CN101317087A - 使用光电流特异性检测被检测物质的方法、其中所使用的电极、测定池和测定装置 - Google Patents
使用光电流特异性检测被检测物质的方法、其中所使用的电极、测定池和测定装置 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了使用光电流、可以以高灵敏度、简便且准确地对具有特异性结合性的被检测物质进行检测和定量的方法,电极,测定池和测定装置。该方法中,结合有敏化染料的被检测物质经由探针物质固定在工作电极上,将该工作电极与对电极一起与电解质介质接触,对上述工作电极照射光,使上述敏化染料光激发,由光激发的敏化染料向工作电极进行电子转移,由此对在工作电极和对电极之间流动的光电流进行检测。工作电极具有电子接受层,在该电子接受层的表面担载有上述探针物质。该电子接受层含有可接受上述敏化染料响应光激发而释放的电子的电子接受物质。电子接受物质是具有比上述敏化染料的最低未占分子轨道(LUMO)的能级低的能级的氧化物半导体。电解质介质含有电解质和溶剂,电解质含有可向氧化状态的敏化染料供给电子的盐,溶剂选自非质子性溶剂和质子性溶剂的至少一种。
Description
发明背景
技术领域
本发明涉及使用光电流,特异性检测核酸、外源性内分泌扰乱物质、抗原等具有特异性结合性的被检测物质的方法,其中所使用的电极,测定池和测定装置。
背景技术
背景技术
分析生物体试样中的DNA的基因诊断方法作为各种疾病的新型预防和诊断方法有望得到人们的重视。可简便且正确地进行上述DNA分析的技术有以下方案。
已知有使被检体DNA与具有与其互补的碱基序列且标记了荧光物质的DNA探针杂交,检测此时的荧光信号的DNA的分析方法(例如参照日本特开平7-107999号公报和日本特开平11-315095号公报)。该方法中,通过染料的荧光来检测杂交产生的双链DNA的形成。
还已知有将改性为单链的基因样品同与其具有互补性的单链核酸探针杂交,然后添加嵌入剂等双链识别物,进行电化学检测的方法(例如参照日本专利第2573443号公报和表面科学Vol.24,No.11,671-676页,2003)。
另一方面,近年来,以二噁英为代表的外源性内分泌扰乱物质(环境激素)对生殖系统和神经系统等的障碍成为社会问题。目前,可通过各种方法进行外源性内分泌扰乱毒性的检测,上述物质仅凭10ppt水平左右的极低浓度即显示毒性。因此,人们希望能够有在上述低浓度范围内的外源性内分泌扰乱物质的检测方法。
特别是外源性内分泌扰乱物质经由受体等蛋白质与靶DNA结合,由此对该DNA的表达等产生影响,产生毒性。即,外源性内分泌扰乱物质不是直接与DNA结合,而是经由受体等蛋白质与DNA间接结合。因此,使用DNA结合性的预筛选等以往的方法并不容易对其结合进行评价。
但是,已知使用敏化染料、由光产生电能的太阳能电池(例如参照日本特开平1-220380号公报)。该太阳能电池具有多晶的金属氧化物半导体,且其表面积在广范围以内形成敏化染料的层。
人们尝试将上述太阳能电池的特性应用于生物化学分析,提出了将通过染料的光激发产生的光电流用于被检测物质(DNA、蛋白质等生物体分子)的检测的方案(例如参照中村等人「光電変換による新しいDNA二本鎖検出法」(“利用光电转换产生的新的DNA双链检测方法”)(日本化学会讲演预稿集Vol.81ST NO.2(2002)第947页以及日本特开2002-181777号公报)。
发明内容
本发明人本次在使用由敏化染料的光激发产生的光电流特异性检测被检测物质中认识到:通过使用含有可向氧化状态的敏化染料供给电子的盐的电解质、选自非质子性溶剂和质子性溶剂的至少一种溶剂的物质作为电解质介质,可以使用光电流,高灵敏度、简便且正确地对被检测物质进行检测和定量。
因此,本发明的目的在于提供:使用光电流,高灵敏度、简便且正确地对具有特异性结合性的被检测物质进行检测和定量的方法,电极,测定池,以及测定装置。
即,根据本发明,提供被检测物质的特异性检测方法,该方法包含:将工作电极与对电极一起与电解质介质接触,该工作电极是经由探针物质固定有结合了敏化染料的被检测物质的电极,对上述工作电极照射光,使上述敏化染料光激发,由被光激发的敏化染料向工作电极进行电子转移,由此对在工作电极与对电极之间流动的光电流进行检测;
其中,上述工作电极具有电子接受层,在该电子接受层的表面担载上述探针物质,所述电子接受层含有电子接受物质,该电子接受物质可以接受上述敏化染料响应光激发而释放的电子;
上述电子接受物质是具有比上述敏化染料的最低未占分子轨道(LUMO)的能级低的能级的氧化物半导体;
上述电解质介质含有电解质和溶剂,所述电解质含有可对氧化状态的敏化染料供给电子的盐,溶剂选自非质子性溶剂和质子性溶剂的至少一种。
本发明的方法还提供电极,该电极在上述方法中作为工作电极使用,其具备:
导电性基材;和
电子接受层,该电子接受层含有电子接受物质,该电子接受物质可接受形成于上述导电性基材上的上述敏化染料根据光激发而释放的电子。
本发明又提供上述方法中使用的测定池,该测定池具备上述工作电极;和对电极。
本发明又提供上述方法中使用的测定装置,该测定装置具备:上述测定池;对上述工作电极的表面照射光的光源;以及测定在上述工作电极和上述对电极之间流动的电流的电流表。
附图说明
图1是说明染料敏化型太阳能电池的原理的图。
图2是被检测物质为单链核酸、探针物质为与上述核酸具有互补性的单链核酸时被检测物质与探针物质固定的步骤的图,(a)表示被检测物质用预先用敏化染料标记的情况,(b)表示在双链核酸中添加可嵌入的敏化染料时的情况。
图3是表示被检测物质为配体、介质物质为受体蛋白分子、探针物质为双链核酸时被检测物质与探针物质固定的步骤的图。
图4是表示配置有光源的测定池的图,图中用虚线包围的部分21是测定池。
图5是图4所示的测定池的平面图。
图6是其它测定池的一个例子的截面图。
图7是图6所示的该测定池的分解立体图。
图8是表示具有互相竞争的特异性结合性的被检测物质和第二被检测物质为抗原、探针物质为抗体时被检测物质与探针物质的固定步骤的图。
图9是表示使用流体型测定池和形成图案的工作电极的装置的一个例子的图。
图10是表示形成图案的工作电极的一个例子的图,(a)表示工作电极的平面图,(b)表示工作电极的截面图,(c)表示另一方案的工作电极的截面图,(d)表示又一方案的工作电极的截面图。
图11是表示形成图案的工作电极的另一个例子的图,(a)表示工作电极的平面图,(b)表示工作电极的截面图,(c)表示另一方案的工作电极的截面图。
图12是表示形成图案的工作电极中使用的光源的一个例子的图。
图13是表示形成图案的工作电极中使用的光源的又一个例子的图。
图14是表示具备光源移动型光照射结构的测定装置的一个例子的图,(a)是整体立体图,(b)表示其俯视图。
图15是表示具备池移动型光照射结构的测定装置的一个例子的图,(a)表示整体立体图,(b)表示其俯视图。
图16是表示图14所示装置中的光源移动型光照射结构的一个例子的图。
图17是表示图15所示装置中的池移动型光照射结构的一个例子的图。
图18是表示具备光照射结构的测定装置的例子图,(a)表示具备图14和16所示的光源移动型结构的装置例子,(b)表示具备图15和17所示的池移动功能型结构的装置例子。
图19是利用MEMS等制备方法的光电流检测装置的一个例子的概略立体图。
图20是图19所示光电检测装置的构成图。
图21是图19所示检测芯片的分解立体图。
图22是表示例1中测定的检测电流值的图表,(a)表示使用FTO电极时的情况,(b)表示使用ITO电极的情况。
图23是表示在例2中测定的互补DNA与非互补DNA的检测电流值的差的图表。图中,PM对应于使用与探针互补的DNA的情况,MM对应于使用与探针非互补的DNA的情况。
图24是表示例3中测定的检测电流值的图,(a)表示使用含有碘的电解液的情况,(b)表示使用不含碘的电解液的情况。
图25是表示例5中制备的在49处位置固定DNA的工作电极的概略图。
图26是表示例6中测定的光电流随时间变化的图。
图27是表示例7中测定的光电流随时间变化的图。
图28是表示例8中测定的光电流随时间变化的图。
图29是表示例9中测定的光电流随时间变化的图。
图30是表示例10中使用各种电解质测定的光电流值的图。图中,PM对应于使用完全一致的探针的情况,SNP对应于使用单个碱基突变的链探针的情况,MM对应于使用完全不一致的探针的情况。
图31是表示在例11中使用各种浓度的乙腈测定的光电流值的图。图中,PM对应于使用完全一致的探针的情况,SNP对应于使用单个碱基突变的链探针的情况,MM对应于使用完全不一致的探针的情况。
图32是表示例13中使用各种电解质测定的光电流值的图。
图33是表示在例14中使用水溶液系的电解液测定的单核苷酸多态性(SNPs)的光电流值的图。
图34是表示在例16中对于罗丹明标记蛋白和非标记蛋白分别测定的光电流值的图。
图35是表示在例17中,对于氢醌、三乙醇胺和NPr4I其中之一与水的混合液进行测定的光电流值随时间变化的图。
图36是表示对图35所得的光电流进行数据处理后的结果图。
图37是表示在例17中将铁氰化钾与水的混合液作为电解液测定的光电流波形的图。
具体实施方式
使用光电流对被检测物质的特异性检测
本发明的方法中,将工作电极和对电极一起与电解质介质接触,其中所述工作电极是结合有敏化染料的被检测物质经由探针物质固定在电极上而成的,对上述工作电极照射光,使上述敏化染料光激发,光激发后的敏化染料向工作电极进行电子转移,由此检测工作电极与对电极之间流动的光电流。工作电极具有电子接受层,该电子接受层含有可接受上述敏化染料响应光激发而释放的电子的电子接受物质,该电子接受层的表面担载有上述探针物质。电子接受物质是具有比上述敏化染料的最低未占分子轨道(LUMO)的能级低的能级的氧化物半导体。
此时,电解质介质使用含有电解质和溶剂的物质,电解质含有可向氧化状态的敏化染料供给电子的盐,溶剂选自非质子性溶剂和质子性溶剂中的至少一种。使用上述电解质介质,则与以在太阳能电池中通常使用的电解质为代表的以往的电解质相比,利用光电流对被检测物质的检测灵敏度和精度飞跃性提高。其原因尚未明确,可以认为是以下因素。以下说明均为假说,并不对本发明造成任何限定。首先,图1表示说明染料敏化型太阳能电池的原理的图。太阳能电池中使用的电解质介质的常规组成是I2/N(C3H7)4I/乙腈。如图1所示,N(C3H7)4I在乙腈(CH3CN)中分离成N(C3H7)4 +和I-,金属I2与上述I-结合,以I3 -的形式溶解。此时,生成的I3 -在太阳能电池中是进行碘的氧化还原循环、可持续发电的必须物质,但在对上述机理进行生物化学分析中,使被检测物质的检测精度降低。结果,如果使用在太阳能电池中通常使用的电解质,特别是在检测对象为SNPs时,则必须检测出电流值的微弱差异,精度降低显著。与此相对,本发明中使用的电解质介质使用含有可向氧化状态的敏化染料供给电子的盐的电解质,因此不含有I2等由对电极接受电子的氧化剂。因此,不会生成I3 -等使测定精度变差的成分,因此检测灵敏度和精度飞跃性提高。
本发明中使用的电解质介质含有电解质、溶剂、以及根据需要的添加物,所述电解质含有可向氧化状态的敏化染料供电子的盐,所述溶剂选自非质子性溶剂和质子性溶剂的至少一种。即,本发明中使用的电解质含有向氧化状态的敏化染料供给电子的还原剂,但不含有由对电极接受电子的氧化剂。电解质的优选例子有:不含有I2或Br2的碘化物和/或溴化物,具体来说为LiI、NaI、KI、CsI、CaI2等金属碘化物;四烷基碘化铵、碘化吡啶鎓、碘化咪唑鎓等季铵化合物的碘盐;LiBr、NaBr、KBr、CsBr、CaBr2等金属溴化物;四烷基溴化胺、溴化吡啶鎓等季铵化合物的溴盐;亚铁氰酸盐、铁氰离子等的金属络合物;硫代硫酸钠、硫代硫酸铵、硫代硫酸钾、硫代硫酸钙等硫代硫酸盐;亚硫酸钠、亚硫酸钾、亚硫酸铵、亚硫酸铁、亚硫酸氢钠、亚硫酸钙等亚硫酸盐等;以及它们的混合物。电解质的更优选的例子有:LiI或四烷基碘化铵、碘化吡啶鎓、碘化咪唑鎓等季铵化合物的碘盐以及它们的混合物,特别优选LiI或四烷基碘化铵。
根据本发明的优选实施方案,电解质介质中的电解质浓度优选为0.001-15M,更优选0.01-10M。
本发明使用的溶剂是非质子性溶剂、质子性溶剂或它们的混合物。即,可以使用以水为主体并混合有缓冲液成分的极性溶剂体系、或非质子性的极性溶剂。非质子性的极性溶剂可以使用:乙腈等腈类,碳酸亚丙酯或碳酸亚乙酯等碳酸酯类,1,3-二甲基咪唑啉酮或3-甲基噁唑啉酮、二烷基咪唑鎓盐等杂环化合物,或二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、环丁砜等。电解质介质中所含的溶剂可以混合多种使用,在实际应用上,可以根据检测对象将溶剂组成适当变更。例如,特别是将电解质制成含有可以向氧化状态的敏化染料供给电子的盐,具体来说制成不含I2的碘化化合物,使用上述非质子性极性溶剂,则可以精度良好地检测微弱的电流值的差,可有效地用于SNP的判定。蛋白质的测定是以缓冲液为主体,通过含有乙腈来保持蛋白质间的结合、抑制阴离子还原能力的降低,由此可以精度良好地进行检测。
根据本发明的优选方案,可以使电解质介质凝胶化(固体化)而使用。凝胶化的方法的例子可通过添加聚合物、添加油凝胶化剂、含有多官能单体类的聚合、聚合物的交联反应等方法进行。凝胶电解质的基质中使用的聚合物的例子有:聚丙烯腈、聚偏氟乙烯等。
本发明的方法中,首先准备含有被检测物质的试样液、工作电极、对电极。本发明中使用的工作电极是在表面具备可以直接或间接与被检测物质特异性结合的探针物质的电极。即,探针物质不只是与被检测物质直接、特异性结合的物质,还可以是首先使被检测物质与受体蛋白分子等媒介物质特异性结合,然后与得到的结合体特异性结合的物质。接着,在敏化染料的共存下,使试样液与工作电极接触,使被检测物质直接或间接与探针物质特异性结合,通过该结合使敏化染料固定在工作电极上。敏化染料是响应光激发,可以向工作电极释放电子的物质,可以对被检测物质或介质物质预先进行标记,或者在被检测物质与探针物质的结合体中使用可嵌入的敏化染料时只添加到试样液中。
使工作电极和对电极与电解质介质接触后,对工作电极照射光,使敏化染料光激发,则由光激发的敏化染料向电子接受物质发生电子转移。由于该电子转移,工作电极和对电极之间流动光电流,通过检测该光电流,可以以高灵敏度检测被检测物质。该检测电流与试样液中被检测试样浓度具有高的相关关系,因此,可以根据所测定的电流量或电量进行被检测试样的定量测定。
被检测物质和探针物质
本发明的方法中的被检测物质只要是具有特异性结合的物质即可,没有特别限定,可以是各种物质。如果是上述被检测物质,则通过将可以与被检测物质直接或间接特异性结合的探针物质担载于工作电极表面,可以使被检测物质与探针物质直接或间接性特异性结合,可以检测。
即,本发明的方法中,作为被检测物质与探针物质可以选择互相特异性结合的物质。即,根据本发明的优选方案,优选以具有特异性结合性的物质作为被检测物质,以与被检测物质特异性结合的物质作为探针物质,担载在工作电极上。由此,可以使被检测物质直接、特异性结合于工作电极上并检测。该方案中,被检测物质和探针物质组合的优选例子有:单链核酸以及与核酸具有互补性的单链核酸的组合,以及抗原和抗体的组合。
根据本发明的优选方案,优选被检测物质为单链核酸,探针物质为与核酸具有互补性的单链核酸。该实施方案中的被检测物质与工作电极的特异性结合步骤如图2(a)和(b)所示。如这些图所示,作为被检测物质的单链核酸1与担载在工作电极3上的作为探针物质的、具有互补性的单链核酸4杂交,形成双链核酸7。
以单链核酸作为被检测物质时,只要与探针物质的核酸具有互补性的部分即可,对于构成被检测物质的碱基对的长度没有限定,但优选探针物质与核酸具有15bp或以上的互补性的部分。根据本发明的方法,即使是具有200bp、500bp、1000bp碱基对的链长较长的核酸,也可以以光电流的形式高灵敏度检测出探针物质与被检测物质核酸之间的特异性结合的形成。
作为被检测物质的含有单链核酸的试样液可以按照公知的方法,从末梢静脉血等血液、白细胞、血清、尿、粪便、精液、唾液、培养细胞、各种器官细胞等组织细胞等的含有核酸的各种检体试样中提取核酸,制备。此时,检体试样中细胞的破坏例如可通过由外部施加振荡、超声波等物理性作用,使载体振荡进行。还可以使用核酸提取溶液,从细胞中使核酸游离。核酸洗脱溶液的例子有含有SDS、曲通(Triton)-X、吐温-20等表面活性剂,皂苷、EDTA、蛋白酶等的溶液。使用这些溶液洗脱核酸时,可以通过37℃或以上的温度下培养来促进反应。
根据本发明的更优选的方案,作为被检测物质的基因含量为微量时,优选通过公知的方法扩增基因后进行检测。扩增基因的方法代表性的是使用聚合酶链反应(PCR)等使用酶的方法。这里,基因扩增法中使用的酶的例子有:DNA聚合酶、Taq聚合酶等DNA依赖型DNA聚合酶,RNA聚合酶I等DNA依赖型RNA聚合酶,Qβ复制酶等RNA依赖型RNA聚合酶,从只通过调节温度即可以连续地反复扩增的角度考虑,优选使用Taq聚合酶的PCR法。
根据本发明的优选方案,上述扩增时可以将核酸用敏化染料特异性标记。通常可通过在DNA中掺入氨基烯丙基改性的dUTP来进行。该分子可以与未改性的dUTP以同样的效率掺入。在下面的偶联阶段中,通过N-羟基琥珀酰亚胺活化的荧光染料与改性dUTP特异性反应,可得到用敏化染料均匀地标记的被检测物质。
根据本发明的优选方案,上述得到的核酸的粗提取液或纯化的核酸溶液首先在90-98℃、优选95℃或以上的温度下实施热变性,可制备单链核酸。
本发明的方法中,被检测物质与探针物质可以间接特异性结合。即,根据本发明的另外的优选方案,优选以具有特异性结合性的物质作为被检测物质,以与该被检测物质特异性结合的物质作为介质物质,使其共存,以可与该介质物质特异性结合的物质作为探针物质,担载在工作电极上。由此,即使是不能与探针物质特异性结合的物质,也可以经由介质物质与工作电极间接地特异性结合并检测。该方案中的被检测物质、介质物质和探针物质的组合的优选例子是:配体、可接受该配体的受体蛋白分子、以及可与该受体蛋白分子特异性结合的双链核酸的组合。配体的优选例子有:外源性内分泌扰乱物质(环境激素)。外源性内分泌扰乱物质是经由受体蛋白分子与DNA结合、对该基因的表达产生影响并产生毒性的物质,根据本发明的方法,可以简便地监测由被检测物质带来的受体等蛋白质与DNA的结合性。该方案的被检测物质与工作电极的特异性结合步骤如图3所示。如图3所示,作为被检测物质的配体10首先与作为介质物质的受体蛋白分子11特异性结合。结合有配体的受体蛋白分子13与作为探针物质的双链核酸14特异性结合。
根据本发明的方法,可以使来自不同获得途径的多个同一被检测物质同时与一种探针物质反应,判断样品由来导致的被检测物质量的差异,由此可以对来自目标获得途径的被检测物质进行定量。具体的应用例子有:在微阵列上的竞争性杂交导致的表达图谱分析。这是为了分析细胞之间特定基因的表达图谱的差异而将用不同的荧光染料标记的被检测物质与同一探针物质进行竞争性杂交。本发明中,通过采用上述方法,可以对细胞间的表达差异进行电化学分析,这是以往所没有的优点。
敏化染料
本发明的方法中,为了通过光电流检测被检测物质的存在,在敏化染料的共存下使被检测物质直接或间接与探针物质特异性结合,通过该结合,使敏化染料固定于工作电极上。为此,本发明的方法中,如图2(a)和图3所示,可以预先对被检测物质1或介质物质11用敏化染料2、12标记。另外,如图2(b)所示,被检测物质与探针物质的结合体7(例如杂交后的双链核酸)中使用可嵌入的敏化染料8时,通过向试样液中添加敏化染料,可以使敏化染料固定在探针物质上。
根据本发明的优选方案,被检测物质为单链核酸时,优选对1个分子的被检测物质标记1个敏化染料。从容易使被检测物质与探针物质形成特异性结合的角度考虑,单链核酸的标记位置优选是单链核酸的5”末端或3’末端的任意位置,从使标记步骤进一步简化的角度考虑,进一步优选被检测物质的5’末端。
根据本发明的又一优选方案,为了提高每1个分子被检测物质的敏化染料的担载量,优选对1个分子的被检测物质进行2个或以上的敏化染料的标记。由此,形成了电子接受物质的工作电极中,可以使单位比表面积的染料担载量更多,可以以更高灵敏度观测光电流响应。
本发明中使用的敏化染料是可以响应光激发而向工作电极释放电子的物质,只要可通过光源的照射跃迁到光激发状态、并且可以由激发状态获得可向工作电极注入电子的电子状态即可。因此,所使用的敏化染料只要是可以在工作电极、特别是电子接受层之间获得上述电子状态即可,可以使用多种敏化染料,无需使用昂贵的染料。
在对多种被检测物质进行分别检测的方案中,对各种被检测物质标记的敏化染料只要是可以以分别不同的波长的光激发的染料即可,例如,只要是可以通过选择照射光的波长来分别激发各被检测物质即可。例如,使用与多种被检测物质对应的多种敏化染料,对各敏化染料照射不同的激发波长的光,则即使多个探针在同一样点上,也可以分别检测出信号。本发明的方法中,被检测物质的数量没有限定,考虑到由光源照射的光的波长和敏化染料的吸收特性,1-5种较为恰当。该方案中可使用的敏化染料只要是可以在照射光的波长区域内引起光激发即可,无需其最大吸收在该波长区域内。特定波长下是否有敏化染料的光吸收反应,这可以使用紫外可见光谱仪(例如岛津制作所制造的UV-3150)测定。
敏化染料的具体例子有金属络合物或有机染料。金属络合物的优选例子是:铜酞菁、钛酞菁等金属酞菁;叶绿素或其衍生物;氯高铁血红素、日本特开平1-220380号公报或日本特表平5-504023号公报中记载的钌、锇、铁和锌的络合物(例如顺式-二氰酸酯-双(2、2’-联二吡啶-4、4’-二羧酸)钌(II))。有机染料的优选例子有:无金属酞菁、9-苯基呫吨系染料、花青系染料、金属花青系染料、呫吨系染料、三苯基甲烷系染料、吖啶系染料、噁嗪系染料、香豆素系染料、部花青系染料、若丹菁(ロダシアニン)系染料、聚甲炔系染料、靛蓝系染料等。敏化染料的其它优选例子还有アマシヤムバイオサイエンス公司(AmershamBiosciences Company)制备的Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、Cy7.5、Cy9;モルキユラ一プロ一ブ公司(Molecular Probe Company)制备的AlexaFluor355、AlexaFluor405、AlexaFluor430、AlexaFluor488、AlexaFluor532、AlexaFluor546、AlexaFluor555、AlexaFluor568、AlexaFluor594、AlexaFluor633、AlexaFluor647、AlexaFluor660、AlexaFluor680、AlexaFluor700、AlexaFluor750;Dyomics公司制备的DY-610、DY-615、DY-630、DY-631、DY-633、DY-635、DY-636、EVOblue10、EVOblue30、DY-647、DY-650、DY-651、DYQ-660、DYQ-661。
可嵌入到双链核酸的敏化染料的优选例子有:吖啶橙、溴乙啶。使用上述敏化染料时,在核酸杂交后添加到试样液中即可以形成用敏化染料标记的双链核酸,因此无需预先对单链核酸进行标记。
工作电极及其制备
本发明中使用的工作电极是表面具备上述探针物质的电极,是可接受经由探针物质固定的敏化染料响应光激发释放的电子的电极。因此,工作电极的构成和材料只要是在与所使用的敏化染料之间可产生上述电子转移的材料即可,没有特别限定,可以是各种构成和材料。
根据本发明的优选方案,优选工作电极具有电子接受层,该电子接受层的表面具备探针物质,其中所述电子接受层含有可接受敏化染料响应光激发而释放的电子的电子接受物质。根据本发明的更优选的方案,优选工作电极进一步含有导电性基材,在该导电性基材上形成电子接受层。该方案的电极如图2和图3所示。图2和图3所示的工作电极3具备导电性基材5、在该导电性基材5上形成并含有电子接受物质的电子接受层6。电子接受层6的表面担载有探针物质4。
本发明的电子接受层6含有电子接受物质,该电子接受物质可以接受经由探针物质4固定的敏化染料响应光激发而释放的电子。即,电子接受物质可以是可以取得可由光激发的标记染料注入电子的能级的物质。这里,可以由光激发的标记染料注入电子的能级(A),例如在使用半导体作为电子接受性材料时是指导带(CB)。即,本发明中使用的电子接受物质只要是该A的能级具有比敏化染料的LUMO能级低的能级即可,换句话说,具有比敏化染料的LUMO的能级低的能级即可。
电子接受物质有:硅、锗等单体半导体;钛、锡、锌、铁、钨、锆、铪、锶、铟、铈、钇、镧、钒、铌、钽等的氧化物半导体;钛酸锶、钛酸钙、钛酸钠、钛酸钡、铌酸钾等钙钛矿型半导体;镉、锌、铅、银、锑、铋等的硫化物半导体;镉、铅的硒化物半导体;镉的碲化物半导体;锌、镓、镉等的磷化物半导体;镓砷、铜-铟-硒化物、铜-铟-硫化物的化合物半导体。上述例举的半导体可以是真性半导体和杂质半导体的任意形式。
根据本发明的优选的方法,电子接受物质使用氧化物半导体。更优选TiO2、ZnO、SnO2、Fe2O3、WO3、Nb2O5、Ta2O3、In2O3、钛酸锶,最优选使用TiO2,铟-锡复合氧化物(ITO)或掺杂氟的氧化锡(FTO)。ITO和FTO不但具有电子接受层的功能,而且还具有导电性基材的功能的性质,因此,通过使用这些材料,无需使用导电性基材,仅凭电子接受层即可以发挥工作电极的功能。
使用半导体作为电子接受物质时,该半导体可以是单晶和多晶的任意一种,优选多晶体,进一步优选与致密的晶体相比具有多孔性的晶体。由此,可以使比表面积增大,更多地吸附被检测物质和敏化染料,以更高的灵敏度检测被检测物质。因此,根据本发明的优选的方案,电子接受层具有多孔性,各孔的孔径优选3-1000nm,更优选10-100nm。
根据本发明的优选方案,在导电性基材上形成了电子接受层的状态下,优选表面积相对于投影面积为10倍或以上,进一步优选100倍或以上。该表面积的上限没有特别限定,通常为1000倍左右。对于构成电子接受层的电子接受物质的微粒粒径,如果以使用将投影面积换算成圆形时的直径的平均粒径计,则一次粒径优选5-200nm,更优选8-100nm,进一步优选20-60nm。分散物中的电子接受性物质的微粒(二次微粒)的平均粒径优选0.01-100μm。另外,为了使入射光散射,提高光捕获率,还可以结合使用粒径尺寸大的例如300nm左右的电子接受物质的微粒,形成电子接受层。
通过凹凸结构,可以使电子接受层6的表面积增大,使探针分子更多地固定,由此可以提高检测灵敏度。生物体分子的大小是0.1-20nm左右,因此,优选通过凹凸结构形成的微孔径为20nm或以上、150nm或以下。通过凹凸结构产生的空间入口比其更小,则比表面积虽然增大,但生物体分子无法与探针结合,检测信号降低。凹凸越粗大则表面积不会过度增加,信号强度也不能提高。适合生物体分子的灵敏度的更优选的范围是50nm或以上、150nm或以下。
根据本发明的优选方案,可以采用将纳米级的柱(柱状物)在表面上有规则地排列的柱结构作为凸结构。其制备方法已知有各种,通常是使用具有纳米级的孔的阳极氧化的氧化铝作为铸型的方法。有如下方法:在铸型中填充陶瓷溶胶,进行热处理,然后通过蚀刻除去氧化铝铸型的方法;或者是将填充的陶瓷的溶胶从铸型上脱模,然后进行热处理的方法。制备柱状的纳米结构体的方法有:日本特开2004-130171所示的在透明基体、透明导电层上制备纳米结构体的方法。这里,是采用向阳极氧化的氧化铝铸型中填充氧化钛溶胶,在300-400℃进行热处理,然后通过蚀刻除去铸型的方法。结果,形成了二氧化钛的纳米管或纳米线作为纳米结构体。
根据本发明的优选方案,凹结构优选采用将含有陶瓷成分的无机-有机掺合物前体进行烧结、由于有机物的氧化分解生成气相而产生的气孔。无机-有机掺合物前体是使有机金属化合物(金属醇盐)氧化以及后续的缩聚反应产生的金属-氧的网络结构与有机聚合物等共存所得的。还有添加市售的氧化钛颗粒(例如テイカ株式会社(Tayca Company)制备的锐钛矿型晶体、商品名AMT-600(平均粒径30nm)等)、或在氧化钛分散液中添加有机聚合物等的方法。关于这些组成有各种提案,例如在日本特开平10-212120号中提出了:在甘醇二甲醚系溶剂(HO-(-CH2CH2O-)n-R,n为1-10、R为烷基或芳基)中使氧化钛颗粒分散,再加入有机聚合物作为分散助剂的组成。将该组成的分散液通过适当的方法(浸涂法、喷涂法、旋涂法、刮涂法、辊涂法、刷涂法、逆辊涂法)涂布在支撑体上,在200-800℃下烧成时,可实现每1cm2(厚度1μm)为40-50cm2的比表面积。日本特开2001-233615中,公开了将含有四烷氧基钛和环氧乙烷、环氧丙烷、环氧乙烷嵌段共聚物、和稳定剂和溶剂的溶胶溶液在基板上滴落,使基板高速旋转,使溶剂蒸发,通过凝胶化获得具有立体结构的有机无机复合氧化钛薄膜,然后进行高温烧结,除去嵌段共聚物,由此形成微细的立体凹结构。还公开了使用寡聚糖(海藻糖)作为有机聚合物的方法(日本特开2004-83376),可得到气孔率为38-56%的陶瓷多孔质膜。
如上所述,提出了各种陶瓷的微细凹凸结构的控制方法,通过将其应用于适合本技术的陶瓷电极材料中,可以制备比表面积大的电极材料。
根据本发明的优选方案,优选工作电极进一步含有导电性基材,电子接受层在导电性基材上形成。可在本发明中使用的导电性基材不仅是象钛等金属那样的支撑体本身具有导电性的导电性基材,还可以是在玻璃或塑料的支撑体表面具有导电材料层的导电性基材。使用具有该导电材料层的导电性基材时,电子接受层在该导电材料层上形成。构成导电材料层的导电材料的例子有:铂、金、银、铜、铝、铑、铟等金属;碳、炭化物、氮化物等导电性陶瓷;以及铟-锡复合氧化物,在氧化锡中掺杂氟所得的物质、氧化锡中掺杂锑所得的物质、氧化锌中掺杂镓所得的物质、或者氧化锌中掺杂铝等所得的物质等导电性金属氧化物,更优选铟-锡复合氧化物(ITO)、氧化锡中掺杂氟所得的金属氧化物(FTO)。如上所述,电子接受层本身可发挥导电性基材的功能时,导电性基材可以省略。本发明中,导电性基材只要是可确保导电性的材料即可,没有特别限定,也包含其本身不具有作为支撑体的强度的薄膜状或点状的导电材料层。
根据本发明的优选方案,导电性基材基本上透明,具体来说优选光的透射率为10%或以上,更优选50%或以上、进一步优选70%或以上。由此可以构成池结构,以使由工作电极的里侧(即导电性基材)照射光,透过工作电极(即导电性基材和电子接受层)的光激发敏化染料。另外,根据本发明的优选方案,导电材料层的厚度优选0.02-10μm左右。进一步根据本发明的优选方案,优选导电性基材的表面电阻为100Ω/cm2或以下,进一步优选40Ω/cm2或以下。导电性基材的表面电阻的下限没有特别的限定,通常为0.1Ω/cm2左右。
电子接受层在导电性基材层上的优选的形成方法的例子有:在导电性支撑体上涂布电子接受物质的分散液或胶体溶液的方法;在导电性支撑体上涂布半导体微粒的前体,通过空气中的水分进行水解,获得微粒膜的方法(溶胶-凝胶法);溅射法;CVD法;PVD法;蒸镀法等。制备作为电子接受物质的半导体微粒的分散液的方法除上述的溶胶-凝胶法之外,还有用乳钵磨碎的方法;边用磨粉碎边分散的方法;或者在合成半导体时在溶剂中以微粒的形式析出并直接使用的方法等。此时的分散介质有水或各种有机溶剂(例如甲醇、乙醇、异丙醇、二氯甲烷、丙酮、乙腈、乙酸乙酯等)。分散时可以根据需要使用聚合物、表面活性剂、酸或螯合剂等作为分散助剂。
电子接受物质的分散液或胶体溶液的涂布方法的优选例子有:涂布系统有:辊涂法、浸泡法,计量系统有:气刀法、刮板法等,使涂布与计量以同一部分完成的有:日本特公昭58-4589号公报所公开的绕线棒法、美国专利2681294号、美国专利2761419号、美国专利2761791号等记载的滑动漏斗法,挤压法、幕涂法、旋涂法、喷涂法等。
根据本发明的优选方案,电子接受层含有半导体微粒时,优选电子接受层的膜厚为0.1-200μm,更优选0.1-100μm,进一步优选1-30μm,最优选2-25μm。由此,可以使单位投影面积的探针物质以及固定的敏化染料量增加,使光电流量增多,同时也可以降低电荷复合所产生的电子的损失。每1m2导电性基材的半导体微粒的涂布量优选为0.5-400g,更优选5-100g。
根据本发明的优选方案,电子接受物质含有铟-锡复合氧化物(ITO)或在氧化锡中掺杂氟的金属氧化物(FTO)时,电子接受层的膜厚优选1nm或以上,更优选10nm-1μm。
根据本发明的优选方案,优选在导电性基材上涂布半导体微粒后实施加热处理。由此,使颗粒之间电接触,还可以提高涂膜的强度或提高与支撑体的贴合性。优选的加热处理温度是40-700℃,更优选100-600℃,优选的加热时间是10分钟-10小时左右。
根据本发明的另外的优选方案,使用聚合物膜等熔点或软化点等低的导电性基材时,为防止热劣化,优选通过不使用高温处理的方法进行膜的形成,上述膜形成方法例如有加压、低温加热、电子射线照射、微波照射、电泳、溅射、CVD、PVD、蒸镀等方法。
在上述得到的工作电极的电子接受层表面担载探针物质。在工作电极上担载探针物质可按照公知方法进行。根据本发明的优选方案,使用单链核酸作为探针物质时,可以在工作电极表面形成氧化层,经由该氧化层使核酸探针与工作电极结合来进行。此时,核酸探针与工作电极的固定可通过向核酸的末端导入官能团进行。由此,导入了官能团的核酸探针可以直接通过固定化反应固定在载体上。向核酸末端导入官能团可以通过酶促反应或使用DNA合成仪进行。酶促反应中使用的酶例如有:末端脱氧核苷酸转移酶、聚腺苷酸聚合酶、多核苷酸激酶、DNA聚合酶、多核苷酸腺苷转移酶、RNA连接酶。还可以通过聚合酶链反应(PCR法)、切口平移法、随机引物法导入官能团。官能团可以导入到核酸的任意部分,可以导入到3’末端、5’末端或随机位置。
根据本发明的优选方案,用于核酸探针与工作电极固定的官能团可优选使用胺、羧酸、磺酸、硫醇、羟基、磷酸等。根据本发明的优选方案,为了使核酸探针与工作电极牢固固定,可以使用将工作电极与核酸探针之间交联的材料。上述交联材料的优选例子有:硅烷偶联剂、钛酸酯偶联剂或聚噻吩、聚乙炔、聚吡咯、聚苯胺等导电性聚合物。
根据本发明的优选方案,可以通过所谓的物理吸附这样更简单的操作即可有效地进行核酸探针的固定。核酸探针与电极表面的物理吸附例如可如下进行。
首先,用超声波洗涤器,用蒸馏水和醇洗涤电极表面。然后将电极插入到含有核酸探针的缓冲液中,使核酸探针吸附于载体表面。
吸附核酸探针后,通过添加阻滞剂来抑制非特异性吸附。可使用的阻滞剂只要是可以包埋未吸附核酸探针的电子接受层表面的位置、并且可通过化学吸附或物理吸附等吸附电子接受物质的物质即可,没有限定,优选具有可经由化学键吸附的官能团的物质。例如,使用氧化钛作为电子接受层时,优选的阻滞剂的例子有:具有羧酸基、磷酸基、磺酸基、羟基、氨基、吡啶基、酰胺等的可吸附于氧化钛的官能团的物质。
根据本发明的优选方案,优选探针物质在工作电极上的互相分开的多个区域上分别担载,利用光源的光照射可对各区域分别进行。由此,可以将多个试样在一片工作电极上测定,因此可以实现DNA芯片的集成化等。根据本发明的更优选的方案,优选形成探针物质担载于工作电极上的互相分开的多个区域的图案,一边由光源照射的光进行扫描,一边以一次性操作对各区域的试样连续地进行被检测物质的检测或定量。
根据本发明的更优选的方案,优选使多种探针物质担载于工作电极上的互相分开的多个区域的各个区域。由此可以同时进行区域的个数乘以各个区域探针物质的种类数的多种样品的测定。
根据本发明的更优选的方案,可以在工作电极上互相分开的多个区域的各个区域内担载不同的探针物质。由此,可以担载与所区分的区域数相当的种类数的探针物质,因此可以同时进行多种被检测物质的测定。该方案可以在各个区域内对不同的被检测物质进行分析,因此可优选利用于单核苷酸多态性的分析(SNPs)的多项目分析。
对电极
本发明中使用的对电极只要是在与电解质介质接触时与工作电极之间有电流流动即可,没有特别限定,可以使用在玻璃、塑料、陶瓷等绝缘性的支撑体上蒸镀金属或导电性的氧化物所得的对电极。对电极的金属薄膜可通过蒸镀或溅射等方法形成,使膜厚为5μm或以下、优选3nm-3μm的范围。对电极中可使用的材料的优选例子有:铂、金、钯、镍、碳、聚噻吩等的导电性聚合物、氧化物、炭化物、氮化物等导电性陶瓷等,更优选铂、碳,最优选铂。这些材料可以按照与电子接受层形成方法同样的方法形成薄膜。
测定方法和装置
本发明的方法中,在敏化染料的共存下,使试样液与工作电极接触,使被检测物质与探针物质直接或间接特异性结合,通过该结合,使敏化染料固定在上述工作电极上。此时,试样液的溶剂使用后述的本发明的缓冲溶液,由此可以提高工作电极对被检测物质的检测灵敏度。
根据本发明的优选方案,以用敏化染料预先标记的单链核酸作为被检测物质时,可以在与作为探针物质的单链核酸之间进行杂交反应。杂交反应的优选温度是37-72℃的范围,其最佳温度根据所使用的探针的碱基序列或长度等而不同。
根据本发明的另一优选方案,在被检测物质和探针物质的结合体(例如杂交后的双链核酸)中使用可嵌入的敏化染料时,通过向试样液中添加敏化染料,可以将结合体用敏化染料特异性地标记。
根据本发明的优选方案,优选将被检测物质直接或间接与探针物质特异性结合,将所得的工作电极用洗涤液洗涤,除去未与工作电极结合的被检测物质。此时的洗涤液可以进一步含有表面活性剂。
本发明的方法中,使被检测物质与敏化染料共同被固定的工作电极与对电极一起与电解质介质接触,对工作电极照射光,使敏化染料光激发,由光激发的敏化染料向工作电极进行电子转移,由此使工作电极与对电极之间有光电流流过,对该光电流进行检测。工作电极和对电极的相对位置关系只要是互相不会电短路、并且可以与电解质介质接触即可,没有特别限定,可以是互相相对配置,或者是在同一平面上互相间隔配置。工作电极和对电极在同一平面上互相间隔配置时,为防止工作电极与对电极之间的电短路,优选在绝缘基板上设置该两种电极。
上述测定池的一个例子如图4和图5所示。图4和图5所示的测定池21是在由工作电极22和对电极23夹持形成的空隙24内填充电解液而成的。工作电极22具备导电性基材26和电子接受层27,配置成使电子接受层27一侧与电解液接触。在工作电极22和对电极23之间插入绝缘间隔物25,由此可以确保盛载电解液的空间24。为了高效地进行氧化还原的循环,电极间的距离优选短,考虑到与工作精度的配合,优选数十μm。还可以利用所谓的MEMS等制备方法,可制成更接近的电极间距离。
工作电极22的上方经由光源罩29配置光源28。即,构成池,以使由工作电极22的里侧(即导电性基材)照射光,透过工作电极(即导电性基材和电子接受层)的光激发敏化染料。特别是,通过由透光性的材料构成对电极,可以使光由对电极的里侧照射,或者当然也可以与工作电极和对电极平行地照射光。本发明中使用的光源只要是可以照射可光激发标记染料的波长的光即可,没有特别限定,作为优选的例子,可以使用荧光灯、黑光灯、灭菌灯、白炽电灯、低压汞灯、高压汞灯、氙灯、汞-氙灯、卤素灯、金属卤化物灯、LED(白色、蓝、绿、红)、激光(CO2激光、染料激光、半导体激光)、太阳光,更优选荧光灯、白炽电灯、氙灯、卤素灯、金属卤化物灯、LED(白色、蓝、绿、红)、太阳光等。还可根据需要使用分光器或带通滤光器,只照射特定波长区域的光。
图6是其它的测定池的一个例子的截面图,图7是该测定池的分解立体图,在基板30上设置对电极23,在该基板30上形成电解液或洗涤液的供给孔31和排出孔32,在对电极23上配置具有盛载电解液的空间24的绝缘间隔物25,在该绝缘间隔物25上设置工作电极22,在该工作电极22的面临空间24的面上,间隔地形成多个电子接受层27。
贯通上述基板30设置工作电极接点33,使其与对电极23不发生干涉。将与电子接受层27结合的探针制成电接点,该工作电极接点33可以进行电极的取出。
上述工作电极22上设置有按压部件34,在该按压部件34上、在与上述多个电子接受层27分别对应的位置上形成贯通孔35。经由该贯通孔35,来自光源28的光照射到工作电极22上。工作电极22与对电极23之间连接有电流表36,由于光照射而在体系内流动的光电流通过电流表来测定。
根据本发明的优选方案,使用可以用互相不同的光波长激发的两种或以上的敏化染料分别检测多种被检测物质时,通过波长选择装置,由光源照射特定波长的光,由此可以分别激发多种染料。波长选择装置的例子有:分光器、滤色器、干涉滤光器、带通滤光器等。还可以根据敏化染料的种类而使用可照射不同的波长的光的多个光源,此时优选的光源的例子可以使用照射特定波长光的激光或LED。为了高效地对工作电极照射光,可以使用石英、玻璃、液体光导管等进行导光。
根据本发明的优选方案,优选由光源照射的光本来基本上不含有紫外线,或者光源的光照射经由除去紫外线的装置进行。由此可以有效地抑制在照射光中含有400nm或以下波长的紫外线时可能发生的电子接受物质本身的光激发导致的本底电流,即,噪声,可以进行精度更高的测定。敏化染料通常可由可见光的吸收而激发,因此,即使除去紫外线,也可以通过可见光的照射,以高灵敏度检测光电流。
除去紫外线的装置的优选例子有光学滤光器、分光器。通过使用光学滤光器或分光器,可以控制照射光的波长,防止工作电极本身的光激发,同时可以只激发敏化染料。优选的光学滤光器的例子有:紫外线截止滤光器等滤色器。从严密的波长控制角度考虑,优选的分光器的例子是内置有衍射光栅的分光器。
释放基本上不含有紫外线的光的光源的优选例子有:激光、无机电致发光(EL)元件、有机电致发光(EL)元件、发光二极管(LED),最优选发光二极管(LED)或激光二极管。由此,可以照射控制为波长分布狭窄的光,可获得小型、轻量、低消耗功率、和长寿命的优点。
根据本发明的更优选的方案,优选除去将所使用的电子接受物质的已知带隙代入到下式中计算得到的、比表1所示的截止波长更短的波长的光。由此,根据电子接受物质的特性,可以有效地抑制本底电流的发生。
带隙(eV)=hγ=hc/λ=1239.8/λ(mm)
(h:普朗克常数、c:光速)
[表1]
表1
由于有电子接受物质中可能含有杂质能级的情况,因此,可以将截止波长设定为比表1所示的波长更偏于长波长一侧,以期万全。另外,工作电极由多个电子接受物质构成时,优选除去比构成成分中带隙最窄的成分的截止波长更短的波长。
如上所述,在工作电极22和对电极23之间连接电流表36,通过电流表测定由于光照射而在体系内流动的光电流。由此可以检测被检测物质。此时的电流值反映了被捕获在工作电极上的敏化染料的量。例如,被检测物质为核酸时,具有互补性的核酸之间形成的双链的量以电流值反映。因此,可以由所得电流值对被检测物质进行定量。因此,根据本发明的优选方案,优选电流表进一步具备由所得电流量和电量计算试样液中被检测物质浓度的装置。
根据本发明的优选方案,检测光电流的步骤可以是测定电流值,由所得电流值和电量计算试样液中的被检测物质浓度。该被检测物质浓度的计算可通过将预先制作的被检测物质浓度和电流值或电量的标准曲线、与所得到的电流值或电量进行对比进行。本发明的方法中,电流值反映了捕获在工作电极上的敏化染料的量,因此,为了获得与被检测物质浓度对应的正确的电流值,可采用定量测定。
根据本发明的另一优选方案,可以使用预先用敏化染料标记的被检测物质作为竞争物质,对未用敏化染料标记的、可与探针物质特异性结合的第二被检测物质进行定量。第二被检测物质优选具有比已标记的被检测物质更容易地与探针物质特异性结合的性质。使这两种被检测物质竞争,与探针物质特异性结合,则可得到检测出的电流值与第二被检测物质的浓度之间的相关关系。即,随着未被染料标记的第二被检测物质数量的增加,与探针物质特异性结合的竞争物质数量减少,因此可以得到随着第二被检测物质浓度的增加、检测电流值减少的标准曲线。因此,可进行未被敏化染料标记的第二被检测物质的检测和定量。
根据本发明的更优选的方案,优选被检测物质和第二被检测物质为抗原、探针物质为抗体。该方案的被检测物质和第二被检测物质与探针物质的固定步骤如图8所示。如图8所示,用敏化染料标记的抗原41和未被敏化染料标记的抗原42竞争性地与抗体43特异性结合。因此,随着未被染料标记的抗原42的增加,与抗体特异性结合的被染料标记的抗原43减少,因此,可得到随着第二被检测物质浓度的增加、检测电流值减少的标准曲线。
使用流体型测定池和形成图案的电极的测定方法和装置
作为本发明的方法和装置的优选实施方案的一个例子,对于使用流体型测定池和形成图案的电极的测定方法和装置进行说明。图9表示装置的整体结构。图9所示的装置50具备流体型测定池51、光源52、电解液罐53、洗涤液罐54、供给泵55、电流表56、排出泵57。流体型测定池51具备形成图案的工作电极58和与工作电极相对的对电极59,工作电极58和对电极59之间形成可盛载电解液或洗涤液且可流动的流路。即,通过供给泵55向测定池51内供给的电解液或洗涤液一边与工作电极58和对电极59接触一边流过流路,然后通过排出泵57排出到测定池51外。这些一连串的工作的控制和光电流值的分析可通过未图示的控制分析装置进行。
工作电极58如下构成:在电子接受层上担载探针物质、形成互相分开的多个区域的图案,一边用光源照射的光进行扫描一边以一次性操作对各区域的试样连续地进行被检测物质的检测和定量。如上所述的形成图案的工作电极的例子如图10(a)-(d)和图11(a)-(c)所示。
图10(a)和(b)所示的工作电极58是在导电性基材58a的整个面上形成的电子接受层58b,在电子接受层58b上沿纵横方向形成担载有探针物质58c的多个样点60的图案。在该工作电极58的导电性基材上实施引线61,经由该引线61,工作电极58全体与电流表56连接。根据该工作电极58,通过对各样点依次进行光照射,可以对每个样点测定在对电极59之间产生的光电流。电极的构成比较简单,因此电极制造容易,具有可利用以往的DNA芯片的制造技术的优点。另外,作为变形例,如图10(c)所示,将电子接受层58b本身形成样点状,在其上担载探针物质58c,或者如图10(d)所示,可省略导电性基材,只由电子接受层58b构成样点状的工作电极58,在其上担载探针物质58c,且对电子接受层58b实施引线61,特别是后者,在制备步骤简略化的同时还可以降低制备成本。在该工作电极中使用的光源52可以如图12所示,制成在工作电极58上沿纵横方向移动的光源,或者如图13所示,多个光源对应工作电极58的各样点排列,将各光源依次亮灯和灭灯。
图11(a)和(b)所示的工作电极58’是在绝缘基板58d’上,含有导电性基材58a’和电子接受层58b’的多个样点60’沿纵横方向形成图案,在该电子接受层58b’上担载探针物质58c’。在各样点60’的导电性基材上分别实施引线61’,经由该引线61’使各样点60’与电流表56连接。根据该工作电极58’,仅对工作电极的整个面同时照射光即可同时且分别地测定在各样点中产生的光电流。另外,还可以分别测定各样点的光电流,因此,不会作为噪声拾取其它样点产生的光电流。作为变形例,如图11(c)所示,省略导电性基材,只由电子接受层58b’上构成样点状的工作电极58’,在其上担载探针物质58c’,且在电子接受层58b’上实施引线61’,制备步骤简略,同时还可以降低制备成本。与图9的工作电极同样,在该工作电极58’上使用的光源52是在工作电极58上沿纵横方向移动的光源,或者是多个光源对应于工作电极58的各个样点排列,将各光源依次亮灯和灭灯。
以下对使用该装置的测定方法的一个例子进行说明。
首先,在敏化染料的共存下,使试样液与工作电极接触,使被检测物质直接或间接与探针物质特异性结合,通过该结合,使敏化染料固定在工作电极58上。此时,对工作电极的电子接受层实施图10所示的样点图案的掩模,得到担载有探针物质的多个样点60在纵横方向上形成图案的工作电极58。将这样得到的工作电极58安装在流体型测定池51中。
接着,使供给泵55工作,由电解液罐53将电解液送至测定池51内,将测定池内的流路用电解液充满,然后停止送液。由光源52对工作电极58照射光,通过电流表56测定在工作电极58和对电极59之间产生的光电流。在测定该光电流值时,优选采用光电流值稳定的照射开始后数十秒后的值。在未图示的控制分析装置中,通过将所得电流值与预先制备的被检测物质浓度和电流值的标准曲线进行对比,可以计算被检测物质的浓度。光电流测定结束后,使供给泵55工作,由洗涤液罐53向测定池51内送入洗涤液,同时使排出泵57工作,将测定池51内的电解液排出,用洗涤液将测定池流路内的电解液置换,然后停止送液和排液。由此,使用用洗涤液洗涤的测定池51,可按照上述同样的顺序进行后面的测定。
具备光照射结构的测定装置
根据本发明的优选方案,预先设置多个光源,且优选上述测定装置具备可以切换该多个光源进行照射的多个固定型光照射结构。
根据本发明的另一优选方案,优选具备光源移动型光照射结构,该光源移动型光照射结构通过使上述光源相对于上述测定池中的工作电极沿着XY方向移动,对工作电极上的任意区域进行光照射。该方案的装置例如有:在可在XY方向上移动的臂上安置光源,固定作为测定池的传感单元的装置。上述方案的测定装置的一个例子的整体立体图如图14(a)所示,其俯视图如图14(b)所示。如图14所示,传感单元59被固定,光源60向传感单元59的开口部移动,进行光照射。图14中,沿XY方向移动的结构可列举:通过皮带62将马达61的旋转变换成直线运动的皮带传动结构,其它的结构例如也可使用通过马达驱动齿条齿轮结构的结构。通过控制马达旋转的开始、停止以及旋转速度,可以对装在传感单元内的传感芯片上的生物体分子固定区域(样点)依次进行光照射,可以设定此时的照射速度或照射时是否有移动。此时所使用的传感单元只要具有可以将本发明的电解质介质填充在对电极和工作电极之间的结构即可。光源沿XY移动时,可以在照射工作电极的区域时停止,或者使工作电极区域连续移动,其中,所述工作电极是结合有上述敏化染料的被检测物质经由探针物质固定其上的工作电极。
根据本发明的另一优选方案,优选具备池移动型光照射结构,该池移动型光照射结构是上述光源被固定,上述测定池相对于该固定的光源沿着XY方向移动,由此对工作电极上的任意区域进行光照射的结构。该方案的装置有:在可沿XY方向移动的台座上安装作为测定池的传感单元并固定光源的装置。上述方案的测定装置的一个例子的整体立体图如图15(a)所示,其俯视图如图15(b)所示。如图15所示,光源60被固定,装有传感单元59的台座63沿XY移动,对传感单元的开口部进行照射。图15中,沿XY方向移动的结构可以列举:通过皮带65将马达64的旋转变换为直线运动的皮带传动结构,也可以使用其它结构、例如通过马达驱动齿条齿轮结构的结构。通过控制马达旋转的开始、停止和旋转速度,可以对装在传感单元59内的传感芯片上的生物体分子固定区域(样点)依次进行光照射,可以设定此时的照射速度或照射时的是否有移动。此时所使用的传感单元59只要具有可以将本发明的电解质介质填充在对电极和工作电极之间的结构即可。测定池沿XY移动时,可以在照射工作电极的区域时停止,或者使工作电极区域连续移动,其中,所述工作电极是结合有上述敏化染料的被检测物质经由探针物质固定其上的工作电极。
图14所示的装置中,作为光源移动型的光照射结构的一个例子,光源60安装在XY移动结构66上的装置构成图如图16所示。图15所示的装置中,作为池移动型光照射结构的一个例子,传感单元63安装在XY移动结构66上的装置构成图如图17所示。如图16和17所示,光源60的开闭、XY移动结构66的控制、电流表67的控制或电流信号的接收可经由接口板68、通过计算机69进行。此时,计算机69可以使用外设的PC,或者是使用内置于装置内的微型电子计算机,输入装置70、显示装置71和存储装置72也可以内置于测定装置内。也可以将输入装置70、显示装置71和存储装置(未图示)的功能适当地分配给内置装置内的微型电子计算机和外设的PC,使其发挥功能。具备上述照射光移动结构的测定装置的一个例子的外观立体图如图18所示。如图18所示,可以将输入工作条件的键盘、按纽等输入装置70,设定条件或测定结果的显示装置71,以及存储装置制成组装在一起的装置。这些功能也可以全部由外设的PC进行。
利用MEMS等制备方法的光电流检测装置
利用MEMS等制备方法的光电流检测装置的一个例子的概略立体图如图19所示,该装置的构成图如图20所示,该装置中使用的检测芯片的分解立体图如图21所示。光电流检测装置73设有光源74、电流表75、可固定检测芯片76的功能、经由检测芯片76的吸引口77吸引的泵78。光源74(多个)、工作电极79的切换(本例是使用图11所示的形成图案的电极的例子),吸引泵77、电流表75的控制或电流信号的接收经由接口板80、通过计算机81进行。此时,计算机81使用内置于装置内的微型电子计算机,输入装置82、显示装置83、存储装置84也内置于测定装置内。输入装置81中,设置用于输入工作条件、设定条件的键盘、按纽,显示装置82显示测定结果。存储装置83进行测定结果的存储。检测芯片76由下部部件85、电极基板86、PDMS芯片87、上部部件88构成,下部部件85具备用于透过光源74的光的开口部89。电极基板86设有使工作电极79、对电极90以及用于和读取装置电连接的端子91。在PDMS芯片87中设有送液用流路92、废液存储93,还设有与上部部件88的电解液注入口94、洗涤液注入口95、试样溶液注入口96连接的溶液口97、98、99。通过使用利用上述MEMS的制备方法的光电流读取装置和检测芯片,可以以微量的试样溶液,简单的操作测定核酸、外源性内分泌扰乱物质、抗原等具有特异性结合性的被检测物质。
在与工作电极的接触下使用的缓冲溶液
根据本发明的优选方案,在与工作电极的接触下使用的缓冲溶液优选使用含有缓冲剂和溶剂的缓冲溶液,所述缓冲剂不含有羧基、磷酸基和氨基。在与工作电极的接触下的使用的例子有:使探针物质固定在工作电极上的处理、使被检测物质经由探针物质固定在工作电极上的处理、对固定了被检测物质的工作电极进行洗涤的处理等。通过使用含有上述缓冲剂的缓冲溶液,无须阻碍测定对象物和工作电极的特性,可以使光电流对被检测物质的检测灵敏度飞跃性提高。该倾向在工作电极的表面含有氧化钛或钛酸锶时尤为显著。
使用上述缓冲溶液则检测灵敏度飞跃性提高,其原理尚未明确,可能认为与通常的生物化学领域中使用的磷酸缓冲液、以及以和胺或羧酸作为主要成分的缓冲溶液不同,可能是由于发生与工作电极的相互作用。即,缓冲剂含有羧基、磷酸基和氨基,则这些基团与工作电极发生某些相互作用,引起工作电极上探针物质的剥离或者阻碍染料向工作电极注入电子,结果可能导致检测电流值的降低,但本发明并不限于此。
上述缓冲剂只要是具有不含有羧基、磷酸基和氨基的化学结构,且具有缓冲作用的缓冲剂即可,没有特别限定,优选的缓冲剂有下式(I)所示的化合物:
[化1]
(式中,R1为可被羟基取代的碳原子数1-4的亚烷基,X为磺酸基或其盐,A为O或YR2-N(这里,R2与R1含义相同,Y为磺酸基或其盐或者羟基))。这些缓冲剂具有可以稳定保持具有核酸、外源性内分泌扰乱物质、抗原等特异性结合性的被检测物质,使测定精度提高的优点。
根据本发明的优选方案,优选亚烷基为亚乙基。上述缓冲剂的具体例子有:2-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸(HEPES)、哌嗪-1,4-双(2-乙磺酸)(PIPES)、哌嗪-1,4-双(2-乙磺酸)倍半钠盐(PIPES倍半钠盐)、以及2-吗啉代乙磺酸(MES)。
根据本发明的优选方案,优选亚烷基为亚丙基。上述缓冲剂的具体例子有:3-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]丙磺酸(EPPS)、2-羟基-3-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]丙磺酸(HEPPSO)、3-吗啉代丙磺酸(MOPS)、2-羟基-3-吗啉代丙磺酸(MOPSO)、以及哌嗪-1,4-双(2-羟基-3-丙磺酸)(POPSO)。
根据本发明的优选方案,优选缓冲剂的浓度为1-200mM,更优选1-100mM,进一步优选10-50mM。
在上述缓冲溶液中使用的溶剂只要不阻碍被检测物质和工作电极的特性即可,没有特别限定。
根据本发明的优选实施方案,为了使核酸、外源性内分泌扰乱物质、抗原等具有特异性结合性的被检测物质稳定保持、使测定精度提高,优选缓冲溶液的pH为5.0-9.0,更优选6.0-8.0,进一步优选6.5-7.5。
上述缓冲溶液的用途只要是在以本发明的方法中使用的、在与工作电极的接触下使用的溶液即可,没有特别限定,优选的用途如上所述,可以是含有被检测物质的试样液的溶剂、含有可与被检测物质直接或间接特异性结合的探针物质的溶液的溶剂、以及工作电极或测定池的洗涤液等。
实施例
通过以下的例子进一步详细说明本发明。但本发明并不受这些例子的限定。
例1(参考)
本例表示经由硅烷偶联剂的结合也可以进行光电转换。具体来说,将FTO玻璃和ITO玻璃的导电面用硅烷偶联剂处理,在表面导入氨基。使该氨基与具有活性酯基的染料反应,通过共价键固定染料。向其照射激发光,测定光电流。其详细内容如下。
将掺杂氟的氧化锡(F-SnO2:FTO)涂层玻璃(エイアイ特殊硝子公司(AI Tokushu Garasu Company)制造、U膜、片电阻:15Ω/□)和掺杂锡的氧化铟(Sn-InO2:ITO)涂层玻璃(东洋精密工业株式会社制造,100Ω/□)在丙酮、含有0.1vol%吐温20的超纯水、进一步用超纯水中各实施15分钟的超声波洗涤,除去污垢和残留有机物等。将其在5M的氢氧化钠水溶液中振荡15分钟。然后为了除去氢氧化钠而在超纯水中振荡5分钟,换水,进行三次。取出玻璃,吹空气,使残留水分挥散,然后浸泡在无水甲醇中脱水。
偶联处理用的溶液以95%甲醇、5%超纯水作为溶剂,加入3-氨基丙基三甲氧基硅烷(APTMS),使浓度为2vol%,在室温下搅拌5分钟制备。
将上述玻璃浸泡在该偶联处理用溶液中,缓慢振荡15分钟。从其中取出玻璃,在甲醇中振荡10次左右,除去剩余的偶联处理用溶液,换三次甲醇进行该操作。然后在110℃下保持30分钟,使偶联剂与玻璃结合。在室温下冷却后,在其上粘贴间隔物用的开孔(5mm方形)的胶带,用镊子的先端除去残留在胶带粘贴面中的空气。再在其上放置形成5mm方形大小开口部的硅片,紧密贴合。
接着,将25μl溶解于50mM HEPES pH7.0并调节为100μM的具有活性酯基的罗丹明(四甲基罗丹明蛋白标记试剂盒,Molecular Probes公司制备)、或者是具有活性酯基的Cy5(Cy5单活性染料盒,AmershamBiosciences公司制备)填充到预先准备的玻璃上的开口部,均匀铺开。然后由正上方用标本玻片盖住,防止气泡进入染料溶液中,放入用湿润的纸等调节蒸汽压的塑料容器中,在37℃下温育过夜。
温育结束后取下标本玻片,在超纯水中振荡洗涤(10分钟×3次)。然后吹空气,除去残余水分,在室温下干燥。
将这样得到的工作电极组装到流体型测定池(装置的实施例1)中。池部分的构成是使工作电极与铂对电极相对,为防止两个电极之间接触导致的短路,制作用于填充电解液的空间,插入膜厚为500μm的硅片。硅片上开有比5mm方形大很多的孔,在其中存留送入的电解液,形成使其与工作电极上的探针固定面接触的结构。工作电极经由电连接的弹簧探针(スプリングプロ一ブ),铂电极经由与端部连接的引线,与电位差计(ビ一·エ一·エス株式会社(PAS Company)ALS Model832A)连接。准备在体积比为7∶3的乙腈和碳酸亚乙酯的混合溶剂中溶解0.01M碘和0.1M四丙基碘化铵形成的混合液作为电解液。将该电解液填充到上述的组装到流体型测定池中的工作电极和铂对电极之间。接着,以固定在流体型测定池上的LED(CCS株式会社,为罗丹明时采用HLV-24GR-NR-3W,中心波长:530nm,输出:67mW;为Cy5时采用HLV-27-NR-R,中心波长:627nm,输出:67mW)作为光源,照射工作电极表面,随时间测定工作电极与铂对电极之间流动的电流。测定进行180秒,光源的照射只是在电流测定开始60秒后进行60秒钟。观测的电流值通过由120秒后的值减去180秒后的值进行补正。
结果,使用FTO电极和ITO电极时的光电流值分别如图22(a)和(b)所示。由这些图可以确认,来自染料的光电流如果经由硅烷偶联剂时比不经由硅烷偶联剂时更大。由此可知,由于硅烷偶联剂,染料的固定量增加,进行了硅烷偶联处理后仍可确保电极的导电性。以上可以显示,实施了硅烷偶联处理的FTO玻璃和ITO玻璃可用作构成染料敏化型生物传感器的工作电极的材料。
例2(参考)
本例是表示互补的DNA和非互补DNA所观测到的电流值的差。具体来说,将FTO玻璃用硅烷偶联剂处理,在表面导入氨基。将该氨基与探针DNA静电结合,进一步照射紫外光,通过共价键将探针固定在电极上。将其与用Cy5标记的靶DNA进行杂交,然后照射激发光,测定光电流。其详细内容如下所述。
掺杂氟的氧化锡(F-SnO2:FTO)涂层玻璃(エイアイ特殊硝子公司(AITokushu Garasu Company)制备,U膜,片电阻(15Ω/□)在丙酮、含有0.1vol%吐温20的超纯水、以及超纯水中各实施15分钟的超声波洗涤,除去污垢和残留有机物。将其在5M氢氧化钠水溶液中振荡15分钟。然后为除去氢氧化钠而在超纯水中振荡5分钟,换水进行三次。取出玻璃,吹空气,使残留水分挥散,然后浸泡到无水甲醇中脱水。
偶联处理用的溶液以95%甲醇、5%超纯水作为溶剂,加入3-氨基丙基三甲氧基硅烷(APTMS),使浓度为2vol%,在室温下进行5分钟的搅拌来制备。
将上述玻璃浸泡在该偶联处理用溶液中,缓慢振荡15分钟。从其中取出玻璃,在甲醇中振荡10次左右,除去剩余的偶联处理用溶液,更换三次甲醇进行上述操作。然后在110℃下保持30分钟,使偶联剂与玻璃结合。在室温下冷却,然后在其上粘贴间隔物用的开孔(5mm方形)的胶带,使用镊子的先端除去残留在胶带粘合面中的空气。再在其上放置形成5mm方形大小开口部的硅片,紧密贴合。
接着,将溶解于2×SSC中、制备为1μM的探针DNA(5’NH2-ACCTTCATCAAAAACATCATCATCC3’)在95℃下保持5分钟,然后立即转移到冰上,保持10分钟,使DNA变性,向之前准备的玻璃上的开口部填充25μl,均匀铺开。
将其在75℃下保持1小时,使溶剂蒸发,然后剥离硅片,用UV交联仪(UVP公司制造的CL-1000型)照射120mJ的紫外光,制成固定有探针的工作电极。
将该工作电极在超纯水中振荡10次左右,除去SSC成分(NaCl与柠檬酸钠),更换两次超纯水进行上述操作。然后在沸水中浸泡2分钟,取出之后吹空气,使残留水分挥散。接着在4℃的无水乙醇中浸泡1分钟进行脱水,吹空气,使残留乙醇挥散。接着,在工作电极上放置形成有5mm方形大小开口部的硅片,使其紧密贴合。
接着,将溶解于5×SSC+0.5%SDS、调节为10nM浓度的与探针互补的DNA(5’GGATGATGATGTTTTTGATGAAGGT-Cy5-3’)和非互补的DNA(5’TTGAGCAAGTTCAGCCTGGTTAAG-Cy5-3’)在95℃下保持5分钟,然后立即转移到冰上,保持10分钟,使DNA变性,向之前准备的工作电极的开口部分别填充25μl,均匀铺开。然后用标本玻片从正上方盖住,防止DNA溶液中进入气泡,装入用润湿的纸等调节蒸气压的塑料容器中,在37℃下温育过夜。
温育结束后取下标本玻片,用加温至37℃的2×SSC+0.1%SDS将工作电极洗涤2秒钟左右。将电极立在载玻片上,按照以下的顺序进行洗涤。
(1)2×SSC+0.2%SDS 室温 振荡3分钟×更换液体3次
(2)0.2×SSC+0.2%SDS 常温 振荡3分钟×更换液体2次
(3)0.2×SSC+0.2%SDS 37℃ 振荡10分钟×更换液体2次
(4)0.2×SSC+0.2%SDS 常温 振荡3分钟×1次
(5)0.2×SSC 常温 振荡10次×更换液体3次
(6)超纯水 常温 振荡10次×更换液体2次
(7)吹空气、除去残留水分。
将这样得到的工作电极组装到流体型测定池中。池部分的构成是使工作电极与铂对电极相对,为了防止两个电极间接触导致的短路、制作用于填充电解液的空间,插入膜厚为500μm的硅片。在硅片上开比5mm方形更大的孔,其中存留有送入的电解液,形成使其与工作电极上的探针固定面接触的结构。工作电极经由电连接的弹簧探针、铂电极经由与端部连接的引线与电位差计(ビ一·エ一·エス株式会社(PAS Company)ALS Model 832A)连接。准备在体积比为7∶3的乙腈和碳酸亚乙酯的混合溶剂中溶解10mM碘和100mM四丙基碘化铵形成的混合液作为电解液。将该电解液填充到上述的组装到流体型测定池中的工作电极和铂对电极之间。接着,以固定在流体型测定池上的LED(CCS株式会社,HLV-27-NR-R,中心波长:627nm)作为光源,照射工作电极表面,随时间测定工作电极与铂对电极之间流动的电流。测定进行180秒,光源的照射只是在电流测定开始60秒后进行60秒钟。观测的电流值通过由120秒后的值减去180秒后的值进行补正。
结果如图23所示,使探针与互补的DNA反应时,可观测到来自标记染料(Cy5)的电流。而与非互补的DNA反应时则未观测到来自Cy5的电流。由此可显示,通过上述的探针固定法制备的DNA传感器高灵敏度且具有特异性。
例3
本例是表示含有金属碘的电解液与不含有金属碘的电解液的电流值的差异,单核苷酸多态(SNPs)的检测中显示不含有金属碘的更为优异。具体来说,将FTO玻璃用硅烷偶联剂处理,在表面导入氨基。将该氨基与探针DNA静电结合,再照射紫外光,通过共价键在电极上固定探针。将其与用罗丹明标记的靶DNA进行杂交,然后照射激发光,测定光电流,检测靶的单核苷酸突变。其具体内容如下。
掺杂氟的氧化锡(F-SnO2:FTO)涂层玻璃(エイアイ特殊硝子公司(AITokushu Garasu Company)制备,U膜,片电阻(15Ω/□)在丙酮、含有0.1vol%吐温20的超纯水、以及超纯水中各实施15分钟的超声波洗涤,除去污垢和残留有机物。将其在5M氢氧化钠水溶液中振荡15分钟。然后为除去氢氧化钠而在超纯水中振荡5分钟,换水进行三次。取出玻璃,吹空气,使残留水分挥散,然后浸泡到无水甲醇中脱水。
偶联处理用的溶液以95%甲醇、5%超纯水作为溶剂,加入3-氨基丙基三甲氧基硅烷(APTMS),使浓度为2vol%,在室温下进行5分钟的搅拌来制备。
将上述玻璃浸泡在该偶联处理用溶液中,缓慢振荡15分钟。从其中取出玻璃,在甲醇中振荡10次左右,除去剩余的偶联处理用溶液,更换三次甲醇进行上述操作。然后在110℃下保持30分钟,使偶联剂与玻璃结合。在室温下冷却,然后在其上粘贴间隔物用的开孔(5mm方形)的胶带,使用镊子的先端除去残留在胶带粘合面中的空气。再在其上放置形成5mm方形大小开口部的硅片,紧密贴合。
接着,将溶解于2×SSC中、制备为1μM的探针DNA(具有与靶完全互补的碱基序列5’-NH2-AGGATGGGCCTCAGGTTCATGCCGC-3’或具有与靶互补但只有一个核苷酸不同的序列:5’-NH2-AGGATGGGCCTCGGGTTCATGCCGC-3’)在95℃下保持5分钟,然后立即转移到冰上,保持10分钟,使DNA变性,向之前准备的玻璃上的开口部填充25μl,均匀铺开。
将其在75℃下保持1小时,使溶剂蒸发,然后剥离硅片,用UV交联仪(UVP公司制造的CL-1000型)照射120mJ的紫外光,制成固定有探针的工作电极。
将该工作电极在超纯水中振荡10次左右,除去SSC成分(NaCl与柠檬酸钠),更换2次超纯水进行上述操作。然后在沸水中浸泡2分钟,取出之后吹空气,使残留水分挥散。接着在4℃的无水乙醇中浸泡1分钟进行脱水,吹空气,使残留乙醇挥散。
接着,将溶解于5×SSC+0.5%SDS、调节为10nM浓度的靶DNA(Rho-DP53-t:5’-Rho-GCGGCATGAACCTGAGGCCCATCCT-3’)在95℃下保持5分钟,然后立即转移到冰上,保持10分钟,使DNA变性,向之前准备的工作电极的开口部填充10μl,均匀铺开。然后用标本玻片从正上方盖住,防止DNA溶液中进入气泡,装入用润湿的纸等调节蒸气压的塑料容器中,在37℃下温育过夜。
温育结束后取下标本玻片,用超纯水将工作电极洗涤2秒钟左右。将电极立在载玻片上,按照以下的顺序进行洗涤。
(1)0.2×SSC+0.2%SDS 63℃浸泡3分钟(使用5L的水槽)
(2)在超纯水中振荡10次×更换液体2次
(3)吹空气、除去残留水分。
将这样得到的工作电极组装到流体型测定池中。池部分的构成是使工作电极与铂对电极相对,为了防止两个电极间接触导致的短路、制作用于填充电解液的空间,插入膜厚为500μm的硅片。在硅片上开比5mm方形更大的孔,其中存留有送入的电解液,形成使其与工作电极上的探针固定面接触的结构。工作电极经由电连接的弹簧探针、铂电极经由与端部连接的引线与电位差计(ビ一·エ一·エス株式会社(PAS Company)ALS Model 832A)连接。电解液准备以下两种。
(1)电解液A
以乙腈作为溶剂,溶解100mM四丙基碘化铵。
(2)电解液B
以乙腈作为溶剂,溶解10mM碘和100mM四丙基碘化铵。
将上述电解液分别填充到之前所述的组装到流体型测定池中的工作电极和铂对电极之间。接着,以固定在流体型测定池上的LED(CCS株式会社,HLV-24GR-NR-3W,中心波长:530nm,输出:67mW)作为光源,照射工作电极表面,随时间测定工作电极与铂对电极之间流动的电流。测定进行180秒,光源的照射只是在电流测定开始60秒后进行60秒钟。观测的电流值通过由120秒后的值减去180秒后的值进行补正。
结果,不含有碘的电解液A和含有碘的电解液B的测定电流值分别如图24(a)和(b)所示。如图24所示,将固定有完全互补链的电极(图中PM)与固定有只有单核苷酸不同的互补链的电极(图中SNP)进行比较,用电解液A测定时平均电流值统计学上显示显著差异(N数:5,误差率:1%)。由此证明,利用染料敏化现象的电流检测型芯片可以检测出核酸序列中的单核苷酸突变。
通过电解液B测定时,与电解液A相比电流值低,平均电流值未见显著差异(N数:5,误差率:1%)。由此可以确认:在检测微弱电流时更优选通过不含有碘的电解液进行测定。
例4
本例是使用多个样点检测单核苷酸多态性(SNPs)的例子。具体来说,是将FTO玻璃用硅烷偶联剂处理,在表面导入氨基。将探针DNA担载于在工作电极中形成的样点上,使特定位置的、单核苷酸不同的两个5’末端的Cy5标记的靶DNA分别与该电极杂交,在特定条件下进行洗涤。工作电极的同一平面上形成Pt,组装到作为对电极的池中,对工作电极照射激发光,测定光电流,对每个探针DNA进行光电流的比较。其详细内容如下。
探针在电极上的担载
掺杂氟的氧化锡(F-SnO2:FTO)涂层玻璃(エイアイ特殊硝子公司(AITokushu Garasu Company)制备,U膜,片电阻:15Ω/□)在丙酮、含有0.1vol%吐温20的超纯水、以及超纯水中各实施15分钟的超声波洗涤,除去污垢和残留有机物。将其在5M氢氧化钠水溶液中振荡15分钟。然后为除去氢氧化钠而在超纯水中振荡5分钟,换水进行三次。取出玻璃,吹空气,使残留水分挥散,然后浸泡到无水甲醇中脱水。
偶联处理用的溶液以95%甲醇、5%超纯水作为溶剂,加入3-氨基丙基三甲氧基硅烷(APTMS),使浓度为2vol%,在室温下进行5分钟的搅拌来制备。
将上述玻璃浸泡在该偶联处理用溶液中,缓慢振荡15分钟。从其中取出玻璃,在甲醇中振荡10次左右,除去剩余的偶联处理用溶液,更换三次甲醇进行上述操作。然后在110℃下保持30分钟,使偶联剂与玻璃结合。在室温下冷却,然后在其上粘贴间隔物用的开孔的胶带(孔:φ=3mm×6个样点,厚度:50μm)。在该胶带上放置按照样点数形成了φ=3mm大小的开口部的硅片(厚度:1mm),使其紧密贴合。
接着,将溶解于2×SSC中、制备为1μM的探针DNA(プロリゴ公司(Proligo LLC)制备,5’-NH2-AGGATGGGCCTCAGGTTCATGCCGC-3’)在95℃下保持5分钟,然后立即转移到冰上,保持10分钟,使DNA变性,向各样点的开口部各填充7μl。
将其在75℃下保持1小时,使溶剂蒸发,然后剥离硅片,用UV交联仪(UVP公司制造的CL-1000型)照射120mJ的紫外光,制成固定有探针DNA的工作电极。
将该工作电极在超纯水中振荡10次左右,除去SSC成分(NaCl与柠檬酸钠),更换2次超纯水进行上述操作。然后在沸水中浸泡2分钟,取出之后吹空气,使残留水分挥散。接着在4℃的无水乙醇中浸泡1分钟进行脱水,吹空气,使残留乙醇挥散。
杂交和洗涤
接着,将在5’末端标记Cy5的两种靶DNA、即,与探针完全互补的靶DNA-1)(プロリゴ公司(Proligo LLC)制备,5’-Cy5-GCGGCATGAACCTGAGGCCCATCCT-3’)和自该5’末端第13号T变换为G的靶DNA-2)(プロリゴ公司(Proligo LLC)制备5’-Cy5-GCGGCATGAACCGGAGGCCCATCCT-3’)分别溶解于5×SSC+0.5%SDS中,调节为1μM的浓度。将其在95℃下保持5分钟,然后分别向3个样点的开口部各填充5μl。然后由正上方用标本玻片盖住,防止气泡进入DNA溶液中,放入用湿润的纸等调节蒸汽压的塑料容器中,在37℃下温育过夜。
温育结束后取下标本玻片,将电极立在载玻片上,在加温至63℃的2×SSC+0.1%SDS中振荡3分钟,然后在常温的超纯水中轻轻震荡,吹空气,除去残余水分。
测定
将上述所得的工作电极组装在流体型测定池(装置的实施例2)中,在流体型测定池上安装光源移动用燕尾形台座(骏河精机(株)制造B05-41M)。池部分的构成是将工作电极和铂对电极配置在同一平面上,为防止两电极之间接触短路、制作用于填充电解液的空间,插入膜厚为500μm的硅片。硅片上开有全部样点均可放入的足够大的开孔,其中存留送入的电解液,形成使电解液与固定在工作电极上的DNA接触的结构。工作电极、对电极一起经由电连接的弹簧探针,与电位差计(ビ一·エ一·エス株式会社(PAS Company)ALS Modl 832A)连接。
准备在乙腈中溶解了100mM四丙基碘化铵的溶液作为电解液。将该电解液填充到之前所述的流体型测定池中。
接着,以固定在光源移动用燕尾形台座上的红色LED(CCS株式会社,HLV-27-NR-R,中心波长为627nm)作为光源,照射工作电极表面,随时间测定工作电极与铂对电极之间流过的电流。光源是使燕尾形台座移动,对各样点照射光。测定是对各样点进行180秒,光的照射只是在电流测定开始60秒后进行60秒钟。所观测的光电流通过120秒后的光电流值减去180秒后的光电流值的差进行补正。
结果,每个靶DNA的光电流值、其平均值、标准偏差(N数为3)如表2所示。进行这些平均值差异的检验,判定为显著差异(误差率5%)。即,可以检测出靶DNA的单核苷酸的不同。
[表2]
例5
本例是制备固定有染料标记的单链DNA的工作电极的例子。
掺杂氟的氧化锡(F-SnO2:FTO)涂层玻璃(エイアイ特殊硝子公司(AITokushu Garasu Company)制备,U膜,片电阻:12Ω/□,形状:50mm×26mm)在丙酮、含有0.1vol%吐温20的超纯水、以及超纯水中各实施15分钟的超声波洗涤,除去污垢和残留有机物。将其在5M氢氧化钠水溶液中振荡15分钟。然后为除去氢氧化钠而在超纯水中振荡5分钟,换水进行三次。取出玻璃,吹空气,使残留水分挥散,然后浸泡到无水甲醇中脱水。
偶联处理用的溶液以95%甲醇、5%超纯水作为溶剂,加入3-氨基丙基三甲氧基硅烷(APTMS),使浓度为2vol%,在室温下进行5分钟的搅拌来制备。
将上述玻璃浸泡在该偶联处理用溶液中,缓慢振荡15分钟。从其中取出玻璃,在甲醇中振荡10次左右,除去剩余的偶联处理用溶液,更换三次甲醇进行上述操作。然后在110℃下保持30分钟,使偶联剂与玻璃结合。在室温下冷却后,放置PDMS片(厚度:1.5mm),使其紧密贴合。该PDMS片上,φ=1mm大小的开口部以1mm的间隔形成49个样点。
接着,将溶解于2×SSC、调节为1μM的罗丹明标记ssDNA(30mer)在95℃下保持5分钟,然后立即转移到冰上,保持10分钟,使DNA变性,向之前准备的玻璃上的PDMS片的49个开口部各添充2μl。将其在75℃下保持1小时,使溶剂蒸发,然后剥离PDMS片,通过UV交联仪(UVP公司制造,CL-1000型)照射120mJ的紫外光,制成固定由罗丹明标记ssDNA的工作电极。
将该工作电极在0.2%SDS溶液中浸泡15分钟×3次,然后在超纯水中振荡,除去SSC成分(NaCl和柠檬酸钠)。然后在沸水中浸泡2分钟,取出后吹空气,使残留水分挥散。接着在4℃的无水乙醇中浸泡1分钟,脱水,吹空气,使残留的乙醇挥散。上述得到的49处固定有DNA的工作电极的概略图如图25所示。
例6
本例是使用光源沿XY移动的结构、使光源在工作电极上的各样点区域停止、进行光电流检测的一个例子。
具有图14所示的光照射结构的装置中安装有例5的方法中制备的工作电极,使光源在固定有罗丹明标记ssDNA的区域停止,进行光电流测定。此时,光源使用光束直径约1mm、波长530nm、输出50mW的绿色激光二极管。光照射时,在对电极和工作电极之间填充溶解于乙腈的0.1M四丙基碘化铵。
其结果如图26所示。这里,只给出了例5中制备的49个样点的固定DNA的区域的一列的结果。由图26可知,来自固定DNA区域的光电流值以分别分离的波形被检测。光电流值的读取可以以光照射期间的任意一点为代表值,还可以以任意多点的平均值为代表值。在任何情况下都优选使光照射期间的获取数据的时期固定地获取数据的方法。
例7
本例是使用光源沿XY移动的结构、使光源在工作电极上的各样点的区域连续移动、同时进行光电流检测的一个例子。
具有图14所示的光照射结构的装置中安装有例5的方法中制备的工作电极,使光源在固定有罗丹明标记ssDNA的区域连续移动,进行光电流测定。此时,光源使用光束直径约1mm、波长530nm、输出50mW的绿色激光二极管。光照射时,在对电极和工作电极之间填充溶解于乙腈的0.1M四丙基碘化铵。
其结果如图27所示。这里,只给出了例5中制备的49个样点的固定DNA的区域的一列的结果。由图27可知,来自固定DNA的区域的光电流值以分别分离的波形被检测。光电流值的读取采用以光照射期间的最高值为代表值的方法较为简便。
例8
本例是使用池台座沿XY移动的结构、使光源在工作电极上的各样点区域停止、进行电流检测的一个例子。
具有图15所示的光照射结构的装置中安装有例5的方法中制备的工作电极,使光源在固定有罗丹明标记ssDNA的区域停止,进行光电流测定。此时,光源使用光束直径约1mm、波长530nm、输出50mW的绿色激光二极管。光照射时,在对电极和工作电极之间填充溶解于乙腈的0.1M四丙基碘化铵。
其结果如图28所示。这里,只给出了例5中制备的49个样点的固定DNA的区域的一列的结果。由图28可知,来自固定DNA的区域的光电流值以分别分离的波形被检测。光电流值的读取可以以光照射期间的任意一点为代表值,还可以以任意多点的平均值为代表值。在任何情况下都优选使光照射期间的获取数据的时期固定地获取数据的方法。
例9
本例是使用池台座沿XY移动的结构、使光源在工作电极上的各样点的区域连续移动、同时进行光电流检测的一个例子。
具有图15所示的光照射结构的装置中安装有例5的方法中制备的工作电极,使光源在固定有罗丹明标记ssDNA的区域连续移动,进行光电流测定。此时,光源使用光束直径约1mm、波长530nm、输出50mW的绿色激光二极管。光照射时,在对电极和工作电极之间填充溶解于乙腈的0.1M四丙基碘化铵。
其结果如图29所示。这里,只给出了例5中制备的49个样点的固定DNA的区域的一列的结果。由图29可知,来自固定DNA的区域的光电流值以分别分离的波形被检测。光电流值的读取采用以光照射期间的最高值为代表值得方法较为简便。
例10
本例是通过使用各种电解质物质和非质子性溶剂的电解液检测单核苷酸多态性(SNPs)的例子。
本例中,p53基因的单核苷酸多态性的检测是使用含有作为电解质物质的NPr4I(四丙基碘化铵),硫代硫酸钠、亚硫酸钠其中之一,与乙腈的混合液作为电解液。电解质物质的浓度制备成0.2M。在工作电极一侧固定有完全一致的探针、单核苷酸突变链探针和完全不一致的探针。各碱基序列如下。
完全一致(PM)探针:5’-NH2-AGGATGGGCCTCAGGTTCATGCCGC-3’单核苷酸突变链(SNP)探针:5’-NH2-AGGATGGGCCTCCGGTTCATGCCGC-3’
完全不一致(MM)探针:5’-NH2-GCGGCATGAACCGGAGGCCCATCCT-3’
与这些探针杂交的靶DNA的碱基序列如下。
靶DNA:5’-罗丹明-GCGGCATGAACCTGAGGCCCATCCT-3’
掺杂氟的氧化锡(F-SnO2:FTO)涂层玻璃(エイアイ特殊硝子公司(AITokushu Garasu Company)制备,U膜,片电阻:12Ω/□,形状:50mm×26mm)在丙酮、超纯水中各实施15分钟的超声波洗涤,除去污垢和残留有机物。将其在5M氢氧化钠水溶液中振荡15分钟。然后为除去氢氧化钠而在超纯水中振荡5分钟,换水进行三次。取出玻璃,吹空气,使残留水分挥散。
偶联处理用的溶液以95%甲醇、5%超纯水作为溶剂,加入3-氨基丙基三甲氧基硅烷(APTMS),使浓度为2vol%,在室温下进行5分钟的搅拌来制备。
将上述玻璃浸泡在该偶联处理用溶液中,缓慢振荡15分钟。从其中取出玻璃,在甲醇中振荡10次左右,除去剩余的偶联处理用溶液,更换三次甲醇进行上述操作。然后在110℃下保持30分钟,使偶联剂与玻璃结合。在室温下冷却后,放置粘合性密封片(厚度:0.5mm),使其紧密贴合。该粘合性密封片上,φ=3mm大小开口部形成9个样点。接着,将制备为1μM的完全一致链、单核苷酸突变链、完全不一致链的探针DNA(25mer)在95℃下保持10分钟,然后立即转移到冰上,保持10分钟,使DNA变性,在之前准备的玻璃上的密封片的9个开口部中各填充5μl,在95℃下保持10分钟,使溶剂蒸发,用UV交联仪(UVP公司制造,CL-1000型)照射120mJ的紫外光,将探针DNA固定(各探针各固定3个样点)。
然后剥离密封片,在0.2%SDS溶液中振荡15分钟×3次,更换三次超纯水进行洗涤,然后在沸水中浸泡2分钟,取出,吹空气,使残留水分挥散。接着在4℃的无水乙醇中浸泡1分钟进行脱水,吹空气,使残留乙醇挥散。
然后,将含有制备为100nM的靶DNA的5×SSC、0.5%SDS溶液放在固定有探针的电极上,用盖玻片形成密闭状态,在37℃下保温10小时。然后在室温的2×SSC中除去盖玻片,将电极立在支架上,在40℃的2×SSC、0.2%SDS溶液中振荡30分钟,然后用水漂洗2次,使电极干燥。
将上述所得的工作电极组装到测定池中,在测定池上安装光源自动移动的XY台座。池部分的构成是使工作电极与铂对电极相对,为防止两个电极之间接触导致的短路、制作用于填充电解液的空间,插入膜厚为500μm的硅片。硅片上开有全部样点均可装入的足够大的开孔,在其中存留送入的电解液,形成使其与固定在工作电极上的DNA接触的结构。工作电极与对电极一起,经由电连接的弹簧探针与高灵敏度电流表连接。
接着,通过固定在自动移动用XY台座上的光源,由工作电极里面上方照射光,随时间测定工作电极与铂对电极之间流动的电流。在工作电极的上方设置与FTO基板上的样点相同形状的遮光部件,在防止对相邻的样点光照射的同时,还设置了未照射光的样点。测定是依次对样点进行扫描,同时经由与计算机连接的高灵敏度电流表,将各样点的电流输出存储在计算机中。
其结果如图30所示。由图30的结果可知,即使使用非质子系的电解液,也可以以光电流值差的形式检测出单核苷酸多态性(SNPs)。
例11
本例是使用含有各种浓度乙腈的电解液、检测单核苷酸多态性(SNPs)的例子。
本例中,p53基因的单核苷酸多态性的检测如下混合液作为电解液使用,除此之外与例10同样进行测定。所述混合液含有作为电解质物质的0.2M NPr4I(四丙基碘化铵)和各浓度的乙腈和水。
其结果如图31所示。由图31的结果表明,即使使用乙腈浓度为10-100%的电解液,也可以以光电流值的差的形式检测出单核苷酸多态性(SNPs)。
例12
本例是制备固定有染料标记单链DNA的工作电极的例子。
掺杂氟的氧化锡(F-SnO2:FTO)涂层玻璃(エイアイ特殊硝子公司(AITokushu Garasu Company)制备,U膜,片电阻:12Ω/□,形状:50mm×26mm)在丙酮、超纯水中各实施15分钟的超声波洗涤,除去污垢和残留有机物。将其在5M氢氧化钠水溶液中振荡15分钟。然后为除去氢氧化钠而在超纯水中振荡5分钟,换水进行三次。取出玻璃,吹空气,使残留水分挥散,然后浸泡在无水乙醇中脱水。
偶联处理用的溶液以95%甲醇、5%超纯水作为溶剂,加入3-氨基丙基三甲氧基硅烷(APTMS),使浓度为2vol%,在室温下进行5分钟的搅拌来制备。
将上述玻璃浸泡在该偶联处理用溶液中,缓慢振荡15分钟。从其中取出玻璃,在甲醇中振荡10次左右,除去剩余的偶联处理用溶液,更换三次甲醇进行上述操作。然后在110℃下保持30分钟,使偶联剂与玻璃结合。在室温下冷却后,放置粘合性密封片(厚度:0.5mm),使其紧密贴合。该粘合性密封片上,φ=3mm大小开口部形成9个样点。接着,将调节了浓度的(100nM、10nM、0nM)罗丹明标记ssDNA(25mer)在95℃下保持10分钟,然后立即转移到冰上,保持10分钟,使DNA变性,在之前准备的玻璃上的片的9个开口部中各填充5μl,在95℃下保持10分钟,使溶剂蒸发,用UV交联仪(UVP公司制造,CL-1000型)照射120mJ的紫外光,将标记ssDNA固定。
然后剥离片,在0.2%SDS溶液中振荡15分钟×3次,更换三次超纯水进行漂洗,然后在沸水中浸泡2分钟,取出,吹空气,使残留水分挥散。接着在4℃的无水乙醇中浸泡1分钟进行脱水,吹空气,使残留乙醇挥散。
例13
本例是通过使用水和各电解质物质的电解液检测染料标记的单链DNA的例子。
本例中,罗丹明标记ssDNA(30mer)的检测是使用含有作为电解质物质的NaI、KI、CaI2、LiI、NH4I、NPr4I(四丙基碘化铵)、硫代硫酸钠、亚硫酸钠其中任意之一与水的混合液作为电解液。电解质浓度为0.2M。检测顺序是:在图2所示的具有光照射结构的装置中安装由例12的方法制备的工作电极,使光源在固定有罗丹明标记ssDNA的区域停止,测定光电流。此时,固定的ssDNA的浓度为0nM、10nM和100nM三种。
其结果如图32所示。由图32的结果可知,使用所研究的任何一种电解质,都可见光电流与ssDNA固定量相关性地增加,表明可以应用。
例14
本例是使用含有NPr4I(四丙基碘化铵)和水的混合液作为电解液,检测单核苷酸多态性(SNPs)的例子。
本例中,p53基因的单核苷酸多态性检测是使用作为电解质物质的0.2M NPr4I(四丙基碘化铵)与水的混合液作为电解液,除此之外与例10同样进行测定。
其结果如图33所示。由图33的结果可知,即使使用水溶液系的电解液,也可以以光电流值差的形式检测出单核苷酸多态性(SNPs)。
例15
本例是通过染料敏化型生物传感技术检测染料标记蛋白质的例子。
FTO玻璃的硅烷偶联处理
掺杂氟的氧化锡(F-SnO2:FTO)涂层玻璃(エイアイ特殊硝子公司(AITokushu Garasu Company)制备,U膜,片电阻:15Ω/□)在丙酮、含有0.1vol%吐温20的超纯水、以及超纯水中各实施15分钟的超声波洗涤,除去污垢和残留有机物。将其在5M氢氧化钠水溶液中振荡15分钟,然后为除去氢氧化钠而在超纯水中振荡5分钟,换水进行三次。从超纯水中取出FTO玻璃,吹空气,使残留水分挥散,然后浸泡在无水甲醇中脱水。甲醇也通过吹空气使其挥散,使FTO玻璃干燥。
偶联处理用的溶液是向95vol%甲醇-5vol%超纯水的混合溶液中加入3-氨基丙基三甲氧基硅烷(APTMS:AVOCADO公司制备),使浓度为2vol%,在室温下进行5分钟的搅拌来制备。
将上述FTO玻璃浸泡在该偶联处理用溶液中,缓慢振荡15分钟。取出FTO玻璃,在无水甲醇中振荡10次左右,除去剩余的偶联处理用溶液,更换无水甲醇进行三次上述操作。然后在110℃下保持30分钟,使偶联剂与玻璃结合。在室温下缓慢冷却后,在其上粘贴间隔物用的开孔胶带(孔:φ=3mm×6个样点,片厚度:50μm)。
低聚DNA的固定
将在5’末端标记生物素的低聚DNA或未标记的低聚DNA(プロリゴ公司(Proligo LLC)制备:序列为5’-TggCTCCTgACCTggAgTCTTCCAgTgTgA-3’)溶解于超纯水中,制成1μM,在95℃下保持5分钟,使DNA变性,分别向胶带的开口部(样点电极)滴落7μl。将其在95℃下保持10分钟,使其干燥,然后用UV交联仪(UVP公司制造,CL-1000型)照射120mJ的紫外光,制成固定有低聚DNA的工作电极。
将该工作电极在0.2%SDS水溶液中振荡15分钟,将洗涤液更换3次进行洗涤,接着,在超纯水中振荡10次左右,将超纯水更换3次进行洗涤,由此除去SDS。然后在沸水中浸泡2分钟,取出之后吹空气,使残余水分挥散。再在4℃的无水乙醇中浸泡1分钟进行脱水,吹空气,使残留乙醇挥散。
罗丹明标记蛋白质的温育和洗涤
使用由Molecular Probes公司销售的试剂盒,用缓冲液(10mMHEPES pH7.4+150mM NaCl+0.05%吐温20)对进行了罗丹明标记的抗生蛋白链菌素(标记比:3.1)进行稀释,使其浓度为10μg/ml。
将7μl该蛋白质溶液滴加到样点电极上,然后盖上标本玻片,在37度下温育1小时。
温育结束后取下标本玻片,将工作电极立在支架上,沉入装满上述缓冲液的染池中,振荡10次左右,更换三次缓冲液进行洗涤。工作电极在测定之前一直浸泡在上述缓冲液中。
测定
将上述得到的工作电极在即将测定之前在超纯水中轻轻振荡,接着吹空气,使残留水分挥散,然后组装到流体型测定池中。池是将工作电极与铂对电极相对配置,在其间插入膜厚500μm的硅片。硅片上开有可以装入全部样点电极进入的足够大的孔,在该部分填充送入的电解液,由此形成样点电极与电解液接触的结构。电解液使用1M硫代硫酸钠与0.1M食盐水的混合溶液。工作电极与铂对电极分别经由电学连接的弹簧探针与电流表(ADVANTEST公司制造:R8240)连接。
在各流体型测定池上覆盖具有与各样点对应的开口部的遮光部件,填充下述电解液,然后通过设置于其上的可移动式激光光源(中心波长:532nm)依次照射各样点,随时间测定工作电极与铂对电极之间流过的光电流。对各样点照射5秒,第5秒的光电流值减去基础电流值进行补正。
其结果如图34所示。由图34的结果可知,使用染料敏化型生物传感器技术可以进行蛋白质的检测。
例17
本例是通过使用水和各种电解质物质的电解液检测染料标记的单链DNA的例子。
本例中,罗丹明标记ssDNA(30mer)的检测是使用含有作为电解质物质的氢醌、三乙醇铵、铁氰化钾、NPr4I(四丙基碘化铵)的任意一种与水的混合液作为电解液。电解质浓度为0.2M。检测顺序是:在图14所示的具有光照射结构的装置中安装由例12的方法制备的工作电极,使光源在固定有罗丹明标记ssDNA的区域停止,测定光电流。
使用含有氢醌、三乙醇胺、NPr4I其中任意之一和水的混合液作为电解液时,得到的光电流波形如图35所示。将图35所得的光电流进行数据处理,结果如图36所示,使用含有铁氰化钾与水的混合液作为电解液时,得到的光电流波形如图37所示。由图35和图36的结果可知,使用氢醌、NPr4I时,可见光电流与ssDNA固定量相关性地增加,但使用三乙醇胺时,只能检测出微弱的光电流。由图35可知,使用氢醌时电流不稳定,并且噪声电流也高,因此氢醌并不适合高精度的检测。如图37所示,使用铁氰化钾时,电流不稳定,几乎未检测出光电流。由该结果可表明,测定中使用的氢醌、三乙醇胺、铁氰化钾、NPr4I(四丙基碘化铵)的各种电解质中,只有NPr4I(四丙基碘化铵)适合于高精度的检测。
Claims (74)
1.被检测物质的特异性检测方法,该方法包含:结合有敏化染料的被检测物质经由探针物质固定在工作电极上,将该工作电极与对电极一起与电解质介质接触,对上述工作电极照射光,使上述敏化染料光激发,由光激发的敏化染料向工作电极进行电子转移,由此,在工作电极和对电极之间形成流动的光电流,检测该光电流,
上述工作电极具有电子接受层,该电子接受层的表面担载有上述探针物质,其中所述电子接受层含有可接受上述敏化染料响应光激发而释放的电子的电子接受物质,
上述电子接受物质是具有比上述敏化染料的最低未占分子轨道(LUMO)的能级更低的能级的氧化物半导体,
上述电解质介质含有电解质和溶剂,所述电解质含有可向氧化状态的敏化染料供给电子的盐,溶剂选自非质子性溶剂和质子性溶剂的至少一种。
2.权利要求1的方法,其中,上述电解质介质的还原电位比上述敏化染料的最高占有分子轨道(HOMO)的能级高,比上述电子接受物质的导带的能级低。
3.权利要求1或2的方法,其中,上述电解质为选自不含有I2的碘化物、不含有Br2的溴化物、硫代硫酸盐、以及亚硫酸盐的至少一种。
4.权利要求3的方法,其中,上述电解质为不含有I2的碘化物。
5.权利要求4的方法,其中,上述碘化物是四烷基碘化铵。
6.权利要求3的方法,其中,上述电解质为选自硫代硫酸盐和亚硫酸盐的至少一种。
7.权利要求6的方法,其中,上述电解质是硫代硫酸盐,该硫代硫酸盐是硫代硫酸钠。
8.权利要求6的方法,其中,上述电解质是亚硫酸盐,该亚硫酸盐是亚硫酸钠。
9.权利要求1-8中任一项的方法,其中,上述溶剂是非质子性溶剂。
10.权利要求1-8中任一项的方法,其中,上述溶剂是质子性溶剂。
11.权利要求1-8中任一项的方法,其中,上述溶剂是非质子性溶剂和质子性溶剂的混合物。
12.权利要求1-9和11中任一项的方法,其中,上述非质子性溶剂是乙腈(CH3CN)。
13.权利要求1-8和10-12中任一项的方法,其中,上述质子性溶剂是水。
14.权利要求1-13中任一项的方法,其中,上述电子接受层的表面经阳离子化处理。
15.权利要求1-14中任一项的方法,其中,为了在电子接受层上担载上述探针物质,使含有探针物质的溶液与上述工作电极接触。
16.权利要求1-15中任一项的方法,该方法还包含在使上述工作电极和对电极与电解质介质接触之前、将上述工作电极用洗涤液洗涤的步骤。
17.权利要求1-16中任一项的方法,其中,上述被检测物质预先用上述敏化染料标记。
18.权利要求1-17中任一项的方法,其中,上述被检测物质是单链核酸,上述探针物质为与上述核酸具有互补性的单链核酸。
19.权利要求18的方法,其中,上述具有互补性的核酸与上述核酸具有15bp或以上的互补性部分。
20.权利要求18或19的方法,其中,上述被检测物质是预先用上述敏化染料标记的核酸,1个分子上述被检测物质被一个或以上上述敏化染料标记。
21.权利要求1-16中任一项的方法,其中,使上述被检测物质与上述探针物质结合的方法是:在敏化染料的共存下,使含有被检测物质的试样液与工作电极接触,还含有介质物质,该介质物质是上述试样液预先用上述敏化染料标记而成的、可与上述被检测物质特异性结合的物质,该介质物质与上述被检测物质的结合物与上述探针物质特异性结合。
22.权利要求21的方法,其中,上述被检测物质是配体,上述介质物质是受体蛋白分子,上述探针物质是双链核酸。
23.权利要求21和22的方法,其中,上述被检测物质是外源性内分泌扰乱物质。
24.权利要求1-23中任一项的方法,其中,上述检测光电流的步骤是测定电流值或电量,由所得电流值或电量计算上述试样液中的被检测物质浓度。
25.权利要求24的方法,其中,由所得电流值或电量计算上述试样液中的被检测物质浓度的步骤是通过将预先制备的被检测物质浓度和电流值或电量的标准曲线与所得电流值或电量进行对比进行的。
26.权利要求24的方法,其中,使上述被检测物质与上述探针物质结合的方法是:在敏化染料的共存下,使含有被检测物质的试样液与工作电极接触,并且上述试样液还含有未被上述敏化染料标记的、可与上述探针物质特异性结合的第二被检测物质,由此,使上述被检测物质和第二被检测物质与上述探针物质竞争性地特异性结合,上述检测光电流的步骤还包含:测定电流值或电量,由所得电流值或电量计算上述试样液中第二被检测物质的浓度。
27.权利要求26的方法,其中,由所得电流值或电量计算上述试样液中第二被检测物质浓度的步骤是通过将预先制作的第二被检测物质浓度和电流值或电量的标准曲线与所得电流值或电量的进行对比进行的。
28.权利要求26或27的方法,其中,上述被检测物质和上述第二被检测物质是抗原,上述探针物质是抗体。
29.权利要求26-28中任一项的方法,其中,上述第二被检测物质具有比上述被检测物质更容易地与上述探针物质特异性结合的性质。
30.权利要求1-29中任一项的方法,其中,上述电子接受物质含有选自氧化钛、氧化锌、氧化锡、氧化铌、氧化铟、氧化钨、氧化钽和钛酸锶的至少一种。
31.权利要求30的方法,其中,上述电子接受物质是氧化钛或钛酸锶。
32.权利要求30的方法,其中,上述电子接受物质是铟-锡复合氧化物(ITO)或掺杂氟的氧化锡(FTO)。
33.权利要求1-32中任一项的方法,其中,上述工作电极还含有导电性基材,上述电子接受层在该导电性基材上形成。
34.权利要求1-33中任意一项的方法,其中,上述敏化染料是金属络合物染料或有机染料。
35.权利要求34的方法,其中,上述敏化染料选自金属酞菁;叶绿素或其衍生物;氯高铁血红素、钌、锇、铁和锌的络合物;无金属酞菁、9-苯基呫吨系染料、花青系染料、金属花青系染料、呫吨系系染料、三苯基甲烷系染料、吖啶系染料、噁嗪系染料、香豆素系染料、部花青系染料、若丹菁系染料、聚甲炔系染料、和靛蓝系染料的至少一种。
36.权利要求34的方法,其中,上述敏化染料为选自Cy3、Cy5、Cy5.5、Cy7、Cy7.5、Cy9、FAM、FITC、HEX、罗丹明、罗丹明绿、ROX、TET、德克萨斯红、贝克曼染料2、贝克曼染料3、贝克曼染料4、荧光素、以及Alexa Fluor染料的至少一种。
37.权利要求1-36中任一项的方法,其中,上述被检测物质存在两种或以上,上述各被检测物质被可以由波长互不相同的光激发的不同的敏化染料标记,对各敏化染料照射不同波长的光,由此分别检测上述各被检测物质。
38.权利要求1-37中任一项的方法,其中,上述工作电极上以互相分开的多个区域区分担载上述探针物质,上述光照射对各区域分别进行。
39.权利要求38的方法,其中,上述电子接受层在上述导电性基材的整个面上形成,检测流过上述导电性基材整体的光电流。
40.权利要求1-36中任一项的方法,其中,上述工作电极还具备绝缘基板,该绝缘基板上,含有上述导电性基材和上述电子接受层的样点以分别互相分开的多个区域区分形成,分别检测在该各区域的导电性基材上流过的光电流。
41.权利要求1-36中任一项的方法,其中,上述工作电极还具备绝缘基板,该绝缘基板上,含有上述电子接受层的样点以分别互相分开的多个区域区分形成,分别检测在各区域的电子接受层流过的光电流。
42.权利要求38-41中任一项的方法,其中,通过在上述工作电极上的互相分开的多个区域的各区域内担载多种探针物质,同时进行多种试样液的测定。
43.权利要求38-41中任一项的方法,其中,通过在上述工作电极上的互相分开的多个区域的各区域内担载不同的探针物质,同时进行多种被检测物质的测定。
44.权利要求1-43中任一项的方法,其中,上述光基本上不含有紫外线。
45.权利要求1-43中任一项的方法,其中,上述光的照射经由除去紫外线的装置进行。
46.权利要求45的方法,其中,上述除去紫外线的装置是光学滤光器或分光器。
47.权利要求44-46中任一项的方法,其中,上述光是由选自激光、无机电致发光(EL)元件和有机电致发光(EL)元件、发光二极管(LED)的至少一个光源发射的光。
48.电极,该电极在权利要求1-47中任一项的方法中用作工作电极,
该电极具备:
导电性基材;和
在该导电性基材上形成的电子接受层,该电子接受层含有可接受上述敏化染料响应光激发而释放的电子的电子接受物质。
49.权利要求48的电极,其中,该电极还具备担载于上述电子接受层上的、可以与上述被检测物质直接或间接特异性结合的探针物质。
50.权利要求48或49的电极,其中,上述电子接受物质是具有比上述敏化染料的最低未占分子轨道(LUMO)的能级低的能级的物质。
51.权利要求48-50中任一项的电极,其中,上述电子接受物质含有选自氧化钛、氧化锌、氧化锡、氧化铌、氧化铟、氧化钨、氧化钽和钛酸锶的至少一种。
52.权利要求48-50中任一项的电极,其中,上述电子接受物质是氧化钛或钛酸锶。
53.权利要求48-50中任一项的电极,其中,上述电子接受物质是铟-锡复合氧化物(ITO)或掺杂氟的氧化锡(FTO)。
54.权利要求48-50中任一项的电极,其中,上述电子接受层为多孔性或者表面具有凹凸结构。
55.权利要求48-54中任一项的电极,其中,上述导电性基材是透明的。
56.权利要求48-55中任一项的电极,其中,上述探针物质在上述电子接受层上的互相分开的多个区域内区分担载。
57.权利要求56的电极,其中,上述电子接受层在上述导电性基材的整个面上形成,并且引线与上述导电性基材连接。
58.权利要求57的电极,该电极还具备绝缘基板,在该绝缘基板上,含有上述导电性基材和上述电子接受层的样点在互相分开的多个区域内区分形成,该各区域的导电性基材分别与引线连接。
59.测定池,该测定池是在权利要求1-47中任一项的被检测物质特异性检测方法中使用的测定池,其具备权利要求48-58中任一项的工作电极和对电极。
60.权利要求59的测定池,该测定池还具备在上述工作电极和上述对电极之间插入的间隔物。
61.测定装置,该测定装置是在权利要求1-47中任一项的被检测物质的特异性检测方法中使用的测定装置,其具备:
权利要求59或60的测定池、
对上述工作电极的表面照射光的光源、测定在上述工作电极和上述对电极之间流动的电流的电流表。
62.权利要求61的装置,其中,上述光源具备根据敏化染料的种类而可照射不同波长的光的多个光源。
63.权利要求61的装置,其中,上述光源还具备波长选择装置,根据敏化染料的种类照射不同波长的光。
64.权利要求61-63中任一项的装置,其中,上述光源是发出基本上不含有紫外线的光的光源。
65.权利要求61-63中任一项的装置,该装置还具备在上述光源和上述工作电极之间除去紫外线的装置。
66.权利要求65的装置,其中,上述除去紫外线的装置是光学滤色器或分光器。
67.权利要求61-63中任一项的装置,其中,上述光源选自激光、无机电致发光(EL)元件、和有机电致发光(EL)元件、发光二极管(LED)的至少一种。
68.权利要求61-67中任一项的装置,其中,上述光源预先设有多个,且上述测定装置还具备将上述多个光源进行切换照射的光照射结构。
69.权利要求61-67中任一项的装置,该装置还具备下述光照射结构:通过使上述光源相对于上述测定池中的工作电极沿XY方向移动,对工作电极上的任意区域进行光照射。
70.权利要求69的装置,其中,XY移动时,光源在照射工作电极的区域时停止,其中,结合有上述敏化染料的被检测物质经由探针物质被固定在所述工作电极上。
71.权利要求69的装置,其中,XY移动时,光源在工作电极区域连续移动,其中,结合有上述敏化染料的被检测物质经由探针物质被固定在所述工作电极上。
72.权利要求61-67中任一项的装置,该装置具备还下述光照射结构:上述光源被固定,通过使上述测定池相对于该固定的光源沿XY方向移动,对工作电极上的任意区域进行光照射。
73.权利要求72的装置,其中,XY移动时,测定池在照射工作电极区域时停止,其中,结合有上述敏化染料的被检测物质经由探针物质被固定在所述工作电极上。
74.权利要求72的装置,其中,XY移动时,测定池在工作电极区域连续移动,其中,结合有上述敏化染料的被检测物质经由探针物质被固定在所述工作电极上。
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