JPWO2012124743A1 - 藍葉エキス製造方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、特に皮膚適用のために好適なトリプタンスリン含有藍葉エキスを提供することを課題とする。本発明により、藍葉のエタノール抽出濃縮物及び多価アルコールを含む混合物を濾過して濾液を回収する工程を含むトリプタンスリン含有藍葉エキス製造方法、並びに、該製造方法で製造される藍葉エキスが提供される。

Description

本発明は、藍葉エキス製造方法に関する。より詳細には、本発明は、トリプタンスリン含有藍葉エキスの製造方法に関する。

藍の葉（藍葉）には、インディカン（インディゴの原料になる）が含まれており、このため世界各地で青色の染料の原料として重用されてきた。現在では、化学合成したインディゴ染料が工業的にはよく用いられようになったが、それでも染料として用いるための栽培は続けられている。

特に、日本で主に栽培される藍であるタデ藍（Polygonum tinctorum）の葉には、インディカン以外にも、有用な成分が多種含まれていることが知られている。例えば、当該藍葉にはトリプタンスリン（以下に構造式を示す）が多く含まれていることが知られている。

トリプタンスリンは、マラセチア属真菌に対して抗菌作用を有し、このため当該真菌が関与するアトピー性皮膚炎に対して有効であるという報告がある（特許文献１）。また、トリプタンスリンが、ＩＶ型アレルギー反応の抑制効果を有するという報告もある（特許文献２）。

このように、トリプタンスリンは特に皮膚に適用する場合に有用な効果を有することが次第に明らかになりつつあり、その需要が高まってきている。

タデ藍からトリプタンスリンを抽出する方法としては、有機溶媒によりタデ藍から抽出する方法が知られている。例えば、抽出液として、ジクロロメタンを用いる抽出方法（特許文献１）や、１，３−ブチレングリコール等を用いる方法が知られている。（なお、水では、トリプタンスリンはほとんど抽出されない。）

しかしながら、有機溶媒を用いると刺激性が強い成分が抽出される可能性が高いため、用いる有機溶媒によっては抽出液を皮膚に適用するには不適であったり、抽出液に含まれるトリプタンスリンが不安定であるなど、皮膚適用のために好適な抽出法は開発されていないのが現状である。また、そもそもトリプタンスリンは光安定性がよくないという問題もある。

特開２００４−１８９７３２号公報 特開２００６−２４１０８０号公報

本発明は、特に皮膚適用のために好適なトリプタンスリン含有藍葉エキスを提供することを課題とする。

本発明者らは、驚くべき事に、藍葉のエタノール抽出物及び多価アルコールを含む混合物を、濾過して濾液を回収することにより、皮膚への刺激が無い（特に皮膚感作性が無い）トリプタンスリン含有藍葉エキスを製造し得ることを見出し、さらに改良を重ねて本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明は例えば以下の項に記載の方法、エキス、組成物等を包含する。
項１．
藍葉のエタノール抽出濃縮物及び多価アルコールを含む混合物を、濾過して濾液を回収する工程を含む、トリプタンスリン含有藍葉エキス製造方法。
項２．
前記混合物が、さらに水を含む、項１に記載のトリプタンスリン含有藍葉エキス製造方法。
項３．
多価アルコールが、１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、イソプレングリコール、及びペンチレングリコールからなる群より選択される少なくとも１種のグリコールである、項１又は２に記載のトリプタンスリン含有藍葉エキス製造方法。
項４．
藍葉のエタノール抽出濃縮物を含水多価アルコールと混合する工程、及び
得られた藍葉のエタノール抽出濃縮物及び多価アルコールを含む混合物を、濾過して濾液を回収する工程を含む、項１〜３のいずれかに記載のトリプタンスリン含有藍葉エキス製造方法。
項５．
前記藍葉が、乾燥藍葉である、項１〜４のいずれかに記載のトリプタンスリン含有藍葉エキス製造方法。
項６．
前記藍葉が、天日乾燥藍葉である、項５に記載のトリプタンスリン含有藍葉エキス製造方法。
項７．
項１〜６のいずれかに記載のトリプタンスリン含有藍葉エキス製造方法で製造されたトリプタンスリン含有藍葉エキス。
項８．
項７に記載のトリプタンスリン含有藍葉エキスを含む皮膚外用組成物。
項Ａ．
藍葉エキスに含まれるトリプタンスリンの光安定性を向上させる方法であって、
当該藍葉のエタノール抽出濃縮物及び多価アルコールを含む混合物を、濾過して濾液を回収する工程を有することを特徴とする、藍葉エキスに含まれるトリプタンスリンの光安定性向上方法。
項Ｂ．
藍葉エキスに含まれるトリプタンスリン量を向上させる方法であって、
天日乾燥藍葉から藍葉エキスを抽出する工程を含むことを特徴とする、方法。
項Ｃ．
藍葉を天日で乾燥させる工程を含む、藍葉に含まれるトリプタンスリン量を向上させる方法。
項Ｄ．
２週間白色光照射後の含有トリプタンスリン量が照射前の８割以上である、溶液形態のトリプタンスリン含有藍葉エキス。

本発明の藍葉エキス製造方法により製造された藍葉エキスに含まれるトリプタンスリンは、温度安定性のみならず光安定性にも優れる。しかも、当該藍葉エキスは、従来製造されていた藍葉エキスに比べ、皮膚刺激性（特に皮膚感作性）が低減されている。さらには、当該藍葉エキスは、非常に優れた抗菌活性を有する。このため、当該藍葉エキスは皮膚外用組成物として用いるのに、また、皮膚概要組成物を製造するために、好適である。

また、本発明の藍葉エキス製造方法によれば、従来の方法に比べ、得られる藍葉エキスに含まれるトリプタンスリンの量を向上させること、及び当該量を調整すること、も可能である。

本発明のトリプタンスリン含有藍葉エキスの製造方法の一例の概略を示す。 従来のトリプタンスリン含有藍葉エキスの製造方法の一例の概略を示す。 図１の製造方法で得た藍Ｅｔ−ＢＧエキスに含まれるトリプタンスリンの安定性を検討した結果を示す。 図２の製造方法で得た藍ＢＧエキスに含まれるトリプタンスリンの安定性を検討した結果を示す。 検討例１にて藍ＢＧエキスの皮膚感作性を検討した際の手順の概略を示す。 検討例にて各藍葉エキスの皮膚感作性を検討した際の判定基準の説明を示す。 検討例２にて藍Ｅｔエキス及び藍Ｅｔ−ＢＧエキスの皮膚感作性を検討した際の手順の概略を示す。 藍葉の状態により、得られる藍葉エキスに含まれるトリプタンスリン量が変化するかを検討した結果を示す。 藍Ｅｔ−ＢＧエキス、藍ＢＧエキス、藍水エキス、又は水を培地に加えて黄色ブドウ球菌を培養したときの、生菌数の割合を比べたグラフである。

以下、本発明について、さらに詳細に説明する。

本発明のトリプタンスリン含有藍葉エキス製造方法は、藍葉のエタノール抽出濃縮物及び多価アルコールを含む混合物を、濾過して濾液を回収する工程を含む。また、本発明は、当該製造方法で製造されるトリプタンスリン含有藍葉エキスも包含する。

藍葉のエタノール抽出濃縮物
藍葉のエタノール抽出濃縮物は、藍葉エタノール抽出物を、濃縮することにより得られる。

藍葉エタノール抽出物は、藍葉をエタノールにより抽出することにより得られる。藍葉を採取する藍としては、トリプタンスリンを葉に含有する藍が好ましく、中でもタデ藍（Polygonum tinctorum）が好ましい。用いる藍葉は、乾燥藍葉であることが好ましい。乾燥藍葉としては、凍結乾燥藍葉、加熱乾燥藍葉、天日乾燥藍葉等が例示できる。特に、天日乾燥藍葉を用いると、得られる藍葉エキスのトリプタンスリン含有量が顕著に多くなるため、好ましい。乾燥藍葉を得る方法は特に制限されず、例えば、藍葉を乾燥させる際、葉を摘み取った後乾燥してもよいし、全草を乾燥させた後に葉を採取してもよい。なお、天日乾燥においては、乾燥時間は天候等の条件に応じて適宜設定できる。例えば、通常日本国において藍葉を収穫できる９〜１１月においては、２〜７日程度天日にさらすことで乾燥させることができる。

エタノール抽出方法は特に限定されず、公知の方法を適宜選択して行うことができる。例えば、エタノールを用いて藍葉を還流抽出することにより、行うことができる。より具体的には、フラスコに冷却器をつなぎ、当該フラスコ内に藍葉及びエタノールを入れ、１〜６時間程度還流を行う方法が例示される。エタノールに加える藍葉の量は適宜設定できる。例えば１００ｍＬのエタノールに対して、乾燥質量換算で１〜１０ｇの藍葉を加えるという量が例示される。なお、抽出に含水エタノール（水とエタノールの混合液）を用いてもよいが、エタノールの割合が高いものが好ましい。例えば、容量比でエタノールが７０％以上が好ましく、９０％以上がより好ましく、９５％以上がさらに好ましく、９９％以上がよりさらに好ましい。

エタノール抽出濃縮物は、エタノール抽出液を濃縮して得られる。エタノール抽出液の濃縮の方法は、特に制限されず、公知の方法を適宜選択して行うことができる。例えば、好適には減圧蒸留により行い得る。つまり、エタノール抽出濃縮物としては、減圧蒸留濃縮物が好適である。減圧蒸留は、例えば減圧蒸留濃縮装置又は真空蒸留濃縮装置を用いて行うことができる。濃縮の程度は、特に制限されないが、例えばエタノール抽出液の質量の９０％以上（好ましくは９０〜９９．９９％程度）が除去される程度が例示される。前述の通り、例えば減圧蒸留又は真空蒸留により当該除去を行い得る。また、例えば、減圧蒸留により質量の変化がほとんど（実質的に）起こらない程度にまで濃縮してもよい。

多価アルコール
本発明に用いる多価アルコールは、通常、外用剤（例えば化粧品、医薬部外品又は外用医薬品）に使用されるものであれば、特に制限されない。多価アルコールの中でも１価アルコール又は２価アルコールが好ましい。具体的には、例えば、グリコール又はグリセリンが好ましい。より具体的には、１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、ペンチレングリコール（１，２−ペンタンジオール）、グリセリン、ジプロピレングリコール、１，３−プロパンジオール、イソプレングリコール（イソペンチルジオール）等が好ましく例示される。中でも１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、ペンチレングリコール、又はイソプレングリコールが好ましく、１，３−ブチレングリコールが特に好ましい。多価アルコールは、１種単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。

藍葉のエタノール抽出濃縮物及び多価アルコールを含む混合物
本発明に用いる、藍葉のエタノール抽出濃縮物及び多価アルコールを含む混合物は、例えば上述の藍葉のエタノール抽出濃縮物及び多価アルコールを混合することにより得られる。エタノール抽出濃縮物と多価アルコールとの混合割合は特に制限されず、適宜設定することができる。例えば質量比でエタノール抽出濃縮物：多価アルコールが、１：１６〜２：１であることが好ましく、１：１３〜１：１であることがより好ましく、１：１０〜１：５であることがさらに好ましい。

エタノール抽出物を濃縮したエタノール抽出濃縮物を用い、さらに加える多価アルコール液量を少なめにすることにより、下述する濾過工程で得られる濾液量が少なくなるため、より濃縮された溶液状態のトリプタンスリン含有藍葉エキスを得ることができる。つまり、溶液状態の藍葉エキス中のトリプタンスリン濃度を高めることや調整することができる。これにより、抽出効率を向上させることができる。

また、藍葉のエタノール抽出濃縮物及び多価アルコールを含む混合物は、さらに水を含んでもよい。かかる混合物は、藍葉のエタノール抽出濃縮物及び多価アルコールを混合し、さらに水を加えて得ることができる。また、藍葉のエタノール抽出濃縮物及び含水多価アルコール（水と多価アルコールの混合液）を混合することにより得ることもできる。いずれの場合も、当該混合物における水と多価アルコールの混合割合は特に制限されず適宜設定できるが、質量比で水：多価アルコールが２５：７５〜７５：２５であることが好ましく、４０：６０〜６０：４０であることがより好ましく、４５：５５〜５５：４５であることがさらに好ましい。なお、含水多価アルコールを用いる場合には、水と多価アルコールの混合割合が当該質量比である含水アルコールを用いることが好ましい。また、含水多価アルコールを混合した後、さらに水及び／又は多価アルコールやエタノールを加えてもよい。

以上のように、本発明のエキス製造方法は、（ｉ）藍葉からエタノール抽出を行う工程、（ｉｉ）藍葉エタノール抽出物を濃縮する工程、（ｉｉｉ）藍葉エタノール抽出濃縮物と多価アルコール又は含水多価アルコールとを混合する（そして、必要に応じてさらに水を混合する）工程、（ｉｖ）藍葉のエタノール抽出濃縮物及び多価アルコールを含む混合物を濾過して濾液を回収する工程、の４工程のうち、（ｉｖ）を含む方法、（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）を含む方法、（ｉｉ）〜（ｉｖ）を含む方法、並びに（ｉ）〜（ｉｖ）を含む方法、を好ましく包含するといえる。

濾過
本発明のエキス製造方法では、上記の混合物は濾過され、濾液が回収される。混合物の濾過の方法は特に制限されず、公知の方法を適宜選択して用いることができる。例えば、濾紙、濾布、ウェッジワイヤースクリーン、ウレタンスクリーン、濾過膜、ガラスフィルター等を用いた濾過機、加圧濾過機、フィルタープレス機、冷却濾過機、吸引濾過器等を単独若しくは組み合わせて利用できる。例えば、濾布濾過機（リーフフィルターやフンダバックフィルターなど）で濾過して得られた濾過液を、さらに濾過膜やガラスフィルターを用いて濾過する方法が好ましく例示される。あるいはまた、約１５μｍ以上（より好ましくは約１０μｍ以上）の粒子を濾過除去できる方法、例えば約１０μｍ以上の粒子を保留できる濾紙（例えばアドバンテック社製 定性濾紙No.1）を用いた吸引濾過も好ましく例示される。

濾過して得られる濾液は、そのままトリプタンスリン含有藍葉エキスとして用い得る。また、得られた濾液を乾燥（例えば減圧乾燥又は凍結乾燥）するなどして固体状（例えば粉末状）にしたものも、トリプタンスリン含有藍葉エキスとして用い得る。このようなトリプタンスリン含有藍葉エキスも、本発明に包含される。

トリプタンスリン含有藍葉エキス
本発明のトリプタンスリン含有藍葉エキスは、溶液状態における光安定性が高く、また、皮膚への刺激（特に皮膚感作性）もほとんど無いため、特に皮膚に適用するのに優れている。特に、上述の濾過により得られる濾液そのものをトリプタンスリン含有藍葉エキスとして用いる場合、白色光下で２週間静置した場合でも、その濃度はほとんど変化しない。具体的には、好ましくは白色光照射前に含まれるトリプタンスリン量の８割以上（より好ましくは９割以上）の量が照射後に存在する。ここでの白色光照射とは、約１００００ルクスの白色光照射をいい、当該照射は通常の白色蛍光灯等を用いて行い得る。

また、濾液を濃縮又は乾燥するなどして、ペースト状や固体状（例えば粉末状）等にしたものも、再度適当な溶媒へ溶解させた場合において、上述と同様の効果を示し得る。ここでの適当な溶媒としては、水、エタノール、及び上述した多価アルコールからなる群より選択される少なくとも１種が例示できる。

当該エキスを溶液形態で用いる場合は、上述の濾液そのものを用いてもよいし、濾液を乾燥（例えば凍結乾燥）するなどして固体状（例えば粉末状）にしたものを適当な溶媒へ溶解させたものを用いてもよい。

なお、藍葉エタノール抽出エキスであっても、藍葉多価アルコール抽出エキスであっても、皮膚への刺激（特に皮膚感作性）が存在するところ、本発明の製造方法で得られる藍葉エキスでは皮膚への刺激（特に皮膚感作性）が非常に低減されている。限定的な解釈を望むものではないが、藍葉には様々な皮膚刺激物質が含まれており、エタノールに溶解する皮膚刺激物質及び多価アルコールに溶解する皮膚刺激物質も含まれているところ、エタノールにも多価アルコールにも溶解する皮膚刺激物資は藍葉には含まれていないため、このような効果が得られるのではないかと推察される。当該推察によれば、エタノール抽出濃縮物はできるだけエタノール抽出物からエタノールを除去したものを用いるのが好ましいと考えられる。また、藍葉多価アルコール抽出濃縮物とエタノールとを混合し、これを濾過して濾液を回収することによっても、同様の効果を奏する藍葉エキスが製造できるのではないかと考えられる。

トリプタンスリン含有藍葉エキスを含む皮膚外用組成物
本発明は、上述のトリプタンスリン含有藍葉エキスを含む皮膚外用組成物も包含する。本発明のトリプタンスリン含有藍葉エキスは、トリプタンスリンの光に対する安定性（光安定性）及び温度安定性が優れており、かつ、皮膚刺激性が低く皮膚へ適用するのに優れているため、当該皮膚外用組成物を用いることで、トリプタンスリンが奏する効果を好ましく享受することができる。すなわち、本発明の皮膚外用組成物であれば、長期間保存しても温度や光によりトリプタンスリン量が減少することがほとんどなく、かつ皮膚刺激が低く、トリプタンスリンの抗炎症効果、抗アレルギー効果等の効果が好ましく発揮され得る。

本発明の皮膚外用組成物は、上述のトリプタンスリン含有藍葉エキス（溶液形態を含む）そのものでもよいし、本発明の効果を損なわない範囲で、当該トリプタンスリン含有藍葉エキスに、さらに皮膚外用のために用いられる公知の任意成分を配合したものでもよい。任意成分の配合量は、本発明の効果を損なわない範囲で適宜設定することができる。例えば、皮膚外用組成物全体に対し、０．１〜９９％が例示される。用いる任意成分としては、公知の界面活性剤、水溶性高分子、着色剤、酸化防止剤、金属封鎖剤、防腐剤、ｐＨ調整剤、清涼剤、香料、保湿剤、紫外線吸収剤、紫外線散乱剤、抗酸化剤、エステル油、動植物油などが例示される。またさらに、皮膚外用のために用いられる他の有効成分を本発明の効果が発揮される範囲で配合することもできる。このような有効成分としては、公知の美白剤、抗炎症剤、シワ形成抑制剤、脂肪分解剤、育毛剤等が例示される。

本発明の皮膚外用組成物は、例えば皮膚外用剤（医薬品、医薬部外品）や化粧料として用いることができる。皮膚外用剤は皮膚への適用に適した剤型、例えば、ゲル剤、クリーム剤、軟膏剤、リニメント剤、ローション剤、乳剤、粉剤、懸濁剤、エアゾール剤、硬膏剤、パップ剤、テープ剤、プラスター剤などで使用できる。好ましくは、ゲル剤、クリーム剤、乳剤である。また、化粧料は、化粧水、乳液、クリーム、美容液、パック、メイクアップベースローション、メイクアップベースクリーム、ファンデーション、アイカラー、チークカラー、リップスティック、日焼け止め等の皮膚化粧料、クレンジングローション、クレンジングクリーム、クレンジングフォーム、洗顔石鹸、洗顔剤、ボディーシャンプー等の皮膚洗浄料、ヘアーシャンプー、ヘアーリンス、ヘアートリートメント等の毛髪用化粧料、浴用剤などとして使用できる。好ましくはクリーム、美容液、日焼け止めである。これらは公知の方法により、上述のトリプタンスリン含有藍葉エキス並びに必要に応じて上述の任意成分及び有効成分を用いて製造することができる。

以下、本発明をより具体的に説明するが、本発明は下記の例に限定されるものではない。

トリプタンスリン含有藍葉エキスの製造
〔製造例〕：概略を図１に示す
タデ藍の天日乾燥葉（全草を７日間天日乾燥後葉を採取）５０ｇを、９９．５％エタノール８００ｍＬ（７４０ｇ）に加え、２時間還流することによりエタノール抽出を行った。抽出後、室温になるまで自然冷却し、＃３００メッシュのステンレス製濾過具を用いた濾過により、葉を除去した。このようにして得られた濾液（藍葉エタノール抽出液）を以下「藍Ｅｔエキス」ともいう。

藍Ｅｔエキス約５３０ｇをロータリーエバポレーターにより減圧蒸留し、総量が７．９ｇ以下になるまで濃縮した。このようにして得られた濃縮物を以下「藍Ｅｔ濃縮エキス」ともいう。

さらに、当該藍Ｅｔ濃縮エキス約５ｇに対し、５０％（w/w）含水１，３−ブチレングリコール８０ｍＬを加えて当該エキスを溶解させた。このようにして得た藍Ｅｔ濃縮エキスが溶解した溶液を、濾過して濾液を回収した。当該濾過は、約１０μｍ以上の粒子を保留できる濾紙（アドバンテック社製 定性濾紙No.1）を用いた吸引濾過である。この濾液を得る検討を２２回繰り返したところ、得られた濾液の平均重量は、約７４ｇであった。当該濾液を以下「藍Ｅｔ−ＢＧエキス」ともいう。藍Ｅｔ−ＢＧエキスは、本発明のトリプタンスリン含有藍葉エキスの好ましい態様の一例である。

〔比較製造例〕：概略を図２に示す
タデ藍の天日乾燥葉（全草を７日間天日乾燥後葉を採取）５０ｇを、５０％（w/w）含水１，３−ブチレングリコールに浸積させ、５５℃で５時間静置した。これを吸引濾過（アドバンテック社製 定性濾紙No.1使用）により濾過し、濾液を回収した。当該濾液を以下「藍ＢＧエキス」ともいう。

藍エキスに含有されるトリプタンスリンの安定性の検討
藍Ｅｔ−ＢＧエキス、及び藍ＢＧエキスを以下の（１）〜（４）の４種類の条件下で保存し、保存開始から１ヶ月後、２ヶ月後、３ヶ月後に、それぞれ、トリプタンスリンの含有量を計測した。なお、藍Ｅｔ−ＢＧエキスについては保存開始から２週間後にも計測した。また、白色蛍光灯の照射では、約１００００ルクスの白色光を各エキスに照射した。具体的には、二本の白色蛍光灯（ＦＬ４０ＳＳ−ＥＸ−Ｄ／３７（長尺状）パナソニック社製：長さ１１９８ｍｍ、ガラス管口径２８ｍｍ）を並行に設置し（間隔約３０ｃｍ）、その中間位置に各エキスを設置して（すなわち、各白色蛍光灯からエキスまでの距離は約１５ｃｍ）照射を行った。
（１）暗所にて室温保存
（２）暗所にて４０℃で保存
（３）暗所にて−５℃で保存
（４）白色蛍光灯常時照射下にて室温保存
なお、トリプタンスリンの含有量の測定は、ＨＰＬＣを用いて、以下の条件で標準品との比較をすることにより行った。
［ＨＰＬＣ条件］
カラム：Cosmosil5C18 MS-II 4.6X150mm (5μｍ)
移動相：水／メタノール＝５０／５０
流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：４０℃
検出波長：２５４ｎｍ
注入量：２０μＬ

藍Ｅｔ−ＢＧエキスの結果を図３に、藍ＢＧエキスの結果を図４に、それぞれ示す。図３及び図４から、藍Ｅｔ−ＢＧエキスは光安定性が優れている（少なくとも光照射によっても１ヶ月間は安定である）のに対し、藍ＢＧエキスでは光によりトリプタンスリンが分解され、トリプタンスリン含有量が減少することが確認できた。また、いずれのエキスも温度安定性は優れていた。さらに、藍Ｅｔ−ＢＧエキスは藍ＢＧエキスにくらべ、トリプタンスリン濃度が顕著に高いこともわかった。これは、藍Ｅｔ−ＢＧエキスが、トリプタンスリンが高濃縮されたエキスであることを示している。なお、上記（４）光照射条件下１ヶ月は、商品として店に陳列された際の光照射１年程度に相当すると推測され、商品化した場合に十分な光安定性を有するものと考えられる。

トリプタンスリン含有藍葉エキスの皮膚刺激性（感作性）の検討
〔検討例１：藍ＢＧエキスの皮膚感作性〕
藍ＢＧエキスの皮膚感作性について、モルモット（感作群５匹、対照群３匹：日本ＳＬＣから購入）を用いてGuinea Pig Maximization Test法（ＧＰＭＴ法）により検討した。なお、当該検討に用いた藍ＢＧエキスのトリプタンスリン濃度は２０．４μｇ／ｍＬであった。また、検討に用いたフロイントの完全アジュバント（ＦＣＡ）はＤＩＦＣＯ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳから購入した。

皮内感作は、具体的には次のようにして行った。すなわち、感作開始日に、感作群には以下の（ａ）（ｂ）（ｃ）をこの順に、対照群には以下の（ａ）（ｄ）（ａ）をこの順に、頚部皮膚の左右２ヶ所に、それぞれ少しずつ投与位置をずらして０．１ｍＬずつ皮内投与した。つまり、いずれのモルモットに対しても、頚部皮膚の左右それぞれにおいて、３ヶ所の皮内投与を行った。なお、感作群における（ａ）→（ｂ）投与時の投与間隔距離は（ｂ）→（ｃ）投与間隔距離より短く、また、対照群における（ａ）→（ｄ）投与時の投与間隔距離は（ｄ）→（ａ）投与間隔距離より短くなるようにした。また、感作群における（ａ）→（ｂ）投与間隔距離と対照群における（ａ）→（ｄ）投与間隔距離、並びに、感作群における（ｂ）→（ｃ）投与間隔距離と対照群における（ｄ）→（ａ）投与間隔距離は、ほぼ同様になるようにした。
（ａ）：フロイントの完全アジュバント（ＦＣＡ）と生理食塩液の当量乳化物
（ｂ）：藍ＢＧエキスの３０w/w％液（溶媒：生理食塩水）
（ｃ）：藍ＢＧエキスの６０w/w％液（溶媒：生理食塩水）とＦＣＡの当量乳化物
（ｄ）：生理食塩水
接触感作は、皮内感作（０日目）から７日目に藍ＢＧエキス０．２ｍＬを２×４ｃｍのリント布に含浸させ、皮内投与部位に４８時間閉塞貼付して行った。

惹起は、２１日目に藍ＢＧエキスの５０w/w％液（溶媒：注射用水）０．１ｍＬを、パッチテスト用絆創膏の布部に含浸させ、モルモットの腹側部に２４時間閉塞貼付して行った。皮膚反応の観察は、惹起貼付除去２４時間後及び４８時間後に行った。当該検討の概略を図５及び次に示す。
試験法：Guinea Pig Maximization Test法（ＧＰＭＴ法）
使用動物：白色モルモット（感作群５匹、対照群３匹）
試料：藍ＢＧエキス
方法：Daｙ0：FCA、試料(30%)、FCA＋試料(60%)を頚部背側部皮内投与 〔感作〕
Daｙ7：試料を48h閉塞貼付(100%) 〔感作〕
Day21：腹側部に試料を閉塞貼付(50%） 〔惹起〕
Day22-23：24h、48h後に観察
なお、試験期間中の一般状態に異常は認められず、体重においても順調な増加推移を示した。皮膚所見（貼付除去４８時間後）の結果を表１に示す。

また、表１における「陽性率」、「平均評点」の算出方法等について図６及び次に示す。
判定：皮膚反応判定基準（Draize法）
紅斑及び痂皮形成0-4＋浮腫0-4=合計0-8（評点）

＜紅班及び痂皮形成＞
0：紅班なし
1：ごく軽度の紅班（やっと認められる程度）
2：明らかな紅班
3：中等度から強い紅班
4：深紅色の強い紅班に痂皮形成（傷害は深部に及ぶ）

＜浮腫形成＞
0：浮腫なし
1：ごく軽度の浮腫（やっと認められる程度）
2：軽度の浮腫（周囲と明らかに区分可能）
3：中等度の浮腫（1mm程盛り上がっている）
4：強い浮腫（1mm以上盛り上がり、周囲にも広がる）

各判定時における「紅斑及び痂皮形成」並びに「浮腫」の合計点が１以上を陽性とし、下記式から陽性率を求めた。感作群の陽性率と対照群の陽性率の差を感作率とし、感作性評価区分は上記基準に従った。但し、感作性が０％の場合は、感作性無しとした。また、下記式から平均評点も算出した。また、下記式から感作率を算出した。

陽性率（％）＝（陽性動物数／全動物数）×１００
平均評点＝（紅斑及び浮腫の合計点）／動物数
感作率（％）＝感作群の陽性率−対象群の陽性率

求めた感作率から、以下のように感作性評価区分を求めることができる。

感作率（％） Grade Classification
0〜8 I Weak
9〜28 II Mild
29〜64 III Moderate
65〜80 IV Strong
81〜100 V Extreme

以上のように、藍ＢＧエキスには皮膚感作性が認められた。なお、感作性評価区分は、惹起濃度５０w/w％でGrade V（Extreme）であった。

〔検討例２：藍Ｅｔエキス及び藍Ｅｔ−ＢＧエキスの皮膚感作性〕
藍Ｅｔエキス及び藍Ｅｔ−ＢＧエキスの皮膚感作性について、モルモット（感作群５匹、対照群３匹：日本ＳＬＣから購入）を用いてAdjuvant and Patch Test法により検討した。なお、当該検討に用いた藍Ｅｔエキスのトリプタンスリン濃度は１７．０μｇ／ｍＬ、藍Ｅｔ−ＢＧエキスのトリプタンスリン濃度は１７．２μｇ／ｍＬであった。また、検討に用いたフロイントの完全アジュバント（ＦＣＡ）はＤＩＦＣＯ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳから購入した。

感作群の感作は次のようにして行った。感作０日目に、フロイントの完全アジュバント（ＦＣＡ）と生理食塩液の当量乳化物を投与部位（頚部皮膚）の四隅に皮内投与した後、投与部位に注射針を用いて＃型の傷を付けた。そして、藍Etエキス０．１mLを含浸させた２×４cmのリント布を用いて、４箇所の＃型の傷全てを覆うようにして、２４時間閉塞貼付した。第１、２日目に皮内投与を除く操作を同様に行った。第７日目に藍Etエキス０．２mLを含浸させた２×４cmのリント布を、同じ部位に４８時間閉塞貼付した。なお、対照群に対しては、エキスの代わりに注射用水を用いて同様に処理を行った。

惹起は、感作第２１日目に、藍Ｅｔエキスの５０w/w％液、又は藍Ｅｔ−ＢＧエキスの５０w/w％液（溶媒はいずれも注射用水）をそれぞれ０．１ｍＬずつパッチテスト用絆創膏の布部に含浸させ、モルモットの左右腹側部に２４時間閉塞貼付して行った。皮膚反応の観察は、惹起貼付除去２４時間後及び４８時間後に行った。当該検討の概略を図７及び次に示す。
試験法：Adjuvant＆Patch-test法
使用動物：白色モルモット（処置群５匹、対照群３匹）
方法：Day 0：FCAを頚部背側部皮内投与(図７では、モルモット模式図の１（頸部）の4隅の＃で投与位置が示される)
Day 0-2：試料を24h閉塞貼付(100%)×3日（藍Ｅｔエキス）
Day 7-9：腹側部に試料を48h閉塞貼付(100%）（藍Ｅｔエキス）
Day 21-22：腹側部に試料を24h閉塞貼付(50%）（藍Ｅｔエキス、藍Ｅｔ−ＢＧエキス）
Day 23-24：貼付除去後24、48hに観察
図７中のマウス模式図には＃型の傷（４ヶ所）、感作時の閉塞貼付部位、及び惹起時の閉塞貼付部位の概略を示す。

なお、試験期間中の一般状態に異常は認められず、体重においても順調な増加推移を示した。５０w/w％液で惹起をした場合の皮膚所見（貼付除去４８時間後）の結果を表２に示す。また、表２における「陽性率」、「平均評点」の算出方法等については、検討例１と同様である（すなわち図６又は上に示される）。

以上のように、藍Ｅｔエキスには皮膚感作性が認められた一方、藍Ｅｔ−ＢＧエキスには皮膚感作性は認められなかった。なお、藍Ｅｔエキスの感作性評価区分は、惹起濃度５０w/w％でGrade III（Moderate）であった。

以上の結果から、藍ＢＧエキス及び藍Ｅｔエキスには皮膚感作性があること、及び藍Ｅｔ−ＢＧエキスには皮膚感作性が無く、従って皮膚への適用に好ましいこと、が確認できた。

各種乾燥藍葉の検討
用いる藍葉の状態により、得られる藍葉エキスに含まれるトリプタンスリン量が変化するかを検討した。

タデ藍全草（地上部）を収穫し、給水スポンジに差した状態で冷蔵輸送し、その後下記の通り乾燥処理を行った。
１）生葉（乾燥処理行わず）
２）全草より葉を採取後、凍結乾燥（１２時間）
３）全草より葉を採取後、加熱乾燥（８０℃、２４時間）
４）全草より葉を採取後、天日乾燥（２日間、開花前）
５）全草より葉を採取後、天日乾燥（２日間、開花後）
６）全草を天日乾燥（７日間）後、葉を採取
いずれの処理においても、タデ藍生葉４０ｇを用いた。乾燥後は、いずれも７．５ｇ程度の乾燥葉となった。

そして、１）〜６）の生葉又は乾燥葉、並びに市販乾燥藍葉を用いて、上記製造例１に記載の方法と同様にして、藍Ｅｔエキスを製造した。そして、当該エキス中に含まれるトリプタンスリンの量を上記の［ＨＰＬＣ条件］にて測定した。

結果を図８に示す。当該結果から、生葉よりも乾燥葉を用いた方が、より多くのトリプタンスリンを含有するエキスを得られること、及び天日乾燥葉を用いると、顕著に多くのトリプタンスリンを含有するエキスを得られること、及び、天日で藍葉を乾燥させることにより、藍葉に含まれるトリプタンスリン量を向上させることができること、がわかった。

藍葉エキスの抗菌活性の検討
以下のようにして、各種藍葉エキスの抗菌活性の強さを検討した。なお、当該検討で用いたＳＣＤ液体培地及びＳＣＤＬＰ寒天培地は、メルク社から購入した。具体的には、ＳＣＤ液体培地は「ソイビーンカゼインダイジェスト」（メルク社製）を、ＳＣＤＬＰ寒天培地は「ポリソルベート８０及びレシチン加ソイビーンカゼインダイジェスト」（メルク社製）を、それぞれ用いた。また、当該検討に用いた「藍水エキス」は、藍ＢＧエキスを製造した方法（つまり、上記〔比較製造例〕に記載の方法）において、５０％（w/w）含水１，３−ブチレングリコールの代わりに水を用いて得た藍葉エキスである。

黄色ブドウ球菌（Staphyrococcus aureus NBRC 13276）を、５ｍＬのＳＣＤ液体培地に懸濁して、３０℃で一晩振盪培養した。これを、ＳＣＤ液体培地で希釈してマクファーランド０．５（生菌数濃度 約1.5 x 10⁸ CFU/mLに相当）に調製し、さらにＳＣＤ液体培地で１００倍に希釈したものを接種菌液とした。

試験管に分注したＳＣＤ液体培地４．５ｍＬに、藍Ｅｔ−ＢＧエキス、藍ＢＧエキス、藍水エキス、又は水を１５０μＬ加え、さらにＳＣＤ液体培地を加えて５ｍＬにメスアップしたエキス含培地に、接種菌液を５０μＬ加えてよく撹拌し、３０℃で２４時間振盪培養した。このようにして得られた培養液を、培養菌液とした。培養菌液を０．８５％塩化ナトリウム溶液で１０倍ずつ段階希釈し、段階希釈した液を１００μＬずつＳＣＤＬＰ寒天培地に播いて３０℃で１日間培養した。具体的には、藍Ｅｔ−ＢＧエキスを加えた培養菌液については、これを１０^４倍又は１０^５倍希釈した液を調製し、各液を寒天培地２枚ずつ（合計４枚）に播いて培養した。また、その他のエキス又は水を加えた培養菌液については、それぞれ、１０^５倍又は１０^６倍希釈した液を調製して用いた以外は、同様に培養した。培地表面に生じたコロニー数を測定し、測定されたコロニー数に基づき、培養菌液１ｍＬに含まれる生菌数（ＣＦＵ／ｍＬ）を求めた。藍葉エキスの代わりに水を用いた場合の生菌数を１としたときの、各藍葉エキスを用いた場合の生菌数の割合をグラフ化した図を図９に示す。図９において、＊はｐ＜０．０５を、＊＊はｐ＜０．００５を、それぞれ示す。なお、藍ＢＧエキス、又は藍水エキスを培地に加えて培養した場合と、代わりに水を培地に加えて培養した場合とでは、有意差はなかった。

以上の結果から、藍Ｅｔ−ＢＧエキスは非常に優れた抗菌活性を示すことが分かった。

以下に、本発明の皮膚外用組成物の処方例を示す。各処方例は、常法に従って調製した。なお、処方例における「藍エキス」は藍Ｅｔ−ＢＧエキスである。また、％は質量％を表す。

Claims (8)

1. 藍葉のエタノール抽出濃縮物及び多価アルコールを含む混合物を、濾過して濾液を回収する工程を含む、トリプタンスリン含有藍葉エキス製造方法。
2. 前記混合物が、さらに水を含む、請求項１に記載のトリプタンスリン含有藍葉エキス製造方法。
3. 多価アルコールが、１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、イソプレングリコール、及びペンチレングリコールからなる群より選択される少なくとも１種のグリコールである、請求項１又は２に記載のトリプタンスリン含有藍葉エキス製造方法。
4. 藍葉のエタノール抽出濃縮物を含水多価アルコールと混合する工程、及び
   得られた藍葉のエタノール抽出濃縮物及び多価アルコールを含む混合物を、濾過して濾液を回収する工程を含む、請求項１〜３のいずれかに記載のトリプタンスリン含有藍葉エキス製造方法。
5. 前記藍葉が、乾燥藍葉である、請求項１〜４のいずれかに記載のトリプタンスリン含有藍葉エキス製造方法。
6. 前記藍葉が、天日乾燥藍葉である、請求項５に記載のトリプタンスリン含有藍葉エキス製造方法。
7. 請求項１〜６のいずれかに記載のトリプタンスリン含有藍葉エキス製造方法で製造されたトリプタンスリン含有藍葉エキス。
8. 請求項７に記載のトリプタンスリン含有藍葉エキスを含む皮膚外用組成物。

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