KR101166749B1 - 열쇼크 단백질 저해제로서의 이소옥사졸 화합물 - Google Patents

열쇼크 단백질 저해제로서의 이소옥사졸 화합물 Download PDF

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Abstract

다음식 (A) 또는 (B)의 이소옥자솔은 HSP90 활성의 저해제이고, 예를들어, 암의 치료에 유용하다:
Figure 112005044121551-pct00207
상기식에서 R1은 식(IA): -Ar1-(Alk1)p-(Z)r-(Alk2)s-Q이고, 이 식에서 어떠한 적합한 조합에 있어,
Ar1은 임의로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴기이고,
Alk1과 Alk2는 임의로 치환된 2가 C1-C6 알킬렌 또는 C2-C6 알켄일렌기이고,
p, r와 s는 각각 0 또는 1이고,
Z는 -O-. -S-, -(C=O)-, -(C=S)-, -SO2-, -C(=O)O-, -C(=O)NRA-, -C(=S)NRA-, -SO2NRA-, -SO2NRA-, -NRAC(=O)-, -NRASO2- 또는 -NRA-(여기서 RA는 수소 또는 C1-C6 알킬이다)이며,
Q는 수소 또는 임의로 치환된 탄소 고리 또는 헤테로 고리기이며;
R2는 (ⅰ)R1에서 정의된 식(IA)의 기;
(ⅱ)카르복스아미드기; 또는
(ⅲ)환 탄소가 임으로 치환되고, 환 질소가 식 -(Alk1)p-(Z)r-(Alk2)a-Q(여기서 Q, Alk1, Alk2, Z, p, r과 s는 상기 식(IA)에서 정의한 바와 같다)에 의하여 임의로 치환된 비방향족 탄소 고리 또는 헤테로 고리환이며,
R3는 수소, 임의로 치환된 시클로알킬, 시클로알켄일, C1-C6 알킬, C1-C6 알켄일 또는 C1-C6 알킨일; 카르복실, 카르복스아미드 또는 카르복실에스테르기이다.

Description

열쇼크 단백질 저해제로서의 이소옥사졸 화합물 {ISOXAZOLE COMPOUNDS AS INHIBITORS OF HEAT SHOCK PROTEINS}
본 발명은 HSP90 저해 활성을 갖는 치환 이소옥사졸과 암과 같은 HSP90 활성의 저해에 반응하는 질병과 관련하여 약제에 사용하는 이러한 화합물의 용도와 이러한 화합물을 함유하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
분자 샤프롱은 단백질의 적당한 접힘과 입체구조를 유지하고 단백질 합성과 분해 사이의 균형을 조절하는데 결정적이다. 이들은 세포 증식과 고사(졸리와 모리모토, 2000; 스미스 등, 1998; 스미스, 2001)와 같은 여러가지 중요한 세포 기능을 조절하는데 중요함을 나타냈었다.
열쇼크 단백질( HSPs )
열쇼크, 알코올, 중금속과 산화성 장애를 포함한 여러가지 환경 장애에 세포의 노출은 통상적으로 열쇼크 단백질(HSPs)로서 알려져 있는 많은 샤프롱의 세포 축적을 가져온다. HSPs의 유도는 초기 장애 손상에 대하여 세포를 보호하고 장애 내성 상태의 유지 회복과 유도를 강화한다. 그러나, 어떠한 HSPs는 중요한 세포 단백질의 성장 리스트의 정확한 접힘, 분해, 집적과 기능을 조절하여 정상적인 장애-유리 조건 하에 주요 분자 샤프롱 역할도 할 수 있는 것이 명백하다.
이들은 예를들어 HSP70, HSP90과 HSP27과 같이 분자량에 따라서 분류된다. 사람의 몇 가지 질병은 잘못 접힌 단백질의 결과에 따라서 얻을 수 있다(티텔 등, 2001; 스미스 등, 1998에서 재검토). 그러므로, 분자 샤프롱 조직을 파괴하는 치료의 전개가 유익함이 증명된다. 몇 가지 질병(예를들어, 알츠하이머 질병, 프리온 질병과 헌팅톤 질병에서 잘못 접힌 단백질은 신경 변성의 질병을 가져오는 단백질 응집을 일으킬 수 있다. 또한, 잘못 접힌 단백질은 세포에서 비조절된 분자와 생리적 기능을 유도하는 야생형 단백질 기능의 손실을 가져올 수 있다.
또한, HSPs는 암에 영향을 끼친다. 예를 들면, 종양 진행 단계에 관계할 수 있는 HSPs의 다른 발현이 나타난다(마아틴 등, 2000; 콘로이 등, 1996; 카와니시 등, 1999; 재밀 등, 1992; 호앙 등, 2000; 뢰비우 등, 1991). 여러 임계 종양 경로에 HSP90의 포함과 항암 활성을 갖는 어떠한 천연 생성물이 이러한 분자 샤프롱을 목표로 하는 발견에 따라서 매혹적인 새로운 개념에서는 HSP 기능을 저해하는 것이 암치료에 유용하다는 것을 전개해 왔다. 첫번째 분자 샤프롱 저해제가 현재 임상 시험을 받고 있다.
HSP90
HSP90은 전체 세포 단백질 중 약 1-2%로 구성도고, 통상 여러가지 다른 단백질 중 하나와 연관하여 이량체로서 세포에 존재한다(참조, 예를들어, 프래트, 1997). 이는 세포 생존율에 필수적이고 이 중 샤프롱 기능을 나타낸다(영 등, 2001). 이들의 천연 배좌는 열쇼크와 같은 여러가지 환경 장애에 의하여 변경된 후 많은 단백질과 상호작용하고, 적당한 단백질 접힘을 확보하고, 비특이적 응집을 방 지하므로서 세포 장애 반응에서 주요한 역할을 한다(스미스 등, 1998). 더불어, 최근 결과에 따르면 HSP90이 돌연 변이체 단백질의 부적합한 접힘을 수정하여 돌연변이 작용에 대하여 완충적인 역할을 할 수 있음을 예상하였다(루테르포오드와 린드퀴스트, 1998). 또한, HSP90은 중요한 조절 역할을 갖는다. 정상적인 생리적 조건하에서 HSP90은 이의 소포체 상동 GRP94와 함께 세포에서 보조관리 역할을 하고, 몇몇 주요 피보호 단백질의 돌연변이와 배좌의 안정성을 유지한다. 이들은 (a)스테로이드 호르몬 수용체, (b)Ser/Thr 또는 티로신 키나아제(예를들어, ERBB2, RAF-1, CDK4와 LCK)와 (c)명백하게 관련되지 않은 단백질, 예를들어, 돌연변이체 p53의 수집과 텔로머라아제 hTERT의 촉매 소단위의 세 그룹으로 세분될 수 있다. 이들 단백질 모두는 세포의 여러가지 생리적 및 생화학적 과정에서 주요한 조절 역할을 한다. 새로운 HSP90 피보호 단백질은 계속적으로 확인된다.
인체에서 높게 보존된 HSP90는 네개의 유전자, 즉, 세포질 HSP90α와 HSP90β 이소형(히키 등. 1989), 소포체에서 GRP94(알곤 등, 1999)와 미토콘드리아 매트릭스에서 HSP75/TRAP1(펠트 등, 2000)로 이루어진다. 계의 멤버 모두는 유사한 활동 유형을 갖지만 세포내에서 이들의 집적에 따라 다른 피보호 단백질에 결합되는 것으로 생각된다. 예를 들면, ERBB2는 GRP94의 특이적 피보호 단백질(알곤 등, 1999)인 것으로 알려져 있고, 형1 종양 괴사 인자 수용체와 RB는 둘 다 TRAP1의 피보호체(송 등, 1995; 첸 등, 1996)인 것으로 나타나 있다.
HSP90은 일정 범위의 피보호 및 조절 단백질(스미스, 2001)과 일련의 복합 상호 작용에 참여한다. 정밀 분자 설명이 밝혀져 남아 있지만, 지난 몇 넌 이상 행 해진 생화학적 및 X-선 결정학적 연구는 HSP90의 샤프롱 기능에 한층 상세하게 설명된 통찰력을 제공했다.
이 발행물에서 초기의 논쟁에 따르면, HSP90은 ATP-의존형 분자 샤프롱(프로드로모우 등, 1997)으로 뉴클레오티드 결합 영역의 이량체화는 ATP 가수 분해에 있어 필수적이고, 이는 바꾸어서 샤프롱 기능에 필수적이다(프로드로모우 등, 2000a). ATP의 결합은 N말단 영역이 '클램프 메카니즘'(프로드로모우와 퍼얼, 2000b)으로 알려져 있는 배좌 스위치를 가져오는 서로간에 더 가깝게 접촉하는 환형 이량체 구조의 형성을 가져온다.
공지된 HSP90 저해제
발견된 첫째 종류의 HSP90 저해제는 벤조퀴논 안사마이신이고, 이는 화합물 허비마이신 A와 겔다나마이신을 포함한다. 이들은 v-Src 종양(우에하라 등, 1985)에 의하여 형질 전환된 섬유 아세포의 악성 표현형으로 전환되고, 다음 두 생체 외(슐트 등, 1998)와 생체 내 동물 도형(수프코 등, 1995)에서 우수한 항암활성을 나타내는 것으로 보인다.
면역 침강과 친화성 기질 연구에서는 겔다나마이신의 주요 활동 메카니즘에 HSP90에 결합하는 것을 포함하는 것으로 나타낸다(화이트셀 등, 1994; 슐트와 네커스, 1998). 더우기, X-선 결정학적 연구에서는 겔다나마이신이 ATP 결합 부위에서 완성되고 HSP90의 고유 ATPase 활성을 저해하는 것으로 나타낸다. 바꾸어서 이것은 피보호 단백질을 샤프롱 할 수 있는 성숙 다량체성 HSP90 복합체의 형성을 예방한다. 따라서, 피보호 단백질은 유비퀴틴 프로테아섬 경로를 통하여 분해하는 것을 표적으로 한다. 17-알릴아미노, 17-데메톡시겔다나마이신(17AAG)은 피보호 단백질 결핍으로 나오는 HSP90의 특성과 세포 배양 및 이종 이식 모형에서 항종양 활성을 보유하지만, 겔다나마이신보다 현저하게 적은 간독성을 갖는다(페이지 등, 1997). 17AAG는 단계 I 임상 시험에서 현재 평가되고 있다.
래디시콜은 v-Src와 v-Ha- Ras 형질전환된 섬유아세포의 악성 표현형으로의 전환을 나타낸 마크로사이클 항생물질이다(퀀 등, 1992; 즈하오 등, 1995). HSP90 저해의 결과로서 여러가지 신호 단백질이 분해되는 것이 나타났다(슐트 등, 1998). X-선 결정학적 데이타에서 래디시콜이 HSP90의 N 말단 영역에 결합하고 고유 ATPase 활성을 저해하는 것을 확인했다(로이 등, 1998). 래디시콜은 화합물의 불안정성 화학적 성질로 인하여 생체 내의 항종양 활성이 부족하다.
쿠마린 항생물질은 HSP90과 상동한 ATP 결합 부위에서 박테리아성 DNA 선회 효소에 결합하는 것으로 알려져 있다. 쿠마린, 노보비오신은 HSP90의 카르복시 말단에 즉, N-말단에 결합하는 벤조퀴논 안사마이신과 래디시콜에 의하여 점유되는 다른 부위에서 결합하는 것으로 나타난다(말쿠 등, 2000b). 그러나, 이것은 HSP90 기능의 저해와 여러가지 HSP90-샤프롱화 신호 단백질의 분해를 가져온다(말쿠 등, 2000a). 겔다나마이신은 HSP90 다음으로 노보비오신에 결합할 수 없으며; 이것으로 N와 C 말단 영역 사이의 약간의 상호작용이 존재해야 하고, 두 부위가 HSP90 샤프롱 성질에 중요한 관점과 일치하는 것이 예상된다.
푸린-주성분 HSP90 저해제, PU3는 ERBB2를 포함한 신호 분자의 분해를 가져오고, 유방암 세포에서 세포 주기 정지와 분화를 일으키는 것을 나타낸다(치오시스 등, 2001).
치료 목적으로서의 HSP90
종양의 표현형을 운용하는데 결정적으로 중요한 여러 신호 경로를 조절하는데 이를 포함하고, 어떠한 생체 활성 천연 생성물이 HSP90 활성을 통하여 이들의 효과를 발휘하는 것을 발견함으로 인하여 분자 샤프롱 HSP90이 현재 항암 약제 개발에 새로운 목표로서 평가되고 있다(네커스 등, 1999).
겔다나마이신, 17AAG와 래디시콜 작용의 우수한 메카니즘은 HSP90의 고유 ATPase 활성의 저해를 유도하는 단백질의 N-말단 영역에 위치하는 ATP 결합 부위에서 HSP90을 결합하는 것이다(참조, 예를들어, 프로드로모우 등, 1997; 스테빈스 등, 1997; 파나레토우 등, 1998).
HSP90 ATPase 활성의 저해는 공동-샤프롱의 점증을 방지하고 이들 피보호 단백질이 유비퀴틴 프로테아섬 경로를 경유하여 분해를 목표로 하는 HSP90 이종 복합체 형의 형성을 조장한다(참조, 예를들어, 네커 등, 1999; 켈랜드 등, 1999).
HSP90 저해제로의 처리는 세포 증식, 세포 주기 조절과 세포 자멸사에 포함되는 중요한 단백질의 선택적 분해를 유도하며, 이들 과정은 암에서 근본적으로 중요하다.
HSP90 기능의 저해는 세포 증식, 세포 주기 조절과 세포 자멸사에 포함되는 중요한 신호 단백질의 선택적 분해를 일으키는 것을 나타내며, 이 과정은 암에서 근본적으로 중요하고 통상적으로 조절이 해제되는 것이다(참조, 예를들어, 초스테인 등, 2001). 임상에 사용하기 위한 이러한 목표로 약제를 개발하는 매력적인 원 리는 형질전환된 표현형과 연관된 단백질을 동시에 고갈시키므로서 강한 항종양 효과를 얻을 수 있고, 암 대 정상 세포에 대한 치료적 이점을 성취할 수 있는 것이다. HSP90 저해의 이들 하류 부분 결과는 세포 배양과 동물 모형에서 HSP90 저해제의 항종양 활성에 원인이 있는 것으로 믿는다(참조, 예를들어, 슐트 등, 1998; 켈랜드 등, 1999).
본 발명은 예를들어, 암 세포 증식을 저해하는 HSP90 저해제로서 치환 이소옥사졸 화합물류의 사용에 관한 것이다. 또한, 본 발명에는 새로운 이소옥사졸 화합물 그 자체와 이를 함유하는 약학적 조성물을 포함한다.
본 발명에 따라서 HSP90 활성 저해용 조성물의 제조에 있어 다음식(A) 또는 (B)의 화합물이나 이들의 염, N-산화물, 수화물 또는 용매화물이나 이의 프로드러그의 용도를 제공한다:
Figure 112005044121551-pct00001
상기식에서
R1은 다음식(IA)의 기이다:
-Ar1-(Alk1)p-(Z)r-(Alk2)s-Q (IA)
이 식에서 어떠한 적합한 조합에 있어,
Ar1은 임의로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴기이고,
Alk1과 Alk2는 임의로 치환된 2가 C1-C6 알킬렌 또는 C2-C6 알켄일렌기이고,
p, r와 s는 각각 0 또는 1이고,
Z는 -O-. -S-, -(C=O)-, -(C=S)-, -SO2-, -C(=O)O-, -C(=O)NRA-, -C(=S)NRA-, -SO2NRA-, -SO2NRA-, -NRAC(=O)-, -NRASO2- 또는 -NRA-(여기서 RA는 수소 또는 C1-C6 알킬이다)이며,
Q는 수소 또는 임의로 치환된 탄소 고리 또는 헤테로 고리기이며;
R2는 (ⅰ)R1에서 정의된 식(IA)의 기;
(ⅱ)카르복스아미드기; 또는
(ⅲ)환 탄소가 임으로 치환되고, 환 질소가 식 -(Alk1)p-(Z)r-(Alk2)a-Q(여기서 Q, Alk1, Alk2, Z, p, r과 s는 상기 식(IA)에서 정의한 바와 같다)에 의하여 임의로 치환된 비방향족 탄소 고리 또는 헤테로 고리환이며,
R3는 수소, 임의로 치환된 시클로알킬, 시클로알켄일, C1-C6 알킬, C1-C6 알켄일 또는 C1-C6 알킨일; 카르복실, 카르복스아미드 또는 카르복실에스테르기이다.
일반적으로, 상기식(I)에서 정의한 화합물 종류는 신규한 것이고, 이러한 종류와 이들의 염, 수화물과 용매화물과 이들의 프로드러그의 모든 새로운 멤버는 본 발명에 포함된다.
여기에 사용되는:
"카르복실기"란 용어는 식 -COOH의 기를 뜻하고;
"카르복실 아스테르기"란 용어는 R이 히드록실 또는 화합물 ROH에서 실질적으로 또는 개념적으로 유도된 기인 식 -COOR의 기를 뜻한다;
"카르복사미드 기"란 용어는 식 -CONRaRb(여기서, -NRaRb는 암모니아 또는 아민 HNRaRb에서 실질적으로 또는 개념적으로 유도된(고리 포함) 일차 또는 이차 아미노기이다)를 뜻한다.
여기에 사용되는 "(CaCb)알킬"(여기서, a와 b는 정수이다)은 a 내지 b의 탄소원자를 갖는 직쇄 또는 분지쇄 알킬기를 뜻한다. 따라서, a가 1이고, b가 6일 때의 예를들면, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, sec-부틸, t-부틸, n-페틸과 n-헥실이 있다.
여기서 사용된 "이가 (Ca-Cb)알킬렌기"(여기서, a와 b는 정수이다) 용어는 a 내지 b의 탄소원자와 두 불만족한 원자가를 갖는 포화 탄화수소쇄를 뜻한다.
여기서 사용된 "(Ca-Cb)알켄일"(여기서, a와 b는 정수이다)란 용어는 a 내지 b의 탄소원자를 갖고, 예를들어, 에텐일과 알릴을 포함한 E 또는 Z 배열의 최소한 하나의 이중 결합을 함유하는 직쇄 또는 분지쇄 알켄일기를 뜻한다.
여기서 사용된 "이가 (Ca-Cb)알켄일렌기"(여기서, a와 b는 정수이다)란 용어는 a 내지 b의 탄소원자, 최소한 하나의 이중 결합과 두 불만족한 원자가를 갖는 탄화수소쇄에 관한 것이다.
여기서 사용된 "(Ca-Cb)알킨일"(여기서, a와 b는 정수이다)이란 용어는 예를들어, 에틴일과 프로프-2-인엘을 포함한 a 내지 b의 탄소원자를 갖고 최소한 하나의 삼중 결합을 함유하는 직쇄 또는 분지쇄 알켄일기를 뜻한다.
여기서 사용된 "이가 (Ca-Cb)알켄일렌기"(여기서, a와 b는 정수이다)란 용어는 a 내지 b의 탄소원자를 갖고, 최소한 하나의 삼중 결합과 두 불만족한 원자가를 함유하는 직쇄 또는 분지쇄 알킨일기를 뜻한다.
여기에 사용된 "시클로알킬"이란 용어는 예를들어, 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실, 시클로헵틸과 시클로옥틸을 포함하여 3-8개의 탄소원자를 갖는 포화 탄소고리기를 뜻한다.
여기에 사용된 "시클로알켄일"이란 용어는 예를들어, 시클로펜텐일, 시클로헥센일, 시클로헵텐일과 시클로옥텐일을 포함하여 3-8개의 탄소원자를 갖는 최소한 하나의 이중 결합을 함유하는 탄소고리기를 뜻한다.
여기에 사용된 "아릴"이란 용어는 모노-, 비- 또는 트리- 탄소고리 방향족기를 뜻한다. 이와 같은 기를 예시하면, 페닐, 비페닐과 나프틸이 있다.
여기에 사용된 "탄소고리"란 용어는 모노시클릭 아릴, 시클로 아릴과 시클로 알켄일기를 포함하여 환 탄소가 모두 탄소인 고리기를 뜻한다.
여기에 사용된 "헤테로아릴"이란 용어는 S, N과 O에서 선택한 하나 또는 그 이상의 헤테로원자를 함유하는 모노-, 비- 또는 트리- 고리 방향족기를 뜻한다. 이와 같은 기를 예시하면, 티에닐, 벤즈티에닐, 푸릴, 벤즈푸릴, 티롤일, 이미다졸일, 벤즈이미다졸일, 티아졸일, 벤즈티아졸일, 이소티아졸일, 벤즈이소티아졸일, 피라졸일, 옥사졸일, 벤즈옥사졸일, 이소옥사졸일, 벤즈이소옥사졸일, 이소티아졸일, 트리아졸일, 벤즈트리아졸일, 티아디아졸일, 옥사다이졸일, 피리딘일, 피리다진일, 피리미딘일, 피라진일, 트리아진일, 인돌일과 인다졸일이 있다.
여기에 사용된 "헤테로사이클일" 또는 "헤테로사이클릭"이란 무제한 용어는 상술한 바와 같은 "헤테로아릴을 포함하고, 특히 S, N와 O에서 선택한 하나 또는 그 이상의 헤테로원자를 함유하는 모노-, 비- 또는 트리- 시클릭 비-방향족기와 이와 같은 다른기에 또는 모노시클릭 탄소고리기에 공유결합된 하나 또는 그 이상의 이러한 헤테로원자를 함유하는 모노시클릭 비-방향족기로 이루어지는 기를 뜻한다. 이와 같은 기를 예시하면, 피롤일, 푸란일, 티에닐, 피페리딘일, 이미다졸일, 옥사졸일, 이소옥사졸일, 티아졸일, 티아디아졸일, 피라졸일, 피리딘일, 피롤리딘일, 피리미딘일, 몰폴린일, 피페라진일, 인돌일, 몰폴린일, 벤즈프란일, 피란일, 이소옥사졸일, 벤즈이미다졸일, 메틸렌디옥시페닐, 에틸렌디옥시페닐, 말레이미도와 석신이미도기가 있다.
일어나는 설명에 다른 언급이 없는 한 여기서 부분적으로 사용된 "치환"이란 용어는 네개 이하의 상화성 치환기로 치환되는 것을 뜻하고, 예를들면, 이들 각각은 독립적으로 (C1-C6)알킬, (C1-C6)알콕시, 히드록시, 히드록시(C1-C6)알킬, 머캅토, 머캅도(C1-C6)알킬, (C1-C6)알킬티오, 할로(플로오로, 브로모와 클로로 포함), 트리플루오로메틸, 트리플루오로메톡시, 니트로, 니트릴(-CN), 옥소, 페닐, -COOH, -COORA-, -CORA, -SO2RA, -CONH2, -SO2NH2, -CONHRA, -SO2NHRA, -CONRARB, -SO2NRABB, -NH2, -NHRA, -NHARB, -OCONH2, -OCONHRA, -OCONRARN, -NHCORA, -NHCOORA, -NRBCOORA, -NHSO2ORA, -NRBSO2OH, -NRBSO2ORA, -NHCONH2, -NRACONH2, -NHCONHRB, -NRACONHRB, -NHCONRARB 또는 -NRACONRARB(여기서, RA와 RB는 각각 (C1-C6)알킬기이다). "임의의 치환기"란 전술한 치환기 중 하나이다. 상술한 치환기 중 (C1-C6)알킬, 할로, 트리플루오로메틸, 트리플루오로메톡시, 트리플루오로메틸술폰일과 페닐이 통상 가장 좋은 친유성으로 생각되는 기이다. 알킬기를 함유하는 열거된 다른 치환기를 존재하는 특별한 알킬기에 따라 친수성일 수 있다.
여기에 사용된 "염"이란 용어는 염기부가염, 산부가염과 사차염을 뜻한다. 산성인 본 발명의 화합물은 알카리 금속 수산화물, 예를들어, 나트륨과 칼륨 수산화물; 알카리 토류 금속 수산화물, 예를들어, 칼슘, 바륨과 마그네슘 수산화물과 같은 염기와; 유기염기, 예를들어, N-메틸-D-글루카민, 콜린 트리스(히드록시메틸)아미노메탄, L-알기닌, L-리신, N-에틸 피페리딘, 디벤질아민 등과 약학적으로 또는 수의학적으로 수용할 수 있는 염을 포함한 염을 형성할 수 있다. 염기성인 이들 화합물(I)은 무기산, 예를들어, 염산 또는 브롬화 수소산과 같은 할로겐화 수소산, 황산, 질산 또는 인산 등과 유기산, 예를들어, 초산, 타르타르산, 푸마르산, 말레산, 말리산, 살리실산, 시트르산, 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 벤조산, 벤젠술폰산, 글루탐산, 락트산과 만델산 등과 약학적으로 또는 수의학적으로 수용할 수 있는 염을 포함한 염을 형성할 수 있다.
치환기와 관련하여 여기에 사용된 "친유성"이란 용어는 양의 치환기 소수성 상수(π)를 갖는 것을 뜻한다(π의 양의 값은 치환기가 수소보다 더 친유성인 것을 나타내는 반면에 음의 값은 수소보다 더 적은 친유성, 즉, 더 큰 친수성을 나타내는 것이다).
본 발명의 몇몇 화합물은 비대칭 탄소원자의 존재 때문에 하나 또는 그 이상의 실질적 또는 우수한 비대칭 중심을 갖는다. 몇몇 비대칭 탄소원자의 존재는 각 비대칭 중심에서 R 또는 S 입체 화학을 갖는 많은 부분 입체 이성질체를 일으킨다. 본 발명은 이와 같은 모든 부분 입체 이성질체와 이의 혼합물을 포함한다.
본 발명의 요지에 상업적으로 이용할 수 있는 다음 세가지 화합물(X), (Y)와 (Z)를 제외한 상기식(A) 또는 (B)의 화합물과 이들의 염, N-산화물, 수화물 또는 용매화물과 이들의 프로드러그를 포함한다:
Figure 112005044121551-pct00002
특히, 본 발명은 이들은 제외하고 치환기 R1, R2와 R3가 다음 섹션에서 "R1기", "R2기"와 "R3기"로 기재되고 언급된 것을 포함한다. 다른 요지로는 HSP90 활성의 저해에 반응하는 질병을 치료하는데 사용하는 이와 같은 화합물의 용도를 포함한다.
R 1 기
일반적으로 R1기에 존재하는 기 Ar1이 임의로 치환된 페닐인 것이 바람직하고, 임의의 치환기 중 하나가 이소옥사졸환에 페닐환이 부착된 점에 대하여 위치 2에서 히드록시인 것이 바람직하다. 다시 말해서, R1기가 다음식(IB)을 갖는 것이다
Figure 112005044121551-pct00003
상기식에서 Alk1, Alk2, p, r, s, Z과 Q는 R1에서 상기 정의한 것과 같고, R은 하나 또는 그 이상의 임의의 치환기를 나타낸다. 이와 같은 구조식에서 히드록실기에 인접한 환 탄소원자가 비치환되는 것이 더 바람직하다. R1의 다음 다른 설명에서 이러한 바람직함을 다른 언급한 가능성과 더불어 사용한다.
본 발명에 관한 가장 간단한 구조는 p, r과 s가 각각 0이고, Q가 수소이므로서 R1이 임의로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴일 때이다. 이와 같은 경우에 R1은 예를들어, 임의로 치환된 페닐, 바람직하기로는 예를들어, 하나 또는 그 이상의 히드록시, 메틸, 에틸, 메톡시, 에톡시, 클로로 또는 브로모에 의하여 더 치환된 2-히드록시페닐이다. 바람직하기로는 R1이 예를들어, 메틸, 에틸, 이소프로필, tert-부틸, 클로로 또는 브로모, 특히 에틸, 이소프로필 또는 클로로와 같이 tert-부틸과 같거나 보다 작은 분자 체적을 갖는 작은 친유성 치환기에 의하여 5위치에서 치환된 2,4-디히드록시페닐인 화합물일 때이다. 이와 같은 본 발명의 5-치환, 2,4-디히드록시 페닐 화합물에서 히드록실기는 히드록실기를 유리하는 몸체에서 분해되는 기에 의하여 보호될 수 있다. 히드록실로 분해되는 이러한 종류의 공지된 프로드러그-형 기에는 메틸카르보닐옥시와 같은 알킬카르보닐옥시기와 디알킬아미노- 또는 이소프로필아미노카르보닐옥시와 같은 알킬아미노카르복시옥시기가 있다.
본 발명에 관련된 다른 간단한 구조식에서 다시 p, r와 s는 각각 0이고, Q는 임의로 치환된 탄소 고리 또는 헤테로사이클릭환, 예를들어, 페닐 또는 피리딜환일 수 있다. 이와 같은 경우 Q는 임의로 치환된 Ar1환에서 직접 치환기이다.
본 발명에 관련되는 더 큰 복합 구조에 있어, p, r과 s 중 하나 또는 그 이상이 1이고, Q가 수소 또는 임의로 치환된 탄소 고리 또는 헤테로 고리환이다. 예를들면, p 와/또는 s가 1이고, r이 0이고, 그러므로 Q는 임의로 치환되는 알킬렌 또는 알켄일렌기, 예를들어, C1-C3 알킬렌기에 의하여 Ar1에 결합된다. 다른 경우, 각 p, r와 s가 1이고, 이 경우 Q는 헤테로원자- 함유 Z기에 의하여 차단되는 알킬렌 또는 알켄일렌기에 의하여 Ar1에 결합된다. 또 다른 경우, p와 s가 0이고, r이 1로서, 이 경우 Q는 헤테로원자- 함유 Z기를 경유하여 Ar1에 결합된다.
상기 형의 특수한 R1기의 예들은 다음 실시예들의 화합물에 표시했다.
R 2 기
R2가 형(ⅰ), 즉, 식(IA)의 기일 때, 예를들며, 페닐, 2-, 3- 또는 4-피리딜, 2- 또는 3-푸란일, 2- 또는 3-티에닐과 티아졸일이 있으며, 여기서 임의의 치환기는 상기 "치환의 정의에 열거된 것이고, 예를들면, 메톡시, 에톡시, 메틸렌디옥시, 에틸렌디옥시, 플루오로, 클로로, 브로모와 트리플루오로메틸이 있다. 예를들어, R2는 메톡시 또는 에톡시와 같은 C1-C6 알콕시에 의하여 또는 플루오로, 클로로, 브로모, 피페라진일, N-메틸피페라진일 또는 피페리딘일에 의하여 4위치에서 치환된 페닐일 수 있다.
특히 바람직한 R2 치환기에는 다음 부분 구조식을 갖는 것이 있다:
Figure 112005044121551-pct00004
상기식에서 치환 아미노기 -NR10R11은 용해화기이다. 이와 같은 용해화기는 의약 화학에 많이 알려져 있다. 예를들면, 몰폴린일, 피페리딘일, 피페라진일, 피롤리딘일, 에틸아미노, 이소프로필아미노, 디에틸아미노, 시클로헥실아미노, 시클로펜틸아미노, 메톡시에틸아미노, 피페리딘-4-일, N-아세틸피페라진일, 메틸술폰일아미노, 티오몰폴린일, 티오몰폴린일디옥시드, 4-히드록시에틸피페리딘일과 4-히드록시피페리딘일이 있다.
출원인의 계속 출원인 국제특허출원번호 PCT/GB2003/005275에는 본 발명과 관련되는 이소옥사졸과 유사한 피라졸 화합물을 저해하는 HSP90이 기술되어 있으며, 이는 유사한 모양으로 HSP90 목표에 포함시키는 것으로 믿는다. 이들 피라졸 화합물은 본원의 이소옥사졸의 R2에 해당하는 위치에 카르복스아미드기를 갖는다. 그러므로, 본 이소옥사졸에서 R2가 상술한 형(ⅱ)의 카르복스아미드기일 때, 예를들면, PCT/GB2003/005275의 피라졸 화합물에 존재하는 것이며, 예를들면, 식 CONRB(Alk)nRA의 카르복스아미드가 있고, 이 식에서
Alk는 2가 알킬렌, 알켄일렌 또는 알킨일렌기, 예를들어, -CH2-, -CH2CH2-, -CH2CH2CH2-, -CH2CH=CH- 또는 -CH2CCCH2 -기이고, Alk기는 임의로 치환될 수 있고,
n는 0또는 1이고,
RB는 수소 또는 C1-C6 알킬 또는 C2-C6 알켄일기, 예를들어, 메틸, 에틸, n- 또는 이소-프로필 또는 알릴이며,
R4는 히드록시 또는 임의로 치환된 탄소 고리, 예를들어, 히드록시 와/또는 클로로-치환페닐과 3,4 메틸렌디옥시페닐; 또는 헤테로고리환이 치환될 수 있는 헤테로시클일, 예를들어, 피리딜, 푸릴, 티에닐, N-피레라진일 또는 N-몰폴린일이며,
또는 RA와 RB는 이들에 결합되는 질소와 함께 O, S와 N에서 선택한 하나 또는 그 이상의 부가적 헤테로 원자를 임의로 함유하고 하나 또는 그 이상의 환 C 또는 N 원자에서 임의로 치환될 수 있는 N-헤테로고리환을 형성하고, 이와 같은 N-헤테로고리환의 예를들면, 몰포리노, 피페리딘일, 피페라진일과 N-페닐피페라진일이 있다.
R 3 기
R3는 예를들면, 수소, 메틸, 에틸, n- 또는 이소-프로필, 트리플루오로메틸, 히드록시에틸, 메틸술폰아미노메틸 또는 R2에서 상술한 -CONRB(Alk)nRA의 카르복스아미드기가 있다. 카르복스아미드기는 특히 에틸아미노카르보닐과 이소프로필아미노카르보닐이 바람직하다.
본 발명에 관련되는 특별한 서브-세트의 화합물은 다음식(ID)의 화합물과 이들의 식(B) 위치 이성질체 및 이들의 염, 용매화합물과 수화물과 이들의 프로드러그로 이루어진다:
Figure 112005044121551-pct00005
상기식에서 각 R은 독립적으로 임의의 치환기를 나타내고, R3는 카르복스아미드기를 나타낸다.
본 발명에 관련되는 바람직한 서브-세트의 다음식(IE)의 화합물과 이들의 식(B) 위치 이성질체 및 이들의 염, 용매화합물과 수화물과 이들의 프로드러그로 이루어진다:
Figure 112005044121551-pct00006
상기식에서 R3는 카르복스아미드기(에틸아미노카르보닐 CH3CH2NHC(=O)- 또는 이소프로필아미노카르보닐 (CH3)2CHNHC(=O)-와 같은 것)를 나타내고; R9는 치환되는 아미노기 -NR10R11이 용해화기인 -CH2NR10R11 또는 -NR10R11(몰폴린일, 피페리딘일, 피페라진일, 피롤리딘일, 에틸아미노, 이소프로필아미노, 디에틸아미노, 시클로헥실아미노, 시클로펜틸아미노, 메톡시에틸아미노, 피페리진-4-일, N-아세틸피페라진일, N-메틸피페라진일, 메틸술폰일아미노, 티오몰폴린일, 티오몰폴린일디옥시드, 4-히드록시에틸피페리딘일과 4-히드록시피페리딘일과 같은 것)를 나타내고; R8는 임의의 치환기, 특히 작은 친유성기(에틸, 이소프로필, 브로모 또는 클로로와 같은 것)를 나타낸다.
본 발명에 관련되는 특수한 화합물들에는 특히 다음 예들의 화합물, 그들의 염, N-산화물, 수화물과 용매화물과 그들의 프로드러그가 있다:
5-(2,4-디히드록시-5-이소프로필-페닐)-4-(4-몰폴린-4-일메틸-페닐)-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸아미드
5-(2,4-디히드록시-5-이소프로필-페닐)-4-(4-피페리딘-1-일메틸-페닐)-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸아미드
4-(4-디에틸아미노에틸-페닐)-5-(2,4-디히드록시-5-이소프로필-페닐)-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸아미드
5-(2,4-디히드록시-5-이소프로필-페닐)-4-[4-(4-메틸-피페라진-1-일메틸)-페닐]-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸아미드
5-(2,4-디히드록시-5-이소프로필-페닐)-4-(4-에틸아미노메틸-페닐)-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸아미드
5-(2,4-디히드록시-5-이소프로필-페닐)-4[4-(이소프로필아미노-메틸)-페닐]이소옥사졸-3-카르복실산 에틸아미드
4-(4-시클로헥실아미노메틸-페닐)-5-(2,4-디히드록시-5-이소프로필-페닐)-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸아미드
4-[4-(tert-부틸아미노-메틸)-페닐]-5-(2,4-디히드록시-5-이소프로필-페닐)-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸아미드
5-(2,4-디히드록시-5-이소프로필-페닐)-4-{4-[(2-메톡시-에틸아미노)-메틸]-페닐}-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸아미드
5-(2,4-디히드록시-5-이소프로필-페닐)-4-(4-몰폴린-4-일메틸)-페닐)-이소옥사졸-3-카르복실산 이소프로필아미드
5-(2,4-디히드록시-5-이소프로필-페닐)-4-[4-(4-메틸-피페라진-1-일메틸)-페닐]-이소옥사졸-3-카르복실산 이소프로필아미드
5-(5-tert-부틸-2,4-디히드록시-페닐)-4-[4-(4-메틸-피페라진-1-일메틸)-페닐]-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸아미드
5-(5-tert-부틸-2,4-디히드록시-페닐)-4-(4-피페리딘-1-일메틸-페닐)-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸아미드
5-(2,4-디히드록시-5-이소부틸-페닐)-4-(4-몰폴린-4-일메틸-페닐)-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸아미드
5-(2,4-디히드록시-5-이소부틸-페닐)-4-(4-피페리딘-1-일메틸-페닐)-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸아미드
5-(5-tert-부틸-2,4-디히드록시-페닐)-4-(4-몰폴린-4-일메틸-페닐)-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸아미드
5-(5-tert-부틸-2,4-디히드록시-페닐)-4-(4-디에틸아미노메틸-페닐)-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸아미드
3-(5-클로로-2,4-디히드록시-페닐)-4-(4-몰폴린-4-일메틸-페닐)-이소옥사졸-5-카르복실산 에틸아미드
4-(4-디에틸아미노메틸-페닐)-5-(4,6-디히드록시-2'-메틸-비페닐-3-일)-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸아미드
4-(4-디에틸아미노메틸-페닐)-5-(4'-플루오로-4,6-디히드록시-비페닐-3-일)-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸아미드
4-(4-디에틸아미노메틸-페닐)-5-(4.6-디히드록시-비페닐-3-일)-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸아미드
5-(2'-플루오로-4,6-디히드록시-비페닐-3-일)-4-(4-피롤리딘-1-일메틸-페닐)-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸아미드
5-(4,6-디히드록시-비페닐-3-일)-4-(4-몰폴린-4-일메틸-페닐)-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸아미드
5-(2,4-디히드록시-5-펜에틸-페닐)-4-(4-몰폰일-4-일메틸-페닐)-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸아미드
5-(5-클로로-2,4-디히드록시-페닐)-4-(4-피페리딘-1-일메틸-페닐)-이소옥사졸-3-카르복실산 이소프로필아미드
4-(4-디에틸아미노메틸-페닐)-5-(5-에틸-2,4-디히드록시-페닐)-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸아미드
5-(5-에틸-2,4-디히드록시-페닐)-4-[4-(4-메틸-피페라진-1-일메틸)-페닐]-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸아미드
5-(5-에틸-2,4-디히드록시-페닐)-4-(4-몰폴린-4-일메틸-페닐)이소옥사졸-3-카르복실산 에틸아미드
5-(5-클로로-2,4-디히드록시-페닐)-4-(4-디에틸아미노메틸-페닐)-이소옥사졸-3-카르복실산 이텔아미드
5-(5-클로로-2,4-디히드록시-페닐)-4-[4-(4-메틸-피페라진-1-일메틸-페닐]-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸아미드
5-(5-클로로-2,4-디히드록시-페닐)-4-(4-몰폴린-4-일메틸-페닐)-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸아미드
본 발명에 관련되는 화합물은 여기서의 제조예의 방법과 같은 문헌의 방법과 이와 유사한 방법으로 제조할 수 있다.
예를들면, 몇몇 식(IA)의 화합물은 히드록실아민과 다음식(Ⅲ)의 화합물을 반응시켜서 제조할 수 있다.
Figure 112005044121551-pct00007
상기식에서 A는 화합물(IA)의 기 R1에 해당하고, R2와 R3는 식(I)에서 정의한 바와 같다. 이러한 방법으로 제조된 화합물을 화학적으로 변형시켜서 원하는 치환기를 도입하여 식(A)의 다른 화합물을 제조할 수 있다. 예를들면, R1이 임의로 이미 치환기를 갖는 페닐환일 때 브로모 치환기의 도입은 sp2 커플링에 의하여 브로모 부위에 다른 치환기를 도입할 수 있다.
식(A)의 몇몇 화합물에 대한 다른 방법으로 이소옥사졸환은 다음 화합물(Ⅳ)을 히드록실아민과 반응시켜서
Figure 112005044121551-pct00008
(상기식에서 R1 1과 R1 3는 상술한 R1과 R3 치환기류의 멤버이다)
다음식(Ⅴ)의 이소옥사졸을 제조한 다음
Figure 112005044121551-pct00009
부가적 치환기 R2를 도입하고(예를들어, 식(Ⅴ)과 sp2 커플링에서 환 탄소를 브롬화 또는 요오드화) 이소옥사졸의 반응생성한 R1 1, R1 3와 R2 치환기를 변형시켜서 형성시킨다.
더우기, 몇몇 이소옥사졸 위치이성질체(B)는 이소옥사졸(A)로부터 트리메틸옥소늄 붕소 트리플루오르화물과 반응시켜서 제조하고, 다시 이러한 방법으로 제조된 화합물을 화학적으로 변형시켜서 원하는 치환기를 주입한 다음 식(IA)의 다른 화합물을 제조한다.
상기 합성에서 히드록실과 같은 반응성기를 보호하고 후에 이를 탈보호하는 것이 바람직함을 이해할 것이다. 또한, 합성의 상세한 설명은 실시예에서 기술한다.
본 발명의 화합물은 HSP90의 저해제이고, 따라서, 암과 같은 HSP90 활성의 저해에 반응하는 질명; C형 간염과 같은 바이러스성 질병(왁스맨, 2002); 이식과 같은 면역 억제(비를마커스, 2000과 요르긴, 2000); 류마티스성 관절염, 천식, MS, 타입 I 당노병, 루푸스, 건선과 염증 장질병과 같은 항-염증질병(부찌, 2000); 낭성 섬유종(풀러, 2000); 맥관형성-관련 질병(후르, 2000과 쿠레바야시, 2001); 당뇨성 망막병증, 혈관종, 건선, 자궁내막증과 종양 맥관형성증을 치료하는데 유용하다. 또한, 본 발명의 HSP90 저해제는 화학요법-유발 독성에 대한 정상세포를 보호하고 세포자멸사를 받는 기능 부전이 근본적 요인인 질병에 유용하다. 또한, 이와 같은 HSP90 저해제는 세포 긴장 또는 열 쇼크 단백질 반응의 유도가 유익한 질병에 예를들면, 심장(후터, 1996과 트로스트, 1998)과 뇌(플루미어, 1997과 래더, 2000)에서 Hsp70의 상승으로 인하여 저산소증-허혈 상해로부터의 보호에 유용하다. 또한, Hsp90은 단백질의 잘못 접힘 또는 응집이 주요 원인의 요인, 예를들어, 스크래피/CJD, 헌팅돈'스와 알츠하이머'스(시들러, 2001; 트래젤트, 1995와 윈클홀퍼, 2001)인 질병에 유용하다.
따라서, 본 발명은:
(ⅰ)포유류, 특히 사람에게서 HSP90 활성의 저해에 반응하는 질병 또는 증상의 치료방법, 이 방법은 상기 HSP90 활성을 저해하는데 효과가 있는 일량정의 상기식(A) 또는 (B)의 화합물, 이들의 염, 수화물 또는 용매화물을 포유류에 투여하여서 하는 것이며;
(ⅱ)특히 HSP90 활성의 저해에 반응하는 질병 또는 증상을 치료하는데 있어 사람에 또는 수의약품으로 사용하는 상기식(A) 또는 (B)의 화합물, 이들의 수화물 또는 용매화물;
(ⅲ)약학적으로 수용할 수 있는 담체와 함께 상기에서 설명한 상기식(A) 또는 (B)의 화합물을 함유하는 약학적 조성물, 특히 본 발명은 살균한 생리학적으로 수용할 수 있는 담체, 예를들어, 식염수에 이러한 화합물을 용해 또는 현탁시킨 용액 또는 현탁액을 포함한다.
어떠한 특정 환자의 구체적인 투약 수준은 사용되는 특정 화합물의 활성도, 나이, 체중, 일반 건강, 성별, 음식물, 투약시간, 투약방법, 배설속도, 약제 조합 및 원인 메카니즘과 치료를 받는 특정 질병의 심도를 포함한 여러가지 요인에 따름을 이해할 것이다. 일반적으로, 경구 투여 제제의 적당한 투약량은 통상 매일 일회, 이회 또는 삼회 또는 주입 또는 다른 방법에 의하여 투여되는 일일 최적량으로 0.1 내지 3000㎎의 범위에 있다. 그러나, 최적의 투약량 수준과 투약 회수는 본 분야의 관습에 따라 임상 시험으로 결정된다.
본 발명에 관련되는 화합물은 그들의 약물동력학적 성질과 일치하는 방법에 의하여 투약용응로 제조된다. 경구 투여 조성물은 정제, 캡슐, 분제, 입제, 당의정과, 경구의, 국소의 또는 살균한 비경구의 용액 또는 현탁액과 같은 액제 또는 겔제의 형태로 할 수 있다. 경구투여용 정제와 캡슐은 단위 투약 표시 형태이고, 결합제, 예를들어, 시럽, 아라비아 고무, 젤라틴, 솔비톨, 트라가칸트 또는 폴리비닐-피롤리돈; 충전제, 예를들어, 락토오스, 설탕, 옥수수-전분, 인산칼슘, 솔비톨, 글리신; 정제윤활제, 예를들어, 스테아르 마그네슘, 탈크, 폴리에틸렌 글리콜 꼬는 실리카; 정제분해물질, 예를들어, 감자전분 또는 황산 라우릴 나트륨과 같은 수용할 수 있는 습윤제와 일반적 기초제를 함유할 수 있다. 정제는 정상의 약학적 실시에 잘 알려져 있는 방법에 따라 피복할 수 있다. 경구액제는 예를들어, 수성 또는 유성 현탁액, 용액, 유탁액, 시럽 또는 엘릭서의 형태로 하거나 사용 전에 물 또는 다른 부형제와 재구성할 수 있는 건조 제품으로 나타낼 수 있다. 이와 같은 액제는 현탁제, 예를들어, 솔비톨, 시럽, 메틸 셀루로오스, 글루코오스 시럽, 젤라틴 수소화 식용유; 유화제, 예를들어, 렉시틴, 모노올레산 솔비탄 또는 아라비아 고무; 비-수성 부형제(이는 식용유를 포함할 수 있다), 예를들어, 아몬드유, 분별된 코코넛 오일, 글리세린과 같은 오일에스테르, 프로필렌 글리콜 또는 에틸 알코올; 방부제, 예를들어, 메틸 또는 프로필 p-히드록시벤조에이트 또는 소르브산과 같은 통상의 첨가제를 함유할 수 있고, 필요하면 통상의 향미제 또는 착색제를 함유할 수 있다.
피부의 국소 사용에 있어, 약제를 크림, 로션 또는 연고로 만들 수 있다. 약제에 사용될 수 있는 크림 또는 연고 제제는 본 분야에 잘 알려져 있는 통상의 제형이고, 예를들면, 영국 약전과 같은 의약품의 표준 교과서에 기술되어 있다.
또한, 유효 성분은 살균한 매체에서 비경구적으로 투여될 수 있다. 사용되는 농도와 부형제에 따라서 약제는 부형제에 현탁 아니면 용해시킬 수 있다. 유리하기로는 국부 마취제, 방부제와 완충제와 같은 보조제를 부형제에 용해시킬 수 있다.
또한, 본 발명의 화합물은 HSP90 활성의 저해에 따른 생체 외 분석에, 예를들면, 시험 화합물을 본 발명의 화합물로 하거나 또는 이것으로 대치하는 선택적 HSP90 저해제 종류를 선별하는데 유용하다. 따라서, 다른 특징으로 본 발명은 상기에서 설명한 상기식(A) 또는 (B)의 화합물과 HSP90 효소를 생체 외에서 접촉시키는 것으로 이루어지거나 HSP90 활성을 저해하는 방법을 포함한다.
다음 실시예는 본 발명의 특별한 화합물 제조와 활성을 예시한 것이다.
실시예 1-4
계통 1: 브로모 중간체의 제조와 연속 아릴화
Figure 112005044121551-pct00010
실시예 1
4-[4-(4- 메톡시 - 페닐 )-3- 메틸 - 이소옥사졸 -5-일]-벤젠-1,3- 디올
Figure 112005044121551-pct00011
단계 1
1-(2,4-디히드록시- 페닐 )-2-(4- 메톡시 - 페닐 )- 에탄온
Figure 112005044121551-pct00012
붕소 트리플루오라이드 에테레이트(25㎖, 0.2㏖)에서 레솔시놀(4.4g, 40m㏖)과 4-메톡시페닐초산(6.6g, 40m㏖)을 질소 분위기 하에 -90분 동안 90℃로 가열하여 엷은 적색 용액을 얻는다. 용액을 냉각시켜서 수성 초산 나트륨(200㎖, 10%)에 붓고 혼합물을 교반하여 담황색 침전물을 얻는다. 고체를 여과하여 제거하고 물(200㎖)로 세척한다. 고체를 초산 에틸(250㎖)에 용해시키고 물(200㎖)로 세척한다. 용액을 무수 황산 마그네슘으로 건조하고 농축하여 황색 반-고체를 얻는다. 디에틸 에테르(100㎖)와 분쇄하여 1-(2,4-디히드록시-페닐)-2-(4-메톡시-페닐)-에탄온을 얻고, 진공에서 건조한다(2.2g).
LC 체류 시간 2.39분 [M+H]+ 259.2 (실행시간 3.75분)
N.M.R(DMSO-d6) 7.95(d J 8.9Hz Ar H ) 7.2(d J 8.7Hz 2Ar H ) 6.9(d J 8.7Hz 2Ar H ) 6.4(d J 9.9 Ar H ) 6.25(s Ar H ) 4.2(s Ar H ) 3.75(s 3OC H 3)
단계 2
7-히드록시-3-(4- 메톡시 - 페닐 )-2- 메틸 - 크로멘 -4-온
Figure 112005044121551-pct00013
초산 무수물(3㎖, 30m㏖)을 DMF(10㎖)에 현탁시킨 탄산 칼륨(4.0g, 29m㏖)과 1-(2,4-디히드록시-페닐)-2-(4-메톡시-페닐)-에탄온(1.95g, 7.5m㏖)의 현탁액에 가하고 생성된 현탁액을 -90분 동안 115℃에서 가열한다. 혼합물을 냉각하여 회색 침전물을 얻는다. 고체를 여과하여 제거하고 물(100㎖)과 디에틸 에테르(2×40㎖)로 세척하여 회색 분말로서 7-히드록시-3-(4-메톡시-페닐)-2-메틸-크로멘-4-온을 얻고, 진공에서 건조한다(1.65g).
LC 체류 시간 2.26분 [M+H]+ 283.2 (실행시간 3.75분)
N.M.R(DMSO-d6) 7.8(d J 8.7Hz Ar H ) 7.2(d J 8.8Hz 2Ar H ) 7.0(d J 8.8Hz 2Ar H ) 6.9(d J 8.7 Ar H ) 6.8(s Ar H ) 3.8(s 3OC H 3) 2.2(s 3C H 3)
단계 3
4-[4-(4- 메톡시 - 페닐 )-3- 메틸 - 이소옥사졸 -5-일]-벤젠-1,3- 디올
Figure 112005044121551-pct00014
염화수소 히드록실아민(0.35g, 5m㏖)을 피리딘(3㎖)에 현탁시킨 7-히드록시- 3-(4-메톡시-페닐)-2-메틸-크로멘-4-온의 현탁액에 가하고 혼합물을 -4시간 동안 환류하에 가열한다. 용액을 냉각시켜서 물(50㎖)에 붓고 디에틸에테르(50㎖)로 추출한다. 추출물을 물(3×50㎖)과 포화 염화 나트륨 수용액(30㎖)으로 세척한다. 용액을 무수 황산 마그네슘으로 건조하고 농축하여 담갈색 검을 얻는다.
조생성물을 실리카에서 초산 에틸/헥산(1:2)으로 용리하면 컬럼 크로마토그래피에 의하여 정제하여 무색 검을 얻는다. 헥산으로 분쇄하여 백색 분말로 4-[4-(4-메톡시-페닐)-3-메틸-이소옥사졸-5-일]-벤젠-1,3-디올을 얻고, 진공에서 건조시킨다(0.087g).
LC 체류 시간 2.20분 [M+H]+ 298.2 (실행시간 3.75분)
N.M.R(DMSO-d6) 7.1(d J 8.8Hz 2Ar H ) 6.85(d J 8.6Hz Ar H ) 6.8(d J 8.8Hz 2Ar H ) 6.25(s Ar H ) 6.15(d J 8.6Hz Ar H ) 3.65(s 3OC H 3) 2.15(s 3C H 3)
실시예 2
4- 브로모 -6-[4-(4- 메톡시 - 페닐 )-3- 메틸 - 이소옥사졸 -5-일]-벤젠-1,3- 디올
Figure 112005044121551-pct00015
벤질트리메틸암모늄 트리브로마이드(3.95g, 10m㏖)를 디클로로메탄(50㎖)에 현탁시킨 4-[4-(4-메톡시-페닐)-3-메틸-이소옥사졸-5-일]-벤진-1,3-디올(실시예 1)(2.95g, 10m㏖)의 빙냉된 현탁액에 적가하고, 혼합물을 실온에서 -60분 동안 교 반한다. 초산에틸(300㎖)을 첨가하고 혼합물로 물(3×200㎖)과 포화 염화 나트륨 수용액(50㎖)으로 세척한다. 용액을 무수 황산 마그네슘으로 건조하고 농축하여 담갈색 고체를 얻는다. 조생성물을 실리카에서 초산 에틸/헥산(1:2)으로 용리하여 컬럼 크로마토그래피에 의하여 정제하여 백색 고체로서 4-브로모-6-[4-(4-메톡시-페닐)-3-메틸-이소옥사졸-5-일]-벤젠-1,3-디올을 얻고, 진공에서 건조한다(3.42g).
LC 체류 시간 2.38분 [M+H]+ 378.2 (실행시간 3.75분)
N.M.R(아세톤-d6) 7.35(s Ar H ) 7.2(d J 8.8Hz 2Ar H ) 6.9(d J 8.8Hz 2Ar H ) 6.65(s Ar H ) 3.8(s 3OC H 3) 2.25(s 3C H 3)
실시예 3
5-[4-(4- 메톡시 - 페닐 )-3- 메틸 - 이소옥사졸 -5-일]-비페닐-2,4- 디올
Figure 112005044121551-pct00016
단계 1
5-(2,4- 비스 - 벤질옥시 -5- 브로모 - 페닐 )-4-(4- 메톡시 - 페닐 )-3- 메틸 - 이소옥사졸
Figure 112005044121551-pct00017
브롬화 벤질(0.36㎖, 3m㏖)을 DMF(5㎖)에 현탁시킨 4-브로모-6-[4-(4-메톡시 -페닐)-3-메틸-이소옥사졸-5-일]-벤젠-1,3-디올(실시예 2)(0.55g, 1.5m㏖)과 탄산 세슘(0.85g, 2.6m㏖)의 현탁액에 가하고 혼합물을 실온에서 -18시간 동안 교반한다. 물(100㎖)을 가하고 혼합물을 디에틸 에테르(2×30㎖)로 추출한다. 조합된 추출물을 물(4×75㎖)과 포화 염화 나트륨 수용액(50㎖)으로 세척한다. 용액을 무수 황산 마그네슘으로 건조하고 농축하여 담갈색 검을 얻는다. 헥산으로 분쇄하여 회색 고체로서 5-(2,4-비스-벤질옥시-5-브로모-페닐)-4-(4-메톡시-페닐)-3-메틸-이소옥사졸을 얻고, 진공에서 건조한다(0.5g).
LC 체류 시간 3.08분 [M+H]+ 558.4 (실행시간 3.75분)
N.M.R(클로로포름-d) 7.55(s Ar H ) 7.35-7.25(m 5Ar H ) 7.2(m 3Ar H ) 6.95(d J 8.8Hz 2Ar H ) 6.85(m 2Ar H ) 6.7(d J 8.8Hz 2Ar H ) 6.35(s Ar H ) 4.95(s 2C H 2) 4.6(s 2C H 2) 3.75(s 3OC H 3) 2.25(s 3C H 3)
단계 2
5-(4,6- 비스 - 벤질옥시 -비페닐-3-일)-4-(4- 메톡시 - 페닐 )-3- 메틸 - 이소옥사졸
Figure 112005044121551-pct00018
인산 칼륨(0.1g, 0.5m㏖)을 질소 분위기 하에 1,4-디옥산(4㎖)에 용해한 5-(2,4-비스-벤질옥시-5-브로모-페닐)-4-(4-메톡시-페닐)-3-이소옥사졸(0.14g, 0.25m㏖)과 페닐붕산(0.095g, 0.75m㏖)의 용액에 가한다. 테트라키스(트리페닐포스핀) 팔라듐(0)(촉매)을 첨가하고 현탁액을 -18시간 80℃로 가열한다. 현탁액을 냉각하고 초산에틸(25㎖)을 가한다. 혼합물을 물(3×25㎖)과 포화 염화 나트륨 수용액(25㎖)으로 세척한다. 용액을 무수 황산 마그네슘으로 건조하고 농축하여 담갈색 검을 얻는다. 헥산으로 분쇄하여 백색 고체로 5-(4,6-비스-벤질옥시-비페닐-3-일)-4-(4-메톡시-페닐)-3-메틸-이소옥사졸을 얻고, 진공에서 건조한다(0.5g).
LC 체류 시간 3.08분 [M+H]+ 554.4 (실행시간 3.75분)
N.M.R(클로로포름-d) 7.4(m 2Ar H ) 7.35(s Ar H ) 7.3-7.1(m 11Ar H ) 6.95(d J 8.8Hz 2Ar H ) 6.9(m 2Ar H ) 6.7(d J 8.8Hz 2Ar H ) 6.45(s Ar H ) 4.9(s 2C H 2) 4.7(s 2C H 2) 3.75(s 3OC H 3) 2.25(s 3C H 3)
단계 3
7-히드록시-3-(4- 메톡시 - 페닐 )-2- 메틸 -6- 페닐 - 크로멘 -4-온
Figure 112005044121551-pct00019
포름산 암모늄(3.2g, 50m㏖)을 질소 분위기 하에 메탄올(20㎖)/초산에틸(10㎖)에 용해한 5-(4,6-비스-벤질옥시-비페닐-3-일)-4-(4-메톡시-페닐)-3-메틸-이소옥사졸(1.4g, 2.5m㏖)의 용액에 가한다. 탄소(10%) 상의 팔라듐(촉매)을 가하고 현탁액을 -18시간 60℃로 가열한다. 현탁액을 냉각시키고 초산에틸(150㎖)을 가하고 현탁액을 여과한다. 여액을 물(3×100㎖)과 포화 염화 나트륨 수용액(50㎖)으로 세 척한다. 용액을 무수 황산 마그네슘으로 건조하고 농축하여 담갈색 검을 얻는다. 메탄올로 분쇄하여 회색 고체로서 7-히드록시-3-(4-메톡시-페닐-2-메틸-6-페닐-크로멘-4-온을 얻고, 진공에서 건조한다.
LC 체류 시간 2.58분 [M+H]+ 359.2 (실행시간 3.75분)
N.M.R(DMSO-d6) 7.9(s Ar H ) 7.5-7.3(m 5Ar H ) 7.25(d J 8.8Hz 2Ar H ) 7.1(s Ar H ) 7.05(d J 8.8Hz 2Ar H ) 3.85(s 3OC H 3) 2.2(s 3C H 3)
단계 4
5-[4-(4- 메톡시 - 페닐 )-3- 메틸 - 이소옥사졸 -5-일]-비페닐-2,4- 디올
Figure 112005044121551-pct00020
염화수소산 히드록실아민(75㎖, 1.08m㏖)을 피리딘(2㎖)에 현탁시킨 7-히드록시-3-(4-메톡시-닐)-2-메틸-6-페닐-크로멘-4-온(105㎖, 0.29m㏖)의 현탁액에 가하고 혼합물을 -6시간 동안 환류하에 가열하여 담황색 용액을 얻는다. 용액을 냉각시키고 물(20㎖)을 가한다. 혼합물을 디에틸 에테르(2×10㎖)로 추출한다. 조합된 추출물을 물(2×20㎖)과 포화 염화 나트륨 수용액(10㎖)으로 세척한다. 용액을 무수 황산 마그네슘으로 건조하고 농축한다. 조생성뭉릉 실리카에서 초산 에틸/헥사(1:1)으로 용리하여 컬럼 크로마토그래피에 의하여 정제하여 회색 분말(80㎖)로서 제목의 화합물을 얻는다.
LC 체류 시간 2.26분 [M+H]+ 374.3 (실행시간 3.75분)
N.M.R(아세톤-d6) 7.5-7.3(m 5Ar H ) 7.2(d J 8.8Hz 2Ar H ) 7.0(d J 8.8Hz 2Ar H ) 6.9(d J 8.8Hz Ar H ) 6.35(s Ar H ) 6.1(d J 8.7Hz Ar H ) 3.85(s 3OC H 3) 2.25(s 3C H 3)
실시예 4
4- 클로로 -6-[4-(4- 메톡시 - 페닐 )-3- 메틸 - 이소옥사졸 -5-일]-벤젠-1,3- 디올
Figure 112005044121551-pct00021
염화수소산 히드록실아민(0.7g, 10m㏖)을 피리딘(4㎖)에 현탁시킨 6-클로로-7-히드록시-3-(4-메톡시-페닐)-2-메틸-크로멘-4-온[실시예 1, 단계 2와 유사하게 제조](0.32g, 1.0m㏖)의 현탁액에 가하고 혼합물을 -6시간 동안 환류하에 가열하여 담황색 용액을 얻는다. 용액을 냉각하고 물(20㎖)을 가한다. 혼합물을 디에틸 에테르(2×10㎖)로 추출한다. 조합된 추출물을 물(2×20㎖)과 포화 염화 나트륨 수용액(10㎖)으로 세척한다. 용액을 무수 황산 마그네슘으로 건조하고 농축한다. 조생성뭉릉 실리카에서 초산 에틸/헥사(1:1)으로 용리하면서 컬럼 크로마토그래피에 의하여 정제하여 회색 분말로서 4-클로로-6-[4-(4-메톡시-페닐)-3-메틸-이소옥사졸-5-일]-벤젠-1,3-디올을 얻는다.
LC 체류 시간 2.37분 [M+H]+ 332.2 (실행시간 3.75분)
N.M.R(아세톤-d6) 7.2(d J 8.8Hz 2Ar H ) 7.15(s Ar H ) 6.9(d J 8.8Hz 2Ar H ) 6.6(s Ar H ) 3.85(s 3OC H 3) 2.25(s 3C H 3)
실시예 1-4의 화합물은 아래와 같은 말라키테 그린 ATPase 분석으로 시험했을 때 범위 A의 HSP90 IC50을 갖는다. 다음 표에서 최종 컬럼은 실시예 12b의 경우를 제외하고, 문제의 화합물에 있어 동일한 기준에서 결과를 나타내고, 여기서 인용된 활성은 하기 형광 편광 분석으로 측정한 것이다.
실시예 5-16은 실시예 1-4에 기술된 반응을 사용하여 제조한다. 제조예 6과 7의 다른 상세한 설명은 실시예 86과 87에서와 유사하다.
Figure 112005044121551-pct00022
Figure 112005044121551-pct00023
*또한 인터바이오스크린으로 시판
§ 엔아민으로 시판
**150℃하에 디메틸포름아미드에서 시안화 구리(I)와 보호된 브롬 레솔시놀 중간체로서부터 제조
***형광 편광 분석: 'A'=<10 uM ; 'B'=>10 uM
실시예 14
4-[4-(4- 메톡시 - 페닐 )-3- 메틸 - 이소옥사졸 -5-일]-6- 펜에틸 -벤젠-1,3- 디올
Figure 112005044121551-pct00024
상술한 바와 같이 실시예 2, 단계 1의 브로모 이소 옥사졸 화합물의 스티릴 붕산 커플링으로부터 제조한 다음 실시예 3과 유사하게 환원하고 히드록실아민으로 처리한다.
LC 체류 시간 2.56분 [M+H]+ 402 (실행시간 3.75분)
실시예 15
4-[4-(4- 메톡시 - 페닐 )-3- 메틸 - 이소옥사졸 -5-일]-2,6- 비스 -(4- 메틸 -피페라진-1- 일메틸 )-벤젠-1,3- 디올
Figure 112005044121551-pct00025
계통 2: 만니시 반응
Figure 112005044121551-pct00026
N-메틸피페라진(0.125㎖, 1.1m㏖)을 1,4-디옥산(4㎖)에 현탁한 4-[4-(4-메톡시-페닐)-3-메틸-이소옥사졸-5-일]-벤젠-1,3-디올(0.15g, 0.5m㏖)과 파라포름알데히드(0.040g)의 현탁액에 가하고 혼합물을 -18시간 동안 환류하에 가열하여 갈색 황색 용액을 얻는다. 용액을 냉각시키고 초산 에틸(25㎖)을 가한다. 혼합물을 물(3×25㎖)과 포화 염화 나트륨 수용액(25㎖)으로 세척한다. 용액을 무수 황산 마그네슘으로 건조하고 농축하여 담갈색 검을 얻는다. 헥산으로 분쇄하여 담갈색 분말로 4-[4-(4-메톡시-페닐)-3-메틸-이소옥사졸-5-일]-2,6-비스-(4-메틸-피페라진-1-일메틸)-벨젠-1,3-디올(0.121g)을 얻는다.
LC 체류 시간 1.61분 [M+H]+ 522.6 (실행시간 3.75분)
N.M.R(아세톤-d6) 7.2(d J 8.8Hz 2Ar H ) 6.95(s Ar H ) 6.8(d J 8.8Hz 2Ar H ) 3.85(s 3OC H 3) 3.75(s 2C H 2) 3.65(s 2C H 2) 2.9-2,0((br s 16 C H 2) 2.3(s 3C H 3) 2.25(s 3OC H 3) 2.2(s 3C H 3)
실시예 16
2,4-디히드록시-5-[4-(4- 메톡시 - 페닐 )-3- 메틸 - 이소옥사졸 -5-일]-벤조산 메틸 에스테르
Figure 112005044121551-pct00027
계통 3: 에스테르의 형성
Figure 112005044121551-pct00028
단계1
n-부틸 리튬(100㎕)을 -78℃에서 질소 분위기 하에 테트라하이드로푸란(2.5㎖)에 용해한 5-(2,4-비스-벤질옥시-5-브로모-페닐)-4-(4-메톡시-페닐)-3-메틸-이소옥사졸(154㎎, 0.28m㏖)의 용액에 가한다. 용액을 30분 동안 -70℃에서 교반하여 오렌지색 용액을 얻는다. 이온을 클로로포름산 메틸(100㎕, 3eq)로 냉각하고 30분 동안 실온에서 가온한다. 용액을 포화 염화 암모늄액(5㎖)으로 낸각한다. 혼합물을 초산 에틸(3×5㎖)로 추출한다. 조합된 추출물을 물(2×5㎖)과 포화 염화 나트륨 수용액(5㎖)으로 세척한다. 용액을 무수 황산 마그네슘으로 건조하고 농축한다. 조생성물을 실리카에서 헥산에서의 초산 에틸(기울기 20% 내지 60% 초산 에틸)로 용리하면서 컬럼 크로마토그래피에 의하여 정제하여 2,4-비스-벤질옥시-5-[4-(4-메톡시-페닐)-3-메틸-이소옥사졸-5-일]-벤조산 메틸 에스테르(72㎎)를 얻는다.
LC 체류 시간 4.95분 [M+H]+ 536.4 (실행시간 7.5분)
N.M.R(DMSO-d6) 7.8(s Ar H ) 7.55(d J 7.1Hz 2Ar H ) 7.4(t J 6.2Hz 2Ar H ) 7.35(d J 6.1Hz Ar H ) 7.3(m 3Ar H ) 7.1(m 4Ar H ) 7.0(s Ar H ) 6.9(d 8.8Hz 2Ar H ) 5.3(s 2C H 2) 5.1(s 2C H 2) 3.78(s OC H 3) 3.76(s OC H 3) 2.28(s C H 3)
단계2
포름산 암모늄(172㎎, 20eq)을 질소 분위기 하에 메탄올(2㎖)/초산 에틸(1㎖)에 용해한 2,4-비스-벤질옥시-5-[4-(4-메톡시-페닐)-3-메틸-이소옥사졸-5-일]-벤조산 메틸 에스테르(72㎎, 0.13m㏖)의 용액에 가한다. y소성의 10% 팔라듐(촉매)을 가하고 현탁액을 하룻밤 60℃로 가열한다. 용액을 냉각시키고 초산 에틸(5㎖)을 가하고 물(2×5㎖)과 포화 염화 나트륨 수용액(5㎖)으로 세척한다. 용액을 무수 황산 마그네슘으로 건조하고 농축한다. 조생성물을 실리카에서 헥산에서의 초산 에틸(기울기 25% 내지 45% 초산 에틸)로 용리하면서 컬럼 크로마토그래피에 의하여 정제하여 2,4-디히드록시-5-[4-(4-메톡시-페닐)-3-메틸-이소옥사졸-5-일]-벤조산 메틸 에스테르(7.0㎎)를 얻는다.
LC 체류 시간 2.49분 [M+H]+ 356.3 (실행시간 37.5분)
N.M.R(CDCl3)δ = 10.85(s ArO H ) 7.52(s ArO H ) 7.12(d J8Hz 2Ar H ) 6.98(s Ar H ) 6.91(d J8Hz 2Ar H ) 6.45(s Ar H ) 3.78(s 3 OC H 3) 3.71(s 3 OC H 3) 2.21(s 3 C H 3)
실시예 14-16의 화합물은 하기와 같은 말라키테 그린 ATPase 분석으로 각각 시험했을 때 범위 'A', 'B'와 'B'의 HSP90 IC50을 갖는다.
또한, 실시예 17-20은 N-포르밀 피페리딘, 페닐 이소시아네이트, 2-메톡시 페닐 이소시아네이트와 벤즈알데히드로 각각 냉각시키면서 제조한다. 최종 탈보호 반응은 실시예 23에 기술된 바와 같이 삼염화 붕소로 행한다(계통 5에서 최종 반응). 실시예 21은 실시예 16, 단계 1에서 나온 부산물이다. 인용된 첨가제는 아래에서 기술한 말레키테 그린 분석에서 얻은 것이다.
Figure 112005044121551-pct00029
Figure 112005044121551-pct00030
실시예 22
4-벤질-6-[4-(4- 메톡시 - 페닐 )-3- 메틸 - 이소옥사졸 -5-일]-벤젠-1,3- 디올
Figure 112005044121551-pct00031
계통 4: 벤질 레솔시놀의 합성
Figure 112005044121551-pct00032
탄산 2- 벤조일 -5- 에톡시카르보닐옥시 - 페닐에스테르에틸에스테르
Figure 112005044121551-pct00033
트리에틸아민(10㎖, 72.2m㏖)을 THF(50㎖)에 용해한 2,4-디히드록시벤조페논(1)의 용액에 가하고 용액을 0℃로 냉각한다. 클로로 포름산 에틸(6.9㎖, 72.2m㏖)을 서서히 가하고 현탁액을 0℃에서 -30분 동안과 실온에서 -3시간 동안 교반한다. 물(150㎖)을 가하고 혼합물을 디에틸 에테르(150㎖)로 추출한다. 추출물을 물(2×150㎖)과 포화 염화 나트륨 수용액(100㎖)으로 세척한다. 용액을 무수 황산 마그네슘으로 건조하고 농축하여 담녹색 검으로 4-벤질-벤젠-1,3-디올을 얻고 방치하여 고체화시킨다(8.2g).
LC 체류 시간 2.73분 [M+H]+ 359.2 (실행시간 37.5분)
δ(클로로포름-d) 7.7(m 2Ar H ) 7.5(m 2Ar H ) 7.35(m 2Ar H ) 7.15(m 2Ar H ) 4.25(q J 7.1Hz 2C H 2) 1.35(t J 7.1Hz 3C H 3) 1.151.35(t J 7.1Hz 3C H 3)
4-벤질-벤젠-1,3- 디올
물(30㎖)에 용해한 붕소수소화 나트륨(1.85㎎, 49m㏖)의 용액을 THF(30㎖)에 용해한 탄산 2-벤조일-5-에톡시카르보닐옥시-페닐 에스테르 에틸 에스테르(3.6g, 10m㏖)의 빙냉용액에 가한다. 혼합물을 0℃에서 -60분 동안과 실온에서 -60시간 동안 교반하여 담적색 현탁액을 얻는다. 물(150㎖)을 가하고 혼합물을 디에틸 에테르 (150㎖)로 추출한다. 추출물을 물(2×100㎖)과 포화 염화 나트륨 수용액(50㎖)으로 세척한다. 용액을 무수 황산 마그네슘으로 건조하고 농축하여 담황색 검을 얻는다. 검을 수산화 나트륨액(20㎖, 10%)에 용해시키고 용액을 -60분 동안 환류하에 가열한다. 용액을 냉각시키고 염산(5㎖, 37%)로 산성화한다. 혼합물을 디에틸 에테르(50㎖)로 추출하고 추출물을 물(3×40㎖)과 포화 염화 나트륨 수용액(30㎖)으로 세척한다. 용액을 무수 황산 마그네슘으로 건조하고 농축하여 짙은 적색검으로 4-벤질-벤젠-1,3-디올을 얻는다(2.1g).
LC 체류 시간 2.28분 [M+H]+ no ion (실행시간 37.5분)
δ(클로로포름-d) 7.2(m 3Ar H ) 7.1(m 2Ar H ) 6.85(d J8.1Hz 2Ar H ) 6.3(d J8.1Hz Ar H ) 6.2(s Ar H ) 3.85(s 2C H 2)
4-벤질-벤젠-1,3-디올을 계통 1 합성에서 출발 물질로 사용하여 실시예 23을 실시한다.
실시예 23
3-{2,4-디히드록시-5-[4-(4- 메톡시 - 페닐 )-3- 메틸 - 이소옥사졸 -5-일]- 페닐 }-아 크릴산
Figure 112005044121551-pct00034
계통 5: 헤크 반응과 삼염화 붕소 탈보호
Figure 112005044121551-pct00035
단계1
3-{2,4- 비스 - 벤질올기 -5-[4-(4- 메톡시 - 페닐 )-3- 메틸 - 이소옥사졸 -5-일]- 페닐 }-아크릴산-tert-부틸 에스테르
Figure 112005044121551-pct00036
디이소프로필에틸 아민(1㎖, 5.7m㏖)을 아크릴산 tert-부틸(1㎖, 6.8m㏖)과 1-부탄올(8㎖)에 현탁시킨 5-(2,4-비스-벤질옥시-5-브로모-페닐)-4-(4-메톡시-페닐)-3-메틸-이소옥사졸(0.56g, 1.0m㏖)의 현탁액에 질소 분위기 하에 가한다. 디클로로비스(트리-0-톨일포스핀)팔라듐(Ⅱ)(촉매)을 가하고 현탁액 -18시간 동안 140℃에서 가열하여 황색/녹색 용액을 얻는다. 용액을 냉각하고 농축하여 황색/녹색 검을 얻는다. 조생성물을 실리카에서 초산에틸/헥산(1:9)으로 용리하면서 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 황색/녹색 검(315㎎)으로 3-{2,4-비스-벤질옥시-5-[4-(4-메톡시-페닐)-3-메틸-이소옥사졸-5-일]-페닐}-아크릴산 tert-부틸-에스테르를 얻는다. 출발물질(170㎎)을 회수한다.
LC 체류 시간 3.23분 [M+H]+ 604.6 (실행시간 37.5분)
N.M.R(클로로포름-d) 7.85(d J 16.1Hz C H ) 7.6(s Ar H ) 7.4-7.25(m 8Ar H ) 7.05(d J 8.8Hz 2Ar H ) 6.9(m 2Ar H ) 6.8(d J 8.8Hz 2Ar H ) 6.5(s Ar H ) 6.35(d J 16.1Hz C H ) 5.05(s 2C H 2) 4.75(s 2C H 2) 3.75(s 3OC H 3) 2.25(s 3C H 3) 1.5(s 9CC H 3)
단계2
3-{2,4-디히드록시-5-[4-(4- 메톡시 - 페닐 )-3- 메틸 - 이소옥사졸 -5-일]- 페닐 }-아 크릴산
Figure 112005044121551-pct00037
삼염화 붕소 용액(2㎖, 1.0M 디클로로메탄)을 질소 분위기 하에 -78℃(드라이 아이스/아세톤)에서 디클로로메탄에 용해한 3-{2,4-비스-벤질옥시-5-[4-(4-메톡시-페닐)-3-메틸-이소옥사졸-5-일]-페닐}-아크릴산 tert-부틸 에스테르(50㎎, 0.09m㏖)의 용액에 서서히 가한다. 생성된 용액을 -78℃에서 -1시간 동안과 실온에서 -90분 동안 교반한다. 용액을 -78℃까지 냉각시키고 물(2㎖)을 가하고 물(2×5㎖)과 포화 염화 나트륨 수용액(10㎖)으로 세척한다. 용액을 무수 황상 마그네슘으로 건조하고 담황색 검으로 농축한다. 헥산으로 분쇄하여 황색 고체를 얻고, 고체를 여과하여 제거하고 헥산으로 세척하고, 진공에서 건조하여 황색분말로 3-{2,4-디히드록시-5-[4-(4-메톡시-페닐)-3-메틸-이소옥사절-5-일]-페닐}-아크릴산(10㎎) 을 얻는다.
LC 체류 시간 2.08분 [M+H]+ 368.3 (실행시간 37.5분)
N.M.R(아세톤-d6) 7.85(d J 16.1Hz C H ) 7.5(s Ar H ) 7.25(d J 8.8Hz 2Ar H ) 6.95(d J 8.8Hz 2Ar H ) 6.6(s Ar H ) 6.35(d J 16.1Hz C H ) 3.8(s 3OC H 3) 2.25(s 3C H 3)
유사하게, 4-[4-(4- 메톡시 - 페닐 )-3- 메틸 - 이소옥사절 -5-일]-6- 스티렐 -벤젠-1,3- 디올(실시예 24)을 5-(2,4-비스-벤질옥시-5-스티릴-페닐)-4-(4-메톡시-페닐)-3-메틸이소옥사졸(실시예 3, 브로모 이소옥사졸 중간체의 스트릴 붕산 커플링으로부터 제조)의 삼염화 붕소 탈보호에 의하여 제조한다.
Figure 112005044121551-pct00038
LC 체류 시간 2.08분 [M+H]+ 368.3 (실행시간 37.5분)
실시예 22-24의 화합물은 하기에서 기술한 말라키테 그린 ATPase 분석으로 시험했을 때 범위 'A', 'B'와 'C' 각각에서 HSP90 IC50을 갖는다.
계통 6: 5-카르복스아미도 이소옥사졸의 합성
Figure 112005044121551-pct00039
실시예 25
5-(5- 클로로 -2,4- 디히드록시페닐 )-4-(4- 메톡시 - 페닐 )- 이소옥사졸 -3- 카르복실 산 에틸아미드
Figure 112005044121551-pct00040
단계 1
1-(5- 클로로 -2,4-디히드록시- 페닐 )- 에탄온
Figure 112005044121551-pct00041
초산(17.5㎖)을 질소 분위기 하에 붕소 트리플루오라이드 에테레이트(200㎖)에 현탁한 4-클로로레솔시놀(42.5g, 0.293m㏖)의 현탁액에 적가한다. 반응 혼합물 을 3.5시간 동안 90℃에서 가열한 다음 실온으로 냉각시킨다. 고체는 냉각 약 1시간 후 형성된다. 혼합물을 700㎖의 10% w/v 초산 나트륨 수용액에 붓는다. 이 혼합물을 2.5시간 동안 강하게 교반한다. 이를 여과하고 물로 세척하고 하룻밤 공기-건조하면 연한 갈색 고체가 형성되어 1-(5-클로로-2,4-디히드록시-페닐)-에탄온(31.6g, 58%)을 얻는다. LCMS: [M-H]+ 185.
단계 2
1-(2,4- 비스 - 벤질옥시 -5- 클로로 - 페닐 )- 에탄온
Figure 112005044121551-pct00042
브롬화 벤질(30㎖)을 아세토니트릴(350㎖)에 혼합한 1-(5-클로로-2,4-디히드록시-페닐)-에탄온(20g, 107m㏖)과 탄산 칼륨(37g, 2.5당량)의 혼합물에 가한다. 혼합물을 6시간 동안 환류하에 가열한 다음 냉각하고 하룻밤 교반한다. 혼합물을 여과하고 고체를 디클로로메탄(3×100㎖)으로 세척한다. 조합된 유기 추출물을 진공에서 증발시켜서 담황색 고체를 얻고 이를 헥산(35㎖)/초산에틸(15㎖)의 혼합물로 분쇄하고 여과하여 회색 고체로서 1-(2,4-비스-벤질옥시-5-클로로-페닐)-에탄온(35.4g, 90%)을 얻는다. 구조식과 일치하는 1H NMR (400MHz).
단계 3
4-(2,4- 비스 - 벤질옥시 -5- 클로로페닐 )-2-히드록시-4-옥소- 부트 -2- 에노산 에틸 에스테르
Figure 112005044121551-pct00043
나트륨 금속(1.35g, 0.058m㏖)을 질소 분위기 하에 교반된 무수 에탄올에 20분 이상 소량씩 가한다. 반응 혼합물을 나트륨이 반응하여 균질의 용액을 나타낼 때까지 10분 더 교반한 다음 1-(2,4-비스-벤질옥시-5-클로로-페닐)-에탄온(10.0g, 0.027㏖)을 2-3분 이상 부분적으로 가하고 생성된 현탁액을 옥살산 디에틸(6㎖, 0.043㏖)의 첨가 전에 5분 동안 교반하여 더 짙은 황색 침전물을 얻는다. 반응 혼합물을 4시간 동안 환류(균질의 갈색 용액을 나타낸다)하에 가열한 다음 실온으로 냉각시키고 초산(6㎖)을 가한다. 고체를 형성하는 생성물을 분쇄하고 여과하고 에탄올로 세척하고 건조하여 황색 고체(12.0g, 95%)를 얻는다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ 1.2 (t, 3H), 4.19 (q, 2H), 5.05 (s, 2H), 5.10 (s, 2H), 6.50 (s, 1H), 7.22-7.41 (m, 10H), 7.97 (s, 1H)
단계 4
5-(2,4- 비스 - 벤질옥시 -5- 클로로페닐 )- 이소옥사졸 -3- 카르복실산 에틸 에스테르
Figure 112005044121551-pct00044
염화수소산 히드록시아민(0.89g; 12.8m㏖)을 무수 에탄올(100㎖)에 현탁한 4-(2,4-비스-벤질옥시-5-클로로페닐)-2-히드록시-4-옥소-부트-2-에노산 에틸 에스테르(5.00g; 10.7m㏖)의 현탁액에 가한다. 반응 혼합물을 4시간 동안 환류 하에 가열한 다음 주위 온도로 냉각시킨다(이 시간 동안 혼합물은 이질성을 유지하지만 더 연한 황색을 된다). 혼합물을 여과하고 여과된 고체를 물(2×20㎖), 에탄올(2×20㎖)로 세척하고 45℃에서 진공하에 건조한다. 이로서 보풀보풀한 황색 고체로서 5-(2,4-벤질옥시-5-클로로페닐)-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸 에스테르를 얻는다. 4.49g(91%) LCMS: [M+H]+ 466,464 (37Cl; 35Cl). 1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ 1.42 (t, 3H), 4.42 (q, 2H), 5.13 (s, 2H), 5.14 (s, 2H), 6.62 (s, 1H), 7.01 (s, 1H), 7.35-7.43 (m, 10H), 8.00 (s, 1H)
단계 5
5-(2,4- 비스 - 벤질옥시 -5- 클로로페닐 )- 이소옥사졸 -3- 카르복실산 에틸 아미드
Figure 112005044121551-pct00045
메탄올 용액(2.0M; 40㎖; 80m㏖)에 용해한 에틸 아민의 용액을 무수 에탄올(50㎖)에 현탁시킨 5-(2,4-비스-벤질옥시-5-클로로페닐)-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸 에스테르(4.40g; 9.51m㏖)의 교반된 현탁액에 가한다. 반응 혼합물을 5시간 동안 80℃(오일-배스 온도)로 가열한다. 반응 혼합물을 주위 온도로 냉각시키고 하 룻밤 방치한다. 무색 고체 생성물이 형성되고 반응 혼합물을 열음-물 배스에 더 냉각시키고, 여과하고 찬 에탄올(2×20㎖)로 세척한다. 무색 생성물을 진공에서 건조하여 5-(2,4-비스-벤질옥시-5-클로로페닐)-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸 아미드 3.42g(78%)을 얻는다. LCMS: [M+H]+ 465,463 (37Cl; 35Cl). 1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ 1.25 (t, 3H), 3.48 (m, 2H), 5.10 (s, 2H), 5.2 (s, 2H), 6.59 (s, 1H), 6.38 (brt, 1H), 7.08 (s, 1H), 7.30-7.41 (m, 10H), 7.97 (s, 1H)
단계 6
5-(2,4- 비스 - 벤질옥시 -5- 클로로페닐 )-4- 브로모 - 이소옥사졸 -3- 카르복실산 에틸아민
Figure 112005044121551-pct00046
초산(0.6M; 7.2㎖; 4.32m㏖)에 용해한 브롬 용액을 주위에서 초산(30㎖)에 현탁시킨 5-(2,4-비스-벤질옥시-5-클로로페닐)-4-브로모-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸 아미드(2.00g; 4.32m㏖)과 초산 나트륨(0.708g, 8.64m㏖)을 가한다. 혼합물을 80℃로 가열하고 5-10분내에 균질화하여 짙은 적색 용액을 얻는다. 용액은 2.5시간 가열 후 황색 나타낸다. TLC 분석하면 출발 물질과 존재하는 생성물을 나타낸다. 초산 용액에 용해한 2.0㎖(1.2m㏖)의 브롬을 다음 2시간 동안 더 가한다. 반응 혼합물을 주위 온도로 냉각하고 초산을 진공에서 제거하여 고체 잔재를 얻고 이를 에 테르(200㎖)와 물(200㎖) 사이에 분배한다. 상을 분리하고 유기상을 물(3×100㎖), 포화 중탄산 나트륨 수용액(2×100㎖)과 포화 염화 나트륨 용액(1×200㎖)으로 세척한다. 유기층을 황산 나트륨으로 건조하고 여과하고 여액 용매를 진공에서 제거하여 황색 오일을 얻고 이를 실리카 겔에서 헥산에서의 1-20% 초산 에틸로 용리하면서 플래쉬 크로마토그래피하여 정제한다. 이로서 무색 고체인 생성물 1.2g(52%)을 얻는다. LCMS: [M+H]+ 543,541 (81Br, 79Br). 1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ 1.26 (t, 1H), 3.50 (m, 2H), 5.10 (s, 2H), 5.12 (s, 2H), 6.62 (s, 1H), 6.74 (brt, 1H), 2.28-7.41 (m, 10H), 7.53 (s, 1H)
단계 7
5-(2,4- 비스 - 벤질옥시 -5- 클로로페닐 )-4-(4- 메톡시 - 페닐 )- 이소옥사졸 -3- 카르 복실산 에틸아미드
Figure 112005044121551-pct00047
4-메톡시페닐붕소산(0.178g, 1.17m㏖)과 5-(2,4-비스-벤질옥시-5-클로로페닐)-4-브로모-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸아미드(0.507g, 0.94m㏖)의 혼합물에 탄산 수소 나트륨(237㎎, 2.82m㏖)을 가한 다음 DMF(5㎖)과 물(1.0㎖)을 가한다. 혼합물을 배출에 의하여 가스를 제거하고 질소로 세척(3회)한 다음, 5분 동안 혼합물에 질소 가스로 거품을 일게 한다.
디클로로비스(트리페닐포스핀)팔라듐(II)(66㎎, 0.094m㏖)을 가하고 반응 혼합물을 2시간 동안 90℃에서 질소 분위기 하에 가열한다(반응 혼합물은 짙은 갈생으로 된다). 다른 10㎎의 디클로로비스(트리페닐포스핀)팔라듐(II)을 가하고 반응 혼합물을 15시간 동안 90℃에서 가열하고 다음 주위 온도로 냉각시킨다. 용매 대부분을 진공에서 제거하고 잔재를 초산 에틸(50㎖)과 물(50㎖) 사이에 분배한다. 이 혼합물을 셀라이트 패드를 통하여 여과하여 팔라듐 잔재를 제거한 다음 상을 분리하고 유기층을 물(2×30㎖)과 포화 염화 나트륨 수용액으로 세척한 다음 황산 나트륨으로 건조한다. 혼합물을 여과하고 여액 용매를 진공에서 제거하여 황색 오일(598㎎)을 얻는다. 조반응 생성물을 실리카 겔에서 흡수에 의하여 정제한 다음 실리카 겔(20g IST)에서 헥산에서의 1-20% 초산 에틸의 용매 기울기로 용리하면서 플래쉬 크로마토그래피한다. 이로서 무색 고체로서 5-(2,4-비스-벤질옥시-5-클로로페닐)-4-(4-메톡시-페닐)-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸아미드(0.223g, 40%)를 얻는다. LCMS: [M+H]+ 571,569 (37Cl, 35Cl). 1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ 1.21 (t, 3H), 3.44 (m, 2H), 3.79 (s, 3H), 4.73 (s, 2H), 6.45 (s, 1H), 6.65 (t, 1H), 6.80 (d, 2H), 7.14-7.44 (m, 8H), 6.95 (m, 2H)
단계 8
5-(5- 클로로 -2,4- 디히드록시페닐 )-4-(4- 메톡시 - 페닐 )- 이소옥사졸 -3- 카르복실 산 에틸아미드
Figure 112005044121551-pct00048
질소 분위기 하에서 디클로로메탄(5㎖)에 용해한 5-(2,4-비스-벤질옥시-5-클로로페닐)-4-(4-메톡시-페닐)-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸아미드(0.213㎎, 0.374m㏖)의 얼음-배스 냉각 용액에 디클로로메탄(1.12㎖ㅣ 1.12m㏖)에 용해한 삼염화 붕소의 1.0M 용액을 가한다. 반응 혼합물을 15분 동안 0℃에서 교반한 다음 35분 동안 주위 온도에서 교반한다. 반응 혼합물을 0℃로 재냉각시키고 포화 탄산 수소 나트륨 수용액(5㎖)을 첨가하여 냉각시킨다. 5분간 교반한 후 디클로로메탄을 진공에서 제거하고 잔재를 초산 에틸(30㎖)과 물(30㎖) 사이에 분배한다. 상을 분리하고 유기 상을 물(30㎖), 포화 염화 나트륨 수용액(30㎖)으로 세척한 다음 황산 나트륨으로 건조한다. 혼합물을 여과하고 여액 용매를 진공에서 제거하여 포옴 상의 무색 고체를 얻고 이를 실리카 겔에서 흡수에 의하여 정제한 다음 실리카 겔(10g IST)에서 헥산에서의 50% 초산 에틸로 용리하면서 플래쉬 크로마토그래피한다. 이로서 무색 고체로서 5-(5-클로로-2,4-디히드록시페닐)-4-(4-메톡시-페닐)-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸아미드(0.097g; 67%)를 얻는다. LCMS: [M+H]+ 391,389 (37Cl, 35Cl). 1H NMR (400 MHz, d6-DMSO)□ 1.08 (t, 3H), 3.22 (m, 2H), 3.73 (s, 3H), 6.59 (s, 1H), 6.87 (d, 1H), 7.13-7.17 (m, 3H), 8.88 (brt, 1H), 10.09 (s, 1H), 10.62 (s, 1H)
실시예 25에서는 하기에 기술된 바와 같이 형광 편광 분석에서 활성 'A'를 갖는다.
유사하게, 실시예 26에서는 상술한 바와 같이 Boc 보호 4-피페라지노페닐 보로네이트 에스테르를 커플링하여 제조한다. 이 보로네이트 에스테르는 boc 보호에 의하여 1-(4-브로모페닐)피페라진으로부터 제조한 다음 비스(테트라메틸피나콜레이트)이붕소와 Pd-촉매 커플링하여 보로네이트 에스테르 형성을 이룬다. 실시예 27에서도 유사하게 제조하고, 실시예 27a에서는 5-(2,4-비스-벤질옥시-5-클로로페닐)-4-브로모-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸아미드를 탈보호하여 제조한다.
Figure 112005044121551-pct00049
Figure 112005044121551-pct00050
*형광 평광 분석
계통 7: 5-(2,4-비스-벤질옥시-5-클로로-페닐)-4-요오드-3-메틸-이소옥사졸 중간체의 제조
Figure 112005044121551-pct00051
실시예 28
4- 클로로 -6-[3- 메틸 -4-(3- 몰폴린 -4- 일메틸 - 페닐 )- 이소옥사졸 -5-일]-벤젠-1,3- 디올
Figure 112005044121551-pct00052
단계 1
1-(2,4- 비스 - 벤질옥시 -5- 클로로 - 페닐 )-3-히드록시- 부트 -2-엔-1-온:
EtOAc(200㎖)에 용해한 케톤(15g)의 용액에 소량씩 나트륨 금속(3.0g)을 가한다. 현탁액을 15분간 실온에서 교반한 다음 하룻밤 환류하에 가열한다. 반응물을 초산으로 냉각시키고 황색 침전물을 여과한다. 이를 헥산에서 분쇄하여 밝은 황색 결정체를 얻는다. NMR로 이것은 대부분의 엔올형-미량의 케토형의 원하는 생성물을 나타낸다.
단계 2
5-(2,4- 비스 - 벤질옥시 -5- 클로로 - 페닐 )-3- 메틸 - 이소옥사졸 :
디케톤(4.0g)을 80% aq EtOH에 현탁시킨다. 염화수소산 히드록시아민(3.4g)과 초산 나트륨(4.0g)을 가하고 2M NaOH로 pH를 8/9로 조정한다. 용액을 24시간 환류시킨다(매우 유사한 Rf 값으로 인하여 TLC에 의한 감시는 어렵다). 이 시간 후 용액을 1M HCl로 pH5로 산성화하고 물에 붓는다. 백색 침전물을 여과하고 물로 세척하고 헥산으로 분쇄하여 백색 고체를 얻는다.
주; 필요하면 화합물을 에테르로 세척하여 통상적으로 요구되지 않는 미량의 불순물을 제거할 수 있다. NMR로 이는 원하는 생성물을 나타낸다.
단계 3
5-(2,4- 비스 - 벤질옥시 -5- 클로로 - 페닐 )-4- 요오도 -3- 메틸 - 이소옥사졸 :
이소옥사졸(2g)을 초산(24㎖)과 물(30㎖)의 혼합물에 넣는다. 일염화요오드(2g 초과)를 가하고, 용액을 2-3시간 동안 80℃로 가열한다. 실온으로 냉각시킨 후 물에서 10% Na2SO3(아황산 나트륨)을 가한다(50㎖). 점성 오렌지색 고체/오일을 혼합물에서 분리하고 물로 세척한다. 이를 아세톤에 용해시킨 다음 여과한다. 진공하에 아세톤을 제거하면 점착성 오렌지색 오일을 얻으며 이를 하룻밤 오렌지색 고체로 고화시킨다. NMR과 LCMS로 이것은 원하는 생성물임을 나타낸다.
단계 4
3-[5-(2,4- 비스 - 벤질옥시 -5- 클로로 - 페닐 )-3- 메틸 - 이소옥사졸 -4-일]- 벤즈알데히드
Figure 112005044121551-pct00053
5-(2,4-비스-벤질옥시-5-클로로-페닐)-4-요오드-3-메틸-이소옥사졸(200㎎, 0.38m㏖)과 3-포르밀벤젠붕산(85㎎, 1.5당량)을 DMF(12㎖)에 용해시킨 후 1M 탄산 수소 나트륨 용액(1.1㎖, 3.0당량)과 Pd(Ph3P)2Cl2(21㎎, 0.08당량)를 교반하면서 가한다. 반응 혼합물을 밀봉된 3개의 마이크로파 튜브로 옮기고 혼합물을 탈기시킨 후 CEM 마이크파 장치에서 15분 동안 150℃의 온도에서 200W의 초기 전력으로 조사한다. 냉각하면서 반응 혼합물을 조합하고 초산 에틸(10㎎)과 물(10㎎) 사이에 분배한다. 수성층을 분리하고 다시 초산 에틸(10㎎)로 추출한다. 유기물을 조합한 다음 물(2×20㎎), 염수(20㎎)로 세척하고 Na2SO4로 건조한 후 진공에서 응축시키고 실리카 겔에서 헥산에서의 25% 초산 에틸로 용리하면서 플래쉬 크로마토그래피하여 정제한다.
LCMS tR = 9.06, MS m/z 510.4 [M+H]+
단계 5
4-{3-[5-(2,4)- 비스 - 벤질옥시 -5- 클로로 - 페닐 )-2- 메틸 - 이소옥사졸 -4-일]-벤 질}- 몰폴린
Figure 112005044121551-pct00054
3-[5-(2,4-비스-벤질옥시-5-클로로-페닐)-3-메틸-이소옥사졸-4-일]-벤즈알데히드(25㎎, 0.05m㏖)와 몰폴린(0.3㎖)을 마이크로파 튜브에서 DCE(0.5㎖)와 혼합한다. 나트륨 트리아세톡시보로하이드리드(15㎎, 1.4단량)를 가하고, 튜브를 밀봉하고, 질소 가스를 주입한다. 1시간 후 나트륨 트리아세톡시보로하이드리드(15㎎)를 더 가하고 반응물을 하룻밤 방치한다. TLC 분석으로 반응이 완성되지 않음을 나타내면 초산 방울을 가하고 반응물을 1M NaHCO3 용액(7㎖)으로 냉각시키고 EtOAc(5㎖)로 추출한 후 다시 반응물을 교반하면서 하룻밤 방치한다. 이것을 MgSO4로 건조하고 용매를 진공에서 제거하여 회색 분말인 13㎎의 조생성물을 얻고 이를 탈보호 단계로 넘긴다.
단계 6
4- 클로로 -6-[3- 메틸 -4-(3- 몰폴린 -4- 일메틸 - 페닐 )- 이속옥사졸 -5-일]-벤젠-1,3- 디올
Figure 112005044121551-pct00055
4-{3-[5-(2,4-비스-벤질옥시-5-클로로-페닐)-3-메틸-이소옥사졸-4-일]-벤질} -몰폴린을 전술한 바와 같이 탈보호하고 조생생물을 디클로로메탄에 10% 에탄올로용리하면서 정제 TLC에 의하여 정제하여 백색분말인 0.6㎎(수율 7%)의 생성물을 얻는다.
LCMS tR = 5.46, MS m/z 399.3 [M-H]-
실시예 28에서는 아래에서 기술한 바와 같이 형광 편광 분석에서 활성 'A'를 갖는다.
실시예 29
1-{3-[5-(2.4- 비스벤질옥시 -5- 클로로 - 페닐 )-3- 메틸 - 이소옥사졸 -4-일]-벤질}-피페리딘-4-카르복실산 아미드
Figure 112005044121551-pct00056
이소니페코트아미드를 몰폴린과 나트륨 트리아세톡시보로하이드리드(3당량) 대신으로 하고 초산(1방울)을 초기에 가하는 것을 제외하고 유사한 공정을 사용하여 4-클로로-6-[3-메틸-4-(3-몰폴린-4-일메틸-페닐)-이소옥사졸-5-일]-벤젠-1,3-디올을 제조한다. 18시간 후 반응을 종료하고 공정 후 얻은 조생성물을 탈보호 단계로 넘긴다.
1-{3-[5-(5- 클로로 -2,4-디히드록시- 페닐 )-3- 메틸 - 이소옥사졸 -4-일]-벤질}-피페리딘-4-카르복실산 아미드
Figure 112005044121551-pct00057
1-{3-[5-(2,4-비스-벤질옥시-5-클로로-페닐)-3-메틸-이소옥사졸-4-일]-벤질}-피페리딘-4-카르복실산 아미드를 전술한 바와 같이 탈보호하고 조생성물을 디클로로메탄에서 10% 에탄올로 용리하면서 정제 TLC에 의하여 정제하여 백색 분말인 0.7㎎(수율 3%)의 생성물을 얻는다.
LCMS tR = 5.36, MS m/z 662.3 [M-H]+
실시예 29에서는 아래헤 기술한 바와 같이 형광 편광 분석에서 활성 'A'를 갖는다.
유사한 방법으로 실시예 30에서 제조한다:
Figure 112005044121551-pct00058
*형광 편광 분석
실시예 31
계통 8:
Figure 112005044121551-pct00059
단계 1
5-(2,4- 비스 - 벤질옥시 -5- 클로로 - 페닐 )-4-요오드- 이소옥사졸 -3- 카르복실시나 에틸아미드
Figure 112005044121551-pct00060
5-(2,4-비스-벤질옥시-5-클로로-페닐)-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸 아미드(0.90g, 1.94m㏖), N-요오도석신이미드(0.44g, 1당량)과 질산 세륨(IV) 암모늄을 아세토니트릴(55㎖)에 현탁시킨 후 환류(오일배스 100℃)하에 가열하여 혼합물이 균질되게 한다. 18시간 후 용액을 냉각시키고 용매를 진공에서 제거하여 짙은 오렌지색 오일을 얻는다. 이것은 DCM(25㎖)과 물(10㎖) 사이에 분배하고, 유기층을 유지하고 염수(2×25㎖)로 세척한 후 Na2SO4로 건조한다. DCM을 진공에서 제거하여 오렌지/탠 색 분말인 0.88g(수율 77%)의 생성물을 얻는다.
LCMS tR = 8.75, MS m/z 589.1 [M+H]+
단계 2
1-(3- 브로모 - 페닐 )-4- 메틸 -피페라진
Figure 112005044121551-pct00061
1,3-디브로모벤젠(0.90㎖, 7.49m㏖), N-메틸피페라진(0.28㎖, 2.50m㏖)과 무수톨루엔(7㎖)을 건조 알곤이 충전된 플라스크에 주사기로 가한다. 용액을 완전하게 혼합한 후 BINAP(47㎖)와 Pd2dba3(23㎎)을 배출시키고, 플라스크에 알곤을 재충전하고 주사기로 DBU(0.93g, 2.5당량)을 가한다. 반응 혼합물을 60℃로 가온한 후 새로히 분쇄된 나트륨 tert-부톡시드를 한부분씩 가하여 반응을 시작한다. 반응물을 하룻밤 60℃에서 교반하면서 방치하고 TLC 분석으로 약간의 피페라진이 아직 존재하는 것을 나타내므로 반응물을 100℃로 가열하고 다른 24시간 동안 교반한 후 이를 EtOAc(20㎖)와 물(20㎖) 사이에 분배한다. 수성층을 다시 EtOAc로 추출하고 조합된 유기물을 1.6M HCl 용액(2×10㎖)으로 세척한다. 생성물을 함유하는 산성 용액을 유사한 체적의 1M NaOH 용액으로 먼저 염기화한 다음 산성 용액으로 하고 주의하여 고체 중탄산 나트륨을 가하여 pH=8.5로 한 후 EtOAc(2×15㎖)로 역추출하고, 이를 염수로 세척하고 MgSO4로 건조하고 증발 건조시켜서 황색 오일인 0.50g(수율 78%)의 순수한 생성물을 얻는다.
LCMS tR = 4.55, MS m/z 255.4/257.3 [M+H]+
단계 3
1- 메틸 -4-[3-(4,4,5,5- 테트라메틸 -[1,3,2]- 디옥사보로란 -2-일)- 페닐 ]-피페라진
Figure 112005044121551-pct00062
알곤이 충전된 밀봉 마이크로파 튜브의 무수톨루엔(1㎖)에 용해한 PdCl2(dppf).DCM(10㎎, 0.012m㏖)의 용액에 1-(3-브로모-페닐)-4-메틸-피페라진(100㎎, 0.39m㏖), Et3N(0.11㎖, 2당량)과 4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보로란(0.09㎖, 1.5당량)을 가한다. 마이크로파 튜브를 배기시키고 알곤으로 역충전한 후 200W의 초기 전력을 사용하여 1시간 동안 100℃하에 CEM 마이크로파 반응기에서 조사한다. 반응 혼합물을 더 많은 톨루엔(6㎖)과 물(10㎖) 사이에 분배하고, 유기층을 분리하고 물(1×10㎖)로 세척하고 MgSO4로 건조한 다음 진공에서 증발시켜서 자주색/갈색 잔재를 얻고 이를 더 정제하지 않고 수주키 커플링에 사용한다.
LCMS tR = 0.97, MS m/z 303.5 [M+H]+
단계 4
5-(2,4- 비스 - 벤질옥시 -5- 클로로 - 페닐 )-4-[3-(4- 메틸 -피페라진-1-일)- 페닐 ]-이소옥사졸㎎-3-카르복실산 에틸아민
Figure 112005044121551-pct00063
5-(2,4-비스-벤질옥시-5-클로로-페닐)-4-브로모-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸아미드(38㎎, 0.07m㏖)과 1-메틸-4-[3-(4,4,5,5-테트라메틸-[1,3,2]-디옥사보로란-2-일)-페닐]-피페라진(31㎎, 2당량)을 전술한 수주키 방법을 사용하여 함께 겨합시켜서 갈색 오일로서 37㎎(수율 83%)의 조생성물을 얻고 이를 탈보호 단계에 넘긴다.
단계 5
5-(5- 클로로 -2,4-디히드록시- 페닐 )-4-[3-(4- 메틸 -피페라진-1-일)- 페닐 ]- 이소 옥사졸-3-카르복실산 에틸아미드
Figure 112005044121551-pct00064
5-(2,4-비스-벤질옥시-5-클로로-페닐)-4-[3-(4-메틸-피페라진-1-일)-페닐]-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸아미드를 전술한 바와 같이 탈보호한다. 반응하는 동안 형성된 침전물을 분리하고, EtOAc와 물 사이에 분배한다. 수성층을 유지하고, 고체 탄산 수소 나트륨을 사용하여 염기화하고 생성물을 EtOAc(2×10㎖)을 사용하여 추출한다. 조합된 유기물을 염수(10㎖)로 세척하고 MgSO4로 건조하고 진공에서 증발시켜서 탠색 분말로서 5.2㎎(수율 20%)의 생성물을 얻는다.
LCMS tR = 5.58, MS m/z 457.3 [M+H]+
δ4(d4-MeOH), 7.17(1H, m, Ar-H), 7.09(1H, s, Ar-H), 6.94(1H, m, Ar-H), 6.80(1H, m, Ar-H), 6.49(2H, s, Ar-H) 3.13(4H, t, NCH 2CH2N-CH3), 2.69(2H, q, CONHCH 2CH3), 2.61(4H, t, NCH2CH 2N-CH3), 2.37(3H, s, NCH2CH2N-CH 3), 1.19(3H, t, CONHCH 2CH3).
실시예 31에서는 하기에 기술한 바와 같이 형광 편광 분석에서 활성 'A'을 갖는다.
하기 표의 실시예 32-38에서는 다음과 같은 변이체로 유사하게 제조한다:
1. 실시예 36에 있어서 디옥사보로란 중간체를 다음과 같이 제조한다:
계통
Figure 112005044121551-pct00065
단계 1
1-(4- 브로모 - 페닐 )-4- 메틸 -피페라진
Figure 112005044121551-pct00066
DMF(15㎖)에서의 1-(4-브로모-페닐)-피페라진(1g, 4.1m㏖)과 탄산 칼륨(1.8g, 3당량)을 요오드화 메틸(250㎕, 1.1당량)로 처리하고, 용액을 하룻밤 실온에서 교반한다. 반응물을 탈염수(10㎖)로 냉각시키고, 초산 에틸로 추출한다. 유기층을 탄산 수소 나트륨으로 세척하여 디메틸화 불순물을 제거하고, 건조 시키고 용매를 제거하여 73% 수율의 1-(4-브로모-페닐)-4-메틸-피페라진을 얻는다.
LC 체류시간 2.21분 [M+H]+ 256 (실행시간 3.75분)
단계 2
1- 메틸 -4-[4-(4,4,5,5- 테트라메틸 -[1,3,2] 디옥사보로란 -2-일)- 페닐 ]-피페라진
Figure 112005044121551-pct00067
DMSO(15㎖)에서의 1-(4-브로모-페닐)-4-메틸-피페라진(750㎎, 3m㏖)을 비스(피나콜라토)디보란(1.1g, 1.5당량)과 초산 칼륨(900㎎, 3당량)으로 처리한다. 현탁 액을 배기한 후 PdCl2(dppf)(촉매)로 처리하고, 80℃에서 교반한다. 부가적 비스(피나콜라토)디보란(1당량)을 3시간 후에 가하고 2시간 더 교반한다. 현탁액을 초산 에틸과 물 사이에 분배한다. 디클로로메탄에서 0-8% 메탄올 기울기로 컬럼 크로마토그래피에 의하여 정제하여 수율 62%로 1-메틸-4-[4-(4,4,5,5-테트라메틸-[1,3,2]디옥사보로란-2-일)-페닐]-피페라진을 얻는다.
LC 체류시간 1.83분 [M+H]+ 303 (실행시간 3.75분)
2. 실시예 37과 38에 있어서, 붕산 중간체를 디아옥사보로란 대신에 사용하고 전자는 다음과 같이 제조한다:
4-[(2- 메틸술폰일 )- 에틸아미노메틸 ]- 페닐붕산
( 실시예 37의 중간체)
Figure 112005044121551-pct00068
에탄올(5㎖)에서의 4-아미노메틸 페닐 붕산 하이드로클로라이드(560㎎, 3m㏖)를 메틸 비닐 술폰(260㎕, 1당량)과 트리에틸 아민(1.2㎖, 3당량)으로 처리한다. 용액을 2시간 동안 100℃에서 교반한다. 에탄올을 진공하에 제거하고, 물과 부탄올에 분배하여 94% 수율로 4-[(2-메틸술폰일)-에틸아미노메틸]-페닐붕산을 얻는다.
LC 체류시간 0.39분 [M+H]+ 258 (실행시간 3.75분)
4-[N- 메틸 S,S- 디옥소 - 티오몰폴리노 ]- 페닐붕산 ( 실시예 38의 중간체)
Figure 112005044121551-pct00069
에탄올(8㎖)에서의 4-아미노메틸 페닐 붕산 하이드로클로라이드(456㎎, 2.4m㏖)를 메틸 비닐 술폰(244㎕, 1당량)과 트리에틸 아민(2당량)으로 처리하고, 용액을 3시간 동안 100℃에서 교반한다. 에탄올을 진공하에 제거하고, 물과 부탄올에 분배하여 88% 수율로 생성물을 얻는다.
LC 체류시간 1.65분 [M+H]+ 270 (실행시간 8분)
Figure 112005044121551-pct00070
Figure 112005044121551-pct00071
실시예 39
계통 9:
Figure 112005044121551-pct00072
단계 1
5-(2,4- 비스 - 벤질옥시 -5- 클로로 - 페닐 )-4-(3- 클로로 - 페닐 )- 이소옥사졸 -3- 카르 복실산 에틸아미드
Figure 112005044121551-pct00073
5-(2,4-비스-벤질옥시-5-클로로-페닐)-4-(3-클로로-페닐)-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸아미드(60㎎, 0.11m㏖)과 3-클로로벤젠 붕산(23㎎, 1.3당량)을 전술한 수주키 방법을 사용하여 함께 결합시켜서 다음 단계에서 택하는 갈색 분말인 35㎎(55% 수율)의 조생성물을 얻는다.
단계 2
[5-(2,4- 비스 - 벤질옥시 -5- 클로로 - 페닐 )-4-(3- 클로로 - 페닐 )- 이소옥사졸 -3- 일메틸 ]-에틸-아민
Figure 112005044121551-pct00074
알곤하에 무수 THF에 용해한 5-(2,4-비스-벤질옥시-5-클로로-페닐)-4-(3-클로로-페닐)-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸아미드(36㎎, 0.06m㏖)의 용액에 1M 보란-THF 착체(1㎖)를 가하고 용액을 하룻밤 환류시킨다. 냉각 후 용액을 신속하게 메탄올(2×20㎖)로 용리되는 Isolute® SPE Flash SCX-2 5g 컬럼에 붓는다. 증발되는 메탄올(2×10㎖)에서 10% 암모니아의 혼합물로 용리하여 원하는 생성물을 회수하여 23㎎(65% 수율)의 밝은 황색 분말을 얻는다.
LCMS(LCT)tR = 8.18, MS m/z 558.8 [M+H]+
실시예 39에서는 하기에 기술한 바와 같이 형광 편광 분석에서 활성 'A'를 간는다.
실시예 40에서는 유사하게 제조한다:
Figure 112005044121551-pct00075
*형광 편광 분석
실시예 41
계통 10:
Figure 112005044121551-pct00076
단계 1
5-(2,4- 비스 - 이소옥시 -5- 클로로 - 페닐 )-4-(4- 포르밀 - 페닐 )- 이소옥사졸 -3- 카르 복실산 에틸아미드
Figure 112005044121551-pct00077
5-(2,4-비스-벤질옥시-5-클로로-페닐)-4-요오드-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸아미드(실시예 31에서와 같이 제조)(2g, 3.4m㏖), 4-포르밀붕산(0.621g, 4.08m㏖), NaHCO3(10.2㎖, 1M 수용액, 10.2m㏖), PdCl2(PPH3)(119㎎, 0.17m㏖)과 DMF(50㎖)롤 조합한다. 혼합물을 5분 동안 이를 통하여 N2 기포가 일어나게 하여 탈기한 후 1시간 동안 80℃에서 가열한다. 혼합물을 진공에서 증발시킨 다음 EtOAc(3×50㎖) 사이에 분배한다. 조합되고 건조(Na2SO4)된 유기물을 진공에서 증발하여 조오일 을 얻는다. 이것을 EtOAc에 용해시키고, SiO2의 플러그로 통과시키고, EtOAc로 세척한다. 여액을 진공에 증발시키고 생성된 오일을 Et2O로 분쇄하여 담색 고체로서 5-(2,4-비스-벤질옥시-5-클로로-페닐)-4-(4-포르밀-페닐)-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸아미드(1.577g, 82%)를 얻는다. LC/MS: RT = 2.908분. 567.3 (MH+)
단계 2
5-(2,4- 비스 - 벤질옥시 -5- 클로로 - 페닐 )-4-(4- 몰폴린 -4- 일메틸 - 페닐 )- 이소옥사 졸-3-카르복실산 에틸아미드
Figure 112005044121551-pct00078
초산(0.37㎖, 6.44m㏖)을 5-(2,4-비스-벤질옥시-5-클로로-페닐)-4-(4-포르밀-페닐)-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸아미드(730㎎, 1.29m㏖), 몰폴린(0.25㎖, 2.58m㏖), 3A 분말 분자체(730㎎)와 MeOH(21㎖)의 혼합물에 적가한다. 이를 N2하에 하룻밤 교반하면서 방치한다. 혼합물을 진공에서 증발시킨 다음 생성된 조생성물을 CH2Cl2(3×40㎖)과 포화 NaHCO3 용액(40㎖) 사이에 분배한다. 조합되고 건조(Na2SO4)된 유기물을 진공에서 증발시켜 황색 고체로서 조생성물 5-(2,4-비스-벤질옥시-5-클로로-페닐)-4-(4-몰폴린-4-일메틸-페닐)-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸아미드 (810㎎)를 얻는다. LC/MS: RT = 2.365분. 638.4 (MH+)
단계 3
5-(4- 클로로 -2,4-디히드록시- 페닐 )-4-(4- 몰폴린 -4- 일메틸 - 페닐 )- 이소옥사졸 -3-카르복실산 에틸아미드
Figure 112005044121551-pct00079
BCl3(CH2Cl2의 1M 용액, 3.87㎖, 3.87m㏖)을 0℃에서 CH2Cl2(30㎖)에 용해한 조생성물 5-(2,4-비스-벤질옥시-5-클로로-페닐)-4-(4-몰폴린-4-일메틸-페닐)-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸아미드(810㎎, -1.29m㏖)의 용액에 적가한다. 다음 반응을 RT에 도달하도록 한다. 포화 수성 NaHCO3(40㎖)을 서서히 가한 다음 반응 생성 혼합물을 진공에서 농축한다. 이를 EtOAc(3×50㎖)와 물(30㎖) 사이에 분배한다. 조합되고 건조(Na2SO4)된 유기물을 진공에서 건조시킨다. CH2Cl2-10% MeOH / 1% NH3 / CH2Cl2로 용리하면서 플래쉬 크로마토그래피하여 황색 포옴으로 5-(5-클로로-2,4-디히드록시-페닐)-4-(4-몰폴린-4-일메틸-페닐)-4-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸아미드(380㎎, 2단계 이상 64%) LC/MS: RT = 1.751분. 458.2 (MH+).
실시예 41에서는 아래에 기술한 바와 같이 형광 편광 분석에서 활성 'A'을 갖는다.
다음 표에서 실시예 42-64에서는 적당한 알데히드 또는 케톤을 사용하여 실시예 41과 유사한 방법으로 제조한다.
Figure 112005044121551-pct00080
Figure 112005044121551-pct00081
Figure 112005044121551-pct00082
Figure 112005044121551-pct00083
Figure 112005044121551-pct00084
● *형광 편광 분석
● **에틸 레솔시놀 출발 물질로부터 제조
부가적 화합물 41a는 실시예 41과 유사한 방법으로 제조한다.
실시예 41:
Figure 112005044121551-pct00085
Figure 112005044121551-pct00086
Figure 112005044121551-pct00087
●*형광 편광 분석
●**에틸 레솔시놀 출발 물질로부터 제조
●***알데히드 중간체의 환원에 의하여 제조
●****중간체 페놀의 알킬화에 의하여 제조
●***** 나프틸 알데히드로부터 제조
실시예 65
반응 계통:
Figure 112005044121551-pct00088
단계 1
1-(2,4- 비스 - 벤질옥시 - 페닐 )- 에탄온
Figure 112005044121551-pct00089
35g의 2,4-디히드록시아세토페논(0.230㏖, 1당량)을 500㎖의 아세토니트릴에 용해시킨다. 79.5g의 탄산 칼륨(0.575㏖, 2.5당량)과 86.6g의 브롬화 벤질(0.506㏖, 2.2당량)을 가한다. 혼합물을 64시간 동안 환류시키고, 냉각시키고, 아세토니트릴을 감압하에 제거한다. 잔재를 물과 초산 에틸 사이에서 분리한다. 잔재는 주로 모노-벤질화 레솔시놀이다.
조생성물(43g)을 250㎖의 DMF에 용해시킨 다음 탄산 칼륨(29g, 0.210㏖, 1.2당량)과 25㎖의 브롬화 벤질(0.210㏖, 1.2당량)을 가하고, 혼합물을 하룻밤 교반한다. 용매를 감압하에 제거하고 잔재를 초산 에틸과 물 사이에서 분리한다. 용매를 제거한 후 잔재를 헥산으로 분쇄하여 초과량의 브롬화 벤질을 제거한다.
LC-MS [M+H]+ = 333
수율: 51.2g(67%)
단계 2
1-(2,4- 비스 - 벤질옥시 -5- 브로모 - 페닐 )- 에탄온
Figure 112005044121551-pct00090
51.2g의 1-(2,4-비스-벤질옥시-페닐)-에탄온(0.154㏖, 1당량)을 250㎖의 DMF 에 용해시키고, 100㎖의 DMF에서의 27.42g의 N-브로모석신이미드(0.154㏖, 1당량)을 적가한다. 혼합물을 하룻밤 실온에서 교반한다. 반응 혼합물을 700㎖의 물에 붓고 침전물을 여별한다. 필터 케이크를 물로 헹구고, 무색 고체를 370㎖의 아세토니트릴로 재결정한다.
LC-MS [M+H]+ = 411 & 413
수율: 58.15g(92%)
단계 3
4-(2,3- 비스 - 벤질옥시 -5- 브로모 - 페닐 )-2,4- 디옥소 -부티르산 에틸 에스테르
Figure 112005044121551-pct00091
9.75g의 나트륨(0.424㏖, 3당량)을 500㎖의 무수 에탄올(1.5시간)에 용해시키고, 58g의 1-(2,4-비스-벤질옥시-5-브로모-페닐)-에탄온(0.141㏖, 1당량)과 30.98g의 옥살산 디에틸(0.212㏖, 1.5당량)을 가하고 혼합물을 2시간 동안 환류시킨다. 냉각시킨 후 혼합물을 220㎖의 2N 수성 HCl에 붓고 생성물을 70㎖의 디클로로메탄으로 추출한다. 용매를 감압하에 제거하고 황색 잔재를 150㎖의 디에틸 에테르로 분쇄한다.
수율: 69.24g(96%)
1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ 1.27(t, 3H), 4.27(q, 2H), 5.13(d, 2H), 6.54(s, 1H), 7.37(m, 10H), 8.17(s, 1H).
단계 4
5-(2,4- 비스 - 벤질옥시 -5- 브로모 - 페닐 )- 이소옥사졸 -3- 카르복실산 에틸 에스테르
Figure 112005044121551-pct00092
69.3g의 4-(2,4-비스-벤질옥시-5-브로모-페닐)-2,4-디옥소-부티르산 에틸 에스테르(0.135㏖, 1당량)을 750㎖의 에탄올에 용해시키고, 14.11g의 염화수소산 히드록실아민(0.203㏖, 1.5당량)을 가한다. 혼합물을 2.5시간 동안 환류시키고 냉각한다. 이를 1000㎖의 물에 부은 다음 침전물을 여벌한다. 필터 케이크를 500㎖의 물로 세척한 다음 75㎖의 디에틸 에테르로 세척하고 건조한다.
수율: 67.62g(99%)
1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ 1.39(t, 3H), 4.41(q, 2H), 5.11(d, 2H), 5.15(d, 2H), 6.85(s, 1H) 6.99(s, 1H), 7.35(m, 10H), 8.16(s, 1H).
단계 5
5-(2,4- 비스 - 벤질옥시 -5- 브로모 - 페닐 )- 이소옥사졸 -3- 카르복실산 에틸아미드
Figure 112005044121551-pct00093
5-(2,4-비스-벤질옥시-5-브로모-페닐)-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸에스테르를 에탄올과 에틸 아민(메탄올에서 2M, 3당량)에 현탁시키고, 생성한 황색 현탁액을 질소하에 환류(80℃)로 가열하고, 이점에서 시약은 용액으로 간다. 이를 14시간 동안 가열한 다음 방치하여 주위 온도로 냉각시킨다. 백색 침전물이 형성되고, 이를 여별하고 에탄올로 더 세척한 후 진공에서 건조시킨다.
LC-MS 체류시간 2.868분 [M+H]+ = 507 & 509 (실행시간 3.75분)
단계 6
5-(2,4- 비스 - 벤질옥시 -5- 스티릴페닐 )- 이소옥사졸 -3- 카르복실산 에틸아미드
Figure 112005044121551-pct00094
트란스-2-페닐 비닐 붕소산(0.472g, 3.2m㏖)과 5-(2,4-비스-벤질옥시-5-브로모페닐)-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸 아미드산(1.079g, 2.13m㏖)의 혼합물에 탄소 수소 나트륨산(536㎎, 3.39m㏖)을 가한 다음 DMF(25㎖)와 물(5㎖)을 가한다. 혼 합물을 배출에 의하여 탈기하고 질소로 세척(3회)한 다음 5분 동안 혼합물에 질소 가스를 기포가 일게한다.
디클로로(트리페닐포스핀)팔라듐(II)(149㎎, 0.21m㏖)을 가하고, 반응 혼합물을 7시간 동안 80℃에서 질소 분위기하에 가열한다(반응 혼합물은 10분 후 짙은 갈색으로 된다). 반응 혼합물을 주위 온도로 냉각시키고 대부분의 용매를 진공에서 제거한다. 생성된 잔재를 초산 에틸(100㎖)과 물(100㎖) 사이에 분배하고, 이 혼합물을 셀라이트 패드를 통하여 여과하여 팔라듐 잔재를 제거한다. 상을 분리하고 유기상을 물(2×50㎖), 포화 염화 나트륨 수용액(100㎖)으로 세척한 다음 황산 나트륨으로 건조한다. 혼합물을 여과하고, 여액 용매를 진공에서 제거하여 갈색 고체(800㎎)를 얻는다. 셀라이트 필터 케이크를 디클로로메탄으로 세척한 다음 황산 나트륨으로 건조한다. 혼합물을 여과하고, 여액 용매를 진공에서 제거하여 갈색 고체(541㎎)를 얻는다. 조합된 생성물 배취를 초산 에틸-헥산 혼합물로 분쇄하여 정제한다. 이로서 밝은 갈색 고체인 5-(2,4-비스-벤질옥시-5-스트릴페닐)-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸아미드(808㎎. 71%)를 얻는다. LCMS: [M+H]+ 531. 1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ 1.12(t, 3H), 3.37(m, 2H), 4.95(s, 2H), 5.07(s, 2H), 6.46(s, 1H) 6.70(brt, 1H), 7.11(s, 1H), 7.17(d, 1H), 7.23(d, 1H), 7.32-7.44(m, 15H), 8.09(s, 1H).
단계 7
5-(2,4- 비스 - 벤질옥시 -5- 펜에틸페닐 )- 이소옥사졸 -3- 카르복실산 에틸아미드
Figure 112005044121551-pct00095
목탄상의 팔라듐 촉매(10%; 50㎎)을 질소 분위기 하에 1,4-디옥산(50㎖)에 용해한 5-(2,4-비스-벤질옥시-5-스티릴페닐)-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸아미드(690㎎, 1.30m㏖)의 탈기된 용액에 가한다. 반응 혼합물을 목탄상의 Pd 촉매(50㎎)을 0.75와 2.5시간에 더 첨가하여 전체 4.75시간 동안 수소화한다. 반응 혼합물을 셀라이트 패드를 통하여 여과하고, 이를 1,4-디옥산(20㎖)과 디클로로메틴(20㎖)로 세척한다. 조합된 여액 용매를 진공에서 제거하여 크림색 고체를 얻고, 이를 실리카 겔(20g, IST)에서 헥산에서의 10 내지 50% 초산 에틸로 용리하면서 플래쉬 크로마토그래피하여 정제한다. 이로서 담황색 고체로서 5-(2,4-비스-벤질옥시-5-펜에틸페닐)-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸아미드(609㎎, 88%)를 얻는다. LCMS: [M+H]+ 533. 1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ 1.26(t, 3H), 2.86-2.96(m, 4H), 3.49(m, 2H), 5.03(s, 2H), 5.18(s, 2H) 6.56(s, 1H), 6.81(t, 1H), 7.07(s, 1H), 7.15-7.20(m, 3H), 7.23-7.28(m, 2H), 7.31-7.42(m, 10H), 7.73(s, 1H).
단계 8
5-(2,4- 비스 - 벤질옥시 -5- 펜에틸페닐 )-4- 브로모 - 이소옥사졸 -3- 카르복실산 에틸아미드
Figure 112005044121551-pct00096
N-브로모석신이미드(207㎎, 1.16m㏖)을 아세토니트릴(20㎖)에 현탁시킨 5-(2,4-비스-벤질옥시-5-펜에틸페닐)-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸아미드(564㎎, 1.06m㏖)의 현탁액에 가한다. 질산 암모늄 세륨(290㎎, 0.53m㏖)을 가하고, 반응 혼합물을 환류 하에 가열하고(균질의 오렌지색 용액을 나타낸다), 30분 동안 교반한다. 반응 혼합물을 주위 온도로 냉각시키고 아세토니트릴을 진공에서 제거한다. 잔재를 초산 에틸(50㎖)과 물(50㎖) 사이에 분배하고, 상을 분리한다. 유기상을 포화 염화 나트륨 수용액(50㎖)으로 세척하고 황산나트륨으로 건조한다. 혼합물을 여과하고 여액 용매를 진공에서 제거하여 황색 오일을 얻고, 이를 실리카 겔(20g, IST)에서 헥산에서의 10-30% 초산 에틸로 용리하면서 플래쉬 크로마토그래피하여 정제한다. 이로서 황색 오일인 5-(2,4-비스-벤질옥시-5-펜에틸페닐)-4-브로모-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸아미드(326㎎, 53%)를 얻는다. LCMS: [M+H]+ 613,611.
단계 9
5-(2,4- 비스 - 벤질옥시 -5- 펜에틸 - 페닐 )-4-(4- 몰폴린 -4- 일메틸 - 페닐 )- 이소옥사 졸-3-카르복실산 에틸아미드
Figure 112005044121551-pct00097
4-몰폴린-4-일메틸-페닐 피나콜 보란(0.215g, 0.71m㏖)과 5-(2,4-벤질옥시-5-펜에틸페닐)-4-브로모-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸아미드(0.347g, 0.57m㏖)의 혼합물에 탄산 수소 나트륨(142㎎, 1.69m㏖)을 가한 다음 DMF(10㎖)와 물(2.0㎖)을 가한다. 혼합물을 배출에 의하여 탈기하고 질소로 세척(3회)한 다음 5분 동안 혼합물에 질소 가스로 기포가 일게한다. 디클로로비스(트리페닐포스핀)팔라듐(II)(40㎎, 0.057m㏖)을 가하고, 반응 혼합물을 5시간 동안 80℃에서 질소 분위기하에 가열한다(반응 혼합물은 짙은 갈색으로 된다). 다른 20㎎(0.029m㏖)의 디클로로비스(트리페닐포스핀)팔라듐(II)을 가하고 반응 혼합물을 15시간 동안 80℃에서 가열한 다음 주위 온도로 냉각시킨다. 대부분의 용매를 진공에서 제거하고, 잔재를 초산 에틸(50㎖)과 물(50㎖) 사이에 분배한다. 이 혼합물을 셀라이트 패드로 여과하여 팔라듐 잔재를 제거한 다음 상을 분리하고 유기상을 물(2×50㎖), 포화 염화 나트륨 수용액(50㎖)로 세척한 다음 황산 나트륨으로 건조시킨다. 혼합물을 여과하고, 여액 용매를 진공에서 제거하여 갈색 오일을 얻는다. 조반응 생성물을 실리카 겔(20g, IST)에서 헥산에서의 30 내지 70% 초산 에틸의 용매 기울기로 용리하면서 플래쉬 크로마토그래피하여 정제한다. 이로서 황색 오일인 5-(2,4-비스-벤질옥시-5-펜에틸-페닐)-4-(4-몰폴린-4-일메틸-페닐)-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸아미드를 얻는다(0.110g, 27%). LCMS: [M+H]+ 708.
단계 10
5-(2,4-디히드록시-5- 펜에틸 - 페닐 )-4-(4- 몰폴린 -4- 일메틸 - 페닐 )- 이소옥사졸 -3-카르복실산 에틸아미드 하이드로클로라이드
Figure 112005044121551-pct00098
질소 분위기 하에 디클로로메탄(4㎖)에 용해한 5-(2,4-비스-벤질옥시-5-펜에틸-페닐)-4-(4-몰폴린-4-일메틸-페닐)-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸아미드(0.109g, 0.15m㏖)의 얼름-배스에서 냉각된 용액에 디클로로메탄(0.45㎖, 0.45m㏖)에 용해한 삼염화 붕소의 1.0M 용액을 가한다. 반응 혼합물을 20분 동안 0℃에서 교반한 다음 3.5시간 동안 주위 온도에서 교반한다. 반응 혼합물을 0℃로 재냉각시키고 포화 탄산 수소 나트륨 수용액(5㎖)을 첨가하여 냉각시킨다. 5분 동안 교반한 후 디클로로메탄을 진공에서 제거하고, 잔재를 초산 에틸(20㎖)과 물(20㎖) 사이에 분배한다. 상을 분리하고 유기상을 물(20㎖), 포화 염화 나트륨 수용액(20㎖)으로 세척한 다음 황산나트륨으로 건조한다. 혼합물을 여과하고 여액 용매를 진공에서 제거하여 밝은 갈색 오일을 얻고, 이를 실리카 겔에서 흡수하여 정제한 다음 실리카 겔(10g, IST)에서 초산 에틸에서의 0-5% 메탄올로 용리하면서 플래쉬 크로마토그래피하여 정제한다. 이로서 무색 오일을 얻고 이를 디에틸 에테르 용액(5㎖)에서 1.0M HCl으로 분쇄하여 5-(2,4-디히드록시-5-펜에틸-페닐)-4-(4-몰폴린-4-일메틸-페닐)-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸아미드 하이드로클로라이드(0.019g; 24%)를 얻는다. LCMS: [M+H]+ 528. 1H NMR(400 MHz, d6-DMSO)□ 1.08(t, 3H), 2.60(m, 4H), 2.90-3.30(m, 6H), 3.67(m, 2H), 3.87(m, 2H), 4.30(s, 2H), 6.46(s, 1H), 6.84(s, 1H), 7.05-7.49(m, 5H), 7.40-7.68(m, 4H), 8.90(brs, 1H), 9.67(s, 1H), 9.89(s, 1H), 10.75(brs, 1H).
실시예 65에서는 아래에 기술한 바와 같이 형광 편광 분석에서 활성 'A'을 갖는다.
다음 표의 실시예들에서는 실시예 64와 유사한 방법으로 제조하고, 아래에 기술한 바와 같이 형광 편광 분석에서 나타낸 활성을 갖는다.
Figure 112005044121551-pct00099
Figure 112005044121551-pct00100
Figure 112005044121551-pct00101
다음 표의 부가적 실시예 75a-v에서는 실시예 65와 유사한 방법으로 제조한다.
Figure 112005044121551-pct00102
Figure 112005044121551-pct00103
Figure 112005044121551-pct00104
Figure 112005044121551-pct00105
Figure 112005044121551-pct00106
실시예 76
반응 계통
Figure 112005044121551-pct00107
단계 1
3-(2,4- 비스 - 벤질옥시 -5- 브로모 - 페닐 )-4-(4- 메톡시 - 페닐 )-5- 메틸 - 이소옥사졸
Figure 112005044121551-pct00108
트리메틸옥소늄 붕소 트리플루오리드(알드리치; 70㎎, 0.47m㏖)를 디클로로메탄(3㎖)에 용해한 5-(2,4-비스-벤질옥시-5-브로모-페닐)-4-(4-메톡시-페닐)-30메틸-이소옥사졸(실시예 3, 단계 1)(120㎎, 0.22m㏖)의 교반된 용액에 가하고 교반을 3시간 동안 계속한다. 생성된 혼합물을 진공에서 농축하면 백색 반고체가 남으며, 이를 염화수소산 히드록실아민(70㎎, 1.0m㏖), 탄산 칼륨(120㎎, 0.8m㏖)과 메탄올(2㎖)과 혼합하고, 18시간 동안 환류하에 가열한다. 반응 혼합물을 물(20㎖)과 초산 에틸(2×10㎖) 사이에 분배하고 조합된 유기물을 무수 황산 마그네슘으로 건조하고, 진공에서 증발하면 무색 오일이 남는다. 조생성물을 실리카(10g)에서 헥산으로 용리하면서 컬럼 크로마토그래피한 다음 디에틸 에테르/헥산(1:1)으로 정제하여 백색 고체인 3-(2,4-비스-벤질옥시-5-브로모-페닐)-4-(4-메톡시-페닐)-5-메틸-이소옥사졸(44㎎, 37%)을 얻는다.
LC 체류시간 5.55분 [M+H]+ 556.0과 558.0 (실행시간 8.00분)
N.M.R(클로로포름-d) 7.64(s Ar H ) 7.356.76(m 14 Ar H ) 6.34(sAr H ) 4.90(s 2C H 2) 4.60(s 2C H 2) 3.79(s 3C H 3) 2.46(s 3C H 3)
단계 2
4- 브로모 -6-[4-(4- 메톡시 - 페닐 )-5- 메틸 - 이소옥사졸 -3-일]- 벤진 -1,3- 디올
Figure 112005044121551-pct00109
삼염화 붕소 용액(디클로로메탄에 1N, 1㎖, 1m㏖)을 디클로로메탄(1㎖)에 용 해한 3-(2,4-비스-벤질옥시-5-브로모-페닐)-4-(4-메톡시-페닐)-5-이소옥사졸(38㎎, 0.068m㏖)의 용액에 가하고 교반을 1시간 동안 계속힌다. 반응 혼합물을 물(20㎖)과 디클로로메탄(2×20㎖) 사이에 분배하고 조합된 유기층을 무수 황산 마그네슘으로 건조하고 진공에서 농축하면 갈색 오일이 남는다. 조생성물을 실리카(10g)에서 헥산으로 용리하면서 컬럼 크로마토그래피한 다음 헥산/디에틸 에테르(3:1 다음 1:1)로 정제하여 무색 오일인 4-브로모-6-[4-(4-메톡시-페닐)-5-메틸-이소옥사졸-3-일]-벤젠-1,3-디올(11㎎, 43%)을 얻는다.
LC 체류시간 2.25분 [M+H]+ 376.1과 378.1 (실행시간 3.75분)
N.M.R(DMSO-d6) 10.40(s O H ) 9.69(s O H ) 7.22(Ar H ) 7.10-6.89(m 4Ar H ) 6.5(s Ar H ) 3.7(s OC H 3) 2.46(s C H 3)
이 화합물은 Hsp90 형광 편광 분석에서 활성 'A'을 갖는다.
실시예 76A
다음 화합물은 시판하고 있는 것이고(인터바이오스크린) 형광 편광 분석에 활성 'B'을 갖는다:
Figure 112005044121551-pct00110
다음 화합물은 실시예 76에 따라 제조한다:
Figure 112005044121551-pct00111
실시예 77
5-(5-tert-부틸-2,4-디히드록시-페닐)-4-(4-몰폴린-4-일메틸-페닐)-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸아미드
Figure 112005044121551-pct00112
반응 계통:
Figure 112005044121551-pct00113
단계 1
1-(5- tert -부틸-2,4-디히드록시- 페닐 )- 에탄온
Figure 112005044121551-pct00114
황산(4㎖, 75m㏖)을 질소 분위기 하에 2-메틸-2-프로판올(35g, 470m㏖)과 트리플루오로초산(80㎖)의 혼합물에 현탁시킨 다히드록시아세토페논(22.8g, 150m㏖)d의 현탁액에 가한다. 생성된 현탁액을 -3시간 동안 오일 배스 온도 70℃로 가열하여 담적색 용액을 얻는다. 생성된 용액을 냉각시키고 얼음/물에 부어 연분홍색 침전물을 얻는다. 고체를 여과하고 물(600㎖)과 헥산(200㎖)으로 세척하여 연분홍색 분말인 1-(5-tert-부틸-2,4-디히드록시-페닐)-에탄온(28.8g, 92%)를 얻는다.
LC 체류시간 2.74분 [M+H]+ 209.1 (실행시간 3.75분)
N.M.R(클로로포름-d) 7.35(s Ar H ) 6.05(s Ar H ) 7.35(m 2Ar H ) 2.35(s 3C H 3) 1.15(s 9 C H 3)
단계 2
1-(2,4- 비스 - 벤질옥시 -5- tert -부틸- 페닐 )- 에탄온
Figure 112005044121551-pct00115
브롬화 벤질(10㎖, 84m㏖)을 DMF(50㎖)에 용해한 아세토페논(13.5g, 65m㏖)의 용액에 가하고, 탄산 칼륨(20g, 145m㏖)을 가하고, 현탁액을 -4시간 동안 실온에서 교반한다. 생성된 현탁액을 물(200㎖)에 부어서 연한 오렌지색 침전물을 얻는다. 고체를 여과하여 제거하고 수세한다. 고체를 디클로로메탄(150㎖)에 용해시키고, 용액을 물(2×100㎖)과 포화 염화 나트륨 수용액(100㎖)으로 세척한다. 용액을 무수 황산 나트륨으로 건조하고 담적색 오일로 농축한다.
오일을 2-메틸-2-프로판올(100㎖)과 칼륨 tert-부톡시드(7.5g, 67m㏖)에 용해시켜서 담황색 침전물을 얻고, 브롬화 벤질(8㎖, 67m㏖)을 가하고, 혼합물을 -1시간 동안 환류하에 가열한다. 생성된 현탁액을 냉각시키고, 물(250㎖)에 부어서 연한 오렌지색 침전물을 얻는다. 고체를 여과하여 제거하고 수세한다. 고체를 초산 에틸에 용해시키고, 물(2×200㎖)과 포화 염화 나트륨 수용액(100㎖)으로 세척한다. 용액을 무수 황산 나트륨으로 건조하고 농축하여 오렌지색 반-고체로 하고, 메탄올로 분쇄하면 연분홍색 고체를 얻는다. 고체를 여과하여 제거하고, 진공(40℃) 에서 건조하여 연분홍색 분말인 1-(2,4-비스-벤질옥시-5-tert-부틸-페닐)-에탄온(9.1g, 36%)을 얻는다.
LC 체류시간 3.03분 [M+H]+ 389.3 (실행시간 3.75분)
N.M.R(클로로포름-d) 7.65(s Ar H ) 7.25-7.15(m 10Ar H ) 6.35(s Ar H ) 4.95(s 2C H 2) 4.9(s 2 C H 2) 2.4(s 3C H 3) 1.2(s 9 C H 3)
단계 3
4-(2,4- 비스 - 벤질옥시 -5- tert -부틸- 페닐 )-2-히드록시-4-옥소- 부트 -2- 에노산 에틸 에스테르
Figure 112005044121551-pct00116
나트륨 에톡시드(2.8g, 41m㏖)를 에탄올(40㎖)에 현탁시킨 1-(2,4-비스-벤질옥시-5-tert-페닐)-에탄온(7.8g, 20m㏖)의 현탁액에 가한다. 옥살산 디에틸(4㎖, 29.5m㏖)을 가하고, 생성된 현탁액을 -2시간 동안 환류하에 가열하여 담적색 용액을 얻는다. 용액을 냉각시키고 물(200㎖)에 붓고, 혼합물을 염산(50㎖, M)으로 산성화하고, 디클로로메탄(150㎖)으로 추출한다. 추출물을 물(2×200㎖)과 포화 염화 나트륨 수용액(100㎖)으로 세척한다. 용액을 무수 황산 나트륨으로 건조하고 농축하여 황색 검으로 한다. 헥산으로 분쇄하여 황색 고체를 얻고, 고체를 여과하여 제거하고 헥산으로 세척하고 진공(40℃)에서 건조하여 황색 분말인 4-(2,4-비스-벤질옥시-5-tert-부틸-페닐)-2-히드록시-4-옥소-부트-2-에노산 에틸 에스테르(9.1g, 93%)를 얻는다.
N.M.R(클로로포름-d) 8.0(s Ar H ) 7.5-7.35(m 11Ar H ) 6.6(s Ar H ) 5.2(s 2C H 2) 5.15(s 2 C H 2) 4.3(q J 7.1Hz 2 C H 2) 1.4(s 9 C H 3) 1.25(t J 7.1Hz 3C H 3)
단계 4
5-(2,4- 비스 - 벤질옥시 -5- tert -부틸- 페닐 )- 이소옥사졸 -3- 카르복실산 에틸 에 스테르
Figure 112005044121551-pct00117
염화수소산 히드록실아민(3.6g, 52m㏖)을 에탄올(75㎖)에 용해한 4-(2,4-비스-벤질옥시-5-tert-부틸-페닐)-2-히드록시-4-옥소-부트-2-에노산 에틸 에스테르(90g, 18.5m㏖)의 용액에 가하고, 현탁액을 -4시간 동안 환류하에 가열한다. 생성된 용액을 냉각하고 물(200㎖)에 부어서 백색 침전물을 얻는다. 고체를 여과하여 제거하고 디클로로메탄(50㎖)에 용해시킨다. 용액을 물(150㎖)과 포화 염화 나트륨 수용액(50㎖)으로 세척한다. 용액을 무수 황산 나트륨으로 건조하고 백색 고체로 농축한다. 고체를 헥산으로 세척하고 진공(40℃)에서 건조하여 담갈색 분말인 5-(2,4-비스-벤질옥시-5-tert-부틸-페닐)-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸 에스테르(8.0g, 89%)를 얻는다.
LC 체류시간 3.13분 [M+H]+ 486.5 (실행시간 3.75분)
N.M.R(클로로포름-d) 7.85(s Ar H ) 7.4-7.25(m 10Ar H ) 6.9(s Ar H ) 6.5(s Ar H ) 5.1(s 2C H 2) 5.0(s 2 C H 2) 4.35(q J 7.1Hz 2 C H 2) 1.4(s 9 C H 3) 1.35(t J 7.1Hz 3C H 3)
단계 5
5-(2,4- 비스 - 벤질옥시 -5- tert -부틸- 페닐 )- 이소옥사졸 -3- 카르복실산 에틸아미드
Figure 112005044121551-pct00118
5-(2,4-비스-벤질옥시-5-tert-부틸-페닐)-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸 에스테르(10.0g, 20.6m㏖)를 메탄올(60㎖, 2.0M)에 용해한 에틸 아민의 용액에 가하고, 현탁액을 -2시간 동안 오일 배스 온도 75℃로 가열한다. 생성된 용액을 냉각하고 담갈색 오일로 농축하고 디클로로메탄(50㎖)을 가하고 용액을 물(100㎖)과 포화 염화 나트륨 수용액(75㎖)으로 세척한다. 용액을 무수 황산 나트륨으로 건조하고 갈색 오일로 농축하고 방치하여 고화시킨다(9.9g, -정량).
LC 체류시간 3.02분 [M+H]+ 485.3 (실행시간 3.75분)
N.M.R(클로로포름-d) 7.8(s Ar H ) 7.4-7.25(m 10Ar H ) 7.0(s Ar H ) 6.75(brt J 5.4Hz N H ) 6.5(s Ar H ) 5.1(s 2C H 2) 5.0(s 2 C H 2) 3.4(dq J 5.4Hz, 7.1Hz 2C H 2) 1.35(s 9 C H 3) 1.15(t J 7.1Hz 3C H 3)
단계 6
5-(2,4- 비스 - 벤질옥시 -5- tert -부틸- 페닐 )-4-요오드- 이소옥사졸 -3- 카르복실산 에틸아미드
Figure 112005044121551-pct00119
N-요오드석신이미드(9.0g, 40m㏖)를 아세토니트릴(60㎖)에 현탁시킨 5-(2,4-비스-벤질옥시-5-tert-부틸-페닐)-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸아미드(9.9g, 20.4m㏖)을 현탁액에 가한다. 질산 세륨 암모늄(0.25g, 0.46m㏖)을 가하고 현탁액을 -18시간 동안 교반한다. 생성된 현탁액을 농축하고 잔재를 디클로로메탄(125㎖)에 용해시킨다. 생성된 용액을 메타 아황산수소 나트륨 수용액(2×100㎖, 5%), 물(100㎖)과 포화 염화 나트륨 수용액(100㎖)으로 세척한다. 용액을 무수 황산 나트륨으로 건조하고 담적색 검으로 농축한다. 에탄올(25㎖)로 분쇄하여 회색 고체를 얻고, 고체를 여과하여 제거하고 에탄올로 세척한다. 진공(40℃)에서 건조하면 회색 고체인 5-(2,4-비스-벤질옥시-5-tert-부틸-페닐)-4-요오드-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸아미드(7.75g, 62%)를 얻는다.
LC 체류시간 3.07분 [M+H]+ 611.2 (실행시간 3.75분)
N.M.R(클로로포름-d) 7.45-7.25(m 11Ar H ) 6.8(brt J 5.4Hz N H ) 6.6(s Ar H ) 5.05(s 4C H 2) 3.5(dq J 5.4Hz, 7.1Hz 2 C H 2) 1.35(s 9 C H 3) 1.2(t J 7.1Hz 3C H 3)
단계 7
5-(2,4- 비스 - 벤질옥시 -5- tert -부틸- 페닐 )-4-(4- 포르밀 - 페닐 )- 이소옥사졸 -3-카르복실산 에틸아미드
Figure 112005044121551-pct00120
인산 칼륨 수용액(25㎖, 1.2M)을 질소 분위기 하에 1,4-디옥산(75㎖)에 용해한 5-(2,4-비스-벤질옥시-5-tert-부틸-페닐)-4-요오도-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸아미드(6.1g, 10m㏖)과 4-포르밀페닐붕산(2.35g, 15.7m㏖)의 용액에 가한다. 디클로로비스(트리-0-톨일 포스핀)팔라듐(II)을 가하고 -1시간 동안 오일 배스 온도 100℃로 혼합물을 가열한다. 혼합물을 냉각시키고 수성층을 분리하고 초산 에틸(100㎖)로 추출한다. 조합된 유기물을 농축하여 담갈색 검을 얻는다.
조생성물을 실리카(600㎖)에서 초산 에틸/헥산(1:3)으로 용리하면서 컬럼 크로마토그래피하여 정제하면 담황색 포옴인 5-(2,4-비스-벤질옥시-5-tert-부틸-페닐)4-(4-포르밀-페닐)-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸아미드(5.18g, 88%)를 얻는다.
LC 체류시간 3.01분 [M+H]+ 589.4 (실행시간 3.75분)
N.M.R(클로로포름-d) 9.75(s C H O) 7.5(d J 6.9Hz 2 Ar H ) 7.2(d J 6.9Hz 2 Ar H ) 7.15-7.0(m 8Ar H ) 6.8(m 2 Ar H 2) 6.65(brt J 5.4Hz N H ) 6.2(s Ar H ) 4.8(s 2C H 2) 4.5(s 2 C H 2) 3.2(dq J 5.4Hz, 7.1Hz 2 C H 2) 1.1(s 9 C H 3) 1.05(t J 7.Hz 3C H 3)
단계 8
5-(2,4- 비스 - 벤질옥시 -5- tert -부틸- 페닐 )-4-(4- 몰폴린 -4- 일메틸 - 페닐 )- 이소옥사졸 -3-카르복실산 에틸아미드
Figure 112005044121551-pct00121
시아노붕소수소화 나트륨(65㎎, 1.03m㏖)을 메탄올(4㎖)에 용해한 5-(2,4-비스-벤질옥시-5-tert-부틸-페닐)-4-(4-포르밀-페닐)-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸아미드(125㎎, 0.21m㏖), 몰폴린(50㎕, 0.57m㏖)과 초산(촉매)의 용액에 가하고 용액을 -72시간 동안 교반한다. 디클로로메탄(50㎖)을 가하고 용액을 물(2×50㎖)과 포화 염화 나트륨 수용액(50㎖)으로 세척한다. 용액을 무수 황산 나트륨으로 건조하고 무색 검으로 농축한다.
조생성물을 실리카(20g)에서 초산 에틸/헥산(1:1)으로 용리하면서 컬럼 크로마토그래피하여 정제하면 무색 오일인 5-(2,4-비스-벤질옥시-5-tert-부틸-페닐)-4-(4-몰폴린-4-일메틸-페닐)-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸아미드를 얻는다.
LC 체류시간 2.56분 [M+H]+ 660.8 (실행시간 3.75분)
N.M.R(클로로포름-d) 7.35-7.05(m 15Ar H ) 6.7(brt J 5.4Hz N H ) 6.4(s Ar H ) 4.9(s 2C H 2) 4.75(s 2 C H 2) 3.6(t J 4.5Hz 4 C H 2) 3.(s 2 C H 2) 3.35(dq J 5.4Hz, 7.1Hz 2 C H 2) 2.35(br s 4 C H 2) 1.15(t J 7.1Hz 3C H 3) 1.1(s 9 C H 3)
단계 9
5-(5- tert -부틸-2,4-디히드록시- 페닐 )-4-(4- 몰폴린 -4- 일메틸 - 페닐 )- 이소옥사졸 -3-카르복실산 에틸아미드
Figure 112005044121551-pct00122
삼염화붕소(1㎖, 디클로로메탄에서 1.0M) 용액을 질소 분위기 하에서 -20℃(얼음/메탄올)에서 디클로로메탄(1㎖)에 용해한 5-(2,4-비스-벤질옥시-5-tert-부틸-페닐)-4-(4-몰폴린-4-일메틸-페닐)-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸아미드(35㎎, 0.05m㏖)의 용액에 가한다. 생성된 용액을 -90분 동안 0℃(얼음/물)에서 교반한다. 메탄올(2㎖)을 가하고 용액을 갈색 검으로 농축한다.
조생성물을 정제 HPLC하여 정제하면 백색 분말인 5-(5-tert-부틸-2,4-디히드록시-페닐)-4-(4-몰폴린-4-일메틸-페닐)-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸아미드(포름산염)(21㎎, 75%)를 얻는다.
LC 체류시간 1.97분 [M+H]+ 480.5 (실행시간 21㎎, 75%)
N.M.R(DMSO-d6) 8.8(t J 5.6Hz N H ) 7.25(d J 7.2Hz 2Ar H ) 7.15(d J 7.2Hz 2Ar H ) 6.7(s 2Ar H ) 6.45(s Ar H ) 3.45(br s 4 C H 2) 3.2(dq J 5.6Hz, 7.2Hz 2 C H 2) 2.3(br s 4 C H 2) 1.1(s 9 C H 3) 1.05(t J 7.1Hz 3C H 3)
이 화합물은 Hsp90 형광 편광 분석에서 활성 'A'를 갖는다.
실시예 77a-f에서는 실시예 77의 화합물의 제조와 유사한 방법으로 제조한다.
Figure 112005044121551-pct00123
Figure 112005044121551-pct00124
실시예 78
5-(2,4-디히드록시-5-이소부틸-페닐)-4-(4-몰폴린-4-일메틸-페닐)-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸아미드
Figure 112005044121551-pct00125
Figure 112005044121551-pct00126
단계 1
1-(2,4- 비스 - 벤질옥시 - 페닐 )- 에탄온
Figure 112005044121551-pct00127
탄산 칼륨(2.5당량)을 아세토니트릴(400㎖)에 용해한 2',4'-디히드록시아세토페논(1당량)의 용액에 가하고 현탁액을 실온에서 교반한다. 브롬화 벤질(2.5당량)을 10분 이상 적가하고 혼합물을 18시간 동안 환류하에 적가한다. 혼합물을 냉각시키고 진공에서 증발하여 슬러리를 얻는다. 슬러리를 물과 초산 에틸 사이에 분배하고 층을 분리한다. 수성층을 디클로로메탄으로 더 추출하고 유기 추출물을 조합하여 건조(MgSO4)하고 진공에서 증발한다. 생성물을 헥산으로 분쇄하고, 여과하고 냉헥산으로 세척하고 45℃에서 진공하에 건조하여 백색 분말로서 1-(2,4-비스-벤질 옥시)-페닐-에탄온을 얻는다.
LC 체류시간 2.704분 [M+H]+ 333.3
단계 2
2,4- 비스 - 벤질옥시 -1- 이소프로펜일 -벤젠
Figure 112005044121551-pct00128
브롬화 메틸트리페닐포스포늄(1.1당량)을 THF에 현탁시키고 질소하에 0℃로 냉각시킨다. 헥산(1.1당량)에서의 1.6M 부틸리튬을 적가하고 30분 동안 교반한다. 1-(2,4-비스-벤질옥시-페닐)-에탄온(1당량)을 THF에 용해시키고 현탁액에 적가한다. 첨가가 완료되었을 때, 얼음 배스를 제거하고 반응혼합물을 하룻밤 질소하에 실온에서 교반한다. 메탄올을 반응혼합물에 가하고 생성된 용액을 진공에서 증발시킨다. 생성된 오일에 헥산을 가하고 30분 동안 환류하에 가열한 다음 셀라이트를 통하여 여과한다. 액체를 진공에서 증발시켜 오일을 얻고 이를 헥산에서의 30% EtOAc로 용리하면서 컬럼 크로마토그래피하여 정제하면 2,4-비스-벤질옥시-1-이소프로펜일-벤젠을 얻는다.
Rf 체류시간 0.722분, 헥산: EtOAc 3:1
단계 3
4-이소프로필-벤젠-1,3- 디올
Figure 112005044121551-pct00129
2,4-비스-벤질옥시-1-이소프로펜일-벤젠을 에탄올 용액에 용해시키고 탄소상의 10% 팔라듐에 가하고 이를 물로 선-급습시킨다. 수소를 플라스크에 주입하고 혼합물을 16시간 동안 흔든다. 촉매를 적당한 방법으로 반응 혼합물로부터 여과하고 액체를 진공에서 농축하여 백색 결정 고체인 4-이소프로필-벤젠-1,3-디올을 얻는다.
LC 체류시간 2.088분 [M+H]+ 153.1
단계 4
1-(2,4-디히드록시-5-이소프로필- 페닐 )- 에탄온
Figure 112005044121551-pct00130
4-이소프로필-벤젠-1,3-디올(1당량)을 BF3.OEt2(6당량)에 용해시키고 초산을 가한다(2당량). 용액을 90℃에서 16시간 동안 가열한 다음 실온으로 냉각시킨다. 용액을 10% NaOAc(수성)로 적가하고 4시간 동안 방치한 후 EtOAc로 추출한다. 유기상을 조합하고 포화 NaHCO3(수성)로 세척한 다음 MgSO4으로 건조하고 여과하고 진공 에서 농축한다. 잔재 오일을 디클로로메탄으로 용리하면서 컬럼 크로마토그래피하여 정제하면 백색 고체인 1-(2,4-디히드록시-5-이소프로필-페닐)-에탄온을 얻는다.
LC 체류시간 2.633분 [M+H]+ 195.1
단계 5
1-(2,4- 비스 - 벤질옥시 -5-이소프로필- 페닐 )- 에탄온
Figure 112005044121551-pct00131
1-(2,4-디히드록시-5-이소프로필-페닐)-에탄온(1당량)을 DMF와 탄산 칼륨(2.2당량)에 용해시킨 다음 브롬화 벤질(2.2당량)을 가한다. 현탁액을 16시간 동안 질소 하에 150℃에서 교반하면서 가열한다. 용액을 실온에서 냉각시키고 혼합물을 1M HCl(수성)에 부은 다음 초산 에틸로 추출한다. 유기상을 조합하고 다시 1M HCl(수성)으로 세척한 다음 염수 용액으로 5회 세척한다. 유기상을 MgSO4으로 건조하고 여과하고 진공에서 농축하여 고체를 얻고 이를 이에틸:헥산(1:1)으로 분쇄하여 정제하므로 1-(2,4-비스-벤질옥시-5-이소프로필-페닐)-에탄올을 얻는다.
LC 체류시간 3.575분 [M+H]+ 375.2
단계 6
4-(2,4- 비스 - 벤질옥시 -5-이소프로필- 페닐 )-2-히드록시-4-옥소- 부트 - 에노산 에틸 에스테르
Figure 112005044121551-pct00132
나트륨(2.8당량)을 실온에서 질소 하에 에탄올에 가하고, 25분 동안 교반하여 나트륨 에톡시드를 얻는다. 1-(2,4-비스-벤질옥시-5-이소프로필-페닐)-에탄온(1당량)을 다른 에탄올에 용해시키고 나트륨 에톡시드 용액에 가한다. 옥살산 디에틸(1.64당량)을 가하고 반응 혼합물을 4시간 동안 환류하에 가열한다. 혼합물을 실온으로 냉각시키고 1M HCl(수성)을 충분히 가하여 반응 혼합물을 산성으로 하고 이를 진공에서 농축한다. 생성된 검을 디클로로메탄과 염수 사이에 분배하고 유기상을 MgSO4으로 건조하고 여과하고 진공에서 증발시켜서 황색 검으로 4-(2,4-비스-벤질옥시-5-이소프로필-페닐)-2-히드록시-4-옥소-부트-2-에노산 에틸 에스테르를 얻는다.
LC 체류시간 3.057분 [M+H]+ 475
단계 7
5-(2,4- 비스 - 벤질옥시 -5-이소프로필- 페닐 )- 이소옥사졸 -3- 카르복실산 에틸 에 스테르
Figure 112005044121551-pct00133
4-(2,4-비스-벤질옥시-5-이소프로필-페닐)-2-히드록시-4-옥소-부트-에놋ㄴ 에틸 에스테르(1당량)을 교반하면서 에탄올에 용해시킨다. 염화수소산 히드록실아민(1.2당량)을 가하고 용액을 질소 분위기에서 4시간 동안 환류하에 가열한다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고 진공에서 농축한다. 잔재를 염수와 디클로로메탄 사이에 분배하고 유기상을 MgSO4으로 건조하고 여과하고 진공에서 농축하여 고체인 5-(2,4-비스-벤질옥시-5-이소프로필-페닐)-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸 에스테르를 얻는다.
LC 체류시간 3.059분 [M+H]+ 472
단계 8
5-(2,4- 비스 - 벤질옥시 -5-이소프로필- 페닐 )- 이소옥사졸 -3- 카르복실산 에틸아미드
Figure 112005044121551-pct00134
5-(2,4-비스-벤질옥시-5-이소프로필-페닐)-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸 에스테르를 메탄올에서의 초과 2M 에틸아민에 용해시키고 600초 동안 120℃에서 스미스 합성기 마이크로파로 가열한다. 용액을 진공에서 농축하여 고체를 얻고 이를 헥산으로 분쇄하면 5-(2,4-비스-벤질옥시-5-이소프로필-페닐)-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸아미드
LC 체류시간 2.979분 [M+H]+ 471.3
단계 9
5-(2,4-비스-벤질옥시-5-이소프로필-페닐)-4-요오드-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸아미드
Figure 112005044121551-pct00135
5-(2,4-비스-벤질옥시-5-이소프로필-페닐)-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸아미드(1당량)를 아세토니트릴과 N-요오도석신이미드(2.0당량)에 용해시킨 다음 질산 암모늄 세륨(0.05당량)을 가하고 용액을 하룻밤 실온에서 교반한다. 반응 혼합물을 진공에서 농축하고 생성된 검을 초산 에틸과 염수 사이에 분배한다. 유기상을 MgSO4으로 건조하고 여과하고 진공에서 농축한다. 잔재를 헥산:초산 에틸 9:1로 용리하면서 컬럼 크로마토그래피하여 정제하면 오일인 5-(2,4-비스-벤질옥시-5-이소프로필-페닐)-4-요오드-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸아미드를 얻는다.
LC 체류시간 2.975분 [M+H]+ 597.2
단계 10
5-(2,4-비스-벤질옥시-5-이소프로필-페닐)-4-요오드-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸아미드
Figure 112005044121551-pct00136
5-(2,4-비스-벤질옥시-5-이소프로필-페닐)-4-요오드-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸아미드(1당량)를 DMF에 용해시킨다. 1M Na2CO3(수성)을 가한 다음 4-포르밀페닐붕산(2당량)을 가하고 촉매 PdCl2(PPh3)2를 가한다. 질소로 주위 온도에서 10분 동안 용액에 기포가 일게 하고, 이 시간 후 온도를 15분 동안 질소 분위기하에 80℃로 상승시킨다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고 반응 혼합물을 초산 에틸로 희석한다. 이 용액을 염수로 세척한 다음 MgSO4으로 건조하고 여과하고 진공에서 증발하여 오일을 얻는다. 헥산에서의 10% EtOAc로 용리하면서 컬럼 크로마토그래피하여 정제하면 백색 고체인 5-(2,4-비스-벤질옥시-5-이소프로필-페닐)-4-요오드-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸 아미드를 얻는다.
LC 체류시간 2.981분 [M+H]+ 575.3
단계 11
5-(2,4-비스-벤질옥시-5-이소프로필-페닐)-4-(4-몰폴린-4-일메틸-페닐)-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸아미드
Figure 112005044121551-pct00137
5-(2,4-비스-벤질옥시-5-이소프로필-페닐)-4-오오도-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸아미드(1당량)를 메탄올에 용해시키고 분말화된 3A체를 가한다. 몰폴린(2당량)을 가한 다음 시아노붕소수소화 나트륨(2당량)을 가한다. 초산(5당량)을 적가하고 현탁액을 16시간 동안 주위 온도에서 질소 하에 교반한다. 반응 혼합물을 DCM으로 희석하고 포화 NaHCO3(수성)으로 세척한다. 유기상을 MgSO4으로 건조하고 여과하고 진공에서 농축한다. 생성된 검을 DCM에서의 1% MeOH로 용리하면서 플래쉬 크로마토그래피하여 정제하면 무색 오일인 5-(2,4-비스-벤질옥시-5-이소프로필-페닐)-4-(4-몰폴린-4-일메틸-페닐)-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸아미드를 얻는다.
LC 체류시간 4.42분 [M+H]+ 646.2 방법 B
단계 12
5-(2,4-디히드록시-5-이소프로필-페닐)-4-(몰폴린-4-일메틸-페닐)-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸아미드
Figure 112005044121551-pct00138
5-(2,4-비스-벤질옥시-5-이소프로필-페닐)-4-(4-몰폴린-4-일메틸-페닐)-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸아미드(1당량)를 DCM에 용해시키고 질소 분위기하에 0℃로 냉각시킨다. DCM에서의 1M BCl3를 적가하고 용액을 30분 동안 이러한 환경하에서 교반한다. 메탄올(2m)을 가하고 반응 혼합물을 진공에서 냉각시킨다. 정제 LC/MS으로 시료를 정제하면 백색 고체로 5-(2,4-디히드록시-5-이소프로필-페닐)-4-(4-몰폴린-4-일메틸-페닐)-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸아미드를 얻는다.
이 화합물은 Hsp90 형광 편광 분석에서 활성 'A'을 찾는다.
실시예 78의 화합물 제조방법과 유사한 방법으로 실시예 78a-u에서 제조한다.
Figure 112005044121551-pct00139
Figure 112005044121551-pct00140
Figure 112005044121551-pct00141
Figure 112005044121551-pct00142
Figure 112005044121551-pct00143
Figure 112005044121551-pct00144
Figure 112005044121551-pct00145
실시예 78v
인산-4- 클로로 -5-( 디에톡시 - 포스포릴옥시 )-2-[3- 에틸카르바모일 -4-(4- 메톡시 -페닐)-이소옥사졸-5-일]-페닐 에스테르 디에틸 에스테르
Figure 112005044121551-pct00146
작은 유리병의 5-(5-클로로-2,4-디히드록시-페닐)-4-(4-메톡시-페닐)-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸아미드(11㎎, 2.1×10-2m㏖)와 MgO(25㎎)의 고체 혼합물에 10방울의 디에틸 클로로포스페이트를 가한다. 생성된 혼합물을 한시간 동안 70℃에서 가열하고 교반하고, 반응 진행을 TLC에 의하여 감시한다. 냉각되었을 때 MeOH(1㎖)와 DCM(1㎖)을 가한다. 여과 후, 용매를 증발시켜서 황색 오일을 얻는다. 디-포스포릴 에스테르를 정제 TLC에 의하여 분리하고 4㎎을 얻는다. Rf = 0.35; 1H NMR δ = 7.95(1H, s, broad); 7.74(1H, s); 7.55(1H, s); 7.32(2H, d, J=9.0 Hz); 6.90(2H, d, J=9.0 Hz); 4.30(8H, q); 3.80(3H, s); 3.40(2H, q); 1.35(12H, t)와 1.25(3H, t). LCMS: (M+1)+ = 661.1 (RT = 7.60분).
실시예 79
5-(2,4-디히드록시-5-이소부틸-페닐)-4-(4-몰폴린-4-일메틸-페닐)-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸아미드
Figure 112005044121551-pct00147
반응 계통
Figure 112005044121551-pct00148
단계 1
1-(2,4-디히드록시- 페닐 )-2- 메틸 -프로판-1-온
Figure 112005044121551-pct00149
레솔시놀(1당량)을 BF3.OEt2(6당량)에 용해시키고 이소부티르산(1당량)을 가 한다. 용액을 90℃에서 1.5시간 동안 가열한 다음 실온으로 냉각시킨다. 용액을 10% NaOAc(수성)에 적가하고, 4시간 동안 방치한 후 EtOAc로 추출한다. 유기상을 조합하고 포화 HCO3(수성)으로 세척한 다음 황산 마그네슘으로 건조하고 여과하고 진공에서 농축하여 적색오일인 1-(2,4-디히드록시-페닐)-2-메틸-프로판-1-온을 얻고, 이를 부가적으로 정제하지 않고 사용한다.
LC 첨류시간 2.279분 [M+H]+ 181.1
단계 2
4-이소부틸-벤젠-1,3- 디올
Figure 112005044121551-pct00150
클로로포름산 에틸(3당량)을 THF에 용해한 1-(2,4-디히드록시-페닐)-2-메틸-프로판-1-온(1당량)과 트리에틸아민(3당량)의 냉각(0℃) 용액에서 서서히 가한다. 혼합물을 주위 온도로 가온하고 3시간 동안 교반한 후 여과하고 고체를 냉각된 THF로 세척한다. 조합된 여액을 0℃로 냉각시키고 THF 여액과 동일한 체적의 물에 붕소수소화 나트륨(4당량)을 서서히 가한다. 혼합물을 주위 온도로 가온하고 3시간 동안 교반하고 물로 희석한다. 혼합물을 디에틸 에테르로 두번 추출하고 조합된 추출물을 농축건조하고 10% 수산화 나트륨 수용액(4당량)에 재현탁시킨다. 혼합물을 90분 동안 환류한 후 냉각시키고 5M 수성 HCl로 산화시키고 디에틸 에테르로 두번 추출한다. 유기 추출물을 황산 마그네슘으로 건조하고 여과하고 농축건조하여 흐린색 오일인 4-이소부틸-벤젠-1,3-디올을 얻고, 이를 더 이상 정제하지 않고 사용한다.
NMR로 구조식과 일치.
실시예 3:
1-(2,4-디히드록시-5-이소부틸- 페닐 )- 에탄온
Figure 112005044121551-pct00151
4-이소부틸-벤젠-1,3-디올(1당량)을 BF3.OEt2(6당량)에 용해시키고 초산(2당량)을 가한다. 용액을 90℃에서 16시간 동안 가열한 다음 실온으로 냉각시킨다. 용액을 10% NaOAc(수성)에 적가하고, 4시간 동안 방치한 후 디에틸 에테르로 두번 추출한다. 유기상을 조합하고 포화 NaHCO3(수성)으로 세척한 다음 황산 마그네슘으로 건조하고 여과하고 진공에서 농축하여 1-(2,4-디히드록시-이소부틸-페닐)-에탄온을 얻고, 이를 더 정제하지 않고 사용한다.
NMR로 구조식과 일치.
단계 4
1-(2,4- 비스 - 벤질옥시 -5-이소부틸- 페닐 )- 에탄온
Figure 112005044121551-pct00152
1-(2,4-디히드록시-5-이소부틸-페닐)-에탄온(1당량)을 DMF와 탄산 칼륨에 용해시킨 다음 브롬화 벤질(4.4당량)을 가한다. 현탁액을 16시간 동안 질소하에 교반하면서 150℃로 가열한다. 용액을 실온으로 냉각시키고 여과하여 농축건조한다. 이 고체를 컬럼 크로마토그래피(실리카, 헥산:초산 에틸 4:1)로 정제하여 무색 결정체인 1-(2,4-비스-벤질옥시-5-이소부틸-페닐)-에탄온을 얻는다.
LC 체류시간 3.030분 [M+H]+ 389.3
단계 5
4-(2,4- 비스 - 벤질옥시 -5-이소부틸- 페닐 )-2,4- 디옥소 -부티르산 에틸 에스테르
Figure 112005044121551-pct00153
나트륨(3당량)을 실온에서 질소하에 에탄올에 가하고 완전히 용해될 때까지 교반한다. 1-(2,4-벤질옥시-5-이소부틸-페닐)-에탄온(1당량)을 가한 다음 옥살산 디에틸(1.5당량)을 가하고 반응 혼합물을 4시간 동안 환류하에 가열한다. 혼합물을 실온으로 냉각하고 2M HCl(수성)으로 산성화하여 4-(2,4-비스-벤질옥시-5-이소부틸 -페닐)-2,4-디옥소-부티르산 에틸 에스테르의 황색 침전물을 얻고 이를 여과하여 얻는다.
LC 체류시간 3.254분 [M+H]+ 489.3
단계 6
5-(2,4- 비스 - 벤질옥시 -5-이소부틸- 페닐 )- 이소옥사졸 -3- 카르복실산 에틸 에스 테르
Figure 112005044121551-pct00154
4-(2,4-비스-벤질옥시-5-이소부틸-페닐)-2,4-디옥소-부티르산 에틸 에스테르(1당량)를 교반하면서 에탄올에 용해시킨다. 염화수소산 히드록실아민(1.2당량)을 가하고 용액을 2시간 동안 환류하에 가열한다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각하여 침전물을 얻는다. 이 침전물을 여과하여 백색 고체인 5-(2,4-비스-벤질옥시-5-이소부틸-페닐)-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸 에스테르를 얻는다.
LC 체류시간 3.261분 [M+H]+ 486.3
단계 7
5-(2,4- 비스 - 벤질옥시 -5-이소부틸- 페닐 )- 이소옥사졸 -3- 카르복실산 에틸아미드
Figure 112005044121551-pct00155
5-(2,4-비스-벤질옥시-5-이소부틸-페닐)-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸 에스테르를 메탄올(10당량)에서의 2M 에틸아민에 용해시키고 600초 동안 120℃에서 스미스 합성기 마이크로파에서 가열한다. 용액을 진공에서 농축하여 백색 고체인 5-(2,4-비스-벤질옥시-5-이소부틸-페닐)-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸아미드를 얻고 이를 더 이상 정제하지 않고 사용한다.
LC 체류시간 3.112분 [M+H]+ 485.3
단계 8
5-(2,4- 비스 - 벤질옥시 -5-이소부틸- 페닐 )-4- 요오도 - 이소옥사졸 -3- 카르복실산 에틸아미드
Figure 112005044121551-pct00156
5-(2,4-비스-벤질옥시-5-이소부틸-페닐)-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸아미드(1당량)와 N-요오도석신아미드(2.0당량)를 아세토니트릴에 용해시키고 질산 암모늄 세륨(0.1당량)을 가하고 용액을 하룻밤 실온에서 교반한다. 반응 혼합물을 진공에서 농축하고 생성된 검을 초산 에틸과 염수 사이에 분배한다. 유기상을 황산 마 그네슘으로 건조하고 여과하고 진공에서 농축한다. 잔재를 4:1 헥산:초산 에틸로 용리하면서 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 오일로서 5-(2,4-벤질옥시-54-이소부틸-페닐)-4-요오도-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸아미드를 얻는다.
LC 체류시간 3.089분 [M+H]+ 611.2
단계 9
5-(2,4- 비스 - 벤질옥시 -5-이소부틸- 페닐 )-4-(4- 포르밀 - 페닐 )- 이소옥사졸 -3- 카 르복실산 에틸아미드
Figure 112005044121551-pct00157
5-(2,4-비스-벤질옥시-5-이소부틸-페닐)-4-요오도-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸아미드(1당량)를 DMF에 용해시키고 1M Na2CO3(수성)(3당량)를 가한 다음 4-포르밀페닐붕산(2당량)과 촉매 PdCl2(PPh3)3를 가한다. 질소로 주위 온도에서 10분 동안 용액에 기포가 일게 하고, 이 시간 후 온도를 2시간 동안 질소 분위기하에 80℃로 상승시킨다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시킨 다음 반응 혼합물을 초산 에틸로 희석한다. 이 용액을 염수로 세척한 다음 황산 마그네슘에서 건조하고 여과하고 진공에서 농축하여 오일을 얻고 이를 헥산에서의 10% EtOAc로 용리하면서 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 백색 고체인 5-(2,4-비스-벤질옥시-5-이소부틸-페닐)-4-(4-포 르밀-페닐)-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸아미드를 얻는다.
LC 체류시간 5.57분 [M+H]+ 589.1 방법 B
단계 10
5-(2,4- 비스 - 벤질옥시 -5-이소부틸- 페닐 )-4-(4- 몰폴린 -4- 일메틸 - 페닐 )- 이소옥 사졸-3-카르복실산 에틸아미드
Figure 112005044121551-pct00158
5-(2,4-비스-벤질옥시-5-이소부틸-페닐)-4-(4-포르밀-페닐)-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸아미드(1당량)를 메탄올에 용해시키고 분말화된 3Å체를 가한다. 몰폴린(2당량)을 가한 다음 초산(5당량)을 가한다. 30분 동안 교반한 후 시아노붕소수소화 나트륨(2당량)을 부분적으로 가하고 현탁액을 16시간 동안 주위 온도에서 질소하에 교반한다. 반응 혼합물을 셀라이트를 통하여 여과하고 농축 건조한다. DCM에서 5% MeOH로 용리하면서 컬럼 크로마토그래피하면 무색 오일인 5-(2,4-비스-벤질옥시-5-이소부틸-페닐)-4-(4-몰폴린-4-일메틸-페닐)-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸아미드를 얻는다.
LC 체류시간 4.53분 [M+H]+ 660.2 방법 B
단계 11
5-(2,4-디히드록시-5-이소부틸- 페닐 )-4-(4- 몰폴린 -4- 일메틸 - 페닐 )- 이소옥사 졸-3-카르복실산 에틸아미드
Figure 112005044121551-pct00159
5-(2,4-비스-벤질옥시-5-이소부틸-페닐)-4-(4-몰폴린-4-일메틸-페닐)-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸아민(1당량)을 DCM에 용해시키고 질소 분위기하에 0℃로 냉각시킨다. DCM(9당량)에서의 1M BCl3를 적가하고 용액을 30분 동안 교반한다. 메탄올(2㎖)을 가하고 반은 혼합물로 진공에서 농축한다. 정제 LC/MS로 시료를 정제하면 백색 고체인 5-(2,4-디히드록시-5-이소부틸-페닐)-4-(4-몰폴린-4-일메틸-페닐)-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸아미드를 얻는다.
LC 체류시간 1.902분 [M+H]+ 480.3
이 화합물은 Hsp90 형광 편광 분석에서 활성 'A'를 갖는다.
실시예 79의 화합물 제조와 유사한 방법으로 실시예 80에서 제조한다. 정제 LC/MS로 시료를 정제하면 백색 고체인 화합물을 얻는다.
Figure 112005044121551-pct00160
실시예 81
N-[5-(5- 클로로 -2,4-디히드록시- 페닐 )-4-(4- 플루오로 - 페닐 )- 이소옥사졸 -3- 일메틸 ]- 메탄술폰아미드
Figure 112005044121551-pct00161
실시예 82
N-[5-(5- 클로로 -2,4-디히드록시-페닐)-4-(4-플루오로-페닐)-이소옥사졸-3-일 메틸 ]- 아세트아미드
5-(2,4- 비스 - 벤질옥시 -5- 클로로 - 페닐 )-4-(4- 플루오로 - 페닐 )- 이소옥사졸 -3- 카 르복실산 아미드
Figure 112005044121551-pct00162
5-(2,4-비스-벤질옥시-5-클로로-페닐)-4-요오도-이소옥사졸-3-카르복실산 아미드(0.45g, 0.80m㏖)를 상술한 표준 조건으로 사용하여 4-플루오로페닐붕산(0.17g, 1.5당량)과 교차 결합시킨다. 조생성물, 오렌지식 고체(0.40g)를 더 정제하지 않고 다음 단계에 사용한다.
LCMS(LCQ)tR = 8.70, MS m/z 529.1 [M+H]+
C-[5-(2,4- 비스 - 벤질옥시 -5- 클로로 - 페닐 )-4-(4- 플루오로 - 페닐 )- 이소옥사졸 -3-일]-메틸아민
Figure 112005044121551-pct00163
알곤하에 무수 THF(20㎖)에 용해한 5-(2,4-비스-벤질옥시-5-클로로-페닐)-4-(4-플루오로-페닐)-이소옥사졸-3-카르복실산 아미드(0.40㎎, 0.76m㏖)의 용액에 1M 보란-THF 착체(1㎖)를 가하고 용액을 하룻밤 환류시킨다. 냉각 후 반응물을 메탄올(10㎖)로 식히고 생성물을 Isolute® SPE Flash SCX-2 5g을 사용하여 정제하면 분말 0.30g(수율 77%)을 얻는다.
LCMS(LCQ)tR = 7.54, MS m/z 515.2 [M+H]+
Figure 112005044121551-pct00164
N-[5-(5- 클로로 -2,4-디히드록시-페닐)-4-(4-플루오로-페닐)-이소옥사졸-3-일 메틸 ]- 메탄술폰아미드
C-[5-(2,4-비스-벤질옥시-5-클로로-페닐)-4-(4-플루오로-페닐)-이소옥사졸-3-일]-메틸아민(100㎎, 0.19m㏖)을 DCM(3㎖)에 용해시킨 후 염화 술폰일 메탄(17㎕, 1.1당량)을 가한다. 용액을 하룻밤 실온에서 교반한 후 진공에서 증발 건조시키면 청색 잔재로 조 벤질 보호 생성물(90㎎)이 남는다. 이를 상술한 삼염화 붕소 표준 공정을 사용하여 탈보호하고 정제 TLC(DCM에서 10% 에탄올)로 정제하고 에테르로 실리카를 속슬레 추출하면 무색에 가까운 고체로서 순수한 화합물(8㎎, 10% 수율)을 얻는다.
LCMS(LCQ)tR = 6.65, MS m/z 411.2 [M+H]-
δH = (d4-MeOH), 7.19(2H, M, Ar-H), 7.04(1H, s, Ar-H), 7.03(2H, m, Ar-H), 6.34(1H, s, Ar-H), 4.27(2H, s, CH2NH), 2.81(3H, s, SO2CH3)
Figure 112005044121551-pct00165
N-[5-(5- 클로로 -2,4-디히드록시- 페닐 )-4-(4- 플루오로 - 페닐 )- 이소옥사졸 -3- 일메틸 ]- 아세트아미드
DCM에 용해한 C-[5-(2,4-비스-벤질옥시-5-클로로-페닐)-4-(4-플루오로-페닐)-이소옥사졸-3-일]-메틸아민(100㎎, 0.19m㏖)의 용액에 무수 초산(130㎕, 7.0당량)과 트리메틸아민(81㎕, 3.0당량)을 가한다. 아민이 소모될 때까지 용액을 실온에서 교반한다. 용매를 제거하면 황색을 띤 오일상의 조벤질 보호 생성물이 남는다. 이를 상술한 바와 같이 삼염화 붕소로 표준 공정을 사용하여 탈보호하고 정제 TLC로 정제하고 에테르를 실리카를 속슬레 추출하면 무색 고체로서 순수한 화합물(10㎎, 14% 수율)을 얻는다.
LCMS(LCQ)tR = 6.57, MS m/z 377.1 [M+H]+
δH = (d4-MeOH), 7.17(2H, M, Ar-H), 7.01(1H, s, Ar-H), 6.98(2H, m, Ar-H), 6.32(1H, s, Ar-H), 4.37(2H, s, CH2NH), 1.77(3H, s, COCH3)
실시예 83, 84와 85
5-(5-에틸-4-히드록시-2- 메톡시 - 페닐 )-4-(4- 몰폴린 -4- 일메틸 - 페닐 )- 이소옥사 졸-3-카르복실산 에틸아미드 (83); 5-(5-에틸-2-히드록시-4- 메톡시 - 페닐 )-4-(4- 몰폴 린-4-일메틸-페닐)-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸아미드 (84); 5-(5-에틸-2,4- 디메톡시 - 페닐 )-4-(4- 몰폴린 -4- 일메틸 - 페닐 )- 이소옥사졸 -3- 카르복실산 - 에틸아미드 (85)
Figure 112005044121551-pct00166
5-(5-에틸-2,4-디히드록시-페닐)-4-(4-몰폴린-4-일메틸-페닐)-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸아미드(25㎎, 0.055m㏖)와 N,N-(디이소프로필)아미노메틸폴리스티렌 [PS-DIEA](35㎎, 3.83m㏖/g, 2.4당량)을 함유하는 알곤이 충전된 플라스크에 무수 DCM(2.3㎖)과 무수 메탄올(0.25㎖)을 가한다. 부드럽게 교반하면서 헥산(28㎕, 1.0당량)에서의 2M(트리메틸실일)디아조메탄을 가하고 용액을 실온에서 하룻밤 교반한다. 알곤으로 10분 동안 용액에 기포를 일으키고 수지를 여별하고 휘발성 물질을 진공에서 제거한다. 조 잔재를 반-정제 HPLC로 정제하면 5-(5-에틸-4-히드록시-2-메톡시-페닐)-4-(4-몰폴린-4-일메틸-페닐)-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸아미드(83)(5.52㎎, 21%), 5-(5-에틸-2-히드록시-4-메톡시-페닐)-4-(4-몰폴린-4-일메틸-페닐)-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸아미드(84)(1.14㎎, 4%), 5-(5-에틸-2,4-디메톡시-페닐)-4-(4-몰폴린-4-일메틸-페닐)-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸아미드(85)(1.46㎎, 5%)와 비-메틸화 출발 물질을 얻는다.
83: LCMS(LCT)tR = 4.95, MS m/z 466.4 [M+H]+
84: LCMS(LCT)tR = 5.14, MS m/z 466.4 [M+H]+
(85): LCMS(LCT)tR = 5.45, MS m/z 480.4 [M+H]+
NMR 데이타로 지정물 확인.
실시예 86
에틸 5-(5-클로로-2-히드록시-페닐)-4-(4-몰폴린-4-일메틸-페닐)-이소옥사졸-3- 카르복스아미드
Figure 112005044121551-pct00167
단계 1
메틸 2- 벤조일옥시 -5- 클로로 - 벤조에이트
Figure 112005044121551-pct00168
아세톤(30㎖)에서 혼합한 메틸 5-클로로-2-히드록시-벤조에이트(2.5g, 13.4m㏖), K2CO3(3.7g, 26.87m㏖)과 브롬화 벤질(2.98g, 17.4m㏖)의 혼합물을 12시간 동안 환류시킨다. 냉각 후 아세톤을 증발시키고, EtOAc(100㎖)을 가하고 여과한다. 유기층을 1M HCl(1×80㎖), 염수(2×80㎖)로 세척한 다음 Na2SO4으로 건조한다. 용 매를 여과하고 증발시킨 후 황색 반-고체를 얻는다(3.2g). 1NMR(d6-아세톤)δ = 7.73(1H, d); 7.60-7.30(1H + 5H, m); 7.28(1H, d); 5.30(2H, s)과 3.90(3H, s).
단계 2
1-(2- 벤질옥시 -5- 클로로 - 페닐 )-2-( 트리페닐 -λ 5 - 포스판일리덴 )- 에탄온
Figure 112005044121551-pct00169
실온에서 건조된 THF(30㎖)에 현탁시킨 브롬화 트리페닐포스포늄(2.14g, 6.0m㏖)의 교반된 현탁액에 헥산(5.25㎖, 8.39m㏖)에서의 1.6M n-BuLi를 가한다. 오렌지색 현탁액을 3시간 동안 교반한 다음 THF에 용해한 메틸 2-벤조일옥시-5-클로로-벤조에이트(0.83g, 3.0m㏖)를 서서히 가한다. 생성된 혼합물을 2시간 동안 60℃에서 교반하고 냉각 후 여과한다. DCM(100㎖)을 여액에 가하고 조합된 유기층을 염수(2×80㎖)로 세척한다. 용매를 여과하고 증발시킨 후 황색 오일을 얻는다(2.0g). 다음 이들을 EtOAc:헥산/1:1로 용리하면서 크로마토그래피하여 정제하면 0.97g의 고체를 얻는다. Rf = 0.88. 1NMR(d6-아세톤)δ = 7.75-7.40(15H, m); 7.30(1H, dd); 7.15(1H, d); 7.05(1H, d); 5.10(2H, s); 3.60(2H, q)과 1.10(3H, s). LCMS: (M+1)+ = 621.2(RT = 6.49분).
단계 4
에틸 3-(2- 벤조일옥시 -5- 클로로 - 벤조일 )-3- 보로모 -3H- 아지린 -2- 카르복실레이트
Figure 112005044121551-pct00170
실온에서 DCM(8㎖)에 용해한 에틸 4-(2-벤질옥시-5-클로로-페닐)-2,4-디옥소-3-(트리페닐-λ5-포스판일리덴)-부티레이트( 0.143g, 0.23m㏖)의 용액에 DCM(6㎖)에서의 TMSN3(40㎎, 0.35m㏖)와 NBS(62㎎, 0.35m㏖)의 혼합물을 가한다. 생성된 용액을 2시간 동안 교반하고 용매를 증발시킨 후 조생성물을 정제 TLC로 정제하며 황색 고체(38㎎)를 얻는다. Rf = 0.73(EtOAc:헥산 1:2). 1H NMR(d6-아세톤)δ = 7.80(1H, d); 7.60(1H, dd); 7.40(5H, m); 7.30(1H, d); 5.20(2H, s); 4.10(2H, q)과 1.00(3H, t). LCMS: (M+1)+ = 438.0 (RT = 7.32분).
단계 5
에틸 5-(2- 벤조일옥시 -5- 클로로 - 페닐 )-4- 브로모 - 이소옥사졸 -3- 카르복실레이트
Figure 112005044121551-pct00171
에틸 3-(2-벤조일옥시-5-클로로-벤조일)-3-브로모-3H-아지린-2-카르복실레이트(55㎎, 0.12m㏖)를 2시간 동안 건조 톨루엔에서 환류하에 가열한다. 용매를 증발시킨 후 조 고체(34㎎)를 얻고 정제 TLC(EtOAc:헥산/1:2)로 정제한다. Rf = 0.73(형광). 1H NMR(d6-아세톤)δ = 7.60(1H, d); 7.50(1H, dd); 7.40(1H, d); 7.30(5H, m); 5.25(2H, s); 4.42(2H, q)과 1.40(3H, t). LCMS: (M+1)+ = 438.0 (RT = 7.09분).
단계 6
에틸 5-(2- 벤질옥시 -5- 클로로 - 페닐 )-4- 브로모 - 이소옥사졸 -3- 카르복스아미드
Figure 112005044121551-pct00172
EtOH(1㎖)에 용해한 에틸 5-(2-벤조일옥시-5-클로로-페닐)-4-브로모-이소옥사졸-3-카르복실레이트(30㎎, 6.8×10-2m㏖)의 용액에 에틸아민(물에서 79%, 1㎖)을 가한다. 용액을 한시간 동안 CEM® 마이크로파 반응기(200w)에서 100℃로 가열한다. 이 후, 용매를 증발시키고 화합물을 정제 TLC로 정제하면 고체(20㎎)를 얻는다. Rf = 0.39(EtOAc:헥산 / 1:4). 1H NMR(d6-아세톤)δ = 8.10(1H, s, broad); 7.50(1H, d); 7.45-7.35(1H + 1H, m); 7.25(5H, m); 5.20(2H, s); 3.40(2H, q)과 1.20(3H, t). LCMS: (M+1)+ = 437.1 (RT = 6.57분).
단계 7
에틸 5-(2- 벤질옥시 -5- 클로로 - 페닐 )-4-(4- 몰폴린 -4- 일메틸 - 페닐 )- 이소옥사졸 -3- 카르복스아미드
Figure 112005044121551-pct00173
DME(1㎖)에서 에틸 5-(2-엔질옥시-5-클로로-페닐)-4-브로모-이소옥사졸-3-카르복스아미드(30㎎, 5.6×10-2m㏖), Pd(Ph3P)4(4㎎, 3.5×10-2m㏖), 4[4-(4,4,5,5-테트라메틸-[1,3,2]디옥사보로란-2-일)-벤질]몰폴린(63㎎, 0.2m㏖)과 1M NaHCO3 옹액(0.2㎖)의 혼합물을 16시간 동안 알곤 가스하에 80℃에서 교반한다. 냉각 후, 용액을 물(8㎖)로 희석하고 EtOAc(2×20㎖)로 추출한다. 조합된 유기층을 염수(1×20㎖)로 세척하고 건조한다. 용매를 여과하고 증발시킨 후 조생성물을 정제 TLC로 정제하면 30㎎ 고체를 얻는다. Rf = 0.44(EtOAc). 1H NMR(d6-아세톤)δ = 8.25(1H, s, broad); 7.60(1H, d); 7.55(1H, dd); 7.45(1H, d); 7.30-6.90(9H, m); 5.00(2H, s); 3.55(4H, m); 3.45(2H + 2H, s + q); 2.30(4H, m)과 1.20(3H, t). LCMS: (M+1)+ = 532.2 (RT = 4.39분).
단계 8
에틸 5-(5- 클로로 -2-히드록시- 페닐 )-4-(4- 몰폴린 -4- 일메틸 - 페닐 )- 이소옥사졸 -3- 카르복스아미드
Figure 112005044121551-pct00174
0℃에서 DCM(5㎖)에 용해한 에틸 5-(2-벤질옥시-5-클로로-페닐)-4-(4-몰폴린-4-일메틸-페닐)-이소옥사졸-3-카르복스아미드(25㎎, 4.7×10-2m㏖)의 용액에 DCM(0.15㎖)에서의 1M BCl3를 가한다. 생성된 흐린 황색 용액을 15분 동안 0℃에서 교반한 다음 맑게 될 때까지 3-4시간 동안 실온에서 교반한다. 이 후, 용액을 MeOH(1㎖)로 식힌다. 포화 NaHCO3(1㎖)를 가한 다음 EtOAc(2×2㎖)로 추출하고 건조한다. 용매를 여과하고 증발한 후 조오일을 정제 TLC(EtOAc : Me OH / 50:1)하여 정제하면 12㎎의 고체를 얻는다. 1H NMR(d4-MeOD)δ = 7.60(2H, d); 7.50-7.30(1H + 1H + 1H, m); 7.00(2H, d); 3.70(4H, m); 3.60(2H, s); 3.50(2H, q); 2.60(4H, m)과 1.25(3H, t). LCMS: (M+1)+ = 442.2 (RT = 3.54분).
4-히드록시-이성질체는 다음과 같은 이의 2-히드록시 대조물과 유사한 방법으로 제조한다:
실시예 87
에틸 5-(3- 클로로 -4-히드록시- 페닐 )-4-(4- 몰폴린 -4- 일메틸 - 페닐)-이소옥사졸 -3- 카르복스아미드
Figure 112005044121551-pct00175
단계 1
메틸 4- 벤조일옥시 -3- 클로로 - 벤조에이트
Figure 112005044121551-pct00176
메틸 3-클로로-4-히드록시-벤조에이트(1.0g, 5.36m㏖)는 조 고체로 얻는다(1.57g). 1H NMR(d6-아세톤)δ = 8.00(1H, d); 7.95(1H, dd); 7.60-7.40(5H, m); 7.35(1H, d); 5.40(2H, s)과 3.90(3H, s).
단계 2
1-(4- 벤질옥시 -3- 클로로 - 페닐 )-2-( 트리페닐 -λ 5 - 포스판일리덴 )- 에탄온
Figure 112005044121551-pct00177
메틸 4-벤조일옥시-3-클로로-벤조에이트(1.5g, 5.40m㏖)는 조 고체로 얻는다(2.5g). Rf = 0.31(EtOAc:헥산 / 1:1). 1H NMR(d6-아세톤)δ = 8.05(1H, d); 7.90(1H, dd); 7.85-7.35(20H, m); 7.20(1H, d); 5.30(2H, s); 4.60(1H, s, trans-H)과 4.50(1H, s, cis-H). LCMS: (M+1)+ = 521.2 (RT = 5.29분).
단계 3
에틸 4-(4- 벤질옥시 -3- 클로로 - 페닐 )-2,4- 디옥소 -3-( 트리페닐 -λ 5 - 포스판일리덴 )- 부티레이트
Figure 112005044121551-pct00178
1-(4-벤질옥시-3-클로로-페닐)-2-(트리페닐-λ5-포스판일리덴)-에탄온(1.84g, 3.53m㏖)은 조 고체로 얻는다(1.43g). 1H NMR(d6-아세톤)δ = 8.00-7.35(22H, m); 7.20(1H, d); 5.35(2H, s); 3.55(2H, q)과 1.14(3H, s). LCMS: (M+1)+ = 621.2 (RT = 7.29분).
단계 4
에틸 3-(4- 벤질옥시 -3- 클로로 - 벤조일 )-3- 브로모 -3H- 아지린 -2-카르복실레이트
Figure 112005044121551-pct00179
에틸 4-(4-벤질옥시-3-클로로-페닐)-2,4-디옥소-3-(트리페닐-λ5-포스판일리덴)-부티레이드(0.74g, 1.19m㏖)는 컬럼 및 정제 TLC로 정제한 후 고체(0.168g)를 얻는다. Rf = 0.24(EtOAc:헥산 / 1:6). 1H NMR(d6-아세톤)δ = 8.00(1H, d); 7.90(1H, dd); 7.50(1H, d); 7.40(5H, m); 5.40(2H, s); 4.05(2H, q)과 0.95(3H, t). LCMS: (M+1)+ = 438.1 (RT = 7.27분).
단계 5
에틸 5-(4- 벤조일옥시 -3- 클로로 - 페닐 )-4- 브로모 - 이소옥사졸 -3- 카르복실레이트
Figure 112005044121551-pct00180
에틸 3-(4-벤조일옥시-3-클로로-벤조일)-3-브로모-3H-아지린-2-카르복실레이트(68㎎, 0.16m㏖)는 정제 TLC와 결정화(EtOH)후 고체(20㎎)를 얻는다. Rf = 0.26(형광)(EtOAc:헥산 / 1:4). 1H NMR(d6-아세톤)δ = 8.00(1H, d); 7.90(1H, dd); 7.50(1H, d); 7.40(5H, m); 5.35(2H, s); 4.45(2H, q)과 1.40(3H, t). LCMS: (M+1)+ = 438.0 (RT = 7.39분).
단계 6
에틸 4-(4- 벤질옥시 -3- 클로로 - 페닐 )-4- 브로모 - 이소옥사졸 -3- 카르복스아미드
Figure 112005044121551-pct00181
에틸 5-(4-벤조일옥시-3-클로로-페닐)-4-브로모-이소옥사졸-3-카르복실레이트(10㎎, 2.3×10-2m㏖)는 조고체(8㎎)로 얻는다. Rf = 0.53 (EtOAc:헥산 / 1:2). 1H NMR(d6-아세톤)δ = 8.15(1H, s, broad); 8.00(1H, d); 7.90(1H, dd); 7.50(1H, d); 7.40(5H, m); 5.32(2H, s); 3.42(2H, q)와 1.20(2H, t).
단계 7
에틸 5-(4- 벤질옥시 -3- 클로로 - 페닐 )-4-(4- 몰폴린 -4- 일메틸 - 페닐 )- 이소옥사졸 -3- 카르복스아미드
Figure 112005044121551-pct00182
에틸 5-(4-벤질옥시-3-클로로-페닐)-4-브로모-이소옥사졸-3-카르복스아미드 (10㎎, 2.3×10-2m㏖)은 조고체(10㎎)로 얻으며 이는 더 이상 정제하지 않고 다음 단계에 사용된다.
단계 8
에틸 5-(3- 클로로 -4-히드록시- 페닐 )-4-(4- 몰폴린 -4- 일메틸 - 페닐 )- 이소옥사졸 -3- 카르복스아미드
Figure 112005044121551-pct00183
에틸 5-(4-벤질옥시-3-클로로-페닐)-4-(4-몰폴린-4-일메틸-페닐)-이소옥사졸-3-카르복스아미드(8㎎, 1.5×10-2m㏖)은 정제 TLC(EtOAc:MeOH / 50:1)하여 두번 정제한 후 조고체(2㎎)를 얻는다. 1H NMR(d4-MeOD)δ = 7.70(2H, d); 7.60(1H, d); 7.45(1H + 1H, m); 7.00(2H, d); 3.80(4H, m); 3.75(2H, s); 3.50(2H, q); 2.82(4H, m)와 1.25(3H, t). LCMS: (M+1)+ = 442.2 (RT = 4.47분).
실시예 88
3-[4-(4- 브로모 - 페닐 )- 이소옥사졸 -5-일]-5- 클로로 -2,6-디히드록시- 벤즈알데히드
Figure 112005044121551-pct00184
단계 1
3-(4- 브로모 - 페닐 )-6- 클로로 -7-히드록시-4-옥소-4H- 크로멘 -8- 카르보알데히드
Figure 112005044121551-pct00185
3-(4-브로모-페닐)-6-클로로-7-히드록시-크로멘-4-온(0.35g, 1m㏖)과 헥사메틸렌 테트라민(0.14g, 1m㏖)을 빙초산(20㎖)에 용해시키고 100℃에서 하룻밤 가열한다. 가온한 6M HCl(10㎖)을 가하고 혼합물을 한 시간 더 가열한 후 물에 붓는다. 형성된 침전물을 여과하고 세척하고 건조하여 담갈색 고체인 순수한 원하는 생성물을 얻는다.
LCMS(LCQ)TR = 8.27, MS m/z 377.3 / 379.2 [M-H]-
단계 2
3-[4-(4- 브로모 - 페닐 )- 이소옥사졸 -5- 클로로 -2,6-디히드록시- 벤즈알데히드
Figure 112005044121551-pct00186
EtOH(6㎖)에 용해한 3-(4-브로모-페닐)-6-클로로-7-히드록시-4-옥소-4H-크로멘-8-카르브알데히드(53.5㎎, 0.14m㏖)의 용액에 염화수소산 히드록실아민(100㎎, 1.4m㏖)을 가한다. 생성된 혼합물을 16시간 동안 환류하에 가열한다. EtOH를 증발시키고 EtOAc(20㎖)를 가한다. 유기층을 포화 NaHCO3로 세척하고 건조한다. 생성된 오일을 에테르로 분쇄하면 고체(33㎎)를 얻는다. 1H NMR(d6-DMSO)δ = 9.83(1H, s); 8.70(1H, s); 8.21(1H, s); 7.78(2H, d)와 7.68(2H, s). LCMS: (M+1)+ = 394.1 (RT = 8.60분).
실시예 89
5-(5-에틸-2-히드록시-4- 메톡시 - 페닐 )-4-(4- 플루오로 - 페닐 )- 이소옥사졸 -3- 카 르복실산 히드록시아미드
Figure 112005044121551-pct00187
단계 1
1-(5-에틸-2,4-디히드록시- 페닐 )-2-(4- 플루오로 - 페닐 )- 에탄온
Figure 112005044121551-pct00188
에틸 레솔시놀(5.37g, 39m㏖)과 4-플로오로페닐초산(6.00g, 39m㏖)을 에테레이트 BF3(40㎖)에 용해시킨다. 용액을 4시간 동안 80℃에서 가열한다. 냉각되었을 때, 물(100㎖)을 주의하여 가하고 용액을 EtOAc(2×80㎖)로 추출한다. 유기층을 포화 NaHCO3(조심하여)(2×100㎖)와 염수(2×100㎖)로 세척한 다음 Na2SO4로 건조한다. 탈색 목탄으로 정제한 후 짙은 녹색 시럽(10.5g)을 얻는다. Rf = 0.4 (EtOAc:n-헥산 / 1:3). 화합물을 더 정제하지 않고 다음 단계에서 사용한다. 1H NMR(d6-아세톤)δ = 7.80(1H, s); 7.35(2H, m); 7.00(1H, m); 6.35(1H, s); 4.35(2H, s); 2.55(2H, q)와 1.10(3H, t).
단계 2
4-(5-에틸-2,4-디히드록시- 페닐 )-3-(4- 플루오로 - 페닐 )-2,4- 디옥소 -부티르산 에틸 에스테르
Figure 112005044121551-pct00189
0℃에서 건조 피리딘(100㎖)에 용해한 1-(5-에틸-2,4-디히드록시-페닐)-2-(4-플루오로-페닐)-에탄온(10.3g, 37.6m㏖)의 용액에 에틸 클로로옥소아세테이트(15.4g, 112.8m㏖)을 가한다. 용액을 4시간 동안 0℃에서 교반하고 16시간 동안 실온에서 교반한다. 수성층을 1M HCl로 중화시키고 DCM(2×100㎖)로 추출한다. 조합 된 DCM 층을 2M HCl(2×80㎖), 포화 NaHCO3(1×100㎖), 염수(1×100㎖)로 세척한 다음 Na2SO4로 건조한다. 용매를 여과하고 증발시킨 후 짙은 갈색 오일을 얻는다(11.4g). Rf = 0.22 (EtOAc:n-헥산 / 1:2). LCMS로 이는 약 6:1 비율의 원하는 생성물 [(M-1)- = 373.1, RT = 7.27]과 환화된 카르복실산 크로멘 [(M-1)- = 355.4, RT = 7.83]의 혼합물을 나타낸다. 소량의 시료를 분광 분석을 하기 위하여 정제 TLC하여 정제한다. 1H NMR(d6-아세톤)δ = 7.75(1H, s); 7.30(2H, m); 7.00(1H, m); 6.45(1H, s); 4.65(1H, s); 4.25(2H, q); 2.55(2H, q)와 1.10(6H, t).
단계 3
6-에틸-3-(4- 플로오로 - 페닐 )-7-히드록시-4-옥소-4H- 크로멘 -2- 카르복실산 에틸 에스테르
Figure 112005044121551-pct00190
4-(5-에틸-2,4-디히드록시-페닐)-3-(4-플루오로-페닐)-2,4-디옥소-부티르산 에틸 에스테르(3.22g, 8.6m㏖)을 0.8M HCl과 MeOH(20㎖/20㎖)에서 100℃로 3시간 동안 환류시킨다. 이후 MeOH를 증발시키고 수성층을 EtOAc(2×60㎖)로 추출한다. 조합된 유기층을 포화 NaHCO3(1×80㎖), 염수(2×80㎖), 물(1×80㎖)로 세척하고 Na2SO4로 건조한다. 탈색 목탄으로 정제하고 용매를 증발시킨 후 갈색의 점성 고체 를 얻는다. 이들을 뜨거운 에테르로 추출하면 짙은 황색 고체를 얻는다(0.26g). Rf = 0.43 (EtOAc:헥산 / 1:2). LCMS: (M+1)+ = 357.3 (RT = 7.83). 1H NMR(d6-아세톤)δ = 9.75(1H, s); 7.80(1H, s); 7.25(2H, m); 7.10(1H, m); 6.90(1H, s); 4.05(2H, q); 2.70(2H, q); 1.20(3H, t)과 0.95(3H, t).
단계 4
6-에틸-3-(4- 플로오로 - 페닐 )-7- 메톡시 -4-옥소-4H- 크로멘 -2- 카르복실산 에틸 에스테르
Figure 112005044121551-pct00191
요오드 메탄(0.10㎖, 12당량)을 아세톤에 용해한 6-에틸-3-(4-플루오로-페닐)-7-히드록시-4-옥소-4H-크로멘-2-카르복실산 에틸 에스테르(50㎎, 0.14m㏖)과 탄산칼슘(58㎎, 3.0당량)의 용액에 가하고 혼합물을 하룻밤 환류시킨다. 휘발성 물질을 진공에서 증발시킨 다음 잔재를 물(15㎖)과 EtOAc(15㎖) 사이에 분배한다. 유기층을 염수로 세척하고 MgSO4로 건조하고 진공에서 증발 건조하면 백색의 결정성 생성물(45㎎, 87% 수율)을 얻는다.
δH(CDCl3), 7.96(1H, s, Ar-H), 7.27(2H, m, Ar-H), 7.12(2H, m, Ar-H), 6.92(1H, s, Ar-H), 4.16(2H, q, CO2CH 2CH3), 3.95(3H, s, OCH 3), 2.71(3H, q, CH 2CH3), 1.24(3H, t, CO2CH2CH 3), 1.04(3H, t, CH2CH 3)
단계 5
5-(5-에틸-2-히드록시-4- 메톡시 - 페닐 )-4-(4- 플루오로 - 페닐 )- 이소옥사졸 -3- 카 르복실산 히드록시아미드
Figure 112005044121551-pct00192
에탄올(2.5㎖)에서의 6-에틸-3-(4-플루오로-페닐)-7-메톡시-4-옥소-4H-크로멘-2-카르복실산 에틸 에스테르(25㎎, 0.068m㏖)에 히드록실아민(물에서 50%, 1㎖)을 가하고 용액을 48시간 교반한다. 휘발성 물질을 진공에서 증발 제거하고 잔재를 정제 TLC(DCM에서 10% MeOH)하여 정제하면 밝은 갈색 고체인 원하는 생성물(3㎎, 12% 수율)을 얻는다.
LCMS(LCT)tR = 6.54, MS m/z 373.17 [M+H]+
δH(d6-아세톤), 10.73(1H, broad s), 8.59(1H, broad s), 7.39(2H, m, Ar-H), 7.07(2H, m, Ar-H), 7.00(1H, s, Ar-H), 6.55(1H, s, Ar-H), 3.82(3H, s, OH 3), 2.48(2H, q, CH 2CH3), 1.30(1H, broad s), 1.01(3H, t, CH2CH 3)
실시예 90
5-(5-에틸-2,4-디히드록시- 페닐 )-4-(4- 플루오로 - 페닐 )- 이소옥사졸 -3- 카르복 실산 히드록시 아미드
Figure 112005044121551-pct00193
에탄올(2.5㎖)에서의 6-에틸-3-(4-플루오로-페닐)-7-히드록시-4-옥소-4H-크로멘-2-카르복실산 에틸 에스테르(25㎎, 0.070m㏖)에 히드록실아민(물에서 50%, 1㎖)을 가하고 용액을 48시간 교반한다. 휘발성 물질을 진공에서 증발 제거하고 잔재를 정제 TLC(DCM에서 15% MeOH)하여 정제하면 갈색 고체인 원하는 생성물(2㎎, 8% 수율)을 얻는다.
LCMS(LCT)tR = 5.63, MS m/z 359.13 [M+H]+
δH(d6-아세톤), 10.72(1H, broad s, CONH), 8.69(1H, broad s, Ar-OH), 8.59(1H, broad s, Ar-OH), 7.39(2H, m, Ar-H), 7.06(2H, m, Ar-H), 6.99(1H, s, Ar-H), 6.52(1H, s, Ar-H), 2.49(2H, q, CH 2CH3), 1.31(1H, broad s), 1.08(3H, t, CH2CH 3)
생물학적 결과
HSP90의 고유 ATPase 활성은 모델계로서 효모 HSP90을 사용하여 측정한다. 무기 인산염을 측정하기 위하여 말라키테 그린의 사용을 기초로 하는 분석을 사용하여 본 실시예들의 몇몇 화합물의 HSP90 저해 활성을 시험한다.
말라키테 그린 ATPase 분석
재료
화학품은 시판하고 있는 최고 순도인 모든 수용액은 AR 물로 만든다. 무기 인산염의 오염을 최소화하는 것이 필요하기 때문에 분석에 사용되는 용액과 기구는 주의하여 취급해야 한다. 유리 기구와 pH 측정기는 사용하기 전에 두 증류수 또는 탈염수로 세척하고 가능하면 플라스틱 기구를 사용해야 한다. 모든 공정에서 장갑을 사용한다.
(1) 그라이너 384-웰(그라이너 781101) 또는 코스타 384-웰 평바닥 폴리스티렌 멀티웰 플레이트(VWR).
(2) (a) 100mM 트리스-HCl, pH 7.4, (b) 150mM KCl, (c) 6mM MgCl2의 분석 완충제. 실온에서 저장.
(3) 0.0812%(w/v) 말라키테 그린(M 9636, 시그마 알드리치 리미티드, 영국, 풀리). 실온에서 저장.
(4) 끓는 물에서의 2.32%(w/v) 폴리비닐 알코올 USP(P 1097, 시그마 알드리치 리미티드, 영국, 폴리)(주해 1 참조), 냉각하고 실온에서 저장.
(5) 6M 염산에서의 5.72%(w/v). 몰리브덴산 암모늄.
(6) 34%(w/v) 시트르산 나트륨. 실온에서 저장.
(7) 100mM ATP, 이나트륨 염, 특이한 품질(47699, 시그마 알드리치). -20℃에서 저장.
(8) 이. 콜리 발현 효모 HSP90 단백질 정제 >95% (참조, 파나레토우 등., 1998)와 -80℃에서 50㎕ 분취량으로 저장.
방법
1. AR 물로 시험 화합물을 500μM으로 희석(DMOS 농도는 2.5%이다). 2.5㎕의 이들 화합물을 직접 낭 플레이트에서 분석 플레이트로 옮기고, 100μM의 최종 분석 농도를 나타낸다. 12포인트 IC50 값을 얻기 위하여 연속 희석 1:2를 행하여 100μM에서 97.6nM으로 분석 범위를 만들고(2,5% DMSO), 2.5㎕의 각 농축물을 분석 플레이트로 옮긴다. 분석 플레이트에서 컬럼 1은 음성 대조물로서 화합물을 함유하지 않는다. 또한 화합물이 없는 부가적 줄은 배경으로 사용된다.
2. 100nM 원료를 분석 완충제로 925μM으로 희석하여 ATP를 제조하고, 각 웰에 분취량 5㎕의 희석된 ATP는 대조물을 포함한다(최종 분석 농도 370μM).
3. 배경 줄에 5㎕의 완충제 첨가.
4. 효소제제를 분석 완충제로 1.05μM으로 희석하고 각 화합물 웰에 분취량 5㎕로 하여 음성 대조물 컬럼에 함유시킨다.
5. 웰의 바닥에 시약을 수집하고 플레이트 시일로 플레이트를 봉하고 37도C에서 하룻밤 배양한다.
6. 첫번째 아침에는 말라키테 그린 시약을 제조한다. 2부의 말라키테 그린 용액, 1부의 폴리비닐 알코올 용액, 1부의 몰리브덴산 암모늄 용액과 2부의 AR 물으리 가한다.
7. 혼합물로 전화시키고, 색이 갈색에서 황금색으로 변할 때까지 약 1시간 동안 방치한다.
8. 각 웰에 40㎕의 말라키테 그린 시약을 가하고 5분 동안 색을 전개시킨다.
9. 각 웰에 50㎕의 시트르산 나트륨 시약을 가한다(참조 주해 2).
10. 플레이트 시일로 재-봉하고 최소한 15분 동안 플레이트 세이커에서 흔든다.
11. 적당한 플레이트 판독기(예를들어, 빅터, 퍼킨 엘머 라이프 사이언스, 밀톤 케인스, 영국)를 사용하여 620nM에서 흡수도를 측정한다. 이러한 조건하에서 대조 흡수도는 0.9 내지 4이고, 배경의 -12의 잡음 비율로 신호를 나타내는 0.2-0.35이다. 이러한 조건을 사용하여 얻은 데이타로 계산한 Z' 계수는 0.6과 0.9 사이이다.
주해
(1) 폴리 비닐 알코올을 어렵게 끓는 물에 용해시키며 2-3시간의 교반이 필요하다.
(2) 말라키테 그린 시약과 시트르산 나트륨 첨가 사이의 시간 간격을 가능한 짧게 유지하여 ATP의 비-효소가수분해를 감소시켜야 한다. 일단 시트르산 나트륨을 가하면 색은 실온에서 4시간 이하 동안 안정성을 갖는다.
(3) 화합물을 Biomek FX 로봇(베크맨 쿨터)을 사용하여 분석 플레이트에 가할 수 있다. 멀티드롭 384 분배기(섬모 래브시스템스, 배이싱스토크, 영국)를 통상적으로 사용하여 플레이트에 시약을 첨가할 수 있다.
(4) 분석 조건은 잡음 차이로 신호를 보유하는 동안 최소의 단백질 농도를 성취하기 위하여 시간 단백질과 기질 농도를 최대한으로 활용하는 것이다.
(5) 신호 대 잡음(S/N)은 다음 방정식을 사용하여 계산한다:
(S-B)/
Figure 112005044121551-pct00194
(S의 SD)2+(B의 SD)2
(6) HSP90의 고유 활성도를 측정하기 위하여 무기 인산염 농도의 범위(0-10μM)를 만들고 620㎚에서 흡수도는 기재된 바와 같이 측정한다. 고유 활성도는 나온 보정 곡선으로 계산한다.
상기 분석에서 시험한 화합물은 두 활성도 범위, 즉, A = <50μM; B = >50μM 중 하나로 지정하고, 이들 지정은 상기에서 기록했다.
또한, 성장 저해 분석은 후보 HSP90 저해제의 평가에 사용한다:
술포호드아민 B( SRB ) 분석에 의한 세포독성의 평가: 50% 저해 농도( IC 50 )의 계산
1일
1) 혈구계로 세포수 측정.
2) 8채널 멀티 피페터를 사용하여 96-웰 마이크로역가 플레이트의 각 웰에 160㎕의 세포 현탁액(3600 세포/웰 또는 2×104 세포/㎖)을 가한다.
3) CO2 배양기로 37℃에서 하룻밤 배양한다.
2일
4) 약제의 원료 용액을 제조하고, 각 약제의 일련의 희석을 매체에서 행하여 웰의 최종 농도를 얻는다.
5) 멀티피페터를 사용하여 40㎕의 약제(5×최종농도로)를 사중극 웰에 가한다.
6) 대조 웰은 96 웰 플레이트의 한쪽에 있고, 여기에 40㎕의 매체를 가한다.
7) 4일동안 CO2 배양기로 배양한다(48시간).
6일
8) 싱크에 매체를 침하시키고 플레이트를 10% 빙냉된 트리클로로초산(TCA)에 침지시킨다. 얼음에서 약 30분 동안 방치한다.
9) 수돗물 욕조에 플레이트를 침지시키고 이를 침하시켜서 플레이트를 수돗물에 3회 세척한다.
10) 배양기에서 건조한다.
11) 96 웰 플레이트의 각 웰[최종 줄(오른편) 제외]에 1% 초산에서의 100㎕의 0.4% SRB를 가하고, 이것은 0% 대조물, 즉, 약제도 아니고 오물도 아니다. 첫번째 줄은 약제는 가지지 않지만, 오물은 갖는 100% 대조물이다. 15분 동안 방치한다.
12) 1% 초산으로 네번 세척하여 비결합된 SRB 오물을 세척제거한다.
13) 플레이트를 배양기에서 제거한다.
14) 100㎕의 10mM 트리스 염기를 사용하여 SRB를 용해시키고 5분 동안 플레이트 세이커에 플레이트를 놓는다.
15) 플레이트 판독기를 사용하여 540㎚에서 흡수도를 측정한다. 사중극 웰의 평균 흡수도를 계산하고, 비처리된 대조 웰의 퍼센트 값을 표시한다.
16) % 흡수치 대 로그 약제 농도를 정하고 IC50을 계산한다.
예시한 바와 같이 실시예 2의 화합물은 SRB 성장 정지 분석에 있어 'A'범위(<50μM)의 IC50을 나타낸다.
또한, 형광 편광 평가는 실시예들의 몇몇 화합물을 평가하는데 사용한다:
형광 편광 분석
형광 편광{또한, 현광 비등방성으로 알려져 있음}은 용액에서 형광 종의 회전으로 측정하고, 여기서 분자가 더 크면 형광 방출을 더 많이 편광되게 한다.
형광단을 편광으로 여기시켰을 때, 방출된 광도 편광된다. 분자크기는 형광 방출의 편광에 비례한다.
형광-표지 탐침-RBT0045864-FAM-
Figure 112005044121551-pct00195
HSP90{전장 인체, 전장 효모 또는 N-말단 영역 HSP90}에 결합시키고 비등방성{탐침:단백질 복합체의 회전}을 측정한다.
시험 화합물을 분석 플레이트에 가하고, 평형으로 방치하고 다시 비등방성을 측정한다. 비등방성의 변화는 HSP90에 화합물의 경쟁적 결합 때문이고, 이로 인하 여 탐침이 방출된다.
재료
화학품은 시판되고 있는 최고 순도인 것이고, 모든 수용액은 AR 물로 만든다.
1) 코스타 96-웰 블랙 평가 플레이트 #3915
2) (a) 100mM 트리스 pH7.4; (b) 20mM KCl; (c) 6mM MgCl2의 평가 완충제. 실온에서 저장.
3) BSA(소혈청알부민) 10㎎/㎖(뉴잉글랜드 바이오래브스 #9001S)
4) 100% DMSO 원료 농도에서 2mM 탐침, RT에서 암실에 저장, 작업 농도는 AR 물로 희석된 200nM이고, 4℃에서 저장한다. 분석에서 최종 농도는 80nM.
5) 이. 콜리는 인체 전장 HSP90 단백질에 발현시키고, >95%로 정제하고(참조, 예를들어, 파나네토우 등, 1998) -80℃에서 50㎕ 분취량으로 저장한다.
프로토콜
1) 웰 11A와 12A(=FP BLNK)에 100㎕ 1x 완충제 첨가
2) 분석 혼합물 제조-모든 시약은 탐침이 감광성이므로 버킷 뚜껑의 얼음에서 유지.
최종농도
·1x Hsp90 FP 완충제 10㎖ 1x
·BSA 10㎎/㎖(NEB) 5.0㎕ 5㎍/㎖
·탐침 200μM 4.0㎕ 800nM
·인체 전장 Hsp90 6.25㎕ 200nM
3) 모든 다른 웰에 분취량 100㎕ 분석 혼합물과 첨가
4) 플레이트를 밀봉하고 평형으로 20분 동안 실온으로 암실에 방치
화합물 희석 플레이트 -1×3 희석 시리즈
1) 투명한 96-웰 V-바닥플레이트-{# VWR 007/008/257}에서 10㎕의 100% DMSO를 웰 B1 내지 H11에 가한다
2) 웰 A1 내지 A11에 17.5㎕의 100% DMSO를 가한다
3) A1에 2.5㎕의 화합물을 가한다. 이것은 2.5nM{50x} 원료 화합물-가정 화합물 20mM을 나타낸다.
4) 웰 A2 내지 A10로 반복. 컬럼 11과 12의 대조.
5) 5㎕를 줄 A에서 줄 B로 이동-컬럼 12는 아님. 웰 혼합.
6) 5㎕를 줄 B에서 줄 C로 이동. 웰 혼합.
7) 줄 G에 반복.
8) 줄 H에 어떠한 화합물도 첨가하지 않는다 - 이것은 0줄이다.
9) 이로서 50μM에서 0.07μM으로 1×3 희석 시리즈를 만든다.
10) 웰 B12에서 20㎕의 100μM 표준 화합물을 제조한다.
11) 첫번째 배양 후 분석 플레이트를 FusionTM a-FP 플레이트 판독기(팩카드 바이오사이언스, 팽보움, 버크셔, 영국)로 판독한다.
12) 첫번째 판독 후 2㎕의 희석된 화합물을 컬럼 1 내지 10의 각 웰에 가한다. 컬럼 11(표준 곡석 제공)에서만이 화합물 B11-H11을 가한다. 웰 B12-H12{양성 대조물}에 2㎕의 100mM의 표준 화합물을 가한다.
13) Z' 인수를 영 대조물과 양성 웰로부터 계산한다. 이는 대체적으로 0.7-0.9의 값을 나타낸다.
상기 분석에서 시험된 화합물은 두 활성도 범위, 즉, A = <10μM; B = >10μM 중 하나로 지정하고, 이들 지정은 상기에 기재했다. 예시한 바와 같이 실시예 2의 화합물은 'A' 범위에서 IC50을 나타낸다.
참고문헌
본 발명과 본 발명이 속하는 기술 상태를 더 안전하게 기술하고 설명하기 위하여 여러가지 간행물을 상기에서 인용했다. 이들 참고용 전체 인용물은 아래에 기술했다. 이들 각 참고문헌은 본 명세서에 그대로 참고적으로 혼입했다.
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  34. 다음식 (A) 또는 (B)의 화합물 또는 이들의 염, N-산화물, 수화물 또는 용매화물:
    Figure 112011051538615-pct00213
    상기식에서
    R1은 5위치에서 메틸, 에틸, 이소프로필, 이소부틸, tert-부틸, 클로로, 또는 브로모에 의하여 치환된 2,4-디히드록시페닐이며;
    R2는 (i) 4위치에서 메톡시, 에톡시, 플루오로, 클로로, 브로모, 피페라진일, N-메틸피페라진일, 또는 피페리딘일에 의하여 치환된 페닐 또는 (ii) 다음식의 기이며:
    Figure 112011051538615-pct00214
    (이 식에서 -NR10R11은 몰폴린일, 피페리딘일, 피페라진일, 피롤리딘일, 에틸아미노, 이소프로필아미노, 디에틸아미노, 시클로헥실아미노, 시클로펜틸아미노, 메톡시에틸아미노, N-아세틸피페라진일, 메틸술폰일아미노, 티오몰폴린일, 티오몰폴린일디옥사이드, 40-히드록시에틸피페리딘일, 또는 4-히드록시피페리딘일 이다);
    R3는 식 -CONRB(Alk)nRA의 카르복스아미드기이며, 여기서.
    Alk는 -CH2-, -CH2CH2-, -CH2CH2CH2-, -CH2CH=CH-, 또는 -CH2CCCH2- 이고;
    RB는 수소, 메틸, 에틸, n- 또는 이소-프로필 또는 알릴이며;
    RA는 수소 또는 히드록실이며; 또는
    RA와 RB는 이들이 결합되는 질소와 함께 O,S와 N에서 선택한 하나 또는 그 이상의 부가적 헤테로 원자를 임의로 함유하는 5- 또는 6-고리 원자의 N-헤테로환식 고리를 형성한다.
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  36. 제 34항에 있어서, 화합물이 상기 식(A) 중 하나인 화합물.
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  45. 제 34항 또는 제 36항에 있어서, R3가 에틸아미노카르보닐 또는 이소프로필아미노카르보닐인 화합물.
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  65. 제 34항에 있어서, 5-(2,4-디히드록시-5-이소프로필-페닐)-4-(4-몰폴린-4-일메틸-페닐)-이소옥사졸-3-카르복실산 에틸아미드 또는 이의 염인 화합물
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  67. 제34항에 따른 화합물과 약학적으로 허용할 수 있는 담체와 함께 이루어지는 암치료용 약학적 조성물.
  68. 제67항에 있어서, 살균한 생리적으로 수용할 수 있는 담체로서 염수에 화합물을 용해 또는 현탁시킨 용액 또는 현탁액 형태의 약학적 조성물.
  69. 제67항에 있어서, 무균 염수에 화합물을 용해 또는 현탁시킨 용액 또는 현탁액 형태인 암치료용 약학적 조성물.
  70. 삭제
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