CN101735965B - 一种菌株热应激修饰方法和装置 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种菌株热应激修饰方法和装置。本发明的热应激修饰方法不需要大量基液，操作简便，效果稳定，得到的热激乳酸菌可加速干酪成熟。本发明不需要使用特定设备，利用常见的实验设备：加料泵、加热装置、不锈钢套管、冷却装置，组合成可连续批量热应激修饰各种乳酸菌株的装置，降低了设备投资和生产成本。

Description

一种菌株热应激修饰方法和装置
技术领域
本发明涉及微生物定向改造技术。具体的说，涉及一种菌株热应激修饰方法和装置。
背景技术
乳酸菌株的修饰是采用各种物理、化学或基因修饰等方法对菌株的某些功能特性进行定向改造，应用于干酪制造中的菌株修饰技术主要目的是抑制乳酸菌的产酸性，同时尽可能多的保留酶活性，使之能在干酪成熟期间加速生化降解，从而促进干酪成熟的方法。修饰发酵剂的方法主要有热休克、冷休克、冷冻或喷雾干燥、溶菌酶处理、溶剂处理和基因修饰等。
菌株热应激修饰方法是采用热处理对乳酸菌株进行定向改造的一种物理方法。筛选后的乳酸菌株经热应激修饰后(称作attenuatedstarter)，菌株的产酸性能受到一定程度的抑制，同时尽可能多的保留酶活力，与干酪加工所用发酵剂一起加入到干酪原料奶中，热应激修饰菌株不影响干酪的制作工艺和最终产品的理化指标，但能够加速干酪蛋白、脂肪的水解，从而缩短干酪成熟时间。与其它修饰方法相比，此方法采用物理热激方法处理可食用性乳酸菌，具有安全性；同时在干酪中使用时操作简便，不需要增添额外的设备，可实现批量连续式处理，是一种实用性很强的促干酪成熟的方法。
目前采用热应激的方法主要通过两种方式进行：一是置换法，将筛选后的菌株在预先加热的一部分基液中保温一定时间实现热激，再加入另一部分基液使热激过程结束，即通过热、冷基液的置换完成热激处理(Frey.J.P.，et al，1986.Heat-and freeze-shocking cause changes inpeptidase and protease activity of Lactobacillus helVeticus.Milchwissenschaft，41(11)：681-685)。这种方法在实际操作时，菌液需用至少10倍于其体积(或重量)的基液进行相交换，所用基液量大、操作不方便，而且在大批量处理时，往往会出现热处理温度不准确的情况，使热应激效果具有极大的不稳定性。
二是通过特殊热交换器进行，将筛选后的菌株直接通过特定热交换设备而完成热激处理(Asensio.C.，et al，1995，Effect of heat treatmenton the proteolytic activity of mesophilic bacteria isolated from goat’smilk cheese，21：25-30)。这种方法不必使用大量的基液进行热处理，操作方便、效果稳定，但由于必须使用特定的设备，分批处理菌液，其设备和生产成本较高，限制了实际应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种操作简便、效果稳定、可连续批量进行热应激菌株处理的热应激修饰方法。
本发明还提供一种进行菌株热应激处理的组合装置。
本发明采用组合设备的热应激修饰方法，包括：
1)菌株的活化；
2)菌株高密度培养；
3)菌株热激处理：热处理温度：50～80℃，热处理时间：5秒～100秒。
在进行热应激修饰前，乳酸菌株一般需要进行活化和高密度培养，使菌体密度达到108～1010cfu/ml。具体的说，以筛选后的菌株为原始菌株，经活化培养后恢复菌株活力；经优化试验确定菌体增殖培养条件，然后采用化学中和法对菌体进行高密度培养，以获得高密度的菌株悬液；之后采用加料泵、加热设备、冷却设备和不锈钢盘管进行热应激处理。
先选择菌株，菌株的活化条件如下：
菌株：原始菌株冻干菌粉
活化培养基：8％～15％的脱脂奶培养基
活化培养温度：25～45℃
活化培养时间：2小时～72小时
菌株经活化，活力恢复后进行高密度培养，培养条件如下：
脱脂奶培养基的配方：8％～15％脱脂奶，酵母提取物0.1％～3.0％，蛋白胨0.1％～3.0％，CaCO3 0.1％～3.0％，乳糖0.1％～3.0％，K2HPO40.05％～5.00％。
培养设备：全自动培养生化反应器
培养温度：25～45℃
培养时间：8小时～72小时
转速：100～600rpm
pH值：4.8～6.8
菌体密度：108～1010cfu/ml
然后经无菌收集后，离心处理(2000～10000g，5～60分钟)，洗涤后收获菌泥，再进行热激处理：
设备：蠕动泵、精密水浴锅、不锈钢盘管、冰浴锅；
热处理温度：50～80℃；
热处理时间：5秒～100秒。
本发明涉及的热激处理方法可广泛用于各种乳酸菌株，如嗜酸性乳酸菌(Lactobacillus acibophilus)、比菲德氏菌(Bifidobacteriumbidus)、乳链球菌(Streptococcus lactis)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacteriuminfantis)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei subsp)、长双叉杆菌(Bifidobacterium longum)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)等，优选瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)。
本发明提供的进行菌株热应激处理的组合装置，包括：
1)加料泵：通过管道与不锈钢盘管1相连，控制进料速度；
2)加热装置：加热不锈钢盘管1；
3)不锈钢盘管1：通过管道与不锈钢盘管2相连，用于菌株的热处理；
4)冷却装置：冷却不锈钢盘管2；
5)不锈钢盘管2：用于菌株的冷却。
其中加料泵可选用蠕动泵，加热装置和冷却装置可分别选择水浴锅和冰浴锅，连接用管道可选择塑料管。其连接方式见图1，管道一端连接待处理菌悬液，另一端连接蠕动泵进口，蠕动泵出口通过管道与不锈钢盘管1的进口相连(该不锈钢管置于精密水浴锅内)，不锈钢管1的出口与不锈钢盘管2通过管道相连(该不锈钢管置于冰浴锅内)，不锈钢盘管2的出口即为出料孔。所用管道可以是各种本领域内常用的管道，优选塑料管。
不锈钢盘管1和2为不锈钢管制成，将不锈钢管旋转盘成5～20圈成同心盘管状，进口与出口处分别为两根竖管，与盘形管制成一体。不锈钢管的内径为3-10mm，外径为4-12mm，优选管外径为6mm，管内径为5mm的不锈钢管。
本发明的热应激处理乳酸菌株的方法不需要大量基液，操作简便、效果稳定，不需要使用特定设备。通过自制热激套管配以辅助设备，就可以实现连续批量热激处理。本发明的热激处理与菌株的活化、高密度增菌培养联用，可形成一系列生产工艺，广泛用于各种菌株同样目的的处理，开创了国内自主创新物理改造菌株加速干酪成熟的先河。
附图说明
图1为菌株热激处理示意图，图中：1、塑料管；2、蠕动泵；3、精密水浴锅；4、冰浴锅；5、不锈钢盘管1；6、不锈钢盘管2。
图2为不锈钢盘管示意图，图中，1、进口；2、出口；3、固定夹板；4、不锈钢盘管。
图3为菌株处理流程图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
以筛选后的瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)(中国微生物菌种保藏中心)为原始菌株，经活化培养后恢复菌株活力。经优化试验确定菌体增殖培养条件，然后采用化学中和法对菌体进行高密度培养，以获得高密度的菌悬液。之后采用蠕动泵、循环式精密水浴锅、冰浴进行热应激处理，最后收集保存，具体步骤见图3。
菌株：瑞士乳杆菌冻干菌粉
活化培养基：12％的脱脂奶培养基
活化培养温度：30℃
活化培养时间：12小时
菌株经活化，活力恢复后进行高密度培养。并经无菌收集后，离心处理、洗涤后收获菌泥。
培养基配方：12％脱脂奶，酵母提取物1.5％，蛋白胨1.5％，CaCO32.0％，乳糖1.0％，K2HPO4 0.1％。
培养设备：全自动培养生化反应器
培养温度：30℃；
培养时间：24小时；
转速：200rpm；
pH值：5.6；
菌体密度：108～1010cfu/ml。
然后经无菌收集后，离心处理(5000g，30分钟)，洗涤后收获菌泥，再利用本发明提出的热激处理设备进行热激处理：
设备：蠕动泵、精密水浴锅、不锈钢盘管1(内径为3mm，外径为4mm，不锈钢管旋转盘成15圈)、不锈钢盘管2(内径为5mm，外径为6mm，不锈钢管旋转盘成20圈)冰浴锅；
热处理温度：55℃；
热处理时间：30秒。
热激处理完毕，无菌收集菌泥，备用。
实施例2
以筛选后的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei subsp，中国微生物菌种保藏中心)为原始菌株，进行活化、高密培养和热激处理，实验条件如下：菌株：干酪乳杆菌冻干菌粉
活化培养基：8％的脱脂奶培养基
活化培养温度：25℃
活化培养时间：2天
菌株经活化，活力恢复后进行高密度培养。并经无菌收集后，离心处理、洗涤后收获菌泥。
培养基配方：8％脱脂奶，酵母提取物0.1％，蛋白胨0.1％，CaCO30.1％，乳糖0.1％，K2HPO4 0.1％。
培养设备：全自动培养生化反应器
培养温度：25℃；
培养时间：72小时；
转速：400rpm；
pH值：6.2；
菌体密度：108～1010cfu/ml。
然后经无菌收集后，离心处理(10000g，15分钟)，洗涤后收获菌泥，再进行热激处理：
设备：蠕动泵、精密水浴锅、不锈钢盘管1(内径为5mm，外径为6mm，不锈钢管旋转盘成20圈)、不锈钢盘管2(内径为5mm，外径为6mm，不锈钢管旋转盘成20圈)冰浴锅；
热处理温度：70℃；
热处理时间：80秒。
热激处理完毕，无菌收集菌泥，备用。

Claims (9)

1.一种菌株热应激修饰方法，包括以下步骤：
1）高密度培养菌株；
2）利用菌株热应激修饰装置进行热激处理菌株：热激处理温度55～70℃，时间30秒～80秒；所述菌株为瑞士乳杆菌或干酪乳杆菌；
所述菌株热应激修饰装置由以下部分组成：
1）加料泵（2）：通过管道（1）与不锈钢盘管1（5）相连，控制进料速度；
2）加热装置（3）：加热不锈钢盘管1（5）；
3）不锈钢盘管1（5）：通过管道（1）与不锈钢盘管2（6）相连，用于菌株的热处理；
4）冷却装置（4）：冷却不锈钢盘管2（6）；
5）不锈钢盘管2（6）：用于菌株的冷却。
2.如权利要求1所述的修饰方法，其特征在于，步骤1）之前还包括：菌株的活化。
3.如权利要求1所述的修饰方法，其特征在于所述高密度培养菌株所用的培养基为脱脂奶培养基，其配方为：8%～15%脱脂奶，酵母提取物0.1％～3.0%，蛋白胨0.1%～3.0%，CaCO30.1%～3.0%，乳糖0.1%～3.0%，K2HPO40.05%～5.00%；培养温度为25～45℃；培养时间为8小时～72小时。
4.如权利要求2所述的修饰方法，其特征在于所述菌株活化所用的活化培养基为权利要求3所述的脱脂奶培养基；活化培养温度为25～45℃；活化培养时间为2～72小时。
5.一种菌株热应激修饰装置，由以下部分组成：
1）加料泵（2）：通过管道（1）与不锈钢盘管1（5）相连，控制进料速度；
2）加热装置（3）：加热不锈钢盘管1（5）；
3）不锈钢盘管1（5）：通过管道（1）与不锈钢盘管2（6）相连，用于菌株的热处理；
4）冷却装置（4）：冷却不锈钢盘管2（6）；
5）不锈钢盘管2（6）：用于菌株的冷却。
6.如权利要求5所述的装置，其特征在于，所述加料泵为蠕动泵。
7.如权利要求5所述的装置，其特征在于，所述加热装置为水浴锅。
8.如权利要求5所述的装置，其特征在于，所述冷却装置为冰浴锅。
9.如权利要求5所述的装置，其特征在于，不锈钢盘管1（5）和2（6）采用的不锈钢管的内径为3-10mm，外径为4-12mm。
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