JP6057610B2

JP6057610B2 - 藍葉エキス及びヨモギエキスを含有する組成物

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Publication number: JP6057610B2
Application number: JP2012183274A
Authority: JP
Inventors: 草刈　剛; 剛草刈; 健太郎山下
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Priority date: 2012-03-09
Filing date: 2012-08-22
Publication date: 2017-01-11
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Also published as: JP2013213018A

Description

本発明は、藍葉エキス及びヨモギエキスを含有する組成物に関する。さらに本発明は、藍葉エキス及びヨモギエキスを含有する抗菌剤、及び肌荒れ改善剤にも関する。

近年、抗菌の重要性の高まりと共に、様々な分野において抗菌剤が使用されている。例えば、一部の皮膚炎（一例としてアトピー性皮膚炎）は菌の繁殖が原因の１つとされており、抗菌剤の適用が皮膚炎の治療にとって非常に有用であることが知られている。このような分野、すなわち生物（特に人間）に適用する分野における抗菌成分としては、安全性の観点から、植物エキスなどの天然成分を使用することが望まれる。

しかしながら、植物エキスには抗菌成分以外にも多種多様な成分が含まれているため、抗菌作用を増大させる目的で植物エキスの適用量を増加させると、抗菌成分以外の成分による悪影響が懸念され得る。例えば、皮膚に適用した場合には、感作性を有する成分による皮膚への刺激が問題となることがある。

従って、抗菌成分以外の成分による悪影響をより低減するという観点からは、抗菌成分として使用する植物エキスの量は通常は少ない方が好ましい。

植物エキスの例としてはヨモギエキスが挙げられる。ヨモギエキスは、肌荒れ防止効果や痒み改善効果等の多様な効果を有することが知られているが、接触感作原性をも有することが報告されている（特許文献１）。

特開平６−２１１６７９号公報

本発明は、抗菌成分として使用する植物エキスの量がより少なくても、より高い抗菌活性を発揮できる組成物を提供することを目的とする。

本発明者等は、特定の製造方法によって得られた藍葉エキスと、接触感作原性を有することが知られているヨモギエキスとを組み合わせたところ、それぞれ単独では抗菌活性を発揮しない濃度においても、高い抗菌活性を発揮することを見出した。かかる知見に基づき、さらに改良を重ねて本発明を完成させるに至った。

即ち、本発明は、下記の構成を有するものを包含する。

項１．藍葉のエタノール抽出濃縮物及び多価アルコールを含む混合物から、不溶物を除去する工程を含む製造方法で製造された藍葉エキス、及びヨモギエキスを含有する組成物。

項２．前記混合物が、さらに水を含む、項１に記載の組成物。

項３．多価アルコールが、１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、イソプレングリコール、及びペンチレングリコールからなる群から選択される少なくとも１種のグリコールである、項１又は２に記載の組成物。

項４．抗菌剤である、項１〜３のいずれかに記載の組成物。

項５．肌荒れ改善剤である、項１〜３のいずれかに記載の組成物。

項６．項１〜５のいずれかに記載の組成物を含有する、化粧料組成物。

項７．項１〜５のいずれかに記載の組成物を含有する、医薬組成物。

項８．藍葉のエタノール抽出濃縮物及び多価アルコールを含む混合物。

本発明によれば、抗菌成分として使用する植物エキスの量がより少なくても、より高い抗菌活性を発揮する組成物を提供することができる。具体的には、本発明の組成物は、特定の製造方法によって得られた藍葉エキス、及びヨモギエキスを組み合わせて含有することにより、増加した抗菌活性を発揮できる。この組み合わせによる抗菌活性増加の程度は、特定の製造方法によって得られた藍葉エキス、及びヨモギエキスそれぞれ単独では抗菌活性を発揮しない含有量で両者を組み合わせた場合であっても、優れた抗菌活性を発揮し得る程度に顕著である。

試験例１にて製造例３に係る藍葉エキスの皮膚感作性を検討した際の手順の概略を示す。試験例１及び２にて各藍葉エキスの皮膚感作性を検討した際の判定基準の概略を示す。試験例２にて製造例１及び２に係る藍葉エキスの皮膚感作性を検討した際の手順の概略を示す。試験例３（藍葉エキス及びヨモギエキスの抗菌活性の検討）の結果を示す。試験例４（藍葉エキス及びヨモギエキスの抗菌活性の検討）の結果を示す。

本発明の組成物は、藍葉エキス及びヨモギエキスを含有する組成物である。

藍葉エキス
本発明に用いる藍葉エキスは、藍葉のエタノール抽出濃縮物及び多価アルコールを含む混合物から、不溶物を除去する工程を含む製造方法で製造された藍葉エキスである。

藍葉のエタノール抽出濃縮物は、藍葉エタノール抽出液を、濃縮することにより得られる。藍葉エタノール抽出液は、藍葉をエタノールで抽出することにより得られる。抽出に供される藍葉としては特に限定されず、中でもタデ藍（Polygonum tinctorium）の葉が好ましい。藍葉は、乾燥藍葉であることが好ましい。乾燥藍葉としては、凍結乾燥藍葉、加熱乾燥藍葉、天日乾燥藍葉などが例示できる。藍葉を乾燥させる際、葉を摘み取った後乾燥してもよいし、全草を乾燥させた後に葉を採取してもよい。なお、天日乾燥においては、乾燥時間は天候に左右される。乾燥時間は適宜設定できる。例えば、通常日本国において藍葉を収穫できる９〜１１月においては、２〜７日程度天日にさらすことで乾燥させることができる。藍葉は、抽出に際して破砕又は粉砕されることが好ましい。

エタノールは水との混合状態であってもよい。エタノールが水との混合状態である場合は、エタノールの割合が高い方が好ましい。例えば、容量比でエタノールが７０％以上が好ましく、９０％以上がより好ましく、９５％以上がさらに好ましく、９９％以上がよりさらに好ましい。

エタノール抽出方法は、藍葉の成分を抽出することができる限り特に限定されるものではなく、公知の方法を適宜選択して行うことができる。例えば、藍葉を加えたエタノールを還流させることにより行うことができる。より具体的には、フラスコに冷却器をつなぎ、当該フラスコ内に藍葉及びエタノールを入れ、１〜６時間程度還流を行う方法が例示される。エタノールに加える藍葉の量は適宜設定できるが、例えば１００ｍＬの有機溶媒に対して乾燥質量換算で１〜１０ｇの藍葉を加えるという量が例示される。

濃縮は、公知の濃縮手段、例えば減圧濃縮や加熱濃縮等により、好ましくは減圧濃縮により、より好ましくは減圧蒸留により行うことができる。濃縮の程度は、特に制限されないが、例えば藍葉エタノール抽出液の質量の９０％以上（好ましくは９０〜９９．９９％程度）が減圧蒸留により除去される程度が例示される。また、例えば、減圧蒸留により質量の変化がほとんど（実質的に）起こらない程度にまで濃縮してもよい。

多価アルコールとしては、通常、外用剤（例えば化粧品又は外用医薬組成物）に使用されるものであれば特に限定されず、例えば外用剤に使用されるグリコール又はグリセリンが好ましい。具体的には、１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、ペンチレングリコール（１，２−ペンタンジオール）、グリセリン、ジプロピレングリコール、１，３−プロパンジオール、イソプレングリコール（イソペンチルジオール）等が好ましく例示される。中でも１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、ペンチレングリコール、又はイソプレングリコールが好ましく、１，３−ブチレングリコールが特に好ましい。多価アルコールは１種又は２種以上を組み合わせて用いることができる。

藍葉のエタノール抽出濃縮物及び多価アルコールを含む混合物は、例えば上述の藍葉のエタノール抽出濃縮物及び多価アルコールを混合することにより得られる。エタノール抽出濃縮物と多価アルコールとの混合割合は特に制限されず、適宜設定することができる。例えば質量比でエタノール抽出濃縮物：多価アルコールが、１：１６〜２：１であることが好ましく、１：１３〜１：１であることがより好ましく、１：１０〜１：５であることがさらに好ましい。

藍葉エタノール抽出液を濃縮した、藍葉のエタノール抽出濃縮物を用い、さらに多価アルコール液量を少なめにすることにより、下述する不溶物除去工程で得られる液量が少なくなるため、より濃縮された溶液状態の藍葉エキスを得ることができる。つまり、溶液状態の藍葉エキス中の有用成分濃度を高めることや調整することができる。これにより、抽出効率を向上させることができる。

また、藍葉のエタノール抽出濃縮物及び多価アルコールを含む混合物は、さらに水を含んでもよい。かかる混合物は、藍葉のエタノール抽出濃縮物及び多価アルコールを混合し、必要に応じてさらに水を加えて得ることができる。当該混合物における水と多価アルコールの混合割合は特に制限されず適宜設定できるが、質量比で水：多価アルコールが２５：７５〜７５：２５であることが好ましく、４０：６０〜６０：４０であることがより好ましく、４５：５５〜５５：４５であることがさらに好ましい。なお、多価アルコールとして含水多価アルコールを用いる場合には、水と多価アルコールの混合割合が当該質量比である含水多価アルコールを用いることが好ましい。また、含水多価アルコールを混合した後、さらに水及び／又は多価アルコールやエタノールを加えてもよい。

以上のように、本発明に用いる藍葉エキスは、（ｉ）藍葉からエタノール抽出を行う工程、（ｉｉ）藍葉エタノール抽出物を濃縮する工程、（ｉｉｉ）藍葉エタノール抽出濃縮物と多価アルコール又は含水多価アルコールとを混合する（そして、必要に応じてさらに水を混合する）工程、（ｉｖ）藍葉のエタノール抽出濃縮物と多価アルコール又は含水多価アルコールとを含む（そして、必要に応じてさらに水を含む）混合物から不溶物を除去する工程、の４工程のうち、（ｉｖ）を含む方法、（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）を含む方法、（ｉｉ）〜（ｉｖ）を含む方法、又は（ｉ）〜（ｉｖ）を含む製造方法により製造された藍葉エキスを包含するといえる。なお、「藍葉エタノール抽出濃縮物及び多価アルコールを含む混合物」も、本発明に用いる藍葉エキスの製造に有用であるため、本発明に包含される。

混合物から不溶物を除去する方法は特に制限されず、公知の方法、例えば混合物を濾過してろ液を回収する方法や、混合物を遠心分離して上清を回収する方法等が挙げられる。これらの中でも混合物を濾過してろ液を回収する方法が好ましく挙げられる。混合物の濾過の方法は特に制限されず、公知の方法を適宜選択して用いることができる。例えば、濾紙、珪藻土、ウェッジワイヤースクリーン、ウレタンスクリーン、濾過膜、ガラスフィルター等を用いた濾過機、加圧濾過機、フィルタープレス機、冷却濾過機、吸引濾過器等を利用できる。また、約１５μｍ以上（より好ましくは約１０μｍ以上）の粒子を濾過除去できる方法が好適である。例えば、約１０μｍ以上の粒子を保留できる濾紙（例えばアドバンテック社製定性濾紙No.1）や珪藻土を用いた吸引若しくは加圧濾過が好ましく例示される。

不溶物が除去された混合物は、そのまま藍葉エキスとして用いてもよいし、必要に応じて更なる精製手段、例えば濾過、クロマトグラフィー等によって精製したものを藍葉エキスとして用いてもよい。また、濾液を、公知の濃縮手段、例えば減圧濃縮や加熱濃縮等により、好ましくは減圧濃縮により濃縮（或いは乾燥）したものを藍葉エキスとして用いてもよい。

ヨモギエキス
ヨモギエキスとしては、ヨモギのエキスであれば特に限定されないが、例えばヨモギを溶媒で抽出して得られた抽出物、すなわちヨモギ溶媒抽出物が挙げられる。ヨモギ溶媒抽出物は、ヨモギを溶媒で抽出してヨモギ抽出液を得る工程を含む製造方法で製造することができる。

抽出に供されるヨモギは、ヨモギ属（Artemisia）の植物体であれば特に限定されない。ヨモギ属の植物としては、例えばヨモギ（Artemisia vulgaris L.、又はArtemisia princeps）、モウコヨモギ（Artemisia mongolia）、ヤマヨモギ（Artemisia montata）、オトコヨモギ(Artemisia japonica Thun.)、シロヨモギ(Artemisia stelleriana)、イヌヨモギ (Artemisia keiskeana)、ヒメヨモギ(Artemisia lavandulaefolia)、ヒトツバヨモギ(Artemisia-monophylla)、ミヤマオトコヨモギ(Artemisia pedunculosa)、タカネヨモギ(Artemisia sinanensis)、ヨモギナ(Artemisia lactiflora)、ニガヨモギ(Artemisia absinthium L.)、カワラニンジン(Artemisia api-acea)、カワラヨモギ(Artemisia capillaris Thunb.)、クソニンジン(Artemisia annua L.)又はハマヨモギ(Artemisia hukudo Makino)が挙げられ、好ましくはヨモギ（Artemisia princeps）、モウコヨモギ（Artemisia mongolia）、ヤマヨモギ（Artemisia montata）、又はオトコヨモギ(Artemisia japonica Thun.)が挙げられる。これらは１種又は２種以上を組み合わせて用いることができる。

抽出に用いられるヨモギの部位としては特に限定されるものではなく、葉、茎、若しくは根等の各部位、全草若しくは地上部、又はこれらの乾燥物が挙げられる。通常、全草又は地上部が用いられ、好ましくは葉が用いられる。ヨモギは、抽出に際して破砕又は粉砕されていることが好ましい。

溶媒としては、特に限定されるものではなく、例えば水又は有機溶媒が挙げられる。これらの中でも、水が好ましく挙げられる。

有機溶媒としては、通常、外用剤（例えば化粧品又は外用医薬組成物）に使用されるものであれば特に限定されず、例えば低級アルコールが挙げられる。低級アルコールとしては、例えばエタノール、イソプロパノール、又はブタノール等が好ましく例示され、中でもエタノールがより好ましく例示される。また、有機溶媒は水との混合状態であってもよく、水との混合状態である場合の方が好ましい。このような有機溶媒としては、例えば、容量比で有機溶媒（好ましくは低級アルコール）が５０％以下の有機溶媒が好ましく、３０％以下の有機溶媒が最も好ましい。

抽出は、通常行われる方法によって行うことができる。抽出に使用する抽出溶媒の量は、抽出中にヨモギの全体を浸漬できる程度の量より多ければ特に限定されないが、抽出によって得られる抽出液中のヨモギ成分濃度を高くするために、可能な限り少ない量に設定することが好ましい。例えば、抽出中に機械力を与えない場合、具体的には抽出中に撹拌しない場合は、ヨモギの全体が全て浸漬する程度の量で十分である。一方、抽出中に機械力を与える場合、具体的には抽出中に撹拌する場合は、抽出に供するヨモギの形状（例えば、破砕されているか否か、及び破砕の程度により異なる）により異なるが、ヨモギの２〜５倍容量の溶媒を使用することが好ましい。抽出中の温度は特に限定されない。好ましくは、溶媒が沸騰しない程度の温度に加温して抽出を行う。

上記抽出後、抽出後のヨモギに対して更に溶媒を加え、上記と同様に抽出を行うことにより、抽出を２回以上行ってもよい。この場合、それぞれの抽出後に得られた抽出液を合一してヨモギ抽出液として用いる。

上記のようにして、ヨモギを溶媒で抽出して得られたヨモギ抽出液は、そのままヨモギ溶媒抽出物として用いてもよいし、必要に応じて更なる精製手段、例えば濾過、クロマトグラフィー等によって精製したものをヨモギ溶媒抽出物として用いてもよい。また、ヨモギ抽出液を、公知の濃縮手段、例えば減圧濃縮や加熱濃縮等により、好ましくは減圧濃縮により濃縮したものをヨモギ溶媒抽出物として用いてもよい。例えば、ヨモギ抽出液にはアレルギーを引き起こす成分が含まれる恐れがあるため、このような成分を除く目的で精製を行うことが好ましい。また、ヨモギ抽出液に含まれる抗炎症、抗かゆみ作用を有する多糖類を濃縮する目的で更に精製を行うことも好ましい。

具体的な精製手段としては、例えば、下記精製例１；
ヨモギ抽出液を減圧濃縮する工程、
得られた濃縮液をｎ−ブタノールを用いて洗浄することにより、ｎ−ブタノール移行部を除去する工程、
ｎ−ブタノール移行部除去後の水層に、大過剰の低級アルコールを添加して沈澱を生じさせる工程、及び
該沈澱を低級アルコールで洗浄し、洗浄された沈澱を得る工程
を含む精製手段が挙げられる。

また、別の具体的精製手段としては、例えば、下記精製例２；
ヨモギ抽出液を減圧濃縮する工程、
得られた濃縮液に低級アルコールを添加して沈澱を生じさせる工程、
濾過により得られた沈澱を少量の水に溶解する工程、
該溶解液に低級アルコールを添加して沈澱を生じさせる工程、及び
濾過により沈澱を得る工程
を含む精製手段が挙げられる。

前記具体的精製手段によって得られた沈澱を更に水に再溶解し、透析処理や濃縮処理などを行って、特定の分子量を有する多糖類を濃縮してもよい。

上記のようにして得られるヨモギ抽出物は、液体、又は固体（軟ペースト、粉末、若しくは顆粒等）等の形態として用いられる。

組成物
本発明の組成物は、少なくとも上記藍葉エキス及び上記ヨモギエキスを混合することにより得られる。少なくとも上記藍葉エキス及び上記ヨモギエキスを混合することにより抗菌活性の相乗効果が得られうる。

本発明の組成物における藍葉エキス配合量は、ヨモギエキスと共に配合された時に抗菌活性を発揮し得る配合量であれば特に限定されない。このような配合量（重量％）としては、例えば、組成物全体の重量に対する藍葉エキスの重量（エキス固形分重量換算）が、０．００１〜１重量％の範囲の配合量が挙げられ、０．０１〜０．５重量％の範囲の配合量が好ましく挙げられ、０．０５〜０．４重量％の範囲の配合量がより好ましく挙げられる。本発明の組成物は、藍葉エキスにヨモギエキスが組み合わされて含有していることにより、このように少ない配合量でも、優れた抗菌活性を発揮することができる。そして、少ない配合量であれば、藍葉エキスに含まれる抗菌成分以外の成分による悪影響（例えば皮膚刺激、皮膚感作）を抑えることが出来る。

本発明の組成物におけるヨモギエキス配合量は、藍葉エキスと共に配合された時に抗菌活性を発揮し得る配合量であれば特に限定されない。このような配合量（重量％）としては、例えば、組成物全体の重量に対するヨモギエキスの重量（エキス固形分重量換算）が、０．００５〜１重量％の範囲の配合量が挙げられ、０．０１〜０．８重量％の範囲の配合量が好ましく挙げられ、０．０２〜０．５重量％の範囲の配合量がより好ましく挙げられる。本発明の組成物は、ヨモギエキスに藍葉エキスが組み合わされて含有していることにより、このように少ない配合量でも、優れた抗菌活性を発揮することができる。そして、少ない配合量であれば、ヨモギエキスに含まれる抗菌成分以外の成分による悪影響（例えば皮膚刺激、皮膚感作）を抑えることが出来る。

本発明の組成物における、藍葉エキスとヨモギエキスの含有比は、藍葉エキス重量（エキス固形分重量換算）：ヨモギエキス重量（エキス固形分重量換算）で、１００：１〜１：２００の範囲の含有比が好ましく挙げられ、２５：１〜１：１００の範囲の含有比がより好ましく挙げられる。

藍葉エキスの固形分重量又はヨモギエキスの固形分重量は、下記式（１）：
エキス固形分重量＝（エキスの総質量）−（エキス中の水質量）−（エキス中の有機溶媒質量）（１）
によって求められる。

エキス中の水質量は、カールフィッシャー法によって測定できる。

エキス中の有機溶媒質量は、ＨＰＬＣ法によって測定できる。

本発明の組成物は、藍葉エキス及びヨモギエキスを含有することにより、優れた抗菌活性を発揮することができる。それ故、本発明の組成物は抗菌剤として使用するのに好適である。特にブドウ球菌属(Staphylococcus属)に属する真正細菌に対する抗菌剤、具体的には黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、及び腐性ブドウ球菌に対する抗菌剤、好ましくは黄色ブドウ球菌に対する抗菌剤として好適である。また、一部の皮膚炎（一例としてアトピー性皮膚炎）に代表される肌荒れは、菌の繁殖が原因の１つとされており、抗菌剤の適用がこのような肌荒れの治療にとって非常に有用であることが知られている。従って、本発明の組成物は肌荒れ改善剤としても好適である。

このように、本発明の組成物は抗菌剤又は肌荒れ改善剤として有用である。従って、本発明の組成物は、皮膚化粧料、頭髪化粧料、入浴剤、育毛剤、口腔用組成物などの人体に直接使用する目的の化粧料、寝具、衣服、住環境（床、壁、カーペット、家具、居住空間など）に使用する消臭剤、除菌剤、清掃剤などに代表される、被使用体が人体と接触しうる化粧料医薬品、食品、洗浄剤、飼料、環境／衛生用品等として使用される組成物の一成分として配合して使用される。以下に、これらの組成物の具体的使用態様について、化粧料、医薬品を例に挙げて説明する。

化粧料組成物
化粧料の分野では、本発明の組成物と共に、香粧学的に許容される公知の担体や公知の添加剤を、公知の方法によって配合することにより、本発明の化粧用組成物、例えば抗菌用化粧用組成物、又は肌荒れ改善用化粧用組成物が提供される。当該化粧料組成物は、優れた抗菌作用を発揮でき、肌荒れ改善に好適である。

当該化粧料組成物の形状については特に制限されないが、例えば、ペースト状、ムース状、ジェル状、液状、乳液状、懸濁液状、クリーム状、軟膏状、シート状、エアゾール状、スプレー状等が挙げられる。また、当該化粧料組成物の形態についても、制限されるものではないが、例えば、ファンデーション、頬紅、マスカラ、アイシャドウ、アイライナー、白粉等のメーキャップ化粧料；乳液、クリーム、ローション、オイル及びパック等の基礎化粧料；ヘアジェル、ヘアスプレー、ヘアリキッド、ヘアトニック、ヘアムース、ポマード、チック、ヘアクリーム、ヘアシャンプー、ヘアトリートメント、ヘアリンス等の毛髪用化粧料；洗顔料、クレンジング、ボディ洗浄料等の洗浄料；清拭剤；清浄剤；入浴剤等の浴用化粧料等が挙げられる。

化粧料組成物における本発明の組成物の配合量は、化粧料組成物全体に対する藍葉エキスの重量（エキス固形分重量換算）及び化粧料組成物全体に対するヨモギエキスの重量（エキス固形分重量換算）が、上記「組成物」で説明した、「組成物全体の重量に対する藍葉エキスの重量（エキス固形分重量換算）」及び「組成物全体の重量に対するヨモギエキスの重量（エキス固形分重量換算）」と同様になるように設定すればよい。

医薬組成物
医薬の分野では、本発明の組成物と共に、薬学的に許容される公知の担体や公知の添加剤を、公知の方法によって配合することにより、本発明の医薬組成物、例えば抗菌用医薬組成物、又は肌荒れ改善用医薬組成物が提供される。なお、当該医薬組成物には、医薬品及び医薬部外品の双方が含まれる。

当該医薬組成物は、内用的に適用されても、また外用的に適用されても、上記所望の作用を発揮することができる、故に、当該医薬組成物は、内服剤；経粘膜適用剤、経皮適用剤等の製剤形態で使用することができる。

当該医薬組成物の剤型としては、適用形態に応じて適宜設定されるが、一例として、錠剤、散剤、粉末剤、顆粒剤、カプセル剤等の固形製剤；液剤、乳剤、懸濁剤等の液状製剤；軟膏剤、ゲル剤等の半固形製剤が挙げられる。

当該医薬組成物の適用量は、適用対象者の性別や年齢、該組成物の適用形態、期待される効果等に基づいて、適宜設定することができる。

医薬組成物における本発明の組成物の配合量は、医薬組成物全体に対する藍葉エキスの重量（エキス固形分重量換算）及び化粧料組成物全体に対するヨモギエキスの重量（エキス固形分重量換算）が、上記「組成物」の項で説明した、「組成物全体の重量に対する藍葉エキスの重量（エキス固形分重量換算）」及び「組成物全体の重量に対するヨモギエキスの重量（エキス固形分重量換算）」と同様になるように設定すればよい。

以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。

１．藍葉エキスの製造
製造例１
タデ藍の天日乾燥葉（全草を７日間天日乾燥後葉を採取）５０ｇを、９９．５％エタノール８００ｍＬ（７４０ｇ）に加え、２時間還流することによりエタノール抽出を行った。抽出後、室温になるまで自然冷却し、＃３００メッシュのステンレス製濾過具を用いた濾過により、葉を除去した。このようにして得られた濾液を藍葉エキスとして以下の試験例で使用した。

なお、製造例１に係る藍葉エキスを原料としてさらに精製工程を経ている、下記製造例２の製造方法の記載から、製造例１に係る藍葉エキス５３０ｇは、エキス固形分重量換算で７．９ｇであることが理解される。このエキス固形分重量は、藍葉エキス全体の約１．５％（（７．９／５３０）×１００（％））に相当する。

製造例２
製造例１に係る藍葉エキスを、約５３０ｇをロータリーエバポレーターにより減圧蒸留し、総量が７．９ｇ以下になるまで濃縮した。このようにして得られた濃縮物を以下「藍Ｅｔ濃縮エキス」ともいう。

さらに、当該藍Ｅｔ濃縮エキス約５ｇに対し、５０％（w/w）含水１，３−ブチレングリコール８０ｍＬを加えて当該エキスを溶解させた。このようにして得た藍Ｅｔ濃縮エキスが溶解した溶液を、濾過して濾液を回収した。当該濾過は、約１０μｍ以上の粒子を保留できる濾紙（アドバンテック社製定性濾紙No.1）を用いた吸引濾過である。この濾液を得る検討を２２回繰り返したところ、得られた濾液の平均重量は、約７４ｇであった。当該濾液を藍葉エキスとして下記試験例において使用した。

なお、上記記載から、製造例２に係る藍葉エキス７４ｇは、藍Ｅｔ濃縮エキス約５ｇほぼ全てが５０％（w/w）含水１，３−ブチレングリコールに溶解したと仮定すると、エキス固形分重量換算で５ｇであることが理解される。このエキス固形分重量は、藍葉エキス全体の約６．８％（（５／７４）×１００（％））に相当する。

製造例３
タデ藍の天日乾燥葉（全草を７日間天日乾燥後葉を採取）５０ｇを、５０％（w/w）含水１，３−ブチレングリコールに浸積させ、５５℃で５時間静置した。これを吸引濾過（アドバンテック社製定性濾紙No.1使用）により濾過し、濾液を回収した。当該濾液を藍葉エキスとして下記試験例において使用した。

２．ヨモギエキスの製造
製造例４
ヨモギ (Artemisia vulgaris L.）乾燥物１kgに４倍容量の水を加え２時間加熱抽出した。この抽出を２回繰り返し、抽出液を濾過して合し、減圧下、溶媒を留去して一定容量になるまで濃縮した（軟エキス）。得られた軟エキスに５倍容量の精製水を加えて溶解した後に、同容量のエタノールを加えた。エタノールを加えることにより生じた沈澱を濾過により分離し、該分離物を乾燥させて粉末を得た。

当該粉末をヨモギエキスとして下記試験例において使用した。

３．藍葉エキスの皮膚刺激性（感作性）の検討
試験例１：製造例３に係る藍葉エキスの皮膚感作性
製造例３に係る藍葉エキスの皮膚感作性について、モルモット（感作群５匹、対照群３匹：日本ＳＬＣから購入）を用いてGuinea Pig Maximization Test法（ＧＰＭＴ法）により検討した。検討に用いたフロイントの完全アジュバント（ＦＣＡ）はＤＩＦＣＯＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳから購入した。

皮内感作は、具体的には次のようにして行った。すなわち、感作開始日に、感作群には以下の（ａ）（ｂ）（ｃ）をこの順に、対照群には以下の（ａ）（ｄ）（ａ）をこの順に、頚部皮膚の左右２ヶ所に、それぞれ少しずつ投与位置をずらして０．１ｍＬずつ皮内投与した。つまり、いずれのモルモットに対しても、頚部皮膚の左右それぞれにおいて、３ヶ所の皮内投与を行った。なお、感作群における（ａ）→（ｂ）投与時の投与間隔距離は（ｂ）→（ｃ）投与間隔距離より短く、また、対照群における（ａ）→（ｄ）投与時の投与間隔距離は（ｄ）→（ａ）投与間隔距離より短くなるようにした。また、感作群における（ａ）→（ｂ）投与間隔距離と対照群における（ａ）→（ｄ）投与間隔距離、並びに、感作群における（ｂ）→（ｃ）投与間隔距離と対照群における（ｄ）→（ａ）投与間隔距離は、ほぼ同様になるようにした。
（ａ）：フロイントの完全アジュバント（ＦＣＡ）と生理食塩液の当量乳化物
（ｂ）：製造例３に係る藍葉エキスの３０w/w％液（媒体：生理食塩水）
（ｃ）：製造例３に係る藍葉エキスの６０w/w％液（媒体：生理食塩水）とＦＣＡの当量乳化物
（ｄ）：生理食塩水
接触感作は、皮内感作（０日目）から７日目に製造例３に係る藍葉エキス０．２ｍＬを２×４ｃｍのリント布に含浸させ、皮内投与部位に４８時間閉塞貼付して行った。

惹起は、２１日目に製造例３に係る藍葉エキスの５０w/w％液（媒体：注射用水）０．１ｍＬを、パッチテスト用絆創膏の布部に含浸させ、モルモットの腹側部に２４時間閉塞貼付して行った。皮膚反応の観察は、惹起貼付除去２４時間後及び４８時間後に行った。当該検討の概略を図１に示す。

なお、試験期間中の一般状態に異常は認められず、体重においても順調な増加推移を示した。皮膚所見（貼付除去４８時間後）の結果を表１に示す。また、表１における「陽性率」、「平均評点」の算出方法等について図２に示す。

試験例２：製造例１及び２に係る藍葉エキスの皮膚感作性
製造例１に係る藍葉エキス及び製造例２に係る藍葉エキスの皮膚感作性について、モルモット（感作群５匹、対照群３匹：日本ＳＬＣから購入）を用いてAdjuvant and Patch Test法により検討した。検討に用いたフロイントの完全アジュバント（ＦＣＡ）はＤＩＦＣＯＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳから購入した。

感作群の感作は次のようにして行った。感作０日目に、フロイントの完全アジュバント（ＦＣＡ）と生理食塩液の当量乳化物を投与部位（頚部皮膚）の四隅に皮内投与した後、投与部位に注射針を用いて＃型の傷を付けた。そして、製造例１に係る藍葉エキス０．１mLを含浸させた２×４cmのリント布を用いて、４箇所の＃型の傷全てを覆うようにして、２４時間閉塞貼付した。第１、２日目に皮内投与を除く操作を同様に行った。第７日目に製造例１に係る藍葉エキス０．２mLを含浸させた２×４cmのリント布を、同じ部位に４８時間閉塞貼付した。なお、対照群に対しては、エキスの代わりに注射用水を用いて同様に処理を行った。

惹起は、感作第２１日目に、製造例１に係る藍葉エキスの５０w/w％液、又は製造例２に係る藍葉エキスの５０w/w％液（媒体はいずれも注射用水）をそれぞれ０．１ｍＬずつパッチテスト用絆創膏の布部に含浸させ、モルモットの左右腹側部に２４時間閉塞貼付して行った。皮膚反応の観察は、惹起貼付除去２４時間後及び４８時間後に行った。当該検討の概略を図３に示す。図３中のマウス模式図には＃型の傷（４ヶ所）、感作時の閉塞貼付部位、及び惹起時の閉塞貼付部位の概略を示す。

なお、試験期間中の一般状態に異常は認められず、体重においても順調な増加推移を示した。５０w/w％液で惹起をした場合の皮膚所見（貼付除去４８時間後）の結果を表２に示す。また、表２における「陽性率」、「平均評点」の算出方法等については、検討例１と同様である（すなわち図２に示される）。

考察
以上の結果から、製造例２に係る製造方法で藍葉エキスを製造すると、藍葉エキスの皮膚感作性をより低減できることが明らかとなった。

４．藍葉エキス及びヨモギエキスを含有する組成物の抗菌活性の検討
試験例３
藍葉エキス及びヨモギエキスを組み合わせた場合の効果について検討した。−８０℃で保存していた黄色ブドウ球菌（Staphyrococcus aureus NBRC 13276）を、５ｍＬのＳＣＤ液体培地に懸濁して、３０℃で一晩振盪培養した。これを、ＳＣＤ液体培地で希釈してマクファーランド０．５に調製し、さらにＳＣＤ液体培地で１００倍に希釈したものを接種菌液とした。

試験管に分注したＳＣＤ液体培地に、製造例２に係る藍葉エキス及び／又は製造例４に係るヨモギエキスを加えて５ｍＬにメスアップしたエキス含培地に、接種菌液を５０μＬ加えてよく撹拌し、３０℃で２４時間振盪培養した。このとき、同時に、菌を加えないエキス含培地も振盪培養した。このようにして得られた培養液を、培養菌液とした。

培養菌液を０．８５％塩化ナトリウム溶液で１０倍ずつ段階希釈し、段階希釈した液１００μＬをＳＣＤＬＰ（ポリソルベート８０及びレシチン加ソイビーンカゼインダイジェスト）寒天培地に播いて３０℃で１日間培養した。

培地表面に生じたコロニー数を測定し、測定されたコロニー数に基づき、培養菌液１ｍＬに含まれる生菌数（ＣＦＵ／ｍＬ）を求めた。この結果を図４に示す。図４中、エキス濃度（０、０．５、又は３）は、エキス含培地（５ｍＬ）中の、製造例２に係る藍葉エキス、又は製造例４に係るヨモギエキスの濃度を示す。

試験例４
藍葉エキス及びヨモギエキスを組み合わせた場合の効果について検討した。感受性ブイヨン１６ｍＬに、製造例２に係る藍葉エキス及び製造例４に係るヨモギエキスを滅菌精製水で希釈したサンプル、又は製造例３に係る藍葉エキス及び製造例４に係るヨモギエキスを滅菌精製水で希釈したサンプルを４ｍＬを加えて、エキス含培地（２０ｍＬ）とした。エキス含培地に、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA IID1677）約１０^７個／ｍＬに調製した試験菌液０．２ｍＬを加え、３５℃で２４時間培養した。このようにして得られた培養液を、培養菌液とした。

培養菌液をＬＰ希釈液及びペプトン食塩緩衝液で１０倍ずつ段階希釈し、段階希釈した液１００μＬをＳＣＤＬＰ寒天培地に播いて３５℃で２４時間培養した。培地表面に生じたコロニー数を測定し、測定されたコロニー数に基づき、培養菌液１ｍＬに含まれる生菌数（ＣＦＵ／ｍＬ）を求めた。この結果を図５に示す。図５中、Ｘ軸に示される数値（０、０・０２５、０．０５、１．２５、又は２．５）は、エキス含培地（２０ｍＬ）中の、製造例２に係る藍葉エキス、製造例３に係る藍葉エキスの濃度を示す。また、製造例４に係るヨモギエキスの濃度も図５の右上に合わせて示す。

考察
以上の結果から、藍葉のエタノール抽出濃縮物及び多価アルコールを含む混合物を濾過してろ液を回収する工程を含む製造方法で製造された藍葉エキスと、ヨモギエキスとを組み合わせて含有させることにより、優れた抗菌活性を発揮させられることが明らかとなった。一方、藍葉の多価アルコール抽出物とヨモギエキスとを組み合わせても、優れた抗菌活性は発揮されなかった。

Claims

藍葉のエタノール抽出濃縮物であって藍葉エタノール抽出液の１０％以下の質量であるエタノール抽出濃縮物、及び多価アルコールを含み、前記エタノール抽出濃縮物と前記多価アルコールとの混合割合（エタノール抽出濃縮物の質量：多価アルコールの質量）が１：１６〜２：１であり、且つ粒径１５μｍ以上の粒子を含まない藍葉エキス、並びに
ヨモギエキス
を含有する組成物。
前記藍葉エキスが、さらに水を含む、請求項１に記載の組成物。
多価アルコールが、１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、イソプレングリコール、及びペンチレングリコールからなる群から選択される少なくとも１種のグリコールである、請求項１又は２に記載の組成物。
抗菌剤である、請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
肌荒れ改善剤である、請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
請求項１〜５のいずれかに記載の組成物を含有する、化粧料組成物。
請求項１〜５のいずれかに記載の組成物を含有する、医薬組成物。
藍葉のエタノール抽出濃縮物であって藍葉エタノール抽出液の１０％以下の質量であるエタノール抽出濃縮物、及び多価アルコールを含み、前記エタノール抽出濃縮物と前記多価アルコールとの混合割合（エタノール抽出濃縮物の質量：多価アルコールの質量）が１：１６〜２：１であり、且つ粒径１５μｍ以上の粒子を含まない混合物。