KR100814625B1 - 살아 있는 세포 또는 조직을 포함하는 캡슐 - Google Patents

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Abstract

살아있는 세포 또는 조직을 충전물로서 함유하며 이러한 세포 또는 조직이 증식할 수 있는 캡슐이 제공된다. 캡슐 내부에서 증식시킬 수 있으므로, 세포 밀도를 매우 높게 할 수 있으며, 예를 들면, 정장작용이 우수한 식품이 제공된다. 또한 식물의 부정배, 부정아, 다아체, 경정, 생장점, 원괴체유사체, 부정근, 모상근 등을 최내층에 포함하며, 이러한 최내층을 피복하는 내피층으로서 경화유를 사용하며, 이의 외층을 젤라틴, 다당류 등의 생분해성 외피막으로 구성되는 이음새 없는 연질 캡슐로 이루어지는, 보존 안정성이 우수하며, 발아율도 높게 유지되는 인공 종자가 제공된다.
살아있는 세포 또는 조직, 이음새 없는 연질 캡슐, 캡슐화 인공 종자, 정장작용, 보존 안정성

Description

살아 있는 세포 또는 조직을 포함하는 캡슐{Capsules containing vital cells or tissues}
본 발명은, 살아 있는 세포 또는 조직을 포함하는 캡슐 및 이의 응용에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 미생물, 식물 또는 동물 유래의 살아 있는 세포 또는 조직을 충전물로서 함유하며 이들 세포 또는 조직이 생육 가능한 캡슐, 이러한 캡슐을 함유하는 식품, 및 보존 안정성이 높고 토양에 파종하면 신속하게 발아하는 재분화 가능한 식물 세포 조직을 포함하는 캡슐화 인공 종자에 관한 것이다.
예로부터, 미생물을 식품에 작용시킨 발효식품을 섭취하여 왔다. 대표적인 발효식품인 요구르트는 우유에 유산균 또는 비피더스균 등(이하, 유산균 등으로서 지칭한다)을 작용시켜 수득되며, 이를 섭취할 경우, 유산균 등이 장내에 들어가 장내에서 활발하게 활동하며 정장작용을 활발히 실행한다. 그러나, 살아 있는 상태로 장에 도달하는 유산균은 극히 일부이며, 이의 대부분은 위의 강한 산성 때문에 사멸된다.
이러한 문제를 해결하기 위해, 유산균 등을 장용성 캡슐에 넣어 장내까지 운반하는 것이 검토되고 있다[참조: 일본 공개특허공보 제(평)8-242763호]. 그러나, 이러한 기술에 사용되고 있는 유산균 등은 동결건조한 것으로서, 동결건조 유산균 등이 수분을 흡수하여 다시 활성을 나타낼 때까지는 상당한 시간이 필요하다.
따라서, 살아 있는 세포를 장내에 전달할 수 있다면, 활성을 즉시 충분히 발휘할 수 있기 때문에, 살아 있는 세포를 장내에 도달시키는 기술이 요망되고 있다.
한편, 생명공학의 놀라운 진보는 의약품의 개발 또는 식물의 개량 등 여러 가지 분야에 영향을 주고 있다. 식물 분야에서는, 재분화 가능한 식물 세포 조직(이하, 단순히 "세포 조직"으로서 지칭한다)을 인공 종자화하는 시도가 이루어지고 있다. 일반적으로, 세포 조직을 다당류, 중합체성 저분자 또는 가교성 중합체의 용액에 분산 또는 현탁시킨 다음, 이를 겔화시킴으로써 겔 내에 세포 조직을 포함시켜, 비드형, 평판형, 막대형 또는 섬유형으로 성형하여 인공 종자화하는 것이 이루어지고 있다.
그러나, 상기한 바와 같이, 겔 내에 세포 조직을 포함한 인공 종자는 실온에서의 건조에 대해 내성이 없고, 제조 후 4일 이내에 파종하지 않으면 안된다는 문제가 있다. 또한, 건조를 방지하기 위해서 냉장보존 또는 액중 보존하지 않는다면, 1개월도 보존할 수 없으며, 농가의 헛간이나 창고 등과 같이 특별한 냉장설비가 없는 건조한 장소에서 보관하는 것이 곤란하다.
이러한 건조의 문제를 해결하기 위해서, 겔의 표면을 파라핀 또는 왁스 등으로 피복하는 시도가 이루어지고 있다. 이러한 시도에 의해 확실히 보존 안정성이 개량되지만, 파라핀 또는 왁스가 안정적이어서 분해되기 어렵기 때문에, 흙 속에 파종해도 발아하지 않는다는 문제가 있다. 이 때문에 파종시에 인공 종자에 1알씩 구멍을 내야하는 불편함이 있어 실용적인 인공 종자가 되지 못한다.
따라서, 식품으로서의 이용뿐만 아니라, 의약 용도, 농업 용도 등으로 광범위하게 이용할 수 있는, 살아있는 세포를 봉입시키고 생육시키는 기술이 요망되고 있다. 특히 인공 종자 분야에서는, 특별한 냉장설비가 없는 건조한 장소에서 적어도 3개월 동안 보존할 수 있고, 토양에 파종하면 수일 내에 발아에 이를 수 있는 인공 종자가 요망되고 있다. 이러한 인공 종자가 수득되면, 실제로 광범위한 식물에 대하여 적용할 수 있으며, 식물 세포 조직 배양기술, 클로닝 기술 또는 바이러스-제거(virus-free) 기술과 더불어, 농업, 임업, 원예업, 화훼 등에 대한 광범위한 응용이 가능해진다.
본 발명자들은 상기의 과제를 해결하기 위해서 예의 연구한 결과, 액체에 현탁된 살아 있는 세포 또는 조직을 포함하는 캡슐을 제조할 수 있고 이를 식품 및 농업분야에 응용할 수 있음을 밝혀내고 본 발명을 완성시켰다.
본 발명은, 액체에 현탁된 살아 있는 세포 또는 조직을 포함하는 캡슐로서, 상기 액체내에서 세포 또는 조직이 증식할 수 있는 캡슐을 제공한다.
보다 바람직한 실시형태에서, 상기 캡슐은 이음새 없는 연질 캡슐(seamless soft capsule)이다.
바람직한 실시형태에서, 상기 세포 또는 조직은 식품용으로 사용되는 세포 또는 식물 조직이다.
바람직한 실시형태에서, 상기 세포 또는 조직은 유산균(비피더스균을 포함한다), 납두균(Bacillus natto), 빵 효모, 양조용 효모, 양조용 사상균, 단세포 조류(algae), 다세포 조류, 식용식물 및 식용식물 조직 및 이들의 동결건조된 균체 또는 조직으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1개 또는 2개 이상의 세포이다.
본 발명은 또한 상기 캡슐을 함유하는 식품에 관한 것이며, 바람직하게는, 상기 캡슐을 함유하는 식품은 과즙 음료, 야채 쥬스, 건강 드링크, 가공유, 두유, 젤리, 요구르트, 유산균 음료, 발효유, 탄산음료, 니어워터(near water) 및 푸딩이다.
또한, 본 발명은 액체에 현탁된 재분화 가능한 식물 세포 조직을 포함하는 인공 종자로서, 당해 액체내에서 세포 또는 조직이 보존되는 인공 종자에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 최내층, 당해 최내층을 피복하는 내피층, 및 당해 내피층을 피복하는 외층을 포함하는 3층 이상의 층 구조를 갖는, 이음새 없는 연질 캡슐로 이루어지는 인공 종자이고, 당해 최내층이 재분화 가능한 식물 세포 조직(세포 조직)을 포함하며, 당해 내피층이 경화유를 주성분으로 하는 내피막으로 구성되며, 당해 외층이 생분해성을 갖는 외피막인 인공 종자를 제공한다.
바람직한 실시형태에서, 상기 외피막은 건조되어 있다.
바람직한 실시형태에서, 상기 재분화 가능한 식물 세포 조직은 부정배, 부정아, 다아체(多芽體), 경정(莖頂), 생장점, 원괴체유사체(protocorm-like body), 부정근 및 모상근(毛狀根)으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된다.
또한, 바람직한 실시형태에서, 상기 내피막은 미생물 분해성의 상온에서 고체인 경화유이다.
별도의 바람직한 형태에서, 상기 외피막은 단백질, 다당류 및 생분해성 플라스틱으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 미생물 분해성 외피막이다.
도 1은 본 발명의 인공 종자의 단면 모식도이다.
본 발명을 실시하기 위한 최상의 방식
종래부터 수성 물질은 캡슐화가 어렵기 때문에, 건조 세포만이 캡슐화되며, 캡슐 내부에 가두어진 세포 또는 조직을 증식시키는 것은 불가능하다고 생각되어 전혀 시도되지도 않았다. 그러나, 본 발명자들은 최초로 수성 물질의 캡슐화에 성공하여, 세포 또는 조직이 캡슐 내부에 가두어져 있는 경우에도 사멸되지 않고 증식이 가능하다는 것을 밝혀냄으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명에 의해서, 예를 들면, 종래에는 동결건조된 유산균, 비피더스균 등만을 송달할 수 있어 완만한 정장작용만이 수득되었던 것이, 살아있는 유산균, 비피더스균 등을 송달함으로써, 즉효의 강력한 정장작용을 수득할 수 있는 효과가 초래된다. 또한, 캡슐 내부에서 세포 또는 조직이 증식할 수 있다는 점에서, 보다 높은 균체 밀도(예를 들면, 약 1010개 내지 1011개/g 캡슐)를 갖는 캡슐을 수득할 수 있기 때문에, 상기의 식품 용도 이외에도, 생물반응기 용도, 의약 용도, 의료 용도, 인공 종자 용도 등의 광범위한 용도로 사용할 수 있다.
한편, 바람직한 경우, 캡슐에 함유되는 액체(내용액)의 비율은 약 30중량% 정도이기 때문에, 균체 밀도가 높은 경우에 내용액의 균체 밀도는 3.3 ×1011개/㎖가 된다. 캡슐화되지 않은 유리 균에서는 이러한 고밀도의 배양이 곤란하다. 또한, 균체를 배양한 후, 이와 같은 고밀도로 농축시키면 현탁액의 점성이 대단히 높아지기 때문에, 캡슐화하는 것이 현재의 기술로서는 매우 어려워 본 발명의 유용성이 보다 분명해진다.
본 발명에서, "캡슐"이란, 외피막을 갖는 구조를 가지며 내부에 세포 또는 조직을 함유하는 현탁액 또는 배양액을 봉입할 수 있는 구조를 갖는 것을 말하며, 주로 구상이지만, 구상 이외의 형상도 가능하다.
캡슐의 외피막으로서는, 종래부터 캡슐용으로 사용되고 있는 것이라면 어떠한 막이라도 사용할 수 있으며, 천연 중합체로 이루어진 피막 또는 합성 중합체 피막이 사용된다. 식품 용도로 사용하는 경우에는 천연 중합체로 이루어진 피막이 바람직하다.
캡슐의 형상에 있어, 2층 구조를 사용할 수 있으며, 3층 구조 또는 그 이상의 층 구조일 수 있지만, 바람직하게는 3층 구조이다.
3층 구조의 경우, 살아 있는 세포 또는 조직을 함유하는 액체가 최내층이고, 이러한 액체를 피복하는 중간층이 친유성 막이며, 최외층이 용도에 따라서, 식용성, 붕괴용이성(예: 생분해성), 장용성, 수불용성 및 생체 적합성 등의 1가지 또는 2가지 이상의 성질을 갖는 외피막인 것이 바람직하다.
최내층(내용물)은, 물, 생리식염수, 완충액, 배양액 또는 세포의 생명 유지에 필요한 성분과 세포를 함유하는 액상 물질이다.
이하, 우선, 식품 용도로 사용하는 캡슐에 관해서 설명하며, 이어서 인공 종자에 관해서 설명하기로 한다.
식품 용도로 사용하는 경우, 중간층의 친유성 막으로서는, 식용에 제공되는 각종 유지류, 지방산류 또는 당의 지방산 에스테르류 등이 사용되지만, 바람직하게는 동물성 유지, 식물성 유지, 이들의 생물학적 또는 화학적 처리된 유지 등이 사용된다. 구체적으로는, 각종 튀김유, 샐러드유, 융점이 35℃ 이하인 경화유, 비타민 E, 밀 배아유, 참기름, 카카오버터, 버터, 마가린, 쇼트닝 및 자당 지방산 에스테르 등을 예시할 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 이러한 친유성 물질을 사용함으로써, 수성 물질을 봉입하는 캡슐이 수득된다.
본 발명의 캡슐을 식품 용도로 사용하는 경우, 식용 외피막으로서는, 천연 중합체 피막, 예를 들면, 젤라틴, 한천, 펙틴, 알긴산, 카라기난, 카드런(curdlan), 전분, 젤란 검, 글루코만난 또는 이들의 혼합물 또는 필요에 따라서, 여기에 단백질, 당단백, 뮤코다당, 당, 당알콜 또는 다가알콜 등을 첨가한 물질로부터 수득되는 중합체 피막이 바람직하다. 첨가하는 천연 중합체의 구체적 예로서는, 아라비아 검, 플루란, 덱스트란, 크산탄 검, 로카스트빈 검(Locust bean gum), 콜라겐, 카제인 등을 들 수 있다.
또한, 필요에 따라서, 구강내 용해성 외피막, 위 용해성 외피막, 소장 용해성 외피막, 대장 용해성 외피막, 불용성이며 배출되는 외피막 등을 선택할 수 있다. 장용성 외피막으로서는, 예를 들면, 젤라틴 또는 한천과 펙틴을 배합하여 수득되는 외피막을 들 수 있다. 외피막에는 성형성 등을 고려하여 글리세린 등이 첨가될 수 있다.
3층 구조의 경우, 바람직한 조합의 예로서는, 중간층(내피막)-외피막으로서 나타내면, 비타민 E 오일-한천, 밀 배아유-알긴산나트륨, 자당 지방산 에스테르-젤라틴, 글리세린 중쇄 지방산 에스테르-카라기난 등을 들 수 있다. 이 중에서도, 비타민 E 오일-2 내지 4% 한천 및 밀 배아유-2 내지 4% 알긴산나트륨이 수득되는 캡슐의 물성 측면에서 바람직하다.
또한, 내용물(최내층), 중간층 및 외피막의 구성비는, 캡슐의 입자직경에 따라서도 다르지만, 부피비로 10 내지 70:10 내지 50:5 내지 50이 바람직하고, 30 내지 50:25 내지 40:25 내지 40이 보다 바람직하다.
본 발명의 캡슐은 이음새 없는 연질 캡슐인 것이 바람직하다. 이음새 없는 연질 캡슐이 중층 구조를 갖는 경우, 친유성막 및 외피막을 각각 박막으로 할 수 있다. 이렇게 함으로써, 세포 또는 조직의 증식에 필요한 물질이 캡슐 내부와 외부 사이를 보다 용이하게 이동할 수 있어 캡슐 내부의 세포 또는 조직이 증식할 수 있다고 생각된다. 또한, 증식된 세포가 외부로 누출되는 경우는 없다.
또한, 필요에 따라서, 외피막의 구멍 직경이 크고 물질 이동에 대한 저항성이 작은 투과성이 양호한 캡슐 외피막을 사용하거나, 반대로 구멍 직경이 작고 물 질 이동 저항성이 큰 차단성이 높은 캡슐 피막을 사용하여, 각각의 용도에 따른 외피막으로서 사용할 수 있다. 또한, 피막에 전하를 갖게 함으로써, 하전된 물질의 투과에 선택성을 갖게 할 수 있어, 보다 다양한 기능을 가진 캡슐을 제조할 수 있다.
캡슐 내부에 봉입할 수 있는 세포 또는 조직에 대한 특별히 제한은 없으며, 세균, 효모, 곰팡이, 조류, 식물의 세포, 식물 또는 동물의 조직을 들 수 있으며, 각각의 용도에 따라서 사용할 수 있다.
식품 용도로 사용되는 세포 또는 식물조직으로서는, 유산균(비피더스균을 포함한다), 납두균, 빵 효모, 양조용 효모(예: 와인 효모, 청주 효모, 된장 효모, 간장 효모 등), 양조용 사상균(예: 누룩균 등), 단세포 조류(예를 들면, 클로레라, 스필리나 등), 다세포 조류(예: 미역, 다시마 등), 식용식물 및 식용식물 조직(예를 들면, 고려인삼 등)을 들 수 있다.
이러한 세포 또는 조직을 포함하는 캡슐은 당업자가 통상 사용하는 방법으로 제조된다. 3층 구조를 갖는 경우, 이음새 없는 연질 캡슐로 제조하는 것이 가장 바람직하다. 이음새 없는 연질 캡슐의 제조방법은 문헌[참조: 일본 공개특허공보 제(평)5-31352호, 식품가공기술, 제15권, p28-33, 1995, 또는 Bioscience & industry, Vol.58, No.7, p31-34(2000)]에 기재되어 있다. 특히, 3중 관 노즐을 사용한 적하법으로 중간층에 유성 물질(예: 경화유)을 개재시켜 제조하는 것이 보다 바람직하다.
캡슐에 봉입하는 세포 또는 조직의 양은 생존 또는 증식할 수 있는 최소량부 터 여과 또는 원심분리에 의해 모은 세포 또는 조직을 충전함으로써 달성되는 고밀도량까지의 범위일 수 있지만, 본 발명의 특징은 캡슐 내부에서 세포 또는 조직의 배양을 실시하여 고밀도까지 증식시키는 것이 가능하다는 점이기 때문에, 캡슐에 봉입하는 세포 또는 조직의 농도는 통상 계대배양시의 세포 또는 조직의 농도로 충분하다.
수득되는 이음새 없는 연질 캡슐의 평균 입자직경은 용도에 따라서 다르지만, 0.1 내지 10mm이다. 보다 바람직하게는, 0.2 내지 8mm이다. 식품에 사용하는 경우, 평균 입자직경은 4mm 이하가 바람직하고, 0.1 내지 2mm가 더욱 바람직하다. 이러한 이음새 없는 연질 캡슐은 식품에 사용하는 경우, 목으로 넘기기가 쉬워 그 자체로 사용되지만, 캡슐 표면에 전분, 전분 분해물, 펙틴 등의 페이스트(paste) 또는 증점제를 피복시킬 수도 있다.
수득된 살아 있는 세포 또는 조직을 함유하는 이음새 없는 연질 캡슐은 적절한 배지에 현탁하고 배양함으로써 증식할 수 있다. 특히, 알긴산 겔과 같이, 겔 형성을 위해 다가의 금속이온이 필요한 피막 재료의 이음새 없는 연질 캡슐은 겔 강도를 유지하기 위해서 필요 농도의 다가 금속이온을 배지에 가하는 것이 바람직하다. 이 때문에, 알긴산 겔의 경우, 염화칼슘, 염화스트론튬, 염화바륨 및 염화알루미늄을 배지량에 대하여 0.01 내지 5중량%로 가할 수 있지만, 바람직하게는 0.5 내지 3중량%이다.
예를 들면, 비피더스균을 봉입한 캡슐을 배양하는 경우, 캡슐 내부에서 비피더스균을 배양증식시킬 수 있기 때문에, 캡슐 내부의 살아있는 비피더스균의 수가 수백억개/g 캡슐 이상으로 상당히 많아지며, 또한 캡슐 내부에서 살아있는 세포를 배양하기 때문에, 세정 균체에서는 상실되는 대사산물(박테리오신이나 다당 등)도 캡슐 내부에 비축된다. 따라서, 캡슐 내에서 증식시킨 비피더스균을 캡슐 통째로 섭취함으로써, 동결건조 균말에 비해 즉효의 보다 강력한 정장작용이 나타나며, 추가로 피부 및 관절을 부드럽게 하는 효과를 나타낸다.
또한, 살아있는 유산균을 봉입한 캡슐은, 캡슐 내부에서 유산균을 배양증식시킬 수 있기 때문에, 당해 캡슐을 유산발효 생물반응기로서 사용하는 경우, 고효율로 유산을 생성하고 균체의 혼입이 없는 배양액이 수득되며, 유산의 회수도 용이하다.
본 발명에서는, 캡슐 내부에 봉입된 세포 또는 조직을 원하는 배지 중에서 증식시킬 수 있다. 이러한 증식된 세포 또는 조직을 포함하는 캡슐은 식품 등의 용도로 사용된다. 예를 들면, 유산균(비피더스균) 또는 고려인삼 조직 등을 캡슐에 봉입하고 증식시킨 후, 과즙 음료, 야채 쥬스, 건강 드링크, 두유, 젤리, 가공유, 요구르트, 유산균 음료, 발효유, 탄산음료, 니어워터 또는 푸딩 등에 첨가하여 본 발명의 캡슐 함유 식품을 제조한다. 또한, 본 발명에 있어서, 젤리라고 하는 경우에는 겔 타입의 식품을 포함한다. 또한, 캡슐이 첨가되는 식품은 상기 식품에 한정되지 않는다.
식품에 첨가하는 캡슐의 양은 특별히 제한되지 않지만, 식품 100g에 대하여, 0.1 내지 10g이 바람직하고, 0.5 내지 3g이 보다 바람직하다.
다음에, 본 발명의 인공 종자에 관해서 설명한다. 본 발명의 인공 종자는 최내층, 당해 최내층을 피복하는 내피층, 및 당해 내피층을 피복하는 외층의 3층 또는 그 이상의 층 구조를 갖는 이음새 없는 연질 캡슐로 이루어지는 인공 종자이다. 본 발명의 인공 종자의 단면 모식도를 도 1에 도시한다. 도 1은 3층 구조인 경우의 도면이다. 최내층에는 세포 조직인 부정배가 함유되어 있다. 이러한 최내층에는 부정배의 생명 유지에 필요한 배지성분과 성장 조절제를 함유하는 액체 성분 또는 겔이 충전되어 있다. 내피층은 경화유를 주성분으로 하는 내피막(도면에서는 내피막(경화유 피막)으로서 표시)으로 구성되어 있다. 또한, 이러한 경화유 피막은 수분의 증발을 방지하고 산소의 투과를 억제한다. 외층은 도 1에서 외피막(젤라틴 피막)으로 표시되어 있으며 물리적 강도를 유지하고 산소의 투과를 억제한다.
또한, 여러 가지 학술문헌, 특허문헌 등의 기술에서, 알긴산칼슘 겔의 단일 비드를 캡슐로 표기하고 있는 경우가 있는데, 이러한 통상의 캡슐은 하기의 제조법에서도 밝혀지는 바와 같이, 본 발명의 이음새 없는 연질 캡슐과는 완전히 다른 것이다. 또한, 본 발명의 인공 종자는 바람직하게는 표면이 건조되어 있으며, 습윤 알긴산 겔과는 다른 것이다.
본 발명에 사용되는 최내층에 함유되는 세포 조직으로서는, 부정배, 부정아, 다아체, 경정, 생장점, 원괴체유사체, 부정근 또는 모상근 등이 바람직하게 사용된다. 바이러스 무병주(virus free) 조직을 사용할 수도 있다.
세포 조직의 생명을 유지시키기 위해서는, 예를 들면, 물, 생리식염수, 완충액, 배양액 또는 세포 조직의 재분화(발아)활성의 유지에 필요한 성분을 함유하는 액상 물질 또는 겔상 물질(이하, 통합하여 배지로서 지칭한다)에 세포 조직을 현탁시키는 것이 바람직하다. 배지로서는, 원하는 식물에 적합한 배지로서, 당업자가 통상 사용하는 배지, 예를 들면, 무라시게·스쿠그(Murashige & Skoog)의 기본배지(1962년: 이하, "MS 배지"로서 지칭한다) 또는 이러한 개질된 배지를 대표적인 배지로서 들 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 또한, 통상의 배양에 사용되는 식물 호르몬, 코코넛 밀크, 카제인 가수분해물 및 효모 추출물 등을 함께 첨가할 수 있다. 또한, 파종 후에 내피막이 붕괴되고 발아까지 시간이 걸려 미생물에 의해 손상을 입는 경우에는, 미생물의 증식을 억제하기 위해서 항균 물질을 첨가할 수 있다.
내피막으로서는, 경화유를 주성분으로 하는 유지가 바람직하게 사용된다. "경화유를 주성분으로 한다"라는 것은, 내피막이 경화유로만 구성되는 경우 또는 경화유에 다른 유지 등을 혼합하여, 원하는 성질을 갖도록 조정하는 것을 포함하는 의미이다. 바람직한 내피막은 미생물 분해성의 상온에서 고체인 경화유이다. "상온에서 고체인 경화유"란, 융점이 약 20℃ 이상인 경화유를 말한다. 융점은 30℃ 이상, 40℃ 이상, 또한 50℃ 이상일 수 있다. 융점이 20 내지 50℃인 경화유가 바람직하게 사용된다. 어떠한 경화유를 선택하는가는 보존온도 또는 파종시기 등을 고려하여 결정할 수 있다.
경화유로서는, 중쇄 지방산의 트리글리세리드 또는 디글리세리드 등을 들 수 있으며, 버터, 마가린, 쇼트닝 또는 카카오버터 등이 예시되지만, 이들에 한정되지 않는다.
이러한 내피막이 내수성을 갖는 것이 수성 물질의 캡슐 형성에 필요할 뿐만 아니라, 세포 조직을 함유하는 최내층의 수분 휘산(揮散)을 방지하기 위해서도 중요하다.
생분해성 또는 미생물 분해성이란, 토양에 파종했을 때에 미생물 또는 그외의 생물에 의해 분해 또는 자화되는 것을 의미한다. 경화유가 분해 또는 자화됨으로써, 내피막이 붕괴되어, 캡슐 외부로 방출될 경우의 장해가 제거됨과 동시에, 산소의 투과성이 높아져 세포 조직이 휴면 상태에서 깨어나 분화 및 증식할 수 있는 환경이 된다.
외피막이 물에 의해 팽윤되며 생분해성 또는 미생물 분해성인 것이, 세포 조직이 분화 및 증식하여 캡슐 외부로 발아할 경우의 장해가 제거된다는 관점에서 바람직하다. 생분해성 또는 미생물 분해성 외피막으로서는, 단백질, 다당류 및 생분해성 플라스틱 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 또는 2개 이상을 조합하여 사용할 수 있다.
단백질류로서는, 젤라틴 및 콜라겐 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 이들은 단독으로 또는 2개 이상을 조합하여 사용할 수 있다.
다당류로서는, 겔을 형성하는 다당이 바람직하게 사용된다. 이러한 다당류로서는, 한천, 카라기난, 아라비아 검, 젤란검, 크산탄 검, 펙틴, 알긴산 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 이들은 단독으로 또는 2개 이상을 조합하여 사용할 수 있다.
생분해성 플라스틱류로서는, 폴리락트산, 폴리하이드록시부티르산 및 이들의 혼합물 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 이들은 단독으로 또는 2개 이상을 조합하여 사용할 수 있다.
또한, 필요에 따라서, 상기 생분해성 물질에 당, 당알콜, 다가알콜, 플루란, 키토산 등을 첨가함으로써 피막의 성질을 바꿀 수 있다.
특히 바람직한 피막으로서는, 건조 후에 산소 차단성이 높아지는 젤라틴을 들 수 있다.
본 발명의 캡슐화된 인공 종자는, 필요에 따라서, 4층 이상의 구조를 가질 수 있으며, 재료를 선택함으로써 피막에 여러 가지 성질을 갖게 할 수 있다. 또한, 캡슐 표면에 약제 등을 피복시킬 수 있다.
이음새 없는 연질 캡슐의 일반적인 제조방법은 상기 식품 용도에서 설명한 바와 같으며, 구체적으로는, 예를 들면, 액체 배지 또는 고체배지에서 생육한 세포 조직(예를 들면 부정배)으로부터 적절한 크기의 부정배를 수득하고, 배지에 현탁하여 캡슐의 내용물(최내층)로 사용하며, 내피막으로서는 상온에서 고체인 경화유를 사용하며, 외피막으로서는 적절한 농도의 상기 생분해성 물질의 용액(예를 들면, 22% 젤라틴 용액)을 사용할 수 있으며, 이러한 성분들을 사용함으로써, 3중 관노즐의 이음새 없는 연질 캡슐 제조기를 사용하여 액중 적하법에 의해 조립한다. 이때, 내용액의 부정배가 각 캡슐내로 1개씩 들어가도록 펌프를 조절한다. 캡슐의 성형과 고화는 응고유 중에서 실시하며, 3층 구조의 캡슐이 되게 한다. 수득된 캡슐로부터 응고유를 탈유한 후, 드럼건조함으로써 건조 캡슐화 부정배의 인공 종자가 수득된다. 건조는 세포 조직이 사멸되지 않도록 저온에서 실시된다.
수득되는 캡슐화 인공 종자의 입자직경은 세포 조직의 크기에 따라서 다르지 만, 1 내지 12mm이다. 보다 바람직하게는, 3 내지 10mm이다. 캡슐에 봉입하는 세포 조직의 수는 조직의 크기에 따라서 다르지만, 1개 내지 여러 개가 가능할 수 있다는 점에서, 재분화율(발아율)도 고려하여 인공 종자로서 적합한 성질을 제공할 수 있는 수를 봉입할 수 있다. 식물에 따라서도 다르지만, 세포 조직의 수는 바람직하게는 1 내지 4개이다.
이와 같이 수득된 본 발명의 인공 종자는 건조한 헛간 등 실온에서 발아능력을 유지하면서 3개월 이상 보존이 가능하며, 특별히 냉장고 또는 저온수 중에서 보존할 필요는 없다. 10℃ 이하의 냉장보관고에서 보존하면, 6개월 이상의 장기보존이 가능하다.
본 발명의 캡슐화 인공 종자는 재분화 가능한 식물 세포 조직(세포 조직)을 포함한 중공 이음새 없는 연질 캡슐의 내피막을 경화유로 구성하고, 외피막을 생분해성 겔(단백질, 다당류) 또는 생분해성 플라스틱류 등으로 구성하고, 표면을 건조시켜 수득된다. 이와 같이 구성함으로써, 캡슐 내부로의 산소공급이 제한되며, 캡슐 내부에서 세포 조직이 일종의 휴면상태로 생존할 수 있으며, 또한 수분의 증발도 억제되어 상온에서 2개월 이상 보존하는 것이 가능하다. 또한, 캡슐을 토양에 파종함으로써, 물과 토양 중의 미생물의 작용에 의해 외피막 및 내피막의 경화유가 분해되어 산소 투과성이 높아지며, 휴면상태에서 깨어나 발아상태로 이행한다고 생각된다.
이하에, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명하지만, 이들은 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.
실시예 1: 살아있는 비피더스균 캡슐을 함유하는 과즙 음료
비피도박테리움·롱검(Bifidobacterium longum) JCM7050의 2개의 백금이(白金耳) 분량의 콜로니를 탈지유 15%, 효모 추출물 0.4%, 글루코스 3%, pH 6.5의 액체 탈지유 배지 100mL에 접종하고, 37℃에서 15시간 동안 아내로팩(AnaeroPack, 제조원: 미쓰비시가스카가쿠 가부시키가이샤)을 사용하여 혐기 상태의 용기 중에서 60rpm으로 서서히 진탕배양하였다. 배양 도중에 pH가 감소되기 때문에, pH 자동조절기를 사용하여 5M-NaOH 수용액으로 pH를 5.5로 유지하였다. 15시간 배양한 후의 균수는 BL 한천배지(제조원: 닛스이 세이야쿠 가부시키가이샤) 위에서 24시간 동안 혐기배양하여 콜로니를 계수하여 구한 결과, 2 ×109개/㎖이였다. 당해 균액을 15% 탈지유 수용액을 45℃에서 15시간 동안 O.01% 판크레아틴 F(제조원: 아마노 세이야쿠 가부시키가이샤)로 처리하고 사용한다는 점을 제외하고는 동일한 조성의 상기 탈지유 배지(이하, "판크레아틴-처리된 탈지유 배지"로서 지칭한다)로 100배 희석하고, 이를 캡슐의 내용으로 사용하였다.
부위 성분 구성비* (중량%)
내용물 비피더스균 액 30
내피막 비타민 E 오일 30
외피막 2% 한천 용액 40
* 캡슐 전체의 구성비

다음에, 표 1에 기재한 처방에 따라서, 3중 관노즐의 이음새 없는 연질 캡슐 제조기를 사용하여 액중 적하법에 의해, 당해 내용액을 함유하는 3층 구조 캡슐(평균 입자직경 1.8mm)을 제조하였다. 외피막으로서는 한천을 사용하며, 캡슐의 성형과 고화는 경화액 중에서 실시하였다.
이러한 캡슐 100g을 판크레아틴-처리된 탈지유 배지 1L에 넣고, 질소 85%, 수소 10%, 탄산가스 5%의 혼합가스[참조: 스미토모 세이카 가부시키가이샤 제조]를 100㎖/분의 유량으로 버블링시키고, 교반 날개를 사용하여 50rpm으로 서서히 교반하고 pH를 5.5로 조절하면서 37℃에서 30시간 동안 배양하였다. 배양후 캡슐내 생균수는 3 ×1010개/g 캡슐(습중량)이였다.
이러한 캡슐 표면을 멸균 증류수로 세정한 후, 투명한 마스컷(muscat) 쥬스 100㎖에 2g으로 첨가하고, 마스컷 쥬스 100㎖당 살아있는 비피더스균 수가 600억개로 지극히 많은 캡슐을 함유하는 마스컷 과즙 음료를 제조하였다. 이러한 살아있는 비피더스균 함유 캡슐을 첨가한 마스컷 과즙 음료는 비피더스균 특유의 나쁜 맛이 없기 때문에, 풍미는 저하되지 않으며 투명함을 유지하고 있어 맛있게 마실 수 있었다. 이러한 캡슐을 함유하는 과즙 음료는 살아있는 비피더스균의 수가 많으며, 정장작용이 기대된다.
실시예 2: 살아있는 유산균 캡슐을 함유하는 야채 쥬스
유산균 락토코커스 락티스(Lactococcus Lactis) JCM7638을 CMG 한천 배지(효모 추출물 0.5%, 폴리펩톤 0.5%, NaCl 0.5%, 글루코스 1%, 한천 2%)에서 배양한 1개의 백금이 분량의 콜로니를 탈지유 12%, 효모 추출물 0.4%, 글루코스 3%, pH 6.5의 액체 탈지유 배지 20㎖에 접종하여, 37℃에서 15시간 동안 정치배양하였다. 15시간 동안 배양한 후의 균수는 2 ×109개/㎖이였다. 이러한 균액을 동일한 탈지유 배지로 500배 희석하여 캡슐의 내용액으로 하였다.
다음에, 실시예 1과 동일하게, 당해 내용액 함유 3층 구조 캡슐(평균 입자직경 1.8mm)을 제조하였다.
수득된 캡슐 100g을, 12% 탈지유 수용액을 0.01% 프로테아제P[참조: 아미노세이야쿠 가부시키가이샤 제조]로 40℃에서 15시간 동안 처리하여 사용한다는 점을 제외하고는 동일한 조성의 상기 탈지유 배지(이하, "프로테아제 P-처리된 유산균용 탈지유 배지"로서 지칭한다) 500㎖에 넣고 5M-NaOH 수용액으로 pH를 5.2로 조절하면서 37℃에서 2일간 50rpm으로 진탕배양하였다. 배양후의 캡슐내 생균수는 6 ×1010개/g 캡슐(습중량)이고, 캡슐 내부에서 유산균이 현저히 증식한 것으로 나타났다.
이와 같이 배양하여 수득된 캡슐을 멸균 증류수로 세정한 후, 야채 쥬스에 1g/10Oml의 비율로 가하였다. 이러한 야채 쥬스는 살아있는 유산균을 다량 함유하고 있음에도 불구하고, 이들의 나쁜 맛이 없고 캡슐을 쉽게 목으로 넘길 수 있으며, 맛있게 마실 수 있었다. 이에 의해, 종래 생각할 수 없었던 야채 쥬스를 마심으로써, 많은 유산균을 섭취할 수 있게 되었다.
실시예 3: 고려인삼 배양세포 캡슐을 함유하는 건강 드링크
슈크로오스 3%와 인돌-3-아세트산(IAA) 1mg/l을 포함하는 Murashige-Skoog 액체 배지(pH 5.6)중에서 계대배양한 고려인삼(Panax ginseng C.A. Meyer)의 세포 5g(습중량)을, 500㎖들이 삼각 플라스크에 넣고 동일한 배지 100㎖을 첨가하여 25℃에서 120rpm으로 2주 동안 진탕배양하여 유리 세포집괴를 수득하였다. 또한, 상기 유리 세포집괴를 80㎛ 눈금의 나일론망으로 여과하고, 이를 통과한 작은 세포집괴를 다시 20㎛의 눈금의 나일론망으로 여과하여, 망 위에 잔류하는 세포집괴를 모았다. 이러한 세포집괴 5g(습중량)을 상기와 동일한 조성의 Murashige-Skoog 액체 배지 100㎖에 현탁하여, 이를 캡슐의 내용액으로서 사용하였다.
이음새 없는 연질 캡슐화는, 내용액인 세포 현탁액을 바이브레이터로 진동시키면서 실시한다는 점을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 실시하였다. 수득된 고려인삼 세포를 함유하는 캡슐 10g을 취하여, 500㎖들이 삼각 플라스크에 넣고 동일한 조성의 Murashige-Skoog 액체 배지 100㎖을 첨가하고, 25℃에서 50rpm으로 3주 동안 배양하였다. 고려인삼세포는 캡슐 내부에서 증식하여 캡슐 내부에 충만되었다. 이와 같이 배양하여 수득된 캡슐 2g을 멸균 증류수로 세정한 후, 캡슐을 부유시키기 위해서 펙틴 0.05g을 첨가한 건강 드링크[모리시타진탄 가부시키가이샤에 의해 제조된 상품명 "슈퍼 역원(Super Rikigen)"과 동일한 조성을 갖는, 고려인삼 추출물을 첨가하지 않은 것] 50ml에 가하여, 살아있는 고려인삼 세포를 함유하는 건강 드링크를 제조하였다. 이러한 건강 드링크는 살아있는 고려인삼의 세포를 함유하고 있음에도 불구하고, 이의 쓴맛이나 나쁜 맛이 없고 목으로 넘기기가 쉬우며 맛있게 마실 수 있었다.
실시예 4: 납두균 캡슐을 함유하는 두유 음료
분쇄한 대두 분말 100g에 슈크로오스 5g, NaCl 1g 및 물 500㎖을 가하여, 121℃에서 30분 동안 오토클레이브한 다음, 원심분리하여 상청액을 수득하였다(이하, "대두분말 추출 배지"로서 지칭한다). 50㎖들이 삼각 플라스크에 당해 대두분말 추출 배지 10㎖을 넣고, 1개의 백금이 분량의 납두균(바실리스 서브틸리스(Bacillus subtilis) IFO13169)의 콜로니를 접종하였다. 이를 30℃에서 15시간 동안 120rpm으로 진탕배양하였다. 이러한 배양액 전체량을 대두분말 추출 배지 90㎖에 가하고 균일하게 현탁하여, 이를 캡슐화의 내용액으로서 사용하였다.
실시예 1과 마찬가지로 캡슐화하여, 수득된 캡슐 100g을 대두분말 추출배지 400㎖에 가하고 30℃에서 100rpm으로 24시간 동안 배양하였다. 배양 동안 캡슐 내부에서 납두균은 증식하여 점성 물질을 생성시킨다. 균수는 3 ×109개/g 캡슐(습중량)이였다. 이러한 캡슐 3g을 증류수로 세정하고 두유 10Oml에 첨가하였다. 이러한 캡슐을 함유하는 두유는 납두균의 냄새도 적고 맛있게 마실 수 있으며, 두유와 함께 납두균과 점성 물질을 섭취할 수 있게 한다.
실시예 5: 캡슐화 비피더스균의 배양방법
실시예 1과 동일한 방식으로 제조한 비피도박테리움 롱검 JCM7050의 캡슐을 보온용 재킷이 부착된 100㎖의 원통형 컬럼에 충전하였다. 외부의 배지조에 판크레아틴-처리 탈지유 배지 1L를 넣고, 상기 배지를 캡슐 충전 컬럼의 아래쪽에서 위쪽으로 10㎖/분으로 흘려 넣고, 다시 배지조로 복귀시켜 순환시켰다. 배지조는 pH 자동조절기를 사용하여 10M의 암모니아수로 pH 5.5로 유지하며, 혐기 상태를 유지하기 위해서 배지조내로 질소 85%, 수소 10%, 탄산가스 5%의 혼합가스(제조원: 스미토모세이카 가부시키가이샤)를 취입하였다. 혼합 가스는 최초 12시간 동안은 100㎖/분으로, 12시간째부터 30시간째까지는 20㎖/분으로 취입하였다. 37℃에서 30시간 동안 배양한 결과, 컬럼내 캡슐의 생균수는 5 ×1010개/g 캡슐로 상당히 많았다.
이러한 캡슐이 충전된 컬럼을 사용하는 배양방법은 캡슐에 물리적인 손상을 주지도 않고, 캡슐 내부에서 고밀도로 비피더스균을 배양할 수 있으며, 또한 잡균 오염의 기회를 감소시킬 수 있었다. 또한, 캡슐을 모을 경우에 캡슐이 파괴되지 않으며, 캡슐을 식품과 혼합되는 장소로 컬럼과 함께 반송할 수 있었다. 따라서, 배양시 및 배양 후의 취급이 상당히 용이해지며, 공업적 수준의 캡슐 내부에서의 비피더스균 배양에 적합하였다.
실시예 6: 동결건조 균체의 캡슐화와 배양
비피도박테리움 롱검 JCM7050을 실시예 1과 동일한 방식으로 탈지유 배지에서 혐기배양하고, 수득된 균체를 4℃에서 8000rpm으로 20분 동안 원심분리하여 모으고, 균체 10배량의 증류수를 가하고 교반 분산시켜 동결건조하였다. 이러한 동결건조 균체를 아내로팩을 넣어 혐기상태가 된 밀폐용기 중에서 냉장 보존한 결과, 지극히 안정적이였다. 상기 동결건조 균체 0.1g을 취하고 탈지유 배지 1L에 현탁하여, 이를 캡슐의 내용액으로서 사용하였다. 상기 현탁액의 생균수는 5 ×107개/㎖이였다.
다음에, 이하의 표 2에 기재한 처방에 따라서, 공중 적하법에 의해 당해 내용액을 함유하는 이음새 없는 연질 캡슐(평균 입자직경 3.5mm)을 제조하였다.
부위 성분 구성비* (중량%)
내용물 비피더스균 액 30
내피막 비타민 E 오일 30
외피막 4% 알긴산나트륨 용액 40
응고액 3% 염화칼슘 수용액
* 캡슐 전체의 구성비

수득된 캡슐 100g을 판크레아틴-처리 탈지유 배지 1L에 넣고, 아내로팩을 사용하여 혐기상태가 된 용기 중에서, 5M의 NaOH 수용액으로 pH를 5.5로 조정하면서 37℃에서 2일 동안 진탕배양하였다. 배양후의 캡슐내 생균수는 2 ×1010개/g 캡슐(습중량)이고, 캡슐 내부에서의 증식이 확인되었다.
실시예 7: 살아있는 비피더스균 캡슐을 함유하는 유산균 음료
유산균 락토코커스 락티스 JCM7638을 CMG 한천배지(효모 추출물 0.5%, 폴리펩톤 0.5%, NaCl 0.5%, 글루코스 1%, 한천 2%)에서 배양하여 콜로니를 수득하였다. 1개의 백금이 분량의 상기 콜로니를 탈지유 12%, 효모 추출물 0.4%, 젖당 3%, pH 6.5로 조정한 액체 탈지유 배지 20㎖에 접종하고 37℃에서 15시간 동안 정치배양한 결과, 균수는 6 ×1O9개/㎖이였다.
이러한 배양액 전체량을 4℃에서 8,000 ×g으로 20분 동안 원심분리하여, 상청액을 버리고, 균체에 생리식염수 40㎖을 가하고, 볼텍스를 사용하여 교반하며, 다시 8,000 ×g으로 20분 동안 원심분리하여 균체를 모았다. 다시 한번 동일한 조작을 반복하여 세정 균체를 수득하였다. 이러한 세정 균체 전체량에 투명한 사과 쥬스 40㎖을 가하여 볼텍스로 균일하게 분산시켰다. 수득된 균체가 균일하게 현탁된 사과 쥬스 0.5㎖을 투명 사과 쥬스 100㎖에 첨가하였다. 이러한 유산균이 현탁된 사과 쥬스 중의 생균수는 1 x 107개/㎖이고, 거의 투명하였다.
한편, 실시예 1과 동일하게 캡슐화하여 배양한 비피더스균 함유 캡슐 2g을 제조하여, 이를 상기에서 수득한 유산균 현탁 사과 쥬스 100㎖에 첨가하였다. 이러한 살아있는 비피더스균 함유 캡슐의 비피더스균의 생균수는 300억개/g 캡슐이였다. 살아있는 비피더스균 함유 캡슐을 함유하는 살아있는 유산균 함유 사과 쥬스는 "유등성령(乳等省令)"의 규격 기준에 준하는 유산균 음료가 되지만, 종래의 유산균 음료와는 전혀 다르며 거의 투명하면서 100㎖당 살아있는 비피더스균 600억개를 섭취할 수 있는, 입에 맞는 좋은 유산균 음료이다.
실시예 8: 당근 부정배를 캡슐화한 인공 종자
당근의 배양세포와 부정배의 생육은 당근의 뿌리를 사용하여 문헌[참조: 「식물 세포 조직배양」(1979년, 하라다, 코마미네편, 이공학사) p91 내지 104]에 기재되어 있는 방법에 준하여 실시하였다. 액체 배지에서 생육한 부정배를 그물코 500㎛과 850㎛의 나일론 메쉬를 사용하여 선별하여, 500 내지 850㎛의 크기의 부정배를 수득하였다. 수득된 부정배는 심장형에서 어뢰형에 이르는 형상을 하고 있었다. 이러한 부정배를 호르몬을 함유하지 않고 키토산 O.2%를 함유하는 MS 배지에 현탁하여, 이를 캡슐의 내용물로서 사용하였다.
부정배의 캡슐화는, 내피막으로서 융점 32℃의 트리글리세리드로 구성된 경화유(파마졸 B-115, 제조원: 니혼유시 가부시키가이샤)를 사용하고 외피막으로서 22% 젤라틴 용액을 사용하고, 3중 관노즐의 이음새 없는 연질 캡슐 제조기를 사용하여 액중 적하법에 의해 실시하였다. 내용액의 부정배가 한개씩 들어가도록 펌프를 조절하였다. 캡슐의 성형과 고화를 응고유 중에서 실시하여 3층 구조의 캡슐을 수득하였다. 수득된 캡슐로부터 응고유를 탈유한 후, 드럼건조함으로써 건조 캡슐화 부정배의 인공 종자를 수득하였다. 건조 후의 입자직경은 7mm이였다.
한편, 비교 실시예로서, 알긴산 겔 비드중에 매몰된 당근 부정배(비교 실시예 1)를 제조하였다. 즉, 실시예 8에서 생육하여 선별한 부정배를 3%(w/v) 알긴산나트륨을 포함하는 MS 배지에 현탁하고, 50mM의 염화칼슘 용액 중에 적가함으로써 부정배가 매몰된 알긴산칼슘 겔 비드(입자직경 약 5mm)를 제조하였다. 이것은 종래 인공 종자로서 보고되어 있는 것과 동일한 것이다.
보존 및 발아시험
상기 부정배를 캡슐화한 인공 종자(실시예 8) 및 부정배가 알긴산칼슘 겔 비드중에 매몰된 겔 비드(비교 실시예 1)를 20℃, 습도 65%의 항온처리기 중에서 3개월 동안 보존하였다. 보존 3일째에 알긴산칼슘 겔 비드는 상당히 건조되어 비드가 작아지며, 1주일만에 부정배도 건조되어, 건조된 상태가 되었다. 한편, 캡슐화 인공 종자에서는 1주일 후에도 외관의 변화가 확인되지 않았다.
인공 종자 제조 직후, 1개월 후, 2개월 후 및 3개월 후에, 각각 토양살균을 실시하지 않은 포장(圃場)의 흙을 넣은 포트에, 표토로부터 2cm 깊이로 각 100알씩 파종하고 살수하였다. 파종 후, 상기 포트를 25℃의 항온처리기에 놓고 3000Lux로 1일당 16시간 동안 조사하면서 2일마다 1회 살수하여 생육시켰다. 각각 3주 후의 발아수를 계수한 결과를 표 3에 기재한다.
당근 인공 종자 캡슐의 발아시험 결과
보존 기간
제조 직후 1개월 2개월 3개월
실시예 8 95 75 72 68
비교 실시예 1 96 0 0 0
숫자는 각각 100알 파종했을 경우의 발아수를 나타낸다.
표 3에 기재한 바와 같이, 제조 직후의 발아율은 실시예 8과 비교 실시예 1이 거의 동일하다. 그러나, 1개월 이상 보존한 경우, 종래 유형의 인공 종자인 비교 실시예 1에서는 전혀 발아하지 않았다. 반면에, 본 발명의 캡슐화 인공 종자에서는 3개월 보존한 후에도 68%라는 높은 발아율이 확인되었다.
이러한 결과로부터 본 발명의 캡슐화 부정배가 인공 종자로서의 보존 안정성에 관해서, 종래의 알긴산 겔 비드중에 매몰된 부정배 유형의 인공 종자보다도 매우 우수한 것으로 나타났다.
실시예 9: 딸기 엽아를 캡슐화한 인공 종자
재배되고 있는 딸기로부터 적출한 경정 조직을 슈크로오스 10g/l 및 겔화제로서의 젤란 검 2g/l를 포함하는 MS 배지에 두고, 어두운 곳에서 25℃에서 14일 동안 배양한 후, 벤질아데닌 0.2mg/l 및 슈크로오스 10g/1을 포함하는 MS 액체 배지에 옮기고, 25℃에서 1일당 2000Lux로 16시간 동안 조사하면서, 150rpm으로 회전 진탕기를 사용하여 배양하였다. 30일 동안 배양한 후, 수득된 엽아를 구멍 간격이 1mm와 1.7mm인 나일론 메쉬를 사용하여 선별하고, 1 내지 1.7mm 크기의 엽아를 수득하였다. 수득한 엽아를 호르몬을 포함하지 않는 MS 액체 배지에 현탁하고, 이를 캡슐화의 내용물로서 사용하였다.
엽아 현탁액을 내보내는 펌프의 유량을 조절한다는 점을 제외하고는 실시예 8과 동일한 방식으로 캡슐화를 실시하였다. 수득된 캡슐을 건조시켜 캡슐화 딸기 엽아의 인공 종자를 수득하였다. 건조 후의 입자직경은 8mm이였다.
한편, 비교 실시예로서, 알긴산 겔 비드중에 매몰된 딸기 엽아를 제조하였다(비교 실시예 2). 실시예 9에서 생육하여 선별한 딸기 엽아를 사용하여 비교 실시예 1과 동일한 방법으로 딸기 엽아가 매몰된 알긴산칼슘 겔 비드(입자직경 약 5mm)를 제조하였다. 이것은 종래, 인공 종자로서 보고되어 있는 것과 동일한 것이다.
수득된 딸기 엽아 인공 종자(실시예 9) 및 알긴산 겔 비드중에 매몰된 딸기 엽아(비교 실시예 2)의 보존과 발아시험을 실시예 8과 동일하게 실시하였다. 결과를 표 4에 기재한다.
딸기 인공 종자의 발아시험 결과
보존 기간
제조 직후 1개월 2개월 3개월
실시예 9 91 71 68 63
비교 실시예 2 94 0 0 0
숫자는 각각 100알 파종했을 경우의 발아수를 나타낸다.

표 4에 기재하는 바와 같이, 제조 직후의 발아율은 실시예 9과 비교 실시예 2이 거의 동일하다. 그러나, 1개월 이상 보존한 경우, 종래 유형의 인공 종자인 비교 실시예 2에서는 전혀 발아하지 않지만, 본 발명의 캡슐화 인공 종자에서는 높은 비율로 발아가 확인되며 3개월 후에도 60% 이상의 발아율을 유지하였다.
이러한 결과로부터, 본 발명의 캡슐화 인공 종자의 보존 안정성은 종래의 알긴산 겔 비드중에 매몰된 유형의 인공 종자와 비교하여 훨씬 우수한 것이 분명하다.
실시예 10: 나비난초(Orchis graminifolia)의 원괴체유사체를 캡슐화한 인공 종자
흰꽃 노란술의 나비난초의 화경액아(花莖腋芽)로부터 형성된 원괴체유사체를 구멍 간격이 1.5mm과 3mm인 나일론 메쉬를 사용하여 선별하고, 1.5 내지 3mm 크기의 원괴체유사체를 수득하였다. 수득된 원괴체유사체를 하이포넥스(HYPONeX) 비료(N/P/K=6.5:6:19) 6g/l, 슈크로오스 15g/l, 키토산 0.2%를 포함한 pH5.6의 배지에 현탁하여, 이를 3중 캡슐의 내용물로서 사용하였다.
이러한 원괴체유사체 현탁액을 내보내는 펌프를 조절하여, 1 원괴체(protocorm)를 1개의 캡슐내에 포함하도록 한다는 점을 제외하고는 실시예 8과 동일한 방식으로 캡슐화를 실시하였다. 수득된 캡슐을 건조시켜 나비난초의 원괴체유사체의 건조 캡슐화 인공 종자를 수득하였다. 건조 후의 입자직경은 9mm이였다.
이러한 인공 종자를 15℃의 어둔운 곳에서 2개월 동안 보존한 후, 토양 살균하지 않은 포장의 흙을 넣은 포트에, 표토로부터 2cm 깊이로 100알 파종하고 살수하였다. 파종 후, 상기 포트를 25℃의 항온처리기에 넣고 3000Lux로 1일당 16시간 동안 조사하면서 2일마다 1회 살수하여 생육시켰다. 2개월 후의 발아수를 계수한 결과, 100알 중 63알이 발아하였다.
실시예 11 내지 16
표 5에 기재한 식물의 부정배, 정아(頂芽) 또는 부정근을 생육하여 실시예 8과 동일하게 캡슐화를 실시하여, 건조시킨 후, 3개월 동안 20℃에서 습도 65%의 항온기 내에서 보존한 후에, 각 100알을 실시예 8과 동일하게 포트에 파종하고, 1 내지 3개월 동안 실시예 8과 동일하게 생육시켜 발아를 관찰하였다. 결과를 표 5에 기재한다.
각종 식물의 인공 종자의 발아시험 결과
실시예 1 식물 세포 조직 입자직경(mm) 발아수
11 아스파라거스 부정배 7 71
12 시클라멘 부정배 8 68
13 나팔나리(Easter lily) 점아 9 53
14 카네이션 부정배 8 62
15 장미 부정근 9 51
16 삼나무 부정근 10 37
발아수는 각각 100알 파종했을 경우의 수를 나타낸다.
표 5의 결과는 본 발명의 캡슐화 인공 종자의 보존 안정성이 우수한 것을 나타내고 있다.
본 발명의 캡슐은, 살아 있는 세포 또는 조직이 캡슐 내부에서 증식할 수 있으며 위산에 의해 용해되지 않는 캡슐이 되도록 구성함으로써, 특히 유산균(비피더스균을 포함한다)을 사용하는 경우, 대량의 살아있는 균을 장에 송달할 수 있기 때문에, 강력한 정장작용이 신속하게 나타난다. 또한, 본 발명의 재분화 가능한 식물 세포 조직을 포함하는 캡슐화 인공 종자는 상온의 건조 상태에서의 보존 안정성이 높고, 또한 토양에 파종하는 경우에 캡슐 피막이 팽윤 및 미생물 작용에 의해 붕괴되어 빠르게 발아에 이르는 인공 종자를 제공할 수 있다. 식물 세포 조직 배양기술, 클로닝 기술, 바이러스-제거 기술과 더불어, 농업, 임업, 원예업, 화훼업 등으로 광범위한 응용이 가능해진다.

Claims (15)

  1. 수성 액체에 현탁된 살아 있는 세포 또는 조직을 포함하는 이음새없는 캡슐로서,
    당해 캡슐이 3중 관노즐이 장착된 이음새없는 캡슐 제조 장치에 의해 제조되고,
    살아 있는 세포 또는 조직을 포함하는 수성 액체가 3중 관노즐의 최내층 관으로 제공되고,
    튀김유, 샐러드유, 비타민 E, 밀 배아유, 참기름, 융점이 35℃ 이하인 경화유, 카카오 버터, 버터, 마가린, 쇼트닝 및 자당의 지방산 에스테르로 이루어진 그룹 중에서 선택된 친유성 물질이 3중 관노즐의 중간관으로 제공되며,
    외막 형성 물질이 3중 관노즐의 최외각관으로 제공되고,
    당해 세포 또는 조직이 당해 수성 액체 내에서 증식될 수 있는, 이음새없는 캡슐.
  2. 제1항에 있어서, 이음새 없는 연질 캡슐(seamless soft capsule)인 캡슐.
  3. 제1항에 있어서, 세포 또는 조직이 식품용으로 사용되는 세포 또는 식물 조직인 캡슐.
  4. 제3항에 있어서, 세포 또는 조직이 유산균(비피더스균을 포함한다), 납두균(Bacillus natto), 빵 효모, 양조용 효모, 양조용 사상균, 단세포 조류, 다세포 조류, 식용식물, 식용식물 조직 및 이들의 동결건조 균체 또는 조직으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 세포 또는 조직인 캡슐.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 제1항에 있어서, 외막 형성이 물질이 젤라틴, 한천, 펙틴, 알긴산, 알긴산염, 카라기난, 카드란(curdlan), 전분, 젤란 검, 글루코만난 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 1종 이상의 천연 중합체인 캡슐.
  14. 제1항 내지 제4항 또는 제13항 중의 어느 한 항에 따르는 캡슐을 함유하는 식품.
  15. 제14항에 있어서, 과즙 음료, 야채 쥬스, 건강 드링크, 가공유, 두유, 젤리, 요구르트, 유산균 음료, 발효유, 탄산음료, 니어워터(near water) 또는 푸딩인, 캡슐을 함유하는 식품.
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