CN103959052A - 被检物质的特异性检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种在利用染料敏化的光电流检测来检测包括生物分子的被检物质时，使用有机溶剂非必需的电解质溶液进行光电流检测的检测方法。通过使电解质介质为不含有机溶剂的水相体系，不仅可以使其可用性提高，而且还可以获得离差较小的测定值。因此，根据本发明利用染料敏化的光电流检测对生物分子等被检物质进行检测的特征是，从被检物质反应到光电流检测的全部步骤都在单一的装置中进行，而且使用非质子溶剂非必需的电解质溶液来施行光电流检测步骤。

Description

被检物质的特异性检测方法
技术领域
本发明涉及一种利用光电流特异性地检测诸如核酸、外源性内分泌干扰物和抗原等具有特异结合性的被检物质的方法，采用该方法可以很容易的发现其测定条件是否合适；本发明还涉及用于该方法的传感器单元和测定装置。
背景技术
基因诊断法作为一种对各种疾病的新型保护方法和新型诊断方法来检测和分析生物样品中的DNA被认为是可行的。为了方便、正确地检测这样的DNA，以下技术已经被提出。
已知有一种DNA的分析方法，其中待检的DNA与具有与其互补的碱基序列的且已被荧光物质标记的DNA探针杂交，检测由此产生的荧光信号(参见例如专利文献1和专利文献2)。在该方法中，通过染料的荧光对杂交产生的双链DNA的形成进行检测。在此荧光检测中，由于用探针DNA固定的多个检测点可以在同一个基板上形成，所以具有可以通过单一检测来分析多个探针DNA的特异性的优点。然而，该检测装置包括检测荧光所必需的光受体单元，其具有较大的尺寸并且昂贵，此外，双链DNA连并成单链、杂交、洗涤和荧光检测的必须用各自不同的仪器进行；因此，不能方便地进行DNA的检测。
同时，通过利用增感染料产生电能的太阳能电池已被公知(参见例如专利文献3)。该太阳能电池具有多晶金属氧化物半导体，并在其表面区域上形成广泛的增感染料层。
随着对利用太阳能电池的这一特性进行生物分析的尝试，已经提出将光激发染料所产生的光电流用于检测被检物质(生物分子，比如DNA和蛋白质)(例如，Nakamura等人,“ANew Method for Detection of DNA Double Chain by Photoelectric Conversion”,Proceeding ofthe Japan Chemical Society,Vol.81ST,No.2(2002),p.947(非专利文献1))。
另外，在过去，本发明的部分发明人提出了一种方法，例如，在专利文献4中提出的利用光电流来特异性地检测诸如核酸、外源性内分泌干扰物和抗原等具有特异结合性的被检物质的方法。
在过去，使用了采用乙腈溶剂的电解质溶液来检测包括太阳能电池的染料敏化的光电流。在也利用染料敏化的光电流检测来检测生物分子等被检物质时，在从被检物质的反应直到光电流的检测的全部过程都在一个单一的设备中进行的情况下，即使在被检物质的反应过程中使用了水性溶剂和盐等，在光电流的检测中也要使用含有常规的非质子极性溶剂如乙腈的电解质溶液。
专利文献1:JP H07-107999A，
专利文献2:JP H11-315095A，
专利文献3:JP H01-220380A，
专利文献4:WO2007/037341A。
非专利文献1:Surface Science,Vol.24,No.11,Pp.671-676,2003。
发明内容
本发明的发明人这次发现，通过使用基于染料敏化的光电流检测来检测像生物分子这样的被检物质时，当从被检物质的反应到对光电流的检测的过程都在单一的装置中进行的情况下，以及在光电流检测中，通过使用不含非质子溶剂、即有机溶剂的电解质水溶液可以对被检物质进行令人满意的检测，所述电解质水溶液包含能够向质子溶剂和增感染料给出电子的电解质。还发现，通过使用电解质水溶液作为电解质溶液，其检测可以更加平稳地进行。本发明基于这些发现。
因此，本发明的目的是，在通过使用基于染料敏化的光电流检测来检测像生物分子这样的被检物质时提供一种检测方法，在该方法中，不但从被检物质反应到光电流检测的过程在一个单一的装置中进行，而且在光电流检测过程中使用了无需含有非质子溶剂的电解质溶液。
因此，根据本发明的用于特异性地检测被检物质的方法，其包括以下步骤：使工作电极和对电极一起与电解质介质接触，其中所述工作电极具有经探针物质固定的增感染料标记的被检物质；然后用光照射所述工作电极以引起增感染料的光激发，由此检测在工作电极和对电极之间流动的由从光激发的增感染料到工作电极之间的电子转移所产生的光电流，
其中，
所述工作电极具有通过包含电子受体物质而形成的电子受体层，所述电子受体物质能够接受响应所述增感染料的光激发而释放的电子，并且探针物质附在该电子受体层的表面上；
在单一的传感器单元中进行以下步骤：
结合反应步骤，使工作电极在反应溶液的存在下与被检物质接触，以获得具有增感染料标记的被检物质的工作电极，所述具有增感染料标记的被检物质通过探针物质固定在工作电极上，在结合反应步骤之后的洗涤步骤，用于使用洗涤液洗掉未结合的物质，和
测定步骤，其中充入电解质介质，然后用光照射，由此测量这样形成的光电流，该步骤在一个单一的传感器单元中进行；并且
所述电解质介质包含水和电解质，而实质上不包含非质子溶剂，所述电解质能够在氧化状态下向增感染料提供电子。
附图说明
图1显示了用于实施本发明的检测方法的装置的例子。
图2显示了用于实施本发明的检测方法的传感器单元构造。
图3显示了传感器单元的电极单元的构造。
图4显示了在含有乙腈和不含乙腈作为电解质介质的情况下的每行的光电流值的散点图。
图5通过柱状图显示了在本发明的检测方法中分别使用完全匹配探针(PM)、单核苷酸多态性(SNP)探针以及失配探针(MM)的光电流值的平均值。
图6显示了在本发明的检测方法中，从荧光值计算得到的增感染料量相对于相应样点中的光电流值的图表。
具体实施方案
使用光电流对被检物质的特异性检测：
在本发明的方法中，首先制备工作电极、对电极和包含被检物质的样品溶液。本发明所使用的工作电极在其表面具有能够直接或间接与被检物质形成特异性结合的探针物质。即，所述探针物质不仅可以是与被检物质形成直接的、特异性的结合的物质，还可以是能够与复合物形成特异性结合的物质，所述复合物通过使被检物质与诸如受体蛋白质分子的介导物质的特异性结合来获得。然后，在增感染料的共存下，使所述样品溶液与工作电极接触，以使所述被检物质与探针物质直接或间接地特异性结合，借以通过该结合将增感染料固定至所述工作电极。所述增感染料是能够在响应光激发时向工作电极释放电子的物质；并且所述增感染料可以预先被标记到被检物质或介导物质上，或者当所使用探针物质能够将所用的增感染料插入到被检物质的复合物中时，所述增感染料可以被简单地添加到所述样品溶液中。
然后，在工作电极和对电极与电解质介质接触后，当光照射到工作电极上引起增感染料的光致激发时，电子从光激的增感染料转移至工作电极表面上的电子受体物质。通过检测工作电极和对电极之间的由这种电子转移所造成的光电流的流动，可以高灵敏度地检测被检物质。也就是说，人们认为光电流值与由于光照射而存在于工作电极上的增感染料的量之间有关系。此外，由于可以假定该被检测的光电流值也与样品溶液中结合一定比例的增感染料的被检样品的量之间有密切关系，所以该被检样品可以基于测定的电流的量或电量进行定量测定。
基于上述基本原理的根据本发明的装置和检测方法在公开的范围内；此外，还存在由包括本发明部分发明人的发明人提出专利申请的装置和方法。上述装置和检测方法可以应用于包括下述文献的文献中所描述的方法和装置：WO2007/037341、JP2006-119111A、JP2006-119128A、JP2007-085941A、JP2008-020205A、JP2008-157915A、JP2008-157916A、JP2008-192770A、JP2008-202995A、JP2009-186453A、JP2009-186454A、JP2009-186462A、JP2010-038813A和JP2011-504882A。
根据本发明的基于上述基本原理的装置和检测方法的基本特征将通过附图来解释。图1所示的测定装置10利用由染料的光致激发所产生的光电流来特异性地检测被检物质，其基本组成包括传感器单元1、向传感器单元1供应流体的流体供给器件2、布置在二者之间的交换集线器3、将光照向附有探针物质的样点的光源激光头4、XY自动平台5以及设置在传感器单元上以在反应和检测期间控制温度调节功能的温度控制单元6，所述样点被布置在安装于传感器单元1内部的工作电极的电子受体层上；并且测定装置10被连接到个人计算机7，以处理从测定装置1发送的信号。
图2显示传感器单元1的结构。在传感器单元1中，以下步骤可以协调地进行：结合反应步骤，其中至少使工作电极与被检物质在反应溶液存在下接触，从而获得具有增感染料-标记的被检物质的工作电极，所述被检物质通过探针物质固定在工作电极上；洗涤步骤，其中在结合反应步骤之后未结合的物质通过洗涤液被洗出；和测定步骤，其中充入电解质介质，然后用光照射，由此测定所形成的光电流；并且该传感器单元具有由包括工作电极在内的构成组件所形成的封闭的空间结构。具体而言，传感器单元1具有工作电极11、对电极12和工作电极导电部分13以及对电极导电部分14(这些能够在电极之间导电)，其中对电极12具有入口15和出口16，通过它们反应溶液、洗涤液和电解质介质分别地被充入和取出。工作电极11和对电极12连同对电极加热器18一起被冲压件17固定。在图2中，光从A方向照射对电极11，且通过多个开口19照向工作电极11，所述多个开口19处于与工作电极11和冲压件20上的各自的多个样点相应的位置，所述冲压件20具有工作电极加热器23。当增感染料被光激发时，发生从被光激发的增感染料至电子受体物质的电子转移(图中未示)。通过检测工作电极与对电极之间的由上述电子转移引起的光电流流动，可以高灵敏度地检测被检物质。
图3进一步解释了工作电极11和对电极12的结构。在工作电极11和对电极12之间，放上当置于对电极的凹陷部分22时以规定距离分开两个电极的O型环21。入口15和出口16布置在所述O型环内的两个边缘，以便可以容易地用传感器内部的溶液取代空气。
在光电流测定步骤中的电解质介质：
在根据本发明的方法中，在单元中进行以下步骤，即，结合反应步骤，其中，至少使工作电极与被检物质在反应溶液存在下接触，从而获得具有增感染料-标记的被检物质的工作电极，所述被检物质通过探针物质固定在工作电极上；洗涤步骤，其中，在结合反应步骤后未结合的物质通过洗涤液被洗出；和测定步骤，其中充入所述电解质介质，然后用光照射，由此测定所形成的光电流。本发明的特征是在此测定步骤中供应的电解质介质包含水和能够向处于氧化状态的增感染料给出电子的电解质，而实质上不含非质子溶剂。由于不含非质子溶剂，也就是实质上不含有机溶剂，所以所述电解质介质可以方便地使用；此外，这变成了归因于其废弃物而对环境负担较小的水溶剂体系。水介质可以提高其在将实际应用本发明的方法的医学环境中的可用性。除了提高其可用性以外，已经发现可以通过将电解质介质更换为不含非质子溶剂的水相体系来获得稳定的测定值，即变差较小的测定值。这是使用水溶剂的一个优点。还不清楚为何离差较小的测定能成为可能；但是据推测，通过使用水溶剂作为电解质介质，从前面的步骤中所引入的水和盐的作用可以变得相当小。
根据本发明的优选实施方案，当后面将提到的杂交反应溶液中的盐浓度由A表示，而后面将提到的洗涤液的盐浓度由B表示时，摩尔比值A/B满足以下关系：优选0.1≤A/B≤10，更优选0.1≤A/B≤7.0，或进一步更优选为0.1≤A/B<7.0。此外，杂交反应溶液的盐浓度(A)优选0.05至1.2mol/L，或更优选0.08至0.6mol/L。洗涤液的盐浓度(B)优选0.05至1.2mol/L或更优选0.08至0.6mol/L。同时，各自的盐浓度分别是包含在反应溶液和洗涤液中的总的盐摩尔浓度。根据该具体实施方案，发现可以获得较稳定的测定值，即离差较小的测定值。根据本发明的发明人获得的信息，观察到的是，虽然通过将电解质介质改变为水介质可以稳定地获得离差较小的测定值，但是通过改变为水介质，探针偶尔从工作电极中释放出来。探针的释放可引起在每个样点都产生离差的风险。然而，假设通过将杂交反应溶液的盐浓度和洗涤液的盐浓度安排在满足上述关系的范围内，该探针的释放可被抑制，并且由此可以获得离差较小的测定值。然而，该解释只是一种假设，因此本发明并不受限于该解释。
在本发明中使用的电解质介质中包含的电解质没有限制，只要其能够在介质中自由移动，从而能够在增感染料、工作电极以及对电极之间给予和接受电子；但是，所述电解质优选可充当还原剂(电子供给剂)的物质，以向通过光照射而被激发的染料给出电子。这样的物质的说明性的实例包括碘化钠(NaI)、碘化钾(KI)、碘化钙(CaI2)、碘化锂(LiI)、碘化铵(NH4I)、四丙基碘化铵(Pr4NI)、硫代硫酸钠(Na2S2O3)、亚硫酸钠(Na2SO3)、氢醌、诸如铁氰化钾和铁氰化铵的铁氰化物盐、亚铁氰化钾、K4[Fe(CN)6]·3H2O(三水合亚铁氰化钾)、亚铁氰化铵、三水合亚铁氰化铵、二茂铁-1,1'-二羧酸、二茂铁甲酸、硼氢化钠(NaBH4)、三乙胺、硫氰酸铵、肼(N2H4)、乙醛(CH3CHO)、N,N,N',N'-四甲基对苯二胺二盐酸盐(TMPD)、L-抗坏血酸、亚碲酸钠(Na2TeO3)、四水合氯化亚铁(II)(FeCl2·4H2O)、EDTA、半胱氨酸、三乙醇胺、三丙基胺、含碘的碘化锂(I/LiI)、三(2-氯乙基)磷酸盐(TCEP)、二硫苏糖醇(DTT)、2-巯基乙醇、2-巯基乙醇胺、二氧化硫脲、草酸、甲醛以及它们的混合物；更优选亚铁氰化钾、K4[Fe(CN)6]·3H2O(三水合亚铁氰化钾)、亚铁氰化铵、三水合亚铁氰化铵、氢醌、L-抗坏血酸、KI和它们的混合物；并且更优选亚铁氰化钾。
此外，所述电解质介质可以包含可作为辅助电解质的物质以降低溶液电阻。示例性的该物质包括氯化物盐，如氯化钠(NaCl)、氯化钾(KCl)、氯化锂(LiCl)、氯化铷(RbCl)、氯化铯(CsCl)、氯化钙(CaCl2)、氯化镁(MgCl2)以及氯化铵(NH4Cl)；硫酸盐，如硫酸钠(Na2SO4)、硫酸钾(K2SO4)、硫酸锂(Li2SO4)、硫酸铷(Rb2SO4)、硫酸铯(Cs2SO4)、硫酸钙(CaSO4)、硫酸镁(MgSO4)和硫酸铵((NH4)2SO4)；硝酸盐，如硝酸钠(NaNO3)、硝酸钾(KNO3)、硝酸锂(LiNO3)、硝酸铷(RbNO3)、硝酸铯(CsNO3)、硝酸钙(Ca(NO3)2)、硝酸镁(Mg(NO3)2)和硝酸铵(NH4NO3)；溴化物盐，如溴化钠(NaBr)、溴化钾(KBr)、溴化锂(LiBr)、溴化铷(RbBr)、溴化铯(CsBr)、溴化钙(CaBr2)、溴化镁(MgBr2)和溴化铵(NH4Br)；柠檬酸盐，如柠檬酸单钠(NaH2(C6H5O7))、柠檬酸二钠(Na2H(C6H5O7))、柠檬酸三钠(Na3(C6H5O7))、柠檬酸单钾(KH2(C6H5O7))、柠檬酸二钾(K2H(C6H5O7))和柠檬酸三钾(K3(C6H5O7))；酸和碱，如硫酸(H2SO4)、盐酸(HCl)、氢氧化钠(NaOH)和氢氧化钾(KOH)；生化缓冲液，如Tris缓冲液、磷酸盐缓冲液、Good’s缓冲液(ADA、PIPES、POPSO、ACES、MOPSO、BES、MOPS、TES、HEPES、DIPSO、TAPSO、POPSO、HEPPSO、EPPS、N-三(羟甲基)甲基甘氨酸(Tricine)、N,N-二羟乙基甘氨酸(Bicine)和TAPS)和它们的组合；更优选氯化钠(NaCl)、氯化钾(KCl)、氯化镁(MgCl2)、硫酸钠(Na2SO4)、硫酸钾(K2SO4)、硫酸镁(MgSO4)、硝酸钠(NaNO3)、硝酸钾(KNO3)、硝酸镁(Mg(NO3)2)、溴化钠(NaBr)、溴化钾(KBr)、溴化镁(MgBr2)以及它们的混合物；进一步更优选氯化钠(NaCl)。
根据本发明的优选实施方案，当洗涤液的盐浓度由B表示，电解质介质的盐浓度由C表示时，摩尔比值B/C满足的关系：优选0.01≤B/C≤200，更优选0.5≤B/C≤100，或进一步优选0.5≤B/C≤58。此外，电解质介质的盐浓度(C)优选0.01至1.5mol/L，或者更优选0.01至0.9mol/L。同时，各自的盐浓度分别是包含在洗涤液和电解质介质中的总的盐的摩尔浓度。根据该具体实施方案，发现可以获得更稳定的测定值，即离差较小的测定值。根据本发明的发明人获得的信息，观察到的是，虽然通过将电解质介质改变为水介质可以稳定地获得离差较小的测定值，但是通过改变为水介质，探针偶尔从工作电极中释放出来。探针的释放可引起在每个样点都产生离差的风险。然而，假设通过将洗涤液的盐浓度和电解质介质的盐浓度安排在满足上述关系的范围内，该探针的释放可被抑制，并且由此可以获得离差较小的测定值。还假设特异性结合的靶标DNA的释放可以被抑制，从而产生如上所述的良好效果。然而，该解释只是假设，因此本发明并不受限于该解释。
被检物质的特异性检测方法：
如上所述，在根据本发明的被检物质的特异性检测方法中，所述结合反应步骤、洗涤步骤和测定步骤在单一的单元中进行，此外，在测定步骤所用的电解质介质包含电解质和水，但是基本上不含非质子溶剂；另一方面，至于不同于上述的条件，在被检物质的特异性检测方法中通常已知或公知的那些条件可以同样使用。
为了说明其通用方法，例如，将杂交反应溶液充入传感器单元1。然后，用于杂交反应的被检物质从设置在传感器单元1上的入口15被引入其中；之后，与探针物质的杂交反应在传感器单元1中被执行，所述探针物质被安排在工作电极上且能够直接或间接地特异性结合被检物质，，所述传感器单元1的温度被调至规定的温度。此后，将洗涤液充入里面以洗出未结合的物质。
在该洗涤过程中，只需要除去未结合的物质，而使与探针物质结合的被检物质尽可能多地保持结合。因此，优选地，所述洗涤液与表面活性剂混合。然而，如果由洗涤液的充入和排出所产生的气泡残留在设置在工作电极上以在传感器单元中在工作电极上反应和检测的探针上,那么可能会引起工作电极表面上的反应的不均匀性；因此，注意气泡的产生和残留是很有必要的。
洗涤后，将洗涤液通过出口16从传感器单元中取出，然后，将电解质介质充入其中；之后，使光从光源照射到传感器单元1以测定光致激发产生的电流值。电解质介质的组分如上所述。测定以后，传感器单元1中的电解质介质被释放到所述传感器单元的外面。
根据本发明的优选实施方案，工作电极与对电极之间的距离优选为0.1至3mm。至于传感器单元的体积，优选使用少量的被检物质来完成杂交反应。根据该构造，在相同的传感器单元中，杂交反应可以在短时间内完成，并且光电流可被明显检测到。
杂交反应：反应溶液
在本发明的检测方法中，对杂交反应的反应溶液并没有特别限制，只要被检物质与探针物质的结合反应可以在其中发生，或者在那里不被干扰。根据本发明优选的实施方案，此反应溶液包含盐；此外，优选地，其中的盐浓度满足上述与洗涤液中的盐浓度的关系。反应溶液中包含的盐的说明性的例子包括氯化物盐，如氯化钠(NaCl)、氯化钾(KCl)、氯化锂(LiCl)、氯化铷(RbCl)、氯化铯(CsCl)、氯化钙(CaCl2)、氯化镁(MgCl2)和氯化铵(NH4Cl)；硫酸盐，如硫酸钠(Na2SO4)、硫酸钾(K2SO4)、硫酸锂(Li2SO4)、硫酸铷(Rb2SO4)、硫酸铯(Cs2SO4)、硫酸钙(CaSO4)、硫酸镁(MgSO4)和硫酸铵((NH4)2SO4)；硝酸盐，如硝酸钠(NaNO3)、硝酸钾(KNO3)、硝酸锂(LiNO3)、硝酸铷(RbNO3)、硝酸铯(CsNO3)、硝酸钙(Ca(NO3)2)、硝酸镁(Mg(NO3)2)和硝酸铵(NH4NO3)；溴化物盐，如溴化钠(NaBr)、溴化钾(KBr)、溴化锂(LiBr)、溴化铷(RbBr)、溴化铯(CsBr)、溴化钙(CaBr2)、溴化镁(MgBr2)和溴化铵(NH4Br)；柠檬酸盐，如柠檬酸单钠(NaH2(C6H5O7))、柠檬酸二钠(Na2H(C6H5O7))、柠檬酸三钠(Na3(C6H5O7))、柠檬酸单钾(KH2(C6H5O7))、柠檬酸二钾(K2H(C6H5O7))和柠檬酸三钾(K3(C6H5O7))；酸和碱，如硫酸(H2SO4)、盐酸(HCl)、氢氧化钠(NaOH)和氢氧化钾(KOH)；生化缓冲溶液，如Tris缓冲液、磷酸盐缓冲液、Good’s缓冲液(ADA、PIPES、POPSO、ACES,MOPSO、BES、MOPS、TES、HEPES、DIPSO、TAPSO、POPSO、HEPPSO、EPPS、N-三(羟甲基)甲基甘氨酸、N,N-二羟乙基甘氨酸和TAPS)以及它们的混合物；更优选氯化钠(NaCl)、氯化钾(KCl)、氯化镁(MgCl2)、硫酸钠(Na2SO4)、硫酸钾(K2SO4)、硫酸镁(MgSO4)、硝酸钠(NaNO3)、硝酸钾(KNO3)、硝酸镁(Mg(NO3)2)、溴化钠(NaBr)、溴化钾(KBr)、溴化镁(MgBr2)、柠檬酸三钠(Na3(C6H5O7))以及它们的混合物；进一步更优选氯化钠(NaCl)和柠檬酸三钠(Na3(C6H5O7))。
洗涤液：
根据本发明的优选实施方案，优选地，在杂交步骤之后，洗涤液被多次充入以洗掉未结合的物质，从而洗涤样点。通过这样做，未结合的物质可以被除去，以便只有与样点上的探针物质结合的被检物质可以保留。
根据本发明优选的实施方案，该洗涤液包含盐；此外，优选其中盐浓度满足上述与在洗涤液中的盐浓度的关系。反应溶液中包含的盐的说明性的例子包括氯化物盐，如氯化钠(NaCl)、氯化钾(KCl)、氯化锂(LiCl)、氯化铷(RbCl)、氯化铯(CsCl)、氯化钙(CaCl2)、氯化镁(MgCl2)和氯化铵(NH4Cl)；硫酸盐，如硫酸钠(Na2SO4)、硫酸钾(K2SO4)、硫酸锂(Li2SO4)、硫酸铷(Rb2SO4)、硫酸铯(Cs2SO4)、硫酸钙(CaSO4)、硫酸镁(MgSO4)和硫酸铵((NH4)2SO4)；硝酸盐，如硝酸钠(NaNO3)、硝酸钾(KNO3)、硝酸锂(LiNO3)、硝酸铷(RbNO3)、硝酸铯(CsNO3)、硝酸钙(Ca(NO3)2)、硝酸镁(Mg(NO3)2)和硝酸铵(NH4NO3)；溴化物盐，如溴化钠(NaBr)、溴化钾(KBr)、溴化锂(LiBr)、溴化铷(RbBr)、溴化铯(CsBr)、溴化钙(CaBr2)、溴化镁(MgBr2)和溴化铵(NH4Br)；柠檬酸盐，如柠檬酸单钠(NaH2(C6H5O7))、柠檬酸二钠(Na2H(C6H5O7))、柠檬酸三钠(Na3(C6H5O7))、柠檬酸单钾(KH2(C6H5O7))、柠檬酸二钾(K2H(C6H5O7))和柠檬酸三钾(K3(C6H5O7))；酸和碱，如硫酸(H2SO4)、盐酸(HCl)、氢氧化钠(NaOH)和氢氧化钾(KOH)；生化缓冲溶液，如Tris缓冲液、磷酸盐缓冲液、Good’s缓冲液(ADA、PIPES、POPSO、ACES、MOPSO、BES、MOPS、TES、HEPES、DIPSO、TAPSO、POPSO、HEPPSO、EPPS、N-三(羟甲基)甲基甘氨酸、N,N-二羟乙基甘氨酸和TAPS)以及它们的混合物；更优选氯化钠(NaCl)、氯化钾(KCl)、氯化镁(MgCl2)、硫酸钠(Na2SO4)、硫酸钾(K2SO4)、硫酸镁(MgSO4)、硝酸钠(NaNO3)、硝酸钾(KNO3)、硝酸镁(Mg(NO3)2)、溴化钠(NaBr)、溴化钾(KBr)、溴化镁(MgBr2)、柠檬酸三钠(Na3(C6H5O7))以及它们的混合物；进一步更优选氯化钠(NaCl)和柠檬酸三钠(Na3(C6H5O7))。
根据本发明的优选实施方案，优选地，该洗涤液包含表面活性剂；并且其中包含的该表面活性剂更优选为0.001％至10％(包括两个端点)。通过在其中混合0.001％或更多的量的表面活性剂，洗涤效率可得到提高。通过在其中使用10％或更少的量的表面活性剂，可能能够抑制由洗涤液的充入和排出所产生的气泡在探针上的残留，以便抑制在工作电极表面上的反应的不均匀性，所述探针布置在工作电极上以在传感器单元中在工作电极上进行反应和检测。
根据本发明的优选实施方案，优选地，在光电流检测步骤之后，多次充入洗涤液以洗涤包括对电极的传感器单元内部。由于传感器单元内部可在测定完成后洗涤，所以可以通过只交换工作电极而不改变对电极，而使下一个反应和检测被连续地执行。
光源：
在本发明中，对使用的光源没有限制，只要其可以照射的光的波长可以使试验燃料(pilot dye)被光激发即可；其示例性的例子包括荧光灯、黑光、卫生灯(sanitary lamp)、白炽灯、低压汞灯、高压汞灯、氙灯、水银氙灯、卤灯、金属卤化物灯、LED(白、蓝、绿和红)、激光束(CO2激光、染料激光和半导体激光)和太阳光。其更优选的示例性的例子包括荧光灯、白炽灯、白炽灯、氙灯、卤灯、金属卤化物灯、LED(白、蓝、绿和红)、太阳光。此外，还可以根据需要使用单色器或带通滤光器来照射特定波长范围的光。
根据本发明的优选实施方案，通过使用两种或更多的能够被互不相同的波长激发的增感染料来分别检测多种被检物质时，通过波长选择器件，由光源照射具有特定波长的光来选择各自特异波长，可分别激发多种染料。波长选择器件的说明性的例子包括单色器、彩色玻璃滤光器、干涉滤光器和带通滤光器。此外，还可以根据增感染料的种类而使用可照射不同波长的光的多个光源；在这种情况下，优选的光源包括可照射特定波长的光的激光束和LED。此外，为了有效地对工作电极照射光，可以使用石英、玻璃或液体光导管进行导光。
被检物质和探针物质：
对本发明的被检物质没有特别限制，只要该物质具有特异结合性即可；因此，许多种类的物质都可以使用。如果使用的是上述被检物质，则通过在工作电极的表面担载能够直接或间接地与被检物质形成特异性结合的探针物质，所述被检物质通过直接或间接地与探针物质形成特异性结合而可以被检测。
即，在本发明中，可以选择彼此之间可形成特异性结合的被检物质和探针物质。换句话说，根据本发明的优选实施方案，优选地，使用具有特异结合性的物质作为被检物质，将与被检物质形成特异性结合的物质担载在工作电极上作为探针物质。由此，可以通过使被检物质直接地在工作电极上形成特异性结合来进行检测。在该实施方案中，可提及的探针物质与被检物质结合的优选的例子有：单链核酸与前者互补的单链核酸的结合，以及抗体和抗原的结合。
根据本发明更优选的实施方案，优选地，使用单链核酸作为被检物质，使用与该单链核酸互补的单链核酸作为探针物质。
当使用单链核酸作为被检物质时，对构成所述被检物质的碱基对的长度没有限制，只要其具有与探针物质的核酸互补的位点即可；但是，优选地，所述探针物质具有10bp或以上的与所述核酸互补的位点。根据本发明，即使是具有200bp、500bp或1000bp的碱基对的链长较长的核酸，也可以以光电流的形式高灵敏度地检测出探针物质与被检物质的核酸之间的特异性结合的形成。
含有作为被检物质的单链核酸的样品溶液可以按照公知的方法，从包括外周静脉血等血液、白细胞、血清、尿、粪便、精液、唾液、培养细胞、各种内脏器官细胞等组织细胞的含有核酸的各种试样中提取核酸来制备。在此过程中，试样中的细胞的破坏可通过例如由外部施加振荡、超声波等物理性作用使载体振荡来进行。备选的是，可以使用核酸提取溶液，从细胞中提取核酸。说明性的核酸洗脱溶液的例子包括含有皂苷、EDTA、蛋白酶和例如十二烷基硫酸钠(SDS)、曲通-X(Triton-X)和吐温-20的表面活性剂的溶液。使用这些溶液洗脱核酸时，可以通过在37℃或以上的温度下培养来促进反应。
根据本发明的更优选的实施方案，当作为被检物质的基因的含量为很小的量时，优选通过公知的方法扩增基因后进行检测。扩增基因的方法的代表性方法的是使用诸如对聚合酶链反应(PCR)响应的酶的方法。这里，基因扩增法中使用的酶的例子有：DNA聚合酶、诸如Taq聚合酶的DNA依赖的DNA聚合酶、诸如RNA聚合酶I的DNA依赖的RNA聚合酶、诸如Qβ复制酶的RNA依赖的RNA聚合酶，然而在它们之中，优选的方法是使用Taq聚合酶的PCR法，因为通过它的扩增可以只通过调节温度即可以连续地反复进行。
根据本发明的优选实施方案，在上述扩增过程中可以将核酸用增感染料特异性地标记。通常，增感染料标记的被检物质可以通过使用在5’-末端侧用增感染料标记的PCR引物来扩增基因而获得。或者，通过掺入增感染料标记的dUTP或氨基烯丙基改性的dUTP，可将所述核酸用增感染料标记。当掺入的是氨基烯丙基改性的dUTP时，在接下来的偶联阶段中，通过N-羟基琥珀酰亚胺活化的增感染料与改性的dUTP特异性反应生成用增感染料均匀地标记的被检物质。
根据本发明的优选实施方案方案，可对上述得到的核酸的粗提取液或纯化的核酸溶液在90℃至98℃、优选95℃或以上的温度下实施热变性以制备单链核酸。或者，通过进行碱性变性来制备所述单链核酸。
在本发明中，被检物质与探针物质可以间接地形成特异性结合。即，根据本发明的另外的优选实施方案，优选通过使用具有特异结合性的物质作为被检物质，在与该被检物质特异性结合的物质共存作为介导物质的条件下，可将与该介导物质特异性结合的物质担载在工作电极上作为探针物质。由此，即使是不能与探针物质特异性结合的物质，也可以通过经由介导物质与工作电极间接地特异性结合来检测。可以提及的被检物质、介导物质和探针物质的组合的优选例子是：配体、可接受该配体的受体蛋白分子以及可与该受体蛋白分子特异性结合的双链核酸的组合。配体的优选例子可以提及外源性内分泌干扰物(环境激素)。外源性内分泌干扰物是经由受体蛋白分子与DNA结合，以此对基因表达产生影响，从而引起毒性作用的物质；根据本发明的方法，可以简便地监测包括由被检物质提供的受体的蛋白质与DNA的结合性。
根据本发明，可以使来自不同来源的多个相同被检物质同时与一种探针物质反应，从而通过判断不同来源的被检物质的量的差异对来自目标来源的被检物质进行定量分析。作为具体的应用例子，可以提及在微阵列上的竞争杂交导致的表达谱分析。在该方法中，为了分析细胞中特定基因的表达谱的差异，将用不同的荧光染料标记的被检物质与同一探针物质进行竞争杂交。本发明中，通过采用上述方法，可以对细胞中的表达差异进行电化学分析，这是以往所没有的优点。
增感染料：
在本发明中，为了通过光电流检测被检物质的存在，所述被检物质在增感染料的共存下与探针物质直接或间接地特异性结合；借助于该结合，所述增感染料被固定至工作电极。为此，在本发明中，被检物质或介导物质可预先用增感染料标记。当使用的是可嵌入到被检物质与探针物质的复合物(例如杂交后的双链核酸)中的增感染料时，通过向样品溶液中添加增感染料，可以使增感染料固定在探针物质上。
根据本发明的优选实施方案，当被检物质为单链核酸时，优选对每一个分子的被检物质标记一个增感染料。为了容易地使被检物质与探针物质形成特异性结合，单链核酸的标记位置优选在单链核酸的5’末端或3’末端；为了使标记步骤更加简便，进一步优选在被检物质的5’末端进行标记。
根据本发明的又一优选实施方案，为了提高每一个分子被检物质所担载的增感染料的量，优选对每一个分子的被检测物质进行两个或以上的增感染料的标记。由此，可以使工作电极上的由其上的电子受体物质形成的每单位比表面积所担载的染料的量更多，以便可以以更高的灵敏度观测光电流响应。
本发明中使用的增感染料可以是能够向工作电极释放电子的物质来响应光激发，能够通过来自光源的光的照射跃迁到光激发状态，并且能够获得电子状态以使电子能够从激发态向工作电极注入电子的物质。因此，由于只要将要使用的增感染料可以在工作电极、特别是电子受体层获得所述电子状态即可，所以可以使用多种增感染料，而无需使用昂贵的染料。
在对多种被检物质进行分别检测的实施方案中，只要标记各被检物质的增感染料可被不同波长的光激发即可，所以如果各被检物质可以例如通过选择照射光的波长来分别激发即可。例如，如果使用与多种被检物质对应多种增感染料，并且对各增感染料照射不同激发波长的光，则即使在同一样点上存在多个探针，也可以分别检测出信号。本发明中，对被检物质的数量没有限定；然而，考虑到由光源照射的光的波长和增感染料的吸收特性，l至5种较为合适。该方案中可使用的增感染料只要可以在照射光的波长范围内引起光激发即可，因此无需其最大吸收在该波长范围内。同时，可以使用紫外可见分光光度计(例如岛津公司制造的UV-3150)测定在特定波长下是否有增感染料的光吸收反应测定。
增感染料的具体例子包括金属络合物和有机染料。优选的金属络合物的说明性的例子包括诸如铜酞菁、钛酞菁的金属酞菁；叶绿素或其衍生物；氯高铁血红素；在JP H01-220380A和JP H05-504023A中所公开的钌、锇、铁和锌的络合物(例如顺式-二氰酸酯-双(2,2-联二吡啶-4,4-二羧酸酯)钌(II))；以及铕络合物。优选的有机染料的说明性例子包括无金属酞菁、9-苯基咕吨类染料、花菁类染料、金属花菁类染料、羰花青染料、咕吨类染料、三苯基甲烷类染料、吖啶类染料、恶嗪类染料、香豆素类染料、部花菁类染料、若丹明染料、聚甲炔类染料以及靛蓝染料。优选的增感染料的其它说明性例子包括Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、Cy7.5和Cy9(全部由通用电气集团生命科学股份有限公司制造)；Alexa Fluor355、Alexa Fluor405、Alexa Fluor430、Alexa Fluor488、Alexa Fluor532、AlexaFluor546、Alexa Fluor555、Alexa Fluor568、Alexa Fluor594、Alexa Fluor633、Alexa Fluor647、Alexa Fluor660、Alexa Fluor680、Alexa Fluor700和Alexa Fluor750(全部由MolecularProbes公司制造)；DY-610、DY-615、DY-630、DY-631、DY-633、DY-635、DY-636、EVOblue10、EVO blue30、DY-647、DY-650、DY-651、DYQ-660和DYQ-661(全部由DyomicsGmbH公司制造)。
关于可嵌入到双链核酸的增感染料的优选例子，可以提及吖啶橙和溴乙啶。当使用上述增感染料时，只通过在核酸杂交后将其添加到样品溶液中，即可以形成用增感染料标记的双链核酸，因此无需预先对单链核酸进行标记。
工作电极及其制备：
本发明所要使用的工作电极是表面具备探针物质的电极，并且可接受经由探针物质固定的增感染料被光激发时所释放的电子的电极。因此，只要其中所使用的增感染料可产生电子转移，则工作电极的构成和材料没有特别限定，可以是各种构成和材料。
根据本发明的优选实施方案，优选工作电极具有含有电子受体物质的电子受体层，所述电子受体物质能够接受增感染料响应光激发而释放的电子，并在该电子受体层的表面具有探针物质。此外，根据本发明的更优选的实施方案，优选工作电极进一步含有导电性基材，电子受体层在该导电性基材上形成。
在本发明中，电子受体层包含能够接受当经由探针物质固定的增感染料被光激发时所释放的电子的电子受体物质。即，所述电子受体物质可以是能够取得可以被注入来自被光激发的试验染料的电子的能级的物质。同时，可以被注入来自被光激发的试验染料的电子的能级(A)，例如在使用半导体作为电子受体材料时，是导电带(CB)。即，本发明中使用的电子受体物质可以是具有能级A(该能级比增感染料的LUMO能级低)，换句话说，具有比增感染料的LUMO能级低的能级的物质。
根据本发明的优选实施方案，电子受体物质优选为选自下组中的至少一种：氧化钛、氧化锌、氧化锡、氧化铌、钛酸锶、氧化铟、铟-锡复合氧化物(ITO)和掺氟的氧化锡(FTO)。最优选使用TiO2、铟-锡复合氧化物(ITO)或掺氟氧化锡(FTO)。ITO和FTO不但具有作为电子受体层，而且还具有作为导电性基材的功能特性；因此，通过使用这些材料，无需使用导电性基材，仅凭电子受体层即可以发挥工作电极的功能。
使用半导体作为电子受体物质时，该半导体可以是单晶体和多晶体中的任意一种；然而，优选多晶体；此外，与致密的晶体相比，多孔性晶体是进一步优选的。因为由此使比表面积增大，所以可以吸附更多的被检物质和增感染料，因此可以以更高的灵敏度检测被检物质。因此，根据本发明的优选实施方案，电子受体层具有多孔性，各孔的孔径优选为3-1000nm，更优选为10-100nm。
根据本发明的优选实施方案，在导电性基材上形成电子受体层的状态下，优选表面积为相对于其投影面积的10倍或以上，进一步优选100倍或以上。该表面积的上限没有特别限定；但通常为1000倍左右。对于构成电子受体层的微粒的粒径，使用将投影面积换算成圆形时的直径，以一级粒子的平均粒径计，优选为5-200nm，更优选为8-100nm，进一步优选为20-60nm。此外，分散物中的电子受体物质的微粒(二级微粒)的平均粒径优选0.01-100μm。备选的是，为了通过使入射光散射来提高光捕获率，可以同时使用粒径尺寸大的、例如为300nm左右的电子受体物质的微粒来形成电子受体层。
通过使用凹凸结构，可以使电子受体层的表面积增大，所以可以使更多的探针分子固定到那里，由此可以提高检测的灵敏度。因为生物分子的大小是约0.1nm至20nm左右，所以通过凹凸结构形成的孔径优选为20nm至150nm(包括两个端点)。如果由凹凸结构形成的空间的入口比其更小，则即使比表面积增大，生物分子也无法与探针结合，所以检测信号降低。另一方面，如果凹凸过于粗大，则表面积不会过度增加，信号强度也不会提高太多。感应生物分子的更优选的范围是50nm至150nm(包括两个端点)。
根据本发明的优选实施方案，优选采用柱结构作为凸结构，其中将纳米级的柱有规则地设置在其表面上。虽然制备该结构的方法已知有许多种，但是通常使用的是采用具有纳米级孔的阳极氧化铝作为模板的方法。一种已知的方法是在模板中填充陶瓷溶胶，进行热处理，然后通过蚀刻除去氧化铝模板；另外一种已知方法是将填充的陶瓷溶胶从模板上脱除，然后对其进行热处理。对于制备柱状纳米结构体的方法，可以提及如JP2004-130171A所示的在透明基体或透明导电层上制备纳米结构体的方法。在该方法中，向阳极氧化铝模板中填充二氧化钛溶胶，在300至400℃下加热，然后通过蚀刻除去模板。结果，形成了由二氧化钛形成的纳米管或纳米线作为纳米结构体。
根据本发明的优选实施方案，优选采用气孔作为凸结构，所述气孔是由于通过燃烧含有陶瓷组分的无机-有机掺合物前体，使有机物通过氧化分解变成气相而产生。金属-氧的网络结构与有机聚合物等共存于所述无机-有机掺合物前体中，其中所述金属-氧的网络结构通过有机金属化合物(金属醇盐)的氧化以及后续的缩聚反应形成。或者，还有向市售的氧化钛颗粒(例如，TAYCA公司制造的锐钛矿型晶体AMT-600(商品名，平均粒径30nm))或氧化钛分散溶液中添加有机聚合物等的方法。关于这些组合物，作出了各种提案；例如，JP H10-212120A中提出了通过将氧化钛颗粒和作为分散助剂的有机聚合物一起分散在甘醇二甲醚系溶剂(HO-(-CH2CH2O-)n-R；n为l-10；R为烷基或芳基)中而获得的组合物。当具有该组成的分散溶液通过适当的方法(浸涂法、喷涂法、旋涂法、刮涂法、辊涂法、刷涂法、逆辊涂法)涂布于载体后在200至800℃下焙烧时，可实现40至50cm2每1cm2(厚度1μm)的比表面积。或者，在JP2001-233615A中公开了一种方法，其中，将含有四烷氧基钛、稳定剂、溶剂和环氧乙烷-环氧丙烷-环氧乙烷嵌段共聚物的溶胶溶液滴在基板上；通过高速旋转该基板使溶剂蒸发，从而使上述溶液变成凝胶而获得具有三维结构的有机-无机复合氧化钛薄膜；然后进行高温焙烧，除去嵌段共聚物，由此形成精细的三维凹结构。此外，还公开了使用寡聚糖(海藻糖)作为有机聚合物从而得到孔隙率为38-56％的陶瓷多孔质膜的方法(JP2004-83376A)。
如上所述，已经提出了关于控制陶瓷的精细凹凸结构的多种方法；因此，通过将这些方法适当地应用于本发明的陶瓷电极材料中，可以得到比表面积大的电极材料。
根据本发明的优选实施方案，优选工作电极进一步含有导电性基材，且电子受体层在导电性基材上形成。可在本发明中使用的导电性基材不仅可以是在诸如钛和其它金属那样的载体本身具有导电性的导电性基材，还可以是在玻璃或塑料载体表面上具有导电材料层的导电性基材。使用具有该导电材料层的导电性基材时，电子受体层在该导电材料层上形成。构成导电材料层的导电材料的说明性例子包括铂、金、银、铜、铝、铑、铟等金属；碳、碳化物和氮化物等导电性陶瓷；以及铟-锡复合氧化物、掺氟氧化锡、掺锑氧化锡、掺镓氧化锌和掺铝氧化锌等导电性金属氧化物，更优选铟-锡复合氧化物(ITO)和掺氟氧化锡(FTO)。然而，如上所述，如果电子受体层本身可发挥导电性基材的功能，那么导电性基材可以省略。此外，在本发明中，对导电性基材没有特别限定，只要是可确保导电性的材料即可，所以也包括自身不具有强度的薄膜状或点状形式的导电材料层。
根据本发明的优选实施方案，优选导电性基材基本上透明；具体来说，优选其透射率为10％或以上，更优选为50％或以上，进一步优选为70％或以上。由此，可以将单元制成具有这样的结构，即该结构使由工作电极的后方(即导电性基材)照射并透过工作电极(即导电性基材和电子受体层)的光可以激发增感染料。另外，根据本发明的优选实施方案，导电材料层的厚度优选为约0.02至约10μm。进一步地，根据本发明的优选实施方案，导电性基材的表面电阻率优选为100Ω/cm2或以下，更优选为40Ω/cm2或以下。对导电性基材的表面电阻率的下限没有特别的限定；但其通常为约0.1Ω/cm2。
在导电性基材层上形成电子受体层的优选的方法的说明性例子包括在导电性载体上涂布电子受体物质的分散溶液或胶体溶液的方法、在导电性载体上涂布半导体微粒的前体之后进行水解以获得微粒膜的方法(溶胶-凝胶法)、溅射法、CVD法、PVD法、蒸镀法和电镀法等。制备作为电子受体物质的半导体微粒的分散溶液的说明性方法除了上述的溶胶-凝胶法之外，还有使用研钵来研磨的方法，使用碾磨机边研磨边形成分散体的方法，以及使用在其合成期间在溶剂中析出的半导体微粒的方法。其中所用的分散介质的说明性例子包括水和各种有机溶剂(例如甲醇、乙醇、异丙醇、二氯甲烷、丙酮、乙腈和乙酸乙酯等)。在进行分散的过程中，可以根据需要使用聚合物、表面活性剂、酸或螯合剂等作为分散助剂。
电子受体物质的分散溶液或胶体溶液的优选的涂布方法的说明性例子包括辊涂法和浸渍法等涂布型方法；气刀法、刮板法等计量型方法；涂布与计量可在同一部分完成的方法，例如JP S58-4589A所公开的绕线棒法、美国专利2681294、美国专利2761419和美国专利2761791中公开的滑动漏斗法；挤压法；幕涂法；旋涂法；喷涂法等。
根据本发明的优选实施方案，当电子受体层由半导体微粒形成时，电子受体层的厚度优选为0.1-200μm，更优选为0.1-100μm，进一步优选为1-30μm，最优选为2-25μm。由此，可以使单位投影面积的探针物质以及被固定的增感染料的量的增加；从而不仅使光电流量增多，同时也可以降低由于电荷复合所产生的电子的损失。此外，每平方米导电性基材的半导体微粒的涂布量优选为0.5-400g，更优选5-100g。
根据本发明的优选实施方案，当电子受体物质含有铟-锡复合氧化物(ITO)或掺氟氧化锡(FTO)时，电子受体层的膜厚优选为l nm或以上，更优选为l0nm至1μm。
根据本发明的优选实施方案，优选在导电性基材上涂布半导体微粒后实施热处理。由此，可以使颗粒之间电接触，而且还可以提高涂膜的强度和与载体的粘附性。热处理温度优选为40-700℃，更优选100-600℃。此外，热处理的时间是10分钟左右至10小时左右。
此外，根据本发明的另外的优选实施方案，当使用聚合物膜等熔点和软化点低的导电性基材时，为防止热劣化的发生，优选通过使用不使用高温处理的方法实现膜的形成；这种形成膜的方法的说明性例子包括加压法、低温加热法、电子束辐照法、微波辐照法、电泳法、溅射法、CVD法、PVD法以及蒸镀法。
在上述得到的工作电极的电子受体层表面担载探针物质。在工作电极上担载探针物质可按照公知的方法进行。根据本发明的优选实施方案，当使用单链核酸作为探针物质时，可以在工作电极表面形成氧化层，然后核酸探针与工作电极可以通过该氧化层结合。此时，通过向核酸的末端引入官能团，可以将所述核酸探针固定到工作电极上。由此，具有引入的官能团的核酸探针可以直接通过固定化反应固定在载体上。向核酸末端引入官能团可以通过酶促反应或使用DNA合成装置进行。在酶促反应中使用的酶的说明性例子包括末端脱氧核苷酸转移酶、多聚腺苷酸聚合酶、多聚核苷酸激酶、DNA聚合酶、多核苷酸腺嘌呤转移酶和RNA连接酶。或者，还可以通过聚合酶链反应法(PCR法)、切口平移法或随机引物法来引入官能团。官能团可以被引入到核酸的任意部分，即，3'末端、5'末端或任意位点。
根据本发明的优选实施方案，用于将核酸探针固定到工作电极的优选官能团的说明性例子包括胺、羧酸、磺酸、硫醇、羟基和磷酸。根据本发明的优选实施方案，为了将核酸探针牢固地固定于工作电极，也可以使用可在工作电极与核酸探针之间交联的材料。优选的交联材料的说明性例子包括硅烷偶联剂、钛酸酯偶联剂和诸如聚噻吩、聚乙炔、聚吡咯、聚苯胺的导电性聚合物。
根据本发明的优选实施方案，可以通过被称为物理吸附的更简便的操作来有效地进行核酸探针的固定。例如按下述过程，可以实现电极表面对核酸探针的物理吸附。首先，使用超声波洗涤器用蒸馏水和醇洗涤电极表面。然后，将电极浸入到含有核酸探针的缓冲液中，以使核酸探针吸附在载体表面上。
吸附核酸探针后，通过向其添加阻断剂可以抑制非特异性吸附。对可使用的阻断剂没有特别限定，只要其可以覆盖电子受体层表面上的未吸附核酸探针的位置，并且可通过化学吸附或物理吸附等被电子受体物质吸附即可；但是，优选具有能够通过化学键被吸附的官能团的物质。例如，当使用氧化钛作为电子受体层时，优选的阻断剂的说明性例子包括具有诸如羧酸基、磷酸基、磺酸基、羟基、氨基、吡啶基、酰胺基的能够被吸附于氧化钛的官能团的物质。
根据本发明的优选实施方案，优选探针物质被担载在工作电极上的互相分开的多个区域上以及对各区域分别进行来自光源的光照射。由此，多个试样可以在一片工作电极上测定；因此可能可以实现DNA芯片的集成化。根据本发明的更优选的实施方案，优选形成这样的模式：具有担载于工作电极上的探针物质的多个区域彼此分开，当通过从光源照射的光进行扫描时，在一次操作中可以连续地检测或者定量地检测每个区域中的样品的被检物质。
根据本发明更优选的实施方案，使多种探针物质担载于工作电极上的互相分开的多个区域的各个区域中。由此，可以同时进行多个样品的测定，所述多个样品的数目由区域个数乘以各个区域中的探针物质的数量得到。
根据本发明更优选的实施方案，不同的探针物质可以担载于在工作电极上彼此分开的多个区域的各个区域中。由此，可以担载与单独的区域数相当的种类数的探针物质；因此，可以同时进行多种被检物质的测定。
对电极：
对本发明中使用的对电极没有特别限定，只要当其与电解质介质接触时与工作电极之间有电流流动即可；因此，当用金属或导电性的氧化物蒸镀玻璃、塑料、陶瓷以及SUS等载体时，这些载体可被使用。或者，通过蒸镀法或溅射法等方法，可以使金属薄膜形成为对电极，其膜厚可为5μm或以下，或优选为3nm-3μm的范围。可用作对电极的优选材料的说明性例子包括铂、金、钯、镍、碳、聚噻吩等导电性聚合物、氧化物、碳化物、氮化物等导电性陶瓷；更优选铂、碳；最优选铂。这些材料可以通过与电子受体层形成方法相类似的方法来形成薄膜。
实施例
通过以下实施例更具体地描述本发明，但本发明并不受这些实施例的限制。
实施例1
电解质介质比较：
通过使用本发明的方法，为了比较，改变电解质介质的检测条件，对p53基因进行检测。
完全匹配探针DNA作为探针DNA被固定在工作电极侧。使用如下所示的碱基序列。
完全匹配探针：5’-TGTAGGAGCTGCTGGTGCA-3’(SEQ ID No.1)
通过PCR法使与该探针DNA杂交的完全匹配的靶标DNA扩增。在完全匹配的靶标DNA的PCR扩增中所用的引物和模板DNA的碱基序列如下。
正向引物：5’-Cy5-GATATTGAACAATGGTTCACTGAAGAC-3’(SEQ ID No.2)
反向引物：5’-GCCCCTCAGGGCAACTGAC-3’(SEQ ID No.3)
由于增殖是通过使用5’末端侧用Cy5标记的正向引物来完成，所以一个靶标DNA分子被一个Cy5染料分子标记。
模板DNA：5’-GATATTGAACAATGGTTCACTGAAGACCCAGGTCCAGATGAAGCTCCCAGAATGCCAGAGGCTGCTCCCCGCGTGGCCCCTGCACCAGCAGCTCCTACACCGGCGGCCCCTGCACCAGCCCCCTCCTGGCCCCTGTCATCTTCTGTCCCTTCCCAGAAAACCTACCAGGGCAGCTACGGTTTCCGTCTGGGCTTCTTGCATTCTGGGACAGCCAAGTCTGTGACTTGCACGGTCAGTTGCCCTGAGGGGC-3’(SEQ ID No.4)
将掺氟氧化锡(F-SnO2:FTO)涂层玻璃(U膜，薄片电阻率为15Ω/平方(square)，形状:75mm×25mm，AGC Fabritech公司制造)设置为工作电极的玻璃基材。将该玻璃基材在丙酮中浸泡15分钟，然后用超纯水在超声波浴中清洗15分钟去除污垢和有机残留物。将该玻璃基材在0.5M的氢氧化钠水溶液中振荡15分钟。之后，在超纯水中振荡清洗5分钟，以除去氢氧化钠；换水，将上述操作重复3次。取出玻璃基材，残留的水被空气吹掉后，将玻璃基材浸泡在无水甲醇中以除去水。将3-氨基丙基三甲氧基硅烷(由Johnson Matthey的子公司Alfa Aesar制造)加入95体积％的甲醇水溶液中，其浓度可变为0.2体积％；然后，将混合物在室温下搅拌5分钟，以得到偶联处理溶液。将玻璃基材浸泡在该偶联-处理溶液中，然后，慢慢振荡15分钟。
接下来，取出玻璃，在甲醇中振荡3分钟；通过更换甲醇，重复该操作三次，以除去过量的偶联处理溶液。然后，将玻璃基材保持在110℃下30分钟，以使偶联剂与玻璃基材结合。玻璃基材冷却到室温后，制备浓度为10μM的探针DNA；然后，将其在95℃下保持10分钟后，迅速将其转移至冰上，并保持10分钟以使DNA变性。采用微阵列LA-BA点样仪(点样针直径为1.5mm，Filgen公司制造)在工作电极上将变性后的探针DNA进行点样，其中在长边方向上为10行，短边方向上为2列，一共20个点，点中心之间的距离为5mm。然后，将其在95℃保持3分钟使溶剂蒸发，然后采用CL-1000型紫外交联仪(UVP有限责任公司生产)照射120mJ的紫外光使探针DNA固定在玻璃基材上。随后，通过在重量/体积比为0.2％的十二烷基硫酸钠(SDS，日本和光纯药工业株式会社制造)水溶液中振荡将其清洗3次；然后，通过在超纯水中振荡5分钟进一步清洗，重复3次。然后，将该玻璃基材在开水中浸泡2分钟，取出，吹空气除掉残余水分。然后，在4℃下将该玻璃基材在无水乙醇中浸泡1分钟，然后吹空气除掉残留的乙醇。由此，获得固定有探针DNA的工作电极。
该固定有探针DNA的电极作为工作电极被安装在图1所示的装置的传感器单元1中。其安装是以如图2所示的这样一种方式完成的，工作电极11附着有0.5毫米厚度的垫片(图中未示)并被设置在面对对电极12的位置。一个电极用作对电极。该传感器单元具有由垫片与两个电极形成的流动通道的流动单元结构。该结构具有被连接到该通道的对立的两端的流体供给口和流体排出口。与流体供给口相连的管道配管连接到泵上以向传感器单元中充入流体；流体排出口与管道配管连接以将充入传感器单元的流体排出。
接下来，将100μL浓度被调整为200nM的完全匹配靶标DNA的水溶液与100μL碱性变性水溶液(2mM乙二胺四乙酸(EDTA，日本和光纯药工业株式会社制造)和0.2M氢氧化钠(NaOH，日本和光纯药工业株式会社制造))混合；然后，所得到的溶液在室温下保持5分钟，以将双链DNA碱性变性为单链DNA。向这些溶液中加入700μL稀释的杂交水溶液(5×SSC，0.1％SDS)和100μL中和水溶液(0.2M盐酸(HCl，日本和光纯药工业株式会社制造))，这些溶液的温度被调节到规定的杂交温度；然后，将它们混合。将该混合后的溶液(1mL)充入到传感器单元中，然后在45℃下于传感器单元中保持10分钟，以与固定到工作电极上的探针DNA进行杂交。在这时，在杂交溶液充入传感器单元之前，通过利用由陶瓷加热器、温度调节器和热敏电阻器组成的温度控制部件，将传感器单元内部的温度调整到规定的杂交温度。十分钟后，使用泵来充入空气，从而使杂交溶液从传感器单元内部彻底排出。然后，为了洗掉没有用于杂交的过剩的靶标DNA等物质，将1500μL洗涤水溶液(3.5×SSC)充入传感器单元中。同时，关于SSC，20×SSC是指20倍浓度的SSC溶液；20×SSC的组合物是0.3M柠檬酸钠(日本和光纯药工业株式会社制造)和3M氯化钠(日本和光纯药工业株式会社制造)的混合物水溶液(以后还将同样使用)。
随后，将电解质介质充入传感器单元以充满所述传感器单元的内部；然后，检测光电流。同时，使用乙腈溶液(0.4M四丙基碘化铵(NPr4I，日本和光纯药工业株式会社制造))作为电解质介质1。除此之外，通过使用按照同样方法制备的固定有探针DNA的工作电极，以几乎相同的程序进行杂交和洗涤；将水溶液(包含0.3M亚铁氰化钾(日本和光纯药工业株式会社制造)、0.01M铁氰化钾(日本和光纯药工业株式会社制造)、0.525M氯化钠(日本和光纯药工业株式会社制造))作为电解质介质2充入传感器单元中以充满传感器单元内部；然后，检测光电流。图4显示了在每一行中来源于各个样点的光电流值与其之前的基础电流值之间的差值的结果。如所能清楚看到的，可以确认的是，通过使用电解质介质2，在行和列之间的分散体较小，因此与使用电解质介质1的情况相比，可以更准确地进行测量。
实施例2
洗涤水溶液的盐浓度：
类似于实施例1，将完全匹配探针DNA作为探针DNA固定到工作电极侧，并施行与完全匹配靶标DNA的杂交。然后，为了洗出过量的靶标DNA和未用于杂交的其他物质等，将1500μL的洗涤水溶液1(3.5×SCC)充入传感器单元中。除此以外，通过使用以类似方式制备的固定有探针DNA的工作电极，具有不同盐浓度的各洗涤水溶液，即，洗涤水溶液2(1.5×SSC)和洗涤水溶液3(0.5×SSC)都各自被充入到传感器单元中。在杂交反应时，结合反应溶液的盐浓度与洗涤水溶液1、洗涤水溶液B以及洗涤水溶液3的盐浓度的比值分别为7、2.33和1。单独的工作电极在633nm的激发波长和670nm的荧光波长的荧光强度通过Typhoon Trio荧光扫描仪(GE Healthcare Life Sciences制造)测定；来自于杂交的荧光值的变差系数通过使用图像分析软件ImageQuant TL(GE Healthcare Life Sciences制造)来计算。结果是，洗涤水溶液1、洗涤水溶液2、洗涤水溶液3的变差系数分别为11.3％、12.1％、19.6％。由此，获得了值和变差系数最小的结果，因此，当所使用的是洗涤水溶液1至3中的洗涤水溶液1时，效果最低。
实施例3
单个碱基变异的测定：
通过与实施例1类似的过程，将完全匹配探针(PM)的6个样点、单个碱基变异链(SNP)以及完全失配探针(MM)固定在工作电极侧；然后，通过与实施例1类似的装置和测定方法测定单个碱基多态性。单独的碱基序列如下所示(使用与实施例1相同的完全匹配靶标DNA)。至于单独的探针，完全匹配探针通过阵列A显示，单个碱基变异链探针通过阵列B显示，完全失配探针通过阵列C显示。
完全匹配探针：5’-TGTAGGAGCTGCTGGTGCA-3’(SEQ ID No.1)
单个碱基变异链(SNP)探针:5’-TGTAGGAGCAGCTGGTGCA-3’(SEQ ID No.5)
完全失配(MM)探针：5’-TGAGCAAGTTCAGCCTGGT-3’(SEQ ID No.6)
关于单独的探针DNA的来自于单独的样点的光电流值与基础电流值之间的差值的结果概括于图5中。如从图5的电流值中所能清楚地看到的，一个碱基的差异(在PM与SNP之间所观察到的电流值差异)和完全失配的差异(在PM与MM之间所观察到的电流值差异)可以是非常显著的。
实施例4
增感染料量与光电流值之间的关系:
通过使用本发明的方法，证实了增感染料量和光电流值之间的关系。将完全匹配探针DNA作为用增感染料标记的探针DNA固定在工作电极侧。使用下面的碱基序列。
完全匹配探针：5’-TGTAGGAGCTGCTGGTGCA-3’(SEQ ID No.1)
一分子的Cy5染料被标记在一分子的DNA的5’末端侧。此外，一个氨基基团被标记在一分子的DNA的3’末端侧。
具有掺氟氧化锡(F-SnO2:FTO)的涂层玻璃(U膜，薄片电阻率为12Ω/平方，形状：75mm×25mm，AGC Fabritech制造)被设置为工作电极的玻璃基材。将该玻璃基材在丙酮中浸泡15分钟，然后用超纯水进行超声波浴15分钟来清洗，以去除污垢和有机残留物。该玻璃基材在0.5M的氢氧化钠水溶液中振荡15分钟。之后，在超纯水中振荡清洗5分钟，以除去氢氧化钠；换水，将上述操作重复3次。取出玻璃基材，残留的水被空气吹掉后，将玻璃基材浸泡在无水甲醇中以除去水。将3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷(Sigma-Aldrich制造)加入超纯水中，使其浓度为0.2体积％；然后，将混合物在室温下搅拌5分钟，得到偶联处理溶液。将玻璃基材浸泡在该偶联处理溶液中，然后，缓慢振荡4小时。
然后，取出玻璃基材，然后在超纯水中振荡3分钟；通过换水，将该操作重复3次，以除去过量的偶联处理溶液。其后，将玻璃基材在110℃下保持30分钟，以使偶联剂与玻璃结合。玻璃基材冷却到室温后，分别制备在超纯水中的浓度分别为0.4、0.2、0.1、0.08、0.04、0.02、0.01、0.008、0.004和0μM的增感染料标记的探针DNA溶液；然后，在95℃下保持10分钟后，将它们迅速转移到冰上，并保持10分钟以使DNA变性。通过使用带IJHBS-1000型喷嘴的Picojet2000S型喷墨测位仪(Microjet公司制造)，将这些变性后的探针DNA溶液(10种)在短边方向上点样，每个浓度点2个样点，总共20个样点，每个样点的溶液体积为600nL，样点中心之间的间隔为5mm。然后，在95℃下干燥3分钟。使用Typhoon Trio型荧光扫描仪(GE Healthcare Life Sciences公司制造)测定工作电极在的633nm激发波长和670nm的荧光波长的荧光强度；采用ImageQuant TL图像分析软件(GE Healthcare Life Sciences公司生产)计算来自用增感染料标记的探针DNA的增感染料的荧光值，从而获得增感染料点样量的校准曲线。
接着，将该工作电极在30℃、90％的湿度下静态保持24小时以使探针DNA固定在玻璃基材上。通过在0.2％SDS溶液中振荡5分钟进行清洗，并重复3次；然后，在超纯水中振荡5分钟进行清洗，并重复3次。之后，将该玻璃基材在沸水中浸泡2分钟，取出，吹空气除去残留的水。随后，在4℃下将玻璃基材在无水乙醇中浸泡1分钟以除去水，然后吹空气除去残留的乙醇。由此，获得固定有被增感染料标记的探针DNA的工作电极。
与实施例1相似，将该固定有被增感染料标记的探针DNA的电极作为工作电极安装在图1所示的装置的传感器单元1的内部。随后，将水溶液(包含0.3M亚铁氰化钾(日本和光纯药工业株式会社制造)、0.01M铁氰化钾(日本和光纯药工业株式会社制造)和0.525M氯化钠(日本和光纯药工业株式会社制造))作为电解质介质填充到传感器单元中以填满传感器单元的内部；然后，测定光电流。进一步地，与上述方法相似，使用荧光扫描仪测定固定有被增感染料标记的探针DNA的电极的荧光强度；然后，通过利用以前计算的校准曲线计算在固定有被增感染料标记的探针DNA的电极中存在的增感染料的量。图6显示的是增感染料的计算量相对于相应样点的光电流值的绘图结果。在图6中可以清楚地看出，增感染料量和光电流值以相关系数为0.965近似线性地变化，所以确认二者是相互关联的。
实施例5
各电解质介质中的电解质浓度：
通过采用本发明的方法，对p53基因和各电解质介质浓度的测定进行研究。将完全匹配探针DNA作为探针DNA固定至工作电极侧。其碱基序列如下。
完全匹配探针：5’-TGTAGGAGCTGCTGGTGCA-3’(SEQ ID No.1)
相对于一个DNA分子，一个氨基基团被标记在3’末端侧。
通过PCR法将与该探针DNA杂交的完全匹配靶标DNA进行扩增。在完全匹配的靶标DNA的PCR扩增中所用的引物和模板DNA的碱基序列如下。
正向引物：5’-Cy5-GATATTGAACAATGGTTCACTGAAGAC-3’(SEQ ID No.2)
反向引物：5’-GCCCCTCAGGGCAACTGAC-3’(SEQ ID No.3)
由于增殖是通过使用5’末端侧用Cy5标记的正向引物来完成的，所以一个靶标DNA分子被一个Cy5染料分子标记。
模板DNA:5’-GATATTGAACAATGGTTCACTGAAGACCCAGGTCCAGATGAAGCTCCCAGAATGCCAGAGGCTGCTCCCCGCGTGGCCCCTGCACCAGCAGCTCCTACACCGGCGGCCCCTGCACCAGCCCCCTCCTGGCCCCTGTCATCTTCTGTCCCTTCCCAGAAAACCTACCAGGGCAGCTACGGTTTCCGTCTGGGCTTCTTGCATTCTGGGACAGCCAAGTCTGTGACTTGCACGGTCAGTTGCCCTGAGGGGC-3’(SEQ ID No.4)
具有掺氟二氧化锡(F-SnO2:FTO)的涂层玻璃(U膜，薄片电阻率为12Ω/平方，形状75mm×25mm，AGC Fabritech制造)被设置作为工作电极的玻璃基材。将该玻璃基材在丙酮中浸泡15分钟，然后用超纯水进行超声波浴15分钟来清洗，以去除污垢和有机残留物。将该玻璃基材在0.5M的氢氧化钠水溶液中振荡15分钟。之后，在超纯水清洗5分钟，除去氢氧化钠；通过换水，将上述操作重复3次。取出玻璃基材，残留的水被空气吹掉后，将玻璃基材浸泡在无水甲醇中以除去水。将3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷(Sigma-Aldrich制造)加入超纯水中，使其浓度为0.2体积％；然后，将混合物在室温下搅拌5分钟，得到偶联处理溶液。将玻璃基材浸泡在该偶联处理溶液中，然后，慢慢振荡4小时。
接着，取出玻璃基材，并在超纯水中振荡3分钟；通过换水，重复该操作3次，以除去过量的偶联处理溶液。然后，将玻璃基材在110℃下保持30分钟，以使偶联剂与玻璃基材结合。玻璃基材冷却到室温后，制备在超纯水中浓度为10μM的探针DNA；然后，将其在95℃下保持10分钟后，迅速将其转移至冰上，并保持10分钟以使DNA变性。通过使用带IJHBS-1000型喷嘴的Picojet2000S型喷墨测位仪(Microjet公司制造)，将变性后的探针DNA溶液在短边方向上点样，每种溶液点4个样点，总共40个样点，每个样点的溶液体积为600nL，样点中心之间的间隔为5mm。然后，将其在95℃下干燥3分钟。
接着，将该工作电极在30℃、90％的湿度下静态保持24小时以使探针DNA固定在玻璃基材上。通过在0.2％SDS溶液中振荡5分钟进行清洗，并重复3次；然后，通过在超纯水中振荡5分钟进行清洗，并重复3次。之后，将该玻璃基材在沸水中浸泡2分钟，取出，吹空气除去残留的水。随后，在4℃下将玻璃基材在无水乙醇中浸泡1分钟以除去水，然后吹空气除去残留的乙醇。由此，获得固定有探针DNA的工作电极。
接下来，将100μL浓度被调整为200nM的完全匹配靶DNA的水溶液与100μL碱性变性水溶液(2mM乙二胺四乙酸(日本和光纯药工业株式会社制造)和0.2M氢氧化钠(日本和光纯药工业株式会社制造))混合；然后，将所得到的溶液在室温下保持5分钟，以使双链DNA碱性变性为单链DNA。向这些溶液中加入700μL稀释的杂交水溶液(5×SSC，0.1％SDS)和100μL中和水溶液(0.28M盐酸(日本和光纯药工业株式会社制造))，这些溶液的温度被调节到规定的杂交温度；然后，将它们混合。将该混合后的溶液(1mL)充入到传感器单元中，然后在55℃下于传感器单元中保持10分钟，以进行使探针DNA固定到工作电极上的杂交。在这时，在杂交溶液充入传感器单元之前，通过利用由陶瓷加热器、温度调节器和热敏电阻器组成的温度控制部件，将传感器单元内部的温度调整到规定的杂交温度。十分钟后，通过使用泵来充入空气，从而使杂交溶液从传感器单元内部彻底排出。然后，为了洗掉没有用于杂交的过剩的靶标DNA等物质，将1500μL洗涤水溶液(0.5×SSC)充入传感器单元中。
随后，通过在超纯水中溶解各电解质来制备作为水溶液的如下所示的电解质介质3至7：电解质3(0.6、0.3、0.1、0.05和0.01M的三水合亚铁氰化钾(日本和光纯药工业株式会社制造)，0.01M铁氰化钾(日本和光纯药工业株式会社制造)，以及0.525M氯化钠(日本和光纯药工业株式会社制造)；电解质4(0.6、0.3、0.1、0.05和0.01M的三水合亚铁氰化铵(日本和光纯药工业株式会社制造)，0.01M铁氰化钾，以及0.525M氯化钠)；电解质5(0.3、0.1、0.05和0.01M的氢醌(日本和光纯药工业株式会社制造)，以及0.525M氯化钠)；电解质6(0.1、0.05、0.01、0.005、0.001、0.0001M的L(+)抗坏血酸(日本和光纯药工业株式会社制造)和0.525M氯化钠)；以及电解质7(0.9、0.6、0.3、0.1和0.05M的碘化钾(日本和光纯药工业株式会社制造)，0.01M碘(日本和光纯药工业株式会社制造)，和0.525M氯化钠)。将由此制备的各水溶液充入传感器单元以充满传感器单元的内部；然后，测定光电流。这些结果列于表1。对于各电解质介质的每个浓度，被认为来自于杂交的靶标DNA分子的增感染料的光电流可被确定。
表1
实施例6
各种电解质介质的盐浓度：
与实施例5类似，制备使用完全匹配探针固定探针DNA的工作电极，然后，施行与200nM的完全匹配靶标DNA的杂交，随后进行洗涤。
然后，通过在超纯水中溶解各电解质8(0.3M的氢醌以及0.525、0.2、0.1和0.01M的氯化钠)获得作为水溶液的各电解质介质8，将其充入传感器单元，以充满传感器的内部；然后，测定光电流。结果列于表2。对于电解质介质的每个盐浓度，被认为来源于杂交的靶标DNA分子的增感染料的光电流可被确定。
表2

Claims (12)

1.一种用于被检物质的特异性检测的方法，其包括以下步骤：使工作电极和对电极一起与电解质介质接触，其中所述工作电极具有经探针物质固定的增感染料标记的被检物质；然后用光照射所述工作电极以引起增感染料的光激发，由此检测由从被光激发的增感染料至工作电极的电子转移产生的、在工作电极和对电极之间流动的光电流，
其中
所述工作电极具有由包含电子受体物质形成的电子受体层，所述电子受体物质能够接受响应所述增感染料的光激发而释放的电子，并且所述探针物质被担载在所述电子受体层的表面上；
在单一的传感器单元中进行以下步骤：
结合反应步骤，使工作电极在反应溶液存在下与被检物质接触，以获得具有增感染料标记的被检物质的工作电极，所述被检物质通过探针物质固定在工作电极上，
在结合反应步骤之后的洗涤步骤，用洗涤液洗掉未结合的物质，和
测定步骤，充入电解质介质，然后用光照射，由此测量这样形成的光电流；并且
所述电解质介质包含水和电解质，而实质不包含非质子溶剂，所述电解质能够在氧化状态下向增感染料提供电子。
2.根据权利要求1所述的用于被检物质的特异性检测的方法，其特征在于，所述反应溶液中所含盐的浓度由A表示，所述洗涤液中所含盐的浓度由B表示；基于此，摩尔比值A/B满足0.1≤A/B≤10。
3.根据权利要求1或2所述的用于被检物质的特异性检测的方法，其特征在于，所述洗涤液中所含盐的浓度由B表示，所述电解质介质中所含盐的浓度由C表示；基于此，摩尔比值B/C满足0.1≤B/C≤100。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的用于被检物质的特异性检测的方法，其特征在于，所述被检物质是生物分子。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的用于被检物质的特异性检测的方法，其特征在于，所述探针物质是生物分子。
6.根据权利要求4或5所述的用于被检物质的特异性检测的方法，其特征在于，所述生物分子是DNA。
7.根据权利要求2-6中任一项所述的用于被检物质的特异性检测的方法，其特征在于，所述盐包括氯化钠。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的用于被检物质的特异性检测的方法，其特征在于，所述电解质包括亚铁氰化物盐。
9.根据权利要求8所述的用于被检物质的特异性检测的方法，其特征在于，所述亚铁氰化物盐包括亚铁氰化钾。
10.根据权利要求8或9所述的用于被检物质的特异性检测的方法，其特征在于，所述亚铁氰化物盐包括亚铁氰化铵。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的用于被检物质的特异性检测的方法，其特征在于，所述电解质包括氢醌。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的用于被检物质的特异性检测的方法，其特征在于，所述电解质包括L-抗坏血酸。
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