KR100902781B1 - 일체형 무균 캡슐 제조장치 - Google Patents

Abstract

본 발명은 세포 고정화 캡슐을 무균적으로 제조할 수 있는 일체형 무균 캡슐 제조장치 및 이를 이용한 무균 캡슐 제조방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 제조장치를 이용하여 무균 캡슐을 제조하는 경우 멀티노즐을 통한 현탁액의 적하 및 경화, 캡슐 세척, 크기별 분류, 및 회수 공정을 밀폐된 일체형의 장치 내에서 수행할 수 있어 캡슐의 미생물 오염 가능성을 현저히 낮춤은 물론, 제조에 필요한 설비 및 공정단계를 획기적으로 줄일 수 있으므로, 동물세포 포집 캡슐을 이용하는 인공장기 관련 산업 분야 등에 유용하게 활용될 수 있다.

Description

일체형 무균 캡슐 제조장치{INTEGRATED DEVICE FOR THE PREPARATION OF ASEPTIC CAPSULES}

본 발명은 세포 고정화 캡슐을 무균적으로 제조할 수 있는 일체형 무균 캡슐 제조장치 및 이를 이용한 무균 캡슐 제조방법에 관한 것이다.

세포 고정화 방법은 세포의 생장 및 분리를 위한 3차원 구조 환경을 제공하는 물질에 세포를 고정하는 것으로서, 항생물질, 백신 및 단클론항체 등을 포함하는 세포 유래의 활성 물질을 생산하는데 사용되며, 당뇨, 간부전, 파킨슨병 및 알츠하이머 등의 치료목적으로 인공장기 분야에 널리 활용 및 연구되고 있다(Willem M., et al., Cell Encapsulation Technology and Therapeutics, 14-15, 1999).

일반적으로, 세포 고정화에 사용되는 고분자로는 알지네이트, 키토산, 폴리비닐알콜, 콜라겐, 카복시메틸셀룰로스, 아가로스, 젤라틴 등의 합성 및 천연 고분자가 있으며(Lambert, F., et al., BioChem. Biophys. Acta., 759, 81-88, 1983), 이러한 고분자 각각의 특성을 이용하여 다양한 형식의 고정화 방법이 개발되고 있 다(Birnbaum, S., et al., FEBS Letters, 122, 393-404, 1981; 및 Brodelius, P., et al., FEBS Letters, 122, 312-319, 1980). 특히, 알지네이트의 경우 면역장벽을 제공하도록 MWCO(molecular weight cut-off)를 조절할 수 있고(Bunger, G., et al., Biomaterials., 26, 2353-2360, 2005) 생체적합성이 우수하기 때문에(Higasi, T. et al., Biosci. and Bioeng., 97, 2004), 임상 적용이 용이하여 현재 널리 사용되고 있다(Orive, G. et al., Nat Med., 9, 104-7, 2003).

이러한 알지네이트를 이용한 고정화 방법에서는 통상적으로 CaCl₂ 또는 BaCl₂와 같은 2가 양이온 가교용액 중에 세포를 함유하는 알지네이트 현탁액을 방울 형태로 압출하여 비드 형상으로 '겔(gel)'화시키게 된다(D. Serp, et al., Biotechnology and Bioengineering, 70(1), 41-53, 2000). 이때, 적절한 크기의 캡슐을 얻기 위해 진동, 원심력, 정전기 또는 공기분사 등의 방법이 이용되고 있으며(Willem M., et al., Cell Encapsulation Technology and Therapeutics, 14-15, 1999), 이러한 고정화 공정을 수행할 수 있는 여러 캡슐 제조 장치들이 시판되고 있다(예: Inotech^® Encapsulation Product(INOTECH Biotechnologies) 및 Encapsulation/Immobilization Systems(Nisco Engineering AG)).

그러나, 진동, 원심력, 정전기 또는 공기분사 등의 방법으로 생성된 캡슐의 경우 적정 크기를 벗어나는 입자 크기를 가지기가 쉬운데, 캡슐의 크기가 너무 큰 경우에는 캡슐 내부에 있는 세포까지 산소가 원활하게 도달하지 못하여 저산소증에 의한 세포괴사가 발생될 수 있고, 반대로 크기가 너무 작은 경우에는 전단응력 등 의 물리적인 힘에 의해 캡슐의 파괴가 일어날 수 있으므로, 상기 고정화 방법으로 생성된 캡슐은 적정 크기의 캡슐만을 수득하기 위한 별도의 선별 공정을 필요로 한다.

또한, 고정화 방법으로 생성된 캡슐은 별도의 세척 공정도 필요로 하기 때문에, 상기와 같은 선별 공정 및 세척 공정을 위해 캡슐을 다른 용기로 이동해야 하는 등, 공정의 편리성이 떨어지고 무균환경 유지가 어려운 문제점이 있었다(대한민국 특허등록 제725730호; 및 D. Serp, et al., Biotechnology and Bioengineering, 70(1), 41-53, 2000).

본 발명자들은 세포 고정화 무균 캡슐의 제조에 있어서 제조 공정의 편리성을 높이고 미생물 오염 문제를 해결할 수 있는 캡슐 제조 장치에 대해 예의 연구한 결과, 적정 크기의 균일한 캡슐을 무균상태로 안전하고 편리하게 제조할 수 있는, 캡슐의 고정화, 선별 및 세척 공정을 한 반응기 내에서 수행하는 일체형 캡슐 제조장치를 개발하여 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명의 목적은 캡슐의 생성, 세척 및 선별의 공정을 무균상태로 안전하고 편리하게 제조할 수 있는 캡슐 제조 장치를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 장치를 이용하여 무균 캡슐을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적에 따라, 본 발명은 단일 용기 내에 멀티노즐, 이중 메쉬 및 가교용액 용기를 포함하는 일체형 무균 캡슐 제조장치를 제공한다.

상기 다른 목적에 따라, 본 발명은 일체형 무균 캡슐 제조장치를 이용하여 무균 캡슐을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일체형 무균 캡슐 제조장치는 멀티노즐을 포함하여 캡슐의 대량 생산을 가능하게 함은 물론, 이중 메쉬를 사용하여 생성된 캡슐의 선별 및 세척을 하나의 용기 내에서 수행할 수 있으므로, 본 발명에 따른 제조장치를 이용하여 무균 캡슐을 제조하는 경우 멀티노즐을 통한 현탁액의 적하 및 경화, 캡슐 세척, 크기별 분류 및 회수 공정을 밀폐된 일체형의 장치 내에서 수행할 수 있어 캡슐의 미생물 오염 가능성을 현저히 낮춤은 물론, 제조에 필요한 설비 및 공정단계를 획기적으로 줄일 수 있다.

이하, 본 발명에 따른 일체형 무균 캡슐 제조장치를 첨부 도면을 참조하여 상세히 설명한다.

도 1을 참조하면, 원료이송장치(2)에 주입된 동물세포-함유 현탁액은 압축 공기(3)에 의해 가압되어 배지 유입 포트(4)를 통해 본 발명에 따른 일체형 무균 캡슐 제조장치(1) 내 멀티노즐(5)로 유입되며, 유입된 세포 현탁액은 멀티노즐(5)을 통해 액적으로 떨어지고 노즐의 측면을 연결하는 공기 유입구(6)를 통해 유입된 공기는 각 노즐 주위로 분사되어 적당한 크기의 캡슐로 생성되게 된다.

이때, 상기 원료 이송 장치(2)는 산소 및 영양분 고갈로 인한 세포 손상이 없도록 냉장 상태가 유지되는 것이 바람직하며, 현탁된 동물세포가 현탁액에 골고루 분포하도록 하기 위해 교반장치를 장착할 수 있다. 또한, 압축 공기(3, 6)는 필터를 통해 멸균된 상태로 공급되며, 가압되는 압력 범위는 각각 독립적으로 0.02 내지 0.3 MPa일 수 있다. 상기 멀티노즐(5)은 스테인리스 스틸이나 폴리카보네이트 재질이 바람직하며, 이러한 멀티노즐(5)의 압출구(7)는 18 내지 24G, 바람직하게는 23 G 크기의 주사용 바늘 1 내지 150개로 이루어질 수 있다. 이때, 상기 바늘의 노즐 밖으로 돌출된 부분은 0.3 내지 1.0 mm, 바람직하게는 0.7 mm 일 수 있고, 바늘 측면에는 공기가 분출되는 구멍이 있을 수 있는데, 이 구멍의 지름은 1.5 내지 3 mm, 바람직하게는 1.5 mm일 수 있다.

상기 압출구(7)를 통해 압출되어 생성된 캡슐의 크기는 평균 직경이 0.3 내지 2.0 mm인 것이 바람직하며, 생성된 캡슐의 크기를 확인하면서 멀티노즐(5)의 상부에 위치한 공기압력 조절장치(8)와 압축 공기(3)의 압력을 이용하여 적절히 조절될 수 있다.

압출구(7)를 통해 배출된 액적은 4℃의 가교용액이 담긴 가교용액 용기(9)에 적하되어, 캡슐 형태로 경화된다. 생성된 캡슐은 세척배지 유입ㆍ배출 포트(13)를 통해 유입된 세척 배지(12)로 수차례 세척된다. 세척된 캡슐은 가교용액 용기(9) 내에 이중으로 설치된 내부 메쉬(10) 및 외부 메쉬(11)를 통해 적정 크기의 캡슐만이 선별되어 캡슐 이송 포트(14)를 통해 다른 용기로 이송되게 된다.

상기 가교 용액 용기(9)는 150 내지 350 mm, 바람직하게는 약 225 mm의 지름, 용기의 높이는 120 내지 220 mm, 바람직하게는 약 170 mm의 높이를 갖는 원통형 구조로서, 용기 맨 위 상단, 즉 멀티노즐 어댑터와 접하는 부분에 지름 5 mm의 공기를 배출하는 배출구가 있어 멀티노즐(5)로부터 가교용액 용기(9) 내부로 유입된 공기를 배출시켜 용기(9) 내부의 양압을 유지하고 무균 환경을 조성할 수 있다. 또한, 본 발명의 무균 캡슐 제조장치는 압출구(7)로 압출된 캡슐이 적절한 적하 거리를 두고 가교 용액으로 적하되도록 하기 위해, 폴리카보네이트 재질의 멀티노즐 어댑터(15)를 장착할 수 있으며, 이때 압출구(7)와 가교 용액 표면과의 적정 거리는 120 내지 160mm, 바람직하게는 약 140mm일 수 있다(도 2 참조).

또한, 가교 용액 용기(9) 내 생성된 캡슐들은 세척이 완료된 후, 가교 용액 용기(9) 내 이중으로 설치된 내부 메쉬(10) 및 외부 메쉬(11)를 통해 적정 크기의 캡슐만이 선별되는데, 이때 내부 메쉬(10)는 캡슐의 적정 크기 범위의 하한을 구경(pore size)으로 하는 구멍으로 이루어지며 바닥이 뚫려있고, 외부 메쉬(11)는 캡슐의 적정 크기 범위의 상한을 구경으로 하는 구멍으로 이루어지며 바닥이 막혀있는 특징이 있다. 상기 내부 메쉬(10)의 구경은 300 내지 2000 ㎛일 수 있으며, 외부 메쉬(11)의 구경은 300 내지 2000 ㎛일 수 있다. 또한, 내부 메쉬(10)의 경 우 외부 메쉬(11)와 포개져 있을 때 적정 크기의 캡슐이 아래로 새어나가지 않도록 메쉬 아래쪽을 실리콘링으로 접착시키는 것이 바람직하다.

상기 내부 메쉬(10)와 외부 메쉬(11)가 적정 크기의 캡슐을 선별하는 원리를 구체적으로 살펴보면, 도 4에 나타낸 바와 같이, 내부 메쉬(10) 및 외부 메쉬(11)가 포개져 있을 때 먼저 적정 크기 범위보다 작은 크기의 캡슐들은 내부 메쉬(10)와 외부 메쉬(11)를 모두 통과하여 세척 배지와 함께 외부로 배출되어 제거되고, 이렇게 해서 내부에 적정 크기 범위의 하한보다 큰 크기를 갖는 캡슐이 남아 있는 상태에서 내부 메쉬(10)를 들어올린 후 외부 메쉬(11)를 들어올리면 적정 크기보다 큰 캡슐들은 바닥이 막혀있는 외부 메쉬(11) 내부에 남아 외부 메쉬(11)와 함께 제거되고, 원하는 크기범위의 캡슐들만이 가교 용액 용기(9) 내에 남게 된다. 예를 들어 직경이 500 내지 1,000 mm 크기의 캡슐을 원하면 내부 메쉬는 구경 500 mm를 외부 메쉬는 1,000 mm 구경을 사용하면 된다.

위 과정을 통해 얻어진 캡슐은 가교용액 용기 하단부에 위치한 캡슐 이송 포트(14)를 통해 원하는 시스템으로 배출되게 된다.

본 발명은 상술한 일체형 무균 캡슐 제조장치를 이용하여 무균 캡슐을 제조하는 방법을 제공한다. 이때 상기 방법은 멀티노즐(5)을 통한 캡슐 압출 단계; 가교 용액 용기(9) 내에서의 캡슐의 경화 단계; 및 내부 메쉬(10) 및 외부 메쉬(11)를 이용하는 캡슐의 세척 및 선별 단계를 포함할 수 있다.

이때, 무균 캡슐 제조방법의 모든 단계는 산소 및 영양분 고갈로 인한 세포 손상이 없도록 4℃의 냉장 조건에서 수행되는 것이 바람직하며, 멀티노즐(5)을 통 한 캡슐 압출 단계는 5 내지 20분 동안, 가교 용액 용기(9) 내에서의 캡슐의 경화 단계는 5 내지 10 분 동안, 그리고 내부 메쉬(10) 및 외부 메쉬(11)를 이용하는 캡슐의 세척 및 선별 단계는 10 내지 30분 동안 수행될 수 있다.

또한, 상기 캡슐 압출 단계에서 멀티노즐에 주입되는 세포 현탁액은 통상적으로 사용되는 세포 포집용 고분자인 알지네이트, 하이드록시프로필셀룰로오스류, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스류, 카르복시메틸셀룰로오스나트륨, 카르보머류, 하일루론산, 메틸셀룰로오스, 카라야검, 수용성전분, 펙틴, 젤라틴, 폴리비닐알코올류 및 폴리비닐피롤리돈으로 이루어진 군 중에서 1종 이상이 선택된 것을 함유할 수 있고, 캡슐 압출 단계는 공기분사 노즐 외에 통상적인 진동 방식 노즐, 정전기를 이용한 노즐 등을 적용하여 수행할 수 있으나, 0.02 내지 0.3 MPa의 압력 조건하에 공기 분사 방식으로 수행하는 것이 바람직하다.

또한, 캡슐 경화 공정은 가교 용액으로 CaCl₂ 수용액, BaCl₂ 수용액_, Ti²⁺, Al²⁺와 같은 다원자가 양이온을 포함하는 수용액, 키토산(chitosan), 폴리아미노산(polyamino acid), 폴리에틸렌이민(polyethylenimine), 폴리아크릴아마이드(polyacrylamide)와 같은 고분자 양이온을 포함하는 수용액을 사용하여 교반하면서 수행하는 것이 바람직하다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예: 본 발명에 따른 일체형 무균 캡슐 제조장치를 이용한 무균 캡슐의 제조

61개의 압출구를 갖는 멀티노즐을 장착한 본 발명에 따른 일체형 무균 캡슐 제조장치에 600 ㎖ 가량의 알지네이트 현탁액을 주입하여 다음과 같이 약 10분간 알지네이트 캡슐을 제조하였다.

멀티노즐을 통해 압출된 캡슐은 4℃의 100 mM CaCl₂ 수용액을 가교용액으로 사용하여 5분간 교반시켜 경화하였으며, CaCl₂ 수용액을 가교용액 용기 하단부에 위치한 세척배지 유입·배출 포트를 통해 외부로 배출시킨 후, 각각 4℃의 RPMI 배지 2 ℓ를 4회, 그리고 윌리암스 E(Williams' E) 배지 2 ℓ를 2회 주입하여 세척하였다. 이때, 세척 배지의 유입 및 배출은 세척배지 유입·배출 포트를 통해 이루어졌으며, 세척 배지에 현탁되어 있는 알지네이트 캡슐을 세척 과정 중에 선별하기 위해 구경(pore size) 500 ㎛인 내부 메쉬와 구경이 1500 ㎛인 외부 메쉬를 사용하였다. 상기 세척 및 선별 공정을 좀 더 구체적으로 설명하면, 도 4에 나타낸 바와 같이, 우선 각각 측면에 메쉬가 형성된 원통형의 내부 메쉬 및 외부 메쉬가 포개어져 있을 때 내부 메쉬의 구경 보다 작은 입경의 캡슐들이 세척배지의 배출과 함께 세척배지 유입·배출 포트를 통해 제거되고, 세척 공정 마지막에 내부 메쉬와 연결된 금속선을 7 cm 정도 위로 잡아 당긴 후 고정한 다음 자석막대로 교반하여 외부 메쉬의 구경 보다 큰 입경의 캡슐만이 외부 메쉬 안에 남도록 하였다. 그 후, 외부 메쉬를 위로 잡아 당겨 고정하여 큰 입경의 캡슐들을 제거한 후, 가교용액 용기 내부에 남은 캡슐들을 가교 용액 용기 하단부에 위치한 캡슐 이송 포트를 통해 원하는 시스템으로 배출하였다.

상기와 같이 수득된 캡슐의 입경을 측정한 결과, 평균 입경이 700 내지 1200 ㎛ 범위였으며, 캡슐의 확대사진을 촬영하여 도 3에 나타내었다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 일체형 무균 캡슐 제조장치는 기존에 각각의 장치에서 행해졌던 캡슐의 생성, 세척, 선별, 회수 공정을 일체형의 한 용기에서 수행할 수 있으며, 멀티노즐을 통한 캡슐의 대량 생산은 물론, 세척 및 이중 메쉬를 사용한 캡슐의 선별을 하나의 용기 내에서 효율적으로 수행할 수 있으므로, 세포를 포집한 캡슐을 이용하여 세포 고정화 분야 및 이를 이용하여 당뇨, 간부전, 파킨슨병 및 알츠하이머 등을 치료하는 인공 장기 분야 등에 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 일체형 무균 캡슐 제조장치의 일례를 나타낸 모식도이고,

도 2는 본 발명에 따른 일체형 무균 캡슐 제조장치 내 장착된 가교용액 용기 부분에 대한 모식도이고,

도 3은 본 발명에 따른 일체형 무균 캡슐 제조장치를 이용하여 수득한 알지네이트 겔 비드의 확대사진이고,

도 4는 본 발명에 따른 일체형 무균 캡슐 제조장치 내부에 장착되는 이중 메쉬를 통한 캡슐 선별 공정을 도식화한 그림이다.

<도 1의 주요 부호에 대한 간단한 설명>

1: 일체형 무균 캡슐 제조장치 2: 원료이송장치 3: 압축 공기

4: 배지 유입 포트 5: 멀티노즐 6: 압축 공기

7: 압출구 8: 공기압력 조절장치 9: 가교용액 용기

10: 내부 메쉬 11: 외부 메쉬 12: 세척 배지

13: 세척배지 유입ㆍ배출 포트 14: 캡슐 이송 포트 15: 멀티노즐 어댑터

Claims (12)

1. 압축 공기 유입구, 세척배지 유입/배출구, 및 캡슐 회수 라인이 장착되고 가교 용액을 포함하는 용기;

   상기 용기의 상부에 위치하고, 세포 현탁액을 압출하여 상기 가교 용액안에서 캡슐로 경화되는 액적(droplets)을 형성하는 멀티 노즐; 및

   원하는 크기 범위의 캡슐을 선별하기 위해 상기 용기의 하부에 제거 가능하도록 배치되고 목적하는 캡슐 입경 범위의 상한을 구경(pore size)으로 하며 바닥이 막혀있는 원통형의 외부 메쉬 및 상기 외부 메쉬내에 제거 가능하도록 배치되고 목적하는 캡슐 입경 범위의 하한을 구경으로 하며 바닥이 뚫려있는 원통형의 내부 메쉬를 포함하는 이중 메쉬

   를 포함하는, 무균 캡슐 제조장치.
2. 제 1 항에 있어서,

   상기 멀티노즐이 1개 내지 150개의 압출구를 포함하는 것을 특징으로 하는 일체형 무균 캡슐 제조장치.
3. 제 2 항에 있어서,

   상기 압출구가 18G 내지 24G 크기의 주사용 바늘인 것을 특징으로 하는 일체형 무균 캡슐 제조장치.
4. 제 3 항에 있어서,

   상기 바늘이 노즐 밖으로 돌출된 부분이 0.3 내지 1mm이고, 바늘 측면에 구경이 1.5 내지 3mm인 구멍이 있는 것을 특징으로 하는 일체형 무균 캡슐 제조 장치.
5. 삭제
6. 삭제
7. 삭제
8. 삭제
9. 제1항의 무균 캡슐 제조장치를 이용하여 무균 캡슐을 제조하는 방법에 있어서,

   멀티 노즐을 이용하여 세포 현탁액을 압출하여 액적을 형성하는 단계;

   가교 용액을 이용하여 액적을 캡슐로 경화시키는 단계; 및

   세척배지를 이용하여 캡슐을 세척하고 내부 메쉬 및 외부 메쉬를 이용하여 원하는 크기 범위의 캡슐을 선별하는 단계

   를 포함하는 방법.
10. 제 9 항에 있어서,

    상기 단계들이 모두 4℃의 냉장 조건 하에 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제 9 항에 있어서,

    상기 세포 현탁액의 압출이 공기분사 방법, 진동방법 또는 정전기를 이용한 방법을 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
12. 제 11 항에 있어서,

    상기 세포 현탁액의 압출이 0.02 내지 0.3 MPa의 압력 조건 하에 공기분사 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.

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