JPWO2008056827A1 - ベタインの製造方法 - Google Patents

Abstract

本発明によって、副反応を従来よりも大幅に防ぎ、カルニチン等のベタインを高収率で得ることができるベタインの製造方法が提供される。本発明はまた、下記式（２）で示されるアミドを４級アミノ化する工程を含む、下記式（１）で示されるベタインの製造方法に関する。［式中、Ａ１、Ａ２及びＡ３は、置換基を有していてもよいＣ１〜Ｃ２０炭化水素基であり、Ｘ１は、ハロゲン原子である。］

Description

本発明は、ベタイン、特にカルニチンの製造方法に関する。

ベタインの一種であるＬ−カルニチンはビタミンＢＴとも言われ、生体内で脂肪酸の代謝に関係している重要な化合物である。心臓疾患治療剤（特開昭５４−７６８３０号）、過脂肪質血症治療剤（特開昭５４−１１３４０９号）、静脈疾患治療剤等（特開昭５８−８８３１２号）としても注目されてきた。
ベタインの一種であるカルニチンの製造方法としては、特開昭５７−１６５３５２号には、Ｄ−マンニトールを原料としてＬ−カルニチンを得る方法、特開昭６２−２７２９８３号には、（Ｒ，Ｓ）−３，４−エポキシ酪酸エステルを出発として不斉加水分解酵素を用いて選択的に（Ｒ）−３，４−エポキシ酪酸エステルを単離、それにトリメチルアミンまたはトリメチルアミン塩酸塩を作用させてＬ−カルニチンに導く方法、特表２００２−５４４２５２号には、（Ｓ）−（−）クロロコハク酸誘導体を対応する酸無水物に変換後、トリメチルアミンを用いてＬ−カルニチンに導く方法、特表２００２−５２９５２８号には、アルキル−４−クロロ−３−オキソブチレートをルテニウム錯体触媒を用いて選択的に不斉水素還元してアルキル−（Ｒ）−（＋）−４−クロロ−３−ヒドロキシブチレートを製造、続いてトリメチルアミンによる４級アミノ化反応を経てＬ−カルニチンを得る方法など、多くの報告がある。
上記特許文献にもあるように、カルニチン製造工程においてＣ４骨格にトリメチルアミン用いて４級アミノ基を導入する工程は避けて通れない重要な工程であり、またこの工程の収率が全体の収率に大きな影響を及ぼすことが多い。この４級アミノ化反応について特開平２−１４２７５８号には、４−ハロゲノ−３−ヒドロキシ酪酸メチルをケトン溶媒下でトリメチルアミンを用いて４級アミノ化し、続いて得られた酪酸エステル誘導体を加水分解する方法が示されている。この４級化アミノ化反応はアルコールを溶媒として無水トリメチルアミンを用い、オートクレーブ中で８０℃もの高温で反応させるが、４−ハロゲノ−３−ヒドロキシ酪酸メチルの脱水反応が進行してオレフィンが生成するため、選択率は３０〜４０％程度と著しく低く、反応時間も２０時間以上と長い。またケトン溶媒を用いると選択性が向上すると記述されているが、選択率は大幅に向上するものの反応時間はさらに長くなり、５０時間を超えても４−ハロゲノ−３−ヒドロキシ酪酸メチルの転化率は８０％程度に過ぎない。溶媒にエーテル系、トルエン等を用いた場合は反応時間はさらに遅延する上、選択率も高くない。
特開平２−２７９９５号には、γ−クロロ−β−ヒドロキシブチロニトリルに３０％のトリメチルアミン水溶液を加えて４級アミノ化する方法が示されている。４℃で一晩放置後、反応液を減圧濾過することで得られる固体は、純度１００％のカルニチンニトリルクロライドとしても収率７５％程度に過ぎず、高収率であるとはいえない。特開昭６０−２５８４８７号には、４−クロロ−３−ヒドロキシブチロニトリルに大過剰の無水トリメチルアミンを加え、無溶媒で１００℃オートクレーブ中で反応させ、カルニチンニトリルクロライドを収率９４％で得る反応が示されているが、反応条件が厳しく、反応時間も２４時間と長い。
一方、４級アミノ化反応ではないがアミノ基を導入する反応例として、特公昭５３−１３６１１号にはγ−クロロ−β−ヒドロキシブタン酸アミドに約１００当量という大過剰なアンモニアを用いて２０℃程度で１６時間反応をさせ、γ−アミノ−β−ヒドロキシブタン酸アミドを得ているが、大過剰のアンモニアを使用することと反応時間が長いという点で問題があった。同様の反応がＨｅｔｅｒｏｃｙｃｌｅｓ，Ｖｏｌ．５３，Ｎｏ．１，２０００に示されており、（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブタンアミドに約１００当量の大過剰なアンモニア水溶液を加えて、密閉系、１２０℃で８時間作用させ、アミノ基を導入する反応が示されているが、やはり大過剰のアンモニアを使用することと反応時間が長いという点で問題があった。
このように４−ハロ−３−ヒドロキシブタンアミドに大過剰のアンモニアを作用させて長時間反応させればアミノ基が導入される知見はあったが、トリアルキルアミンを作用させた場合については全く知られていなかった。
また、カルニチンなどのベタイン製造工程において全体の収率に大きな影響を及ぼすトリアルキルアミンによる４級アミノ化工程は、従来の４−ハロゲノ−３−ヒドロキシ酪酸メチルやγ−クロロ−β−ヒドロキシブチロニトリルのトリメチルアミンによる４級アミノ化反応では副反応の進行が多く、目的の４級アミノ化生成物を高収率で得ることが困難であった。

そこで本発明では、カルニチンなどのベタイン製造工程で重要な４級アミノ化工程において副反応を従来よりも大幅に防ぎ、カルニチンなどのベタインを高収率で得ることを目的とする。
この従来のカルニチン製造工程における４級アミノ化反応の副反応を防止するため本発明者らが鋭意検討した結果、４−ハロ−３−ヒドロキシブタンアミドを４級アミノ化反応の反応基質として用いることで、ブチロニトリルや酪酸エステルのトリアルキルアミンによる４級アミノ化反応時に起こっていた副反応を大幅に抑えることに成功した。この４−ハロ−３−ヒドロキシブタンアミドを、カルニチン製造工程における４級アミノ化反応の反応基質として用いてカルニチンを製造すると、従来の方法よりも収率が大幅に向上するとともに、反応時間も短縮し、副生成物を大幅に抑えることが可能である。また、この製造方法は、カルニチンのみならず、一定のベタインに適用可能である。
すなわち、本発明は以下に関する。
（１）次式（２）：

［式中、Ｘ^１は、ハロゲン原子である。］
で示される４−ハロ−３−ヒドロキシブタンアミドを（ＮＡ^１Ａ^２Ａ^３）で示されるトリアルキルアミンで４級アミノ化する工程を含む、次式（２’）：

［式中、Ａ^１、Ａ^２及びＡ^３は、それぞれ、互いに独立し、同一または異なって、置換基を有していてもよいＣ_１〜Ｃ_２０炭化水素基であり、Ｘ^１は、ハロゲン原子である。］
で示される４−トリアルキルアミノ−３−ヒドロキシブタンアミドハロゲン化物の製造方法。
（２）前記トリアルキルアミンが、トリメチルアミン、トリエチルアミンおよびトリブチルアミンからなる群より選択されるものである、（１）に記載の方法。
（３）次式（２’）：

［式中、Ａ^１、Ａ^２及びＡ^３は、それぞれ、互いに独立し、同一または異なって、置換基を有していてもよいＣ_１〜Ｃ_２０炭化水素基であり、Ｘ^１は、ハロゲン原子である。］
で示される４−トリアルキルアミノ−３−ヒドロキシブタンアミドハロゲン化物を加水分解する工程を含む、次式（１）：

［式中、Ａ^１、Ａ^２及びＡ^３は、それぞれ、互いに独立し、同一または異なって、置換基を有していてもよいＣ_１〜Ｃ_２０炭化水素基である。］
で示されるベタイン、またはベタインの塩の製造方法。
（４）Ａ^１、Ａ^２およびＡ^３がメチル基である、（３）に記載の方法。
（５）次式（２）：

［式中、Ｘ^１は、ハロゲン原子である。］
で示される４−ハロ−３−ヒドロキシブタンアミドは、次式（３）：

［式中、Ｘ^１は、ハロゲン原子である。］
で示される４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルをアミド化する工程により得られるものである、（３）または（４）に記載の方法。
（６）アミド化がニトリルヒドラターゼで処理するものである、（５）に記載の方法。
（７）前記ニトリルヒドラターゼが、アクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）属、アシドボラックス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ）属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、カセオバクター（Ｃａｓｅｏｂａｃｔｅｒ）属、コマモナス（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ディーツィア（Ｄｉｅｔｚｉａ）属、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、エルビニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属、ジオバチルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ゴルドナ（Ｇｏｒｄｏｎａ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌａ）属、ミクロアスカス（Ｍｉｃｒｏａｓｃｕｓ）モルガネラ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ）属、パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）属、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、シュードノカルディナ（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、シクタリジウム（Ｓｙｃｔａｌｉｄｉｕｍ）属、ツカムレラ（Ｔｕｋａｍｕｒｅｌｌａ）属に属する微生物からなる群より選択される微生物によって産生される、（６）に記載の方法。
（８）前記４−ハロ−３−ヒドロキシブタンアミドの製造工程が、反応液が凍らない温度〜５℃で行われる、（５）〜（７）のいずれか１項に記載の方法。
（９）次式（３）：

［式中、Ｘ^１は、ハロゲン原子である。］
で示される４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルは、次式（４）：

［式中、Ｘ^１は、ハロゲン原子である。］
で示されるエピハロヒドリン、
または、次式（５）：

［式中、Ｘ^１は、上記の意味を有する。Ｘ^２は、Ｘ^１と互いに独立し、同一または異なったハロゲン原子である。］
で示される１，３−ジハロ−２−プロパノールと、
青酸または青酸塩とを反応させる工程により得られるものである、（５）〜（８）のいずれか１項に記載の方法。
（１０）青酸または青酸塩との反応が酵素触媒の存在下で行われるものである（９）に記載の方法。
（１１）前記酵素触媒がハロヒドリンエポキシターゼである（１０）に記載の方法。
（１２）次式（３）：

［式中、Ｘ^１は、ハロゲン原子である。］
で示される４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルが、（Ｒ）体過剰で製造される、（１１）に記載の方法。
（１３）前記ハロヒドリンエポキシターゼが、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アグロバクテリウム属、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属およびアースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物からなる群より選択される微生物によって産生される、（１１）または（１２）に記載の方法。
本発明によれば、カルニチン等のベタインの製造工程において重要なトリアルキルアミンを用いた４級アミノ化反応を、４−ハロ−３−ヒドロキシブタンアミドを基質として用いることにより、主たる副生生物であるクロトン酸誘導体の生成を従来よりも大幅に抑えることが可能となり、高収率でカルニチンなどのベタインを製造することが可能となる。

以下に本発明の実施の形態について説明する。以下の実施形態は、本発明を説明するための単なる例示であって、本発明をこの実施形態にのみ限定することは意図されない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施することが可能である。
なお、本明細書において引用した全ての刊行物、例えば、先行技術文献および公開公報、特許公報その他の特許文献は、その全体が本明細書において参照として組み込まれる。本明細書は、本願優先権主張の基礎となる特願２００６−３０３９７２号明細書の内容を包含する。
本発明では、次式（２）：

［式中、Ｘ^１は、ハロゲン原子である。］
で示される４−ハロ−３−ヒドロキシブタンアミドを（ＮＡ^１Ａ^２Ａ^３）で示されるトリアルキルアミンで４級アミノ化する工程を含む、次式（２’）：

［式中、Ａ^１、Ａ^２及びＡ^３は、それぞれ、互いに独立し、同一または異なって、置換基を有していてもよいＣ_１〜Ｃ_２０炭化水素基であり、Ｘ^１は、ハロゲン原子である。］で示される４−トリアルキルアミノ−３−ヒドロキシブタンアミドハロゲン化物を製造する方法が提供される。また、本発明は、次式（２’）：

［式中、Ａ^１、Ａ^２及びＡ^３は、それぞれ、互いに独立し、同一または異なって、置換基を有していてもよいＣ_１〜Ｃ_２０炭化水素基であり、Ｘ^１は、ハロゲン原子である。］
で示される４−トリアルキルアミノ−３−ヒドロキシブタンアミドハロゲン化物を加水分解する工程を含む、次式（１）：

［式中、Ａ^１、Ａ^２及びＡ^３は、それぞれ、互いに独立し、同一または異なって、置換基を有していてもよいＣ_１〜Ｃ_２０炭化水素基である。］で示されるベタイン、またはベタインの塩を製造する方法が提供される。
さらに、本発明において、下記式（２）で示されるアミドを４級アミノ化する工程と、アミド基を加水分解する工程とを含む、下記式（１）で示されるベタインの製造方法が提供される。

［式中、Ｘ^１、Ａ^１、Ａ^２及びＡ^３は、上記の意味を有する。］
本発明では、下記式（２）で示されるアミドを４級アミノ化する工程を含む、下記式（１）で示されるベタインの製造方法が提供される。

上記式中、Ａ^１、Ａ^２及びＡ^３は、それぞれ、互いに独立し、同一または異なって、置換基を有していてもよいＣ_１〜Ｃ_２０炭化水素基である。
本明細書において、「Ｃ_１〜Ｃ_２０炭化水素基」の炭化水素基は、飽和若しくは不飽和の非環式であってもよいし、飽和若しくは不飽和の環式であってもよい。Ｃ_１〜Ｃ_２０炭化水素基が非環式の場合には、線状でもよいし、枝分かれでもよい。「Ｃ_１〜Ｃ_２０炭化水素基」には、Ｃ_１〜Ｃ_２０アルキル基、Ｃ_２〜Ｃ_２０アルケニル基、Ｃ_２〜Ｃ_２０アルキニル基、Ｃ_４〜Ｃ_２０アルキルジエニル基、Ｃ_６〜Ｃ_１８アリール基、Ｃ_７〜Ｃ_２０アルキルアリール基、Ｃ_７〜Ｃ_２０アリールアルキル基、Ｃ_３〜Ｃ_２０シクロアルキル基、Ｃ_４〜Ｃ_２０シクロアルケニル基、（Ｃ_３〜Ｃ_１０シクロアルキル）Ｃ_１〜Ｃ_１０アルキル基などが含まれる。
本明細書において、「Ｃ_１〜Ｃ_２０アルキル基」は、Ｃ_１〜Ｃ_１０アルキル基であることが好ましく、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル基であることが更に好ましい。アルキル基の例としては、制限するわけではないが、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、ドデカニル等を挙げることができる。
本明細書において、「Ｃ_２〜Ｃ_２０アルケニル基」は、Ｃ_２〜Ｃ_１０アルケニル基であることが好ましく、Ｃ_２〜Ｃ_６アルケニル基であることが更に好ましい。アルケニル基の例としては、制限するわけではないが、ビニル、１−プロペニル、２−プロペニル、イソプロペニル、２−ブテニル等を挙げることができる。
本明細書において、「Ｃ_２〜Ｃ_２０アルキニル基」は、Ｃ_２〜Ｃ_１０アルキニル基であることが好ましく、Ｃ_２〜Ｃ_６アルキニル基であることが更に好ましい。アルキニル基の例としては、制限するわけではないが、エチニル、プロピニル、ブチニル等を挙げることができる。
本明細書において、「Ｃ_４〜Ｃ_２０アルキルジエニル基」は、Ｃ_４〜Ｃ_１０アルキルジエニル基であることが好ましく、Ｃ_４〜Ｃ_６アルキルジエニル基であることが更に好ましい。アルキルジエニル基の例としては、制限するわけではないが、１，３−ブタジエニル等を挙げることができる。
本明細書において、「Ｃ_６〜Ｃ_１８アリール基」は、Ｃ_６〜Ｃ_１２アリール基であることが好ましい。アリール基の例としては、制限するわけではないが、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、インデニル、ビフェニリル、アントリル、フェナントリル等を挙げることができる。
本明細書において、「Ｃ_７〜Ｃ_２０アルキルアリール基」は、Ｃ_７〜Ｃ_１２アルキルアリール基であることが好ましい。アルキルアリール基の例としては、制限するわけではないが、ｏ−トリル、ｍ−トリル、ｐ−トリル、２，３−キシリル、２，４−キシリル、２，５−キシリル、ｏ−クメニル、ｍ−クメニル、ｐ−クメニル、メシチル等を挙げることができる。
本明細書において、「Ｃ_７〜Ｃ_２０アリールアルキル基」は、Ｃ_７〜Ｃ_１２アリールアルキル基であることが好ましい。アリールアルキル基の例としては、制限するわけではないが、ベンジル、フェネチル、ジフェニルメチル、トリフェニルメチル、１−ナフチルメチル、２−ナフチルメチル、２，２−ジフェニルエチル、３−フェニルプロピル、４−フェニルブチル、５−フェニルペンチル等を挙げることができる。
本明細書において、「Ｃ_３〜Ｃ_２０シクロアルキル基」は、Ｃ_３〜Ｃ_１０シクロアルキル基であることが好ましい。シクロアルキル基の例としては、制限するわけではないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル等を挙げることができる。
本明細書において、「Ｃ_４〜Ｃ_２０シクロアルケニル基」は、Ｃ_４〜Ｃ_１０シクロアルケニル基であることが好ましい。シクロアルケニル基の例としては、制限するわけではないが、シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル等を挙げることができる。
本明細書において、Ａ^１、Ａ^２及びＡ^３で示される「Ｃ_１〜Ｃ_２０炭化水素基」には、置換基が導入されていてもよい。この置換基としては、例えば、Ｃ_１〜Ｃ_１０アルコキシ基（例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ等）、Ｃ_６〜Ｃ_１２アリールオキシ基（例えば、フェニルオキシ、ナフチルオキシ、ビフェニルオキシ等）、アミノ基、水酸基、ハロゲン原子（例えば、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素）又はシリル基などを挙げることができる。この場合、置換基は、置換可能な位置に１個以上導入されていてもよく、好ましくは１個〜４個導入されていてもよい。置換基数が２個以上である場合、各置換基は同一であっても異なっていてもよい。
本明細書において、Ａ^１、Ａ^２及びＡ^３は、それぞれ互いに独立し、同一または異なって、Ｃ_１〜Ｃ_２０アルキル基、Ｃ_３〜Ｃ_２０シクロアルキル基、またはＣ_６〜Ｃ_１８アリール基であることが好ましく、Ｃ_１〜Ｃ_１０アルキル基、Ｃ_３〜Ｃ_１０シクロアルキル基、またはＣ_６〜Ｃ_１２アリール基であることが更に好ましく、なかでもメチル基は生体内で脂肪酸の代謝に関係している重要な化合物であるカルニチンに導かれることから、特に好ましい。
本明細書において、ベタインの塩とは、ベタインと、塩酸、硫酸、硝酸などの鉱酸との塩、フマル酸、酒石酸などの有機酸との塩、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどの塩基との塩などを示す。例えばカルニチン塩酸塩、カルニチンフマル酸塩、カルニチン酒石酸塩などが挙げられる。
上記式中、Ｘ^１は、ハロゲン元素を指し、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素を示すが、入手し易さから塩素、臭素であることがより好ましい。
上記式（３）で示される４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリル、上記式（４）で示されるエピハロヒドリン、上記式（２）で示される４−ハロ−３−ヒドロキシブタンアミド、上記式（２’）で示される４−トリアルキルアミノ−３−ヒドロキシブタンアミドハロゲン化物、上記式（１）で示されるベタインには不斉炭素が存在するが、本発明はラセミ体、光学活性体のどちらでも実施可能である。また上記のような光学活性な原料を用いたり、光学活性な化合物を製造して以降の各反応を行った場合も、本発明は温和な条件下での反応が可能であることから、光学純度を低下させることなくベタインまで製造することができる。
本明細書において水性溶媒とは、水または、水と有機溶剤との混合物のことである。水と有機溶剤は二相系でも構わない。使用される有機溶剤としては特に制限はないが、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノールなどのアルコール系溶媒、アセトン、メチルイソブチルケトンなどのケトン系溶媒、酢酸エチル、プロピオン酸エチル、メタクリル酸メチルなどのエステル系溶媒、ペンタン、ヘキサン、ヘプタンなどの炭化水素系溶媒、ベンゼン、トルエン、キシレンなどの芳香族系溶媒、ジクロロメタン、クロロホルムなどの塩素系溶媒、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシドなどが挙げられ、これらの混合溶剤を用いても構わない。水への溶解度が高いアルコール系溶媒、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドを使用することがより好ましい。水に溶解する範囲で有機溶剤を使用することがより好ましく、水が多いと反応速度が速くなることから、水を単独で使用することが特に好ましい。
本発明の製造方法では、下記式（２）で示される４−ハロ−３−ヒドロキシブタンアミドを経由する工程を含む。本明細書において、「経由する」とは、下記式（２）で示されるアミドを出発物質として用いる場合と、出発物質としては他の物を用いるが、中間体として下記式（２）で示されるアミドを経由する場合との双方を意味する。

［式中、Ｘ^１は、上記の意味を有する。］
本発明にかかるベタインの製造方法では、４−ハロ−３−ヒドロキシブタンアミドを４級アミノ化反応の基質として用いることが好ましい。この方法は従来の方法よりも４級アミノ化生成物収率が大幅に改善し、副生成物を大幅に抑えることが可能である。
上記式（２）で示される４−ハロ−３−ヒドロキシブタンアミドの製法は特に制限はない。例えば化学的反応により得る方法として、エステルとアンモニアを用いてアミドに変換する方法、酸ハロゲン化物とアンモニアを用いてアミドに変換する方法、酸や塩基を触媒としてニトリルをアミドに変換する方法などが挙げられ、いずれの方法でも構わない。ニトリルからアミドに変換する方法としては、塩酸などの鉱酸やギ酸などを使用する方法、過酸化水素とアルカリを作用させる方法、二酸化マンガンを用いる方法などが知られており、いずれの方法を用いてもよい。
またニトリルヒドラターゼの作用により前記式（３）で示される４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルをアミド化して上記式（２）で示される４−ハロ−３−ヒドロキシブタンアミドを製造することもできる。この反応は温和な条件下で行うことが可能であるため、厳しい条件や複雑な操作を必要とする酸・塩基触媒を用いた際の副反応の進行を抑制することが可能である。

［式中、Ｘ^１は、上記の意味を有する。］
上記式（３）で示される４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルにニトリルヒドラターゼを作用させた場合、上記式（２）で示されるアミドからさらに加水分解反応が起こることはなく、温和な条件下で、しかもほぼ定量的に上記式（２）で示されるアミドを得ることができる。
本発明において、上記式（２）で示されるアミドの前駆体である、４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの製法は特に限定されないが、たとえば、下記式（４）で示されるエピハロヒドリンと青酸とから合成する方法（特開２００２−２４１３５７に示されている）、エピハロヒドリンと青酸塩とから合成する方法（特開２００４−１８２６０７参照）、

［式中、Ｘ^１は、上記の意味を有する。］
下記式（５）で示される１，３−ジクロロ−２−プロパノールと青酸とから合成する方法（特開平５−２１９９６５参照）

［式中、Ｘ^１は、上記の意味を有する。Ｘ^２は、Ｘ^１と互いに独立し、同一または異なったハロゲン原子である。］
など、いずれの方法で合成したものも使用することができる。ここで、青酸塩としては、青酸のアルカリ金属塩を用いることが好ましく、ＮａＣＮ、ＫＣＮ、ＬｉＣＮを用いることがより好ましい。また、前記式（４）で示されるエピハロヒドリンの光学活性体を用いた場合、光学活性な４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを製造することも可能である。
また、酵素触媒（ハロヒドリンエポキシダーゼ）を用いることにより、前記式（４）で示されるエピハロヒドリンや前記式（５）で示される１，３−ジハロ−２−プロパノールから、直接光学活性４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを製造してもよい。
本発明において、ハロヒドリンエポキシダーゼは前記式（４）で示されるエピハロヒドリンや前記式（５）で示される１，３−ジハロ−２−プロパノールから、４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを生成する機能を有すれば特に限定されない。
ハロヒドリンエポキシダーゼを産生する微生物としては、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アグロバクテリウム属、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属およびアースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物である。
具体的微生物としては、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ．Ｎ−１０７４（ＦＥＲＭ ＢＰ−２６４３）、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ．Ｎ−４７０１（ＦＥＲＭ ＢＰ−２６４４）、アグロバクテリウム ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）ＡＤ１、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ．ＧＰ１およびアースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ｓｐ．ＡＤ２等が挙げられる。
特に好ましい微生物は、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ．Ｎ−１０７４（ＦＥＲＭ ＢＰ−２６４３）、及びミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ．Ｎ−４７０１（ＦＥＲＭ ＢＰ−２６４４）である。Ｎ−４７０１株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１−１−１中央第６）に平成１年４月１９日付で寄託されており、その受託番号はＦＥＲＭ ＢＰ−２６４３及びＦＥＲＭ ＢＰ−２６４４である。
また、上記微生物のハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子をクローニングし、形質転換（導入）した微生物も、上記のハロヒドリンエポキシダーゼを産生する微生物として含まれる。
ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋに公表されており、コリネバクテリウムｓｐ．（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）Ｎ−１０７４由来のハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子（ｈｈｅＢ）のＡｃｃｅｓｓｉｏｎ番号はＤ９０３５０である。
本発明に係るハロヒドリンエポキシダーゼは、上述の方法で調製されたハロヒドリンエポキシダーゼ活性を有する微生物を培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。
ハロヒドリンエポキシダーゼ活性を有する微生物を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が挙げられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー等が挙げられる。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅若しくは炭酸カルシウム等が挙げられる。
上記微生物の培養は常法によればよく、例えばｐＨ４〜１０、温度１０〜４５℃の範囲にて好気的に１０〜１８０時間培養する。培養は液体培養、固体培養のいずれでも行うことができる。形質転換体の培養は、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、３０〜４０℃で行うことが好ましい。培養中は必要に応じてアンピシリンやカナマシン等の抗生物質、インデューサーを培地に添加してもよい。
上記の方法で調製したハロヒドリンエポキシダーゼを培養して得られる培養物またはその処理物は前記式（４）で示されるエピハロヒドリンや前記式（５）で示される１，３−ジハロ−２−プロパノールから、４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを製造することができる。「処理物」とは、菌体の破砕物、薬剤処理した菌体、固定化した菌体、粗酵素・精製酵素等の菌体抽出物を意味する。
反応液の溶媒としては、特に制限はないが、一般には前記水性溶媒を用いる。特に水が好ましく、酵素活性の最適ｐＨ４〜１０の付近である水または緩衝液を使用する。緩衝液としては、例えば、リン酸、ホウ酸、クエン酸、グルタル酸、リンゴ酸、マロン酸、ｏ−フタル酸、コハク酸又は酢酸等の塩等によって構成される緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液あるいはグッド緩衝液等が好ましい。
反応温度は、５〜５０℃、反応ｐＨ は４〜１０の範囲で行うことが好ましい。反応温度は、より好ましくは１０〜４０℃である。反応ｐＨは、より好ましくはｐＨ６〜９である。反応時間は基質等の濃度、菌体濃度あるいはその他の反応条件等によって適時選択するが、１〜１２０時間で終了するように条件を設定することが好ましい。尚、本反応においては、反応の進行に伴い生成する塩素イオンを適当なアルカリで中和することでより反応を円滑に進行させることができる。
また、シアン化合物としては、シアン化水素、シアン化カリウム、シアン化ナトリウム、シアン酸又はアセトンシアンヒドリン等の反応液中に添加した際にシアンイオン（ＣＮ−）又はシアン化水素を生じる化合物又はその溶液を用いることができる。
反応液中の基質濃度は、酵素安定性の観点から０．０１〜２０（Ｗ／Ｖ）％が好ましく、０．０１〜１０％が特に好ましい。
また、シアン化合物の使用量は、酵素安定性の観点から基質の１〜３倍量（モル）が好ましい。
以上のような方法で製造された上記式（３）で示される４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルは、公知の方法を用いて採取および精製することができる。例えば、反応液から遠心分離等の方法を用いて菌体を除いた後、酢酸エチルなどの溶媒で抽出を行い、減圧下に溶媒を除去することにより４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルのシロップを得ることができる。しばしば着色が発生し反応液が褐色になるが、活性炭などにより脱色操作を行ってもよい。また、これらのシロップを減圧下に蒸留することによりさらに精製することもできる。
光学活性な４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを用いて本発明を実施する場合、その光学純度は、以後の反応が温和な条件であることから、光学純度を低下させることなくベタインまで製造することが可能である。
本発明において、ニトリルヒドラターゼは特に限定されないが、上記式（３）で示される４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルのニトリルをアミドへ変換する反応を触媒する酵素であり、国際的な酵素分類によればリアーゼに属する酵素である。本発明で使用するニトリルヒドラターゼを有する微生物は、例えば、アクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）属、アシドボラックス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ）属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、カセオバクター（Ｃａｓｅｏｂａｃｔｅｒ）属、コマモナス（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ディーツィア（Ｄｉｅｔｚｉａ）属、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、エルビニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属、ジオバチルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ゴルドナ（Ｇｏｒｄｏｎａ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌａ）属、ミクロアスカス（Ｍｉｃｒｏａｓｃｕｓ）モルガネラ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ）属、パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）属、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、シュードノカルディナ（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、シクタリジウム（Ｓｙｃｔａｌｉｄｉｕｍ）属、ツカムレラ（Ｔｕｋａｍｕｒｅｌｌａ）属に属する微生物である。
本発明で使用するニトリルヒドラターゼとしては、具体的には、アースロバクター グロビフォルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｏｂｉ−ｆｏｒｍｉｓ）ＩＦＯ １２１３８、ブレビバクテリウム ヘルボラム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｌｖｏｌｕｍ）ＡＴＣＣ １１８２２、コリネバクテリウム フラベシエンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｅｓ−ｃｅｎｓ）ＩＡＭ １６４２、ロドコッカス エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＩＦＯ １２５４０およびＩＦＯ １２５３９、ストレプトマイセスアルボグリセルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｏｇｒｉｓｅｏｌｕｓ）ＨＵＴ ６０４５、ストレプトマイセス クリゾマルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｈｒｙｓｏｍａｌｌｕｓ）ＨＵＴ ６１４１、ストレプトマイセス シネレオルバー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｅｒｅｏｕｒｕｂｅｒ）ＨＵＴ６１４２、ストレプトマイセス ヂアスタチカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）ＨＵＴ ６１１６、ストレプトマイセス オリバセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｏｌｉｖａｃｅｕｓ）ＨＵＴ ６０６１、ストレプトマイセス ルブロシアノヂアスタチカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｒｕｂｒｏｃｙａｎｏｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）ＨＵＴ ６１１７、クレブシエラ ニュウモニアエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＩＦＯ １２０１９、ＩＦＯ ３３１９、ＩＦＯ １２０５９、ＩＡＭ １０６３、クレブシエラ ニュウモニアエ サブスピーシズ ニュウモニアエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ｓｕｂｓｐ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＮＨ−３６Ｔ２株、セラチア ピリムシカ（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ）ＩＦＯ ３０５５、セラチア マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）ＩＡＭ １１０５、エルビニア キャロトボラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）ＩＦＯ ３０５７、ツカムレラ ポーロメタボラム（Ｔｕｋａｍｕｒｅｌｌａ ｐａｕｒｏｍｅｔａｂｏｌｕｍ）ＪＣＭ ３２２６、ゴルドナ ルブロペルチンクタス（Ｇｏｒｄｏｎａ ｒｕｂｒｏｐｅｒｔｉｎｃｔｕｓ）ＪＣＭ ３２２７、モルガネラ モルガニ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ ｍｏｒｇａｎｉｉ）ＩＦＯ ３８４８、プロテウス ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）ＩＦＯ ３１６７、エンテロバクター エアロジェネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）ＩＦＯ １２０１０、ミクロアスカス デスモスポラス（Ｍｉｃｒｏａｓｃｕｓ ｄｅｓｍｏｓｐｏｒｕｓ）ＩＦＯ６７６１、キャンディダ グイリエモンディー（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）ＮＨ−２株（ＦＥＲＭ Ｐ−１１３５０号）、パントエア アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）ＮＨ−３株（ＦＥＲＭ Ｐ−１１３４９号）などが産生するニトリルヒドラターゼが挙げられる。
なお、ＡＴＣＣ番号が付与された微生物菌株は、各々アメリカンタイプカルチァーコレクション（ＡＴＣＣ）から容易に入手することができる。また、ＩＦＯ番号の付された微生物は、（財）醗酵研究所（ＩＦＯ）発行の「Ｌｉｓｔ ｏｆ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ、第８版、第１巻（１９８８）」に記載されており、現在は独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部生物遺伝資源部門遺伝資源保存課から入手できる。ＩＡＭ番号の付された微生物は東京大学応用微生物学研究所から入手できる。ＪＣＭ番号の付された微生物は、理化学研究所 系統微生物保存機関発行の「Ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｏｆ ｓｔｒａｉｎｓ 第４版（１９８９）」に記載されており、理化学研究所 系統微生物保存機関より入手できる。ＨＵＴ番号の付された微生物は、日本微生物保存連盟（ＪＦＣＣ）発行の「Ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｏｆ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ、第４版（１９８７）」に記載されており、広島大学工学部から入手できる。ＦＥＲＭ番号の付された微生物は、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターから入手できる。
さらに、本発明で使用するニトリルヒドラターゼとしては、さらに山田らが土壌より分離したロドコッカス ロドクロウス Ｊ−１〔ＦＥＲＭ ＢＰ−１４７８号〕、及びアースロバクター ｓｐ．ＳＫ１０３〔ＦＥＲＭ Ｐ−１１３００号〕、カセオバクター ｓｐ．ＢＣ２３〔ＦＥＲＭ Ｐ−１１２６１号〕、シュードモナス ｓｐ．ＢＣ１５−２〔ＦＥＲＭ ＢＰ−３３２０号〕、シュードモナス ｓｐ．ＳＫ３１〔ＦＥＲＭ Ｐ−１１３１０号〕、シュードモナス ｓｐ．ＳＫ８７〔ＦＥＲＭ Ｐ−１１３１１号〕、シュードモナスｓｐ．ＳＫ１３〔ＦＥＲＭ ＢＰ−３３２５号〕、ロドコッカス ｓｐ．ＳＫ７０〔ＦＥＲＭ Ｐ−１１３０４号〕、ロドコッカス ｓｐ．ＨＲ１１〔ＦＥＲＭ Ｐ−１１３０６号〕およびロドコッカス ｓｐ．ＳＫ４９〔ＦＥＲＭ Ｐ−１１３０３号〕などが産生するニトリルヒドラターゼも挙げられる。これらの細菌は、それぞれ上記寄託番号にて独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託されている。
また、上記微生物のニトリルヒドラターゼ遺伝子をクローニングし、形質転換（導入）した微生物も、上記のニトリルヒドラターゼを産生する微生物として含まれる。例えば、米国特許第５８０７７３０号に記載のシュードノカルディア（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ）属のニトリルヒドラターゼ遺伝子で形質転換した大腸菌（ＭＴ−１０８２２株（ＦＥＲＭ ＢＰ−５７８５））、特開平８−２６６２７７号公報記載のアクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）属のニトリルヒドラターゼで形質転換した大腸菌（ＭＴ−１０７７０株（ＦＥＲＭ Ｐ−１４７５６））、特開平４−２１１３７９号公報記載のロドコッカス・ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）種のニトリルヒドラターゼで形質転換した微生物などが挙げられる。
本発明で使用するニトリルヒドラターゼを産生する微生物を培養するための培地組成としては、特に限定されないが、通常これらの微生物が生育し得るものならば何でも使用することができる。例えば、炭素源としてグルコース、フラクトース、シュークロース、マルトースなどの糖類、酢酸、クエン酸などの有機酸類、エタノール、グリセロールなどのアルコール類など、窒素源としてペプトン、肉エキス、酵母エキス、タンパク質加水分解物、アミノ酸類などの天然窒素源の他に各種無機、有機酸アンモニウム塩などが使用でき、このほか、無機塩、微量金属、ビタミンなどが必要に応じて適宜使用される。この際、より高い酵素活性を誘導させるために４−クロロ−３−ヒドロキシブチロニトリル、プロピオニトリル、イソブチロニトリル、ベンジルシアニドなどの各種ニトリル化合物、４−クロロ−３−ヒドロキシブタンアミド、プロピオンアミド、イソブタンアミドなどの各種アミド化合物などを培地に添加することがより好ましい。上記微生物の培養は常法によればよく、例えばｐＨ４〜１０、温度１０〜４５℃の範囲にて好気的に１０〜１８０時間培養する。培養は液体培養、固体培養のいずれでも行うことができる。
本発明において、４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルに酵素を作用させて４−ハロ−３−ヒドロキシブタンアミドを得る方法としては特に限定されないが、上記のようにして得たニトリルヒドラターゼを産生させた微生物の培養液あるいは遠心分離などにより得た菌体の懸濁液に基質を添加する方法、前記微生物菌体処理物（例えば菌体破砕物、菌体抽出物など）、ニトリルヒドラターゼ粗酵素、精製酵素などの懸濁液に基質を添加する方法、あるいは常法により固定化した菌体または菌体処理物、粗酵素、精製酵素などを反応液に添加する方法、微生物の培養時に基質を培養液に添加して培養と同時に反応を行う方法、基質の水溶液を調製して上記のようにして得た微生物培養液、微生物菌体、微生物菌体処理物、ニトリルヒドラターゼ粗酵素、精製酵素、あるいはそれらを固定化したものを一括若しくは分割して添加する方法などが挙げられるが、このアミド化反応が発熱反応であり、発熱による反応の暴走を防ぐことから菌体の懸濁液を基質の水溶液に添加し、反応速度を制御することが好ましい。
エピハロヒドリンや１，３−ジクロロ−２−プロパノールを原料とし、青酸または青酸塩と作用させて４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを製造する方法などで合成した反応終了液をそのまま用いて、次のニトリルヒドラターゼによるアミド化反応を行ってもよい。この場合、系内に残存している青酸化合物がニトリルヒドラターゼを失活させてしまうことがしばしばある。それを防止するために予め酸性条件下で加熱、減圧、トッピングなどの操作を行い、系内の青酸濃度を１０ｐｐｍ以下、さらには１ｐｐｍ以下にすることがより好ましい。
さらに、系内の青酸濃度を１ｐｐｍ以下にしても４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルのアミド化反応が迅速に進行しない場合は、４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルまたはその溶液を加熱処理することでアミド化反応が迅速に進行する場合がある。
その加熱方法は、本発明の目的が達成されれば特に制限はなく、加圧、減圧、常圧条件下のいずれも選択できる。また４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルおよびその溶液を、その沸点以上に加熱し、還流又は留去する方法などが挙げられる。溶液は有機溶剤でも水溶液でもそれらの混合液でも構わないが、通常アミド化反応は水溶媒中で行われ、連続して反応を行うことが可能であることから、水溶媒中で加熱処理することが好ましい。
加熱時間は、０．１〜１００時間程度で、０．５〜５０時間が好ましく、さらに好ましくは１〜１０時間である。加熱温度は、４０℃程度から４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルが分解しない温度までの範囲で処理することが可能であり、６０〜１５０℃が好ましい。４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの水溶液を加熱処理する時、その分解を防ぐため、ｐＨは中性〜酸性領域が好ましく、ｐＨ１〜７がより好ましい。
また、微量の金属塩を添加することで、４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリル中に極微量含まれるシアンイオンを金属錯体とすることで低減させることにより、アミド化反応を迅速に進行させることもできる。金属錯体とする方法は、該ニトリルとニトリルヒドラターゼを接触させる前に、青酸と反応して金属シアン化物錯体を形成する金属を、該ニトリルまたは該ニトリルを含む溶液に金属塩として添加することにより、シアンイオンを金属シアノ化錯体とする方法である。金属としては、コバルト、ニッケル、亜鉛が好ましく、塩の形態としては、特に制限されないが、硝酸塩、塩化物、硫酸塩、カルボン酸塩が例示できる。また水和物を用いてもよい。
微量の金属塩を添加する時には、４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを含む溶液に含まれるシアンイオン濃度に応じた量の金属塩を添加する必要がある。金属添加量が不十分な場合ではシアンイオンの影響を十分に除去できない。また、金属添加量が過剰な場合では逆にアミド化反応を阻害するようである。また、金属塩の添加後にはニトリルヒドラターゼが高活性を示す至適ｐＨに再度調節してから、アミド化反応に移ることが好ましい。
本発明におけるニトリルヒドラターゼによるアミド化反応の条件に特に制限がなく、その反応温度は使用する酵素によって適宜決定される。一般には反応液が凍らない温度〜５０℃程度である。「反応液が凍らない温度」とは、どのような反応液中でアミド化反応を行うかにより、その温度は異なる。希薄溶液での反応であれば、反応液に溶解している溶質のモル濃度（ｍｏｌ／ｋｇ）と溶媒のモル凝固点降下の値からその温度は算出できる。例えば、水媒体に溶解した１４％程度の４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルをアミド化反応に供する場合、その反応液が凍らない温度とは、水の凝固点降下が１．８５８、４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルのモル濃度（ｍｏｌ／ｋｇ）が１．１７１であるので、凝固点は約−２℃程度となる。特許第３０１４１７１号には４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルに酵素を作用させて４−ハロ−３−ヒドロキシブタンアミドを合成する反応温度は、５〜５０℃と記載されている。本発明において特にベタインの製造を行う目的での４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの４−ハロ−３−ヒドロキシブタンアミドへのアミド化反応は、副反応の進行を抑制するために反応液が凍らない温度〜３０℃程度がより好ましく、反応液が凍らない温度〜５℃が特に好ましい。４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリル濃度は特に限定されないが、０．０１〜５０（Ｗ／Ｖ）％程度が通常で、０．１〜４０％程度がより好ましい。反応液のｐＨは４〜１０の範囲が好ましく、６〜９で行うことがより好ましい。反応時間は基質濃度、菌体濃度あるいはそのほかの反応条件によって変わるが、通常０．５〜１２０時間で終了するように条件を設定することが好ましく、副反応の進行を抑制するためにも、０．５〜２４時間程度、さらには０．５〜１５時間程度で終了するように設定することがより好ましい。
以上のようにして合成した４−ハロ−３−ヒドロキシブタンアミドは、抽出、カラム分離、再結晶等の定法に従い、単離精製することができる。ニトリルヒドラターゼを有する微生物を用いた場合、反応終了後に菌体等を濾過してもよいが、４−ハロ−３−ヒドロキシブタンアミドは水溶液中で不安定であり、低温で濾過操作を行う必要がある。０〜１０℃程度で操作を行うことがより好ましい。
４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの光学活性体をアミド化反応の基質として用いた場合、４−ハロ−３−ヒドロキシブタンアミドも光学活性体となるが、光学活性体のどちらか一方が過剰な状態であれば、４−ハロ−３−ヒドロキシブタンアミドの再結晶操作などを行えば光学純度を向上させることが可能である。またラセミ体の４−ハロ−３−ヒドロキシブタンアミドを製造した場合は、光学分割剤などを用いて光学活性な４−ハロ−３−ヒドロキシブタンアミドを得ることも可能である。
本発明で使用する上記式（２）で示される４−ハロ−３−ヒドロキシブタンアミドは、精製したものを使用してもよく、ニトリルヒドラターゼを作用させた後の水溶液の状態でもよい。但し、前述のように４−ハロ−３−ヒドロキシブタンアミドは水溶液中で不安定であり、単離精製を行うとさらなる反応を起こして収率の低下を招くことがある。この点、カラム精製等による単離精製は、繁雑な上８０％程度の単離精製収率であること、また最終生成物までのトータル収率を考慮すると、ニトリルヒドラターゼを作用させたあとの水溶液をそのまま使用することが好ましい。
前述のように４−ハロ−３−ヒドロキシブタンアミドは水溶液中で不安定であることから、副反応を抑制するために４−ハロ−３−ヒドロキシブタンアミドの製造終了後、４８時間以内にトリアルキルアミンによる４級アミノ化反応に移ることがより好ましく、１０時間以内であることが特に好ましい。またトリアルキルアミンと接触させるまで、反応終了液の温度は０〜１０℃に保つことが好ましい。
本発明において、下記式（１）で示されるベタインの製造方法は、下記式（２）で示されるアミドを４級アミノ化する工程と、アミド基を加水分解する工程とを含むことが好ましい。化合物（２）の加水分解反応は様々な副反応が起こるため、収率向上の観点から４級アミノ化工程を先に行って化合物（２’）で示される４−トリアルキルアミノ−３−ヒドロキシブタンアミドハロゲン化物を製造し、続いて加水分解工程を行う。

［式中、Ｘ^１、Ａ^１、Ａ^２及びＡ^３は、上記の意味を有する。］
本発明において、上記式（２）で示されるアミドを４級アミノ化する工程において、トリメチルアミン、トリエチルアミン、トリブチルアミン等のトリアルキルアミン（ＮＡ^１Ａ^２Ａ^３）を使用することが好ましい。本発明で使用するトリアルキルアミンは、無水の状態でも水溶液の状態でも構わない。
４級アミノ化反応において、上記式（２）で示される４−ハロ−３−ヒドロキシブタンアミドの溶液を用いて反応を行う場合、その溶媒は特に限定されるものではないが、前記水性溶媒を用いることが好ましい。
４級アミノ化反応において、上記式（２）で示される４−ハロ−３−ヒドロキシブタンアミドの溶液を用いて反応を行う場合、この反応の際に使用するトリアルキルアミンは、無水のトリアルキルアミンでもその水溶液でもどちらでも構わないが、４−ハロ−３−ヒドロキシブタンアミド溶液の溶媒として、水と相溶性のある有機溶剤を用いた場合は、トリアルキルアミンの水溶液を用いた方が高収率と高反応速度をもたらすことが多いためより好ましく、水を単独で用いて反応を行う方が高収率と高反応速度をもたらすため、４−ハロ−３−ヒドロキシブタンアミドの水溶液、あるいは、４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルからニトリルヒドラターゼを作用させて４−ハロ−３−ヒドロキシブタンアミドを合成した反応あがりの水溶液をそのまま用いることが、特に好ましい。
水性溶媒中で４級アミノ化反応を開始する時は、４−ハロ−３−ヒドロキシブタンアミドにトリアルキルアミンを添加しても、トリアルキルアミンに４−ハロ−３−ヒドロキシブタンアミドを添加しても、どちらでも構わない。添加が完了した後に所定の温度へ上昇させることが好ましい。
４級アミノ化反応における４−ハロ−３−ヒドロキシブタンアミドの濃度は、特に限定されるものではないが、通常０．１〜５０％程度であり、１〜２０％程度がより好ましい。一方、トリアルキルアミンの使用量は、特に限定されるものではないが、通常４−ハロ−３−ヒドロキシブタンアミドに対して１．０〜２０．０当量（モル）であり、１．１〜８．０当量程度がより好ましい。反応温度は特に限定されるものではないが、通常−１０℃〜６０℃程度であり、０℃〜５０℃程度がより好ましい。
またトリメチルアミンなどの沸点が低いトリアルキルアミンを使用する時は、トリアルキルアミンの揮発によるトリアルキルアミンの減少に注意を払うことが好ましい。特に反応に用いるトリアルキルアミンの当量数が、４−ハロ−３−ヒドロキシブタンアミドに対して１．２当量以下などの比較的低当量である時、気化しないように注意を払った場合とそうでない場合との４−トリアルキルアミノ−３−ヒドロキシブタンアミドハロゲン化物の収率には顕著な違いが見られる。
４級アミノ化反応では褐色に着色することがある。この脱色のため、活性炭などによる脱色操作を行ってもよい。
以上のようにして合成した上記式（２’）で示される４−トリアルキルアミノ−３−ヒドロキシブタンアミドハロゲン化物は、抽出、カラム分離、再結晶、電気透析、イオン交換法等の定法に従い、単離精製することができる。
４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルまたは４−ハロ−３−ヒドロキシブタンアミドの光学活性体を４級アミノ化反応の前駆体、若しくは基質として用いた場合、上記式（２’）で示される４−トリアルキルアミノ−３−ヒドロキシブタンアミドハロゲン化物も光学活性体となるが、光学活性体のどちらか一方が過剰な状態であれば、上記式（２’）で示される４−トリアルキルアミノ−３−ヒドロキシブタンアミドハロゲン化物の再結晶操作などを行えば光学純度を向上させることが可能である。またラセミ体の４−トリアルキルアミノ−３−ヒドロキシブタンアミドハロゲン化物を製造した場合は、光学分割剤などを用いて光学活性な４−トリアルキルアミノ−３−ヒドロキシブタンアミドハロゲン化物を得ることも可能である。
４−ハロ−３−ヒドロキシブタンアミドを基質として用い、水性溶媒中で４級アミノ化反応を行うと、これまで報告されたような４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルや４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルの４級アミノ化反応と比較して、格段に４級アミノ化生成物の収率が高い。４級アミノ化反応は、ハロヒドリン化合物から脱塩酸反応が起こってエポキシ化合物が生成した後、トリアルキルアミンの求核攻撃により４級アミノ化物が生成する反応が主反応、クロトン酸誘導体への異性化反応が副反応であると想定される。このクロトン酸誘導体への異性化反応の起こりやすさが４級アミノ化生成物の収率の高低を左右し、異性化のし易さを決定するのは官能基の電子吸引性であると予想される。ニトリルやエステルといった官能基よりもアミドの方が電子吸引性が低く、クロトン酸誘導体への異性化反応が起こりにくい。このためエポキシ体→クロトン酸誘導体への異性化反応の割合が減少し、その分トリアルキルアミンの求核攻撃の割合が上昇して４級アミノ化生成収率が高くなったものと想定される。
本発明において、上記式（２’）で示される４−トリアルキルアミノ−３−ヒドロキシブタンアミドハロゲン化物を加水分解する工程において、加水分解反応の方法は特に限定されず、酸触媒、塩基触媒を用いた種々の公知の方法で行うことができる。例えば特公昭４３−２６８４９、特開昭５５−１３２９９にはシュウ酸を用いて加水分解反応を行う方法、特公昭４３−２６８５０にはｎ−亜硝酸ブチルと氷酢酸及び塩酸ガスを用いて加水分解する方法、特開平１−２８７０６５には、カルニチンニトリルクロライドから一貫してアルカリ金属水酸化物やアルカリ土類金属水酸化物などの塩基触媒を用いてニトリル→アミド→カルボン酸への加水分解する方法が示されている。また特開平０４−３２０６７９にはカルニチンアミドをＬ−カルニチンに変換する酵素を用いる方法が示されているが、酸触媒、塩基触媒、酵素触媒のいずれの方法にも限定されるものではない。
４−トリアルキルアミノ−３−ヒドロキシブタンアミドハロゲン化物の加水分解反応における主な副生成物は、脱水体であるクロトノベタインである。
４−トリアルキルアミノ−３−ヒドロキシブタンアミドハロゲン化物の酸触媒による加水分解反応では、このクロトノベタインの副生を抑える（対ベタインで０．１ｗｔ％以下）ことが可能であるが、反応速度が遅いために厳しい反応条件が必要である。使用される酸性物質としては、塩酸、硫酸、リン酸、硝酸などの鉱酸や、酢酸、トリフルオロ酢酸などの比較的低炭素数の有機酸などが使用されるが、工業的によく使用される塩酸や硫酸を使用することが好ましい。
４−トリアルキルアミノ−３−ヒドロキシブタンアミドハロゲン化物の塩基触媒による加水分解では、酸触媒の場合よりもクロトノベタインの生成量は多いが、塩基の種類によっては室温下でも効率よく加水分解反応を進めることができ、このような穏やかな反応条件下であればクロトノベタインの生成を抑える（対ベタインで１ｗｔ％以下程度）ことも可能である。また塩基触媒の場合は副生するアンモニアを気化除去できるため、加水分解後の中和の際に副生する塩を少なくすることが可能になる。使用される塩基性物質としては、アルカリ金属水酸化物、アルカリ土類金属水酸化物、アルカリ金属の炭酸塩または重炭酸塩、第３級アミン、第４級アンモニウムヒドロキシド、塩基性陰イオン交換樹脂などが挙げられ、具体的にはＮａＯＨ、ＫＯＨ、Ｃａ（ＯＨ）_２、Ｎａ_２ＣＯ_３、Ｋ_２ＣＯ_３、トリエチルアミン、ＮＨ_４ＯＨ、陰イオン交換樹脂ＩＲＡ−４００などが挙げられる。これらは単独で用いても、２種類以上を組み合わせて用いてもよい。特にＮａＯＨ、ＫＯＨは反応を室温下でも効率よく進めることができ、しかもクロトノベタインの副生が少ないので好ましい。
酸、塩基の使用量は、上記式（２’）で示される４−トリアルキルアミノ−３−ヒドロキシブタンアミドハロゲン化物に対して等モル以上になるように加えればよく、１．１〜５．０当量程度がより好ましい。上記式（２’）で示される４−トリアルキルアミノ−３−ヒドロキシブタンアミドハロゲン化物の濃度は特に限定されないが、通常は１〜５０％程度で、５〜３０％程度がより好ましい。反応温度は特に限定されないが、通常は５〜１００℃が好ましい。酸触媒を用いた場合はクロトノベタインの生成は極めて少ないため、反応時間の観点から６０〜１００℃が特に好ましい。また塩基触媒を用いた場合を鋭意検討した結果、クロトノベタインの副生量は反応温度に依存し、反応温度を低くしたほうが生成を抑えられることがわかった。よって塩基触媒を用いた場合は、クロトノベタインの副生を抑える観点から、１０〜６０℃がより好ましい。
溶媒としては特に制限はないが、前記水性溶媒が好ましく、反応速度と副反応抑制の観点から水単独を溶媒として使用することが特に好ましい。また４級アミノ化反応を水性溶媒で行った場合は、そのまま水性溶媒で加水分解反応を行うことがより好ましい。
これまで述べてきた４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルのアミド化反応、４−ハロ−３−ヒドロキシブタンアミドの４級アミノ化反応、４−トリアルキルアミノ−３−ヒドロキシブタンアミドハロゲン化物の加水分解反応は、反応速度の観点からいずれも水性溶媒中で行うことが好ましい。特に、水単独を反応溶媒とすることでさらにその効果は顕著となる。また、エピハロヒドリンまたは１，３−ジハロ−２−プロパノールから４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを合成する反応も、通常は水性溶媒中で行われる。よって前述のすべての反応において水を単独で溶媒として用いると、出発原料からベタインまでワンポットで反応させることもできるため、より好ましい。
加水分解反応では、薄い褐色に着色することがある。また加水分解反応終了後の中和後にも着色することがある。この脱色のため、活性炭などによる脱色操作を行ってもよい。
上記のようにして得られたベタインは、抽出、カラム分離、再結晶、電気透析、イオン交換法等の定法に従い、単離精製することができる。
４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリル、４−ハロ−３−ヒドロキシブタンアミド、４−トリアルキルアミノ−３−ヒドロキシブタンアミドハロゲン化物の光学活性体を加水分解反応の前駆体、若しくは基質として用いた場合、得られたベタインも光学活性体となるが、光学活性体のどちらか一方が過剰な状態であれば、ベタインの再結晶操作などを行えば光学純度を向上させることが可能である。またラセミ体のベタインを製造した場合は、光学分割剤などを用いることによって、光学活性なベタインを得ることも可能である。
４−ハロ−３−ヒドロキシブタンアミド、４−トリアルキルアミノ−３−ヒドロキシブタンアミドハロゲン化物およびベタインのいずれの段階でも再結晶操作などで光学純度を向上させることが可能であるが、各反応工程において副生成物が発生するため、ベタインまで製造してから精製を兼ねた再結晶操作などにより光学純度向上操作をまとめて行うことがより好ましい。
本発明において、光学活性なエピハロヒドリン、４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリル、４−ハロ−３−ヒドロキシブタンアミド、４−トリアルキルアミノ−３−ヒドロキシブタンアミドハロゲン化物を製造または使用してベタインの製造を行った場合、光学純度を低下させることなく対応する光学活性なベタインを生成することができる。すなわち本発明は、光学活性なベタイン、特にＬ−カルニチンを製造する方法として有用である。

以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明はこの例のみに限定されるものではない。
本発明において使用した各種定量分析方法について、分析方法詳細を以下に示す。
分析方法（１）
・ 分析対象化合物

・ 試料調製方法 ：反応液を移動相に溶解
・ カラム ：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３Ｖ，４．６ｍｍ
Ｉ．Ｄ．×２５０ｍｍ，粒径５μｍ（ＧＬサイエンス製）
・ カラムオーブン温度 ：４０℃
・ 移動相 ：水／アセトニトリル／りん酸＝７０／３０／０．１、
１ｍＬ／ｍｉｎ
・ 検出器 ：示差屈折計（ＲＩ）
・ 注入量 ：２０μｌ
・ 保持時間 ：ＤＣＰ １５．７ｍｉｎ
：ＥＣＨ １１ｍｉｎ
：ＣＨＢＮ ７．２ｍｉｎ
分析方法（２）
・ 分析対象化合物

・ 試料調製方法 ：反応液を移動相に溶解
・ カラム ：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３Ｖ，
４．６ｍｍ Ｉ．Ｄ．×２５０ｍｍ、粒径５μｍ
（ＧＬサイエンス製）
・ カラムオーブン温度：４０℃
・ 移動相 ：０．０５％ トリフルオロ酢酸水溶液、１ｍＬ／ｍｉｎ
・ 検出器 ：示差屈折計（日本分光製ＲＩ−２０３１）
・ 注入量 ：２０μｌ
・ 保持時間 ：ＣＨＢＮ １１．０ｍｉｎ
：ＣＨＢＡ ６．７ｍｉｎ
：ＨＣＡｍ ４．４ｍｉｎ
分析方法（３）
・ 分析対象化合物

・ 試料調製方法 ：反応液を移動相に溶解
・ カラム ：Ｓｈｏｄｅｘ ＩＣ ＹＫ−４２１，
４．６ｍｍ Ｉ．Ｄ．×１２５ｍｍ（ＧＬサイエンス製）
・ カラムオーブン温度：４０℃
・ 移動相 ：３ｍＭ ＨＮＯ_３ａｑ／ＡＴＮ＝４／６、１ｍＬ／ｍｉｎ
・ 検出器 ：電気伝導度検出器（ＣＤ−５） Ｓｈｏｄｅｘ製
・ 注入量 ：２０μｌ
・ 保持時間 ：Ｃａｒ−アミド １０．２ｍｉｎ
：Ｃａｒ−ニトリル ８．９ｍｉｎ
：Ｃａｒ ７．９ｍｉｎ
分析方法（４）
・ 分析対象化合物

・ 試料調製方法 ：反応液を移動相に溶解
・ カラム ：Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ １００−５Ｎ（ＣＨ_３）_２，
４．６ｍｍ Ｉ．Ｄ．×２５０ｍｍ（ＧＬサイエンス製）
・ カラムオーブン温度：４０℃
・ 移動相 ：５０ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４（ｐＨ＝４．７）ａｑ／ＡＴＮ
＝３５／６５、１ｍＬ／ｍｉｎ
・ 検出器 ：ＵＶ検出器（２０５ｎｍ） 日本分光製ＵＶ−９３０
・ 注入量 ：５μｌ
・ 保持時間 ：Ｃａｒ １０．８ｍｉｎ
：ＣＢ １３．０ｍｉｎ
分析方法（５） （Ｒ）−ＣＨＢＮ光学純度測定法
（Ｒ）−ＣＨＢＮの光学純度は、以下のようにして測定した。
（Ｒ）−ＣＨＢＮ１μｌにジクロロメタン２０μｌ、ピリジン２０μｌを加えた後、（Ｒ）−α−メトキシ−α−（トリフルオロメチル）フェニルアセチルクロライド（ＭＴＰＡ）２μｌを添加し、そのまま室温で５時間撹拌を行った。反応終了液にジイソプロピルエーテル３００μｌを添加し、続いて１Ｎ ＨＣｌ水溶液３５０μｌを用いて洗浄し、有機層を回収した。さらに有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液３５０μｌで洗浄し、有機層を減圧乾燥、残渣をイソプロパノールに溶解させ、これをＨＰＬＣで分析を行った。
本分析に用いたＨＰＬＣシステムは以下の通りである。
・ 分析対象化合物

・ カラム ：Ｐａｒｔｉｓｉｌ−５（ＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅ）
４．６ｍｍ×２５０ｍｍ
・ カラムオーブン温度 ：４０℃
・ 移動相 ：ヘキサン：イソプロパノール＝９９：１、１ｍｌ／ｍｉｎ
・ 検出器 ：ＵＶ ２５４ｎｍ
・ 保持時間 ：（Ｒ）−ＣＨＢＮ ＭＴＰＡエステル：１１．９ｍｉｎ
：（Ｓ）−ＣＨＢＮ ＭＴＰＡエステル：１３．０ｍｉｎ
分析方法（６） Ｌ−カルニチンの光学純度測定
Ｌ−カルニチンの光学純度は、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏ．Ａｎａｌ．，１４（１９９６）１５７９−１５８４に従い、以下のようにして測定した。
光学純度を測定したいカルニチン乾燥試料に、２ｍｇ／ｍｌの９−アントロイルニトリルのＤＭＳＯ溶液１ｍｌと、０．１ｍｇ／ｍｌキヌクリジンのアセトニトリル溶液１ｍｌを加えて溶解し、８０℃で９０分間反応をさせる。室温まで冷却した後、シリカゲルカートリッジカラム（１ｃｃ Ｂｏｎｄ Ｅｌｕｔ（Ｖａｒｉａｎ））に乗せ、メタノール／アセトニトリル＝９：１溶液１０ｍｌで未反応の９−アントロイルニトリル、キヌクリジンを洗い流す。続いて５ｍｌの超純水を流し、得られた溶液を以下のＨＰＬＣで解析を行う。
・ 分析対象化合物

・ カラム ：Ｕｌｔｒｏｎ ＥＳ−ＯＶＭ（信和化工社製）
２．０ｍｍ×１５０ｍｍ
・ カラムオーブン温度 ：４０℃
・ 移動相 ：アセトニトリル／２０ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４
（ｐＨ＝４．５）＝１７／８３
・ 流量 ：０．２ｍｌ／ｍｉｎ
・ 検出器 ：ＵＶ ２５４ｎｍ
・ 注入量 ：２５μｌ
・ 保持時間 ：Ｌ−カルニチン：６．８ｍｉｎ
：Ｄ−カルニチン：５．２ｍｉｎ
Ｌ−カルニチンの光学純度は上記Ｄ，Ｌ−カルニチンのＡＲＥＡから、下記式にて表される。
光学純度（％ｅｅ）＝（Ｌ−カルニチンＡＲＥＡ−Ｄ−カルニチンＡＲＥＡ）／
（Ｌ−カルニチンＡＲＥＡ＋Ｄ−カルニチンＡＲＥＡ）×１００
Ｉ．４−クロロ−３−ヒドロキシブチロニトリル（ＣＨＢＮ）合成
［実施例１］
エピクロロヒドリン＋青酸→ＣＨＢＮ合成（特開２００２−２４１３５７参照）

攪拌機、温度計、ジムロート冷却管を備えた３Ｌセパラブルフラスコに、エピクロロヒドリン２７４．９３ｇ（２．９７ｍｏｌ）、水１２７１．３ｇ、硫酸ナトリウム１９１．７５ｇ（１．３５ｍｏｌ）を仕込み、温水浴中で攪拌しながら内温５０〜６０℃でシアン化水素７２．３ｇ（２．７０ｍｏｌ）を１時間かけて反応液中に直接供給した。その後、内温５０〜６０℃で熟成を６時間行った。反応液を水浴で冷却した後、酢酸エチル１Ｌで１回抽出を行った。有機層を減圧下に濃縮し、ＣＨＢＮの粗生成物を２４９．３３ｇ得た。ＧＣ分析の結果、純度８０．９％、収率６２．５％であった。上記の抽出ＣＨＢＮ（粗生成物）を単蒸留により精製を行い、精製品１８７．５１ｇを得た。
［実施例２］
エピクロロヒドリン＋青酸ナトリウム→ＣＨＢＮ合成（特開２００４−１８２６０７参照）

撹拌機、滴下漏斗、温度計、ｐＨ計を備えた密閉型のガラスフラスコに、窒素雰囲気下でエピクロロヒドリン２６２．３ｇ、水７００ｇを仕込み、撹拌下に４０℃で反応液のｐＨが８となるように制御しながら３０．６ｗｔ％青酸ナトリウム水溶液４３２．３ｇ（２．７ｍｏｌ）と６５ｗｔ％硫酸水溶液２０３．７ｇ（１．３５ｍｏｌ）を３時間かけて同時に滴下した。滴下後、撹拌下４０℃で５時間反応させた。次いで、ガラスフラスコを密閉したまま酢酸エチル２５０ｍｌを加えて４０℃で抽出操作を行った。内容物を分液漏斗に移して有機層を取得し、得られた有機層を減圧下５０℃で濃縮し、さらに減圧蒸留を行ってＣＨＢＮ１９０．６ｇを得た。得られたＣＨＢＮの実得収率は５８．１％であった。
［実施例３］
１，３−ジクロロ−２−プロパノール＋青酸ナトリウム→ＣＨＢＮ合成

ｉ）ハロヒドリンエポキシダーゼ発現形質転換微生物の培養
ハロヒドリンエポキシダーゼ活性を持つ大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９／ｐＳＴ１１１（ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０９２２、特開平５−３１７０６６号参照）を、ＬＢ培地（１％バクトトリプトン、０．５％バクトイーストエキス、０．５％ＮａＣｌ、１ｍＭ ＩＰＴＧ、５０μｇ／ｍｌアンピシリン）が１００ｍＬずつ入れた５００ｍＬ容三角フラスコ、２０本それぞれに植菌し、３７℃で２０時間振盪培養した。２０本分の培養菌体を遠心分離により集菌し、集菌した菌体を５０ｍＭ トリス−硫酸緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄し、５０ｍＭ トリス−硫酸緩衝液（ｐＨ８．０）を２０ｇになるように加え、懸濁した。この菌体懸濁液０．２５ｇを５０ｍＭ トリス−硫酸緩衝液（ｐＨ８．０）１００ｍＬに加え、さらに５０ｍＭとなるように１，３−ジクロロ−２−プロパノールを加え、２０℃で１０分間反応した。ＨＰＬＣにより反応液中のエピクロロヒドリンの量を測定したところ、１１ｍＭであった。
なお、ｐＳＴ１１１は、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ．Ｎ−１０７４のハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子（ｈｈｅＢ）を含むＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ１．１Ｋｂ断片をｐＵＣ１１８に結合させたプラスミドである。また、ｐＳＴ１１１は、特開平５−３１７０６６公報に記載されており、ＪＭ１０９／ｐＳＴ１１１は、受領番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０９２２として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１−１−１中央第６）に平成３年３月１日付けで国際寄託されている。
ｉｉ）１，３−ジクロロ−２−プロパノールからの（Ｒ）−ＣＨＢＮの合成
ｐＨ電極、ならびにｐＨコントローラーにより制御されたアルカリ投入配管を装着した５００ｍＬ容フラスコに水１７０．６ｇ、１ｍｏｌ／ｋｇ トリス−硫酸緩衝液（ｐＨ８．０）３３．５ｇ、６ｍｏｌ／ｋｇ ＮａＣＮ水溶液５７．０ｇを入れ、９８％硫酸 １５．５ｇで、ｐＨ８．０に調整した。１，３−ジクロロ−２−プロパノール１３．３ｇを入れ、均一に溶解するまで攪拌した。
系内のｐＨを７．９〜８．０に維持するよう、６ｍｏｌ／ｋｇ ＮａＣＮ水溶液を投入するようにｐＨコントローラーを設定し、ｉ）で調製したハロヒドリンエポキシダーゼ活性を持つ菌体懸濁液４７．２ｇ（１８．９ｋＵ）を加え、２０℃で反応を開始した。
２０℃で系内のｐＨを７．９〜８．０に維持しながら、反応開始直後より、１，３−ジクロロ−２−プロパノール３６．７ｇを４．５時間かけて均等に滴下した。その後、２０℃で系内のｐＨを７．９〜８．０に維持しながら、１．５時間（反応開始から６時間）反応させた。反応終了時、６ｍｏｌ／ｋｇ ＮａＣＮ水溶液は、５４．４ｇ投入されており、反応液の全量は４２８．２ｇであった。このとき、反応系内の１，３−ジクロロ−２−プロパノールの濃度は３．７％（１５．８ｇ）であり、４−クロロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの濃度は７．１％（３０．４ｇ；収率６５．６％）であった。また、このときの４−クロロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの光学純度は９２％ｅｅの（Ｒ）−体過剰であった。
この反応液を塩酸でｐＨ＝５．０に調節し、６０℃、１４０ｔｏｒｒで減圧して１１時間ＨＣＮの除去を行い、反応系内のＨＣＮを硝酸銀で滴定、１ｐｐｍ以下であることを確認した。
［実施例４］
１，３−ジクロロ−２−プロパノール＋青酸→ＣＨＢＮ合成

ｉ）ハロヒドリンエポキシダーゼ発現形質転換微生物の培養は実施例３と同様に行った。
ｉｉ）１，３−ジクロロ−２−プロパノールからの（Ｒ）−ＣＨＢＮの合成
ｐＨ電極、ならびにｐＨコントローラーにより制御されたアルカリ投入配管を装着した３００ｍＬ４つ口フラスコに水１２７．５５ｇ、ＨＣＮ４．４１ｇ（０．１６３２ｍｏｌ）を入れ、３０％ＮａＯＨ ０．６５ｇ（０．００４９ｍｏｌ）で、ｐＨ７．５に調整した。１，３−ジクロロ−２−プロパノール１０．００ｇ（０．０７７５ｍｏｌ）を入れ、均一に溶解するまで攪拌した。
上記ｉ）の方法により調製したハロヒドリンエポキシダーゼ活性を持つ菌体懸濁液２０．００ｇを加え、２０℃で反応を開始した。系内のｐＨを７．５〜７．６に維持するよう、３０％ＮａＯＨを投入するようにｐＨコントローラーを設定し、投入されたＮａＯＨとほぼ等モルの割合で１，３−ジクロロ−２−プロパノール，ＨＣＮを追加していくことで、系内の１，３−ジクロロ−２−プロパノールの濃度を０．５ｍｏｌ／ｋｇを超えないよう、また、系内のシアンイオン濃度を１．１ｍｏｌ／ｋｇを超えないようにした。
２３時間後、４−クロロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを０．７５３ｍｏｌ／ｋｇ蓄積することができ、その光学純度は９４．８％ｅ．ｅ．の（Ｒ）−体過剰であった。反応により消費された１，３−ジクロロ−２−プロパノールからの収率は９６．３％であった。
この反応液を塩酸でｐＨ＝５．０に調節し、６０℃、１４０ｔｏｒｒで減圧して１１時間ＨＣＮの除去を行い、反応系内のＨＣＮを硝酸銀で滴定、１ｐｐｍ以下であることを確認した。
ＩＩ．４−ハロ−３−ヒドロキシブタンアミド合成
［実施例５］
本発明で使用したニトリルヒドラターゼは、以下のようにして調製した。
（培養及び反応用菌体液の調製方法）
ニトリルヒドラターゼ活性を有するロドコッカス ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）Ｊ−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４７８）を、３０Ｌ容ジャーファーメンター（高杉製作所社製）にてグルコース２質量％、尿素１質量％、ペプトン０．５質量％、酵母エキス０．３質量％、塩化コバルト０．０５質量％を含む、２０Ｌの培地（ｐＨ７．０）に植菌し、温度３０℃で好気的に６０時間培養した。上記の方法により培養して得た菌体を遠心分離により集菌し、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．７）にて同量で２回洗浄後、懸濁し、反応用菌体液とした。
［実施例６］
ＣＨＢＮ（実施例１）→ＣＨＢＡ合成

実施例１で合成した精製品ＣＨＢＮ：１６ｇ（１３４ｍｍｏｌ）を採取し、１３０℃で２時間加熱を行った。冷却後、２０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ＝７．５）８４ｇを加え、実施例５で調製したＪ−１菌を２００μＬ滴下し氷浴下２℃で反応を開始した。３時間後ＣＨＢＮの転化率は１００％に達し、ＣＨＢＡが１８．３ｇ（収率９９．３％）生成していることを確認した。
上記反応終了液５０．１ｇ（ＣＨＢＡ９．２０ｇ含有）を採取し、セライト５ｇを加えてエバポレーターで４０℃で乾固した。残渣をシリカゲル３０ｇの上に乗せ、酢酸エチル４００ｇをキャリアーとして流して溶出させた。溶出した酢酸エチル溶液をエバポレーターで乾固し、ＣＨＢＡの白色固体を７．２７ｇ（単離収率７９％）で得た。
［実施例７］
ＣＨＢＮ（実施例２）→ＣＨＢＡ合成

実施例２で合成した蒸留品ＣＨＢＮ：１．６ｇ（１３．４ｍｍｏｌ）を採取し、２０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ＝７．５）８．４ｇを加え、ＣｏＣｌ_２・６Ｈ２Ｏの１ｍｇ／ｍｌ水溶液を３８８μｌ添加して２時間撹拌した後、実施例５で調製したＪ−１菌を２０μＬ滴下し氷浴下で反応を開始した。３時間後ＣＨＢＮの転化率は１００％に達し、ＣＨＢＡが１．８４ｇ（収率９９．８％）生成していることを確認した。
［実施例８］
ＣＨＢＮ（実施例３）→ＣＨＢＡ合成

実施例３で合成した（Ｒ）−ＣＨＢＮ水溶液：１０．０ｇ（（Ｒ、Ｓ）−ＣＨＢＮ濃度１６．７％、１３．９７ｍｍｏｌ含有）を採取し、１００℃で４時間加熱を行った。冷却後、ＮａＯＨａｑで中和してｐＨ＝７．０２とし、実施例５で調製したＪ−１菌を６３μＬ滴下し氷浴下で反応を開始した。２時間後ＣＨＢＮの転化率は１００％に達し、（Ｒ）−ＣＨＢＡが１．９１ｇ（収率９９．４％）生成していることを確認した。
［実施例９］
ＣＨＢＮ（実施例４）→ＣＨＢＡ合成

実施例４で合成した（Ｒ）−ＣＨＢＮ水溶液：５０．０ｇ（（Ｒ、Ｓ）−ＣＨＢＮ濃度１４．０％、５８．６ｍｍｏｌ含有）を採取し、ＣｏＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏの１ｍｇ／ｍｌ水溶液を１．７ｍｌ添加した後、ＮａＯＨａｑで中和してｐＨ＝７．０６とし、２時間撹拌した。その後実施例５で調製したＪ−１菌を２７０μＬ滴下し氷浴下で反応を開始した。２時間後ＣＨＢＮの転化率は１００％に達し、（Ｒ）−ＣＨＢＡが８．０４ｇ（収率９９．７％）生成していることを確認した。
ＩＩＩ．ＣＨＢＡの４級アミノ化反応（カルニチンアミドクロライド合成）
［実施例１０］
ＣＨＢＡ（精製品）の４級アミノ化反応

実施例６で合成した精製品ＣＨＢＡ：１．８４ｇ（１３．４ｍｍｏｌ）に純水を加えて１０．２ｇにし、３０％トリメチルアミン水溶液３．１５ｇ（１６．０ｍｍｏｌ）を加え、３０℃で反応を開始した。４時間後ＣＨＢＡの転化率は１００％に達し、Ｃａｒ−アミドが２．４８ｇ（収率９４．０％）、ＨＣＡｍが０．０７１ｇ（収率５．２％）生成していることを確認した。
［比較例１］
ＣＨＢＮ（実施例１精製品）の４級アミノ化反応

実施例１で合成した精製品ＣＨＢＮ：１．６ｇ（１３．４ｍｍｏｌ）に純水を加えて１０．２ｇにし、３０％トリメチルアミン水溶液６．６０ｇ（３３．５ｍｍｏｌ）を加え、３０℃で反応を開始した。７時間後ＣＨＢＮの転化率は１００％に達し、Ｃａｒ−ニトリルが１．５６ｇ（収率６５．１％）生成していることを確認した。
［比較例２］
４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸メチルの４級アミノ化反応

４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸メチル：２．０ｇ（１３．１ｍｍｏｌ）に純水を加えて１０．０ｇにし、３０％トリメチルアミン水溶液５．１６ｇ（２６．２ｍｍｏｌ）を加え、３０℃で反応を開始した。反応途中でγ−ヒドロキシブチロラクトンが観測され、７時間後４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸メチルの転化率は１００％に達した。この時エステルのメチル基とγ−ヒドロキシブチロラクトンが消滅していることを確認、Ｃａｒが０．３６ｇ（収率１７．１％）生成していることを確認した。１Ｈ，１３Ｃ−ＮＭＲ測定により、Ｃａｒの他に３，４−ジヒドロキシ酪酸が生成していることを確認した。
［実施例１１］
ＣＨＢＡ（実施例７水溶液）の４級アミノ化反応

実施例７の反応終了液１０．１８ｇ（ＣＨＢＡ１．８４ｇ含有）に３０％トリメチルアミン水溶液２１．１５ｇ（１０７．３ｍｍｏｌ）を加え、３０℃で反応を開始した。０．７５時間後ＣＨＢＡの転化率は１００％に達し、Ｃａｒ−アミドが２．５５ｇ（収率９６．９％）、ＨＣＡｍが０．０５７ｇ（収率４．２％）生成していることを確認した。
［実施例１２］
ＣＨＢＡ（実施例９水溶液）の４級アミノ化反応

実施例９の反応終了直後２６．０ｇ（ＣＨＢＡ４．０２ｇ含有）を取り出し、ただちに３０％トリメチルアミン水溶液８．３ｇ（３５．０ｍｍｏｌ）を加え、３０℃の水浴につけて反応を開始した。４時間後ＣＨＢＡの転化率は１００％に達し、Ｃａｒ−アミドが５．４２ｇ（収率９４．４％）、ＨＣＡｍが０．１５ｇ（収率５．０％）生成していることを確認した。
［実施例１３］
ＣＨＢＡ（実施例９水溶液）の４級アミノ化反応

実施例９の反応終了直後、２６．０ｇ（ＣＨＢＡ４．０２ｇ含有）を取り出して２０℃で１５時間放置した。ＨＰＬＣ分析の結果、ＣＨＢＡは２．８４ｇに減少していた。そのまま３０％トリメチルアミン水溶液８．３ｇ（３５．０ｍｍｏｌ）を加え、３０℃の水浴につけて反応を開始した。４時間後ＣＨＢＡの転化率は１００％に達し、Ｃａｒ−アミドが３．８４ｇ（収率９４．６％）、ＨＣＡｍが０．１０ｇ（収率４．８％）生成していることを確認した。実施例９のアミド化反応終了直後のＣＨＢＡ量（４．０２ｇ）を基準にすると、Ｃａｒ−アミドの収率は６６．８％、ＨＣＡｍの収率は３．４％である。
以上４級アミノ化反応をまとめると以下のようになる。ＣＨＢＡを基質として用いて４級アミノ化反応を用いる優位性は明らかである。

ＩＶ．カルニチンアミドクロライドの加水分解反応
［実施例１４］
Ｃａｒ−アミド（実施例１０水溶液）の加水分解反応

実施例１０の反応終了液１３．２０ｇ（Ｃａｒ−アミド２．４５ｇ含有）に３０％ＮａＯＨａｑを２．６８ｇ（２０．０ｍｍｏｌ）加え、５０℃で反応を開始した。５時間後、Ｃａｒ−アミドの転化率は１００％に達し、反応を終了した。系内をＨＣｌａｑで中和後、エバポレーターで減圧して水を除去し、次いでエタノール１０ｍｌを加えてさらに水を共沸除去させた。このエタノールによる水の共沸除去操作を計３回行い、析出した白色固体に再度エタノール１０ｍｌを加えてよく撹拌する。溶けない白色固体はＮａＣｌであり、これを吸引濾過で濾別して濾液中のＣａｒを定量すると、Ｃａｒ１．９４ｇ（収率９６．６％）、ＣＢ０．０３ｇ（対Ｃａｒ１．５ｗｔ％）が生成していることがわかった。
［実施例１５］
Ｃａｒ−アミド（実施例１２）→Ｃａｒ合成

実施例１２の反応終了液１６．３７ｇ（Ｃａｒ−アミド２．５９ｇ含有）に４８％ＮａＯＨａｑを２．２ｇ（２６．４ｍｍｏｌ）加え、３０℃で反応を開始した。８時間後、Ｃａｒ−アミドの転化率が８０％に達した後４０℃に昇温して、さらに６時間反応をさせたところ、Ｃａｒ−アミドの転化率が１００％に達し、反応を終了した。系内をＨＣｌａｑで中和後、反応液中の（Ｌ）−ＣａｒとＣＢを定量すると、（Ｌ）−Ｃａｒが２．０９ｇ（収率９８．５％）、ＣＢが０．０１５ｇ（対Ｃａｒ０．７％）生成していることがわかった。この水溶液の一部を採取して乾燥させ、Ｃａｒの光学純度を測定したところ、９４．２％ｅ．ｅ．であった。
［実施例１６］
Ｃａｒ−アミド（実施例１２）→Ｃａｒ合成

実施例１２の反応終了液１６．３７ｇ（Ｃａｒ−アミド２．５９ｇ含有）に３６％ＨＣｌａｑを４．０１ｇ（３９．６ｍｍｏｌ）加え、８０℃で反応を開始した。８時間後、Ｃａｒ−アミドの転化率が１００％に達し、反応を終了した。系内をＮａＯＨａｑで中和後、反応液中の（Ｌ）−ＣａｒとＣＢを定量すると、（Ｌ）−Ｃａｒ２．１１ｇ（収率９９．４％）、ＣＢ０．００１ｇ（収率０．０５％）が生成していることがわかった。この水溶液の一部を採取して乾燥させ、Ｃａｒの光学純度を測定したところ、９４．５％ｅ．ｅ．であった。

本発明により、ベタインの製造方法が提供される。本発明は、副反応を従来よりも大幅に防ぎ、カルニチン等のベタインを高収率で得ることができる点で有用である。

Claims (13)

1. 次式（２）：
   

   

   ［式中、Ｘ^１は、ハロゲン原子である。］
   で示される４−ハロ−３−ヒドロキシブタンアミドを（ＮＡ^１Ａ^２Ａ^３）で示されるトリアルキルアミンで４級アミノ化する工程を含む、次式（２’）：
   

   

   ［式中、Ａ^１、Ａ^２及びＡ^３は、それぞれ、互いに独立し、同一または異なって、置換基を有していてもよいＣ_１〜Ｃ_２０炭化水素基であり、Ｘ^１は、ハロゲン原子である。］
   で示される４−トリアルキルアミノ−３−ヒドロキシブタンアミドハロゲン化物の製造方法。
2. 前記トリアルキルアミンが、トリメチルアミン、トリエチルアミンおよびトリブチルアミンからなる群より選択されるものである、請求項１に記載の方法。
3. 次式（２’）：
   

   

   ［式中、Ａ^１、Ａ^２及びＡ^３は、それぞれ、互いに独立し、同一または異なって、置換基を有していてもよいＣ_１〜Ｃ_２０炭化水素基であり、Ｘ^１は、ハロゲン原子である。］
   で示される４−トリアルキルアミノ−３−ヒドロキシブタンアミドハロゲン化物を加水分解する工程を含む、次式（１）：
   

   

   ［式中、Ａ^１、Ａ^２及びＡ^３は、それぞれ、互いに独立し、同一または異なって、置換基を有していてもよいＣ_１〜Ｃ_２０炭化水素基である。］
   で示されるベタイン、またはベタインの塩の製造方法。
4. Ａ^１、Ａ^２およびＡ^３がメチル基である、請求項３に記載の方法。
5. 次式（２）：
   

   

   ［式中、Ｘ^１は、ハロゲン原子である。］
   で示される４−ハロ−３−ヒドロキシブタンアミドは、次式（３）：
   

   

   ［式中、Ｘ^１は、ハロゲン原子である。］
   で示される４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルをアミド化する工程により得られるものである、請求項３または４に記載の方法。
6. アミド化がニトリルヒドラターゼで処理するものである、請求項５に記載の方法。
7. 前記ニトリルヒドラターゼが、アクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）属、アシドボラックス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ）属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、カセオバクター（Ｃａｓｅｏｂａｃｔｅｒ）属、コマモナス（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ディーツィア（Ｄｉｅｔｚｉａ）属、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、エルビニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属、ジオバチルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ゴルドナ（Ｇｏｒｄｏｎａ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌａ）属、ミクロアスカス（Ｍｉｃｒｏａｓｃｕｓ）モルガネラ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ）属、パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）属、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、シュードノカルディナ（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、シクタリジウム（Ｓｙｃｔａｌｉｄｉｕｍ）属、ツカムレラ（Ｔｕｋａｍｕｒｅｌｌａ）属に属する微生物からなる群より選択される微生物によって産生される、請求項６に記載の方法。
8. 前記４−ハロ−３−ヒドロキシブタンアミドの製造工程が、反応液が凍らない温度〜５℃で行われる、請求項５〜７のいずれか１項に記載の方法。
9. 次式（３）：
   

   

   ［式中、Ｘ^１は、ハロゲン原子である。］
   で示される４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルは、次式（４）：
   

   

   ［式中、Ｘ^１は、ハロゲン原子である。］
   で示されるエピハロヒドリン、
   または、次式（５）：
   

   

   ［式中、Ｘ^１は、上記の意味を有する。Ｘ^２は、Ｘ^１と互いに独立し、同一または異なったハロゲン原子である。］
   で示される１，３−ジハロ−２−プロパノールと、
   青酸または青酸塩とを反応させる工程により得られるものである、請求項５〜８のいずれか１項に記載の方法。
10. 青酸または青酸塩との反応が酵素触媒の存在下で行われるものである請求項９に記載の方法。
11. 前記酵素触媒がハロヒドリンエポキシターゼである請求項１０に記載の方法。
12. 次式（３）：
    

    

    ［式中、Ｘ^１は、ハロゲン原子である。］
    で示される４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルが、（Ｒ）体過剰で製造される、請求項１１に記載の方法。
13. 前記ハロヒドリンエポキシターゼが、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アグロバクテリウム属、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属およびアースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物からなる群より選択される微生物によって産生される、請求項１１または１２に記載の方法。