JPWO2007037341A1 - 光電流を用いた被検物質の特異的検出方法、それに用いられる電極、測定用セルおよび測定装置 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、光電流を用いて、核酸、外因性内分泌攪乱物質、抗原等の特異的結合性を有する被検物質を特異的に検出する方法、それに用いられる電極、測定用セル及び測定装置に関する。
生体試料中のDNAを解析する遺伝子診断法が、各種病気の新たな予防および診断法として、有望視されている。このようなDNA解析を簡便かつ正確に行う技術として、以下のものが提案されている。
前記作用電極が、前記増感色素が光励起に応じて放出する電子を受容可能な電子受容物質を含んでなる電子受容層を有し、この電子受容層の表面に前記プローブ物質が担持され、
前記電子受容物質が、前記増感色素の最低非占有分子軌道(LUMO)のエネルギー準位よりも低いエネルギー準位を有する酸化物半導体であり、
前記電解質媒体が、酸化された状態の増感色素に電子を供給しうる塩からなる電解質と、非プロトン性溶媒およびプロトン性溶媒から選択される少なくとも一種の溶媒とを含んでなる方法が提供される。
導電性基材と、
該導電性基材上に形成される、前記増感色素が光励起に応じて放出する電子を受容可能な電子受容物質を含んでなる電子受容層と
を備えたものが提供される。
上記作用電極と、
対電極と、
を備えたものが提供される。
上記測定用セルと、
前記作用電極の表面に光を照射する光源と、
前記作用電極と前記対電極との間を流れる電流を測定する電流計と
を備えたものが提供される。
本発明の方法にあっては、増感色素が結合した被検物質がプローブ物質を介して固定された作用電極を、対電極と共に電解質媒体に接触させ、前記作用電極に光を照射して前記増感色素を光励起させ、光励起された増感色素から作用電極への電子移動に起因して作用電極と対電極との間に流れる光電流を検出する。作用電極は、前記増感色素が光励起に応じて放出する電子を受容可能な電子受容物質を含んでなる電子受容層を有し、この電子受容層の表面に前記プローブ物質が担持される。電子受容物質は、前記増感色素の最低非占有分子軌道(LUMO)のエネルギー準位よりも低いエネルギー準位を有する酸化物半導体である。
本発明の方法における被検物質としては、特異的な結合性を有する物質であれば限定されず、種々の物質であってよい。このような被検物質であれば、被検物質と直接または間接的に特異的に結合可能なプローブ物質を作用電極表面に担持させておくことにより、被検物質をプローブ物質に直接または間接的に特異的に結合させて検出することが可能となる。
本発明の方法にあっては、被検物質の存在を光電流で検出するために、増感色素の共存下、プローブ物質に被検物質を直接または間接的に特異的に結合させて、該結合により増感色素を作用電極に固定させる。そのために、本発明の方法にあっては、図2(a)および図3に示されるように被検物質1あるいは媒介物質11に予め増感色素2,12で標識しておくことができる。また、図2(b)に示されるように被検物質およびプローブ物質の結合体7(例えばハイブリダイゼーション後の二本鎖核酸)にインターカレーション可能な増感色素8を用いる場合には、試料液に増感色素を添加することにより、プローブ物質に増感色素を固定させることができる。
本発明に用いる作用電極は、上記プローブ物質を表面に備えた電極であり、プローブ物質を介して固定された増感色素が光励起に応じて放出する電子を受容可能な電極である。したがって、作用電極の構成および材料は、使用される増感色素との間で上記電子移動が生じるものであれば限定されず、種々の構成および材料であってよい。
まず、電極表面を、超音波洗浄器を用いて蒸留水およびアルコ−ルで洗浄する。その後、電極を核酸プロ−ブを含有する緩衝液に挿入して核酸プロ−ブを担体表面に吸着させる。
本発明に用いる対電極は、電解質媒体に接触させた場合に作用電極との間に電流が流れることができるものであれば特に限定されず、ガラス、プラスチック、セラミックス等の絶縁性の支持体に、金属もしくは導電性の酸化物を蒸着したものが使用可能である。また、対電極としての金属薄膜を5μm以下、好ましくは3nm〜3μmの範囲の膜厚になるように、蒸着やスパッタリングなどの方法により形成して作成することもできる。対電極に使用可能な材料の好ましい例としては、白金、金、パラジウム、ニッケル、カーボン、ポリチオフェン等の導電性ポリマー、酸化物、炭化物、窒化物等の導電性セラミックス等が挙げられ、より好ましくは、白金、カーボンであり、最も好ましくは白金である。これらの材料は電子受容層の形成方法と同様の方法により薄膜形成が可能である。
本発明の方法にあっては、増感色素の共存下、試料液を作用電極に接触させて、プローブ物質に被検物質を直接または間接的に特異的に結合させ、この結合により増感色素を前記作用電極に固定させる。このとき、試料液の溶媒として後述する本発明の緩衝溶液を用いることにより、作用電極による被検物質の検出感度を向上させることができる。
バンドギャップ(eV) = hν = hc/λ = 1239.8/λ(mm) (h:プランク定数、c:光速)
本発明の方法および装置の好ましい実施態様の一例として、フロー型測定用セルおよびパターニング電極を用いた測定方法および装置について説明する。図9に、装置の全体構造を示す。図9に示される装置50は、フロー型測定用セル51と、光源52と、電解液タンク53と、洗浄液タンク54と、供給ポンプ55と、電流計56と、排出ポンプ57とを備えてなる。フロー型測定用セル51は、パターニングされた作用電極58と、作用電極に対向する対電極59とを備えてなり、作用電極58および対電極59の間に、電解液または洗浄液を収容しかつ流すことができる流路が形成される。すなわち、供給ポンプ55により測定用セル51内に供給された電解液または洗浄液は、作用電極58および対電極59に接触しながら流路を通過した後、排出ポンプ57により測定用セル51外に排出されるように構成されている。これら一連の動作の制御および光電流値の解析は図示しない制御解析装置により行われることができる。
まず、増感色素の共存下、試料液を作用電極に接触させて、プローブ物質に被検物質を直接または間接的に特異的に結合させ、この結合により増感色素を作用電極58に固定させる。このとき、作用電極の電子受容層に図10に示されるスポットパターンのマスキングを施して、プローブ物質が担持された複数のスポット60が縦横方向にパターニングされた作用電極58を得る。こうして得られた作用電極58をフロー型測定用セル51に装着する。
本発明の好ましい態様によれば、光源があらかじめ複数個設けられてなり、かつ前記測定装置が、該複数個の光源を切り替えて照射する、複数固定型の光照射機構を備えてなるのが好ましい。
MEMSのような製造方法を利用した光電流検出装置の一例の概略斜視図を図19に、この装置の構成図を図20に、この装置に使用される検出チップの分解斜視図を図21に示す。光電流検出装置73には光源74、電流計75、検出チップ76を固定できる機能、検出チップ76の吸引口77を介して吸引するポンプ78が設けられている。光源74(複数個)、作用電極79の切り替え(本例は図11に示したパターニング電極を用いた例を示す)、吸引ポンプ77、電流計75の制御や電流信号の受信はインターフェースボード80を介してコンピュータ81によって行う。この時、コンピュータ81は装置内に組み込まれたマイコンを用い、入力装置82、表示装置83、記憶装置84も測定装置に組み込まれている。入力装置81では動作条件、設定条件の入力のためのキー、ボタン設けられ、表示装置82には測定結果が表示される。記憶装置83では測定結果の記憶を行うことができる。検出チップ76は下部部材85、電極基板86、PDMSチップ87、上部部材88から構成されており、下部部材85には光源74の光を通すための開口部89が備えられている。電極基板86には作用電極79、対電極90、及び読取装置と電気的に接続するための端子91が設けられている。PDMSチップ87には送液用流路92、廃液溜め93が設けられ、上部部材88の電解液注入口94、洗浄液注入口95、試料溶液注入口96に連結した溶液口97、98、99も設けられている。上記MEMSのような製造方法を利用した光電流読取装置及び検出チップを用いることにより、核酸、外因性内分泌攪乱物質、抗原等の特異的結合性を有する被検物質を微量な試料溶液でかつ簡単な操作で測定することができる。
本発明の好ましい態様によれば、作用電極との接触下で使用される緩衝溶液として、カルボキシル基、リン酸基、およびアミノ基を含まない緩衝剤と、溶媒とを含んでなる緩衝溶液を用いるのが好ましい。作用電極との接触下での使用の例としては、プローブ物質を作用電極に固定化させる処理、被検物質をプローブ物質を介して作用電極に固定化させる処理、被検物質の固定化後の作用電極を洗浄する処理等が挙げられる。そして、上記緩衝剤を含む緩衝溶液を用いることにより、測定対象物および作用電極の特性を阻害することなく、光電流による被検物質の検出感度を飛躍的に向上させることができる。この傾向は、作用電極の表面が酸化チタンやチタン酸ストロンチウムからなる場合において、特に顕著である。
本例はシランカップリング剤を介した結合でも光電変換が可能なことを示すものである。具体的には、FTOガラスおよびITOガラスの導電面をシランカップリング剤で処理して表面にアミノ基を導入した。このアミノ基と活性エステル基を持つ色素を反応させて、共有結合により色素を固定化した。これに励起光を照射して光電流を測定した。その詳細は以下の通りである。
本例は相補的DNAと非相補的DNAの観測される電流値の差を示すものである。具体的には、FTOガラスをシランカップリング剤で処理して表面にアミノ基を導入した。このアミノ基とプローブDNAを静電的に結合させ、さらに紫外光を照射してプローブを共有結合で電極上に固定化した。これとCy5で標識したターゲットDNAとをハイブリダイゼーションさせてから励起光を照射して光電流を測定した。その詳細は以下の通りである。
(1)2×SSC+0.2%SDS 室温 振盪3分×液を換えて3回
(2)0.2×SSC+0.2%SDS 常温 振盪3分×液を換えて2回
(3)0.2×SSC+0.2%SDS 37℃ 振盪10分×液を換えて2回
(4)0.2×SSC+0.2%SDS 常温 振盪3分×1回
(5)0.2×SSC 常温 振盪10回×液を換えて3回
(6)超純水 常温 振盪10回×液を換えて2回
(7)空気を吹き付けて残水を除去
本例は金属ヨウ素を含む電解液と含まない電解液の電流値についての差を示すものであり、一塩基変換(SNPs)の検出には金属ヨウ素を含まない方が優れることを示す。具体的には、 FTOガラスをシランカップリング剤で処理して表面にアミノ基を導入した。このアミノ基とプローブDNAを静電的に結合させ、さらに紫外光を照射してプローブを共有結合で電極上に固定化した。これとローダミンで標識したターゲットDNAとをハイブリダイゼーションさせてから励起光を照射して光電流を測定し、ターゲットの一塩基変異を検出した。その詳細は以下の通りである。
(1)0.2×SSC+0.2% SDS 63℃ 3分間浸漬(5Lの水槽を使用)
(2)超純中水で振盪10回×液を換えて2回
(3)空気を吹き付けて残水を除去
(1)電解液A
アセトニトリルを溶媒とし、テトラプロピルアンモニウムヨーダイド100mMを溶解した。
(2)電解液B
アセトニトリルを溶媒とし、ヨウ素10mMとテトラプロピルアンモニウムヨーダイド100mMを溶解した。
また電解液Bで測定したところ、電解液Aに比べて電流値が低く、平均電流値に有意差はなかった(N数:5、危険率:1%)。微弱電流を検出する際はヨウ素を含まない電解液で測定を行う方がより望ましいことが確認できた。
本例は、複数のスポットを用いて一塩基変換(SNPs)を検出した例である。具体的には、FTOガラスをシランカップリング剤で処理して表面にアミノ基を導入した。プローブDNAを作用電極上に形成したスポットに担持し、この電極に、特定の位置の一塩基が異なる2つの5'末端Cy5標識ターゲットDNAをそれぞれハイブリダイゼーションさせ、特定の条件で洗浄した。作用電極の同一平面上にPtを形成して対極としたセルへ組み込み、作用電極に励起光を照射して光電流を測定し、プローブDNAごとの光電流を比較した。その詳細は以下の通りである。
フッ素をドープした酸化スズ(F-SnO2:FTO)コートガラス(エイアイ特殊硝子社製、U膜、シート抵抗:15Ω/□)をアセトン、0.1vol% Tween20を含む超純水、さらに超純水中で各15分間の超音波洗浄を施して、汚れおよび残存有機物の除去を行った。これを5Mの水酸化ナトリウム水溶液中で15分間振盪させた。その後で水酸化ナトリウムの除去のために超純水中での5分間の振盪を、水を入れ替えて3回行った。ガラスを取り出して空気を吹き付けて残水を飛散させてから無水メタノールに浸漬させて脱水した。
続いて5'末端にCy5標識した2種類のターゲットDNA、すなわちプローブと完全に相補的なターゲットDNA-1)(プロリゴ社製 5'-Cy5-GCGGCATGAACCTGAGGCCCATCCT-3')と、その5'末端から13番目のTがGに代わったターゲットDNA-2)(プロリゴ社製 5'-Cy5-GCGGCATGAACCGGAGGCCCATCCT-3')を別々に5×SSC+0.5%SDSに溶かしてそれぞれ1μMの濃度に調整した。これを95℃で5分間保持した後、それぞれ別々の3スポットの開口部に5μlずつ充填した。そしてDNA溶液中に気泡が入らないようにプレパラートガラスで真上から蓋をして、湿らせた紙などで蒸気圧が調製されたプラスチック容器に収容し、37℃で一晩インキュベートさせた。
こうして得られた作用電極をフロー型測定セル(装置の実施例2)に組み込み、フロー型測定セル上には光源移動用アリ式ステージ(駿河精機(株)製 B05-41M)を取り付けた。セル部分の構成は作用電極と白金対電極とを同一平面に配置し、両電極間に接触による短絡を防止し、電解液を充填するための空間を作り出すことを目的として、膜厚が500μmのシリコンシートを挿入した。シリコンシートには全スポットが入る十分大きい穴が空いており、ここに送液された電解液が溜まり、作用電極上に固定化されたDNAが接触する構造になっている。作用電極、対電極共に、電気的に接しているスプリングプローブを介してポテンシオスタット(ビー・エー・エス株式会社 ALS Modl832A)に接続した。
本例は、色素標識一本鎖DNA固定化作用電極を作製した例である。
本例は光源がXY移動する機構を用いて、作用電極上の各スポット領域で光源を停止させて光電流検出を行った一例である。
本例は光源がXY移動する機構を用いて、作用電極上の各スポット領域で光源を連続的に移動させながら光電流検出を行った一例である。
本例はセルステージがXY移動する機構を用いて、作用電極上の各スポット領域で光源を停止させて電流検出を行った一例である。
本例はセルステージがXY移動する機構を用いて、作用電極上の各スポット領域で光源を連続的に移動させながら光電流検出を行った一例である。
本例は各種の電解質物質および非プロトン性溶媒を用いた電解液により一塩基多型(SNPs)を検出した例である。
完全一致(PM)プローブ: 5'-NH2-AGGATGGGCCTCAGGTTCATGCCGC-3'
一塩基変異鎖(SNP)プローブ: 5'-NH2-AGGATGGGCCTCCGGTTCATGCCGC-3'
完全不一致(MM)プローブ: 5'-NH2-GCGGCATGAACCGGAGGCCCATCCT-3'
これらのプローブとハイブリダイゼーションさせるターゲットDNAの塩基配列は下記のとおりである。
ターゲットDNA: 5'-ローダミン-GCGGCATGAACCTGAGGCCCATCCT-3'
本例は各種濃度のアセトニトリル含有電解液を用いて一塩基多型(SNPs)を検出した例である。
本例は、色素標識一本鎖DNA固定化作用電極を作製した例である。
このカップリング処理用溶液に上記ガラスを浸漬させ、ゆっくりと15分間振盪させた。それからガラスを取り出し、メタノール中で10回ほど振盪させて余剰なカップリング処理用溶液を除く操作を、メタノールを3回換えて行った。その後110℃で30分間保持してカップリング剤をガラスと結合させた。室温下で冷却した後、φ=3mmの大きさの開口部が9スポット形成された粘着性シール(厚さ:0.5mm)を載置して密着させた。続いて濃度調整した(100 nM、10nM、0nM)ローダミン標識ssDNA(25mer)を95℃で10分間保持した後、直ちに氷上に移して10分間保持してDNAを変性させ、先に用意したガラス上のシールの9開口部に5μlずつ充填し、95℃で10分保持して溶媒を蒸発させた後で、UVクロスリンカー(UVP社CL-1000型)で120mJの紫外光を照射して、標識ssDNAを固定化した。
本例は水と各電解質物質を用いた電解液により色素標識一本鎖DNAを検出した例である。
本例はNPr4I(テトラプロピルアンモニウムヨージド)と水を含む混合液を電解液として使用し、一塩基多型(SNPs)を検出した例である。
本例は色素増感型バイオセンサ技術により色素標識蛋白質を検出した例である。
フッ素をドープした酸化スズ(F-SnO2:FTO)コートガラス(エイアイ特殊硝子社製、U膜、シート抵抗:15Ω/□)をアセトン、Tween20を0.1vol%含む超純水、さらに超純水中で各15分間の超音波洗浄を施して、汚れおよび残存有機物の除去を行った。次に5Mの水酸化ナトリウム水溶液中で15分間振盪させ、その後で水酸化ナトリウムの除去のために超純水中での5分間の振盪を、水を入れ替えて3回行った。超純水からFTOガラスを取り出して空気を吹き付けて残水を飛散させてから無水メタノールに浸漬させて脱水させた。メタノールも空気を吹き付けることで飛散させてFTOガラスを乾燥させた。
カップリング処理用の溶液は95vol%メタノール−5vol%超純水の混合溶液に3-アミノプロピルトリメトキシシラン(APTMS:AVOCADO社製)を2vol%となるように加え、室温下で5分間の攪拌を行って調製した。
このカップリング処理用溶液に上記FTOガラスを浸漬させ、ゆっくりと15分間振盪させた。FTOガラスを取り出して、無水メタノール中で10回ほど振盪させて余剰なカップリング処理用溶液を除く操作を、無水メタノールを入れ替えて3回行った。その後110℃で30分間保持してカップリング剤をガラスと結合させた。室温放置による徐冷後、これにスペーサ用穴あきテープ(穴:φ=3mm×6スポット、シートの厚み:50μm)を貼った。
5’末端にビオチンを標識したオリゴDNAまたは未標識のオリゴDNA(プロリゴ社製:配列は5’-TggCTCCTgACCTggAgTCTTCCAgTgTgA-3')を超純水に溶かして1μMとし、95℃で5分間保持してDNAを変性させ、テープ開口部(スポット電極)に7μlずつ滴下した。これを95℃で10分間保持させて乾燥させた後にUVクロスリンカー(UVP社CL-1000型)で120mJの紫外光を照射して、オリゴDNA固定化作用電極とした。
この作用電極を0.2%SDS水溶液中で15分間振盪させる洗浄を、液を3回換えて行った。続いて超純水中で10回ほど振盪させる洗浄を、超純水を3回換えて行うことでSDSの除去を行った。その後で沸騰水に2分間浸漬させ、取り出してから空気を吹き付けて残水を飛散させた。さらに4℃の無水エタノールに1分間浸漬させて脱水し、空気を吹き付けて残エタノールを飛散させた。
Molecular Probes社から市販されているキットを用いてローダミン標識を行ったストレプトアビジン(標識比:3.1)を緩衝液(10mM HEPES pH7.4 + 150mM NaCl + 0.05% Tween20)により10ug/mlになるよう希釈を行った。
この蛋白質溶液7μlをスポット電極に滴下してからプレパラートガラスを被せて37℃で1時間インキュベートさせた。
インキュベート終了後にプレパラートガラスを取り外し、作用電極をラックに立てて上記緩衝液を満たした染色バットに沈め、10回ほど振盪させる洗浄を、緩衝液を3回換えて行った。なお作用電極は測定直前まで上記緩衝液に浸漬させておいた。
こうして得られた作用電極は測定直前に超純水中で軽く振盪させ、次に空気を吹き付けて残水を飛散させてからフロー型測定セルに組み込んだ。セルは作用電極と白金対電極とを対向に配置し、その間に膜厚500μmのシリコンシートを挿入した。シリコンシートには全てのスポット電極が入るよう十分大きい穴が空いており、この部分に送液された電解液が充填されることでスポット電極が電解液と接触する構造になっている。電解液は1Mのチオ硫酸ナトリウムと0.1Mの食塩水の混合溶液を用いた。作用電極と白金対電極はそれぞれ電気的に接しているスプリングプローブを介して電流計(ADVANTEST社製:R8240)に接続した。
このフロー型測定セルに、各スポット毎に対応した開口部を持つ遮光部材を被せ、下記電解液を充填させてから、その上に設置された可動式のレーザー光源(中心波長:532nm)で各スポットを順次照射して、作用電極と白金対電極との間に流れる光電流を経時的に測定した。各スポットを5秒間照射して、5秒目の光電流値からベース電流値を差し引くことで補正を行った。
本例は水と各種の電解質物質を用いた電解液により色素標識一本鎖DNAを検出した例である。
Claims (74)
- 増感色素が結合した被検物質がプローブ物質を介して固定された作用電極を、対電極と共に電解質媒体に接触させ、前記作用電極に光を照射して前記増感色素を光励起させ、光励起された増感色素から作用電極への電子移動に起因して作用電極と対電極との間に流れる光電流を検出することを含んでなる被検物質の特異的検出方法であって、
前記作用電極が、前記増感色素が光励起に応じて放出する電子を受容可能な電子受容物質を含んでなる電子受容層を有し、この電子受容層の表面に前記プローブ物質が担持され、
前記電子受容物質が、前記増感色素の最低非占有分子軌道(LUMO)のエネルギー準位よりも低いエネルギー準位を有する酸化物半導体であり、
前記電解質媒体が、酸化された状態の増感色素に電子を供給しうる塩からなる電解質と、非プロトン性溶媒およびプロトン性溶媒から選択される少なくとも一種の溶媒とを含んでなる方法。 - 前記電解質媒体の還元電位が、前記増感色素の最高被占有分子軌道(HOMO)のエネルギー準位よりも高く、前記電子受容物質の伝導帯のエネルギー準位よりも低い、請求項1に記載の方法。
- 前記電解質が、I2を含まないヨウ化物、Br2を含まない臭化物、チオ硫酸塩、および亜硫酸塩からなる群から選択される少なくとも一種である、請求項1または2に記載の方法。
- 前記電解質が、I2を含まないヨウ化物である、請求項3に記載の方法。
- 前記ヨウ化物が、テトラアルキルアンモニウムヨーダイドである、請求項4に記載の方法。
- 前記電解質が、チオ硫酸塩および亜硫酸塩からなる群から選択される少なくとも一種である、請求項3に記載の方法。
- 前記電解質がチオ硫酸塩であり、該チオ硫酸塩がチオ硫酸ナトリウムである、請求項6に記載の方法。
- 前記電解質が亜硫酸塩であり、該亜硫酸塩が亜硫酸ナトリウムである、請求項6に記載の方法。
- 前記溶媒が、非プロトン性溶媒である、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記溶媒が、プロトン性溶媒である、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記溶媒が、非プロトン性溶媒とプロトン性溶媒の混合物である、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記非プロトン性溶媒が、アセトニトリル(CH3CN)である、請求項1〜9および11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プロトン性溶媒が、水である、請求項1〜8および10〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記電子受容層の表面がカチオン化処理されてなる、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プローブ物質を電子受容層に担持せしめるために、プローブ物質を含む溶液を前記作用電極に接触させる、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記作用電極と対電極とを電解質媒体に接触させる前に、前記作用電極を洗浄液で洗浄する工程をさらに含んでなる、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記被検物質が予め前記増感色素で標識されてなる、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法。
- 前記被検物質が一本鎖の核酸であり、前記プローブ物質が前記核酸に対して相補性を有する一本鎖の核酸である、請求項1〜17のいずれか一項に記載の方法。
- 前記相補性を有する核酸が、前記核酸に対して15bp以上の相補性部分を有する、請求項18に記載の方法。
- 前記被検物質が予め前記増感色素で標識されてなる核酸であり、前記被検物質1分子につき前記増感色素が1つ以上標識されている、請求項18または19に記載の方法。
- 前記プローブ物質に前記被検物質を結合させる手段が、増感色素の共存下、被検物質を含む試料液を作用電極に接触させることであり、更に前記試料液が、予め前記増感色素で標識されてなる、前記被検物質と特異的に結合可能な媒介物質をさらに含んでなり、該媒介物質と前記被検物質との結合物が前記プローブ物質に特異的に結合する、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法。
- 前記被検物質がリガンドであり、前記媒介物質が受容体蛋白質分子であり、前記プローブ物質が二本鎖の核酸である、請求項21に記載の方法。
- 前記被検物質が外因性内分泌攪乱物質である、請求項21または22に記載の方法。
- 前記光電流を検出する工程が、電流値または電気量を測定し、得られた電流値または電気量から前記試料液中の被検物質濃度を算出する、請求項1〜23のいずれか一項に記載の方法。
- 得られた電流値または電気量から前記試料液中の被検物質濃度を算出する工程が、予め作成された被検物質濃度と電流値または電気量との検量線と、得られた電流値または電気量とを対比することにより行われる、請求項24に記載の方法。
- 前記プローブ物質に前記被検物質を結合させる手段が、増感色素の共存下、被検物質を含む試料液を作用電極に接触させることであり、更に前記試料液が、前記増感色素で標識されていない、前記プローブ物質に特異的に結合可能な第二の被検物質をさらに含んでなり、それにより、前記被検物質および第二の被検物質を前記プローブ物質に競合させて特異的に結合させ、そして、前記光電流を検出する工程が、電流値または電気量を測定し、得られた電流値または電気量から前記試料液中の第二の被検物質濃度を算出することをさらに含んでなる、請求項24に記載の方法。
- 前記得られた電流値または電気量から前記試料液中の第二の被検物質濃度を算出する工程が、予め作成された第二の被検物質濃度と電流値または電気量との検量線と、得られた電流値または電気量とを対比することにより行われる、請求項26に記載の方法。
- 前記被検物質および前記第二の被検物質が抗原であり、前記プローブ物質が抗体である、請求項26または27に記載の方法。
- 前記第二の被検物質が、前記被検物質よりも前記プローブ物質に特異的に結合しやすい性質を有する、請求項26〜28のいずれか一項に記載の方法。
- 前記電子受容物質が、酸化チタン、酸化亜鉛、酸化スズ、酸化ニオブ、酸化インジウム、酸化タングステン、酸化タンタル、およびチタン酸ストロンチウムからなる群から選択される少なくとも一種を含んでなる、請求項1〜29のいずれか一項に記載の方法。
- 前記電子受容物質が酸化チタンまたはチタン酸ストロンチウムである、請求項30に記載の方法。
- 前記電子受容物質がインジウム-スズ複合酸化物(ITO)またはフッ素がドープされた酸化スズ(FTO)である、請求項30に記載の方法。
- 前記作用電極が導電性基材をさらに含んでなり、前記電子受容層が該導電性基材上に形成されてなる、請求項1〜32のいずれか一項に記載の方法。
- 前記増感色素が金属錯体色素または有機色素である、請求項1〜33のいずれか一項に記載の方法。
- 前記増感色素が、金属フタロシアニン;クロロフィルまたはその誘導体;ヘミン、ルテニウム、オスミウム、鉄及び亜鉛の錯体;メタルフリーフタロシアニン、9-フェニルキサンテン系色素、シアニン系色素、メタロシアニン系色素、キサンテン系色素、トリフェニルメタン系色素、アクリジン系色素、オキサジン系色素、クマリン系色素、メロシアニン系色素、ロダシアニン系色素、ポリメチン系色素、およびインジゴ系色素からなる群から選択される少なくとも一種である、請求項34に記載の方法。
- 前記増感色素が、Cy3、Cy5、Cy5.5、Cy7、Cy7.5、Cy9、FAM、FITC、HEX、Rhodamine、Rhodamine-Green、ROX、TET、TEXAS RED、Beckman Dyes2、Beckman Dyes3、Beckman Dyes4、フルオレセイン、およびアレクサフルオール(Alexa Fluor)色素からなる群から選択される少なくとも一種である、請求項34に記載の方法。
- 前記被検物質が二種以上存在し、前記各被検物質が互いに異なる波長の光で励起可能な異なる増感色素で標識され、各増感色素毎に異なる波長の光を照射することにより、前記各被検物質を個別に検出する、請求項1〜36のいずれか一項に記載の方法。
- 前記作用電極上に前記プローブ物質が互いに分離された複数の領域毎に区分されて担持されてなり、前記光照射が各領域に対して個別に行われる、請求項1〜37のいずれか一項に記載の方法。
- 前記電子受容層が前記導電性基材の全面にわたって形成されてなり、前記導電性基材全体を流れる光電流を検出する、請求項38に記載の方法。
- 前記作用電極が絶縁基板をさらに備えてなり、該絶縁基板上に、前記導電性基材および前記電子受容層からなるスポットが、互いに分離された複数の領域毎に区分されて形成されてなり、該各領域の導電性基材毎に流れる光電流を個別に検出する、請求項1〜36のいずれか一項に記載の方法。
- 前記作用電極が絶縁基板をさらに備えてなり、該絶縁基板上に、前記電子受容層からなるスポットが、互いに分離された複数の領域毎に区分されて形成されてなり、該各領域の電子受容層毎に流れる光電流を個別に検出する、請求項1〜36のいずれか一項に記載の方法。
- 前記作用電極上の互いに分離された複数の領域の各領域に複数種類のプローブ物質が担持させることにより、複数の試料液の測定を同時に行う、請求項38〜41のいずれか一項に記載の方法。
- 前記作用電極上の互いに分離された複数の領域の各領域毎に異なるプローブ物質が担持させることにより、複数種類の被検物質の測定を同時に行う、請求項38〜41のいずれか一項に記載の方法。
- 前記光が紫外線を実質的に含まない、請求項1〜43のいずれか一項に記載の方法。
- 前記光の照射が、紫外線を除去する手段を介して行われる、請求項1〜43のいずれか一項に記載の方法。
- 前記紫外線を除去する手段が、光学フィルタまたは分光器である、請求項45に記載の方法。
- 前記光が、レーザ、無機エレクトロルミネッセンス(EL)素子、および有機エレクトロルミネッセンス(EL)素子、発光ダイオード(LED)からなる群から選択される少なくとも一つの光源から放出された光である、請求項44〜46のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1〜47のいずれか一項に記載される方法において作用電極として用いられる電極であって、
導電性基材と、
該導電性基材上に形成される、前記増感色素が光励起に応じて放出する電子を受容可能な電子受容物質を含んでなる電子受容層と、
を備えた、電極。 - 前記電子受容層上に担持される、前記被検物質と直接または間接的に特異的に結合可能なプローブ物質をさらに備えた、請求項48に記載の電極。
- 前記電子受容物質が、前記増感色素の最低非占有分子軌道(LUMO)のエネルギー準位よりも低いエネルギー準位を有する物質である、請求項48または49に記載の電極。
- 前記電子受容物質が、酸化チタン、酸化亜鉛、酸化スズ、酸化ニオブ、酸化インジウム、酸化タングステン、酸化タンタル、およびチタン酸ストロンチウムからなる群から選択される少なくとも一種を含んでなる、請求項48〜50のいずれか一項に記載の電極。
- 前記電子受容物質が酸化チタンまたはチタン酸ストロンチウムである、請求項48〜50のいずれか一項に記載の電極。
- 前記電子受容物質がインジウム-スズ複合酸化物(ITO)またはフッ素がドープされた酸化スズ(FTO)である、請求項48〜50のいずれか一項に記載の電極。
- 前記電子受容層が多孔性または表面に凹凸構造を有する、請求項48〜50のいずれか一項に記載の電極。
- 前記導電性基材が透明である、請求項48〜54のいずれか一項に記載の電極。
- 前記プローブ物質が、前記電子受容層上の互いに分離された複数の領域毎に区分されて担持されてなる、請求項48〜55のいずれか一項に記載の電極。
- 前記電子受容層が前記導電性基材の全面にわたって形成され、また前記導電性基材にリード線が接続されてなる、請求項56に記載の電極。
- 絶縁基板をさらに備えてなり、該絶縁基板上に、前記導電性基材および前記電子受容層からなるスポットが、互いに分離された複数の領域毎に区分されて形成されてなり、該各領域の導電性基材毎に個別にリード線が接続されてなる、請求項57に記載の電極。
- 請求項1〜47のいずれか一項に記載の被検物質の特異的検出方法に用いられる測定用セルであって、
請求項48〜58のいずれか一項に記載の作用電極と、
対電極と、
を備えた、測定用セル。 - 前記作用電極と前記対電極との間に挿入されるスペーサをさらに備えた、請求項59に記載の測定用セル。
- 請求項1〜47のいずれか一項に記載の被検物質の特異的検出方法に用いられる測定装置であって、
請求項59または60に記載される測定用セルと、
前記作用電極の表面に光を照射する光源と、
前記作用電極と前記対電極との間を流れる電流を測定する電流計と
を備えた、測定装置。 - 前記光源が、増感色素の種類に応じて異なる波長の光を照射可能な複数の光源を備えた、請求項61に記載の装置。
- 前記光源が、波長選択手段をさらに備えてなり、増感色素の種類に応じて異なる波長の光を照射可能とされてなる、請求項61に記載の装置。
- 前記光源が、紫外線を実質的に含まない光を放出する光源である、請求項61〜63のいずれか一項に記載の装置。
- 前記光源と前記作用電極との間に、紫外線を除去する手段をさらに備えた、請求項61〜63のいずれか一項に記載の装置。
- 前記紫外線を除去する手段が、光学フィルタまたは分光器である、請求項65に記載の装置。
- 前記光源が、レーザ、無機エレクトロルミネッセンス(EL)素子、および有機エレクトロルミネッセンス(EL)素子、発光ダイオード(LED)からなる群から選択される少なくとも一つである、請求項61〜63のいずれか一項に記載の装置。
- 前記光源があらかじめ複数個設けられてなり、かつ前記測定装置が、該複数個の光源を切り替えて照射する光照射機構をさらに備えてなる、請求項61〜67のいずれか一項に記載の装置。
- 前記測定用セル中の作用電極に対し、前記光源がXY方向へ移動することによって、作用電極上の任意の領域に光照射する光照射機構をさらに備えてなる、請求項61〜67のいずれか一項に記載の装置。
- XY移動時に光源が、前記増感色素が結合した被験物質がプローブ物質を介して固定された作用電極の領域を照射する際に停止する、請求項69に記載の装置。
- XY移動時に光源が、前記増感色素が結合した被験物質がプローブ物質を介して固定された作用電極の領域を連続的に移動する、請求項69に記載の装置。
- 前記光源が固定され、該固定された光源に対し、前記測定用セルがXY方向へ移動することによって、作用電極上の任意の領域に光照射する光照射機構をさらに備えてなる、請求項61〜67のいずれか一項に記載の装置。
- XY移動時に測定用セルが、前記増感色素が結合した被験物質がプローブ物質を介して固定された作用電極の領域を照射する際に停止する、請求項72に記載の装置。
- XY移動時に測定用セルが、前記増感色素が結合した被験物質がプローブ物質を介して固定された作用電極の領域を連続的に移動する、請求項72に記載の装置。
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