KR101097006B1 - 베타인의 제조 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명에 의해, 부반응을 종래보다 대폭 억제하여, 카니틴 등의 베타인을 고수율로 얻을 수 있는 베타인의 제조 방법이 제공된다. 또한, 본 발명은 하기 화학식 2로 표시되는 아마이드를 4급 아미노화하는 공정을 포함하는, 하기 화학식 1로 표시되는 베타인의 제조 방법에 관한 것이다.
Figure 112009034577717-pct00050
[상기 식에서, A1, A2 및 A3은 치환기를 갖고 있어도 좋은 C1 내지 C20 탄화수소기이며, X1은 할로젠 원자이다.]

Description

베타인의 제조 방법{PROCESS FOR PRODUCTION OF BETAINE}
본 발명은 베타인, 특히 카니틴의 제조 방법에 관한 것이다.
베타인의 일종인 L-카니틴은 바이타민 BT라고도 불리고, 생체 내에서 지방산의 대사에 관여하는 중요한 화합물이다. 심장 질환 치료제(일본 공개 특허 공보 소54-76830호), 과지방질 혈증 치료제(일본 공개 특허 공보 소54-113409호), 정맥 질환 치료제(일본 공개 특허 공보 소58-88312호) 등으로도 주목받고 있다.
베타인의 일종인 카니틴의 제조 방법으로, 일본 공개 특허 공보 소57-165352호에는, D-만니톨을 원료로 하여 L-카니틴을 얻는 방법, 일본 공개 특허 공보 소62-272983호에는, (R,S)-3,4-에폭시뷰티르산에스터를 출발로 하여 비대칭 가수 분해 효소를 사용하여 선택적으로 (R)-3,4-에폭시뷰티르산에스터를 단리(單離), 그것에 트라이메틸아민 또는 트라이메틸아민염산염을 작용시켜 L-카니틴으로 유도하는 방법, 일본 공표 특허 공보 제2002-544252호에는, (S)-(-)클로로석신산 유도체를 대응하는 산무수물로 변환한 후, 트라이메틸아민을 사용하여 L-카니틴으로 유도하는 방법, 일본 공표 특허 공보 제2002-529528호에는, 알킬-4-클로로-3-옥소뷰틸레이트를 루테늄 착체 촉매를 사용하여 선택적으로 비대칭 수소 환원하여 알킬-(R)- (+)-4-클로로-3-하이드록시뷰틸레이트를 제조하고, 계속해서 트라이메틸아민에 의한 4급 아미노화 반응을 통해 L-카니틴을 얻는 방법 등의 많은 보고가 있다.
상기 특허 문헌에도 있는 바와 같이, 카니틴 제조 공정에서 C4 골격에 트라이메틸아민을 사용하여 4급 아미노기를 도입하는 공정은 피할 수 없는 중요한 공정이며, 또한 이 공정의 수율이 전체의 수율에 큰 영향을 미치는 경우가 많다. 이 4급 아미노화 반응에 대하여 일본 공개 특허 공보 평2-142758호에는, 4-할로게노-3-하이드록시뷰티르산메틸을 케톤 용매 하에서 트라이메틸아민을 사용하여 4급 아미노화하고, 계속해서 얻어진 뷰티르산에스터 유도체를 가수 분해하는 방법이 기재되어 있다. 이 4급 아미노화 반응은 알코올을 용매로 하여 무수트라이메틸아민을 사용하고, 오토클레이브 내에서 80℃ 정도의 고온으로 반응시키지만, 4-할로게노-3-하이드록시뷰티르산메틸의 탈수 반응이 진행되어 올레핀이 생성되기 때문에, 선택율은 30 내지 40% 정도로 현저히 낮고, 반응 시간이 20시간 이상으로 길다. 또한, 케톤 용매를 사용하면 선택성이 향상한다고 기술되어 있지만, 선택율은 대폭 향상됨에도 불구하고 반응 시간은 더 길어져, 50시간을 초과하여도 4-할로게노-3-하이드록시뷰티르산메틸의 전화율은 80% 정도에 불과하다. 용매로 에터계, 톨루엔 등을 사용한 경우는 반응 시간은 더더욱 지연되지만, 선택율도 높지 않다.
일본 공개 특허 공보 평2-27995호에는, γ-클로로-β-하이드록시뷰티로나이트릴에 30%의 트라이메틸아민 수용액을 첨가하여 4급 아미노화하는 방법이 기재되어 있다. 4℃에서 하룻밤 방치한 후, 반응액을 감압 여과함으로써 얻어지는 고체는, 순도 100%의 카니틴나이트릴클로라이드로 하여도 수율 75% 정도에 지나지 않 아, 고수율이라고는 할 수 없다. 일본 공개 특허 공보 소60-258487호에는, 4-클로로-3-하이드록시뷰티로나이트릴에 지나치게 많은 무수트라이메틸아민을 첨가하고, 무용매로 100℃의 오토클레이브 내에서 반응시켜, 카니틴나이트릴클로라이드를 수율 94%로 얻는 반응이 기재되어 있지만, 반응 조건이 엄격하고, 반응 시간도 24시간으로 길다.
한편, 4급 아미노화 반응은 아니지만 아미노기를 도입하는 반응예로서, 일본 특허 공보 소53-13611호에는 γ-클로로-β-하이드록시뷰테인산아마이드에 약 100당량이라는 지나치게 많은 암모니아를 사용하여 20℃ 정도로 16시간 반응시키고, γ-아미노-β-하이드록시뷰테인산아마이드를 얻고 있지만, 지나치게 많은 암모니아를 사용하는 것과 반응 시간이 길다고 하는 점에서 문제가 있었다. 마찬가지의 반응이 Heterocycles, Vol.53, No.1, 2000에 기재되어 있고, (S)-4-클로로-3-하이드록시뷰테인아마이드에 약 100당량의 지나치게 많은 암모니아 수용액을 첨가하여, 밀폐계, 120℃에서 8시간 작용시켜, 아미노기를 도입하는 반응이 기재되어 있지만, 역시 지나치게 많은 암모니아를 사용하는 것과 반응 시간이 길다고 하는 점에서 문제가 있었다.
이와 같이, 4-할로-3-하이드록시뷰테인아마이드에 지나치게 많은 암모니아를 작용시켜 장시간 반응시키면 아미노기가 도입되는 지견은 있었지만, 트라이알킬아민을 작용시킨 경우에 관해서는 전혀 알려져 있지 않았다.
또한, 카니틴 등의 베타인 제조 공정에 있어서 전체의 수율에 큰 영향을 미치는 트라이알킬아민에 의한 4급 아미노화 공정은, 종래의 4-할로게노-3-하이드록 시뷰티르산메틸이나 γ-클로로-β-하이드록시뷰틸로나이트릴의 트라이메틸아민에 의한 4급 아미노화 반응에서는 부(副)반응의 진행이 많아, 원하는 4급 아미노화 생성물을 고수율로 얻기 어려웠다.
발명의 개시
그래서 본 발명에서는, 카니틴 등의 베타인 제조 공정에서 중요한 4급 아미노화 공정에 있어서 부반응을 종래보다 대폭 억제하여, 카니틴 등의 베타인을 고수율로 얻는 것을 목적으로 한다.
이 종래의 카니틴 제조 공정에서의 4급 아미노화 반응의 부반응을 방지하기 위해 본 발명자들이 예의 검토한 결과, 4-할로-3-하이드록시뷰테인아마이드를 4급 아미노화 반응의 반응 기질로서 사용함으로써, 뷰티로나이트릴이나 뷰티르산에스터의 트라이알킬아민에 의한 4급 아미노화 반응 시에 일어나던 부반응을 대폭 억제하는 것에 성공했다. 이 4-할로-3-하이드록시뷰테인아마이드를, 카니틴 제조 공정에서의 4급 아미노화 반응의 반응 기질로서 사용하여 카니틴을 제조하면, 종래의 방법보다 수율이 대폭 향상됨과 아울러, 반응 시간도 단축되어, 부생성물을 대폭 억제하는 것이 가능하다. 또한, 이 제조 방법은 카니틴뿐만 아니라, 일정한 베타인에 적용 가능하다.
즉, 본 발명은 이하에 관한 것이다.
(1) 하기 화학식 2:
Figure 112009034577717-pct00001
[상기 식에서, X1은 할로젠 원자이다.]
로 표시되는 4-할로-3-하이드록시뷰테인아마이드를 (NA1A2A3)으로 표시되는 트라이알킬아민으로 4급 아미노화하는 공정을 포함하는, 하기 화학식 2a:
Figure 112009034577717-pct00002
[상기 식에서, A1, A2 및 A3은 각각 서로 독립적이고, 동일하거나 다르고, 치환기를 갖고 있어도 좋은 C1 내지 C20 탄화수소기이며, X1은 할로젠 원자이다.]
로 표시되는 4-트라이알킬아미노-3-하이드록시뷰테인아마이드 할로젠화물의 제조 방법.
(2) 상기 트라이알킬아민이 트라이메틸아민, 트라이에틸아민 및 트라이뷰틸아민으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 (1)에 기재된 방법.
(3) 하기 화학식 2a:
[화학식 2a]
Figure 112009034577717-pct00003
[상기 식에서, A1, A2 및 A3은 각각 서로 독립적이고, 동일하거나 다르고, 치환기를 갖고 있어도 좋은 C1 내지 C20 탄화수소기이며, X1은 할로젠 원자이다.]
로 표시되는 4-트라이알킬아미노-3-하이드록시뷰테인아마이드 할로젠화물을 가수 분해하는 공정을 포함하는, 하기 화학식 1:
Figure 112009034577717-pct00004
[상기 식에서, A1, A2 및 A3은 각각 서로 독립적이고, 동일하거나 다르고, 치환기를 갖고 있어도 좋은 C1 내지 C20 탄화수소기이다.]
로 표시되는 베타인 또는 베타인 염의 제조 방법.
(4) A1, A2 및 A3이 메틸기인 (3)에 기재된 방법.
(5) 하기 화학식 2:
[화학식 2]
Figure 112009034577717-pct00005
[상기 식에서, X1은 할로젠 원자이다.]
로 표시되는 4-할로-3-하이드록시뷰테인아마이드는 하기 화학식 3:
Figure 112009034577717-pct00006
[상기 식에서, X1은 할로젠 원자이다.]
으로 표시되는 4-할로-3-하이드록시뷰티로나이트릴을 아마이드화하는 공정에 의해 얻어지는 것인 (3) 또는 (4)에 기재된 방법.
(6) 아마이드화가 나이트릴하이드라타아제(nitrile-hydratase)로 처리하는 것인 (5)에 기재된 방법.
(7) 상기 나이트릴하이드라타아제가, 아크로모박터(Achromobacter) 속(屬), 아시도보락스(Acidovorax) 속, 아그로박테리움(Agrobacterium) 속, 아스로박터(Arthrobacter) 속, 바실러스(Bacillus) 속, 브레비박테리움(Brevibacterium) 속, 버크홀데리아(Burkholderia) 속, 칸디다(Candida) 속, 카세오박터(Caseobacter) 속, 코마모나스(Comamonas) 속, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속, 디엣지아(Dietzia) 속, 엔테로박터(Enterobacter) 속, 어비니아(Erwinia) 속, 지오바실러스(Geobacillus) 속, 고도나(Gordona) 속, 클렙시엘라(Klebsiela) 속, 마이크로아스커스(Microascus) 모가넬라(Morganella) 속, 판토에아(Pantoea) 속, 프로테우스(Proteus) 속, 슈도모나스(Pseudomonas) 속, 슈도노카디아(Pseudonocardia) 속, 로도코커스(Rhodococcus) 속, 리조비움(Rhizobium) 속, 세라티아(Serratia) 속, 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속, 사이탈리듐(Syctalidium) 속, 투카무렐라(Tukamurella) 속에 속하는 미생물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 미생물에 의해 산생(産生)되는 (6)에 기재된 방법.
(8) 상기 4-할로-3-하이드록시뷰테인아마이드의 제조 공정이 반응액이 얼지 않는 온도 내지 5℃에서 행해지는 (5) 내지 (7) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(9) 하기 화학식 3:
[화학식 3]
Figure 112009034577717-pct00007
[상기 식에서, X1은 할로젠 원자이다.]
로 표시되는 4-할로-3-하이드록시뷰티로나이트릴은 하기 화학식 4:
Figure 112009034577717-pct00008
[상기 식에서, X1은 할로젠 원자이다.]
로 표시되는 에피할로하이드린,
또는, 하기 화학식 5:
Figure 112009034577717-pct00009
[상기 식에서, X1은 상기한 의미를 갖는다. X2는 X1과 서로 독립적이고, 동일하거나 다른 할로젠 원자이다.]
로 표시되는 1,3-다이할로-2-프로판올과,
시안화수소 또는 시아나이드염을 반응시키는 공정에 의해 얻어지는 것인 (5) 내지 (8) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(10) 시안화수소 또는 시아나이드염과의 반응이 효소 촉매의 존재 하에서 행해지는 것인 (9)에 기재된 방법.
(11) 상기 효소 촉매가 할로하이드린에폭시다아제인 (10)에 기재된 방법.
(12) 하기 화학식 3:
[화학식 3]
Figure 112009034577717-pct00010
[상기 식에서, X1은 할로젠 원자이다.]
으로 표시되는 4-할로-3-하이드록시뷰티로나이트릴은 (R)체 과잉으로 제조되는 (11)에 기재된 방법.
(13) 상기 할로하이드린에폭시다아제가, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속, 마이크로박테리움(Microbacterium) 속, 아그로박테리움 속, 마이코박테리움(Mycobacterium) 속 및 아스로박터(Arthrobacter) 속에 속하는 미생물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 미생물에 의해 산생되는 (11) 또는 (12)에 기재된 방법.
본 발명에 따르면, 카니틴 등의 베타인의 제조 공정에서 중요한 트라이알킬아민을 사용한 4급 아미노화 반응을, 4-할로-3-하이드록시뷰테인아마이드를 기질로서 사용함으로써, 주된 부생 생물인 크로톤산 유도체의 생성을 종래보다 대폭 억제 하는 것이 가능해져, 고수율로 카니틴 등의 베타인을 제조할 수 있게 된다.
이하에 본 발명의 실시의 형태에 대하여 설명한다. 이하의 실시 형태는 본 발명을 설명하기 위한 단순한 예시로서, 본 발명을 이 실시 형태로만 한정하는 것을 의도하는 것은 아니다. 본 발명은 그 요지를 일탈하지 않는 한, 다양한 형태로 실시하는 것이 가능하다.
또, 본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 예컨대, 선행 기술 문헌 및 공개 공보, 특허 공보 그 밖의 특허 문헌은 그 전체가 본 명세서에서 참조로서 포함된다. 본 명세서는 본원 우선권 주장의 기초로 되는 일본 특허 출원 제2006-303972호 명세서의 내용을 포함한다.
본 발명에서는, 하기 화학식 2:
[화학식 2]
Figure 112009034577717-pct00011
[상기 식에서, X1은 할로젠 원자이다.]
로 표시되는 4-할로-3-하이드록시뷰테인아마이드를 (NA1A2A3)으로 표시되는 트라이알킬아민에 의해 4급 아미노화하는 공정을 포함하는 하기 화학식 2a:
[화학식 2a]
Figure 112009034577717-pct00012
[상기 식에서, A1, A2 및 A3은 각각 서로 독립적이고, 동일하거나 다르고, 치환기를 갖고 있어도 좋은 C1 내지 C20 탄화수소기이며, X1은 할로젠 원자이다.]
로 표시되는 4-트라이알킬아미노-3-하이드록시뷰테인아마이드 할로젠화물을 제조하는 방법이 제공된다. 또한, 본 발명은, 하기 화학식 2a:
[화학식 2a]
Figure 112009034577717-pct00013
[상기 식에서, A1, A2 및 A3은 각각 서로 독립적이고, 동일하거나 다르고, 치환기를 갖고 있어도 좋은 C1 내지 C20 탄화수소기이며, X1은 할로젠 원자이다.]
로 표시되는 4-트라이알킬아미노-3-하이드록시뷰테인아마이드 할로젠화물을 가수 분해하는 공정을 포함하는 하기 화학식 1:
[화학식 1]
Figure 112009034577717-pct00014
[상기 식에서, A1, A2 및 A3은 각각 서로 독립적이고, 동일하거나 다르며, 치 환기를 갖고 있어도 좋은 C1 내지 C20 탄화수소기이다.]
로 표시되는 베타인 또는 베타인의 염을 제조하는 방법이 제공된다.
또한, 본 발명에 있어서, 하기 화학식 2로 표시되는 아마이드를 4급 아미노화하는 공정과, 아마이드기를 가수 분해하는 공정을 포함하는 하기 화학식 1로 표시되는 베타인의 제조 방법이 제공된다.
Figure 112009034577717-pct00015
[상기 식에서, X1, A1, A2 및 A3은, 상기한 의미를 갖는다.]
본 발명에서는, 하기 화학식 2로 표시되는 아마이드를 4급 아미노화하는 공정을 포함하는 하기 화학식 1로 표시되는 베타인의 제조 방법이 제공된다.
Figure 112009034577717-pct00016
상기 식에서, A1, A2 및 A3은 각각 서로 독립적이고, 동일하거나 다르며, 치환기를 갖고 있어도 좋은 C1 내지 C20 탄화수소기이다.
본 명세서에서, 「C1 내지 C20 탄화수소기」의 탄화수소기는 포화 또는 불포화의 비환식(非環式)이라도 좋고, 포화 또는 불포화의 환식(環式)이라도 좋다. C1 내지 C20 탄화수소기가 비환식인 경우에는, 선상이라도 좋고, 분기되어도 좋다. 「 C1 내지 C20 탄화수소기」에는, C1 내지 C20 알킬기, C2 내지 C20 알켄일기, C2 내지 C20 알킨일기, C4 내지 C20 알킬다이엔일기, C6 내지 C18 아릴기, C7 내지 C20 알킬아릴기, C7 내지 C20 아릴알킬기, C3 내지 C20 사이클로알킬기, C4 내지 C20 사이클로알켄일기, (C3 내지 C10 사이클로알킬) C1 내지 C10 알킬기 등이 포함된다.
본 명세서에서, 「C1 내지 C20 알킬기」는 C1 내지 C10 알킬기인 것이 바람직하고, C1 내지 C6 알킬기인 것이 더욱 바람직하다. 알킬기의 예로는, 제한되는 것은 아니지만, 메틸, 에틸, 프로필, 아이소프로필, n-뷰틸, sec-뷰틸, tert-뷰틸, 펜틸, 헥실, 도데칸일 등을 들 수 있다.
본 명세서에서, 「C2 내지 C20 알켄일기」는 C2 내지 C10 알켄일기인 것이 바람직하고, C2 내지 C6 알켄일기인 것이 더욱 바람직하다. 알켄일기의 예로는, 제한되는 것은 아니지만, 바이닐, 1-프로펜일, 2-프로펜일, 아이소프로펜일, 2-뷰텐일 등을 들 수 있다.
본 명세서에서, 「C2 내지 C20 알킨일기」는 C2 내지 C10 알킨일기인 것이 바람직하고, C2 내지 C6 알킨일기인 것이 더욱 바람직하다. 알킨일기의 예로는, 제한되는 것은 아니지만, 에틴일, 프로핀일, 뷰틴일 등을 들 수 있다.
본 명세서에서, 「C4 내지 C20 알킬다이엔일기」는 C4 내지 C10 알킬다이엔일 기인 것이 바람직하고, C4 내지 C6 알킬다이엔일기인 것이 더욱 바람직하다. 알킬다이엔일기의 예로는, 제한되는 것은 아니지만, 1,3-뷰타다이엔일 등을 들 수 있다.
본 명세서에서, 「C6 내지 C18 아릴기」는 C6 내지 C12 아릴기인 것이 바람직하다. 아릴기의 예로는, 제한되는 것은 아니지만, 페닐, 1-나프틸, 2-나프틸, 인덴일, 바이페닐릴, 안트릴, 페난트릴 등을 들 수 있다.
본 명세서에서, 「C7 내지 C20 알킬아릴기」는 C7 내지 C12 알킬아릴기인 것이 바람직하다. 알킬아릴기의 예로는, 제한되는 것은 아니지만, o-톨릴, m-톨릴, p-톨릴, 2,3-자일릴, 2,4-자일릴, 2,5-자일릴, o-큐멘일, m-큐멘일, p-큐멘일, 메시틸 등을 들 수 있다.
본 명세서에서, 「C7 내지 C20 아릴알킬기」는 C7 내지 C12 아릴알킬기인 것이 바람직하다. 아릴알킬기의 예로는, 제한되는 것은 아니지만, 벤질, 펜에틸, 다이페닐메틸, 트라이페닐메틸, 1-나프틸메틸, 2-나프틸메틸, 2,2-다이페닐에틸, 3-페닐프로필, 4-페닐뷰틸, 5-페닐펜틸 등을 들 수 있다.
본 명세서에서, 「C3 내지 C20 사이클로알킬기」는 C3 내지 C10 사이클로알킬기인 것이 바람직하다. 사이클로알킬기의 예로는, 제한되는 것은 아니지만, 사이클로프로필, 사이클로뷰틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실 등을 들 수 있다.
본 명세서에서, 「C4 내지 C20 사이클로알켄일기」는 C4 내지 C10 사이클로알 켄일기인 것이 바람직하다. 사이클로알켄일기의 예로는, 제한되는 것은 아니지만, 사이클로프로펜일, 사이클로뷰텐일, 사이클로펜텐일, 사이클로헥센일 등을 들 수 있다.
본 명세서에서, A1, A2 및 A3으로 표시되는 「C1 내지 C20 탄화수소기」에는, 치환기가 도입되어 있어도 좋다. 이 치환기로는, 예컨대, C1 내지 C10 알콕시기(예컨대, 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 뷰톡시 등), C6 내지 C12 아릴옥시기(예컨대, 페닐옥시, 나프틸옥시, 바이페닐옥시 등), 아미노기, 하이드록실기, 할로젠 원자(예컨대, 불소, 염소, 브롬, 요오드) 또는 실릴기 등을 들 수 있다. 이 경우, 치환기는 치환 가능한 위치에 1개 이상 도입되어 있어도 좋고, 바람직하게는 1개 내지 4개 도입되어 있어도 좋다. 치환기수가 2개 이상인 경우, 각 치환기는 동일하거나 다를 수 있다.
본 명세서에서, A1, A2 및 A3은, 각각 서로 독립적이고, 동일하거나 다르며, C1 내지 C20알킬기, C3 내지 C20 사이클로알킬기, 또는 C6 내지 C18 아릴기인 것이 바람직하고, C1 내지 C10 알킬기, C3 내지 C10 사이클로알킬기, 또는 C6 내지 C12 아릴기인 것이 더욱 바람직하고, 그 중에서도 메틸기는 생체 내에서 지방산의 대사에 관계하는 중요한 화합물인 카니틴으로 유도되기 때문에 특히 바람직하다.
본 명세서에서, 베타인의 염이란, 베타인과, 염산, 황산, 질산 등의 광산(鑛酸)과의 염, 푸마르산, 타르타르산(酒石酸) 등의 유기산과의 염, 수산화나트륨, 수 산화칼륨 등의 염기와의 염 등을 나타낸다. 예컨대, 카니틴염산염, 카니틴푸마르산염, 카니틴타르타르산염 등을 들 수 있다.
상기 식에서, X1은 할로젠 원소를 가리키고, 불소, 염소, 브롬, 요오드를 나타내지만, 입수 용이성 때문에 염소, 브롬인 것이 더 바람직하다.
상기 화학식 3으로 표시되는 4-할로-3-하이드록시뷰티로나이트릴, 상기 화학식 4로 표시되는 에피할로하이드린, 상기 화학식 2로 표시되는 4-할로-3-하이드록시뷰테인아마이드, 상기 화학식 2a로 표시되는 4-트라이알킬아미노-3-하이드록시뷰테인아마이드 할로젠화물, 상기 화학식 1로 표시되는 베타인에는 비대칭 탄소가 존재하지만, 본 발명은 라세미체, 광학 활성체의 어느 쪽에서도 실시 가능하다. 또한, 상기와 같은 광학 활성인 원료를 사용하거나, 광학 활성인 화합물을 제조하여 이후의 각 반응을 행한 경우에도, 본 발명은 온화한 조건 하에서의 반응이 가능하기 때문에, 광학 순도를 저하시키지 않고 베타인까지 제조할 수 있다.
본 명세서에서 수성 용매란, 물 또는 물과 유기 용제와의 혼합물이다. 물과 유기 용제는 2상계라도 상관없다. 사용되는 유기 용제로는 특별히 제한은 없지만, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 아이소프로판올, 뷰탄올 등의 알코올계 용매, 아세톤, 메틸아이소뷰틸케톤 등의 케톤계 용매, 아세트산에틸, 프로피온산에틸, 메타크릴산메틸 등의 에스터계 용매, 펜테인, 헥세인, 헵테인 등의 탄화수소계 용매, 벤젠, 톨루엔, 자일렌 등의 방향족계 용매, 다이클로로메테인, 클로로폼 등의 염소계 용매, 아세토나이트릴, 다이메틸폼아마이드, 테트라하이드로퓨란, 다이메틸설폭사이 드 등을 들 수 있고, 이들의 혼합 용제를 사용하여도 상관없다. 물에의 용해도가 높은 알코올계 용매, 아세토나이트릴, 다이메틸폼아마이드, 다이메틸설폭사이드를 사용하는 것이 더욱 바람직하다. 물에 용해하는 범위로 유기 용제를 사용하는 것이 더욱 바람직하고, 물이 많으면 반응 속도가 빨라지기 때문에, 물을 단독으로 사용하는 것이 특히 바람직하다.
본 발명의 제조 방법에서는, 하기 화학식 2로 표시되는 4-할로-3-하이드록시뷰테인아마이드를 경유하는 공정을 포함한다. 본 명세서에서, 「경유한다」란, 하기 화학식 2로 표시되는 아마이드를 출발 물질로서 사용하는 경우와, 출발 물질로는 다른 물질을 사용하지만, 중간체로서 하기 화학식 2로 표시되는 아마이드를 경유하는 경우의 쌍방을 의미한다.
[화학식 2]
Figure 112009034577717-pct00017
[상기 식에서, X1은 상기한 의미를 갖는다.]
본 발명에 따른 베타인의 제조 방법에서는, 4-할로-3-하이드록시뷰테인아마이드를 4급 아미노화 반응의 기질로서 사용하는 것이 바람직하다. 이 방법은 종래 의 방법보다 4급 아미노화 생성물 수율이 대폭 개선되고, 부생성물을 대폭 억제하는 것이 가능하다.
상기 화학식 2로 표시되는 4-할로-3-하이드록시뷰테인아마이드의 제법은 특별히 제한은 없다. 예컨대, 화학적 반응에 의해 얻는 방법으로서, 에스터와 암모 니아를 사용하여 아마이드로 변환하는 방법, 산할로젠화물과 암모니아를 사용하여 아마이드로 변환하는 방법, 산이나 염기를 촉매로 하여 나이트릴을 아마이드로 변환하는 방법 등을 들 수 있고, 어느 쪽의 방법이라도 상관없다. 나이트릴로부터 아마이드로 변환하는 방법으로는, 염산 등의 광산이나 포름산 등을 사용하는 방법, 과산화 수소와 알칼리를 작용시키는 방법, 2산화망간을 사용하는 방법 등이 알려져 있고, 어느 쪽의 방법이라도 사용할 수 있다.
또한, 나이트릴하이드라타아제의 작용에 의해 상기 화학식 3으로 표시되는 4-할로-3-하이드록시뷰티로나이트릴을 아마이드화하여 상기 화학식 2로 표시되는 4-할로-3-하이드록시뷰테인아마이드를 제조할 수도 있다. 이 반응은 온화한 조건 하에 행하는 것이 가능하기 때문에, 엄격한 조건이나 복잡한 조작을 필요로 하는 산·염기 촉매를 사용했을 때의 부반응의 진행을 억제하는 것이 가능하다.
Figure 112009034577717-pct00018
[상기 식에서, X1은 상기한 의미를 갖는다.]
상기 화학식 3으로 표시되는 4-할로-3-하이드록시뷰티로나이트릴에 나이트릴하이드라타아제를 작용시킨 경우, 상기 화학식 2로 표시되는 아마이드로부터 추가로 가수 분해 반응을 일으키지 않고, 온화한 조건 하에서, 게다가 거의 정량적으로 상기 화학식 2로 표시되는 아마이드를 얻을 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 화학식 2로 표시되는 아마이드의 전구체인, 4-할로- 3-하이드록시뷰티로나이트릴의 제법은 특별히 한정되지 않지만, 예컨대, 하기 화학식 4로 표시되는 에피할로하이드린과 시안화수소로 합성하는 방법(일본 공개 특허 공보 제2002-241357호 참조), 에피할로하이드린과 시아나이드염으로 합성하는 방법(일본 공개 특허 공보 제2004-182607호 참조),
[화학식 4]
Figure 112009034577717-pct00019
[상기 식에서, X1은 상기한 의미를 갖는다.]
하기 화학식 5로 표시되는 1,3-다이클로로-2-프로판올과 시안화수소로 합성하는 방법(일본 공개 특허 공보 평5-219965호 참조)
[화학식 5]
Figure 112009034577717-pct00020
[상기 식에서, X1은 상기한 의미를 갖는다. X2는 X1과 서로 독립적이고, 동일하거나 다른 할로젠 원자이다.]
등, 어느 방법으로 합성한 것도 사용할 수 있다. 여기서, 시아나이드염으로는, 시안화수소의 알칼리 금속염을 사용하는 것이 바람직하고, NaCN, KCN, LiCN을 사용하는 것이 더욱 바람직하다. 또한, 상기 화학식 4로 표시되는 에피할로하이드린의 광학 활성체를 사용한 경우, 광학 활성인 4-할로-3-하이드록시뷰티로나이트릴을 제조하는 것도 가능하다.
또한, 효소 촉매(할로하이드린에폭시다아제)를 사용함으로써, 상기 화학식 4로 표시되는 에피할로하이드린이나 상기 화학식 5로 표시되는 1,3-다이할로-2-프로판올로부터, 직접 광학 활성 4-할로-3-하이드록시뷰티로나이트릴을 제조할 수도 있다.
본 발명에 있어서, 할로하이드린에폭시다아제는 상기 화학식 4로 표시되는 에피할로하이드린이나 상기 화학식 5로 표시되는 1,3-다이할로-2-프로판올로부터, 4-할로-3-하이드록시뷰티로나이트릴을 생성하는 기능을 갖는 것이면 특별히 한정되지 않는다.
할로하이드린에폭시다아제를 산생하는 미생물로는, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속, 마이크로박테리움(Microbacterium) 속, 아그로박테리움 속, 마이코박테리움(Mycobacterium) 속 및 아스로박터(Arthrobacter) 속에 속하는 미생물이다.
구체적인 미생물로는, 코리네박테리움(Corynebacterium) sp.N-1074(FERM BP-2643), 마이크로박테리움(Microbacterium) sp.N-4701(FERM BP-2644), 아그로박테리움 라디오박터(Agrobacterium radiobacter) AD1, 마이코박테리움(Mycobacterium) sp.GP1 및 아스로박터(Arthrobacter) sp.AD2 등을 들 수 있다.
특히 바람직한 미생물은, 코리네박테리움(Corynebacterium) sp.N-1074(FERM BP-2643), 및 마이크로박테리움(Microbacterium) sp.N-4701(FERM BP-2644)이다. N-4701주는, 독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터(이바라기현 츠쿠바시 히가시 1-1-1 츄우오우 다이 6)에 평성 1년 4월 19일부로 기탁되어 있 고, 그 수탁 번호는 FERM BP-2643 및 FERM BP-2644이다.
또한, 상기 미생물의 할로하이드린에폭시다아제 유전자를 클로닝하여, 형질 전환(도입)한 미생물도, 상기의 할로하이드린에폭시다아제를 산생하는 미생물로서 포함된다.
할로하이드린에폭시다아제 유전자는, 예컨대, GenBank에 공표되어 있고, 코리네박테리움(Corynebacterium) sp.N-1074 유래의 할로하이드린에폭시다아제 유전자(hheB)의 Accession 번호는 D90350이다.
본 발명에 따른 할로하이드린에폭시다아제는, 상술한 방법으로 조제된 할로하이드린에폭시다아제 활성을 갖는 미생물을 배양하여, 그 배양물로부터 채취하는 것에 의해 얻을 수 있다.
할로하이드린에폭시다아제 활성을 갖는 미생물을 배양하는 배지(培地)로는, 미생물이 자화(資化)할 수 있는 탄소원, 질소원, 무기염류 등을 함유하고, 형질 전환체의 배양을 효율적으로 행할 수 있는 배지이면, 천연 배지, 합성 배지의 어느 것이라도 사용할 수 있다. 탄소원으로는, 글루코스, 프럭토스, 수크로스, 전분 등의 탄수화물, 아세트산, 프로피온산 등의 유기산, 에탄올, 프로판올 등의 알코올류를 들 수 있다. 질소원으로는, 암모니아, 염화암모늄, 황산암모늄, 아세트산암모늄, 인산암모늄 등의 무기산 또는 유기산의 암모늄염 또는 그 밖의 함질소 화합물 외에, 펩톤, 고기 추출물(meat extract), 콘 스팁 리커(corn steep liquor) 등을 들 수 있다. 무기물로는, 인산 제 1 칼륨, 인산 제 2 칼륨, 인산마그네슘, 황산마그네슘, 염화나트륨, 황산 제 1 철, 황산망간, 황산구리 또는 탄산칼슘 등을 들 수 있다.
상기 미생물의 배양은 통상적 방법에 의하면 좋고, 예컨대, pH 4 내지 10, 온도 10 내지 45℃의 범위에서 호기(好氣)적으로 10 내지 180시간 배양한다. 배양은 액체 배양, 고체 배양의 어느 것으로도 할 수 있다. 형질 전환체의 배양은 진탕 배양 또는 통기 교반 배양 등의 호기적 조건 하에, 30 내지 40℃에서 행하는 것이 바람직하다. 배양 중에는 필요에 따라 엠피실린이나 카나마이신 등의 항생 물질, 인듀서를 배지에 첨가할 수도 있다.
상기의 방법으로 조제한 할로하이드린에폭시다아제를 배양하여 얻어지는 배양물 또는 그 처리물은 상기 화학식 4로 표시되는 에피할로하이드린이나 상기 화학식 5로 표시되는 1,3-다이할로-2-프로판올로부터, 4-할로-3-하이드록시뷰티로나이트릴을 제조할 수 있다. 「처리물」이란, 균체(菌體)의 파쇄물, 약제 처리한 균체, 고정화한 균체, 조(粗)효소·정제 효소 등의 균체 추출물을 의미한다.
반응액의 용매로는, 특별히 제한은 없지만, 일반적으로는 상기 수성 용매를 사용한다. 특히 물이 바람직하고, 효소 활성의 최적 pH 4 내지 10의 부근인 물 또는 완충액을 사용한다. 완충액으로는, 예컨대, 인산, 붕산, 시트르산, 글루탈산, 사과산, 말론산, o-프탈산, 석신산 또는 아세트산 등의 염 등에 의해 구성되는 완충액, Tris 완충액 또는 Good 완충액 등이 바람직하다.
반응 온도는 5 내지 50℃, 반응 pH는 4 내지 10의 범위로 하는 것이 바람직하다. 반응 온도는 더욱 바람직하게는 10 내지 40℃이다. 반응 pH는 더욱 바람직하게는 pH 6 내지 9이다. 반응 시간은 기질 등의 농도, 균체 농도 또는 그 밖의 반응 조건 등에 따라 적시 선택하지만, 1 내지 120시간으로 종료하도록 조건을 설정하는 것이 바람직하다. 또한, 본 반응에 있어서는, 반응의 진행에 따라 생성하는 염소 이온을 적당한 알칼리로 중화함으로써 반응을 보다 원활하게 진행시킬 수 있다.
또한, 시안 화합물로는, 시안화수소, 시안화칼륨, 시안화나트륨, 시안산 또는 아세톤시안하이드린 등의 반응액 중에 첨가했을 때에 시안 이온(CN-) 또는 시안화수소를 생성하는 화합물 또는 그의 용액을 사용할 수 있다.
반응액 중 기질 농도는 효소 안정성의 관점에서 0.01 내지 20(W/V)%가 바람직하고, 0.01 내지 10%가 특히 바람직하다.
또한, 시안 화합물의 사용량은 효소 안정성의 관점에서 기질의 1 내지 3배량(몰)이 바람직하다.
이상과 같은 방법으로 제조된 상기 화학식 3으로 표시되는 4-할로-3-하이드록시뷰티로나이트릴은 공지의 방법을 사용하여 채취 및 정제할 수 있다. 예컨대, 반응액으로부터 원심 분리 등의 방법을 사용하여 균체를 제거한 후, 아세트산에틸 등의 용매로 추출을 행하여, 감압 하에 용매를 제거함으로써 4-할로-3-하이드록시뷰티로나이트릴의 시럽을 얻을 수 있다. 종종 착색이 발생하여 반응액이 갈색으로 되지만, 활성탄 등에 의해 탈색 조작을 행하여도 좋다. 또한, 이들의 시럽을 감압 하에 증류함으로써 더욱 정제할 수도 있다.
광학 활성인 4-할로-3-하이드록시뷰티로나이트릴을 사용하여 본 발명을 실시하는 경우, 그 광학 순도는 이후의 반응이 온화한 조건이기 때문에, 광학 순도를 저하시키지 않고 베타인까지 제조하는 것이 가능하다.
본 발명에 있어서, 나이트릴하이드라타아제는 특별히 한정되지 않지만, 상기 화학식 3으로 표시되는 4-할로-3-하이드록시뷰티로나이트릴의 나이트릴을 아마이드로 변환하는 반응을 촉매하는 효소이며, 국제적인 효소 분류에 의하면 리아제(lyase)에 속하는 효소이다. 본 발명에서 사용하는 나이트릴하이드라타아제를 갖는 미생물은, 예컨대, 아크로모박터(Achromobacter) 속, 아시도보락스(Acidovorax) 속, 아그로박테리움(Agrobacterium) 속, 아스로박터(Arthrobacter) 속, 바실러스(Bacillus) 속, 브레비박테리움(Brevibacterium) 속, 버크홀데리아(Burkholderia) 속, 칸디다(Candida) 속, 카세오박터(Caseobacter) 속, 코마모나스(Comamonas) 속, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속, 디엣지아(Dietzia) 속, 엔테로박터(Enterobacter) 속, 어비니아(Erwinia) 속, 지오바실러스(Geobacillus) 속, 고도나(Gordona) 속, 클렙시엘라(Klebsiela) 속, 마이크로아스커스(Microascus) 모가넬라(Morganella) 속, 판토에아(Pantoea) 속, 프로테우스(Proteus) 속, 슈도모나스(Pseudomonas) 속, 슈도노카디아(Pseudonocardia) 속, 로도코커스(Rhodococcus) 속, 리조비움(Rhizobium) 속, 세라티아(Serratia) 속, 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속, 사이탈리듐(Syctalidium) 속, 투카무렐라(Tukamurella) 속에 속하는 미생물이다.
본 발명에서 사용하는 나이트릴하이드라타아제로는, 구체적으로는, 아스로박터 글로비포미스(Arthrobacter globi-formis) IFO 12138, 브레비박테리움 헬볼룸(Brevibacterium helvolum) ATCC 11822, 코리네박테리움 프라브-센 스(Corynebacterium flaves-cens) IAM 1642, 로도코커스 에리스로폴리스(Rhodococcus erythropolis) IFO 12540 및 IFO 12539, 스트렙토마이세스 알보그리세올러스(Streptomyces albogriseolus) HUT 6045, 스트렙토마이세스 크리소말러스(Streptomyces chrysomallus) HUT 6141, 스트렙토마이세스 시네레오우러버(Streptomyces cinereouruber) HUT 6142, 스트렙토마이세스 디아스태티커스(Streptomyces diastaticus) HUT 6116, 스트렙토마이세스 올리바세우스(Streptomyces olivaceus) HUT 6061, 스트렙토마이세스 루브로시아노디아스태티커스(Streptomyces rubrocyanodiastaticus) HUT 6117, 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae) IFO 12019, IFO 3319, IFO 12059, IAM 1063, 클렙시엘라 뉴모니아 서브스피시즈 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae) NH-36T2 주, 세라티아 플라이뮤티카(Serratia plymuthica) IFO 3055, 세라티아 마세센스(Serratia marcescens) IAM 1105, 어비니아 카로토보라(Erwinia carotovora) IFO 3057, 투카무렐라 파우로메타볼룸(Tukamurella paurometabolum) JCM 3226, 고도나 루브로퍼틴터스(Gordona rubropertinctus) JCM 3227, 모가넬라 모가니(Morganella morganii) IFO 3848, 프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris) IFO 3167, 엔테로박터 에어로제네스(Enterobacter aerogenes) IFO 12010, 마이크로아스커스 데모스포러스(Microascus desmosporus) IFO 6761, 칸디다 귈리어몬디(Candida guilliermondii) NH-2주(FERM P-11350호), 판토아 아글로메란스(Pantoea agglomerans) NH-3주(FERM P-11349호) 등이 산생하는 나이트릴하이드라타아제를 들 수 있다.
또, ATCC 번호가 부여된 미생물 균주는 각각 ATCC(American Type Culture Collection)로부터 용이하게 입수할 수 있다. 또한, IFO 번호가 부여된 미생물은, (재(財)) 발효 연구소(IFO) 발행의 「List of Cultures, 제8판, 제 1 권(1988)」에 기재되어 있고, 현재는 독립 행정 법인 제품 평가 기술 기반 기구 바이오테크놀로지 본부 생물 유전 자원 부문 유전 자원 보존과로부터 입수할 수 있다. IAM 번호가 부여된 미생물은 동경 대학 응용 미생물학 연구소로부터 입수할 수 있다. JCM 번호가 부여된 미생물은 이화학 연구소 계통 미생물 보존 기관 발행의「Catalogue of strains 제4판(1989)」에 기재되어 있고, 이화학 연구소 계통 미생물 보존 기관으로부터 입수할 수 있다. HUT 번호가 부여된 미생물은 일본 미생물 보존 연맹(JFCC) 발행의 「Catalogue of Cultures, 제4판(1987)」에 기재되어 있고, 히로시마 대학 공학부로부터 입수할 수 있다. FERM 번호가 부여된 미생물은 독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터로부터 입수할 수 있다.
또한, 본 발명에서 사용하는 나이트릴하이드라타아제로는, 야마다 등이 토양으로부터 분리한 로드코커스 로드클로스 J-1[FERM BP-1478호], 및 애스로박터 sp.SK103[FERM P-11300호], 카세오박터 sp.BC23[FERM P-11261호], 슈도모나스 sp.BC15-2[FERM BP-3320호], 슈도모나스 sp.SK31[FERM P-11310호], 슈도모나스 sp.SK87[FERM P-11311호], 슈도모나스 sp.SK13[FERM BP-3325호], 로도코커스 sp.SK70[FERM P-11304호], 로도코커스 sp.HR11[FERM P-11306호] 및 로도코커스 sp.SK49[FERM P-11303호] 등이 산생하는 나이트릴하이드라타아제도 들 수 있다. 이들 세균은 각각 상기 기탁 번호에 의해 독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터에 기탁되어 있다.
또한, 상기 미생물의 나이트릴하이드라타아제 유전자를 클로닝하여, 형질 전환(도입)한 미생물도, 상기의 나이트릴하이드라타아제를 산생하는 미생물로서 포함된다. 예컨대, 미국 특허 제5807730호에 기재된 슈도노카디아(Pseudonocardia) 속의 나이트릴하이드라타아제 유전자로 형질 전환된 대장균(MT-10822주(FERM BP-5785)), 일본 공개 특허 공보 평8-266277호에 기재된 아크로모박터(Achromobacter) 속의 나이트릴하이드라타아제로 형질 전환된 대장균(MT-10770주(FERM P-14756)), 일본 공개 특허 공보 평4-211379호에 기재된 로도코커스·로도크로스(Rhodococcus rhodochrous) 종의 나이트릴하이드라타아제로 형질 전환된 미생물 등을 들 수 있다.
본 발명에서 사용하는 나이트릴하이드라타아제를 산생하는 미생물을 배양하기 위한 배지 조성으로는 특별히 한정되지 않지만, 보통 이들 미생물이 생육할 수 있는 것이면 관계없이 사용할 수 있다. 예컨대, 탄소원으로서 글루코스, 프럭토스, 수크로스, 말토스 등의 당류, 아세트산, 시트르산 등의 유기산류, 에탄올, 글라이세롤 등의 알코올류 등, 질소원으로서 펩톤, 고기 추출물, 효모 추출물, 단백질 가수 분해물, 아미노산류 등의 천연 질소원의 외에 각종 무기, 유기산 암모늄염 등을 사용할 수 있고, 이 외에, 무기염, 미량 금속, 비타민 등이 필요에 따라 적절히 사용된다. 이 때, 보다 높은 효소 활성을 유도시키기 위해 4-클로로-3-하이드록시뷰티로나이트릴, 프로피오나이트릴, 아이소뷰티로나이트릴, 벤질시아나이드 등의 각종 나이트릴 화합물, 4-클로로-3-하이드록시뷰테인아마이드, 프로피온아마이 드, 아이소뷰테인아마이드 등의 각종 아마이드 화합물 등을 배지에 첨가하는 것이 더욱 바람직하다. 상기 미생물의 배양은 통상적 방법으로 행하여도 좋고, 예컨대, pH 4 내지 10, 온도 10 내지 45℃의 범위에서 호기적으로 10 내지 180시간 배양한다. 배양은 액체 배양, 고체 배양의 어느 방법으로도 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 4-할로-3-하이드록시뷰티로나이트릴에 효소를 작용시켜 4-할로-3-하이드록시뷰테인아마이드를 얻는 방법으로는 특별히 한정되지 않지만, 상기한 바와 같이 하여 얻은 나이트릴하이드라타아제를 산생시킨 미생물의 배양액 또는 원심 분리 등에 의해 얻은 균체의 현탁액에 기질을 첨가하는 방법, 상기 미생물 균체 처리물(예컨대, 균체 파쇄물, 균체 추출물 등), 나이트릴하이드라타아제 조효소, 정제 효소 등의 현탁액에 기질을 첨가하는 방법, 또는 통상적 방법에 의해 고정화한 균체 또는 균체 처리물, 조효소, 정제 효소 등을 반응액에 첨가하는 방법, 미생물의 배양 시에 기질을 배양액에 첨가하여 배양과 동시에 반응을 행하는 방법, 기질의 수용액을 조제하여 상기한 바와 같이 하여 얻은 미생물 배양액, 미생물 균체, 미생물 균체 처리물, 나이트릴하이드라타아제 조효소, 정제 효소, 또는 그들을 고정화한 것을 일괄 또는 분할하여 첨가하는 방법 등을 들 수 있지만, 이 아마이드화 반응이 발열 반응이어서, 발열에 의한 반응의 폭주를 막는다는 점에서 균체의 현탁액을 기질의 수용액에 첨가하여 반응 속도를 제어하는 것이 바람직하다.
에피할로하이드린나 1,3-다이클로로-2-프로판올을 원료로 하고, 시안화수소 또는 시아나이드염과 작용시켜 4-할로-3-하이드록시뷰티로나이트릴을 제조하는 방 법 등에 의해 합성된 반응 종료액을 그대로 사용하여, 다음의 나이트릴하이드라타아제에 의한 아마이드화 반응을 행하여도 좋다. 이 경우, 계 내에 잔존하고 있는 시안화수소 화합물이 나이트릴하이드라타아제를 실활시켜 버리는 경우가 종종 있다. 그것을 방지하기 위해 미리 산성 조건 하에 가열, 감압, 토핑 등의 조작을 행하여, 계 내의 시안화수소 농도를 10ppm 이하, 그 위에 1ppm 이하로 하는 것이 더욱 바람직하다.
또한, 계 내의 시안화수소 농도를 1ppm 이하로 하여도 4-할로-3-하이드록시뷰티로나이트릴의 아마이드화 반응이 신속하게 진행되지 않는 경우는, 4-할로-3-하이드록시뷰티로나이트릴 또는 그의 용액을 가열 처리하는 것에 의해 아마이드화 반응이 신속하게 진행되는 경우가 있다.
그 가열 방법은 본 발명의 목적이 달성되는 것이면 특별한 제한은 없고, 가압, 감압, 상압 조건 하의 어느 조건에서도 선택할 수 있다. 또한, 4-할로-3-하이드록시뷰티로나이트릴 및 그 용액을, 그 비점 이상으로 가열하고, 환류 또는 증류하는 방법 등을 들 수 있다. 용액은 유기 용제이거나 수용액이거나 또는 그들의 혼합액이어도 상관없지만, 보통 아마이드화 반응은 수(水)용매 중에서 실시되고, 연속해서 반응을 행할 수 있기 때문에, 수용매 중에서 가열 처리하는 것이 바람직하다.
가열 시간은 0.1 내지 100시간 정도이고, 0.5 내지 50시간이 바람직하며, 더 바람직하게는 1 내지 10시간이다. 가열 온도는 40℃ 정도부터 4-할로-3-하이드록시뷰티로나이트릴이 분해되지 않는 온도까지의 범위로 처리하는 것이 가능하고, 60 내지 150℃가 바람직하다. 4-할로-3-하이드록시뷰티로나이트릴의 수용액을 가열 처리할 때, 그 분해를 막기 위해, pH는 중성 내지 산성 영역이 바람직하고, pH 1 내지 7이 더욱 바람직하다.
또한, 미량의 금속염을 첨가함으로써, 4-할로-3-하이드록시뷰티로나이트릴 중에 극미량 포함되는 시안 이온을 금속 착체로 하는 것에 의해 저감시킴으로써, 아마이드화 반응을 신속하게 진행시킬 수도 있다. 금속 착체로 하는 방법은, 상기 나이트릴과 나이트릴하이드라타아제를 접촉시키기 전에, 시안화수소와 반응하여 금속 시안화물 착체를 형성하는 금속을, 상기 나이트릴 또는 상기 나이트릴을 포함하는 용액에 금속염으로서 첨가함으로써, 시안 이온을 금속 사이아노화 착체로 하는 방법이다. 금속으로는, 코발트, 니켈, 아연이 바람직하고, 염의 형태로는, 특별히 제한되지 않지만, 질산염, 염화물, 황산염, 카복실산염을 예시할 수 있다. 또한 수화물을 사용할 수도 있다.
미량의 금속염을 첨가할 때에는, 4-할로-3-하이드록시뷰티로나이트릴을 포함하는 용액에 포함되는 시안 이온 농도에 따른 양의 금속염을 첨가해야 한다. 금속 첨가량이 불충분한 경우에는 시안 이온의 영향을 충분히 제거할 수 없다. 또한, 금속 첨가량이 지나친 경우에는 반대로 아마이드화 반응을 저해할 수도 있다. 또한, 금속염의 첨가 후에는 나이트릴하이드라타아제가 고활성을 나타낼 때마다 적절한 pH로 재차 조절하고 나서, 아마이드화 반응으로 이행하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서의 나이트릴하이드라타아제에 의한 아마이드화 반응의 조건에 특별한 제한은 없고, 그 반응 온도는 사용하는 효소에 따라 적절히 결정된다. 일반적으로는 반응액이 얼지 않는 온도 내지 50℃ 정도이다. 「반응액이 얼지 않는 온도」란, 어떠한 반응액 중에서 아마이드화 반응을 행하는가에 따라, 그 온도는 다르다. 희박 용액에서의 반응이면, 반응액에 용해되어 있는 용질의 몰농도(㏖/㎏)와 용매의 몰 응고점 강하의 값으로부터 그 온도는 산출할 수 있다. 예컨대, 수(水) 매체에 용해된 14% 정도의 4-할로-3-하이드록시뷰티로나이트릴을 아마이드화 반응에 제공하는 경우, 그 반응액이 얼지 않는 온도란, 물의 응고점 강하가 1.858, 4-할로-3-하이드록시뷰티로나이트릴의 몰 농도(㏖/㎏)가 1.171이므로, 응고점은 약 -2℃ 정도로 된다. 일본 특허 공보 제3014171호에는 4-할로-3-하이드록시뷰티로나이트릴에 효소를 작용시켜 4-할로-3-하이드록시뷰테인아마이드를 합성하는 반응 온도는, 5 내지 50℃로 기재되어 있다. 본 발명에 있어서 특히 베타인을 제조할 목적에서의 4-할로-3-하이드록시뷰티로나이트릴의 4-할로-3-하이드록시뷰테인아마이드로의 아마이드화 반응은, 부반응의 진행을 억제하기 위해 반응액이 얼지 않는 온도 내지 30℃ 정도가 더욱 바람직하고, 반응액이 얼지 않는 온도 내지 5℃가 특히 바람직하다. 4-할로-3-하이드록시뷰티로나이트릴 농도는 특별히 한정되지 않지만, 보통 0.01 내지 50(W/V)% 정도이고, 0.1 내지 40% 정도가 더욱 바람직하다. 반응액의 pH는 4 내지 10의 범위가 바람직하고, 6 내지 9로 하는 것이 더욱 바람직하다. 반응 시간은 기질 농도, 균체 농도 또는 그 외의 반응 조건에 따라 변하지만, 보통 0.5 내지 120시간으로 종료하도록 조건을 설정하는 것이 바람직하고, 부반응의 진행을 억제하기 위해서도, 0.5 내지 24시간 정도, 더욱이는 0.5 내지 15시간 정도로 종료하도록 설정하는 것이 더 바람직하다.
이상과 같이 하여 합성한 4-할로-3-하이드록시뷰테인아마이드는 추출, 컬럼 분리, 재결정 등의 정법(定法)에 따라, 단리(單離) 정제할 수 있다. 나이트릴하이드라타아제를 갖는 미생물을 사용한 경우, 반응 종료 후에 균체 등을 여과할 수도 있지만, 4-할로-3-하이드록시뷰테인아마이드는 수용액 중에서 불안정하여, 저온에서 여과 조작을 행할 필요가 있다. O 내지 10℃정도로 조작을 행하는 것이 더욱 바람직하다.
4-할로-3-하이드록시뷰티로나이트릴의 광학 활성체를 아마이드화 반응의 기질로서 사용한 경우, 4-할로-3-하이드록시뷰테인아마이드도 광학 활성체로 되지만, 광학 활성체의 어느 한쪽이 과도한 상태이면, 4-할로-3-하이드록시뷰테인아마이드의 재결정 조작 등을 행하면 광학 순도를 향상시킬 수 있다. 또한 라세미체의 4-할로-3-하이드록시뷰테인아마이드를 제조한 경우는, 광학 분할제 등을 사용하여 광학 활성인 4-할로-3-하이드록시뷰테인아마이드를 얻는 것도 가능하다.
본 발명에서 사용하는 상기 화학식 2로 표시되는 4-할로-3-하이드록시뷰테인아마이드는 정제한 것을 사용할 수도 있고, 나이트릴하이드라타아제를 작용시킨 후의 수용액의 상태일 수도 있다. 단, 전술한 바와 같이 4-할로-3-하이드록시뷰테인아마이드는 수용액 중에서 불안정하여, 단리 정제를 행하면 더 반응을 일으켜 수율의 저하를 초래하는 경우가 있다. 이러한 점에서, 컬럼 정제 등에 의한 단리 정제는 번잡한 것에 더하여 80% 정도의 단리 정제 수율이라는 점, 또한 최종 생성물까지의 총수율을 고려하면, 나이트릴하이드라타아제를 작용시킨 후의 수용액을 그대로 사용하는 것이 바람직하다.
전술한 바와 같이, 4-할로-3-하이드록시뷰테인아마이드는 수용액 중에서 불안정하기 때문에, 부반응을 억제하기 위해 4-할로-3-하이드록시뷰테인아마이드의 제조 종료 후, 48시간 이내에 트라이알킬아민에 의한 4급 아미노화 반응으로 이행하는 것이 더욱 바람직하고, 10시간 이내인 것이 특히 바람직하다. 또한 트라이알킬아민과 접촉시킬 때까지, 반응 종료액의 온도는 0 내지 10℃로 유지하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 하기 화학식 1로 표시되는 베타인의 제조 방법은 하기 화학식 2로 표시되는 아마이드를 4급 아미노화하는 공정과, 아마이드기를 가수 분해하는 공정을 포함하는 것이 바람직하다. 화합물(2)의 가수 분해 반응은 다양한 부반응이 일어나기 때문에, 수율 향상의 관점에서 4급 아미노화 공정을 먼저 행하여 화합물(2a)로 표시되는 4-트라이알킬아미노-3-하이드록시뷰테인아마이드 할로젠화물을 제조하고, 계속해서 가수 분해 공정을 행한다.
Figure 112009034577717-pct00021
[상기 식에서, X1, A1, A2 및 A3은 상기한 의미를 갖는다.]
본 발명에 있어서, 상기 화학식 2로 표시되는 아마이드를 4급 아미노화하는 공정에서, 트라이메틸아민, 트라이에틸아민, 트라이뷰틸아민 등의 트라이알킬아민(NA1A2A3)을 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명에서 사용하는 트라이알킬아민은 무수의 상태여도 수용액 상태여도 상관없다.
4급 아미노화 반응에서, 상기 화학식 2로 표시되는 4-할로-3-하이드록시뷰테인아마이드의 용액을 사용하여 반응을 행하는 경우, 그 용매는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 상기 수성 용매를 사용하는 것이 바람직하다.
4급 아미노화 반응에서, 상기 화학식 2로 표시되는 4-할로-3-하이드록시뷰테인아마이드의 용액을 사용하여 반응을 행하는 경우, 이 반응 시에 사용하는 트라이알킬아민은 무수의 트라이알킬아민이거나 그의 수용액이어도 상관없지만, 4-할로-3-하이드록시뷰테인아마이드 용액의 용매로서, 물과 상용성이 있는 유기 용제를 사용한 경우는, 트라이알킬아민의 수용액을 사용한 편이 고수율과 고반응 속도를 가져오는 경우가 많기 때문에 더욱 바람직하고, 물을 단독으로 사용하여 반응을 행하는 쪽이 고수율과 고반응 속도를 가져오기 때문에, 4-할로-3-하이드록시뷰테인아마이드의 수용액, 또는 4-할로-3-하이드록시뷰티로나이트릴로부터 나이트릴하이드라타아제를 작용시켜 4-할로-3-하이드록시뷰테인아마이드를 합성한 반응 완결된 수용액을 그대로 사용하는 것이 특히 바람직하다.
수성 용매 중에서 4급 아미노화 반응을 시작할 때는, 4-할로-3-하이드록시뷰테인아마이드에 트라이알킬아민을 첨가하여도, 트라이알킬아민에 4-할로-3-하이드록시뷰테인아마이드를 첨가하여도 상관없다. 첨가가 완료한 후에 소정의 온도로 상승시키는 것이 바람직하다.
4급 아미노화 반응에서의 4-할로-3-하이드록시뷰테인아마이드의 농도는, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 보통 0.1 내지 50% 정도이며, 1 내지 20% 정도가 더 욱 바람직하다. 한편, 트라이알킬아민의 사용량은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 보통 4-할로-3-하이드록시뷰테인아마이드에 대하여 1.0 내지 20.0당량(몰)이며, 1.1 내지 8.0당량 정도가 더욱 바람직하다. 반응 온도는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 보통 -10℃ 내지 60℃ 정도이며, 0℃ 내지 50℃ 정도가 더욱 바람직하다.
또한, 트라이메틸아민 등의 비점이 낮은 트라이알킬아민을 사용할 때는, 트라이알킬아민의 휘발에 의한 트라이알킬아민의 감소에 주의하는 것이 바람직하다. 특히, 반응에 사용하는 트라이알킬아민의 당량수가, 4-할로-3-하이드록시뷰테인아마이드에 대하여 1.2당량 이하 등의 비교적 저당량일 때, 기화하지 않도록 주의를 한 경우와 그렇지 않은 경우의 4-트라이알킬아미노-3-하이드록시뷰테인아마이드 할로젠화물의 수율에는 현저한 차이가 보인다.
4급 아미노화 반응에서는 갈색으로 착색되는 경우가 있다. 이 탈색 때문에, 활성탄 등에 의한 탈색 조작을 행하여도 좋다.
이상과 같이 하여 합성한 상기 화학식 2a로 표시되는 4-트라이알킬아미노-3-하이드록시뷰테인아마이드 할로젠화물은 추출, 컬럼 분리, 재결정, 전기 투석, 이온 교환법 등의 정법에 따라, 단리 정제할 수 있다.
4-할로-3-하이드록시뷰티로나이트릴 또는 4-할로-3-하이드록시뷰테인아마이드의 광학 활성체를 4급 아미노화 반응의 전구체, 또는 기질로서 사용한 경우, 상기 화학식 2a로 표시되는 4-트라이알킬아미노-3-하이드록시뷰테인아마이드 할로젠화물도 광학 활성체로 되지만, 광학 활성체의 어느 한쪽이 과도한 상태에서, 상기 화학식 2a로 표시되는 4-트라이알킬아미노-3-하이드록시뷰테인아마이드 할로젠화물의 재결정 조작 등을 행하면 광학 순도를 향상시킬 수 있다. 또한, 라세미체의 4-트라이알킬아미노-3-하이드록시뷰테인아마이드 할로젠화물을 제조한 경우는, 광학 분할제 등을 사용하여 광학 활성인 4-트라이알킬아미노-3-하이드록시뷰테인아마이드 할로젠화물을 얻는 것도 가능하다.
4-할로-3-하이드록시뷰테인아마이드를 기질로서 사용하여, 수성 용매 중에서 4급 아미노화 반응을 행하면, 지금까지 보고되었던 것과 같은 4-할로-3-하이드록시뷰티로나이트릴이나 4-할로-3-하이드록시뷰티르산에스터의 4급 아미노화 반응과 비교하여, 현저하게 4급 아미노화 생성물의 수율이 높다. 4급 아미노화 반응은 할로하이드린 화합물로부터 탈염산 반응이 일어나 에폭시 화합물이 생성된 후, 트라이알킬아민의 구핵(求核) 공격에 의해 4급 아미노화물이 생성하는 반응이 주반응, 크로톤산 유도체로의 이성화 반응이 부반응이라고 상정된다. 이 크로톤산 유도체로의 이성화 반응의 발생 용이성이 4급 아미노화 생성물의 수율의 고저를 좌우하고, 이성화의 용이성을 결정하는 것은 작용기의 전자 흡인성이라고 예상된다. 나이트릴이나 에스터와 같은 작용기보다 아마이드 쪽이 전자 흡인성이 낮고, 크로톤산 유도체로의 이성화 반응이 일어나기 어렵다. 이 때문에 에폭시체→크로톤산 유도체로의 이성화 반응의 비율이 감소하고, 그 만큼 트라이알킬아민의 구핵 공격의 비율이 상승하여 4급 아미노화 생성 수율이 높아진 것이라 상정된다.
본 발명에 있어서, 상기 화학식 2a로 표시되는 4-트라이알킬아미노-3-하이드록시뷰테인아마이드 할로젠화물을 가수 분해하는 공정에서, 가수 분해 반응의 방법 은 특별히 한정되지 않고, 산 촉매, 염기 촉매를 사용한 여러 가지의 공지된 방법으로 행할 수 있다. 예컨대, 일본 특허 공보 소43-26849호, 일본 공개 특허 공고 소55-13299호에는 옥살산을 사용하여 가수 분해 반응을 행하는 방법, 일본 특허 공고 소43-26850호에는 n-아질산뷰틸과 빙초산 및 염산 가스를 사용하여 가수 분해하는 방법, 일본 공개 특허 공보 평1-287065호에는, 카니틴나이트릴클로라이드로부터 일괄하여 알칼리 금속 수산화물이나 알카리토 금속 수산화물 등의 염기 촉매를 사용하여 나이트릴→아마이드→카복실산으로의 가수 분해하는 방법이 기재되어 있다. 또한, 일본 공개 특허 공보 평04-320679호에는 카니틴아마이드를 L-카니틴으로 변환하는 효소를 사용하는 방법이 기재되어 있지만, 산 촉매, 염기 촉매, 효소 촉매의 어떤 방법으로 한정되는 것은 아니다.
4-트라이알킬아미노-3-하이드록시뷰테인아마이드 할로젠화물의 가수 분해 반응에서의 주된 부생성물은 탈수체인 크로토노베타인이다.
4-트라이알킬아미노-3-하이드록시뷰테인아마이드 할로젠화물의 산 촉매에 의한 가수 분해 반응에서는, 이 크로토노베타인의 부생을 억제하는 (대 베타인으로 0.1 wt% 이하) 것이 가능하지만, 반응 속도가 느리기 때문에 엄격한 반응 조건이 필요하다. 사용되는 산성 물질로는, 염산, 황산, 인산, 질산 등의 광산이나, 아세트산, 트라이플루오로아세트산 등의 비교적 저탄소수의 유기산 등이 사용되지만, 공업적으로 잘 사용되는 염산이나 황산을 사용하는 것이 바람직하다.
4-트라이알킬아미노-3-하이드록시뷰테인아마이드 할로젠화물의 염기 촉매에 의한 가수 분해에서는, 산 촉매의 경우보다 크로토노베타인의 생성량은 많지만, 염 기의 종류에 따라서는 실온 하에서도 효율적으로 가수 분해 반응을 진행시킬 수 있고, 이러한 온화한 반응 조건 하에서라면, 크로토노베타인의 생성을 억제하는(대 베타인으로 1wt% 이하 정도) 것도 가능하다. 또한, 염기 촉매의 경우는 부생하는 암모니아를 기화 제거할 수 있기 때문에, 가수 분해 후의 중화 시에 부생하는 염을 적게 할 수 있게 된다. 사용되는 염기성 물질로는, 알칼리 금속 수산화물, 알카리토류 금속 수산화물, 알칼리 금속의 탄산염 또는 중탄산염, 제 3 급 아민, 제 4 급 암모늄하이드록사이드, 염기성 음이온 교환 수지 등을 들 수 있고, 구체적으로는 NaOH, KOH, Ca(OH)2, Na2CO3, K2CO3, 트라이에틸아민, NH4OH, 음이온 교환 수지 IRA-400 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용할 수도, 두 가지 이상을 조합시켜 사용할 수도 있다. 특히 NaOH, KOH는 반응을 실온 하에서도 효율적으로 진행시킬 수 있고, 또한 크로토노베타인의 부생이 적으므로 바람직하다.
산, 염기의 사용량은 상기 화학식 2a로 표시되는 4-트라이알킬아미노-3-하이드록시뷰테인아마이드 할로젠화물에 대하여 등몰 이상이 되도록 첨가하면 좋고, 1.1 내지 5.0당량 정도가 더욱 바람직하다. 상기 화학식 2a로 표시되는 4-트라이알킬아미노-3-하이드록시뷰테인아마이드 할로젠화물의 농도는 특별히 한정되지 않지만, 보통은 1 내지 50% 정도이고, 5 내지 30% 정도가 더욱 바람직하다. 반응 온도는 특별히 한정되지 않지만, 보통은 5 내지 100℃가 바람직하다. 산 촉매를 사용한 경우는 크로토노베타인의 생성은 매우 적기 때문에, 반응 시간의 관점에서 60 내지 100℃가 특히 바람직하다. 또한 염기 촉매를 사용한 경우를 예의 검토한 결 과, 크로토노베타인의 부생량은 반응 온도에 의존하고, 반응 온도를 낮게 하는 편이 생성을 억제할 수 있다는 것을 알았다. 따라서, 염기 촉매를 사용한 경우는, 크로토노베타인의 부생을 억제하는 관점에서 10 내지 60℃가 더욱 바람직하다.
용매로는 특별히 제한은 없지만, 상기 수성 용매가 바람직하고, 반응 속도와 부반응 억제의 관점에서 물 단독을 용매로서 사용하는 것이 특히 바람직하다. 또한, 4급 아미노화 반응을 수성 용매로 행한 경우는, 그대로 수성 용매로 가수 분해 반응을 행하는 것이 더욱 바람직하다.
지금까지 기술한 4-할로-3-하이드록시뷰티로나이트릴의 아마이드화 반응, 4-할로-3-하이드록시뷰테인아마이드의 4급 아미노화 반응, 4-트라이알킬아미노-3-하이드록시뷰테인아마이드 할로젠화물의 가수 분해 반응은 반응 속도의 관점에서 어느 것이나 수성 용매 중에서 행하는 것이 바람직하다. 특히, 물 단독을 반응 용매로 하는 것에 의해 그 효과는 더욱 현저해진다. 또한, 에피할로하이드린 또는 1,3-다이할로-2-프로판올로부터 4-할로-3-하이드록시뷰티로나이트릴을 합성하는 반응도 보통은 수성 용매 중에서 행해진다. 따라서, 전술한 모든 반응에서 물을 단독으로 용매로 사용하면, 출발 원료로부터 베타인까지 1포트에서 반응시킬 수도 있기 때문에 더욱 바람직하다.
가수 분해 반응에서는, 엷은 갈색으로 착색하는 경우가 있다. 또한, 가수 분해 반응 종료 후의 중화 후에도 착색하는 경우가 있다. 이 탈색을 위해, 활성탄 등에 의한 탈색 조작을 행하여도 좋다.
상기한 바와 같이 하여 얻어진 베타인은 추출, 컬럼 분리, 재결정, 전기 투 석, 이온 교환법 등의 정법에 따라, 단리 정제할 수 있다.
4-할로-3-하이드록시뷰티로나이트릴, 4-할로-3-하이드록시뷰테인아마이드, 4-트라이알킬아미노-3-하이드록시뷰테인아마이드 할로젠화물의 광학 활성체를 가수 분해 반응의 전구체, 또는 기질로서 사용한 경우, 얻어진 베타인도 광학 활성체로 되지만, 광학 활성체의 어느 한쪽이 과도한 상태이면, 베타인의 재결정 조작 등을 행하면 광학 순도를 향상시킬 수 있다. 또한, 라세미체의 베타인을 제조한 경우는, 광학 분할제 등을 사용함으로써, 광학 활성인 베타인을 얻는 것도 가능하다.
4-할로-3-하이드록시뷰테인아마이드, 4-트라이알킬아미노-3-하이드록시뷰테인아마이드 할로젠화물 및 베타인의 어느 단계에서도 재결정 조작 등으로 광학 순도를 향상시키는 것이 가능하지만, 각 반응 공정에서 부생성물이 발생하기 때문에, 베타인까지 제조하고 나서 정제를 겸한 재결정 조작 등에 의해 광학 순도 향상 조작을 정리하여 행하는 것이 더욱 바람직하다.
본 발명에 있어서, 광학 활성인 에피할로하이드린, 4-할로-3-하이드록시뷰티로나이트릴, 4-할로-3-하이드록시뷰테인아마이드, 4-트라이알킬아미노-3-하이드록시뷰테인아마이드 할로젠화물을 제조 또는 사용하여 베타인의 제조를 행한 경우, 광학 순도를 저하시키지 않고 대응하는 광학 활성인 베타인을 생성할 수 있다. 즉, 본 발명은 광학 활성인 베타인, 특히 L-카니틴을 제조하는 방법으로서 유용하다.
<실시예>
이하, 실시예에 의해 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이 예에만 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 사용한 각종 정량 분석 방법에 대하여, 분석 방법을 상세하게 이하에 나타낸다.
분석 방법 (1)
● 분석 대상 화합물
◇ 1,3-다이클로로-2-프로판올(이하, DCP라 약칭함)
◇ 에피클로로하이드린(이하, ECH라 약칭함)
◇ 4-클로로-3-하이드록시뷰티로나이트릴(이하, CHBN이라 약칭함)
● 시료 조제 방법 : 반응액을 이동상에 용해
● 컬럼 : Inertsil ODS-3V, 4.6㎜
I.D.×250㎜, 입경 5㎛(GL 사이언스제)
● 컬럼 오븐 온도 : 40℃
● 이동상 : 물/아세토나이트릴/인산=70/30/0.1, 1㎖/min
● 검출기 : 시차 굴절계(RI)
● 주입량 : 20㎕
● 유지 시간 : DCP 15.7min
: ECH 11min
: CHBN 7.2min
분석 방법 (2)
● 분석 대상 화합물
◇ 4-클로로-3-하이드록시뷰티로나이트릴(이하, CHBN이라 약칭함)
◇ 4-클로로-3-하이드록시뷰테인아마이드(이하, CHBA라 약칭함)
◇ 4-하이드록시사이클로톤아마이드(이하, HCAm이라 약칭함)
● 시료 조제 방법 : 반응액을 이동상에 용해
● 컬럼 : Inertsil ODS-3V,
4.6㎜ I.D.×250㎜, 입경 5㎛(GL 사이언스제)
● 컬럼 오븐 온도 : 40℃
● 이동상 : 0.05% 트라이플루오로아세트산 수용액, 1㎖/min
● 검출기 : 시차 굴절계(일본 분광제 RI-2031)
● 주입량 : 20㎕
● 유지 시간 : CHBN 11.0min
: CHBA 6.7min
: HCAm 4.4min
분석 방법 (3)
● 분석 대상 화합물
◇ 카니틴아마이드클로라이드(이하, Car-아마이드라 약칭함)
◇ 카니틴나이트릴클로라이드(이하, Car-나이트릴이라 약칭함)
◇ 카니틴(이하, Car라 약칭함)
● 시료 조제 방법 : 반응액을 이동상에 용해
● 컬럼 : Shodex IC YK-421,
4.6㎜ I.D.×125㎜(GL 사이언스제)
● 컬럼 오븐 온도 : 40℃
● 이동상 : 3mM HNO3aq/ATN=4/6, 1㎖/min
● 검출기 : 전기 전도도 검출기(CD-5) Shodex제
● 주입량 : 20㎕
● 유지 시간 : Car-아마이드 10.2min
: Car-나이트릴 8.9min
: Car 7.9min
분석 방법 (4)
● 분석 대상 화합물
◇ 카니틴(이하, Car라 약칭함)
◇ 크로토노베타인(이하, CB라 약칭함)
● 시료 조제 방법 : 반응액을 이동상에 용해
● 컬럼 : Nucleosil 100-5N(CH3)2,
4.6㎜ I.D.×250㎜(GL 사이언스제)
● 컬럼 오븐 온도 : 40℃
● 이동상 : 50mM KH2PO4(pH=4.7) aq/ATN
=35/65, 1㎖/min
● 검출기 : UV 검출기(205㎚) 일본 분광제 UV-930
● 주입량 : 5㎕
● 유지 시간 : Car l0.8min
: CB 13.0min
분석 방법 (5) (R)-CHBN 광학 순도 측정법
(R)-CHBN의 광학 순도는 아래와 같이 하여 측정했다.
(R)-CHBN 1㎕에 다이클로로메테인 20㎕, 피리딘 20㎕를 첨가한 후, (R)-α-메톡시-α-(트라이플루오로메틸)페닐아세틸클로라이드(MTPA) 2㎕를 첨가하고, 그대로 실온에서 5시간 교반을 실시했다. 반응 종료액에 다이아이소프로필에터 300㎕를 첨가하고, 계속해서 1N HCl 수용액 350㎕를 사용하여 세정하여, 유기층을 회수하였다. 유기층을 포화탄산수소나트륨 수용액 350㎕로 더욱 세정하고, 유기층을 감압 건조, 잔류물을 아이소프로판올에 용해시켜, 이것을 HPLC로 분석했다.
본 분석에 사용한 HPLC 시스템은 이하와 같다.
● 분석 대상 화합물
◇ (R)-CHBN MTPA 에스터
◇ (S)-CHBN MTPA 에스터
● 컬럼 : Partisil-5(GL Science)
4.6㎜×250㎜
● 컬럼 오븐 온도 : 40℃
● 이동상 : 헥세인:아이소프로판올=99:1, 1㎖/min
● 검출기 : UV 254㎚
● 유지 시간 : (R)-CHBN MTPA 에스터: 11.9min
: (S)-CHBN MTPA 에스터: 13.0min
분석 방법 (6) L-카니틴의 광학 순도 측정
L-카니틴의 광학 순도는, J. Pharm. Bio. Anal., 14(1996) 1579-1584에 따라, 아래와 같이 하여 측정했다.
광학 순도를 측정하고자 하는 카니틴 건조 시료에, 2㎎/㎖의 9-안트로일나이트릴의 DMSO 용액 1㎖와, 0.1㎎/㎖ 키누크리딘의 아세토나이트릴 용액 1㎖를 첨가하여 용해하고, 80℃에서 90분간 반응시켰다. 실온까지 냉각한 후, 실리카겔 카트리지 컬럼(1cc Bond Elut(Varian))에 로드하고, 에탄올/아세토나이트릴=9:1 용액 10㎖로 미반응의 9-안트로일나이트릴, 키누크리딘을 씻어 낸다. 계속해서 5㎖의 초순수를 흘려, 얻어진 용액을 이하의 HPLC로 해석을 행한다.
● 분석 대상 화합물
◇ L-카니틴
◇ D-카니틴
● 컬럼 : Ultron ES-OVM(신와 화공사 제품)
2.0㎜×150㎜
● 컬럼 오븐 온도: 40℃
● 이동상 : 아세토나이트릴/20mM KH2PO4
(pH=4.5)=17/83
● 유량 : 0.2㎖/min
● 검출기 : UV 254㎚
● 주입량 : 25㎕
● 유지 시간 : L-카니틴:6.8min
: D-카니틴:5.2min
L-카니틴의 광학 순도는 상기 D, L-카니틴의 AREA로부터, 다음 식으로 표시된다.
광학 순도(%ee)=(L-카니틴AREA-D-카니틴AREA)/
(L-카니틴AREA+D-카니틴AREA)×100
I. 4-클로로-3-하이드록시뷰티로나이트릴(CHBN) 합성
[실시예 1]
에피클로로하이드린+시안화수소→CHBN 합성(일본 공개 특허 공보 제2002-241357호 참조)
Figure 112009034577717-pct00022
교반기, 온도계, 딤로츠(Dimroth) 냉각관을 구비한 3L 세퍼러블 플라스크에, 에피클로로하이드린 274.93g(2.97㏖), 물 1271.3g, 황산나트륨 191.75g(1.35㏖)을 투입하고, 온수욕 중에서 교반하면서 내온 50 내지 60℃에서 시안화수소 72.3g(2.70㏖)을 1시간에 걸쳐 반응액 중에 직접 공급했다. 그 후, 내온 50 내지 60℃에서 숙성을 6시간 실시했다. 반응액을 수욕으로 냉각한 후, 아세트산에틸 1L로 1회 추출을 행했다. 유기층을 감압 하에 농축하여, CHBN의 조생성물을 249.33g 수득했다. GC 분석 결과, 순도 80.9%, 수율 62.5%였다. 상기의 추출 CHBN(조생성물)을 단증류에 의해 정제를 행하여, 정제품 187.51g을 수득했다.
[실시예 2]
에피클로로하이드린+시안화 나트륨→CHBN 합성(일본 공개 특허 공보 제2004-182607호 참조)
Figure 112009034577717-pct00023
교반기, 적하 깔때기, 온도계, pH계를 구비한 밀폐형의 유리 플라스크에, 질소 분위기 하에서 에피클로로하이드린 262.3g, 물 700g을 투입하고, 교반 하에 40℃에서 반응액의 pH가 8이 되도록 제어하면서 30.6wt% 시안화 나트륨 수용액 432.3g(2.7㏖)과 65wt% 황산 수용액 203.7g(1.35㏖)을 3시간에 걸쳐 동시에 적하했다. 적하 후, 교반 하 40℃에서 5시간 반응시켰다. 이어서, 유리 플라스크를 밀폐한 채로 아세트산에틸 250㎖를 첨가하여 40℃에서 추출 조작을 행했다. 내용물을 분액 깔대기를 통해 유기층을 취득하고, 얻어진 유기층을 감압 하 50℃에서 농축하고, 감압 증류를 더욱 행하여 CHBN 190.6g를 수득했다. 얻어진 CHBN의 실제 수율은 58.1%였다.
[실시예 3]
1,3-다이클로로-2-프로판올+시안화 나트륨→CHBN 합성
Figure 112009034577717-pct00024
ⅰ) 할로하이드린에폭시다아제 발현 형질 전환 미생물의 배양
할로하이드린에폭시다아제 활성을 갖는 대장균(Eschehchia coli) JM109/pST11l(FERM ABP-10922, 일본 공개 특허 공보 평5-317066호 참조)을, LB 배지(1% 백토 트립톤, 0.5% 백토 이스트 추출물, 0.5% NaCl, 1mM IPTG, 50㎍/㎖ 엠피실린)를 100㎖ 씩 넣은 500㎖ 용량의 삼각 플라스크 20개 각각에 식균하여, 37℃에서 20시간 진탕 배양했다. 20개 분량의 배양균체를 원심 분리에 의해 집균하고, 집균된 균체를 50mM 트리스-황산 완충액(pH 8.0)으로 세정하고, 50mM 트리스-황산 완충액(pH8.0)을 20g이 되도록 첨가하여, 현탁했다. 이 균체 현탁액 0.25g을 50mM 트리스-황산 완충액(pH 8.0) 100㎖에 첨가하고, 그 위에 50mM이 되도록 1,3-다이클로로-2-프로판올을 첨가하여, 20℃에서 10분간 반응했다. HPLC에 의해 반응액 중의 에피클로로하이드린의 양을 측정한 결과, 11mM이었다.
또, pST111은 코리네박테리움(Corynebacterium) sp.N-1074의 할로하이드린에폭시다아제 유전자(hheB)를 포함하는 BamHI-PstI 1.1Kb 단편을 pUC118에 결합시킨 플러스미드이다. 또한, pST111은, 일본 공개 특허 공보 평5-317066호에 기재되어 있고, JM109/pST111은 수령 번호 FERM ABP-10922로서, 독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터(이바라기현 츠쿠바시 히가시 1-1-1 츄우오우 다이 6)에 1991년 3월 1일부로 국제 기탁되어 있다.
ⅱ) 1,3-다이클로로-2-프로판올로부터의 (R)-CHBN의 합성
pH 전극, 및 pH 컨트롤러에 의해 제어된 알칼리 투입 배관을 장착한 500㎖ 용량 플라스크에 물 170.6g, 1㏖/㎏ 트리스-황산 완충액(pH 8.0) 33.5g, 6㏖/㎏ NaCN 수용액 57.0g을 넣고, 98% 황산 15.5g에 의해 pH 8.0으로 조정했다. 1,3-다이클로로-2-프로판올 13.3g을 넣고, 균일하게 용해될 때까지 교반했다.
계 내의 pH를 7.9 내지 8.0으로 유지하기 위해, 6㏖/㎏ NaCN 수용액을 투입하도록 pH 컨트롤러를 설정하고, i)에서 조제한 할로하이드린에폭시다아제 활성을 갖는 균체 현탁액 47.2g(18.9kU)을 첨가하여, 20℃에서 반응을 시작했다.
20℃에서 계 내의 pH를 7.9 내지 8.0으로 유지하면서, 반응 개시 직후부터, 1,3-다이클로로-2-프로판올 36.7g을 4.5시간에 걸쳐 균등하게 적하했다. 그 후, 20℃에서 계 내의 pH를 7.9 내지 8.0으로 유지하면서, 1.5시간(반응 개시로부터 6시간) 반응시켰다. 반응 종료 시, 6㏖/㎏ NaCN 수용액은 54.4g 투입되어 있고, 반응액의 전량은 428.2g이었다. 이 때, 반응계 내의 1,3-다이클로로-2-프로판올의 농도는 3.7%(15.8g)이며, 4-클로로-3-하이드록시뷰티로나이트릴의 농도는 7.1%(30.4g; 수율 65.6%)였다. 또한, 이 때의 4-클로로-3-하이드록시뷰티로나이트릴의 광학 순도는 92%ee의 (R)-체 과잉이었다.
이 반응액을 염산에 의해 pH=5.0으로 조절하고, 60℃, 140Torr로 감압하여 11시간 동안 HCN을 제거하고, 반응계 내의 HCN을 질산은에 의해 적정, 1ppm 이하인 것을 확인했다.
[실시예 4]
1,3-다이클로로-2-프로판올+시안화수소→CHBN 합성
Figure 112009034577717-pct00025
ⅰ) 할로하이드린에폭시다아제 발현 형질 전환 미생물의 배양은 실시예 3과 마찬가지로 실시했다.
ⅱ) 1,3-다이클로로-2-프로판올로부터의 (R)-CHBN의 합성
pH 전극 및 pH 컨트롤러에 의해 제어된 알칼리 투입 배관을 장착한 300㎖ 4구 플라스크에 물 127.55g, HCN 4.41g(0.1632㏖)을 넣고, 30% NaOH 0.65g(0.0049㏖)에 의해 pH 7.5로 조정했다. 1,3-다이클로로-2-프로판올 10.00g(0.0775㏖)를 넣고, 균일하게 용해할 때까지 교반했다.
상기 i)의 방법에 의해 조제한 할로하이드린에폭시다아제 활성을 갖는 균체 현탁액 20.00g을 첨가하여, 20℃에서 반응을 시작했다. 계 내의 pH를 7.5 내지 7.6로 유지하도록, 30% NaOH를 투입하도록 pH 컨트롤러를 설정하고, 투입된 NaOH와 거의 등몰의 비율로 1,3-다이클로로-2-프로판올, HCN을 추가해 감으로써 계 내의 1,3-다이클로로-2-프로판올의 농도를 0.5㏖/㎏을 초과하지 않도록, 또한 계 내의 시안 이온 농도를 1.1㏖/㎏을 초과하지 않도록 했다.
23시간 후, 4-클로로-3-하이드록시뷰티로나이트릴을 0.753㏖/㎏ 축적할 수 있고, 그 광학 순도는 94.8%e.e.의 (R)-체 과잉이었다. 반응에 의해 소비된 1,3-다이클로로-2-프로판올로부터의 수율은 96.3%였다.
이 반응액을 염산으로 pH=5.0으로 조절하고, 60℃, 140Torr로 감압하여 11시 간 HCN의 제거를 행하고, 반응계 내의 HCN을 질산은에 의해 적정하여, 1ppm 이하인 것을 확인했다.
Ⅱ. 4-할로-3-하이드록시뷰테인아마이드 합성
[실시예 5]
본 발명에서 사용한 나이트릴하이드라타아제는 아래와 같이 하여 조제했다.
(배양 및 반응용 균체액의 조제 방법)
나이트릴하이드라타아제 활성을 갖는 로도코카스 로도크로우스(Rhodococcus rhodochrous)J-1(FERM BP-1478)을, 30L 용량의 자 발효조(jar fermenter, 다카스기 제작소사 제품)로 글루코스 2질량%, 요소 1질량%, 펩톤 0.5질량%, 효모 추출물 0.3질량%, 염화코발트 0.05질량%를 포함하는, 20L의 배지(pH 7.0)에 식균하고, 온도 30℃에서 호기적으로 60시간 배양했다. 상기의 방법에 의해 배양하여 얻은 균체를 원심 분리에 의해 집균하고, 50mM 인산 완충액(pH 7.7)에 의해 동일 양으로 2회 세정한 후, 현탁하여, 반응용 균체액으로 했다.
[실시예 6]
CHBN(실시예 1)→CHBA 합성
Figure 112009034577717-pct00026
실시예 1에서 합성한 정제품 CHBN: 16g(134m㏖)을 채취하고, 130℃에서 2시간 가열했다. 냉각 후, 20mM의 인산 버퍼(pH=7.5) 84g를 첨가하고, 실시예 5로 조 제한 J-1균을 200㎕ 적하하여 빙욕(氷欲) 하에 2℃로 반응을 시작했다. 3시간 후 CHBN의 전화율은 100%에 도달하고, CHBA가 18.3g(수율 99.3%) 생성되어 있는 것을 확인했다.
상기 반응 종료액 50.1g(CHBA 9.20g 함유)을 채취하고, 세라이트 5g를 첨가하여 증발기로 40℃에서 건고(乾固)했다. 잔류물을 실리카겔 30g 상에 실어, 아세트산에틸 400g을 캐리어로서 흘려 용출시켰다. 용출한 아세트산에틸 용액을 증발기로 건고하고, CHBA의 백색 고체를 7.27g(단리 수율 79%) 수득했다.
[실시예 7]
CHBN(실시예 2)→CHBA 합성
Figure 112009034577717-pct00027
실시예 2에서 합성한 증류품 CHBN:1.6g(13.4m㏖)을 채취하고, 20mM의 인산 버퍼(pH=7.5) 8.4g를 첨가하여, CoCl2·6H2O의 1㎎/㎖ 수용액을 388㎕ 첨가하여 2시간 교반한 후, 실시예 5에서 조제한 J-1균을 20㎕ 적하하여 빙욕 하에서 반응을 시작했다. 3시간 후 CHBN의 전화율은 100%에 도달하고, CHBA가 1.84g(수율99.8%) 생성되어 있는 것을 확인했다.
[실시예 8]
CHBN(실시예 3)→CHBA 합성
Figure 112009034577717-pct00028
실시예 3에서 합성한 (R)-CHBN 수용액: 10.0g((R,S)-CHBN 농도 16.7%, 13.97m㏖ 함유)을 채취하여, 100℃로 4시간 가열했다. 냉각 후, NaOHaq로 중화하여 pH=7.02로 하고, 실시예 5에서 조제한 J-1균을 63㎕ 적하하여 빙욕 하에서 반응을 시작했다. 2시간 후 CHBN의 전화율은 100%에 도달하고, (R)-CHBA가 1.91g(수율 99.4%) 생성되어 있는 것을 확인했다.
[실시예 9]
CHBN(실시예 4)→CHBA 합성
Figure 112009034577717-pct00029
실시예 4에서 합성한 (R)-CHBN 수용액: 50.0g((R,S)-CHBN 농도 14.0%, 58.6m㏖ 함유)를 채취하고, CoCl2·6H2O의 1㎎/㎖ 수용액을 1.7㎖ 첨가한 후, NaOHaq로 중화하여 pH=7.06으로 하고, 2시간 교반했다. 그 후, 실시예 5에서 조제한 J-1균을 270㎕ 적하하여 빙욕 하에서 반응을 시작했다. 2시간 후 CHBN의 전화율은 100%에 도달하고, (R)-CHBA가 8.04g(수율 99.7%) 생성되어 있는 것을 확인했다.
Ⅲ. CHBA의 4급 아미노화 반응(카니틴아마이드클로라이드 합성)
[실시예 10]
CHBA(정제품)의 4급 아미노화 반응
Figure 112009034577717-pct00030
실시예 6에서 합성한 정제품 CHBA:1.84g(13.4m㏖)에 순수를 첨가하여 10.2g으로 하고, 30% 트라이메틸아민 수용액 3.15g(16.0m㏖)을 첨가하여, 30℃에서 반응을 시작했다. 4시간 후 CHBA의 전화율은 100%에 도달하고, Car-아마이드가 2.48g(수율 94.0%), HCAm이 0.071g(수율 5.2%) 생성되어 있는 것을 확인했다.
[비교예 1]
CHBN(실시예 1 정제품)의 4급 아미노화 반응
Figure 112009034577717-pct00031
실시예 1에서 합성한 정제품 CHBN:1.6g(13.4m㏖)에 순수를 첨가하여 10.2g으로 하고, 30% 트라이메틸아민 수용액 6.60g(33.5m㏖)을 첨가하여, 30℃에서 반응을 시작했다. 7시간 후 CHBN의 전화율은 100%에 도달하고, Car-나이트릴이 1.56g(수율 65.1%) 생성되어 있는 것을 확인했다.
[비교예 2]
4-클로로-3-하이드록시뷰티르산메틸의 4급 아미노화 반응
Figure 112009034577717-pct00032
4-클로로-3-하이드록시뷰티르산메틸: 2.0g(13.1m㏖)에 순수를 첨가하여 10.0g으로 하고, 30% 트라이메틸아민 수용액 5.16g(26.2m㏖)을 첨가하여, 30℃에서 반응을 시작했다. 반응 도중에 γ-하이드록시뷰티로락톤이 관측되고, 7시간 후 4-클로로-3-하이드록시뷰티르산메틸의 전화율은 100%에 도달했다. 이 때 에스터의 메틸기와 γ-하이드록시뷰티로락톤이 소멸하고 있는 것과, Car가 0.36g(수율 17.1%) 생성되어 있는 것을 확인했다. 1H, 13C-NMR 측정에 의해, Car 외에 3,4-다이하이드록시뷰티르산이 생성되어 있는 것을 확인했다.
[실시예 11]
CHBA(실시예 7 수용액)의 4급 아미노화 반응
Figure 112009034577717-pct00033
실시예 7의 반응 종료액 10.18g(CHBA 1.84g 함유)에 30% 트라이메틸아민 수용액 21.15g(107.3m㏖)을 첨가하여, 30℃에서 반응을 시작했다. 0.75시간 후 CHBA의 전화율은 100%에 도달하고, Car-아마이드가 2.55g(수율 96.9%), HCAm이 0.057g(수율 4.2%) 생성되어 있는 것을 확인했다.
[실시예 12]
CHBA(실시예 9 수용액)의 4급 아미노화 반응
Figure 112009034577717-pct00034
실시예 9의 반응 종료 직후 26.0g(CHBA 4.02g 함유)을 취출하고, 곧 30% 트라이메틸아민 수용액 8.3g(35.0m㏖)을 첨가하여, 30℃의 수욕에 담가 반응을 시작했다. 4시간 후 CHBA의 전화율은 100%에 도달하고, Car-아마이드가 5.42g(수율 94.4%), HCAm이 0.15g(수율 5.0%) 생성되어 있는 것을 확인했다.
[실시예 13]
CHBA(실시예 9 수용액)의 4급 아미노화 반응
Figure 112009034577717-pct00035
실시예 9의 반응 종료 직후, 26.0g(CHBA 4.02g 함유)을 취출하여 20℃에서 15시간 방치했다. HPLC 분석의 결과, CHBA는 2.84g으로 감소되어 있었다. 그대로 30% 트라이메틸아민 수용액 8.3g(35.0m㏖)을 첨가하여, 30℃의 수욕에 담가 반응을 시작했다. 4시간 후 CHBA의 전화율은 100%에 도달하고, Car-아마이드가 3.84g(수율 94.6%), HCAm이 0.10g(수율 4.8%) 생성되어 있는 것을 확인했다. 실시예 9의 아마이드화 반응 종료 직후의 CHBA량(4.02g)을 기준으로 하면, Car-아마이드의 수율은 66.8%, HCAm의 수율은 3.4%이다.
이상 4급 아미노화 반응을 정리하면 아래와 같이 된다. CHBA를 기질로서 사용하여 4급 아미노화 반응을 사용하는 우위성(優位性)은 분명하다.
Figure 112009034577717-pct00036
Ⅳ. 카니틴아마이드클로라이드의 가수 분해 반응
[실시예 14]
Car-아마이드(실시예 10 수용액)의 가수 분해 반응
Figure 112009034577717-pct00037
실시예 10의 반응 종료액 13.20g(Car-아마이드 2.45g 함유)에 30% NaOHaq를 2.68g(20.0m㏖) 첨가하여, 50℃에서 반응을 시작했다. 5시간 후, Car-아마이드의 전화율은 100%에 도달하고, 반응을 종료했다. 계 내를 HClaq로 중화한 후, 증발기로 감압하여 물을 제거하고, 이어서 에탄올 10㎖를 첨가하여 물을 더 공비(共沸) 제거시켰다. 이 에탄올에 의한 물의 공비 제거 조작를 총 3회 행하여, 석출한 백색 고체에 재차 에탄올 10㎖를 첨가하여 잘 교반한다. 녹지 않은 백색 고체는 NaCl이며, 이것을 흡인 여과로 걸러내어 여과액 중의 Car를 정량하면, Car 1.94g(수율 96.6%), CB 0.03g(대 Car 1.5wt%)이 생성되어 있는 것을 알았다.
[실시예 15]
Car-아마이드(실시예 12)→Car 합성
Figure 112009034577717-pct00038
실시예 12의 반응 종료액 16.37g(Car-아마이드 2.59g 함유)에 48% NaOHaq를 2.2g(26.4m㏖) 첨가하여, 30℃에서 반응을 시작했다. 8시간 후, Car-아마이드의 전화율이 80%에 도달한 후 40℃로 승온하여, 다시 6시간 더 반응시킨 결과, Car-아마이드의 전화율이 100%에 도달하여, 반응을 종료했다. 계 내를 HClaq에서 중화한 후, 반응액 중의 (L)-Car와 CB를 정량하면, (L)-Car가 2.09g(수율 98.5%), CB가 O.015g(대 Car 0.7%) 생성되어 있는 것을 알았다. 이 수용액의 일부를 채취하여 건조시켜, Car의 광학 순도를 측정한 결과, 94.2%e.e.이었다.
[실시예 16]
Car-아마이드(실시예 12)→Car 합성
Figure 112009034577717-pct00039
실시예 12의 반응 종료액 16.37g(Car-아마이드 2.59g 함유)에 36% HClaq를 4.01g(39.6m㏖) 첨가하여, 80℃에서 반응을 시작했다. 8시간 후, Car-아마이드의 전화율이 100%에 도달하여, 반응을 종료했다. 계 내를 NaOHaq에서 중화한 후, 반응액 중의 (L)-Car와 CB를 정량하면, (L)-Car 2.11g(수율 99.4%), CB 0.001g(수율 0.05%)이 생성되어 있는 것을 알았다. 이 수용액의 일부를 채취하여 건조시켜, Car의 광학 순도를 측정한 결과, 94.5%e.e.였다.
본 발명에 의해 베타인의 제조 방법이 제공된다. 본 발명은 부반응을 종래보다 대폭 방지하여, 카니틴 등의 베타인을 고수율로 얻을 수 있는 점에서 유용하다.

Claims (13)

  1. 하기 화학식 2로 표시되는 4-할로-3-하이드록시뷰테인아마이드를 (NA1A2A3)으로 표시되는 트라이알킬아민으로 4급 아미노화하는 공정을 포함하는, 하기 화학식 2a로 표시되는 4-트라이알킬아미노-3-하이드록시뷰테인아마이드 할로젠화물의 제조 방법:
    [화학식 2]
    Figure 112011028046040-pct00040
    [상기 식에서, X1은 할로젠 원자이다.]
    [화학식 2a]
    Figure 112011028046040-pct00041
    [상기 식에서, A1, A2 및 A3은 각각 서로 독립적이고, 동일하거나 다르며, C1 내지 C10 알콕시기, C6 내지 C12 아릴옥시기, 아미노기, 하이드록실기, 할로젠 원자 및 실릴기로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 내지 4개의 치환기에 의해 치환 또는 비치환된 C1 내지 C20 탄화수소기이며, X1은 할로젠 원자이다.]
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 트라이알킬아민이 트라이메틸아민인 제조 방법.
  3. 하기 화학식 2로 표시되는 4-할로-3-하이드록시뷰테인아마이드를 (NA1A2A3)으로 표시되는 트라이알킬아민으로 4급 아미노화하여, 하기 화학식 2a로 표시되는 4-트라이알킬아미노-3-하이드록시뷰테인아마이드 할로젠화물을 얻는 공정, 및
    상기 4-트라이알킬아미노-3-하이드록시뷰테인아마이드 할로젠화물을 가수 분해하는 공정을 포함하는, 하기 화학식 1로 표시되는 베타인 또는 베타인 염의 제조 방법:
    [화학식 2]
    Figure 112011028046040-pct00051
    [상기 식에서, X1은 할로젠 원자이다.]
    [화학식 2a]
    Figure 112011028046040-pct00052
    [상기 식에서, A1, A2 및 A3은 각각 서로 독립적이고, 동일하거나 다르며, C1 내지 C10 알콕시기, C6 내지 C12 아릴옥시기, 아미노기, 하이드록실기, 할로젠 원자 및 실릴기로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 내지 4개의 치환기에 의해 치환 또는 비치환된 C1 내지 C20 탄화수소기이며, X1은 할로젠 원자이다.]
    [화학식 1]
    Figure 112011028046040-pct00043
    [상기 식에서, A1, A2 및 A3은 각각 서로 독립적이고, 동일하거나 다르며, C1 내지 C10 알콕시기, C6 내지 C12 아릴옥시기, 아미노기, 하이드록실기, 할로젠 원자 및 실릴기로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 내지 4개의 치환기에 의해 치환 또는 비치환된 C1 내지 C20 탄화수소기이다.]
  4. 제 3 항에 있어서,
    A1, A2 및 A3이 메틸기인 제조 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    하기 화학식 2로 표시되는 4-할로-3-하이드록시뷰테인아마이드가 하기 화학식 3으로 표시되는 4-할로-3-하이드록시뷰티로나이트릴을 아마이드화하는 공정에 의해 얻어지는 것인 제조 방법:
    [화학식 2]
    Figure 112009037269066-pct00044
    [상기 식에서, X1은 할로젠 원자이다.]
    [화학식 3]
    Figure 112009037269066-pct00045
    [상기 식에서, X1은 할로젠 원자이다.]
  6. 제 5 항에 있어서,
    아마이드화가 나이트릴하이드라타아제로 처리하는 것인 제조 방법.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 나이트릴하이드라타아제가, 아크로모박터(Achromobacter) 속, 아시도보락스(Acidovorax) 속, 아그로박테리움(Agrobacterium) 속, 아스로박 터(Arthrobacter) 속, 바실러스(Bacillus) 속, 브레비박테리움(Brevibacterium) 속, 버크홀데리아(Burkholderia) 속, 칸디다(Candida) 속, 카세오박터(Caseobacter) 속, 코마모나스(Comamonas) 속, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속, 디엣지아(Dietzia) 속, 엔테로박터(Enterobacter) 속, 어비니아(Erwinia) 속, 지오바실러스(Geobacillus) 속, 고도나(Gordona) 속, 클렙시엘라(Klebsiela) 속, 마이크로아스커스(Microascus) 모가넬라(Morganella) 속, 판토에아(Pantoea) 속, 프로테우스(Proteus) 속, 슈도모나스(Pseudomonas) 속, 슈도노카디아(Pseudonocardia) 속, 로도코커스(Rhodococcus) 속, 리조비움(Rhizobium) 속, 세라티아(Serratia) 속, 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속, 사이탈리듐(Syctalidium) 속, 투카무렐라(Tukamurella) 속에 속하는 미생물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 미생물에 의해 산생되는 제조 방법.
  8. 제 5 항에 있어서,
    상기 4-할로-3-하이드록시뷰테인아마이드의 제조 공정이 반응액이 얼지 않는 온도 내지 5℃에서 행해지는 제조 방법.
  9. 제 5 항에 있어서,
    하기 화학식 3으로 표시되는 4-할로-3-하이드록시뷰티로나이트릴이, 하기 화학식 4로 표시되는 에피할로하이드린, 또는 하기 화학식 5로 표시되는 1,3-다이할로-2-프로판올과, 시안화수소 또는 시아나이드염을 반응시키는 공정에 의해 얻어지는 것인 제조 방법:
    [화학식 3]
    Figure 112009037269066-pct00046
    [상기 식에서, X1은 할로젠 원자이다.]
    [화학식 4]
    Figure 112009037269066-pct00047
    [상기 식에서, X1은 할로젠 원자이다.]
    [화학식 5]
    Figure 112009037269066-pct00048
    [상기 식에서, X1은 상기한 의미를 갖는다. X2는 X1과 서로 독립적이고, 동일하거나 다른 할로젠 원자이다.]
  10. 제 9 항에 있어서,
    시안화수소 또는 시아나이드염과의 반응이 효소 촉매의 존재 하에서 행해지는 것인 제조 방법.
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 효소 촉매가 할로하이드린에폭시다아제인 제조 방법.
  12. 제 11 항에 있어서,
    하기 화학식 3으로 표시되는 4-할로-3-하이드록시뷰티로나이트릴이 (R)체 과잉으로 제조되는 제조 방법:
    [화학식 3]
    Figure 112009034577717-pct00049
    [상기 식에서, X1은 할로젠 원자이다.]
  13. 제 11 항에 있어서,
    상기 할로하이드린에폭시다아제가, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속, 마이크로박테리움(Microbacterium) 속, 아그로박테리움속, 마이코박테리움(Mycobacterium) 속 및 아스로박터(Arthrobacter) 속에 속하는 미생물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 미생물에 의해 산생되는 염의 제조 방법.
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