopa, carboquone, meturedopa, e uredopaÊ etileniminas e metilamelaminas incluindo altretamina, trietilenemelamina, trietilenefosforamida, mostardas de azoto, tais como clorambucil, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, cloridrato de óxido de mecloretamina, melfalano, novembichin, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostarda de uraciloÊ nitrosureias, tais como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustinaÊ antibióticos, tais como aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, caliceamicina, carabicina, caminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina, epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatin, zorubicinÊ anti-metabólitos, tais como metotrexato e 5 fluoruracilo-(5-FU)Ê análogos de ácido fólico, tais como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexatoÊ análogos de purina, tais como a fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguaninaÊ análogos de pirimidina, tais como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, 5-FUÊ androgénios, tais como calusterona, propianato de dromostalonona, epitiostanol, mepitiostana, testolactona, anti-adrenais, tais como aminoglutetimida, mitotano, trilostanoÊ reabastecedor de ácido fólico, tal como ácido frolínicoÊ aceglatonaÊ glicosídeo aldofosfamidaÊ ácido aminolevulínicoÊ ansacrinaÊ bestrabucilÊ bisantrenoÊ edatraxatoÊ defofaminaÊ demecolcinaÊ diaziquonaÊ elformitinaÊ acetato de eliptínioÊ etoglucidaÊ nitrato de gálioÊ hidroxiureiaÊ lentinanaÊ lonidaminaÊ mitoguazonaÊ mitoxantronaÊ mopidamolÊ nitracrinaÊ pentostatinaÊ fenametÊ pirarubicinaÊ ácido podofilínicoÊ 2-etilhidrazidaÊ procarbazinaÊ PSKÊ pag 55 razoxanoÊ sizofuranoÊ espirogermânioÊ ácido tenuazónicoÊ triaziquonaÊ 2,2',2"-triclorotrietilaminaÊ uretanoÊ vindesinaÊ dacarbazinaÊ manomustinaÊ mitobronitolÊ mitolactolÊ pipobromanÊ gacitosinaÊ arabinosídeo ("Ara-C")Ê ciclofosfamidaÊ tiotepaÊ taxõides, por exemplo, paclitaxel (TAXOL) e docetaxel (TAXOTERE) clorambucil,Ê gencitabinaÊ 6-tioguaninaÊ mercaptopurina, metotrexatoÊ análogos de platina, tais como cisplatina e carboplatinaE vinblastinaE platinaÊ etoposide (VP-16)Ê ifosfamidaÊ mitomicina CÊ mitoxantronaÊ vincristinaÊ vinorelbinaÊ navelbinaÊ novantronaÊ teniposideÊ daunomicinaÊ aminopterinaÊ xelodaÊ ibandronatoÊ CPT11Ê inibidor da topoisomerase RFS 2000Ê difluormetilornitina (DMFO)Ê ácido retinóicoÊ esperamicinaÊ capecitabina, e sais farmaceuticamente aceitáveis, ácidos ou derivados de qualquer um dos acima. Os agentes quimioterapêuticos incluem também agentes anti-hormonais que atuam para regular ou inibir a ação hormonal em tumores, tais como anti-estrogénios, incluindo por exemplo o tamoxifeno, o raloxifeno, da aromatase inibindo 4(5)-imidazol, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifene, LYllpOlS, onapristona e toremifeno (Fareston)Ê e anti-androgénios, tais como flutamida, nilutamida e bicalutamida, leuprolide, goserelina eÊ e seus sais farmaceuticamente aceitáveis, ácidos ou derivados de qualquer um dos acima.
Em determinadas formas de realização, o agente quimioterapêutico é um inibidor da topoisomerase. Inibidores de topoisomerases são agentes de quimioterapêutica que interferem com a ação de uma enzima topoisomerase (por exemplo, a topoisomerase I ou II) . Inibidores de topoisomerases incluem, mas não estão limitados a, doxorubicina HC1, citrato de daunorrubicina, mitoxantrona HC1, actinomicina D, etoposide, topotecano HC1, teniposide (VM-26), e irinotecano. Em determinadas formas de realização, o segundo agente terapêutico é irinotecano. Em determinadas formas de realização, o tumor a ser tratado é um tumor colorretal e o segundo agente terapêutico é um inibidor da topoisomerase, tal como irinotecano. Nalgumas formas de realização, o agente de ligação a Wnt compreende a SEQ ID NO: 53 e o segundo agente terapêutico é irinotecano. Nalgumas formas de realização, o agente de ligação a Wnt compreende a SEQ ID NO: μ5 e o segundo agente terapêutico é irinotecano.
Em determinadas formas de realização, o agente quimioterapêutico é um antimetabólito. Um antimetabólito é um produto químico com uma estrutura que é semelhante a um metabólito necessário para reações bioquímicas normais, mas diferentes o suficiente para interferir com uma ou mais funções normais de células, tais como a divisão celular. Antimetabólitos incluem, mas não estão limitados a, gencitabina, fluoruraciloa, capecitabina, metotrexato de sódio, ralitrexed, tegafur, pemetrexed, citosina arabmoside, tioguanina, 5-azacitidina, 6-mercaptopurina, azatioprina, 6-tioguanina, pentostatina, fosfato de fludarabina, e cladribina, bem como sais farmaceuticamente aceitáveis, ácidos ou derivados de qualquer destes. Em determinadas formas de realização, o segundo agente terapêutico é gencitabina. Em determinadas formas de realização, o tumor a ser tratado é um tumor pancreãtico e o segundo agente terapêutico é um antimetabólito (por exemplo, a gencitabina). Nalgumas formas de realização, o agente de ligação a Wnt compreende a SEQ ID NO: 53 e o segundo agente terapêutico é gencitabina. Nalgumas formas de realização, o agente de ligação a Wnt compreende a SEQ ID NO: μ5 e o segundo agente terapêutico é gencitabina.
Em determinadas formas de realização, o agente quimioterapêutico é um agente antimitótico, incluindo, mas não se limitam a, agentes que ligam a tubulina. A título de exemplo não limitante, o agente compreende um taxano. Em determinadas formas de realização, o agente compreende paclitaxel ou o docetaxel ou seu sal farmaceuticamente aceitável, o ácido, ou um derivado de paclitaxel ou docetaxel. Em determinadas formas de realização, o agente é paclitaxel (TAXOL), docetaxel (TAXOTERE), paclitaxel ligado à albumina (ABRAXANE), DHA-paclitaxel, ou PG-paclitaxel. Em determinadas formas de realização alternativas, o agente antimitótico compreende um alcaloide da vinca, tais como vincristina, vinblastina, vinorelbina ou vindesina, ou sais farmaceuticamente aceitáveis, ácidos, ou os seus derivados. Nalgumas formas de realização, o agente antimitótico é um inibidor da EG5 cinesina ou um inibidor de uma quinase mitótica, tais como Aurora A ou Plkl. Em determinadas formas de realização, onde o agente quimioterapêutico administrado em combinação com o agente de ligação a Wnt ou polipéptido compreende um agente antimitótico, o cancro ou um tumor a ser tratado é o cancro da mama ou um tumor de mama. Em determinadas formas de realização, o tumor a ser tratado é um tumor da mama e o segundo agente terapêutico é paclitaxel. Nalgumas formas de realização, o agente de ligação a Wnt compreende a SEQ ID NO: 53 e o segundo agente terapêutico é paclitaxel. Nalgumas formas de realização, o agente de ligação a Wnt compreende a SEQ ID NO: μ5 e o segundo agente terapêutico é paclitaxel.
Em determinadas formas de realização, o tratamento envolve a administração combinada de um agente de ligação a Wnt da presente invenção e terapêutica de radiação. 0 tratamento com o agente de ligação a Wnt pode ocorrer antes, simultaneamente com, ou subsequentemente à administração de terapêutica de radiação. Quaisquer tais programações de dosagem para a terapêutica de radiação podem ser utilizadas como determinada pelo médico qualificado.
Em algumas formas de realização, o segundo agente terapêutico compreende um anticorpo. Consequentemente, o tratamento pode envolver a administração combinada de agentes de ligação a Wnt da presente invenção com anticorpos contra antigénios associados a tumores, incluindo, mas não se limitam a, anticorpos que ligam a EGFR, ErbB2, HER2, D114, Notch eôou VEGF. Exemplos de anticorpos anti-DLLi4 estão descritos, por exemplo, na Patente US μ.μ50.124. Anticorpos anti-DLL4 adicionais são descritos em, por exemplo, nas Publicações de Patente Internacional WO 2008Ô091222 e WO 2008ό0μ93326, e Publicações de Pedido de Patente US2008Ô0014196, US 2008ό01μ584μ, US 2008Ô0181899, e US 2008ό010μ648. Em determinadas formas de realização, o segundo agente terapêutico é um anticorpo que é um inibidor da angiogénese (por exemplo, um anticorpo anti-VEGF). Nalgumas formas de realização, o agente de ligação a Wnt compreende a SEQ ID NO: 53 e o segundo agente terapêutico é um anticorpo anti-VEGF. Nalgumas formas de realização, o agente de ligação a Wnt compreende a SEQ ID NO: μ5 e o segundo agente terapêutico é um anticorpo anti-VEGF. Em determinadas formas de realização, o segundo agente terapêutico é um inibidor da sinalização de divisão. Nalgumas formas de realização, o segundo agente terapêutico é um anticorpo antidivisão. Exemplos de anticorpos antidivisão são descritos, por exemplo, na Publicação de Pedido de Patente US 2008Ô0131434. Em determinadas formas de realização, o segundo agente terapêutico é o bevacizumab (Avastin), o trastuzumab (Herceptin), panitumumab (Vectibix), ou cetuximab (Erbitux). Administração combinada pode incluir coadministração, quer numa única formulação farmacêutica ou utilizando formulações separadas, ou a administração consecutiva em qualquer ordem, mas geralmente dentro de um período de tempo, tal que todos os agentes ativos possam exercer as suas atividades biológicas simultaneamente.
Além disso, o tratamento pode incluir a administração de uma ou mais citoquinas (por exemplo, linfocinas, interleucinas, fatores de necrose tumoral, eôou fatores de crescimento) ou pode ser acompanhada por remoção cirúrgica do tumor ou células cancerígenas ou de qualquer outra terapêutica considerado necessário assistida por um médico.
Para o tratamento da doença, a dosagem adequada de um agente da presente invenção depende do tipo de doença a ser tratada, da gravidade e do curso da doença, a resposta da doença, se o agente é administrado para fins terapêuticos ou preventivos, terapêutica anterior, história clínica do paciente, e assim por diante, tudo ao critério da assistência do médico. 0 agente pode ser administrado uma vez ou durante uma série de tratamentos com duração de alguns dias a vários meses, ou até que a cura seja efetuada ou uma diminuição do estado de doença seja alcançada (por exemplo, redução do tamanho do tumor). Esquemas de dosagem ideias podem ser calculados a partir de medições de acumulação de droga no corpo do paciente e podem variar dependendo da potência relativa de um agente individual. A administração médica pode facilmente determinar dosagens ideias, metodologias de dosagem e as taxas de repetência. Em determinadas formas de realização, a dosagem é de 0,01 pg para 100 mg por kg de peso corporal, e pode ser administrada uma vez ou mais por dia, semanalmente, mensalmente ou anualmente. Em determinadas formas de realização, a dosagem do recetor solúvel ou outro agente de ligação a Wnt é de cerca de 0,1 mg a cerca de 20 mg por kg de peso corporal. Em determinadas formas de realização, o agente de ligação a Wnt é administrado uma vez por semana. Em determinadas formas de realização, o agente de ligação a Wnt é administrado uma vez a cada duas semanas ou uma vez de três em três semanas. A assistência médica pode estimar as taxas de repetição para a dosagem baseado em tempos de residência medidos e concentrações do fármaco em fluidos corporais ou tecidos. A presente invenção proporciona ainda métodos de agentes de triagem para a eficácia na inibição de sinalização de Wnt, para atividade antitumoral, eôou atividade contra células estaminais cancerígenas. Em determinadas formas de realização, o método compreende a comparação do nível de um ou mais marcadores de diferenciação eôou um ou mais marcadores de sternness de um primeiro tumor sólido (por exemplo, um tumor sólido compreendendo células estaminais cancerígenas), o qual foi exposto ao agente para o nível de um ou mais marcadores de diferenciação num segundo tumor sólido que não tenha sido exposto ao agente. Nalgumas formas de realização, o método compreende: (a) a exposição de um primeiro tumor sólido, mas não um segundo tumor sólido, para o agente, (b) avaliação do nível de um ou mais marcadores de diferenciação eôou um ou mais marcadores de sternness nos primeiro e segundo tumores sólidos, e (c) comparação do nível de um ou mais marcadores de diferenciação no primeiro tumor primeiro e no nível de um ou mais marcadores de diferenciação no segundo tumor sólido. Em determinadas formas de realização, o(s) nível(is) aumentados de um ou mais marcadores de diferenciação em relação ao primeiro tumor sólido para os níveis de um ou mais marcadores de diferenciação no segundo tumor sólido indica atividade antitumoral (ou anticancro de células tronco) , e (b) níveis diminuídos de um ou mais marcadores de sternness indicam atividade antitumoral (ou anticancro de células tronco). Em determinadas formas de realização, o agente liga a uma ou mais proteínas Wnt. Em determinadas formas de realização, o agente é um recetor FZD solúvel. Em determinados métodos, o agente é um anticorpo, tal como um anticorpo anti-Wnt. Métodos adicionais para triar agentes incluem, mas não estão limitados a, métodos compreendendo comparar os níveis de um ou mais marcadores de diferenciação de um primeiro tumor sólido que foi exposto a um agente para os níveis de um ou mais marcadores de diferenciação num segundo tumor sólido que não tenha sido exposto ao agente. Em determinadas formas de realização, os métodos incluem compreender (a) expor um primeiro tumor sólido, mas não um segundo tumor sólido, ao agente, (b) avaliar os níveis de um ou mais marcadores de diferenciação nos primeiro e segundo tumores sólidos, e (c) comparar os níveis de um ou mais marcadores de diferenciação no primeiro tumor para os níveis de um ou mais marcadores de diferenciação no segundo tumor sólido. Em determinadas formas de realização, o agente é um agente de ligação a Wnt. Em determinadas formas de realização, o agente é um inibidor da via de sinalização Canónica Wnt. Em determinadas formas de realização, o agente inibe a ligação de uma ou mais proteínas Wnt humanas a um ou mais recetores FZD humanos. Em determinadas formas de realização, níveis aumentados de um ou mais marcadores de diferenciação em relação ao primeiro tumor sólido para níveis de um ou mais marcadores de diferenciação no segundo tumor sólido indica a eficácia contra as células estaminais tumorais sólidas (CSCs). Em determinadas formas de realização alternativas, níveis diminuídos de um ou mais marcadores de diferenciação (isto é, os marcadores de diferenciação negativos) em relação ao primeiro tumor sólido para os níveis de um ou mais marcadores de diferenciação no segundo tumor sólido indica a eficácia contra as células estaminais tumorais sólidas.
Em determinadas formas de realização, o tumor sólido no método de rastreio é um tumor pancreático. Em determinadas formas de realização, o tumor sólido é um tumor pancreático e um ou mais marcadores de diferenciação pode compreender um ou mais mucinas (por exemplo, Mucl6), um ou mais citoqueratinas (por exemplo, CK20) eôou cromogranina A (CHGA).
Em determinadas formas de realização alternativas, o tumor sólido no método de rastreio é um tumor do cólon. Nalgumas formas de realização, o tumor sólido é um tumor do cólon e um ou mais marcadores de diferenciação pode compreender um ou mais citoqueratinas (por exemplo, citoqueratina μ ou CK20).
Em determinadas formas de realização, um ou mais marcadores sem potência utilizados nos métodos de rastreio no presente documento descritos compreendem ALDH1 AI, APC, ΑΧΓΝ2, BMI1, CD44, FGF1, GJB1, GJB2, HES1, JAG1, LGR5, LHX8, MYC, NANOG, NEUR0D1, NEUR0G2, NOTCH1, N0TCH2, N0TCH3, N0TCH4, PROCR, RARRES1, RARRES3, RBP2 , S0X1, S0X2, ASCL2ÔTDGF1, 0LFM4, MSI1 , DASH 1 , EPHB3 eÔOU EPHB4 . Em determinadas formas de realização, dois ou mais marcadores de sternness, três ou mais marcadores de sternness, quatro ou mais marcadores de sternness, cinco ou mais marcadores de sternness, seis ou mais, ou 10 ou mais marcadores de sternness são selecionados a partir do grupo consistindo em ALDH1A1, APC, ΑΧΓΝ2, BMI1, CD44, FGF1, GJBi, GJB2, HES1, JAG1, LGR5, LHX8, MYC, NANOG, NEUROD1, NEUROG2, NOTCH1, N0TCH2, N0TCH3, N0TCH4, PROCR, RARRES1 RARRES3, RBP2, SOXl, SOX2, ASCL2, TDGF 1, OLFM4, MSI1, DASH 1, EPHB3 e EPHB4.
Em determinadas formas de realização, um ou mais marcadores de diferenciação utilizados nos métodos de rastreio compreendem ALDOB, BMP2, ΒΜΡμ, BMPR1B, CEACAM5, CEACAM6, CDX1, CDX2, CLCA2, COL1A2, COL6A1, CHGA, CSTA, CST4, CK20, DAB2 , FABP4, GST1, KRT4, KRTp, KRT15, KRTlp, KRT20, LAMal, MUC3A, MUC4, MUC5AC, MUC5B, MUC 13, MUC 15, MUC16, MUClp, NDRG2, PIP, PLUG, SPRRI A, REG4, VSIG1 eôou XAF1. Em determinadas formas de realização dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, seis ou mais, ou 10 ou mais marcadores de diferenciação utilizados nos métodos de rastreio são selecionados a partir do grupo consistindo em ALDOB, BMP2, ΒΜΡμ, BMPR1 B, CEACAM5, CEACAM6, CDX1, CDX2, CLCA2, COL 1 A2, C0L6A1, CHGA, CSTA, CST4, CK20, DAB 2, FABP4, GST1, KRT4, KRTp, KRT 15, KRTlp, KRT20, LAMA 1, MUC3A, MUC4, MUC5AC , MUC5B, MUC13, MUC 15, MUC 16, MUClp, NDRG2, PIP, PLUNC, SPRRIA, REG4, VSIG1 e XAF1 .
Outros marcadores de diferenciação potenciais para pâncreas e cólon, bem como outros tipos de tumores são conhecidos pelos os peritos na especialidade. Além disso, a utilidade dos marcadores de diferenciação potenciais num método de rastreio pode ser facilmente avaliada por um perito na especialidade pelo tratamento do tipo de tumor desejado com um ou mais dos recetores solúveis FZD descritos no presente documento, tal como FZD8-Fc e, em seguida, avaliar as alterações na expressão do marcador pelo tumor tratado em relação ao controlo. Exemplos não limitantes de tais métodos podem, por exemplo, ser encontrados nos Exemplos específicos a seguir. A presente invenção proporciona ainda métodos para produzir agentes de ligação a Wnt solúveis. Em determinadas formas de realização, o método compreende a produção de um agente de ligação a Wnt solúvel que compreende um domínio de Fri FZD8 humana numa célula, em que pelo menos 80™ do agente de ligação a Wnt têm uma sequência N-terminal de ASA, o método compreendendo utilizar uma sequência de sinal selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: μΐ, SEQ ID NO: μ0, SEQ ID NO: μ2, SEQ ID NO: μ3 e SEQ ID NO: μ4 para a produção do agente de ligação a Wnt. Nalgumas formas de realização do método, a sequência de sinal é SEQ ID NO: μΐ. Nalgumas formas de realização pelo menos cerca de 90™ pelo menos cerca de 95™, ou pelo menos cerca de 98™ do agente de ligação a Wnt tem uma sequência N-terminal de ASA. Nalgumas formas de realização, a célula é uma célula de mamífero. Nalgumas formas de realização, o agente de ligação a Wnt compreende uma região Fc humana. Nalgumas formas de realização, o agente de ligação a Wnt compreende uma sequência de aminoãcidos selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 4 8 e SEQ ID NO: 1. Nalgumas formas de realização, o agente de ligação a Wnt compreende a SEQ ID NO: 53. Nalgumas formas de realização, o agente de ligação a Wnt compreende a SEQ ID NO: 50. Nalgumas formas de realização, a célula compreende um polinucleótido compreendendo um polinucleótido que codifica um polipéptido tendo a sequência da SEQ ID NO: μ5.
EXEMPLOS É entendido que os exemplos e formas de realização no presente documento descritas são apenas para fins ilustrativos. EXEMPLO 1
Produção de FZD8-Fc ADNc que codifica FZD8-FC (54F03) foi subclonado num vetor de expressão pEE14.4 (Lonza), digerido com Hindlll e EcoRI. Após a clonagem, o ADN pEE14.4-FZDS-Fc foi linearizado por digestão com Pvul e, subsequentemente, introduzido em células SG-CH0K1 por eletroporação utilizando procedimentos padrão. Clones estáveis que expressam FZD8-Fc foram obtidos e expandidos em meio isento de soro. FZD8-Fc foi purificado por captura de afinidade utilizando uma resina conjugada com proteína A. Análise SDS - PAGE revelou mais do que 98% de pureza e o nível de endotoxina foi inferior a 1 EUômg de proteína. A sequência de aminoácidos de FZD8-Fc é a SEQ ID NO: 1 e a sequência polinucleotídica que codifica FZDS-Fc é a SEQ ID NO: 2. EXEMPLO 2
Farmacocinética de FZDS-Fc em rato A farmacocinética do FZDS-Fc (54F03) foi avaliada em ratos num estudo farmacocinético de duas semanas (PK) , utilizando doses de 2 mgôkg e 10 mgôkg. Ratos Sprague Dawley, cinco machos em cada grupo, foram doseados com FZDS-Fc através da veia caudal a 2 mgôkg ou 10 mgôkg e seguidos durante duas semanas com amostras recolhidas nos pontos de tempo 1, 24, 48, μ2, 96 , 168, 240 e 336 horas. Em cada ponto de tempo, 1 ml de sangue foi recolhido em tubos de potãssio-EDTA e centrifugado. Os sobrenadantes de plasma foram recolhidos e congelados até que as amostras fossem analisadas. 0 nível de proteína de fusão FZD8-FC presente no plasma em cada ponto de tempo foi quantificado e a semivida de FZD8-Fc foi calculada para as duas doses. Como mostrado na Figura 1, a semivida de FZDS-Fc foi estimada em 163 horas a 2 mgôkg e em 15μ horas a 10 mgôkg. EXEMPLO 3
Atividade antitumoral de FZDS-Fc no modelo de tumor pancreático
Inibição do crescimento do tumor por FZDS-Fc no modelo de tumor pancreático. A atividade antitumoral de FZD8-Fc (54F03) foi avaliada no modelo de xenoenxerto de tumor de pâncreas PN4 . Células dissociadas 0MP-Pn4 (50.000 por animal) foram injetados por via subcutânea em ratinhos machos NODôSCID de 6-8 semanas de idade. 0 crescimento do tumor foi monitorizado semanalmente e as medições do tumor foram iniciadas uma vez que o tumor foi palpável. No dia 50, os ratinhos com volumes médios de tumores de 13μ mrrt foram distribuídos aleatoriamente em 4 grupos de 10 animais cada. Os animais foram injetados quer com anticorpo de controlo, FZD8-Fc (15 mgôkg), gencitabina (2 mgôkg) ou uma combinação de FZD8-Fc e gencitabina. A administração do FZD8-Fc e gencitabina foi realizada através de injeção na cavidade intraperitoneal, uma vez por semana (gencitabina) ou duas vezes por semana (FZD8-Fc). Os tumores foram medidos duas vezes por semana e volume do tumor foi determinado utilizando a fórmula lu2(axb2)Ê onde a comprimento e, b = largura. Os dados são expressos como média e média ± S.E.M. As médias dos grupos foram comparadas pelo teste t de Student bicaudal, não pareado. Valores de probabilidade (p) de <0,05 foram interpretados como significativamente diferentes. 0 tratamento com FZD8-FC resultou numa redução de 66% no crescimento do tumor, como mostrado na Figura 2 (p <0,001) . Além disso, o tratamento com FZDS-Fc e gencitabina resultou numa redução de 2 9% do crescimento do tumor em relação ao tratamento com FZD8-FC por si só (p = 0,04 vs FZDS-Fc por si só) (Figura 2) . Consequentemente, FZD8-Fc demonstrou atividade anti-crescimento tumoralem modelo de tumor do pâncreas PN4 como um agente único, bem como em combinação com gencitabina.
Redução na população de CD44Mhi em tumores PN4 tratados com FZD8-Fc. Tumores de controlo e tratados a partir do estudo de xenoenxerto 0MP-PN4 descrito acima foram recolhidos no final do estudo (dia 85) . Os tumores foram processados e dissociados em células individuais. As suspensões de células individuais derivadas de 5 tumores de cada grupo de tratamento foram reunidas, e as amostras reunidas foram, em seguida, incubadas em gelo durante 30 min com anticorpos que ligam seletivamente a células de ratinho (a-ratinho-CD45-biotina 1:200 de diluição e rato α-ratinho H2Kd-biotina 1:100 de diluição, BioLegend, San Diego, CA), seguido pela adição de contas magnéticas marcadas com estreptavidina (Invitrogen, Carlsbad, CA) . As células de ratinho foram removidas com a ajuda de um imã. Para a análise de marcadores de superfície de células humanas, a suspensão de células tumorais individuais foi corada com anticorpos anti-ESA (Biomeda, Hayward, CA) e anti-CD44 (BD Biosciences, San Jose, CA) que foram diretamente conjugados com fluorocromos. As células mortas foram excluídas utilizando o corante de viabilidade DAPI. Uma citometria de fluxo foi realizada utilizando um instrumento de FACS Aria (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) . Os perfis de dispersão lateral e de dispersão direta foram utilizados para eliminar aglomerados de células. A análise dos tumores tratados com anticorpo de controlo revelou que 12,μ% da quantidade de população do tumor expressaram tanto ESA quanto CD44 em níveis elevados. A população dupla positiva não foi significativamente afetada pelo tratamento com gencitabina por si só (13,9%) como mostrado na Figura 3, mas o tratamento com qualquer um FZD8-Fc ou a combinação de FZD8-Fc com gencitabina reduziu a população dupla positiva (1,9™ e Ι,μ™ respetivamente).
Análise de tumores PN4 tratados com FZD8-Fc por meio de ensaio de diluição limit ante. Os ensaios de diluição limitante (LDA) podem ser utilizados para avaliar o efeito de agentes terapêuticos em células estaminais de tumores de cancro sólidos e na tumorigenicidade de um tumor compreendendo as células estaminais do cancro. Tais ensaios podem ser utilizados para determinar a frequência de células estaminais cancerígenas em tumores de animais tratados com a proteína de fusão FZD8-Fc ou outro agente e para comparar esta frequência com a frequência de células estaminais cancerígenas em tumores de animais de controlo.
Tumores de controlo e tratados a partir do estudo xenoenxerto PN4 descrito acima foram recolhidas no final do estudo (dia 85). Os tumores foram processados e dissociados em células individuais. As suspensões de células individuais derivados de 5 tumores de cada grupo de tratamento foram reunidas, e as amostras reunidas foram, em seguida, incubadas em gelo durante 30 min com anticorpos que ligam seletivamente células de ratinhos (a-ratinho-CD45-biotina 1:200 de diluição e de rato α-ratinho H2Kd-biotina 1:100 de diluição, BioLegend, San Diego, CA), seguido pela adição de contas magnéticas marcadas com estreptavidina (Invitrogen, Carlsbad, CA) . As células de ratinho foram removidas com a ajuda de um imã. As células humanas em suspensão foram recolhidas, contadas e coradas para marcadores de superfície celular e doses de células adequadas (30, 9 0 e 2μ0 células) em tampão de FACS foram misturadas numa mistura de 1:1 com Matrigel e injetadas por via subcutânea em ratinhos NODôSCID (10 ratinhos por dose de células por grupo de tratamento). Os tumores são colocados para crescer durante até 4 meses.
No ponto de tempo desejado, a percentagem de ratinhos com tumores detetáveis foi determinada em todos os grupos injetados com FZD8-Fc-tratados com células tumorais e em comparação com a percentagem de ratinhos com tumores detetáveis nos controlos. Por exemplo, o número de ratinhos injetados com 125 células tumorais tratadas com o anticorpo de controlo que possuem tumores detetáveis é determinada e comparada com o número de ratinhos injetados com 125 células tumorais tratadas com FZD8-FC que têm tumores detetáveis.
No dia μ5 após a injeção das células, as taxas do tumor nos vários grupos foram as seguintes: controlo - μ ratinhos de 30 ratinhosÊ FZDS-Fc - 3 ratinhos de 30 ratinhosÊ gencitabina - μ ratinhos de 30 ratinhosÊ FZDS-Fc e gencitabina - 0 ratinhos de 30 ratinhos (Figura 4). A taxa de tumor reduzida no FZDS-Fc e nos grupos tratados em combinação indicou que a frequência de cancro de células estaminais foi reduzida em tumores pancreáticos PN4 por FZDS-Fc. A evidência a partir da avaliação de ambos, a expressão de CD44 e a análise de diluição limitante da dose revelou que tratamento FZDS-Fc reduz a frequência de cancro de células estaminais em tumores pancreáticos PN4. A frequência de células estaminais do cancro (CSC) pode ser calculada utilizando a software L-CalcTM (StemCell Technologies Inc.Ê www.stemcell.com). Resumidamente, com base na estatística de Poisson, exatamente um cancro de células estaminais existe entre o número conhecido de células injetadas se 3μ% dos animais não conseguem desenvolver tumores. A frequência CSC para o grupo tratado com anticorpo de controlo foi de 1:280, a frequência CSC para o grupo tratado com gencitabina foi de 1:4μ6, a frequência CSC para o grupo tratado com FZDS-Fc foi de 1:881 e a frequência CSC para o grupo tratado com uma combinação de FZDS-Fc e gencitabina foi calculada como sendo inferior a !:3μ63. Este número não pode ser determinado com precisão porque a taxa de tumor neste grupo foi de zero, mesmo com a dose mais elevada de células. EXEMPLO 4
Diferenciação celular aumentada de tumores pancreáticos por FZDS-Fc
Diferenciação celular aumentada de tumores Pn4 e PN8 com tratamento com FZD8-Fc. Tumores de controlo e tratados a partir do estudo xenoenxerto 0MP-PN4 descrito acima (Exemplo 3) foram recolhidos no final do estudo (dia 85) . Os tumores foram fixados em formalina, embebidos em parafina e secções de tumor de 4 pm de espessura foram cortadas. Após desparafinização e hidratação, as secções foram tratadas com ácido acético aquoso, durante 5 minutos à temperatura ambiente. As secções foram então tratadas com 1% de azul de alciano em 3% de ácido acético aquoso durante 30 minutos e lavadas com água. As secções foram contracoradas em vermelho neutro rápido, desidratados e montados. Utilizando este método, as sialomucinas presentes nas amostras de tecido se coram de azul e o fundo aparecem como rosa ou vermelho. 0 tratamento de tumores com PN4 FZDS-Fc causou um aumento de células expressando sialomucinas, em comparação com os tumores tratados com anticorpo de controlo ou gencitabina (Fig. 5, onde as sialomucinas aparecem como um cinzento escuro). 0 tratamento de combinação de FZD8-Fc e gencitabina também aumentou a expressão de sialomucinas em tumores pancreáticos PN4. Portanto, o tratamento com FZD8-Fc de tumores PN4 aumentou a frequência de células diferenciadas expressando mucina. Resultados semelhantes foram observados no modelo xenoenxerto de tumor pancreãtico PN8 (Fig. 6).
Diferenciação celular aumentada de tumores PN13 com tratamento com FZDS-Fc. A capacidade de diferenciação celular de FZD8-Fc foi também avaliada em modelo de xenoenxerto de tumor de pâncreas 0MP-PN13. Células dissociadas 0MP-PN13 (50.000 por animal) foram injetadas por via subcutânea em em ratinhos machos de 6-8 semanas de idade NODôSCID. O crescimento do tumor foi monitorizado semanalmente e medições do tumor foram iniciadas uma vez que os tumores foram palpáveis. No dia 40, ratinhos com o volume tumoral médio de 114 mraJ foram distribuídos aleatoriamente em 4 grupos de 10 animais cada. Os animais foram injetados com um anticorpo de controlo ou FZD8-FC (15mgôkg). A administração do FZD8-Fc e anticorpo de controlo foi realizada através de injeção na cavidade intraperitoneal, duas vezes por semana. Após 19 dias de tratamento, os tumores foram excisados e análise imunohistoquímica foi realizada utilizando técnicas padrão. Resumidamente, os tumores foram fixados em formalina, embebidos em parafina e secções de tumor de 4 pm de espessura foram cortadas. Após desparafinização e hidratação, as secções de tumor foram submetidas a um processo de recuperação de antigénio em tampão Tris (pH 9,5). As secções foram incubadas com peróxido de hidrogénio (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) durante 10 minutos para bloquear as peroxidases endógenas. Anticorpo anti-Ki6!EI (Dako, clone MIB-1) em 1:200 de diluição em tampão de bloqueio (NHS a 3% , BSA a 1%, Tween-20 a 0,1%, em PBS) foi adicionado a cada seção e incubado durante 1 hora. As lâminas foram lavadas 3 vezes em PBST durante 5 minutos cada. Anticorpo anti-ratinho secundário conjugado com HRP (ImmPRESS™ anti-ratinho, Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA) foi adicionado às lâminas e incubado durante 30 minutos. Após várias lavagens com PBST, o substrato Vector Nova Red (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA) foi adicionado para a localização do antigénio Ki60 . As secções foram tratadas com ácidoacético aquoso durante 5 minutos à temperatura ambiente. As secções foram então tratadas com 1% de azul de alciano em 3% de ácido acético aquoso durante 30 min e lavadas com água. As secções foram contracoradas em vermelho neutro rápido, desidratados e montados. utilizando este método, sialomucinas presentes nas amostras de tecido apresentam coloração azul e as células em proliferação são marcadas com vermelho escuro. 0 tratamento de tumores PN13 com FZDS-Fc resultou num aumento em células expressando sialomucinas, em comparação com os tumores tratados com anticorpo de controlo. 0 tratamento de tumores PN13 com FZD8-Fc também resultou numa diminuição da proliferação de células como denotado por expressão de Κίβμ. A Figura μ mostra uma clara diminuição do número de células em proliferação (identificado por pontos negros) no tecido a partir de tumores tratados FZDS-Fc. Consequentemente, o tratamento de tumores PN13 com FZDS-Fc diminuiu a proliferação celular, e aumentou a frequência de células diferenciadas expressando mucina.
Coloração de MuclG aumentada em tumores PN13 com FZDS-Fc. Secções de tumor a partir de tumores PN13 tratados com anticorpo de controlo ou FZD8-Fc foram obtidas e tratadas como descrito acima. Neste exemplo, o anticorpo anti-MUC16 (Abeam, Cambridge, MA) em tampão de bloqueio a 1:200 de diluição (NHS a 3 %, BSA a 1%, Tween-20 a 0,1% em PBS) foi adicionado a cada seção e incubado durante 1 horas. 0 anticorpo ligado foi detetado utilizando o protocolo de imunohistoquímica descrito acima. 0 tratamento de tumores PN13 com FZDS-Fc resultou num aumento em células expressando Mucl6, em comparação com os tumores tratados com anticorpo de controlo (Figura 8, coloração escura).
Coloração de CK20 aumentada em tumores PN13 com FZD8-FC. Secções de tumor foram obtidas e tratadas como descrito acima. Neste exemplo, o anticorpo anti-CK20 (clone Ks20.8, Dako, Carpinteria, CA) em tampão de bloqueio a 1 200 de diluição (NHS a 3 %, BSA a 1%, Tween-20 a 0,1% em PBS) foi adicionado a cada seção e incubado durante 1 hora. 0 anticorpo ligado foi detetado utilizando o protocolo de imunohistoquímica descrito acima. 0 tratamento de tumores PN13 com FZDS-Fc resultou num aumento em células que expressam CK2 0, em comparação com os tumores tratados com anticorpo de controlo (Figura 9, coloração escura). EXEMPLO 5
Inibição do crescimento do tumor da mama in vivo por FZDS-Fc . Células tumorais de mama dissociadas PE13 (50.000 por animal) foram injetadas por via subcutânea nas massas de gordura mamária de ratinhos NODôSCID. Os ratinhos foram monitorizados semanalmente e os tumores foram deixados a crescer até que eles fossem de aproximadamente 106 mm3. No dia 2μ, pós injeção de células, os ratos foram distribuídos aleatoriamente em quatro grupos de tratamento (n = 10 ratinhosôgrupo) e tratado com anticorpo de controlo, FZDS-Fc (54F03), taxol ou uma combinação de FZD8-Fc e taxol. 0 taxol foi administrado intraperitonealmente a uma dose de μ, 5 mgôkg uma vez por semana e FZD8-Fc foi administrado intraperitonealmente a uma dose de 5 mgôkg duas vezes por semana. Os tumores foram medidos nos dias indicados na Figura 10. 0 tratamento com FZD8-Fc foi observado que reduz o crescimento do tumor em 20% (p = 0,002) como um agente único em relação ao grupo anticorpo de controlo. Além disso, o tratamento com a combinação de FZD8-Fc e taxol reduziu o crescimento do tumor em 55% (p = 0,003) em relação ao taxol tratamento por si só (Figura 10). EXEMPLO 6
Inibição do crescimento do tumor de cólon in vivo por FZDS-Fc 0 efeito de doses múltiplas e regime de dosagem de FZDS-Fc (54F03) sobre o crescimento de xenoenxertos de tumor do cólon C28 foi analisado. Células dissociadas C28 (10.000 por animal) foram injetadas por via subcutânea em ratinhos machos de 6-8 semanas de idade NODôSCID. No dia 2, os ratinhos foram divididos em 6 grupos de 10 animais cada. Os animais foram injetados quer com anticorpo de controlo ou FZDS-Fc em doses de 1,5 mgôkg (duas vezes por semana), 5 mgôkg (uma vez e duas vezes por semana) e 15 mgôkg (uma vez e duas vezes por semana). A administração do anticorpo e FZDS-Fc foram realizadas através de injeção na cavidade intraperitoneal. 0 crescimento do tumor foi monitorizado semanalmente e medições do tumor foram iniciadas uma vez que os tumores foram palpáveis. Os tumores foram medidos duas vezes por semana e volume do tumor foi determinado conforme descrito no presente documento. 0 tratamento com 15 mgôkg de FZD8-Fc (duas vezes por semana) resultou na redução de 83% no crescimento do tumor versus o tratamento com o anticorpo de controlo, como mostrado na Figura 11A (p <0,001). Além disso, o tratamento com FZDS-Fc com a menor dose avaliada (1,5 mgôkg administrada duas vezes por semana) também resultou numa redução de 52% do crescimento versus o grupo de controlo de tratamento de anticorpo (Figura 11 A). Consequentemente, FZDS-Fc demonstrou atividade anti-crescimento tumoral no modelo de tumor do cólon C28-OMP como um agente único de uma forma dependente da dose. 0 efeito de FZD8-Fc em combinação com um agente quimioterapêutico sobre o crescimento de xenoenxertos de tumor do cólon C28 foi analisado. Células tumorais do cólon C28 dissociadas (10.000 células) foram injetadas por via subcutânea em ratinhos machos de 6-8 semanas de idade NODôSCID, Os tumores foram deixados crescer durante 21 dias até chegarem a um volume médio de 128 mm3. Os ratinhos foram distribuídos aleatoriamente (n = 10 por grupo) e tratados com FZD8-FC (54F03) (15 mgôkg, uma vez por semana), irinotecano (15 mgôkg, uma vez por semana), uma combinação de FZDS-Fc e irinotecano ou um anticorpo controlo. A administração do FZDS-Fc, irinotecano e anticorpo de controlo foi realizada através de injeção na cavidade intraperitoneal. 0 crescimento do tumor foi monitorizado e os volumes de tumor foram medidos com compassos de calibre eletrónicos nos pontos de tempo indicados. Os dados são expressos como média ± DP.
Como mostrado na Figura 11B, o tratamento com FZD8-Fc como um agente único (- Δ -) resultou na redução de 66% no crescimento do tumor ao longo do tratamento com o anticorpo de controlo () (p <0,001). Além disso, o tratamento com FZD8-FC em combinação com irinotecano (-·-) resultou numa redução de μ6% de crescimento sob o grupo de tratamento com o anticorpo controlo (p <0,001), que era maior do que qualquer dos agentes isolados. Consequentemente, FZD8-Fc demonstrou atividade anti-crescimento tumoral no modelo de tumor do cólon C2 8-OMP como um agente único, bem como em combinação com um agente quimioterapêutico. EXEMPLO μ
Diferenciação celular aumentada de tumores do cólon por FZDS-Fc
Coloração de CK20 aumentada em tumores C28 com FZDS-Fc. Tumores de controlo e tratados a partir do estudo de xenoenxerto C28 descrito acima (Exemplo 6) foram recolhidos no final do estudo. Os tumores foram excisados e análise imunohistoquímica foi realizada utilizando técnicas padrão. Resumidamente, os tumores foram fixados em formalina, embebidos em parafina, e secçõesde tumores de espessura 4 μιπ foram cortadas. Após desparafinização e hidratação, as secções de tumor foram submetidas a um processo de recuperação de antigénio em tampão de Tris (pH 9,5) . As secções foram incubadas com peróxido de hidrogénio (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) durante 10 minutos para bloquear as peroxidases endógenas. Anticorpo anti-CK20 (clone Ks20.8, Dako, Carpinteria, CA) em tampão de bloqueio a 1:200 de diluição (NHS a 3 %, BSA a 1%, Tween-2 0 a 0,1, em PBS) foi adicionado a cada seção e incubadas durante 1 hora. As lâminas foram lavadas 3 vezes em PBST durante 5 minutos cada. Anticorpo anti-ratinho secundário conjugado com HRP (ImmPRESS™ anti-ratinho Ig, Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA) foi adicionado às lâminas e incubadas durante 30 minutos. Após várias lavagens com PBST, o substrato Vector Nova Red (Vector Laboratories Inc. , Burlingame, CA) foi adicionado para a localização do antigénio CK2Q, 0 tratamento de tumores C28 com FZDS-Fc resultou num aumento em células que expressam CK20, em comparação com os tumores tratados com anticorpo de controlo (Figura 12, a coloração escura). EXEMPLO 8
Atividade antitumoral de FZD8-Fc em modelo de tumor pancreático
Inibição do crescimento do tumor por FZD8-FC no modelo de tumor pancreático PN21. A atividade antitumoral de FZDS-Fc (54F03) foi avaliada no modelo de xenoenxerto de tumor de pâncreas PN21. Células 0MP-PN21 dissociadas (50.000 por animal) foram injetadas por via subcutânea em ratinhos machos NODôSCID de 6-8 semanas de idade. 0 crescimento do tumor foi monitorizado semanalmente e medições do tumor foram iniciadas uma vez que os tumores foram palpáveis. No dia 36, os ratinhos com volumes médios de tumor de 144 mm3 foram distribuídos aleatoriamente em 4 grupos de 9 animais cada. Os animais foram injetados com anticorpo de controlo, FZD8-Fc (15 mgôkg), gencitabina (2 mgôkg) ou uma combinação de FZD8-Fc e gencitabina. Administração do FZD8-Fc e gencitabina foi realizada através de injeção na cavidade intraperitoneal, uma vez por semana. Os tumores foram medidos duas vezes por semana e volume do tumor foi determinado conforme descrito no presente documento. 0 tratamento com FZDS-Fc resultou numa redução de 66% no crescimento do tumor em relação ao controlo, como mostrado na Figura 13A (p <0,001). Além disso, o tratamento com uma combinação de FZD8-FC e gencitabina resultou numa maior redução do crescimento do tumor em comparação com qualquer dos agentes isolados (p = 0,001 vs gencitabina). Consequentemente, FZDS-Fc demonstrou atividade anti-crescimento tumoral no modelo de tumor do pâncreas PN21 como um agente único, bem como em combinação com gencitabina.
Análise de tumores PN21 tratados com FZDS-Fc pelo ensaio de diluição limítante. Tal como descrito acima no Exemplo 3, um ensaio de diluição limítante foi utilizado para avaliar o efeito do tratamento com FZD8-Fe por si só ou em combinação com gencitabina em células estaminais de cancro de tumor sólido no modelo de tumor pancreãtico PN21.
Tumores de controlo e tratados a partir do estudo xenoenxerto PN21 descrito acima foram recolhidos no final do estudo. Os tumores foram processados e dissociados em células individuais. As suspensões de células individuais derivadas de 5 tumores de cada grupo de tratamento foram reunidas, e as amostras reunidas foram, em seguida, incubadas em gelo durante 30 mm, com anticorpos que ligam seletivamente a células de ratinhos (α-ratinho CD45-biotina 1:200 de diluição e de rato α-rato H2Kd -biotina 1: 100 de diluição, BioLegend, San Diego, CA), seguido pela adição de esferas magnéticas marcadas com estreptavidina (Invitrogen, Carlsbad, CA). As células de ratinhos foram removidas com a ajuda de um imã. As células humanas em suspensão foram recolhidas, contadas e coradas para marcadores de superfície celular e doses de células adequadas (30, 90 e 2μ0 células) em tampão de FACS foram misturados numa mistura 1:1 com Matrigel e injetado por via subcutânea em ratinhos NODôSCID (10 ratinhos por dose de células por grupo de tratamento). Os tumores são deixados crescer durante até 4 meses.
No ponto de tempo desejado, a percentagem de ratinhos com tumores detetáveis foi determinada em todos os grupos injetados com células tumorais tratadas e comparada com a percentagem de ratinhos com tumores detetáveis em células de controlo tratadas. Por exemplo, o número de ratinhos injetados com 125 células tumorais tratadas com anticorpo de controlo que possuem tumores detetáveis é determinada e comparado com o número de ratinhos injectados com 125 Células tumorais tratadas com FZDS-Fc que possuem tumores detetáveis.
No dia μ2, após a injeção das células, as taxas de tumor nos vários grupos foram determinadas e a frequência do cancro de células estaminais foi calculada utilizando o software L-CalcTM (StemCell Technologies Inc.Ê www.stemcell.com). Como mostrado na Figura 13 B, o tratamento com FZDS-Fc reduziu a frequência de células estaminais cancerígenas para 1:9μ6, uma redução de aproximadamente quatro vezes, em comparação com o tratamento com o anticorpo controlo. Em contraste, o tratamento com gencitabina aumentou ligeiramente a frequência de células estaminais cancerígenas. Significativamente, o tratamento com uma combinação de FZDS-Fc e gencitabina reduziu a frequência de cancro de células estaminais para 1: 54μ2, quase uma redução de 25 vezes em comparação com o tratamento controlo. Surpreendentemente, o tratamento com a combinação de FZDS-Fc e gencitabina reduziu a frequência de cancro de células estaminais cerca de 5,5 vezes maior do que o tratamento FZDS-Fc por si só e apesar do fato de que a gencitabina parece que efetivamente aumenta a frequência de cancro de células tronco. EXEMPLO 9
Diferenciação celular aumentada em tumores PN21 com FZDS-Fc. A capacidade de diferenciação celular de FZDS-Fc foi também avaliada no modelo xenoenxerto de tumor de pâncreas 0MP-PN21. Tumores PN21 dos estudos descritos no Exemplo 8, foram recolhidos e fixados em formalina, embebidos em parafina e secções de tumor de 4 0 m de espessura foram cortadas. Após desparafinação e hidratação, as secções de tumor foram submetidas a um processo de recuperação de antigénio em tampão Tris (pH 9,5). As secções foram incubadas com peróxido de hidrogénio (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) durante 10 minutos para bloquear as peroxidases endógenas. Anticorpo Anti-Ki6p (clone MIB-1, Dako, Carpinteria, CA) em tampão de bloqueio (NHS a 3™, BSA a 1™ e Tween-2 0 a 0,1™ em PBS) a 1:200 de diluição foi adicionado a cada seção e incubado durante 1 hora. As lâminas foram lavadas 3 vezes em PBST durante 5 minutos cada. Anticorpo anti-ratinho secundário conjugado com HRP (ImmPRESSB anti-ratinho, Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA) foi adicionado às lâminas e incubado durante 30 minutos. Após várias lavagens com PBST, substrato Vector Nova Red (Vector Laboratories Inc. , Burlingame, CA) foi adicionado para a localização do Κϊβμ antigénio. As secções foram tratadas com ácido acético aquoso durante 5 minutos à temperatura ambiente. As secções foram então tratadas com 1™ de azul de alciano em 3™ de ácido acético aquoso durante 30 minutos e lavadas com água. As secções foram contracoradas em vermelho neutro rápido, desidratadas e montadas. Utilizando este método, sialomucinas no tecido de amostras são marcadas como azul e o fundo aparece como rosa ou vermelho. 0 tratamento de tumores PN21 com FZD8-Fc resultou num aumento em células expressando sialomucinas, em comparação com os tumores tratados com anticorpo de controlo (Figura 14, a coloração cinzenta escura). 0 tratamento de tumores PN21 com FZD8-Fc ou FZD-Fc em combinação com gencitabina resultou num aumento em células que expressam sialomucinas, em comparação com os tumores tratados com anticorpo de controlo ou gencitabina sozinha (Figura 15) . 0 tratamento de tumores com FZD8-Fc ou a combinação de FZD8-Fc e gencitabina também resultou numa diminuição da proliferação de células denotados por expressão de Κί6μ.
Consequentemente, o tratamento de tumores PN21 com FZDS-Fc, quer isoladamente ou em combinação com gencitabina, diminuiu a proliferação celular, e aumentou a frequência de células diferenciadas expressando mucina. EXEMPLO 10
Produção de variantes de FZD8-Fc
Produção de variantes de FZD8-Fc. Variantes de FZD8-Fc foram produzidas em DNA2.0 (Menlo Park, CA) . DNA2.0 sintetizou e montou oligonucleõtidos de cadeia simples curtos para produzir as diferentes proteínas variantes de FZDS-Fc, 54F05, 54F08, 54F09, 54F12, 54F13, 54F14, 54F15, 54F16, 54Flp, 54F18, 54F19, 54F20, 54F21 e 54F22 . Os oligonucleotides reunidos foram subsequentemente clonados e a sequência verificada. EXEMPLO 11
Inibição da sinalização de Wnt por variantes de FZDS-Fc A capacidade das variantes de FZD8-Fc para bloquear ou inibir a ativação da via de sinalização de Wnt foi determinada in vitro utilizando um ensaio repórter de luciferase. Células STF293 foram cultivadas em DMEM suplementado com antibióticos e FCS a 10%. As células STF293 são transfectadas estavelmente com um vetor repórter contendo sete cópias do elemento de resposta TCF transcricional ligado a um promotor a montante de um gene repórter da luciferase de pirilampo. Esta construção mede a atividade da via de sinalização canónica de Wnt. As células foram adicionadas a placas de culturas a 10.000 células por poço. Depois de uma incubação durante a noite as variantes de FZD8-Fc ou JAGl-Fc de ratinhos de controlo foram adicionados em combinação com meio Wnt3a condicionado. As variantes FZDS-Fc e JAGl-Fc foram utilizados em concentrações de 20, 4, 0,8, 0,16, 0,03, 0,006, 0,0012, e 0.0003 ugôml. As células foram incubadas em 25% de meio condicionado Wnt3A que tinha sido preparado a partir de células L que expressam de forma estável Wnt3a. Após incubação durante a noite (aproximadamente 18 horas), os níveis de luciferase foram medidos utilizando um kit de ensaio de luciferase Steady-Glo® (Promega, Madison, WI).
De A atividade de bloqueio das variantes FZD8-Fc foi determinada e é apresentada na Quadro 3 como atividade relativa em comparação com a mesma execução de referência padrão em cada ensaio que foi fixado em 100™.
Quadro 3
EXEMPLO 12
Farmacocinética de variantes de FZD8-Fc em ratos A farmacocinética do várias variantes de FZDS-Fc foi avaliada em ratos num estudo de farmacocinética (PK)de duas semanas. As variantes FZD8-Fc avaliadas foram 54F03, 54F09, 54F12, 54F13, 54F15 e 54F16. Ratos Sprague Dawley, cinco machos em cada grupo, foram doseados com variantes de FZDS-Fc através da veia caudal a 10 mgôkg e seguido por duas semanas com amostras recolhidas em pontos de tempo 1, 24, 48, μ2, 96, 168, 240 e 336 horas. Em cada ponto de tempo, 1 ml de sangue foi recolhido em tubos de potássio-EDTA e centrifugado. Os sobrenadantes de plasma foram recolhidos e congelados até que as amostras foram analisadas. 0 nível de proteína variante de FZDS-Fc presente no plasma em cada ponto de tempo foi quantificado e a semivida de cada variante de FZD8-Fc foi calculada. A semivida das variantes FZD8-Fc é mostrada na Quadro 4.
Quadro 4
EXEMPLO 13
Farmacocinética de variantes de FZD8-Fc em macacos cinomolgos
Quatro macacos cinomolgos machos jovens adultoôadulto foram divididos aleatoriamente em dois grupos de dois, e administrado um bolus intravenoso (IV) de variante de FZD-Fc 54F15 ou variante 54F16 com uma dose de 3 0 mgôkg. Os animais foram observados duas vezes ao dia (manhã e tarde) para mortalidade e os sinais de dor e sofrimento.
Observações de lateral de jaula para a saúde geral e a aparência foram feitas uma vez por dia. No dia da dosagem, cada animal foi observado a cerca de 1 e 4 horas pós-dose para a mortalidade e sinais de dor e sofrimento. Quaisquer observações incomuns foram observadas ao longo da duração do estudo e anotadas. Os pesos corporais foram tomados no dia da administração da dose e no final da recolha de sangue. Sangue (aproximadamente 0,5 ml) foi recolhido a partir de uma veia femoral através seringa e agulha e transferidos para tubos contendo anticoagulante EDTA K3 de pré-dose e em 1, 6, 12, 24, 48, μ2, 96, 168, 240 e 336 horas pós-dose para análise de farmacocinética. Além disso, o sangue (aproximadamente 0,5 ml) foi recolhido a partir de uma veia femoral através de uma seringa e agulha e transferido para tubos sem anticoagulante de pré-dose e em 336 horas pós-dose para a análise de anticorpo antifãrmaco (ADA) . Sobrenadantes de plasma foram recolhidos e congelados até que as amostras sejam analisadas.
Imunoensaios HTRF (fluorescência resolvida no tempo homogénea ) foram realizados para determinar a concentração FZD-Fc em amostras de plasma de animais para análise de farmacocinética e da concentração de anticorpo antifãrmaco no soro. A concentração FZD-Fc no plasma em função do tempo foi analisada por meio de análise não compartimentai (NCA) com Phoenix™ WinNonlin® Versão 6.0 utilizando um modelo de administração de bolus IV. 0 nível de variantes de FZD8-Fc presentes no plasma em cada ponto de tempo foi quantificado (Figura 16) e a semivida das variantes de FZD8-Fc 54F15 e 54F16 foi calculada. Como mostrado na Quadro 5, a semivida da variante de FZD8-Fc 54F15 foi estimada em 102 horas a 30 mgôkg e a semivida da variante de FZD-FC8 54F16 foi estimada em 13μ horas a 30 mgôkg.
Quadro 5
EXEMPLO 14
Inibição do crescimento do tumor de cólon in vivo por variantes de FZD8-Fc Células tumorais de cólon C28 dissociadas (10.000 células) foram injetadas por via subcutânea em ratinhos machos de 6-8 semanas de idade NQDôSCID. Os tumores foram deixados crescer durante 28 dias até chegarem a um volume médio de 145 mmm3. Os ratinhos foram divididos aleatoriamente (n = 9 por grupo) e tratados com variantes de FZD8-Fc ou um anticorpo de controlo a uma dose de 15 mgôkg duas vezes por semana. A administração das variantes de FZDS-Fc e anticorpo de controlo foi realizada através de injeção na cavidade intraperitoneal. 0 crescimento do tumor foi monitorizado e os volumes de tumor foram medidos com compassos de calibre eletrónicos nos pontos de tempo indicados. Os dados são expressos como média ± S.E.M..
Variantes 54F12 e 54F13 não tiveram nenhum efeito aparente sobre o crescimento do tumor, com volumes tumorais substancialmente iguais aos tumores em ratinhos tratados com anticorpo de controlo. Em contraste, o tratamento com variantes 54F03, 54F09, 54F15 e 54F16 resultou em aproximadamente 56%, μ0%, 64% e μ0% de redução (respetivamente) no crescimento do tumor, em comparação com o tratamento com o anticorpo de controlo, como mostrado na Figura 1μ. Consequentemente, a atividade anti-crescimento tumoral das variantes FZD8-Fc pareceu ser afetada pela sequência de aminoãcido na junção entre a fração FZD8 e a fração Fc. Além disso, atividade anti-crescimento tumoral pareceu ser afetada pela fonte da região Fc, jã que ambas as variantes que são proteínas de fusão de IgG2 (54F12 e 54F13), não inibiram o crescimento do tumor neste modelo. EXEMPLO 15
Inibição do crescimento de tumor pancreãtico in vivo por variantes de FZD8-Fc Células pancreáticas tumorais PN4 dissociadas (10.000 células) foram injetadas por via subcutânea em ratinhos machos de 6-8 semanas de idade NODôSCID. Os tumores foram deixados crescer durante 36 dias até chegarem a um volume médio de 121 mm3. Os ratinhos foram divididos aleatoriamente (n = 10 por grupo) e tratados com variantes de FZD8-Fc ou um anticorpo de controlo a uma dose de 15 mgôkg duas vezes por semana. A administração das variantes FZDS-Fc e anticorpo de controlo foi realizada através de injeção na cavidade intraperitoneal. 0 crescimento do tumor foi monitorizado e os volumes de tumor foram medidos com compassos de calibre eletrónicos nos pontos de tempo indicados. Os dados são expressos como média ± S.E.M.
As variantes 54F12 e 54F13 reduziram o crescimento do tumor a menos do que 20%, em comparação com tumores em ratinhos tratados com anticorpo de controlo. 0 tratamento com as variantes de FZD8-Fc 54F03, 54F09, 54F15 e 54F16 reduziu o crescimento do tumor aproximadamente 20% a 60% em comparação com o tratamento com o anticorpo de controlo. Como mostrado na Figura 18, as variantes de 54F09 e 54F16 reduziu o crescimento do tumor por maior quantidade, 45% (p <0,001) e 60% (p <0,001), respetivamente. Consequentemente, a atividade anti-crescimento tumoral das variantes de FZDS-Fc pareceu ser afetada pela sequência de aminoãcidos na junção entre a fração FZD8 e a fração Fc. Como visto no Exemplo 14, atividade anti-crescimento tumoral também pareceu ser afetada pela fonte da região Fc, já que ambas as variantes que são proteínas de fusão de IgG2 (54F12 e 54F13) tinham mais fraca atividade antitumoral do que as variantes FZD8-Fc que são proteínas de fusão IgGl. Células pancreáticas tumorais provenientes dos ratinhos portadores de tumor descritos acima foram recolhidas e picadas em fragmentos de aproximadamente 1 mmJ, seguido por digestão enzimática a 1 grama por 10 ml de 300 pgôml de colagenase e 2 00 Uôml de DNase I durante 2 horas a 37° Cô 5% de C02 com mistura intermitente com uma pipeta de 10 ml para dispersar as células. A digestão foi parada pela adição de um volume igual de tampão FACS (Ix solução salina tamponada com Hanks (HBSS), soro fetal de vitelo a 2% inactivado pelo calor (FCS) e 2 mM de HEPES pH 7,4) . As células foram filtradas através de filtros de nylon de 40 μιτι e recolhidas por centrifugação a 150 xg durante 5 minutos. Os glóbulos vermelhos foram lisados num tampão hipotõnico contendo cloreto de amónio durante 2 minutos em gelo, e as células foram lavadas de novo com tampão FACS em excesso, e ressuspensas com tampão FACS em 1χ10μ célulasôml.
As suspensões de células individuais recentemente preparadas foram coradas durante 20 minutos em gelo com anti-rato H-2Kd biotinilado (clone SF 1-1,1, Biolegend, San Diego, CA) a 5 pmôml, anti-ratinho CD45 biotinilado (30-F1 1, Biolegend) com 2,5 pmôml e estreptavidina-PerCP-Cy5.5 (eBioscience, San Diego, CA) com 1:200 de diluição. 0 anticorpo não ligado foi removido por lavagem duas vezes com 10 volumes de tampão de FACS. Para a análise de marcadores de superfície de células humanas, a suspensão de células individuais do tumor foi corada com anti-ESA-FITC (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) com 1:50 de diluição, CD44-PE-CyH anti-humano (eBioscience, San Diego, CA) com 1:100 de diluição, e CD201-PE anti-humano (BD Biosciences) a 1:5 de diluição. As células são lavadas e ressuspensas em tampão de FACS contendo 2,5u gôml de 41-6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). Células coradas com uma única cor fluorescente foram utilizadas para a calibração do instrumento. Quaisquer células de ratinhos restantes (positivo para H-2Kd e CD45) e células mortas (DAPI-positivo) foram excluídas durante a separação de células. Dupletos celulares e agrupamentos foram excluídos utilizando obstrução de discriminação de dupleto.
Como mostrado na Figura 19, o tratamento de ratinhos portadores de tumor com as variantes de FZD8-Fc 54F03 e 54F16 diminuiu a percentagem de células CD44hl, em comparação com ratinhos tratados com o anticorpo de controlo. Embora a percentagem de células CD201+ CD44+ fosse pequena, o tratamento de ratinhos portadores de tumor com FZD8-Fc variantes 54F03 e 54F16 diminuiu a percentagem de células CD2G1+ CD44+, em comparação com ratinhos tratados com o anticorpo de controlo. CD44 tem sido demonstrado ser um marcador de células tumorigénicas (por exemplo, células estaminais cancerígenas). Além disso, nalgumas formas de realização, as células que são CD44ni CD201+ foram consideradas mais tumorigénicas do que células CD44ni CD44hl CD201. Consequentemente, é importante que variantes de FZD8-Fc foram capazes de diminuir a percentagem de ambas as populações de células CD44hl e CD44hl CD201+, consequentemente, diminuindo a percentagem ou o número de células tumorigénicas nos ratinhos tratados. EXEMPLO 16
Caracterização de N-terminais 0 local de clivagem de sequência de sinal correto na proteína FZD8 está predito para ser entre o aminoãcido 25 (uma alanina) e o aminoãcido 26 (uma alanina) Ê a clivagem neste local deixa um N-terminal de ASA. A análise por espectrometria de massa foi utilizada para determinar a massa de proteínas FZD8-Fc, em comparação com a massa teórica da proteína FZD8-Fc clivada no local predito.
Variantes FZD8-Fc adicionais com sequências de sinal modificadas foram produzidas em DNA2.0 (Menlo Park, CA) como descrito acima. ADN 2.0 sintetizou e montou com oligonucleotides cadeia simples curtos para produzir as proteínas variantes de FZD8-Fc 54F23, 54F35. Os oligonucleótidos reunidos foram subsequentemente clonados e a sequência verificada. 0 ADN de plasmídeo de cada variante FZD8-Fc foi preparado utilizando kits QIAGEN maxi-prep seguindo o protocolo do fabricante. A expressão de cada variante foi feita utilizando reagente Freestyle™ MAX (Life Technologies) e células 293FS. As células foram cultivadas até fase log e diluídas até IxlO6 célulasôml. Para cada reação, 315 ug de ADN de plasmídeo foram diluídos em 5 ml de OptiMEM Pro. Num tubo diferente, 315ul de reagente
Freestyle™ MAX foram diluídos em 5ml de OptiMEM Pro. 0 ADM de plasmídeo foi complexado com o reagente Freestyle™ MAX, adicionando gota a gota o reagente diluído ao ADN, seguido por uma incubação de 15 minutos à temperatura ambiente. 0 complexo ADN-reagente foi então adicionado a 250 ml de células 293FS. As reações de expressão foram deixadas crescer durante μ-IO dias, altura em que, eles foram recolhidas por centrifugação e filtração. Cada variante Fzd8-Fc foi purificada por meio de purificação por afinidade utilizando uma coluna MAbSelect 5ml HiTrap SURE. Resumidamente, os meios recolhidos foram passados através de colunas que tinham sido equilibradas com tampão de ligação. As colunas foram lavadas com tampão de ligação para remover o material não ligado e, em seguida, proteína de FZD8-Fc foi eluída com tampão de eluição. As amostras eluídas foram então dialisadas num tampão adequado para espectrometria de massa.
Aproximadamente 2 50 0 g de cada amostra FZD8-Fc fora reduzidos com Tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP) durante 30 minutos a 3μ° C para separar as cadeias pesada e leve do anticorpo. Amostras reduzidas foram então alquiladas por tratamento com iodoacetamida durante 30 minutos a 3μ° C. As amostras foram passadas sobre colunas NAP-5 (GE Health Care) para alterar o tampão para 10 mM de Tris-HCl (pH μ,4). A permuta de tampão foi seguida de deglicosilação com PNGase F endoglicosidase. Amostras foram incubadas durante a noite a 3μ° C a uma razão de 1:200 (enzima: amostra) . As reações foram paradas por adição de ácido. As amostras de FZD8-Fc reduzidas, alquiladas e deglicosiladas foram carregadas em frascos para análise de cromatografia líquida-espectrometria de massa (LCÔMS), utilizando um espectrómetro de massa Waters UPLC™ e eletrospray-QToF. Calibração de massa de cada análise de amostra utilizando agrupamentos de ião de ácido trifluoracético césio foi realizada com uma fonte de iões de eletrospray dupla Waters
LockSpray™.
Como mostrado na Figura 20A, uma proteína FZDS-Fc (54F16) com uma sequência de sinal que era a mesma sequência da sequência nativa foi produzida como uma mistura heterogénea em relação à sequência N-terminal. Uma proporção da proteína presente na amostra era equivalente em massa a uma proteína clivada nos aminoácidos 25 e 26 (pico a 41μ04,0) com uma sequência N-terminal de ASA. No entanto, mais do que 50% da proteína estavam presentes numa forma com uma massa diferente (pico a 41918,2) . Este pico mais provavelmente representa uma proteína clivada nos aminoácidos 22 e 23Ê clivagem neste local deixa uma sequência N-terminal de AAAASA (SEQ ID NO: μ6).
Variantes FZDS-Fc com sequências de sinal SEQ ID NO: 68 a SEQ ID NO: μ4 foram geradas, purificadas a partir de cultura de células e analisadas por espectrometria de massa como descrito acima. Observou-se que as variantes com sequências de sinal da SEQ ID NO: μ0 a SEQ ID NO: μ4 produziram uma amostra de proteína quase completamente homogénea (vários resultados representativos são mostrados nas Figuras 20B-20E). Variante de FZD8-Fc 54F26 que compreende a SEQ ID NO: 53 com a sequência de sinal SEQ ID NO: μΐ estava presente predominantemente (mais de 95%) como uma proteína clivada nos aminoácidos 25 e 26 (pico 41930,1) com uma sequência N-terminal de ASA (Fig. 20B). Resultados semelhantes foram também observados com uma variante compreendendo SEQ ID NO: 53 e a sequência de sinal SEQ ID NO: μ2 (54F28, Fig. 20C), uma variante compreendendo SEQ ID NO: 53 e a sequência de sinal SEQ ID NO: μ3 (54F30, Fig. 2 0D) e uma variante compreendendo SEQ ID NO: 53 e a sequência de sinal SEQ ID NO: μ4 (54F32, Fig. 20E) . Resultados semelhantes foram observados com as proteínas produzidas a partir de transfeções transientes e estáveis. EXEMPLO 1μ
Inibição do crescimento do tumor de cólon in vivo por variantes de FZD8-Fc Células tumorais de cólon C28 dissociadas (10.000 células) foram injetadas por via subcutânea em ratinhos machos de 6-8 semanas de idade NODôSCID. Os tumores foram deixados crescer durante 56 dias até chegarem a um volume médio de 1μ5 mm3. Os ratinhos foram divididos
aleatoriamente (n = 10 por grupo) e tratado com construções de FZD8-Fc 54F03, 54F23, 54F26, ou um anticorpo de controlo a uma dose de 15 mgôkg duas vezes por semana. A administração das variantes de FZD8-Fc e anticorpo de controlo foi realizada através de injeção na cavidade intraperitoneal. 0 crescimento do tumor foi monitorizado e os volumes de tumor foram medidos com compassos de calibre eletrónicos nos pontos de tempo indicados. Os dados são expressos como média ± S.E.M.
Variantes de FZD8-FC 54F23 e 54F26 são produzidas como predominantemente uma proteína homogénea com uma N-terminal de aminoácidos ASA, enquanto 54F03 é produzida como uma mistura de proteínas heterogéneas com N-terminais de aminoácidos ASA e AAAASA. Como mostrado na Figura 21, o tratamento com variantes de FZD8-Fc 54F03 e 54F23, e 54F26 reduziu o crescimento do tumor em 48%, 5μ% e 52%,
respetivamente, em comparação com o tratamento com o anticorpo de controlo depois de três semanas de tratamento. LISTA DE SEQUÊNCIAS
Sequência de aminoácidos de FZD8-Fc-variante 54F03 (sem sequência de sinal prevista; a sequência de ligante "GRA" entre a sequência FZD8 e a sequência da proteína de fusão está sublinhada) (SEQ ID N0:i)
ASAKELACQEITVP LC KGIGYNYTYMPNQFNHDTQDEAGLEVHQFWPLVEIQC S PD LKFF
LCSMYTPICLEDYKKPLPPCRSVCERAKAGCAPLMRQYGFAWPDRMRCDRLPEQGNPDTL
CMDYNRTDLTTGRADKTHTCPP C PAP ELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTF EVTCWVDV
SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK
ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ
PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
K
Sequência de codificação de FZD8-Fc (os nucleõtidos codificando sequênciad derivadas a partir de FZD8 estão sublinhados) (SEQ ID NO:2)
A TG GAG TGGGG T TAGCTGTTGGAAGTGACCTCGCTGCTGGCCGCCTTGGCGCTGCTGCAG C G C T CTAGCGGCGCTGCGGCCGCCTCGGCCAAGGAGCTGGCÃTGCCAAGAGATCACCGTG CCGCTGTGTAAGGGCATCGGCTACAACTACACCTACATGCCCAATCAGTTCAACCACGAC ACG CAAGACGAGG CGG GCCTGGAGGTGCACCAGT TCTGGCCGCTGGTGGAGAT CCAGTGC TCGCCCGATCTCAAGTTCTTC CTGTGCAGCATGTACACGCCCATCTGCCTAGAGGACTAC AAG AAG CCGCTGCCGCCCTGCCGCTCGGTGTGCGAGCGCGCCAAGGCCGGCTGCGCGCCG CTCATGCGCCAGTACGGCTTCGCCTGGCCCGACCGCATGCGCTGCGACCGGCTGCCCGAG CAAGGCAACCCTGACACGCTGTGCATGGACTACAACCGCACCGAC CTAACCACCGG GCGC GCCGACÂAAACTCACACATGC C CACCGTGCCCAGCAC CTGAACTCCTGGGGGGACCGTCA GTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTC ACATGCGTGGTGG TGGAC G TGAG C CA C GAAGAC CCTGAGGT CAAGTT CAAC T GGTACGT G GA CGGCGTGGAGGTG CATAAT G C CAAGACAAAG C C G C GGGAG GAG CAGTA CAA CAG CACG TACCGTGTGGT CAG C G T C CT CAC CGT C CT G CA CCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTAC AAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGC CCTC CCAGCCC CCAT CGAGAAAACCATCT CCAAAGC C AAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCAT C CCGGGATGAGCT GAC C AAGAACCAG GTCAGCCT GAC CTGCCTGGT CAAAGG CTTCTATCC CAG C GACAT CG C CGT G GAGT GGGAGAGC AAT G GG CAG C C GGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGAC T C C GA CG GCTCCTTCTTCCTCT ACAG CAAG C T CA C CGTGGACAAGAG CAGGTGG CAGCAG GGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAG AGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
Sequências mínimas de domínio Fri de FZD e SFRP aminoácidos 116-22μ de h-FZDl (SEQ ID NO:3)
CQPISIPLCTDIAYNQTIMPNLLGHTNQEDAGLEVHQFYPLVKVQCSAELKFFLCSMYAP
V C T VL E QAL PPCRSLCE RARQGC E AL MNKF G FQW PDTLKCSKFPVH GAG E L C
Aminoácidos 39-150 de h-FZD2 (SEQ ID N0:4)
CQPISIPLCTDIAYNQTIMPNLLGHTNQEDAGLEVHQFYPLVKVQCSPELRFFLCSMYAP VCTVLEQAIPPCRSIGERARQGCEALMNKFGFQWPERLRCEHFPRHGAEQIC
Aminoácidos 28-133 de h-FZD3 (SEQ ID NO:5)
CEPITLRMCQDLPYNTTFMPNLLNHYDQQTAALAMEPFHPMVNLDCSRDFRPFLCALYAP ICMEYGRVTLPC RRLCQRAYSE C S KLMEMFGVPWPEDMECSRFPDC
Aminoãcidos 48-161 de h-FZD4 (SEQ ID NO:6)
CDPIRISMCQNLGYNVTKMPNLVGHELQTDAELQLTTFTPLIQYGCSSQLQFFLCSVYVP MCTSKINIPIGPCGGMCLS VKER CEPVLKEFG FAW P E S L NC S KF P PQNDH WHM C
Aminoãcidos 33-14μ de h-FZD5 (SEQ ID ΝΟ:μ)
CQEITVPMCRGIGYNLTHMPNQFNHDTQDEAGLEVHQFWPLVEIQCSPDLRFFLCSMYTP ICLPDYHKPLPPCRSVCERAKAGCSP1MRQYGFAWPERMSCDRLPV1GRDAEVLC
Aminoãcidos 24-129 de h-FZD6 (SEQ NO:8)
CEPITVPRCMKMAYNMTFFPNLMGHYDQSIAAVEMEHFLPLANLECSPNIETFLCKAFVP
TCIEQIHWPPCRKLCEKVYSDCKKLIDTFGIRWPEELECDRLQYC
Aminoãcidos 49-160 de Ιι-ΡΖϋμ (SEQ ID NO: 9)
CQPISIPLCTDIAYNQTILPNLLGHTNQEDAGLEVHQFYPLVKVQCSPEuRFFLCSMYAP VCTVLDQAIPPCRSLCERARQGCEALMNKFGFQWP ERLRCENF PVHGAGEIC
Aminoãcidos 35-148 de h-FZD8 (SEQ ID NO:10)
CQEITVPLCKGIGYNYTYMPNQFNHDTQDEAGLEVHQFWPLVEIQCSPDLKFFLCSMYTP ICLEDYKKPLPPCRSVCERAKAGCAPLMRQYGFAWPDRMRCDRLPEQGNPDTLC
Aminoãcidos 39-152 de h-FZD9 (SEQ ID NO:11)
CQAVEIPMCRGIGYNLTRMPNLLGHTSQGEAAAELAEFAPLVQYGCHSHLRFFLCSLYAP MCTDQVSTPIPACRPMCEQARLRCAPIMEQ FNFGW PD SLDCARL PTRNDPHALC
Aminoãcidos 34-14μ de h-FZD10 (SEQ ID NO:12)
CQPIEIPMCKDIGYNMTRMPNLMGHENQREAAIQLHEFAPLVEYGCHGHLRFFLCSLYAP
MCTEQVSTPIPACRVMCEQARLKCSPIMEQFNFKWPDSLDCRKLPNKNDPNYLC
Aminoãcidos 5μ-165 de h-SFRPl (SEQ ID NO:13)
CVDI ΡΑΟΕΚΕΟΗΝνθΥΚΚΜνμΡΝΕΕΕΗΕΤΜΑΕνΚ00Α33ΚνΡΕΕΝΚΝ0ΗΑΘΤ0νΡΕΟ5ΕΕ APVCLDRPIYPCRWLCEAVRDSCEPVMQFFGFYWPEMLKCDKFPEGDVC
Aminoãcidos 40-152 de h-SFRP2 (SEQ ID NO:14)
CKPIPANLQLCHGIEYQNMRL PNLLGHETMKEVLEQAGAWIPLVMKQCHPDTKKFLCS LF APVCLDDLDETIQPCHSLCVQVKDRCAPVMSAFGFPWPDMLECDRFPQDNDLC
Aminoácidos 35-14μ de h-SFRP3 (SEQ ID NO:15)
C ΞPVRIPLCKSLPWNMTKMPNHLHHSTQANAILAIEQFEGLLGTHCS PDLLFFLCAMYAP
IC TID FQH E PIKPCKS VC E RARQG CE PILIKYRHSW PE NLAC EEL PVYDRGVC
Aminoácidos 24-136 de h-SFRP4 (SEQ ID MO:16)
CEAVRIPMCRHMPWNITRMPNHLHHSTQENAILAIEQYEELVDVNCSAVLRFFFCAMYAP
ICTLEFLHDPIKPCKSVCQRARDD CE PLMKMYNHSWPE S LACDELPVYDRGVC
Aminoácidos 53-162 de h-SFRP5 (SEQ ID ΝΟ:1μ)
CLDIPAD LP LCHTVGYKRMRLPNLLEHESLAEVKQQAS SKL PLLAKRCH SDTQVF L C S L F APVCLDRPIYPCRSLC EAVRAGCAPLMEAYGF PWPEMLHCHKFP LDND L C
Sequências Fc
Região Fc de IgGi Humana (SEQ ID NO:18)
D KTHT C P P C PAPE LLGGP S VFL F P PK P KDTLMIS RT PE VT CVWDVSH ED P EVKFNWYVD GVEVHNAKTKPR EEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK GQ PREPQVYTLP P S RDELT KNQVS LT CLVKG FY P S DIAVEWE SNGQ P EMNY KTTP PVLDS DGS FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFS CSVMHEALHNHYTQKSL S LS PG K
Região Fc de IgGi Humana (SEQ ID NO :42)
KSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNW YVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEY KC KVSNKALPAPIE KTIS KAKGQP R E PQVYTLPP ΞRDE LTKNQVS LTCLVKGFYP S DIAVEWE S NGQ PENNY KTT PPV LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Região Fc de IgGi Humana (SEQ ID NO:43)
EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWS VLTVLHQDWLMGKEYKCKVSNKAL PAP IEKT IS KAKGQPREPQVYTLP PSRDELTKNQVSLTC LVKGFYP SDIAVEW E SNGQ PENNY KTT P PVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL S L S PGK
Região Fc de IgG2 Humana (SEQ ID NO :44)
CVECPPCPAP PVAGPSVFLFPPKP KDTLMIS RT P E VT CVWD V S Η E D P EVQ FN WYVDG VE VHNAKTKPRESQFNSTFRWSVLTWHQDWLWGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQP REPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGS F F LYS KLTVDKS RWQQGNVF SC SVMHEALHNHYTQ KS LS LS PGK
Sequências de domínio Fri de FZD
Domínio Fri de FZD4 Humana (sequência de sinal prevista sublinhada) (SEQ ID NO :19)
M LAMAWRGAGPSVPGAPGGVGLSLGLLLQLLL LLGPARGFGDEΞERRCDPIRIS MCQHLG YNVT KMPNLVGHÊLQTDAELQ LTTFTPLIQYGCSS QLQFFLCS VYV PMCTEKINIPIG PC GGMCLSVKRRCEPVLKE FG FAWPE S LNCSKF PPQNDHNHMCMEGPGDEEV
Domínio Fri de FZD5 Humana (sequência de sinal prevista sublinhada) (SEQ ID NO:20)
MARPDPSAPPSLLLLLLAQLVGRAAAASKAPVCQEITVP.MCRGIGYNLTHMPlNrQFNHDTQ
DEAGLEVHQFWPLVEIQCSPDLRFFLCSMYTPICLPDYHKPLPPCRSVCERAKAGCSPLM
RQYGFAWPERMSCDRLPVLGRDAEVLCMDYNRSEATT
Domínio Fri de FZD8 Humana (sequência de sinal prevista sublinhada) (SEQ ID NO :21)
Μ E WGYL L E VT S L LAALALLQR5S GAAAASAKELACQ EITVPL C KGIGYNYTYM PNQ FNHD TQDEAGLEVHQFWPLVEIQCSPDLKFFLCSMYTPICLEDYKKPLPPCRSVCERAKAGCAP LMRQYGFAWPDRMRCDRLPEQGNPDTLCMDYNRTDLTT
Sequência de aminoãcidos de domínio Fri de FZD1 Humana sem sequência de sinal prevista (SEQ ID NO:32Ê aminoãcidos 8μ-23μ de SEQ ID ΝΟ:2μ)
QQPPPPPQQQQSGQQYNGERGISVPDHGYCQPISIPLCTDIAYNQTIMPNLLGHTNQEDA GLEVHQFYPLVKVQCSAELKFFLCSMYAPVCTVLEQALPPCRSLCERARQGCEALMNKFG FQW PDTL KCE KFPVHGAGELCVGQNTSD KGT
Sequência de aminoãcidos de domínio Fri de FZD2 Humana sem sequência de sinal prevista SEQ ID NO:33Ê aminoãcidos 24-159 de SEQ ID NO:28)
QFHGΞKGISIPDHGFCQPISIPLCTDIAYNQTIMPNLLGHTNQEDAGLEVHQFYPLVKVQ CSPELRFFLCSMYAPVCTVLEQAIPPCRSICE RARQGCEA LMN KFG FQWP E R LRCE HF PR HGAEQICVGQ KIH S E DG
Sequência de aminoácidos de domínio Fri de FZD3 Humana sem sequência de sinal prevista (SEQ ID NO:34Ê aminoácidos 23-143 de SEQ ID NO :29)
HSLFSCEPITLRMCQDLPYNTTFMPNLLNH'YDQQTAALAMEP FHPMVNLDCSRDF
RP FLCAL YAP ICMEYGRVTL PCRRLCQRAY S E C S KL-M EM FGVPWP EDMECSRFPDCDEPY
PRLVDL
Sequência de aminoácidos de domínio Fri de FZD4 Humana sem sequência de sinal prevista e (SEQ ID NO:35Ê aminoácidos 40 -ΙμΟ de SEQ ID NO :22)
FGDEEERRCDPIRISMCQNLGYNVTKMPNLVGHELQTDAELQLTTFTPLIQYGCSSQLQF FLCSVYVPMCTEKlNIPIGPCGGMCLSVKRRCEPVLKEFGFAWPESLNCS KFPPQNDHNH
MCMEGPGDEEV
Sequência de aminoácidos de domínio Fri de FZD5 Humana sem sequência de sinal prevista (SEQ ID NO:36Ê aminoácidos 2μ-15μ de SEQ ID NO :23)
AS KAPVCQEITV PMCRGIGYNLTHM PNQFNHDTQDEAGL EVHQFW PLVEIQC S PDLR FFL CSMYTPICLPDYHKPLPPCRSVCERAKAGCSPLMRQYGFAWPERMSCDRLPVLGRDAEVL CMDYMRSEATT
Sequência de aminoácidos de domínio Fri de FZD6 Humana sem sequência de sinal prevista (SEQ ID ΝΟ:3μΕ aminoácidos 19- 146 de SEQ ID NO:24)
HS LFTCEPITV PR C ΜKMAYNMTF FPNLMGHYDQSIAAVEMEHFLPLANLECS PNIET F LC KAFV P T CIE QIHWP P CRKL CE KVYSD C KKLIDTFGIRW P E E1E C DRLQYCD ETVPVT FD PHTEFLG
Sequência de aminoácidos de domínio Fri de FZDp Humana sem sequência de sinal prevista (SEQ ID NO:38Ê aminoácidos 33- ΙμΟ de SEQ ID NO :25)
QPYHGEKGISVPDHGFCQPISIPLCTDIAYNQTILPNLLGHTNQEDAGLEVHQFYPLVKV QCSP ELRFFLC S MYAPVCTVLDQAIP PCRS LCERARQGCEALMNKFGFQWP E RLRCENFP
VHGAGEICVGQNTSDGSG
Sequência de aminoãcidos de domínio Fri de FZD8 Humana sem sequência de sinal prevista (SEQ ID NO:39Ê aminoãcidos 28- 158 de SEQ ID NO:30)
ASAKELACQEITVPLCKGIGYNYTYMPNQFNHDTQDEAGL EVHQ FWPLVEIQCS PDLKFF LCSMYTPICLEDYKKPLPPCRSVCE RAKAGCAPLMRQYGFAW PDRMRCDRLPE QGNPDTL CMDYNRTDLTT
Sequência de aminoãcidos de domínio Fri de FZD9 Humana sem sequência de sinal prevista (SEQ ID NO:40Ê aminoãcidos 23- 159 de SEQ ID NO:31)
LEIGRFDPERGRGAAPCQAVEIPMCRGIGYNLTRMPNLLGHTSQGEAAAELAEFAP LVQY GCHSHLRFFLCSLYAPMCTDQVSTPIPACRPMCEQARLRCAPIMEQFNFGWPDSLDCARL PTRNDPHALCMEAPENA
Sequência de aminoãcidos de domínio Fri de FZD10 Humana sem sequência de sinal prevista (SEQ ID NO:41Ê aminoãcidos 21-154 de SEQ ID NO:26)
IS SMDMERPGDGKCQPIEIPMCKDIGYNMTRMPNLMGHENQREAAIQLHEFAPLVEYGCH GHLRFFLCSLYAPMCTEQVSTPIPACRVMCEQARLKC SPIMEQFNFKWPDSLDCRKLPNK
ND PNYLCMEAPNNG
Sequências de domínio extracelular FZD (ECD) ECD de FZD1 humana com sequência de sinal (SEQ ID Ν0:2μ)
MAEE EAPKKSRAAGGGASWELCAGAL SARLAE EGS GDAGGRRRP PVD PRRLARQ L LLLLW LLEAPLLLGVRAQAAGQGPGQGPGPGQQPPPPPQQQQSGQQYNGERGISVPDHGYCQPIS IP L CTDIAYNQTIMPNL LGHTNQE DAGLEVHQFYP LVKVQC SAEL KF FL C SMYAPVCTVL E QAL PPCRSLCERARQGC EALMNKFGF QWPDTLKCEKFPVHGAGELCVGQNTSDKGTPTP Ξ L L PE FWT S NPQHGGGGHRGGFPGGAGASERGKFSCPRALKV P S Y LMYH FLGE KDCGAPC
EPTKVYGLMYFGPBELRFSRT ECD de FZD2 humana com sequência de sinal (SEQ ID NO:28)
MRPRSALPRLLLPLLLLPAAGPAQFHGEKGISIPDHGFCQPISIPLC7DIAYNQTIMPNL
LGHTNQEDAGLEVHQFYPLVKVQCSPELRFFLCSMYAPVCTVLEQAIPPCRSICERARQG
CEALMNKFGFQWPERLRCEHFPRHGAEQICVGQNHSEDGAPALLTTAPPPGLQPGAGGTP
GGPGGGGAPPRYATLEHPFHCPRVLKVPSYLSYKFLGERDCAAPCEPARPDGSMFFSQEE
TRFARLWILT ECD de FZD3 humana com sequência de sinal (SEQ ID NO:29)
MAMTWIVFSLWPLTVFMGHIGGHSLFSCEPITLRMCQDLPYNTTFMPNLLNHYDQQTAAL AMEPFHPMVNLDCSRDFRPFLCALYAPICMEYGRVTLPCRRLCQRAYSECSKLMEMFGVP WPEDMECSRF PDCDEPY PRLVDLNLAGEPTEGAPVAVQRDYGFWC PRELKIDPDLGYSFL HVRDC S P PCPNMYFRREE L S FAR Y ECD de FZD4 humana com sequência de sinal (SEQ ID NO :22)
MLAMAWRGAGPSVPGAPGGVGLSLGLLLQLLLLLGPARGFGDEEERRCDPIRISMCQNLG YNVTKMPNLVGH E LQTDAELQLTTFTPLIQYGCSSQLQFFLCSVYVPMCTEKINIPIGPC GGM CL ΞV KRRC Ξ PVL KEFGFAW PE S LNCS KF P P QNDHNHMCMEG PGDE EV P L PHKTPIQ P GEE CH SVGTN S DQ YIWKR S LNC VL KCGYDAGL Y SRSAKEFTDI ECD de FZD5 humana com sequência de sinal (SEQ ID NO :23)
MARPDPSAP P SLLLLLLAQLVGRAAAA3KAPVCQEITVPMCRGIGYNLTHMPNQFNHDTQ DEAGLEVHQFWPLVEIQCSPDLRFFLCSMYTPICLPDYHKPLPPCRSVCERAKAGCSPLM RQYGFAWPERMSCDRLPVLGRDAEVLCMDYNRSEATTAPPRPFPAKPTLPGPPGAPASGG
E C PAGG PFVCKCREPFVPIL KESHPLYNKVRTGQVPNCAVPCYQPSFSADERT ECD de FZD6 humana com sequência de sinal (SEQ ID NO:24)
M EM FT FLL T CI FL P L LRGH S L FTC E PI TV PRCFIKMAYNMT F F PNLMGH YD Q SIAAVEM E H FLPLANLECSPNIETFLCKAFVPTCIEQIHWPPCRKLCEKVYSDCKKLIDTFGIRWPEE LECDRLQYCDETVPVTFDPHTEFLGPQKKTEQVQRDIGFWCPRHLKTSGGQGYKFLGIDQ CAP PC PNMYFKSDELEFAKSFIGTVSI ECD de ΡΖΟμ humana com sequência de sinal (SEQ ID NO:25)
MR D P GAAA P L S S LG L CALVLA L LGAL S AGAGAQ PYHGEKGISVPDHGFCQPISIPLCTDI AYNQTIL PNLLGHTHQEDAGLEVHQFY PLVKVQCSPELRFFLCSMYAPVCTVLDQAIPPG R S L C Ξ RARQGCEALMNKFGFQWPERLRCENFPVHGAGEICVGQNT S DGSGG PGGGPTAYP TAPYLPDLPFTALPPGASDGRGRPAFPFSCPRQLKVPPYLGYRFLGERDCGAPCEPGRAN GLMYFKE EE RRFARL ECD de FZD8 humana com sequência de sinal (SEQ ID NO:30)
MEWGYLLEVTS LLAALALLQRS SGAAAASAKE LACQEITVPLC KGIGYNYTYMPNQFNHD TQDEAGLEVHQ FWPLVEIQCSPDLKFFLCSMYTPICLEDYKKPLPP CRSVCE RAKAGCAP LMRQYGFAWPDRMRCDRLPEQGNPDTLCMDYNRTDLTTAAPSPPRRLPPPPPGEQPPSGS GHGR PPGARPPHRGGGRGGGGGDAAAPPARGGGGGGKARPPGGGAA P C EPGCQC RAPMVS VSSERHPLYNRVKTGQIANCALPCHNPFFSQDERAFT ECD de FZD9 humana com sequência de sinal (SEQ ID NO:31)
MAVAP LRGAL LLWQL LAAGGAALEIGR FD P ERGRGAAPCQAVEIPMCRGIGYNLTRMPNL LGHTSQGEAAAELAEFAPLVQYGCHSHLRFFLCSLYAPMCTDQVSTPIPACRPMCEQARL RCA PIME QFNFGW PD S LDCARL PTRND PHAL CMEA PENATAGPAE PHKGLGML PVAPR PA R P PGD LGPGAGGSGTCEMP EKFQYVEKS RSCAPRCG PGVEVFWS RRDKD F ECD de FZD10 humana com sequência de sinal (SEQ ID NO:26)
MQRPGPRLWLVLQVMGSCAAISSMDMERPGDGKCQPIEIPMCKDIGYNMTRMPNLMGHEN QREAAIQLHEFAPLVEYGCHGHLRFFLCSLYAPMCTEQVSTPIPACRVMCEQARLKCSPI MEQFNFKWPDSLDCRKLPNKNDPNYLCMEAPNNGSDEPTRGSGLFPPLFRPQRPHSAQEH PL KDGG PGRGGCDNPGKFHHVE KSASCAPL CT PGVDVYWS RED KRFA
Variantes FZDS-Fc
Sequência de aminoácidos de FZD8-Fc variante 54F03 (sem sequência de sinal previstaÊ clivagem alternativa) (SEQ ID NO:4 5)
AAAASAKELACQE I TVPLCKGIGYNYTYM PNQ FNHDTQDEAGLEVHQFWPL,VE IQCS PDL KF FT CSMYTPICLEDYKKPLPPCRSVCERAKAGCAP LMRQYGFAWPDRMRCDRLP EQGNP DTLCM DY MRTD LTTGRADKTHTCP P C PAP ELLGG PSVFL F P P KP KDTLMIS RT P EVTCW VDVS Η E DPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEY KC KV
S N KALPA PIE KTIΞKAKGQ PREPQVYTLPP S RDELTKNQVS LTC LVKG F Y PSDIAVE WE S NGQPENNY KTTPPVLDSDGS FF LYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL S L SPC-K
Sequência de aminoãcidos de FZD8-Fc variante 54F09 (sem sequência de sinal prevista) (SEQ ID NO:46)
ASAKELACQEITVPLCKGIGYNYTYMPNQFNHDTQDEAGLEVHQFWPLVEIQCSPDLKFF LCSMYTPIC1EDYKKPLPPCRSVCERAKAGCAPLMRQYGFAWPDRMRCDRLPEQGNPDTL CMDYNRTDLTTAAPSPPDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCW VDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES NGQPENNYKTT P PVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPGK
Sequência de aminoácidos de FZD8-FC variante 54F09 (sem sequência de sinal previstaÊ clivagem alternativa) (SEQ ID ΝΟ:4μ)
AAAASAKELACQEITVPLC KGIGYNYTYMPKQFNHDTQQEAGLEVHQFW PLVET QCSFDL KF F L C SMYT PICLEDYKKPLPPCRSVCERAKAGCAPLMRQYGFAWPDRMRCDRLPEQCNF DTLCMDYNRTDLTTAAPSPPDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVWDVSH ED PE VKFN W YVDGVE VHNAKTKFRSE QYN3 T YR WS VL TVLHQDWLNGKEYK CKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHMHyTQKS LSLSPGK
Sequência de aminoácidos de FZD8-FC variante 54F15 (sem sequência de sinal prevista) (SEQ ID NO:48)
ASAKELACQEITVPLCKGIGYNYTYM PNQ FNHDTQDEAGLEVHQ FWPLVEIQCSPDLKFF LCSMYTPICLEDYKKPLPPCRSVCERAKAGCAPLMRQYGFAWPDRMRCDRLPEQGNPDTL CMDYNRTDLTTAAPD KTHTC PPG PAPE L LGG P Ξ VF L F P PK P KDTLM IS R T F E VTCVWD V SHED P EVKFNWYVDGVEVHNAKT KP REEQYNS TYRWSVLTVLHQD WLNGK3YKC KVSNK ALPAPIE KTIS KAKGQ PR EPQVYTLP PSRDE LXKNQVS LTCLVKGF YP S DIAVEWES NGQ PENNY KTT P PVLDS DG SFFLYS KLTVDKS RWQQGNVF S CS VMHEAL HNHYTQKSLS LS PG K
Sequência de aminoácidos de FZD8-FC variante 54F15 (sem sequência de sinal previstaÊ clivagem alternativa) (SEQ ID NO:4 9)
AAAASAKELACQEITVPLC KGIGYNYTYMPNQFNHDTQDEAGLEVHQ FW PLVEIQC SPDL
KFFLCS ÍY '/TP I CLEDYKKPLP PCRSVCE RAKA.GCAPLMRQ YGF.AWPDRMRC DRLPEQGNP DTLCMD YNRT D LTTAAPD KTH TC P P C PA PELLGGPSVFLFPPKP KDTLMISRTPEVTCW VDVSHED P E VKFNW YVDGVE VHMAKT KP RE E QYNST YR WS VLT VLKQD WLNGKÉ Y KC KV S N KA L P A PIE KTIS KA KG Q P R E P Q V Y T L P P S R D S L T KN Q V S L T C L V KG F Y E S DIAV E W E S NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSfíWQQGMVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL
SPGK
Sequência de aminoácidos de variantes de FZD8-Fc 54F16, 54Flq, 54F18, 54F23, 54F25, 54F2q, 54F29, 54F31 e 54F34 (sem sequência de sinal prevista) (SEQ ID NO:50)
ASAKELACQEIT VP LCKGIGYNYTYM PNQFNHDTQDEAGLEVHQFWPLVEIQCS PD LKFF L C S Μ Y TPICLED Y KKP L P PCRSVCERAKAGCA?LMRQYG FAW?D RMRCDRL PΞ QGNPDTL CKDYNRTDLTTKSSD KTHTC P P C PAP E L LGGP SVFLFPPXPKDTLMISRTP EVTCWVDV SHED P E VKFNW YVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDW L KGKEYKC KVSNK ALPAPIEKTIS KAKGQFREPQVYTLPP SRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGQ PENN Y KTTP PV LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGtP/FSC SVMHEALHKHYTQKSLSLSPG K
Sequência de aminoácidos de variante de FZD8-Fc 54F16 (sem sequência de sinal previstaÊ clivagem alternativa) (SEQ ID NO:51)
AAAASAKELACQEITVPLCKGIGYNYTYMPNQFNHDTQDEAGLEVHQFWPLVETQCSPDL KFFLCSMYTPICLEDYKKPLPPCRSVCERAKAGCAPLMRQYGFAWPDRMRCDRLPEQGNP
D T L CMDYNRTDLTTKS S DKTHTC P P C PAP E L LGGP SVFLF P PKP KDTLM i S RT PE VTCW VDV3HEBPEVKFNWY\rDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV S N KAL PAPIEKTIS KA KGQ P R E P QV Y TLPPSRDELT KN Q V Ξ L T C L VKG F Y P S DI A.V E W Ξ Ξ NGQPENNYKTTPPVLDS DGS FFLYS KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPG
Sequência de aminoácidos de variante de FZD8-Fc 54F16 (com sequência de sinal) (SEQ ID NO:52)
M FIWGYLLEVTSLLAALALLQRSSGAAAASAKELACQHITVPLCKGIGΥΝYTYMPNQFNHD TQDEAG LEVHQ FW PLVEIQ C S PDL KF FLC SMYT PIC LEDY KK P LP PCRSVC ERAKAGC A P LMRQYGFAWPDRMRCDRLPEQGNPDTLCMDYNRrDLTTXSSDKTHTCPFCPAFELLGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL PAP IΕΚΤISXAKGQPREPQVYTLP PSRDELT KN Q VS L T C L V KG F Y P Ξ DIAVE WE S N G Q Ρ E NN Y K T T P P VL D S D G S F F L Y S KL T VD K. S R W Q Q GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Sequência de aminoácidos de variantes de FZD8-Fc 54F19, 54F20, 54F24, 54F26, 54F28, 54F30, 54F32, 54F34 e 54F35 (sem sequência de sinal prevista) (SEQ ID NO:53)
ASAKELACQEITVPLCKGIGYNYTYMPNQFNHDTQDEAGLEVHQFWFLVEIQCSPDLKFF LCSMYTPI CLEDYKKPL P P C R S V C E RA KAG CAP LMRQ YG FAW PD RMRCDRL P E QGNPDTL CMDYNRTDLTTE PKS SDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFP PKPKDTLMIS RGPEVT CWV DVSHED PEVKFNW YVDGVEVHNAKT KPREEQYN S TYRWS VLT VLHQD WLNG KEYKC KVS N KAL PA PIE KTIS KAKGQPRE PQVYTLP PSRDELTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESN GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLS PGK
Sequência de aminoácidos de variante de FZD8-FC 54F19 (sem sequência de sinal previstaÊ clivagem alternativa) (SEQ ID NO:54)
ALAASAXELACQEITVPLCKGIGYNYTYMPNQF NHDTQDEAGLE VHQ FW PLVEIQCS PD L KF FLC SMYT PICL E DY KKP L PP CRSVCE RAKAGCAPLMRQYGFAWPD RMRCDRL PEQGNP DTLCMDYNRTDLTTE PKS SDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVT C WVDVSHEDPEV KFNW YVDGVB VHNAKTK PRE E QYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKE YKC KVSNKALPAPIE KTΓS KAKGQ P RE PQ VYTL P P S RDE LT KNQVS L TC LVKGFY P S DIAVEW
Es ngqp ennykttp pvldsdgsfflyskl tvdks rwq qgnvf s c sVMHEALHKHytqks l
SLSPGK sequência de aminoácidos de variante de FZD8-Fc 54F20 (sem sequência de sinal previstaÊ clivagem alternativa) (SEQ ID NO:55)
VLAASAKELACQEITVPLCKGIGYNYTYMPNQFNHDTQDSAGLEVHQFWPLVEIQCSPDL
K FFLCS MYTPIC LEDYKKPL P PCRSVCERAKAGCAPLMRQYGFAWPDRMRCDRL PEQGNP DTLCMDYNRTDLTTEPKSSDKTHTCP P C PA PEL LGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTC
VVVDV S Hã D PEVKFNWYVDGVEVKNAKT KPREE Q YNS T YR WS VLTVL HQDWLNGKE YKC K V S KKAL PAPIEKTIS KAKGQPRE PQVYTLPP S RD E LT KNQVSL TCLVKGFY P S DIAVEW ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL SLSPGK sequência de aminoácidos de variante de FZD8-Fc 54F34 (sem sequência de sinal prevista) (SEQ ID NO:65)
KELACQEITV P L C KGIGYNYTYMPNQFNHDTQDEAGLEVKQFWP LVEIQCSPDLKFFLCS MYTPICLEDYKKPLPPCRSVCERAKAGCAPLMRQYGFAWPDRMRCDRLPEQGNPDTLCMD
YNRTDLTTEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVS H ED PE VKFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQ YNS TYRWSVLTVLHQDWLNG KE YKCKVS NKA L PAPIE KTIS KAKGQPRE PQVYTLP P Ξ RDE LT KNQVS LTCLVKGFY PSDIAVEWE SNGQ P ENNYKTT PPVLDSDGSFFLYS KLTVD KS RWQQGNVF S C SVMHEALHNHYTQKS LSLSPGK sequência de aminoácidos de variante de FZDS-Fc 54F33 (sem sequência de sinal prevista) (SEQ ID NO:66)
KELACQEITVPLCKGIGYNYTYMPNQFNHDTQDEAGLEVHQFWPLVEIQCSPDLKFFLCS MYTPICLEDYKKPLPPCRSVCERAKAGCAPLMRQYGFAWPDRMRCDRLPEQGNPDTLCMD YNRTDLTTKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHE D PE VKFNWYVDGVE VHNAKT KPRE EQYNSTYRWSVLTVLHQDW LNGKE YKC KVSN KALP APIE KTIS KAKGQ P REPQV YTLP P S RD E LTKNQVS LT CLVKGFY P S DIAVEWE SNGQ PEN NYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH'YTQKSL S LS PG K ECD de ROR1 humana com sequência de sinal (SEQ ID NO:56)
MHRPRRRGTRPPLLALLAALLLAARGAAAQETELSVSAELVPTSSWNISSELNKDSYLTL
DEPMNNITTSLGQTAELHCKVSGNPPPTIRWFKNDAPWQEPRRLSFRSTIYGSRLRIRN
LDTTDTGYFQCVATNGKEWSSTGVLFVKFGPPPTASPGYSDEYEEDGFCQPYRGIACAR
FIGNRTVYMESLHMQGEIENQITAAFTMIGTSSHLSDKCSQFAIPSLCHYAFPYCDETSS
VPKPRDLCRDEGEILENVLCQTEYIFARSNPMILMRLKLPNCEDLPQPESPEAANCIRIG
IPMADPINKHHKCYNSTGVDYRGTVSVTKSGRQCQPWNSQYPHTHTFTALRFPELNGGHS
YCRNPGNQKEAPWCFTLDENFKSDLCDIPACDSKDSKEKNKMEILY ECD de ROR2 humana com sequência de sinal (SEQ ID ΝΟ:5μ)
MARGSALPRRPLLCIPAVWAAAALLLSVSRTSGEVEVLDPNDPLGPLDGQDGPIPTLKGY FLNFLE PVNNITIVQGQTAILHCKVAGMPP PNVRWLKNDAPWQE PRRIIIRKTEYGSRL RIQDLDTTDTGYYQCVATNGMKTITATGVLFVRLGPTHSPMHNFQDDYHEDGFCQPYRGI ACARFIGNRTIYVDSLQMQGEIE NRITAAFTMIGTSTHLSDQCSQFAIP S F CM FVFPL C D ARS RTPKPRELCRDECEVLESDLCRQEYTIARSNPLILMRLQLPKCEALP ΜPE S PDAANC MRIGIPAE RLGRYHQCYNGΞGMDYRGTAS TT KS GHQ CQ PWALQHPH SHHLS ST D FPE LGG G HAYCRN PGGQMEG PW C FTQNKNVRMELCDVPSCSPRDSS KMG
Domínio mínimo Fri de h-RORl (SEQ NO :58)
CQPYRGIACARFIGNRTVYMESLHMQGEIENQITAAFTMIGTSSHLSDKCSQFAIPSLCH
YAFPYCDETSSVPKPRDLCRDECEILENVLCQTEYIFARSNPMILMRLKLPNCEDLPQPE
SPEAANC
Domínio mínimo Fri de h-ROR2 (SEQ ID NO:59)
CQPYRGIACARFIGNRTIYVDSLQMQGEIENRITAAFTMIGTSTHLSDQCSQFAIPSFCH FVFPLCDARSRTPKPRELCRDECEVLESDLCRQEYTIARSNPLILMRLQLPKCEALPMPE S PDAANC
Ligante (SEQ ID NO:60)
Ligante ESGGGGVT (SEQ ID NO:61)
LESGGGGVT
Ligante (SEQ ID NO :62)
GRAQVT
Ligante (SEQ ID NO:63)
WRAQVT
Ligante (SEQ ID NO:64)
ARGRAQVT
Sequência de Sinai (SEQ ID ΝΟ:6μ) MEWGYLLEVTSLLAALALLQRSSGAAA
Sequência de Sinai (SEQ ID NO:68) MEWGYLLEVTSLLAALALLQRSSGALA
Sequência de Sinal (SEQ ID NO:69)
MEWGYLLEVT S LLAALALLQRS SGVLA
Sequência de Sinal (SEQ ID ΝΟ:μΟ)
MEWGYLLEVTSLLAALLLLQRS PI VHA
Sequência de Sinal (SEQ ID ΝΟ:μ1)
MEWGYLLEVTSLLAALFLLQRSPIVHA
Sequência de Sinal (SEQ ID ΝΟ:μ2)
MEWGYLLEVTSLLAALLLLQRSPFVHA
Sequência de Sinal (SEQ ID ΝΟ:μ3)
MEWGYLLEVTSLLAALLLLQRSPIIYA
Sequência de Sinal (SEQ ID ΝΟ:μ4)
MEWGYLLEVTSLLAALLLLQRSPIAHA FZD8-Fc variante 54F26 com sequência de sinal (SEQ ID ΝΟ:μ5)
MEWGYLLEVTSLLAALFLLQRSPIVHAASAKELACQEITVPLCKGIGYNYTYMPNQFNHD T Q D E AG L EVHQ FW P LVEIQC S PDL KFFL C S ΜYT PICLΞ DYKKPL P PCRSVCERAKAGCAP LMRQYGFAWPDRMRCDRLPEQGNPDTLCMDYNRTDLTTEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGG P SVFL F P P KPKDTLMIS RTPEVTCVWDVSHED P EVKFNWYVDGVEVHNAKT KPR E EQYN STYRWS'VLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKAL PAP IE KTIS KAKGQPRE PQVYTLP PSRDE LT KNQVS LTCLVKGF'YPSDIAVEWE SNGQPENNYKTTP PVLDSDGS FFLY S KLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Sequência N-terminal (SEQ ID ΝΟ:μ6)
AAAASA
DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO
Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.
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Claims (18)

REIVINDICAÇÕES
1. Um polipéptido compreendendo: (i) um agente de ligação a Wnt compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 53Ê e (ii) uma sequência de sinal selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID Ν0:μ2, SEQ ID ΝΟ:μΟ, SEQ ID Ν0:μ1, SEQ ID NO:μ3 e SEQ ID NO:μ4.
2. Um polipéptido de acordo com a reivindicação 1 compreendendo a SEQ ID NO: μ2 e a SEQ ID NO: 53.
3. Um polinucleótido isolado compreendendo um polinucleótido que codifica o polipéptido de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2.
4. Uma célula: (i) produzindo o polipéptido de acordo com quaisquer da reivindicação 1 ou reivindicação 2Ê ou (ii) compreendendo o polinucleótido de acordo com a reivindicação 3.
5. Uma composição compreendendo um agente de ligação a Wnt compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 53, em que pelo menos 80™ do dito agente de ligação a Wnt tem uma sequência de aminoácidos N-terminal Ala Ser Ala (ASA) .
6. Uma composição de acordo com a reivindicação 5 que é uma composição farmacêutica compreendendo um portador farmaceuticamente aceitável. μ.
Uma composição de acordo com a reivindicação 5 ou a reivindicação 6 para utilização no tratamento do cancro ou para utilização no tratamento de uma doença associada com a ativação da sinalização canónica de Wnt.
8. A composição para utilização de acordo com a revindicação μ, em que o cancro é cancro pancreãtico, cancro hepatocelular ou cancro do ovário.
9. A composição para utilização de acordo com a revindicação μ ou 8, em que o agente de ligação a Wnt se destina a ser administrado com um segundo agente terapêutico.
10. A composição para utilização de acordo com a revindicação 9, em que o segundo agente terapêutico é um agente quimioterapêutico.
11. A composição para utilização de acordo com a revindicação 10, em que o agente quimioterapêutico é paclitaxel, paclitaxel ligado a albumina, carboplatina, irinotecano ou gencitabina.
12. A composição para utilização de acordo com a revindicação 10, em que o agente quimioterapêutico é gencitabina e o cancro é cancro pancreático.
13. A composição para utilização de acordo com a revindicação 10, em que o agente quimioterapêutico é paclitaxel e o cancro é cancro pancreãtico.
14. A composição para utilização de acordo com a revindicação 9, em que o segundo agente terapêutico é um inibidor da angiogénese.
15. A composição para utilização de acordo com a revindicação 14, em que o inibidor da angiogénese é um anticorpo anti-VEGF.
16. Um método in vitro de produzir uma composição de acordo com a reivindicação 5, o método compreendendo expressar numa célula um polipéptido compreendendo a SEQ ID NO: 53 e uma sequência de sinal selecionada a partir de um grupo consistindo em: SEQ ID Ν0:μ2, SEQ ID ΝΟ:μΟ, SEQ ID Ν0:μ1, SEQ ID Ν0:μ3 e SEQ ID NO :μ4, pelo qual pelo menos 80™ de um agente de ligação a Wnt produzido pela célula tem a sequência de aminoácidos N-terminal Ala Ser Ala (ASA). 1μ.
Um método in vitro de produzir um polipéptido de ligação a Wnt compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:53, o método compreendendo: (i) expressar numa célula hospedeira um polipéptido de acordo com a reivindicação 1 ou 2 sob condições onde a sequência de sinal é clivada pela célula hospedeiraÊ e (ii) purificar o polipéptido de ligação a Wnt da SEQ ID NO:53.
18. Um polipéptido de ligação a Wnt compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 53 produzida pelo método de acordo com a reivindicação 1μ.
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