CN102917721B - Wnt拮抗剂和治疗与筛选方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含Wnt拮抗剂的组合物和治疗与Wnt相关的疾病和病症（诸如癌症）、诱导分化以及减少癌干细胞的发生频率的方法，以及筛选此类Wnt拮抗剂的新型方法。具体来说，本发明公开可溶性FZD、SFRP和Ror受体及其用途。

Description

WNT拮抗剂和治疗与筛选方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2010年1月12日提交的美国临时申请第61/294,270号、2010年10月15日提交的美国临时申请第61/393,675号和2010年12月17日提交的美国临时申请第61/424,408号的优先权权益，其全部内容以引用的方式并入本文。
发明领域
本发明提供用于治疗癌症和其它与Wnt相关的疾病或病症的新型组合物和方法，以及用于鉴别其它新型治疗剂的新型筛选方法。具体来说，本发明提供包含用于治疗实体瘤和其它与Wnt相关的疾病和病况的可溶性受体蛋白质的Wnt拮抗剂。
发明背景
癌症为发达国家中的一个主要死亡原因，仅在美国每年就有超过百万人被诊断罹患癌症且造成50万人死亡。总体而言，据估计每3人中超过1人在其一生中会患上出某种形式的癌症。癌症有超过200种不同的类型，其中四种：乳癌、肺癌、大肠直肠癌和前列腺癌占了新病例的一半以上（Jemal等,2009,CancerJ.Clin.,58:225-249)。
Wnt信号传递途径已被鉴别为癌症疗法的潜在标靶。Wnt信号传递途径是胚胎模式形成、胚胎后期组织维护和干细胞生物学的数种关键调节因子之一。更具体来说，Wnt信号传递在产生细胞极性和细胞命运特化（包括干细胞群的自我更新）上扮演重要角色。Wnt途径的不受控管地活化与许多人类癌症有关，癌症中肿瘤细胞的命运发展可被改变以维持其未分化和增生状态。因此，癌变可通过夺取控制正常发展的恒定机制和由干细胞进行的组织修复来进行(综述在Reya&Clevers，2005,Nature,434:843-50;Beachy等,2004,Nature,432:324-31中)。
Wnt信号传递途径首先是在发展突变体无翅(wg)果蝇和小鼠原癌基因int-1(现在称为Wnt1)中阐明(Nusse&Varmus,1982,Cell,31:99-109；VanOoyen&Nusse,1984,Cell,39:233-40；Cabrera等,1987,Cell,50:659-63；Rijsewijk等,1987,Cell,50:649-57)。Wnt基因编码分泌型脂质修饰的糖蛋白，其中19种已在哺乳动物中鉴别出。这些分泌型配体活化由Frizzled(FZD)受体家族成员和低密度脂蛋白(LDL)受体相关蛋白5或6(LRPS/6)所组成的受体复治物。所述FZD受体为G-蛋白偶联受体(GPCR)超家族的七次跨膜结构域蛋白并且含有一个大胞外N端配体结合域，此结合域具有10个经过保留的半胱氨酸，称为富含半胱氨酸的结构域(CRD)或Fri结构域。有十种人FZD受体，FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9和FZD10。不同FZDCRD对特殊Wnt具有不同的结合亲和力(Wu&Nusse2002,J.Biol.Chem.，277:41762-9)，并且FZD受体已被分类成下述活化典型β-连锁蛋白(β-catenin)途径的受体和活化非典型途径的受体（Miller等,1999，Oncogene,18:7860-72）。为了形成与FZD配体结合的受体复合物，FZD受体与LRP5/6，单次跨膜蛋白(single-passtransmembraneprotein)（具有四个胞外EGF样结构域，由6个YWTD氨基酸重复子分隔）交互作用（Johnson等,2004,J.BoneMineralRes.,19:1749）。
受体结合时典型Wnt信号传递途径被活化是通过胞浆蛋白Dishevelled(Dsh)直接与FZD受体交互作用介导，此可使细胞质稳定和β-连锁蛋白积累。无Wnt信号时，β-连锁蛋白是局部位于包含肿瘤抑制蛋白腺瘤结肠息肉(APC)和Axin的细胞质破坏复合物中。这些蛋白质作为关键支架以允许糖原合成酶激酶3β(GSK3β)结合β-连锁蛋白并将其磷酸化，且将其标记以经由泛素/蛋白酶体途径降解。Dsh活化造成GSK3β磷酸化以及所述破坏复合物的分解。然后，累积的细胞质β-连锁蛋白被转运到细胞核，在此处与TGF/LEF族的DNA结合蛋白交互作用来活化转录作用。
除了典型的信号传递途径外，Wnt配体还活化β-连锁蛋白依赖性途径（Veeman等,2003,Dev.Cell,5:367-77）。非典型的Wnt信号传递涉及多种过程，但最令人信服的为经由类似于果蝇平面细胞极性(PCP)途径的机制牵涉原肠运动。其它潜在的非典型的Wnt信号传递机制包括钙流、JNK以及小G蛋白和异三聚体G蛋白两者。拮抗性通常可在典型和非典型途径之间观察到，而且有证据指出非典型的信号传递可遏制癌细胞形成(Olson&Gibo，1998Exp.CellRes.,241:134;Topol等，2003.J.CellBiol.,162:899-908)。因此，在某些情况下，FZD受体是作为典型的Wnt信号传递途径的负向调节子。例如，当与FZD1共同表达时，FZD6经由TAK1-NLK途径压制经过Wnt3a诱导的典型信号传递（Golan等,2004,JBC279:14879-88）。类似地，FZD2显示出在Wnt5a的存在下经由TAK1-NLKMAPK级联反应拮抗典型的Wnt信号传递(Ishitani等,2003,Mol.Cell.Biol.,23:131-39)。
典型的Wnt信号传递途径也在维持小肠和大肠干细胞群中扮演核心角色，所述途径的不适当活化在大肠直肠癌中扮演重要角色(Reya&Clevers,2005,Nature,434:843)。小肠的吸收上皮细胞是排列成绒毛和腺窝。干细胞存在于腺窝中，慢慢地分裂以产生快速增殖细胞，使迁出腺窝的所有分化的细胞群占据小肠绒毛。Wnt信号传递的级联反应在控制沿着腺窝-绒毛轴的细胞命运中具有主导作用，对维持干细胞群是必要的。经由同源重组遗传性丧失TCF7/2（Korinek等,1998,Nat.Genet.,19:379)或过度表达Dickkopf-1(Dkk1)（一种强力的分泌型Wnt拮抗剂）（Pinto等,2003,GenesDev.,17:1709-13;Kuhnert等,2004,PNAS,101:266-71）来破坏Wnt信号传递会造成小肠干细胞群体竭尽。
Wnt信号传递在癌症中的角色首先是由确定Wnt1(原先为int1)为乳腺肿瘤中的致癌基因而被揭露，所述乳腺肿瘤是经由在附近插入小鼠病毒转化而成（Nusse&Varmus,1982,Cell31:99-109）。至今已累积更多Wnt信号传递在乳癌中的角色的证据。例如β-连锁蛋白转殖基因在乳腺中过度表达造成过度增生及腺癌(Imbert等,2001,J.CellBiol.153:555-68;Michaelson&Leder,2001，Oncogene,20:5093-9)，然而丧失Wnt信号传递会扰乱正常的乳腺发育(Tepera等,2003,J.CellSci.,116:1137-49;Hatsell等,2003，J.MammaryGlandBiol.Neoplasia8:145-58)。最近，乳腺干细胞已被证明是由Wnt信号传递活化(Liu等,2004,PNAS,101:4158-4163)。在人类乳癌中，β-连锁蛋白的积累涉及超过50%的癌症中的Wnt信号传递活化，虽然并未鉴别出特定的基因突变，但观察到Frizzled受体表达上调(Brennan&Brown,2004,J.MammaryGlandNeoplasia,9:119-31;Malovanovic等,2004,Int.J.Oncol,25:1337-42)。
结肠直肠癌最常经由活化Wnt信号传递级联反应中的突变起动。全部结肠直肠癌中约有5-10%为遗传性，主要形式之一为家族性腺瘤性息肉病(FAP)，此为一种体染色体显性遗传疾病，其中约80%受影响的受试者中的腺瘤样息肉(APC)基因含有胚系突变。其它Wnt途径组分（包括Axin和β-连锁蛋白）中也被鉴别出突变。个别腺瘤为含有第二个去活化的等位基因的上皮细胞无性繁殖瘤，而大量FAP腺瘤透过致癌基因和/或肿瘤抑制基因的额外突变不可避免地造成腺癌发展。再者，Wnt信号传递途径活化（包括APC和β-连锁蛋白中的功能获得突变(gain-of-functionmutation))可在小鼠模型中诱导增生发展和肿瘤生长(Oshima等,1997,CancerRes,57:1644-9;Harada等,1999,EMBOJ.,18:5931-42)。
发明概述
本发明提供多种结合一种或多种人Wnt蛋白的药剂（包括但不限于：可溶性FZD受体和其它包含Fri结构域的药剂），以及使用那些药剂的新方法。本发明进一步提供通过向有需要的受试者施用所述药剂的使用所述药剂来治疗癌症的方法。在一些实施方案中，所述方法包括抑制癌细胞生长。在某些实施方案中，所述Wnt结合剂为一种Wnt拮抗剂。本发明也提供筛选这类Wnt结合剂的新方法。同样地，本发明提供编码所述药剂的多核苷酸、制造所述药剂的方法，以及各种包含所述药剂的组合物。
因此，在一个方面中，本发明提供一种抑制肿瘤生长的方法。在某些实施方案中，所述方法包含将肿瘤与有效量的结合一种或多种Wnt蛋白（例如，人Wnt蛋白）的药剂接触。所述方法可在体内或体外进行。在某些实施方案中，所述肿瘤是在受试者中，而肿瘤与药剂的接触包含向受试者施用治疗有效量的Wnt结合剂。
在另一方面中，本发明提供降低包含癌干细胞的肿瘤中的癌干细胞发生频率的方法。因此，本发明也提供降低肿瘤的致瘤性的方法。在一些实施方案中，所述方法包括将肿瘤与有效量的结合一种或多种Wnt蛋白（例如，人Wnt蛋白）的药剂接触。所述方法可在活体内或体外进行。例如所述接触可包含向具有肿瘤的人类施用有效量的Wnt结合剂。
在另一方面中，本发明提供诱导肿瘤中的细胞分化，或诱导肿瘤中的分化标记表达的方法。在某些实施方案中，所述方法包括将肿瘤与有效量的结合一种或多种Wnt蛋白（例如，人Wnt蛋白）的药剂接触。所述方法可在体内或体外进行。
再在另一方面中，本发明提供治疗受试者中的癌症的方法，其包含向受试者施用治疗有效量的Wnt结合剂。
在另一方面中，本发明提供治疗受试者内的疾病的方法，其中所述疾病与Wnt信号传递活化相关，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的Wnt结合剂。
在另一方面中，本发明提供治疗受试者中的病症的方法，其中所述病症的特征为干细胞和/或祖细胞的水平提高，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的Wnt结合剂。
在本文提供的上述方面以及其它方面中每一方面的某些实施方案中，所述Wnt结合剂为一种多肽。在某些实施方案中，所述药剂为一种可溶性受体。
在本文提供的上述方面以及其它方面中每一方面的某些实施方案中，所述药剂包含结合一种或多种Wnt蛋白的FZD受体的Fri结构域，或FZDFri结构域的片段。在某些实施方案中，所述FZD受体为人FZD受体。例如，所述Fri结构域可能来自一人FZD4或人FZD5。在某些替代实施方案中，所述药剂为可包含结合一种或多种Wnt蛋白的人FZD8受体的Fri结构域或所述Fri结构域的片段。在某些实施方案中，所述Wnt结合剂为一种可溶性FZD受体。在替代实施方案中，所述Wnt结合剂不包含FZD受体的Fri结构域。
在本文提供的上述方面以及其它方面中每一方面的某些实施方案中，所述药剂包含结合一种或多Wnt蛋白的可溶性Frizzled相关蛋白(SFRP)的结构域，或SFRPFri结构域的片段。在某些实施方案中，所述SFRP为人SFRP。
在本文提供的上述方面以及其它方面中每一方面的某些实施方案中，所述药剂包含结合一种或多种Wnt蛋白的Ror蛋白的Fri结构域，或RorFri结构域的片段。在某些实施方案中，所述Ror蛋白为人Ror蛋白。
在本文提供的上述方面以及其它方面中每一方面的某些实施方案中，所述药剂进一步包含人Fc区。在某些实施方案中，所述Wnt结合剂为一种融合蛋白。在某些实施方案中，所述Wnt结合剂包含SEQIDNO:1。在某些实施方案中，所述Wnt结合剂包含SEQIDNO:46。在某些实施方案中，所述Wnt结合剂包含SEQIDNO:48。在某些实施方案中，所述Wnt结合剂包含SEQIDNO:50。在某些实施方案中，所述Wnt结合剂包含SEQIDNO:53。在一些实施方案中，所述Wnt结合剂（信号序列裂解前）包含SEQIDNO:50和选自以下组成的组的信号序列：SEQIDNO:67、SEQIDNO:68、SEQIDNO:69、SEQIDNO:70、SEQIDNO:71、SEQIDNO:72、SEQIDNO:73和SEQIDNO:74。在一些实施方案中，所述Wnt结合剂（信号序列裂解前）包含SEQIDNO:50和选自以下组成的组的信号序列：SEQIDNO:70、SEQIDNO:71、SEQIDNO:72、SEQIDNO:73和SEQIDNO:74。在一些实施方案中，所述Wnt结合剂（信号序列裂解前）包含SEQIDNO:50和SEQIDNO:71。在一些实施方案中，所述Wnt结合剂（信号序列裂解前)包含SEQIDNO:53和选自以下组成的组的信号序列：SEQIDNO:67、SEQIDNO:68、SEQIDNO:69、SEQIDNO:70、SEQIDNO:71、SEQIDNO:72、SEQIDNO:73和SEQIDNO:74。在一些实施方案中，所述Wnt结合剂（信号序列裂解前）包含SEQIDNO:53和选自以下组成的组的信号序列：SEQIDNO:70、SEQIDNO:71、SEQIDNO:72、SEQIDNO:73和SEQIDNO:74。在一些实施方案中，所述Wnt结合剂（信号序列裂解前)包含SEQIDNO:53和SEQIDNO:71。
在本文提供的上述方面以及其它方面中每一方面的某些实施方案中，所述Wnt结合剂结合一种或多种、两或更多种、三种或更多种、或四种或更多种选自由以下组成的组的人Wnt蛋白：Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt10a和Wnt10b。在某些实施方案中，所述药剂结合Wnt1、Wnt2、Wnt3、Wnt3a和Wnt7b。
在本文提供的上述方面以及其它方面中每一方面的某些实施方案中，所述药剂为Wnt拮抗剂。在某些实施方案中，所述药剂抑制Wnt信号传递。在某些实施方案中，所述药剂抑制Wnt典型的Wnt信号传递。
在本文提供的上述方面以及其它方面中每一方面的某些实施方案中，所述肿瘤或癌症为选自由以下组成的组的肿瘤/癌症：结肠直肠肿瘤/癌症、胰脏肿瘤/癌症、肺肿瘤/癌症、卵巢肿瘤/癌症、肝肿瘤/癌症、乳房肿瘤/癌症、肾脏肿瘤/癌症、前列腺肿瘤/癌症、胃肠瘤/癌症、黑素瘤、子宫颈肿瘤/癌症、膀胱肿瘤/癌症、胶质母细胞瘤和头颈部肿瘤/癌症。
在本文提供的上述方面以及其它方面中每一方面的某些实施方案中，所述方法进一步包括将肿瘤与第二治疗剂接触，或向受试者施用第二治疗剂。在某些实施方案中，所述第二治疗剂为一种化学治疗剂。在某些实施方案中，所述第二化学治疗剂为一种抗代谢物（例如，吉西他滨(gemcitabine)）或抗有丝分裂剂（例如，紫杉烷，诸如太平洋紫杉醇）。
在另一方面中，本发明提供包含选自由以下组成的组的序列的多肽：SEQIDNO:1、SEQIDNO:45、SEQIDNO:46、SEQIDNO:47、SEQIDNO:48、SEQIDNO:49、SEQIDNO:50、SEQIDNO:51、SEQIDNO:53、SEQIDNO:54、SEQIDNO:55、SEQIDNO:65和SEQIDNO:66，以及制造多肽的细胞和包含所述多肽的组合物。还提供包含所述多肽和药学上可接受的载体的药物组合物。此外，本发明还提供包含编码以下的多肽的多核苷酸的多核苷酸：SEQIDNO:1、SEQIDNO:45、SEQIDNO:46、SEQIDNO:47、SEQIDNO:48、SEQIDNO:49、SEQIDNO:50、SEQIDNO:51、SEQIDNO:53、SEQIDNO:54、SEQIDNO:55、SEQIDNO:65和SEQIDNO:66，或具有SEQIDNO:2的序列的多肽。本发明同样提供包含所述多核苷酸的载体和细胞。
在另一方面，本发明提供筛选药剂的抗肿瘤活性和/或抗癌干细胞之活性的方法。在某些实施方案中，所述方法包括将已暴露于一种药剂的第一实体肿瘤（例如，一种包含癌干细胞的实体肿瘤）中的一种或多种分化标记和/或一种或多种干细胞性标记的水平与尚未暴露于所述药剂的第二实体肿瘤中的一种或多种分化标记的水平相比较。在一些实施方案中，所述方法包括：(a)使第一实体肿瘤暴露于所述药剂，但第二实体肿瘤则不暴露；(b)评估在第一和第二实体肿瘤中的一种或多种分化标记和/或一种或多种干细胞性标记的水平；及(c)将第一实体肿瘤中的一种或多种分化标记的水平与第二实体肿瘤中的一种或多种分化标记的水平相比较。在某些实施方案中，(a)所述第一实体肿瘤中的一种或多种分化标记相对于所述第二实体肿瘤所增加的水平表示所述药剂的抗肿瘤或抗癌干细胞活性；和/或(b)所述一种或多种干细胞标记相对于所述第二实体肿瘤所降低的水平表示所述药剂的抗肿瘤或抗癌干细胞活性。在某些实施方案中，所述药剂结合一种或多种Wnt蛋白。在某些实施方案中，所述药剂为可溶性FZD受体。在某些替代实施方案中，所述药剂为一种抗体，诸如抗FZD或抗Wnt杭体。在某些替代实施方案中，所述药剂为小分子。
根据马库西(Markush)组或其它替代分组法描述本发明的观点或实施方案时，本发明不仅包含作为一个整体的上列全部组，还单独地包含所述组的各成员以及所述主要组的所有可能的子组，还有缺少一个或多个组成员的主要组。本发明也设想明确排除一个或多个本发明要求保护的任何组的成员。
附图简述
图1.大鼠中的FZD8-Fc(54F03)的药物动力学。施用单剂量(10mg/kg)的FZD8-Fc后评估FZDS-Fc的药物动力学性质。在施用后1、24、48、72、96、168、240和336小时测定FZD8-Fc的血清浓度。
图2.通过FZD8-Fc(54F03)治疗来抑制PN4胰脏肿瘤增长。将PN4胰脏肿瘤细胞皮下注射到NOD/SCID小鼠中。用FZD8-Fc(-▲-)、吉西他滨(-■-)、FZD8-Fc与吉西他滨的组合(-▲-)或对照抗体(-●-)治疗小鼠。显示的数据为治疗后几天的肿瘤体积(mm3)。
图3.用FZD8-Fc(54F03)治疗后PN4肿瘤中的CD44hi细胞群体减少。将用对照抗体、FZD8-Fc、吉西他滨或FZD8-Fc与吉西他滨的组合治疗的肿瘤细胞表面染色来检测ESA和CD44。对每一治疗组来说，在染色前汇集来自五个肿瘤的单一细胞混悬液。
图4.经过FZD8-Fc(54F03)治疗的PN4胰脏肿瘤的体内限数稀释分析。
图5.用FZD8-Fc(54F03)治疗的PN4胰脏肿瘤中细胞分化增加。用阿尔新蓝(alcianblue)将经过对照抗体、FZD8-Fc、吉西他滨或FZD8-Fc与吉西他滨的组合治疗的PN4肿瘤的石蜡切片染色以便检测表达粘蛋白的细胞。
图6.用FZD8-Fc(54F03)治疗的PN8胰脏肿瘤中细胞分化增加。用阿尔新蓝将经过对照抗体、FZD8-Fc、吉西他滨或FZD8-Fc与吉西他滨的组合治疗的PN8肿瘤的石蜡切片染色以便检测表达粘蛋白的细胞。
图7.用FZD8-Fc(54F03)治疗后PN13胰脏肿瘤中细胞分化增加而增殖减少。用阿尔新蓝将经过对照抗体或FZD8-Fc治疗的PN13肿瘤的石蜡切片染色以便检测表达粘蛋白的细胞。此外，将切片染色以检测Ki67(一种活跃地增殖细胞的标记）。
图8.用FZD8-Fc(54F03)治疗后PN13胰脏肿瘤中Muc16染色增加。将经过对照抗体或FZD8-Fc治疗的PN13肿瘤的石蜡切片染色以便检测Muc16蛋白。
图9.用FZD8-Fc(54F03)治疗后PN13胰脏肿瘤中CK20染色增加。将经过对照抗体或FZD8-Fc治疗的PN13肿瘤的石蜡切片染色以便检测CK20蛋白。
图10.以用FZD8-Fc(54F03)与太平洋紫杉醇的组合治疗后PE13乳房肿瘤生长受抑制。将PE13乳房肿瘤细胞皮下注射到NOD/SCID小鼠中。用对照抗体(-●-)、FZD8-Fc(-●-)、太平洋紫杉醇(-▲-)或FZD8-Fc与太平洋紫杉醇的组合(-○-)治疗小鼠。数据显示治疗后几天的肿瘤体积(mm3)。
图11.FZD8-Fc(54F03)以剂量依赖方式抑制C28结肠肿瘤生长。将C28结肠肿瘤细胞皮下注射到NOD/SCID小鼠中。用FZD8-Fc1.5mg/kg，每周两次(-▲-)，5mg/kg，每周一次(-▼-)，5mg/kg，每周两次(-○-)，15mg/kg，每周一次(-□-)或15mg/kg，每周两次(-△-)或对照抗体(-■-)治疗小鼠。数据显示治疗后数天的肿瘤体积(mm3)（图11A）。用FZD8-Fc与伊立替康(irinotecan)的组合抑制结肠肿瘤生长。用FZD8-Fc(-▲-)、依立替康(-▼-)、FZDS-Fc与依立替康的组合(-●-)或对照抗体(-■-)治疗小鼠。数据显示治疗后数天的肿瘤体积(mm3)（图11B）。
图12用FZD8-Fc(54F03)治疗后C28肿瘤中CK20染色增加。将经过对照抗体或FZD8-Fc治疗的C28肿瘤的石蜡切片染色以便检测CK20蛋白。
图13.用FZD8-Fc(54F03)治疗后PN21胰脏肿瘤生长受抑制并且癌干细胞发生频率降低。将PN21胰脏肿瘤细胞皮下注射到NOD/SCID小鼠中。用FZD8-Fc(-▼-)、吉西他滨(-▲-)、FZDS-Fc与吉西他滨的组合(-■-)或对照抗体(-●-)治疗小鼠。数据显示治疗后数天的肿瘤体积(mm3)（图13A）。经过FZD8-Fc治疗的PN21胰脏肿瘤的体内限数稀释分析（图13B）。
图14.用FZD8-Fc(54F03)治疗后PN21胰脏肿瘤中细胞分化增加。用阿尔新蓝将经过对照抗体或FZD8-Fc治疗的PN21肿瘤的石蜡切片染色以便检测粘蛋白。
图15.用FZD8-Fc(54F03)治疗后PN21胰脏肿瘤中细胞分化增加而增殖减少。用阿尔新蓝将经过对照抗体、FZD8-Fc、吉西他滨或FZD8-Fc与吉西他滨的组合治疗的PN21肿瘤的石蜡切片染色以便检测粘蛋白。此外，将切片染色以检测Ki67（一种活跃地增殖细胞的标记）。
图16.猴体内FZD8-Fc变异体的药物动力学。施用单一剂量(30mg/kg)的FZD8-Fc变异体54F15和54F16后评估变异体的药物动力学性质。在施用后的1、6、12、24、48、72、96、168、240和336小时测定54F15(-○-)和54F16(-◆-)的血清浓度。
图17.用FZD8-Fc变异体治疗后C28结肠肿瘤生长的抑制情形。将C28结肠肿瘤细胞皮下注射到NOD/SCID小鼠中。用对照抗体(-X-)、54F03(-□-)、54F09(-▲-)、54F12(-▼-)、54F13(-◆-)、54F15(-○-)或54F16(-△-)治疗小鼠。显示的数据为治疗后数天的肿瘤体积(mm3)。
图18.用FZD8-Fc变异体治疗后PN4胰脏肿瘤生长受抑制。将PN4胰脏肿瘤细胞皮下注射到NOD/SCID小鼠中。用对照抗体(-●-)、54F03(-■-)、54F09(-▼-)、54F12(-〇-)、54F13(-▲-)、54F15(-□-)或54F16(-◆-)治疗小鼠。显示的数据为治疗后数天的肿瘤体积(mm3)。
图19.用FZD8-Fc变异体54F03和54F16治疗后PN4肿瘤中CD44hi和CD44+CD201+细胞减少。将用对照抗体、FZD8-Fc变异体54F03或变异体54F16治疗的肿瘤细胞表面染色以便检测ESA、CD44和CD201并通过FACS分析。
图20.FZD8-Fc蛋白的N端特征。通过质谱仪分析FZD8-Fc变异体并显示54F16(图20A）、54F26(图20B)、54F28(图20C)、54F30(图20D)以及54F32(图20E）的结果。
图21.用FZD8-Fc变异体治疗后C28结肠肿瘤生长的抑制情形。将C28结肠肿瘤细胞皮下注射到NOD/SCID小鼠中。用对照抗体(-■-)、54F03(-△-)、54F23(-▼-)或54F26(-○-)治疗小鼠。显示的数据为治疗后数天的肿瘤体积(mm3)。
发明详述
本发明提供新型药剂，包括但不限于结合一种或多种人Wnts的包含人Frizzled(FZD)受体的Fri结构域、人分泌型Frizzled相关蛋白(SFRPs)，或Ror蛋白质的多肽。本发明还提供包含所述Wnt结合剂的相关多肽和多核苷酸、组合物以及制备Wnt结合剂的方法。本发明进一步提供使用Wnt结合剂的方法，诸如抑制肿瘤生长、治疗癌症、诱导分化以及减少致瘤性的方法。本发明也提供筛选用于鉴别具有抗肿瘤活性和/或抗癌干细胞的活性的新型Wnt结合剂药剂的方法。
制造包含人FZD8的Fri结构域及Fc结构域的Wnt结合剂，本文中称为FZD8-FC或FZD8-Fc(54F03)(实施例1)。产生多种FZD8-FC蛋白的变异体（实施例10)。制造显示出N端具有约95%或更高的同源性的FZD8-Fc蛋白（实施例16)。使用数种FZD8-FC变异体在显示出FZD8-FC变异体的半衰期至少为100小时的大鼠中进行药物动力学研究（实施例2和实施例12；图1和表4)。以FZD8-Fc变异体54F15及54F16在猴子体内进行药物动力学研究，其证明这些蛋白质具有至少100个小时的半衰期（实施例13和表5)。以单独的FZD8-Fc(54F03)或FZD8-Fc与化学治疗剂的组合治疗时显示出可减少胰脏肿瘤、乳房肿瘤和结肠肿瘤的生长（实施例3、5、6和8和图2、10、11B和13A）。此外，治疗显示出可减少胰脏模型中的CD44+细胞的百分比并降低癌干细胞的发生频率（实施例3和实施例8以及图3、4和13B）。以单独的FZD8-Fc(54F03)或FZD8-FC与化学治疗剂的组合治疗时显示出可增加胰脏肿瘤细胞及结肠肿瘤细胞的细胞分化（实施例4、7和9及图5-9、12、14和15）。以FZD8-FC变异体治疗时显示出可抑制结肠及胰脏肿瘤生长，抑制程度是取决在该变异体（实施例14、15和17及图17、18和21）。以FZD8-FC变异体54F03和变异体54F16治疗时显示出可减少胰脏肿瘤中的CD44hi细胞以及CD44+CD202+细胞的百分比（实施例15及图19）。
I.定义
如本文所用的术语“拮抗剂”包括任何部分或完全阻断、抑制或中和蛋白质（例如癌干细胞标记）的表达或生物活性的分子。阻断、抑制或中和生物活性包括但不限于抑制肿瘤生长。术语“拮抗剂”包括任何部分或完全阻断、抑制或中和Wnt途径的生物活性的分子。合适的拮抗剂分子包括但不限于天然FZD受体蛋白（包括可溶性FZD受体以及SFRPs的衍生物和Ror蛋白质的衍生物）的片段和/或氨基酸序列变异体。
“经过分离”的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物为处于自然界中不存在的形式中的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物。经过分离的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物包括那些已被纯化到一定程度使其不再为可在自然界中发现的形式。在一些实施方案中，经过分离的抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物为实质上纯的。
如本文所用的术语“实质上纯的”是指一种物质，其至少为50%纯的（即，不含污染物），优选至少为90%纯的，更优选至少为95%纯的，更优选至少为98%纯的，再更优选至少为99%纯的。
如本文所用的术语“可溶性受体”是指在所述受体的第一跨膜结构域前的受体蛋白的N端胞外片段，其可以可溶性形式从细胞分泌出。在一些实施方案中，所述受体蛋白为一种FZD受体。在一些实施方案中，所述受体蛋白为一种Ror受体。
如本文所用的术语“FZD可溶性受体”是指在所述受体的第一跨膜结构域前的人FZD受体蛋白的N端胞外片段，其可以可溶性形式从细胞分泌出。包含整个N端胞外结构域(ECD)（此处称为“FZDECD”）以及较小片段的两种FZD可溶性受体均在设想范围内。此处还公开包含Fri结构域的FZD可溶性受体（本文称为“FZDFri”）。与包含整个FZDECD的可溶性受体相比较，FZDFri可溶性受体可显示改变的生物活性（例如蛋白质半衰期增加）。蛋白质半衰期可经由以聚乙二醇(PEG)或聚氧化乙烯(PEO)共价修饰来进一步增加。FZD可溶性受体包括FZDECD或Fri结构域，其在框构内连接其它功能和结构蛋白，包括但不限于人Fc区（例如来自免疫球蛋白IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE的或IgM的人Fc)；蛋白标签（例如myc、FLAG、GST)；其它内源性蛋白或蛋白片段；或任何其它有用的蛋白质序列，包括介于FZDECD或Fri结构域与连接的蛋白质之间的任何连接子区。在某些实施方案中，FZD受体的Fri结构域是直接连接人Fc区。在某些实施方案中，所述FZD受体的Fri结构域是连接人IgG1Fc（本文称为“FZDFri.Fc"）。在一些实施方案中，FZD受体的Fri结构域是以肽连接子连接人Fc区。FZD可溶性受体也包括含有氨基酸插入、缺失、取代和/或保存性取代的变异体蛋白。
如本文所用的术语“连接子”或“连接子区”是指插入第一多肽（例如FZD组分）与第二多肽（例如Fc区)之间的连接子。在一些实施方案中，所述连接子为肽连接子。连接子不应对多肽的表达、分泌或生物活性有不利影响。优选地，连接子不具抗原性并且不引发免疫反应。
如本文所用的术语“癌症”和“癌性”是指或描述哺乳动物的生理病状，其中细胞群体的特点为细胞生长不受管控。据了解，术语癌症包含Wnt依赖性癌症。癌症的实例包括但不限在癌瘤、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病。这类癌症更特别的实例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰脏癌、胶质母细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝脏癌症、膀胱癌、肝癌、乳癌、大肠癌、结肠直肠癌、皮肤癌、黑素瘤、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾脏癌、肝癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝细胞癌症和各类头颈部癌。
术语“增生症”和“增生性疾病”是指与异常细胞增殖相关的疾病，诸如癌症。
如本文所用的术语“肿瘤”和“赘瘤”是指由过度细胞生长或增殖（无论是良性（非癌性）或恶性（癌性），包括癌前病变）产生的任何组织团块。在某些实施方案中，所述肿瘤为一种上皮细胞肿瘤。在某些实施方案中，所述肿瘤为一种Wnt依赖性肿瘤。
如本文所用的术语“受试者”是指任何动物（例如，哺乳动物），包括但不限于人、非人灵长类动物、犬、猫、啮齿动物等为特定治疗的接受者。通常，术语“受试者”和“患者”在指人类受试者时可在本文中互换使用。
如本文所用的术语“癌干细胞”和“CSC”和“肿瘤干细胞”以及“实体肿瘤干细胞”可互换使用并且是指来自以下的实体肿瘤的细胞群体：(1)具有广大的增殖能力；(2)具有不对称细胞分裂的能力以产生一种或多种具有降低的细胞增殖或发展潜力的已分化后代；以及(3)具有自我更新或自我维护的对称细胞分裂的能力。与大多数无法形成肿瘤的肿瘤细胞相比较，这些“癌干细胞”、“CSCs”、“肿瘤干细胞”或“实体肿瘤干细胞”的性质赋予那些癌干细胞在系列移植入免疫功能低下的宿主(例如小鼠）中时形成可触知的肿瘤的能力。相对在以杂乱无章的方式分化，癌干细胞进行自我更新以当突变发生时形成具有可随时间改变的异常细胞类型的肿瘤。
“癌症细胞”和“肿瘤细胞”以及语法等义词是指源自肿瘤的总细胞群体，包括其中包含大量肿瘤细胞群体的非致瘤细胞和致瘤干细胞（本文也称为癌干细胞）。
术语“致瘤的”是指实体肿瘤干细胞的功能特性，包括自我更新（产生额外的致瘤性癌干细胞）和增殖以产生所有其它可使实体肿瘤干细胞形成肿瘤的肿瘤细胞（引起分化，因而为非致瘤肿瘤细胞）等性质。与非致瘤性肿瘤细胞相比较（其在系列移植时无法形成肿瘤），这些自我更新和增殖以生成所有其它肿瘤细胞的性质赋予癌干细胞在系列移植到免疫功能低下的宿主（例如小鼠）时形成可触知的肿瘤的能力。据观察，自实体肿瘤取得肿瘤细胞后，非致瘤性肿瘤细胞可在初次移植入免疫功能低下的宿主（例如，小鼠）时形成肿瘤，但那些非致瘤性肿瘤在系列移植时不会产生肿瘤。
如本文所用的术语“可接受的药学载体”或“药学上可接受的载体”是指当与药物组合物的活性成分，诸如治疗性多肽结合时允许所述治疗性多肽（例如）保留其生物活性的任何物质。此外，“可接受的药学载体”不会引发接受的受试者的免疫反应。在一些实施方案中，“药学载剂”可与“药学载体”互换使用。实例包括但不限于任何标准的药学载体，诸如磷酸盐缓冲的盐溶液、水和各种油/水乳剂。用在气溶胶或胃肠道外施用的稀释剂的实例为磷酸盐缓冲的生理盐水或生理(0.9%)盐水。
术语“治疗有效量”是指可有效“治疗”受试者或哺乳动物中的疾病或病症的药剂（例如，可溶性受体或其它药物）的量。在癌症的情况中，所述药剂（例如可溶性受体）的治疗有效量可减少癌症细胞的数量；降低肿瘤的大小；降低癌干细胞的发生频率；抑制和/或停止癌症细胞浸润到周围器官；抑制和/或停止肿瘤转移；抑制和/或停止肿瘤生长；和/或缓解一种或多种与癌症相关的症状至一定程度。所述药剂（例如，可溶性受体）防止现存癌细胞生长和/或杀死现存癌细胞的程度可称为抑制细胞生长和/或细胞毒性。
如本文所用的术语“抑制肿瘤生长”是指任何可抑制肿瘤细胞生长的机制。在某些实施方案中，肿瘤细胞的生长是经由减缓肿瘤细胞增殖而受抑制。在某些实施方案中，肿瘤细胞的生长是经由停止肿瘤细胞增殖而受抑制。在某些实施方案中，肿瘤细胞的生长是经由杀死肿瘤细胞而受抑制。在某些实施方案中，肿瘤细胞的生长是经由诱导肿瘤细胞凋亡而受到抑制。在某些实施方案中，肿瘤细胞的生长是经由诱导肿瘤细胞分化而受抑制。在某些实施方案中，肿瘤细胞的生长是经由剥夺肿瘤细胞的营养而受抑制。在某些实施方案中，肿瘤细胞的生长是经由防止肿瘤细胞迁移而受抑制。在某些实施方案中，肿瘤细胞的生长是经由防止肿瘤细胞入侵而受抑制。
诸如“治疗(treating/treatmet/totreat)”和“缓解(alleviating/toalleviate)”的术语是指下列两个意思：1)治愈、减缓、减轻诊断的病理学病状或病症的症状和/或停止诊断的病理学病状或病症进展的治疗措施，和2)预防或减缓针对的病理学病状或病症的发展的预防或防止措施。因此，需要治疗的患者包括那些已患有所述病症的患者；那些容易患有所述病症的患者；以及那些希望预防所述病症的患者。在某些实施方案中，如果所述患者显示出一种或多种下列情况，那么所述受试者的癌症被成功地根据本发明的方法“治疗”：癌症或肿瘤细胞的数量减少，或完全不存在；肿瘤尺寸减小；抑制或未出现癌症或肿瘤细胞浸润到周边器官，包括例如癌症扩散到软组织和骨头；抑制或未出现肿瘤转移；抑制或未出现肿瘤或癌症生长；与特定癌症相关的一种或多种症状减轻；发病率和死亡率降低；生活品质改善；致瘤性、致瘤性发生频率或肿瘤的致瘤能力减少；肿瘤中癌干细胞的数量或发生频率减少；致瘤性细胞分化成非致瘤性状态；或这些效果的一些组合。
如本文所用的术语“多核苷酸”和“核酸”是指由数个经由磷酸二酯键链接的核苷酸单位（核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或相关的结构变异体）所组成的聚合物，包括但不限于DNA或RNA。这个术语涵盖包含任何具有已知的DNA和RNA碱基类似物的序列，包括但不限于：4-乙酰胞嘧啶、8-羟基-N6-甲基腺苷、氮丙啶胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-(羧羟基-甲基）尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧甲基胺甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧甲基-胺甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基-氨基-甲基-2-硫尿嘧啶、βD-甘露糖基Q核苷(queosine)、5'-甲氧羰基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基醋酸甲酯、尿嘧啶-5-氧基醋酸、氧基丁氧核苷(butoxosine)、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、N-尿嘧啶-5-氧基醋酸甲酯、尿嘧啶-5-氧基醋酸、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫胞嘧啶及2,6-二氨基嘌呤。所述核苷酸的序列可由非核苷酸组分打断。多核苷酸可在聚合化后被进一步修饰，诸如与标签组分共轭结合。其它类型的修改包括例如“封端以类似物取代一种或多种天然产生的核苷酸；核苷酸间修改，诸如不带电荷的键联（例如膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酸酰胺化物、氨基甲酸酯等）和带电键联（例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)；悬挂部分，诸如蛋白质（例如，核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚-L-赖氨酸等）；嵌入物（例如吖啶、补骨脂内酯等）；螯合物（例如金属、放射活性金属、硼、氧化金属等）；烷化剂；修饰的键联（例如，α异位性核酸等）；以及未经过修饰的多核苷酸形式。此外，任何通常存在于糖中的羟基均可由例如膦酸基、磷酸基所取代，用标准的保护基保护，或经过活化来制备对额外核苷酸的额外键联，或可共轭结合固相支撑物。5'和3'端OH可被磷酸化或由胺或具有1至20个碳的有机封端基团部分所取代。其它羟基也可衍生成标准保护基。多核苷酸还可含有本领域中众所周知的类似形式的核糖或脱氧核糖，包括（例如）2’-O-甲基-、2'-O-烯丙基、2'-氟或2’-叠氮基-核糖、碳环糖类似物、α-异位糖、差向异构糖类，诸如阿拉伯糖、木糖或来苏糖(lyxoses)、吡喃糖、呋喃糖、庚酮糖(heptuloses)、无环类似物和无碱基核苷类似物，诸如甲基核糖苷。一个或多个磷酸二酯键联可由替代键联基团来取代。这些替代键联基团包括但不限于其中磷酸化物由P(O)S（“硫代酸酯”）、P(S)S（“二硫代酸酯”）、(O)NR2（“酰胺化物”）、P(O)R、P(O)OR'、CO或CH2（“甲缩醛”）所取代的实施方案，其中各个R或R'是独立地由H、或取代或未取代的烷基(1-20C)，其可选择地含有醚(--O--)键联、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳烷基。并非需要所有在多核苷酸中的键联均相同。
如本文所用的术语“载体”是指将DNA段从一个细胞转移至另一个细胞的核酸分子。术语“载体”是指一种构建物，其可递送并优选表达一种或多种对宿主细胞重要的基因或序列。载体的实例包括但不限于病毒载体、裸DNA或RNA表达载体、质粒、噬菌质粒、粘性质粒或噬菌体载体、与阳离子性冷凝剂相关的DNA或RNA表达载体，以及囊封在脂质体中的DNA或RNA表达载体。
如本文所用的术语“多肽”和“肽”以及“蛋白质”和“蛋白质片段”等可互换使用以指任何长度的氨基酸残基的聚合物。这些术语适用于其中所述聚合物中的一个或多个氨基酸残基为对应的天然氨基酸的人造化学模拟物的氨基酸聚合物，并且术语还适用于天然氨基酸聚合物和非天然氨基酸聚合物。所述聚合物可为直链型或分支型，其可包含经过修饰的氨基酸，并且其可由非氨基酸中断。这些术语也包含已经过天然或介入方式修饰的氨基酸聚合物；这些修饰方式，为例如形成二硫键、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化，或任何其它操作或修饰，诸如与标记组分共轭结合。定义还包括（例如）含有一种或多种氨基酸类似物（包括，例如非天然氨基酸，等）以及本领域已知的其它修饰的多肽。据了解，由于本发明的多肽是以抗体为基础（至少部分），在某些实施方案中，所述多肽可能以单链或联结链的形式出现。
“氨基酸”一词是指天然和合成氨基酸，以及功能类似在天然氨基酸的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然氨基酸为由遗传密码编码，以及那些稍后被修饰的氨基酸，例如，羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸酯和邻磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然氨基酸相同的基础化学结构（例如，结合氢的α碳、羧基、氨基和R基的化合物），例如，丝氨酸、正白氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这类的类似物可具有经过修饰的R基（例如正白氨酸）或经过修改的肽骨架，但保留与天然氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构，但功能类似于天然氨基酸的化学化合物。
多肽或其它药剂“特异结合”一种蛋白质是指与替代物质（包括不相关的蛋白质）相比较，所述多肽或其它药剂更频繁地、更迅速地、持续更久地、亲和力更强地，或以上述各项的一些组合的方式与所述蛋白质反应或结合。在某些实施方案中，“特异结合”是指（例如）一种药剂以约0.1mM或更小，但更常为小于约1μM的KD结合一种蛋白质。在某些实施方案中，“特异结合”是指一种药剂通常以至少约0.01μM或更小，至少约0.01μM或更小，并且其它时间以至少约1nM或更小的KD结合一种蛋白质。由在不同物种中的同源蛋白间的序列一致性，特异结合可包括能辨识超过一种物种中的特定蛋白质（诸如Wnt蛋白）的药剂。同样地，由在不同Wnt蛋白在Wnts序列的某些区中的同源性，特异结合可包括能辨识超过一种Wnt蛋白的多肽（或其它药剂）。据了解，特异结合第一个标靶的药剂可能会或可能不会特异结合第二个标靶。因此，“特异结合”并不一定需要（虽然可包括）唯一结合，即，结合单一标靶。因此，在某些实施方案中，药剂可能特异结合超过一个目标（例如多种不同的人Wnts)。一般而言，但不一定，提及的结合意指特异性结合。
在两种或更多种核酸或多肽的情形下，“一致”或“一致性百分比”是指当比较和对准（如果必要时，引进沟隙）最大一致性时，在不考虑任何保存性氨基酸替代为序列一致性的一部分下，两个或更多个序列或子序列彼此相同或具有特定百分比的核苷酸或氨基酸残基彼此相同。一致性百分比可使用序列比较软件或演算法或通过目视检查测量。可用于对准氨基酸或核苷酸序列的各种演算法和软件是本领域已知的。一种这类序列对准演算法的非限制性实例为描述于Karlin等,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.,87:2264-2268中的演算法，在Karlin等,1993，PNAS90;5873-5877中有所修改并被并入NBLAST和XBLAST程序中（Altschul等1991,NucleicAcidsRes.,25:3389-3402)。其它可用于对准序列的可公开取得的软件程序包括但不限于GappedBLAST、BLAST-2、WU-BLAST-2（Altschul等，1991,MethodsinEnzymology,266:460-480)、ALIGN、ALIGN-2（加州南旧金山，Genentech公司）、Megalign(DNASTAR)及Bestfit程序（威斯康辛序列分析包，Unix第8版，遗传学电脑集团(GeneticsComputerGroup)，威斯康辛州，麦迪逻市，UniversityResearchPark,575ScienceDrive,Madison,WI53711)。
在一些实施方案中，当使用序列比较演算法或通过目视检查来测量时，本发明的两个核酸或多肽实质上相同，意思是其具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%并且在一些实施方案中，具有至少95%、96%、97%、98%、99%的核苷酸或氨基酸残基一致性。在一些实施方案中，一致性出现在长度为至少约10、至少约20、至少约40-60、至少约60-80或介于其间的整数的残基的序列区中。在某些实施方案中，一致性是出现在超过60-80个残基长的较长区域（诸如至少约90-100残基）中。在一些实施方案中，在相比较的序列的全长（诸如核苷酸序列的编码区）中，所述序列实质上一致。
“保存性氨基酸取代”为其中一个氨基酸残基由另一个具有类似侧链的氨基酸残基替换。具有类似侧链的氨基酸残基族群已在本领域中鉴别出，包括碱性侧链（例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸）、酸性侧链（例如，天门冬氨酸、谷氨酸）、不带电荷的极性侧链（例如，甘氨酸、天门冬酰胺、谷酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸）、非极性侧链（例如，丙氨酸、缬氨酸、白氨酸、异白氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸）、β-支链型侧链（例如，苏氨酸、缬氨酸、异白氨酸）和芳香族侧链（例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸）。例如苯丙氨酸取代酪氨酸为一种保存性取代。优选地，多肽序列中的保存性取代和本发明的其它药剂不会终止含有所述氨基酸序列的多肽结合标靶（即，所述多肽或其它药剂结合的一种或多种Wnts)。鉴别不排除标靶结合的核苷酸和氨基酸保存性取代的方法为本领域所众所周知的（参见，例如Brummell等,1993,Biochem.,32:1180-87；Kobayashi等,1999,ProteinEng.12:879-84；和Burks等,1997PNAS,94:412-17)。
如本文所用的术语“约”是指所指明的数字加或减10%。例如，“约10%”指明9%至11%的范围。
除非另有明确规定，本公开内容和权利要求书中所使用的单数形式“一(a/an)”和“所述(the)”包括复数形式。
要了解，凡是本文中以措辞“包含”描述的实施方案也提供以“由...组成”和/或“主要由...组成”等术语描述的类似实施方案。
如短语中使用的“和/或”，诸如“A和/或B”中，意指同时包括A和B；A或B；A（单独）和B（单独）。同样地，如短语中使用的“和/或”，诸如“A、B和/或C”，是意图涵盖以下每一实施方案：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A（单独）；B（单独）和C（单独）。
II.Wnt结合剂
本发明提供结合（例如特异结合）一种或多种人Wnt蛋白(Wnts)的药剂。这些药剂在本文中称为“Wnt结合剂”。在某些实施方案中，所述药剂特异结合一个、二个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个Wnt蛋白。以非限制性实例说明，所述Wnt结合剂可能结合Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt10a和/或Wnt10b。在某些实施方案中，所述Wnt结合剂结合Wnt1、Wnt2、Wnt3、Wnt3a和Wnt7b。
在某些实施方案中，所述Wnt结合剂为一种Wnt拮抗剂。在某些实施方案中，所述药剂抑制Wnt信号传递。在一些实施方案中，所述药剂抑制典型的Wnt信号传递。
在某些实施方案中，所述Wnt结合剂为一种多肽。在某些实施方案中，所述Wnt结合剂为一种可溶性受体。
在某些实施方案中，所述Wnt结合剂包含FZD受体的胞外结构域。在一些实施方案中，所述Wnt结合剂包含FZD受体的Fri结构域。在某些实施方案中，所述FZD受体为一种人FZD受体。在某些实施方案中，所述人FZD受体为FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9或FZD10。在一些替代实施方案中，所述Wnt结合剂包含一部分SFRP。在一些实施方案中，所述Wnt结合剂包含SFRP的Fri结构域。在某些实施方案中，所述SFRP为人SFRP。在一些实施方案中，所述人SFRP为SFRP1、SFRP2、SFRP3、SFRP4或SFRP5。在其它替代实施方案中，所述Wnt结合剂包含Ror蛋白的胞外结构域。在一些实施方案中，所述Wnt结合剂包含Ror蛋白的Fri结构域。在某些实施方案中，所述Ror为人Ror。在一些实施方案中，所述人Ror为Ror1或Ror2。
在某些实施方案中，所述Wnt结合剂为一种可溶性受体。在一些实施方案中，所述Wnt结合剂为一种可溶性蛋白。在某些实施方案中，所述Wnt结合剂为一种可溶性FZD受体。可溶性FZD受体的非限制性实例可在美国专利第7,723,477号中找到，其全部内容以引用的方式并入本文。在某些实施方案中，所述Wnt结合剂为可溶性SFRP或可溶性Ror受体。
FZD1的Fri结构域包括SEQIDNO:27的约氨基酸87-237。FZD2的Fri结构域包含SEQIDNO:28的约氨基酸24-159。FZD3的Fri结构域包括SEQIDNO:29的约氨基酸23-143。FZD4的Fri结构域包括SEQIDNO:22的约氨基酸40-170。FZD5的Fri结构域包括SEQIDNO:23的约氨基酸27-157。FZD6的Fri结构域包括SEQIDNO:24的约氨基酸19-146。FZD7的Fri结构域包括SEQIDNO:25的约氨基酸33-170。FZD8的Fri结构域包括SEQIDNO:30的约氨基酸28-158。FZD9的Fri结构域包括SEQIDNO:31的约氨基酸23-159。FZD10的Fri结构域包括SEQIDNO:26的约氨基酸21-154。每一人FZD受体的相对应、预测的Fri结构域序列是以SEQIDNO:32-41提供。每一人FZD受体(FZD1-10)的最小、核心Fri结构域序列是以SEQIDNO:3-12提供。每一人SFRPs(SFRP1-5)的最小、核心Fri结构域序列是以SEQIDNO:13-17提供。人Rorl和Ror2的最小、核心Fri结构域序列是以SEQIDNO:58和SEQIDNO:59提供。本领域技术人员对与每一个Fri结构域对应的确切氨基酸可能会有不同的理解。因此，以上和此处概述的结构域的N端或C端可延长或缩短1、2、3、4、5、6、7、8、9或甚至10个氨基酸。
在某些实施方案中，所述Wnt结合剂包含结合一种或多种人Wnt蛋白的人FZD受体的Fri结构域或所述Fri结构域的片段或变异体。在某些实施方案中，所述人FZD受体为FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9或FZD10。在某些实施方案中，所述人FZD受体为FZD4。在某些替代实施方案中，所述人FZD受体为FZD5。在某些其它替代实施方案中，所述人FZD受体为FZD8。在某些实施方案中，所述FZD为FZD4并且所述Wnt结合剂包含SEQIDNO:6或包含SEQIDNO:19的约氨基酸40至170。在某些实施方案中，所述FZD为FZD5并且所述Wnt结合剂包含SEQIDNO:7或包含SEQIDNO:20的约氨基酸27-157。在某些实施方案中，所述FZD为FZD7并且所述Wnt结合剂包含SEQIDNO:9或包含SEQIDNO:25的约氨基酸33至170。在某些实施方案中，所述FZD为FZD8并且所述Wnt结合剂包含SEQIDNO:10或包含SEQIDNO:21的约氨基酸28-158。在某些实施方案中，所述FZD为FZD10并且所述Wnt结合剂包含SEQIDNO:12或包含SEQIDNO:26的约氨基酸21-154。
在某些实施方案中，所述Wnt结合剂包含选自由SEQIDNO:3-12组成的组的最小Fri结构域序列。在某些实施方案中，所述Wnt结合剂包含选自由SEQIDNO:13-17组成的组的最小Fri结构域序列。在某些实施方案中，所述Wnt结合剂包含选自由SEQIDNO:58和SEQIDNO:59组成的组的最小Fri结构域序列。
在某些实施方案中，所述Wnt结合剂包含任一前述FZDFri结构域序列的变异体，所述变异体含有一个或多个（例如一个、二个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个等）保存性取代并且能够结合Wnt。
在某些替代实施方案中，所述Wnt结合剂包含人SFRP的Fri结构域，或结合一种或多种人Wnt蛋白的这类Fri结构域的片段或变异体。例如，在某些实施方案中，所述药剂包含选自由SEQIDNO:13-17组成的组的最小SFRPFri结构域序列。在某些实施方案中，所述Wnt结合剂包含任一前述SFRPFri结构域序列的变异体，所述变异体含有一个或多个（例如一个、二个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个等）保存性取代并且保持结合Wnt的能力。
在某些替代实施方案中，所述Wnt结合剂包含人Ror蛋白的Fri结构域，或结合一种或多种人Wnt蛋白的Fri结构域的片段或变异体。例如，在某些实施方案中，所述药剂包含选自由SEQIDNO:58和SEQIDNO:59组成的组的最小RorFri结构域序列。在某些实施方案中，所述Wnt结合剂包含任一前述RorFri结构域序列的变异体，所述变异体含有一个或多个（例如一个、二个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个等）保存性取代并且保持结合Wnt的能力。
在某些实施方案中，所述Wnt结合剂（诸如包含人FZD受体或其它可溶性FZD受体的药剂的最小Fri结构域）进一步包含人Fc区（例如人IgG1Fc区）。所述Fc区可从任何类别的免疫球蛋白，IgG、IgA、IgM、IgD和IgE取得。在一些实施方案中，所述Fc区为野生型Fc区。在一些实施方案中，所述Fc区为突变的Fc区。在一些实施方案中，所述Fc区是在N端由1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸（例如，在绞链区）截断。在一些实施方案中，绞链区中的一个氨基酸被改变以阻挡形成不良的二硫键。在一些实施方案中，半胱氨酸由丝氨酸取代以阻挡形成不良的二硫键。在某些实施方案中，所述Fc区包含SEQIDNO:18、SEQIDNO:42或SEQIDNO:43，或是由SEQIDNO:18、SEQIDNO:42或SEQIDNO:43组成。
在某些实施方案中，Wnt结合剂为包含至少一种FZD受体、SFRP或Ror蛋白和Fc区的最小Fri结构域的融合蛋白。如本文所用的“融合蛋白”为一种由核酸分子表达的杂交蛋白，所述核酸分子包含具有至少两个基因的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述第一多肽的C末端是连接所述免疫球蛋白Fc区的N端。在一些实施方案中，所述第一多肽（例如，FZDFri结构域）是直接连接Fc区（即，无插入的肽连接子）。在一些实施方案中，所述第一多肽是经由肽连接子连接Fc区。
如本文所用的术语“连接子”是指插入第一多肽（例如，FZD组分）和第二多肽（例如，Fc区）之间的连接子。在一些实施方案中，所述连接子为肽连接子。连接子不应对多肽的表达、分泌或生物活性有不利的影响。连接子不应有抗原性并且不应该引起免疫反应。本领域技术人员已知合适的连接子，其通常包括甘氨酸和丝氨酸残基的混合物，并且通常包括立体上未被遮蔽的氨基酸。可被纳入有用的连接子中的其它氨基酸包括苏氨酸和丙氨酸残基。连接子的长度可在（例如）1-50个氨基酸、1-22个氨基酸、1-10个氨基酸、1-5个氨基酸或1-3个氨基酸的范围内。连接子可包括但不限于SerGly、GGSG、GSGS、GGGS、S(GGS)n（其中n为1-7）、GRA、聚(Gly)、聚(Ala)、ESGGGGVT(SEQIDNO:60)、LESGGGGVT(SEQIDNO：61)、GRAQVT(SEQIDNO:62)、WRAQVT(SEQIDNO:63)和ARGRAQVT(SEQIDNO:64)。如本文所用的连接子为一种不包括来自第一多肽（例如，FZDFri结构域）的C端或第二多肽（例如Fc区）的N端的氨基酸残基的插入肽序列。
FZD受体、SFRPs和Ror蛋白含有指导蛋白质运送的信号序列。信号序列（又称为信号肽或前导序列）是位于新生多肽的N端。信号序列将多肽靶向内质网并将蛋白质归类到其目标位置，例如到达细胞器的内部空间、到内膜、到细胞外膜，或经由分泌到达细胞外。大多数信号序列是在蛋白质被运送到内质网后通过信号肽酶从蛋白质分裂出来。信号序列从多肽裂解通常是发生在氨基酸序列中的特定部位并且是取决于信号序列中的氨基酸残基。虽然通常具有一个特定裂解位点，信号肽酶可能辨识和/或使用超过一个裂解位点，而产生异源多肽N端。例如，使用信号序列内的不同裂解位点可能产生具有不同N端氨基酸的多肽。因此，在一些实施方案中，本文所述的多肽可能包含具有不同N端的多肽的混合物。在一些实施方案中，所述N端的长度相差1、2、3、4或5个氨基酸。在一些实施方案中，所述多肽实质上同质，即，所述多肽具有相同的N端。在一些实施方案中，所述多肽的信号序列包含一个或多个（例如一个、二个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个等）氨基酸取代和/或缺失。在一些实施方案中，所述多肽的信号序列包含的氨基酸取代和/或缺失可容许一个裂解位点占主导地位，从而产生具有一个N端的实质上同源的多肽。在一些实施方案中，所述信号序列为SEQIDNO:67（SEQIDNO：30的氨基酸1-27）。在一些实施方案中，SEQIDNO:67的氨基酸25和/或26由不同氨基酸所取代。在一些实施方案中，SEQIDNO:67的氨基酸17、18、19、23、24、25和/或26由不同氨基酸所取代。在一些实施方案中，SEQIDNO:67的氨基酸17、23、24、25和26由不同氨基酸所取代。在一些实施方案中，SEQIDNO:67的氨基酸17由苯丙氨酸或白氨酸所取代。在一些实施方案中，SEQIDNO:67的氨基酸23由脯氨酸所取代。在一些实施方案中，SEQIDNO:67的氨基酸24由异白氨酸和苯丙氨酸所取代。在一些实施方案中，SEQIDNO:67的氨基酸25由缬氨酸、异白氨酸或丙氨酸所取代。在一些实施方案中，SEQIDNO:67的氨基酸26由组氨酸、酪氨酸或组氨酸所取代。在一些实施方案中，SEQIDNO:67的氨基酸25由缬氨酸所取代。在一些实施方案中，SEQIDNO:67的氨基酸26由白氨酸所取代。在一些实施方案中，所述多肽的信号序列包含选自表1中所列的组的序列或由表1中所列的组所组成。
表1
MEWGYLLEVTSLLAALALLQRSSGAAA SEQ ID NO:67
MEWGYLLEVTSLLAALALLQRSSGALA SEQ ID NO:68
MEWGYLLEVTSLLAALALLQRSSGVLA SEQ ID NO:6915 -->
MEWGYLLEVTSLLAALLLLQRSPIVHA SEQ ID NO:70
MEWGYLLEVTSLLAALFLLQRSPIVHA SEQ ID NO:71
MEWGYLLEVTSLLAALLLLQRSPFVHA SEQ ID NO:72
MEWGYLLEVTSLLAALLLLQRSPIIYA SEQ ID NO:73
MEWGYLLEVTSLLAALLLLQRSPIAHA SEQ ID NO:74
在某些实施方案中，所述Wnt结合剂包含含有FZD结构域组分和Fc区的第一多肽。在一些实施方案中，所述FZD结构域组分是来自FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9或FZD10。在一些实施方案中，所述Fc区是来自IgG1免疫球蛋白。在一些实施方案中，所述Wnt结合剂包含：(a)第一多肽，其主要由选自由以下组成的组的氨基酸组成：SEQIDNO:27的X1至Y1、SEQIDNO:28的X2至Y2、SEQIDNO:29的X3至Y3、SEQIDNO:22的X4至Y4、SEQIDNO:23的X5至Y5、SEQIDNO:24的X6至Y6、SEQIDNO:25的X7至Y7、SEQIDNO:30的X8至Y8、SEQIDNO:31的X9至Y9和SEQIDNO:26的X10至Y10；以及
(b)第二多肽，其主要由SEQIDNO:43的氨基酸A至B组成；
其中X1=氨基酸69、70、71、72、73、74、75或76
Y1=氨基酸236、237、238、239、240、241、242或243
X2=氨基酸22、23、24、25、26、27或28
Y2=氨基酸158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171或172
X3=氨基酸18、19、20、21、22、23、24或25
Y3=氨基酸141、142、143、144、145、146、147、148或149
X4=氨基酸38、39、40、41或42
Y4=氨基酸168、169、170、171、172、173、174、175或176
X5=氨基酸25、26、27、28或29
Y5=氨基酸155、156、157、158、159、160、161、162、163或164
X6=氨基酸19、20、21、22、23或24
Y6=氨基酸144、145、146、147、148、149、150、151或152
X7=氨基酸22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33或34
Y7=氨基酸178、179、180、181、182、183、184、185或186
X8=氨基酸25、26、27、28、29、30或31
Y8=氨基酸156、157、158、159、160、161、162、163或164
X9=氨基酸21、22、23或24
Y9=氨基酸137、138、139、140、141、142、143、144、145或146
X10=氨基酸20、21、22、23、24或25
Y10=氨基酸152、153、154、155、156、157、158、159或160
A=氨基酸1、2、3、4、5或6
B=氨基酸231或232。
在一些实施方案中，所述第一多肽直接连接所述第二多肽。在一些实施方案中，所述第一多肽是经由肽连接子连接所述第二多肽。在一些实施方案中，所述第一多肽是经由肽连接子GRA连接所述第二多状。在一些实施方案中，“只要由某些氨基酸组成”的多肽（例如，第一或第二多肽）可能在一端或两端包括一个或多个（例如一个、二个、三个、四个或更多个）其它的氨基酸，只要所述其它的氨基酸不会实质上影响Wnt结合剂的功能即可。
在某些实施方案中，所述Wnt结合剂包含：(a)第一多肽，其主要由SEQIDNO:30的氨基酸X至Y组成；和(b)第二多肽，其主要由SEQIDNO:43的氨基酸A至B组成；其中所述第一多肽直接连接所述第二多肽；且其中
X=氨基酸25、26、27、28、29、30或31
Y=氨基酸156、157、158、159、160、161、162、163或164
A=氨基酸1、2、3、4、5或6
B=氨基酸231或232。
在一些实施方案中，所述第一多肽主要由SEQIDNO:30的氨基酸25-158组成。在其它实施方案中，所述第一多肽由SEQIDNO:30的氨基酸25-158组成。在一些实施方案中，所述第一多肽主要由SEQIDNO:30的氨基酸28-158组成。在其它实施方案中，所述第一多肽由SEQIDNO:30的氨基酸28-158组成。在一些实施方案中，所述第一多肽由SEQIDNO:30的氨基酸31-158组成。在一些实施方案中，所述第二多肽由SEQIDNO:43的氨基酸1-232组成。在一些实施方案中，所述第二多肽由SEQIDNO:43的氨基酸3-232组成。在一些实施方案中，所述第二多肽由SEQIDNO:43的氨基酸6-232组成。在一些实施方案中，所述第一多肽为SEQIDNO:39并且所述第二多肽为SEQIDNO:43。在一些实施方案中，所述第一多肽为SEQIDNO:39并且所述第二多肽为SEQIDNO:42。在一些实施方案中，所述第一多肽为SEQIDNO:39并且所述第二多肽为SEQIDNO:18。
在一些实施方案中，所述Wnt结合剂为包含第一多肽和第二多肽的多肽，其中所述多肽是选自表2。
表2
第一多肽 第二多肽
SEQ ID NO:30的氨基酸25-158 SEQ ID NO:43的氨基酸1-232
SEQ ID NO:30的氨基酸25-158 SEQ ID NO:43的氨基酸1-231
SEQ ID NO:30的氨基酸25-158 SEQ ID NO:43的氨基酸2-232
SEQ ID NO:30的氨基酸25-158 SEQ ID NO:43的氨基酸2-231
SEQ ID NO:30的氨基酸25-158 SEQ ID NO:43的氨基酸3-232
SEQ ID NO:30的氨基酸25-158 SEQ ID NO:43的氨基酸3-231
SEQ ID NO:30的氨基酸25-158 SEQ ID NO:43的氨基酸4-232
SEQ ID NO:30的氨基酸25-158 SEQ ID NO:43的氨基酸4-231
SEQ ID NO:30的氨基酸25-158 SEQ ID NO:43的氨基酸5-232
SEQ ID NO:30的氨基酸25-158 SEQ ID NO:43的氨基酸5-231
SEQ ID NO:30的氨基酸25-158 SEQ ID NO:43的氨基酸6-232
SEQ ID NO:30的氨基酸25-158 SEQ ID NO:43的氨基酸6-231
SEQ ID NO:30的氨基酸26-158 SEQ ID NO:43的氨基酸1-232
SEQ ID NO:30的氨基酸26-158 SEQ ID NO:43的氨基酸1-231
SEQ ID NO:30的氨基酸26-158 SEQ ID NO:43的氨基酸2-23217 -->
SEQ ID NO:30的氨基酸26-158 SEQ ID NO:43的氨基酸2-231
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在一些实施方案中，所述Wnt结合剂包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQIDNO:1、SEQIDNO:45、SEQIDNO:46、SEQIDNO:47、SEQIDNO:48、SEQIDNO:49、SEQIDNO:50、SEQIDNO:51、SEQIDNO:53、SEQIDNO:54、SEQIDNO:55、SEQIDNO:65和SEQIDNO:66。
在某些实施方案中，所述Wnt结合剂包含以下序列：SEQIDNO:1。在某些替代实施方案中，所述药剂包含SEQIDNO:1的序列，所述序列包含一个或多个（例如，一个、二个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个等）保存性取代。在某些实施方案中，所述药剂包含与SEQIDNO:1具有至少约90%、约95%或约98%的序列一致性的序列。在某些实施方案中，SEQIDNO:1的变异体保持结合一种或多种人Wnts的能力。
在某些实施方案中，所述Wnt结合剂包含以下序列：SEQIDNO:46。在一些实施方案中，所述Wnt结合剂为SEQIDNO:46。在某些替代实施方案中，所述药剂包含SEQIDNO:46的序列，所述序列包含一个或多个（例如，一个、二个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个等）保存性取代。在某些实施方案中，所述药剂包含与SEQIDNO:46具有至少约90%、约95%或约98%的序列一致性的序列。在某些实施方案中，SEQIDNO:46的变异体保持结合一种或多种人Wnts的能力。
在某些实施方案中，所述Wnt结合剂包含以下序列：SEQIDNO:48。在一些实施方案中，所述Wnt结合剂为SEQIDNO:48。在某些替代实施方案中，所述药剂包含SEQIDNO:48的序列，所述序列包含一个或多个（例如，一个、二个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个等）保存性取代。在某些实施方案中，所述药剂包含与SEQIDNO:48具有至少约90%、约95%或约98%的序列一致性的序列。在某些实施方案中，SEQIDNO:48的变异体保持结合一种或多种人Wnts的能力。
在某些实施方案中，所述Wnt结合剂包含以下序列：SEQIDNO:50。在一些实施方案中，所述Wnt结合剂为SEQIDNO:50。在某些替代实施方案中，所述药剂包含SEQIDNO:50的序列，所述序列包含一个或多个（例如，一个、二个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个等）保存性取代。在某些实施方案中，所述药剂包含与SEQIDNO:50具有至少约90%、约95%或约98%的序列一致性的序列。在某些实施方案中，SEQIDNO:50的变异体保持结合一种或多种人Wnts的能力。
在某些实施方案中，所述Wnt结合剂包含以下序列：SEQIDNO:53。在一些实施方案中，所述Wnt结合剂为SEQIDNO:53。在某些替代实施方案中，所述药剂包含SEQIDNO:53的序列，所述序列包含一个或多个（例如，一个、二个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个等）保存性取代。在某些实施方案中，所述药剂包含与SEQIDNO:53具有至少约90%、约95%或约98%的序列一致性的序列。在某些实施方案中，SEQIDNO:53的变异体保持结合一种或多种人Wnts的能力。
在一些实施方案中，本文所述的Wnt结合剂抑制肿瘤或肿瘤细胞的生长。在一些实施方案中，所述Wnt结合剂诱导肿瘤中的细胞分化。在一些实施方案中，所述Wnt结合剂诱导肿瘤或肿瘤细胞上的分化标记的表达。在某些实施方案中，所述Wnt结合剂降低肿瘤中癌干细胞的发生频率。在一些实施方案中，包含SEQIDNO:46的Wnt结合剂抑制肿瘤生长的程度超过包含SEQIDNO:1的Wnt结合剂。在一些实施方案中，包含SEQIDNO:48的Wnt结合剂抑制肿瘤生长的程度超过包含SEQIDNO:1的Wnt结合剂。在一些实施方案中，包含SEQIDNO:50的Wnt结合剂抑制肿瘤生长的程度超过包含SEQIDNO:1的Wnt结合剂。在一些实施方案中，包含SEQIDNO:53的Wnt结合剂抑制肿瘤生长的程度超过包含SEQIDNO:1的Wnt结合剂。在一些实施方案中，本文所述的Wnt结合剂抑制肿瘤生长的程度超过包含FZD结构域组分、Fc结构域和连接所述FZD结构域组分和Fc结构域的连接子组分的Wnt结合剂。在一些实施方案中，所述连接子组分为一种插入肽连接子。
在某些实施方案中，本文所述的Wnt结合剂抑制Wnt依赖性肿瘤的生长。在一些实施方案中，所述肿瘤为选自由以下组成的组的肿瘤：结肠直肠瘤、结肠瘤、胰脏瘤、肺肿瘤、卵巢瘤、肝脏瘤、乳房肿瘤、肾肿瘤、前列腺瘤、胃肠瘤、黑素瘤、子宫颈瘤、膀胱瘤、胶质母细胞瘤以及头颈部肿瘤。在某些实施方案中，所述肿瘤为结肠直肠瘤。在某些实施方案中，所述肿瘤为胰脏肿瘤。在某些实施方案中，所述肿瘤为乳房肿瘤。
在某些实施方案中，提供包含选自由以下组成的组的氨基酸序列的多肽：SEQIDNO:1、SEQIDNO:45、SEQIDNO:46、SEQIDNO:47、SEQIDNO:48、SEQIDNO:49、SEQIDNO:50、SEQIDNO:51、SEQIDNO:53、SEQIDNO:54、SEQIDNO:55、SEQIDNO:65和SEQIDNO:66。在某些实施方案中，多肽包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQIDNO:1、SEQIDNO:46、SEQIDNO:48、SEQIDNO:50和SEQIDNO:53。在一些实施方案中，多肽由选自由以下组成的组的氨基酸序列组成：SEQIDNO:1、SEQIDNO:46、SEQIDNO:48、SEQIDNO:50和SEQIDNO:53。在某些实施方案中，所述多肽包含以下氨基酸序列：SEQIDNO:50。在一些实施方案中，所述多肽为SEQIDNO:50。在某些实施方案中，所述多肽包含以下氨基酸序列：SEQIDNO:53。在一些实施方案中，所述多肽为SEQIDNO:53。
在某些实施方案中，所述多肽（在信号序列裂解前）包含SEQIDNO:50和选自以下组成的组的信号序列：SEQIDNO:67、SEQIDNO:68、SEQIDNO:69、SEQIDNO:70、SEQIDNO:71、SEQIDNO:72、SEQIDNO:73和SEQIDNO:74。在某些实施方案中，所述多肽（在信号序列裂解前）包含SEQIDNO:50和选自以下组成的组的信号序列：SEQIDNO:70、SEQIDNO:71、SEQIDNO:72、SEQIDNO:73和SEQIDNO:74。在一些实施方案中，所述多肽（在信号序列裂解前）包含SEQIDNO:53和选自以下组成的组的信号序列：SEQIDNO:67、SEQIDNO:68、SEQIDNO:69、SEQIDNO:70、SEQIDNO:71、SEQIDNO:72、SEQIDNO:73和SEQIDNO:74。在一些实施方案中，所述多肽（在信号序列裂解前）包含SEQIDNO:53和选自以下组成的组的信号序列：SEQIDNO:70、SEQIDNO:71、SEQIDNO:72、SEQIDNO:73和SEQIDNO:74。在一些实施方案中，所述多肽包含SEQIDNO:71和SEQIDNO:50。在一些实施方案中，所述多肽包含SEQIDNO:71和SEQIDNO:53。在一些实施方案中，所述多肽包含SEQIDNO:75。在一些实施方案中，所述多肽主要由SEQIDNO:75组成。
在一些实施方案中，所述多肽为实质上经过纯化的多肽，其包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQIDNO:1、SEQIDNO:46、SEQIDNO:48、SEQIDNO:50和SEQIDNO:53。在某些实施方案中，所述实质上经过纯化的多肽至少90%是由具有ASA的N端序列的多肽所组成。在一些实施方案中，所述新生多肽包含选自由SEQIDNO:67-74组成的组的信号序列。在一些实施方案中，所述新生多肽包含SEQIDNO:71的信号序列。在一些实施方案中，所述新生多肽包含一种信号序列，此信号序列可产生具有一个N端序列的实质上同源的多肽产物。
在某些替代实施方案中，所述药剂不包含FZD受体的Fri结构域。
在某些实施方案中，所述Wnt结合剂为一种抗体（例如，特异结合一种或多种Wnt蛋白的抗体）。
在某些实施方案中，所述Wnt结合剂包含免疫球蛋白的Fc区。本领域技术人员将明白，本发明的结合剂将包含其中至少一部分的Fc区已被缺失或以其它方式改变以提供所需的生化特性的融合蛋白（诸如当与包含固有或未改变的恒定区的具有大致相同的致免疫性的融合蛋白相比较时，增加的癌症细胞局部化、增加的肿瘤侵透性、降低的血清半衰期或增加的血清半衰期）。Fc区的修饰可包括在一个或多个结构域中加入、缺失或置换一个或多个氨基酸。本文公开的经过修饰的融合蛋白可包括变更或修饰两个重链恒定区（CH2或CH3)中的一个或多个或绞链区。在其它实施方案中，去除整个CH2结构域（ACH2构造）。在一些实施方案中，以短氨基酸间隔子（例如，10aa残基）置换被删去的恒定区，所述短氨基酸间隔子提供一些通常是由缺失的恒定区赋予的分子弹性。
在一些实施方案中，所述经过修饰的融合蛋白是经过遗传工程处理以直接将CH3结构域与抗体的绞链区相连接。在其它实施方案中，将一个肽间隔子插入绞链区与经过改质的CH2和/或CH3结构域之间。例如，可表达构造物，其中CH2结构域已被缺失并且剩余的CH3结构域（经过修饰或未经过修饰)是以5-20个氨基酸间隔子连接所述绞链区。可加入能确保恒定区的调控要素保持不受约束并且容易接近，或所述绞链区仍保持弹性的这类间隔子。然而，应注意：在某些情况下，氨基酸间隔子可能显示出具致免疫性并且引起对抗所述构造物的不必要的免疫反应。因此，在某些实施方案中，任何加入所述构造物中的间隔子将相对来说无致免疫性，以维持所述经过改质的抗体的所需生物学品质。
在一些实施方案中，所述经过修饰的融合蛋白可能仅缺失部分恒定区或几个或甚至是单一氨基酸被取代。例如，在CH2结构域中的选定区域中的单一氨基酸突变可能就足以大幅减少Fc结合，从而增加癌症细胞局部化和/或肿瘤侵透。类似地，单纯地使控制要调控的特定效应子功能（例如，补体C1q结合）的一个或多个恒定区的一部分缺失可能是合适的。这类部分缺失恒定区可能改进抗体的选定特征（例如，血清半衰期），但使其它与受试者恒定区有关的所需功能保持完整。此外，正如上文提到，所公开的融合蛋白的恒定区可透过一个或多个氨基酸的突变或取代，增强所产生的构造物的变化形廓来修饰。就此而言，破坏由保存性结合位点（例如Fc结合）提供的活性，但大致上保持经过修饰的抗体的构形和免疫变化形廓可能是可行的。在某些实施方案中，所述经过改质的融合蛋白包含在恒定区中加入一个或多个氨基酸，以增强目标特性（诸如减少或增加效应子功能），或供更多的细胞毒素或碳水化合物连接。
本领域中已知的是，恒定区介导数种效应子功能。例如，将补体的C1组分与IgG或IgM抗体（与抗原结合）的Fc区结合可活化补体系统。活化补体对细胞病原体的调理作用和溶解很重要。补体活化也刺激炎症反应并且还可能涉及自体免疫过敏。此外，抗体的Fc区可结合表达Fc受体(FcR)的细胞。对不同类别的抗体（包括IgG(γ受体）、IgE(ε受体）、IgA(α受体）和IgM(μ受体））特异的Fc受体有多种。抗体结合细胞表面上的Fc受体触发许多重要并且互异的生物反应，包括吞没和毁坏经过抗体包覆的颗粒、清除免疫复合物、由杀手细胞溶解经过抗体包覆的标靶细胞（抗体依赖性的经过细胞介导的细胞毒性或ADCC)、释出炎症传介子、胎盘转移以及控制免疫球蛋白制造。
在一些实施方案中，所述Wnt结合剂提供改变的效应子功能，其转而影响所施用的药剂的生物变化形廓。例如，在一些实施方案中，使恒定区缺失或去活化（透过点突变或其它方式）可能会降低循环的经过修饰的药剂（例如，Wnt结合剂）的Fc受体结合力，从而增加癌细胞局部化和/或肿瘤侵透。在其它实施方案中，修改恒定区可增加或降低作用剂的血清半衰期。在一些实施方案中，所述恒定区经过修改以排除二硫键或寡糖部分。
在某些实施方案中，Wnt结合剂不具有通常与Fc区相关的一种或多种效应子功能。在一些实施方案中，所述药剂不具有ADCC活性，和/或不具有补体依赖性细胞毒性(CDC)活性。在某些实施方案中，所述药剂不会结合Fc受体和/或补体因子。在某些实施方案中，所述药剂不具有效应子功能。
在一些实施方案中，本文所述的Wnt结合剂所述经过修改以降低致免疫性。一般而言，当使用人体蛋白作为治疗剂时，免疫反应完全对抗这些蛋白是罕见的。然而，虽然许多融合蛋白包含与自然界中发现的序列相同的多肽序列，数种治疗性融合蛋白显示出在哺乳动物中具有致免疫性。在一些研究中，包含连接子的融合蛋白被发现较不包含连接子的融合蛋白更具有致免疫性。因此，在一些实施方案中，通过计算方法分析本发明的多肽以预测致免疫性。在一些实施方案中，分析所述多肽是否存有T细胞和/或B细胞抗原决定部位。如果鉴别和/或预测出任何T细胞或B细胞抗原决定部位，那么可能对这些区进行修改（例如，氨基酸取代）以破坏或毁坏该抗原决定部位。本领域已知可用来预测T细胞和/或B细胞抗原决定部位的各种算法和软件。例如软件程序SYFPEITHI、HLABind、PEPVAC，RANKPEP，Disc0Tope，ElliPro和抗体抗原决定部位预测(AntibodyEpitopePrediction)均可公开地取得。
在某些实施方案中，提供制任何造本文所述的Wnt结合剂或多肽的细胞。在一些实施方案中，提供包含任何本文所述的Wnt结合剂或多肽的组合物。在一些实施方案中，所述组合物包含多肽，其中至少80%、90%、95%、97%、98%或99%的所述多肽具有ASA的N端序列。在一些实施方案中，所述组合物包含一种多肽，其中100%的所述多肽具有ASA的N端序列。在一些实施方案中，所述组合物包含一种多肽，其中至少80%的所述多肽具有ASA的N端序列。在一些实施方案中，所述组合物包含一种多肽，其中至少90%的该多肽具有ASA的N端序列。在一些实施方案中，该组合物包含一种多肽，其中至少95%的所述多肽具有ASA的N端序列。
本发明的多肽可为重组多肽、天然多肽或合成多肽。本领域中将承认本发明的一些氨基酸序列可被改变，但对蛋白质的结构或功能无显著影响。如果考虑序列中这类差异时，那么应记住蛋白质上将有决定活性的关键区。因此，本发明进一步包括显示出大致活性的多肽变异体或包括FZD蛋白区、SFRP蛋白或Ror蛋白区（诸如本文所讨论的蛋白质部分）的多肽变异体。这类突变包括缺失、插入、倒置、重复子和型态替换。如下文所述，关于何种氨基酸变化可能为表型上沉默的指导可在Bowie等,1990,Science,247:1306-10中找到。
当然，本领域技术人员将根据多种因素（包括上文所述的因素）来制作氨基酸取代的数目。在某些实施方案中，任何给定的可溶性受体多肽的取代数目将不超过50、40、30、25、20、15、10、5或3。
本发明多肽的片段或部分可用于通过肽合成方法产生相对应的全长多肽；因此，所述片段可作为制造全长多肽的中间体。所述多肽的这些片段或部分也可称为“蛋白质片段”或“多肽片段”。
本发明的蛋白片段为可结合一种或多种人Wnt蛋白（例如人FZD受体、人SFRP或Ror蛋白）的蛋白质的一部分或全部。在一些实施方案中，所述片段对一种或多种人Wnt蛋白具有高亲和力。本文所述的融合蛋白的一些片段为包含至少一部分FZD受体、SFRP的胞外部分或Ror蛋白的胞外部分的蛋白质片段（其含有连接免疫球蛋白的至少部分恒定区的结合域，例如Fc区）。蛋白质片段的结合亲和力可在约10-11至10-12M的范围内，虽然不同大小的片段的亲和力可能有很大的不同。在一些实施方案中，所述片段的长度为约100至约200个氨基酸并且包含连接免疫球蛋白的至少部分恒定区的结合域。
本发明的Wnt结合剂可通过本领域中已知的任何方法来分析特异的结合。可使用的免疫分析包括但不限于使用诸如以下的技术的竞争性和非竞争性分析系统：BIAcore分析、FACS分析、免疫荧光、免疫细胞化学、蛋白质印迹、放射免疫分析、ELISA、“夹层”免疫分析、免测沉淀分析、沉淀反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散分析、聚结分析、补体结合分析、免疫放射分析法、荧光免疫分析和蛋白质A免疫分析。此类分析是本领域中的常规和众所周知的方法（参见，例如Ausubel等编,1994,CurrentProtocolsinMolecularBiology,第1卷,JohnWiley&Sons,Inc.,NewYork,其全部内容以引用的方式并入本文）。
例如，多肽与人Wnt的特异结合可使用ELISA来测定。ELISA分析包括制备抗原，用抗原涂布96孔微量滴定板的板孔，向板孔中添加与诸如酶底物（例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶）共轭结合的可检测的化合物的多肽（例如Wnt结合剂），孵育一段时间并且检测所述药剂的存在。在一些实施方案中，所述多肽（例如Wnt结合剂）不与可检测的化合物共轭结合，但是取而代之与识别加入板孔中的多肽的第二共轭结合抗体共轭结合。在一些实施方案中，代替用抗原涂布板孔，可将多肽（例如Wnt结合剂）涂布于板孔并且在添加抗原之后，可将与可检测的化合物共轭结合的第二抗体添加到经过涂布的板孔。本领域技术人员应知晓可经过修改来增大所检测的信号的参数以及本领域中已知ELISA的其它变化（参见，例如Ausubel等,编,1994,CurrentProtocolsinMolecularBiology,第1卷,JohnWiley&Sons,Inc.,NewYorkat11.2.1）。
药剂与Wnt的结合亲和力和结合剂-抗原交互作用的解离速率可由竞争性结合分析测定。竞争性结合分析的一个实例是放射免疫分析，包括在增加量的没有经过标记的抗原的存在下，用目标结合剂孵育经过标记的抗原（例如3H或125I）或其片段或变异体，接着检测与经过标记的抗原结合的抗体。结合剂对Wnt的亲和力和解离速率可通过Scatchard绘图分析来测定。在一些实施方案中，BIAcore动力学分析用于测定药剂结合一种或多种人Wnts的结合与解离速率。BIAcore动力学分析包含分析抗体碎片与抗体表面上的固定的Wnt抗原的结合与解离。
在某些实施方案中，Wnt结合剂以约1μM或更小、约100nM或更小、约40nM或更小、约20nM或更小或约10nM或更小的解离常数(KD)结合至少一种Wnt。
在某些实施方案中Wnt结合剂（例如，FZD8-Fc）是由所述药剂结合的至少一种Wnt（即，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10Wnts）的拮抗剂。在某些实施方案中，所述药剂抑制经过结合的人Wnt的一种或多种活性的至少约10%、至少约20%、至少约30%、至少约50%、至少约75%、至少约90%或约100%。
用于测定Wnt结合剂（或候选Wnt结合剂）是否抑制Wnt信号传递的体内和体外分析是本领域中已知的。例如，可使用基于细胞的荧光素酶报导基因分析来体外测量典型的Wnt信号传递水平，所述分析利用含有荧光虫荧光素酶报告基因上游的TCF结合结构域的多个副本的TCF/Luc报告基因(Gazit等,1999,Oncogene18;5959-66)。将在一种或多种Wnts存在下（例如，由经过转染的细胞表达的或由Wnt调节培养基提供的）与Wnt结合剂存在下的Wnt信号传递的水平与不存在Wnt结合剂时的信号传递水平相比较。除了TCF/Luc报告基因分析之外，Wnt结合剂（或候选药剂）对典型的Wnt信号传递的作用可通过体外或体内测量所述药剂对β-连锁蛋白调节的基因的作用来测量，所述β-连锁蛋白调节的基因诸如c-myc（He等,Science,281:1509-12(1998)）、细胞周期蛋白D1（Tetsu等,Nature,398:422-6(1999)）和/或纤维连接蛋白（Gradl等Mol.CellBiol.,19:5576-87(1999)）。在某些实施方案中，所述药剂对Wnt信号传递的作用还可通过测量所述药剂对Dishevelled-1、Dishevelled-2、Dishevelled-3、LRP5、LRP6和/或β-连锁蛋白的磷酸化状态的作用来评定。
本文所述的多肽可通过本领域已知的任何合适的方法制造。这类方法的范围从直接蛋白质合成法至构建编码多肽序列的DNA序列，以及在合适的宿主内表达那些序列。在一些实施方案中，DNA序列是采用基因重组技术，提供分离或合成编码目标野生型蛋白的DNA序列来构建。任选地，所述序列可藉由定点突变来突变以提供其功能类似物。参见，例如Zoeller等,1984,PNAS,81:5662-66和美国专利第4,588,585号。在一些实施方案中，利用重组技术，提供分离超过一种编码两种目标多肽的DNA序列来构建DNA序列并将这些DNA序列连结在一起以产生融合蛋白质。在一些实施方案中，将两种多肽融合可在这两种多肽间的交界处（即，DNA序列连结位点）加入额外的氨基酸。这些额外的氨基酸被认为是一种连接子。在一些实施方案中，肽连接子是插入所述融合蛋白的两个多肽之间。
在一些实施方案中，编码目标多肽的DNA序列可使用寡核苷酸合成器，通过化学合成法来构建。这类寡核苷酸可根据所需的多肽的氨基酸序列设计。在一些实施方案中，所述寡核苷酸是经过设计以选择制造目标重组多肽的宿主细胞所偏好的密码子。标准方法可应用于合成编码目标多肽的核苷酸序列。例如，可使用完整的氨基酸序列来构建逆翻译基因。此外，可合成含有编码特定多肽的核苷酸序列的DNA寡聚物。例如，可合成数种编码部分所需多肽的小寡核苷酸，再进行连结。所述个别寡核苷酸通常含有用于供互补性装配的5'或3'悬端。在一些实施方案中，合成编码所需的融合蛋白的核苷酸序列以使两种多肽直接连接，而不需插入肽连接子。
一旦装配后（通过合成、定点突变、基因重组技术或其它方法），可将编码目标特定多肽的多核苷酸序列插入表达载体中并经过操作连接至适合于所需宿主中表达所述多肽的表达调控序列。正确的组合可通过核苷酸定序、限制酶切作图和/或在合适的宿主中表达生物活性多肽来确认。如本领域所众所周知，为了在宿主中高度表达经过转染的基因，必须将该基因经过操作连接至可在所选择的表达宿主中作用的转录和翻译表达调控序列。
在某些实施方案中，使用重组表达载体来放大和表达编码本文所述的Wnt结合剂和多肽的DNA。例如，重组表达载体可为可复制的DNA构造物，其具有编码包含FZDFri结构域及Fc区的融合蛋白的合成DNA片段或自cDNA衍生的DNA片段，此DNA片段是可经过操作连接至从哺乳动物、微生物、病毒或昆虫基因衍生的合适的转录或翻译调控元素上。转录单位一般包含装配以下：(1)遗传元素或在基因表达中具有调节作用的元素，例如，转录启动子和/或促进子，(2)转录成mRNA及翻译成蛋白质的结构性或编码序列，以及(3)合适的转录和翻译起始和终止序列。调控元素可包括操作子序列以控制转录。可额外纳入在宿主中复制的能力（这通常是由复制起源赋予）和促进识别转化株的选择基因。当DNA区在功能上彼此关联时，此DNA是“经过操作性连接的”。例如，如果信号肽的DNA（分泌前导序列）是以参与多肽分泌的先质表达，那么此DNA是经过操作性连接至所述多肽的DNA；如果启动因子控制序列的转录，那么此DNA是经过操作性连接至所述编码序列；或者，如果核糖体的结合位点的位置可允许翻译，那么此DNA是经过操作性连接至编码序列。一般而言，经过操作性连接意指连续的，并且在分泌前导序列的情况下，是指连续的并且是在阅读框架中。在一些实施方案中，意图用于酵母表达系统中的构造元素可包含能使宿主细胞胞外分泌翻译蛋白的前导序列。在一些实施方案中，当重组蛋白表达时不需要前导序列或转运序列时，其可包括一个N端甲硫氨酸残基。此残基可选择地接着从所表达的重组蛋白裂解出，以提供最终产品。
表达调控序列和表达载体的选择是取决于所选择的宿主。可采用的表达宿主/载体组合有很多种。可用的真核宿主的表达载体包括，例如包含来自SV40、牛乳头瘤病毒、腺病毒和巨细胞病毒的表达调控序列的载体。用于细菌宿主的有用的表达载体包括已知的细菌质粒（诸如来自大肠杆菌的质粒，包括：pCRl、pBR322、pMB9和其衍生物），以及宿主范围较广的载体，诸如M13和其它丝状单股DNA噬菌体。
用于表达Wnt结合剂的合适宿主细胞包括原核生物、酵母、昆虫或受适当的启动因子控制的较高等的真核细胞。原核生物包括革兰氏阴性或革兰氏阳性有机体，例如，大肠杆菌或杆菌。较高等的真核细胞包括如下述的已建立的哺乳动物起源的细胞株。还可使用无细胞的翻译系统。用在细菌、真菌、酵母菌和哺乳动物细胞宿主的适当的选殖和表达载体描述在Pouwels等,1985，CloningVectors:ALaboratoryManual,Elsevier,N.Y中，其相关公开内以引用的方式并入本文。
使用不同哺乳动物或昆虫细胞培养系统来表达重组多肽。在一些实施方案中，在哺乳动物细胞中表达重组蛋白是优选的，因为这类蛋白质一般都经过正确折叠、适当修饰并且完全为功能性的。合适的哺乳动物宿主细胞株的实例包括C0S-7(从猴肾衍生)、L-929(从小鼠纤维母细胞衍生)、C127(从小鼠乳房肿瘤衍生)、3T3细胞(从小鼠纤维母细胞衍生)、CHO(从中国仓鼠卵巢衍生)、HeLa细胞(从人子宫颈癌衍生)和BHK(从地鼠肾脏纤维母细胞衍生)细胞系。哺乳动物表达载体可包含非转录元素，诸如复制起源、连接要表达的基因的合适启动子和增强子和其它5'或3'侧翼非转录序列，以及5'或3'非翻译序列，诸如必要的核糖体结合位点、多聚腺苷酸化位点、DNA剪接供给体和接受体位点，以及转录终止序列。本领域技术人员已知用于在昆虫细胞中制造异源蛋白的杆状病毒系统，并且由Luckow和Summers,1988，Bio/Technology6:47进行了综述。
转化宿主所制造的蛋白质可根据任何适当方法纯化。这类标准方法包括色谱分析法（例如，离子交换，亲和力和尺寸排阻管柱色谱分析法）、离心、差别溶解度、或任何其它用于纯化蛋白的标准技术。可将亲和标签（诸如六聚组氨酸、麦芽糖结合结构域、流感外套序列(influenzacoatsequence)及谷胱甘肽-S-转移酶）连接至蛋白质以容许经由通过适当的亲和色谱柱来简易地纯化。分离出的蛋白质也可使用诸如蛋白质水解、质谱分析(MS)、高效液相色层分析法(HPLC)、核磁共振(NMR)和X-射线晶体学这类技术决定物理特征。
在一些实施方案中，首先使用可商购的蛋白质浓缩过滤器（例如Amicon或MilliporePellicon超滤单位）将来自表达系统（其分泌重组蛋白进入培养基中）的上清液浓缩。浓缩步骤之后，将浓缩物施用在合适的纯化基质上。在一些实施方案中，可使用阴离子交换树脂，例如具有侧连二乙氨基乙基(DEAE)的基质或底物。所述基质可为烯丙酰胺、琼脂糖、葡聚糖、纤维素或其它在蛋白质纯化中普遍采用的类型。在一些实施方案中可使用阳离子交换步骤。合适的阳离子交换器包括各种含有磺丙基或羧甲基的不溶性基质。在一些实施方案中，可使用羟基磷灰石(CHT)培养基，包括但不限于陶瓷羟基磷灰石。在一些实施方案中，可使用一种或多种采用疏水性RP-HPLC培养基（例如，具有侧连甲基或其它脂族基团的硅胶）的逆相HPLC步骤来进一步纯化融合蛋白。还可使用一些或全部上述纯化步骤的各种组合来提供均质的重组蛋白。
在一些实施方案中，可通过例如先从细胞小粒萃取，再进行一次或多次浓缩、盐析、水溶液中离子交换和/或尺寸排阻色谱步骤来将在细菌培养中产生的重组蛋白分离出。HPLC可用来作为最终的纯化步骤。用在表达重组蛋白的微生物细胞可通过任何方便的方法破坏，包括冻融循环、超音波、机械破坏，或使用细胞溶解剂。
领域已知的用于纯化抗体和其它蛋白的方法还包括，例如那些描述于美国专利申请第2008/0312425号；第2008/0177048号和第2009/0187005号中的方法。
本文所述的多肽可经过进一步修饰以包含不是所述蛋白质的正常部分的其它化学部分。那些衍生部分可改善蛋白质的溶解度、生物半衰期或吸收。所述部分还可减少或排除蛋白质等的任何不良副作用。对于那些部分的概述可以在Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,第21版,UniversityoftheSciences,Philadelphia,2005中找到。
最适合衍生的化学部分包括水溶性聚合物。水溶性聚合物较合适，因为其所连接的蛋白质不会在水性环境（诸如生理环境）中沉淀。在一些实施方案中，所述聚合物对制备治疗性产品或组合物而言为药学上可接受的。本领域技术人员将有能力根据所述聚合物/蛋白质共轭物是否将用于治疗来选择所需的聚合物，若是，则考虑所需剂量、循环时间、对蛋白质水解的抗性以及其它考量。衍生的有效性可经由施用所需形式的衍生物（即：通过渗透性泵、或注射或输液，或进一步配制以便用于口服、肺部或其它递送途径）来确定，并测定其效力。合适的水溶性聚合物包括但不限于：聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三噁烷，乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸类（无论是均聚物或随机共聚物）、葡聚糖、聚（正乙烯基吡咯烷酮）-聚乙二醇、乙二醇、丙二醇同聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙烯化的多元醇（例如甘油）、聚乙烯醇和那些的混合物。聚乙二醇丙醛由于在水中很稳定因此在制造上可具有优势。
这样连接的聚合物分子的数目可以有所不同，并且本领域技术人员将有能力决定其对功能的效果。技术者可以相同或不同化学部分（例如，聚合物，诸如不同重量的聚乙二醇）进行单次衍生化，或可提供二次，三次，四次或一些衍生化组合。聚合物分子对蛋白质（或肽）分子在反应混合物中的比例如同其浓度一样会有所不同。一般来说，最佳的比例（就反应效率来说，没有多余的未反应的蛋白质或聚合物）将取决于，诸如所需的衍生程度（例如单、二、三等）、所选择的聚合物的分子量、所述聚合物是否为有分支或无分支以及反应条件等因素。
所述聚乙二醇分子（或其它化学部分）连接蛋白质时应考虑对蛋白质的功能性或抗原结构域的影响。本领域技术人员可使用的连接方法有多种。参见，例如EP0401384，其公开内容以引用的方式并入本文（将PEG与G-CSF偶联），也参见Malik等,1992,Exp.Hematol.,20:1028-35（报道了使用三氟代乙烷磺酰氯将GM-CSF聚乙二醇化）。例如，聚乙二醇可经由反应基，诸如游离氨基或羧基共价结合氨基酸残基。反应基团为那些活化的聚乙二醇分子可与之结合的基团。具有游离氨基的氨基酸残基可包括酸赖氨酸残基和N端氨基酸残基。那些具有游离羧基的基团可包括天门冬氨酸残基、氨酸谷氨酸残基及C端氨基酸残基。巯基也可作为一种用于连接聚乙二醇分子的反应基。为了治疗目的，可连接至一个氨基上，诸如连接在N端或赖氨酸基团。如果需要结合受体，则应该避免连接在对受体结合重要的残基上。
技术者可以专门设计一种氨基端经过化学修饰的蛋白质。使用聚乙二醇说明本组合物：技术者可从各种不同的聚乙二醇分子（通过分子量、支化等）、反应混合物中的聚乙二醇分子对蛋白质（或肽）分子的比例、要进行的聚乙二醇化反应的类型以及取得所选择的N端聚乙二醇化蛋白质的方法来选择。取得N端聚乙二醇化的制品（即，如果需要时，则将此部分与其它单聚乙二醇化的部分分开）的方法可经由从聚乙二醇化的蛋白质分子群体纯化N端聚乙二醇化物质来进行。选择性N端化学修饰可经由还原性烷基化反应来完成，所述反应是利用特定蛋白质中可用于衍生的不同类型的一级氨基的差别反应性（赖氨酸相对于N端)进行。在适当的反应条件下，可实现以含有羰基的聚合物实质上选择性衍生化蛋白质N端。例如，技术者可在能容许其利用赖氨酸残基的ε氨基间的pKa差异和蛋白质N端残基的α氨基间的pKa差异的pH值下进行反应来选择性地将蛋白质N端聚乙二醇化。通过这类选择性衍生化可控制水溶性聚合物连接蛋白质，例如与聚合物的共轭结合主要是发生在蛋白质N端并且其它反应基团（诸如赖氨酸侧链氨基）并未发生显著修饰。使用还原性烷基化，所述水溶性聚合物可为上述类型并且应该具有用于与蛋白质偶联的单一反应醛。可使用包含单一反应醛的聚乙二醇丙醛。
聚乙二醇化通过本领域已知的任何聚乙二醇化反应进行。参见，例如FocusonGrowthFactors,1992,3:4-10；EP0154316，其公开内容以引用的方式并入本文；EP0401384；以及本文中所引用的关于聚乙二醇的其它公布。聚乙二醇化反应可由反应性聚乙二醇分子（或类似的反应性水溶性聚合)经由酰化反应或烷基化反应进行。
因此，要根据本发明使用的可溶性受体多肽可考虑包括聚乙二醇化的可溶性受体蛋白或变异体，其中所述PEG基团是经由酰基或烷基连接。这类产品可经过单次聚乙二醇化或多次聚乙二醇化。所述聚乙二醇基一般是在氨基酸的α或ε氨基处连接蛋白质，但还可考虑PEG基可连接与蛋白质连接的任何氨基酸，而所述氨基酸在适当的反应条件具有足够反应性以便连接到PEG基团。
用于酰化和烷基化两种方法中的聚合物分子可从如上述的水溶性聚合物中选择。所选择的聚合物应经过修饰而具有单一反应基团，诸如用于酰化的活性酯或用于烷基化的醛，从而可如本方法所提供来控制聚合化的程度。示例性的反应性PEG醛为在水中稳定的聚乙二醇丙醛，或其单CM-C10烷氧基或芳氧基衍生物（参见美国专利第5,252,714号)。所述聚合物可为有分支或无分支的。对酰化反应来说，所选择的聚合物应具有单一反应性酯基。对本发明的还原性烷基化来说，所选择的聚合物应具有单一反应性醛基。一般来说，所述水溶性聚合物将不会从天然糖基残基选择，因为通过哺乳动物重组表达系统制造这些聚合物通常更加方便。所述聚合物可具有任何分子量，并且可为有分支或无分支的。聚乙二醇为一种可用于本文中的水溶性聚合物。如本文所使用的，聚乙二醇是意图包含已用于衍生其它蛋白质的任何PEG形式，诸如单(C1-C10)烷氧基或芳氧基聚乙二醇。
其它反应参数，诸如溶剂、反应时间、温度等，以及纯化产品的方式可根据与以水溶性聚合物衍生化的蛋白质相关的公布的信息逐案测定（参见本文引用的公布）。在某些实施方案中，所述Wnt结合剂不是从人FZD或SFRP衍生的多肽。本领域已知多种用于鉴别和制造以高亲和力结合蛋白质标靶的多肽的方法。参见，Skerra,2007,Curr.Opin.Biotechnol.,18:295-304；Hosse等,2006,ProteinScience,15:14-27；Gill等,2006,Curr.Opin.Biotechnol.,17:653-58；Nygren,2008,FEBSJ.,275:2668-76；和Skerra,2008,FEBSJ.,275:2677-83，每一文献的全部内容各以引用的方式并入本文。在某些实施方案中，已使用噬菌体展示技术来鉴别/制造Wnt结合多肽。在某些实施方案中，所述多肽包含选自由以下组成的组的蛋白支架类型：蛋白A、载脂蛋白、纤粘蛋白结构域、锚蛋白同源重复结构域及硫氧化还原蛋白。
在一些实施方案中，所述Wnt结合剂为一种非蛋白分子。在某些实施方案中，所述药剂为一种小分子。可用于鉴别非蛋白质Wnt结合剂的组合化学库和技巧是本领域技术人员已知的。参见，例如Kennedy等,2008,J.Comb.Chem.,10:345-54；Dolle等,2007,J.Comb.Chem.,9:855-902；和Bhattacharyya,2001,Curr.Med.Chem.,8:1383-404，每一文献的全部内容各以引用的方式并入本文。在某些进一步实施方案中，所述药剂为碳水化合物、糖胺聚糖、糖蛋白或蛋白聚糖。
在某些实施方案中，所述药剂为核酸适配子。适配子为根据其结合另一分子的一能力选择（例如，从随机或突变池中选择）的多核苷酸。在一些实施方案中，所述适配子包含DNA多核苷酸。在某些替代实施方案中，所述适配子包含RNA多核苷酸。在某些实施方案中，所述适配子包含一个或多个经过修饰的核酸残基。制造和筛选用于结合蛋白质的核酸适配子的方法是本领域中众所周知的。参见，例如美国专利第5,270,163号；第5,683,867号；第5,763,595号；第6,344,321号；第7,368,236号；第5,582,981号；第5,756,291号；第5,840,867号；第7,312,325号；和第7,329,742号、国际专利公布第WO02/077262号和第WO03/070984号、美国专利申请第2005/0239134号；第2005/0124565号；和第2008/0227735号，每一专利的全部内容以引用的方式并入本文。
在某些实施方案中，Wnt结合剂在小鼠、食蟹猴或人中的循环半衰期为至少约5小时、至少约10小时、至少约24小时、至少约3天、至少约1周或至少约2周。在某些实施方案中，Wnt结合剂为IgG（例如，IgG1或IgG2）抗体，其在小鼠、食蟹猴或人中的循环半衰期为至少约10小时、至少约24小时、至少约3天、至少约1周或至少约2周。本领域中已知增加药剂（诸如多肽和抗体）的半衰期的方法。例如，增加IgG抗体的循环半衰期的已知方法包括在Fc区中引入突变，从而增加抗体与新生Fc受体(FcRn)在pH6.0下的pH依赖性结合（参见，例如美国专利公布第2005/0276799号、第2007/0148164号、和第2007/0122403号）。增加缺Fc区的抗体片段的循环半衰期的已知方法包括如聚乙二醇化的技术。
在某些实施方案中，当经由大鼠尾静脉施用剂量为约2mg/kg至约10mg/kg的本文所述的Wnt结合剂和多肽时，所述Wnt结合剂和多肽在大鼠中的半衰期为至少约50小时。在某些实施方案中，当经由大鼠尾静脉施用剂量为约10mg/kg的Wnt结合剂或多肽时，所述Wnt结合剂或多状在大鼠中的半衰期为至少约50小时。在某些实施方案中，当经由大鼠尾静脉施用剂量为约2mg/kg至约10mg/kg的Wnt结合剂或多肽时，所述Wnt结合剂或多肽在大鼠中的半衰期为至少约100小时。在某些实施方案中，当经由大鼠尾静脉施用剂量为约10mg/kg的Wnt结合剂或多肽时，所述Wnt结合剂或多肽在大鼠中的半衰期为至少约100小时。在某些实施方案中，当经由大鼠尾静脉施用剂量为约2mg/kg至约10mg/kg的Wnt结合剂时，所述Wnt结合剂在大鼠中的半衰期为至少约120小时。在某些实施方案中，当经由大鼠尾静脉施用剂量为约2mg/kg至约10mg/kg的Wnt结合剂时，所述Wnt结合剂和多肽在大鼠中的半衰期为至少约150小时。
在某些实施方案中，所述药剂为包含人FZD受体的Fri结构域（或结合一种或多种Wnts的Fri结构域的片段或变异体）和人Fc区的可溶性FZD受体，并且所述可溶性FZD受体在体内（例如小鼠或大鼠）的半衰期较包含FZD受体的胞外结构域和人Fc区的可溶性FZD受体的半衰期长。
本发明提供制造本文所述的Wnt结合剂或多肽的细胞。在一些实施方案中，所述细胞制造包含人FZD8的Fri结构域的可溶性Wnt结合剂，其中至少约80%的Wnt结合剂具有ASA的N端序列。在一些实施方案中，所述细胞制造包含人FZD8的Fri结构域的可溶性Wnt结合剂，其中至少约85%、至少约90%、至少约95%或至少约98%的Wnt结合剂具有ASA的N端序列。在一些实施方案中，所述细胞为一种哺乳动物细胞。在一些实施方案中，所述细胞制造包含人Fc区的Wnt结合剂。在一些实施方案中，所述细胞制造包含选自由以下组成的组的氨基酸序列的Wnt结合剂：SEQIDNO:53、SEQIDNO:50、SEQIDNO:46、SEQIDNO:48和SEQIDNO:1。在一些实施方案中，所述细胞制造包含SEQIDNO:53的氨基酸序列的Wnt结合剂。在一些实施方案中，所述细胞制造包含SEQIDNO:50的氨基酸序列的Wnt结合剂。
本发明提供本文所述的细胞所制造的Wnt结合剂。
本发明还提供包含本文所述的Wnt结合剂或多肽的组合物。在一些实施方案中，所述组合物包含含有人FZD8的Fri结构域的可溶性Wnt结合剂，其中至少约80%的Wnt结合剂具有ASA的N端序列。在一些实施方案中，所述组合物包含含有人FZD8的Fri结构域的可溶性Wnt结合剂，其中至少约85%、至少约90%、至少约95%或至少约98%的Wnt结合剂具有ASA的N端序列。在一些实施方案中，所述组合物包含含有人Fc区的Wnt结合剂。在一些实施方案中，所述组合物包含含有选自由以下组成的组的氨基酸序列的Wnt结合剂：SEQIDNO:53、SEQIDNO:50、SEQIDNO:46、SEQIDNO:48和SEQIDNO:1。在一些实施方案中，所述组合物包含含有SEQIDNO:53的氨基酸序列的Wnt结合剂。在一些实施方案中，所述组合物包含含有SEQIDNO:50的氨基酸序列的Wnt结合剂。在一些实施方案中，本文所述的组合物进一步包含药学上可接受的载体。
本发明还提供包含本文所述的Wnt结合剂或多肽的组合物的使用方法。
III.多核苷酸
在某些实施方案中，本发明包含多核苷酸，所述多核苷酸含有编码特异结合人Wnt蛋白的多肽或这类多肽的片段的多核苷酸。例如，本发明提供包含编码可溶性FZD受体或编码这类可溶性受体的片段的核酸序列的多核苷酸。在一些实施方案中，本发明提供包含编码可溶性SFRP、可溶性Ror蛋白或编码这类可溶性蛋白的片段的核酸序列的多核苷酸。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含编码任何本文所述的Wnt结合剂的多核苷酸。本发明的多核苷酸可为RNA形式或DNA形式。DNA包括cDNA、基因组DNA和合成的DNA；并且可为双股或单股，如果为单股，那么可为编码股或非编码（反义）股。
在某些实施方案中，所述多核苷酸是经过分离的。在某些实施方案中，所述多核苷酸是实质上纯的。
本发明提供一种多核苷酸，其包含编码包含以下序列的多肽的多核苷酸：SEQIDNO:1、SEQIDNO:45、SEQIDNO:46、SEQIDNO:47、SEQIDNO:48、SEQIDNO:49、SEQIDNO:50、SEQIDNO:51、SEQIDNO:52、SEQIDNO:53、SEQIDNO:54、SEQIDNO:55、SEQIDNO:65、SEQIDNO:66和SEQIDNO:75。在一些实施方案中，所述多核苷酸进一步包含编码选自由以下组成的组的多肽信号序列的多核苷酸：SEQIDNO:67、SEQIDNO:68、SEQIDNO:69、SEQIDNO:70、SEQIDNO:71、SEQIDNO:72、SEQIDNO:73和SEQIDNO:74。在一些实施方案中，所述多核苷酸进一步包含编码选自由以下组成的组的多肽信号序列的多核苷酸：SEQIDNO:70、SEQIDNO:71、SEQIDNO:72、SEQIDNO:73和SEQIDNO:74。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含编码具有SEQIDNO:71和SEQIDNO:50的序列的多肽的多核苷酸。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含编码具有SEQIDNO:71和SEQIDNO:53的序列的多肽的多核苷酸。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含编码具有SEQIDNO:75的序列的多肽的多核苷酸。本发明进一步提供包含SEQIDNO:2的序列的多核苷酸。
本发明提供一种多核苷酸，其包含编码包含以下的多肽的多核苷酸：选自由SEQIDNO:71、SEQIDNO:70、SEQIDNO:72、SEQIDNO:73组成的组的信号序列；人FZD8的Fri结构域；以及人Fc区。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含编码包含SEQIDNO：71的信号序列；人FZD8的Fri结构域；以及人Fc区的多肽的多核苷酸。
本发明还提供一种多核苷酸，其包含与具有SEQIENO:2的序列的多核苷酸杂交和/或与编码具有下列序列的多肽的多核苷酸杂交的多核苷酸：SEQIDNO:1、SECIDNO:45、SEQIDNO:46、SEQIDNO:47、SEQIENO:48、SEQIDNO：49、SEQIDNO:50、SEQIDNC:51、SEQIDNO:52、SEQIDNO:53、SEQIDNO:54、SEQIDNO:55、SEQIDNO:65、SEQIDNO:66和SEQIDNO:75。在某些实施方案中，所述杂交是在高度严格的条件下进行。
在某些实施方案中，多核苷酸包含成熟多肽的编码序列，所述成熟多肽在同一阅读框架中连结至可协助（例如）多肽（例如，前导序列或信号序列，其可作为用来控制多肽从细胞转运的分泌序列）从宿主细胞表达和分泌的多核苷酸上。具有前导序列的多肽为一种前体蛋白并且前导序列可被宿主细胞裂解以形成所述多肽的成熟形式。所述多核苷酸也可编码为成熟蛋白质加额外的5'端氨基酸残基的前体蛋白。具有前序列的成熟蛋白为一种前体蛋白并且为所述蛋白质的去活化形式。所述前序列一旦被裂解后，仍就保留活性成熟蛋白。
在某些实施方案中，多核苷酸包含成熟多肽的编码序列，所述成熟多肽在同一阅读框架中连结至可容许（例如）纯化经过编码的多肽的标记序列上。例如，在细菌宿主的情况下，所述标记序列可为由pQE-9载体供应的六聚组氨酸标签以供允许连结所述标记的成熟多肽纯化，或者，当使用哺乳动物宿主（例如，COS-7细胞）时，所述标记序列可为流感血凝素蛋白源性的血凝素(HA)标签。
本发明进一步涉及上述的编码（例如）片段、类似物和衍生物的多核苷酸的变异体。本发明的多核苷酸的片段或部分可用于合成本发明的全长核苷酸。
在某些实施方案中，本发明提供经过分离的多核苷酸，其包含与编码含有本文所述的可溶性FZD受体或其它Wnt结合剂的多肽的多核苷酸至少为80%一致、至少85%一致、至少90%一致、至少95%一致，并且在一些实施方案中，至少为96%、97%、98%或99%一致的多核苷酸。
具有与参考核苷酸序列至少为（例如）95%“一致”的核苷酸序列的多核苷酸是意指多核苷酸的核苷酸序列与参考序列相一致，但多核苷酸序列所含有的参考核苷酸序列中每100个核苷酸中最多可有五个点突变。换句话说，为了取得与参考核苷酸序列具有至少95%一致性的核苷酸序列的多核苷酸，可使参考序列中至多5%的核苷酸缺失或由另一核苷酸取代，或可将至多为参考序列中全部核苷酸的5%的核苷酸数插入参考序列中。这些参考序列的突变可出现在参考核苷酸序列的氨基或羧基端位置或介于那些终端位置之间的任何处，并且是单独地散置在参考序列中的核苷酸间或在参考序列内的一个或多个连续群组中。
多核苷酸变异体可在编码区、非编码区或两者中含有改变。在一些实施方案中，多核苷酸变异体含有可产生沉默氨基酸取代、加入或缺失，但不改变经过编码的多肽的性质或活性的改变。在一些实施方案中，核苷酸变异体是由遗传密码的简并性造成的沉默取代产生。在一些实施方案中，核苷酸变异体包含造成表达差异（例如增加或减少表达）的核苷酸序列，即使氨基酸序列未被改变。多核苷酸变异体可因各种原因产生，例如为特定的宿主将密码子表达最佳化（改变人mRNA中的密码子成为较受细菌宿主，诸如大肠杆菌偏好的密码子）。
本文所述的多核苷酸可通过本领域已知的任何适当的方法产生。如本文的一些实施方案中所述，DNA序列是利用基因重组技术，通过分离或合成编码目标野生型蛋白的DNA序列来构建。在一些实施方案中，DNA序列的构建是利用基因重组技术，通过分离出超过一种编码二种目标多肽的DNA序列，再将这些DNA序列连结在一起以产生融合蛋白。
在一些实施方案中，可使用寡核苷酸合成器，通过化学合成来构建DNA序列。这类寡核苷酸可根据所需多肽的基酸序列来设计。标准方法可应用在合成编码目标多肽的多核苷酸序列。例如，可使用完整的氨基酸序列来构建逆翻译基因。此外，可合成含有编码特定多肽的核苷酸序列的DNA寡聚体。例如，可合成数个编码所需多肽的部分的小寡核苷酸，然后将其连结。个别的寡核苷酸通常包含用于互补性装配的5'或3'悬端。在一些实施方案中，合成编码所需的融合蛋白的核苷酸序列，以便这两种多肽是直接连接，而无插入肽连接子。
一旦装配后（通过合成、定点突变、基因重组技术或其它方法），可将编码所需的特定多肽的多核苷酸序列插入表达载体中并经过操作性连接至适合在所需宿主中表达所述多肽的表达调控序列。正确的组合可通过核苷酸定序、限制酶切作图和/或在合适的宿主中表达生物活性多肽来确认。如本领域中众所周知的，为了在宿主中高度表达经过转染的基因，必须将所述基因操作性连接至可在所选择的表达宿主中作用的转录和翻译表达调控序列。
本发明提供包含本文所述的多核苷酸的载体。本发明也提供包含所述载体或本文所述的载体或多核苷酸的细胞。
IV.药物组合物
本发明进一步提供包含结合一种或多种Wnt蛋白的药剂（例如可溶性FZD受体）和/或为Wnt拮抗剂的药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物包含如本文所述的Wnt结合剂和多肽。这些药物组合物可用于抑制肿瘤细胞生长和治疗人类患者的癌症。在一些实施方案中，如本文所述的Wnt结合剂可用于制造治疗癌症的药物。
通过将本发明的纯化的药剂或拮抗剂与药学上可接受的载体、赋形剂和/或稳定剂组合来制备为无菌冻干粉末、水溶液等形式的供存储和使用的制剂(Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,第21版,UniversityoftheSciences,Philadelphia,2005)。合适的载体、赋形剂或稳定剂包含非毒性缓冲剂，诸如，磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；盐类，诸如氯化钠；抗氧化剂，包括抗坏血酸及甲硫氨酸；防腐剂（例如十八烷基二甲苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵；氯化苄氧乙铵；苯酚、丁基醇或苄基醇；对羟基过苯甲酸烷基酯，诸如对羟基过苯甲酸甲酯或对羟基过苯甲酸丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇和间甲酚）；低分子量多肽(诸如少于约10个氨基酸残基）；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酸、天门冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；碳水化合物类，诸如单糖、双糖、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；形成盐的抗衡离子，诸如钠；金属复合物（例如，锌-蛋白质复合物）；和/或非离子型界面活性剂，诸如TWEEN或聚乙二醇（PEG)。
本发明的药物组合物可以任何数目的方式施用以供局部或全身性治疗。施用可为局部施用（诸如粘膜，包括阴道和直肠投递），诸如透皮贴片、膏剂、涂剂、乳膏、凝胶、滴液、栓剂、喷雾、液体和粉末；肺部施用（例如经由吸入或吹入粉末或气溶胶，包括通过雾化器；经由气管内、鼻内、表皮和透皮途径）；口服；或经由肠胃道外途径施用，包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌肉内注射或输注；或经由颅内途径（例如鞘内或脑室）施用。
治疗性制剂可为单位剂型。这类制剂包括用在口服、经由肠胃道外或直肠途径施用或用在经由吸入施用的片剂、丸剂、胶囊、粉末、颗粒、溶液或在水或非水性培养基中的混悬液，或栓剂。在固体组合物（诸如片剂）中，主要活性成分是与药物载体混合。传统的压片成分包括玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨醇、滑石粉、硬脂酸、硬脂酸镁、磷酸二钙或胶和其它稀释剂（例如水）以形成含有本发明的化合物或其非毒性药学上可接受的盐的均匀混合物的固态预制组合物。然后，将固态预制组合物再细分为上述类型的单位剂型。新型组合物的片剂、丸剂，等可经过涂布或经过复合来提供可赋予长效优势的剂型。例如，所述片剂或丸剂可包含由外成分覆盖的内组合物。此外，这两种成分可由肠衣层分开，所述肠衣层可用来抵抗崩解并可允许内成分完整通过胃部或延迟释出。可用在此类肠衣层或涂层的材料有多种，包括多种聚合酸和聚合酸与诸如虫胶、鲸蜡醇和醋酸纤维素这类物质的混合物。
药物制剂包括与脂质体复合的本发明的拮抗剂（例如，Wnt结合剂）(Epstein等,1985,PNAS,82:3688；Hwang等,1980,PNAS,77:4030；和美国专利第4,485,045和第4,544,545号)。美国专利5,013,556中公开了循环时间增加的脂质体。脂质体可通过逆相蒸发包含磷脂酰胆碱、胆固醇和聚乙二醇衍生化的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组成物来产生。将脂质体通过具有界定的孔径的过滤器挤出以产生具有所需直径的脂质体。
拮抗剂（例如Wnt结合剂）也可包在微胶囊中。这类微胶囊是通过（例如）凝聚技术或界面聚合法，例如分别使用羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊，在胶体药物递送系统（例如脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米粒子及纳米胶囊）或在粗乳剂中制备（如Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,第21版,UniversityoftheSciencesPhiladelphia,2005中所述）。
此外，可制备缓释制剂。缓释制剂的合适实例包括含有所述药剂的固态疏水聚合物的半渗透性基质，所述基质为成型制品形式（例如薄膜或微胶囊）。缓释基质的实例包括聚酯、水凝胶，诸如聚(2-羟乙基-丙烯酸甲酯)或聚(乙烯醇)、聚交酯（美国专利第3,773,919号)、L-谷氨酸与7乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯-醋酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物，诸如LUPRONDEPOTTM（由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林所组成的注射微球）、蔗糖醋酸异丁酸酯和聚-D-(-)-3-羟丁酸。
V.使用方法
本发明的Wnt结合剂（包括可溶性受体）可用在多种应用中，包括但不限于治疗性处理方法（诸如治疗癌症）。在某些实施方案中，所述药剂可用在抑制Wnt信号传递（例如，典型的Wnt信号传递）、抑制肿瘤生长、诱导分化、缩小肿瘤体积、降低癌干细胞发生频率和/或降低肿瘤的致瘤性。使用方法可为体外、离体或体内的方法。在某些实施方案中，所述Wnt结合剂或多肽为其所结合的一种或多种人Wnt蛋白的拮抗剂。
在某些实施方案中，所述Wnt结合剂或拮抗剂可用在治疗与Wnt信号传递活化相关的疾病。在特殊的实施方案中，所述疾病为一种依赖Wnt信号传递的疾病。在特殊的实施方案中，所述Wnt信号传递为典型的Wnt信号传递。在某些实施方案中，所述Wnt结合剂或拮抗剂可用在治疗特征为干细胞和/或祖细胞水平提高的病症。
在某些实施方案中，用Wnt结合剂或拮抗剂（例如，可溶性FZD受体、SFRP源性蛋白或可溶性Ror受体）治疗的疾病为一种癌症。在某些实施方案中，所述癌症的特征为Wnt依赖性肿瘤。在某些实施方案中，所述癌症的特征为表达一种或多种Wnt结合剂（例如可溶性受体）所结合的Wnt。
在某些实施方案中，用Wnt结合剂或拮抗剂治疗的疾病不是癌症。举例来说，所述疾病可为一种代谢病症，诸如肥胖症或糖尿病（例如II型糖尿病）(JinT.,2008,Diabetologia,51:1771-80)。或者，所述疾病可能为骨骼病症，诸如骨质疏松症、骨关节炎或类风湿性关节炎(CorrM.,2008,Nat.Clin.Pract.Rheumatol.,4:550-6；Day等,2008,BoneJointSurg.Am.,90Suppl1:19-24)。所述疾病也可能为一种肾脏病症，诸如多囊性肾病(Harris等,2009,Ann.Rev.Med.,60:321-37；Schmidt-Ott等,2008,KidneyInt.,74:1004-8；Benzing等,2007,J.Am.Soc.Nephrol.,18:1389-98)。或者，可治疗眼部病症，包括但不限于黄斑变性和家族性渗出性玻璃体视网膜病变(Lad等,2009,StemCellsDev.,18:7-16)。还可治疗心血管疾病，包括心肌梗塞、动脉粥样硬化和瓣膜疾病(Al-AlyZ.,2008,Transl.Res.,151:233-9；Kobayashi等,2009,Nat.CellBiol.,11:46-55；vanGijn等,2002,Cardiovasc.Res.,55:16-24；Christman等,2008,Am.J.Physiol.HeartCirc.Physiol.,294:H2864-70)。在一些实施方案中，所述疾病为一种肺部病症，诸如特发性肺动脉高血压或肺纤维化(Laumanns等,2008,Am.J.Respir.CellMol.Biol.,2009,40:683-91；等,2008PLoSONE,3:e2142)。在一些实施方案中，用Wnt结合剂治疗的疾病为一种肝脏疾病，诸如肝硬化或肝纤维化(Cheng等,2008,Am.J.Physiol.Gastrointest.LiverPhysiol.,294:G39-49)。
本发明提供治疗癌症的方法，其包括向受试者（例如，需要治疗的受试者）施用治疗有效量的Wnt结合剂。在某些实施方案中，所述癌症为选自由以下组成的组的癌症：结肠直肠癌、胰脏癌、肺癌、卵巢癌、肝癌、乳癌、肾脏癌、前列腺癌、胃肠癌、黑素瘤、子宫颈癌、膀胱癌、胶质母细胞瘤及头颈癌。在某些实施方案中，所述癌症为胰脏癌。在某些实施方案中，所述癌症为结肠直肠癌。在某些实施方案中，所述癌症为乳癌。在某些实施方案中，所述受试者为人。
本发明进一步提供使用本文所述的Wnt结合剂抑制肿瘤生长的方法。在某些实施方案中，所述抑制肿瘤生长的方法包括使肿瘤或肿瘤细胞与Wnt结合剂体外接触。例如，将表达标靶Wnt的永生细胞株或癌细胞株在添加Wnt结合剂以抑制肿瘤细胞生长的培养基中培养。在一些实施方案中，从患者的样品（诸如，例如组织活体切片、胸腔积液，或血液样本）分离出肿瘤细胞并在添加Wnt结合剂以抑制肿瘤细胞生长的培养基中培养。
在一些实施方案中，抑制肿瘤生长的方法包括使肿瘤或肿瘤细胞与Wnt结合剂（例如，FZD可溶性受体）在体内接触。在某些实施方案中，在动物模型中，使肿瘤或肿瘤细胞与Wnt结合剂接触。例如，可向已在免疫功能低下的小鼠（例如NOD/SCID小鼠）中生长的表达一种或多种Wnts的异种移植体施用Wnt结合剂以抑制肿瘤生长。在某些实施方案中，从患者的样品（诸如，例如组织活体切片、胸腔积液，或血液样本）分离出癌干细胞并将其注射入免疫功能低下的小鼠中，再向小鼠施用Wnt结合剂以抑制肿瘤细胞生长。在一些实施方案中，在将致瘤性细胞引入动物的同时或不久之后向动物施用Wnt结合剂，以便防止肿瘤生长。在一些实施方案中，Wnt结合剂是在致瘤性细胞已生长成特定大小的肿瘤后施用，以作为一种治疗剂。
在某些实施方案中，抑制肿瘤生长的方法包括向受试者施用治疗有效量的Wnt结合剂。在某些实施方案中，所述受试者是人。在某些实施方案中，所述受试者具有肿瘤或肿瘤已切除。
本发明还提供降低包含癌干细胞的肿瘤中的癌干细胞的发生频率的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的Wnt结合剂。此外，还提供诱导受试者中的肿瘤细胞分化的方法，其中所述方法包含向受试者施用治疗有效量的Wnt结合剂。在一些实施方案中，用在诱导肿瘤中的分化标记表达的方法包括向受试者施用治疗有效量的Wnt结合剂。在某些实施方案中，所述受试者为人。
在某些实施方案中，所述肿瘤为其中Wnt信号传递活跃的肿瘤。在某些实施方案中，活跃的Wnt信号传递为典型Wnt信号传递。在某些实施方案中，所述肿瘤为一种Wnt依赖性肿瘤。例如，在一些实施方案中，所述肿瘤对轴抑制素(axin)过度表达敏感。在某些实施方案中，所述肿瘤在腺瘤性息肉(APC)肿瘤抑制基因中不包含失活突变（例如截断突变）或在β-连环素基因中不包含活化突变。在某些实施方案中，所述肿瘤表达一个或多个Wnt基因标志(genesignature)的基因。在某些实施方案中，所述受试者中正接受治疗的癌症涉及这类肿瘤。
在某些实施方案中，所述肿瘤表达一种或多种Wnt结合剂结合的人Wnt蛋白。在某些实施方案中，所述肿瘤过度表达人Wnt。
在某些实施方案中，所述肿瘤为选自由以下组成的组的肿瘤：结肠直肠瘤、胰脏肿瘤、肺肿瘤、卵巢瘤、肝肿瘤、乳房肿瘤、肾脏肿瘤、前列腺瘤、胃肠瘤、黑素瘤、子宫颈瘤、膀胱瘤、胶质母细胞瘤和头颈肿瘤。在某些实施方案中，所述肿瘤为结肠直肠瘤。在某些实施方案中，所述肿瘤为胰脏肿瘤。在某些实施方案中，所述肿瘤为乳房肿瘤。
本发明还提供抑制细胞中的Wnt信号传递的方法，所述方法包括使细胞与有效量的Wnt结合剂接触。在某些实施方案中，所述细胞为肿瘤细胞。在某些实施方案中，所述方法为一种体内方法，其中所述使细胞与药剂接触的步骤包括向受试者施用治疗有效量的药剂。在一些替代实施方案中，所述方法为一种体外或离体方法。在某些实施方案中，受抑制的Wnt信号传递为典型的Wnt信号传递。在某些实施方案中，所述Wnt信号传递是通过Wnt1、Wnt2、Wnt3、Wnt3a、Wnt7a、Wnt7b和/或Wnt10b信号传递实现。在某些实施方案中，所述Wnt信号传递是通过Wnt1、Wnt3a、Wnt7b和/或Wnt10b信号传递实现。
此外，本发明提供降低肿瘤在受试者中的致瘤性的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的Wnt结合剂。在某些实施方案中，所述肿瘤包含癌干细胞。在一些实施方案中，肿瘤的致瘤性通过降低肿瘤中癌干细胞的发生频率而降低。在某些实施方案中，通过施用Wnt结合剂来降低肿瘤中的癌干细胞的发生频率。在某些实施方案中，所述药剂或抗体能够在动物模型（诸如小鼠异种移植模型）中降低包含癌干细胞的肿瘤的致瘤性。在某些实施方案中，肿瘤中的癌干细胞的数目或发生频率被降低至少约两倍、约三倍、约五倍、约十倍、约50倍、约100倍或约1000倍。在某些实施方案中，癌干细胞的数目或发生频率的降低通过使用动物模型的限数稀释分析来测定。有关使用限数稀释分析来测定肿瘤中的癌干细胞数目或频率降低的其它实例和指导可在以下中找到：例如，国际公布第WO2008/042236号、美国专利申请公布第2008/0064049号和美国专利申请公布第2008/0178305号，每一专利的全部内容都以引用的方式并入本文。
因此，本发明还提供降低肿瘤中的癌干细胞的发生频率的方法，所述方法包括使肿瘤与有效量的Wnt结合剂（例如可溶性FZD受体、可溶性Ror受体或SFRP-Fc融合蛋白）接触。
本发明进一步提供将致瘤性细胞分化成非致瘤性细胞的方法，所述方法包括使致瘤性细胞与Wnt结合剂接触（例如，通过向受试者施用Wnt结合剂来进行，其中所述受试者具有包含致瘤性细胞的肿瘤或已切除这类肿瘤）。在某些实施方案中，所述致瘤性细胞为胰脏肿瘤细胞。在某些替代实施方案中，所述致瘤性细胞为结肠肿瘤细胞。
本发明还提供本文所述的Wnt结合剂在诱导细胞（包括但不限在于肿瘤细胞）分化的用途。例如，本发明设想诱导细胞分化的方法，所述方法包括使细胞与有效量的本文所述的Wnt结合剂（例如可溶性FZD受体、可溶性Ror受体或SFRP-Fc融合蛋白）接触。本发明还提供诱导受试者的肿瘤中的细胞分化的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的Wnt结合剂。在某些实施方案中，所述肿瘤为胰脏肿瘤。在某些其它实施方案中，所述肿瘤为结肠肿瘤。
本发明进一步提供治疗受试者的疾病或病症的方法，其中所述疾病或疾病是与Wnt信号传递活化有关和/或特征为干细胞和/或祖细胞水平提高。在一些实施方案中，所述治疗方法包括向受试者施用治疗有效量的Wnt结合剂。在某些实施方案中，所述Wnt信号传递为典型的Wnt信号传递。
Wnt结合剂或拮抗剂是根据已知方法，以适当的药物组成物形式向患者施用。合适的施用方法包括但不限于静脉内（以大丸剂形式或在一段时间内连续输注来施用）、肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、动脉内、滑膜内、鞘内、口服、局部或吸入途径。
在某些实施方案中，除了施用Wnt结合剂外，治疗方法进一步包括在施用Wnt结合剂之前、同时和/或随后施用第二个治疗剂（例如抗癌剂）。本发明还提供包含Wnt结合剂与第二种治疗剂的医药组成物。
要了解，Wnt结合剂与第二种治疗剂的组合可以任何顺序或同时施用。在选定的实施方案中，Wnt结合剂将向已预先接受第二种治疗剂治疗的患者施用。在某些其它实施方案中，Wnt结合剂和第二种治疗剂将实质上同时或并行投药。例如，可在受试者接受第二种治疗剂的疗程（例如，化疗）的同时向受试者使用Wnt结合剂。在某些实施方案中，Wnt结合剂将在用第二种治疗剂治疗的一年内施用。在某些替代实施方案中，Wnt结合剂将在用第二种治疗剂进行的任何治疗的10、8、6、4或2个月内施用。在某些其它实施方案中，Wnt结合剂将在用第二种治疗剂进行的任何治疗的4、3、2或1周内施用。在一些实施方案中，Wnt结合剂将在用第二种治疗剂进行的任何治疗的5、4、3、2或1天内施用。要进一步了解，这二种药剂或治疗可在数小时或数分钟内（即，实质上同时）向受试者施用。
用至少两种治疗剂进行的组合疗法经常使用通过不同作用机制作用的药剂，虽然这并非必要的。使用具不同作用机制的药剂的组合疗法可能造成相加或协同效应。组合疗法可能允许每一药剂的使用剂量低于单一疗法中所使用的剂量，从而降低毒性副作用。组合疗法可能降低发展出抗药性癌细胞的可能性。在一些实施方案中，组合疗法包含影响（例如抑制或杀死）非致瘤性细胞的治疗剂和影响（例如抑制或杀死）致瘤性CSCs的治疗剂。
有用的治疗（例如抗癌）剂类别包括，例如抗微管蛋白剂、奥利斯汀(auristatins)、DNA小沟区结合剂、DNA复制抑制剂、烷化剂（例如，铂复合物，诸如顺铂、单(铂)、双(铂)和三核铂复合物及卡铂）、蒽环类、抗生素、抗叶酸剂、抗代谢剂、化疗增敏剂、倍癌霉素(duocarmycins)、依托泊苷(etoposides)、氟化嘧啶、离子载体、拉克左素(lexitropsins)、亚硝基脲、顺铂(platinols)、执行化合物(performingcompound)、嘌呤抗代谢剂、嘌呤霉素(puromycins)、辐射增敏剂、类固醇、紫杉烷类、拓扑异构酶抑制剂、长春花生物碱、等。在某些实施方案中，第二种治疗剂为一种抗代谢剂、抗有丝分裂剂、拓扑异构酶抑制剂或血管生成抑制剂。
可与Wnt结合剂组合施用的治疗剂包括化学治疗剂。因此，在一些实施方案中，治疗方或涉及组合施用本发明的Wnt结合剂与化学治疗剂或多种不同化学治疗剂的混合物。以Wnt结合剂治疗可在施用化学疗法之前、同时或随后发生。本发明所考虑的化学疗法包括本领域已知的化学物质或药物并且可从市面上购得，诸如吉西他滨、伊立替康、阿霉素、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷(“Ara-C”)、环磷酰胺、噻替哌（thiotepa)、白消安(busulfan)、细胞毒素(cytoxin)、太平洋紫杉醇、甲胺蝶呤、顺铂、美法仑(melphalan)、长春新碱和卡铂。组合施用可以包括共同投药（无论是在单一的药物制剂中还是使用分开的制剂），或以任何顺序连续施用，但一般是在一段期间内使用，从而使所有活性剂可以同时发挥其生物活性。这类化学治疗剂的制备方法和给药时间表可根据制造商的指示或由技术熟练的从业人员根据经验决定。这类化学疗法的制备方法和给药时间表也描述在ChemotherapyServiceEd.,M.C.Perry,Williams&Wilkins,Baltimore,Md(1992)中。
可用于本发明的化学治疗剂也包括但不限于烷基化剂，诸如噻替哌及环磷酰胺；磺酸烷酯，诸如白消安、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮杂环丙院，诸如苯柔多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、甲基多巴(meturedopa)及普力多巴(uredopa)；乙烯亚胺及甲基三聚氰胺(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙烯三聚氰胺、三乙烯磷酰胺、三乙烯硫代磷酰胺及三羟甲基三聚氰胺；氮芥，诸如苯丁酸氮芥、萘氮芥(chlornaphazine)、氯磷酰胺、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酸胺、二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、盐酸二氯甲基二乙胺氧化物、马法兰、新恩比兴(novembichin)、苯芥胆固醇(phenesterine)、拨尼氮芥(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶芥末；亚硝基脲，诸如卡莫司汀、氯脲菌素(chlorozotocin)、福替目丁(fotemustine)、洛莫司汀、嘧啶亚硝脲(nimustine)、雷莫司汀(ranimustine)；抗生素，诸如阿克拉霉素(aclacinomysins)、放线菌素、蒽霉素(authramycin)、重氮乙酰丝氨酸、博来霉素(bleomycins)、放线菌素(cactinomycin)、卡奇霉素(calicheamicin)、卡拉比辛(carabicin)、洋红霉素(caminomycin)、嗜癌菌素(carzinophilin)、色霉素(chromomycins)、更生霉素、柔红霉素、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-氧代-L-正白氨酸、阿霉素、表阿霉素、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素、霉酣酸、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycins)、培洛霉素(peplomycin)、紫菜霉素(potfiromycin)、嘌哈霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素、链脲菌素、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢剂，诸如甲胺蝶呤反5-氟尿嘧旋(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)，甲胺蝶呤、蝶罗呤(pteropterin)、三甲喋呤(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-统基曝哈、硫咪嘌呤(thiaraiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、氮杂胞苷、6-氮杂尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷、二脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷、5-FU；雄激素，诸如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄院(mepitiostane)，去气睾内酯(testolactone)；抗肾上腺，诸如胺鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如福林叶酸(frolinicacid)；醋葡醒内酯(aceglatone)；醛磷酰胺(aldophosphamide)葡糖苷；氨基乙酰丙酸；安丫啶(amsacrine)；贝曲布索(bestrabucil)；比山群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；迪氟法迈(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；艾氟米辛(elformithine)；依利醋铵(elliptiniumacetate)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓，羟基脲，香菇多糖；氯尼达明(lonidamine)；丙酮双脒腙(mitoguazone)；米托意酿(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋胺氮芥(phenamet)，吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼酸；2-乙基肼；甲基苄肼；PSK；雷佐生(razoxane)；西佐喃(sizofuran)；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonicacid)；三乙撑亚胺苯醌(triaziquone)；2,2',2''-三氯三乙胺；聚胺酯(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴晓(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴脱氧己六醇(mitolactol)；脉泊溴院(pipobroman)；嘉胞苷(gacytosine)；阿糖胞苷("Ara-C"）；环磷酰胺；塞替派；类毒素，例如例如太平洋紫杉醇(TAXOL)和多西紫杉醇(TAXOTERE)、苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；硫嘌呤；甲胺蝶呤；铂类似物，诸如顺铂及卡铂；长春新碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；异长春花碱；诺消灵(novantrone)；替尼泊苷；柔红霉素；氨基喋呤；希罗达(xeloda)；伊班膦酸盐(ibandronate)；CPT11；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；维甲酸；埃斯波霉素(esperamicins)；卡培他滨；和上述任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。化学治疗剂还包括在调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素剂，诸如抗雌激素，包括例如他莫昔芬、雷洛昔芬、芳香酶抑制剂4(5)-咪唑、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、雷洛西芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)及托瑞米芬(toremifene)(Fareston)；以及抗雄激素，诸如氟他胺(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、醋酸亮丙瑞林及戈舍瑞林(goserelin)；和上述任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
在某些实施方案中，化学治疗剂为一种拓扑异构酶抑制剂。拓扑异构酶抑制剂为干扰拓扑异构酶（例如，拓扑异构酶I或II）的作用的化学治疗剂。拓扑异构酶抑制剂包括但不限于：阿霉素HCl、柔红霉素柠檬酸盐、米托蒽醌HCl、放线菌素D、依托泊苷、拓扑替康HCl、替尼泊苷(VM-26)和伊立替康。在某些实施方案中，第二种治疗剂为伊立替康。在某些实施方案中，要治疗的肿瘤为结肠直肠肿瘤并且第二种治疗剂为一种拓扑异构酶抑制剂（诸如伊立替康）。在一些实施方案中，将Wnt结合剂包含SEQIDNO:53并且第二种治疗剂为伊立替康。在一些实施方案中，Wnt结合剂包含SEQIDNO:75并且第二种治疗剂为依立替康。
在某些实施方案中，化学治疗剂为一种抗代谢剂。抗代谢剂为一种化学物质，其结构类似于正常生化反应所需的代谢物，但与代谢物的不同之处足以干扰细胞的一种或多种正常功能（诸如细胞分裂）。抗代谢剂包括但不限于：吉西他滨、氟尿嘧啶、卡培他滨、甲胺蝶呤钠、雷替曲塞(ralitrexed)、培美曲塞、替加气(tegafur)、阿糖胞苷、硫鸟嘌呤、5-氮杂胞苷、6-硫基嘌呤、硫唑嘌呤、6-硫鸟嘌呤、喷托斯汀(pentostatin)、氟达拉滨(fludarabine)磷酸盐和克拉屈滨(cladribine)，以及这些药剂中任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。在某些实施方案中，第二种治疗剂为吉西他滨。在某些实施方案中，要治疗的肿瘤为胰脏肿瘤并且第二种治疗剂为抗代谢剂（例如，吉西他滨）。在一些实施方案中，Wnt结合剂包含SEQIDNO:53并且第二种治疗剂为吉西他滨。在一些实施方案中，Wnt结合剂包含SEQIDNO:75并且第二种治疗剂为吉西他滨。
在某些实施方案中，化学治疗剂为一种抗有丝分裂剂，包括但不限于结合微管蛋白的药剂。通过非限制性的实例说明，药剂包含紫杉烷。在某些实施方案中，药剂包含太平洋紫杉醇或多西紫杉醇，或太平洋紫杉醇或多西紫杉醇的药学上可接受的盐、酸或衍生物。在某些实施方案中，药剂为太平洋紫杉醇(TAXOL)、多西紫杉醇(TAXOTERE)、与白蛋白结合的太平洋紫杉醇(ABRAXANE)、DHA-太平洋紫杉醇或PG-太平洋紫杉醇。在某些替代实施方案中，抗有丝分裂剂包含长春生物碱，诸如长春新碱、长春花碱、长春瑞滨或长春地辛，或其药学上可接受的盐、酸或衍生物。在一些实施方案中，抗有丝分裂剂为一种Eg5驱动蛋白的抑制剂或有丝分裂激酶的抑制剂，诸如AuroraA或Plk1。在与Wnt结合剂或多肽组合施用的化学治疗剂包含抗有丝分裂剂的某些实施方案中，癌症或正接受治疗的肿瘤为乳癌或乳房肿瘤。在某些实施方案中，要治疗的肿瘤为乳房肿瘤并且第二种治疗剂为太平洋紫杉醇。在一些实施方案中，Wnt结合剂包含SEQIDNO:53并且第二种治疗剂为太平洋紫杉醇。在一些实施方案中，Wnt结合剂包含SEQIDNO:75并且第二种治疗剂为太平洋紫杉醇。
在某些实施方案中，治疗涉及组合施用本发明的Wnt结合剂和放射疗法。用Wnt结合剂的治疗可在施用放射疗法之前、同时和/或随后发生。用于这类放射疗法的任何给药时间表可由技术熟练的从业人员的决定来使用。
在一些实施方案中，第二种治疗剂包含抗体。因此，治疗可能涉及组合施用本发明的Wnt结合剂与针对肿瘤相关抗原的抗体（包括但不限于结合EGFR、ErbB2、HER2、DLL4、Notch和/或VEGF的抗体）。例如，美国专利第7,750,124号中描述了抗DLL4抗体，其全部内容以引用的方式并入本文。其它抗DLL4抗体描述于（例如）国际专利公布第WO2008/091222号和第WO2008/0793326号以及美国专利第US2008/0014196号、第US2008/0175847号、第US2008/0181899号和第US2008/0107648号（每一专利的全部内容以引用的方式并入本文）中。在某些实施方案中，第二种治疗剂为一种作为血管生成抑制剂的抗体（例如，抗VEGF抗体）。在一些实施方案中，Wnt结合剂包含SEQIDNO:53并且第二种治疗剂为抗VEGF抗体。在一些实施方案中，Wnt结合剂包含SEQIDNO:75并且第二种治疗剂为抗VEGF抗体。在某些实施方案中，第二种治疗剂为一种Notch信号传递抑制剂。在一些实施方案中，第二种治疗剂为抗Notch抗体。示例性抗Notch抗体描述在（例如）美国专利申请公布第US2008/0131434号（其全部内容以引用的方式并入本文）中。在某些实施方案中，第二种治疗剂为贝伐单抗(AVASTIN)、曲妥珠单抗(trastuzumab,HERCEPTIN)、帕尼单抗(panitumumab,VECTIBIX)或西妥昔单抗(ERBITUX)。组合施用可包括共同施用（无论是在单一药物制剂中还是使用分开的制剂），或以任何顺序连续施用，但一般是在一段期间内使用，从而使所有活性剂可以同时发挥其生物活性。
此外，治疗可包括施用一种或多种细胞因子（例如，淋巴因子、白介素、肿瘤坏死因子和/或生长因子），或可以伴随使用外科手术切除肿瘤或癌细胞或任何其它主治医生认为必要的疗法。
对于疾病的治疗来说，本发明的药剂的适当剂量取决于要治疗的疾病的类型、疾病严重程度和进展状态、疾病的反应性、施用所述药剂是为了治疗或预防目的、先前疗法、患者的临床病史等，均由主治医生来酌情权衡。所述药剂可一次施用或在持续数天至数个月的系列治疗中施用，或施用直到病愈或达到疾病状态减轻（例如，肿瘤的大小缩小）。最理想的给药时间表可从测量药物在患者体内积聚的情况计算得出并且将根据个别药剂的相对效カ而有不同。实施施用的医师可轻松地确定最佳剂量、给药方法和重复率。在某些实施方案中，每公斤体重的剂量为0.01μg到100mg，并且可每天、每周、每月或每年施用一次或多次。在某些实施方案中，可溶性受体或其它Wnt结合剂的剂量是从每公斤体重约0.1mg至约20mg。在某些实施方案中，每周施用一次Wnt结合剂。在某些实施方案中，每两周或每三周施用一次Wnt结合剂。治疗医师可根据测得的药物在体液或组织中的停留时间和浓度估算重复给药率。
本发明进一步提供筛选药剂抑制Wnt信号传递的效力、抗肿瘤活性和/或对抗癌干细胞的活性的方法。在某些实施方案中，所述方法包含比较已接触所述药剂的第一实体肿瘤（例如，包含癌干细胞的实体肿瘤）中的一种或多种分化标记和/或一种或多种干细胞性标记的水平与未曾接触所述药剂的第二实体肿瘤中的一种或多种分化标记的水平。在一些实施方案中，所述方法包括：(a)使第一实体肿瘤接触所述药剂，但第二实体肿瘤则不接触；(b)评估第一和第二实体肿瘤中的一种或多种分化标记和/或一种或多种干细胞性标记的水平；及(c)比较第一实体肿瘤中的一种或多种分化标记的水平与第二实体肿瘤中的一种或多种分化标记的水平。在某些实施方案中，所述(a)相对于第二实体肿瘤中的一种或多种分化标记的水平而言，所述第一实体肿瘤中的一种或多种分化标记的水平增加表示具有抗肿瘤（或抗癌干细胞）活性；并且所述(b)一种或多种干细胞性标记的水平降低表示具抗肿瘤（或抗癌干细胞）活性。在某些实施方案中，所述药剂结合一种或多种Wnt蛋白。在某些实施方案中，所述药剂为FZD可溶性受体。在某些方法中，所述药剂为一种抗体，诸如抗Wnt抗体。
用于其它筛选的方法包括但不仅限于包括以下的方法：比较已接触一种药剂的第一实体肿瘤中的一种或多种分化标记的水平与未曾接触所述药剂的第二实体肿瘤中的一种或多种分化标记的水平。在某些实施方案中，所述方法包括包含：(a)使第一实体肿瘤接触所述药剂，但第二实体肿瘤则不接触；(b)评估第一和第二实体肿瘤中的一种或多种分化标记的水平；及(c)比较第一实体肿瘤中的一种或多种分化标记的水平与第二实体肿瘤中的一种或多种分化标记的水平。在某些实施方案中，所述药剂为Wnt结合剂。在某些实施方案中，所述药剂为典型Wnt信号传递途径的抑制剂。在某些实施方案中，所述药剂抑制一种或多种人Wnt蛋白结合一种或多种人FZD受体。在某些实施方案中，相对于第二实体肿瘤中的一种或多种分化标记的水平，第一实体肿瘤中的一种或多种分化标记的水平增加表示具有对抗实体肿瘤干细胞(CSCs)的效力。在某些替代实施方案中，相对于第二实体肿瘤中的一种或多种分化标记的水平，第一实体肿瘤中的一种或多种分化标记（即，负分化标记）的水平降低表示具有抗实体肿瘤干细胞的效力。
在某些实施方案中，在筛选方法中的实体肿瘤为胰脏肿瘤。在某些实施方案中，实体肿瘤为胰脏肿瘤并且一种或多种分化标记可包含一种或多种粘蛋白（例如Muc16）、一种或多种细胞角蛋白（例如CK20）和/或嗜铬粒蛋白A(CHGA)。
在某些替代实施方案中，筛选方法中的实体肿瘤为结肠肿瘤。在一些实施方案中，实体肿瘤为结肠肿瘤并且一种或多种分化标记可能包含一种或多种细胞角蛋白（例如细胞角蛋白7或CK20)。
在某些实施方案中，用于本文所述的筛选方法中的一种或多种干细胞性标记包含ALDH1A1、APC、AXIN2、BMI1、CD44、FGF1、GJB1、GJB2、HES1、JAG1、LGR5、LHX8、MYC、NANOG、NEUROD1、NEUROG2、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4、PROCR、RARRES1、RARRES3、RBP2、SOX1、SOX2、ASCL2、TDGF1、OLFM4、MSI1、DASH1、EPHB3和/或EPHB4。在某些实施方案中，两或更多种干细胞性标记、三或更多种干细胞性标记、四或更多种干细胞性标记、五或更多种干细胞性标记、六或更多种或十或更多种干细胞性标记选自由以下组成的组：ALDH1A1、APC、AXIN2、BMI1、CD44、FGF1、GJB1、GJB2、HES1、JAG1、LGR5、LHX8、MYC、NANOG、NEUROD1、NEUROG2、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4、PROCR、RARRES1、RARRES3、RBP2、SOX1、SOX2、ASCL2、TDGF1、OLFM4、MSI1、DASH1、EPHB3和EPHB4。
在某些实施方案中，用于筛选方法中的一种或多种分化标记包含ALDOB、BMP2、BMP7、BMPR1B、CEACAM5、CEACAM6、CDX1、CDX2、CLCA2、COL1A2、COL6A1、CHGA、CSTA、CST4、CK20、DAB2、FABP4、GST1、KRT4、KRT7、KRT15、KRT17、KRT20、LAMA1、MUC3A、MUC4、MUC5AC、MUC5B、MUC13、MUC15、MUC16、MUC17、NDRG2、PIP、PLUNC、SPRR1A、REG4、VSIG1和/或XAF1。在某些实施方案中，用于筛选方法中的两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种或十种或更多种分化标记选自由以下组成的组：ALDOB、BMP2、BMP7、BMPR1B、CEACAM5、CEACAM6、CDX1、CDX2、CLCA2、COL1A2、COL6A1、CHGA、CSTA、CST4、CK20、DAB2、FABP4、GST1、KRT4、KRT7、KRT15、KRT17、KRT20、LAMA1、MUC3A、MUC4、MUC5AC、MUC5B、MUC13、MUC15、MUC16、MUC17、NDRG2、PIP、PLUNC、SPRR1A、REG4、VSIG1和XAF1。
用于胰脏和结肠以及其它肿瘤类型的其它可能的分化标记是本领域技术人员已知的。此外，可能的分化标记在筛选方法中的用途可通过本领域技术人员用一种或多种本文所描述的可溶性FZD受体（诸如FZD8-Fc）治疗需要的肿瘤类型，然后再评估所述标记在经过治疗的肿瘤中相对于对照组中的表达变化来轻松地评估。这类方法的非限制性实例可（例如）在以下具体实施例中找到。
本发明进一步提供用于制造可溶性Wnt结合剂的方法。在某些实施方案中，所述方法包括制造在细胞中包含人FZD8的Fri结构域的可溶性Wnt结合剂（其中所述Wnt结合剂的至少80%具有ASA的N端序列），所述方法包括使用选自以下组成的组的信号序列：SEQIDNO:71、SEQIDNO:70、SEQIDNO:72、SEQIDNO:73和SEQIDNO:74来自制造Wnt结合剂。在方法的一些实施方案中，信号序列是SEQIDNO:71。在一些实施方案中，所述Wnt结合剂的至少约90%、至少约95%或至少约98%具有ASA的N端序列。在一些实施方案中，所述细胞为哺乳动物细胞。在一些实施方案中，所述Wnt结合剂包含人Fc区。在一些实施方案中，所述Wnt结合剂包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQIDNO:53、SEQIDNO:50、SEQIDNO:46、SEQIDNO:48和SEQIDNO:1。在一些实施方案中，所述Wnt结合剂包含SEQIDNO:53。在一些实施方案中，所述Wnt结合剂包含SEQIDNO:50。在一些实施方案中，所述细胞包含多核苷酸，所述多核苷酸包含编码具有SEQIDNO:75的序列的多肽的多核苷酸。
实施例
应理解，本文所述的实施例和实施方案仅用于说明目的，并且本领域技术人员根据这些实施例和实施方案将可联想到各种修改或变化，并且这些修改或变化应包括在本申请的精神和范围内。
实施例1
FZD8-Fc的制造方法
将编码FZD8-Fc(54F03)的cDNA亚克隆到pEE14.4表达载体(Lonza)中，用HindIII和EcoRI酶切。克隆后，用PvuI酶切以将PEE14.4-FZD8-FcDNA线性化，随后再采用标准程序，通过电穿孔法将其引入GS-CHOK1细胞中。取得表达FZD8-Fc的稳定克隆，并将其在不含血清的培养基中增殖。使用与蛋白A共轭结合的树脂，通过亲和力捕捉来纯化FZD8-Fc。SDS-PAGE分析结果揭示出其纯度大于98%并且内毒素水平低于1EU/毫克蛋白质。
FZD8-Fc的氨基酸序列为SEQIDNO:1并且编码FZD8-Fc的多核苷酸序列为SEQIDNO:2。
实施例2
大鼠中的FZD8-Fc的药物动力学
在两周的药物动力学(PK)研究中，使用2mg/kg及10mg/kg的剂量在大鼠中评估FZD8-Fc(54F03)的药物动力学。经由尾静脉用2mg/kg或10mg/kg的FZD8-Fc对每一组中的5只雄性SpragueDawley大鼠给药，追踪两周并在1、24、48、72、96、168、240和336小时的时间点收集样品。在每一时间点收集1ml血液到钾-EDTA管中并进行离心。收集血浆上清液并冷冻，直至分析样品。
对每一时间点的血浆中所存在的FZD8-Fc融合蛋白的水平进行定量并计算两种剂量的FZD8-Fc的半衰期。如图1中所示，据估计，剂量为2mg/kg的FZD8-Fc的半衰期为163小时，在10mg/kg时为157小时。
实施例3
FZD8-Fc在胰脏肿瘤模型中的抗肿瘤活性
在胰脏肿瘤模型中双FZD8-Fc抑制肿瘤生长。在PN4胰脏肿瘤异种移植模型中评估FZD8-Fc(54F03)的抗肿瘤活性。将分离的OMP-PN4细胞（50,000/动物）皮下途径注射到6-8周龄的雄NOD/SCID小鼠中。每周监测肿瘤生长，一旦可触知肿瘤时，就开始测量肿瘤。在第50天，将具有平均肿瘤体积为137mm3的小鼠随机分成4组，每组10只。为动物注射对照组抗体、FZD8-Fc(15mg/kg)、吉西他滨(2mg/kg)或FZD8-Fc与吉西他滨的组合。施用FZD8-Fc和吉西他滨是经由注射到腹膜内腔来进行，每周一次（吉西他滨）或每周两次(FZDS-Fc)。每周测量肿瘤两次并使用公式1/2(a×b2)(其中a=长度而b=宽度）测定肿瘤体积。数据以平均值和平均值±S.E.M.表示。使用Student双尾试验、非配对t试验比较小组平均值。概率(P)值<0.05被解释为具有显著差异。
如图2所示，用FZD8-Fc治疗可使肿瘤生长减少66%(p<0.001)。此外，相对于用单独的FZD8-Fc治疗，用FZD8-Fc和吉西他滨治疗使肿瘤生长减少29%（相对于单独的FZD8-Fc，p=0.04)（图2）。因此，FZD8-Fc可以单一药剂和与吉西他滨组合的形式在PN4胰脏肿瘤模型中显示出抗肿瘤生长活性。
用FZD8-Fc治疗的PN4肿瘤中CD44hi群体减少。在研究结束时（第85天）收获来自上述OMP-PN4异种移植研究的对照组和经过治疗的肿瘤。处理肿瘤并将其分解成单一细胞。将源自每一治疗组的5个肿瘤的单细胞混悬液汇集，然后将汇集的样品在冰上与选择性结合小鼠细胞的抗体（α-小鼠CD45-生物素1:200稀释液和大鼠α-小鼠H2Kd-生物素1:100稀释液，加州圣地牙哥，BioLegend）一起孵育30分钟，再添加经过抗生蛋白链菌素标示的磁珠（加州卡尔斯巴德，Invitrogen公司）。借助磁铁的协助除去小鼠细胞。为了分析人细胞表面标记，用直接与荧光染料共轭结合的抗ESA（加州Hayward，Biomeda）和抗CD44（加州圣荷西，BD生物科学）抗体将单一肿瘤细胞混悬液染色。使用存活力染料DAPI来排除死亡细胞。使用FACSAria仪器（新泽西州，富兰克林湖市，BectonDickinson公司）进行流式细胞分析。使用侧向散射和前向散射变化轮廓来排除细胞团块。
分析用对照抗体治疗的肿瘤揭示出12.7%的大块肿瘤群同时表达出高水平的ESA和CD44两者。如图3所示，双阳性群体未显著受到用单独的吉西他滨(13.9%)治疗影响，但用FZD8-Fc或FZD8-Fc与吉西他滨的组合治疗时可缩小该双阳性群体（分别为1.9%和1.7%）。
通过限数稀释分析来分析经过FZD8-Fc治疗的PN4肿瘤。限数稀释分析(LDA)可用来评估治疗剂对实体肿瘤癌干细胞和包含该癌干细胞的肿瘤的致瘤性的效果。这类分析可用来测定用FZD8-Fc融合蛋白或其它治疗剂治疗的动物的肿瘤中的癌干细胞的发生频率，并与对照组动物的肿瘤中的癌干细胞的发生频率相比较。
在研究结束（第85天）时，收获来自上述PN4异种移植研究的对照组和经过治疗的肿瘤。处理肿瘤并将其分解成单一细胞。将来自每一治疗组的5个肿瘤的单一细胞混悬液汇集，然后将汇集样品在冰上与选择性结合小鼠细胞的抗体（α-小鼠CD45-生物素1:200稀释液和大鼠α-小鼠H2Kα-生物素1:100稀释液，加州圣地牙哥，BioLegend）一起孵育30分钟，再添加经过抗生蛋白链菌素标示的磁珠（加州，卡尔斯巴德，Invitrogen公司）。借助磁铁的协助除去小鼠细胞。收获、计算混悬液中的人细胞并对细胞表面标记进行染色，将在FACS缓冲液中的合适的细胞剂量（30、90和270个细胞）与Matrigel以1:1混合并且皮下注射到NOD/SCID小鼠中（每一治疗组每一剂量10只小鼠）。使肿瘤生长4个月。
在所需的时间点，在所有经过注射用FZD8-Fc治疗的肿瘤细胞的组中测定具有可检测的肿瘤的小鼠百分比，并与对照组中具有可检测的肿瘤的小鼠百分相比较。例如，测定经过注射125个用对照抗体治疗的肿瘤细胞的小鼠中具有的可检测的肿瘤的小鼠数目，并将此数目与经过注射125个用FZDS-Fc治疗的肿瘤细胞的小鼠中具有的可检测的肿瘤的小鼠数目相比较。
在注射细胞后第75天，每一组中的肿瘤侵染率如下：对照组-30只小鼠的7只；FZD8-Fc-30只小鼠的3只；吉西他滨-30只小鼠的7只；FZD8-Fc与吉西他滨-30只小鼠的0只（图4）。FZD8-Fc组及组合治疗组中的肿瘤侵染率降低表示FZD8-Fc可降低PN4胰脏肿瘤中的癌干细胞的发生频率。从评估CD44的表达和限数剂量稀释分析得到的证据揭示出FZD8-Fc治疗可以减少PN4胰脏肿瘤中的癌干细胞的发生频率。
癌干细胞(CSC)的发生频率可使用L-CalcTM软件（干细胞科技公司(StemCellTechnologies)；www.stemcell.com）计算出。简单来说，基于泊松(Poisson)统计，如果37%的动物无法发展肿瘤，那么在已知的注射的细胞数中正好存在一个癌干细胞。用对照组抗体治疗的小组中CSC的发生频率为1:280，用吉西他滨治疗的小组中CSC的发生频率为1:476，用FZD8-Fc治疗的小组中CSC的发生频率为1:881，而用FZD8-Fc与吉西他滨组合治疗的小组中CSC的发生频率为1:3763。由于即使是在最高细胞剂量下肿瘤在此组中的侵染率是零，所以此数字可能无法被准确地确定。
实施例4
通过FZD8-Fc增加胰脏肿瘤的细胞分化
用FZD8-Fc治疗的PN4和PN8肿瘤中的细胞分化增加。在研究结束（第85天）时，收获来自上述OMP-PN4异种移植研究（实施例3）的对照组和经过治疗的肿瘤。将肿瘤在福马林中固定，包埋在石蜡中并切成4μm厚的切片。脱蜡并水化后，在室温下，用醋酸水溶液处理切片5分钟。然后，用在3%醋酸水溶液中的1%阿尔新蓝处理切片30分钟，再用水洗净。将切片在中性快速红中进行复染色、脱水并固定。使用此方法，在组织样品中的唾液酸粘蛋白(sialomucins)染上蓝色，并且背景显示为粉红色或红色。
与用对照抗体或吉西他滨治疗的肿瘤相比较，用FZD8-Fc治疗PN4肿瘤使表达唾液酸粘蛋白的细胞增加（图5，其中唾液酸粘蛋白显示出为暗灰色）。用FZD8-Fc和吉西他滨组合治疗也增加PN4胰脏肿瘤中的唾液酸粘蛋白的表达。因此，用FZD8-Fc治疗PN4肿瘤可增加表达唾液酸粘蛋白的已分化细胞的发生频率。类似的结果可在PN8胰脏肿瘤的异种移植模型中见到（图6）。
用FZD8-Fc治疗的PN13肿瘤中细胞分化增加。同样在OMP-PN13胰脏肿瘤异种移植模型中评估FZD8-Fc的细胞分化能力。将经过分离的OMP-PN13细胞（每只动物50,000个）皮下注射到6-8周龄的雄性NOD/SCID小鼠中。每周监测肿瘤生长，一旦可触知肿瘤时，就开始测量肿瘤。在第40天，将平均肿瘤体积为114mm3的小鼠随机分成4组，每组10只。为动物注射对照抗体或FZD8-Fc(15mg/kg)。经由注射到腹膜内腔来施用FZD8-Fc和对照抗体，每周两次。治疗19天后，切除肿瘤并采用标准技术进行免疫组织化学分析。简单来说，将肿瘤在福马林中固定，包埋在石蜡中并切成4μm厚的切片。脱蜡并水化后，将肿瘤切片在Tris缓冲液(pH9.5)中进行抗原撷取流程(retrievalprocess)。将切片与过氧化氢（密苏里州圣路易市，Sigma-Aldrich公司）一起孵育10分钟来阻断内源性过氧化物酶。将在阻断缓冲液（在PBS中，3%NHS、1%BSA、0.1%吐温20）中稀释200倍的抗Ki67抗体（Dako，克隆MIB-1）添加到每一切片中并孵育1小时。在PBST中轻洗玻片3次，每次5分钟。将与HRP(ImmPRESSTM抗小鼠，加州柏宁顿VectorLaboratories公司）共轭结合的抗小鼠二级抗体加至玻片上并孵育30分钟。用PBST清洗多次后，添加VectorNovaRed底物（加州柏宁顿，VectorLaboratories公司）来定位Ki67抗原。在室温下，用醋酸水溶液处理切片5分钟。然后，以在3%醋酸水溶液中的1%阿尔新蓝处理切片30分钟，再以水洗净。将切片在中性快速红中进行复染色、脱水并固定。使用此方法，在组织样品中的唾液酸粘蛋白染上蓝色，且增殖的细胞被标记为暗红色。
与用对照抗体治疗的肿瘤相比较，用FZD8-Fc治疗PN13肿瘤使表达唾液酸粘蛋白的细胞增加。Ki67的表达指出用FZD8-Fc治疗PN13肿瘤也使细胞增殖减少。图7显示来自经过FZD8-Fc治疗的肿瘤的组织中，增殖的细胞数量明显减少（由黑点确定）。因此，用FZD8-Fc治疗PN13肿瘤可减少细胞增殖并增加表达粘蛋白的已分化细胞的发生频率。
用FZD8-Fc治疗的PN13肿瘤中Muc16染色增加。取得来自用对照抗体或FZD8-Fc治疗的PN13肿瘤的肿瘤切片并如上述来处理。在这个实施例中，将在阻断缓冲液（在PBS中，3%NHS、1%BSA、0.1%吐温20）中稀释200倍的抗Muc16（麻省剑桥，Abeam）抗体添加到每一切片中并孵育1小时。利用上述的免疫组织化学方案检测结合的抗体。
与用对照抗体治疗的肿瘤相比较，用FZD8-Fc治疗PN13肿瘤使表达Muc-16的细胞增加（图8，暗染色）。
用FZD8-Fc治疗的PN13肿瘤中CK20染色增加。如上述取得并处理肿瘤切片。在这个实施例子中，将在阻断缓冲液（在PBS中，3%NHS、1%BSA、0.1%吐温20）中稀释1:200倍的抗CK20（克隆Ks20.8，加州卡平特里亚(Carpinteria)，Dako）抗体添加到每一切片中并孵育1小时。利用上述的免疫组织化学检测方案检测结合的抗体。
与用对照抗体治疗的肿瘤相比较，用FZD8-Fc治疗PN13肿瘤使表达CK20的细胞增加（图9，暗染色）。
实施例5
通过FZD8-Fc抑制体内乳房肿瘤生长
将经过分离的PE13乳房肿瘤细胞（每只动物50,000个）皮下注射到NOD/SCID小鼠的乳脂肪垫中。每周监测小鼠并使肿瘤生长直到肿瘤体积为106mm3。在注射细胞后27天，将小鼠随机分为4个治疗组（n=10只/组）并用对照抗体、FZD8-Fc(54F03)、紫杉醇或FZD8-Fc与紫杉醇的组合进行治疗。经由腹膜内途径施用剂量为7.5mg/kg的紫杉醇，每周一次，以及经由腹膜内途径施用量为5mg/kg的FZD8-Fc，每周二次。在图10所指出的那天测量肿瘤。
相对于对照抗体组，用单一药剂形式的FZD8-Fc治疗时，可观察到肿瘤生长减少20%(p=0.002)。此外，与用单独的紫杉醇治疗相比较，用FZD8-Fc与紫杉醇的组合治疗可使肿瘤生长减少55%(p=0.003)（图10）。
实施例6
通过FZD8-Fc抑制体内结肠肿瘤生长
分析多剂量的FZD8-Fc(54F03)和给药方案对C28结肠肿瘤异种移植的生长的效果。将经过分离的C28细胞（每只动物10,000个）皮下注射到6-8周龄的雄性NOD/SCID小鼠中。第2天，将小鼠随机分成6组，每组10只。为动物注射对照抗体或下列剂量的FZD8-Fc：1.5mg/kg（每周二次）、5mg/kg（每周一次和二次）和15mg/kg（每周一次和二次）。经由注射到腹膜内腔来施用抗体和FZD8-Fc。每周监测肿瘤生长，一旦可触知肿瘤时，就开始测量肿瘤。每周测量肿瘤两次并如本文所述测定肿瘤体积。
如图11A所示，与用对照抗体治疗组相比较，用15mg/kg的FZD8-Fc（每周二次）治疗可使肿瘤生长减少83%(p<0.001)。此外，与用对照抗体治疗组相比较，用经过评估的最低剂量的FZD8-Fc（每周二次1.5mg/kg）治疗可使肿瘤生长减少52%（图11A）。因此，为单一药剂形式的FZD8-Fc可在OMP-C28结肠肿瘤模型中显示出剂量依赖性的抗肿瘤生长活性。
分析FZD8-Fc(54F03)与化学治疗剂组合时对C28结肠肿瘤异种移植生长的效果。将经过分离的C28结肠肿瘤细胞（10,000个细胞）皮下注射到6-8周龄的雄性NOD/SCID小鼠中。使肿瘤生长21天，直到肿瘤平均体积达到128mm3。将小鼠随机分组（每组10只），并用FZD8-Fc(54F03)（5mg/kg，每周一次）、伊立替康（15mg/kg，每周一次）和FZD8-Fc与伊立替康的组合或对照抗体治疗。经由注射到腹膜内腔来施用FZDS-Fc和对照抗体。监测肿瘤生长并在指定的时间点用电子卡尺测量肿瘤体积。数据以平均值±S.E.M.表示。
如图11B所示，与对照抗体(-■-)治疗组相比较，用单一药剂形式的FZD8-Fc(-▲-)治疗可使肿瘤生长减少66%(p<0.001)。此外，与用对照抗体治疗组相比较，用FZD8-Fc与伊立替康的组合(-●-)治疗可使肿瘤生长减少76%(p<0.001)，此数值高于单独使用任一药剂的情况。因此，FZD8-Fc和FZD8-Fc与化学治疗剂的组合可在OMP-C28结肠肿瘤模型中显示出抗肿瘤生长活性。
实施例7
通过FZD8-Fc增加结肠肿瘤的细胞分化
用FZD8-Fc增加在C28肿瘤中的CK20染色。在研究结束时收获来自上述（实施例6）C28异种移植研究中的对照肿瘤和经过治疗的肿瘤。切除肿瘤并采用标准技术进行免疫组织化学分析。简单来说，将肿瘤在福马林中固定，包埋在石蜡中并切成4μm厚的切片。脱蜡并水化后，将肿瘤切片在Tris缓冲液(pH9.5)中进行抗原撷取流程。将切片与过氧化氢（密苏里州圣路易市，Sigma-Aldrich公司）一起孵育10分钟以阻断内源性过氧化物酶。将在阻断缓冲液（在PBS中，3%NHS、1%BSA、0.1%吐温20）中稀释200倍的抗CK20抗体（克隆Ks20.8，Dako，加州Carpinteria）添加到每一切片中并孵育1小时。在PBST中清洗玻片3次，每次5分钟。将与HRP（ImmPRESSTM抗小鼠免疫球蛋白，加州柏宁顿，VectorLaboratories公司）共轭结合的抗小鼠二级抗体添加至玻片上并孵育30分钟。用PBST清洗多次后，加入VectorNovaRed底物（加州柏宁顿，VectorLaboratories公司）来定位CK20抗原。
与用对照抗体治疗的肿瘤相比较，用FZD8-Fc治疗C28肿瘤使表达CK20的细胞增加（图12，暗染色）。
实施例8
FZDS-Fc在胰脏肿瘤模型中的抗肿瘤活性
在PN21胰脏肿瘤模型中通过FZD8-Fc抑制肿瘤生长。在PN21胰脏肿瘤异种移植模型中评估FZD8-Fc(54F03)的抗肿瘤活性。将分离的OMP-PN21细胞（每只动物50,000个）皮下注射到6-8周龄的雄性NOD/SCID小鼠中。每周监测肿瘤生长，一旦可触知肿瘤时，就开始肿瘤测量。在第36天，将平均肿瘤体积为144mm3的小鼠随机分成4组，每组9只。为动物注射对照组抗体、FZD8-Fc(15mg/kg）、吉西他滨（2mg/kg）或FZD8-Fc与吉西他滨的组合。经由注射到腹膜内腔来施用FZD8-Fc和吉西他滨，每周一次。每周测量肿瘤两次，并如本文所述测定肿瘤体积。
如图13A所示，与对照组相比较，用FZD8-Fc的治疗使肿瘤生长减少66%(p<0.001)。此外，与用任ー单独药剂的治疗相比较，用FZD8-Fc与吉西他滨的组合治疗时肿瘤生长减少较多（相对于吉西他滨，p=0.001）。因此，FZD8-Fc作为单一药剂或与吉西他滨组合时可在PN21胰脏肿瘤模型中显示出抗肿瘤生长活性。
通过限数稀释分析来分析经过FZD8-Fc治疗的PN21肿瘤。如以上实施例3所述，使用限数稀释分析来评估用单独的FZD8-Fc或FZD8-Fc与吉西他滨的组合治疗时对PN21胰脏肿瘤模型中的实体肿瘤癌干细胞的效果。
在研究结束时，收获来自上述PN21异种移植研究的对照组和经过治疗的肿瘤。处理肿瘤并将其分解成单一细胞。将来自每一治疗组的5个肿瘤的单细胞混悬液汇集，然后将经过汇集的样品在冰上与选择性结合小鼠细胞的抗体（α-小鼠CD45-生物素1:200稀释液和大鼠α-小鼠H2Kd-生物素1:100稀释液，加州圣地牙哥，BioLegend)一起孵育30分钟，再添加经过抗生蛋白链菌素标记的磁珠（加州，卡尔澌巴德，Invitrogen公司）。借助磁铁的协助除去小鼠细胞。收获、计算混悬液中的人细胞并对细胞表面标记进行染色，将在FACS缓冲液中的合适的细胞剂量（30、90和270个细胞）与Matrigel以1:1混合并皮下注射到NOD/SCID小鼠中（每一治疗组每一剂量10只小鼠）。使肿瘤生长4个月。
在需要的时间点，在注射经过治疗的肿瘤细胞的所有组中测定具有可检测的肿瘤的小鼠百分比，并与对照组中具有可检测的肿瘤的小鼠百分相比较。例如：测定在经过注射125个用对照抗体治疗的肿瘤细胞的小鼠中具有可检测的肿瘤的小鼠数目，并将此数目与已注射125个用FZD8-Fc治疗的肿瘤细胞的小鼠中具有可检测的肿瘤的小鼠数目相比较。
在注射细胞后第72天，测定每一组中的肿瘤侵染率并使用L-CalcTM软件（StemCell技术公司；www.stemcell.com）计算癌干细胞的发生频率。如图13B所示，与用对照抗体的治疗相比较，用FZD8-Fc的治疗可使癌干细胞的发生频率降低至1:976，约降低4倍。相反，用吉西他滨治疗使癌干细胞的发生频率略为增加。明显地，与用对照抗体治疗相比较，用FZD8-Fc与吉西他滨的组合治疗可将癌干细胞的发生频率降低至1:5472，几乎降低25倍。令人惊讶地，与单独用FZD8-Fc治疗相比较，以FZD8-Fc与吉西他滨的组合治疗时，癌干细胞的发生频率降低的程度高出约5.5倍，尽管事实上吉西他滨似乎实际上增加癌干细胞发生频率。
实施例9
用FZD8-Fc增加PN21肿瘤的细胞分化。同样在OMP-PN21胰脏肿瘤异种移植模型中评估FZD8-Fc的细胞分化能力。收获来自实施例8中所描述的研究的PN21肿瘤并将其在福马林中固定，包埋在石蜡中并切成4μm厚的切片。脱蜡并水化后，将肿瘤切片在Tris缓冲液(pH9.5)中进行抗原修复方法。将切片与过氧化氢（密苏里州圣路易斯，Sigma-Aldrich公司）一起孵育10分钟来阻断内源性过氧化物酶。将在阻断缓冲液（在PBS中，3%NHS、1%BSA、0.1%吐温20）中稀释200倍的抗Ki67抗体（克隆MIB-1，Dako，加州卡平特里亚）添加到每一切片中并孵育1小时。在PBST中轻洗玻片3次，每次5分钟。将与HRP（ImmPRESSTM抗小鼠，加州柏宁顿，VectorLaboratories公司）共轭结合的抗小鼠二级抗体加至玻片上并孵育30分钟。以PBST清洗多次后，加入VectorNovaRed底物（加州柏宁顿，VectorLaboratories公司）来定位Ki67抗原。在室温下，用醋酸水溶液处理切片5分钟。然后，以在3%醋酸水溶液中的1%阿尔新蓝处理切片30分钟，再用水清洗。将切片在中性快速红中进行复染色、脱水并固定。使用此方法，在组织样品中的唾液酸粘蛋白染上蓝色，并且背景出现粉红色或红色。
与用对照抗体治疗的肿瘤相比较，用FZD8-Fc治疗PN21肿瘤使表达唾液酸粘蛋白的细胞增加（图14，深灰色染色）。与用对照抗体或单独的吉西他滨治疗的肿瘤相比较，用FZD8-Fc或FZD8-Fc与吉西他滨的组合治疗PN21肿瘤使表达唾液酸粘蛋白的细胞增加（图15）。通过Ki67的表达指出用FZD8-Fc或FZD8-Fc与吉西他滨的组合治疗PN21肿瘤也使细胞增殖减少。因此，用FZD8-Fc（单独或与吉西他滨组合）治疗PN21肿瘤可减少细胞增殖并增加表达唾液酸粘蛋白的分化细胞的发生频率。
实施例10
FZD8-Fc变异体的制造方法
FZD8-Fc变异体的制造方法。在DNA2.0（加州，MenloPark）制造FZD8-Fc的变异体。DNA2.0合成并装配短的单股寡核苷酸来制造不同的FZD8-Fc变异蛋白，54F05、54F08、54F09、54F12、54F13、54F14、54F15、54F16、54F17、54F18、54F19、54F20、54F21和54F22。接着，将经过装配的寡核苷酸克隆并验证序列。
实施例11
通过FZD8-Fc变异体抑制Wnt信号传递
使用荧光素酶报告基因分析，在体外测定FZD8-Fc变异体阻断或抑制Wnt信号传递途径活化的能力。将STF293细胞在补充有抗生素和10%胎牛血清(FCS)的DMEM中培养。用含有七份TCF转录反应要素副本（其连接至萤火虫荧光素酶报告基因的启动子上游）的报告基因载体稳定转染STF293。此构建体测量典型Wnt信号传递途径的活性。将这些细胞以每孔10,000个细胞加入培养板中。经过过夜孵育后，将FZD8-Fc变异体或对照小鼠JAG1-Fc与以Wnt3a-调节的培养基一起加入。FZD8-Fc变异体和JAG1-Fc的使用浓度为20、4、0.8、0.16、0.03、0.006、0.0012和0.0003ug/ml。将这些细胞培养在从稳定表达Wnt3a的L细胞制备的25%Wnt3A调节培养基中。培养过夜（约18小时）后，使用荧光素酶分析试剂盒（威斯康辛州麦迪逊市，Promega公司）测量荧光素酶的水平。
测定FZD8-Fc变异体的阻断活性并以与每一分析中所运行的相同参考标准（设定为100%）比较的相对活性呈现在表3中。
表3
FZD8-Fc变异体 相对活性%
54F03 107,143
54F05 167
54F08 137
54F09 156,157
54F12 52
54F13 103
54F14 125
54F15 128
54F16 125
实施例12
FZD8-Fc变异体在大鼠中的药物动力学
在两周药物动力学(PK)研究中评估若干种FZD8-Fc变异体在大鼠中的药物动力学。所评估的FZD8-Fc变异体为54F03、54F09、54F12、54F13、54F15和54F16。经由尾静脉用10mg/kg的FZD8-FC变异体对每一组中5只雄性SpragueDaw1ey大鼠给药，追踪两周并在1、24、48、72、96、168、240和336小时的时间点采集样品。在每一时间点收集1ml血液至钾-EDTA管中并离心。收集血浆上清液并冷冻，直到分析样品。
对每一时间点的血浆中所存在的FZD8-Fc变异蛋白的水平进行定量并计算每一FZD8-Fc变异体的半衰期。FZD8-Fc变异体的半衰期示于表4中。
表4
FZD8-Fc变异体 以小时计的t1/2 Fc区
54F03 162 IgG1
54F09 136 IgG1
54F12 152 IgG2
54F13 268 IgG2
54F15 109 IgG1
54F16 154 IgG1
实施例13
FZD8-Fc变异体在食蟹猴中的药物动力学
将4只青年期/成年期雄性未曾经过处置的食蟹猴随机分为两组，每组两只并由静脉注射(IV)施用剂量为30mg/kg的FZD8-Fc变异体54F16或FZD8-Fc变异体54F15的大丸剂。每天观察动物的死亡率以及痛苦与和不愉快的征兆两次（上午和下午）。每天在笼边观察一般健康和外观一次。在给药当天，在给药后1和4小时观察每只动物的死亡率以及痛苦与不愉快的征兆。记录在整个研究持续时间中注意到的任何不寻常的观察结果。在给药当天和采血结束时测量体重。在给药前与给药后1、6、12、24、48、72、96、168、240和336小时，经由注射器和针头从股静脉收集血液（约0.5ml），并将其转移到含有EDTAK3抗凝剂的管中，以供进行PK分析。此外，在给药前与给药后336小时经由注射器和针头从股静脉收集血液（约0.5毫升），并将其转移到不含抗凝剂的管中，以供进行抗药物抗体(ADA)分析。收集血浆上清液并冷冻直到分析样品。进行HTRF（均相时间分辨荧光）免疫分析以测定动物血浆样品中的FZD8-Fc浓度以供PK分析。使用大丸剂IV施用模型，以PhoenixTM 6.0版，通过非隔室分析(NCA)来分析血浆中的FZD-Fc浓度对时间的变化。
对每一时间点的血浆中所存在的FZD8-Fc变异体水平（图16）进行定量并计算FZD8-Fc变异体54F15和54F16的半衰期。如表5中所示，据估计，在30mg/kg的剂量下，FZD8-Fc变异体54F15的半衰期为102小时，而FZD8-Fc变异体54F16在30mg/kg的剂量下，半衰期估计为137小时。
表5
实施例14
通过FZD8-Fc变异体抑制体内结肠肿瘤生长
将分离的C28结肠肿瘤细胞（10,000个）皮下注射到6-8周龄的雄性NOD/SCID小鼠中。使肿瘤生长28天直到肿瘤达到平均体积为145mm3。将小鼠随机分配（n=9只/组）并用剂量为15mg/kg的FZD8-Fc变异体或对照抗体治疗，每周二次。经由注射到腹膜内腔来施用FZD8-Fc变异体和对照抗体。监测肿瘤生长并在指定的时间点用电子卡尺测量肿瘤体积。数据以平均值±S.E.M表示。
变异体54F12和54F13对肿瘤生长无明显影响，肿瘤体积大致上与用对照抗体治疗的小鼠中的肿瘤相同。相反，如图17所示，与用对照抗体的治疗相比较，用变异体54F03、54F09、54F15及54F16治疗可使肿瘤生长减少约56%、70%、64%和70%（分别）。因此，FZD8-Fc变异体的抗肿瘤生长活性似乎受到FZD8部分与Fc部分间的交界处的氨基酸序列影响。此外，由于在此模型中，为IgG2融合蛋白的两种变异体（54F12和54F13）并未抑制肿瘤生长，抗肿瘤生长活性似乎受Fc区的来源影响。
实施例15
通过FZD8-Fc变异体抑制体内胰脏肿瘤生长
将分离的PN4胰脏肿瘤细胞（10,000个细胞）皮下注射到6-8周龄的雄性NOD/SCID小鼠中。使肿瘤生长36天直到肿瘤达到平均体积为112mm3。将小鼠随机分配（n=10只/组）并用剂量为15mg/kg的FZD8-Fc变异体或对照抗体治疗，每周二次。经由注射到腹膜内腔来施用FZD8-Fc变异体及对照抗体。监测肿瘤生长并在指定的时间点用电子卡尺测量肿瘤体积。数据以平均值±S.E.M表示。
与用对照抗体治疗的小鼠体内的肿瘤相比较，变异体54F12和54F13降低肿瘤生长少于20%。与用对照抗体治疗相比较，用FZD8-Fc变异体54F03、54F09、54F15和54F16治疗时可降低肿瘤生长约20%至60%。如图18所示，变异体54F09和54F16降低肿瘤生长的程度分别为最大量45%(p<0.001)和60%(p<0.001)。因此，FZD8-Fc变异体的抗肿瘤生长活性似乎受到FZD8部分与Fc部分间的交界处的氨基酸序列影响。如实施例14中所知，由于在此模型中，为IgG2融合蛋白的两种变异体（54F12和54F13)的抗肿瘤生长活性较为IgG1融合蛋白的FZD8-Fc变异体弱，抗肿瘤生长活性似乎受Fc区的来源影响。
收获来自上述带有肿瘤的小鼠的胰脏肿瘤细胞并将其切碎成约1mm3的片段，再在37°C/5%CO2下，以每10ml的300μg/ml胶原酶和200U/ml的DNaseI中加入1克肿瘤片段的比例进行酶解2小时并通过10ml移液管间歇混合以便分散细胞。加入等体积的FACS缓冲液（1×汉克氏(Hanks)缓冲盐水溶液(HBSS)、2%热灭活的胎牛血清(FCS)和2mMHEPESpH7.4）以停止分解。将细胞通过40μm尼龙过滤器过滤并在150xg下通过离心5分钟来进行收集。将红血球在冰上，在含有氯化铵的低张缓冲液中溶解2分钟，并用过量FACS缓冲液再次清洗细胞，将细胞以1×107细胞/毫升的浓度再混悬于FACS缓冲液中。
用5μg/ml生物素化的抗小鼠H-2Kd（克隆SFI-1.1，加州圣地牙哥，Biolegend）、2.5μg/ml生物素化的抗小鼠CD45（30-F11,Biolegend）和抗生蛋白链菌素-PerCP-Cy5.5(加州圣地牙哥,eBioscience)（1:200稀释）为新鲜制备的单细胞混悬液染色20分钟。用10倍体积的FACS缓冲液清洗两次以除去没有结合的抗体。为了分析人细胞表面标记，用1:50稀释的抗ESA-FITC（加州Auburn，Miltenyi生物技术公司）、1:100稀释的抗人CD44-PE-Cy7（加州圣地牙哥，eBioscience）和1:5稀释的抗人CD201-PE（BDBioscience）为肿瘤单细胞混悬液染色。清洗细胞，将其再混悬于含有2.5μg/ml的4’-6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)的FACS缓冲液中。使用以单荧光色染色的细胞进行仪器校正。在细胞分选期间排除任何剩余的小鼠细胞（对H-2Kd和CD45来说为阳性）和死细胞（DAPI阳性）。使用双粘体辨别出入限制(doubletdiscriminationgating)来排除细胞双粘体和团块。
如图19所示，与用对照抗体治疗的小鼠相比较，用FZD8-Fc变异体54F03和54F16治疗携带肿瘤的小鼠可降低CD44hi细胞的百分比。虽然CD201+CD44+细胞的百分比小，与用对照抗体治疗的小鼠相比较，用FZD8-Fc变异体54F03和54F16治疗携带肿瘤的小鼠可降低CD20J+XD44+细胞的百分比。已证实CD44为致瘤细胞（例如癌干细胞）的标记。此外，在一些系统中，发现为CD44hiCD201+的细胞较CD44hiCD201-细胞更具致瘤性。因此，重要的是，FZD8-FC变异体可以降低CD44hi与CD44hiCD201+两种细胞群的百分比，从而降低在经过治疗的小鼠中的致瘤细胞的百分比或数目。
实施例16
N端的表征
预测FZD8蛋白中的正确的信号序列裂解位点是介于氨基酸25（丙氨酸）与氨基酸26（丙氨酸）之间；此位点的裂解遗留下ASA的N端。使用质谱分析并与在预测位点裂解的FZD8-Fc蛋白的理论质量相比较来测定FZD8-Fc蛋白的质量。
如以上所述，在DNA2.0（加州MenloPark）制造带有经过修饰的信号序列的其它FZD8-Fc变异体。DNA2.0合成并装配短的单股寡核苷酸来制造FZD8-Fc变异蛋白，54F23至54F35。接着，克隆经过装配的寡核苷酸并验证序列。
使用QIAGENmaxi-prep试剂盒，依照制造商的方案制备每一FZD8-Fc质粒变异体的质粒DNA。使用FreeStyleTMMAX试剂（生命技术(LifeTechnologies)）和293FS细胞表达每一变异体。使细胞生长至对数期并稀释成1×106细胞/毫升。在每一反应，将315ug的质粒DNA在5ml的OptiMEMPro中稀释。在不同试管中，将315ul的FreeStyleTMMAX试剂在5mlOptiMEMPro中稀释。将经过稀释的FreeStyleTMMAX试剂逐滴滴加到DNA中，在室温下孵育15分钟以将质粒DNA与FreeStyleTMMAX试剂复合。然后，将DNA-试剂复合物加入250ml的293FS细胞中。使表达反应物生长7-10天，此时，通过离心和过滤来收获反应物。采用5mlHiTrapMAbSelectSURE柱，通过亲和力纯化法纯化每一FZD8-FC变异体。简单来说，将收获的培养基通过已用结合缓冲液平衡的管柱。以结合缓冲液清洗管柱以除去没有结合的物质，然后，以洗提缓冲液洗提FZD8-Fc蛋白。然后，将经过洗提的样本透析到适合用于质谱分析的缓冲液中。
在37°C下，用三(2-羧乙基)膦(TCEP)还原约250μg的每一FZD8-FC样品30分钟以便分离抗体的重链和轻链。然后，在37°C下，以碘乙酰胺处理还原的样品30分钟来将其烷基化。将样品通过NAP-5柱(GEHealthCare)以将缓冲液改为10mMTris-HCl(pH7.4)。改变缓冲液之后，用内切葡聚糖酶PNGaseF进行去糖基化。将样品在37°C下，以1:200的比例（酶：样品）孵育过夜。加入酸来终止反应。将经过还原、烷基化及去糖基化的FZD8-Fc样品装填到小瓶中以使用WatersUPLCTM和电喷雾-QToF质谱仪进行液态色谱分析-质谱分析(LC/MS)。使用三氟醋酸铯离子簇，用WatersLockSprayTM双电喷雾离子源进行每一样品分析的质量校准。
如图20A所示，关于N端序列，以异源混合物的形式制造带有与天然序列相同的信号序列的FZD8-Fc蛋白（54F16）。样品中存在的一定比例的蛋白质的质量等于在氨基酸25和26处裂解，带有ASA的N端序列的蛋白质（波峰在41704.0）。然而，超过50%的蛋白质是以具有不同质量的形式（波峰在41918.2）存在。此波峰最可能代表在氨基酸22和23处裂解的蛋白质；在此位点的裂解遗留具AAAASA的N端序列（SEQIDNO:76）。
产生具有信号序列SEQIDNO:68至SEQIDNO:74的FZD8-Fc变异体，从细胞培养物中纯化，并如上述通过质谱来分析。据观察，具有信号序列SEQIDNO:70至SEQIDNO:74的变异体产生几乎完全同源的蛋白质样品（图20B-20E示出若干代表性的结果）。带有信号序列SEQIDNO:71的包含SEQIDNO:53的FZD8-Fc变异体54F26主要（超过95%）以在氨基酸25和26处裂解的带有ASA的N端序列的蛋白质（波峰在41930.1）形式存在（图20B）。类似的结果还见于包含SEQIDNO:53和信号序列SEQIDNO:72的变异体（54F28，图20C）、包含SEQIDNO:53和信号序列SEQIDNO:73的变异体（54F30，图20D）以及包含SEQIDNO:53和信号序列SEQIDNO:74的变异体（54F32，图20E）。类似的结果可在从瞬时和稳定转染制造的蛋白质中观察到。
实施例17
由FZD8-Fc变异体抑制体内结肠肿瘤生长
将分离的C28结肠肿瘤细胞(10,000个细胞)皮下注射到6-8周龄的雄性NOD/SCID小鼠中。使肿瘤生长56天直到肿瘤达到平均体积为175mm3。将小鼠随机分配（n=10只/组）并用剂量为15mg/kg的FZD8-Fc构建体54F03、54F23、54F26或对照抗体治疗，每周二次。经由注射到腹膜内腔来施用FZD8-Fc变异体和对照抗体。监测肿瘤生长并在指定的时间点用电子卡尺测量肿瘤体积。数据以平均值±S.E.M来表示。
FZD8-Fc变异体54F23和54F26主要是以带有氨基酸ASA的N端的同源蛋白的形式产生，而54F03是以带有氨基酸ASA和AAAASA的N端的异源蛋白混合物的形式产生。如图21所示，治疗三周后，与用对照抗体的治疗相比较，用FZD8-Fc变异体54F03、54F23和54F26的治疗分别降低肿瘤生长48%、57%和52%。
本文所引用的所有出版物、专利、专利申请、网站和登记编号/数据库序列（包括多核苷酸和多肽序列）的全部内容均纳为本文中所有目的的参考，其程度犹如每一出版物、专利、专利申请、网站或登记编号/数据库序列被具体和单独指明纳为参考一样。
序列表
FZD8-Fc氨基酸序列变异体54F03（无预测的信号序列；介于融合蛋白的FZD8序列与Fc序列之间的“GRA”连接序列加有下划线）(SEQIDNO:1)
ASAKELACQEITVPLCKGIGYNYTYMPNQFNHDTQDEAGLEVHQFWPLVEIQCSPDLKFF
LCSMYTPICLEDYKKPLPPCRSVCERAKAGCAPLMRQYGFAWPDRMRCDRLPEQGNPDTL
CMDYNRTDLTTGRADKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV
SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK
ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ
PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
K
FZD8-Fc编码序列（编码由FZD8衍生的序列的核苷酸加有下划线）
(SEQIDNO:2)
ATGGAGTGGGGTTACCTGTTGGAAGTGACCTCGCTGCTGGCCGCCTTGGCGCTGCTGCAG
CGCTCTAGCGGCGCTGCGGCCGCCTCGGCCAAGGAGCTGGCATGCCAAGAGATCACCGTG
CCGCTGTGTAAGGGCATCGGCTACAACTACACCTACATGCCCAATCAGTTCAACCACGAC
ACGCAAGACGAGGCGGGCCTGGAGGTGCACCAGTTCTGGCCGCTGGTGGAGATCCAGTGC
TCGCCCGATCTCAAGTTCTTCCTGTGCAGCATGTACACGCCCATCTGCCTAGAGGACTAC
AAGAAGCCGCTGCCGCCCTGCCGCTCGGTGTGCGAGCGCGCCAAGGCCGGCTGCGCGCCG
CTCATGCGCCAGTACGGCTTCGCCTGGCCCGACCGCATGCGCTGCGACCGGCTGCCCGAG
CAAGGCAACCCTGACACGCTGTGCATGGACTACAACCGCACCGACCTAACCACCGGGCGC
GCCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCA
GTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTC
ACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTG
GACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACG
TACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTAC
AAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCC
AAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACC
AAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTG
GAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGAC
TCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAG
GGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAG
AGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
最小FZD和SFRPFri结构域序列
h-FZD1氨基酸116-227(SEQIDNO:3)
CQPISIPLCTDIAYNQTIMPNLLGHTNQEDAGLEVHQFYPLVKVQCSAELKFFLCSMYAP
VCTVLEQALPPCRSLCERARQGCEALMNKFGFQWPDTLKCEKFPVHGAGELC
h-FZD2氨基酸39-150(SEQIDNO:4)
CQPISIPLCTDIAYNQTIMPNLLGHTNQEDAGLEVHQFYPLVKVQCSPELRFFLCSMYAP
VCTVLEQAIPPCRSICERARQGCEALMNKFGFQWPERLRCEHFPRHGAEQIC
h-FZD3氨基酸28-133(SEQIDNO:5)
CEPITLRMCQDLPYNTTFMPNLLNHYDQQTAALAMEPFHPMVNLDCSRDFRPFLCALYAP
ICMEYGRVTLPCRRLCQRAYSECSKLMEMFGVPWPEDMECSRFPDC
h-FZD4氨基酸48-161(SEQIDNO:6)
CDPIRISMCQNLGYNVTKMPNLVGHELQTDAELQLTTFTPLIQYGCSSQLQFFLCSVYVP
MCTEKINIPIGPCGGMCLSVKRRCEPVLKEFGFAWPESLNCSKFPPQNDHNHMC
h-FZD5氨基酸33-147(SEQIDNO:7)
CQEITVPMCRGIGYNLTHMPNQFNHDTQDEAGLEVHQFWPLVEIQCSPDLRFFLCSMYTP
ICLPDYHKPLPPCRSVCERAKAGCSPLMRQYGFAWPERMSCDRLPVLGRDAEVLC
h-FZD6氨基酸24-129(SEQIDNO:8)
CEPITVPRCMKMAYNMTFFPNLMGHYDQSIAAVEMEHFLPLANLECSPNIETFLCKAFVP
TCIEQIHVVPPCRKLCEKVYSDCKKLIDTFGIRWPEELECDRLQYC
h-FZD7氨基酸49-160(SEQIDNO:9)
CQPISIPLCTDIAYNQTILPNLLGHTNQEDAGLEVHQFYPLVKVQCSPELRFFLCSMYAP
VCTVLDQAIPPCRSLCERARQGCEALMNKFGFQWPERLRCENFPVHGAGEIC
h-FZD8氨基酸35-148(SEQIDNO:10)
CQEITVPLCKGIGYNYTYMPNQFNHDTQDEAGLEVHQFWPLVEIQCSPDLKFFLCSMYTP
ICLEDYKKPLPPCRSVCERAKAGCAPLMRQYGFAWPDRMRCDRLPEQGNPDTLC
h-FZD9氨基酸39-152(SEQIDNO:11)
CQAVEIPMCRGIGYNLTRMPNLLGHTSQGEAAAELAEFAPLVQYGCHSHLRFFLCSLYAP
MCTDQVSTPIPACRPMCEQARLRCAPIMEQFNFGWPDSLDCARLPTRNDPHALC
h-FZD10氨基酸34-147(SEQIDNO:12)
CQPIEIPMCKDIGYNMTRMPNLMGHENQREAAIQLHEFAPLVEYGCHGHLRFFLCSLYAP
MCTEQVSTPIPACRVMCEQARLKCSPIMEQFNFKWPDSLDCRKLPNKNDPNYLC
h-SFRP1氨基酸57-165(SEQIDNO:13)
CVDIPADLRLCHNVGYKKMVLPNLLEHETMAEVKQQASSWVPLLNKNCHAGTQVFLCSLF
APVCLDRPIYPCRWLCEAVRDSCEPVMQFFGFYWPEMLKCDKFPEGDVC
h-SFRP2氨基酸40-152(SEQIDNO:14)
CKPIPANLQLCHGIEYQNMRLPNLLGHETMKEVLEQAGAWIPLVMKQCHPDTKKFLCSLF
APVCLDDLDETIQPCHSLCVQVKDRCAPVMSAFGFPWPDMLECDRFPQDNDLC
h-SFRP3氨基酸35-147(SEQIDNO:15)
CEPVRIPLCKSLPWNMTKMPNHLHHSTQANAILAIEQFEGLLGTHCSPDLLFFLCAMYAP
ICTIDFQHEPIKPCKSVCERARQGCEPILIKYRHSWPENLACEELPVYDRGVC
h-SFRP4氨基酸24-136(SEQIDNO:16)
CEAVRIPMCRHMPWNITRMPNHLHHSTQENAILAIEQYEELVDVNCSAVLRFFFCAMYAP
ICTLEFLHDPIKPCKSVCQRARDDCEPLMKMYNHSWPESLACDELPVYDRGVC
h-SFRP5氨基酸53-162(SEQIDNO:17)
CLDIPADLPLCHTVGYKRMRLPNLLEHESLAEVKQQASSWLPLLAKRCHSDTQVFLCSLF
APVCLDRPIYPCRSLCEAVRAGCAPLMEAYGFPWPEMLHCHKFPLDNDLC
Fc序列
人IgG1Fc区(SEQIDNO:18)
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD
GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK
GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS
DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
人IgG1Fc区(SEQIDNO:42)
KSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNW
YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS
KAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV
LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
人IgG1Fc区(SEQIDNO:43)
EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKF
NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT
ISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP
PVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
人IgG2Fc区(SEQIDNO:44)
CVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVE
VHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQP
REPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGS
FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
FZDFri结构域序列
人FZD4Fri结构域（预测的信号序列加有下划线）(SEQIDNO:19)
MLAMAWRGAGPSVPGAPGGVGLSLGLLLQLLLLLGPARGFGDEEERRCDPIRISMCQNLG
YNVTKMPNLVGHELQTDAELQLTTFTPLIQYGCSSQLQFFLCSVYVPMCTEKINIPIGPC
GGMCLSVKRRCEPVLKEFGFAWPESLNCSKFPPQNDHNHMCMEGPGDEEV
人FZD5Fri结构域（预测的信号序列加有下划线）(SEQIDNO:20)
MARPDPSAPPSLLLLLLAQLVGRAAAASKAPVCQEITVPMCRGIGYNLTHMPNQFNHDTQ
DEAGLEVHQFWPLVEIQCSPDLRFFLCSMYTPICLPDYHKPLPPCRSVCERAKAGCSPLM
RQYGFAWPERMSCDRLPVLGRDAEVLCMDYNRSEATT
人FZD8Fri结构域（预测的信号序列加有下划线）(SEQIDNO:21)
MEWGYLLEVTSLLAALALLQRSSGAAAASAKELACQEITVPLCKGIGYNYTYMPNQFNHD
TQDEAGLEVHQFWPLVEIQCSPDLKFFLCSMYTPICLEDYKKPLPPCRSVCERAKAGCAP
LMRQYGFAWPDRMRCDRLPEQGNPDTLCMDYNRTDLTT
无预测的信号序列的人FZD1Fri结构域氨基酸序列(SEQIDNO:32;
SEQIDNO:27的氨基酸87-237)
QQPPPPPQQQQSGQQYNGERGISVPDHGYCQPISIPLCTDIAYNQTIMPNLLGHTNQEDA
GLEVHQFYPLVKVQCSAELKFFLCSMYAPVCTVLEQALPPCRSLCERARQGCEALMNKFG
FQWPDTLKCEKFPVHGAGELCVGQNTSDKGT
无预测的信号序列的人FZD2Fri结构域氨基酸序列SEQIDNO:33;
SEQIDNO:28的氨基酸24-159)
QFHGEKGISIPDHGFCQPISIPLCTDIAYNQTIMPNLLGHTNQEDAGLEVHQFYPLVKVQ
CSPELRFFLCSMYAPVCTVLEQAIPPCRSICERARQGCEALMNKFGFQWPERLRCEHFPR
HGAEQICVGQNHSEDG
无预测的信号序列的人FZD3Fri结构域氨基酸序列(SEQIDNO:34;
SEQIDNO:29的氨基酸23-143)
HSLFSCEPITLRMCQDLPYNTTFMPNLLNHYDQQTAALAMEPFHPMVNLDCSRDFRPFLCALYAPICMEYGRVTLPCRRLCQRAYSECSKLMEMFGVPWPEDMECSRFPDCDEPY
PRLVDL
无预测的信号序列的人FZD4Fri结构域氨基酸序列(SEQIDNO:35;
SEQIDNO:22的氨基酸40-170)
FGDEEERRCDPIRISMCQNLGYNVTKMPNLVGHELQTDAELQLTTFTPLIQYGCSSQLQF
FLCSVYVPMCTEKINIPIGPCGGMCLSVKRRCEPVLKEFGFAWPESLNCSKFPPQNDHNH
MCMEGPGDEEV
无预测的信号序列的人FZD5Fri结构域氨基酸序列(SEQIDNO:36;
SEQIDNO:23的氨基酸27-157)
ASKAPVCQEITVPMCRGIGYNLTHMPNQFNHDTQDEAGLEVHQFWPLVEIQCSPDLRFFL
CSMYTPICLPDYHKPLPPCRSVCERAKAGCSPLMRQYGFAWPERMSCDRLPVLGRDAEVL
CMDYNRSEATT
无预测的信号序列的人FZD6Fri结构域氨基酸序列(SEQIDNO:37;
SEQIDNO:24的氨基酸19-146)
HSLFTCEPITVPRCMKMAYNMTFFPNLMGHYDQSIAAVEMEHFLPLANLECSPNIETFLC
KAFVPTCIEQIHVVPPCRKLCEKVYSDCKKLIDTFGIRWPEELECDRLQYCDETVPVTFD
PHTEFLG
无预测的信号序列的人FZD7Fri结构域氨基酸序列(SEQIDNO:38;
SEQIDNO:25的氨基酸33-170)
QPYHGEKGISVPDHGFCQPISIPLCTDIAYNQTILPNLLGHTNQEDAGLEVHQFYPLVKV
QCSPELRFFLCSMYAPVCTVLDQAIPPCRSLCERARQGCEALMNKFGFQWPERLRCENFP
VHGAGEICVGQNTSDGSG
无预测的信号序列的人FZD8Fri结构域氨基酸序列(SEQIDNO:39;
SEQIDNO:30的氨基酸28-158)
ASAKELACQEITVPLCKGIGYNYTYMPNQFNHDTQDEAGLEVHQFWPLVEIQCSPDLKFF
LCSMYTPICLEDYKKPLPPCRSVCERAKAGCAPLMRQYGFAWPDRMRCDRLPEQGNPDTL
CMDYNRTDLTT
无预测的信号序列的人FZD9Fri结构域氨基酸序列(SEQIDNO:40;
SEQIDNO:31的氨基酸23-159)
LEIGRFDPERGRGAAPCQAVEIPMCRGIGYNLTRMPNLLGHTSQGEAAAELAEFAPLVQY
GCHSHLRFFLCSLYAPMCTDQVSTPIPACRPMCEQARLRCAPIMEQFNFGWPDSLDCARL
PTRNDPHALCMEAPENA
无预测的信号序列的人FZD10Fri结构域氨基酸序列(SEQIDNO:41;
SEQIDNO:26的氨基酸21-154)
ISSMDMERPGDGKCQPIEIPMCKDIGYNMTRMPNLMGHENQREAAIQLHEFAPLVEYGCH
GHLRFFLCSLYAPMCTEQVSTPIPACRVMCEQARLKCSPIMEQFNFKWPDSLDCRKLPNK
NDPNYLCMEAPNNG
FZD胞外结构域(ECD)序列
具有信号序列的人FZD1ECD(SEQIDNO:27)
MAEEEAPKKSRAAGGGASWELCAGALSARLAEEGSGDAGGRRRPPVDPRRLARQLLLLLW
LLEAPLLLGVRAQAAGQGPGQGPGPGQQPPPPPQQQQSGQQYNGERGISVPDHGYCQPIS
IPLCTDIAYNQTIMPNLLGHTNQEDAGLEVHQFYPLVKVQCSAELKFFLCSMYAPVCTVL
EQALPPCRSLCERARQGCEALMNKFGFQWPDTLKCEKFPVHGAGELCVGQNTSDKGTPTP
SLLPEFWTSNPQHGGGGHRGGFPGGAGASERGKFSCPRALKVPSYLNYHFLGEKDCGAPC
EPTKVYGLMYFGPEELRFSRT
具有信号序列的人FZD2ECD(SEQIDNO:28)
MRPRSALPRLLLPLLLLPAAGPAQFHGEKGISIPDHGFCQPISIPLCTDIAYNQTIMPNL
LGHTNQEDAGLEVHQFYPLVKVQCSPELRFFLCSMYAPVCTVLEQAIPPCRSICERARQG
CEALMNKFGFQWPERLRCEHFPRHGAEQICVGQNHSEDGAPALLTTAPPPGLQPGAGGTP
GGPGGGGAPPRYATLEHPFHCPRVLKVPSYLSYKFLGERDCAAPCEPARPDGSMFFSQEE
TRFARLWILT
具有信号序列的人FZD3ECD(SEQIDNO:29)
MAMTWIVFSLWPLTVFMGHIGGHSLFSCEPITLRMCQDLPYNTTFMPNLLNHYDQQTAAL
AMEPFHPMVNLDCSRDFRPFLCALYAPICMEYGRVTLPCRRLCQRAYSECSKLMEMFGVP
WPEDMECSRFPDCDEPYPRLVDLNLAGEPTEGAPVAVQRDYGFWCPRELKIDPDLGYSFL
HVRDCSPPCPNMYFRREELSFARY
具有信号序列的人FZD4ECD(SEQIDNO:22)
MLAMAWRGAGPSVPGAPGGVGLSLGLLLQLLLLLGPARGFGDEEERRCDPIRISMCQNLG
YNVTKMPNLVGHELQTDAELQLTTFTPLIQYGCSSQLQFFLCSVYVPMCTEKINIPIGPC
GGMCLSVKRRCEPVLKEFGFAWPESLNCSKFPPQNDHNHMCMEGPGDEEVPLPHKTPIQP
GEECHSVGTNSDQYIWVKRSLNCVLKCGYDAGLYSRSAKEFTDI
具有信号序列的人FZD5ECD(SEQIDNO:23)
MARPDPSAPPSLLLLLLAQLVGRAAAASKAPVCQEITVPMCRGIGYNLTHMPNQFNHDTQ
DEAGLEVHQFWPLVEIQCSPDLRFFLCSMYTPICLPDYHKPLPPCRSVCERAKAGCSPLM
RQYGFAWPERMSCDRLPVLGRDAEVLCMDYNRSEATTAPPRPFPAKPTLPGPPGAPASGG
ECPAGGPFVCKCREPFVPILKESHPLYNKVRTGQVPNCAVPCYQPSFSADERT
具有信号序列的人FZD6ECD(SEQIDNO:24)
MEMFTFLLTCIFLPLLRGHSLFTCEPITVPRCMKMAYNMTFFPNLMGHYDQSIAAVEMEH
FLPLANLECSPNIETFLCKAFVPTCIEQIHVVPPCRKLCEKVYSDCKKLIDTFGIRWPEE
LECDRLQYCDETVPVTFDPHTEFLGPQKKTEQVQRDIGFWCPRHLKTSGGQGYKFLGIDQ
CAPPCPNMYFKSDELEFAKSFIGTVSI
具有信号序列的人FZD7ECD(SEQIDNO:25)
MRDPGAAAPLSSLGLCALVLALLGALSAGAGAQPYHGEKGISVPDHGFCQPISIPLCTDI
AYNQTILPNLLGHTNQEDAGLEVHQFYPLVKVQCSPELRFFLCSMYAPVCTVLDQAIPPC
RSLCERARQGCEALMNKFGFQWPERLRCENFPVHGAGEICVGQNTSDGSGGPGGGPTAYP
TAPYLPDLPFTALPPGASDGRGRPAFPFSCPRQLKVPPYLGYRFLGERDCGAPCEPGRAN
GLMYFKEEERRFARL
具有信号序列的人FZD8ECD(SEQIDNO:30)
MEWGYLLEVTSLLAALALLQRSSGAAAASAKELACQEITVPLCKGIGYNYTYMPNQFNHD
TQDEAGLEVHQFWPLVEIQCSPDLKFFLCSMYTPICLEDYKKPLPPCRSVCERAKAGCAP
LMRQYGFAWPDRMRCDRLPEQGNPDTLCMDYNRTDLTTAAPSPPRRLPPPPPGEQPPSGS
GHGRPPGARPPHRGGGRGGGGGDAAAPPARGGGGGGKARPPGGGAAPCEPGCQCRAPMVS
VSSERHPLYNRVKTGQIANCALPCHNPFFSQDERAFT
具有信号序列的人FZD9ECD(SEQIDNO:31)
MAVAPLRGALLLWQLLAAGGAALEIGRFDPERGRGAAPCQAVEIPMCRGIGYNLTRMPNL
LGHTSQGEAAAELAEFAPLVQYGCHSHLRFFLCSLYAPMCTDQVSTPIPACRPMCEQARL
RCAPIMEQFNFGWPDSLDCARLPTRNDPHALCMEAPENATAGPAEPHKGLGMLPVAPRPA
RPPGDLGPGAGGSGTCENPEKFQYVEKSRSCAPRCGPGVEVFWSRRDKDF
具有信号序列的人FZD10ECD(SEQIDNO:26)
MQRPGPRLWLVLQVMGSCAAISSMDMERPGDGKCQPIEIPMCKDIGYNMTRMPNLMGHEN
QREAAIQLHEFAPLVEYGCHGHLRFFLCSLYAPMCTEQVSTPIPACRVMCEQARLKCSPI
MEQFNFKWPDSLDCRKLPNKNDPNYLCMEAPNNGSDEPTRGSGLFPPLFRPQRPHSAQEH
PLKDGGPGRGGCDNPGKFHHVEKSASCAPLCTPGVDVYWSREDKRFA
FZD8-Fc变异体
FZD8-Fc变异体54F03氨基酸序列（无预测的信号序列；替代裂解）(SEQIDNO:45)
AAAASAKELACQEITVPLCKGIGYNYTYMPNQFNHDTQDEAGLEVHQFWPLVEIQCSPDL
KFFLCSMYTPICLEDYKKPLPPCRSVCERAKAGCAPLMRQYGFAWPDRMRCDRLPEQGNP
DTLCMDYNRTDLTTGRADKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVV
VDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV
SNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES
NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL
SPGK
FZD8-Fc变异体54F09氨基酸序列（无预测的信号序列）(SEQIDNO:46)
ASAKELACQEITVPLCKGIGYNYTYMPNQFNHDTQDEAGLEVHQFWPLVEIQCSPDLKFF
LCSMYTPICLEDYKKPLPPCRSVCERAKAGCAPLMRQYGFAWPDRMRCDRLPEQGNPDTL
CMDYNRTDLTTAAPSPPDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVV
VDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV
SNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES
NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL
SPGK
FZD8-Fc变异体54F09氨基酸序列（无预测的信号序列；替代裂解）(SEQIDNO:47)AAAASAKELACQEITVPLCKGIGYNYTYMPNQFNHDTQDEAGLEVHQFWPLVEIQCSPDL
KFFLCSMYTPICLEDYKKPLPPCRSVCERAKAGCAPLMRQYGFAWPDRMRCDRLPEQGNP
DTLCMDYNRTDLTTAAPSPPDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT
CVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYK
CKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE
WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS
LSLSPGK
FZD8-Fc变异体54F15氨基酸序列（无预测的信号序列）(SEQIDNO:48)
ASAKELACQEITVPLCKGIGYNYTYMPNQFNHDTQDEAGLEVHQFWPLVEIQCSPDLKFF
LCSMYTPICLEDYKKPLPPCRSVCERAKAGCAPLMRQYGFAWPDRMRCDRLPEQGNPDTL
CMDYNRTDLTTAAPDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV
SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK
ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ
PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
K
FZD8-Fc变异体54F15氨基酸序列（无预测的信号序列；替代裂解）(SEQIDNO:49)AAAASAKELACQEITVPLCKGIGYNYTYMPNQFNHDTQDEAGLEVHQFWPLVEIQCSPDL
KFFLCSMYTPICLEDYKKPLPPCRSVCERAKAGCAPLMRQYGFAWPDRMRCDRLPEQGNP
DTLCMDYNRTDLTTAAPDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVV
VDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV
SNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES
NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL
SPGK
FZD8-Fc变异体54F16、54F17、54F18、54F23、54F25、54F27、54F29、54F31和54F34氨基酸序列（无预测的信号序列）(SEQIDNO:50)
ASAKELACQEITVPLCKGIGYNYTYMPNQFNHDTQDEAGLEVHQFWPLVEIQCSPDLKFF
LCSMYTPICLEDYKKPLPPCRSVCERAKAGCAPLMRQYGFAWPDRMRCDRLPEQGNPDTL
CMDYNRTDLTTKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV
SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK
ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ
PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
K
FZD8-Fc变异体54F16氨基酸序列（无预测的信号序列；替代裂解）(SEQIDNO:51)AAAASAKELACQEITVPLCKGIGYNYTYMPNQFNHDTQDEAGLEVHQFWPLVEIQCSPDL
KFFLCSMYTPICLEDYKKPLPPCRSVCERAKAGCAPLMRQYGFAWPDRMRCDRLPEQGNP
DTLCMDYNRTDLTTKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVV
VDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV
SNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES
NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL
SPG
FZD8-Fc变异体54F16氨基酸序列（具有信号序列）(SEQIDNO:52)
MEWGYLLEVTSLLAALALLQRSSGAAAASAKELACQEITVPLCKGIGYNYTYMPNQFNHD
TQDEAGLEVHQFWPLVEIQCSPDLKFFLCSMYTPICLEDYKKPLPPCRSVCERAKAGCAP
LMRQYGFAWPDRMRCDRLPEQGNPDTLCMDYNRTDLTTKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPS
VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST
YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELT
KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ
GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
FZD8-Fc变异体54F19、54F20、54F24、54F26、54F28、54F30、54F32、54F34和54F35氨基酸序列（无预测的信号序列）(SEQIDNO:53)
ASAKELACQEITVPLCKGIGYNYTYMPNQFNHDTQDEAGLEVHQFWPLVEIQCSPDLKFF
LCSMYTPICLEDYKKPLPPCRSVCERAKAGCAPLMRQYGFAWPDRMRCDRLPEQGNPDTL
CMDYNRTDLTTEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV
DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS
NKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN
GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLS
PGK
FZD8-Fc变异体54F19氨基酸序列（无预测的信号序列；替代裂解）(SEQIDNO:54)ALAASAKELACQEITVPLCKGIGYNYTYMPNQFNHDTQDEAGLEVHQFWPLVEIQCSPDL
KFFLCSMYTPICLEDYKKPLPPCRSVCERAKAGCAPLMRQYGFAWPDRMRCDRLPEQGNP
DTLCMDYNRTDLTTEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTC
VVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKC
KVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW
ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL
SLSPGK
FZD8-Fc变异体54F20氨基酸序列（无预测的信号序列；替代裂解）(SEQIDNO:55)VLAASAKELACQEITVPLCKGIGYNYTYMPNQFNHDTQDEAGLEVHQFWPLVEIQCSPDL
KFFLCSMYTPICLEDYKKPLPPCRSVCERAKAGCAPLMRQYGFAWPDRMRCDRLPEQGNP
DTLCMDYNRTDLTTEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTC
VVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKC
KVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW
ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL
SLSPGK
FZD8-Fc变异体54F34氨基酸序列（无预测的信号序列）(SEQIDNO:65)
KELACQEITVPLCKGIGYNYTYMPNQFNHDTQDEAGLEVHQFWPLVEIQCSPDLKFFLCS
MYTPICLEDYKKPLPPCRSVCERAKAGCAPLMRQYGFAWPDRMRCDRLPEQGNPDTLCMD
YNRTDLTTEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKA
LPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQP
ENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
FZD8-Fc变异体54F33氨基酸序列（无预测的信号序列）(SEQIDNO:66)
KELACQEITVPLCKGIGYNYTYMPNQFNHDTQDEAGLEVHQFWPLVEIQCSPDLKFFLCS
MYTPICLEDYKKPLPPCRSVCERAKAGCAPLMRQYGFAWPDRMRCDRLPEQGNPDTLCMD
YNRTDLTTKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE
DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP
APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN
NYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
具有信号序列的人ROR1ECD(SEQIDNO:56)
MHRPRRRGTRPPLLALLAALLLAARGAAAQETELSVSAELVPTSSWNISSELNKDSYLTL
DEPMNNITTSLGQTAELHCKVSGNPPPTIRWFKNDAPVVQEPRRLSFRSTIYGSRLRIRN
LDTTDTGYFQCVATNGKEVVSSTGVLFVKFGPPPTASPGYSDEYEEDGFCQPYRGIACAR
FIGNRTVYMESLHMQGEIENQITAAFTMIGTSSHLSDKCSQFAIPSLCHYAFPYCDETSS
VPKPRDLCRDECEILENVLCQTEYIFARSNPMILMRLKLPNCEDLPQPESPEAANCIRIG
IPMADPINKNHKCYNSTGVDYRGTVSVTKSGRQCQPWNSQYPHTHTFTALRFPELNGGHS
YCRNPGNQKEAPWCFTLDENFKSDLCDIPACDSKDSKEKNKMEILY
具有信号序列的人ROR2ECD(SEQIDNO:57)
MARGSALPRRPLLCIPAVWAAAALLLSVSRTSGEVEVLDPNDPLGPLDGQDGPIPTLKGY
FLNFLEPVNNITIVQGQTAILHCKVAGNPPPNVRWLKNDAPVVQEPRRIIIRKTEYGSRL
RIQDLDTTDTGYYQCVATNGMKTITATGVLFVRLGPTHSPNHNFQDDYHEDGFCQPYRGI
ACARFIGNRTIYVDSLQMQGEIENRITAAFTMIGTSTHLSDQCSQFAIPSFCHFVFPLCD
ARSRTPKPRELCRDECEVLESDLCRQEYTIARSNPLILMRLQLPKCEALPMPESPDAANC
MRIGIPAERLGRYHQCYNGSGMDYRGTASTTKSGHQCQPWALQHPHSHHLSSTDFPELGG
GHAYCRNPGGQMEGPWCFTQNKNVRMELCDVPSCSPRDSSKMG
h-ROR1最小Fri结构域（SEQIDNO:58）
CQPYRGIACARFIGNRTVYMESLHMQGEIENQITAAFTMIGTSSHLSDKCSQFAIPSLCH
YAFPYCDETSSVPKPRDLCRDECEILENVLCQTEYIFARSNPMILMRLKLPNCEDLPQPE
SPEAANC
h-ROR2最小Fri结构域（SEQIDNO:59）
CQPYRGIACARFIGNRTIYVDSLQMQGEIENRITAAFTMIGTSTHLSDQCSQFAIPSFCH
FVFPLCDARSRTPKPRELCRDECEVLESDLCRQEYTIARSNPLILMRLQLPKCEALPMPE
SPDAANC
连接子(SEQIDNO:60)
ESGGGGVT
连接子(SEQIDNO:61)
LESGGGGVT
连接子(SEQIDNO:62)
GRAQVT
连接子(SEQIDNO:63)
WRAQVT
连接子(SEQIDNO:64)
ARGRAQVT
信号序列(SEQIDNO:67)
MEWGYLLEVTSLLAALALLQRSSGAAA
信号序列(SEQIDNO:68)
MEWGYLLEVTSLLAALALLQRSSGALA
信号序列(SEQIDNO:69)
MEWGYLLEVTSLLAALALLQRSSGVLA
信号序列(SEQIDNO:70)
MEWGYLLEVTSLLAALLLLQRSPIVHA
信号序列(SEQIDNO:71)
MEWGYLLEVTSLLAALFLLQRSPIVHA
信号序列(SEQIDNO:72)
MEWGYLLEVTSLLAALLLLQRSPFVHA
信号序列(SEQIDNO:73)
MEWGYLLEVTSLLAALLLLQRSPIIYA
信号序列(SEQIDNO:74)
MEWGYLLEVTSLLAALLLLQRSPIAHA
具有信号序列的FZD8-Fc变异体54F26(SEQIDNO:75)
MEWGYLLEVTSLLAALFLLQRSPIVHAASAKELACQEITVPLCKGIGYNYTYMPNQFNHD
TQDEAGLEVHQFWPLVEIQCSPDLKFFLCSMYTPICLEDYKKPLPPCRSVCERAKAGCAP
LMRQYGFAWPDRMRCDRLPEQGNPDTLCMDYNRTDLTTEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGG
PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN
STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDE
LTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW
QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
N端序列(SEQIDNO:76)
AAAASA

Claims (14)

1.一种Wnt结合多肽，其由下述组成：
(a)第一多肽SEQIDNO:39；和
(b)第二多肽SEQIDNO:43；
其中，所述第一多肽的C端直接连接所述第二多肽的N端；以及
(c)在所述Wnt结合多肽一端或两端的可选的一个、二个、三个或四个氨基酸。
2.一种Wnt结合多肽，其是氨基酸序列SEQIDNO:53。
3.一种FZD-Fc变异体多肽，所述多肽由权利要求1或权利要求2所述的Wnt结合多肽以及SEQIDNO:72的N末端信号序列组成。
4.一种细胞，其制造权利要求1或权利要求2所述的Wnt结合多肽。
5.一种细胞，其包含权利要求3所述的FZD-Fc变异体多肽。
6.一种药物组合物，其包含权利要求1或权利要求2所述的Wnt结合多肽和药学上可接受的载体。
7.一种多核苷酸，其编码如权利要求1或权利要求2所述的Wnt结合多肽。
8.一种多核苷酸，其编码权利要求3所述的FZD-Fc变异体多肽。
9.一种细胞，其包含权利要求7所述的多核苷酸。
10.一种细胞，其包含权利要求8所述的多核苷酸。
11.权利要求1或权利要求2所述的Wnt结合多肽在制造用于治疗癌症的药物中的用途。
12.权利要求1或权利要求2所述的Wnt结合多肽在制造用于治疗与Wnt信号传递活化有关的疾病的药物中的用途。
13.如权利要求11所述的用途，其中所述治疗包括施用第二治疗剂。
14.如权利要求12所述的用途，其中所述治疗包括施用第二治疗剂。
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